(57)【要約】【課題】ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡをより高感度に測定することができる方法並びにそのためのプライマー及びプローブを提供することである。さらに、本発明の目的は、上記した３種類のキメラ遺伝子を同時に高感度に測定することができる方法並びにそのためのプライマー及びプローブを提供すること。【解決手段】特定の塩基配列を有し、ＰＭＬ遺伝子のエクソン３中の領域にハイブリダイズする第１のフォワードプライマー、特定の塩基配列を有し、ＰＭＬ遺伝子のエクソン６中の領域にハイブリダイズする第２のフォワードプライマー、及び特定の塩基配列を有し、ＲＡＲＡ遺伝子のエクソン３中の領域にハイブリダイズするリバースプライマーを用いた核酸増幅法により、ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡをより高感度に測定する【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、又は該核酸の１０％以下の塩基が置換した核酸から成る、核酸増幅法によるＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ測定用のフォワードプライマー。
【請求項２】
配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸から成る、請求項１記載のプライマー。
【請求項３】
前記核酸が、配列表の配列番号２に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸である請求項２記載のプライマー。
【請求項４】
前記核酸が、配列表の配列番号３に示す塩基配列を有する２０ｍｅｒの核酸から成る請求項３記載のプライマー。
【請求項５】
配列表の配列番号４に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、又は該核酸の１０％以下の塩基が置換した核酸から成る、核酸増幅法によるＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ測定用のフォワードプライマー。
【請求項６】
配列表の配列番号４に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸から成る請求項５記載のプライマー。
【請求項７】
前記核酸が、配列表の配列番号５に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸である請求項６記載のプライマー。
【請求項８】
前記核酸が、配列表の配列番号６に示す塩基配列を有する２１ｍｅｒの核酸から成る請求項７記載のプライマー。
【請求項９】
配列表の配列番号７に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、又は該核酸の１０％以下の塩基が置換した核酸から成る、核酸増幅法によるＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ測定用のリバースプライマー。
【請求項１０】
配列表の配列番号７に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸から成る、請求項９記載のリバースプライマー。
【請求項１１】
前記核酸が、配列表の配列番号８に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸である請求項１０記載のプライマー。
【請求項１２】
前記核酸が、配列表の配列番号９に示す塩基配列を有する１９ｍｅｒの核酸から成る請求項１１記載のプライマー。
【請求項１３】
リアルタイムＰＣＲ法用のプライマーである請求項１ないし１２のいずれか１項に記載のプライマー。
【請求項１４】
配列表の配列番号１０に示す塩基配列又はその相補鎖に、１〜５塩基の間隔を空けてハイブリダイズする、それぞれ１５塩基以上の一組の核酸であって、ハイブリダイズした状態において各核酸の互いに近接する末端領域に、共働してＦＲＥＴ効果を生じる蛍光色素がそれぞれ結合されている、核酸増幅法によるＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ測定用の一組のプローブ。
【請求項１５】
配列表の配列番号１１に示す塩基配列又はその相補鎖にハイブリダイズする請求項１４記載の一組のプローブ。
【請求項１６】
１つのプローブの核酸が、配列表の配列番号１２に示す塩基配列を有する３０ｍｅｒの核酸であり、他のプローブの核酸が、配列表の配列番号１３に示す塩基配列を有する２４ｍｅｒの核酸である請求項１５記載の一組のプローブ。
【請求項１７】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のフォワードプライマーと、請求項５ないし８のいずれか１項に記載のフォワードプライマーと、請求項９ないし１２のいずれか１項に記載のリバースプライマーとを用いて核酸増幅法により被検ｍＲＮＡ又はそのｃＤＮＡを増幅し、増幅産物を測定することを含むＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡの測定方法。
【請求項１８】
