(57)【要約】【課題】簡便かつ抽出効率のよい土壌中の微生物のＤＮＡ抽出方法を提供する。【解決手段】微生物が含まれる土壌を瞬間凍結し、この瞬間凍結した土壌を凍結乾燥した後粉砕し、土壌に含まれる微生物のＤＮＡを抽出することを特徴とする土壌中の微生物のＤＮＡ抽出方法。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物が含まれる土壌を瞬間凍結し、この瞬間凍結した土壌を凍結乾燥した後粉砕し、土壌に含まれる微生物のＤＮＡを抽出することを特徴とする土壌中の微生物のＤＮＡ抽出方法。
【請求項２】
前記微生物が、菌類または真核生物であることを特徴とする請求項１記載の土壌に含まれる微生物のＤＮＡ抽出法。
【請求項３】
前記瞬間凍結が、液体窒素、液体酸素または液体空気を用いる瞬間凍結であることを特徴とする請求項１または２に記載の土壌に含まれる微生物のＤＮＡ抽出方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡの抽出が、粉砕した土壌にカチオン界面活性剤を含有する緩衝液を反応させ、有機溶媒と混合して水相を分離し、該水相からアルコール系溶媒でＤＮＡを析出させる方法であることを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載の土壌に含まれる微生物のＤＮＡ抽出方法。
【請求項５】
微生物が含まれる土壌を瞬間凍結し、この瞬間凍結した土壌を凍結乾燥した後粉砕し、土壌に含まれる微生物のＤＮＡを抽出し、特異的に反応するプライマーを該ＤＮＡに加え、ＰＣＲ法により検出することを特徴とする土壌に含まれる微生物のＤＮＡ分析方法。
【請求項６】
前記微生物が、菌類または真核生物であることを特徴とする請求項５に記載の土壌に含まれる微生物のＤＮＡ分析方法。
【請求項７】
前記瞬間凍結が、液体窒素、液体酸素または液体空気を用いる瞬間凍結であることを特徴とする請求項５または６に記載の土壌に含まれる微生物のＤＮＡ分析方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡの抽出が、粉砕した土壌にカチオン界面活性剤を含有する緩衝液を反応させ、有機溶媒と混合して水相を分離し、該水相からアルコール系溶媒でＤＮＡを析出させる方法であることを特徴とする請求項５ないし請求項７のいずれか１項に記載の土壌に含まれる微生物のＤＮＡ分析方法。
【請求項９】
前記プライマーが配列番号１で示される担子菌ウスヒラタケのＤＮＡに特異的に反応するプライマーであることを特徴とする請求項５に記載の土壌に含まれる微生物のＤＮＡ分析方法。
【請求項１０】
前記プライマーが配列番号２で示される担子菌ウスヒラタケのＤＮＡに特異的に反応するプライマーであることを特徴とする請求項５に記載の土壌に含まれる微生物のＤＮＡ分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、環境浄化処理地等の土壌に含まれる微生物のＤＮＡ抽出方法および土壌に含まれる微生物の同定もしくは定量方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
有毒なダイオキシンや農薬、有害化学物質等の難分解性化学物質に汚染された土壌から、これらダイオキシン等の難分解性化合物を除去する方法として、難分解性化合物を無機化する菌類等の微生物を加えて処理する微生物を用いた環境修復技術が着目されている（ＲＴ　Ｌａｍａｒ　ら：Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　１９９６（１６），２８６−２９４　．　　Ｈｅｉｎｚ　Ｗｉｌｋｅｓら：Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆｅｂ．１９９６，３６７−３７１）　。