(57)【要約】【課題】本発明は、皮膚におけるＩＶ型および／またはＶＩＩ　型コラーゲンの産生を促進することで、皮膚基底膜構造の正常化または機能・構造の維持を図る基底膜ケア薬剤を提供することを課題とする。【解決手段】加水分解カゼイン、プレエキス、ブナの芽エキス、エリスリナエキス、可溶性卵殻膜、カッコンエキスおよび西洋キヅタエキスよりなる群から選ばれる一種または二種以上を有効成分とする、ＩＶ型および／またはＶＩＩ　型コラーゲンのコラーゲンの産生促進剤を提供する。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
加水分解カゼイン、ブナの芽エキス、可溶性卵殻膜、カッコンエキスおよび西洋キヅタエキスよりなる群から選ばれる一種または二種以上を有効成分とする、ＩＶ型およびＶＩＩ　型コラーゲンの産生促進剤。
【請求項２】
加水分解カゼイン、プレエキス、ブナの芽エキス、エリスリナエキス、可溶性卵殻膜、カッコンエキスおよび西洋キヅタエキスよりなる群から選ばれる一種または二種以上を有効成分とする、ＩＶ型コラーゲンの産生促進剤。
【請求項３】
加水分解カゼイン、ブナの芽エキス、可溶性卵殻膜、カッコンエキスおよび西洋キヅタエキスよりなる群から選ばれる一種または二種以上を有効成分とする、ＶＩＩ　型コラーゲンの産生促進剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載のコラーゲンの産生促進剤を含んでなる、皮膚基底膜ケア用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はコラーゲン産生促進剤、詳しくは表皮基底膜の主要構成成分であるＩＶ型コラーゲンおよびＶＩＩ　型コラーゲンの産生促進剤に関する。さらには、基底膜構造を良い状態に保つことによって、老化防止効果を奏する基底膜ケア用組成物を提供することに関する。皮膚基底膜ケア用組成物とは皮膚基底膜をケアすることによって皮膚のシワ形成を抑制し、皮膚のハリや弾力を維持し、若々しい肌の状態を維持する皮膚外用剤である。
【０００２】
【従来の技術】
皮膚の構造は大きく分けて角層、表皮、基底膜、真皮、皮下組織からなる。基底膜は表皮と真皮の境界部に存在し、その機能は、多岐にわたり、表皮の真皮への接着、表皮の極性の決定、表皮の分化・増殖の制御、さらには真皮の細胞が産生する因子や血成分由来の栄養供給の制御に関与している。そのため、表皮基底膜は皮膚の構造、恒常性の維持にとってきわめて重要な役割を果たしている。この表皮基底膜は、皮膚老化に伴い多重化、断裂などの構造異常を示すことが報告されている（Ｌａｖｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　Ｄｅｒｍａｔｏｌ．　１９７９　７３：　５９−６６）。したがって表皮基底膜の構造変化が、しわ、たるみなどの老徴の発現、老化に伴う皮膚機能低下の一因となっていると考えられている。実際、皮膚基底膜構造を詳細に観察すると、２０代後半から３０代前にかけて基底膜ダメージが高頻度に観察されるようになり、皮膚老化の誘導に重要な役割を示している　（ＩＦＳＣＣ　Ｍａｇａｚｉｎｅ，　２０００　４（４）：１５−２３）。したがって、表皮基底膜の構造を良い状態に保つことが、皮膚の健康、将来の老化を防止するという点からも重要であることより、新たなスキンケアとして皮膚基底膜ケアの重要性が提唱されている。
【０００３】
基底膜の主要な構成成分にはラミニン５、ＩＶ型コラーゲン、ＶＩＩ　型コラーゲンなどがある。このうちラミニン５については、本発明者らが既に着目しており、ラミニン５の産生能を高める薬剤として、大豆由来の調製物やリゾフォスファチジルコリン、リゾフォスファチジン酸等を見出した（特開平１１−３４３２２６号、特開２０００−２２６３０８号公報）。
【０００４】
本発明は、基底膜ケアをさらに進歩させるため、ラミニン５とともに、基底膜の主要構成成分であるＩＶ型コラーゲン、ＶＩＩ　型コラーゲンに着目したものである。
【０００５】
