(57)【要約】【課題】  新しいオステオレギュリン・ポリペプチド、そのポリペプチドをコードしている新しい核酸配列、新しいベクター、新しい抗体の提供。【解決手段】  オステオレギュリンは、骨のホメオスタシス、脂肪過多、アテローム性動脈硬化に見られるプラークの石灰化を調節する役割を持っている。したがって、本発明は、上記提供に加え、オステオレギュリン活性の調節剤を同定するためのスクリーニング・アッセイと、オステオレギュリン活性に関連した病気または異常をかかえる哺乳類の治療法にも関する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子を改変した結果、オステオレギュリン遺伝子の機能が破壊された、ヒト以外の遺伝子改変哺乳動物。
【請求項２】
前記哺乳動物が、前記改変に関してヘテロ接合である、請求項２に記載の哺乳動物。
【請求項３】
前記哺乳動物が、前記改変に関してホモ接合である請求項１に記載の哺乳動物。
【請求項４】
前記哺乳動物が、囓歯類である、請求項１に記載の哺乳動物。
【請求項５】
前記囓歯類が、マウスであることを特徴とする、請求項４に記載の哺乳動物。
【請求項６】
オステオレギュリン遺伝子の機能破壊を含む改変を行なった、遺伝子改変動物の細胞。
【請求項７】
前記細胞が、前記改変に関してヘテロ接合である、請求項６に記載の動物細胞。
【請求項８】
前記細胞が、前記改変に関してホモ接合である、請求項６に記載の動物細胞。
【請求項９】
前記細胞が、胚幹（ES）細胞またはES様細胞である、請求項６に記載の動物細胞。
【請求項１０】
前記細胞が、ヒトである、請求項６に記載の動物細胞。
【請求項１１】
前記細胞が、ネズミ科の動物である、請求項６に記載の動物細胞。
【請求項１２】
オステオレギュリンの活性を変化させる薬剤のスクリーニング法であって、この方法は、薬剤をオステオレギュリン・ポリペプチドと接触させてからそのオステオレギュリンの活性を測定する操作を含んでおり、その薬剤の存在下とその薬剤の不在下におけるオステオレギュリン・ポリペプチドの活性の差が、その薬剤がその活性を変化させたことを示していることを特徴とする方法。
【請求項１３】
オステオレギュリンの発現を変化させる薬剤のスクリーニング法であって、この方法は、コーディング配列と作用可能な状態で連結されたオステオレギュリン遺伝子調節要素を含むヌクレオチド配列を有する細胞に薬剤を接触させてからそのコーディング配列の発現を測定する操作を含んでおり、その薬剤の存在下とその薬剤の不在下におけるオステオレギュリンの発現の差が、その薬剤がオステオレギュリンの発現を変化させたことを示していることを特徴とする方法。
【請求項１４】
骨重量および／または骨密度、肥満症、血管の弾力性、および／またはアテローム性動脈硬化に見られるプラークの石灰化を調節することによって哺乳動物を治療する方法であって、オステオレギュリンの調節剤を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記調節剤が、オステオレギュリンのアンタゴニストであり、そのアンタゴニストを投与して骨重量および／または骨密度を増大させることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記調節剤が、オステオレギュリンのアゴニストであり、そのアゴニストを投与して肥満症を減少させることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
【請求項１７】
前記調節剤が、オステオレギュリンのアンタゴニストであり、そのアンタゴニストを投与してアテローム性動脈硬化に見られるプラークの安定性を増大させることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
【請求項１８】
前記調節剤が、オステオレギュリンのアゴニストであり、そのアゴニストを投与して血管の弾力性を増大させることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、2000年２月29日に出願された米国プロビジョナル出願第60／185, 617号、及び2000年９月22日出願された米国プロビジョナル出願第60／234,500号からの優先権を請求する。
発明の属する技術分野
本発明は、骨のホメオスタシス、脂肪過多（肥満症）、アテローム性動脈硬化に見られるプラークの石灰化を調節する役割を持った新しいオステオレギュリン・ポリペプチドに関するものである。本発明はまた、オステオレギュリン活性の調節剤を同定するためのスクリーニング・アッセイと、オステオレギュリン活性に関連した病気または異常をかかえる哺乳動物の治療方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
骨は、形成と再形成のプロセスを連続的に行なっているダイナミックな組織である（パーフィット、J. Cellular Biochemistry、第55巻、273-286ページ、1994年）。骨格が成長しているときには、石灰化によって形成された骨の量が、骨吸収によって失われた骨の量を上回っているのに対し、成熟した大人では、骨の減少と形成が等しくなり、完成した骨格が維持される。しかし、老化、閉経後のエストロゲン不足、ステロイド治療の長期化など、ある特定の条件のもとでは、形成される骨量が、骨吸収によって失われる骨の量に追いつかなくなる。時間が経つと、このようにバランスがくずれたことの結果として、骨量が減少し、完成した骨格の維持が危うくなる。
【０００３】
骨の再形成は、骨吸収を行なう破骨細胞と骨を形成する骨芽細胞が高度な連携プレーをする非常に複雑なプロセスである。骨芽細胞は、間葉細胞系に由来し、分化して新しい骨基質を形成する役割を担っている（ウロダルスキー、Clinical Orthopaedics & Related Research、第276巻、93ページ、1990年）。以上に加え、骨芽細胞が生産するさまざまな因子が、副甲状腺ホルモンやビタミンDなどの内分泌シグナルに応答して、破骨細胞の形成や破骨細胞の骨吸収活動を調節している。老化に伴う骨の減少は、骨芽細胞系に欠陥が生じた結果であると主張されている（ロドリゲス他、J. of Cellular Biochemistry、第75巻、414-423ページ、1999年；エルドマン他、Mechanism of Aging & Development、第110巻、73-85ページ、1999年；ロール他、J. of Bone & Mineral Research、第9巻、355-366ページ、1994年；カッツバーグ他、Bone、第25巻、667-673ページ、1999年）。間葉前躯体の数が不十分であること、または、間葉前躯体が増殖、分化する能力を失って、十分な数の骨芽細胞が機能するようにならないことのいずれかが原因だというのである。
【０００４】
骨芽細胞は、増殖、基質の成熟、石灰化という3段階の分化プロセスを経て成長する（オービン、J. of Cellular Biochemistry、第72巻、396-410ページ、1999年；スタインとライアン、Endocrine Reviews、第14巻、424-442ページ、1993年；マラヴァル他、J. of Cellular Biochemistry、第74巻、616-627ページ、1999年）。この分化プロセスの間、細胞外にある骨基質タンパク質やそれ以外の遺伝子に、よく特徴付けられた時間的、空間的発現パターンが現われる（マラヴァル他、J. of Cellular Biochemistry、第74巻、616-627ページ、1999年；オウエン他、J. of Cellular Physiology、第143巻、420-430ページ、1990年；イングラム他、J. of Bone & Mineral Research、第8巻、1019-1029ページ、1993年）。骨基質は主にタイプIのコラーゲンでできており、そのコラーゲンが、ミネラルを形成するヒドロキシアパタイトを堆積させるための細胞外構成成分となっている。骨芽細胞は、コラーゲン以外のタンパク質も細胞外マトリックスの中に分泌する（ロベイ、Connective Tissue Research、第35巻、131-136ページ、1996年；ボスキー、Connective Tissue Research、第35巻、357-363ページ、1996年）。コラーゲン以外のタンパク質としては、プロテオグリカン、硫化した糖タンパク質、よくリン酸化したRGDモチーフ・タンパク質、グラ・アミノ酸残基を含有するように変化したタンパク質などが挙げられる。具体例としては、ビグリカン、オステオネクチン、骨のシアロタンパク質、オステオポンチン、オステオカルシンなどが挙げられる。これらタンパク質の多くが持っている機能はまだ正確にはわかっていないが、これらタンパク質には石灰化を促進する役割のあることが多くの証拠によって裏づけられている（ロベイ、Connective Tissue Research、第35巻、131-136ページ、1996年）。1つの例外が、グラ・ペプチドであるオステオカルシンで、このペプチドは、遺伝子のノックアウト技術により、骨形成をマイナス方向に調節する機能を持つことがわかっている（デュシー他、Nature、第382巻、448-452ページ、1996年）。
【０００５】
骨芽細胞が分化していく様子は、頭蓋冠細胞または骨髄細胞を用いた初代細胞培養において明らかにされている。骨髄は、脂肪細胞系、骨芽細胞系、繊維芽細胞系、造血細胞系の多能性幹細胞を含んでいる（オウエン他、J. of Cellular Physiology、第143巻、420-430ページ、1990年；ベレスフォード、J. of Cell Science、第102巻、341-351ページ、1992年；ハーバートソンとオービン、Bone、第21巻、491-500ページ、1997年）。ラット、マウス、ヒトの骨髄は、骨のもとになる細胞を含むことが明らかにされている。その細胞が増殖すると、骨芽細胞に分化する方向へと誘導される。ラットとヒトの培養細胞は、デキサメタゾンなどの分化剤を必要とするが、マウスに由来する細胞は、デキサメタゾンがなくても分化することができる（リカード他、J. of Bone & Mineral Research、第11巻、312-324ページ、1996年；マニアトプーロス他、Cell & Tissue Research、第254巻、317-330ページ、1988年；チェン他、Endocrinology、第112巻、1739-1745ページ、1983年）。インビトロで分化した骨芽細胞は、コラーゲン以外のタンパク質を、時期を管理するやり方で細胞外マトリックスに分泌する能力を示す。これは、骨芽細胞が、石灰化プロセスにおいて、これらタンパク質のそれぞれに対する制御機能を有することを示唆している可能性がある（ヤオ他、J. of Bone & Mineral Research、第9巻、231-240ページ、1994年）。以上に加え、分化した骨髄培養物は、β-グリセロリン酸塩などのリン酸塩の存在下で成長させた場合には、マトリックスの堆積とミネラルであるヒドロキシアパタイトの形成を容易にする能力を持つ。これらの性質があるため、骨髄細胞の分化は、骨の再形成のメカニズムと骨芽細胞の機能を研究するための有効なモデルとなっている。
【０００６】
骨粗鬆症による骨折は、アメリカ合衆国だけで1年に約700,000件ある。そのため骨粗鬆症による骨折は、老齢者の死や怪我とも大きな関連がある。従って、骨の再形成プロセスを健康な状態と病気の状態の両方においてさらによく理解し、骨粗鬆症または骨に関係したそれ以外の異常に伴う骨の減少を、予防、低下、または逆転させる必要性が明らかにある。
【発明の開示】
【０００７】
発明の要約
われわれは、45kDaのポリペプチドをコードしていて、ラットの骨芽細胞と骨細胞において特異的に発現する新規なcdNA転写産物の配列を決定した。われわれはさらに、マウスとヒトの場合の配列も明らかにした。われわれは、キャラクテリゼーションを行なうことによって、そのタンパク質が、骨と歯に存在している細胞外基質タンパク質であるdmp1と一部が相同で、RGDモチーフを含む分泌タンパク質であることを明らかにした（ロール他、J. of Bone & Mineral Research、第9巻、355-366ページ、1994年；カッツバーグ他、Bone、第25巻、667-673ページ、1999年）。そこでわれわれは、哺乳類のこのタンパク質を“オステオレギュリン”と呼ぶことにした。オステオレギュリンの発現パターンと機能をさらに研究することによって、（詳細な説明の中で説明するように）オステオレギュリンが、骨のホメオスタシス、脂肪過多、アテローム性動脈硬化に見られるプラークの石灰化を調節する役割を持っていることを確認した。
【０００８】
本発明は、新規なオステオレギュリン・ポリペプチドと、そのポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列、このオステオレギュリン配列を含む発現ベクター、そして本発明のオステオレギュリンを発現するように遺伝子を改変したトランスジェニック宿主に関するものである。
【０００９】
本発明の別の特徴は、内在性オステオレギュリン遺伝子の一方または両方のコピーを壊すように遺伝子を改変したヒト以外の哺乳類の細胞と動物細胞にある。オステオレギュリン遺伝子を破壊するためにホモ接合またはヘテロ接合にした遺伝子改変マウスを研究することにより、オステオレギュリン遺伝子の発現がなかったり低下したりすると、メスにおいて骨重量量が増加し、骨の石灰化が促進され、骨の形成が増え、脂肪が増加することがわかる。これらの表現型は、オステオレギュリンが、骨重量／骨密度と脂肪に対して負の調節機能を持っていることを示唆している。骨のホメオスタシスにおけるこの機能は、骨組織においてオステオレギュリンを大量に発現させた結果によってだけでなく、骨の機能調節の役割を有する他のタンパク質とオステオレギュリンが似ていることによっても裏づけられる。
【００１０】
オステオレギュリンが、骨の形成、骨密度、骨の石灰化、脂肪過多に関して負の調節機能を有することが発見されたため、本発明は、オステオレギュリンの活性、またはオステオレギュリン遺伝子の発現を変えることのできる薬剤を同定するスクリーニング・アッセイにも関係する。そのような薬剤は、骨粗鬆症などの骨の異常を治療するために、哺乳類に、好ましくはヒトに投与するのに役立つ。その薬剤を投与することによって、骨の修復または再生を促進したり、脂肪過多やアテローム性動脈硬化に見られるプラークの石灰化に伴う異常を治療したりするのである。
【００１１】
本発明の第１の局面においては、本発明は以下の：
配列番号2, 4, 6, 8, 34、又は46のアミノ酸配列；又は高ストリンジェント条件下、配列番号1, 3, 5, 7, 33、又は45に示すコーディング配列の相補物をもつプローブとハイブリダイズするであろうポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列；又は、配列番号2, 4, 6, 8, 34、又は46を含むアミノ酸配列に対し少なくとも90％の同一性、より好ましくは95％の同一性をもつアミノ酸配列を含む単離され又は精製されたポリペプチド、又は異種ポリペプチドであって、オステロレギュリン活性を有する前記ポリペプチドを特徴とする。好ましくは上記ポリペプチドは哺乳動物及び／又は天然由来である。
【００１２】
第２の関連局面においては、本発明は、以下の：配列番号1, 3, 5, 7, 33、又は45に示すコーディング配列；上記ポリペプチド、好ましくは配列番号2, 4, 6, 8, 34、又は46のいずれかをコードする配列；又は高ストリンジェント条件下、上記ポリヌクレオチドのいずれかの相補物をもつプローブに、好ましくはプローブの全長に、ハイブリダイズする配列、を含む単離され又は精製されて、ポリヌクレオチドを特徴とする。
【００１３】
好ましくは、上記配列は、配列番号1, 3, 5, 7, 33、又は45に示すコーディング配列の相補物にハイブリダイズし、又はその配列は哺乳類のｃＤＮＡライブラリー中に存在する。
【００１４】
本発明は、本発明のポリペプチド、好ましくは、配列番号2, 4, 6, 8, 34、又は46のポリペプチドに選択的に結合する抗体、本発明のポリヌクレオチド、好ましくは配列番号1, 3, 5, 7, 33、又は45のポリヌクレオチドを含むベクター、及び本発明のポリヌクレオチド、好ましくは、配列番号1, 3, 5, 7, 33、又は45に示すコーディング配列のポリヌクレオチドを発現するトランスジェニック宿主をも特徴とする。好ましい宿主は、トランスフェクトされた宿主細胞又はトランスジェニック哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、サル）をも特徴とする。
【００１５】
本発明の他の局面は、遺伝子を改変した結果、オステオレギュリン遺伝子の機能が破壊された、ヒト以外の遺伝子改変哺乳動物である。この哺乳動物は、前記改変に関してヘテロ接合であるか、又は前記改変に関してホモ接合であることができる。好ましくは、この哺乳動物は、囓歯類、より好ましくは、マウスである。
【００１６】
関連局面においては、本発明は、オステオレギュリン遺伝子の機能破壊を含む改変を行なった、遺伝子改変動物の細胞をも提供する。この細胞は、前記改変に関してヘテロ接合であるか又はホモ接合である。好ましくは、この動物細胞は、胚幹（ES）細胞またはES様細胞であり、この細胞は、ヒトであり、又は細胞は、ネズミ科の動物である。
【００１７】
オステオレギュリンの活性を変化させる（例えば、骨重量、骨密度、肥満症、血管弾力性、及び／又はアテローム性動脈硬化症のプラークの石灰化の調節に影響を及ぼす）薬剤のスクリーニング方法も本発明の追加の特徴である。この方法は、薬剤をオステオレギュリン・ポリペプチドと接触させてからそのオステオレギュリン・ポリペプチドの活性を測定する操作を含んでおり、その薬剤の存在下と不在下におけるオステオレギュリン・ポリペプチドの活性の差が、その薬剤が活性を変化させたかどうかを示していることを特徴とする。
【００１８】
オステオレギュリンの発現を調節することにより上述のオステオレギュリン活性のいずれを変化させる薬剤のスクリーニング方法も本発明は特徴とする。この方法は、コーディング配列と作用可能な状態で連絡されたオステオレギュリン遺伝子調節要素（例えばオステオレギュリン・プロモーター配列）を含むヌクレオチド配列を有する細胞に薬剤を接触させてからそのコード配列の発現を測定する操作を含んでおり、その薬剤の存在下と不在下におけるオステオレギュリンの発現の差が、その薬剤が発現を変化させたかどうかを示していることを特徴とする。
【００１９】
本発明はさらに、骨重量および／または骨密度、脂肪過多、血管の弾力性、および／または、アテローム性動脈硬化に見られるプラークの石灰化を調節することによって哺乳類の治療を行なう方法を提供する。この方法には、オステオレギュリンの調節剤を哺乳類に投与する操作が含まれる。その調節剤は、オステオレギュリンのアゴニストになっていて、投与することによって過多状態の脂肪を減少させるようなものであることが好ましい。あるいは、その調節剤は、オステオレギュリンのアンタゴニストになっていて、（例えば脳卒中を防ぐために）投与してアテローム性動脈硬化に見られるプラークの石灰化を増大させることによりプラークの安定性を大きくするようなものであることが好ましい。あるいは、その調節剤は、オステオレギュリンのアゴニストになっていて、投与してアテローム性動脈硬化に見られるプラークの石灰化を減少させることにより血管の弾力性を増大させるようなものであることが好ましい。
【００２０】
本発明のさらなる局面は、請求項3又は4のポリペプチドの製法を特徴とする。本法は、（ａ）上記ポリペプチドの発現のために好適な条件下で細胞を培養し、ここで、上記細胞は上記ポリペプチドをコードする異種ヌクレオチドを含み、そして上記ポリヌクレオチドはプロモーター配列に作用可能な状態で連結されており；そして（ｂ）上記ポリペプチドを回収する、を含む。好ましくは、上記ポリヌクレオチドは、配列番号1, 3, 5、又は7を含み、又は上記細胞がバクテリア細胞である場合、好ましいポリヌクレオチドは配列番号33又は配列番号45、又はＮ-末端シグナル配列を欠くオステオレギュリン・ポリペプチドをコードするラット又はマウス核酸配列を含む。
【００２１】
当業者であれば、本発明を説明するためにこの明細書と請求項で使用する用語が完全に理解できるであろう。しかし、特別な記載がない限り、以下の用語はこれから説明するような意味で用いる。
【００２２】
“オステオレギュリンの活性”は、骨の石灰化、骨密度、および／または、骨の形成に関する負のレギュレータであり、骨の面積、骨ミネラル量および骨ミネラル密度、および／または、骨密度を低下させる機能がある。“オステオレギュリンの活性”には、アテローム性動脈硬化に見られるプラークの石灰化の減少と、脂肪過多の促進も含まれる。“オステオレギュリン活性”をもつポリペプチドは上記活性の中の少なくとも１を示す。
【００２３】
オステオレギュリンの“アゴニスト”とは、オステオレギュリンの生物活性を強める分子、またはオステオレギュリンの真似をする分子のことである。アゴニストとしては、タンパク質、核酸、炭水化物、小さな分子のほか、細胞内のオステオレギュリンの量を増やすこと、またはシグナル伝達経路のオステオレギュリン・ポリペプチドの信号伝達を増やすことによって、オステオレギュリンの活性を増大させる他の任意の化合物または組成物が挙げられる。
【００２４】
“対立遺伝子変異体”とは、オステオレギュリンをコードしている別の形態の遺伝子のことである。対立遺伝子変異体は、核酸配列中に少なくとも1つの突然変異が起こった結果として生まれる可能性がある。その結果としてmRNAまたはポリペプチドが変化する可能性があるが、その構造または機能は、変化することもあれば、変化しないこともある。1つの遺伝子には、天然の対立遺伝子変異体がまったくない場合、1つある場合、多数ある場合がある。対立遺伝子変異体を生じさせる一般的な突然変異は、通常、ヌクレオチドが自然に欠失したり、挿入されたり、置換されたりすることが原因で起こる。それぞれのタイプの変化は、単独で起こったり、組み合わさって起こったりする上、1回だけでなく複数回起こる可能性もある。
【００２５】
オステオレギュリンをコードしている“変化した”核酸配列には、さまざまなヌクレオチドが欠失したり、挿入されたり、置換されたりしているが、オステオレギュリンの機能特性のうちの少なくとも1つを持つポリペプチドを生じさせる配列が含まれる。この定義には多型が含まれるが、その多型は、オステオレギュリンをコードしているポリヌクレオチドに対する特別なオリゴヌクレオチド・プローブを用いて容易に検出することのできることもあれば、そうでないこともある。コードされたタンパク質も“変化した”状態にできる。その変化したタンパク質は、アミノ酸残基が欠失したり、挿入されたり、置換されたりしているが、それはサイレントな変化であり、同じ機能のオステオレギュリンが得られる。アミノ酸残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または、両親媒性が似ている場合には人為的にアミノ酸を置換することができるが、オステオレギュリンの生物活性または免疫性には変化がないというのが置換にあたっての条件である。例えば負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸があり、正に荷電したアミノ酸としては、リシン、アルギニンがある。互いに似たような親水性を持ち、極性のある側鎖が荷電していないアミノ酸の組み合わせとしては、アスパラギンとグルタミン；セリンとトレオニンがある。互いに似たような親水性を持ち、側鎖が荷電していないアミノ酸の組み合わせとしては、ロイシンとイソロイシンとバリン；グリシンとアラニン；フェニルアラニンとチロシンがある。
【００２６】
“増幅”は、核酸配列のコピーを増やすことと関係している。増幅は、一般に、当業者には周知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法により行なう。
【００２７】
オステオレギュリンの“アンタゴニスト”とは、オステオレギュリンの生物活性を抑制する、または低下させる分子のことである。アンタゴニストとしては、抗オステオレギュリン抗体などのタンパク質、核酸、炭水化物、小さな分子のほか、細胞内のオステオレギュリンの量を減らすこと、またはシグナル伝達経路のオステオレギュリン・ポリペプチドの信号伝達を減らすことによってオステオレギュリンの活性を低下させる他の任意の化合物または組成物が挙げられる。
【００２８】
“抗体”という用語は、免疫グロブリン分子の全体、または、その一部であってエピトープと結合することができるFabフラグメント、F(ab')2フラグメント、Fvフラグメントなどの断片のことを指す。オステオレギュリン・ポリペプチドと結合する抗体は、部分が欠けていない完全なポリペプチドを用いて、あるいは、免疫反応を起こす抗原などの目的とする小さなペプチドを含む断片を用いて得ることができる。動物（例えばマウス、ラット、ウサギ）に免疫反応を起こさせるのに用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドは、RNAの翻訳によって、あるいは化学的合成によって得ることができ、望むのであれば、輸送タンパク質と結合させることができる。ペプチドと化学的に結合する輸送タンパク質としてよく利用されるのは、ウシ血清アルブミン、チログロブリン、スカシガイのヘモシアニンなどである。次に、結合したペプチドを用いて動物に免疫反応を起こさせる。
【００２９】
“生物活性がある”という用語は、天然の分子と同じ構造、調節機能、生物学的機能を有するタンパク質を意味する。また、“免疫活性のある”とは、天然、組み換え、または、合成のオステオレギュリンまたはそのオステオレギュリンの任意のオリゴペプチドが、適切な動物または細胞に特定の免疫反応を起こして特定の抗体と結合する能力のことを意味する。
【００３０】
所定のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む“組成物”とは、一般に、そのポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む任意の組成物のことである。この組成物は、乾燥物の形態でもよいし、水溶液を含んでいてもよい。
【００３１】
“保存されるアミノ酸置換”とは、置換が起こったときに、もとのタンパク質の性質を最小限しか阻害しないアミノ酸置換のことである。すなわち、そのタンパク質の構造と機能、中でも機能が保存されるため、そうした置換によって構造や機能が大きくは変化しないアミノ酸置換である。以下の表Aに、もとのアミノ酸と置換可能であるために保存されるアミノ酸置換と見なされるアミノ酸を示す。
【００３２】
【表１】
2004173696.tif 000002
【００３３】
一般に、保存されるアミノ酸置換は、（a）置換領域のポリペプチドの骨組み構造、例えばβシートまたはαヘリックスなどを維持し、（b）置換部位の分子の電荷または疎水性を維持し、および／または、（c）側鎖の大きさを維持している。
【００３４】
“誘導された（derivative）”という用語は、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列を化学的に修飾することを指す。ポリヌクレオチド配列の化学的修飾としては、例えば、水素が、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基、アミノ基と置換されることなどが挙げられる。誘導されたポリヌクレオチドは、天然のポリヌクレオチドの生物学的機能または免疫機能を少なくとも1つは維持したポリペプチドをコードしている。誘導されたポリヌクレオチドとは、グリコシル化、ペジル化（pegylation）、または任意の同様のプロセスによって修飾されているが、誘導される前のポリペプチドの生物学的機能または免疫機能を少なくとも1つは維持しているポリヌクレオチドのことである。
【００３５】
“断片”とは、オステオレギュリンまたはオステオレギュリンをコードしているポリヌクレオチドに特有の一部分で、配列が親と一致しているが、親の配列よりも短いものを指す。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、あるいはそれ以外の目的に用いる断片は、長さが、少なくとも5個、10個、15個、20個、25個、30個、40個、50個、60個、75個、100個、150個、250個、または少なくとも500個の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基にすることができる。断片は、分子の特定の領域から選択すること、または分子の特定の領域が欠けていることが好ましい。例えば、オステオレギュリン・ポリペプチド断片として、オステオレギュリンのN末端シグナル配列、例えば配列番号2，4，6、又は8のアミノ酸1-16であることができる。あるいは断片は、RGDモチーフを含んでいてもよい。
【００３６】
“一致”という用語は、相補性の程度を指す。一致には、部分的に似ている場合や完全に一致している場合がある。“類似”という用語は、“一致”という用語の代わりに使用することができる。一致した配列が標的となる核酸とハイブリダイズするのを少なくとも部分的に妨げる部分的相補配列は、“実質的に類似”であると呼ぶ。完全に相補的な配列が標的配列とハイブリダイズするのが妨げられたかどうかは、低ストリンジェンシー条件下のハイブリダイゼーション・アッセイ（サザン・ブロット法、ノーザン・ブロット法、溶液ハイブリダイゼーションなど）によって調べることができる。実質的に類似した配列またはハイブリダイゼーション用プローブは、低ストリンジェンシー条件下、完全に類似した（一致した）配列が標的配列と結合するのと競合し、その結合を抑制する。低ストリンジェンシー条件という表現は、非特異的結合が許されるような状態を意味しているわけではない。低ストリンジェンシー条件は、むしろ、2つの配列が、特異的（すなわち選択的）相互作用によって互いに結合することが要求される。非特異的結合が存在していないことは、相補性がほんの部分的にであれ欠けている（すなわち類似または一致が約30％未満）第2の標的配列を用いて調べることができる。非特異的結合が存在していないと、実質的に類似した配列またはプローブは、第2の非相補的標的配列にはハイブリダイズしない。
【００３７】
