(57)【要約】【課題】γ−グルタミルシステイン合成酵素、上記酵素をコーディングする遺伝子、上記遺伝子を含む発現ベクター、上記ベクターを形質導入した形質転換体、上記形質転換体を利用してグルタチオンを大量生産する方法を提供する。【解決手段】メタノール資化性酵母のハンセヌラポリモルパから分離したグルタチオン生合成に関与するγ−グルタミンシステイン合成酵素及びこれをコーディングする遺伝子、上記遺伝子を含む発現ベクター、上記ベクターを形質導入した形質転換体、上記形質転換体を利用してグルタチオンを大量生産する。本発明の遺伝子がグルタチオン生合成欠損変異株に導入されるとグルタチオン生合成機能と共に重金属耐性及び細胞増殖機能を回復及び増加させられるため、グルタチオンを利用した重金属吸着、補助酵素の生産、肝機能強化剤及び脱毒性化剤の製造に有用に使用できる。【選択図】  図３
2004173503.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハンセヌラポリモルパ由来のγ−グルタミルシステイン合成酵素のプロモータ及び遺伝子を含む配列番号１で記載されるゲノミックＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号２で記載されるハンセヌラポリモルパ由来のγ−グルタミルシステイン合成酵素のプロモータ。
【請求項３】
配列番号３で記載されるハンセヌラポリモルパ由来のγ−グルタミルシステイン合成酵素。
【請求項４】
請求項３の合成酵素をコーディングする遺伝子。
【請求項５】
配列番号４で記載されることを特徴とする請求項４に記載の遺伝子。
【請求項６】
請求項４の遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項７】
発現ベクターは、ｐＧ２４であることを特徴とする請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
請求項６の発現ベクターを宿主細胞に形質導入した形質転換体。
【請求項９】
ｐＧ２４発現ベクターを大腸菌ＤＨ５ａに形質導入した請求項８に記載の形質転換体（寄託番号  ＫＣＴＣ１０３７０ＢＰ）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グルタチオン生合成遺伝子に関するものである。より具体的には、
グルタチオン生合成機能欠損変異株に導入する時、グルタチオン生合成機能と共に重金属耐性及び細胞増殖機能を回復させるγ−グルタミルシステイン合成酵素に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ，  ＧＳＨ）は、好気性原核細胞と真核細胞内に最も多いチオール（ｔｈｉｏｌ）系化合物であり、酸化ストレス反応及び重金属のような生体異物質の毒性に対する防禦反応に関与する重要な生理的機能を持ったトリペプチドである。γ−グルタミル−Ｌ−システイングリシン（γ−ｇｌｕｔａｍｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅｇｌｙｃｉｎ）を構成成分とするグルタチオンは細胞内で、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−システイン及びグリシンを利用してγ−グルタミルシステイン合成酵素（γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，  以下「γ−ＧＣＳ」と略称する）及びグルタチオン合成酵素（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，  以下「ＧＳ」と略称する）の連鎖作用によって生成される。グルタチオン生合成関連酵素のγ−ＧＣＳとＧＳをコーディングする二遺伝子は、大腸菌、植物、ネズミ及び人体（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  ａｎｄ  Ｍｕｌｃａｈｙ，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ａｒｅａｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １９９９，  ７３，  ２０９−２６７）だけではなく、酵母のサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びスキゾサッカロマイセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）から分離された（Ｏｈｔａｋｅ  ａｎｄ  Ｙａｂｕｕｃｈｉ，  Ｙｅａｓｔ，  １９９１，  ７，  ９５３；  Ａｌ−Ｌａｈｈａｍ等，  Ｙｅａｓｔ，  １９９９，  １５，  ３８５）。
【０００３】
サッカロマイセスセレビシエの場合、グルタチオン生合成経路の一番目段階であり律速段階（ｒａｔｅ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｓｔｅｐ）に関与する酵素のγ−ＧＣＳをコーディングするＧＳＨ１  遺伝子の発現が反応性酸素族（Ｈ２Ｏ２）、過酸素陰イオン発生系及び重金属カドミウム等によって調節される。これは、転写因子のＹａｐ１、Ｓｋｎ７、Ｍｅｔ−４、Ｍｅｔ−３１、Ｍｅｔ−３２及びＣｂｆ１によって調節されたと報告されている（Ｗｕ等，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，  １９９４，  １４，  ５８３２；  Ｌｅｅ等，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９９，  ２７４，  １６０４０；  Ｄｏｒｍｅｒ等，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２０００，  ２７５，  ３２６１１）。
