(57)【要約】【課題】エンベロープを持つタイプのウィルスだけでなく、エンベロープを持たないタイプのウィルスの不活化も可能で、それ以外の病原性微生物も不活化して、抗原自体には影響を与えることなく安全で高い免疫活性を保持したまま病原性や感染性を消滅ないしは減衰させることができる方法を提供する。【解決手段】病原性微生物を含む液体を耐圧容器１０内に充満させて耐圧容器内から気体を排除し、耐圧容器内に液体を密封した後、耐圧容器を冷却して液体の全部または一部を凍結させ、耐圧容器内に高圧を発生させる。発生した高圧と低温と凍結との３つの要素を耐圧容器内の病原性微生物に作用させ、それらの相乗効果により病原性微生物を不活化する。【選択図】      図１
2004285019.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体外異物を含む液体を耐圧容器内に充満させて耐圧容器内から気体を排除し、耐圧容器内に前記液体を密封した後、耐圧容器を冷却して、前記液体の全部または一部を凍結させ、耐圧容器内に高圧を発生させることを特徴とする生体外異物の不活化方法。
【請求項２】
前記生体外異物が病原性微生物である請求項１記載の生体外異物の不活化方法。
【請求項３】
前記生体外異物が、受動免疫に係る抗体を産生する抗原となり得るものである請求項１または請求項２記載の生体外異物の不活化方法。
【請求項４】
前記生体外異物が、免疫誘導を与える抗原となり得るものである請求項１または請求項２記載の生体外異物の不活化方法。
【請求項５】
前記生体外異物が、能動免疫に係る抗原となり得るものである請求項４記載の生体外異物の不活化方法。
【請求項６】
前記抗原がワクチンの原料となる請求項３記載の生体外異物の不活化方法。
【請求項７】
前記抗原が診断薬の原料となる請求項３ないし請求項５のいずれかに記載の生体外異物の不活化方法。
【請求項８】
前記液体が塩類溶液である請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の生体外異物の不活化方法。
【請求項９】
前記液体が有機溶媒含有水溶液である請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の生体外異物の不活化方法。
【請求項１０】
前記液体がゲル状物質またはゾル状物質を含む請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の生体外異物の不活化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、ウィルス、細菌等の病原性微生物や花粉などのように病気の原因となる生体外部の異物であって生体内に侵入したときに免疫反応を引き起こす抗原となり得る生体外異物を不活化する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
我々生体は、外部の異物、すなわち外界に存在するウィルス、細菌等の病原性微生物や細菌毒素、花粉、塵などが侵入してきたときに、これを抗原として認識する。抗原は、高分子のタンパク質がその代表的なものであるが、多糖類、核酸、脂質なども抗原となり得る。これら抗原の刺激により、生体内ではそれぞれの抗原に応答して特異的な抗体を産生する。これが、一般に免疫反応と呼ばれている現象である。そして、生体が微生物感染、異物侵入などの抗原の刺激によって後天的に免疫反応を引き起こすことを能動免疫と呼び、一方、同種または異種の動物で産生された抗体を別の個体に経口的にあるいは注射等により接種して、人為的に生体に免疫能を付与することを受動免疫と呼んでいる。
【０００３】
免疫の仕組みを医学に応用したのが、ワクチンの製造である。ワクチンには、病原性を弱めた病原体微生物を含む弱毒性ワクチンと、不活化処理により病原性や感染性を無くさせた病原体微生物を含む不活化ワクチンとがある。弱毒性ワクチンは、主として不活化を行えない病原性微生物のワクチンとして、炭疽、ＢＣＧ、はしか、痘瘡、黄熱などの病気の予防に用いられているが、他の微生物による汚染の危険性や強毒株への復帰の可能性といった問題点が指摘されている。
