(57)【要約】【課題】透析や限外ろ過操作を行わず、又、ハロゲン化炭化水素を使用しないブロック共重合体−薬剤複合体の工業化可能な製造方法は知られていない。【解決手段】水、または水と混和する低沸点有機溶媒と水との混合溶媒に、親水性高分子構造部分と疎水性ポリアミノ酸構造部分からなるＡＢ型ブロック共重合体と薬剤を溶解し、続いて溶液を濃縮する工程を含むことを特徴とするブロック共重合体−薬剤複合体の製造法を提供する。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水、または水と混和する低沸点有機溶媒と水との混合溶媒に、親水性高分子構造部分と疎水性ポリアミノ酸構造部分からなるＡＢ型ブロック共重合体と薬剤を溶解し、続いて溶液を濃縮する工程を含むことを特徴とするブロック共重合体−薬剤複合体の製造法。
【請求項２】
製造工程に透析又は限外ろ過工程を含まない請求項１記載のブロック共重合体−薬剤複合体の製造法。
【請求項３】
ＡＢ型ブロック共重合体における親水性高分子構造部分がポリエチレンオキサイド誘導体であり、疎水性ポリアミノ酸構造部分が側鎖カルボキシル基にアントラサイクリン系抗癌剤が結合したアスパラギン酸を含むポリアスパラギン酸である請求項１又は２に記載のブロック共重合体−薬剤複合体の製造法。
【請求項４】
ＡＢ型ブロック共重合体における親水性高分子構造部分がポリエチレンオキサイド誘導体であり、疎水性ポリアミノ酸構造部分が側鎖カルボキシル基にアントラサイクリン系抗癌剤が結合したグルタミン酸を含むポリグルタミン酸である請求項１又は２に記載のブロック共重合体−薬剤複合体の製造法。
【請求項５】
疎水性ポリアミノ酸構造部分における側鎖カルボキシル基に結合したアントラサイクリン系抗癌剤がドキソルビシンである、請求項３又は４に記載のブロック共重合体−薬剤複合体の製造法。
【請求項６】
薬剤がアントラサイクリン系抗癌剤である請求項１〜５のいずれか１項に記載のブロック共重合体−薬剤複合体の製造法。
【請求項７】
アントラサイクリン系抗癌剤がドキソルビシンまたはその塩である請求項６記載のブロック共重合体−薬剤複合体の製造法。
【請求項８】
水、または水と混和する低沸点有機溶媒と水との混合溶媒に、親水性高分子構造部分と疎水性ポリアミノ酸構造部分からなるＡＢ型ブロック共重合体と薬剤を溶解し、続いて溶液を濃縮し、更に凍結乾燥する工程を含むことを特徴とするブロック共重合体−薬剤複合体を含む凍結乾燥製剤の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、親水性高分子構造部分と疎水性ポリアミノ酸構造部分からなるブロック共重合体が形成する高分子ミセルに薬剤を含有させブロック共重合体−薬剤複合体を得る際に、透析又は限外ろ過工程を含まないブロック共重合体−薬剤複合体の製造法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ポリエチレングリコール構造部分とポリアスパラギン酸誘導体部分からなるブロック共重合体が形成する高分子ミセルにドキソルビシンを含有させた高分子ブロック共重合体−薬剤複合体が特開平７−６９９００号公報等に記載されており、遊離のドキソルビシンと比較して低い毒性の範囲で高い抗腫瘍効果を示すことが記載されている。該ブロック共重合体−薬剤複合体は、ブロック共重合体と薬剤をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ：沸点１５３℃（１０１．３ｋＰａ））と水の混合溶媒中に溶解させた後、透析操作により有機溶媒であるジメチルホルムアミドを水に置換し、更に透析、限外ろ過操作により精製し製造されている。