(57)【要約】【課題】ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のある種に起因する感染の診断を可能にする。【解決手段】ヒト免疫不全ウイルスによってヒト体内で誘導される抗体により認識され得る抗原ペプチド、免疫原性を有するペプチド、特定形態のエイズの潜在性をヒトに関してｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断するための組成物の製造における該ペプチドの使用、ヒトに関する特定形態のエイズのｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断法におけるこれらペプチドのうち特定のものの使用、診断用キットの構成におけるこれらペプチドの使用を提供する。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ−２のエンベロープタンパク質と共通な免疫学的特性を有し、４０個以下のアミノ酸残基を有するペプチドであって、
（１）Ｘ−−−−ＶＴＶ−ＹＧＶＰ−Ｗ−−ＡＴ−−ＬＦＣＡ−Ｚ又は
ＸＶＴＶ−ＹＧＶＰ−Ｗ−−ＡＴＺ
［式中、Ｘ及びＺはＯＨ基もしくはＮＨ２基を表すか又は、Ｘ及びＺは１〜５個のアミノ酸残基を含む基を表すが、但し得られたペプチドは依然抗体産生を誘導できるものであり、各ダッシュは前述のごときペプチドが下記の配列
2004002421.tif 000007
のうちの１つの免疫学的特性を保持できるようにするアミノアシル残基の中から選択したアミノアシル残基に対応する］
2004002421.tif 000008
［式中、Ｘ及びＺはＯＨ基もしくはＮＨ２基を表すか又は、Ｘ及びＺは１〜５個のアミノ酸残基を含む基を表し、各ダッシュは前述のごときペプチドが下記の配列
2004002421.tif 000009
のうちの１つの免疫学的特性を保持できるようにするアミノアシル残基の中から選択したアミノアシル残基に対応する］
2004002421.tif 000010
［式中、Ｘ及びＺはＯＨ基もしくはＮＨ２基を表すか又は、Ｘ及びＺは１〜５個のアミノ酸残基を含む基を表し、各ダッシュは前述のごときペプチドが下記の配列
2004002421.tif 000011
のうちの１つの免疫学的特性を保持できるようにするアミノアシル残基の中から選択したアミノアシル残基に対応する］
2004002421.tif 000012
［式中、Ｘ及びＺはＯＨ基もしくはＮＨ２基を表すか又は、Ｘ及びＺは１〜５個のアミノ酸残基を含む基を表すし、各ダッシュは前述のごときペプチドが下記の配列
2004002421.tif 000013
のうちの１つの免疫学的特性を保持できるようにするアミノアシル残基の中から選択したアミノアシル残基に対応する］
から成る群より選択される前記ペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の少なくとも１つのペプチドを医薬上許容し得るビヒクルと組合せて含む抗原組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の少なくとも１つのペプチド又はこのペプチドと担体分子との結合体を、ワクチン製造で用いる医薬上許容し得るビヒクルと組み合わせて含む免疫原組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ヒトの体内で後天的免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に変性し得るリンパ節障害を誘発し得るウイルスから精製状態で得ることのできる抗原と共通の免疫学的性質、場合によっては免疫原性を有するペプチドに係わる。
【０００２】
本発明は特定的には、ＮＡＴＵＲＥで規定された命名法に従いＨＩＶと略して呼ばれるウイルスによってヒト体内で誘導される抗体により認識され得る抗原ペプチドに係わる。本発明はまた、免疫原性を有するか又はｉｎ　ｖｉｖｏで免疫原になり得るペプチドにも係わる。この免疫原性は、ウイルスＨＩＶ−２の特徴的抗原を認識し且つ、少なくともこれらペプチドのうちの或るものに関しては、ＨＩＶ−１に由来する抗原さえも認識する抗体のｉｎ　ｖｉｖｏ誘導という形で現れ得る。
【０００３】
本発明は更に、特定形態のエイズの潜在性をヒトに関してｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断するための組成物の製造における前記ペプチドの使用にも係わり、且つ前記エイズウイルスのうちの特定のものに関しては、レトロウイルスＨＩＶに対する免疫原組成物及びワクチン組成物の製造における使用にも係わる。
【０００４】
本発明はまた、免疫原ペプチドもしくは免疫原になったペプチドによりｉｎ　ｖｉｖｏ誘導され得る抗体の前記と同じ目的における使用にも係わり、且つこれら抗体のうちの特定のものに関しては、これらヒトエイズに対する薬剤の有効成分の製造における使用にも係わる。
【０００５】
本発明は更に、ヒトに関する特定形態のエイズのｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断法におけるこれらペプチドのうちの特定のものの使用と、診断用「キット」の構成におけるこれらペプチドの使用とにも係わる。
【０００６】
【従来の技術】
ＬＡＶ−１又はＨＩＶ−１と称する第１のレトロウイルスは、既に特許出願ＧＢ．８３／２４．８００及び１４／０９／８４付出願ＥＰ．８４／４０１．８３４で単離され且つ開示されている。このウイルスはまた、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２０　ｎｏ．４５−９９，２０，８６８−８７１ページで、Ｆ．Ｂａｒｒｅ　Ｓｉｎｏｕｓｓｉ他によっても記述されている。
【０００７】
ＬＡＶ　ＥＬＩ及びＬＡＶ　ＭＡＬと称する前記ウイルスＨＩＶ−１の変異体も特許出願ＥＰ．８４／４０１．８３４で単離され且つ特徴分析されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
ウイルスＨＩＶ−１及びその変異体は下記の特性を有する：
−　ヒトＬｅｕ３細胞（又はＴ４リンパ球）及びこれらの細胞から誘導した「無限増殖性（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｓｅｅｓ）」細胞を好ましいターゲットとする。
−　Ｍｇ２＋イオンの存在を必要とする逆転写酵素活性を有し且つポリ（アデニレート−オリゴ−デオキシチミジラーゼ）
ポリ（Ａ）−オリゴ（ｄＴ）１２−１８）に対して大きな活性を示す。
−　ショ糖勾配で１．１６〜１．１７の密度を有する。
−　平均直径が１３９ナノメートルであり、且つ平均直径４１ナノメートルの核を有する。
−　これらウイルスの溶解物（ｌｙｓａｔ）がＨＴＬＶ−１のタンパク質ｐ２４と免疫学的に交差反応しないタンパクｐ２５（コアタンパク質）を含む。
−　それ自体のエンベロープを構成するタンパク質ｐ４２を含む。
−　分子量１１０，０００のエンベロープタンパク質ｇｐ１１０も含む。
【０００９】
欧州特許Ｎｏ．　８７／４００，１５１，４には、別の部類に属し且つ前記レトロウイルスに対してわずかな免疫学的関係しかもたないレトロウイルスの単離及び特徴分析が記載されている。これらのレトロウイルスはまとめてＨＩＶ−２と称され、リンパ節障害又はエイズの症状を有する複数のアフリカ人患者から単離された。
【００１０】
ＨＩＶ−２型レトロウイルスはＨＩＶ−１型レトロウイルスと同様にＴ４ヒトリンパ球に対して指向性を示し、これらリンパ球中で増殖すると細胞変性効果を及ぼし、その結果全身に及ぶ慢性の多発腺症又はエイズを引き起こすという特徴を有する。
【００１１】
より一般的には、ＨＩＶ−２によって精製されたウイルスは通常下記の特性を有する：
−　レトロウイルスＨＩＶ−２が好むターゲットはヒトＬｅｕ３細胞（又はＴ４リンパ球）及びこれらＴ４リンパ球から誘導された「無限増殖性」細胞である。
−　Ｔ４ヒトリンパ球に対して細胞毒性を示す。
−　Ｍｇ２＋イオンの存在を必要とする逆転写酵素活性を有し且つポリ（アデニレート−オリゴデオキシチルミジラーゼ）（ポリ（Ａ）−オリゴ（ｄＴ）　１２−１８）に対して大きな活性を示す。