【０００４】
一方、不活化ワクチンは、コレラ、ジフテリア、百日咳、破傷風、インフルエンザ、ポリオ、狂犬病、チフスなどに用いられる。これらの不活化ワクチンやトキソイド（変性毒素）ワクチンの製造、あるいは診断用抗原の製造を始めとする種々の抗原の製造においては、ホルマリンによる不活化処理法が一般的に使用されている。しかしながら、この不活化方法では、ホルムアルデヒド自体による環境毒性や、ホルマリンによる抗原タンパク質の変性などが大きな問題となっている。
【０００５】
ホルマリンによる不活化処理法以外にも、ベータプロピオラクトン、バイナリーエチレンイミン、マーシオレート、チメロサル、グルタルアルデヒドなどといった薬剤による化学的不活化方法、あるいは、熱や紫外線による物理的不活化方法が行われている。しかしながら、これらの不活化方法においても、病原性微生物の表面構造を変性させて病原性や感染性を無くさせる際に、抗原となり得るタンパク質も変性を受け、病原性微生物の表在性抗原の免疫原性（抗体産生などの免疫応答を誘導する特性）に影響を与え、ワクチンとしての性能を低下させる、といった問題点が指摘されている。
【０００６】
これらの問題点を解決する物理的不活化方法として、３００ＭＰａ以上の高圧処理により病原性微生物の抗原性を保ったまま病原性や感染性を低下させる方法（以下、「高圧処理法」という）が提案されている（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００７】
【非特許文献１】
功刀滋、嶋田昇二、鈴木敦士、林力丸編，「高圧バイオサイエンス」，さんえい出版株式会社，１９９４年５月，ｐ．１６４−１７１
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、ウィルスは、その構造によって大きく２つの種類に分けることができる。その１つは、ウィルス表面を構成している糖タンパク質と脂質からなるエンベロープと呼ばれる構造体を持つタイプであり、他の１つは、エンベロープを持たずに熱や溶媒に耐性のある強固なタンパク質の殻で覆われたタイプである。エイズウィルスやヘルペスウィルスなどは、エンベロープを持つタイプのウィルスであるが、これらのウィルスは、高圧処理法により、完全ではないが相当の部分を不活化することが可能である。これに対し、ポリオウィルスやロタウィルスなどは、エンベロープを持たないタイプのウィルスであり、これらのウィルスは、高圧処理法によっては全く不活化することができない。しかも、高圧処理法を実施するためには、３００ＭＰａ以上といった超高圧を作り出さなければならないが、それには大掛かりな装置を必要とし、コストも莫大なものになる、といった問題点がある。
【０００９】
また、ロタウィルスなどのようにエンベロープを持たないタイプのウィルスについては、薬剤による不活化も難しく、その不活化ワクチンを使用したときの副作用が問題となっている。
【００１０】
この発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、エンベロープを持つタイプのウィルスだけでなく、エンベロープを持たないタイプのウィルスの不活化も可能であり、それ以外の病原性微生物など、広く生体外異物を不活化して、抗原自体には影響を与えることなく安全で高い免疫活性を保持したまま病原性や感染性を消滅ないしは減衰させることができ、実施するのも比較的容易で、大掛かりな装置を必要としない生体外異物の不活化方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
請求項１に係る発明は、生体外異物を不活化する方法において、生体外異物を含む液体を耐圧容器内に充満させて耐圧容器内から気体を排除し、耐圧容器内に前記液体を密封した後、耐圧容器を冷却して、前記液体の全部または一部を凍結させ、耐圧容器内に高圧を発生させることを特徴とする。
【００１２】