しかし、透析、限外ろ過操作を行うと、含有させた薬剤（例えばドキソルビシン）の一部も除去されてしまう（Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍ，　１６，　Ｎｏ．５，　４０１−４０８　（２００１））ため失われる薬剤は無駄となり、ブロック共重合体に対し含有薬剤量を多くすることができず、さらに含有量が連続的に変化するため含有薬剤量を一定にすることも困難である。加えて、透析および限外ろ過操作は共に実験室で行うには簡便な方法であるが、工業的に製造するには特別な設備が必要で、実際の製造には長時間を要する工程であり、工業的に現実性の高い実用的な製造法ではない。
【０００３】
又、特開２００１−２２６２９４号公報には、ブロック共重合体と水難溶性薬物のクロロホルム溶液を水中で機械的撹拌や超音波照射等でエマルションとし、クロロホルムを蒸発除去する高分子ブロック共重合体−薬剤複合体の製造法が記載されているが、工場における使用に制限があり、水と混和しないハロゲン化炭化水素であるクロロホルムの使用も含めて工業的に実用的な方法ではない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
透析や限外ろ過操作を行わず、又、ハロゲン化炭化水素を使用しないブロック共重合体−薬剤複合体の工業的に製造可能な製造方法は知られておらず、また、ブロック共重合体に対して含有薬剤量を高める実用的な方法もなく、従って、ブロック共重合体−薬剤複合体の実用的で新規な製造法が望まれていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究の結果、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、
（１）水、または水と混和する低沸点有機溶媒と水との混合溶媒に、親水性高分子構造部分と疎水性ポリアミノ酸構造部分からなるＡＢ型ブロック共重合体と薬剤を溶解し、続いて溶液を濃縮する工程を含むことを特徴とするブロック共重合体−薬剤複合体の製造法；
（２）製造工程に透析又は限外ろ過工程を含まない上記（１）記載のブロック共重合体−薬剤複合体の製造法；
（３）ＡＢ型ブロック共重合体における親水性高分子構造部分がポリエチレンオキサイド誘導体であり、疎水性ポリアミノ酸構造部分が側鎖カルボキシル基にアントラサイクリン系抗癌剤が結合したアスパラギン酸を含むポリアスパラギン酸である上記（１）又は（２）に記載のブロック共重合体−薬剤複合体の製造法；
（４）ＡＢ型ブロック共重合体における親水性高分子構造部分がポリエチレンオキサイド誘導体であり、疎水性ポリアミノ酸構造部分が側鎖カルボキシル基にアントラサイクリン系抗癌剤が結合したグルタミン酸を含むポリグルタミン酸である上記（１）又は（２）に記載のブロック共重合体−薬剤複合体の製造法；
（５）疎水性ポリアミノ酸構造部分における側鎖カルボキシル基に結合したアントラサイクリン系抗癌剤がドキソルビシンである、上記（３）又は（４）に記載のブロック共重合体−薬剤複合体の製造法；
（６）薬剤がアントラサイクリン系抗癌剤である上記（１）〜（５）のいずれかに記載のブロック共重合体−薬剤複合体の製造法；
（７）アントラサイクリン系抗癌剤がドキソルビシンまたはその塩である上記（６）記載のブロック共重合体−薬剤複合体の製造法；
（８）水、または水と混和する低沸点有機溶媒と水との混合溶媒に、親水性高分子構造部分と疎水性ポリアミノ酸構造部分からなるＡＢ型ブロック共重合体と薬剤を溶解し、続いて溶液を濃縮し、更に凍結乾燥する工程を含むことを特徴とするブロック共重合体−薬剤複合体を含む凍結乾燥製剤の製造法；
