(57)【要約】【課題】環状イヌロオリゴ糖、単糖、２糖、直鎖オリゴ糖及びイヌリンからなる糖液より、効率よく環状オリゴ糖を分離・精製する方法を提供すること。【解決手段】環状イヌロオリゴ糖、単糖、２糖、直鎖オリゴ糖及びイヌリンからなる糖液中に存在する２糖、直鎖オリゴ糖及び未反応のイヌリンをエキソ型及びエンド型の加水分解酵素を用いて単糖まで低分子化することにより、目的とする環状イヌロオリゴ糖のみを効率良く選択的に分離する。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フルクトース分子がβ−（２→１）結合で環状に結合した環状イヌロオリゴ糖、単糖、２糖、直鎖オリゴ糖及びイヌリンを含有する糖液に、β−（２→１）フルクトシド結合を切断する能力を有するエキソ型酵素及びエンド型酵素の混合物またはこれらの酵素を産生する一種或いは二種以上の微生物を作用させ、ついで得られる糖液から該環状イヌロオリゴ糖を採取すること特徴とする環状イヌロオリゴ糖の分離・精製方法。
【請求項２】
β−（２→１）フルクトシド結合を切断する能力を有するエキソ型酵素及びエンド型酵素の混合物またはこれらの酵素を産生する一種或いは二種以上微生物の作用により、糖液中の２糖、直鎖オリゴ糖及びイヌリンが単糖類に分解されることを特徴とする請求項１記載の分離・精製方法。
【請求項３】
フルクトース分子がβ−（２→１）結合で環状に結合した環状イヌロオリゴ糖、単糖、２糖、直鎖オリゴ糖及びイヌリンを含有してなる糖液が、β−（２→１）結合フルクトースポリマーに作用して分子内転移反応によりフルクトース６〜８分子からなる環状オリゴ糖を生じさせる酵素または該酵素を産生する微生物をイヌリンに作用させて得られたものであることを特徴とする請求項１または２に記載の分離・精製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は環状イヌロオリゴ糖の分離・精製方法に関し、詳細にはエキソ型及びエンド型酵素で処理をすることにより効率よく目的とする環状イヌロオリゴ糖を分離精製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
環状イヌロオリゴ糖は、イヌリンからバチルス  サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）  ＭＺＮｏ．３１由来の酵素、サイクロイヌロオリゴサッカライドフラクタノトランスフェラーゼ（以下、「ＣＦＴａｓｅ」と略記する）の作用によりその生産が初めて報告された物質である（下記の特許文献１および特許文献２を参照）。環状イヌロオリゴ糖は、フルクトース分子がβ−（２→１）結合で環状に結合した糖であり、フルクトース残基がそれぞれ６個からなるサイクロイヌロヘキサオース、７個からなるサイクロイヌロヘプタオース、８個からなるサイクロイヌロオクタオースの存在が知られている。
【０００３】
環状のオリゴ糖としては、グルコースが６〜８個結合したサイクロデキストリンが知られている。しかしサイクロデキストリンが水に溶けにくい性質を有しているのに対し、環状イヌロオリゴ糖は水に対する溶解性が極めて高い。構造的には、サイクロデキストリンがバケツ型の円筒構造をなしているのに対し、環状イヌロオリゴ糖は分子内空洞も小さく、分子内に形成されたβ−（２→１）フルクトシド結合部分を有したクラウン環を形成している（下記の非特許文献１を参照）。そして、該環状イヌロオリゴ糖がクラウンエーテル様の選択的な金属イオンの捕捉能を有することも明らかになった（下記の非特許文献２を参照）。
【０００４】
