(57)【要約】【課題】予じめ定められた性質を利用して遺伝子産物を得るという全く新規な方法を開発すること。【解決手段】　生物学的手段によってペプチドまたはポリペプチドを製造するための方法であって、少なくとも部分的にはストキャスティック合成ポリヌクレオチドからなる遺伝子を、１つの共通の培地内で同時に作成し；このようにして得た遺伝子を培養によって蛋白質を生産するクローンを生じさせ；特定された性質を少なくとも１つ有するペプチドまたはポリペプチドを生産するこれらのクローンを確認するよう、形質転換されたこのようなクローンについて、スクリーニング及び／又は選択を行う、ことを含むことを特徴とする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
予じめ定められた結合性を有するペプタイド、ポリペプタイドまたは蛋白質を同定する（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ）方法であって：
（ａ）該予じめ定められた結合性（ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｐｅｒｔｙ）を検出するためのリガンドを供給し；
（ｂ）ストキャスティックに生成した（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃａｌｌｙ　ｇｅｎｅｒａｔｅｄ）ポリヌクレオチド配列の多様な集団を合成し、しかして、該ポリヌクレオチド配列は、４以上のアミノ酸位置で２以上のアミノ酸残基の予じめ定められた頻度（ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｏｒ　ｍｏｒｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ　ａｔ　ｆｏｕｒ　ｏｒ　ｍｏｒｅ　ａｍｉｎｏａｃｉｄ　ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）をコードするものであり；
（ｃ）該ストキャスティックに生成したポリヌクレオチド配列の多様な集団（ｄｉｖｅｒｓｅ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）をひとつの発現ベクター集団（ａ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ）に挿入して、ストキャスティックに生成したポリヌクレオチド配列を含む多様な発現ベクター集団を形成せしめ；
（ｄ）ストキャスティックに生成したポリヌクレオチド配列を含む多様な発現ベクター集団を発現せしめて、４以上のアミノ酸位置で２つ以上のアミノ酸残基を該予じめ定められた頻度で有する該ペプタイド、ポリペプタイド、または蛋白質の多様な集団を製造し；そして
（ｅ）該予じめ定められた性質を有する１以上のペプタイド、ポリペプタイド、または蛋白質と結合しこれを検出できる条件下で、該リガンドを用いることによって（ｗｉｔｈ　ｓａｉｄ　ｌｉｇａｎｄ）、該多様なペプタイド、ポリペプタイド、または蛋白質の集団をスクリーニングする；ことからなることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、組換えＤＮＡ技術に関するものであって、更に詳細には、リガンドとの結合性という性質を利用する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
　本発明は、ストキャスティック遺伝子及び結合性という予じめ定められた性質を有効に利用する技術に関するものであるが、このようなことは従来知られておらず新規である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
　本発明は、予じめ定められた構造、式、配列を有する遺伝子産物を専らその対象としている技術の現状において、予じめ定められた性質を利用するという従来未知の全く新規な方法を開発する目的でなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
　本発明は、上記目的を達成するためになされたものであって、ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質を発現することのできる遺伝子を含有する形質転換された宿主細胞を用いて、つまり組換えＤＮＡ技術を利用して、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質を同定、分離又は取得するための方法を、その目的対象とするものである。
【０００５】
　この発明は、特に、一応（ｉｎ　ａ　ｆａｓｈｉｏｎ）次のことができるストキャスティック遺伝子（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ　ｇｅｎｅ）またはストキャスティック遺伝子のフラグメントを製造することを目途とするものである：該遺伝子またはその断片は、これらの遺伝子の転写または翻訳の後に、（およそ少なくとも１０，０００の）非常に数多くの全く新規な蛋白質を、これらの蛋白質を発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ）しうるこれらの遺伝子をそれぞれ含有する（バクテリアまたは真核細胞からなる）宿主細胞の存在下で、同時に得ることができるものであり、しかる後に、該クローンの内どれが希望する性質を有する蛋白質を生産するのかを決定する目的で、選択又はクリーニングを行うものである。該希望する性質としては、例えば、構造的、酵素的、触媒的、抗原的、薬学的性質、またはリガンドとしての性質（ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｌｉｇａｎｄｉｎｇ）があり、そして更に一般的には、化学的、生化学的、生物学的その他の性質があるのである。
【０００６】
　この発明は、また、利用できる性質、特に化学的、生化学的、または生物学的性質、を有するＤＮＡまたはＲＮＡ配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を得る方法を、その目的とするものである。
【０００７】
　したがって、この発明が、科学、工学、及び医学の非常に数多くの分野において、非常に数多くの応用に受け入れられることは、明白なことである。
【０００８】
　この発明にしたがってペプタイドまたはポリペプタイドを製造するための方法は、次の特徴を有するものである：少なくとも一部分は合成ストキャスティックポリヌクレオチドからなる遺伝子を、同じ培地中で同時に製造し；このようにして得られた遺伝子を宿主細胞内に導入し；ストキャスティック遺伝子をクローニングし（ｃｌｏｎｅ）そしてこれらのストキャスティック遺伝子の各々によって発現される蛋白質の製造が行われるよう、これらの遺伝子を含有する形質転換された宿主細胞の独立クローン（ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｌｏｎｅ）を同時に培養し；希望する活性を少なくとも１つは有するペプタイドまたはポリペプタイドを生産するこれらのクローンを確認する（ｉｄｅｎｔｉｆｙ）よう、形質転換された宿主細胞のクローンの選択及び／又はスクリーニングを行い；しかる後に、このようにして確認したクローンを単離し；そして、これらを培養して、該性質を有する少なくとも１つのペプタイドまたはポリペプタイドを生産させるのである。
【発明の効果】
【０００９】
　多様なストキャスティック遺伝子集団及び結合性という予じめ定められた性質を有効に利用することによって、該性質を有するペプタイド類を同定、分離することができ、また該ペプタイド類をコードするポリヌクレオチド配列を分離、製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
　この方法を実施する第１の態様においては、ストキャスティック遺伝子は次のようにして製造する。すなわち、はじめに直線状となした発現ベクターの２つの端部からの４種類のデオキシホスホヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔのストキャスティック共重合によって；次いで、それらの３′末瑞が相補的であるところの２つのストキャスティック配列（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有する発現ベクター１分子によって構成された、ストキャスティック第１ＤＮＡ鎖（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ　ｆｉｒｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｏｆ　ＤＮＡ）を形成するよう、コヘッシブ−エンド（ｃｏｈｅｓｉｖｅ　ｅｎｄ）を形成せしめ；ひき続いてストキャスティック第２ＤＮＡ鎖を合成することによって、製造するのである。
【００１１】
　この方法を実施するための第２の態様によれば、ストキャスティックＤＮＡ断片を形成するよう、コヘッシブ−エンドを有しないオリゴヌクレオチドの共重合によって、続いて、予じめ直線化した発現ベクターに該断片を連結することによって、ストキャスティック遺伝子を製造するのである。
【００１２】
　発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ）としては、プラスミド、特に細菌プラスミドが使用できる。発現ベクターとしてｐＵＣ８プラスミドを使用すると卓越した結果が得られる。また発現ベクターとしては、ウイルスＤＮＡ、または、ウイルスＤＮＡとプラスミドとのハイブリッドも使用することができる。宿主細胞としては、ＨＢ１０１及びＣ６００といった原核生物細胞、または真核生物細胞が使用できる。
【００１３】
　上述した第２の態様による方法を利用する場合には、１群の回帰性オクタマー（ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ　ｏｃｔａｍｅｒ）を形成するオリゴヌクレオチドを利用することができる。
【００１４】
　次のグループからなる回帰性オクタマーを利用すれば、特に、良い結果が得られる：
５’ＧＧＡＡＴＴＣＣ　３’
５’ＧＧＴＣＧＡＣＣ　３’
５’ＣＡＡＧＣＴＴＧ　３’
５’ＣＣＡＴＡＴＧＧ　３’
５’ＣＡＴＣＧＡＴＧ　３’。
【００１５】
　１群の回帰性ヘプタマー（ｈｅｐｔａｍｅｒ）を形成するオリゴヌクレオチドを使用することも可能である。
【００１６】
　次のグループからなる回帰性ヘプタマーを利用すれば、非常に良い結果が得られる：
５’ＸＴＣＧＣＧＡ　３’
５’ＸＣＴＧＣＡＧ　３’
５’ＲＧＧＴＡＣＣ　３’
式中、Ｘ＝Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴ
Ｒ＝Ａ又はＴ。
【００１７】
　これらの手法を利用する方法の内で特に有利な方法によれば、上述した手法によって得た形質転換された宿主細胞の独立クローンのカルチャーから、プラスミドの形質転換性ＤＮＡ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ＤＮＡ）を分離、精製し；次いで、この精製されたＤＮＡは、少なくとも１つの制限酵素（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｚｙｍｅ）で切断するが、この酵素は、回帰性オクタマーまたはヘプタマー中には存在するけれども使用した発現ベクター中には存在しない特異的酵素切断部位に、対応するものである；この切断処理の後に、制限酵素を失活させ；このようにして得た直線化されたストキャスティックＤＮＡ断片の総体（ｅｎｓｅｍｂｌｅ）を、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて同時に処理して、新しいストキャスティック配列を含む新しいＤＮＡ総体を創製し、その結果、この新しい総体は、当初の総体における遺伝子の数よりもより多い沢山のストキャスティック遺伝子を、含むことができることになるのである。そこで、この新しい形質転換性ＤＮＡの総体を、宿主細胞を形質転換しそしてこれらの遺伝子をクローニング（ｃｌｏｎｅ）するために、利用し；そして最後に、スクリーニング及び／又は選択処理を利用して、形質転換された宿主細胞の新しいクローンを分離し、そして、これらを培養して、少なくとも１つのペプタイドまたはポリペプタイド、例えば新しい蛋白質を製造するのである。
【００１８】
　宿主細胞のクローンを選択するときの基準として利用できる性質としては、与えられたクローンから生産されたペプタイドまたはポリペプタイドが有するところの、与えられた化学反応を触媒する能力を挙げることができる。
【００１９】
　例えば、いくつかのペプタイド及び／又はポリペプタイドの製造にあっては、上記した性質としては、化学的化合物からなる最初のグループから目的とする最終の１つの化合物にいたる一連の反応を触媒する能力（ｃａｐａｃｉｔｙ）を、利用することができる。