前記増幅産物と、請求項１４ないし１６のいずれか１項に記載の一組のプローブとをハイブリダイズさせ、蛍光を測定することにより前記増幅産物を測定する請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記増幅産物を増幅反応中にリアルタイムに測定するリアルタイム核酸増幅法（ただし、前記プローブのハイブリダイズ領域と、前記リバースプライマーのハイブリダイズ領域が重複しない）により行う請求項１７又は１８記載の方法。
【請求項２０】
核酸増幅反応をキャピラリーチューブ内で行う請求項１９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ測定用核酸及びプローブ並びにそれを用いたＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡの測定方法に関する。
【従来の技術】
【０００２】
前骨髄球性白血病患者においては、染色体転座により、１５番染色体上に位置するＰＭＬ（ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ　ｌｅｕｋｅｍｉａ）遺伝子と、１７番染色体上に位置するＲＡＲＡ（ｒｅｔｉｎｏｉｃ　ａｃｉｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｌｐｈａ）遺伝子とが融合し、その転写物であるＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡが生成することが知られている。転座により生じるキメラ遺伝子には、ｂｃｒ１、ｂｃｒ２及びｂｃｒ３の３種類が知られている。ｂｃｒ１では、ＰＭＬ遺伝子のエクソン６の３’末端とＲＡＲＡ遺伝子のエクソン３の５’末端が融合しており、ｂｃｒ２では、ＰＭＬ遺伝子のエクソン６の３’末端領域が欠失したものの３’末端とＲＡＲＡ遺伝子のエクソン３の５’末端が融合しており、ｂｃｒ３では、ＰＭＬ遺伝子のエクソン３の３’末端とＲＡＲＡ遺伝子のエクソン３の５’末端が融合している。これらのキメラ遺伝子及びその塩基配列は公知である。ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡを測定することは、前骨髄球性白血病の診断及び治療効果の判定に有用である。
【０００３】
ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡの測定方法としては、ＰＭＬ遺伝子にハイブリダイズするプライマーと、ＲＡＲＡ遺伝子にハイブリダイズするプライマーとを用いて、ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡのｃＤＮＡを増幅し、増幅産物を測定する方法が知られている。増幅産物をリアルタイムで測定する、リアルタイムＰＣＲにより、被検核酸を定量する方法も知られている（例えば特開２００２−１３６３００号公報）。しかしながら、公知の方法よりも高感度にＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡを測定することができれば、より正確な診断やより早期における疾病の発見が可能であるので有利なことは言うまでもない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡをより高感度に測定することができる方法並びにそのためのプライマー及びプローブを提供することである。さらに、本発明の目的は、上記した３種類のキメラ遺伝子を同時に高感度に測定することができる方法並びにそのためのプライマー及びプローブを提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、特定のプライマー及び／又はプローブを用いることにより、公知の方法よりも高感度にＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡを測定できることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、又は該核酸の１０％以下の塩基が置換した核酸から成る、核酸増幅法によるＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ測定用のフォワードプライマーを提供する。また、本発明は、配列表の配列番号４に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、又は該核酸の１０％以下の塩基が置換した核酸から成る、核酸増幅法によるＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ測定用のフォワードプライマーを提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号７に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、又は該核酸の１０％以下の塩基が置換した核酸から成る、核酸増幅法によるＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ測定用のリバースプライマーを提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号１０に示す塩基配列又はその相補鎖に、１〜５塩基の間隔を空けてハイブリダイズする、それぞれ１５塩基以上の一組の核酸であって、ハイブリダイズした状態において各核酸の互いに近接する末端領域に、共働してＦＲＥＴ効果を生じる蛍光色素がそれぞれ結合されている、核酸増幅法によるＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ測定用の一組のプローブを提供する。