ポリヌクレオチド配列に関して用いる“パーセント一致”、“％一致”という用語は、標準的なアルゴリズムを用いてアラインメントしたときに少なくとも2つのポリヌクレオチド配列の間でヌクレオチドが一致している割合を指す。そのようなアルゴリズムを用いると、2つの配列の間のアラインメントを最適化するために、標準的かつ再現可能なやり方で、比較している配列の中にギャップを挿入することができて、それら2つの配列の比較がより意味のあるものになる。ポリヌクレオチド配列同士のパーセント一致は、MEGALIGNのバージョン3.12e配列アラインメント・プログラムに組み込まれたCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルト・パラメータを用いて決定することができる。このプログラムは、LASERGENEソフトウエア・パッケージという分子生物学解析プログラム・セット（DNASTAR、マディソン、ウィスコンシン州）の一部である。CLUSTAL Vについては、ヒギンズとシャープ、CABIOS、第5巻、151-153ページ、1989年と、ヒギンズ他、CABIOS、第8巻、189-190ページ、1992年に説明されている。ポリヌクレオチド配列をペアにしてアラインメントするには、デフォルト・パラメータを以下のように設定する。すなわち、Ktuple=2、ギャップ・ペナルティ=5、ウインドウ=4、“対角項保存”=4である。“重みをつけた”残基の重み表をデフォルトとして選択する。パーセント一致は、CLUSTAL Vが、アラインメントされたポリヌクレオチド配列ペアの間の“パーセント類似”として教えてくれる。別の方法として、よく使われていて自由に入手することのできる配列比較アルゴリズムのセットが、国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）から、基本的な局所的アラインメント検索ツール（BLAST）（アルトシュール他、J. Mol. Biol.、第215巻、403-410ページ、1990年）として提供されている。これは、いくつかの提供元から入手することができる。提供元としては、NCBI、ベテスダ、MID、http://www.ncbi.nim.nih.lzov/BLAST/がある。BLASTというソフトウエア・セットには、さまざまな配列解析プログラムが含まれている。そうしたプログラムの1つである“blastn”は、既知のポリヌクレオチド配列を様々なデータベースから得られた別のポリヌクレオチド配列とアラインメントするのに用いられる。また、“BLAST2 Sequences”と呼ばれるツールも入手可能である。このツールは、2つのヌクレオチド配列を直接ペアにして比較するのに用いられる。“BLAST2 Sequences”ツールは、http://www.ncbi.nim.nih.lzov/gorf/bl2.htmにアクセスして、対話方式で利用することができる。“BLAST2 Sequences”ツールは、blastnと（以下に説明する）blastpの両方で利用することができる。BLASTプログラムは、ギャップとそれ以外のパラメータをデフォルト設定で用いるのが一般的である。例えば、2つのヌクレオチド配列を比較するには、“BLAST2 Sequences”ツールのバージョン2.0.9（1999年5月7日）をデフォルト・パラメータに設定してblastnを用いるとよい。デフォルト・パラメータは、例えば、行列をBLOSUM62、一致の得点を1、不一致のペナルティを-2、オープン・ギャップを5、延長ギャップを-2、ペナルティ・ギャップ×脱落を-50、予測を10、ワード・サイズを1、フィルターをオン、にするとよい。パーセント一致は、規定された配列、例えば特定の配列ID番号で規定された配列の全長にわたって測定することができる。あるいは、��れよりも短い長さ、例えば、規定されたより長い配列から抜き出した断片の全長にわたって測定することもできる。そのような断片としては、例えば、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも70個、少なくとも100個、または少なくとも200個の連続したヌクレオチドからなる断片が考えられる。ここに挙げた長さは単なる例であって、パーセント一致を測定する長さとしては、この明細書の中に掲げた表、図面、配列リストに示した配列の任意の断片の長さを用いることができる。しかし、一致の程度がよくない核酸配列でも、遺伝暗号の縮重のために類似したアミノ酸配列をコードしている可能性がある。この縮重を利用して核酸配列を変化させることにより、どの核酸配列も実質的に同じオステオレギュリン・タンパク質をコードしているような本発明の多数の核酸配列を得ることができる。
【００３８】
ポリペプチド配列に関して用いる“パーセント一致”、“％一致”という用語は、標準的なアルゴリズムを用いてアラインメントしたときに少なくとも2つのポリペプチド配列の間でアミノ酸残基が一致している割合を指す。ポリペプチド配列をアラインメントさせる方法は周知である。いくつかのアラインメント法では、保存されるアミノ酸置換が考慮されている。そのような保存される置換は、すでに詳しく説明したが、一般に、置換部位において、疎水性と酸性を維持し、したがってポリペプチドの構造と機能を維持する。ポリペプチド配列相互の間のパーセント一致は、MegAlign（登録商標）配列アラインメント・プログラム（ディーエヌエースター社、マディソン、ウィスコンシン州）に組み込まれたCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルト・パラメータを用いて決定することができる。CLUSTAL Vを用いてポリペプチド配列をペアにしてアラインメントするには、デフォルト・パラメータを以下のように設定する。すなわち、Ktuple=1、ギャップのペナルティ=-3、ウインドウ=5、“対角項保存”=5である。残基の重み表のデフォルトとしてはPAM250行列を選択する。ポリヌクレオチドのアラインメントのときと同様、パーセント一致は、CLUSTAL Vが、アラインメントされたポリペプチド配列のペアの間の“パーセント類似”として教えてくれる。
【００３９】
別の方法として、NCBIのBLASTソフトウエア・セットを用いることもできる。例えば、2つのポリペプチド配列をペアにして比較するには、blastnをデフォルト・パラメータに設定して“BLAST2 Sequences”ツールのバージョン2.0.9（1999年5月7日）を用いるとよい。デフォルト・パラメータは、例えば、行列をBLOSUM62、オープン・ギャップを11、延長ギャップを1、ペナルティ・ギャップ×脱落を50、予測を10、ワード・サイズを3、フィルターをオン、にするとよい。パーセント一致は、規定されたポリペプチド配列、例えば特定の配列ID番号（例えば、2、4、6、8、10）で規定された配列の全長にわたって測定することができる。あるいは、それよりも短い長さ、例えば、規定されたより長いポリペプチド配列から抜き出した断片の全長にわたって測定することもできる。そのような断片としては、例えば、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも70個、または少なくとも100個の連続したアミノ酸残基からなる断片が考えられる。ここに挙げた長さは単なる例であって、パーセント一致を測定する長さとしては、この明細書の中に掲げた表、図面、配列リストに示した配列の任意の断片の長さを用いることができる。
【００４０】
“宿主”とは、異種ポリヌクレオチドによりトランスフェクトされ、かつ、それを発現することができるトランスジェニック細胞（例えば、哺乳動物、バクテリア、昆虫）又は動物（例えば、非ヒト哺乳動物）を意味する。
【００４１】
“人工染色体（HACs）”は、線状の微小染色体である。その中には、サイズが約6kb-10MbのDNA配列を組み込むことが可能性である。この染色体の中には、染色体の安定な有糸分裂と維持に必要なすべての要素が含まれている。
【００４２】
“ヒト化された抗体”とは、もともとはヒト以外の抗体分子だったものが、抗原以外のものが結合する領域におけるアミノ酸配列が変化してその抗体がヒトの抗体に非常によく似た状態になっているが、それでも元の結合能力は維持しているような抗原分子を意味する。
【００４３】
“ハイブリダイゼーション”とは、規定のハイブリダイゼーション条件において、1本のポリヌクレオチド鎖が、塩基がペアになることを通じて相補的な鎖と結合して2本鎖になるプロセスのことを指す。特異的なハイブリダイゼーションが起こるということは、2つの核酸配列が高い割合で一致していることを示している。特異的なハイブリダイゼーション複合体は、許容アニール条件のもとで形成され、“洗浄”操作の後もハイブリッドが形成されたままになる。条件が厳しくなるほど非特異的結合が少なくなる、すなわち、核酸配列の鎖がペアの間で完全には一致しない結合が許されにくくなるので、洗浄操作は、ハイブリダイゼーション・プロセスにおける条件の厳しさを決めるのに特に重要である。核酸配列をアニールするための許容条件は、当業者であれば容易に決定できて、どのハイブリダイゼーション実験でも同じであろう。しかし洗浄条件は、条件の厳しさをどの程度望んでいるかによって、したがってハイブリダイゼーションの特異性によって、実験ごとに異なる可能性がある。許容アニール条件は、例えば、約6×SSC、約1％（w/v）のSDS、約100pg/mlの変性したサケ精子DNAの存在下において、68℃にて実現される。
【００４４】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、一部、洗浄操作が行なわれる温度との関連で決まる。一般に、そのような洗浄温度は、規定のイオン強度とpHにおける特定の配列の融点（Tm）よりも約5〜20℃低い温度の範囲から選択する。Tmは、（規定のイオン強度とpHにおいて）標的配列の50％が、その配列と完全に一致したプローブとハイブリダイズする温度である。Tmを計算するための式と核酸のハイブリダイゼーション条件は周知であり、サムブルック他、『分子クローニング：実験室マニュアル』、第2版、第1巻〜第3巻、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、プレインヴュー、ニューヨーク州、1989年に記載されている。特に、第2巻の第9章を参照されたい。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチド間でハイブリッドを形成するための高ストリンジェント条件としては、約0.2〜1.0×SSCと約0.1％のSDSの存在下で55〜68℃にて1時間洗浄を行なうという条件がある。
【００４６】
一般に、ハイブリダイゼーション反応は、温度を約65℃、60℃、55℃、または42℃にして行なうことができる。SSCの濃度は、SDSが約0.1％存在しているという条件下で、約0.1〜2XSSCの範囲で変えることができる。通常は、非特異的なハイブリダイゼーションを阻止するため、阻止剤を用いる。阻止剤としては、例えば、約100〜200pg/mlの変性したサケ精子DNAが挙げられる。特殊な状況、例えばRNAとDNAの間でハイブリダイゼーションを行なわせる場合には、有機溶媒、例えば約35〜50％v/vのホルムアミドも用いることができる。当業者には、有効なさまざまな洗浄条件が明らかであろう。特に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションが実現するということは、ヌクレオチド間に進化上の類似性があることを示唆している。そのような類似性は、それらヌクレオチド同士、また、それらヌクレオチドによってコードされたポリペプチド同士が似た役割を持っていることを強く示唆している。
【００４７】
“ハイブリダイゼーション複合体”という用語は、2つの核酸配列の間で相補的な塩基同士の間に水素結合が形成されたために形成された複合体のことを意味する。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液中に存在している配列同士の間に形成されることもあれば、一方の核酸配列が溶液中にあり、他方の核酸配列が固体支持体（例えば、紙、膜、フィルター、チップ、ピン、スライドガラス）に固定されているような核酸配列間に形成されることもある。
【００４８】
“単離または精製された”は、“人間の手によって”自然な状態から変化したことを意味する。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが自然界に存在しているとして、それが元の環境から変化させられた、および／または、移された場合に、“単離または精製された”と言う。例えば、“単離または精製された”ポリヌクレオチドは、自然界で結合する相手である別のポリヌクレオチド配列から離されている。同様に、“単離または精製された”ポリペプチドは、自然界で結合する相手である、細胞の少なくとも1つの要素から離されている。好ましくは、このポリペプチドは、他の成分から少なくとも60％、より好ましくは少なくとも75％、そして最も好ましくは少なくとも90％フリーである。
【００４９】
“作用可能な状態で連結された”とは、第1の核酸配列が第2の核酸配列と機能的に関係を持った状態にされている状態を意味する。例えば、プロモーターは、そのプロモーターがコード配列の転写または発現を調節する機能を持っているのであれば、コード配列と機能的に関連している。一般に、機能的に関連したDNA配列は、近接または連続した位置にあり、2つのタンパク質コード領域を合体させる必要がある場所では、同じリーディング・フレームの中にある。
【００５０】
“ペプチド核酸（PNA）”とは、リシンで終わるアミノ酸残基群で構成されたペプチド鎖と結合しており、長さが少なくとも約5ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス分子またはアンチ遺伝子剤を意味する。末端にリジンがあるため、この組成物は可溶性である。PNAは、相補的な1本鎖のDNAまたはRNAと結合して転写産物が延びるのを停止することが好ましい。また、PNAは、ペジル化によって細胞内における寿命を延ばすことができる。
【００５１】
“ポリヌクレオチド”は、一般に、任意のRNA配列（例えばmRNA配列）、RNA様の配列、DNA（例えばcDNA配列またはゲノム配列）、またはDNA様の配列を指し、その中には、1本鎖の配列、2本鎖の配列、3本鎖の配列、センス鎖、アンチセンス鎖、ヌクレオチドのアナログを用いて生成させた配列、RNAとDNAを含むハイブリッド分子、修飾された塩基を含むRNAまたはDNAが含まれるが、これがすべてではない。ポリヌクレオチドは、天然のものでも合成されたものでもよい。
【００５２】
“ポリペプチド”は、アミノ酸配列、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質配列、または、これらのうちの任意のものの断片を指す。ポリペプチドは、天然のものでも合成されたものでもよい。ポリペプチドには、翻訳後のプロセスなどの自然のプロセス、または、従来技術として周知の化学的修飾のいずれかによって変化したアミノ酸配列が含まれる（例えば、『タンパク質  - 
構造と分子的特性』、クライトン編、W.H.フリーマン社、ニューヨーク、ニューヨーク州、第2版、1993年；『共有結合によるタンパク質の翻訳後修飾』、ジョンソン編、アカデミック・プレス、ニューヨーク、ニューヨーク州、1983年；サイフター他、Meth. Enzymol.、第182巻、626-646ページ、1990年；ラタン他、Ann. NY Acad. Sci.、第663巻、48-62ページ、1992年を参照のこと）。
【００５３】
“プローブ”とは、オステオレギュリンをコードしている核酸配列、その相補体、またはその断片のうちで、一致する核酸配列、対立遺伝子の核酸配列、または関連した核酸配列を検出するのに用いられるもののことである。プローブは、検出可能な標識分子またはレポーター分子に付着した、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。代表的な標識としては、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光物質、酵素などが挙げられる。
【００５４】
“プライマー”とは、アニールによる相補的な塩基とのペア形成を通じて標的ポリヌクレオチドに結合させることのできる短い核酸（通常は短いDNAオリゴヌクレオチド）のことである。プライマーは、次に、DNAポリメラーゼという酵素を用いて標的DNA鎖に沿って延長させることができる。プライマーのペアは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって核酸配列を増幅（及び同定）するために用いることができる。
【００５５】
本発明で用いるプローブとプライマーは、一般に、既知の配列に含まれる連続した少なくとも15個のヌクレオチドを含んでいる。特異性を増すためには、それよりも長いプローブとプライマーを用いるとよい。用いられるのは、例えば、既知の核酸配列中の少なくとも20個、25個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、または少なくとも150個の連続したヌクレオチドを含むプローブとプライマーである。プローブとプライマーは、これらの例よりもはるかに長くてもよい。この明細書の中に掲げた表、図面、配列リストに示した任意の長さのものを用いることができる。
【００５６】
プローブとプライマーの作り方と使用法は、文献に記載されている（例えば、サムブルック他、『分子クローニング：実験室マニュアル』、第2版、第1巻〜第3巻、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、プレインヴュー、ニューヨーク州、1989年；オースベル他、『分子生物学における最近のプロトコル』、グリーン・パブリケーション・アソシエーション＆ワイリー-インターサイエンシーズ社、ニューヨーク、ニューヨーク州、1987年；イニス他、『PCRのプロトコル
−  実施法と応用のためのガイド』、アカデミック・プレス、サンディエゴ、カリフォルニア州、1990年）。PCRプライマーのペアは、既知の配列から導き出すことができる。そのためには、例えば専用のコンピュータ・プログラムを用いる（例えば、Primerのバージョン0.5、1991年、ホワイトヘッド生物医学研究所、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）。
【００５７】
プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、従来技術として知られている専用のソフトウエアを利用して選択する。例えば、OLIGO4.06ソフトウエアが、PCRプライマーのペアを個々のヌクレオチドに至るまで選択するのに役立つ。また、このソフトウエアは、入力した32kbまでのポリヌクレオチド配列から、オリゴヌクレオチドと、それよりも大きな5,000個までのヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを解析するのにも役立つ。同様な別のプライマー選択プログラムでは、性能を向上させるための工夫がさらになされている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム（入手先は、テキサス大学西南医学センターのゲノム・センター、ダラス、テキサス州）を用いるとメガ塩基の配列から特定のプライマーを選択することができるため、ゲノム・レベルの視点でプライマーを設計するのに役立つ。Primer3プライマー選択プログラム（入手先は、ホワイトヘッド研究所／MITゲノム研究センター、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を用いると、ユーザーは“プライミングの間違いライブラリー”を入力することができる。つまり、プライマーが結合する部位として避けるべき配列をユーザーが指定できる。Primer3は、特にマイクロアレイ用のオリゴヌクレオチドを選択するのに役立つ。（最後の2つのプライマー選択プログラムのソース・コードは、それぞれの提供元から得ることができるし、ユーザーの特別な必要性に応じて変更することもできる。）PrimeGenプログラム（入手先は、英国ヒト・ゲノム・マッピング・プロジェクト・リソース・センター、ケンブリッジ、イギリス）は、多重配列アラインメントに基づいてプライマーを設計するため、アラインメントされた核酸配列の最も保存された領域または最も保存されていない領域のいずれかとハイブリダイズするプライマーを選択することができる。したがってこのプログラムは、独自のオリゴヌクレオチドとポリヌクレオチド断片および保存されたオリゴヌクレオチドとポリヌクレオチド断片の両方を同定するのに役立つ。上記のいずれかの選択方法を用いて同定されたオリゴヌクレオチドとポリヌクレオチド断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えば、PCRプライマー、配列決定プライマー、マイクロアレイの要素として、あるいは、核酸サンプル中の全体または一部が相補的なポリヌクレオチドを同定するための特異的プローブとして役立つ。なお、オリゴヌクレオチドの選択法は、上記のものに限定されない。
【００５８】
“置換”とは、1個以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドで置き換えることを意味する。
【００５９】
特定の核酸配列の“変異体”は、“BLAST2 Sequences”ツールのバージョン2.0.9をデフォルト・パラメータに設定してblastnを用いたとき、ある1つの核酸配列の中の所定の長さにわたって、配列の少なくとも40％がその特定の核酸配列と一致する核酸配列として定義される。そのような核酸のペアは、例えば、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、またはそれ以上の割合が所定の長さにわたって一致していてもよい。変異体としては、例えば、（すでに定義した）“対立遺伝子”変異体、“スプライス”変異体、“種”変異体、または“多型”変異体などが可能である。スプライス変異体は、参照分子とかなり一致している可能性があるが、mRNAを処理する際のエキソンの選択的スプライシングのために、ポリヌクレオチドの数が参照分子より多かったり少なかったりするのが一般である。対応するポリペプチドは、機能ドメインが追加されていたり、参照分子に存在しているドメインが欠けていたりする。種変異体とは、種ごとに異なるポリヌクレオチド配列のことである。その配列から生まれるポリペプチド同士の間では、一般に、アミノ酸がかなり一致している。多型変異体は、ある1つの種の個体間に存在する、特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列における変異のことである。多型変異体には、ポリヌクレオチド配列がヌクレオチド塩基1個だけ変化している“一塩基多型（SNPs：スニップ）”も含まれる。スニップの存在は、例えば、ある一定の集団、ある病気の状態、またはある病気の傾向を示している可能性がある。
【００６０】
“形質転換”または“トランスフェクション”とは、外来性DNAがそれを受け入れる細胞の中に入ってその細胞を変化させるプロセスのことである。形質転換は、従来技術で周知のさまざまな方法を用いて外来性核酸配列を原核生物または真核生物の宿主細胞に導入することによって起こすことができる。形質転換する細胞のタイプに応じて方法を選択する。方法としては、ウイルス感染法、電気穿孔法、熱ショック法、リポフェクション法、パーティクル・ガン法などがあるが、これだけに限られるわけではない。“形質転換された”細胞という用語には、安定に形質転換された細胞と、一時的に形質転換された細胞が含まれる。形質転換された安定な細胞では、導入されたDNAが、自動的に複製を行なうプラスミドまたは宿主染色体の一部として、複製能力を持つようになっている。一時的に形質転換された細胞では、導入されたDNAまたはRNAが、限られた期間だけ発現する。このような形質転換され又はトランスフェクトされた細胞のすべてを“トランスジェニック”という。
【００６１】
“遺伝子を改変した”ヒト以外の哺乳類の細胞または動物の細胞は、遺伝子工学によってヒト以外の哺乳類または動物、あるいはその子孫に導入される改変に関してヘテロ接合またはホモ接合である。改変を行なうのに利用できる標準的な遺伝子工学の方法としては、相同的組み換え、ウイルス・ベクターを用いた遺伝子トラッピング、放射線照射、化学的突然変異誘発、アンチセンスRNAをコードしているヌクレオチド配列だけを用いたトランスジェニックな発現、アンチセンスRNAをコードしているヌクレオチド配列と触媒作用を有するリボザイムを組み合わせたトランスジェニックな発現などがある。好ましい遺伝子改変法は、例えば、相同的組み換えまたはウイルス・ベクターによる遺伝子トラッピングという方法を利用して“外来性核酸配列”を遺伝子座に導入することにより、内在性遺伝子を改変する方法である。“外来性核酸配列”とは、遺伝子の中に天然には存在しない外部の配列のことである。外来性DNAは、オステオレギュリン遺伝子の任意の領域、例えば、エンハンサー、プロモーター、レギュレーター領域、非コード領域、コード領域、イントロン、エキソンなどに挿入することができる。最も好ましい遺伝子工学的方法は、相同的組み換えである。相同的組み換えにより、外来性核酸配列が単独で、あるいは外来性核酸配列と内在性遺伝子配列の一部欠失とが組み合わさり、標的に狙いを定めたように挿入される。
【００６２】
“機能が破壊された”オステオレギュリン遺伝子とは、通常は野生型オステオレギュリン遺伝子が発現している細胞の中で、破壊された遺伝子がコードしているオステオレギュリン・ポリペプチドの細胞活性が低下するように遺伝子が改変されたオステオレギュリン遺伝子のことである。遺伝子の改変によって細胞内のあらゆる野生型オステオレギュリン遺伝子のコピーが（例えば、遺伝子を改変したヒト以外の哺乳類の細胞または動物の細胞がオステオレギュリン遺伝子の破壊に関してホモ接合になっているとか、あるいは、元々存在している野生型オステオレギュリン遺伝子のコピーだけが今回は破壊されるとかによって）実質的に消されてしまうと、そのような遺伝子改変の結果として、オステオレギュリン・ポリペプチドの活性が、適切に制御されていて野生型オステオレギュリン遺伝子を発現している細胞と比べて低下することになる。オステオレギュリン・ポリペプチドの活性がこのように低下した原因は、オステオレギュリン遺伝子の発現が低下したこと（すなわち、オステオレギュリンのmRNAのレベルが実質的に低下し、オステオレギュリン・ポリペプチドの生産レベルが低下したこと）、および／または、破壊されたオステオレギュリン遺伝子が、野生型のオステオレギュリン・ポリペプチドと比べて機能または安定性が低下するように突然変異したポリペプチドをコードしていることにある。遺伝子を改変したヒト以外の哺乳類の細胞または動物の細胞の中にあるオステオレギュリン・ポリペプチドの活性は、野生型のものと比べて50％以下になっていることが好ましい。さらに好ましいのは、活性が野生型の25％以下になっていることであり、それ以上に好ましいのは10％以下になっていることである。しかし最も好ましいのは、オステオレギュリン遺伝子を破壊した結果、オステオレギュリンの活性が検出不能になることである。
【００６３】
機能が破壊されたオステオレギュリン遺伝子を含む“ヒト以外の遺伝子改変哺乳類”とは、例えば、望みの遺伝子を改変した胚盤胞または胚を作り、次に、その胚盤胞または胚を代理母に移植して胎内で成長させることによって新たに生み出したヒト以外の哺乳類のことである。遺伝子を改変した胚盤胞または胚は、マウスの場合には、遺伝子を改変した胚幹（ES）細胞をマウスの胚盤胞に移植することによって、または、ES細胞を四細胞胚と一体化することによって作ることができる。また、遺伝子を改変した胚を有するさまざまな種は、核移植によって得ることができる。核移植の場合には、ドナー細胞は、体細胞または多分化能を有する幹細胞であり、遺伝子工学により、その細胞において、オステオレギュリン遺伝子の機能を破壊するという望みの遺伝子改変がなされるようにする。次に、この細胞の核を、核を取り除いた受精卵母細胞または処女生殖卵母細胞に移し、胚を再構成し、成長させて胚盤胞にする。上記のいずれかの方法によって作った遺伝子改変胚盤胞は、次に、当業者には周知の標準的な方法に従って代理母に移植する。“ヒト以外の遺伝子改変哺乳類”には、上記の方法で作った哺乳類の子孫がすべて含まれるが、その子孫は、オステオレギュリン遺伝子の機能が破壊された遺伝子改変コピーを少なくとも1つ受け継いでいる必要がある。遺伝子改変哺乳類のあらゆる体細胞と生殖細胞が、この改変を含んでいることが好ましい。破壊されたオステオレギュリン遺伝子を含むように遺伝子を改変したヒト以外の好ましい哺乳類としては、マウス、ラットなどの囓歯類、ネコ、イヌ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ヒツジ、ブタ、フェレットなどが挙げられる。
【００６４】
機能が破壊されたオステオレギュリン遺伝子を含む“遺伝子改変動物の細胞”とは、遺伝子工学により、機能が破壊されたオステオレギュリン遺伝子を含むようにされた動物の細胞（ヒトの細胞も含む）と、その破壊されたオステオレギュリン遺伝子を受け継いだ娘細胞のことである。これらの細胞は、従来技術で知られている標準的ないずれかの方法に従って、培養中に遺伝子を改変することもできる。培養中の細胞の遺伝子を改変する別の方法として、破壊されたオステオレギュリン遺伝子を含むように遺伝子を改変したヒト以外の哺乳類の細胞を分離する方法もある。本発明の動物の細胞は、初期段階の細胞または組織培養物から得ることが可能であり、また、培養に適した細胞系、腫瘍形成性の細胞系、形質転換された細胞系からも得ることができる。これらの細胞や細胞系が由来するのは、例えば、内皮細胞、上皮細胞、ランゲルハンス島、ニューロン、それ以外の神経組織由来の細胞、中皮細胞、骨細胞、リンパ球、軟骨細胞、造血細胞、免疫細胞、主要な腺または器官の細胞（例えば、精巣、肝臓、肺、心臓、胃、膵臓、腎臓、皮膚）、筋肉細胞（骨格筋、平滑筋、心筋）、外分泌細胞または内分泌細胞、繊維芽細胞、胚幹細胞、その他の全能性、多能性の幹細胞（例えば、ES細胞、ES様細胞、胚幹生殖（EG）細胞のほか、子孫細胞や組織由来の幹細胞などのその他の幹細胞）からである。好ましい遺伝子改変細胞は、ES細胞である。さらに好ましいのはマウスまたはラットのES細胞であり、それ以上に好ましいのはヒトのES細胞である。
【００６５】
“ES細胞”または“ES様細胞”とは、胚、原始生殖細胞、または奇形腫細胞に由来する多能性の幹細胞のことである。この細胞は、自己を無限に再生させるとともに、3つの胚葉で表わされるどのタイプの細胞にも分化することができる。
【００６６】
“変化する（modulates）”とは、増加または減少する（完全に消滅することも含む）ことである。
【００６７】
本発明の他の特徴ならびに利点は、以下の詳細な説明と請求の範囲から明らかになろう。本発明を特定の実施態様に基づいて説明したが、実行可能なそれ以外の改変や変更も本発明の一部であり、そうした改変や変更が添付の請求の範囲にも含まれることが理解されよう。本出願は、この明細書から出発したが従来技術において既知の方法または普通に行なわれている方法の中に収まってしまうもの、または難しい実験をせずに確認できるものも含め、本発明の原理に一般的に従った等価物、変化形、用途、改作をすべて含むことを想定したものである。核酸およびポリペプチドの作り方と利用法に関する補足的な参考事項が、分子生物学、タンパク質の科学、免疫学の標準的な教科書に記載されている（例えば、デイヴィス他、『分子生物学における基本的な方法』、エルスヴィア・サイエンシーズ・パブリッシング社、ニューヨーク、ニューヨーク州、1986年；ヘイムズ他、『核酸のハイブリダイゼーション』、ILプレス、1985年；「分子クローニング」、サムブルック他、『分子生物学における最近のプロトコル』、オースベル他編、ジョン・ワイリー＆サンズ社；『ヒトの遺伝学における最近のプロトコル』、ドラコポーリ他編、ジョン・ワイリー＆サンズ社；『タンパク質の科学における最近のプロトコル』、ジョンE.コリガン他編、ジョン・ワイリー＆サンズ社；『免疫学における最近のプロトコル』、ジョンE.コリガン他編、ジョン・ワイリー＆サンズ社を参照のこと）。引用したすべての出版物を、全体として本明細書中に援用する。
詳細な説明
本発明は、オステオレギュリンと呼ばれる哺乳類の新しいタンパク質と、オステオレギュリンをコードするポリヌクレオチドと、破壊されたオステオレギュリン遺伝子を含むように遺伝子を改変した、ヒト以外の哺乳類と動物の細胞と、外来性オステオレギュリン・タンパク質をトランスフェクトされた宿主細胞と、外来性オステオレギュリン・タンパク質を発現する宿主細胞とに関するものである。
【００６８】
われわれは、オステオレギュリンが、骨密度、骨の石灰化、脂肪過多の程度を調節する機能を有することを発見した。したがって、本発明の別の特徴により、第1に、オステオレギュリンの活性および／または発現を変化させる薬剤を同定するスクリーニング・アッセイが提供され、第2に、オステオレギュリンの活性または発現を調節する薬剤を用いて骨組織または脂肪組織と関連した異常を治療または予防する方法が提供される。
