(57)【要約】【課題】特定の細胞を簡単、大量、高回収率で分離、回収するための材料を得るために、メルカプト基を持つリガンドを、ピリジルジスルフィド基を持つ基材に反応させることによりジスルフィド結合を介してリガンドを基材に固定化することを特徴とする製造方法を提供する。【解決手段】メルカプト基を持つリガンドを含む溶液とピリジルジスルフィド基を持つ基材を反応させることによりジスルフィド結合を介してリガンドを基材に固定化することを特徴とする体外循環用リガンド固定化材料の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
メルカプト基を持つリガンドを含む溶液とピリジルジスルフィド基を持つ基材を反応させることによりジスルフィド結合を介してリガンドを基材に固定化することを特徴とする体外循環用リガンド固定化材料の製造方法。
【請求項２】
メルカプト基を持つリガンドを含む溶液において、メルカプト基を持つリガンドの濃度が１ｍｇ／ｍｌ以下であることを特徴とする請求項１記載の体外循環用リガンド固定化材料の製造方法。
【請求項３】
メルカプト基を持つリガンドを含む溶液において、メルカプト基を持つリガンドの濃度が０．２ｍｇ／ｍｌ以下であることを特徴とする請求項１記載の体外循環用リガンド固定化材料の製造方法。
【請求項４】
メルカプト基をもつリガンドが、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネートを反応させた後、還元して得られたリガンドであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料の製造方法。
【請求項５】
メルカプト基をもつリガンドが、２−イミノチオランを反応させて得られたリガンドであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料の製造方法。
【請求項６】
メルカプト基をもつリガンドが、リガンドを還元して得られたリガンドであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料の製造方法。
【請求項７】
リガンドが蛋白質および／またはペプチドであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料の製造方法。
【請求項８】
蛋白質および／またはペプチドが、抗体、レセプター、サイトカイン、分化因子、増殖因子および接着因子からなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項７記載の体外循環用リガンド固定化材料の製造方法。
【請求項９】
基材が平膜状あるいは繊維状または中空糸状であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料の製造方法。
【請求項１０】
基材が多孔質であることを特徴とする請求項９に記載の体外循環用リガンド固定化材料の製造方法。
【請求項１１】
基材がポリスチレン、ポリスルホン、セルロース、ポリメチルメタクリレート、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリアクリロニトリルからなる群より１つ以上選択される高分子化合物からなることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料の製造方法。
【請求項１２】
基材が表面にアミノ基を有するものであり、これにＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネートを反応させてピリジルジスルフィド基を導入することを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料の製造方法。
【請求項１３】
基材のアミノ基がポリエチレンイミン由来であることを特徴とする請求項１２に記載の体外循環用リガンド固定化材料の製造方法。
【請求項１４】
メルカプト基を持つリガンドを含む溶液とピリジルジスルフィド基を持つ基材を反応させることによりジスルフィド結合を介してリガンドを固定化したことを特徴とする体外循環用リガンド固定化材料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液中の有用物質あるいは病因物質を効率よく除去回収する、あるいは細胞分離、濃縮する材料および該材料を再利用するために、ジスルフィド基を介して基材にリガンドを固定した材料の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、リガンド、特に抗体を用いて、抗体と相互作用する細胞を選択的に分離する試みがなされている。かかる試みは、抗体を担体に固定化した材料を用い、ここに血液細胞などの細胞群を流すことにより、抗体と相互作用する特定の細胞だけを除去する技術が検討されている。
【０００３】
例えば、ヒト表面抗原を認識する抗体を不織布に固定化し、特定の血球成分を除去する技術が提案されている（特許文献１参照）。しかし、このような技術では、抗体と相互作用する特定の血球成分のみがが血液から除去されるだけであり、それらの特定の血球成分を担体表面から回収し、さらに利用することは困難である。
【０００４】
そこで、特定の細胞を回収、利用する技術として、フローサイトメトリーによる方法や最近では磁気ビーズ法などが提案されているが（例えば、非特許文献１参照）、いずれも少量の細胞を対象としており、さらに、細胞と標識抗体とを反応させた後、分離作業をするという非常に煩雑な操作が必要であり、特定の細胞を大量に回収する際は、時間、コストがかかることが問題であった。
【０００５】
還元剤により切断可能なジスルフィド結合を介して、リガンドを材料に固定化する方法も検討されているが、材料に粒子などを用いているため、磁気ビーズ法と同様に大量の細胞の処理には適していない（特許文献２参照）。
【０００６】
さらに、上記のような従来の回収技術で血液から特定の細胞を回収する場合には、一度血液を体外に取り出した後に、血液を分離材料へ添加するという方法をとる必要があり、大気中の雑菌や微生物により汚染される危険性がある。さらに、体外へ取り出せる血液量に限界があるため、処理できる血液量が少なく、回収できる細胞数が少なくなる傾向にある。そのため、血液を体外に取り出す前にＧ−ＣＳＦ等の医薬品により目的とする細胞数を上昇させるなどの方法が行われているが、これら医薬品による副作用が重大な問題となってくる。