に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明のブロック共重合体−薬剤複合体の製造法は、水、または水と混和する低沸点有機溶媒と水との混合溶媒に、親水性高分子構造部分と疎水性ポリアミノ酸構造部分からなるＡＢ型ブロック共重合体と薬剤を溶解し、引き続いて溶液を濃縮する工程を含むことを特徴とし、特に透析又は限外ろ過操作を行わない方法である。
【０００８】
本発明において透析とは、半透膜を用い濃度差に基づく拡散により低分子成分（有機溶媒や塩を含む）を除去する操作である。又、限外ろ過とは、限外ろ過膜（分画分子量：５０００〜５００００）を用い溶液を濃縮しながらブロック共重合体−薬剤複合体中の低分子成分を除去する操作である。
【０００９】
本発明に使用される薬剤は特に限定されないが、本発明の複合体は血管透過性に基づき腫瘍集積性に優れる点を有することから抗癌剤が好ましく、臨床に使用されている種々の抗癌剤が挙げられるが、特にアントラサイクリン系抗癌剤が好ましい。アントラサイクリン系抗癌剤としては、例えばダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、アクラルビシン、エピルビシン、イダルビシン等が挙げられるが、特にドキソルビシンが好ましい。
【００１０】
本発明に使用される、親水性高分子構造部分と疎水性ポリアミノ酸構造部分からなるブロック共重合体における親水性高分子構造部分としては、通常知られている親水性を示す高分子化合物は全て含まれるが、具体的には例えば、ポリエチレンオキシド、ポリサッカライド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等、又はそれらの誘導体等が挙げられ、特にポリエチレンオキシド誘導体が好ましい。ポリエチレンオキシド誘導体として具体的には、例えば後記一般式（Ｉ）における親水性高分子構造部分が挙げられる。
【００１１】
本発明における疎水性ポリアミノ酸構造部分とは、疎水性を示すα−アミノ酸又はβ−アミノ酸等若しくはそれらの誘導体等であれば特に限定されないが、側鎖カルボキシル基にアントラサイクリン系抗癌剤残基が結合したアミノ酸を含むポリアミノ酸が好ましい。ポリアミノ酸として具体的には、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸等が挙げられる。側鎖カルボキシル基に結合したアントラサイクリン系抗癌剤残基としては、上記の本発明に使用される薬剤として挙げたアントラサイクリン系抗癌剤の残基が挙げられ、疎水性ポリアミノ酸としてはドキソルビシンの結合したアスパラギン酸を含むポリアスパラギン酸が特に好ましい。ブロック共重合体１分子中の疎水性ポリアミノ酸構造部分におけるアントラサイクリン系抗癌剤残基の重量割合は好ましくは２０％〜７０％であり、より好ましくは２５％〜６０％である。
【００１２】
又、本発明に使用される親水性高分子構造部分と疎水性ポリアミノ酸構造部分からなるＡＢ型ブロック共重合体は、例えば特開平７−６９９００号公報や特開平５−９５５号公報等に記載の方法に準じて製造されるものでもよい。即ち、片末端メトキシ片末端アミノプロポキシポリエチレングリコールと、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物又はγ−ベンジル−Ｌ−グルタメート−Ｎ−カルボン酸無水物を反応させ、得られるブロック共重合体の末端アミノ基をアシル化、側鎖ベンジルエステルをアルカリ加水分解し、生じる側鎖の遊離カルボン酸とアントラサイクリン系抗癌剤を縮合剤と反応助剤を用いて縮合して得られる。該公報の方法で製造されるブロック共重合体は、例えば下記一般式（Ｉ）で表されるものと推定される。
【００１３】
【化１】
2004018494.tif 000002
【００１４】
