(57)【要約】　　　（修正有）【課題】臓器線維化症の発生に関する分子的メカニズムを明らかにすることにより、臓器線維化症の治療の手がかりとなる物質を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるヒト由来タンパク質（Ｃ／ＥＢＰδ）が、平滑筋αアクチン遺伝子（ＳＭαＡ）の転写活性を増強する因子である。この転写因子を阻害すると、ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔの形成が抑制できる。Ｃ／ＥＢＰδ遺伝子が欠損したマウスを用いた実験では、ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔの形成が抑制され、腎炎の症状も軽微であった。また、ＳＭαＡ遺伝子の転写因子としては、Ｃ／ＥＢＰδおよびこのｂ−ＺＩＰ以外にも、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰγ、Ｃ／ＥＢＰε、ＣＨＯＰがあり、これらのｂ−ＺＩＰも転写因子である。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる平滑筋αアクチン遺伝子の転写因子。
【請求項２】
配列番号１から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸残基が、置換、欠失若しくは付加している請求項１記載の転写因子。
【請求項３】
平滑筋αアクチン遺伝子の第１イントロン上のＣＡｒＧモチーフ（ＣＣ（Ａ／Ｔ）６ＧＧ）に結合する請求項１または２記載の転写因子。
【請求項４】
平滑筋αアクチン遺伝子の転写を活性化し、これにより発現した平滑筋αアクチンが、さらにｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ形成を制御する請求項１から３のいずれかに記載の転写因子。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の転写因子を含む進行性臓器線維化症のマーカー。
【請求項６】
進行性臓器線維化症が、進行性腎臓障害、白内障、肝硬変、肺線維症、膵線維化症、皮膚ケロイド症、心筋線維化症、乳腺線維化および癌からなる群から選択される少なくとも一つである請求項５記載のマーカー。
【請求項７】
請求項１から４のいずれかに記載の転写因子を認識可能な抗体。
【請求項８】
請求項７記載の抗体を含む進行性臓器線維化症の検出試薬。
【請求項９】
進行性臓器線維化症が、進行性腎臓障害、白内障、肝硬変、肺線維症、膵線維化症、皮膚ケロイド症、心筋線維化症、乳腺線維化および癌からなる群から選択される少なくとも一つである請求項８記載の検出試薬。
【請求項１０】
抗体が、モノクローナル抗体である請求項８または９記載の検出試薬。
【請求項１１】
進行性臓器線維化症の治療薬のスクリーニング方法であって、前記治療薬の候補化合物が、請求項１から４のいずれかに記載の転写因子を阻害するか否かを判定する工程を含むスクリーニング方法。
【請求項１２】
進行性臓器線維化症が、進行性腎臓障害、白内障、肝硬変、肺線維症、膵線維化症、皮膚ケロイド症、心筋線維化症、乳腺線維化および癌からなる群から選択される少なくとも一つである請求項１１記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項１から４のいずれかに記載の転写因子をコードする平滑筋αアクチン遺伝子の転写因子の遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、平滑筋αアクチン（ＳＭαＡ）遺伝子の転写因子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
我が国の慢性維持透析患者数は２０万人を越え、年間の新規透析導入患者数は３万人におよぶ。その原疾患としての糖尿病性腎症、慢性糸球体腎炎、高血圧性腎硬化症が、導入患者の７７％を占める。その進行抑制、寛解導入、治癒を達成することは、増加の一途をたどる維持透析患者数抑制し、ひいては医療費抑制への道となる。したがって、個々の原疾患に対する治療が重要であることは言うまでも無いが、これらの疾患に共通の進行機序を解明することは、根本的な治療法の確立につながり、有力な治療アプローチといえる。
【０００３】
進行性腎障害に共通の病理学的特徴の一つとして、ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔの出現が、挙げられる。腎糸球体ではメサンギウム細胞が活性化されてｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔとなり、糸球体硬化へと進展する。また尿細管間質では、線維化病変に先行してｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔが出現する。種々のヒト腎疾患で糸球体・尿細管間質のｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ発現の程度が腎不全進行への予後と関連するとの報告も数多い。また、腎のみならず肝臓、肺、心臓、膵臓、眼（角膜、水晶体）、皮膚、乳腺、癌組織などでｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔの出現が線維化病変に先行することが知られており、それぞれの臓器での線維化症、すなわち肝硬変、肺線維症、心筋線維化、膵線維症、白内障、皮膚ケロイド、乳腺線維化、癌組織等の線維化制御の観点から研究が進められている。