グルタチオンは、メタノール代謝過程に必須的な役割を担当している。メタノール代謝過程を見ると、メタノールはペロキシゾームでホルムアルデヒドと過酸化水素に転換され（Ｓａｈｍ  Ｈ．，  Ａｄｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｅｎｇ．，  １９７７，  ６，  １０３）、転換されたホルムアルデヒドは、細胞質に行ってギ酸に酸化され脱水素酵素（ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）反応によって最終的に二酸化炭素になる。ホルムアルデヒドが酸化されるためには、補助因子にグルタチオンを利用したＮＡＤ＋−依存脱水素酵素にとって反応が進行される。また、メタノールで培養されたキャンディダボイディニ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）の場合、ペロキシゾームの膜表面で生成されるアルキルハイドロペロキサイド（ａｌｋｙｌ  ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅｓ）に対する反応に関与するグルタチオンペロキシダーゼのＣｂＰｍｐ２０蛋白質と共に相当な濃度の還元型グルタチオンがペロキシゾーム部位で観察された（Ｓａｋａｉ等，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ２００２，  １４８，  ２６９７）。
【０００４】
上記の研究報告を通してグルタチオンは、メタノールの酸化に随伴する多様な代謝産物を無毒化（ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ）することに関与するため、メタノール代謝に必須的であることが分かった。実際に、メタノールは細胞内にグルタチオン含量を増加させることが報告されていて、特にホルムアルデヒド脱水素化酵素欠損変異株で、その現象がさらに明確に現れた（Ｓｉｂｉｒｎｙ等，  Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  １９９０，  １５４，  ５６６）。したがって、メタノールを唯一な炭素源に使用するメタノール資化性酵母は、グルタチオンのよい供給源になると期待されている。
グルタチオンは、酵母のような微生物の外にも動物の肝臓等にも広く分布していて、生体内の呼吸系、酸化還元反応、解毒作用、酵素復活作用、補助酵素としての作用等、重要な生理作用を持っている。また、有毒化合物、反応性酵素誘導体及び放射線による酸化損傷に対する細胞保護物として、そして、一般的に細胞に損傷を与える物質を不活性化させるにおいて重要な役割をしている。
【０００５】
上記で明らかにしたように、多様な機能を持ったグルタチオンは、肝機能強化や脱毒性のための治療剤に有用であるだけではなく、スポーツ飲料等の健康補助のための食品添加剤に活用でき、グルタチオンの大量生産に対する需要が漸次増加している（Ｙｉｎ等，  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  １９９８，  １４，  ８５）。従来には、グルタチオンを生産するためには、醗酵工業的製造方法で酵母を培養してその培養された酵母からグルタチオンを抽出する方法が広く利用されてきた。例えば、酵母培養にあたり、グルタチオンを構成する３種のアミノ酸であるＬ−システイン、Ｌ−グルタミン酸及びグリシンを単独または混合添加する方法（日本特許  第４８０９２５７９号及び第５３０９４０８９号）、Ｌ−システインを添加する方法、メチオニン及びその誘導体を添加する方法があった。または、培養する酵母において、突然変異菌株であるメチオニンアナログ耐性菌株を利用する方法、メチオニンまたはメチオニン・リジン要求菌株を利用する方法、ＬまたはＤ，Ｌ−エチオニン感受性菌株を利用する方法等があり、報告された（米国特許  第４５９６７７５号及び第４５８２８０１号）。
【０００６】
近来では、遺伝子組換え技術の発達によってグルタチオン生合成に関与する酵素の遺伝子を大腸菌または酵母に多重導入することによってグルタチオンの生産性を高める研究が行なわれている。その例として、大腸菌由来のグルタチオン生合成関連遺伝子のｇｓｈＩ及びｇｓｈＩＩを多重コピープラスミドに挿入して大腸菌に導入する場合、細胞内でグルタチオン合成系の非酵素活性が４０倍上昇した（Ｗａｔａｎａｂｅ等，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  １９８６，  ２４，  ３７５；  日本特許  第２０３１６９００号）。
また、ｇｓｈＩ及びｇｓｈＩＩを多重コピープラスミドに挿入してサッカロマイセスセレビシエに導入した場合、細胞内で３０％程度のグルタチオン生産が増加した（日本特許  第６１０５２２９９号及び欧州特許  第０３００１６８号）。
【０００７】
