(57)【要約】　　　（修正有）【課題】フラビウィルスの適切に処理した遺伝子産物を発現する組換えポックスウィルス及びその組換えポックスウィルスの産生方法の提供。【解決手段】日本脳炎ウイルス、黄熱ウイルスおよびデング熱ウイルスのようなフラビウイルスからの異種ＤＮＡを含有する、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルスおよびカナリアウイルスのような組換えポックスウイルスについて記載している。好ましい実施態様において、組換えポックスウイルスは、中和抗体、血球凝集抑制抗体およびフラビウイルス感染に対する防御免疫を誘発することのできるフラビウイルスＥおよびＭタンパク質を含有する細胞外粒子を産生する。また、ワクチン接種した宿主動物中に免疫学的応答を誘発する組換えポックスウイルスを含有するワクチンについても記載している。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アビポックスウイルスゲノムの非必須領域中に少なくとも１つの日本脳炎ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えアビポックスウイルスであって、
前記アビポックスウイルスが、野生型の単離体から得られ、ニワトリ胚繊維芽細胞での連続継代、それに続くマスターウイルス種の寒天での連続的プラーク精製、および更なる継代による１つのプラーククローンの増幅によって弱毒化されたアビポックスウイルスであることを特徴とする組み換えアビポックスウイルス。
【請求項２】
前記ＤＮＡが、日本脳炎ウイルスタンパク質のＣのＣ末端１５アミノ酸、ｐｒｅＭ、およびＥをコードすることを特徴とする請求項１記載の組換えアビポックスウイルス。
【請求項３】
前記ＤＮＡが、日本脳炎ウイルスタンパク質のＮＳ１およびＮＳ２Ａをさらにコードすることを特徴とする請求項２記載の組換えアビポックスウイルス。
【請求項４】
前記ＤＮＡが、日本脳炎ウイルスタンパク質のＣの残りの配列をさらにコードすることを特徴とする請求項３記載の組換えアビポックスウイルス。
【請求項５】
アビポックスウイルスゲノムの非必須領域中に少なくとも１つの日本脳炎ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えアビポックスウイルスであって、
前記アビポックスウイルスが、ニワトリ胚繊維芽細胞での２００回を越える連続継代、それに続く４回の連続プラーク精製、さらに５回の更なる連続継代による増幅によって弱毒化されたカナリヤポックスウイルスであって、
前記ＤＮＡが、日本脳炎ウイルスタンパク質のＥのＣ末端３０アミノ酸、ＮＳ１およびＮＳ２Ａをコードすることを特徴とする組換えアビポックスウイルス。
【請求項６】
前記ＤＮＡが、日本脳炎ウイルスタンパク質のＮＳ２Ｂをさらにコードすることを特徴とする請求項５記載の組換えアビポックスウイルス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関　連　出　願
この出願は、１９９０年　８月１５日に出願された第０７／５６７，９６０号の一部継続出願である、１９９１年　６月　６日に出願された第０７／７１１，４２９号のさらに一部継続出願である、１９９１年　６月１３日に出願された第０７／７１４，６８７号の一部継続出願である。
【０００２】
産業上の利用分野
本発明は修飾ポックスウイルスおよびその製造方法並びに使用方法に関するものである。本発明はさらに詳細には、そのウイルスがフラビウイルス遺伝子の遺伝子産生物を発現する組換えポックスウイルス、およびフラビウイルス感染に対する防御免疫を提供するワクチンに関するものである。
【０００３】
いくつかの出版物がこの出願に参照されている。これらの参照文献に関する全ての引用を、請求項に先立つ明細書の最後に記載する。これらの参照文献は、本発明が属する従来技術を記載している。
【０００４】
発明の背景
ワクシニアウイルスおよび最近では他のポックスウイルスが、異種遺伝子の挿入および発現に用いられている。異種遺伝子を生感染ポックスウイルスに挿入する基本技術は、供与体プラスミド中の異種遺伝子要素を側面に有するＤＮＡ配列と救助（ｒｅｓｃｕｉｎｇ）ポックスウイルス中に存在する相同配列との間の組換え体を含む（ピッチーニら、１９８７）。　特に、組換えポックスウイルスは、従来技術において知られ、その開示がここに参照文献として引用されている米国特許第４，６０３，１１２　号に記載のワクシニアウイルスの合成組換え体を産生する方法に類似した２段階によって構成される。
【０００５】
第１に、ウイルスに挿入されるＤＮＡ遺伝子配列、特に非ポックス源からの読取り枠は、ポックスウイルスのＤＮＡの断片と相同なＤＮＡが挿入されたＥ．ｃｏｌｉプラスミド構造中に配される。それとは別に、挿入されるＤＮＡ遺伝子配列はプロモーターに連結される。そのプロモーター−遺伝子結合は、可欠座を含有するポックスＤＮＡの領域を側面に有するＤＮＡ配列に相同なＤＮＡにより両端に配されるようにプラスミド構造に配される。産生したプラスミド構造は次いでＥ．ｃｏｌｉバクテリア内での成長により増大し（クレウェル、１９７２）、単離される（クレウェルら、１９６９；マニアチスら、１９８６）。
【０００６】
第２に、挿入されるＤＮＡ遺伝子配列を含有する単離プラスミドは、ポックスウイルスとともに細胞培養、例えば鶏胚繊維芽細胞中にトランスフェクションされる。プラスミド中の相同ポックスＤＮＡとウイルスゲノムとの間の組換え体それぞれは、異種ＤＮＡ配列のそのゲノムの可欠領域の存在により修飾されたポックスウイルスを産生する。「異種」ＤＮＡという用語は、外因性ＤＮＡがそこに配されるゲノムにより通常は産生されない遺伝子産生物をコードする外因性ＤＮＡ、特に非ポックス源からのＤＮＡを指す。
【０００７】
遺伝子組換えは一般的に、ＤＮＡの２つの鎖の間のＤＮＡの相同断片の交換である。あるウイルスにおいては、ＲＮＡがＤＮＡと置き代わる。核酸の相同断片は、ヌクレオチド塩基の同一配列を有する核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の断片である。
【０００８】
遺伝子組換えは、感染宿主細胞内の新たなウイルスゲノムの複製または産生中に自然に行なわれる。したがって、ウイルス遺伝子間の遺伝子組換えは、２つ以上の異なるウイルスまたは他の遺伝子構造物に併感染した宿主細胞中で行なわれるウイルス複製周期中に生じる。第１のゲノムからのＤＮＡ断片は、ＤＮＡが第１のウイルスゲノムのＤＮＡと相同である第２の併感染ウイルスのゲノムの断片を構成する際に交互に用いられる。
【０００９】
しかしながら、組換えはまた、完全には相同ではない異なるゲノム中のＤＮＡの断片間にも行なえる。そのような断片の１つが、例えば、相同ＤＮＡの部分に挿入される抗体決定因子をコードする遺伝子または遺伝子標識の、第１の断片内への存在を除いた別のゲノムの断片と相同な第１のゲノムからのものである場合、組換えはまだ行なうことができ、その組換えの産生物は次いで組換えウイルスゲノム中の遺伝子または遺伝子標識の存在により検出可能である。
【００１０】
修飾感染ウイルスによる挿入ＤＮＡ遺伝子配列の発現を成功させるには２つの条件を要する。第１に、挿入は、修飾ウイルスが存在できるようにウイルスの可欠領域中に行なわれなければならない。挿入ＤＮＡの発現の第２の条件は、挿入ＤＮＡと適切な関係にあるプロモーターの存在である。そのプロモーターは、発現されるＤＮＡ配列から上流に位置するように配されなければならない。
【００１１】
フラビウイルス属（ｆａｍｉｌｙ　Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ　）は、世界の温暖地域および熱帯地域の両方に重大な公衆健康問題を生じる約６０の節足動物媒介ウイルスからなる（ショープ、１９８０；モナス、１９８６）。これらの因子のいくつかに対していくつかの高度に成功した不活化ワクチンおよび弱毒化ワクチンが開発されているが、残りのウイルス、とりわけデング熱に対する組換えワクチンを生成するためにフラビウイルス属の分子生物学の研究が盛んに行なわれてきた（ブランド、１９８８）。
【００１２】
フラビウイルスタンパク質は、陽性鎖ゲノムＲＮＡ中に存在する１本の長い翻訳読取り枠（ＯＲＦ）によりコードされる。構造タンパク質をコードする遺伝子が、その後に非構造糖タンパク質ＮＳ１および残りの非構造タンパク質が続くゲノムの５′末端に発見された（ライスら、１９８５）。そのフラビウイルスのウイルス粒子は、外被糖タンパク質であるＥ、膜タンパク質であるＭ、およびカプシドタンパク質であるＣを含有する。日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）の場合、ウイルス粒子の調製には通常、膜タンパク質であるｐｒＭに対して少量の糖タンパク質前駆体を含有する（メイソンら、１９８７ａ　）。一方ＪＥＶ感染細胞内においては、Ｍタンパク質が高分子量ｐｒＭタンパク質としてほとんど独占的に存在する（メイソンら、１９８７ａ　；シャピロら、１９７２）。
【００１３】
３つのフラビウイルス糖タンパク質（ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１）それぞれに特有の、受動的に行なわれた単クローン性抗体（ＭＡｂｓ）の防御効果を試験した研究により、これら抗原それぞれに対する免疫は致死ウイルス攻撃接種から部分的な防御または完全な防御となることが示される。Ｅに対する単クローン性抗体は、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）（木村、黒田ら、１９８８；メイソンら、１９８９）、デング熱第２種ウイルス（コフマンら、１９８７）、および黄熱病（ＹＦ）（グッドら、１９８６）による感染からの防御を提供する。ほとんどの場合、受動的防御は、生体外のウイルスを中和するこれらＥ　ＭＡｂｓの能力と相関性がある。最近、コフマンら（１９８９）は、受動的防御はまた、生体外の弱いまたは検知不能中和活性を示すｐｒＭ　ＭＡｂｓにより生成できることを示した。動物を感染から防御する構造タンパク質特有ＭＡｂｓの能力は、構造タンパク質抗体が標的細胞に結合するウイルスを遮断することにより弱毒化するという従来の前提と矛盾していない。黄熱病（シュレシンジャーら、１９８５；グッドら、１９８６）およびデング熱第２種ウイルス（ハンチャンら、１９８８）のＮＳ１タンパク質に対してＭＡｂｓを用いた受動的防御実験は、この非構造糖タンパク質に対する抗体が致死ウイルス感染から動物を防御することを示した。これらのＭＡｂｓはウイルス結合特性を示さないので、その防御はおそらく、ウイルス感染の弱毒化の従来にはない機構のいくつかにより成立する。
【００１４】
感染から宿主を防御するＮＳ１免疫の能力への付加的支持は、黄熱病ウイルス感染細胞（シュレジンジャーら、１９８５）またはデング熱第２種ウイルス感染細胞（シュレジンジャーら、１９８７）のいずれかから精製されたＮＳ１が相同ウイルスによる感染からの防御免疫を誘発するという直接の免疫から生じる。
【００１５】
これら３つのフラビウイルス糖タンパク質抗原の主な構造を得る重大な進歩がなされたが、その３次元構造についてはほとんど知られていない。これら抗原の、正しく折り畳まれ、あるいは正確に組み立てられた形状を作成する能力は、効果的な組換えワクチンの産生に重要である。ＮＳ１基準のワクチンの場合、ＮＳ１の二量体化（ウィンクラーら、１９８８）が最大防御応答を引き出すのに求められる。Ｅタンパク質に関して、Ｅ．ｃｏｌｉ中で産生されたＥタンパク質抗原（メイソンら、１９８９）および変性条件下で調製された本物の（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ　）Ｅタンパク質（ウェングラーら、１９８９ｂ　）が抗体の中和を引き起こさなかったので、防御免疫応答を引き出すのに正確な折り畳みがおそらく求められる。これらのタンパク質は西ナイルウイルスの細胞付帯形状にあるヘテロダイマー中に発見されるので、Ｅタンパク質の正確な折り畳みは、そのｐｒＭタンパク質の協調合成を要する（ウェングラーら、１９８９ａ　）。Ｅの正確な折り畳みおよびＥとｐｒＭのウイルス粒子への組立ては、ＪＥＶ感染細胞中のＥの未熟性形状とともに分泌装置の初期の区画に共保持されたＮＳ１タンパク質の協調合成を要する（メイソン、１９８９）。
【００１６】
フラビウイルス糖タンパク質に基づく組換えフラビイウルスワクチンを産生する研究がいくつか成功しているが、動物モデル系が中和抗体の予期した産生と常に相関があるわけではない（ブレイら、１９８９；ドベルら、１９８８；松浦ら、１９８９；安田ら、１９９０；サングら、１９８８；サオら、１９８７）。　安田ら（１９９０）は、Ｃの１２７　のアミノ酸から６５、ｐｒＭの全て、Ｅの全て、およびＮＳ１の３５２　のアミノ酸から５９をコードするＪＥＶの領域を含むワクシニア組換え体を報告した。ハイシら（１９８９）は、ｐｒＭの１６７　のアミノ酸から１７、Ｅの全ておよびＮＳ１の３５２　のアミノ酸から５７をコードする日本脳炎配列を含むワクシニア組換え体を報告した。
【００１７】
ドベルら（１９８８）は、Ｃの全て、ｐｒＭの全て、Ｅの全ておよびＮＳ１の３５２　のアミノ酸から１６のデング熱２のコード配列を含むワクシニア組換え体を報告した。
【００１８】
サオら（１９８７）は、Ｃの全て、ｐｒＭの全て、Ｅの全て、ＮＳ１の全ておよびＮＳ２Ａの全てのデング熱４のコード配列を含むワクシニア組換え体を報告した。ブレイら（１９８９）は、（ｉ）　Ｃの全て、ｐｒＭの全て、およびＥの４５４　のアミノ酸から４１６　、（ｉｉ）ｐｒＭの１６７　のアミノ酸から１５およびＥの４５４　のアミノ酸から４１６　、（ｉｉｉ）　インフルエンザＡウイルス血球凝集素の１８のアミノ酸およびＥの４５４　のアミノ酸から４１６　、および（ｉｖ）多核性ウイルスＧ糖タンパク質の７１のアミノ酸およびＥの４５４　のアミノ酸から４１６　、のデング熱４コード配列を含む一連のワクシニア組換え体を報告した。
【００１９】
組換えフラビウイルスワクチンを産生するこれらの研究にもかかわらず、ワクシニア組換え体によるＪＥＶ　Ｅタンパク質の適切な発現は満足には得られていない。ハイシら（１９８９）は、そのワクシニア組換え体によるＪＥＶ　Ｅタンパク質の細胞質発現を示したが、その分布はＪＥＶ感染細胞中に観察された分布とは異なるものであった。安田ら（１９９０）は、その細胞表面上にワクシニア組換え体によるＪＥＶ　Ｅタンパク質の発現を検出した。ｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質を発現する組換えワクチンは、約１０のＬＤ５０である攻撃誘発ウイルスからネズミを防御した。安田ら（１９９０）は、抗ＪＥＶ免疫応答並びに防御を引き出したが、Ｅ特有単クローン抗体のパネルに対する反応性はＪＥＶ感染細胞に観察された反応性からの差異を示した。デング熱第２種構造タンパク質は組換え体ワクシニアウイルスにより発現されている（ドベルら、１９８８）。これらのウイルスは感染細胞内の構造糖タンパク質の合成を引き出したが、それらは検知できる抗デング熱免疫応答を引き起こすことも、デング熱感染から猿を防御することもしなかった。いくつかの研究においても、ワクシニアウイルス中のデング熱第４種構造タンパク質および非構造タンパク質の発現部分について検討されている（ブレイら、１９８９；ファリグアウトら、１９８９；サオら、１９８７）。興味のあることに、Ｐ７．５　早遅プロモーター（Ｐ７．５　ｅａｒｌｙ−ｌａｔｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　）の制御の元でＣからＮＳ２Ａに延びるウイルスＯＲＦの全５′末端を含有した組換え体がｐｒＭ、Ｅ、およびＮＳ１の細胞内形状を産生したが、ＮＳ１の形状がこの組換えウイルスに感染した細胞から放出されたとしても、どの構造タンパク質の細胞外形状の合成も引き出すこともできなかった（ブレイら、１９８９；サオら、１９８７）。他の構造タンパク質遺伝子を有するまたは有さないデング熱第４種のＥ遺伝子のいくつかの形状を含む追加の組換えウイルスもまた試験した（ブレイら、１９８９）。これらの組換えウイルスのいくつかが防御を引き起こすことができたが、Ｅの細胞外形状を産生もせず、中和抗体を引き起こさなかった。Ｃ末端切断Ｅタンパク質遺伝子を発現するデング熱ワクシニア組換え体は、Ｅの細胞外形状の合成を引き起こし、接種したネズミ中のデング熱ウイルス脳炎に対する抵抗の水準を増大させた（マンら、１９９１）。
【００２０】
したがって、適切に処理した形状のフラビウイルスタンパク質を産生するフラビウイルス組換えポックスウイルスおよびフラビウイルスの感染に対する防御免疫を与えるワクチンの提供は、現在の技術状態を超えてはるかに望ましい進歩であることが認識されよう。
【００２１】
発明の目的
それゆえ、本発明の目的は、そのウイルスがフラビウイルスの適切に処理した遺伝子産生物を発現する組換えポックスウイルス、およびその組換えポックスウイルスを産生する方法を提供することにある。
【００２２】
さらに本発明の付加的な目的は、ポックスウイルスベクター中のフラビウイルスコード配列のクローニングおよび発現を提供することにある。
【００２３】
本発明の別の目的は、フラビウイルス中和抗体、血球凝集抑制抗体およびフラビウイルス感染と致死フラビウイルス攻撃接種に対する防御免疫を引き起こすことのできるワクチンを提供することにある。
【００２４】
本発明のこれらおよび他の目的並びに利点は以下の考察の後に容易に明確となる。
【００２５】
発明の概略
一面において、本発明は、フラビウイルス感染に対して防御免疫を引き起こすことのできる細胞外フラビウイルス構造タンパク質を産生する組換えポックスウイルスに関するものである。特に、その組換えポックスウイルスは、中和抗体および血球凝集抑制抗体を引き起こすことのできるフラビウイルスＥおよびＭタンパク質を含有する細胞外粒子を産生する。ポックスウイルスは、好ましくはワクシニアウイルスまたは鶏痘ウイルスまたはカナリア痘ウイルスのようなアビポックス（ａｖｉｐｏｘ）である。フラビウイルスは、好ましくは日本脳炎ウイルス、黄熱ウイルスおよびデング熱ウイルスである。
【００２６】
本発明によると、組換えポックスウイルスは、細胞外媒質に放出できる宿主フラビウイルス構造タンパク質中に発現するポックスウイルスゲノムの可欠領域中のフラビウイルスからのＤＮＡを含有する。特に、そのＤＮＡは、前駆体を構造タンパク質Ｍ、構造タンパク質Ｅ、および非構造タンパク質ＮＳ１とＮＳ２Ａにコードする日本脳炎ウイルスコード配列を含有する。より詳しくは、組換えポックスウイルスは、フラビウイルス構造タンパク質Ｅおよびタンパク質Ｍを含有する粒子を発現するポックスウイルスゲノムの可欠領域中のフラビウイルスからのＤＮＡを含有する。別の面において、本発明は、ワクチンに感染した宿主動物中に免疫学的反応を引き起こすワクチンに関し、そのワクチンは、担体およびその可欠領域中にフラビウイルスからのＤＮＡを含有する組換えポックスウイルスを含有する。
【００２７】
特に、その組換えウイルスは、ｐｒＭからＮＳ２Ｂに延びるフラビウイルスＯＲＦの部分を発現する。組換えウイルスに感染した細胞の生化学分析により、組換えウイルスは全ての３つのフラビウイルス糖タンパク質−ｐｒＭ、Ｅ、およびＮＳ１の適切に処理された形状の産生を明細に示すことが分かった。組換えウイルスは、Ｍタンパク質およびＥタンパク質の完全に処理された形状を含む細胞外粒子の合成を引き起こした。さらに、ネズミ免疫研究の結果、中和抗体の誘発および高水準の防御は免疫組換えウイルスの能力と関連して、２つの構造膜タンパク質を含む細胞外粒子を産生したことが示された。
【００２８】
図面の簡単な説明
図面を参照することにより、本発明をよりよく理解する。
図１は、ＪＥＶ構造タンパク質コード領域、ＮＳ１およびＮＳ２Ａの部分のコード配列を含む供与体プラスミドｐＳＰＪＥＶＳＨ１２ＶＣおよびｐＳＰＪＥＶＬ１４ＶＣを構成する方法を示す模式図である。
【００２９】
図２は、ＪＥＶ構造タンパク質コード領域、ＮＳ１、ＮＳ２ＡおよびＮＳ２Ｂの部分のコード配列を含む供与体プラスミドｐＳＰＪＥＶ１１ＶＣおよびｐＳＰＪＥＶ１０ＶＣを構成する方法を示す模式図である。
【００３０】
図３は、供与体プラスミドを構成するために用いられるオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列（翻訳開始および停止をイタリック体で、初期転写停止を下線で示した）を示す。
【００３１】
図４は、４つの組換えワクシニアウイルスｖＰ６５０、ｖＰ５５５、ｖＰ６５８およびｖＰ５８３に挿入されたＪＥＶコード領域の地図である。
【００３２】
図５は、ＪＥＶ感染および組換えワクシニアウイルスｖＰ６５０、ｖＰ５５５、ｖＰ６５８およびｖＰ５８３の感染により産生された細胞溶解産物ＮＳ１タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による比較を示す。
【００３３】
図６は、ＪＥＶ感染および組換えワクシニアウイルスｖＰ６５０、ｖＰ５５５、ｖＰ６５８およびｖＰ５８３の感染により産生された培養液ＮＳ１タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による比較を示す。
【００３４】
図７は、ＪＥＶ感染および組換えワクシニアウイルスｖＰ６５０、ｖＰ５５５、ｖＰ６５８およびｖＰ５８３の感染により産生された細胞溶解産物Ｅタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による比較を示す。
【００３５】
図８は、ＪＥＶ感染および組換えワクシニアウイルスｖＰ６５０、ｖＰ５５５、ｖＰ６５８およびｖＰ５８３の感染により産生された培養液Ｅタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による比較を示す。
【００３６】
図９は、ＪＥＶ感染細胞およびワクシニア組換え体ｖＰ５５５およびｖＰ６５０に感染した細胞から収穫された培養液中に発見されたＥタンパク質の形状のショ糖勾配分析による比較を示す。
【００３７】
図１０は、ＪＥＶで、およびワクシニア組換え体ｖＰ５５５およびｖＰ６５８でワクチン接種した動物からの攻撃接種前の血清のＪＥＶ特有反応性のイムノプレシピテーション分析による比較を示す。
【００３８】
図１１は、チミジンキナーゼ遺伝子の削除のためのプラスミドｐＳＤ４６０の構成方法および組換えワクシニアウイルスｖＰ４１０の産生方法を示す模式図。
【００３９】
図１２は、出血性領域の削除のためのプラスミドｐＳＤ４８６の構成方法および組換えワクシニアウイルスｖＰ５５３の産生方法を示す模式図。
【００４０】
図１３は、ＡＴＩ領域の削除のためのプラスミドｐＭＰ４９４Δの構成方法および組換えワクシニアウイルスｖＰ６１９の産生方法を示す模式図。
