(57)【要約】【課題】検体内に取り込まれたヘモフィリス  インフルエンザ菌の存在を特異的かつ迅速に検出する手段を提供する。【解決手段】ヘモフィリス  インフルエンザ菌が保有するＤＮＡの切断片、特に、３５０〜６００の塩基長を有する１種以上の核酸断片を含み、かつ同菌が保有するＤＮＡに対して特異的な交差反応性を示す検出用プローブ。【選択図】                なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘモフィリス  インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）菌の検出用プローブであって、当該プローブが、ヘモフィリス  インフルエンザ菌が保有するＤＮＡに対して特異的な交差反応性を示し、かつ以下の塩基配列、すなわち、
（ａ）  配列番号：１乃至４のいずれかに記載の塩基配列；
（ｂ）  塩基配列（ａ）と７０％以上の相同性を有する塩基配列；または、
（ｃ）  塩基配列（ａ）および／または（ｂ）に対して相補的な塩基配列、を含む、
ことを特徴とするヘモフィリス  インフルエンザ菌の検出用プローブ。
【請求項２】
前記塩基配列が、３５０〜６００塩基長を有する１種以上のの核酸断片である請求項１に記載の検出用プローブ。
【請求項３】
前記ＤＮＡが、染色体ＤＮＡである請求項１または２に記載の検出用プローブ。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかに記載の検出用プローブを用いる、ことを特徴とするヘモフィリス  インフルエンザ菌の検出方法。
【請求項５】
前記検出方法が、以下の工程、すなわち；
（ａ）  臨床検体より取得した生体由来の食細胞を支持担体上に固定し、
（ｂ）  固定した食細胞の細胞膜の透過性を亢進する化学処理を行い、
（ｃ）  食細胞に含まれる感染症原因菌の染色体ＤＮＡを得、
（ｄ）  ストリンジェントな条件下で、当該ＤＮＡと請求項１乃至３のいずれかに記載の検出用プローブとのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、および
（ｅ）  ハイブリダイゼーションシグナルを検出する、
工程を含む請求項４に記載の検出方法。
【請求項６】
前記臨床検体が、血液、組織液、リンパ液、脳脊髄液、膿、粘液、鼻水、痰、尿、腹水、透析排液、組織洗浄液、皮膚、肺、腎、粘膜、およびこれらの組み合わせからなるグループから選択される請求項５に記載の検出方法。
【請求項７】
請求項１乃至３のいずれかに記載の検出用プローブを用いることを特徴とするヘモフィリス  インフルエンザ菌の同定方法。
【請求項８】
前記同定方法が、以下の工程、すなわち；
（ａ）  臨床検体より取得した生体由来の食細胞を支持担体上に固定し、
（ｂ）  固定した食細胞の細胞膜の透過性を亢進する化学処理を行い、
（ｃ）  食細胞に含まれる感染症原因菌の染色体ＤＮＡを得、
（ｄ）  当該ＤＮＡをアルカリ変性および中和処理し、および
（ｅ）  ストリンジェントな条件下で、当該ＤＮＡと請求項１乃至３のいずれかに記載の検出用プローブとのドットブロットハイブリダイゼーションを行う、
工程を含む請求項７に記載の同定方法。
【請求項９】
前記臨床検体が、血液、組織液、リンパ液、脳脊髄液、膿、粘液、鼻水、痰、尿、腹水、透析排液、組織洗浄液、皮膚、肺、腎、粘膜、およびこれらの組み合わせからなるグループから選択される請求項８に記載の同定方法。
【請求項１０】
ヘモフィリス  インフルエンザ菌の同定方法であって、以下の工程、すなわち；
（ａ）  菌種不明の感染症原因菌の染色体ＤＮＡを得、
（ｂ）  請求項１乃至３のいずれかに記載の検出用プローブを構成する塩基配列の少なくとも一部からなるプライマーを調製し、
（ｃ）  当該ＤＮＡと当該プライマーとの共存系でのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって当該ＤＮＡを増幅し、および
（ｄ）  増幅されたＤＮＡを検出する、
工程を含む、ことを特徴とするヘモフィリス  インフルエンザ菌の同定方法。
【請求項１１】
食細胞に貪食されたヘモフィリス  インフルエンザ菌の遺伝子を観察する方法であって、以下の工程、すなわち；
（ａ）  臨床検体より取得した生体由来の食細胞を支持体上に固定し、
（ｂ）  固定した食細胞の細胞膜の透過性を亢進する化学処理を行い、
（ｃ）  食細胞に含まれる感染症原因菌の染色体ＤＮＡを得、
（ｄ）  ストリンジェントな条件下で、当該ＤＮＡと請求項１乃至３のいずれかに記載の検出用プローブとのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、
（ｅ）  ハイブリダイゼーションシグナルを検出し、
（ｆ）  工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返し、および
（ｇ）  ハイブリダイゼーションシグナルの経時的変化をモニターする、
工程を含む、ことを特徴とする食細胞に貪食されたヘモフィリス  インフルエンザ菌の遺伝子を観察する方法。
【請求項１２】
請求項１乃至３のいずれかに記載の検出用プローブおよびＤＮＡ露出処理剤を含む、ことを特徴とするヘモフィリス  インフルエンザ菌の検出キット。
【請求項１３】
前記ＤＮＡ露出処理剤が、リゾスタフィン、リゾチーム、Ｎ−アセチルムラミダーゼ、ザイモラーゼおよびこれらの組み合わせからなるグループから選択される酵素を含む請求項１２に記載の検出キット。
【請求項１４】
前記検出用プローブが、界面活性剤と共存している請求項１２または１３に記載の検出キット。
【請求項１５】
前記検出キットが、血液分離試薬、酵素前処理試薬、酵素試薬、アセチル化試薬、ブロッキング試薬、標識抗体、標識抗体希釈液、発色前処理液、発色試薬、対比染色液、ＰＢＳ原液、ハイブリダイゼーション原液、標識抗体洗浄液、発色試薬洗浄液、プローブ希釈液、バッファーＡおよびこれらの組み合わせからなるグループから選択される試薬をさらに含む請求項１２乃至１４のいずれかに記載の検出キット。
【請求項１６】
前記検出キットが、ＡＰＳコートスライドグラス、低速遠心機、恒温機、血球計算盤、振とう機、湿潤箱、恒温槽、光学顕微鏡、可変式ピペット、採血管、チップ、ピペット、染色ビン、メスシリンダー、注射筒、シリンジトップフィルターおよびこれらの組み合わせからなるグループから選択される器具をさらに含む請求項１２乃至１５のいずれかに記載の検出キット。
【請求項１７】
チップ基板および当該基板の表面にその一端が固定されてなるＤＮＡ断片を有するＤＮＡチップであって、当該断片が請求項１乃至３のいずれかに記載の検出用プローブまたはその断片である、ことを特徴とするＤＮＡチップ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一般に、ヘモフィリス  インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）菌の検出技術の改良に関し、詳細には、ヘモフィリス  インフルエンザ菌の検出および同定のための新規のプローブ、これらプローブを利用したヘモフィリス  インフルエンザ菌の検出および同定方法と、その関連技術に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
ヘモフィリス  インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）菌は、グラム陰性桿菌であり、上部気道の上皮細胞内へ侵入した状態で常在している。  ヘモフィリス  インフルエンザ菌は、莢膜を有する菌株と有さない菌株に大別される。  この内、莢膜を有する菌株は、莢膜多糖体の血清型によってタイプａ〜タイプｆの６種類に分類されている。  一方で、莢膜を有さない菌株は、型別不能型として分類されている。  莢膜を有する菌株は、臨床検体より分離される頻度は低いものの、一般的に、病原性は強く、その中でも血清型タイプｂは最も病原性の強い菌として知られている。  特に、タイプｂは、主として小児や乳幼児に、急性化膿性髄膜炎、急性喉頭蓋炎、肺炎、蜂窩織炎、敗血症、関節炎などの重篤な病態を引き起こすため、小児科医からはヘモフィリス  インフルエンザ菌を迅速かつ正確に診断および検出する方法が望まれていた。  また、小児科医不足の問題から、小児科を専門としない医師も、ヘモフィリス  インフルエンザ菌を容易に診断および検出できる方法が切望されている。
【０００３】
我が国の成人の急性気管支炎、肺炎、咽頭炎、慢性気管支炎、慢性呼吸器感染症、中耳炎、副鼻腔炎の症例では、型別不能型のヘモフィリス  インフルエンザ菌が起炎菌となることが多い。  特に、慢性気管支炎を伴う気管支拡張症の患者および高齢者などに重篤な肺炎を引き起こすことが多く、その早期診断方法の確立が求められている。  しかしながら、臨床症状は、発熱、悪寒、呼吸困難、咳、膿性痰、胸痛など、他の細菌性肺炎と同様であるため、臨床症状のみでは確定診断ができない。  また、ヘモフィリス  インフルエンザ菌は咽頭の常在菌であるため、ヘモフィリス  インフルエンザ菌が培養によって上気道から検出されても、必ずしも異常所見に至らないという問題がある。
【０００４】
現在、ヘモフィリス  インフルエンザ菌による呼吸器感染症の診断は、臨床症状、血液検査（好中球増加に基づく白血球増加、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）陽性、赤沈亢進など）、画像診断、喀痰のグラム染色および培養結果などによって総合的に行われている。
【０００５】
また、ヘモフィリス  インフルエンザ菌による髄膜炎の診断は、髄液圧亢進、髄液中の細胞数増加、蛋白陽性、糖低値など化膿性髄膜炎の臨床症状、髄液沈渣のグラム染色や培養結果などに基づいて行われている。  さらに、喉頭蓋炎にあっては、臨床症状、喉頭鏡所見、気管内挿管により得た喉頭蓋穿刺物のグラム染色および培養結果によって診断が行われている。  また、敗血症にあっては、血液培養によって、そして、関節炎にあっては、関節穿刺液の染色と培養により診断が行われている。
【０００６】
このように、ヘモフィリス  インフルエンザ菌が関与していても病態によって診断方法が異なり、また、多種多様な検査が必要となるため迅速な確定診断ができず、診断にも多額の費用を要するなどの問題があった。  さらに、菌の培養に長時間を有する上に、薬剤感受性成績の結果を得るまでには、さらに３〜４日の培養が必要であることも、迅速な診断を難しくしている。
【０００７】
感染症の治療は、理論的には第一に起因菌を確定し、第二に起因菌に応じた的確な治療を行うことが重要である。  それを達成するためには、事前に細菌検査などを行う必要があるが、臨床においては急を要することもあり、現実的にはこれら処置が殆ど実施されていないのが現状である。  すなわち、多くの医師は独自の治療経験に基づいて診断や起炎菌の予測を行い、予測された起因菌に対する抗菌薬を投与し治療経過を観察した後に治療を終了するか、起因菌同定の検査結果を待ってから抗菌薬を変更するなどの処置を行っている。  このような現在の治療方針によれば、起因菌に対して効力を示さない抗菌薬が投与される可能性が多分にあり、適切な処置を施せずに患者を危険な状態に放置する可能性も否めず、また、抗菌薬の無駄使いによる医療費の増加が懸念されている。  加えて、感染症を疑われた時点で大量に抗生物質を投与されている場合には、たとえ検体中に起因菌が含まれていても、細菌の増菌や増殖が抑えられている場合があり、実際のところ、これらの検体から起因菌を培養できる可能性は極めて低いものとなっている。
【０００８】
従来のインフルエンザ菌を含めた細菌の検出方法として、アンピシリン耐性インフルエンザ菌を用いた検出法がある（例えば、特許文献１を参照）が、具体的な臨床検体の扱い方が欠けており、また、検体内に混在する他の菌との交叉反応についての証明には至っていない。
【０００９】
また、ヘモフィリス  インフルエンザ菌の外膜タンパク質に対するポリクローナル抗体の調製方法と当該抗体を用いた診断方法も提案されている（例えば、特許文献２を参照）。
【００１０】
さらに、リボソームタンパク質に対する抗体を用いて各種微生物を検出する方法なども考案されている（例えば、特許文献３を参照）が、このような免疫学的検査法による測定結果は、培養法による検査結果と一致しないことが多く、偽陽性や偽陰性の結果を示す場合がよくあり、また、その手技が煩雑であるなどの問題点が残されている。
【００１１】
公知のインフルエンザ菌に関与する検出キットとしては、ＲａｐＩＤ  ＮＨキット（アムコ社）、Ｓｌｉｄｅｘ  ｍｅｎｉｎｇｉ  ｋｉｔ  （ｂｉｏＭｅｒｉｅｕ社）およびインフルエンザ菌遺伝子検出試薬（湧永製薬）などが市販されている。  しかし、これらはヘモフィリスインフルエンザ菌に特異的でないという問題があり、臨床検体を使用した場合には検出率が低下するという問題がある。
【００１２】
このような諸問題を解決するために、本出願人は、貪食細胞に貪食された外来微生物の検出および／または同定のための方法を発明した（特許文献４を参照）。  すなわち、この方法によれば、貪食細胞中に存在する外来微生物由来の遺伝子は、これら遺伝子に対して特異的にハイブリダイゼーション可能なプローブを用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって検出される。  具体的には、この方法は、生体由来の臨床検体より取得した食細胞を固定し、これら食細胞に対して細胞膜の透過性を亢進させるための処理を施し、食細胞内に取り込まれた感染症原因菌のＤＮＡを露出し、ストリンジェントな条件下で感染症原因菌のＤＮＡにハイブリダイゼーション可能な検出用ＤＮＡプローブを用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、および、ハイブリダイズシグナルの出現の有無によって感染症原因菌を検出および／または同定する、との一連の工程を含む。
【００１３】
敗血症が疑われた患者の血液を、この方法に従って検査したところ、血液培養法と比較して約４倍の感度で菌を検出し、さらに２４時間以内に判定を終えることができたことから、この方法は感染症分野において脚光を浴びている。
【００１４】
【特許文献１】
特開２０００−３４２２６８号
【特許文献２】
特公平０６−６４０６５号
【特許文献３】
国際公開パンフレット第  ＷＯ００／０６６０３  号
【特許文献４】
特公平０７−４０号
【００１５】
このように、本願発明は、ヘモフィリス  インフルエンザ菌の検出に有用な新規プローブ、特に、ハイブリダイゼーション用プローブの提供に加え、これらプローブを利用することで、従前の検出方法よりも検出効率ならびに検出感度に優れた検出方法や検出手段の実現をも、その目的としている。
