(57)【要約】【課題】ネコの皮膚等の体細胞から作出したクローン胚（体細胞クローン胚）および体外受精により得られる体外受精胚は、体外で分割し桑実胚、胚盤胞、脱出胚盤胞へと発育する。いずれのステージの胚も子宮に移植すれば子ネコへと発育する。本発明は、より妊娠率の高くなる脱出胚盤胞への発育率を向上させることのできる培養方法を解決するものである。さらに、未成熟な卵子および成熟した卵子を任意の時間、また任意の数量を必要時に使用できるようにするために、卵子を凍結保存しクローン猫および体外受精ネコの生産に役立たせる。【解決手段】クローン胚および体外受精胚を含むネコ胚を、牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加した培養液で培養することにより、効率的に脱出途中の胚盤胞（脱出途中胚盤胞）および脱出胚盤胞へ発育させる方法を提供する。卵子を高濃度のエチレングリコール液と蔗糖液により急速に凍結保存し、融解後、一定の制限された時間内に卵子を蔗糖液に浸漬することにより、半永久的に保存でき、かつ任意の時間に使用可能となる卵子を提供する。【選択図】　図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネコ体細胞クローン胚およびネコ体外受精胚作出に用いる培養液に、１％〜２０％の牛胎児血清を添加することにより、体細胞クローン胚および体外受精胚を効率的に脱出途中胚盤胞および脱出胚盤胞へ発生させることができる体外培養方法。
【請求項２】
培養初期（培養４８〜７２時間目）の培養液からグルコースを除去することにより、効率的に胚盤胞へ発育させることができる請求項１に記載の体外培養方法。
【請求項３】
培養初期（培養４８〜７２時間目）の培養液に、グルコースの代替としてピルビン酸を添加することにより、胚の発育を高めることができる請求項１に記載の体外培養方法。
【請求項４】
凍結保存した卵子を融解後、０．２〜０．７Ｍ　蔗糖液に２０秒〜１分未満の間、卵子を浸漬することにより、体外受精後に胚盤胞を作成することができる凍結保存ネコ卵子の融解後の処理方法。
【請求項５】
凍結保存した卵子を融解後、０．２〜０．７Ｍ　蔗糖液に２０秒〜１分未満の間、卵子を浸漬することにより、卵子を猫クローン胚作成のレシピエント卵子として使用できる凍結保存ネコ卵子の融解後の処理方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、体細胞クローン猫を作成するため、または体外受精により新たなネコを作出するために必要な胚を効率的に作出する体外培養技術に関する。さらに、クローン胚および体外受精胚作出に必要な卵子を凍結保存後に融解する技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
通常、哺乳動物胚の体外培養には、蛋白源である血清もしくは牛血清アルブミンが添加されている。しかし、ネコ卵子を血清添加培地で培養すると、卵子の成熟能に血清が悪影響を及ぼす（Ｗｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｒｅｐｒｏｄ．　Ｆｅｒｔｉｌ．　１０４，　３１５−３２３，　１９９５）ことが発表されて以来、体外受精後の胚の発育には主として牛血清アルブミンが使用されてきた。しかし、牛血清アルブミンを添加した培養液では胚盤胞まで発育するが、その後の脱出胚盤胞への発育は困難である。最近、人血清を用いることにより胚盤胞への発育が促進されることが明らかにされたが（Ｋａｎｄａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｖｅｔ．　Ｍｅｄ．　Ｓｃｉ．，　６０，　４２３−４３１，　１９９８）、人血清は感染等取り扱いが難しく、実用化上問題である。
【０００３】
