(57)【要約】【課題】ｇｐ１３０を強く刺激することが知られているＩＬ−６レセプターとＩＬ−６を直接融合した１本のポリペプチドであるＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６の構造を明確化するための結晶解析のため、糖鎖の切断、及び結晶化に使用する溶液を提供する。【解決手段】糖鎖を切断したＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合蛋白質を用いるＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合蛋白質の結晶作製法であって、好ましくは少なくとも硫酸アンモニウム又はポリエチレングリコールのいずれかを含む溶液を用いる結晶作製法により前記課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖鎖を切断したＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合蛋白質を用いる、ＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合蛋白質の結晶作製法。
【請求項２】
結晶作製において、少なくとも硫酸アンモニウム又はポリエチレングリコールのいずれかを含む溶液を用いることを特徴とする、請求項１に記載の結晶作製法。
【請求項３】
請求項又は請求項２に記載の方法で作製された結晶を用いる、ＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合蛋白質の結晶構造解析法。
【請求項４】
請求項３の結晶構造解析により得られた３次元座標。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合蛋白質の結晶作製法等に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
重要な生理活性あるいは薬効を有する蛋白質の結晶作製およびその構造解析は、低分子合成化合物の医薬品開発において、非常に重要であることがよく知られている。上記蛋白質は通常生体内では微量にしか存在しないため、結晶作製にはリコンビナント蛋白質が通常用いられる。
【０００３】
糖鎖を有するリコンビナント蛋白質の結晶作製において、糖鎖の切断はしばしば大きな問題となる。糖鎖が不均一な場合は糖鎖を切断する方が好ましいと考えられるが、一方で糖鎖を切断することで蛋白質の疎水性が高まり、立体構造が変化したり、容器に吸着することが起こる。
【０００４】
また、結晶作製において、溶液、特にリザーバーとして用いる溶液の組成は非常に重要であるが、蛋白質ごとに最適組成が異なることが知られている。
【０００５】
ＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合蛋白質はＩＬ−６レセプターとＩＬ−６が融合した１本のポリペプチドであり、ｇｐ１３０を強く刺激することが知られている（例えば、特許文献１参照）が、該蛋白質の結晶作製は報告されていない。なお、大腸菌で発現された糖鎖をもたないＩＬ−６の結晶作製については既に報告されているが、ＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合蛋白質は酵母または動物細胞を宿主として発現され糖鎖をもつために、結晶作製条件は大きく異なると考えられる。
【０００６】
【特許文献１】
特開２００１−８６９０号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本願の目的は、糖鎖をもつＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合蛋白質の結晶化における糖鎖の切断および使用する溶液に関するものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために成された本願請求項１の発明は、糖鎖を切断したＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合蛋白質を用いることを特徴とするＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合蛋白質の結晶作製法に関するものである。本願請求項２の発明は、請求項１の発明に係り、結晶化において、少なくとも硫酸アンモニウムかポリエチレングリコールのいずれかを含む溶液を用いることを特徴とする。本願請求項３の発明は、ＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合蛋白質の結晶構造解析において、請求項１または請求項２に係る方法で作製された結晶を用いることを特徴とする。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
本発明で使用されるＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合蛋白質は天然には存在しないので、組換え品（リコンビナント）を用いる。ＩＬ−６レセプターとＩＬ−６は、自由度の高いペプチドで融合してもよいし、直結型でもよい。
【００１０】
本発明で使用されるリコンビナントＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合蛋白質を発現させるための宿主は特に限定はなく、酵母や動物細胞が例示されるが、生産性という観点からピキア酵母が好ましい。
【００１１】
本発明で使用される糖鎖切断の方法についても酵素処理や化学処理があげられ、特に限定はないが、後の実施例に記載されているエンドグリコシダーゼが好ましい。糖鎖切断の確認は、ＳＤＳ存在下で通常の電気泳動を行えばよい。
【００１２】
また、本発明で使用されるリザーバー溶液には硫酸アンモニウムあるいはポリエチレングリコールのいずれかを用いることが好ましい。ここで、硫酸アンモニウムの濃度としては１〜２Ｍ、ポリエチレングリコールの種類としてはＰＥＧ３０００、濃度は２０〜４０％が特に好ましい。