【００４１】
図１４は、血球凝集素遺伝子の削除のためのプラスミドｐＳＤ４６７の構成方法および組換えワクシニアウイルスｖＰ７２３の産生方法を示す模式図。
【００４２】
図１５は、遺伝子クラスター［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］の削除のためのプラスミドｐＭＰＣＳＫ１Δの構成方法および組換えワクシニアウイルスｖＰ８０４の産生方法を示す模式図。
【００４３】
図１６は、巨大サブユニットである、リボヌクレオチドレダクターゼの削除のためのプラスミドｐＳＤ５４８の構成方法および組換えワクシニアウイルスｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）の産生方法を示す模式図。
【００４４】
図１７は、ＣからＮＳ２Ｂをコードする領域のＪＥＶのナカヤマ鎖のＤＮＡ配列を示す。
【００４５】
図１８は、ワクシニアウイルスｖＰ５５５、ｖＰ８２５、ｖＰ９０８、ｖＰ９２３、ｖＰ８５７、ｖＰ８６４およびカナリア痘ウイルスｖＣＰ１０７中に挿入されたＪＥＶコード領域の地図である。
【００４６】
図１９は、ワクシニアウイルスｖＰ７６６、ｖＰ７６４、ｖＰ８６９、ｖＰ７２９、ｖＰ７２５、ｖＰ９８４、ｖＰ９９７、ｖＰ１００２、ｖＰ１００３およびカナリア痘ウイルスｖＣＰ１２７中に挿入されたＹＦコード領域の地図である。
【００４７】
図２０は、ＤＥＮ種類１の大西洋鎖のＤＮＡ配列の部分を示す。
【００４８】
図２１は、ワクシニアウイルスｖＰ８６７、ｖＰ９６２およびｖＰ９５５中に挿入されたＤＥＮコード領域の地図である。
【００４９】
図２２は、Ｃ５　ＯＲＦを含むカナリア痘ＰｖｕＩＩ断片のＤＮＡ配列を示す。
【００５０】
図２３は、Ｃ５を削除するためのプラスミドｐＲＷ８４８を構成する模式図である。
【００５１】
図２４は、Ｃ３　ＯＲＦを含むカナリア痘の７３５１基本対断片のＤＮＡ配列を示す。
【００５２】
発明の詳細な説明
説明のための以下の実施例により、本発明およびその多くの利点がよりよく理解される。
【００５３】
実施例１−ＪＥＶ遺伝子のワクシニアウイルス供与体プラスミドへのクローニング
ワクシニアウイルスであるｖＰ４１０のコペンハーゲン鎖のチミジンキナーゼ変異体（グオら、１９８９）を用いて組換え体ｖＰ６５８を産生した（下記参照）。１１−ｋＤａ晩期ワクシニアウイルスプロモーターの制御下のＨＡ領域中のベータガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルス（ｖＰ４２５）（グオら、１９８９）を用いて組換え体ｖＰ５５５、ｖＰ５８３およびｖＰ６５０を産生した。全てのワクシニアウイルス株は、１０％の熱不活化胎児牛血清（ＦＢＳ）を加えたタカの最小基本媒質（ＭＥＭ）中のＶＥＲＯ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ８１）細胞中またはＭＲＣ−５（ＡＴＤＤ　ＣＣＬ１７１）細胞中で産生された。７．５　％のＦＢＳおよび抗生物質を補ったＭＥＭ中の３７℃で成長した子供のハムスターの腎臓細胞（ＢＨＫ２１−１５クローン）、または５％のＦＢＳを用いたことを除いては同一条件で成長したＶＥＲＯ細胞を用いて生合成研究を行なった。全ての生体外実験に用いられたＪＥＶウイルスは、ＪＥＶのナカヤマ鎖の継代５５哺乳ネズミ脳懸濁液に感染したＣ６／３６細胞から産生した浄化培養液である（メイソン、１９８９）。
【００５４】
制限酵素は、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ社（ゲイサースブルグ、ＭＤ）、ニューイングランドバイオラボ社（ビバーリー、ＭＡ）、またはベーリンガーマンハイムバイオケミカル（インディアナポリス、ＩＮ）から入手した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼはニューイングランドバイオラボ社から入手した。クローニング、スクリーニング、およびプラスミド精製の若干の変更に関して、標準組換えＤＮＡ技術を用いた（マニアチスら、１９８６）。核酸配列は、アルカリ変性二重鎖プラスミドテンプレート上の標準ジデオキシ鎖終末反応（サンガーら、１９７７）を用いて確認した。配列プライマー、および他のオリゴヌクレオチドは、標準化学法を用いて合成した（バイオサーチ８７００、サンラフィール、ＣＡ；応用バイオシステム３８０　Ｂ、フォスターシティー、ＣＡ）。ＪＥＶワクチン組換えウイルスを構成するのに用いたＪＥＶ　ｃＤＮＡは、ＪＥＶのナカヤマ鎖から誘導した（マックアダら、１９８７）；全てのヌクレオチドは、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２ＡおよびＮＳ２Ｂコード領域の最新配列と結合したＣコード領域の配列を含む図１７Ａおよび１７Ｂ中に示した配列データ（配列番号５２）から誘導する。
【００５５】
プラスミドｐＪＥＶ３／４は、ＪＥＶ　ｃＤＮＡのＢｇｌＩＩ−ＡｐａＩ断片（ヌクレオチド　２５５４−３５５８）、ＡｐａＩ−ＢａｌＩ断片（ヌクレオチド　３５５９−４１２５）、およびアニールしたオリゴのＪ３（配列番号４４）とＪ４（配列番号４５）［図３；ワクチン早期転写終止シグナルが続く翻訳停止（ＴＴＴＴＴＡＴ；ユエンら、１９８７）、ＥａｇＩ部位、およびＨｉｎｄＩＩＩ粘着末端を含有する］を、ｐＵＣ１８を消化したＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩにクローニングすることにより誘導した。ｐＪＥＶ３／４は、ＥｃｏＲＶによるＪＥＶ配列（ヌクレオチド２６７２）内およびＳａｃＩによるｐＵＣ１８内で消化され、プラスミド起点およびヌクレオチド２６７２−４１２５に延びるＪＥＶ　ｃＤＮＡ配列を含有する断片はＪＥＶ　ｃＤＮＡのＳａｃＩ−ＥｃｏＲＶ断片（ヌクレオチド２１２５−２６７１）に連結される。産生したプラスミド、ｐＪＥＶ１は、Ｅの最後の３つ目のＳａｃＩ部位からＢａｌＩ（ヌクレオチド４１２５）の２つのアミノ酸残基（ａａ）を通じてＮＳ２Ｂの予測Ｎ末端へと延びるウイルスＯＲＦを含んだ（図１）。
【００５６】
合成オリゴＪ１Ｂ（配列番号４６）およびＪ２Ｂ（配列番号４７）（図３；ＸｈｏＩ粘着末端、ＳｍａＩ部位、Ｃの最後の１５のａａ、および粘着ＨｉｎｄＩＩＩ末端を有するＪＥＶ　ｐｒＭの最初の９のａａを含有する）を、ＪＥＶ　ｃＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片（ヌクレオチド４０７−２１２４）、およびＸｈｏＩ−ＳａｃＩで切断されたベクターｐＩＢＩ２４に連結した（インターナショナルバイオテクノロジー社、ニューヘブン、ＣＴ）。産生したプラスミドｐＪＥＶ２は、ｐｒＭの予測Ｎ末端を先導するメチオニン（Ｍｅｔ）コドン（ヌクレオチド３３７−３３９）発生１５ａａとＥの最後の３つ目で発見されたＳａｃＩ部位（ヌクレオチド２１２４）との間に延びるウイルスＯＲＦを含有した（図１）。
【００５７】
合成オリゴＪ７（配列番号４８）およびＪ８（配列番号４８）（図３；ＢａｍＨＩとＮｃｏＩの粘着末端を含有する）を用いて、ＪＥＶ　ｃＤＮＡのＮｃｏＩ−ＳａｃＩ断片（ヌクレオチド１３３６−２１２４）を、ＢａｍＨＩ−ＳａｃＩで切断されたｐＩＢＩ２４にクローニングしてｐＳＰＮＣ７８を産生した。オリゴヌクレオチドＪ９（配列番号５０）およびＪ１０（配列認識晩後５１）（図３；ＨｉｎｄＩＩＩ粘着末端、ＳｍａＩ部位、およびＪＥＶ　ｃＤＮＡのヌクレオチド８１１−８３２を含有する）を用いて、ＪＥＶ　ｃＤＮＡのＨｉｎｃＩＩ−ＮｃｏＩ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｃｏＩで切断されたｐＳＰＮＣ７８にクローニングした。産生したプラスミドｐＪＥＶ５は、ＥのＮ末端を先行する２５ａａを生じるＭｅｔコドン（ヌクレオチド８１１−８１３）とＥの最後の３つに発見されたＳａｃＩ部位（ヌクレオチド２１２４）との間に延びるウイルスＯＲＦを含んだ（図１）。
【００５８】
ｐＴＰ１５は、血球凝集素（ＨＡ）遺伝子が削除されたワクシニアウイルスのＨｉｎｄＩＩＩ　Ａ断片からの配列により側面についたポリリンカー領域に挿入された晩期／早期ワクシニアウイルスＨ６プロモーターを含有する。ＳｍａＩ−ＥａｇＩで切断されたｐＴＰ１５を精製して、ｐＪＥＶ１のＳａｃＩ−ＥａｇＩ挿入部を加えたｐＪＥＶ２からの精製したＳｍａＩ−ＳａｃＩ挿入部に連結して、ｐＳＰＪＥＶＬを産生した（図１）。ｐＳＰＪＥＶＬを産生するのに用いた独特なＳｍａＩ部位に対応する６つのｂｐは次いでオリゴヌクレオチド定方向二重鎖分裂変異誘発により除去して、Ｈ６プロモーターが直接ＡＴＧ出発コドンを先行するｐＳＰＪＥＶＬ１４ＶＣを産生した（図１）。　ＳｍａＩ−ＥａｇＩ　ｐＴＰ１５断片を、ｐＪＥＶ１のＳａｃＩ−ＥａｇＩ挿入部を加えたｐＪＥＶ５からの精製したＳｎａＯ−ＳａｃＩ挿入部に連結してｐＳＰＪＥＶＳＨを産生した（図１）。ｐＳＰＪＥＶＳＨを産生するのに用いた独特なＳｍａＩ部位に対応する６つのｂｐは次いで上述したように除去して、Ｈ６プロモーターが直接ＡＴＧ出発コドンを先行するｐＳＰＪＥＶＳＨ１２ＶＣを産生した（図１）。
【００５９】
オリゴヌクレオチド定方向変異誘発（クンケル、１９８５）を用いて、ｐＪＥＶ２のＥ遺伝子中の潜在ワクシニアウイルス早期転写終止シグナル（ＴＴＴＴＴＧＴ；ヌクレオチド１３０４−１３１０）（ユエンら、１９８７）をＴＣＴＴＴＧＴに変更し、プラスミドｐＪＥＶ２２を産生した（図２）。同様の変更をｐＪＥＶ５に行なって、ｐＪＥＶ６を産生した（図２）。
【００６０】
合成オリゴＪ３７およびＪ３８［図３；ＪＥＶヌクレオチド４４９７−４５１２、翻訳停止、早期転写終止シグナル（ＴＴＴＴＴＡＴ；ユエンら、１９８７）、ＥａｇＩ部位、およびＨｉｎｄＩＩＩ粘着末端を含有する］を用いて、ＪＥＶ　ｃＤＮＡのＳａｃＩ−ＤｒａＩ断片（ヌクレオチド２１２５−４４９６）を、ＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで切断されたｐＩＢＩ２４にクローニングした。産生したプラスミドｐＪＥＶ７は、Ｅの最後の３つ目に発見されたＳａｃＩ部位（ヌクレオチド２１２５）とＮＳ２Ｂの最後のコドン（ヌクレオチド４５１２）との間に延びるウイルスＯＲＦを含んだ（図２）。ＳｍａＩ−ＥａｇＩで切断したｐＴＰ１５を精製して、ｐＪＥＶ７のＳａｃＩ−ＥａｇＩ挿入部を加えたｐＪＥＶ２２からの精製ＳｍａＩ−ＳａｃＩ挿入部に連結した。ｐＳＰＪＥＶ１０を産生するのに用いたＳｍａＩ部位に対応する６つのｂｐを上述したように除去して、ｐＳＰＪＥＶ１０９ＶＣを産生した（図２）。ＳｍａＩ−ＥａｇＩで切断されたｐＴＰ１５をｐＪＥＶ６のＳｍａＩ−ＳａｃＩ挿入部およびｐＪＥＶ７のＳａｃＩ−ＥａｇＩ挿入部で連結して、ｐＳＰＪＥＶ１１を産生した（図２）。ｐＳＰＪＥＶ１１を産生するのに用いたＳｍａＩ部位に対応する６つのｂｐを上述したように除去して、ｐＳＰＪＥＶ１１ＶＣを産生した（図２）。
【００６１】
実施例２−ワクシニアウイルス組換え体の構成
組換え供与体プラスミドの治療ワクシニアウイルスに感染した組織培養細胞へのトランスフェクションする方法およびニトロセルロースフィルター上でのｉｎｓｉｔｕハイブリダーゼーションによる組換え体の同定方法が記載されている（グオら、１９８９；パニカリら、１９８２）。ｐＳＰＪＥＶＬ１４ＶＣ、ｐＳＰＪＥＶＳＨ１２ＶＣ、およびｐＳＰＪＥＶ１０ＶＣを、ｖＰ４２５感染細胞にトランスフェクションして、それぞれワクシニア組換え体ｖＰ５５５、ｖＰ５８３、およびｖＰ６５０を産生した（図４）。ｐＳＰＪＥＶ１０１ＣをｖＰ４１０感染細胞にトランスフェクションして、ワクシニア組換え体ｖＰ６５８を産生した（図４）。
【００６２】
実施例３−生体外ウイルス感染および放射能標識
ＢＨＫまたはＶＥＲＯ細胞単一層を直径３５ｍｍのさらに調製し、ワクシニアウイルス（ｍ．ｏ．ｉ．が２）またはＪＥＶ（ｍ．ｏ．ｉ．が５）で感染せしめて放射能標識の前に１１時間（ワクチン）または１６時間（ＪＥＶ）培養した。１１時間または１６時間の予備感染を行なって、培地を除去して、２％のＦＢＳおよび２５０　μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−Ｍｅｔを含有する暖かいＭｅｔ不含有媒質と置き換えた。細胞を１時間３７℃で培養して、未標識Ｍｅｔの通常の量の１０倍を含有する暖かい保持媒質で濯ぎ、以下に記載するように採取する前にこの同様の高濃度Ｍｅｔ媒質で６時間培養した。ある場合について、澄んだ培養液の試料を、１０から３５％の連続ショ糖勾配を調製し、遠心分離して上述したように分析するショ糖勾配遠心分離により分析した（メイソン、１９８９）。
【００６３】
実施例４−ラジオイムノプレシピテーション、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびエンドグルコシダーゼ処理
放射能標識細胞溶解産物および培養液を採取し、ウイルスタンパク質をイムノプレシピテーションし、エンドグルコシダーゼで切断し、上述したように正確にＳＤＳ含有ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中で分離した（メイソン、１９８９）。別記しないが、全てのＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料は、電気泳動の前に５０ｍｌのジチオスレイトール（ＤＴＴ）の存在下での加熱により調製した。
【００６４】
実施例５−組換えワクシニアウイルスの構成
ｐｒＭからＮＳ２Ｂに延びるＪＥＶコード領域の部分を発現した４つの異なるワクシニアウイルス組換え体を構成した。これらの組換えウイルスに含まれるＪＥＶ　ｃＤＮＡ配列を図４に示す。全ての４つの組換えウイルスにおいて、ＪＥＶ　ｃＤＮＡの感覚鎖はワクシニアウイルス早期／晩期Ｈ６プロモーターの後ろに位置し、翻訳はウイルスｃＤＮＡ配列の５′末端に位置する自然発生ＪＥＶ　Ｍｅｔコドンから始まると予測された（図４）。
【００６５】
組換え体ｖＰ５５５は、構造タンパク質前駆体ｐｒＭ、構造糖タンパク質Ｅ、非構造糖タンパク質ＮＳ１、および非構造タンパク質ＮＳ２ＡのＮ末端に先行する推定上の１５ａａシグナル配列をコードする（マックエイダら、１９８７）。組換え体ｖＰ５８３は、ＮＳ２Ａ、ＮＳ１、ＥおよびＥのＮ末端に先行する推定上のシグナル配列をコードする（マックエイダら、１９８７）。組換え体ｖＰ６５０は、ＮＳ２Ｂコード領域の添加によりｖＰ５５５と同一のタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む。組換え体ｖＰ６５８は、ＮＳ２Ｂの添加によりｖＰ５８３と同一のタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む。組換え体ｖＰ６５０およびｖＰ６５８において、Ｅ中の潜在ワクシニアウイルス早期転写終止シグナル（ＴＴＴＴＴＧＴ；ヌクレオチド１０８７−１０９４）は、ａａ配列を変えることなくＴＣＴＴＴＧＴに変更できた。この配列が生体外転写アッセイにおいて転写終末を増大させるように示されたので、この変更はＥおよびＮＳ１の発現の水準を増大させるために行なわれた（ユエンら、１９８７）。　組換えワクシニアゲノム内にあるＪＥＶ遺伝子の位置および配向は、組換えワクシニアウイルスＤＮＡの制限酵素切断により確認される。これらの分析中に、組換え体ｖＰ５５５、ｖＰ５８３、およびｖＰ６５０は、ＨｉｎｄＩＩＩ　ＮおよびＭを通じて、およびＨｉｎｄＩＩＩ　Ｋの中へのＨｉｎｄＩＩＩ　Ｃ断片内からの削除部分を有した。この同一の削除は、ｖＰ４２５親ウイルス中にも観察された。興味のあることに、これらのウイルスはｖＰ４１０およびその誘導体ｖＰ６５８よりも、ＶＥＲＯ細胞中でほとんど細胞変性ではない。
【００６６】
組換えワクシニアウイルスにより発現された場合、ＮＳ１は適切に処理され分泌された
図５および６は、ＪＥＶ感染または組換えワクシニアウイルスによる感染により産生されたＮＳ１タンパク質の比較を示すものである。ＢＨＫ細胞をＪＥＶまたは組換えワクシニアウイルスで感染させ、１時間３５Ｓ−Ｍｅｔで標識して、６時間追跡した。細胞溶解産物（図５）または各細胞層から調製した培養液（図６）の等しい分画を、イムノプレシピテーションし、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の前に、モック切断（ｍｏｃｋ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　）（Ｍ）、エンドＨによる切断（Ｈ）、またはＰＮＧａｓｅ　Ｆによる切断（Ｆ）のいずれかを行なった。
【００６７】
図５および６中に示した瞬間標式追跡実験からのデータにより、本物のＮＳ１およびＮＳ１′に対するサイズが等しいタンパク質を４つの組換えワクシニアウイルス中で合成して、そこから分泌させたことを示す。さらに、これらタンパク質のエンドＨおよびＰＮＧａｓｅ　Ｆに対する感受性は、ＮＳ１の組換え体形状がグリコシル化されたことを示した。特に、ＮＳ１の細胞関連形状は全て２つの未熟成（エンドＨ感受性）Ｎ連鎖グリカン（ｇｌｙｃａｎ）を含み、一方細胞外形状は、１つの未熟成グリカンと１つの複合体または雑種（エンドＨ抵抗）グリカンを含んだ（メイソン、１９８９）。興味のあることに、これらの瞬間標式追跡研究は全て４つの組換え体による類似のＮＳ１産生水準を示し、ｖＰ５５５およびｖＰ５８３中のＥコード領域の末端近くに存在する潜在ワクシニア早期転写終止シグナルは、ＴＴＴＴＴＧＴが変性されたｖＰ６５０またはｖＰ６５８と比較して産生したＮＳ１の量を著しくは減少させなかったことを示唆する。図５および６に示した実験は１１時間後感染したＢＨＫ細胞上に行なわれたが、４または８時間後感染した瞬間標識した感染ＶＥＲＯ細胞による同様な実験は、このＴＴＴＴＴＧＴ配列の存在または不在に関するＮＳ１発現中の相違を現さなかった。ＮＳ２Ａ（ｖＰ５５５およびｖＰ５８３）コード領域またはＮＳ２ＡとＮＳ２Ｂ（ｖＰ６５０およびｖＰ６５８）コード領域の両者のいずれかを含むワクシニアウイルスからのＮＳ１の合成の比較により、ＮＳ２Ｂコード領域の存在または不在はＮＳ１発現になんの影響も与えないことが示された。これらの結果は、ＮＳ２Ａ遺伝子のみが適切なＮＳ１の処理に必要であることを示すファルゴートら（１９８９）の結果と一致する。
【００６８】
組換えワクシニアウイルスにより発現された場合、ＥおよびｐｒＭを適切に処理する
図７および８は、ＪＥＶ感染または組換えワクシニアウイルスによる感染により産生されたＥタンパク質の比較を示すものである。ＢＨＫ細胞をＪＥＶまたは組換えワクシニアウイルスで感染させ、１時間３５Ｓ−Ｍｅｔで標識して、６時間追跡した。細胞溶解産物（図７）または各細胞層から調製した培養液（図８）の等しい分画を、イムノプレシピテーションし、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の前に、モック切断（ｍｏｃｋ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　）（Ｍ）、エンドＨによる切断（Ｈ）、またはＰＮＧａｓｅ　Ｆによる切断（Ｆ）のいずれかを行なった。
【００６９】
図７および８に示した瞬間標式追跡実験からのデータは、Ｅに対してサイズで同一なタンパク質をＥ遺伝子を含有する全ての組換えワクシニアウイルスで感染した細胞中で合成した。しかしながら、Ｅタンパク質ウイルスは、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、およびＮＳ２Ａ（ｖＰ５５５およびｖＰ６５０；図４、７および８参照）をコードするウイルスＯＲＦの領域を含むワクシニアウイルスで感染した細胞から放出されたのみであった。エンドグルコシダーゼ感受性（図７および８）は、ワクシニア組換え体で感染した細胞により合成されたＥタンパク質の細胞内および細胞外の両方がグリコシル化されたことを示した。細胞外形状はエンドＨ切断に対して抵抗を有したが、Ｅの細胞関連形状はエンドＨ感受性であった。
【００７０】
Ｍ（およびｐｒＭ）に特有なＭＡｂを用いた放射能標識したワクシニア感染細胞から調製したイムノプレシピテーションは、ｐｒＭがｖＰ５５５およびｖＰ６５０で感染した細胞中で合成されたことを示した。これらの組換えワクシニアウイルスのいずれかに感染した細胞は、ＪＥＶ感染細胞により産生されたｐｒＭタンパク質とサイズが等しいｐｒＭの細胞様形状を産生し、正確なサイズのＭタンパク質は、これらの２つのウイルスに感染した細胞の培養液中で検出された。
【００７１】
ｖＰ５５５およびｖＰ６５０に感染した細胞から採取した細胞外液体は、ショ糖密度勾配中の血球凝集活性のピークとともに移動したＥの形状を含んだ。興味のあることに、この血球凝集素は、ＪＥＶ感染細胞の培養液中に発見された非感染血球凝集素（ＳＨＡ）（ラッセルら、１９８０）の遅い沈降ピークに類似して移動した（図９）。さらに、これらの同一の分画はＭの完全に処理された形状を含み、ｖＰ５５５感染細胞およびｖＰ６５０感染細胞がＪＥＶの両方の構造膜タンパク質を含有する粒子を産生したことを示した。これらの粒子はおそらく、Ｂ型肝炎ウイルスに感染したヒトの血液中に発見された２２ｎｍのＢ型肝炎ウイルス粒子に類似した、空のＪＥＶエンベロープを表し（チオライスら、１９８５）、Ｂ型肝炎表面抗原遺伝子を発現する細胞から放出される（デュボイスら、１９８０；モリアーティーら、１９８１）。血球凝集活性は、洗浄剤による分断に感受性のあるＪＥＶタンパク質の粒子形状を必要とするので、組換えウイルスに感染した細胞の上澄液の血球凝集特性を試験した（エッケルら、１９７５）。これらの血球凝集アッセイにより、ｖＰ５５５およびｖＰ６５０に感染した細胞から収穫した上澄液は、抗ＪＥＶ抗体により抑制され、ＪＥＶ血球凝集素と同一のｐＨ最適条件を有した血球凝集活性を含むことが示された。どの血球凝集活性も、ｖＰ４１０、ｖＰ５８３、またはｖＰ６５８に感染した細胞の培養液中には検出されなかった。
【００７２】
組換えワクシニアウイルスは細胞外粒子を産生する
組換えワクシニアウイルスｖＰ５５５は、空のウイルスエンベロープのように反応するＥ含有およびＭ含有細胞外粒子を産生した。ＪＥＶ構造タンパク質を含有する細胞外粒子の合成を引き起こすこの組換えウイルスの能力は、これらの抗原の適切に処理され折り畳まれた形状を産生するシステムを提供する。
【００７３】
