(57)【要約】【課題】  急性呼吸窮迫症候群、胎便吸引症候群、肺胞性炎症などの肺不全の治療に有効な肺胞洗浄用医薬組成物を提供する。【解決手段】  界面活性物質を薬学的に許容しうる水性媒体に希釈する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的に許容しうる水性媒体に希釈した界面活性物質を含む肺胞洗浄用医薬組成物。
【請求項２】
前記希釈界面活性物質が前記組成物中に０．１〜５０mg／mlで存在する請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記希釈界面活性物質が前記組成物中に０．５〜２０mg／mlで存在する請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記希釈界面活性物質が前記組成物中に２〜１０mg／mlで存在する請求項２記載の医薬組成物。
【請求項５】
哺乳動物から単離した天然肺胞界面活性物質、又はその断片を含む請求項１記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記哺乳動物が、ウシ、ブタ及びヒトからなる群より選ばれる請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記天然肺胞界面活性物質が、界面活性物質タンパク質ＳＰ−Ｂ及びＳＰ−Ｃからなる群より選ばれる請求項５記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記天然肺胞界面活性物質が実質的に単離したヒト肺胞界面活性物質（ＳＰ）タンパク質である請求項５記載の医薬組成物。
【請求項９】
１種以上のリン脂質を含み、ポリペプチドを含まない請求項１記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、呼吸窮迫症候群の治療；肺組織炎症からの炎症滲出液の除去；及び新生児における胎便吸引症候群の治療を含む種々の治療的使用に適したポリペプチド、タンパク質及び他の種々の有機分子を含む界面活性物質分子からなる肺胞洗浄用医薬組成物関する。
【背景技術】
【０００２】
関連出願のクロス・リファレンス
本願は、1995年６月７日出願の同時係属出願第08/488,123号の一部継続出願であり、その出願は1995年４月11日出願の出願第08/419,824号の一部継続出願であり、その出願は1993年５月12日出願の出願第08/060,833号の継続出願であり（現在米国特許第 5,407,914号) 、その出願は1991年６月14日出願の出願第07/715,397号の一部継続出願であり（現在は米国特許第 5,260,273号) 、その出願は1989年１月４日出願の出願第07/293,201号の一部継続出願であり（現在は米国特許第5,164,369号) 、その出願は1988年１月６日出願の出願第 141,200号の一部継続出願である（現在は出願放棄している) 。上記の明細書の記載は本願明細書に含まれるものとする。
【０００３】
１．胎便吸引症候群
米国では、胎便で汚染された羊水は全分娩の５〜２０％に存在する。米国では、毎年、約２6,０００人の新生児が長期の換気処置を必要とする進行性肺不全、低酸素症、炭酸過剰症及びアシドーシスを含む胎便吸引症候群（ＭＡＳ) (Wiswellら, Pediatr. Clin. North Am., 40:955-981, 1993; Gregory ら, J. Pediatrics, 85:848-852, 1974)を発症している。致命的な症例には生存のために模型人工肺(extracorporeal membrane oxygenation(ECMO)) が必要である(Bascik, Pediatr. Clin. North Am., 24:463-479, 1977; Moront ら, J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 97:706-714, 1990; Toomasian ら, ASAID Trans., 34:140-147, 1988) 。死亡率は、４〜１２％でばらつきがある。（例えば、Wiswell ら, Id., 1993; Coltar ら, Br. J. Obstet. Gynecol., 96:411-414, 1989; Davisら, Am. J.Obstet. Gynecol., 151:731-736, 1985; Faleiglia, Obstet. Gynecol., 71:349-353, 1988 参照) 。
胎便吸引症は、低酸素血症、血管短絡及びコンプライアンス減少をきたすことがある(Tylerら, Pediatrics 62:454-459, 1978; Chen ら, Crit. Care. Med.,13:233-236, 1985) 。実験論文から、胎便の吸入後に胸膜下肺胞の虚脱が起こること(Nieman ら, J. Appl. Physiol., 58:129-136, 1985; Clarkら, Pediatr. Res., 13:532, 1979)及び肉眼的及び顕微鏡的拡張不全が生じること(Clarkら, J.Pediatr., 110:765-770, 1987; Sun ら, J. Appl. Physiol., 77:1961-1971, 1994; Sunら, Acta Paediatr., 82:182-189, 1993; Sun ら, Biol. Neonate, 63:96-104, 1993; Seo ら, Pediatr. Pathol., 10:539-548, 1990) がわかった。
【０００４】
拡張不全は、微粒子の胎便、いわゆる化学的肺臓炎及び界面活性物質の胎便誘導機能障害による機械的閉塞(Tylerら, Pediatrics, 62:454-459, 1978; Gooding ら, Radiology, 100:131-135, 1971; Tranら, Pediatr. Res., 14:34-38, 1980)に起因するものである。機械的閉塞が胎便誘導肺胞損傷に役割を果たすものであるが、機械的閉塞を予防するろ過胎便の使用は肺機能の低下及び肺胞虚脱をまねいた(Chen ら, Crit. Care Med., 13:233-236, 1985)。これにより、肺組織における界面活性物質に関する胎便の生体内での直接作用が示された。胎便吸引後に採取された拡張不全の肺の界面活性物質抽出液は、拡張した肺から採取されたものに比べてウィルヘルミー秤分析での表面張力が弱いことを示し(Clarkら, J.Pediatr. 110:765-770, 1987)、成体ラット及び仔ブタの実験では、胎便吸引の６０分後の洗浄により除去した界面活性物質は表面張力特性が弱かった(Sunら,Acta Paediatr., 82:182-189, 1993; Davey ら, Ped. Res., 16:101-108, 1993)。
界面活性物質に関する胎便の直接作用は、試験管内で示された。界面活性物質の表面活性の用量依存性の低下はヒト胎便によって生じた(Daveyら, Id., 1993;Mosesら, Am J Obstet Gynecol., 164:477-481, 1991)。胎便のクロロホルム抽出液及び水性抽出液は共に活性であった(Sunら, Acta Paediatr., 82:182-189,1993; Moses ら, Am J Obstet Gynecol., 164:477-481, 1991)が、別の実験では(Clarkら, J. Pediatr., 110:765-770, 1987) 有機抽出液のみが活性であった。
【０００５】
界面活性物質の物理的性質の変化の原因となる胎便の成分は、脂肪酸、コレステロール、胆汁酸塩、ビリルビン及びタンパク質分解酵素が含まれる(Clarkら,J. Pediatr., 110:765-770, 1987; Sun ら, Acta Paediatr., 82:182-189, 1993; Moses ら, Am J Obstet Gynecol, 164:477-481, 1991; Henderson ら, Can. J. Surg., 18:64-69, 1975; Lieberman, Gastroenterology, 50:183-190, 1966)。
肺機能障害の発症の他の要因は、『化学的肺臓炎』であった(Gregoryら, J. Pediatrics, 85:848-852, 1974; Bascik, Pediatr. Clin. North Am., 24:463-479, 1977; Tylerら, Pediatrics, 62:454-459, 1978) 。その機能障害ははっきりと定義されなかったが、胎便成分と肺組織の相互作用の結果として起こることが考えられる。また、『化学的肺臓炎』を胎盤吸引によって促進される炎症反応から区別することは困難である(Tylerら, Pediatrics, 62:454-459, 1978; Sun ら, J. Appl. Physiol., 77:1961-1971, 1994; Daveyら, Ped. Res., 16:101-108,1993)。かかる炎症反応は、浮腫、白血球蓄積及び出血を特徴とし、肺の胎便への曝露の２〜５時間後に発生し、唯一の報告書によれば４８時間で重篤度が高まる(Tylerら, Pediatrics, 62:454-459, 1978) 。
炎症応答を開始する胎便成分、及び関係する系を仲介する分子は十分に理解されていない。更に、肺機能に関する炎症応答の影響は求められなかった。
【０００６】
界面活性物質機能が胎便吸引によって害されるという証拠と共に、外因性界面活性物質による治療的介入を目ざして努力された。 Autenらは、１４新生児--７ＭＡＳ及び７呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）で肺炎を伴う--を仔ウシ肺界面活性物質抽出液で治療し、肺機能の改善が見られたが、胸のラジオグラフの透明化が最小限にすぎなかった(Autenら, Pediatrics, 87:101-107, 1991) 。大多数の患者には追加の界面活性物質治療が必要であった。(Davisら, Pediatr. Pulmonol., 13:108-112, 1992も参照) 。
Lotzeらは、ＭＡＳ、肺炎、ヒアリン膜症、新生児の特発性肺高血圧症をもつ２８新生児において４回のボラス用量のウシ界面活性物質に対する応答を比較し、対照グループの同じ２８新生児は空気のみで処置された(J. Pediatr., 122:261-268, 1993)。ウシ界面活性物質をボラス投与するものを含むその実験における新生児全員がＥＣＭＯを必要としたが、界面活性物質治療は肺の仕組みを改善しかつＥＣＭＯに対する時間を短縮することがわかった。最初の実験を界面活性物質グループの１６７患者及び空気プラセボグループの１６１患者を含むように増加した場合、界面活性物質グループにＥＣＭＯの必要の減少が統計的に有意な方法で見られたが疾患が最も重篤でない患者においてのみであった。換気に対する時間、酸素の必要性、流量に対する時間、又は気胸、間質性肺気腫及び慢性肺疾患の頻度には差がなかった(Lotze, Ped. Research, 39:#4 226A, 1996)。
【０００７】
別の実験では、重篤なＭＡＳ（ｎ＝２０）或いは重篤なＲＤＳ（ｎ＝２９）をもつ満期新生児にウシ界面活性物質をボラス投与すると６時間でａ／Ａ比の増大及び酸素指数の低下が生じた (Khammashら, Pediatrics, 92:135-139, 1993) 。しかしながら、両グループのほとんどの新生児には、追加用量の界面活性物質が必要であった。
ＭＡＳの動物モデルにおいて界面活性物質ボラス治療の効能に取り組む実験からの結果が混ぜられた。 Sunらは、成体ラット及び新生児ウサギにヒト胎便スラリーを気管内点滴注入すると肺損傷が引き起こされ、それがブタ肺界面活性物質抽出液のボラス投与によって減少したことを見出した(Sunら, J. Appl. Physiol., 77:1961-1971, 1994; Sunら, Biol. Neonate, 63:96-104, 1993; Sun ら, Am. J. Crit. Care Med., 154:764-770, 1996)。同様に、 Smithも界面活性物質をボラス投与するとＭＡＳ動物モデルの肺機能の改善をもたらすと主張した。(Smithら, 第９回新生児高頻度人工換気年次会議で発表された『胎便吸引症候群（ＭＡＳ）の治療における外因性界面活性物質』, ユタ州スノーバード, 1992年４月２日参照）。
【０００８】
しかしながら、 WiswellらがＭＡＳの仔ブタモデルにおいて２種類の異なる界面活性物質を実験した場合には、６時間かけて平均気道圧及びａ／Ａ比に対照との差が見出されなかった(Wiswellら, Pediatrics Res, 36:494-500, 1994) 。組織学的所見も、治療グループと対照グループで似ていた。従って、ウシ由来又はブタ由来界面活性物質標品が投与される場合、特にボラスとして投与される場合、現在までの実験は結果が意義不明であることを意味している。
ＭＡＳ治療における界面活性物質のボラス戦略の効能が可変及び有限なので、最近は肺胞洗浄を用いる方法に関心が集中してきた。ＭＡＳモデルとして仔ブタ又はウサギを用いる実験に限定され、動物の胎便損傷肺が洗浄液で処置された。研究者らは、界面活性物質を投与する場合に肺機能が改善するが食塩水洗浄のみが用いられる場合には改善されないと主張した(Parankaら, Pediatr Res, 31:625-628, 1992; Ohamaら, Acta Paediatr Japonica, 33:236-238, 1994) 。(Balaramanら, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 153:1838-1843, 1996 も参照) 。同様に、共にＥＣＭＯが予定された重篤なＭＡＳをもつ２ヒト新生児を反復食塩水洗浄、１０ml／kgで処置した後、ウシ界面活性物質を点滴した。両新生児は、ａ／Ａの増大及び胸のラジオグラフの透明化で速やかに応答した(Ibaraら, Acta.Paed. Japonica, 37:64-67, 1995) 。