一方、グルタチオンの高い重金属吸着能を活用して重金属に対する耐性及び蓄積能が向上した組換え菌株を開発する目的で、グルタチオン生合成遺伝子が有用に活用されている。一例として、γ−ＧＣＳとＧＳをコーディングする大腸菌由来の遺伝子であるｇｓｈＩ及びｇｓｈＩＩを過発現させたインド芥子（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）苗木は、野生苗木に比べてカドミウム（Ｃｄ）に対する耐性が増加され、ピトチェラチン（ｐｙｔｏｃｈｅｌａｔｉｎ）、γ−グルタミルシステイン、グルタチオン及び総非たんぱく質形チオールの濃度が増加した（Ｚｈｕ等．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  １９９９，  １２１，  １１６９；  Ｚｈｕ等，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  １９９９，  １１９，  ７３）。さらにグルタチオン合成関連遺伝子の発現は、重金属のような毒性物質の存在可否によって敏感に調節及び誘導される（Ｄｏｒｍｅｒ等  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２０００，  ２７５，  ３２６１１）。したがって、γ−ＧＣＳ及びＧＳをコーディングする遺伝子由来のプロモータを発光蛋白質、または蛍光たんぱく質等のようなリポーターたんぱく質発現のためのプロモータに使用すれば、毒性物質探知用バイオセンサー開発に必要な組換え菌株開発に有用に活用できる（国際公開番号Ｗ０９００８８２６号）。
【０００８】
伝統的酵母のサッカロマイセスセレビシエ及び分裂酵母のスキゾサッカロマイセスポンベの場合、グルタチオン生合成の始めの段階に作用するγ−ＧＣＳをコーディングする遺伝子のＧＳＨ１またはＧＣＳ１が欠損したｇｓｈ変異株等は、グルタチオンが添加されていない合成培地で生育できず、ＭＮＮＧ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ’−ｎｉｔｒｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）に対する抵抗性が顕著に強化され、カドミウムイオンに対する敏感性が増加される特徴を示した（Ｋｉｓｔｌｅｒ等，  Ｍｕｔａｔ．  Ｒｅｓ．，  １９８６，  １７３，  １１７；  Ｇｌａｅｓｅｒ等，  Ｃｕｒｒ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １９９１，  １９，  ２０７）。
また、本発明者達は、メタノール資化性酵母のハンセヌラポリモルパ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ，一名Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）でＭＮＮＧに対する耐性を持つ反面、カドミウムイオン及びメタノールに敏感に反応して、メタノールまたは複数炭素源を基質にするグルタチオン欠乏培地では成長できない変異株を分離したことがある（Ｕｂｉｙｖｏｖｋ等，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  １９９９，  ６８，  ２６）。「ｇｓｈ１−２  ｌｅｕ１−１」及び「ｇｓｈ２−１  ｌｅｕ１−１」と命名されたハンセヌラポリモルパのｇｓｈ１及びｇｓｈ２  変異株は、野生型菌株に比べて細胞内総グルタチオン含量が極端に少なく、γ−ＧＣＳ活性はないがＧＳ活性は野生型菌株と似ていた。また、ｇｓｈ２変異株は、カドミウムにとても敏感である反面、ｇｓｈ１変異株はクロムに非常に敏感だった。
【０００９】
それで、本発明者達は、生体内で重要な生理作用をし、重金属吸着機能を持ったグルタチオンを大量生産するために本発明者達が分離した変異株（Ｕｂｉｙｖｏｖｋ等，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  １９９９，  ６８，  ２６）からグルタチオン生合成に関与する重要な遺伝子をクローニングし、これをグルタチオン欠乏変異株に導入することによってグルタチオンの生合成が増加して重金属に対する耐性が回復されることを確認して本発明を完成した。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、γ−グルタミルシステイン合成酵素、上記酵素をコーディングする遺伝子、上記遺伝子を含む発現ベクター、上記ベクターを形質導入した形質転換体、上記形質転換体を利用してグルタチオンを大量生産する方法を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明は、ハンセヌラポリモルパ由来のγ−グルタミルシステイン合成酵素のプロモータ及び遺伝子を含むゲノミックＤＮＡを提供する。
また、本発明は、ハンセヌラポリモルパ由来のγ−グルタミルシステイン合成酵素のプロモータを提供する。
また、本発明は、ハンセヌラポリモルパ由来のγ−グルタミルシステイン合成酵素を提供する。
【００１２】
また、本発明は、上記γ−グルタミルシステイン合成酵素をコーディングする遺伝子を提供する。
また、本発明は、上記遺伝子を含む発現ベクターを提供する。
また、本発明は、上記ベクターを宿主細胞に導入した形質転換体を提供する。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、ハンセヌラポリモルパ由来のγ−グルタミルシステイン合成酵素のプロモータ及び遺伝子を含むゲノミックＤＮＡを提供する。