【０００７】
そこで、最近、特定の細胞を簡単、大量、高回収率で分離、回収するための材料を得るために、基材上に抗体などのリガンドを固定し、ここに血液などの接触させて特定の細胞を分離、回収する試みがなされている。しかし、リガンドを基材に固定する際の反応条件が詳細に検討されていないため、リガンドを固定化する際に高価なリガンドを高濃度で反応させる必要がある場合は、材料を作製するためのコストが非常に高くなるという問題がある。
【０００８】
【非特許文献１】
ポール・Ｔ・シャープ（Ｐ．Ｔ．Ｓｈａｒｐｅ），「生化学実験法１３−細胞分離法−」，第１版，東京化学同人，１９９１年，ｐ．１５１〜１９０ｐ
【０００９】
【特許文献１】
国際公開第９７／０２７８７８号パンフレット
【００１０】
【特許文献２】
国際公開第９６／３１７７６号パンフレット
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明では、上記従来技術の問題を解消するものであり、特定の細胞を簡単、大量、高回収率で分離、回収するための材料を得るために、メルカプト基を持つリガンドを、ピリジルジスルフィド基を持つ基材に反応させることによりジスルフィド結合を介してリガンドを基材に固定化することを特徴とする製造方法を提供することを目的とする。この方法では、０．２ｍｇ／ｍｌと比較的低濃度でリガンドを固定化することができる。このため、少量しか入手できないリガンドや高価なリガンドを使用する場合、少量のリガンドを使用するだけでジスルフィド結合を介してリガンドを固定化した材料を提供できる。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明は主として下記構成を有する。すなわち、「メルカプト基を持つリガンドとピリジルジスルフィド基を持つ基材を反応させることによりジスルフィド結合を介してリガンドを基材に固定化することを特徴とする体外循環用リガンド固定化材料の製造方法」
この方法では、１ｍｇ／ｍｌ以下、特に０．２ｍｇ／ｍｌと比較的低濃度でリガンドを固定化することができる。このため、少量しか入手できないリガンドや高価なリガンドを使用する場合、少量のリガンドを使用するだけでジスルフィド結合を介してリガンドを固定化した材料を提供できる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明は体外循環用リガンド固定化材料の製造方法であって、メルカプト基を持つリガンドとピリジルジスルフィド基を持つ基材を反応させることによりジスルフィド結合を介してリガンドを基材に固定化することによってなされる。
【００１４】
リガンドをジスルフィド結合を介して基材に固定化する場合、ピリジルジスルフィド基を導入したリガンドとメルカプト基を導入した基材を反応させる方法と、メルカプト基を導入したリガンドとピリジルジスルフィド基を導入した基材を反応させる方法がある。リガンドにピリジルジスルフィド基を導入した場合、ピリジルジスルフィド基は疎水性であるため、ピリジルジスルフィド化リガンドを水系溶媒に溶解させた場合、ピリジルジスルフィド基がリガンド内部に潜り込んでしまい、メルカプト基を有する基材への反応効率が低くなる可能性がある。そこで本発明においては、リガンドをジスルフィド結合を介して基材に固定化するにあたって、リガンドにメルカプト基、基材にピリジルジスルフィド基を導入したものを反応させる。リガンドの基材への固定化は、通常、リガンドを溶媒に溶解させた溶液の状態にして基材と接触させることにより行うが、この方法により、リガンドが１ｍｇ／ｍｌ以下、さらには０．２ｍｇ／ｍｌ以下の低濃度でもジスルフィド結合を介してリガンドを基材に固定化することが可能となる。
【００１５】
以下詳細に説明する。
【００１６】
反応に使用するメルカプト基をもつリガンドについては、そのリガンド上にメルカプト基の数を十分に有する場合、そのまま使用することも可能だが、リガンドが生理活性物質の場合、一般的に生理活性物質上のメルカプト基の数は少なく、反応性に乏しいため、生理活性物質にメルカプト基を導入する必要がある。この場合、生理活性物質にメルカプト基を導入する方法として、メルカプト基と他の反応性基を併せ持つ化合物を生理活性物質に反応させる方法やピリジルジスルフィド基を生理活性物質に導入した後、ピリジルジスルフィド基を還元してメルカプト基を導入する方法、あるいは、リガンドがタンパク質の場合には、還元剤によりタンパク質分子内のジスルフィド結合を還元してメルカプト基を生成する方法などがあげられる。
【００１７】
メルカプト基と他の反応性基を併せ持つ化合物としては、２−メルカプトエタノール、６−メルカプト−１−ヘキサノール、メルカプトウンデカノール、２−アミノエタンチオール、メルカプト酢酸、メルカプトプロピオン酸、メルカプトこはく酸、メルカプトウンデカン酸、メルカプト安息香酸、２−メルカプトスルホン酸、メルカプトフェノール、システインなどがあげられる、これら化合物のメルカプト基以外の反応性基を利用してリガンドに反応させれば、メルカプト基をリガンドに導入することができる。また、このような化合物以外にも２−イミノチオランを使用すれば、これがリガンドのアミノ基と反応して、リガンドにメルカプト基を簡単に導入することができる。
【００１８】
また、リガンドにピリジルジスルフィド基を導入するためには、通常、リガンドのアミノ基と反応する活性基とピリジルジスルフィド基を持つ架橋剤を利用することが好ましい。このような架橋剤としては、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート、スクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエートや水溶性のスルホスクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエートなどがあげられる。水に不溶性の架橋剤を用いる場合、ジメチルスルホキシドやメタノールなどの可溶性の有機溶媒に溶解後、リガンドを溶解した水系の反応液に添加することにより利用できる。リガンドへのピリジルジスルフィド基の導入率はリガンド１モルあたり１モル以上であることが必要であるが、導入率を上げるためにピリジルジスルフィド化剤の仕込量を上げると失活したり、凝集したりするおそれがある。このため、仕込量はリガンド１モルあたり１０モル以下が望ましい。
【００１９】
