(57)【要約】【課題】カルボキシル基に、カルボキシル基に結合しうる求核性試薬が結合したヒアルロン酸誘導体の親水性を向上し、単離して固体としたヒアルロン酸誘導体の水性溶媒への溶解を容易とする方法及び親水性が向上したヒアルロン酸誘導体を提供する。【解決手段】下記の工程を含む製造方法によってヒアルロン酸誘導体を製造する。工程Ａ：ヒアルロン酸のカルボキシル基と、カルボキシル基に結合しうる求核性試薬とを水性溶媒中で結合させてヒアルロン酸誘導体溶液を得る工程；工程Ｂ：工程Ａで得たヒアルロン酸誘導体溶液をアルカリ性として親水性を向上したヒアルロン酸誘導体の溶液を得る工程。【選択図】　　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程を含むヒアルロン酸誘導体の製造方法。
工程Ａ：ヒアルロン酸のカルボキシル基と、カルボキシル基と結合しうる求核性試薬とを水性溶媒中で反応させてヒアルロン酸誘導体溶液を得る工程；
工程Ｂ：工程Ａで得たヒアルロン酸誘導体溶液をアルカリ性として、親水性を向上したヒアルロン酸誘導体の溶液を得る工程。
【請求項２】
更に下記の工程を含む請求項１記載のヒアルロン酸誘導体の製造方法。
工程Ｃ：工程Ｂで得た溶液を中和する工程。
【請求項３】
更にヒアルロン酸誘導体を単離する工程を含む請求項１又は２記載のヒアルロン酸誘導体の製造方法。
【請求項４】
下記の工程を含むヒアルロン酸誘導体の親水性向上方法。
工程Ａ：ヒアルロン酸のカルボキシル基と、カルボキシル基と結合しうる求核性試薬とを水性溶媒中で反応させてヒアルロン酸誘導体溶液を得る工程；
工程Ｂ：工程Ａで得たヒアルロン酸誘導体溶液をアルカリ性として、親水性を向上したヒアルロン酸誘導体の溶液を得る工程。
【請求項５】
更に下記工程を含むことを特徴とする請求項４記載のヒアルロン酸誘導体の親水性向上方法。
工程Ｃ：工程Ｂで得た溶液を中和する工程。
【請求項６】
ヒアルロン酸のカルボキシル基と、カルボキシル基と結合しうる求核性試薬とが結合したヒアルロン酸誘導体であって、固形の状態のヒアルロン酸誘導体を１．０重量％で水性溶媒に溶解して得られる水性溶液が２４℃の温度条件下、５．０ｋｇ／ｃｍ２の加圧下で多孔質フィルター（孔径（ポアサイズ）が０．４５μｍで直径が２５ｍｍ）を１分間に２ｍＬ以上通過可能であることを特徴とするヒアルロン酸誘導体。
【請求項７】
下記工程を経て得られうるヒアルロン酸誘導体。
工程Ａ：ヒアルロン酸のカルボキシル基と、カルボキシル基に結合しうる求核性試薬とを水性溶媒中で反応させてヒアルロン酸誘導体溶液を得る工程；
工程Ｂ：工程Ａで得たヒアルロン酸誘導体溶液をアルカリ性として親水性を向上したヒアルロン酸誘導体の溶液を得る工程；
工程Ｃ：工程Ｂで得た溶液を中和する工程。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はヒアルロン酸がカルボキシル基において、カルボキシル基と結合しうる求核性試薬と結合したヒアルロン酸誘導体の親水性を向上させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒアルロン酸はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルクロン酸とがβ１，３結合で結合してなる二糖単位が繰り返してβ１，４結合して構成された多糖であり、グリコサミノグリカンの一種である。ヒアルロン酸は重量平均分子量が１０，０００〜３０，０００，０００であるが、各二糖単位にカルボキシル基及び多数のヒドロキシル基を有していることから極めて親水性が高く、例えば自重の約１０００倍の水を保持することが可能である。このようなヒアルロン酸が示す高い親水性には、特に基本骨格中各二糖単位に存在するカルボキシル基が大きく関与していると考えられる。
【０００３】
ヒアルロン酸のカルボキシル基に、カルボキシル基と結合しうる求核性試薬を結合させてヒアルロン酸を修飾して得られるヒアルロン酸の誘導体としては、例えば光反応性ヒアルロン酸が挙げられる（例えば特開平８−１４３６０４号等）。この先行文献に記載された光反応性ヒアルロン酸は反応液中では溶解した状態であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、ヒアルロン酸のカルボキシル基への、カルボキシル基と結合しうる求核性試薬の結合はヒアルロン酸の親水性の低下を招くという問題点が存在した。すなわち二糖単位１個あたり０．０５個以上のカルボキシル基にこのような求核性試薬を結合したヒアルロン酸の誘導体は、一度単離して固形とした後に再度水に溶解しようとしてもゲル化あるいは白濁して完全には溶解しないという問題点が存在した。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者はヒアルロン酸のカルボキシル基と、カルボキシル基と結合しうる求核性試薬とを結合した際に、生じたヒアルロン酸誘導体の親水性が低下するという問題を解決すべく鋭意検討した。その結果、ヒアルロン酸にカルボキシル基と結合しうる求核性試薬を結合した後に反応液をアルカリ性とすることで、そのヒアルロン酸誘導体を固体として再度水に溶解させる際に容易に溶解させることができる「親水性が向上したヒアルロン酸誘導体」が得られることを発見し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち本発明は以下の通りである。