さらに、本発明は、上記本発明の２種類のフォワードプライマーと、上記本発明のリバースプライマーとを用いて核酸増幅法により被検ｍＲＮＡ又はそのｃＤＮＡを増幅し、増幅産物を測定することを含むＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡの測定方法を提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の、ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ測定用の第１のフォワードプライマーは、配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、又は該核酸の１０％以下の塩基が置換した核酸、好ましくは、配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、さらに好ましくは、配列表の配列番号２に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、さらに好ましくは、配列表の配列番号３に示す塩基配列を有する２０ｍｅｒ（塩基数が２０という意味、以下、同様）の核酸（以下、「フォワードプライマー１」ということがある）から成る。なお、上記した置換は、できるだけ少ない方が好ましく、置換がないことが最も好ましく、置換がある場合でも１塩基、とりわけ、５’末端又はその近傍に置換があることが比較的好ましい。このことは、置換を許容している後述の第２のフォワードプライマー及びリバースプライマーにもあてはまる。第１のフォワードプライマーのサイズは、１５塩基以上４０塩基以下であるが、１８塩基〜３０塩基程度が好ましい。なお、図１に、ｂｃｒ１キメラ遺伝子中の、ＰＭＬ遺伝子とＲＡＲＡ遺伝子の融合点近傍の塩基配列並びにフォワードプライマー１及び後述する他のプライマー並びにプローブがハイブリダイズする領域を示す（図１に示される塩基配列は配列番号１４に示す）。第１のフォワードプライマーは、ＰＭＬ遺伝子のエクソン３中の領域にハイブリダイズするものであり、ｂｃｒ３キメラ遺伝子及びｂｃｒ２遺伝子の領域の増幅に関与する。
【０００８】
本発明の、ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ測定用の第２のフォワードプライマーは、配列表の配列番号４に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、又は該核酸の１０％以下の塩基が置換した核酸、好ましくは、配列表の配列番号４に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、さらに好ましくは、配列表の配列番号５に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、さらに好ましくは、配列表の配列番号６に示す塩基配列を有する２１ｍｅｒの核酸（以下、「フォワードプライマー２」ということがある）から成る。第２のフォワードプライマーのサイズは、１５塩基以上４１塩基以下であるが、１８塩基〜３０塩基程度が好ましい。第２のフォワードプライマーは、ＰＭＬ遺伝子のエクソン６中の領域にハイブリダイズするものであり、ｂｃｒ１キメラ遺伝子の領域の増幅に関与する。
【０００９】
本発明の、ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ測定用のリバースプライマーは、配列表の配列番号７に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、又は該核酸の１０％以下の塩基が置換した核酸、好ましくは、配列表の配列番号７に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、又は該核酸の１０％以下の塩基が置換した核酸、さらに好ましくは、配列表の配列番号８に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、さらに好ましくは、配列表の配列番号９に示す塩基配列を有する１９ｍｅｒの核酸（以下、「リバースプライマー１」ということがある）から成る。リバースプライマーのサイズは、１５塩基以上３９塩基以下であるが、１８塩基〜３０塩基程度が好ましい。リバースプライマーは、ＲＡＲＡ遺伝子のエクソン３中の領域にハイブリダイズするものであり、全てのキメラ遺伝子の増幅に関与する。
【００１０】
上記した第１及び第２のフォワードプライマー並びにリバースプライマーは、核酸増幅法におけるプライマーとして用いられるものである。核酸増幅法自体はこの分野において周知であり、代表的なものとしてＰＣＲ法を挙げることができる。ＰＣＲ法自体は周知であり、そのためのキット及び装置も市販されているので、容易に実施することができる。ＰＣＲ法により増幅されるものはＤＮＡであるから、ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡをＰＣＲ法により測定するためには、先ず、キメラｍＲＮＡのｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅する（ＲＴ−ＰＣＲ法）。ｃＤＮＡの合成方法自体は、この分野において周知であり、通常、ランダムプライマー又はオリゴｄＴプライマーをプライマーとして用い、逆転写酵素の作用によりｍＲＮＡを鋳型として第一鎖ｃＤＮＡを合成し、ｍＲＮＡを分解後、第二鎖ｃＤＮＡを合成する方法が採用される。なお、核酸増幅法は、ＰＣＲ法に限定されるものではなく、例えば、増幅産物がアンチセンスｍＲＮＡであるＮＡＳＢＡ法等の他の核酸増幅法を用いることも可能である。増幅産物は、電気泳動にかけてバンドを検出したり、プローブとハイブリダイズさせてプローブを測定すること等により、周知の方法により容易に測定することができる。なお、本明細書において、「測定」と言う語は、検出と定量の双方を包含する意味で用いている。