−　ショ糖勾配で１．１６の密度を有する。
−　平均直径が１４０ナノメートルであり、且つ平均直径４１ナノメートルの核を有する。
−　ＨＵＴ型の又はＴ４タンパク質を発現する永代細胞系で培養できる。
−　Ｔ８リンパ球に対しては感染性を示さない。
−　これらウイルスの溶解物がウイルスＨＴＬＶ−Ｉ又はＨＴＬＶ−ＩＩのタンパク質ｐ２４と免疫学的に交差反応しないタンパク質ｐ２６を含む。
−　これらの溶解物が更に、放射線免疫沈降テストでＨＴＬＶ−Ｉ又はＨＴＬＶ−ＩＩのタンパク質ｐ１９により免疫学的に認識されないタンパク質ｐ１６も含む。
−　ＨＴＬＶ−Ｉのｇｐ１１０とは免疫学的に交差反応しないが、ＳＴＬＶ−ＩＩＩ（サルから単離したウイルス）のエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１４０とは免疫学的に交差反応する分子量約１３０，０００〜１４０，０００のエンベロープ糖タンパク質も含む。
−　これらウイルスの溶解物が更に、分子量３２，０００から４２，０００〜４５，０００の範囲の３５Ｓ−システインで標識できる抗原も含む。これらの抗原は特に分子量約３６，０００の抗原と分子量約４２，０００の抗原とを含み、これら抗原（ｐ３６及びｐ４２）の一方がウイルスＨＩＶ−２のトランスメンブラン糖タンパク質を構成すると考えられる。
−　ＨＩＶ−２のゲノムＲＮＡが緊縮条件下でＨＩＶ−１のゲノムＲＮＡとハイブリダイズしない。
−　非緊縮条件下でＨＩＶ−２のゲノムＲＮＡがＨＩＶ−１のｅｎｖ遺伝子及びその隣のＬＴＲとも、ＨＩＶ−１のゲノムのｐｏｌ領域の配列ともハイブリダイズしない。
−　非緊縮条件下で、ＨＩＶ−１領域のヌクレオチド配列と僅かにハイブリダイズする。
【００１２】
以前はＳＴＬＶ　ＩＩＩという呼称で知られており、現在はＳＩＶ−１と称する別のレトロウイルスは、アカゲザル（ｓｉｎｇｅ　ｍａｃａｑｕｅ　ｒｈｅｓｕｓ）から単離された（Ｍ．Ｄ．Ｄａｎｉｅｌ他，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２８，　１２０１（１９８５）、Ｎ．Ｌ．Ｌｅｔｗｉｎ他，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０，　７１（１９８５）、“ＳＴＬＶ−ＩＩＩｍａｃ”という呼称で）。
【００１３】
野性ミドリザルからは更に別の“ＳＴＬＶ−ＩＩＩＡＧＭ”（又はＳＩＶＡＧＭ）と称するレトロウイルスが単離された。しかしながらアカゲザルの体内に存在する前記ウイルスと異なり、”ＳＴＬＶ−ＩＩＩＡＧＭ”の存在はアフリカミドリザルの体内でエイズタイプの病気を誘発することはないと推測される。
【００１４】
１９８６年２月７日にはレトロウイルスＳＩＶ−１ｍａｃの株が番号Ｉ−５２１でＣＮＣＭに寄託された。研究の結果レトロウイルスＳＩＶ−１は、ＨＩＶ−２から類似の条件で単離できる構造タンパク質又は糖タンパク質に対して或る程度の免疫学的関係を有する或る種のタンパク質を含むことが判明した。このレトロウイルスＳＩＶ−１はサル体内で感染性を示すことが判明しており、これを単離した研究者等によってＳＴＬＶ−ＩＩＩと命名された（前出の文献参照）。
【００１５】
便宜上、これらのウイルスは以下の説明ではＳＩＶ（英語の”Ｓｉｍｉａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｖｉｒｕｓ”（サルの免疫不全ウイルス）の略字）と称し、場合によってはその後に由来となるサルの種類を示す略字、例えばアカゲザルであればＭＡＣ（又はｍａｃ）、アフリカミドリザルであればＡＧＭ（”Ａｆｒｉｃａｎ　Ｇｒｅｅｎ　Ｍｏｎｋｅｙ”の略字）を付加して示すことにする。
【００１６】
前述の方法と同じ方法を使用して調べたところ、ＳＩＶ−１ｍａｃからは下記のタンパク質も得られることが判明した：
−　分子量約２７キロダルトンの主要核タンパク質ｐ２７。
−　エンベロープの主糖タンパク質ｇｐ１４０。
−　トランスメンブランと思われるタンパク質ｐ３２。このタンパク質は、ウイルスを予め３５Ｓ−システインで標識しておくとＲＩＰＡでは殆ど観察されないが、ウェスターン法では広い帯の形態で観察され得る。
【００１７】
【発明を解決するための手段】
前述のウイルスＨＩＶ−２及びＳＩＶを更に深く研究した。その結果レトロウイルスＨＩＶ−２に関しては、該レトロウイルスのゲノムのＲＮＡの相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列も得ることができた。ＨＩＶ−２グループの代表的レトロウイルス（ＨＩＶ−２　ＲＯＤ）のｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列を１９８６年２月２１日に番号Ｉ−５２２、名称ＬＡＶ−ＩＩ　ＲＯＤでＣＮＣＭに寄託した。
【００１８】
このヌクレオチド配列とその中に含まれる読取り枠（ｐｈａｓｅｓ　ｄｅ　ｌｅｃｔｕｒｅ　ｏｕｖｅｒｔｅ）とを図１Ａに示す。
【００１９】
また、別のレトロウイルスに関しては、これらレトロウイルスの完全ヌクレオチド配列も得ることができた。特にＳＩＶのゲノムＲＮＡから誘導したｃＤＮＡについてこれが得られた。　ウイルスＳＩＶ−１ｍａｃのヌクレオチド配列を解明するに必要な該ウイルスのクローニング及び配列決定は下記の条件で実施した：
ウイルスＳＩＶ（Ｄａｎｉｅｌ他によりＳｃｉｅｎｃｅ（１９８５），　２２８，　ｐ．
１２０１−１２０４に記載の単離体ＳＴＬＶ−ＩＩＩｍａｃ１４２−８３）に感染した細胞ＨＵＴ　７８のＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３Ａで部分的に消化したものをバクテリオファージベクターＬａｍｂｄａ　ＥＬＢＬ３のＢａｍＨＩ位にクローニングしてゲノムライブラリー（ｂａｎｑｕｅ　ｇｅｎｏｍｉｑｕｅ）を構成した。このようにして形成したゲノムライブラリーの２百万個の組換えファージを、クローンＬａｍｂｄａ−ＲＯＤ４、Ｌａｍｂｄａ−ＲＯＤ３５及びＥ２（Ｃｌａｖｅｌ他（１９８６），　Ｎａｔｕｒｅ，　３２４，　ｐ．６９１）に由来するウイルスＨＩＶ−２の配列を用いて、安全性Ｐ３条件の下にその場でスクリーニングし、ニックトランスレーションにかけた。
【００２０】
５０℃の５×ＳＳＣでハイブリダイゼーションを行い、５０℃の２×ＳＳＣで洗浄した。ウイルス配列を全部含むクローンが１つだけ得られた。このクローンはＬａｍｂｄａ−ＳＩＶ−１と称する。このファージＬａｍｂｄａ−ＳＩＶ−１の挿入体は全体で１６．５ｋｂの大きさを有し、左方ＬＴＲの最初の２５０個の塩基が欠失しているだけで右方ＬＴＲは完全である組込みプロウイルスを含む。
【００２１】
この組込みプロウイルスを、ファージＭ１３ｍｐ８におけるランダムフラグメントのサブクローニングの後でジデオキシヌクレオチド法により配列決定した。３００個のサブクローンが解析された。
【００２２】
プラスミドｐＳＩＶ−１．１及びｐＳＩＶ−１．２に挿入したクローンＬａｍｂｄａ−ＳＩＶ−１に由来するｃＤＮＡフラグメントを、１９８７年４月１５日に番号Ｉ−６５８（ｐＳＩＶ−１．１）及びＩ−６５９（ｐＳＩＶ−１．２）でＣＮＣＭに寄託した。
【００２３】
結果を添付図面に示した。
【００２４】
これらの図面のうち、図１ＢはＳＩＶのウイルスゲノムのヌクレオチド配列と、遺伝子生成物ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、Ｑ、Ｘ、Ｒ、ｔａｔ、ａｒｔ、Ｆに対応するウイルスタンパク質に関して前記ヌクレオチド配列から誘導した配列とを示している。
【００２５】
図３から図１１及び図１Ｃは、ウイルス遺伝子及びＬＴＲの理論的生成物をＨＩＶ２とＳＩＶｍａｃとの間で比較している（λＳＩＶ−１）。
【００２６】
本発明は、ＳＩＶ−１の完全ゲノムに由来するｃＤＮＡから得られるｃＤＮＡフラグメントにも係わる。これらのフラグメントは、ｃＤＮＡの完全配列に由来し且つ本発明の有利なペプチドをコードする１つ以上の配列を含む。これらの配列は図１Ｂに示し、該ウイルスのＬＴＲ配列に関するものは図１Ｃに示した。
【００２７】