【００２０】
　多数のペプタイド及びポリペプタイドから構成される総体を再帰的自触反応によって（ｒｅｆｌｅｘｉｖｅｌｙ　ａｕｔｏｃａｔａｌｙｔｉｃ）製造する目的の場合は、該性質としては、適宜な培地中で上記総体をアミノ酸及び／又はオリゴペプタイドから合成する際、それを触媒する能力を挙げることができる。
【００２１】
　また、該性質としては、与えられた化合物の生物学的又は化学的諸性質を選択的に修飾する（ｍｏｄｉｆｙ）能力、例えばポリペプタイドの触媒活性を選択的に修飾する能力、を利用することもできる。
【００２２】
　また、該性質としては、例えばホルモン、神経伝播体、ゆ着因子、成長因子、及び、ＤＮＡの複製の特異的レギュレータ及び／又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳の特異的レギュレータの中から選ばれる少なくとも１つの生物学的活性化合物が有する少なくとも１つの生物学的機能を、刺激し、阻害し、または修飾する能力、を利用することもできる。
【００２３】
　また、該性質としては、ペプタイドまたはポリペプタイドが与えられたリガンド（ｌｉｇａｎｄ）と結合する能力、を利用することもできる。
【００２４】
　この発明は、また、上記した方法で得たペプタイドまたはポリペプタイドを、リガンドの検出及び／又は滴定のために使用することも、その目的対象とするものである。
【００２５】
　この発明を実施するための特に有利な態様によれば、形質転換された宿主細胞（ｈｏｓｔ　ｃｅｌｌ）のクローンを選ぶ基準（ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ）は、これらのペプタイドまたはポリペプタイドが有するところの、例えば蛋白質といった生物学的活性分子の効果をシミュレートしたり修飾したりする能力であり、そして、この性質を有するペプタイドまたはポリペプタイドの少なくとも１つを生産する形質転換された宿主細胞のクローンを、次のようにして、スクリ一ニングし及び／又は選択する。：すなわち、この活性分子に対する抗体を調製し；次に、これらの抗体を精製した後、このペプタイドまたはポリペプタイドを含有するクローンを確認する（ｉｄｅｎｔｉｆｙ）するのにこれらの抗体を利用し；次いで、このようにして確認したクローンを培養し、これらのクローンによって生成されたペプタイドまたはポリペプタイドを分離、精製し；そして最後に、ペプタイドまたはポリペプタイドをｉｎｖｉｔｒｏアッセイにかけて、それが該分子の効果をシミュレートしたり（ｓｉｍｕｌａｔｅ）または修飾したりする能力（ｃａｐａｃｉｔｙ）を有することを確かめるのである。
【００２６】
　この発明に係る方法を実施するための他の態様によれば、選択の基準にして役立つ性質としては、与えられた抗原のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅｓ）の内の１つに類似したエピトープを少なくとも１つ有するか否かという点である。
【００２７】
　この発明は、上記した方法によって得られそして化学療法的に活性な物質として有用なポリペプタイドを製造するのに、利用される。
【００２８】
　特に、該抗原がＥＧＦの場合には、この発明によれば、上皮腫の化学療法的処置に有用なポリペプチドを得ることができる。
【００２９】
　この方法の変形によれば、ＤＮＡハイブリッドの天然の部分によって発現される蛋白質に対応する抗体に対する親和クロマトグラフィによって、希望する性質を有するペプタイドまたはポリペプタイドを生成する形質転換宿主細胞のクローンを、確認しそして単離する。
【００３０】
　例えば、ハイブリッドＤＮＡの天然の部分がβ−ガラクトシダーゼ発現遺伝子を含んでいる場合には、抗−β−ガラクトシダーゼ抗体に対する親和クロマトグラフィによって、形質転換された宿主細胞の該クローンを、有利に確認しそしてこれを単離することができるのである。ハイブリッド　ペプタイドまたはポリペプタイドの発現及び精製の後に、それらの新規な部分を分離しそして単離すればよいのである。
【００３１】
　この発明は、また、ワクチンを調製するのに上述した方法を利用するのにも応用される；その応用は次の特徴を有するものである。すなわち、病原剤（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ａｇｅｎｔ）に対する抗体を単離する、例えば、この病原剤に対する抗体産生能を有する動物体内にこの病原剤を注入し、しかる後に生成される抗体を単離し；そして、病原剤のエピトープの１つに類似した少なくとも１つのエピトープを有する蛋白質を少なくとも１つ生成しうるクローンを確認するのに、これら上記した抗体を使用し；これらのクローンに対応する形質転換宿主細胞を培養して、これらの蛋白質を製造し；この蛋白質を細胞のクローンから単離、精製し；そして、この蛋白質を、該病原剤に対するワクチンの製造のために、使用するのである。
【００３２】
　例えば、抗−ＨＶＢワクチンを調製するためには、ＨＶＢウイルスのカプシド蛋白質（ｃａｐｓｉｄｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を少なくとも１つ抽出、精製し；ＨＶＢウイルスのエピトープの１つに類似したエピトープを少なくとも１つ有するこの蛋白質に対する抗体を産生する能力を有する動物に、この蛋白質を注入し；そして、この蛋白質を製造するよう、これらのクローンに対応する形質転換された宿主細胞のクローンを培養し；これらの細胞のクローンのカルチャー（ｃｕｌｔｕｒｅ）から、該蛋白質を単離、精製し；そして、抗−ＨＶＢワクチン製造のために、この蛋白質を利用すればよいのである。
【００３３】
　この発明に係る方法を実施する有利な態様によれば、宿主細胞は、バクテリアからなり、例えば、そのゲノムかβ−ガラクトシダーゼを発現する天然の遺伝子も含まずまたＥＢＧ遺伝子も含まないようなエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、すなわちＺ−，ＥＢＧ−Ｅ．ｃｏｌｉから成る。形質転換細胞は、培地中において、Ｘｇａｌ及びインディケーターＩＰＴＧの存在下で、培養し、そしてβ−ガラクトシダーゼ機能が陽性の細胞を検出する；しかる後に、大規模培養のために、形質転換ＤＮＡを宿主細胞の適宜なクローン内に移入して（ｂｅ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ）、少なくとも１つのペプタイドまたはポリペプタイドを製造するのである。
【００３４】
　また、形質転換された宿主細胞を選択する基準として利用される性質としては、これらのクローンの培養によって製造されたポリペプタイドまたは蛋白質が有するところの、与えられた化合物への結合能を、挙げることもできる。
【００３５】
　この化合物は、特に、ペプタイド、ポリペプタイド及び蛋白質の中から、とりわけ、ＤＮＡの転写活性（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）を調節する蛋白質の中から、有利に選ぶことができる。他方、該化合物は、ＤＮＡ及びＲＮＡ配列の中からも選ぶことができる。
【００３６】
　またこの発明は、次のような蛋白質もその目的とするものである。すなわち、これらの蛋白質とは、形質転換された宿主細胞のクローンを選択する判断基準として利用される性質が、ＤＮＡの転写活性をコントロールする調整蛋白質（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ）とこれらの蛋白質とが結合する能力、さもなくば（ｏｒ　ｅｌｓｅ）ＤＮＡ及びＲＮＡ配列とこれらの蛋白質が結合する能力、から構成される場合に得られる蛋白質をいうのである。
【００３７】
　更にまた、この発明は、上述した第１番目の特定ケースにおいて得た蛋白質を、隣接ＤＮＡ配列の複製又は転写をコントロールするｃｉｓ調整配列として利用することも、その目的としている。
【００３８】
　他方、また、この発明の目途としては、既述した第２番目のケースにおいて得た蛋白質の利用も包含されるものであるが、該利用とは、ＤＮＡのある配列を、このＤＮＡ配列を含有しこの蛋白質を発現する細胞内で、転写し又は複製する性質を修飾するために、該蛋白質を利用することをいうのである。
【００３９】
　また、この発明は、ＤＮＡの製造方法もその目的対象とするものであって、この方法は、少なくとも１部分はストキャスティック合成ポリヌクレオチドから成る遺伝子を、同一培地内で同時に生産することによって特徴づけられるものであり、次の点を特徴とするものである。すなわち、このようにして得られた遺伝子を宿主細胞内に導入して、形質転換された宿主細胞の総体（ｅｎｓｅｍｂｌｅ）を生成せしめ；この総体にスクリーニング及び／又は選択処理を行って、少なくとも１つの希望する性質を有するストキャスティックＤＮＡ配列（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆ　ＤＮＡ）をそれらのゲノム中に含有する宿主細胞を、確認し；そして最後に、このようにして確認した宿主細胞のクローンからＤＮＡを単離するのである。
【００４０】
　更にまた、この発明は、ＲＮＡを製造するための手法もその目的対象とするものであって、この手法（ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）は、少なくともその１部分はストキャスティック合成ポリヌクレオチドから成る遺伝子を、同一培地内で同時に生産することによって特徴づけられるものであり、次の点を特徴とするものである。
【００４１】
　すなわち、このようにして得た遺伝子を宿主細胞内に導入して、形質転換された宿主細胞の総体を生成せしめ；このようにして製造した宿主細胞を同時に培養し、そして、希望する性質を少なくとも１つ有するストキャスティックＲＮＡ配列を含有する宿主細胞を確認するように、この総体のスクリーニング及び／又は選別を行い；そして、このようにして確認した宿主細胞から、ＲＮＡを単離するのである。該性質としては、例えばペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質であってもよいところの、与えられた化合物に対する結合能であってもよいし、また、与えられた化学反応の触媒能であてもよいし、また、転移ＲＮＡとなり得る能力であってもよい。
【００４２】
　さて次に、実施例を挙げながら、本発明に係る方法を更に詳細に、そしてまたその応用についても記述するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【実施例】
【００４３】
　先ず最初に、ストキャスティック遺伝子（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ　ｇｅｎｅ）の合成を行い、そして、形質転換されたバクテリアのクローンを製造するために、バクテリア内にこれらの遺伝子を導入するのに特に有用な手法について、記述することにする。
【００４４】
　Ｉ）発現ベクター上の直接合成
　次のようにして、発現ベクター上の直接合成を行った。
【００４５】
　ａ）ベクターの直線化
　ｐＵＣ８発現ベクター３０マイクログラム、すなわち約１０13分子について、適宜な標準バッファー３００Ｌ中でＰｓｔＩ制限酵素１００ユニットを用いて３７℃で２時間これをインキューベートして、該ベクターを直線化する。この直線化されたベクター（ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ　ｖｅｃｔｏｒ）は、フェノール−クロロホルムで処理し、次いでエタノール中に沈澱せしめ、３０Ｌの容積中に取り上げ、そして、標準ＴＥＢバッファー中０．８％アガロースゲル上に負荷する（ｌｏａｄｅｄ）。３Ｖ／ｃｍの場で３時間移動せしめた後、直線化されたベクターを電気的に溶出し（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｅｌｕｔｅｄ）、エタノール中で沈澱させ、そして水３０Ｌ中にとり上げる。
【００４６】
　ｂ）酵素ターミナル　トランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を用いるストキャスティック合成
　ｄＧＴＰ　１ｍＭ、ｄＣＴＰ　１ｍＭ、ｄＴＴＰ　０．３ｍＭ及びｄＡＴＰ１ｍＭの存在下、適宜なバッフアー３００Ｌ中で、直線化されたベクター３０μｇをＴｄＴ３０ユニットと３７℃で２時間反応させる。対応するメッセンジャーＲＮＡ中における“終止”コドンの頻度を減少せしめるために、低濃度のｄＴＴＰを選択する。他のデスオキシヌクレオチド　トリホスフェートよりもより低い濃度のｄＡＴＰを使用すれば、いく分好ましくはないけれども、これと同様の結果を得ることができる。続いて、この反応工程中にアリクォート（ａｌｉｑｕｏｔｅｓ）を採取してそのゲルについて分析を行いつつ、ＰｓｔＩ部位の３’末端上での重合を進行させる。