【０００９】
２．急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）
ＡＲＤＳは、肺の炎症性疾患であり、全ての年齢の人間に起こり、米国では１年で約５０，０００〜１００，０００の人々が関係する。病気が進行するにつれて、肺機能が低下し、機械的換気を必要とし、約４０〜５０％の患者がその疾患で死亡する。
胃の内容物のような損傷物質の吸入、煙又はＮＯ2 を含む有害気体の吸入、肺炎、肺挫傷、外傷、多回輸注、火傷、敗血症、膵炎等を含む多くの開始因子がＡＲＤＳの発症をまねく。初期の疾患は、好中球の蓄積による肺における浮腫応答が特徴であり、フィブリン沈着物及びコラーゲン産生により１週間で慢性に進行する。間質性浮腫と共に上皮細胞に対する損傷が初期相に見られる。
損傷の発生中に固有の界面活性物質が分解して機能を失い、肺胞の拡張不全虚脱が顕著である。
合併症が顕著であり、腎臓、肝臓、胃腸管及びその動脈系を含む末梢器官の不全が共通である。死亡率は、不全を受ける系の数に比例して上昇する。この疾患に特異的な治療法はない。
外因性界面活性物質を用いることにより得られた効能が変動性であるので--特に界面活性物質が非ヒト源に由来する場合又は界面活性物質がボラスとして投与される場合--及び標準洗浄法が用いられる場合にいくぶん意義不明な結果が得られたので、別の治療法及び製剤が必要とされることは明らかである。従って、本明細書に開示される組成物及び方法は、当該技術において記載された治療法及び組成物よりかなり実質的に改善する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、肺の炎症を肺胞界面活性物質で治療するのに下記の３つの条件の組合わせが肺不全を示す種々の内科疾患に優れた治療法を与えることを発見した。
（１）肺に希釈界面活性物質を洗浄法で投与して損傷物質及び／又は炎症滲出液を除去する、肺を膨張させる及び肺機能を改善する。
（２）希釈界面活性物質投与及び肺機能の過程の監視を、調節した呼気終末陽圧下で行う；及び
（３）希釈界面活性物質洗浄液を短い間隔の時間調節吸引を用いて肺から除去する。
本発明は、本明細書に開示された界面活性物質組成物、特に洗浄組成物に希釈した界面活性物質として処方、調製及び使用される種々の界面活性物質分子を開示する。
特に、本発明は、一般的には急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）又は特に多数の新生児が罹る胎便吸引症候群（ＭＡＳ）のような肺不全の治療に有効な組成物を開示する。希釈界面活性物質洗浄は、また、哺乳動物における肺胞性炎症、肺胞性感染症、敗血症、肺胞性外傷、脳又は体内の外傷、膵炎、胃の内容物の吸引、加熱蒸気吸入、有害気体吸入、急性低酸素血症、胎児循環残存症、先天性横隔膜ヘルニア、肺炎、多回輸注及び類似病態と関連がある肺不全（例えば、ＲＤＳ）を治療するために行われる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の組成物は、下記の段階を含む哺乳動物の肺胞洗浄方法に使用することができる。
ａ）ベンチレータによるガス呼気終末陽圧（ＰＥＥＰ）を該哺乳動物の肺区域へ調節圧、好ましくは約４〜２０cmＨ2 Ｏ圧で加える段階；
ｂ）薬学的に許容しうる水性媒体に希釈した界面活性物質を含む洗浄組成物を該肺の１以上の葉又は区域へ点滴する段階；及び
ｃ）該肺から得られた肺胞液を、好ましくは約２０〜１００mmＨｇの陰圧の短い間隔の気管・気管支吸引を用いて除去する段階。
典型的には、点滴段階（ｂ）の前の予め選定された時間、好ましくは約３０分までＰＥＥＰを加え、典型的には、段階（ｂ）と段階（ｃ）中に連続して及び除去工程（ｃ）後の予め選定された時間、好ましくは約６時間までＰＥＥＰを加える。
本発明の組成物は、新生児、乳児、幼若年及び成体に対して用いられ、いかなる哺乳動物の肺不全の治療にも適するが、ヒト集団におけるＡＲＤＳ程度までのために特にヒトにおいて重要である。
好適実施態様においては、新生児を治療する場合にはベンチレータＰＥＥＰレベルは４〜１５cmＨ2 Ｏ、好ましくは６〜９cmＨ2 Ｏに維持され、乳児、幼若年及び成体を治療する場合には好ましくは約６〜１２cmＨ2 Ｏに維持される。これらのレベルは、治療中に肺の拡張を促進して肺胞への治療的界面活性物質の接触を高めること及び特に回収相で肺からの液体及び界面活性物質機能の阻害物質の除去速度を高めることがわかった。ガスは、任意により、酸素を多く含むガス、即ち、約２１〜１００％Ｏ2 を加えることができる。
【００１２】
希釈界面活性物質は、典型的には０．１〜５０mg／ml、好ましくは０．５〜２０mg／mlで洗浄組成物中に存在する。洗浄組成物は、典型的には約４〜６０ml／kg、好ましくは約８〜３０ml／kgの容量で点滴される。
点滴した洗浄組成物を含む肺胞液を除去する短い間隔の吸引は、吸引段階中に起こる動脈酸素の低下を最小にするために重要である。典型的な吸引間隔は、約２〜１２０秒、好ましくは５〜２０秒である。短い吸引除去段階は、必要とされるように、典型的には２〜３回、患者の病態によって通常約５秒〜５分の除去段階の間の間隔で反復される。
更に、点滴及び除去段階の組合わせが複合『洗浄』として必要とされるように１〜５回まで反復される。
組成物が本明細書に記載された希釈界面活性物質として処方される限り、洗浄組成物中界面活性物質活性を有する有効成分として種々の化合物、物質及び分子のいずれもが用いられる。界面活性物質は、実質的に単離した天然肺胞界面活性物質（ＳＰ）タンパク質又はその断片、ペプチドを含む合成肺胞界面活性物質、有機擬似体等を含むことができる。また、界面活性物質はタンパク質又はペプチドを含まないこともできる。
【００１３】
好ましい合成肺胞界面活性物質は、１種以上のリン脂質及びタンパク質又はポリペプチドを含み、ポリペプチドがリン脂質と混合される場合にはリン脂質のみの界面活性物質活性より大きい界面活性物質活性を有する合成肺胞界面活性物質を生成する。具体的なポリペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基及び約６０個を超えないアミノ酸残基を含み、下記式で表される疎水性及び親水性アミノ酸残基交互領域を有する配列を含む。
（Ｚa Ｕb ) c Ｚd
（式中、ＺはＲ、Ｄ、Ｅ及びＫからなる群より独立して選ばれた親水性アミノ酸残基であり；
ＵはＶ、Ｉ、Ｌ、Ｃ及びＦからなる群より独立して選ばれた疎水性アミノ酸残基であり；
ａは平均値の約１〜約５であり；
ｂは平均値の約３〜約２０であり；
ｃは１〜１０であり；及び
ｄは０〜３である。）
【００１４】
下記式で表されるアミノ酸残基配列を有するポリペプチド：
KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK,
下記式からなる群より選ばれたアミノ酸残基配列を有するポリペプチド：
KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK,
KLLLLLLLLKLLLLLLLLKLL,及び
KKLLLLLLLKKLLLLLLLKKL,又は
下記式からなる群より選ばれたアミノ酸残基配列を有するポリペプチド：
DLLLLDLLLLDLLLLDLLLLD,
RLLLLRLLLLRLLLLRLLLLR,
RLLLLLLLLRLLLLLLLLRLL,
RRLLLLLLLRRLLLLLLLRRL,
RLLLLCLLLRLLLLCLLLR,
RLLLLCLLLRLLLLCLLLRLL,及び
RLLLLCLLLRLLLLCLLLRLLLLCLLLR
を含む界面活性物質組成物が特に好ましい。
【００１５】
本発明に用いられる合成肺胞界面活性物質は、典型的には、ポリペプチド：リン脂質を重量比約１：７〜約１：1,０００の範囲で含む。好ましいリン脂質は、下記の成分からなる群より選ばれる。
1,２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ジパルミトイルホスファチジルコリン、ＤＰＰＣ）；
ホスファチジルグルセロール（ＰＧ）；及び
ＤＰＰＣとＰＧの重量比約３：１の混合物。好適実施態様においては、合成肺胞界面活性物質はパルミチン酸を更に含む。
従って、本発明の種々の好適実施態様においては、種々の界面活性物質ポリペプチド、組成物、製剤、及びその製造及び使用方法が開示される。
【００１６】
図面の簡単な説明
下記の図面においては、特許請求の範囲の方法を行う３つの処置条件の重要性が示される。
（１）希釈界面活性物質による肺胞洗浄は、肺機能をかなり高める（図２、図４〜図７、図９、図１１、図１２及び図２１）。洗浄処置による損傷物質の除去（図８）及び炎症滲出液の除去（図１３〜図１６）によりその機能が改善される。界面活性物質洗浄は、また、肺における炎症過程の復帰を阻止する（図１７〜図２０）。
（２）呼気終末陽圧（ＰＥＥＰ）は、洗浄処置で肺の界面活性物質誘導拡張（図２１及び図２２）及びＯ2 飽和度の低下を減少させること（図２３）に重要な役割を果たす。
（３）短い間隔の時間調節陰圧吸引は、Ｏ2 飽和度の低下を減少させることに対して重要である（図２４及び図２５）。
【００１７】
図１は、実施例１に記載される本発明の界面活性物質ペプチドの合成に用いられるメリフィールド法を示すスキームである。
図２は、実施例６に記載される未熟児サルにおける肺機能に関するＫＬ4 含有界面活性物質と非ペプチド界面活性物質の投与の影響を比較したグラフである。動脈／肺胞酸素圧比（ａ／Ａ）を、帝王切開後約１１時間かけて周期的にＫＬ4界面活性物質の用量（黒い棒線）又は非ペプチド界面活性物質（斜線の棒線）で処置した未熟児赤毛ザルにおいて測定した。各棒線は、示された時間の0.５時間以内の全有効データ点の平均±ＳＥＭを示す。★印は、グループ間の統計的有意差を示す。
図３は、実施例５に記載される気管内胎便を投与したウサギのＰａＯ2 応答を示すグラフである。成体ウサギに７．５ml／kgの食塩水（白い丸、ｎ＝３）又は２５mg／mlスラリーのヒト胎便（黒い四角、ｎ＝７）をｔ＝０時間に投与した。ＰａＯ2 を５時間追った。データは平均±ＳＥＭとして示される。−０．５時間と０時間の点は−０．７７〜−０．０３時間の異なる時間の投与前に得られた平均値であり、残りの点は記載された時間に最も近い点である。≧１．０時間の全ての点についてｐ＜０．０５。
【００１８】
図４〜図７は、実施例５に記載される圧（cmＨ2 Ｏ）の関数として気容積（ml／kg）変化の変化を示したコンプライアンス曲線を示すグラフである。コンプライアンス曲線は、ｔ＝０時間のコンプライアンス評価直後に気管内に点滴した１８７．５mg／kgのヒト胎便を投与した４匹の代表的なウサギについて示されている。図４は処置されないウサギを示し、図５はｔ＝１．１時間に２mg／mlのＫＬ4 界面活性物質を用いて３回及び１５mg／mlのＫＬ4 界面活性物質を用いて１回（各々２０ml／kg）洗浄したウサギを示すグラフである。図６は食塩水（２０ml／kg）で３回洗浄した胎便損傷ウサギを示し、図７は１．１時間にＫＬ4 界面活性物質（１００mg／kg）をボラス点滴したウサギを示すグラフである。各ウサギについて、胎便を投与する直前（白い丸）、胎便投与の約０．９時間後（救助処置前、白い四角）、及び胎便投与の約5.４時間後（救助処置の４時間後、黒い三角）の時点のコンプライアンスデータを示す。各ウサギは、その処置グループのウサギの代表例である。
図８は、実施例５に記載されるＫＬ4 界面活性物質洗浄による胎便除去を示すグラフである。成体ウサギの肺にヒト胎便（１８７．５mg／kg）を点滴した。約１．１時間後に、各ウサギを２mg／ml濃度の２０ml／kgのＫＬ4 界面活性物質で少なくとも３回洗浄した。データは、６匹のウサギについて各洗浄で回収した点滴胎便の平均±ＳＥＭ％として示されている。
【００１９】
図９は、実施例５に記載される希釈ＫＬ4 界面活性物質による洗浄後の胎便損傷ウサギにおける肺機能の変化を示すグラフである。ｔ＝０に気管内に点滴した胎便１８７．５mg／kgでウサギを損傷させた。約１時間後に、１２匹のウサギを２０ml／kgを用いて希釈ＫＬ4 界面活性物質（２〜５mg／ml）で２〜４回洗浄し、続いて高濃度（１０〜１５mg／ml）の界面活性物質で１回洗浄した（黒い四角）。５匹の対照ウサギを２０ml／kgの食塩水で３〜４回洗浄した（白い丸）。データは、平均±ＳＥＭ％として示されている。−０．５時間と０時間の点は、−１．０〜−０．０３時間の種々の時間の投与前に得られた平均値であり、残りの点は記載された時間に最も近い点である。＞１時間の全ての点についてｐ＜０．０５。
図１０は、実施例５に記載されるＫＬ4 界面活性物質のボラス点滴後の胎便損傷ウサギにおける肺機能の変化を示すグラフである。５匹のウサギを、ｔ＝０に気管内に点滴した胎便１８７．５mg／kgで損傷させた。約１．１時間後に、各ウサギに１００mg／kgＫＬ4 界面活性物質を３．３３ml／kgの容量で投与した。データは、平均±ＳＥＭ％として示されている。−０．５時間と０時間の点は、−１．０〜−０．０３時間の種々の時間の投与前に得られた平均値であり、残りの点は記載された時間に最も近い点である。
【００２０】
図１１は、実施例５に記載される胎便損傷新生児赤毛ザルのＫＬ4 界面活性物質洗浄による処置の影響を示すグラフである。７匹の新生児赤毛ザルに胎便（６５６mg／kg平均量）を分娩時の気管液に投与した。６匹を２mg／mlに希釈したＫＬ4 界面活性物質の３又は４回の洗浄で平均時間２．８時間に処置し、続いて１５mg／mlのＫＬ4 界面活性物質或いは３０mg／mlのボラス１００mlを用いて洗浄し、１匹は未処置のままとし、対照とした。示されたデータは、指定時間におけるａ／Ａ比の平均±ＳＥＭ値である。時間０は、洗浄処置の開始として定義されている。
図１２は、実施例７に記載されるＡＲＤＳモデルとして細菌性ＬＰＳ誘導肺損傷による処置で内在界面活性物質が部分的に欠乏した成体ウサギにおいてＰａＯ2 として測定した肺機能を示すグラフである。細菌ＬＰＳ０．７５μg/kgを点滴した後、成体ウサギに界面活性物質５mg／mlを含有する希釈ＫＬ4 界面活性物質を含む洗浄液を投与するか又は処置しなかった。ＬＰＳ前及びその後８時間ＰａＯ2 を追った。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。