ＬＴＲ配列（図１Ｃ）に関しては、ＳＩＶのｃＤＮＡのヌクレオチド配列をウイルスＨＩＶ−２　ＲＯＤのヌクレオチド配列に対応させて配置した。図１Ｂを図３から図１１までと対比させるとゲノム全体に関して得られるこの対応状態によって、これら２つのウイルスに共通の基本的構造エレメントを有するヌクレオチド配列の位置付け又は演繹が可能になる。
【００２８】
本発明は勿論、ＳＩＶに由来するｃＤＮＡ及びそのフラグメント（又はそれらを含む組換体）を、ウイルスＨＩＶ−２保菌者の疑いのある患者から得た血清又はその他の生物学的液体もしくは組織の試料中にウイルスＨＩＶ−２が存在するか否かを診断する場合のプローブとして使用することにも係わる。これらのプローブは標識するのが好ましい（放射性標識、酵素標識、蛍光標識、等）。ウイルスＨＩＶ−２又はＨＩＶ−２変異体の診断で使用するのに特に適したプローブは、ウイルスＳＩＶのゲノムの相補ｃＤＮＡの全体もしくは一部分を含むか、又は特に種々のクローンに含まれる組換えフラグメントを含むことを特徴とし得る。
【００２９】
ウイルスＨＩＶ−２の診断法及び診断キットで使用されるプローブは前述のプローブには限定されない。エイズの疑いのある個体の生物学的流体中でＨＩＶ−２又はこれに類似したウイルスに対する抗体を検出できるものであれば、ウイルスＳＩＶ、ＳＩＶ変異体又はこれらと類似の構造をもつウイルスに由来する総てのヌクレオチド配列をこの種のプローブとして使用し得る。
【００３０】
前記検出はそれ自体公知の任意の方法で実施し得る。一例として、前記プローブを血清又はその他の生物学的流体、例えば髄液、唾液等の中に含まれる細胞から得た核酸と接触させてもよい。あるいは、前述のごとき生物学的流体中の核酸がこれらプローブとハイブリダイズできるような状態になっていれば、これらプローブと核酸との間のハイブリダイゼーションを生起させる条件の下に、前記プローブを前記流体自体と接触させる方法も使用し得る。この場合には、ハイブリダイゼーションが生起したか否かの検出がｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断の最終ステップとなる。ハイブリダイゼーション反応を利用する前記診断は、所期のウイルスのタイプを区別する必要がない場合には、夫々ＨＩＶ−２及びＳＩＶ−１又はＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２及びＳＩＶに由来する複数のプローブの混合物を用いて実施することもできる。
【００３１】
一般的には、ウイルスＨＩＶ−２保菌者の疑いのある患者から得た血清又は他の生物学的液体もしくは組織の試料中にウイルスＨＩＶ−２又はその変異体が存在するか否かを診断する方法は、下記の諸ステップからなる：
１／　疑いのある患者から採取した試料中の細胞のＤＮＡを、適当な膜上で標識を付けた前記プローブの１つと接触させることにより、緊縮条件下で少なくとも１回のハイブリダイゼーションを行う。
【００３２】
２／　前記ハイブリダイゼーションの緊縮条件を保持できる溶液で前記膜を洗浄する。
【００３３】
３／　免疫検出法でウイルスＨＩＶ−２の存在を検出する。
【００３４】
本発明の方法の別の好ましい実施態様では、前記ハイブリダイゼーションを非緊縮条件で実施し、且つ前記膜の洗浄を該ハイブリダイゼーション条件に適合した条件で行う。
【００３５】
本発明は勿論、ＳＩＶ変異体の類似領域に位置した配列に対応する核酸、並びに遺伝子コードの縮重による修飾を利用することによって得られる総ての核酸に係わる。
【００３６】
前出の欧州特許８７／４００，１５１，４には、以後“ｇａｇタンパク質”と称するコアタンパク質、及び以後”ｅｎｖタンパク質”と称するエンベロープタンパク質の解明にもつながった比較研究も記載されている。この研究の結果によれば、ＨＩＶ−２のコアタンパク質（ｇａｇタンパク質）はＨＩＶ−１のコアタンパク質に対してエンベロープタンパク質（ｅｎｖタンパク質）より小さい差を示す。全体的に言えば、ＨＩＶ−２のｅｎｖタンパク質はウイルスＨＩＶ−１の対応ｅｎｖタンパク質に対する免疫学的関係が無いとはいわないまでも極めて薄い。
【００３７】
これに対し、ウイルスＨＩＶ−２及びＳＩＶのｃＤＮＡ配列構造の比較検査では、タンパク質レベルに現れる或る共通の特徴が明らかになった。
【００３８】
全体的に言えば、ＨＩＶ−２及びＳＩＶ−１のタンパク質には大きな免疫学的関係が存在する。
【００３９】
ＨＩＶ−２のエンベロープの主糖タンパク質は、免疫学的には、ＨＩＶ−１のエンベロープの主糖タンパク質よりもＳＩＶのエンベロープの主糖タンパク質の方に近いことが判明した。
【００４０】
これは分子量レベル、即ちＨＩＶ−２及びＳＩＶの主糖タンパク質が１３０〜１４０キロダルトンであるのに対しＨＩＶ−１の主糖タンパク質が約１１０キロダルトンであるという点だけにとどまらず、免疫学的特性についても言えることである。というのも、ＨＩＶ−２に感染した患者から採取した血清、より特定的にはＨＩＶ−２のｇｐ１４０に対して形成された抗体はＳＩＶ−１ｍａｃのｇｐ１４０を認識するが、これと同じ血清及び同じＨＩＶ−２抗体が類似のテストでＨＩＶ−１のｇｐ１１０を認識することはないからである。ＨＩＶ−２のｇｐ１４０と反応しなかった抗ＨＩＶ−１血清はＨＩＶ−２抽出物の中に含まれる３５Ｓ−システインで標識された分子量２６キロダルトンのタンパク質を沈降させる。
【００４１】
ＨＩＶ−２の主コアタンパク質は、ＨＩＶ−１のｐ２５とＳＩＶのｐ２７との中間の平均分子量（約２６，０００）を有すると思われる。
【００４２】
これらの所見は、前述のごとき患者の１人から単離したＨＩＶ−２から得たウイルス抽出物について行ったテストの結果に基づくものである。第２の患者から単離したＨＩＶ−２のウイルス抽出物に関しても同様の結果が得られた。
【００４３】
研究を更に進めた結果、本発明者等はＨＩＶ−２又はＳＩＶ、更にはＨＩＶ−１のタンパク質ｇａｇ及びｅｎｖの構造内に含まれる配列と同じか又は類似のアミノ酸配列をもつ第１のペプチドグループを発見するに至った。これらのペプチドは特に、ウイルスＨＩＶ−２又はその変異体の１つによるヒトの感染の診断に使用できる。
【００４４】
そこで本発明は、より特定的にはウイルスＨＩＶ−２に感染した患者の生物学的試料、特に血清中のウイルスＨＩＶ−２又はその変異体に対する抗体のｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出を行うための診断方法及び診断組成物にも係わる。これらペプチドのうちの或るものは、ウイルスＨＩＶ−２による感染とウイルスＨＩＶ−１による感染との相違をより明確に示してくれる。
【００４５】
このような研究の推進の結果、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２の両者のｅｎｖタンパク質を認識し得る抗体の産生をｉｎ　ｖｉｖｏで誘導することができるような構造的特徴を有する免疫原ペプチド又は免疫原になり得るペプチドの合成も可能になった。これらのペプチドの少なくとも一部分は、ウイルスＨＩＶ−１にもウイルスＨＩＶ−２にも結合して主にこれらウイルスの中和をより特定的に行うことができるような構造的特徴も有する。このようなタイプのペプチドは特にウイルスＨＩＶに対するワクチン、従ってエイズに対するワクチンの有効成分の製造に使用すると有利であるといえる。
【００４６】
【発明の実施の形態】
以後、本発明のペプチドの構造に含まれるアミノ酸残基は、一義的意味を有するアミノ酸残基に関しては下記の表に示すように単一文字（大文字）で各天然アミノ酸を示す国際命名法を用いて表すことにする。
Ｍ　　　メチオニン
Ｌ　　　ロイシン
Ｉ　　　イソロイシン
Ｖ　　　バリン
Ｆ　　　フェニルアラニン
Ｓ　　　セリン
Ｐ　　　プロリン
Ｔ　　　スレオニン
Ａ　　　アラニン
Ｙ　　　チロシン
Ｈ　　　ヒスチジン
Ｑ　　　グルタミン
Ｎ　　　アスパラギン
Ｋ　　　リジン
Ｄ　　　アスパラギン酸
Ｅ　　　グルタミン酸
Ｃ　　　システイン
Ｗ　　　トリプトファン
Ｒ　　　アルギニン
Ｇ　　　グリシン
所定タンパク質の特徴的アミノ酸鎖中の位置に起因して複数の意味を有し得るアミノ酸は、その意味が重要でなければ（どのアミノ酸でもよければ）「−」で示し、そのアミノ酸が１つより多い限定数の好ましい意味を有する場合には小文字で示し得る。この場合には、その小文字が表し得る意味はそのアミノ酸が属するペプチドに対して必ず正確に定義される。