一般式（Ｉ）のポリアミノ酸構造部分における各構成部分の結合順は限定されずランダムでも規則的であってもよい。なお、式中Ｒは好ましくは水酸基又はアントラサイクリン系抗癌剤残基であり、Ｒ１は好ましくは水素原子又は低級アルキル基、より好ましくは低級アルキル基であり、Ｒ２は好ましくは低級アルキレン基であり、Ｒ３は好ましくはメチレン基又はエチレン基であり、Ｒ４は好ましくは水素原子又は低級アシル基、より好ましくは低級アシル基である。ｎは好ましくは５〜１０００の整数を示し、ｍは好ましくは２〜３００の整数を示し、ｘ＋ｙは好ましくは０〜３００の整数を示し、より好ましくは、ｎが８０〜３００であり、ｍが２０〜５０であり、ｘ＋ｙが０〜５０であり、但し、ｘ＋ｙはｍより大きくなることはない。ｘ及びｙは上記条件を満たす整数であれば、０を含む如何なる値も取り得る。
【００１５】
Ｒとしてのアントラサイクリン系抗癌剤残基におけるアントラサイクリン系抗癌剤としては、上記の本発明に使用される薬剤として挙げたアントラサイクリン系抗癌剤と同様であり、好ましいアントラサイクリン系抗癌剤も上記と同じくドキソルビシンである。
【００１６】
Ｒ１における低級アルキル基としては、好ましくは炭素数１〜４の直鎖又は分岐アルキル基が挙げられ、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基等が挙げられ、より好ましくはメチル基である。
【００１７】
Ｒ２における低級アルキレン基としては、好ましくは炭素数１〜４の直鎖又は分岐アルキレン基が挙げられ、具体的には、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、２−メチルトリメチレン基、テトラメチレン基等が挙げられ、より好ましくはトリメチレン基である。
【００１８】
Ｒ３は、好ましくはメチレン基又はエチレン基であって、より好ましくはメチレン基である。
【００１９】
Ｒ４における低級アシル基としては、好ましくは炭素数１〜４のアシル基が挙げられ、具体的には、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基等が挙げられ、より好ましくはアセチル基である。
【００２０】
一般式（Ｉ）のアントラサイクリン系抗癌剤残基とポリアミノ酸側鎖との結合様式は特に限定されないが，好ましくはアントラサイクリン系抗癌剤のアミノ基又は水酸基と，ポリアミノ酸の側鎖カルボン酸によるアミド結合又はエステル結合が挙げられ，特に好ましくはアントラサイクリン系抗癌剤のアミノ糖部分の１級アミノ基とポリアミノ酸のカルボン酸側鎖によるアミド結合が挙げられる。
【００２１】
一般式（Ｉ）で表される親水性高分子構造部分と疎水性ポリアミノ酸構造部分からなるブロック共重合体において、特に好ましくは、Ｒ１がメチル基、Ｒ２がトリメチレン基、Ｒ３がメチレン基、Ｒ４がアセチル基、ｎが８０〜３００、ｍが２０〜５０、ｘ＋ｙがｍより大きくない０〜５０であるブロック共重合体が挙げられる。
【００２２】
次に、本発明の製造法について説明する。親水性高分子構造部分と疎水性ポリアミノ酸構造部分からなるＡＢ型ブロック共重合体を、水、又は水と混和する低沸点の有機溶媒と水との混合溶媒に溶解する。本発明における低沸点の有機溶媒とは、沸点が１００℃（１０１．３ｋＰａ）以下の有機溶媒が挙げられ、好ましくは沸点が５０℃〜１００℃（１０１．３ｋＰａ）の有機溶媒が挙げられ、水と混和する低沸点の有機溶媒の具体的としては、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン等であり、ブロック共重合体を高濃度で溶解することができるエタノールが特に好ましい。混合溶媒における有機溶媒と水との比率はブロック共重合体が溶解すれば特に限定されないが、望ましくは１：９から９：１、さらに望ましくは１：３から３：１である。また、このとき溶解を促進するために加温しても構わない。加温する際の温度はブロック共重合体が分解せず、安定性が保たれる範囲であればよく、望ましくは３０℃〜１００℃、さらに望ましくは３０℃〜６０℃である。
