(57)【要約】【課題】アスペルギルス属糸状菌のセルフクローニング株の効率的な生産方法、この方法に使用する環状ヌクレオチド、及び、アスペルギルス属糸状菌のセルフクローニング株を提供する。【解決手段】ｎｉａＤ、ａｒｇＢ、ｓＣ、ｐｔｒＡ、ｐｙｒＧ、ａｍｄＳ、オーレオバシジン耐性遺伝子、ベノミル耐性遺伝子及びハイグロマイシン耐性遺伝子からなる群より選ばれるアスペルギルス属糸状菌（Ａ）種由来のマーカー遺伝子と、アスペルギルス属糸状菌（Ａ）種由来の目的遺伝子発現カセットとを含む環状ヌクレオチド。この環状ヌクレオチドを用いて、アスペルギルス属糸状菌（Ａ）種を形質転換するセルフクローニング株の製造方法。【選択図】  図１
2004329143.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｎｉａＤ、ａｒｇＢ、ｓＣ、ｐｔｒＡ、ｐｙｒＧ、ａｍｄＳ、オーレオバシジン耐性遺伝子、ベノミル耐性遺伝子及びハイグロマイシン耐性遺伝子からなる群より選ばれるアスペルギルス属糸状菌（Ａ）種由来のマーカー遺伝子と、アスペルギルス属糸状菌（Ａ）種由来の目的遺伝子発現カセットとを含む環状ヌクレオチド。
【請求項２】
マーカー遺伝子がｎｉａＤである請求項１に記載の環状ヌクレオチド。
【請求項３】
アスペルギルス属糸状菌（Ａ）種に由来するヌクレオチドのみからなる請求項１又は２に記載の環状ヌクレオチド。
【請求項４】
アスペルギルス属糸状菌（Ａ）種のセルフクローニング株を作製するための、請求項１、２又は３に記載の環状ヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の環状ヌクレオチドを用いてアスペルギルス属糸状菌（Ａ）種を形質転換するアスペルギルス属糸状菌のセルフクローニング株の製造方法。
【請求項６】
（ｉ）    請求項１から４のいずれかに記載の環状ヌクレオチドを用いて、その環状ヌクレオチドに含まれるマーカー遺伝子が変異したアスペルギルス属糸状菌（Ａ）種の変異株を形質転換する工程と、
（ｉｉ）  そのマーカー遺伝子の発現を指標にその環状ヌクレオチド中の目的遺伝子が導入された形質転換体を選択する工程と
を含むアスペルギルス属糸状菌のセルフクローニング株の製造方法。
【請求項７】
請求項１から４のいずれかに記載の環状ヌクレオチドを用いてアスペルギルス属糸状菌（Ａ）種を形質転換することにより得られるアスペルギルス属糸状菌のセルフクローニング株。
【請求項８】
アスペルギルス属糸状菌（Ａ）種の染色体ＤＮＡ中に、アスペルギルス属糸状菌（Ａ）種由来の目的遺伝子発現カセットが、アスペルギルス属糸状菌（Ａ）種由来の二つの同一マーカー遺伝子に挟まれた状態で存在し、そのマーカー遺伝子がｎｉａＤ、ａｒｇＢ、ｓＣ、ｐｔｒＡ、ｐｙｒＧ、ａｍｄＳ、オーレオバシジン耐性遺伝子、ベノミル耐性遺伝子及びハイグロマイシン耐性遺伝子からなる群より選ばれるものであるアスペルギルス属糸状菌のセルフクローニング株。
【請求項９】
二つのマーカー遺伝子の一方が変異したマーカー遺伝子である請求項８に記載のアスペルギルス属糸状菌のセルフクローニング株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術的分野】
本発明は、アスペルギルス属糸状菌のセルフクローニング株の作製に用いられる環状ヌクレオチド、この環状ヌクレオチドを用いてアスペルギルス属糸状菌のセルフクローニング株を製造する方法、及びこの方法により得られるセルフクローニング株に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アスペルギルス属糸状菌は、種々の酵素源、種々の２次代謝産物源として世界中の産業で利用されている。特に麹菌の代表的な菌種であるアスペルギルスオリザ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）は我が国の代表的な食品微生物であり、長年の間清酒、醤油、味噌、味醂、焼酎などの醸造産業で利用されてきた。
【０００３】
アスペルギルスオリザは、高いタンパク質生産能と醸造微生物としての安全性とから、異種タンパク質生産の宿主として注目されている。また、遺伝子組み換えを行うことにより、効率よく、各種タンパク質などの生産量が数百倍となった菌種を得ることができる。
【０００４】
近年では、麹菌アスペルギルスオリザが有する優れた蛋白質分泌生産能を利用して、遺伝子組み換え麹菌を用いて工業用酵素剤が生産されている（非特許文献１、特許文献１）。麹菌の形質転換方法としては、硝酸還元酵素遺伝子のｎｉａＤを利用した方法が確立されている（非特許文献２）。また、本発明者らは、宿主としてアスペルギルスオリザを用いた異種タンパク質の生産においては、アスペルギルス属の他の種のような近縁の種由来の遺伝子を用いることにより一層高い生産量が得られること、及び、特にアスペルギルスオリザ由来の遺伝子をアスペルギルスオリザの高発現プロモーターの制御下で発現させた場合に非常に大量のタンパク質が生産されることを報告している（特許文献２）。
【０００５】
しかし、効率よく遺伝子組み換えを行うために、通常大腸菌ベクター／宿主としての大腸菌の系が用いられることから、これらの方法により得られる組み換え体は、大腸菌ベクターや大腸菌由来のマーカー遺伝子などの異種生物由来の配列を含む。麹菌アスペルギルスオリザは食品産業に利用されることが多いところ、我が国では食品への遺伝子組み換え体の利用は依然として多くの消費者から敬遠されている。
【０００６】
このため、麹菌の育種は、主に、旧来の変異剤や紫外線を用いた変異法で行われている。変異法は、目的とするタンパク質を高発現する菌種を得る方法として非常に効率が悪い。また、タンパク質生産量も数倍程度にしか向上しない。
【０００７】
そこで、目的とするタンパク質を高発現し、かつ麹菌アスペルギルスオリザ由来のＤＮＡのみ含む遺伝子組み換え体を実用化するためには、育種法は遺伝子組み換えであるが、得られた形質転換体は麹菌由来のＤＮＡしか含まないセルフクローニング株又はナチュラルオカレンスの株であることが望ましい。セルフクローニングとは、宿主、ベクター及び挿入ＤＮＡが全て同一種に属する場合を指す。またナチュラルオカレンスの株とは、組み換え体と同等の遺伝子構成を有する生細胞が自然界に存在するものを指す（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｈｌｗ．ｇｏ．ｊｐ／ｔｏｐｉｃｓ／ｉｄｅｎｓｈｉ／ａｎｚｅｎ／ｔｕｕｃｈｉ２．ｈｔｍｌ）。
【０００８】
セルフクローニング株は、大腸菌由来のベクター遺伝子や抗生物質耐性遺伝子、その他の異種生物由来の蛋白質や低分子化合物を含まない点で、旧来の変異剤や紫外線を用いた変異法で得られる株と変わりがない。また、その酵素生産量は、遺伝子組み換え体の生産量と同等で、変異法では得られないほど高い生産量となる。
【０００９】
このようなセルフクローニング微生物としては出芽酵母や乳酸菌での育種例が知られている。これらは遺伝子組み換え体を構築後、感受性遺伝子を利用して不要な異種遺伝子のみを染色体からループアウトさせて除去する手法で作製されている（非特許文献３）。
【００１０】
しかし、麹菌アスペルギルスオリザを含むアスペルギルス属糸状菌では、全ての株に有効なセルフクローニング株の育種方法は報告されていない。このようなセルフクローニング技術を麹菌アスペルギルスオリザあるいは工業用に利用される他のアスペルギルス属糸状菌向けに開発できれば、食品産業に適用することができる。
【００１１】
【特許文献１】
特開昭６２−２７２９８８号公報
【００１２】
【特許文献２】