（１）　下記の工程を含むヒアルロン酸誘導体の製造方法。
工程Ａ：ヒアルロン酸のカルボキシル基と、カルボキシル基と結合しうる求核性試薬とを水性溶媒中で反応させてヒアルロン酸誘導体溶液を得る工程；
工程Ｂ：工程Ａで得たヒアルロン酸誘導体溶液をアルカリ性として、親水性を向上したヒアルロン酸誘導体の溶液を得る工程。
（２）　更に下記の工程を含む（１）記載のヒアルロン酸誘導体の製造方法。
工程Ｃ：工程Ｂで得た溶液を中和する工程。
（３）　更にヒアルロン酸誘導体を単離する工程を含む（１）又は（２）記載のヒアルロン酸誘導体の製造方法。
（４）　下記の工程を含むヒアルロン酸誘導体の親水性向上方法。
工程Ａ：ヒアルロン酸のカルボキシル基と、カルボキシル基と結合しうる求核性試薬とを水性溶媒中で反応させてヒアルロン酸誘導体溶液を得る工程；
工程Ｂ：工程Ａで得たヒアルロン酸誘導体溶液をアルカリ性として、親水性を向上したヒアルロン酸誘導体の溶液を得る工程。
（５）　更に下記工程を含むことを特徴とする（４）記載のヒアルロン酸誘導体の親水性向上方法。
工程Ｃ：工程Ｂで得た溶液を中和する工程。
（６）　ヒアルロン酸のカルボキシル基と、カルボキシル基と結合しうる求核性試薬とが結合したヒアルロン酸誘導体であって、固形の状態のヒアルロン酸誘導体を１．０重量％で水性溶媒に溶解して得られる水性溶液が２４℃の温度条件下、５．０ｋｇ／ｃｍ２の加圧下で多孔質フィルター（孔径（ポアサイズ）が０．４５μｍで直径が２５ｍｍ）を１分間に２ｍＬ以上通過可能であることを特徴とするヒアルロン酸誘導体。
（７）　下記工程を経て得られうるヒアルロン酸誘導体。
工程Ａ：ヒアルロン酸のカルボキシル基と、カルボキシル基に結合しうる求核性試薬とを水性溶媒中で反応させてヒアルロン酸誘導体溶液を得る工程；
工程Ｂ：工程Ａで得たヒアルロン酸誘導体溶液をアルカリ性として親水性を向上したヒアルロン酸誘導体の溶液を得る工程；
工程Ｃ：工程Ｂで得た溶液を中和する工程；
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
（１）本発明製造方法
本発明製造方法は下記の工程を含むヒアルロン酸誘導体の製造方法である。
工程Ａ：ヒアルロン酸のカルボキシル基と求核性試薬（光反応性基を含む求核性試薬を除く）とを水性溶媒中で結合させてヒアルロン酸誘導体溶液を得る工程；工程Ｂ：工程Ａで得たヒアルロン酸誘導体溶液をアルカリ性とする工程。
【０００８】
本発明製造方法はヒアルロン酸のカルボキシル基と、カルボキシル基と結合しうる求核性試薬とを水性溶媒中で結合させてヒアルロン酸誘導体溶液（水溶液）を得る工程（工程Ａ）を含む。工程Ａにおいて使用されるヒアルロン酸の由来は特に限定はされない。ヒアルロン酸は例えば動物由来、微生物由来等何れであっても使用することができる。ヒアルロン酸の重量平均分子量は特に限定されず、例えば１０，０００〜５，０００，０００が例示され、好ましくは２０，０００〜３，０００，０００が挙げられる。なお、本発明製造方法に使用されるヒアルロン酸は塩を形成していない遊離した状態でも良く、また薬学的に許容されうる塩の状態でも良い。ヒアルロン酸の薬学的に許容されうる塩とは、例えばナトリウム塩、カリウム塩のようなアルカリ金属イオンとの塩、又はマグネシウム塩、カルシウム塩のようなアルカリ土類金属イオンとの塩が挙げられる。ヒアルロン酸誘導体を生体に適用するための医用材料等に使用する場合に生体への親和性が特に高いことから、使用されるヒアルロン酸塩はアルカリ金属イオンとの塩が好ましく、その中でもナトリウムイオンとの塩が特に好ましい。
【０００９】
本発明製造方法における求核性試薬は求核剤と呼ばれる試薬であって、化学大辞典（株式会社東京化学同人発行）によると「核すなわち電子不足反応中心に対して高い親和性をもつ試剤である。一般に非共有電子対をもち、負電荷をもつものもあり、他の分子を攻撃し結合を形成する場合、結合電子２個を供与する試剤である。広い意味ではルイス塩基としての挙動を示す試剤である。」と定義付けられている。しかし、本発明製造方法における「カルボキシル基と結合しうる求核性試薬」とはこのような求核剤であって、更にヒアルロン酸のカルボキシル基の炭素原子に親和性を有し、結合の形成に電子対を供与する攻撃性を有し、具体的には該カルボキシル基と結合することできる物質である。