(57)【要約】      （修正有）【課題】免疫応答を正又は負に調節する新規な免疫受容体タンパク質、及び該タンパク質をコードする遺伝子の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ細胞の免疫応答を抑制させる機能を有するタンパク質；特定のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ細胞の免疫応答を活性化させる機能を有するタンパク質；前記タンパク質をコードする遺伝子。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示す免疫受容体タンパク質。
（ａ）  配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）  配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ細胞の免疫応答を抑制させる機能を有するタンパク質
【請求項２】
以下の（ｃ）又は（ｄ）に示す免疫受容体タンパク質。
（ｃ）  配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｄ）  配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ細胞の免疫応答を活性化させる機能を有するタンパク質
【請求項３】
請求項１又は２に記載の免疫受容体タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）  配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）  配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞の免疫応答を抑制させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項５】
以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡからなる遺伝子。
（ｃ）  配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）  配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞の免疫応答を活性化させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項６】
請求項４又は５に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項７】
請求項４又は５に記載の遺伝子により形質転換された形質転換体。
【請求項８】
請求項７に記載の形質転換体を培地に培養し、得られる培養物から免疫受容体タンパク質を採取することを特徴とする、請求項１又は２に記載の免疫受容体タンパク質の製造方法。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の免疫受容体タンパク質のいずれか一方、又はその両方を認識する抗体。
【請求項１０】
ＩＴＩＭモチーフを有する抑制性免疫受容体の細胞外保存領域をコードする遺伝子をプローブとして用いて対となる活性化免疫受容体遺伝子を単離する方法。
【請求項１１】
ＩＴＡＭモチーフを有する活性化免疫受容体の細胞外保存領域をコードする遺伝子をプローブとして用いて対となる抑制性免疫受容体遺伝子を単離する方法。
【請求項１２】
請求項１又は２に記載の免疫受容体タンパク質、又は該タンパク質を発現する細胞若しくは細胞膜をリガンドが含まれることが予想される被験物質に作用させ、該免疫受容体タンパク質に対して親和性のある物質を選択することを特徴とする、該免疫受容体タンパク質に対するリガンドのスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法により得られる請求項１又は２に記載の免疫受容体タンパク質に対するリガンド。
【請求項１４】
（ａ）請求項１又は２に記載の免疫受容体タンパク質を該免疫受容体タンパク質に対するリガンドに被験物質の非存在下において作用させた場合と、（ｂ）請求項１又は２に記載の免疫受容体タンパク質を該免疫受容体タンパク質に対するリガンドに被験物質の存在下において作用させた場合とを比較し、該免疫受容体タンパク質と該リガンドの結合に対して影響を与える物質を選択することを特徴とする、該免疫受容体タンパク質に対するアンタゴニスト又はアゴニストのスクリーニング方法。
【請求項１５】
請求項１又は２に記載の免疫受容体タンパク質を含むことを特徴とする、該免疫受容体タンパク質に対するアンタゴニスト又はアゴニストのスクリーニング用キット。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法、又は請求項１５に記載のキットを用いて得られる、請求項１又は２に記載の免疫受容体タンパク質に対するアンタゴニスト又はアゴニスト。
【請求項１７】
請求項１若しくは２に記載の免疫受容体タンパク質、又は該タンパク質をコードする遺伝子を有効成分として含む免疫機能制御用医薬。
【請求項１８】
請求項１若しくは２に記載の免疫受容体タンパク質に対するリガンド、又は請求項１若しくは２に記載の免疫受容体タンパク質に対するアンタゴニスト若しくはアゴニストを有効成分として含む免疫機能制御用医薬。
【請求項１９】
請求項９に記載の抗体を含む請求項１又は２に記載の免疫受容体タンパク質の検出用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な免疫受容体タンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、及び該タンパク質の製造方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫反応は活性化及び抑制性の細胞膜受容体からの正と負のシグナルのバランスにより制御を受けている。リンパ球や骨髄球系細胞などの免疫細胞の活性化は、活性化レセプターである細胞膜受容体がそのリガンドを認識し結合することによって、細胞膜受容体自身やその受容体に会合するアダプター分子の細胞内領域に存在する免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ：ＩＴＡＭ）  と呼ばれるＹ−ｘ−ｘ−Ｌ−ｘ（６−８）−Ｙ−ｘ−ｘ−Ｌ（ｘは任意のアミノ酸）から成る特徴的な配列のチロシンがリン酸化されることにより開始される（非特許文献１、非特許文献２参照）。一方、この活性化した免疫細胞は、抑制性レセプターである細胞膜受容体分子がリガンドと結合することによって細胞内領域に存在する免疫受容体チロシンベース抑制性モチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｍｏｔｉｆ：ＩＴＩＭ）と呼ばれる  （Ｉ／Ｖ／Ｌ／Ｓ）−ｘ−Ｙ−ｘ−ｘ−（Ｌ／Ｖ）（ｘは任意のアミノ酸を示す）から成る特徴的配列のチロシンが脱リン酸酵素を介して抑制的に制御されることがわかってきた（非特許文献１、非特許文献３参照）。
【０００３】
活性化受容体及び抑制性受容体は、▲１▼いずれも細胞外領域が高度に保存されていること、▲２▼活性化受容体はその細胞内領域に活性化モチーフＩＴＡＭがあるか、あるいは膜貫通領域にＦｃεＲＩγ又はＤＡＰ１２のようなＩＴＡＭをもつアダプター分子と会合するための荷電アミノ酸を持っていること、▲４▼抑制性受容体は細胞内領域に抑制性モチーフＩＴＩＭを有していること、▲５▼活性化受容体は抑制性受容体に比べて細胞内領域が短いこと、が特徴として挙げられる。また、活性化受容体の多くは、抑制性受容体と対（ペア）をなしており、その両方の遺伝子が染色体上の小さなクラスターに位置していることも明らかにされている（非特許文献４参照）。活性化受容体と抑制性受容体の両方を含む遺伝子ファミリー群としては、例えば、ＭＨＣクラスＩリガンドを認識するＮＫ抑制性受容体ファミリーであるＫＩＲ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２、及びＬｙ４９が知られている  （非特許文献５参照）。またＴ細胞上に発現するＣＤ２８及びＣＴＬＡ４は同じリガンド（例えば、ＣＤ８０及びＣＤ８６）に結合し、それぞれ相反する正及び負のシグナルを送達する（非特許文献６参照）。同様に、Ｂ細胞及び／又は骨髄球系細胞は、ヒト及びマウスＦｃγ受容体（非特許文献７、非特許文献８参照）、マウスペア免疫グロブリン（Ｉｇ）様受容体（ＰＩＲ）（非特許文献９、非特許文献１０参照）とそのヒトホモログＩｇ様転写物（ＩＬＴ；ＣＤ８５）（非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３参照）、及びシグナル制御タンパク質（ＳＩＲＰ）（非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６参照）などのペア受容体ファミリーを発現する。
【０００４】
これらのファミリー分子群は細胞外領域構造が極めて保存されているため、しばしば共通の、あるいは類似のリガンドを認識するが、その結果しての免疫細胞の反応は正（活性化）と負（抑制性）のまったく相反したものとなる。このようにまったく相反する免疫応答を誘導する現象の免疫学的意義は極めて興味深く、正と負のシグナルが生体内でどのように総合化され統御されているのかを解明することは免疫系の理解にとって非常に重要であると考えられる。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｌａｎｉｅｒ，  Ｌ．Ｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １３，  ３２６−３３１，  ２００１
【非特許文献２】
Ｂｏｌｌａｎｄ，  Ｓ．，  Ｒａｖｅｔｃｈ，  Ｊ．Ｖ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ７２，  １４９−１７７，  １９９８
【非特許文献３】
Ｒａｖｅｔｃｈ，  Ｊ．Ｖ．，  Ｌａｎｉｅｒ，  Ｌ．Ｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９０，  ８４−８９，  ２０００
【非特許文献４】
Ｍａｒｔｉｎ，  Ａ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ２３，  ８１−８，  ２００２）
【非特許文献５】
Ｌａｎｉｅｒ，  Ｌ．Ｌ．，  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １６，  ３５９−９３，  １９９８
【非特許文献６】
Ｃｈａｍｂｅｒｓ，  Ｃ．Ａ．  ＆  Ｊ．Ｐ．  Ａｌｌｉｓｏｎ，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，  １１，  ２０３−２１０，  １９９９
【非特許文献７】
Ｒａｖｅｔｃｈ，  Ｊ．Ｖ．  ＆  Ｒ．Ａ．  Ｃｌｙｎｅｓ，  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １６，  ４２１−３２，  １９９８
【非特許文献８】
Ｄａｅｒｏｎ，  Ｍ．，  Ａｎｎｕｒ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １５，  ２０３−３４，  １９９７
【非特許文献９】
Ｋｕｂａｇａｗａ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，  ＵＳＡ，  ９４，  ５２６１−５２６６，  １９９７
【非特許文献１０】
Ｈａｙａｍｉ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２７２，  ７３２０−７３２７，  １９９７
【非特許文献１１】
Ｓａｍａｒｉｄｉｓ，  Ｊ．  ＆  Ｍ．  Ｃｏｌｏｎｎａ，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ２７，  ６６０−６６５，  １９９７
【非特許文献１２】
Ｂｏｒｇｅｓ，  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １５９，  ５１９２−５１９６，  １９９７
