(57)【要約】【課題】植物の開花を促進する遺伝子、および、該遺伝子の発現量を指標とした植物の開花時期を予測する方法を提供することを課題とする。【解決手段】イネのＲＦＴ１遺伝子が、出穂（開花）の促進機能をもつことを明らかにした。該遺伝子の発現量をイネの生育過程で調査し、その発現量が長日条件における到穂日数と高い負の相関を示すことを明らかにした。これらの結果に基づいて、任意のイネ品種の出穂期を簡便に予測する方法を開発した。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
自然日長条件または長日条件下において、植物の開花を促進する機能を有する植物由来のタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号：３または６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１、２、４または５に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：３または６に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：１、２、４または５に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項２】
イネ由来である、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）請求項１または２に記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（ｂ）請求項１または２に記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（ｃ）植物細胞における発現時に、ＲＮＡｉ効果により、請求項１または２に記載のＤＮＡの発現を抑制するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（ｄ）植物細胞における発現時に、共抑制効果により、請求項１または２に記載のＤＮＡの発現を抑制するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
【請求項４】
植物の開花を促進するために用いる、請求項１または２に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
植物の開花を遅延するために用いる、請求項３に記載のＤＮＡ。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項７】
請求項１から５のいずれかに記載のＤＮＡまたは請求項６に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【請求項１１】
請求項８に記載の形質転換植物体の製造方法であって、請求項１から５のいずれかに記載のＤＮＡまたは請求項６に記載のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。
【請求項１２】
請求項１または２に記載のＤＮＡを植物体の細胞内で発現させることを特徴とする、植物の開花を促進する方法。
【請求項１３】
植物体の細胞内における、内因性の請求項１または２に記載のＤＮＡの発現を抑制することを特徴とする、植物の開花を遅延する方法。
【請求項１４】
請求項３に記載のＤＮＡを植物に導入することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１または２に記載のＤＮＡの発現量を測定する工程を含む、自然日長条件または長日条件下における植物の開花時期を予測する方法。
【請求項１６】
請求項１または２に記載のＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１６に記載のオリゴヌクレオチドを含む、植物の開花時期を予測するための試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物の開花促進遺伝子ＲＦＴ１および該遺伝子の発現を指標とした植物の開花時期を予測する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
イネの出穂期（開花時期）は主に日長に依存する感光性とそれ以外の要因（基本栄養成長性あるいは感温性）によって決定されている。この出穂期に関する遺伝解析は古くから行われ、これまでＳｅ１座（第６染色体）、Ｅ１座（第７染色体）、Ｅ２座（不明）、Ｅ３座（第３染色体）、あるいはＥｆ１　座（第１０染色体）等の出穂期関連遺伝子が突然変異や品種に内在する変異として見い出されている。近年、ＤＮＡマーカーがイネの遺伝解析に利用されるようになって、出穂期のような複雑な遺伝に従う形質の遺伝解析（量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）のマッピング）が進展した。それらの背景のもと、イネの感光性に関与する遺伝子の単離が進められてきた（Ｙａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　１２：２４７３−２４８４，　２０００；　Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　ＰＮＡＳ　９８：７９２２−７９２７，　２００１）。しかしながら、依然として多くの出穂期関連遺伝子が単離同定されずに残されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、植物の開花を促進する遺伝子を提供することにある。また、本発明は、該遺伝子の発現量を指標とした植物の開花時期を予測する方法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った。本発明者らは、出穂期関連遺伝子Ｈｄ３ａをマップベースクローニングによって単離同定する過程で、ＲＦＴ１遺伝子を見出した。ＲＦＴ１遺伝子がイネの出穂に影響を与えるかどうかを明らかにするために、ＲＦＴ１遺伝子の相補ＤＮＡ断片の形質転換を行った。形質転換には、日本型品種日本晴およびインド型品種Ｋａｓａｌａｔｈ由来のｃＤＮＡ断片を用いた。検討の結果、短日条件における日本晴およびＫａｓａｌａｔｈのＲＦＴ１遺伝子を導入した形質転換個体（Ｔ０）の一部は著しい早生となり、なかには移植前後にすでに出穂する個体も認められた。長日条件においても、早生個体は観察された。ベクターのみの個体は、出穂まで移植後約４０〜５０日を要し、同じ条件で栽培した日本晴とは大きな差は認められなかった。これらの結果から、ＲＦＴ１遺伝子は出穂を促進させる作用をもつことが明らかとなった。
【０００５】