また、これらの難分解性化学物質に対して真核生物、とりわけきのことして知られる木材腐朽担子菌の分解除去能力に注目が集まっている（Ｋｈａｄａｒ　Ｖａｌｌｉら；Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ａｐｒ．１９９２，２１３１−２１３７　）。土壌中にそれら菌類を作用させる際に、菌類の動態、微生物量を把握する技術が重要である。土壌中の菌体量を把握する手段として、当該菌を特異的に増殖させうることができる培地に土壌を加え、増殖した菌量を測定する方法や、土壌を直接顕微鏡で観察する方法、菌体成分に着目して、その成分量によって菌体量を推定する方法等（　土壌微生物実験法：養賢堂）　があるが、いずれの手段も特定の菌体量を把握する方法としては困難な方法である。そこで、菌の種類によって違いのあるゲノムＤＮＡ　を指標に、その定量が可能であれば環境中の菌体量が把握可能である。このような背景から、土壌に含まれる微生物のＤＮＡをいかに効率的に抽出するかが問題となる。
【０００３】
土壌に含まれる微生物のうち原核生物である細菌のＤＮＡ抽出法としては、従来以下のような方法が知られてきた。
（１）土壌懸濁液をミキサー等で攪拌後、遠心分離または陽イオン交換樹脂により土壌成分と菌体分画分に分離し、さらに高速遠心により菌体を回収後、溶菌処理してＤＮＡを抽出する方法。（對馬誠也；土と微生物Ｎｏ．４６，３３−４０　）
（２）土壌を７０℃で、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）処理後、ビーズを用いて機械的に溶菌し、ＤＮＡをアルカリ緩衝液で抽出し、さらに塩化セシウムやハイドロキシアパタイトによって高度に精製する方法。（對馬誠也；土と微生物Ｎｏ．４６，３３−４０　）
（３）土壌をリソザイム処理後、凍結融解による溶菌を経て、ＤＮＡ抽出カラム等を用いて生成する方法。（對馬誠也；土と微生物Ｎｏ．４６，３３−４０　）
（４）菌類を含んだ土壌を、凍結溶融を繰り返して細胞を破壊する方法（Ｔｓａｉ，　Ｙ　ら、ａｐｐｌ．　ｅｎｖｉｒｏｎ．　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　５７，　１０７０−１０７４（１９９１））　。
【０００４】
しかしながら、上記従来法は細菌を対象としており、より複雑で強固な構造を有する真核生物や菌類のＤＮＡを土壌から抽出したり、また土壌中の真核生物や菌類の同定もしくは定量の報告はない。
【０００５】
また、土壌に含まれる真核生物や菌類等の微生物の同定や定量を行う方法も報告されていない。
【０００６】
さらに、土壌中に存在または投入された菌類は、細胞構造が複雑かつ菌糸を成長させて複雑に土壌と接触しているため、土壌に含まれる菌類について細菌を対象とする従来技術で処理しても、ＤＮＡを十分に抽出できない。さらに、ＰＣＲ法による定量は、ＰＣＲ反応により目的微生物の極微量なＤＮＡを増幅する必要があるが、土壌中に存在する腐植酸等の有機物がＰＣＲを阻害するため、抽出されたＤＮＡの精製を高める必要があった（對馬誠也；土と微生物Ｎｏ．４６，３３−４０　）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記従来技術に鑑み、現在のところ、土壌中の菌類等の微生物のＤＮＡを高精製度で抽出し、土壌中の微生物を同定かつ定量する技術は見当たらない。
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、簡便かつ抽出効率のよい土壌中の微生物のＤＮＡ抽出方法、高精度な土壌中の微生物のＤＮＡ分析方法および種特異的に増幅することが可能な検出効率のよいプライマーを提供し、土壌中に含まれる菌類等の微生物の菌体数を推定する技術を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するための本発明の要旨は、以下の通りである。
（１）　　微生物が含まれる土壌を瞬間凍結し、この瞬間凍結した土壌を凍結乾燥した後粉砕し、土壌に含まれる微生物のＤＮＡを抽出することを特徴とする土壌中の微生物のＤＮＡ抽出方法。
