(57)【要約】【課題】ＡｈＲリガンドを認識する遺伝子発現誘導因子の開発、及び、それを用いた異種遺伝子誘導発現系の開発。また、該発現系を導入した真核生物を用いて、該リガンドをモニタリングおよび／または軽減する技術の開発。【解決手段】構成的または条件的な転写を行う第１プロモーター配列と；該第１プロモーター配列の下流に配置された、ＤＮＡ結合領域、核局在化シグナル配列、該リガンド結合制御領域および転写活性化領域を含む第１転写構造体と；該ＤＮＡ結合領域を特異的に結合して、該転写活性化領域の作用によりその支配下にある転写単位を転写せしめる１以上の第２プロモーター配列と；該第２プロモータ配列の下流に配置された、レポーター遺伝子を含む第２転写構造体とを具備するベクターを提供する。また、該ベクターによる形質転換体、並びに、該リガンドをモニタリングおよび／または軽減する方法を提供する。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
構成的または条件的な転写を行う第１プロモーター配列と；
該第１プロモーター配列の下流に配置された、ＤＮＡ結合領域、核局在化シグナル配列、ＡｈＲリガンド結合制御領域および転写活性化領域を含む第１転写構造体と；
前記ＤＮＡ結合領域を特異的に結合して、前記転写活性化領域の作用によりその支配下にある転写単位を転写せしめる１以上の第２プロモーター配列と；
前記第２プロモーター配列の下流に配置された、レポーター遺伝子を含む第２転写構造体とを具備するベクターであって、
前記第１プロモーターおよび第１転写構造体、並びに、前記第２プロモーターおよび第２転写構造体は、真核生物の細胞内の染色体上もしくはエピソーム上にシスもしくはトランスに配置されるようになっており、
前記ベクターを導入した前記細胞内において、該細胞に侵入したＡｈＲリガンドが前記第１転写構造体の転写産物の翻訳産物と結合し、前記ＡｈＲリガンドの存在量に応じた量の複合体を形成することにより、前記第２転写構造体の転写が前記複合体の存在量に応じて亢進することを特徴とするベクター。
【請求項２】
第３プロモーター配列と、第３プロモーター配列の下流に配置されて該配列の支配下で転写される、Ａｒｎｔ遺伝子および／または薬剤耐性遺伝子を含む第３転写構造体とを、前記第１および／または第２転写構造体と同一分子内に更に具備する、請求項１記載のベクター。
【請求項３】
前記第１および／または第３プロモーター配列がＣａＭＶ３５Ｓプロモーター配列またはＧ−ｂｏｘプロモーター配列である、請求項１〜２記載のベクター。
【請求項４】
前記第２プロモーター配列がＬｅｘＡプロモーター配列またはＸＲＥ配列である、請求項１〜３記載のベクター。
【請求項５】
前記ＡｈＲリガンドがダイオキシン類および／または多環状芳香族炭化水素である、請求項１〜４記載のベクター。
【請求項６】
前記ＤＮＡ結合領域がＬｅｘＡのＤＮＡ結合領域またはＡｈＲのＤＮＡ結合領域である、請求項１〜５記載のベクター。
【請求項７】
前記核局在化シグナル配列がＳＶ４０由来配列である、請求項１〜６記載のベクター。
【請求項８】
前記転写活性化領域が１以上のＡｈＲ転写活性化領域またはＶＰ１６転写活性化領域である、請求項１〜７記載のベクター。
【請求項９】
前記第１転写構造体がＸＤＶ／ＸＶＤ、ＡｈＲ、またはＡｈＲＶを転写単位として含む、請求項１〜８記載のベクター。
【請求項１０】
前記第３転写構造体に含まれる前記薬剤耐性遺伝子がＮＰＴＩＩである、請求項１〜９記載のベクター。
【請求項１１】
前記第２転写構造体に含まれるレポーター遺伝子がＧＵＳ、ＧＦＰ、またはチトクロームｐ４５０をコードする遺伝子である、請求項１〜１０記載のベクター。
【請求項１２】
請求項１〜１１の何れか１項に記載のベクターで形質転換した形質転換体。
【請求項１３】
前記形質転換体が植物である、請求項１２記載の形質転換体。
【請求項１４】
前記植物が高等植物である、請求項１３記載の形質転換体。
【請求項１５】
前記高等植物がタバコである、請求項１４記載の形質転換体。
【請求項１６】
前記形質転換体が酵母である、請求項１２記載の形質転換体。
【請求項１７】
染色体内に、前記第２プロモーター配列としてのＬｅｘＡプロモーター配列およびその下流にある前記第２転写構造体としてのＬａｃＺ転写単位を含む酵母Ｌ４０株を、前記第１プロモーターとしてのＧＡＬ１プロモーターの下流に配置された前記第１転写構造体としてのＸＤＶ／ＸＶＤを具備するベクターにより形質転換した形質転換体。
【請求項１８】
請求項１２〜１７記載の形質転換体を培養または栽培する工程を含み、該培養体において前記レポーター遺伝子が発現することによって、前記形質転換体の成育環境における前記ＡｈＲリガンドの存在をモニターすることを特徴とする、ＡｈＲリガンドをモニタリングする方法。
【請求項１９】
請求項１２〜１７記載の形質転換体を培養または栽培する工程を含み、前記ＡｈＲリガンドを前記形質転換体の体内で代謝させることにより前記形質転換体の成育環境に存在する前記ＡｈＲリガンドを前記成育環境から軽減する方法。
【請求項２０】
前記ＡｈＲリガンドがダイオキシン類および／または多環状芳香族炭化水素である、請求項１８または１９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なアリルハイドロカーボン受容体（ＡｈＲ）リガンド特異的な遺伝子発現誘導因子、及び、その機能に基づく異種遺伝子誘導発現系の利用技術に関する。さらに、本発明は、当該因子の機能に基づく異種遺伝子誘導発現系を導入した真核生物を用いて、ダイオキシン類（ＨＡＨｓ；ハロゲン化芳香族炭化水素）および／または多環状芳香族炭化水素（ＰＡＨｓ）などのＡｈＲリガンドをモニタリングし、また該リガンドを環境から軽減する技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、ヒトの生活や産業活動の発展に伴い、不特定多数の化学物質が環境に放出されており、重大な環境汚染問題となっている。それら化学物質のなかには、環境負荷化学物質、即ち、安定であるため環境において長期に残留して、生態系及びヒトの健康に影響を及ぼすことが懸念されている化学物質がある。環境負荷化学物質には、ダイオキシン類、多環状芳香族炭化水素、内分泌撹乱化学物質（環境ホルモン）、残留農薬などがある。これら環境負荷化学物質は、ｐｐｔ、ｐｐｂ、あるいは、ｐｐｍのレベルで大気、水、土壌、農産物などにおいて検出され、しかも、極低濃度で生態系に影響を与えることが知られている。そこで、極低濃度の環境負荷化学物質の環境における分布、動態をモニタリングする技術、および／または、該物質を環境から軽減する新たな技術の開発が求められている。
【０００３】
従来技術による環境負荷化学物質のモニタリングは、モニタリングする地域の多地点から試料を採集し、多数の前記試料を実験施設に運搬した後に機器分析を用いて該物質を検出及び定量することにより行われてきた。機器分析は感度、精度に優れているが、分析設備と熟練技術とを必要とし、時間がかかり、しかも、機器、試薬等に要する経費が高いという問題がある。従って、簡便迅速、高感度で安価な方法が求められている。
【０００４】
生物は環境負荷化学物質を認識して、それらを代謝・排泄する機能を有している。このような生物機能に基づいて環境負荷化学物質をモニタリングする技術は、有機溶媒の多用などによる二次汚染の危険性が少ないことなどから、公共の理解を得やすい。
【０００５】
これまでにも、生物機能を利用して環境負荷化学物質をモニタリングする方法の開発が行われてきた。このような方法には、女性ホルモン（エストロジェン）、男性ホルモン（アンドロジェン）、甲状腺ホルモンなどの内分泌系機能に関与するレセプターを用い、該レセプターに対する応答性を指標とした環境ホルモンのアッセイ法などが知られている。また、生体内における抗原、抗体反応の特異性を利用した、環境負荷化学物質に特異的な免疫化学測定法なども知られている。
【０００６】
