(57)【要約】【課題】グリセルアルデヒドによるメイラード反応生成物を合成し、これを利用した医薬組成物および臨床検査方法を提供すること。【解決手段】（１）式（Ｉ）【化１】2004250404.tif 000014（式中、Ｒ１は水素、アミノ酸残基、ペプチド残基、又は置換されていてもよいアルキル基を表し、Ｒ２又はＲ３はそれぞれ独立に、水酸基又はそのエステル化基を表し、Ｘ−は１価の陰イオンを表す。）で示される化合物、（２）（１）に記載された式（Ｉ）で表される化合物を含有する医薬組成物、（３）（２）に記載された医薬組成物を用いたがん細胞の増殖抑制方法、（４）（１）に記載された化合物を指標とする臨床検査方法。【選択図】  図２
2004250404.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2004250404.tif 000013
（式中、Ｒ１は水素、アミノ酸残基、ペプチド残基、又は置換されていてもよいアルキル基を表し、Ｒ２又はＲ３はそれぞれ独立に、水酸基又はそのエステル化基を表し、Ｘ−は１価の陰イオンを表す。）で示される化合物。
【請求項２】
請求項１に記載された式（Ｉ）で表される化合物を含有する医薬組成物。
【請求項３】
請求項２に記載された医薬組成物を用いたがん細胞の増殖抑制方法。
【請求項４】
請求項１に記載された式（Ｉ）で表される化合物を指標とする臨床検査方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ピリジニウム化合物を使用する医薬組成物および臨床検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質やアミノ酸等のアミノ化合物と還元糖の非酵素的反応は一般にメイラード反応と呼ばれ、食品の着色、香気成分の生成、劣化等に広く関与していることが知られている（非特許文献１参照）。近年、生体内でもメイラード反応が進行し、多くのタンパク質が糖化されており、糖尿病などの生活習慣病や老化の成因に強く関連していることが徐々に明らかにされつつある（非特許文献２参照）。
【０００３】
メイラード反応は大別すると次の２段階の反応で説明される。すなわち、還元糖のホルミル基がタンパク質のＮ末端アミノ基や、リジンのε−アミノ基と反応してシッフ塩基を形成した後、１，２−エナミノールを経てアマドリ転位産物が生成する前期反応と、その後、酸化、脱水、縮合などの複雑な反応を経て、次第に褐色、蛍光、分子内及び分子間の架橋形成、またマクロファージなどが持つＡＧＥ受容体によってリガンドとして認識されるなどの特徴を有するメイラード反応後期段階生成物（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ：ＡＧＥ）へと変化する後期反応に分けて考えられる。
【０００４】
ＡＧＥとはメイラード反応前期中間体が酸化、脱水反応などの複雑な反応を経て不可逆的に生成した構造体の総称であり、カルボキシメチルリジン、ピラリン、ペントシジン、クロスリン、イミダゾロン等が知られているが、まだ多くの生体内ＡＧＥが同定されていないと言われている。糖尿病合併症、アルツハイマー病、動脈硬化症等の多くの細胞障害性疾患においてＡＧＥの関与が推測されており、診断・治療への応用が期待されているが、現状ではそのような応用例はない。また、生体内メイラード反応に関する研究例としては、還元糖を反応剤として用いるものがほとんどであり、他の反応剤を用いた研究例はほとんどない。
【０００５】
近年、糖尿病合併症やアルツハイマー病の病変部が抗グリセルアルデヒド修飾タンパク質抗体で染色されることから、グリセルアルデヒドによる生体内メイラード反応の生成物が疾病に深く関与していることが推測されている。グリセルアルデヒドの生体内メイラード反応の生成物を定量することができれば、糖尿病合併症やアルツハイマー病の進行度を推測する指標になると考えられるが、指標となるグリセルアルデヒドによる生体内メイラード反応生成物が単離、同定された研究例はいままでになかった。
【０００６】
【非特許文献１】
早瀬文孝、化学と生物、３１（９）、５９２（１９９３）
【非特許文献２】
永井竜児、佐野裕之、堀内正公、化学と生物、３６（２）、８３（１９９８）
【０００７】
【解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、グリセルアルデヒドによるメイラード反応生成物を合成し、これを利用した医薬組成物および臨床検査方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記の課題は以下の手段により達成された。