（２）　　前記微生物が、菌類または真核生物であることを特徴とする（１）記載の土壌に含まれる微生物のＤＮＡ抽出法。
（３）　　前記瞬間凍結が、液体窒素、液体酸素または液体空気を用いる瞬間凍結であることを特徴とする（１）または（２）に記載の土壌に含まれる微生物のＤＮＡ抽出方法。
（４）　　前記ＤＮＡの抽出が、粉砕した土壌にカチオン界面活性剤を含有する緩衝液を反応させ、有機溶媒と混合して水相を分離し、該水相からアルコール系溶媒でＤＮＡを析出させる方法であることを特徴とする（１）ないし（３）のいずれかに記載の土壌に含まれる微生物のＤＮＡ抽出方法。
（５）　　微生物が含まれる土壌を瞬間凍結し、この瞬間凍結した土壌を凍結乾燥した後粉砕し、土壌に含まれる微生物のＤＮＡを抽出し、特異的に反応するプライマーを該ＤＮＡに加え、ＰＣＲ法により検出することを特徴とする土壌に含まれる微生物のＤＮＡ分析方法。
（６）　　前記微生物が、菌類または真核生物であることを特徴とする（５）に記載の土壌に含まれる微生物のＤＮＡ分析方法。
（７）　　前記瞬間凍結が、液体窒素、液体酸素または液体空気を用いる瞬間凍結であることを特徴とする（５）または（６）に記載の土壌に含まれる微生物のＤＮＡ分析方法。
（８）　　前記ＤＮＡの抽出が、粉砕した土壌にカチオン界面活性剤を含有する緩衝液を反応させ、有機溶媒と混合して水相を分離し、該水相からアルコール系溶媒でＤＮＡを析出させる方法であることを特徴とする（５）ないし（７）のいずれかに記載の土壌に含まれる微生物のＤＮＡ分析方法。
（９）　　前記プライマーが配列番号１で示される担子菌ウスヒラタケのＤＮＡに特異的に反応するプライマーであることを特徴とする（５）に記載の土壌に含まれる微生物のＤＮＡ分析方法。
（１０）　　前記プライマーが配列番号２で示される担子菌ウスヒラタケのＤＮＡに特異的に反応するプライマーであることを特徴とする請求項５に記載の土壌に含まれる微生物のＤＮＡ分析方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の対象となる微生物は、菌類または真核生物であり、特に限定されるものではないが、具体的には、土壌の浄化に有用性が期待される担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ　）を含む真核菌類（Ｅｕｋａｒｙｏｍｙｃｏｔａ　）を挙げることができる。
【００１１】
これらの微生物を含む土壌（土壌に初めから含まれる場合や、土壌に投入した場合も含む）から微生物のＤＮＡを抽出する最初の処理は、対象となる土壌を瞬間凍結することである。
【００１２】
瞬間凍結する必要性は、土壌中に存在する微生物由来のＤＮＡ損傷（自己消化や土壌水分中に含まれる微生物や酵素による消化や反応）を防止するためである。水分を含んだ土壌を瞬間凍結すれば、内在する水分が凍結しても結晶が成長することがないため、土壌構造を維持することができる。
【００１３】
土壌を瞬間凍結する方法は特に限定されないが、例えば液体窒素、液体酸素または液体空気等の液化した気体を用いれば簡単に行える。しかし、瞬間凍結できる方法であれば、これらに限定されない。
【００１４】
ＤＮＡを抽出するための次の工程は、凍結した土壌を冷凍乾燥することである。冷凍乾燥する方法は、冷凍室をそなえた真空装置で凍結状態のまま水分を直接昇華させて乾燥する方法であれば特に限定されない。凍結乾燥する条件としては、例えば、−６５℃〜−９０℃、１３．３３Ｐａ以下で凍結乾燥すればよい。
【００１５】
凍結乾燥する理由は、微生物に関しては、凍結しながら乾燥することにより、細胞やＤＮＡの損傷を受けずに、破壊されやすい細胞または微生物を得ることができるからである。
【００１６】
土壌に関しては、上記瞬間凍結した土壌中の水分が凍結乾燥により除去できるため、土壌構造が変化せず、土壌の砕易性（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｅ　）が増す。
