(57)【要約】【課題】　ＣＤ４の異なる５側面領域の１つが示す表面に類似した表面を有する化合物を開示する。好ましくない免疫応答を特徴とする状態に罹患した又はかかりやすいと疑われる個人の治療方法であって、ＣＤ４糖タンパク質の側面の一部を模倣する少なくとも１種の化合物を該個人に投与することを含む治療方法を開示する。【解決手段】　本発明の化合物は、２０アミノ酸以下を含み、Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ、Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ、Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ、Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０、Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ、Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ、Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ、Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６６、Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ、及びＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏから成る群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、Ｔ細胞増殖を阻害することができる。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．３１、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．３２、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．３３、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．３４、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．３５、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．３６、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．３７、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．３８、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．３９、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．４０、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．５９、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．６０、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．６１、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．６２、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．６３、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．６４、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．６５、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．４３、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．４４、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．４５、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．４６、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．４７、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．４８、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．４９、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．５０、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．５１、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．５２、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．５３、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．５４、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．５５、若しくはＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．５６、又は、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．３１、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．３２、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．３３、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．３４、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．３５、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．３６、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．３７、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．３８、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．３９、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．４０、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．５９、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．６０、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．６１、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．６２、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．６３、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．６４、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．６５、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．４３、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．４４、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．４５、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．４６、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．４７、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．４８、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．４９、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．５０、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．５１、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．５２、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．５３、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．５４、ＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．５５、若しくはＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ．５６の逆のアミノ酸配列によって表されるペプチドを含む化合物であって、Ｔ細胞増殖を阻害する化合物。
【請求項２】
　アミノ酸がＤアミノ酸である、請求項１の化合物。
【請求項３】
　１０より少ないアミノ酸を含む、請求項１又は２の化合物。
【請求項４】
　薬剤学的に受容可能なキャリヤー若しくは希釈剤、及び１若しくはそれより多くの請求項１ないし３のいずれかに記載の化合物を含む薬剤組成物であって、Ｔ細胞の好ましくない増殖によって特徴付けられる状態を有する、又は有する疑いのある個体を治療するための薬剤組成物。
【請求項５】
　Ｔ細胞の好ましくない増殖によって特徴付けられる状態を有する、又は有する疑いのある個体を治療するための医薬を、請求項１ないし３のいずれかに記載の化合物を用いて製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　関連特許出願に対するクロスリファレンス
　本出願は、係属中の１９９２年１１月３日出願の米国特許出願第０７／９７７，６９２号の一部継続出願であり、前記米国特許出願は本明細書に援用される。
【０００２】
　発明の分野
　本発明は免疫学の分野に関し、特に、例えばヘルパーＴ細胞の好ましくない活性化のような、好ましくない免疫応答の阻害に関する。
【背景技術】
【０００３】
　発明の背景
　正常なＴ細胞は哺乳動物の免疫応答の不可欠な部分であるが、場合によっては、例えばＴ細胞の好ましくない増殖のような、好ましくない免疫応答を阻害することが望ましい。例えば、自己免疫疾患は“自己”抗原に対する免疫反応として特徴づけられる。自己免疫疾患には、全身性狼瘡エリテマトーデス（ＳＬＥ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）及び多発性硬化症（ＭＳ）がある。ＳＬＥとＲＡは今までは例えば免疫抑制薬と組み合わせた、ステロイド又は抗炎症剤のような、抗炎症剤／免疫抑制薬によって治療されてきた。ＭＳに対しては今までに効果的な治療法が発見されていないが、ＡＣＴＨ及び他の免疫抑制薬は、再発中に投与する場合には、ある程度の応答を誘発していた。例えばＲＡ、ＳＬＥ及びＭＳに関連するような、好ましくない免疫応答の抑制はこれらの症状に対処する(combat)ために非常に望ましい。Ｔ細胞は免疫応答の不可欠な部分である。したがって、Ｔ細胞増殖の抑制を目的とする治療法はこのような好ましくない免疫応答を治療するために非常に望ましい。
【０００４】
　Ｔ細胞は移植片拒絶及び対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）にも関与してきた。例えばシクロスポリンのような免疫抑制薬の投与は、移植片拒絶に対処する試みに現在用いられている１方法である。ＧＶＨＤは今まではドナー骨髄からＴ細胞を枯渇させることによって治療されてきた。自己免疫疾患の場合におけるように、移植された器官の拒絶を減じて、宿主生体のＴ細胞が移植された細胞を“異物”と認識することを阻止するために、好ましくない免疫応答はＴ細胞レベルにおいて目標とされてきた。
【０００５】
　さらに、Ｔ細胞性白血病に関連した異常なＴ細胞増殖はＴ細胞増殖を抑制することによって治療することができる。白血病に罹患した患者は低い生存率を有し、一般に化学療法によって治療される。Ｔ細胞の好ましくない増殖を抑制する方法はこのような白血病の治療に有用である。
【０００６】
　全身性狼瘡エリテマトーデス（ＳＬＥ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）及び多発性硬化症（ＭＳ）；移植片拒絶及び対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）；並びにＴ細胞性白血病を含む自己免疫疾患を治療するための新規な化合物及び方法が必要とされている。例えばＴ細胞の好ましくない増殖のような好ましくない免疫応答の抑制を目的とした新規な化合物及び方法が必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
　発明の概要
　本発明は糖タンパク質ＣＤ４の側面(lateral surface)を配座的に(conformationally)模倣する化合物を提供する。本発明の化合物は好ましくは２０アミノ酸以下、より好ましくは１０〜１５アミノ酸以下であり、ＣＤ４の特定の領域に由来するアミノ酸配列を含み、哺乳動物における免疫応答を調節するために有用である。この特定のアミノ酸配列はＳｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ、Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ、Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ、Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０、Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ、Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ、Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ、Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６６、Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ、又はＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏを含む。
【０００８】
