(57)【要約】【課題】アネキシン５の生理活性を抑制するポリペプチド、及びその誘導体、更には、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体及びそれらの利用方法を提供すること。【解決手段】アネキシン５のアミノ末端側、１５アミノ酸残基からなるペプチド配列及び該配列を含有するポリペプチド誘導体又は修飾ポリペプチドからなるアネキシン５の生理活性抑制物質。該物質は、アネキシン５の作用を拮抗的に阻害し、アネキシン５の生理活性を抑制する。本発明のアネキシン５の生理活性抑制物質は、アネキシン５の生理活性を抑制して、アネキシン５が関与する性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）によるＬＨの合成・放出を抑制する。本発明は、更にアネキシン５の特異配列である本発明のペプチド配列をコードするＤＮＡ、そのアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び抗体とその利用方法からなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１のポリペプチド又は配列表の配列番号１のポリペプチド配列を含むアネキシン５の生理活性抑制物質。
【請求項２】
配列表の配列番号１のポリペプチドの１〜数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加したポリペプチド配列を含み、かつアネキシン５の生理活性抑制作用を有するアネキシン５の生理活性抑制物質。
【請求項３】
配列表の配列番号１のポリペプチド配列を含む物質が、配列表の配列番号１のポリペプチド配列を含むポリペプチド誘導体であることを特徴とする請求項１記載のアネキシン５の生理活性抑制物質。
【請求項４】
配列表の配列番号１のポリペプチド配列を含む物質が、配列表の配列番号１のポリペプチド配列を含む修飾ポリペプチドであることを特徴とする請求項１記載のアネキシン５の生理活性抑制物質。
【請求項５】
配列表の配列番号１のポリペプチド配列を含む物質が、配列表の配列番号１のポリペプチドのアミノ末端をアセチル基で修飾したポリペプチドであることを特徴とする請求項４記載のアネキシン５の生理活性抑制物質。
【請求項６】
アネキシン５の生理活性抑制が、アネキシン５の性腺刺激ホルモン放出ホルモンの合成・放出を調節する生理活性の抑制であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のアネキシン５の生理活性抑制物質。
【請求項７】
配列表の配列番号１のポリペプチドをコードすることを特徴とするＤＮＡ配列。
【請求項８】
配列表の配列番号１のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、配列表の配列番号２のＤＮＡ配列であることを特徴とする請求項７記載のＤＮＡ配列。
【請求項９】
請求項７又は８記載のＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアネキシン５の遺伝子の発現及びアネキシン５の生理活性機能を特異的に抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項７又は８記載のＤＮＡ配列のアンチセンス鎖の全部又は一部からなるアネキシン５の遺伝子検出用プローブ。
【請求項１１】
配列表の配列番号１のポリペプチドを用いて誘導され、該ポリペプチドに特異的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項１２】
抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１１記載の抗体。
【請求項１３】
抗体が、ポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項１１記載の抗体。
【請求項１４】
請求項１または２記載のアネキシン５生理活性抑制物質を有効成分とすることを特徴とするアネキシン５の生理活性抑制剤。
【請求項１５】
請求項３記載のアネキシン５の生理活性抑制物質を有効成分とすることを特徴とするアネキシン５の生理活性抑制剤。
【請求項１６】
請求項４又は５記載のアネキシン５の生理活性抑制物質を有効成分とすることを特徴とするアネキシン５の生理活性抑制剤。
【請求項１７】
アネキシン５の生理活性抑制が、アネキシン５の性腺刺激ホルモンの合成・放出を調節する生理活性の抑制であることを特徴とする請求項１４〜１６のいずれか記載のアネキシン５の生理活性抑制剤。
【請求項１８】
請求項１１〜１３のいずれか記載の抗体を用いることを特徴とするアネキシン５の検出、測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アネキシン５の生理活性抑制物質及び該生理活性抑制物質を有効成分とするアネキシン５の生理活性抑制剤、特にアネキシン５の生理活性を抑制するポリペプチド、該ポリペプチドのポリペプチド誘導体又は修飾ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体及びそれらの利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