本発明の配列番号１で記載される遺伝子は、γ−グルタミルシステイン合成酵素（γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）活性が欠乏したハンセヌラポリモルパ変異菌株（ｇｓｈ２）のグルタチオン生合成能を回復させる機能がある。上記ＤＮＡは、γ−グルタミルシステイン合成酵素のプロモータ及びγ−グルタミルシステイン合成酵素をコーディングする遺伝子を含んでいる（ＧｅｎＢａｎｋ，  寄託番号ＡＦ４３５１２１）。上記遺伝子全体４１９５個の塩基配列中で１番から４５０番までは、γ−グルタミルシステイン合成酵素のプロモータ部位であり、４５１番から２４０３番までは、γ−グルタミルシステイン合成酵素をコーディングする遺伝子部位（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ，  ＯＲＦ）であり、残りの２４３６番から３１４０番及び２６９１番から３１４６番までは、報告されていないたんぱく質コーディング遺伝子部位（ＯＲＦ）である。
【００１３】
また、本発明は、  ハンセヌラポリモルパ由来のγ−グルタミルシステイン合成酵素のプロモータを提供する。
本発明のプロモータは、上記配列番号１で記載される塩基配列の１番から４５０番までの配列からなり、グルタチオン生合成に関係するγ−グルタミルシステイン合成酵素の発現を誘導してグルタチオンの生合成を増加させる役割をするプロモータであり、配列番号２で記載される塩基配列またはその一部塩基配列であり得る。また、グルタチオン合成関連遺伝子の発現が重金属のような毒性物質の存在可否によって敏感に調節され誘導されることによって、本発明のプロモータと一緒に発光たんぱく質または蛍光蛋白質のようなリポーター蛋白質をコーディングする遺伝子を含む発現ベクターを製造して形質導入させた組換え菌株を利用すれば、毒性物質を探知するのに有用にたやすく使用できる。
【００１４】
また、本発明は、ハンセヌラポリモルパ由来のγ−グルタミルシステイン合成酵素を提供する。
本発明者達は、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性の欠乏によってグルタチオン生合成能が欠損したハンセヌラポリモルパ変異菌株のグルタチオン生合成能を回復させる機能を持った配列番号１で記載される塩基配列に３個のたんぱく質コーディング遺伝子部位（４５１番から２４０３番、２４３６番から３１４０番及び２６９１番から３１４６番）が存在することを確認した後、これらの各々の遺伝子が含まれた発現ベクターを製造して、これを形質導入した形質転換体を利用してグルタチオン生合成能力を調査した。その結果、４５１番から２４０３番のたんぱく質コーディング遺伝子部位を含む遺伝子で製造された形質転換体だけがグルタチオン生合成能力が増加したことが分かった（表２  参照）。
【００１５】
それで、上記４５１番から２４０３番のたんぱく質コーディング遺伝子部位がどのような蛋白質をコーディングするのかを分析するために配列の相同性分析を行なった結果、上記配列はキャンディダアルビカン（Ｃ．  ａｌｂｉｃａｎｓ）のＧｃｓ１ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ  寄託番号ＡＡＧ４３４１２）遺伝子と５３％の同一性と６９％類似性を示し、サッカロマイセスセレビシエのＳｃＧｓｈ１ｐ遺伝子と４７％の同一性と６１％の類似性を示した。また、スキゾサッカロマイセスポンベのＳｐＧｃｓ１ｐ遺伝子と４６％の同一性と６３％の類似性を示し、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）のＨｓＧＣＳｈ遺伝子と４５％の同一性と６３％の類似性を示した。他のγ−グルタミルシステイン合成酵素とも相当に高い類似性を示すことが分かった（図２  参照）。それで、本発明者達は、上記蛋白質がγ−グルタミルシステイン合成酵素であることを確認した。本発明のγ−グルタミルシステイン合成酵素は、上記配列番号１で記載される塩基配列の４５１番から２４０３番のたんぱく質コーディング遺伝子配列からコーディングされる配列番号３で記載されるアミノ酸配列を持っている。
【００１６】
また、本発明は、上記γ−グルタミルシステイン合成酵素をコーディングする遺伝子を提供する。
本発明の遺伝子は、上記でハンセヌラポリモルパのγ−グルタミルシステイン  合成酵素であることを確認した配列番号３で記載される酵素をコーディングする遺伝子であり、配列番号４で記載される塩基配列を持つことが好ましい。配列番号４で記載される本発明の遺伝子配列は、４５０ｂｐ程度の５’  隣接領域配列と１７９２ｂｐ程度の３’  隣接配列を持っていて、典型的なＴＡＴＡ  ボックス、ＣＡＡＴボックス及びポリアデニレイション（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）配列は、観察されなかった。しかし、たんぱく質翻訳開始コドンから上流４１６ｂｐ地点においてサッカロマイセスセレビシエのＧＳＨ１遺伝子発現を調節する蛋白質のＣｂｆ１が結合する部位と知られているＣＤＥＩ−結合地域（ＧＣＡＣＧ）（「地域」は「領域」ともいう。以下、同様。）と推定される配列は観察された（図２  参照）。したがって、本発明の遺伝子は、反応性酸素族や重金属カドミウム存在可否により、Ｃｂｆ１相同蛋白質によって発現が調節されることが分かった。
【００１７】
また、他の生物体由来のγ−グルタミルシステイン合成酵素のように本発明の遺伝子は、グルタチオン−結合蛋白質で一般的に観察されるグルタチオンとの特異的相互作用に関連する配列番号５で記載されるＧＷＲＶＥＦＲＰＭＥ  モチーフ、保存されたリジン及びアルギニン残基を持っていて、酵素の活性中心部と推定される配列番号６で記載されるＭＧＦＧＭＧＸＸＣＬＱ領域でよく保存されたシステイン残基を持っている（図２  参照）。