　本発明は糖タンパク質ＣＤ４の側面を配座的に模倣する化合物を含む薬剤組成物に関する。本発明の薬剤組成物中に含まれる化合物は好ましくは２０アミノ酸以下、より好ましくは１０〜１５アミノ酸以下であり、ＣＤ４の特定の領域に由来するアミノ酸配列を含み、哺乳動物における免疫応答を調節するために有用である。この特定のアミノ酸配列はＳｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ、Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ、Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ、Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０、Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ、Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ、Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ、Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６６、Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ、又はＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏを含む。
【０００９】
　本発明の化合物は哺乳動物において免疫応答を調節するＴ細胞の増殖を抑制するために有用である。本発明は、例えば全身性狼瘡エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、移植片拒絶、対宿主性移植片病及びＴ細胞性白血病のような、好ましくない免疫応答を特徴とする症状に罹患した、又はこのような症状に罹患しやすいと疑われる個人の治療方法であって、該個人に糖タンパク質ＣＤ４の側面を配座的に模倣する化合物を含む薬剤組成物を投与する段階を含む前記治療方法に関する。本発明の薬剤組成物に含まれる化合物は好ましくは２０アミノ酸以下、より好ましくは１０〜１５アミノ酸以下であり、ＣＤ４の特定の領域に由来するアミノ酸配列を含み、哺乳動物における免疫応答を調節するために有用である。この特定のアミノ酸配列はＳｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ、Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ、Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ、Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０、Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ、Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ、Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ、Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６６、Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ、又はＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏを含む。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
　発明の詳細な説明
　ＣＤ４は、Ｔ細胞受容体と相乗作用的に機能して、Ｔ細胞活性化に関与するシグナルを発生する細胞表面糖タンパク質である。これの発現は、抗原提示(antigen presenting)細胞上の自己クラスＩＩ主要組織適合型複合体（ＭＨＣ）タンパク質に関連した外来抗原(foreignantigen)の認識と相関関係にある（ビッディソン(Biddison)等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９８２，１５６，１０６５〜１０７１）。これの発現は、Ｔ細胞レパートリーを決定する正及び負の胸腺選択プロセスを調節するために重要である。ＣＤ４は、免疫グロブリンスーパーファミリーの要素に対して相同性(homology)を示す４外部領域を有する；特に、アミノ末端領域（Ｄ１）は免疫グロブリンＶκ鎖に対する高い相同を示す（パーネス(Parnes)，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８９，４４，２６５〜３１１）。ＣＤ４の２アミノ末端領域（Ｄ１，Ｄ２）はクラスＩＩ制限Ｔ細胞の機能応答(functionalresponse)の増強に関係づけられている（フロイリー(Fleury)等，Ｃｅｌｌ，１９９１，６６，１０３７〜１０４９）。非常に多くの証拠が、ＣＤ４がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）との補受容体(coreceptor)として作用し、クラスＩＩＭＨＣタンパク質の非多形部分(nonpolymorphicportion)と結合するが、ＴＣＲは抗原及びＭＨＣの多形部分と特異的に結合することを示唆している（ガイ(Gay)等，Ｎａｔｕｒｅ，１９８７，３２８，６２６〜６２９）。ＣＤ４がこの相互作用の総結合活性を強化して、生理学的濃度における外来抗原の認識を可能にすると広く考えられている。
【００１１】
　補受容体としてのＣＤ４の存在はＴ細胞応答を３００倍程度に強化することができる（ジャネウェイ(Janeway)，Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９１，３，１５３〜１６０）。ＣＤ４の主要な寄与がアフィニティーエンハンサーとしてではなくシグナル伝達分子としてであることを、幾つかの研究が実証している。実際に、幾つかの直接結合研究では、ＣＤ４の存在はＴ細胞に対するＭＨＣアフィニティに影響を及ぼさなかった(マツイ(Matsui)等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１７８８〜１７９１）。ＣＤ４はＴＣＲ仲介シグナル伝達経路に密接に関係して、Ｔヘルパー細胞の活性化を生ずる。ＣＤ４に特異的なモノクローナル抗体がレクチン又はＣＤ３−ＴＣＲに対する抗体によって誘導されるＴ細胞活性化を、これらの系におけるクラスＩＩリガンドの不存在にも拘わらず、阻害することができることを多くの研究が実証している（バンク(Bank)とチェス(Chess)のＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９８５，１６２，１２９４〜１３０３；タイト(Tite)等のＪ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８６，２，１７９〜１８９）。これらのデータはＣＤ４が負のシグナルを供給することができるという仮説をある程度導いている。他のデータは、ＣＤ４が正のシグナルを供給することができること、および活性化域値を２〜３桁(twoto three orders of magnitude)低下させるシグナル伝達複合体(signalling complex)にＣＤ４が包含されていることを明白に示している（レドベッター(Ledbetter)等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８８，１８，５２５〜５３２）。
【００１２】
　ＣＤ４の細胞質領域はｐ５６ｌｃｋ、ｓｒｃ関連チロシンキナーゼに非共有結合的に関係する（バーバー(Barber)等，ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　１９８９，８６，３２７７〜３２８１）。細胞質テール(cytoplasmic tail)の部位特異的突然変異は、ｐ５６ｌｃｋと結合するために必要である二重システインモチーフ(double cysteinemotif)を画定する（シャウ(Shaw)等，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０，１０，１８５３〜１８６２；ターナー(Turner)等，Ｃｅｌｌ，１９９０，６０，７５５〜７６５）。ｐ５６ｌｃｋに関して不完全なトランスジェニックマウスはＴ細胞を発生することができず（Ｔａｋ　Ｍａｋ，個人的情報）、細胞質領域を有さないＣＤ４突然変異体はＴ細胞活性化において不充分であり（Ｇｌａｉｃｈｅｎｈａｕｓら，Ｃｅｌｌ１９９１， ６４． ５１１−５２０）、ｐ５６ｌｃｋの誘導(triggering)がＴ細胞活性化に関与することを強く示唆する。保存された(conserved)カルボキシ末端チロシンキナーゼ領域を有する他のｓｒｃファミリー要素によると同様に、別個の(distinct)細胞受容体との結合が特有のアミノ末端を介して生じ；このようにして、細胞外リガンドがチロシンキナーゼを制御することができる。ＣＤ４の抗体架橋が、ＣＤ３−ＴＣＲ複合体のζ鎖（及び恐らくは△鎖とε鎖）のチロシン残基上のリン酸化を生ずることが実証されている（バーバー等，１９８９，上記文献）。ＣＤ３リン酸化の正味結果は、ＣＤ３−ＴＣＲ複合体内の分子間結合を変えて、Ｔ細胞活性化に関係した段階的なイベントを生じることである。
【００１３】
　ＣＤ４は、異なる細胞上の分子とのその相互作用との他に、他のＴ細胞表面分子との相互作用にも、恐らくシグナル伝達分子としてのその能力(capacity)において関係する。ＣＤ４とＣＤ３／ＴＣＲ複合体との間の物理的結合は幾つかのグループによって実証されている。ジャネウェイ等のＣＳＨ　Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．１９８９，ＬＩＶ，６５７〜６６６は、モノクローナル抗ＣＤ４がＴＣＲのある種のエピトープに対するモノクローナル抗体に応じたＴ細胞クローンの活性化を阻害することができるが、他のＴ細胞クローン活性化を阻害できないことを実証した。さらに、高効力抗ＴＣＲはＣＤ４によるＴＣＲのコキャッピング(cocapping)及びコモジュレーション(comodulation)を惹起したが、低効力（２０〜５００倍）抗ＴＣＲは惹起することができなかった。他の研究は、ＣＤ４とＣＤ３／ＴＣＲ複合体との間の物理的結合が活性化Ｔ細胞上でのみ効果的に生ずるが、休止Ｔ細胞では生じないことを実証している（ミットレル(Mittler)等，ＰＮＡＳ　ＵＳＡ，１９８９，８６，８５３１〜８５３５；リバス(Rivas)等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８８，１４０，２９１２〜２９１８）。ＣＤ４とＣＤ４５との間で物理的結合が生ずることが判明している。ＣＤ４５は造血系(hemopoietic)起源の全ての細胞上に発現される膜結合タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰアーゼ）である。ＣＤ４５ネガティブ(negative)Ｔ細胞変異体はＴＣＲ仲介イベントを通してＴ細胞を活性化することができないが、ＩＬ−２仲介路を介して刺激されることができる（マッチュース(Matthews)等，ＣＳＨ　Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．１９８９，ＬＩＶ，６７５〜６８２）。ＣＤ４５が試験管内分析(invitro assay)においてｐ５６ｌｃｋを直接に脱リン酸化して、ｐ５６ｌｃｋキナーゼ活性を明白に増強することが報告されている（ムステリン(Mustelin)等，ＰＮＡＳ　ＵＳＡ，１９８９，８６，６３０２〜６３０６）。蛍光共鳴エネルギー転移分析を用いて、活性化Ｔ細胞の表面上の２分子の密接な物理的近接を実証したが、休止Ｔ細胞では実証しなかった（ミットレル等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９１，１４７，３４３４〜３４４０）。機能的に、ＣＤ４によるＣＤ４５のコクラスターリング(coclustering)はｐ５６ｌｃｋリン酸化状態の変化を生じ、同時にキナーゼ活性を増加させる（オスタガード(Ostergaard)とトローブリッジ(Trowbridge)，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９０，１７２，３４７〜３５０）。さらに、ジアンザニ(Dianzani)等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９０，２０，２２４９〜２２５７は、ＣＤ４と種々なＣＤ４５イソフォーム(isoform)との間の物理的結合と、免疫学的メモリー状態との相関関係を実証している。ＣＤ４タンパク質、特にその側面は、最終的にはＴ細胞増殖の刺激を生ずる、複雑なシグナル伝達路(complexsignalling pathway)の調節に関与すると考えられる。
【００１４】
　ＣＤ４タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、ＣＤ４タンパク質のアミノ酸配列とは周知である。ここで用いるかぎり、ＣＤ４の特定のアミノ酸残基を表すために用いられるナンバーリング(numbering)系は周知の標準ナンバーリング系であり、当業者によって通例用いられるものである。例えば、マッドン(Maddon,P)等の（１９８５）ＣＥＬＬ，４２：９３〜１０４；マッドン等の（１９８６）ＣＥＬＬ，４７：３３３〜３４８；及びフッセイ(Hussey,R.E.)の（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３１：７８〜８１を参照のこと、これらの各々は本明細書に援用される。
【００１５】
　本発明は哺乳動物における免疫応答を調節するために有用なペプチドと、方法を提供する。ここでは（１）ＣＤＲ１；（２）ＣＤＲ３；（３）１２７；（４）１４７；及び（５）１６１と名付けられ、好ましくは１５アミノ酸以下である、ＣＤ４の異なる５領域のうちの１つの少なくとも１部分に対応するアミノ酸配列を含むペプチドを提供する。本発明のペプチドは制限された配座(conformation)と、タンパク質間の分子間相互作用に介入することによって免疫応答を調節する能力とを有する。
【００１６】
　該領域は糖タンパク質ＣＤ４の結晶構造に基づいて決定された。特に、ＣＤ４タンパク質のＤ１−Ｄ２領域によって示され、タンパク質−タンパク質相互作用に関与すると考えられるＣＤ４側面をモデル化し、配座的に制限されたペプチドを設計するための鋳型として用いた。図１はＣＤ４のＤ１−Ｄ２領域を示す。
【００１７】
　上記で特定したＣＤ４の異なる５領域の各々は、必須アミノ酸に加えてフランキング配列を含む特定のアミノ酸配列から形成される。これらはＣＤ４に存在するので、これらの領域はそれぞれ他の分子と相互作用することができる表面を形成する。本発明の化合物は、ＣＤ４のこれらの異なる領域の１つ以上をモデルとして用いて設計される。本発明の化合物はＣＤ４の５特定領域の少なくとも１つの表面に類似した表面を有する。したがって、本発明の化合物はＣＤ４の該５領域の少なくとも１つの分子間相互作用を模倣することができる。本発明の化合物はＴ細胞増殖を阻害することができ、それによって、好ましくないＴ細胞増殖を特徴とする障害及び状態の治療及び予防に有用である。
【００１８】
　ここで用いるかぎり、“化合物”なる用語は、ペプチドと非ペプチドとを含む分子を意味し、非限定的に少なくとも幾つかの非ペプチジル結合によって結合されたアミノ酸残基を含む分子を包含する。ここで用いる“ペプチド”なる用語は、ネイティブな(native)ペプチド結合によって結合された自然発生のアミノ酸サブユニットから形成されるポリペプチドを意味する。したがって、この用語は実際上、自然発生サブユニット又はそれらの密接な相同体(homolog)を意味する。アミノ酸なる用語は自然発生ペプチドに類似した部(portion)を有するが、非自然発生部を有する部分(moiety)をも意味する。したがって、ペプチドは変化したアミノ酸又は結合を有することができる。ペプチドはまた、本発明の要旨に矛盾しない他の変更をも含むことができる。このようなペプチドは天然ペプチドと機能的に相互交換可能であるが構造的に異なるとして最も良く表現される。ここで用いるかぎり、“化合物”及び“ペプチド”なる用語は相互交換可能に用いられる。本発明の化合物はＣＤ４の５特定領域の少なくとも１つを含むＣＤ４フラグメントを含み、ＣＤ４の５特定領域の少なくとも１つの表面を模倣する物理的表面を有し、Ｔ細胞増殖を阻害することができる。本発明のペプチドは約３アミノ酸〜約１００アミノ酸の範囲の長さであることができる。本発明の幾つかの実施態様では、本発明のペプチドは約３アミノ酸〜約５０アミノ酸の長さである。本発明の好ましい実施態様では、本発明のペプチドは約３アミノ酸〜約２０アミノ酸の長さであり、より好ましくは約３〜１５アミノ酸の長さである。ペプチドができるかぎり小さいことが好ましい。幾つかの実施態様では、ペプチドは約３〜１０アミノ酸である。本発明のペプチドのアミノ酸配列は少なくとも２〜７アミノ酸であるＣＤ４領域の一部を含む。