この不活化方法によると、図３に概略断面図を示すように、生体外異物を含む液体１が耐圧容器２の容器本体３内に充満させられ、容器本体３の開口部が密栓４によって気密に閉塞されることにより、液体１が耐圧容器２内に密封される。この状態で耐圧容器２が冷却させられることにより、耐圧容器２内の液体１は、凝固点以下の温度に冷却されて凍結し、これに伴って体積膨張する。このとき、液体１は耐圧容器２内に封じ込められているので、耐圧容器２の内壁面により凍結物の体積膨張が抑えられ、このため、耐圧容器２の内部に高圧が発生する。この発生した高圧と低温と凍結との３つの要素が耐圧容器２内の生体外異物に同時に作用し、このため、それらの相乗効果により生体外異物の一部が変性して、生体外異物が不活化される。そして、この方法は、高圧と低温と凍結の作用によって生体外異物を不活化させるものであるため、一部の薬剤による化学的不活化方法、あるいは、熱や紫外線による物理的不活化方法によったときのように、抗原となり得るタンパク質等が変性を受ける、といったことはない。
【００１３】
請求項２に係る発明は、請求項１記載の不活化方法において、前記生体外異物が病原性微生物であることを特徴とする。この方法によると、ウィルス、細菌等の病原性微生物が不活化される。
【００１４】
請求項３に係る発明は、請求項１または請求項２記載の不活化方法において、前記生体外異物が、受動免疫に係る抗体を産生する抗原となり得るものであることを特徴とする。この方法によると、生体外異物が不活化されて、受動免疫に係る抗体を産生する抗原材料が得られる。
【００１５】
請求項４に係る発明は、請求項１または請求項２記載の不活化方法において、前記生体外異物が、免疫誘導を与える抗原となり得るものであることを特徴とする。この方法によると、生体外異物が不活化されて、免疫誘導を与える抗原材料が得られる。
【００１６】
請求項５に係る発明は、請求項４記載の不活化方法において、前記生体外異物が、能動免疫に係る抗原となり得るものであることを特徴とする。この方法によると、生体外異物が不活化されて、能動免疫に係る抗原材料が得られる。
【００１７】
請求項６に係る発明は、請求項３記載の不活化方法において、前記抗原がワクチンの原料となることを特徴とする。この方法によると、ワクチンの原料となる抗原材料が得られる。
【００１８】
請求項７に係る発明は、請求項３ないし請求項５のいずれかに記載の不活化方法において、前記抗原が診断薬の原料となることを特徴とする。この方法によると、診断薬の原料となる抗原材料が得られる。
【００１９】
請求項８に係る発明は、請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の不活化方法において、前記液体が塩類溶液であることを特徴とする。
【００２０】
請求項９に係る発明は、請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の不活化方法において、前記液体が有機溶媒含有水溶液であることを特徴とする。
【００２１】
請求項１０に係る発明は、請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の不活化方法において、前記液体がゲル状物質またはゾル状物質を含むことを特徴とする。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、この発明の好適な実施形態について図面を参照しながら説明する。
【００２３】
最初に、図１に基づいて、この発明に係る生体外異物の不活化方法を実施するために使用される不活化装置の構成について説明する。図１は、不活化装置の概略構成の１例を示す縦断面図である。この不活化装置は、内部に液体を収容することが可能である耐圧容器１０を備え、耐圧容器１０は、液体注入口１４が形設された容器本体１２、および、この容器本体１２の液体注入口１４を閉塞する密栓１６から構成されている。容器本体１２は、例えば１００〜２００ＭＰａ以上の高圧に耐える構造を有しており、例えばステンレス鋼材で厚肉に形成されている。容器本体１２の寸法の１例を示すと、外径が１２５ｍｍで、内径が８０ｍｍであり、高さが３２０ｍｍ程度である。容器本体１２の上部内周面には、雌ねじが螺刻されている。また、密栓１６は、容器本体１０の内部圧力が１００〜２００ＭＰａ以上に上昇しても、内部に密封された液体が漏出しないように、容器本体１２の液体注入口１４を液密に閉塞することができる構造となっており、容器本体１２の雌ねじに螺合する雄ねじが螺刻されている。密栓１６の上部には、密栓１６を容器本体１２の上部に螺入させる際に把持されるハンドル１８が一体に固着されている。
