(57)【要約】      （修正有）【課題】  ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質、その遺伝子、及びそれらの利用方法を提供すること。【解決手段】  ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、及び該ＤＮＡによって発現されるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質からなる。また、本発明は、該ＤＮＡ及びタンパク質の変異体ＤＮＡ及び変異体タンパク質、本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体、本発明の遺伝子を染色体上で欠損させた非ヒト動物、及び該抗体や非ヒト動物及び本発明の遺伝子プローブを用いた細胞の免疫賦活機能の判定及びインターフェロン誘導シグナル伝達活性物質のスクリーニング方法、からなる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
インターフェロン誘導シグナル伝達活性が、インターフェロンβの誘導シグナル伝達活性であることを特徴とする請求項１記載のインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
配列表の配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含むことを特徴とする請求項１又は２記載のＤＮＡ。
【請求項４】
配列表の配列番号３に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含むことを特徴とする請求項１又は２記載のＤＮＡ。
【請求項５】
請求項３又は４記載の遺伝子を構成するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする請求項１又は２記載のＤＮＡ。
【請求項６】
インターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であることを特徴とする請求項１又は２記載のＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質
【請求項７】
インターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であることを特徴とする請求項１又は２記載のＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質
【請求項８】
ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質。
【請求項９】
インターフェロン誘導シグナル伝達活性が、インターフェロンβの誘導シグナル伝達活性であることを特徴とする請求項８記載のインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質。
【請求項１０】
配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項８又は９記載のタンパク質。
【請求項１１】
配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質。
【請求項１２】
配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項８又は９記載のタンパク質。
【請求項１３】
配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか記載のＤＮＡを、発現用ベクターに組込んだことを特徴とするインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質発現組換えベクター。
【請求項１５】
請求項１４記載のインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質発現組換えベクターを宿主細胞へ導入したことを特徴とする形質転換細胞。
【請求項１６】
請求項８〜１３のいずれか記載のタンパク質と特異的に結合する抗体。
【請求項１７】
抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１６記載の抗体。
【請求項１８】
ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損したことを特徴とする非ヒト動物。
【請求項１９】
非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする請求項１８記載のインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損したことを特徴とする非ヒト動物。
【請求項２０】
ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した細胞に、請求項１〜７のいずれか記載のＤＮＡを導入することを特徴とするインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質を発現する細胞の調製方法。
【請求項２１】
請求項１〜７のいずれか記載のＤＮＡ又はその部分からなることを特徴とする、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードする遺伝子検出用プローブ。
【請求項２２】
請求項２１記載の遺伝子検出用プローブを用いて遺伝子を検出し、判定することを特徴とする細胞のウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活機能の判定方法。
【請求項２３】
請求項１６又は１７記載の抗体を用いて、細胞のウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質の発現状態を検出することを特徴とする、細胞のウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活機能の判定方法。
【請求項２４】
請求項１８記載のウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物に、被検物質を投与し、該非ヒト動物のインターフェロン誘導活性を測定・評価することを特徴とする、細胞のウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質、その遺伝子、及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体は、常に微生物の侵入等の危機に曝されている。このような危機に対する生体防御は、自然免疫と獲得免疫の協調作用により確立される。自然免疫を担当するマクロファージ、樹状細胞などの抗原提示細胞は、Toll-like receptor（ＴＬＲ）と呼ばれる一群の膜タンパク質を介して、病原体を認識する。この認識により活性化された抗原提示細胞は、ＩＬ−１２、ＴＮＦなどの炎症性サイトカインを産生すると同時に、ＣＤ４０などの補助機能分子の発現を増強する。補助機能分子の発現は、抗原提示細胞と協同して、獲得免疫を担当するＴ細胞の増殖を誘導する。また、ＩＬ−１２は、ナイーブＴ細胞やインターフェロン（ＩＦＮ）を産生する１型ヘルパーＴ（Ｔｈ１）細胞へと分化誘導し、細胞性免疫を確立させる。したがって、ＴＬＲを介したシグナルは、獲得免疫を量的、質的、双方の面から制御していることになる。
【０００３】
ＴＬＲは、病原体のような微生物の特有の成分を認識するレセプターであるが、ＴＬＲには多くのファミリーがあることが確認されている。即ち、ＴＬＲレセプターファミリーは、微生物の構成成分のそれぞれ特定の構造を認識することにより微生物の侵入を認識し、本来の免疫活性を引き起こす（Annu Rev Immunol. 20, 197, 2002；Nat. Immunol 2, 675, 2001；Nat. Rev. Immunol. 1, 135, 2001）。ＴＬＲレセプターファミリーのうち、ＴＬＲ４はグラム陰性菌由来のリポ多糖（ＬＰＳ）のレセプターとして機能している。ＴＬＲ２は、グラム陽性菌由来のペプチドグリカン及び様々な菌由来のリポタンパク質との応答に必須である。ＴＬＲ１とＴＬＲ６はトリアシル化されたマイクロプラズマのリポタンパク質をそれぞれＴＬＲ２とヘテロ二量体を形成することによって認識している（J. Immunol. 169, 10, 2002）。ＴＬＲ５はフラジェリン（flagellin）を認識する。ＴＬＲ３とＴＬＲ９はそれぞれ二重鎖ＲＮＡとＣｐＧＤＮＡ（微生物ＤＮＡ）のレセプターである。ＴＬＲ７は抗ウイルス化合物の応答に関与している（Nat. Immunol. 3, 196, 2002）。
【０００４】
ＴＬＲファミリーは、ＩＬ−１レセプター（ＩＬ−１Ｒ）ファミリー（Nat. Immunol 2, 675, 2001）と相同性のある細胞外のロイシンリッチリピート（leucine-rich repeat：ＬＲＲ）領域とＩＬ−１Ｒの細胞質内領域と相同性の高い領域（ＴＩＲ領域）とを含んでいる。ＩＬ−１Ｒに類似し、ＴＬＲはＩＲＡＫをＭｙＤ８８アダプター経由で誘導され、ＴＲＦ６そして最終的にはＮＦ−κＢの活性を誘導する。即ち、ＴＬＲファミリーは、上記ＩＬ−１Ｒと同様にアダプタータンパク質であるＭｙＤ８８を介し、ＩＬ−１Ｒ結合キナーゼ（ＩＲＡＫ）をリクルートし、ＴＲＡＦ６を活性化し、下流のＮＦ−κＢを活性化することが知られている（J. Exp. Med. 187, 2097-2101, 1998、Mol. Cell 2, 253-258, 1998、Immunity 11, 115-122, 1999）。ＴＬＲを介した炎症性サイトカインの産生はＭｙＤ８８分化細胞においては完全に遮断されている。