【非特許文献１３】
Ｗｅｇｔｍａｎｎ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ，  ７，  ６１５−６１８，  １９９７
【非特許文献１４】
Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３８６，  １８１−１８６，  １９９７
【非特許文献１５】
Ｆｕｊｉｏｋａ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，  １６，  ６８８７−６８９９，  １９９６
【非特許文献１６】
Ｏｈｎｉｓｈｉ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２７１，  ２５５６９−２５５７４，  １９９６
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、骨髄球系細胞などの増殖、活性化、分化を含む免疫応答に関与する新規なペアの活性化及び抑制性免疫受容体遺伝子を取得し、該受容体の分子的及び機能的特性を解明することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、マウスのマクロファージから、細胞内領域にＩＴＩＭを持ち、抑制性シグナルを伝達する抑制性免疫受容体タンパク質（ＭＡＩＲ−Ｉ）、該抑制性免疫受容体タンパク質の細胞外領域にある免疫グロブリンドメインに高い相同性を有し、活性化シグナルを伝達する活性化免疫受容体タンパク質（ＭＡＩＲ−ＩＩ）を単離することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）  以下の（ａ）又は（ｂ）に示す免疫受容体タンパク質。
（ａ）  配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）  配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ細胞の免疫応答を抑制させる機能を有するタンパク質
（２）  以下の（ｃ）又は（ｄ）に示す免疫受容体タンパク質。
（ｃ）  配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｄ）  配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ細胞の免疫応答を活性化させる機能を有するタンパク質
（３）  上記（１）又は（２）の免疫受容体タンパク質をコードする遺伝子。
（４）  以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）  配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）  配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡの相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞の免疫応答を抑制させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（５）  以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡからなる遺伝子。
（ｃ）  配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）  配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡの相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞の免疫応答を活性化させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（６）上記（４）又は（５）の遺伝子を含有する組換えベクター。
（７）上記（４）又は（５）の遺伝子で形質転換させた形質転換体。
（８）上記（７）の形質転換体を培地に培養し、得られる培養物から免疫受容体タンパク質を採取することを特徴とする、上記（１）又は（２）の免疫受容体タンパク質の製造方法。
（９）  上記（１）又は（２）の免疫受容体タンパク質のいずれか一方、又はその両方を認識する抗体。
（１０）  上記（９）の抗体を用いる上記（１）又は（２）の免疫受容体タンパク質の定量方法。
（１１）  上記（９）の抗体を含む上記（１）又は（２）の免疫受容体タンパク質の定量用キット。
（１２）  ＩＴＩＭモチーフを有する抑制性免疫受容体の細胞外保存領域をコードする遺伝子をプローブとして用いて対となる活性化免疫受容体遺伝子を単離する方法。
（１３）ＩＴＡＭモチーフを有する活性化免疫受容体の細胞外保存領域をコードする遺伝子をプローブとして用いて対となる抑制性免疫受容体遺伝子を単離する方法。
（１４）上記（１）又は（２）の免疫受容体タンパク質、又は該タンパク質を発現する細胞若しくは細胞膜をリガンドが含まれることが予想される被験物質に作用させ、該タンパク質に対して親和性のある物質を選択することを含む、上記（１）又は（２）の免疫受容体タンパク質に対するリガンドのスクリーニング方法。
（１５）  上記（１４）の方法により得られる上記（１）又は（２）の免疫受容体タンパク質に対するリガンド。
（１６）  （ａ）上記（１）又は（２）の免疫受容体タンパク質を該免疫受容体タンパク質に対するリガンドに被験物質の非存在下において作用させた場合と、（ｂ）上記（１）又は（２）の免疫受容体タンパク質を該免疫受容体タンパク質に対するリガンドに被験物質の存在下において作用させた場合とを比較し、該免疫受容体タンパク質と該リガンドの結合に対して影響を与える物質を選択することを特徴とする、該免疫受容体タンパク質に対するアンタゴニスト又はアゴニストのスクリーニング方法。
（１７）  上記（１）又は（２）の免疫受容体タンパク質を含むことを特徴とする、該免疫受容体タンパク質に対するアンタゴニスト又はアゴニストのスクリーニング用キット。
（１８）  上記（１６）の方法、又は上記（１７）のキットを用いて得られる、上記（１）又は（２）の免疫受容体タンパク質に対するアンタゴニスト又はアゴニスト。
（１９）  上記（１）若しくは（２）の免疫受容体タンパク質、又は該タンパク質をコードする遺伝子を有効成分として含む免疫機能制御用医薬。
（２０）  上記（１）若しくは（２）の免疫受容体タンパク質に対するリガンド、又は上記（１）若しくは（２）の免疫受容体タンパク質に対するアンタゴニスト若しくはアゴニストを有効成分として含む免疫機能制御用医薬。
（２１）  上記（９）の抗体を含む上記（１）又は（２）の免疫受容体タンパク質の検出用試薬。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の免疫受容体タンパク質は、その細胞外領域が互いに高度に保存された骨髄球系−関連免疫グロブリン様受容体（ｍｙｅｌｏｉｄ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩと称する新規なペアの活性化及び抑制性受容体タンパクである。ＭＡＩＲ−Ｉは、マクロファージ、顆粒球、マスト細胞、及び樹状細胞を含む大多数の骨髄球系細胞上に発現し、細胞質内領域にチロシンベースの局在モチーフとチロシンベースの免疫受容体抑制性モチーフを含み、受容体のインターナリゼーションを誘発し、マスト細胞からのＩｇＥ−媒介脱顆粒を抑制する。他方、ＭＡＩＲ−ＩＩは、マクロファージ及びＢ細胞のサブセットに発現し、チロシンベースの免疫受容体活性化モチーフを有するアダプター分子ＤＡＰ１２と会合し、マクロファージからの炎症性サイトカイン分泌を亢進する。従って、ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩ  は、自然免疫応答を正又は負にそれぞれ調節し、細胞シグナリングと免疫応答に重要な制御的役割を果たす。
【００１０】
１．本発明の免疫受容体タンパク質をコードする遺伝子の単離
本発明の免疫受容体タンパク質（以下、ＭＡＩＲともいう）をコードする遺伝子のクローニングは、例えば骨髄球とＢ細胞の分化に必須の転写因子であるＰＵ．１を欠失したＰＵ．１−１−マウスと野生株マウスとの間で胎生１４日齢肝臓を材料としてＲＤＡ（Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）法に基づくＰＣＲ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎにより行うことができる。ＲＤＡ法とは、制限酵素消化したゲノムＤＮＡにアダプターを付加し、ＰＣＲ  によってゲノムＤＮＡの断片を増幅（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）したもの同士をｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  法（引き算法）により比較することによって変異欠失ＤＮＡを検出するものある。
【００１１】
ＭＡＩＲをコードする遺伝子また、下記の免疫系細胞や組織に由来するｃＤＮＡライブラリーを、上記ＲＤＡ法で調製したＤＮＡ断片をもとにして合成したＤＮＡプローブを用いてスクリーニングすることにより単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのｍＲＮＡ供給源としては、ＭＡＩＲのｍＲＮＡが発現している細胞であれば特に限定されず、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル等）のあらゆる免疫系細胞［例えば、マクロファージ、マスト細胞、顆粒球（好中球、好塩基球、好酸球）、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞等］、又はそれらの細胞が存在するあらゆる組織（例えば、脾臓、リンパ節、骨髄、肝臓等）が挙げられる。
【００１２】
ｍＲＮＡの調製は、当該技術分野において通常用いられる手法により行うことができる。例えば、上記細胞又は組織を、グアジニン試薬、フェノール試薬等で処理して全ＲＮＡを得た後、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムやセファロース２Ｂを担体とするポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法により、あるいはバッチ法によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得る。さらに、ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ（Ａ＋）ＲＮＡをさらに分画してもよい。
【００１３】
次いで、得られたｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、該一本鎖ｃＤＮＡからＤＮＡ合成酵素Ｉ、ＤＮＡリガーゼ及びＲｎａｓｅＨ等を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成する。合成した二本鎖ｃＤＮＡをＴ４ＤＮＡ合成酵素によって平滑化後、アダプター（例えば、ＥｃｏＲＩアダプター）の連結、リン酸化等を経て、λｇｔ１１等のベクターに組み込んでｉｎ  ｖｉｖｏパッケージングすることによってｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。また、λファージ以外にもプラスミドを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製することもできる。
【００１４】
上記のようにして得られる形質転換体から目的のＤＮＡを有する株を選択するスクリーニング方法としては、例えば、マウス肝から精製した後記ＭＡＩＲ−Ｉａのアミノ酸配列に対応するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを合成し、これを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う方法が挙げられる。
【００１５】
ここで用いられる鋳型ＤＮＡとしては、前記ｍＲＮＡから逆転写反応により合成されたｃＤＮＡが挙げられる。また、プライマーは、増幅したときのＤＮＡ断片の予想サイズ、あるいは縮重コドンの組み合わせなどを適宜検討しながら、上記のアミノ酸配列情報に基づいて設計することができる。
