(57)【要約】【課題】有機イオウ試薬を使用することにより低濃度で作用し、安価で不快臭の無い検査方法、検査キットの製造方法を与えることを目的とする。【解決手段】硫黄原子炭素原子硫黄原子の原子配列を化学構造に有する有機イオウ試薬、ルシフェリン、アデノシン三リン酸、およびマグネシウムイオンを含む甲虫ルシフェラーゼ検出試薬キット。さらに、補酵素Ａを含む上記甲虫ルシフェラーゼ検出試薬キット。硫黄原子炭素原子硫黄原子の原子配列を化学構造に有する有機イオウ試薬、ルシフェリン、アデノシン三リン酸、およびマグネシウムイオンを含む水溶液と、甲虫ルシフェラーゼを含むサンプルとを混合して混合液とする工程１、および、前記混合液からの発光を測定する工程２を含む甲虫ルシフェラーゼの検出方法。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
硫黄原子炭素原子硫黄原子の原子配列を化学構造に有する有機イオウ試薬、ルシフェリン、アデノシン三リン酸、およびマグネシウムイオンを含む甲虫ルシフェラーゼ検出試薬キット。
【請求項２】
さらに、補酵素Ａを含む請求項１記載の甲虫ルシフェラーゼ検出試薬キット。
【請求項３】
硫黄原子炭素原子硫黄原子の原子配列を化学構造に有する有機イオウ試薬、ルシフェリン、アデノシン三リン酸、およびマグネシウムイオンを含む水溶液と、甲虫ルシフェラーゼを含むサンプルとを混合して混合液とする工程１、および、
前記混合液からの発光を測定する工程２を含む甲虫ルシフェラーゼの検出方法。
【請求項４】
さらに、水溶液が補酵素Ａを含む請求項３記載の甲虫ルシフェラーゼ検出方法。
【請求項５】
水溶液全体に対する有機イオウ試薬の濃度が、０．０１ｍＭから２００ｍＭである請求項３または４記載の甲虫ルシフェラーゼの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、有機イオウ試薬に特徴を有するルシフェリン／ルシフェラーゼの発光検出用の試薬キット及び当該キットを用いた甲虫ルシフェラーゼの検出方法に関する。
本発明で得られた検出キットは、甲虫ルシフェラーゼ酵素をレポーターおよびシグナルとしたあらゆるアッセイ系に適用される。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでルシフェリン／ルシフェラーゼによる発光反応を行われせる際、その発光パターンはフラッシュ状に観察されるため、一定量の発光試薬を注入させる特別な装置を用いなければこの発光反応を正確に測定することはできなかった。これを改善すべく、ルシフェラーゼの検出方法として、チオール類を用いる方法により発光の半減期をおよそ５分間と延長し、かつ発光量を増大させ得る手法が発明されている（特許文献１参照）。この方法によりルシフェリン／ルシフェラーゼによる発光量の正確な測定が、発光試薬の自動注入装置を持たないルミノメーターや液体シンチレーションカウンターでも可能となった。この手法の発明後、ルシフェラーゼをレポーター遺伝子として、培養細胞などで発現されたルシフェラーゼを高感度に測定することが可能となり、ルシフェリン／ルシフェラーゼによる発光反応は広く用いられるようになってきている。
【０００３】
【特許文献１】
特許第３１７１５９５号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、当該チオール試薬はメルカプタン基に由来する不快臭を持っており測定に関して作業能率が悪い。また、前記公報記載のジチオトレイトール（ＤＴＴ）は、試薬として非常に高価である上に、測定に支障をきたさない充分なルシフェリン／ルシフェラーゼ反応を実現するためには５ｍＭ以上の高濃度を使用しなければならなかった。またＤＴＴは前記公報に記載されるような高濃度の水溶液中では劣化し易く、溶存酸素などにより酸化もしくは劣化されたＤＴＴは、ルシフェリン／ルシフェラーゼ反応の効率を著しく阻害することが知られている。