【００１９】
　ペプチドの三次構造は必ずしもその親タンパク質の三次構造を模倣しないので、ペプチド類似体を共有結合的に閉じて、所望の折り畳みパターン(folding pattern)を強制することが必要であった。固定した(rigid)等電子性類似体ではなく、ペプチドはネイティブタンパク質の形状及び移行(movement)にオーバーラップするように予定の配座的レパートリーに制限された。本発明の幾つかの実施態様では、アミノー及びカルボキシー末端システィンと分子内ジスルフィドとを用いて、ペプチドを閉じて、ポテンシャル溶液配座異性体(potentialsolution conformer)を限定した。ペプチドを環状化する他の手段も公知である。
【００２０】
　ペプチドを機能的配座(functional conformational)に環状化するために用いる方法は、アミノ酸配列に末端においてプロリンを組み込むことを含む。幾つかの実施態様では、アミノ酸配列プロリンーグリシンープロリン（ＰＧＰ）を用いて、実施例１に述べるペプチド類似体に強制されたターン(constrainedturn)を与えることができる。ＰＧＰターンモチーフに重要であることは、アミノ酸プロリンがペプチド鎖のバックボーンに課することができる堅い束縛(rigidconstraint)である。プロリンの側鎖、五員環（プロリジル環）はペプチド基の窒素原子に共有結合するので、隣接ペプチドと共に、バックボーンのＣα（ｐｈｉ）結合を中心とした回転をシス配置を採り易いように明白に限定する。これに反して、グリシン残基の特有の可撓性は、他のアミノ酸が経験するような立体的側鎖束縛なしに、堅い隣接プロリンによって強く誘導される、固定されたターンの発生を可能にする。その配座折り畳みレパートリーがネイティブタンパク質のものにオーバーラップするような類似体を予測するために、大量の水溶液中でモデル化したペプチドにおいて、エネルギー依存性運動のコンピュータシミュレーションと分子メカニック計算とを実施した。
【００２１】
　本発明の好ましい実施態様では、ペプチドは１５個以下のアミノ酸残基から成り、ＣＤ４分子の表面を模倣する表面を形成するために、環状化されるか又はさもなくば配座的に制限される。本発明のペプチドはＣＤ４の特定領域の少なくとも１つからの少なくとも必須アミノ酸配列を含む。これらはさらに、ＣＤ４分子における必須配列に隣接するＣＤ４配列、又は非ＣＤ４配列、又はＣＤ４と非ＣＤ４配列との組合せを含む。さらに、ペプチドは環状化を促進する残基を含む、適当な三次元コンホメーションを得るために必要な非ＣＤ４残基を含むことができる。
【００２２】
　以下では、Ｔ細胞増殖に関連したシグナル伝達プロセスに関与すると見なされているＣＤ４の異なる５領域の各々を説明する。各領域を構成するアミノ酸配列と各領域の必須アミノ酸配列との確認を含める。本発明の化合物は必須配列と、好ましくはフランキング配列の一部又は全てとを含む。上述したように、該化合物はＣＤ４配列のみ又はＣＤ４と非ＣＤ４配列との組合せを含むことができる。本発明の化合物はそれらが配座的に類似するＣＤ４領域を模倣する。したがって、これらは、Ｔ細胞増殖の刺激のシグナル伝達(signaling)に関係するタンパク質を含む、本発明の化合物が存在しなければＣＤ４自体と相互作用するであろう、他のタンパク質と相互作用することができる。ＣＤ４の異なる５領域の１つからのアミノ酸配列を含む化合物を用いて、免疫応答を調節して、Ｔ細胞増殖を阻害することができる。
【００２３】
　ＣＤ４のＣＤＲ１領域はアミノ酸１７〜２２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５）を含み、ＣＤＲ１の必須アミノ酸はアミノ酸１９〜２１（Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ）と、１８〜２０（Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ）である。ＣＤＲ１ペプチドはＣＤ４のアミノ酸１９〜２１（Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ）を含み、ＣＤ４からの付加的フランキング配列を含むことができる。本発明の幾つかの実施態様では、ペプチドはアミノ酸１７〜２２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５）、１７〜２１（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６）、１８〜２１（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７）、１８〜２２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８）又は１９〜２２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９）を含む。本発明の幾つかの実施態様は付加的なＣＤ４又は非ＣＤ４フランキング配列を含む。
【００２４】
　ＣＤ４のＣＤＲ３領域はアミノ酸８７〜９３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０）を含み、ＣＤＲ３の必須アミノ酸はアミノ酸８８〜９０（Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ）、８９〜９１（Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ）又は９０〜９２（Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ）である。ＣＤＲ３ペプチドはＣＤ４のアミノ酸８８〜９０（Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ）、８９〜９１（Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ）又は９０〜９２（ＬｙｓＧｌｕ　Ｇｌｕ）を含む。本発明の幾つかの実施態様では、ペプチドはアミノ酸８７〜９３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０）、８７〜９０（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１）、８７〜９１（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２）、８７〜９２（ＳＥＱ　ＩＤＮＯ：２３）、８８〜９１（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４）、８８〜９２（ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：２５）、８８〜９３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６）、８９〜９２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７）、８９〜９３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８）又は９０〜９３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２９）を含む。本発明の幾つかの実施態様は付加的なＣＤ４又は非ＣＤ４フランキング配列を含む。
【００２５】
　ＣＤ４の１２７領域はアミノ酸１１７〜１２８（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５８）を含み、必須アミノ酸はアミノ酸１２０〜１２４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０）である。１２７ペプチドはＣＤ４のアミノ酸１２０〜１２４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０）を含む。本発明の幾つかの実施態様では、ペプチドはアミノ酸１１７〜１２８（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５８）、１１７〜１２４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１）、１１７〜１２５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３２）、１１８〜１２４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３３）、１１８〜１２５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３４）、１１８〜１２６（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３５）、１１９〜１２４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３６）、１１９〜１２５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３７）、１１９〜１２６（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３８）、１２０〜１２５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３９）、１２０〜１２６（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０）、１１７〜１２７（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５９）、１１８〜１２７（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６０）、１１８〜１２８（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６１）、１１９〜１２７（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６２）、１１９〜１２８（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６３）、１２０〜１２７（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６４）又は１２０〜１２８（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６５）を含む。
【００２６】
　本発明の幾つかの実施態様は付加的なＣＤ４又は非ＣＤ４フランキング配列を含む。
　ＣＤ４の１４７領域はアミノ酸１５８〜１７１を含み、必須アミノ酸はアミノ酸１６４〜１６６（Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ）である。１４７ペプチドはＣＤ４の少なくともアミノ酸１６４〜１６６（Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ）を含む。本発明の幾つかの実施態様では、ペプチドはアミノ酸１６３〜１６６（ＳＥＱ　ＩＤＮＯ：４１）を含む。本発明の幾つかの実施態様は付加的なＣＤ４又は非ＣＤ４フランキング配列を含む。
【００２７】
　ＣＤ４の１６１領域はアミノ酸１３０〜１３８（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４２）を含み、必須アミノ酸はアミノ酸１３３〜１３５（Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ）である。１６１ペプチドはＣＤ４の少なくともアミノ酸１３３〜１３５（Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ）を含む。本発明の幾つかの実施態様では、ペプチドはアミノ酸１３０〜１３８（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４２）、１３０〜１３５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４３）、１３０〜１３６（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４４）、１３０〜１３７（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４５）、１３１〜１３５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４６）、１３１〜１３６（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４７）、１３１〜１３７（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４８）、１３１〜１３８（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４９）、１３２〜１３５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５０）、１３２〜１３６（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５１）、１３２〜１３７（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２）、１３２〜１３８（ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：５３）、１３３〜１３６（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５４）、１３３〜１３７（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５５）又は１３３〜１３８（ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：５６）を含む。本発明の幾つかの実施態様は付加的なＣＤ４又は非ＣＤ４フランキング配列を含む。
【００２８】
　ＣＤ４の異なる５領域の１つより多い領域からの必須アミノ酸を含む本発明の化合物を構成することができる。例えば、ＣＤ４領域のＣＤＲ１とＣＤＲ３の三次元構造は相互にきわめて近接して生ずる。ＣＤ４のＣＤＲ１領域はアミノ酸１７〜２２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５）を含み、ＣＤＲ１の必須アミノ酸はアミノ酸１９〜２１（Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ）である。ＣＤ４のＣＤＲ３領域はアミノ酸８７〜９３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０）を含み、ＣＤＲ３の必須アミノ酸はアミノ酸８８〜９０（Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ）、８９〜９１（Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ）又は９０〜９２（Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ）である。１実施態様では、化合物がＣＤ４上の２つの領域によって形成される表面を模倣する用に、両領域からの配列を含む化合物を構成することができる。このような化合物は両領域からのアミノ酸配列を含み、所望により２領域誘導配列の間にアミノ酸残基を含むことができる。単一の領域に従ってモデルを作成して化合物を設計する場合と同様に、化合物に含めるべきＣＤ４残基と非ＣＤ４残基との画定においては配座的考慮が最も重要である。幾つかの実施態様では、化合物はＣＤ４アミノ酸１８〜２０（Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ）と８８〜９０（Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ）とを含む。さらに、化合物はシステインを含むことができる。さらに、幾つかの実施態様では、化合物は２領域誘導配列の間にプロリンとアラニンとを含む。１実施態様は、システイン間のジスルフィド結合によって環状化された、配列Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５７）を含む。