【００１６】
【課題を解決するための手投】
本発明は、従来技術で認識されていた上掲の不都合に鑑みて発明されたものであって、その要旨とするところは、ヘモフィリス  インフルエンザ菌に対して特異的な交差反応を示し、かつ（ａ）  配列番号：１乃至４のいずれかに記載の塩基配列；（ｂ）  塩基配列（ａ）と７０％以上の相同性（ホモロジー）を有する塩基配列；または、（ｃ）  塩基配列（ａ）および／または（ｂ）に対して相補的な塩基配列を含む、ヘモフィリス  インフルエンザ菌の検出用プローブにある。
【００１７】
また、本発明によれば、前述した検出用プローブを用いたヘモフィリス  インフルエンザ菌の検出方法も提供される。  この検出方法は、（ａ）  臨床検体より取得した生体由来の食細胞を支持体上に固定し、（ｂ）  固定した食細胞の細胞膜の透過性を亢進する化学処理を行い、（ｃ）  食細胞に含まれる感染症原因菌の染色体ＤＮＡを得、（ｄ）  ストリンジェントな条件下で、得られた染色体ＤＮＡと本発明の検出用プローブとの間でｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、および（ｅ）  ハイブリダイゼーションシグナルを検出する、との工程を含む。
【００１８】
さらに、本発明の他の態様によれば、ヘモフィリス  インフルエンザ菌の同定方法が提供される。  この同定方法は、（１）  菌種不明の感染症原因菌の染色体ＤＮＡを得、（２）  本発明の検出用プローブを構成する塩基配列の少なくとも一部からなるプライマーを調製し、（３）得られた染色体ＤＮＡと当該プライマーとの共存系でのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって当該ＤＮＡを増幅し、および（４）  増幅されたＤＮＡを検出する、との工程を含む。
【００１９】
そして、本発明のさらに他の態様によれば、食細胞に貪食された外来微生物、とりわけ、ヘモフィリス  インフルエンザ菌の遺伝子を観察するための方法が提供される。  この観察方法は、（ｉ）  臨床検体より取得した生体由来の食細胞を支持体上に固定し、（ｉｉ）  固定した食細胞の細胞膜の透過性を亢進する化学処理を行い、（ｉｉｉ）  食細胞に含まれる感染症原因菌の染色体ＤＮＡを得、（ｉｖ）  ストリンジェントな条件下で、得られた染色体ＤＮＡと本発明の検出用プローブとのｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、（ｖ）  ハイブリダイゼーションシグナルを検出し、（ｖｉ）  工程（ｉ）〜（ｖ）を繰り返し、および（ｖｉｉ）  ハイブリダイゼーションシグナルの経時的変化をモニターする、との工程を含む。
【００２０】
加えて、本発明のさらに他の態様によれば、本発明の検出用プローブ、食細胞含有検体調製器具、支持担体、細胞膜用化学処理剤、ＤＮＡ露出処理剤、ハイブリダイゼーション用具およびハイブリダイゼーションシグナル検出器具を含むヘモフィリス  インフルエンザ菌の検出キットが提供される。
【００２１】
そして、本発明のさらに別の態様によれば、チップ基板および当該基板の表面にその一端が固定されてなる本発明の検出用プローブまたはその断片とを具備したＤＮＡチップが提供される。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下に、本願発明を詳細に説明する。
【００２３】
定  義
まず、本明細書で使用する「臨床検体」の語は、生体由来の食細胞が含まれる臨床検体を総称するものであり、例えば、血液、組織液、リンパ液、脳脊髄液、膿、粘液、鼻水、痰などの体液が挙げられる。  また、糖尿病、腎障害、肝障害などの病態によっては、尿、腹水、透析排液などの他に、鼻腔、気管支、皮膚、各種臓器、骨などを洗浄した後の洗浄液にも生体由来の食細胞が含有されるため、これらも臨床検体の範疇に包含される。  加えて、皮膚、肺、腎、粘膜などの組織も本発明の臨床検体として用いることができる。  これはすなわち、食細胞の一つであるマクロファージには、単球、肺胞マクロファージ、腹腔マクロファージ、固定マクロファージ、遊離マクロファージ、ハンゼマンマクロファージ、炎症性マクロファージ、肝クッパー細胞、脳ミクログリア細胞などの様々な形態に変化するため、血液のみならず、これらを含有する組織までもが本発明の臨床検体として用いることができることによる。  例えば、腎炎が疑われる患者から、腎生検に従って腎組織を採取し、トリプシン等の酵素を用いることによって細胞を剥離してこの組織内に存在する食細胞を取得し、得られた食細胞を用いることで、腎炎の原因微生物を検出および同定することができる。
【００２４】
次に、本明細書で使用する「食細胞」の語は、外来微生物を含めた異物を自身の細胞内に取り込むことのできる細胞を指すものであって、例えば、マクロファージ、単球、好中球、好酸球などが挙げられる。  また、Ｕ９３７細胞、ＨＬ６０細胞などの食細胞系も、本発明において好適に使用することができる。
【００２５】
食細胞（白血球）画分は、公知の方法によって臨床検体から取得することができる。  例えば、約５ｍｌのヘパリン加静脈血（白血球数の少ない場合は１０ｍｌ）を採取し、この血液と血液分離試薬［塩化ナトリウム２２５ｍｇとデキストラン（分子量  ２００，０００〜３００，０００）１．５ｇを含み、滅菌精製水にて全量を２５ｍｌに調製したもの］とを４：１程度の割合で混和した後、約１０℃〜約４０℃で、約１５分〜約１２０分間、好ましくは、約３７℃で、約３０分間静置することによって、白血球画分（上層）を取得することができる。
【００２６】
食細胞の固定
このようにして得た白血球画分を、約０℃〜約２０℃にて、約１００×ｇ〜約５００×ｇで、約３分〜約６０分間、好ましくは、約４℃にて、約１４０×ｇ〜約１８０×ｇで、約１０分間遠心分離することによって、白血球を得ることができる。
【００２７】
遠心分離の際に赤血球が混入してしまった場合には、溶血操作を行うのが好ましい。  例えば、白血球のペレットに滅菌精製水１ｍｌを加えて懸濁した後、直ちに、過剰量のＰＢＳ［塩化ナトリウム１８．２４ｇ、リン酸一水素ナトリウム１２水和物６．０１２ｇおよびリン酸二水素ナトリウム二水和物１．１２３ｇを含み、かつ滅菌精製水で全量を１２０ｍｌに調製したもの（以下、単に『ＰＢＳ原液』と称する）を、滅菌精製水で２０倍に希釈して得たもの］（以下、単に『ＰＢＳ』と称する）を加えて等張化した後、再度、約４℃の温度下にて、約１４０×ｇ〜約１８０×ｇで、約１０分間遠心分離する。
【００２８】
あるいは、このような遠心分離を行わなくとも、貪食細胞が本質的に有する接着能力を利用して、以下のようにして、スライドグラスに接着させることもできる。  白血球を固定する方法として、例えば、カルノア固定を行うことができる。  具体的には、白血球を支持できる担体（支持担体）に白血球のペレットを載置し、カルノア固定液（エタノール：クロロホルム：酢酸＝６：３：１で混合して得た液）に２０分間程度浸した後、約５０％〜約９０％、好ましくは、約７５％のエタノール液に約５分間浸して、完全に風乾する。
【００２９】
このような支持担体としては、不溶性素材から形成されたものが好ましく、例えば、ガラス、金属、合成樹脂（ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリル酸エステル、ナイロン、ポリアセタール、フッ素樹脂など）、多糖類（セルロース、アガロースなど）が好適に使用できる。  不溶性支持担体の形状としては、例えば、板状、盆状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、管状等の種々の形状とすることができる。
【００３０】
特に、本発明の実施態様において好ましい支持担体として、スライドグラスがある。  このようなスライドグラスとして、例えば、スライドグラス（商品番号ＭＳ３１１ＢＬ：日本エアーブラウン社製）がある。  このＭＳ３１１ＢＬスライドグラスは、その表面に、直径５ｍｍの円形ウェルを１４個有している。
【００３１】
また、実際の適用を考慮すれば、支持担体への細胞の接着性を改善する目的で、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ、ＳＩＧＭＡ社）を、その表面にコートしてなるＡＰＳコートスライドグラスが好ましい。  その他に、ポリ−Ｌ−リジンやゼラチンをコートしてなるスライドグラスも好適に使用できる。  これらＡＰＳコートスライドグラスの作製手順は、まず、スライドホルダーにスライドグラスを固定する。  固定したスライドグラスを、希釈した中性洗剤に３０分以上浸して洗浄し、水道水で洗剤を十分に除去し、精製水で洗浄した後に、高温（１００℃以上）で十分に乾燥させ、その後、室温で放置冷却する。  次いで、スライドグラスを２％ＡＰＳ含有アセトンに１分間浸し、直ちにアセトンおよび滅菌精製水で順次軽く洗浄した後に、風乾する。  さらに再度、スライドグラスを１〜１０％ＡＰＳ含有アセトンに１分間浸し、直ちにアセトンおよび滅菌精製水で順次軽く洗浄した後に、風乾を行った後、約２０℃〜約６０℃、好ましくは約４２℃で乾燥させることで、ＡＰＳコートスライドグラスが得られる。
【００３２】
ＡＰＳコートスライドグラス表面に白血球を支持させる場合、各ウェルに白血球が単層に広がるように塗抹して、風乾するのが好ましい。  固定化する食細胞の密度（ｘ個／ｍｌ）は、約５×１０６個／ｍｌ＜ｘ個／ｍｌ＜約１×１０８個／ｍｌ、好ましくは、約１×１０７個／ｍｌ≦ｘ個／ｍｌ≦約５×１０７個／ｍｌに調整する。  また、これに対応して、ＡＰＳコートスライドグラスに固定される１ウェル当たりの白血球の細胞数（ｙ個／ウェル（直径５ｍｍ））は、約２．５×１０４個／ウェル＜ｙ個／ウェル＜約５×１０５個／ウェル、好ましくは、約５×１０４個／ウェル≦ｙ個／ウェル≦約２．５×１０５個／ウェルに調整する。
【００３３】
具体的には、白血球画分を、約４℃にて、約１４０×ｇ〜約１８０×ｇで、１０分間遠心分離して得た白血球ペレットに、少量のＰＢＳを加えて懸濁し、血球計算盤を用いて白血球数を計測する。
【００３４】
そして、約５×１０４個／ウェル〜約２．５×１０５個／ウェルの細胞数となるようにＰＢＳで調製した白血球懸濁液５μｌを、ＡＰＳコートスライドグラスの各ウェルに白血球が単層に広がるように塗抹し、完全に風乾させることによって、白血球がその表面に固定支持されたＡＰＳコートスライドグラスが調製される。
【００３５】
細胞膜の透過性亢進処理
食細胞の細胞膜の透過性を亢進させるための処理を行う。  この処理方法として、白血球が固定支持されたＡＰＳコートスライドグラスを、ＰＢＳに約３〜約３０分間浸し、その後、酵素前処理試薬（サポニン１．２５ｇ、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（比重１．０６８〜１．０７５（２０／４℃）、ｐＨ（５ｗ／ｖ％）  ５．５〜７．５）１．２５ｍｌ、ＰＢＳ原液２５ｍｌを混合し、滅菌精製水にて全量５０ｍｌに調製したもの）を、滅菌精製水で約２倍〜約５０倍に希釈した溶液に浸し、振とう機で約３〜約３０分間振とうする方法を用いることができる。
【００３６】
内在細菌ＤＮＡの取得
次に、食細胞内に存在する感染症原因菌のＤＮＡを得る。  具体的には、まず、スライドグラス１枚につき酵素試薬（Ｎ−アセチルムラミダーゼ、リゾチームおよび／またはリゾスタフィン；以下、単に『酵素試薬』と称する）に対して、酵素試薬溶解液（フェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）含有ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を、ＰＢＳで１００倍希釈したもの］を１ｍｌ加えて酵素試液を調製した。  その後、約２０℃〜約６０℃、好ましくは、約３７℃〜約４２℃の湿潤箱内で、この酵素試薬１ｍｌを白血球塗抹部位に滴下して、約１０〜約６０分間静置して、感染症原因菌のＤＮＡを露出する。  その後、０．２ｍｏｌ／ｌの塩酸を含むＰＢＳ（ＰＢＳ原液に塩酸を加え、滅菌精製水で２０倍希釈して、塩酸の終濃度を０．２ｍｏｌ／ｌに調製したもの）に浸し、そのまま振とう機上で約３〜約３０分間振とうする。  ＤＭＳＯは、５％以上の濃度でリゾチームおよびリゾスタフィンの活性を低下させる可能性があるため、５％未満の濃度で使用するのが好ましい。
【００３７】
食細胞の形態を保持させる物質であるＰＭＳＦ以外に、他の公知のプロテアーゼ阻害剤、例えば、トシルリジンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）およびそれらの混合物などを用いることもできる。  そのような場合は、ＤＭＳＯなどの溶解剤を適宜変更すればよい。
【００３８】
酵素試薬として用いられる各酵素の力価範囲は、次の通りである。  リゾスタフィンの力価範囲は、約１単位／ｍｌ〜約１，０００単位／ｍｌ、好ましくは、約１０単位／ｍｌ〜約１００単位／ｍｌである。  また、Ｎ−アセチルムラミダーゼの力価範囲は、約１０単位／ｍｌ〜約１０，０００単位／ｍｌ、好ましくは、約１００単位／ｍｌ〜約１，０００単位／ｍｌである。そして、リゾチームの力価範囲は、約１，０００単位／ｍｌ〜約１，０００，０００単位／ｍｌ、好ましくは、約１０，０００単位／ｍｌ〜約１００，０００単位／ｍｌである。  なお、原因菌がカンジダ  アルビカンスなどの真菌である場合には、ザイモラーゼを単独あるいは他の酵素と併用して使用するのが好ましく、その力価範囲は、約５０〜約５００単位／ｍｌ、好ましくは、約１００単位／ｍｌ〜約５００単位／ｍｌである。  また、ザイモラーゼを使用する場合、ＰＭＳＦまたは公知のプロテアーゼ阻害剤を併用するのが特に好ましい。
【００３９】
また、グラム陽性菌とグラム陰性菌の菌体成分の違い、すなわち、ペプチドグリカンまたはリポポリサッカライドの違いにより、使用酵素を適宜選択することができる。  特に、グラム陽性菌とグラム陰性菌の種別にかかわらず、より効果的に菌体を溶菌させるために、２種類以上の酵素を使用することもできる。  リゾチーム、リゾスタフィン、およびＮ−アセチルムラミダーゼの３種類の酵素を混合した酵素試薬を使用することによって、１種類の酵素に依った場合と比較して溶菌活性が高まる。
【００４０】
酵素試薬の至適酵素処理温度は、約２６℃〜約５９℃、好ましくは、約３７℃〜約４２℃に設定する。  また、酵素試薬の酵素処理時間は、少なくとも約１５分以上、好ましくは、約１５分〜約１２０分、あるいは、少なくとも約２０分以上、好ましくは、約３０分〜約６０分とする。
【００４１】
