(57)【要約】【課題】ＤＮＡの塩基配列の決定や配列の相同性の解析をすることなく、アビオトロフィア属とグラニュリカテラ属の細菌を同定する方法を提供することを目的とする。【解決手段】オリゴヌクレオチド４９ｆと５０ｒを１対のプライマーとしたＰＣＲにより、アビオトロフィア属に分類されているアビオトロフィア・デフェクティバを特異的に同定することができる。また、オリゴヌクレオチド５５ｆと５６ｒを１対のプライマーとしたＰＣＲにより、グラニュリカテラ属に分類されているグラニュリカテラ・アディアセンスとグラニュリカテラ・パラアディアセンスを特異的に同定することができる。さらに、オリゴヌクレオチド４１ｆと４２ｒを１対のプライマーとしたＰＣＲにより、グラニュリカテラ属に分類されているグラニュリカテラ・エレガンスを特異的に同定することができる。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列に相同性があるオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列表の配列番号２に記載の塩基配列に相同性があるオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列表の配列番号３に記載の塩基配列に相同性があるオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドをＰＣＲのプライマーとして利用することにより細菌を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、アビオトロフィア属とグラニュリカテラ属に分類されている細菌の同定に関するものである。より詳しくは、３対のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲ法によって、特定の細菌から特定の大きさのＤＮＡ断片が増幅されてくることに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
特開平１１−１３７２５９号（以下、先行技術１という）に、アビオトロフィア属を含むグラム陽性連鎖球菌の同定に関する記載がある（請求項７および実施例１５から２０）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、先行技術１には、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡの塩基配列の決定と配列の相同性の解析をしなければならないという問題点がある。
本発明は、ＤＮＡの塩基配列の決定や配列の相同性の解析をすることなくアビオトロフィア属とグラニュリカテラ属の細菌を同定する方法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本願発明者は、鋭意研究の結果、アビオトロフィア属とグラニュリカテラ属を構成している細菌の種ごとに特異性が異なる３対のオリゴヌクレオチドをＰＣＲのプライマーとして用い、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ断片の検出を行うだけで種が特定できることをもって発明を完成し、上記課題を解決した。すなわち、
【０００５】
本発明の細菌とは、アビオトロフィア属とグラニュリカテラ属であり、より詳しくはアビオトロフィア属はアビオトロフィア属とグラニュリカテラ属に分けられ、アビオトロフィア属のアビオトロフィア・デフェクティバとグラニュリカテラ属の４つの種（アディアセンス、パラアディアセンス、エレガンス、バラエノプテレ）である。
本発明のＰＣＲとは、オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用する方法によりＤＮＡの増幅を行うことをいう。ＰＣＲの反応条件は常法により設定すればよい。
【０００６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号１に記載の塩基配列に相同性があるオリゴヌクレオチドである。
このオリゴヌクレオチドの２本（４９ｆと５０ｒ）を１対のプライマーとするプライマー１を用いることによって、アビオトロフィア属に分類されているアビオトロフィア・デフェクティバを特異的に同定することができる。また、
【０００７】
本発明のオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号２に記載の塩基配列に相同性があるオリゴヌクレオチドである。