【００１７】
また、粉砕時に水分が存在すると、粉砕効率が低下するばかりでなく、粉砕中に物理的に露出したＤＮＡが化学的生物的攻撃を受けやすくなる反応の場を与えることになる。このような現象を避けるために、凍結乾燥により土壌中の水分を除去するのである。
【００１８】
ＤＮＡを抽出するための次の工程は、凍結乾燥した土壌を、粉砕することである。粉砕方法は、特に限定されないが、例えば、乳鉢で粉砕する方法、ボールミルで粉砕する方法、ミキサー等の剪断による方法、打撃剪断方式細胞破砕機（マルチビーズショッカー、安井器械製）のような打撃剪断力で粉砕する方法が挙げられる。粉砕の程度は特に限定されるものではないが、例えば１〜０．１μｍ以下程度に粉砕すればよい。
【００１９】
ＤＮＡを抽出するための次の工程は、粉砕した凍結乾燥土壌を、緩衝液を用いて抽出する工程である。
【００２０】
緩衝液としては、カチオン界面活性剤を含む緩衝液を挙げることができ、例えば、１％〜２％のセチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）、０．７　〜１．４　Ｍの塩化ナトリウム、５０〜１００　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ　、１０〜２０ｍＭ　ＥＤＴＡ　を含む緩衝液を挙げることができる。
【００２１】
粉砕した凍結乾燥土壌と緩衝液を反応させた後、有機溶媒と混合し、次いで水相を分離する。この時用いる有機溶媒としては、例えば、緩衝液（ＴＥ　ｂｕｆｆｅｒ　、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ　、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８．０））で飽和したフェノール、イソアミルアルコール／クロロホルム、塩化ベンジル等を挙げることができる。有機溶媒の添加量としては、前記カチオン界面活性剤含有の緩衝液添加量に対して１倍〜５倍、好ましくは１倍〜２倍が適当である。有機溶媒を添加した後の混合時間は、１分以上好ましくは１０分間である。
【００２２】
分離した水相にアルコール等を添加することにより、土壌中の微生物のＤＮＡが高純度で析出させることができる。この時、添加するアルコール類としては、例えば、分離した水相量に対して、０．６〜１倍量のイソプロパノールまたは２〜３倍量のエタノールを挙げることができる。
【００２３】
以上の方法により、土壌に含まれる微生物のＤＮＡを効率的かつ高純度で抽出することができる。
【００２４】
抽出した微生物のＤＮＡをＰＣＲで分析するためには、これら微生物と特異的に反応するプライマーを用いればよい。
【００２５】
プライマーの配列の選択方法は、目的の微生物もしくは微生物群が共通して保有する染色体のＤＮＡ配列の一部を用いればよい。配列の一部と相同性のある短鎖ＤＮＡをプライマーとして用いる。プライマーの長さは、１５ｂｐ〜３５ｂｐが望ましい。担子菌ウスヒラタケのＤＮＡを分析するためのプライマーを、配列番号１、配列番号２に例示する。
【００２６】
分析しようとする目的生物以外の他の微生物由来のＤＮＡ増幅を防止するために、ホモロジー検索等を行い、相同性のない配列を選択する。また、イントロン配列の利用を併用することにより、他の生物由来のＤＮＡとの相同性を低下させ、目的の微生物由来のＤＮＡのみを増幅することが可能となる。
【００２７】
土壌から抽出した微生物由来のＤＮＡ量を測定する方法として、ＰＣＲ法を用いたＤＮＡの定量を行う。
【００２８】
ＰＣＲ　法を用いたＤＮＡ定量法には、大きく以下の３種類の方法を挙げることができるが、いずれの定量方法を用いてもよい。
（１）競合ＰＣＲ　法（Ｓｉｅｂｅｒｔ　ＰＤ，　Ｌａｒｒｉｃｋ　ＪＷ：Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ＰＣＲ，　Ｎａｔｕｒｅ３５９：５５７−５５７，　１９８２）