図１３〜図１６は、実施例７に記載されるＬＰＳ損傷後の連続洗浄液に存在する炎症滲出液の４種類の成分の量を示す４つのパネルに棒グラフを示すグラフである。第１、第２及び第３洗浄液が各パネルに示され、各洗浄液に存在する成分の量が示される。
【００２１】
図１７〜図２０は、実施例７に記載される成体ウサギにおいてＬＰＳ損傷後に希釈界面活性物質で処置した３時間後の肺胞洗浄液に存在する炎症滲出液中の４種類の成分の量を示す４つのパネルに棒グラフを示すグラフである。図１３〜図１６に記載された界面活性物質洗浄処置の３時間後に、対照及び界面活性物質処置ウサギの肺から食塩水肺胞洗浄液を集めた。炎症成分の内容物が各々に分析され、各パネルに示され、各洗浄液に存在する成分の量が示される。
２つのパネルの図２１及び図２２は、実施例８に記載される胎便損傷ブタにおける希釈界面活性物質による肺機能の改善に関する高ＰＥＥＰレベルの影響を示すグラフである。胎便損傷ブタを、８cmＨ2 ＯのＰＥＥＰ（図２１）又は６cmＨ2 ＯのＰＥＥＰ（図２２）で指定した時間に（矢印）界面活性物質洗浄により処置した。胎便点滴中に、界面活性物質洗浄中に及び洗浄処置後の約２〜４時間に経時ＰａＯ2 を追うことにより肺機能を測定した。
図２３は、実施例８に記載される界面活性物質洗浄処置でのＯ2 飽和度（ＳａＯ2)に関する経時ＰＥＥＰの影響を示すグラフである。８cmＨ2 ＯのＰＥＥＰにおいて、Ｏ2 飽和度の減少はＰＥＥＰが６cmＨ2 Ｏに維持される場合に生じる減少よりかなり少ない。
２つのパネルの図２４及び図２５は、実施例８に記載される胎便損傷ブタにおける希釈界面活性物質洗浄による肺機能の改善に関する吸引間隔の時間の長さの影響を示すグラフである。胎便損傷ブタを実施例８に記載されるように処置し、陰圧を１０秒間（図２４）又は約６０秒間（図２５）用いて洗浄及び吸引した。胎便点滴中、界面活性物質洗浄中及び洗浄処置後に経時ＳａＯ2 （飽和Ｏ2)を追うことにより肺機能を測定した。
【発明の効果】
【００２２】
本発明に従うと、呼吸窮迫症候群の治療、肺組織炎症からの炎症滲出液の除去及び新生児における胎便吸引症候群の治療を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
Ａ．定義
アミノ酸：個々の好適実施態様においては、有効なものとして同定されたアミノ酸残基は天然Ｌ配置である。しかしながら、下記のＤ−アミノ酸、置換アミノ酸（例えば、Ｒ基で修飾されたアミノ酸）、アミノ酸代謝産物及び異化代謝産物、『レトロ』バックボーンを有するアミノ酸、及びアミノ酸模擬体又は類縁体も本発明での使用に企図され、本発明に包含される。
標準ポリペプチド命名法、J. Biol. Chem., 243:3557-59, 1969 に従うに当たり、共通アミノ酸残基の略号は下記の対応表に示される通りである。
【００２４】
【表１】
2004250459.tif 000002
【００２５】
特にことわらない限り、本明細書に式で表されるアミノ酸残基はアミノ末端からカルボキシ末端への慣用的方向に左から右への向きがあることは留意されなけらばならない。更に、『アミノ酸残基』という用語は、対応表に示されるアミノ酸及び37 C.F.R. §1.822(b)(4) に示されかつ本願明細書に含まれるものとするアミノ酸のような修飾されたアミノ酸及び特異なアミノ酸を含むように広く定義される。『アミノ酸残基』という用語は、また、Ｄ−アミノ酸、置換アミノ酸（例えば、Ｒ基で修飾されたアミノ酸）、修飾されたアミノ酸（例えば、アミノ酸代謝産物、異化代謝産物、及び『設計された』側鎖をもつアミノ酸）、及びアミノ酸模擬体又は類縁体を含むように広く定義される。
更に、アミノ酸残基配列の始め又は終わりのダッシュ（−）は、通常はアミノ末端及びカルボキシ末端での各々Ｈ及びＯＨ（水素基及び水酸基）のような基、又は１個以上のアミノ酸残基の配列への結合を示すことは留意されなければならない。更に、残基配列の右端の斜線（／）はその配列が次の行に続くことを意味することも留意されなければならない。
薬学的に許容しうるという用語は、ヒトに投与された場合にアレルギー又は類似の都合の悪い反応を生じない分子及び組成物を意味する。
ポリペプチド及びペプチドという用語は、隣接残基のα−アミノ基とカルボキシ基間のペプチド結合によって一方をもう一方に結合した約６０を超えない線状のアミノ酸残基を示すために本明細書では同じ意味に用いられる。
【００２６】
タンパク質という用語は、ポリペプチドのように一方をもう一方に結合した約６０より大きい線状のアミノ酸残基を示すために本明細書で用いられる。
界面活性物質活性  本明細書に用いられるこの用語は、空気／水界面の表面張力を低下させる有機分子、タンパク質又はポリペプチドのような物質--脂質との混合、単独或いは他の有機分子との組合わせの能力を意味する。測定は、生体外分析によるウイルヘルミーバランス又は脈動気泡サーファクトメータで行われる。タンパク質又はポリペプチドがリン脂質と混合される場合の空気−水界面の表面張力の測定を用いる、例えば、Kingら, Am. J. Physiol. 223:715-726 (1972)の測定又はその中に示された分析を参照されたい。更に、肺に入る空気の一定圧におけるコンプライアンス又はエアフローの増加の生体内測定は、例えば、Robertson, Lung, 158:57-68 (1980) の分析で容易に行われる。この分析では、評価されるべき試料は帝王切開により早産した胎児ウサギ又はヒツジへ気管内チューブを介して投与される。（これらの『未熟児』は自身のＰＳを欠き、ベンチレータで援助される。） 肺コンプライアンス、血液ガス及びベンチレータ圧の測定は活性指数を示す。界面活性物質活性の試験管内分析は脈動気泡の表面張力を低下させる能力として評価され、本明細書に示される胎児ウサギを用いる生体内分析は Revakら, Am. Rev. Respir. Dis., 134:1258-1265 (1986) に詳細に記載されている。
【００２７】
Ｂ．肺胞界面活性物質--概要
天然に存在する肺胞界面活性物質は、肺胞気−水界面に単層の形成を促進しかつ表面張力の低下により呼気中の肺胞の虚脱を防止する脂質とタンパク質の複合混合物である。未熟児及びたまに満期新生児が正常な肺機能に十分な内在性界面活性物質を欠くことがある。それは、機械的換気及び高圧酸素の投与を必要とする呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）と呼ばれる病態を生じることがある。残念ながら、かかる介入は、肺組織に永続的損傷を与え、未熟児網膜症（ＲＯＰ）を引き起こすことがあり失明にいたる。
肺胞界面活性物質（ＰＳ）は、成熟哺乳動物肺の肺胞上皮に並んでいる。天然ＰＳは、肺気−液体界面の表面張力を低下させるために相互作用するリン脂質とアポタンパク質の双方を含むために『リポタンパク質複合体』として記載されてきた。天然界面活性物質は、数種の脂質化合物を含み、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）がホスファチジルグリセロール（ＰＧ）及びパルミチン酸（ＰＡ）と共に主成分である。少なくとも３種の特異的タンパク質を会合し、ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ及びＳＰ−Ｃと呼ばれる。これら３種のうちＳＰ−ＢとＳＰ−Ｃは、低分子量の相対的に疎水性の異なったタンパク質であり、界面活性物質リン脂質混合物の表面活性特性を高めることがわかった。バルク相の層板器質化から空気−水界面へ脂質の移動を容易にすると共に呼気中の脂質単層を安定化すると考えられる。ＳＰ−Ｂ（ＳＰ１８とも言われる）の構造は、荷電したアミノ酸（主に塩基性）が別の疎水性残基の長さの範囲内でかなり規則的な間隔で位置する点で特異である。天然ＳＰ−Ｂ配列の残基５９〜８０からなるドメインについては、それらの荷電基は生物活性に必要であることがわかった。更に、ＤＰＰＣとＰＧを組合わせた場合に疎水性−親水性ドメインがモデルである天然及び合成ペプチドは、良好な界面活性物質活性を示す。
【００２８】
界面活性物質は肺上皮細胞に層板体の形で貯蔵され、輸送後、構造転移して管状ミエリンを形成した後に空気−水界面に単層を生じる。界面活性物質タンパク質ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ及びＳＰ−Ｃがそれらの構造転移を促進しかつ肺胞の拡張及び収縮中に脂質単層を安定化することが提唱された。しかしながら、脂質−タンパク質相互作用の分子レベルでの理解は現在欠けている。従って、本発明は、新生児及び成体におけるＲＤＳの治療についてだけでなく一般の脂質−タンパク質相互作用に与えることができる洞察のために重要な意味がある。
現在、数種の内在性界面活性物質製剤が新生児ＲＤＳの治療に用いられている。それらは罹患率と死亡率を下げたが、連続的改善が必要である。特に、機械的換気及び高圧酸素の投与のために起こることがある合併症のために、未熟児において正常な肺機能が早く確立されるほど、臨床上の成果が良好となる。
上記のことと一致して、外因性界面活性物質での重要な特徴としては、投与後急速に肺胞に広がる能力及び肺胞気−水界面において安定な単層を維持する能力が含まれるので反復処置を必要としない。従って、優れた外因性界面活性物質の調製に有効な種々の化合物及び組成物が本明細書に開示される。
【００２９】
Ｃ．界面活性物質組成物
本発明の界面活性物質組成物は、呼吸窮迫症候群の治療に有効な肺胞界面活性物質（ＰＳ）を形成するために界面活性物質活性を有する種々の薬学的に許容しうる界面活性物質のいずれかを含有することができる。典型的には、界面活性物質組成物は１種以上のリン脂質を混合している。肺胞界面活性物質を形成するのに有効なリン脂質は、当該技術において周知である。界面活性物質の天然及び合成双方のリン脂質の使用の総説についてはNotterら, Clin. Perinatology, 14:433-79 (1987)参照されたい。
１種以上のリン脂質を含むことができる界面活性物質活性を有する本発明のタンパク質、ポリペプチド、アミノ酸残基含有分子、又は他の有機分子（集団的に『界面活性物質分子』) を用いて調製される本発明の界面活性物質組成物は、呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）の治療に十分に適当である。かかる界面活性物質組成物は、典型的には、本明細書に記載される企図される使用によって希釈したものから濃縮したものまでにわたる。従って、界面活性物質組成物は、得られた組成物が界面活性物質活性をもつ限り約０．０５重量％程度からほぼ１００重量％まで脂質を含有することができる。重量％は、組成物重量中の化合物の重量％を意味する。従って、５０重量％の脂質を有する組成物は、例えば、全組成物１００ｇあたり脂質５０ｇを含有する。典型的には、界面活性物質組成物は０．１〜５０重量％の脂質を含有するが、高い方の濃度の脂質が『ボラス』法及び濃縮貯蔵液から希釈した界面活性物質組成物を調製するのに用いられる。従って、リン脂質及び界面活性物質分子を共に含有する具体的な界面活性物質組成物は、０．１％、１％、１０％、５０％、８０％、ほぼ１００重量％の脂質及び約５０％、２０％、１０％、１重量％未満の界面活性物質分子を含有することができる。
【００３０】
界面活性物質組成物は、界面活性物質分子溶液とリポソーム懸濁液とを混合することにより、界面活性物質分子とリポソーム懸濁液とを混合することにより、又は有機溶媒の存在下に直接界面活性物質分子とリン脂質を混合することにより調製される。
本発明のリポソーム界面活性物質組成物は、一般的には、有機溶媒系で脂質及び遊離脂肪酸と混合し、乾燥し、再水和した本発明の界面活性物質分子を含有する滅菌リポソーム懸濁液である。界面活性物質活性をもつ種々の化合物及び物質であることから、本発明に有効な界面活性物質組成物が検出可能なタンパク質又はポリペプチドを含まないことがありかつリン脂質、水性媒体及び／又はバッファーのみ含むことは理解されるべきである。
本発明の個々の好適実施態様においては、薬学的に許容しうるリン脂質と混合した界面活性物質分子の有効量を含むＲＤＳを治療するのに有効な肺胞界面活性物質が開示される。ある好適実施態様においては、界面活性物質分子はポリペプチド又はタンパク質であり、ある好適実施態様においては、界面活性物質分子はアミノ酸残基、修飾アミノ酸、アミノ酸誘導体、アミノ酸類縁体及び類似分子、又はその活性に似ている他の有機分子を含むことができる界面活性物質活性を示す有機分子である。
【００３１】
あるポリペプチド−リン脂質の組合わせの最適ポリペプチド：リン脂質重量比を決定する方法は周知であるが、治療上有効な比は約１：５〜約１：１０，０００、好ましくは約１：７〜約１：５，０００、更に好ましくは約１：１０〜約１：１０００、最も好ましくは約１：１５〜約１：１００の範囲であることが求められた。
本発明の界面活性物質組成物の脂質部分は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）好ましくは約５０〜約９０重量％、更に好ましくは約５０〜約７５重量％であり、残りは不飽和ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、トリアシルグリセロール、パルミチン酸、スフィンゴミエリン又はその混合物を含む。
本リポソーム界面活性物質組成物を形成するのに有効なリン脂質は、当該技術において周知である。（例えば、界面活性物質の天然及び合成双方のリン脂質の使用の総説についてNotterら, Clin. Perinatology, 14:433-79, 1987 参照。)。本明細書に開示される好ましい界面活性物質組成物の調製に有用な方法及び物質は、下記の実施例にも記載される。
本発明の肺胞界面活性物質は、一般的には、本ポリペプチド溶液をリポソーム懸濁液と混合することにより又は有機溶媒の存在下に直接本ポリペプチド（又は他の有機界面活性物質分子）と脂質を混合することにより調製される。次いで、透析又は窒素下で蒸発する及び／又は真空に曝露することにより溶媒が除去される。
【００３２】