これら環境負荷化学物質のなかでもポリ塩化ジベンゾ―パラ―ダイオキシン（ＰＣＤＤｓ）、ポリ塩化ジベンゾフラン（ＰＣＤＦｓ）、コプラナーＰＣＢ（Ｃｏ−ＰＣＢｓ）などの物質の総称である「ダイオキシン類」とベンツピレン、メチルコランスレンなどの「多環状芳香族炭化水素」は、哺乳動物に対して、免疫毒性、催奇形性や発癌促進などの様々な生体毒性を呈し、生態系やヒトの健康への影響が心配されている物質である。ダイオキシン類においても、レセプターを用いるインビトロアッセイ法の試薬キットが市販化されている。
しかし、上記の環境負荷化学物質を測定する従来技術においては、非特異的な吸着などにより、過反応を示す場合がある。
【０００７】
また、前記技術は何れも採集した試料を逐次採集地から実験室に持ち帰り、各種分析に適した試薬および機器等を使用して測定するものである。従って、実験施設のない、又は、その利用が実質的に困難である場所（例えば、実験施設から遠隔地の野外）においては実施できない。
更に、前記技術では実験施設での分析後にしか測定結果が判明しないので、採集地点における迅速なオンサイト測定はできない。
【０００８】
一方、環境負荷化学物質による汚染の軽減には、物理化学的方法や微生物を用いる方法が試みられている。しかし、環境負荷化学物質のように環境中に極低濃度で存在し、しかも、水、土壌、大気、農産物など広範囲にわたり存在している物質の軽減化は、従来の技術により効率的に対処することは極めて困難であり、新たな技術開発が必要である。
従来技術においては、以上述べたような解決すべき多くの課題が残されている。
【０００９】
【本発明が解決しようとする課題】
本発明は、環境負荷化学物質であるダイオキシン類、多環状芳香族炭化水素などを含むＡｈＲリガンドを特異的に認識する新規な遺伝子発現誘導因子を開発すること、及び、前記遺伝子発現誘導因子を用いた異種遺伝子誘導発現系の利用技術を開発することを課題とする。また、本発明は、前記異種遺伝子誘導発現系を導入した真核生物を用いて、環境における環境負荷化学物質をモニタリングする技術、及び、前記物質を環境から軽減する技術を提供することを課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下に示す手段によって本発明の課題を解決するものである。
即ち、本発明は、
構成的または条件的な転写を行う第１プロモーター配列と；
該第１プロモーター配列の下流に配置された、ＤＮＡ結合領域、核局在化シグナル配列、ＡｈＲリガンド結合制御領域および転写活性化領域を含む第１転写構造体と；
前記ＤＮＡ結合領域を特異的に結合して、前記転写活性化領域の作用によりその支配下にある転写単位を転写せしめる１以上の第２プロモーター配列と；
前記第２プロモーター配列の下流に配置された、レポーター遺伝子を含む第２転写構造体とを具備するベクターであって、
前記第１プロモーターおよび第１転写構造体、並びに、前記第２プロモーターおよび第２転写構造体は、真核生物の細胞内の染色体上もしくはエピソーム上にシスもしくはトランスに配置されるようになっており、
前記ベクターを導入した前記細胞内において、該細胞に侵入したＡｈＲリガンドが前記第１転写構造体の転写産物の翻訳産物と結合し、前記ＡｈＲリガンドの存在量に応じた量の複合体を形成することにより、前記第２転写構造体の転写が前記複合体の存在量に応じて亢進することを特徴とするベクターを提供する。
【００１１】
また、本発明は、前記ベクターで形質転換した形質転換体を提供する。
さらに、本発明は、前記形質転換体を培養または栽培する工程を含み、該培養体において前記レポーター遺伝子が発現することによって、前記形質転換体の成育環境における前記ＡｈＲリガンドの存在をモニターすることを特徴とする、ＡｈＲリガンドをモニタリングする方法を提供する
さらに、本発明は、前記形質転換体を培養または栽培する工程を含み、前記ＡｈＲリガンドを前記形質転換体の体内で代謝させることにより前記形質転換体の成育環境に存在する前記ＡｈＲリガンドを前記成育環境から軽減する方法を提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
ＡｈＲリガンドの中でも、ダイオキシン類は特に哺乳動物に対して極低濃度で毒性を発現する。その際、ダイオキシン類は細胞内で、アリルハイドロカーボン受容体（ＡｈＲ）に特異的に結合する。その後、リガンドが結合した受容体複合体は、ＡｈＲ核移行タンパク質（Ａｒｎｔ）と共にヘテロ２量体を形成する。次いで、このへテロ２量体は、標的遺伝子であるＣＹＰ１Ａ１遺伝子の５’上流に存在する発現制御領域、即ち、ＸＲＥ配列に特異的に結合することにより、標的であるＣＹＰ１Ａ１遺伝子を誘導発現する。その結果として、ＣＹＰ１Ａ１遺伝子などの標的遺伝子の転写を活性化する。
【００１３】
この転写を介して生成したＣＹＰ１Ａ１はある種のダイオキシン類を代謝するが、最も毒性の高い２，３，７，８−ＴＣＤＤは代謝しない。なお、ダイオキシン異性体の毒性の程度は、動物実験における各種生体影響や試験管内実験のデータを総合的に評価して、最強毒性の２，３，７，８−ＴＣＤＤの毒性を１とした相対毒性係数であるＴｏｘｉｃｉｔｙ　Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ　Ｆａｃｔｏｒ（ＴＥＦ）に基づいて決定されている。また、哺乳動物の細胞培養を用いた場合、ＡｈＲを介してのシグナル伝達系は、ダイオキシン類の環境基準値１ｐｐｂとその調査指標値０．２５ｐｐｂに対して、０．０１ｐｐｂのＴＣＤＤを検出することができる。
【００１４】
このようにして、哺乳動物のＡｈＲは、極低濃度のダイオキシン類などのＡｈＲリガンドを認識した後に、特定の酵素系の遺伝子を転写することができる。　そこで、本発明者は、上記に示したような生命現象を、環境負荷化学物質の環境モニタリングおよび／または該物質汚染の軽減に利用することができるのではないかとの着想を得て、鋭意研究を行った結果、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
本発明は、哺乳動物のＡｈＲが極低濃度のＡｈＲリガンドを認識できるという特徴を利用するものである。即ち、図１に示すように、ＡｈＲの構造を、（１）ＤＮＡ結合ドメイン、（２）リガンド結合制御ドメイン、及び（３）転写活性化ドメインの３つの機能領域に分割する。各ドメインをコードする遺伝子領域のうち、前記リガンド結合制御領域を基本構造体とし、それに適切なＤＮＡ結合領域及びヘルペスウイルスＶＰ１６因子の転写活性化領域などの同種または異種の機能領域を融合することにより、広範囲の真核生物で機能する非常に高感度な新規ＡｈＲリガンド特異的遺伝子誘導発現因子を創製した（図２Ａ〜図２Ｄ）。
【００１６】
また、本発明は、本来のＡｈＲが機能発現に必要とするＡｒｎｔなどの因子を必要とせず、単純化したことを特徴とするものである（図３）。
これまで、ＡｈＲにおけるリガンド結合制御機構を利用した遺伝子発現誘導因子を創製した報告例は無い。従って、本発明は世界で初めて、ＡｈＲリガンド特異的な異種遺伝子誘導発現系の機能を植物及び酵母において実証するものである（図４）。
【００１７】
以下で更に具体的に本発明を説明する。
本発明は以下に記載するようなベクターを導入した形質転換体を用いて、本発明の課題を解決する。即ち、前記ベクターは、
構成的または条件的な転写を行う第１プロモーター配列と；
該第１プロモーター配列の下流に配置された、ＤＮＡ結合領域、核局在化シグナル配列（ＮＬＳ）、ＡｈＲリガンド結合制御領域および転写活性化領域を含む第１転写構造体と；
前記ＤＮＡ結合領域を特異的に結合して、前記転写活性化領域の作用によりその支配下にある転写単位を転写せしめる１以上の第２プロモーター配列と；
前記第２プロモータ配列の下流に配置された、レポーター遺伝子を含む第２転写構造体とを具備するベクターであって、
前記第１プロモーターおよび第１転写構造体、並びに、前記第２プロモーターおよび第２転写構造体は、真核生物の細胞内の染色体上もしくはエピソーム上にシスもしくはトランスに配置されるようになっており、