【００４７】
説明の便宜上これらのペプチドは、場合に応じて特定のＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２又はＳＩＶのｅｎｖもしくはｇａｇタンパク質に含まれるアミノ酸配列に関する数字を後に付加した略字ｅｎｖ又はｇａｇで表すことにする。
【００４８】
また、下記の式では、
−　基Ｘは遊離ＮＨ２基、もしくは特に炭素原子を１〜５個含む１つ又は２つのアルキル基によってアミド化されたＮＨ２基を表すか、又はアミノ酸を１〜５個含み、そのＮ末端アミノ酸自体が前述のごとき遊離もしくはアミド化ＮＨ２基を有するようなペプチド基を表し、
−　基Ｚは遊離−ＯＨ基、もしくは１〜５個の炭素原子含むアルキル基を有するアルコキシルを表すか、又はアミノ酸を１〜５個含み、そのＣ末端アミノ酸自体が前述のごとき遊離−ＯＨ基もしくはアルコキシルを有するようなペプチド基を表す。この場合ＸもしくはＺ又はその両方に含まれる１〜５個のアミノ酸を有する基は、その存在がこれらを含まないペプチドの免疫学的特性、場合によっては免疫原性の保持と基本的に両立するような基である。
【００４９】
本発明のペプチドはＨＩＶ−２の抗原と共通の免疫学的特性を有し、これらペプチドのうちのあるものはＨＩＶ−１もしくはその変異体の抗原とも共通の免疫学的特性を有する。これら本発明のペプチドの特徴は、ＳＩＶの抗原と共通のペプチド構造も有することにある。これらのペプチドは通常４０個以下のアミノ酸残基を含むと有利である。
【００５０】
以下に好ましいペプチドを挙げる。
ｅｎｖ１
ＸＲＶ−ＡＩＥＫＹＬ−ＤＱＡ−ＬＮ−ＷＧＣＡＦＲＱＶＣＺ
ｅｎｖ２
Ｘ−ＬＥ−ＡＱＩ−ＱＱＥＫＮＭＹＥＬＱＫＬＮＺ
ｅｎｖ３
ＸＥＬＧＤＹＫＬＶＥＩＴＰＩＧ−ＡＰＴ−−ＫＲ−−−−−Ｚ
ｅｎｖ４
Ｘ−−−−ＶＴＶ−ＹＧＶＰ−ＷＫ−ＡＴ−−ＬＦＣＡ−Ｚ
ｅｎｖ５
Ｘ−−−ＱＥ−−Ｌ−ＮＶＴＥ−Ｆ−−Ｗ−ＮＺ
ｅｎｖ６
ＸＬ−−−Ｓ−ＫＰＣＶＫＬＴＰＬＣＶ−−Ｚ
ｅｎｖ７
Ｘ−−−Ｎ−Ｓ−ＩＴ−−Ｃ−Ｋ−−−−Ｚ
ｅｎｖ８
Ｘ−Ｉ−−−ＹＣ−Ｐ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｃ−Ｎ−ＴＺ
ｅｎｖ９
Ｘ−−−−−−Ａ−Ｃ−−−−−−Ｗ−−Ｚ
ｅｎｖ１０
Ｘ−Ｇ−ＤＰＥ−−−−−−ＮＣ−ＧＥＦ−ＹＣＮ−−−−−ＮＺ
ｅｎｖ１１
Ｘ−−−−−Ｃ−ＩＫＱ−Ｉ−−−−−−Ｇ−−−ＹＺ
本発明はより特定的には下記のペプチドに係わる。
ｅｎｖ１
ＸＲＶ−ＡＩＥＫＹＬ−ＤＱＡ−ＬＮ−ＷＧＣＡＦＲＱＶＣＺ
ｅｎｖ２
Ｘ−ＬＥ−ＡＱＩＱＱＥＫＮＭＹＥＬＱＫＬＮＺ
ｅｎｖ３
ＸＥＬＧＤＹＫＬＶＥＩＴＰＩＧ−ＡＰＴ−−ＫＲ−−−−−Ｚ
ｅｎｖ４
Ｘ−−−−ＶＴＶ−ＹＧＶＰ−Ｗ−−ＡＴ−−ＬＦＣＡ−Ｚ
ｅｎｖ５
Ｘ−−−−Ｅ−−Ｌ−ＮＶＴＥ−Ｆ−−Ｗ−ＮＺ
ｅｎｖ６
ＸＬ−−−Ｓ−ＫＰＣＶＫＬ−ＰＬＣ−−−Ｚ
ｅｎｖ７
Ｘ−−−Ｎ−Ｓ−Ｉ−−−Ｃ−Ｋ−−−−Ｚ
ｅｎｖ８
Ｘ−Ｉ−−−ＹＣ−Ｐ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｃ−Ｎ−ＴＺ
ｅｎｖ９
Ｘ−−−−−−Ａ−Ｃ−−−−−−Ｗ−−Ｚ
ｅｎｖ１０
Ｘ−Ｇ−ＤＰＥ−−−−−−ＮＣ−ＧＥＦ−ＹＣ−−−−−−ＮＺ
ｅｎｖ１１
Ｘ−−−−−Ｃ−Ｉ−Ｑ−Ｉ−−−−−−Ｇ−−−ＹＺ
前記ペプチドに対応する有利なペプチドは下記の構造を有する。
ｅｎｖ１
ＸＲＶＴＡＩＥＫＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧＣＡＦＲＱＶＣＺ、又は
ＸＲＶＴＡＩＥＫＹＬＫＤＱＡＱＬＮＡＷＧＣＡＦＲＱＶＣＺ
ｅｎｖ２
ＸＳＬＥＱＡＱＩＱＱＥＫＮＭＹＥＬＱＫＬＮＳＷＺ、又は
ＸＬＬＥＥＡＱＩＱＱＥＫＮＭＹＥＬＱＫＬＮＳＷＺ
ｅｎｖ３
ＸＥＬＧＤＹＫＬＶＥＩＴＰＩＧＦＡＰＴＫＥＫＲＹＳＳＡＨＺ、又は
ＸＥＬＧＤＹＫＬＶＥＩＴＰＩＧＬＡＰＴＮＶＫＲＹＴＴＧ−Ｚ
（これから明らかなように、ペプチドｅｎｖ１、ｅｎｖ２、ｅｎｖ３は
ＨＩＶ−２とＳＩＶ−１との間の極めて大きい免疫学的関係を証明している。実際、第１番目のペプチドはＨＩＶ−２ゲノムに含まれ、第２番目のペプチドはＳＩＶ−１に含まれる）。
ｅｎｖ４
ＸａｂｃｄＶＴＶｅＹＧＶＰｆＷｏｇＡＴｈｉＬＦＣＡｊＺ
ａからｊまでの文字は下記の意味を有し得る：
ａはＣ、Ｅ又はＤ
ｂはＴ、Ｋ、Ｄ、Ｎ又はＩ
ｃはＱ又はＬ
ｄはＹ又はＷ
ｅはＦ又はＹ
ｆはＴ、Ｖ又はＡ
ｇはＮ又はＥ
ｈはＩ又はＴ
ｉはＰ又はＴ
ｊはＴ又はＳ
ｏはＫ又はＲ
ｅｎｖ５
ＸａｂｃｏＥｄｅＬｆＮＶＴＥｇＦｈｉＷｊＮＺ
ａからｊまでの文字は下記の意味を有し得る：
ａはＤ又はＰ
ｂはＤ又はＮ
ｃはＹ又はＰ
ｄはＩ、Ｖ、Ｉ又はＬ
ｅはＴ、Ｖ、Ｅ又はＡ
ｆはＶ、Ｇ又はＥ又は−
ｇはＡ、Ｎ、Ｇ又はＳ
ｈはＤ又はＮ
ｉはＡ又はＭ
ｊはＮ、Ｋ又はＥ
ｏはＱ又はＳ
ｅｎｖ６
ＸＬａｂｃＳｄＫＰＣＶＫＬｏＰＬＣｕｅｆＫＺ
ａからｆまでの文字は下記の意味を有し得る：
ａはＦ又はＷ
ｂはＥ又はＤ
ｃはＴ又はＱ
ｄはＩ又はＬ
ｅはＡ、Ｓ又はＴ
ｆはＭ又はＬ
ｏはＴ又はＳ
ｕはＶ又はＩ
ｅｎｖ７
ＸａｂＣＮｘＳｙＩｏｃｄＣｅＫｆｇｈｉＺ
文字ａからｉ並びにｘ及びｙは下記の意味を有し得る：
ａはＮ又はＴ又はＩ
ｂはＨ又はＳ又はＮ
ｃはＥ又はＱ
ｄはＳ、Ａ又はＣ
ｅはＤ又はＰ
ｆはＨ、Ｖ又はＤ
ｇはＹ又はＳ
ｈはＷ又はＦ
ｉはＤ又はＥ
ｘはＴ又はＲ
ｙはＶ又はＡ
ｏはＴ又はＱ
ｅｎｖ８
ＸａＩｂｃｄＹＣｘＰｅＧｆＡｇＬｈＣｉＮｊＴＺ
文字ａからｋ並びにｘは下記の意味を有し得る：
ａはＡ又はＰ
ｂはＲ又はＰ
ｃはＦ、Ｉ又はＣ
ｄはＲ又はＨ
ｅはＰ又はＡ
ｆはＹ又はＦ
ｇはＬ又はＩ
ｈはＲ又はＫ
ｉは−又はＮ
ｊはＤ又はＫ
ｘはＡ又はＴ
ｅｎｖ９
ＸｗａｂｃｘｙＡｄＣｅｆｇｈｉｚＷｊｋＺ
文字ａからｋ並びにｘからｚは下記の意味を有し得る：
ａはＫ又は−又はＥ
ｂはＲ又は−
ｃはＰ又はＭ又はＩ
ｄはＷ又はＨ又はＹ
ｅはＷ又はＮ又はＴ又はＲ
ｆはＦ又はＩ
ｇはＫ又はＳ又はＮ又はＧ
ｈはＧ又はＲ又はＥ
ｉは−又はＡ又はＴ
ｊはＫ又はＮ又はＤ又はＳ
ｋはＤ又はＡ又はＮ又はＫ又はＥ
ｗはＮ、Ｄ又はＩ
ｘはＲ又はＧ又はＫ
ｙはＱ又はＫ又はＲ
ｚはＫ又はＥ又はＱ又はＮ
ｅｎｖ１０
ＸａＧｂＤＰＥｃｄｅｆｇｈＮＣｉＧＥＦｊＹＣｏｋｘｌｍｎＮＺ
文字ａからｎ並びにｘは下記の意味を有し得る：
ａはＫ又は−又はＧ
ｂはＳ又はＧ又は−
ｃはＶ又はＩ
ｄはＡ又はＶ又はＴ
ｅはＹ又はＴ又はＭ又はＦ
ｆはＭ又はＨ
ｇはＷ又はＳ
ｈはＴ又はＦ
ｉはＲ又はＧ
ｊはＬ又はＦ
ｏはＮ又はＫ
ｋはＭ又はＳ
ｌはＷ又はＱ又はＫ又はＧ
ｍはＦ又はＬ
ｎはＬ又はＦ
ｘはＴ又はＳ又はＮ
ｅｎｖ１１
ＸａｂｃｄｗＣｅＩｏＱｆＩｘｇｙｈｉｚＧｊｋｌＹＺ
文字ａからｌ並びにｗからｚは下記の意味を有し得る：
ａはＲ又はＴ又はＳ又はＮ
ｂはＮ又はＩ
ｃはＹ又はＴ
ｄはＡ又はＬ又はＶ
ｅはＨ又はＲ
ｆはＩ又はＦ
ｇはＴ又はＭ
ｈはＨ又はＱ又はＡ
ｉはＫ又はＥ
ｊはＲ又はＫ
ｋはＮ又はＡ
ｌはＶ又はＭ
ｗはＰ又はＱ
ｘはＮ又はＫ
ｙはＷ又はＶ
ｚはＶ又はＴ又はＫ
ｏはＫ又はＲ
遺伝子ｇａｇによりコードされ且つｇａｇ１で表される抗原ペプチドの構造も以下に示す：
ＸＤＣＫＬＶＬＫＧＬＧａＮＰＴＬＥＥＭＬＴＡＺ
文字ａはＭ又はＴを意味する。
【００５１】
一般的には、本発明のペプチドの前記式中に存在する単一の意味をもつ（従って国際命名法に対応する大文字で表される）アミノ酸は、ＨＩＶ又はＳＩＶ−１のうち少なくとも一方のｅｎｖ又はｇａｇタンパク質の対応ｅｎｖ又はｇａｇ配列中に同じ順序で配列された同一のアミノ酸に対応することが知見されよう。
【００５２】
これらの配列の位置は、図２に示したＨＩＶ−２　ＲＯＤ（ＣＮＣＭＮｏ．Ｉ−５３２）及びＨＩＶ−１　ＢＲＵ（ＣＮＣＭ　Ｎｏ．Ｉ−２３２）夫々のｅｎｖタンパク質のアミノ酸配列中で下線によって明示されている。
ＳＩＶ−１ｍａｃ（ＣＮＣＭ　Ｎｏ．Ｉ．５２１）及びＨＩＶ−２　ＲＯＤ夫々のｅｎｖ及びｇａｇタンパク質のアミノ酸配列は図３及び図４に示した。　これらの配列の特定位置に出現する実線は、ＨＩＶ−１及び
ＨＩＶ−２の対応タンパク質配列並びにＳＩＶ及びＨＩＶ−２の対応タンパク質配列において互いに同じアミノ酸（その場合は星印がつく）又は２つの点を同一鉛直線上に配置できるように、これらの配列に含まれる特定アミノ酸を図面から故意に除去したことを示すためのものである。
