(57)【要約】【課題】ＥＴＢ遺伝子及びＥＴＡ遺伝子の測定方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブの提供。【解決手段】エンドセリンＡ（ＥＴＡ）遺伝子のエキソンの領域から設計されたオリゴヌクレオチドを含む、ＥＴＡ遺伝子の増幅用プライマー及び検出用プローブ、並びにエンドセリンＢ（ＥＴＢ）遺伝子のエキソンの領域から設計されたオリゴヌクレオチドを含む、ＥＴＢ遺伝子の増幅用プライマー及び検出用プローブ。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドセリン受容体Ａ（以下、エンドセリンＡやＥＴＡと記す場合あり）遺伝子のエキソン１、２、３、４、５、６及び７から選ばれるいずれかのエキソンの塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドを含む、エンドセリンＡ遺伝子の増幅用フォワードプライマー。
【請求項２】
オリゴヌクレオチドが配列番号１に示される塩基配列を有するものである請求項１記載のプライマー。
【請求項３】
エンドセリン受容体Ａ遺伝子のエキソン２、３、４、５、６、７及び８から選ばれるいずれかのエキソンの塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドを含む、エンドセリンＡ遺伝子の増幅用リバースプライマー。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドが配列番号２に示される塩基配列を有するものである請求項３記載のプライマー。
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のオリゴヌクレオチドを含む、エンドセリン受容体Ａ遺伝子の測定用プローブ。
（ａ）  エンドセリン受容体Ａ遺伝子のエキソン１、２、３、４、５、６、７及び８の全部又は一部の領域の塩基配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド
（ｂ）  エンドセリン受容体Ａ遺伝子のエキソン１、２、３、４、５、６、７及び８の全部又は一部の領域の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド
【請求項６】
プローブが、リポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素により標識されたものである請求項５記載のプローブ。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドが、配列番号３に示される塩基配列を有するものである請求項５又は６記載のプローブ。
【請求項８】
請求項１又は２に記載のフォワードプライマー、請求項３又は４に記載のリバースプライマー、及び請求項５〜７のいずれかに記載のプローブを含む、エンドセリン受容体Ａ遺伝子の測定用キット。
【請求項９】
フォワードプライマーが配列番号１に示す塩基配列を有するものであり、リバースプライマーが配列番号２に示す塩基配列を有するものであり、かつ、プローブが配列番号３に示す塩基配列を有するものである請求項８記載のキット。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載のフォワードプライマー、請求項３又は４に記載のリバースプライマー、及び請求項５〜７のいずれかに記載のプローブを用いて、被検試料中の測定すべきエンドセリン受容体Ａ遺伝子を鋳型として増幅反応を行ない、得られる反応液から蛍光強度を測定することを特徴とするエンドセリン受容体Ａ遺伝子の測定方法。
【請求項１１】
フォワードプライマーが配列番号１に示す塩基配列を有するものであり、リバースプライマーが配列番号２に示す塩基配列を有するものであり、かつ、プローブが配列番号３に示す塩基配列を有するものである請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
エンドセリン受容体Ｂ（以下、エンドセリンＢやＥＴＢと記す場合あり）遺伝子のエキソン１、２、３、４、５、６から選ばれるいずれかのエキソンの塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドを含む、エンドセリン受容体Ｂ遺伝子の増幅用フォワードプライマー。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドが配列番号４に示される塩基配列を有するものである請求項１２記載のプライマー。
【請求項１４】
エンドセリン受容体Ｂ遺伝子のエキソン２、３、４、５、６、７から選ばれるいずれかのエキソンの塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドを含む、エンドセリン受容体Ｂ遺伝子の増幅用リバースプライマー。
【請求項１５】
オリゴヌクレオチドが配列番号５に示される塩基配列を有するものである請求項１４記載のプライマー。
【請求項１６】
以下の（ａ）又は（ｂ）のオリゴヌクレオチドを含む、エンドセリン受容体Ｂ遺伝子の測定用プローブ。
（ａ）  エンドセリン受容体Ｂ遺伝子のエキソン１、２、３、４、５、６及び７の全部又は一部の領域の塩基配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド
（ｂ）  エンドセリン受容体Ｂ遺伝子エキソン１、２、３、４、５、６及び７の全部又は一部の領域の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド
【請求項１７】
プローブが、リポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素により標識されたものである請求項１６記載のプローブ。