【００４７】
　３’末端当り添加したヌクレオチドの平均値が３００に達するか又はそれをこえたときに、反応を終止し、そして、示差沈澱によってまたはＢｉｏｇｅｌ　Ｐ６０といった分子篩を有するカラムを通過させることによって、遊離のヌクレオチドをポリマーから分離する。エタノール中で沈澱させて濃縮した後、ポリマーを更にＴｄＴを用いて重合させるが、その場合、最初はｄＡＴＰの存在下、次にｄＴＴＰの存在下で重合を行う。これら最後の２つの反応は、ゲル上で濾過することによって分離しそして短時間（３０秒〜３分）行うが、それは、ポリマーの３’末端に順次１０−３０Ａを加え次いで１０−３０Ｔを加えるためである。
【００４８】
　ｃ）第２のストキャスティックＤＮＡ鎖の合成
　上記した操作終了時には、ベクターの各分子は、それぞれ、２つのストキャスティック配列を持っているが、該配列の３′末端は相補的になっている。このポリマー混合物は、しかる後に、相補的末端がハイブリッド化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）するのに都合の良い条件で、インキューベートする（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、６５℃で１０分間、ひき続き１時間当り３〜４℃の割合で温度を下げながら２２℃にまでもっていく。そこで、ハイブリッド化したポリマーは、４つのヌクレオチド
　トリホスフェートの存在下（２００ｍＭ）、４０℃で２時間の間、ポリメラーゼ１の大きなフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ）６０ユニットと反応させる。この工程で、ハイブリッドポリマーの３’端部からの第２鎖の合成が完了する。しかる後に、線状化されたベクターから出発したこの直接合成の結果得られる分子は、適格細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ）を形質転換するのに用いるのである。
【００４９】
　ｄ）適格クローンの形質転換
　ＣａＣｌ2　６ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　６ｍＭ、ｐＨ８、ＭｇＣｌ2　６ｍＭの存在下、濃度１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌのＣ６００の適格ＨＢ１０１　１００〜２００ｍｌを、（上記で得た）ストキャスティックＤＮＡ調製物とともに、０℃で３０分間インキューベートする。この混合物に対して、３７℃、３分間の温度ショックを与えた後、抗生物質を含まないＮＺＹ培地を４００〜８００ｍｌ添加する。形質転換されたカルチャーは、３７℃で６０分間インキューベートした後、アンピシリンを４０μｇ／ｍｌ含有するＮＺＹ培地を添加して１０Ｌに希釈する。３７℃で３〜５時間インキューベートした後、増殖した（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）カルチャーを遠心分離し、そして、形質転換細胞のペレットをライオファイルし、−７０℃で貯蔵する。このようなカルチャーは独立形質転換株（ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ）を３×１０7〜１０8含有しており、またこれらの独立形質転換株は、発現ベクター内に挿入されたユニーク（ｕｎｉｑｕｅ）ストキャスティック遺伝子を、それぞれ１個含有している。
【００５０】
　ＩＩ）コヘッシブ−エンドを持たないオリゴヌクレオチドを出発原料とするストキャスティック遺伝子の合成
　この手法は次の事実に基礎をおくものである。その事実とは、慎重に選んだ回帰性オリゴヌクレオチドを重合することにより、ストキャスティック遺伝子の構築ができることであり、該遺伝子は、６個の可能な解読フレーム（ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｌａｍｅ）のいずれにおいても“終止”コドンを含むものではなく、また一方、すべてのアミノ酸を特定化するトリプレットのバランスのとれた表現を確実にするものである。更にまた、結果として得られる蛋白質において、シーケンス　モチーフ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｍｏｔｉｆ）の反復を避けるために、オリゴヌクレオチドは、３の倍数ではない数の塩基を含むことができる。以下に述べる実施例は、これらの基準を満たすところの可能性のある結合の内の１つの使用を、記述したものである：
　ａ）オクタマーグループの選定
　該オリゴヌクレオチドのグループは次式で示され：
５’　ＧＧＡＡＴＴＣＣ　３’
５’　ＧＧＴＣＧＡＣＣ　３’
５’　ＣＡＡＧＣＴＴＧ　３’
５’　ＣＣＡＴＡＴＧＧ　３’
５’　ＣＡＴＣＧＡＴＧ　３’
５つの回帰体（ｐａｌｉｎｄｒｏｍｅ）（このように自己相補性配列）からなるものであって、これは、ストキャスティック重合が、“終止”コドンを全く発生させないこと、そしてまたすべてのアミノ酸を特定すること、を容易に確認させるものである。
【００５１】
　どのような“終始（ｓｔｏｐ）”コドンも発生させることがなく且つポリペプタイド中に発見されるアミノ酸をすべて特定化するような、回帰性オクタマーのグループであれば上記以外のものも使用できることは明白である。また、２本鎖ＤＮＡを形成する相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）が同じく使用されるという条件の下であれば、オクタマーの非回帰性グループであってもまたその他のオリゴマーであっても、これらのものも使用できることは明らかである。
【００５２】
　ｂ）オクタマーのグループからストキャスティック遺伝子のアセンブリー
　ＡＴＰ　１ｍＭ、ポリエチレングリコール１０％、及びＴ４　ＤＮＡリガーゼ１００ユニットを含有する適宜なバッファー１００μｌ中で、上述したオリゴヌクレオチド（常法にしたがって予じめ５’の位置でリン酸化しておく）の各々５μｇを含有する混合物を、１３℃で６時間反応させる。この工程は、２本鎖状態でしかもコヘッシブ−エンドを有しないオリゴマーのストキャスティック重合を行うものである。その結果得られたポリマーは、モレキュラーシーブ（Ｂｉｏｇｅｌ　Ｐ６０）を通して単離し、２０〜１００オリゴマーを有するものを回収する。濃縮した後、このフラクションを、上述した条件のもとで、再度Ｔ４　ＤＮＡリガーゼによる触媒及び重合処理にかける。しかる後に、上述したようにして、少なくとも１００オリゴマーがアセンブルした（ａｓｓｅｍｂｌｅｄ）ポリマーを単離する。
【００５３】
　ｃ）宿主プラスミドの調製
　上述したようにして、適宜なバッファー中で、ＳｍａＩ酵素によってｐＵＣ８発現ベクターを線状化する。このＳｍａＩによって線状化されたベクターは、コヘッシブ−エンドを有してはいない。したがって、この直線化ベクターは、仔牛の腸から得たアルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）を用いて、つまり適宜なバッファー中においてベクター１マイクログラム当り該酵素１ユニットのレベルで、３７℃で３０分間処理する。しかる後に、このＣＩＰ酵素は、フェノール−クロロホルムを用いて連続２回の抽出を行って、これを失活させる。直線化され脱リン酸された（ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ）ベクターは、エタノール中で沈澱させ、次いで１ｍｇ／ｍｌで水中で再溶解させる。
【００５４】
　ｄ）ストキャスティック遺伝子のベクターヘの連結
　ベクターとポリマーとを等モル量ずつ混合し、これを、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ１０００ユニット、ＡＴＰ　１ｍＭ、ポリエチレングリコール１０％の存在下、適宜なバッファー中において１３℃で１２時間インキューベートする。この工程によって、ストキャスティックポリマーが発現ベクター内に連結されて、２本鎖の環状分子が形成される。したがって、この分子は形質転換することが可能である。
【００５５】
　適格クローンの形質転換
　適格クローンの形質転換は、先述した方法にしたがって実施する。
【００５６】
　ＩＩＩ）ヘプタマーのグループを出発原料とするストキャスティック遺伝子のアセンブリー
　この手法は、すぐ上で検討したものとは、次の点で相違する。つまりこの手法は、同一のモチーフをより少ない数だけ有するストキャスティック配列の代りに、可変性（ｖａｒｉａｂｌｅ）コヘッシブ−エンドを有する回帰性ヘプタマー（ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ　ｈｅｐｔａｍｅｒ）を利用するものである。
【００５７】
　ａ）ヘプタマーのグループの選定
　例えば、次に示す３つの回帰性ヘプタマーを利用することができる：
５’　ＸＴＣＧＣＧＡ　３’
５’　ＸＣＴＧＣＡＧ　３’
５’　ＲＧＧＴＡＣＣ　３’
式中、Ｘ＝Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴ
Ｒ＝Ａ又はＴ。
【００５８】
　ここにおいて、重合化の際に“終止”コドンを発生することは全くなく、そして、すべてのアミノ酸を特定するトリプレットは生成するものである。これらと同一の条件を満たすものであれば、上記以外のヘプタマーグループを用いることができるのは明白なことである。
【００５９】
　ｂ）ヘプタマーのグループの重合
　この重合処理は、オクタマーについて上述したのと全く同じ方法で実施する。
【００６０】
　ｃ）コヘッシブ端部の除去
　このようにして得たポリマーは、その２つの５’末端に１つの対になっていない塩基を有している。したがって、対応する３’末端に相補的な塩基を加えてやる必要がでてくる。これは次のようにして行う：２重鎖ポリマー（ｄｏｕｂｌｅ
　ｓｔｒａｎｄｅｄ　ｐｏｌｙｍｅｒ）１０マイクログラムを、４つのデオキシヌクレオチド−ホスフェート（２００ｍＭ）１００μｌの存在下、Ｋｌｅｎｏｗ酵素１０ユニットと、４℃で６０分間反応させる。フェノールクロロホルム抽出によって酵素を失活せしめ、示差沈澱によって、ポリマーから遊離のヌクレオチド残渣を洗い落す。次いで、上述した手法によって、このポリマーを（予じめ直線化し脱リン酸しておいた）宿主プラスミドに連結するのである。
【００６１】
　次の点に注目すべきである。すなわち、既述したこれら最後の２つの手法は回帰性オクタマーまたはヘプタマーを利用するものであるが、これらはある制限酵素の特異的部位を構成するものである。大低の場合、ｐＵＣ８発現ベクターからはこれらの部位は消失している。したがって、次のような処理をすることによって、ストキャスティック遺伝子の最初の調製物の複雑性を相当高くすることができる：上述した最後の２つの手法の内の１つによって得た１０7の独立形質転換株のカルチャーから誘導したプラスミドＤＮＡを、単離する。このＤＮＡを精製した後、これをＣｌａＩ制限酵素（手法ＩＩ）又はＰｓｔＩ制限酵素（手法ＩＩＩ）を用いて、部分的に消化する。酵素失活後、部分消化されたＤＮＡはＴ４　ＤＮＡリガーゼで処理するが、これは、最初の配列の基本的な性質は保持する一方で、非常に数多くの新規配列を創造する効果を有するものである。そこで、この新規なストキャスティック配列の総体は、コンピテント細胞を形質転換するのに使用できるのである。また、手法ＩＩ及びＩＩＩによってクローン化された（ｃｌｏｎｅｄ）ストキャスティック遺伝子は、クローニングベクターに属しそしてストキャスティックＤＮＡ配列内には表現されない制限部位を利用することによって、ｐＵＣ８発現ベクターから無傷のまま切り出すことができるのである。
【００６２】
　丁度述べたばかりの２つの手法によって発生するストキャスティック遺伝子内での組換えは、反復的分子モチーフ（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　ｍｏｔｉｆ）による内部相同（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ）の結果生じるものであるが、この組換えは、ｉｎ　ｖｉｖｏでコード連鎖（ｃｏｄｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の突然変異生成を達成するためのもう１つの重要な方法である。その結果、新しい遺伝子の数を増加させることとなり、これらの遺伝子は検査することができるものである。
【００６３】
　最後に、新しい合成遺伝子を発生させるためのすべての手法について、ｉｎ　ｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔｒｏで遺伝子を修飾するための共通の技術を利用することができる。この共通の技術は、数多く存在し、例えば、解読フレームの変更、プロモータに対する配列の逆転、点突然変異、１又はいくつかのサプレッサ転移ＲＮＡを発現する宿主細胞の利用が挙げられる。