本発明製造方法における好ましい「カルボキシル基と結合しうる求核性試薬」の例としては、例えば蛍光標識物質（４−アミノフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等）、アミノ酸（例えばロイシン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン、フェニルアラニン、トラネキムサン酸等）又はその誘導体（例えばメチルエステル、エチルエステル、ベンジルエステル等、又はスペーサー（アミノアルキルアルコール又はアルキルアミン等）が結合したアミノ酸（ロイシン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン、フェニルアラニン、トラネキムサン酸等））或いはその重合体（すなわちペプチド、タンパク質等（例えばエンケファリン、ブラジキニン、オキシトシン、アンジオテンシン等）、縮合剤（水溶性カルボジイミド（例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ・ＨＣｌ）、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド−メト−ｐ−トルエンスルホネート、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチルカルボジイミド塩酸塩等））、その他の医薬品（メトトレキセート、ダウノマイシン、マイトマイシンＣ、シトシンアラビノシド、アドリアマイシン、ベスタチン等）又はスペーサー（アミノアルキルアルコール又はアルキルジアミン）が結合した医薬品（インドメタシン、アセメタシン、サラゾスルファピリジン、メトトレキセート、ベスタチン等）、脂肪酸（プロピオン酸、カプロン酸、カプリル酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸等）にスペーサー（アミノアルキルアルコール又はアルキルジアミン等）が結合したスペーサー結合脂肪酸が好ましくは挙げられる。
【００１０】
これらの求核性試薬の分子量は、１００乃至１５，０００であることが好ましく、特に２００乃至１０，０００であることがより好ましい。このような分子量の求核性試薬をヒアルロン酸のカルボキシル基に結合させるとヒアルロン酸の親水性が低下するが、特に本発明製造方法によって親水性の低下が押さえられ、ヒアルロン酸が本来有する親水性が維持されるからである。
【００１１】
なお、光によって架橋する性質を有する光反応性基は本発明製造方法において使用される「カルボキシル基と結合しうる求核性試薬」からは除外されることが好ましい。ここで光反応性基とは、紫外線照射によって光二量化反応又は光重合反応を生ずる化合物であって、ケイ皮酸、置換ケイ皮酸（例えばアミノケイ皮酸（ベンゼン環のいずれかの水素がアミノ基に置換したケイ皮酸））、アクリル酸、マレイン酸、フマル酸、ソルビン酸、クマリン、チミン又はこれらの誘導体を示す。
【００１２】
ヒアルロン酸と求核性試薬との結合は、例えば水溶性カルボジイミド等の水溶性の縮合剤を使用する方法、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド（ＨＯＳｕ）やＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）等の縮合補助剤と上記の縮合剤とを使用する方法、活性エステル法、酸無水物法等が挙げられる。これらの中では水性溶媒の存在下の反応として、水溶性の縮合剤を使用する方法又は反応補助剤と水溶性の縮合剤とを使用する方法が好ましい。このようなヒアルロン酸のカルボキシル基と求核性試薬との結合はカルボン酸エステル又は酸アミド結合でなされることが好ましい。従って、求核性試薬はその構造中にカルボン酸エステルを形成するためのヒドロキシル基又は酸アミドを形成するためのアミノ基が存在する物質であることが最も好ましい。なお、本来アミノ基が存在しない化合物に上述したアミノアルキルアルコールやアルキルジアミンなどのスペーサーを結合させてアミノ基を導入した化合物も本発明における求核性試薬には包含されることはいうまでもない。
【００１３】
本発明製造方法における水性溶媒とは水、水混和性の有機溶媒、又はこれらの混合溶媒が挙げられる。水混和性の有機溶媒とは、例えばジオキサン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトン、アルコール（メタノール、エタノール等）等が挙げられる。
【００１４】
本発明におけるヒアルロン酸への、カルボキシル基と結合しうる求核性試薬の導入率（例えば吸光度の測定やアミノ酸分析、質量分析等の方法で測定することができる）は、０．０５〜４０％、好ましくは０．１〜３０％、最も好ましくは０．３〜２５％である。このような導入率の範囲内であると、ヒアルロン酸が有する生体親和性及び保水性を維持しつつ、求核性試薬が有する特有の性質も有したヒアルロン酸誘導体が得られるからである。なお、この値は反応させるヒアルロン酸のモル数と求核性試薬のモル数とを調節することで適宜変更、調節することが可能である。
【００１５】