【０００５】
しかしながら、近年の研究によればそれぞれのＴＬＲを通るシグナル経路がそれぞれ異なり、従って異なる生体反応を生じることが示されている（Nat. Immunol 2, 675, 2001）。事実、ＴＬＲ４シグナルは、ＭｙＤ８８依存経路と非依存的経路の両方を含んでいる。前者はサイトカインの産生に必須であり、後者はＩＲＦ−３の活性化と、その後のインターフェロンβ（interferon-beta：ＩＦＮ−β）及びＩＦＮ−誘導（inducible）遺伝子（J. Immunol. 167, 5887, 2001、Nat. Immunol. 3, 392, 2002、Essential role for TIRAP in activation of the signaling cascade shared by TLR2 and TLR4. Nature in press. 2002）の誘導に関与している。更に、ＭｙＤ−８８非依存的経路は樹状細胞（ＤＣｓ）を機能的に成熟させている（J. Immunol. 166, 5688, 2001）。ＭｙＤ−８８非依存的経路はＴＬＲ３シグナルでも観察されている（Nature 413, 732, 2001）。
【０００６】
近年、ＴＩＲＡＰ／ＭａｌがＴＩＲ領域に隠れている二番目のアダプター分子として発見された（Nat. Immunol. 2, 835, 2001、Nature 413, 78, 2001）。インビトロでの研究においては、ＴＩＲＡＰ／ＭａｌがＭｙＤ−８８非依存的経路でのＬＰＳ誘導による活性化に関与していることを示唆している（Nat. Immunol. 2, 835, 2001）。しかしながら、ＴＩＲＡＰ欠損マウスにおける研究でＴＩＲＡＰがＴＬＲ２とＴＬＲ４経由のＭｙＤ−８８非依存的シグナル経路内でアダプターとして機能していることが明らかになった（Essential role for TIRAP in activation of the signaling cascade shared by TLR2 and TLR4. Nature in press, 2002）。これらの研究は、ＴＩＲを含むいくつかのアダプター分子がＴＬＲを介したシグナル経路に関与し、これらのアダプターの異なる使用がＴＬＲシグナルの特異性をもたらし、さらにＭｙＤ−８８非依存的経路がＴＩＲＡＰ以外の分子によって介されていることを示唆している。
【０００７】
一方、細菌感染を防御する機構に関与するタンパク質及びその遺伝子に関する開示としては、ＴＬＲ４分子を介したＮＦ−κＢ活性化の増加に関与する性質を有するタンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子（特開２０００−２６２２９０号公報）、及び、細菌感染による過剰なＬＰＳ応答を抑制するフィードバック機構に関与していることが示唆される、ＴＬＲ４遺伝子から選択的にスプライシングの結果生ずるｍＲＮＡのコードするタンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子（特開２００２−１７６９８６号公報）などが開示されている。しかしながら、上記のように、ＴＬＲを介したシグナル経路に関与するタンパク質や該タンパク質をコードする遺伝子については、その全容は明らかになっていない。
【特許文献１】特開２０００−２６２２９０号公報
【特許文献２】特開２００２−１７６９８６号公報
【非特許文献１】J. Immunol. 167, 5887, 2001
【非特許文献２】Nat. Immunol. 3, 392, 2002
【非特許文献３】Nat. Immunol. 2, 835, 2001
【非特許文献４】Nature 413, 78, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質、その遺伝子、及びそれらの利用方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ＴＬＲ（Toll-like receptor）ファミリーが病原体の構成成分の認識に必須の役割を演じる受容体であることを、遺伝子欠損マウスを作製することにより示してきた。ＭｙＤ８８は、ＴＬＲファミリーの細胞質内領域と相同性の高いＴＩＲドメインをもつアダプターであるが、遺伝子欠損マウスの解析から、全てのＴＬＲファミリーを介した炎症性サイトカインの産生誘導のシグナル伝達に必須であることを示した。しかしながら、リポ多糖を認識するＴＬＲ４を介したシグナルの場合には、ＭｙＤ８８欠損マウスでも炎症性サイトカインの反応は認めないにも関わらず、インターフェロン誘導性遺伝子の発現を誘導した。
【００１０】
更に、ＴＬＲ４に特異的に結合する分子としてＴＩＲＡＰが同定されたが、遺伝子欠損マウスの解析から、ＴＩＲＡＰがＴＬＲ４だけでなくＴＬＲ２を介した炎症性サイトカインの産生にも必須であることを示した。ＴＩＲＡＰ欠損マウスでも、ＴＬＲ４を介したインターフェロン誘導性遺伝子の発現は誘導されることから、ＭｙＤ８８、ＴＩＲＡＰに依存しないシグナルの存在が示唆された。
【００１１】
ウイルス由来の二重鎖ＲＮＡを認識するＴＬＲ３を介したシグナルでも、インターフェロン誘導性遺伝子の発現が誘導されることから、ＴＬＲ４を介したＭｙＤ８８、ＴＩＲＡＰ非依存性のシグナルとＴＬＲ３を介したシグナルには共通の分子の関与が示唆された。そこで、ＭｙＤ８８及びＴＩＲＡＰと同様にＴＩＲドメインを有する分子を検索した結果、ＴＩＲドメインを有する遺伝子ＴＲＩＦ（TIR domain containing adaptor inducing interferon-beta）を見い出した。この遺伝子はヒトではコーディング領域（coding region）が２，１３６ｂｐで、７１２のアミノ酸をコードする。マウスでは、２，１９９ｂｐで、７３３アミノ酸をコードしている。ヒト、マウスともに、ＴＩＲドメインがタンパク質の中央部分に存在している（図２）。
【００１２】
２９３細胞（human embryonic kidney cell）に、インターフェロンβ（IFN-beta）の遺伝子プロモーター下にルシフェラーゼ（luciferase）を組み込んだプラスミド（plasmid）とともに導入して、この遺伝子を発現させるとルシフェラーゼ活性化を増強した。この結果は、該遺伝子によりコードされるタンパク質が、インターフェロンβの発現に関与していることを示している。ＭｙＤ８８、ＴＩＲＡＰを発現させてもインターフェロンβ遺伝子のプロモーターは活性化されないことから、ＴＩＲドメインを有するタンパク質のなかでも、該遺伝子によりコードされるタンパク質がインターフェロンの誘導シグナルに特異的に関与していることを示していた。ＴＩＲドメインだけにした本遺伝子によりコードされるタンパク質の変異タンパク質では、本遺伝子によりコードされるタンパク質全長の導入によるインターフェロンβの遺伝子プロモーターの活性化をブロックするドミナントネガティブ（dominant negative：抑制）効果を有する。
【００１３】
２９３細胞にヒトＴＬＲ３（human TLR3）を発現させた細胞では、二重鎖ＲＮＡ刺激でインターフェロンβの遺伝子プロモーターが活性化される。このことは、ＴＬＲ３を介したシグナルがインターフェロンβの誘導に関わっていることを示唆している。これに、本遺伝子によりコードされるタンパク質のドミナントネガティブ（抑制）型、該タンパク質−ＴＩＲを導入すると、二重鎖ＲＮＡ刺激によるインターフェロンβの遺伝子プロモーターの活性化をブロックした。このブロックはＭｙＤ８８、ＴＩＲＡＰのＴＩＲドメインでは誘導できないことから、本遺伝子によりコードされるタンパク質がＭｙＤ８８、ＴＩＲＡＰ非依存性のインターフェロン誘導のシグナルに関与していることを示している。
【００１４】
本発明は、上記知見に基づいて完成されたものである。即ち、本発明は、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、及び該ＤＮＡによって発現されるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質からなる。該ＤＮＡは、配列表の配列番号１及び配列番号３に、及び、該タンパク質は、配列表の配列番号２及び配列番号４に示される。また、本発明は該ＤＮＡ及びタンパク質の変異体ＤＮＡ及び変異体タンパク質を含む。更に、本発明は、本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体、本発明の遺伝子を染色体上で欠損させた非ヒト動物、及び該抗体や非ヒト動物及び本発明の遺伝子プローブを用いた細胞の免疫賦活機能の判定及びインターフェロン誘導シグナル伝達活性物質のスクリーニング方法、等を含むものである。
【００１５】