Ｎ−アセチルムラミダーゼに関しては、エンテロコッカス  フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）の熱処理乾燥粉末ならびにＮ−アセチルムラミダーゼと共に、２ｍｍｏｌ／ｌ  塩化マグネシウムを含む５ｍｍｏｌ／ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ６．０）中にて、３７℃で、５分間反応させた場合、６００ｎｍでの吸光度が下がる現象が認められる。  また、ストレプトコッカス  サリヴァリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  （ＩＦＯ３３５０）の熱処理細胞を、３７℃、ｐＨ  ７．０の条件下で、１分間に１μｇを溶菌する酵素活性を１単位とした場合、２，０００単位／ｍｇ以上の活性を示すＮ−アセチルムラミダーゼを使用することが望ましい。
【００４２】
リゾチームに関しては、ミクロコッカス  ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）とリゾチームと共に、ＰＢＳ中にて、３７℃で、５分間反応させた場合、６００ｎｍの吸光度が下がる現象が認められる。  また、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓを、３５℃、ｐＨ  ６．２の条件下で、１分間に５４０ｎｍの吸光度を０．００１下げる時の酵素活性を１単位とした場合、５０，０００単位／ｍｇ以上の活性を示すリゾチームを使用することが望ましい。
【００４３】
リゾスタフィンに関しては、スタフィロコッカス  エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）とリゾスタフィンが共に、ＰＢＳ中にて、３７℃で、５分間反応させた場合、６００ｎｍの吸光度が下がる現象が認められる。  また、スタフィロコッカス  アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）を、３７℃、ｐＨ  ７．５の条件下で、１０分間で、  ６２０ｎｍの吸光度を０．２４０から０．１２５に下げる酵素活性を１単位とした場合、５００単位／ｍｇ以上の活性を示すリゾスタフィンを使用することが望ましい。
【００４４】
ザイモラーゼ（商品名：ザイモリエイス、生化学工業）は、アルスロバクタールテサル（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｌｕｔｅｓｕ１）の培養液から調製された酵素で、酵母生細胞の細胞壁に対する溶解活性が大きい。  ザイモラーゼに含まれる細胞壁溶解に関与する必須酵素は、β−１，３−グルカン  ラミナリペンタオヒドロラーゼ（β−１，３−ｇｌｕｃａｎ  ｌａｎｉｍａｒｉｐｅｎｔａｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）であり、これは、β−１，３−結合のグルコースポリマーに作用して、主生成物としてラミナリペンタオースを生成する。  ザイモリエイス−１００Ｔは、硫安分画に精製され、さらにアフィニティークロマトグラフィーにより精製された酵素であって（Ｋｉｔａｍｕｒａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｆｅｒｍｅｎｔ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，  ６０，  ２５７，  １９８２）、１００，０００単位／ｇの活性を有している。  しかしながら、この酵素の活性は、基質となる酵母の種類、培養条件および生育時期により変化することが知られている（Ｋｉｔａｍｕｒａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０，  ３２３，  １９７４；Ｋｉｔａｍｕｒａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ４５，  １７６１，  １９８１；  Ｋｉｔａｍｕｒａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ４６，  ５５３，  １９８２）。  ザイモリエイス−１００Ｔは、β−１，３−グルカナーゼを約１．０×１０７単位／ｇ、プロテアーゼを約１．７×１０４単位／ｇ、そして、マンナーゼを約６．０×１０４単位／ｇを含み、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅは認められない（Ｋｉｔａｍｕｒａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  １８，  ５７，  １９７２）。  また、ザイモリエイスの至適ｐＨは約５．５〜約８．５であり、約６．５〜約７．５のｐＨが特に至適性に優れており、至適温度は約２５〜約５５℃であり、約３５〜約４５℃の温度が特に望ましい。
【００４５】
さらに、酵母（対数増殖期細胞）に対する溶菌スペクトラム（属名）として、Ａｓｈｂｙａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ、Ｅｎｄｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ、Ｋｌｏｅｋｅｒａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｍｅｔｓｃｈｋｏｗｉａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓなどがある。  特に、カンジダ属には、カンジダ  アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ  トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダパラシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ  ガラクタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇａｌａｃｔａ）、カンジダ  ギリエルモンジ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンジダ  クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）等がある。
【００４６】
これらの属に属する菌も、本発明の適用対象に加えることができる。
【００４７】
ザイモラーゼの賦活剤として、ＳＨ化合物、例えば、システイン、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールなどを用いることができる。  ザイモラーゼは、ビール酵母懸濁液を基質として、約２５℃の温度下で、約２時間置いた反応液（ザイモラーゼ：０．０５〜０．１ｍｇ／溶液ｍｌの１ｍｌ、基質：ビール酵母懸濁液（２ｍｇ乾燥重量／ｍｌ）３ｍｌ、緩衝液：Ｍ／１５リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．５）５ｍｌを含み、滅菌精製水１ｍｌで全量を１０ｍｌに調製したもの）でのＡ８００を３０％減少するに必要な酵素活性を１単位とする。  なお、ザイモリエイス−１００Ｔは、約１００，０００単位／ｇの活性を有している。
【００４８】
酵素試薬溶解液として用いられる（プロテアーゼから白血球を保護してその形態を保持させるために添加される）ＰＭＳＦは、約１０μｍｏｌ／ｌ  以上の濃度で効果が認められ、約０．１ｍｍｏｌ／ｌ  以上の濃度では、白血球の形態の劣化が完全に抑制されていたことから、約１０μｍｏｌ／ｌ〜約１０ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは、約０．１ｍｍｏｌ／ｌ〜約１ｍｍｏｌ／ｌの範囲であることが好ましい。  また、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）の濃度としては、約５％未満の濃度で使用でき、約２％以下の濃度が好ましく、約１％程度の濃度が最も好ましい。  従って、酵素試薬溶解液としては、０．１ｍｏｌ／ｌ  ＰＭＳＦ含有ＤＭＳＯを、ＰＢＳで約１００〜約１，０００倍希釈して調製したものが好ましい。
【００４９】
感染症原因菌のＤＮＡを得た後に、細胞膜タンパク質のアセチル化工程を加えてもよい。  具体的には、アセチル化試薬（トリエタノールアミン７．４６ｇと適量の塩酸を含み、かつ適量の滅菌精製水で全量を５０ｍｌとしたもの）に無水酢酸を加え、滅菌精製水で約２倍〜約５０倍に希釈し、好ましくは、約１０倍に希釈して、無水酢酸の終濃度を約０．１〜約３．０％、好ましくは、約０．８％に調製したアセチレーション試薬にスライドグラスを浸し、振とう機上で５〜３０分間振とうする。  その後、スライドグラスを、７５％、８５％、９８％のエタノールに順に、それぞれ約２〜約５分間ずつ浸して、完全に風乾させる。
【００５０】
また、アセチル化工程の後に、感染症原因菌のＤＮＡをアルカリ処理する工程を挿入することができる。  これにより、感染症原因菌のＤＮＡは、一本鎖のＤＮＡになる。  具体的には、スライドグラスを、約１０ｍｍｏｌ／ｌ〜約３００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは約７０ｍｍｏｌ／ｌの濃度の水酸化ナトリウムを含むＰＢＳ（ＰＢＳ原液に水酸化ナトリウムを加え、滅菌精製水で約２０倍希釈し、水酸化ナトリウムの終濃度を７０ｍｍｏｌ／ｌ  に調製したもの）に約２〜約５分間浸して、アルカリ処理を行う。  その後、スライドグラスを、７５％、８５％、９８％のエタノールに順に、それぞれ約２〜約５分間ずつ浸して、完全に風乾させる。
【００５１】
Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
ストリンジェントな条件下にて、感染症原因菌のＤＮＡとハイブリダイゼーション可能な検出用ＤＮＡプローブを用いてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行う。
【００５２】
Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施するにあたって、まず、プローブ希釈液を用いて調製した検出用ＤＮＡプローブ含有液（プローブ液）を塗抹部位に塗布し、約２５℃〜約５０℃、好ましくは、約３７℃〜約４２℃の湿潤箱内で、約１〜約３時間、好ましくは、約２時間静置させる。  その後、ハイブリダイゼーション洗浄液［ハイブリダイゼーション原液（塩化ナトリウム１３．１５ｇとクエン酸三ナトリウム２水和物６．６１５ｇとを含み、滅菌精製水にて全量を７５ｍｌに調整したもの、以下、単に、『ハイブリダイゼーション原液』と称する）を、ハイブリダイゼーション原液：滅菌精製水：ホルムアミド＝５：４５：５０の割合で混合して調製したもの］を３つの染色ビンに用意し、それぞれを順に、約３５〜約４５℃、好ましくは、約４２℃で、約１０分間ずつ浸す。  その後、ＰＢＳに浸したままで、振とう機上で、約５〜約３０分間振とうさせる。  詳細には、プローブ希釈液は、サケ精子ＤＮＡ  ６００μｌ、１００×デンハート溶液５０μｌ、前出のハイブリダイゼーション原液５００μｌ、ホルムアミド２２５０μｌ、５０％硫酸デキストラン１０００μｌを含んでいる。  プローブ液には、１５ｎｇの各検出用ＤＮＡプローブを含有せしめるのが好ましく、プローブ希釈液にて全量を５０μｌとするのが望ましい。
【００５３】
ヘモフィリス  インフルエンザ菌のプローブ濃度は、約０．１〜約２．４ｎｇ／μｌ、好ましくは約０．６〜約１．８ｎｇ／μｌ、より好ましくは、約０．６〜約１．２ｎｇ／μｌとする。
【００５４】
また、ハイブリダイゼーションの試験時間は、少なくとも約３０分以上、好ましくは、約６０分以上、より好ましくは、約９０分以上とする。  最も好ましくは、ハイブリダイゼーション時間を１２０分〜９００分に設定すべきである。
【００５５】
Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの実施において、検出感度を高める観点からして、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤の使用が好ましい。  ＳＤＳの好ましい濃度は、約１％以下、好ましくは、約０．１％〜約０．７５％、より好ましくは約０．２５％〜約０．５％である。  ＳＤＳは、ハイブリダイゼーションの際に用いる溶液に添加されていればよく、プローブ希釈液またはプローブ液に事前に混合して用いてもよい。
【００５６】
また、ＤＮＡプローブとしては、約３５０〜約６００塩基長、好ましくは、約３５０〜約５５０塩基長、最も好ましくは、約３５０〜約５００塩基長の長さを有する１種以上の核酸断片とするのが好ましい。  これはすなわち、食細胞内へのプローブの導入を円滑にし、かつ取り込まれている外来微生物の遺伝子への確実な接触が許容されることによる。  ところで、プローブの塩基長は、必ず上記塩基長範囲に収まらなければならないことを意味するものではなく、プローブ塩基長の分布に上記範囲の塩基長が含まれていればよい。  これらプローブは、１種で用いても数種（１種以上）で用いても良い。  １種以上のプローブとは、一菌種に対してハイブリダイズできる複数種のプローブであってもよく、また、一菌種に対してプローブは１つであるが、菌種が複数種存在するためにプローブの種類が複数種となっていてもよく、プローブの種類が１種以上であれば特に制限されない。
【００５７】
なお、プローブは、食細胞自体との交差反応性に乏しい（ハイブリダイズしない）配列を有するＤＮＡ断片を含むものとすることが好ましく、プローブの起源種と異なる他の菌種に由来する遺伝子とハイブリダイズするものであってはならない。
【００５８】
例えば、サブトラクション法を用いれば、短時間で特異プローブを作成することができる。  これらプローブは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ビオチン、ジゴキシゲニン（ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−１１−ｄＵＴＰ）等の非放射性同位体標識用物質を用いて、定法のニックトランスレーション法に従って、調製およびラベルすることができる。  プローブの鎖長は、ニックトランスレーション反応において添加するＤＮａｓｅＩとＤＮＡポリメラーゼＩの量比を変化させることによって、最も効率よく標識付け可能なように制御できる。
【００５９】
