(57)【要約】【課題】低コストで微生物を培養することができるとともに、従来の方法で培養した培養液に比べて菌体濃度を高密度化し、微生物全活性を高めることができる微生物用培地及び微生物培養方法を提供すること。【解決手段】有機系窒素源としてコーンスティープリカーと、主たる炭素源として多価アルコールを含有することを特徴とする微生物用培地、および前記微生物用培地に微生物を添加して微生物を培養することを特徴とする微生物培養方法とする。前記多価アルコールとしては、グリセリンが好ましく、コーンスティープリカーと多価アルコールの含有量は、重量比で１：０．０００１〜５．０であることが好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機系窒素源としてコーンスティープリカーと、主たる炭素源として多価アルコールを含有することを特徴とする微生物用培地。
【請求項２】
前記炭素源としての多価アルコールがグリセリンであることを特徴とする請求項１に記載の微生物用培地。
【請求項３】
コーンスティープリカーと多価アルコールの含有量が、重量比で１：０．０００１〜５．０であることを特徴とする請求項１又は２に記載の微生物用培地。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかに記載の微生物用培地に微生物を添加して微生物を培養することを特徴とする微生物培養方法。
【請求項５】
前記微生物がバークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）に属する微生物であることを特徴とする請求項４に記載の微生物培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は微生物用培地及び微生物培養方法に関する。その目的は、従来に比べて低コストで微生物を培養することができるとともに、従来の方法で培養した培養液に比べて菌体濃度を高密度化し、微生物全活性を高めることができる微生物用培地及び微生物培養方法を提供することにある。
【０００２】
【従来の技術】
医薬品、食品或いは食品添加物等として利用することができる微生物代謝産物を採取するために、或いは、前記したような有用な微生物代謝産物を生成することができる微生物又は有害物質を分解することができる細菌等の有用な微生物を採取するために、固形又は液体の培地が利用されて微生物の増殖が図られている。
通常、微生物を培養して増殖する場合、ペプトンや酵母エキスを配合した培地が広く使用されている。一般的に、ペプトンや酵母エキスを添加した培地で微生物を培養すると、最小培地で微生物を培養した場合に比べて、微生物の増殖性が高まることが知られている。
【０００３】
また、ペプトンや酵母エキスを配合しない培地の開発も進められており、例えば、焼酎蒸留残渣を配合した培地が提案されている（例えば特許文献１参照）。
【０００４】
【特許文献１】
特開２００１−２０４４５９号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上述の微生物用培地には以下のような問題が存在した。まず、ペプトンや酵母エキスを含有した微生物用培地の場合、ペプトンや酵母エキスが共に高価であるために、微生物を工業的に培養しようとする場合、コストが高くなり、経済的でないといった問題があった。
また上述のいずれの微生物用培地を使用して微生物を培養した場合も、微生物の増殖量の限界値が低く、生産性の面でも問題があった。
【０００６】
本発明者らは上記従来の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、有機系窒素源としてコーンスティープリカー及び主たる炭素源としてグリセリンを配合して調製した微生物用培地が、従来の微生物用培地に比べて低コストで微生物を培養することができるとともに、従来の方法で培養した同種の培養液に比べて菌体濃度を高密度化し、微生物全活性を高めることができることを見いだし、本発明の完成に至った。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
即ち、請求項１に係る発明は、有機系窒素源としてコーンスティープリカーと、主たる炭素源として多価アルコールを含有することを特徴とする微生物用培地に関する。
請求項２に係る発明は、前記炭素源としての多価アルコールがグリセリンであることを特徴とする請求項１に記載の微生物用培地に関する。