本発明製造方法はヒアルロン酸誘導体を反応液の状態で、反応液をアルカリ性とする処理（アルカリ処理）をする工程を含む（工程Ｂ）。工程Ｂにおける反応液をアルカリ性とする処理において、反応液をアルカリ性とするために加える塩基は特に限定はされず、反応液に加えることで反応液がアルカリ性となる性質を有する有機塩基又は反応液に加えることで反応液がアルカリ性となる性質を有する無機塩基の何れであっても使用することができる。しかしながら、水性溶媒によってなる反応液中での処理を考慮すると無機塩基の方が安定性の面から好ましい。そして無機塩基の中では、ヒアルロン酸の低分子化や求核性試薬の分解等に影響を及ぼす畏れが低いことから水酸化ナトリウムのような、反応液を強アルカリ性（ｐＨ１２以上）とする無機塩基よりはむしろ炭酸水素ナトリウムや炭酸ナトリウムのような、反応液を弱アルカリ性とする無機塩基の方が好ましい。ここで、アルカリ処理のｐＨ条件は７．２〜１１、好ましくは７．５〜１０が例示される。
【００１６】
上記の塩基（有機塩基又は無機塩基）の使用量や処理時間は目的とする親水性の程度（後述のフィルター通過性の有無を親水性の程度の判定基準とする）に応じて適宜調節される。例えばヒアルロン酸１ｇ相当量に対して炭酸水素ナトリウム２５０ｍｇ（ヒアルロン酸のモル数に対して５倍量）を使用する場合は４〜６時間、炭酸水素ナトリウム５００ｍｇ以上（ヒアルロン酸のモル数に対して１０倍量以上）を使用する場合は２〜４時間撹拌処理することで親水性が充分に高められたヒアルロン酸誘導体が得られる。
【００１７】
このように調製されたヒアルロン酸誘導体の溶液を、場合により有機酸（酢酸等）又は無機酸（塩酸等）による中和を行う（工程Ｃ）。中和を行わずにヒアルロン酸誘導体の単離・精製を行うことも可能であるが、中和を行うことが好ましい。中和することにより単離されたヒアルロン酸誘導体におけるカルボキシル基（求核性試薬が結合していないもの）が塩を形成して安定性の面で優れるからである。
【００１８】
本発明製造方法は、アルカリ性処理後（又はその後の中和後）の溶液からヒアルロン酸誘導体を単離する工程（工程Ｄ又はＤ’）を含むことが好ましい。ヒアルロン酸誘導体の単離はヒアルロン酸誘導体の溶液に極性有機溶媒を添加することで行うことができる。ここで極性有機溶媒は例えばエタノール、メタノール、アセトン等が例示され、特にヒアルロン酸誘導体を医用材料等に用いる場合にはエタノールが好ましい。エタノールは生体への毒性が低いからである。ヒアルロン酸誘導体の単離を行う際には、予め溶液に塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、又は、酢酸ナトリウム等のような塩を加えておくことが好ましい。塩は特に塩化ナトリウムが好ましい。塩化ナトリウムは生体への影響が低いからである。塩の添加量は、最終濃度で０．３％以上、好ましくは０．５〜１０％、最も好ましくは４〜８％が挙げられる。塩析の効果により、ヒアルロン酸誘導体を効率的に沈殿として単離できるからである。ただし、上記添加する塩の量に関わらず、エタノール等の非極性有機溶媒を使用することでヒアルロン酸誘導体を沈殿として単離することが可能である。
【００１９】
沈殿として得られたヒアルロン酸誘導体に、必要に応じてエタノール洗浄や乾燥等の各処理を適用することも可能である。
【００２０】
（２）本発明物質
本発明物質はヒアルロン酸のカルボキシル基と、カルボキシル基に結合しうる求核性試薬とが結合したヒアルロン酸誘導体であって、固形の状態のヒアルロン酸誘導体を１．０重量％で水性溶媒に溶解して得られる水性溶液が２４℃の条件下、５．０ｋｇ／ｃｍ２の加圧下で多孔質フィルター（孔径（ポアサイズ）が０．４５μｍで直径が２５ｍｍ）を１分間に２ｍｌ以上通過可能であることを特徴とするヒアルロン酸誘導体である。
【００２１】
本発明物質は上記本発明製造方法によって調製されるヒアルロン酸誘導体である。
このような本発明物質の化学構造は、本発明製造方法によるアルカリ処理を行なう前の「求核性試薬が結合したヒアルロン酸の誘導体」と同じであるが、高次構造（立体構造）は異なっていると考えられる。この相違は物性の相違として把握することが可能である。
【００２２】
従って、本発明物質であるヒアルロン酸誘導体は、その水性溶液中における分子分散特性が高いという物性によって従来のヒアルロン酸誘導体と明確に区別される。この分子分散特性を示す物性としては多孔質フィルターの通過性が挙げられる。そして多孔質フィルターの通過性の高さは上記の分子分散特性の高さを示す。なお、多孔質フィルターの通過性は、多孔質フィルターを通過した前後の水性溶液中のヒアルロン酸誘導体の濃度を比較することにより確認することが可能である。上記条件で本発明物質のヒアルロン酸誘導体水溶液を通過させた場合、通過前後で水溶液中のヒアルロン酸誘導体の濃度の変化がない。
【００２３】