（２）ＰＣＲ−ＭＰＮ　法（Ｌｉｎｅ　Ｆｒｄｓｌｕｎｄ　ｅｔ　ａｌ：ａｐｐｌ．　ｅｎｖｉｒｏｎ．　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　６７，　１６２３−１６１８（２００１）
（３）ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ−ＰＣＲ　法（Ｒｉｒｉｅ　ＫＭ　ｅｔ　ａｌ：Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ，　１９９７：２４５（２）：１５４−１６０，　Ｗｏｏ　ＴＨ　ら：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．　１９９８　Ｊｕｎ：２４（６）：９５４：９６２）
【００２９】
【実施例】
次に本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００３０】
本発明の有用性を示すためには、土壌から抽出したＤＮＡ　の微量定量測定系が必要である。そこで、定量ＰＣＲ　システムの定量性を示す。
【００３１】
（実施例１）　　特異的プライマーの作成
本研究室で難分解性化学物質を分解すると示唆される、白色腐朽担子菌のひとつであるウスヒラタケ（ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｐｕｌｍｏｎａｒｉｕｓ　）をモデル担子菌とした。対象の担子菌のゲノムＤＮＡ　がＰＣＲ　法で定量されるための特異的プライマーを作成し、そのプライマーの特異性を評価した。配列候補として、白色腐朽担子菌が持つ酵素の構造遺伝子配列の一部を使用した。ウスヒラタケとしては、マンガンパーオキシダーゼの構造遺伝子中のエキソン配列とイントロン配列の一部を組み合わせて、特異的プライマーとした（プライマーセット１：　配列番号１、配列番号２）。
【００３２】
モデル菌として同種のウスヒラタケで異なる菌株２菌株を、別種の菌として、ヒラタケ、シイタケ、エリンギ、ヤマブシタケ、ヌメリスギタケモドキ、カワラタケ、ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ　ｃｒａｓｓａ、ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ　ｃｒｉｓｏｓｐｏｒｉｕｍを純粋培養した菌糸体からＤＮＡ　を抽出した。これらのＤＮＡ　のＰＣＲ　増幅を確認するために、ほとんどの真菌のリボゾームＲＮＡ　遺伝子の増幅が可能とされる増幅用プライマー（Ｄａｍｓ，Ｅ　　らＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１６（Ｓｕｐ．）：ｒ８７−ｒ１７３　）を用いてＰＣＲ　を行った。ＰＣＲ　反応液としては、１０×ＥｘＴａｑ　ｂｕｆｆｅｒ（ＴＡＫＡＲＡ　ＳＨＵＺＯ　ＣＯ．，ＬＴＤ）５ｕｌ　、０．２ｍＭ　ｄＮＴＰ、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２　、０．５ｕＭ　ＰＣＲ　プライマー（ｆｏｒｗａｒｄ　）（配列：５’−ＧＴＡＧＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＧＴＣＴＣ−３’　、　配列番号３）、０．５ｕＭ　ＰＣＲ　プライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ　）（配列：５’−ＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣＣＡＧＡＣＴＴＧＣ−３’　、配列番号４）、０．２５ｕｌ　ＴＡＫＡＲＡ　Ｅｘ　Ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（ＴＡＫＡＲＡ　ＳＨＵＺＯ　ＣＯ．，ＬＴＤ）に１０ｎｇの上記ＤＮＡ　を加え、全体で５０ｕｌになるようにＨ２Ｏ　を加えた。ＰＣＲ　の反応は９５℃にて１　分間前加熱後、９５℃３０秒変性・５５℃１　分アニーリング・７２℃１　分３０秒伸長からなるサイクルを３０回行い、７２℃にて１０分間加熱後４　℃に冷却した。