請求項３に係る発明は、コーンスティープリカーと多価アルコールの含有量が、重量比で１：０．０００１〜５．０であることを特徴とする請求項１又は２に記載の微生物用培地に関する。
請求項４に係る発明は、請求項１乃至３のいずれかに記載の微生物用培地に微生物を添加して微生物を培養することを特徴とする微生物培養方法に関する。
請求項５に係る発明は、前記微生物がバークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）に属する微生物であることを特徴とする請求項４に記載の微生物培養方法に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に係る微生物用培地及び微生物培養方法について説明する。本発明に係る微生物用培地は、コーンスティープリカー及び多価アルコールを含有する。
コーンスティープリカーは主として有機系窒素源であり、かつ、ビタミン、ミネラルを培地に供給するために添加される。コーンスティープリカーはトウモロコシ澱粉生産時の副産物であり、トウモロコシ澱粉湿式製粉法の工程で生成される浸漬液を濃縮して生成するトウモロコシ濃縮浸漬液を乳酸発酵させたものである。コーンスティープリカーには、窒素源であるタンパク質、ペプチド、アミノ酸の他、乳酸、亜硫酸、糖分、ミネラル、ビタミン等が含まれている。
【０００９】
コーンスティープリカーの含有量は特に限定されないが、培地全量中、０．１〜２０重量％、好ましくは１〜１５重量％、より好ましくは３〜１０重量％となるように配合される。コーンスティープリカーの含有量が０．１重量％未満の場合、微生物の増殖速度が遅く、実用的でない。２０重量％を超えて添加すると、それ以上の効果が得られないばかりか、逆に微生物の増殖速度を遅らせる場合があるために、いずれの場合も好ましくない。
【００１０】
本発明に係る微生物用培地では、窒素源として、前述のコーンスティープリカーに加えて、従来から培地の窒素源として用いられている、アンモニア、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、硝酸ナトリウムなどの無機窒素化合物、或いは酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、ペプトン、グルテン粉、綿実粉、大豆粉、乾燥酵母、尿素、アミノ酸等の有機窒素化合物を適宜任意に配合することができる。
【００１１】
炭素源は主に培地に炭素を供給するために配合される。炭素源としての多価アルコールの含有量は特に限定されないが、培地全量中、０．０１〜１０重量％、好ましくは０．０５〜５重量％、より好ましくは０．１〜３重量％となるように添加される。多価アルコールの含有量が０．０１重量％未満の場合、微生物の増殖速度が遅く、実用的でなく、一方、１０重量％を超えて添加すると、それ以上の効果が得られないばかりか、微生物の正常な増殖を妨げる恐れがあるために、いずれの場合も好ましくない。
炭素源としては、従来から培地成分として用いられている多価アルコールであれば特に限定されず、例えば、グリセリン、或いはグルコース、スクロース、フルクトース、澱粉、ラクトース、アラビノース、キシロース、デキストリン、糖蜜、液糖などの糖を例示することができる。これらの炭素源のうちの一種又は二種以上を使用することができる。
特に本発明では、前述の多価アルコールのうち、グリセリンを使用することが好ましい。グリセリンを使用することによって、他の種類の多価アルコールを使用した場合に比べて、微生物全活性を高めることができる。
【００１２】
上述したコーンスティープリカーと多価アルコールの配合比は特に限定されず、コーンスティープリカー及び多価アルコールを前述の添加量の範囲内で添加することが好ましい。より好ましくは、コーンスティープリカーと多価アルコールを前述の添加量の範囲内で添加するとともに、重量比でコーンスティープリカー：多価アルコール＝１：０．０００１〜５．０、好ましくは１：０．０１〜１．５、より好ましくは１：０．１〜０．５となるように添加する。
有機系窒素源であるコーンスティープリカーと、主たる炭素源である多価アルコールとをそれぞれ添加して培地を調製することにより、より好ましくは前述した配合比でコーンスティープリカーと多価アルコールをそれぞれ添加して培地を調製することにより、従来の微生物用培地の場合に比べて、培養液中の菌体濃度を高密度化し、微生物全活性を高めることができる。また酵母エキスやペプトンを窒素源や炭素源の主成分として配合される従来の培地に比べて、培地調製にかかるコストを低減することができる。また、本発明に係る微生物用培地を使用して培養した微生物は、他の培地を使用して培養した同種の微生物に比べて高い微生物活性を有し、しかも長期間微生物活性が低下することなく、安定的に保存することができ、特に耐冷凍性が大幅に向上する。