ＩＶ型コラーゲンは基底膜の骨格を形成し、ナイトジェンを介してラミニン複合体と相互作用している。ＶＩＩ　型コラーゲンは、基底膜を真皮につなぎとめる働きをし、皮膚構造を強固にしている。詳しくは、ＶＩＩ　型コラーゲンが形成するアンカリング線維が基底膜のラミナデンサから発し、真皮中のコラーゲン線維（Ｉ型、ＩＩＩ　型、Ｖ型コラーゲンからなる）と相互作用し、再度のラミナデンサに結合することによって、基底膜と真皮の結合を強固なものにしている。
【０００６】
ＩＶ型コラーゲンについては、加齢と共に基底膜中で低下することが観察されている（Ｖａｚｑｕｅｚ　Ｆ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍａｔｕｒｉｔａｓ　１９９６，　２５：　２０９−２１５）。したがって、表皮基底膜中のＩＶ型コラーゲンの発現促進は皮膚老化の防止において重要な役割を担うと考えられる。
【０００７】
また、ＶＩＩ　型コラーゲンにおいても、高齢者由来の皮膚線維芽細胞が若い人由来の皮膚線維芽細胞に比べて、タンパク質レベルおよびｍＲＮＡレベルで産生能が低下するとの報告　（Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，　１０２：２０５−２０９，　１９９４）がある。また、ＶＩＩ　型コラーゲンにより構成されるアンカリング線維は、正常皮膚において生理的老化および光老化に伴い減少するとの報告もある（辻卓夫、日皮会誌　１０５：９６３−９７５，　１９９５，　Ｔｉｄｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｉｎｖｅｓｔ　Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，　８３：４４８−４５３，　１９８４）。しわ改善効果についてよく知られているレチノイン酸をＵＶ傷害皮膚に連続塗布すると、アンカリング線維の数が有意に増加すると報告されていることより　（Ｗｏｏｄｌｅｙ，　ＪＡＭＡ，　２６３：３０５７−３０５９，　１９９０）、アンカリング線維の増加はしわ等の老化現象の改善に関与している可能性が示唆されている。
【０００８】
以上のことから、基底膜骨格を形成するＩＶ型コラーゲン、表皮と真皮を結合させているアンカリング線維の主構成成分であるＶＩＩ　型コラーゲンの産生を促進することは、若齢時のような健康で若々しい皮膚を維持するために重要な成分であると考えられる。
【０００９】
ＩＶ型およびＶＩＩ　型コラーゲン産生制御因子のスクリーニング方法については、本発明者らが、簡易スクリーニング法を開発している（特願２００１−６３７４９）。この方法では、ＩＶ型およびＶＩＩ　型コラーゲン産生を促進する薬剤をスクリーニングすることが可能となっている。
【００１０】
これまで、コラーゲン産生の促進剤に関して検討されてきているが、これらの検討は、すべて対象を真皮の主要構成成分であり、かつ、線維性のコラーゲンであるＩ型またはＩＩＩ型コラーゲンであり、同じコラーゲンとして分類される本発明が対象とするＩＶ型、ＶＩＩ型コラーゲンとは、その分子構造、遺伝子、その産生制御が全く異なっている。事実、Ｉ、ＩＩＩ型コラーゲンは表皮ケラチノサイトでは産生されないが、ＩＶ型、ＶＩＩ型コラーゲンはケラチノサイトで産生されるコラーゲンである。すなわち、それぞれのコラーゲンの産生制御機構は異なっており、過去にコラーゲン産生促進作用を示すと報告されたものでも、ＩＶ型、ＶＩＩ型コラーゲン産生効果について検討したが、ほとんどのものが無効であった。したがって、ここで述べるＩＶ型、ＶＩＩ型コラーゲン産生促進剤は、特異的なスクリーング法を用いてはじめて見出されたものである。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、皮膚におけるＩＶ型およびＶＩＩ　型コラーゲンの産生を促進することで、皮膚基底膜構造の正常化または機能・構造の維持を図る基底膜ケア薬剤を提供することにある。さらに、ラミニン５産生促進剤単独での基底膜ケアに追加して、ＩＶ型、ＶＩＩ　型コラーゲン産生促進剤を付加することによって基底膜ケア効果を高めることにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは多種多様の物質についてＩＶ型コラーゲンおよびＶＩＩ　型コラーゲンの産生能の増強作用について検討してきた。その結果、ＩＶ型コラーゲンとＶＩＩ　型コラーゲンを同時に産生促進する薬剤、ＩＶ型コラーゲンの産生を促進する薬剤、ＶＩＩ　型コラーゲンの産生を促進する薬剤を見出した。