【０００５】
本発明の目的は、安価でメルカプタン臭の少ないかつ低濃度で充分な発光が得られる検査方法とキットを提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、硫黄原子炭素原子硫黄原子の原子配列を化学構造に有する有機イオウ試薬、ルシフェリン、アデノシン三リン酸、およびマグネシウムイオンを含む甲虫ルシフェラーに関する。
また、本発明は、さらに、補酵素Ａを含む上記甲虫ルシフェラーゼ検出試薬キットに関する。
【０００７】
また、本発明は、硫黄原子炭素原子硫黄原子の原子配列を化学構造に有する有機イオウ試薬、ルシフェリン、アデノシン三リン酸、およびマグネシウムイオンを含む水溶液と、甲虫ルシフェラーゼを含むサンプルとを混合して混合液とする工程１、および、
前記混合液からの発光を測定する工程２を含む甲虫ルシフェラーゼの検出方法。
【０００８】
また、本発明は、さらに、水溶液が補酵素Ａを含む上記甲虫ルシフェラーゼ検出方法に関する。
【０００９】
また、本発明は、水溶液全体に対する有機イオウ試薬の濃度が、０．０１ｍＭから２００ｍＭである上記甲虫ルシフェラーゼの検出方法に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明で使用されるルシフェラーゼは、甲虫由来のホタル・ルシフェリン、即ち多複素式有機酸Ｄ−（−）−２−（６’−ヒドロキシ−２’−ベンゾチアゾリル）−△２−チアゾリン−４−カルボン酸（以降は特に記載のない限り、“ルシフェリン”と表記する）を発光基質とし、これを酸化触媒して光子を発する酵素で、ホタル科を始め、コメツキ科、ホタルモドキ科、イリオモテボタル科など甲虫由来で発光反応に与る酵素全てを含む。この中には組み換えＤＮＡ技術や変異技術などにより、酵素タンパク自体の安定性や発光特性などが人為的に改変された酵素をも含まれる。
【００１１】
本発明で使用するルシフェリンは、上記の甲虫由来ルシフェリンであり、甲虫より直接抽出および精製されたものや、化学合成されたものも含む。
【００１２】
本発明で使用してもよい補酵素Ａ（ＣｏＡ）は、酵母より抽出・精製されたもので、リチウム塩やナトリウム塩の形態のものも含む。
【００１３】
本発明で使用する有機イオウ試薬は、硫黄原子炭素原子硫黄原子の原子配列を化学構造に有する有機イオウ試薬であり、そのため、有機アミン類、無機のアンモニウムと塩形成能の有する化合物であり、錯体形成能を有するものでも使用可能である。
【００１４】
また、水に可溶か分散可能であればフリーの形の有機イオウ試薬として使用可能である。本発明に使用される硫黄原子炭素原子硫黄原子の原子配列を化学構造に有する有機イオウ試薬としては、ジチオカルバミン酸塩類、キサントゲン酸塩類、チオりん酸塩、チアゾール類、などが利用出来る。
例えば、
【００１５】
ジチオカルバミン酸塩類としてはペンタメチレンジチオカルバミン酸ピペリジン、メチルペンタメチルジチオカルバミン酸ピペコリン、ジメチルジチオカルバミン酸亜鉛、ジエチルジチオカルバミン酸亜鉛、ジブチルジチオカルバミン酸亜鉛、エチルフェニルジチオカルバミン酸亜鉛、ジメチルジチオカルバミン酸ソーダ、ジエチルジチオカルバミン酸ソーダ、ジブチルジチオカルバミン酸ソーダ、ジメチルジチオカルバミン酸カリ、ジメチルジチオカルバミン酸銅、ジメチルジチョカルバミン酸鉄、エチルフェニルジチカルバミン酸鉛、ジエチルジチカルバミン酸セレン、ジエチルジチオカルバミン酸テルルガルが金属塩はこれに限定されることは無く目的に応じて周期律表に記載の金属塩であれば使用可能である。
【００１６】
キサントゲン酸塩類としてはブチルキサントゲン酸亜鉛、イソプロピルキサントゲン酸ソーダ等があるがこれに限定されることはない。周期律表に記載金属と塩が形成可能であれば使用可能である。
【００１７】
チオりん酸塩としてはピペリジンービスー（ｏ，ｏ−ジステアリルジチオフォスフェート）などがある。