ここに記載した組換えウイルスは、構造タンパク質Ｍ、構造タンパク質Ｅ、および非構造タンパク質ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、およびＮＳ２Ｂへの前駆体をコードするＪＥＶ　ＯＲＦの部分を含む。これらの組換えウイルスに感染した細胞により産生されたＥおよびＮＳ１タンパク質には、タンパク質分解開裂およびＪＥＶに感染した細胞により産生された同一のタンパク質とは区別できない方法でのＮ連鎖炭水化物添加がなされる。これらのデータはさらに、タンパク質分解開裂およびＥとＮＳ１へのＮ連鎖炭水化物添加には、３′がウイルスゲノム中のＮＳ２Ａに位置したフラビウイルス非構造タンパク質を必要としないことを示す（ブレイら、１９８９；ドベルら、１９８８；ファルゴートら、１９８９；ファンら、１９９０；松浦ら、１９８９；ルーツ−リナレスら、１９８９；安田ら、１９９０；サングら、１９８８；サオら、９１８７）。　興味のあることに、組換えワクシニアウイルス中に挿入されたＯＲＦの部分は、ｐｒＭおよびＥの晩期段階処理に著しく効果があるが、ＮＳ１の結末には効果がなかった。ＮＳ１をコードした全ての組換えウイルスは、このタンパク質の熟成細胞外形状を産生し、このことは、ＮＳ２ＡおよびＮＳ２Ｂの存在下で産生されたＮＳ１が適切に処理されてトランスフェクションされた細胞から分泌されたことを示す以前の研究と一致する（ファンら、１９９０）。一方、Ｅタンパク質コード領域を含む４つの組換え体のうち２つのみが、Ｅの細胞外形状を産生した。これら２つの組換え体ｖＰ５５５およびｖＰ６５０は、Ｅ、ＮＳ１、およびＮＳ１Ａに加えてｐｒＭコード領域を含有したという点で、残りの組換え体とは異なった。Ｅの細胞外形状がＥとｐｒＭの両方のコード領域を含むウイルスによってのみ産生され、Ｅの細胞外形状はＭと連結されるという発見は、ｐｒＭおよびＥの同時合成が細胞外液体を標的とする粒子の形成に必要であることを示唆する。
【００７４】
実施例６−動物防御研究
生後３週間の異系交配スイスネズミを、０．１　ｍｌのＰＢＳで希釈した１０７ｐｆｕのワクシニアウイルスを有する腹腔内注射により免疫した。接種３週間後、選択したネズミをレトロオービタルサイナス（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌ　ｓｉｎｕｓ）から採血し、血清を−７０℃で貯蔵した。採血から２、３週間後に、ネズミを組換えウイルスで再接種、もしくはＪＥＶに感染したほ乳ネズミの脳で希釈した腹腔内注射により攻撃接種した（ベイジン鎖（Ｂｅｉｊｉｎｇ　ｓｔｒａｉｎ）；多重ネズミ継代）（ハン、１９８２）。ネズミの群と攻撃接種したウイルスの継代との間に観察された致死量の変動のため、致死量滴定を各攻撃接種実験について行なった。攻撃接種に続いて、ネズミを１日ごとに３週間観察した。
【００７５】
組換えワクシニアウイルスに対する免疫応答の評価
各群ごとに採血した代表動物から等量の血清のアリコートを混合することにより、ネズミのプール血清を調製した。３マイクロリットルのプール血清の試料を、３５Ｓ−Ｍｅｔ標識ＪＥＶ感染細胞から得た洗浄処理細胞培養液と混合し、次いで抗原抗体混合物を、家兎抗ネズミイムノグロブリン（ダコパット、ゴストラップ、デンマーク）で被覆した固定化黄色ブドウ球菌バクテリア（酵素センター、マルデン、ＭＡ）で培養し、全ての級のネズミの抗体が沈殿したのを確認した。家兎イムノグロブリン重鎖と放射能標識ウイルス抗原の共移動から生じる電気泳動人為構造を避けるため、およびＥタンパク質とＮＳ１′タンパク質の明確な分離を成すために電気泳動の前に、これらの沈殿から得た試料をジチオスレイトールで処理しなかった。中和試験を、以下の変更に記載ような熱不活化血清（５６℃で２０分）について行なった（テシュら、１９８７）。（１）　最終濃度が２．５　％になるまで、新鮮な溶けたヒトの血清を全てのウイルス／抗体希釈物中に加え、（２）　ウイルスの吸収に続いて、細胞単層を０．５　％のカルボキシメチルセルロース（シグマ、セントルイス、ＭＯ）を含む媒質で覆い、（３）　２０％のエタノール中に溶解した０．１　％クリスタル紫で染色することにより注入後６日間でプラークを視覚化した。血球凝集試験および結晶凝集抑制（ＨＡＩ）試験を、クラークらの方法（１９５８）を変更することにより行なった。
【００７６】
ｖＰ５５５によるワクチン接種はＪＥＶに対してＪＥＶの１０，０００ＬＤ５０よりも大きな防御を提供した
ネズミ中で高い末梢病原性を示すＪＥＶのベイジン鎖を用いた致死ＪＥＶ注入から異系交配ネズミを防御する組換えワクシニアウイルスの能力を試験した（ハング、１９８２）。４つ全ての組換えワクシニアウイルスがこのウイルスの致死攻撃接種からの防御をいくらか提供できることを示す予備実験に基づいて、２つのウイルス（ｖＰ５５５およびｖＰ６５８）を綿密な攻撃接種研究に選択した。ｖＰ５５５はＥの細胞外形状の合成を引き起こし、一方ｖＰ６５８はＥのどの細胞外形状も産生しなかったがＮＳ２Ｂタンパク質をコードするいくつかのｃＤＮＡ配列を含んだ。いくつかの攻撃接種ウイルスの希釈物を試験した攻撃接種試験において、防御水準にあるワクシニア組換え体による追加免疫の効果を実験し、ワクチン接種した動物のサブセット中の血清応答を評価した。これらの組換えウイルスの単一接種の結果は、組換えウイルスｖＰ５５５は、全ての攻撃接種においてｖＰ６５８より良好な水準の防御をもたらしたことを示した（表１）。両方の組換えウイルスは、攻撃接種ウイルスのより低い水準で良好な防御を提供し、これはＪＥＶの高い投与による防御を圧倒する能力と一致した。表１はまた、ＪＥＶの１０，０００ＬＤ５０より多いＪＥＶの完全な防御は、２回のｖＰ５５５の接種によりなされ、このことは試験した攻撃接種量においてｖＰ６５８ではそうではないことを示す。図１０は、組換えワクシニアウイルスでワクチン接種した動物からの攻撃接種前の血清のＪＥＶ特有反応性の分析を示すものである。防御実験（表１および２参照）に用いた動物のサブユニットから採取した血清をプールし、ＪＥＶ感染細胞の培養液から採取した放射能標識タンパク質をイムノプレシピテーションするその能力について、アリコートを試験した。図１０のオートラジオグラムの右側の２つのレーンは、未接種ネズミ（−）から、またはＪＥＶの通常の致死量を生き延びたネズミから得た血清でイムノプレシピテーションした試料から調製した。その分析は、（１）　ｖＰ５５５で免疫した動物のみがＥに対する強い免疫応答を示し、（２）　第２の接種により、Ｅタンパク質に対する反応性において著しい増大を示した。
【００７７】
中和分析およびこれらの動物から採取した血清のＨＡＩデータは、イムノプレシピテーション分析の結果を確証し、１００　％防御されたｖＰ５５５で追加投与された動物が非常に高水準の中和抗体および血球凝集抑制抗体を有することを示した（表２）。これらの水準の中和抗体および血球凝集抑制抗体は、ＪＥＶのベイジン鎖の通常の致死量を生き延びたナイーブなネズミに達成された滴定量に類似していた。
【００７８】
中和抗体を引き起こすｖＰ５５５の能力は、ｖＰ５５５が構造タンパク質ＥおよびＭの細胞外微粒子形状を産生するという事実に関係する。ＳＨＡ状粒子はおそらく、感染ＪＥＶ粒子中に発見された配置に非常に似た配置に折り畳まれて組み立てられたＥおよびＭを含有する空のＪＥＶエンベロープを表す。組換えｖＰ５５５およびｖＰ６５０は、全ての３つのＪＥＶ糖タンパク質にコード領域を含有するので、構造タンパク質の細胞外形状を産生し、それによりウイルスエンベロープの組立てに必要なＪＥＶ遺伝子産生物の全てを提供する。他の研究者（上記参照）は、ＮＳ１およびＮＳ２Ａの存在不在にかかわらず、全て３つの構造タンパク質（Ｃ、ｐｒＭ、およびＥ）を発現する細胞によるＥの細胞外形状の産生を検出することができていない。ｖＰ５５５およびｖＰ６５８により産生された粒子に似た粒子を産生するその組換えウイルスの無能は、その組換えゲノム中にＣタンパク質遺伝子の存在によるものであろう。特に、ゲノムＲＮＡの不在下で産生されたＣタンパク質はウイルス膜タンパク質の適切な組立てを妨げることが可能である。あるいは、ノークら（１９８９）の生体外翻訳実験により検出された形状と類似のＣの不完全に処理された形状が、Ｃ遺伝子を発現する細胞からの構造膜タンパク質の放出を妨げる。
【００７９】
【表１】
2004089185.tif 000002
【表２】
2004089185.tif 000003
【００８０】
実施例７−弱毒化ワクシニアワクチン株ＮＹＶＡＣ
新たなワクシニアワクチン株ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）を開発するために、既知または潜在毒性因子をコードするゲノムの６つの可欠領域を削除することにより、ワクシニアウイルスのコペンハーゲンワクチン鎖を変性した。配列削除を下記に詳細に記載する。ワクシニア制限断片、読取り枠、およびヌクレオチドの位置の全ての名称は、ゴベルら、１９９０ａ　、ｂ　により報告された用語法に基づくものである。
【００８１】
削除座はまた、異種遺伝子の挿入のための受容座として作成した。
【００８２】
続いてＮＹＶＡＣ中で削除された領域を以下に記載する。また、削除領域の省略形および読取り枠の名称（ゴベルら、１９９０ａ　、ｂ　）および全ての削除を含むワクシニア組換え体（ｖＰ）の名称もまた、記載する：
（１）　チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ；Ｊ２Ｒ）ｖＰ４１０；
（２）　出血性領域（ｕ；Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）ｖＰ５５３；
（３）　Ａ型封入体領域（ＡＴＩ；Ａ２６Ｌ）ｖＰ６１８；
（４）　血球凝集素遺伝子（ＨＡ；Ａ５６Ｒ）ｖＰ７２３；
（５）　宿主域遺伝子領域（Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ）ｖＰ８０４；および
（６）　巨大サブユニットリボヌクレオチドリダクターゼ（Ｉ４Ｌ）ｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）
【００８３】
ＤＮＡクローニングおよび合成
プラスミドを構成し、スクリーニングして標準方法により成長せしめた（マニアチスら、１９８６；パーカスら、１９８５；ピッチーニら、１９８７）。制限エンドヌクレアーゼを、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、ゲイサースブルク、ＭＤ；ニューイングランドイオラボ、ビバリー、ＭＡ；およびベーリンガーマンハイムバイオケミカル、インディアナポリス、ＩＮから得た。Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノー（ｋｌｅｎｏｗ）断片を、ベーリンガーマンハイムバイオケミカルから得た。ＢＡＬ−３１エキソヌクレアーゼおよびファージＴ４　ＤＮＡリガーゼをニューイングランドバイオラボから得た。試薬は様々な供給者により支持されたように用いた。
【００８４】
合成オリゴデオキシリボヌクレオチドを、前述したようにバイオサーチ８７５０または応用バイオシステム３８０Ｂ　ＤＮＡシンセサイザー上で調製した（パーカスら、１９８９）。前述したようにシケナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ　）（タボーら、１９８７）を用いたジデオキシ鎖終止法（サンガーら、１９７７）によりＤＮＡ配列を行なった（グオら、１９８９）。配列を確証するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅（エンゲルケら、１９８８）は、自動パーキンエルマーセタスＤＮＡサーマルサイクラー中の従来の合成オリゴヌクレオチドプライマーおよび遺伝子増幅（ＧｅｎｅＡｍｐ）ＤＮＡ増幅試薬キット（パーキンエルマーセタス、ノルウォーク、ＣＴ）を用いて行なった。過剰のＤＮＡ配列を、制限エンドヌクレアーゼ切断とそれに続くＢＡＬ−３１エキソヌクレアーゼによる限定切断および合成オリゴヌクレオチドを用いた変異誘発（マンデッキ、１９８６）によりプラスミドから削除した。
【００８５】
細胞、ウイルス、およびトランスフェクション
ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株の培養起源および条件は以前に記載した（グオら、１９８９）。前述したように、組換え、ニトロセルロースフィルターでのｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、およびベータガラクトシダーゼのスクリーニングにより、組換えウイルスを産生する（パニカリら、１９８２；パーカスら、１９８９）。
【００８６】
チミジンキナーゼ遺伝子（Ｊ２Ｒ）の削除のためのプラスミドｐＳＤ４６０の構成
ここで図１１を参照すると、プラスミドｐＳＤ４０６は、ｐＵＣ８にクローニングされるワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ　Ｊ（位置８３３５９−８８３７７）を含有する。ｐＳＤ４０６をＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｖｕＩＩで切断し、ｐＵＣ８にクローニングされるＨｉｎｄＩＩＩの左側からの１．７ｋｂの断片をＨｉｎｄＩＩＩ／Ｓｍａｉで切断し、ｐＳＤ４４７を形成した。ｐＳＤ４４７はＪ２Ｒ（位置８３８５５−８４３８５）のための完全な遺伝子を含有する。開始コドンはＮｌａＩＩＩ部位内に含まれ、終止コドンはＳｓｐＩ部位内に含まれる。転写の方向は図１１の矢印により示される。
【００８７】
左側アームを得るために、０．８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片をｐＳＤ４４７から単離し、次いでＮｌａＩＩＩで切断して０．５ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｌａＩＩＩ断片を単離した。アニールした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４３／ＭＰＳＹＮ４４（配列番号１／配列番号２）
【化１】
2004089185.tif 000004
を０．５ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｌａＩＩＩ断片と連結してＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ１８ベクタープラスミドに取り込み、プラスミドｐＳＤ４４９を産生した。
【００８８】
ワクシニア右側アームおよびｐＵＣベクター配列を含有する制限断片を得るために、ワクシニア配列内のＳｓｐＩ（部分的な）およびｐＵＣ／ワクシニア結合でのＨｉｎｄＩＩＩで切断し、２．９ｋｂベクター断片を単離した。このベクター断片をアニールした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４５／４６（配列番号３／配列番号４）
【化２】
2004089185.tif 000005
と連結し、ｐＳＤ４５９を産生した。
【００８９】
右側アームと左側アームとを１つのプラスミドに結合させるために、０．５ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩ断片をｐＳＤ４４９から単離し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩで切断したｐＳＤ４５９と連結してプラスミドｐＳＤ４６０を産生した。ｐＳＤ４６０は、野生型親ワクシニアウイルスコペンハーゲン株ＶＣ−２との再結合のための供与体プラスミドとして用いた。３２Ｐ標識プローブを、テンプレートとしてのＭＰＳＹＮ４５（配列番号４）およびプライマーとしての補足２０ｍｅｒオリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４７（配列番号５）（５′ＴＴＡＧＴＴＡＡＴＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣ３′）を用いたプライマー伸長により合成した。組換えウイルスｖＰ４１０をプラークハイブリダイゼーションにより確認した。
【００９０】
出血性領域の削除のためのプラスミドｐＳＤ４８６の構成（Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）
ここで図１２を参照すると、プラスミドｐＳＤ４１９はｐＵＮ８にクローニングされるワクシニアＳａｌＩ　Ｇ（位置１６０，０００−１７３，３５１）を含有する。ｐＳＤ４２２はｐＵＮ８にクローニングされる、右側の連続ワクシニアＳａｌＩ断片、ＳａｌＩ　Ｊ（位置１７３，３５１−１８２，７４６）を含有する。出血領域ｕ、Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ（位置１７２，５４９−１７３，５５２）の削除のためのプラスミドを構成するために、ｐＳＤ４１９を左側アームの供給源として用い、ｐＳＤ４２２を右側アームの供給源として用いた。ｕ領域の転写の方向は図１２の矢印により示す。ｐＳＤ４１９から望ましくない配列を除去するために、ｐＳＤ４１９をＮｃｏＩ／ＳｍａＩで切断し、続いてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノー断片での鈍端および連結によりＮｃｏＩ部位（位置１７２，２５３）の左側の配列を除去してプラスミドｐＳＤ４７６を産生した。ワクシニア右側アームは、Ｂ１４Ｒの終止コドンでのＨｐａＩでのｐＳＤ４２２の切断および右側のＮｒｕＩ０．３ｋｂでの切断により得た。この０．３ｋｂ断片を単離して、ｐＳＤ４７６から単離した３．４ｋｂＨｉｎｃＩＩと連結し、プラスミドｐＳＤ４７７を産生した。ｐＳＤ４７７中のワクシニアｕ領域の部分的な削除の位置を三角で示す。ｐＳＤ４７７中の残りのＢ１３Ｒコード配列は、ＣｌａＩ／ＨｐａＩでの切断により除去し、産生したベクター断片をアニールした合成オリゴヌクレオチドＳＤ２２ｍｅｒ／ＳＤ２０ｍｅｒ（配列番号６／配列番号７）
【化３】
2004089185.tif 000006
と連結し、ｐＳＤ４７９を産生した。ｐＳＤ４７９はＢａｍＨＩ部位の続く開始コドン（下線）を含有する。ｕプロモーターの制御下でＢ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ（ｕ）削除座中にＥ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼを配するために、ベータガラクトシダーゼ遺伝子を含有する３．２ｋｂＢａｍＨＩ断片をｐＳＤ４７９のＢａｍＨＩ部位中に挿入し、ｐＳＤ４７９ＢＧを産生した。ｐＳＤ４７９ＢＧは、ワクシニアウイルスｖＰ４１０との再結合のための供与体プラスミドとして用いた。組換えワクシニアウイルスｖＰ５３３を色素基体Ｘ−ガル（Ｘ−ｇａｌ）の存在下で青いプラークとして単離した。ｖＰ５３３において、Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ領域は削除され、ベータガラクトシダーゼにより置き換えられた。
【００９１】
ｖＰ５３３からベータガラクトシダーゼ配列を除去するために、ポリリンカー領域を含むがｕ削除接合部に開始コドンを含まないｐＳＤ４７７の誘導体であるプラスミドｐＳＤ４８６を用いた。最初に上述したようにｐＳＤ４７７からＣｌａＩ／ＨｐａＩベククター断片をアニールした合成オリゴヌクレオチドＳＤ４２ｍｅｒ／ＳＤ４０ｍｅｒ（配列番号８／配列番号９）
【化４】
2004089185.tif 000007
と連結し、プラスミドｐＳＤ４７８を産生した。次に、ｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＥｃｏＲＩ部位を、ＥｃｏＲＩでのｐＳＤ４７８の切断、続いてのＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノー断片での鈍端および連結により破壊し、プラスミドｐＳＤ４７８Ｅ−　を産生した。ｐＳＤ４７８Ｅ−　をＢａｍＨＩおよびＨｐａＩで切断し、アニールした合成オリゴヌクレオチドＨＥＭ５／ＨＥＭ６（配列番号１０／配列番号１１）
【化５】
2004089185.tif 000008
と連結し、ｐＳＤ４８６を産生した。ｐＳＤ４８６は組換えワクシニアウイルスｖＰ５３３との再結合のための供与体プラスミドとして用い、Ｘ−ガルの存在下で透明プラークとして単離されるｖＰ５５３を産生した。
【００９２】
ＡＴＩ領域（Ａ２６Ｌ）の削除のためのプラスミドｐＭＰ４９４Δの構成
ここで図１３を参照すると、ｐＳＤ４１４はｐＵＣ８中にクローニングされるＳａｌＩ　Ｂを含有する。Ａ２６Ｌ領域の左側の望ましくないＤＮＡ配列を除去するために、ｐＳＤ４１４をワクシニア配列（位置１３７，０７９）内のＸｂａＩおよびｐＵＣ／ワクチニチア接合部でのＨｉｎｄＩＩＩで切断し、次いでＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノー断片で鈍端して連結し、プラスミドｐＳＤ４８３を産生した。Ａ２６Ｌ領域の右側の望ましくないワクシニアＤＮＡ配列を除去するために、ｐＳＤ４８３をＥｃｏＲＩ（位置１４０，６６５およびｐＵＣ／ワクシニア接合部）で切断して連結し、プラスミドｐＳＤ４８４を産生した。Ａ２６Ｌコード領域を除去するために、ｐＳＤ４８４をＡ２６Ｌ　ＯＲＦから少し上流のＮｄｅＩ（部分的な）（位置１３９，００４）およびＡ２６Ｌ　ＯＲＦから少し下流のＨｐａＩ（位置１３７，８８９）で切断した。５．２ｋｂベクター断片を単離してアニールした合成オリゴヌクレオチドＡＴＩ３／ＡＴＩ４（配列番号１２／配列番号１３）
【化６】
2004089185.tif 000009
と連結し、Ａ２６Ｌの上流領域を再構成し、Ａ２６Ｌ　ＯＲＦを、上述したように制限部位ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩおよびＨｐａＩを含有する短いポリリンカー領域と置き換えた。産生したプラスミドは、ｐＳＤ４８５と称した。ｐＳＤ４８５のポリリンカー領域中のＢｇｌＩＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位は特有ではないので、望ましくないＢｇｌＩＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位を、ＢｇｌＩＩ（位置１４０，１３６）およびｐＵＣ／ワクシニア接合部のＥｃｏＲＩで切断し、続いてのＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノー断片による鈍端および連結によりプラスミドｐＳＤ４８３（上述した）から除去した。産生したプラスミドはｐＳＤ４８９と称した。Ａ２６Ｌ　ＯＲＦを含有するｐＳＤ４８９から１．８ｋｂＣｌａＩ（位置１３７，１９８）／ＥｃｏＲＶ（位置１３９，０４８）断片は、ｐＳＤ４８５からの対応するポリリンカー含有ＣｌａＩ／ＥｃｏＲＶ断片と置き換えた。ｐＳＤ４９２のポリリンカー領域中のＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位は独特なものである。