【００１３】
ＩＶ型コラーゲンとＶＩＩ　型コラーゲンを同時に産生促進する薬剤としては、加水分解カゼイン、ブナの芽、可溶性卵殻膜、カッコン、西洋キヅタよりなる群から選ばれる植物及び動物由来の抽出物の一種または二種以上を有効成分とする皮膚外用剤が提供される。
【００１４】
ＩＶ型コラーゲンの産生促進剤としては、加水分解カゼイン、｛プレ（一般名　Ｐｕｌｅ、学名　Ａｌｓｔｏｎｉａ　ｓｃｈｏｌａｒｉｓ、キョウチクトウ科の生薬）、ブナの芽、エリスリナ（一般名　ａｍａｓｓｉｓａ、学名　ｅｒｙｔｒｉｎａ　ｓｐ．、マメ科の生薬）、可溶性卵殻膜、カッコン、西洋キヅタよりなる群から選ばれる植物及び動物由来の抽出物の一種または二種以上を有効成分とする皮膚外用剤が提供される。
【００１５】
ＶＩＩ型コラーゲンの産生促進剤としては、ブナの芽、加水分解カゼイン、カッコン、可溶性卵殻膜、西洋キヅタよりなる群から選ばれる植物及び動物の抽出物の一種または二種以上を有効成分とする皮膚外用剤が提供される。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明の、ＩＶ型コラーゲンおよびＶＩＩ　型コラーゲンの産生促進効果がある基底膜ケア用組成物に用いる有効成分は具体的には以下のとおりである。
【００１７】
「加水分解カゼイン」とは、カゼインタンパクを加水分解して得れらる薬剤である。本発明で用いられる「加水分解カゼイン」は市販のものであってもよく、例えば牛乳カゼインタンパクを加水分解して製造されるプロモイスミルク（成和化成株式会社製商品名）が挙げられる。
【００１８】
「プレ（Ｐｕｌｅ）」とは、キョウチクトウ科　Ａｌｓｔｏｎｉａ　ｓｃｈｏｌａｒｉｓ．であり、東南アジア原産の常緑樹である。本発明に用いられる「プレエキス」には、好ましくは樹皮から抽出したエキスを用いる。
【００１９】
「ブナの芽」とは、ブナ科ブナ属植物の木の芽である。別名シロブナ、ホンブナ、ソバグリ等の名称で呼ばれるブナ科ブナ属ブナ（Ｆａｇｕｓ　ｃｒｅｎａｔａ　Ｂｌｕｍｅ）、同科同属クロブナ（Ｆａｇｕｓ　ｊａｐｏｎｉｋａ　Ｍａｘｉｍ）、同科同属アメリカブナ（Ｆａｇｕｓ　ｇｒａｎｄｉｆｏｌｉａ）、同科同属ヨーロッパブナ（Ｆａｇｕｓ　ｓｙｌｖａｔｉｃａ　Ｌ．）、同科同属シダレブナ（Ｆａｇｕｓ　ｓｙｌｖａｔｉｃａ　Ｌ．ｖａｒ．　ｐｅｎｄｕｌａ）、同科同属ムラサキブナ（Ｆａｇｕｓ　ｓｙｌｖａｔｉｃａ　Ｌ．ｖａｒ．　ｐｕｒｐｕｒｅａ）、または同科同属オリエントブナ（Ｆａｇｕｓ　ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓＬｉｐｓｋｙ）等の芽を、１種または２種以上を混合したものから抽出して「ブナの芽エキス」が得られる。本発明に用いられるブナ属植物の木の芽は、芽の部分であればその有効性が認められるが、好ましくは幼芽を用いた方が有効性は高い。本発明で用いられる「ブナの芽エキス」は市販のものであってもよく、例えばＧＡＴＵＬＩＮＥ　ＲＣ（池田物産株式会社製商品名）が挙げられる。
【００２０】
「エリスリナ」とは、マメ科　ｅｒｙｔｒｉｎａ　ｓｐ．であり、高原、湿地などに自生する植物である。本発明に用いられる「エリスリナエキス」には、好ましくは葉から抽出したエキスを用いる。
【００２１】
「可溶性卵殻膜」とは、鶏の卵の卵殻膜を加水分解抽出して得られる可溶性卵殻膜ケラチンを含む薬剤である。本発明で用いられる「可溶性卵殻膜」は市販のものであってもよく、例えば卵殻膜ケラチン加水分解物（キューピー株式会社製商品名）が挙げられる。
【００２２】
