(57)【要約】【課題】５０℃の高温条件下で広範な種類の複素環硫黄化合物を分解できる微生物を見出し、これを用いて石油等を効率的に脱硫する手段を提供する。【解決手段】５０℃においてジベンゾチオフェン類やベンゾチオフェン類、ナフトチオフェン類、及びこれらのアルキル誘導体などの複素環硫黄化合物のＣ−Ｓ結合を選択的に切断する能力を有する新規脱硫菌マイコバクテリウム・フレイＷＵ−０１０３株を得た。これを用いることにより、石油、特に軽油や重油から効率良く脱硫することができる。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
５０℃において複素環硫黄化合物のＣ−Ｓ結合を選択的に切断する能力を有する微生物又は該微生物が産生する酵素を用いて前記複素環硫黄化合物を分解することを特徴とする複素環硫黄化合物の分解方法。
【請求項２】
前記複素環硫黄化合物がジベンゾチオフェン類、ベゾチオフェン類、ナフトチオフェン類、及びこれらのアルキル誘導体であることを特徴とする請求項１記載の複素環硫黄化合物の分解方法。
【請求項３】
前記複素環硫黄化合物は石油又は石炭に含まれるものであることを特徴とする請求項１又は２記載の複素環硫黄化合物の分解方法。
【請求項４】
前記微生物がマイコバクテリウム属に属する微生物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の複素環硫黄化合物の分解方法。
【請求項５】
前記微生物がマイコバクテリウム・フレイに属する微生物又はそれらの変異株であることを特徴とする請求項４記載の複素環硫黄化合物の分解方法。
【請求項６】
前記微生物がマイコバクテリウム・フレイＷＵ−０１０３株又はその変異株であることを特徴とする請求項５記載の複素環硫黄化合物の分解方法。
【請求項７】
複素環硫黄化合物のＣ−Ｓ結合を選択的に切断する能力を有するマイコバクテリウム・フレイＷＵ−０１０３株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、多種の複素環硫黄化合物を脱硫する能力を有する新規微生物及びその利用方法に関する。さらに詳しくは、軽油等の化石燃料中に含まれる、ジベンゾチオフェン（ｄｉｂｅｎｚｏｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）類、ベンゾチオフェン（ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）類、ナフトチオフェン（ｎａｐｈｔｈｏ［１，２−ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）類、に加えて、難除去性の長鎖アルキルチオフェン誘導体を含むアルキルチオフェン類を、５０℃の高温条件下でＣ−Ｓ結合を選択的に切断する微生物又は該微生物が産生する酵素を利用した、効率的脱硫方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
【特許文献１】
特開平２０００−２４５４６６号公報
【特許文献２】
特開２００１−２３１５４６号公報
【非特許文献１】
Ｈｏｕａｌｌａ，Ｍ．，　ｅｔ　ａｌ．，　ｃａｔａｌｔ．，　６１，　５２３−５２７（１９８０）
【非特許文献２】
Ｋａｇｅ，　Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｎｄ．　Ｅｎｇ．　Ｃｈｅｍ．　Ｒｅｓ．，　３１，　１５７７−１５８０（１９９２）
【非特許文献３】
Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｏ，Ｄ．Ｊ．，Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，　７３，　３９−４５（１９９４）
【非特許文献４】
Ｌｅｅ，　Ｍ．Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ，．　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　１５６４１４ｄ　ｖｏｌ．　８５　（１９７６）
【非特許文献５】
Ｉｓｂｉｓｔｅｒ，　Ｊ．　Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏａｌ，　ｉｎ　Ｃｏａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ｓｅｒ．　９，　ｐ．　６２７（１９８５）
【非特許文献６】
Ｋｉｌｂａｎｅ，　Ｊ．　Ｊ．，　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，　Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ，　３，　６９−７０（１９９０）
【非特許文献７】
Ｋｒｏｐｐ，　Ｋ．Ｇ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　６３，　３４６３−３４７３　（１９９７）
【非特許文献８】
古屋俊樹　他、２００２年度日本農芸化学会大会講演要旨集、ｐ．１１　（２００２）
