(57)【要約】【課題】培養の過程に応じてマイクロチャンバーの形状を任意に変化させることのできるマイクロチャンバーを提供する。【解決手段】特定の波長に対して透明なガラス基板１０１上に、前記特定の波長に対して吸収を持つ領域１０２と、その吸収領域の他に、前記特定の波長に対して吸収を持たず、かつ、常温では固体で加熱によって溶解する物質の領域１０３を積層し、特定の波長の集束光４０２をこの波長に対して吸収を持たず、かつ、加熱によって溶解する吸収領域に照射し、集束光近傍のみで局所的に発熱させ、その熱によって吸収領域に接して存在する溶解物質の領域１０３を局所的に溶解させ、集束光の移動に伴って空間４０３を形成する。【選択図】　　　図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の波長に対して吸収を持たない基板上に、前記特定の波長に対する吸収を持つ吸収層と、前記特定の波長に対して吸収を持たず、かつ、水の沸点より低い温度に融点を持つ固体物質によって形成された領域とが配設されていることを特徴とする細胞培養マイクロチャンバー。
【請求項２】
吸収層は、基板表面に配置した薄膜であって、その上には前記の水の沸点より低い温度の融点を持つ物質によって形成された領域が配設されていることを特徴とする請求項１の細胞培養マイクロチャンバー。
【請求項３】
吸収層としての薄膜は、可視光について透過率５０％以上となる厚さであることを特徴とする請求項２の細胞培養マイクロチャンバー。
【請求項４】
吸収層は、基板表面に配置した薄膜パターンであって、その線幅は前記特定の波長より細いことを特徴とする請求項１ないし３のいずれかの細胞培養マイクロチャンバー。
【請求項５】
吸収層は、前記特定の波長に対する吸収を持つ微粒子であって、これらが前記水の沸点より低い温度に融点を持つ物質中に配置されていることを特徴とする請求項１の細胞培養マイクロチャンバー。
【請求項６】
水の沸点より低い温度に融点を持つ固体物質は、その融点が４５度以下の物質であることを特徴とする請求項１の細胞培養マイクロチャンバー。
【請求項７】
水の沸点より低い温度に融点を持つ固体物質は、アガロースであることを特徴とする請求項１の細胞培養マイクロチャンバー。
【請求項８】
水の沸点より低い温度に融点を持つ固体物質として２つ以上の異なる融点の物質が組み合わせて配置されていることを特徴とする請求項１の細胞培養マイクロチャンバー。
【請求項９】
特定の波長は、水の吸収の無い波長であることを特徴とする請求項１の細胞培養マイクロチャンバー。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれかの細胞培養マイクロチャンバーを備えた細胞培養装置であって、前記特定の波長に対して吸収を持たず、かつ、水の沸点より低い温度の融点を持つ固体物質によって形成された領域を加熱溶解して空間を形成することのできる前記特定の波長の光照射の手段を有していることを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１１】
光照射の手段は集束光を照射するものであることを特徴とする請求項１０の細胞培養装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する分野】
この出願の発明は、細胞の状態を顕微鏡観察しながら、１細胞単位で培養することのできる、新しい細胞培養マイクロチャンバーに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、細胞の状態の変化や、細胞の薬物等に対する応答を観察するのに、細胞集団の値の平均値をあたかも一細胞の特性であるかの様に観察してきた。しかし、実際には細胞は集団の中で細胞周期が同調しているものはまれであり、各々の細胞が異なった周期でタンパク質を発現している。これらの問題を解決するべく、同調培養等の手法が開発されているが、培養された細胞の由来が全く同一の一細胞からではないことから、培養前の由来細胞各々の遺伝子の違いがタンパク質発現の違いを生み出す可能性があり、実際に刺激に対する応答の結果を解析するときに、そのゆらぎが細胞の反応機構自体が普遍的に持つ応答のゆらぎに由来するものなのか、細胞の違い（すなわち遺伝情報の違い）に由来するゆらぎなのか明らかにすることは難しかった。また、同様の理由から、細胞株についても、一般には完全に一細胞から培養したものではないため、刺激に対する応答の再現性が細胞各々の遺伝子の違いによってゆらぐものか明らかにするのは難しかった。さらにまた、細胞に対する刺激（シグナル）は、細胞周辺の溶液に含まれるシグナル物質、栄養、溶存気体の量によって与えられるものと、他の細胞との物理的接触によるものの２種類があることからも、ゆらぎについての判断が難しいのが実情であった。