【００９３】
ワクシニア１１ｋＤａプロモーター（バートレットら、１９８５；パーカスら、１９９０）の制御下でＥ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子を含有する３．３ｋｂＢｇｌＩＩカセット（シャピラら、１９８３）を、ｐＳＤ４９２のＢｇｌＩＩ部位中に挿入し、ｐＳＤ４９３ＫＢＧを産生した。プラスミドｐＳＤ４９３ＫＢＧは、治療ウイルスｖＰ５５３との再結合に用いられた。Ａ２６Ｌ削除領域にベータガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルスｖＰ５８１を、Ｘ−ガルの存在下で青いプラークとして単離した。　ワクシニア組換えウイルスｖＰ５８１からベータガラクトシダーゼ配列を除去するプラスミドを産生するために、プラスミドｐＳＤ４９２のポリリンカー領域を、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ１７７（配列番号１４）
【化７】
2004089185.tif 000010
を用いた変異誘発により削除した。産生したプラスミドｐＭＰ４９４Δにおいて、全Ａ２６Ｌ　ＯＲＦを含有するワクシニアＤＮＡ包囲位置［１３７，８８９−１３８，９３７］を削除する。ｐＭＰ４９４Δおよびワクシニア組換え体ｖＰ５８１を含有するベータガラクトシダーゼ間の再結合により、Ｘ−ガルの存在下での透明なプラークとして単離されたワクシニア削除変異体ｖＰ６１８が産生された。血球凝集素遺伝子（Ａ５６Ｒ）の削除のためのプラスミドｐＳＤ４６７の構成
ここで図１４を参照すると、ワクシニアＳａｌＩ　Ｇ制限断片（位置１６０，７４４−１７３，３５１）はＨｉｎｄＩＩＩ　Ａ／Ｂ接合部（位置１６２，５３９）と交差している。ｐＳＤ４１９はｐＵＣ８にクローニングされるワクシニアＳａｌＩ　Ｇを含有する。血球凝集素（ＨＡ）遺伝子の転写の方向は、図１４中の矢印で示す。ＨｉｎｄＩＩＩ　Ｂから誘導されたワクシニア配列を、ワクシニア配列内およびｐＵＣ／ワクシニア接合部のＨｉｎｄＩＩＩでのｐＳＤ４１９の切断および続いての連結により除去した。産生したプラスミドｐＳＤ４５６は、左の０．４ｋｂのワクシニア配列と右に０．４ｋｂのワクシニア配列が付いたＡ５６Ｒ、およびＨＡ遺伝子を含有する。Ａ５６Ｒコード配列を、Ａ５６Ｒコード配列から上流のＲｓａＩ（不分的な；位置１６１，０９０）および遺伝子の端に近いＥａｇＩ（位置１６２，０５４）でｐＳＤ４５６を切断することにより除去した。ｐＳＤ４５６からの３．６ｋｂＲｓａＩ／ＥａｇＩベクター断片を単離し、アニールした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ５９（配列番号１５）、ＭＰＳＹ６２（配列番号１６）、ＭＰＳＹＮ６０（配列番号１７）、およびＭＰＳＹＮ６１（配列番号１８）
【化８】
2004089185.tif 000011
と連結させ、Ａ５６Ｒ　ＯＲＦから上流のＤＮＡ配列を再構成してＡ５６Ｒ　ＯＲＦを上述したポリリンカー領域と置き換えた。産生するプラスミドはｐＳＤ４６６である。ｐＳＤ４６６中のワクシニア削除は、位置［１６１，１８５−１６２，０５３］を包囲する。ｐＳＤ４６６中の削除部位を図１４中の三角形で示す。
【００９４】
ワクシニア１１ｋＤａプロモーターの制御下で（バートレットら、１９８５；グオら、１９８９）Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼを含有する３．２ｋｂＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩ（部分的な）（シャピラら、１９８３）を、ｐＳＤ４６６のＢｇｌＩＩ部位に挿入し、ｐＳＤ４６６ＫＢＧを形成した。プラスミドｐＳＤ４６６ＫＢＧは、治療ウイルスｖＰ６１８との再結合に用いた。Ａ５６Ｒ削除部にベータガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルスｖＰ７０８を、Ｘ−ガルの存在下で青いプラークとして単離した。
【００９５】
ベータガラクトシダーゼ配列を、供与体プラスミドｐＳＤ４６７を用いてｖＰ７０８から削除した。ＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩおよびＢａｍＨＩ部位が、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩでｐＳＤ４６６が切断され、続いてのＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノー断片での鈍端および連結によりｐＵＣ／ワクシニア接合部から除去された点を除いては、ｐＳＤ４６７はｐＳＤ４６６と同一である。ｖＰ７０８とｐＳＤ４６７との再結合により、Ｘ−ガルの存在下で透明なプラークとして単離された組換えワクシニア削除変異体ｖＰ７２３が産生した。
【００９６】
読取り枠［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］の削除のためのプラスミドｐＭＰＣＳＫ１Δの構成ここで図１５を参照すると、以下のワクシニアクローンをｐＭＰＣＳＫ１Δの構成に用いた。ｐＳＤ４２０はｐＵＣ８にクローニングされるＳａｌＩ　Ｈである。ｐＳＤ４３５はｐＵＣ１８にクローニングされるＳｐｎＩ　Ｆである。ｐＳＤ４３５はＳｐｈＩで切断され、再連結されてｐＳＤ４５１を形成した。ｐＳＤ４５１において、ＨｉｎｄＩＩＩ　Ｍ中のＳｐｈＩ部位の左側のＤＮＡ配列を除去する（パーキンスら、１９９０）。ｐＳＤ４０９はｐＵＣ８にクローニングされるＨｉｎｄＩＩＩ　Ｍである。
【００９７】
ワクシニアから［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］遺伝子クラスターまを削除する基体を提供するために、最初にＥ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼを、以下のようにワクシニアＭ２Ｌ削除座（グオら、１９９０）に挿入した。ｐＳＤ４０９中のＢｇｌＩＩ部位を除去するために、プラスミドをワクシニア配列（位置２８，２１２）のＢｇｌＩＩおよびｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＢａｌＨＩで切断し、次いで連結してプラスミドｐＭＰ４０９Ｂを産生した。ｐＭＰ４０９Ｂを独特のＳｐｈＩ部位（位置２７，４１６）で切断した。Ｍ２Ｌコード配列を、合成オリゴヌレオチドＭＰＳＹＮ８２（配列番号１９）
【化９】
2004089185.tif 000012
を用いた突然誘発（グオら、１９９０；マンデク、１９８６）により除去した。産生したｐＭＰ４０９Ｄは、上述したようなＭ２Ｌ削除座に挿入される独特なＢｇｌＩＩ部位を含有する。１１ｋＤａのプロモーターの存在下（バートレットら、１９８５）でＥ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子を含有する３．２ｋｂＢａｍＨＩ（部分的な）／ＢｇｌＩＩカセット（バートレットら、１９８５）を、ＢｇｌＩＩで切断したｐＭＰ４０９Ｄに挿入した。産生したプラスミドｐＭＰ４０９ＤＢＧ（グオら、１９９０）は、治療（ｒｅｓｃｕｉｎｇ）ワクシニアウイルスｖＰ７２３との再結合のための供与体プラスミドとして用いられる。Ｍ２Ｌ削除座に挿入されるベータガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルスｖＰ７８４を、Ｘ−ガルの存在下で青いプラークとして単離した。
【００９８】
ワクシニア遺伝子［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］を削除したプラスミドを、ＳａｍＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＵＣ８中に組み込んで、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノー断片で鈍端とした。ワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ　Ｃ配列からなる左側アームは、ｐＳＤ４２０をＸｂａＩ（位置１８，６２８）で切断し、続いてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノー断片での鈍端およびＢｇｌＩＩ（位置１９，７０６）での切断により得た。ワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ　Ｋ配列からなる右側アームは、ＢｇｌＩＩ（位置２９，０６２）およびＥｃｏＲＶ（位置２９，７７８）でｐＳＤ４５１を切断することにより得た。産生したプラスミドｐＭＰ５８１ＣＫは、ＨｉｎｄＩＩＩ　Ｃ中のＢｇｌＩＩ部位（位置１９，７０６）とＨｉｎｄＩＩＩ　Ｋ中のＢｇｌＩＩ部位（位置２９，０６２）との間のワクシニア配列の削除されたものである。プラスミドｐＭＰ５８１ＣＫ中のワクシニア配列の削除部位は、図１５中の三角形により示す。
【００９９】
ワクシニア削除接合部での過剰のＤＮＡを除去するために、プラスミドｐＭＰ５８１ＣＫをワクシニア配列（位置１８，８１１；１９，６５５）内のＮｃｏＩ部位で切断し、Ｂａｌ−３１エキソヌクレアーゼで処理し、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２３３（配列番号２０）
【化１０】
2004089185.tif 000013
を用いた変異誘発（マンデク、１９８６）を施した。産生したプラスミドｐＭＰＣＳＫ１Δは、１２ワクシニア読取り枠［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］を包囲するワクシニア配列位置１８，８０５−２９，１０８が削除されたものである。ワクシニア組換え体を含有するベータガラクトシダーゼとｐＭＰＣＳＫ１Δとの間の組換え体ｖＰ７８４により、Ｘ−ガルの存在下で透明なプラークとして単離されたワクシニア削除変異体ｖＰ８０４が得られた。
【０１００】
巨大なサブユニット、リボヌクレオチドリダクターゼ（Ｉ４Ｌ）を削除するためのプラスミドｐＳＤ５４８の構成
ここで図１６を参照すると、プラスミドｐＳＤ４０５はｐＵＣ８にクローニングされるワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ（位置６３，８７５−７０，３６７）を含有する。ｐＳＤ４０５は、ワクシニア配列内のＥｃｏＲＶ（位置６７，９３３）およびｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＳａｍＩで切断され、連結されてプラスミドｐＳＤ５１８を産生した。ｐＳＤ５１８は、ｐＳＤ５４８の構成に用いられる全てのワクシニア制限断片の供給源として用いられた。
【０１０１】
ワクシニアＩ４Ｌ遺伝子は位置６７，３７１−６５，０５９に亘る。Ｉ４Ｌの転写の方向は、図１６中の矢印で示す。Ｉ４Ｌコード配列の部分を削除したベクタープラスミド断片を得るために、ｐＳＤ５１８をＢａｍＨＩ（位置６５，３８１）およびＨｐａＩ（位置６７，００１）で切断し、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノー断片を用いて鈍端とした。この４．８ｋｂベクター断片を、ワクシニア１１ｋＤａプロモーター（バートレットら、１９８５；パーカスら、１９９０）の制御下でＥ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子を含有する３．２ｋｂＳｍａＩカセット（シャピラら、１９８３）と連結し、プラスミドｐＳＤ５２４ＫＢＧを産生した。ｐＳＤ５２４ＫＢＧは、ワクシニアウイルスｖＰ８０４との再結合のための供与体プラスミドとして用いた。Ｉ４Ｌ遺伝子の部分的な削除部中にベータガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルスｖＰ８５５を、Ｘ−ガルの存在下で青いプラークとして単離した。
【０１０２】
ｖＰ８５５からベータガラクトシダーゼおよびＩ４Ｌ　ＯＲＦの残りを削除するために、削除プラスミドｐＳＤ５４８を構成した。左右のワクシニア側端アームを以下詳細に示すようにｐＵＣ８中に別々に組立て、図１６に概略を示した。左ワクシニア側端アームを受け入れるベクタープラスミドを構成するために、ｐＵＣをＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、アニールした合成オリゴヌクレオチド５１８Ａ１／５１８Ａ２（配列番号２１／配列番号２２）
【化１１】
2004089185.tif 000014
と連結し、プラスミドｐＳＤ５３１を産生した。ｐＳＤ５３１をＲｓａＩ（部分的な）およびＢａｍＨＩで切断し、２．７ｋｂベクタープラスミドを単離した。プラスミドｐＳＤ５１８をＢｇｌＩＩ（位置６４，４５９）／ＲｓａＩ（位置６４，９９４）で切断し、０．５ｋｂプラスミドを単離した。２つのプラスミドをともに連結し、Ｉ４Ｌコード配列の左側に完全なワクシニア側アームを含有するｐＳＤ５３７を産生した。
【０１０３】
右ワクシニア側端アームを受け入れるベクタープラスミドを構成するために、ｐＵＣ８をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、アニールした合成オリゴヌクレオチド５１８Ｂ１／５１８Ｂ２（配列番号２３／配列番号２４）
【化１２】
2004089185.tif 000015
と連結し、プラスミドｐＳＤ５３２を産生した。ｐＳＤ５３２をＲｓａＩ（部分的な）／ＥｃｏＲＩで切断し、２．７ｋｂベクタープラスミドを単離した。ｐＳＤ５１８をワクシニア配列（位置６７，４３６）内のＲｓａＩおよびワクシニア／ｐＵＣ接合部でのＥｃｌＲＩで切断し、０．６ｋｂプラスミドを単離した。２つのプラスミドをともに連結し、Ｉ４Ｌコード配列の右側に完全なワクシニア側アームを含有するｐＳＤ５３８を産生した。
【０１０４】
右ワクシニア側アームを、ｐＳＤ５３８からの０．６ｋｂＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩプラスミドとして単離し、ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩで切断したｐＳＤ５３７ベクタープラスミド中に連結した。産生したプラスミドｐＳＤ５３９において、左側に０．６ｋｂワクシニアＤＮＡ、右側に０．６ｋｂワクシニアＤＮＡを側端に有し、全てがｐＵＣバックグラウンドにあるポリリンカー領域により、Ｉ４ＬＯＲＦ（位置６５，０４７−６７，３８６）を置き換えた。ワクシニア配列内の削除部の部位を図１６中に三角形で示す。ｐＳＤ５３９のｐＵＣ誘導部分中のベータガラクトシダーゼ配列と組換えワクシニアウイルスｖＰ８５５中のベータガラクトシダーゼ配列との再結合の可能性を避けるために、ワクシニアＩ４Ｌ削除カセットを、ｐＳＤ５３９から取り出し、全てのベータガラクトシダーゼ配列が除去されてポリリンカー領域と置き換えられたｐＵＣ誘導体であるｐＲＣ１１中に挿入した（コリナンズら、１９９０）。ｐＳＤ５３９をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩで切断し、１．２ｋｂプラスミドを単離した。このプラスミドをＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩで切断したｐＲＣ１１（２．３５ｋｂ）中に連結し、ｐＳＤ５４８を産生した。ｐＳＤ５４８とワクシニア組換え体ｖＰ８５５を含有するベータガラクトシダーゼとの組換え体により、Ｘ−ガルの存在下で透明プラークとして単離されたワクシニア削除変異体ｖＰ８６６が得られた。
【０１０５】
組換えワクシニアウイルスｖＰ８６６からのＤＮＡを、制限切断および続いてのアガロースゲル上での電気泳動により分析した。制限模様は予期したものであった。上述した６つの削除座を側面に有するプライマーおよびテンプレートとしてｖＰ８６６を用いたポリメラーゼ連鎖反応（エンゲルケら、１９８８）は、予期したサイズのＤＮＡプラスミドを産生した。削除接合部の領域の回りのＰＣＲ産生断片の配列分析により、その接合部は予期されたものであることが確信された。上述したような６つの作成した削除部を含有する組換えワクシニアウイルスｖＰ８６６は、ワクシニアワクチン株「ＮＹＶＡＣ」を示した。
【０１０６】
実施例８−はしか融合および血球凝集素糖タンパク質を発現するＮＹＶＡＣ−ＭＶ組換え体の構成
はしかウイルスＭＶ（エドモンストン株）のＨＡタンパク質およびＦタンパク質をコードする配列のｃＤＮＡコピーをＮＹＶＡＣ中に挿入し、ＮＹＶＡＣ−ＭＶを示す二重組換え体を産生した。その組換え体は確実に、両者の感染細胞の表面上のはしか糖タンパク質を発現した。イムノプレシピテーション分析は、ＦおよびＨＡ糖タンパク質の正確な処理を示した。その組換え体はまた、融合細胞形成を引き起こすことを示した。
【０１０７】
細胞およびウイルス
ＮＹＶＡＣ−ＭＶの産生に用いられる治療ウイルスは、ＮＹＶＡＣを示すワクシニアウイルスの修飾コペンハーゲン株であった。全てのウイルスが成長し、ＶＥＲＯ細胞単一層上で滴定した。
【０１０８】
プラスミド構成
プラスミドｐＳＰＭ２ＬＨＡ（テイラーら、１９９１）は、前述したワクシニアウイルスＨ６プロモーターにより正確なＡＴＧからＡＴＧ配置中に連結された完全はしかＨＡ遺伝子を含有する（テイラーら、１９８８ａ　、ｂ　；グオら、１９８９；パーカスら、１９８９）。３′のほとんどの２６ｂｐを欠いたＨＡ遺伝子により正確なＡＴＧ：ＡＴＧ配置に融合したＨ６プロモーターの３′のほとんどの２４ｂｐを含有する１．８ｋｐｂＥｃｏＲＶ／ＳｍａＩ断片をｐＳＰＭ２ＬＨＡから単離した。この断片を、ｐＳＰＭＨＨＡ１１（タイラーら、１９９１）の１．８ｋｐｂＥｃｏＲＶ／ＳｍａＩ断片を置き換え、ｐＲＷ８０３を産生するのに用いた。プラスミドｐＲＷ８０３は、完全なはしかＨＡ遺伝子に正確に連結した完全Ｈ６プロモーターを含有する。
【０１０９】
はしかＨＡ遺伝子による以前の構成物を確認する際に、コドン１８（ＣＣＣ）の配列を公表された配列と比較して削除した（アルハティブら、１９８６）。そのＣＣＣ配列を、オリゴヌクレオチドＲＷ１１７（配列番号３９）
【化１３】
2004089185.tif 000016
を用いたクンケル法（クンケル、１９８５）によりオリゴヌクレオチド変異体により置き換えた。１本鎖テンプレートを、ｐＩＢＩ２５中のｐＲＷ８０３からのＨ６／ＨＡカセットを含有するプラスミドｐＲＷ８１９から誘導した（インターナショナルバイオテクノロジー社、ニューハブン、ＣＴ）。コドン１８でのプロリン残基にコードする挿入された（ＣＣＣ）を含有する変異誘発プラスミドはｐＲＷ８２０を示した。ｐＲＷ８２０のＨｉｎｄＩＩＩ部位とＸｂａＩ部位との間の配列は、ヌクレオチド配列分析により確認された。ＨｉｎｄＩＩＩ部位はＨ６プロモーターの５′縁にあり、一方ＸｂａＩ部位はＨＡ遺伝子の開始コドンから下流の２３０ｂｐに位置する。ＸｂａＩ（上記）からの下流のＨＡコード配列を含み、終止コドンを含む、ｐＲＷ８０３からの１．６ｋｂｐＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ断片を用いて、ｐＲＷ８２０の等量の断片と置き換え、ｐＲＷ８３７を産生した。ｐＲＷ８３７内に含まれた変異誘発発現カセットは、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩによる切断により誘導され、２ｍＭ　ｄＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片を用いて鈍端とされ、ｐＳＤ５１３のＳｍａＩ部位に挿入されてｐＲＷ８４３を産生した。プラスミドｐＳＤ５１３は、ポリリンカー配列の添加によりプラスミドｐＳＤ４６０から誘導された。プラスミドｐＳＤ４６０は、ワクシニアウイルスからのチミジンキナーゼ遺伝子の削除を可能にするように誘導された（図１１）。
【０１１０】
はしかウイルスＦ遺伝子をＨＡ挿入プラスミド中に挿入するために、ｐＳＰＨＭＦ上に手枝を施した。プラスミドｐＳＰＨＭＦ７（タイラーら、１９９１）は、前述したワクシニアウイルスＨ６プロモーターに３′で近位のはしかＦ遺伝子を含有する。ＡＴＧ配置のための完全なＡＴＧを達成し、プロモーターの３′端とはしかＦ遺伝子との間の介在配列を除去するために、オリゴヌクレオチドＳＰＭＡＤ（配列番号４０）
【化１４】
2004089185.tif 000017
を用いてオリゴヌクレオチド定方向突然変異を行なった。産生したプラスミドはｐＳＰＭＦ７５Ｍ２０と称した。
【０１１１】
ＡＴＧ構造のための正確なＡＴＧとなるようにＨ６プロモーターと連結したはしかＦ遺伝子を含有するプラスミドｐＳＰＭＦ７５Ｍ２０を、ＮｒｕＩおよびＥａｇＩで切断した。Ｈ６プロモーターの３′のほとんどの２７ｂｐおよび完全な融合遺伝子を含有する、産生された１．７ｋｂｐ鈍端断片を単離し、ＮｒｕＩおよびＸｂａＩで切断し鈍端となっている中間プラスミドｐＲＷ８２３中に挿入した。産生したプラスミドｐＲＷ８４１は、ｐＩＢＩ２５ベクター中のはしかＦ遺伝子と連結したＨ６プロモーターを含有した（インターナショナルバイオテクノロジー社、ニューハブン、ＣＴ）。Ｈ６／はしかＦカセットを、ＳｍａＩによる切断によりｐＲＷ８４１から削除し、産生した１．８ｋｂ断片をｐＲＷ８４３（はしかＨＡ遺伝子を含有する）中に挿入した。最初にプラスミドｐＲＷ８４３をＮｏｔＩで切断して２ｍＭ　ｄＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片で鈍端とした。それゆえ、産生したプラスミドｐＲＷ８５７は、尾部対尾部の構造で連結したＨＡ遺伝子およびはしかウイルスＦを含有する。両方の遺伝子はワクシニアウイルスＨ６プロモーターと連結している。
【０１１２】
ＮＹＶＡＣ−ＭＶの発達
プラスミドｐＲＷ８５７を、前述したリン酸カルシウム沈殿法を用いてＮＹＶＡＣ感染ＶＥＲＯ細胞中にトランスフェクションした（パニカリら、１９８２；ピッチーニら、１９８７）。陽性プラークを、特定のＭＶ　ＦおよびＨＡ放射能標識プローブに対するｉｎ　ｓｉｔｕプラークハイブリダイゼーションに基づいて選択し、純粋な固体群が達成されるまで６連続のプラーク生成を行なった。次いで１つの代表的なプラークを増幅し、産生した組換え体をＮＹＶＡＣ−ＭＶと称した（ｖＰ９１３）。
【０１１３】
実施例９−ＪＥＶ遺伝子のワクシニアウイルス供与体プラスミドへのクローニング