前記ベクターを導入した前記細胞内において、該細胞に侵入したＡｈＲリガンドが前記第１転写構造体の転写産物の翻訳産物と結合し、前記ＡｈＲリガンドの存在量に応じた量の複合体を形成することにより、前記第２転写構造体の転写が前記複合体の存在量に応じて亢進することを特徴とするベクターである。
【００１８】
前記ベクターにおいて、前記第１プロモーター配列は、支配下にある前記第１転写構造体を構成的または条件的に発現せしめる配列であればよく、特に限定されない。
「構成的に発現せしめる」前記第１プロモーター配列としては、前記ベクターを導入した宿主生物の細胞内で常に活性であるプロモーター配列を使用できる。例えば、植物の場合、前記構成的に発現せしめる第１プロモーター配列としては、ＣａＭＶ３５Ｓ（カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ）プロモーター配列またはＧ−ｂｏｘプロモーター配列などを使用できる。
【００１９】
「条件的に発現せしめる」前記第１プロモーター配列は、前記ベクターを導入した宿主生物の細胞内で、前記第１プロモーター配列の支配下にある遺伝子などの発現を、意図する時点で誘導し得るものである。例えば、酵母においては、前記条件的に発現せしめる第１プロモーター配列としては、例えばＧＡＬ１プロモーター配列などを使用することができる。この場合は、ガラクトースを培地中に添加することにより、前記第１プロモーター配列の支配下にある遺伝子などの発現を誘導できる。
【００２０】
当業者であれば、目的および／または形質転換する対象に応じて、適切な前記第１プロモーター配列を選択することができる。
【００２１】
前記ＤＮＡ結合領域は、前記第２プロモーター配列に特異的に結合する領域であり、前記第２プロモーター配列との組み合わせにより適宜選択されるものである。例えば、前記ＤＮＡ結合領域がＡｈＲのＤＮＡ結合領域であれば、前記第２プロモーター配列には１以上のＸＲＥ配列を選択することが好ましい。この「ＸＲＥ」は生体異物応答配列（Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ　Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　Ｅｌｅｍｅｎｔ）であり、ＡｈＲリガンドなどの生体異物に応答するシス作用性の転写制御配列である。また、「ＸＲＥ」は、ダイオキシンに応答するシス作用性の転写制御配列であるダイオキシン応答配列（ＤＲＥ；　Ｄｉｏｘｉｎ　Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　Ｅｌｅｍｅｎｔ）と実質的に同義の配列を有するものである。「ＸＲＥ」の配列は当業者であれば、例えば公知文献（Ａｍｙ　Ｌｕｓｓｋａ，　ｅｔ　ａｌ．，　１９９３）などを参考にして適切な配列を選択できる。
【００２２】
前記ＤＮＡ結合領域としてＡｈＲのＤＮＡ結合領域を使用する場合、例えばマウスＡｈＲのアミノ酸番号１〜８２残基に対応するＤＮＡ配列を含む領域などを使用することができる。マウスＡｈＲの該領域を前記ＤＮＡ結合領域として用いる場合にはＡｒｎｔとの複合体形成が転写活性化の亢進に必要である。
また、例えば、前記ＤＮＡ結合領域がＬｅｘＡのＤＮＡ結合領域であれば、前記第２プロモーター配列には１以上のＬｅｘＡプロモーター配列を選択することが好ましい。該ＬｅｘＡのＤＮＡ結合領域は、例えばバクテリアリプレッサーＬｅｘＡのアミノ酸番号１〜２０２残基に対応するＤＮＡ配列を含む領域などを使用することができる。
【００２３】
本発明の「第２プロモーター配列」としては、複数のプロモーター配列単位をタンデムに配置したものが好適に使用される。
当業者であれば、適切な前記ＤＮＡ結合領域、及び、前記第２プロモーター配列の組み合わせを選択することができる。
【００２４】
本発明のベクターにおける前記核局在化シグナル配列は、前記第１転写構造体の翻訳産物である蛋白質を細胞の核内に局在化するものであればよく、特に限定されるものではない。好ましくは、ＳＶ４０由来の核局在化シグナル配列が使用される。
【００２５】
本発明のベクターにおける前記ＡｈＲリガンド結合制御領域は、由来する生物種に限定されるものではなく、例えばヒト、ラット、モルモットなど、様々な種に由来するＡｈＲリガンド結合制御ドメインをコードする領域を使用できる。即ち、前記ＡｈＲリガンド結合制御領域を含む前記第１転写構造体が、ＡｈＲリガンドを特異的に結合して複合体を形成し、結果として前記第２転写構造体の転写亢進を生じる範囲を含む領域を使用できる。例えば、マウスのＡｈＲを使用する場合は、ＡｈＲ蛋白質のアミノ酸番号８３〜５９３の範囲、好ましくは８３〜４９４の範囲に対応したＤＮＡ配列を含む領域が使用される。
【００２６】
本発明のベクターにおける前記転写活性化領域は、由来する生物種に限定されず、様々な種に由来するアミノ酸配列を有するものを使用できる。即ち、前記転写活性化領域を含む前記第１転写構造体がＡｈＲリガンドを特異的に結合して複合体を形成し、前記複合体が特異的に結合する前記第２プロモーター配列の下流に配置される転写単位の転写を亢進し、結果として前記第２転写構造体の転写亢進を生じる範囲を含む領域を使用できる。例えば、前記転写活性化領域は、様々な種に由来するＡｈＲの転写活性化領域、好ましくは、単純ヘルペスウイルス　ＶＰ１６蛋白質の転写活性化領域を１以上タンデムに連結した配列が使用され、より好ましくは、単純ヘルペスウイルス　ＶＰ１６蛋白質の転写活性化ドメインにおけるアミノ酸番号４１３〜４９０に対応したＤＮＡ配列を１以上タンデムに連結した配列が使用される。
【００２７】
本発明において「領域」という用語は本発明のベクターに関して使用される場合には２つの意味を有する。即ち、第一に一定の鎖長を有する核酸を意味する用語として使用され、該ベクターを構成する各種遺伝子に由来する核酸配列部分を意味する。第二に蛋白質を意味する用語として使用され、前記核酸配列部分がコードする蛋白質分子の全体もしくはそのドメインを意味する。従って、各「領域」はベクターを構成する核酸を意味するが、その「領域」が翻訳された場合には蛋白質を意味すると理解されるべきである。
【００２８】
本発明のベクターにおいて、前記第１プロモーター配列の下流に配置される前記第１転写構造体は、前記ＤＮＡ結合領域、前記核局在化シグナル配列、前記ＡｈＲリガンド結合制御領域および前記転写活性化領域を含む転写単位であり、上記で説明したように前記第１プロモーター配列の支配下で転写される。この第１転写構造体は、前記ＤＮＡ結合領域、前記核局在化シグナル配列、前記ＡｈＲリガンド結合制御領域および前記転写活性化領域を含むものであれば特に限定されない。しかし、前記第１プロモーター配列の下流側から順に、前記ＤＮＡ結合領域、前記核局在化シグナル配列、前記ＡｈＲリガンド結合制御領域、前記転写活性化領域が配置されることが好ましい。
【００２９】
前記第１転写構造体としては、ＸＤＶ／ＸＶＤ、野生型ＡｈＲ、またはＡｈＲＶ（キメラＡｈＲ）を転写単位として含むものが好適に使用される。
前記ＸＤＶ／ＸＶＤは、図２Ａ〜図２Ｄに示されるようなドメイン構造を有するものである。即ち、（ａ）ＬｅｘＡのＤＮＡ結合領域（バクテリアリプレッサーＬｅｘＡのアミノ酸番号１〜２０２残基に対応するＤＮＡ配列を含む領域）、（ｂ）ＳＶ４０のＮＬＳ、（ｃ）もしくは（ｃ’）マウスＡｈＲリガンド結合制御領域（マウスＡｈＲのアミノ酸番号８３〜４９４、もしくは８３〜５９３に対応するＤＮＡ配列を含む領域）、及び（ｄ）前記ＶＰ１６蛋白質の転写活性化領域におけるアミノ酸番号４１３〜４９０の領域に対応するＤＮＡ配列を１〜４個タンデムに連結した配列からなるキメラ分子である。