【０００３】
石油のような炭化水素燃料から硫黄を除去する方法としては、現在水素化脱硫法が主流である。水素化脱硫は、石油留分中の硫黄化合物を金属触媒等の存在下で水素と反応させ、硫黄を硫化水素として除去する、極めて完成度の高い脱硫プロセスである。
【０００４】
しかし、金属触媒は、基質特異性が低いため多様な硫黄化合物を分解し、化石燃料全体の硫黄含量を低下させる目的には適しているが、複素環式有機硫黄化合物などの特定の硫黄化合物に対してはその脱硫効果が不十分となる。その原因の一つは、複素環式有機硫黄化合物中の硫黄原子の周囲に存在する置換基による立体障害であり（Ｈｏｕａｌｌａ，Ｍ．，　ｅｔ　ａｌ．，　ｃａｔａｌｔ．，　６１，　５２３−５２７（１９８０））、実際、水素化脱硫後の軽油中にはベンゾチオフェン類、ジベンゾチオフェン類の種々のアルキル化誘導体が著量残存することが知られている（Ｋａｇｅ，　Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｎｄ．　Ｅｎｇ．　Ｃｈｅｍ．　Ｒｅｓ．，　３１，　１５７７−１５８０（１９９２））。水素化脱硫により、これらの複素環硫黄化合物を完全に脱硫しようとすると、より高い反応温度や圧力、水素添加量の増大が必要となり、多くの設備投資とコストが必要となる。
【０００５】
一方、微生物による酵素反応を利用して比較的穏和な条件下で脱硫を行う方法としてバイオ脱硫法がある（Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｏ，Ｄ．Ｊ．，Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，　７３，　３９−４５（１９９４））。バイオ脱硫法では、酵素の高い基質特異性により、水素化脱硫では脱硫できなかった複素環有機硫黄化合物中の硫黄分も比較的穏和な条件で除去することが可能である。
【０００６】
バイオ脱硫法としては、まずＣ−Ｃ結合攻撃型の細菌による脱硫反応が報告されたが　（Ｌｅｅ，　Ｍ．Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ，．　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　１５６４１４ｄ　ｖｏｌ．　８５　（１９７６））、これらは原油の脱硫においては、１）化石燃料中に多く存在する２位及び３位が置換されたジベンゾチオフェン類を分解できない、２）炭素骨格破壊経路が燃料のエネルギー含量を低下させる、３）炭素骨格破壊経路の主要産物が３−ヒドロキシ−２−ホルミルベンゾチオフェンのため十分な脱硫ができない、といった問題点があった。
【０００７】
次いで、硫黄化合物中のＣ−Ｓ結合を特異的に切断して、硫黄を硫酸塩の形で遊離し脱硫する細菌が報告された。Ｃ−Ｓ結合切断型の反応はエネルギーロスにつながるＣ−Ｃ結合の切断を行わないため、硫黄原子のみを硫黄化合物から除去でき、脱硫反応としては理想的である。例えば、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）ＣＢ１、アシネトバクター・エスピー（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．）ＣＢ２がチオフェンの硫黄を硫酸塩に変換すること（Ｉｓｂｉｓｔｅｒ，　Ｊ．　Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏａｌ，　ｉｎ　Ｃｏａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ｓｅｒ．　９，　ｐ．６２７（１９８５））や、ロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＡＴＣＣ５３９６８がジベンゾチオフェンをヒドロキシビフェニルと硫酸塩に変換させること（Ｋｉｌｂａｎｅ，　Ｊ．　Ｊ．，　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，　Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ，　３，　６９−７０（１９９０））などの報告がある。しかしながら、これらの菌株ではアルキル化ベンゾチオフェン類やナフトチオフェン類に対する分解活性はない。
【０００８】
Ｃ−Ｓ結合に特異的なアルキル化ベンゾチオフェン分解菌としては、ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．）Ｔ０９株（特開平２０００−２４５４６６号）が知られているが、これにはナフトチオフェンの分解活性はない。
【０００９】
一方、ナフトチオフェン分解菌としては、Ｋｒｏｐｐらがシュードモナス・エスピーＷ１株について報告しているが（Ｋｒｏｐｐ，　Ｋ．Ｇ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　６３，　３４６３−３４７３　（１９９７））、この菌株はＣ−Ｃ結合切断型であり真の意味での脱硫は困難である。
【００１０】