このオリゴヌクレオチドの２本（５５ｆと５６ｒ）を１対のプライマーとするプライマー２を用いることによって、グラニュリカテラ属に分類されているグラニュリカテラ・アディアセンスとグラニュリカテラ・パラアディアセンスを特異的に同定することができる。さらに、
【０００８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号３に記載の塩基配列に相同性があるオリゴヌクレオチドである。
このオリゴヌクレオチドの２本（４１ｆ　と４２ｒ）を１対のプライマーとするプライマー３を用いることによって、グラニュリカテラ属に分類されているグラニュリカテラ・エレガンスを特異的に同定することができる。
【０００９】
本発明の細菌を同定する方法は、これらのオリゴヌクレオチドをＰＣＲのプライマーとして利用することからなる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態を、（１）本発明によって同定される細菌、（２）ＰＣＲのプライマーとして使用する３対のオリゴヌクレオチドの由来、（３）被検菌の対象になった細菌、（４）ゲノムＤＮＡの抽出方法、（５）ＰＣＲの反応、（６）ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ断片の検出方法、（７）実施例および（８）比較例、の順で説明する。
【００１１】
（１）本発明によって同定される細菌
本発明により、アビオトロフィア属とグラニュリカテラ属の細菌を特異的に同定することができる。これらの細菌は、ヒトの口腔内の常在細菌として分離される一方、臨床的には、細菌性心内膜炎、敗血症、結膜炎、脳膿瘍、咽頭炎、尿道感染症などの患者の血液や感染巣から起炎菌として分離される。最近、心内膜炎発症の原因の１つに歯科治療が指摘され、国によっては、「人工弁の装着者や高血圧患者など心内膜炎になりやすい人々に歯科治療を行う場合には、感染を予防するような処置をとるように」という勧告を学会が出しているところもある。
【００１２】
細菌学的には、これらの細菌は通性嫌気性グラム陽性連鎖球菌である。しかし、ふつうの連鎖球菌用の培地には増殖せず、ピリドキサール誘導体やＬ−システインが添加された培地にのみ増殖することができる。このように特異な栄養要求性を示すため、アビオトロフィア属とグラニュリカテラ属の細菌はエヌビーエス（ＮＶＳ、Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｌｙ　Ｖａｒｉａｎｔ　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）と呼ばれてきた。ＮＶＳはピリドキサール誘導体やＬ−システインを添加しない普通の培地の寒天平板では、スタフィロコッカス・アウレウスなど他の細菌のコロニーの周囲に衛星状に生育してサテライトコロニーを形成するという特徴をもっている。
【００１３】
問題になるのは、これらの細菌はコロニーが小さく、顕微鏡下での形態や染色性は不均一で、培養に数日を要することがあるなど、同定のための分離培養が難しいということである。そのため病気の診断に際し、細菌感染の所見があるにもかかわらず、原因菌が同定できないまま、培養陰性の炎症と診断されたケースが多くある。細菌を分離培養せずに同定することができれば、問題は解決される。
【００１４】
細菌を分離培養せずに同定する方法の１つに、ＰＣＲを利用したものがある。しかし、今までの方法は、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、配列の相同性を既知のデータと比較し、最も高い相同性を示す細菌をもって種を決定するという煩雑なものであった。
【００１５】
（２）ＰＣＲのプライマーとして使用する３対のオリゴヌクレオチドの由来
以下の説明文に記述の登録番号とは、ＤＤＢＪのデータベースで検索できるデータに付与されているアクセッション番号である。
（ア）プライマー１のオリゴヌクレオチドの由来
ＤＤＢＪのデータベースから、ストレプトコッカス・ミュータンスのデキストラングルコシダーゼ遺伝子ｄｅｘＢをコードしている塩基配列を探した（登録番号Ｍ７７３５１）。このなかにＴＧＧＡＴＧＡＣＡＡＴＧＧＣＴの配列がある。この配列をもつオリゴヌクレオチドをプライマーにして、健康なヒトの口腔内から分離された臨床分離株の１つであるアビオトロフィア・デフェクティバＹＴＳ２のゲノムを鋳型としたＰＣＲを行った。その結果、約０．６４ｋｂの大きさのＤＮＡ断片が増幅された。この断片にはＹＴＳ２株に由来する塩基６３３ｂｐが含まれていた（配列表、配列番号１）。
【００１６】