【請求項１８】
オリゴヌクレオチドが、配列番号６に示される塩基配列を有するものである請求項１６又は１７記載のプローブ。
【請求項１９】
請求項１２又は１３に記載のフォワードプライマー、請求項１４又は１５に記載のリバースプライマー、及び請求項１６〜１８のいずれかに記載のプローブを含む、エンドセリン受容体Ｂ遺伝子の測定用キット。
【請求項２０】
フォワードプライマーが配列番号４に示す塩基配列を有するものであり、リバースプライマーが配列番号５に示す塩基配列を有するものであり、かつ、プローブが配列番号６に示す塩基配列を有するものである請求項１９記載のキット。
【請求項２１】
請求項１２又は１３に記載のフォワードプライマー、請求項１４又は１５に記載のリバースプライマー、及び請求項１６〜１８のいずれかに記載のプローブを用いて、被検試料中の測定すべきエンドセリン受容体Ｂ遺伝子を鋳型として増幅反応を行ない、得られる反応液から蛍光強度を測定することを特徴とするエンドセリン受容体Ｂ遺伝子の測定方法。
【請求項２２】
フォワードプライマーが配列番号４に示す塩基配列を有するものであり、リバースプライマーが配列番号５に示す塩基配列を有するものであり、かつ、プローブが配列番号６に示す塩基配列を有するものである請求項２１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるエンドセリン受容体Ａ及びＢ遺伝子の測定方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブに関する。
【０００２】
【従来の技術】
エンドセリン１  （ＥＴ１）、血管作動性ペプチド（ＶＩＣ）／エンドセリン−２（ＥＴ−２）  （以下「ＶＩＣ／ＥＴ−２」ということもある）、及び  エンドセリン−３は、血管収縮、平滑筋収縮、細胞増殖などの様々な生物活性を有するペプチドである（  非特許文献１、２参照）。エンドセリンペプチドの生物学的活性は、２つのエンドセリン受容体（エンドセリン  Ａ  （ＥＴＡ）  受容体及び  エンドセリン  Ｂ  （ＥＴＢ）  受容体）によって調節されている  （非特許文献３、４参照）。エンドセリン受容体  Ａ（以下、単に、エンドセリンＡあるいはＥＴＡということがある。）とエンドセリン受容体Ｂ（以下、単にエンドセリンＢあるいはＥＴＢということがある。）の遺伝子発現の定量は、ノザンブロット法で行われてきたが、手間がかかり、マウスとラットとヒトで検出プローブを使い分ける等煩雑で迅速な解析が困難であった。生理的や病的な状態におけるペプチドとその受容体の関連を解析することを困難にしている。この問題を克服するためには、エンドセリン  ＡとエンドセリンＢの遺伝子発現の定量法を開発し、ｍＲＮＡ  発現レベルにおける差異や生体内分布を分子生物学的アプローチにより解明することが効果的な手段である。
【０００３】
従来より、エンドセリン受容体  Ａ遺伝子（以下、単に、エンドセリンＡ遺伝子あるいはＥＴＡ遺伝子ということがある。）とエンドセリン受容体Ｂ遺伝子（以下、単にエンドセリンＢ遺伝子あるいはＥＴＢ遺伝子ということがある。）のｍＲＮＡ発現レベルにおける差異を解明するには、ノーザンブロット及びＲＮａｓｅプロテクションアッセイにより試験されている（非特許文献５，６，７参照）。
【０００４】
しかしながら、これらの技術は低用量のエンドセリン  ＡとエンドセリンＢのｍＲＮＡを検出できるほどの感度は有していないため、ｍＲＮＡの定量的測定が困難である。また、電気泳動、エチジウムブロミドでの染色、およびデンシトメトリーによるスキャニングを含む複数の手動処理を行う場合は、操作が煩雑であり多くの時間がかかる。
【非特許文献１】Ｄｏｈｅｒｔｙ，  Ａ．  Ｍ．，  １９９２，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３５，  １４９３−１５０８
【非特許文献２】Ｒｕｂａｎｙｉ，  Ｇ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ｐｏｌｏｋｏｆｆ，  Ｍ．  Ａ．，  １９９４，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｒｅｖ．  ４６，  ３２５−４１５
【非特許文献３】Ａｒａｉ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４８，  ７３０−７３２
【非特許文献４】Ｓａｋｕｒａｉ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４８，  ７３３−７３６
【非特許文献５】Ｓａｉｄａ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｍｉｔｓｕｉ，  Ｙ．，  １９９１，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １０８９，  ４０４−４０６
【非特許文献６】Ｆｉｒｔｈ，  Ｊ．  Ｄ．  ａｎｄ  Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ，  Ｐ．  Ｊ．，  １９９２，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９０，  １０２３−１０３１
【非特許文献７】ｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅ，  Ｓ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｊ．  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．  ４３，  ２０３−２０９