【０００３】
一方、従来より、バイオテクノロジーの研究分野において細胞の観察を行う場合には、大型培養器にて培養された細胞群の一部を一時的に培養器から取り出して顕微鏡にセットし、観察を行うか、あるいは、顕微鏡全体をプラスチックの容器で囲い温度を管理し、その中に小さい別の容器を用い二酸化炭素濃度、及び湿度を管理しつつ、顕微鏡観察を行っていた。このとき、細胞を培養しながら、古くなった培養液と新鮮な培養液を交換することで溶液条件を一定にすることが工夫されてきている。たとえば特開平１０−１９１９６１に開示されている方法では、循環ポンプが、基材表面に対する培地のレベルを基材の上端縁高さより高いレベルと下端縁高さより低いレベルとの間で上げ・下げ操作し、上記低レベルに下がると培地を供給し、上記高レベルに上がると培地を排出する機構によって栄養状態を一定に保っている。また、特許公開平８−１７２９５６では、培養容器内に、新たな培地を培養容器に導入する導入管と、培養容器の培地を外部に排出する排出管と、培養容器の気体部分とポンプとを連通する気管の各一端を挿入し、前記導入管、排出管及び気管の夫々の管路に培養容内への菌の侵入を阻止するフィルターを設けており、培養槽の栄養状態を一定に保つ構成になっている。しかし、いずれの発明の場合も、培養細胞の溶液環境と、細胞間の物理的接触を制御しながら培養する例は知られていない。
【０００４】
そこで、この出願の発明者らは、これらの問題点を解決し、新たに特定の一細胞のみを選択し、その一細胞を細胞株として培養する技術、および細胞を観察する場合に、細胞の溶液環境条件を制御し、かつ、容器中での細胞濃度を一定に制御する技術、あるいは相互作用する細胞を特定しながら培養観察する技術を発明し特願２０００−３５６８２７として特許出願した。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、発明者らによって新たに提案されたマイクロチャンバーは、それまでに知られていない構成の特徴のあるものであったが、ガラス微細加工技術等を用いてマイクロチャンバー形状を形成させるため、予め培養を開始する前にガラス表面に形状を作成し、その形状を利用して細胞を培養することができるものであった。そのため、各マイクロチャンバー間の相互作用を決める各マイクロチャンバー間を繋ぐ流路のパターンは培養後の状態に応じて柔軟に変化させることは難しかった。また、培養の経過に応じて各マイクロチャンバ自体の形状を変化させてゆくことも難しかった。
【０００６】
また、集束光等の熱を利用することで加熱、変形させる技術は、赤外光の波長より小さな三次元的局所領域での加熱が不可能であった。
【０００７】
そこで、この出願の発明は、発明者らによって開発された上記のマイクロチャンバーについてのさらなる詳細な検討を踏まえ、培養の過程に応じてマイクロチャンバーの形状を任意に変化させることのできる新しいマイクロチャンバーを提供することを課題とし、さらには、ナノレベルの微細な領域を局所的に加熱することのできる、新しい細胞培養マイクロチャンバーを提供することを課題としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、特定の波長に対して透明な基板上に、前記特定の波長に対して吸収を持つ領域と、その吸収領域の他に、前記特定の波長に対して吸収を持たず、かつ、水の沸点より低い温度の融点を持つ固体、たとえば常温では固体で加熱によって溶解する物質の領域によって構成される細胞培養マイクロチャンバーを提供し、また、このマイクロチャンバーを備えるとともに前記特定の波長の光照射の手段を有する細胞培養装置を提供する。