さらに、ＲＦＴ１遺伝子のイネの出穂に対する役割をより詳細に解析するために、人工調節環下の短日（１０時間）および長日（１４．５時間）条件下において、極早生品種はやまさり、ＡＲＣ１０３１３、早生品種アキヒカリ、日本晴および極晩生品種ＮｏｎａＢｏｋｒａを栽培し、生育過程に置けるＲＦＴ１およびＨｄ３ａのｍＲＮＡ量の変化を解析した。短日条件ではＨｄ３ａ遺伝子のｍＲＮＡが日本晴およびＮｏｎａ　Ｂｏｋｒａで播種後１０日目で既に検出されたのに対して、ＡＲＣ１０３１３では２０日目から検出された。はやまさりにおいては７０日後までＨｄ３ａｍＲＮＡは検出できなかった。一方、短日条件でのＲＦＴ１遺伝子のｍＲＮＡは、はやまさり、日本晴およびＮｏｎａ　Ｂｏｋｒａにおいて播種後１０日目で検出できたが、ＡＲＣ１０３１３においては４０日目において検出された。これらの発現量と出穂期の関係を見ると、短日条件ではＨｄ３ａおよびＲＦＴ１遺伝子のどちらもが出穂に関与する可能性が示唆された。長日条件下ではＨｄ３ａのｍＲＮＡは、ＡＲＣ１０３１３の７０日目に検出されたが、それ以外の品種では検出できなかった。一方、ＲＦＴ１遺伝子のｍＲＮＡは、はやまさりおよびアキヒカリでは播種後４０日目でその転写量が増大し、はやまさりの転写量が最も増大していた。ＡＲＣ１０３１３および日本晴では播種後７０日目で検出された。Ｎｏｎａ　Ｂｏｋｒａでは播種後７０日目においてもｍＲＮＡは検出できなかった。これらのｍＲＮＡの転写レベルの高低は長日条件下における出穂の早晩をよく反映していた。
【０００６】
また、出穂期が異なるイネの２７品種・近縁種について、圃場での生育過程におけるＨｄ３ａおよび　ＲＦＴ１のｍＲＮＡ発現量を調査した。２００１年４月２３日（４／２３）に播種し、５／２３に移植した植物体の葉を６／１２、７／１０および８／７に採取し、ＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。その結果、Ｈｄ３ａはいずれの時期においてもインド型の１系統（ＡＲＣ１０３１３）を除くすべての品種において転写レベルは低かった。一方、ＲＦＴ１の発現量は生育初期から増加する品種が認められ、その転写産物量と出穂期（到穂日数）の間には相関が認められた。これらの結果から、自然日長条件下ではＨｄ３ａ　ではなくＲＦＴ１遺伝子の働きによって出穂が決定されることが示唆された。
【０００７】
さらに、発現量と出穂期の相関をより詳細に解析するために、定量ＰＣＲ法による各生育時期でのＲＦＴ１遺伝子のｍＲＮＡ量を比較した。その結果、各生育時期において、極めて高い負の相関関係が認められた。
【０００８】
以上の結果から、自然日長条件または長日条件下において、植物の開花を促進する機能を有するＲＦＴ１遺伝子とその利用方法が提供できる。
【０００９】
即ち、本発明は、
〔１〕　自然日長条件または長日条件下において、植物の開花を促進する機能を有する植物由来のタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ、
（ａ）配列番号：３または６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：１、２、４または５に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
（ｃ）配列番号：３または６に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号：１、２、４または５に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
〔２〕　イネ由来である、〔１〕に記載のＤＮＡ、
〔３〕　下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ、
（ａ）〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、
（ｂ）〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ、
（ｃ）植物細胞における発現時に、ＲＮＡｉ効果により、〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡの発現を抑制するＲＮＡをコードするＤＮＡ、
（ｄ）植物細胞における発現時に、共抑制効果により、〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡの発現を抑制するＲＮＡをコードするＤＮＡ、
〔４〕　植物の開花を促進するために用いる、〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡ、
〔５〕　植物の開花を遅延するために用いる、〔３〕に記載のＤＮＡ、
〔６〕　〔１〕から〔５〕のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター、
〔７〕　〔１〕から〔５〕のいずれかに記載のＤＮＡまたは〔６〕に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞、
〔８〕　〔７〕に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体、
〔９〕　〔８〕に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体、
〔１０〕　〔８〕または〔９〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料、
〔１１〕　〔８〕に記載の形質転換植物体の製造方法であって、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載のＤＮＡまたは〔６〕に記載のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法、
〔１２〕　〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡを植物体の細胞内で発現させることを特徴とする、植物の開花を促進する方法、
〔１３〕　植物体の細胞内における、内因性の〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡの発現を抑制することを特徴とする、植物の開花を遅延する方法、
〔１４〕　〔３〕に記載のＤＮＡを植物に導入することを特徴とする、〔１３〕に記載の方法、
〔１５〕　〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡの発現量を測定する工程を含む、自然日長条件または長日条件下における植物の開花時期を予測する方法、
〔１６〕　〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチド、
〔１７〕　〔１６〕に記載のオリゴヌクレオチドを含む、植物の開花時期を予測するための試薬、
を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明は、自然日長条件または長日条件下において、植物の開花を促進する機能を有する植物由来のＲＦＴ１タンパク質をコードするＤＮＡを提供する。
【００１１】
本発明において、ＲＦＴ１タンパク質をコードするＤＮＡが由来する植物としては、特に限定はなく、イネ、シロイヌナズナ、ダイズ、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、アサガオ、カンキツ、リンゴなどが挙げられる。
【００１２】
また、上記ＤＮＡが導入されることで開花が促進される植物としては、特に制限はなく、例えば、有用農作物や鑑賞用植物等を挙げることができる。具体的には、有用農作物としては、例えばイネなどの単子葉植物や、ダイズ等の双子葉植物が挙げられる。また、果樹としてカンキツ類、リンゴ、ナシおよびモモ、さらには観賞用植物として、例えばキク、アサガオ、ポインセチア、コスモス等の花卉植物が挙げられる。
【００１３】
本発明において開花とは通常、花が咲くことを指すが、イネを含むイネ科植物等においては出穂を意味する。本発明において開花の促進とは、開花時期を早めることを指す。また、開花の遅延とは、開花時期を遅らせることを指す。