本発明物質におけるヒアルロン酸は例えば動物由来、微生物由来等何れであっても使用することができる。ヒアルロン酸の重量平均分子量は特に限定されず、例えば１０，０００〜５，０００，０００が例示され、好ましくは２０，０００〜３，０００，０００が挙げられる。なお、本発明物質におけるヒアルロン酸は塩を形成していない遊離した状態でも良く、また薬学的に許容されうる塩の状態でも良い。ヒアルロン酸の薬学的に許容されうる塩とは、例えばナトリウム塩、カリウム塩のようなアルカリ金属イオンとの塩、又はマグネシウム塩、カルシウム塩のようなアルカリ土類金属イオンとの塩が挙げられる。ヒアルロン酸誘導体を生体に適用するための医用材料等に使用する場合に生体への親和性が特に高いことから、使用されるヒアルロン酸塩はアルカリ金属イオンとの塩が好ましく、その中でもナトリウムイオンとの塩が特に好ましい。
【００２４】
本発明物質における求核性試薬は求核剤と呼ばれる試薬であって、化学大辞典（株式会社東京化学同人発行）によると「核すなわち電子不足反応中心に対して高い親和性をもつ試剤である。一般に非共有電子対をもち、負電荷をもつものもあり、他の分子を攻撃し結合を形成する場合、結合電子２個を供与する試剤である。広い意味ではルイス塩基としての挙動を示す試剤である。」と定義付けられている。しかし、本発明物質における「カルボキシル基と結合しうる求核性試薬」とはこのような求核剤であって、更にヒアルロン酸のカルボキシル基の炭素原子に親和性を有し、結合の形成に電子対を供与する攻撃性を有し、具体的には該カルボキシル基と結合することできる物質である。本発明製造方法における好ましい「カルボキシル基と結合しうる求核性試薬」の例としては、、例えば蛍光標識物質（４−アミノフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等）、アミノ酸（例えばロイシン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン、フェニルアラニン、トラネキムサン酸）又はその誘導体（例えばメチルエステル、エチルエステル、ベンジルエステル等、スペーサー（アミノアルキルアルコール又はアルキルアミン等）が結合したアミノ酸（ロイシン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン、フェニルアラニン、トラネキムサン酸等））或いは重合体（ペプチド、タンパク質等（例えばエンケファリン、ブラジキニン、オキシトシン、アンジオテンシン等）、縮合剤（水溶性カルボジイミド（例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ・ＨＣｌ）、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド−メト−ｐ−トルエンスルホネート、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチルカルボジイミド塩酸塩等））、その他の生理活性物質（メトトレキセート、ダウノマイシン、マイトマイシンＣ、シトシンアラビノシド、アドリアマイシン、ベスタチン等）又はスペーサー（アミノアルキルアルコール又はアルキルジアミン）を結合した生理活性物質（インドメタシン、アセメタシン、サラゾスルファピリジン、メトトレキセート、ベスタチン等）、脂肪酸（プロピオン酸、カプロン酸、カプリル酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸等）にスペーサー（アミノアルキルアルコール又はアルキルジアミン等）が結合したスペーサー結合脂肪酸が好ましくは挙げられる。
【００２５】
これらの求核性試薬の分子量は、１００乃至１５，０００であることが好ましく、特に２００乃至１０，０００であることがより好ましい。このような分子量の求核性試薬をヒアルロン酸のカルボキシル基に結合させるとヒアルロン酸の親水性が低下するが、特に本発明物質の親水性の低下が押さえられ、ヒアルロン酸が本来有する親水性が維持されるからである。
【００２６】
このような求核性試薬をヒアルロン酸のカルボキシル基に単に結合すると、通常はヒアルロン酸の誘導体の親水性は極めて低いものとなり、一度固形の状態としたヒアルロン酸の誘導体は再度水に充分に溶解することはない。特に上述した多孔質フィルター通過性は極めて低いものとなる。しかし、本発明物質はその製造工程（本発明製造方法）において反応液をアルカリ性とする工程が含まれていることから、多孔質フィルター通過性が極めて高く、この点で従来のヒアルロン酸の誘導体とは明確に区別される。
【００２７】
なお、光によって架橋する性質を有する光反応性基を有する求核性試薬は本発明物質における求核性試薬からは除外される。ここで光反応性基とは、紫外線照射によって光二量化反応又は光重合反応を生ずる化合物であって、ケイ皮酸、置換ケイ皮酸（例えばアミノケイ皮酸（ベンゼン環のいずれかの水素がアミノ基に置換したケイ皮酸））、アクリル酸、マレイン酸、フマル酸、ソルビン酸、クマリン、チミン又はこれらの誘導体を示す。
【００２８】
ヒアルロン酸のカルボキシル基と求核性試薬との反応は共有結合であり、その中でも特に酸エステル結合又は酸アミド結合が好ましい。
【００２９】