Ｃ−Ｓ結合に特異的なナフトチオフェン類分解菌としては、古屋らがロドコッカス・エスピーＷＵ−Ｋ２Ｒ株を報告している（古屋俊樹　他、２００２年度日本農芸化学会大会講演要旨集、ｐ．１１　（２００２））。この報告によれば、ＷＵ−Ｋ２Ｒ株はベンゾチオフェンおよびナフトチオフェンを脱硫することは可能であるが、ジベンゾチオフェンの分解活性はない。一方、特開２００１−２３１５４６号に開示されているＷＵ−Ｆ１株はアルキル化ナフトチオフェンおよびジベンゾチオフェンを脱硫することは可能であるが、ベンゾチオフェンの分解活性はない。
【００１１】
以上のとおり、種々の脱硫菌が報告されているが、それぞれの菌株の基質特異性は限られたものであり、広範な複素環硫黄化合物の分解に対応できるものはない。しかも、各菌株はそれぞれ異なった至適作用条件（温度、ｐＨ等）を有するため、複数の菌株を組み合わせて脱硫を行うことにも困難がある。例えば、上述のＷＵ−Ｋ２Ｒ株の至適作用温度は３０〜３７℃であり、ＷＵ−Ｆ１株は４０〜５０℃であり、これらを組み合わせたとしても、効率的な脱硫を行うことはできない。
【００１２】
ところで、石油精製プロセス中の脱硫行程では、高温・高圧条件下で分別蒸留や脱硫反応が行われる。したがって、水素化脱硫では分解できなかったジベンゾチオフェン類、ベンゾチオフェン類、ナフトチオフェン類、長鎖アルキルチオフェン誘導体などの硫黄化合物を分解するために、従来の石油精製プロセス中にバイオ脱硫プロセスを組み込もうとした場合、常温近くまで石油留分を冷却することなく、より高い冷却途中の温度でバイオ脱硫反応ができるほうが望ましい。上述の例でいうと、ＷＵ−Ｋ２Ｒ株の至適作用温度である常温の３０〜３７℃よりも、ＷＵ−Ｆ１株の４０〜５０℃の高温条件下の方が望ましい。
【００１３】
また、通常３０〜３７℃付近でほとんどの微生物は増殖するが、４５℃を超えても生育可能な微生物は限られてくる。このため、４０〜５０℃、特に５０℃近辺の高温条件下でバイオ脱硫反応を行うことは、雑菌汚染対策となる。通常の工業的プロセスにおいては、無菌操作は不可能であり、この雑菌汚染対策は非常に効果的であると考えられる。
【００１４】
石油製品中には、複素環硫黄化合物としてジベンゾチオフェン類、ベンゾチオフェン類、ナフトチオフェン類及び難除去性のそれらの長鎖アルキル誘導体などが存在する。そして、前述のとおり、ある種のアルキル化ジベンゾチオフェン類のほかアルキル化ベンゾチオフェン類、アルキル化ナフトチオフェン類、アルキル化ベンゾナフトチオフェン類は、通常の水素化脱硫及び微生物脱硫を経た後でも、軽油中に残存している。そこで、ジベンゾチオフェン類、ベンゾチオフェン類、ナフトチオフェン類に加え、高度難除去性硫黄化合物である、４，６−，ジプロピルジベンゾチオフェン等の長鎖アルキル化複素環硫黄化合物を高温条件下で、Ｃ−Ｓ結合を特異的に分解し、脱硫できる微生物があれば、脱硫効率は飛躍的に向上することが期待される。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
すなわち、本発明の解決すべき課題は、５０℃の高温条件下で通常のジベンゾチオフェン類、ベンゾチオフェン類、ナフトチオフェン類に加え、高度難除去性複素環式硫黄化合物である長鎖アルキルチオフェン誘導体を含む、広範な種類の複素環硫黄化合物から硫黄を分離、除去できる微生物を見出し、これを用いて石油製品等を効率的に脱硫する手段を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、５０℃の高温条件下で複素環硫黄化合物のＣ−Ｓ結合を選択的に切断し、ジベンゾチオフェン類やベンゾチオフェン類、ナフトチオフェン類に加え、難除去性の長鎖アルキルチオフェン誘導体を分解し、硫黄を除去できる新規脱硫菌マイコバクテリウム・フレイＷＵ−０１０３株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９６２）を得た。該菌株は、多種の複素環硫黄化合物に作用し、これを用いることにより、石油製品等から効率よく硫黄を分離、除去できることを見出し、本発明を完成した。
【００１７】
本発明の請求項１記載の複素環硫黄化合物の分解方法は、５０℃において複素環硫黄化合物のＣ−Ｓ結合を選択的に切断する能力を有する微生物又は該微生物が産生する酵素を用いて前記複素環硫黄化合物を分解することを特徴とする。
【００１８】
また、本発明の請求項２記載の複素環硫黄化合物の分解方法は、前記請求項１記載において、前記複素環硫黄化合物がジベンゾチオフェン類、ベゾチオフェン類、ナフトチオフェン類、及びこれらのアルキル誘導体であることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明の請求項３記載の複素環硫黄化合物の分解方法は、前記請求項１又は２において、前記複素環硫黄化合物は石油又は石炭に含まれるものであることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明の請求項４記載の複素環硫黄化合物の分解方法は、前記請求項１〜３のいずれか１項において、前記微生物がマイコバクテリウム属に属する微生物であることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明の請求項５記載の複素環硫黄化合物の分解方法は、前記請求項４において、前記微生物がマイコバクテリウム・フレイに属する微生物又はそれらの変異株であることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明の請求項６記載の複素環硫黄化合物の分解方法は、前記請求項５において、前記微生物がマイコバクテリウム・フレイＷＵ−０１０３株又はその変異株であることを特徴とする。