また、上記のピリジルジスルフィド基やタンパク質分子内のジスルフィド基を還元する際に使用する還元剤としては、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール、システイン、還元型グルタチオンなどがあげられる。
【００２０】
また、リガンドが抗体の場合、抗体にピリジルジスルフィド基を導入して、還元する場合には、抗体自体の還元による失活を防ぐために、酢酸緩衝液中などで還元することにより抗体自身の還元を抑えることができる。また、抗体をペプシンで消化切断した後、還元剤で還元し、プロテインＧカラムやゲルろ過カラムで精製することによって、抗体の可変部位にメルカプト基を導入したフラグメントを得ることも可能である。
【００２１】
本発明で使用するリガンドはターゲット物質と相互作用をもつものであれば、合成物質でも天然物質でもよいが、特異性の点から天然物質であることが望ましい。天然物質は、ａ）細胞や病因物質などのターゲット物質と相互作用をもつものや、ｂ）抗血栓性を有するもの、ｃ）細胞を活性化するもの、ｄ）アポトーシスを誘導するもの、ｅ）増殖、分化因子、ｆ）サイトカイン、ｇ）接着因子などが好適に用いられる。
ａ）細胞や病因物質などのターゲット物質と相互作用をもつもの：
細胞や病因物質などのターゲット物質と相互作用をもつものの場合、特異性の点から抗体およびレセプターを好ましく用いることができる。用いる抗体としては、例えば、抗ＣＤ１ａ抗体、抗ＣＤ１ｂ抗体、抗ＣＤ１ｃ抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ１０抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤｗ１２抗体、抗ＣＤ１３抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１５抗体、抗ＣＤ１６ａ抗体、抗ＣＤ１６ｂ抗体、抗ＣＤ１８抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ２４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ２６抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ３２抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４２ａ抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体、抗ＣＤ４９ｄ抗体、抗ＣＤ５０抗体、抗ＣＤ５４抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ５７抗体、抗ＣＤ５８抗体、抗ＣＤ６１抗体、抗ＣＤ６２Ｌ抗体、抗ＣＤ６２Ｐ抗体、抗ＣＤ６６抗体、抗ＣＤ６９抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８１抗体、抗ＣＤ８６抗体、抗ＣＤ９５抗体、抗ＣＤ１０２抗体、抗ＣＤ１０５抗体、抗ＣＤ１０６抗体、抗ＣＤ１０９抗体、抗ＣＤｗ１１９抗体、抗ＣＤ１２０ａ抗体、抗ＣＤ１２０ｂ抗体、抗ＣＤ１２１ａ抗体、抗ＣＤｗ１２１ｂ抗体、抗ＣＤ１２２抗体、抗ＣＤ１２３抗体、抗ＣＤ１２６抗体、抗ＣＤｗ１２８ａ抗体、抗ＣＤ１３０抗体、抗ＣＤｗ１３１抗体、抗ＣＤ１３２抗体、抗ＣＤ１３３抗体、抗ＣＤ１３４抗体、抗ＣＤ１０５抗体、抗ＣＤ１３８抗体、ＣＤ１５２抗体、抗ＣＤ１５４抗体、抗ＣＤ１９９抗体、抗低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）抗体、抗酸化ＬＤＬ抗体、抗β２ミクログロブリン抗体、抗ＣＣＲ１抗体、抗ＣＣＲ２抗体、抗ＣＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ４抗体、抗ＣＣＲ５抗体、抗ＣＣＲ７抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体、抗ＣＸＣＲ５抗体、抗ＣＸＣＲ１抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。また、レセプターとしては例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＲ５等のサイトカインレセプターやＦｃγ、Ｆｃε等のイムノグロブリンレセプター、ＲＡＧＥ、ＬＤＬレセプター等のスカベンジャ−レセプター等、Ｔ細胞レセプターや主要組織適合性抗原等の細胞認識レセプター等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの抗体やレセプターは、単独で基材に固定化しても良いし、複数の抗体やレセプターを組み合わせても良い。抗体は、アフィニティーの高さからモノクローナル抗体が好ましい。
【００２２】
これら抗体やレセプターは目的によって種々選定することができ、例えば本発明の方法で作製した材料を血液中の有用物質や病因物質を特異的に除去、回収する用途に使用する場合には、細胞、無機物、タンパク質、ＤＮＡ、脂質、糖、ウィルスなどがターゲットとして挙げられる。例えば、抗ＣＤ２抗体を用いればＴ細胞およびＮＫ細胞を分離でき、抗ＣＤ３抗体を用いればＴ細胞を分離でき、抗ＣＤ４抗体を用いればヘルパーＴ細胞を分離でき、抗ＣＤ８抗体を用いればサイトトキシックＴ細胞を分離でき、抗ＣＤ１１ａを用いれば白血球を分離でき、抗ＣＤ１１ｂを用いれば単球を分離でき、抗ＣＤ１４抗体を用いれば単球やマクロファージを分離でき、抗ＣＤ１５抗体を用いれば顆粒球やミエロイド細胞を分離でき、抗ＣＤ１６細胞を用いれば好中球あるいは休止期ＮＫ細胞を分離でき、抗ＣＤ１９抗体を用いればＢ細胞を分離でき、抗ＣＤ２２抗体を用いればＢ細胞を分離でき、抗ＣＤ２７抗体を用いればナイーブＢ細胞やメモリーＢ細胞を分離でき、抗ＣＤ３０抗体を用いれば活性化Ｂ細胞および活性化Ｔ細胞を分離でき、抗ＣＤ３３細胞を用いれば単球、顆粒球およびミエロイド細胞を分離でき、抗ＣＤ３４抗体を用いれば造血幹細胞を分離でき、抗ＣＤ４５抗体を用いれば白血球を分離でき、抗ＣＤ５６抗体を用いればＮＫ細胞を分離でき、抗ＣＤ６１抗体を用いれば巨核球及びその前駆細胞を分離でき、抗ＣＤ６６抗体を用いれば顆粒球を分離でき、抗ＣＤ６９抗体を用いれば活性化Ｔ細胞や活性化Ｂ細胞やＮＫ細胞を分離でき、抗ＣＤ７１抗体を用いれば赤芽球や活性化されたリンパ芽球を分離でき、抗ＣＤ１０５抗体を用いれば内皮細胞、抗ＣＤ１３３抗体を用いれば神経幹細胞を分離できる。
ｂ）抗血栓性を有するもの：