前記ＸＤＶ／ＸＶＤのドメイン（ｃ）もしくは（ｃ’）は何れを使用してもよく、またＸＤＶ／ＸＶＤのドメイン（ａ）〜（ｄ）は如何なる順序で配置されていてもよい。例えば、第一プロモーターに近い方からから順に、（ａ）→（ｂ）→（ｃ）→（ｄ）の順序であってもよい（図２ＡのＬｅｘＡ―ＡｈＲ８３―４９４―ＶＰ１６、ＬｅｘＡ―ＡｈＲ８３―４９４―ＶＰ３２、ＬｅｘＡ―ＡｈＲ８３―４９４―ＶＰ４８、及びＬｅｘＡ―ＡｈＲ８３―４９４―ＶＰ６４を参照）。また、（ａ）→（ｂ）→（ｃ’）→（ｄ）の順序であってもよい（図２ＢのＬｅｘＡ―ＡｈＲ８３―５９３―ＶＰ１６、ＬｅｘＡ―ＡｈＲ８３―５９３―ＶＰ３２、ＬｅｘＡ―ＡｈＲ８３―５９３―ＶＰ４８、及びＬｅｘＡ―ＡｈＲ８３―５９３―ＶＰ６４を参照）。さらに、（ａ）→（ｄ）→（ｂ）→（ｃ’）の順序であってもよい（図２ＣのＬｅｘＡ―ＶＰ１６―ＡｈＲ８３―５９３、ＬｅｘＡ―ＶＰ３２―ＡｈＲ８３―５９３、ＬｅｘＡ―ＶＰ４８―ＡｈＲ８３―５９３、及びＬｅｘＡ―ＶＰ６４―ＡｈＲ８３―５９３を参照）。
【００３０】
前記野生型ＡｈＲは、図１に示すドメイン構造を有する例えばヒト、ラット、モルモットなどの様々な種に由来する野生型ＡｈＲを使用することができ、好ましくはマウス由来の野生型ＡｈＲが使用できる。
前記ＡｈＲＶは、ＡｈＲの転写活性化領域のみが、前記ＶＰ１６蛋白質の転写活性化領域を１以上タンデムに連結した配列で置換されたものである（図２ＤのＡｈＲＶ、ＡｈＲＶ３２、ＡｈＲＶ４８、ＡｈＲＶ６４を参照）。前記ＡｈＲＶがマウス由来のＡｈＲである場合は、マウスＡｈＲのアミノ酸番号４９５以降が、前記ＶＰ１６蛋白質の転写活性化領域におけるアミノ酸番号４１３〜４９０の領域を１〜４個タンデムに連結した配列で置換されることが好ましい。
【００３１】
前記第２プロモーター配列は、前記ＤＮＡ結合領域を特異的に結合して、前記転写活性化領域の作用によりその支配下にある転写単位を転写せしめる配列であれば特に限定されない。しかし、上記で説明したように、前記第２プロモーター配列は前記ＤＮＡ結合領域を特異的に結合する領域であり、前記ＤＮＡ結合領域との組み合わせにより適宜選択されることが好ましい。
【００３２】
本発明において「レポーター遺伝子」という用語は、本発明で提供される方法の第一態様である「ＡｈＲリガンドをモニタリングする方法」において、上記で説明したように「レポーター遺伝子」の翻訳産物を検出および／または定量し得るものを広く意味している。さらに、この用語は、本発明で提供される方法の第二態様である「ＡｈＲリガンドを成育環境から軽減する方法」において、上記で説明したように、ＡｈＲリガンドを代謝し得る薬物代謝酵素遺伝子などをも広く意味している。
【００３３】
前記第一態様において、前記レポーター遺伝子は、その翻訳産物を検出および／または定量し得るものであれば特に限定されないが、例えばＬａｃＺ、β―グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、またはチトクロームｐ４５０をコードする遺伝子などを使用できる。この場合、前記レポーター遺伝子の翻訳産物の検出および／または定量は、適宜前記レポーター遺伝子の翻訳産物の活性及び性状に基づいた方法を用いればよい。特に、ＬａｃＺ、β―グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）などは汎用されるレポーター遺伝子であり、当業者であれば容易に検出および／または定量することが可能である。また、特異的に結合する抗体などを用いて検出および／または定量可能なものも使用できる。従って、抗体などにより検出および／または定量可能であれば、抗原性が既知の蛋白質もしくはその断片をコードする核酸を用い、発現した前記蛋白質等を抗体を用いて検出してもよい。
【００３４】
なお、第一態様および第二態様の夫々について述べたレポーター遺伝子は、所望により、これらを組合わせて使用してもよい。この場合には、複数の蛋白質を融合タンパク質として発現させる手法などを用いることができる。
【００３５】
また、前記第一態様は、前記レポーター遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡを検出および／または定量することによっても実施することができる。前記転写産物を検出および／または定量する手段としては、例えばＲＴ−ＰＣＲを利用した方法などがある（図８を参照）。
【００３６】
前記第二態様において、前記レポーター遺伝子はＡｈＲリガンドを代謝し、結果として生物に無害な物質に変換し得るものであればよい。例えば、チトクロームｐ４５０遺伝子が好適に使用される。
前記チトクロームｐ４５０は、生体に侵入した異物や薬物などを代謝して無毒化する酵素であり、基質特異性、関与する反応などを異にする多くのグループから成る遺伝子ファミリーの総称である。当業者であれば、対象とするＡｈＲリガンドに適切なチトクロームｐ４５０遺伝子を適宜選択して使用することができる。例えば、ＡｈＲリガンドがダイオキシン類である場合には、ＣＹＰ１Ａ１（ＣＹＰ１Ａ２）遺伝子を使用して、ダイオキシン類を酸化的代謝することにより環境に無害なより生体外に排泄され易く、毒性の低い代謝物に変換することができる（Ｔ．　Ｓａｋａｋｉ等、２００２）。
【００３７】
さらに、前記チトクロームｐ４５０遺伝子は、前記第一態様における前記レポーター遺伝子として使用することもできる。即ち、ある特定反応を触媒するチトクロームｐ４５０遺伝子を発現させ、生成したチトクロームｐ４５０を生体内で前記特定反応の基質物質と接触させて、発色などの検出可能なシグナルを発生する反応を生じさせることにより、前記第一態様のモニタリングを実施することができる。例えば、前記レポーター遺伝子としてβ―グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を使用し、前記特定物質として導入される５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ―３―ｉｎｄｏｌｙｌ―β―Ｄ―ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ（Ｘ−Ｇｌｕｃ）を脱エステルして、インドキシル誘導体モノマーを生じ、これが空気酸化重合してインジゴチン色素が生成され、青色を呈することにより、前記第一態様のモニタリングを実施することができる。
【００３８】
前記第２転写構造体は、前記第２プロモータ配列の支配下で転写される転写単位であり、１以上の前記レポーター遺伝子を含むものである。
【００３９】
前記第１プロモーターおよび第１転写構造体、並びに、前記第２プロモーターおよび第２転写構造体は、真核生物の細胞内の染色体もしくはエピソーム上において、同一分子内（シス）もしくは異なる分子間（トランス）に配置される。即ち、同一細胞内に前記第１プロモーターおよび第１転写構造体、並びに、前記第２プロモーターおよび第２転写構造体が存在していればよい。
【００４０】
また、前記第１転写構造体および前記第２転写構造体は、ｍＲＮＡから蛋白質への翻訳効率を向上させる目的などで、その５’側に非翻訳領域を含んでもよく、前記生物体が植物の場合はアルファルファモザイクウイルスもしくはトマトモザイクウイルスなどの５’−非翻訳領域を使用することができる。
また、前記第１転写構造体および前記第２転写構造体は、その３’−非翻訳領域に、形質転換する生物体における適切な転写終結配列を含むが、前記生物体が植物の場合はノパリンシンターゼ・ターミネーター（Ｎｏｓ−Ｔ）、エンドウ　ｒｂｃＳ−３Ａ・ターミネーター（Ｔ３Ａ）、エンドウ　ｒｂｃＳ−Ｅ９・ターミネーター（ＴＥ９）などを使用できる。
【００４１】
前記ＡｈＲリガンドは、前記第１転写構造体の転写産物の翻訳産物と結合し、前記ＡｈＲリガンドの存在量に応じた量の複合体を形成して、前記第２転写構造体の転写が前記複合体の存在量に応じて亢進する物質を想定できるが、好ましくはポリ塩化ジベンゾ―パラ―ダイオキシン（ＰＣＤＤｓ）、ポリ塩化ジベンゾフラン（ＰＣＤＦｓ）、コプラナーＰＣＢ（Ｃｏ−ＰＣＢｓ）などのダイオキシン類、および／またはベンツピレン、メチルコランスレンなどの多環状芳香族炭化水素である。
【００４２】