【００２９】
　ここに述べるアミノ酸配列はアミノ末端からカルボキシ末端まで又はカルボキシ末端からアミノ末端までの配列で進行するように構成される。配列がアミノ末端からカルボキシ末端まで進行する場合には、配列は通常Ｌアミノ酸から構成される。化合物の構成にＤアミノ酸を用いる場合には、配列はＣＤ４において生ずる順序とは逆になり、それ故、カルボキシ末端からアミノ末端まで進行する。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１〜６５を含めて、ここに述べるアミノ酸配列の各々はアミノ末端からカルボキシ末端まで進行するアミノ酸配列とカルボキシ末端からアミノ末端まで進行するアミノ酸配列とを表すように意図される。
【００３０】
　ＣＤ４タンパク質の側面を模倣する化合物を用いて、ヒトにおける好ましくない免疫応答を処理することができる。例えば、慢性関節リウマチ、多発性硬化症及びＳＬＥのような自己免疫疾患を、このような疾患に罹患した患者にこの好ましくない免疫応答を抑制するために本発明の化合物を投与することによって治療することができる。Ｔ細胞増殖の阻害は、この好ましくない免疫応答を抑制することができる１つの手段である。本発明の化合物は、移植片拒絶又は対宿主性移植片病に罹患した患者の治療にも有用である。移植組織、器官、骨髄等を受容した患者に本発明の化合物を投与することによって、拒絶を惹起する、好ましくない免疫応答を抑制して、外来物質の拒絶が回避される。例えば、本発明の化合物を対宿主性移植片病に罹患した患者に投与して、“自己”認識免疫応答を抑制することができる。本発明の幾つかの実施態様では、化合物の投与がＴ細胞増殖を阻害することができる。さらに、移植処置の準備として、移植片の拒絶を生ずる好ましくない免疫応答の可能性を減ずるために、本発明の化合物を患者に投与することができる。本発明の化合物は例えばＴ細胞性白血病に関連したＴ細胞増殖のような、異常なＴ細胞増殖を処理するために投与することもできる。本発明の方法に従って、そのような異常なＴ細胞増殖に苦しむ患者に本発明の化合物を投与し、Ｔ細胞の異常な増殖を抑制する。本発明の幾つかの好ましい実施態様では、表１に記載するペプチドが提供される。
【００３１】
　本発明のペプチドは下記の周知の方法のいずれかによって製造することができる。ペプチドは便利には、メリフィールド(Merrifield)がＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１５：２１４９〜２１５４（１９６３）に最初に述べた固相合成方法を用いて製造することができる。他のペプチド合成方法は、例えば、ボダンツキー(M.Bodanszky)等の（１９７６）Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，第２版；ケント(Kent)とクラークルイス(Clark-Lewis)のＳｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２９５〜３５８頁，アリタロ(Alitalo,K.)等編集，Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，（アムステルダム，１９８５）；並びに、当業者に周知の他の参考文献に見い出すことができる。ペプチド合成方法の概要はスチャート(J.Stuart)とヤング(J.D.Young)のＳｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｌｉａ，Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ（イリノイ州，ロックフォード）（１９８４）に見い出される。Ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ，第ＩＩ巻，第３ｄ版，１０５〜２３７頁，ノイラス(Neurath,H.)等編集，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（ニューヨーク州，ニューヨーク）（１９７６）に述べられている、溶液方法によるペプチド合成も用いることができる。このような合成に用いるための適当な保護基は上記文献並びにマコミー(J.F.W.McOmie)のＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ（ニューヨーク州，ニューヨーク）（１９７３）に見い出される。
【００３２】
　一般に、これらの合成方法は成長するペプチド鎖に１個以上のアミノ酸残基又は適当な保護されたアミノ酸残基を逐次添加することを含む。通常は、第１アミノ酸残基のアミノ又はカルボキシル基は選択的に除去される、適当な保護基によって保護される。例えばリシンのような、反応性側基(side group)を含むアミノ酸に対しては、選択的に除去される、異なる保護基が用いられる。
【００３３】
　例として固相合成を用いて、保護されたアミノ酸又は誘導体化アミノ酸を不活性な固体担体にその保護されないカルボキシル基又はアミノ基を介して付着させる。アミノ又はカルボキシル基の保護基を次に選択的に除去して、適当に保護された相補的（アミノ又はカルボキシル）基を有する配列の次のアミノ酸を混合して、固体担体に既に付着した残基と反応させる。次に、この新たに加えたアミノ酸残基からアミノ又はカルボキシル基の保護基を除去して、次のアミノ酸（適当に保護された）を加え、以後同様に繰り返す。全ての必要なアミノ酸が適当な配列で結合された後に、残留する末端保護基及び側基保護基（並びに固体担体）を順次又は同時に除去して、最終ペプチドを得る。本発明のペプチドはベンジル化又はメチルベンジル化アミノ酸を有さないことが好ましい。このような保護基部分を合成の過程で用いることができるが、ペプチドの使用前にこれらの保護基部分を除去する。配座を制限するために分子内結合を形成するには、他の箇所で述べたように、付加的反応が必要である。
【００３４】
　本発明のペプチドは組み換えＤＮＡ方法によっても製造されるが、このような方法は、精製と、その後に、配座的にペプチドを制限するための化学的修飾を必要とするので好ましくない。
【００３５】
　Ｌ−アミノ酸を含むペプチドの他に、本発明による薬剤組成物はＤ−アミノ酸から構成されるペプチドを含むことができる。分解(degradation)に関与する大抵の酵素は四面体型α−炭素を認識するので、酵素認識とその後の開裂(cleavage)を避けるためにＤ−アミノ酸を用いた。Ｄ−アミノ酸を用いて、アミノ酸配列を逆転しても同じ折り畳み表示(foldedpresentation)が得られることをコンピュータ研究が実証する。したがって、Ｄ−アミノ酸から成るペプチドは分解を受けにくい。本発明の幾つかの実施態様では、この開示を通して表示するアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を逆の順序（すなわち、カルボキシ末端からアミノ末端まで）で有する、Ｄ−アミノ酸を含む化合物を提供する。したがって、本発明の開示は本明細書に記載する配列の各々を、Ｄ−アミノ酸を含むカルボキシ末端からアミノ末端までのペプチドを付加的に表すものとして、特に包含するように意図される。
【００３６】
　アミノ酸配列の保存的置換(conservative substitution)を行うことも可能である。当業者はアミノ酸を保存的置換したＣＤ４類似体を容易に設計することができる。例えば、アミノ酸置換のダイホッフ(Dayhof)ルールと呼ばれるルールに従うと（ダイホッフ(Dayhof,M.D.)の（１９７８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．第５巻，付録３）、ペプチド配列のアミノ酸残基は同等な(comparable)アミノ酸残基と置換することができる。このような置換は周知であり、各アミノ酸の電荷及び構造特徴に基づいて行われる。
【００３７】
　ＣＤ４領域の一部を含む合成ペプチドを、これらの部分がＣＤ４中に存在するときのゲオメトリー(geometry)を模倣するために、環状化することができる。環状化はシステイン残基間のジスルフィド結合によって容易にされる。システイン残基は、ＣＤ４領域に由来するペプチド部分に隣接する、ペプチド上の位置に含まれることができる。ＣＤ４領域に由来するペプチド部分中のシステイン残基を削除及び／又は保存的置換して、このような残基を含むジスルフィド結合の形成を除去することができる。或いは、例えばアミノ及びカルボキシ末端における又はこれらの末端近くのアミノ酸残基のような、ペプチドのアミノ酸残基の間に例えばアミド結合のような共有結合を用いて、ペプチドを環状化することができる。
【００３８】
　本発明はＣＤ４のアミノ酸配列の少なくとも一部を含むペプチドを含有する化合物を提供する。このＣＤ４部分は２〜１００アミノ酸から成る。好ましい実施態様では、ＣＤ４部分は２〜２０アミノ酸から、より好ましくは２〜１５アミノ酸から成る。幾つかの実施態様では、非ＣＤ４アミノ酸配列が形成される。他の実施態様では、ペプチドはＣＤ４アミノ酸配列のみを含む。本発明のペプチドのアミノ酸配列の少なくとも１０％がＣＤ４の一部に由来することが好ましい。幾つかの実施態様では、本発明のペプチドのアミノ酸配列の約２０〜２５％より多くがＣＤ４の一部に由来することが好ましく、３０〜４０％がＣＤ４の一部に由来することがより好ましく、５０％より多くがＣＤ４の一部に由来することがさらに好ましい。幾つかの実施態様では、本発明のペプチドのアミノ酸配列中のＣＤ４の一部に由来する割合は約６０％に又は約７５％以上に近づく。
【００３９】
　本明細書で定義した構造特性を有するペプチドが本発明の薬剤組成物及び方法に有用であるか否かを判定するために、このようなペプチドを用いて、ルーチンの分析を実施して、ペプチドが必要な活性を有するかどうか、すなわちペプチドがＴ細胞増殖を阻害することができるかどうかを知ることができる。Ｔ細胞増殖を阻害するペプチドの能力は、Ｔ細胞増殖分析におけるその活性を観察することによって判定することができる。Ｔ細胞増殖分析は当業者に周知であり、容易に入手可能な出発物質から構成することができる。下記実施例５〜１６は化合物が必要な活性を有するか否かを判定するために使用可能な分析の説明を提供する。　上記構造特性を有するペプチドはルーチンに合成することができる。このようなペプチドを標準分析法によって試験して、それらが本発明の薬剤組成物及び方法に有用であるかどうかを判定することができる。
【００４０】
　本発明は、本発明の化合物と、薬剤学的に受容されるキャリヤー又は希釈剤とを含む薬剤組成物を提供する。本発明の薬剤組成物は選択した投与形に依存して組成を選択して、当業者によって配合されることができる。適当な薬剤学的キャリヤーは、この分野における標準の参考文献であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，オソール（A.Osol)に記載されている。本発明の方法を実施する場合に、本発明のペプチドを単独で、又は他の診断薬、治療薬若しくは添加剤と組合せて用いることができる。このような添加剤には、例えばフレーバー(flavoring)、着色剤、安定剤、増粘剤(thickeningmaterial)、浸透剤(osmotic agent)及び抗菌剤のような賦形剤がある。このような添加剤はインビトロ(in vitro)でのペプチドの使用、貯蔵中の組成物の安定性、又は最適の効果を得るために重要な他の性質を強化する。
【００４１】
　非経口的投与に関しては、本発明のペプチドを、例えば、薬剤学的に受容される非経口用ビヒクル(parenteral vehicle)と組合せて、溶液、懸濁液、エマルジョン又は凍結乾燥粉末として配合することができる。このようなビヒクルの例は水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液及び５％ヒト血清アルブミンである。リポソームと、例えば不揮発性油のような非水性ビヒクルをも使用可能である。ビヒクル又は凍結乾燥粉末は、等張性を維持する添加剤（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール）及び化学的安定性を維持する添加剤（例えば、緩衝液及び防腐剤）を含むことができる。この組成物を一般に用いられる方法によって滅菌する。例えば、注射による投与に適した非経口組成物は０．９％塩化ナトリウム溶液注に活性成分１．５重量％を溶解することによって製造される。
【００４２】
　本発明による薬剤組成物は単回量として又は複数回量として投与することができる。本発明の薬剤組成物は個別の治療剤として又は他の治療剤と組合せて投与することができる。本発明による治療は、逐次的に又は同時に投与される通常の治療剤と組合せることができる。
【００４３】
　本発明の薬剤組成物は、活性剤を標的細胞に到達させることができる任意の手段によって投与される。ペプチドは経口投与した場合には消化されやすいので、吸収を最適にするために非経口投与、すなわち静脈内、皮下又は筋肉内投与が通常用いられる。静脈内投与は注入ポンプ(infusion pump)を用いて達成される。本発明の薬剤組成物はエマルジョンとして配合することができる。或いは、本発明の薬剤組成物は鼻腔内投与又は吸入投与用のエーロゾル薬剤として配合することができる。場合によっては、局所投与が望ましいこともある。
【００４４】
　投与量は例えば薬力学的特性；その投与形式と投与経路；レシピエントの年齢、健康及び体重；症状の性質と重症度；並行治療の種類；治療の回数(frequency)のような要素に依存して変化する。ペプチドの用量は通常、体重５０ｋｇにつき約１〜３０００ｍｇ；好ましくは体重５０ｋｇにつき１０〜１０００ｍｇ；より好ましくは体重５０ｋｇにつき２５〜８００ｍｇでありうる。通常、個人に対して１〜６回の分割量で又は持続放出形で一日に投与される８〜８００ｍｇが、望ましい結果を得るために効果的である。
【００４５】
　治療すべき疾患又は障害に依存して、本発明の薬剤組成物を配合して、最も効果的に投与することができる。本発明の開示を考慮するならば、投与形式は当業者に明らかであろう。
【実施例】
【００４６】
　下記実施例は例示的であり、本発明の限定を意図するものではない。
　実施例
　実施例１　　分子モデル化
　マウスＣＤ４タンパク質（Ｌ３Ｔ４）の分子モデルを、ヒトＣＤ４の高解像度結晶構造（ブルックハーベン(Brookhaven)コード：ｌＣＤ４）から開発した。コンピュータアルゴリズムを用いてエネルギー依存性運動(energydependent motion)（分子動力学）をシミュレートして、分子メカニック計算を実施した。この研究はＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ／Ｐｏｌｙｇｅｎ　Ｉｎｃ．（カリフォルニア州，パサデナ）によって供給されるコンピュータ用化学パッケージと、Ｓｉｌｉｃｏｎ　Ｇｒａｐｈｉｃｓ（カリフォルニア州，マウンテインビュー）のＰｏｗｅｒ　Ｓｅｒｉｅｓ　４Ｄ／４８０パラレルプロセスコンピュータ(parallelprocess computer)とを用いて実施した。モデル化パッケージの説明はジェイムソン(Jameson,B.A.)のＮａｔｕｒｅ，１９８９，３４１，４６５によって既述されている。