ワクシニアウイルスｖＰ４１０のコペンハーゲン株のチミジンキナーゼ変異体を用いて組換え体ｖＰ８２５、ｖＰ８２９、ｖＰ８５７およびｖＰ８６４を産生した（下記参照）。ｖＰ５５５の産生は以前に記載している（メイソンら、１９９１）。全てのワクシニアウイルス株は、鷹の最小限の実質的な媒質に１０％の熱不活化牛の胎児の血清（ＦＢＳ）を加えたＶＥＲＯ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ８１）細胞中で産生した。５％のＦＢＳおよび抗生物質を補ったＭＥＭ中の３７℃で成長させたＶＥＲＯ細胞、または１０％のＦＢＳおよび必須ではないアミノ酸を用いたことを除いては同一条件下で成長したヒーラ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ２）細胞を用いて、生合成を行なった。全ての生体外実験に用いたＪＥＶウイルスは、ＪＥＶのナカヤマ株の継代５５哺乳ネズミ脳懸濁液に感染したＣ６／３６細胞から調製した浄化培養液であった（メイソン、１９８９）。動物攻撃接種実験は、ＪＥＶの高病原性Ｐ３株を用いて行なった（多重ネズミ継代；ホーング、１９８２）。
【０１１４】
ＪＥＶのＣタンパク質にコードするｃＤＮＡは、モロニーネズミ白血病ウイルス逆転写酵素を用いた岡山とベルグの方法の応用により得られた（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、ゲイサースブルク、ＭＤ）（ダレシオおよびゲラード、１９８８）。ゲノミックＲＮＡは、ＪＥＶのナカヤマ株の継代５５哺乳ネズミ脳懸濁液に感染したＣ６／３６細胞からの懸濁培養からのレピックらの方法（１９８３）により調製したビリオンから単離した。最初の鎖ｃＤＮＡ合成は、ＪＥＶのＥコード領域の塩基９８６から１００５に補足した合成オリゴヌクレオチド（配列番号５２）から行なった（図１７ＡおよびＢ）。二重鎖ｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ部位を含有する合成オリゴヌクレオチド（ニューイングランドバイオラボ、ビバリー、ＭＡ）に連結し、ＥｃｏＲＩ開裂ｐＢＲ３２２（ニューイングランドバイオラボ）で処理したホスファターゼ中に挿入し、産生したＤＮＡを用いてＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５細胞（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を転換した。プラスミドを制限酵素切断により分析して、非コードＲＮＡの８１ヌクレオチドに対応するｃＤＮＡおよびＣコード領域並びにｐｒＭコード領域を含有するプラスミド（ｐＣ２０）を同定した。ｐＣ２０を、ＥｃｏＲＩを有するリンカー部位、およびＡＴＧ開始コドンの２８ｂｐ５′に位置する内部ＤｒａＩ部位で切断し、ＣおよびｐｒＭコード領域を含有する産生断片を、ｐＵＣ１８で切断したＳｍａＩ−ＥｃｏＲＩ中に挿入し、プラスミドｐＤｒ２０を産生した。ＪＥＶのナカヤマ株のｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、およびＮＳ２Ｂコード領域の現在の配列と結合したｐＣ２０のＣコード領域の配列を図１７ＡおよびＢ（配列番号５２）に示す。全てのヌクレオチドの座標は、Ｃタンパク質Ｍｅｔ開始コドンで始まる番号付けのこの現在の配列に基づいている。　ｐＵＣ１８（前記）のＳｍａＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位にＪＥＶ　ｃＤＮＡ（ヌクレオチド−２８から１０００）を含有するプラスミドｐＤｒ２０を、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、ＪＥＶ　ｃＤＮＡ挿入物をｐＩＢＩ２５（インターナショナルバイオテクノロジー社、ニューハブン、ＣＴ）中にクローニングし、プラスミドＪＥＶ１８を産生した。ＪＥＶ１８を、ＪＥ配列（ヌクレオチド２４）内のＡｐａＩ、およびｐＩＢＩ２５内のＸｈｏＩで切断し、アニールしたオリゴヌクレオチドＪ９０（配列番号５４）およびＪ９１（配列番号５５）（ＸｈｏＩ粘着端、ＳｍａＩ部位、およびＪＥヌクレオチド１から２３を含有する）と連結し、プラスミドＪＥＶ１９を産生した。ＪＥＶ１９を、ｐＩＢＩ２５内のＸｈｏＩおよびＪＥ配列（ヌクレオチド６０２）内のＡｃｃＩで切断し、産生した６１３ｂｐ断片を、プラスミド起点、およびカルボキシ末端４０％ｐｒＭとＥの３分の２のアミノ末端をコードするＪＥＶ　ｃＤＮＡを含有するＪＥＶ２（図１）のＸｈｏＩ断片およびＡｃｃＩ断片にクローニングして、ＣのＡＴＧからＥの最後の３分の１に発見されたＳａｃＩ部位（ヌクレオチド２１２４）を含有するプラスミドＪＥＶ２０を産生した。
【０１１５】
Ｅの最後の３分の１からＮＳ２Ｂの最初の２つのアミノ酸までのＪＥ配列（ヌクレオチド２１２４から４１２６）、プラスミド起点およびワクシニア配列を含有するＪＥＶ８（１３０４から１３１０までのＴＴＴＴＴＧＴヌクレオチドがＴＣＴＴＴＧＴに変化したＪＥＶＬ（図１）と類似のプラスミド）からのＳｍａＩ−ＳａｃＩ断片を、ＪＥＶ２０からの精製ＳｍａＩ−ＳａｃＩ挿入物と連結し、ＪＥＶ２２−１を産生した。ＪＥＶ２２−１を構成するのに用いた独特なＳｍａＩ部位に対応する６ｂｐを、オリゴヌクレオチド定方向二重鎖分裂突然変異（マンデック、１９８６）を用いて除去し、Ｈ６プロモーターが直ちにＡＴＧ開始コドンに先行するＪＥＶ２４を産生した。
【０１１６】
プラスミドＪＥＶ７（図２）をＪＥ配列（ヌクレオチド２３８１）内のＳｐｈＩおよびＩＢＩ２４内のＨｉｎｄＩＩＩで切断した。アニールしたオリゴヌクレオチドＪ９４およびＪ９５［ＳｐｈＩ粘着末端、翻訳停止、ワクシニア早期停止終止シグナル（ＴＴＴＴＴＡＴ；ユエンら、１９８７）翻訳停止、ＥａｇＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ粘着末端を含有する］への連結により、Ｅの最後の３分の１にあるＳａｃＩ部位からＥのカルボキシ末端に亘るＪＥ　ｃＤＮＡを含有するプラスミドＪＥＶ２５を産生した。ＪＥＶ２５からのＳａｃＩ−ＥａｇＩ断片をＪＥＶ８のＳａｃＩ−ＥａｇＩ断片（１５ａａ　Ｃ、ｐｒＭおよび３３７から２１２４までのＥヌクレオチドの３分の２のアミノ末端をコードするＪＥ　ｃＤＮＡ、プラスミド起点およびワクシニア配列を含有する）に連結して、プラスミドＪＥＶ２６を産生した。ＡＴＧ開始コドンに先行する独特なＳｍａＩ部位を上述したように除去して、Ｈ６プロモーターが直ちにＡＴＧ開始コドンに先行するＪＥＶ２７を産生した。
【０１１７】
オリゴヌクレオチドＪ９６、Ｊ９７、Ｊ９８およびＪ９９（ＳｐｈＩ粘着末端とともに２２９３から２３８０までのＪＥヌクレオチドを含有する）を、キナーゼ化（ｋｉｎａｓｅｄ　）し、アニールし、ＳｍａＩ−ＳｐｈＩで切断しアルカリ性ホスファターゼで処理したｐＩＢＩ２５に連結して、プラスミドＪＥＶ２８を産生した。ＪＥＶ２８を、ＪＥ配列（ヌクレオチド２３０１）内のＨｐａＩおよびｐＩＢＩ２５配列内のＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アルカリ性ホスファターゼで処理した。ＪＥＶ１からのＨｐａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片またはＪＥＶ７からのＨｐａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（図７）への連結により、ＪＥＶ２９［ＳｍａＩ部位、それに続く３０ａａＥ、ＮＳ１、ＮＳ２Ｂ（ヌクレオチド２２９３から４５１２）にコードするＪＥ　ｃＤＮＡを含有する］およびＪＥＶ３０［ＳｍａＩ部位、それに続く３０ａａＥ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ（ヌクレオチド４５１２）にコードするＪＥ　ｃＤＮＡを含有する］を産生した。
【０１１８】
ＪＥＶ２９からのＳｍａＩ−ＥａｇＩ断片を、ｐＴＰ１５で切断したＳｍａＩ−ＥａｇＩに連結して（メイソンら、１９９１）、ＪＥＶ３１を産生した。ＪＥＶ３１を産生するのに用いた独特なＳｍａＩ部位に対応する６ｂｐを上述したように除去して、Ｈ６プロモーターが直ちにＡＴＧ開始コドンに先行するＪＥＶ３３を産生した。
【０１１９】
ＪＥＶ３０からのＳｍａＩ−ＥａｇＩ断片を、ｐＴＰ１５で切断したＳｍａＩ−ＥａｇＩに連結して、ＪＥＶ３２を産生した。ＪＥＶ３２を産生するのに用いた独特なＳｍａＩ部位に対応する６ｂｐを上述したように除去して、Ｈ６プロモーターが直ちにＡＴＧ開始コドンに先行するＪＥＶ３４を産生した。オリゴヌクレオチドＪ９０（配列番号２５）、Ｊ９１（配列番号２６）、Ｊ９４（配列番号２７）、Ｊ９５（配列番号２８）、Ｊ９６とＪ９７（配列番号２９）、およびＪ９９とＪ９８（配列番号３０）を以下に示す：
【化１５】
2004089185.tif 000018
【０１２０】
ワクシニアウイルス組換え体の構成
組換え供与体プラスミドの治療ワクシニアウイルスに感染した組織培養細胞へのトランスフェクション方法、およびニトロセルロースフィルター上でのｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる組換え体の同定方法が記載されている（パニカリら、１９８２；グオら、１９８９）。ＪＥＶ２４、ＪＥＶ２７、ＪＥＶ３３、およびＪＥＶ３４を、ｖＰ４１０感染細胞にトランスフェクションし、それぞれワクシニア組換え体ｖＰ８２５、ｖＰ８２９、ｖＰ８５７およびｖＰ８６４を産生した（図１８）。
【０１２１】
生体外ウイルス感染および放射能標識
ヒーラ細胞単一層を、直径３５ｍｍのさら上に調製し、放射能標識の前にワクシニアウイルス（ｍ．ｏ．ｉ．が２）またはＪＥＶ（ｍ．ｏ．ｉ．が５）に感染させた。感染より１６時間後、細胞を３５Ｓ−Ｍｅｔを含有する媒質で瞬間標識し、メイソンら（１９９１）により詳細に記載されているように過剰の未標識Ｍｅｔの存在下で６時間追跡した。ＪＥＶ感染細胞は、ラジオイムノプレシピテーションにより攻撃接種前または後のネズミ血清を調査するための放射性活性タンパク質の調製のために、上述したように放射能標識した。
【０１２２】
ラジオイムノプレシピテーション、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびエンドグルコシダーゼ処理
放射能標識細胞溶解産物および培養液を採取し、ウイルスタンパク質をイムノプレシピテーションし、エンドグルコシダーゼで切断し、メイソン（１９８９）により詳細に記載されているようにＳＤＳ含有ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中で分離した。
【０１２３】
動物防御実験
メイソンらにより（１９９１）詳細に記載されているように、ネズミ防御実験を行なった。手短に言うと、生後３週間のネズミの群をワクシニアウイルスの１０７ｐｆｕの腹腔内（ｉｐ）注射により免疫し、それから３週間後の血清を選択したネズミから採取した。ネズミは次いで、組換えウイルスで再接種したか、またはＪＥＶのＰ３株に感染した哺乳ネズミ脳の懸濁液のｉｐ注射により攻撃接種した。３週間後、追加抗原を行なったネズミを再採血し、ＪＥＶのＰ３株で攻撃接種した。攻撃接種に続いて、３週間の間毎日ネズミを観察し、実験動物の同腹子を用いて各攻撃接種実験において、致死量滴定を行なった。加えて、攻撃接種後４週間を生き延びた全ての動物から血清を採取した。
【０１２４】
組換えワクシニアウイルスに対する免疫応答の評価
メイソンら（１９９１）により詳細に記載されているように、洗浄剤処理した細胞溶解産物または３５Ｓ−Ｍｅｔ標識ＪＥＶ感染細胞から得た培養液からのＪＥＶタンパク質を沈殿させる能力についてその血清を試験した。１％のカルボキシメチルセルロースを上塗り媒質に用い、血球凝集中和試験（ＮＥＵＴ）に結晶の視覚化に５日のインキュベーションを用いたことを除いてはメイソンら（１９９１）により記載されたようにして、血球凝集抑制（ＨＡＩ）試験およびＮＥＵＴ試験を行なった。
【０１２５】
組換えワクシニアウイルスの構造
ＣからＮＳ２Ｂに亘るＪＥＶコード領域の部分を発現した４つの異なるワクシニア組換え体（ＨＡ座における）を構成した。これらの組換えウイルス中に得られたＪＥＶ　ｃＤＮＡ配列を図１８に示す。全ての４つの組換えウイルスにおいて、ＪＥＶ　ｃＤＮＡの感覚鎖はワクシニアウイルス早期／晩期Ｈ６プロモーターの後ろに位置し、翻訳はウイルスｃＤＮＡ配列の５′末端に位置する自然に生じるＪＥＶ　Ｍｅｔコドンから発生すると予期された。
【０１２６】
組換え体ｖＰ８２５は、カプシドタンパク質Ｃ、構造タンパク質前駆体ｐｒＭ、構造糖タンパク質Ｅ、非構造糖タンパク質ＮＳ１、および非構造タンパク質ＮＳ２Ａをコードした（マックエイダら、１９８７）。組換え体ｖＰ８２９は、ｐｒＭのアミノ末端、並びにｐｒＭ、およびＥに先行する推定１５ａａシグナル配列をコードした。組換え体ｖＰ８５７は、Ｅの３０ａａ疎水性カルボキシ末端、それに続くＮＳ１およびＮＳ２ＡをコードするｃＤＮＡを含有した。組換え体ｖＰ８６４は、ＮＳ２Ｂの添加に伴いｖＰ８５７と同様のタンパク質をコードするｃＤＮＡを含有した。組換え体ｖＰ８２５およびｖＰ８２９において、Ｅ中の潜在的ワクシニアウイルス早期転写終止シグナル（ＴＴＴＴＴＧＴ；ヌクレオチド１３９９−１４０５）は、ａａ配列を変更することなくＴＣＴＴＴＧＴに変えられた。この配列は生体外転写アッセイにおける転写終止を増大させることを示していたので、この変化は、Ｅの発現の水準を増大するために行なった（ユエンら、１９８７）。
【０１２７】
組換えワクシニアウイルスにより発現されたときにＥおよびｐｒＭを適切に処理した
瞬間追跡実験により、Ｅとサイズが等しいタンパク質がＥ遺伝子を含有する全ての組換えワクシニアウイルスに感染した細胞中で合成されたことが示された（表３）。ＪＥＶ、ｖＰ５５５およびｖＰ８２９に感染した細胞の場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてより遅く移動したＥタンパク質はまた、感染細胞から採取した培養液中で検出された（表３）。ＪＥＶ感染細胞およびｖＰ５５５感染細胞により産生されたＥのこの細胞外形状は、ｖＰ８２９感染細胞により産生されたＥの細胞外形状について確認されたように、熟成Ｎ連鎖グリカンを含有した（メイソン、１９８９；メイソンら、１９９１）。興味深いことに、ｐｒＭおよびＥに加えてＣコード領域を含有したｖＰ８２５は、細胞外液中に放出されない形状にあるＥの合成を明示した（表３）。Ｍ（およびｐｒＭ）に特定のＭＡｂを用いた放射能標識ワクシニア感染細胞から調製したイムノプレシピテーションは、ｐｒＭがｖＰ５５５、ｖＰ８２５、およびｖＰ８２９に感染した細胞中で合成され、ＭがｖＰ５５５またはｖＰ８２９に感染した細胞の培養液中で検出されたことを示した（表３）。
【０１２８】
ｖＰ５５５およびｖＰ８２９に感染した細胞から採取した細胞外液は、ｖＰ４１０、ｖＰ８２５、ｖＰ８５７またはｖＰ８６４に感染した細胞の培養液中に検出されなかったＨＡ活性を含んだ。ｖＰ８２９感染細胞の培養液中に観察されたＨＡ活性は、ｖＰ５５５感染細胞から得たものの８倍であった。このＨＡは、抗ＪＥＶ抗体による抑制および最適ｐＨに基づくＪＥＶ感染細胞中で産生したＨＡに類似しているように思われた（メイソンら、１９９１）。感染細胞から得た培養液で調製したショ糖密度勾配の分析は、ＪＥＶ培養液中に発見されたゆっくり沈殿した血球凝集素（ＳＨＡ）のピークと共移動したｖＰ８２９試料中のＨＡ活性のピークを確認した（表３）。この結果により、ｖＰ８２９感染細胞は、ｖＰ５５５感染細胞から収穫した培養液中に観察されたＥおよびＭを含有するからのウイルスエンベロープに似た細胞外粒子を産生したことが分かった（図９）。
【０１２９】
組換えワクシニアウイルスにより発現されたときにＮＳ１を適切に処理し分泌した
瞬間追跡実験の結果により、本物のＮＳ１およびＮＳ１′とサイズが等しいタンパク質がｖＰ５５５、ｖＰ８２５、ｖＰ８５７およびｖＰ８６４に感染した細胞中で合成されたことが示された（表３）。ｖＰ５５５感染細胞により産生されたＮＳ１は、より高い分子量形状の感染細胞の培養液中に放出された。ＮＳ１はまた、ｖＰ８５７およびｖＰ８６４に感染した細胞の培養液中にも放出された（表３）。ＮＳ２Ａ（ｖＰ８５７）またはＮＳ２ＡとＮＳ２Ｂ（ｖＰ８６４）の両者のいずれかを含有するワクシニアウイルスからのＮＳ１の合成の比較により、ＮＳ２Ａ遺伝子のみがＮＳ１の適切な処理に必要であることを示す以前のデータと一致して、ＮＳ２Ｂコード領域の存在または不在はＮＳ１発現には影響しないことが示された（ファルゴートら、１９８９；メイソンら、１９９１）。ｖＰ８２５感染細胞によるＮＳ１の放出効率は、ｖＰ５５５感染細胞、ｖＰ８５７感染細胞またはｖＰ８６４感染細胞中で合成されたＮＳ１のものよりも１０倍以上低かった。
【０１３０】
組換えワクシニアウイルスがＪＥＶ抗原に対する免疫応答を引き起こした
各群の選択した動物から集めた攻撃接種前の血清に対して、放射能標識ＥおよびＮＳ１をイムノプレシピテーションする能力について試験した。これらの研究の結果により（表３）、（１）　Ｅに対する免疫応答は以下の順番であること、ｖＰ８２９＞ｖＰ５５５＞ｖＰ８２５、（２）　ＮＳ１およびＮＳ２Ａをコードする全てのウイルスは、ＮＳ１に対する抗体を誘発したこと、および（３）　全ての免疫応答は、組換えウイルスの２回目の接種により増大したことが示された。これらの動物から採取した血清のＨＡＩデータ（表４）および中和の分析により、ＲＩＰにより示されたようなＥに対する免疫応答がこれら他の血清試験と良好に相関する（表４）ことを示すイムノプレシピテーション分析の結果を確認した。
【０１３１】
組換えウイルスのワクチン接種は致死ＪＥＶ感染からの防御を提供した
全ての組換えワクシニアウイルスは、ネズミにＪＥＶの末梢病原性Ｐ３鎖により致死感染からのある程度の防御を提供することができた（ハング、１９８２）（表４）。これらの研究はｖＰ５５５の防御潜在能力を確認し（メイソンら、１９９１）、ｖＰ８２５およびｖＰ８２９を接種した動物の同様な防御を示した。強い免疫応答を誘発した組換えウイルスｖＰ８５７およびｖＰ８６４はより低い水準の防御を示したが、これらの組換え体を接種したネズミは、対照ウイルスｖＰ４１０を接種したネズミと比較した場合にまだ著しく防御されていた（表４）。
【０１３２】
攻撃接種前の免疫応答はＪＥＶ複製の水準を示す
これらの組換えウイルスを接種した動物への致死攻撃接種からの防御の機構をより明確に理解するために、ＪＥＶを認識する攻撃接種前の血清中の抗体の能力を評価した。これらの研究に関して、放射能標識ＪＥＶ感染細胞溶解産物らの抗原を用い、高度免疫ネズミ（メイソンら、１９８７ａ　）中の高水準の抗体を誘発するＮＳ３タンパク質に対する応答を試験した。これらの研究の結果（表５）は、高水準の防御を誘発した組換えウイルス（ｖＰ８２９、ｖＰ５５５、およびｖＰ８２５）でワクチン接種した動物の群がＮＳ３に対する低い抗原応答を示した生存データと完全に相関したが、ＮＳ１のみを発現した組換え体（ｖＰ８５７およびｖＰ８６４）をワクチン接種した群の生存動物からの血清は、ＮＳ３に対するより高い攻撃接種前の免疫応答を示した。
【０１３３】
【表３】
2004089185.tif 000019
【表４】
2004089185.tif 000020
【表５】
2004089185.tif 000021
【０１３４】
実施例１０−ＪＥＶ遺伝子のワクシニア（ＮＹＶＡＣ）供与体プラスミドへのクローニング
プラスミドｐＭＰ２ＶＣＬ（Ｋ１Ｌ宿主域遺伝子の上流のワクシニア配列内のポリリンカー領域を含有する）を、ポリリンカー内のＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで切断し、アニールしたオリゴヌクレオチドＳＰＨＰＲＨＡ　ＡからＤと連結して、ＨｉｎｄＩＩＩ部位、Ｈ６プロモーター−１２４から−１（パーカスら、１９８９）およびＸｈｏＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩを含有するものを産生した：
【化１６】
2004089185.tif 000022
【０１３５】
プラスミドｐＳＤ５４４ＶＣ（ポリリンカー領域で置き換えたＨＡ遺伝子の部位を囲むワクシニア配列および６つの読取り枠中の翻訳終止コドンを含有する）をポリリンカー内のＸｈｏＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片で満たし、アルカリ性ホスファターゼで処理した。ＳＰ１２６をＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＳｍａＩの切断により単離したＨ６プロモーターおよびクレノーで処理した。Ｈ６プロモーター断片のｐＳＤ５４４ＶＣへの連結により、ポリリンカー領域（ＨＡ転写の方向に）にＨ６プロモーターを含有するＳＰＨＡ−Ｈ６を産生した。
【０１３６】
プラスミドＪＥＶＬ１４ＶＣ（図１）をＨ６プロモーター中のＥｃｏＲＶおよびＪＥＶ配列のＳａｃＩ（ヌクレオチド２１２４）で切断し、１７８９ｂｐ断片を単離した。ＪＥＶＬ１４ＶＣを、Ｔ５ＮＴに続くＥａｇＩ部位のＥｃｌＸＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片で満たし、ＪＥＶ配列のＳａｃＩ（ヌクレオチド２１２４）で切断し、２００５ｂｐ断片を産生した。１７８９ｂｐＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩおよび２００５ｂｐ（ＳａｃＩ充填ＥｃｌＸＩ）断片を、ＥｃｏＲＶ（Ｈ６内の）と連結し、ＳｍａＩ（ポリリンカー内）で切断し、ＳＰ１２６をアルカリ性ホスファターゼで処理し、ＪＥＶ３５を産生した。ＪＥＶ３５をｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）感染細胞中にトランスフェクションし、ワクシニア組換え体ｖＰ９０８を産生した（図１８）。
【０１３７】
ＪＥＶ３５をＳａｃＩ（ＪＥ配列ヌクレオチド２１２４内）およびＥｃｌＸＩ（Ｔ５ＮＴの後ろ）で切断し、５４９７ｂｐ断片を単離し、ＪＥＶ２５のＳａｃＩ（ＪＥＶヌクレオチド２１２５）からＥａｇＩ断片（Ｅの残りの３分の２、翻訳停止およびＴ５ＮＴを含有する）に連結し、ＪＥＶ３６を産生した。ＪＥＶ３６をｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）感染細胞中にトランスフェクションし、ワクシニア組換え体ｖＰ９２３を産生した（図１８）。オリゴヌクレオチドＳＰＨＰＲＨＡ　ＡからＤ（配列番号３１）、（配列番号３２）、（配列番号３３）および（配列番号３４）を連結して、以下の配列（配列番号５６／配列番号５７）を産生した：
【化１７】
2004089185.tif 000023
【０１３８】
動物防御実験