【００６９】
オステオレギュリンのアミノ酸配列とヌクレオチド配列
本発明には、オステオレギュリン・ポリペプチド配列が含まれる。含まれるのは、例えば、ラットのオステオレギュリン（Fig.1B、配列番号2）、マウスのオステオレギュリン（Fig.2B、配列番号4）、ヒトのオステオレギュリン（Fig.3BとFig.4B、Fig.21AとFig.21B、それぞれ配列番号6, 8, 34及び46）、および、これらの変異体、ホモログ、断片、誘導体の配列である。
【００７０】
この明細書に示したオステオレギュリンはすべて、セリンとグリシンと荷電したアミノ酸を豊富に含むとともに、分泌されるポリペプチドを標的とした、アミノ末端が荷電した疎水性シグナル配列を含んでいる。インテグリンによる結合やシグナル伝達を通じた細胞と基質の間の相互作用に関与する要素であるRGD配列も、すべての配列で保存されている。これら配列を比較してみると、ラットのオステオレギュリンとマウスのオステオレギュリンは67％が一致しており、ヒトのオステオレギュリンとラットまたはマウスのオステオレギュリンは45％が一致している。Fig.5に示すように、配列間で一致している箇所は、配列の全体にわたって分布している。上記のオステオレギュリン配列の好ましい変異体、ホモログ、断片、誘導体は、保存されたRGD配列（Fig.5の下線部）を含んでいる。
【００７１】
これらオステオレギュリンは、細胞外マトリックスを構成する一群のリン糖タンパク質と共通する構造的特徴を有する。リン糖タンパク質としては、例えば、オステオポンチン、象牙質（dentin）、シアロホスホタンパク質、象牙質基質タンパク質1、骨のシアロタンパク質IIなどが挙げられる。これらリン糖タンパク質はすべて、骨または象牙質で発現し、石灰化の調節を行なう役割を担っている（ドスーザ他、J. of Bone & Mineral Research、第12巻、2040-2049ページ、1997年；ロベイ、Connective Tissue Research、第35巻、131-136ページ、1996年；ボスキー、Connective Tissue Research、第35巻、357-363ページ、1996年）。
【００７２】
本発明はまた、オステオレギュリン・ポリペプチドをコードしている核酸配列や、そのあらゆる変異体、ホモログ、誘導体、断片をコードしている核酸配列にも関する。具体例を挙げるならば、ラットのオステオレギュリンに関するコード配列とcDNA由来の配列の全長（Fig.1Aと配列番号1）、マウスのオステオレギュリンに関するコード配列とcDNA由来の配列の全長（Fig.2Aと配列番号3）、ヒトのオステオレギュリンに関する2つのスプライス変異体（Fig.3Aと配列番号5；Fig.4Aと配列番号7）がある。本発明に含まれるものとしては、さらに、緩やかな条件や厳しい条件などのさまざまな条件で本発明のポリヌクレオチド配列とハイブリダイズできるポリヌクレオチド配列がある（例えば、ヴァールとバーガー、Methods Enzymol.、第152巻、399-407ページ、1987年；キンメル、Methods Enzymol.、第152巻、507-511ページ、1987年を参照のこと）。
【００７３】
オステオレギュリンをコードしている核酸配列は、プロモーターや調節要素などの上流の配列を検出することを目的として、核酸配列の一部を用い、さらに、従来技術で知られているPCRに基づいたさまざまな方法を利用して延長させることができる。例えば、制限部位PCRという方法を利用することができるが、この方法では、ぴったり重なった一般的なプライマーを用いて、クローニング・ベクターの内部においてゲノムDNAから未知の配列を増幅している（例えば、サーカー，G、PCR Methods Applic.、第2巻、318-322ページ、1993年を参照のこと）。逆PCRという別の方法では、さまざまな方向に広がるように延びるプライマーを用いて、環状のテンプレートから未知の配列を増幅している。このテンプレートは、既知の遺伝子座とその周囲の配列を含む制限断片に由来する（例えば、トリリャ他、Nucleic Acids Res.、第16巻、8186ページ、1988年を参照のこと）。第3の方法は捕捉PCRで、この方法は、ヒトおよび酵母の人工染色体DNAの中の既知の配列と隣接したDNA断片をPCRで増幅する操作を含んでいる（例えば、レイガーストローム他、PCR Methods Applic.、第1巻、111-119ページ、1991年を参照のこと）。この方法では、制限酵素による多数回の切断とリガンド形成を利用して、遺伝子工学で作った2本鎖の配列を未知配列中のある領域に挿入し、その後にPCRを行なう。
【００７４】
本発明の別の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、適切な宿主細胞の中にあってオステオレギュリンの発現を指示する組み換えDNA分子の中や、その組み換えホモログ、変異体、誘導体、断片の中でクローニングすることができる。オステオレギュリンをコードしている配列を変えるための本発明のヌクレオチド配列は、従来技術で周知の方法を用いて作ることができる。オステオレギュリンをコードしている配列を変える目的はさまざまで、例えば、遺伝子産物のクローニング、処理、および／または、発現状態の変更などが目的であるが、目的がここに記したものに限定されるわけではない。
【００７５】
ランダムな断片化によるDNAシャッフリングと、PCRによる遺伝子断片の再組み立てと、合成したオリゴヌクレオチドとを利用して、ヌクレオチド配列を作ることができる。例えば、オリゴヌクレオチドを媒介とした位置指定突然変異誘発を利用して突然変異を導入することにより、新しい制限部位を作り出したり、グリコシル化のパターンを変化させたり、コドンの好みを変えたり、スプライス変異体を生み出したりすることができる。別の実施態様では、従来技術で周知の化学的な方法を用いて、オステオレギュリンをコードしている配列の全体または一部を合成することができる（例えば、カルーサーズ他、Nucleic Acids Symp. Ser.、第7巻、215-223ページ、1980年；ホーン他、Nucleic Acids Symp. Ser.、第7巻、225-232ページ、1980年を参照のこと）。また、化学的な方法を用いてオステオレギュリンそのもの、またはその断片を合成することもできる。例えば、さまざまな固相技術を用いて、ペプチドを合成することができる（例えば、ロバージ他、Science、第269巻、202-204ページ、1995年を参照のこと）。合成の自動化は、ABI 431Aペプチド合成装置を用いて実現することができる（パーキン-エルマー社）。さらに、オステオレギュリンのアミノ酸配列、またはその任意の一部を、直接合成している間に変えること、および／または、他のタンパク質からの配列またはその任意の一部と組み合わせることによって、ポリペプチドの変異体を作ることができる。ペプチドは、高性能液体クロマトグラフィーで実質的に精製することができる（例えば、キエズとレニアー、Methods Enzymol.、第182巻、392-421ページ、1990年を参照のこと）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認できる（例えば、クライトン、『タンパク質、構造、分子的特性』、WHフリーマン社、ニューヨーク、ニューヨーク州、1984年を参照のこと）。
【００７６】
オステオレギュリンをコードしている発現ベクター
生物活性のあるオステオレギュリンを発現させるためには、オステオレギュリンまたはその誘導体をコードしているヌクレオチド配列を、適切な発現ベクターに挿入するとよい。適切な発現ベクターとは、適切な宿主の中で挿入されたコード配列の転写と翻訳を制御するのに必要な要素を含んだベクターのことである。必要な要素としては、エンハンサー、構成的プロモーター、誘導的プロモーター、ベクターに由来する5'末端と3'末端の非翻訳領域、および／またはオステオレギュリンをコードしているポリヌクレオチド配列に由来する5'末端と3'末端の非翻訳領域などの調節配列が挙げられる。そのような要素は、強さや特異性がさまざまであってよい。特別な開始シグナルを用いて、オステオレギュリンをコードしている配列をより効果的に翻訳することもできる。そのような信号としては、ATG開始コドンや、隣接した配列、例えばコザック（Kozac）配列などがある。オステオレギュリンをコードしている配列とその開始コドンに加え、上流の調節配列が適切な発現ベクターに挿入されている場合には、それ以外の転写制御シグナルまたは翻訳制御シグナルは必要なくなる。しかし、コード配列またはその断片だけが挿入されている場合には、外来性翻訳制御シグナルが、フレーム内ATG開始コドンも含め、ベクターに与えられる必要がある。外来性翻訳要素と開始コドンは、天然のものでも合成のものでもよい。使用する個々の宿主細胞系にとって適切なエンハンサーを含めることで、発現の効率を大きくすることができる（例えば、シャーフ他、Results Probl. Cell Differ.、第20巻、125-162ページ、1994年を参照のこと）。当業者に周知のいろいろな方法を利用して、オステオレギュリンをコードしている配列と、適切な転写制御要素と、適切な翻訳制御要素とを含む発現ベクターを構成することができる。これらの方法では、インビトロでの組み換えDNA技術と、合成技術と、インビボでの遺伝子組み換えが利用されている（例えば、サムブルック他、『分子クローニング：実験室マニュアル』、第4章、第8章、第16章、第17章、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、プレインヴュー、ニューヨーク州、1989年；オースベル他、『分子生物学における最近のプロトコル』、第9章、第13章、第16章、ジョン・ワイリー＆サンズ社、ニューヨーク、ニューヨーク州、1995年を参照のこと）。オステオレギュリンをコードしている配列を組み込んでオステオレギュリンを発現させるためには、さまざまな発現ベクター／宿主系を用いることができる。具体例としては、組み換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドDNA発現ベクターで形質転換した微生物；酵母の発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス（例えばバキュロウイルス）の発現ベクターを感染させた昆虫細胞系；ウイルス（例えばカリフラワー・モザイク・ウイルス（CaNW）またはタバコ・モザイク・ウイルス（TMV））の発現ベクターやバクテリア（例えばTiまたはpBR322プラスミド）の発現ベクターで形質転換した植物細胞系；動物細胞系などが挙げられるが、これだけに限られるわけではない。本発明は、用いる宿主細胞の制約を受けない。
【００７７】
バクテリア系では、オステオレギュリンをコードしているポリヌクレオチド配列をどのような用途に用いるかに応じて、多数のクローニング・ベクターと発現ベクターを選択することができる。例えば、オステオレギュリンをコードしているポリヌクレオチド配列を一般的にクローニングしたり、サブクローニングしたり、増やしたりするには、pBlueScript（ストラタジーン社、ラ・ジョラ、カリフォルニア州）またはpSport1プラスミド（ライフ・テクノロジーズ社、ゲサーズバーグ、メリーランド州）などの多機能大腸菌ベクターを用いるとよい。オステオレギュリンをコードしている配列をベクターの中に多数あるクローニング部位と結合させるとlacZ遺伝子が破壊されるため、組み換え分子を含むことによって形質転換されたバクテリアを同定するための色彩スクリーニングが可能になる。さらに、これらベクターは、インビボでの転写、ジデオキシ法による配列決定、ヘルパー・ファージを用いた1本鎖の救助、クローニングされた配列内における重なった欠失の生成にも役立つ（例えば、ファン・ヘーケとシュスター、J. Biol. Chem.、第264巻、5503-5509ページ、1989年を参照のこと）。例えば抗体を生産するために大量のオステオレギュリンが必要な場合には、オステオレギュリンを高レベルで発現させるベクターを用いるとよい。例えば、強力な誘導的T5またはT7バクテリオファージ・プロモーターを含むベクターを用いることができる。
【００７８】
オステオレギュリンをコードしている配列を用いて形質転換した宿主細胞
オステオレギュリンの生産には酵母の発現系を用いることができる。構成的プロモーターまたは誘導的プロモーターを含む多数のベクター、例えばα因子、アルコール・オキシダーゼ、PGHプロモーターなどを含む多数のベクターを、サッカロミセス・セレヴィジエ（Saccharomyces cerevisiae）またはピキア・パストリス（Pichia pastoris）などの酵母の中で用いることができる。さらに、そのようなベクターは、発現したタンパク質を分泌するか細胞内に保持するかを制御するとともに、安定に増殖できるよう外来性配列が宿主ゲノムと一体化するのを可能にしている（例えば、オースベル、1995年；ビター他、Methods Enzymol.、第153巻、516-544ページ、1987年；スコアラー他、BioTechnology、第12巻、181-184ページ、1994年を参照のこと）。オステオレギュリンの発現には植物系も用いることができる。オステオレギュリンをコードしている配列の転写は、ウイルス・プロモーター、例えばCaNWの35Sプロモーターと19Sプロモーターを単独で使用することによって、あるいはそのプロモーターをTMVに由来するオメガ・リーダー配列と組み合わせて使用することによって促進できる（タカマツ、EMBO J.、第6巻、307-311ページ、1987年）。また、RUBISCOの小さなサブユニットや熱ショック・プロモーターなどの植物プロモーターも用いることができる（例えば、コルッツィ他、EMBO J.、第3巻、1671-1680ページ、1984年；ブロイ他、Science、第224巻、838-843ページ、1984年；ウィンター他、Results Probl. Cell Differ.、第17巻、85-105ページ、1991年を参照のこと）。これら構造物は、直接DNAを形質転換することによって、または病原体を介したトランスフェクションによって、植物細胞の中に導入することができる（例えば、『マグローヒル科学技術年鑑』、マグローヒル社、ニューヨーク、ニューヨーク州、191-196ページ、1992年を参照のこと）。
【００７９】
哺乳類の細胞では、ウイルスに基づく多数の発現系を用いることができる。発現ベクターとしてアデノウイルスを用いる場合には、オステオレギュリンをコードしている配列は、後期プロモーターと3つの部分からなるリーダー配列とからなるアデノウイルス転写／翻訳複合体に連結させることができる。ウイルス・ゲノムを重要でないE1領域またはE3領域に挿入することにより、伝染性ウイルスを得ることができる。そのウイルスが、感染した宿主細胞内でオステオレギュリンを発現させる（例えば、ローガンとシェンク、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第81巻、3655-3659ページ、1984年を参照のこと）。さらに、哺乳類の宿主細胞における発現を増大させるためには、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いることができる。タンパク質を高レベルで発現させるには、SV40またはEBVをベースとしたベクターを用いることもできる。
【００８０】
プラスミドに挿入して発現させることができるよりも大きなDNA断片を輸送するには、ヒト人工染色体（HACs）も用いることができる。治療を目的とする場合には、約6kb〜10MbのHACsを構成し、従来の輸送方法（リポソーム、ポリカチオンのアミノポリマー、または小胞）で輸送する（例えば、ハリントン他、Nat. Genet.、第15巻、345-355ページ、1997年を参照のこと）。組み換えタンパク質を哺乳類系で長期にわたって生産させるためには、細胞系の中でオステオレギュリンが安定に発現することが好ましい。例えば、オステオレギュリンをコードしている配列は、ウイルスの複製起点および／または内在性発現要素を含むことのできる発現ベクターと、同じベクターまたは別のベクターに乗った選択マーカー遺伝子とを用いて、細胞系に導入することができる。ベクターを導入した後、増殖培地の中で細胞を約1〜2日間成長させ、それから選択培地に切り換える。選択マーカーの目的は、選択した薬剤に対する耐性を与えることである。したがって、選択マーカーが存在していることで、導入された配列をうまく発現する細胞を成長させて回収することができる。安定に形質転換されて耐性を持つようになった細胞のクローンは、そのタイプの細胞に適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。
【００８１】
形質転換した細胞系を回収するには、選択系をいくつ用いてもよい。選択系としては、tk-細胞で用いられる単純ヘルペスウイルス・チミジン・キナーゼ、apr-細胞で用いられるアデニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子などが挙げられるが、これだけに限られるわけではない（例えば、ウィグラー他、Cell、第11巻、223-232ページ、1997年；ローウィー他、Cell、第22巻、817-823ページ、1980年を参照のこと）。また、選択の基準として、代謝拮抗物質耐性、抗生物質耐性、または除草剤耐性を利用することができる。例えば、dhftは、メトトレキセートに対する耐性を与え、ネオはアミノグリコシド・ネオマイシンとG-418に対する耐性を与え、alsとpatはクロルスルフロンとホスフィノトリシン・アセチルトランスフェラーゼに対する耐性を与える（例えば、ウィグラー他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第77巻、3567-3570ページ、1980年；コルベール-ガラパン他、J. Mol. Biol.、第150巻、1-14ページ、1981年を参照のこと）。選択を可能にするさらに別の遺伝子が知られている。それは例えばtrpBとhisDであり、これらは細胞が必要とする代謝産物を変えてしまう（例えば、ハートマンとマリガン、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第85巻、8047-8051ページ、1988年を参照のこと）。また、アントシアニン、グリーン蛍光タンパク質（GFP；クロンテック社、パロ・アルト、カリフォルニア州）、βグルクロニダーゼとその基質であるβグルクロニド、ルシフェラーゼとその基質であるルシフェリンなど、目で見ることのできるマーカーも使用可能である。これらマーカーは、形質転換された細胞の同定に使用できるだけでなく、特定のベクター系が原因となったタンパク質の過渡的な発現量または安定な発現量を明らかにするのにも用いることができる（例えば、ロデス、Methods Mol. Biol.、第55巻、121-131ページ、1995年を参照のこと）。マーカー遺伝子の発現の有無が、目的の遺伝子が存在しているかどうかを示唆しているとはいえ、その遺伝子が実際に存在していて発現することを確認する必要がある。例えば、オステオレギュリンをコードしている配列をマーカー遺伝子配列の中に挿入した場合には、オステオレギュリンをコードしている配列を含む形質転換細胞は、マーカー遺伝子の機能がないことで確認できる。別の方法として、マーカー遺伝子を、単一のプロモーターを制御しながら、オステオレギュリンをコードしている配列に隣接させることができる。誘導または選択に応答してマーカー遺伝子が発現すると、普通は、その遺伝子に隣接した遺伝子も同様に発現する。
【００８２】
一般に、オステオレギュリンをコードしている核酸配列を含んでいてオステオレギュリンを発現する宿主細胞は、当業者に知られているさまざまな方法で確認することができる。そうした方法としては、膜、溶液、チップに基づいて核酸配列またはタンパク質配列を検出／定量化する技術を含むさまざまな方法、例えばDNA-DNAハイブリダイゼーション法、DNA-RNAハイブリダイゼーション法、PCR増幅法、タンパク質バイオアッセイ、イムノアッセイなどがあるが、これだけに限られるわけではない。
【００８３】
特別なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを用いてオステオレギュリンの発現を検出、測定する免疫学的方法が、従来技術で知られている。そうした方法の具体例としては、固相酵素免疫検定法（ELISAs）、放射線免疫検定法（RIAs）、蛍光活性化セル・ソーティング法（FACS）がある。オステオレギュリン上の互いに干渉しない2つのエピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた2部位モノクローナル利用イムノアッセイが好ましいが、競合的結合アッセイを利用してもよい。これらのアッセイやそれ以外のアッセイは、従来技術として周知である（例えば、ハンプトン、『血清学的方法、実験室マニュアル』のセクション4、APSプレス、セント・ポール、ミネソタ州、1990年；コリガン他、『免疫学における最近のプロトコル』、グリーン・パブリケーション・アソシエーション＆ワイリー-インターサイエンシーズ社、ニューヨーク、ニューヨーク州、1997年；パウンド、『免疫化学プロトコル』、ヒューマナ・プレス、トトワ、ニュージャージー州、1998年を参照のこと）。当業者の間ではさまざまな標識技術や接合技術が知られており、そうした技術を核酸やアミノ酸を分析するためのさまざまな方法において用いることができる。
【００８４】
オステオレギュリンをコードしているポリヌクレオチドと関連した配列を検出するためにハイブリダイゼーション用またはPCR用の標識したプローブを作る方法としては、オリゴ標識、ニック・トランスレーション、末端標識、標識したヌクレオチドを用いたPCR増幅などがある。
【００８５】
また、オステオレギュリンをコードしている配列またはその任意の断片をクローニングして、mRNAプローブを作るためのベクターに挿入することができる。そのようなベクターは従来技術で知られていて市販されているため、そのベクターにT7、T3、SP6などの適切なRNAポリメラーゼと標識したヌクレオチドとを添加することにより、インビトロでRNAプローブを合成することができる。こうした方法は、市販されているさまざまなキットを用いて実施することができる（例えば、アマーシャム・ファルマシア・バイオテック社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州；プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州；USバイオケミカル社、クリーヴランド、オハイオ州）。検出を容易にするのに用いる適切なレポーター分子または標識としては、放射性核種、酵素、蛍光体、化学発光体、発色剤のほか、基質、共因子、インヒビター、磁性粒子などがある。
【００８６】
オステオレギュリンをコードしているヌクレオチド配列を用いて形質転換した宿主細胞は、その細胞にタンパク質を発現させてそのタンパク質を回収するのに適した条件で培養するとよい。形質転換細胞が生産したタンパク質は、配列および／または用いたベクターが何であるかに応じて、分泌させたり、細胞内に保持したりすることができる。当業者なら知っていることだが、オステオレギュリンをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞または真核細胞の膜を通じてオステオレギュリンを分泌させるシグナル配列を含むように設計することができる。さらに、挿入した配列の発現を変化させる能力、または、発現したタンパク質を所望のやり方で処理する能力に注目して、宿主細胞の子孫を選択することができる。ポリペプチドをそのように変化させる方法としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、アシル化などの方法があるが、これだけに限定されるわけではない。翻訳後処理によって“プレプロ”タンパク質または“プロ”タンパク質を切断し、タンパク質のターゲッティング、折り畳み、および／または活性化を行なうこともできる。
【００８７】
翻訳後に活性化させるための特殊な細胞構造や特徴的なメカニズムを有するさまざまな宿主細胞（例えば、CHO、HeLa、MDCK、HEK293、及びW138）が、アメリカ基準培養コレクション（ATCC、マナサス、ヴァージニア州）から入手できる。その中から宿主細胞を選択して、外来性タンパク質の正しい修飾と正しい処理を確実に行なわせることができる。本発明の別の実施態様では、上記のいずれかの宿主系の中で、オステオレギュリンをコードしている天然の核酸配列、修飾した核酸配列、または組み換えた核酸配列を異種配列と結合させる。その結果、融合タンパク質が翻訳される。例えば、市販されている抗体が認識できる異種部分を含むキメラのオステオレギュリン・タンパク質により、オステオレギュリン活性の阻害剤のためのペプチド・ライブラリーを容易にスクリーニングできるようになる可能性がある。異種タンパク質とペプチド部分により、市販されているアフィニティ・マトリックスを用いて融合タンパク質を容易に精製できるようになる可能性もある。そのようなペプチド部分としては、グルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、赤血球凝集素（HA）などがあるが、これだけに限定されるわけではない。GST、MBP、Trx、CBP、6-Hisを用いると、それぞれ、固定化したグルタチオン、マルトース、酸化フェニルアルシン、カルモジュリン、金属キレート樹脂の上で同系の融合タンパク質を精製することができる。FLAG、c-myc、赤血球凝集素（HA）を用いると、これらエピトープ・タグを特異的に認識する市販のモノクローナル抗体とポリクローナル抗体を利用して融合タンパク質をイムノアフィニティ精製することができる。融合タンパク質が、タンパク質の分解による切断部位を、オステオレギュリンをコードしている配列と異種タンパク質配列の間に含むようにすることで、精製後にオステオレギュリンを異種部分から切り離せるようにすることもできる。融合タンパク質の発現と精製の方法については、オースベルの著書（1995年、前掲文献の第10章）に記載されている。市販されているさまざまなキットを用いると、融合タンパク質の発現と精製が容易になる。
【００８８】
本発明のさらに別の実施態様では、放射線で標識したオステオレギュリンの合成は、インビトロで、TNTウサギ網状赤血球ライセート系、または、コムギ胚芽抽出物系（プロメガ社）を用いて実現することができる。これらの系は、T7、T3、SP6プロモーターと機能的に関連したタンパク質コード配列の転写および翻訳と関係している。翻訳は、放射線標識したアミノ酸前躯体、例えば35S-メチオニンの存在下で起こる。
【００８９】
オステオレギュリンの断片は、組み換え手段によってだけでなく、固相技術を利用してペプチドを直接合成することによっても生産することができる（例えば、クライトン、前掲文献、55-60ページを参照のこと）。タンパク質の合成は、手作業で行なうこともできるし、自動化することもできる。合成の自動化は、例えば、ABI（登録商標）431Aペプチド合成装置（パーキン-エルマー社、ノーウォーク、コネチカット州）を用いて実現することができる。オステオレギュリンのさまざまな断片が別々に合成された後に組み合わされて、全長の分子が生まれる。
【００９０】
破壊されたオステオレギュリン遺伝子を含む、ヒト以外の遺伝子改変哺乳類と
遺伝子改変動物の細胞
1．ヒト以外の遺伝子改変哺乳類と遺伝子改変動物の細胞
本発明によって得られるヒト以外の遺伝子改変哺乳類と遺伝子改変動物の細胞（ヒトの細胞も含む）は、オステオレギュリン遺伝子の機能を破壊する改変に関してヘテロ接合またはホモ接合である。遺伝子改変動物の細胞は、遺伝子工学により遺伝子を改変した培養細胞から得ることができ、ヒト以外の遺伝子改変哺乳類の細胞の場合には、遺伝子を改変したヒト以外の哺乳類から細胞を分離することができる。
【００９１】
オステオレギュリンの遺伝子座は、従来技術でいくつか知られている遺伝子改変技術のうちの1つを利用して機能を破壊する。そうした技術としては、化学的突然変異誘発（リンチック、Trends in Genetics、第7巻、15-21ページ、1991年；ラッセル、Environmental & Molecular Mutagenesis、第23巻（補巻24）、23-29ページ、1994年）、放射線照射（ラッセル、前掲文献）、オステオレギュリン遺伝子アンチセンスRNAを、単独で、または触媒となるRNAリボザイム配列と組み合わせてトランスジェニック発現させること（ルイックス他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第96巻、12174-12179ページ、1999年；ソーコル他、Transgenic Research、第5巻、363-371ページ、1996年；エフラット他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第91巻、2051-2055ページ、1994年；ラーソン他、Nucleic Acids Research、第22巻、2242-2248ページ、1994年）、外来性核酸配列をオステオレギュリン遺伝子座に挿入することによるオステオレギュリン遺伝子の破壊などが挙げられる。最後のものについては、以下により詳しく説明する。外来性配列は、相同的組み換え、またはウイルス・ベクターの挿入により組み込むことが好ましい。オステオレギュリン遺伝子を破壊する最も好ましい方法は相同的組み換えであり、その方法には、内在性オステオレギュリン遺伝子配列の一部を削除することが含まれる。
【００９２】
外来性配列を一体化すると、以下のメカニズムのうちの1つ以上によってオステオレギュリン遺伝子の機能が破壊される。そのメカニズムとは、オステオレギュリン遺伝子の転写プロセスまたは翻訳プロセスに干渉すること（例えば、プロモーターの認識を妨げたり、転写終止部位または翻訳停止コドンをオステオレギュリン遺伝子に導入したりすること）；オステオレギュリン遺伝子をコードしている配列をゆがめて、正常な機能を有するオステオレギュリン・ポリペプチドをもはやコードしていないようにすること（例えば、オステオレギュリン遺伝子をコードしている配列に外来性コード配列を挿入すること、または、フレーム・シフト突然変異またはアミノ酸置換を導入すること、または、二重に乗り換えが起こっている場合には、オステオレギュリン遺伝子をコードしている配列のうちで機能的なYタンパク質の発現に必要な部分を削除すること）である。
【００９３】
細胞のゲノムの中にあるオステオレギュリン遺伝子座に外来性DNA配列を挿入するときには、従来技術で知られている標準的な方法に従う。例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿法、レトロウイルス感染法、微量注入法、バイオリスティックス法、リポソーム・トランスフェクション法、DEAE-デキストラン・トランスフェクション法、トランスファーインフェクション法などの方法による（例えば、ニューマン他、EMBO J.、第1巻、841-845ページ、1982年；ポター他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第81巻、7161-7165ページ、1984年；チュー他、Nucleic Acids Research、第15巻、1311-1326ページ、1987年；トーマスとカペッキ、Cell、第51巻、503-512ページ、1987年；バウム他、Biotechniques、第17巻、1058-1062ページ、1994年；ビーウェンガ他、J. Neuroscience Methods、第71巻、67-75ページ、1997年；ツァン他、Biotechniques、第15巻、868-872ページ、1993年；レイとゲージ、Biotechniques、第13巻、598-603ページ、1992年；ロー、Mol. Cell. Biol.、第3巻、1803-1814ページ、1983年；ニコロフ他、Mol. Biotech.、第10巻、93-101ページ、1998年；リンネイ他、Dev. Biol.（Orlando）、第213巻、207-216ページ、1999年；ツィンマーとグルス、Nature、第338巻、150-153ページ、1989年；ロバートソン他、Nature、第323巻、445-448ページ、1986年を参照のこと）。外来性DNAを細胞内に導入する好ましい方法は、電気穿孔法である。