具体的には本発明は、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項１）や、インターフェロン誘導シグナル伝達活性が、インターフェロンβの誘導シグナル伝達活性であることを特徴とする請求項１記載のインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項２）や、配列表の配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含むことを特徴とする請求項１又は２記載のＤＮＡ（請求項３）や、配列表の配列番号３に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含むことを特徴とする請求項１又は２記載のＤＮＡ（請求項４）や、請求項３又は４記載の遺伝子を構成するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする請求項１又は２記載のＤＮＡ（請求項５）や、インターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であることを特徴とする請求項１又は２記載のＤＮＡ、即ち、（ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、（ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質（請求項６）や、インターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であることを特徴とする請求項１又は２記載のＤＮＡ、即ち、（ａ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、（ｂ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質（請求項７）や、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質（請求項８）や、インターフェロン誘導シグナル伝達活性が、インターフェロンβの誘導シグナル伝達活性であることを特徴とする請求項８記載のインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質（請求項９）や、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項８又は９記載のタンパク質（請求項１０）や、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質（請求項１１）や、配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項８又は９記載のタンパク質（請求項１２）や、配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質（請求項１３）からなる。
【００１６】
また本発明は、請求項１〜７のいずれか記載のＤＮＡを、発現用ベクターに組込んだことを特徴とするインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質発現組換えベクター（請求項１４）や、請求項１４記載のインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質発現組換えベクターを宿主細胞へ導入したことを特徴とする形質転換細胞（請求項１５）や、請求項８〜１３のいずれか記載のタンパク質と特異的に結合する抗体（請求項１６）や、抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１６記載の抗体（請求項１７）や、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損したことを特徴とする非ヒト動物（請求項１８）や、非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする請求項１８記載のインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損したことを特徴とする非ヒト動物（請求項１９）や、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した細胞に、請求項１〜７のいずれか記載のＤＮＡを導入することを特徴とするインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質を発現する細胞の調製方法（請求項２０）からなる。
【００１７】
さらに本発明は、請求項１〜７のいずれか記載のＤＮＡ又はその部分からなることを特徴とする、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードする遺伝子検出用プローブ（請求項２１）や、請求項２１記載の遺伝子検出用プローブを用いて遺伝子を検出し、判定することを特徴とする細胞のウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活機能の判定方法（請求項２２）や、請求項１６又は１７記載の抗体を用いて、細胞のウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質の発現状態を検出することを特徴とする、細胞のウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活機能の判定方法（請求項２３）や、請求項１８記載のウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物に、被検物質を投与し、該非ヒト動物のインターフェロン誘導活性を測定・評価することを特徴とする、細胞のウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性物質のスクリーニング方法（請求項２４）からなる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、生物の微生物の侵入に対する生体防御機構に関与する、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質、及び該タンパク質をコードする遺伝子を取得し、同定したことにより、本発明が、ウイルス感染によるインターフェロン誘導の分子機構の解明に大きく貢献できることのみならず、該ウイルス由来二重鎖ＲＮＡによる免疫賦活機構に関わる疾病の診断や該疾病を治療する治療薬の創出に有力な手段を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードする遺伝子からなる。該遺伝子は、配列表の配列番号１又は配列番号３に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含むＤＮＡからなる。本発明のインターフェロン誘導シグナル伝達活性としては、インターフェロンβの誘導シグナル伝達活性が挙げられる。
【００２０】
また、本発明は、次の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードするＤＮＡ；
(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質、からなる変異遺伝子を含む。該変異遺伝子を取得するには、本発明の配列表の遺伝子配列情報により、適宜公知の遺伝子工学の手法により変異させて、取得することができる。
【００２１】
更に、本発明は本発明の遺伝子（配列表の配列番号１又は配列番号３のＤＮＡ）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつウイルス由来二重鎖ＲＮＡによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、すなわち、インタクトな遺伝子の変異体を含む。該遺伝子を取得するには、例えば、配列表の配列番号１又は配列番号３に示される塩基配列からＤＮＡプローブを作製し、該ＤＮＡプローブを用いて、ＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションし、かつ機械受容チャネル機能を有するものを選択して、取得することができる。該ＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。
【００２２】
本発明の、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質としては、配列表の配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質や、配列表の配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるウイルス由来二重鎖ＲＮＡによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質の機能を有する変異体タンパク質を具体的に挙げることができる。これらのタンパク質は、それをコードする本発明の遺伝子を用いて遺伝子工学的に、或いは本発明のＤＮＡ配列情報に基づき、その配列を組換えて公知の方法により調製することができる。本発明で取得した配列表の配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質は、いずれも、ＴＩＲドメインがタンパク質の中央部分に存在している。本発明のインターフェロン誘導シグナル伝達活性としては、インターフェロンβの誘導シグナル伝達活性が挙げられる。
【００２３】
本発明のウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質は、本発明の遺伝子を用いて、遺伝子工学的に公知の方法により、製造することができる。即ち、本発明の遺伝子を、本発明のインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質を発現するための発現ベクターに組込み、該組換えベクターを宿主細胞へ導入し、形質転換させて、該細胞を培養することにより、遺伝子を発現させて、本発明のインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質を製造することができる。
【００２４】
上記本発明のタンパク質の遺伝子工学的製造に用いる発現系としては、該本発明のタンパク質を宿主細胞内で発現させることができる発現系であればどのようなものでもよく、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。これら発現系は、発現を起こさせるだけでなく、発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。
【００２５】