【００１３】
さらに、本発明では、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウム等のリン酸塩、硫酸マンガン、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄等の硫酸塩、或いは、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カルシウムなどの無機塩類を適宜任意に添加することができる。
無機塩類を添加する場合、その含有量は特に限定されないが、培地全量中、０．００１〜１重量％、好ましくは０．０１〜０．５重量％となるように添加される。
【００１４】
尚、微生物を培養した際に培地が発泡する場合は、液体パラフィン、高級アルコール、植物油、ミネラル油、シリコン、界面活性剤等の消泡剤を配合することができる。
【００１５】
上記した各成分を水に溶解して本発明に係る微生物用培地が調製される。各成分を溶解混合する水としては、水道水、イオン交換水、工業用水、精製水等を例示することができるが特に限定されない。
本発明に係る微生物用培地のｐＨは、培養される微生物に適したｐＨに調整すればよいが、例えば、ｐＨ２．０〜１２．０、好ましくは５．０〜８．０、より好ましくは６．０〜８．０に調整される。
【００１６】
本発明に係る微生物用培地は、液体培地又は固体培地のいずれにも適用することができるが、液体培地として使用することが好ましい。
【００１７】
本発明に係る微生物用培地は、あらゆる微生物の培養に使用することができ、好ましい微生物としては、バークホルデリア  セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）等のＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属などに属する微生物を例示することができる。
【００１８】
上述した微生物用培地を用いて微生物を培養するには、まず、本発明に係る微生物用培地をオートクレーブ等の公知の滅菌方法で滅菌した後に、培養する微生物の所要量を添加する。次に、微生物を添加した培地を、所定の培養温度、培養時間で培養すればよい。
【００１９】
培養温度は特に限定されず、培養する微生物に適した温度で培養すればよい。例えば、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）に属する微生物を培養する場合、１５〜４５℃、好ましくは２０〜４０℃とされる。
培養時間は特に限定されず、培養する微生物に適した時間培養すればよい。例えば、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）に属する微生物を培養する場合、培養条件により異なるが、一般的には１２時間以上、好ましくは２０〜６０時間とされる。
【００２０】
本発明に係る微生物用培地を固体培地として用いる場合、培地成分に寒天等を加えて滅菌処理を行い、シャーレや試験管等に固形状培地を作成して微生物を撒種し、上記条件で培養すればよい。
一方、本発明に係る微生物用培地を液体培地として用いる場合、滅菌処理した培地に微生物を接種した後、上記条件で培養すればよい。
尚、本発明に係る微生物用培地を液体培地として用いる場合、培地内を好気的条件に維持するために、培地を振盪又は攪拌、或いはポンプ装置等を使用して培地内に通気を行うことができる。攪拌はプロペラ若しくはこれに準じる機械的攪拌装置を使用することにより行われる。またポンプ装置には滅菌フィルター等を設置し、滅菌エアーを培養液に通気する。
培地を攪拌する場合、攪拌速度は特に限定されないが、０〜５００ｒｐｍ、好ましくは５０〜４００ｒｐｍ、より好ましくは１００〜３００ｒｐｍとされる。また培地内に滅菌エアーを通気させる場合、通気量は特に限定されないが、０〜５．０ｖｖｍ、好ましくは０．１〜２．０ｖｖｍとされる。
【００２１】
本発明に係る微生物培養方法は、予め培養槽に培地を仕込む回分培養、微生物の増殖に見合う基質を培養槽に添加する流加培養、培養槽に培地を連続的に供給するとともに、増殖した微生物を抜き取る連続培養等で行うことができる。
【００２２】