特開平１１−１５４２７１
【００１３】
【非特許文献１】
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ６，  ｐ１４１９  （１９８８）
【００１４】
【非特許文献２】
Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，ｖｏｌ２１８，ｐ９９−１０４（１９８９）
【００１５】
【非特許文献３】
Ｙｅａｓｔ，  ｖｏｌ１５，ｐ１−１０，  （１９９９）
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、アスペルギルス属糸状菌のセルフクローニング株の効率的な生産方法、この方法に使用する環状ヌクレオチド、及び、アスペルギルス属糸状菌のセルフクローニング株を提供することを主目的とする。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために本発明者は研究を重ね、以下の知見を得た。
▲１▼  ｎｉａＤ、ａｒｇＢ、ｓＣ、ｐｔｒＡ、ｐｙｒＧ、ａｍｄＳ、オーレオバシジン耐性遺伝子、ベノミル耐性遺伝子及びハイグロマイシン耐性遺伝子からなる群より選ばれるアスペルギルス属糸状菌（Ａ）種由来のマーカー遺伝子と、その糸状菌（Ａ）種由来の目的遺伝子発現カセットとを含む環状ヌクレオチドを用いて糸状菌（Ａ）種を形質転換することにより、非常に効率よく、糸状菌（Ａ）種の染色体ＤＮＡのそのマーカー遺伝子部位で挿入型の相同組み換えが起こり、その結果、糸状菌（Ａ）種の染色体ＤＮＡの当該マーカー遺伝子部位に目的遺伝子が挿入された形質転換体が効率よく得られる。
【００１８】
この方法では、マーカー遺伝子として上記９種のいずれかの遺伝子を用いること、及び、マーカー遺伝子と目的遺伝子発現カセットとを含むＤＮＡを環状にすることが、形質転換の効率を向上させるために重要である。
▲２▼  目的遺伝子発現カセットに糸状菌（Ａ）種由来の高発現エンハンサーを含ませることにより、この形質転換体は目的遺伝子を高発現するものとなる。また、この形質転換体は、異種生物由来のＤＮＡを含まないため、食品産業を始めとする様々な産業において利用する場合にも従来の変異株と同等の安全性を確保できるとともに、その物質生産性は従来の変異株では得られない程高く遺伝子組換え体と同程度であることが期待される。
【００１９】
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の環状ヌクレオチド等を提供する。
【００２０】
項１．  ｎｉａＤ、ａｒｇＢ、ｓＣ、ｐｔｒＡ、ｐｙｒＧ、ａｍｄＳ、オーレオバシジン耐性遺伝子、ベノミル耐性遺伝子及びハイグロマイシン耐性遺伝子からなる群より選ばれるアスペルギルス属糸状菌（Ａ）種由来のマーカー遺伝子と、アスペルギルス属糸状菌（Ａ）種由来の目的遺伝子発現カセットとを含む環状ヌクレオチド。
【００２１】
項２．  マーカー遺伝子がｎｉａＤである項１に記載の環状ヌクレオチド。
【００２２】
項３．  アスペルギルス属糸状菌（Ａ）種に由来するヌクレオチドのみからなる項１又は２に記載の環状ヌクレオチド。
【００２３】
項４．  アスペルギルス属糸状菌（Ａ）種のセルフクローニング株を作製するための、項１、２又は３に記載の環状ヌクレオチド。
【００２４】
項５．  項１から４のいずれかに記載の環状ヌクレオチドを用いてアスペルギルス属糸状菌（Ａ）種を形質転換するアスペルギルス属糸状菌のセルフクローニング株の製造方法。
【００２５】
項６．  （ｉ）    項１から４のいずれかに記載の環状ヌクレオチドを用いて、その環状ヌクレオチドに含まれるマーカー遺伝子が変異したアスペルギルス属糸状菌（Ａ）種の変異株を形質転換する工程と、
（ｉｉ）  そのマーカー遺伝子の発現を指標にその環状ヌクレオチド中の目的遺伝子が導入された形質転換体を選択する工程と
を含むアスペルギルス属糸状菌のセルフクローニング株の製造方法。
【００２６】
項７．  項１から４のいずれかに記載の環状ヌクレオチドを用いてアスペルギルス属糸状菌（Ａ）種を形質転換することにより得られるアスペルギルス属糸状菌のセルフクローニング株。
【００２７】
項８．  アスペルギルス属糸状菌（Ａ）種の染色体ＤＮＡ中に、アスペルギルス属糸状菌（Ａ）種由来の目的遺伝子発現カセットが、アスペルギルス属糸状菌（Ａ）種由来の二つの同一マーカー遺伝子に挟まれた状態で存在し、そのマーカー遺伝子がｎｉａＤ、ａｒｇＢ、ｓＣ、ｐｔｒＡ、ｐｙｒＧ、ａｍｄＳ、オーレオバシジン耐性遺伝子、ベノミル耐性遺伝子及びハイグロマイシン耐性遺伝子からなる群より選ばれるものであるアスペルギルス属糸状菌のセルフクローニング株。
【００２８】
項９．  二つのマーカー遺伝子の一方が変異したマーカー遺伝子である項８に記載のアスペルギルス属糸状菌のセルフクローニング株。
【００２９】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）環状ヌクレオチド
基本的構成
本発明の環状ヌクレオチドは、ｎｉａＤ、ａｒｇＢ、ｓＣ、ｐｔｒＡ、ｐｙｒＧ、ａｍｄＳ、オーレオバシジン耐性遺伝子、ベノミル耐性遺伝子及びハイグロマイシン耐性遺伝子からなる群より選ばれるアスペルギルス属糸状菌（Ａ）種由来のマーカー遺伝子と、アスペルギルス属糸状菌（Ａ）種由来の遺伝子発現カセットとを含む環状ヌクレオチドである。
アスペルギルス属糸状菌（Ａ）種
アスペルギルス属糸状菌（Ａ）種は、特に限定されない。例えば、アスペルギルスオリザ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルスカワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルスウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｕｓａｍｉｉ）、アスペルギルスソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルスニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）などの種を使用できる。特に、我が国では長年清酒、醤油、味噌、みりん等の醸造食品に利用されてきた安全な微生物であり我が国の産業上極めて利用頻度が高い宿主である点で、アスペルギルスオリザが好ましい。
マーカー遺伝子
マーカー遺伝子としては、アスペルギルス属糸状菌（Ａ）種由来のマーカー遺伝子であって、ｎｉａＤ（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９，１７９５−１７９７（１９９５））、ａｒｇＢ  （Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌ，  ６，  ３８６−３８９，  （１９８４）），  ｓＣ  （Ｇｅｎｅ，  ８４，  ３２９−３３４，  （１９８９））、ｐｔｒＡ  （Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  ６４，  １４１６−１４２１，  （２０００））、ｐｙｒＧ  （Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，  １１２，  ２８４−２８９，  （１９８３）），  ａｍｄＳ  （Ｇｅｎｅ，  ２６，  ２０５−２２１，  （１９８３））、オーレオバシジン耐性遺伝子  （Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ，  ２６１，  ２９０−２９６，  （１９９９））、ベノミル耐性遺伝子  （Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ８３，  ４８６９−４８７３，  （１９８６））及びハイグロマイシン耐性遺伝子  （Ｇｅｎｅ，  ５７，  ２１−２６，  （１９８７））からなる群より選ばれるマーカー遺伝子を使用する。