本発明により提供されるベクターの作用は、前記ベクターを導入した細胞内において、該細胞に侵入したＡｈＲリガンドが前記第１転写構造体の転写産物の翻訳産物と結合し、前記ＡｈＲリガンドの存在量に応じた量の複合体を形成することにより、前記第２転写構造体の転写が前記複合体の存在量に応じて亢進することを特徴とするものである。つまり、前記第１転写構造体の翻訳産物は本発明における「遺伝子発現誘導因子」の本体であり、一種の転写因子として作用して、対応する転写単位であるレポーター遺伝子を含む前記第２転写構造体の転写を亢進せしめるものである。前記第１転写構造体の翻訳産物の機能的特徴は、ＡｈＲリガンドが結合することにより活性化して転写活性化能が亢進すること、並びに、前記転写活性化能がＡｈＲリガンド量の増加に伴い更に亢進することである。
【００４３】
また、本発明のベクターは第３プロモーター配列と、第３プロモーター配列の下流に配置されて該配列の支配下で転写される、Ａｒｎｔ遺伝子および／または薬剤耐性遺伝子を含む第３転写構造体とを、前記第１および／または第２転写構造体と同一分子内に更に具備するものであってもよい。
この第３プロモーター配列としては、前記第１プロモーター配列と同様の配列を使用できる。
前記Ａｒｎｔ遺伝子は由来する生物種に限定されず、例えばヒト、ラット、モルモットなど、様々な種に由来するＡｒｎｔ遺伝子を使用できる。
【００４４】
前記薬剤耐性遺伝子は形質転換した細胞を選択し得るものであれば良く、目的によって、および／または、形質転換する対象によって適切な薬剤耐性遺伝子を選択すればよい。一般的には、本発明のベクターを増幅する目的で使用される宿主細胞、および／または、該ベクターを用いて形質転換した形質転換体を選択し得るものが使用される。前記薬剤耐性遺伝子としては、例えばＮＰＴＩＩ（ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼＩＩ）が使用できる。
【００４５】
前記第３転写構造体はＡｒｎｔ遺伝子および／または薬剤耐性遺伝子を含むものであるが、目的により他の遺伝子を含んでもよい。
また、前記第３転写構造体は、ｍＲＮＡから蛋白質への翻訳効率を向上させる目的などで、その５’側に非翻訳領域を含んでもよく、前記生物体が植物の場合はアルファルファモザイクウイルスもしくはトマトモザイクウイルスなどの５’−非翻訳領域を使用することができる。
また、前記第３転写構造体は、その３’−非翻訳領域に、形質転換する生物体における適切な転写終結配列を含むが、前記生物体が植物の場合はノパリンシンターゼ・ターミネーター（Ｎｏｓ−Ｔ）、エンドウ　ｒｂｃＳ−３Ａ・ターミネーター（Ｔ３Ａ）、エンドウ　ｒｂｃＳ−Ｅ９・ターミネーター（ＴＥ９）などを使用できる。
【００４６】
上記の「前記第１および／または第２転写構造体と同一分子内に更に具備する」とは、一般的には前記第３プロモーター配列および前記第３転写構造体が、前記第１および／または第２転写構造体と同一分子内に含まれることを意味している。この場合、前記第１〜３転写構造体は同一ベクター内に配置され、結果として、前記第１〜３転写構造体は形質転換細胞中の同一分子中に配置されることになる。
しかしながら、それぞれのプロモーター及び転写構造体は真核生物の同一細胞内に機能的に存在していればよく、特にそれらの分子上の配置は限定されるものではない。
【００４７】
本発明のベクターは当業者であれば、公知の方法に基づき適切に構築することができる。即ち、
本発明のベクターを構成する各領域をコードする核酸の配列情報は、公知の配列情報をデータベースから検索して取得することができる。また、該核酸は、前記配列情報に基づいて設計したプライマー、及び、鋳型となる核酸を含むライブラリーを使用したＰＣＲ法などを用いることにより取得することができる。
前記鋳型となる核酸を含むライブラリーは、各種の生物の各種臓器由来のものを、商業的に又は各寄託機関から入手することができる。
取得した該核酸を公知の分子生物学的な手法を用いて適切に連結することにより、本発明のベクターを構築することができる。
【００４８】
また、本発明は、本発明のベクターにより形質転換した形質転換体を提供する。
本発明のベクターにより好適に形質転換される生物は真核生物である。前記真核生物として、植物、より好ましくは高等植物、もっとも好ましくはタバコなどが使用できる。また、前記真核生物として酵母、好ましくは酵母Ｌ４０株が使用できる。
前記形質転換体が植物の場合は、本発明の植物用ベクターにより、植物体を形質転換して作成することができる。前記植物用ベクターは本発明のベクターの一態様であり、本発明のベクターが具備すべき構成要素を含む植物用のベクターである。
【００４９】
当業者であれば、適切な構成を有する前記植物用ベクターを構築して形質転換体を作成できるが、例えば図７に例示されるようなベクターを使用することができる。
図７の上段に例示したベクターはＴ―ＤＮＡバイナリーベクター系に準拠したベクターであり、ＲＢ（ライトボーダー）の位置から順に以下に示す領域からなるベクターである。すなわち、
前記第２プロモーターとして、６つのマウスＸＲＥ配列をタンデムに連結した配列（ＣａＭＶ３５Ｓ−Ｐ　ｃｏｒｅ配列が続く）、
前記第２転写構造体に含まれる前記レポーター遺伝子として、ＧＵＳ遺伝子（ＮＴの転写終結配列が続く）、
前記第１プロモーターとして、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター配列、
前記第１転写構造体として、前記野生型ＡｈＲもしくは前記ＡｈＲＶ（アルファルファモザイクウイルスの５’−非翻訳領域を先行配列として有し、また後続配列としてＮＴの転写終結配列を有する）、
前記第３プロモーターとして、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター配列、
前記第３転写構造体として、マウスＡｒｎｔ遺伝子（アルファルファモザイクウイルスの５’−非翻訳領域を先行配列として有し、また後続配列としてＮＴの転写終結配列を有する）、
前記第３プロモーターとして、更にノパリンシンターゼ　プロモーター配列、
前記第３転写構造体として、更にＮＰＴＩＩ遺伝子（ノパリンシンターゼ　ターミネーター配列が続く）、
を含んでなるベクターである。
【００５０】
前記ＣａＭＶ３５Ｓ−Ｐ　ｃｏｒｅ配列は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター配列の一部の領域（−６０〜＋８）からなる配列である。
【００５１】
前記第１転写構造体が前記野生型ＡｈＲであるベクターはｐＳＫＡ２Ｇ（ＡｈＲ−ＧＵＳ）と呼称され、又、前記第１転写構造体が前記ＡｈＲＶであるベクターはｐＳＫＡｖＡｔＧ（ＡｈＲＶ−ＧＵＳ）と呼称される。
【００５２】
図７の下段に例示したベクターもＴ―ＤＮＡバイナリーベクター系に準拠したベクターであり、ＲＢ（ライトボーダー）の位置から順に以下に示す領域からなるベクターである。すなわち、
前記第１プロモーター配列として、Ｇ−ｂｏｘプロモーター配列、
前記第１転写構造体として前記ＸＤＶ／ＸＶＤ（トマトモザイクウイルスの５’−非翻訳領域を先行配列として有し、また後続配列としてＴＥ９の転写終結配列を有する）、
前記第３プロモーターとして、ノパリンシンターゼ　プロモーター配列、
前記第３転写構造体として、ＮＰＴＩＩ遺伝子（ノパリンシンターゼ　ターミネーター配列が続く）、
前記第２プロモーター配列として、ＬｅｘＡプロモーター配列（図中ではＸ４６−Ｐと表記）、
前記第２転写構造体に含まれる前記レポーター遺伝子として、ＧＵＳ遺伝子（Ｔ３Ａの転写終結配列が続く）、
を含んでなるベクターである。
【００５３】
また、図中の訳語を以下に説明する。
ＡｈＲ：マウスＡｈＲ（Ｃ５７ＢＬ／６系統由来）
Ａｒｎｔ：マウスＡｒｎｔ　（Ｃ５７ＢＬ／６系統由来）
ＣａＭＶ３５−Ｐ：カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ−プロモーター
ＧＵＳ：β−グルクロニダーゼ
ＮＰＴＩＩ：ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ　ＩＩ