【００２４】
密栓１６には、その内部をそれぞれ縦方向に貫通するように２本の貫通細孔２０、２２が形成されている。そして、一方の貫通細孔２０の上端部には、例えばダイヤフラム式の圧力計２４が装着されている。この圧力計２４により、耐圧容器１０の内部に発生する圧力が測定されるようになっている。また、他方の貫通細孔２２の上端部には、詰め栓２６が着脱自在に装着され、貫通細孔２２の上端口を液密に閉塞することができるようになっている。貫通細孔２２は、容器本体１２内に液体を注入した後、密栓１６によって容器本体１２の液体注入口１４を閉塞するときに、耐圧容器１０内から気体を完全に追い出すための気体の通路となる。そして、耐圧容器１０内から気体を完全に追い出し、貫通細孔２２を通ってその上端口から液体を多少オーバーフローさせた後に、詰め栓２６によって貫通細孔２２の上端口を閉塞する。これにより、液体を耐圧容器１０内に充満させて耐圧容器１０内から完全に気体を排除した状態で、耐圧容器１０内に液体を密封することができる。
【００２５】
上記した不活化装置を使用して病原性微生物等の生体外異物、例えばウィルスの不活化処理を行おうとするときは、まず、ウィルスを含む液体、すなわち、ウィルス溶液またはウィルス溶液と凍結媒体との混合溶液（以下、「含有液体」という）を、耐圧容器１０の容器本体１２内へ注入して充満させる。凍結媒体としては、水、硫酸マグネシウムや硫酸カリウム等の塩類の水溶液、エタノール等の有機溶媒を含有する水溶液、あるいは、ゲル状物質またはゾル状物質を含む溶液などが使用される。特に、冷却されて凍結するときに凍結と共晶生成により膨張する塩類溶液を凍結媒体として用いた場合には、含有液体の凍結物の体積膨張が、水を冷却して凍結させるときの体積膨張より大きくなるので、耐圧容器の内部により高い圧力を発生させることができる。そして、容器本体１２の液体注入口１４を密栓１６によって閉塞し、上記したように、耐圧容器１０内から完全に気体を排除した状態で、耐圧容器１０内に含有液体を充満させて密封する。
【００２６】
次に、含有液体を密封した耐圧容器１０を備えた不活化装置は、冷凍庫内へ入れられ、冷却される。耐圧容器１０が冷却されて、含有液体の温度が凝固点以下となることにより、含有液体が凝固し始める。そして、含有液体の温度の低下に従って含有液体の凍結が進み、凍結に伴って含有液体が部分的に体積膨張する。ところが、含有液体は、耐圧容器１０内に充満した状態で密封されているため、耐圧容器１０の内壁面により内容物全体としての体積膨張が抑えられ、それに伴って耐圧容器１０の内部の圧力が上昇して高圧が発生する。この含有液体の凍結によって発生した高圧がウィルスの表面構造にかかり、さらに低温による冷却効果と凍結作用が加わって、それらの相乗効果により、ウィルスのタイプに拘わらず、すなわち、エンベロープを持つタイプのウィルスだけでなく、エンベロープを持たないタイプのウィルスであっても、ウィルスの表面構造が変形されあるいは破壊される。この結果、ウィルスが完全に不活化されることとなる。そして、ウィルスには高圧と低温と凍結が作用するだけであるので、一部の薬剤を用いた不活化方法あるいは熱や紫外線による不活化方法によったときのように、抗原となり得るタンパク質までが変性を受ける、といったことがない。
【００２７】
上記のようにして得られた不活化物は、受動免疫に係る抗体を産生する抗原材料、免疫誘導を与える抗原材料、能動免疫に係る抗原材料などとして利用され、それらの抗原材料は、ワクチンの原料や診断薬の原料などとなる。特に、従来は不活化処理を行えなかったウィルスのワクチン製造などへの利用の可能性が考えられる。
【００２８】
【実施例】
次に、この発明のより具体的な実施例について説明する。