リガンドにおいて、抗血栓性を有するものとしては、ヘパリン、トロンモボジュリン、ヒルジンなどがあげられる。これらを材料に固定化したものは、血液浄化用カラムやカテーテル、人工血管などに利用できる。
ｃ）細胞を活性化するもの：
細胞を活性化するものとして、インターフェロン、インターロイキン、抗ＣＤ３抗体やＴ細胞レセプター、主要組織適合性抗原等の細胞認識レセプター、スーパー抗原、フィトヘマグルチニン、リポポリサッカライド、コンナカバリンＡ、ピーナッツアグルチニン等が挙げられる。例えば、材料に抗ＣＤ３抗体を固定化したものを用いてリンパ球を培養すれば、培養によりリンパ球が活性化され、培養されたリンパ球をがん免疫療法に用いることができる。
ｄ）アポトーシスを誘導するもの：
アポトーシスを誘導するものとしては、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＦａｓリガンドやＣＤ４０リガンドなどある。
ｅ）増殖、分化因子：
増殖、分化因子としては、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、ＦＧＦ−２、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、オステオネクチン、アンジオポイエチン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、ノッチリガンド（Ｄｅｌｔａ１，Ｄｅｌｔａ３，Ｄｅｌｔａ４，Ｊａｇｇｅｄ１，  Ｊａｇｇｅｄ２）などが挙げられる。また、同じ作用をもつ上記タンパクの遺伝子をもちいることもできる。
ｆ）サイトカイン：
サイトカインとして、インターロイキン−１α、インターロイキン−１β、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１４、インターロイキン−１５、インターロイキン−１６、インターロイキン−１７、インターロイキン−１８、顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ、）顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ＭＣＰ−１、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）などが挙げられる。
【００２３】
がん細胞を認識するものとして、マンノース６リン酸などが挙げられ、癌患者の血中に存在するガン細胞を除去し、転移を抑制のための血液浄化カラムに用いることができる。
ｇ）接着因子：
接着因子として、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、カテニンやカドヘリン等のカドヘリンファミリー、Ｉ−ＣＡＭなどのＩｇスーパーファミリー、セレクチンファミリー、シアロムチンファミリーなどがあげられる。
【００２４】
以上用いる天然物質は市販の天然物質や医薬品を用いても良いし、抗体の場合には、ハイブリドーマから作製してもよい。
【００２５】
本発明においてリガンドを固定化する基材としては、血液などの細胞群を一度に大量に処理できる体外循環に使用可能な基材であればよく、基材の形状としては平膜状、中空糸状、繊維状、粒子状、ゲル状、スポンジ状、カットファイバーなどが適しているが、閉鎖系で圧力損失を伴わず、細胞を傷つけず体外循環できる利点から平膜状、中空糸状、繊維状が望ましく、また、表面積を確保し、細胞との相互作用を大きくする点からこれらは多孔質であることが望ましい。多孔質材料の場合は、製造条件を制御することにより孔の制御も可能である。
【００２６】
また、基材に使用される素材は、医療用に用いられている素材が好ましく、例えば、ポリ塩化ビニル、セルロース系ポリマー、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレンなどが挙げられる。この中でも特にポリスルホンは成形が容易で、成形したときの膜性能に優れているため、好適に用いられる。
【００２７】
ポリスルホンの具体例としては、テイジンアモコ社製”ユーデル”（登録商標）ポリスルホンＰ−１７００、Ｐ−３５００、ＢＡＳＦ社製”ウルトラソン”（登録商標）Ｓ３０１０、Ｓ６０１０、住友化学製”ビクトレックス”（登録商標）、テイジンアモコ社製”レーデルＡ”（登録商標）、ＢＡＳＦ社製”ウルトラソンＥ”（登録商標）等のポリスルホンが挙げられる。又、本発明で用いられるポリスルホンは上記式（１）及び／又は（２）で表される繰り返し単位のみからなるポリマーが好適ではあるが、本発明の効果を妨げない範囲で他のモノマーと共重合していても良い。特に限定するものではないが、他の共重合モノマーは１０重量％以下であることが好ましい。
【００２８】
【化１】
2004223118.tif 000002
【００２９】
【化２】
2004223118.tif 000003
【００３０】
また、ポリスルホンなどの疎水性の高分子は、血液や細胞と接触するような用途で使用する際は、その接触面を親水化することが好ましい。親水化の方法としては、ポリビニルピロリドンやポリエチレングリコールなどのポリスルホン系高分子との相溶性に優れる親水性高分子を加工前のポリスルホン溶液に添加するなど、血液や細胞との接触面を親水性の化合物でコーティングすることにより達成できる。これらのうちで血液適合性の観点からポリビニルピロリドンが好適に用いられる。使用するポリビニルピロリドンとしては、特に限定されないが、入手の容易さから、市販されている重量平均分子量１１０万、４．５万、２．９万、９０００、２９００のものが好適に用いられるが、もちろんそれ以外の分子量のものを使用してもかまわない。ポリビニルピロリドンの重量平均分子量は特に限定されるものではないが、２０００〜２００００００が好ましく、１００００〜１５０００００がより好ましい。なお、ここで記したポリビニルピロリドンの重量平均分子量は、基材に使用する原料段階での分子量である。作製された基材においては、放射線架橋などの手段によりポリビニルピロリドンの分子量は原料段階での分子量より大きなものとなっている場合もある。これらのポリビニルピロリドンは、ホモポリマーが好適であるが、他のモノマーと共重合されたものであってもかまわない。ここで、他の共重合モノマーの量は特に限定するものではないが、１０重量％以下であることが好ましい。
【００３１】
ポリスルホン系材料に多孔質性を付与するには、あらかじめポリスルホン溶液にポリビニルピロリドンをブレンドさせることにより達成できる。