【００５３】
本発明は前述のペプチドの他に、これらペプチドの抗原性又は免疫原性を変化させない範囲で、且つこれらのペプチドによる抗原又は抗体の認識の特性を実質的に変化させない範囲で、１つ以上のアミノ酸の挿入及び／又は欠失及び／又は置換によって修飾したペプチドにも係わる。
【００５４】
特に好ましい具体例として、本発明はＨＩＶ−２型ウイルスのエンベロープ糖タンパク質のペプチド構造と共通の免疫学的特性を有するペプチドに係わる。これらのペプチドは４０個以下の個数のアミノ酸残基を含む。
【００５５】
本発明のこれらの好ましいペプチドは下記の配列を有する：
2004002421.tif 000002
2004002421.tif 000003
2004002421.tif 000004
2004002421.tif 000005
本発明のペプチドは更に有利になことに、ペプチド合成分野で一般に使用されている方法によって製造することができる。この合成は、均質溶液中又は固相上で実施し得る。
【００５６】
一例として、Ｅ．　Ｗｕｎｓｃｈ編”Ｍｅｔｈｏｄｅｎ　ｄｅｒ　Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ　Ｃｈｅｍｉｅ（有機化学の方法）”，Ｖｏｌ．　１５−Ｉ及びＩＩ．，ＴＨＩＥＭＥ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ　１９７４でＨＯＵＶＥＮＷＥＹＬにより記載されている均質溶液中合成法を使用してもよい。
【００５７】
この合成法は、連続したアミノ酸を２つずつ所定の順序で逐次縮合させるか、又はアミノ酸と予め形成されており既に複数のアミノ酸を含んでいるフラグメントとを適切な順序で縮合させるか、又は前述のごとく予め形成した複数のフラグメントを縮合させることからなる。勿論、これらのアミノ酸又はフラグメントが有する反応基は、特にカルボキシル基の活性化の後でペプチド結合に通常使用されることになる前記成分の一方のアミノ基及びその他の成分のカルボキシル基を除いて、ペプチド合成でよく知られている方法により予め総て保護しておく必要がある。別の方法として、カルボジイミド型の一般的結合試薬、例えば１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）−カルボジイミドを用いる結合反応を使用することもできる。使用するアミノアシルが更に別の酸官能基を有する場合（特にグルタミン酸の場合）には、これらの官能基を例えばｔ−ブスチルエステルで保護する。
【００５８】
アミノ酸を１つずつ結合させていく漸進的合成法では、先ずＣ末端アミノ酸を所望配列中の近隣アミノアシルに対応するアミノ酸と縮合させることによって合成を開始し、これをＮ末端アミノ酸まで順次繰り返すようにするが好ましい。本発明の別の好ましい方法では、”Ｓｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．，４５，　２１４９−２１５４）と題する論文でＲ．Ｄ．ＭＥＲＲＩＦＩＥＬＤによって開示されている方法を使用する。
【００５９】
ＭＥＲＲＩＦＩＥＬＤの方法でペプチド鎖を形成するには、多孔率の極めて高いポリマー樹脂を使用し、これに当該鎖の第１のＣ末端アミノ酸を固定する。このアミノ酸はそのカルボキシル基を介して前記樹脂に固定し、そのアミン官能基は例えばｔ−ブチルオキシカルボニル基で保護する。
【００６０】
このようにして第１のＣ末端アミノ酸を樹脂に固定したら、この樹脂を酸で洗浄して前記アミン官能基の保護基を除去する。
【００６１】
アミン官能基の保護基がｔ−ブチルオキシカルボニル基の場合には、前記樹脂をトリフルオロ酢酸で洗浄することによって該保護基を除去し得る。
【００６２】
次いで、Ｃ末端アミノアシル残基から数えて所期の配列の第２アミノアシルを供給する第２のアミノ酸を、当該鎖に固定した第１Ｃ末端アミノ酸の脱保護アミン官能基に結合させる。好ましくは、この第２アミノ酸のカルボキシル官能基を例えばジシクロヘキシルカルボジイイミドによって活性化し且つアミン官能基を例えばｔ−ブチルオキシカルボニルで保護する。
【００６３】
このようにして、アミノ酸を２つ含み且つその末端アミン官能基が保護された所期のペプチド鎖の第１部分が得られる。次いで、前記アミン官能基の脱保護を前述のごとく行い、第３のアミノアシルの固定を第２番目のＣ末端アミノ酸の付加の場合と類似の条件で実施し得る。
【００６４】
このようにして、ペプチド鎖を構成することになるアミノ酸を、既に形成され且つ樹脂に固定されたペプチド鎖部分にあってその都度予め脱保護されたアミン基に次々に結合させていく。
【００６５】
所望のペプチド鎖が完成したら、このペプチド鎖を構成する種々のアミノ酸の保護基を除去し、例えばフッ化水素酸によって樹脂からペプチドを離脱させる。
【００６６】
本発明は、前述のごときペプチドモノマーの水溶性オリゴマーにも係わる。このオリゴマー化は本発明のペプチドモノマーの免疫原性を増加させ得る。これらのオリゴマーはモノマー単位を例えば２〜１０個含み得るが、この個数は限定的なものではない。
【００６７】
このオリゴマーに含まれるモノマー単位は総てが配列１のポリペプチドもしくは配列２のポリペプチドのみで構成されるか、又はこれらポリペプチドの双方によって構成される。
【００６８】
このオリゴマー化の実施には、ペプチド分野で通常使用されている任意の重合法を使用し得る。この重合は、所望の免疫原性を得るのに必要な数のモノマー単位を含むオリゴマー又はポリマーが得られるまで続ける。
【００６９】
このモノマーのオリゴマー化又は重合は、１つの方法として、該モノマーと架橋剤、例えばグルタルアルデヒドとを反応させることにより実施し得る。
【００７０】
その他、例えば、ホモ二官能性又はヘテロ二官能性結合剤の存在下でモノマー単位をそのカルボキシル末端基及びアミン末端基を介して逐次結合させることからなる別のオリゴマー化又は結合方法を使用することもできる。
【００７１】
また、前述のごときアミノ酸を１７個含む単位を１つ以上有する分子を製造する場合には、適当な対応ヌクレオチド配列を含む所定の核酸によって形質転換した微生物を用いる遺伝子工学技術を使用し得る。
【００７２】
本発明は、ウイルスＨＩＶ−２　ＲＯＤのｃＤＮＡ配列に由来する配列を１つ以上含む核酸にも係わる。これらの配列は前述の配列で使用した番号付けによって示され、本発明の有利な特定ペプチドをコードする。
ｅｎｖ１をコードする配列　　ヌクレオチド７８５０〜７９２７
ｅｎｖ２〃　　　　　　　　　　　〃　　　　　　８０３０〜８０９５
ｅｎｖ３〃　　　　　　　　　　　〃　　　　　　７６０１〜７６３６
ｅｎｖ４〃　　　　　　　　　　〃　　　　　　　６１７０〜６２４７
ｅｎｖ５〃　　　　　　　　　　〃　　　　　　　６２９４〜６３４９
ｅｎｖ６〃　　　　　　　　　　〃　　　　　　　６３９２〜６４４５
ｅｎｖ７〃　　　　　　　　　　〃　　　　　　　６７２４〜６７６３
ｅｎｖ８〃　　　　　　　　　　〃　　　　　　　６７９４〜６８３８
ｅｎｖ９〃　　　　　　　　　　〃　　　　　　　７１１２〜７１６２
ｅｎｖ１０〃　　　　　　　　　〃　　　　　　　７２５３〜７３３６
ｅｎｖ１１〃　　　　　　　　　〃　　　　　　　７３５８〜７４２６
ｇａｇ１〃　　　　　　　　　　〃　　　　　　　１５３５〜１５９７
本発明はまた、ウイルスＳＩＶに対応する核酸にも係わる。これらの核酸はウイルスＳＩＶ−１のｃＤＮＡに由来する配列を１つ以上含む。ペプチドｅｎｖ１〜ｅｎｖ１１とｇａｇ１とをコードするこれらの配列は、ＨＩＶ−２に関して説明した対応配列との比較によって図３で位置決定し得る。
【００７３】
勿論、本発明はＨＩＶ−２　ＲＯＤ又はＳＩＶの変異体から誘導されたｃＤＮＡの類似領域に配置された配列に対応する核酸、並びに遺伝子コードの縮重を利用することによる前記核酸の修飾によって得られるような核酸にも係わる。
【００７４】
本発明は更に、本発明のペプチド（又は前記オリゴマー）と生理学的に許容し得る非毒性キャリヤ分子（天然又は合成）とを、これらキャリヤ分子及びペプチドに夫々担持された相補的反応基を介して共有結合させることにより得られる結合体にも係わる。適切な基の具体例は下記の通りである。