【００２９】
［実施例１］
単純ヘルペスウィルスＩ型（ＨＳＶ−１）、ヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ）、ヒトエイズウィルス（ＨＩＶ）およびロタウィルス（ＲＶ）について、耐圧容器内に密封した含有液体を凍結させて高圧をかける処理（以下、「凍結昇圧処理」という）による不活化を試みた。また、比較試験として、常温で含有液体に高圧をかける処理（以下、「常温高圧処理」という）、および、常圧で含有液体を凍結させる処理（以下、「常圧凍結処理」という）による不活化試験も行った。
【００３０】
サイバー（Ｓｅｉｂｅｒｔ）株のＨＳＶ−１を１０％牛血清含有ダルベッコＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ／５％ＦＢＳ）によって希釈した後、上記した方法によりウィルス溶液を耐圧容器内に密封し、耐圧容器を冷凍庫内に収容して、−２０℃の温度で２４時間冷却した。この間に、耐圧容器の内部の圧力は２００ＭＰａに達した。凍結昇圧処理が終了すると、耐圧容器を冷凍庫から取り出し、室温で１時間静置した後、密栓を外して耐圧容器を開封し、内容物が溶解しているのを確認して、耐圧容器内からウィルス溶液を取り出した。
【００３１】
また、ＨＳＶ−１液をポンプ式加圧法により２５℃の温度で１０分間、２００ＭＰａまで加圧し、常温高圧処理したウィルス溶液を作成した。さらに、ＨＳＶ−１液を常圧下で−２０℃の温度の冷凍庫内において２４時間冷却し、常圧凍結処理したウィルス溶液も作成した。
【００３２】
２４穴プレートを使用し、１ｍＬのＤＭＥＭ／５％ＦＢＳに懸濁させたベロ（Ｖｅｒｏ）細胞を１ウェル当たり３×１０万（細胞数）培養し、翌日に段階希釈した上記ウィルス溶液１００μＬを感染させた。溶液を３７℃の温度で１時間培養した後、培地を捨て、２％メチルセルロース／ＤＭＥＭ５％ＦＢＳを１ｍＬ加えた。さらに、溶液を３７℃の温度で、５％二酸化炭素を含む空気中において３日間培養した後、液を捨て、２．５％グルタルアルデヒドを加えて３０分間、室温で細胞を固定した。その後、再び液を捨て、３７℃の温度で乾燥させた後、５％メチレンブルーによって３０分間、染色し、水洗した後、プラークをカウントした。希釈率から元のウィルス溶液の力価を計算し、１ｍＬ当たりのＰＦＵ値の対数値で感染性を表した。
【００３３】
ＨＣＭＶ、ＨＩＶ、ＲＶについても、上記と同様の操作により凍結昇圧処理、常温高圧処理および常圧凍結処理による不活化を試み、それぞれの感染性を測定した。ＨＩＶおよびＲＶについては、感染性を５０％終末点（ＴＣＩＤ５０）で表した。試験結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】
2004285019.tif 000003
【００３５】
表１に示した結果から分かるように、常温高圧処理では、ＨＣＭＶについて僅かに感染性の低下が認められたが、他のウィルスについては殆ど感染性の低下が認められなかった。また、高圧処理時間の延長や圧力の更なる上昇を行った場合には、ＨＳＶ−１、ＨＣＭＶおよびＨＩＶのエンベロープを持つウィルスについて若干は感染性の低下が認められたが、エンベロープを持たないＲＶについては全く効果がなかった。
【００３６】
常圧凍結処理では、ＨＳＶ−１にについて僅かに感染性の低下が認められたが、他のウィルスについては殆ど感染性の低下が認められなかった。
【００３７】
これに対し、凍結昇圧処理では、すべてのウィルスについて検出限界以下まで顕著に感染性が低下していた。このように、高圧処理または凍結処理のみでは不活化することができないウィルスについても、高圧・低温・凍結の３つの要素を同時に作用させることができる凍結昇圧処理によると完全に不活化することができた。
【００３８】
［実施例２］
ＨＳＶ−１について、さらに凍結昇圧処理による不活化を試み、ウィルスの力価を測定するとともに、マウスへの接種によりウィルスの感染能を検出した。
【００３９】