動物個体において、細胞間の情報連絡とそれに基づく細胞の機能変化は、動物個体の恒常性を維持するための基本的プロセスであり、そのために、無機イオンからタンパク質までのさまざまな物質が情報担体として関与している。中でも、カルシウムイオンは、多くの細胞で情報伝達に利用される重要な情報担体である。カルシウムイオンは、各種タンパク質に結合することによって、そのタンパク質機能の賦活化や分布の変化をもたらし、細胞固有の生理機能の発現に寄与している。
【０００３】
近年、新しいカルシウム結合タンパク質として、アネキシンファミリーのタンパク質が注目を集めている（Ｃｅｌｌ　５５，　１−３，　１９８８、Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ　１１９７，　６３−９３，　１９９４）。アネキシンは、分子内に約７０アミノ酸残基からなる相同性の高い４回（アネキシン６は８回）の繰り返し構造を持ち、この部位がカルシウムとリン脂質への結合能を示す（Ｃｅｌｌ　５５，　１−３，　１９８８、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６，　８０６７−８０９２，　１９８７）。カルモジュリンやトロポニンなどの、いわゆるＥＦバンドスーパーファミリーに属するタンパク質とは、カルシウム結合様式の異なる新しいカテゴリーのタンパク質である。アネキシンは、カルシウム濃度に依存したリン脂質結合能という機能を持つこと、動物種間で相同性が極めて高いことから、重要な生理機能を担ったタンパク質であると推定されている。
【０００４】
アネキシンを用いた生化学的実験では、（１）プロスタグランジン産生の律速酵素である、ホスホリパーゼＡ２の抑制作用（Ｎａｔｕｒｅ　３２０，　７７−８１，　１９８６、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６３，　１０，　７９９−８１１，　１９８８）、（２）血液凝固抑制作用（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６，　８０８７−８０９２，　１９８７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７，　６６４５−６６５３，　１９８８、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６５，　１７，　４２０−４２３，　１９９０）、（３）電位依存性のカルシウムチャネル活性、（４）プロテインキナーゼＣの抑制作用（Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１９１，　４２１−４２９，　１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３１，　１８８６−１８９１，　１９９２）、（５）膜の融合活性などの細胞内外を作用点とする機能（Ｃｅｌｌ　５５，　１−３，　１９８８、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　１１０，　１３−２５，　１９９０、Ｊ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１１４，　１１３５−１１４７，　１９９１）が示唆されているものの、作用点を含め実際の生理機能は不明のままであった。
【０００５】
アネキシン５は、各種組織にもっとも豊富に存在するアネキシンのひとつである。上記の機能に加え、アネキシン５はタンパク質キナーゼＣ活性及び血液凝固を阻害する（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６５，　１７４２０−１７４２３，　１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３１，　１８８６−１８９１，　１９９２）。コラーゲンに対する高い親和性が報告されており、基底膜への細胞付着における役割が示唆されている（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　３１０，　１４３−１４７，　１９９２）。アネキシン５は、広く組織間に分布しており、その分布は、細胞種に特異的である（Ｊ．　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．　３９，　１１８９−１１９８，　１９９１、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　５，　９−１４，　１９９６）。また、アネキシン５は卵巣腫瘍のマーカータンパク質として利用可能であり（Ｇｙｎｅｃｏｌ　Ｏｂｓｔｅｔ　Ｉｎｖｅｓｔ　３２，　１０７−１１１，　１９９１）、アネキシン５の自己抗体は何人かの紅斑性狼瘡（ＬＥ：ｌｕｐｕｓ　ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）患者で検出されている（Ａｍ．　Ｊ．　Ｈｅｍａｔｏｌ．　４７，　５６−５８，　１９９４）。こうした観察結果は、アネキシン５が、いくつかの重要な細胞機能に関与していることを示唆している。
【０００６】