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、エンドセリン  ＡとエンドセリンＢを高精度にかつ簡便に定量することができる方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、特定のプライマー及びプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ法を採用することにより、非常に高感度に、かつ高い再現性をもってエンドセリン  ＡとエンドセリンＢ遺伝子を正確に定量することができることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）  エンドセリン  Ａ遺伝子のエキソン１、２、３、４、５、６及び７から選ばれるいずれかのエキソンの塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドを含む、エンドセリンＡ遺伝子の増幅用フォワードプライマー。
（２）  オリゴヌクレオチドが配列番号１に示される塩基配列を有するものである（１）記載のプライマー。
（３）  エンドセリン  Ａ遺伝子のエキソン２、３、４、５、６、７及び８から選ばれるいずれかのエキソンの塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドを含む、エンドセリンＡ遺伝子の増幅用リバースプライマー。
（４）  オリゴヌクレオチドが配列番号２に示される塩基配列を有するものである（３）記載のプライマー。
（５）  以下の（ａ）又は（ｂ）のオリゴヌクレオチドを含む、エンドセリンＡ遺伝子の測定用プローブ。
（ａ）  エンドセリンＡ遺伝子のエキソン１、２、３、４、５、６、７及び８の全部又は一部の領域の塩基配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド
（ｂ）  エンドセリンＡ遺伝子のエキソン１、２、３、４、５、６、７及び８の全部又は一部の領域の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド
【０００８】
（６）  プローブが、リポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素により標識されたものである（５）記載のプローブ。
（７）  オリゴヌクレオチドが、配列番号３に示される塩基配列を有するものである（５）又は（６）記載のプローブ。
（８）  （１）又は（２）に記載のフォワードプライマー、（３）又は（４）に記載のリバースプライマー、及び請求項（５）〜（７）のいずれかに記載のプローブを含む、エンドセリンＡ遺伝子の測定用キット。
（９）  フォワードプライマーが配列番号１に示す塩基配列を有するものであり、リバースプライマーが配列番号２に示す塩基配列を有するものであり、かつ、プローブが配列番号３に示す塩基配列を有するものである（８）記載のキット。
（１０）  （１）又は（２）に記載のフォワードプライマー、（３）又は（４）に記載のリバースプライマー、及び請求項（５）〜（７）のいずれかに記載のプローブを用いて、被検試料中の測定すべきエンドセリンＡ遺伝子を鋳型として増幅反応を行ない、得られる反応液から蛍光強度を測定することを特徴とするエンドセリンＡ遺伝子の測定方法。
【０００９】
（１１）  フォワードプライマーが配列番号１に示す塩基配列を有するものであり、リバースプライマーが配列番号２に示す塩基配列を有するものであり、かつ、プローブが配列番号３に示す塩基配列を有するものである（１０）記載の方法。
（１２）  エンドセリンＢ遺伝子のエキソン１、２、３、４、５及び６から選ばれるいずれかのエキソンの塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドを含む、エンドセリンＢ遺伝子の増幅用フォワードプライマー。
（１３）  オリゴヌクレオチドが配列番号４に示される塩基配列を有するものである（１２）記載のプライマー。
（１４）  エンドセリンＢ遺伝子のエキソン２、３、４、５、６及び７から選ばれるいずれかのエキソンの塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドを含む、エンドセリンＢ遺伝子の増幅用リバースプライマー。
（１５）  オリゴヌクレオチドが配列番号５に示される塩基配列を有するものである（１４）記載のプライマー。
【００１０】
（１６）  以下の（ａ）又は（ｂ）のオリゴヌクレオチドを含む、エンドセリンＢ遺伝子の測定用プローブ。
（ａ）  エンドセリンＢ遺伝子のエキソン１、２、３、４、５、６及び７の全部又は一部の領域の塩基配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド
（ｂ）  エンドセリンＢ遺伝子の１、２、３、４、５、６及び７の全部又は一部の領域の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド
（１７）  プローブが、リポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素により標識されたものである（１６）記載のプローブ。
（１８）  オリゴヌクレオチドが、配列番号６に示される塩基配列を有するものである（１６）又は（１７）記載のプローブ。
（１９）  （１２）又は（１３）に記載のフォワードプライマー、（１４）又は（１５）に記載のリバースプライマー、及び（１６）〜（１８）のいずれかに記載のプローブを含む、エンドセリンＢ遺伝子の測定用キット。
（２０）  フォワードプライマーが配列番号４に示す塩基配列を有するものであり、リバースプライマーが配列番号５に示す塩基配列を有するものであり、かつ、プローブが配列番号６に示す塩基配列を有するものである（１９）記載のキット。
【００１１】