メイソンら（１９９１）により記載されたように正確にネズミ防御実験を行なった。生後３週間のネズミの群を、１０７ｐｆｕのワクシニアウイルスの腹腔内（ｉｐ）注射により免疫して、３週間後の血清を選択したネズミから採取した。次いでネズミを、ＪＥＶのＰ３鎖に感染した哺乳ネズミ脳の懸濁液（多重ネズミ継代；ハング、１９８２））でｉｐ注射により攻撃接種した。攻撃接種に続いて、３週間に亘って毎日ネズミを観察した。
【０１３９】
ＪＥＶ　ＮＹＶＡＣ組換え体に対する免疫応答の評価
メイソンら（１９９１）が記載したように、血球凝集抑制（ＨＡＩ）試験を行なった。
【０１４０】
ＪＥＶ　ＮＹＶＡＣ組換え体でのワクチン接種は致死ＪＥＶ感染からの防御を提供した
ＮＹＶＡＣ組換え体ｖＰ９０８およびｖＰ９２３は、高水準の血球凝集抑制抗体を誘発し、１００，０００　ＬＤ５０以上ＪＥＶに対してネズミを防御した（表６）。
【０１４１】
【表６】
2004089185.tif 000024
【０１４２】
実施例１１−ＹＦ遺伝子のワクシニアウイルス供与体プラスミドへのクローニング
ワクシニアウイルス（ＷＲ鎖）ｖＰ２９３（パーカスら、１９８９）の宿主域変異体を用いて全ての組換え体を産生した（下記参照）。全てのワクシニアウイルス株は、５−１０％の生まれたての牛の血清を補足した鷹ＭＥＭ中のＶＥＲＯ細胞（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ８１）またはＭＲＣ−５細胞（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ１７１）のいずれかで産生した（フロー研究所、マックリーン、ＶＡ）。
【０１４３】
ＹＦワクシニア組換えウイルス（クローン１０ＩＩＩからクローン２８ＩＩＩ）を構成するのに用いたＹＦ　１７Ｄ　ｃＤＮＡクローンは、チャールズライス（ワシントン大学スクールオブメディスン、セントルイス、ＭＯ）から得て、全てのヌクレオチド同格物は、ライスらの１９８５年に代表される配列データから誘導される。
【０１４４】
カルボキシ末端８０％ｐｒＭ、Ｅおよびアミノ末端８０％ＮＳ１（ヌクレオチド５３７−３２６６）をコードするＹＦ　ｃＤＮＡを含有するプラスミドＹＦ０は、ＹＦ　ｃＤＮＡのＡｖａＩからＮｓｉＩ断片（ヌクレオチド５３７−１６５８）およびＹＦ　ｃＤＮＡのＮｓｉＩからＫｐｎＩ断片（ヌクレオチド１６５９−３２６６）をＡｖａＩおよびＫｐｎＩで切断したＩＢＩ２５（インターナショナルバイオテクノロジー社、ニューハブン、ＣＴ）中にクローニングすることにより誘導した。Ｃおよびアミノ末端２０％ｐｒＭをコードするＹＦ　ｃＤＮＡを含有するプラスミドＹＦ１は、ＹＦ　ｃＤＮＡのＲｓａＩからＡｖａＩ断片（ヌクレオチド１６６−５３６）およびアニールしたオリゴＳＰ４６およびＳＰ４７（不能ＨｉｎｄＩＩＩ粘着末端、ＸｈｏＩおよびＣｌａＩ部位およびＹＦヌクレオチド１１９−１６５を含有する）をＡｖａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したＩＢＩ２５中にクローニングすることにより誘導した。Ｅのカルボキシ末端の６０％およびＮＳ１のアミノ末端の２５％をコードするＹＦ　ｃＤＮＡを含有するプラスミドＹＦ３は、ＹＦ　ｃＤＮＡのＡｐａＩからＢａｍＨＩ断片（ヌクレオチド１６０４−２７２５）をＡｐａＩおよびＢａｍＨＩで切断したＩＢＩ２５中にクローニングすることにより産生した。ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂのカルボキシ末端の２０％およびＮＳ３のアミノ末端の２０％をコードするＹＦ　ｃＤＮＡを含有するプラスミドＹＦ８は、ＹＦ　ｃＤＮＡのＫｐｎＩからＸｂａＩ断片（ヌクレオチド３２６７−４９４０）をＫｐｎＩおよびＸｂａＩで切断したＩＢＩ２５中にクローニングすることにより誘導した。ＮＳ２Ｂのカルボキシ末端の６０％およびＮＳ３のアミノ末端の２０％をコードするＹＦ　ｃＤＮＡを含有するプラスミドＹＦ９は、ＹＦ　ｃＤＮＡのＳａｃＩからＸｂａＩ断片（ヌクレオチド４３３９−４９４０）をＳａｃＩおよびＸｂａＩで切断したＩＢＩ２５中にクローニングすることにより産生した。Ｃ、ｐｒＭのカルボキシ末端の２５％およびＥのアミノ末端の４０％をコードするＹＦ　ｃＤＮＡを含有するプラスミドＹＦ１３は、ＹＦ　ｃＤＮＡのＢａｌＩからＡｐａＩ断片（ヌクレオチド３８４−１６０３）をＡｐａＩおよびＳｍａＩで切断したＩＢＩ２５中にクローニングすることにより誘導した。
【０１４５】
オリゴヌクレオチド定方向突然変異（クンケル、１９８５）を用いて、潜在ワクシニアウイルス早期転写終止シグナル（ユエンら、１９８７）４９ａａを、ＹＦ１中のＣ遺伝子のアミノ末端（ＴＴＴＴＴＣＴヌクレオチド２６３−２６９およびＴＴＴＴＧＴヌクレオチド２６９−２７５）から（配列番号３５）ＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＴに変化させてプラスミドＹＦ１Ｂを産生し、ＹＦ３中のＥ遺伝子においては、（ヌクレオチド１８８６−１８９３ＴＴＴＴＴＴＧＴよりカルボキシ末端からのＴＴＣＴＴＴＧＴ１８９ａａおよびヌクレオチド２４２９−２４３５ＴＴＴＴＴＧＴよりカルボキシ末端からのＴＴＣＴＴＧＴ８ａａ）プラスミドＹＦ３ＢおよびＹＦ３Ｃを産生した。ＹＦ３ＣからのＰｓｔＩからＢａｍＨＩ断片（ヌクレオチド１９６５−２７２５）を、ＹＦ３Ｂの対応する断片と交換して、両者とも変異化転写終止シグナルを有するカルボキシ末端６０％Ｅおよびアミノ末端２５％ＮＳ１をコードするＹＦ　ｃＤＮＡ（ヌクレオチド１６０４−２７２５）を含有するＹＦ４を産生した。ＹＦ４からのＡｐａＩからＢａｍＨＩ断片（ヌクレオチド１６０４−２７２５）を、ＹＦ０中の等しい領域と置き換えて、両者とも変異化転写終止シグナルを有するｐｒＭ、Ｅのカルボキシ末端８０％およびアミノ末端８０％のＮＳ１をコードするＹＦ　ｃＤＮＡ（ヌクレオチド５３７−３２６６）を含有するプラスミドＹＦ６を産生した。プラスミドＹＦ６をＩＢＩ２５配列内のＥｃｏＲＶおよびヌクレオチド５３７でのＡｖａＩで切断し、ＹＦ１ＢからのＥｃｏＲＶからＡｖａＩ断片（ＩＢＩ２５内のＥｃｏＲＶからヌクレオチド５３６でのＡｖａＩ）に連結し、１１９でのＸｈｏＩ部位とＣｌａＩ部位および４つの変異化転写終止シグナルを有するＣからＮＳ１のアミノ末端の８０％をコードするＹＦ　ｃＤＮＡを含有するＹＦ２を産生した。
【０１４６】
上述したオリゴヌクレオチド定方向突然変異を用いて、Ｅのカルボキシ末端からのＡＴＧ１７ａａに先行するＸｈｏＩ部位およびＣｌａＩ部位（ヌクレオチド２４０２−２４０４）をプラスミドＹＦ３Ｃ中に挿入してＹＦ５を産生し、ｐｒＭのカルボキシ末端からのＡＴＧ１９ａａに先行するＸｈｏＩ部位およびＣｌａＩ部位（ヌクレオチド９１７−９１９）をプラスミドＹＦ１３中に挿入してＹＦ１４を産生し、Ｅのカルボキシ末端からのＡＴＧ２３ａａに先行するＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド２３８４−２３８６）をプラスミドＹＦ３Ｃ中に挿入してＹＦ２５を産生し、Ｃのカルボキシ末端からのＡＴＧ（ヌクレオチド４１９）２１ａａおよびＸｈｏＩ部位をプラスミドＹＦ１中に挿入してＹＦ４５を産生した。
【０１４７】
ＹＦ５からのＡｐａＩからＢａｍＨＩ断片（ヌクレオチド１６０４−２７２５）を、ＹＦ０の対応する領域と交換して、２４０２でのＸｈｏＩ部位とＣｌａＩ部位（Ｅのカルボキシ末端からの１７ａａ）および２４２９−２４３５での変異化転写終止シグナル（Ｅのカルボキシ末端からの８ａａ）を有する、カルボキシ末端８０％のＥ、ｐｒＭおよびアミノ末端８０％のＮＳ１をコードするＹＦ　ｃＮＤＡ（ヌクレオチド５３７−３２６６）を含有するＹＦ７を産生した。ＹＦ２５からのＡｐａＩからＢａｍＨＩ断片（ヌクレオチド１６０４−２７２５）を、ＹＦ０の対応する領域と交換して、ヌクレオチド２３８４でのＸｈｏＩ部位（Ｅのカルボキシ末端からの２３ａａ）および２４２８−２４３５での変異化転写終止シグナル（Ｅのカルボキシ末端からの８ａａ）を有する、カルボキシ末端８０％のＥ、ｐｒＭおよびアミノ末端８０％のＮＳ１をコードするＹＦ　ｃＮＤＡ（ヌクレオチド５３７−３２６６）を含有するＹＦ２６を産生した。
【０１４８】
ＹＦ１４からのＡｖａＩからＡｐａＩ断片（ヌクレオチド５３７−１６０３）を、ＹＦ６の対応する領域と置き換えて、９１７でのＸｈｏＩ部位とＣｌａＩ部位（ｐｒＭのカルボキシ末端からの１９ａａ）および変異化転写終止シグナルを有する、カルボキシ末端８０％のｐｒＭおよびアミノ末端８０％のＮＳ１をコードするＹＦ　ｃＮＤＡ（ヌクレオチド５３７−３２６６）を含有するＹＦ１５を産生した。ＹＦ６を、ＩＢＩ２３内のＥｃｏＲＶおよびＹＦ内のヌクレオチド５３７でのＡｖａＩで切断し、ＹＦ４５ｋＥｃｏＲＶ（ＩＢＩ２５内）からＡｖａＩ断片と連結し、４１９でのＸｈｏＩ部位（Ｃのカルボキシ末端からの２１ａａ）を有し２つの転写終止シグナルを除去した、Ｃからアミノ末端８０％のＮＳ１をコードするＹＦ　ｃＤＮＡ（ヌクレオチド１１９−３２６６）を含有するＹＦ４６を産生した。
【０１４９】
上述したオリゴヌクレオチド定方向突然変異を用いて、ＮＳ２Ｂのカルボキシ末端でのＳｍａＩ部位（ヌクレオチド４５６９）をプラスミドＹＦ９中に挿入してＹＦ１１を産生し、ＮＳ２Ａのカルボキシ末端でのＳｍａＩ部位（ヌクレオチド４１８０）をプラスミドＹＦ８中に挿入してＹＦ１０を産生した。ＹＦ１１からのＳａｃＩからＸｂａＩ断片（ヌクレオチド４３３９−４９４０）およびＹＦ８からのＡｓｐ７１８からＳａｃＩ断片（ヌクレオチド３２６２−４３３８）を、Ａｓｐ７１８およびＸｂａＩで切断したＩＢＩ２５に連結して、ＮＳ２Ｂのカルボキシ末端の後にＳｍａＩ部位（ヌクレオチド４５６９）を有する、カルボキシ末端２０％のＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂおよびアミノ末端２０％のＮＳ３をコードするＹＦ　ｃＤＮＡ（ヌクレオチド３２６２−４９４０）を含有するＹＦ１２を産生した。
【０１５０】
プラスミドｐＨＥＳ４は、ワクシニアＫ１Ｌ宿主域遺伝子、早期／晩期ワクシニアウイルスＨ６プロモーター、独特なマルチクローニング制限部位、翻訳終止コドン、および早期転写終止シグナルを含有する（パーカスら、１９８９）。カルボキシ末端２０％のＮＳ１、ＮＳ２ＡおよびＮＳ２ＢをコードするＹＦ１２からのＫｐｎＩからＳｍａＩ断片（ヌクレオチド３２６７−４５６９）、１９ａａ　ｐｒＭ、Ｅおよびアミノ末端８０％のＮＳ１をコードするＹＦ１５からのＸｈｏＩからＫｐｎＩ、およびＸｈｏＩ−ＳｍａＩ切断ｐＨＥＳ４を連結して、ＹＦ１３を産生した。２３ａａ　Ｅ、アミノ末端２５％のＮＳ１をコードするＹＦ２６からのＸｈｏＩからＢａｍＨＩ断片（ヌクレオチド２３８４−２７２５）を、ＹＦ２３からのＸｈｏＩからＢａｍＨＩ断片（カルボキシ末端７５％ＮＳ１、ＮＳ２ＡとＮＳ２Ｂ、複製の元およびワクシニア配列を含有する）と連結させて、ＹＦ２８を産生した。
【０１５１】
ＸｈｏＩ−ＳｍａＩで切断したｐＨＥＳ４を、１７ａａＥおよびアミノ末端８０％のＮＳ１をコードするＹＦ７からのＸｈｏＩからＫｐｎＩ断片（ヌクレオチド２４０２−３２６６）と、カルボキシ末端２０％のＮＳ１およびＮＳ２ＡをコードするＹＦ１０からのＫｐｎＩからＳｍａＩ断片（ヌクレオチド３２６７−４１８０）とに連結し、ＹＦ１８を産生した。Ｃ、ｐｒＭ、Ｅおよびアミノ末端２５％のＮＳ１をコードするＹＦ２からのＸｈｏＩからＢａｍＨＩ断片（ヌクレオチド１１９−２７２５）を、ＹＦのＸｈｏＩからＢａｍＨＩ断片（複製とワクシニア配列の元である、カルボキシ末端７５％のＮＳ１およびＮＳ２Ａを含有する）と連結し、ＹＦ１９を産生した。同一のＹＦ２からのＸｈｏＩからＢａｍＨＩ断片を、ＹＦ２８からのＸｈｏＩからＢａｍＨＩ断片（複製とワクシニア配列の元である、カルボキシ末端７５％のＮＳ１およびＮＳ２Ａを含有する）と連結し、ＹＦ２０を産生した。２１ａａＣ、ｐｒＭ、Ｅおよびアミノ末端２５％のＮＳ１をコードするＹＦ４６からのＸｈｏＩからＢａｍＨＩ断片（ヌクレオチド４１９−２７２５）をＹＦ１８からのＸｈｏＩからＢａｍＨＩ断片と連結し、ＹＦ４７を産生した。オリゴヌクレオチドＳＰ４６（配列番号３６）およびＳＰ４７（配列番号３７）を以下に示す：
【化１８】
2004089185.tif 000025
【０１５２】
ワクシニア組換え体の構成
組換え供与体プラスミドの治療ワクシニアウイルスに感染した組織培養細胞へのトランスフェクション方法および宿主範囲選択による組換え体の同定方法およびニトロセルロースフィルター上でのｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション方法が記載されている（パーカスら、１９８９）。ＹＦ１８、ＹＦ２３、ＹＦ２０、ＹＦ１９およびＹＦ４７を宿主域変異体ｖＰ２９３（パーカスら、１９８９）に感染した細胞にトランスフェクションし、ワクシニア組換え体ｖＰ７２５、ｖＰ７２９、ｖＰ７６４、ｖＰ７６６およびｖＰ８６９を産生した。ｖＰ２９３のバックグランド中に貯蔵された宿主域遺伝子を含有するｖＰ４５７が記載されている（パーカスら、１９８９）。
【０１５３】
生体外感染および放射能標識
放射能標識を付ける前に、１時間に亘りＶＥＲＯ細胞単層をワクシニアウイルス（ｍ．ｏ．ｉ．＝１０）に感染させた。吸収期間後、接種物を除去して、感染細胞を、２０ｕＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−Ｍｅｔおよび２％の透析ＦＢＳを含有するＭｅｔフリー媒質（ＭＥＭ）で覆った。全ての試料を感染後８時間で採取した。
【０１５４】
ヒーラ細胞単層を放射能標識の前にワクシニアウイルス（ｍ．ｏ．ｉ．＝２）またはＹＦ１７Ｄ（ｍ．ｏ．ｉ．＝４）で感染させた。ワクシニアの感染の１６後またはＹＦ１７Ｄの感染の３８時間後、細胞を３５Ｓ−Ｍｅｔ含有媒質で瞬間標識し、過剰の未標識Ｍｅｔの存在下で６時間追跡した。
【０１５５】
ラジオイムノプレシピテーションおよびポリアミドゲル電気泳動
放射能標識細胞溶解産物および培養液を採取して、ウイルスタンパク質をＹＦＥおよびＮＳ１に対する単クローン性抗体でイムノプレシピテーションし、メイソンにより記載されたように（１９８９）正確にＳＤＳ含有ポリアクリルアミドゲル中で分離した。
【０１５６】
動物防御実験
生後３週間のネズミを、１０７ｐｆｕのワクシニアウイルスまたはＹＦ１７Ｄを含有する哺乳ネズミ脳の１０％の懸濁液で腹腔内注射により免疫した。３週間後、選択したネズミから血清を採取した。次いでネズミを、組換えウイルスまたはＹＦ１７Ｄで再接種したか、またはＹＦＶのフレンチ神経親和性鎖のｉ．ｃ．注射により攻撃接種した。３週間後、追加免疫した動物を再度採血し、ＹＦＶのフレンチ神経親和性鎖で攻撃接種した。攻撃接種に続いて、３週間に亘り毎日ネズミを観察し、実験動物の同腹子を用いて各実験において致死滴定を行なった。加えて、攻撃接種から４週間後、全ての生存動物から血清を採取した。
【０１５７】
組換えワクシニアウイルスに対する免疫応答の評価
血清について、メイソンらにより記載されているように（１９９１）洗浄剤処理細胞溶解産物からの放射能標識ＹＦＶタンパク質を沈殿させる能力を試験した。ヒトの血清をウイルス／抗体希釈液に加えなかったことを除いては、メイソンらにより記載されたように（１９９１）中和試験を行なった。血球凝集試験および血球凝集抑制（ＨＡＩ）試験をメイソンらにより記載されたように（１９９１）行なった。
【０１５８】
組換えワクシニアウイルスの構造
宿主域選択システムを用いて、ＣからＮＳ２Ｂに亘るＹＦコード領域の部分を発現した５つの異なるワクシニアウイルス組換え体を構成した（パーカスら、１９８９）。これらの組換え体に含まれるＹＦ　ｃＤＮＡ配列を図１９に示す。５つの全ての組換えウイルスにおいて、ＹＦ　ｃＤＮＡの感覚鎖はワクシニアウイルス早期／晩期Ｈ６プロモーターの背後に位置し、翻訳はウイルスｃＤＮＡ配列の５′末端に位置するＭｅｔコドンから開始されると思われる（図１９）。
【０１５９】
組換え体ｖＰ７２５は、非構造タンパク質ＮＳ１のＮ末端に先行する推定の１７−ａａシグナル配列および非構造タンパク質ＮＳ１とＮＳ２Ａをコードした（ライスら、１９８５）。組換え体ｖＰ７２９は、ＥのＮ末端に先行する推定の１９−ａａシグナル配列、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２ＡおよびＮＳ２Ｂをコードした（ライスら、１９８５）。組換え体ｖＰ７６４は、Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２ＡおよびＮＳ２Ｂをコードした（ライスら、１９８５）。組換え体ｖＰ７６６は、Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１およびＮＳ２Ａをコードした（ライスら、１９８５）。組換え体ｖＰ８６９は、構造タンパク質前駆体ｐｒＭのＮ末端に先行する推定の２１−ａａシグナル配列およびｐｒＭ　Ｅ、ＮＳ１とＮＳ２Ａをコードした（ライスら、１９８５）。
【０１６０】
組換えワクシニアウイルスによるＥタンパク質の発現
ヒーラ細胞中の瞬間追跡実験は、ＹＦ１７Ｄ　Ｅとサイズが等しいタンパク質がｖＰ８６９に感染した細胞中で合成され、培養液中に分泌されたことを示した（表７）。標識の同一条件下で、どの細胞内Ｅまたは細胞外ＥもｖＰ７６６、ｖＰ７２９または対照ワクシニアウイルスｖＰ４５７に感染した培養物中に検出されなかった（表７）。
【０１６１】
ＶＥＲＯ細胞中の連続標識実験は、ｖＰ８６９により発現されたＥタンパク質とサイズが等しいタンパク質がｖＰ７６６およびｖＰ７２９に感染した培養液中で発現されたことを示した（表７）。これらの結果により、ｖＰ８６９感染細胞により産生されたＥタンパク質は、ｖＰ７６６またはｖＰ７２９により発現されたＥタンパク質よりも安定な形状にあることが示唆される。ＹＦ１７Ｄは以前、他のＹＦ単離物より不安定なＥタンパク質を産生することが示されている（ケインら、１９８９）。
【０１６２】
ｖＰ８６９に感染した細胞から採取した細胞外液は、ｖＰ７６６、ｖＰ７２９、ｖＰ７２５またはｖＰ４５７感染細胞の培養液中に検出されなかったＨＡ活性を含んだ（表７）。このＨＡは、そのｐＨ最適性に基づくＹＦ１７Ｄ感染細胞中に産生されたＨＡに類似するようである。
【０１６３】
組換えワクシニアウイルスによるＮＳ１タンパク質の発現
ヒーラ細胞中の瞬間追跡実験の結果は、本物のＹＦ１７Ｄ　ＮＳ１とサイズが等しいタンパク質がｖＰ７２５、ｖＰ７６６、およびｖＰ７２９に感染した細胞中で合成されたことを示した（表７）が、合成された量は大幅に、変化した。ｖＰ７２５感染細胞およびｖＰ７２９感染細胞により産生されたＮＳ１は、ＹＦ１７Ｄ感染細胞により分泌されたＮＳ１に類似の高分子量の感染細胞の培養液中に放出された。ｖＰ７６６感染細胞はＮＳ１を分泌しなかったが、細胞内ＮＳ１の水準はこの組換え体に関して最も低かった（表７）。ＮＳ１を合成するｖＰ８６９の失敗は、この組換え体を産生するのに用いられる供与体プラスミド（ＹＦ４７）中の塩基（ヌクレオチド２９６２）の削除のためである。
【０１６４】
致死ＹＦ攻撃接種からの防御
最初の実験において、ＹＦＶのフレンチ神経親和性の致死攻撃接種からネズミを防御する能力に関して、ｖＰ４５７、ｖＰ７６４、およびｖＰ８６９をＹＦ１７Ｄと比較した（表８、実験Ｉ）。ｖＰ８６９は、著しい防御を提供したが、ｖＰ７６４はせいぜい対照ワクシニアウイルスｖＰ４５７ほどの防御しか提供しなかった。
【０１６５】
第２の防御実験は、ＹＦ１７Ｄに対するｖＰ８６９、ｖＰ７６６、ｖＰ７２５、ｖＰ７２９，およびｖＰ５４７のフレンチ神経親和性鎖ＹＦＶの致死攻撃接種に対してネズミを防御する能力を比較することによって行なった（表８、実験ＩＩ）。１回または２回の接種またはｖＰ８６９を受けたネズミを攻撃接種から防御し、どの他の組換え体では１回または２回の接種後に防御的ではなかった。さらに、ｖＰ８６９接種ネズミになされた防御の水準は、ＹＦ１７Ｄで免疫することによりなされた水準と等しかった。各群の選択された動物から採取した攻撃接種前の血清について、放射能標識Ｅタンパク質およびＮＳ１タンパク質をイムノプレシピテーションする能力の試験、およびＮｅｕｔとＨＡ抗体の存在の試験を行なった。表９に示すように、ｖＰ８６９およびＹＦ１７Ｄ免疫ネズミのみが、Ｅタンパク質に応答し、その応答は２回目の接種により増大した。ｖＰ７２９、ｖＰ７２５またはｖＰ７６６で２回接種したネズミはＮＳ１に対する抗体を産生した。高水準のＮｅｕｔ（表１０）およびＨＡＩ抗体（表１１）は、ｖＰ８６９接種ネズミ中に存在したが、他の組換え体で接種したどのネズミ中にも存在せず、イムノプレシピテーション分析の結果を確信し、これらの高水準の抗体が防御に必要であることを示唆した。
【０１６６】
【表７】
2004089185.tif 000026
【表８】
2004089185.tif 000027
【表９】
2004089185.tif 000028
【表１０】
2004089185.tif 000029
【表１１】
2004089185.tif 000030
【０１６７】
実施例１２−ＹＦ遺伝子のＮＹＶＡＣ供与体プラスミドへのクローニング
２１アミノ酸Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ（ＮＳ１ヌクレオチド２９６２中の塩基の欠けた）をコードするＹＦ　ｃＤＮＡを含有するＹＦ４７からのＸｈｏＩからＳｍａＩ成分（ヌクレオチド４１９−４１８０）を、ＸｈｏＩ−ＳｍａＩで切断したＳＰＨＡ−Ｈ６（ＨＡ領域供与体プラスミド）に連結し、ＹＦ４８を産生した。ＹＦ４８をＳａｃＩ（ヌクレオチド２４９０）で切断し、Ａｓｐ７１８（ヌクレオチド３２６２）で部分的に切断し、６７００ｂｐ断片（複製のプラスミド起点、ワクシニア配列、２１アミノ酸Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、アミノ末端３．５　％ＮＳ１、カルボキシ末端２３％ＮＳ１、ＮＳ２Ａを含有する）を単離し、ＹＦ１８からのＳａｃＩ−Ａｓｐ７１８断片（２９６２での塩基とともにＮＳ１の残りを含有する）に連結し、ＹＦ５１を産生した。ＹＦ５１における独特のＸｈｏＩ部位に対応する６ｂｐを、オリゴヌクレオチド定方向二本鎖開裂突然変異を用いて除去し（マンデッキ、１９８６）、ＨＡ座供与体プラスミド中のＮＳ２Ａ、ＹＦ２１アミノ酸Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１をコードするＹＦ５０を産生した。ＹＦ５０をｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）感染細胞中にトランスフェクションし、組換え体ｖＰ９８４を産生した（図１９）。ＹＦ５０をｖＰ９１３感染細胞（ＮＹＶＡＣ−ＭＶ）中にトランスフェクションし、組換え体ｖＰ１００２を産生した（図１９）。
【０１６８】