その領域のアミノ酸配列は、例えばラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ）という細菌のｄｌｔＢ、ｄｌｔＣと呼ばれる隣り合う２つの遺伝子がコードしているタンパク質（ともにＤ−アラニル　リポテイコ酸の生合成に関係したタンパク質、登録番号ＡＥ００６３５８）のアミノ酸配列と相同性がある。
配列番号１に記載したアビオトロフィア・デフェクティバＹＴＳ２株由来の６３３ｂｐからなる配列の中から、７６番から９３番までの配列（４９ｆ）と、４７４番から４９４番までの配列の相補鎖配列（５０ｒ）を選び、これらの配列をもつオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機によって人工的に合成し（ジェンセット社製）、１対からなるプライマー１を作成した。
【００１７】
（イ）プライマー２のオリゴヌクレオチドの由来
健康なヒトの口腔内から分離された臨床分離株の１つであるグラニュリカテラ・パラアディアセンスＴＫＴ１　（ＤＤＢＪに１６Ｓ　ｒＲＮＡの遺伝子の塩基配列が登録されている、登録番号ＡＢ０２２０２７）のゲノムＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩで消化し、約３．３　ｋｂからなる断片を得た。この断片の塩基配列の一部に、アミノ酸２７４残基をコードする８２５ｂｐからなる領域がある（配列表、配列番号２）。
そのアミノ酸配列は、例えばカルドセラム・サッカロリティカム（Ｃａｌｄｏｃｅｌｌｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）という細菌のＸｙｎＣ呼ばれる遺伝子がコードしているタンパク質（アセチルエステラーゼ、登録番号Ｍ３４４５９）のアミノ酸配列と相同性がある。
【００１８】
配列番号２に記載したグラニュリカテラ・パラアディアセンスＴＫＴ１株由来の８２５ｂｐからなる配列の中から、６１番から８２番までの配列（５５ｆ）と７８２番から８０３番までの配列の相補鎖配列（５６ｒ）を選び、これらの配列をもつオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機によって人工的に合成し（ジェンセット社製）、１対からなるプライマー２を作成した。
【００１９】
（ウ）プライマー３のオリゴヌクレオチドの由来
健康なヒトの口腔内から分離された臨床分離株の１つであるグラニュリカテラ・エレガンスＨＨＣ５（ＤＤＢＪに１６Ｓ　ｒＲＮＡ　遺伝子の塩基配列が登録されている、登録番号ＡＢ０２２０２６）のゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、１６４２ｂｐからなる断片を得た（配列表、配列番号３）。
この断片にコードされているアミノ酸配列は、ストレプトコッカス・ゴードニイという細菌のａｒｃＡ、ａｒｃＢに相当する隣り合う２つの遺伝子がコードしているタンパク質（アルギニンジヒドロラーゼおよびオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ、登録番号ＡＦ１７２７３０）のアミノ酸配列と相同性がある。
【００２０】
配列番号３に記載したグラニュリカテラ・エレガンスＨＨＣ５株由来の１６４２ｂｐからなる配列の中から、２１４番から２２９番までの配列（４１ｆ）と７００番から７１９番までの配列の相補鎖配列（４２ｒ）を選び、これらの配列をもつオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機によって人工的に合成し（ジェンセット社製）、１対からなるプライマー３を作成した。
【００２１】
本発明のＰＣＲのプライマーになる３対のオリゴヌクレオチドの塩基配列と、ＰＣＲによって増幅されるＤＮＡ断片の大きさ、および各プライマーを使用したＰＣＲによって特異的にＤＮＡが増幅されるようなゲノムをもつ細菌（本発明によって同定される細菌）を表１に示す。
【００２２】
【表１】
2004089107.tif 000002
【００２３】
（３）被検菌
１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の相同性に基づいた分類によって、特異な栄養要求性をもつＮＶＳとして知られていた連鎖球菌はストレプトコッカス属からアビオトロフィア属という新しい属に分類された。しかし、すぐに、アビオトロフィア属はアビオトロフィア属とグラニュリカテラ属に分けられ、結果としてＮＶＳは現在、アビオトロフィア属のアビオトロフィア・デフェクティバとグラニュリカテラ属の４つの種（アディアセンス、パラアディアセンス、エレガンス、バラエノプテレ）に分類されている。