【００１４】
本発明において、自然日長条件とは、日本の初夏（４月）から盛夏（８月）の日長条件であり、好ましくは１日の日照時間が１４時間から１６時間程度になる条件である。また、本発明において、長日条件とは、人工気象室において１日２４時間のうち、明期が暗期よりも長い条件であり、具体的には、日照時間が１４時間以上になる条件である。本実施例では明期を１４．５時間、暗期を９．５時間に設定したが、この条件に限定されるものではない。
【００１５】
また、本発明において、ＲＦＴ１タンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば配列番号：１、２、４または５に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡや配列番号：３または６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００１６】
また、本発明は、配列番号：３または６に記載のアミノ酸配列からなるＲＦＴ１タンパク質と構造的に類似しており、自然日長条件または長日条件下において植物の開花を促進する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを包含する。
【００１７】
あるＤＮＡが、自然日長条件または長日条件下において植物の開花を促進する機能を有するタンパク質をコードするか否かは、例えば、該ＤＮＡが導入された植物の開花が自然日長条件または長日条件下において促進するか否か、または、該ＤＮＡの発現を抑制するＤＮＡが導入された植物の開花が自然日長条件または長日条件下において遅延するか否かを観察することで検証することができる。
【００１８】
このようなＤＮＡには、例えば、配列番号：３または６に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする変異体、誘導体、アリル、バリアントおよびホモログが含まれる。
【００１９】
アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードするＤＮＡを調製するための当業者によく知られた方法としては、例えば、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（Ｋｒａｍｅｒ　Ｗ　＆　Ｆｒｉｔｚ　Ｈ−Ｊ：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　１５４：　３５０，　１９８７）が挙げられる。また、自然界においても、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得る。このように、ＲＦＴ１タンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡであっても、天然型のＲＦＴ１タンパク質（配列番号：３または６）と同等の機能を有するタンパク質をコードする限りは、本発明のＲＦＴ１タンパク質をコードするＤＮＡに含まれる。また、たとえ塩基配列が変異していても、その変異がタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わないこと（縮重変異）があるが、このような縮重変異体も本発明のＲＦＴ１タンパク質をコードするＤＮＡに含まれる。
【００２０】
配列番号：３または６に記載のアミノ酸配列からなるＲＦＴ１タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを調製するために、当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ＥＭ：　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　９８：　５０３，　１９７５）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ　ＲＫ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：　１３５０，　１９８５、Ｓａｉｋｉ　ＲＫ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：　４８７，　１９８８）を利用する方法が挙げられる。すなわち、ＲＦＴ１領域のゲノム塩基配列（配列番号：１もしくは４）、ＲＦＴ１　ｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：２もしくは５）、または、その一部をプローブとして、また、ＲＦＴ１領域のゲノム塩基配列、ＲＦＴ１　ｃＤＮＡの塩基配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、イネや他の植物からＲＦＴ１タンパク質をコードするＤＮＡと高い相同性を有するＤＮＡを単離することは、当業者にとって通常行い得ることである。このように、ハイブリダイゼーション技術やＰＣＲ技術によって単離し得るＲＦＴ１タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡもまた、本発明のＲＦＴ１タンパク質をコードするＤＮＡに含まれる。
【００２１】
このようなＤＮＡを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、６Ｍ　尿素、０．４％　ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ　尿素、０．４％　ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣの条件下では、より相同性の高いＤＮＡを単離できると期待される。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を指す。
【００２２】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８７：２２６４−２２６８，　１９９０、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９０：　５８７３，　１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ＳＦ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　２１５：　４０３，　１９９０）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。
【００２３】