ＵＴＲ：アルファルファモザイクウイルス　５’非翻訳領域
ＲＢ：ライトボーダー
ＬＢ：レフトボーダー
ＮＴ：ノパリンシンターゼ　ターミネーター
ＶＰ１６：単純ヘルペスウイルス　ＶＰ１６蛋白質転写活性化ドメイン（４１３−４９０ａ．ａ）
Ω：トマトモザイクウイルス　５’非翻訳領域
Ｘ４６−Ｐ：ＬｅｘＡプロモーター配列
Ｇ１０−Ｐ：キメラＧ−ｂｏｘ　プロモーター
Ｔ３Ａ：エンドウ　ｒｂｃＳ−３Ａ　ターミネーター
ＴＥ９：エンドウ　ｒｂｃＳ−Ｅ９　ターミネーター
上記植物用ベクターを導入したアグロバクテリウムを用い、これをリーフディスク法により植物体に導入して、本発明の形質転換体を作成する。
前記植物がタバコの場合においても、同様に形質転換体を作成できる。
【００５４】
前記形質転換体が酵母の場合は、本発明の酵母用ベクターにより酵母を形質転換して、本発明の形質転換体を作成することができる。前記酵母用ベクターは本発明のベクターの一態様であり、本発明のベクターが具備すべき構成要素を含む酵母用のベクターである。
当業者であれば、適切な構成を有する前記酵母用ベクターを構築して形質転換体を作成できるが、例えば図３に例示されるようなベクターを使用することができる。
【００５５】
図３に例示したベクターは、前記第１転写構造体として前記ＸＤＶ／ＸＶＤのｃＤＮＡを、酵母用発現プラスミドｐＹＥＳ３／ＣＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ）のマルチクローニング部位にあるＸｈｏ　Ｉ部位に順方向に挿入して構築したものである。
前記ｐＹＥＳ３／ＣＴは、前記第１プロモーター配列としてのＧＡＬ１プロモ一夕ー、前記転写終結配列としてのＣＹＣ１ターミネーターで構成される発現カセットを有し、酵母において炭素源ガラクトース存在下で導入した前記ＸＤＶ／ＸＶＤの発現を制御することができるものである。
【００５６】
酵母Ｌ４０株は、その染色体内に、前記第２プロモーター配列としてのＬｅｘＡプロモーター配列およびその下流に配置された前記第２転写構造体としてのＬａｃＺ転写単位を既に含んでいる。従って、前記ｐＹＥＳ３／ＣＴに前記ＸＤＶ／ＸＶＤを導入したベクターなど適切なベクターで形質転換することにより、本発明の形質転換体として使用可能となる（図３を参照）。
【００５７】
また、本発明は形質転換体を培養または栽培する工程を含み、該培養体において前記レポーター遺伝子が発現することによって、前記形質転換体の成育環境における前記ＡｈＲリガンドの存在をモニターすることを特徴とする、ＡｈＲリガンドをモニタリングする方法を提供する。
【００５８】
前記形質転換体が植物である場合には、該植物を測定地の土壌などに植えて栽培し、一定期間にわたり栽培した後に、上記で説明したようにして前記レポーター遺伝子に特異的な方法により、前記測定地の環境に存在する前記ＡｈＲリガンドを検出および／または定量できる。
【００５９】
さらに、本発明は形質転換体を培養または栽培する工程を含み、前記ＡｈＲリガンドを前記形質転換体の体内で代謝させることにより、前記形質転換体の成育環境に存在する前記ＡｈＲリガンドを前記成育環境から軽減する方法を提供する。
前記形質転換体が植物である場合には、該植物を測定地の土壌などに植えて栽培することにより、上記で説明したように、前記レポーター遺伝子に特異的な薬物代謝活性を利用して前記測定地の環境に存在する前記ＡｈＲリガンドを代謝し、該リガンドを環境中から軽減することができる。
前記方法が対象とする前記ＡｈＲリガンドとしては、ＡｈＲに結合し得る様々なアリールハイドロカーボンを想定できるが、ダイオキシン類および／または多環状芳香族炭化水素などが好適な対象である。
【００６０】
以上説明したように、本発明の方法によれば、環境における環境負荷化学物質をオンサイトでモニタリングし、またオンサイトで環境からこれら負荷物質を軽減することができる。当然ながら、土壌、水などの試料を目的とする環境から採集し、これを現場から離れた実験室などに運んだ後に、本発明の形質転換体を用いて本発明によるモニタリングを実施することもできる。
【００６１】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００６２】
〔実施例１〕
ＡｈＲリガンド特異的な遺伝子誘導発現因子（ＸＤＶ／ＸＶＤ）の構築
＜実験材料＞
マウスＣ５７ＢＬ／６系統由来のＡｈＲの構造を図１に示す（Ｗｈｉｔｅｌａｗ，　Ｍ．Ｌ．，　ｅｔ　ａｌ．，　１９９３，　ａｎｄ　Ｗｈｉｔｌｏｃｋ，　Ｊ．Ｐ．，　１９９９）。ＡｈＲの構造は上記で説明したように、（１）ＤＮＡ結合ドメイン、（２）ＡｈＲリガンド結合制御ドメイン、及び（３）転写活性化ドメインをコードする領域に大別できる。そこで、ＡｈＲリガンド結合制御領域に異種のＤＮＡ結合領域や転写活性化領域を融合することにより、新規のＡｈＲリガンド特異的遺伝子発現誘導因子（ＸＤＶ／ＸＶＤ）を創製した。
【００６３】
即ち本発明では、マウスＡｈＲのＡｈＲリガンド結合制御領域：Ｄ（アミノ酸８３〜４９４残基、及びアミノ酸８３〜５９３残基）とバクテリアリプレッサーＬｅｘＡのＤＮＡ結合領域（アミノ酸１〜２０２残基）；Ｘ、ヘルペスウイルスＶＰ１６の転写活性化領域（アミノ酸４１３〜４９０残基）；Ｖを組み合わせることにより、ＡｈＲリガンド特異的遺伝子発現制御因子；ＸＤＶ／ＸＶＤを構築した（以下、新規ＡｈＲリガンド特異的遺伝子発現制御因子をＸＤＶ／ＸＶＤと略称する）。
【００６４】
マウスＣ５７ＢＬ／６系統由来の肝臓のｃＤＮＡライブラリーから、マウスＡｈＲ　ｃＤＮＡをクローニングした。また、ＬｅｘＡ、及びＶＰ１６のｃＤＮＡは、ｐＥＧ２０２（ＯｒｉＧｅｎｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｉｎｃ．　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，　Ｍａｒｙｌａｎｄ）及びｐＥＲ１（Ｚｕｏ，　Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．，　２０００）を鋳型としてＰＣＲ法によってクローニングした。各ｃＤＮＡの塩基配列の５’末端に制限酵素Ｘｈｏ　Ｉ認識部位を、３’末端に制限酵素Ｓａｌ　Ｉ認識部位を導入し、それらを融合することによりＸＤＶ／ＸＶＤ　ｃＤＮＡを構築した。その他のＤＮＡ配列は、合成ＤＮＡリンカーを挿入することにより得た。それらの構造を図２Ａ〜図２Ｄに記す。ＸＤＶ／ＸＶＤの各々のｃＤＮＡを大腸菌において発現させウエスタン分析を用いて相当するタンパク質の産生を確認した。
【００６５】
＜ＸＤＶ／ＸＶＤの酵母レポーターアッセイ系を用いた性能評価＞
酵母発現系を用いたレポーター遺伝子アッセイ系を用いて、ＸＤＶ／ＸＶＤの性能の評価を行った。各々のＸＤＶ／ＸＶＤのｃＤＮＡを酵母用発現プラスミドｐＹＥＳ３／ＣＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ）のマルチクローニング部位のＸｈｏ　Ｉ部位に順方向に挿入し、各々のＸＤＶ／ＸＶＤの酵母用発現プラスミドを構築した。ｐＹＥＳ３／ＣＴは、ＧＡＬ１プロモ一夕ー、ＣＹＣ１ターミネーターで構成される発現カセットを有し、酵母において炭素源ガラクトース存在下においてＸＤＶ／ＸＶＤの発現を制御することができる。
【００６６】
染色体にＬｅｘＡオペレータープロモーターとβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ＬａｃＺ）から構成されるレポーターユニットを有する酵母Ｌ４０株［（ＭＡＴａ　ｈｉｓ３Δ２００　ｔｒｐ１−９０１　ｌｅｕ２−３１１２　ａｄｅ２　ＬＹＳ２：：（４ｌｅｘＡｏｐ−ＨＩＳ３）ＵＲＡ３：：（８ｌｅｘＡｏｐ−ｌａｃＺ）ＧＡＬ４）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ）］を形質転換し、ＸＤＶ／ＸＶＤの発現とリガンド処理に依存したＬａｃＺ活性を指標に評価した。シングルコロニーを１．６ｍＬの適切なアミノ酸および炭素源としてグルコースを含む選択液体培地で一晩、３０℃で培養した後、１６０μＬを最終液量１．６ｍＬになるように適切なアミノ酸と炭素源としてガラクトース、ラフィノース、及びＡｈＲリガンドを含む液体誘導培地に添加し、１６〜１８時間、３０℃で培養した。