一方、ＳＭαＡは、ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔの代表的な分子マーカーであり、ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ研究でもＳＭαＡの発現をもってｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ出現とすることが一般的である。その一つの理由としてモノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ＃１Ａ４）を用いたＳＭαＡの免疫染色が簡便、鋭敏かつ特異的である点が挙げられる。しかし、臓器線維化症において、ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔおよびＳＭαＡが出現することが知られているが、その分子的メカニズムは不明である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、臓器線維化症の発生に関する分子的メカニズムを明らかにすることにより、臓器線維化症の治療の手がかりとなる物質を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明者等は、臓器線維化症発生の分子的メカニズムを解明するために、一連の研究を重ねたところ、ＣＣＡＡＴ／ｅｎｈａｎｃｅｒ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃ／ＥＢＰ）のファミリータンパク質およびそれらのｂａｓｉｃ−ｒｅｇｉｏｎ　ｌｅｕｃｉｎｅ　ｚｉｐｐｅｒ（ｂ−ＺＩＰ）が、ＳＭαＡ遺伝子の転写を活性化する因子（転写因子）であることを突き止めた。そして、さらに研究を進めたところ、この転写因子の発現抑制若しくは前記転写因子の阻害等により、ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔの形成が抑制され、また臓器線維化症の発症も抑制されるか若しくは軽微になることを見出し、本発明に到達した。
【０００６】
すなわち、本発明のＳＭαＡ遺伝子の転写因子は、配列番号１から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質若しくはペプチドである。また、本発明のＳＭαＡ遺伝子の転写因子の遺伝子は、前記本発明の転写因子をコードする。なお、配列番号１から１２のタンパク質等とＣ／ＥＢＰファミリータンパク質等との関係は以下の通りである。
【０００７】
配列番号１：Ｃ／ＥＢＰδ
配列番号２：Ｃ／ＥＢＰα
配列番号３：Ｃ／ＥＢＰβ
配列番号４：Ｃ／ＥＢＰγ
配列番号５：Ｃ／ＥＢＰε
配列番号６：ＣＨＯＰ
配列番号７：Ｃ／ＥＢＰδのｂ−ＺＩＰ
配列番号８：Ｃ／ＥＢＰαのｂ−ＺＩＰ
配列番号９：Ｃ／ＥＢＰβのｂ−ＺＩＰ
配列番号１０：Ｃ／ＥＢＰγのｂ−ＺＩＰ
配列番号１１：Ｃ／ＥＢＰεのｂ−ＺＩＰ
配列番号１２：ＣＨＯＰのｂ−ＺＩＰ
【０００８】
【発明の実施の形態】
つぎに、本発明をさらに詳しく説明する。
【０００９】
（本発明の好ましい形態）
ＳＭαＡ遺伝子の転写を調節する機能を有するのであれば、配列番号１から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸残基が、置換、欠失若しくは付加していてもよい。また、本発明の転写因子は、ＳＭαＡ遺伝子の第１イントロン上のＣＡｒＧモチーフ（ＣＣ（Ａ／Ｔ）６ＧＧ）に結合する。また、前述のように、本発明の転写因子により、ＳＭαＡ遺伝子の転写が活性化され、これにより発現したＳＭαＡが、さらにｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ形成を制御すると推察される。
【００１０】
本発明の転写因子は、進行性臓器線維化症のマーカーとして使用できる。前記進行性臓器線維化症は、例えば、進行性腎臓障害、白内障、肝硬変、肺線維症、膵線維化症、皮膚ケロイド症、心筋線維化症、乳腺線維化、癌等がある（以下、同じ）。
【００１１】
本発明の転写因子は、これを認識可能な抗体で検出可能である。したがって、この抗体を含む検出試薬によって、前記進行性臓器線維化症を検出できる。前記抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体であってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００１２】
本発明の転写因子を阻害すれば、前記進行性臓器線維化症を抑制できるから、本発明の転写因子は、前記進行性臓器線維化症の治療薬のスクリーニングに使用できる。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、進行性臓器線維化症の治療薬のスクリーニング方法であって、前記治療薬の候補化合物が、本発明の転写因子を阻害するか否かを判定する工程を含む方法である。
【００１３】
（Ｃ／ＥＢＰファミリーとその構造、標的ＤＮＡ配列）