また、上記本発明のタンパク質の遺伝子工学的製造に用いる、宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、卵母細胞等の動植物細胞など、公知の宿主細胞の中から選択して用いることができる。また、本発明の遺伝子の宿主細胞への導入は、公知の標準的な実験室マニュアルに記載される方法等を用いて実施することができる。
【００２６】
本発明は、本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体を含む。該抗体としては、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体等を具体的に挙げることができる。これらは上記本発明のウイルス由来二重鎖ＲＮＡによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質を抗原として用いて常法により作製することができる。その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点ではより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の抗体を用いて、細胞のウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質の発現状態を検出することにより、細胞のウイルス由来二重鎖ＲＮＡによる免疫賦活機能を判定することができる。
【００２７】
上記のような抗体を用いたタンパク質の検出に際して用いる、検出手段としては、適宜公知の手段を用いることができる。例えば、本発明のモノクローナル抗体等に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、125Ｉ、32Ｐ、35Ｓ又は3Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、抗体の反応を検出し、タンパク質の発現を検知することができる。また免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を用いることができる。
【００２８】
本発明は、更に、染色体上で本発明のウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能を欠損させ、該遺伝子機能の欠損したノックアウト非ヒト動物を含む。該非ヒト動物を作製するには、配列表の配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において、その一部のアミノ酸を他のアミノ酸に変換したアミノ酸配列をコードする遺伝子を導入することにより、インターフェロン誘導シグナル伝達活性タンパク質をコードする遺伝子機能を欠損させて行うことができる。また、動物遺伝子の、配列表の配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において、その一部のアミノ酸配列に相当する部分を欠失させ、インターフェロン誘導シグナル伝達活性タンパク質をコードする遺伝子機能を欠損させて行うことができる。本発明における非ヒト動物としては、トリ、ウサギ、マウス、ラット等の非ヒト動物を具体的に挙げることができるが、実験用として用いる目的からは、マウスが特に好ましい。本発明のインターフェロン誘導シグナル伝達活性タンパク質をコードする遺伝子機能を欠損した非ヒト動物の作製に際して、遺伝子を導入する方法としては、ターゲティングベクターの構築等公知の適宜の方法を用いることができる。
【００２９】
本発明においては、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した細胞に、本発明の遺伝子（ＤＮＡ）を導入することによって細胞機能を修復し、インターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質を発現する細胞を調製することができる。
【００３０】
また、本発明の遺伝子（ＤＮＡ）又はその部分からなるＤＮＡ配列をウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードする遺伝子検出用プローブとして用いて、遺伝子を検出し、検体中のＤＮＡ配列と配列表の配列番号１又は配列番号３のＤＮＡ配列とを比較することによって、判定することにより、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活機能の判定を行うことができる。該判定により、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質の機能又は発現に関連する疾病を診断することができる。
【００３１】
また、前記のように、本発明の抗体は、細胞のウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質の発現状態の検出に用いて、細胞のウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活機能の判定に用いることができる。該判定により、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質の機能又は発現に関連する疾病を診断することができる。
【００３２】
本発明のインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードする遺伝子検出用プローブや本発明の抗体は、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質の機能又は発現に関連する疾病の診断用のキットとして製品化することができる。
【００３３】
本発明は、本発明のウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を用いて、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性物質のスクリーニングを行うことができる。該インターフェロン誘導シグナル伝達活性物質のスクリーニングには、被検物質を非ヒト動物に投与し、該非ヒト動物の、例えばインターフェロンβのようなインターフェロン誘導活性を測定・評価することにより行うことができる。該インターフェロン誘導シグナル伝達活性物質は、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質の機能又は発現に関連する疾病の治療に用いることができる。
【実施例１】
【００３４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【００３５】
この実施例では、ＴＬＲを経たシグナル伝達経路を更に明らかにするために、ＭｙＤ８８とＴＩＲＡＰ以外のＴＩＲ領域を含むアダプター分子を検索し、データベースによるスクリーニングによりＴＲＩＦ（インターフェロン−β（interferon-beta）を誘導するＴＩＲ領域を含むアダプター）と名づけた新規のアダプター分子を同定した。この実験により、ＴＲＩＦがＭｙＤ８８或いはＴＩＲＡＰではなく、ＩＦＮ−βのプロモーター及びＴＲＩＦのドミナントネガティブ（抑制）型を優位的に活性化し、ポリ（Ｉ：Ｃ）に介されたＴＬＲ３反応を阻害することから、この新規アダプターがＴＬＲ３シグナルにおける特異的な役割をもつことを確認した。
【００３６】
［遺伝子の同定と機能の解明］
材料と方法
（免疫沈降と免疫ブロット）
２９３細胞に、発現ベクターに表示されたＤＮＡ断片を挿入したプラスミドをトランスフェクションし、一過性発現させた。細胞を０．１５％ＮＰ−４０、２０ｍＭ  トリス−ＨＣＬ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸塩、１ｍＭ  Ｎａ3ＶＯ4、及びプロテアーゼ阻害剤（混合物：Roche Diagnostics社製）を含む溶菌バッファー中で溶解した。細胞溶解液をProtein G-sepharose（Amersham社製）で前精製を１時間行い、次に２μｇの抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体（Sigma社製）、２μｇの抗Ｍｙｃ ＰＬ１４抗体（ＭＢＬ社製）もしくは１μｇの抗ヒトＩＲＦ−３抗体（SantaCruz社製）及びProtein G-sepharose（Amersham社製）で２時間免疫沈降した。
【００３７】
免疫沈降物を、溶解液中で洗浄し、ＳＤＳサンプルバッファーに溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ポリフッ化ビニリデン膜（BIO-RAD社製）に移した。Ｆｌａｇがタグされた（Flag-tagged）タンパク質やＭｙｃがタグされた（Myc-tagged）タンパク質はＨＲＰ標識抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体もしくはＨＲＰ標識抗Ｍｙｃ ９Ｅ１０抗体（SantaCruz社製）とそれぞれ反応させた。内因性のＩＲＦ−３は抗ヒトＩＲＦ−３抗体とＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Amersham社製）と反応させ、抗体によって認識されたバンドをＥＣＬシステムによって検出した（PerkinElmer Life Sciences社製）。
【００３８】
［実験結果と考察］
（ＴＲＩＦの同定）