【００２３】
さらに、本発明の請求項７は、複素環硫黄化合物のＣ−Ｓ結合を選択的に切断する能力を有するマイコバクテリウム・フレイＷＵ−０１０３株である。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２５】
本発明にかかる複素環硫黄化合物の分解方法は、５０℃において複素環硫黄化合物のＣ−Ｓ結合を選択的に切断する能力を有する微生物又は該微生物が産生する酵素を用いることを特徴とするものである。
【００２６】
本発明において、「複素環硫黄化合物」とは、例えばジベンゾチオフェン類、ベンゾチオフェン類、ナフトチオフェン類、及びそれらの化合物に長鎖アルキル基が結合した長鎖アルキルチオフェン誘導体などが挙げられる。また、「長鎖アルキル基」とは、炭素数が１〜１２程度のものまでを含む。
【００２７】
また、前記「Ｃ−Ｓ結合を選択的に切断する」とは、複素環硫黄化合物中のＣ−Ｓ結合を特異的に切断するが、Ｃ−Ｃ結合には作用しないか、あるいは作用してもＣ−Ｓ結合に比較して極めて小さな作用しか示さないことを意味する。
【００２８】
本発明に使用する微生物は、非対称構造を有する複素環硫黄化合物をＣ−Ｓ結合を選択的に切断する能力を有するものであれば特に限定されないが、ジベンゾチオフェン類やベンゾチオフェン類、ナフトチオフェン類に加え、難除去性硫黄化合物である長鎖アルキルチオフェン誘導体類を広く分解する能力を有することが好ましい。
【００２９】
また、前記微生物はマイコバクテリウム属に属する微生物が好ましく、マイコバクテリウム・フレイに属する菌株がより好ましく、特にマイコバクテリウム・フレイＷＵ−０１０３株又はその変異株が最も好ましい。なお「マイコバクテリウム・フレイＷＵ−０１０３株の変異株」とは、ＷＵ−０１０３株を起源とする菌株であって、ＷＵ−０１０３株と同様に多種の複素環硫黄化合物のＣ−Ｓ結合を選択的に切断する能力を有しているが、他の１以上の性質においてＷＵ−０１０３株と異なる菌株を意味する。なお、マイコバクテリウム・フレイＷＵ−０１０３株については後段にて詳述する。
【００３０】
使用する微生物はどのような形態のものであってもよく、培養菌体で無く休止菌体でもよい。休止菌体は、例えば、以下のようにして調製することができる。まず、新鮮な培地に対し適当量、例えば１〜２％容量の種菌を接種し、５０℃で往復あるいは回転振とう培養を行う。この際、種菌としては対数増殖期後期のものが好適であるが、対数増殖期初期から定常期のいずれの状態の菌でも構わない。また、接種量も必要に応じて容量を増減できる。
【００３１】
培地としては常温性脱硫菌培地が好適であるが他の培地でも構わない。培地の栄養源としては通常用いられているものが広く用いられる。炭素源としては利用可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、エタノールなどが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、カゼイン加水分解物、などの有機栄養物質も使用できる。脱硫反応に影響を与える可能性のある硫黄化合物を含まない培地で培養するのが望ましい場合には、塩化アンモニウムのような無機窒素化合物も使用できる。しかし、マイコバクテリウム・フレイＷＵ−０１０３株は硝酸還元性を有していないため、硝酸塩は無機窒素源として好ましくない。そのほか、リン酸塩、炭酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、ナトリウム、鉄、マンガン、亜鉛、モリブデン、タングステン、銅、ビタミン類、などが必要に応じて用いられる。
【００３２】
通常の培養は、約５０℃で振盪又は通気条件下で好気的に２日ないし３日行う。ただし、培養温度は４５℃が好適であるが、３０℃〜５５℃近辺の温度範囲にある任意の温度でも構わない。培養して得られた菌体を遠心分離等の手段により分離集菌することにより、休止菌体を得ることができるが、一度集菌した菌体を洗浄後再度集菌することが望ましい。この際、菌体は対数増殖期中期から後期で集菌するのが好適であるが、対数増殖期初期から定常期の菌体でも構わない。分離集菌のための手段としては、遠心分離の他、濾過や沈降分離などいかなる方法を用いても構わない。菌体の洗浄には、生理食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等のいかなる緩衝液も使用でき、また水を使用して菌体洗浄を行っても構わない。
【００３３】