【００４７】
　　Ｌ３Ｔ４タンパク質
　一般に、Ｉｇスーパーファミリーのアミノ酸組成と機能的性質とは非常に多様である；しかし、バックボーン折り畳みパターンは主として、構造を維持する比較的少数の重要な残基の不変性(conservation)のために、顕著に保存される。これらの重要な(key)構造モチーフを未知タンパク質を既知構造に比較して、調節することによって最大化した。重要な位置により重く重みをかけ、化学的に相同な変化又は同様な構造特性を有する残基のいずれかを含む変化をあまり不利としないような、構造的に類似したマトリックスを用いる。構造的相同性を最大化した後に、Ｌ３Ｔ４タンパク質のアミノ酸組成をヒトＣＤ４の結晶構造のバックボーンにスーパーインポーズし、新たに組み入れた側鎖を連続シリーズのエネルギー最小化計算で平衡させた。Ｉｇ折り畳み構造(fold)は一連のペアード非並列β鎖(pairedantiparallel beta strands)の充分に画定された系列から成るので、これらのペアード(paired)構造を最初に基本的単位として処理した。動力学的計算の第１シリーズでは、非並列鎖を再配列させ、続いてペアード鎖を隣接鎖と相互作用させ、最後に、全構造を配座的に平衡させた。計算の全てを大量の水性溶媒の存在下で実施した。得られた構造は長時間の動力学的ラン（１００ピコ秒）において安定であり、例えば加熱及び冷却のような、エネルギー変動(perturbation)に対して安定であった。次に、この構造を機能的ペプチド類似体の設計のための鋳型として用いた。
【００４８】
　　ペプチド
　相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３基礎構造(substructure)の存在によって形成されるタンパク質表面を用いて、免疫グロブリン可変領域を抗原に接触させる。Ｌ３Ｔ４もまた、ＩｇスーパーファミリーのメンバーとしてＣＤＲ類似領域を用いて、タンパク質−タンパク質相互作用を仲介するという仮説が立てられた。望ましい折り畳みパターンを強制するために、ペプチドを共有結合的に閉ざし、配座異性体の可能な発生源を制限するように、例えばアミノ末端とカルボキシ末端のような合理的に設計された化学的束縛と、分子内ジスルフィド富化操作とをいくつかのペプチド類似体に導入した。
【００４９】
　　ペプチド１
　Ｌ３Ｔ４領域１のＣＤＲ３類似領域を、これは逆ターンによって接続された２個の非並列β鎖から成り、その折り畳みが残りの構造からある程度独立しているので、ペプチド模倣体(mimic)を設計するための１候補として選択した。
【００５０】
　予想されるタンパク質構造の分析から、ＣＤＲ３類似領域の一部（残基８６〜９７）のみが溶媒に暴露され、結合のために、すなわちカルボキシ末端β鎖と逆ターンの一部とを結合させるために利用可能であると予測された。したがって、ネイティブ配列を完全に保持しながらこれらの構造を維持するようにペプチドを設計した。ＣＤＲ３類似配座中の８６〜９３領域の存在を安定化する非並列β鎖ステムループ構造の形成を強制するようなターンモチーフ(turn motif)を用いた。ペプチド類似体中に制約されたターンを与えるためにアミノ酸配列プロリンーグリシンープロリン（ＰＧＰ）を用いた。ＰＧＰターンモチーフにとって重要であることは、アミノ酸プロリンがペプチド鎖のバックボーンに与えることができる堅い束縛(rigidconstraint)である。プロリンの側鎖、五員環（プロリジル環）はペプチド基の窒素原子に共有結合されるので、隣接ペプチド結合と共に、バックボーンのＮ−Ｃα（ｐｈｉ）結合を中心とした回転をシス配置を採り易いように明白に限定する。これに反して、グリシン残基の特有の可撓性は、他のアミノ酸が経験するような立体的側鎖束縛なしに、堅い隣接プロリンによって強く誘導される、堅いターン(tightturn)の発生を可能にする。その配座折り畳みレパートリーがネイティブタンパク質のものにオーバーラップするような類似体を予測するために、大量の水溶液中でモデル化したペプチドにおいて、エネルギー依存性運動のコンピュータシミュレーションと分子メカニック計算とを実施した。ペプチド１のアミノ酸配列はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１として示す。
【００５１】
　　ペプチド２
　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１と同様に、ペプチド２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３，ｍＣＤＲ３スクランブル）をＣＤＲ３類似領域から誘導した。しかし、この配列はスクランブルであった(scrambled)。
【００５２】
　　ペプチド３
　ペプチド３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３，ｈＰＧＰｔｉｄｅ）をヒトＣＤ４のＣＤＲ３類似領域から誘導した。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に存在する同じＰＧＰターンモチーフを有する。
【００５３】
　　ペプチド４
　ペプチド４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４，ｈ１５８〜１７１　Ｃ−Ｃ）は側面（ヒトＣＤ４タンパク質のＤ２領域に由来）の中央コーナーの１つを表す。ＣＤ４タンパク質の残基１６５の周囲に集中する中央縁において側面からの明白なトポロジカル突出が生ずる。このペプチドは表面露出アミノ酸Ｌｅｕ（１６２）、Ｇｌｎ（１６３）、Ａｓｎ（１６４）、Ｇｌｎ（１６５）、Ｌｙｓ（１６６）、Ｌｙｓ（１６７）及びＧｌｕ（１６９）の表現を模倣するように設計された。分子動力学のコンピュータシミュレーションとメカニックとを用いて、可能なペプチド配列を選別して、残基１５８〜１７１を含む配列に到達した、この場合に、ペプチドを環状化して、ネイティブタンパク質に見られる表面の一部を再現するために、Ｐｈｅ１７０をシステインと置換した。
【００５４】
　　ペプチド５
　ペプチド５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５，ｈ１１７〜１２６，線状）は残基１２２に集中した、ＣＤ４のＤ１−Ｄ２領域の側面の中央に、ペプチド４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４）とは反対側に側面(side)を有する。この配列ではプロリンが自然に広範囲に見い出されるために、配座的制約は不必要であった。
【００５５】
　　ペプチド６
　ペプチド６（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６，ｈ１３０〜１３８，Ｃ−Ｃ）は残基１３４に集中した、ＣＤ４のＤ１−Ｄ２領域の側面の最低部を表す。表面露出残基Ａｒｇ（１３１）、Ａｒｇ（１３４）、Ｌｙｓ（１３６）及びＡｓｎ（１３７）を正確に位置付けることを試みた。ねじれ歪を避けるために、最初に人為的に導入したシステインはＤ−アミノ酸であった。
【００５６】
　　ペプチド７
　ペプチド７（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７，ｍ８６〜１０４，Ｃ−Ｃ）は、折り畳みを達成するために、末端にシステインを組み込んだＬ３Ｔ４ＣＤＲ３領域の一部を表す。
【００５７】
　　ペプチド８
　ペプチド８（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８，ｍ８６〜１０４，線状）は、配列とサイズにおいて、ペプチド７（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７）に同じであるが、束縛(restraining)カルボキシル末端システインを有さない。ペプチド７（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７）とは異なり、線状ペプチドは、フェニルアラニン１０４がシステインに置換されていないので、環化することができない。
【００５８】
　　ペプチド９
　ペプチド９（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９，ｍ８６〜１０４，スクランブル）は、両端においてシステインを含み、ペプチド７（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７）と同じアミノ酸組成を有したが、その配列順序はランダムであった。この形(version)において、ペプチド７（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７）中に存在する負のパッチ(patch)が細胞反応に影響を与える可能性を除外するために、負に荷電したアミノ酸のパッチを保有した。
【００５９】
　　ペプチド１０
　ペプチド１０（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０，ｍ８６〜１０３，Ｃ−Ｃ）は、真正の(authentic)ＣＤＲ３類似体に比べるとアミノ酸１個分だけ切頭されていた。このペプチドは不適当な配座レパートリーを有するように故意に設計された。
【００６０】
　実施例２　　ペプチド合成
　アプライド　バイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）（カルフォルニア州，フォスターシティ）４３０Ａ，完全自動化ペプチド合成器で、ジェイムソン（Jameson)等の方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８，２４０，１３３５）に従って、ペプチドを合成した。内部システイン残基を含むペプチドを再生し(refolded)、それらを０．１Ｍ　ＮＨ4ＨＣＯ3中に１００μｇ／ｍｌで溶解し、２３℃において空気に暴露させながら一晩撹拌することによって酸化した。このペプチドは、この操作の終了時に、Ｅｌｌｍａｎｓ試薬、ＨＰＬＣ分析及びゲル濾過によって監視すると９５％より大きい分子内ジスルフィド結合を示す。ペプチドを凍結乾燥し、完全培地(complete medium)中に再懸濁させ、生物学的分析に用いる前に０．２２μフィルターに通して濾過した。合成されたペプチドの配列を以下の表Ｉに示す。
【００６１】
【表１】
2004107352.tif 000002
【００６２】
　　実施例３　　ＮＭＲ測定とペプチド　モデル化
　ペプチド５ｍｇを１０ｍＭリン酸カリウム４５０μｌ中に溶解した。この溶液のｐＨを６．０に調節し、重水素化トリフルオロエタノール５０μｌを加えた。得られた溶液を５ｍｍ　ＮＭＲ管に移した。
【００６３】
　全ての１Ｈ　ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ（マサチュセッツ州，ビレリカ）ＡＭＸ６００分光光度計に２７８Ｋにおいて記録した。全てのスペクトルは５℃において得られた。下記２Ｄ　ＮＭＲ実験、二重量子濾過相関スペクトロスコピー（double quantum filtered correlated spectroscopy）（ＤＱＦ−ＣＯＳＹ）と、完全相関スペクトロスコピー（totallycorrelated spectroscopy）（ＴＯＣＳＹ）とを用いて、スピン特定割り当て（spin specific assignment）を行った。バックス（Ｂａｘ）とデイビス（Ｄａｖｉｓ），Ｊ．Ｍａｇ．Ｒｅｓｏｎ．１９８５，６５，３５５。ＮＯＥＳＹ実験を用いて、逐次割り当てを行い、二次構造を検出した。クマール（Ｋｕｍａｒ）等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９８０，９５，１。　両次元において６００Ｈｚのスペクトル幅を用い、１６及び６４スキャン（ｓｃａｎ）をそれぞれＴＯＣＳＹとＮＯＥＳＹに関してｔ１増分につき記録した。混合時間はＴＯＣＳＹでは７０ｍｓ、ＮＯＥＳＹスペクトルでは４００ｍｓであった。
【００６４】
　ＮＯＥ誘導距離制約（NOE derived distance constraint）をモデル化プログラムディスカバー（modelling programDiscover）（Ｂｉｏｓｙｍ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カルフォルニア州，サンジエゴ）に用いられる標準圧力場（standard force field）に導入した。模擬アニーリングプロセス（simulatedannealing process）　を用いて、ペプチドモデルを得た。大量の水の中でのペプチドの拡大配座を高温（９００Ｋ）分子動力学（moleculardynamics）（ＭＤ）に暴露させ、３００ＫにおいてＭＤを実施することによってアニーリングし、最後に、０．０１ｋｃａｌ／ｍｏｌ−Åの平均誘導体（averagederivative）に最小化した。
【００６５】
　ペプチド１の溶液構造を二次元ＮＭＲと、距離制約分子動力学とによって特徴づけた。幾つかの長い距離ｉ，ｉ＋３ＮＯＥが観察されたが、ｉ，ｉ＋４ＮＯＥは観察されなかった。距離制約分子動力学の結果は図９Ａに示す。プロチド（ｐｒｏｔｉｄｅ）のこの配座異性体は、得られた収束構造（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）のファミリーの典型的なものであり、約０．５Åのバックボーン位置における平均平方根（ＲＭＳ，root mean square）偏差を有する。
【００６６】
　プロチドの提案された構造とＬ３Ｔ４の残基８６〜９６の構造との詳細な比較は、推定結合面を含むＡｒｇ（６）〜Ｇｌｕ（９）のペプチド領域がネイティブタンパク質に表される配座に類似した提案配座で暴露面を形成することを実証した。しかし、ペプチド１（ＳＥＱ　ＩＤ　１）の他の領域はＬ３Ｔ４タンパク質に殆ど又は全く類似性を示さなかった。
【００６７】
　環状化とＰＧＰ“ベンド（ｂｅｎｄ）”配列とによる立体的制約は、適当な接触面が暴露されるように、配座異性体ファミリーの二次構造を充分に固定するように思われる。表面暴露領域におけるアミノ酸のバックボーンと、特に側鎖は可撓性であり、プロチドの提案されたバックボーン構造がＬ３Ｔ４領域とは異なるとしても、エネルギー的に接近可能な、適当な静電面を有する。
【００６８】
　　実施例４　　円二色性測定
　ＣＤ測定の全てはＪｏｂｉｎ　Ｙｖｏｎ（ニュージャーシー州，エジソン）ＣＤ６分光光度計において０．０５ｃｍの光路長さを有する円形石英セルを用いて実施した。ペプチドの濃度は１０ｍＭリン酸カリウム中０．２ｍｇ／ｍｌであった。各測定値は、２秒間の総合時間での、０．２ｎｍのステップにおける４回反復スキャンの平均値であった。ＣＤ曲線をＣＣＡ／ＬｉｃｏｍｂとＰｒｏｖｅｎｃｈｅｒ最小二乗プログラムとを用いて分析した。
【００６９】
　水溶液中では、ペプチド１（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）のＣＤスペクトルは、２００ｎｍ以下において強い陰性帯を示した。この種のスペクトルは周期的な二次構造の欠損をしばしば意味する。３０％トリフルオロエタノールの添加又はジスルフィド結合のジチオスレイトールによる還元は知覚されうるほどにＣＤスペクトルを変化させなかった。
【００７０】
　　実施例５　　細胞ライン