【００１６】
このようにして得られたＤＮＡ増幅断片を、３２Ｐ、３５Ｓ又はビオチン等で標識してプローブとし、これを形質転換体のＤＮＡを変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダイズさせ、得られたポジティブ株を検索することによりスクリーニングすることができる。
【００１７】
得られたクローンについて塩基配列の決定を行う。塩基配列の決定はマキサム−ギルバートの化学修飾法、又はＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定機（例えばＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製３７３Ａ  ＤＮＡシークエンサー、ＴＡＫＡＲＡ社製ＢｃａＢＥＳＴジデオキシシークエンシングキット等）を用いて配列決定が行われる。得られた塩基配列を、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウエアエンジニアリング社）等のＤＮＡ解析ソフトによって解析し、得られたＤＮＡ鎖中にコードされているタンパク質コード部分を見出す。
【００１８】
上記の方法で取得される本発明の受容体タンパク質コードする遺伝子としては、例えば、配列番号１の塩基配列で表されるマウス由来の免疫抑制性受容体タンパク質ＭＡＩＲ−Ｉａをコードする遺伝子、そのアイソタイプである配列番号５の塩基配列で表されるマウス由来の免疫抑制性受容体タンパク質ＭＡＩＲ−Ｉｂをコードする遺伝子、配列番号３の塩基配列で表されるマウス由来の免疫活性化受容体タンパク質ＭＡＩＲ−ＩＩａをコードする遺伝子、そのアイソタイプである配列番号７の塩基配列で表されるマウス由来の免疫活性化受容体タンパク質ＭＡＩＲ−ＩＩｂをコードする遺伝子が挙げられる。
【００１９】
本発明の免疫受容体タンパク質は、  （ａ）  配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、又は（ｂ）  配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ細胞の免疫応答を抑制させる機能を有するタンパク質；又は（ｃ）  配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、又は（ｄ）配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ細胞の免疫応答を活性化させる機能を有するタンパク質である。
【００２０】
上記の「配列番号２（又は配列番号４）に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００２１】
上記アミノ酸の欠失、付加及び置換は、上記免疫受容体タンパク質をコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法又は  Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて、あるいは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  シリーズキットを用いて変異が導入される。
【００２２】
上記の「細胞の免疫応答を抑制させる機能を有する」とは、細胞の免疫応答の抑制性活性（例えば、脱顆粒の抑制、サイトカイン産生減少、細胞障害活性抑制、抗原提示機能抑制、貧喰能抑制等）が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が有する活性と実質的に同等であることをいう。
また、上記の「細胞の免疫応答を活性化させる機能を有する」とは、細胞の免疫応答の活性化活性（例えば、脱顆粒の促進、サイトカイン産生亢進、細胞障害活性亢進、抗原提示機能亢進、貧喰能亢進等）が、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が有する活性と実質的に同等であることをいう。
【００２３】
より詳細には、当該活性が同等（例えば、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）である限り、分子量等の量的要素は元のタンパク質と異なっていてもよい。
【００２４】
上記いずれかの免疫受容体タンパク質中の部分アミノ酸配列を含むペプチド（部分ペプチドともいう）も本発明の範囲に含まれる。特に、本発明の部分ペプチドの中でも、免疫受容体タンパク質が天然に存在する場合に細胞膜の外に露出し、且つリガンド結合活性を保有する部分は、免疫受容体タンパク質のリガンドを決定において特に有用である。そのような部分ペプチドとしては、配列番号２又は配列番号４で表わされるアミノ酸配列の疎水性プロット解析において、細胞外領域（親水性部位）と分析される部分が挙げられる。本発明の部分ペプチドを構成するアミノ酸数は、少なくとも１０個以上、好ましくは３０個以上、より好ましくは８０個以上である。
【００２５】
本発明の免疫受容体タンパク質又はその部分ペプチドは、必要に応じて塩の形態、好ましくは生理学的に許容される酸付加塩の形態で提供され得る。そのような塩としては、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）の塩、有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）の塩等が挙げられる。
【００２６】
本発明の免疫受容体タンパク質は、該タンパク質を発現しているヒトや哺乳動物の培養細胞又は組織からの抽出・分離よって、あるいは後述のように該タンパク質をコードするＤＮＡを含む形質転換体を培養することによっても製造することができる。ヒトや哺乳動物の組織又は細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織又は細胞をホモジナイズ後、酸等で抽出を行い、得られた抽出液を疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィーを組み合わせることにより単離精製することができる。
【００２７】
また、前記部分ペプチドは、公知のペプチド合成法又は前記免疫受容体タンパク質を適当なペプチダーゼ（例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ）で切断することによって製造することができる。ペプチド合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。
【００２８】
本発明の免疫受容体タンパク質をコードする遺伝子は、上記の本発明の免疫受容体タンパク質をコードする遺伝子であればいかなるものでもよく、具体的には、（ａ）  配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ、（ｂ）  配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞の免疫応答を抑制させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子；又は（ｃ）  配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ、（ｄ）  配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞の免疫応答を活性化させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
【００２９】
上記の「配列番号１（又は配列番号３）に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡ」としては、配列番号１（又は配列番号３）で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ等が挙げられる。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が６００〜９００ｍＭであり、温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃での条件をいう。
【００３０】
一旦本発明の遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又は本遺伝子のｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明の遺伝子を得ることができる。
【００３１】
２．組換えベクター及び形質転換体の作製
（１）  組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の遺伝子を連結することにより得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミド  ＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＲＳＥＴ、ｐＢＲ３２２，  ｐＢＲ３２５，  ｐＵＣ１１８，  ｐＵＣ１１９，  ｐＵＣ１８，  ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０，  ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３，  ＹＥｐ２４，  ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００３２】
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター  ＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００３３】
本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを含有するものを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００３４】
このようなベクターとしては、宿主細胞が大腸菌である場合は、例えばｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）  、ｐＴｒｘＦＵＳベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）  、ｐＣＹＢベクター（ＮＥＷＥＮＧＬＡＭＤ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｓ社製）  等が、宿主細胞が酵母である場合は、例えばｐＥＳＰ−１発現ベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）  、ｐＡＵＲ１２３ベクター（宝酒造社製）、ｐＰＩＣベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）  等が、また宿主細胞が動物細胞である場合は、例えばｐＭＡＭ−ｎｅｏ発現ベクター  （ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）  、ｐＣＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）  、ｐＢＫ−ＣＭＶベクター  （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）  等が、宿主細胞が昆虫細胞である場合は、例えばｐＢａｃＰＡＫベクター  （ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）  、ｐＡｃＵＷ３１ベクター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）  、ｐＡｃＰ（＋）ＩＥ１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）  等がそれぞれ挙げられる。
【００３５】