肺胞界面活性物質組成物は、好ましくは、気管内投与、例えば、液体の懸濁液剤として、乾燥粉末の『噴霧剤』として又はエアゾル剤として処方される。当業者は、本発明の界面活性物質組成物が洗浄に用いられる液体の懸濁液剤又はエアロゾル剤を含むがこれに限定されない種々の使用及び投与方法に処方されることを理解するであろう。
例えば、界面活性物質（界面活性物質分子−脂質ミセル）は、水、食塩水、デキストロース、グリセロール等の薬学的に許容しうる賦形剤と液体に懸濁される。界面活性物質含有治療用組成物は、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等を含むｐＨ緩衝剤のような非毒性補助物質を少量含むことができる。噴霧剤形の界面活性物質を調製するために、界面活性物質は本明細書に記載されるように調製され、次に、凍結乾燥され、乾燥粉末として回収される。
エアゾル投与に用いられる場合には、本界面活性物質は追加の界面活性物質及び噴射剤と共に微細な粉末として供給される。投与される典型的な界面活性物質は、リン脂質及びエステルである。しかしながら、本例においては、他の成分の界面活性物質複合体、ＤＰＰＣ及びＰＧを用いることが好ましい。有用な噴射剤は、典型的には周囲条件で気体であり、圧力下で凝縮される。低級アルカン及びフッ化アルカン、例えば、フレオンが用いられる。エアゾル剤は、成分が放出されるまで圧力下に維持されるように適切なバルブを備えた容器に入れられる。
【００３３】
リポソーム界面活性物質組成物を調製するために、界面活性物質分子又はポリペプチド分子は、その分子を実質的に集合体でない単量体に維持する有機溶媒に溶解される。かかる溶媒は、極性又は非極性であり約９〜約１５(cal・cm3)1/2又は約９〜約１５ヒルデブランド単位（Ｈ）の範囲の溶解度パラメーターデルタ（δ）を示すものであることが好ましい。
特に好ましい溶媒は、Ｃ1 〜Ｃ4 脂肪族アルコールのような水素結合溶媒、即ち、メタノール（δ＝１４．５Ｈ）、エタノール（δ＝１２．７Ｈ）、ｎ−プロパノール（δ＝１１．９Ｈ）、イソプロパノール（δ＝１１．５Ｈ）、ｎ−ブタノール（δ＝１１．４Ｈ）、イソブタノール（δ＝１０．８Ｈ）等である。ハロゲン化溶媒中トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）及びクロロホルム（δ＝９．３Ｈ）が特に好ましい。脂肪族アルコールとハロゲン化溶媒の混合物又は混和物が同様に用いられる。
リポソーム界面活性物質組成物の好ましい製造方法においては、ポリペプチド又は他の界面活性物質分子をリン脂質と共に有機溶媒に溶解し、得られた溶液を緩衝水溶液と混合する。次に、得られた懸濁液を透析して有機溶媒を除去する。また、有機溶媒は蒸発及び減圧によっても除去される。このように生成した乾燥脂質／ポリペプチドを、水性緩衝系で再水和してリポソームを生成する。
【００３４】
本発明は、また、種々の界面活性物質組成物、特にリポソーム界面活性物質を企図する。従って、好適実施態様においては、本発明は約１０個のアミノ酸残基及び約６０個を超えないアミノ酸残基を含むポリペプチドから調製されたリポソーム界面活性物質組成物を開示し、荷電アミノ酸残基と非荷電アミノ酸残基の交互グループ、及びと薬学的に許容しうるリン脂質で構成され、該ポリペプチドは該リン脂質より組成物の界面活性物質活性を増大させるのに十分な量で存在する。
他の好適態様においては、本発明の界面活性物質分子は荷電残基と非荷電残基の交互グループで構成された界面活性物質分子を含み、該残基はアミノ酸、修飾アミノ酸、アミノ酸類縁体又は誘導体等とすることができる。本明細書に開示される界面活性物質活性をもつ分子は、本発明の組成物に使用するのに特に好ましい。
本発明の個々の好適実施態様においては、上記のように界面活性物質組成物は１種以上のリン脂質を含む。ポリペプチド：リン脂質の重量比は、本発明の種々の好ましい界面活性物質組成物において約１：７〜約１：１，０００の範囲である。適切なリン脂質は次の群：１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ジパルミトイルホスファチジルコリン、ＤＰＰＣ);ホスファチジルグリセロール（ＰＧ);及び約３：１の重量比のＤＰＰＣとＰＧの混合物より選ばれることが好ましい。
【００３５】
種々の好適実施態様においては、本発明の界面活性物質組成物（例えば、リポソーム界面活性物質）はパルミチン酸を更に含む。ある実施態様においては、リン脂質は界面活性物質の脂質部分の約５０〜９０重量％を含み、パルミチン酸は残りの１０〜５０重量％を含む。ある好適実施態様のように、リン脂質は1,２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ジパルミトイルホスファチジルコリン、ＤＰＰＣ);ホスファチジルグリセロール（ＰＧ);及びＤＰＰＣとＰＧの混合物からなる群より選ばれる。ＤＰＰＣとＰＧの混合物が選ばれる場合には、ＤＰＰＣとＰＧは約３：１の重量比で存在することが好ましい。
例えば、本発明のある実施態様においては、本発明の界面活性物質組成物は組成物１ml中各々ＫＬ4 ペプチド０．８mg、ＤＰＰＣ１９．９５mg、ＰＯＰＧ６．６５mg、及びＰＡ３．９９mgを含む。個々の実施態様においては、界面活性物質は無菌的に調製され、２mlか５mlの懸濁液を送達するのに十分な量を含むバイアルで供給される。従って、ある具体的な製剤では、約５．０ ml/kgの投薬量で投与される約２６．６ mg/mlのリン脂質濃度を有する標品により約１３３ mg/kgの用量が得られる。同様に、約５．７ ml/kgの投薬量で投与される約３５ mg/mlのリン脂質濃度を有する具体的な標品により約２００ mg/kgの用量が得られる。
【００３６】
最終好適界面活性物質組成物は、界面活性物質ポリペプチド（又は本発明の他の界面活性物質分子）を含む滅菌リポソーム懸濁液を含んでいる。具体的な説明として、ＫＬ4 ペプチドを含む薬剤産物／界面活性物質組成物を例として記載する。
ペプチドは、好ましくは、有機溶媒系で脂質及び脂肪酸と混合され、次に、蒸発及び減圧除去される。乾燥した脂質／ペプチド混合物を水性緩衝系で再水和してリポソームを形成する。同時に、有機溶媒で薬剤成分を滅菌ろ過し、後続の処理は全て無菌的に行われる。
ある具体的な組成物は、界面活性物質ペプチド及び脂質成分を含んでいる。ある実施態様においては、脂質成分はＤＰＰＣ及び／又はＰＯＰＧを含んでいる。ある好適実施態様においては、組成物はパルミチン酸（ＰＡ）を含んでいる。
例えば、ＫＬ4 ペプチドを含む界面活性物質組成物は、ＤＰＰＣとＰＯＰＧの３：１重量比の混合物からリン脂質に匹敵する１５重量％のパルミチン酸（ＰＡ）と有機溶媒中で調製される。ＫＬ4 ペプチドは、３重量％のリン脂質濃度として界面活性物質分散液に調製される。有機溶媒は、窒素減圧下で蒸発することにより脂質／ペプチドから除去される。トリス緩衝液を加えてペプチド含有界面活性物質のリポソームを形成する。
本発明の界面活性物質組成物においてタム緩衝系も含まれる。（タムは、トリス、トロメタミン、及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとしても知られる緩衝剤である。） 個々の好適実施態様においては、組成物のｐＨは約６．５〜8.０である。
【００３７】
従って、ある好適実施態様においては、本発明の界面活性物質組成物は、組成物１mlあたりペプチド約０．８０mg、ＤＰＰＣ１９．９５mg、ＰＯＰＧ６．６５mg、ＰＡ３．９９mg、及びタム緩衝系１mlを含んでいる。他の好適実施態様においては、本発明の界面活性物質組成物は生理的ｐＨ及び重量オスモル濃度を有するタム緩衝液１mlあたり次の成分：ペプチド、１．０５mg；ＤＰＰＣ、２６．２５mg；ＰＯＰＧ、８．７５mg；及びＰＡ、５．２５mgが含まれる。界面活性物質組成物は、好ましくは無菌的に調製され、２mlか６mlの懸濁液を送達するのに十分な容量を含むバイアルで非発熱原性無菌溶液として供給される。
開示した方法に従って使用するのに好ましい種々の界面活性物質分子、タンパク質及びポリペプチドは、上で及び次の項に記載される。本明細書に開示されるように用いられる界面活性物質組成物の他の好適成分としては、本明細書に記載される種々のリン脂質及びパルミチン酸が含まれる。
例えば、現在、関連方法に用いられている既知の種々の界面活性物質が記載されている。これらの界面活性物質は、希釈界面活性物質洗浄が有益であるという発見による本発明で使用するのに全て適する。これらの界面活性物質としては、ＢＬＥＳ、Infasurf又はＣＬＳＥ（仔ウシ肺界面活性物質, Forest Products)、Alveofact(Thomae, ドイツ) のようなウシ、ブタ又はヒツジ種を含むがこれらに限定されない哺乳動物の肺の水性洗浄から得られた天然の界面活性物質；界面活性物質ＴＡ（田辺、日本国東京）、Survanta(Beractant, Abbott Laboratories,イリノイ州アボットパーク) 、Curosurf(Chiesi Farmaceutici, イタリー国パルマ) のようなこれに限定されない有機溶媒によって動物肺から抽出された界面活性物質材料が含まれる。
【００３８】
更に、界面活性物質は、補助的ペプチド又はタンパク質の内容物と混合した或いはそれを含まない界面活性物質の急速な拡散を誘発するパルミチン酸又は他の因子のような種々のリン脂質又は脂肪酸分子を含むことができる。界面活性物質は、ペプチド又はタンパク質を除く清浄剤と共に又は含まずにExosurf(コルホセリルパルミテート、セチルアルコール及びチロキサポール; Burroghs-Wellcome,ノースカロライナ州リサーチトライアングルパーク) 、ＡＬＥＣ (肺拡散合成化合物,Britannia, Ltd.) のようなリン脂質、ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）＋ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）とコレステロール、即ち、ＤＯＰＥ−ＤＰＰＣ−コレステロール (The Liposome社, ニュージャージー州プリンストン) のようなリン脂質ブレンドを含むことができる。
界面活性物質は、リン脂質、拡散剤及びタンパク質又はペプチドを含むことができる。リン脂質は、ホスファチジルコリン（例えば、ＤＰＰＣ）又はホスファチジルグリセロール（例えば、ＰＯＰＧ）等である。拡散剤は、空気−水界面に沿って拡散する速度を増すものであり、パルミチン酸、コレステロール、清浄剤等が含まれる。タンパク質及びペプチドは、本明細書に記載されたもの又はリン脂質の界面活性物質活性を増大させるものであり、天然源から単離されるか、化学合成されるか、ＳＰ−Ｃのような組換えＤＮＡ技術によって生産される。
これらの及び他の界面活性物質の組成物及び調製方法に関する詳細は、次の米国特許第 4,603,124号、同第 5,013,720号、同第 5,024,995号、同第 5,171,737号、同第 5,185,154号、同第 5,238,920号、同第 5,302,581号、同第 5,547,937号、同第 5,552,161号及び同第 5,614,218号に見られ、これらの明細書の記載は本願明細書に含まれるものとする。
【００３９】
本発明の界面活性物質は、剤形に適切なように気管内チューブ、気管支鏡、カニューレ、エアゾル投与、又は懸濁液又は粉末の吸気への噴霧によって投与される。全リン脂質含量によって測定されたＰＳ量、約１．０〜約５００ mg/kg、好ましくは約５０〜約５００ mg/kg、典型的には約５０ mg/kg、１００ mg/kg、１３３ mg/kg又は２００ mg/kgの投与量が１回に投与される。新生児の使用には、通常１回又は２回の投与が十分である。成人には、正常な範囲内のＰＯ2 を生じるのに十分な再構成界面活性物質複合体を投与しることが好ましい（例えば、Hallman ら, J. Clinical Investigation, 70:673-682, 1982 参照) 。治療の用法は個体によって異なってよく、ＲＤＳの程度、現在の症状及び他の適切な可変部分に左右されることは理解されるべきであり、１回又は多数回の用量が個体に投与される。
本明細書に開示されるように、本発明は、本明細書に記載される個々の使用によって濃縮及び希釈双方の界面活性物質組成物の使用を企図する。濃縮界面活性物質組成物は、典型的には、『ボラス』型投与に用いられ、希釈界面活性物質組成物は、典型的には、『洗浄』型投与に用いられる。
濃縮界面活性物質は、典型的には１ミリリットル(ml)あたり２０〜２００ミリグラム(mg)、好ましくは約２５〜１００ mg/mlの界面活性物質の活性化合物を有する。希釈界面活性物質は、界面活性物質の活性化合物を典型的には約０．１〜２０ mg/ml、好ましくは約０．５〜１０ mg/mlの濃度で含む。本発明に従って界面活性物質を調製するのに適切なポリペプチドは、すぐ下の項Ｄに記載される。
【００４０】
Ｄ．タンパク質及びポリペプチド
本発明のタンパク質又はポリペプチド（本タンパク質又はポリペプチド）は、そのアミノ酸残基配列と新規な機能特性を特徴とする。薬学的に許容しうるリン脂質と混合した場合の本タンパク質又はポリペプチドは、リン脂質のみの界面活性物質活性より大きい界面活性物質活性を有する肺胞界面活性物質を形成する。例えば、界面活性物質活性を有するタンパク質又はポリペプチドは、実施例に記載される界面活性物質で測定した場合にΔＰが低い。
６０個以上のアミノ酸残基--即ち、タンパク質分子を含む分子が、本発明の界面活性物質組成物に有効であることも理解されるべきである。本開示が主にアミノ酸残基、類縁体及び／又は他の有機分子に集中しているが、疎水性アミノ酸残基と親水性アミノ酸残基の領域を交互するタンパク質及び本明細書に記載される界面活性物質能を有するタンパク質も本開示によって企図されかつ包含されるものである。
１０個以下のアミノ酸残基を含む界面活性物質活性を示す分子も本発明によって企図される。例えば、５個のアミノ酸誘導体又は類縁体に結合した５個のアミノ酸残基を含む分子は、特に、疎水性アミノ酸残基と親水性アミノ酸残基の領域を交互しかつ本明細書で定義される界面活性物質活性がある場合には本明細書に開示されるように有効である。従って、肺胞との相互作用を最大にする配置を有する２〜１００個のアミノ酸残基が本発明によって企図される。大きな分子はいくぶん合成が難しいが本明細書に開示される６０個以上のアミノ酸残基を含む分子（又はその類縁体）でさえ開示された特徴をもっていれば優れた界面活性物質であることは当業者に理解されなければならない。