本発明者は、アネキシン５が下垂体前葉で発現することを報告した（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　１８６，　８９４−８９８，　１９９２）。以前、本発明者の研究室にて行った、抗アネキシン５又は抗ＬＨβ（ＬＨ＝黄体形成ホルモン）のいずれかで染色した下垂体組織隣接切片の免疫組織化学的研究では、性腺刺激ホルモン産生細胞上でアネキシン５が集約的に発現していた（Ｃｅｌｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｒｅｓ．　２９２，　８５−８９，１９９８）。しかし、性腺刺激ホルモン産生細胞それ自体がアネキシン５を合成しているのかはわからなかった。というのは、たとえ性腺刺激ホルモン産生細胞と比較すれば弱いものであるにしろ、下垂体細胞の大半がアネキシン５に対する免疫応答性をもつことが判明しているからである（Ｃｅｌｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｒｅｓ．　２９２，　８５−８９，
１９９８、Ｅｎｄｏｃｒ．　Ｊ．　２，　３５７−３６２，　１９９４）。
【０００７】
下垂体前葉におけるアネキシン５のｍＲＮＡの発現は、卵巣切除後に増大し、この増大はエストロゲンの投与によって抑制された（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ　Ｅｎｄｏｃｒｎｏｌ．　１４１，　７３−７８，　１９９８）。これらの知見から、本発明者は、性腺刺激ホルモン分泌にアネキシン５が果たす役割を提案し、下垂体性腺刺激ホルモン産生細胞におけるアネキシン５の役割について調査した結果、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）の刺激作用のもとで性腺刺激ホルモン産生細胞によってアネキシン５のｍＲＮＡが発現することを実証し、アネキシン５がインビトロでのＬＨ及び卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を刺激することを報告した（Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　７５，　２−１１，　２００２）。アネキシン５の遺伝子及びアミノ酸配列については、既に報告があり（Ｊ．　Ｂｉｏ．　Ｃｈｅｍ．　２６３，　２２，　１０７９９−１０８１１，　１９８８、Ｇｅｎｅ　１４９，　２，　２５３−２６０，　１９９４）、それらの配列については、ＧｅｎＢａｎｋのデーターベースにおいて、アクセッションナンバー、Ｍ２１７３１によって、ＮＣＢＩのデーターベースにおいて、アクセッションナンバー、ＮＭ００１１５４によって検索することができる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、アネキシン５の生理活性抑制物質及び該生理活性抑制物質を有効成分とするアネキシン５の生理活性抑制剤、特にアネキシン５の生理活性を抑制するポリペプチド、該ポリペプチドのポリペプチド誘導体又は修飾ポリペプチドを提供すること、及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体及びそれらの利用方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、アネキシン５の生理的機能及び構造について研究の結果、アネキシン５のアミノ末端側、１５アミノ酸残基からなるアネキシン５作用ペプチド配列があることを見い出し、本発明を完成するに至った。この配列は、アネキシン５に特異的な配列であり、この配列を含有するポリペプチド誘導体又は修飾ポリペプチドを構築することにより、アネキシン５の作用を拮抗的に阻害し、アネキシン５の生理活性を抑制することができる。
【００１０】
例えば、前記するように、アネキシン５については、その生理機能研究が進展し、近年本発明者らによって、このタンパク質が下垂体前葉で、性腺刺激ホルモン（黄体形成ホルモンと卵胞刺激ホルモン）の分泌を著しく刺激することが見い出され、性腺刺激ホルモン産生細胞における当該ホルモンの合成・放出を調節することが確認されている。この下垂体性腺刺激ホルモン産生細胞におけるアネキシン５の作用に拮抗して、本発明の生理活性抑制物質を投与することにより、アネキシン５の作用を阻害して、その結果として性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）の作用を抑制することができる。
【００１１】
また、本発明においては、本発明のアネキシン５における作用特異配列を利用して、該ポリペプチド配列に特異的に結合する抗体を作製することにより、該抗体を用いて、アネキシン５の検出、測定を行うことができる。また、該アネキシン５における作用特異配列をコードするＤＮＡ配列を用いて、該配列のアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製することにより、アネキシン５の遺伝子の発現を抑制したり、またアネキシン５の遺伝子の検出用プローブとして用いることができる。
【００１２】