本発明のＤＮＡには、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび化学合成ＤＮＡが含まれる。ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの調製は、当業者にとって常套手段により行うことが可能である。ゲノムＤＮＡは、例えば、ＲＦＴ１タンパク質をコードするＤＮＡを有するイネ品種からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣなどが利用できる）を作製し、これを展開して、本発明のＲＦＴ１タンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：１、２、４または５）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことで調製できる。また、本発明のＲＦＴ１タンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：１、２、４または５）に特異的なプライマーを作製し、これを利用したＰＣＲを行って調製することも可能である。ｃＤＮＡは、例えば、ＲＦＴ１タンパク質をコードするＤＮＡを有するイネ品種から抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをλＺＡＰなどのベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことで、またＰＣＲを行うことにより調製できる。
【００２４】
本発明のＲＦＴ１タンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、植物の開花を促進するために用いることができる。該ＤＮＡを用いることによって、自然日長条件または長日条件だけでなく、短日条件でも開花の促進を行うことが可能である。ここで、短日条件とは、人工気象室において１日２４時間のうち、暗期が明期よりも長い条件であり、具体的には、１日の日照時間が１１時間以下になる条件である。本実施例では明期を１０時間、暗期を１４時間に設定したが、これに制限されない。
【００２５】
開花が促進された形質転換植物体を作製するには、上記ＤＮＡを適当なベクターに挿入して、後述する方法で、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。本発明は、このような植物の開花を促進させる方法を提供する。
【００２６】
本発明は植物の開花を遅延させる方法もまた提供する。開花が遅延した形質転換植物体は、例えばＲＦＴ１タンパク質をコードするＤＮＡの発現を抑制するＤＮＡを適当なベクターに挿入して、後述する方法で、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させることによって作製できる。「ＲＦＴ１タンパク質をコードするＤＮＡの発現の抑制」には、これらＤＮＡの転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、ＤＮＡの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。また、翻訳されたタンパク質が植物細胞内で本来の機能を発揮しないことも含まれる。
【００２７】
植物における特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者に最もよく利用されている。植物細胞におけるアンチセンス効果は、電気穿孔法で導入したアンチセンスＲＮＡが植物においてアンチセンス効果を発揮することをエッカーらが示したことで初めて実証された（Ｅｃｋｅｒ　ＪＲ　＆　Ｄａｖｉｓ　ＲＷ：　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８３：　５３７２，　１９８６）。その後、タバコやペチュニアにおいてもアンチセンスＲＮＡの発現により標的遺伝子の発現が低下した例が報告されており（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｋｒｏｌ　ＡＲ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｎａｔｕｒｅ　３３３：　８６６，　１９８８）、現在では、アンチセンス技術は植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。
【００２８】
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を抑制する（平島および井上：　新生化学実験講座２　核酸ＩＶ　遺伝子の複製と発現　（日本生化学会編，　東京化学同人）　ｐｐ．３１９−３４７，　１９９３）。
【００２９】
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用により標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むＤＮＡも、本発明で利用されるアンチセンスＤＮＡに含まれる。使用されるアンチセンスＤＮＡは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたＤＮＡは、公知の方法を用いることで、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスＤＮＡの配列は、形質転換される植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、アンチセンスＤＮＡの長さは少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上である。通常用いられるアンチセンスＤＮＡの長さは５ｋｂよりも短く、好ましくは２．５ｋｂよりも短い。
【００３０】
内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リボザイムをコードするＤＮＡを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子のことを指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、ＲＮＡを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅ　Ｐに含まれるＭ１　ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子：　蛋白質核酸酵素，　３５：　２１９１，　１９９０）。
【００３１】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５という配列のＣ１５の３’側を切断するが、その活性にはＵ１４とＡ９との塩基対形成が重要とされ、Ｃ１５の代わりにＡ１５またはＵ１５でも切断され得ることが示されている（Ｋｏｉｚｕｍｉ　Ｍ，　ｅｔ　ａｌ：　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　２２８：　２２８，　１９８８）。基質結合部位が標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することができる（ＫｏｉｚｕｍｉＭ，　ｅｔ　ａｌ：　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　２３９：　２８５，　１９８８、小泉誠および大塚栄子：　蛋白質核酸酵素　３５：　２１９１，　１９９０、　Ｋｏｉｚｕｍｉ　Ｍ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１７：　７０５９，　１９８９）。例えば、ＲＦＴ１タンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号：２または５）中には、標的となり得る部位が複数存在する。
【００３２】