【００４１】
本発明に従ってリポソーム界面活性物質を調製するのに適切なポリペプチドは、当業者に既知の手法によってアミノ酸から合成される。用いうる多くの手法のきわめて良好な概要は、固相ペプチド合成についてはJ.M. Steward & J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., サンフランシスコ,1969, J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", Vol.2, p.46, Academic Press (ニューヨーク), 1983 及び古典的溶液合成についてはE. Schroder& K. Kubke, "The Peptides", Vol.1, Academic Press(ニューヨーク), 1965 に見出される。
一般に、これらの方法は、１個以上のアミノ酸残基又は適切に保護されたアミノ酸残基を成長するペプチド鎖に逐次付加することを含んでいる。通常は、最初のアミノ酸残基のアミノ基かカルボキシル基が選択的に除去可能な適切な保護基で保護される。選択的に除去可能な別の保護基は、反応性側鎖基を含むアミノ酸（例えば、リシン）に用いられる。
【００４２】
具体例としての固相合成を用いて、保護又は誘導化アミノ酸が不活性固体支持体に非保護カルボキシル基又はアミノ基を介して結合される。次に、アミノ基又はカルボキシル基の保護基が選択的に除去され、適切に保護された相補的（アミノ又はカルボキシル）基を有する配列に次のアミノ酸を混合し、固相支持体に既に結合した残基とアミド結合を形成するのに適切な条件下で反応させる。次に、アミノ基又はカルボキシル基の保護基が新たに付加したアミノ酸残基から除去され、次のアミノ酸（適切に保護された）が次々に付加される。所望のアミノ酸が全て適切な配列に結合した後に、残りの末端基と側鎖基の保護基（及び固体支持体）が連続して又は同時に除去されて最終ポリペプチドを生成する。次に、そのポリペプチドを低級脂肪族アルコールに溶解することにより洗浄し、乾燥する。乾燥した界面活性物質ポリペプチドは、場合によっては既知の手法で精製される。（本発明のポリペプチドを調製する種々の方法は下記の実施例に記載される。）
好ましくは、界面活性物質ポリペプチドは、荷電及び非荷電アミノ酸残基領域を交互にもつアミノ酸残基配列を含むポリペプチドである。疎水性と親水性のアミノ酸残基領域を交互にもつアミノ酸残基配列を含むポリペプチドが本発明に好ましい。それらのグループの中で特に好ましい界面活性物質ポリペプチドは、少なくとも約４個、更に好ましくは少なくとも約８個、更に好ましくは少なくとも約１０個のアミノ酸残基を有するものとして確認され、通常は長さが約６０個のアミノ酸残基を超えない。
【００４３】
好ましくは、本発明の界面活性物質ポリペプチドは、次式で表される荷電アミノ酸残基と非荷電アミノ酸残基の交互グループで構成される： [( 荷電 )a (非荷電 )b ] c ( 荷電 )d (式中、ａは平均値の約１〜約５であり；ｂは平均値の約３〜約２０であり；ｃは１〜１０であり；ｄは０〜３である。） アミノ酸残基のみだけで構成されない有機界面活性物質分子は、荷電及び非荷電（又は親水性／疎水性）構成分子の交互グループで構成された類似構造を有する。ある好適実施態様においては、界面活性物質ポリペプチドは次式で表されるアミノ酸残基の交互グループをもつ配列を含んでいる：（Ｚa Ｊb ) c Ｚd (式中、ＺはＲ、Ｄ、Ｅ及びＫからなる群より独立して選ばれたアミノ酸残基であり；Ｊはα−アミノ脂肪族カルボン酸であり；ａは平均値の約１〜約５であり；ｂは平均値の約３〜約２０であり；ｃは１〜１０であり；ｄは０〜３である。）
他の実施態様においては、本発明の好ましいポリペプチドは、次式で表されるアミノ酸残基領域の交互グループをもつ配列を含んでいる：（Ｂa Ｕb ) c Ｂd(式中、ＢはＨ、５−ヒドロキシリシン、４−ヒドロキシプロリン及び３−ヒドロキシプロリンからなる群より独立して選ばれたアミノ酸残基であり；ＵはＶ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｙ及びＦからなる群より独立して選ばれたアミノ酸残基である。）
好適態様においては、Ｂはコラーゲンに由来するアミノ酸であり、５−ヒドロキシリシン、４−ヒドロキシプロリン及び３−ヒドロキシプロリンからなる群より選ばれることが好ましく；ａは平均値の約１〜約５であり；ｂは平均値の約３〜約２０であり；ｃは１〜１０であり；ｄは０〜３である。
【００４４】
別の好適実施態様においては、本発明の界面活性物質ポリペプチドは次式で表されるアミノ酸残基の交互グループをもつ配列を含んでいる：（Ｂa Ｊb ) c Ｂd (式中、ＢはＨ、５−ヒドロキシリシン、４−ヒドロキシプロリン及び３−ヒドロキシプロリンからなる群より独立して選ばれたアミノ酸残基であり；Ｊはα−アミノ脂肪族カルボン酸であり；ａは平均値の約１〜約５であり；ｂは平均値の約３〜約２０であり；ｃは１〜１０であり；ｄは０〜３である。）
適切な式において『Ｊ』を含む種々の実施態様においては、Ｊは炭素原子４〜６個を含むα−アミノ脂肪族カルボン酸である。他の好適態様においては、Ｊは炭素原子６個以上を含むα−アミノ脂肪族カルボン酸である。別の態様においては、Ｊは、好ましくはα−アミノブタン酸、α−アミノペンタン酸、α−アミノ−２−メチルプロパン酸及びα−アミノヘキサン酸からなる群より選ばれる。
他の好適実施態様は、次式で表されるアミノ酸残基の交互グループをもつ配列を含む界面活性物質ポリペプチドを開示している：（Ｚa Ｕb ) c Ｚd (式中、ＺはＲ、Ｄ、Ｅ及びＫからなる群より独立して選ばれたアミノ酸残基であり；ＵはＶ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｙ及びＦからなる群；Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ及びＦからなる群；又はＬ及びＣからなる群より独立して選ばれたアミノ酸残基であり；ａは平均値の約１〜約５であり；ｂは平均値の約３〜約２０であり；ｃは１〜１０であり；ｄは０〜３である。）
【００４５】
上記式において、ＺとＵ、ＺとＪ、ＢとＵ、及びＢとＪは、各出現時に独立して選ばれるアミノ酸残基である。更に、上記式の各々において、ａは通常平均値の約１〜約５であり；ｂは通常平均値の約３〜約２０であり；ｃは１〜１０であり；ｄは０〜３である。
上記実施態様のある態様においては、ＺとＢは荷電アミノ酸残基である。ある好適実施態様においては、ＺとＢは疎水性又は正に荷電したアミノ酸残基である。ある態様においては、ＺはＲ、Ｄ、Ｅ及びＫからなる群より選ばれることが好ましい。関連実施態様においては、Ｚは好ましくはＲ及びＫからなる群より選ばれる。別の好適実施態様においては、ＢはＨ、５−ヒドロキシリシン、４−ヒドロキシプロリン及び３−ヒドロキシプロリンからなる群より選ばれる。ある好適実施態様においては、ＢはＨである。他の好適実施態様においては、Ｂはコラーゲン成分のアミノ酸残基であり、５−ヒドロキシリシン、（δ−ヒドロキシリシン）、４−ヒドロキシプロリン及び３−ヒドロキシプロリンからなる群より選ばれる。
種々の開示実施態様においては、ＵとＪは非荷電アミノ酸残基であることが好ましい。他の好適実施態様においては、ＵとＪは疎水性アミノ酸残基である。ある実施態様においては、ＵはＶ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｙ及びＦからなる群より選ばれることが好ましい。他の好適実施態様においては、ＵはＶ、Ｉ、Ｌ、Ｃ及びＦからなる群より選ばれる。別の好適実施態様においては、ＵはＬ及びＣからなる群より選ばれる。個々の好適実施態様においては、ＵはＬである。
【００４６】
同様に、個々の実施態様においては、Ｂは、Ｈ、５−ヒドロキシリシン、４−ヒドロキシプロリン及び３−ヒドロキシプロリンからなる群より選ばれることが好ましいアミノ酸である。また、Ｂは、５−ヒドロキシリシン、４−ヒドロキシプロリン及び３−ヒドロキシプロリンを含むコラーゲン由来アミノ酸からなる群より選ばれる。
本発明の他の実施態様においては、荷電及び非荷電アミノ酸は修飾アミノ酸の群より選ばれる。例えば、ある好適実施態様においては、荷電アミノ酸は数例を示すためにシトルリン、ホモアルギニン又はオルニチンからなる群より選ばれる。同様に、個々の好適実施態様においては、非荷電アミノ酸は、α−アミノブタン酸、α−アミノペンタン酸、α−アミノ−２−メチルプロパン酸及びα−アミノヘキサン酸からなる群より選ばれる。
本発明の好適実施態様においては、『ａ』、『ｂ』、『ｃ』及び『ｄ』は荷電又は非荷電残基（又は親水性残基又は疎水性残基）の数を示す数字である。種々の実施態様においては、『ａ』は平均値の約１〜約５、好ましくは約１〜約３、更に好ましくは約１〜約２、最も好ましくは１である。
種々の実施態様においては、『ｂ』は平均値の約３〜約２０、好ましくは約３〜約１２、更に好ましくは約３〜約１０、最も好ましくは約４〜８の範囲である。ある好適実施態様においては、『ｂ』は約４である。
【００４７】
種々の実施態様においては、『ｃ』は１〜１０、好ましくは２〜１０、更に好ましくは３〜８又は４〜８の範囲、最も好ましくは３〜６の範囲である。ある好適実施態様においては、『ｃ』は約４である。
種々の実施態様においては、『ｄ』は０〜３又は１〜３である。ある好適実施態様においては、『ｄ』は０〜２又は１〜２であり、他の実施態様においては、『ｄ』は１である。
アミノ酸残基--例えば、Ｚ又はＵで表される残基--が独立して選ばれるということは、各出現時に指定した群からの残基が選ばれることを意味する。即ち、『ａ』が２である場合には、Ｚで表される親水性残基の各々が独立して選ばれ、ＲＲ、ＲＤ、ＲＥ、ＲＫ、ＤＲ、ＤＤ、ＤＥ、ＤＫ等を含むことができる。『ａ』及び『ｂ』が平均値であるということは、反復配列（例えば、Ｚa Ｕb ) がペプチド配列内でいくぶん変動させることができるが『ａ』及び『ｂ』の平均値が各々約１〜約５及び約３〜約２０であることを意味する。
例えば、下記の表１に『ＫＬ８』と称されるペプチドの式（Ｚa Ｕb ) c Ｚdを用いると、式はＫ1 Ｌ8 Ｋ1 Ｌ8 Ｋ1 Ｌ2 として書き換えられ、『ｂ』の平均値は６ [即ち、(8+8+2)/3 = 6]であり、ｃは３であり、ｄは０である。
上記式の具体的な好適ポリペプチドは、下記表１に示される。
【００４８】
【表２】
2004250459.tif 000003
【００４９】
肺胞との相互作用を最大にする配置を有する約４〜６０個のアミノ酸残基の複合ポリペプチドも適切である。複合ポリペプチドは、実質的にアミノ末端配列及びカルボキシ末端配列からなる。アミノ末端配列は、上記式で定義される本発明の疎水性領域のポリペプチド又は疎水性ペプチド、好ましくは疎水性ポリペプチドのアミノ酸配列を有する。カルボキシ末端配列は、本カルボキシ末端ペプチドのアミノ酸残基配列を有する。
天然界面活性物質タンパク質（ＳＰ）に由来する又はそれと同様な特徴をもつタンパク質及びポリペプチドは、本方法に有用である。述べたように哺乳動物種から単離したＳＰが用いられるが、ウシ、ブタ及びヒト界面活性物質が特に好ましい。
天然界面活性物質タンパク質としては、ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−Ｃ又はＳＰ−Ｄ、又はその断片が単独で又は脂質と組合わせて含まれる。好ましい断片は、ＳＰ−Ｂのアミノ末端残基１〜２５である。
関連ペプチドは、配列スクシニル -Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Gln-Trp-Lys-アミドを有するＷＭＡＰ−１０ペプチド (Marion Merrell Dow Research Institute)である。代替的ペプチドは、本明細書に記載されるリン脂質の混合物において表面張力の低下を誘発させるリシン、アルギニン又はヒスチジンのポリマーである。
【００５０】
更に、ヒトＳＰ１８（ＳＰ−Ｂ）界面活性物質タンパク質は、本明細書に記載されるように用いられる。例えば、米国特許第 5,407,914号；同第 5,260,273号；及び同第 5,164,369号を参照されたい。これらの明細書の記載は本願明細書に含まれるものとする。
従って、ある実施態様においては、本発明の界面活性物質分子はポリペプチドを含んでいる。ある態様においては、界面活性物質ポリペプチドは約４個、更に好ましくは約１０個のアミノ酸残基を含んでいる。個々の実施態様においては、界面活性物質ポリペプチドは好ましくは６０個以下のアミノ酸残基、通常は約３５個より少ないアミノ酸残基、更に好ましくは約２５個より少ないアミノ酸残基を含んでいる。個々の好適実施態様においては、本ポリペプチドはＳＰ１８モノマー配列--例えば、ＳＰ１８の直線配列の相接する残基の単一グループに対応する。他の実施態様においては、本ポリペプチドは、好ましくは荷電アミノ酸残基と非荷電アミノ酸残基の領域を交互にもつか又は疎水性アミノ酸残基と親水性アミノ酸残基の領域を交互にもつ。
本発明のポリペプチドは、また、保存的或いは非保存的の挿入、欠失及び置換のような種々の変化に供することができ、かかる変化は使用にある種の利点を与える。保存的置換は、あるアミノ酸残基を生物学的に類似した他の残基に置換するものである。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンのようなある疎水性残基を他のもので置換又はある極性残基をアルギニンとリシン間、グルタミン酸とアスパラギン酸間又はグルタミンとアスパラギン間等の他のもので置換することが挙げられる。『保存的置換』という用語は、かかるポリペプチドが必要な結合活性を示すならば非置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸の使用も含まれる。
【００５１】
追加の残基は、例えば、ポリペプチドを標識又は固体マトリックス、又はキャリヤに便利にくっつけることができる『リンカー』となるために、本発明のポリペプチドの両末端で付加される。本発明のポリペプチドと用いられる標識、固体マトリックス及びキャリヤは当該技術において既知であり、本明細書にも例が記載されている。