【００３３】
また、ウスヒラタケ特異的プライマーの特異性を評価するために、上記ＰＣＲ
においてプライマーをプライマーセット１（ｆｏｒｗａｒｄ　プライマー：　配列５’−ＣＴＡＧＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧＴＴＴＴＣ−３’、配列番号１）、及びｒｅｖｅｒｓｅ　プライマー：　配列５’−ＡＧＡＧＴＡＣＣＡＧＣＡＡＡＡＴＧＡＡＣＣＣＴＡＡ−３’　、配列番号２））を使用した。ＰＣＲ　の反応は９４℃にて１　分間前加熱後、９４℃３０秒変性・５７℃２　分アニーリング・７２℃１　分伸長からなるサイクルを３０回行い、７２℃にて１０分間加熱後４　℃に冷却した。
【００３４】
これらの増幅産物を１％アガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロミド染色後ＵＶ照射により検出した。この結果を図１、２に示す。
【００３５】
リボゾームＲＮＡ　増幅用プライマーを使用したＰＣＲ　では、すべての菌体由来ＤＮＡ　において増幅が確認された（図１、増幅を矢印で示す）。一方、プライマーセット１を使用したＰＣＲ　においては、ウスヒラタケ２菌株において増幅が確認され、別種の菌由来ＤＮＡ　からは増幅が確認されなかった。
【００３６】
以上のことから、モデル担子菌であるウスヒラタケに特異的なプライマーの特異性が示された。
【００３７】
（実施例２）プライマーの定量性
実施例１で使用されたプライマーセット１のＤＮＡ　定量性を確認するために、超遠心塩化セシウム密度勾配法で高度に精製抽出したうすひらたけゲノムを用いて、プライマーセット１を使用したＰＣＲ　を行った。ＰＣＲ　は、Ｒｏｃｈｅ　社製のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ３３０を用いた。本機は、通常のＰＣＲ　の様な厳密な温度制御に加え、蛍光分光光度計も備わっている。ＰＣＲ　反応液中に、あらかじめｄｓＤＮＡ　（二本鎖ＤＮＡ　）に特異的に結合するＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎＩ（Ｒｏｃｈｅ　社製他）を加えておくと、目的ＤＮＡ　が増幅されるに従い二本鎖ＤＮＡ　とＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎＩで結合反応が起こり、それに対して励起された後に発する蛍光を測定することで、ＰＣＲ　サイクル毎の増幅を経時的に測定できる。
【００３８】
抽出されたゲノムをＡ２６０で吸光測定し得られたＤＮＡ　濃度を元に、鋳型ＤＮＡ　量　１００ｎｇ〜１ｐｇ　で、増幅を検討した。各サンプルにおいて、ｎ＝３　で実験を行った。ＰＣＲ　反応液としては、ＰＣＲ　ＭａｓｔｅｒＭｉｘ　液（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＰＣＲ　反応用Ｂｕｆｆｅｒ、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２　、０．２ｍＭ　ｄＮＴＰ、０．５ｕＭ　ＰＣＲ　プライマーセット１（ｆｏｒｗａｒｄ　プライマー：　配列５’−ＣＴＡＧＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧＴＴＴＴＣ−３’、配列番号１）、及びｒｅｖｅｒｓｅ　プライマー：　配列５’−ＡＧＡＧＴＡＣＣＡＧＣＡＡＡＡＴＧＡＡＣＣＣＴＡＡ−３’　、配列番号２））を含む）２０ｕｌ反応液中に超遠心で精製したウスヒラタケＤＮＡ　を鋳型として使用して、反応に供した。　ＰＣＲ反応条件は９５℃にて１０分間前加熱後、９５℃１５秒変性・５９℃１０　　秒アニーリング・７２℃１２秒伸長からなるサイクルを４０回行った。また、サイクル毎に７２℃と９５℃の間での８３℃１　秒間励起波長４７０ｎｍ　でＰＣＲ　反応物を励起し、蛍光波長５３０ｎｍ　を測定した。各サンプルのＰＣＲ　サイクルにおける蛍光強度を図３に示す。