【００３０】
相同組換えのみ起こる細菌や出芽酵母の形質転換とは異なり、アスペルギルス属糸状菌の形質転換では相同組換え及び非相同組換えの双方が起こり得る。セルフクローニング株を例えば食品産業等に利用する場合には、形質転換に供された遺伝子が宿主染色体上の特定の位置に組み込まれていることが安全性の点で望ましい。上記の特定のマーカー遺伝子を使用することにより、宿主の当該マーカー遺伝子部位への挿入型の相同組み換えが非常に効率的に起こり、その結果、宿主染色体ＤＮＡ中に非常に効率よく目的遺伝子が挿入される。特に、ｎｉａＤが好ましい。
【００３１】
これらのマーカー遺伝子は、上記文献に記載された配列に基づき設計されたプライマーを用いアスペルギルス属糸状菌（Ａ）種の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う方法や、上記文献に記載された配列に基づき設計されたプローブを用いてアスペルギルス属糸状菌（Ａ）種の染色体ＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーションにより取得する方法などにより容易に入手できる。
【００３２】
本発明において、「アスペルギルス属糸状菌（Ａ）種に由来する」とは、アスペルギルス属糸状菌の特定の（Ａ）種に存在する配列であることを意味する。
目的遺伝子発現カセット
目的遺伝子は、特に限定されず、アスペルギルス属糸状菌（Ａ）種に由来する遺伝子であって、宿主となる糸状菌（Ａ）種に目的とする性質を与えることができる遺伝子であればよい。このような遺伝子として、代表的にはタンパク質（最終的に糖タンパク質になるものを含む）をコードする遺伝子が挙げられ、このような遺伝子を含む環状ヌクレオチドを用いて後述する方法でセルフクローニング株を作製することにより、そのタンパク質をセルフクローニング株に大量に生産させることができるようになる。
【００３３】
タンパク質をコードする遺伝子の目的遺伝子発現カセットには、通常、エンハンサー（プロモーター配列を含む）、そのタンパク質の構造遺伝子（オープンリーディングフレーム）及びターミネーターが含まれる。
【００３４】
目的遺伝子発現カセットは、アスペルギル属糸状菌（Ａ）種の染色体ＤＮＡ中に存在する配列のままで使用してもよく、又は、アスペルギルス属糸状菌（Ａ）種の染色体ＤＮＡ中に互いに離れて存在するプロモーター及びオープンリーディングフレーム、エンハンサー、並びに、ターミネーターなどを別々に単離した後融合して用いてもよい。いずれにしても、目的遺伝子発現カセットがアスペルギルス属糸状菌（Ａ）種に由来する配列からなるものであればよい。
【００３５】
構造遺伝子としては、それには限定されないが、例えばフィターゼ、リアーゼ、ペクチナーゼのようなペクチン分解酵素、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、イソメラーゼ、インベルターゼ、トランスフェラーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、キチナーゼ、カタラーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼのようなタンパク質分解酵素、アミノペプチダーゼ又はカルボキシペプチダーゼなどのタンパク質の構造遺伝子が挙げられる。
これらの構造遺伝子は、麹菌ＥＳＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｒｉｂ．ｇｏ．ｊｐ／ｋｅｎ／ＥＳＴ／ｄｂ／ｂｌａｓｔ．ｈｔｍｌ）を検索する方法で容易に入手できる。なお本発明者は、麹菌アスペルギルスオリザ由来のグルコアミラーゼ遺伝子ｇｌａＢ  （Ｇｅｎｅ，  ２０７，  １２７−１３４，  （１９９８）及びｇｌａＡ  （Ｇｅｎｅ，  １０８，  １４５−１５０，  （１９９２））、フコースレクチン遺伝子ｆｌｅＡ（特開２００２−１１２７８６号）などをクローニングしている。
【００３６】
糸状菌由来の遺伝子の発現制御には、転写制御因子が結合するエンハンサーとＲＮＡポリメラーゼなどの基本転写因子が結合するプロモーターが不可欠である。エンハンサー配列は多様であるためあらゆる遺伝子に共通するコンセンサス配列が存在しないが、プロモーター配列は、通常開始コドン上流５０−１５０  ｂｐに存在することが多いＴＡＴＡモチーフが一般的である（Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ａｎｄ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  ２５，  １８５−２２１，  （１９９０））。例えば、ｇｌａＢエンハンサーでは配列番号４の塩基番号２６９〜２７４  のｔａｔａａａ、ｓｏｄＭエンハンサーでは配列番号１５の塩基番号９０１〜９０６のｔａｔａｔｔ、ｍｅｌＯエンハンサーでは配列番号２２の塩基番号１０３７〜１０４３  のｔａｔｔｔａａがプロモーター配列と推測される。よって、セルフクローニングでの目的遺伝子の発現には、エンハンサー及びプロモーターの両方の配列が必須である。
ターミネーターは、アスペルギルス属糸状菌（Ａ）種由来のターミネーター遺伝子であれば、制限なく使用できる。例えば、グルコアミラーゼｇｌａＢターミネーター（配列番号６）などを使用できる。
【００３７】
エンハンサーは、アスペルギルス属糸状菌（Ａ）種に由来するエンハンサーであればよく、特に限定されない。例えばα−アミラーゼ遺伝子エンハンサーａｍｙＢ  （Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  ５６，  １８４９−１８５３，  （１９９２）），  グルコアミラーゼ遺伝子エンハンサーｇｌａＡ（Ｇｅｎｅ，  １０８，  １４５−１５０，  （１９９２））、α−グルコシダーゼ遺伝子エンハンサーａｇｄＡ（Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ，  ３０，  ４３２−４３８，  （１９９６））、マンガンＳＯＤ遺伝子エンハンサーｓｏｄＭ（特開２００１−２２４３８１）、チロシナーゼ遺伝子エンハンサーｍｅｌＯ（特開２００１−０４６０７８）、グルコアミラーゼ遺伝子エンハンサーｇｌａＢ（特開２０００−２４５４６５、特開平１１−２４３９６５）等が挙げられる。特に、液体培養特異的高発現エンハンサーである点でｓｏｄＭ又はｍｅｌＯが好ましく、固体培養特異的高発現エンハンサーである点でｇｌａＢが好ましい。
【００３８】
エンハンサーの位置は、特に限定されず、構造遺伝子及びターミネーターからなる単位の上流又は下流のいずれに存在していてもよい。また、構造遺伝子、ターミネーター及びエンハンサーは直接連結されていてもよいが、それらの間に１〜２０００塩基程度のヌクレオチドが挟まれていてもよい。但し、これらのヌクレオチドの配列はアスペルギルス属糸状菌（Ａ）種由来の配列であることが望ましい。例えば、目的タンパク質が菌体内タンパク質として生産されるものである場合は、目的遺伝子のオープンリーディングフレームに隣接して上流に糸状菌（Ａ）種の既知の分泌タンパク質の遺伝子を配置することにより、目的タンパク質とその分泌タンパク質との融合タンパク質として菌体外に分泌させることができる。