一例として、本願発明のプローブＨＩ−２１−８の２μｇを効率よくラベル化し、また、外来微生物ＤＮＡと効率よくｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイズ可能なプローブ鎖長（３５０〜６００）にするためには、全量１００μｌの反応液中に、１０Ｕ／μｌのＤＮＡポリメラーゼＩの２μｌに対し、全量１００μｌの反応液中に約１０〜約３５０ｍＵ、好ましくは、約２５〜約２００ｍＵ、より好ましくは、約５０〜約１５０ｍＵに調製されたＤＮａｓｅＩを６μｌ存在するように調製する。  この場合、各酵素の容量および反応液全量などは、上記した至適反応条件の比率が一定である限り、適宜変更してもよい。  換言すれば、全量１００μｌでの２０ＵのＤＮＡポリメラーゼＩに対して、ＤＮａｓｅＩの濃度を、約１０〜約３５０ｍＵ、好ましくは、約２５〜約２００ｍＵ、より好ましくは、約５０〜約１５０ｍＵの濃度に調整する。  さらに換言すれば、１単位のＤＮＡポリメラーゼＩに対して、約０．５／１０００〜約１７．５／１０００、好ましくは、約１．２５／１０００〜約１０／１０００、より好ましくは、約２．５／１０００〜約７．５／１０００単位のＤＮａｓｅＩを用いてニックトランスレーション反応を行うのが望ましい。  また、１μｇのＤＮＡに関して着眼すれば、１０ＵのＤＮＡポリメラーゼＩに対して、ＤＮａｓｅＩを約５〜約１７５ｍＵ、好ましくは、約１２．５〜約１００ｍＵ、より好ましくは、約２５〜約７５ｍＵにすればよい。  他のプローブに関しては、上記した至適反応条件を参考にして、ＤＮＡ量、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＤＮａｓｅＩに関する至適反応条件を決定することができる。  加えて、効率よくラベル化でき、しかも外来微生物ＤＮＡと効率よくｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションできるプローブ鎖長（約３５０〜約６００塩基長）に調節することもできる。
【００６０】
ところで、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施する際に用いられる「ストリンジェントな条件」とは、例えば、ホルムアミド約３０％〜約６０％、好ましくは、約５０％の存在下、約３０〜約５０℃、好ましくは、約３８〜約４２℃でインキュベートし、その後、洗浄を行う条件である。
【００６１】
Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った後に、ブロッキングの工程を加えることもできる。  具体的には、湿潤箱内でスライドグラス１枚につきブロッキング試薬（ウサギ正常血清２ｍｌとＰＢＳ原液０．５ｍｌを含み、かつ滅菌精製水にて全量を１０ｍｌに調製したもの）１ｍｌを塗抹部位に滴下し、約１５〜約６０分間静置する。  その後、ブロッキング試薬を除去する。
【００６２】
ハイブリダイズシグナルの検出
菌由来の遺伝子（ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ）とハイブリダイズした結果に生じるシグナルを検出するために、定法の抗原−抗体反応等を利用した呈色反応を行う。
【００６３】
すなわち、ハイブリダイゼーションを終えた試料を充分に洗浄した後に、ブロッキング処理を行い、次いで、抗ＦＩＴＣ抗体、抗ジゴキシゲニン抗体などの接合物、例えば、アルカリホスファターゼ接合物を用いて処理し、その後、接合物の発色系にてシグナルを発色して、ハイブリダイゼーションの状況を確認する。  例えば、プローブとして、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰでラベルしたプローブを用いた場合、抗ジゴキシゲニン−アルカリホスファターゼ接合物を用い、一般に使用されるアルカリホスファターゼに対する基質（ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート等）を利用して検出すればよい。
【００６４】
呈色反応の後に洗浄して得た塗沫標本は、ナフトールブラック、Ｆａｓｔ  Ｇｒｅｅｎ（２０ｍｇ／５０ｍｌ、Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）等で対比染色を行い、光学顕微鏡によって検鏡すると細胞内シグナルが観察される。
【００６５】
詳細には、ハイブリダイゼーションによるシグナルを得るには、例えば、検出用ＤＮＡプローブとしてジゴキシゲニン標識ＤＮＡプローブを用いる場合には、標識抗体（アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液１．０５単位、バッファーＡ（トリエタノールアミン７４６ｍｇ、塩化ナトリウム１７．５ｍｇ、塩化マグネシウム６水和物２０．３ｍｇ、塩化亜鉛１．３６ｍｇ、ウシ血清アルブミン１０００ｍｇおよび適量の塩酸を含み、かつ滅菌精製水適量にて全量を１００ｍｌに調製したもの）１２．６μｌにて全量を１４μｌに調製したもの）を標識抗体希釈液（トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン８．４８ｍｇ、塩化ナトリウム６．１４ｍｇおよび塩酸適量を含み、かつ適量の滅菌精製水で全量を０．７ｍｌに調製したもの）で約１０〜倍約２００倍、好ましくは、約５０倍に希釈した標識抗体液を調製し、これを塗抹部位に１０μｌずつ滴下し、約１５〜約６０分間静置する。  その後、標識抗体洗浄液（１ｍｌのポリソルベート２０と５０ｍｌのＰＢＳ原液を含み、かつ滅菌精製水にて全量を１００ｍｌに調製したもの）を約２倍〜約５０倍、好ましくは、約１０倍に希釈した溶液に浸し、そのままの状態で、振とう機上で約５〜約３０分間振とうする。  この操作を２回繰り返した後、発色前処理液−１（トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン６．０６ｇ、塩化ナトリウム２．９２ｇおよび適量の塩酸を含み、かつ適量の滅菌精製水にて全量を５０ｍｌに調製したもの）と発色前処理液−２（塩化マグネシウム６水和物５．０８ｇを含み、かつ滅菌精製水にて全量を５０ｍｌに調製したもの）を等量混合し、滅菌精製水で５倍程度に希釈した発色前処理液に浸し、そのままの状態で振とう機上で約５〜約３０分間振とうする。  その後、スライドグラス１枚につき発色試薬（ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェイト（ＢＣＩＰ））１ｍｌを、０．２μｍシリンジトップフィルターを装着したディスポーザブルシリンジでろ過しながら、スライドグラスの塗抹部位に滴下し、湿潤箱中で約１０℃〜約４５℃、好ましくは、約３７℃で、約１５〜約６０分間遮光静置する。  その後、発色試薬洗浄液（トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン６０６ｍｇ、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム２水和物１８６ｍｇおよび適量の塩酸を含み、かつ適量の滅菌精製水にて全量を５０ｍｌに調製したもの）を約２倍〜約５０倍、好ましくは、約１０倍に希釈した溶液に約２〜約１０分間浸し、風乾した後、対比染色液（ファストグリーンＦＣＦ（食用緑色３号）５０ｍｇを含み、かつ適量の滅菌精製水にて全量を５０ｍｌに調製したもの）を約２倍〜約５０倍、好ましくは、約１０倍に希釈した溶液、それに約０．１〜約５％、好ましくは、約１％の酢酸溶液に浸す。  その後、前出の発色試薬洗浄液を約２倍〜約５０倍、好ましくは、約１０倍に希釈した溶液に再度浸して余分の対比染色液を洗い流し、完全に風乾する。  また、発色試薬は、個別に調製した試薬でもよい。
【００６６】
アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液は、ブロッティング用メンブレンに、ジゴキシゲニンをラベルしたＤＮＡを１ｎｇブロットし、ブロッキング後、１０，０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液で処理し、発色基質（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）を反応させると、ＤＮＡのブロッティング部位が発色し、ジゴキシゲニンがラベルされていないＤＮＡで同様の操作をしても発色は認められないものを使用するのが望ましい。  また、抗ジゴキシゲニン抗体は、ヒツジ由来のものが好ましい。  詳細には、免疫処置したヒツジ血清より、イオン交換クロマトグラフィーと抗体カラムクロマトグラフィーを経て精製したものが好ましい。
【００６７】
発色試薬（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液、ｐＨ  ９．０〜１０．０）として、ニトロテトラゾリウムブルー（ＮＢＴ）３．３ｍｇ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェイト（ＢＣＩＰ）１．６５ｍｇ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド９９μｇ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン１２１ｍｇ、適量の塩酸、塩化ナトリウム５８．４ｍｇ、および塩化マグネシウム６水和物１０１．６ｍｇを含み、かつ適量の滅菌精製水にて全量を１０ｍｌに調製したものが好ましい。
【００６８】
この発色試薬としては、アルカリフォスファターゼをラベルしたタンパク質をブロッティング用メンブレンにブロットし、発色試薬でメンブレンを遮光室温で処理すると、ブロット部位に暗紫色のシグナルが現れる試薬が好ましい。
【００６９】
このような対比染色を行う場合、シグナルと細胞のコントラストをさらに明確にさせるため、食用色素、例えば、黄色４号（タートラジン）を使用することができる。  その理由として、基質によって紫色を呈色し、また、ナフトールブラックにより青色を呈色するなど、発現した色が互いに類似していると、明確な対比染色が行いにくいことが挙げられる。  これまでに試されなかった食用色素を用いたところ、対比染色時の色相の差異が明確になり、実用的であることが判明した。
【００７０】
ところで、ジゴキシゲニンを標識化する方法として、ニックトランスレーション法を用いることができる。  また、ジゴキシゲニンを標識化するその他の方法として、ＰＣＲ法、ランダムプライマーラベリング法、ｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスクリプションラベリング法、ターミナルトランスフェラーゼラベリング法なども使用可能である。
【００７１】
交差反応の有無の判定は、光学顕微鏡で鏡検（×１，０００）した際に、単一ウェルにおいて、対比染色液によって染色された細胞において、青紫色の発色が１つでも認められた場合に陽性と判定する。
【００７２】
また、検出用プローブの調製方法は、特許第２９６５５４４号を参照することで明らかになろう。
【００７３】
さらに、本発明のプローブＨＩ−２１−８を、例えば、ヘモフィリス  インフルエンザ菌ＨＩ−２１−８のワーキングセルバンクから釣菌して培養するには、白金耳または使い捨てプラスチックループ等を用いて当該ワーキングセルバンクから釣菌して、これを滅菌シャーレ内に置いた５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有Ｌ−ブロス固形培地に画線塗抹する。  一晩培養した後、シングルコロニーを採取し、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有のＬ−ブロス培地５ｍｌに植菌して、３７℃で終夜振とう培養する（前培養）。  次いで、前出の液体培地４００ｍｌが入った培養用フラスコに、前培養液を２．５ｍｌずつ植菌して、約３７℃で終夜振とう培養する（本培養）。
【００７４】
そして、ヘモフィリス  インフルエンザ菌ＨＩ−２１−８のプラスミドＤＮＡを抽出すべく、本培養した培養液を約４℃にて、約４，０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌する。  培養上清を除去し、ＳＴＥ（１０ｍｍｏｌ／ｌ  トリス塩酸（ｐＨ  ８．０）、１ｍｍｏｌ／ｌ  エチレンジアミン−四酢酸２ナトリウム塩（ＥＤＴＡ）、０．１ｍｍｏｌ／ｌ  塩化ナトリウム）を２０ｍｌ加えて菌体を再懸濁し、約４℃にて、４，０００×ｇで、１０分間遠心分離して集菌する。  １０ｍｇ／ｍｌリゾチームを含む溶液−１（５０ｍｍｏｌ／ｌ  グルコース、２５ｍｍｏｌ／ｌ  トリス塩酸（ｐＨ  ８．０）、１０ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ）５ｍｌを加え、菌体を懸濁して、室温で５分間放置する。  溶液−２（０．２ｍｍｏｌ／ｌ  水酸化ナトリウム、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））１０ｍｌを加え、転倒混和して、氷上で１０分間放置する。  氷冷した溶液−３（３ｍｏｌ／ｌ  酢酸カリウム（ｐＨ  ４．８））７．５ｍｌを加え、転倒混和して氷上で１０分間放置する。  高速冷却遠心機を用いて、約４℃にて、約４５，０００×ｇで３０分間遠心分離した後、上清を回収し、室温になるまで放置する。  その後、０．６容量（約２４ｍｌ）のイソプロパノールを加え、転倒混和して、室温で１５分以上放置する。  高速冷却遠心機を用いて、約２５℃にて、約２８，０００×ｇで３０分間遠心分離した後、上清を捨て、７０％エタノールでペレットを洗浄し風乾する。  風乾した後、ＴＥ（１０ｍｍｏｌ／ｌ  トリス塩酸（ｐＨ  ８．０）、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ）を８ｍｌ加えて、溶解する（プラスミドＤＮＡの抽出）。
【００７５】