【００１８】
チアゾール類としては２−メルカプトベンゾチアゾール、２−メルカプトベンゾチアゾール亜鉛塩、２−メルカプトベンゾチアゾールナトリウム塩、２−メルカプトベンゾチアゾールシクロヘキシルアミン塩、２−メルカプトベンゾチアゾール銅塩などがあるがこれに限定される必要は無く周期律表に記載の金属と塩あるいは錯体を形成可能なら使用可能である。これらの有機イオウ試薬は単族で所用することも出来るが混合して使用することも可能である。
【００１９】
これらの有機イオウ試薬の使用量は０．０１ｍＭから２００ｍＭであるが好ましくは、０．１から５ｍＭである。
【００２０】
本発明の検査キット、検査方法に関して添加剤として各種の界面活性剤等を添加して使用することも可能である。
【００２１】
【実施例】
以下、実施例に本発明を具体的に説明するが、これらの発明を限定するものではない。
【００２２】
実施例１
「ピッカジーン発光キット（東洋インキ製造株式会社製：製品番号ＰＧＬ１００）」に添付されている取扱い説明書に記載してある組成に従い、２０ｍＭ　トリシン，１．０７ｍＭ　（ＭｇＣＯ３）４Ｍｇ（ＯＨ）２・５Ｈ２Ｏ，２．６７ｍＭ　硫酸マグネシウム，０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ，２７０μＭ　ＣｏＡ，４７０μＭ　ルシフェリン，５３０μＭ　アデノシン三リン酸（ＡＴＰ），ｐＨ　７．８なる「ルシフェラーゼ発光試薬」を調製した。なお同処方に記載されている３３．３ｍＭ　ジチオトレイトール（ＤＴＴ）は添加していない。次にこの「ルシフェラーゼ発光試薬」に、ジエチルジチオカルバミン酸ソーダを終濃度がそれぞれ０ｍＭ、０．３３ｍＭ、３．３ｍＭ、３３．３ｍＭとなるように加えた。
ルシフェラーゼを１００ｎｇ／ｍＬ含む酵素溶液を、ルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ製　ＬＢ９５０６）用の測定キュベットに１０μＬ採った。続いて、調製した上記の各「ルシフェラーゼ発光試薬１００μＬを添加し、即座にルミノメーターにセットして試薬添加直後から２００秒後までの発光量（ＲＬＵ）を測定し、この間の最大発光量（ＲＬＵ／秒）ならびに２００秒間の積算発光量（ＲＬＵ／２００秒間）の各測定値を得た（表１）。
ＤＴＴなどのチオール試薬を使用せず、有機イオウ試薬を適用した本発明による発光系において、ジエチルカルバミン酸ソーダを加えた「ルシフェラーゼ発光試薬」では、試薬添加直後に急速に発光が減衰するフラッシュ発光ではなく、発光量が２００秒間にわたってほぼ一定値を持続しながら徐々に減衰するグロー発光が確認された。
ジエチルカルバミン酸ソーダを加えない系（０ｍＭ）に比べ、０．３３ｍＭと３ｍＭで最大発光量（ＲＬＵ／秒）は微増するに留まるも、発光の持続性や安定性の指標となる積算発光量（ＲＬＵ／２００秒）ではおよそ１．７倍の発光量の増加が認められた。また３３．３ｍＭの高濃度では、低濃度（０．３３ｍＭ、３．３ｍＭ）での結果に比べ、最大発光量（ＲＬＵ／秒）と積算発光量（ＲＬＵ／２００秒）ともにおよそ２／５に減少する傾向が認められた。
【００２３】
実施例２
「ピッカジーン発光キット（東洋インキ製造株式会社製：製品番号ＰＧＬ１００）」に添付されている取扱い説明書に記載してある組成に従い、２０ｍＭ　トリシン，１．０７ｍＭ　（ＭｇＣＯ３）４Ｍｇ（ＯＨ）２・５Ｈ２Ｏ，２．６７ｍＭ　硫酸マグネシウム，０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ，２７０μＭ　ＣｏＡ，４７０μＭ　ルシフェリン，５３０μＭ　アデノシン三リン酸（ＡＴＰ），ｐＨ　７．８なる「ルシフェラーゼ発光試薬」を調製した。なお同処方に記載されている３３．３ｍＭ　ジチオトレイトール（ＤＴＴ）は添加していない。次にこの「ルシフェラーゼ発光試薬」に、ジメチルジチオカルバミン酸ソーダを終濃度がそれぞれ０ｍＭ、０．３３ｍＭ、３．３ｍＭ、３３．３ｍＭとなるように加えた。