ＭｙＤ８８と、ＴＩＲ領域のＴＩＲＡＰ以外の分子がＴＬＲを介したシグナル経路に関与していると予測し、ＴＩＲドメインを有する配列をexpressed sequence tag（ＥＳＴ）データベース上で検索し、新規のヒトｃＤＮＡクローン（アクセッション番号：ＢＣ００９８６０、配列番号１）を同定し、ＴＲＩＦと命名した。この遺伝子はＮＣＢＩに登録されているＴＩＲ領域（ｓｍａｒｔ００２５５  ＴＩＲ）と非常に類似していた（図１ａ）。この断片をプローブとして、この遺伝子の完全長ｃＤＮＡを同定した。ＭｙＤ８８（２９６アミノ酸をコード）とＴＩＲＡＰ／Ｍａｌ（２３５アミノ酸）と比較すると、この遺伝子には２１３６ｂｐの長いオープンリーディングフレームがあり、７１２アミノ酸（配列番号２）をコードしていた（図１ｂ）。
【００３９】
このヒトＴＲＩＦアミノ酸配列がコードされたｃＤＮＡは未知の機能のマウスＴＲＩＦ  ｃＤＮＡクローン（アクセッション番号：ＸＭ１１０２４４、配列番号３）と５５％の相同性を示した。この遺伝子産物をＴＲＩＦ、即ちＩＦＮ−βを誘導するアダプターを含むＴＩＲ領域とした（図２）。
【００４０】
ＴＲＩＦのＴＩＲ領域は、ＴＲＩＦタンパク質のＣ末端側に存在した。また、ＴＬＲ中に保存されＴＬＲを介したシグナルの活性に必須なプロリン残基がみられた（図１ａ）（Science 282, 2085, 1998；J. Immunol. 162, 374, 1999；Nature 401, 811, 1999）。ＴＲＩＦの発現を、ヒトの組織から抽出した全ＲＮＡを用いてノーザンハイブリダイゼーションにより解析した。プローブとして、ヒトＴＲＩＦ ｃＤＮＡの６７８〜１４８１番目のｃＤＮＡ断片を、［32Ｐ］−ｄＣＴＰでメガプライムＤＮＡラベリングキット（Amersham社製）を用いてラベルし、human MTN blot（Clontech社製）のExpressHyb solution（Clontech社製）１０ｍｌで６５℃、１２時間ハイブリダイズを行った後、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃で３０分、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣで６５℃、３０分洗浄し、BioMax MSフィルム（KODAK社製）で現像を行った。その結果、脳、肺、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、骨格筋等多くの組織で観察され、特に肝臓で高発現していた（図１ｃ）。
【００４１】
（ＴＲＩＦによるＩＦＮ−βプロモーターとＮＦ−κＢ誘導活性）
ＭｙＤ８８及びＴＩＲＡＰの強制発現が、２９３細胞においてＮＦ−κＢの活性を誘導することを、ヒトＥＬＡＭ−１遺伝子のＮＦ−κＢ応答性プロモーター（配列番号５）のルシフェラーゼ活性を測定することにより解析した。（図３ａ、左）。ＴＲＩＦの発現はＭｙＤ８８或いはＴＩＲＡＰを介する誘導と比較して低水準ではあるが、ＮＦ−κＢの活性化を誘導した。ＬＰＳ（ＴＬＲ４リガンド）及び二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）（ＴＬＲ３リガンド）は、ＭｙＤ８８非依存的にＩＦＮ−βの発現を誘導した（Nat. Immunol. 3, 392, 2002、J. Immunol. 162, 374, 2002、Nature 413, 732, 2001）。次にマウスＩＦＮ−βプロモーター（配列番号６）活性をルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いて観察した（図３ａ、右）。レポータープラスミドと共に誘導されたＭｙＤ８８或いはＴＩＲＡＰの発現が誘導されたときは、プロモーター活性は観察されなかった。しかしながら、ＴＲＩＦの発現は、ＩＦＮ−βのプロモーター活性を劇的に誘導した。
【００４２】
ＴＲＩＦタンパク質内のプロモーターの活性に必須な領域を同定するために、末端欠損型ＴＲＩＦを数種類作製した。ＴＩＲ領域及びＴＲＩＦのＮ末端側半分（１〜５４１番目のアミノ酸）を含むものを△Ｃ、ＴＩＲ領域及びＴＲＩＦのＣ末端側半分（３８０番目〜Ｃ末端終点までのアミノ酸）含むものを△Ｎ、及びＴＩＲ領域でのみ構成されているものを△Ｎ△Ｃとした（図３ｂ）。２９３細胞にＮＦ−κＢ応答性ルシフェラーゼレポーターを共トランスフェクションさせると、△Ｃ或いは△Ｎの一方が全長ＴＲＩＦを介する誘導と比較して活性が減少しているものの、ルシフェラーゼ活性を誘導した（図３ｃ、左）。ＩＦＮ−βプロモーター由来ルシフェラーゼ遺伝子の場合、△Ｃは全長ＴＲＩＦによる誘導と同程度のプロモーター活性が認められたが、△Ｎでは認められなかった（図３ｃ、右）。△Ｎ△Ｃにおいては、ルシフェラーゼレポータープロモーターの活性は認められなかった。これらの結果により、ＴＲＩＦの明確な領域が次に挙げる２種類のプロモーターの活性化の原因となること、即ち、ＴＲＩＦのＮ末端の一部分はＩＦＮ−βプロモーター活性に必須であり、ＴＲＩＦのＮ末端とＣ末端双方の一部分はＮＦ−κＢの活性化に関与している、ということが示唆された。
【００４３】
（ＴＲＩＦ抑制型のＴＬＲ経由シグナル伝達経路への影響）
ＭｙＤ８８及びＴＩＲＡＰの場合と同様に、ＴＲＩＦのＴＩＲ領域（△Ｎ△Ｃ）の発現はドミナント阻害因子（dominant inhibitor）として作用した。全長ＴＲＩＦが誘導したＮＦ−κＢ及びＩＦＮ−βプロモーターの活性化はＴＲＩＦ△Ｎ△Ｃの発現により顕著に抑制された（図４ａ）。ＴＲＩＦ△Ｎ△Ｃを用いて、ＴＲＩＦがＴＬＲ依存性シグナル伝達経路であるかどうかを解析した。２９３細胞におけるＴＬＲ４／ＭＤ−２の発現は、この細胞がＬＰＳに応答してＮＦ−κＢレポーターを活性化することを可能にした。ＴＲＩＦ△Ｎ△Ｃの共発現は、ＴＬＲ４−に依存したＮＦ−κＢの活性化を阻害（inhibit）した（図４ｂ）。さらに、ＴＬＲ−２及びＴＬＲ−７に依存したＮＦ−κＢの活性化は、ＴＲＩＦ△Ｎ△Ｃの発現により抑制（prohibit）された（図４ｃ、ｄ）。ＭｙＤ８８及びＴＩＲＡＰの強制発現は、ＮＦ−κＢのリガンド非依存的な活性化をもたらした。ＴＲＩＦ△Ｎ△Ｃの共発現は、ＭｙＤ８８及びＴＩＲＡＰを介したＮＦ−κＢの活性化を顕著に阻害した（図４ｅ、ｆ）。これらの結果により、ＴＲＩＦがＭｙＤ８８及びＴＩＲＡＰの下流で多くのＴＬＲ仲介シグナル伝達経路に関与していることが示唆された。
【００４４】
他のＴＬＲメンバーと比較して、ＴＬＲ３は、ＩＬ−１２及びＴＮF−ａ（Biochem. Biophys. Res. Commun. 293, 1364, 2002）のような他の炎症性サイトカインよりもさらに優性にＩＦＮ−βを誘導する独自のシグナル経路を介している。安定してＴＬＲ３を発現している２９３細胞に、１００ｎｇのレポータープラスミドをlipofectamine 2000（Invitrogen社製）を用いてトランスフェクションし、２４時間後に５０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）で８時間刺激すると、ＮＦ−κＢ及びＩＦＮ−βプロモーターの両方が活性化された（図４ｅ、ｆ）。ＭｙＤ８８及びＴＩＲＡＰの抑制型の共発現は、ＩＦＮ−βプロモーター及びＮＦ−κＢ応答性ＥＬＡＭ−１プロモーターの活性をポリ（Ｉ：Ｃ）依存的に阻害しなかったことから、ＴＬＲ−３シグナルは主にＭｙＤ−８８非依存的経路で構成されていることを示している（図４ｅ、ｆ）。ＴＲＩＦの強制発現はＩＦＮ−βプロモーターを優位的に活性化したことから、我々はＴＬＲ３シグナルにおけるＴＲＩＦの役割に焦点を当てた。ＭｙＤ８８及びＴＩＲＡＰの抑制型に対する明確な対照として、ＴＲＩＦ△Ｎ△ＣはＴＬＲ３を安定して発現する２９３細胞において、両プロモーターのポリ（Ｉ：Ｃ）依存的な活性を阻害した。これらの結果は、ＴＲＩＦがＴＬＲ３シグナルのＭｙＤ８８非依存的活性化に関与していることを示している。
【００４５】
（ＴＲＩＦによるＴＬＲ３及びＩＲＦ−３の認識）
ＴＲＩＦが、ＴＬＲ３或いはＴＬＲ２を認識するかどうかを解析した。ヒト腎細胞２９３細胞に７μｇのＦｌａｇ−ＴＬＲ２（ＦｌａｇがタグされたＴＬＲ２：Flag-tagged TLR2）若しくはＦｌａｇ−ＴＬＲ３（ＦｌａｇがタグされたＴＬＲ３：Flag-tagged TLR3）と、３μｇのＭｙｃ−ＴＲＩＦ（ＭｙｃがタグされたＴＲＩＦ：Myc-tagged TRIF）をトランスフェクションし、一過性発現させた。ｍｏｃｋ（対照）群においては、空のベクターを１０μｇトランスフェクションしたものを用いた。トランスフェクションの３６時間後、細胞を０．１５％ＮＰ−４０、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸塩、１ｍＭ  Ｎａ3ＶＯ4、及びプロテアーゼ阻害剤（混合物はRoche Diagnostics社製）を含む溶菌バッファー中で溶解した。
【００４６】
細胞溶解液をProtein G-sepharose（Amersham社製）を用いて前精製を１時間行い、次に２μｇの抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体（anti-Flag M2 antibody：Sigma社製）、２μｇの抗Ｍｙｃ ＰＬ１４抗体（anti-Myc PL14 antibody：ＭＢＬ社製）もしくは１μｇの抗ヒトＩＲＦ−３抗体（anti-human IRF-3 antibody:SantaCruz社製）及びProtein G-sepharose（Amersham社製）で２時間免疫沈降を行った（図５ａ）。免疫沈降物を、溶解バッファーで洗浄した後、ＳＤＳサンプルバッファーに溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量別に分離し、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（BIO-RAD社製）に移した。Flag-Taggedタンパク質及びMyc-Taggedタンパク質は、それぞれＨＲＰ標識抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体もしくはＨＲＰ標識抗Ｍｙｃ ９Ｅ１０抗体（SantaCruz社製）とそれぞれ反応させた。内因性のＩＲＦ−３は抗ヒトＩＲＦ−３抗体及びＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Amersham社製）と反応させ、抗体によって認識されたバンドをＥＣＬシステム（PerkinElmer Life Sciences社製）により検出した。