（２）  形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明のＤＮＡを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌；サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等の酵母；サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ヒトＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等の動物細胞；あるいはＳｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞が挙げられる。
【００３６】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００３７】
大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２、ＤＨ１などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法（Ｃｏｈｅｎ，  Ｓ．Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９７２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ  ６９，  ２１１０−２１１４）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３８】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法（Ｂｅｃｋｅｒ，  Ｄ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １９４，１８２−１８７）、スフェロプラスト法（Ｈｉｎｎｅｎ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９７８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ  ７５，  １９２９−１９３３）、酢酸リチウム法（Ｉｔｏｈ，  Ｈ．  （１９８３）  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １５３，
１６３−１６８）等が挙げられる。
【００３９】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００４０】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
また、上記の各宿主細胞への遺伝子導入は、組換えベクターによらない方法、例えばパーティクルガン法なども用いることができる。
【００４１】
３．本発明の免疫受容体タンパク質の製造
本発明の免疫受容体タンパク質は、前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
【００４２】
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、その宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【００４３】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー等が用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００４４】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で６〜２４時間行う。培養期間中、ｐＨは７．０〜７．５に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４５】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドール酢酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００４６】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１〜３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４７】
培養後、本発明の免疫受容体タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより該タンパク質を抽出する。また、本発明の免疫系受容体タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明の免疫受容体タンパク質を単離精製することができる。
【００４８】
４．本発明の免疫受容体タンパク質に対する抗体
本発明の抗体は以下の一般的な抗体調製方法によって取得できるが、特に、ＭＡＩＲ−Ｉのみを認識するＴＸ−８、ＭＡＩＲ−ＩとＭＡＩＲ−ＩＩの両方を認識するＴＸ−１０、ＭＡＩＲ−ＩＩのみを認識するＴＸ−１３は、Ｓｈｉｂｕｙａ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １，  ４４１−６，  ２０００の記載に従って調製することができる。具体的には、後記実施例の示すように、ＭＡＩＲ−Ｉ又はＭＡＩＲ−ＩＩを発現しているＢａ／Ｆ３形質転換体とヒトＩｇＧのＦｃ部分の融合タンパク質を足蹠に注射することによって免疫化したラット由来の膝窩リンパ節細胞とＳｐ２／０  骨髄腫細胞株とを融合することによって調製する。
【００４９】
（１）  抗原の調製
本発明においては、前記の通り単離精製した本発明の免疫受容体タンパク質又はその一部の断片を抗原として用いる。
（２）ポリクローナル抗体の作製
前記のようにして調製した抗原を用いて動物を免疫する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、ウサギの場合、例えばアジュバントを用いて１００〜５００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。
【００５０】
免疫は、哺乳動物（例えばラット、マウス、ウサギなど）に投与することにより行われる。投与部位は静脈内、皮下又は腹腔内である。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜３週間間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜３回免疫を行う。そして、最終の免疫日から６〜６０日後に抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。抗体価の測定は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ；ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ；ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ）等により行うことができる。
【００５１】
抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００５２】
（３）  モノクローナル抗体の作製
（３−１）  免疫及び抗体産生細胞の採取
上記のようにして調製された抗原タンパク質を用いて動物を免疫する。必要であれば、免疫を効果的に行うため、前記と同様アジュバント（市販のフロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント等）を混合してもよい。
【００５３】
免疫は、哺乳動物（例えばラット、マウス、ウサギなど）に投与することにより行われる。抗原の１回の投与量は、マウスの場合１匹当たり５０μｇである。投与部位は、主として静脈内、皮下、腹腔内である。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜３週間間隔で、最低２〜３回行う。そして、最終免疫後、抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞が好ましい。
【００５４】
（３−２）  細胞融合
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物由来の細胞であって一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株として、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地  （ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む）  で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。例えば、ミエローマ細胞の具体例としてはＰ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４などのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
【００５５】
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中に、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを１５：１〜２５：１の割合で混合し、ポリエチレングリコール等の細胞融合促進剤存在下、あるいは電気パルス処理（例えばエレクトロポレーション）により融合反応を行う。
【００５６】
（３−３）  ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地を用いて培養し、生育する細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
【００５７】
次に、増殖したハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法  （ＥＬＩＳＡ；  ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、ＲＩＡ  （ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ）等によってスクリーニングすることができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的に単クローン抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立する。
【００５８】
（３−４）  モノクローナル抗体の採取
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％牛胎児血清含有  ＲＰＭＩ−１６４０培地又はＭＥＭ  培地等の動物細胞培養培地中、通常の培養条件  （例えば３７℃，５％  ＣＯ２濃度）  で３〜１０日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。
【００５９】
上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安分画法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、又はこれらの方法を組み合わせることにより精製することができる。
【００６０】
５．本発明の抗体による免疫受容体タンパク質の定量方法、定量用キット
本発明の抗体を用いた免疫受容体タンパク質の定量は、例えばイムノブロット法、酵素抗体法（ＥＩＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光抗体法、免疫細胞染色等より行うことが可能であるが、それらに限定されるものではない。
また、上記抗体は、その断片であってもよく、具体的には、当該抗体の一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）が挙げられる。
【００６１】