【００３９】
また、目的遺伝子発現カセットとしては、その他に、アンチセンス、コサプレッション又はＲＮＡｉ  （相補型２本鎖リボヌクレオチド）などのジーンサイレンシングカセットなどが挙げられる。これらのヌクレオチドもアスペルギルス属糸状菌（Ａ）種由来のものを使用する。アスペルギルス属糸状菌の遺伝子破壊は非常に困難であるところ、目的遺伝子発現カセットとしてジーンサイレンシングカセットを含む環状ヌクレオチドを用いてアスペルギルス属糸状菌（Ａ）種を形質転換することにより、産業上好ましくない酵素などの遺伝子の発現を抑制することができる。例えば、醸造食品の褐変化に関与するチロシナーゼ遺伝子、有用酵素又は有用２次代謝産物の分解に関わる酵素の遺伝子などの発現を抑制することができる。
その他
環状ヌクレオチドには、上記マーカー遺伝子と目的遺伝子発現カセットとが含まれていればよい。他にどのような配列が含まれていてもよいが、アスペルギルス属糸状菌（Ａ）種に由来しない配列（他種生物由来の配列又は人工的な配列）が含まれていないことが望ましい。これにより、形質転換されて得られる糸状菌は安全性が極めて高いものとなる。
【００４０】
環状ヌクレオチドの大きさは、通常３０００〜２００００塩基程度、特に５０００〜１００００塩基程度であることが好ましい。上記範囲であれば、安定的に分子内結合して環状のヌクレオチドにすることができるとともに、エンハンサー、ターミネーター、プロモーター及び目的遺伝子を広範囲から選択することができる。
環状ヌクレオチドの作製方法
本発明の環状ヌクレオチドは、例えば以下の方法で作製することができる。
【００４１】
先ず、アスペルギルス属糸状菌（Ａ）種のマーカー遺伝子（例えばｎｉａＤ）を大腸菌ベクターに組み込むことにより大腸菌プラスミド（Ｉ）を構築する。別途、糸状菌（Ａ）種由来のエンハンサー（プロモーターを含む）、糸状菌（Ａ）種由来の目的遺伝子のオープンリーディングフレーム及び糸状菌（Ａ）種由来のターミネーター遺伝子をコンビネーションＰＣＲで融合し、融合遺伝子としての目的遺伝子発現カセットを得る。次いで、大腸菌プラスミド（Ｉ）中のマーカー遺伝子と目的遺伝子発現カセットとが隣接するように、目的遺伝子発現カセットを大腸菌プラスミド（Ｉ）に組み込み、大腸菌プラスミド（ＩＩ）を得る。
【００４２】
さらに、大腸菌プラスミド（ＩＩ）を鋳型として、マーカー遺伝子及び目的遺伝子発現カセットからなる単位をＰＣＲで増幅し、末端をリン酸化及び平滑末端化した後、分子内ライゲーション（セルフライゲーション）により環状ヌクレオチドを得る。
（ＩＩ）アスペルギルス属糸状菌のセルフクローニング株の製造方法
本発明のアスペルギルス属糸状菌のセルフクローニング株の製造方法は、上記説明した本発明の環状ヌクレオチドを用いてアスペルギルス属糸状菌（Ａ）種を形質転換する方法である。
【００４３】
本発明において、「セルフクローニング株」とは、実質的に宿主糸状菌（Ａ）種と同種の生物由来のヌクレオチドから構成される株をいう。糸状菌（Ａ）種に由来しない配列が含まれる場合もせいぜい１〜１０塩基程度、特に６〜１０塩基程度である。この程度の大きさの挿入配列は、例えば制限酵素部位を導入するために挿入される場合がある。
【００４４】
宿主の糸状菌としては、マーカー遺伝子及び目的遺伝子が由来するアスペルギルス属糸状菌（Ａ）種の菌株を用いる。形質転換株を容易に選択できるように、導入するマーカー遺伝子が変異した変異株を用いることが好ましい。この場合は、  （ｉ）  上記説明した環状ヌクレオチドを用いて、その環状ヌクレオチドに含まれるマーカー遺伝子が変異したアスペルギルス属糸状菌（Ａ）種の変異株を形質転換した後、（ｉｉ）  そのマーカー遺伝子の発現を指標にその環状ヌクレオチド中の目的遺伝子が導入された形質転換体を選択すればよい。
また、マーカー遺伝子が変異していないアスペルギルス属糸状菌（Ａ）種を宿主として用いることもでき、この場合は、目的遺伝子の発現又は目的遺伝子の発現量の増大などを指標に形質転換体を選択すればよい。
形質転換方法は、特に限定されず、ＰＥＧ−カルシウム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法などの公知の方法を制限なく採用できる。
（ＩＩＩ）セルフクローニング株
これにより得られる本発明のセルフクローニング株は、本発明のセルフクローニング株は、アスペルギルス属糸状菌（Ａ）種の染色体ＤＮＡ中にアスペルギルス属糸状菌（Ａ）種由来の目的遺伝子発現カセットがアスペルギルス属糸状菌（Ａ）種由来の二つの同一マーカー遺伝子に挟まれた状態で存在し、そのマーカー遺伝子はｎｉａＤ、ａｒｇＢ、ｓＣ、ｐｔｒＡ、ｐｙｒＧ、ａｍｄＳ、オーレオバシジン耐性遺伝子、ベノミル耐性遺伝子及びハイグロマイシン耐性遺伝子からなる群より選ばれるものである。マーカー遺伝子はｎｉａＤが好ましい。
上記説明したセルフクローニング株の製造方法において、使用する環状ＤＮＡに含まれるマーカー遺伝子が変異した宿主を使用する場合は、二つのマーカー遺伝子の片方は変異したものとなる。例えば、ｎｉａＤとｇｌａＢ発現カセットとを含む環状ＤＮＡを使用して、ｎｉａＤが変異した宿主を形質転換することにより得られるセルフクローニング株は、その染色体ＤＮＡ中に、変異型ｎｉａＤと野生型ｎｉａＤとの間にｇｌａＢ発現カセットが挟まれた配列を有する。
また、染色体ＤＮＡ中に大腸菌ベクター等の異種生物由来のヌクレオチドは実質的に存在しない。また、このセルフクローニング株は、エンハンサーを含む環状ヌクレオチドを用いて形質転換を行う場合は、エンハンサーの種類によっても異なるが、目的遺伝子の発現量が野生株の３〜１０００倍程度に向上したものとなる。
【００４５】
【実施例】
以下、本発明を実施例を示して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
実施例１（ｇｌａＢエンハンサー支配下でのフコースレクチン生産セルフクローニング株の育種）
＜マーカー遺伝子の大腸菌ベクターへの組み込み＞
麹菌アスペルギルスオリザ由来の硝酸還元酵素遺伝子ｎｉａＤ（配列番号１）をＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片となるようにプライマーＡ（５’−ａａｃｔｇｃａｇａａｃａｇｇｃｃｃｃａａａｔｔｃａａｔｔａａｔｔｇｃａ−３’：配列番号２）とプライマーＢ（５’−ｃｃｃａａｇｃｔｔｔｇｇａｔｔｔｃｃｔａｃｇｔｃｔｔｃａａｔａｃａａａｃｃ−３’：配列番号３）を用いて麹菌ゲノムＤＮＡを鋳型としてＬＡ−Ｔａｑ（宝ホールディングス）を用いて以下の条件のＰＣＲにより増幅した。
ＰＣＲ条件
・  ９６℃  （５分間）を１サイクル
・  ９６℃  （２０秒間）、６０℃  （３０秒間）、  ７２℃  （５分間）  を３０サイクル
・７２℃  （７分間）を１サイクル
得られたＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで３７℃で処理後、アガロースゲル電気泳動で切り出した。切り出しは、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）を用いた。大腸菌プラスミドｐＵＣ１１９（宝ホールディングス）にＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．１（宝ホールディングス）を用いてライゲーションし、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ  ）ＪＭ１０９株に形質転換した。その結果、ｎｉａＤマーカーがサブクローニングされたプラスミドｐＮＩＡ２を得た。プラスミドｐＮＩＡ２の構成を図１に示す。