本発明に係る微生物用培地及び微生物培養方法は、医薬品、食品、食品添加物、酵母等の生産に使用される微生物の培養、或いは農業生産、有害物分解等に用いられる微生物の培養に用いることができる。
【００２３】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づき説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。尚、配合量は重量％である。
（培地の調製）
以下に示される組成の培地を調製し、それぞれ実施例１及び比較例１の液体培地とした。
尚、コーンスティープリカーとしては、オリエンタル酵母工業社製のコーンスティープリカーＡＳＴ（商品名）を使用した。消泡剤としては、ダウコーニング社製のＦＳアンチフォーム０２８（商品名）を使用した。ペプトンとしては、ＤＩＦＣＯ社製のＴｒｙｐｔｏｎｅ  Ｐｅｐｔｏｎｅ（商品名）を使用した。酵母エキスとしては、ＤＩＦＣＯ社製のＹｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ（商品名）を使用した。
【００２４】
＜実施例１の液体培地の組成＞
コーンスティープリカー    ３０ｇ
グリセリン                １０ｇ
リン酸塩                  １．８ｇ
硫酸塩                    １．２２ｇ
無機塩                    ０．１０ｇ
水                        １０００ｍＬ
【００２５】
＜比較例１の液体培地の組成＞
ペプトン                  １０ｇ
酵母エキス                ５ｇ
ＮａＣｌ                  ５ｇ
消泡剤                    ５０ｍｇ
水                        １０００ｍＬ
【００２６】
（微生物の培養試験１）
上記調製した実施例１の液体培地に２Ｎクエン酸水溶液を加えてｐＨ７．２に調整し、オートクレーブで滅菌処理した。この実施例１の液体培地に０．５％のバークホルデリア  セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）ＡＩＫ菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０８）の前培養液を添加して、エアポンプで通気を行い（通気量：０．４ｖｖｍ）、液体培地を攪拌（攪拌速度：２００ｒｐｍ）しながら、培地中の菌体密度が最大値に達するまで（２３時間）３０℃で培養した。
上記調製した比較例１の液体培地に２Ｎクエン酸水溶液を加えてｐＨ７．２に調整し、オートクレーブで滅菌処理した。この比較例１の液体培地に０．５％のバークホルデリア  セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）ＡＩＫ菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０８）の前培養液を添加して、エアポンプで通気（通気量：０．４ｖｖｍ）を行い、液体培地を攪拌（攪拌速度：２００ｒｐｍ）しながら、培地中の菌体密度が最大値に達するまで（１５時間）３０℃で培養した。
【００２７】
（菌体量の測定）
培養前と培養後の実施例１及び比較例１の液体培地から所定量の液体培地を抜き取り、それぞれを適当に希釈したサンプルの６６０ｎｍにおける吸光度を、分光光度計を用いて測定し、吸光度の差を菌体の増殖量とした。結果を表１に記載する。
【００２８】
【表１】
2004329157.tif 000002
【００２９】
表１の結果に示されるように、本発明に係る液体培地を使用して微生物を培養した場合、従来の培地を使用して微生物を同じ条件で培養した場合に比べて、菌体量が約３倍に増加した。
従って、本発明に係る微生物用培地を用いた培養方法は、従来の微生物用培地を用いる方法に比べて、培養液中に含まれる菌体密度が高く、生産の効率を大幅に高めることができる。また、菌体密度が約３倍になることから、微生物製剤化する際の製品ひとつあたりの容量を１／３にすることが可能であり、保存性や輸送性を大幅に高めることが可能である。
一般的に、酵母エキスを添加した培地で微生物を培養すると、微生物を最小培地で培養した場合に比べて、高い増殖性を示すことが知られている。本発明に係る微生物用培地は、酵母エキスを添加した培地よりもさらに高い増殖性を示すことが可能であり、しかも培地の原材料費は約１／５である。
【００３０】
（微生物保存性試験）