このように、上記環状イヌロオリゴ糖は非常に高価で且つ安全性に問題があるクラウンエーテルに替わるクラウンエーテル様の用途が期待され、新しい機能糖として注目を浴びている。したがって、新しい機能性が期待される環状イヌロオリゴ糖の効率的且つ安価に生産する方法を確立することも重要な要素になってきている。従来、イヌリン等にＣＦＴａｓｅを作用させることにより環状イヌロオリゴ糖を製造しようとした場合、反応液中に存在する未反応のイヌリン、イヌロオリゴ糖、スクロースやフルクトース、グルコース等の副生は避けられず、環状イヌロオリゴ糖の分離・精製を複雑なものにしていた。これは、従来より糖の分離・精製に用いられてきたゲル型樹脂が低分子の単糖類、２糖類及び／または未反応のイヌリンは除去できるものの、直鎖オリゴ糖は樹脂に対する親和性が環状イヌロオリゴ糖に近似しているため分離が困難であることによる。また、環状イヌロオリゴ糖を含有する糖液より環状イヌロオリゴ糖のみを分離精製する方法としては、活性炭を用いて分画する方法（下記の特許文献３を参照）およびシロキサン系のシリカ担体を用いて分画する方法（下記の非特許文献３を参照）が知られているが、これらの方法でも環状イヌロオリゴ糖を直鎖のイヌロオリゴ糖から分離・精製することは簡単なことではなかった。
【０００５】
そこで、環状イヌロオリゴ糖、単糖、２糖、直鎖オリゴ糖及びイヌリンからなる糖液より環状オリゴ糖を精製する方法として、該糖液にエキソ型酵素を作用させ共存する未反応のイヌリン、直鎖オリゴ糖、２糖を単糖のグルコースとフルクトースに分解後、環状イヌロオリゴ糖を常法のクロマトなどを用いて分離する方法が開示されている（下記の特許文献４を参照）。この方法は優れた環状イヌロオリゴ糖の分離・精製方法ではあるが、エキソ型酵素だけで処理する場合、イヌリンに対する分解速度が極めて遅く反応に長時間を必要とする。また添加する酵素量が少ない場合にはイヌリンが未分解のまま反応液中に残存してしまう。残存したイヌリンはその後の分離工程でも除去可能ではあるが、環状イヌロオリゴ糖の分離・精製工程を非常に複雑なものとしてしまうという欠点があった。
【０００６】
【特許文献１】
特開平２−２５２７０１号公報
【特許文献２】
特開平２−２５５０８５号公報
【非特許文献１】
Ｍａｓａｍｉ  Ｓａｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，ｖｌ．２１７，ｐ．７−１７，１９９１
【非特許文献２】
Ｎａｏｋｏ  Ｙｏｓｈｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，ｐ．３５３−３５６，１９９３
【特許文献３】
特開平２−２５２７０１号公報
【非特許文献３】
日本生物工学会  平成４年度大会
【特許文献４】
特開平７−２７４９９０号公報
【０００７】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者らは効率よく環状イヌロオリゴ糖、単糖、２糖、直鎖オリゴ糖及びイヌリンからなる糖液より、環状オリゴ糖を分離・精製する方法の開発をすべく鋭意研究を進めた結果、該糖液中に存在する２糖、直鎖オリゴ糖及び未反応のイヌリンをエキソ型及びエンド型の加水分解酵素を併用して単糖まで低分子化することにより、目的とする環状イヌロオリゴ糖のみを効率良く選択的に分離できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、請求項１記載の本発明はフルクトース分子がβ−（２→１）結合で環状に結合した環状イヌロオリゴ糖、単糖、２糖、直鎖オリゴ糖及びイヌリンを含有する糖液に、β−（２→１）フルクトシド結合を切断する能力を有するエキソ型酵素及びエンド型酵素の混合物またはこれらの酵素を産生する一種或いは二種以上の微生物を作用させ、ついで得られる糖液から該環状イヌロオリゴ糖を採取すること特徴とする環状イヌロオリゴ糖の分離・精製方法である。請求項２記載の本発明はβ−（２→１）フルクトシド結合を切断する能力を有するエキソ型酵素及びエンド型酵素の混合物またはこれらの酵素を産生する一種或いは二種以上微生物の作用により、糖液中の２糖、直鎖オリゴ糖及びイヌリンが単糖及び／または２糖に分解されることを特徴とする請求項１記載の分離・精製方法である。さらに、請求項３記載の本発明はフルクトース分子がβ−（２→１）結合で環状に結合した環状イヌロオリゴ糖、単糖、２糖、直鎖オリゴ糖及びイヌリンを含有してなる糖液が、β−（２→１）結合フルクトースポリマーに作用して分子内転移反応によりフルクトース６〜８分子からなる環状オリゴ糖を生じさせる酵素または該酵素を産生する微生物をイヌリンに作用させて得られたものであることを特徴とする請求項１または２に記載の分離・精製方法である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につき詳細に説明する。