次に、ヘモフィリス  インフルエンザ菌ＨＩ−２１−８含有プラスミドＤＮＡの精製を行う。  得られたプラスミドＤＮＡに、１０ｍｇ／ｍｌエチジウムブロマイド８００μｌおよび塩化セシウム８．６ｇを加え、転倒混和して溶解させる。  その溶解液を超遠心用チューブに入れ、キャップまたはシールをする。  垂直型ローターにより、約２０℃にて、５００，０００×ｇで５時間超遠心した後、紫外線ライト照射下で注射筒または注射針を使用して、プラスミドＤＮＡのバンドを分取する。  分取したプラスミドＤＮＡ溶液に、等量のＴＥ飽和  ｌ−ブタノールを加えて転倒混和し、微量高速遠心機を用いて、約１５，０００×ｇで、５分間遠心分離し、上清を取り除く。  この操作を繰り返し、プラスミドＤＮＡ溶液中のエチジウムブラマイドを取り除く。  次に、ＴＥを加えて１．５ｍｌの体積とし、脱塩カラム（ＮＡＰ−１０）で脱塩する。  脱塩したプラスミドＤＮＡ溶液に、３ｍｏｌ／ｌ  酢酸ナトリウム溶液を３０μｌ加えて混和した後、３倍量の９９．５％エタノールを加えて転倒混和し、−２０℃で、３０分以上放置する。  その後、微量冷却高速遠心機を用いて、４℃にて、１５，０００×ｇで２０分間遠心分離して上清を除いた後、冷７０％エタノールを加えて懸濁する。  そして、再度、微量冷却高速遠心機を用いて、４℃にて、１５，０００×ｇで２０分間遠心分離して上清を除き、プラスミドＤＮＡの沈渣を減圧下で乾固させる。  プラスミドＤＮＡに１００μｌのＴＥを加えて完全に溶解させ、２６０ｎｍの吸光度で濃度を測定する（ヘモフィリス  インフルエンザ菌ＨＩ−２１−８含有プラスミドＤＮＡの精製）。  その後、ヘモフィリス  インフルエンザ菌ＨＩ−２１−８含有プラスミドＤＮＡの制限酵素処理、およびアガロース電気泳動によるＨＩ−２１−８のサイズチェックを行う。
【００７６】
次いで、ヘモフィリス  インフルエンザ菌プローブＨＩ−２１−８含有プラスミドＤＮＡの制限酵素処理およびアガロース電気泳動を経て、プローブＨＩ−２１−８の精製を行う。  そのために、分子量確認が終了したプローブＨＩ−２１−８含有プラスミドＤＮＡ１ｍｇを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ単独もしくは他の制限酵素と組み合わせて、３７℃で、１．５時間以上の時間をかけて反応を進行せしめることにより消化する。
【００７７】
プラスミドＤＮＡを消化した後、反応液の一部を０．８％アガロースで電気泳動して、消化が完全に終了したことを確認する。  消化を確認した後、分取用の０．８％アガロースゲルで電気泳動し、プローブＨＩ−２１−８のバンドを採取する。  採取したプローブＨＩ−２１−８をアガロースゲルから抽出および精製して、吸光度計にてその濃度を測定する。
【００７８】
精製したプローブＨＩ−２１−８の一部を、０．８％アガロースゲルで電気泳動し、シングルバンドであることを確認する。
【００７９】
次に、プローブＨＩ−２１−８のラベル化を行うために、以下の表１に記載の組成を有する反応液において、精製したＨＩ−２１−８の２μｇに対してジゴキシゲニンの標識付けを行う。
【００８０】
【表１】
2004173628.tif 000002
【００８１】
表１において、「Ｘ」とは、プローブ原液の濃度に応じて好ましいプローブ濃度となるように添加することができる容量を指し、この容量に伴い精製水量Ｙを決定して最終容量を調整する。
【００８２】
標識付した後、反応液にＴＥを１００μｌ  加えて反応を停止させる。  反応停止液をスピンカラムに注入し、約４℃にて、約３８０×ｇで約１０分間遠心分離して、遊離のヌクレオチドを除く。  次に、溶出液の濃度を吸光度計により測定し、ＴＥで約１０ｎｇ／μｌ  に調製する。
【００８３】
標識付けを確認するために、標識付けしたプローブＨＩ−２１−８の０．５μｌをメンブレンに滴下して、風乾する。  ブロッキング試薬にこのメンブレンを浸し、室温で３０分間ブロッキングする。  ０．１ｍｏｌ／ｌ  トリス塩酸（ｐＨ  ７．５）と０．１５ｍｏｌ／ｌ  塩化ナトリウムで５，０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液に、そのメンブレンを室温で３０分間浸す。  ０．１ｍｏｌ／ｌ  トリス塩酸（ｐＨ  ７．５）および０．１５ｍｏｌ／ｌ  塩化ナトリウムにメンブレンを浸し、室温で約１０分間振とうして、２回洗浄する。  ０．５ｍｏｌ／ｌ  トリス塩酸（ｐＨ  ９．５）、０．１５ｍｏｌ／ｌ  塩化ナトリウム、５０ｍｍｏｌ／ｌ  塩化マグネシウムに、室温下で、メンブレンを約１０分間浸す。
【００８４】
室温および遮光下で、発色試薬にメンブレンを、約１０分間浸す。  メンブレンをＴＥに浸し、発色を停止させる。  スポット下部分の青紫色の発色で、標識付の確認を行う。
【００８５】
１ｍｌのディスポーザブルシリンジに、少量の滅菌済みグラスウールを充填してスピンカラムを作製する。  １ｍｍｏｌ／ｌ  トリス塩酸（ｐＨ  ７．５）、１ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、０．１％  ＳＤＳで膨潤させたセファデックスＧ−５０をシリンジに詰める。  １５ｍｌのディスポーザブルコニカルチューブにシリンジを入れ、約４℃にて、約３２０×ｇで約１０分間遠心分離し、余分の緩衝液を落とす。  ディスポーザブルコニカルチューブからシリンジを抜き、排出された緩衝液を捨てた後、１．５ｍｌのエッペンドルフ型チューブをディスポーザブルコニカルチューブの底に入れ、その上にシリンジを入れる。
【００８６】
ドットブロットハイブリダイゼーション
プローブの特異性を確認するために、以下の手順に従って、ドットブロットハイブリダイゼーションを行う。
【００８７】
まず、スポットした各ゲノムＤＮＡを変性するために、定法に従い０．５ｍｏｌ／ｌ  水酸化ナトリウム、１．５ｍｏｌ／ｌ  塩化ナトリウム溶液で飽和した濾紙（ワットマン社製３ＭＭ）上に、調製した各種細菌ゲノム１００ｎｇ  をナイロンメンブレン（ポールバイオダインタイプＢ、日本ポール社製）にスポットし、風乾したメンブレンを１０分間静置する。  次に、０．５ｍｏｌ／ｌ  トリス塩酸（ｐＨ  ７．５）、１．５ｍｏｌ／ｌ  塩化ナトリウム溶液で飽和した前出の濾紙上に１０分間静置して変性ＤＮＡを中和する。  さらに２×ＳＳＣ（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓａｌｉｎｅ  Ｃｉｔｒａｔｅ）溶液で飽和した前記濾紙上に５分間静置し、洗浄する。
【００８８】
そして、メンブレンを風乾し、２×ＳＳＣ溶液にメンブレンを浸し、５分間浸透する。  定法に従い、プラスチックバッグ内でプレハイブリタイゼーション溶液にメンブレンを浸し、４２℃で、６０分間親和させる。  プラスチックバッグ内でプローブ４００ｎｇを含むハイブリタイゼーション溶液の１５ｍｌにメンブレンを浸し、４２℃で、一晩反応させる。  次に、２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）溶液にメンブレンを浸し、５分間洗浄する（この工程を２回繰り返す）。  その後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液にメンブレンを浸し、６０℃で、１０分間洗浄する（この工程を３回繰り返す）。  ２×ＳＳＣ溶液にメンブレンを浸し、５分間洗浄する。  メンブレンを３％ウシ血清アルブミン、１％ブロッキングバッファー（ベーリンガー社製）、０．１ｍｏｌ／ｌ  トリス塩酸（ｐＨ  ７．５）、０．１５ｍｏｌ／ｌ  塩化ナトリウムを含む溶液にメンブレンを浸し、３０分間緩慢に振とうする。
【００８９】
次いで、アルカリフォスフアターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体（ベーリンガー社製）を、０．１ｍｏｌ／ｌ  トリス塩酸（ｐＨ  ７．５）および０．１５ｍｏｌ／ｌ  塩化ナトリウム溶液で５，０００倍希釈した溶液にメンブレンを浸し、３０分間緩慢に振とうする。  次に、０．１ｍｏｌ／ｌ  トリス塩酸（ｐＨ  ７．５）、０．１５ｍｏｌ／ｌ  塩化ナトリウム溶液にメンブレンを浸し、１５分間振とうする（この工程を２回繰り返す）。  ０．１ｍｏｌ／ｌ  トリス塩酸（ｐＨ  ９．５）、０．１ｍｏｌ／ｌ  塩化ナトリウム、５ｍｍｏｌ／ｌ  塩化マグネシウムを含む溶液にメンブレンを浸し、５分間振とうする。  ＮＢＴ−ＢＣＩＰ溶液（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）にメンブレンを浸し、遮光下で発色反応させる。  ＴＥ（１０ｍｍｏｌ／ｌ  トリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ）にメンブレンを浸し、発色反応を止め、風乾する。  プレハイブリダイゼーション溶液およびハイブリダイゼーション溶液の組成を、以下の表２に示す。
【００９０】
【表２】
2004173628.tif 000003
【００９１】
前述したｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション工程において使用される界面活性剤としては、公知の界面活性剤が使用できる。
【００９２】
界面活性剤は、アニオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン界面活性剤および両性界面活性剤に大別される。
【００９３】
アニオン界面活性剤とは、陰イオン界面活性剤とも称されるものであって、水中で電離して有機陰イオンとなるものである。  界面活性剤の分子中の親油基をＲとして表現すると、ＲＣＯＯＮａ、ＲＳＯ３Ｎａ、ＲＳＯ４Ｎａの式で表される。  ＲＣＯＯＮａのように弱酸性基を含有するものでは、その水溶液は加水分解しやすく弱アルカリ性を呈するが、ＲＳＯ３Ｎａ，  ＲＳＯ４Ｎａなどの強酸性基を有するものでは、その水溶液は、加水分解を受けにくく、中性を呈する。  陰イオン性であるから、多量の陽イオン性物質の存在で界面活性を失うことがあり、また強酸性にした時にも失活する。
【００９４】
非イオン性界面活性剤とは、親水基が非イオン性のものをいう。  親水基として酸化エチレン基（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）が多用され、この官能基の数が多くなるに従って、親水性が増す。  反対に、親油基の炭素数が増加すると、親油性が増加する。
【００９５】
従って、親水性や親油性を様々に変化させた界面活性剤が得られるのが特徴である。  非イオン性界面活性剤は、水中で電離せず、無機塩の影響も受けにくいため、生体に及ぼす作用も少ない。  しかも、洗浄作用は、強力で、泡立ちは比較的少ないため、洗剤のみならず、医薬品、化粧品、食品などの様々な用途で使用される。  水溶性の非イオン性界面活性剤は、温度が上昇すると、ある時点で水に溶解しにくくなり、水溶液が濁り出すが、これは親水基と水との水素結合が切断されるために生じる。
【００９６】
カチオン界面活性剤は、陽イオン界面活性剤とも称され、これは、水中で、電離して有機陽イオンとなるものである。  カチオン界面活性剤は、一般に洗浄作用は大きくはないが、細菌などのアニオン性のものと強く結合するため、殺菌作用が大きい。  また、繊維やプラスチックでの帯電防止能もある。  代表的なカチオン界面活性剤であるドデシルトリメチルクロリド［Ｃ１２Ｈ２５（ＣＨ３）３Ｎ］Ｃｌは水溶性であるが、一方で、ジドデシルジメチルアンモニウムクロリド［（Ｃ１２Ｈ２５）２（ＣＨ３）２Ｎ］Ｃｌは水に溶解しにくく、水中では２分子膜状のベシクルを形成し、これはベンゼンには溶解する。
【００９７】
両性界面活性剤とは、分子内にアニオン基とカチオン基の両者を併せ持っている界面活性剤である。  水溶液中での電離状態はアミノ酸に類似しており、両性界面活性剤には、アミノ酸誘導体が多く存在する。  従って、アミノ酸と同様に等電点を有し、等電点よりアルカリ性側にある場合にはアニオン界面活性剤として、酸性側にある場合にはカチオン界面活性剤として作用する。  等電点で水溶性は最低となり、表面張力も最も低下する。  両性界面活性剤は、殺菌剤、帯電防止剤などの用途に用いられている。
【００９８】
また、アニオン界面活性剤は、カルボン酸型、スルホン酸型、硫酸エステル型およびリン酸エステル型に分類され、非イオン性界面活性剤は、エステル型、エーテル型、エステルエーテル型およびアルカノールアミド型に分類される。  カチオン界面活性剤は、アルキルアミン塩型および第四級アンモニウム塩型に分類され、両性界面活性剤は、カルボキシベタイン型、２−アルキルイミダゾリンの誘導型およびグリシン型に分類される。
【００９９】
さらに、アニオン界面活性剤のカルボン酸型は、脂肪酸モノカルボン酸塩、Ｎ−アシルサルコシン塩およびＮ−アシルグルタミン酸塩に細分される。  それぞれの代表例として、脂肪酸モノカルボン酸塩として、ラウリン酸ナトリウムおよび薬用石鹸が、Ｎ−アシルサルコシン塩として、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、Ｎ−アシルグルタミン酸塩、それに、Ｎ−ラウロイルグルタミン酸二ナトリウムなどがある。  また、スルホン酸型は、ジアルキルスルホコハク酸塩、アルカンスルホン酸塩、アルファオレフィンスルホン酸塩、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル（分岐鎖）  ベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩−ホルムアルデヒド縮合物およびＮ−メチル−Ｎ−アシルタウリン塩に細分される。  その代表例として、ジアルキルスルホコハク酸塩として、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、アルカンスルホン酸塩はドデカンスルホン酸ナトリウム、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩には直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムが、また、アルキル（分岐鎖）ベンゼンスルホン酸塩として、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキルナフタレンスルホン酸塩として、ブチルナフタレンスルホン酸ナトリウム、Ｎ−メチル−Ｎ−アシルタウリン塩としてはＮ−メチル−Ｎ−ステアロイルタウリンナトリウムなどがある。
【０１００】
また、硫酸エステル型は、アルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩および油脂硫酸エステル塩に細分される。  その代表例として、アルキル硫酸塩として、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびセチル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩はポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸トリエタノールアミンなどがある。  また、リン酸エステル型は、アルキルリン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸塩およびポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルリン酸塩に細分される。  その代表例として、アルキルリン酸塩として、モノラウリルリン酸二ナトリウムがある。