【００３９】
ＰＣＲ　で定量を行う際の重要な点は、ＰＣＲ　反応でＤＮＡ　増幅が指数的に増加している所では、初期鋳型ＤＮＡ　量とＤＮＡ　増幅量に相関がある点である。各サンプルにおいて、ある蛍光強度に達するために必要なＰＣＲ　反応サイクル数を決定するために、ベースライン（ある蛍光強度の値）を設定してそれとの交点（ＰＣＲ　反応におけるサイクル数）をグラフにしたものを図４に示す。
【００４０】
１００ｎｇ　〜１ｐｇ　の範囲において初期ＤＮＡ　濃度とサイクル数に相関があり、モデル担子菌としてのウスヒラタケゲノムを特異的に増幅可能なプライマーが、ＤＮＡ　濃度の定量に１ｐｇ　の検出限界で使用可能であることが示された。
【００４１】
（実施例３）土壌からの抽出と定量
あらかじめモデル菌としてのウスヒラタケ培養菌糸体を土壌に一定の割合で混和（乾燥菌体重量比に換算して１００ｍｇ　〜１０ｕｇ菌糸体／１ｇ　土壌）した土壌試料を作成した。混合した土壌は▲１▼鹿沼土▲２▼園芸土（組成：赤土７０％　牛堆肥１５％　バーミュキュライト５％木炭５％ピートモス５％）▲３▼黒色土▲４▼真砂土（能勢町焼却炉周辺土壌）を使用した。
【００４２】
各混合土壌を、液体窒素を用いて瞬間凍結した。瞬間凍結した土壌を、凍結乾燥機（　凍結真空乾燥機ＦＭ−２５　−ＥＬ−ＶＰ−ＳＦ、バーチス社製）で温度−８５℃、減圧度１３．３３Ｐａ　以下で凍結乾燥した。凍結乾燥した土壌を、打撃剪断方式細胞破砕機（商品名マルチビーズショッカー、安井器械（株）製）を用　　いて２０００ｒｐｍ　にて１０秒間３　回粉砕した。
【００４３】
粉砕された乾燥土壌３０ｍｇを秤取し、６５℃のＣＡＴＢバッファー（１％セチルトリメチルアンモニウムブロマイド、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ９．５　）、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　、０．７Ｍ塩化ナトリウム）を６５０ｕｌ　加えた。６５℃で５　分毎に攪拌しながら１時間処理した。
【００４４】
次いで、クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）液を６５０ｕｌ　加え、室温で２０分間混合した。さらに、室温で２０，０００×ｇ　で１５分間遠心し、上層を分取した。この操作を２回繰り返した。
【００４５】
得られた上層６００ｕｌ　に、−２０℃の１００％イソプロパノールを分取した上層液量に対して０．６ｖｏｌ加え、静かに混和した後、−２０℃で１，０００　×ｇ　にて５分間遠心し、上清を除去し沈殿を回収した。さらに、−２０℃の７０％　エタノールを６００ｕｌ　加え、攪拌した後、−２０℃で１，０００　×ｇ　にて５分間遠心し、上清を除去し沈殿を回収した。沈殿物を自然乾燥後、ＴＥ　ｂｕｆｆｅｒ　（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ　、１ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））１００ｕｌ　を加え、５５℃で沈殿回収されたＤＮＡ　を溶解した。
【００４６】
上記のようにして得られたＤＮＡ　溶液のうち、２ｕｌ　を投入ＤＮＡ　溶液とし（黒色土に関しては溶液を１０倍希釈したものを投入）、実施例２と同様の条件でＰＣＲ　反応に供し蛍光強度測定をした。同時に実施例２で行った実験を行い、検量線を作成し、各土壌中に存在するウスヒラタケＤＮＡ　量と土壌中に存在する菌体量の関係を見た。検量線を図５に示す。図５の検量線によりそれぞれの土壌における、各割合で菌糸体が混和された土壌から抽出されたウスヒラタケＤＮＡ　量が推定される。推定されたＤＮＡ　量と土壌中に混和された菌体量の関係を示す。鹿沼土を図６（ｎ＝１）　、園芸土を図７（ｎ＝１）　、黒色土を図８（ｎ＝１）　、真砂土を図９（ｎ＝３）　に示す。