ヒトＳＭαＡ遺伝子には、５’上流に２ヵ所、第一イントロンに１ヵ所、それぞれＣＡｒＧモチーフ（ＣＣ（Ａ／Ｔ）６ＧＧ）が存在する。ＣＡｒＧ配列は、もともと血清応答因子（ＳＲＦ）の結合部位としてｃ−ｆｏｓ遺伝子上流で同定されたものであり、成長因子誘導遺伝子および筋構成タンパク質の転写調節に関与することが知られている。本発明者等は、第一イントロンのＣＡｒＧ配列が、平滑筋細胞およびｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔにおけるＳＭαＡ発現にとって必須であり、前述のように、ヒトＳＭαＡ遺伝子第一イントロン中に存在するＣＡｒＧ配列（ＣＡｒＧ＃０）に結合する転写因子が、Ｃ／ＥＢＰファミリータンパク質（それぞれのｂ−ＺＩＰ）であることを明らかにした。
【００１４】
Ｃ／ＥＢＰは、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰγ、Ｃ／ＥＢＰδ、Ｃ／ＥＢＰεおよびＣＨＯＰの６種類からなる遺伝子ファミリーを形成しており、これまでに、脂肪分化、糖代謝、自然免疫、造血などに重要な機能を果たしていることが明らかにされている。図１にＣ／ＥＢＰファミリーの構造を模式的に示す。Ｃ／ＥＢＰファミリーは、Ｎ末から転写活性化領域、ＤＮＡ結合領域（塩基性アミノ酸領域）、ロイシンジッパー領域からなる。ＣＨＯＰを除くファミリー間においてＤＮＡ結合領域、ロイシンジッパー領域は高い相同性を示す。ロイシンジッパーを介してホモ二量体あるいはヘテロ二量体を形成し、ＤＮＡ結合領域で種々の遺伝子のプロモーター領域に結合する。Ｃ／ＥＢＰファミリーの標的ＤＮＡ配列は、Ｔ（Ｔ／Ｇ）ＮＮＧＮＡＡ（Ｔ／Ｇ）（Ｎは任意）とされているが、これに該当しないケースも見られる。図２に、ヒトＳＭαＡ遺伝子第一イントロン中のＣＡｒＧ＃０配列と、その中に存在するＣ／ＥＢＰ結合配列を示す。ＳＭαＡ遺伝子ＣＡｒＧ＃０は、Ｃ／ＥＢＰファミリーの共通結合配列を含んでおり、Ｃ／ＥＢＰδのみならず、他のＣ／ＥＢＰファミリーメンバーも、同部位に結合し得る。
【００１５】
【実施例】
つぎに、本発明の実施例について説明する。なお、本発明は、以下の実施例によって制限的に解釈されない。
【００１６】
（実施例１）
Ｃ／ＥＢＰδのＣＡｒＧ＃０への結合の確認（１）
この実施例では、酵母ワン‐ハイブリッドシステムにより、Ｃ／ＥＢＰδがＣＡｒＧ＃０に結合することを確認した。その手法および結果を下記に示す。
【００１７】
（酵母ワン‐ハイブリッドシステムに使用したプラスミドの作成）
下記に示す２本の相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号１３および１４）を使用した。これらは、ＳＭαＡの第一イントロン中に存在するＣＡｒＧモチーフエレメントの２０−ｂｐを３回繰り返した配列となっており、１カ所の点変異（それぞれ、Ｇ→ＡおよびＣ→Ｔ：下線部分）を含み、ＥｃｏＲＩ部位が付け加えられている。この点変異はＣＣ（Ａ／Ｔ）ＧＧ構造を変化させ、同部位へのＳＲＦの結合を消失させる。これらのオリゴヌクレオチドをアニールさせて、プラスミドｐＨＩＳｉ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＥ１ｂミニマルプロモータおよびｐＬａｃＺｉ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のｔＣＹＣ１ミニマルプロモータの上流に挿入し、酵母ワン‐ハイブリッドシステムで使用するプラスミドであるｐＨＩＳｉ−３ＣＡｒＧＭ　および　ｐＬａｃ−３ＣＡｒＧＭを作成した。
【００１８】
（配列番号１３）
５’ａａｔｔｃＧＴＴＴＴＡＣＣＴＡＡＴＴＡＴＧＡＡＡＴＧＴＴＴＴＡＣＣＴＡＡＴＴＡＴＧＡＡＡＴＧＴＴＴＴＡＣＣＴＡＡＴＴＡＴＧＡＡＡＴＧＡ３’
【００１９】
（配列番号１４）
５’ａａｔｔＴＣＡＴＴＴＣＡＴＡＡＴＴＡＧＧＴＡＡＡＡＣＡＴＴＴＣＡＴＡＡＴＴＡＧＧＴＡＡＡＡＣＡＴＴＴＣＡＴＡＡＴＴＡＧＧＴＡＡＡＡＣ３’
【００２０】
（酵母ワン‐ハイブリッドシステムによるｃＤＮＡのクローニング）
酵母ワン‐ハイブリッドシステムによるｃＤＮＡクローニングは　ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ　ワン‐ハイブリッドシステム（Ｃｌｏｎｔｈｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｊａｐａｎ　Ｌｔｄ．）を使用して実施した。前記プラスミドｐＬａｃ−３ＣＡｒＧＭとｐＨＩＳ−３ＣＡｒＧＭを、ＮｃｏＩとＸｈｏＩによる切断で直鎖状にし、これを酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＹＭ４２７１のゲノムに組み込み、レポーター株であるＹＭ−３ＣＡｒＧＭを作製した。この酵母をヒト成人肝臓　ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ　ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）で形質転換した。このシステムではヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーが、プラスミドｐＧＡＰ１０（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）のＥｃｏＲＩ部位に導入されており、ＧＡＬ４活性化領域−ｃＤＮＡ融合タンパク質が酵母で産生されるようになる。