これらアビオトロフィア属とグラニュリカテラ属の種なかで、バラエノプテレと呼ばれる種だけがヒト以外の生物（鯨）からの分離株（１株）をもつものである。
【００２４】
アビオトロフィア属の１１株とグラニュリカテラ属の３９株、およびこれらの細菌と系統樹で近い位置にある連鎖球（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ，　Ｄｏｌｏｓｉｇｒａｎｕｌｕｍ，　Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ，　Ｇｅｍｅｌｌａ，　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の２３株と、その周囲にＮＶＳがサテライトコロニーを形成する黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）および遺伝子組み換えの実験によく使用される大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）のそれぞれ１株を被検菌とした。これらを表２に示し、実施例の結果とともに示す。
【００２５】
（４）ゲノムＤＮＡの抽出方法
（細菌の培養）
アビオトロフィア属とグラニュリカテラ属の細菌は、ピリドキサール塩酸塩（０．００１％）を添加したＴＨブロス（Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ　ｂｒｏｔｈ；ＢＢＬ社製）で嫌気的に（窒素　８０％、水素　１０％、二酸化炭素　１０％）培養した。ただし、グラニュリカテラ・エレガンスの標準株であるＤＳＭ　１１６９３株のみは、ピリドキサール塩酸塩（０．００１％）の代わりに馬血清（５％）とＬ−システイン塩酸塩（０．０１％）を添加したトッドヘビットブロスで培養した。
その他の連鎖球菌（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ，　Ｄｏｌｏｓｉｇｒａｎｕｌｕｍ，　Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ，　Ｇｅｍｅｌｌａ，　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）と黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）はトッドヘビットブロスで嫌気的に培養した。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）はＬＢブロス（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ　ｂｒｏｔｈ；　Ｄｉｆｃｏ社製）で好気的に培養した。
【００２６】
（ゲノムＤＮＡの調整）
培養液１ｍｌを遠心し、菌のペレットを得た。それを１００μｌの緩衝液（１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含有した１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ，　ｐＨ　７．４）に懸濁し、沸騰水中で３分間加熱した。加熱処理後、再度遠心し、得られた上清をＴＥ緩衝液（１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ　７．４）で１０倍に希釈した。この希釈液をゲノムＤＮＡの溶液とした。このＤＮＡはＰＣＲでは鋳型となる。
【００２７】
（５）ＰＣＲの反応
（反応溶液の調整）
ＰＣＲの反応に必要なＤＮＡポリメラーゼと緩衝液を２倍の濃度で含んだＴａｑ溶液（タカラ社製）を１０μｌ、ゲノムＤＮＡを２μｌ、これに最終濃度がそれぞれ０．２　μＭになるように希釈した１対のプライマーを８μｌ加えて総量２０μｌの反応溶液とした。
【００２８】
（反応）
ＰＣＲの反応は常法により行えばよいが、好ましい１例として、サーマルサイクラーを用いて、９４℃で１分間加熱した後、引き続き、変性９４℃で１分間、アニーリング５０℃で０．５　分間、伸長反応６２℃で１分間のサイクルを２５サイクル行った。
【００２９】
（６）増幅されたＤＮＡ断片の検出
ＰＣＲの反応終了後、溶液８μｌを採取し、これを分子量マーカーと同時に２％アガロースゲルで電気泳し（１００Ｖ、２０から３０分間）、ゲルをエチジウムブロマイドで染色する。染色後のゲルを紫外線照射すると、増幅されたＤＮＡ断片は蛍光を発する１本のバンドに見える。バンドの位置をマーカーの相対移動度と比較し、増幅されたＤＮＡ断片の大きさを推定する。
【００３０】