【００１１】
核酸増幅法は、また、増幅産物をリアルタイムで測定する、リアルタイム核酸増幅法によっても行うことができる。リアルタイム核酸増幅法によれば、キメラｍＲＮＡの定量を正確に行うことができ、より好ましい。リアルタイム核酸増幅法の代表例はリアルタイム検出ＰＣＲ法であり、被検ｍＲＮＡのｃＤＮＡを鋳型として、周知の方法により行うことができる。リアルタイム検出ＰＣＲ法には、インターカレーション法、ＴａｑＭａｎ（商品名）プローブ法、Ｓｕｎｒｉｓｅユニプライマー（商品名）（モレキュラービーコン法）及びハイブリダイゼーションプローブ法等があるが、上記本発明のプライマーは、これらのいずれにも用いることができ、好ましくは、ハイブリダイゼーションプローブ法に用いることができる。これらのリアルタイム検出ＰＣＲ法自体は、周知であり、そのためのキット及び装置も市販されているので容易に行うことができる。ＰＣＲ反応は、マイクロチューブ内で行ってもよいが、より容積の小さいキャピラリーチューブ内で行うと、反応液の温度変更をより迅速、的確に行うことができ好ましい。なお、キャピラリーチューブは、例えば内径が０．５ｍｍ〜１ｍｍ程度、内容積が１０〜２０μｌ程度の毛管であり、キャピラリーチューブ及びこれを用いてリアルタイム検出ＰＣＲを行うための装置は、ライトサイクラーの商品名でＲｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社から市販されている。
【００１２】
本発明は、さらに、上記本発明のプライマーを用いて増幅された増幅産物の測定に有用なプローブをも提供する。本発明のプローブは、配列表の配列番号１０に示す塩基配列又はその相補鎖に、１〜５塩基の間隔を空けてハイブリダイズする、それぞれ１５塩基以上の一組の核酸であって、ハイブリダイズした状態において各核酸の互いに近接する末端領域に、共働してＦＲＥＴ効果を生じる蛍光色素がそれぞれ結合されている、核酸増幅法によるＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ測定用の一組のプローブであり、好ましくは、配列表の配列番号１１に示す塩基配列又はその相補鎖にハイブリダイズする一組のプローブであり、さらに好ましくは、１つのプローブの核酸が、配列表の配列番号１２に示す塩基配列を有する３０ｍｅｒの核酸（以下、「プローブ１」ということがある）であり、他のプローブの核酸が、配列表の配列番号１３に示す塩基配列を有する２４ｍｅｒの核酸（以下、「プローブ２」というこがある）一組のプローブである。なお、ここで、「ハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーションプローブ法の増幅反応条件下においてハイブリダイズするという意味であり、好ましくは、配列表の配列番号１０に示す塩基配列又はその相補鎖中の連続する１５塩基以上の領域と同一の塩基配列を有するものであり、さらに好ましくは、配列表の配列番号１１に示す塩基配列又はその相補鎖中の連続する１５塩基以上の領域と同一の塩基配列を有するものである。ここで、ＦＲＥＴは、蛍光共鳴エネルギー転移（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）であり、ＦＲＥＴ効果を生じる蛍光色素の組み合わせは周知であり、市販もされている。ドナー蛍光色素の例として、フルオレッセイン、アクセプター蛍光色素の例として、ＬＣ　Ｒｅｄ６４０等を挙げることができる。これらの蛍光色素は、ハイブリダイゼーションプローブ法のための市販のキットに含まれている。各蛍光色素は、増幅産物とハイブリダイズした状態において、各核酸の互いに近接する末端領域、好ましくは末端のヌクレオチドに結合される。例えば、プローブがアンチセンス鎖とハイブリダイズする場合、上流の領域（センス鎖を基準として）にハイブリダイズするプローブの３’末端にドナー色素（又はアクセプター色素）を結合し、下流の領域にハイブリダイズするプローブの５’末端にアクセプター色素（又はドナー色素）を結合する。このようにすることにより、一組のプローブが増幅産物にハイブリダイズした状態では、ドナー色素とアクセプター色素とが近接して存在するので、これらが共働してＦＲＥＴ効果が起きるので、プローブ、ひいては増幅産物の測定が可能になる。各プローブのサイズは１５塩基以上であるが、１８塩基〜３５塩基程度が好ましい。本発明の一組のプローブは、特に、ハイブリダイゼーションプローブ法によるリアルタイム検出ＰＣＲ法に好ましく用いられるが、リアルタイム検出ではない核酸増幅法による増幅産物の測定に用いることもできる。なお、本発明のプローブを、前記した本発明のリバースプライマーと同時に用いてハイブリダイゼーションプローブ法によるリアルタイム検出ＰＣＲ法を行う場合には、該プローブのハイブリダイズ領域と、前記リバースプライマーのハイブリダイズ領域が重複しないように両者を設定する。