【００６７】
各種ＡｈＲリガンド（ダイオキシン類）は、ＤＭＳＯに溶解させ、培地中でのＤＭＳＯの最終濃度を０．１％とした。培養後、２００μＬの菌液から集菌した酵母をＺ−バッファー（６０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４，４０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４，１ｍＭ　ＭｇＳＯ４，１０ｍＭ　ＫＣｌ，３５ｍＭ　β−メルカプトエタノール）に懸濁し、ＣＨＣｌ３と０．１％ＳＤＳを処理した後、基質液オルト−ニトロフェニル−β−ガラクトピラノシド（４ｍｇ／ｍｌになるようにＺ−バッファーに溶解）を添加し、混合後、３７℃で反応をさせた。反応を適時に１Ｍ　Ｎａ２ＣＯ３を添加することにより停止させ、遠心処理した後、上清の４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。ＬａｃＺユニットは、以下の計算式で求めた。
【００６８】
ＬａｃＺユニット＝４１５ｎｍにおける吸光度／（２００μＬの酵母菌液を１ｍＬにメスアップした希釈酵母菌液１ｍＬの６００ｎｍにおける吸光度）×反応時間（分））ｘ１０００
ＡｈＲリガンド、即ち、２０−メチルコランスレン（２０−ＭＣ）、β−ナフトフラボン（β−ＮＦ）、インジゴ（Ｉｎｄｉｇｏ）を酵母アッセイ系に供した。解析に供したＸＤＶ／ＸＶＤのうち、１２種においてＡｈＲリガンド、２０−ＭＣ処理に依存的な転写活性が認められた（表１）。とりわけ、ＬｅｘＡ−ＡｈＲ８３−４９４−ＶＰ３２、ＬｅｘＡ−ＡｈＲ８３−４９４−ＶＰ４８、ＬｅｘＡ−ＡｈＲ８３−４９４−ＶＰ６４、ＬｅｘＡ−ＶＰ３２−ＡｈＲ８３−５９３およびＬｅｘＡ−ＶＰ４８−ＡｈＲ８３−５９３の活性が高く、処理特異的な非常に強い遺伝子転写活性化能を示した（図５）。
【００６９】
ＸＤＶ／ＸＶＤの基本性能を評価するにあたり、非常に強い転写活性化能を有するポジティブコントロールとして用いたＬｅｘＡ−ＶＰ１６（ＸＶＰ１６）との比較においても、これらは同等もしくはそれ以上の活性を示した。同様の条件で、２０−ＭＣの処理濃度を７段階に振分けて各種ＸＤＶ／ＸＶＤのＡｈＲリガンド処理濃度依存的遺伝子誘導発現活性を比較した。その結果、全てのＸＤＶ／ＸＶＤにおいてその転写活性にＡｈＲリガンドの処理濃度に対する濃度依存性を確認した。その一例を図５に示す。とりわけ、非常に高い転写活性を示したＬｅｘＡ−ＡｈＲ８３−４９４−ＶＰ３２、ＬｅｘＡ−ＡｈＲ８３−４９４−ＶＰ４８は、５ｎＭの２０−ＭＣでも有意な転写活性を示した。
【００７０】
さらに、同様の条件下で、他の２種のＡｈＲリガンドであるβ−ＮＦ及びインジゴの処理による各々のＸＤＶ／ＸＶＤの転写活性を解析した。その結果、図６に示すように、各ＡｈＲリガンドにおけるＬａｃＺ活性に差異が認められるものの、いずれのＡｈＲリガンド処理においてもＬａｃＺ活性の増強が認められた。また、ここには示していないが、炭素源としてグルコースを用いた２０−ＭＣ処理条件下では、炭素源としてガラクトースを用いたＤＭＳＯ処理条件下におけるＬａｃＺ活性と殆ど差異が認められなかったことから、本解析で検出されたＬａｃＺ活性は、ＸＤＶ／ＸＶＤの転写活性化能に依存することが確認できた。
【００７１】
【表１】
2004089068.tif 000002
【００７２】
〔実施例２〕
ＡｈＲリガンド特異的なＡｈＲを介したレポーター遺伝子誘導発現系の構築
＜実験材料＞
哺乳動物において、ＡｈＲリガンドを受容するＡｈＲを介したシグナル伝達系を構成するＡｈＲ、Ａｒｎｔ及びそれら転写活性化因子の特異的結合ＤＮＡ配列であるＸＲＥを導入することにより、植物において哺乳動物ＡｈＲリガンド特異的遺伝子誘導発現系の構築を行った。マウスＣ５７ＢＬ／６系統の肝臓ｃＤＮＡライブラリーから、ＡｈＲ　ｃＤＮＡ（Ｓｃｈｍｉｄｔ，　Ｊ．Ｖ．，　ｅｔ　ａｌ．，　１９９３）とＡｒｎｔ　ｃＤＮＡ（Ｒｅｉｓｚ−Ｐｏｒｓｚａｓｚ，　Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ．，　１９９４）をクローニングした。両ｃＤＮＡを構成的に植物において発現させるため、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ−Ｐ）とノパリンシンターゼターミネ−夕ー（Ｎｏｓ−Ｔ）からなる発現ユニットに順方向に挿入した転写因子発現ユニットとＸＲＥ配列をタンデムに有する植物キメラプロモーターとレポーター遺伝子及びＮｏｓ−Ｔからなるレポーターユニットを保持した２種の植物用発現プラスミドｐＳＫＡ２ＧとｐＳＫＡｖＡｔＧを構築した（構造を図７に示す）。ｐＳＫＡｖＡｔＧは、ＡｈＲの転写活性化ドメインをＶＰ１６転写活性化ドメインと置換したキメラＡｈＲ（ＡｈＲＶ遺伝子）を保持する。各々のプラスミドを導入したアグロバクテリウムを用いてリーフディスク法によりタバコ植物体（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　ｃｖ．　Ｓｕｍｓｕｎ　ＮＮ）を形質転換した。
【００７３】
＜実験方法＞
各々の植物発現用プラスミドについて、二度の抗生物質カナマイシン耐性により選抜した再分化個体からゲノムＤＮＡを抽出し、ＡｈＲもしくはＡｈＲＶ、Ａｒｎｔ、ＧＵＳに対し各々に特異的なプライマーを用いてゲノムＰＣＲ分析を行った。その結果、３種全てにおいて相当するサイズのｃＤＮＡバンドの増幅が確認できたものを形質転換タバコ植物体として以降の解析に用いた（個体数については表２に示す）。
【００７４】
植物用発現プラスミドｐＳＫＡ２ＧとｐＳＫＡｖＡｔＧで形質転換した植物体を以後、ＡｈＲ−ＧＵＳ、ＡｈＲＶ−ＧＵＳ植物体とそれぞれ称する。取得した全形質転換植物の培養２〜３週目の腋芽を２週間ＡｈＲリガンド（２５　μＭ　２０−ＭＣ、２５μＭ　β−ＮＦ、５０μＭ　インジゴ）を含む培地で生育させた後、植物体茎葉部から可溶性タンパク質画分を抽出し、ＧＵＳ活性を測定した。培地にはＴｗｅｅｎ２０　０．０１％と、ＡｈＲリガンド２０−ＭＣもしくは溶媒ＤＭＳＯ溶液を終濃度０．１％になるように添加した。同様に、ＡｈＲリガンド、２０−ＭＣの濃度を８段階に振ったＭＳ培地上にて腋芽を２週間培養し、ＡｈＲリガンドの処理濃度依存的なレポーターの発現を解析した。また、同様に２５μＭ　２０−ＭＣを含むＭＳ培地上にて腋芽を２週間培養し、レポーターの植物体における組織特異的発現をＧＵＳ染色法を用いて解析した。即ち、植物体各組織をＸ―Ｇｌｕｃ溶液（０．１Ｍ　リン酸ナトリウム緩衝液，　ｐＨ　７．０、　１．９ｍＭ　Ｘ−ｇｌｕｃｕｒｏｄｉｄｅ、　０．５ｍＭ　Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、　０．５ｍＭ　Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６、　０．３％　（ｖ／ｖ）　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、　２０％メタノール）　中にて減圧浸透処理後、一晩３７℃でインキュベートし、７０％エタノールを添加して反応を停止させる。その後、７０％エタノール中にて脱色し、光学もしくは実態顕微鏡下で植物体組織を観察する。さらに、形質転換植物体におけるＡｈＲ、ＡｈＲＶ、Ａｒｎｔなどの導入遺伝子発現の確認を葉組織から全ＲＮＡを抽出した後に、各々の遺伝子に特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ解析により行った。なお、アクチン遺伝子を内在の発現指標として用いた（図８）。
【００７５】
【表２】