【００４７】
既に報告したとおり、ＭｙＤ８８及びＴＩＲＡＰのＴＩＲ領域はＴＬＲとの相互作用に必須である。そこで、ＴＲＩＦのＴＩＲ領域（△Ｎ△Ｃ）がＴＬＲ３を認識するかどうかを解析した。Ｆｌａｇ−ＴＬＲ３を安定的に発現させた２９３細胞に、空のベクター若しくはＭｙｃ−ＴＲＩＦ（△Ｎ△Ｃ）発現ベクター（１０μｇ）をトランスフェクションし、一過性発現させた。Ｍｙｃ−ＴＲＩＦ△Ｎ△ＣをＦｌａｇ−ＴＬＲ３で免疫沈降した後、上記と同様の方法により免疫ブロットを行った。その結果、ＴＲＩＦがＴＩＲ領域を介してＴＬＲ３を認識する（図５ｂ）ことから、ポリ（Ｉ：Ｃ）．ポリ（Ｉ：Ｃ）に応答してＩＦＮ−βの誘導を介し、ＬＰＳによる刺激がＩＲＦ−３を活性化することを示唆された（J. Biol. Chem. 274, 35535, 1999、FEBS Lett. 517, 251, 2001）。
【００４８】
さらに、ＴＲＩＦが、内因性のＩＲＦ−３を認識するかどうかを解析した。２９３細胞に５μｇのＦｌａｇ−ＧＳＴもしくはＦｌａｇ−ＴＲＩＦ発現ベクターをトランスフェクションし、一過性発現させた。トランスフェクション２４時間後に細胞を溶解し、全細胞溶解物を抗Ｆｌａｇ抗体、若しくは抗ヒトＩＲＦ−３抗体と共に免疫沈降した後、抗Ｆｌａｇ抗体を用いて、上記と同様の方法により免疫ブロットを行った。また、内因性ＩＲＦ−３を検出するために、全細胞溶解物（whole cell lysate：ＷＣＬ）を抗ＩＲＦ−３抗体を用いて免疫ブロットした。その結果、ＴＲＩＦがＩＲＦ−３に認識されることから、ＴＲＩＦがＩＲＦ−３と相互作用することが示唆された（図５ｃ）。
【００４９】
［考察］
本実験において、ＴＩＲ領域を含む新規アダプター分子を同定してＴＲＩＦと命名し、解析を行った。ＴＲＩＦの過剰発現は、ＥＬＡＭ−１遺伝子のＮＦ−κＢ応答性プロモーターと同様、ＩＦＮ−β遺伝子のプロモーターを活性化した。既に公知であるアダプター分子であるＭｙＤ８８やＴＩＲＡＰとは異なり、ＴＲＩＦはＮＦ−κＢ応答性プロモーターと比較してＩＦＮ−βプロモーターを優位的に活性化させた。注目すべき点は、ＴＲＩＦの抑制型は、ＭｙＤ８８或いはＴＩＲＡＰではなく、完全にＴＬＲ３を介したシグナルを阻害したことである。このことは、ＴＬＲ３シグナルにおけるＴＲＩＦの特異的な役割を示している。さらに、ＴＲＩＦの抑制型は、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、或いはＴＬＲ７を介したＮＦ−κＢ活性を阻害することから、他のＴＬＲシグナル経路において何らかの役割が存在することが示唆される。それぞれのＴＬＲ応答におけるＴＲＩＦの機能的役割がノックアウトマウスの発生の過程で観察されたとしても、ＴＲＩＦが優位的にＩＦＮ−βプロモーターを活性化させ、ＴＲＩＦがＩＲＦ−３と認識するということは、ＴＲＩＦがＴＬＲ３シグナルのＭｙＤ８８非依存的経路においてＴＲＩＦが関与していることを示している。
【実施例２】
【００５０】
Toll-like receptor（ＴＬＲ）の刺激は、炎症性サイトカインの産出を導く共通のＭｙＤ８８依存経路、及びＩＦＮ−βの生成を導き、ＴＬＲ３及びＴＬＲ４シグナルに独特のＭｙＤ８８非依存経路の活性化を誘因する。本実施例で、本発明者は、ＴＩＲドメインを含むアダプター、ＴＲＩＦをコードする遺伝子を破壊し、ＴＲＩＦ欠損マウスを作製して、ＴＲＩＦのＴＬＲを経たシグナル伝達経路における役割について更に明らかにした。
【００５１】
すなわち、ＴＲＩＦ欠損マウスには、ＴＬＲ３及びＴＬＲ４を介したＩＦＮ−βの発現及びＩＲＦ−３の活性化に欠陥があった。更に、ＴＬＲ４を介した、炎症性サイトカインの産出が、ＴＲＩＦ欠損マクロファージで、消失していた。ＭｙＤ８８及びＴＲＩＦの両方が欠損したマウスでは、ＴＬＲ４刺激に応答したＮＦ−κＢの活性化が完全に喪失していた。これらの結果は、ＴＲＩＦが、ＴＬＲ３及びＴＬＲ４を介したシグナル経路に必須であることを立証した。
【００５２】
［ＴＲＩＦ欠損マウスの作製と機能の解明］
材料と方法
（ＴＲＩＦ欠損マウスの作製）
ＥＳ細胞（Ｅ１４．１）のゲノムＤＮＡから、ＰＣＲ法で、Takara LA TaqTM（TaKaRa社製）を使用して、Trif遺伝子を単離した。ＴＲＩＦ  ＯＲＦ全体をコードする２．１Ｋｂ断片をネオマイシン耐性遺伝子カセット（ｎｅｏ）で置換して、ターゲティングベクターを構築した。負の選択のために、ＰＧＫプロモーターにより促進された単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼを、ゲノム断片に挿入した（図１ａ）。ターゲティングベクターをＥＳ細胞に挿入した後、Ｇ４１８及びgancyclovir二重耐性コロニーを選択し、ＰＣＲ法及びサザンブロット法でスクリーニングした。相同的な組替え体をＣ５７ＢＬ／６メスのマウスに注入し、ヘテロＦ１子をインタークロスして、ＴＲＩＦ欠損マウスを作製した。ＴＲＩＦ欠損マウスとそれらをインタークロスした野生型の同腹子とを実験に使用した。
【００５３】
（抗体）
Ｒ−４８４は株式会社ジャパンエナジー、医薬バイオ研究所から提供された。ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドを、文献記載に準じて調製した。サルモネラ内毒素Ｒｅ５９５からのＬＰＳを、フェノールクロロフォルム石油エーテル抽出過程により調製した。S.aureus（黄色ブドウ球菌）からのＰＧＮ及びポリ（Ｉ：Ｃ）は、それぞれFluka社及びAmersham社から購入した。抗phosphoＪＮＫ抗体及び抗ＥＲＫ１／２抗体は、Cell Signaling社より購入した。抗ＪＮＫ１抗体は、Santa Cruz社から購入した。免疫沈降又は免疫ブロット用に、ＴＲＩＦマウスのアミノ酸６７２〜６８４又は７１８〜７３２に対するポリクロナール抗ＴＲＩＦ抗体を、それぞれ産出した。ＩＦＲ−３マウスのアミノ酸１３１〜１４４に対するポリクロナール抗ＩＲＦ３抗体を産出した。ＦＡＣＳ分析を行った抗ＩｇＭ抗体は、Jackson ImmunoResearch Laboratoryから購入した。
【００５４】
（電気泳動度シフト法）
胎児の繊維芽細胞及び肺繊維芽細胞（１×１０6）を、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳ、５０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）及び１０ｎｇ／ｍｌＴＮＦ−αで、示された時間刺激した。細胞から核抽出物を精製し、ＮＦ−κＢ  ＤＮＡ結合部位用の特異のプローブとインキュベートし、電気泳動し、文献記載に準じて、オートラジオグラフィで視覚化した（Immunity 9:143,1998）。
【００５５】
（炎症誘発性サイトカイン濃度の測定）
９６well plateで、ＰＧＮ、ＬＰＳ、Ｒ−８４８又はＣｐＧ  ＤＮＡの示された濃度で、チオグリコール酸が誘出した腹腔マクロファージを培養した（well毎に５×１０4細胞）。腹腔マクロファージが産出したＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０を、製造者の指示に従って、ＥＬＩＳＡで測定した（Genzyme社製）。
【００５６】
（Ｂ細胞増殖分析）
９６well plateで、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＬＰＳ、Ｒ−８４８又はＣｐＧ  ＤＮＡの示された濃度で、２４時間脾細胞（１×１０5）を培養した。１マイクロキュリーの［3Ｈ］チミジンを、後半の１２時間パルスし、次に［3Ｈ］摂取量を、βシンチレーション計数器（Packard社製）で測定した。
【００５７】
（フローサイトメトリー分析）
２００万の脾細胞を、５０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳ又は１０μｇ／ｍｌの抗ＩｇＭ抗体で培養した。３６時間の培養後、細胞を収集し、ＰＥ共役抗Ｂ２２０抗体及びビオチン共役抗ＣＤ６９抗体、抗ＣＤ８６抗体、抗Ｉ−Ａｂ抗体、その後ストレプトアビジンＦＩＴＣで染色した。染色した細胞はCellQuest software（Becton Dickison 社製）を使用して、ＦＡＣＳ  Caliburで分析した。
【００５８】
（ウェスタンブロット分析）
肺繊維芽細胞（１×１０6）を、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳで、示された時間刺激した。次に、１．０％  Nonidet-P 40、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ及びプロテアーゼ抑制カクテル（Roche社製）を含む溶解緩衝液内で、細胞を溶解した。細胞溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）で分解し、ＰＶＤＦ細胞膜（BioRad社製）上に移動した。細胞膜は、抗phosphoＪＮＫ抗体又は抗ＪＮＫ１抗体でブロットし、強化された化学発光システムにより視覚化した（NEN Life Science Product社製）。
【００５９】
（肺繊維芽細胞の調整）
マウスの肺を切除し、ＰＢＳ内で洗浄し、小さく切断し、攪拌し、３０分間３７℃で酵素消化した。消化緩衝液（１０ｍｌ／肺）は、４００ｎＭのＥＤＴＡを含む０．２５％のトリプシン溶液である。生じた細胞懸濁液に、冷えた完全ＤＭＥＭ培地を加えた。遠心分離（１１００ｒｐｍ、５分間）した後、ペレットを完全培地に再び懸濁し、その後皿で培養した。切除から１０日で、肺繊維芽細胞を各実験に使用した。