ＹＦ４８における独特のＸｈｏＩ部位に対応する６ｂｐを、オリゴヌクレオチド定方向二本鎖開裂突然変異を用いて除去し、ＹＦ４９を産生した。オリゴヌクレオチド定方向突然変異（クンケル、１９８５）を用いて、Ｅのカルボキシ末端でのＳｍａＩ部位をＹＦ４中に挿入し、ＹＦ１６を産生した。ＹＦ４９のＡｐａＩ−ＳｍａＩ断片（複製のプラスミド起点、ワクシニア配列および２１アミノ酸Ｃ、ｐｒＭ、およびアミノ末端４３％ＥをコードするＹＦ５３を含有する）を、ＹＦ１６からのＡｐａＩ−ＳｍａＩ断片（カルボキシ末端５７％Ｅを含有するヌクレオチド１６０４−２４５２）と連結し、ＨＡ座供与体プラスミド中のＥ、２１アミノ酸Ｃ、ｐｒＭをコードするＹＦ５３を産生した。ＹＦ５３をｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）感染細胞中にトランスフェクションし、組換え体ｖＰ１００３を産生した（図１９）。ＹＦ５３をｖＰ９１３感染細胞（ＮＹＶＡＣ−ＭＶ）中にトランスフェクションし、組換え体ｖＰ９９７を産生した（図１９）。
【０１６９】
実施例１３−デング熱第１種のワクシニアウイルス供与体プラスミドへのクローニング
ＤＥＮワクシニア組換え体を構成するのに用いたＤＥＮ　ｃＤＮＡはＤＥＮ−１の西太平洋鎖から誘導した（メイソンら、１９８７ｂ　）。ヌクレオチド座標１−３７４５は、その出版物中にある。図２０（配列番号５３）は、ヌクレオチド３３９２から６１１７の配列を示す。
【０１７０】
カルボキシ末端８４％ＮＳ１およびアミノ末端４５％ＮＳ２ＡをコードするＤＥＮｃＤＮＡを含有するプラスミドＤＥＮ１（ヌクレオチド２５５９−３７４５、メイソンら、１９８７Ｂ　）は、ＤＥＮ　ｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片（ヌクレオチド２５７９−３７４０）およびアニールしたオリゴヌクレオチドＤＥＮ１（配列番号３８）とＤＥＮ２（配列番号３９）（ＸｂａＩ粘着末端、翻訳終止コドン、Ｔ５ＡＴワクシニアウイルス早期転写終止シグナルユエンら（１９８７）、ＥａｇＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ粘着末端を含有する）を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ８にクローニングすることにより誘導した。ＤＥＮ１からのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（ヌクレオチド２５５９−３７４５）およびＥのカルボキシ末端３６％とアミノ末端１６％ＮＳ１をコードするＤＥＮ　ｃＤＮＡのＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片（ヌクレオチド１４４７−２５５９、メイソンら、１９８７Ｂ　）を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩで切断したＩＢＩ２４（インターナショナルバイオテクノロジー社、ニューハブン、ＣＴ）に連結し、カルボキシ末端６４％ＥからＮＳ１に塩基を欠いた（ヌクレオチド２４６７）アミノ末端４５％ＮＳ２ＡをコードするＤＥＮ３を産生した。
【０１７１】
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩで切断したＩＢＩ２４を、アニールしたオリゴヌクレオチドＤＥＮ９（配列番号４０）およびＤＥＮ１０（配列番号４１）［ＨｉｎｄＩＩＩ粘着末端、ＳｍａＩ部位、ＤＥＮヌクレオチド３７７−４２８（メイソンら、１９８７Ｂ　）およびＸｂａＩ粘着末端を含有する］に連結し、ＳＰＤ９１０を産生した。ＳＰＤ９１０をＳａｃＩ（ＩＢＩ２４内）およびＡｖａＩ（ヌクレオチド４２３でのＤＥＮ内）で切断し、ＤＥＮ　ｃＤＮＡのＡｖａＩ−ＳａｃＩ断片（ヌクレオチド４２４−１４４７メイソンら、１９８７Ｂ　）と連結し、カルボキシ末端１１ａａＣ、ｐｒＭおよびアミノ末端３６％ＥをコードするＤＥＮ４を産生した。
【０１７２】
カルボキシ末端６４％Ｅおよびアミノ末端１８％ＮＳ１をコードするＤＥＮ　ｃＤＮＡを含有するプラスミドＤＥＮ６（ヌクレオチド２４６７が存在するヌクレオチド１４４７−２５７９、メイソンら、１９８７Ｂ　）は、ＤＥＮ　ｃＤＮＡのＳａｃＩ−ＸｈｏＩ断片をＩＢＩ２５（インターナショナルバイオテクノロジー社、ニューハブン、ＣＴ）中にクローニングすることにより誘導した。ＤＥＮ５′未翻訳領域の５１塩基、Ｃ、ｐｒＭおよびアミノ末端３６％ＥをコードするＤＥＮ　ｃＤＮＡを含有するプラスミドＤＥＮ１５ｆ、ＤＥＮ　ｃＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片（ヌクレオチド２０−１４４７、メイソンら、１９８７Ｂ　）をＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩで切断したＩＢＩ２５中にクローニングすることにより誘導した。カルボキシ末端５５％ＮＳ２Ａおよびアミノ末端２８％ＮＳ２ＢをコードするＤＥＮ　ｃＤＮＡを含有するプラスミドＤＥＮ２３（ヌクレオチド３７４５−４２１３、図２０）（配列番号５３）は、ＤＥＮ　ｃＤＮＡのＸｂａＩ−ＳｐｈＩ断片をＸｂａＩ−ＳｐｈＩで切断したＩＢＩ２５中にクローニングすることにより誘導した。カルボキシ末端５５％ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂおよびアミノ末端２４アミノ酸ＮＳ３をコードするＤＥＮ　ｃＤＮＡを含有するプラスミドＤＥＮ２０（ヌクレオチド３７４５−４５６３、図２０）（配列番号５３）は、ＤＥＮ　ｃＤＮＡのＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩで切断したＩＢＩ２５中にクローニングすることにより誘導した。
【０１７３】
オリゴヌクレオチド定方向突然変異を用いて（クンケル、１９８５）、潜在ワクシニアウイルス早期転写終止シグナル（ユエンら、１９８７）を変化させて、カルボキシ末端からの２９ａａ（ヌクレオチド８２２−８２８　ＴＴＴＴＴＣＴからＴＡＴＴＴＣＴ）およびカルボキシ末端からの１３ａａ（ヌクレオチド８７０−８７５　ＴＴＴＴＴＡＴからＴＡＴＴＴＡＴ）のＤＥＮ４中のｐｒＭ遺伝子においてはプラスミドＤＥＮ４７を産生し、アミノ末端からの１７ａａ（ヌクレオチド２４４８−２４５４　ＴＴＴＴＴＧＴからＴＡＴＴＴＧＴ）のＤＥＮ６中のＮＳ１遺伝子中においてはプラスミドＤＥＮ７を産生した。
【０１７４】
上述したオリゴヌクレオチド定方向突然変異を用いて、ＮＳ２Ａのカルボキシ末端でのＥａｇＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位（ヌクレオチド４１０２）をプラスミドＤＥＮ２３中に挿入してＤＥＮ２４を産生し、Ｅのカルボキシ末端からのＡＴＧ１５ａａおよびＳｍａＩ部位をＤＥＮ７（ヌクレオチド２３４８）中に挿入してＤＥＮ１０を産生し、ＮＳ２Ｂのカルボキシ末端でのＥａｇＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位（ヌクレオチド４４９２）をプラスミドＤＥＮ２０中に挿入してプラスミドＤＥＮ２１を産生し、プラスミドＤＥＮ１５中のヌクレオチド６０−６７をワクシニアウイルス早期／晩期Ｈ６プロモーターの一部（位置−１から−２１、パーカスら、１９８９）と置き換えてＤＥＮ６１（ＤＥＮヌクレオチド２０−５９、Ｈ６プロモーターのＥｃｏＲＩ部位から−１およびＤＥＮヌクレオチド６８−１４４７を含有する）を産生した。
【０１７５】
ＤＥＮ７からのＳａｃＩ−ＸｈｏＩ断片（ヌクレオチド１４４７−２５７９）をＤＥＮの対応する領域と交換し、カルボキシル末端６４％のＥとアミノ末端４５％のＮＳ２ＡをコードするＤＥＮ　ｃＤＮＡ（ヌクレオチド１４４７−３７４５）を含有し、ヌクレオチド２４６７および修飾転写終止シグナル（ヌクレオチド２４４８−２４５４）を有するＤＥＮ１９を産生した。ＤＥＮ１９からのＸｈｏＩ−ＸｂａＩ断片（ヌクレオチド２５７９−３７４５）およびＤＥＮ２４からのＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（ＩＢＩ２５中のＨｉｎｄＩＩＩを通じたＸｈｏＩヌクレオチド３７４５ＤＥＮ）を、ＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで切断したＩＢＩ２５に連結して、カルボキシル末端８２％のＮＳ１、ＮＳ２Ａとアミノ末端２８％のＮＳ２ＢをコードするＤＥＮ　ｃＤＮＡ（ヌクレオチド２５７９−４２１３）を含有し、４１０２にＥａｇＩ部位を有し、ヌクレオチド２４６７が存在し、突然変異転写終止シグナル（ヌクレオチド２４４８−２４５４）を有するＤＥＮ２５を産生した。ＤＥＮ１９からのＸｈｏＩ−ＸｂａＩ断片（ヌクレオチド２５７９−３７４５）を、ＸｈｏＩ（ＩＢＩ２５内）およびＸｂａＩ（ＤＥＮヌクレオチド３７４５）で切断したＤＥＮ２１に連結して、カルボキシル末端８２％のＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂとアミノ末端２４ａａのＮＳ３をコードし（ヌクレオチド２５７９−４５６４）、ヌクレオチド２４６７が存在し、修飾転写終止シグナル（ヌクレオチド２４４８−２４５４）および４４９２にＥａｇＩ部位を有するＤＥＮ２２を産生した。
【０１７６】
ＤＥＮ１６からのＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片（ヌクレオチド２０−５９、Ｈ６プロモーターの−１までのＥｃｏＲＶ部位、およびＤＥＮヌクレオチド６８−４９４）を、ＤＥＮ４７からのＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片（カルボキシル末端８３％ｐｒＭおよびアミノ末端３６％Ｅヌクレオチド４９４−１４４７および複製のプラスミド起点）と連結し、Ｃ、ｐｒＭおよびアミノ末端３６％Ｅをコードし、Ｈ６プロモーターの一部およびＣのアミノ末端に先行するＥｃｏＲＶ部位を有するＤＥＮ１７を産生した。カルボキシ末端１３ａａＣ、ｐｒＭおよびアミノ末端３６％ＥをコードするＤＥＮ１７からのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片（ヌクレオチド３７０−１４４７）を、アニールしたオリゴヌクレオチドＳＰ１１１およびＳＰ１１２（不能ＨｉｎｄＩＩＩ粘着末端、Ｈ６プロモーターの−１までのＥｃｏＲＶ部位、およびＢｇｌＩＩ粘着末端を有するＤＥＮヌクレオチド３５０−３６９を含有する）に連結し、Ｈ６プロモーターの−１までのＥｃｏＲＶ部位、カルボキシ末端２０ａａＣ、ｐｒＭおよびアミノ末端３６％のＥをコードするＤＥＮ３３を産生した。
【０１７７】
ＳｍａＩ−ＥａｇＩで切断したｐＴＰ１５（メイソンら、１９９１）を、カルボキシ末端１１ａａＣ、ｐｒＭおよびアミノ末端３６％ＥをコードするＤＥＮ４からのＳｍａＩ−ＳａｃＩ断片、およびカルボキシ末端６４％Ｅ、ＮＳ１およびアミノ末端４５％ＮＳ２ＡをコードするＤＥＮ３からのＳａｃＩ−ＥａｇＩ断片に連結し、ＤＥＮＬを産生した。カルボキシ末端６４％のＥおよびアミノ末端１８％のＮＳ１をコードするＤＥＮ７からのＳａｃＩ−ＸｈｏＩ断片（ヌクレオチド１４４７−２５７９）を、カルボキシ末端５５％のｐｒＭおよびアミノ末端３６％のＥをコードするＤＥＮ４７からのＢｓｔＥＩＩ−ＳａｃＩ断片（ヌクレオチド６３１−１４４７）およびＤＥＮＬからのＢｓｔＥＩＩ−ＸｈｏＩ断片（カルボキシ末端１１ａａＣ、アミノ末端４５％ｐｒＭ、カルボキシ末端８２％ＮＳ１、カルボキシ末端４５％ＮＳ２Ａ、複製の機転およびワクシニア配列を含有する）に連結し、ＤＥＮ８を産生した。オリゴヌクレオチド定方向二本鎖開裂突然変異を用いて独特のＳｍａＩ部位（Ｈ６プロモーターとＡＴＧとの間に位置する）を除去し、Ｈ６プロモーターがＡＴＧ開始コドンに直接に先行するＤＥＮ８ＶＣを産生した。
【０１７８】
Ｃ、ｐｒＭおよびアミノ末端３６％ＥをコードするＤＥＮ１７からのＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩ断片（−２１から−１の位置のＨ６プロモーターＤＥＮヌクレオチド６８−１４４７）を、ＤＥＮ８ＶＣのＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩ断片（ワクシニア配列、−２１から−１２４までのＨ６プロモーター、複製の起点およびアミノ末端６４％Ｅ、ＮＳ１、アミノ末端４５％ＮＳ２Ａヌクレオチド１４４７−３７４５を含有する）に連結し、ＤＥＮ１８を産生した。カルボキシ末端８２％ＮＳ１およびＮＳ２ＡをコードするＤＥＮ２５からのＸｈｏＩ−ＥａｇＩ断片（ヌクレオチド２５７９−４１０２）を、ＤＥＮ１８のＸｈｏＩ−ＥａｇＩ断片（複製の起点、ワクシニア配列およびＤＥＮ　Ｃ　ｐｒＭ、Ｅおよびアミノ末端１８％ＮＳ１ヌクレオチド６８−２５７９）に連結し、ＤＥＮ２６を産生した。ＤＥＮ８ＶＣからのＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩ断片（１１ａａＣ、ｐｒＭおよびアミノ末端３６％Ｅをコードする−２１から−１までの位置のＨ６プロモーターＤＥＮヌクレオチド３７７−１４４７）を、ＤＥＮ２６のＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩ断片（複製の起点、ワクシニア配列、およびヌクレオチド２８９４でのＮＳ１に塩基の欠けた、カルボキシ末端６４％Ｅ、ＮＳ１およびＮＳ２ＡをコードするＤＥＮ領域を含有する）に連結し、ＤＥＮ３２を産生した。ＤＥＮ３２をｖＰ４１０感染細胞中にトランスフェクションして、組換え体ｖＰ８６７を産生した（図２１）。
【０１７９】
ＤＥＮからのＳａｃＩ−ＸｈｏＩ断片（ヌクレオチド１４４７−２５７９）を、ＤＥＮ３中の対応する領域と置き換えて、カルボキシ末端６４％Ｅ、ＮＳ１およびアミノ末端４５％ＮＳ２ＡをコードするＤＥＮ　ｃＤＮＡを含有し、Ｅのカルボキシ末端からのＡＴＧ１５ａａおよびＳｍａＩ部位を有するＤＥＮ１１を産生した。ＤＥＮ１１からのＳｍａＩ−ＥａｇＩ断片（カルボキシ末端１５ａａＥ、ＮＳ１およびアミノ末端４５％ＮＳ２Ａヌクレオチド２３４８−３７４５）を、ＳｍａＩ−ＥａｇＩで切断したｐＴＰ１５に連結して、ＤＥＮ１２を産生した。
【０１８０】
ＤＥＮからのＸｈｏＩ−ＥａｇＩ断片（ヌクレオチド２５７９−４４９２）を、上述したＤＥＮ１８からのＸｈｏＩ−ＥａｇＩ断片と連結して、ＤＥＮ２７を産生した。ＤＥＮ１２からのＥｃｏＲＶ−ＰｓｔＩ断片（１５ａａ、ＮＳ１をコードする−２１から−１の位置のＨ６プロモーターＤＥＮヌクレオチド２３４８−３４４７）を、ＤＥＮ２７からのＥｃｏＲＶ−ＰｓｔＩ断片（複製の起点、ワクシニア配列、−２１から−１２４のＨ６プロモーターおよびＮＳ２ＡとＮＳ２ＢをコードするＤＥＮ　ｃＤＮＡを含有する）に連結し、ＤＥＮ３１を産生した。
【０１８１】
ＤＥＮ８ＶＣからのＥｃｏＲＶ−ＸｈｏＩ断片（カルボキシ末端１１ａａＣ、ｐｒＭ　Ｅ、アミノ末端１８％ＮＳ１をコードする−２１から−１の位置のＨ６プロモーターＤＥＮヌクレオチド３７７−２５７９）を、ＤＥＮ３１からのＥｃｏＲＶ−ＸｈｏＩ断片（複製の起点、ワクシニア配列およびカルボキシ末端８２％ＮＳ１、ＮＳ２ＡとＮＳ２Ｂをコードし、２８９４のＮＳ１に塩基を有するＤＥＮｃＤＮＡを含有する）に連結し、ＤＥＮ３５を産生した。ＤＥＮ３５を、ｖＰ４１０感染細胞中にトランスフェクションし、組換え体ｖＰ９５５を産生した（図２１）。ＤＥＮ３３からのＥｃｏａｒｖ−ＳａｃＩ断片（カルボキシ末端２０ａａＣ、ｐｒＭおよびアミノ末端３６％Ｅをコードする−２１から−１の位置のＨ６プロモーターＤＥＮヌクレオチド３５０−１４４７）およびＤＥＮ３２からのＳａｃＩ−ＸｈｏＩ断片（カルボキシ末端６４％およびアミノ末端１８％ＮＳ１ヌクレオチド１４４７−２５７９をコードする）を、上述したＤＥＮ３１からのＥｃｏａｒｖ−ＳａｃＩ断片に連結して、ＤＥＮ３４を産生した。ＤＥＮ３４を、ｖＰ４１０感染細胞中にトランスフェクションし、組換え体ｖＰ９６２を産生した（図２１）。オリゴヌクレオチドＤＥＮ１（配列番号３８）、ＤＥＮ２（配列番号３９）、ＤＥＮ９（配列番号４０）、ＤＥＮ１０（配列番号４１）、ＳＰ１１（配列番号４２）、およびＳＰ１１２（配列番号４３）を以下に示す：
【化１９】
2004089185.tif 000031
組換えワクシニアウイルスに対する免疫応答
生後３週間のネズミに、１０７ｐｆｕのワクシニア組換え体ｖＰ９６２、ｖＰ９５５、ｖＰ８６７、ｖＰ４５２（ワクシニア対照）または１００　μｌのデング第１種ハワイ鎖を含有する哺乳ネズミの１０％懸濁液をｉｐで接種した。３週間後に血清を採取した。ネズミの１つの群には再接種し、４週間後に血清を採取した。血清は、メイソンら（１９９１）により記載されたように、ＨＡＩ抗体について検定した。
【０１８２】
表１２は、２回ｖＰ９６２で免疫したネズミは高水準のＨＡＩ抗体を発達させ、その水準はデング第１種ハワイ鎖で免疫した動物中に得られた水準と等しかった。
【０１８３】
【表１２】
2004089185.tif 000032
【０１８４】
ＤＥＮ第１種　２０ａａＣ、ｐｒＭ、ｅを含有するワクシニア感染ベクターの構成
カルボキシ末端２３％Ｅをコードする３３８ｂｐ断片（ヌクレオチド２０５５−２３９２、メイソンら、１９８７ｂ　）、ＴＡＧ停止コドンＴ５ＮＴワクシニア早期転写終止シグナル（ユエンら、１９８７）およびＥｃｌＸＩ部位とＢａｍＨＩ部位は、テンプレートとしてのプラスミドＤＥＮ７およびオリゴヌクレオチド（配列番号５８／配列番号５９）
【化２０】
2004089185.tif 000033
を用いたＰＣＲ（エンゲルケら、１９８８）から誘導された。ＰＣＲ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ（ＤＥＮヌクレオチド、メイソンら、１９８７ｂ　）およびＢａｍＨＩ（ＴＡＧ、およびＴ５ＮＴ部位とＥｃｌＸＩ部位に続く）により切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩで切断されたＩＢＩ２５中にクローニングされ、ＤＥＮ３６を産生した。ＤＥＮ３４をＥｃｏＲＶ（Ｈ６プロモーター内）およびＥ内のＨｉｎｄＩＩＩ（ＤＥＮヌクレオチド２０６１；メイソンら、１９８７ｂ　）で切断し、１７３３ｂｐ断片（−１までのＨ６プロモーターのＥｃｏＲＶ、２０ａａＣ、ｐｒＭおよびアミノ末端７７％Ｅを含有する）を単離した。ＤＥＮ３６をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｌＸＩで切断し、３１１ｂｐ断片（ＤＥＮヌクレオチド２０６２−２３９２　ＴＡＧ　Ｔ５ＮＴ　ＥｃｌＸＩ　粘着末端を含有する）を単離した。１７３３ｂｐ断片および３３１ｂｐ断片をＥｃｏＲＶ／ＥｃｌＸＩで切断したｐＴ１５（グオら、１９８９）に連結し、プラスミドＤＥＮ３８を産生した。プラスミドＤＥＮ３８は、ワクシニア感染細胞中にトランスフェクションしてＤＥＮ２０ａａＣ、ｐｒＭおよびＥをコードする組換え体を産生できる。実施例１４−ＪＥＶタンパク質を発現するＡＬＶＡＣ組換え体の構成
この実施例は、ＪＥＶ１５ａａＣ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａをコードするカナリアポックス組換え体ｖＣＰ１０７および１５ａａＣ、ｐｒＭ、Ｅをコードするカナリアポックス供与体プラスミド（ＪＥＶＣＰ５）の発達を記載する。
【０１８５】
細胞とウイルス
親カナリアポックスウイルス（レントシュラー鎖）は、カナリアのワクチン鎖である。そのワクチン鎖は、野生種単離体から得られ、鶏胚繊維芽細胞上の２００　以上の血清の通路により弱毒化された。マスターウイルスたねには、かんてんの４つの連続プラーク精製を行ない、株ウイルスが生体外組換え試験における親ウイルスとして用いられた後のさらに５つの通過により１つのプラーククローンを増幅した。プラーク精製カナリアポックス単離体は、ＡＬＶＡＣと称する。
【０１８６】
カナリアポックス感染ベクターの構成
８８０ｂｐカナリアポックスＰｖｕＩＩ断片を、ｐＵＣ９のＰｖｕＩＩ部位の間にクローニングして、ｐＲＷ７６７４．５を形成した。この断片の配列を図２２（配列番号９０）中の位置１３７２と２２５１の間に示す。Ｃ５で示した読取り枠の制限を定義した。その読取り枠は、断片内の位置１５３７で開始し、位置１８５７で終止すると定義された。Ｃ５の削除は、読取り枠の中断なく行なわれた。位置１５３８から位置１８３６までの塩基は、配列ＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＧＣＣＴＡＧＣＴＡＧＴＴＴにより置き換えられた。この置換配列は、ワクシニアウイルスＲＮＡポリメラーゼにより認識される翻訳停止および転写終止シグナルが続くＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩの挿入部位を含有する（ユエンら、１９８７）。Ｃ５　ＯＲＦの削除は、下記に示すように行なった（図２３）。プラスミドｐＲＷ７６４．５はＲｓａＩにより部分的に切断され、直鎖状の産生物が単離された。ＲｓａＩ直鎖状断片はＢｇｌＩＩで再び切断され、いまＲｓａＩからＢｇｌＩＩのｐＲＷ７６４．５断片が位置１５２７から位置１８３２の削除により単離され、以下に示す合成オリゴヌクレオチドのベクターとして用いられた：
【化２１】
2004089185.tif 000034
オリゴヌクレオチドＲＷ１４５（配列番号６０）およびＲＷ１４６（配列番号６１）をアニールし、上述したｐＲＷ７６４．５ＲｓａＩベクターおよびＢｇｌＩＩベクター中に挿入した。産生したプラスミドはｐＲＷ８３１と称する。
【０１８７】
ＪＥＶ１５ａａＣ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａを含有する感染ベクターの構成
ｐＲＷ８３８の構成を下記に示す（図２３）。Ｈ６プロモーターの翻訳開始コドンと狂犬病ＧのＡＴＧを重複させるＡからＥのオリゴヌクレオチドを、ｐＲＷ７３７としてのｐＵＣ９中にクローニングした。ＡからＥのオリゴヌクレオチドは、ＮｒｕＩで開始し、狂犬病ＧのＨｉｎｄＩＩＩ部位を通じてＢｇｌＩＩに続くＨ６プロモーターを含有する。ＡからＥのオリゴヌクレオチドの配列を下記に示す：
【化２２】
2004089185.tif 000035
アニールしたＡからＥのオリゴヌクレオチドを以下に示す：
【化２３】
2004089185.tif 000036