【００１３】
本発明の、ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡの測定方法は、上記した第１及び第２のフォワードプライマー並びにリバースプライマーを用いて核酸増幅法を行い、増幅産物を測定するものであり、用いるプライマーに特徴がある。用いるプライマー以外の方法については、上記した通り、常法により行うことができる。なお、被検ｍＲＮＡを定量する場合には、核酸増幅が正しく起きたか否かを確認するための対照として、Ｇ６ＰＤＨ遺伝子のような、ハウスキーピング遺伝子を同時に増幅することが好ましい。これも常法である。なお、リアルタイム検出ＰＣＲ法では、ハウスキーピング遺伝子とのコピー数の比を計算することにより、検量線を作成しなくても被検ｍＲＮＡの定量が可能である。このような計算方法は周知であり（例えば、臨床検査　ｖｏｌ．４４　ｎｏ．６　２０００年６月、ｐｐ．６６８−６７８）、市販のリアルタイム検出ＰＣＲ用の装置に添付されているコンピューターソフトを用いて行うことができる。
【００１４】
本発明の方法によれば、第１のフォワードプライマーとリバースプライマーによりｂｃｒ３及びｂｃｒ２キメラ遺伝子の領域が高効率に増幅され、第２のフォワードプライマーとリバースプライマーによりｂｃｒ１キメラ遺伝子の領域が高効率に増幅される。従って、本発明の方法によれば、全てのタイプのキメラ遺伝子を同時に高感度に測定することができる。また、増幅産物の測定に本発明の一組のプローブを用いると、増幅産物を高感度に測定できる。
【００１５】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１６】
実施例１、比較例１〜５
（１）　概要
上記したフォワードプライマー１（配列番号３）、フォワードプライマー２（配列番号６）及びリバースプライマー１（配列番号９）をプライマーとして用い、さらに上記したプローブ１（配列番号１２、３’末端にドナー色素であるフルオレッセインを結合）及びプローブ２（配列番号１３、５’末端にアクセプター色素であるＬＣ　Ｒｅｄ６４０を結合、３’末端はリン酸化）をハイブリダイゼーションプローブとして用いた、ハイブリダイゼーションプローブ法による逆転写リアルタイム検出ＰＣＲを行った（実施例１）。被検試料は、ｂｃｒ３遺伝子を含むことが知られているヒト白血病細胞株ＨＴ９３（文献：Ｋｉｓｈｉ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．　Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ　ａｎｄ　ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ　ｉｎ　ａ　ｎｅｗｌｙ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ａｃｕｔｅ　ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ｗｉｔｈ　ｔ（１５；１７）．　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｒｙ．　１９９８；　２６：　１３５−１４２．）又はｂｃｒ１遺伝子を含むことが知られているヒト白血病細胞株ＮＢ４（文献：Ｌａｎｏｔｔｅ，　ｅｔ　ａｌ．　ＮＢ４，　ａ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ｗｉｔｈ　ｔ（１５；１７）　ｍａｒｋｅｒ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ａ　ｈｕｍａｎ　ａｃｕｔｅ　ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ　ｌｅｕｋｅｍｉａ（Ｍ３）．　Ｂｌｏｏｄ．　１９９１；　７７：　１０８０−１０８６．）から常法により抽出した、既知濃度の全ｍＲＮＡである。一方、比較のため、市販のコンピューターソフトを駆使し、該コンピューターソフトが推奨する適切なプライマー及びプローブを用いたことを除き、実施例１と全く同様にして測定を行った（比較例１〜５）。比較例で用いた第１のフォワードプライマー（以下、「フォワードプライマー１’」）、第２のフォワードプライマー（以下、「フォワードプライマー２’」）及びリバースプライマー（以下、「リバースプライマー１’」）の塩基配列を、配列番号１５、１６及び１７にそれぞれ示す。また、比較例で用いたプローブ（３’末端にドナー色素であるフルオレッセインを結合、以下、「プローブ１’」）及びプローブ（５’末端にアクセプター色素であるＬＣ　Ｒｅｄ６４０を結合、３’末端はリン酸化、以下、「プローブ２’」）の塩基配列を配列番号１８及び１９にそれぞれ示す。比較例１〜５では、これらのプライマー及びプローブを、実施例１で用いたプライマー及びプローブと組み合わせて用いた。各例で用いたプライマー及びプローブの組み合わせを下記表１に示す。
【００１７】
【表１】
表１
2004089089.tif 000002
【００１８】
（２）　具体的な方法
（ｉ）　ｃＤＮＡ合成
下記表２に示す組成を有するｃＤＮＡマスター混合物を調製した。
【００１９】
【表２】
表２
2004089089.tif 000003
【００２０】