【００３２】
基材としてポリスルホン系中空糸を用いる場合、ポリスルホン系中空糸は例えば以下のようにして製造できるが、これに限定されない。
【００３３】
ポリスルホンとポリビニルピロリドン（重量比率２０：１〜１：５が好ましく、５：１〜１：１がより好ましい）を良溶媒（Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジオキサンなどが好ましい）および良溶媒の混合溶液に溶解させた原液（濃度は、１０〜３０重量％が好ましく、１５〜２５重量％がより好ましい）を二重環状口金から吐出する際に内側に注入液を流し、乾式部を走行させた後凝固浴へ導く。この際、乾式部の湿度が影響を与えるために、乾式部走行中に膜外表面からの水分補給によって、外表面近傍での相分離挙動を速め、孔径拡大し、結果として透析の際の透過・拡散抵抗を減らすことも可能である。ただし、相対湿度が高すぎると外表面での原液凝固が支配的になり、かえって孔径が小さくなり、結果として透析の際の透過・拡散抵抗を増大する傾向がある。そのため、相対湿度としては６０〜９０％が好適である。また、注入液組成としてはプロセス適性から原液に用いた溶媒を基本とする組成からなるものを用いることが好ましい。注入液濃度としては、例えばジメチルアセトアミドを用いたときは、４５〜８０重量％、さらには６０〜７５重量％の水溶液が好適に用いられる。
【００３４】
上記の基材を、本発明に使用する為には、ピリジルジスルフィド基を基材上に導入する必要がある。
【００３５】
基材にピリジルジスルフィド基を導入するには、基材上のアミノ基にピリジルジスルフィド基を持つ架橋剤を反応させる方法や基材上のメルカプト基に２，２’−ジチオジピリジン、４，４’―ジチオピリジンを反応させる方法がある。
【００３６】
アミノ基を持つ基材に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基とピリジルジスルフィド基を持つ架橋剤を反応させれば、基材上にピリジルジスルフィド基を導入できる。このような架橋剤としては、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート、スクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエートや水溶性のスルホスクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエートなどがあげられる。
【００３７】
また、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基をもつ架橋剤を用いる場合は基材表面にアミノ基が必要であるが、基材表面にアミノ基がない場合、基材表面にアミノ基を導入する必要があるため、基材表面の官能基をアミノ基に変換する反応か、あるいはアミノ基を持つポリマーや低分子物質を結合させることにより達成できる。
【００３８】
基材に表面にアミノ基を含有させる方法として、材料に対して活性基の官能基を導入し、それに続いてアミンの誘導体を含有する溶液に浸漬または付着させてアミノ基を導入することが出来る。また、付着したアミンの誘導体を放射線照射により固定化する方法もある。
【００３９】
アミンと反応する活性基としてはクロロメチル基、クロロアセトアミドメチル基、エポキシ基などが利用される。
【００４０】
放射線処理としては、湿潤状態でγ線・電子線などを照射すればよい。ここでいう湿潤状態とは、材料を乾燥させない状態のことを言う。その程度は特に限定されるものではないが、通常、材料が１重量％以上の水分を含んでいることが好ましい。放射線の吸収線量は湿潤状態で１０〜５０ｋＧｙ程度が好ましく、２０ｋＧｙを超える線量を照射した場合は、滅菌処理を同時に行うことも可能である。この際、吸収線量は線量測定ラベルをモジュールの表面に貼り付けるなどして測定することができる。得られたアミノ基含有材料を医療用途に用いる場合は、リガンド固定化操作を無菌下で行うことが望ましい。
【００４１】
アミンの誘導体としては、ポリマーであってもモノマーであってもよい。モノマーの場合は、アンモニア、エチレンジアミン、テトラエチレンペンタミン、デンドリマー、アグマチンなどが用いられる。アミノ基含有ポリマーの例としては、ポリアルキレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリリジン、アジリジン（エチレンイミン）化合物を有するポリマー、ポリエチレンイミン誘導体、キトサン、およびそれらに置換基の導入されたもの、およびこれらを構成するモノマー単位からなる共重合体などが挙げられ、アミノ基量の多いポリマーが好適に用いられる、特にポリエチレンイミンでは分子量６００以上の直鎖状、分岐状のものが好ましく用いられる。
【００４２】
また、ポリエチレンイミン誘導体として、ポリエチレンイミンをアルキル化、カルボキシル化、フェニル化、リン酸化、スルホン化、メルカプト化、ピリジルジスルフィド化などによってアミノ基をさらに所望の割合で化学修飾したものが用いられる。
【００４３】
アミノ基含有ポリマーの中でも毒性の低さ、入手のしやすさ、取り扱いのしやすさなどから、分岐状のポリエチレンイミンが好適に用いられる。
【００４４】
基材表面にメルカプト基を導入するためには、基材上の活性基に２−メルカプトエタノール、６−メルカプト−１−ヘキサノール、メルカプトウンデカノール、２−アミノエタンチオール、メルカプト酢酸、メルカプトプロピオン酸、メルカプトこはく酸、メルカプトウンデカン酸、メルカプト安息香酸、２−メルカプトスルホン酸、メルカプトフェノール、システインなどのメルカプト基を持つ化合物を反応させればよい。
【００４５】
リガンドと基材を反応させる際には、メルカプト基を持つリガンドを含む溶液を作製し、この溶液にピリジルジスルフィド基を持つ基材を浸漬して反応させることによりジスルフィド結合を介してリガンドを基材に固定化する。リガンドを含む溶液の溶媒としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−塩酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ハンクス緩衝液など各種緩衝液が好ましく、緩衝液にジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、メタノール、エタノールなどの有機溶媒を添加しても良い。リガンドを含む溶液のリガンド濃度は、固定化密度を上げるためには高くし、固定化密度を下げるには低くする。本発明の製造方法では、リガンド濃度が１ｍｇ／ｍｌ以下でも基材にリガンドを固定化することができ、さらには、リガンド濃度が０．２ｍｇ／ｍｌ以下の場合でもリガンドを基材に固定化することができる。反応の温度は０℃〜５０℃の間が好ましく、より好ましくは４℃〜３７℃の間で反応させることが好ましい。