【００６４】
　上述したことを考慮すると、次のことが明白になる。つまり、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを酵素重合すれば、極めて多数の（例えば１０億以上の）各種遺伝子をｉｎ　ｖｉｔｒｏで構築することができるのである。この重合化は、確率的に（ｉｎ　ａ　ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ　ｍａｎｎｅｒ）実施され、それは、反応混合物中に存在するヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのそれぞれの濃度によって決定されるものである。
【００６５】
　上で指示したように、２つの方法は、このような遺伝子（又はコード化配列）をクローニングするのに利用することができる：重合は、予じめ直線化したクローニング発現ベクターに対して直接行うか；または、逐次重合をすすめ、次いでポリマーを発現ベクターに連結することもできる。
【００６６】
　これら２つのケースにおいて、次の工程は、適格バクテリア細胞（又はカルチャー内の細胞）の形質転換又はトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）である。この工程は、生細胞内でストキャスティック遺伝子をクローニングすることから成り、生細胞中で遺伝子が不定的に増殖し発現するのである。
【００６７】
　上述した手法のほかに、ストキャスティック配列の合成に適当な方法であれば他の方法をすべて使用することが、明らかにうまくいくものである。特に、化学合成によって得たＤＮＡ又はＲＮＡの１本鎖オリゴマーを、生化学的手段によって重合し、次いで、このような遺伝子をクローニングするために、２本鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を発生せしめるのに確立された手法によって、これらのＤＮＡ又はＲＮＡセグメントを処理することができる。
【００６８】
　形質転換された宿主細胞のクローンのスクリーニングまたは選択
　本発明に係る手法における次なる工程は、選択又はスクリーニングによって、形質転換又はトランスフェクションを受けた細胞を調査することから成るものであり、この調査の目的は、細胞が有する形質転換又はトランスフェクションＤＮＡが、希望する性質を有する転写製品（ＲＮＡ）又は翻訳製品（蛋白質）の合成につながっていく、そのような細胞を１個又は数個単離すること、である。これらの性質としては、例えば、酵素的、機能的、又は構造的なものを挙げることができる。
【００６９】
　本発明に係る方法において、最も重要な面の１つは、この方法によって、有用な生産物（ＲＮＡ又は蛋白質）を同時にスクリーニングまたは選択できることであり、そしてまた、該生産物を生産する遺伝子が得られることである。また、既述したようにして合成されクローン化されたＤＮＡは、それ自体が生産物となり有用な生化学的性質を有するところのＤＮＡ配列を単離するために、選択又はスクリーニングすることができる。
【００７０】
　さて次に、工業的又は医学的応用の見地からして、新規な蛋白質が重大な関心事となるような形質転換細胞にあって、目的とするクローンをスクリーニングまたは選択するための好適な手法を以下に述べることにするが、本発明はこの例に限定されるものではない。
【００７１】
　これらの手法の内の１つは次のような思想によるものである：すなわち、ある蛋白質、又は、生化学的若しくは医学的に興昧のある他のタイプの分子であって、ただし、該分子は免疫原性を有しているか（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ）あるいは既に免疫原性化されているものであるが、この蛋白又は分子に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を、確立された技術によって製造又は取得し；しかる後に、ストキャスティック遺伝子によって形質転換された非常に多数のクローンの中から、その蛋白質が上記した抗体と反応するクローンを確認するため、これらの抗体をプローブ（ｐｒｏｂｅ）として使用するものである。この反応は、ストキャスティック遺伝子によって合成されたポリペプタイドと最初の分子との間に存する構造的相同（ｓｔｒａｃｔｕｒａｌ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ）、の結果である。このようにして、最初の分子上で抗原決定基（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）又はエピトープとして行動する新規蛋白質を数多く単離することができる。このような新規蛋白質は、最初の分子の効果を容易にシミュレートし、刺激し、変調し、又はブロックしうるものである。この選択又はスクリーニング手段が、それ自体、非常に多くの薬学的及び生化学的用途を有し得ることは、明らかである。
【００７２】
　具体的な例において、この操作の第１の態様を以下に説明することとするが、この例のみに限定されるものではない：ＥＧＦ（表皮成長因子）は、血液中に存在する小さな蛋白質であって、その役割は、上皮細胞を刺激することにある。その効果は、上皮細胞の膜内に位置する特異的レセプタとＥＧＦとの間の相互作用によって、得られるものである。ＥＧＦの免疫原性を高めるためにＫＬＨ（カギアナ　カサガイのヘモシアニン）に結合したＥＧＦを動物に注入することによって、ＥＧＦに対する抗体を調製する。例えば、ＥＧＦ又はＥＧＦ断片に相当する合成ペプタイドをリガンドとしたアフィニティカラムを通すことによって、免疫化した動物の抗−ＥＧＦ抗体を精製する。そして、この精製された抗−ＥＧＦ抗体は、クロロホルムで融解せしめた（ｌｙｓｅｄ）多数の細菌クローンを固体支持体上でスクリーニングするためのプローブとして、使用するのである。抗−ＥＧＦ抗体はストキャスティック　ペプタイドまたは蛋白質と結合するのであるが、該ペプタイドまたは蛋白質が有するエピトープは、最初の抗原のそれに類似のものである。該固体支持体を放射活性を有するプロテインＡ又は放射活性を有する抗−抗体とインキューベートした後、オートラジオグラフィ処理することによって、上記したようなペプタイドまたは蛋白質を含有するクローンが明らかにされる。
【００７３】
　これらの工程は、このようなクローン、すなわちその各々が、スクリーニング抗体と反応する蛋白質（及びその遺伝子）を１つ含有しているようなクローンを、確認するものである。非常に数多くのバクテリア細胞のコロニーまたはウィルスのプラーク（例えば約１，０００，０００）内でのスクリーニングを、うまく実施することができるし、また、例えば約１ナノグラムといった極微量の蛋白製品をうまく検出することができる。しかる後に、これら確認したクローンを培養し、そして検出した蛋白質を常法によって精製する。これらの蛋白質は、上皮細胞カルチャー中ｉｎ　ｖｉｔｒｏでテストを行い、これらの蛋白質が該カルチャー内でＥＧＦの効果を阻害し、シミュレートし、又は変調する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）か否かを決定する。このようにして得た蛋白質の内のいくつかのものは、上皮腫の化学療法的処置のために用いることができる。このようにして得た蛋白質の活性は、既述したのと類似の方法にしたがい、蛋白質をコード化するＤＮＡを突然変異することによって、これを改良することができる。この手法の変形の１つとしては、ワクチンとして使用することができるこれらのストキャスティック
　ペプタイド、ポリペプタイド、または蛋白質を精製することが挙げられるが、その目的は、一般的には、病原剤に対する免疫性を付与したり、または、免疫システムに対して別の効果を与えたりすること、例えば、与えられた抗原に関して、この抗原に対する抗体とこれらのペプタイド、ポリペプタイドまたは蛋白質を結合させることによって、この抗原に対する耐性を付与したりあるいは過感作性を軽減したりすること、である。このようなペプタイド、ポリペプタイドまたは蛋白質は、ｉｎ　ｖｉｖｏのみでなくｉｎ　ｖｉｔｒｏでも使用できることは明らかである。
【００７４】
　更に正確には、与えられた抗原Ｘに対する抗体と反応する新規な蛋白質からなる総体（ｅｎｓｅｍｂｌｅ）において、その各々は、Ｘに共通したエピトープを少なくとも１つ有するものであり、したがって、この総体は、Ｘに共通したエピトープの総体を有することになる。このため、総体又は亜−総体（ｓｕｂ−ｅｎｓｅｍｂｌｅ）を、Ｘに対する抗原性を付与するためのワクチンとして使用することができるのである。例えば、Ｂ型肝炎ウィルスの１つ又はいくつかのカプシド蛋白質の精製を容易に行うことができる。そこで、これらの蛋白質は、例えばラビットといった動物内に注入することができるようになり、そして、最初の抗原に対応する抗体を、親和カラム精製によって回収することができる。これらの抗体は、上述したように、最初の抗原のエピトープの少なくとも１つに類似したエピトープを１つ有する蛋白質を少なくとも１つ産生するクローンを、確認する（ｉｎｄｅｎｔｉｆｙ）のに使用してもよい。精製した後、Ｂ型肝炎に対する防御の目的で、これらの蛋白質を（単独又は併用して）抗原として使用する。ワクチンの最終製品は、更に、最初の病原剤にアクセスする必要がないのである。
【００７５】
　上記手法の記述において、選択（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）又はスクリーニングを行うための手段を数多く述べてきた点に注目されたい。これらの手法は、すぺて、形質転換クローンからの特定蛋白質を精製することを必要としているようである。これら蛋白質の精製は、確立された手法で行うことができ、特に、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換によるもの、及び親和クロマトグラフィーによる技術を利用することができる。また、ストキャスティック遺伝子によって産生された蛋白質は、例えばβ−ガラクトシダーゼ酵素配列を有するハイブリッド蛋白質の形でクローニングされ得るものである。この酵素は、抗−β−ガラクトシダーゼ抗体に対する親和クロマトグラフィ一にかけることができ、続いてハイブリッド部分を切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）して、（つまり、ハイブリッド蛋白質のバクテリアの部分と新規な部分とを分離するものである。）ペプタイドまたはポリペプタイドが有する特異的反応に対する触媒能を検出することに基礎をおくところの、第２のスクリーニングまたは選択方法にしたがって、ペプタイドまたはポリペプタイド及び対応する遺伝子を選択するための原理と手法とを、以下に記述することにする。
【００７６】
　通常の場合、これは酵素β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）によって果される機能であるが、ラクトースの切断を触媒することができるところの、蛋白質という特定のケースにおけるスクリーニングまたは選択について、これを具体的に以下に記述するが、この例に限定されるものではない。
【００７７】
　上述したように、本法の第１工程は発現ベクターの非常に大きな総体を生成せしめることにあり、その各々はそれぞれ異なった新規蛋白質を発現するものである。具体的には、例えば、ＰｓｔＩ制限部位にＤＮＡのストキャスティック配列をクローニングしたｐＵＣ８発現ベクターを、選んでもよいのである。次に、このようにして得たプラスミドをＥ．ｃｏｌｉのクローン（ｃｌｏｎｅ）内に導入するが、ただしそのクローンは、β−ガラクトシダーゼ、Ｚに対する天然の遺伝子及び第１の遺伝子とは関係がないけれどもβ−ｇａｌ機能に対して突然変異をひき起す可能性がある第２の遺伝子ＥＢＧの双方を、既知の遺伝子技術によって、ゲノムから既に除去しておいたものである。このような宿主細胞（Ｚ−，ＥＢＧ−）は、それ自体では、ラクトースの加水分解を触媒することができず、その結果、生長用炭素源としてラクトースを使用することはできない。このため、β−ｇａｌ機能をスクリーニングまたは選択するのに、このような宿主クローンを利用することができることになるのである。
【００７８】
　新規なβ−ｇａｌ機能発現遺伝子を有する、形質転換されたＥ．ｃｏｌｉクローンを分析するための便利な生物学的アッセイは、先に述べた形質転換バクテリアを、培地中にＸ−ｇａｌを含有するペトリ皿の中で培養することから成る。この場合、β−ｇａｌ機能を発現する細菌コロニーは、すべて、青いコロニーとなて可視化される。このような生物学的アッセイを用いると、弱い触媒活性でさえも検知することができる。この特徴的酵素の特異的活性は、１秒当り１０〜１０，０００生産物分子に亘っている。
【００７９】