ルシフェラーゼを１００ｎｇ／ｍＬ含む酵素溶液を、ルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ製　ＬＢ９５０６）用の測定キュベットに１０μＬ採った。続いて、調製した上記の各「ルシフェラーゼ発光試薬１００μＬを添加し、即座にルミノメーターにセットして試薬添加直後から２００秒後までの発光量（ＲＬＵ）を測定し、この間の最大発光量（ＲＬＵ／秒）ならびに２００秒間の積算発光量（ＲＬＵ／２００秒間）の各測定値を得た（表１）。
ＤＴＴなどのチオール試薬を使用せず、有機イオウ試薬を適用した本発明による発光系において、ジメチルジチオカルバミン酸ソーダを加えた「ルシフェラーゼ発光試薬」では、試薬添加直後に急速に発光が減衰するフラッシュ発光ではなく、発光量が２００秒間にわたってほぼ一定値を持続しながら徐々に減衰するグロー発光が確認された。
ジメチルジチオカルバミン酸ソーダを加えない系（０ｍＭ）に比べ、０．３３ｍＭと３ｍＭで最大発光量（ＲＬＵ／秒）は微増するに留まるも、発光の持続性や安定性の指標となる積算発光量（ＲＬＵ／２００秒）ではおよそ１．７倍の発光量の増加が認められた。また３３．３ｍＭの高濃度では、低濃度（０．３３ｍＭ、３．３ｍＭ）での結果に比べ、最大発光量（ＲＬＵ／秒）と積算発光量（ＲＬＵ／２００秒）ともに１／６近くに減少する傾向が認められた。
【００２４】
比較例１
「ピッカジーン発光キット（東洋インキ製造株式会社製：製品番号ＰＧＬ１００）」に添付されている取扱い説明書に記載してある組成に従い、２０ｍＭ　トリシン，１．０７ｍＭ　（ＭｇＣＯ３）４Ｍｇ（ＯＨ）２・５Ｈ２Ｏ，２．６７ｍＭ　硫酸マグネシウム，０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ，２７０μＭ　ＣｏＡ，４７０μＭ　ルシフェリン，５３０μＭ　アデノシン三リン酸（ＡＴＰ），ｐＨ　７．８なる「ルシフェラーゼ発光試薬」を調製した。なお同処方に記載されている３３．３ｍＭ　ジチオトレイトール（ＤＴＴ）は添加していない。次にこの「ルシフェラーゼ発光試薬」に、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を終濃度がそれぞれ０ｍＭ、０．３３ｍＭ、３．３ｍＭ、３３．３ｍＭとなるように加えた。
ルシフェラーゼを１００ｎｇ／ｍＬ含む酵素溶液を、ルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ製　ＬＢ９５０６）用の測定キュベットに１０μＬ採った。続いて、調製した上記の各「ルシフェラーゼ発光試薬１００μＬを添加し、即座にルミノメーターにセットして試薬添加直後から２００秒後までの発光量（ＲＬＵ）を測定し、この間の最大発光量（ＲＬＵ／秒）ならびに２００秒間の積算発光量（ＲＬＵ／２００秒間）の各測定値を得た（表１）。
本「ルシフェラーゼ発光試薬」は、試薬添加直後に急速に発光が減衰するフラッシュ発光ではなく、発光量が２００秒間にわたってほぼ一定値を持続しながら徐々に減衰するグロー発光が確認された。
ＤＴＴを加えない系（０ｍＭ）に比べ、０．３３ｍＭと３ｍＭで最大発光量（ＲＬＵ／秒）はほとんど差は認められなかった。これに対し、発光の持続性や安定性の指標となる積算発光量（ＲＬＵ／２００秒）はＤＴＴ濃度に比例して増加し、３３．３ｍＭの高濃度で最大の発光量が認められ、これはＤＴＴを加えない場合に比べ１．８倍であった。
【００２５】
本発明の効果を比較した結果を表１に示した。既存のチオール試薬を用いた方法と比較して、遙かに低濃度で充分な発光強度が得ることができた。
【００２６】
表１
【表１】
2004089117.tif 000002
【００２７】
【発明の効果】
本発明により、安価でメルカプタン臭の少ないかつ低濃度で充分な発光が得られる検査方法とキットの製造が可能となった。