すなわち本発明は、配列表の配列番号１のポリペプチド又は配列表の配列番号１のポリペプチド配列を含むアネキシン５の生理活性抑制物質（請求項１）や、配列表の配列番号１のポリペプチドの１〜数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加したポリペプチド配列を含み、かつアネキシン５の生理活性抑制作用を有するアネキシン５の生理活性抑制物質（請求項２）や、配列表の配列番号１のポリペプチド配列を含む物質が、配列表の配列番号１のポリペプチド配列を含むポリペプチド誘導体であることを特徴とする請求項１記載のアネキシン５の生理活性抑制物質（請求項３）や、配列表の配列番号１のポリペプチド配列を含む物質が、配列表の配列番号１のポリペプチド配列を含む修飾ポリペプチドであることを特徴とする請求項１記載のアネキシン５の生理活性抑制物質（請求項４）や、配列表の配列番号１のポリペプチド配列を含む物質が、配列表の配列番号１のポリペプチドのアミノ末端をアセチル基で修飾したポリペプチドであることを特徴とする請求項４記載のアネキシン５の生理活性抑制物質（請求項５）や、アネキシン５の生理活性抑制が、アネキシン５の性腺刺激ホルモン放出ホルモンの合成・放出を調節する生理活性の抑制であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のアネキシン５の生理活性抑制物質（請求項６）からなる。
【００１３】
また本発明は、配列表の配列番号１のポリペプチドをコードすることを特徴とするＤＮＡ配列（請求項７）や、配列表の配列番号１のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、配列表の配列番号２のＤＮＡ配列であることを特徴とする請求項７記載のＤＮＡ配列（請求項８）や、請求項７又は８記載のＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアネキシン５の遺伝子の発現及びアネキシン５の生理活性機能を特異的に抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド（請求項９）や、請求項７又は８記載のＤＮＡ配列のアンチセンス鎖の全部又は一部からなるアネキシン５の遺伝子検出用プローブ（請求項１０）や、配列表の配列番号１のポリペプチドを用いて誘導され、該ポリペプチドに特異的に結合することを特徴とする抗体（請求項１１）や、抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１１記載の抗体（請求項１２）や、抗体が、ポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項１１記載の抗体（請求項１３）からなる。
【００１４】
さらに本発明は、請求項１または２記載のアネキシン５生理活性抑制物質を有効成分とすることを特徴とするアネキシン５の生理活性抑制剤（請求項１４）や、請求項３記載のアネキシン５の生理活性抑制物質を有効成分とすることを特徴とするアネキシン５の生理活性抑制剤（請求項１５）や、請求項４又は５記載のアネキシン５の生理活性抑制物質を有効成分とすることを特徴とするアネキシン５の生理活性抑制剤（請求項１６）や、アネキシン５の生理活性抑制が、アネキシン５の性腺刺激ホルモンの合成・放出を調節する生理活性の抑制であることを特徴とする請求項１４〜１６のいずれか記載のアネキシン５の生理活性抑制剤（請求項１７）や、請求項１１〜１３のいずれか記載の抗体を用いることを特徴とするアネキシン５の検出、測定方法（請求項１８）からなる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明は、配列表の配列番号１のポリペプチド又は配列表の配列番号１のポリペプチド配列を含むアネキシン５の生理活性抑制物質からなる。該配列番号１のポリペプチド配列は、アネキシン５のアミノ末端側、１５アミノ酸残基に相当する。該配列は、アネキシン５の作用ペプチド配列としての機能を有する特異的な配列であり、この配列を含有し、かつアネキシン５の続きの配列とは相違するポリペプチド誘導体又は修飾ポリペプチドを構築することにより、アネキシン５の作用を拮抗的に阻害し、アネキシン５の生理活性を抑制することができる。
【００１６】
本発明のポリペプチド誘導体としては、機能、合成或いは取り扱いの容易性から、配列番号１の１５アミノ酸残基に続いて、数個から数十の適宜のアミノ酸を結合したポリペプチド誘導体を用いることが好ましい。アセチル基等で修飾したポリペプチドとしては、アミノ末端をアセチル基で修飾したポリペプチドが、特に好ましい。
また、本発明は、配列表の配列番号１のポリペプチドの１〜数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加したポリペプチド配列を含み、かつアネキシン５の生理活性抑制作用を有する、配列表の配列番号１のポリペプチドの変異体のアネキシン５生理活性抑制物質からなる。
【００１７】
本発明のアネキシン５の生理活性抑制物質はアネキシン５の生理活性抑制剤として使用することができる。本発明のアネキシン５の生理活性抑制物質は、アネキシン５の生理機能を、拮抗阻害的に阻害し、アネキシン５の生理活性を抑制する。例えば、アネキシン５は、視床下部の分泌する性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）の下垂体ゴナドトロフでの作用を媒介することが知られているが、本発明の生理活性抑制物質の投与により、アネキシン５の生理機能を拮抗的に阻害し、性腺刺激ホルモン（ＬＨ及びＦＳＨ）の合成・放出を抑制することができる。