【００４６】
本発明の製造方法で得られる材料を利用すれば、ターゲットとなる有用物質や病因物質をリガンドにより捕捉でき、さらに、ジスルフィド結合を介して基材にリガンドが固定化されていることから、還元剤を用いた外部刺激によりリガンドを基材から脱離させることにより、捕捉した有用物質や病因物質を回収する事が可能である。このため、血液浄化用途、細胞分離用途、細胞培養用途として使用することができる。
【００４７】
また、ターゲット物質を捕捉あるいは回収する際に使用する溶媒として、様々なｐＨ値のリン酸、酢酸、クエン酸などの緩衝液をもちいることができ、さらに緩衝液の中にウシ血清アルブミンや抗体などのタンパク質あるいはカチオン性、アニオン性などのポリマーなどを含有していても良い。
【００４８】
細胞を回収する際は本発明で作製した材料を全血と作用させてもよいし、血漿分画や単核球分画などにした後、作用させてもよい。
【００４９】
以上のような方法で、回収した有用物質、病因物質を分析に用いることが可能である。また、細胞の場合はそれを培養し、分析や治療などに利用できる。例えば、リガンドとして抗ＣＤ４抗体を使用し、このリガンドを固定化した本発明の材料に血液を通してＣＤ４陽性のＴ細胞を捕捉し、ジチオスレイトールなどの還元剤でリガンドを脱離することにより、捕捉した細胞を大量に回収し、この細胞に様々な刺激を加えて活性化させ体内に戻すことにより、癌、アレルギー、感染症、臓器移植、あるいは自己免疫疾患の治療やワクチンとしてもちいることができる。
【００５０】
また、例えば、リガンドとして抗ＣＤ３４抗体を使用し、このリガンドを固定化した本発明の材料に臍帯血を通して、造血幹細胞を捕捉し、ジチオスレイトールなどの還元剤でリガンドを脱離することにより、造血幹細胞を大量に回収し、回収した造血幹細胞を培養して輸血医療に用いたり、様々な組織幹細胞に分化させることにより、肝疾患や神経疾患、血管傷害などの細胞療法に用いることができる。
【００５１】
また、例えば、リガンドとして抗ＣＤ１３３抗体を使用し、このリガンドを固定化した本発明の材料に臍帯血を通して、神経幹細胞を捕捉し、ジチオスレイトールなどの還元剤でリガンドを脱離することにより、神経幹細胞を大量に回収し、回収した神経幹細胞を培養して神経幹細胞移植に用いたり、様々な神経細胞に分化させることにより、パーキンソン病やアルツハイマー病など神経疾患、脳梗塞により壊死した神経細胞の修復などの細胞療法に用いることができる。
【００５２】
【実施例】
以下に実施例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５３】
１．メルカプト基を持つヒト免疫グロブリン誘導体の作製
ＮａＣｌを０．１５ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に５ｍｇ／ｍｌに溶解した精製ヒト免疫グロブリンＧ（シグマ社製）にＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（以下、ＳＰＤＰと略す）を２０ｍＭに溶解したジメチルスルホキシド溶液をヒト免疫グロブリンＧ１モルに対して１０モル添加し、室温で３０分反応させた後、ＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）で高分子量分画に精製した。ヒト免疫グロブリンＧ１モルあたりのＳＰＤＰ導入量は４．２モルであった。再度ＰＤ−１０カラムを用いて酢酸緩衝液（０．５Ｍ酢酸、０．５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５）に置換し、合成したＳＰＤＰ化ヒト免疫グロブリンを２５ｍＭのジチオスレイトール（以下、ＤＴＴと略す）を含む酢酸緩衝液中で還元反応を行い、メルカプト基を有するヒト免疫グロブリン誘導体（以下、ＨＳ−ＩｇＧと略す）を合成した  。
【００５４】
２．ピリジルジスルフィド基を持つ平膜の作製
ポリスルホン（テイジンアモコ社製”ユーデル”（登録商標）Ｐ−３５００）１８重量部、ポリビニルピロリドン（ＢＡＳＦ社製”Ｋ３０”（登録商標））９重量部をＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド７２重量部、水１重量部に加え、９０℃、１４時間加熱溶解した。この溶液を０．１ｍｍスペーサー付きのガラス板に塗布し、ドクターブレードにて溶液を引き延ばしたものを水中にいれて、凝固させ、ポリスルホン／ポリビニルピロリドンブレンドからなる平膜状の材料を作製した。ポリスルホン／ポリビニルピロリドンブレンド材料を十分水洗した後、１重量％のポリエチレンイミン（分子量１万、和光純薬製）水溶液に浸漬して、２５ｋＧｙにてγ線照射して、表面にアミノ基をもつ平膜を作製した。作製した平膜１ｃｍ２にＳＰＤＰを２０ｍＭに溶解したジメチルスルホキシド溶液を加えて１時間振盪させ、表面にピリジルジスルフィド基を持つ平膜を作製した。
【００５５】
３．実施例１
２．で作製したピリジルジスルフィド基を持つ平膜１ｃｍ２を１．で合成したＨＳ−ＩｇＧ０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液に浸漬し、室温で１５時間振盪させた。１５時間後のリン酸緩衝液に含まれるヒト免疫グロブリンＧの吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、ＨＳ−ＩｇＧが平膜に固定化されていることが確認された。また、この膜を２５ｍＭのＤＴＴを含むリン酸緩衝液で還元し、脱離されたヒト免疫グロブリン量をＨＰＬＣおよび吸光度（２８０ｎｍの吸収）で測定したところ、還元処理により１０μｇ／ｃｍ２ヒト免疫グロブリンＧが平膜から脱離された。
【００５６】
また、還元後のポリスルホン平膜１ｃｍ２を再度２，２’−ジチオジピリジンを用いてピリジルスルフィド基を導入し、ＨＳ−ＩｇＧを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液１ｍｌに室温で４．５時間浸漬することにより、再度ＨＳ−ＩｇＧをポリスルホン平膜にジスルフィド結合を介して固定化することができた。
【００５７】