　ストキャスティック遺伝子によって合成された蛋白質は、１００秒当り約１分子というように特異的活性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）が弱いことを考慮に入れると、このような触媒活性の検知を可能にするという課題が依然として残っている。培地中にＸ−ｇａｌを含有したぺトリ皿内で、そして非代謝性インデューサであるＩＰＩＧ（イソプロピル−Ｄ−チオガラクトシド）の存在下において、青い領域を可視化するに当っては、１平方ミリ当り約１０10〜ｌ０11分子のＸ−ｇａｌを切断する必要がある。弱い酵素を発現しそして表面積１ｍｍ2を占める細菌コロニーは、その細胞数が１０7〜１０8である。もしも各細胞が弱い酵素をわずか１コピーしか有しないのであれば、各細胞は、検知すべきＸ−ｇａｌの１０，０００〜１００の切断を触媒することが必要となるであろうし、それには２．７〜２７０時間を要することになるであろう。選択された条件の下では、細胞当りの各プラスミドのコピー数を５〜２０コピー／細胞にまで増幅でき（ａｍｐｌｉｆｙ）更には１００又は１０００にまでも増輻することができるようになるし、また、細胞の蛋白質の１０％までは新規遺伝子によって特定することができるので、活性の弱い酵素が細胞当り１００分子の場合には、青いコロ二ーを検知するのに必要な時間は、約０．２７〜２．７時間となる。
【００８０】
　これらの事実の結果として、各コロニーがそれぞれ異なった新規遺伝子を発現しそしてその選択基準としてβ−ｇａｌ機能発現能を利用するような、非常に数多くの独立細菌コロニーのスクリーニングが、充分にうまく行われることになるのである。直径１０ｃｍのぺトリ皿１個中に約２０００コロニーが存在しても、これらのスクリーニングが可能なのである。このようにして、Ｘ−ｇａｌ寒天シート１平方メートル上で、約２０００万コロニーをスクリーニングすることができるのである。
【００８１】
　Ｘ−ｇａｌぺトリ皿上で青色を呈するバクテリアコロニーがあっても、これが偽陽性である場合があるので、その点に留意すべきである。その原因は、バクテリアゲノム中に突然変異が起ってラクトース代謝能が付与されたり、または、該コロニーの細胞によって発現される新規蛋白質の触媒活性の結果として生じる理由以外の理由によるものである。陽性コロニーからの発現ベクターのＤＮＡを精製しそしてＺ−，ＥＢＧ−Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を再度形質転換すれば、このような偽陽性を直接除去することができる。もしもβ−ｇａｌ活性が発現ベクター内で新規遺伝子によってコード化された新規蛋白質によるものであれば、該ベクターによって形質転換されたこれらの細胞はすべてβ−ｇａｌ機能を示すことになろう。これとは逆に、最初の青いコロニーが宿主細胞のゲノム内での突然変異によるものであれば、このような現象はめったに起るものではないし形質転換とは別のものであり、したがって、ｇａｌ機能発現性を有する形質転換Ｅ．ｃｏｌｉの新規クローンの細胞数は、ゼロまたは小さいものとなろう。
【００８２】
　ナイーブな（ｎａｉｖｅ）バクテリアを再度形質転換した後の陽性クローン（青色）のすべてからの全発現ベクターであれば、これを大量に同時に精製する力は強調されるはずである。この目的が、触媒機能を有する蛋白質を選択するためのスクリーニングを実施することであることを考慮に入れ、そしてまた、新規なペプタイドまたはポリペプタイドがこの機能を実行する可能性が、弱くてもせいぜい１０-6であり、一方、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌宿主の１つのクローンが、これと同じ機能を実行できるような突然変異を受ける可能性が、１０-5であることを考慮に入れると、スクリーニングした２０００万の形質転換細菌について次のような計算をすることができる：すなわち、２０の陽性クローンが、その各々が担持している発現ベクター内の新規遺伝子に由来するものといい得るであろうし、一方、２００の陽性クローンがゲノム突然変異の結果得られたものといい得るであろう。ナイーブなバクテリアを発現ベクター混合物で再度形質転換（ｒｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）した後に得た２２０の陽性の細菌クローン全部について、これから得た発現ベクターを大量精製（ｍａｓｓ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）すれば、多数の陽性クローンと非常に少数の細菌クローンを製造することができることになろう：該陽性クローンは、希望する機能を有する新規な蛋白質をコード化する（ｃｏｄｅ）２０の発現ベクターを用いて形質転換したこれらすべてのバクテリアから成るものであり、一方、該細菌クローンは、ゲノムの突然変異の結果生じたものであり、関心の的とはならない発現ベクターを２００有するものである。このような再度の形質転換の後に、陽性の細菌コロニーからの発現ベクターの精製サイクルを少し行うと、同一機能に対して、宿主細胞内でのバックグラウンド突然変異の率が高いにもかかわらず、希望する触媒活性に対して本当に陽性を示すところの極めてまれな発現ベクターを検知することができる。
【００８３】
　このタイプのスクリーニング操作にひき続き、確立された技術によって新規蛋白質を精製することができる。このような蛋白質の大量生産は、有用な蛋白質の確認がそれをコード化する遺伝子の同時確認（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）と共に行われることによって、可能となるものである。その結果、その合成と単離とを大規模に行うためには、同一の発現ベクターも使用可能であるし、また、新規遺伝子を更に適当な発現ベクター内に移入（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）させることもできるのである。
【００８４】
　このスクリーニング方法は、適当な生物学的アッセイが存在するのであればすべての酵素機能に対して適用しても、うまくいくものである。このようなスクリーニングにあっては、探し求めている該酵素機能が宿主細胞にとって有用である必要はない。酵素機能についてスクリーニングを行うことができるだけでなく、他のすべての希望する性質についてもスクリーニングを行うことができるが、このような性質に対しては適当な生物学アッセイが確立できることが必要である。したがって、触媒活性又は他のすべての希望する性質について、Ｘ−ｇａｌペトリプレート上で可視化されるβ−ｇａｌ機能という簡単なケースにおいてすらも、約１億、場合によっては１０億もの新しい遺伝子のスクリーニングをうまく行うことができるのである。
【００８５】
　形質転換された宿主細胞の選択
　他方、新しい遺伝子をコードする発現ベクターを含有する宿主細胞の生存に対してその性質の存否が基本的な役割をなしたり、または、その存否が、希望する新しい遺伝子をコーディングしそして発現するこれらのウィルスを選択するのに使用できたりする場合には、触媒的又はその他いかなる性質をも選択する技術が使用可能である。非限定的な具体的実施例として、β−ガラクトシダーゼ機能の選択（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）について記述することにする。Ｚ−ＥＢＧ−Ｅ．ｃｏｌｉの適宜のクローンは、ラクトースを唯一の炭素源とした場合には生育することができない。したがって、上述した第１工程を行った後に、他の炭素源を少しずつ無くしていったり又はスタート時からラクトースのみを使用したりするという条件を選び、新しい遺伝子をコード化する発現ベクターによって形質転換された非常に多数の宿主細胞を、このような選定された条件のもとで培養することができるのである。このような選択工程中に、下記によって、ｉｎ　ｖｉｖｏでの突然変異の生成が生じ、そのために希望する触媒機能を満たす能力（ｃａｐａｃｉｔｙ）を適応できるように改良することができるのである。上記突然変異の生成は、組換えによって；または、発現ベクターを回収しそしてそれらの新規遺伝子を各種の突然変異誘発物質により、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで突然変異を生成させるエクスプリシティ（ｅｘｐｌｉｃｉｔｙ）により；または、その他すべての既知の技術によって；行われるものである。このケースのように、選択技術と便利なバイオアッセイ技術とが同時に存在する場合には、はじめに、次のような選択技術を用いることができる。すなわち、β−ｇａｌ機能を発現する宿主細菌の表現（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を富化し、そして、陽性細胞を効率よく確立するためにＸ−ｇａｌ培地を用いるペトリ皿上でスクリーニングを行う、という選択技術を用いることができるのである。使いやすいバイオアッセイが存在しない場合には、それぞれ異なった１個又は少数の宿主細胞であって、その発現ベクターが希望する反応を触媒する蛋白質をコード化するような該宿主細胞を精製するためには、順次きびしくしていく選択方法を適用するのが最も容易なルートである。
【００８６】
　特定の反応を触媒する能力の外に、数多くの種類の構造的特徴と機能的特徴とを有する新しい蛋白質を見出すために、これらの技術を利用することができる。例えば、次のような新しい蛋白質のスクリーニングまたは選択を行うことができる。該新規蛋白質とは、ＤＮＡのシス−調節部位（ｃｉｓ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｓｉｔｅ）に結合し、それによって宿主細胞の機能の内の１つの発現をブロックし、または、ＤＮＡの転写をブロックしたり、転写その他を刺激したりする蛋白質をいうのである。
【００８７】
　例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの場合、ラクトースオペロンのリプレッサ（ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）に突然変異を起した（ｉ−）クローン　ミュータント（ｃｏｌｏｎｅ
　ｍｕｔａｎｔ　ｉｎ）は、ラクトース　オペレータが抑制されないという事実故に、構造的にβ−ｇａｌ機能を発現する。このタイプの細胞は、すべて、Ｘ−ｇａｌ培地を含有するペトリプレート上で青いクローンを産生する。このような宿主細胞を、新規蛋白質を合成する発現ベクターを用いて形質転換し、そして、青色でないこれらのクローンを検出するためにＸ−ｇａｌぺトリプレート上で、ふるい分けを行うことができる。これらの中には、該新規蛋白質がラクトース　オペレータ（ｌａｃｔｏｓｅ　ｏｐｅｒａｔｏｒ）に結合してβ−ｇａｌの合成を抑制する（ｒｅｐｒｅｓｓ）場合を示すものがある。そのようなときには、このようなプラスミドを単離して再度形質転換を行い、β−ｇａｌを生産しないこれらのクローンを単離し、そしてしかる後に詳細な確認を行えばうまくいくのである。
【００８８】
　上述したように、有用な蛋白質のみでなく、有用な性質を有する生産物としてのＲＮＡとＤＮＡとをそれ自体の中で創製した後にこれを分離するために、この方法を利用することができる。これは、次の事実の結果である。すなわち、一方では、この手法は、他の細胞又は生化学的構成々分と直接相互反応することができるＤＮＡのストキャスティック配列を創製することに存するものであり、他方、発現ベクター内でクローニングされたこれらの配列は、それ自体多種類の生化学的相互反応を行うことのできるＲＮＡに転写される、という事実の結果なのである。
【００８９】
　それ自体有用なＤＮＡを創製しそして選択するために該手法を使用する実施例この実施例は、有用なＤＮＡの選択、及びそのＤＮＡに結合する調節蛋白質（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の精製と該蛋白質の作用のメカニズムの研究について、説明するものである。標準的技術によって得られる蛋白質であるエストラジオールリセプタ（ｏｅｓｔｒａｄｉｏｌ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の調製について検討する。ステロイド系性ホルモンであるエストラジオールの存在下では、該リセプタは、その構造（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）が変化し、ゲノムＤＮＡ中のある特定の配列と強固に結合し、その結果、性別に関係する遺伝子の転写が影響を受け、そして受精率のコントロールに影響が出てくるのである。エストラジオール、そのリセプタ、及びそれらのベクター中に挿入された数多くの各種ＤＮＡ配列からなる混合物をインキューベートした後、この混合物をニ卜ロセルロース　メンブランで濾過することによって、エストロゲン−リセプタ複合体に結合するストキャスティツクＤＮＡ配列を直接選択する。ここにおいて、蛋白質に結合したこれらのＤＮＡのみがメンブランに保持されるのである。洗滌しそして溶出した後、メンブランから遊離されてきたＤＮＡを、そのまま、バクテリアを形質転換するのに使用する。形質転換されたバクテリアを培養した後、これらが含んでいるベクターを再度形質転換し、そして、上述したようにして、インキューベーション、濾過及び形質転換を１又は数サイクル実施する。これらの手法を行うことによって、エストラジオール−リセプタ　コンプレックスに対して高い親和性を有するストキャスティックＤＮＡ配列を、単離することができる。このような配列は、数多くの診断的応用及び薬学的応用、特に、受精率のコントロールと不妊症の処理のための応用に、途を拓くものである。