【００１８】
本発明のアネキシン５の生理活性抑制物質を、細胞に投与するには、該生理活性抑制物質を注射剤のような形で投与することができる。この場合には、該生理活性抑制物質を水や生理食塩水又はブドウ糖溶液等に溶解させて調製し、必要に応じて薬学的に許容される緩衝剤、保存剤或いは安定化剤を含有させて投与することができる。本発明のアネキシン５の生理活性抑制物質を、アネキシン５が発現されている卵巣、副腎、心臓、肺、甲状腺などの器官に投与して、アネキシン５が関与している生理機能を抑制することができる。
【００１９】
本発明のアネキシン５の生理活性抑制物質におけるポリペプチドは、周知のポリペプチドの合成法によって合成することができる。また、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を用いて遺伝子工学操作によって、製造することもできる。
本発明のアネキシン５の生理活性抑制物質である配列表の配列番号１のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、配列表の配列番号２の配列で示される。該配列は、アネキシン５の特異配列を示す。該ＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを構築し、用いることにより、アネキシン５の遺伝子の発現及びアネキシン５の生理活性機能を特異的に抑制することができる。
【００２０】
なお、ここで本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが「ＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、該温度条件以外に種々の要素があるが、当業者であれば種々の要素を組み合わせて、前記ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することができる。
【００２１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に導入するには、この分野で通常用いられる方法を用いることができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞へ直接投与することができる。また、必要に応じて、薬学的に許容される細胞内導入試薬、例えば、リポフェクチン試薬、リポフェクトアミン試薬、ＤＯＴＡＰ試薬等と共に投与することができる。また、該ＤＮＡ配列のアンチセンス鎖の全部又は一部からなる配列を作製して、アネキシン５の遺伝子検出用プローブとして用いることもできる。
【００２２】
更に、本発明においては、本発明のポリペプチドである配列表の配列番号１のポリペプチドを抗原として用いて、抗体を誘導し、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生することができる。該抗体は、モノクローナル抗体として、又は、ポリクローナル抗体として、本発明のポリペプチドを抗原として、常法により作製することができる。該抗体とアネキシン５の抗原抗体反応を用いて、周知の免疫検査法により、アネキシン５の検出、測定を行うことができる。
【００２３】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
（アネキシン５生理活性抑制物質ＡＮ−１４の調製）
ヒトアネキシン５のｃＤＮＡ配列（データベース：ＧｅｎＢａｎｋ　　アクセッションナンバー：Ｍ２１７３１（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６３，　２２，　１０７９９−１０８１１，　１９８８）をもとに、アミノ末端側１５アミノ酸残基からなるペプチドの設計・合成を行い、ＡＮ−１４とした。ＡＮ−１４は、ヒトアネキシン５のアミノ末端側１５アミノ酸残基（配列表配列番号１）を有し、該ペプチドのアミノ末端側（アラニン）をアセチル化したものである。すなわち、Ａｃ−ＡＱＶＬＲＧＴＶＴＤＦＰＧＦＤなるペプチド構造を有する。ＡＮ−１４のＭＡＳＳデータ、及びＨＰＬＣデータを、図１及び図２に示す。
【００２４】
（ＡＮ−１４の下垂体初代培養細胞におけるＧｎＲＨのＬＨ放出促進作用の抑制）
成熟したメスのウイスター・イマミチ系ラットの下垂体より細胞を分離し（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１０７，　１０９５−１１０４，　１９８０）、１ウエルあたり１０５個の細胞を９６ウエルの培養トレーを用いて１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中で２日間前培養した。実験当日に牛胎児血清を除いた培養液で３時間前培養し、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ：コンセラール）を加えて１時間培養した。実験群には、ＧｎＲＨに加えてＡＮ−１４を１μｇ／ｍｌの濃度で加えた。各群とも、ｎ＝５で行った。１時間後に培養液を回収して時間分解蛍光免疫測定法でラットの黄体形成ホルモン（ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ：ＬＨ）の放出量を測定した（図３）。その結果、ＧｎＲＨのみの群（●−●）と比べ、ＧｎＲＨにＡＮ−１４を添加した群（■−■）ではＧｎＲＨ濃度依存的にＬＨの放出が抑制されることが明らかになった。