【００７５】
本発明の結合体の構成に使用されるキャリヤ分子又は高分子支持体の具体例としては、破傷風アナトキシン、卵白アルブミン、血清アルブミン、ヘモシアミン等のような天然タンパク質が挙げられる。
【００７６】
合成高分子支持体としては、例えばポリリジン又はポリ（Ｄ−Ｌ−アラニン）−ポリ（Ｌ−リジン）が挙げられる。
【００７７】
文献には別のタイプの使用可能な高分子支持体も記載されており、これらの支持体は通常２０，０００より大きい分子量を有する。
【００７８】
本発明の結合体はそれ自体公知の方法、例えばＩｎｆｅｃｔ．ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３３，１９３−１９８（１９８１）でＦＲＡＮＴＺ及びＲＯＢＥＲＴＳＯＮにより開示されている方法、又はＡｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎ−ｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（１９８１年１０月），Ｖｏｌ．４２，ｎｏ．４，６１１−４，６１４にＰ．Ｅ．ＫＡＵＦＦＭＡＮにより開示されている方法に従い、適当なペプチド及びキャリヤ分子を用いて合成し得る。
【００７９】
実際の操作では、非限定的具体例として下記に挙げるような化合物：グルタルアルデヒド、クロルギ酸エチル、水溶性カルボジイミド即ち［Ｎ−エチル−Ｎ’（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド，ＨＣｌ］、ジイソシアネート、ビス−ジアゾベンジジン、ジクロロ−ｓ−トリアジン、トリクロロ−ｓ−トリアジン、臭化シアン、及びＳｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（１９７８），Ｖｏｌ．８，ｐ．７−２３（ＡＶＲＡＭＥＡＳ，ＴＥＲＮＹＮＣＫ，ＧＵＥＳＤＯＮ）に記載の結合剤を結合剤として使用すると有利である。
【００８０】
結合方法としては、ペプチドの１つ以上の反応基とキャリヤ分子の１つ以上の反応基とを用いる任意の方法を使用し得る。有利には、カルボキシル官能基及びアミン官能基を使用する。これらの官能基はタンパク質の合成で使用されている種類の結合剤、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、等の存在下で結合反応を生起し得る。特にペプチド及びキャリヤ分子に夫々担持されたアミノ基を相互に結合する場合には、結合剤としてグルタルアルデヒドも使用し得る。
【００８１】
本発明のペプチドは抗原性を有する。従ってこれらのペプチドはウイルスＨＩＶ−２による感染の診断に使用できる。
【００８２】
前述のごとく、ウイルスＨＩＶ−２に対する抗体をヒトの生物学的流体、特に血清又は髄液中で検出する方法に使用できるペプチドは研究の結果２つのグループに分けられた。　第１のグループ（Ｉ）はペプチドｇａｇ１を含む。これらのペプチドは抗ＨＩＶ−２抗体を識別し、従ってＨＩＶ−２による感染を検出することができる。これらのペプチドは抗ＨＩＶ−１抗体も或る程度認識し得る。
【００８３】
第２のグループ（ＩＩ）は、より特定的にはトランスメンブラン部分及びエンベロープタンパク質の外側部分の末端に存在するペプチドに対応するペプチドを含む。これらのペプチドは先にｅｎｖ１、ｅｎｖ２及びｅｎｖ３と称したペプチドである。これらのペプチドを用いればＨＩＶ−２に対する抗体の存在を特異的に識別することができ、従ってヒト体内でＨＩＶに起因する過去又は現在の感染、より特定的にはＨＩＶ−２によって生じた感染とＨＩＶ−１によって生じた感染とを区別することができる。
【００８４】
本発明は更に、前記ペプチドのうちの少なくとも１つ、又はこのペプチドのオリゴマーの少なくとも１つを含む組成物にも係わる。この組成物は、ウイルスＨＩＶ−２に対する抗体を含むヒト由来血清によって認識され得るという特徴を有する。
【００８５】
本発明は、生物学的流体、特にヒト血清中でＨＩＶ−２に対する抗体を検出すべく本発明のペプチドを１種以上使用するｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断法に係わる。
【００８６】
一般的には、前記ｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断法は下記のステップを含む：
−　前記生物学的液体を前記ペプチドと接触させ、
−　物理学的又は化学的方法により前記生物学的液体中にペプチド−抗体複合体が存在するか否かを検出する。
【００８７】
本発明の好ましい実施態様の１つでは、抗原−抗体複合体の検出を免疫酵素テスト（ＥＬＩＳＡタイプ）、免疫蛍光テスト（ＩＦＡタイプ）、放射線免疫テスト（ＲＩＡタイプ）又は放射線免疫沈降テスト（ＲＩＰＡタイプ）によって行う。
【００８８】
従って本発明は、酵素、蛍光性、放射性等の適当な標識で標識された本発明のペプチドにも係わる。
【００８９】
このような方法は例えば下記のステップを含む：
−　所定量の本発明ペプチド組成物を微量滴定プレートの複数の凹部に沈着させ、
−　診断すべき血清を希釈度を上げながら前記凹部に導入し、
−　前記微量滴定プレートをインキュベーションにかけ、
−　前記微量滴定プレートを繰り返し洗浄し、
−　基質を加水分解して該基質の吸収スペクトラムを少なくとも１つの所定波長で変化させることのできる酵素の中から選択した酵素を用いて標識した血液のイムノグロブリンに対する抗体を前記微量滴定プレートの凹部に導入し、
−　加水分解された基質の量を対照との比較により検出する。
【００９０】
本発明は、生物学的流体中にウイルスＨＩＶ−２に対する抗体が存在するか否かを診断し、場合によってはＨＩＶ−１に対する抗体の存在も診断するｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断に使用するためのキットにも係わる。このキットは、
−　本発明のペプチド組成物と、
−　免疫反応を生起させるのに適した媒体を構成するための試薬と、
−　免疫反応によって生じた抗原−抗体複合体を検出するための試薬と、
−　前記ペプチド組成物によって認識される抗体を含まない基準となる生物学的流体組織
とを含み、前記抗原−抗体複合体検出用試薬は、特に前記ポリペプチド組成物が標識されていない場合には、標識を有し得、又は標識した試薬で認識され得るようなものであってよい。
【００９１】
本発明は本発明のペプチドに対して形成された抗体自体にも係わる。
【００９２】
本発明の抗体は勿論、ポリクローナル抗体には限定されない。
【００９３】
本発明は、本発明のペプチドの１つに対して免疫した動物、特にマウス又はラットの脾臓細胞と適当な骨髄腫細胞系の細胞とから通常の方法で形成し得、且つこれら動物の免疫のために最初に使用されたペプチドを認識するモノクローナル抗体を産生する能力に鑑みて選択され得る任意のハイブリドーマによって産生される総てのモノクローナル抗体にも係わる。
【００９４】
本発明はまた、有効成分が本発明のペプチドの少なくとも１つ又は該ペプチドのオリゴマー、又はキャリヤ分子と結合した状態のペプチドからなるようなワクチンの製造に使用するための免疫原組成物であって、製薬的に許容し得るベヒクルとの組合わせにより、レトロウイルスＨＩＶ−２のタンパク質の阻害、更にはレトロウイルスＨＩＶ−２自体の阻害を生起するに十分な量で前記ペプチドに対する抗体の産生を誘導することを特徴とする。
【００９５】
ワクチン製造用の前記免疫原組成物は、より特定的には前記ペプチドｅｎｖ４、ｅｎｖ５、ｅｎｖ６、ｅｎｖ７、ｅｎｖ８、ｅｎｖ９、ｅｎｖ１０、ｅｎｖ１１のうちの少なくとも１つ、更にはこれらの混合物を含むと有利である。
【００９６】
ワクチンの有効成分を構成するのに適したこれらのペプチドのうちの或るものは、ＨＩＶ−２及びＳＩＶ中だけでなくＨＩＶ−１中でも大きな保存度を示すエンベロープ糖タンパク質の領域に対応するアミノ酸基本構造を有するため特に好ましい。これらの特に好ましいペプチドはｅｎｖ４と称するペプチド、並びにペプチドｅｎｖ５、ｅｎｖ６及びｅ１０のうち特定のものである。
【００９７】