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｂｕｚａｙａｎ　ＪＭ：　Ｎａｔｕｒｅ　３２３：　３４９，　１９８６）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なＲＮＡ切断リボザイムを作出できることが示されている（Ｋｉｋｕｃｈｉ　Ｙ　＆Ｓａｓａｋｉ　Ｎ：　Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１９：　６７５１，　１９９１、菊池洋：　化学と生物　３０：　１１２，　１９９２）。
【００３３】
標的を切断できるように設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるように、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。このとき、転写されたＲＮＡの５’端や３’端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われることがあるが、こういった場合は、転写されたリボザイムを含むＲＮＡからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の５’側や３’側にシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である（Ｔａｉｒａ　Ｋ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ　３：　７３３，　１９９０、Ｄｚｉａｎｏｔｔ　ＡＭ　＆　Ｂｕｊａｒｓｋｉ　ＪＪ：　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８６：　４８２３，　１９８９、Ｇｒｏｓｓｈａｎｓ　ＣＡ　＆　Ｃｅｃｈ　ＴＲ：　Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１９：　３８７５，　１９９１、Ｔａｉｒａ　Ｋ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１９：　５１２５，　１９９１）。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにすることで、より効果を高めることもできる（Ｙｕｙａｍａ　Ｎ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ　１８６：　１２７１，　１９９２）。このように、リボザイムを用いて本発明における標的遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を抑制することができる。
【００３４】
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒａｎｃｅ（ＲＮＡｉ）によっても行うことができる。ＲＮＡｉとは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖ＲＮＡを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。ＲＮＡｉの機構の詳細は明らかではないが、最初に導入した二本鎖ＲＮＡが小片に分解され、何らかの形で標的遺伝子の指標となることにより、標的遺伝子が分解されると考えられている。ＲＮＡｉは植物においても効果を奏することが知られている（Ｃｈｕａｎｇ　ＣＦ　＆　Ｍｅｙｅｒｏｗｉｔｚ　ＥＭ：　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９７：　４９８５，　２０００）。例えば、植物体におけるＲＦＴ１タンパク質をコードするＤＮＡの発現をＲＮＡｉにより抑制するためには、ＲＦＴ１タンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号：２または５）またはこれと類似した配列を有する二本鎖ＲＮＡを目的の植物へ導入し、得られた植物体から野生型植物体と比較して開花が遅延した植物を選択すればよい。ＲＮＡｉに用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を有する。また、配列の同一性は上述した手法により決定できる。
【００３５】
内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するＤＮＡの形質転換によって起こる共抑制によっても達成できる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、少なくともその機構の一部はＲＮＡｉの機構と重複していると考えられている。共抑制は植物においても観察される（Ｓｍｙｔｈ　ＤＲ：　Ｃｕｒｒ　Ｂｉｏｌ　７：　Ｒ７９３，　１９９７、Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ　Ｒ：　Ｃｕｒｒ　Ｂｉｏｌ　６：　８１０，　１９９６）。例えば、ＲＦＴ１タンパク質をコードするＤＮＡが共抑制された植物体を得るためには、ＲＦＴ１タンパク質をコードするＤＮＡまたはこれと類似した配列を有するＤＮＡを発現できるように作製したベクターＤＮＡを目的の植物へ形質転換し、得られた植物体から野生型植物体と比較して開花が遅延した植物を選択すればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を有する。また、配列の同一性は上述した手法により決定できる。
【００３６】
本発明は、本発明のＤＮＡを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む形質転換植物体の製造方法を提供する。
【００３７】
本発明において、植物細胞が由来する植物としては、特に制限はない。また、植物細胞の形質転換に用いられるベクターは、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内で恒常的に遺伝子を発現させるためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクターや、外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることもできる。ここで言う「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
【００３８】
植物細胞へのベクターの導入には、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。アグロバクテリウム（例えば、ＥＨＡ１０１）を介する方法においては、例えば、超迅速単子葉形質転換法（特許第３１４１０８４号）を用いることが可能である。また、パーティクルガン法においては、例えば、バイオラッド社のものを用いることが可能である。形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Ｔｏｋｉ　Ｓ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１００：　１５０３，　１９９５）。
【００３９】