【００９４】
2．相同的組み換え
相同的組み換え法は、オステオレギュリン遺伝子を含む細胞にオステオレギュリン遺伝子ターゲッティング・ベクターを導入することによってオステオレギュリン遺伝子を破壊することを目的とする。このベクターがオステオレギュリン遺伝子に狙いを定めてその遺伝子を破壊する能力は、オステオレギュリン遺伝子と相同なヌクレオチド配列をベクターの中に組み込むことにより生まれる。この相同な領域があるために、ベクターと内在性オステオレギュリン遺伝子配列の間でハイブリダイゼーションが起こりやすくなる。ハイブリダイゼーションが起こると、ターゲッティング・ベクターとゲノム配列の間で乗り換えが起こる確率が非常に大きくなる。この乗り換えの結果、ベクターの配列がオステオレギュリン遺伝子座と一体化し、オステオレギュリン遺伝子の機能破壊が起こる。
【００９５】
ターゲッティングに用いるベクターを作ることに関する一般原理は、ブラッドレイ他（Biotechnol.、第10巻、534ページ、1992年）にまとめられている。相同的組み換えによってDNAを挿入するためには、異なる2つのタイプのベクターを用いることができる。すなわち、挿入ベクターと置換ベクターである。挿入ベクターは、オステオレギュリン遺伝子と相同な領域を含むとともに、2本鎖の切断部を有する環状DNAである。相同な領域と内在性オステオレギュリン遺伝子の間でハイブリッドが形成された後、2本鎖の切断位置において乗り換えが1回だけ起こり、ベクターの全配列が、その乗り換え部位においてその内在性オステオレギュリン遺伝子に挿入される。
【００９６】
相同的組み換えに用いるのにそれよりも好ましいベクターは、置換ベクターである。置換ベクターは、環状ではなく線状である。置換ベクターをオステオレギュリン遺伝子と一体化するには、乗り換えが2回必要である。すなわち、ターゲッティング・ベクターとオステオレギュリン遺伝子の間で形成されたハイブリッドの2つの部位で乗り換えが起こる必要がある。2回乗り換えが起こる結果、2つの乗り換え部位の間に挟まれたベクター配列がオステオレギュリン遺伝子と一体化し、もともと2つの乗り換え部位の間に広がっていた対応する内在性オステオレギュリン遺伝子配列が削除される（例えば、トーマスとカペッキ、Cell、第51巻、503-512ページ、1987年；マンスール他、Nature、第336巻、348-352ページ、1988年；マンスール他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第87巻、7688-7692ページ、1990年；マンスール、GATA、第7巻、219-227ページ、1990年を参照のこと）。
【００９７】
ターゲッティング・ベクター内の相同領域は、一般に、長さが少なくとも100ヌクレオチドである。より好ましいのは、この相同領域の長さが少なくとも1〜5キロ塩基（kb）となっていることである。相同領域にとって必要な最小の長さまたは関連性の程度の最低値は明らかにされていないとはいえ、相同的組み換えの効率は、一般に、相同領域の長さと、ターゲッティング・ベクターとオステオレギュリン遺伝子座の関連性の度合とによって決まる。置換ベクターを用いて内在性オステオレギュリン遺伝子の一部を相同的組み換えにより削除する場合にさらに考慮すべき事柄は、内在性オステオレギュリン遺伝子のうちで削除される部分のサイズである。内在性オステオレギュリン遺伝子のこの部分が1kbよりも長いのであれば、1kbよりも長い相同領域を有するターゲッティング・カセットを用いて組み換え効率を大きくすることが好ましい。相同的組み換えにおいて効果的な配列の選択法および使用法に関するこれ以上詳しい説明は、文献に記載されている（例えば、デングとカペッキ、Mol. Cell. Biol.、第12巻、3365-3371ページ、1992年；ボラーグ他、Annu. Rev. Genet.、第23巻、199-225ページ、1989年；ワルドマンとリスケイ、Mol. Cell. Biol.、第8巻、5350-5357ページ、1988年を参照のこと）。
【００９８】
本発明のオステオレギュリン遺伝子ターゲッティング・ベクターを構成する際には、ベクターの骨格として、さまざまなクローニング・ベクターを用いることができる。例えば、pBluescript関連プラスミド（例えば、Bluescript KS+11）、pQE70、pQE60、pQE-9、pBS、pD10、phagescript、phiX174、pBK Phagemid、pNH8A、pNH16a、pNH18Z、pNH46A、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5 PWLNEO、pSV2CAT、pXT1、pSG（ストラタジーン社）、pSVK3、PBPV、PMSG、pSVL、pBR322、pBR322をベースとしたベクター、pBM9、pBR325、pKH47、pBR328、pHC79、phage Charon28、pKB11、pKSV-10、pK19関連プラスミド、pUCプラスミド、プラスミドのpGEMシリーズなどが挙げられる。これらのベクターは、いろいろな会社から入手することができる（例えば、ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ社、インディアナポリス、インディアナ州；キアジェン社、ヴァレンシア、カリフォルニア州；ストラタジーン社、ラ・ジョラ、カリフォルニア州；プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州；ニュー・イングランド・バイオラブズ社、ベヴァリー、マサチューセッツ州）。しかし、他の任意のベクター、例えばプラスミド、ウイルス、またはその一部も、所望の宿主細胞の中で複製可能かつ生存可能である限りは使用することができる。ベクターには、ゲノムを改変する宿主細胞の中でそのベクターの複製を可能にする配列も含まれていてよい。そのようなベクターを用いると、組み換えを起こすことのできる相互作用期間を長くすることができるため、ターゲッティングの効率がよくなる（『分子生物学』、オースベル他編、ユニット9.16、図9.16.1を参照のこと）。
【００９９】
本発明のターゲッティング・ベクターを増殖させるのに用いる宿主が特別なものであるかどうかは重要ではない。宿主の具体例としては、大腸菌K12RR1（ボリヴァー他、Gene、第2巻、95ページ、1977年）、大腸菌K12 HB101（ATCC番号33694）、大腸菌MM21（ATCC番号336780）、大腸菌DH1（ATCC番号33849）、大腸菌株DH5α、大腸菌STBL2などが挙げられる。また、C.セレヴィジエ、枯草菌などの宿主も用いることができる。上記の宿主は市販されている（例えば、ストラタジーン社、ラ・ジョラ、カリフォルニア州；ライフ・テクノロジーズ社、ロックヴィル、メリーランド州）。
【０１００】
ターゲッティング・ベクターを作るには、オステオレギュリン遺伝子ターゲッティング構造物を上記のベクター骨格に付加する。本発明のオステオレギュリン遺伝子ターゲッティング構造物は、オステオレギュリン遺伝子と相同な領域を少なくとも1ヶ所含んでいる。オステオレギュリン遺伝子と相同な領域を作るには、オステオレギュリンのゲノム配列またはcDNA配列をベースにしてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）プライマーを生産する。このプライマーを用いたハイファイPCR増幅により、オステオレギュリン配列の所望の領域を増幅する（マッティラ他、Nucleic Acids Res.、第19巻、4967ページ、1991年；エッカートとクンケル、PCR Methods Appl.、第1巻、17ページ、1991年；アメリカ合衆国特許第4,683,202号）。ゲノム配列が、ゲノム・クローン・ライブラリーから、または、ゲノムDNA調製物から得られる。ゲノム・クローン・ライブラリーまたはゲノムDNA調製物は、オステオレギュリン遺伝子を破壊するターゲットとなる動物からのものであることが好ましい。
【０１０１】
本発明のターゲッティング構造物は、ポジティブ・マーカー・タンパク質をコードしている外来性ヌクレオチド配列も含んでいることが好ましい。ベクターを一体化した後にポジティブ・マーカーが安定に発現するというのは、細胞の生存能力を損なうことなく、同定を可能にする特徴をその細胞に与えることを意味する。したがって、置換ベクターの場合には、マーカー遺伝子が2つの隣接相同領域の間に位置するため、2回の乗り換えの後、そのマーカー遺伝子がオステオレギュリン遺伝子と一体化する。
【０１０２】
ポジティブ・マーカー・タンパク質は、選択を可能にするタンパク質であることが好ましい。そのようなタンパク質が細胞内で安定に発現するというのは、選択を可能にする特徴的な表現型がその細胞に与えられたことを意味する。すなわち、その特徴により、その特徴がなかったとしたら致命的な条件下におけるその細胞の生存能力が向上する。したがって、選択を可能にする条件を課すことにより、生存可能性を基準にして、ポジティブ選択マーカーをコードしているベクター配列を安定に発現している細胞を、そのベクター配列をうまく一体化できなかった他の細胞から分離することができる。ポジティブ選択マーカー・タンパク質（とそれに合った選択薬剤）の具体例としては、ネオ（G418またはカノマイシン）、hyg（ヒグロマイシン）、hisD（ヒスチジノール）、gpt（キサンチン）、ble（ブレオマイシン）、hprt（ヒポキサンチン）などが挙げられる（例えば、カペッキとトーマス、アメリカ合衆国特許第5,464,764号；カペッキ、Science、第244巻、1288-1292ページ、1989年を参照のこと）。選択マーカーの代わりに用いることのできる他のポジティブ・マーカーとしては、βガラクトシダーゼ、ホタルのルシフェラーゼ、GFPなどのレポーター・タンパク質がある（例えば、『サイトメトリーにおける最近のプロトコル』、ユニット9.5；『分子生物学における最近のプロトコル』、ユニット9.6、ジョン・ワイリー＆サンズ社、ニューヨーク、ニューヨーク州、2000年を参照のこと）。
【０１０３】
上記のポジティブ選択操作では、オステオレギュリン遺伝子座を標的とした相同的組み換えによってベクターを一体化した細胞と、ベクター配列を染色体の任意の位置にランダムな非相同的組み換えによって一体化した細胞とを区別していない。したがって、相同的組み換えのために置換ベクターを用いる場合には、ネガティブ選択マーカー・タンパク質をコードしているヌクレオチド配列も含むようにすることが好ましい。ネガティブ選択マーカーが発現するというのは、そのマーカーを発現する細胞を所定の薬剤と接触させた場合にその細胞が生存できなくなることを意味する（すなわち、選択を可能にする所定の条件において、そのマーカー・タンパク質が細胞にとって致命的になる）。ネガティブ選択マーカー（とそれに合った致死剤）の具体例としては、単純ヘルペスウイルス・チミジン・キナーゼ（ガンシクロビア、または1, 2-デオキシ-2-フルオロ-α-d-アラビノフランシル-5-ヨードウラシル）、Hprt（6-チオグアニン、または、6-チオキサンチン）、ジフテリア毒素、リシン毒素（ricin）、シトシン・デアミナーゼ（5-フルオロシトシン）などが挙げられる。
【０１０４】
ネガティブ選択マーカーをコードしているヌクレオチド配列は、置換ベクターの2つの相同領域の外に位置する。このような配置になっているため、たとえベクターの一体化がランダムな非相同的組み換えによって起こったとしても、細胞は、ネガティブ選択マーカーだけを一体化し、このマーカーだけを安定に発現させる。他方、オステオレギュリン遺伝子とターゲッティング構造物内の2つの相同領域の間での相同組み換えにおいては、ネガティブ選択マーカーをコードしている配列は一体化されない。したがって、ネガティブ条件にすることにより、ランダムな非相同的組み換えによってターゲッティング・ベクターを一体化した細胞は、生き残れなくなる。
【０１０５】
上記のように、ポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーを組み合わせることが好ましい。というのも、相同的組み換えによってベクターを一体化した細胞だけ、つまり、破壊されている可能性のあるオステオレギュリン遺伝子を含む細胞だけをより効果的に選択できるような一連のポジティブ選択操作とネガティブ選択操作を設計できるからである。ポジティブ-ネガティブ選択方式、選択マーカー、ターゲッティング構造物のさらに別の具体例は、例えば、アメリカ合衆国特許第5,464,764号、WO 94/06908、ヴァランシウスとスミシーズ、Mol. Cell. Biol.、第11巻、1402ページ、1991年に記載されている。
【０１０６】
マーカー・タンパク質がベクターの一体化に伴って安定に発現するためには、ベクターを一体化するときに、マーカーをコードしている配列が内在性オステオレギュリン遺伝子プロモーターと機能的に関連するようにターゲッティング・ベクターを設計するとよい。次に、オステオレギュリン遺伝子を正常に発現する細胞の中で、オステオレギュリン遺伝子プロモーターによりマーカーを発現させる。別の方法として、ベクター内のターゲッティング構造物の中にあるそれぞれのマーカーが、オステオレギュリン遺伝子プロモーターとは独立に発現を起こさせる独自のプロモーターを含むようにすることができる。この後者の方法には、オステオレギュリン遺伝子を一般には発現しない細胞の中でマーカーを発現させることができるという利点がある（スミスとバーグ、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.、第49巻、171ページ、1984年；セディヴィとシャープ、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第86巻、227ページ、1989年；トーマスとカペッキ、Cell、第51巻、503ページ、1987年）。
【０１０７】
マーカー遺伝子を発現させるのに用いることのできる外来性プロモーターとしては、細胞特異的なプロモーター、時期特異的なプロモーター、構成的プロモーター、誘導的プロモーター、調節可能なプロモーターなどがある。そうしたプロモーターの具体例としては、単純ヘルペスウイルス・チミジン・キナーゼ・プロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター／エンハンサー、SV40プロモーター、PGKプロモーター、PMC1-ネオ、メタロチオネイン・プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニア・ウイルス7.5Kプロモーター、トリのβグロブリン・プロモーター、ヒストン・プロモーター（例えば、マウスのヒストンH3-614）、βアクチン・プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ、筋肉アクチン・プロモーター、カリフラワー・モザイク・ウイルス35Sプロモーターなどが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない（一般的な参考文献として、サムブルック他、『分子クローニング：実験室マニュアル』、第1巻〜第3巻、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州、1989年；『分子生物学における最近のプロトコル』、ジョン・ワイリー＆サンズ社、ニューヨーク、ニューヨーク州、2000年；ストラタジーン社、ラ・ジョラ、カリフォルニア州を参照のこと）。
【０１０８】
細胞が、ベクター配列を、目的とするオステオレギュリン遺伝子座と一体化したかどうかを確認するためには、そのベクター一体化現象に特異的なプライマーまたはゲノム・プローブを、PCR法またはサザン・ブロット解析法と組み合わせて用いることができる。そうすることによって、ベクターがオステオレギュリン遺伝子座と一体化していることを明らかにできる（エルリッヒ他、Science、第252巻、1643-1651ページ、1991年；ツィンマーとグルス、Nature、第338巻、150ページ、1989年；ムエリック他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第87巻、4712ページ、1990年；シーズリー他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第88巻、4294ページ、1991年）。
【０１０９】
3．遺伝子トラッピング
外来性核酸配列をオステオレギュリン遺伝子座に挿入してオステオレギュリン遺伝子の機能を破壊する別の方法は、遺伝子トラッピングである。遺伝子トラップ・ベクターをコードしている配列を遺伝子の中にランダムに挿入するため、この方法では、エキソンをスプライスしてmRNAにするという、すべての哺乳類に備わっている細胞機構を利用する。遺伝子トラップ・ベクターは、一旦挿入されると突然変異を起こし、トラップされたオステオレギュリン遺伝子の機能を破壊する可能性がある。この突然変異誘発系は、相同的組み換えとは異なり、かなりランダムな突然変異を発生させる。したがって、機能が破壊されたオステオレギュリン遺伝子を含む遺伝子改変細胞を得るためには、この特別な突然変異を含む細胞がどれであるかを明らかにし、その細胞を、さまざまな遺伝子にランダムな突然変異を含んでいる細胞プールの中から選択する必要がある。
【０１１０】
遺伝子トラッピングのための系とベクターは、遺伝子を改変した囓歯類の細胞やそれ以外のタイプの細胞で使用されてきた。そのことが、文献に記載されている（例えば、アレン他、Nature、第333巻、852-855ページ、1988年；ベレン他、Genes Dev.、第3巻、1288-1300ページ、1989年；ビアー他、Genes Dev.、第3巻、1273-1287ページ、1989年；ボンヌロ他、J. Virol.、第66巻、4982-4991ページ、1992年；ブレンナー他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第86巻、5517-5521ページ、1989年；チャン他、Virology、第193巻、737-747ページ、1993年；フリードリッヒとソリアノ、Methods Enzymol.、第225巻、681-701ページ、1993年；フリードリッヒとソリアノ、Genes Dev.、第5巻、1513-1523ページ、1991年；ゴフ、Methods Enzymol.、第152巻、469-481ページ、1987年；ゴスラー他、Science、第244巻、463-465ページ、1989年；ホープ、Develop.、第113巻、399-408ページ、1991年；カー他、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.、第2巻、767-776ページ、1989年；レディ他、J. Virol.、第65巻、1507-1515ページ、1991年；レディ他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第89巻、6721-6725ページ、1992年；スカーンズ他、Genes Dev.、第6巻、903-918ページ、1992年；フォン・メルヒナーとルレイ、J. Virol.、第63巻、3227-3233ページ、1989年；ヨシダ他、Transgen. Res.、第4巻、277-287ページ、1995年を参照のこと）。
【０１１１】
プロモーター・トラップ・ベクター、または5'ベクターは、5'末端から3'末端の方向に向けて、スプライス受容配列、翻訳開始コドンとオープン・リーディング・フレームを一般的な特徴とするエキソン、および／または、内部リボソームが入る部位を含んでいる。一般に、これらプロモーター・トラップ・ベクターは、プロモーター、またはそのプロモーターと機能的に関連したスプライス供与配列を含んでいない。したがって、プロモーター・トラップ・ベクター配列は、宿主細胞のゲノムと一体化された後は上流遺伝子の正常なスプライシングを阻害するので、終止エキソンとして機能する。ベクターをコードしている配列が発現するかどうかは、ベクターが、破壊された遺伝子のイントロンと本来のリーディング・フレームの中で一体化するかどうかによって決まる。そのような場合には、細胞のスプライシング機構によって、ベクターをコードしている配列の上流にあるトラップされた遺伝子からエキソンがスプライスされる（ザンブロヴィッツ他、WO 99/50426）。
【０１１２】
上記のプロモーター・トラップ・ベクターと同様の効果をもたらす別の方法は、入れ子になった終止コドンのセットが、プロモーター・トラップ・ベクターのスプライス受容部位と翻訳開始コドンの間か、スプライス受容部位とポリアデニル化配列の間の領域に存在しているベクター、あるいは、入れ子になった終止コドンのセットが、遺伝子工学によってその領域に組み込まれたベクターを用いることである。遺伝子工学によって独立なリボソームの入る部位（IRES）がコード配列に含まれるようにすることで、そのコード配列が、宿主細胞のゲノムの中で一体化部位とはほとんど独立に発現するようにすることができる。一般に、IRESは入れ子になった終止コドンのセットと関連させて用いるが、必ずしもそうしなくてはならないわけではない。
【０１１３】
遺伝子トラッピングの別の方法は、3'遺伝子トラップ・ベクターを用いることである。このタイプのベクターは、機能面での組み合わせとして、プロモーター領域と、そのプロモーターと隣接していてそのプロモーターによって発現するコード配列と、そのコード配列のエキソンの3'末端を規定するスプライス供与配列とを含んでいる。この遺伝子トラップ・ベクターが宿主細胞のゲノムと一体化すると、一体化された遺伝子トラップ・ベクター配列の下流に位置するトラップされた遺伝子から、このベクターによって発現した転写産物がスプライスされて、スプライス受容配列となる。したがって、ベクターが一体化された結果として、3'遺伝子トラップ・カセットをコードしている配列と、下流にある任意の細胞エキソンとを含む融合転写産物が発現する。なお、細胞内エキソンには、ターミナル・エキソンとそれをポリアデニル化するシグナルが含まれている。このようなベクターが遺伝子と一体化すると、細胞のスプライシング機構によって、トラップされた遺伝子の3'エキソンの上流にあってベクターをコードしている配列がスプライスされる。このようなベクターの1つの利点は、3'遺伝子トラップ・ベクターの発現が、遺伝子トラップ・カセットの中にあるプロモーターによって起こされるため、そのベクターを、通常は宿主細胞の中で発現する遺伝子と一体化する必要はないことである（ザンブロヴィッツ他、WO 99/50426）。3'遺伝子トラップ・ベクターと一体化させることのできる転写プロモーターと転写エンハンサーの具体例としては、ターゲッティング・ベクターに関して説明したものが挙げられる。
【０１１４】
プロモーターまたは3'遺伝子トラップ・ベクターの構造要素として用いられるウイルス・ベクター骨格は、標的細胞のゲノムに挿入可能なさまざまなベクターの中から選択することができる。適切な骨格ベクターとしては、単純ヘルペスウイルス・ベクター、アデノウイルス・ベクター、アデノ関連ウイルス・ベクター、レトロウイルス・ベクター、レンチウイルス・ベクター、仮性狂犬病ウイルス・ベクター、αヘルペスウイルス・ベクターなどが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。ウイルス・ベクター、特に、複製されない細胞を改変するのに適したウイルス・ベクターに関する総合的な概説と、そのようなベクターを外来性ポリヌクレオチド配列の発現との関連で用いる方法は、『ウイルス・ベクター：遺伝子治療と神経科学への応用』、カプリットとローウィー編、アカデミック・プレス、サン・ディエゴ、1995年に記載されている。
【０１１５】
遺伝子トラッピングにはレトロウイルス・ベクターを用いることが好ましい。このベクターは、アメリカ合衆国特許第5,449,614号に記載されているようなレトロウイルス・パッケージング細胞系と組み合わせて用いることができる。ネズミ以外の哺乳類の細胞をゲノム改変のための標的細胞として利用する場合には、両種指向性パッケージング細胞系または汎指向性パッケージング細胞系を用いて適切なベクターをパッケージすることができる（オリー他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第93巻、11400-11406ページ、1996年）。すぐ上で説明した3'遺伝子トラップ・ベクターに変えることのできる代表的なレトロウイルス・ベクターは、例えば、アメリカ合衆国特許第5,521,076号に記載されている。
【０１１６】
遺伝子トラップ・ベクターは、相同的組み換えに用いられるターゲッティング・ベクターに関して上で説明したポジティブ・マーカー遺伝子を1つ以上含んでいてもよい。ポジティブ・マーカーは、ターゲッティング・ベクターにおいて用いられるのと同様、遺伝子トラッピング・ベクターにおいても用いられる。それは、そのベクターが細胞ゲノムと一体化した細胞がどれであるかを明らかにして、その細胞を選び出すためである。遺伝子工学によってマーカー遺伝子が独立なリボソームの入る部位（IRES）を含むようにすることで、そのマーカーが、ベクターが標的細胞のゲノムと一体化した位置とはほとんど独立に発現できるようにすることができる。
【０１１７】
遺伝子トラップ・ベクターは、そのベクターに感染した宿主細胞のゲノムと極めてランダムに一体化するゆえ、破壊されたオステオレギュリン遺伝子を含む遺伝子改変細胞は、ベクターの一体化がランダムになされた細胞群の中から見つけ出す必要がある。この細胞群における遺伝子改変は、十分にランダムかつ十分な頻度で起こるため、この細胞群では、細胞ゲノムに含まれるほとんどすべての遺伝子における突然変異が見られる。そのため、オステオレギュリン遺伝子が破壊された細胞を、その細胞群の中から見つけられる可能性がある（ザンブロヴィッツ他、WO 99/50426；サンズ他、WO 98/14614を参照のこと）。
【０１１８】
破壊されたオステオレギュリン遺伝子を含む個々の突然変異細胞系は、突然変異した細胞群の中に見つける。その際には、例えば、逆転写とポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を利用して、オステオレギュリン遺伝子配列の中にある突然変異を明らかにする。このプロセスは、クローンをプールすることで効率化が可能である。例えば、破壊されたオステオレギュリン遺伝子を含む個々のクローンを見つけるには、1つのプライマーを遺伝子トラップ・ベクターに固定し、別のプライマーをオステオレギュリン遺伝子配列の中に入れ、RT-PCRを行なう。ポジティブRT-PCRの結果は、ベクター配列がオステオレギュリン遺伝子の転写産物にコードされていることを示している。これは、オステオレギュリン遺伝子が、遺伝子トラップ・ベクターの一体化によって破壊されたことを意味している（例えば、サンズ他、WO 98/14614を参照のこと）。
【０１１９】
4．オステオレギュリン遺伝子の時間的破壊、空間的破壊、破壊誘導
本発明のいくつかの実施態様では、内部オステオレギュリン遺伝子の機能破壊は、特定の発達段階、すなわち細胞サイクルの特定の段階において（時間的破壊）、または、特定のタイプの細胞において（空間的破壊）起こる。他の実施態様では、オステオレギュリン遺伝子の破壊は、所定の条件が整ったときに誘起される。Cre-Lox系などの組み換え酵素除去系を用いると、オステオレギュリン遺伝子を特定の発達段階において、あるいは、特定の組織または特定のタイプの細胞の中で、あるいは、特定の環境条件のもとで、活性化または不活性化することができる。一般に、Cre-Lox技術を利用した方法は、トーレスとクーン、『条件つき遺伝子ターゲッティング実験のプロトコル』、オックスフォード大学出版、1997年に記載されているようにして実現される。Cre-Lox系と似た方法は、FLP-FRT系を利用して実施することもできる。相同的組み換え、またはウイルスの挿入によって遺伝子を所定の条件のもとで破壊するために組み換え酵素除去系をどのように利用するかに関してのさらに詳しい説明は、例えば、アメリカ合衆国特許第5,626,159号、アメリカ合衆国特許第5,527,695号、アメリカ合衆国特許第5,434,066号、WO 98/29533、オーバン他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第89巻、6861-6865ページ、1992年；オゴーマン他、Science、第251巻、1351-1355ページ、1991年；ザウアー他、Nucleic Acids Research、第17巻、147-161ページ、1989年；バリナガ、Science、第265巻、26-28ページ、1994年；アカギ他、Nucleic Acids Research、第25巻、1766-1773ページ、1997年に記載されている。ヒト以外の哺乳類または動物の細胞の遺伝子を改変する際には、1つ以上の組み換え酵素系を用いることができる。
【０１２０】
Cre-Lox系などの組み換え酵素系を用いることにより、相同的組み換えを利用してオステオレギュリン遺伝子の時間的破壊、空間的破壊、破壊誘導を行なう場合には、オステオレギュリン遺伝子コード領域の一部を、loxP部位に隣接したオステオレギュリン遺伝子コード領域を含むターゲッティング構造物と置き換える。この遺伝子改変がなされたヒトでない哺乳類と動物の細胞は、機能するオステオレギュリン遺伝子をloxP部位と隣接した位置に含んでいる。オステオレギュリン遺伝子の時間的破壊、空間的破壊、破壊誘起は、それぞれ、所望の空間制御プロモーター、時間制御プロモーター、誘導プロモーターの制御のもとでヒトでない哺乳類または動物において発現する新たな導入遺伝子の発現パターン、すなわちCre組み換え酵素導入遺伝子の発現パターンが原因となって起こる。Cre組み換え酵素は、loxP部位を組み換えの標的とする。したがって、Cre組み換え酵素導入遺伝子が発現すると、loxP部位は組み換えられ、loxP部位とloxP部位の間に挟まれたオステオレギュリン遺伝子コード領域が除去される。その結果、オステオレギュリン遺伝子の機能が破壊される（ラジェウスキー他、J. Clin. Invest.、第98巻、600-603ページ、1996年；サントーンジュ他、Nucleic Acids Research、第24巻、3875-3877ページ、1996年；アガー他、J. Clin. Invest.、第100巻、169-179ページ、1997年；ブロカード他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第94巻、14559-14563ページ、1997年；フェイル他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第93巻、10887-10890ページ、1996年；クーン他、Science、第269巻、1427-1429ページ、1995年）。
【０１２１】