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【００７６】
＜実験結果＞
形質転換タバコ植物体を用いたＧＵＳ遺伝子発現解析を行ったところ、複数のＡｈＲ−ＧＵＳ、ＡｈＲＶ−ＧＵＳ植物体において、ＡｈＲリガンドの処理に特異的なレポーターであるβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ：β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）の発現の増強が認められた。とりわけ、ＡｈＲＶ−ＧＵＳ植物体のｌｉｎｅ４とｌｉｎｅ２１において非常に強いＡｈＲリガンド処理（２０−ＭＣ）に依存的なＧＵＳ活性の増強が認められ、植物において非常に強力な異種遺伝子発現プロモーターとして広く用いられているＣａＭＶ３５Ｓ−Ｐの制御下でＧＵＳを発現した個体との比較において、それより強いＧＵＳ活性を示した（図９）。
【００７７】
β−ＮＦやインジゴなどの複数種のＡｈＲリガンドを処理したところ同様にＧＵＳ活性の増強が認められ、とりわけ、２０−ＭＣとβ−ＮＦの処理で顕著であった。また、ＡｈＲリガンドの溶媒に用いたＤＭＳＯと何も添加しないＭＳ培地間でＧＵＳ活性を比較したところ、殆どその差異は認められなかった（図１０）。さらに、ＡｈＲリガンドとして２０−ＭＣを用いた濃度依存的誘導発現解析を行ったところ、２０−ＭＣ処理濃度とＧＵＳ活性の間に相関性が確認され、形質転換植物体において培地中の５ｎＭの２０−ＭＣを検出できることが確認された（図１）。ＤＭＳＯによるコントロールではＧＵＳの発現は検出できなかった（図１２、Ａ）。図１２の（Ａ）ＤＭＳＯ処理において、葉（上段の図）及び茎（下段の図）の何れにおいても全くＧＵＳの発現は検出されなかった。しかしながら、２０−ＭＣを含むＭＳ培地上にて培養した場合、地上部組織において顕著なＧＵＳレポーター遺伝子の発現に伴う青色呈色（図中では黒色）が観察された（図１２、Ｂ）。図１２の（Ｂ）２０−ＭＣ処理において、葉（上段の図）の全体にわたり点状のＧＵＳ発現が認められる、また茎部（下段の図）においては、特に維管束部分に沿って強い発現が認められた。
【００７８】
一方、ＡｈＲリガンド処理時に特異的なＧＵＳ活性の増強を示した植物個体から全ＲＮＡを抽出して、ＲＴ−ＰＣＲ解析を行った結果、いずれの個体においてもＡｈＲもしくはＡｈＲＶ、及び、ＡｒｎｔのメッセンジャーＲＮＡへの転写を確認した（図８）。以上の結果は、各種ＡｈＲリガンドは植物体の根系を介して吸収され、茎葉部において導入した哺乳動物ＡｈＲリガンド特異的遺伝子誘導発現系を活性化すること示しており、本発現系を導入した形質転換タバコ植物はダイオキシン類などのＡｈＲリガンドの環境モニタリング植物として使用し得ることが実証された。
【００７９】
〔実施例のまとめ〕
実施例１は、哺乳動物におけるＡｈＲを介したシグナル伝達系を単純化した遺伝子発現誘導因子ＸＤＶ／ＸＶＤを提供するための構成の例を示したものである。本来、ＡｈＲはＡｒｎｔとヘテロ２量体を形成し、標的遺伝子ＣＹＰ１Ａ１の発現制御領域に存在する結合配列ＸＲＥに結合し、ｍＲＮＡへの転写を活性化させる。しかし、実施例で例示されるＸＤＶ／ＸＶＤは、ＤＮＡ結合領域をＬｅｘＡのＤＮＡ結合領域と置換しており、結合配列としてＸＲＥを必要としないものである。前記ＸＤＶ／ＸＶＤは、ＬｅｘＡの結合配列であるＬｅｘＡプロモーター配列に単独もしくはホモ２量体で結合するが、その機能発現にはＡｒｎｔを必要としない。
【００８０】
前記ＬｅｘＡプロモーター配列はバクテリア由来の配列であり、本発明の宿主として用いる真核生物において内在のタンパク質群による偽陽性発現が非常に低い。従って、バックグランドを低く保てることから極低濃度のＡｈＲリガンドに対する適用性を有する。更に、前記ＸＤＶ／ＸＶＤの転写活性化領域は、酵母、哺乳動物、植物において非常に強い転写活性化能を有するＶＰ１６のものと置換している。従って、前記ＸＤＶ／ＸＶＤは真核生物において広く適用性を有している。
【００８１】
実施例２は、哺乳動物におけるＡｈＲリガンドによる遺伝子誘導発現制御機構を植物において構成する遺伝子系を提供する態様を示すものである。即ち、植物を用いてＡｈＲリガンドに対応した環境におけるオンサイトでのバイオモニタリング、または、汚染軽減の技術を提供するものである。
【００８２】
【参照文献】
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２．Ｗｈｉｔｅｌｏｃｋ，　Ｊ．，　Ｐ．，　Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｔｏｘｉｃｏｌ．　３９：　ｐｐ．１０３−１２５，　１９９９．
３．Ｚｕｏ，　Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｌａｎｔ　Ｊ．　２４，　ｐｐ．２６５−２７３，　２０００。
【００８３】
４．Ｓｃｈｍｉｄｔ，　Ｊ．Ｖ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６８　（２９），　ｐｐ．　２２２０３−２２２０９，　１９９３．
５．Ｒｅｉｓｚ−Ｐｏｒｓｚａｓｚ，　Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　１４（９）　ｐｐ．　６０７５−６０８６，　１９９４．
６．Ａｍｙ　Ｌｕｓｓｋａ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６８（９），　ｐｐ．６５７５−６５８０，　１９９３．
７．Ｓａｋａｋｉ，　Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｏｈｙｓｉｃｓ，　４０１　ｐｐ．　９１−９８，　２００２．
【図面の簡単な説明】
【図１】アリルハイドロカーボン受容体（ＡｈＲ）の構造と機能を示した図である。
【図２Ａ】新規ＡｈＲリガンド特異的遺伝子発現誘導因子（ＸＤＶ／ＸＶＤ）の構造を示した図である。
【図２Ｂ】新規ＡｈＲリガンド特異的遺伝子発現誘導因子（ＸＤＶ／ＸＶＤ）の構造を示した図である。
【図２Ｃ】新規ＡｈＲリガンド特異的遺伝子発現誘導因子（ＸＤＶ／ＸＶＤ）の構造を示した図である。
【図２Ｄ】キメラＡｈＲ（ＡｈＲＶ）の構造を示した図である。
【図３】ＸＤＶ／ＸＶＤの酵母レポーターアッセイ系を用いた性能評価方法の概略を示した図である。
各種ＸＤＶ／ＸＶＤ発現プラスミドを導入した酵母を−晩、炭素源としてグルコースを含む液体選抜培地にて前培養後、ＡｈＲリガンド、及び炭素源としてガラクトースを添加した液体選抜培地にて、１４〜１６時間培養し、ＬａｃＺ活性を測定した。
【図４】ＡｈＲリガンドに対するＡｈＲを介した遺伝子誘導発現系を導入し、レポーター遺伝子を発現したモニタリング用及び薬物代謝酵素遺伝子を発現した汚染軽減型植物の作出の概要を示す図である。
【図５】ＸＤＶ／ＸＶＤによるＡｈＲリガンド処理濃度依存的ＬａｃＺ遺伝子誘導発現活性を示すグラフである。
【図６】酵母におけるＸＤＶ／ＸＶＤによる各種ＡｈＲリガンド処理特異的ＬａｃＺ遺伝子誘導発現活性を示すグラフである。
【図７】ＡｈＲを介したＧＵＳ遺伝子誘導発現系の植物用発現プラスミドの構造を示す図である。
【図８】形質転換タバコ植物体のＲＴ−ＰＣＲ解析を示す電気泳動の写真である。
【図９】形質転換タバコ植物体の２０−メチルコランスレン処理によるＧＵＳ誘導活性を示すグラフである。
【図１０】形質転換タバコ植物体の各種ＡｈＲリガンド処理によるＧＵＳ誘導活性を示すグラフである。
【図１１】形質転換タバコ植物体のＡｈＲリガンド・２０−ＭＣによる処理濃度依存的ＧＵＳ誘導活性を示すグラフである。
【図１２】２０−ＭＣ処理による形質転換タバコ植物組織中のＧＵＳ活性を示す写真である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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