アミノ酸残基リンカーは、通常少なくとも１個の残基であり、４０個以上の残基とすることができ、たいてい１〜１０個の残基である。結合に用いられる典型的なアミノ酸残基は、チロシン、システイン、リシン、グルタミン酸及びアスパラギン酸等である。更に、本発明のポリペプチド配列は、末端ＮＨ2 アシル化、例えば、アセチル化、又はチオグリコール酸アミノ化、末端カルボキシルアミノ化、例えば、アンモニア、メチルアミノ等によって修飾されている配列によって天然配列と異なることができる。
他の実施態様においては、本発明のポリペプチドは、０未満、好ましくは−１以下、更に好ましくは−２以下の複合疎水性をもつアミノ酸残基配列を有する。ペプチドの複合疎水性の定量は、実施例３に詳述されている。これらの疎水性ポリペプチドは、ＳＰ１８の疎水性領域の機能を行う。従って、好適実施態様においては、アミノ酸配列はＳＰ１８の荷電及び非荷電--又は疎水性及び親水性--残基のパターンと似ている。
【００５２】
しかしながら、本発明のポリペプチド及び他の界面活性物質分子が、天然のＳＰ１８と類似の配列を有する分子に限定されない。対照的に、本発明の最も好ましい界面活性物質分子は、同様の界面活性物質活性及び荷電／非荷電（又は疎水性／親水性）残基交互配列をもつ以外は個々のアミノ酸残基配列についてＳＰ１８にほとんど似ていないものがある。
本発明のある開示実施態様は、ペプチド含有標品、塩基性極性リシン（Ｋ）残基によって結合した４個の疎水性ロイシン（Ｌ）の反復単位からなるヒトＳＰ−Ｂの模擬配列である２１残基ペプチドを含んでいる。本明細書で『ＫＬ4 』と略語で示されるこの具体的なペプチドは、次のアミノ酸残基配列を有する：
KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK(配列番号１）。
リン脂質ジパルミトイルホスファチジルコリン及びパルミトイルホスファチジルコリン、オレオイルホスファチジルグリセロール（３：１）及びパルミチン酸と混合したリン脂質−ペプチド水性分散液は『ＫＬ4 界面活性物質』と名付けられ、通常、本明細書ではその方法で呼ばれる。種々の実験及び臨床におけるＫＬ4 界面活性物質の効能は以前に報告されている。例えば、Cochraneら, Science,254:566-568 (1991); Vincentら, Biochemistry, 30:8395-8401 (1991); Cochrane ら, Am J Resp & Crit Care Med, 152:404-410 (1996); Revakら, Ped. Res., 39:715-724 (1996)参照。
【００５３】
Ｅ．アミノ酸、天然代謝産物、誘導体、設計類縁体及び他の有機分子
本発明の界面活性物質分子は、上記で定義されかつここで更に記載される界面活性物質活性を有する有機分子が含まれる。ポリペプチド及びタンパク質はたいてい具体例として記載されているが、本発明の界面活性物質分子が慣用のアミノ酸側鎖或いはポリアミドバックボーン構造を有するものに限定されないことは理解されるべきである。
前述のように、本発明は、タンパク質、ポリペプチド、及びアミノ酸残基を含む分子を含む種々の界面活性物質分子、及び種々の界面活性物質組成物を企図する。生物学的組成物に使用するのに好ましい『慣用の』天然アミノ酸（即ち、上記Ａ項の『対応表』を考える傾向があるが、慣用でないが天然に存在するアミノ酸、天然アミノ酸の代謝産物及び異化代謝産物、置換アミノ酸、アミノ酸類縁体、及び『Ｄ』配置のアミノ酸を含む種々の他の分子が本発明の分子及び組成物に有効であるということも言える。更に、『設計』アミノ酸誘導体、類縁体及び模擬体も本発明の種々の化合物、組成物及び方法、及び非アミド結合から構成されるバックボーン構造を含むポリマーに有効である。
例えば、上記Ａ項の『対応表』に示されたＬ−アミノ酸のほかに、ホモアルギニン、シトルリン、オルニチン及びα−アミノブタン酸のようなアミノ酸代謝物も本発明の分子及び組成物に有効である。従って、上記の種々の式において、『荷電した』Ｚ、又はＢはホモアルギニン、シトルリン又はオルニチン、及び本明細書で同定された種々の他の分子を含むことができる。同様に、Ｊはα−アミノブタン酸（α−アミノ酪酸としても知られる）、α−アミノペンタン酸、α−アミノヘキサン酸、及び本明細書で同定された種々の他の分子を含むことができる。
【００５４】
更に、通常はタンパク質由来でないが天然に既知である置換アミノ酸は本明細書に開示されるように有効であり、次の例が挙げられる：Ｌ−カナバニン；１−メチル−Ｌ−ヒスチジン；３−メチル−Ｌ−ヒスチジン；２−メチル−Ｌ−ヒスチジン；α，ε−ジアミノピメリン酸（Ｌ体、メソ体、又はその両者);サルコシン；Ｌ−オルニチンベタイン；Ｌ−ヒスチジンのベタイン（ヘルジニン);Ｌ−シトルリン；Ｌ−ホスホアルギニン；Ｄ−オクトピン；ｏ−カルバミル−Ｄ−セリン；γ−アミノブタン酸；及びβ−リシン。若干の例を示す次のものを含むＤ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸類縁体は、本発明のタンパク質、ペプチド及び組成物に有効である：Ｄ−アラニン、Ｄ−セリン、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−アロイソロイシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−プロリン、及びＤ−アロヒドロキシプロリン。上記のものは本発明の界面活性物質分子にも用いられ；従って、式｛( 荷電 )a ( 非荷電 )b ｝c ( 荷電 )d に対応するものが使用するのに特に好ましい。
本発明は、また、代謝産物及び異化代謝産物を含む広範囲のアミノ酸が界面活性物質活性を示す分子に混合されることを開示する。例えば、オルニチン、ホモアルギニン、シトルリン及びα−アミノブタン酸のような分子は、本明細書に記載される界面活性物質活性を示す分子の有用な成分である。本発明の界面活性物質分子は長い直鎖分子を含むことができ；α−アミノペンタン酸及びα−アミノヘキサン酸はかかる有用な分子の２つの追加例である。
【００５５】
本発明は、また、修飾が起こる時間又は位置に無関係に類縁体、代謝産物、異化代謝産物及び誘導体を含む種々の修飾アミノ酸を包含することは理解されるべきである。実質的に、修飾アミノ酸を３つの部門に分けることができる:(１）アミノ酸の異化代謝産物及び代謝産物;(２）転写後修飾によって生じた修飾アミノ酸（例えば、側鎖の修飾);及び（３）非代謝又は非異化過程によってアミノ酸に生成される修飾（例えば、修飾アミノ酸又は誘導体の研究室での合成）。
本発明は、また、直鎖、分枝鎖、或いは炭化水素又は複素環配置のメチレン基を付加又は消去することにより長い又は短縮した側鎖を含む残基単位のアミノ酸の側鎖を容易に設計することができることを企図する。直鎖及び分枝鎖構造は、Ｓ、Ｏ又はＮのような非炭素原子を含むこともできる。脂肪酸は、本明細書の界面活性物質分子の有用な成分とすることもできる。設計側鎖は、荷電又は極性基付加物で（Ｒ′）又はそれを含まずに（Ｒ）終わることができる。
更に、異なるリンカーの使用から生じる分子を含む類縁体も、本明細書に開示されるように有効である。アミド結合以外の結合によって共に結合した側鎖を有する分子--例えば、若干の例として示すカルボキシエステル又はホスホエステル、エチレン、メチレン、ケトン又はエーテル結合によって成分が結合されるアミノ酸側鎖又は他の側鎖（Ｒ−又はＲ′−）を含む分子--も本明細書に開示されるように有効である。実質的に、アミノ酸側鎖、Ｒ又はＲ′基含有分子は、該分子が親水性と疎水性残基を交互に含みかつ本明細書に記載される界面活性物質活性を示す限り本明細書に開示されるように有効である。
【００５６】
本発明は、また、適切なリンカーによって結合したペプチド二量体、例えば、シスチン分子によって結合したペプチド二量体を含む分子を企図する。（当業者が気づくように、２つのシステイン分子はチオール基の酸化によって形成されたジスルフィド架橋によって一緒に結合される。） 従って、かかるリンカー又は架橋は異なるポリペプチド鎖、二量体、三量体等を架橋することができる。ペプチド二量体及び／又は他のペプチド多量体を結合するために用いられる他の有効なリンカーとしては、上記に示されたもの、例えば、若干の例を示すカルボキシエステル又はホスホエステル、エチレン、メチレン、ケトン又はエーテル結合が挙げられる。
本明細書に開示される多くの有効なポリペプチド--例えば、ＫＬ4 ポリペプチド（配列番号１）--はペプチド結合によって結合される『Ｌ』体の天然に存在するアミノ酸を含むことが理解されるが、アミノ酸側鎖類縁体を含む分子、非アミド結合（例えば、異なるバックボーン）も顕著な界面活性物質活性を示しかつ他の利点も有することは理解されるべきである。例えば、容易に分解しない分子を構築することが望ましい場合には（例えば、界面活性物質組成物に使用するために）、一連のＤ−アミノ酸を含むポリペプチド分子を合成することが望ましい。『レトロ』バックボーン--即ち、カルボキシル末端からアミノ末端の逆方向に構築された内部アミド結合を有する分子--も更に分解しにくく、本明細書に記載される種々の用途に有用である。例えば、下記式はバックボーンに『レトロ』結合を有する具体的な分子を示すものである。
【００５７】
【化１】
2004250459.tif 000004
【００５８】
他の態様においては、『剛い』コンホメーションを用いる分子を構築することが望ましく、これを達成する手段はメチル又は他の基をアミノ酸のα炭素原子に付加するものである。
上述したように、ＣＨ3 基以外の基もα炭素原子に付加される。即ち、本発明の界面活性物質分子はα炭素にＣＨ3 を取り込むもののみに限定されない。例えば、上記の側鎖及び分子のいずれもがα炭素成分の指定したＣＨ3 基を置換することができる。
本明細書に用いられるポリペプチド及びアミノ酸残基の『類縁体』という用語は、アミノ酸の代謝産物又は異化代謝産物、及び『天然に存在する』Ｌ体アミノ酸と言われるものに通常見られるものと異なる結合、バックボーン、側鎖又は側鎖基を含む分子を包含するものである。（『類縁体』と『誘導体』は本明細書では同じ意味で便利に用いられる。） 従って、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸に似ている分子及び『設計』側鎖を有するアミノ酸（即ち、界面活性物質活性を有する分子において１個以上のアミノ酸を置換することができるアミノ酸）も本明細書の『類縁体』と『誘導体』に包含される。
１個以上の伸長又は置換Ｒ又はＲ′基を有するアミノ酸を含む有効な界面活性物質分子の幅広い配列も本発明によって企図される。また、当業者は、得られた分子が本明細書に記載される界面活性物質活性を有する限り個々のアミノ酸、結合、及び／又は鎖自体に種々の修飾をすることができる--修飾は本発明の範囲内に入る分子を生成する--ことを開示から理解しなければならない。
【００５９】
Ｆ．治療法
本発明は、また、本明細書に開示される種々の新規な化合物及び組成物と共に有効な種々の治療法を開示する。ＫＬ4 界面活性物質の使用が例として本明細書に記載されるが本明細書に開示される他の化合物及び組成物--並びに界面活性物質活性を有しかつ当業者に既知の化合物及び組成物--も記載した方法に従って有効であることは理解されるべきである。
本発明は、また、新生児及び成人を含むあらゆる年齢の患者において呼吸窮迫症候群を治療する好ましい方法を開示する。かかる方法は、本発明のポリペプチド（又は他の界面活性物質分子）及び薬学的に許容しうるリン脂質から調製された界面活性物質組成物--好ましくはリポソーム界面活性物質組成物--の治療的に有効な量をかかる治療を必要としている患者に投与することを特徴とし、該ポリペプチドがリン脂質よりも該組成物の界面活性物質活性を増大するのに十分な量で該リン脂質と混合される。本発明は、また、該ポリペプチドが約１０〜６０個のアミノ酸残基及び式 [( 荷電 )a ( 非荷電 )b ] c ( 荷電 )d （式中、ａは平均値の約１〜約５であり；ｂは平均値の約３〜約２０であり；ｃは１〜１０であり；ｄは０〜３である。）で表される荷電アミノ酸残基と非荷電アミノ酸残基の交互グループで構成される呼吸窮迫症候群を治療する方法を開示する。個々の好適実施態様においては、薬学的に許容しうるリン脂質と混合される場合のポリペプチドは、該リン脂質のみの界面活性物質活性より大きい界面活性物質活性を有する肺胞界面活性物質を形成する。
【００６０】
下記に示される個々の実施例に示される本発明の界面活性物質化合物及び組成物を投与する種々の方法が有効である。治療を必要とする個体--例えば、呼吸窮迫症候群をもつ新生児又は成人--の要求に基づいて異なる治療法が適切である。
従って、新生児が胎便を吸引した場合には特定の治療方法が推奨される。かかる治療法では、本発明の界面活性物質組成物による患者の肺の洗浄が行われる。界面活性物質による１回の洗浄が必要な全てであり、また、多回界面活性物質洗浄も適切である。更に、希釈界面活性物質洗浄が食塩水と界面活性物質洗浄の組合わせより良好な結果を生じる傾向があることが下記に示されるにもかかわらず--食塩水洗浄に続いて１回以上の洗浄が適切な治療である。
界面活性物質を用いる洗浄法は、実質的に次のように行われる。ＫＬ4 界面活性物質又は他の界面活性物質（例えば、本発明のもの）を、気管内チューブのような種々の可撓性チューブ様装置を含む食塩水洗浄法で典型的に用いられる器具を用いて投与することが好ましい。従って、例えば、チューブによって挿入されるカニューレを含む気管内チューブ装置--例えば、吸引するために--は開示された方法に従って使用するのに適切である。好ましくは、洗浄液を肺に及び肺から各々安全かつ効能ある送達及び除去するのに適切に用いられる装置が本明細書で使用するのに企図される。
【００６１】
肺胞洗浄用の具体的な装置は、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）用に備えられた換気装置であり、肺に呼気終末陽圧（ＰＥＥＰ）をかける手段、肺に液体を点滴する手段及び陰圧吸引を用いて肺から肺胞液を除去する手段を含まなければならない。