【０００９】
たとえば、具体的には、この出願の発明の細胞培養装置では、上記特定の波長の集束光を上記細胞培養マイクロチャンバーの特定の領域に照射する手段を有する。ここで、前記特定の波長に対して吸収を持たず、かつ、固体の物質領域は、前記特定の波長の集束光が照射されることで吸収領域では局所的に発熱し、その熱によって吸収領域に接して存在する固体物質の領域が局所的に溶解して分散し、集束光の移動に伴って空間を形成する。
【００１０】
また、ナノレベルの微細な領域を局所的に加熱する手段を提供するためには、前記吸収を持つ吸収領域のパターンを微細描画によってナノレベルの微細な形状に形成し、このパターンに集束光を照射することで、薄膜層の線幅程度に限定された照射光の波長より小さな微小領域を局所的に加熱することができる。
【００１１】
さらに前記細胞培養マイクロチャンバー上面にはチャンバー内から細胞が出ないようにその上面を被覆する細胞が通過できない程度の目の粗い前記集束光に対して光学的に透明な半透膜と、その上面は培養液が循環する溶液交換部液交換を可能とする手段を有するものとすることもできる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。
【００１３】
まず、この出願の発明の細胞培養マイクロチャンバーの基本構成の一例を図１の実施例を用いて説明する。たとえば図１に例示したように、この出願の発明の細胞培養マイクロチャンバー１００では、スライドガラス等の光学的に透明な基板１０１上に、クロムの蒸着層などの光学吸収を持つ吸収層としての薄膜層１０２が配置されている。透過光で観察をする場合には、薄膜層１０２の膜厚は、光を完全に吸収しない程度で、かつ、むらの無い程度の薄いものであることが望ましい。たとえば、クロムの場合には、膜厚５０Åで可視領域の透過光７０％程度である。次に、吸光薄膜層１０２の上に、アガロース等の光学的に透明で、かつ、低融点温度で、細胞等に対して毒性を持たない物質の領域１０３が積層されている。この領域１０３の物質は、この出願の発明において規定するところの、特定の波長に対して吸収を持たず、かつ、水の沸点より低い温度の融点を持つ固体物質である。アガロースはその代表例であるが、一般的にはその融点が４５℃以下のものが望ましい。特にアガロースを用いた場合には、細胞との接着性も無く、また、細胞に対してのシグナル物質でもないことから細胞にとっては無害なだけでなく、培養実験データへの影響が小さく最適であると考えられる。前記領域１０３においては、細胞１０４等の試料を導入する複数の穴１０５が、領域１０３を形成するときに鋳型によって形成されており、各穴１０５には、各々特定の細胞１０４が培養されている。このとき、たとえばクロムの蒸着層等の吸光薄膜層１０２表面にシラン化処理を施し、その上にコラーゲン等の細胞吸着性の因子を塗布固定して、上記細胞１０４が穴１０５の底面に安定して接着できるように加工を加えてもよい。また、この実施例のように領域１０３の上面にセルロース等の光学的に透明な半透膜１０９でカバーをすることで、外部からの微生物等のコンタミネーションを防ぎ、かつ、細胞が穴１０５から逃げるのを防ぐことも可能である。このとき、たとえば領域１０３がアガロース、半透膜１０９がセルロースであるとき、共に糖鎖の一部を開環させて、−ＣＨＯ残基にアミノ末端を持つアビジン、ビオチンをそれぞれ修飾し、アビジン−ビオチン結合を通して、半透膜１０９と領域１０３を結合させてもよい。細胞１０４を培養するとき、培養液の循環が必要な場合には、領域１０３をすべて覆う形状の光学的に透明な容器１０６を被せて、管１０７から溶液を導入し、管１０８から廃液を回収すればよい。
【００１４】
図２は、領域１０３、すなわち、アガロース等の光学的に透明で、かつ、低融点温度を有し、細胞等に対して毒性を持たない物質の領域に形成した穴１０５の配置の一例を示したものである。図からもわかるように、複数の穴１０５が領域１０３上に配置されており、ここに細胞を導入して培養することができる。
【００１５】