【０１０１】
ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸塩には、リン酸ナトリウムポリオキシエチレンラウリルエーテルおよびリン酸ポリオキシエチレンオレイルエーテル（８ＭＯＬ）がある。
【０１０２】
非イオン性界面活性剤のエステル型は、脂肪酸グリセリン、脂肪酸ソルビタンおよび脂肪酸ショ糖エステルに細分される。  それぞれの代表例として、脂肪酸グリセリンとして、モノステアリン酸グリセリン、脂肪酸ソルビタンとしてはモノステアリン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、セスキオレイン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、ポリソルベート２０（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、ポリソルベート６０およびポリソルベート８０、脂肪酸ショ糖エステルはステアリン酸ショ糖エステルがある。  また、エーテル型は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルおよびポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールに細分される。  その代表例として、ポリオキシエチレンアルキルエーテルとして、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテルおよびポリオキシエチレンセチルエーテルなどがあり、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルとして、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルおよびポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルがある。  また、エステルエーテル型は、脂肪酸ポリエチレングリコールおよび脂肪酸ポリオキシエチレンソルビタンに細分される。  それそれの代表例として、脂肪酸ポリエチレングリコールには、オレイン酸ポリエチレングリコールが、また、脂肪酸ポリオキシエチレンソルビタンには、パルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタンおよびポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートなどがある。  また、アルカノールアミド型は、脂肪酸アルカノールアミドだけであり、ラウリン酸ジエタノールアミドがその代表例である。
【０１０３】
カチオン界面活性剤のアルキルアミン塩型には、モノアルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩およびトリアルキルアミン塩があり、モノステアリルアミン塩酸塩がその代表例である。  また、第四級アンモニウム塩型は、塩化（または臭化、沃化）アルキルトリメチルアンモニウム、塩化（または臭化、沃化）ジアルキルジメチルアンモニウム、および塩化アルキルベンザルコニウムに細分される。それぞれの代表例として、塩化（または臭化、沃化）アルキルトリメチルアンモニウムとして、塩化ステアリルトリメチルアンモニウムが、塩化（または臭化、沃化）ジアルキルジメチルアンモニウムとして、塩化ジステアリルジメチルアンモニウムが、また、塩化アルキルベンザルコニウムとして、塩化ラウリルベンザルコニウムがある。
【０１０４】
両性界面活性剤のカルボキシベタイン型には、アルキルベタインしかなく、ラウリルベタインが、その代表例である。  また、２−アルキルイミダゾリンの誘導型としては、２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタインだけであり、２−ウンデシル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタインが、その代表例として挙げられる。  また、グリシン型として、アルキル（またはジアルキル）ジエチレントリアミノ酢酸があり、その代表例として、ジオクチルジエチレントリアミノ酢酸がある。
【０１０５】
さらに、上掲のものに加えて、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ラウリルサルコシン、サポニン、ＢＲＩＪ３５、アルキルアリルポリエーテルアルコール、高級アルコール硫酸化物、Ｎ−ココイル−Ｌ−アルギニンエチルエステルＤＬ−ピロリドンカルボン酸塩、Ｎ−ココイル−Ｎ−メチルアミノエチルスルホン酸ナトリウム、コレステロール、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン、スクワラン、ステアリルアルコール、ステアリン酸ポリオキシル４０、セタノール、セトマクロゴール１０００、セバシン酸ジエチル、ノニルフェノキシポリオキシエチレンエタン硫酸エステルアンモニウム、ポリオキシエチレンオレイルアミン、ポリオキシエチレンソルビットミツロウ、ポリオキシル３５ヒマシ油、マクロゴール４００、Ｎ−ヤシ油脂肪酸アシルＬ−アルギニンエチル・ＤＬ−ピロリドンカルボン酸塩、ラウリルジメチルアミンオキシド液、ラウロマクロゴール、メチルセルロース、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油２０およびポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、ＣＨＡＰＳ、デオキシコール酸、ジギトニン、ｎ−ドデシルマルトシド、ノニデットＰ４０、ｎ−オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ラウリル酸シュクロース、ドデシルポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ，ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルフォネート等も利用することができる。
【０１０６】
上掲の各種界面活性剤は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの工程において使用されることが重要であり、その使用方法は特に限定されない。  例えば、プローブ液またはプローブ希釈液中に混合されていてもよいし、プローブ液とは別に調製した界面活性剤を含有する溶液を、プローブ液を塗抹部位に塗布する前、同時または後に添加してもよいし、当業者は適宜変更することができる。
【０１０７】
なお、本発明において、必要に応じて、陽性コントロールフローブを調製することもできる。  例えば、まず、Ｕ９３７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５９３．２）のゲノムＤＮＡの抽出と精製を行うために、３７℃、５％炭酸ガスインキュベーター内で、ＲＰＭＩ１６４０培地（２５ｍｌ）を入れた細胞培養フラスコ（１７５ｃｍ３）内でＵ９３７細胞を培養する。
【０１０８】
Ｕ９３７培養液を５０ｍｌの遠沈管に入れ、４℃にて、２２０×ｇで１０分間遠心分離し、Ｕ９３７細胞を回収する。  細胞を１０ｍｌのＰＢＳで懸濁洗浄し、再度４℃にて、１８０×ｇで１０分間遠心分離し、細胞を回収する。  その後、上清を廃棄して、細胞を１ｍｌの２００μｇ／ｍｌプロテネースＫ含有１％ＳＤＳ含有ＴＥ溶液で懸濁し、３７℃で３０分間放置する。  フェノール抽出を３〜４回繰り返し、除蛋白を行う。  エタノール沈殿によって析出したゲノムを回収し、５００μｌの２．５μｇリボヌクレアーゼ含有滅菌精製水に溶解し、４２℃で３０分間放置する。  フェノール抽出を２〜３回繰り返し、除蛋白を行う。  エタノール沈殿によって析出したゲノムを回収し、５００μｌのＴＥに溶解する。  その後、吸光度計により濃度を測定し、ジゴキシゲニンラベルに供することにより、陽性コントロールプローブを作製することができる。  また、陽性コントロールプローブは、Ｕ９３７ゲノムを１００ｎｇスポットしたメンブレンに、陽性コントロールプローブをドットハイブリダイゼーションした時に、ハイブリッド形成が確認できるものを用いるのがよい。
【０１０９】
同様に、必要に応じて、陰性コントロールプローブを公知の方法で調製することもできる。
【０１１０】
その他の実施態様
本発明の検出方法を利用したヘモフィリス  インフルエンザ菌の検出および／または同定のためのキットも、本発明によって提供される。  本発明のキットによれば、ＤＮＡを得る工程で使用される酵素（ＤＮＡ露出処理剤）が、少なくとも、リゾスタフィン、リゾチーム、Ｎ−アセチルムラミダーゼ、ザイモラーゼからなるグループから選択される１種以上の酵素、界面活性剤が添加されたプローブ液、それに、１種以上の検出用ＤＮＡプローブを具備している。  本発明のキットには、以下の実施例に例示するような、血液分離試薬、酵素前処理試薬、酵素試薬、アセチル化試薬、プローブ液、ブロッキング試薬、標識抗体、標識抗体希釈液、発色前処理液−１、発色前処理液−２、発色試薬、対比染色液、ＰＢＳ原液、ハイブリダイゼーション原液、標識抗体洗浄液、発色試薬洗浄液、ＡＰＳコートスライドグラス、プローブ希釈液、バッファーＡ等を利用することが可能である。  これらの内、少なくとも、酵素試薬とプローブ液とを含むことが好ましい。  また、クロロホルム、エタノール、無水酢酸、ＤＭＳＯ、ＰＭＳＦ、ホルムアミド、酢酸、塩酸、水酸化ナトリウム等の各種試薬を用いることも可能である。  さらに、低速遠心機、恒温器、血球計算盤、振とう機、湿潤箱、恒温槽、光学顕微鏡、可変式ピペット、採血管、チップ、ピペット、染色ビン、メスシリンダー、注射筒、０．２μｍシリンジトップフィルターなどの器具を装備していてもよい。
【０１１１】
本発明によれば、生体由来の食細胞を含む臨床検体中に含まれる、食細胞によって貪食された外来微生物の遺伝子をモニターする方法が提供される。
【０１１２】
また、本発明によれば、原因菌の候補となる微生物の遺伝子を同定する工程を含み、同定された結果に基づいて敗血症原因菌または菌血症原因菌を特定する方法も提供される。  この方法によれば、様々な敗血症が疑われた患者血液の診断に実際に応用したところ、投与された抗菌薬の影響を受けることなく、血液培養法に比べて約４倍の感度で起因菌を検出することができ、検出菌株の一致率は良好であることが明らかになっている。  そして、血液培養では、検査に少なくとも３日以上、通常は１４日程度を要するのに比較して、本発明の方法によれば全操作完了までに約８時間という極めて短時間の簡便な操作によって正確な結果を得ることができる。  従って、この方法によれば、敗血症または菌血症などの、速やかに、かつ的確な対処が必要とされる感染症の診断や予後診断のモニター等において有用マーカーが提供されるのである。
【０１１３】
また、本発明のプローブの塩基配列情報を参照してプライマーをデザインすれば、ハイブリダイゼーションを行わなくとも、ＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅によって、感染症原因菌の同定も可能となるのである。
【０１１４】
さらに、本願発明のプローブまたはその断片をＤＮＡチップに組み込んで利用できることも明らかである。  そうすれば、ＤＮＡチップを用いて、ヘモフィリス  インフルエンザ菌の存在の確定が可能となる。
【０１１５】
加えて、本発明で開示した塩基配列は、ヘモフィリス  インフルエンザ菌のゲノミックＤＮＡをランダムにクローニングして得られたものであり、それ故、本発明の塩基配列の有用性はその相補鎖にまで及ぶものである。  さらに、野性株が保有するＤＮＡに変異部分が存在することは当然考えられるが、一般的に、本発明のプローブと７０％程度、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有する塩基配列は、本発明の目的を達成することができると考えられるので、本発明にはこれら相同配列も当然に包含されるものである。
【０１１６】
Ａ．ヘモフィリス インフルエンザ菌の検出および同定
臨床検体からのヘモフィリス  インフルエンザ菌の一般的な検出および同定のための手順の具体例を、以下に詳述する。
【０１１７】
（１）  採血および血液検体の処理
臨床検体として、敗血症が疑われた患者より採取した血液検体を用いる。  各患者からヘパリン加静脈血１０ｍｌを採取し、採取した血液と血液分離試薬（塩化ナトリウム２２５ｍｇ、デキストラン（分子量：２００，０００〜３００，０００）１．５ｇ、滅菌精製水にて全量２５ｍｌに調製したもの）を４：１の割合で混和した後、３７℃で３０分間静置することにより、白血球画分（上層）を取得する。  このようにして得た白血球画分を４℃にて１６０×ｇで１０分間遠心分離することで、白血球を得る。  次に、得られた白血球のペレットに滅菌精製水１ｍｌを加えて懸濁し、これに直ちに過剰量のＰＢＳ（塩化ナトリウム１８．２４ｇ、リン酸一水素ナトリウム１２水和物６．０１２ｇ、リン酸二水素ナトリウム２水和物１．１２３ｇ、滅菌精製水にて全量１２０ｍｌにしたもの（ＰＢＳ原液）を滅菌精製水にて２０倍に希釈したもの）を加えて等張化した後に、再度４℃下で、１６０×ｇで１０分間遠心分離を行う。
【０１１８】
（２）  白血球の固定
３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ、ＳＩＧＭＡ社）をスライドグラス（商品番号ＭＳ３１１ＢＬ、日本エアーブラウン社製）にコートしたＡＰＳコートスライドグラスを使用する。
【０１１９】
ＡＰＳコートスライドグラスの作製に当たって、まず、スライドホルダーにスライドグラス（ＭＳ３１１ＢＬ）を固定した後、希釈した中性洗剤中に３０分以上浸して洗浄し、水道水で洗剤を十分に取り除き、次に、スライドグラスを精製水にて洗浄し、高温（１００℃以上）で十分に乾燥させた後、室温で放置冷却する。  その後、スライドグラスを２％ＡＰＳ含有アセトンに１分間浸し、直ちにアセトン及び滅菌精製水で順次軽く洗浄した後、風乾する。  さらに再度、スライドグラスを２％ＡＰＳ含有アセトンに１分間浸し、直ちにアセトンおよび滅菌精製水で順次軽く洗浄する。  その後、風乾する操作を行った後に、４２℃で乾燥させて、ＡＰＳコートスライドグラスを作製する。
【０１２０】
白血球画分を、４℃にて１６０×ｇで１０分間遠心分離することにより得た白血球ペレットに、少量のＰＢＳを加えて懸濁し、血球計算盤を用いて白血球数を計測する。
【０１２１】