本発明の複素環硫黄化合物の分解方法では、上記微生物に代えて該微生物が産生する酵素を用いてもよい。該酵素は、非対称構造を有する複素環硫黄化合物をＣ−Ｓ結合を選択的に切断する能力を有するものであれば特に限定されない。このような酵素は、上記微生物の菌体を含む培養産物から、その酵素活性を指標としてクロマトグラフィー等を利用して単離精製することができる。酵素は一旦単離精製されれば、公知の方法により該酵素の遺伝子を単離して、これを導入した形質転換体を作製することにより、大量生産して用いることも可能である。
【００３４】
本発明の複素環硫黄化合物の分解方法の対象となる、複素環硫黄化合物が含まれる物質は、微生物等が分解可能な該複素環硫黄化合物を含むものであれば特に限定されない。このような物質としては、石油（原油及び精製された各種石油製品の両者を含む）や石炭などの化石燃料を例示することができるが、人工的に調製された試料であってもよい。また、該物質は固形状物質であってもよいが、液状物質または液体と混合したスラリー状の方が好ましい。液状であれば微生物や酵素を作用させることが容易なためである。
【００３５】
前記物質との接触は、微生物や酵素のＣ−Ｓ結合切断能が発揮させ得る態様であれば特に限定されない。具体的な接触方法としては、上記微生物等を脱硫対象物質（液状物質）に添加し、反応させる方法や上記微生物等を緩衝液等に懸濁し、これに複素硫黄化合物を添加し、反応させる方法などを例示することができる。
【００３６】
以下に後者の方法について詳述する。微生物の菌体（休止菌体が好ましい）を懸濁させる緩衝液としては、ｐＨ６〜７が好適であるが、他のｐＨでも構わない。また、緩衝液の代わりに、水や培地等を使用しても構わない。菌体懸濁液の濃度は、ＯＤ６６０が１〜５０の間が好適であるが、必要に応じて増減できる。
【００３７】
基質としては、多種の複素硫黄化合物、例えば、ジベンゾチオフェン類、ベンゾチオフェン類、ナフトチオフェン類、及びこれらのアルキル化誘導体などを例示することができる。濃度は５０〜５０００ｐｐｍが好適であるが、必要に応じて増減できる。また、複素環有機硫黄化合物を添加する前に反応温度と同じ温度に反応液を予備加熱してもよい。反応は５０℃で行うのが好適であるが、３０℃〜５５℃の任意の温度でもよく、また反応時間は１〜２時間が好適であるが、必要に応じて増減できる。また、菌体と複素環硫黄化合物の反応は、テトラデカン等の有機溶媒を添加した油水２相系で行っても構わない。この場合、用いる有機溶媒はテトラデカンの他、Ｃ８〜Ｃ２０のｎ−パラフィンやケロシン、軽油、重油などでもよい。また、必要ならば反応液上方の気相を完全あるいは部分的に酸素で置換封入しても構わない。
【００３８】
上記反応は、菌体に代えて、前述の該菌体が産生する酵素を用いても良い。
【００３９】
反応後の生成物の抽出は以下のようにして行うことができる。反応液を６規定の塩酸を用いてｐＨ２前後に調整した後、酢酸エチルを用いて撹拌抽出する。しかし、抽出に使用する溶媒は、酢酸エチルに限定されるものではなく、目的とする反応生成物が抽出できるものであればいずれの溶媒を用いても構わない。酢酸エチルの量は反応液に対し等量が好適であるが、必要に応じて増減できる。また、反応生成物の分離は、逆相Ｃ１８カラムあるいは順相シリカカラムを用いて行うことができるが、必要に応じて他のカラムを用いても構わない。また、分離に使用する方法はこれらの方法に限定されるものではなく、反応生成物が分離できる方法であればいかなる方法を用いても構わない。反応生成物の分析は、液体クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー／質量スペクトル分析、ガスクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー／質量スペクトル分析、ガスクロマトグラフィー／原子発光検出分析、ガスクロマトグラフィー／フーリエ変換赤外分光分析、核磁気共鳴法、などを使用して行うことができる。また、必要に応じて他の分析方法を併せて利用しても構わない。さらに、分析に使用する方法はこれらの方法に限定されるものではなく、反応生成物が分析できる方法であればいずれの方法を使用しても構わない。
【００４０】
本発明の複素環硫黄化合物の分解方法は、化石燃料の脱硫に利用することができる。即ち、マイコバクテリウム属に属し、５０℃の高温条件下において、複素環硫黄化合物のＣ−Ｓ結合を選択的に切断する能力を有する微生物又は該微生物が産生する酵素を化石燃料に接触させることにより、化石燃料中に含まれる複素環硫黄化合物のＣ−Ｓ結合を切断し、硫黄原子を硫酸イオンの形で化石燃料から除去することが可能になる。特に、本発明の複素環硫黄化合物の分解方法は、アルキル化チオフェン誘導体を多く含む軽油や重油の脱硫に好適である。
【００４１】
次に、本発明に用いられる微生物の好適な一例である、前記マイコバクテリウム・フレイＷＵ−０１０３株について説明する。ＷＵ−０１０３株は、本発明者らが日本各地から採取した多種類の土壌を分離源としてスクリーニングによって見出したもので、ジベンゾチオフェン類、ベンゾチオフェン類、ナフトチオフェン類に加えて難除去性のこれらの長鎖アルキル誘導体を含む複素環硫黄化合物を５０℃の高温条件下で分解する能力を有する。
