(57)【要約】【課題】培養容器の底面に付着して増殖する細胞を非侵襲的に回収するとともに、製造効率を向上する。【解決手段】生体組織補填材４を内部に配置した培養容器１の一内面を底面２として、該底面２において細胞の培養を行う一次培養ステップと、前記生体組織補填材４が下部に配置されるように前記底面２を傾斜させ、底面２に成長していた細胞を生体組織補填材４上に流下させる流下ステップと、前記生体組織補填材４に付着した細胞を培養する二次培養ステップとを備える生体組織補填体の製造方法を提供する。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体組織補填材を内部に配置した培養容器の一内面を底面として、該底面において細胞の培養を行う一次培養ステップと、
前記生体組織補填材が下部に配置されるように前記底面を傾斜させ、底面に成長していた細胞を生体組織補填材上に流下させる流下ステップと、
前記生体組織補填材に付着した細胞を培養する二次培養ステップとを備える生体組織補填体の製造方法。
【請求項２】
前記培養容器が、可撓性のあるシート状の底面と、その底面の周縁から立ち上がる縁部とを有し、
前記流下ステップが、前記生体組織補填材の配置された部分を最下位にして前記底面を折り畳む請求項１に記載の生体組織補填体の製造方法。
【請求項３】
可撓性のあるシート状の底面と、該底面の周縁から立ち上がる縁部とを有し、内部に培地を貯留可能な生体組織補填体の製造装置。
【請求項４】
細胞を培養する底面と、該底面に隣接する内側面とを有し、該内側面に生体組織補填材を配置してなる培養容器。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、生体組織補填体の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、間葉系幹細胞等の幹細胞は、様々な組織に分化でき、その組織を再生することができる細胞として知られている。間葉系幹細胞は、骨髄液に含まれている。しかしながら、骨髄液から採取可能な間葉系幹細胞はごく微量であり、組織の再生に必要な量の間葉系幹細胞を得るためには、骨髄液を培養することにより増殖させる必要がある。
【０００３】
間葉系幹細胞を培養するには、患者から採取した骨髄液を平坦な培養容器上に播種して、適当な培地内において培養する。骨髄液内の赤血球や白血球などの造血系の細胞は培地内に浮遊する一方、間葉系幹細胞は培養容器の底面に付着して増殖する性質を有している。したがって、培地交換によって造血系の細胞を廃棄することにより、培養容器の底面に付着して増殖した間葉系幹細胞のみを抽出することが可能となる（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００４】
【非特許文献１】
吉川，「骨髄間葉系細胞による培養真皮、培養骨−骨髄間葉系細胞による再生医療−」，バイオインダストリー，株式会社シーエムシー出版，２００１年，第１８巻，第７号，ｐ．４６−５３
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このようにして抽出された間葉系幹細胞を生体組織に補填するためには、培養容器の底面から非侵襲的に回収する必要がある。従来、培養容器の底面に付着して増殖した間葉系幹細胞を回収するには、スクレーパのようなもので掻き落としたり、トリプシンのような蛋白質分解酵素を培養容器内に供給して、培養容器の底面から間葉系幹細胞を剥がすことが行われている。
しかしながら、これらの方法は、回収すべき間葉系幹細胞に損傷を与える可能性があるため、好ましくない。
【０００６】
この発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、培養容器の底面に付着して増殖する細胞を非侵襲的に回収するとともに、製造効率を向上することができる生体組織補填体の製造方法を提供することを目的としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、この発明は、以下の手段を提供する。
請求項１に係る発明は、生体組織補填材を内部に配置した培養容器の一内面を底面として、該底面において細胞の培養を行う一次培養ステップと、前記生体組織補填材が下部に配置されるように前記底面を傾斜させ、底面に成長していた細胞を生体組織補填材上に流下させる流下ステップと、前記生体組織補填材に付着した細胞を培養する二次培養ステップとを備える生体組織補填体の製造方法を提供する。