細胞数が１×１０５個／ウェルとなるようにＰＢＳで調製した白血球懸濁液５μｌを、ＡＰＳコートスライドグラスの各ウェルに白血球が単層に広がるように塗抹し、完全に風乾することにより、白血球をＡＰＳコートスライドグラスに支持させる。
【０１２２】
その後、カルノア固定液（エタノール：クロロホルム：酢酸＝６：３：１で混合して得た固定液）に２０分間浸した後、７５％エタノール液に５分間浸し、完全に風乾させる。
【０１２３】
（３）  白血球細胞膜の透過性亢進処理
ＰＢＳに１０分間浸した後、酵素前処理試薬（サポニン１．２５ｇ、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（比重１．０６８〜１．０７５（２０／４℃）、ｐＨ（５ｗ／ｖ％）  ５．５〜７．５）１．２５ｍｌ、ＰＢＳ原液２５ｍｌを混合し、滅菌精製水で全量を５０ｍｌに調製したもの）を滅菌精製水で１０倍に希釈した溶液に浸し、振とう機で１０分間振とうさせる。
【０１２４】
（４）  菌体壁の溶菌酵素処理
スライドグラス１枚につき酵素試薬（ザイモラーゼ２００単位／ｍｌ、Ｎ−アセチルムラミダーゼ１，０００単位／ｍｌ、リゾチーム１００，０００単位／ｍｌおよび／またはリゾスタフィン１００単位／ｍｌ）に酵素試薬溶解液（ＰＢＳで０．１ｍｏｌ／ｌ  フェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）含有ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を１００倍希釈して調製したもの）を１ｍｌ加えて酵素試液を調製する。  その後、感染症原因菌のＤＮＡを得るために、３７℃〜４２℃の湿潤箱中で、この酵素試液１ｍｌを白血球塗抹部位に滴下し、３０分間静置することによって、感染症原因菌のＤＮＡを露出させる。  その後、０．２ｍｏｌ／ｌ  塩酸含有ＰＢＳ（ＰＢＳ原液に塩酸を加え、滅菌精製水にて２０倍希釈し、塩酸の終濃度を０．２ｍｏｌ／ｌ  に調製したもの）に浸し、そのまま振とう機上で１０分間振とうする。
【０１２５】
（５）  細胞膜タンパク質のアセチル化
アセチル化試薬（トリエタノールアミン７．４６ｇと適量の塩酸を含み、適量の滅菌精製水で全量を５０ｍｌとしたもの）に無水酢酸を加え、滅菌精製水で１０倍希釈し、無水酢酸の終濃度を０．８％に調整したアセチレーション試薬にスライドグラスを浸し、振とう機上で１０分間振とうする。  その後、７５％、８５％、９８％エタノールに、順次３分間ずつ浸し、完全に風乾させる。
【０１２６】
（６）  菌体ＤＮＡのアルカリ処理［二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性］
スライドグラスを、７０ｍｍｏｌ／ｌ  水酸化ナトリウム含有ＰＢＳ（ＰＢＳ原液に水酸化ナトリウムを加え、滅菌精製水で２０倍希釈し、水酸化ナトリウムの終濃度を７０ｍｍｏｌ／ｌ  に調製したもの）に３分間浸す。  その後、７５％、８５％、９８％エタノールに、順次、３分間ずつ浸し、完全に風乾させる。
【０１２７】
（７）  ハイブリダイゼーション
プローブ希釈液（０．５％ＳＤＳ、サケ精子ＤＮＡ６００μｌ、１００×デンハート溶液５０μｌ、ハイブリダイゼーション原液５００μｌ、ホルムアミド２２５０μｌ、５０％硫酸デキストラン１０００μｌが含まれる）にて調製したジゴキシゲニン標識ＤＮＡプローブ１５ｎｇを含有する液（プローブ液、１．０ｎｇ／μｌ）を塗抹部位に塗布し、３７℃〜４２℃の湿潤箱内に２時間静置させる。  ジゴキシゲニン標識ＤＮＡプローブは、ニックトランスレーション法で調製する。  その後、ハイブリダイゼーション洗浄液（ハイブリダイゼーション原液（塩化ナトリウム１３．１５ｇ、クエン酸三ナトリウム２水和物６．６１５ｇ、滅菌精製水にて全量７５ｍｌに調製したもの、前出）をハイブリダイゼーション原液：滅菌精製水：ホルムアミド＝５：４５：５０の割合で混合して調製したもの）を３つの染色ビンに用意し、順次４２℃で１０分間ずつ浸す。  その後、ＰＢＳに浸し、そのまま振とう機上で１０分間振とうする。
【０１２８】
プローブＨＩ−２１−８、ＨＩ−５７−３４、ＨＩ−６３−４３およびＨＩ−６５−３９に、ジゴキシゲニンを標識付けするために、ニックトランスレーション法を用いる。
【０１２９】
（８）  ブロッキング
Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った後、ブロッキングの操作を行う。
【０１３０】
具体的には、湿潤箱内にてスライドグラス１枚につきブロッキング試薬（ウサギ正常血清２ｍｌとＰＢＳ原液０．５ｍｌを含み、滅菌精製水で全量を１０ｍｌに調製したもの）１ｍｌを塗抹部位に滴下し、これを３０分間静置する。  その後、ブロッキング試薬を除去する。
【０１３１】
（９）  標識抗体との反応
標識抗体（アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液１．０５単位、バッファーＡ（トリエタノールアミン７４６ｍｇ、塩化ナトリウム１７．５ｍｇ、塩化マグネシウム６水和物２０．３ｍｇ、塩化亜鉛１．３６ｍｇ、ウシ血清アルブミン１０００ｍｇおよび塩酸適量を含み、滅菌精製水適量で全量を１００ｍｌに調製したもの）１２．６μｌにて全量を１４μｌに調製したもの）を、標識抗体希釈液（トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン８．４８ｍｇ、塩化ナトリウム６．１４ｍｇおよび適量の塩酸を含み、適量の滅菌精製水で全量を０．７ｍｌに調製したもの）で５０倍希釈した標識抗体液を調製し、この標識抗体液を塗抹部位に１０μｌずつ滴下し、これを３０分間静置する。  その後、標識抗体洗浄液（１ｍｌのポリソルベート２０と５０ｍｌのＰＢＳ原液を含み、滅菌精製水で全量を１００ｍｌに調製したもの）を１０倍に希釈した溶液に浸し、そのまま振とう機上で１０分間振とうさせた。  この操作を２回繰り返した後、発色前処理液−１（トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン６．０６ｇ、塩化ナトリウム２．９２ｇおよび適量の塩酸を含み、適量の滅菌精製水で全量を５０ｍｌに調製したもの）と発色前処理液−２（塩化マグネシウム６水和物５．０８ｇを含み、滅菌精製水で全量を５０ｍｌに調製したもの）を等量混合し、滅菌精製水で５倍に希釈した発色前処理液に浸し、そのまま振とう機上で１０分間振とうする。
【０１３２】
（１０）  シグナル検出
スライドグラス１枚につき発色試薬［ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェイト（ＢＣＩＰ）溶液、ｐＨ  ９．０〜１０．０：ＮＢＴ  ３．３ｍｇ、ＢＣＩＰ  １．６５ｍｇ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド９９μｇ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン１２１ｍｇ、適量の塩酸、塩化ナトリウム５８．４ｍｇおよび塩化マグネシウム６水和物１０１．６ｍｇを含み、適量の滅菌精製水で全量を１０ｍｌに調製したもの］１ｍｌを、０．２μｍシリンジトップフィルターを装着したディスポーザブルシリンジを用いてろ過しながら、スライドグラスの塗抹部位に滴下し、湿潤箱内で、３７℃で、３０分間遮光静置する。  その後、発色試薬洗浄液（トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン６０６ｍｇ、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム２水和物１８６ｍｇおよび適量の塩酸を含み、適量の滅菌精製水で全量を５０ｍｌに調製したもの）を１０倍に希釈した溶液に５分間浸し、風乾した後、対比染色液（ファストグリーンＦＣＦ（食用緑色３号）５０ｍｇ、滅菌精製水にて全量５０ｍｌに調製したもの）を１０倍に希釈した溶液および１％酢酸溶液に浸す。  その後、前記発色試薬洗浄液を１０倍に希釈した溶液に再度浸して余分の対比染色液を洗い流し、完全に風乾させる。
【０１３３】
（１１）  判  定
判定は、光学顕微鏡で鏡検（×１，０００）した場合に、単一のウェル内の対比染色液により染まった細胞に於いて、青紫色の発色シグナルが１つでも認められた場合に「陽性」と判定する。
【０１３４】
Ｂ．貪食サンプルからのヘモフィリス インフルエンザ菌の検出
貪食サンプルからのヘモフィリス  インフルエンザ菌の一般的な検出手順の事例を以下に詳述する。
【０１３５】
（１）  貪食サンプルの作製
（ｉ）  Ｕ９３７細胞の調製
３７℃、５％炭酸ガスインキュベーター内で、ＲＰＭＩ  １６４０培地（２５ｍｌ）を入れた細胞培養フラスコ（１７５ｃｍ３）内にて、Ｕ９３７細胞（ヒト単球株化細胞、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５９３．２）を培養する。  次に、Ｕ９３７細胞培養液を、５０ｍｌの遠沈管に入れ、４℃、２２０×ｇで１０分間遠心分離し、Ｕ９３７細胞を回収する。  その後、回収したＵ９３７細胞を、２００μｌのＰＢＳで懸濁し、血球計算盤で細胞数を計算し、細胞数を約１×１０４個／μｌ〜約２×１０４個／μｌに調製する。
【０１３６】
（ｉｉ）  細菌貪食サンプルの調製
ヘモフィリス  インフルエンザ菌を、５ｍｌのＢＨＩ培養液に植菌し、３７℃で８時間以上培養する。  培養した菌液を、４℃、２，０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌する。  上清を捨てた後、菌のペレットを５ｍｌのＰＢＳで懸濁し、再度４℃、２，０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌する。  集菌した菌を５ｍｌのＰＢＳで懸濁した後、ＰＢＳにて希釈して、吸光度計により菌液の濁度（Ｏ．Ｄ．＝６００ｎｍ）を、０．０１６〜０．０２４にしたものを１５ｍｌ調製する。  このようにして得た菌液は、１７５ｃｍ３の培養用フラスコに移し、３０分間室温で静置させる。
【０１３７】
ヘパリン加健常ヒト血液５０ｍｌを採取し、血球分離試薬を４：１の割合で加え、３７℃で３０分間静置し、白血球画分を分取し、これをＰＢＳで５０ｍｌにする。  培養用フラスコ内の上清を静かに捨て、ＰＢＳで希釈した白血球画分を１０ｍｌずつフラスコに加え、室温で１０分間静置させる。  培養用フラスコ内の上清を捨て、フラスコの底に付着した白血球を０．０２％ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ  １０ｍｌで１５ｍｌの遠沈管に回収し、４℃、１４０×ｇ〜１８０×ｇで１０分間遠心分離し、白血球を収集する。  収集した白血球に赤血球の混入が認められたときは、１ｍｌの滅菌精製水にて白血球の沈渣を穏やかに懸濁して溶血させた後、１４ｍｌのＰＢＳを加えて等張化し、再度４℃、１４０×ｇ〜１８０×ｇで１０分間遠心分離を行い、白血球を収集する。  収集した白血球をＰＢＳで懸濁し、血球計算盤にて細胞数を計測し、１×１０４個／μｌ〜５×１０４個／μｌに調製する。
【０１３８】
このようにして得られた貪食サンプルを、ＨＩ貪食サンプルとする。
【０１３９】
当該貪食サンプルの利点として、（１）  ヘモフィリス  インフルエンザ菌が検出される臨床検体の入手が困難であり、そのため本発明のプローブの特異性評価などの各種試験ができないという問題点を、臨床検体の代わりに人為的に作製した当該貪食サンプルを使用することにより回避できること、（２）  本発明のプローブまたはキット等の特異性試験、感度試験、再現性試験などの性能試験に利用できること、（３）  貪食サンプルで得られた各種試験結果を、臨床検体に適用できること、（４）  温度条件、反応時間条件、酵素処理条件などの各種条件設定に利用できること、などが挙げられる。
【０１４０】
（ｉｉｉ）  塗抹固定
（ｉ）で得たＵ９３７細胞と、（ｉｉ）で調製したＨＩ貪食サンプルを、ＡＰＳコートスライドグラスの各ウェルに５μｌずつ塗抹し、風乾させる。
【０１４１】
次に、カルノア固定液にスライドグラスを２０分間浸した後、７５％エタノールに５分間浸し、カルノア固定液を洗浄して風乾させた後、試験に使用するまで４℃で保存する（Ａ（２）の項目を参照）。  次いで、固定サンプルの前処理を、Ａ（３）の項目に記載の手順に従って行う。
【０１４２】
（２）  貪食サンプルの規格及び試験方法
（ｉ）  細胞数
細菌貪食サンプルのスライドグラスに塗抹固定する細胞数を、約５．０×１０４〜約２．５×１０５個／ウェルとし、また、Ｕ９３７細胞の細胞数を、約５．０×１０４〜約１．０×１０５個／ウェルとする。
【０１４３】
（ｉｉ）  貪食率
スライドグラスに塗抹固定した細菌貪食サンプルをアクリジンオレンジ染色液で染色し、蛍光顕微鏡（×１，０００）で無作為に約２００個の細胞を計測する。
【０１４４】
計測した細胞の中で、細胞内に細菌を貪食している細胞（貪食に特徴的な形態変化が認められた細胞）を陽性細胞とし、以下の数式に従って、貪食率を算出する。
【０１４５】
【数１】
2004173628.tif 000004
【０１４６】
（３）  試験方法
調製した貪食サンプルを検体とする。  使用したＨＩ貪食サンプルを塗抹したスライドグラスを用いて、各プローブの特異性を検討する。
【０１４７】
（４）  結  果
プローブＨＩ−２１−８、ＨＩ−５７−３４、ＨＩ−６３−４３およびＨＩ−６５−３９とともに、貪食細胞中に取り込まれたヘモフィリス  インフルエンザ菌由来のＤＮＡと特異的にハイブリダイズすることが判明する。  また、（プローブＨＩ−２１−８、ＨＩ−５７−３４、ＨＩ−６３−４３およびＨＩ−６５−３９の二つ以上を含む）混合プローブによれば、単独に比較して強いシグナルが得られることが判明する。  このことから、使用するプローブは複数種混合して使用するのが好ましい。
【０１４８】
貪食サンプルで得られた結果は、臨床検体に適用できるので、本発明のプローブは臨床検体においても有用であることが証明される。
【０１４９】
【実施例】
本発明を、実施例に沿って以下に詳細かつ具体的に説明するが、これら実施例の開示に基づいて、本発明が限定的に解釈されるべきでないことは勿論である。
【０１５０】
実施例１：ヘモフィリス インフルエンザ菌検出用プローブの調製
臨床菌株ヘモフィリス  インフルエンザ菌を、チョコレートＩＩ寒天培地（日本ベクトンディッキンソン社製）で一晩培養し、培養菌体を集菌して、溶菌工程においてＮ−アセチルムラミダーゼＳＧを加えた。  そして、Ｓａｉｔｏ−Ｍｉｕｒａ変法（”Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｙ  ｐｈｅｎｏｌｔｒｅａｔｍｅｎｔ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  ｖｏｌ．７２，ｐｐ．６１９−６２９（１９６３））に準じて、ゲノミックＤＮＡを抽出した。