【００４２】
マイコバクテリウム・フレイＷＵ−０１０３株は、特許生物寄託センターにＦＥＲＭ　Ｐ−１８９６２（受託日：平成１４年８月５日）として寄託されている。
【００４３】
マイコバクテリウム・フレイＷＵ−０１０３株の培養は微生物の通常の培養法にしたがって行えばよいが、培養の形態は液体培養が好ましい。培地の栄養源としては通常用いられているものが広く用いられる。炭素源としては利用可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、エタノールなどが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、カゼイン加水分解物、などの有機栄養物質も使用できる。脱硫反応に影響を与える可能性のある硫黄化合物を含まない培地で培養するのが望ましい場合には、塩化アンモニウムのような無機窒素化合物も使用できる。しかし、マイコバクテリウム・フレイＷＵ−０１０３株は硝酸還元性を有していないため、硝酸塩は無機窒素源として好ましくない。そのほか、リン酸塩、炭酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、ナトリウム、鉄、マンガン、亜鉛、モリブデン、タングステン、銅、ビタミン類、などが必要に応じて用いられる。培養は、ｐＨ６〜８、温度５０℃付近の温度で振盪又は通気条件下で好気的に２〜３日間行うことが好ましい。
【００４４】
マイコバクテリウム・フレイＷＵ−０１０３株は、ジベンゾチオフェン類、ベンゾチオフェン類、ナフトチオフェン類、などの多種の複素環硫黄化合物を分解する性質を有している。例えば、本微生物マイコバクテリウム・フレイＷＵ−０１０３株によるナフトチオフェン類の分解の結果、分解産物として生成する主たる化合物は後述の実施例１に示すように２’−ヒドロキシナフチルエテン、２−（２’−ヒドロキシナフチルエテン）−１−アール及びナフトフランであった。また、ジベンゾチオフェンの代謝経路は４Ｓ経路（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，　Ｊ　Ｒ；　Ｏｌｓｏｎ，　Ｅ　Ｓ；　Ｓｔａｎｌｅｙ，　Ｄ　Ｃ；　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｉｂｅｎｚｏｔｈｉｏｐｈｅｎｅ：　ａ　ｓｕｌｆｕｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐａｔｈｗａｙ，　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，　Ｖｏｌｕｍｅ　１０７，　Ｉｓｓｕｅ　１，　１９９３，　Ｐａｇｅｓ　３１−３５）であった。
【００４５】
前記生成物の構造解析は、例えばナフトチオフェンを唯一の硫黄源として含む培地で本微生物株を５０℃で培養し、得られた培養液を遠心分離後、上清を約ｐＨ２に調整後酢酸エチル抽出した抽出物を用いる。抽出物は主として液体クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー／質量スペクトル分析により分析すればよい。必要に応じて、１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル分析、紫外線吸収スペクトル分析を行ってもよい。その結果、ナフトチオフェンは脱硫されて２’−ヒドロキシナフチルエテン、２−（２’−ヒドロキシナフチルエテン）−１−アール及びナフトフランに変換されることが確認されている。
【００４６】
以上詳述したとおり、本発明の複素環硫黄化合物の分解方法は、５０℃において複素環硫黄化合物のＣ−Ｓ結合を選択的に切断する能力を有する微生物又は該微生物が産生する酵素を用いて前記複素環硫黄化合物を分解するものであり、前記複素環硫黄化合物としては、ジベンゾチオフェン類、ベゾチオフェン類、ナフトチオフェン類、及びこれらのアルキル誘導体など、石油又は石炭などに含まれる広範な多種の複素環硫黄化合物が該当する。そして、前記微生物として、マイコバクテリウム属に属する微生物、好ましくはマイコバクテリウム・フレイに属する微生物又はそれらの変異株、さらに好ましくはマイコバクテリウム・フレイＷＵ−０１０３株又はその変異株を用いるものである。したがって、ジベンゾチオフェン類、ベンゾチオフェン類、ナフトチオフェン類に加え、高度難除去性複素環式硫黄化合物である長鎖アルキルチオフェン誘導体を含む、広範な種類の複素環硫黄化合物を分解することができ、複素環硫黄化合物が石油又は石炭が燃焼する際に空気中に拡散し、環境汚染の原因となることを防止することができる。また、また、５０℃の高温条件下で脱硫を行うことにより、従来の石油精製プロセス中に本発明による複素環硫黄化合物の分解方法を組み込んだ場合、常温近くまで石油留分を冷却すること無しに、より高い冷却途中の温度で脱硫反応を行うことができるので、石油中、特に軽油、重油等に残存する高度難除去性複素環硫黄化合物の脱硫効率を飛躍的に向上させることができる。さらに、５０℃の高温条件下で脱硫を行うことにより、雑菌の生育が制限されるので、脱硫プロセス中の雑菌汚染対策の効果がある。