具体的には、ＥＬＩＳＡ  法による場合は、以下の通り行う。まず、希釈した血液等の試料を９６ウェルマイクロプレートに吸着させた後、一次抗体として本発明の抗体を反応させる。次いで、発色反応に必要なＰＯＤ（ペルオキシダーゼ）  等の特異的酵素で標識した抗グロブリン抗体を反応させ、洗浄後、発色基質としてＡＢＴＳ２，２’−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）  等を添加して発色させ、比色法により測定することによって試料中の本発明の免疫受容体タンパク質を検出する。あるいは、サンドイッチＥＬＩＳＡ  法による場合は、以下の通り行う。まず、希釈した血液等の試料を、予め本発明の抗体を吸着させた９６ウェルマイクロプレートに添加して一定時間インキュベートする。その後、プレートを洗浄し、ビオチンで標識した精製抗体を各ウェルに添加して一定時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、酵素標識アビジンを添加してさらにインキュベートする。インキュベート後、プレートを洗浄し、発色基質としてオルトフェニレンジアミン等を添加して発色させ、比色法によって測定する。
【００６２】
また、本発明の抗体は免疫受容体タンパク質定量用キットに用いることもできる。当該キットは、少なくとも本発明の抗体を含むものであればよく、該抗体を固相に固定させる場合にあっては、該抗体とは抗原認識部位が異なり、二次抗体として用いられる抗体を含んでいてもよい。二次抗体として用いられる抗体は、例えば酵素等で標識されていてもよく、これら２つの抗体の他に、各種試薬（例えば、酵素基質、緩衝液、希釈液等）を含んでいてもよい。
【００６３】
６．ペア免疫受容体遺伝子の単離方法
ＩＴＩＭモチーフを有する抑制性免疫受容体とＩＴＡＭモチーフを有する活性化免疫受容体とは、その細胞外領域が互いに高度に保存されている。従って、本発明においては、上記のモチーフを有するいずれかの免疫受容体遺伝子が取得できれば、その細胞外保存領域をコードする遺伝子をプローブとして用いて対となる免疫受容体遺伝子を前述のｃＤＮＡライブラリー等から単離することができる。例えば、ＭＡＩＲ−Ｉの場合は、プローブとなりうる細胞外領域として、配列番号１に示される塩基配列のうち、第６３番目〜第５９６番目の塩基配列、好ましくは第１３５番目〜第４８８番目の塩基配列を含むＤＮＡが例示される。
【００６４】
７．本発明の受容体タンパク質に対するリガンドのスクリーニング方法
本発明の受容体タンパク質に対するリガンドのスクリーニング方法は、本発明の免疫受容体タンパク質、又は該タンパク質を発現する細胞若しくは細胞膜をリガンドが含まれることが予想される被験物質に作用させ、該タンパク質に対して親和性のある物質を選択することを特徴とする。親和性のある物質を選択する具体的手法としては、本発明の免疫受容体タンパク質、又は該受容体タンパク質を発現する細胞若しくは細胞膜に被験物質を作用させ、該受容体タンパク質に対する被験物質の結合量を測定するか、あるいは、細胞の免疫応答シグナルを測定することなどにより行う。ここで、免疫応答シグナルとしては、例えば、脱顆粒（ヒスタミン、セロトニンなどの化学物質の放出）、ロイコトリエンや血小板活性化因子の合成、サイトカイン放出、補体の活性化、抗体産生、細胞内タンパク質のリン酸化、貧喰、細胞障害などをいう。測定において結合量の多い被験物質、免疫応答シグナルが強い被験物質を本発明の受容体タンパク質に対するリガンドの候補物質として選択することができる。
【００６５】
被験物質としては任意の物質を使用することができ、その種類は特に限定されない。被験物質の具体例としては、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、天然物抽出物（植物抽出液、動物組織・動物細胞抽出液）、あるいは化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる
【００６６】
８．本発明の受容体タンパク質に対するアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング系
本発明の受容体タンパク質は、該受容体タンパク質とリガンドとの結合を阻害する物質（アンタゴニスト）、該受容体に結合してリガンドと同様な免疫応答を起こす物質（アゴニスト）のスクリーニングするための手段（スクリーニング方法、スクリーニング用キット）として有用である。
【００６７】
本発明の受容体タンパク質に対するアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法は、（ａ）免疫受容体タンパク質を該免疫受容体タンパク質に対するリガンドに被験物質の非存在下において作用させた場合と、（ｂ）免疫受容体タンパク質を該免疫受容体タンパク質に対するリガンドに被験物質の存在下において作用させた場合とを比較し、該免疫受容体タンパク質と該リガンドの結合に対して影響を与える物質を選択することを特徴とする。被験物質を添加した場合に免疫受容体タンパク質とリガンドとの結合量が減少又は増加する被験物質が見つかれば、その被験物質は、本発明のタンパク質とリガンドとの結合を阻害又は拮抗し、免疫応答を制御するのに役立つアンタゴニスト又はアゴニストの候補物質となる。
【００６８】
また、本発明の受容体タンパク質は  該タンパク質に対するアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング用キットに用いることもできる。当該キットは、少なくとも本発明の受容体タンパク質を含むものであればよく、標識リガンド、リガンド標準液、各種試薬（例えば、緩衝液、洗浄液、希釈液等）を含んでいてもよい。
【００６９】
被験物質としては任意の物質を使用することができ、その種類は特に限定されない。被験物質の具体例としては、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、天然物抽出物（植物抽出液、動物組織・動物細胞抽出液）、あるいは化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる
【００７０】
９．本発明の免疫応答機能制御用医薬
本発明の免疫受容体タンパク質は免疫応答と活性化させる機能又は抑制させる機能を有する。また、本発明のリガンド、アンタゴニスト、アゴニストは前記受容体タンパク質に結合することができ、免疫受容体からの活性化シグナル、抑制性シグナルを変化させる機能を果たす。従って、本発明のタンパク質、遺伝子、リガンド、アンタゴニスト、アゴニストはいずれも免疫応答機能制御用医薬として用いることができる。例えば、本発明の医薬を免疫制御機構の不全が原因となる疾患に用いると、免疫活性化と免疫抑制性の方向を制御することによって該疾患の治療を行うことができる。かかる疾患としては、例えば、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、全身性エリマトーデス、慢性関節リウマチ、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、ベーチェット病、強直性脊椎炎、インスリン依存性糖尿病、悪性貧血など）、アレルギー性疾患（例えば花粉症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹血管浮腫、血清病、アナフィラキシー、薬剤アレルギーなど）、免疫不全疾患（原発性免疫不全症候群、続発性免疫不全症候群など）、腫瘍（肺癌、乳癌、大腸癌、膀胱癌、骨髄性白血病、神経芽細胞腫、黒色腫、パーキットリンパ腫など）などが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００７１】
本発明の医薬は、各種製剤形態に調製し、経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる。本発明の医薬を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等に製剤化するか、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。また、本発明の医薬を非経口投与する場合は、静脈内注射剤（点滴を含む）、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、皮下注射剤、坐剤などに製剤化し、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。
【００７２】
これらの各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等などを適宜選択し、常法により製造することができる。
【００７３】
上記各種製剤は、医薬的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物は、剤型に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。
【００７４】
本発明の医薬の投与量は、投与対象の年齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変えることができる。例えば、本発明のタンパク質の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組合せとして投与される有効量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇ〜１０００  ｍｇの範囲の投与量を選ぶことができ、１日１回から数回に分けて１日以上投与される。
【００７５】
本発明の遺伝子を免疫系疾患に対する遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の遺伝子を注射により直接投与する方法のほか、該遺伝子が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。また、本発明の遺伝子をリポソームなどのリン脂質小胞に導入し、そのリポソームを投与する方法を採用してもよい。
【００７６】
遺伝子治療剤の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内等の全身投与のほか、免疫系組織（骨髄、リンパ節など）に局所投与を行うことができる。さらに、カテーテル技術、外科的手術等と組み合わせた投与形態を採用することもできる。
【００７７】
本発明の遺伝子治療剤の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、通常は、本発明の遺伝子の重量にすると成人１日あたり０．１〜１００ｍｇ／体重の範囲が適当である。
【００７８】
１０．免疫受容体タンパク質検出用試薬
本発明の抗体は、本発明の免疫受容体タンパク質又はその部分断片と反応するため、該受容体タンパク質の検出用試薬として使用することができる。免疫受容体タンパク質の検出方法は特に限定されるものではなく、例えばウエスタンブロッティング法などを採用することができる。例えば、被検対象（細胞成分又はその各分画等）を電気泳動等により分画し、次に、予め標識（放射標識、蛍光染色等）された本発明の抗体と反応させてシグナルを検出する。本発明の免疫受容体タンパク質の検出に使用する抗体は、該受容体タンパク質の全長アミノ酸配列を有するタンパク質に対する抗体でもよく、該受容体タンパク質の部分アミノ酸配列を有するペプチドに対する抗体でもよい。
【００７９】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００８０】
実施例に用いた抗体のうち、コントロールラット及びマウスのＩｇＧ、抗−マウスＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０、ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ１）、ＣＤ１１ｃ、Ｌｙ６Ｇ（Ｇｒ−１）及びＣＤ３２／１６  ｍＡｂｓ、ならびにＤＸ−５ｍＡｂはＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）より入手した。抗−ホスホチロシンｍＡｂ（４Ｇ１０）及び抗−ＦｃεＲＩγｍＡｂはＵｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，  ＮＹ）より、また抗−Ｆｌａｇ  ｍＡｂはＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）より入手した。抗−ＳＨＰ−１、抗−ＳＨＰ−２、抗−ＳＨＩＰ抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  ＣＡ）より入手した。ラットＩｇＥ  抗−ＤＮＰ  ｍＡｂはＺｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ）より入手した。抗−ＤＡＰ１２ポリクローナル抗体は愛媛大学医学部より入手した。