【００２３】
本発明の製造法において、ブロック共重合体の水、又は水と混和する低沸点の有機溶媒と水との混合溶媒中の濃度は、溶解していれば特に限定されないが、通常２％〜１０％が好ましい。
【００２４】
続いて、得られたブロック共重合体溶液に薬剤、例えば塩酸ドキソルビシンを添加すると、溶解し均一な溶液が得られる。さらにこの溶液は、安定性や他の必要性に応じｐＨ調整をしても構わない。この際のｐＨ範囲は、薬剤が分解しなければ特に限定されないが、塩酸ドキソルビシンの場合、ｐＨ４〜７が好ましい。
【００２５】
得られた複合体の溶液を濃縮することにより、溶液中に有機溶媒が含まれる場合には、この有機溶媒、たとえばエタノールが留去され、ブロック共重合体が形成する高分子ミセルの内核に薬剤が含有されたブロック共重合体−薬剤複合体が得られる。従って、従来の方法で行われていた透析、限外ろ過といった操作を行う必要がなくなった。こうして得られたブロック共重合体−薬剤複合体はレーザー光散乱により数十ｎｍの粒子径が確認され、高分子ミセルを形成していることが明らかとなり、ゲルろ過カラムを用いた内包薬剤の定量から、製造に用いた薬剤の内８０％以上の薬剤が内包されていることが確認された。
【００２６】
また、本発明では、更に得られたブロック共重合体−薬剤複合体を凍結乾燥することにより、凍結乾燥製剤とすることもできる。凍結乾燥の際、ｐＨを一定にするために緩衝能をもった塩類、例えば、リン酸ナトリウムや酢酸ナトリウムなどを加えてもよい。
【００２７】
又、この凍結乾燥製剤は、例えば注射用水、生理食塩水、緩衝能を持たせた生理食塩水などに再溶解するとブロック共重合体−薬剤複合体溶液となる。
【００２８】
本製造法では、添加する薬剤が従来の製造法の様に製造操作過程で失われることはなく、薬剤が無駄にならないばかりか、ブロック共重合体に対する薬剤の内包率も高くすることが可能である。たとえば、特開平７−６９９００号公報の実施例に示されている製造法によれば、製造に用いたドキソルビシンの利用率および薬剤含有率は表１の通りであるが、後記の本製造法による実施例においては、表１に示すように薬剤の利用率および薬剤含有率ともに大幅に改善された。
【００２９】
【表１】
2004018494.tif 000003
【００３０】
ブロック共重合体が形成するミセルに薬剤を含有させ、遊離の薬剤と比較して低い毒性の範囲で高い抗腫瘍効果を示すことがブロック共重合体−薬剤複合体の特徴であるが、薬剤内包率を上げるということは相対的に必要なブロック共重合体量が少量でよいことになり、経済性の点でも実用上優れている。
【００３１】
以下に本発明を実施例で示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３２】
実施例１
上記一般式（Ｉ）においてＲ１＝メチル基、Ｒ２＝トリメチレン基、Ｒ３＝メチレン基、Ｒ４＝アセチル基、Ｒ＝水酸基またはドキソルビシン残基（ドキソルビシンの結合している割合が平均４５％）、ポリエチレングリコールの平均分子量５２８７、アスパラギン酸の平均ユニット数２８．１であるブロック共重合体２０．００ｇに注射用水１００ｍＬを加え、３５℃に加温し懸濁させた。０．５Ｎ水酸化ナトリウム溶液を６．０ｍＬ加え攪拌した後、無水エタノール１００ｍＬを加えた。ブロック共重合体が溶解したことを確認した後、塩酸ドキソルビシン３．９０６ｇを添加し溶解させた。０．５Ｎ水酸化ナトリウム５．９ｍＬを加えｐＨを６に調整し、注射用水１８８ｍＬを加えた。１時間後、溶液をメンブランフィルター（ミリポア；ＧＶタイプ０．２２μｍ）にてろ過した後、減圧下溶媒を留去しブロック共重合体−薬剤複合体の溶液を得、更に凍結乾燥を行うことにより、ブロック共重合体−薬剤複合体の凍結乾燥物２２．９６ｇを得た。この複合体の薬剤含有量は１６．３１％であった。