（２１）  （１２）又は（１３）に記載のフォワードプライマー、（１４）又は（１５）に記載のリバースプライマー、及び（１６）〜（１８）のいずれかに記載のプローブを用いて、被検試料中の測定すべきエンドセリンＢ遺伝子を鋳型として増幅反応を行ない、得られる反応液から蛍光強度を測定することを特徴とするエンドセリンＢ遺伝子の測定方法。
（２２）  フォワードプライマーが配列番号４に示す塩基配列を有するものであり、リバースプライマーが配列番号５に示す塩基配列を有するものであり、かつ、プローブが配列番号６に示す塩基配列を有するものである（２１）記載の方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
最近、リポーター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素とが結合されたプローブの存在下にＰＣＲを行い、標的核酸の増幅に伴ってリアルタイムに増加する蛍光強度を測定することにより、検体中の標的核酸の測定を行なう技術が開発されている。この技術を「リアルタイムＰＣＲ法」といい、そのためのキットも市販されている。本発明者は、リアルタイムＰＣＲ法により、マウスエンドセリンＡ（ＥＴＡ）遺伝子及びエンドセリンＢ（ＥＴＢ）遺伝子の発現レベルを迅速かつ定量的に解析する方法を完成した。そして、マウスエンドセリンＡ（ＥＴＡ）ペプチドをコードするＤＮＡ及びエンドセリンＢ（ＥＴＢ）ペプチドをコードするＤＮＡに特異的なプライマー対及びプローブを設計した。本発明は、測定の感度及び／又は再現性を満足させるために設計された上記プライマー及びプローブを提供するものである。
【００１３】
１．プライマーの設計
（１）  ＥＴＡ遺伝子検出用プライマー
ＥＴＡ遺伝子検出用のプライマー、すなわちＰＣＲのフォワードプライマー（センスプライマーともいう）及びリバースプライマー（アンチセンスプライマーともいう）は、ＥＴＡ遺伝子のうちエキソン領域から設計及び合成することができる。ＥＴＡ遺伝子は、図１−１、図１−３に示すように、Ｅｘｏｎ  １〜８の領域から構成されており、上記２つのプライマーは、これらの各エキソン領域のうち、一方を上流側のエキソン領域の塩基配列に基づき設計し（フォワードプライマー）、他方をその下流側のエキソン領域の塩基配列に基づき設計する（リバースプライマー）。
【００１４】
例えば、ＥＴＡのプライマーをＥｘｏｎ  １〜３に基づき設計する際において、フォワードプライマーをＥｘｏｎ  １領域の配列に基づいて設計する場合は、リバースプライマーは、その下流側のＥｘｏｎ  ２又はＥｘｏｎ  ３領域の配列に基づいて設計する。リバースプライマーは、設計の基礎となる配列に相補的となるように設計する。また、このプライマーとしては、上記各エキソン領域の塩基配列の全て及びその一部の配列を用いることができるが、それぞれのエキソン領域からＰＣＲによる増幅効率を考慮してプライマーを設計するのが望ましい。
【００１５】
以上のようにして設計されたＥＴＡ遺伝子増幅用フォワードプライマーとして、例えばＥＴＡＦ０１プライマーが挙げられ、リバースプライマーとして例えばＥＴＡＲ０１プライマーが挙げられる。
フォワードプライマー
ＥＴＡＦ０１：  ５’−ｇｃｔｇｇｔｔｃｃｃｔｃｔｔｃａｃｔｔａａｇｃ−３’（配列番号１）
リバースプライマー
ＥＴＡＲ０１：  ５’−ｔｃａｔｇｇｔｔｇｃｃａｇｇｔｔａａｔｇｃ−３’（配列番号２）
本発明のプライマーは、通常の化学合成、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＤＮＡ自動合成装置を用いた化学合成により得ることができる（以下同様）。
【００１６】
（２）  エンドセリンＢ遺伝子増幅用プライマー
エンドセリンＢ遺伝子検出用のプライマー、すなわちＰＣＲのフォワードプライマー（センスプライマーともいう）及びリバースプライマー（アンチセンスプライマーともいう）は、エンドセリンＢ遺伝子のうち、図１−２、図１−３に示すエキソン領域（Ｅｘｏｎ  １〜７）の塩基配列に基づき上記ＥＴＡプライマーと同様にして、設計及び合成することができる。
【００１７】
例えば、エンドセリンＢのＥｘｏｎ  ２、３、４、５の領域からプライマーを設計する場合、任意に２つの領域を選択し、その選択されたエキソン領域の上流側のエキソン領域からフォワードプライマーを、下流側のエキソン領域からリバースプライマーを設計する。なお、リバースプライマーは、設計の基礎となる配列に相補的となるように設計する。また、このプライマーとしては、上記各エキソン領域の塩基配列の全て及びその一部の配列を用いることができるが、それぞれのエキソン領域からＰＣＲによる増幅効率を考慮してプライマーを設計するのが望ましい。
【００１８】
具体的には、エンドセリンＢ遺伝子増幅用プライマーとして、例えばＥＴＢＦ０１プライマーが挙げられ、リバースプライマーとして例えばＥＴＢＲ０１プライマーが挙げられる。
フォワードプライマー
ＥＴＢＦ０１：  ５’−ｔｇｔｇｃｔｃｔａａｇｔａｔｔｇａｃａｇａｔａｔｃｇａｇ  −３’（配列番号４）
リバースプライマー
ＥＴＢＲ０１：  ５’−ｇｇｃｔｇｔｃｔｔｇｔａａａａｃｔｇｃａｔｇａ  −３’（配列番号５）
【００１９】
（３）プライマーセット及びキット
上記（１）及び（２）の各プライマーは、それぞれＥＴＡ遺伝子、ＥＴＢ遺伝子を増幅するためのプライマーセットとして使用される。
【００２０】
上記プライマーセットは、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ等）、検出用プローブ、バッファー等とともに、それぞれの遺伝子増幅用キットとして使用されるものである。従って、ＥＴＡ遺伝子増幅用又はＥＴＢ遺伝子増幅用のプライマーセットを単独で使用しても、ＥＴＡ遺伝子増幅用及びＥＴＢ遺伝子増幅用のプライマーセットを組み合わせて使用してもよい。
【００２１】