＜フコースレクチン遺伝子発現カセットの調製＞
グルコアミラーゼ遺伝子ｇｌａＢのエンハンサー（ｇｌａＢエンハンサー）０．３６−ｋｂ（配列番号４）、フコースレクチン遺伝子（ｆｌｅＡ）オープンリーディングフレーム１．１−ｋｂ（配列番号５）及びグルコースアミラーゼ遺伝子ｇｌａＢのターミネーター（ｇｌａＢターミネーター）１．０−ｋｂ（配列番号６）からなる融合遺伝子発現カセットの構築を試みた。
【００４６】
ｇｌａＢエンハンサーは、プライマーＣ（５’−ａａｃｔｇｃａｇｃｃａｇｔｇａｇａａｃｔａａｇａｇａａｔｇｇｃｇｇｃａｃｇｇ  −３’：配列番号７）及びプライマーＤ（５’−  ｇｃｃａｇｇａｇｔａｇａｃａｔｇａｔｇｇｔｇｇｔｇａｃｔｔｃｃａａｇａａａｃａａ  −３’：配列番号８）を使用して麹菌ゲノムＤＮＡを鋳型としてＬＡ−Ｔａｑ（宝ホールディングス）を用いてＰＣＲ増幅した。  ｆｌｅＡオープンリーディングフレームは、プライマーＥ（５’−  ｇａａｇｔｃａｃｃａｃｃａｔｃａｔｇｔｃｔａｃｔｃｃｔｇｇｃｇｃｃｃａａｇａａｇｔｔｃｔｔｔｔｃｃ  −３’配列番号９）及びプライマーＦ（５’−  ｇｃａｃｔｇｇａａａｇｔａｃａｔｃｔａｃｔｃａｇｃｃｇｇａｇｇｇａｇａｇｃｃｃｇｇｃｇａｃｃｃ−３’：配列番号１０）を用いて麹菌ゲノムＤＮＡを鋳型としてＬＡ−Ｔａｑ（宝ホールディングス）を用いてＰＣＲ増幅した。ｇｌａＢターミネーターは、プライマーＧ（５’−ｃｃｃｔｃｃｇｇｃｔｇａｇｔａｇａｔｇｔａｃｔｔｔｃｃａｇｔｇｃｇｔｇｔａｇｔｃ−３’：配列番号１１）及びプライマーＨ（５’−  ａｃｇｃｇｔｃｇａｃｇｃｇａａｃａｇａｇｃｔａｔａｃｃｔｔｃａｃａｔａｃｃ−３’：配列番号１２）を用いて麹菌ゲノムＤＮＡを鋳型としてＬＡ−Ｔａｑ（宝ホールディングス）を用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ条件は以下の条件とした。
【００４７】
・  ９６℃  （５分）を１サイクル
・  ９６℃  （２０秒）、  ６０℃  （３０秒）、  ７２℃  （５分）を３０サイクル
・７２℃  （７分）を１サイクル
得られたＰＣＲ増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）を用いて目的断片を切り出した。
【００４８】
次に２段階目のＰＣＲとしてこれらの３つのフラグメントを混合し、プライマーＣ及びプライマーＨを用いてＬＡ−Ｔａｑ（宝ホールディングス）によるＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ条件は以下の条件とした。
【００４９】
・  ９６℃  （５分）を１サイクル
・９６℃  （２０秒）、  ６８℃  （７分）を３０サイクル
・  ６８℃  （７分）を１サイクル
上記ＰＣＲの結果、約２．５−ｋｂの融合遺伝子産物が増幅した。得られたＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＰｓｔＩ−ＳａｌＩで３７℃で処理後、アガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）を用いて目的ＤＮＡ断片を切り出した。
＜マーカー遺伝子／目的遺伝子の融合遺伝子の調製＞
このＤＮＡ断片をｐＮＩＡ２にＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．１（宝ホールディングス）を用いてライゲーションすることにより、マーカー遺伝子と目的遺伝子発現カセットとの融合遺伝子がサブクローニングされたプラスミドｐＮＢＦを得た。このプラスミドで大腸菌Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株を形質転換した。
【００５０】
次に、本発明の環状ヌクレオチドを得るためのＰＣＲを行った。プラスミドｐＮＢＦを鋳型としてプライマーＩ（５’−ｇｃｇａａｃａｇａｇｃｔａｔａｃｃｔｔｃａｃａｔａｃｃｔｔｃｔｇｇａｃｇａａ−３’：配列番号１３）とプライマーＪ（５’−  ａａｇｃｔｔｔｇｇａｔｔｔｃｃｔａｃｇｔｃｔｔｃａａｔａｃａａａｃｃａｔｃａｇａ−３’：配列番号１４）を用いてＬＡ−Ｔａｑ（宝ホールディングス）によるＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ条件は以下の条件とした。
【００５１】
・  ９６℃  （５分）で１サイクル
・  ９６℃  （２０秒）、  ６８℃  （１０分）で３０サイクル
・６８℃  （７分）で１サイクル
その結果、約７．６−ｋｂの融合遺伝子産物（マーカー遺伝子／目的遺伝子発現カセット）が増幅した。得られたＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動で切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）で抽出した。
【００５２】
本遺伝子をＴ４  ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ（宝ホールディングス）で３７℃１時間処理し、次いでＴ４  ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ（宝ホールディングス）で３７℃１時間処理後、フェノールクロロホルム抽出及びエタノール沈殿した。これをＴ４  ＤＮＡリガーゼで１６℃で２０時間処理することにより、セルフライゲーションさせた後に、エタノール沈殿させた。これにより、本発明の環状ヌクレオチドが得られた。
＜セルフクローニング株の調製＞
定法であるＰＥＧ−カルシウム法（Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ，  ２１８，  ９９−１０４，  （１９８９）により、上記環状ヌクレオチドを用いて、Ａ．  ｏｒｙｚａｅのｎｉａＤ変異株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１３０３４として寄託済み）を形質転換した。硝酸を単一窒素源とするツアペクドックス（Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ）培地（２％グルコース、０．１％リン酸１水素２カリウム、０．０５％塩化カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．００１％硫酸鉄、０．３％硝酸ナトリウム）で生育できる株を選択することにより、ｆｌｅＡを保持する形質転換体を複数得た。
＜セルフクローニング株の染色体ＤＮＡの解析＞
これらの形質転換体のゲノムＤＮＡを定法により抽出し、ＳａｌＩ処理し、アガロースゲル電気泳動に供し、アガロースゲルからＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋メンブレンにアルカリトランスファーし、さらにＧｅｎｅ  Ｉｍａｇｅ  ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス）を用いてサザンブロット解析を行った
サザンブロッティングの結果を図２に示す。ｎｉａＤをプローブとした場合には、約１６−ｋｂの単一バンドが検出され、ｎｉａＤ部位に１コピー形質転換されていることが分かる。また大腸菌ベクターｐＵＣ１１９をプローブとした場合は、いかなるバンドも確認できなかった。このことから、大腸菌由来の遺伝子が存在せずアスペルギルスオリザ由来の遺伝子だけがｎｉａＤ部位に１コピー導入されたセルフクローニング株が得られたことが分かる。