loxPに隣接したオステオレギュリン遺伝子とCre組み換え酵素導入遺伝子の両方を含む細胞は、標準的なトランスジェニック技術を用いて作ることができる。また、ヒトでない遺伝子改変哺乳類の場合には、親の一方が、loxP部位に隣接したオステオレギュリン遺伝子を含み、もう一方の親がCre組み換え酵素導入遺伝子を含むヒトでない遺伝子改変哺乳類同士を、所望のプロモーターの制御下で交配させると、上記の2つの遺伝子を含む細胞が得られる。組み換え酵素系や特定のプロモーターを利用してオステオレギュリン遺伝子の時間的破壊、空間的破壊、破壊誘導を起こすことに関するさらに詳しい説明は、例えば、ザウアー、Meth. Enz.、第225巻、890-900ページ、1993年；グー他、Science、第265巻、103-106ページ、1994年；アラキ他、J. Biochem.、第122巻、977-982ページ、1997年；ダイメッキ、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第93巻、6191-6196ページ、1996年；マイヤーズ他、Nature Genetics、第18巻、136-141ページ、1998年に記載されている。
【０１２２】
オステオレギュリン遺伝子の誘導破壊は、テトラサイクリン応答バイナリー系を用いて実現することもできる（グロッセンとブジャード、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第89巻、5547-5551ページ、1992年）。この系では、Tetプロモーターを、内在性オステオレギュリン遺伝子調節要素と、テトラサイクリンによる制御が可能なリプレッサー（TetR）を発現する導入遺伝子とに導入するという細胞の遺伝子改変を行なう。そのような細胞では、テトラサイクリンの投与によってTetRが活性化し、今度はそのことによってオステオレギュリン遺伝子の発現が抑制され、したがってオステオレギュリン遺伝子の機能が破壊される（サントーンジュ他、Nucleic Acids Research、第24巻、3875-3877ページ、1996年；アメリカ合衆国特許第5,922,927号）。
【０１２３】
オステオレギュリン遺伝子の時間的破壊、空間的破壊、破壊誘導を起こすための上記の系は、遺伝子改変法として遺伝子トラッピングを利用する場合にも用いることができる。そのことについては、例えば、WO 98/29533に記載されている。
【０１２４】
5．遺伝子を改変したヒト以外の哺乳類と動物の細胞の作製
上記の遺伝子改変法は、動物由来のほとんどすべてのタイプの体細胞または幹細胞の中にあるオステオレギュリン遺伝子の機能を破壊するのにも用いることができる。遺伝子を改変した本発明の動物細胞には、ヒトも含めた哺乳類の細胞と鳥類の細胞が含まれるが、それだけに限定されるわけではない。これらの細胞は、培養に適した細胞系、腫瘍形成性細胞系、遺伝子改変細胞系などの、遺伝子工学によって作られた任意の動物細胞系に由来するものが可能である。また、これらの細胞は、所望の改変がなされたオステオレギュリン遺伝子を含むヒト以外の遺伝子改変哺乳類から分離したものでもよい。
【０１２５】
細胞がヘテロ接合であってもホモ接合であってもオステオレギュリン遺伝子は破壊される。オステオレギュリン遺伝子が破壊されたホモ接合の細胞（オステオレギュリン-／-）を得るためには、両方の対立遺伝子に対して直接に配列ターゲッティングを行なうことが可能である。この方法は、ポジティブ選択マーカーをリサイクルすることによって容易に実現することができる。この方法では、ポジティブ選択マーカーをコードしているヌクレオチド配列が、Cre-LoxP系を用いて対立遺伝子の一方を破壊した後に、除去される。したがって、ターゲッティングを行なう次のラウンドで、同じベクターを用いてオステオレギュリン遺伝子の第2の対立遺伝子を破壊することができる（アブインとブラッドレイ、Mol. Cell. Biol.、第16巻、1851-1856ページ、1996年；セディヴィ他、T.I.G.、第15巻、88-90ページ、1999年；クルス他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第88巻、7170-7174ページ、1991年；モーテンセン他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第88巻、7036-7040ページ、1991年；テ・リエレ他、Nature（London）、第348巻、649-651ページ、1990年）。
【０１２６】
オステオレギュリン-／-であるES細胞を得る別の方法は、オレギュリン遺伝子の破壊に関してヘテロ接合である細胞群（オステオレギュリン+／-）の細胞をホモ遺伝子化することである。この方法においては、薬剤耐性選択マーカーを発現するオステオレギュリン+／-標的クローンを、非常に高濃度の薬剤環境で選び出す。この選択により、薬剤耐性マーカーをコードしている配列を2つとも発現する細胞が選び出される。したがって、その細胞が、オステオレギュリンの破壊に対してホモ接合である（モーテンセン他、Mol. Cell. Biol.、第12巻、2391-2395ページ、1992年）。さらに、遺伝子を改変した動物細胞は、オステオレギュリン-／-であるヒト以外の遺伝子改変哺乳類から得ることもできる。その哺乳類は、生殖細胞系がオステオレギュリン+／-であるヒト以外の哺乳類を交配させて作ったもので、これについては以下に説明する。
【０１２７】
所望の細胞または細胞系の遺伝子を改変した後、オステオレギュリン遺伝子座が改変の部位となったことを、従来技術で知られている標準的なPCR法またはサザン・ブロット法で確認することができる（例えば、アメリカ合衆国特許第4,683,202号；エルリッヒ他、Science、第252巻、1643ページ、1991年を参照のこと）。オステオレギュリン遺伝子の機能が破壊されたことは、通常はオステオレギュリン遺伝子を発現している細胞の中で、オステオレギュリン遺伝子のメッセンジャーRNA（mRNA）のレベルおよび／またはオステオレギュリン・ペプチドのレベルが低下していることによっても確認できる。オステオレギュリン遺伝子のmRNAのレベルは、逆転写酵素を用いたポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）法、ノーザン・ブロット法、またはイン・サイチュー・ハイブリダイゼーションで測定することができる。細胞が生産するオステオレギュリン・ポリペプチドのレベルの定量は、例えば、従来技術で知られている標準的なイムノアッセイにより行なうことができる。そのようなイムノアッセイとしては、RIAs（放射線免疫検定法）、ELISAs（固相酵素免疫検定法）、“サンドイッチ”イムノアッセイ、免疫放射線測定アッセイ、ゲル内沈降反応、免疫拡散アッセイ、（例えば、金コロイド、酵素、放射性アイソトープ標識を用いた）イン・サイチュー・イムノアッセイ、ウエスタン・ブロット法、二次元ゲル分析、沈降反応、免疫蛍光アッセイ、プロテインAアッセイ、免疫電気泳動アッセイなどの技術を利用した競合アッセイまたは非競合アッセイが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【０１２８】
遺伝子を改変した好ましい動物細胞は、胚幹（ES）細胞とES様細胞である。これらの細胞は、マウス（エヴァンス他、Nature、第129巻、154-156ページ、1981年；マーチン、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第78巻、7634-7638ページ、1981年）、ブタやヒツジ（ノタニアンニ他、J. Reprod. Fert. Suppl.、第43巻、255-260ページ、1991年；キャンベル他、Nature、第380巻、64-68ページ、1996年）、ヒトを含む霊長類（トムソン他、アメリカ合衆国特許第5,843,780号；トムソン他、Science、第282巻、1145-1147ページ、1995年；トムソン他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第92巻、7844-7848ページ、1995年）などのさまざまな種の移植前の胚および胚盤胞に由来する。
【０１２９】
これらの細胞は多能性である。すなわち、これらの細胞は、適切な条件のもとで、外胚葉、中胚葉、内胚葉という全部で3つある胚葉に由来するさまざまなタイプの細胞に分化していく。培養条件にもよるが、ES細胞のサンプルは、分化の方向が決まっていない幹細胞として培養することができる。そのサンプルは、単一のサンプル内でさまざまなタイプの細胞に分化することもできれば、特定のタイプの細胞へと分化させることもできる。例えば、マクロファージ様細胞、神経細胞、心筋細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、骨格筋細胞、角質細胞に分化させたり、好酸球、マスト細胞、赤芽球前駆細胞、巨核球などの造血細胞に分化させたりする。方向性の決まった分化は、培地に特定の成長因子または基質成分を含めることで実現される。この点に関するさらに詳しい説明は、例えばケラー他、Curr. Opin. Cell Biol.、第7巻、862-869ページ、1995年；リー他、Curr. Biol.、第8巻、971ページ、1998年；クルーグ他、J. Clin. Invest.、第98巻、216-224ページ、1996年；リーシュケ他、Exp. Hematol.、第23巻、328-334ページ、1995年；ヤマネ他、Blood、第90巻、3516-3523ページ、1997年；ヒラシマ他、Blood、第93巻、1253-1263ページ、1999年に記載されている。
【０１３０】
遺伝子改変に用いるのに特別な胚幹細胞系は必要ない。ネズミのES細胞系としては、例えば、AB-1（マクマホンとブラッドレイ、Cell、第62巻、1073-1085ページ、1990年）、E14（フーパー他、Nature、第326巻、292-295ページ、1987年）、D3（デッチマン他、J. Embryol. Exp. Morph.、第87巻、27-45ページ、1985年）、CCE（ロバートソン他、Nature、第323巻、445-448ページ、1986年）、RW4（ゲノム・システムズ社、セントルイス、ミズーリ州）、DBA/1lacJ（ローチ他、Exp. Cell Res.、第221巻、520-525ページ、1995年）などがある。文献に記載されている方法に従い、ネズミの遺伝子改変ES細胞を用いて遺伝子改変マウスを作ることができる（ロバートソン、『奇形ガン腫と胚幹細胞：実践的アプローチ』、E.J.ロバートソン編、オックスフォード、IRLプレス、71-112ページ、1987年；ツィルストラ他、Nature、第342巻、435-438ページ、1989年；シュヴァルツバーグ他、Science、第246巻、799-803ページ、1989年）。
【０１３１】
望み通り機能が破壊されたオステオレギュリン遺伝子がES細胞に含まれていることを確認した後、従来技術で知られている方法に従ってそのES細胞を宿主となる適切な胚盤胞に注入し、キメラ・マウスを作る（カペッキ、Trends Genet.、第5巻、70ページ、1989年）。本発明で用いるマウスの胚盤胞は特別なものである必要はない。そのような胚盤胞の具体例としては、C57BL6マウス、C57BL6アルビノ・マウス、スイス異系交配マウス、CFLPマウス、MFIマウスから由来した胚盤胞が挙げられる。また、ES細胞は、凝集ウエルの中で四細胞胚の間に挟み込むこともできる（ナギー他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第90巻、8424-8428ページ、1993年）。
【０１３２】
遺伝子改変ES細胞を含む胚盤胞または胚は、次に、偽妊娠したメスのマウスに移植し、子宮内で成長させる（ホーガン他、『マウスの胚の取り扱い：実験室マニュアル』、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州、1988年；『奇形ガン腫と胚幹細胞：実践的アプローチ』、E.J.ロバートソン編、IRLプレス、ワシントンD.C.、1987年）。代理母から生まれた仔マウスをスクリーニングして、オステオレギュリン遺伝子が破壊されたキメラ・マウスを同定する。一般に、そのような仔マウスは、遺伝子が改変されたドナーES細胞に由来するいくつかの細胞と、もとの胚盤胞に由来する他の細胞とを含んでいる。そのような状況において、ドナーES細胞に由来する細胞を胚盤胞に由来するそれ以外の細胞と区別するため、まず、表皮の色による選択法により、表皮の色がモザイクになっている仔マウスをスクリーニングする。別の方法として、仔マウスの尾の組織から採取したDNAを用いて遺伝子改変細胞を含むマウスを同定することもできる。
【０１３３】
生殖細胞中に破壊されたオステオレギュリン遺伝子を含むキメラ・マウスを交配すると、生殖細胞と体細胞のすべての中に破壊されたオステオレギュリン遺伝子を含む仔マウスが生まれる。次に、オステオレギュリン遺伝子の破壊に関してヘテロ接合のマウスを交配し、ホモ接合のマウスを作る（例えば、アメリカ合衆国特許第5,557,032号；アメリカ合衆国特許第5,532,158号を参照のこと）。
【０１３４】
遺伝子改変を1つの細胞から1匹の動物個体全体へと広げる上記ES細胞技術に代わる方法は、核移植法である。この方法を用いると、マウスの他にもヒト以外の遺伝子改変哺乳類を作ることができる。作れるのは、例えば、ヒツジ（マクリース他、Nature、第405巻、1066-1069ページ、2000年；キャンベル他、Nature、第389巻、64-66ページ、1996年；シュニーケ他、Science、第278巻、2130-2133ページ、1997年）、仔ウシ（チベッリ他、Science、第280巻、1256-1258ページ、1998年）である。要するに、体細胞（例えば繊維芽細胞）または多能性幹細胞（例えばES様細胞）を核のドナーとして選択し、遺伝子を改変して機能が破壊されたオステオレギュリン遺伝子が含まれるようにする。DNAベクターを体細胞に導入してオステオレギュリン遺伝子を突然変異させる場合には、プロモーターのないマーカーを含むベクターをオステオレギュリン遺伝子と一体化させ、オステオレギュリン遺伝子のプロモーターの制御のもとにそのマーカーを発現させるようにすることが好ましい（セディヴィとデュトリオー、T.I.G.、第15巻、88-90ページ、1999年；マクリース他、Nature、第405巻、1066-1069ページ、2000年）。オステオレギュリン遺伝子が適切に破壊されたドナー細胞から採取した核は、次に、核を取り除いた受精卵母細胞または処女生殖卵母細胞に移植する（キャンベル、他、Nature、第380巻、64ページ、1996年；ウィルムート他、Nature、第385巻、810ページ、1997年）。胚が再構成され、培養によって桑実胚／胚盤胞の段階へと成長したとき、その胚を代理母に移植して、全期間にわたって子宮内で成長させる。
【０１３５】
本発明には、遺伝子を改変したヒト以外の哺乳類と動物の子孫も含まれる。その子孫は、オステオレギュリン遺伝子の破壊という遺伝子改変に関してヘテロ接合またはホモ接合であるが、親となるヒト以外の哺乳類および動物の細胞と遺伝的に同じであるとは限らない。というのも、後続の世代において、オステオレギュリン遺伝子を破壊した当の遺伝子座以外の遺伝子座に突然変異が起こったり環境の影響が及んだりする可能性があるからである。
【０１３６】
6．ヒト以外の哺乳類と動物の“ヒト化された”細胞
破壊された内在性オステオレギュリン遺伝子を含むように遺伝子を改変した本発明のヒト以外の哺乳類と（ヒト以外の）動物の細胞をさらに改変して、ヒトのオステオレギュリン配列を発現するようにできる（以後、“ヒト化された”と呼ぶ）。細胞をヒト化する好ましい方法には、相同的組み換えによって、内在性オステオレギュリン配列を、ヒトのオステオレギュリン配列をコードしている核酸配列で置き換える操作が含まれる。ベクターは、5'と3'の相同アームとポジティブ／ネガティブ選択法に関してターゲッティング・ベクターとして従来から利用されているベクターと同じである。しかし、ベクターは、組み換え後に、内在性配列と置き換わるヒトのオステオレギュリン配列や、塩基対の変化、エキソンの置換、またはコドンの置換によって、内在性配列を、ヒトのオステオレギュリンをコードするように変化させる配列も含んでいる。相同的組み換えが起こったことが確認されると、CreまたはFlpを媒介とした位置指定組み換えを利用して、選択（例えば、ネオによる選択）に基づいた任意の配列を除去することができる（ダイメッキ、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第93巻、6191-6196ページ、1996年）。
【０１３７】
内在性配列をヒトのオステオレギュリン配列で置き換える場合には、その置換が内在性翻訳開始部位のすぐ下流で起こるようにすることが好ましい。置換位置をこのように決めることにより、オステオレギュリン遺伝子の時間的、空間的発現のパターンが維持される。ヒトの配列は、適切な処理のためにポリAという尾が3'末端についたヒトcDNAの全長、または、ゲノム配列全体にすることができる（シアオ他、Transgenic Res.、第8巻、295-302ページ、1999年）。内在性遺伝子の代わりにそれに対応するヒトの遺伝子を発現させるために細胞の遺伝子やヒト以外の哺乳類の遺伝子を改変する方法に関するさらに詳しい説明は、例えば、サリヴァン他、J. Biol. Chem.、第272巻、17972-17980ページ、1997年；ローム他、J. Biol. Chem.、第271巻、23380-23388ページ、1996年；スコット他、アメリカ合衆国特許第5,777,194号に記載されている。
【０１３８】
そのような“ヒト化された”生物を作る別の方法は、内在性遺伝子を破壊した後、ノックアウトした胚にヒトの配列をコードしている遺伝子を前核の微量注入によって導入するという、2段階からなる方法である。
【０１３９】
スクリーニング法
本発明によれば、オステオレギュリンの活性を増大させる調節剤または抑制する調節剤を同定するための方法（この明細書では、“スクリーニング・アッセイ”とも呼ぶ）が提供される。そのような調節剤としては、例えば、検査化合物、薬剤、タンパク質、ペプチド、ペプチド様のもの、ペプトイド、小さな分子、その他の化学物質などが挙げられる。したがって、このようにして同定された物質を治療のためのプロトコルにおいて使用することにより、骨の成長／形成、骨密度、骨の石灰化、および／または、脂肪過多を調節することができる。そのような治療法は、例えば、骨粗鬆症の予防や、骨の修復または再生の促進に役立つ可能性がある。
【０１４０】
スクリーニングに用いる検査化合物は、個別に選択するか、あるいは化合物ライブラリーから得られる。そのようなライブラリーとしては、生物学ライブラリー、ペプトイド・ライブラリー（ペプチドの機能を持っているが、酵素による分解に対する耐性があるために生物活性を失わない、非ペプチド骨格を有する新規な分子のライブラリー）（例えば、ツッカーマン、J. Med. Chem.、第37巻、2678-2685ページ、1994年を参照のこと）、空間的にアクセス可能な固相または液相の並列ライブラリー、解析を必要とする合成ライブラリー法、“1ビーズ・化合物”ライブラリー法、アフィニティ・クロマトグラフィーによる選択を利用した合成ライブラリー法などが挙げられる。
【０１４１】
分子ライブラリーの合成方法の具体例は、例えば、ドゥウィット他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第90巻、6909ページ、1993年；エルド他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第91巻、11422ページ、1994年；ツッカーマン、J. Med. Chem.、第37巻、2678ページ、1994年；チョー他、Science、第261巻、1303ページ、1995年；キャレル他、Angew. Chem. Int. Ed. Engl.、第33巻、2061ページ、1994年；ギャロップ他、J. Med. Chem.、第37巻、1233ページ、1994年に記載されている。
【０１４２】
化合物のライブラリーを提供する形態としては、溶液中（例えば、フーテン、Biotechniques、第13巻、412-421ページ、1992年）、ビーズ上（ラム、Nature、第354巻、82-84ページ、1991年）、チップ上（フォドー、Nature、第364巻、555-556ページ、1993年）、バクテリアと胞子（ラドナー、アメリカ合衆国特許第5,223,409号）、プラスミド（カル他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第89巻、1865-1869ページ、1992年）、ファージ上（スコット他、Science、第249巻、386-390ページ、1990年；デヴリン、Science、第249巻、404-406ページ、1990年；クワーラ他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第87巻、6378-6382ページ、1990年；フェリーチ、J. Mol. Biol.、第222巻、301-310ページ、1991年；ラドナー、前掲特許）が可能である。
【０１４３】
好ましい態様では、薬剤がオステオレギュリン・ポリペプチドの細胞活性を変化させる効果は、カルシウムのホメオスタシスおよび／または骨密度に関してある役割を果たしているようなタイプの細胞、例えば腎臓、腸、副甲状腺、C細胞、甲状腺、視床下部、骨に由来する細胞の中で測定する。好ましい細胞は、SaOS、UMR、ros、MC3T3L1、U2OS、MG-63、HOS5などの骨芽細胞系（アメリカ基準培養コレクション、マナサス、ヴァージニア州から入手できる）と、骨髄または頭蓋冠の調製物に由来する骨芽細胞初代培養物である。大腿骨と頸骨の骨髄細胞を遠心分離によって回収し、100mMにつき15×106細胞の密度にして、10％のウシ胎仔血清と50μg／mlのゲンタマイシンを加えたα最少必須培地（ジブコ／BRL社、ゲサーズバーグ、メリーランド州）で培養する。頭蓋冠調製物は、例えば、オウエン他、J. Cell. Physiol.、第143巻、420-430ページ、1990年に記載されているようにして調製する。
【０１４４】
オステオレギュリンの効果は、培養した細胞の中またはインビボで調べることができる。天然の供給源から得られたオステオレギュリン・タンパク質、または、バクテリアや哺乳類の宿主細胞で発現したオステオレギュリン・タンパク質は、検査試薬の存在下または不在下で、細胞に与えたり哺乳類に投与したりすることができる。別の方法として、遺伝子を改変するという方法でオステオレギュリン・タンパク質をテスト細胞または哺乳類に投与することも可能であろう。その場合、例えば遺伝子導入、裸のDNAの輸送、またはウイルス・ベクターの挿入といった手段を利用して、オステオレギュリンをコードしている外来性配列を培養細胞または哺乳類の中で発現させる。
【０１４５】
ある薬剤が、骨の構造または骨の石灰化におけるオステオレギュリンを媒介とした変化を増大または減少させる場合には、その薬剤は、オステオレギュリン活性のそれぞれインヒビターまたはエンハンサーであることがわかる。そのような変化は、例えば、フォン・コッサ染色法（フォン・コッサ、Bietr. Anat.、第29巻、163ページ、1901年）によって、組織構造計測法（例えば、シモンズ他、J. Pharmacol. & Exp. Therap.、第286巻、341-344ページ、1998年）によって、骨細胞の増殖を測定することによって、および／または、アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、オステオポンチンなどの骨芽細胞活性化マーカーの値を測定することによって調べることができる。組織構造の計測値は、コンピュータ支援画像解析法を用いて解析することができる（Bioquant II、Mバイオメトリックス社、ナッシュヴィル、テネシー州）。
【０１４６】
本発明の別の態様において、オステオレギュリン・タンパク質の発現を変化させる薬剤の同定法が提供される。この方法では、オステオレギュリン遺伝子を発現させることのできる細胞（例えば、骨芽細胞系）が用いられる。内在性オステオレギュリン遺伝子の発現量、または導入遺伝子の発現量は、あるポリペプチド（例えば、レポーター・タンパク質）をコードしている核酸配列と機能的に関連したオステオレギュリン遺伝子調節要素（例えば、オステオレギュリンのプロモーター）を含む導入遺伝子を用いて形質転換することによって、そのオステオレギュリン遺伝子調節要素がそのコード配列の発現を制御するようにした細胞の中で測定することができる。
【０１４７】
例えば、オステオレギュリンのATG開始部位の13bp上流からその開始部位の約400-10000bp上流まで広がっているゲノムDNA断片をベクター（例えばpGL3、プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州）の中にクローニングして、そのゲノム断片に含まれるオステオレギュリン遺伝子調節要素が、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子の発現を調節するようにする。次に、このベクターを、通常はオステオレギュリン遺伝子を発現する細胞の中にトランスフェクトする。オステオレギュリンの発現を増加または減少させる薬剤は、このトランスフェクトされた細胞の中のルシフェラーゼのそれぞれ増加レベルまたは減少レベルによって同定される。好ましい実施態様では、オステオレギュリン遺伝子のプロモーターはヒトまたはマウスのものである。
【実施例】
【０１４８】
実施例
マウスとヒトのオステオレギュリンの同定法およびキャラクテリゼーション法は、特別の記載がない限りは、ラットのオステオレギュリンの同定法およびキャラクテリゼーション法と同様である。
【０１４９】
ラットのオステオレギュリン
1．オステオレギュリンの単離
ラットのオステオレギュリン遺伝子を、骨芽細胞が分化している間に遺伝子の発現が誘起された遺伝子プールから単離した。ラットの初期段階の骨髄細胞（RBMC）を分離し、10nMのデキサメタゾンの存在下で骨芽細胞に分化させた（リカード他、Developmental Biology、第161巻、218-228ページ、1994年；リボイ他、J. of Cellular Physiology、第146巻、370-378ページ、1991年）。この培養系は、過去の文献に記載されているのと同様（マニアトプーロス他、Cell & Tissue Research、第254巻、317-330ページ、1988年；リカード他、Developmental Biology、第161巻、218-228ページ、1994年；リボイ他、J. of Cellular Physiology、第146巻、370-378ページ、1991年）、骨芽細胞への分化促進にはデキサメタゾン処理を必要とした。そのことは、骨芽細胞マーカー遺伝子の誘起（図6）によって、あるいは、βグリセロリン酸塩などのリン酸塩を培地に入れたときにフォン・コッサ染色により石灰化が検出できたことによって確かめられた。
【０１５０】
ラットの初期段階の骨髄細胞（RBMC）を上記のようにして分離し、骨芽細胞に分化させた（リカード他、Developmental Biology、第161巻、218-228ページ、1994年；リボイ他、J. of Cellular Physiology、第146巻、370-378ページ、1991年）。年齢が3ヶ月のメスのスパラグ・ドーレイ（Sparague Dawley）マウスの頸骨と大腿骨から骨髄を分離し、15％のウシ胎仔血清、2mMのグルタミン、0.1mg/mlのゲンタマイシン、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンを添加した最少必須培地（MEM）（ジブコ／BRL社、ゲサーズバーグ、メリーランド州）に入れた。分離した骨髄細胞を100μmのメッシュで濾過し、培地で3回洗浄し、密度を1×106細胞／cm2にして10cmの組織培養皿に入れた。細胞は、CO2を5％にして37℃で4日間放置し、定着させた。細胞は90％が融合するまで成長させ、その時点で、培地内にて50μg/mlのアスコルビン酸塩と10nMのデキサメタゾンで処理した。培地は、最初の定着期間が過ぎた後は一週間に3回交換した。この細胞培養物の石灰化能力を測定するため、この細胞培養物を50μg/mlのアスコルビン酸塩／10nMのデキサメタゾン／10mMのβグリセロリン酸塩の中に維持し、フォン・コッサ染色を行なった。
【０１５１】
フォン・コッサ染色法の硝酸銀染色によって頭蓋冠と骨髄の培養物の石灰化が目に見えるようになる。細胞から培地を取り除き、培養皿をリン酸緩衝溶液（PBS）で1回洗浄した。細胞を、冷やしたメタノール（-20℃）で10分間固定した。次に、培養皿を直射日光に当てながら5％AgNO3で5分間染色した。次に、培養皿を水で洗浄し、石灰化を調べた。
【０１５２】
デキサメタゾン処理したRBMCからのcDNAと賦形剤処理した培養物からのcDNAの間で差し引きハイブリダイゼーションを行なうことにより、骨芽細胞の分化期間を通じて誘起された遺伝子が豊富に含まれるcDNAライブラリーを構成した（ワンとブラウン、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第88巻、11505-11509ページ、1991年；リベラ-ゴンザレス他、J. of Steroid Biochemistry & Molecular Biology、第64巻、13-24ページ、1998年）。要するに、処理していない培養物から抽出した5μgのポリA+mRNAとデキサメタゾン処理した培養物から抽出した5μgを用い、Superscript IIという逆転写酵素を製造メーカー（ジブコ／BRL社、ゲサーズバーグ、メリーランド州）が指定した条件に従って利用して、cDNAを作った。差し引きハイブリダイゼーションを5ラウンド行なった後のPCR産物を、Bam HIで切断した／アルカリホスファターゼで処理したpBSSK+（ストラタジーン社、ラ・ジョラ、カリフォルニア州）と結合させた。過去の文献（リベラ-ゴンザレス他、J. of Steroid Biochemistry & Molecular Biology、第64巻、13-24ページ、1998年）に記載されているようにして、ラウンド5のプローブとハイブリダイズさせることにより、コロニーをスクリーニングした。
【０１５３】
差し引きハイブリダイゼーションを5ラウンド行なった後、ラウンド5の差し引きされたcDNAをプローブとして用いてコロニーをスクリーニングすることにより、クローンを分析した。このステップでは、ライブラリーをそのライブラリー自身とハイブリダイズさせた。こうした条件のもとで、クローンの約70％がプラスのハイブリダイゼーション・シグナルを出した。この結果は、ハイブリダイズしていないクローンは、効果的に差し引かれなかった集団の中ではメッセージをほとんど出さなかったことを示唆している。ハイブリダイズしたコロニーだけを選択して、さらに分析を行なった。ハイブリダイズしたクローンを全部で153個ランダムに選び出し、配列を決定した。挿入された配列のサイズは、150-450bpであった。この配列データを集め、BLASTアルゴリズム（アルトシュール他、J. of
Molecular Biology、第215巻、403-410ページ、1990年）を用いてジェンバンク（GenBank）に登録されている既知の遺伝子と比較した。賦形剤またはデキサメタゾンで処理したRBMC培養物から得られた合計20μgのRNAをノーザン・ブロット法で分析し、調節の有無を決定した。全部で153個のクローンを解析した結果を表1にまとめてある。