【００８１】
［実施例１］    （ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩのクローニング及び分子特性）
（１）ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩのクローニング
骨髄球系細胞による免疫応答に関与する新規な遺伝子を同定するために、骨髄球系細胞を欠いているＰＵ．１−／−マウスと野生株由来の１４日齢の胎仔肝を、ＰＣＲ−べースのサブトラクティブハイブリダイゼーションであるｒｅｐｒｅｓｅｔａｔｉｏｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  （ＲＤＡ）に供した。
【００８２】
まず、全ＲＮＡをＩｓｏｇｅｎ  ＬＳ溶液（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ）を用いて単離し、オリゴ（ｄＴ）−プライム二本鎖ｃＤＮＡをｃＤＮＡ合成システム（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いて製造業者の指示に従って合成した。ＲＤＡはＩｗａｍａ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  ２６，  ３０３４−４３，  １９９８に記載の方法に従って実施した。サブトラクションして得られたＤＮＡ断片から骨髄球細胞に特異的なｃＤＮＡ（ＭＡＩＲ−Ｉａ）を同定した。全長ＭＡＩＲ−Ｉａ  ｃＤＮＡをＲＤＡによって作成したｃＤＮＡ断片をプローブとしてマクロファージｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによってクローン化した。
【００８３】
ＭＡＩＲ−Ｉａのアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。ＭＡＩＲ−Ｉａ  は３１４個のアミノ酸からなるＩ型膜貫通型糖タンパク質であり、２７個のアミノ酸のリーダー配列、１５２個のアミノ酸の細胞外領域、２３個のアミノ酸の膜貫通領域、及び１１２個のアミノ酸の細胞内領域を有する（図１Ａ）。細胞内領域はアミノ酸配列ＶＥＹＳＴＬ及びＬＨＹＳＳＶを含み（図１Ａ）、それらはＩＴＩＭｓ（Ｉ／Ｖ／Ｌ／ＳｘＹｘｘＬ／Ｖ）のコンセンサス配列と一致した。また、ＩＴＩＭ−様配列ＹＶＮＬ及びＹＳＥＩはＭＡＩＲ−Ｉａがタンパク質チロシンホスファターゼを補充し、抑制性シグナルを媒介することを示した。なお、ＩＴＩＭ−様モチーフＹＶＮＬは受容体インターナリゼーションに関与するコンセンサス配列でもある（Ｍａｒｋｓ，Ｓ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ７，  １２４−１２８，  １９９７；  Ｂｏｌｌ，  Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｍｂｏ  Ｊ，  １５，  ５７８９−９５，  １９９６）。
【００８４】
次に、ＭＡＩＲ−Ｉａがペア受容体のメンバーであるかどうかを調べるために、ＭＡＩＲ−Ｉａ  の細胞外領域をコードするｃＤＮＡ（配列番号１の第６３番目〜第５９６番目の塩基配列）をプローブとして用いてマクロファージｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。その結果、ＭＡＩＲ−Ｉａのアミノ酸配列と９２％相同性のある一つのＩｇ−様ドメインが存在する細胞外領域、荷電アミノ酸（Ｌｙｓ）を有する膜貫通領域、及び短い（２０アミノ酸）細胞内テイルを含むタンパク質をコードするクローンを同定し、これをＭＡＩＲ−ＩＩａと命名した。さらに、ＭＡＩＲ−Ｉａ  に４つ、ＭＡＩＲ−ＩＩａに２つの追加的アミノ酸を含むアイソフォームを見出し、それぞれＭＡＩＲ−Ｉｂ（アミノ酸配列：配列番号６）、ＭＡＩＲ−ＩＩｂ（アミノ酸配列：配列番号８）と命名した。
【００８５】
図１Ａに、ＭＡＩＲ−Ｉａ、ＭＡＩＲ−Ｉｂ、ＭＡＩＲ−ＩＩａ、ＭＡＩＲ−ＩＩｂのアミノ酸配列の比較を示す。図１Ａにおいて、下線は推定されるリーダー配列及び膜貫通領域を、丸で囲んだ箇所は細胞外領域におけるＮ−結合グリコシル部位及び膜貫通領域における荷電アミノ酸残基を、太字（図１Ａに示すアミノ酸配列の５５番目及び１１３番目のアミノ酸）はＩｇ−様ドメインのジスルフィド結合に関与するシステイン残基を表す。枠で囲んだ箇所は、細胞内領域のＩＴＩＭ、ＩＴＩＭ−様又は局在モチーフを表す。ＭＡＩＲ−Ｉ、ＭＡＩＲ−Ｉｂ、ＭＡＩＲ−ＩＩａ、及びＭＡＩＲ−ＩＩｂ  ｃＤＮＡ配列データはＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪからそれぞれ受理番号ＡＢＯ０９１７６５、ＡＢＯ０９１７６６、ＡＢＯ０９１７６７、及びＡＢＯ０９１７６８で入手可能である。
【００８６】
図１Ｂは、ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩタンパク質の模式図を示す。細胞外領域における一対のシステイン残基はＩｇ−様ドメインの形成のための内部鎖ジスルフィド結合に関与すると考えられ、ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩ  がＩｇスーパーファミリーのメンバーであることを示す。
【００８７】
（２）ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩのサザンブロット分析
図１Ｃに、ゲノムＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩのサザンブロット分析を示す。マウスゲノムＤＮＡを制限酵素（Ｅ；Ｅｃｏ−ＲＩ、Ｂ；Ｂａｍ−ＨＩ、Ｈ；Ｈｉｎｄ−ＩＩＩ、Ｘ；Ｘｂａ−Ｉ、Ｐ；Ｐｓｔ−Ｉ）で消化し、ＭＡＩＲ−Ｉの細胞外領域をコードするｃＤＮＡでプローブした。ＭＡＩＲ−Ｉｂ及びＭＡＩＲ−ＩＩｂは、ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩのゲノムＤＮＡ配列によって示されるように、  ＭＡＩＲ−Ｉａ及びＭＡＩＲ−ＩＩａの代替的スプライシング変異体である。上記のサザンブロット分析によれば、単一のハイブリダイゼーションパターンであることがわかり、これはＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩが単一の遺伝子によってコードされることを示す（図１Ｃ）。
【００８８】
（３）染色体ＦＩＳＨ法による解析
ダイレクトＲ−バンドＦＩＳＨ法をマウス及びラットにおけるＭＡＩＲ−Ｉ遺伝子の染色体アサインメントのために用いた。Ｒ−バンド染色体及びＦＩＳＨの調製をＭａｔｓｕｄａ，  Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ，  ６１，  ２８２−５，１９９２及びＭａｔｓｕｄａ，  Ｙ．  ＆  Ｃｈａｐｍａｎ，  Ｖ．Ｍ．，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，  １６，  ２６１−７２，  １９９５  に記載されるように行った。ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩ遺伝子はマウス１１番染色体のＥ２バンドの近位領域に位置し、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）及びゲノムＤＮＡ配列データベースによって決定されるように、それぞれ６つ及び４つのエキソンからなる。データベースリサーチによれば、ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩは、アミノ酸レベルでそれぞれヒトＣＭＲＦ−３５−Ｈ９（Ｇｒｅｅｎ，  Ｂ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １０，  ８９１−９，  １９９８）と４４％、ヒトＣＭＲＦ−３５（Ｇｒｅｅｎ，  Ｂ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １０，  ８９１−９，  １９９８）と４９％の相同性を有することがわかった。ＣＭＲＦ−３５−Ｈ９、ＣＭＲＦ−３５はマウス１１番染色体に対応するヒト１７番染色体上に位置することから（Ｃｌａｒｋ，  Ｇ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，  ５５，  １０１−９，  ２０００）、これらがマウスＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩのヒト相同体であると考えられる。
【００８９】
（４）免疫ブロッティング
マウスＴ細胞白血球ＢＷ５１４７細胞を、Ｎ末端をＦｌａｇペプチドでタグ化したＭＡＩＲ−Ｉａ及びＭＡＩＲ−ＩＩａ  ｃＤＮＡで形質転換した。Ｆｌａｇ−タグ化  ＭＡＩＲ−Ｉａ又はＭＡＩＲ−ＩＩａを発現するＢＷ５１４７細胞又は親ＢＷ５１４７細胞を１％  ＮＰ−４０、プロテアーゼインヒビター（１ｍＭ  ＰＭＳＦ及び２０  Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｕ／ｍｌアプロチニン）、及びホスファターゼインヒビター（１ｍＭ  ＥＧＴＡ，  １０ｍＭ  ＮａＦ，  １ｍＭ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７，  ０．１ｍＭ  β−グリセロリン酸塩、１ｍＭ  Ｎａ３Ｖ０４）を含むＴｒｉｓ−緩衝化生理食塩水（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１５ｍＭ  ＮａＣｌ，  ｐＨ８．０）に溶解した。タンパク質を還元下又は非還元条件下で、抗−Ｆｌａｇ  ｍＡｂを用いて免疫ブロッティングによって分析した。結果を図２Ａに示す。ＢＷ５１４７形質転換体上のＦｌａｇ−タグ化ＭＡＩＲ−Ｉａ及びＭＡＩＲ−ＩＩａの抗−Ｆｌａｇ−ｍＡｂとの免疫沈降物は、それぞれ〜５０  ｋＤａび〜３５ｋＤａの分子量を有していた（図２Ａ）。
【００９０】
（５）ＭＡＩＲ−ＩａのＮ−グルコシダーゼ処理
ＭＡＩＲ−ＩａのＮ−グリコシル化を調べるために、Ｆｌａｇ−タグ化ＭＡＩＲ−Ｉａを発現するＢＷ５１４７形質転換体を抗−Ｆｌａｇ  ｍＡｂ又はコントロールＩｇＧと共に免疫沈降させ、製造業者によって推奨される条件を用いてＮ−グリコシダーゼＦ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）にて処理した。
【００９１】
ＭＡＩＲ−Ｉａの移動度はＮ−グルコシダーゼＦ処理後〜５０  ｋＤａから〜４５  ｋＤａに減少した（図２Ｂ）。これは、ＭＡＩＲ−Ｉ  ｃＤＮＡから予想されるポリペプチドのサイズ及び細胞外領域のＮ−結合グルコシル部位の存在に一致した。
【００９２】
［実施例２］    （ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩ  の発現）
（１）ノーザンブロット分析
ＭＡＩＲ−Ｉ  ｃＤＮＡをＲｅａｄｙ  ｔｏ  Ｇｏ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｂｅａｄｓ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）を用いて［３２Ｐ］−ｄＣＴＰにて標識化した。種々のマウス組織由来の各レーン中にある約１０μｇの全ＲＮＡを含む膜を、［３２Ｐ］−ｄＣＴＰ−標識化ｃＤＮＡプローブに、改良Ｃｈｕｒｃｈ’ｓハイブリダイゼーション緩衝液  （０．５Ｍ  Ｃｈｕｒｃｈ’ｓ  リン酸緩衝液、７％ＳＤＳ、１％ＢＳＡ）中で６８℃にてハイブリダイズした。その膜をＣｈｕｒｃｈ’ｓ洗浄緩衝液（４０ｍＭ  Ｃｈｕｒｃｈ’ｓ  リン酸緩衝液、１％ＳＤＳ）中で６８℃にて１時間洗浄し、オートラジオグラフィーに供した。図３Ａ、図３ＢにＭＡＩＲ−Ｉ及び／又はＭＡＩＲ−ＩＩ転写物の発現をＭＡＩＲ−Ｉ細胞外部分をコードするｃＤＮＡをプローブとして用いるノーザンブロット法によって分析した結果を示す。ＭＡＩＲ転写物の優位な発現が脾臓、骨髄、腹腔マクロファージ、骨髄球系細胞株（４１６Ｂ、ＷＥＨＩ３、ＲＡＷ、及びＭ１細胞）などの造血組織において検出されたが、非造血器官では検出されなかった（図３Ａ）。