【００２５】
（下垂体ゴナドトロフ株化細胞であるＬβＴ２細胞の増殖に対するＧｎＲＨの抑制効果に対するＡＮ−１４の拮抗作用）
下垂体の性腺刺激ホルモン産生細胞（ゴナドトロフ）を腫瘍化して樹立した株化細胞であるＬβＴ２細胞（カリフォルニア大学サンディエゴ校のＰ．　Ｍｅｌｌｏｎ博士より供与）を継代し、コンフルエントの状態に達する前に分離し、直径３５ｍｍのディッシュに２０万個の細胞を播種して１０％の牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中で培養した。その際、ＬβＴ２細胞をＧｎＲＨ未添加群（対照群）、ＤＭＥＭ培地に１０−７ＭのＧｎＲＨ（コンセラール）のみを添加した群、ＧｎＲＨと１μｇ／ｍｌのＡＮ−１４を添加した群、ＧｎＲＨと細胞増殖に関わるシグナル伝達因子であるＭＡＰＫＫ（ＭＥＫ）の抑制剤であるＰＤ９８０５９を添加した群の計４群に分けてそれぞれ培養を行い、４日目に細胞をトリプシンで剥離して顕微鏡観測下で細胞数を数えた（図４）。その結果、ＧｎＲＨは細胞増殖を抑制し、ＡＮ−１４はその作用に拮抗することが明らかになった。
【００２６】
（ＧｎＲＨのＬＨβサブユニット遺伝子発現に対する促進効果へのＡＮ−１４の拮抗作用の観察）
ＬＨβプロモーター領域（−７９７〜＋５）をルシフェラーゼ遺伝子発現ベクターであるｐＧＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に導入し、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子をレポーターとするＬＨβプロモーターレポーターベクター（−７９７／＋５　ＬＨβＬＵＣ：図５）を作製した。このレポーターベクターをリポフェクション法によりＬβＴ２細胞に導入後、４２時間の培養を行った。次に、ＬＨβプロモーターレポーターベクター導入ＬβＴ２細胞をそれぞれ、Ｇ−群（プロモーターを入れない空のベクターを導入した対照群）、Ｇ群（１０−７ＭのＧｎＲＨ（コンセラール）を添加）、ＡＮ０．１＋Ｇ群（ＧｎＲＨと０．１μｇ／ｍｌのＡＮ−１を添加）、ＡＮ１＋Ｇ群（ＧｎＲＨと１μｇ／ｍｌのＡＮ−１４を添加）、ＡＮ１０＋Ｇ群（ＧｎＲＨと１０μｇ／ｍｌのＡＮ−１４を添加）の計５群（各群とも、ｎ＝５）にわけ、６時間の培養を行った後、常法により細胞を溶解してルシフェラーゼ活性を測定した（図６）。その結果、ＧｎＲＨは著しくＬＨβサブユニット遺伝子発現を促進し、ＡＮ−１４は濃度依存的にＧｎＲＨの作用に対して拮抗することが明らかになった。
【００２７】
【発明の効果】
本発明により、アネキシン５の生理活性抑制物質及び該生理活性抑制物質を有効成分とするアネキシン５の生理活性抑制剤を提供することによって、アネキシン５の生理活性を調整することができる。例えば、本発明のアネキシン５の生理活性抑制物質を、アネキシン５が発現している卵巣、副腎、心臓、肺、甲状腺などの器官に投与して、アネキシン５が関与している生理機能を抑制することができる。これによって、例えば、性ホルモンの分泌を抑制して、性ホルモン依存性疾患に対する予防或いは治療を可能とする。
また、本発明によって、アネキシン５の特異配列であるポリペプチドをコードするＤＮＡ、そのアンチセンスオリゴヌクレオチド、更には本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供することによって、アネキシン５の遺伝子の発現の調整を行ったり、或いはアネキシン５の検出、測定を可能とする。これらはアネキシン５の生理機能の解明に役立ち、かつアネキシン５の生理活性調節にも役立つものであり、アネキシン５に関する機能障害の予防や治療に役立つものである。
【００２８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例において調製された、本発明のアネキシン５の生理活性抑制物質ＡＮ−１４のＭＡＳＳスペクトル分析の結果を示す図である。
【図２】本発明の実施例において調製された、本発明のアネキシン５の生理活性抑制物質ＡＮ−１４のＨＰＬＣの結果を示す図である。（紫外線波長：２１０ｎｍ、溶出：Ａ溶液：０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、Ｂ溶液：０．１％ＴＦＡ／ＡＣＮ、グラジエント：１０％〜６０％のＢ溶液で３０分間、流速：１．０ｍｌ／分）
【図３】ラット下垂体初代培養細胞におけるＧｎＲＨのＬＨ放出量に対するＡＮ−１４の影響を時間分解蛍光免疫測定法により測定した結果を示す図である。
【図４】下垂体ゴナドトロフ株化細胞であるＬβＴ２細胞の増殖に対するＧｎＲＨの抑制効果に対するＡＮ−１４の拮抗作用を示す図である。
【図５】ＬＨβプロモーター領域（−７９７〜＋５）をルシフェラーゼ遺伝子発現ベクターであるｐＧＬ３に導入して作製した、ＬＨβプロモーターレポーターベクターを示す図である。
【図６】ＧｎＲＨのＬＨβサブユニット遺伝子発現に対する促進効果へのＡＮ−１４の拮抗作用をルシフェラーゼ活性を測定することにより解析した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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