図３は、細胞培養マイクロチャンバー１００の、前記の領域１０３の形状を加工するための集束光を導入するための装置の構成の一例を示したものである。この装置では、細胞等の試料を細胞培養マイクロチャンバ１００で培養しながらその状態変化を観察するために、顕微鏡観察系、培養液循環系を備え、そして細胞培養マイクロチャンバ１００の形状を培養途中に加工変形させるために集束光照射系を有している。図３からもわかるように顕微観察光学系の光路上に培養マイクロチャンバ１００を配置しており、この培養マイクロチャンバ１００に溶液を供給する培養液供給・廃棄部がつながっている。すなわちまず、顕微観察光学系は、以下のような構成になっている。光源３０１から照射された光は、フィルター３０２で特定の波長に調整され、コンデンサレンズ３０３によって集光されて、培養マイクロチャンバ１００に照射される。照射された光は、透過光として対物レンズ３０５での観察に用いられる。培養マイクロチャンバ１００内部の透過光像は、ミラー３１１によってフィルタ３１２通過後、カメラ３１３に誘導され、カメラの受光面に結像する。従って、培養チャンバ１００の素材は、フィルタ３０２で選択された波長の光に対して、光学的に透明な素材であることが望ましい。具体的には、ホウケイ酸ガラス、石英ガラス等のガラスや、ポリスチレン等の樹脂やプラスチック、あるいはシリコン基板等の固体基板および、アガロース等の高分子を用いる。また特にシリコン基板を用いる場合は波長９００ｎｍ以上の波長の光を観測に用いることが考慮される。また、上記吸光層１０２のところで述べたように、光の吸収が１００％未満となるような膜厚あるいは吸収を持たない波長を選択的に用いることが望ましい。
【００１６】
また、光源３０８から照射された光も、フィルター３０９で波長選択された後に、ダイクロイック・ミラー３１０によって対物レンズ３０５に誘導され、培養マイクロチャンバー１００内部の蛍光観察の励起光として用いられる。培養マイクロチャンバー１００から発した蛍光は再度対物レンズ３０５によって集光され、フィルター３１２によって励起光をカットした後の蛍光と透過光のみをカメラ３１３で観察することができる。このとき、フィルター３０２、３０９、３１２の組み合わせを調整することで、透過光のみをカメラ３１３で観察したり、あるいは蛍光のみを観察したり、透過光像と蛍光像を同時に観察することもできる。
【００１７】
光路内には、レーザー光源３０７で発生させたレーザー光を可動ダイクロイック・ミラー３０６によって対物レンズ３０５に導入する機構も備わっている。このレーザーは対物レンズ３０５によって集束光となり、培養マイクロチャンバー１００を局所的に加熱することができる。集光点を移動させる場合には、可動ダイクロイック・ミラーを移動させることで、培養マイクロチャンバー１００内でのレーザーの集束位置を動かすことが可能である。このレーザーの波長としては、水の吸収を持たず、光化学作用を持たない波長が望ましい。たとえばＮｄ：ＹＡＧレーザーの１０６４ｎｍなどでは、水、ガラス、アガロース等に対して顕著な吸収はなく、選択的にクロム薄膜層のみでレーザー光吸収が起こり、光が吸収されたクロム薄膜層の光集束点近傍のみで局所的に発熱する。この加熱によって、図４に沿って後段で詳しく説明するとおり、細胞培養マイクロチャンバー１００の形状を培養途中において加工変形させることが可能とされる。
【００１８】
また、カメラで得られた画像データは画像処理解析装置３１４によって解析され、さまざまな解析結果を基に可動ダイクロイック・ミラー３０６や、培養マイクロチャンバー１００が載っている温調機能付可動ＸＹステージ３０４の位置を制御するためにＸ−Ｙ　方向に自在に移動させるステージ移動用モーター３１５を駆動することができる。これによって細胞の形状を認識したり、認識後にその細胞を追跡し、つねに画像の中心に位置させたり、対物レンズとの距離を調節することで画像のピントを特定の細胞に合わせたりすることが可能とされる。あるいは、一定時間の周期で可動ダイクロイック・ミラー３０６や、培養マミクロチャンバ１００が載っている温調機能付ステージ３０４を制御したり、一定間隔でステージ移動用モーター３１５を駆動することができる。
【００１９】