ＡからＥのオリゴヌクレオチドをキナーゼ化し、アニールし、（５分間９５℃とし、次いで室温まで冷却する）ｐＵＣ９のＰｖｕＩＩ部位の間に挿入した。産生したプラスミドｐＲＷ７３７を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩＩで切断し、ｐｔｇ１５５ＰＲＯ（キーニーら、１９８４）の１．６ｋｂｐ　ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片のベクターとして用いてｐＲＷ７３９を産生した。ｐｔｇ１５５ＰＲＯ　ＨｉｎｄＩＩＩ部位は、狂犬病Ｇ翻訳開始コドンの８６ｂｐ下流にある。ＢｇｌＩＩは、ｐｔｇ１５５ＰＲＯ中の狂犬病Ｇ翻訳停止コドンの下流にある。ｐＲＷ７３９をＮｒｕＩで部分的に切断し、ＢｇｌＩＩで完全に切断し、前述したＨ６プロモーター（テイラーら、１９８８ａ　；グオら、１９８９；パーカスら、１９８８９　）の３′末端を含有する１．７ｋｂｐ　ＮｒｕＩ−ＢｇｌＩＩ断片をｐＲＷ８２４のＮｒｕＩとＢａｍＨＩとの間に挿入した。産生したプラスミドはｐＲＷ８３２と称する。ｐＲＷ８２４への挿入はＮｒｕＩのＨ６プロモーター５′を加えた。ＳｍａＩが続くＢａｍＨＩのｐＲＷ８２４配列は、ＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧである。ｐＲＷ８２４は、正確にワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結した非関連遺伝子を含有するプラスミドである。ＮｒｕＩおよびＢａｍＨＩによる切断は、この非関連遺伝子を完全に削除した。Ｈ６促進狂犬病Ｇを含有する１．８ｋｂｐ　ｐＲＷ８３２　ＳｍａＩ断片を、ｐＲＷ８３１のＳｍａＩ中に挿入し、プラスミドｐＲＷ８３８を形成した。
【０１８８】
ｐＲＷ８３８を狂犬病糖タンパク質遺伝子の３′において、Ｈ６プロモーター内でＥｃｏＲＶにより切断したＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片で満たされたＥｃｏＲＩで切断し、アルカリ性ホスファターゼで処理し、Ｈ６プロモーターの５′１０３ｂｐ、複製のプラスミド起点およびＣ５側端アームを含有する３２０２ｂｐ断片を単離した。ワクシニアウイルス供与体プラスミド中の１５アミノ酸Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２ＡをコードするＪＥＶ　ｃＤＮＡを含有するプラスミドＪＥＶＬ１４ＶＣ（図１）（ヌクレオチド３３７−４１２５、図１７ＡおよびＢ）（配列番号５２）を、Ｈ６プロモーター中のＥｃｏＲＶおよびＪＥＶ配列中のＳａｃＩ（ヌクレオチド２１２４）で切断し、１８０９ｂｐ断片を単離した。ＪＥＶＬ１４ＶＣをＴ５ＡＴに続くＥａｇＩ部位でのＥｃｌＸＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片で満たし、ＪＥＶ配列中のＳａｃＩ（ヌクレオチド２１２４）で切断して２０１１ｂｐ断片を産生した。１８０９ｂｐＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩ、２０１１ｂｐ　ＳａｃＩ充填ＥｃｌａＸＩおよび３２０２ｂｐ　ＥｃｐＲＶ充填ＥｃｏＲＩ断片を連結し、ＪＥＶＣＰ１を産生した。ＪＥＶＣＰ１をＡＬＶＡＣ感染初代ＣＥＦ細胞中にトランスフェクションし、１５アミノ酸Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａをコードするカナリアポックス組換え体ｖＣＰ１０７を産生した（図１８）。ＪＥＶ１５ａａｃ、ｐｒＭ、Ｅを含有するＣ５挿入ベクターの構成
Ｃ５の上流の１５３５ｂｐ、ＫｐｎＩ／ＳｍａＩ／ＸｂａＩおよびＮｏｔＩ部位を含有するポリリンカーおよびカナリアポックスＤＮＡの４０４ｂｐ（Ｃ５コード配列の３１組の塩基および下流配列の４７３ｂｐ）を含有するＣ５挿入ベクターは以下のようにして誘導した。カナリアポックスＤＮＡの遺伝子ライブラリーは、ｐＲＷ７６４．５でプローブしたコスミッドベクターｐｕＫ１０２（ノーフら、１９８２）中で構成し、２８ｋｂ挿入部を含有するクローン（ｐＨＣＯＳ１）が同定された。Ｃ５領域を含有するｐＨＣＯＳ１からの３．３ｋｂ　ＣｌａＩ断片が同定された。ＣｌａＩ断片の配列分析は、ヌクレオチド１−１３７２らか図２２中の配列（配列番号９０）を広げるのに用いられた。
【０１８９】
新たなＣ５挿入ベクターを２段階で構成した。ヌクレオチドＣ５Ａ（配列番号６７）（５′−ＡＴＣＡＴＣＧＡＡＴＴＣＴＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＴＧＴＴＡＴＡＣＴＴＴＧ−３′）とＣ５Ｂ（配列番号６８）（５′−ＧＧＧＧＧＴＡＣＣＴＴＴＧＡＧＡＧＴＡＣＣＡＣＴＴＣＡＧ−３′）、およびテンプレートとしての精製遺伝子カナリアポックスＤＮＡを用いたＰＣＲ増幅（エンゲルケら、１９８８）により１５３５ｂｐ上流配列を産生した。この断片をＥｃｏＲＩ（オリゴＣ５Ａ内）で切断し、ＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩで切断したｐＵＣ８中にクローニングし、Ｃ５ＬＡＢを産生した。オリゴヌクレオチドＣ５Ｃ（配列番号６９）（５′−ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＡＡＡＧＡＴＣＴＡＡＡＡＴＧＣＡＴＡＡＴＴＴＣ−３′）とＣ５ＤＡ（配列番号７０）（５′−ＡＴＣＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴＡＴＴＣＴＡＡＡＣＴＡＧＧＡＡＴＡＧＡＴＧ−３′）を用いたＰＣＲ増幅により４０４ｂｐアームを産生した。この断片をＰｓｔＩ（オリゴＣ５ＤＡ内）で切断し、ＳｍａＩ／ＰｓｔＩで切断したＣ５ＬＡＢ中にクローニングし、ｐＣ５Ｌを産生した。
【０１９０】
ｐＣ５Ｌを、ポリリンカー内のＡｓｐ７１８およびＮｏｔＩで切断し、アルカリ性ホスファターゼで処理し、キナーゼ化しアニールしたオリゴヌクレオチドＣＰ２６（配列番号７１）およびＣＰ２７（配列番号７２）（不能Ａａｐ７１８部位、６つの読取り枠中の翻訳停止コドン、ワクシニア早期転写終止シグナル（ユエンおよびモス、１９８７）、ＢａｍＨＩ　ＫｐｎＩ　ＸｈｏＩ　ＸｂａＩ　ＣｌａＩおよびＳｍａＩ制限部位、ワクシニア早期転写終止シグナル、６つの読取り枠中の翻訳停止コドン、および不能ＮｏｔＩ部位を含有する）と連結し、プラスミドＣ５ＬＳＰを産生した。早期／晩期Ｈ６ワクシニアウイルスプロモーター（グオら、１９８９；パーカスら、１９８９）は、テンプレートとしてのｐＲＷ８２４およびオリゴヌクレオチドＣＰ３０（配列番号７３）（５′−ＴＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧＧＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＡＧＧＣＡＧＧＧＣＧ−３′）とＣＰ３１（配列番号７２）（５′−ＴＡＧＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣＣＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＣＧＧＡＴＡＴＣＧ−３′）を用いたＰＣＲ増幅（エンゲルケら、１９８８）により誘導した。ＰＣＲ産生物を、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ（それぞれＣＰ３０（配列番号７５）およびＣＰ３１（配列番号７４）の５′末端に存在する部位）で切断し、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩで切断したＣ５ＬＳＰと連結させ、ＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰを産生した。ＣＰ２６（配列番号７１）およびＣＰ２７（配列番号７２）を以下に示す：
【化２４】
2004089185.tif 000037
プラスミドＪＥＶ３６をＨ６プロモーター内のＥｃｏＲＶおよびＪＥＶ配列内のＳｐｈＩ（ヌクレオチド２３８０）で切断し、２０６５ｂｐ断片を単離した。プラスミドＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰをＨ６プロモーター内のＥｃｏＲＶおよびポリリンカー内のＸｂａＩで切断し、２０６５ｂｐ断片およびアニールしたオリゴヌクレオチドＳＰ１３１（配列番号７５）およびＳＰ１３２（配列番号７６）（ＳｐｈＩ粘着末端、Ｅコード領域を完了するＴヌクレオチド、翻訳停止、ワクシニア早期転写終止シグナル（ＡＴ５ＡＴ；ヤエンおよびモス、１９８７）、第２の翻訳停止、およびＸｂａＩ粘着末端）に連結し、Ｃ５側アームの間のＨ６プロモーターの制御下で１５アミノ酸Ｃ、ｐｒＭおよびＥをコードするプラスミドＪＥＶＣＰ５を産生した。ＪＥＶＣＰ５はＡＬＶＡＣまたはＡＬＶＡＣ組換え体感染細胞中にトランスフェクションしてＪＥＶ１５ａａＣ、ｐｒＭおよびＥをコードする組換え体を産生できる：
【化２５】
2004089185.tif 000038
【０１９１】
実施例１５−ＹＦＶタンパク質を発現するＡＬＶＡＣ組換え体の構成
カナリアポックス挿入ベクターの構成
８．５ｋｂカナリアポックスＢｇｌＩＩ断片を、ｐＢＳ−ＳＫプラスミドベクターのＢａｍＨＩ部位中にクローニングし、ｐＷＷ５を形成した。ヌクレオチド配列分析により、Ｃ３で示された読取り枠は図２４Ａ−Ｃの配列（配列番号８３）中の位置１４５８で開始し、位置２８９７で終止することが分かった。異種の遺伝子をＣ３読取り枠を完全に削除したＣ３座中に挿入するための供与体プラスミドを構成するために、ＰＣＲプライマーを用いてＣ３に関連する５′および３′配列を増幅した。５′配列のためのプライマーは、ＲＧ２７７（配列番号７７）（５′−ＣＡＧＴＴＧＧＴＡＣＣＡＣＴＧＧＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＣＡＧ−３′）およびＲＧ２７８（配列番号７８）（５′−ＴＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＧＴＴＴＴＴＡＴＡＧＣＴＡＡＴＴＡＧＴＣＡＡＡＴＧＴＧＡＧＴＴＡＡＴＡＴＴＡＧ−３′）であった。３′配列のためのプライマーは、ＲＧ２７９（配列番号７９）（５′ＴＣＧＣＴＧＡＡＴＴＣＧＡＴＡＴＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＧＡＴＴＴＴＴＡＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＡＴＣＡＡＡＴＡＡＡＡＡＧＣＡＴＡＣＡＡＧＣ−３′）およびＲＧ２８０（配列番号８０）（５′−ＴＴＡＴＣＧＡＧＣＴＣＴＧＴＡＡＣＡＴＣＡＧＴＡＴＣＴＡＡＣ−３′）であった。プライマーは、ワクシニア転写および翻訳終止シグナルが側端に付いた多重クローニング部位を含有するように設計された。また、左アームおよび右アームの５′末端と３′末端には、２つのアームをＡｓｐ７１８／ＳａｃＩで切断したｐＢＳ−ＳＫプラスミドベクター中に連結できる適切な制限部位（左アームにはＡｓｐ７１８とＥｃｏＲＩ、右アームにはＥｃｏＲＩとＳａｃＩ）が含まれた。産生したプラスミドはｐＣ３Ｉと称した。
【０１９２】
Ｃ３座の直ぐ上流のカナリアポックスＤＮＡの９０８ｂｐ断片（ヌクレオチド５３７−１４４４、図２４Ａ−Ｃ（配列番号８３））は、プラスミドｐＷＷ５のＮｓｉＩおよびＳｓｐＩでの切断により得られた。カナリアポックスＤＮＡの６０４ｂｐ断片（ヌクレオチド１−６０４、図２４Ａ−Ｃ（配列番号８３））は、テンプレートとしてのプラスミドｐＷＷ５およびオリゴヌクレオチドＣＰ１６（配列番号８１）（５′−ＴＣＣＧＧＴＡＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＣＴＴＣＴＧＣ−３′）とＣＰ１７（配列番号８２）（５′−ＴＣＧＣＴＣＧＡＧＴＡＧＧＡＴＡＣＣＴＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＡＣＧ−３′）を用いたＰＣＲ（エンゲルケら、１９８８）により誘導された。６０４ｂｐ断片は、Ａｓｐ７１８およびＸｈｏＩ（それぞれオリゴヌクレオチドＣＰ１７およびＣＰ１７の５′末端に存在する部位）で切断し、Ａｓｐ７１８／ＸｈｏＩで切断してアルカリ性ホスファターゼで処理したＩＢＩ２５（インターナショナルバイオテクノロジー社、ニューハブン、ＣＴ）中にクローニングし、プラスミドＳＰＣ３ＬＡを産生した。ＳＰＣ３ＬＡを、ＩＢＩ２５内のＥｃｏＲＶおよびカナリアポックスＤＮＡ内のＮｓｉＩで切断し（ヌクレオチド５３６、図２４Ａ−Ｃ（配列番号８３））、９０８ｂｐＮｓｉＩ−ＳｓｐＩ断片に連結し、Ｃ３座の上流のカナリアポックスＤＮＡの１４４４ｂｐを含有するＳＰＣＰＬＡＸを産生した。
【０１９３】
カナリアポックスＤＮＡの２１７８ｂｐＢｇｌＩＩ−ＳｔｙＩ断片（ヌクレオチド３０３５−５２１２、図２４Ａ−Ｃ（配列番号８３））をｐＢＳ−ＳＫのＰｓｔＩ部位中にクローニングされたカナリアポックスＤＮＡの６．５ｋｂ　ＮｓｉＩ断片を含有するプラスミドｐＸＸ４から単離した。カナリアポックスＤＮＡの２７９ｂｐ断片（ヌクレオチド５１９４−５４７２、図２４Ａ−Ｃ（配列番号８３））を、テンプレートとしてのプラスミドｐＸＸ４およびオリゴヌクレオチドＣＰ１９（配列番号８４）（５′−ＴＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＡＣＡＡＴＡＡＣＡＴＡＧ−３′）とＣＰ２０（配列番号８５）（５′−ＴＡＧＧＡＧＣＴＣＴＴＴＡＴＡＣＴＡＣＴＧＧＧＴＴＡＣＡＡＣ−３′）を用いたＰＣＲ（エンゲルケら、１９８８）により単離した。２７９ｂｐ断片をＸｈｏＩおよびＳａｃＩ（それぞれオリゴヌクレオチドＣＰ１９およびＣＰ２０の５′末端に存在する部位）で切断し、ＳａｃＩ−ＸｈｏＩで切断してアルカリ性ホスファターゼで処理したＩＢＩ２５中にクローニングし、プラスミドＳＰＣ３ＲＡを産生した。
【０１９４】
ポリリンカーに追加の独特な部位を加えるために、ｐＸ３Ｉをポリリンカー領域内のＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩで切断し、アルカリ性ホスファターゼで処理し、キナーゼ化してアニールしたオリゴヌクレオチドＣＰ１２（配列番号８６）とＣＰ１３（配列番号８７）（ＥｃｏＲＩ粘着末端、ＸｈｏＩ部位、ＢａｍＨＩ部位およびＣｌａＩに適合する粘着末端を含有する）に連結して、プラスミドＳＰＣＰ３Ｓを産生した。ＳＰＣＰ３ＳをＣ３座の下流のカナリアポックス配列内のＳｔｙＩ（ヌクレオチド３０３５）およびＳａｃＩ（ｐＢＳ−ＳＫ）で切断し、ＳＰＣ３ＲＡからの２６１ｂｐ　ＢｇｌＩＩ−ＳａｃＩ断片（ヌクレオチド５２１２−５４７２、図２４Ａ−Ｃ（配列番号８３））およびｐＸＸ４からの２１７８ｂｐ　ＢｇｌＩＩ−ＳｔｙＩ断片（ヌクレオチド３０３５−５２１２、図２４Ａ−Ｃ（配列番号８３））と連結して、Ｃ３座の下流のカナリアポックスＤＮＡの２５７２ｂｐを含有するプラスミドＣＰＲＡＬを産生した。ＳＰＣＰ３ＳをＣ３座の上流のカナリアポックス配列内のＡｓｐ７１８（ｐＢＳ−ＳＫ中）およびＡｃｃＩ（ヌクレオチド１４３５）で切断し、ＳＰＣＰＬＡＸからのＡｓｐ７１８−ＡｃｃＩで切断した断片と連結し、Ｃ３座の上流のカナリアポックスＤＮＡの１４５７ｂｐを含有するプラスミドＣＰＬＡＬを産生した。ＣＰＬＡＬをＣ３座の下流のカナリアポックス配列内のＳｔｙＩ（ヌクレオチド３０３５）およびＳａｃＩ（ｐＢＳ−ＳＫ中）で切断し、ＣＰＲＡＬからの２４３８ｂｐ　ＳｔｙＩ−ＳａｃＩ断片に連結し、Ｃ３座の下流のカナリアポックス配列の１４５７ｂｐ、６つの読取り枠中の停止コドン、早期転写終止シグナル、ポリリンカー領域、早期転写終止シグナル、６つの読取り枠中の停止コドン、およびＣ３座の下流のカナリアポックス配列の２５７２ｂｐを含有するプラスミドＣＰ３Ｌを産生した。
【０１９５】
早期／晩期Ｈ６ワクシニアウイルスプロモーター（グオら、１９８９；パーカスら、１９８９）は、テンプレートとしてのｐＲＷ８３８およびオリゴヌクレオチドＣＰ２１（配列番号８８）（５′−ＴＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧＧＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＧＴＴＡＴＴＡＧＡＣＡＡＧＧＴＧ−３′）とＣＰ２２（配列番号８９）（５′−ＴＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＧＣＧＧＡＴＡＴＣＧ−３′）を用いたＰＣＲ（エンゲルケら、１９８８）により誘導した。ＰＣＲ産生物をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ（それぞれオリゴヌクレオチドＣＰ２１およびＣｐ２２の５′末端に存在する部位）で切断し、ポリリンカー内のＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断されたＣＰ３Ｌに連結し、プラスミドＶＱＨ６ＣＰ３Ｌを産生した：
【化２６】
2004089185.tif 000039
ＡＬＶＡＣ供与体プラスミドＶＱＨ６ＣＰ３Ｌをポリリンカー内のＸｈｏＩおよびＳｍａＩで切断し、ＹＦ５１（ＹＦアミノ酸Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａをコードするヌクレオチド４１９−４１８０）からの３７７２ｂｐ　ＸｈｏＩ−ＳｍａＩ断片と連結し、ＹＦ５２を産生した。ＵＰ５２中の独特のＸｈｏＩ部位に対応する６ｂｐを、オリゴヌクレオチド定方向二本鎖開裂突然変異（マンデッキ、１９８６）を用いて除去し、ＹＦＣＰ３を産生した。ＹＦＣＰ３をＡＬＶＡＣ感染初代ＣＥＦ細胞中にトランスフェクションし、２１ａａＣ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａをコードするカナリアポックス組換え体ｖＣＰ１２７を産生した（図１９）。
【０１９６】
ＹＦＶ２１ａａＣ、ｐｒＭ、Ｅを含有するＣ３挿入ベクターの構成
ＹＰ５２をＹＦ　ｃＤＮＡの３′末端のＳｍａＩおよびＡｐａＩ（ＹＦヌクレオチド１６０４）で切断して、８３４４ｂｐ断片を単離し（複製の起点、カナリアポックスＤＮＡおよび２１アミノ酸Ｃ、ｐｒＭ、並びにアミノ末端５７％ＥをコードするＹＦ　ｃＤＮＡを含有する）、ＹＦ１６からのＡｐａＩからＳｍａＩ断片（カルボキシ末端４３％Ｅを含有するヌクレオチド１６０４−２４５２）に連結し、ＹＦ５４を産生した。ＹＦ５４中の独特のＸｈｏＩ部位に対応する６ｂｐを上述したように除去し、２１アミノ酸Ｃ、ｐｒＭ、およびＥをコードするＹＦ　ｃＤＮＡを含有するＹＦＣＰ４を産生した。ＹＦＣＰ４は、ＡＬＶＡＣまたはＡＬＶＡＣ組換え体感染細胞中にトランスフェクションしてＹＦＶ２１ａａＣ、ｐｒＭ、Ｅをコードする組換え体を産生できる。
【０１９７】
【参考文献】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、供与体プラスミドｐＳＰＪＥＶＳＨ１２ＶＣおよびｐＳＰＪＥＶＬ１４ＶＣを構成する方法を示す模式図である。
【図２】図２は、供与体プラスミドｐＳＰＪＥＶ１１ＶＣおよびｐＳＰＪＥＶ１０ＶＣを構成する方法を示す模式図である。
【図３】図３は、供与体プラスミドを構成するために用いられるオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列を示す。
【図４】図４は、４つの組換えワクシニアウイルスに挿入されたＪＥＶコード領域の地図である。
【図５】図５は、細胞溶解産物ＮＳ１タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による比較を示す。
【図６】図６は、培養液ＮＳ１タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による比較を示す。
【図７】図７は、細胞溶解産物Ｅタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による比較を示す。
【図８】図８は、培養液Ｅタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による比較を示す。
【図９】図９は、培養液中に発見されたＥタンパク質の形状のショ糖勾配分析による比較を示す。
【図１０】図１０は、ワクチン接種した動物からの攻撃接種前の血清のＪＥＶ特有反応性のイムノプレシピテーション分析による比較を示す。
【図１１】図１１は、プラスミドｐＳＤ４６０の構成方法および組換えワクシニアウイルスｖＰ４１０の産生方法を示す模式図。
【図１２】図１２は、プラスミドｐＳＤ４８６の構成方法および組換えワクシニアウイルスｖＰ５５３の産生方法を示す模式図。
【図１３】図１３は、プラスミドｐＭＰ４９４Δの構成方法および組換えワクシニアウイルスｖＰ６１９の産生方法を示す模式図。
【図１４】図１４は、プラスミドｐＳＤ４６７の構成方法および組換えワクシニアウイルスｖＰ７２３の産生方法を示す模式図。
【図１５】図１５は、プラスミドｐＭＰＣＳＫ１Δの構成方法および組換えワクシニアウイルスｖＰ８０４の産生方法を示す模式図。
【図１６】図１６は、プラスミドｐＳＤ５４８の構成方法および組換えワクシニアウイルスｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）の産生方法を示す模式図。
【図１７Ａ】図１７Ａは、ＣからＮＳ２Ｂをコードする領域のＪＥＶのナカヤマ鎖のＤＮＡ配列を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは図１７Ａの続きである。
【図１８】図１８は、ワクシニアウイルスおよびカナリア痘ウイルス中に挿入されたＪＥＶコード領域の地図である。
【図１９】図１９は、ワクシニアウイルスおよびカナリア痘ウイルス中に挿入されたＹＦコード領域の地図である。
【図２０】図２０は、ＤＥＮ種類１の大西洋鎖のＤＮＡ配列の部分を示す。
【図２１】図２１は、ワクシニアウイルスに挿入されたＤＥＮコード領域の地図である。
【図２２】図２２は、Ｃ５　ＯＲＦを含むカナリア痘ＰｖｕＩＩ断片のＤＮＡ配列を示す。
【図２３Ａ】図２３Ａは、Ｃ５を削除するためのプラスミドｐＲＷ８４８を構成する模式図である。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは図２３Ａの続きである。
【図２４Ａ】図２４Ａは、Ｃ３　ＯＲＦを含むカナリア痘の７３５１基本対断片のＤＮＡ配列を示す。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは図２４Ａの続きである。
【図２４Ｃ】図２４Ｃは図２４Ｂの続きである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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