例えば、イネにおいて形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールを用いてプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Ｄａｔｔａ　ＳＫ：　Ｉｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｔｏ　Ｐｌａｎｔｓ　（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ　Ｉ　ａｎｄ　Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，　Ｅｄｓ）　ｐｐ．６６−７４，　１９９５）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Ｔｏｋｉ　Ｓ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１００：　１５０３，　１９９２）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ　Ｐ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９：　９５７，　１９９１）、およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Ｈｉｅｉ　Ｙ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｐｌａｎｔ　Ｊ　６：　２７１，　１９９４）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００４０】
ゲノム内に本発明のＤＮＡが導入された形質転換植物体がいったん得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることができる。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなど）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。
【００４１】
また、本発明は、本発明のＤＮＡの発現量を測定する工程を含む、自然日長条件または長日条件下における植物の開花時期を予測する方法を提供する。本発明のＤＮＡの発現量の測定は、ＲＮＡやｃＤＮＡなどの核酸や本発明のＤＮＡからコードされるタンパク質の発現量を指標とすることもできる。よって、「本発明のＤＮＡの発現量」には、これら核酸やタンパク質の発現量も含まれる。
【００４２】
該方法では、本発明のＤＮＡの発現量が増加すれば穂の形態形成が始まることから、発現量によって出穂が始まる時期を予測することが可能である。
【００４３】
また、該方法では、自然日長条件下において、本発明のＤＮＡの発現量をモニタリングすることで、条件下での植物の開花時期を予測することが可能であるだけでなく、人工気象室の長日条件下における本発明のＤＮＡの発現量をモニタリングすることによって、栽培時期に依存することなく、自然日長条件での植物の開花時期を予測することもまた可能である。
【００４４】
以下に本発明の予測方法の具体的な態様を記載するが、本発明の予測方法は、それらの方法に限定されるものではない。
【００４５】
本発明のＤＮＡの発現量を測定する工程を含む予測方法の一つの態様としては、まず、被検植物から経時的にＲＮＡ試料を調製する。次いで、該ＲＮＡ試料に含まれるＲＦＴ１タンパク質をコードするＲＮＡの量を測定する。その他の態様としては、まず、被検植物から経時的にＲＮＡ試料を調製する。次いで、該ＲＮＡ試料からｃＤＮＡ試料を合成する。次いで、該ｃＤＮＡ試料に含まれるＲＦＴ１タンパク質をコードするｃＤＮＡの量を測定する。このような方法としては、当業者に周知の方法、例えばノーザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡアレイ法等を挙げることができるが、上記方法は、これらの方法に限定されない。
【００４６】
ＲＮＡやｃＤＮＡ試料の調製は、当業者に周知の方法で行うことができる。例えば被検植物の播種１０日後から出穂３０日前までの葉から、ｍＲＮＡを単離する。
【００４７】
ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，　Ｊ．　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９７９）　１８，　５２９４−５２９９）　、ＡＧＰＣ法　（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，　Ｐ．　ａｎｄ　Ｓａｃｃｈｉ，　Ｎ．，　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　（１９８７）　１６２，　１５６−１５９）　等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）　等を使用して全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ　ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）　を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ　（生化学工業社）等を用いて行うこともできる。
【００４８】
また、本発明のＤＮＡの発現量を測定する工程を含む予測方法の別の態様としては、まず、被検植物から経時的にタンパク質試料を調製する。本発明において、タンパク質試料は、例えば、被検植物の播種１０日後から出穂３０日前までの葉から、当業者に周知の方法で調製することができる。
【００４９】
本発明の方法においては、次いで、該タンパク質試料に含まれるＲＦＴ１タンパク質の量を測定する。このような方法としては、当業者に周知の方法、例えば、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法、２次元電気泳動法、プロテインチップによる解析法（蛋白質　核酸　酵素　Ｖｏｌ．４７　Ｎｏ．５（２００２）、蛋白質　核酸　酵素　Ｖｏｌ．４７　Ｎｏ．８（２００２））、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光法、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法が挙げられるが、上記方法は、これらに限定されない。
【００５０】
本発明はまた、植物の開花時期を予測するための試薬を提供する。このような試薬としては、ＲＦＴ１タンパク質をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む試薬が挙げられる。また、ＲＦＴ１タンパク質に結合する抗体を含む試薬も挙げられる。
【００５１】
上記オリゴヌクレオチドは、ＲＦＴ１タンパク質をコードするＤＮＡ（例えば配列番号：２または５）に特異的にハイブリダイズするものである。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、ＲＦＴ１タンパク質をコードするＤＮＡに対し、完全に相補的である必要はない。
【００５２】
上記オリゴヌクレオチドを含む試薬としては、上記方法に使用しうるプローブ（該プローブが固定された基板の形態であってもよい）やプライマーが挙げられる。上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは１７ｂｐ〜３０ｂｐである。プライマーは、本発明のＤＮＡの少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。このようなプライマーとしては、例えば、配列番号：９、１０、１３、１４、１７および１８に記載のＤＮＡが例示できるが、これらに限定されるものではない。