【０００８】
この発明によれば、一次培養ステップにおいて、細胞が培養容器の底面に増殖する。次いで、流下ステップにおいて、培養容器の底面を傾斜させることにより、底面において成長していた細胞が、自重により下方に向かって流れ落ちる。このとき、生体組織補填材を下部に配置しておくことにより、流れ落ちた細胞は生体組織補填材の上に付着する。その後、二次培養ステップを行うことにより、生体組織補填材に付着した細胞が、生体組織補填材を足場にして増殖することができ、これにより生体組織補填体が製造されることになる。
【０００９】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の生体組織補填体の製造方法において、前記培養容器が、可撓性のあるシート状の底面と、その底面の周縁から立ち上がる縁部とを有し、前記流下ステップが、前記生体組織補填材の配置された部分を最下位にして前記底面を折り畳む生体組織補填体の製造方法を提供する。
【００１０】
この発明によれば、シート状の底面を広げた状態で内部に培地と細胞とを供給することにより、一次培養ステップにおいて細胞が底面に付着するように成長させられる。そして、流下ステップにおいては、底面を折り畳むことにより傾斜させその最下位に配置した生体組織補填材上に細胞を流下させる。これにより、生体組織補填材上に細胞が回収されるので、これを二次培養することにより生体組織補填体を製造することが可能となる。
【００１１】
請求項３に係る発明は、可撓性のあるシート状の底面と、該底面の周縁から立ち上がる縁部とを有し、内部に培地を貯留可能な生体組織補填体の製造装置を提供する。
この発明によれば、縁部によって囲まれた底面上に培地を貯留して、培地内に細胞を供給することにより、細胞を培養することが可能となる。そして、細胞が培養された後には、底面を撓ませて周縁を全周にわたって持ち上げるように傾斜させることにより、底面に付着して成長していた細胞が底面の中央部に向かって流れ落ちる。底面の中央部に生体組織補填材を配置しておくことにより、流れ落ちた細胞を生体組織補填材に付着させ、そこで生体組織補填材を足場として細胞をさらに成長させ、生体組織補填体を製造することが可能となる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
この発明の一実施形態に係る生体組織補填体の製造方法について、図１を参照して説明する。
本実施形態に係る生体組織補填体の製造方法は、例えば、骨補填体の製造方法であって、患者から採取した骨髄細胞から間葉系幹細胞を増殖させる一次培養ステップと、成長した間葉系幹細胞を骨補填材に付着させる流下ステップと、骨補填材に付着した間葉系幹細胞を、骨補填材を足場として成長させる二次培養ステップとを備えている。
【００１３】
一次培養ステップは、図１（ａ）に示されるように、直方体の箱状に形成された硬質の板材からなる培養容器１の一内面を底面２として、患者から採取した骨髄細胞から間葉系幹細胞を増殖させるステップである。培養容器１の底面２に隣接する他の一内面３には、ブロック状の骨補填材４が配置されている。骨補填材４は、例えば、βリン酸三カルシウム多孔体からなり、前記内面３全体を覆うように配置されている。
【００１４】
一次培養ステップは、このように構成された培養容器１内に所定量の培地Ａとともに骨髄細胞を供給することにより行われる。培地Ａは、例えば、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ：最小必須培地）、ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ：ウシ胎児血清）、抗生剤を８４：１５：１の配合比率で混合したものである。なお、この配合比率は任意であり、また、ウシ胎児血清に代えてヒト血清を用いてもよい。
【００１５】
そして、一次培養ステップは、混合された骨髄細胞および培地Ａを所定の温度（例えば、３７±０．５℃）およびＣＯ２濃度（例えば５％）等の培養条件に維持することにより、所定時間にわたって行われる。所定時間が経過すると、培地Ａ内の栄養分が減少し、排出物が増大するので、培養途中においてこれを補うために、定期的な培地交換が行われる。