「カッコン」とは、マメ科　クズ「Ｐｕｅｒａｒｉａ　ｈｉｒｓｕｔａ　Ｍａｔｓｕｍｕｒａ」（またはマメ科　Ｐｕｅｒａｒｉａ　ｌｏｂａｔａ　Ｏｈｗｉ、マメ科　Ｐｕｅｒａｒｉａ　ｔｈｕｎｂｅｒｇｉａｎａ　Ｂｅｎｔｈ．）である。この貯蔵根を細切断し乾燥した後、「カッコンエキス」を得る。漢方では下熱、鎮痙に効果があるとされている。また、ラミニン５の産生促進効果があることも確認されている（特願平２００１−２５０２９５）。本発明で用いられる「カッコンエキス」は市販のものであってもよく、例えばファルコレックス　カッコン　Ｂ（一丸ファルコス株式会社製商品名）が挙げられる。
【００２３】
「西洋キヅタ」ウコギ科　Ｈｅｄｅｒａ　ｈｅｌｉｘ　（一般名　アイビー）であり、常緑つる性の低木である。本発明に用いられる「西洋キヅタエキス」には、好ましくは葉から抽出したエキスを用いる。また本発明で用いられる「西洋キヅタエキス」は市販のものであってもよく、例えばコスメレン・セイヨウキズタエキス（日光ケミカルズ株式会社製商品名）が挙げられる。
【００２４】
上記植物のエキスは、通常公知の方法により、それぞれの原料植物から、抽出することにより製造したものである。すなわち、原料植物を、生のまま、又は必要により乾燥した後、そのまま若しくは粉砕して、抽出溶媒と共に浸漬または加熱還流した後、濾過し、濃縮して得られる。この際、用いられる抽出溶媒は、通常、植物抽出物の抽出用に用いられている溶媒であれば何でもよい。例えば、熱水、低級アルコール（メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブタノール等）、多価アルコール（プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等）、これらのアルコール類の含水物、炭化水素系溶媒（ｎ−ヘキサン、トルエン等）、クロロホルム、ジクロルエタン、四塩化炭素、酢酸エチルエステル、エーテル等、あるいはこれらの混合物等の有機溶媒を挙げることができる。本発明における抽出物の配合量は、外用剤全量中、乾燥物として０．０００２〜２０．０重量％、好ましくは０．００１〜１．０重量％である。０．０００２重量％未満であると、本発明でいう効果が十分に発揮されず、２０．０重量％を超えると製剤化が難しいので好ましくない。
【００２５】
本発明の皮膚外用剤には、上記必須成分以外に、通常化粧品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば、美白剤、保湿剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００２６】
本発明皮膚外用剤が採り得る剤型や用途は、特に限定されるものではなく、例えば、水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系等の剤型で用いることができる。また、本発明の皮膚外用剤の用途は、化粧水，乳液，クリーム，パック等の基礎化粧料、口紅，アイシャドー，ファンデーション等のメーキャップ化粧料、シャンプー，リンス，ヘアトニック等の頭髪化粧料、ボディー化粧料、芳香化粧料、洗浄料等の他、軟膏等の形態で用いる医薬品や医薬部外品等、多岐にわたり用いることが可能である。
【００２７】
【実施例】
以下、具体例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。
ＩＶ型、ＶＩＩ　型コラーゲンの産生能の測定試験
（１）　ヒト線維芽細胞の培養
ヒト線維芽細胞は新生児包皮より単離し、１０％胎児牛血清（ＦＢＳ）含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　（ＤＭＥＭ）で培養した。トリプシン−エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）処理によって接着細胞を浮遊させ、ろ過して均一な細胞懸濁液を得た。遠心分離によって細胞を集め２５０μＭ　（アスコルビン酸グルコシド）ＡＡ２Ｇ−０．２５％ＦＢＳ−ＤＭＥＭに２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるよう懸濁した（ここでは、アスコルビン酸グルコシドを用いたが、アスコルビン酸に関しては、アスコルビン酸そのもの、アスコルビン酸リン酸エステルなどの誘導体も使用可能である）。細胞懸濁液０．５ｍＬずつ２４穴プレートに播種し、細胞が接着した後、植物、動物由来の抽出物を添加した。３７℃にて４８時間培養した後、培養上清を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を新たなチューブに得た。−２０℃に保存し、後日コラーゲン濃度を測定した。細胞内および固相に残存したコラーゲンは、培養上清回収後のプレートに界面活性剤を含むトリス塩酸緩衝液を添加し、凍結後、再溶解して回収した。