形質変換体は、ウラシル、ヒスチジンおよびロイシン欠乏プレート（２０　ｍＭ　３−ａｍｉｎｏｔｒｉａｚｏｌｅ含有）上で選択した。大きなコロニー（Ｈｉｓ＋）を選択し、同様の組成のプレートにもう一度播種し、β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。コロニーはニトロセルロース膜に移し（Ｈｙｂｏｎｄ　Ｃ　Ｅｘｔｒａ；　Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、液体窒素に浸して後、０．８　ｍＭ　５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−ｂ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅと共に３０℃でインキュベートした。青色になったコロニー（ＬａｃＺ＋）を回収し、プラスミドをコロニーから単離した。
【００２１】
2004081122.tif 000003
【００２２】
（実施例２）
Ｃ／ＥＢＰδのＣＡｒＧ＃０への結合の確認（２）
この実施例では、ＧＳＴ−Ｃ／ＥＢＰδ融合タンパク質を組換ＤＮＡ技術によって大腸菌内で作成し、それを精製して電気泳動移動度検定（ＥＭＳＡ）を行い、Ｃ／ＥＢＰδタンパク質がＣＡｒＧ＃０配列へ結合することを確認した例である。その条件および操作方法は、以下のとおりである。また、その結果を、図３に示す。この図は、ヒトＳＭαＡ　イントロン中のＣＡｒＧモチーフエレメントを含むプローブと大腸菌で作成された組み換えＧＳＴ−Ｃ／ＥＢＰδタンパク質との複合体を電気泳動移動度検定（ＥＭＳＡ）により検出した結果を示す電気泳動写真である。同図（Ａ）では、Ｃ／ＥＢＰ結合コンセンサス配列（Ｃ／ＥＢＰＢＳ）をプローブとして用いた。図示のように、Ｃ／ＥＢＰδ‐Ｃ／ＥＢＰＢＳ複合体によるバンドは、非標識イントロンＣＡｒＧ配列プローブ（ｌａｎｅ２）または非標識Ｃ／ＥＢＰＢＳ（ｌａｎｅ３）による競合を受け消失した。
同図（Ｂ）では、イントロンＣＡｒＧ配列をプローブとして用いた。図示のように、Ｃ／ＥＢＰδ−ＣＡｒＧ複合体によるバンドは、非標識イントロンＣＡｒＧ配列プローブ（ｌａｎｅ２）または非標識Ｃ／ＥＢＰＢＳ（ｌａｎｅ３）による競合を受け消失した。以上のように、Ｃ／ＥＢＰδ組換タンパク質は、ＣＡｒＧ＃０およびＣ／ＥＢＰ結合コンセンサス配列に結合し、これらの結合は同配列のコンペティターによって競合作用を受けた。
【００２３】
（ＧＳＴ−Ｃ／ＥＢＰδ融合タンパク質の構築と精製）
ＧＳＴ−Ｃ／ＥＢＰδは、ｐＧＥＸ　６Ｐ−１ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）上で構築した。ＧＳＴ−Ｃ／ＥＢＰδで、大腸菌ＢＬ２１株を形質転換した。タンパク質発現を、１ｍＭのｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅで誘導した。細胞を、溶解バッファー（５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ　８．３，　５００　ｍＭ　ＮａＣｌ，　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ，　２　ｍＭ　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，　５０　μｇ／ｍｌｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ）に再攪拌し、フレンチプレス細胞破壊装置（ＳＩＭ−ＡＭＩＮＣＯ）により細胞を溶解した。その組換えタンパク質は、グルタチオン‐セファロース４Ｂゲルを用いて精製した。その組換えタンパク質の純度および量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のクーマシーブルー染色によって測定した。
【００２４】
（電気泳動移動度検定（ＥＭＳＡ））
ＥＭＳＡに使用されるイントロンＣＡｒＧモチーフエレメントの二重鎖ＤＮＡ断片は、イントロンＣＡｒＧモチーフエレメントを含むプラスミドＤＮＡから調製した。断片は、ＥｃｏＲＩ制限酵素処理することでそのプラスミドから放出された。その断片は、１０％ポリアクリルアミドゲルから精製され、γ−３２Ｐ　ｄＡＴＰ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）存在下でＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて３２Ｐで標識した。Ｃ／ＥＢＰ結合配列の二重鎖ＤＮＡ断片は、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　社から得た。２〜４μｇのＧＳＴ−Ｃ／ＥＢＰδを、２０　ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ，　ｐＨ　７．９，　５０　ｍＭ　ＫＣｌ，　３　ｍＭ　ＭｇＣｌ２，　１０％　グリセロール，　１　ｍＭ　ｄｉｔｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，　０．５　ｍＭ　ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ，　１　μｇ　ポリ（ｄＩｄＣ）および１０　μｇ　ウシ血清アルブミン中で、約０．１５　ｐｍｏｌのγ−３２Ｐ末端標識二重鎖ＤＮＡ断片とインキュベーションした。複合体は、非変性ゲル（アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝２９：１）を用いた電気泳動によって分離した。競合実験は、１．５　ｐｍｏｌの非標識二重鎖断片をインキュベーションの手順に加えることによって行った。