【００３３】
試験例１
実施例１で調製した凍結乾燥物をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に溶解し１ｍｇ／ｍＬの溶液とした。この試料溶液を５℃にて１晩静置したのち、分析に使用した。水で膨潤させたセファデックスＧ−２５（ファルマシア製：グレード、ファイン）約２ｍＬをガラスカラムに充填した。このカラムに試料溶液を２００μＬアプライした。水で展開しミセル部分を分取したのち、同量のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で希釈した後、水−ＤＭＦ（１：１）溶液を用いて５ｍＬにメスアップした（これを溶液１とした）。これとは別に、試料溶液２００μＬを５ｍＬメスフラスコにとり、水−ＤＭＦ（１：１）溶液を用いて５ｍＬにメスアップした（これを溶液２とした）。溶液１、２を、ミセル構造を壊す逆相ＨＰＬＣにて分析し、得られたチャートのドキソルビシンのピーク面積の比（溶液１中の遊離ドキソルビシン量／溶液２中の遊離ドキソルビシン量）を計算した。実施例１で調製したブロック共重合体−薬剤複合体の薬剤内包率は９４．９％であった。
【００３４】
逆相ＨＰＬＣの分析条件
カラム　Ｗａｔｅｒｓ　Ｓｙｍｍｅｔｒｙ　Ｃ８　φ４．６ｘ２５０ｍｍ
カラム温度　４０℃
溶離液
（Ａ）０．０５％ＭＳ−３＋０．０１％ＴＦＡ（ＭＳ−３はジーエルサイエンス製イオンペアー試薬、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸）
（Ｂ）ＣＨ３ＣＮ
グラジェント
時間（分）　　０　　２０　　２５　　３５　　５０　　５１　　６０
Ｂ（％）　　２０　　４０　　４０　　９０　　９０　　２０　　２０
検出器　　ＵＶ（４８５ｎｍ）
流速　　　０．８ｍＬ／分
注入量　　２０μＬ
【００３５】
応用例１
ＣＤＦ１メスのマウスの背側部皮下にマウス大腸癌Ｃｏｌｏｎ２６細胞を移植し、腫瘍の体積が１００ｍｍ３前後に達した時点から実施例１で得られたブロック共重合体−薬剤複合体又は塩酸ドキソルビシンを静脈内に投与した。ブロック共重合体−薬剤複合体は冷暗所に保存した凍結乾燥品を、リン酸で緩衝能を持たせた生理食塩水（ｐＨ７．４）で溶解して投与した。投与量は複合体中の薬剤量をもとに決定した。薬剤の抗腫瘍効果は、移植６０日後の腫瘍消失（治癒）マウス数と投与後１４日目における腫瘍増殖阻害率から判定した。結果を表２に示す。
【００３６】
【表２】
2004018494.tif 000004
【００３７】
塩酸ドキソルビシンをそのまま投与した場合と比べ、本発明のブロック共重合体−薬剤複合体として投与した場合の方が、全ての投与群でより強い腫瘍の縮小効果を示した。また、観察期間（６０日）終了時の治癒マウス数も塩酸ドキソルビシン投与群より多く、ブロック共重合−薬剤複合体は、遊離の薬剤と比較して、低い毒性の範囲で高い抗腫瘍効果を示すことが明らかとなった。
【００３８】
【発明の効果】
本発明のミセル型ブロック共重合体−薬剤複合体の製造法は透析、限外ろ過操作を含まないためその操作性も大幅に向上し、薬剤の利用率が高く、薬剤含量を高く且つ再現よくでき、従来の製造法に比べて短時間で調製可能である。また、特殊な設備が必要ではなく多量の水を使用しなくてもよいことから、実施が容易で工業化する際に非常に優れた方法である。本発明により、低い毒性の範囲で高い抗腫瘍効果を示すブロック共重合体−薬剤複合体が経済的に、かつ簡便に提供される。