【００９０】
　それ自身有用なＲＮＡの創製と選択
　既述したところにしたがって、多数のストキャスティックＤＮＡ配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を製造し発現ベクター内でクローニング（ｃｌｏｎｅｄ）する。その結果、形質転換細胞においてこれらの配列から転写されたＲＮＡは、それ自体で有用な生産物となり得るものである。以下に述べる手法によって、サプレッサ転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）をコード化するストキャスティック遺伝子を選択することができる：ａｒｇＥ．遺伝子内で“ノンセンス（ｎｏｎｓｅｎｓｅ）”突然変異を有する適格細菌細胞の中に、多数の（１０8以上）ストキャスティック配列を形質転換する。これら形質転換されたバクテリアは、最小培地上にプレートする。この最小培地は、アルギニンは含有しないが、該プラスミド用の選択性抗生物質（ベクターがｐＵＣ８の場合にはアンピシリン）を含有するものである。アルギニンを合成できるように形質転換されたバクテリアだけが、生育できるはずである。このフェノタイプ（ｐｈｅｎｏ　ｔｙｐｅ）は、宿主ゲノムの復帰突然変異により、または細胞内にサプレッサが存在することによって起り得るものである。このようにして形質転換された各コロニーがａｒｇ＋表現型か否かを、そのベクター内のストキャスティック遺伝子の存在によって試験することはたやすいことである：それは、そのコロニーからのプラスミドを精製し、そしてそれがそれによって形質転換されてａｒｇＥ細胞のすべてに対してＡｒｇ＋フェノタイプを与えることを、確認すればそれで足りるからである。
【００９１】
　反応連鎖を触媒することができる蛋白質の選択
　他の選択手段を以下に記述するが、該手段は、独立した応用に途を拓くものであり、関連する反応連鎖（ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）を触媒できるいくつかの新規蛋白質を同時にそして平行的に選択するという原理をベースとするものである。
【００９２】
　この方法の基本的な考え方は次のとおりである：最初の化合物を建築用ブロックまたは建設エレメントと考えると、これら当初化合物の総体から１またはいくつかの希望する化合物を触媒化された化学反応の連鎖によって合成したいという希望が出てくるが、その際、非常に数多くの反応ルートが存在し、それらは、他のものに完全に又は一部置換することができ、すべて熱力学的に可能であり、そして、建築ブロックのセットから希望する１又はそれ以上のターゲット化合物ヘと至るものである。もしも、建築ブロック化合物から標的とする化合物へと至る反応径路の少なくとも１つの各工程が、それぞれ、反応から構成されるものであってしかもその各反応が触媒されるものであれば、標的化合物を能率的に合成する方が都合が良い。他方、多数の独立した又は１部独立した反応径路の内で、どれが触媒されるものであるのかを決定することは、比較的重要なことではない。既に述べてきたように、その各々が相異なる新しい蛋白質を発現するところの宿主細胞を非常に数多く取得できるやり方について、説明してきたところである。
【００９３】
　これら新規な蛋白質のそれぞれが、建築ブロック（ｂｕｉｌｄｉｎｇ　ｂｌｏｃｋ）の総体から目的とする化合物へと導く可能性のある反応すべてからなるセット（ｓｅｔ）における、１つの又はその他の可能性のある反応を触媒する候補者、なのである　。もしも、可能性のある反応が充分な数だけ触媒されるよう、ストキャスティック蛋白質が、充分の数だけ、建築ブロック化合物を含む反応混合物中に存在しておれば、建築ブロック化合物のセットからターゲット化合物へと導く一連の関連する反応順序が、高い可能性をもって、新規蛋白質からなるサブセット（ｓｕｂｓｅｔ）によって触媒されることになるであろう。この手法を、１つのターゲット化合物の触媒現象だけでなくいくつかのターゲット化合物を同時に触媒する触媒現象へと進展させることができることは、明白なことである。
【００９４】
　この原理によれば、希望する化学反応連鎖を触媒する新規蛋白質のセットを平行して選択するために、次のようにして処理を進めることができる：。
【００９５】
　１．希望するターゲット化合物へと導く可能性を有する共存する反応の数を増加させる目的で、好ましくは適当な数の異なった化学種（ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｓｐｅｃｉｅｓ）を利用することによって、建築ブロックを構成する化合物の希望するセットを特定する。
【００９６】
　２．適当量の反応媒体を用い、非常に数多くの新規なストキャスティック蛋白質を添加する。ただし、これらの蛋白質は、これらの蛋白質を合成する形質転換細胞又はトランスフェク卜細胞（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｃｅｌｌ）から単離したものである。ターゲット化合物が形成されたか否かを決定するために、アッセイを行う。もしそうであれば、この形成には新規蛋白質の混合物の存在が必要であることを確認する。もしそうであれば、そこで、該混合物は、建築ブロックセットからターゲット化合物へと至る１又はいくつかの反応径路を触媒する蛋白質のサブセットを含んでいなければならない。最初のクローンの総体を精製しそして分割するが、これらのクローンは、新規なストキャスティック蛋白質のセットを合成し、ターゲット化合物に至る反応連鎖を触媒するのに必要なサブセットを合成するものである。
【００９７】
　更に正確に、新規蛋白質の選択について以下に述べることにするが、この実施例のみに限定されるものではない。該新規蛋白質は、特定の小さな蛋白質の合成、とりわけ、より小さなペプタイドとアミノ酸から構成される建築ブロックからのペンタペプタイドの合成を触媒できるものである。すべてこのペプタイドは、アミノ末端からカルボキシ末端へと配向されており、２０の異なったタイプのアミノ酸からなる直線配列から構成されるものである。２つのより小さなペプタイド（又は２個のアミノ酸）の末端縮合により、またはより大きなペプタイドの加水分解によって、１つの工程で、すべてのペプタイドを形成することができる。このようにして、Ｍ−１縮合反応によって、Ｍ残基を有するペプタイドを生成せしめることができる。反応、これによって、長さ１、２、３・・・Ｍ残基を有する１セットのペプタイドが相互転化され得る（ｃａｎ　ｂｅ　ｉｎｔｅｒｃｏｎｖｅｒｔｅｄ）のであるが、これらの反応数Ｒは、可能な分子種（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｓｐｅｃｉｅｓ）の数Ｔよりも大きいものである。これは、下記数１と書き表わすことができる。
【００９８】
【数１】
2004089197.tif 000002
　このようにして、与えられたペプチド総体を出発物質として、非常に多数の独立した又は一部独立した反応径路が、特定の標的ペプタイドの合成へとつながっていくのである。ペンタペプタイドを選択するが、その存在は、例えば、ＨＰＬＣ（液相高速クロマトグラフィー）、ペーパークロマトグラフィーその他といったいくつかの通常の分析技術によって、手軽に決定することができる。稀釈した水性媒体中でペプチド結合を形成するには、エネルギーが必要である。しかし、もしも縮合反応（ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）にあづかるペプタイドが適度に濃縮されていれば、ペプチド結合の形成は、加水分解上熱力的に好都合であるし、例えばペプシンやトリプシンといった適宜な酵素触媒の存在下、ＡＴＰや他の高エネルギー化合物の存在を必要とすることなく、ペプチド結合が形成されるのである。小さなペプタイドであって、建築ブロックセットを構成するものであり、そしてそのアミノ酸は、トレーサーとして作用するよう、3Ｈ、14Ｃ、35Ｓで放射活性的にマークしてなる、小さなペプタイドのこのような反応混合物は、縮合反応に導くため、充分に高い濃度で使用することができる。
【００９９】
　例えば、次のように処理をすすめていけばうまくいくのである：建築ブロックセットを構成するために選択した、各アミノ酸とアミノ酸を２〜４個有する小さなペプタイド１５ｍｇを、０．１Ｍ、ｐＨ７．６のホスフェートバッファー０．２５ｍｌ〜１．０ｍｌ中に溶解する。上述したところにしたがって発生せしめそして単離した多数の新規な蛋白質を、それらの細菌又は他の宿主細胞から精製する。これらの新規蛋白混合物を、同じバッファー中で最終濃度が０．８〜１．０ｍｇ／ｍｌとなるまで溶解する。０．２５ｍｌ〜０．５ｍｌの蛋白質混合物を、建築ブロック混合物に添加する。これを２５℃〜４０℃で１〜４０時間インキューベートする。規則正しい間隔で、８μｌのアリクォート（ａｌｉｑｕｏｔｓ）を取り出し、最初のものは、“ブランク”として使用し、新規蛋白混合物を添加する前に取り上げる。これらのアリクォートは、溶剤としてｎ−ブタノール−酢酸−ピリジン−水（容積比で３０：６：２０：２４）を用いるクロマトグラフィーによって、これらを分析する。クロマトグラムは、これを乾燥させ、そしてニンヒドリンまたは（増感紙を用いて又は用いることなく）オートラジオグラフィーによって分析する。建築ブロックセットを構成する化合物が放射活性的にマークされているので、ターゲット化合物は、放射活性を有するであろうし、１−１０ｎｇのレベルといった検出可能な充分に高い特異的活性を有することになろう。標準的なクロマトグラフィー分析の代りに、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を用いることができ、これはより速くしかも実施するのがより簡単である。更に概説すれば、通常の分析手法であればすべてのものが使用可能である。その結果、最初の建築ブロックとして用いた化合物に比して、ターゲット化合物の収量がその重量の１ｐｐｍ以下であっても、これを検出できることになるのである。
【０１００】
　もしもペンタペプチドが、上記した条件のもとで生成されたものであれば、ただし、抽出物として、ストキャスティック遺伝子を含まない発現ベクターによって形質転換された宿主細胞から誘導されたもの、を利用しないで生成されたものであれば、このペンタペプチドの生成は細菌汚染物（ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ）の結果ではないということとなり、したがって、反応混合物中に新規な蛋白質のサブセットを存在せしめる必要がでてくるのである。
【０１０１】
　次の工程は、細胞の特定のサブセットを分離することからなるものである。該細胞は、新規な蛋白質を有する発現ベクターを含有するものであり、該蛋白質は、ターゲットとしてのペンタペプタイドに導く反応の順序を触媒するものである。実施例として、この連鎖を形成する反応の数が５とした場合、必要な反応を触媒する新規な蛋白質は約５つ存在する。新規遺伝子をコード化する発現ベクターを含有するバクテリアのクローンバンク（ｃｌｏｎｅ　ｂａｎｋ）が、約１，０００，０００という多数の異なる（ｄｉｓｔｉｎｃｔ）新規遺伝子を有している場合、これらすべての発現ベクターは、一団として（ｅｎ　ｍａｓｓｅ）分離し、そして、１０8の細菌からなる１００の異なるセットの中に再度形質転換せしめるが、その際、形質転換される各セット内の細菌数が平均して当初の遺伝子数の約半分、すなわち約５００，０００となるよう、ベクター対バクテリアの比率を充分に低くしておく。したがって、１００セットのバクテリアの内の与えられたどの１つをとっても、それが５つの臨界的（ｃｒｉｔｉａｌ）新規蛋白質の全体のセットを含む確率は、（１／２）5＝１／３２となるのである。バクテリアの最初の１００セットの内、約３つのものが５つの臨界的形質転換体を有することになろう。これらのセットの各々において、新しい遺伝子の全数は、１，０００，０００というよりはむしろわずかに５００，０００となる。連続的にこの処理を、本件においてはトータルで約２０回、くり返すことにより、５つの臨界的な新規蛋白質を分離する。これにひき続いて、５つのストキャスティック遺伝子からなるこのセットについて、突然変異を生成させそして選択処理を行うことによって、必要な触媒機能を改良することができる。２０の反応からなる１つの連鎖（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を触媒する必要があり、そしてまた新規蛋白質をコーディングする２０の遺伝子を併行して分離する必要がある場合には、１０8のバクテリアの各セットがそれぞれ１０6のストキャスティック遺伝子の８０％を受けとるよう、形質転換数を調節し、そしてこのようなバクテリアのセットを２００使用すれば、それで足りるのである。２０の新規蛋白質すべてが１つのセット内に発見される確率は、下記数２である。