【００４７】
それぞれの土壌から抽出したサンプルのＤＮＡ　濃度と混和した菌体量との間に相関があり、定量可能であることが示された。
【００４８】
黒色土のような腐食性土壌によっては、ＰＣＲ　反応に対する阻害物質も同時に抽出されるため、ＤＮＡ　抽出溶液を希釈してＰＣＲ　反応液に投入される阻害物質量を減少させることにより測定は可能であった。
【００４９】
検出限界としては、鹿沼土、園芸土、真砂土で、１０ｕｇ菌体量／１ｇ　土壌であり、黒色土で１００ｕｇ　菌体量／１ｇ　土壌であったが、ＤＮＡ　抽出のみを取り上げると、どの土壌でも同程度の抽出効率であることが示された。
【００５０】
以上より、あらかじめ測定すべき土壌に測定したい菌体を既知量投入し、本発明で示した抽出法によってＤＮＡ　を抽出し、検量線を作成することにより、どのような土壌でも定量することができる。
【００５１】
【発明の効果】
本発明により、土壌に含まれる微生物のＤＮＡを効率的かつ高純度で抽出することができ、微生物の量が極微量であっても、簡便かつ高精度で分析することが可能となった。
【００５２】
本発明により、土壌に含まれる微生物の分析が容易にできるので、ダイオキシン等の難分解性化学物質で汚染された土壌の微生物処理に際し土壌中の微生物の分析が容易となる。
【００５３】
また、土壌微生物全般にも応用できることから、耕作地や森林土壌における微生物の挙動、例えば土壌中の菌根菌量の把握等にも適用できる。
【００５４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は純粋培養した各種担子菌から抽出したＤＮＡ　を鋳型ＤＮＡ　として、ほとんどの真核生物で増幅可能なプライマーを用いてＰＣＲ　反応を行い、増幅の有無を示す電気泳動写真であり、図面代用写真である。
【図２】図２は純粋培養した各種担子菌から抽出したＤＮＡ　を鋳型ＤＮＡ　として、モデル菌としてのウスヒラタケに特異的に増幅可能なプライマーを用いてＰＣＲ　反応を行い、増幅の有無を示す電気泳動写真であり、図面代用写真である。
【図３】図３は高度に精製したウスヒラタケゲノムＤＮＡ　を鋳型に、様々な初期濃度であらかじめＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　　Ｉを加えた反応液でＰＣＲ　を行い、サイクル毎にＰＣＲ　反応液を４７０ｎｍ　で励起し５３０ｎｍ　の蛍光強度を測定したグラフである。
【図４】図４は、図３における蛍光強度が１になるときのサイクル数を縦軸に、横軸に初期鋳型ＤＮＡ　量をとり、それらの相関を示したグラフである。
【図５】図５は、本発明の方法により土壌より抽出されたゲノムＤＮＡ　の定量を行う際に、ある蛍光強度に到達した際のサイクル数をＤＮＡ　濃度に換算する際に必要な検量線を示したグラフである。
【図６】図６は、あらかじめ既知量のモデル菌を土壌に添加した土壌が鹿沼土である場合に、本発明の方法により抽出されたＤＮＡ　の、定量値と投入されている菌体量との関係を示したグラフである。
【図７】図７は、あらかじめ既知量のモデル菌を土壌に添加した土壌が園芸土である場合に、本発明の方法により抽出されたＤＮＡ　の、定量値と投入されている菌体量との関係を示したグラフである。
【図８】図８は、あらかじめ既知量のモデル菌を土壌に添加した土壌が黒色土である場合に、本発明の方法により抽出されたＤＮＡ　の、定量値と投入されている菌体量との関係を示したグラフである。
【図９】図９は、あらかじめ既知量のモデル菌を土壌に添加した土壌が真砂土（能勢町焼却炉周辺土壌）である場合に、本発明の方法により抽出されたＤＮＡ　の、定量値と投入されている菌体量との関係を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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