【０１５４】
【表２】
2004173696.tif 000003
【０１５５】
差し引きライブラリーが効果的に行なわれた証拠として、リボソームRNAによる汚染が非常に少なく（1/153）、ミトコンドリア遺伝子による汚染もなかった（0/153）。骨芽細胞が分化している間に誘起されたと過去の文献で報告されているオステオポンチン、骨のシアロタンパク質、オステオカルシンなどの遺伝子（オウエン他、J. Cell. Physiol.、第143巻、420-430ページ、1990年）を同定した結果、差し引きライブラリーが骨芽細胞マーカー遺伝子を含んでいることが確認された。
【０１５６】
プラスミドDNAを、ハイブリダイズしたコロニーから分離し、その配列を決定した。精製したDNAの配列は、ABI 373配列自動決定装置において、Big Dye Terminator（BDT）Taq FS試薬（PEバイオシステムズ社、フォスター市、カリフォルニア州）を用いたサイクル・シークエンシングを製造メーカーのプロトコルに従って行なうことにより決定した。ただし、以下のような変更を行なった。1）半反応BDTの反応物（50％BDT、50％ABI 5×バッファー）に5％のDMSOを含む。2）サイクル・シークエンシングにおける熱変化では熱い状態から出発する。すなわち、95℃を1分間を1サイクル、98℃を45秒間、50℃を10秒間、60℃を4分間を1サイクルの後、98℃を15秒間、50℃を10秒間、60℃を4分間を全部で30サイクルとする（MJ Tetrad Thermal Cycler、MJリサーチ社、ウォータータウン、マサチューセッツ州）。シークエンシング反応の生成物をゲル濾過カートリッジ（エッジ・バイオシステムズ社、ゲサーズバーグ、メリーランド州）で精製し、電気泳動にかけた。電気泳動は、2500ボルト、40ミリアンペアにて18時間、5.75％Page-Plus（アムレスコ社、ソロン、オハイオ州）／6M尿素のゲル上で、1×TBE、移動度ファイル4％、ABI コンピュータ化した100塩基のコーリングという条件にて行なった。
【０１５７】
cDNAの全長をクローニングするため、デキサメタゾン処理したRBMCから分離したmRNAをもとにしてcDNAライブラリーを構成した。その際にpSPORT1ベクター系を利用したが、このベクターについては製造メーカー（ジブコ／BRL社）が説明している（ワンとブラウン、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第88巻、11505-11509ページ、1991年；リベラ-ゴンザレス他、J. of Steroid Biochemistry & Molecular Biology、第64巻、13-24ページ、1998年）。このcDNAライブラリーをHybond N膜（アマーシャム社、アーリントン・ハイツ、イリノイ州）に移し、変性させ、Stralinker（ストラタジーン社）と架橋させ、標準的な方法でハイブリダイズさせた（サムブルック他、『分子クローニング：実験室マニュアル』、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1989年）。ハイブリダイゼーション・プローブを、以下のようなオリゴヌクレオチド
195A（5'-GCCGCTCTAGAACTAGTGGATC-3'）（配列番号9）と、
195B（5'-AGGTCGACGGTATCGATAAGC-3'）（配列番号10）
を用いてPCR法を行なうことによって得た。そのプローブを用いてBluescript II
SK+（pBSSK+、ストラタジーン社）からのcDNA挿入物を増幅した。
【０１５８】
増幅したcDNA断片は、ゲルで精製し、［32P］-dCTP（Ready-to-Go Mix、ファルマシア社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を用いたランダムなプライミング反応で標識した。100万個のコロニーを、差し引きcDNAライブラリーから取り出した［32P］で標識された異なる3つの断片とハイブリダイズさせることにより、スクリーニングした。プラスの反応を示した28個のクローンを同定し、配列を決定した。
【０１５９】
最長のクローンは、51-35と呼ばれて1664bpの長さがある。このクローンは、3つのプローブすべてとハイブリダイズした。このクローンに関しては、2本の鎖の両方について配列を決定した。この最長のクローンの最初のヌクレオチドは、図1に示した配列番号1の全長の塩基17に対応している。
【０１６０】
mRNAの5'末端は、RNAリガーゼを媒介としたcDNA末端高速増幅（RACE）法によって決定した。この方法については、過去の文献に記載されている（フローマン、『PCR法とその応用』、第4巻、S40-S58ページ（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1994年））。デキサメタゾン処理したRBMCから抽出した合計50μgのRNAを仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（ベーリンガー・マンハイム社、インディアナポリス、インディアナ州）で脱リン酸化し、タバコの酸性ピロホスファターゼ（エピセンター・テクノロジーズ社、マディソン、ウィスコンシン州）を用いて5'のキャップを取り除いた。プラスミドpGbx-1（マイケル・フローマン博士、ニューヨーク州立大学薬理学部、ストーニー・ブルック、ニューヨーク州からの提供）から得られたRNAリンカーを、T4 RNAリガーゼ（エピセンター・テクノロジーズ社、マディソン、ウィスコンシン州）を用いて、キャップを除去されたRNAと結合させた。そのRNAをcDNAに変換した。その際に用いたのは、Superscript IIという逆転写酵素とpoly dT（ロベイ、Connective Tissue Research、第35巻、131-136ページ、1996年；ボスキー、Connective Tissue Research、第35巻、357-363ページ、1996年；デュシー他、Nature、第382巻、448-452ページ、1996年；ベレスフォード、J. of Cell Science、第102巻、341-351ページ、1992年；ハーバートソンとオービン、Bone、第21巻、491-500ページ、1997年；リカード他、J. of Bone & Mineral Research、第11巻、312-324ページ、1996年；マニアトプーロス他、Cell & Tissue Research、第254巻、317-330ページ、1988年）プライマー（ジブコ／BRL社）である。PCR法においてNRC-1-288A & 44AとNRC-1-288B & 44Bというプライマーのペアをそれぞれ第1ラウンドと第2ラウンドで用い、cDNAの5'末端を増幅した。約420bpの単一のPCR産物が、第2ラウンドのPCRで得られた。ピロホスファターゼ処理を省略した対照のサンプルは、PCR産物を生産しなかった。これは、420bpの産物が、5'末端のキャップを有する全長のmRNAから得られたらしいことを示唆している。第2ラウンドのPCR断片は、分離し、TAクローニング・キット（インヴィトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）を用いて結合させた。プラスミドを含む挿入物の配列を決定した。
【０１６１】
遺伝子特異的プライマー：
44A：5'-GTTAGGTAGTGCGTGCTTCG-3'（配列番号11）
44B：5'-GGACATCTGTTGGAATTACGC-3'（配列番号12）
pGbx-1 RNAリンカー・プライマー：
NRC-1-288A：5'-CCAAGACTCACTGGGTACTGC-3'（配列番号13）
NRC-2-288B：5'-CTAGAGGGGCCTGTTGAACC-3'（配列番号14）。
【０１６２】
2．オステオレギュリンのキャラクテリゼーション
カイト-ドゥーリットルの疎水性プロットにより、オステオレギュリンには、疎水性リーダー配列と、そのあとに続く親水性タンパク質が含まれていることがわかった（Fig.7A）。予想されるアミノ酸配列は、分泌タンパク質のシグナル配列として特徴的なN末端の正に荷電した領域（N-領域）を欠いているとはいえ、シグナル配列として特徴的なアミノ末端の疎水性領域（H-領域）は、フォン・ヒーネが述べているように確かに含んでいる（フォン・ヒーネ、Nucleic Acids Research、第14巻、4683-4690ページ、1986年）。アミノ酸配列から細胞内におけるタンパク質の局在部位を予測するプログラムであるPSORT IIでアミノ酸配列を解析すると、このタンパク質が細胞外タンパク質であるらしいことがわかる（ナカイとカネヒサ、Genomics、第14巻、897-911ページ、1992年；マクゲオック、Virus Research、第3巻、271-286ページ、1985年）。予想される切断部位は、アラニン16とアラニン17の間である。実際の切断がアラニン16の後ろで起こると仮定すると、分泌されるタンパク質は長さが419アミノ酸で、分子量の計算値は44744.47Daとなる。
【０１６３】
プロセスされたタンパク質の予想されるアミノ酸組成をFig.7Bに示す。この配列は、セリン、グリシン、荷電したアミノ酸残基を豊富に含んでいる。このタンパク質は、pHの計算値が8.67で、翻訳後修飾がない中性のpHのときには正味の電荷が+5.13となる塩基性タンパク質であろう。リン酸化部位となりうる部位が、種を超えて共通する9つのカゼイン・キナーゼII部位を含め、多数ある。リン酸化部位が翻訳後修飾されるとタンパク質の酸性度が大きくなる可能性がある。結局、配列の解析により、いくつかの細胞外マトリックス・タンパク質に特徴的な、種を超えて共通するRGDインテグリン認識モチーフが1つ明らかになった（Fig.1）。
【０１６４】
BLAST1.4アルゴリズム（アルトシュール他、J. of Molecular Biology、第215巻、403-410ページ、1990年）を利用してオステオレギュリンのcDNA配列をジェンバンクのデータと比較したところ、データベースの中の既知のどの遺伝子とも一次配列の相同性はほとんど見られなかった。弱い相同性がタンパク質DMP1（AG1としても知られる）に見られた（ジョージ、J. of Biological Chemistry、第268巻、12624-12630ページ、1993年）。一次配列の相同性を、Fig.8にアラインメントして示す。一次配列のレベルでの相同性は比較的少ない（22％一致、37％類似、予想確率3×106）とはいえ、全体的な類似性はあるので、これら2つのタンパク質が互いに関連していることが裏づけられる。オステオレギュリンは、DMP1と同じ特徴を持っている。例えば、どちらの遺伝子も大きな電荷を持ち、セリンを豊富に含み、疎水性リーダー配列を持っている。また、オステオレギュリンは、非常に組織特異的な発現をするという点がDMP1と似ている。DMP1は、成熟した歯芽細胞で非常によく発現する（マクドゥーガル他、J. of Bone & Mineral Research、第13巻、422-431ページ、1998年）。なお歯芽細胞とは、オステオレギュリンのmRNAを発現して骨を形成する骨芽細胞と似た、歯を形成する細胞のことである。
【０１６５】
3．発現と他の骨芽細胞マーカー
ノーザン・ブロット法を用い、培養物の中で分化しているRBMCにおける遺伝子発現の変化を21日間にわたって検出した（Fig.9）。プロテオグリカンが豊富な細胞供給源に合うように変えたプロトコルに従ってTrizol試薬（ジブコ／BRL社）を用い、細胞培養物からRNAを分離した（チョムチンスキーとマッキー、BioTechniques、第19巻、942-945ページ、1995年）。細胞をTrizolの中で均質化し、クロロホルムを添加してから抽出した。0.25容積のイソプロパノールと0.25容積の1.2MのNaCl／0.8Mのクエン酸ナトリウムを用い、水相を沈殿させた。サルヴァトーリ他のもの（サルヴァトーリ他、BioTechniques、第13巻、510-512ページ、1992年）を変更したクロロホルム／ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）／酢酸カリウム抽出物を用いてRNAをさらに精製した。RNAを0.6mlの水の中に再び分散させ、0.07mlの20％SDSを添加した。クロロホルム（0.3ml）を添加して混合した。次に、酢酸カリウム／冷やした酢酸（0.3ml）をサンプルに添加して混合し、14,000×gで5分間にわたり遠心分離した。イソプロパノール0.75mlを添加して水相を沈殿させ、70％エタノールで洗浄し、水中に再度分散させた。
【０１６６】
グアニジン・イソチオシアナート抽出物を用い、その後に塩化セシウム密度勾配遠心分離を行なうことによって、ラットの組織からRNAを分離した（サムブルック他、『分子クローニング：実験室マニュアル』、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1989年）。組織を液体窒素の中で凍らせた。組織プールをRNA抽出物バッファー（4Mのグアニジン・イソチオシアナート、0.03Mの酢酸ナトリウム、0.4mg/mlの塩化セシウム）の中で均質化し、サルコシルを0.5％（w/v）まで添加した。この均質物を、5.7Mの塩化セシウム／0.03Mの酢酸ナトリウムを含む3mlのパッドの上に層状に置き、100,000×gで14-16時間遠心分離した。全RNAを回収し、水に溶かした。
【０１６７】
ノーザン・ブロット法を行なうため、合計20μgのRNAを、1×MOPS-酢酸塩バッファーの中で0.9％アガロース-ホルムアルデヒド・ゲルを用いた電気泳動によって分離し、Nytran膜（シュライヒャー・アンド・シュエル社、キーン、ニューハンプシャー州）の上に移し、架橋させた。フィルターは、バッファーの中で42℃にてあらかじめハイブリダイズさせた。バッファーに含まれているのは、脱イオン化した50％ホルムアミド、6×SSC（1×SSC＝0.15MのNaCl、0.015Mのクエン酸ナトリウム、pH7）、7.5×デンハルト溶液（1×デンハルト溶液＝フィコール、ポリビニルピロリドン、ウシ血清アルブミンをそれぞれ0.02mg/ml）、0.5%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、熱変性させ、超音波処理をしたサケ精子DNA100μg/mlである。ハイブリダイゼーションは、42℃にて、［32P］-dCTPで標識したcDNAプローブを1.5×106cpm/mlの割合で含む新鮮な予備ハイブリダイゼーション・バッファーの中で、ランダム・オリゴヌクレオチド・プライミング・キット（ファルマシア・バイオテック社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を用いて行なった。16〜20時間にわたってハイブリダイゼーションを行なった後、フィルターを、室温にて0.3×SSC／0.1％SDSで3回洗浄し、次に、55℃にて0.1×SSC／0.1％SDSで30分間洗浄した。ブロットを蛍光スクリーンの上に載せ、時期の異なるものについて撮影した。シグナルは、Fuji BAS 2000（フジ・メディカル・システムズUSA社、スタンフォード、コネチカット州）上での蛍光画像分析によって定量化した。放射性標識した次のcDNAプローブを添加する前に、フィルターのストリッピングを予備ハイブリダイゼーション・バッファーの中で57℃にて一晩行なった後、さまざまなcDNAプローブを同じフィルター上で用いた。
【０１６８】
それぞれのcDNAプローブが、ラットの頸骨またはROS17/2.8細胞のRNAをRT-PCR法で増幅することにより得られた。特異的なプローブ領域は以下の通りである。
【０１６９】
アルカリホスファターゼ：ジェンバンク＃J03572 309bp；ヌクレオチド797-1106。
【０１７０】
骨のシアロタンパク質：ジェンバンク＃J04215 924bp；ヌクレオチド116-1036。
【０１７１】
オステオカルシン：ジェンバンク＃X04141 290bp；ヌクレオチド10-300。
【０１７２】
オステオネクチン：ジェンバンク＃M99252 217bp；ヌクレオチド757-974。
【０１７３】
オステオポンチン：ジェンバンク＃M14656 766bp；ヌクレオチド259-1025。
【０１７４】
酒石酸塩耐性酸性ホスファターゼ：ジェンバンク＃M76110 469bp；ヌクレオチド218-687。
【０１７５】
18S rRNA：ジェンバンク＃M29839 700bp；ヌクレオチド377-1074。
【０１７６】
過去の文献（マニアトプーロス他、Cell & Tissue Research、第254巻、317-330ページ、1988年；リカード他、Developmental Biology、第161巻、218-228ページ、1994年；リボイ他、J. of Cellular Physiology、第146巻、370-378ページ、1991年）に基づき予想されるように、デキサメタゾンなしで培養したRBMCは、確かにアルカリホスファターゼ、オステオネクチン、オステオポンチンのmRNAを低レベルで発現させるものの、骨のシアロタンパク質やオステオカルシンのmRNAは発現させない。デキサメタゾンが分化を誘起したのである。そのことは、オステオポンチン、アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、骨のシアロタンパク質のmRNAの発現増加からわかる。オステオレギュリンのmRNAは、6日目に初めて検出できるようになり、21日間を通じて増加していった。したがって、オステオレギュリンの発現は、骨芽細胞タイプの細胞への分化の増大と関係していた。オステオレギュリン発現の時間的パターンは、この培養系の中では骨のシアロタンパク質およびオステオカルシンの発現パターンと非常によく似ていた。これらのmRNAは、骨芽細胞の分化プログラムの後期において発現するゆえ、成熟した骨芽細胞のマーカーと見なされる（オービン、Journal of Cellular Biochemistry、第72巻、396-410ページ、1999年；オウエン他、J. Cell. Physiol.、第143巻、420-430ページ、1990年；リカード他、Developmental Biology、第161巻、218-228ページ、1994年）。
【０１７７】
4．オステオレギュリンの組織分布
ノーザン・ブロット法では、心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣からのポリA+RNAにはオステオレギュリンは検出されなかった（Fig.9A）。同一のフィルターをアクチン・プローブとハイブリダイズさせることにより、そのフィルターに完全なmRNAが含まれていることがわかった（Fig.9A）。さらに、脳下垂体、頸骨の骨幹、子宮、骨髄、頸骨の骨幹端、腸、大動脈、デキサメタゾン処理したRBMC+／-、褐色脂肪、白色脂肪から抽出した合計20μgのRNAについて、オステオレギュリンの発現を調べた（Fig.9B）。オステオレギュリンは、頸骨の骨幹および骨幹端と、デキサメタゾン処理したRBMCにおいて発現していたが、他の組織では検出できなかった。この結果に基づくと、オステオレギュリンが骨において極めて特異的に発現したことがわかる。
【０１７８】
骨におけるオステオレギュリンの発現の特徴をさらにはっきりとさせるため、骨のさまざまな部分からの全RNAに対してノーザン・ブロット法を実施した（Fig.10）。オステオレギュリンの発現は、頸骨の骨幹、骨幹端、成長板において最高で、大腿骨頸部や頭蓋冠においてはそれよりも少ないことがわかった。この方法では、オステオレギュリンのmRNAを骨髄や骨膜で検出することはできなかった。オステオレギュリンの発現は、他の骨マーカーの発現とは異なっていた。非常に注目すべきなのは、オステオレギュリンのmRNAが頸骨の骨幹中央部でよく発現していたことである。このサンプルは、主に皮質骨を代表していた。他の骨芽細胞マーカー、例えばアルカリホスファターゼ、オステオポンチン、オステオネクチンなどは、頸骨の骨幹の皮質骨の中では低レベルにしか発現しない。また、破骨細胞マーカーである酒石酸塩耐性アルカリホスファターゼは、頸骨の骨幹においては低レベルにしか検出できない。オステオレギュリンは、オステオカルシンや骨のシアロタンパク質と比較するだけでも、分布が非常に異なっていることがわかった。オステオレギュリンは、頸骨の骨幹、骨幹端、成長板においてほぼ同じように発現するのに対し、オステオカルシンと骨のシアロタンパク質は、頸骨の骨幹よりも頸骨の骨幹端または成長板のほうに豊富に存在している。
【０１７９】
5．骨芽細胞系における発現
RBMC培養物は、デキサメタゾン処理の後は主に骨芽細胞からなるとはいえ、実際には多くのタイプの細胞を含んでいた。骨のさまざまな部分に由来するRNAも、同様に、骨に存在している多くのタイプの細胞に由来するものだった。オステオレギュリンが骨芽細胞において発現していることのより強力な証拠を得るため、よく性質のわかった骨芽細胞系であるUMR106細胞とROS17/2.8細胞におけるオステオレギュリンの発現パターンを調べた。UMR-106細胞は、ATCC（アメリカ基準培養コレクション、マナサス、ヴァージニア州）から入手したもので、その細胞を、熱で不活性化した10％のウシ胎仔血清とゲンタマイシン50μg/mlを添加したDMEM/F12培地（ジブコ／BRL社）の中で培養した。その細胞を10cmの組織培養皿に入れ、80％コンフルエントになるまで成長させた。次に、その細胞を、一方では10nMのデキサメタゾンを含む対照培地に入れ、他方では10nMのデキサメタゾンと50μg/mlアスコルビン酸を含む培地に入れた。細胞には新鮮な培地を一週間に3回供給し、24時間または14日間経過したときにTrizol試薬を用いて以下に記載したようにして細胞からRNAを抽出した。ROS17/2.8細胞は、バーバラ・クリーム（コネチカット大学健康センター、内分泌学・代謝部門、ファーミントン、コネチカット州）から提供されたもので、それを、UMR-106細胞培養物と同じようにして培養し、処理した。
【０１８０】
細胞を、デキサメタゾンまたは賦形剤の存在下で1日間または14日間培養した。全RNAを抽出し、ノーザン・ブロット法を行なった（Fig.11）。UMR-106細胞では、オステオレギュリンのmRNAが、デキサメタゾンの存在下、またはデキサメタゾン／アスコルビン酸の存在下で1日後に低レベルで検出できた。mRNAの発現は、デキサメタゾンの存在下で14日目までに増加し、デキサメタゾン／アスコルビン酸の存在下では14日目に最高になった。デキサメタゾン、またはデキサメタゾン／アスコルビン酸の存在下で培養したROS17/2.8細胞では、14日目より1日目のほうが発現レベルが高かった。オステオレギュリンのmRNAがこれら骨芽細胞系で発現したことは明らかである。
【０１８１】
さまざまな分化条件におけるUMR-106細胞でのオステオレギュリンのmRNA発現を、UMR細胞内の他の骨芽細胞マーカーと比較した（Fig.12）。オステオレギュリンのmRNAはデキサメタゾン／アスコルビン酸によって誘起され、デキサメタゾン単独だと誘起の程度はそれよりも少なかった。これはFig.7とも矛盾しない。オステオカルシンとアルカリホスファターゼも、デキサメタゾン、またはデキサメタゾン／アスコルビン酸によって誘起された。オステオレギュリンの誘起パターンはオステオカルシンの誘起パターンと似ていたとはいえ、違いも観察された。すなわち、オステオカルシンは、アスコルビン酸だけが存在している条件でも培養の全期間を通じて誘起された。これに対してオステオレギュリンのmRNAのほうは、アスコルビン酸単独では14日後に誘起されていなかった。オステオレギュリンの誘起には、デキサメタゾン処理が必要であった。
【０１８２】
6．発現ベクター
ラットのオステオレギュリンのための哺乳類発現ベクターを、コード領域をPCR法を利用して増幅することによって作った（プライマー36393.65E：5'-AAGGTGAACGACACCAGAGAGC-3'（配列番号15）と36392.65F：5'-TGACCAAGTCTGGTACCTTGC-3'（配列番号16）。このPCR断片を、TAクローニング・キット（インヴィトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）を用いてクローニングした。次に、Eco RIで切断したpCR2.1からの挿入物を、CMV哺乳類発現ベクターpcDNA3（インヴィトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）に、正しい方向にサブクローニングした。
【０１８３】
バクテリアにオステオレギュリン・タンパク質を発現させるため、オステオレギュリンの全コード領域をPCR法で増幅し、pCR2.1にサブクローニングした。その際、プライマー（36318.170A：5'-GCCGGATCCATGCAGGCTGTGTCTGTTGGAC-3'（配列番号17）および36318.170B：5'-GCCGAATTCCAGGACCAGAGCTGGGAAC-3'（配列番号18）と、TAクローニング・キット（インヴィトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）を用いた。pCR2.1内の正しい方向の挿入物を、PCRプライマーに組み込まれたBamHI部位とpCR2.1のNotI部位を用いて、フレーム内でバクテリア発現プラスミドpET-28a（ノヴァジェン社、マディソン、ウィスコンシン州）のBam HI／Not I部位にサブクローニングした。この構造物が、（ヒスチジン）6-タグとT7-タグをアミノ末端に有する融合タンパク質を生み出した。GST融合タンパク質が、Bam HI／Eco RI断片を大腸菌発現構造物pGEX-2TK（ファルマシア社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）の中にサブクローニングすることにより生み出された。
【０１８４】
ベクターの製造会社（ファルマシア社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）が示唆しているように、GST融合タンパク質は、イソプロピル-β-D-ガラクトース（IPTG）によってバクテリア菌株BL-21（DE3）（ノヴァジェン社）の中で発現した。オステオレギュリン融合タンパク質の大部分は、不溶性の封入体の中に存在していた。この組み換えタンパク質は、8Mの尿素／0.5MのトリスHCl（pH8）／0.5MのNaCl／1mMのEDTA／1mMのDTTを用いて封入体から溶解させた。
【０１８５】
pET28aヒスチジン-タグ・オステオレギュリン融合タンパク質は、バクテリア菌株BL-21（DE3）（ノヴァジェン社、マディソン、ウィスコンシン州）の中で発現したので、Ni-NTAスーパーフロー樹脂上で、製造メーカー（キアジェン社、ヴァレンシア、カリフォルニア州）の指示に従って封入体から精製した。このタンパク質を、8Mの尿素／0.1MのNaPO4／0.01MのトリスHCl、pH4.5の中でNTA樹脂から溶離した。
【０１８６】
7．免疫組織化学
アフィニティ精製したアンチ・オステオレギュリン・ポリクローナル抗体を作って利用し、オステオレギュリン・タンパク質が免疫組織化学により正常な大人の骨組織の中だけで発現するようにした。リサーチ・ジェネティックス社（ハンツヴィル社、アラバマ州）が、ウサギの免疫を確立することによって、力値の大きなポリクローナル抗血清を生産した。免疫原として、高純度に精製したGST-オステオレギュリン融合タンパク質を約20mg含むポリアクリルアミド・ゲルのスライスを用いた。この物質は、封入体から溶解させたGST-オステオレギュリン融合タンパク質をSDS-PAGEで精製することにより得られた。
【０１８７】
pET28aの中で発現したヒスチジン・タグ・オステオレギュリン融合タンパク質を、0.2MのNaHCO3／0.5MのNaCl（pH8.3）で4℃にてよく透析して再生した。次に、透析後のタンパク質を、ブロモシアンで活性化したセファロース4Bと4℃にて一晩かけて結合させたが、このやり方は製造メーカー（ファルマシア社）の指示に従ったものである。樹脂1mlにつきタンパク質が約5mg結合した。
【０１８８】
オステオレギュリン抗体を、文献に記載されている方法に従ってアフィニティ精製した（ハーロウとレーン、『抗体：実験室マニュアル』、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州、1988年）。要するに、抗血清5mlを10mMのトリスHCl（pH7.5）の中に希釈し、上記のようにオステオレギュリンと結合した樹脂に1回分の分量として添加した。カラムを10mMのトリスHCl（pH7.5）でよく洗浄し、次に、500mMのNaCl＋10mMのトリスHCl（pH7.5）でよく洗浄した。酸感受性の相互作用抗体を100mMのグリシン（pH2.5）で溶離し、1床分の容積の1MトリスHCl（pH8）が入ったチューブの中に回収した。塩基感受性の抗体を100mMのトリエチルアミン（pH11.5）を用いて溶離し、1MのトリスHCl（pH8）が入ったチューブの中に回収した。これら2つの分画を0.02％のアジ化ナトリウムを含むPBSでよく透析し、ウエスタン・ブロット法で反応を調べた。
【０１８９】
アフィニティ精製した抗体の結合力を、オステオレギュリンを発現する発現ベクターをトランスフェクトされた細胞から抽出したタンパク質上でウエスタン・ブロット法を行なうことにより明らかにした。サンプルは、Novex（サンディエゴ、カリフォルニア州）10％ビス-トリス・ゲルで電気泳動をかけることにより分離し、半乾燥輸送系を用いてニトロセルロースに移した。ブロットは、ロッシュ社（マンハイム、ドイツ）が市販している1％ウエスタン・ブロッキング試薬を用いて1時間かけてブロックし、0.5％ブロックの中に希釈した一次抗体を、1時間かけてブロットに添加した。洗浄後、ヤギの抗ウサギ抗体ぺルオキシダーゼ二次抗体（ロッシュ社）を0.5％ブロックの中に希釈し、1時間かけてブロットに添加した。洗浄後、シグナルが検出されたので、アマーシャム社（バッキンガムシャー、イギリス）のECL検出キットをこの製造メーカーの指示に従って用い、量を測定した。
【０１９０】
成熟したラットの頸骨を4％パラホルムアルデヒドの中に固定し、10％EDTAの中でカルシウムを除去した。骨を標準的な方法を用いてパラフィンの中に埋め、シラン化したスライド（ダイジーン社、ベルツヴィル、メリーランド州）の上に5ミクロンの複数の切片を置き、一晩中50℃に加熱した。スライドに再び水を加え、切片をメタノールに3％H2O2を溶かした溶液の中で培養することによって、内在性ぺルオキシダーゼの活性をブロックした。0.01MのHCl中で20,000単位のペプシンに消化させたため、抗原部位が露出した。切片を1％BSA／PBSの中でブロックし、それを、一次抗体を1：500の割合で0.1％BSA／PBSに希釈したものと一緒に、あるいは対照としてのウサギのIgG （ヴェクター・ラボラトリー社、バーリンゲーム、カリフォルニア州）と一緒に、濡らしたチェンバーの中で4℃にて一晩培養した。セイヨウワサビのぺルオキシダーゼと結合した抗ウサギIgG Fab断片（アマーシャム・ライフ・サイエンシーズ社）からなる二次抗体を1：100の割合で0.1％BSA／PBSに希釈し、室温にて頸骨の切片上に1時間置いた。DAB基質クロマゲン・システム（ヴェクター・ラボラトリー社）を、この製造メーカーの指示に従って利用して検出を行なった。
【０１９１】