上記結果から、本発明の遺伝子はグルタチオン要求性補完機能と共にグルタチオン生合成経路で最も重要な第一段階の反応に作用するγ−ＧＣＳをコーディングすることが分かる。
【００１８】
また、本発明は、上記遺伝子を含む発現ベクターを提供する。
本発明の発現ベクターは、γ−グルタミルシステイン合成酵素を生産できるように製造した発現ベクターであり、グルタチオンの生合成を増加させられる発現ベクターである。本発明の好ましい実施例では、配列番号４で記載される遺伝子をｐＹＴ３  ベクターに挿入して製造したベクターを「ｐＹＴ３−ｐＧ２４」と命名した。
また、本発明は、上記ベクターを宿主細胞に導入した形質転換体を提供する。
上記で宿主細胞は、バクテリア、酵母、真菌類、植物細胞及び動物細胞で構成された群から選ぶことが好ましい。本発明の好ましい実施例では、上記ｐＹＴ３−ｐＧ２４発現ベクターをグルタチオン生合成酵素が欠乏したハンセヌラポリモルパ変異菌株に導入した形質転換体を製造し、これを「Ｇｓｈ＋Ｌｅｕ＋（ｐＧ２４）」と命名した。また、形質転換体のグルタチオン生合成能力及び重金属耐性に対する反応を調査した結果、グルタチオン生合成能力が増加され重金属耐性が増加したことを確認した（表２  参照）。本発明者達は、ｐＧ２４発現ベクターを大腸菌ＤＨ５ａに形質導入した形質転換体を製造し、それを２００２年１１月８日付けで、韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託した（寄託番号  ＫＣＴＣ１０３７０ＢＰ）。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。
但し、下記の実施例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるものではない。
＜実施例  １＞  ハンセヌラポリモルパからグルタチオン生合成遺伝子のクローニング
本発明者達は、メタノール資化性酵母のハンセヌラポリモルパ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）菌株からＭＮＮＧ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ’−ｎｉｔｒｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）に対する耐性を持つ反面、カドミウムイオンとメタノールに敏感に反応し、グルタチオン欠乏培地では成長できない変異株のｇｓｈ１（ｇｓｈ１−２  ｌｅｕ１−１）及びｇｓｈ２（ｇｓｈ２−１  ｌｅｕ１−１）を分離したことがある（Ｕｂｉｙｖｏｖｋ等，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  １９９９，  ６８，  ２６）。上記ｇｓｈ１及びｇｓｈ２  変異株は、野生型菌株に比べて総グルタチオン含量が非常に少なく、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性が無いが、二番目グルタチオン生合成酵素の活性は、野生型菌株と類似であり、ｇｓｈ２  変異株は、カドミウムにとても敏感である反面、ｇｓｈ１  変異株はクロムにとても敏感だった。それで、本発明者達は、上記ｇｓｈ変異菌株からグルタチオン生合成に関与する遺伝子をクローニングしようとした。
＜１−１＞  グルタチオン要求性を回復する形質転換体の選別
本発明者達は、ハンセヌラポリモルパ−大腸菌シャトルプラスミドのｐＹＴ３（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＦ３４７０１６）にハンセヌラポリモルパＣＢＳ４７３２  ｌｅｕ２菌株（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ，  Ｄｅｌｆｔ，  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ）のゲノムＤＮＡライブラリー（Ｔａｎ等，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １９９５，  １２８，  ３０７）がクローニングされたベクターを使用してハンセヌラポリモルパ変異株のｇｓｈ１−２  ｌｅｕ２（４９５−１４５Ｌ）とｇｓｈ２−１  ｌｅｕ２（４９５−４０Ｌ）に既存の電気的方法（Ｆａｂｅｒ等，  Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ，  １９９４，  ２５，  ３０５）で形質転換させた。上記形質導入されたハンセヌラポリモルパ菌株をグルコースが含まれたグルタチオン無添加合成培地（１０ｇ／ｌグルコース、１μｇ／ｌ  ビオチン、０．２ｍｇ／ｌチアミンハイドロクロライド、微量元素、２０ｍｇ／ｍｌロイシン）（Ｓｉｂｉｒｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９０，１５４，５６６）で培養した後、グルタチオンなしでも成長できる形質転換体を選別した。
【００２０】