【００１６】
一次培養ステップにおいては、間葉系幹細胞は、培養容器１の底面２に付着して成長し、造血系の細胞等は、培地Ａ内に浮遊する。したがって、培地交換を行うことにより、培養容器１内には間葉系幹細胞が残り、他の細胞は廃棄されることになる。
【００１７】
このようにして、培養容器１の一内面２に間葉系幹細胞が成長した状態で、次の流下ステップに移行する。流下ステップでは、図１（ｂ）に示されるように、間葉系幹細胞５が付着して成長した内面２を側面とし、骨補填材４が配置されている内面３を底面とするように培養容器１を回転させる。間葉系幹細胞５は、水平に近い底面において棲み易く、急傾斜した底面では成長できないので、培養容器１を回転させて放置することにより、側面となった内面２を流れ落ちる。新たに培養容器１の底面となった内面３には骨補填材４が配置されているので、流れ落ちた間葉系幹細胞５は、骨補填材４の上に付着する。
【００１８】
この状態で、二次培養ステップが行われる。
二次培養ステップは、図１（ｃ）に示されるように、上記のように配置した培養容器１内に適当な培地Ｂを供給して、所定の培養条件を維持することにより行われる。
二次培養ステップにおいて使用される培地Ｂとしては、例えば、上述した一次培養ステップにおける培地Ａに加えて、成長因子、例えば、サイトカイン、濃縮血小板、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦやこれらを複合させたもの等の成長に寄与する物質を混合することにしてもよい。また、エストロゲン等のホルモン剤や、ビタミン等の栄養剤を混合することにしてもよい。
これにより、骨補填材４に付着した間葉系幹細胞５が骨補填材４を足場として成長し、骨補填体が製造されることになる。
【００１９】
このように、本実施形態に係る生体組織補填体の製造方法によれば、培養容器１を傾斜させる流下ステップにより、自重により間葉系幹細胞５を培養容器１の底面２から剥がすことが可能となる。したがって、スクレーパやトリプシンによることなく間葉系幹細胞５を回収して骨補填材４に付着させることができる。その結果、細胞に損傷を与えることがなく、健全な状態で二次培養ステップを行うことができるので、培養効率を向上することができる。また、トリプシンによる場合には、トリプシンを供給することによる剥離工程、剥離された後にトリプシンを除去する遠心分離工程が必要となるが、本実施形態に係る製造方法によれば、それらが不要となり、簡易に骨補填体を製造することができる。
【００２０】
次に、この発明の第２の実施形態に係る生体組織補填体の製造装置について、図２および図３を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る製造装置１０も、骨補填体の製造装置であって、図２に示されるように、略円形のシート状の底面部１１と、その底面部１１の周縁から全周にわたって立ち上がる縁部１２とを備えている。
【００２１】
シート状の底面部１１は、可撓性を有する材質からなり、任意の形態に変形させることができるようになっている。前記縁部１２も可撓性を有する材質からなり、底面部１１が水平におかれたときに、その周縁に全周にわたる側壁を形成するように構成されている。
【００２２】
このように構成された本実施形態に係る生体組織補填体の製造装置１０により、骨補填体を製造するには、水平に置いた底面部１１の略中央部に、例えば、βリン酸三カルシウム多孔体からなる骨補填材１３を配置する。そして、図３（ａ）に示されるように、所定量の培地Ａを底面部１１上に供給する。培地Ａは縁部１２によって外部に漏れないように保持されて製造装置１０内に貯留される。この培地Ａ内に骨髄細胞を投入し、所定の培養条件下に配することにより一次培養ステップが行われる。培地Ａの成分、培養条件等は第１の実施形態と同様でよい。
【００２３】
そして、定期的な培地交換を行いながら間葉系幹細胞が底面部１１の表面に付着して成長した後に、底面部１１の周囲を持ち上げることにより流下ステップが行われる。底面部１１は可撓性のあるシート状の部材により構成されているので、周縁を持ち上げることにより、図３（ｂ）に示されるように、骨補填材１３が配置されている中央部が最も低くなるように変形する。これにより、底面部１１が、周縁から中央部に向かって低くなるように傾斜させられるので、底面部１１の表面に付着して成長していた間葉系幹細胞１４は、低くなっている中央部に向かって集まるように流れ落ちる。