本発明の好ましい実施態様の１つでは、ワクチンの有効成分を構成するのに適した免疫原ペプチド（又はこれらペプチドのフラグメント）を、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ及びＨＩＶ−１のエンベロープ糖タンパク質中で５０％を越えるアミノ酸相同性を示し、ウイルスのエンベロープの外側部分に属し、欠失が全くもしくは殆ど無く、且つ結合の安定化と結合ループの構成とに有利なシステイン残基を含む配列に対応する式で示されるものの中から選択する。
【００９８】
下記のペプチドはこの好ましいペプチドの部類に属する。
ｅｎｖ４
ＸＶＴＶ−ＹＧＶＰ−Ｗ−−ＡＴＺ
ｅｎｖ５
ＸＬ−ＮＶＴＥ−ＦＺ
ｅｎｖ６
ＸＫＰＣＶＫＬ−ＰＬＣ−Ｚ
ｅｎｖ７
ＸＮ−Ｓ−Ｉ−Ｚ
ｅｎｖ１０
ＸＮＣ−ＧＥＦ−ＹＣ−Ｚ
ｅｎｖ１１
ＸＣ−Ｉ−Ｑ−ＩＺ
有利な薬剤組成物は、本発明の少なくとも１種類の生成物を有効量含む溶液、懸濁液又は注射用のリポソームからなる。これらの溶液、懸濁液又はリポソームは滅菌等張水相、好ましくは食塩水又はグルコース含有水相で構成する。
【００９９】
本発明はより特定的には、真皮内注射、筋内注射又は皮下注射、又は乱切法で投与するのに適した溶液、懸濁液又はリポソームに係わる。
【０１００】
本発明はまた、別の投与形態、特に経口投与に適した薬剤組成物にも係わる。
【０１０１】
ウイルスＨＩＶ−２に対する抗体の産生において有効なワクチンとして使用し得る本発明の薬剤組成物は、例えば、本発明のペプチドの量が１０〜５００μｇ／ｋｇ、好ましくは５０〜１００μｇ／ｋｇになるような用量で投与し得る。
【０１０２】
但し、これらの用量値は非限定的なものにすぎない。
【０１０３】
前述のごとく、先に述べた種々のペプチドはその免疫学的特性を根本的（実質的に）に変えることはないような修飾を含み得る。このような修飾の結果得られる等価ペプチドも後の請求の範囲に含まれる。これら等価ペプチドの具体例としては、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ又はＨＩＶ−１の別の変異体のｃＤＮＡの領域中の、ＨＩＶ−２　ＲＯＤ、ＳＩＶ及びＨＩＶ−１　ＢＲＵに関して説明した条件と類似の条件で一直線に並べた時の等価領域に対応する構造を有するペプチドが挙げられる。これらのペプチドの別の具体例としては、ＣＮＣＭに寄託されたｃＤＮＡ、特に寄託番号Ｉ−５０２、Ｉ−６４２（ＨＩＶ−２　ＩＲＭＯ）、Ｉ−６４３（ＨＩＶ−２　ＥＨＯ）における前述のごとき領域、並びに場合によってはＣＮＣＭに番号Ｉ−２３２、Ｉ−２４０、Ｉ−２４１、Ｉ−５５０、Ｉ−５５１で寄託されたＨＩＶ−１変異体のｃＤＮＡ中の等価領域に対応する構造を有するペプチドが挙げられる。
【０１０４】
本発明のペプチドは更に下記の式で示すこともできる（式中、Ｘ、Ｚ及びダッシュ「−」は前述の意味を表す）。
2004002421.tif 000006
本発明は、前述のＳＩＶペプチド以外に、ウイルスＳＩＶのｃＤＮＡでコードされたタンパク質にも係わる。本発明はまた、免疫学的にＳＩＶ−１ｍａｃと密接な関係をもつ総てのウイルスのタンパク質、特にそのエンベロープのタンパク質及び糖タンパク質が免疫学的に交差反応し且つｃＤＮＡが少なくとも９５％、好ましくは９８％以上の相同性を有する総てのウイルスのタンパク質にも係わる。
【０１０５】
本発明は特に下記のタンパク質に係わる。
１／遺伝子ｅｎｖによってコードされた図３のエンベロープのタンパク質及び糖タンパク質、
２／図４に示したタンパク質ＧＡＧ、
３／図５に示したタンパク質ＰＯＬ、
４／図６に示したタンパク質Ｑ
５／図７に示したタンパク質Ｒ、
６／図８に示したタンパク質Ｘ、
７／図９に示したタンパク質Ｆ、
８／図１０に示したタンパク質ＴＡＴ。
【０１０６】
ＳＩＶの前述のタンパク質のアミノ酸はウイルスＨＩＶ−２の対応タンパク質のアミノ酸配列と一直線上になるように示した。これら２つの配列の間に配置された鉛直点はこれら２つのウイルスのタンパク質に共通のアミノ酸に対応する。
【０１０７】
前述のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は図１Ｂに示した。本発明は、前述のヌクレオチド配列以外に、やはりレトロウイルスＳＩＶ又はその変異体のタンパク質をコードする修飾ヌクレオチド配列にも係わる。
【０１０８】
前述の配列（図１Ｂ）における番号付けで示されるこれらのｃＤＮＡ配列には下記のものがある。
−ＧＡＧをコードする配列、ヌクレオチド　５５１〜２０６８
−ＰＯＬ〃　　　　　　　　　〃　　　　　　　１７２６〜４８９３
−　Ｑ　　　　　　　　　　　〃　　　　　　　　　〃　　　　　　　４８２６〜５４６７
−　Ｘ　　　　　　　　　　　〃　　　　　　　　　〃　　　　　　　５２９８〜５６３３
−　Ｒ　　　　　　　　　　　〃　　　　　　　　　〃　　　　　　　５６３７〜５９３９
−　Ｆ　　　　　　　　　　　〃　　　　　　　　　〃　　　　　　　８５６９〜９３５４
−　ＴＡＴ−１　　　　　　　　〃　　　　　　　　　〃　　　　　　５７８８〜６０８４
−　ＡＲＴ−１　　　　　　　　〃　　　　　　　　　〃　　　　　　６０１４〜６１３０
−　ＴＡＴ−２　　　　　　　　〃　　　　　　　　　〃　　　　　　８２９６〜８３９１
−　ＡＲＴ−２　　　　　　　　〃　　　　　　　　　〃　　　　　　８２９４〜８５４８
−　ＥＮＶ　　　　　　　　　　〃　　　　　　　　　〃　　　　　　６０９０〜８７３２
従って本発明は、前述のタンパク質がウイルスＳＩＶから得られる場合又は、特により小さいペプチドの合成に関して説明した前述のごとき方法の１つに従い合成によって製造される場合には、当然これらのタンパク質にも係わる。
【０１０９】
本発明はまた、ＨＩＶ−２のタンパク質、更にはＨＩＶ−２自体に対する抗体が存在するか否かを調べる診断における前述のごときタンパク質の使用、又はこれらタンパク質のうちの或るものに関しては、いずれかのウイルスＨＩＶに起因する感染の診断における使用にも係わる。例えば、対応遺伝子によってコードされたペプチドＧＡＧは、抗ＨＩＶ−１抗体又は抗ＨＩＶ−２抗体の存在を検出するのに使用できる。ＥＮＶタンパク質は好ましくはＨＩＶ−２又はその変異体の１つに起因する感染の特異的診断に使用され、時にはＨＩＶ−２又はＨＩＶ−１による感染の診断に使用される。
【０１１０】
従って本発明は更に、生物学的流体特にヒト血清中のＨＩＶ−２に対する抗体、及び場合によってはＨＩＶ−１に対する抗体も検出するｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断の方法にも係わる。ＳＩＶの前記タンパク質を診断目的に使用し得るこのような方法は、本発明で既に説明した。
【０１１１】
本発明はまた、生物学的流体中のウイルスＨＩＶ−２に対する抗体、及び場合によってはＨＩＶ−１に対する抗体の存在をｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断するための「キット」にも係わる。前述のごときペプチドを使用するこの種のキットについても本発明で既に説明した。
【０１１２】
本発明は更に、ワクチンの製造に使用するための、有効成分が有利には少なくともウイルスＳＩＶのＥＮＶタンパク質の一部分で構成されるような免疫原組成物にも係わる。前記タンパク質はキャリヤ分子と結合した形態を有していてもよい。この免疫原組成物はレトロウイルスＨＩＶ−２のタンパク質、更にはレトロウイルスＨＩＶ−２自体を阻害するのに十分な量で前記ペプチドに対する抗体の産生を誘導する。
【０１１３】
但し、ＳＩＶタンパク質の診断に使用できるのはＥＮＶ又は
ＧＡＧタンパク質のみに限らない。先に説明したタンパク質のうちの別のタンパク質も診断用、更にはワクチン用の組成物の製造に使用し得る。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ１】ＨＩＶ−２　ＲＯＤのｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列及びその中に含まれる読み取り枠である。
【図１Ａ２】ＨＩＶ−２　ＲＯＤのｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列及びその中に含まれる読み取り枠である。