（１）式（Ｉ）
【化２】
2004250404.tif 000003
（式中、Ｒ１は水素、アミノ酸残基、ペプチド残基、又は置換されていてもよいアルキル基を表し、Ｒ２又はＲ３はそれぞれ独立に、水酸基又はそのエステル化基を表し、Ｘ−は１価の陰イオンを表す。）で示される化合物、
（２）（１）に記載された式（Ｉ）で表される化合物を含有する医薬組成物、
（３）（２）に記載された医薬組成物を用いたがん細胞の増殖抑制方法、
（４）（１）に記載された化合物を指標とする臨床検査方法。
【０００９】
以下に上記本発明を説明する。
本発明者らは、グリセルアルデヒドのメイラード反応について種々研究を重ねた結果、グリセルアルデヒドとＮα−アセチルリジンの反応生成物から新規なピリジニウム化合物を単離同定した。このピリジニウム化合物は、１−（５−アセチルアミノ−５−カルボキシペンチル）−３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルピリジニウムであり、下記にその化学式を示す。
【化３】
2004250404.tif 000004
【００１０】
この化合物は、１分子のＮα−アセチルリジンと２分子のグリセルアルデヒドが反応して生成したと考えられる化学構造を有する。
以下、本化合物をＧＬＡＰ（ＧＬｙｃｅｒＡｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）と略称する。
本発明は、下記のＧＬＡＰ化合物（Ｉ）の用途を提供するものである。
【化４】
2004250404.tif 000005
（式中、Ｒ１は水素、アミノ酸残基、ペプチド残基、又は置換されていてもよいアルキル基を表し、Ｒ２又はＲ３はそれぞれ独立に、水酸基又はそのエステル化基を表し、Ｘ−は１価の陰イオンを表す。）
【００１１】
例えば、ＧＬＡＰの生理作用について検討した結果、ヒト骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０増殖抑制活性を示すことを見出し、この知見に基づいて上記ＧＬＡＰ化合物を含有する医薬組成物を完成させた。
【００１２】
【発明の実施の形態】
式（Ｉ）において、Ｒ１は水素、アミノ酸残基、ペプチド残基、又は置換されていてもよいアルキル基を表す。残基とは、アミノ酸又はペプチドから水素を１つ除いた基を意味する。アミノ酸としては、化合物として入手可能なアミノ酸であり、天然型アミノ酸又はそのエステル体が好ましく、リジン、Ｎα−アセチルリジンなどが例示できる。ペプチドとしては、アミノ酸１〜２０残基であり、１〜１０残基が好ましく、グリシルリジンなどが例示できる。置換されていてもよいアルキル基としては、炭素数（Ｃ）が１〜２０であり、Ｃ１〜１０が好ましく、メチル基、エチル基、イソプロピル基などが例示できる。
Ｒ２又はＲ３はそれぞれ独立に、水酸基又はそのエステルを表す。エステルとしては、Ｃ１〜２０のエステルであり、Ｃ１〜６が好ましく、酢酸エステルなどが例示できる。
【００１３】
本発明の式（Ｉ）において、より好ましい置換基の組み合わせは、次の式（ＩＩ）で表される化合物である。
【化５】
2004250404.tif 000006
（式中、Ｒ１は水素又はアシル基を表し、Ｒ２はＯＨ、アルコキシ基又はアミノ基を表し、Ｒ３は水素又は低級アルキル基を表し、Ｒ４は水素又は低級アルキル基を表し、Ｘ−は薬理学的に許容される１価の陰イオンを表し、ｎは１以上の整数を表す。）
式（ＩＩ）においてＲ１が表すアシル基は、Ｃ１〜２０であり、Ｃ２〜８が好ましく、アセチル基、エチルカルボニル基、プロピルカルボニル基、ベンゾイル基などが例示できる。
Ｒ２が表すアルコキシ基は、Ｃ１〜２０であり、Ｃ１〜８が好ましく、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、フェノキシ基などが例示できる。Ｒ２が表すアミノ基としては遊離のアミノ基の他に１置換アミノ基でもよく、メチルアミノ基、アニリノ基が例示できる。
Ｒ３又はＲ４の表す低級アルキル基としては、Ｃ１〜６であり、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基があげられる。
Ｘ−は、薬理学的に許容される１価の陰イオンである。生体内に存在できる１価の陰イオンであればよく、例えば塩化物イオン、臭化物イオンなどが例示できる。