【００４７】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４８】
〔実施例１〕　ナフトチオフェンを高温（５０℃）で分解する菌の分離
【００４９】
１．微生物の単離
目的の微生物の分離には、ナフトチオフェンを唯一の硫黄源として含む表１のＡＦ培地を使用した。まず、シリコン栓付試験管（容量２７ｍｌ、直径１８ｍｍ×長さ１８０ｍｍ）に培地５ｍｌ、５ｇ／ｌのナフトチオフェン／エタノール溶液を０．０５ｍｌ、及び日本各地より採集した土壌１スパーテル（約０．５ｇ）を加え、５０℃で一週間振盪培養（振盪速度２４０ｒｐｍ）し集積培養を行った。培地に濁りの認められた試料については、その培養液０．２ｍｌを新鮮な同培地に加え、集積培養を３〜４回繰り返した。これらの集積培養により菌体の増殖が認められた試料について、培養物を生理食塩水にて希釈した。得られた希釈液を、ＬＢ培地（Ｂａｃｔｏ　Ｔｒｙｐｔｏｎｅ　１０ｇ／Ｌ、酵母エキス　５ｇ／Ｌ、　ＮａＣｌ　１０ｇ／Ｌ）に、最終濃度１．５％となるように寒天を加えて作製したプレート上に塗布し、５０℃で静置培養してコロニーを形成させた。形成したコロニーの一部をナフトチオフェンを含む培地に植菌し、菌体の生育とナフトチオフェンの分解を調べた。ナフトチオフェンの分解が認められたコロニーを選択し、前述の一連の操作を２〜３回繰り返すことにより目的の菌株を単離した。尚、単一での生育が見られなかった菌株についてはチアミンなどの補因子の添加や炭素源などの変更を行い、単一菌株での生育培地を決定した。表２に改良した培地であるＡＮ培地の組成を示す。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
【表２】
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【００５２】
２．微生物の同定
生育の確認されたサンプルから１株、ＷＵ−０１０３株を分離し、その性質を調べた結果、マイコバクテリウム・フレイと同定された。また、ＷＵ−０１０３株の脱硫についての至適作用条件は、５０℃前後、ｐＨ４〜９であった。表３にＷＵ−０１０３株の菌学的性質を示す。
【００５３】
【表３】
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【００５４】
３．微生物の代謝産物
マイコバクテリウム・フレイＷＵ−０１０３株によるベンゾチオフェンとナフトチオフェンの分解代謝産物についてＧＣ／ＭＳにより分析した結果、代謝産物として前者はベンゾチオフェンスルホン及びベンゾフラン、後者は２’−ヒドロキシナフチルエテン、２（２’−ヒドロキシナフチルエテン）−１−アール及びナフトフランが検出された。これらの化合物はベンゾチオフェン及びナフトチオフェンを添加しない場合は検出されなかった。同様にジベンゾチオフェンの代謝産物として２−ヒドロキシビフェニルが検出された。以上の結果は、ＷＵ−０１０３株が硫黄原子を特異的に除去する経路で複素環硫黄化合物を分解することを強く示している。
【００５５】
〔実施例２〕　微生物による複素環硫黄化合物の分解
【００５６】
１．非対称構造を有する複素環硫黄化合物類の分解
マイコバクテリウム・フレイＷＵ−０１０３株を用いて複素環硫黄化合物類の分解率を測定した。複素環硫黄化合物の分解には各種化合物を唯一の硫黄源として表２のＡＮ培地を使用した。まず、シリコン栓付試験管（容量２７ｍｌ、直径１８ｍｍ×長さ１８０ｍｍ）に培地５ｍｌ、終濃度が０．２７ｍＭとなるように複素環硫黄化合物／エタノール溶液を５０μｌ、複素環硫黄化合物が揮発性の場合は複素環硫黄化合物／テトラデカン溶液として５０μｌ添加し、前培養液を５０μｌ（１％）加え、５０℃で２日間振とう培養（振とう速度２４０ｒｐｍ）を行った。培養後は培養液を酸性にした後、酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグラフィーで分解率を測定した。複素環硫黄化合物の分解率を表４に示す。
【００５７】
【表４】
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【００５８】
２．長鎖アルキルジベンゾチオフェン誘導体の分解
マイコバクテリウム・フレイＷＵ−０１０３株を用いて長鎖アルキルジベンゾチオフェン誘導体の分解率を測定した。長鎖アルキルジベンゾチオフェン誘導体の分解には各種化合物を唯一の硫黄源として表２のＡＮ培地を使用した。まず、シリコン栓付試験管（容量２７ｍｌ、直径１８ｍｍ×長さ１８０ｍｍ）に培地５ｍｌ、終濃度が０．６ｍＭとなるように複素環硫黄化合物／エタノール溶液を５０μｌ、油水二相系反応の場合は複素環硫黄化合物／テトラデカン溶液を１ｍｌ、前培養液を５０μｌ（１％）加え、５０℃で４日間振とう培養（振とう速度２４０ｒｐｍ）を行った。培養後は培養液を酸性にした後、酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグラフィーで分解率を測定した。複素環硫黄化合物の分解率を表５に示す。
【００５９】
【表５】