本発明物質におけるヒアルロン酸への求核性試薬の導入率（例えば吸光度の測定やアミノ酸分析、質量分析等の公知の方法で測定することもできる）は、０．０５〜４０％、好ましくは０．１〜３０％、最も好ましくは０．３〜２５％である。このような導入率の範囲内であると、ヒアルロン酸が有する生体親和性及び保水性を維持しつつ、求核性試薬が有する特有の性質も有したヒアルロン酸誘導体が得られるからである。なお、この値は反応させるヒアルロン酸のモル数と求核性試薬のモル数とを調節することで適宜変更、調節することが可能である。
【００３０】
このような本発明物質のうち、特に求核性試薬として蛍光標識物質が結合した本発明物質は例えばヒアルロン酸やそれを使用した医薬・医用材料の生体内での代謝を観察・追跡するためのマーカとして使用することが可能である。また、求核性試薬として生理活性物質やペプチド、タンパク質等が結合した本発明物質は例えば徐放性製剤等の医用材料として使用することが可能である。例えば生理活性物質としてインドメタシン等の鎮痛剤をヒアルロン酸のカルボキシル基に結合させて得た本発明物質は、関節等の密封環境に投与することで潤滑作用と鎮痛作用とを有する優れた医用材料として使用することが可能である。
【００３１】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に詳説する。
試験例
フィルター通過性試験
１．０重量％で被検物質を溶解した５ｍＭリン酸緩衝生理食塩水を調製する。２４℃条件下５．０ｋｇ／ｃｍ２の加圧下で多孔質フィルター（孔径０．４５μｍで直径２５ｍｍ）に上記で調製した被検物質の溶液を通過させ、１分間あたりの通貨量（ｍｌ）を測定する。２ｍｌ以上通過した場合を「○」、２ｍｌ未満通過した場合を「△」、通過しない場合を「×」で示す。
【００３２】
実施例１
４−アミノフルオレセイン（４−Ａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）導入ヒアルロン酸
重量平均分子量９０万のヒアルロン酸１．０ｇ（２．５ｍｍｏｌ／二糖単位）を水１５０ｍＬ／ジオキサン７５ｍＬに溶解させた後、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド３．０ｍｍｏｌ／水１ｍＬ、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ１．５ｍｍｏｌ／水１ｍＬ、４−アミノフルオレセイン１．５ｍｍｏｌ／水１ｍＬを順次加え、一昼夜攪拌した。
【００３３】
（１）対照の調製（アルカリ処理を行なわず調製）
上記反応液から２２．５ｍＬを抜き出し、塩化ナトリウム１００ｍｇを加え攪拌した後エタノール５０ｍＬに加え沈殿させ、沈殿物を８０％エタノールで４回、エタノールで２回洗浄し、４０℃にて一晩真空乾燥した。８１ｍｇの橙色固体を得た。カルボキシル基への４−アミノフルオレセインの導入率を吸光度により算出したところ０．３％だった。
【００３４】
（２）被検物質の調製（アルカリ処理を行なって調製）
（１）の２２．５ｍＬ抜き出した残りの反応液に炭酸水素ナトリウムを５００ｍｇ加え、４時間３０分攪拌した。反応液に酢酸を加え中和後、塩化ナトリウム６．０ｇを加え攪拌した。エタノール５００ｍＬに加え沈殿させ、沈殿物を８０％エタノールで４回、エタノールで３回洗浄し、４０℃にて一晩真空乾燥した。８３０ｍｇの橙色固体を得た。カルボキシル基への４−アミノフルオロセインの導入率は０．３％だった。
【００３５】
（３）フィルター通過性の検討
上記（１）及び（２）で得た対照物質と被検物質について試験例記載の方法でフィルター通過性を検討した。その結果、対照物質は繊維状の不溶物であったが、被検物質は透明の溶液であった。対照はフィルターを全く通過しなかったが、被検物質は容易にフィルターを通過した（表１）。
【００３６】
【表１】
表１
2004018750.tif 000002
【００３７】
実施例２
ロイシンメチルエステル導入ヒアルロン酸
重量平均分子量９０万のヒアルロン酸４００ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ／二糖単位）を水６０ｍＬ／ジオキサン３０ｍＬに溶解させた後、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド０．６ｍｍｏｌ／水２ｍＬ、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ０．３ｍｍｏｌ／水２ｍＬ、ロイシンメチルエステル塩酸塩０．３ｍｍｏｌ／水２ｍＬを順次加え、２時間３０分攪拌した。
【００３８】
（１）対照の調製（アルカリ処理を行なわず調製）
上記反応液から４５ｍＬを抜き出し、塩化ナトリウム１．２ｇを加え攪拌した後エタノール１００ｍＬに加え沈殿させ、沈殿物を８０％エタノールで２回、エタノールで２回洗浄し、４０℃にて一晩真空乾燥した。１５０ｍｇの橙色固体を得た。ロイシンエチルエステルの導入率は２０．９％だった。
【００３９】
（２）被検物質の調製（アルカリ処理を行なって調製）