【００２５】
（実施例３）
Ｃ／ＥＢＰδによるＣＡｒＧ＃０を含むプロモーターの活性化
この実施例では、Ｃ／ＥＢＰδがヒトＳＭαＡ遺伝子第一イントロン中ＣＡｒＧ＃０配列への結合を介して遺伝子発現を制御するかどうかを、インビトロトランスフェクションによりＣ／ＥＢＰδを強制発現させて、それによるＣＡｒＧ＃０プロモーター‐ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子領域の活性化によって解析した。その条件および操作方法は、以下のとおりである。その結果、図４のグラフに示すように、Ｃ／ＥＢＰδ存在下にＣＡｒＧ＃０を含むプロモーターは約４倍の活性増加を示し、細胞内でＣ／ＥＢＰδはＣＡｒＧ＃０を介して遺伝子発現を制御することが明らかとなった。
【００２６】
（トランスフェクション解析のためのプラスミド）
ヒトＣ／ＥＢＰδの完全長ｃＤＮＡを、酵母ワン−ハイブリッドシステムにより得て、ｐＣＡＧＧＳのＥｃｏＲＩ部位に挿入することによって、ｐＣＡＧＧＳ−Ｃ／ＥＢＰδを構築した。イントロンＣＡｒＧモチーフ（＋１０９８）を含むＳＭαＡイントロン第１領域中＋９７２から＋１１５２までの１８０　ｂｐの配列、および、２０　ｂｐのイントロンＣＡｒＧモチーフを３つ直列配置した配列を、ｐＳＶ０−ＣＡＴプラスミドに挿入することによって、トランスフェクション検定のためのレポータープラスミドｐＳＶ−ｉｎｔ１８０−ＣＡＴおよびｐＳＶ−３ＣＡｒＧ−ＣＡＴをそれぞれ構築した。
【００２７】
（細胞培養とＤＮＡトランスフェクション）
Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を、１０％　ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ペニシリンＧ　（１００　Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン　（１００　ｍｇ／ｍｌ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇａｌｅ’ｓ培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃、５％　ＣＯ２大気下で培養した。トランスフェクション検定のため、細胞を、６　ｃｍディッシュの中に４×１０４細胞／ｃｍ２の密度で播種した。密度は、トランスフェクション時（播種後２４時間後）に細胞が８０％の密集になるように選択した。一過的トランスフェクション実験は、リポフェクタミン試薬（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ、　ＵＳＡ）を使用し、製造メーカのアドバイスに従い、レポータープラスミドおよび発現プラスミドを３通りトランスフェクトすることからなる。すなわち、各ウェルのトランスフェクションにつき、０．５μｇのレポータープラスミド、０．５μｇの発現プラスミドおよび０．５μｇのルシフェラーゼレポータープラスミド（ｐＧＶ−Ｐ２；　２０μｌの１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ８．０），　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ中）を、無菌マイクロ遠心チューブの中で、２０μｌのリポフェクタミン試薬および６００μｌの血清フリーＤＭＥＭとともに３０分間インキュベートし、使用した。発現プラスミドの量が足りない場合には、ｐＣＡＧＧＳベクターを加えてトランスフェクトするＤＮＡの総量を一定に保った。インキュベーションの間、各ウェルを、残存血清を除くために２回洗浄した。そして、２回目の洗浄の後、２．４　ｍｌの新しいトランスフェクション培地および６００μｌのＤＮＡ／リポフェクタミン試薬／培地　溶液をそれぞれのウェルに加えた。トランスフェクション後４時間後、１０％　ＦＣＳを含む３ｍｌのＤＭＥＭを各ウェルに加えた。トランスフェクション後２４時間後に培地を交換した。７２時間後、スクレーピングによって細胞を溶解バッファー中に回収した。
【００２８】
（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）検定）
Ｃ２Ｃ１２細胞の単層培養を、氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、４００μｌのＰｉｃａＧｅｎｅ（登録商標）細胞培養溶解試薬ＬＣ（Ｔｏｙｏ　Ｉｎｋｉ　Ｃｏ．）とともに、１５分間室温でインキュベートした。そして、細胞をかき集め、２分間、１２０００　ｇの遠心分離により回収した。その上清は、直接検定したか、または−２０℃で凍結保存した。細胞溶解液物中のＣＡＴ活性検定は、［１４Ｃ］−クロラムフェニコール（５７　ｍＣｉ／ｍｍｏｌ，　Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏ．，　Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，　英国）および等量の細胞質抽出液を使用して行った。アセチル化産物は、ＭＥＲＣＫ　Ｓｌｉｌｉｃａ　Ｇｅｌ　６０　Ｆ２５４を使用して薄層クロマトグラフィーによって分離し、ＭＡＣ　ＢＡＳ　ＩＩＩｓ　（Ｆｕｊｉ）に露光させた。［１４Ｃ］−クロラムフェニコールからそのアセチル化誘導体への変換％は、ＢＡＳ　１５００　ＭＡＣ　（Ｆｕｊｉ）を使用して計算した。