【００５３】
また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、ＲＦＴ１タンパク質をコードするＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも１５ｂｐ以上の鎖長を有する。このようなプローブとしては、例えば、配列番号：１９に記載のＤＮＡが例示できるが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。
【００５５】
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
【００５６】
上記の試薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチドや抗体以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤（ＢＳＡやゼラチンなど）、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
【００５７】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］　ＲＦＴ１遺伝子について
ＲＦＴ１遺伝子は、出穂期関連遺伝子Ｈｄ３ａをマップベースクローニングによって単離同定する過程で見出された遺伝子である。すなわちＨｄ３ａ遺伝子領域の精度の高い遺伝地図を作成したところ、Ｈｄ３ａ遺伝子の候補領域として絞り込まれたゲノム領域外に、Ｈｄ３ａ遺伝子と塩基配列が類似する遺伝子の存在が明らかとなった。この遺伝子は、組み換え個体の存在から、遺伝学的にＨｄ３ａ遺伝子の候補からは除外されていた（図１）。
【００５８】
［実施例２］　ＲＦＴ１候補遺伝子の塩基配列および推定アミノ酸配列の比較
イネ品種Ｋａｓａｌａｔｈおよび日本晴について、ＲＦＴ１領域約２．９ｋｂのゲノムおよびＲＦＴ１候補遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を解析した。ゲノムおよびｃＤＮＡの塩基配列の比較から、ＲＦＴ１は４つのｅｘｏｎ（４６１ｂｐ、６２ｂｐ、４１ｂｐおよび４７３ｂｐ）からなり、コード領域は５３７ｂｐであると推定された。日本晴の塩基配列に対し、Ｋａｓａｌａｔｈでは転写開始点上流域約１ｋｂの領域に１３箇所の１塩基置換および１０塩基欠失、２塩基挿入、１１塩基挿入が見られ、転写領域内には２１箇所の１塩基置換および１塩基欠失、１１塩基欠失、８塩基欠失が存在した。そのうち翻訳領域内に存在していたのは１０箇所の１塩基置換で、３’末に見いだされた４個がアミノ酸置換を引き起こすことが推定された。
【００５９】
Ｈｄ３ａとＲＦＴ１の推定アミノ酸配列の比較を行なった（図２）。Ｈｄ３ａとＲＦＴ１間のアミノ酸配列の相同性は全体で約９１％と高く、特にＣ末端側は９８％のアミノ酸が一致していた。ＲＦＴ１のＫａｓａｌａｔｈおよび日本晴間の配列を比較すると、Ｎ末端側で１アミノ酸、Ｃ末端側で４アミノ酸が異なっており、Ｋａｓａｌａｔｈの配列のほうが　Ｈｄ３ａと似た配列を持っていた。
【００６０】
Ｋａｓａｌａｔｈおよび日本晴のＲＦＴ１領域のゲノム塩基配列をそれぞれ配列番号：１および４に、ｃＤＮＡの塩基配列をそれぞれ配列番号：２および５に、これらＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：３および６に示す。
【００６１】
［実施例３］　ＲＦＴ１遺伝子の出穂に対する作用
ＲＦＴ１遺伝子がイネの出穂に影響を与えるかどうかを明らかにするために、ＲＦＴ１遺伝子の相補ＤＮＡ断片の形質転換を行った。形質転換には、日本型品種日本晴およびインド型品種Ｋａｓａｌａｔｈ由来のｃＤＮＡ断片を用いた。すなわち、Ｋａｓａｌａｔｈの成熟期の葉から抽出した全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型にして、ＰＣＲ法でコード領域をカバーするｃＤＮＡ断片の増幅を試みた。増幅にはプライマー対５’−ＧＧＡＴＴＧＡＡＣＧＧＣＡＧＧＡＧＡＴＡＣＣ−３’（配列番号：９）および　５’−ＴＧＣＣＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＴＣＧ−３’（配列番号：１０）を用いた。増幅した８２０ｂｐのｃＤＮＡ断片をＴｉ−プラスミドベクターｐＰＺＰ２Ｈａ３（Ｆｕｓｅ　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１８：　２１９−２２２，　２００１）に組み込み、アグロバクテリウムを介して日本晴に導入した。再分化植物体は速やかに短日条件（１０時間明）のグロースチャンバーに移して育成し、出穂までの所要日数（到穂日数）を調査した。
【００６２】
短日条件における日本晴およびＫａｓａｌａｔｈのＲＦＴ１遺伝子を導入した形質転換個体（Ｔ０）の一部は著しい早生となり、なかには移植前後にすでに出穂する個体も認められた（図３および表１）。長日条件においても、早生個体は観察された（表１）。ベクターのみの個体は、出穂まで移植後約４０〜５０日を要し、同じ条件で栽培した日本晴とは大きな差は認められなかった（表１）。これらの結果から、ＲＦＴ１遺伝子は出穂を促進させる作用をもつことが明らかとなった。
【００６３】
【表１】
2004089036.tif 000002
【００６４】
［実施例４］　ＲＦＴ１候補遺伝子の発現レベルと出穂時期の関係
ＲＦＴ１遺伝子のイネの出穂に対する役割をより詳細に解析するために、人工調節環下の短日（１０時間）および長日（１４．５時間）条件下において、極早生品種はやまさり、ＡＲＣ１０３１３、早生品種アキヒカリ、日本晴および極晩生品種Ｎｏｎａ　Ｂｏｋｒａを栽培し、生育過程に置けるＲＦＴ１およびＨｄ３ａのｍＲＮＡ量の変化を解析した。短日条件ではＨｄ３ａ遺伝子のｍＲＮＡが日本晴およびＮｏｎａ　Ｂｏｋｒａで播種後１０日目で既に検出されたのに対して、ＡＲＣ１０３１３では２０日目から検出された。はやまさりにおいては７０日後までＨｄ３ａｍＲＮＡは検出できなかった（図４）。一方、短日条件でのＲＦＴ１遺伝子のｍＲＮＡは、はやまさり、日本晴およびＮｏｎａ　Ｂｏｋｒａにおいて播種後１０日目で検出できたが、ＡＲＣ１０３１３においては４０日目において検出された（図４）。これらの発現量と出穂期の関係を見ると、短日条件ではＨｄ３ａおよびＲＦＴ１遺伝子のどちらもが出穂に関与する可能性が示唆された。長日条件下ではＨｄ３ａのｍＲＮＡは、ＡＲＣ１０３１３の７０日目に検出されたが、それ以外の品種では検出できなかった（図４）。一方、ＲＦＴ１遺伝子のｍＲＮＡは、はやまさりおよびアキヒカリでは播種後４０日目でその転写量が増大し、はやまさりの転写量が最も増大していた。ＡＲＣ１０３１３および日本晴では播種後７０日目で検出された。Ｎｏｎａ　Ｂｏｋｒａでは播種後７０日目においてもｍＲＮＡは検出できなかった。これらのｍＲＮＡの転写レベルの高低は長日条件下における出穂の早晩（到穂日数の大小）をよく反映していた（図４）。
【００６５】
長日条件における出穂とＲＦＴ１遺伝子の関係をより詳細に調べるために、出穂期が異なるイネの２７品種・近縁種における自然日長条件下での出穂期とＲＦＴ１およびＨｄ３ａ遺伝子の発現パターンを調査した。供試したイネ品種の到穂日数は、北海道の極早生品種では６月下旬（播種後約６０日）から出穂を始め、７月下旬から８月（約９０−１２０日）にかけて多くの品種が出穂し、極晩生品種・野生種などでは１１月下旬（約２００日）に出穂した（表２）。