【０１０２】
【数２】
2004089197.tif 000003
　したがって、２００セット内の２つが、ターゲット化合物の生成を触媒するのに必要な２０の新規遺伝子を有することになるのである。この２０の新規遺伝子を単離するのに必要なサイクル数は、およそ３０である。
【０１０３】
　上記した原理及び手法は、ペプタイドの場合から、化学の多数の領域へと広げられるものである。該化学の領域とは、化学反応が、一般的な酵素機能が可能な、水性媒質、温度、ｐＨ、及び濃度の各条件のもとで行われるような、化学頷域である。いずれの場合においても、希望する１又はそれ以上のターゲット化合物の生成を検知するために、分析方法を利用することが必要である。また、ターゲット化合物に至る反応連鎖の数を増加させるのに充分な多数の建築ブロック化合物を選択することも、必要なことである。
【０１０４】
　また、標的としてのペンタペプタイドの合成について行ってきた具体的な実施例は、次のとおり他へも普及せしめることができる：。
【０１０５】
　記述した手法は、他の生産物の内、ストキャスティック　ペプタイド及び蛋白質を産み出すものである。これらのペプタイド又は蛋白質は、他の化合物に対して、触媒的にあるいは他の方法で作用することができる。また、これらは、それらが作用するところの基質を構成することもできる。したがって、このようなストキャスティック　ペプタイドまたは蛋白質が有するところの能力であって、それらの間で相互作用を行いそしてそれによってそれらの間のコンホーメーション、構造又は機能を修飾改変する能力を、選択（又はスクリーニング）することが可能となるのである。同じ様にして、これらのペプタイド及び蛋白質が有する能力であって、それらの間で、加水分解、縮合、トランスペプチド作用又はその他ぺプタイドを修飾する反応を触媒する能力、を選択（又はスクリーニング）することも可能である。例えば、ひき続いて、ストキャスティック　ペプタイド及び蛋白質のセットの少なくとも１つのメンバーによって、ある与えられたストキャスティック　ペプタイドの加水分解をひき続き行うことができ、そして、与えられた蛋白質の放射活性標識化を行い、続いてストキャスティック蛋白質混合物と共に、Ｍｇ、Ｃａ、Ｚｎ、Ｆｅといったイオン及びＡＴＰ又はＧＴＰの存在下でインキュベー卜して、その測定を行うことができる。そこで、マークした蛋白質の放射活性フラグメントの出現を、既述したようにして測定するのである。この反応を触媒する１又はそれ以上のストキャスティック蛋白質は、上述したように、それらを生成する遺伝子にそって、形質転換クローンのライブラリー（ｌｉｂｒａｒｙ）の逐次消失（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ　ｄｉｍｉｎｕｔｉｏｎ）を行うことによって、再度単離することができる。
【０１０６】
　この手法は、ストキャスティック　ペプタイド及びポリペプタイドの総体の選定にまで広げられるが、これらのペプタイド類は、最初の建築ブロック（アミノ酸及び小さなペプチド）からセットのペプチドまたはポリペプチドヘ至る１セッ卜の反応を触媒しうるものである。したがって、それ自身を合成し得る総体を選択することもできるのである；このような再帰的自己触媒反応のセットは、反応生成物はコンスタン卜に希釈するが建築ブロックの濃度は一定に維持するケモスタット（ｃｈｅｍｏｓｔａｔ）において、確立することができる。二者択一的に、標準法によりリポソーム内にペプタイドの複合セットを封入することによって、上記のようなセットの合成が促進助長される。このようなリポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）の周囲の高張水雰囲気では、より大きな蛋白質を形成する縮合反応によれば、リポソーム内の滲透圧が低下して、この縮合反応によって生成した水分子をリポソーム外へと追い出し、そのためにより大きなポリマーの合成がうまくいくのである。このような自己触媒反応の総体の存在は、２次元ゲル電気泳動とＨＰＬＣによって、ペプチドとポリペプチドとが安定な分布でもって合成されるのを見て、これを確認することができる。反応量の適量は、使用する分子種の数とペプチド結合が加水分解される以上にペプチド結合をうまく形成するのに必要な濃度と、によってきまってくる。自巳触媒反応の総体（ａｕｔｏｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｅｎｓｅｍｂｌｅ）の分子種の分布は、異なった自己触媒反応の総体の出現により、自由に変えたり変化させたりする。自己触媒反応のセットを構成するペプタイド及びポリペプタイドは、（本発明に係る手法によって与えられたようにコード化されたペプチド及びポリペプチドからなる）大きな最初の総体と共通するあるエレメントを有してもよいが、また、最初の総体をコーディングするストキャスティック遺伝子の総体によってコード化されるものではないところの、ペプチド及びポリペプチドを含有することもできる。
【０１０７】
　このような自己触媒反応のセットを確立するのにその生産物が必要とされるところの、ストキャスティック遺伝子のセットは、既述したように、形質転換クローンのライブラリーの逐次消失によって、これを単離することができる。また、ストキャスティック遺伝子によって最初にコード化されそして自己触媒反応のセット内で連続的に合成されたコード化ぺプタイドを、自己触媒反応のセットは含むこともできる。ペプチド及び蛋白質のコード化されたこのサブセットを単離するために、自己触媒反応のセット（ａｕｔｏｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｓｅｔ）を使用して、動物の免疫を通し、自己触媒反応のセットを構成する非常に数多くの構成成分を認識するポリクローナル血清を得ることができる。
【０１０８】
　これらの血清は、ストキャスティック遺伝子ライブラリーのスクリーニングに利用することができ、血清中に存在する抗体と結合しうる蛋白質を発現するこれらの遺伝子を発見することができる。
【０１０９】
　このストキャスティック遺伝子のセットは、ストキャスティック　セットの中に存続しているコード化されたストキャスティック蛋白質を、非常に数多く発現するものである。このような自己触媒反応セットのコード化された構成々分の残りの部分は、ストキャスティック遺伝子ライブラリーの逐次消失によって、これを単離することができるが、該ライブラリーから、免疫法によって検出されたサブセットを、はじめに除去しておく。
【０１１０】
　記述したところによって得た、このようなペプタイド及び蛋白質の自己触媒反応セットには、実用的な応用を数多く見出すことが可能である。
【０１１１】
　なお、本発明の他の実施の態様は、以下のとおりである。
【０１１２】
　１．生物学的手段によってペプタイドまたはポリペプタイドを製造するための方法であって、少なくとも部分的にはストキャスティック合成ポリヌクレオチドからなる遺伝子を、１つの共通の培地内で同時に作成し；このようにして得た遺伝子を宿主細胞内に導入し；ストキャスティック遺伝子をクローニングしそしてこれらのストキャスティック遺伝子の各々によって発現される蛋白質の製造に至るよう、これらの遺伝子を含有する形質転換宿主細胞の独立クローンを同時に培養し；特定された性質を少なくとも１つ有するペプタイドまたはポリペプタイドを生産するこれらのクローンを確認するよう、形質転換されたこのようなクローンについて、スクリーニング及び／又は選択を行い；このようにして確認したクローンを単離し、次いで、該性質を有する少なくとも１つのペプタイドまたはポリペプタイドを生産するように、該クローンを生長させること、を特徴とする方法。
【０１１３】
　２．実施態様第１項において、該遺伝子は次のようにして製造することを特徴とする方法：予じめ直線化した１つの発現ベクターの２つの末端からはじめて、４つのタイプのデオキシホスホヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ及びＴをストキャスティック共重合させることによリ；次いで、それらの３’末端が相補的であるところの２つのストキャスティック配列を有する発現ベクター１分子によって構成されるストキャスティック第１ＤＮＡ鎖を創製するよう、コヘッシブ−エンドを形成することにより；そしてひき続いて第２のストキャスティックＤＮＡ鎖を合成せしめることによって；製造する方法。
【０１１４】
　３．実施態様第１項において、ストキャスティックＤＮＡフラグメントを生成するよう、コヘッシブ−エンドを有しない２本鎖オリゴヌクレオチドをストキャスティック共重合せしめることにより；ひき続いて、予じめ直線状とした１つの発現ベクター内にこれらのフラグメントを連結するとによって；該遺伝子を製造する方法。
【０１１５】
　４．実施態様第２項又は第３項において、発現ベクターがプラスミドであること、を特徴とする同項記載の方法。
【０１１６】
　５．実施態様第４項において、発現ベクターがｐＵＣ８であること、を特徴とする同項記載の方法。
【０１１７】
　６．実施態様第２項又は第３項において、発現ベクターがウィルスＤＮＡの断片であること、を特徴とする同項記載の方法。
【０１１８】
　７．実施態様第２項又は第３項において、発現ベクターがプラスミドとウィルスＤＮＡとのハイブリッドであること、を特徴とする同項記載の方法。
【０１１９】
　８．実施態様第１項〜第６項において、宿主細胞が原核細胞であること、を特徴とする同項記載の方法。
【０１２０】
　９．実施態様第１項〜第７項において、宿主細胞が真正核細胞であること、を特徴とする同項記載の方法。
【０１２１】
　１０．実施態様第８項において、該細胞がＨＢ１０１及びＣ６００から選ばれること、を特徴とする同項記載の方法。
【０１２２】
　１１．実施態様第３項において、オリゴヌクレオチドか１群のパルインドロミックオクタマーを形成すること、を特徴とする同項記載の方法。
【０１２３】
　１２．実施態様第１１項において、回帰性オクタマーの該グループが次のグループであること、を特徴とする同項記載の方法：
５’ＧＧＡＡＴＴＣＣ　３’
５’ＧＧＴＣＧＡＣＣ　３’
５’ＣＡＡＧＣＴＴＧ　３’
５’ＣＣＡＴＡＴＧＧ　３’
５’ＣＡＴＣＧＡＴＧ　３’。
【０１２４】
　１３．実施態様第３項において、オリゴヌクレオチドが１群の回帰性ヘプタマーを生成すること、を特徴とする同項記載の方法。
【０１２５】
　１４．実施態様第１３項において、パリンドロミック　ヘプタマーの該グループが次のグループであること、を特徴とする同項記載の方法：
５’ＸＴＣＧＣＧＡ　３’
５’ＸＣＴＧＣＡＧ　３’
５’ＲＧＧＴＡＣＣ　３’
式中、Ｘ＝Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴそしてＲ＝Ａ又はＴ。
【０１２６】
　１５．実施態様第４項、及び実施態様第１２項又は第１４項のいずれか１項において、実施態様第１１項又は第１３項に特定した方法にしたがって得た形質転換された宿主細胞のインデペンデント　クローンの培養物から誘導したトランスフォーミングＤＮＡを、先ず最初に、分離、精製し；次いで、これら回帰性オクタマーまたはヘプタマー中には存在するけれども使用した発現ベクターには存在しない特定の制限部位に対応する少なくとも１つの制限酵素を用いて、該精製されたＤＮＡを切断し；しかる後に、新規なストキャスティック　シーケンスを有するＤＮＡの新規アンサンブルを創製するよう、上記によって得た線状ストキャスティックＤＮＡ断片のアンサンブル（ｅｎｓｅｍｂｌｅ）を、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼによって同時に処理し；この新規なトランスフォーミングＤＮＡのアンサンブルを用いて、宿主細胞の形質転換とこのような遺伝子のクローニングを行い；そして最後に、スクリーニング及び／又は選択を行い、そして形質転換された細胞の新しいクローンを単離し；そして、これらを生長せしめて、希望する性質を有するペプタイドまたはポリペプタイドを少なくとも１つ製造すること、を特徴とする同項記載の方法。
【０１２７】
　１６．実施態様第１項において、該性質がある与えられた化学反応を触媒し得る能力であること、を特徴とする同項記載の方法。
【０１２８】
　１７．実施態様第１項において、該性質が、ある与えられた最初の化合物グループから少なくとも１つのターゲット化合物へと至る１つの反応連鎖を触媒し得る能力であること、を特徴とする同項記載のいくつかのペプタイド及び／又はポリペプタイドを製造するための方法。