本発明により精製することができる環状オリゴ糖としては、サイクロイヌロヘキサオース（フルクトース６分子がβ−（２→１）結合で環状に結合したもの）、サイクロイヌロヘプタオース（フルクトース７分子がβ−（２→１）結合で環状に結合したもの）、サイクロイヌロオクタオース（フルクトース８分子がβ−（２→１）結合で環状に結合したもの）などの、フルクトース分子がβ−（２→１）結合で環状に結合した環状イヌロオリゴ糖である。
【００１０】
本発明で定義する直鎖オリゴ糖とは、構成糖が３〜十数個程度結合したものであり、末端にグルコースが結合したフルクトースが２〜十数個程度結合したフラクトオリゴ糖やフルクトースが２〜数十個程度結合したイヌロオリゴ糖、フルクトースポリマー等が挙げられる。また２糖としてはシュークロース、イヌロビオース等を挙げることができる。単糖としては、フルクトース、グルコースが挙げられる。なお、イヌリンとはフラクトオリゴ糖よりも鎖長の長いポリマーをさす。
【００１１】
環状イヌロオリゴ糖、単糖、２糖、直鎖オリゴ糖及びイヌリンからなる糖液（以下、「環状イヌロオリゴ糖含有糖液」と称する）は、キクイモ、ゴボウ、チコリ、ヤーコン等のイヌリン含有量の高い植物の抽出液、該植物抽出物より精製したイヌリン、スクロースからイヌリン合成酵素により酵素合成したイヌリンを含む溶液中でＣＦＴａｓｅ、またはＣＦＴａｓｅを産生する菌、例えばバチルスポリミキサＭＧ−ＣＦ６  （生命研菌寄第１９１５８号）、バチルス  サーキュランス  ＭＺ  Ｎｏ．３１（生命研菌寄第９９４３号）、バチルス  サーキュランス  ＭＣＩ−２５５４（生命研菌寄第１１９４０号）等由来のＣＦＴａｓｅを作用させることにより、得ることができる。その際、該微生物の菌体そのものを作用させてもよいし、また該菌体からＣＦＴａｓｅを抽出し、そのまま、あるいは固定化等を行ってから作用させてもよい。またＣＦＴａｓｅは、遺伝子工学的に製造された組換えＣＦＴａｓｅを用いることもできる。その際、組換えＣＦＴａｓｅは天然物ＣＦＴａｓｅと同様にして反応に供することができ、さらには組換えＣＦＴａｓｅを産生する形質転換体を反応させることもできる。
【００１２】
また環状イヌロオリゴ糖含有糖液は、上記したイヌリン含有量の高い植物の抽出液、該抽出液から精製したイヌリン、及び／またはイヌリンを炭素源として含む培養液で上記菌株を培養し、その培養上清中から得ることもできる。その場合、例えば炭素源としてイヌリンを１〜４０％含有させ、そのほか窒素源として大豆粉、小麦胚芽、コーンスティープリカー、綿実粕、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸ソーダ、尿素等が使用できる。その他必要に応じて、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸、その他のイオンを生成する無機塩類等を添加した培地に生産菌を接種し、振とう培養を行う。この際、培養温度は２０〜４０℃が、また培養時間は使用する菌に応じた至適時間、すなわちＣＦＴａｓｅを生産させ、その培養上清中に環状イヌロオリゴ糖を生産させるのに至適となる時間培養させれば良い。得られた培養液を遠心分離、限外濾過膜等により除菌し、得られた溶液中の酵素を加熱処理により失活させる。こうして得られた液が環状イヌロオリゴ糖含有糖液である。
【００１３】
またＣＦＴａｓｅを作用させる場合、例えば前記の方法により培養を行った培養液を遠心分離、限外濾過膜等により除菌し、得られた培養液を作用させてもよいし、あるいは該培養液からさらに精製し、部分精製酵素または精製酵素として作用させてもよい。この培養液、部分精製酵素、精製酵素を作用させる場合、例えばｐＨを６〜９に調整した緩衝液中で約０．５％以上の濃度のイヌリンに３０〜７０℃で３０分以上作用させる等によって、所望とする環状イヌロオリゴ糖含有糖液が得られる。