【００２４】
この中央部には骨補填材１３が配置されているので、流れ落ちた間葉系幹細胞１４は骨補填材１３の上に付着する。
そして、この状態で、適当な培地Ｂを供給して培養条件を整えることにより二次培養ステップが行われる。これにより、骨補填材１３に付着した間葉系幹細胞１４が骨補填材１３を足場として成長し、骨補填体が製造されることになる。
【００２５】
このように、本実施形態に係る生体組織補填体の製造装置１０によれば、シート状の底面部１１を変形させて傾斜させるだけで、間葉系幹細胞１４を回収して骨補填材１３に付着させることができるので、間葉系幹細胞１４に損傷を与えることなく効率的に骨補填体を製造することができる。
【００２６】
なお、上記各実施形態においては、間葉系幹細胞５，１４の底面２，１１への付着を緩和して、傾斜による流下を促進するために、顆粒状の骨補填材を底面２，１１に配置してもよい。また、底面２，１１に、所定の温度を境界として疎水性と親水性とが切り替わる温度応答性処理を施すことにしてもよい。
【００２７】
温度応答性処理は、温度応答性高分子ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を共有結合で固定することにより行われる。温度応答性処理された領域は、３２℃を境界温度として、それ以上では、市販の細胞用培養容器と同程度の弱い疎水性を呈するが、温度を境界温度以下に冷却することにより高い親水性を呈するようになる領域である。したがって、例えば、３７℃で培養した後に３２℃以下に冷却することにより、底面２，１１を高い親水性を呈するように変化させ、容易に間葉系幹細胞を剥離させることができる。このようにすれば、さらに迅速に細胞を健全な状態で回収することができる。
【００２８】
また、この発明においては、生体組織として骨を例に挙げ、骨髄液から抽出した間葉系幹細胞５，１４を培養する場合について説明したが、骨髄液のみならず末梢血や臍帯血から抽出することにしてもよい。また、間葉系幹細胞５，１４に限定されるものではなく、ＥＳ細胞、体性幹細胞、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞等の体細胞の培養にも使用できる。
【００２９】
また、骨補填材４，１３として、βリン酸三カルシウム多孔体を例示して説明したが、これに代えて、生体組織に親和性のある材料であれば任意のものでよく、生体吸収性の材料であればさらに好ましい。特に、生体適合性を有する多孔性のセラミックスや、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒアルロン酸、またはこれらの組合せを用いてもよい。また、チタンの様な金属であってもよい。また、形態もブロック状、顆粒状、ゲル状等任意の形態を適用することにしてもよい。
【００３０】
【発明の効果】
以上、説明したように、この発明に係る生体組織補填体の製造方法によれば、一次培養ステップにおいて底面に成長させた細胞を流下ステップにおいて自重で流れ落ちることとし、流れ落ちる先に生体組織補填材を配置しておくことにより、流れ落ちた細胞を生体組織補填材に付着させるので、スクレーパやトリプシン等の細胞に損傷を与える処理を行うことなく、非侵襲的に健全な状態で、細胞を生体組織補填材に付着させ、簡易かつ効率的に生体組織補填体を製造することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の一実施形態に係る生体組織補填体の製造方法を説明するためのステップ図である。
【図２】この発明の第２の実施形態に係る生体組織補填体の製造装置を示す斜視図である。
【図３】図２の製造装置による流下ステップを示す縦断面図である。
【符号の説明】
１　培養容器
２　底面
４，１３　骨補填材（生体組織補填材）
５，１４　間葉系幹細胞（細胞）
１０　製造装置
１１　底面部（底面）
１２　縁部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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