ミヤマ（Ｍｉｙａｍａ）株またはアマカタ（Ａｍａｋａｔａ）株のＨＳＶ−１を、上記実施例１と同様の操作により、凍結昇圧処理または常圧凍結処理した後、ベロ細胞を用いたプラーク法によってウィルスの力価を測定した。その結果を表２に示す。表中の数字は、それぞれＰＦＵ値を示す。検出感度は、１ＰＦＵである。
【００４０】
【表２】
2004285019.tif 000004
【００４１】
表２に示した結果から分かるように、凍結昇圧処理したウィルスは、感染能力を完全に消失していた。一方、常圧凍結したウィルスでは、ウィルスの力価に殆ど変化は認められず、昇圧の効果によりウィルスが不活化したことが確認された。
【００４２】
次に、未処理の、または凍結昇圧処理したＭｉｙａｍａ株のＨＳＶ−１を８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に投与し、感染試験を行った。未処理群については、１０万ＰＦＵ／１００μＬを投与し、凍結昇圧処理群については、処理前の力価に基づいて１０万ＰＦＵ相当を１００μＬの食塩等張リン酸緩衝液に懸濁させて接種した。各群のマウスの数は、それぞれＮ＝１０である。マウスの生存を毎日確認し、生存曲線を作成した。図２に、その結果を示す。
【００４３】
図にから分かるように、未処理ウィルスを接種したマウスは、接種後８日以内に全例が死亡したのに対し、凍結昇圧処理したウィルスを与えたマウスは、全例が急性ヘルペス感染症を免れた。したがって、凍結昇圧処理によってウィルスの感染能が失われたことが、このマウスを用いた実験結果においても確認された。
【００４４】
さらに、凍結昇圧処理したウィルスを与えて生き残ったマウスに、未処理のＭｉｙａｍａ株のＨＳＶ−１を上記と同様にして腹腔内に投与したところ、７例のマウスが急性ヘルペス感染死を免れることができた。これにより、凍結昇圧処理したＨＳＶ−１にワクチン抗原としての活性が残っていることが示された。
【００４５】
【発明の効果】
請求項１に係る発明の生体外異物の不活化方法によると、エンベロープを持つタイプのウィルスだけでなく、エンベロープを持たないタイプのウィルスの不活化も可能であり、それ以外の病原性微生物など、広く生体外異物を不活化することができて、抗原自体には影響を与えることなく安全で高い免疫活性を保持したまま病原性や感染性を消滅ないしは減衰させることができる。このため、この不活化方法は、ワクチンやその他の有用な抗原の製造に利用することができる。そして、この不活化方法は、それを実施するのが比較的容易で、実施のために大掛かりな装置を必要としない。
【００４６】
請求項２に係る発明の不活化方法によると、ウィルス、細菌等の病原性微生物を不活化することができる。
【００４７】
請求項３ないし請求項５に係る各発明の不活化方法によると、生体外異物を不活化して、受動免疫に係る抗体を産生する抗原材料、免疫誘導を与える抗原材料および能動免疫に係る抗原材料をそれぞれ得ることができる。
【００４８】
請求項６および請求項７に係る各発明の不活化方法によると、ワクチンの原料となる抗原材料および診断薬の原料となる抗原材料をそれぞれ得ることができる。
【００４９】
請求項８ないし請求項１０に係る各発明の不活化方法によると、生体外異物を含む液体を凍結させて体積膨張させ、確実に耐圧容器の内部に高圧を発生させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明に係る生体外異物の不活化方法を実施するために使用される不活化装置の概略構成の１例を示す縦断面図である。
【図２】この発明に係る不活化方法により処理したウィルスの感染試験の結果を、未処理ウィルスの感染結果と共に示す図である。
【図３】この発明に係る不活化方法について説明するための図であって、耐圧容器の概略断面図である。
【符号の説明】
１  生体外異物を含む液体
２、１０  耐圧容器
３、１２  容器本体
１４  容器本体の液体注入口
４、１６  密栓
２０、２２  貫通細孔
２４  圧力計
２６  詰め栓
【図１】
2004285019.tif 000005
【図２】
2004285019.tif 000006
【図３】
2004285019.tif 000007