その結果、ｇｓｈ変異株のグルタチオン要求性を補完する機能を持つようになったことによってグルタチオン無しでも成長する形質転換体を選別した。上記形質転換体からプラスミドを分離してＢａｍＨＩで切断して電気泳動で確認した結果、約７．５ｋｂ及び９．６ｋｂのＤＮＡ切片があることを確認して、上記ＤＮＡ切片各々が挿入されたベクターを「ｐＧ１」及び「ｐＧ２」と命名して、グルタチオン無添加培地で成長する上記ベクターが形質導入された形質転換体を各々「Ｇｓｈ＋Ｌｅｕ＋（ｐＧ１）」及び「Ｇｓｈ＋Ｌｅｕ＋（ｐＧ２）」と命名した。
＜１−２＞  形質転換体のグルタチオン生合成及び重金属に対する耐性の分析
本発明者達は、上記実施例＜１−１＞で選別した形質転換体がグルタチオンを生合成するかどうかを分析するために野生型菌株ＮＣＹＣ４９５  ｌｅｕ１−１（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ  Ｃｌｕｓｔｕｒｅｓ，  Ｆｏｏｄ  Ｒｅａｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｎｏｒｗｉｃｈ，  ＵＫ）、ｇｓｈ変異菌株ｇｓｈ１−２  ｌｅｕ１−１、ｇｓｈ２−１  ｌｅｕ１−１及びグルタチオン遺伝子が導入された形質転換体Ｇｓｈ＋Ｌｅｕ＋（ｐＧ１）及びＧｓｈ＋Ｌｅｕ＋（ｐＧ２）を１％が添加されたセミ合成培地（１％グリセロール、０．０５％酵母エキス、２０ｍｇ／ｌロイシン）で培養後グリセロール１％が添加された合成培地（グリセロール１％、ビオチン１μｇ／ｌ、チアミンハイドロクロライド０．２ｍｇ／ｌ、微量元素、ロイシン２０ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｂｉｒｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９０，１５４，５６６）で１４時間培養した。上記培養後、ブレッヘ及びバッシの方法（Ｂｒｅｈｅ  ａｎｄ  Ｂｕｒｃｈ，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １９７６，  ７４，  １８９）によって細胞破砕液から蛋白質（ｍｇ）に含まれた総グルタチオンの含量（ｎｍｏｌ）を測定した。また、グルタチオンの生合成に関係した酵素のγ−グルタミルシステイン合成酵素（γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎ  ｓｙｎｔａｓｅ，  以下「γ−ＧＣＳ」と略称する）及びグルタチオン合成酵素（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ  ｓｙｎｔａｓｅ，  以下「ＧＳ」と略称する）の活性を分析するためにセミ合成培地で培養された対数期中盤の細胞からウビボグの方法（Ｕｂｉｙｖｏｖｋ等，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  １９９９，  ６８，  ２６）にしたがって３０分間、蛋白質（ｍｇ）に含まれたγ−ＧＣＳ及びＧＳの含量（ｎｍｏｌ）を測定した。また、重金属に対する耐性を分析するために１％グルコース重金属のカドミウム（０．０５ｍＭ）またはクロム（０．４ｍＭ）を含む固体合成培地で酵母細胞を３日間培養後、酵母成長を観察及び分析した。
【００２１】
その結果、形質転換体Ｇｓｈ＋Ｌｅｕ＋（ｐＧ１）及びＧｓｈ＋Ｌｅｕ＋（ｐＧ２）は、グルタチオン生合成が増加し、メタノールまたは複数炭素源（グルコース及びメタノール）を基質にした合成培地での成長能力が野生型水準に回復しただけではなく、カドミウム（Ｃｄ）及びクロム（Ｃｒ）イオンに対する抵抗性が野生型菌株と同じくらいに現れ、形質転換されていない  ｇｓｈ１とｇｓｈ２  変異株自体よりＭＮＮＧにさらに敏感に反応した（表  １）。
【００２２】
【表１】
2004173503.tif 000003
【００２３】
それで、Ｇｓｈ＋Ｌｅｕ＋（ｐＧ１）及びＧｓｈ＋Ｌｅｕ＋（ｐＧ２）形質転換体に導入されたｐＧ１及びｐＧ２ベクターのインサートＤＮＡを分析してみた（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄｎ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８９）。
その結果、ｐＧ１ベクターのＢａｍＨＩで切断される７．５ｋｂ  ＤＮＡ切片は、四つのたんぱく質コーディング部位を含んでいるが、グルタチオン合成遺伝子とは関連しない遺伝子だった。次に、ｐＧ２ベクターのＢａｍＨＩで切断される９．６ｋｂ  ＤＮＡ切片を再びＢａｍＨＩまたはＸｂａＩで切断した結果、３．９ｋｂ（ＢａｍＨＩ）、４．０ｋｂ（ＢａｍＨＩ）、３．３ｋｂ（ＸｂａＩ）と４．２ｋｂ（ＸｂａＩ）の小さなＤＮＡ断片に切断されたことが分かった。それで、上記ＤＮＡ切片各々をｐＹＴ３ベクターに挿入して製造したベクターを各々ｐＧ２１、ｐＧ２２、ｐＧ２３及びｐＧ２４と命名した（図  １）。
【００２４】
上記ベクターをｇｓｈ２  変異株に再び形質転換させ、形質転換された各々の形質転換体を「Ｇｓｈ＋Ｌｅｕ＋（ｐＧ２１）」、「Ｇｓｈ＋Ｌｅｕ＋（ｐＧ２２）」、「Ｇｓｈ＋Ｌｅｕ＋（ｐＧ２３）」及び「Ｇｓｈ＋Ｌｅｕ＋（ｐＧ２４）」と命名した。  形質転換体を上記と同一な方法でグルタチオン生合成及び重金属耐性に対する分析した結果、Ｇｓｈ＋Ｌｅｕ＋（ｐＧ２４）形質転換体だけが野生型と同一にグルタチオンを生合成したことを確認した（表  ２）。
【００２５】
【表２】
2004173503.tif 000004
【００２６】
＜実施例  ２＞  グルタチオン生合成遺伝子の分析