【００６０】
（Native−ＰＡＧＥ分析：非還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
肺繊維芽細胞（１×１０6）及び腹腔マクロファージ（５×１０6）を、それぞれ５０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）及び１μｇ／ｍｌのＬＰＳで、示された期間刺激し、その後溶解した。native−ＰＡＧＥサンプル緩衝液内の細胞溶解物（６２．５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ６．８、１５％のグリセロール及び１％のデオキシコラーテ）を、native−ＰＡＧＥで単離し、その後文献記載に準じて、抗ＩＲＦ−３抗体で免疫ブロットした（Int. Immunol. 14, 783, 2002）。
【００６１】
［実験結果と考察］
Toll-like receptor（ＴＬＲ）は、微生物の構成成分の特異なパターンを認識し、ＭｙＤ８８、ＴＩＲＡＰ及びＴＲＩＦ等のＴｏｌｌ／ＩＬ−１レセプター（ＴＩＲ）ドメインを有するアダプターを経由した、シグナル伝達経路の活性化を通じて、自然免疫反応を誘発する（Annu. Rev. Immunol. 20:197,2002; Annu. Rev. Immunol. 21:335,2003）。ＭｙＤ８８は、全てのＴＬＲに共通のアダプターであるが、ＴＩＲＡＰはＴＬＲ２及びＴＬＲ４を介したシグナル経路に特異的に関与している（Nat. Immunol. 2, 675, 2001、Nature 420, 324, 2002、Nature 420, 329, 2002）。共通のＭｙＤ８８依存経路に加えて、ＴＬＲ３及びＴＬＲ４は、ＩＲＦ−３の活性化とＩＦＮ―βの誘導を導くＭｙＤ８８非依存経路を使用している（J. Immunol. 167, 5887, 2001、Int. Immunol. 14, 1225, 2002、Immunity 17, 251, 2002）。ＩＦＮ−βを誘導するＴＩＲドメインを有するアダプター（ＴＲＩＦ）が、ＩＦＮ−βプロモーターを活性化し、ＴＬＲ３と関連する、ＴＩＲドメインを有する、第３のアダプターであると同定した（J. Immunol. 169, 6668, 2002、Nat. Immunol. 4, 161, 2003）。
【００６２】
ＴＲＩＦの生理学的な役割を評価するために、本発明者は、胚性幹（ＥＳ）細胞内の相同組換えを行って、ＴＲＩＦが欠損したマウスを作製した。マウスTrif遺伝子は、１つのエクソンで構成されている。本発明者は、１つのエクソン全体をネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）で置換した、ターゲティングベクターを構築した（図６Ａ）。正しくターゲットされたＥＳ細胞クローンを使用して、突然変異対立遺伝子を有するマウスを作製した（図６Ｂ）。Trif遺伝子を破壊したホモ接合体の突然変異マウスは、想定されたメンデル比で出生し、健康に発育した。ノーザンブロット分析は、突然変異マウスの腹腔マクロファージが、ＴＲＩＦ  ｍＲＮＡを発現しないことを示唆した（図６Ｃ）。肺繊維芽細胞の免疫ブロット分析により、Trif遺伝子を破壊すると、ＴＲＩＦタンパク質の発現が消失することを確認した（図６Ｄ）。
【００６３】
初期のインビトロの研究は、ＴＲＩＦが、ＴＬＲ３を介したＩＦＮ−βの誘導に関与していることを示唆していた（J. Immunol. 169:6668,2002; Nat. Immunol. 4:161,2003）。したがって、本発明者は、まず、腹腔マクロファージにおいてポリ（Ｉ：Ｃ）刺激で誘導されるＩＦＮ−β及びＲＡＮＴＥＳ、ＩＰ−１０、及びＭＣＰ−１などの幾つかのＩＦＮ誘導性遺伝子のｍＲＮＡを分析した（図７Ａ）。ＴＲＩＦ-/-マウスのマクロファージでは、ポリ（Ｉ：Ｃ）に応答したＩＦＮ−β及びＩＦＮ誘導性遺伝子の発現が欠陥を示した。これは、ＴＬＲ３-/-マウスで見られた結果と一致した（Nature 413, 732, 2001）。更に、ＴＲＩＦ-/-マウスの脾細胞は、ポリ（Ｉ：Ｃ）に応答した、増殖に著しい欠陥を示した。しかし、ＴＬＲ９リガンドＣｐＧ  ＤＮＡには正常に応答した（図７Ｂ）。ＴＲＩＦ-/-Ｂ細胞は、ポリ（Ｉ：Ｃ）誘導性の、ＣＤ６９、ＣＤ８６及びＭＨＣクラスIIの細胞表面上の発現の増加に著しい欠陥があったが、抗ＩｇＭ抗体誘導性では障害はなかった（図７Ｃ）。したがって、ＴＲＩＦ-/-マウス及びＴＬＲ３-/-マウスは、ポリ（Ｉ:Ｃ）に対する応答に欠陥があり、ＴＲＩＦが、ＴＬＲ３を介したシグナル経路に必須であることを示唆した。
【００６４】
ＴＬＲ３リガンドに加えて、ＴＬＲ４リガンドＬＰＳが、ＩＦＮ−β及びＩＦＮ誘導性遺伝子の発現をＭｙＤ８８非依存性に誘導することを示した（J. Immunol. 167, 5887, 2001、Int. Immunol. 14, 1225, 2002、Immunity 17, 251, 2002）。本発明者らは、胎児の繊維芽細胞におけるＬＰＳ刺激で誘導されるＲＡＮＴＥＳ、ＩＰ−１０及びＭＣＰ−１などのＩＦＮ誘導性遺伝子のｍＲＮＡを分析した（図８Ａ）。ＴＲＩＦ-/-細胞では、ＬＰＳが誘導するＩＦＮ誘導性遺伝子の発現は著しく減少した。したがって、ＴＲＩＦ-/-マウスは、ＬＰＳに対するＭｙＤ８８非依存的応答に欠陥があった。
【００６５】
次に、ＭｙＤ８８依存性で誘導される、幾つかのＴＬＲリガンドに応答した、炎症性サイトカインの産出を分析した（図８Ｂ）。野生型及びＴＲＩＦ-/-のマクロファージは、両方とも、ＴＬＲ２リガンドベプチドグリカン、ＴＬＲ７リガンドＲ−８４８及びＴＬＲ９リガンドＣｐＧ  ＤＮＡに応答して、同程度のレベルのＩＬ−１２ｐ４０を生成した。
【００６６】
しかし、ＬＰＳが誘導するＴＮＦ−α、ＩＬ−６、及びＩＬ−１２ｐ４０の生成は、ＴＲＩＦ-/-マクロファージでは、消失した（図８Ｂ、Ｃ）。さらに、ＴＲＩＦ-/-マウスの脾細胞は、Ｒ−８４８に応答して、通常通り増殖するにもかかわらず、ＬＰＳに応答した増殖では著しい欠陥を示した（図８Ｄ）。さらに、ＬＰＳが誘導するＣＤ６９及びＣＤ８９発現の増加は、ＴＲＩＦ-/-Ｂ細胞では、抗ＩｇＭ抗体が誘導する発現が通常通りであったにもかかわらず、著しく減少した（図８Ｅ）。したがって、ＴＲＩＦ-/-マウスは、ＭｙＤ８８依存経路及びＭｙＤ８８非依存経路が介するＬＰＳに対する応答に欠陥を示した。
【００６７】
ＴＬＲ３及びＴＬＲ４を通るＭｙＤ８８非依存経路では、ＩＲＦ−３転写遺伝子が活性化されていると報告されていた（J. Immunol. 167, 5887, 2001、Int. Immunol. 14, 1225, 2002、Immunity 17, 251, 2002）。
【００６８】
確かに、native-ＰＡＧＥ分析（非還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動）は、野生型の肺繊維芽細胞及び腹腔マクロファージでそれぞれ、ポリ（Ｉ：Ｃ）及びＬＰＳ誘導性の、ＩＲＦ−３二量体が形成されたことを示した（図９Ａ、Ｂ）。しかし、ＴＲＩＦ-/-細胞では、ポリ（Ｉ：Ｃ）又はＬＰＳ誘導性のＩＲＦ−３の二量体は形成されなかった。この観察結果は、ＴＬＲ３及びＴＬＲ４シグナリングにおけるＭｙＤ８８非依存経路の活性化に、ＴＲＩＦが必須であることを示している。ＩＲＦ−３に加えて、ＮＦ−κＢは、野生型の肺繊維芽細胞で、ポリ（Ｉ：Ｃ）に応答して、活性化した（図９Ｃ）。ＴＬＲ３-/-及びＴＲＩＦ-/-細胞で、ポリ（Ｉ：Ｃ）誘導性ＮＦ−κＢ活性化は著しく低下し、ＴＬＲ３が介するシグナル経路で、ＴＲＩＦが重要な役割を持つことを示唆した。それとは対照的に、ＬＰＳ刺激は、ＴＲＩＦ-/-胎児繊維芽細胞でも、ＮＦ−κＢ及びＭＡＰキナーゼＪＮＫのほぼ通常通りの活性化を導いた（図９Ｄ）。ＴＬＲ４シグナリングでは、ＭｙＤ８８依存経路は、ＮＦ−κＢ及びＭＡＰキナーゼの初期相（early phase)の活性化を導くが、ＭｙＤ８８非依存経路は、ＭｙＤ８８-/-細胞内の遅延したＮＦ―κＢ及びＭＡＰキナーゼ活性化で立証されているように、ＮＦ−κＢ及びＭＡＰキナーゼの、遅延相（late phase）の活性化を導く（J. Immunol. 167, 5887, 2001、Immunity 11, 115, 1999）。
【００６９】
そこで、本発明者は、ＴＲＩＦ依存性の遅延したＮＦ−κＢ及びＪＮＫ活性化の欠陥が、ＴＲＩＦ-/-マウスのＭｙＤ８８依存性の早期活性化により遮蔽されていると仮定し、ＴＲＩＦ及びＭｙＤ８８の両方が欠損したマウスを作製した。ＴＲＩＦ／ＭｙＤ８８ダブルノックアウトマウスの胎児繊維芽細胞では、ＬＰＳが誘導するＮＦ−κＢ及びＪＮＫの活性化が完全に消失していた（図９Ｅ）。更に、例えばＩＰ−１０、ＭＣＰ−１及びＲＡＮＴＥＳなどのＩＦＮ誘導性遺伝子のＬＰＳによる誘導は、ＴＲＩＦ／ＭｙＤ８８ダブルノックアウト細胞では全く観察されなかった（図９Ｆ）。これらの観察結果は、ＴＬＲ４が介するＭｙＤ８８非依存性経路の活性化に、ＴＲＩＦが必須であることを明確に示した。
【００７０】
本発明者は、ＴＲＩＦ-/-マウスの分析で明らかになったＴＲＩＦの生理学的機能を報告する。ＴＲＩＦ-/-マウスは、ＴＬＲ３及びＴＬＲ４リガンドが誘導するＭｙＤ８８非依存性の応答において、著しい欠陥があった。ＴＲＩＦ-/-マウスでは、すべてのポリ（Ｉ：Ｃ）誘導性応答が消失していたので、ＴＲＩＦは、ＴＬＲ３シグナル経路では、ＴＬＲ３シグナリングに必須のアダプターである。ＴＬＲ４刺激では、ＴＲＩＦ-/-マウスは通常のＬＰＳ誘導性ＭｙＤ８８依存性ＮＦ−κＢ及びＭＡＰキナーゼ活性化を示したにもかかわらず、ＬＰＳ誘導性の炎症性サイトカインの産出には欠陥があった。ＭｙＤ８８及びＴＩＲＡＰは、ＴＬＲ４シグナル経路において、重要な役割を持つことが示された。