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【００６０】
以上の結果から、マイコバクテリウム・フレイＷＵ−０１０３株は複素環硫黄化合物の構造が対称、非対称に関わらず、唯一の硫黄源として生育、分解可能であった。また特に難脱硫性の長鎖アルキルジベンゾチオフェン誘導体も脱硫可能であったことから、ＷＵ−０１０３株は複素環硫黄化合物について広範な分解活性を有することが確認された。さらに油水系での分解率が高く、実際の微生物脱硫に好適であることを強く示唆している。また、ＤＢＴ類は水に難溶であるため水系反応においてＤＢＴ類は完全に溶解せず懸濁状態（スラリー状）になっているが、ＷＵ−０１０３株は水系においてもＤＢＴ類の分解を行うことは懸濁状態の石炭などに含まれる有機硫黄化合物に対しても好適であることを強く示唆している。
【００６１】
〔実施例３〕　水素化脱硫後の軽油の脱硫
マイコバクテリウム・フレイＷＵ−０１０３株を用いて水素化脱硫後の軽油の脱硫量について測定した。軽油の脱硫には硫黄含有量３９０ｐｐｍの軽油を唯一の硫黄源として表２のＡＮ培地を使用した。まず、シリコン栓付振とうフラスコ（容量５００ｍｌ、直径１０８ｍｍ×長さ２２７ｍｍ×首径３２ｍｍ）に培地１００ｍｌ、硫黄含有量３９０ｐｐｍの軽油を２ｍｌ添加した。前培養液を１ｍｌ（１％）加え、５０℃で１０日間振とう培養（振とう速度２４０ｒｐｍ）を行った。培養後は遠心分離により上層の軽油を回収し、ガスクロマトグラフィーで軽油の硫黄含有量を測定した。その結果、図１に示されるように、ＷＵ−０１０３株は初期濃度３９０ｐｐｍの軽油を１１０ｐｐｍまで脱硫した。また、反応前に検出された複数の有機硫黄化合物のピークが消失（あるいは極端に減少）していることも明らかである。このことはＷＵ−０１０３株が実際の軽油の脱硫に適用可能であることを強く示している。
【００６２】
以上、実施例１〜３の結果から、マイコバクテリウム・フレイＷＵ−０１０３株はジベンゾチオフェンやナフトチオフェン、ベンゾチオフェン及びそれらのアルキル誘導体である複素環硫黄化合物をＣ−Ｓ結合を特異的に切断して脱硫する能力を持ち、軽油、重油等に残存する高度難除去性複素環式硫黄化合物の除去に適していることがわかった。また、その脱硫活性の至適温度（５０℃前後）を考慮すると、石油製品の中でも水素化脱硫後の軽油の脱硫に適していると考えられた。
【００６３】
【発明の効果】
本発明の請求項１記載の複素環硫黄化合物の分解方法は、５０℃において複素環硫黄化合物のＣ−Ｓ結合を選択的に切断する能力を有する微生物又は該微生物が産生する酵素を用いて前記複素環硫黄化合物を分解するものであり、従来の石油精製プロセス中に本発明による複素環硫黄化合物の分解方法を組み込んだ場合、常温近くまで石油留分を冷却すること無しに、より高い冷却途中の温度で脱硫反応を行うことができるので、脱硫効率を飛躍的に向上させることができる。さらに、５０℃の高温条件下で脱硫を行うことにより、雑菌の生育が制限されるので、脱硫プロセス中の雑菌汚染対策の効果がある。
【００６４】
本発明の請求項２記載の複素環硫黄化合物の分解方法は、前記請求項１記載において、前記複素環硫黄化合物がジベンゾチオフェン類、ベゾチオフェン類、ナフトチオフェン類及びこれらのアルキル誘導体であり、石油中、特に軽油、重油等に残存する高度難除去性複素環硫黄化合物の脱硫効率を飛躍的に向上させることができる。
【００６５】
本発明の請求項３記載の複素環硫黄化合物の分解方法は、前記請求項１又は２において、前記複素環硫黄化合物は石油又は石炭に含まれるものであり、複素環硫黄化合物が石油又は石炭が燃焼する際に空気中に拡散し、環境汚染の原因となることを防止することができる。
【００６６】
本発明の請求項４記載の複素環硫黄化合物の分解方法は、前記請求項１〜３のいずれか１項において、前記微生物がマイコバクテリウム属に属する微生物であり、請求項５記載の複素環硫黄化合物の分解方法は、前記請求項４において、前記微生物がマイコバクテリウム・フレイに属する微生物又はそれらの変異株であり、請求項６記載の複素環硫黄化合物の分解方法は、前記請求項５において、前記微生物がマイコバクテリウム・フレイＷＵ−０１０３株又はその変異株であるので、５０℃の高温条件下でジベンゾチオフェン類、ベンゾチオフェン類、ナフトチオフェン類に加え、高度難除去性複素環式硫黄化合物である長鎖アルキルチオフェン誘導体を含む、広範な種類の複素環硫黄化合物を分解することができる。
【００６７】
本発明の請求項７は、複素環硫黄化合物のＣ−Ｓ結合を選択的に切断する能力を有するマイコバクテリウム・フレイＷＵ−０１０３株であり、５０℃の高温条件下でジベンゾチオフェン類、ベンゾチオフェン類、ナフトチオフェン類に加え、高度難除去性複素環式硫黄化合物である長鎖アルキルチオフェン誘導体を含む、広範な種類の複素環硫黄化合物を分解する能力を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例３における軽油の硫黄含有量の測定結果を示すガスクロマトグラフィーのチャートである。
【図１】
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