　２２Ｄ１１はＣＤ４＋，ＰＣＣ特異的Ｔ細胞ハイブリドーマであり、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ　Ｌ−グルタミン、５０ｍＭ　ＭＥＭ非必須アミノ酸、５０ｍＭ　ＭＥＭ必須アミノ酸、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）及び１０％熱不活化ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中に維持する（イボンヌ　パターソン（Ｙｖｏｎｎｅ　Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ）、ペンシルバニア大学、ペンシルバニア州，フィラデルフィアから入手）。Ｄ１０．Ｇ４．１はＣＤ４＋，コンアルブミン特異的Ｔ細胞クローンであり、ＡＴＣＣ，メリーランド州，ロックビルから入手した（ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ２２４）。クローンを１０〜１４日間毎に、１ｍＭグルタミン、５ｘ１０５Ｍ　２−ＭＥ及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ　１６４０中の１００μｇ／ｍｌ　Ａｇと支持細胞（Ｃ３Ｈ照射脾臓細胞）とによって刺激した。ＣＴ２０はＩＬ−２依存性Ｔ細胞クローンであり、ＲＰＭＩ　１６４０，１０％ＦＣＳ中に維持し、Ｌｙｍｐｈｏｃｕｌｔ（Ｂｉｏｔｅｓｔ，ニュージャーシー州，デンビル）、ＩＬ−２供給源を補充した。ハイブリドーマＧＫ１．５（αＬ３Ｔ４）、１４５−２Ｃ１１（αＣＤ３ε）、Ｈ５７−５９７（αＴＣＲ−βＣ）及びＭＫＤ６（αＩ−Ａｄ）は例えばワイルド（Ｗｉｌｄｅ）等のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８３，１３１，２１７８；レオ（Ｌｅｏ）等のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８７，８４，１３７４；クボ（Ｋｕｂｏ）等のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８９，１４２，２７３６；及びカプラー（Ｋａｐｐｌｅｒ）等のＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９８１，５３，１１９８によって記載されているように維持した。
【００７１】
　　実施例６　　混合リンパ球反応
　混合リンパ球反応は主要組織適合型複合体（ＭＨＣ）不適合ドナーのＴリンパ球に対する個人のＴリンパ球の応答である。ＣＤ４＋，Ｔ細胞は外来ＭＨＣタンパク質を認識し、これに応じて、ＣＤ４分子に非常に依存的に増殖する。
【００７２】
　マウスを殺し、脾臓を無菌的に摘出した。脾臓をナイロンメッシュに穏やかに圧し通し、この細胞をＲＰＭＩ　１６４０と赤血球の低張性溶解物（hypotonic lysis）とによって洗浄することによって、細胞懸濁液を製造した。ＲＰＭＩ　１６４０で３回洗浄した後に、細胞を完全培地（ＲＰＭＩ　１６４０，１０％熱不活化ＦＣＳ、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、及び５ｘ１０５の２−ＭＥ）中に再懸濁させた。丸底９６孔プレートにおいて、１ｘ１０５応答（responder）細胞（ＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞）を１ｘ１０５の刺激（stimulator）細胞（Ｃ３Ｈ脾臓細胞，２０００ラド照射）と共に３通りに（intriplicate）インキュベートし（最終容量　２００μｌ）、指定濃度のペプチド（０．０１、０．１、１、１０、１００及び１０００μＭペプチド）を加えて、３７℃、５％ＣＯ２において５日間インキュベートした。チミジン組込みを測定する１２時間前に、１μＣｉ／孔の［３Ｈ］ＴｄＲを加えた。細胞から標識ＤＮＡをガラス繊維フィルター上にＰＨＤ細胞回収器（マサチュセッツ州，ケンブリッジ）を用いて回収し、ＣＰＭを１２０９Ｒａｃｋｂｅｔａ（ＬＫＢ，ニュージャーシー州，ピスカタウェイ）を用いて液体シンチレーション計測によって測定した。
【００７３】
　　実施例７
　実施例６に述べたようにＭＬＲを実施した。細胞を下記ペプチド：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１（ｍＰＧＰｔｉｄｅ）、及び対照ペプチド，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３（ｈＰＧｔｉｄｅｓ）及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３（ｍＣＤＲ３スクランブル）の各々の０．０１、０．１、１、１０、１００及び１０００μＭと共にインキュベートした。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１はペプチドの低濃度において阻害活性を示したが、対照ペプチドのＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３とは活性を殆ど又は全く示さなかった。図２は、ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２Ｄ）抗Ｃ３Ｈ（Ｈ−２Ｋ）アロレスポンス（alloresponse）での、ＣＤ４依存性混合リンパ球反応（ＭＬＲ）に対するＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１（ｍＰＧＰｔｉｄｅ）の免疫抑制反応を実証する。活性は０．０１μＭ　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の添加後に約８５０００ＣＰＭであり、２００μＭ　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の添加後に約３００００ＣＰＭであった。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３は、ＰＧＰモチーフの所有がそれだけでは生物学的活性のために充分でないことを実証する。活性は０．０１μＭ　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３において約７５０００ＣＰＭであり、２００μＭ　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３の添加後に約６００００ＣＰＭであった。同様に、活性は０．０１μＭ　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３の添加後に約８００００ＣＰＭであり、２００μＭ　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３の添加後に約９００００ＣＰＭであった。
【００７４】
　Ｌ３Ｔ４ＣＤＲ３類似体による以前の研究（マクドンネル（ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ）等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２，１４９，１６２６）におけるように、抗原発現細胞ではなく、応答Ｔ細胞の予備処理としてＴ細胞に直接位置づけられるＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の活性は刺激を阻害した。さらに、ＩＬ−２又はＬＰＳ仲介Ｂ細胞刺激に対するＴ細胞応答の阻害は見られなかったので、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の免疫抑制効果はＴ細胞受容体複合体を通して発生されるシグナルに対して特異的であった。これらのデータは、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の作用機構がシス型ＣＤ４相互作用を破壊し、正常Ｔ細胞活性化カスケードからそれを分離することであることを示唆する。
【００７５】
　　実施例８
　ペプチドｓＣＤ４、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４の０．０１、０．１、１、１０、１００、５００及び１０００μＭを用いて、ＭＬＲを実施例６に述べたように実施した。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２（ｈ８４−１０１，Ｃ−Ｃ）は、ペプチドの高濃度においても殆ど又は全く活性を示さなかったｓＣＤ４、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４（ｈ１８−４０線状）、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３（ｈ８４−１０１スクランブル）及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２（ｈ８４−１０１線状）に比べて、低濃度において阻害活性を示した。図３は、ヒトＣＤ４　ＣＤＲ３類似体ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２（ｈ８４−１０１　Ｃ−Ｃ）がＭＬＲの増殖応答を阻害することができ；低μｍｏｌ濃度においても半最大阻害が見られる（５００μＭペプチドでは陽性対照の約３０％ＣＰＭ）ことを実証するデータを示す。ｓＣＤ４とＳＥＱＩＤ　ＮＯ：１４（ＣＤ４，１８−４０）とは若干の阻害を示した（１０００μＭペプチドにおいて陽性対照の約４５〜５５％ＣＰＭ）が、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２（ｈ８４−１０１線状）及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３（ｈ８４−１０１スクランブル）は殆ど又は全く活性を示さなかった。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２（ｈ８４−１０１線状）は１００μＭペプチドでは陽性対照の約９５％ＣＰＭを示し、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３（ｈ８４−１０１スクランブル）は５００μＭペプチドでは陽性対照の約１００％ＣＰＭを示した。
【００７６】
　　実施例９
　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０の０．０１、０．１、１、５、２０、５０及び１００μＭを用いて、ＭＬＲを実施例６に述べたように実施した。ネズミのペプチドＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７（ｍ８６−１０４，Ｃ−Ｃ）、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８（ｍ８６−１０４，線状）、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９（ｍ８６−１０４，スクランブル）及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０（ｍ８６−１０３，Ｃ−Ｃ）は、ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２Ｄ）抗Ｃ３Ｈ（Ｈ−２Ｋ）アロレスポンスでの、ＭＬＲに対するそれらの効果に関して試験した。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７は、ペプチドの低濃度においても活性を示した。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８はペプチドの高濃度において限定された活性を示し、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９は不活性であった。図４は、ＣＤＲ３類似体がＬ３Ｔ４依存性応答を阻害できることを示す。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７は低μｍｏｌ範囲において抑制活性を示した。２０μＭにおいて、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７は陽性対照の約４５％ＣＰＭを示し、１００μＭでは陽性対照の約０％ＣＰＭを示した。完全な配列を有するが配座の変化を示す両ペプチド（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０）は非常に限定された活性を、試験した最高濃度においてのみ示した。２０μＭにおいて、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０は対照の約９５％〜約１００％ＣＰＭを示した。１００μＭでは、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８は対照の約８０％ＣＰＭを示し、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０は対照の約５５％ＣＰＭを示した。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９は殆ど又は全く活性を示さず、添加ペプチドの濃度に関係なく、対照の約１００％のＣＰＭを示した。スクランブルペプチドの不活化は、負の電荷が免疫応答を抑制するために充分でないことを実証する。したがって、両配列並びに配座に関してこの電荷の存在が生物学的活性のために必要である。Ｂ及びＤアロタイプに対するＭＬＲも実施したところ、同じ阻害が認められ、この阻害がＨ−２Ｋ制限応答に限定されないことが実証された。
【００７７】
　　実施例１０
　ＭＬＲを実施例６に述べたように実施した。ｈ８４−１０１　Ｃ−Ｃ、ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：４、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１、（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４＋ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５）及びＣＤ４に対するモノクローナル抗体（ＯＫＴ４Ａ）を、ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２Ｄ）抗Ｃ３Ｈ（Ｈ−２Ｋ）アロレスポンスにおけるＭＬＲに対するこれらの効果に関して試験した。ＭＬＲをペプチド又は抗体（ＭＬＲ）を添加せずにも実施した。各ペプチドは中等レベル（３０〜５０％）で阻害活性を有するが、両類似体を一緒に加えた場合には（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５）、効果は相乗的であり、ＣＤ４に対するモノクローナル抗体（ＯＫＴ４Ａに比べて、阻害は１００％に近かった。結果は表ＩＩに要約する。
【００７８】
【表２】
2004107352.tif 000003
【００７９】
　　実施例１１　　ＩＬ−２産生の阻害
　丸底９６孔プレートにおいて、１ｘ１０５Ｔ細胞ハイブリドーマー２２Ｄ１１細胞を、５ｘ１０５支持細胞（照射Ｃ３Ｈ脾臓細胞）及び１００μｇ／ｍｌ　ＰＣＣ、又はＨ５７−５９７−（αＴＣＲ）被覆孔中の１ｘ１０5の２２Ｄ１１、及び指定濃度のペプチド（０．０１、０．１、１、１０、５０及び１００μＭ）と共に３通りに培養することによって、ＩＬ−２産生を分析した。２４時間目に、細胞はペレット化し、上澄みを他の９６孔プレートに１ｘ１０４のＣＴ２０細胞／孔と共に移した。細胞を１μＣｉ／孔の［３Ｈ］ＴｄＲと共に、２４時間インキュベーションの最後の４時間インキュベートした。細胞から標識ＤＮＡをガラス繊維フィルター上にＰＨＤ細胞回収器（マサチュセッツ州，ケンブリッジ）を用いて回収し、ＣＰＭを１２０９Ｒａｃｋｂｅｔａ（ＬＫＢ，ニュージャーシー州，ピスカタウェイ）を用いて液体シンチレーション計測によって測定した。応答はＩＥｋ制限され、ＰＣＣ特異性であった。
【００８０】
　　実施例１２