【００７１】
本発明者の観察結果は、恐らくＴＬＲ４とこれら３つ（又はそれ以上）のＴＩＲドメインを有するアダプターとの大きな複合体の形成を通じて、ＴＲＩＦが、ＭｙＤ８８依存経路にも関与していることを示唆した。ＩＦＮ−βプロモーターの活性化にはＮ末端部分だけが関与していたが、ＮＦ−κＢ活性化は、ＴＲＩＦのＮ末端及びＣ末端部分の両方が誘導されることを示された（J. Immunol. 169, 6668, 2002）。したがって、ＴＲＩＦのＣ末端部分は、ＴＬＲ４シグナリングのＭｙＤ８８依存経路において必要となる可能性がある。本発明者は、ウイルス感染に重要な役割を持つと想定される、ＭｙＤ８８非依存経路を調節する必須のアダプターを同定した。ウイルス感染へのＴＲＩＦの関与に関する、ＴＲＩＦ-/-マウスの細かな分析は、ＴＬＲとウイルス認識との関係に新たな見識を提供する。
【００７２】
［実施例２における図面の解説］
図６は、突然変異Trif遺伝子の標的欠損について示す図である。
（Ａ）Trif遺伝子、ターゲッティングベクター、及び予測した欠損遺伝子の構造。塗りつぶしたボックスは、コードしたエクソンを示す。制限酵素：H、Hinc II。
（Ｂ）ヘテロ接合体をインタークロスして出生した子のサザンブロットによる分析。ゲノムＤＮＡを、マウス尾部から抽出し、Hinc IIで消化し、電気泳動し、ａで示したラジオラベルしたプローブとハイブリダイズした。サザンブロット分析したところ、野生型（＋／＋）では、単一の３．８ｋｂバンドを、ホモ接合体（−／−）では、６．１ｋｂバンドを、又、ヘテロ接合型（＋／−）では両方を生じた。
（Ｃ）胎児繊維芽細胞のノーザンブロット分析。胎児の繊維芽細胞から抽出した全ＲＮＡ（１０μｇ）を電気泳動し、ナイロン細胞膜に移動し、ＴＲＩＦ断片をプローブとして、ハイブリダイズした。同じ細胞膜を、β−アクチンプローブで再度ハイブリダイズした。
（Ｄ）ＴＲＩＦの内因性発現。胎児の繊維芽細胞から調製した細胞溶解物を、抗ＴＲＩＦ抗体で、免疫沈殿した。次に、免疫沈澱物を別の抗ＴＲＩＦ抗体で、免疫ブロットした。タンパク質発現を調べるために、ＥＲＫ１／２に対する抗体で、同じ溶解物にブロットした。
図７は、ＴＲＩＦ欠損細胞内のポリ（Ｉ：Ｃ）応答の欠陥について示す図である。
（Ａ）腹腔マクロファージを、５０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）で、示された時間刺激した。全ＲＮＡ（５μｇ）を抽出し、ＩＦＮ−β、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＣＰ−１の発現を調べるために、ノーザンブロット分析を行った。同じ細胞膜を、β−アクチンプローブで再度ハイブリダイズした。
（Ｂ）ポリ（Ｉ：Ｃ）又はＣｐＧ  ＤＮＡで刺激した脾細胞の増殖。ポリ（Ｉ：Ｃ）又はＣｐＧ  ＤＮＡの示された濃度で、脾細胞を２４時間培養した。［3Ｈ］チミジン（１μＣｉ）を後半の１２時間パルスした。［3Ｈ］チミジン取り込みを、シンチレーション計数器（Packard社製）で測定した。
（Ｃ）脾臓Ｂ２２０＋細胞を、５０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）又は１０μｇ／ｍｌの抗ＩｇＭ抗体と共に培養した。３６時間の培養後、細胞を収集し、ビオチン共役抗ＣＤ６９抗体若しくは抗ＣＤ８６抗体で、又は抗Ｉ−Ａb抗体に続いてストレプトアビジンＰＥで染色した。Cell Quest softwareを使用して、ＦＡＣＳ Caliburで染色した細胞を分析した。
【００７３】
図８は、ＴＲＩＦ欠損細胞内のＬＰＳに対する応答の欠陥について示す図である。
（Ａ）胎児の繊維芽細胞を、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳで、示された時間刺激した。全ＲＮＡ（１０μｇ）を抽出し、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＣＰ−１の発現を調べるために、ノーザンブロット分析を行った。同じ組織膜をβ−アクチンプローブで再度ハイブリダイズした。
（Ｂ）ＴＲＩＦ欠損マウス又は野生型のマウスからの腹腔マクロファージを、刺激しない状態にしたか、又は１０μｇ／ｍｌのペプチドグリカン（ＰＧＮ）、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ、１００ｎＭのＲ−８４８、３０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ-γの存在下の１μＭのＣｐＧ  ＤＮＡで刺激した。ＥＬＩＳＡによるＩＬ−１２ｐ４０分析のために、２４時間後に、上澄みを収集した。表示値は、平均値±標準偏差の３倍である。
（Ｃ）腹腔マクロファージを、３０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γの存在下、示されたＬＰＳ濃度で、２４時間刺激し、上澄みにＥＬＩＳＡを行い、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０を測定した。表示値は、平均値±標準偏差の３倍である。
（Ｄ）ＬＰＳ又はＣｐＧ  ＤＮＡで刺激した脾細胞の増殖。脾細胞を、ＬＰＳ又はＣｐＧ  ＤＮＡの示された濃度で、２４時間培養した。［3Ｈ］チミジン（１μＣｉ）を後半の１２時間パルスした。［3Ｈ］チミジン取り込みを、シンチレーション計数器（Packard社製）で測定した。
（Ｅ）脾細胞Ｂ２２０＋を、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳ又は１０μｇ／ｍｌの抗ＩｇＭ抗体で培養した。３６時間培養した時点で、細胞を収穫し、ビオチン共役抗ＣＤ６９抗体又はＣＤ８６抗体で染色し、続いてストレプタビジンＰＥで染色した。Cell Quest softwareを使用して、ＦＡＣＳ Caliburで、染色した細胞を分析した。
【００７４】
図９は、ＴＲＩＦ欠損及びＴＲＩＦ／ＭｙＤ８８ダブルノックアウト細胞におけるシグナルカスケードの活性化（Ａ及びＢ）について示す図である。
肺繊維芽細胞（Ａ）又は腹腔マクロファージ（Ｂ）を、（Ａ）５０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）又は（Ｂ）１μｇ／ｍｌのＬＰＳで、示された時間刺激した。細胞可溶物を調製し、native-PAGEを行った。ウェスタンブロット法により、ＩＲＦ−３の単量体（矢印）又は、二量体（矢頭）を検出した。
（Ｃ及びＤ）（Ｃ）５０μｇ／ｍｌポリ（Ｉ：Ｃ）及び（Ｄ）１０μｇ／ｍｌのＬＰＳで、繊維芽細胞を、示された時間刺激した。核抽出物を調製し、ＮＦ−κＢ特異プローブを使用して、ＥＭＳＡで、ＮＦ−κＢ  ＤＮＡ結合活性化を測定した。矢印及び米印は、誘導されたＮＦ−κＢ複合体及び非特異バンドを、それぞれ示している（上パネル）。細胞抽出物に対する抗phosphoＪＮＫ特異抗体を使用して、ＬＰＳ刺激細胞のＪＮＫ活性化を、ウエスタンブロット法で、測定した（下パネル）。（Ｆ）野生型及びＴＲＩＦ／ＭｙＤ８８ＤＫＯマウスの胎児の繊維芽細胞を、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳで、示された時間刺激した。全ＲＮＡ（１０μｇ）を抽出し、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＣＰ−１の発現を調べるために、ノーザンブロット法で分析した。同じ細胞膜をβ―アクチンプローブで、再度ハイブリダイズした。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】本発明の実施例において同定したヒトＴＲＩＦ（ｈＴＲＩＦ）を示す図である。ａは、ヒトＴＲＩＦのアミノ酸配列と、既知であるｓｍａｒｔ００２５５  ＴＩＲのアミノ酸配列との比較を、ｂは、ＴＲＩＦ、ＭｙＤ８８、及びＴＩＲＡＰ／Ｍａｌの構造模式図を、ｃは、ヒトＴＲＩＦ ｍＲＮＡの組織分布をそれぞれ示す。
【図２】本発明の実施例において、ヒトＴＲＩＦとマウスＴＲＩＦのアミノ酸配列を比較したことを示す図である。枠で囲った配列はＴＩＲドメインを示す。
【図３】本発明の実施例において、ＴＲＩＦが、ＩＮＦ−βプロモーター及びＮＦ−κＢの活性を誘導することを示す図である。
【図４】本発明の実施例において、ＴＲＩＦの抑制型が、ＴＬＲ経由のシグナル伝達経路の活性化を阻害することを示す図である。
【図５】本発明の実施例において、ＴＲＩＦのＴＩＲ領域が、ＴＬＲ３及びＩＲＦ−３を認識することを示す図である。なお、図中のＩＰは、免疫沈降に用いた抗体を、ＩＢは、免疫ブロットに用いた抗体をそれぞれ示す。
【図６】本発明の実施例において、突然変異Trif遺伝子の標的欠損について示す図である。
【図７】本発明の実施例において、ＴＲＩＦ欠損細胞内のポリ（Ｉ：Ｃ）応答の欠陥について示す図である。
【図８】本発明の実施例において、ＴＲＩＦ欠損細胞内のＬＰＳに対する応答の欠陥について示す図である。
【図９】本発明の実施例において、ＴＲＩＦ欠損及びＴＲＩＦ／ＭｙＤ８８ダブルノックアウト細胞におけるシグナルカスケードの活性化について示す図である。
【図１】
2004173679.tif 000002
【図２】
2004173679.tif 000003
【図３】
2004173679.tif 000004
【図４】
2004173679.tif 000005
【図５】
2004173679.tif 000006
【図６】
2004173679.tif 000007
【図７】
2004173679.tif 000008
【図８】
2004173679.tif 000009
【図９】
2004173679.tif 000010
【配列表】
2004173679000001.app