以下、本発明を実施例および比較例により詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。細菌の株名を表す数字の前についているＡＴＣＣ、ＤＳＭ、ＮＣＦＢ、ＮＣＴＣはそれぞれアメリカ、ドイツ、イギリスに存在する微生物の収集・分類・保存・頒布などを行っている国際的な機関に　由来するものであることを示しており、その株が属する種の標準株か代表株として使用される。それ以外の株は臨床分離株であるが、すべて性状が明らかな公知の株である。
【００３１】
（７）実施例
〔実施例１〕　アビオトロフィア・デフェクティバから増幅されるＤＮＡ断片の検出
アビオトロフィア・デフェクティバの１１株（ＡＴＣＣ　４９１７６，　ＰＥ７，　ＳＣ１０，　ＮＶＳ−４７，　Ｃ１−２，　Ｃ８−３，　Ｓ１０５７−１，　ＴＫ−１，　ＴＫ−４，　ＹＫ−３，　ＹＴＳ２　）からゲノムＤＮＡを抽出した。前述の方法に従って、ゲノムＤＮＡとそれぞれのプライマー存在下にＰＣＲ反応を行い、増幅されたＤＮＡ断片が検出されるかどうかを調べた。その結果、プライマー１を用いた場合は全ての株から同じ大きさのＤＮＡ断片（０．４２　ｋｂ）が検出されたが、プライマー２とプライマー３の場合にはＤＮＡ断片は検出されなかった。
【００３２】
〔実施例２〕　グラニュリカテラ・アディアセンスから増幅されるＤＮＡ断片の検出
グラニュリカテラ・アディアセンスの１６株（ＡＴＣＣ　４９１７５，Ｃ５０，Ｇ４０，　ＧａＤ，Ｌ６１，Ｃ１−１，Ｃ１−３，Ｃ２−１，Ｃ２−２，Ｃ６−２，ＨＨＣ３，ＨＨＰ１，Ｐ６−１，Ｓ９６１−２，Ｓ１０５８−２，ＹＴＣ１）からゲノムＤＮＡを抽出した。前述の方法に従って、ゲノムＤＮＡとそれぞれのプライマー存在下にＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡ断片が検出されるかどうかを調べた。その結果、プライマー２を用いた場合は全ての株から同じ大きさのＤＮＡ断片（０．７４ｋｂ）が検出されたが、プライマー１とプライマー３の場合にはＤＮＡ断片は検出されなかった。
【００３３】
〔実施例３〕　グラニュリカテラ・パラアディアセンスから増幅されるＤＮＡ断片の検出
グラニュリカテラ・パラアディアセンスの１４株（ＡＴＣＣ　２７５２７，Ｃ４−１，　Ｃ４−３，Ｃ５−１，ＨＫＴ１−１，ＨＫＴ１−２，ＨＫＴ１−４，ＨＫＴ２−２，ＮＭＰ２，Ｐ７−４，Ｓ４９−２，ＴＫＴ１，ＴＫＴ２，ＹＴＴ３）からゲノムＤＮＡを抽出した。前述の方法に従って、ゲノムＤＮＡとそれぞれのプライマー存在下にＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡ断片が検出されるかどうかを調べた。その結果、プライマー２を用いた場合は全ての株から同じ大きさのＤＮＡ断片（０．７４ｋｂ）が検出されたが、プライマー１とプライマー３の場合にはＤＮＡ断片は検出されなかった。
【００３４】
〔実施例４〕　グラニュリカテラ・エレガンスから増幅されるＤＮＡ断片の検出
グラニュリカテラ・エレガンスの８株（ＤＳＭ　１１６９３，Ｃ９−２，ＨＨＣ５，ＮＭＰ３，Ｓ４３−１，Ｓ９４３−２，Ｓ１０５２−１，ＹＴＭ１）からゲノムＤＮＡを抽出した。前述の方法に従って、ゲノムＤＮＡとそれぞれのプライマー存在下にＰＣＲ反応を行い、増幅されたＤＮＡ断片が検出されるかどうかを調べた。その結果、プライマー３を用いた場合は全ての株から同じ大きさのＤＮＡ断片（０．５１ｋｂ）が検出されたが、プライマー１とプライマー２の場合にはＤＮＡ断片は検出されなかった。
【００３５】
〔比較例１〕　グラニュリカテラ・バラエノプテレから増幅されるＤＮＡ断片の検出
グラニュリカテラ・バラエノプテレ　ＡＴＣＣ　７００８１３株からゲノムＤＮＡを抽出した。前述の方法に従って、ゲノムＤＮＡとそれぞれのプライマー存在下にＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡ断片が検出されるかどうかを調べた。その結果、どのプライマーを用いた場合にもＤＮＡ断片は検出されなかった。
【００３６】
〔比較例２〕　他の連鎖球菌や黄色ブドウ球菌や大腸菌から増幅されるＤＮＡ断片の検出