２．検出用プローブ
本発明のプローブは、オリゴヌクレオチドに後述するリポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素を結合させて標識したものを使用することができる。
【００２２】
（１）  ＥＴＡ遺伝子検出用プローブ
ＥＴＡ遺伝子検出用プローブとしては、上記プライマーを使用してＰＣＲ反応により、増幅されるＥＴＡ遺伝子部分の各一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズ可能なものであれば特に制限されない。Ｅｘｏｎ  １〜８の塩基配列の全てあるいはその一部と相補的な配列を有するかあるいはストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なものであればよい。
このようなＥＴＡ遺伝子検出用プローブのオリゴヌクレオチド部分は、ＥＴＡのｍＲＮＡの配列に基づいて設計することができる。
【００２３】
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、ナトリウム濃度が１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭであり、温度が６０〜６８℃での条件をいう従って、本発明に使用されるプローブは、上記ストリンジェントな条件でＥＴＡ（好ましくはＥＴＡ）のｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる限り、１又は数個（例えば１〜１０個）の塩基に欠失、置換、付加等の変異があってもよい。また、プローブの配列が、ハイブリダイズすべき領域の塩基配列に対して１〜１０％程度のミスマッチがあっても（全体として９０％以上の相同性を有する）、上記ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる限り、上記プローブは本発明の範囲に含まれる。例えば、マウス又はラットと約９０％の相同性を有するヒト由来のＥＴＡ遺伝子とハイブリダイズするプローブも、本発明の範囲に含まれる。
プローブの特に好ましい例として、エンドセリンＡ遺伝子のＥｘｏｎ１〜３の全部又は一部の領域の塩基配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、特に、配列番号３に示される塩基配列を有するものを挙げることができる。
【００２４】
（２）  エンドセリンＢ遺伝子検出用プローブ
エンドセリンＢ遺伝子検出用プローブも上記プライマーを使用してＰＣＲ反応により、増幅されるＥＴＢ遺伝子部分の各一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズ可能なものであれば特に制限されない。Ｅｘｏｎ  １〜７の塩基配列の全てあるいはその一部と相補的な配列を有するかあるいはストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なものであればよい。
このようなエンドセリンＢ遺伝子検出用プローブのオリゴヌクレオチド部分は、エンドセリンＢのｍＲＮＡの配列に基づいて設計することができる。ストリンジェントな条件は前記と同様である。
エンドセリンＢ遺伝子検出用プローブの特に好ましい例として、配列番号６に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができる。
【００２５】
（３）  標識物質
前記リポーター蛍光色素は、リポーター蛍光色素が前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移によりその蛍光強度が抑制され、前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されていない状態では蛍光強度が抑制されないものである。リポーター蛍光色素としては、ＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレッセイン）などのフルオレッセイン系蛍光色素が好ましく、クエンチャー蛍光色素としては、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）などのローダミン系蛍光色素が好ましい。これらの蛍光色素は公知であり、容易に入手可能である。リポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素の結合位置は特に限定されないが、通常、プローブのオリゴヌクレオチド部の一端（好ましくは５’末端）にリポーター蛍光色素が、他端にクエンチャー蛍光色素を結合する。なお、オリゴヌクレオチドに蛍光色素を結合する方法は公知である（Ｎｏｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８４）  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３３８７−３４０３；  Ｉｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１２：１２５３−１２５４）。
【００２６】
３．増幅反応
本発明の方法では、上記本発明のフォワードプライマーと、上記本発明のリバースプライマーと、上記本発明のプローブとを用い、被検試料中の測定すべきＥＴＢ遺伝子又はＥＴＡ遺伝子を鋳型として増幅反応を行なう。増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）により行うことができるが、リアルタイムＰＣＲ法を採用することが好ましい。リアルタイムＰＣＲは、鋳型、プライマー、及び標識されたプローブの混合反応系（反応チューブ）において、増幅反応と蛍光強度の測定とを同時に実施するものであり、テンプレートにハイブリダイズした特定のプローブから放出された蛍光レポーター色素をリアルタイムで検出し、検出器に連結したコンピューターでＰＣＲ産物を自動的に分析する方法である。このリアルタイム検出ＰＣＲ法自体は公知であり、そのための装置及びキットも市販されているので、本発明においては、このような市販の装置及びキットを用いて行なうことができる（例えばＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ  キット又はＴａｑＭａｎ  ＥＺ  ＲＴ−ＰＣＲ  キット等）。