（１）の４５ｍＬ抜き出した残りの反応液に炭酸水素ナトリウムを２００ｍｇ加え、２時間４０分攪拌した。反応液に酢酸を加え中和後、塩化ナトリウム２．４ｇを加え攪拌した。エタノール１００ｍＬに加え沈殿させ、沈殿物を８０％エタノールで２回、エタノールで２回洗浄し、４０℃にて一晩真空乾燥した。２４７ｍｇの橙色固体を得た。ロイシンエチルエステルの導入率は２０．９％だった。
【００４０】
（３）フィルター通過性の検討
対照物質と被検物質について試験例記載の方法でフィルター通過性を検討した。その結果、対照物質は繊維状の不溶物であったが、被検物質は透明の溶液であった。対照はフィルターを全く通過しなかったが、被検物質は容易にフィルターを通過した（表２）。
【００４１】
【表２】
表２
2004018750.tif 000003
【００４２】
実施例３
水溶性カルボジイミド導入ヒアルロン酸
重量平均分子量９０万のヒアルロン酸４００ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ／二糖単位）を水６０ｍＬに溶解させ０．１Ｎ塩酸にてｐＨ４．７５に調整した。ＥＤＣＩ・ＨＣｌ１．０ｍｍｏｌ／水２ｍＬを加え２時間１５分攪拌した。
【００４３】
（１）対照の調製（アルカリ処理を行なわず調製）
上記反応液から３０ｍＬを抜き出し、塩化ナトリウム１．２ｇを加え攪拌した後エタノール１５０ｍＬを加え沈殿させ、沈殿物を８０％エタノールで２回、エタノールで２回洗浄し、４０℃にて１０時間真空乾燥した。１６９ｍｇの白色固体を得た。
【００４４】
（２）被検物質の調製（アルカリ処理を行なって調製）
（１）の３０ｍＬ抜き出した残りの反応液に３％炭酸水素ナトリウム水溶液４ｍＬを加え、３時間攪拌した。反応液に酢酸を加え中和後、塩化ナトリウム１．３ｇを加え攪拌した。エタノール２００ｍＬを加え沈殿させ、沈殿物を８０％エタノールで２回、エタノールで２回洗浄し、４０℃にて１０時間真空乾燥した。１６４ｍｇの白色固体を得た。
【００４５】
（３）フィルター通過性の検討
対照物質と被検物質について試験例記載の方法でフィルター通過性を検討した。その結果、対照物質は繊維状の不溶物であったが、被検物質は透明の溶液であった。対照はフィルターを全く通過しなかったが、被検物質は容易にフィルターを通過した（表３）。
【００４６】
【表３】
表３
2004018750.tif 000004
【００４７】
実施例４
各種本発明物質の合成
（１）インドメタシン導入ヒアルロン酸
重量平均分子量９０万のヒアルロン酸を水３０ｍＬ／ジオキサン１５ｍＬに溶解させた後、２ＭのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド水溶液２５０μＬ、１Ｍ　ＥＤＣＩ・ＨＣｌ水溶液２５０μＬ、別途アミノアルキルアルコールとインドメタシンを結合して調製したアミノアルキルアルコール結合インドメタシンを０．５Ｍで含むジメチルホルムアミド２ｍＬを順次添加し、撹拌して反応させる。
【００４８】
反応液に炭酸水素ナトリウムを１００ｍｇ添加し、３時間撹拌し、反応液に酢酸を加えて中和し、更に塩化ナトリウム２００ｍｇを添加して撹拌する。その反応液にエタノール１００ｍＬを加えて沈殿させ、沈殿を８０％エタノールで２回、エタノールで２回洗浄し、４０℃で一晩真空乾燥して、本発明物質であるインドメタシン導入ヒアルロン酸を得ることができる。
【００４９】
（２）グルタミン導入ヒアルロン酸
重量平均分子量９０万のヒアルロン酸２００ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ／二糖単位）を水３０ｍＬ／ジオキサン１５ｍＬに溶解させた後、２ＭのＮ−ヒドロキシこはく酸イミド水溶液２５０μＬ、１Ｍ　ＥＤＣＩ・ＨＣｌ水溶液２５０μＬ、０．５Ｍグリシン塩酸塩水溶液５００μＬを順次加え、一晩攪拌する。
【００５０】
反応液に炭酸水素ナトリウムを２００ｍｇ加え、３時間攪拌する。反応液に酢酸を加え中和後、塩化ナトリウム２００ｍｇを加え攪拌し、エタノール１００ｍＬに加え沈殿させて沈殿物を得る。沈殿物を８０％エタノールで２回、エタノールで２回洗浄し、４０℃にて一晩真空乾燥し、１７６ｍｇの白色固体として、本発明物質であるグルタミン導入ヒアルロン酸を得ることができる。アミノ酸分析により導入されたグリシンを測定すると導入率は２．４％である。
【００５１】
（３）メトトレキセート導入ヒアルロン酸
重量平均分子量９０万のヒアルロン酸１００ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ／二糖単位）を水１５ｍＬ／ジオキサン７．５ｍＬに溶解させた後、０．２ＭのＮ−ヒドロキシこはく酸イミド水溶液１ｍＬ、０．１Ｍ　ＥＤＣＩ・ＨＣｌ水溶液１ｍＬ、０．１Ｍメトトレキセートを含むジメチルホルムアミド１ｍＬを順次加え、一昼夜攪拌する。
【００５２】
反応液に炭酸水素ナトリウムを１００ｍｇ加え、３時間攪拌する。反応液に酢酸を加え中和後、塩化ナトリウム１００ｍｇを加え攪拌し、エタノール１００ｍＬに加え沈殿させて沈殿物を得る。沈殿物を８０％エタノールで２回、エタノールで２回洗浄し、４０℃にて一晩真空乾燥し、１００．４ｍｇの白色固体として本発明物質であるメトトレキセート導入ヒアルロン酸を得ることができる。吸光度より算出したメトトレキセート導入率は１７．４％である。