【００６６】
【表２】
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2004089036.tif 000004
【００６７】
出穂促進機能を有するＨｄ３ａおよび　ＲＦＴ１について、圃場での生育過程におけるｍＲＮＡ発現量を調査した。２００１年４月２３日（４／２３）に播種し、５／２３に移植した植物体の葉を６／１２、７／１０および８／７に採取し、ＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。ｍＲＮＡ量の比較にはイネユビキチン遺伝子を用いた。ＲＴ−ＰＣＲ　に用いたプライマーは、Ｈｄ３ａの解析ではＨｄ３ａ−４５　５’−　ＴＣＡＧＡＡＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧ　−３’（配列番号：１１）およびＨｄ３ａ−４６：　５’−　ＡＣＣＴＴＡＧＣＣＴＴＧＣＴＣＡＧＣＴＡ−３’（配列番号：１２）を、ＲＦＴ１ではＴＦＬ−１：５’−　ＧＴＡＣＣＡＣＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＴＴ−３’（配列番号：１３）およびＴＦＬ−２　５’−　ＡＴＡＣＡＧＣＴＡＧＧＣＡＧＧＴＣＴＣＡ　−３’（配列番号：１４）を用いた。イネユビキチン遺伝子では、ＯｓＵＢＱ−Ｕ２　５’−ＧＣＣＧＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＴＧＴＧＧＴ−３’（配列番号：１５）およびＯｓＵＢＱ−Ｌ２　５’−ＴＧＡＡＧＣＡＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＴＡＡＡＡ−３’（配列番号：１６）を用いた。Ｈｄ３ａはいずれの時期においてもインド型の１系統を除くすべての品種において転写レベルは低かった（図５）。一方、ＲＦＴ１の発現量は生育初期から増加する品種が認められ、その転写産物量と出穂期（到穂日数）の間には相関が認められた（図５）。これらの結果から、自然日長条件下ではＨｄ３ａ　ではなくＲＦＴ１遺伝子の働きによって出穂が決定されることが示唆された。
【００６８】
発現量と出穂期の相関をより詳細に解析するために、定量ＰＣＲ法による各生育時期でのＲＦＴ１遺伝子のｍＲＮＡ量を比較した。定量ＰＣＲには以下のプライマーを用いた。
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【００６９】
ＲＦＴ１ｍＲＮＡとイネユビキチン遺伝子ｍＲＮＡ量の比を発現量の指標として、到穂日数との相関を見たところ、６／１２では極めて高い負の相関関係（ｒ＝０．８７８１７）が認められた（図６）。供試した品種のなかで極晩生３品種はその相関関係には適合しなかった。７／１０および８／７では、極早生３品種ならびに極晩生３品種をのぞく２１品種においては、相関関係（ｒ＝０．８６５３０，　ｒ＝０．５６３６４）となり、いずれも極めて高い負の相関を示した。ＲＦＴ１のｍＲＮＡ量は出穂後減少することが観察され、このことが７／１０および８／７の極早生品種では、相関関係が保持されない原因であると考えられる。一方、極晩生品種の到穂日数は約２００日程度で他の品種の到穂日数に比べて著しくおおきい。このことが他の品種で認められた高い相関関係が極晩生品種では認められない原因であると考えられる。
【００７０】
以上の結果から、比較的日長の長い期間に栽培される自然日長条件（つくば市４月〜９月）あるいは一定にした長日条件（１４．５時間）のもとでの出穂にはＲＦＴ１遺伝子が重要な役割を演じていることが明らかとなった。短日条件での出穂にはＲＦＴ１遺伝子よりＨｄ３ａ遺伝子の働きが強いと考えられる。また、例えば、長日条件に設定した人工気象室におけるＲＦＴ１遺伝子の発現量のモニタリングによって、栽培時期に依存することなく、自然日長条件（圃場）での任意の品種の出穂期を予測することができると考えられる。
【００７１】
【発明の効果】
植物のＲＦＴ１遺伝子が、自然日長条件または長日条件下において、植物の開花を促進する機能を有することが判明した。品種改良における開花時期の改変は（１）交雑による早生・晩生系統の選抜、（２）放射線や化学物質による突然変異誘起などによって行われてきた。これらの作業は長期間を要することや変異の程度や方向性を制御できないことなどの問題があった。これに対し、本発明においては、単離したＲＦＴ１遺伝子の利用による開花時期の新しい改変法を確立することができた。すなわち、単離・同定したＲＦＴ１遺伝子は、植物の開花を促進する作用をもつ。したがって、この遺伝子をセンス鎖で形質転換することにより、植物の開花促進を図ることができる。一方、ＲＦＴ１遺伝子の機能が保持されている品種、例えば日本晴あるいはＫａｓａｌａｔｈ、にアンチセンス方向にＲＦＴ１遺伝子を導入することにより、開花を遅延させることができる。形質転換に要する期間は交配による遺伝子移入に比較して極めて短期間であり、他の形質の変化を伴わないで開花時期の改変が可能となる。単離したＲＦＴ１遺伝子を利用することにより、植物の開花時期を容易に変化させることができ、異なる地域に適応した植物品種育成に貢献できると考えられる。
【００７２】
また、ＲＦＴ１遺伝子のｍＲＮＡ量をモニターすることによって、任意の植物品種の開花時期を簡便に予測する手法を開発した。品種育成において、任意の品種の開花時期を予め予測することは極めて有用である。すなわち、任意の品種の交雑を行うためには、開花時期を一致させることが必要である。本発明により、予め、栽培する前に開花時期を予測することで、適切な日長処理が適用可能となり、品種の交配を効率化できるものと考えられる。
【００７３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＲＦＴ１遺伝子の染色体上での位置を示す図である。Ｈｄ３ａ遺伝子から短腕末端側１０ｋｂにＨｄ３ａと相同性の高い遺伝子ＲＦＴ１が存在する。
【図２】日本晴とＫａｓａｌａｔｈから由来するＲＦＴ１およびＨｄ３ａタンパク質の推定アミノ酸配列を示す図である。Ｈｄ３ａ（Ｋａｓａｌａｔｈ）、Ｈｄ３ａ（日本晴）、ＲＦＴ１（Ｋａｓａｌａｔｈ）、および、ＲＦＴ１（日本晴）は、それぞれ、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：３、および、配列番号：６に示している。
【図３】ＲＦＴ１遺伝子の過剰発現個体を示す写真である。再分化後約２０日を経過した個体を示している。矢印は形成された穎花を示す。（Ａ）左は過剰発現個体、右は通常の発現を示す個体である。（Ｂ）過剰発現個体を拡大した写真である。
【図４】出穂期が異なるイネ５品目種の短日（１０時間明）と長日（１４．５時間明）におけるＲＦＴ１、Ｈｄ３ａおよびＵＢＱ遺伝子の転写レベルと出穂期の関係を示す写真である。
【図５】供試２７品目の到穂日数（Ａ）とＨｄ３ａおよびＲＦＴ１遺伝子のｍＲＮＡ量（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｂ）を示す図および写真である。ＵＢＱは対照に用いたユビキチンｍＲＮＡである。
【図６】ＲＦＴ１遺伝子のｍＲＮＡレベルと到穂日数の相関関係を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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