＜セルフクローニング株の目的遺伝子の発現量の確認＞
以下のようにして、本セルフクローニング株のフコースレクチン生産性を検討した。ｇｌａＢエンハンサーは、固体培養特異的に発現するエンハンサーであることから（特開２０００−２４５４６５、特開平１１−２４３９６５）、セルフクローニング株を７０％精米の米麹を用いた固体培養（３０〜３５℃で３日間）に供した。得られた米麹１０ｇを水５０ｍｌで室温３時間抽出濾過後、その上清５０μｌ相当を濃縮乾固したものをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
【００５３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図３に示す。図３から明らかなように、対照とした野生株には認められない分子量３５，０００のバンドが検出された。このことから、セルフクローニング株では、フコースレクチン（分子量３５，０００）（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６，１００２−１００８（２０００２））が菌体外に多量に分泌生産されていることが分かる。
【００５４】
以上の結果、育種したセルフクローニング株は、麹菌アスペルギルスオリザ由来のＤＮＡしか含んでいないにもかかわらず、野生株に較べてフコースレクチンの生産量が大幅に増加した。フコースレクチンは研究用試薬、臨床用試薬としての用途があることから、得られたセルフクローニング株は、安全な非遺伝子組み換え体として産業上有効に利用可能な株である。
実施例２（ｓｏｄＭエンハンサー支配下でのグルコアミラーゼ生産セルフクローニング株の育種）
＜グルコアミラーゼ遺伝子発現カセットの調製＞
マンガンＳＯＤ遺伝子ｓｏｄＭのエンハンサー（ｓｏｄＭエンハンサー）１．０−ｋｂ（配列番号１５）、グルコアミラーゼ遺伝子ｇｌａＢオープンリーディングフレーム１．６−ｋｂ（配列番号１６）及びグルコアミラーゼ遺伝子ｇｌａＢのターミネーター１．０−ｋｂ（配列番号６）からなる融合遺伝子発現カセットの構築を試みた。
【００５５】
ｓｏｄＭエンハンサーは、プライマーＫ（５’−ａａｃｔｇｃａｇｔｔａｔｇｔａｃｔｃｃｇｔａｃｔｃｇｇｔｔｇａａｔｔａｔｔａａｔｃｇｇｇ−３’：配列番号１７）とプライマーＬ（５’−  ｇａａｇｇｔｔｇｔｔｃｃｇｃａｔｔｔｔｇｇｇｔｇｇｔｔｔｇｇｔｔｇｇｔａｔｔｃｔｇｇｔｔ  −３’：配列番号１８）とを使用して、麹菌ゲノムＤＮＡを鋳型としてＬＡ−Ｔａｑ（宝ホールディングス）を用いてＰＣＲ増幅した。ｇｌａＢオープンリーディングフレームは、プライマーＭ（５’−  ｃｃａａｃｃａａａｃｃａｃｃｃａａａａｔｇｃｇｇａａｃａａｃｃｔｔｃｔｔｔｔｔｔｃｃｃ  −３’：配列番号１９）とプライマーＮ（５’−  ｇｃａｃｔｇｇａａａｇｔａｃａｔｃｔａｃｃａｃｇａｃｃｃａａｃａｇｔｔｇｇｇｇｔａｇｔ−３’：配列番号２０）  とを使用して、麹菌ゲノムＤＮＡを鋳型としてＬＡ−Ｔａｑ（宝ホールディングス）を用いてＰＣＲ増幅した。ｇｌａＢターミネーターは、プライマーＯ（５’−ｃｔｇｔｔｇｇｇｔｃｇｔｇｇｔａｇａｔｇｔａｃｔｔｔｃｃａｇｔｇｃｇｔｇｔａｇｔｃｔａｃ−３’：配列番号２１）とプライマーＨ（配列番号１２）を用いて、麹菌ゲノムＤＮＡを鋳型としてＬＡ−Ｔａｑ（宝ホールディングス）を用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ条件は以下の条件とした。
【００５６】
・  ９６℃  （５分）で１サイクル
・  ９６℃  （２０秒）、  ６０℃  （３０秒）、  ７２℃  （５分）で  ３０サイクル
・７２℃  （７分）で  １サイクル
得られたＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）を用いて目的断片を切り出した。
【００５７】
次に２段階目のＰＣＲとしてこれらの３つのフラグメントを混合し、プライマーＫとプライマーＨを用いてＬＡ−Ｔａｑ（宝ホールディングス）によるＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ条件は以下の条件とした。
【００５８】
・  ９６℃  （５分）で１サイクル
・９６℃  （２０秒）、  ６８℃  （７分）で  ３０サイクル
・  ６８℃  （７分）で１サイクル
上記ＰＣＲの結果、約３．７−ｋｂの融合遺伝子産物が増幅した。得られたＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＰｓｔＩ−ＳａｌＩで３７℃処理後、アガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）を用いて目的ＤＮＡ断片を切り出した。
＜マーカー遺伝子／目的遺伝子の融合遺伝子の調製＞
このＤＮＡ断片を実施例１で得たｐＮＩＡ２にＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．１（宝ホールディングス）を用いてライゲーションすることにより、マーカー遺伝子と目的遺伝子発現カセットとの融合遺伝子がサブクローニングされたプラスミドｐＮＭＢを得た。このプラスミドで大腸菌Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株を形質転換した。
【００５９】
次に、本発明の環状ヌクレオチドを得るためのＰＣＲを行った。プラスミドｐＮＭＢを鋳型としてプライマーＩとプライマーＪを用いてＬＡ−Ｔａｑ（宝ホールディングス）によるＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ条件は以下の条件とした。
【００６０】
・  ９６℃  （５分）で１サイクル
・  ９６℃  （２０秒）、  ６８℃  （１０分）で  ３０サイクル
・６８℃  （７分）で  １サイクル
その結果、約８．８−ｋｂの融合遺伝子産物（マーカー遺伝子／目的遺伝子発現カセット）が増幅した。得られたＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動で切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）で抽出した。
【００６１】
本遺伝子をＴ４  ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ（宝ホールディングス）で３７℃１時間処理し、Ｔ４  ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ（宝ホールディングス）で３７℃１時間処理後、フェノールクロロホルム抽出及びエタノール沈殿した。これをＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃で２０時間処理することによりセルフライゲーションさせた後に、エタノール沈殿させた。これにより本発明の環状ヌクレオチドが得られた。
＜セルフクローニング株の調製＞
ＰＥＧ−カルシウム法により、上記環状ヌクレオチドを用いてＡ．  ｏｒｙｚａｅのｎｉａＤ変異株ＦＥＲＭ  Ｐ−１３０３４を形質転換した。実施例１と同様の硝酸を単一窒素源とする培地で生育できる株を選択することにより、ｇｌａＢ遺伝子を保持する形質転換体を複数得た。
＜セルフクローニング株の染色体ＤＮＡの解析＞