　ＩＬ−２産生に対するＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１の効果を測定するために、実施例１１に従って分析を実施した。ＳＥＱ　ＩＤＮＯ：７は、ペプチドの低濃度においても阻害活性を示した。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０とはペプチドの高濃度において限定された活性を示し、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１とは不活性であった。図５は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７（ｍ８６−１０４，Ｃ−Ｃ）が低μＭ範囲においてＩＬ−２産生の抑制活性を示すことを説明する。　５０μＭＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７の投与はＩＬ−２産生を対照のＩＬ−２産生の約３０％まで阻害し、１００μＭＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７の投与はＩＬ−２産生を対照のＩＬ−２産生の約２５％まで阻害した。完全な配列を有するが配座の変化を示す両ペプチド（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８（ｍ８６−１０４，線状）とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０（ｍ８６−１０３，Ｃ−Ｃ））は限定された活性を、試験した最高濃度においてのみ示した。５０μＭ及び１００μＭのＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８の投与は、それぞれ、対照のＩＬ−２産生の約９０％及び６０％を生じた。同様に、５０μＭ及び１００μＭのＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０の投与は、それぞれ、対照のＩＬ−２産生の約８５％及び７０％を生じた。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９（ｍ８６−１０４，スクランブル）は殆ど又は全く活性を示さず、対照のＩＬ−２産生の約１００％を生じた。
【００８１】
　　実施例１３　　Ｔ細胞増殖分析
　Ｔ細胞増殖分析に関しては、Ｄ１０．Ｇ４．１細胞を刺激後１０〜１４日目に用いた。Ｆｉｃｏｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ニュージャーシー州，ピスカタウェイ）での遠心分離によって生存細胞を選択し、３回洗浄した。１ｘ１０５Ｄ１０細胞を、丸底９６孔プレートにおいて、５ｘ１０５支持細胞、１００μｇ／ｍｌコンアルブミン、及び指定ペプチド濃度（０．０１、０．１、０．５、１、５、２５、５０及び１００μＭ）と共に３通りに７２時間培養した。最後の１６時間は、細胞を１μＣｉ／孔の［３Ｈ］ＴｄＲと共に、インキュベートした。上記のように、細胞を回収し、導入放射能を計測した。応答はＩ−Ａｋ制限され、コンアルブミン特異性であった。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７は、ペプチドの低濃度において阻害活性を示した。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０とはペプチドの高濃度において限定された活性を示し、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１とは不活性であった。　図６は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７（ｍ８６−１０４，Ｃ−Ｃ）が低μＭ範囲においてＴ細胞増殖の抑制活性を示すことを説明する。５μＭペプチド濃度では、Ｔ細胞増殖は対照の約６５％に減ぜられた（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１）。２５〜１００μＭペプチド濃度では、Ｔ細胞増殖は対照の約３０％に減ぜられた。完全な配列を有するが配座の変化を示す両ペプチド（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８（ｍ８６−１０４，線状）とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０（ｍ８６−１０３，Ｃ−Ｃ））は非常に限定された活性を、試験した最高濃度においてのみ示す。ＳＥＱ　ＩＤＮＯ：８は、１００μＭペプチド濃度において対照の約８０％のＴ細胞増殖を示し、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０は、１００μＭペプチド濃度において対照の約７５％のＴ細胞増殖を示した。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９（ｍ８６−１０４，スクランブル）は１００μＭペプチド濃度において対照の１００％のＴ細胞増殖を示し、完全に不活性であった。
【００８２】
　　実施例１４　　植物凝集素Ｔ細胞増殖分析
　マイトジェン植物凝集素（ＰＨＡ）はＣＤ３／ＴＣＲ複合体を架橋することによってＴ細胞を活性化する。ヒト血液を被験者（ｖｏｌｕｎｔｅｅｒ）ドナーから採取する。Ｆｉｃｏｌｌグラジエント（ｇｒａｄｉｅｎｔ）上での分離によってリンパ球を精製する。Ｔ細胞をヒツジ赤血球へのロゼット形成によって分離する。富化（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）Ｔ細胞集団を５μｇ／ｍｌ植物凝集素（ＰＨＡ）によって刺激する。図７はＤ２ペプチド類似体がＰＨＡ刺激に応じてＴ細胞増殖を阻害できることを示す。０．００００２５、０．０００２５、０．００２５、０．０２５、０．２５、２．５、２５及び２５０μＭペプチド濃度を試験した。ＭＬＲ分析と同様に、各Ｄ２誘導ペプチドは単独では、中等度の用量依存性阻害活性を示した。結果は図７に示す。０．２５μＭのＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１の添加は、それぞれ、４７０００ＣＰＭ、５３５００ＣＰＭ、４８０００ＣＰＭ、及び５０００ＣＰＭを生じた。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５とを一緒に加えた場合には、観察される阻害率は有意に上昇した。一緒に加えたＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５の０．２５μｇ（合計）は４１５００ＣＰＭを生じた。阻害のためのペプチド必要量は２桁減少し、両ペプチドの間に相乗効果があることを実証した。例えば、組合せたＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５の僅か２．５μｇ（合計）が３４５００ＣＰＭを生じた。２５０μｇのＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６は、それぞれ、３８０００ＣＰＭ、３９５００ＣＰＭ及び３９５００ＣＰＭを生じた。
【００８３】
　　実施例１５　　細胞死分析
　細胞死分析のために、平底９６孔培養プレートにｍＡｂ（１００μｇ／ｍｌ）１００μｌを３７℃にわたって４時間で塗布し；次に、このプレートを指定濃度のペプチド又は抗体を入れてインキュベートした。ペプチドを１００μＭで用いた。モノクローナル抗体ＧＫ１．５（α−Ｌ３Ｔ４）、１４５−２Ｃ１１（α−ＣＤ３）及び陰性対照ＭＫＤ６（α−１Ａｄ）を飽和濃度で用いた。２４時間目に、培養上澄み１００μｌを取り出し、上述したように、ＩＬ−２産生に関して分析した。その後、細胞を回収し、細胞生存率を［３Ｈ］ＴｄＲ摂取の阻害によって、かつトリパンブルー排除試験によって監視した。結果は３通り培養の平均値として表す。
【００８４】
　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７（ｍ８６−１０４，Ｃ−Ｃ）は抗ＴＣＲ刺激２２Ｄ１１細胞による受容体仲介細胞死を阻害した。完全な配列を有するが配座の変化を示す両ペプチド（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８（ｍ８６−１０４，線状）とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０（ｍ８６−１０３，Ｃ−Ｃ））は非常に限定された活性を、試験した最高濃度においてのみ示した。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９（ｍ８６−１０４，スクランブル）は完全に不活性であった。結果は表ＩＩＩに要約する。
【００８５】
【表３】
2004107352.tif 000004
【００８６】
　　実施例１６　　抗ＣＤ３、ＬＰＳ及びｒＩＬ−２に対するＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞増殖応答へのペプチドの効果
　抗ＣＤ３（１４５−２Ｃ１１）、ＬＰＳ及びｒＩＬ−２の増殖効果に対するＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７（ｍ８６−１０４，Ｃ−Ｃ）の効果を試験した。ＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞を丸底９６孔プレートに１ｘ１０５脾臓細胞／孔で接種し、抗ＣＤ３（１４５−２Ｃ１１，１％組織培養上澄み）又はリポ多糖（ＬＰＳ，１０μｇ／ｍｌ）又はマウスｒＩＬ−１（１００Ｕ／ｍｌ）によって刺激した。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７はαＣＤ３に対するＴ細胞増殖応答を阻害したが、ＬＰＳ又はｒＩＬ−２に対するＴ細胞増殖応答には殆ど又は全く効果を示さなかった。図８から分かるように、このペプチドはＬＰＳ仲介Ｂ細胞増殖の阻害を示さず、阻害活性の特異性を実証した。αＣＤ３に対する細胞の増殖応答は用量依存的に抑制されたが、ｒＩＬ−２に対する細胞増殖応答には効果が見られず、Ｔ細胞活性化の阻害能力がＴＣＲを介して発生されるシグナルに限定されるように見えることを実証した。
【００８７】
　　実施例１７
　ネズミ８６ー１０３ペプチド（共有結合的に閉じた環状類似体を形成するために位置１０３に導入した非ＣＤ４システインを含む）のインビトロ活性はこのペプチドのごく小部分、残基Ａｒｇ−９１、Ｌｙｓ−９２、Ｇｌｕ−９３及びＧｌｕ−９４に属する。さらに、これらのアミノ酸の活性はそれらの空間的並置（ｓｐａｃｉａｌ　ｊｕｘｔａｐｏｓｉｔｉｏｎ）に決定的に依存する。したがって、ＣＤＲ３類似体の可能な活性にはバックボーン折り畳みと配列とが重要であるという予想に反して、類似体の完全な活性を与えるものは、“表面”を形成するための、空間におけるアミノ酸側鎖原子の正確な位置である。
【００８８】
　新規に開発されたＣＤ４誘導類似体の活性は、例えば多発性硬化症のような自己免疫疾患の治療に有用であると示すことができる。多発性硬化症は病因がまだ分からない自己免疫疾患である。これは中枢神経系（ＣＮＳ）のミエリン破壊を生ずる慢性再発性炎症性応答を含む。この疾患のエフェクター期（ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｐｈａｓｅ）におけるニューロンのミエリン鞘の破壊機構は不明であり、非特異的な細胞活性又はシトキン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）活性によると考えられるが、早期病巣に見られる小リンパ球の大半はＣＤ４＋　ヘルパー／インデューサーＴ細胞サブセットによる（ライネ（Ｒａｉｎｅ）とシャインベルグ（ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇ）の（１９８８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１８９〜２０１）。如何なる抗原（例えば、ミエリン塩基性タンパク質又はプロテオリピド）がこの応答を刺激するのかに関する論争にも拘わらず、ＣＮＳ中へのＣＤ４＋Ｔ細胞の浸潤レベルが多発性硬化症発作に相関すると考えられる。多発性硬化症の臨床経過と臨床発現の両方が、ＣＮＳ病巣部位並びにこの疾患の動態と進行に依存して、可変である。
【００８９】
　多発性硬化症の研究には実験的アレルギー性腦脊髄炎（ＥＡＥ）が最良の実験動物モデルと考えられる。この理由は、このモデルがヒト障害と同じ臨床的及び組織病態学的特徴の多くを共有するからである。ＥＡＥはマウスを含めた幾つかの動物種に、粗ＣＮＳ組織抽出物、精製ＭＢＰ、プロトリピド、又はこれらの抗原分子の活性部分から成る合成ポリペプチドを接種することによって、発症させることができる。抗原は完全フロインドアジュバンド（ＣＦＡ）と共に皮下投与されるが、この標準方法の我々の改良方法では、誘導のために０日目と、７日目の２回投与する（コーンゴールド（Ｋｏｒｎｇｏｌｄ）等、（１９８６）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４：３０９〜３１５，本明細書に援用される）。疾患の症状は最初の免疫化後１５〜１９日目に通常生じ、２５日間まで継続する。マウスは通常、急性ＥＡＥ発作から回復するが、後に再発するか、又は再免疫化時に重度な（ｅｎｈａｎｃｅｄ）疾患発症を受けやすい。マウスの臨床神経学的症状を四肢衰弱度と麻痺度とに基づいてスコアをつけ、組織病態学的分析がＣＮＳへの細胞浸潤度とミエリン破壊度とを明らかにする。ネズミＥＡＥモデルからＣＤ４＋Ｔ細胞が疾患の誘導に重要であることが明らかであり、ＥＡＥと多発性硬化症の分野における免疫学的研究の主要目的は、ＣＮＳ抗原と反応するようなＣＤ４＋Ｔ細胞を、免疫系全体を危険にさらすことなく、特異的に阻害することができるアプローチを見いだすことであった。
【００９０】
　ＣＤ４タンパク質のＣＤＲ３類似領域のＤ−アミノ酸類似体は、特に例えば多発性硬化症のようなミエリン破壊疾患に関して、自己免疫疾患の治療に強力でかつ有用な治療活性を有することが実証されている。
【００９１】
　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の逆配列である下記ペプチドを、標準方法によってＤ−アミノ酸を用いて合成し、当面の問題に関連した分析で試験した。
　　Ｄ−アミノ酸ＣＤＲ３類似ペプチド＃１：
　　　　　ＣＰＧＰＥＥＫＲＮＥＬＥＣ
　全Ｌ−アミノ酸類似体ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１を、ヒト多発性硬化症の実験的アレルギー性腦脊髄炎ネズミモデルで試験した。この類似体は疾患の進行の経過に対して統計的に有意な効果を有さないことが判明した。
【００９２】
　上記の全Ｄ−アミノ酸配列はこの自己免疫障害の進行を顕著に妨げることが判明した。全Ｄ−アミノ酸逆配列類似体のインビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）効力はこの化合物の治療価値を実証する。
【００９３】
　　実施例１８　　ＥＡＥの臨床発生率に対するＣＤ４−ＣＤＲ３類似体（ＣＤ４−ＣＤＲ３−ｌｉｋｅ　Ａｎａｌｏｇ）の効果
　急性ＥＡＥの誘導を非常に受けやすいＳＪＬマウスを、コーンゴールド等、（１９８６）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４：３０９〜３１５の記載に従って免疫化した。したがって、粗ＳＪＬマウス脊髄ホモジネート（ＭＳＣＨ）１ｍｇをリン酸塩緩衝化溶液０．１５ｍｌ中で希釈し、等量のＣＦＡ中でエマルジョン化した。この接種物０．１５ｍｌをメタファン麻酔したマウスの側腹部後方に皮下注射した。第２回接種を、第１回と同様に、７日目に投与した。マウスを毎日、疾患の症状に関して評価して、０〜５の採点した（０＝疾患の臨床発現なし；１＝尾弛緩、軽度の後肢衰弱を付随又は付随せず；２＝尾弛緩、中等度の後肢衰弱を付随；３＝重度の後肢衰弱及び軽度の前肢衰弱；４＝完全な後肢麻痺、中等度の前肢衰弱を付随；５＝四肢麻痺又は瀕死の状態）。
【００９４】