【００５３】
（４）ダウノマイシン導入ヒアルロン酸
重量平均分子量９０万のヒアルロン酸を水３０ｍＬ／ジオキサン１５ｍＬに溶解させた後、２ＭのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド水溶液２５０μＬ、１Ｍ　ＥＤＣＩ・ＨＣｌ水溶液２５０μＬ、０．５Ｍダウノマイシンを含むジメチルホルムアミド２ｍＬを順次添加し、撹拌して反応させる。
【００５４】
反応液に炭酸水素ナトリウムを１００ｍｇ添加し、３時間撹拌し、反応液に酢酸を加えて中和し、更に塩化ナトリウム２００ｍｇを添加して撹拌する。その反応液にエタノール１００ｍＬを加えて沈殿させ、沈殿を８０％エタノールで２回、エタノールで２回洗浄し、４０℃で一晩真空乾燥して本発明物質であるダウノマイシン導入ヒアルロン酸を得ることができる。
【００５５】
（５）マイトマイシンＣ導入ヒアルロン酸
重量平均分子量９０万のヒアルロン酸を水３０ｍＬ／ジオキサン１５ｍＬに溶解させた後、２ＭのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド水溶液２５０μＬ、１Ｍ　ＥＤＣＩ・ＨＣｌ水溶液２５０μＬ、０．５ＭマイトマイシンＣを含むジメチルホルムアミド２ｍＬを順次添加し、撹拌して反応させる。
【００５６】
反応液に炭酸水素ナトリウムを１００ｍｇ添加し、３時間撹拌し、反応液に酢酸を加えて中和し、更に塩化ナトリウム２００ｍｇを添加して撹拌する。その反応液にエタノール１００ｍＬを加えて沈殿させ、沈殿を８０％エタノールで２回、エタノールで２回洗浄し、４０℃で一晩真空乾燥して本発明物質であるマイトマイシンＣ導入ヒアルロン酸を得ることができる。
【００５７】
（６）サラゾスルファピリジン導入ヒアルロン酸
重量平均分子量９０万のヒアルロン酸を水３０ｍＬ／ジオキサン１５ｍＬに溶解させた後、２ＭのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド水溶液２５０μＬ、１Ｍ　ＥＤＣＩ・ＨＣｌ水溶液２５０μＬ、別途アミノエチルアルコールとサラゾスルファピリジンとを結合して調製したアミノエチルアルコール結合サラゾスルファピリジンを０．５Ｍで含むジメチルホルムアミド２ｍＬを順次添加し、撹拌して反応させる。
【００５８】
反応液に炭酸水素ナトリウムを１００ｍｇ添加し、３時間撹拌し、反応液に酢酸を加えて中和し、更に塩化ナトリウム２００ｍｇを添加して撹拌する。その反応液にエタノール１００ｍＬを加えて沈殿させ、沈殿を８０％エタノールで２回、エタノールで２回洗浄し、４０℃で一晩真空乾燥して本発明物質であるサラゾスルファピリジン導入ヒアルロン酸を得ることができる。
【００５９】
（７）プロピオン酸導入ヒアルロン酸
重量平均分子量９０万のヒアルロン酸を水３０ｍＬ／ジオキサン１５ｍＬに溶解させた後、２ＭのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド水溶液２５０μＬ、１Ｍ　ＥＤＣＩ・ＨＣｌ水溶液２５０μＬ、別途ＥＤＣＩ・ＨＣｌで活性化させてエチレンジアミンとプロピオン酸とを結合して調製したエチレンジアミン結合プロピオン酸を０．５Ｍで含むジメチルホルムアミド２ｍＬを順次添加し、撹拌して反応させる。
【００６０】
反応液に炭酸水素ナトリウムを１００ｍｇ添加し、３時間撹拌し、反応液に酢酸を加えて中和し、更に塩化ナトリウム２００ｍｇを添加して撹拌する。その反応液にエタノール１００ｍＬを加えて沈殿させ、沈殿を８０％エタノールで２回、エタノールで２回洗浄し、４０℃で一晩真空乾燥して本発明物質であるプロピオン酸導入ヒアルロン酸を得ることができる。
【００６１】
（８）アセメタシン導入ヒアルロン酸
重量平均分子量９０万のヒアルロン酸を水３０ｍＬ／ジオキサン１５ｍＬに溶解させた後、２ＭのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド水溶液２５０μＬ、１Ｍ　ＥＤＣＩ・ＨＣｌ水溶液２５０μＬ、別途アミノアルキルアルコールとアセメタシンとを結合して調製したアミノアルキルアルコール結合アセメタシンを０．５Ｍで含むジメチルホルムアミド２ｍＬを順次添加し、撹拌して反応させる。
【００６２】
反応液に炭酸水素ナトリウムを１００ｍｇ添加し、３時間撹拌し、反応液に酢酸を加えて中和し、更に塩化ナトリウム２００ｍｇを添加して撹拌する。その反応液にエタノール１００ｍＬを加えて沈殿させ、沈殿を８０％エタノールで２回、エタノールで２回洗浄し、４０℃で一晩真空乾燥して本発明物質であるアセメタシン導入ヒアルロン酸を得ることができる。
【００６３】
【発明の効果】
本発明によりカルボキシル基に、カルボキシル基に結合しうる求核性試薬が結合したヒアルロン酸誘導体の親水性を向上し、単離して固体としたヒアルロン酸誘導体の水性溶媒への溶解を容易とする方法が提供される。