ＰＣＲチューブ（０．２　ｍｌ）に上記ｃＤＮＡマスター混合物１０μｌを入れ、被検核酸１０μｌを入れ、チューブをサーモサイクラーにセットして、２５℃１０分間のアニーリング、４２℃、６０分間の逆転写、９５℃、５分間の逆転写の不活性化、及び４℃への放冷を行い、ｃＤＮＡを合成した。
【００２１】
（ｉｉ）　ライトサイクラー（商品名）を用いたハイブリダイゼーションプローブ法によるリアルタイム検出ＰＣＲ
下記表３に示す組成を有するＰＣＲマスター混合物を調製した。
【００２２】
【表３】
表３
2004089089.tif 000004
【００２３】
一方、下記表４に示す組成を有する、コントロールとしてのＧ６ＰＤＨ遺伝子増幅用のＰＣＲマスター混合物を調製した。
【００２４】
【表４】
表４
2004089089.tif 000005
【００２５】
ライトサイクラー（商品名）に付属するキャピラリーに、上記ＰＣＲマスター混合物１５μｌを入れ、（ｉ）で得られたｃＤＮＡ溶液又はネガティブコントロールとして水５μｌを加えた。キャピラリーチューブに栓をし、ライトサイクラー（商品名）装置にセットして、９５℃、１０秒間の変性工程後、９５℃、１０秒間の変性工程、６３℃、１０秒間のアニーリング工程、及び７２℃、８秒間の伸長工程から成るサイクルを繰り返した。増幅反応中、蛍光をリアルタイムで測定した。
【００２６】
各濃度の試料ｍＲＮＡについてのＣＰ値及び最終蛍光強度を測定した。なお、ＣＰ値は、横軸にサイクル数、縦軸に蛍光強度をプロットした場合に、蛍光強度が急激に立ち上がるサイクル数を意味し、被検核酸の量が同一である場合には、これが小さいほど増幅効率が高い。
【００２７】
（３）　結果
結果を下記表５及び表６に示す。
【００２８】
【表５】
表５　　ＣＰ値
2004089089.tif 000006
【００２９】
【表６】
表６　　蛍光強度
2004089089.tif 000007
【００３０】
以上の結果から、本発明のプライマー及びプローブのいずれか１つないし３つだけをコンピューターソフトが推奨するプライマー又はプローブに変更した場合と比較しても、本発明の方法の方が、少なくともいずれかの型のＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡの増幅効率（プライマーを変更した場合、比較例１〜４）又は蛍光強度（プローブを変更した場合、比較例５）において、比較例の方法を上まるものであった。
【００３１】
【発明の効果】
ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡをより高感度に測定することができる方法並びにそのためのプライマー及びプローブ、並びに３種類のｂｃｒ遺伝子を同時に高感度に測定することができる方法並びにそのためのプライマー及びプローブが提供された。本発明の方法によれば、ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡを高感度に測定することができる、すなわち、より低濃度のキメラｍＲＮＡを測定することができるので、前骨髄球性白血病の診断及び治療効果の判定に威力を発揮するものと考えられる。
【００３２】
【配列表】
2004089089.tif 000008
【００３５】
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【００３８】
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【００４１】
2004089089.tif 000011
2004089089.tif 000012
【００４４】
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【００４５】
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【００４６】
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【００４７】
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【００４８】
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【００４９】
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【００５０】
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【００５１】
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【００５２】
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【００５３】
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【００５４】
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【００５５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの融合点近傍の塩基配列並びに実施例及び比較例で用いたプライマー及びプローブがハイブリダイズする位置を示す図である。
【図１】
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