　マウスを４群に分けた：第１群，治療せず；第２群，２日目と８日目にＤ−アミノ酸ＣＤＲ３類似ペプチド＃１　０．５ｍｇを静脈内投与（ｉ．ｖ．）；第３群，１２日目にＤ−アミノ酸ＣＤＲ３類似ペプチド＃１をｉ．ｖ．投与；第４群２日目と８日目に、Ｄ−アミノ酸ＣＤＲ３類似ペプチド＃１と同じ長さの対照Ｄ−ポリペプチドをｉ．ｖ．投与。図１０に示すように、非治療群（任意の投球の症状を有するマウス）におけるＥＡＥ発生率レベルは実験の１９日目までに８３％に達し、対照ペプチドで治療した群でも同様なレベルに達した（７１％）。他方では、２日目と８日目に、又は１２日目のみにＤ−アミノ酸ＣＤＲ３類似ペプチド＃１によって治療した両群は、それぞれ、３６％と３１％の最大ＥＡＥ発生率に達した。疾患の症状を発現したマウスの最初の発症の平均時間はＤ−アミノ酸ＣＤＲ３類似ペプチド＃１によって治療したマウスでは遅かった（２日目と８日目に又は１２日目に治療したマウスでは、それぞれ、１７．１日と１７．０日であり、これに比べて、非治療群と対照ペプチド群では、それぞれ、１５．６日と１５．２日）。
【００９５】
　　実施例１９　　ＥＡＥの臨床重症度に対するＤアミノ酸ＣＤＲ３類似ペプチド＃１の効果
　上記と同じ実験を用いて、種々な治療群からのマウスを疾患の臨床的発現に関して評価した。図１１に示すように、非治療群と対照ペプチド群とのマウスの平均ＥＡＥ重症度は、実験の１７日〜１８日にそれぞれ２．１７と２．２９の最大値に達したが、２日目と８日目に又は１２日目にＤ−アミノ酸ＣＤＲ３類似ペプチド＃１を投与した群が達した最大重症度は、それぞれ、０．７７と０．７５であり、１９〜２１日目にピーク活性を示した。ターキー（Ｔｕｋｅｙ）の多重変動分析（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｖａｒｉａｎｃｅ）によると、非治療群と、Ｄ−アミノ酸ＣＤＲ３類似ペプチド＃１による２日目と８日目治療群の間では、１６〜１９日目と２４日目に（０．０１≦ｐ≦０．０４）；非治療群と、Ｄ−アミノ酸ＣＤＲ３類似ペプチド＃１による１２日目治療群の間では、１６〜２４日目に（０．０１≦ｐ≦０．０５）；及び対照ペプチド２日目と８日目治療群と、Ｄ−アミノ酸ＣＤＲ３類似ペプチド＃１による２日目と８日目治療群の間では、１７日目に（ｐ＝０．０２）であり、この差は統計的に有意である。
【００９６】
　　実施例２０　　エフェクター期のＥＡＥの臨床重症度に対するＤアミノ酸ＣＤＲ３類似ペプチド＃１の効果
　Ｄ−アミノ酸ＣＤＲ３類似ペプチド＃１が、症状がひと度発現した場合に、それ故、疾患のエフェクター期に対応して、ＥＡＥの発症に効果を及ぼすことができるか否かを研究するために、３０ＳＪＬマウスに０日と７日目にＭＳＣＨとＣＦＡを上述のように接種した。１６日目までに等級１レベルの臨床ＥＡＥ発現した１２マウスを選択し、ランダムに非治療群と、Ｄ−アミノ酸ＣＤＲ３類似ペプチド＃１　０．５ｍｇｉ．ｖ．治療群とに分けた。図１２に示すように、非治療マウス群では１８日までに平均２．４までに疾患が進行したが、Ｄ−アミノ酸ＣＤＲ３類似ペプチド＃１治療群では１９日目に１．１７の重症度に達するにすぎず、その後重症度は迅速に低下した。１８日目に、非治療群と治療群との差は統計的に有意であった（ｐ＝０．００３）。
【００９７】
　　実施例２１　　ＥＡＥ試験し、Ｄ−アミノ酸ＣＤＲ３類似ペプチド＃１で治療したマウスからのＴ細胞の表現型と機能性
　０日目と７日目にＥＡＥ誘導のための接種を受け、治療されないか、又はＤ−アミノ酸ＣＤＲ３類似ペプチド＃１　０．５ｍｇｉ．ｖ．で１２日目に治療されたＳＪＬマウスを２７日目に、脾臓とリンパ節とにおけるＣＤ４＋と、ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットに関してサンプリングした（頚部リンパ節、軸性（ａｘｉａｌ）リンパ節、上腕リンパ節、鼠蹊リンパ節、腸間膜リンパ節からプール）。細胞の表現型はＦＩＴＣ標識抗ネズミＣＤ４とＣＤ８モノクローナル抗体とによるフローサイトメトリック分析によって評価した。図１３に示すように、２群におけるリンパ系器官の細胞組成は同等であった。Ｄ−アミノ酸ＣＤＲ３類似ペプチド＃１で治療されたマウスのＣＤ４＋細胞が有意に減少しないという結果が特に興味深い（０．７６≦ｐ≦０．９９）。さらに、Ｄ−アミノ酸ＣＤＲ３類似ペプチド＃１治療群のマウスからのリンパ節細胞を照射（１５００ｃＧｙ）ＭＨＣ同種刺激脾臓細胞（ＣＢＡ株）に対する混合リンパ球反応での免疫応答性を分析した。図１４に示すように、Ｄ−アミノ酸ＣＤＲ３類似ペプチド＃１治療群は、ＭＨＣ同種抗原に対して、良好ではないとしても、同等の増殖反応を示した（３Ｈチミジン摂取によって測定した同種反応を照射ＳＪＬ刺激細胞を用いる同系反応によって除して、刺激インデックスを算出した）。
【００９８】
　　実施例２２　　ＣＤ４＋Ｔ細胞によって仲介されるＧＶＨＤの発症に対するＤ−アミノ酸ＣＤＲ３類似ペプチド＃１の効果
　下記データは、移植処置を受ける又は移植処置から回復した個人への治療剤としてのＣＤ４類似体の使用を支持する。臨床骨髄移植は危険性の高い白血病、再生不良性貧血、重度な免疫不全合併症を含めた幾つかの疾患の重要な治療方法である。さらに、このアプローチによって治療される可能性がある広範囲な代謝性及び遺伝性障害が存在する。しかし、現在、骨髄移植の有用性は、幾つかの危険要素によって限定されており、重要な要素は対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）であり、これはしばしば、移植組織の高い割合で生ずる致死的併発症である。ＧＶＨＤの危険性は、骨髄ドナーとレシピエントとのＨＬＡ適合によって減ぜられ、適合した兄弟が第一選択である。しかし、北アメリカではＨＬＡ適合兄弟を有する患者は３０％未満に過ぎない、それ故、血縁関係ではないが、適当なＨＬＡ適合ドナーをナショナル　マロードナープログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｍａｒｒｏｗ　Ｄｏｎｏｒ　Ｐｒｏｇｒａｍ）から求めなければならない。血縁関係のないＨＬＡ適合ドナーを発見する確率は現在、３０〜４０％のオーダーであり、登録ドナーの全体数に依存する。血縁の又は血縁関係の無いＨＬＡ適合移植組織の両方において、ＧＶＨＤの危険性は、非ＨＬＡ多重マイナー組織適合型（Ｈ）抗原の格差（ｄｉｓｐａｒｉｔｙ）のためにまだ非常に高い。血縁関係が無い場合、ＧＶＨＤは、これがこれらの部位の相違の可能性を高めるので、幾らか多い。
【００９９】
　骨髄接種物を汚染する成熟ドナーＴ細胞がＧＶＨＤの原因となることは明らかであり、幾つかの研究がこのようなＴ細胞の存在しないことが疾患の発生率を有意に低下させることを示している。しかし、ドナーＴ細胞の除去も白血病再発の大きな発生率を生じている。これらの完全な免疫寛容患者に少なくともあるレベルの免疫適格性を与えて、残留白血病細胞に対処するのみでなく、偶発的な感染症に対抗することが重要に思われる。これに関して、ＣＤ４−ＣＤＲ３類似体が宿主のマイナーＨ抗原に反応し、ＧＶＨＤの原因となるドナーＣＤ４＋Ｔ細胞のサブポピュレーションを特異的に減ずることができるならば、残りの免疫が完全な状態で残されて、白血病再発及び感染症を抑制することが可能になる。
【０１００】
　Ｂ１０．Ｄ２　ＣＤ４＋Ｔ細胞をＴ細胞欠失骨髄と共に移植することも照射（８５０ｃＧｙ）ＤＢＡ／２マウスに致命的なＧＶＨＤ応答を誘発することが今までに判明している（コーンゴールドとスプレント（Ｓｐｒｅｎｔ）、Ｊ　Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６５：１５５２〜１５６４）。図１５に示すように、Ｂ１０．Ｄ２　ＣＤ４＋Ｔ細胞の移植は１５日間のメジアン生存時間によってＤＢＡ／２レシピエントに致命的なＧＶＨＤの８３％発生率を生じた。ドナーＴ細胞欠失骨髄のみの移植は６５日目の実験終了まで完全な生存を生じた。一方、Ｄアミノ酸ＣＤＲ３類似ペプチド＃１　０．５ｍｇｉ．ｖ．で治療された、Ｂ１０．Ｄ２　ＣＤ４＋Ｔ細胞のＤＢＡ／２レシピエントは、有意に高い生存率（５７％）と、非治療群に比べて、６５日間より長い有意に延長されたメジアン生存時間とを示した（ｐ＝０．０４）。このデータは、Ｄアミノ酸ＣＤＲ３類似ペプチド＃１がＧＶＨＤの発症と移植されたドナーＣＤ４＋Ｔ細胞の同種反応性（ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）とに減少効果を有しうることを実証する。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】図１は、水接近可能な面を指示したＬ３Ｔ４タンパク質モデルのリボン表示を示す。
【図２】図２は、ＢＡＬＢ／ｃ抗Ｃ３Ｈ混合リンパ球反応に対するＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１（（黒三角）によって表されるネズミＣＤＲ３類似体(analog)）、対照ペプチドＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９（（白丸）によって表されるｍＣＤＲ３スクランブル(scramble)）及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３（（白四角）によって表されるヒトＣＤＲ３類似体）の効果を説明するグラフである。
【図３】図３は、ヒト混合リンパ球反応に対するＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２（ｈ８４−１０１　Ｃ−Ｃ）、ｓＣＤ４（ＣＤ４タンパク質の２アミノ末端領域の溶解性組換え体）、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４（ｈ１８−４０線状(linear)）、及び対照ペプチドＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３（ｈ８４−１０１スクランブル）とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２（ｈ８４−１０１線状）の効果を説明するグラフである。
【図４】図４は、ＢＡＬＢ／ｃ抗Ｃ３Ｈ混合リンパ球反応に対するＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７（ｍ８６−１０４　Ｃ−Ｃ，（白三角））、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８（ｍ８６−１０４線状，（白四角））、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９（ｍ８６−１０４スクランブル，（白丸））、及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０（ｍ８６−１０３　Ｃ−Ｃ，（黒三角））の効果を説明するグラフである。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７はペプチドの低濃度において阻害活性を示した。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０とは、ペプチドの高濃度において限定された活性を示し、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９は不活性であった。
【図５】図５は、ＩＬ−２産生に対するＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７（ｍ８６−１０４　Ｃ−Ｃ，（白三角））、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８（ｍ８６−１０４線状，（白四角））、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９（ｍ８６−１０４スクランブル，（白丸））、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０（ｍ８６−１０３　Ｃ−Ｃ，（黒三角））及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１（無関係対照，（黒四角））の効果を説明するグラフである。
【図６】図６は、Ｔ細胞増殖に対するＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７（ｍ８６−１０４　Ｃ−Ｃ，（白三角））、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８（ｍ８６−１０４線状，（白四角））、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９（ｍ８６−１０４スクランブル，（白丸））、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０（ｍ８６−１０３　Ｃ−Ｃ，（黒三角））及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１（無関係対照，（黒四角））の効果を説明するグラフである。
【図７】図７は、Ｔ細胞のＰＨＡ仲介刺激の阻害効果に対するＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４＋対照ペプチド（白三角）、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５＋対照ペプチド（白四角）、ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：６＋対照ペプチド（白丸）、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４＋ＳＥＱ　ＩＤＮＯ：５（黒三角）及び対照ペプチド（黒丸）の効果を説明するグラフである。
【図８】図８は、αＣＤ３（１４５−２Ｃ１１，（白三角））、ＬＰＳ（白四角）及びｒＩＬ−２（白丸）の増殖結果(proliferative effect)に対するＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７（ｍ８６−１０４　Ｃ−Ｃ）の効果を説明するグラフである。
【図９】図９は、タンパク質モデルに基づくＬ３Ｔ４のＣＤＲ３類似領域(CDR3 like region)の水接近可能な面（図９Ｂ）と、ＮＭＲ分析に基づくＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の推定結合領域(putativebinding region)の水接近可能な面（図９Ａ）との比較である。
【図１０】図１０は、無処理マウスと、対照ペプチド又はＤアミノ酸ＣＤＲ３類似ペプチド＃１を投与したマウスとにおけるＥＡＥ発生率のレベルを示すグラフである。
【図１１】図１１は、無処理マウスと、対照ペプチド又はＤアミノ酸ＣＤＲ３類似ペプチド＃１を投与したマウスとにおける重症度を示すグラフである。
【図１２】図１２は、症状の発現後の、無処理マウスと、対照ペプチド又はＤアミノ酸ＣＤＲ３類似ペプチド＃１を投与したマウスとにおける重症度を示すグラフである。
【図１３】図１３は、無処理マウスと、Ｄアミノ酸ＣＤＲ３類似ペプチド＃１を投与したマウスとにおける類リンパ器官の細胞組成(cellular composition)の比較を示す棒グラフである。
【図１４】図１４は、無処理マウスと、Ｄアミノ酸ＣＤＲ３類似ペプチド＃１を投与したマウスとからの細胞による同種(allogeneic)ＭＨＣ抗原に対する増殖応答の比較を示す棒グラフである（刺激インデックスは３Ｈ−チミジン摂取によって測定される同種応答を照射ＳＪＬ刺激細胞(irradiatedSJL stimulator cell)を用いた同系(syngeneic)応答によって除して算出した）。
【図１５】図１５は、無処理の場合と、Ｄアミノ酸ＣＤＲ３類似ペプチド＃１を投与した場合との２ｘ１０6のＢ１０．Ｄ２　ＣＤ４＋　Ｔ細胞移植後のマウスの比較生存率を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2004107352.tif 000018
【図１５】
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【配列表】
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