【００２７】
反応は、被検ＥＴＢ遺伝子及びＥＴＡ遺伝子、上記本発明のフォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブ並びに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを含む溶液を調製して行なう。ｄＴＴＰに代えて、ｄＵＴＰを用い、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）を加えることが、事前に行われたＰＣＲの産物からの混入ＤＮＡを分解することができる点で好ましい。反応の具体的な条件は下記実施例に詳述されている。なお、被検試料としては、ＥＴＢ遺伝子又はＥＴＡ遺伝子を含有する可能性のあるいずれのものであってもよく、例えば血清等が挙げられる。ＥＴＢ遺伝子及びＥＴＡ遺伝子の調製は、従来のゲノムＤＮＡの調製の場合と同様に行なうことができ、例えば塩化セシウム密度勾配超遠心法、ＳＤＳ溶解法又はクロロホルム抽出法等により行うことができる。下記実施例にも具体的に記載されている。
【００２８】
増幅反応に使用されるＤＮＡポリメラーゼとしてはＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）、ＡｍｐｌｉＴａｑ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）  、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）等が挙げられる。
増幅の条件は、好ましくは、９５℃で１０分反応させた後、９５℃で２０秒及び６２℃２分の反応を１サイクルとしてこれを５０サイクル行う。
【００２９】
４．検出
増幅ＤＮＡは、上記プローブと相補的な領域を含んでいるので、プローブは一本鎖状態の増幅ＤＮＡにハイブリダイズする。プローブが完全にハイブリダイズした状態で、プローブがハイブリダイズしている一本鎖ＤＮＡを鋳型とする伸長が起きると、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によりプローブが５’末端側から加水分解される。この分解の結果、プローブのオリゴヌクレオチド部分に結合されているレポーター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素とがバラバラになり、クエンチャー蛍光色素に起因する蛍光共鳴エネルギー転移により抑制されていたレポーター蛍光色素からの蛍光強度が増加する。一方、被検試料中にＥＴＢ又はＥＴＡ  ＤＮＡが存在しない場合には、ＤＮＡの増幅が起こらないので、プローブはＤＮＡにハイブリダイズせず、従ってＤＮＡポリメラーゼによって加水分解されることもない。このため、レポーター蛍光色素からの蛍光は、クエンチャー蛍光色素により抑制されたままであり、蛍光強度は増加しない。従って、蛍光強度を測定することにより、被検試料中にＥＴＢ及びＥＴＡ  ＤＮＡを検出することが可能である。なお、本発明において、「測定」とは、目的ＤＮＡの定性的検出及び定量のいずれをも意味する。
【００３０】
本発明の方法においてリアルタイムＰＣＲ法を採用する場合は、蛍光強度を測定しながらＰＣＲ反応を行なう。測定される蛍光強度は、あるサイクル数（＝限界周期）を過ぎると急激に増加する。そして、被検試料中のＥＴＢ及びＥＴＡ  ＤＮＡの量が多いほど、少ないサイクル数で蛍光強度が急に増加する。従って、何サイクルを過ぎた時に蛍光強度の急激な増加が始まるかを調べることにより、被検試料中のＥＴＢ及びＥＴＡ  ＤＮＡの測定を行なうことができる。
【００３１】
具体的には、例えば、ＥＴＢ及びＥＴＡ  ＤＮＡを含まないネガティブコントロールにおける各サイクル（例えば３〜１５サイクル）の蛍光強度の標準偏差の１０倍を閾値として設定し、蛍光強度がこの閾値を超えるサイクル数を調べることにより、正確に被検試料中のＥＴＢびＥＴＡ  ＤＮＡを測定することができる。すなわち、被検試料中のＥＴＢ及びＥＴＡ  ＤＮＡ数の常用対数を横軸に、上記閾値を超えた時のサイクル数を縦軸にとると、測定結果はほぼ完全に直線上にのるので、検量線を作成しておけば、何サイクルで閾値を超えるかを調べることにより被検試料中のＥＴＢ及びＥＴＡ  ＤＮＡの量を測定することができる。従って、本発明の方法によれば、従来のＰＣＲのように、ＰＣＲ後に電気泳動を行なって増幅を調べる操作が不要であり、非常に簡便である。
【００３２】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は下記実施例に限定されるものではない。    〔実施例１〕
（１）  全ＲＮＡの調製
成体（１０週齢）の雄及び雌のＳｌｃ：ＩＣＲマウス（日本クレア）に麻酔をかけ、脳（大脳及び小脳）、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胃、小腸、子宮、卵巣及び精巣を摘出した。上記組織を氷冷ＰＢＳ（−）で十分洗浄し、重量を測定した後、１００ｍｇの各組織を速やかにホモゲナイズした。全ＲＮＡは、Ｉｓｏｇｅｎ  溶液（ニッポンジーン）を用い、使用説明書に従って上記各組織のホモジネートから調製した。
【００３３】
（２）  標準ｃＤＮＡのクローニング