【００１４】
これらの環状イヌロオリゴ糖含有糖液から環状イヌロオリゴ糖を分離・精製するには、環状イヌロオリゴ糖含有糖液にβ−（２→１）フルクトシド結合を切断する能力を有するエキソ型及びエンド型酵素の混合物またはこれらの酵素を産生する微生物を作用させて、環状イヌロオリゴ糖含有糖液中の環状イヌロオリゴ糖以外の成分、具体的には２糖、直鎖オリゴ糖及び未反応のイヌリン等のフルクタンを単糖まで酵素分解する。これらの酵素としては、２糖、直鎖オリゴ糖及びイヌリン等のフルクタンに作用してこれらのβ−（２→１）フルクトシド結合を切断することのできるエキソ型及びエンド型酵素の混合物であれば特に制限はない。このような作用を有するエキソ型酵素の例を上げればβ−フルクトフラノシダーゼ（インベルターゼ、サッカラーゼ）、エキソ型イヌリナーゼ等である。また、エンド型の酵素としてはエンド型イヌリナーゼやエンド型イヌリナーゼ活性を有するレバナーゼを例示することができる。これらの酵素はいずれも由来は問わず、市販されているものでもよく、これらの酵素を生産する菌体または菌体外に分泌された酵素等をそのまま作用させてもよく、あるいは菌体、菌体外に分泌された酵素等を精製して作用させてもよい。たとえばβ−フルクトフラノシダーゼを生産する菌としては、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物等が知られている（ＴｈｅＥｎｚｙｍｅｓ（３ｒｄｅｄ．），ｖｌ．５，ｐ．２９１−３０５，１９７１）。エキソ型イヌリナーゼを生産する菌としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する微生物等が知られている（特開昭６２−２０８２７７号）。エンド型酵素生産菌としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する微生物等が知られている（特開昭６２−２０８２７７号公報、特開昭６２−２２８２９３号公報、特開平３−８３５８１号公報、特開平３−１９８７７４号公報および特開平４−１９０７８９号公報）。なお、上記のエンド型酵素生産菌の中には、エキソ型酵素を同時に生産する菌も存在するため、これらの生産菌ではエキソ型酵素を添加しなくとも本発明の目的とするエキソ型及びエンド型酵素の混合物として使用できる。
【００１５】
環状イヌロオリゴ糖含有糖液にエキソ型及びエンド型酵素の混合物またはこれらの酵素を生産する微生物を作用させる方法としては、オリゴ糖切断酵素、当該酵素を産生する微生物、当該酵素を産生する微生物の培養上清、さらにはこれらを適当な担体に固定化した固定化酵素、固定化菌体等を、例えばｐＨ３〜８．５程度に調整した０．０１−０．３Ｍの緩衝液中で、ブリックス（糖度）約０．５〜７０の濃度の環状イヌロオリゴ糖含有糖液を３０〜８０℃で１０分以上作用させる等により、環状イヌロオリゴ糖含有糖液中の直鎖オリゴ糖、イヌリン等のフルクタンを低分子化することができる。上述したように、エキソ型及びエンド型酵素量の混合物と該酵素の反応時間は適宜選択することができるが、酵素量が多すぎたり反応時間が長すぎた場合にはエンド型酵素の作用により環状イヌロオリゴ糖も分解されてしまうことから、エンド型酵素の添加量は環状イヌロオリゴ糖含有液糖の固形分１ｇ当たり１単位から１０００単位とし、反応時間を添加する酵素単位に応じて１０分から１０時間とすることが好ましい。このとき、エキソ型酵素の量は、環状イヌロオリゴ糖を分解できないことから過剰量に添加しても差し支えない。なお、ここでいう酵素単位１単位は、イヌリンを基質としたとき１分間に１マイクロモルのグルコースに相当する還元力を示す酵素量である。反応温度とｐＨについては、ｐＨ３〜４において５０〜８０℃で長時間酵素反応を行うとイヌリンやオリゴ糖だけでなく環状イヌロオリゴ糖の酸加水分解が進んでしまうことから好ましくなく、これらの条件下で酵素反応を行う場合には、５０℃を越えない温度範囲でできる限り短時間の反応（２時間以内）にとどめることが、環状イヌロオリゴ糖の回収効率の点からも好ましい。
【００１６】