【００９３】
（２）逆転写−ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
さらに血球系列でのＭＡＩＲ−Ｉ及び  ＭＡＩＲ−ＩＩの発現を詳細に解析するため、骨髄、脾臓、胸腺からフローサイトメトリーにより各血球系列に分離し、ＭＡＩＲ−Ｉ−特異的プライマー及びＭＡＩＲ−ＩＩ−特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを以下のようにして行った。まず、ＲＮＡを骨髄、脾臓、胸腺からフローサイトメトリーによって精製した系統−分化した細胞（ｌｉｎｅａｇｅ−ｃｏｍｍｉｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ）から得た。このＲＮＡを逆転写し、ＨＰＲＴコントロールを用いて相対量に調節されたｃＤＮＡをセルソーターによる精製細胞から調製した。これらのｃＤＮＡを鋳型とし、ＭＡＩＲ−Ｉ−特異的プライマー（５’−ＡＡＧＣＴＧＡＴＡＧＧＣＡＴＣＣＡＧＡＧＣ−３’：配列番号９及び５’−ＡＡＧＧＡＧＴＣＡＣＡＧＧＴＡＡＡＧＧＴＣ−３’：配列番号１０）、ＭＡＩＲ−ＩＩ−特異的プライマー（５’−ＴＣＧＡＧＣＣＴＴＧＡＧＡＧＴＧＧＴＡＧＡＣ−３’：配列番号１１及び５’−ＡＧＧＡＧＣＴＧＴＧＴＴＴＡＧＧＧＡＣＡＧ−３’：配列番号１２）、又はＨＰＲＴ−特異的プライマー（５’−ＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＧＧＡＣＣＴＣＴ−３’：配列番号１３及び５’−ＣＡＣＡＧＧＡＣＴＡＧＡＡＣＡＣＣＴＧＣ−３’：配列番号１４）を用いるＰＣＲ増幅に供した。ｃＤＮＡの量をＴａｑＭａｎＲｏｄｅｎｔ  ＧＡＰＤＨコントロール試薬（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ，  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を用いて定量的ＰＣＲによって標準化した（Ｓａｋａｍｏｔｏ，  Ｎ  ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ３１，  １３１０−６，  ２００１）。ＰＣＲは：各サイクル２０秒間変性（９４℃）、２０秒間アニーリング（５５℃）、及び３０秒間伸長（７２℃）の条件で行った。図３ＢにＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩ転写物はいずれもリンパ球造血前駆細胞、顆粒球、マクロファージ、赤血球系細胞、及び骨髄中のＢ細胞、脾臓中のＴ，Ｂ，及びＮＫ細胞を含む多系列の前駆細胞において発現したが、胸腺中のＴ細胞では検出されなかった（図３Ｂ）。
【００９４】
（３）ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩタンパク質の細胞表面発現解析
タンパク質レベルでの発現を解析するために、ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩタンパク質にそれぞれ特異的に反応するモノクローナル抗体ＴＸ−８及びＴＸ−１３を作成し、細胞表面における分子の発現をフローサイトメトリーで検討した。
【００９５】
（３−１）  抗体の作成
ＴＸ−８（抗−ＭＡＩＲ−Ｉ）、ＴＸ−１０（抗−ＭＡＩＲ−Ｉと抗−ＭＡＩＲ  −ＩＩ）及びＴＸ−１３（抗−ＭＡＩＲ−ＩＩ）ｍＡｂは、Ｓｈｉｂｕｙａ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １，  ４４１−６，  ２０００の記載に従い、ＭＡＩＲ−Ｉ又はＭＡＩＲ−ＩＩを発現しているＢａ／Ｆ３形質転換体とヒトＩｇＧのＦｃ部分の融合タンパク質を足蹠に注射することによって免疫化したラット由来の膝窩リンパ節細胞とＳｐ２／０  骨髄腫細胞株とを融合することによって調製した。
【００９６】
（３−２）フローサイトメトリー
Ｎ−末端をＦｌａｇ  ｃＤＮＡでタグ化したＭＡＩＲ−Ｉ又はＭＡＩＲ−ＩＩ  をｐＭＸレトロウイルスベクターにサブクローニングした（Ｋｉｔａｍｕｒａ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，  ＵＳＡ，  ９２，  ９１４６−５０，  １９９５）。Ｆｌａｇ−タグ化ＭＡＩＲ−１及びＭＡＩＲ−ＩＩを安定に発現するＢＷ５１４７，  Ｂａ／Ｆ３及びＲＡＷ細胞をＳｈｉｂｕｙａ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  １１，  ６１５−２３，  １９９９に従って樹立した。
【００９７】
図４ＡはＭＡＩＲ−Ｉ又はＭＡＩＲ−ＩＩを発現しているＢＷ５１４７形質転換体をコントロールＩｇＧ又は抗−ＭＡＩＲ−Ｉ（ＴＸ−８  ｍＡｂ）又は抗−ＭＡＩＲ−ＩＩ（ＴＸ−１３  ｍＡｂ）、続いてアロフィコシアニン（ＡＰＣ）−結合ストレプトアビジンで染色した結果を示す。
【００９８】
また、図４Ｂ，Ｃ，ＤはＣ５７／ＢＬ６マウス由来の脾臓、骨髄、又は腹腔マクロファージをビオチン−結合抗−ＭＡＩＲ−Ｉ（ＴＸ−８  ｍＡｂ）又は抗−ＭＡＩＲ−ＩＩ（ＴＸ−１３  ｍＡｂ）及びＰＥ−結合ｍＡｂ、続いてアロフィコシアニン（ＡＰＣ）−結合ストレプトアビジンで染色した結果を示す。フローサイトメトリーによる脾臓及び骨髄細胞の分析では、ＭＡＩＲ−Ｉはマクロファージ、樹状細胞、顆粒球、骨髄由来マスト細胞、及びＢ細胞の一部のサブセットを含むほとんどの骨髄球系細胞上で発現しているが、Ｔ細胞やＮＫ細胞では発現していないことが示された（図４Ｂ、Ｃ、Ｄ）。他方、ＭＡＩＲ−ＩＩタンパク質はＢ細胞のセブサット及び腹腔マクロファージのサブセットの細胞表面上でのみ検出され、ＲＴ−ＰＣＲの分析結果とは異なって樹状細胞、マスト細胞などには発現が認められなかった（図４Ｂ、Ｃ、Ｄ）。このことは、ＭＡＩＲ−ＩＩ分子の細胞膜上の発現が何らかの機構によって制御されている可能性が示唆され、転写物発現が認められても必ずしもタンパク質の細胞表面発現が起こらないことがわかった。
【００９９】
（４）細胞表面上のＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩタンパク質発現の制御機構
細胞表面上のタンパク質発現の制御機構を調べるために、脾臓から精製したＢ細胞をＬＰＳ  （１０μｇ／ｍｌ）の存在下又は不存在下で４８時間培養し、培養前又は後、上記の抗−ＭＡＩＲ−Ｉ（ＴＸ−８  ｍＡｂ）又は抗−ＭＡＩＲ−ＩＩ（ＴＸ−１３  ｍＡｂ）で染色した。４８時間培養後、ＭＡＩＲ−ＩＩ分子が細胞膜上で顕著に検出され、ＬＰＳの刺激によってそれはさらに増強された（図４Ｅ）。
【０１００】
［実施例３］    ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩ  の機能解析
（１）インターナリゼーションアッセイ
ＭＡＩＲ−Ｉの細胞内領域はチロシンベースの局在モチーフ（ＹＶＮＬ）を含んでおり、（図１Ａ）、このモチーフはタンパク質のエンドソーム及びライソソームターゲッティングに関係し、アゴニスト−誘導インターナリゼーションに関与していることが報告されている（Ｍａｒｋｓ，  Ｓ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ７，  １２４−１２８，  １９９７；  Ｂｏｌｌ，  Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｍｂｏ  Ｊ，  １５，  ５７８９−９５，  １９９６）。従って、ＭＡＩＲ−Ｉが架橋後にインターナリゼーションを誘導するか否かを調べるために、腹腔マクロファージ上に発現しているＭＡＩＲ−Ｉをビオチン標識化抗−ＭＡＩＲ−Ｉ  ｍＡｂ（ＴＸ−８）、ＡＰＣ−標識化ストレプトアビジンで架橋し、４℃又は３７℃にて１時間インキュベートした。インターナリゼーションを受けなかった細胞表面ＭＡＩＲ−Ｉを除くために細胞を２．５％トリプシンにて処理（＋）又は処理せず（−）、フローサイトメトリーによって分析した。架橋後４℃でインキュベートした細胞の蛍光強度はトリプシン処理により顕著に減少したのに対し、架橋後３７℃でインキュベートした細胞では、トリプシン処理に関わらず蛍光は一定であった（図５Ａ）。これはＭＡＩＲ−Ｉの架橋が３７℃における培養中に受容体インターナリゼーションを誘導したことを示す。
【０１０１】
Ｎ末端をＦｌａｇ−タグ化したＭＡＩＲ−Ｉを発現するＢａ／Ｆ３形質転換体を抗−Ｆｌａｇ  ｍＡｂとインキュベートし、続いてＦＩＴＣ−標識化抗−マウスＩｇＧ第二抗体で架橋した。細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０に再懸濁し、ポリリジンで前もって被覆したチャンバースライド（Ｌａｂ−ＴｅｋＩＩ、Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｒｃ，  Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，  ＩＬ）に載せ、３７℃にて３０分間インキュベートした。細胞を１５００ｒｐｍで４℃にて５分間遠心し、ＰＢＳにて２回洗浄し、３％パラホルムアルデヒドで固定した。細胞をＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ，ＣＡ）を含むＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤとともに載せ、共焦点走査レーザ顕微鏡下で分析した。緑色の蛍光がインキュベーション前では細胞表面にのみ検出されたのに対し、３７℃にて３０分間インキュベーション後では細胞内に豊富に観察され（図５Ｂ）、ＭＡＩＲ−Ｉは架橋後にインターナリゼーションを受けたことを示している。これに対し、局在モチーフ内のチロシン残基（Ｙ−Ｆ２３３）が変異を受けたＭＡＩＲ−Ｉのインターナリゼーションは検出されず、これは２３３位のチロシンがＭＡＩＲ−Ｉのインターナリゼーションを担っていることを示す。
【０１０２】
（２）ＭＡＩＲ−Ｉのチロシンリン酸化、ホスファターゼとの会合
ＭＡＩＲ−Ｉの細胞内領域におけるＩＴＩＭに対する共通配列の存在は、ＭＡＩＲ−Ｉはチロシンリン酸化を受け、ＳＨ−２−含有チロシンホスファターゼ補充する可能性を示唆した。そこで、骨髄由来培養マスト細胞上に発現したＭＡＩＲ−Ｉが過バナジン酸塩の刺激によってチロシンリン酸化されるかどうかを調べた。
【０１０３】
成体Ｂａｌｂ／ｃマウスの大腿及び頚骨由来の骨髄細胞を１０％ＦＢＳ、マウスｒＩＬ−３（４ｎｇ／ｍｌ；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）及びマウスｒＳＣＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地において２×１０５／ｍｌの濃度で培養した。培養後の骨髄由来のマスト細胞を１０分間３７℃にて過バナジン酸塩で刺激し、又は刺激せず、１％ＮＰ−４０（図６Ａ）又は１％ジギトニン（Ｓｉｇｍａ）緩衝液（０．１２％  Ｔｒｉｔｏｎ−１００（片山化学製）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  トリエチルアミン（片山化学製）、又はプロテアーゼ及びホスファターゼインヒビターを含む上述の１％ＮＰ−４０緩衝液）（図６Ｂ）に溶解し、コントロールＩｇＧ、抗−ＭＡＩＲ−Ｉ、抗−ＳＨＰ−Ｉ、抗−ＳＨＰ−ＩＩ、又は抗−ＳＨＩＰで免疫沈降した。免疫沈降物を抗−ホスホチロシンｍＡｂ（抗−ｐＹ）（図６Ａ）又は抗−ＭＡＩＲ−Ｉ（図６Ｂ）でイムノブロットした。図６Ａに示すように、過バナジン酸塩による刺激はＭＡＩＲ−Ｉのチロシンリン酸化を顕著に誘導した（図６Ａ）。タンパク質−チロシンホスファターゼＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２、及びポリホスフェートイノシトール５−ホスファターゼＳＨＩＰによって免疫沈降すると、マスト細胞の過バナジン酸塩の刺激後、ＭＡＩＲ−ＩはＳＨＩＰと結合したが、ＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２とは結合しなかった（図６Ｂ）。これらの結果は、ＭＡＩＲ−Ｉは細胞質内領域のチロシンがリン酸化された後、抑制性シグナルを媒介する可能性があることを示す。