頸骨細胞および大腿骨細胞の石灰化能力を評価するため、培養物を50μg/mlのアスコルビン酸塩／10nMのデキサメタゾン／10mMのβ-グリセロリン酸塩の中に維持し、フォン・コッサ染色法で染色してミネラルの堆積を評価した。骨髄を年齢が3ヶ月のメスのスパラグ・ドーレイというラットの頸骨および大腿骨から分離し、15％のウシ胎仔血清、2mMのグルタミン、0.1mg/mlのゲンタマイシン、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンを追加した最小必須培地（MEM）（ジブコ／BRL社、ゲサーズバーグ、メリーランド州）の中に入れた。分離した骨髄細胞を100μmのメッシュで濾過し、培地で3回洗浄し、密度を1×106細胞／cm2にして10cmの組織培養皿に入れた。細胞は、CO2を5％にして37℃で4日間放置し、定着させた。細胞は90％が融合するまで成長させ、その時点で、培地内にて50μg/mlのアスコルビン酸塩と10nMのデキサメタゾンで処理した。培地は、最初の定着期間が過ぎた後は一週間に3回交換した。
【０１９２】
骨梁骨と皮質骨の両方とも、表面部の骨細胞に特異的な染色が検出された。これは、高度に分化した骨芽細胞で発現が起こっていることを示している。破骨細胞、軟骨細胞、骨膜細胞には特異的な染色は検出されなかった。また、骨髄に含まれている造血系細胞は、オステオレギュリンに関してマイナスの反応であった。
【０１９３】
マウスのオステオレギュリン
1．単離とキャラクテリゼーション
ラットのオステオレギュリンと強い相同性を示すマウスのcDNAの全体（配列番号3：Fig.1）を、弱い条件のハイブリダイゼーションとPCR法を利用してクローニングした。3'-UTRを除きラットのオステオレギュリンのcDNA配列の大部分をコードしている1255bpのプローブが、ラットのオステオレギュリンのcDNAライブラリー・クローンをプラスミドpSPORT（Invitrogen）の中にあるSa II部位とcDNAの中にある内部Xho I部位で切断することにより得られた。標準的なプロトコル（25）に従って、マウスの129ゲノムλライブラリーを培養し、Hybond N+フィルターに移した。フィルターを、5×SSC／5×デンハルト溶液／5％硫酸デキストラン／0.5％SDS／500μg/mlサケ精子DNAの中で、65℃にて一晩かけて1×106cpm/mlとハイブリダイズさせた。そのフィルターを、25℃にて2×SSC／0.1％SDSの中で20分間ずつ2回洗浄し、65℃にて2×SSC／0.1％SDSの中で20分間ずつ2回洗浄し、最後に、65℃にて1×SSC／0.1％SDSの中で20分間洗浄した。陽性プラークを、ハイブリダイゼーション・スクリーニングをさらに2ラウンド行なうことによって精製した。その結果、プローブとハイブリダイズした約15kbのλクローンが得られた。
【０１９４】
mRNAの5'末端を、上記のようにRNAリガーゼを媒介としたRACEによって決定した。マウスの頸骨から抽出した合計50μgのRNAを仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（ベーリンガー・マンハイム社、インディアナポリス、インディアナ州）で脱リン酸化し、タバコの酸性ピロホスファターゼ（エピセンター・テクノロジーズ社、マディソン、ウィスコンシン州）を用いて5'キャップを除去した。プラスミドpGbx-1（フローマン博士、ニューヨーク州立大学薬理学部、ストーニー・ブルック、ニューヨーク州からの提供）から作ったRNAリンカーを、T4 RNAリガーゼ（エピセンター・テクノロジーズ社、マディソン、ウィスコンシン州）を用いて、キャップを除去したRNAと結合させた。そのRNAをcDNAに変換した。その際に用いたのは、Superscript II逆転写酵素とポリdT（ロベイ、Connective Tissue Research、第35巻、131-136ページ、1996年；ボスキー、Connective Tissue Research、第35巻、357-363ページ、1996年；デュシー他、Nature、第382巻、448-452ページ、1996年；ベレスフォード、J. of Cell Science、第102巻、341-351ページ、1992年；ハーバートソンとオービン、Bone、第21巻、491-500ページ、1997年；リカード他、J. of Bone & Mineral Research、第11巻、312-324ページ、1996年；マニアトプーロス他、Cell & Tissue Research、第254巻、317-330ページ、1988年）プライマー（ジブコ／BRL社）である。PCR法によりcDNAの5'末端を増幅した。その際、第1ラウンドと第2ラウンドにおいて、プライマーのペア、NRC-1-288A & 36387.233BとNRC-1-288B & 36387.233Aをそれぞれ用いた。第2ラウンドのPCRにおいて、長さが約550bpある単一のPCR産物が得られた。ピロホスファターゼ処理を省略した対照のサンプルは、PCR産物を生産しなかった。これは、約550bpの産物が、5'キャップを有する全長のmRNAから得られたらしいことを示している。第2ラウンドのPCR断片を分離し、TAクローニング・キット（インヴィトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）を用いてクローニングした。プラスミドを含む挿入物の配列を決定した。
【０１９５】
mRNAの3'末端を、3'RACEキットを製造メーカー（ジブコ／BRL社）の指示に従って用いて決定した。合計で5μgのマウス頸骨を、提供されたAPプライマーを用いて逆転写した。PCR法において、プライマー36387.233Eと、提供されたAUAPプライマーを用いた。サイズの似た2つの断片を、TAクローニング・キット（インヴィトロジェン社）を用いてクローニングし、配列を決定した。これら2つの断片の配列は、3'末端の短い付加配列を除いて一致していた。
【０１９６】
遺伝子特異的プライマー：
36387.233A：5'-TGTGTCAGGTAGTGAGTGCTCC-3'（配列番号19）
36387.233B：5'-ACTGCCACCATGTCCTTCTC-3'（配列番号20）
pGbx-1 RNAリンカー・プライマー：
NRC-1-288A：5'-CCAAGACTCACTGGGTACTGC-3'（配列番号21）
NRC-2-288B：5'-CTAGAGGGGCCTGTTGAACC-3'（配列番号22）。
【０１９７】
cDNAは長さが1741bpで、441個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしていた。ラットのアミノ酸配列とアラインメントしたところ、約70％が一致していることがわかった（Fig.5）。重要なことだが、構造上の主要な特徴は保存されていた。どちらのタンパク質も、セリン、グリシン、荷電したアミノ酸を豊富に含むとともに、分泌されるペプチドのためのシグナル配列であると思われる疎水性領域をアミノ末端に備えていた。インテグリンによる結合とシグナル伝達を通じて細胞-マトリックス間の相互作用と関係している可能性のあるRGD配列も保存されていた（Fig.1）。
【０１９８】
2．組織分布
マウスのオステオレギュリンmRNAは、石灰化を促進されたマウスの頭蓋冠細胞と骨髄細胞の初代培養物において発現した。骨髄は、大腿骨と頸骨から遠心分離によって回収した。細胞ペレットを粉末にし、100μmのフィルターを通した。細胞を数え、4×105細胞／cm2の密度で培養した。細胞は、10％のFBSと50μg/mlのゲンタマイシンを補ったMEMα培地の中で成長させた。培地は7日目に交換した。10日目、一方では、β-グリセロリン酸塩（10mM）とL-アスコルビン酸（50μg/ml）を補ったMEMα培地（＋FBSとゲンタマイシン）を用いて細胞に対して石灰化した小節の形成を促進し、他方では、細胞に追加成分なしの標準的なMEMα培地（＋FBSとゲンタマイシン）を供給して放置した。培地は3日ごとに交換した。RNAを得るため、またはフォン・コッサ染色を行なうため、細胞のアリコートをいくつかの時期に回収した。
【０１９９】
頭蓋冠の全体を産後3日の仔マウスから取り出した。頭蓋冠を冷たいPBSで2回洗浄し、酵素カクテル10mlの中で消化させた。酵素カクテルには、血清フリーのMEM（ジブコ／BRL社）に溶かした0.2mg/mlのコラゲナーゼP（ベーリンガー・マンハイム社、インディアナポリス、インディアナ州）と、0.25％のトリプシン溶液（ジブコ／BRL社、カタログ番号15090番）が含まれていた。15分後、酵素カクテルを除去してから頭蓋冠をPBSで洗浄し、新しい酵素カクテルを添加した。30分後、細胞を70μmのフィルターで濾過し、FBSを4ml添加してプロテアーゼを中和した。次に、細胞をPBSで2回洗浄し、MEMα培地（＋10％FBSと50μg/mlのゲンタマイシン）の中に再度分散させ、細胞の数を数えた。頭蓋冠細胞を2×104細胞／cm2の密度で培養した。細胞がほぼ融合するまで、3日ごとに養分を供給した。次に、50μg/mlのL-アスコルビン酸と10mMのβ-グリセロリン酸塩を補ったMEMα培地（＋10％FBSと50μg/mlのゲンタマイシン）を用いて頭蓋冠培養物の分化を促進させた。RNAを得るため、またはフォン・コッサ染色を行なうため、上記のように細胞を所定のいくつかの時期に回収した。
【０２００】
オステオレギュリンのmRNAは、頭蓋冠培養物の中でアスコルビン酸／βグリセロールリン酸処理を行なってから7日目に出現し、14日目までに一定値に達した。オステオレギュリンの発現は、骨髄培養物では7日後に検出され、21日目までに一定値に達した。この発現パターンは、細胞の分化プログラムが進むにつれ骨芽細胞系にオステオレギュリンが誘起されることを示唆している。このパターンは、ラットのmRNAで観察されたパターンとまったく同じである。
【０２０１】
ノーザン・ブロット法によってわかったmRNAの組織分布は、マウスにおいてはオステオレギュリンが極めて骨特異的であることを示している（Fig.13）。高レベルのオステオレギュリンのメッセージがマウスの頸骨からのmRNAにおいて検出されたが、他のあらゆる組織は、ポリA+mRNAを調べた場合でさえマイナスの反応であった。RT-PCR法で増幅したcDNAをサザン・ブロット法で分析するという非常に感度の高い方法を用いると、低レベルのオステオレギュリンmRNAが、褐色細胞、白色細胞、精巣、大動脈で検出された。大動脈でオステオレギュリンが発現していることは、特に血管の石灰化が起こりうるような病理生理学的条件のもとでは、重要であるように思われた（シンケ他、Annals of Medicine、第30巻、538-541ページ、1998年）。
【０２０２】
骨組織において特にオステオレギュリンが発現していることを、オステオレギュリン遺伝子のプロモーター要素を制御したときのレポーター遺伝子の発現によってさらに確認した。オステオレギュリンのATG開始部位の上流側に隣接した配列である450bpと4.5kbの長さのネズミの2つの断片を、ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子と機能的に関連したPGL3基本ベクターにクローニングした。これら上流断片のそれぞれをコードしているベクターを、それぞれが独立したサンプルである骨細胞系UMRとヒト腎臓の胚細胞系HEK293にトランスフェクトした。どちらの上流断片も、骨細胞系の中でルシフェラーゼを発現させた。ルシフェラーゼの発現は、デキサメタゾンの投与によって増大した。他方、ルシフェラーゼの活性は、上記の制御レベルだと腎臓細胞系では増加しなかった。したがって、450bpの断片または4.5kbの断片のいずれかが実際に機能する発現要素を含んでいて、生理学的に意味のある組織特異的パターンでの発現を制御している。
【０２０３】
長さが450bpの上流断片をクローニングするため、マウスのオステオレギュリン・プロモーターの以下のようなHind III断片を、pGL3ベクターのHind III部位にクローニングした（CBFA部位となる可能性のある部分に下線を引いた。また、CCAATボックスとなる可能性のある部分は太字にした）。
【０２０４】
【化１】
2004173696.tif 000004
【０２０５】
マウスのオステオレギュリン・プロモーターの4.5kb上流断片は、配列番号44の配列と、配列番号43の上流に付加されている4.1kbの配列を含んでいた。この4.5kbの断片を、マウスのBACクローン#17535からサブクローニングされた20kbのSpe断片を切断した一部であるpGL3ベクターにクローニングした。
【０２０６】
3．発現ベクター
哺乳類においてオステオレギュリンを発現させるため、ゲノムλクローンから得られた配列情報を用いた。つまり、5'-RACEプライマーと3'-RACEプライマーを設計して、マウスのオステオレギュリンcDNAのコード領域を含む1340bpの断片を増幅した。（36393.44C：5'-TTTCCTGAAGGTGAATGACG-3'（配列番号23）と、36393.44H：5'-CTAGTCACCATGACTCTCACTAG-3'（配列番号24））。1340bpの断片をPCR法によって作り、TAクローニング・キット（インヴィトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）を用いてpCR2.1にクローニングした。次に、EcoR IでpCR2.1から切断した挿入物を、CMV哺乳類発現ベクターpcDNA3（インヴィトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）に、正しい方向にサブクローニングした。
【０２０７】
オステオレギュリン・タンパク質をバクテリアに発現させるため、オステオレギュリンの全コード領域をPCR法で増幅し、TAクローニング・キット（インヴィトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）を用いてpCR2.1にサブクローニングした。その際、プライマーとして、41766.188A：5'-GCCGGATCCATGACGCCAGAGGGCC-3'（配列番号25）と、36393.44H：5'-CTAGTCACCATGACTCTCACTAG-3'（配列番号26）を用いた。pCR2.1への挿入物を、PCRプライマーに組み込まれたBamHI部位とpCR2.1のEcoR I部位を用いて、バクテリア発現構造物pGEX-6P（ファルマシア社）のBam HI／Eco RI部位にフレーム内でサブクローニングした。この構造物が、GSTをアミノ末端に有する融合タンパク質を作り出した。GSTは、PreScissionプロテアーゼ（ファルマシア社）を用いて切断することができる。このGST融合タンパク質は、ベクター製造メーカー（ファルマシア社）の指摘通り、IPTGによってバクテリア菌株BL-21（DE3）（ノヴァジェン社）の中で発現した。オステオレギュリン融合タンパク質の大部分は、不溶性封入体の中に存在していた。この融合タンパク質は、8Mの尿素／0.5MのトリスHCl（pH8）／0.5MのNaCl／1mMのEDTA／1mMのDTTを用いて封入体から溶解させた。8Mの尿素によって溶解した約16mgのタンパク質を、SDS-PAGEによりさらに精製した。Coomassie Blueで5分間染色することによってオステオレギュリン-GSTタンパク質を同定した。ゲル・バンドを除去した。
【０２０８】
宿主であるバクテリアの中で起こるタンパク質分解を減らすため、アミノ末端に存在する26個のアミノ酸からなるほぼ疎水性の部分を取り除いた大腸菌発現構造物も作った。オステオレギュリンのcDNA領域をPCR法で増幅し、TAクローニング・キット（インヴィトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）を用いてpCR2.1にサブクローニングした。その際、プライマーとして、41766.252A：5'-GGATCCATGCCGAATGAAGACAGGA-3'（配列番号27）と、36393.44H：5'-CTAGTCACCATGACTCTCACTAG-3'（配列番号28）を用いた。次に、pCR2.1への挿入物を、PCRプライマーに組み込まれたBam HI部位とpCR2.1のNot I部位を用いて、バクテリア発現構造物pGEX-6P（ファルマシア社）のBam HI／Not I部位にサブクローニングした。この発現構造物は、m51-35デルタ-pGEXと名づけた。マウスのオステオレギュリン-GST融合タンパク質は、IPTGによってバクテリア菌株BL-21（DE3）（ノヴァジェン社）の中で発現した。このバクテリア・ペレットは、凍結融解と、溶解バッファー（50mlのトリスHCl（pH7.5）／100mlのNaCl／0.5％のTriton×100／1mMのEDTA／5mMのDTTに、40mlにつきプロテアーゼ・インヒビターのタブレット1個（ベーリンガー・マンハイム社）を加えたもの）中での超音波処理によって溶解させた。溶解したタンパク質は、GST-セファロース上で精製し、PreScissionプロテアーゼを用いて切断した。その際、製造メーカー（ファルマシア社）の勧める樹脂上プロトコルに従った。分離したタンパク質を、HiTrap（商標）SPカラム（ファルマシア社）上での陽イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。高純度に精製されたオステオレギュリン・タンパク質が、約0.4MのNaClでSPカラムから溶離した。
【０２０９】
4．免疫組織化学
ザイメッド・ラボラトリーズ社（サウス・サンフランシスコ、カリフォルニア州）が、ウサギの免疫を確立することによって、力値の大きなポリクローナル抗血清を生産した。初回の免疫原は、pGEX-6Pベクターにより発現したGST融合オステオレギュリンの全長を含む、SDS PAGEゲルのスライスであった。最終回の免疫原は、GSTを含まず、HiTrap SPカラム上での陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製した後に得られたアミノ末端リーダー配列も含まない、可溶性で高純度に精製されたオステオレギュリン・タンパク質であった。マウスの抗オステオレギュリン抗体を、ラットの抗体について記載したのと同様にしてアフィニティ精製した。
【０２１０】
タンパク質レベルでのオステオレギュリンの発現は、頸骨の細長い切片を免疫組織化学で分析することによって確認した。マウスのオステオレギュリン・タンパク質は、骨芽細胞と骨細胞において発現していた。これは、ラットのオステオレギュリンの発現パターンと一致している。骨芽細胞、軟骨細胞、骨膜細胞には、特異的な染色は検出できなかった。また、骨髄に含まれている造血系細胞は、オステオレギュリンに関してマイナスの反応であった。
【０２１１】
5．オステオレギュリン遺伝子のゲノム構造とターゲッティング
マウスのオステオレギュリンをコードしているゲノムDNAをクローニングし、BACクローンを用いてマッピングした。cDNAの5'末端に対する124bpプローブを、PCR法で作った。その際、プライマーとして、
36393.80A：5'-TTTCAGCAAATGCCCAGAG-3'（配列番号29）と、
36393.80B：5'-CCAGGTCATACTGAAGAGGAGC-3'（配列番号30））を用いた。マウスの頸骨のcDNAをテンプレートとして用いた。上記124bp挿入物を融点の低いアガロースから分離してからジェノムシステムズ社（セントルイス、ミズーリ州）に送り、ハイブリダイゼーション・スクリーニングによってマウスのES-129 SVIII BACライブラリーをスクリーニングしてもらった。単一のクローンが同定され、特性が明らかになった。
【０２１２】
マウスのオステオレギュリン遺伝子は、3つのエキソンで構成されていた。2つは小さな76bpのエキソンと78bpのエキソンで、1597bpの長さがある第3のエキソンからは10.5kb離れていた（Fig.14）。ジェノムシステムズ社が、同社のプロトコルに従って蛍光イン・シチュ・ハイブリダイゼーション（FISH）を行なった。その結果、オステオレギュリン遺伝子は、マウスの第5染色体の5E3-E5バンドに位置していることが確認された。要するに、マウスBACクローンからのDNAを、ニック・トランスレーションによってジゴキシゲニンdUTPで標識したのである。標識したプローブをマウスの切断されたDNAと合体させ、50％ホルムアルデヒド、10％硫酸デキストラン、2×SSCを含む溶液中で、マウスの繊維芽胚細胞に由来する正常な中期の染色体とハイブリダイズさせた。ハイブリッドを形成したスライドを蛍光発光する抗ジゴキシゲニン抗体の中で培養し、DAPIで対比染色することにより、特異的なハイブリダイゼーション・シグナルが検出された。
【０２１３】
最初のFISH実験において、中くらいのサイズの染色体が特異的に標識された。その染色体は、DAPI染色に基づくと、第5染色体であると考えられた。第5染色体のセントロメア領域に対して特異性のあるプローブをマウスのBACクローンとハイブリダイズさせ、2回目の実験を行なった。この実験の結果、第5染色体のセントロメアと中央部が特に標識された。特異的標識を行なった10本の第5染色体を測定したところ、オステオレギュリン遺伝子が、第5染色体のテロメアの異質染色質−真正染色質の境界から62％の距離に位置していることがわかった。そこは、5E3-E5バンドに対応する。合計80個の中期細胞を調べたところ、72個が特異的に標識された。
【０２１４】
オステオレギュリンの最大のエキソンである第3エキソンを除去し、その代わりにネオマイシン選択マーカー遺伝子を入れたターゲッティング・ベクターを作った（Fig.14）。オステオレギュリン遺伝子座をマッピングし、ターゲッティング・ベクターを作るには、標準的な遺伝子マッピング法と遺伝子サブクローニング法を利用した（サムブルック他、『分子クローニング：実験室マニュアル』、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1989年）。以下の制限酵素、すなわちNot I、Xba I、Spe I、Bam HI、Xho I（ニュー・イングランド・バイオラブズ社、ベヴァリー、マサチューセッツ州）を用いてオステオレギュリン遺伝子座のマッピングを行なうとともに、オステオレギュリン遺伝子座に対するターゲッティング構造物を作った。制限マッピングと、サザン・ハイブリダイゼーションと、配列データとによって、オステオレギュリンの第3エキソンが3kbのXba／Speゲノム制限断片の中にあることを確認した。オステオレギュリン遺伝子座からのゲノムDNA断片をJNS2ターゲッティング・プラスミド（ドンブロヴィッツ他、Cell、第75巻、969-976ページ、1993年）にクローニングした。5'相同性のある1.8kbのNot I／Xba Iゲノム断片を、pBluescript（ストラタジーン社）のNot I部位とXba I部位にクローニングし、次に、そのゲノム断片を、Not I部位およびXho I部位を伴った状態で、JNS2のNot I部位とXho I部位にクローニングした。JNS2のこれら部位は、ネオマイシン選択マーカー遺伝子の5'末端に位置する。3'相同性のある8kbのSpe I／Xba I断片を、JNS2のXba I部位にクローニングした。JNS2のXba I部位は、ネオマイシン選択マーカー遺伝子の3'末端に位置する。このターゲッティング・ベクターとオステオレギュリン遺伝子座の組み換えが成功すると、オステオレギュリン遺伝子の3.0kbの断片が、ネオマイシン選択マーカー遺伝子と置き換わる。このターゲッティング・ベクターとオステオレギュリン遺伝子座の組み換えによってネオマイシン遺伝子が挿入されることを通じ、BamH I部位がオステオレギュリン遺伝子座に導入される。胚幹細胞におけるターゲッティングは、標的相同部である3'領域と相同な500bpのXba I／BamH Iプローブによるハイブリダイゼーションを利用したサザン・ブロット法で検出した。Bam HIでES細胞DNAを切断すると、標的としていない対立遺伝子で15kbのハイブリッド・バンドが検出され、標的とした対立遺伝子で8kbのハイブリッド・バンドが検出された。この切断によって、翻訳された配列である配列番号4のメチオニン27から最後のアスパラギン酸441までをコードしているDNAが除去された。
【０２１５】
129sjマウス系から由来したE14Tg2a胚幹（ES）細胞系を用いてオステオレギュリン遺伝子座の遺伝子ターゲッティングを行なった（フーパー他、Nature、第326巻、292-295ページ、1987年）。多能性ES細胞を、幹細胞培地（SCML）内のマイトマイシンC処理した初期段階の胚繊維芽細胞（PEF）供給層の上で培養した。なおSCMLは、ES細胞専用の15％ウシ胎仔血清（ライフ・テクノロジーズ社、メリーランド州、カタログ番号LTI#10439-024番）、0.1mMの2-メルカプトエタノール（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州、#M-7522）、0.2mMのL-グルタミン（ライフ・テクノロジーズ社、カタログ番号LTI#25030-081番）、0.1mMの非必須アミノ酸MEM（ライフ・テクノロジーズ社、カタログ番号LTI#11140-050番）、1000u/mlの組み換えたネズミの白血病抑制因子（ESGRO、ライフ・テクノロジーズ社、カタログ番号LTI#13275-029番）、ペニシリン／ストレプトマイシン（ライフ・テクノロジーズ社、カタログ番号LTI#15140-122番）を補ったD-MEM（ライフ・テクノロジーズ社、ゲサーズバーグ、メリーランド州、カタログ番号LTI#10829-018番）からなる。
【０２１６】
SCML内の1×107個の細胞と、線状にした25μgのターゲッティング・ベクターとに対し、BTX Electro Cell Manipulator 600（BTX社、サン・ディエゴ、カリフォルニア州）を用い、電圧280ボルト、キャパシタンス50μf、抵抗360オームで電気穿孔を行なった。SCML内で電気穿孔を行なった24時間後、ポジティブ／ネガティブ選択を開始した。SCMLは、G418（ポジティブ）を200μg/mlと、ガンシクロビル（ネガティブ）を2μM含んでいた。選択を開始してから8〜10日後、耐性のあるコロニーをマイクロピペットで取り出した。耐性のあるES細胞コロニーの増殖とスクリーニングを、モーンとコラー（モーン、『DNAクローニング4』（ヘイムズ編）、143〜184ページ、オックスフォード大学出版、ニューヨーク、1995年）の記載に従って行なった。ネオマイシンとガンシクロビルに耐性のあるクローン70個のうち、4つが望む組み換え現象に関してプラスの反応であった。これは、ターゲッティングの頻度が17回に1回であることを意味する。
【０２１７】
注入用の細胞を、モーンとコラー（モーン、『DNAクローニング4』（ヘイムズ編）、143〜184ページ、オックスフォード大学出版、ニューヨーク、1995年）の記載に従って調製した。標的となるES細胞10〜15個をC57BL/6マウスの胚の胞胚腔に導入し、これらの胚をさらに偽妊娠代理母の中に導入して成長させた。表皮の色に基づきES細胞の寄与が90％を超えると判断したキメラを、C57BL/6マウスと交配した。突然変異の標的である領域のまさに3'末端と相同な850bpのSpe I／Msc Iプローブを用い、サザン・ブロット法により仔マウスの遺伝子型を調べた。DNAの尾部をBamH I／BgI Iで二重に切断すると、野生型の対立遺伝子には10kbのハイブリッド・バンドが現われ、標的とする対立遺伝子には9kbのハイブリッド・バンドが現われた。
【０２１８】
マウスの以下の組織からRNAを抽出した。用いた組織は、大動脈、頸骨（野生型、ノックアウト、ヘテロ接合）、生誕後14.5日の胚、脳、心臓、腸、腎臓、環状、肺、皮膚、脾臓、精巣である。Superscript II逆転写酵素とポリdT（12〜18）プライマー（ジブコ／BRL社）を用いてRNAをcDNAに変換した。PCR法で483bpの内在性cDNAを増幅した。その際、プライマーとして、
36499-143A：5'-ACTATCCACAAGTGGCCTCG-3'（配列番号31）と、
36499-143B：5'-CTGTTGGCTTGCTCAGTTCC-3'（配列番号32））を用いた。1％TAEアガロース・ゲル上でPCRの反応産物8μlを電気泳動にかけた。標準的なサザン・ブロット法に従い、DNAをNytranフィルターに移し、層状に架橋させた。次に、ノーザン・ブロットについて説明したのと同様にして、ブロットを、放射性標識した861bpのcDNAプローブとハイブリダイズさせた。
【０２１９】
ヘテロ接合のマウスを交配させることにより、野生型の仔、ヘテロ接合の突然変異体、ホモ接合の突然変異体が、メンデル比に従って生まれた。野生型マウス、ヘテロ接合マウス、ノックアウト・マウスの頸骨から抽出したmRNAに対してノーザン・ブロット法を行なったところ、ノックアウト・マウスではオステオレギュリンのメッセージがなく、ヘテロ接合マウスではオステオレギュリンの発現が低下していた。サザン・ブロット法により、オステオレギュリン遺伝子の破壊を確認した（Fig.15）。頸骨の切片に対する免疫組織化学により、野生型マウスの骨細胞の中にオステオレギュリン・タンパク質のあることが明らかになった。ホモ接合の突然変異体では、頸骨の切片にオステオレギュリン・タンパク質の反応はなかった。
【０２２０】
6．遺伝子改変マウスの表現型分析
オステオレギュリンの突然変異に関してヘテロ接合のマウスとホモ接合のマウスは仔を産むことができた。また、明らかに重大な異常は一般に見られなかった。オステオレギュリンの突然変異がマウスの骨の生理に影響を与えるかどうかを確認するため、年齢が4ヶ月と1年で性別、遺伝子型の異なる少なくとも12匹のマウスからなる複数のグループを調べ、DEXA、pQCT、組織構造計測によって骨のさまざまなパラメータを分析した。
【０２２１】
マウスを12時間明るく／12時間暗くするサイクルの環境に置き、食料と水を自由に摂らせた。殺す12日前に、蛍光色素カルセイン（シグマ・ケミカル社）を10mg/kgの割合で皮下注射した。殺す当日、マウスに麻酔をかけ、二重エネルギーＸ線吸収（DEXA）計でスキャンした。次に頸部をずらしてマウスを安楽死させ、後肢を取り除き、70％エタノールの中に入れた。これは、以下に説明する末梢定量的コンピュータ断層撮影（pQCT）と組織構造計測をあとで行なうためである。
【０２２２】
DEXA分析には、生きたマウスのＸ線画像から骨、脂肪、肉の重量を推定する操作が含まれる。マウスを安楽死させてから、囓歯類の体全体をスキャンするためのソフトウエア（ハギワラ他、Bone & Mineral、第22巻、57-68ページ、1993年）を備えたDEXA（Hologic 4500、ホロジック社、ベッドフォード、マサチューセッツ州）を用いてマウスの体全体をスキャンし、骨の面積、骨塩量、骨密度を測定した。スキャンする面積は15×8cmで、解像度は0.0254×0.0127cm、スキャン速度は7.25mm/秒であった。
【０２２３】
体全体にわたる骨の面積、骨塩量、骨塩密度を、野生型、ヘテロ接合の突然変異体、ホモ接合（ノックアウト）の突然変異体で比較すると、オステオレギュリン遺伝子の破壊によってヘテロ接合の突然変異体とホモ接合の突然変異体では骨が増加することがわかる（表2）。メスのマウスでは、骨の面積が、野生型と比べてヘテロ接合の場合には11％増加し、ホモ接合の場合には15％増加している。骨塩量の増加は、それぞれ14％と18％である。オスでは、これらパラメータの値が、やはりかなり増加している。年齢が1年のヘテロ接合マウスとノックアウト・マウスでは、骨梁骨でさらに大きな増加が見られた。
【０２２４】
【表３】
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【０２２５】
オステオレギュリンを破壊したマウスの骨のパラメータを調べることに加え、DEXAも利用して体脂肪の測定を行なった。メスのノックアウト・マウスとヘテロ接合マウスでは、野生型マウスと比較して、体重、脂肪量、体脂肪率が有意に増加していた（表３）。さらに、腸間膜、性腺、腎臓の脂肪塊を取り除き、それぞれの重量を測定した（表4）。メスのノックアウト・マウスとヘテロ接合マウスは、白色脂肪の重量が野生型マウスよりも有意に大きかった。これらのデータは、メスのマウスにおけるオステオレギュリンの突然変異が、軽度の肥満として現われることを示唆している可能性がある。