目的とする環状イヌロオリゴ糖は、上述のエキソ型及びエンド型酵素処理後の反応溶液から公知の手段を用いて分離、精製することができる。例えば、得られた反応溶液を活性炭を充填したカラムに通液し、水で十分に洗浄後エタノール水溶液を用いて溶出することにより、環状イヌロオリゴ糖と単糖類を簡単に分離することができる。また、得られた反応溶液を適当なゲル型濾過材に接触させることにより、環状イヌロオリゴ糖と単糖類とを効率良く分離することもできる。この場合のゲル型濾過材としては市販のデキストラン系ゲル、ポリスチレン系ゲル、ポリアクリルアミド系ゲル、セルロース系ゲル、カチオン系ゲル型イオン交換体が好適に利用できる。
【００１７】
具体的な精製手段としては、例えば以下のような方法を挙げることができる。まず上記した活性炭或いは活性炭とセライトの混合物を脱塩水にてスラリー化し、十分に気泡を除去した後分離カラムに充填する。該カラムに、充填した活性炭重量の１／２〜１／１００、好ましくは１／５〜１／２０重量の環状イヌロオリゴ糖含有酵素分解溶液（固形分換算）を送入し、次いでカラム容積の２〜１０倍量の水で洗浄後、カラム容積の２〜１０倍量の２０〜５０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液を用いて環状イヌロオリゴ糖画分を溶出する。この環状イヌロオリゴ糖画分を濃縮後、凍結乾燥機或いはスプレードライヤーなどを用いて粉末化することにより所望の環状イヌロオリゴ糖を得ることができる。さらに、環状イヌロオリゴ糖含有酵素分解溶液（固形分換算）に対し５〜２０倍重量の活性炭粉末を加えてよく攪拌後、吸引或いは加圧濾過により活性炭を回収し、これを活性炭量の１０倍以上の水で洗浄後、２０〜５０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液に懸濁する。適当な時間攪拌後、濾過により活性炭を除去してろ液を回収する。このろ液を減圧濃縮し、粉末化して環状イヌロオリゴ糖を得ることも可能である。また、上記に示したゲル濾過材を充填したカラムに、カラム容量の１／１０〜１／１００容量の環状イヌロオリゴ糖含有酵素分解溶液を送入し、水で溶出することによって環状イヌロオリゴ糖画分を単糖類や２糖類と分離後、濃縮し粉末化することもできる。
【００１８】
また分離効率を上げ、溶離水の使用量を減らす目的で、公知の種々のクロマト分離手法や擬似移動床法を用いることにより、更に効果的な分画を行うこともできる。
【００１９】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）イヌリン４％、イーストエキストラクト０．２％、硝酸ナトリウム０．５％、硫酸マグネシウム０．０５％、塩化カリウム０．０５％、燐酸１カリウム０．０５％、塩化第二鉄０．００１％を含んだ培地２００ｍｌをｐＨ７．５に調整して、１２０℃で１５分間蒸気滅菌した。この滅菌した培地にバチルスポリミキサＭＧ−ＣＦ６  （生命研菌寄第１９１５８号）  を接種し、２００ｒｐｍで３５℃、４８時間振とう培養を行った。培養終了後遠心分離により菌体を除菌し、培養上清液を得た。上記の操作を繰り返して培養上清液４０００ｍｌを得、これを減圧濃縮して粗環状イヌロオリゴ糖含有液糖（約５００ｍｌ、固形分として７２ｇ）とした。
【００２０】
この粗環状イヌロオリゴ糖含有糖液のｐＨを１Ｍクエン酸で４．５に調整後、エキソ型及びエンド型イヌリナーゼ混合酵素（商品名Ｆｒｕｃｔｏｚｙｍｅ  Ｌ、  Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ社製）を０．５ｍｌ（約１０００単位）加え、６０℃で１時間作用させた。これを１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、遠心分離により変性蛋白を除いた。得られた反応溶液を高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、糖分としては環状イヌロオリゴ糖、フルクトース、グルコースのみであった。
【００２１】