【００１４】
式（ＩＩ）において、置換基及び陰イオンの最も好ましい組み合わせは、Ｒ１がアセチル基であり、Ｒ２はヒドロキシ基であり、Ｒ３およびＲ４は水素であり、ｎは４であり、Ｘ−は塩素イオンである。
また、一連のＧＬＡＰ化合物には不斉炭素が存在するが、本発明においてはそれぞれの光学的に純粋な鏡像異性体及びその混合物も含まれる。
【００１５】
以下に式（ＩＩ）に表される化合物の具体例を示す。
（１）１−（５−アセチルアミノ−５−カルボキシペンチル）−３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルピリジニウムクロリド
（２）１−（５−アミノ−５−カルボキシペンチル）−３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルピリジニウムクロリド
（３）１−（５−アセチルアミノ−５−カルボキシペンチル）−３−メトキシ−５−ヒドロキシメチルピリジニウムクロリド
（４）１−（５−アミノ−５−カルボキシペンチル）−３−メトキシ−５−ヒドロキシメチルピリジニウムクロリド
（５）１−（５−アセチルアミノ−５−カルボキシプロピル）−３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルピリジニウムクロリド
（６）１−（５−アミノ−５−カルボキシプロピル）−３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルピリジニウムクロリド
（７）１−（５−アセチルアミノ−５−カルボキシプロピル）−３−メトキシ−５−ヒドロキシメチルピリジニウムクロリド
（８）１−（５−アミノ−５−カルボキシプロピル）−３−メトキシ−５−ヒドロキシメチルピリジニウムクロリド
【００１６】
次に、本発明における式（Ｉ）の好ましい実施の形態である式（ＩＩ）で表される化合物の合成について説明する。
【００１７】
本発明の式（ＩＩ）で表される化合物は、グリセルアルデヒドと適当なアミノ酸をリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、２５℃ないし６０℃、最も好ましくは３７℃にて、１日ないし１４日間、最も好ましくは７日間インキュベートすることにより合成することができる。反応混合物をセルロースアセテートメンブレンフィルターに通し不溶物を除去した後に、水−アセトニトリル系で平衡化した逆相ＨＰＬＣにて容易に精製することができる。こうして単離された本発明の式（ＩＩ）で表される化合物は、定法に従い、質量分析スペクトル、核磁気共鳴スペクトル等によりその化学構造を決定することができる。
【００１８】
また、本発明の式（ＩＩ）で表される化合物は、次に示す反応式にしたがって有機合成的手法により製造することもできる。
（反応式Ａ）
【化６】
2004250404.tif 000007
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｘ−及びｎは前記式（ＩＩ）と同義である。）
すなわち、アミノ酸誘導体（ＩＩＩ）とピリジン誘導体（ＩＶ）を加熱下に反応させることにより化合物（ＩＩ）が得られる。
例えば、アミノ酸誘導体（ＩＩＩ）として２−アセチルアミノ−６−クロロヘキサン酸を用い、ピリジン誘導体（ＩＶ）として３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルピリジンを用いることにより、１−（５−アセチルアミノ−５−カルボキシペンチル）−３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルピリジニウムクロリド（化合物（１））が得られる。
原料物質として用いるアミノ酸誘導体（ＩＩＩ）は、公知のアミノ酸を出発物質として、例えば次の方法で製造することができる。
【００１９】
（反応式Ｂ）
【化７】
2004250404.tif 000008
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ−及びｎは前記式（ＩＩ）と同義である。）
すなわち、塩化チオニルの存在下、アミノ酸（Ｖ）とＲ２Ｈを縮合し（ＶＩ）を得る。ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）の存在下、（ＶＩ）とＲ１Ｈを縮合し（ＶＩＩ）を得た後に、末端水酸基をハロゲン化することによりアミノ酸誘導体（ＩＩＩ）を得ることができる。