４．ピリジルジスルフィド基を持つヒト免疫グロブリン誘導体の作製
ＮａＣｌを０．１５ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に精製ヒト免疫グロブリンＧ（シグマ社製）を５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、さらに、ＳＰＤＰを２０ｍＭとなるように溶解したジメチルスルホキシド溶液を抗体１モルに対して１０モル添加し、室温で３０分反応させた後、ＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）で高分子量分画を精製し、ＳＰＤＰ基を持つヒト免疫グロブリン誘導体（以下、ＳＰＤＰ−ＩｇＧと略す）を合成した。
【００５８】
５．メルカプト基をもつ平膜の作製
ポリスルホン（テイジンアモコ社製”ユーデル”（登録商標）Ｐ−３５００）１８重量部、ポリビニルピロリドン（ＢＡＳＦ社製”Ｋ３０”（登録商標））９重量部をＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド７２重量部、水１重量部に加え、９０℃、１４時間加熱溶解した。この溶液を０．１ｍｍスペーサー付きのガラス板に塗布し、ドクターブレードにて溶液を引き延ばしたものを水中にいれて、凝固させ、ポリスルホン／ポリビニルピロリドンブレンドからなる平膜状の材料を作製した。
【００５９】
上記、ポリスルホン／ポリビニルピロリドンブレンド材料を十分水洗した後、１重量％のポリエチレンイミン（分子量１万、和光純薬製）水溶液に浸漬して、２５ｋＧｙにてγ線照射した。放射線処理した支持体は、十分水洗した。
【００６０】
上記のアミノ基を含有するポリスルホン平膜をＮａＣｌを０．１５ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にＳＰＤＰを２０ｍＭに溶解したジメチルスルホキシド溶液を最終ＳＰＤＰ濃度が１．２ｍＭとなるように添加した溶液に２．５時間浸漬した（室温）。反応させた平膜をメタノールで洗浄した後、水洗した材料を２５ｍＭのＤＴＴを含むリン酸緩衝液で還元し、表面にメルカプト基をもつポリスルホン平膜を得た。
【００６１】
６．比較例１
５．で作製した平膜１ｃｍ２を４．で得られたＳＰＤＰ−ＩｇＧを０．５ｍｇ／ｍｌあるいは３．６ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液１ｍｌに室温で４．５時間浸漬した後、ＮａＣｌを０．１５ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。その後、平膜を、外部刺激として２５ｍＭのＤＴＴを含むリン酸緩衝液に浸漬して還元し、この還元液をＨＰＬＣおよび吸光度（２８０ｎｍの吸収）で測定した。その結果、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で反応させた平膜からはヒト免疫グロブリンＧの脱離は確認されなかったが、３．６ｍｇ／ｍｌの濃度で反応させた平膜からは２７．５μｇのヒト免疫グロブリンＧの脱離が確認された。
【００６２】
７．メルカプト基を持つヒト免疫グロブリン誘導体の作製（２）
０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）に３．５ｍｇ／ｍｌで溶解した精製ヒト免疫グロブリンＧ（シグマ社製）１ｍＬに２−イミノチオラン（シグマ社製）を２．５ｍｇ添加し、室温で６０分反応させた後、ＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）で高分子量分画に精製し、リン酸緩衝液に置換して、メルカプト基を有するヒト免疫グロブリン誘導体（以下、ＨＳ−ＩｇＧ（２）と略す）を合成した。
【００６３】
８．実施例２
２．で作製したピリジルジスルフィド基を持つ平膜１ｃｍ２を７．で合成したＨＳ−ＩｇＧ（２）０．５ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液に室温で３時間振盪させた。３時間後のリン酸緩衝液に含まれるヒト免疫グロブリンＧの吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、ＨＳ−ＩｇＧ（２）が平膜に固定化されていることが確認された。また、この膜を２５ｍＭのＤＴＴを含むリン酸緩衝液で還元し、脱離されたヒト免疫グロブリン量をＨＰＬＣおよび吸光度（２８０ｎｍの吸収）で測定したところ、還元処理により２５μｇ／ｃｍ２のヒト免疫グロブリンＧが平膜から脱離された。
【００６４】
９．メルカプト基をもつ抗体可変部位（Ｆａｂ）フラグメントの作製
ヒト免疫グロブリンＧ１０ｍｇとペプシン１ｍｇを１ｍｌの０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解し、３７℃で２４時間消化分解した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲカラムによりリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いてＦ（ａｂ’）２フラグメントを回収した。回収したＦ（ａｂ’）２フラグメントに１０ｍＭとなるように２−メルカプトエタノールを添加し、３７℃で１．５時間還元を行い、ＰＤ−１０カラムで高分子量分画に精製し、メルカプト基をもつ抗体可変部位（Ｆａｂ）フラグメント（Ｆａｂ−ＳＨ）を得た。
【００６５】
１０．実施例３
２．で作製したピリジルジスルフィド基を持つ平膜１ｃｍ２を９．で合成したＦａｂ−ＳＨ  ０．１５ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液に室温で３時間振盪させた。３時間後のリン酸緩衝液に含まれるＦａｂフラグメントの吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、Ｆａｂフラグメントが平膜に固定化されていることが確認された。また、この膜を２５ｍＭのＤＴＴを含むリン酸緩衝液で還元反応し、脱離されたＦａｂフラグメントをＨＰＬＣおよび吸光度（２８０ｎｍの吸収）で測定したところ、還元処理により５５μｇ／ｃｍ２のＦａｂフラグメントが平膜から脱離された。
【００６６】
１１．ピリジルジスルフィド基あるいはメルカプト基を導入した修飾ポリスチレン繊維の作製