これらの形質転換体のゲノムＤＮＡを定法により取得し、ＳａｌＩ処理し、アガロースゲル電気泳動に供し、アガロースゲルからＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋メンブレンにアルカリトランスファーし、さらにＧｅｎｅ  Ｉｍａｇｅ  ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス）を用いてサザンブロット解析を行った。
【００６２】
サザンブロッティングの結果を図４に示す。ｎｉａＤをプローブとした場合は、約１７−ｋｂの単一バンドが検出され、ｎｉａＤ部位に１コピー形質転換されていることが分かる。また大腸菌ベクターｐＵＣ１１９をプローブとした場合は、いかなるバンドも確認できなかった。このことから、大腸菌由来の遺伝子が存在せずアスペルギルスアリザ由来の遺伝子だけがｎｉａＤ部位に１コピー導入されたセルフクローニング株の取得ができたことが分かる。
＜セルフクローニング株の目的遺伝子の発現量の確認＞
以下のようにして、本セルフクローニング株のグルコアミラーゼ生産性を検討した。ｓｏｄＭエンハンサーは、液体培養特異的に発現するエンハンサーであることから（特開２００１−２２４３８１）、本セルフクローニング株を液体培地（デキストリン６％、硫酸マグネシウム０．１％、リン酸水素２カリウム０．１％、塩化カリウム０．０５％、硫安０．２％、硫酸鉄０．００００１Ｍ、ｐＨ６．３）中で３７℃で３日間培養した。
【００６３】
グルコアミラーゼ活性をキッコーマン株式会社製の糖化力測定キットを用いて測定し、測定に当たり標準グルコアミラーゼとして比活性０．３６Ｕ／ｍｇのグルコアミラーゼを用いた。その結果、菌体外のグルコアミラーゼ生産量は１．２ｇ／１Ｌ−ｂｒｏｔｈであった。
【００６４】
また得られた培養上清５０μｌ相当を濃縮乾固したものをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＳＤＡ−ＰＡＧＥの結果を図５に示す。図５から明らかなように、対照とした野生株には認められない分子量５０，０００〜１００，０００のバンドが検出されている。このことから、グルコアミラーゼ（分子量（５０，０００−１００，０００）（Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８４，５３２−５３７，１９９７））が菌体外に多量に分泌生産されていることが分かる。
【００６５】
以上の結果、育種したセルフクローニング株は、麹菌アスペルギルスオリザ由来の遺伝子しか含んでいないにもかかわらず、野生株に較べてグルコアミラーゼの生産量が大幅に増加した。グルコアミラーゼは産業用酵素剤、研究用試薬、臨床用試薬としての用途があることから、得られたセルフクローニング株は、安全な非遺伝子組み換え体として産業上有効に利用可能な株である。
実施例３（ｍｅｌＯエンハンサー支配下でのフコースレクチン生産セルフクローニング株の育種）
＜フコースレクチン発現カセットの調製＞
チロシナーゼ遺伝子ｍｅｌＯエンハンサー１．２−ｋｂ（配列番号２２）、フコースレクチン遺伝子ｆｌｅＡのオープンリーディングフレーム１．１−ｋｂ（配列番号５）及びグルコアミラーゼ遺伝子ｇｌａＢターミネーター１．０−ｋｂ（配列番号６）からなる融合遺伝子発現カセットの構築を試みた。
【００６６】
ｍｅｌＯエンハンサーは、プライマーＰ（５’−ａａｃｔｇｃａｇｔｔａｔｇｔａｃｔｃｃｇｔａｃｔｃｇｇｔｔｇａａｔｇｃｔｔｇｃｃｔｔｇｇｃｔｃａａａｔｃｇｔｔｃａｔｇ−３’：配列番号２３）とプライマーＱ（５’−  ｃｇｃｃａｇｇａｇｔａｇａｃａｔｔｇｔｇａａｃｃａａａｇｔａａｔｃａｇａａｇａｔｇ−３’：配列番号２４）とを用いて麹菌ゲノムＤＮＡを鋳型としてＬＡ−Ｔａｑ（宝ホールディングス）を用いてＰＣＲ増幅した。ｆｌｅＡオープンリーディングフレームは、プライマーＲ（５’−ｇａｔｔａｃｔｔｔｇｇｔｔｃａｃａａｔｇｔｃｔａｃｔｃｃｔｇｇｃｇｃｃｃａａｇａａｇｔｔｃ−３’：配列番号２５）とプライマーＦとを用いて麹菌ゲノムＤＮＡを鋳型としてＬＡ−Ｔａｑ（宝ホールディングス）を用いてＰＣＲ増幅した。ｇｌａＢターミネーターは、プライマーＧとプライマーＨとを用いて、麹菌ゲノムＤＮＡを鋳型としてＬＡ−Ｔａｑ（宝ホールディングス）を用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ条件は以下の条件とした。
【００６７】
・  ９６℃  （５分）で１サイクル
・  ９６℃  （２０秒）、  ６０℃  （３０秒）、  ７２℃  （５分）で  ３０サイクル
・７２℃  （７分）で  １サイクル
得られたＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）を用いて切り出した。
【００６８】
次に２段階目のＰＣＲとしてこれらの３つのフラグメントを混合し、プライマーＰとプライマーＨを用いてＬＡ−Ｔａｑ（宝ホールディングス）によるＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ条件は以下の条件とした。
【００６９】
・  ９６℃  （５分）で１サイクル
・９６℃  （２０秒）、  ６８℃  （７分）で  ３０サイクル
・  ６８℃  （７分）で  １サイクル
上記ＰＣＲの結果、約３．３−ｋｂの融合遺伝子産物が増幅した。得られたＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＰｓｔＩ−ＳａｌＩで３７℃処理後、アガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）を用いて目的ＤＮＡ断片を切り出した。
＜マーカー遺伝子／目的遺伝子発現カセットの融合遺伝子の調製＞
このＤＮＡ断片を実施例１で得たｐＮＩＡ２にＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．１（宝ホールディングス）を用いてライゲーションすることにより、マーカー遺伝子と目的遺伝子発現カセットとの融合遺伝子がサブクローニングされたプラスミドｐＮＥＦを得た。このプラスミドで大腸菌Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株を形質転換した。
【００７０】
次に、本発明の環状ヌクレオチドを得るためのＰＣＲを行った。プラスミドｐＮＥＦを鋳型としてプライマーＩとプライマーＪとを用いてＬＡ−Ｔａｑ（宝ホールディングス）によるＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ条件は以下の条件とした。
【００７１】
・  ９６℃  （５分）で１サイクル
・  ９６℃  （２０秒）、  ６８℃  （１０分）で  ３０サイクル
・６８℃  （７分）で  １サイクル
その結果、約８．４−ｋｂの融合遺伝子産物（マーカー遺伝子／目的遺伝子発現カセット）が増幅した。得られたＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）で抽出した。
【００７２】
本遺伝子をＴ４  ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ（宝ホールディングス）で３７℃１時間処理し、Ｔ４  ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ（宝ホールディングス）で３７℃１時間処理後、フェノールクロロホルム抽出及びエタノール沈殿した。これをＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃で２０時間処理することにより、セルフライゲーションさせた後に、エタノール沈殿させた。これにより本発明の環状ヌクレオチドが得られた。