例えば、アミノ酸（Ｖ）として６−ヒドロキシノルロイシンを用いれば、化合物（１）の原料物質である２−アセチルアミノ−６−クロロヘキサン酸が得られる。
また、ピリジン誘導体（ＩＶ）は、公知の５−ヒドロキシニコチン酸メチルを出発物質として、例えば次の方法で製造することができる。
【００２０】
（反応式Ｃ）
【化８】
2004250404.tif 000009
（式中、Ｒ３及びＲ４は前記式（ＩＩ）と同義である。）
すなわち、５−ヒドロキシニコチン酸メチルのフェノール性水酸基をアルキル化して（ＶＩＩＩ）を得る。（ＶＩＩＩ）のエステル部分を水素化アルミニウムリチウムで還元し（ＩＸ）を得た後に、水酸基をアルキル化することによりピリジン誘導体（ＩＶ）を得ることができる。
例えば、５−ヒドロキシニコチン酸メチルを水素化アルミニウムリチウムで還元することにより、化合物（１）の原料物質である３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルピリジンが得られる。
【００２１】
以下に、１−（５−アセチルアミノ−５−カルボキシペンチル）−３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルピリジニウムクロリド（化合物（１））の製造について説明する。
（反応式Ａ１）
【化９】
2004250404.tif 000010
２−アセチルアミノ−６−クロロヘキサン酸（ＩＩＩ）と３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルピリジン（ＩＶ）を加熱下に反応させることにより１−（５−アセチルアミノ−５−カルボキシペンチル）−３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルピリジニウムクロリド（化合物（１））が得られる。
【００２２】
原料物質である２−アセチルアミノ−６−クロロヘキサン酸（ＩＩＩ）は以下の方法により製造できる。
（反応式Ｂ１）
【化１０】
2004250404.tif 000011
すなわち、ＤＣＣの存在下、６−ヒドロキシノルロイシンと酢酸を縮合することにより化合物（ＶＩＩ）を得る。化合物（ＶＩＩ）の水酸基を四塩化炭素、トリフェニルホスフィンでクロロ化することにより２−アセチルアミノ−６−クロロヘキサン酸（ＩＩＩ）が得られる。
【００２３】
原料物質であるピリジン誘導体３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルピリジン（ＩＶ）は以下の方法により製造できる。
（反応式Ｃ１）
【化１１】
2004250404.tif 000012
すなわち、５−ヒドロキシニコチン酸メチルを水素化アルミニウムリチウムで還元することにより３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルピリジン（ＩＶ）が得られる。
【００２４】
本発明の式（Ｉ）で表される化合物は蛍光性物質（励起：２９８ｎｍ、蛍光：３８８ｎｍ）であるので、蛍光吸収スペクトルを測定することにより容易に検出・定量することができる。また、２９０ｎｍ付近に紫外吸収極大を有するためにＬＣ−ＭＳスペクトルの測定やＨＰＬＣ分析も検出・定量の補助的手段となりうる。
【００２５】
本発明の式（Ｉ）で表される化合物は、製剤化し、医薬組成物として使用することができる。
【００２６】
製剤としては特定のものに限定されず、日本薬局方に規定された製剤の中から治療方針に合うものを選ぶことができ、錠剤、注射剤、顆粒剤などが例示できる（渡邊光夫編、日本薬局方マニュアル、南山堂（１９９８年））。
【００２７】
製剤の保存中の性状および品質の基準を確保し、又はその有用性を高めるために添加剤を加えることができる。添加剤としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤などが例示できる（日本医薬品添加剤協会編集、医薬品添加物辞典、薬事日報社（１９９４年））。
【００２８】
本発明のＧＬＡＰ化合物は、がん細胞増殖抑制剤として非経口的に投与することができる。その投与量は、治療すべき疾患の程度により増減されるが、通常１日当り０．０１ないし１０ｍｇ／Ｋｇの範囲内で選ばれる。このものは、細胞毒性による細胞増殖抑制作用を示すため、他の細胞増殖抑制剤よりも少ない量の投与で十分な効果が得られる。また、このものは０．１ないし１０％濃度の水性溶液として製剤化されるが、所望に応じ溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、安定剤、保存剤、無痛化剤など注射剤に慣用されている添加剤を併用することもできる。さらに、必要な場合には他の抗悪性新生物剤と併用することもできる。