一方、猫クローン胚および体外受精胚作出に必要な卵子は、一般に動物病院で避妊手術により採取された卵巣を用いる。この場合、十分な量の卵巣の確保が難しく、胚作成時に使用する卵子の数は不十分であり、技術の実用化の障害となっていた。十分な量の卵子を確保するためには、卵子の凍結保存技術の開発が望まれる。他の動物種において凍結機を使用しない卵子のガラス化凍結保存方法が報告されているが（Ｏｔｏｉ　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ　３７，　７７−８５，　１９９８）、ネコ卵子に関する報告はなく、実用化のために具体的な方法の確立が望まれており、本法により確立された。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、牛胎児血清を使用することにより、ネコ胚の発生率を向上できる実用的な胚培養技術を提供し、それに用いる実用的な卵子の凍結保存法の確立を目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、ネコ体細胞クローン作出技術の開発をめざして体外受精胚の培養をベースに鋭意検討した結果、培養液に添加する蛋白を血清アルブミンから牛胎児血清に変えることにより、胚盤胞より進んだステージの脱出途中および脱出胚盤胞（図１）まで発育させる培養方法を実現した。さらに、培養開始７２時間目まで胚をグルコース無添加の牛血清アルブミン培地で培養し、牛血清アルブミン培地から牛胎児血清添加培地に変える事により、より発生率の向上した実用的な培養技術の確立に成功した。また、本発明の第二は、凍結融解した卵子を例えば３０秒間０．５Ｍ　蔗糖液に浸漬することにより、凍結融解後、効率的に生存性の高い卵子を提供できるガラス化凍結技術を確立した。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の胚培養法は、牛胎児血清を培養液に添加し脱出胚盤胞まで発育させる新しい培養法である。ネコ体細胞クローン胚およびネコ体外受精胚作出に用いる培養液に添加する牛胎児血清は、１％〜２０％の範囲が良い。特に、５％牛胎児血清を添加した時に、体細胞クローン胚および体外受精胚を効率的に脱出途中胚盤胞および脱出胚盤胞へ発生させることができる。さらに、胚を培養初期（４８〜７２時間目）までグルコースを除去した培地で培養することにより、発生率を向上させることができる。第二の特徴は、ガラス化凍結保存したネコ卵子を融解した後の処理法であり、蔗糖液で処理する時間を２０秒〜１分未満に限定することにより生存した卵子を提供できる技術である。この場合の蔗糖液の濃度は、０．２〜０．７Ｍの範囲が使用可能であるが、０．５Ｍ　蔗糖液、３０秒間が最適である。
【０００７】
【実施例】
動物病院で避妊手術により採取したネコ卵巣を３０〜３５℃に保温した生理食塩液に入れて持ち帰り、卵巣以外の組織を除去した。卵巣は、約１０　ｍＬの０．３％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ中に移し、フェザー刃で細切後、緊密に卵丘細胞が付着した卵子を選抜して、各種ホルモン（ＨＭＧ　０．１　ＩＵ／ｍＬ，ＨＣＧ　１０　ＩＵ／ｍＬ，エストラジオール　１　μｇ／ｍＬ）と０．４％　ＢＳＡを含む　ＴＣＭ１９９液（成熟培養液）で３〜４回洗浄した。ついで、１００μＬドロップの成熟培養液に５個〜８個の卵子を移し、３８℃、５％　ＣＯ２、９５％　空気の気相条件下で２４時間培養して、卵子を成熟させた。
【０００８】
成熟した卵子と凍結融解した精子を用いて体外受精した。体外受精は１０μｇ／ｍＬヘパリンを含むＢＯ液に２００万／ｍＬの濃度に精子を調整し、精子を含む１００μＬのドロップを作成して、その中に培養した卵子を５〜８個移し、前記気相条件下で１２時間培養した。
【０００９】
体外受精後、卵子をＭＫ１液に移し、卵子周囲に付着する卵丘細胞をピペットで除去した。除去後、５００μＬの同じＭＫ１液で７２時間培養し、分割した胚だけを取り出し１００μＬドロップのＭＫ１液中で５〜７日間培養した。
【００１０】
体外受精直後の胚（１細胞期胚）を０．４％　ＢＳＡもしくは５％　牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加した　ＭＫ１液で培養し、その発生状況を　表１に示した。また、体外受精後０．４％　ＢＳＡで胚を培養し、桑実胚および胚盤胞に発生した胚をそれぞれの添加した液で培養した結果を併せて示した。
【００１１】
【表１】
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【００１２】