ＥＴＡ及びＥＴＢのマウスｃＤＮＡは、マウスｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングすることによりクローニングした。
ラットｃＤＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲによってクローニングした。
【００３４】
得られたｃＤＮＡを制限酵素で処理した後、ＰＣＲを行いＤＮＡを増幅した。得られた制限酵素断片及びＰＣＲ産物は、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋  クローニングキット  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて使用説明書に従ってクローニングし、ダイデオキシターミネーターサイクルシークエンシングキット及びモデル３７３ＡＤＮＡシークエンサー（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により配列決定を行った。プラスミドに挿入されたｃＤＮＡは、ＥＴＡ遺伝子及びＥＴＢ遺伝子の発現レベルを測定するための定量的標準物質として使用した。
【００３５】
（３）  プライマーの合成及びプローブの調製
以下に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを化学合成し、これらの混合物をそれぞれフォワードプライマー及びリバースプライマーとした。
また、プローブ用オリゴヌクレオチドとして、下記に示す配列のものを化学合成した。これらのオリゴＤＮＡの５’末端にＦＡＭを、３’末端にＴＡＭＲＡを結合し、プローブとした。
【００３６】
マウスＥＴＡ、ＥＴＢ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブを以下に示す。ＧＡＰＤＨ遺伝子は、定常的に発現している遺伝子であり、陽性コントロールとして使用することができる。
ＥＴＡ遺伝子増幅用プライマー及びプローブ：
センス：            ５’−  ｇｃｔｇｇｔｔｃｃｃｔｃｔｔｃａｃｔｔａａｇｃ  −３’（配列番号１）
アンチセンス：      ５’−  ｔｃａｔｇｇｔｔｇｃｃａｇｇｔｔａａｔｇｃ  −３’（配列番号２）
プローブ：        ＦＡＭ−ａａｃｃｇｇｔｇｔｇａａｃｔｇｃｔｃａｇｃｔｔｃｔｔｇ  −ＴＡＭＲＡ（配列番号３）
ＥＴＢ遺伝子増幅用：
センス：            ５’−  ｔｇｔｇｃｔｃｔａａｇｔａｔｔｇａｃａｇａｔａｔｃｇａｇ  −３’（配列番号４）
アンチセンス：      ５’−  ｇｇｃｔｇｔｃｔｔｇｔａａａａｃｔｇｃａｔｇａ  −３’（配列番号５）
プローブ：          ＦＡＭ−ａｇｃｃａｇａａｃｃａｃａｇａｇａｃｃａｃｃｃａａａ−ＴＡＭＲＡ（配列番号６）
ＧＡＰＤＨ遺伝子増幅用：
センス：            ５’−ｃｔｔｃａｃｃａｃｃａｔｇｃａｇａａｇｇｃ−３’（配列番号７）
アンチセンス：      ５’−ｇｇｃａｔｇｇａｃｔｇｔｇｇｔｃａｔｇａｇ−３’（配列番号８）
プローブ：        ＦＡＭ−ｃｃｔｇｇｃｃａａｇｇｔｃａｔｃｃａｔｇａｃａａｃｔｔｔ−ＴＡＭＲＡ（配列番号９）
なお、上記プライマーを用いたときの増幅断片のサイズは、ＥＴＡについては１２９ｂｐ、ＥＴＢについては２４０ｂｐ、ＧＡＰＤＨについては２３８ｂｐである（表１）。
【表１】
2004329062.tif 000002
特異的プライマー、プローブ、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡのＧｅｎＢａｎｋ登録番号
【００３７】
（４）  標準濃度ＤＮＡの調製
ＥＴＢ又はＥＴＡ遺伝子配列を含むプラスミドを作製してＤＮＡを抽出し、分子量よりコピー数を算出し、１０８から１０１コピー／μｌまで１０倍希釈系列を作製した。
定量化に適した希釈範囲を調べるため、またこのシステムのアッセイ限界を測定するため、本発明者は、予備実験として、連続的に１０倍に希釈したクローンの標準テンプレートを増幅し、閾値周期（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅｓ）に対して標準テンプレートの開始量（ｓｔａｒｔｉｎｇ  ａｍｏｕｎｔ）をプロットすることにより標準曲線を作成した。標準曲線は、開始時の分子（ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の１００，０００倍の範囲にわたり、良好な定量性を示した。
【００３８】
（５）  反応液の調製
本実施例では、リアルタイムＰＣＲのためにＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ  キットを用いて遺伝子の定量を行った。上記プライマー、プローブ及びＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ  Ｃｏｒｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、反応チューブ１本あたり、下記に示す反応液を調製した。
１Ｘ  バッファー
３．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、
２００μＭ  ｄＡＴＰ，  ｄＣＴＰ，  ｄＧＴＰ、
４００μＭ  ｄＵＴＰ、
０．０２５Ｕ／μｌ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ポリメラーゼ、
１００ｎＭ  ＴａｑＭａｎ  プローブ、
２００ｎＭ  各プライマー
【００３９】
（６）  リアルタイム検出ＰＣＲ
チューブ１本あたり、上記反応液を分注し、標準濃度ＤＮＡを加え、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にセットし、以下の条件でＰＣＲを行なった。ＰＣＲの各サイクル毎に蛍光強度を測定した。