【図１Ａ３】ＨＩＶ−２　ＲＯＤのｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列及びその中に含まれる読み取り枠である。
【図１Ａ４】ＨＩＶ−２　ＲＯＤのｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列及びその中に含まれる読み取り枠である。
【図１Ａ５】ＨＩＶ−２　ＲＯＤのｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列及びその中に含まれる読み取り枠である。
【図１Ａ６】ＨＩＶ−２　ＲＯＤのｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列及びその中に含まれる読み取り枠である。
【図１Ａ７】ＨＩＶ−２　ＲＯＤのｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列及びその中に含まれる読み取り枠である。
【図１Ａ８】ＨＩＶ−２　ＲＯＤのｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列及びその中に含まれる読み取り枠である。
【図１Ａ９】ＨＩＶ−２　ＲＯＤのｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列及びその中に含まれる読み取り枠である。
【図１Ｂ１】ＳＩＶのウイルスゲノムのヌクレオチド配列とｇｅｎｅ生成物ｇａｇ，　ｐｏｌ，　ｅｎｖ，　Ｑ，　Ｘ，Ｒ，　ｔａｔ，　Ｆに対応するウイルスタンパク質に関して前記ヌクレオチド配列から誘導した配列である。
【図１Ｂ２】ＳＩＶのウイルスゲノムのヌクレオチド配列とｇｅｎｅ生成物ｇａｇ，　ｐｏｌ，　ｅｎｖ，　Ｑ，　Ｘ，Ｒ，　ｔａｔ，　Ｆに対応するウイルスタンパク質に関して前記ヌクレオチド配列から誘導した配列である。
【図１Ｂ３】ＳＩＶのウイルスゲノムのヌクレオチド配列とｇｅｎｅ生成物ｇａｇ，　ｐｏｌ，　ｅｎｖ，　Ｑ，　Ｘ，Ｒ，　ｔａｔ，　Ｆに対応するウイルスタンパク質に関して前記ヌクレオチド配列から誘導した配列である。
【図１Ｂ４】ＳＩＶのウイルスゲノムのヌクレオチド配列とｇｅｎｅ生成物ｇａｇ，　ｐｏｌ，　ｅｎｖ，　Ｑ，　Ｘ，Ｒ，　ｔａｔ，　Ｆに対応するウイルスタンパク質に関して前記ヌクレオチド配列から誘導した配列である。
【図１Ｂ５】ＳＩＶのウイルスゲノムのヌクレオチド配列とｇｅｎｅ生成物ｇａｇ，　ｐｏｌ，　ｅｎｖ，　Ｑ，　Ｘ，Ｒ，　ｔａｔ，　Ｆに対応するウイルスタンパク質に関して前記ヌクレオチド配列から誘導した配列である。
【図１Ｂ６】ＳＩＶのウイルスゲノムのヌクレオチド配列とｇｅｎｅ生成物ｇａｇ，　ｐｏｌ，　ｅｎｖ，　Ｑ，　Ｘ，Ｒ，　ｔａｔ，　Ｆに対応するウイルスタンパク質に関して前記ヌクレオチド配列から誘導した配列である。
【図１Ｂ７】ＳＩＶのウイルスゲノムのヌクレオチド配列とｇｅｎｅ生成物ｇａｇ，　ｐｏｌ，　ｅｎｖ，　Ｑ，　Ｘ，Ｒ，　ｔａｔ，　Ｆに対応するウイルスタンパク質に関して前記ヌクレオチド配列から誘導した配列である。
【図１Ｂ８】ＳＩＶのウイルスゲノムのヌクレオチド配列とｇｅｎｅ生成物ｇａｇ，　ｐｏｌ，　ｅｎｖ，　Ｑ，　Ｘ，Ｒ，　ｔａｔ，　Ｆに対応するウイルスタンパク質に関して前記ヌクレオチド配列から誘導した配列である。
【図１Ｃ１】ウイルス遺伝子及びＬＴＲの理論的生成物をＨＩＶ２とＳＩＶｍａｃとの間で比較した図である。
【図１Ｃ２】ウイルス遺伝子及びＬＴＲの理論的生成物をＨＩＶ２とＳＩＶｍａｃとの間で比較した図である。
【図２ａ】ＨＩＶ−２ＲＯＤ及びＨＩＶ−１ＢＲＵ夫々のｅｎｖタンパク質のアミノ酸配列である。
【図２ｂ】ＨＩＶ−２ＲＯＤ及びＨＩＶ−１ＢＲＵ夫々のｅｎｖタンパク質のアミノ酸配列である。
【図２ｃ】ＨＩＶ−２ＲＯＤ及びＨＩＶ−１ＢＲＵ夫々のｅｎｖタンパク質のアミノ酸配列である。
【図３ａ】ＳＩＶ−ｍａｃのｅｎｖタンパク質のアミノ酸配列である。
【図３ｂ】ＨＩＶ−２　ＲＯＤのｅｎｖタンパク質のアミノ酸配列である。
【図４ａ】ＳＩＶ−ｍａｃのｇａｇタンパク質のアミノ酸配列である。
【図４ｂ】ＨＩＶ−２　ＲＯＤのｇａｇタンパク質のアミノ酸配列である。
【図５ａ】ＳＩＶ−ｍａｃ及びＨＩＶ−２　ＲＯＤ夫々のｐｏｌタンパク質のアミノ酸配列である。
【図５ｂ】ＳＩＶ−ｍａｃ及びＨＩＶ−２　ＲＯＤ夫々のｐｏｌタンパク質のアミノ酸配列である。
【図５ｃ】ＳＩＶ−ｍａｃ及びＨＩＶ−２　ＲＯＤ夫々のｐｏｌタンパク質のアミノ酸配列である。
【図６】ＳＩＶ−ｍａｃ及びＨＩＶ−２　ＲＯＤ夫々のＱタンパク質のアミノ酸配列である。
【図７】ＳＩＶ−ｍａｃ及びＨＩＶ−２　ＲＯＤ夫々のＲタンパク質のアミノ酸配列である。
【図８】ＳＩＶ−ｍａｃ及びＨＩＶ−２　ＲＯＤ夫々のＸタンパク質のアミノ酸配列である。
【図９】ＳＩＶ−ｍａｃ及びＨＩＶ−２　ＲＯＤ夫々のＦタンパク質のアミノ酸配列である。
【図１０】ＳＩＶ−ｍａｃ及びＨＩＶ−２　ＲＯＤ夫々のｔａｔタンパク質のアミノ酸配列である。
【図１１】ＳＩＶ−ｍａｃ及びＨＩＶ−２　ＲＯＤ夫々のａｒｔタンパク質のアミノ酸配列である。
【図１Ａ１】
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【図１Ａ２】
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【図１Ａ３】
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【図１Ａ４】
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【図１Ａ５】
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【図１Ａ６】
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【図１Ａ７】
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【図１Ａ８】
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【図１Ａ９】
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【図１Ｂ１】
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【図１Ｂ２】
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【図１Ｂ３】
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【図１Ｂ４】
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【図１Ｂ５】
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【図１Ｂ６】
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【図１Ｂ７】
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【図１Ｂ８】
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【図１Ｃ１】
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【図１Ｃ２】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
2004002421.tif 000036
【図３ｂ】
2004002421.tif 000037
【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
2004002421.tif 000040
【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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