【０２２６】
【表４】
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【０２２７】
【表５】
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【０２２８】
野生型マウス、ヘテロ接合マウス、ノックアウト・マウスの近位頸骨の横断面の形をpQCTにより高解像度で測定した。骨密度は、過去の論文（バリカ他、J . of Bone & Mineral Research、第14巻、1067-1074ページ、1999年）に記載されているように、Stratec XCT 960 M（ノーランド・メディカル・システムズ社、フォート・アトキンソン、ウィスコンシン州）を用いて測定した。遠位大腿骨の骨幹端の末端部から3mmのところに位置する厚さ1mmのスライスをスキャンした。解析には、XMICEバージョン5.1というソフトウエア（ノーランド・メディカル・システムズ社、フォート・アトキンソン、ウィスコンシン州）を利用した。
【０２２９】
ホモ接合突然変異マウスは、メスもオスも、骨梁骨の量と密度が野生型マウスと比べて有意に大きかった。さらに、ヘテロ接合マウスのオスは、骨梁骨の量と密度が野生型よりも有意に大きかった。また、ヘテロ接合マウスとホモ接合マウスのオスは、皮質骨の面積、全骨量、骨の合計面積が、野生型よりも有意に増加していた（表5）。
【０２３０】
【表６】
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【０２３１】
オステオレギュリンが突然変異したマウスにおける骨梁骨の増加の特徴をさらに明確にするため、骨の切片の骨梁の形態を、以前に報告されているように骨の組織形態計測により調べた（シモンズ他、J. of Pharmacology & Experimental Therapeutics、第286巻、341-344ページ、1998年）。頸骨の骨幹端をカルセインで二重標識した切片の組織形態計測により、骨の組成が細胞レベル／ミクロ・レベルで測定できる。また、カルセイン二重標識により、2週間までの骨の成長量を測定できる。pQCT分析の後、水分を除去した近位頸骨をメチルメタクリレートの中に浸し、ライヘルト-ユング・ポリカットSミクロトーム（ライカ社、ディアフィールド、イリノイ州）を用いて4μmと10μmの細長い切片を作った。4μmの切片を、改良したマッソンのトリクローム染料で染色し、骨幹端の静的な組織形態パラメータを、コンピュータ支援画像解析システム（Bioquant II、Mバイオメトリックス社、ナッシュヴィル、テネシー州）を用いて測定した。骨梁骨の体積、骨梁骨の数と厚さ、破骨細胞の数など、骨に関するパラメータは、標準的な方法（パーフィット他、J . of Bone & Mineral Research、第2巻、595-610ページ、1987年）により決定した。標識限界の割合、ミネラルの付着成長速度、骨の形成速度／骨の体積は、染色していない10μmの切片上でカルセイン蛍光色素のシグナルを定量することによって決定した。
【０２３２】
年齢4ヶ月の時点では、メスのホモ接合マウスにおいて、野生型マウスと比べて骨梁骨の体積が50％多くなっていることが観察された（Fig.16）。オスでは、ホモ接合マウスのほうが野生型マウスよりも骨梁骨の体積が32％多い。オスのヘテロ接合マウスも、骨梁骨の体積が野生型マウスよりも有意に多いことがわかった。
【０２３３】
オステオレギュリン遺伝子を破壊した効果は、1年後のほうがより顕著であった。オスとメスのノックアウト・マウスにおいて、骨梁骨の体積が、野生型マウスと比べてそれぞれ2倍〜3倍多かった。骨梁骨の体積の増加は、骨梁の数と厚さの増加を反映していた（Fig.16）。
【０２３４】
ヘテロ接合マウスにおいて骨が増加するという表現型の効果が見られることは、特に注目するに値する。これは、対立遺伝子の一方が失われ、その結果として遺伝子の発現が低下すると、表現型の効果が骨に有意な形で現われることを示している。もう1つ注目すべき点は、ヘテロ接合マウスもノックアウト・マウスも、野生型マウスと比べると、老化と関連した骨の損失が少ないように見えたことである。年齢が1年のオスとメスのグループは、対応する4ヶ月の個体と比べると、骨梁の体積がそれぞれ約40％と約70％少なかった。それに対してオスのノックアウト・マウスは、年齢が1年の時点で骨梁骨の損失はなく、メスのノックアウト・マウスは、年齢が1年の時点で骨梁骨がほんの15％減少していただけであった（Fig.16）。したがって、オステオレギュリンの発現が低下し、その結果としてオステオレギュリンの活性が低下すると、老化と関連した骨の損失が起こらないよう保護されることになる。
【０２３５】
ヘテロ接合マウスとノックアウト・マウスにおいて観察された骨梁骨の体積の純増分は、理論上は以下のいずれかの原因によって生じた可能性がある。すなわち、1）破骨細胞による骨吸収の減少、2）骨芽細胞を介した骨の形成の増加、3）骨芽細胞と破骨細胞の効果の組み合わせ、のいずれかである。組織形態計測の結果、破骨細胞の数または面積には有意な差がないことが明らかになった。カルセインで二重標識した骨を用いた動的な組織形態学的計測によって標識後10日間までの骨の形成速度を測定した結果によると、ミネラルの付着成長速度に差は見られなかった。年齢が1年のオスとメスのマウスにおいて、骨の単位体積あたりの骨形成速度が統計学的に有意に増加したことが観察された。しかし、突然変異マウスのほうにより多量に存在している骨梁骨で規格化すると、骨の単位面積あたりの骨形成速度に差はなかった。したがって、組織形態計測の結果からは、オステオレギュリンの除去による骨の増加が、骨芽細胞の効果なのか、破骨細胞の効果なのか、それともそれらの何らかの組み合わせの効果なのかは明らかにならなかった。
【０２３６】
7．生体外（exvivo）培養
ヘテロ接合マウスとノックアウト・マウスにおいて骨梁骨の体積が増加したことの裏にある細胞メカニズムをさらに調べるため、野生型マウスと突然変異マウスに由来する培養物のインビトロでの石灰化力と破骨能力を調べた。3つの遺伝子型すべてから抽出した骨髄細胞の初代培養物を、アスコルビン酸塩とβ-グリセロリン酸塩の存在下で成長させて骨芽細胞の分化を誘起し、骨の小節の形成を促進した。3週間成長させた後、石灰化をフォン・コッサ染色により検出し、画像解析によって石灰化の量を測定した。ヘテロ接合マウスとノックアウト・マウスに由来する培養物は、野生型マウスの骨髄からの培養物よりも骨の小節が有意に多かった。これは、分析した前者の骨髄に、骨芽細胞前躯体がより多く含まれていることを示している。さらに、小節あたりの石灰化面積は、ノックアウト・マウスに由来する培養物で増加していた（Fig.17A）。年齢が3日のマウスの頭蓋冠に由来する第2の培養系でも似たような結果が得られた。骨芽細胞がより豊富に含まれているこの系では、ノックアウト・マウスの頭蓋冠培養物が、石灰化した基質を60％多く生産したことが、可溶化したアリザリン・レッド染料の量を測定することによって、明らかになった（Fig.17B）。さらに、ノックアウト・マウスからの骨芽細胞は、生誕後わずか3日の時点ですでに石灰化能力が増大していることをこの実験は示していた。
【０２３７】
骨の表現型の増大に破骨細胞の形成または活性不足が寄与したかどうかを確かめるため、破骨細胞の活動を促進する条件下で、野生型マウス、ヘテロ接合マウス、ノックアウト・マウスの骨髄を培養した。骨髄培養物が酒石酸塩耐性アルカリホスファターゼ（TRAP）に対してポジティブな多核細胞を形成する能力は、低下していなかった（Fig.17C）。実際、ノックアウト・マウスとヘテロ接合マウスの骨髄培養物は、野生型マウスに由来する培養物よりも、TRAPに対してポジティブな多核細胞の数が多い傾向があった。
【０２３８】
2週間という標識期間の間は、ミネラルの付着成長速度または骨の形成速度に違いは見られなかった。これは、突然変異マウスにおいて骨の体積増加へとつながる現象が、標識期間の前に起こったことを示しているように思われる。
【０２３９】
8．統計的方法
インビボでのパラメータの統計的有意性は、スチューデントの両側t検定により判断した。
【０２４０】
ヒトのオステオレギュリン
1．単離
ヒトのオステオレギュリンの2つのスプライス変異体を同定した。一方の変異体の核酸配列とアミノ酸配列を、それぞれFig.3A（配列番号5）とFig.3B（配列番号6）に示す。他方の変異体の核酸配列とアミノ酸配列は、それぞれFig.4A（配列番号7）とFig.4B（配列番号8）に示してある。Ｎ-末端シグナル配列を欠く上記２つのポリペプチド変異体は、それぞれ、Fig.21A（配列番号34）とFig.21B（配列番号46）に示され、そして配列番号33と配列番号45の核酸配列によりコードされる。ヒトのオステオレギュリンを同定する第1のステップは、配列番号1に示したラットのcDNAプローブをヒトのゲノムDNAにハイブリダイズさせることだった。ラットのcDNAプローブは、32P-CTPで標識した（Prime-It（登録商標）IIランダム・プライマー標識キット、カタログ番号300385番、ストラタジーン社、ラ・ジョラ、カリフォルニア州）。ヒト、ラット、マウスのゲノムDNA（10μg）（それぞれカタログ番号6550-1番、6750-1番、6650-1番、クロンテック社、パロ・アルト、カリフォルニア州）を、制限酵素EcoR IまたはPST I（ニュー・イングランド・バイオラブズ社、ベヴァリー、マサチューセッツ州）のいずれかで37℃にて一晩かけて切断させた。次に、切断されたDNAのサンプルを、0.8％アガロース／1％TAEゲルで35Vにて一晩電気泳動にかけて分離した。そのゲルを“溶液A”（1.5MのNaCl、500mMのNaOH）の中で2回にわたり30分間洗浄して変性させ、次に、“溶液B”（1Mの酢酸アンモニウム、200mMのNaOH）の中で中和した。次に、ゲル中のDNAを、溶液Bを用いて毛管現象により一晩かけてHybond Nナイロン膜（カタログ番号RPN303N、アマーシャム・ファルマシア・バイオテック社、バッカムシャー、イギリス）に移した。次に、Stratalinker（“自動架橋”セット、ストラタジーン社）を用いてDNAを膜と架橋させた。ハイブリダイゼーションは、ローラー・ボトルに入れた10mlの標準的な溶液（Quickhybe（登録商標）溶液、カタログ番号201221番、ストラタジーン社）の中で60℃にて1時間行なわせた。膜を包装用ラップで包み、2日間にわたりＸ線フィルムに当てた。そのフィルムから、ラットのプローブが単一のヒト遺伝子とハイブリダイズしたことが明らかになった（Fig.18）。
【０２４１】
次に、ラットのオステオレギュリンcDNAプローブを用いてヒト・ゲノムBACライブラリー（ジェノム・システムズ社、パロ・アルト、カリフォルニア州）をスクリーニングした。BACクローンDNA（2.5μg）とラットのゲノムDNA（10μg）のサンプルを、Bam HI、Eco RI、Eco RV、Hind III、Pst I、Spe Iを用いて切断し、次に、それらサンプルに対して上記のようにして電気泳動をかけ、プローブのハイブリダイゼーションを行なわせた。ハイブリダイゼーションの結果をFig.19に示す。Hind IIIヒトBACクローン・ライブラリーのハイブリッド断片は、ヒトのゲノムDNAサンプル中のハイブリッド断片と同じサイズであった。
【０２４２】
BACクローン22725のHind IIIハイブリッド断片を1.5％低溶融アガロース／TAEゲルで電気泳動にかけ、LiClで精製して2-3kbの断片を分離した。分離されたその挿入DNAをpBluescript（カタログ番号212205番、ストラタジーン社）にクローニングし、Hind IIIで切断し、リン酸塩で処理した。一晩かけてT4 DNAリガーゼ（クロンテック社）による処理を行なった後、連結反応用サンプル1μmを用いてDh5-αコンピテント大腸菌細胞（ジブコ／BRL社）を形質転換した。形質転換されたコロニーは白色で、AMP耐性であった。そのコロニーを選び出して5mlを一晩培養し、これら細胞から抽出したDNAを精製した（Quiagen Robot（登録商標）miniprep、キアジェン社、ヴァレンシア、カリフォルニア州）。次に、すでに説明したのと同様にして、クローンをHind IIIで切断し、1％アガロース／TAEゲルで電気泳動にかけ、ナイロンに移し、ラットの全長cDNAプローブとハイブリダイズさせた。このハイブリダイゼーションの結果をFig.20に示す。クローン2、4、6、12を選び出してその配列を分析した（ジェノム・システムズ社）。その結果、これらクローンが、配列番号33（Fig.21A）で表わされるオステオレギュリンのcDNA断片であることがわかった。このcDNA断片は、分泌シグナル配列の欠けた配列番号34（Fig.21B、配列番号6のアミノ酸38-525と同じ）のオステオレギュリン・ポリペプチドをコードしている。
【０２４３】
配列番号5と配列番号7のヒトのオステオレギュリン配列の全長は、BACクローンのヒト配列（配列番号9）を用いてBLAST検索を行なうことによりセレラ・データベースのコンピュータを利用した解析によって決定した。同定されたヒト配列（セレラ・クローン・コンティグ│41787504）を、ジーンワイズ・プログラムを用いてマウスのオステオレギュリン配列（配列番号3）と比較した。この比較により、同定されたゲノム配列が、BACクローンと同じヒト配列をコードしていて、付加された上流コード・エキソンも含んでいることが確認された。
【０２４４】
MEGALIGN（登録商標）プログラム（ディーエヌエースター社、マディソン、ウィスコンシン州）を用いてセレラ・ゲノム配列の逆相補体とマウスのオステオレギュリンのcDNA配列（配列番号3）のアラインメントを行なった結果、これら配列の5'末端非翻訳領域に相同な部分のあることがわかった。マウスのcDNA配列とヒト・ゲノム配列で行なったアラインメントの結果に基づいてPCRプライマーを設計し、ヒトcDNA配列の5'末端を増幅した。3'プライマーは、BACクローンの3'末端エキソンに基づいて設計した。ヒト骨芽細胞SaOSから抽出したRNAの全量を逆転写した。その際、SuperScript（登録商標）を、製造メーカーが勧めるプロトコル（ジブコ／BRL社、ゲサーズバーグ、メリーランド州）に従って用いた。ハイファイPCR（ベーリンガー・マンハイム社）の第1ラウンドを、プライマーのペア、CAAACTTTAATTTCAGCAAA（配列番号35）／GCGCCATATTCTTCTTGGTC（配列番号36）を用いて行なった。第1ラウンドのPCR産物（0.001μl）をテンプレートとして用い、第2ラウンドのPCRを行なった。その際に用いたプライマーのペアは、CTTTAAATTTCAGCAAAATGCCC（配列番号37）／CATCCTCAGGCCATTGTGAG（配列番号38）である。その結果得られた433bpの産物をTAクローニング・ベクター（クロンテック社）にサブクローニングし、次いで、この産物の配列を決定した。その配列は、エキソン4から先が重なっていることがわかったため、全配列をコンパイルすることができた（配列番号5と7）。プライマーのペアGCCATGCGAGTTTTCTGTGTGGG（配列番号39）／TGGTGGACTAGTCACCATCG（配列番号40）を用いてPCR法で増幅することにより、この配列のコード領域を確認した。配列を解析したところ、2つのスプライス変異体cDNA（配列番号5と7）と、これら核酸配列によってコードされている2つのポリペプチド（配列番号6と8）が明らかになった。その配列が、Fig.3A、Fig.3B、Fig.4A、Fig.4Bに示してある。配列番号6と8に示すオステオレギュリン・ポリペプチドのための疎水リーダー配列は、アミノ酸1〜37を欠く。これらのリーダー配列を欠いたオステオレギュリンのためのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号34と配列番号46に示す（これらは、それぞれ、配列番号33と配列番号45によりコードされる）。
【０２４５】
2．キャラクテリゼーション
MegAlign（ディーエヌエースター社）を利用したクラスター分析またはワン・ペア分析により、配列番号6に示したヒトのオステオレギュリン配列をラットおよびマウスのオステオレギュリン配列とアラインメントした。次に、Fig.5に示したように、配列を手作業で解析した。クラスター分析によると、配列番号6で表わされるヒトのオステオレギュリン配列は、マウスのオステオレギュリン配列と44.6％が一致し、ラットのオステオレギュリン配列とは44.7％が一致していた。このポリペプチドの全長にわたって相同性が保存されていた。セリンを豊富に含む尾部とRGDモチーフは、ラットやマウスと同様、ヒトのオステオレギュリンにおいても保存されていた。
【０２４６】
ヒトのオステオレギュリン遺伝子のゲノム構造を表6に示す。
【０２４７】
【表７】
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【０２４８】
ヒトのオステオレギュリン遺伝子が染色体上でどこに存在しているかを、BACクローン22725（ジェノム・システムズ社）のFISH分析によって調べたところ、第4染色体のq22バンドに位置していることがわかった。
【０２４９】
クローン22725から精製したDNAをニック・トランスレーションによってジゴキシゲニンdUTPで標識した。標識したプローブは、切断されたヒトDNAと結合させ、50％ホルムアルデヒド、10％硫酸デキストラン、2×SSCを含む溶液中で、PHAによって刺激された末梢血リンパ球由来の中期染色体とハイブリダイズさせた。ハイブリッドが形成されたスライドをフルオレセインで標識した抗ジゴキシゲニン抗体の中で培養し、続いて一色実験のためにDAPIで対比染色すると、特異的なハイブリダイゼーション・シグナルが検出された。二色実験のための検出用プローブは、スライドをフルオレセインで標識した抗ジゴキシゲニン抗体とアビジン・テキサス・レッドの中で培養し、続けてDAPIで対比染色することによって作ることができる。最初の実験により、グループBの染色体の長腕が特異的に標識された。この染色体は、サイズ、形態、バンドのパターンに基づき、第4染色体である判断した。第2の実験では、ビオチンで標識したプローブを、クローン22725とハイブリダイズさせた。このプローブは、第4染色体のセントロメアに対する特異性を有する。この実験により特異的な標識がなされ、第4染色体のセントロメアは赤色に、長腕は緑色になった。特異的に染色された10本の第4染色体を測定したところ、クローン22725は、第4染色体の長腕qの中で、セントロメアからテロメアに向かって距離が28％のところに位置していることがわかった。そこは、第4染色体のq22バンドに対応する領域である（Cytogenet. Cell Genet.、第65巻、206-219ページ、1994年）。中期の細胞を合計で80個分析したところ、73個が特異的に標識された。
【０２５０】
3．組織分布
オステオレギュリンの発現をノーザン・ブロット法で分析したところ、Fig.22に示したように、脳、骨髄、胎盤において発現していることがわかった。オステオレギュリンのmRNAが見られなかった組織としては、前立腺、精巣、卵巣が挙げられる。ヒトのMTNノーザン・ブロットは、市販品を入手した（カタログ番号7780-1番、7759-1番、7757-1番、クロンテック社、パロ・アルト、カリフォルニア州）。上記のようにQuickhybe（登録商標）（ストラタジーン社、ラ・ジョラ、カリフォルニア州）の中で、SaOS細胞系のcDNAから増幅したヒト・オステオレギュリンのエキソン4に対するプローブを68℃にて1時間にわたって膜とハイブリダイズさせ、サザン・ブロット法を実施した。ブロットを2×SSC／0.1％SNDで室温と60℃にて洗浄し、1週間フィルムに当てた。
【０２５１】
逆転写PCR法を行なった後、PCR産物をサザン・ブロット法で分析したところ、ヒトのオステオレギュリンが、脳、ヒトの骨細胞系SaOS、胎盤、副腎、卵巣、末梢血リンパ球、骨髄、胎児の脳で発現していることがわかった。その様子をFig.23に示す。オステオレギュリンの発現を、ヒトの24種類の組織について、rtPCRによってスクリーニングした。その際、Origene Rapid-Scan（登録商標）ヒトcDNAパネル（カタログ番号HSCA-101、オリジーン・テクノロジーズ社、ロックヴィル、メリーランド州）に含まれるcDNAと、ヒトの骨細胞系SaOSから調製したcDNAを利用した。プライマー（5'-AGATGCTGTTGATGTCAGCC-3'）（配列番号41）と、（5'-AAGACCACGAGAAGGAATGG-3'）（配列番号42）を用い、115bpの産物を増幅した。すでに説明したのと同様にして、そのPCR産物20μlを1％アガロース／TAEゲルで電気泳動にかけ、膜に移し、同じプライマーのペアを用いてヒトの骨細胞系SaOSから作ったプローブとハイブリダイズさせた。
【図面の簡単な説明】
【０２５２】
【図１】Fig.1Aは、ラットのオステオレギュリンをコードしているヌクレオチド配列（配列番号1）である。
【図２】Fig.1Bは、そこから予想されるアミノ酸配列（配列番号2）を示す。シグナル配列には下線を引いた。
【図３】Fig.2Aは、マウスのオステオレギュリンをコードしているヌクレオチド配列（配列番号3）である。
【図４】Fig.2Bは、そこから予想されるアミノ酸配列（配列番号4）である。
【図５】Fig.3Aは、ヒトのオステオレギュリンをコードしているヌクレオチド配列（配列番号5）である。
【図６】Fig.3Bは、そこから予想されるアミノ酸配列（配列番号6）である。
【図７】Fig.4Aは、ヒトのオステオレギュリンをコードしている別のヌクレオチド配列（配列番号7）である。
【図８】Fig.4Bは、そこから予想されるアミノ酸配列（配列番号8）である。
【図９】Fig.5は、ラット、マウス、ヒトのオステオレギュリン・ポリペプチドをアラインメントした図である。保存されているRGDモチーフに下線を引いた。
【図１０】Fig.6は、ラットの骨髄細胞培養物がデキサメタゾン処理によって骨芽細胞に分化していく間にオステオレギュリンのmRNAが増加したことを示すノーザン・ブロットである。対照から、あるいはデキサメタゾン処理したラットの骨髄細胞培養物から合計20μgのRNAを抽出し、図に示した日数のときにノーザン・ブロット法で分析した。フィルターに対しては、プローブとして、順番に、アルカリ・ホスファターゼ（AP）、骨のシアロタンパク質（BSP）、オステオカルシン（Oc）、オステオネクチン（On）、オステオポンチン（Op）、対照である18S rRNA（18S）を用いた。
【図１１】Fig.7Aは、カイト-ドゥーリットル・アルゴリズムに従ってラットのオステオレギュリン・ポリペプチドのヒドロパシー指数を計算した結果をプロットした図である。この図は、疎水性リーダー配列が、予想されるアミノ酸配列のアミノ末端にあることを示唆している。
【図１２】Fig.7Bは、アラニン16とアラニン17の間でこのタンパク質を分解した後に予想される、オステオレギュリン・ポリペプチドのアミノ酸組成を示す。
【図１３】Fig.8は、ラットのオステオレギュリンのアミノ酸配列と、歯の象牙質および骨基質タンパク質Dmp1/Ag1とのアラインメントを示している。両者の間には、わずかに相同性が見られる。この図は、ラットのオステオレギュリンの一次アミノ酸配列を、ラットのDmp（配列番号43）の最初から447番目までのアミノ酸とアラインメントしたものである。
【図１４】Fig.9は、ラットの骨組織におけるオステオレギュリンmRNAの非常に特異的な発現パターンを示している。Fig.9(A)は、いろいろな組織から抽出した2μgのポリA＋RNAに対するノーザン・ブロットである。レーン1は心臓；レーン2は脳；レーン3は脾臓；レーン4は肺；レーン5は肝臓；レーン6は骨格筋；レーン7は腎臓；レーン8は精巣のノーザン・ブロットである。このブロットでは、プローブとして、オステオレギュリンcDNAの後、対照としてアクチンを用いた。Fig.9(B)は、いろいろな組織から抽出した合計20μgのRNAに対するノーザン・ブロットである。レーン9は脳下垂体；レーン10は脛骨の骨幹；レーン11は子宮；レーン12は髄；レーン13は脛骨の骨幹端；レーン14は腸；レーン15は大動脈；レーン16はRBMC＋賦形薬；レーン17はRBMC＋デキサメタゾン；レーン18は褐色脂肪；レーン19は白色脂肪のノーザン・ブロットである。フィルターに対し、プローブとして、オステオレギュリンの後、対照である18Sを用いた。
【図１５】Fig.10は、ラットの脛骨の骨幹、骨幹端、成長板においてオステオレギュリンのmRNAが大量に発現している様子を示す。これは、いろいろな骨組織から抽出した合計20μgのRNAに対するノーザン・ブロットである。レーン1は髄；レーン2は骨膜；レーン3は脛骨の骨幹；レーン4は脛骨の骨幹端；レーン5は大腿骨頸部；レーン6は成長板；レーン7は頭蓋冠のノーザン・ブロットである。このブロットでは、プローブとして、順番に、オステオレギュリン（OR）、アルカリ・ホスファターゼ（AP）、骨のシアロタンパク質（BSP）、オステオカルシン（Oc）、オステオネクチン（On）、オステオポンチン（Op）、酒石酸塩耐性アルカリ・ホスファターゼ（TRAP）、内部対照としての18S rRNA（18S）を用いた。
【図１６】Fig.11は、不死化した骨芽細胞系において発現したオステオレギュリンのノーザン・ブロットである。UMR106細胞とROS17/2.8細胞から抽出した合計20μgのRNAについて調べた。レーン1は時刻0；レーン2は賦形薬で1日間処理；レーン3はデキサメタゾンで1日間処理；レーン4は10nMのデキサメタゾンと50μg/mlのアスコルビン酸で1日処理；レーン5は賦形薬で14日間処理；レーン6は10nMのデキサメタゾンで14日間処理；レーン7は10nMのデキサメタゾンと50μg/mlのアスコルビン酸で14日処理したものである。同じフィルターに対し、プローブとして、順番に、オステオレギュリンと内部対照としての18S rRNAを用いた。
【図１７】Fig.12は、UMR106細胞内ではオステオレギュリンのmRNAの誘導がオステオカルシンのmRNAの誘導とは異なることを示すノーザン・ブロットである。UMR106細胞から抽出した合計20μgのRNAについて調べた。レーン1は10nMのデキサメタゾンで2日間処理；レーン2は10nMのデキサメタゾンで3日間処理；レーン3は10nMのデキサメタゾンで10日間処理；レーン4は賦形薬で14日間処理；レーン5は50μg/mlアスコルビン酸で14日処理；レーン6は10nMのデキサメタゾンで14日間処理；レーン7は10mMのBGPで14日間処理；レーン8は10nMのデキサメタゾンと50μg/mlのアスコルビン酸で14日処理；レーン9は、10nMのデキサメタゾン、10mMのBGP、50μg/mlのアスコルビン酸で14日処理し、図に示したメッセージを得た。図中の記号は、アルカリ・ホスファターゼ（AP）、オステオカルシン（Oc）、オステオネクチン（On）、オステオポンチン（Op）、内部対照としての18S rRNA（18S）である。
【図１８】Fig.13Aは、マウスのさまざまな組織において発現しているオステオレギュリンのノーザン・ブロットであり、オステオレギュリン遺伝子が骨に特異的に発現していることを示している。
【図１９】Fig.13B（上の図）は、オステオレギュリン特異的なプライマーを用いてマウスのさまざまな組織の逆転写（RT）-PCR産物にハイブリダイゼーションさせた結果を示すサザン・ブロットである。オステオレギュリンのメッセージが、骨だけでなく、胚、精巣、褐色脂肪、白色脂肪、大動脈においても低レベルであるが検出される。下の図は、各RNAサンプルに対し、アクチンをプライマーとした場合のRT-PCR産物についての結果を示している。
【図２０】Fig.14は、ネズミのオステオレギュリン遺伝子を標的として破壊するための遺伝子の編成と戦略を示している。マウスのオステオレギュリン遺伝子のエキソンのサイズとイントロン／エキソンの境界が図示されている。オステオレギュリン遺伝子座を有するターゲッティング・ベクターを組み換えると、最大の第3エキソンが、ネオマイシン選択マーカー遺伝子と置き換わる。ターゲッティングが成功したかどうかは、外来性プローブ（プローブ1）と内在性プローブ（プローブ2）の両方を用いて検出した。図中の記号は、X=Xba I、Bg=BgI I、Sp=Spe I、M=Msc I、B=Bam HIである。
【図２１】Fig.15Aは、標的であるマウスのオステオレギュリン遺伝子座が破壊されたことを確認するためのDNA尾部のサザン・ブロットである。DNA尾部は、Bam HIとBgI Iで切断され、プローブ2とハイブリダイズした。10kbのバンドが、野生型対立遺伝子の位置に検出され、9kbのバンドが、標的とした対立遺伝子の位置に検出される。Fig.15Bは、野生型マウス、ヘテロ接合マウス、ノックアウト・マウスの骨から抽出したRNAのRT-PCR産物にハイブリダイゼーションさせた結果を示すサザン・ブロットである。ヘテロ接合マウスのレーンではメッセージが減少し、ノックアウト・マウスのレーンにはメッセージがないことに注意されたい。
【図２２】Fig.16は、年齢が4ヶ月と1年のマウスの骨の表現型に現われたオステオレギュリン遺伝子破壊の効果を組織形態計測によって定量化したグラフである（*=p<0.05）。図中の記号は、野生型（WT）、ヘテロ接合（Het）、ホモ接合またはノックアウト（KO）である。
【図２３】Fig.16の続きである。
【図２４】Fig.17Aは、骨髄の初代培養物をフォン・コッサ染色することにより、石灰化した小節の量を測定したグラフである。
【図２５】Fig.17Bは、頭蓋冠の初代培養物をアリザリン・レッドで染色した場合のグラフである。Fig.17Cは、骨髄培養物を酒石酸塩耐性アルカリ・ホスファターゼ（TRAP）で細胞化学的に染色することにより、破骨細胞の新生量を測定したグラフである。TRAPに対してポジティブで3つ以上の不連続な核を持つ細胞を数えた（*=p<0.05）。
【図２６】Fig.18は、ラットのオステオレギュリン・プローブがヒトの遺伝子DNAとハイブリダイズしていることを示すサザン・ブロットである。図中の記号は、マウス（M）、ラット（R）、ヒト（H）である。
【図２７】Fig.19は、ラットのcDNAがヒトBACクローン33735(B)とハイブリダイズしていることを示すサザン・ブロットである。
【図２８】Fig.20は、ハイブリッドを形成しているヒトBACクローン22725からのHind III断片のサブクローニングの詳細を示すサザン・ブロットである。クローン2、4、6、12には目的とする挿入物が含まれていると判断し、それらクローンの配列を分析した。
【図２９】Fig.21Aは、Ｎ-末端シグナル配列を欠くヒトのオステオレギュリンをコードしている核酸配列である（配列番号34）を示す。
【図３０】Fig.21Bは、N末端のシグナル配列が欠く第2のヒトオステオレギュリン・ポリペプチドのためのアミノ酸配列（配列番号46）を示す。このアミノ酸配列番号45によりコードされる。
【図３１】Fig.22は、ヒトのオステオレギュリンの発現が組織ごとにどのように異なるかを示すノーザン・ブロットである。他の組織については示していないが、前立腺、精巣、卵巣を含め、オステオレギュリンは発現していなかった。
【図３２】Fig.23は、オステオレギュリンの組織ごとの発現をRT-PCR産物のサザン・ブロットとして示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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