【００２９】
本発明のＧＬＡＰ化合物は糖尿病合併症、アルツハイマー病、動脈硬化症の診断の指標として用いることができる。これらの疾患を有する患者の血液、尿あるいは病変組織を採取し、ＧＬＡＰ化合物量を定量することにより病気の進行度を正確に判断することができ、医師は病気の進行度に応じた的確な治療をすることが可能である。また、抗ＧＬＡＰ抗体を作成することにより、免疫学的手法を用いてＧＬＡＰ化合物量を定量することも可能である。
【００３０】
本発明のＧＬＡＰ化合物ががん細胞増殖抑制剤であることを利用すれば、がんの重篤度の段階あるいはレベルおよび薬物、放射線、またはいくつかの他の処置形態へのがんの感応性を決定するための診断評価あるいはキットとして使用することができる。患者由来の細胞を組織培養する。細胞培養物、及び同一あるいは異なる患者からの細胞株、初代細胞、あるいは非新生物細胞でありうるコントロール培養物（陽性及び／あるいは陰性コントロール細胞）に、本発明のＧＬＡＰ化合物を加える。化合物処理培養物及びコントロール培養物を、一定期間、好ましくは１日、より好ましくは１ないし６時間、さらに最も好ましくは１時間未満インキュベートする。培養物を、インキュベーション期間後試験し、細胞分裂、細胞増殖、ＤＮＡ複製、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質合成、あるいはサイトカイン、サイトカインレセプター、他の細胞表面分子または他の抗原の発現量を決定する。コントロールと比較して活性への効果が大きくなると、試験されるがんの特定の形態が処置を必要とする見込みが大きくなる。このような評価は、特定の患者のための最善の治療方針の決定における診断ツールとして、および可能な治療的あるいは予防的用途のための新しい化合物のスクリーニングのための診断ツールとしても広く有用であり得る。ガンの重篤度対化学療法の有効性の図あるいは表を作成することが可能となる。このようにして、有効性が大きく、かつ危険性の少ない治療薬を選択することが可能である。
【００３１】
さらに本発明のＧＬＡＰ化合物は近年生体内メイラード反応の関与が予測されている腫瘍破壊因子（ＴＮＦ）やインターロイキン１（ＩＬ−１）等のサイトカイン産生の分子レベルでのメカニズム解明のための研究ツールとして利用が可能である。また、新規ＡＧＥ受容体の発見及びそのｃＤＮＡのクローニングのための研究ツールとしても利用が可能であり、ひいてはいまだに発症メカニズムが未解明で特効薬のない治療薬の研究に応用することが可能である。
【００３２】
（合成例１）
１−（５−アセチルアミノ−５−カルボキシペンチル）−３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルピリジニウムの合成、単離及び構造決定を行った。
グリセルアルデヒド（２００ｍＭ）とＮα−Ｌ−アセチルリジン（１００ｍＭ）を０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、３７℃にて１週間インキュベートした。反応混合物をセルロースアセテートメンブレンフィルター（０．２０μｍ）に通した後に、逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｅｇａｓｉｌ−ＯＤＳ、溶離液：リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）−アセトニトリル系、流量：４ｍｌ／ｍｉｎ、測定波長：２１５ｎｍ）に付した。このときのＨＰＬＣチャートを図１に示した。保持時間２０分前後の画分を分取することにより１−（５−アセチルアミノ−５−カルボキシペンチル）−３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチルピリジニウム単離した。次にこのものの化学構造を決定するためにＭＳスペクトル及びＮＭＲスペクトルを測定した。
【００３３】
ＭＳスペクトルデータ
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ  ｍ／ｚ：２９７（［Ｍ］＋）