【０１０４】
（３）セロトニン放出アッセイ
ＭＡＩＲ−Ｉは細胞質領域にＩＴＩＭをもつが、これが実際に抑制性のシグナル伝達を担うどうかを確認するために、骨髄細胞をＩＬ−３とＳＣＦで培養して誘導したマスト細胞において、ＭＡＩＲ−ＩがＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）を介した脱顆粒を抑制するか否かを解析した。Ｉｇ−Ｅ−媒介セロトニン放出アッセイをＵｅｈａｒａ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，  １０８，  １０４１−５０，  ２００１の記載に従って行った。まず、骨髄細胞由来マスト細胞を３Ｈ−セロトニン（５−［１，２−３Ｈ（Ｎ）］−ヒドロキシトリプタミンクレアチニン硫酸塩）（５μＣｉ／ｍｌ；ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｓｔｓ  Ｉｎｃ．，  Ｂｏｓｔｏｎ，  ＭＡ）とともに５時間３７℃にてインキュベートし、さらに１時間バックグランド放射活性を減らすために再インキュベートした。３Ｈ−セロトニン負荷マスト細胞を１０μｌのラットＩｇＥ抗−ＤＮＰ  ｍＡｂ（２５μｇ／ｍｌ）及び種々の濃度のラット抗−ＭＡＩＲ−Ｉ又はコントロールＩｇＧ  （ＩｇＥ  ｍＡｂ＋抗−ＭＡＩＲ−Ｉ  又はＩｇＥ  ｍＡｂ＋コントロールＩｇＧ）を含む９６ウェルプレートに入れ、３０分間４℃にてインキュベートし、洗浄し、２５μＬの培地中に再懸濁した。抗体−初回刺激を受けたマスト細胞を２５μｌのウサギ抗−ラットＩｇ抗体（４０μｇ／ｍｌ）のＦ（ａｂ’）２断片で３７℃にて３０〜６０分間チャレンジした。反応を５０μｌの冷ＰＢＳを加えることによって停止させた。上清の３Ｈ−セロトニンを液体シンチレーションカウンダーにて測定した。３Ｈ−セロトニンの全取り込み量を１％ＳＤＳ／１％ＮＰ４０を含むＰＢＳにてマスト細胞を溶解することによって測定し、セロトニン放出の割合を１００×（上清のｃｐｍ／全取り込み量のｃｐｍ）によって定義した。図６Ｃに示すように、ＭＡＩＲ−Ｉと抗−ＭＡＩＲ−Ｉ  ｍＡｂの架橋は濃度依存的に骨髄由来マスト細胞からのＩｇＥ−媒介セロトニン放出を抑制した。
【０１０５】
（４）ＭＡＩＲ−ＩＩのアダプター分子の会合
ＭＡＩＲ−Ｉとは異なって、ＭＡＩＲ−ＩＩは細胞内領域が短く、シグナル伝達に関与する配列を持たないこと、及び膜貫通領域の正電荷を持つリジン酸残基の存在から考え、同部位に負に荷電したアミノ酸残基をもったＦｃεＲＩγやＤＡＰ１２などのアダプター分子が会合することが予想された。そこで、ＭＡＩＲ−ＩＩのＦｃεＲＩγ又はＤＡＰ１２のようなアダプター膜貫通タンパクとの非共有結合を調べるために、ＦｃεＲＩγもＤＡＰ１２も発現しない２９３Ｔ細胞をＭＡＩＲ−ＩＩ  ｃＤＮＡとＦｃεＲＩγ又はＤＡＰ１２のいずれかで形質転換した。形質転換体を１％ジギトニン緩衝液に溶解し、細胞溶解物をコントロールＩｇＧ、抗−ＤＡＰ１２又は抗−ＦｃεＲＩγと共に免疫沈降させ、単離したタンパク質を抗−  ＭＡＩＲ−ＩＩでイムノブロットした。図７Ａに示すように、ＭＡＩＲ−ＩＩとＤＡＰ１２との共免疫沈降が確認され、ＭＡＩＲ−ＩＩはＤＡＰ１２と会合していることが明らかとなったが、ＦｃεＲＩγとの共免疫沈降は確認されなかった。同様に、ＭＡＩＲ−ＩＩ遺伝子導入したマウスマクロファージＲＡＷ細胞を用いて免疫沈降を行ったところ、ＭＡＩＲ−ＩＩとＤＡＰ１２との共免疫沈降は確認されたが、ＦｃεＲＩγとの共免疫沈降は確認されなかった（図７Ｂ）。
【０１０６】
一次細胞におけるＭＡＩＲ−ＩＩのＤＡＰ１２との生理学的結合を確かめるために、脾臓細胞をＬＰＳで刺激し、１％ジギトニン緩衝液に溶解し、抗−ＦｃεＲＩ又は抗−ＤＡＰ１２と免疫沈降した。単離したンパク質を抗−ＭＡＩＲ−ＩＩにて再び免疫ブロットすると、ＭＡＩＲ−ＩＩはＤＡＰ１２と共免疫沈降するが、ＦｃεＲＩγとは共免疫沈降しなかった（図７Ｃ）。これらの結果は、ＤＡＰ１２がＭＡＩＲ−ＩＩ  に対する生理学的パートナーであることを示す。
【０１０７】
また、２９３Ｔ細胞をＦｌａｇ−タグ化ＤＡＰ１２、ＭＡＩＲ−ＩＩ、又はＦｌａｇ−タグ化ＤＡＰ１２＋ＭＡＩＲ−ＩＩで形質転換し、ビオチン−結合抗−ＭＡＩＲ−ＩＩ及びＦＩＴＣ−結合抗−Ｆｌａｇ  ｍＡｂ、続いてＡＰＣ−結合ストレプトアビジンで染色した。ＭＡＩＲ−ＩＩ及びＤＡＰ１２の細胞表面発現をフローサイトメトリーによって分析した結果を図７Ｄに示す。２９３Ｔ細胞の細胞表面上のＤＡＰ１２発現はＭＡＩＲ−ＩＩの発現に依存していることが観察された（図７Ｄ）。
【０１０８】
（５）ＴＮＦ−α分泌
ＤＡＰ１２はＩＴＡＭを有しており、活性化シグナルを伝えることが明らかになっている（Ｌａｎｉｅｒ，  Ｌ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ．２１，  ６１１−６１４，  ２０００；  Ｔｏｍａｓｅｌｌｏ，  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２７３，  ３４１１５−３４１１９，  １９９８；  Ｌａｎｉｅｒ，  Ｌ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３９１，  ７０３−７０７，  １９９８）。実際に、ＭＡＩＲ−ＩＩから活性化シグナルの伝達があるか否かを解析した。Ｆｌａｇ−タグ化ＭＡＩＲ−ＩＩ又はＣ５７ＢＬ／６マウス由来の腹腔マクロファージを発現するＲＡＷ細胞を抗−ＣＤ３２／１６（ＦｃγＲ）で前処理し、プラスチック被覆コントロールＩｇＧ、抗−Ｆｌａｇ又は抗−ＭＡＩＲ−ＩＩ  ｍＡｂで刺激し、４８時間培養した。細胞上清中のＴＮＦ−α濃度をＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ  （ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を用いて製造業者の指示に従って測定した。図８に示すように、Ｎ末端にＦｌａｇを付加したＭＡＩＲ−ＩＩ遺伝子を導入した形質転換体では、抗−Ｆｌａｇ抗体で架橋すると炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αの生産が有意に亢進した。また、腹腔マクロファージで直接ＭＡＩＲ−ＩＩ分子を抗−ＭＡＩＲ−ＩＩ抗体で架橋してもＴＮＦ−αの分泌が顕著に増加した。しかしながら、抗ＭＡＩＲ−ＩＩ  抗体の架橋後、腹腔マクロファージからのＩＬ−６及びＩＬ−１２分泌の顕著な増加は認められなかった。これらの結果はＭＡＩＲ−ＩＩ  が離れたシグナリング経路を媒介し、マクロファージにおけるＴＮ−α分泌を導くことを示す。
【０１０９】
【発明の効果】
本発明によれば、免疫応答を正又は負に調節する新規な免疫受容体タンパク質が提供される。本発明の免疫受容体タンパク質は、免疫応答を活性化及び抑制させる機能を有するため、自然免疫反応の制御機構の解明や免疫調節物質の探索、抗アレルギー薬や抗炎症薬などの医薬の開発に有用である。
【０１１０】
【配列表】
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【０１１１】
【配列表フリーテキスト】
配列番号９：合成ＤＮＡ
配列番号１０：合成ＤＮＡ
配列番号１１：合成ＤＮＡ
配列番号１２：合成ＤＮＡ
配列番号１３：合成ＤＮＡ
配列番号１４：合成ＤＮＡ
【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａは、本発明の免疫受容体タンパク質ＭＡＩＲ−Ｉａ、ＭＡＩＲ−Ｉｂ、ＭＡＩＲ−ＩＩａ、ＭＡＩＲ−ＩＩｂのアミノ酸配列の比較を示す。
図１Ｂは、ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩタンパク質の模式図を示す。
図１Ｃは、ゲノムＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩのサザンブロット分析を示す。
【図２】図２Ａは、Ｆｌａｇ  −タグ化ＭＡＩＲ−Ｉ又はＭＡＩＲ−ＩＩを発現するＢＷ５１４７細胞を溶解し、タンパク質を還元下又は非還元条件下で抗−Ｆｌａｇ  ｍＡｂで免疫ブロットした結果を示す。
図２Ｂは、Ｆｌａｇ−タグ化  ＭＡＩＲ−Ｉを発現するＢＷ５１４７細胞又は親ＢＷ５１４７細胞を溶解し、タンパク質を抗−Ｆｌａｇ  ｍＡｂと免疫沈降させ、沈殿物をＮ−グリコシダーゼＦで処理又は処理せず、非還元下、抗−Ｆｌａｇ  ｍＡｂで免疫ブロットした結果を示す。
【図３】図３Ａ、図３ＢはＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩ転写物の発現をノーザンブロット法によって分析した結果を示す。
【図４】図４Ａは形質転換細胞（ＢＷ５１４７細胞）におけるＭＡＩＲ−Ｉ又はＭＡＩＲ−ＩＩの細胞膜表面発現を抗−ＭＡＩＲ−Ｉ（ＴＸ−８  ｍＡｂ）又は抗−ＭＡＩＲ−ＩＩ（ＴＸ−１３  ｍＡｂ）を用いて分析した結果を示す。図４Ｂ，Ｃ，Ｄはマウス由来の脾臓、骨髄、又は腹腔マクロファージにおけるＭＡＩＲ−Ｉ又はＭＡＩＲ−ＩＩの細胞膜表面発現を抗ＭＡＩＲ−Ｉ（ＴＸ−８  ｍＡｂ）又は抗−ＭＡＩＲ−ＩＩ（ＴＸ−１３  ｍＡｂ）を用いて分析した結果を示す。図４Ｅは、Ｂ細胞をＬＰＳ  の存在下又は不存在下で培養後、ＭＡＩＲ−Ｉ又はＭＡＩＲ−ＩＩの細胞膜表面発現を抗−ＭＡＩＲ−Ｉ（ＴＸ−８  ｍＡｂ）又は抗−ＭＡＩＲ−ＩＩ（ＴＸ−１３  ｍＡｂ）で分析した結果を示す。
【図５】図５Ａは、腹腔マクロファージ上のＭＡＩＲ−Ｉを抗−ＭＡＩＲ−Ｉ  ｍＡｂ（ＴＸ−８）で架橋し、４℃又は３７℃にてインキュベーション後、フローサイトメトリーで分析した結果を示す。図５Ｂは、ＭＡＩＲ−Ｉ発現細胞を抗−ＭＡＩＲ−Ｉ  ｍＡｂ（ＴＸ−８）で架橋し、３７℃でインキュベーションする前後において共焦点レーザ顕微鏡下で分析した結果を示す。
【図６】図６Ａは、骨髄由来マスト細胞を過バナジン酸塩で刺激後、コントロールＩｇＧ又は抗−ＭＡＩＲ−Ｉで免疫沈降し、免疫沈降物を抗−ホスホチロシンｍＡｂ（抗−ｐＹ）でイムノブロットした結果を示す。図６Ｂは、骨髄由来マスト細胞を過バナジン酸塩で刺激後、コントロールＩｇＧ、抗−ＭＡＩＲ−Ｉ、抗−ＳＨＰ−Ｉ、抗−ＳＨＰ−ＩＩ、又は抗−ＳＨＩＰで免疫沈降し、免疫沈降物を抗−ＭＡＩＲ−Ｉ  でイムノブロットした結果を示す。図６ＣはＭＡＩＲ−Ｉと抗−ＭＡＩＲ−Ｉ  ｍＡｂの架橋後における骨髄由来マスト細胞からのＩｇＥ−媒介セロトニン放出アッセイの結果を示す。
【図７】図７Ａは、ＭＡＩＲ−ＩＩ＋ＤＡＰ１２、又はＭＡＩＲ−ＩＩ＋ＦｃεＲＩで形質転換した細胞（２９３Ｔ）をコントロールＩｇＧ、抗−ＤＡＰ１２、抗−  ＦｃεＲＩ  で免疫沈降し、免疫沈降物を抗−ＭＡＩＲ−ＩＩ（ＴＸ−１０）でイムノブロットした結果を示す。図７Ｂは、ＭＡＩＲ−ＩＩで形質転換した細胞（ＲＡＷ）をコントロールＩｇＧ、抗−ＤＡＰ１２、又は抗−  ＦｃεＲＩ  で免疫沈降し、免疫沈降物を抗−ＭＡＩＲ−ＩＩ（ＴＸ−１０）でイムノブロットした結果を示す。図７Ｃは脾臓細胞をコントロールＩｇＧ、抗−ＤＡＰ１２、又は抗−  ＦｃεＲＩ  で免疫沈降し、免疫沈降物を抗−ＭＡＩＲ−ＩＩ（ＴＸ−１０）でイムノブロットした結果を示す。図７Ｄは、２９３Ｔ細胞をＦｌａｇ−タグ化ＤＡＰ１２、ＭＡＩＲ−ＩＩ、又はＦｌａｇ−タグ化ＤＡＰ１２＋ＭＡＩＲ−Ｉで形質転換し、ビオチン−結合抗−ＭＡＩＲ−ＩＩ及びＦＩＴＣ−結合抗−Ｆｌａｇ  ｍＡｂ、続いてＡＰＣ−結合ストレプトアビジンで染色後、ＭＡＩＲ−ＩＩ及びＤＡＰ１２の細胞表面発現をフローサイトメトリーによって分析した結果を示す。
【図８】図８（左の図）は、Ｆｌａｇタグ化ＭＡＩＲ−ＩＩ遺伝子を導入した形質転換体を抗−Ｆｌａｇ抗体で架橋した後のＴＮＦ−α生産を示す。図８（右の図）は、腹腔マクロファージ上のＭＡＩＲ−ＩＩ分子を抗−ＭＡＩＲ−ＩＩ抗体で架橋した後のＴＮＦ−αの生産を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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