細胞溶解物中のタンパク質は、ＢｉｏＲａｄタンパク質検定試薬とともにウシγ−グロブリンを標準に使用するクーマシーブリリアントブルー結合方法（ＢｉｏＲａｄ，　Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，　ＣＡ）で測定した。同じ実験においてトランスフェクション効率を標準化するため、ウイルスのＬＴＲからのルシフェラーゼ活性を示すｐＧＶ−Ｐ２を、該細胞に共トランスフェクトした。細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性は、ＰｉｃａＧｅｎｅ（登録商標）ルミネセンスキット（Ｔｏｋｙｏ　Ｉｎｋｉ　Ｃｏ．）を用いて測定した。
【００２９】
（実施例３）
ヒトＩｇＡ腎症でのＳＭαＡとＣ／ＥＢＰδの発現
この実施例では、ヒトＩｇＡ腎症でのＳＭαＡとＣ／ＥＢＰδの発現を調べた。すなわち、下記に示す方法により、ヒトＩｇＡ腎症患者の腎生検の連続切片をＳＭαＡおよびＣ／ＥＢＰδに対する特異的抗体で染色した。図５の顕微鏡写真に示すように、中等度の細胞増殖を示す糸球体で、ＳＭαＡとＣ／ＥＢＰδの発現が確認でき、またメサンギウム領域に両者の免疫染色が陽性であった。
【００３０】
（免疫染色）
マウスモノクローナル抗ＳＭαＡ抗体（１Ａ４）　（ペルオキシダーゼ結合型，　ＥＰＯＳ，ＤＡＫＯ社，　Ｄｅｎｍａｒｋ）およびウサギポリクローナル抗Ｃ／ＥＢＰδ抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，　Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ，　ＣＡ，　ＵＳＡ）を使用した。ヒトＩｇＡ腎症患者より得られたパラフィン切片（２μｍ、ホルマリン固定）に対し、キシレンによる脱パラフィン、ついでエタノール／水混和物による加水後、過酸化水素水（３％）によって内因性ペルオキシダーゼを不活性化した。その後、切片をリン酸緩衝化生理食塩水で３分×３回洗浄し、３０分間ブロッキング（ＳＭαＡには１０％　ウマ血清、Ｃ／ＥＢＰδには１０％　ヤギ血清を使用）し、その後、前記同様の洗浄を行った。一次抗体を切片にのせてから４℃で１６時間静置した。３回洗浄後、Ｃ／ＥＢＰδ染色では二次抗体（ビオチン結合ヤギ抗ウサギ抗体、１／１５０希釈、Ｖｅｃｔｏｒ　ＡＢＣ　Ｋｉｔ；　ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　Ｉｎｃ．　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，　ＣＡ，　ＵＳＡ）を切片にアプライし、１時間室温で静置した。そしてアビジン‐ビオチン結合ホースラディシュペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ）と共に室温で４０分間静置した。ＳＭαＡ染色、Ｃ／ＥＢＰδ染色とも最終段階のペルオキシダーゼ活性は、０．３５　ｍｇ／ｍｌ　ｐ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ，　１０　ｍｇ／ｍｌ　Ｈ２Ｏ２　ｉｎ　５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ　７．６）を用いて検出した。メチルグリーンで核染色後、前記切片をカバーグラスでマウントした。
【００３１】
（実施例４）
ラット糸球体腎炎でのＳＭαＡとＣ／ＥＢＰδの発現増加
ラットに代表的な増殖性糸球体腎炎であるＴｈｙ−１腎炎を惹起し、糸球体病変でのＳＭαＡとＣ／ＥＢＰδの発現を、連続切片を用いて同一糸球体で観察した。腎炎発症後７日での免疫組織化学的観察結果を、図６の顕微鏡写真（倍率４００倍）に示す。同図において、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、糸球体腎炎ラットであり、ＥおよびＦはコントロールラットである。同図に示すように、ＳＭαＡ（Ｂ、Ｄ、Ｆ）およびＣ／ＥＢＰδ（Ａ、Ｃ、Ｅ）が、Ｔｈｙ−１糸球体腎炎ラットおよびコントロールラットにおいて、検出された。正常糸球体では、メサンギウム領域において、いずれのタンパク質もほとんど発現を認めないが、病変糸球体ではメサンギウム領域にＳＭαＡとＣ／ＥＢＰδの発現増強を認めた。
【００３２】
つぎに、ラット糸球体腎炎でのＳＭαＡとＣ／ＥＢＰδの発現増加を遺伝子発現のレベルで解析した。すなわち、単離した糸球体より得たＲＮＡを用いＲＴ−ＰＣＲによって遺伝子発現を評価した。ＲＴ−ＰＣＲの条件および操作方法は、以下のとおりである。この結果を、図７に示す。また、あわせて代表的なケモカインであるＭＣＰ−１の遺伝子発現も同図に示す。正常糸球体ではいずれのｍＲＮＡ発現は少ないが、病変糸球体ではＳＭαＡとＣ／ＥＢＰδの発現増強を認めた。ＭＣＰ−１についても同様に、正常ではほとんど発現がなく病変糸球体では発現増強が認められた。
【００３３】
（糸球体の分離とＲＴ−ＰＣＲ解析）