次に、培養液供給・廃棄部を説明する。培養マイクロチャンバー１００に複数の種類の種類、濃度の異なる培養液を培養液槽３１６から供給する機能を有する供給装置３１７によって供給された培養液は、供給装置内の温度調節機構によって液温を調節され、さらに溶存空気交換機構によって溶存気体の成分が調整され、流速を調節されながら培養マイクロチャンバー１００に供給される。容器１００の培養液はまたポンプ３１８を用いて容器内部の溶液を吸引することができる。吸引した溶液は廃液溜３１９に送られる。
【００２０】
つぎに、図４を用いて、実際にレーザー集束光によって領域１０３の形状が変化する過程を説明する。対物レンズ３０５によって培養マイクロチャンバー１００に照射されたレーザー集束光４０２は、選択的に吸光層１０２で吸収され、照射位置近傍で局所的に熱を発生する。このとき、その他の領域１０１、１０３ではレーザー集束光による吸収は無いため、直接の吸収による発熱は無いが、集光点での吸熱層１０２の局所発熱によって、近傍の領域１０３が局所的に溶解し、溶解した成分は培養液の水溶液中に拡散する。この状態で、集束光の位置を矢印４０１の方向に移動させると、領域１０３は選択的に吸光層１０２の近傍で溶解し、トンネル４０３を形成する。このとき、トンネルの径の大きさは、照射するレーザーの径、強度、移動速度に依存して変化させることができる。
【００２１】
図５は、培養マイクロチャンバーの別の基本構成の１つを示した実施例である。この実施例では図１　の実施例で構成物が１つであった領域１０３を、融点の異なる２つの領域５０１と５０２からなるものとしている。これによって、たとえば、領域５０１の融点が領域５０２より低いものを用いた場合、集束光の加熱強度を適当に調節することによって領域５０１のみを選択的に排除することができる。また集束光強度を上げることによって、領域５０１、５０２をともに溶解することも可能である。この実施例では、異なる融点の領域を２相に積層しているが、さらに３層以上の異なる融点の素材を積層してもよい。また、三次元に領域分けをして、異なる融点の領域を配置してもよい。そして加熱集束光の強度を調節することで、溶解領域を段階的に選択することが可能である。具体的には、たとえば異なる融点を持つ低融点アガロースを積層することで実現できるが、アガロースとプラスチックなど異なる素材を用いてもよい。
【００２２】
図６も培養マイクロチャンバーの別の基本構成の１つを示した実施例である。この実施例では、吸熱層６０１、６０２、６０３を領域１０３中の特定の高さの断層に配置している。そのため、この実施例の特徴は、集束光の加熱によって吸光層６０１、６０２、６０３が発熱した場合、この層を保持している領域１０３が、ともに溶解してしまうため、溶解と同時に吸光層が除去されることである。また、吸光・発熱によって作られるトンネルの高さは、領域１０３中の吸光層の位置に依存する。
【００２３】
図７の実施例も図６と同様、吸光層を領域１０３中に構成したものである。ただし、この実施例では吸光層ではなく、吸光を持った微粒子７０１を用いている。これによって、たとえば、領域１０３のある高さに層状に微粒子７０１を配置して特定の高さで層状に領域１０３を溶解したり、あるいは領域１０３全体に満遍なく微粒子７０１を分散させることで、領域１０３の集束レーザー光が照射された領域全体を溶解させることもできる。
【００２４】
図８は実際に集束光を用いて領域１０３を溶解させた結果の一例を示したものである。スライドガラス上に厚さ５０ｎｍのクロムを蒸着し、その上にコラーゲンを塗布した基板上に厚さ５０μｍｍのアガロースを積層し、アガロースが凝固する前に鋳型によって、５０μｍｘ５０μｍの鋳型を当てて穴８０１を形成した培養マイクロチャンバー８１に、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー集束光８０２を照射して移動させると基板８２のように穴が掘られる。照射後には基板８３のように直径５μｍ程度のトンネル８０３が形成される。同様な処理を行うことで、順次、基板８４に見られるようにトンネル８０４を掘り、基板８５のようにトンネル８０５を、基板８６のようにトンネル８０６を掘ってゆくことができる。そして更には、基板８７に見られるように形成したトンネルを繋ぐトンネル８０７を形成することもできる。
【００２５】