＜セルフクローニング株の調製＞
ＰＥＧ−カルシウム法により、上記環状ヌクレオチドを用いてＡ．  ｏｒｙｚａｅのｎｉａＤ変異株ＦＥＲＭ  Ｐ−１３０３４を形質転換した。硝酸を単一窒素源とする培地で生育できる株を選択することにより、ｆｌｅＡ遺伝子を保持する形質転換体を複数得た。
＜セルフクローニング株の染色体ＤＮＡの解析＞
これらの形質転換体のゲノムＤＮＡを定法により取得し、ＳａｌＩ処理し、アガロースゲル電気泳動に供し、アがロースゲルをＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋メンブレンにアルカリトランスファーし、さらにＧｅｎｅ  Ｉｍａｇｅ  ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス）を用いてサザンブロット解析を行った。
【００７３】
サザンブロッティングの結果を図６に示す。ｎｉａＤをプローブとした場合は、約１７−ｋｂの単一バンドが検出され、ｎｉａＤ部位に１コピー形質転換されていることが分かる。また大腸菌ベクターｐＵＣ１１９をプローブとした場合は、いかなるバンドも確認できなかった。このことから、大腸菌由来の遺伝子が存在せず麹菌アスペルギルスオリザ由来の遺伝子だけがｎｉａＤ部位に１コピー導入されたセルフクローニング株が取得できたことが分かる。
＜セルフクローニング株の目的遺伝子の発現量の確認＞
以下のようにして、本セルフクローニング株のフコースレクチン生産性を検討した。ｍｅｌＯエンハンサーは、液体培養特異的に発現するエンハンサーであることから（特開２００１−０４６０７８）、本セルフクローニング株を液体培地（グルコース３％、硫酸マグネシウム０．１％、リン酸水素２カリウム０．１％、塩化カリウム０．０５％、硫安０．２％、硫酸鉄０．００００１Ｍ、ｐＨ６．３）で３７℃で３日間培養した。回収した麹菌培養菌体を海砂で破砕し、ＰＢＳにより抽出し、遠心した。得られた粗酵素菌体蛋白質２０μｇ相当をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
【００７４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図７に示す。図７から明らかなように、対照とした野生株には認められない分子量３５，０００のバンドが検出された。このことから、セルフクローニング株では、フコースレクチン（分子量３５，０００）（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６，１００２−１００８（２００２））が菌体内に多量に生産されていることが分かる。
【００７５】
以上の結果、育種したセルフクローニング株は、麹菌アスペルギルスオリザ由来の遺伝子しか含んでいないにもかかわらず、野生株に較べてフコースレクチンの生産量が大幅に増加した。フコースレクチンは研究用試薬、臨床用試薬としての用途があることから、得られたセルフクローニング株は、安全な非遺伝子組み換え体として産業上有効に利用可能な株である。
【００７６】
＜形質転換効率の比較＞
マーカー遺伝子と目的遺伝子発現カセットとの融合遺伝子を用いてアスペルギルスオリザを形質転換し、形質転換効率を、実施例１〜３のように環状ヌクレオチドを用いる方法、線状ヌクレオチドを用いる方法、及び、大腸菌ベクターに組み込まれた状態のプラスミドを用いる方法の間で比較した。
【００７７】
形質転換試験１
実施例１において、ｎｉａＤとｆｌｅＡ発現カセットとを大腸菌ベクターにサブクローニングしたプラスミドｐＮＢＦを鋳型としてＰＣＲで増幅したＤＮＡをセルフライゲーションすることにより得られた環状ヌクレオチド、実施例１において上記セルフライゲーションを行う前の線状ＤＮＡ、及び、実施例１で調製した大腸菌プラスミドｐＮＢＦを用いて、実施例１と同じ条件でアスペルギルスオリザｎｉａＤ変異株（ＦＥＲＭＰ−１３０３４）を形質転換した。
【００７８】
形質転換試験２
実施例２において、ｎｉａＤとｇｌａＢ発現カセットとを大腸菌ベクターにサブクローニングしたプラスミドｐＮＢＦを鋳型としてＰＣＲで増幅したＤＮＡをセルフライゲーションすることにより得られた環状ヌクレオチド、実施例２において上記セルフライゲーションを行う前の線状ＤＮＡ、及び、実施例２で調製した大腸菌プラスミドｐＮＢＦを用いて、実施例２と同じ条件でアスペルギルスオリザｎｉａＤ変異株（ＦＥＲＭＰ−１３０３４）を形質転換した。
【００７９】
形質転換試験３
実施例３において、ｎｉａＤとｆｌｅＡ発現カセットとを大腸菌ベクターにサブクローニングしたプラスミドｐＮＢＦを鋳型としてＰＣＲで増幅したＤＮＡをセルフライゲーションすることにより得られた環状ヌクレオチド、実施例３において上記セルフライゲーションを行う前の線状ＤＮＡ、及び、実施例３で調製した大腸菌プラスミドｐＮＢＦを用いて、実施例３と同じ条件でアスペルギルスオリザｎｉａＤ変異株（ＦＥＲＭＰ−１３０３４）を形質転換した。
【００８０】
上記形質転換試験１〜３において、形質転換に供したＤＮＡの１μｇ当たりに得られる形質転換体の個数を形質転換効率とした。結果を以下の表１に示す。
【００８１】
【表１】
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【００８２】
表１から、形質転換により目的遺伝子が導入されたセルフクローニング株を得るに当たり、目的遺伝子を線状のままで用いると実質的に形質転換は起こらないが、環状ヌクレオチドの形にすることにより極めて高効率で形質転換が起こることが分かる。また、その効率は目的遺伝子を大腸菌ベクターに組み込んで用いる場合よりはるかに高いことも分かる。
【００８３】
【発明の効果】
本発明によれば、アスペルギルス属糸状菌のセルフクローニング株の効率的な生産方法、この方法に使用する環状ヌクレオチド、及び、アスペルギルス属糸状菌のセルフクローニング株が提供された。
さらにいえば、麹菌アスペルギルスオリザに代表されるアスペルギルス属糸状菌の育種は取得効率の低い変異法、又は、取得効率はよいが食品産業でパブリックアクセプタンスが低い遺伝子組み換え法に依存していた。このことから、食品産業界では、遺伝子組み換え法のような簡便な技術を用いて、異種生物の遺伝子を含まないセルフクローニング株を育種することが長年にわたり渇望されてきた。本発明によれば、目的とする性質を、非常に簡便に、効率的かつ安全な方法でアスペルギルス属糸状菌に導入することができた。
【００８４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１において得たプラスミドｐＮＩＡ２の構成を示す図である。
【図２】実施例１において得られた形質転換株の染色体ＤＮＡにｆｌｅＡが組み込まれていることを示す図である。
【図３】実施例１において得られた形質転換株がフコースレクチンを大量に生産していることを示す図である。
【図４】実施例２において得られた形質転換体の染色体ＤＮＡにｇｌａＢが組み込まれていることを示す図である。
【図５】実施例２において得られた形質転換株がグルコアミラーゼを大量に生産していることを示す図である。
【図６】実施例３において得られた形質転換体の染色体ＤＮＡにｆｌｅＡが組み込まれていることを示す図である。
【図７】実施例３において得られた形質転換株がフルコースクチンを大量に生産していることを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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