正常および抗−Ｔｈｙ１　　糸球体炎ラットからの糸球体の分離は、標準的な篩い分け方法（ｓｉｅｖｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ）によって行った。分離した糸球体の総ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ，　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，　ＭＤ）を使用して、製造メーカーの指示に従い、グアニジウム‐チオシアネート‐フェノール‐クロロフォルム抽出手順により抽出した。抽出されたＲＮＡは、ＲＮａｓｅフリー無菌水に溶解し、混入ＤＮＡは、ＤＮａｓｅＩ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）で分解した。逆転写は、Ｇｅｎｅ−Ａｍｐ　ＲＮＡ　ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，　Ｎｏｒｗａｌｋ，　ＣＴ，　ＵＳＡ）を用いて、１．０μｇの総ＲＮＡを鋳型に、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチドをプライマーに使用して行った（４２℃×６０分および９５℃×７分）。そのｃＤＮＡは、一揃いのＣ／ＥＢＰδ、ＭＣＰ−１およびＳＭαＡに対するプライマーを使用しＰＣＲによって増幅した。
【００３４】
（実施例５）
Ｃ／ＥＢＰδ遺伝子欠損マウス（ノックアウトマウス）を用いた検討
この実施例では、Ｃ／ＥＢＰδ遺伝子欠損マウスを用いて、培養細胞での遺伝子発現、２種類の腎障害モデルで遺伝子発現および病変の程度を解析し、Ｃ／ＥＢＰδの腎ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ形成、線維化病変形成への関与を確認した。
【００３５】
（１）　ノックアウトマウス由来培養メサンギウム細胞の遺伝子発現
野生型（ＷＴ）マウスおよびＣ／ＥＢＰδ遺伝子欠損（−／−）マウス由来の培養メサンギウム細胞におけるＳＭαＡおよびＭＣＰ−１のｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲで比較した。Ｃ／ＥＢＰδ（−／−）マウスは、大阪大学微生物病研究所の審良教授が開発したものであり、同教授から本発明のために供与された。培養メサンギウム細胞は、６週令Ｃ／ＥＢＰδ（−／−）マウスおよび野生型１２９マウスより単離した糸球体を３種類のメッシュを用いて精製し、それを１７％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ　１６４０培地と共に、３７℃、５％ＣＯ２含有空気中で３週間孵置することで得た。前述と同様の手法を用いて培養メサンギウム細胞からＲＮＡを単離し、逆転写酵素による処理によって一本鎖ｃＤＮＡへと変換し、これをＭＣＰ−１、ＳＭαＡに特異的なセンス・アンチセンスのセットのプライマー用いてＰＣＲによって増幅した。これらの結果を、図８に示す。図示のように、Ｃ／ＥＢＰδ遺伝子欠損マウスより単離・培養したメサンギウム細胞では野生型のメサンギウム細胞と比較してＳＭαＡ、ＭＣＰ−１いずれの遺伝子発現も低下していた。
【００３６】
（２）　ノックアウトマウスでの糸球体腎炎モデルの解析
マウスでの代表的増殖性腎炎モデルであるハブ毒腎炎を作成し、Ｃ／ＥＢＰδノックアウトマウスと野生型（ＷＴ）マウスの腎炎を比較した。すなわち、まず、６週令Ｃ／ＥＢＰδ（−／−）マウスおよび野生型　１２９マウスに対し一側腎臓摘出を行い、その後、尾静脈よりハブ毒（Ｈａｂｕ　ｐｉｔ　ｖｉｐｅｒ，　Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ　ｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓ、和光純薬社製）を１．５　ｍｇ／ｋｇ　体重で投与した。ハブ毒投与８日後に腎臓を摘出した。腎臓をスライスし、４％パラフォルムアルデヒド溶液中で浸潤固定の後パラフィン包埋した。薄切標本（２μｍ）を作成し、ＰＡＳ染色および前述の手法でＳＭαＡの免疫組織染色をほどこした上、病変の解析に供した。その結果を、図９に示す。同図において、Ａは野生型（ＷＴ）のＰＡＳ染色、Ｂは、野生型（ＷＴ）のＳＭαＡの免疫組織化学的染色、ＣはＣ／ＥＢＰδ遺伝子欠損マウスのＰＡＳ染色、ＤはＣ／ＥＢＰδ遺伝子欠損マウスのＳＭαＡの免疫組織化学染色を、それぞれ示す。
図示のように、ノックアウトマウスでは、糸球体病変は軽度であり、また糸球体でのＳＭαＡ発現も少なかった。
【００３７】
つぎに、野生型（ＷＴ）およびＣ／ＥＢＰδ遺伝子欠損マウスにおいて、ハブ毒腎炎（第８病日）における糸球体１個当たりの細胞数を比較した。すなわち、前記２群において、血管極を含む糸球体３０個ずつ（１個体当たり１０個×３匹）を抽出し、平均値を、ｎｏｎ−ｐａｉｒｅｄ−ｔｅｓｔで検定した。この結果を、図１０に示す。
図示のように、糸球体内細胞数は、前記ノックアウトマウスで有意に低下していた。
【００３８】
（３）　ノックアウトマウスでの間質病変モデルの解析
代表的な間質線維化モデルである一側尿管結紮腎（ＵＵＯ）を作成し、ノックアウトマウスと野生型で比較した。すなわち、６週令Ｃ／ＥＢＰδ（−／−）　マウスおよび　野生型　１２９マウスに対し、麻酔下で、左腎尿管を結紮することで一側尿管結紮術を施行し、７日後に腎臓を摘出した。得られた腎組織の一部は４％パラフォルムアルデヒド固定後、パラフィン包埋し、既述の方法でＳＭαＡの免疫組織染色を行った。また同時に一部分の腎組織は既述の方法によってＲＮＡ単離に供した。