ＵＮＧの失活、ＤＮＡポリメラーゼの活性化  ９５℃、１０分間
ＰＣＲ  ９５℃、２０秒間
６２℃、２分間
このＰＣＲサイクルは５０回繰り返した。
【００４０】
（６）  結果
サンプルの閾値周期を標準テンプレートのものと比較した標準曲線を用いて、サンプルのｃＤＮＡの定量化を行った。なお、ｃＤＮＡの定量値をｍＲＮＡの発現量の指標とした。ＥＴＡ  およびＥＴＢの遺伝子発現レベルを、前記のＧＡＰＤＨによって標準化された遺伝子発現率で表した。
【００４１】
本発明の方法の再現性を測定するために、遺伝子発現率のアッセイ内（Ｉｎｔｒａ）及びアッセイ間（ｉｎｔｅｒ）の変動係数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ：ＣＶ）を計算した。アッセイ内変動計数は、３つの異なるサンプルを８回アッセイした後に計算した。また、アッセイ間変動計数は、３つの異なるサンプルについてそれぞれ２週間間隔で８回のアッセイを行った後に算出した。
その結果、アッセイ内ＣＶは１６．２  ％〜５５．０  ％の範囲であり、アッセイ間ＣＶは２４．２％  〜５６．５  ％の範囲であった（表２）。
【００４２】
【表２】
2004329062.tif 000003
【００４３】
これらの結果は、２者のサンプルの発現量を比較した場合、１．５倍をやや超える増加が認められた場合に有意な変化として検出できることを示している。すなわち、同一のサンプルの発現量を測定した場合、１．５倍以内であれば再現性があるといえる。
【００４４】
このシステムを用いてマウス組織におけるＥＴＡおよび  ＥＴＢの遺伝子発現レベルを測定した（図２）。図２において、横軸（組織名）に示す記号の意味は以下の通りである（全てマウス由来）。
Ｃｒ：大脳、Ｃｌ：小脳、Ｈｅ：心臓、Ｌｕ：肺、Ｋｉ：腎臓、Ｓｐ：脾臓、Ｓｔ：胃、Ｉｎ：小腸、
Ｕｔ：子宮、Ｏｖ：卵巣、Ｔｅ：精巣
図２は、４つの独立した実験値の平均±ＳＤとして示されている。
ＥＴＢ遺伝子発現は、すべての組織において比較的高いレベルでみられたが、高レベルのＥＴＡ遺伝子発現は、主に肺、心臓、大腸、精巣、子宮、および卵巣において観察された。
【００４５】
ところで、このアッセイシステムによるｍＲＮＡの定量化に関する最も大きな問題は、抽出中のサンプルテンプレートにゲノムＤＮＡが混入することである。ｍＲＮＡもゲノムＤＮＡもテンプレートになりうるため、ｍＲＮＡだけではなく、ゲノムＤＮＡ由来の蛍光シグナルも検出され、その結果、正当なｍＲＮＡレベルが過大に測定されるおそれがある。そこで、定量化後、電気泳動によってＰＣＲ産物がｍＲＮＡ由来か、あるいは混入したゲノムＤＮＡ由来かを特定できるように、ゲノムＤＮＡのイントロン領域の配列が含まれるようにプライマーの配列を設計し、ＰＣＲを行った。
ＰＣＲ後、増幅産物をアガロースゲル又はアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、エチジウムブロマイドにより可視化した。
【００４６】
結果を図３に示す。ゲノムＤＮＡが混入したときに予測される増幅断片のサイズは、３．７  Ｋｂｐ  （ＥＴＡ）、４．９  Ｋｂｐ  （ＥＴＢ）  及び６１３  ｂｐ  （ＧＡＰＤＨ）であり、いずれも本来増幅されるべき断片のサイズよりも大きい。しかしながら、ゲノムＤＮＡ由来のサイズの大きい増幅断片は、どのサンプルにおいても検出されず、本発明の方法により目的とするＤＮＡのみを増幅できることが分かった（図３）。
【００４７】
以上のことから、本発明の方法により、上記組織におけるＥＴＢ及びＥＴＡの  遺伝子発現（ｍＲＮＡ）を迅速かつ高感度に定量化することができた。なお、高感度に遺伝子を検出することができるのは、ＰＣＲ産物が集積したためではなく、ＰＣＲ反応のごく初期の段階でレポーターから放出された特定のシグナルに基づいているからである。よって、従来の方法では発現レベルが低すぎて検出できない腎臓及び肝臓においても、ＥＴＢ  ｍＲＮＡ  レベルを定量することができた。
【００４８】
【発明の効果】
本発明により、ＥＴＢ遺伝子及びＥＴＡ遺伝子を高感度で正確に、かつ、簡便に測定する方法が提供される。組織におけるＥＴＡ及びＥＴＢ  ｍＲＮＡが希少であることを考慮すると、迅速で感度が高く、正確でかつ再現性が高い本発明の方法（多くのサンプルを一度に分析することを可能にしている）は、定量的遺伝子発現の分析に有用である。
【００４９】
【配列表】
2004329062.tif 000004
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【００５０】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号９：合成ＤＮＡ
【図面の簡単な説明】
【図１−１】ヒトのＥＴＡ受容体の遺伝子構造を示す図である。エキソンに相当する所は、大文字の塩基配列で示した。
【図１−２】ヒトのＥＴＢ受容体の遺伝子構造を示す図である。エキソンに相当する所は、大文字の塩基配列で示した。
【図１−３】ＥＴＡとＥＴＢの遺伝子構造の比較を示す図である。
【図２】ＥＴＡ遺伝子及びＥＴＢ遺伝子の発現レベルを測定した結果を示す図である。（Ａ）マウスの各種臓器におけるＥＴＡとＥＴＢの遺伝子発現量の比較。（Ｂ）ＥＴＢとＥＴＡの発現量の比較。
【図３】ＥＴＡ遺伝子及びＥＴＢ遺伝子の発現レベルを測定した結果を示す図である。各組織抽出サンプル中にゲノミックＤＮＡ由来のバンドがないことを示す電気泳動像である。楔型矢印はｍＲＮＡ由来のバンドを示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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