【００１３】
【発明の効果】
本願発明の結晶作製法によれば、ＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合蛋白質の結晶を作製し、さらには構造解析を行うことができる。本願発明の方法は、従来報告のなかった低分子合成化合物をｇｐ１３０刺激剤あるいはｇｐ１３０阻害剤として開発するためのリード化合物の決定に特に有用である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下に、発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１５】
実施例１　ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質の精製
特開１１−１８８６５０号公報に記載のＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を発現するピキア・パストリス種の酵母の凍結物を１００ｍｌのＢＭＧＹ（Ｂａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　１０ｇ／ｌ、ＢａｃｔｏＰｅｐｔｏｎｅ　２０ｇ／ｌ、Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａｓｅ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　１．３４ｇ／ｌ、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０、グリセロール１０ｇ／ｌ、ビオチン０．４ｍｇ／ｌ）培地に接種し、市販の培養装置（ＮＢＳ社製、Ｇ−２０型）にて２８℃、２００ｒｐｍの条件で２４時間前培養を行った。
【００１６】
８ｌのＢＭＧＹ（Ｂａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　１５ｇ／ｌ、ＢａｃｔｏＰｅｐｔｏｎｅ　３０ｇ／ｌ、その他は上記ＢＭＧＹと同一組成）培地に前記培養液１００ｍｌを接種し、１６ｌのジャー（ＮＢＳ社製、ＳＦ−１１６型）にて２８℃、３５０ｒｐ、通気量１ｖｖｍの条件で溶存酸素濃度をモニタリングしつつ培養を行った。
【００１７】
培養開始から１６時間後、溶存酸素濃度が急激に上昇したことによりグリセロールの枯渇を確認し、培地にメタノール３００ｍｌ、Ｂａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　１５ｇ、Ｂａｃｔｏ　Ｐｅｐｔｏｎｅ　３０ｇの混合水溶液を２ｌ添加し、１１２ＶＡＤの発現を誘導した。
【００１８】
メタノール添加後２０時間で培養を終了し、培養液を集めた。
【００１９】
培養液８ｌを水に対して５時間透析した後、電気伝導度計でモニターしながら、２０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．５）及び純水を添加し、ＮａＣｌ濃度として約５０ｍＭとなるまで希釈した。更にｐＨメーターをモニターしながら、５０％酢酸水溶液を滴下し、ｐＨを５．５とし、これを精製原料とした。
【００２０】
ＳＰ基を有する吸着体粒子を含む市販の装置（商品名；吸着流動床ストリームライン−ＳＰ（カラム；ＳＴＬＥＡＭＬＩＮＥ　Ｃ−５０；５ｃｍＩＤ×１００ｃｍ、ゲル；ストリームライン用ＳＰ；３００ｍｌ、アマシャムファルマシアバイオテク社製）に対し、２０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．５）を上方送液することにより平衡化し、上記のように調製した精製原料（６リットル、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質量が１０９ｍｇ、総蛋白質量が２．４ｇ）を線速毎時３００ｃｍで送液した。精製原料の送液後、平衡化緩衝液を引き続き上方送液することで充分に洗浄し、カラム上部に純水を注入してアダプターを下降させゲルをパック状態にした。次いで、７５ｍＭ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．５）を線速毎時３００ｃｍで下方送液し夾雑物を除去した。洗浄による夾雑物の除去後、２００ｍＭ　ＮａＣｌ、５％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む２０ｍＭ　リン酸塩緩衝液（ｐＨ６．５）を線速毎時１５０ｃｍで下方送液しＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質画分を得た。
【００２１】
次に回収したＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質画分をゲルろ過クロマトグラフィーに供するため、限外ろ過膜処理により濃縮した。市販の限外ろ過膜（商品名；ペリコンＸＬ、日本ミリポア社製）に０．４５マイクロメーターのメンブランフィルター（日本ミリポア社製）でろ過した回収画分を供した。
【００２２】
引き続き限外ろ過膜処理後の画分をゲルろ過クロマトグラフィー工程に供した。限外ろ過膜濃縮液（２１ミリリットル）を１００ｍＭ　ＮａＣｌの２０ｍＭ　リン酸塩緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したゲルろ過クロマトグラフィーカラム（商品名；ＴＳＫｇｅｌ　Ｇ３０００ＳＷ（２１．５ｍｍＩＤ×３０ｃｍ、東ソー（株）製）に、毎分５．０ミリリットルで送液、添加し、２８０ｎｍにおける吸収のモニター結果と標準蛋白質の保持時間を指標としてＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質画分を回収した。
【００２３】