連鎖球菌の２３株（Ａ．　ｕｒｉｎａｅ　ＮＣＦＢ　２８９３，　Ａ．　ｖｉｒｉｄａｎｓ　ＤＳＭ　２０３４０，　Ｄ．　ｐｉｇｒｕｍ　ＮＣＦＢ　２９７５，　Ｅ．　ｄｕｒａｎｓ　ＡＴＣＣ　１９４３２，　Ｅ．　ｆａｅｃａｌｉｓＳＳ４９９，　Ｅ．　ｈｉｒａｅ　ＡＴＣＣ　９７９０，　Ｇ．　ｈａｅｍｏｌｙｓａｎｓ　ＡＴＣＣ　１０３７９，　Ｇ．　ｍｏｒｂｉｌｌｏｒｕｍ　ＡＴＣＣ　２７８２４，　Ｓ．　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ　ＡＴＣＣ　３３３９，　Ｓ．ｂｏｖｉｓ　ＡＴＣＣ　３３３１７，　Ｓ．　ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ　ＮＣＴＣ　１０７０８，Ｓ．　ｃｒｉｃｅｔｕｓ　ＡＴＣＣ　１９６４２，　Ｓ．　ｇｏｒｄｏｎｉｉ　ＡＴＣＣ　１０５５８，　Ｓ．　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ　ＡＴＣＣ　２７３３５，　Ｓ．　ｍｉｔｉｓ　ＡＴＣＣ　６２４９，　Ｓ．　ｍｕｔａｎｓ　ＡＴＣＣ　３３５３５，　Ｓ．　ｏｒａｌｉｓ　ＡＴＣＣ　９８１０，　Ｓ．　ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ　ＡＴＣＣ　１５９０９，　Ｓ．　ｐｙｏｇｅｎｅｓ　ＳＶ，　Ｓ．　ｒａｔｔｉ　ＡＴＣＣ　１９６４５，　Ｓ．　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ　ＡＴＣＣ　１３４１９，　Ｓ．　ｓａｎｇｕｉｎｉｓ　ＡＴＣＣ　１０５５６，　Ｓ．　ｓｏｂｒｉｎｕｓ　ＯＭＺ１７６）と、黄色ブドウ球菌の１株　（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ　ＡＴＣＣ　２１０２７）と、大腸菌の１株（Ｅ．ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０）を選んだ。これらの菌株から前述の方法に従って、ゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノムＤＮＡとそれぞれのプライマー存在下にＰＣＲ反応を行い、増幅されたＤＮＡ断片が検出されるかどうかを調べた。その結果、すべての菌株で、どのプライマーを用いた場合にもＤＮＡ断片は検出されなかった。
以上の実施例と比較例の結果を表２にまとめた。
【００３７】
【表２】
2004089107.tif 000003
【００３８】
結論として、ＰＣＲの結果を電気泳動法で調べるだけで簡単に、
（１）　プライマー１はアビオトロフィア・デフェクティバを特異的に同定し、
（２）　プライマー２はグラニュリカテラ・アディアセンスとグラニュリカテラ・パラアディアセンスを特異的に同定し、
（３）　プライマー３はグラニュリカテラ・エレガンスを特異的に同定する。
（４）　グラニュリカテラ・パラアディアセンスはグラニュリカテラ・アディアセンスのなかから分離されたグループで、両者のあいだには生化学的性状による差異はなく、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼイションによる差異も１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の配列の相同性に基づく差異もエレガンスやバラエノプテレに比較すると極めて小さい。臨床学的にみても、両者の間に差は認められておらず、同一プライマーによって、アディアセンスとパラアディアセンスが区別されずに検出されるとしても問題にはならない。
（５）　グラニュリカテラ・バラエノプテレはどのプライマーでも同定されない。しかし、バラエノプテレはヒト以外の生物（鯨）から分離された種であり、しかもＡＴＣＣ　７００８１３の１株しか知られていない。
【００３９】
したがって、ヒト以外の動物を対象にするのでなければバラエノプテレを同定する必要はない。以上のことから、本発明による３対のオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーにしたＰＣＲにより、アビオトロフィア属とグラニュリカテラ属の細菌を簡単に同定することができるのは明らかである。
【００４０】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明のオリゴヌクレオチドをＰＣＲのプライマーとして用いることにより、増幅されたＤＮＡの有無と大きさだけでアビオトロフィア属とグラニュリカテラ属の細菌を同定することができる。
増幅されたＤＮＡの塩基配列を決定したり配列の相同性を検索したりする必要がないので、誰にでも簡単・明瞭に細菌の同定ができる。
【００４１】
【配列表】
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【００４２】
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【００４３】
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