【００２８】
（２）　サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるＩＶ型、ＶＩＩ型コラーゲンの測定
培養上清、細胞層に存在するＩＶ型、ＶＩＩ型コラーゲンは、本発明者らが開発したサンドイッチＥＬＩＳＡ法（特願２００１−６３７４９）によって測定した。ＶＩＩ　型コラーゲン及びＩＶ型コラーゲンに対する抗体は精製ＶＩＩ　型コラーゲン及びＩＶ型コラーゲンをそれぞれ抗原として、モノクローナル抗体の場合はマウス等を感作動物として用い、ポリクローナル抗体の場合はウサギ等を感作動物として用い、常法（Ｌｕｎｓｔｒｕｍ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　１９８６，　２６１：９０４２−９０４８；　Ｈｕｒｌｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９９４，　１０７：　２６２３−２６３４）に従って作製されたものである。
本実施例において使用した抗体は以下の通りである：
ＶＩＩ　型コラーゲン特異的抗体
モノクローナル抗体ＮＰ−１８５；
モノクローナル抗体ＮＰ−３２；
ＩＶ型コラーゲン特異的抗体
モノクローナル抗体ＪＫ−１９９　；
ポリクローナル抗体ａｎｔｉ　ｔｙｐｅＩＶ−Ｃ
【００２９】
詳しくは、固層抗体にモノクローナル抗体　（ＪＫ１９９，　ＮＰ１８５）、ニ次抗体にビオチン化した抗体（ｂ−ａｎｔｉ　ｔｙｐｅＩＶ−Ｃ、ｂ−ＮＰ３２）を用いた。抗体でコーティーングした９６穴プレートにサンプルを入れて３７℃で２時間結合反応させたのちに洗浄した。その後あらかじめアビジン−パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）を結合させたビオチン化抗体を３７℃１時間反応させた。洗浄後、ＰＯＤの基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液を加え約３０分間反応させた。１Ｍ　硫酸溶液で反応を止めた後ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００３０】
ＩＶ型、ＶＩＩ型コラーゲンの産生量は、培地中に遊離された量と細胞層に残った量との総和をもって示した。
【００３１】
（３）　結果
動物・植物由来の抽出物の添加によるＩＶ型コラーゲン産生促進効果を下記表１に示す。
【００３２】
【表１】
2004018471.tif 000002
【００３３】
【表２】
2004018471.tif 000003
【００３４】
ＩＶ型コラーゲン産生においては「加水分解カゼイン」、「プレエキス」、「ブナの芽エキス」「エリスリナエキス」を加えて培養することによって、明らかにＩＶ型コラーゲン産生が促進された。また、「可溶性卵殻膜」、「カッコンエキス」、「西洋キヅタエキス」を加えた場合もＩＶ型コラーゲン産生が促進された。
【００３５】
ＶＩＩ　型コラーゲンの産生においては「ブナの芽エキス」、「加水分解カゼイン」を加えて培養することによって、明らかにＶＩＩ　型コラーゲン産生が促進された。「カッコンエキス」、「可溶性卵殻膜」、「西洋キヅタエキス」を加えた場合も、ＶＩＩ　型コラーゲン産生が促進された。
【００３６】
【発明の効果】
本発明の基底膜ケア用組成物は、皮膚外用剤（医薬品、医薬部外品、化粧品を含む）等に配合することにより、表皮基底膜の主要構成成分であるＶＩＩ　型コラーゲンおよびＩＶ型コラーゲンの産生を促進する。ＶＩＩ　型コラーゲンおよびＩＶ型コラーゲンの産生を促進にすることによって基底膜をケアし、優れた老化防止効果を奏するものである。