図９および図１０は、培養マイクロチャンバ１００にトンネルを掘るだけでなく、培養マイクロチャンバの穴の形状を変えることが可能であることを示すための実施例である。図９では、丸い形状の穴９１１を四角い形状の穴９１２へと変化させることが可能であることを示している。また、図１０では、丸い穴１０１１を星型の形状１０１２への変化させることが可能であることを示している。
【００２６】
図１１は、微細加工技術によって集束光の波長より微小な吸光領域を形成することで、光の波長より小さな領域で局所的に発熱・溶解を可能にする実施例を説明した図である。微細加工技術によって形成した吸光層のパターン１１０２の線幅がマイクロメートルより小さいとき、たとえば１０６４ｎｍの波長の集束レーザー光を照射すると、選択的に吸光領域のパターンでのみ光の吸収が起こり、光の波長より小さな領域のみで局所的に加熱することができ、トンネル１１０４が形成される。これは、通常の集束光を用いた加熱のみでは光の波長程度までしか発熱源を集束できないことから、サブミクロン以下の形状のトンネル等を形成するには有効な手段である。同様に、サブミクロン以下の吸光微粒子を用いた場合にも同様な効果がある。
【００２７】
もちろん、この出願の発明は以上の例示説明に限定されるものではない。その細部についてさらに様々な形態が可能であることは言うまでもない。
【００２８】
【発明の効果】
以上詳述したように、この出願の発明によって、従来不可能であった、生物細胞等を培養しつつ容器の形状をその培養過程に応じて変化させることが可能となる。また、光の波長以下の領域で局所的に物質を溶解させて、構造を形成することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この出願の発明の基本構成の一例を示した模式図である。
【図２】図１で示した培養マイクロチャンバーの構成を示した模式図である。
【図３】図１で示した培養マイクロチャンバーを観察し集束光局所過熱する装置構成の一例を示した模式図である。
【図４】集束光局所過熱による培養マイクロチャンバー加工プロセスを説明する模式図である。
【図５】培養マイクロチャンバーの構成の一例を示した模式図である。
【図６】培養マイクロチャンバーの構成の一例を示した模式図である。
【図７】培養マイクロチャンバーの構成の一例を示した模式図である。
【図８】集束光局所過熱による培養マイクロチャンバー加工プロセスの一例を説明した顕微鏡写真である。
【図９】培養マイクロチャンバーの構成の一例を示した模式図である。
【図１０】培養マイクロチャンバーの構成の一例を示した模式図である。
【図１１】培養マイクロチャンバーの構成の一例を示した模式図である。
【符号の説明】
１００　細胞培養マイクロチャンバー
１０１　光学的に透明な基板
１０２、６０１、６０２、６０３　光学吸収を持つ薄膜層
１０３、５０１、５０２　光学的に透明で、かつ、低融点温度で細胞等に対し　て毒性を持たない物質の領域
１０４　細胞等の試料
１０５、８０１　穴
１０６　光学的に透明な容器
１０７、１０８　管
３０１　光源
３０２、３０９、３１２　フィルター
３０３　コンデンサレンズ
３０４　温調機能付ステージ
３０５　対物レンズ
３０６　可動ダイクロイック・ミラー
３０８　光源
３１０　ダイクロイック・ミラー
３１１　ミラー
３１３　カメラ
３１５　ステージ移動用モーター
３１６　培養液槽
３１７　供給装置
３１８　ポンプ
３１９　廃液溜
４０１　矢印
４０２　レーザー集束光
４０３、８０３、８０４、８０５、８０６、８０７、１１０４　トンネル
７０１　吸光を持った微粒子
８０２　Ｎｄ：ＹＡＧレーザー集束光
９１１、１０１１　丸い形状の穴
９１２　四角い形状の穴
１０１２　星型の形状の穴
１１０２　微細加工技術によって形成した吸光層のパターン
【図１】
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【図２】
2004081086.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2004081086.tif 000011
【図１０】
2004081086.tif 000012
【図１１】
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