ＲＮＡは既述の方法によるＲＴ−ＰＣＲを用いたＩ型コラーゲン、ＳＭαＡの遺伝子発現解析に供した。
【００３９】
前記免疫染色の結果（結紮７日後）を図１１に示す。同図において、Ａは野生型（ＷＴ）のＳＭαＡの免疫組織化学的染色写真であり、ＢはＣ／ＥＢＰδ遺伝子欠損マウスのＳＭαＡの免疫組織化学的染色写真である。図示のように、前記ノックアウトマウスでは、間質病変が野生型に比較して軽度であった。また，定量的ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現の評価の結果を、図１２に示す。同図では、ＳＭαＡおよびｃｏｌｌａｇｅｎ　Ｉ（Ｉ型コラーゲン）のｍＲＮＡの発現量を、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡに対する比として表している。図示のように、前記ノックアウトマウスでのＳＭαＡ、Ｉ型コラーゲンの遺伝子発現は、野生型に比較して有意に低下していた。
【００４０】
（実施例の結果のまとめ）
以上の結果から、Ｃ／ＥＢＰδは、ヒトＳＭαＡ遺伝子第一イントロン中のＣＡｒＧ配列に結合する因子であることが確認され、ヒト、ラットの糸球体腎炎病変ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔで発現が増強すること、またその逆にＣ／ＥＢＰδ欠損マウスでは糸球体、間質両方の病態モデルで病変およびｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔの出現が軽度であることが明らかとなった。また、これまでの報告から、Ｃ／ＥＢＰδのＤＮＡ結合および、転写調節は、図１で示したＤＮＡ結合領域（塩基性アミノ酸領域）、およびロイシンジッパー構造すなわち両者をあわせてｂ−ＺＩＰと呼ばれるドメインによって媒介されることが知られている。最近の報告でもＣ／ＥＢＰメンバーのＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδのｂ−ＺＩＰ構造のみを残した欠失変異体はいずれもインターロイキン６およびＭＣＰ−１の転写誘導能を示した（Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２７５，　１６３７３−１６３８１，　２０００）。よって、ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ形成にはＣ／ＥＢＰファミリーが積極的に関与するといえ、さらにＣ／ＥＢＰ発現調整薬およびＣ／ＥＢＰのｂ−ＺＩＰドメインの活性調整薬が、ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ形成を伴う進行性臓器線維化（白内障、肝硬変、肺線維症、膵線維化症、皮膚ケロイド症、心筋線維化症、乳腺線維化、癌等）に対する治療薬の創薬ターゲットとなり得る。また、Ｃ／ＥＢＰは、ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ形成を伴う進行性臓器線維化（白内障、肝硬変、肺線維症、膵線維化症、皮膚ケロイド症、心筋線維化症、乳腺線維化、癌等）のマーカーとしても利用できる。
【００４１】
【発明の効果】
以上のように、本発明のＳＭαＡ遺伝子の転写因子は、腎症等の進行性臓器線維化症の検出用マーカーとして使用でき、また、この転写因子が、ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ形成制御に関与していることから、進行性臓器線維化症の治療薬の創薬ターゲットとなり得る。
【００４２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ヒトＣ／ＥＢＰファミリーの構造を模式的に表す図である。
【図２】図２は、Ｃ／ＥＢＰおよびＳＲＦの結合配列を示す図である。
【図３】図３は、Ｃ／ＥＢＰδがＣＡｒＧ＃０に結合することを示す電気泳動の写真である。
【図４】図４は、Ｃ／ＥＢＰδによるＣＡｒＧ＃０の活性化を示すグラフである。
【図５】図５は、糸球体でのＳＭαＡおよびＣ／ＥＢＰδの発現を示す顕微鏡写真である。
【図６】図６Ａ〜Ｆは、ラット糸球体腎炎におけるＳＭαＡおよびＣ／ＥＢＰδの発現を示
す顕微鏡写真である。
【図７】図７は、ＲＴ−ＰＣＲによる糸球体遺伝子の発現を評価した電気泳動写真である。
【図８】図８は、ＲＴ−ＰＣＲによる培養メサンギウム細胞での遺伝子発現を評価した電気泳動写真である。
【図９】図９Ａ〜Ｄは、ハブ毒腎炎モデルマウス（８日目）における糸球体の病理組織を示す顕微鏡写真である。
【図１０】図１０は、野生型（ＷＴ）とＣ／ＥＢＰδ遺伝子欠損マウスにおけるハブ毒腎炎モデルマウス（８日目）における糸球体１個当たりの細胞数を示すグラフである。
【図１１】図１１は、一側尿管結紮腎（７日目）の腎組織の状態を示す顕微鏡写真である。
【図１２】図１２は、一側尿管結紮腎（７日目）の腎におけるＳＭαＡおよびｃｏｌｌａｇｅｎ　Ｉ
の遺伝子の発現を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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