【０１２９】
　１８．実施態様第１６項に記載された、再帰的自己触媒性の（ｒｅｆｌｅｘｉｖｅ１ｙ　ａｕｔｏｃａｔａｌｙｔｉｃ）ペプタイド及び／又はポリペプタイドの１つ以上からなるアンサンブル（ｅｎｓｅｍｂｌｅ）を製造するための方法であって、該性質が、アミノ酸及び／又はオリゴペプタイドを出発原料として該アンサンブルそれ自体を合成する能力であること、を特傲とする同項記載の方法。
【０１３０】
　１９．実施態様第１項において、該性質が、ある与えられた化合物の化学的及び／又は生物学的性質を選択的に修正し得る能力であること、を特傲とする同項記載の方法。
【０１３１】
　２０．実施態様第１９項において、該性質が、あるポリペプタイドの触媒活性を選択的に修飾し得る能力であること、を特徴とする同項記載の方法。
【０１３２】
　２１．実施態様第１９項において、該性質が、少なくとも１つの生物学的活性化合物の少なくとも１つの生物学的機能をシミュレートしまたはモディファイし得る能力であること、を特徴とする同項記載の方法。
【０１３３】
　２２．実施態様第２１項において、該生物学活性化合物は、ホルモン、神経伝播体、ゆ着又は生長因子、及び、ＤＮＡの複製及び／又は転写の特異的レギュレータ、及び／又はＲＮＡの翻訳の特異的レギュレータから選択すること、を特徴とする同項記載の方法。
【０１３４】
　２３．実施態様第１項において、該性質が、与えられたリガンドに結合し得る能力であること、を特徴とする同項記載の方法。
【０１３５】
　２４．実施態様第２３項に記載した方法によって得たペプタイドまたはポリペプタイドの、リガンドの検出及び／又はタイトレーションのための利用。
【０１３６】
　２５．実施態様第１項において、該性質が、ある与えられた抗体の抗原のエピトープの１つに類似したエピトープを少なくとも１つ有すること、を特徴とする同項記載の方法。
【０１３７】
　２６．実施態様第１９項及び第２５項において、該性質が、生物学的活性分子の効果をシミュレート又は修飾する能力であり、そして、この性質を有するペプタイドまたはポリペプタイドを少なくとも１つ製造するところの形質転換宿主細胞のクローンのスクリーニング及び／又は選択は、次のようにして行う、すなわち、該分子に対する抗体を調製しそしてこのようにして得たこれらの抗体を利用してこれらのペプタイドまたはポリペプタイドを含有するクローンを確認し、次に、このようにして確認したクローンを生長せしめ、そしてこれらのクローンによって製造されたペプタイドまたばポリペプタイドを分離、精製し、そして最後に、この（これらの）ペプタイド又はポリペプタイドを、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでアッセイにかけて、それが該分子の効果をシミュレートまたは修飾する能力を有することを確認することにより、上記スクリーニング及び／又は選択を行うこと、を特徴とする同項記載の方法。
【０１３８】
　２７．実施態様第１項又は第２６項に係る方法によって取得され、薬学的及び／又は化学療法的作用を有する活性物質として利用することができる、ペプタイドまたはポリペプタイド。
【０１３９】
　２８．実施態様第２５項に係る方法によって取得されたペプタイドまたはポリペプタイドであって、該抗原に対して特異的な遊離抗体とこれらのペプタイドまたはポリペプタイドとの間で結合を形成せしめることによって、これら遊離の抗体の濃度をｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｉｎ　ｖｉｖｏで減少せしめるのに利用することができる、ペプタイドまたはポリペプタイド。
【０１４０】
　２９．免疫学的過感作性を抑制する剤として利用することができる、実施態様第２７項又は第２８項に係るペプタイドまたはポリペプタイド。
【０１４１】
　３０．実施態様第２５項に係る方法によって取得され、該抗原に関する耐性を創製する剤として利用することができるペプタイドまたはポリペプタイド。
【０１４２】
　３１．実施態様第２５項において、抗原がＥＧＦであることを特徴とする同項記載の方法。
【０１４３】
　３２．実施態様第３１項に係る方法によって取得され、エピテリオマス（ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｍａｓ）の化学療法的処置のために利用することができるペプタイドまたはポリペプタイド。
【０１４４】
　３３．実施態様第１項において、希望する性質を有するペプタイドまたはポリペプタイドを生産する形質転換宿主細胞のクローンについて、ＤＮＡハイブリッドの天然のフラグメントによって発現される１つの蛋白質に対応する抗体上で親和クロマトグラフィー処理することにより、該クローンを、確認しそして分離すること、を特徴とする同項記載の方法。
【０１４５】
　３４．実施態様第３３項において、ＤＮＡハイブリッドの天然フラグメントがβーガラクトシダーゼ発現遺伝子を含有し、そして、抗ーβ−ガラクトシダーゼ抗体を用いるアフィニティ　クロマトグラフィーによって、形質転換宿主細胞の該クローンを確認しそして単離すること、を特徴とする同項記載の方法。
【０１４６】
　３５．実施態様第１項又は第３４項において、ハイブリッド　ペプタイドまたはポリペプタイドの発現と精製を行った後に、新規フラグメントを分離しそして単離すること、を特徴とする同項記載の方法。
【０１４７】
　３６．実施態様第２５項又は第２６項に係る方法を、ワクチンの調製に応用することであって、病原剤（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ａｇｅｎｔ）に対する抗体を取得し、そして、病原剤のエピトープの１つに類似したエピトープを少なくとも１つ有する少なくとも１つの蛋白質を生産するこれらのクローンを確認するために、該抗体を使用し；形質転換宿主細胞の対応するクローンを、この蛋白質を生産するように、生長せしめ；この蛋白質を、細胞クローンの培養物（ｃｕｌｔｕｒｅ）から単離、精製し；そして、この蛋白質を、病原剤に対するワクチンの製造のために使用すること、を特徴とする同項記載の方法の応用。
【０１４８】
　３７．実施態様第３６項に係る、抗ＨＶＢワクチンの調製のための応用であって、ＨＶＢウィルスの少なくとも１つのカプシド蛋白質（ｃａｐｓｉｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を抽出、精製し；この蛋白質を、この蛋白質に対する抗体を形成しうる動物の体内に注入し；これらの抗体を回収、精製し；これらの抗体を用いて、ＨＶＢウィルスのエピトープの１つに似た少なくとも１つのエピトープを有する少なくとも１つの蛋白質を製造するこれらのクローンを確認し；この蛋白質を産生するよう、これらのクローンに対応する形質転換宿主細胞のクローンを生育せしめ；宿主細胞のこれら培養物から、この蛋白質を単離、精製し；そして、抗−ＨＶＢワクチン製造のために、この蛋白質を使用すること、を特徴とする同項記載の応用。
【０１４９】
　３８．実施態様第１項において、宿主細胞が、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）タイプのバクテリアから成るものであるが、そのゲノムには天然のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子もＥＢＧ遺伝子も含まれていない、つまり、Ｚ−，ＥＢＧ−Ｅ．ｃｏｌｉから成るものであり；インデューサ（ｉｎｄｕｃｅｒ）ＩＰＴＧをも含有するＸ−ｇａｌ培地中で、これらの形質転換宿主細胞を培養し；β−ガラクトシダーゼ機能に対して陽性であるところのクローンを、培地中で検出し；しかる後に、β−ガラクトシダーゼ機能を備えたペプタイド、ポリペプタイド又は蛋白質の少なくとも１つを工業的に製造するのに適した宿主細胞クローンに、このＤＮＡを移入（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）すること、を特徴とする同項記載の方法。
【０１５０】
　３９．実施態様第１項において、該性質が、ある与えられた化合物に結合する能力であること、を特徴とする同項記載の方法。
【０１５１】
　４０．実施態様第３９項において、該化合物が、ペプタイド、ポリペプタイド及び蛋白質の中から選択されるものであること、を特徴とする同項記載の方法。
【０１５２】
　４１．実施態様第４０項において、該蛋白質が、ＤＮＡの転写活性又は複製を調節する（ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ）蛋白質であること、を特徴とする同項記載の方法。
【０１５３】
　４２．実施態様第３９項において、該化合物が、ＤＮＡ及びＲＮＡ配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）から選択されるものであること、を特徴とする同項記載の方法。
【０１５４】
　４３．実施態様第４０項又は第４２項に記載の方法によって得られた蛋白質。
【０１５５】
　４４．ＤＮＡを製造するための方法であって、少なくとも一部分はストキャスティック合成（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）ポリヌクレオチドからなる遺伝子を、同一培地中で製造し；形質転換された宿主細胞のある総体（ｅｎｓｅｍｂｌｅ）を製造するよう、上記により製造した遺伝子を宿主細胞内に導入し；このようにして製造した宿主細胞の独立クローン（ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｌｏｎｅ）を製造するよう、これらを生育せしめ；少なくとも１つの希望する性質を有するこれらＤＮＡのストキャスティック配列（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を含むこれら宿主細胞を確認する（ｉｄｅｎｔｉｆｙ）よう、この総体について、スクリーニング及び／又は選定を行い；そして、確認された宿主細胞培養物から、このようなＤＮＡを単離すること、を特徴とする方法。
【０１５６】
　４５．講求の範囲第４４項において、該性質が、与えられた化合物に結合する能力であること、を特徴とする同項記載の方法。
【０１５７】
　４６．実施態様第４５項において、該化合物が、ペプタイド、ポリペプタイド及び蛋白質の中から選択するものであること、を特徴とする同項記載の方法。
【０１５８】
　４７．実施態様第４５項において、該化合物が、ＤＮＡの転写活性又は複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を調節する化合物であること、を特徴とする同項記載の方法。
【０１５９】
　４８．実施態様第４７項において、該化合物が、ＤＮＡの転写又は複写をコントロールする調節蛋白質であること、を特徴とする同項記載の方法。
【０１６０】
　４９．実施態様第４６項又は第４７項に係る方法によって取得されたＤＮＡ配列の利用であって、近隣ＤＮＡ配列（ｎｅｉｇｈｂｏｒｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＤＮＡ）の複製又は転写のシス−調節配列（ｃｉｓ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）としての、利用。
【０１６１】
　５０．実施態様第４２項において、取得された蛋白質が、ＤＮＡの転写活性、複製、又は安定性を修飾する能力を有すること、を特徴とする同項記載の方法。
【０１６２】
　５１．実施態様第４８項に係る方法によって取得した蛋白質の利用であって、このＤＮＡ配列を含有しそしてこの蛋白質を発現する細胞内でのＤＮＡ配列の転写、複製、又は安定性を修飾するための、利用。
【０１６３】
　５２．ＲＮＡを製造するための方法であって、少なくとも一部分はストキャスティック合成ポリヌクレオチドからなる遺伝子を、同一培地中で同時に製造し；このようにして得た遺伝子を宿主細胞内に導入して、形質転換宿主細胞の総体を製造し；このようにして製造した形質転換宿主細胞のインデペンデント　クローンを、同時に生育せめ；この総体についてスクリーニング及び／又は選択を行って、希望する性質を少なくとも１つ有するＲＮＡのストキャスティック　シーケンスを含有する宿主細胞を確認し；そして、このようにして確認した宿主細胞のカルチヤーから、ＲＮＡを単離すること、を特徴とする方法。
【０１６４】
　５３．実施態様第５２項において、該性質が、ある与えられた化合物に結合する能力であること、を特徴とする同項記載の方法。
【０１６５】
　５４．実施態様第５２項において、該性質が、ある与えられた化学反応を触媒する能力（ｃａｐａｃｉｔｙ）であること、を特徴とする同項記載の方法。
【０１６６】
　５５．実施態様第５２項において、該性質がトランスファＲＮＡであること、を特徴とする同項記載の方法。