【０１５１】
抽出したＤＮＡ  １０μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ  １０Ｕで完全消化し、ベクターｐＧＥＭ−３Ｚ（ＰＲＯＭＥＧＡ社製）にランダムクローニングした。  クローン化されたプラスミドＤＮＡを後出の実施例３−（１）に記載の方法に従って抽出し、ナイロンフィルターに転写した。  ヘモフィリス  インフルエンザ菌標準菌株ゲノミックＤＮＡをジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰでラベルしたものをプローブに用い、サザンブロット  ハイブリダイゼーションを実施した。  すなわち、ナイロンフィルターを４５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、４２℃の条件下で終夜ハイブリダイゼーションを行った後、実施例２に記載の方法に従い、ナイロンフィルターの洗浄、発色を実施した。  その結果、ヘモフィリス  インフルエンザ菌ゲノミックＤＮＡと特異的に反応した４種のＤＮＡ断片が選抜された。
【０１５２】
なお、ここで選抜された各プローブを、プローブＨＩ−２１−８、ＨＩ−５７−３４、ＨＩ−６３−４３およびＨＩ−６５−３９と命名した。
【０１５３】
実施例２：プローブの種特異性の検討
実施例１で選抜した各プローブと各種感染症原因菌株のＤＮＡとの反応性を、以下の方法により検討した。
【０１５４】
まず、検討対象菌株として、ヘモフィリス  インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  臨床分離株）、ヘモフィリス  パラインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  臨床分離株）、スタフィロコッカス  アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ１２６００）、スタフィロコッカス  エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＡＴＣＣ１４９９０）、エシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ１１７７５）、クレブシエラ  ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  臨床分離株）、エンテロバクター  クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ  臨床分離株）、エンテロコッカスフェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ１９４３３）、シトロバクター  フレウンディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ  臨床分離株）、バクテロイデス  フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＳＭＵＭ−２２７５）、シュードモナス  ジミヌタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ  ＩＦＯ１４２１３）、ミクロコッカス  ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ  ＪＣＭ１４６４）およびＵ９３７（ヒトゲノムＤＮＡ）を準備した。
【０１５５】
そして、各臨床菌株に関して、実施例１に記載の方法に従って、各菌株が保有するＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡの一定量（例えば、１０〜１００ｎｇ）をナイロンフィルターにスポットして、アルカリ変性したものをドット  ブロット  ハイブリダイゼーションの試料とした。  次いで、Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−１１−ｄＵＴＰ（ＢＲＬ社製）でラベルしたプローブで、マニアティスのマニュアル（Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８９））に従い、４５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、４２℃の条件下で、終夜ハイブリダイゼーションを実施した。  終夜ハイブリダイゼーションを終えた試料に関して、マニュアルに従い、５５℃にて０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる２０分間の洗浄を２回行った後に、Ａｎｔｉ−Ｄｉｇ−ＡＬＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（ＢＲＬ社製）で検出および発色させ、ハイブリダイゼーションの状況を確認した。
【０１５６】
その結果、プローブＨＩ−２１−８、ＨＩ−５７−３４、ＨＩ−６３−４３およびＨＩ−６５−３９は、いずれもヘモフィリス  インフルエンザ菌のゲノムＤＮＡに対してのみ特異的に反応することが確認された。
【０１５７】
実施例３：塩基配列の解析
実施例２で種特異性が確認されたＤＮＡプローブ（計４本）の塩基配列を、下記の方法に従って決定した。
【０１５８】
（１）  プラスミドＤＮＡの調製
サブクローン化された（塩基配列を決定すべき）挿入断片をｐＧＥＭ−３Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に含んだ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２，ＪＭ１０９形質転換体を、５ｍｌのＬｕｒｉａ−Ｂａｃｔａｎｉ  Ｍｅｄｉｕｍ（ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ，１０ｇ／ｌ；ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／ｌ；ＮａＣｌ，１０ｇ／ｌ；５Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ  ７．０に調整）に植菌し、一晩培養した。  培養液を遠心分離（５，０００ｒｐｍ、５分間）して集菌した。  沈殿物に２．５ｍｇ／ｍｌの濃度でリゾチーム（Ｓｉｇｍａ）を含む５０ｍＭグルコース／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液を１００μｌ  加え、室温で５分間放置した。  得られた懸濁液に１％の濃度でドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を含む０．２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加えて混合した。
【０１５９】
５Ｍ酢酸カリウム水溶液（ｐＨ  ４．８）１５０μｌ  をさらに加えて混合し、１５分間氷冷した。  そして、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１５分間）して得た上清を、フェノール／ＣＨＣｌ３処理し、上清に２倍量のエタノールを加え、さらに遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、５分間）して沈澱を得た。  この沈澱物を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）／０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液１００μｌ  に溶解し、１０ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ）溶液を加え、室温で１５分間放置した。  この調製物に０．１Ｍ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ  ４．８）を３００μｌ加え、フェノール／ＣＨＣｌ３処理し、上清にエタノールを加えて沈殿を得た。  この沈澱物を乾燥し、１０μｌの蒸留水に溶解したものをＤＮＡ試料とした。
【０１６０】
（２）  塩基配列決定の前処理
塩基配列決定の前処理をＡｕｔｏＲｅａｄ（登録商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ファルマシア製）を用いて行った。
【０１６１】
まず、鋳型となるＤＮＡが３２μｌ  溶液中に５〜１０μｇの濃度になるように調整した。  １．５ｍｌのミニチューブ（エッペンドルフ）に、鋳型ＤＮＡ３２μｌを移し、２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を８μｌ  加えて穏やかに混合した。  そして、軽く遠心した後、室温で１０分間放置した。  ３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ４．８）７μｌ  と蒸留水４μｌ  を加え、さらにエタノールを１２０μｌ  加えて混合し、エタノール−ドライアイス上で１５分間放置した。  そして、１５分間遠心分離して沈澱したＤＮＡを集め、注意しながら上清を除去した。  得られた沈殿物を７０％エタノールで洗浄し、１０分間遠心分離した。  そして、注意しながら再度上清を除去し、減圧条件下で沈澱物を乾燥した。
【０１６２】
沈殿物を蒸留水１０μｌに溶解し、蛍光性のプライマー〔Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ；５’−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｄ［ＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ（配列番号：５）］−３’、（１．６ｐｍｏｌ／μｌ  ；０．４２Ａ２６０ｕｎｉｔ／ｍｌ）；Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ，５’−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｄ［ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ（配列番号：６）］−３’  （２．１ｐｍｏｌ／μｌ；０．４２Ａ２６０ｕｎｉｔ／ｍｌ）〕２μｌ（０．４２Ａ２６０ｕｎｉｔ／ｍｌ、４〜６ｐｍｏｌ）とアニーリング用緩衝液２μｌを加え穏やかに混合した。  そして、軽く遠心した後、６５℃で５分間熱処理を行い、素早く３７℃の条件下に置き、そこで１０分間保温した。  保温後１０分以上室温で放置し、軽く遠心した。  そして、延長用緩衝液１μｌとジメチルスルホキシド３μｌを加えたものを試料とした。
【０１６３】
４本のミニチューブにＡ、Ｃ、ＧおよびＴと記入し、それぞれのチューブにＡＭｉｘ（ｄｄＡＴＰをｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｃ７ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰと共に溶解したもの）、Ｃ  Ｍｉｘ（ｄｄＣＴＰをｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｃ７ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰと共に溶解したもの）、Ｇ  Ｍｉｘ（ｄｄＧＴＰをｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｃ７ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰと共に溶解したもの）およびＴ  Ｍｉｘ（ｄｄＴＴＰをｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｃ７ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰと共に溶解したもの）を、２．５μｌ  ずつ分注した。
【０１６４】
なお、それぞれの溶液は使用時までは水中で保存し、使用時には３７℃で１分間以上保温してから使用した。  希釈したＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；６〜８ｕｎｉｔｓ／２μｌ）２μｌをＤＮＡ試料に加え、ピペッティングもしくは穏やかな混合により、完全に混合した。  混合後すぐに、この混合液を４．５μｌずつ保温しておいた４種の溶液に分注した。  なお、分注に際しては新しいチップを用いた。
【０１６５】
３７℃で５分間保温し、停止溶液を５μｌずつそれぞれの反応液に加えた。  この分注においても、新しいチップを用いた。  ９０℃で２〜３分間保温し、すぐに氷中で冷却した。
【０１６６】
そして、電気泳動には、１レーン当たり４〜６μｌの試料を泳動した。
【０１６７】
（３）  塩基配列の決定
実施例１〜２に開示した、ヘモフィリス  インフルエンザ菌が保有するＤＮＡに対して特異性を有するプローブそれぞれの塩基配列の決定を、泳動温度４５℃、泳動時間６時間として、Ａ．Ｌ．Ｆ．  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒシステム（ファルマシア社製）を用いて行った。  各上流と下流から明らかになった配列から順次プライマーをデザインし、上記の操作を繰り返した。
【０１６８】
その結果、プローブＨＩ−２１−８（配列番号１）、ＨＩ−５７−３４（配列番号２）、ＨＩ−６３−４３（配列番号３）およびＨＩ−６５−３９（配列番号４）の各塩基配列の全容が明らかになった。
【０１６９】
【発明の効果】
このように、本発明の検出用プローブによれば、それをｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに適用することで、極めて短時間の内に、検出対象菌に対して安定なシグナルを発現することができるため、迅速かつ的確な検査結果をもたらすことが可能となる。
【０１７０】
また、これにより、ヘモフィリス  インフルエンザ菌のみならず、敗血症や菌血症などの疾患に対する診断材料を医療現場に迅速に提供でき、人命救助の観点からも多大な貢献が期待されるものである。
【０１７１】
【配列表】
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