実施例１及び比較例１の培地を使用して培養した微生物の保存安定性試験を行った。試験方法は、まず、上述と同様の方法で実施例１及び比較例１の液体培地を使用して油脂を分解することができる微生物であるバークホルデリア  セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）ＡＩＫ菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０８）を培養した後、この培地に３％（Ｗ／Ｖ）のグリセリンを添加して均一になるまで攪拌した。１００ｍＬずつ分注した後に、−２０℃の条件下で保存し、経時的に微生物活性と生菌数を測定した。
微生物活性の測定は、３２日間凍結保存した各サンプルを融解し、菌数が一定になるように生理食塩水で希釈した。つぎに、既知濃度の食用油脂を含有する合成培地に菌数を一定にした各サンプルを接種し、３０℃、１５０ＲＰＭで培養を行った。一定時間（１３時間）培養後の各合成培地に含まれる油脂濃度を測定することで油脂の分解量、すなわち、油脂分解活性を算出した。
生菌数の測定は、大腸菌生育用の一般栄養培地に寒天等を加えて固形培地とし、融解した各サンプル（保存前、１４日間保存、３２日間保存）を適当に希釈後、固形培地上に塗布して３０℃にて静置培養を行った。１〜２日間の培養後、形成されたコロニー数をカウントし、コロニー数と希釈倍率から生菌数を測定した。結果を表２（生菌数）、表３（油脂分解活性）に記載する。
【００３１】
【表２】
2004329157.tif 000003
【表３】
2004329157.tif 000004
【００３２】
表２と表３に示されるように、本発明に係る微生物用培地を使用して培養した微生物は、従来の培地を使用して培養した場合と比べて長期保存による生菌数への影響が少なく、微生物活性も比較例１よりも向上している。すなわち、単位菌体量あたりの微生物活性を維持した状態で、冷凍保存による生菌数への影響を低減させることができる。
【００３３】
（微生物の培養試験２）
上記実施例１の液体培地において、コーンスティープリカーの含有量を１／３に減じた液体培地を調製し、実施例２の液体培地とした。また上記実施例１の液体培地において、コーンスティープリカーの含有量を２／３に減じた液体培地を調製し、実施例３の液体培地とした。
また上記実施例１〜３の液体培地において、グリセリンの代わりに同量の液糖を配合した液体培地を調製し、それぞれ実施例４〜６の液体培地とした。
実施例１〜６及び比較例１の液体培地に２Ｎクエン酸水溶液を加えてｐＨ７．２に調整し、２５０ｍＬの三角フラスコに５０ｍＬずつ分注した後、オートクレープで滅菌処理した。この実施例１〜６及び比較例１の液体培地に１％のバークホルデリア  セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）ＡＩＫ菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０８）の前培養液を添加して、液体培地を攪拌（攪拌速度：１５０ｒｐｍ）しながら培養した。
【００３４】
（菌体量の測定）
培養前と所要時間培養した後の液体培地から所定量の液体培地を抜き取り、それぞれを適当に希釈したサンプルの６６０ｎｍにおける吸光度を、分光光度計を用いて測定し、吸光度の差を菌体の増殖量とした。結果を表４に記載する。
【００３５】
【表４】
2004329157.tif 000005
【００３６】
表４の結果に示されるように、各実施例の液体培地を使用して培養した場合、従来の培地である比較例１の液体培地を使用して培養した場合に比べて、最高で３〜４倍に菌体量を増加できることが分かる。
また主たる炭素源としてグリセリンを配合した実施例１〜３は、炭素源として液糖を配合した実施例４〜６に比べて菌体量を増加できることが分かる。
【００３７】
以上の試験結果から、本発明に係る微生物用培地及び微生物の培養方法は、従来に比べて培地原料費約１／５の低コストで微生物を培養することができるとともに、従来の方法で培養した培養液と比べて菌体濃度が約３倍、しかも接種菌体量を一定とした場合の微生物活性は同等以上であり、結果として微生物全活性を約３倍に高めることができることが分かる。
【００３８】
【発明の効果】
以上詳述した如く、本発明に係る微生物用培地及び微生物の培養方法は、従来に比べて低コストで微生物を培養することができるとともに、従来の方法で培養した培養液と比べて菌体濃度を高密度化し、微生物全活性を高めることができる。