次に回収したＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質画分を陽イオン交換クロマトグラフィーに供するため、限外ろ過膜処理により緩衝液を交換した。限外ろ過膜に０．４５マイクロメーターのメンブランフィルターでろ過した回収画分を供した。限外ろ過膜処理の間、適宜、５％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む２０ｍＭ　酢酸塩緩衝液を保持液であるＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質溶液に添加することにより、緩衝液の交換を行った。緩衝液交換はｐＨおよび電気伝導度の測定値を目安として行った。
【００２４】
引き続き限外ろ過膜処理後の画分を、陽イオン交換クロマトグラフィー工程に供した。陽イオン交換クロマトグラフ用カラム（商品名；ＴＳＫｇｅｌ　ＳＰ−５ＰＷ（２１．５ｍｍＩＤ×１５ｃｍ、東ソー（株）製）を５％（ｖ／ｖ）グリセロールの２０ｍＭ　酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．５）で充分に平衡化し、調製液を流速８．０（ミリリットル／分）で前記画分を送液した。送液後、前記平衡化緩衝液でカラムを洗浄し、平衡化緩衝液と１０００ｍＭ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸塩緩衝液を用いて９５〜１９５ｍＭのＮａＣｌ濃度勾配によりＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質画分を流速毎分８．０ミリリットルで溶出させ、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質画分７５ミリリットルを回収した。　これにより最終的に３０ミリグラムの精製ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質が回収された。なお、蛋白質の定量は、市販の定量キット（商品名；プロテインアッセイキット、日本バイオ・ラッドラボラトリー社製）を使用した。
【００２５】
実施例２　ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質の糖鎖切断
実施例１に記載の方法で得られた精製ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を２０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ６．５）、０．１Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　２−メルガプトエタノール（２−ＭＥ）、０．１％　β−ＯＧ、プロテアーゼインビターカクテル（製品名：Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ　ｔａｂｌｅｔ、ロシュ社製）、１５０ユニットのエンドグリコシダーゼ（製品名：ＥｎｄｏＨｆ、生化学工業製）を含む溶液で４℃、２０時間処理した。処理後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分子量が約４５ｋＤａとなっていること、すなわち糖鎖が切断されていることを確認した。
【００２６】
さらに、ＣＭによる陽イオン交換およびＤＥＡＥによる陰イオン交換を行い、吸着部分のみを分取した。これらの操作により、切断された糖鎖を除いた。
【００２７】
実施例３　ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質の結晶化（１）
実施例２の方法で得られた糖鎖が切断されたＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を４．５ｍｇ／ｍｌになるように５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）、０．２Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　２−ＭＥ、０．１％　β−ＯＧに溶解した。リザーバー溶液には、１．６Ｍ　硫酸アンモニウム、０．１Ｍ　Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ　ＮａＣｌを用い、４℃で２０日間保温した。
【００２８】
その結果、図１に示される結晶の作製が見られた。結晶の大きさは、短方向０．１ｍｍ、長方向０．３ｍｍの平面型であった。また、単結晶ではなく、複数の結晶が重なりあった構造をとっていた。
【００２９】
実施例４　ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質の結晶化（２）
実施例２の方法で得られた糖鎖が切断されたＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を７．０ｍｇ／ｍｌになるように５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）、０．２Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　２−ＭＥ、０．１％　β−ＯＧに溶解した。リザーバー溶液には、３０％ポリエチレングリコール４０００、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、０．２Ｍ　酢酸ナトリウムを用い、４℃で１５日間保温した。
【００３０】
その結果、図２に示される結晶の作製が見られた。その結果、図２に示される結晶の作製が見られた。結晶の大きさは、短方向０．１ｍｍ、長方向０．３ｍｍの平面型であった。また、単結晶ではなく、複数の結晶が重なりあった構造をとっていた。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例３の方法で作製された結晶の写真である。
【図２】図２は、実施例４の方法で作製された結晶の写真である。図中、１メモリは２５μｍである。
【図１】
2004131441.tif 000002
【図２】
2004131441.tif 000003