本発明者達は、上記実施例１でグルタチオン生合成能力が野生型に復帰したことが確認されたＧｓｈ＋Ｌｅｕ＋（ｐＧ２４）形質転換体から標準酵母遺伝子方法を利用してｐＧ２４プラスミドＤＮＡを分離し、アガロースゲル電気泳動によって分離されたＤＮＡの大きさを確認した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄｎ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８９）。上記確認されたＤＮＡの塩基配列分析は、ＧＰＳ−１ゲノムプライミングシステム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）及び塩基配列自動分析機（ＢｉｇＤｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｄｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を使用して行なった。
【００２７】
その結果、ｐＧ２４プラスミドＤＮＡは、全体４１９５ｂｐ大きさの配列番号１で記載される塩基配列であることを確認した。上記全体ＤＮＡには、５９３ｂｐ、４５６ｂｐ及び１９５３ｂｐ大きさをした３つのたんぱく質コーディング地域（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ，  ＯＲＦ）が存在した。上記３つのたんぱく質コーディング地域中、５９３ｂｐ及び４５６ｂｐ  大きさの小さなたんぱく質コーディング地域を含むｐｇ２２ベクターは、ｇｓｈ２変異株のグルタチオン欠乏能力を復帰させられず、今まで報告された蛋白質との類似性もとても低かった（表２参照）。それに反して、１９５３ｂｐ大きさで６５０個のアミノ酸をコーディングする最も大きなたんぱく質コーディング地域を含むｐｇ２４ベクターは、ｇｓｈ２変異株をグルタチオン合成能力を持った形質に変換させる機能を持っていて、上記のたんぱく質コーディングする遺伝子は、キャンディダアルビカン（Ｃ．  ａｌｂｉｃａｎｓ）のＧｃｓ１ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ  寄託番号ＡＡＧ４３４１２）遺伝子と５３％の同一性と６９％類似性を示した。また、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＳｃＧｓｈ１ｐ遺伝子と４７％の同一性と６１％の類似性を示し、スキゾサッカロマイセスポンベ（Ｓｃｈ．  ｐｏｍｂｅ）のＳｐＧｃｓ１ｐ遺伝子と４６％の同一性と６３％の類似性を示し、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）のＨｓＧＣＳｈ遺伝子と４５％の同一性と６３％の類似性を示し、他のγ−ＧＣＳとも相当に高い類似性を示した（図  ２）。それで、本発明者達は、上記４１９５ｂｐ大きさのｐＧ２４プラスミドＤＮＡがハンセヌラポリモルパγ−ＧＣＳをコーディングする遺伝子であると推定して「ＨｐＧＳＨ２」と命名し、２００２年９月２４日付けでＧｅｎＢａｎｋに寄託した（寄託番号ＡＦ４３５１２１）。
＜実施例  ３＞  ＨｐＧＳＨ２  遺伝子の構成成分特性分析
本発明者達は、上記実施例２で分離したＨｐＧＳＨ２  遺伝子の塩基配列に存在する細部構成要素を分析するために配列番号１で記載される塩基配列を利用してたんぱく質コーディング地域、たんぱく質配列相同性分析及び配列分析をした。具体的に、たんぱく質コーディング地域（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ；  ＯＲＦ）は、ＮＣＢＩ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ，  ＵＳＡ）のグラフ分析プログラムのＯＲＦ  Ｆｉｎｄｅｒを使用して分析した。たんぱく質配列相同性分析は、ＢＬＡＳＴサーバーを使用し、配列分析は、ＭｕｌｔＡｌｉｎプログラムを使用した（Ｃｏｒｐｅｔ，  Ｆ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９８８，  １６，  １０８８１）。
【００２８】
その結果、配列番号１で記載されるＨｐＧＳＨ２遺伝子は、４５０ｂｐ程度の５’隣接領域配列（１番から４５０番まで）と１７９２ｂｐ程度の３’隣接配列（２４０１番から４１９５番まで）を持っていて、典型的なＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴボックス及びポリアデニレイション（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）配列は、観察されなかった。しかし、たんぱく質翻訳開示コドンから上流４１６ｂｐ  地点でサッカロマイセスセレビシエのＧＳＨ１遺伝子発現を調節する蛋白質のＣｂｆ１が結合する部位と知られたＣＤＥＩ−結合地域（ＧＣＡＣＧ）と推定される配列（３１番から３５番まで）が観察された（図  ２）。これを通してハンセヌラポリモルパ遺伝子ＨｐＧＳＨ２が反応性酸素族や重金属カドミウム存在可否によってＣｂｆ１相同蛋白質によって発現が調節されることが分かった。
【００２９】