ＦＡＢ−ＭＳ  ｍ／ｚ：２９７（［Ｍ］＋）
ＨＲ−ＦＡＢ−ＭＳ  ｍ／ｚ（［Ｍ］＋）：計算値Ｃ１４Ｈ２１Ｎ２Ｏ５：２９７．１４５０  実測値：２９７．１４２５
ＭＳスペクトルデータよりこのものの分子量は２９７であり、分子式はＣ１４Ｈ２１Ｎ２Ｏ５であることがわかった。
【００３４】
ＮＭＲスペクトルデータ
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルデータ
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ１．４０  （ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−），１．９０（，ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２），２．００（，ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−），２．１０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３ＣＯ−），４．２０（ｍ，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２−），４．５０（ｍ，１Ｈ，−ＣＨ−），７．９４（ｓ，１Ｈ，＝ＣＨ−），８．３４（ｓ，１Ｈ，＝ＣＨ−），８．３８（ｓ，１Ｈ，＝ＣＨ−）．
【００３５】
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルデータ
１３Ｃ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ２１．７（ＣＨ３），２１．７（ＣＨ２），２９．９（ＣＨ２），３０．１（ＣＨ２），５３．０（ＣＨ），６０．０（ＣＨ２），６２．０（ＣＨ２），１２９．５（ＣＨ），１３１．６（ＣＨ），１３４．０（ＣＨ），１４３．３（Ｃ），１５６．７（Ｃ），１７４．０（Ｃ），１７７．０（Ｃ）
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルデータ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルデータより全水素及び炭素の帰属を決定した。また、ＤＥＰＴスペクトル、１Ｈ−１ＨＣＯＳＹ、１Ｈ−１３ＣＣＯＳＹスペクトルを測定・解析することにより帰属の妥当性を評価した。
【００３６】
【実施例】
次に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はそれらの例によってなんら限定されるものではない。
（実施例１）
ヒト白血病細胞ＨＬ−６０に対するＧＬＡＰ類縁化合物の細胞毒性と細胞増殖抑制活性についての実験方法及び結果を以下に示す。
ＨＬ−６０細胞を５００００ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるようにＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で調整し、培養用２４孔プラスチックプレートに１ｍｌずつ分注した。２４時間培養した後、ＧＬＡＰ（１００μｇ／ｍｌ）を添加した。さらに２４時間または９６時間培養し、トリパンブルー色素排除法を用いて生細胞数を計測した。なお、ＧＬＡＰを添加していないものを対照とした。
結果を図２に示す。ＧＬＡＰを添加したプレートの細胞数は対照群に比較して有意に細胞数が少なく、ＧＬＡＰの添加によってＨＬ−６０細胞の増殖が抑制されていることがわかった。
【００３７】
【発明の効果】
本発明におけるＧＬＡＰ化合物は濃度依存的な細胞毒性作用を示すことから、骨髄性白血病等の血液がん及び固形がんのがん細胞増殖を抑制するのに用いることができる。本発明におけるＧＬＡＰ化合物は糖尿病合併症、アルツハイマー病、動脈硬化症等の細胞障害性疾患の進行度合を正確に把握するための臨床検査の判断指標として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＧＬＡＰを単離する際のＨＰＬＣチャートを示す。横軸は保持時間を表し、単位は分である。縦軸は２１５ｎｍにおける吸光度を表す。
【図２】ヒト白血病細胞ＨＬ−６０に対するＧＬＡＰの細胞増殖抑制活性を示したグラフである。
【図１】
2004250404.tif 000015
【図２】
2004250404.tif 000016