５０重量比の海成分（４６重量比のポリスチレンと４重量比のポリプロピレンの混合物）と５０重量比の島成分（ポリプロピレン）とからなる海島型複合繊維（厚さ：２．６デニール、島の数１６）を、３５ｇのＮ−メチロール−α−クロロアセトアミド、２３２．５ｇのニトロベンゼン、２３２．５ｇの９８％硫酸、０．５ｇのパラホルムアルデヒドの混合液を１０℃で２時間反応させた。繊維をニトロベンゼンで洗浄し、メタノールで反応を停止させた。これによりクロロアセトアミドメチル化架橋ポリスチレン繊維（以下、ＡＭＰＳｔ繊維と略す）を得た。得られたＡＭＰＳｔ繊維を編地とした（以下、ＡＭＰＳｔ編地と略す）。  ポリエチレンイミン（分子量１万、和光純薬製）０．５７ｇを、トリエチルアミン０．９５ｇ、ジメチルスルホキシド４８．５ｇに溶解し、この溶液に上で作製したＡＭＰＳｔ編地を１．０２ｇ（クロロ含量２．６ｍｍｏｌ相当）加え攪拌した。反応は３０℃で３時間行った。その後ジメチルスルホキシド、メタノール、純水で洗浄した。得られたＡＭＰＳｔ編地をＡＭＰＳｔ編地１とする。
【００６７】
上記のアミノ基を含有するＡＭＰＳｔ編地１をＮａＣｌを０．１５ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にＳＰＤＰを２７ｍＭに溶解したジメチルスルホキシド溶液に０．５時間浸漬し（室温）、リン酸緩衝液洗浄して、ピリジルジスルフィド基を導入した修飾ポリスチレン繊維（ＳＰＤＰ編地）を得た。また、この繊維の一部を１００ｍＭのＤＴＴを含むリン酸緩衝液で還元し、表面にメルカプト基をもつを編地（ＳＨ編地）を得た。
【００６８】
１２．実施例４
１１．で作製したＳＰＤＰ編地１ｃｍ２を１．で合成したＨＳ−ＩｇＧ０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液１ｍｌに室温で３時間振盪させた。３時間後のリン酸緩衝液に含まれるヒト免疫グロブリンＧの吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が消失し、ＨＳ−ＩｇＧが平膜に固定化されていることが確認された。また、この膜を２５ｍＭのＤＴＴを含むリン酸緩衝液で還元し、脱離されたヒト免疫グロブリン量をＨＰＬＣおよび吸光度（２８０ｎｍの吸収）で測定したところ、還元処理により１５０μｇ／ｃｍ２ヒト免疫グロブリンＧが平膜から脱離された。
【００６９】
また、還元後の編地１ｃｍ２を再度２，２’−ジチオジピリジンを用いてピリジルスルフィド基を導入し、ＨＳ−ＩｇＧを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液１ｍｌに室温で４時間浸漬することにより、再度ＨＳ−ＩｇＧをポリスルホン平膜にジスルフィド結合を介して固定化することができた。
【００７０】
１３．比較例２
１１．で作製したＳＨ編地１ｃｍ２を４．で得られたＳＰＤＰ−ＩｇＧを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液１ｍｌに室温で３時間浸漬した後、ＮａＣｌを０．１５ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した後、編地を外部刺激として２５ｍＭのＤＴＴを含むリン酸緩衝液に浸漬して還元し、還元液をＨＰＬＣおよび吸光度（２８０ｎｍの吸収）で測定したが、ヒト免疫グロブリンＧは確認できなかった。
【００７１】
１４．ピリジルジスルフィド基をもつ中空糸膜の作製
ポリスルホン（テイジンアモコ社製”ユーデル”（登録商標）Ｐ−３５００）１８部、ポリビニルピロリドン（ＢＡＳＦ社製”Ｋ３０”（登録商標））９部をＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド７２部、水１部に加え、９０℃、１４時間加熱溶解した。この製膜原液を外径０．３ｍｍ、内径０．２ｍｍのオリフィス型二重円筒型口金より吐出し芯液としてジメチルアセトアミド５８部、水４２部からなる溶液を吐出させ、乾式長３５０ｍｍを通過した後、水１００％の凝固浴に導き中空糸膜を得た。
【００７２】
中空糸膜を１００００本束ね、中空糸膜中空部を閉塞しないようにポリウレタン系ポッティング剤で両末端をモジュールケースに固定し、モジュールを作製した後、ポリエチレンイミン（分子量１００万、ＢＡＳＦ社製）０．１重量％を含む水溶液を中空糸膜内側から外側にかけてろ過をかけることにより、ポリエチレンイミンを中空糸膜内表面に集積して充填した後、２５ｋＧｙでγ線照射した。中空糸膜を水洗した後、ＮａＣｌを０．１５ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にＳＰＤＰを２０ｍＭに溶解したジメチルスルホキシド溶液を最終ＳＰＤＰ濃度が１．２ｍＭとなるように添加した溶液を中空糸膜内部に室温で１時間灌流し、中空糸膜内表面をＳＰＤＰ化した後、膜をメタノールで洗浄し、内表面にピリジルジスルフィド基をもつポリスルホン中空糸膜を得た。
【００７３】
１５．実施例５
１４．で得られたモジュールを解体して中空糸膜（約２０ｃｍ）を取り出し、中空糸膜を３６本束ね、中空糸膜中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で両末端をモジュールケースに固定し、ミニモジュールを作製した。該ミニモジュールの直径は約７ｍｍ、長さは約１０ｃｍである。ミニモジュール内部に７．で得られたＨＳ−ＩｇＧ（２）を０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液１．５ｍｌを室温で灌流し、３時間後リン酸緩衝液の免疫グロブリンの吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が消失し、免疫グロブリンがポリスルホン中空糸膜内表面にジスルフィド結合を介して固定化されたことが確認された。
【００７４】
ここで得られた免疫グロブリン固定化中空糸膜内部に外部刺激として２５ｍＭのＤＴＴを含むリン酸緩衝液を１時間灌流して、ジスルフィド結合を還元し、脱離された免疫グロブリン量をＨＰＬＣで測定したところ、還元処理により２７０μｇの免疫グロブリンが脱離された。
【００７５】
【発明の効果】
本発明によれば、特定の細胞を簡単、大量、高回収率で分離、回収するための対外循環用リガンド固定化材料を製造するにあたって、比較的低濃度でリガンドを固定化することができる。このため、少量しか入手できないリガンドや高価なリガンドを使用する場合、少量のリガンドを使用するだけでジスルフィド結合を介してリガンドを固定化した材料を提供できる。