また、他の生物体由来のγ−グルタミルシステイン合成酵素のように、ハンセヌラポリモルパＨｐＧｓｈ２ｐは、グルタチオン−結合蛋白質で一般的に観察されるグルタチオンとの特異的相互作用に関連する配列番号５で記載されるＧＷＲＶＥＦＲＰＭＥモチーフ（配列番号３で記載されるアミノ酸配列の４５７番から４６６番まで）と保存されたリジンまたはアルギニン残基（配列番号３で記載されるアミノ酸配列の４５９番と５０３番アミノ酸残基）を持っていて（Ｃｏｂｌｅｎｚ  ａｎｄ  Ｗｏｌｆ，  Ｙｅａｓｔ，  １９９５，  １１，  １１７１）、酵素の活性中心部と推定される配列番号６で記載されるＭＧＦＧＭＧＸＸＣＬＱ領域でよく保存されシステイン残基（配列番号３で記載されるアミノ酸配列の２５１番目ないし２６１番目）を持っていた（図  ２）。したがって、ｇｓｈ２変異株のグルタチオン要求性補完機能と共に上記の色々な構造的な特徴は、ＨｐＧＳＨ２遺伝子がグルタチオン生合成経路で最も重要な第一段階反応に作用するγ−ＧＣＳをコーディングすることが分かった。
＜実施例  ４＞  ＨｐＧＳＨ２  遺伝子のコピー数及び構造分析
ハンセヌラポリモルパ野生型菌株（ＣＢＳ４７３２  ｌｅｕ２）、ｇｓｈ２変異株（ｇｓｈ２−１  ｌｅｕ１−１）及びプラスミドｐＧ２４が導入されたｇｓｈ２形質転換体（Ｇｓｈ＋Ｌｅｕ＋（ｐＧ２４））からＨｐＧＳＨ２  遺伝子のコピー数と構造に対する情報を得るためにサザンブロットを行なった。具体的に、ＤＮＡプローブを製造するためにＨｐＧＳＨ２遺伝子をＢａｍＨＩで切断して収得された２．０ｋｂ  ＨｐＧＳＨ２断片（図  ３のＡ）を準備した。上記各々細胞から染色体を分離して制限酵素ＰｓｔＩで切断後、上記で製造したＤＮＡプローブを利用して一般的な方法でサザンブロット分析を行なった（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄｎ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８９）。
【００３０】
その結果、野生型菌株では、ＨｐＧＳＨ２遺伝子の単一染色体コピーに該当する４．０  ｋｂ  ＰｓｔＩ断片でハイブリダイゼーション・シグナル（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ）が現れ、形質転換されないｇｓｈ２菌株では、４．０ｋｂ  ＰｓｔＩ断片の代わりに６．５ｋｂ  ＰｓｔＩ断片でハイブリダイゼーション・シグナルが現れた。また、プラスミドｐＧ２４が導入されたｇｓｈ２形質転換体（Ｇｓｈ＋Ｌｅｕ＋（ｐＧ２４））は、導入されたｐＧ２４からのＰｓｔＩ断片（４．０ｋｂ）と染色体ＤＮＡからのＰｓｔＩ断片（６．５ｋｂ）による二個のハイブリダイゼーション・シグナルが現れた。４．０ｋｂ断片が６．５ｋｂ断片よりさらに濃いシグナルを示した（図  ３のＢ）。上記結果を通してｇｓｈ２変異がＨｐＧＳＨ２  ＯＲＦを取り巻いている二つのＰｓｔＩ位置中の一カ所に位置するであろうことが分かり、野生型ＨｐＧＳＨ２遺伝子の導入によってｇｓｈ２変異株の欠損表現型が野生型に補完されたことが分かり、ｇｓｈ２形質転換体にＨｐＧＳＨ２遺伝子が多重に導入されたことが分かった。したがって、γ−ＧＣＳ欠損表現型に対するＨｐＧＳＨ２遺伝子の補完  能力は、本発明で確保されたＨｐＧＳＨ２遺伝子がハンセヌラポリモルパのγ−ＧＣＳをコーディングしていて、ｇｓｈ２形質転換体の重金属に対する耐性が増加（表  １及び表  ２）した理由は、ＨｐＧＳＨ２遺伝子の多重導入によって誘導されたことが分かった。
【００３１】
本発明者達は、ｐＧ２４発現ベクターを大腸菌ＤＨ５ａに形質導入した形質転換体を製造し、これをを２００２年１１月８日付けで韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託した（寄託番号  ＫＣＴＣ１０３７０ＢＰ）。
【００３２】
【発明の効果】
上記で詳しく見たように、本発明のハンセヌラポリモルパ  菌株から分離されたグルタチオン生合成遺伝子をグルタチオン生合成欠損変異株に導入させるとグルタチオン生合成機能と共に重金属耐性及び細胞増殖機能を回復または増加させられ、グルタチオンを利用した重金属吸着、補助酵素の生産、肝機能強化剤及び脱毒性化剤として有用に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＧ２プラスミドに挿入された９．６  ｋｂ  ＤＮＡ切片の制限酵素による切断部位を示した図である。
【図２】ハンセヌラポリモルパ  ＨｐＧＳＨ２  遺伝子の塩基配列を他種のグルタチオン生合成酵素遺伝子と相同比較分析したもので、
ＳｃＧｓｈ１ｐ：  サッカロマイセスセレビシエ
ＣａＧｃｓ１ｐ：  キャンディダアルビカン
ＳｐＧｃｓ１ｐ：  スキゾサッカロマイセスポンベ及び
ＨｓＧＣＳｈ：  ヒト
【図３】ＨｐＧＳＨ２  遺伝子のコピー数分析によるサザンブロット分析によって製造したプローブ  ＤＮＡ（Ａ）及び上記プローブを利用して野生菌株または形質転換体の遺伝子を  サザンブロット分析した電気泳動写真（Ｂ）である。
ライン１：  ＤＮＡ  サイズマーカー。
ライン２：  ｇｓｈ２−１  ｌｅｕ１−１  変異株。
ライン３ないしライン７：  Ｇｓｈ＋Ｌｅｕ＋（ｐＧ２４）  菌株。
ライン８：  ＮＣＹＣ４９５  ｌｅｕ１−１  野生型菌株。
【配列表】
2004173503.tif 000005
2004173503.tif 000006
2004173503.tif 000007
2004173503.tif 000008
2004173503.tif 000009
2004173503.tif 000010
2004173503.tif 000011
2004173503.tif 000012
2004173503.tif 000013
【図１】
2004173503.tif 000014
【図２】
2004173503.tif 000015
【図３】
2004173503.tif 000016