表１に示したように、ＢＳＡ添加培養液では脱出胚盤胞まで発育しないことが確認され、ＦＢＳを添加することにより、いずれのステージの胚（１細胞期胚、桑実胚、胚盤胞）も脱出途中および脱出胚盤胞まで発育する率を高めた。特にＦＢＳの添加により、胚盤胞から脱出途中胚盤胞へと高率に発育させることができた。さらに、本法により猫クローン胚をＦＢＳ添加培地で培養したところ、１７．３％（９／５２）のクローン胚が胚盤胞に発育した。
【００１３】
体外受精後の胚（１細胞期胚）を７２時間目までグルコース添加もしくは無添加のＭＫ１液（ＢＳＡ添加）で培養後、５％　ＦＢＳ添加　ＭＫ１液で５日間培養した結果を表２に示す。
【００１４】
【表２】
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【００１５】
表２に示すように、胚の培養開始後７２時間目までグルコース無添加の培地で培養した場合に、胚盤胞まで発育する率は高かった。この結果は、グルコースの添加が後期の胚の発育に悪影響を及ぼすことを示している。そこで、クローン胚および体外受精胚のエネルギー源となるグルコースの代替としてピルビン酸を培地に添加した場合、胚の発育を高めた。
【００１６】
卵子の凍結保存法として、卵子採取後、２４時間成熟培養した卵子を凍結保存した。凍結保存は０．３％　ＢＳＡを含む　ＴＣＭ１９９液で４０％　エチレングリコール（ＥＧ）液＋０．３Ｍ　蔗糖液（４０％　ＥＧ液）を作成し、卵子を２０％　ＥＧ液で２分間浸漬して、最終濃度４０％　ＥＧ液への平衡を行い、０．２５ｍＬプラスチックストローに卵子を充填した。４０％ＥＧ液に浸漬後１〜２分以内にストローへの充填および液体窒素への浸漬を行い、凍結保存した（図２）。
【００１７】
融解はストローを２０℃の温水中で１０〜１５秒保持することにより行い、ストローの卵子を含む内溶液を３５ｍｍのデイッシュに取り出し、卵子のみを０．５Ｍ　蔗糖を含むＴＣＭ１９９液（０．５Ｍ　蔗糖液）に移し、３０秒間０．５Ｍ　蔗糖液で平衡した。平衡後卵子を成熟培養液に移し、上記気相条件下で１時間培養した。培養後、上記に従い体外受精および体外培養した（図２）。体外培養による胚の発生状況を表３に示した。なお比較として、融解後の０．５Ｍ　蔗糖液で０分，１分，５分間浸漬した結果を併せて示す。
【００１８】
【表３】
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【００１９】
ウシ等の卵子のガラス化保存では凍結融解後、卵子を０．５Ｍ　蔗糖液に５分間浸漬する必要がある（Ｏｔｏｉ　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ，　１９９８）。しかし、表３に示したように、融解後５分間蔗糖液に浸漬すると体外受精後胚盤胞への発育は見られなかった。一方、３０秒間の浸漬のみが胚盤胞へ発育した。なお、凍結液の基礎液として卵子の培養に用いたＴＣＭ１９９液以外に、培養には使用していないリン酸緩衝液　（ＰＢＳ）を用いても同様な結果が得られた。
【００２０】
【発明の効果】
本発明は、以上説明したように構成されているので、以下に記載されるような効果を奏する。ネコの体細胞クローン胚および体外受精胚を含む胚作出のための効率的な培養方法を提供する。とくに脱出途中および脱出胚盤胞までの発育を促進する培養方法である。また、胚を７２時間目までグルコースを除去した培地で培養することにより、より高い移植可能な胚盤胞が得られる。
【００２１】
第二に、ネコ卵子の凍結保存を可能とし、体外受精後、胚盤胞を作成することができる。本技術は猫クローン胚作成用のレシピエント卵子としても使用できる。本技術により、任意の時間に使用可能となる卵子を提供できることから、効率的な胚生産が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ネコの胚発育ステージにおける桑実胚（ａ）、胚盤胞（ｂ）、脱出途中胚盤胞（ｃ）、脱出胚盤胞（ｄ）を示す図である。
【図２】卵子の凍結融解方法を示す図である。
【図３】従来の猫クローンおよび体外受精技術と本発明による改良点を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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