この環状イヌロオリゴ糖含有酵素処理溶液をそのまま水で平衡化した活性炭カラム（４０×９００ｍｍ）に供した。カラムを６０００ｍｌの水で洗浄後、同量の３０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液で溶出した。エタノール水溶液画分を減圧濃縮し、凍結乾燥して環状イヌロオリゴ糖混合物約３０ｇを得た。
【００２２】
（実施例２）イヌリン４％、イーストエキストラクト０．２％、硝酸ナトリウム０．５％、硫酸マグネシウム０．０５％、塩化カリウム０．０５％、燐酸１カリウム０．０５％、塩化第二鉄０．００１％を含んだ培地２００ｍｌをｐＨ７．５に調整して、１２０℃で１５分間蒸気滅菌した。この滅菌した培地にバチルスポリミキサ  ＭＧ−ＣＦ６  （生命研菌寄第１９１５８号）  を接種し、２００ｒｐｍで３５℃、４８時間振とう培養を行った。培養終了後遠心分離により菌体を除菌し、培養上清液を得た。得られた培養上清１８０ｍｌを水に対して一晩透析し粗酵素液とした。これに最終濃度が１０％となるように２０％イヌリン溶液を加え、３５℃で６０時間反応させた。得られた反応液を環状イヌロオリゴ糖含有糖液として次の操作を行った。
【００２３】
実施例１と同様に、上記環状イヌロオリゴ糖含有糖液のｐＨを４．５に調整後、エキソ型及びエンド型イヌリナーゼ混合酵素（商品名Ｆｒｕｃｔｏｚｙｍｅ  Ｌ、  Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ社製）を０．５ｍｌ（約１０００単位）加え、６０℃で３０分間作用させた。これを１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた後、遠心分離により変成蛋白を除いた。得られた環状イヌロオリゴ糖含有反応溶液を高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、糖分としては環状イヌロオリゴ糖、フルクトース及びグルコースのみであった。
【００２４】
この環状イヌロオリゴ糖含有酵素処理溶液をそのまま水で平衡化した活性炭カラム（４０×４７５ｍｍ）に供した。カラムを３０００ｍｌの水で洗浄後、同量の３０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液で溶出した。エタノール水溶液画分を減圧濃縮し、凍結乾燥して環状イヌロオリゴ糖混合物約１５ｇを得た。
【００２５】
（実施例３）実施例２と同様にして環状イヌロオリゴ糖含有糖液を得た。この環状イヌロオリゴ糖含有糖液のｐＨを４．５に調整後、エキソ型及びエンド型イヌリナーゼ混合酵素（商品名Ｆｒｕｃｔｏｚｙｍｅ  Ｌ、  Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ社製）を０．１ｍｌ（約４００単位）加え、６０℃で３時間作用させた。これを１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた後、遠心分離により変成蛋白を除いた。得られた環状イヌロオリゴ糖含有反応溶液を高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、糖分としては環状イヌロオリゴ糖、フルクトース及びグルコースのみであった。
【００２６】
この環状イヌロオリゴ糖含有反応溶液１０ｍｌをトーヨーパールＨＷ−４０Ｓ（東ソー社製）カラム（５０×９００ｍｍ）に供した。カラムを水で溶出し示差屈折計で糖を検出した。環状イヌロオリゴ糖含有画分を集めて、高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、環状イヌロオリゴ糖だけが検出された。上記の操作を１０回繰り返して環状イヌロオリゴ糖の凍結乾燥粉末３．８ｇを得た。
【００２７】
【発明の効果】
本発明方法によれば、環状イヌロオリゴ糖、イヌリン、直鎖オリゴ糖、２糖類、グルコース、フルクトース等を含有する溶液から目的とする環状イヌロオリゴ糖を高収率で分離・精製できる。得られた環状イヌロオリゴ糖は、食品・化学品分野をはじめその他の広い分野での利用が期待できる。