代表的な装置は、米国特許第 4,895,719号、同第 5,207,220号、同第 5,299,566号及び同第 5,309,903号に記載されており、これらの明細書の記載は本願明細書に含まれるものとする。
本明細書に示される特に有利な結果は、動脈酸素（ＰａＯ2)の持続した回復、正常な肺コンプライアンス及び本明細書で細菌性ＬＰＳの点滴を用いるモデルで証明されるように胎便吸引又は内在界面活性物質の部分的低下による肺損傷後の炎症の消失を生じる希釈界面活性物質を用いて肺胞洗浄方法を行うことにより得られた。これらの方法は、肺不全、特に急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）がある種々の肺の病態のいずれかを治療するのに使用するために有効であると考えられる。
肺不全がある病態としては、新生児胎便吸引、肺胞性炎症、肺胞性感染症が含まれるがこれらに限定されない。肺不全は、敗血症、肺胞性損傷、肺胞性滲出液の蓄積、膵炎、胃の内容物の吸引、加熱蒸気吸入、煙又は有害気体吸入、急性酸素欠乏症、胎児循環、先天性横隔膜ヘルニア、肺炎、感染症又は多回輸注から生じる炎症等を含む種々の病態に付随することがある。
本明細書に示される本希釈界面活性物質洗浄法は、炎症の伝達物質を除去しかつ同時に肺機能を保存及び／又は回復させ、効果的な治療法を与える。
【００６２】
肺胞洗浄を適用するといくつかの有益な特徴が生じる。肺胞洗浄の洗浄作用は、デブリ、死細胞、自由な炎症細胞及び液等を除去し、閉塞している液体及び物質を有する肺胞を洗浄し、肺胞洗浄液の典型的には３０〜９５％を胎便又は炎症滲出液のような望ましくない物質と共に除去する。希釈界面活性物質は、肺胞膜を治療し、組織のコンプライアンスを改善する。界面活性物質による洗浄前、洗浄中及び洗浄後に呼気終末陽圧（ＰＥＥＰ）として指定した量のベンチレーター空気圧をかけると洗浄及び治療相において接触を最大にするために肺を拡張し、洗浄過程の動力学を改善し、特に、肺胞における酸素交換を不安定なものにすることがある過程で患者の酸素圧及びガス交換を改善する。更に、肺胞（洗浄）液を除去するために短い間隔の気管・気管支吸引の使用は、動脈酸素飽和度を許容しうるレベル及び安全なレベルより下げない方法で注意深く投与される。
肺胞洗浄法は哺乳動物で行われ、肺不全に罹っている成人、幼若年及び乳児、新生児と乳児の両方を含むヒトに特に適する。
哺乳動物の肺胞洗浄方法は、ベンチレーター手段による気相（ガス）呼気終末陽圧（ＰＥＥＰ）を哺乳動物の肺、肺分節又は葉へ加える段階を含む。その後、薬学的に許容しうる水性媒体に希釈した界面活性物質を含む洗浄組成物を哺乳動物の肺又は肺分節に点滴する。その後、肺分節に存在する洗浄組成物を含むいくらかの又は全部の肺胞液を、陰圧を用いて短い間隔の気管・気管支吸引を加えることにより除去する。
【００６３】
ＰＥＥＰは典型的には４〜２０センチメートル(cm)Ｈ2 Ｏ圧範囲で投与されるが、その圧は患者及び肺の病態によって変動させることができる。肺が強くなった成人、幼若年及び新生児以外の乳児については、その範囲は好ましくは６〜１２cmＨ2 Ｏ、更に好ましくは約８〜１０cmＨ2 Ｏである。肺嚢が加圧に敏感で脆弱な新生児については、ＰＥＥＰは約４〜１５cmＨ2 Ｏ、好ましくは約６〜９cmＨ2 Ｏ、更に好ましくは約８cmＨ2 Ｏの範囲とすることができる。
ガスＰＥＥＰの投与は、典型的には、処置の前に血液酸素を安定化するために希釈界面活性物質洗浄液を点滴する前に、典型的には約３０分前までに、更に好ましくは約５〜３０分前までに肺に加えられる。更に、ＰＥＥＰは点滴及び除去の両段階の処置中連続して加えられることが好ましい。連続ＰＥＥＰを加える圧と短い間隔の吸引に対する両方の効果は正味圧の短時間の一時的な低下を生じ、吸引間隔が終わるとＰＥＥＰ維持レベルに急速に戻る。更に、処置後の肺胞に酸素圧を維持するために洗浄液除去段階後の時間、ＰＥＥＰが加えられる。好ましくは、除去段階後約２４時間まで、好ましくは約１２時間まで、更に好ましくは約0.５〜６時間ＰＥＥＰが維持される。
投与ガスは追加酸素、典型的には酸素約２１〜１００％、好ましくは酸素約５０〜１００％を含むことができる。
洗浄液及び肺胞液を除去する方法の吸引相は短い間隔、即ち、１〜１２０秒で投与される。典型的な吸引間隔は、３０秒未満、好ましくは２０秒未満、更に好ましくは約５〜２０秒である。好ましい間隔は２〜１２０秒、好ましくは５〜２０秒である。吸引時間は、洗浄処置の吸引相を伴うことができる飽和動脈酸素（ＳａＯ2)の低下を最少にするために短い。
【００６４】
肺胞液を除去するために要する１回を超える吸引がある場合に吸引処置の交換として、ＰａＯ2 レベルが回復する機会を与えるために１回の吸引間隔に続いて直ちに他の吸引間隔があるよりは短い吸引間隔の間に休止があることが望ましい。典型的な休止時間は約３０秒〜１５分、好ましくは約１〜５分である。
肺胞液を除去するために加えられる吸引は、約１０〜１５０ミリメートル(mm)水銀（Ｈｇ）、好ましくは約２０〜１２０mmＨｇ、更に好ましくは約６０〜１００mmＨｇの陰圧である。吸引カテーテル又は類似の吸引手段は、換気装置内に、典型的には装置のベンチレーターチューブを通って気管支に伸びるカニューレとして存在する。カニューレの尖端は、典型的には、ファイバーオプティック観察手段によって分節気管支に進められ、点滴及び除去はカニューレの尖端を通って与えられる。
希釈洗浄法を行うにあたり、洗浄液が繰り返し投与されることは理解される。従って、点滴及び除去段階は、本明細書に記載されるＰＥＥＰを加える間、連続して反復される。典型的には、点滴及び除去（洗浄液サイクル）を２〜５回順に反復されるが、正しいとされる場合には追加の反復が行われる。更に、希釈界面活性物質の含量を反復洗浄液の過程で変えることができる。例えば、第１回の１〜３洗浄サイクルは洗浄組成物約0.１〜１０ mg/mlの濃度の希釈界面活性物質を用いて行われ、第２回の１〜５洗浄サイクルは約１０〜５０ mg/mlの濃度の希釈界面活性物質を用いて行われる。
【００６５】
気管内チューブ装置の肺での位置によって、洗浄組成物は肺葉、肺分節又は肺両側を洗浄し、これは装置が終わる気管支チューブでの位置によって決定される。従って、『肺』という用語は、肺葉、肺分節、２又は３葉を含む肺一側、又は全肺が本方法の組合わせで表されるが患者の体重に基づいて容積が調節されることを含むことは理解される。
洗浄組成物を点滴するにあたり、カニューレ、気管支鏡、気管内チューブ等のような種々の方法でプロセスが行われることも理解される。好適方法においては、点滴は、典型的には装置チューブ末端で肺を観察する手段によって、典型的にはファイバーオプチック気管支鏡及び気管支チューブ及び末端肺葉の視覚表示の照射手段によって肉眼でモニターされる。従って、適切な洗浄組成物容量の推定値が述べられるが、実際の点滴容量は観察手段によって援助された点滴プロセス中の開業医の判断に左右されることが理解される。
肺胞洗浄法は、典型的には、肺の病態の程度に基づいて必要とされる左肺と右肺双方及び肺葉を含む数の肺で行われる。典型的には、左と右の肺の気管支分節の３０〜１００％で連続して処置が行われる。
気管支鏡又は気管内チューブに、気管支の気道の内径に合うように及びそれによって方法を行う圧範囲に耐えることができる適合を得るように設計された固定又は拡大する環が取り付けられる。この特徴は、肺の区域を洗浄する限りでは特に望ましく、肺の残りの部分が呼吸することができ、患者のガス交換に対する処置の外傷を最少にする。
【００６６】
本発明のＫＬ4 界面活性物質溶液又は他の新規な界面活性物質溶液は、本処置に適切な製剤で洗浄により投与される。約１０〜２０ ml/kgを含む界面活性物質製剤が呼吸窮迫症候群の治療に有効であることがわかったが、洗浄治療用製剤は気管内チューブによる効率のよい送達及び除去を容易にするために更に希釈する傾向がある。
従って、洗浄組成物の組合わせで用いられる場合の『希釈界面活性物質』は、該洗浄組成物が、界面活性物質活性を与えるが該組成物が洗浄を施すことができる液体粘性をもつような量で存在するのに十分な量で本明細書に定義される該組成物に界面活性物質活性を与える１種以上の物質を含むことを示している。
従って、洗浄によって被検者（又は患者）に投与するのに有効な界面活性物質含有組成物は、該組成物が点滴後３０秒未満で吸引除去を施すような粘性である限り約５０ mg/mlまでの濃度に希釈されることが好ましい。本明細書での使用には典型的には約０．１〜５０ mg/mlの用量が企図される。更に、それより多い用量の投与が種々の場合に--例えば、被検者が少量に十分に応答しない場合、又は高濃度の界面活性物質活性含有物質を可能にしつつ製剤が粘性を下げる場合には適切である。
通常は、被検者（又は患者）の体重１kgあたり約４〜６０mlの界面活性物質の量が各投薬で投与されるか、典型的には右肺と左肺間に等分されるか又は肺区域に分けられる。個々の患者の要望に基づいて--治療を与えている当業者の医師又は他の個人によって容易に決定される--多量又は少量の界面活性物質が各投与で送達される。約８〜３０ ml/kgを含む量が好ましく、約１０〜２５ ml/kgを含む量が更に好ましい。従って、洗浄組成物は、典型的には約４〜６０ ml/kg、好ましくは約８〜３０ ml/kg、更に好ましくは約１６〜２５ ml/kgの容量で点滴される。
【００６７】
洗浄組成物に存在する界面活性物質の量を記載するに当たり、重量は特にことわらない限りリン脂質リン酸塩として測定された量を意味する。
洗浄によって投与される界面活性物質の量は、個々の患者における『肺に対して』記載される。従って、洗浄のために有効な量の界面活性物質は、約２００〜８００ml／肺７０kg成人、好ましくは約４００ml／肺、及び約３０〜６０ml／肺３kg新生児、好ましくは約５０ml／肺を含むことができる。上記のように、治療を受ける個体の成熟した状態及びサイズに基づいて界面活性物質の投与量--及び用量--が適切なように調節される。
被検者は、個体の病態の程度及び最初の洗浄に対する被検者の応答に基づいて１回以上の洗浄を受けることができる。界面活性物質の投薬及び投与量は後続の洗浄において異なってもよい。被検者が最初の洗浄で典型的な用量を投与される場合には、後続の洗浄は同じ用量、少ない用量又は多い用量を用いて投与され、被検者の要望及び応答に左右される。
同様に、各洗浄で投与される界面活性物質の量は異なってもよく--一定のままでもよく--個々の患者の要望に左右される。適切な場合においては、最初又は後続の洗浄に続いて多くの用量--例えば、１０〜５０ mg/mlまでが洗浄投与される。例えば、被検者は、０．１〜１０ mg/mlの濃度の界面活性物質で１〜３回洗浄投与され、続いて１０〜５０ mg/mlの濃度の界面活性物質で１〜５回洗浄投与される。
【００６８】
上記のように、投与されるべき用量は、被検者のサイズ及び成熟の状態並びに被検者の病態の程度で異なる。当業者は、本明細書に教示されるように容易にこれらの要因を決定しかつ洗浄によって投与される用量を調整することができる。
界面活性物質のボラス投与も適切である。従って、例えば、１５〜１００ mg/mlの界面活性物質１０〜３００ mg/kgのボラスが、１回以上の洗浄処置の前に又は後に投与される。
治療の種類、投薬及び使用量は、個々の被検者の病態の種類及び重篤度によって異なることは理解される。従って、例えば、被検者が胎便吸引に罹患している新生児である場合には、１回以上の界面活性物質洗浄を含む治療の用法が施されると思われる。界面活性物質のボラス投与に続いて洗浄投与も行われる。
上述のように、本発明のある態様は、肺機能を改善しかつ呼吸路において胎便又は他の有害物質の存在に対する応答で通常生じる炎症反応を阻止するために希釈界面活性物質による洗浄によって気道から胎便又は炎症滲出液を除去するものであった。多くの実施例は、好適実施態様の使用--例えば、外因性界面活性物質を含む合成ペプチド--に集中しているが、他の界面活性物質含有洗浄組成物が開示した方法に従って用いられることは特に理解される。界面活性物質の具体的な製剤及びその使用方法も本明細書に開示される。
下記の実施例は、本発明を具体的に説明するものであるがこれらに限定されない。
【実施例】
【００６９】
１．界面活性物質組成物の調製
材料．  1,２−ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）及び１−パルミトイル、２−オレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）及びパルミチン酸（ＰＡ）は、 Avanti Polar Lipids Inc.(アラバマ州バーミンガム) から入手した。Ｌ−α−ジパルミトイル− [ジパルミトイル−１−14Ｃ] ホスファチジルコリン (14Ｃ−ＤＤＣ）は、 New England Nuclear (マサチューセッツ州ボストン) から入手した。アミノ酸配列 KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLKを有するＫＬ4ペプチドは、本明細書に記載されるように合成されるか又は R.W. Johnson Pharmaceutical Research Institute(カリフォルニア州ラジョラ) から入手した。塩、緩衝液及び有機溶媒は、全て入手可能な最高グレードのものを用いた。
手順  本発明のペプチド--例えば、ＫＬ4 --の合成は、種々の既知の合成法に従って行われる。次の手順は具体例として記載される。ＫＬ4 ペプチド（９mg）、ＤＰＰＣ（２２５mg）、ＰＯＰＧ（７５mg）及びＰＡ（４５mg）を２．５ミリリットル(ml)の９５％エタノールに４５℃で溶解した。次に、この溶液を７．５mlの蒸留水に４５℃で急速に攪拌しつつ加え、続いて２mlの５００mMＮａＣｌ、２５０mMトリス−酢酸塩ｐＨ７．２を加えた。得られた乳状懸濁液を３７℃で１５分間攪拌し、次に、存在するエタノールを１００容量の１３０mMＮａＣｌ、２０mMトリス−酢酸塩ｐＨ７．２緩衝液、３７℃に対する透析（スペクトラポア２；１3,０００分子量区分）で除去した。透析溶液を２回変えることにより４８時間透析を続けた。
【００７０】
また、下記の手順が本明細書に記載されるように用いられるペプチド--例えば、ＫＬ4 ペプチド--のバッチを合成するのに有効である。界面活性物質ペプチドの合成に用いられる化学薬品及び試薬としては次のものが含まれる。
ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−リシン（Ｃ１−Ｚ）ＰＡＭ樹脂(t-Boc-L-Lys(C1-Z); AppliedBiosystems, カリフォルニア州フォスターシティ);
ａ−Ｂｏｃ−ε−（２−クロロ−ＣＢＺ）−Ｌ−リシン (Bachem, カリフォルニア州サンディエゴ);
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシン−Ｈ2 Ｏ (N-Boc-L-Leu; Bachem);
ジクロロメタン(DCM; EM Science, ニュージャージー州ギブスタウン又はFisher, ペンシルバニア州ピッツバーグ);
トリフルオロ酢酸 (TFA; Halocarbon);
ジイソプロピルエチルアミン(DIEA; Aldrich, ミシガン州アルドリッヒ);
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド(DMF; EM Science, ニュージャージー州ギブスタウン);
ジメチルスルホキシド (DMSO; Aldrich);
Ｎ−メチルピロリドン (NMP; Burdick & Jackson, ミシガン州マスケゴン);
１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物 (HOBt; Aldrich);
１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド (DCC; Aldrich);
酢酸無水物 (Ac2O; Mallinckrodt, ミズリー州セントルイス);及び
フッ化水素 (HF; Air Products, ペンシルバニア州アレンタウン) 。
ＫＬ4 ペプチドを合成する手段は、メリフィールド法を用いてカップラー 296ペプチドシンセサイザー (Vega Biotechnologies, アリゾナ州ツクソン) で行われる（図１参照）。『典型的な』合成は次のように記載される。鎖延長は、下記の表２に記載される手順により１００ｇのリシンＰＡＭ樹脂で行った。工程７、１０及び１１以外の工程は全て自動で行った。
【００７１】
【表３】
2004250459.tif 000005
【００７２】
ペプチド−樹脂が脱保護され、適切なアミノ酸誘導体が生成された。適切なアミノ酸を１リットルのＮＭＰに溶解した。透明な溶液を得た後、その溶液にＨＯＢｔを加えた。そのＨＯＢｔを溶解した時にその溶液にＤＣＣを加えた。その溶液を室温で１時間攪拌した。その１時間の攪拌中に副生成物、ジシクロヘキシルウレア（白色沈殿）が生じた。この副生成物をワットマン#1ろ紙を用いてブフナー漏斗でろ別した。次に、ろ液を工程 No.７の Vega 296 反応容器の内容物に手で加えた。
次に、シンセサイザーを、工程 No.９の完了後に停止するように計画した。ペプチド樹脂の分割量を Sarinら (アプライドバイオシステムス431Aユーザーマニュアル、補遺Ａ）の量的ニンヒドリン試験にかけた。カップリング効率は、全合成にわたって良好であった。ロイシン１２（サイクル９）とロイシン５（サイクル１６）後に未反応ペプチド樹脂をアセチル化した。各アセチル化後に、ペプチド樹脂をジクロロメタンで洗浄した（表２、工程１１参照）。
合成の終わりに、計画の工程１〜３（表２参照）を完了することにより完結したペプチド樹脂を脱保護した（Ｂｏｃ基の除去）。次に、脱保護ペプチド樹脂を十分な量の無水エタノールで洗浄し、Ｐ2 Ｏ5 により減圧下で乾燥した。乾燥した脱保護ペプチド樹脂の重量は２５６．４８ｇであった。バッチを１００ｇのｔ−Ｂｏｃ−リシン（Ｃ１−Ｚ）ＯＣＨ2 ＰＡＭ樹脂で０．６４ミリモル／ｇの置換で開始したので、負荷は６４ミリモルに相当した。最初の１００ｇの樹脂を引き算すると重量増加分は１５６．４８ｇであった。発生期保護ペプチド（樹脂に固定されたＣ末端リシンを除く）の分子量は３０１１．６０４ｇ／モルであった。
【００７３】
ＨＦ切断  ペプチド樹脂の２５６．４８ｇロットを３つに大きく分けてフッ化水素（ＨＦ）で処理した。 Peninsula Laboratories(カリフォルニア州ベルモント) 製のＶ型ＨＦ反応装置を液体フッ化水素を用いてペプチド樹脂の切断に用いた。使用前にアニソールを蒸留した。ＨＦを処理せずに用いた。冷却のためにドライアイス、イソプロパノール及び液体窒素が必要である。
最初のＨＦについては、約８８ｇのＫＬ4 ペプチド樹脂を磁気スターバーを備えた１リットルの反応容器に入れた。そのペプチド樹脂に２５mlの蒸留アニソールを加えた。全装置を組立て漏出試験した後に、全レベルが約３００mlに達するまでＨＦを反応容器に凝縮した。ペプチドの樹脂からの切断は、−４℃で１時間処理した。ＨＦの部分的除去は、水アスピレーターで１〜２時間行った。１〜２時間後に、残りのＨＦを高圧（機械的真空ポンプ）で１〜２時間除去した。反応容器の温度は、ＨＦ除去プロセスを通して−４℃に維持した。
次に、ＨＦ装置を大気圧に平衡にし、反応容器の底に油状スラッジが見られた。冷無水エーテル（７００ml、−２０℃に予備冷却した）を反応容器の内容物に加えた。樹脂の凝集塊をガラス棒を用いてエーテルで摩砕した。樹脂が沈降した後にそのエーテルを傾瀉した。次に、樹脂を５００mlの室温の無水エーテルで洗浄し、約５分間攪拌した。樹脂が沈降した後にそのエーテルを傾瀉した。自由流動性になるまで樹脂を洗浄した（合計４〜５回）。樹脂を煙霧フード内で一晩乾燥した。
【００７４】
次に、得られた乾燥ＨＦ処理樹脂を秤量し、フリーザーで貯蔵した。１．０２１ｇの乾燥ＨＦ処理樹脂を取り出し、５０mlの５０％酢酸／水で抽出し、３０分間攪拌した。樹脂を粗い焼結ガラス漏斗でろ過し、ろ液を凍結乾燥ジャーに集めた。ろ液を約く２００mlの水で希釈し、シェル凍結し、凍結乾燥機に入れた。１ｇの抽出ＨＦ処理樹脂は５６９mgの粗ペプチドを生じた。下記の表は、残りのＫＬ4 ペプチド樹脂の大量ＨＦ処理を纏めたものである。
【表４】
2004250459.tif 000006
【００７５】
精製  ドル・オリバーモデルＢ分取用ＨＰＬＣ(Dorr-Oliver, Inc., コネチカット州ミルフォード) を用いて精製した。このユニットをリニアモデル 204分光光度計及びキップ＆ゾネンのデュアルチャネルレコーダに接続した。その分取用ＨＰＬＣにバイダックＣ4 支持体、１５〜２０ミクロン及び３００Ａ孔サイズ(Vydac, カリフォルニア州ヘスペリア) を充填した放射状に圧縮した１０×６０cmカートリッジを含むウォーターズKIL250カラムモジュール(Waters Associates, マサチューセッツ州ミルフォード) を連結した。溶媒『Ａ』は水中０．１％ＨＯＡｃからなり、溶媒『Ｂ』はアセトニトリル中０．１％ＨＯＡｃからなるものとした。流速を４００ml／分に設定し、カートリッジを１５０〜２００ psiに圧縮し、分取用ＨＰＬＣ系背圧は５５０〜６００ psiであった。
【００７６】
最初のドル・オリバー実験については、HF#1の２０ｇのＨＦ処理樹脂を５００mlの氷酢酸で抽出した。水（５００ml）を樹脂／酢酸混合物に加えた。この５０％酢酸／水溶液を２５分間攪拌した。樹脂を粗い焼結ガラス漏斗でろ別した。ペプチド含有ろ液をとっておき、ドル・オリバーに充填した。用いたＨＰＬＣ勾配は１〜４０％『Ｂ』４５分であり、数分間均一に保持した。その時点の『Ｂ』％％を１分につき１％上げて最終％の４４％にした（示されていない）。
画分を手で集め、ＨＰＬＣで分析した。純度≧９５％にあう全画分を一緒にプールし、大きなガラス容器に貯蔵した。この物質は引き続き『ＢＰＳ#1』と呼ばれる。所望成分があるが９５％以上の純度に適っていない全画分を集め再循環した。ドル・オリバーユニットで少なくとも１０回分取用ＨＰＬＣ実験を行った（データは示されていない）。
逆浸透、凍結乾燥  ＢＰＳ#1の全量は約６０リットルであった。ペプチド溶液を最終容量の２リットルに濃縮するために逆浸透を用いた。ペプチドを保持するためにR74A膜を含むミリポアモデル6015逆浸透ユニットを用いた。得られた２リットルのＢＰＳ#1をワットマン#1ろ紙を用いてブフナー漏斗でろ過し、約１１個の凍結乾燥ジャーに分け、同量の水で希釈した。凍結乾燥ジャーをシェル凍結し、凍結乾燥した。手順の終わりの乾燥ＬＤ50ペプチドの全量は、４０．２５ｇであった。
【００７７】
再凍結乾燥  異なる凍結乾燥条件（例えば、ペプチド濃度、凍結乾燥されるべき溶媒の組成、凍結乾燥工程の長さ、貯蔵温度等）により溶解度特性の異なる乾燥標品が得られることがわかった。乾燥ＫＬ4 ペプチドが１ mg/mlのクロロホルム：メタノール（１：１）溶液に可溶性であり、１０ mg/mlに≧９０％可溶性であることが望ましい。これらの基準が上記の凍結乾燥工程の終わりに適っていない場合には、ペプチドは再凍結乾燥される。典型的な再凍結乾燥を次に記載する。
約５ｇのペプチドを２リットルのアセトニトリルにガラスフラスコ中で攪拌しつつ徐々に加える。約１分後、３リットルのミリＱ水を加え、次に、５０mlの酢酸（酢酸の最終濃度＝１％）を加える。これを３７℃で３日間攪拌し、ブフナー漏斗でワットマン#1ろ紙によってろ過し、凍結乾燥ジャーに入れる。次に、ドライアイスとイソプロピルアルコールを用いてシェル乾燥し、凍結乾燥機に入れる。凍結乾燥時間は３〜７日に変えてもよい。次に、最終乾燥生成物を秤量し、パッケージに入れ、分割量を溶解度及び化学分析に用いる。
【００７８】
２．医薬製剤
界面活性物質組成物は、全リン脂質４０ mg/mlを含有するように処方され、組成は下記式に基づく。
ＰＬT ＝全リン脂質＝ＤＰＰＣ＋ＰＯＰＧ
３ＤＰＰＣ：１ＰＯＰＧ
１ＰＬT ：０．１５ＰＡ：０．０３ペプチド
上記式を用いて、最終生成物１mlに対して好ましい組成物は実質的に下記の通りである。
【００７９】
【表５】
2004250459.tif 000007
【００８０】
更に、緩衝系／懸濁液については、最終生成物１mlに対して組成物は下記の成分を含むことができる。
【００８１】
【表６】
2004250459.tif 000008
【００８２】
タム緩衝系は、実質的に次の通り調製される。酢酸 (AR Select, ACS, Mallinckrodt, ケンタッキー州パリス) でｐＨ７．２±０．５にｐＨ調整した０．３７mlのタム溶液（トロメタミン注射液, NDC 0074-1593-04, Abbott Laboratories, イリノイ州ノースシカゴ) を０．３３mlの食塩水（０．９％塩化ナトリウム注射液, USP, Abbott Laboratories) 及び０．３０mlの水（注射用滅菌水, USP, Abbott Laboratories) と混合し、滅菌ろ過する。
【００８３】
３．ポリペプチド界面活性物質活性の試験管内評価
界面活性物質活性の測定  最小（γ分）気泡半径の気体−液体界面前後の表面圧の測定を、Enhorning, J. Appl. Physiol., 43:198-203 (1977) に記載された脈動気泡法を用いて時間を変えて求めた。
概要としては、エンホーニングサーファクトメータ(Surfactometer International, オンタリオ州トロント) は、最大（０．５５mm）半径と最小（０．４mm）半径間の２０サイクル／分の速度で脈動する気泡の液体−気体界面前後の圧力勾配（ΔＰ）を測定するものである。３７℃の水を封入した２０μl の試料チャンバ内で生じた気泡を光学顕微鏡でモニターし、圧力の変化を０cmＨ2 Ｏと−２cmＨ2 Ｏを測定したストリップチャート記録計で記録する。
複合疎水性値の定量  各ペプチドの複合疎水性値を、Hoppら, PNAS USA, 78:3824-3829 (1981) の表１に記載される対応する疎水性値をペプチド内の各アミノ酸残基に帰属させることにより求め、この文献の記載は本願明細書に含まれるものとする。あるペプチドの疎水性値を合計し、その合計が複合疎水性値を表す。
界面活性物質の調製  溶媒と混合した後、各ペプチドをリン脂質（ＤＰＰＣ：ＰＧ）３：１と混合して下記の方法の１つに従って界面活性物質を形成した。
【００８４】
方法Ａは、１６μl のペプチド／溶媒混合物（ペプチド４０μg)を４００μgのリン脂質を含有する１００μl のクロロホルムと混合し、その混合物を３７℃で約１０分間攪拌してペプチド／リン脂質混合物を形成することにより達成された。そのペプチド／リン脂質混合物をＮ2 下で乾燥することによりクロロホルムを除去した。このように形成された界面活性物質を９０μl のＨ2 Ｏと混合し、３７℃で約１０分間穏やかに攪拌した。引き続き、１０μl の９％ＮａＣｌを界面活性物質含有溶液に混合した。
方法Ｂは、まず４００μg のリン脂質を含む１００μl のクロロホルムをガラス管に入れ、Ｎ2 下３７℃で約１０分間乾燥してそのクロロホルムを除去することにより達成された。１６μl のペプチド／溶媒混合物及び７４μl のＨ2 Ｏを乾燥したリン脂質と混合し、次に３７℃で約１０分間穏やかに攪拌した。このように形成された界面活性物質に１０μl の９％ＮａＣｌを混合した。方法Ｃは、まずポリペプチド−ＰＬ混合物を４３℃で１０分間維持し、その後、Ｎ2 下で乾燥して混合物から溶媒を除去することにより達成された。必要な場合には、混合物を真空に１５分曝露することにより乾燥して乾燥ポリペプチド−ＰＬ混合物を形成した。次に、水を各乾燥混合物と最終ＰＬ濃度４ mg/ml或いは１０ mg/mlを得るのに必要な容量の９０％に等しいように算出された量（表４に示される）で混合して第２混合物を形成した。この第２混合物を４３℃で１時間攪拌しながら維持した。引き続き、所望のＰＬ濃度を得るのに必要な容量の１０％に等しい６％ＮａＣｌ容量を第２混合物と混合し、得られた最終混合物を４３℃で１０分間維持した。たいていの場合、最終混合物を凍結と解凍の３サイクルの最後の段階に供した。
結果  表３に示した界面活性物質をその表に示されるように調製した。
【００８５】
【表７】
2004250459.tif 000009
【００８６】
表３に示された界面活性物質の各々について、上記のエンホーニングの『気泡分析』を用いて試験管内表面張力の低下能が証明される界面活性物質活性を分析した。
この実験の結果（データは示されていない）から、薬学的に許容しうるリン脂質と混合した場合に本ポリペプチドが低ΔＰ値で証明されるようにリン脂質のみより大きな界面活性物質活性をもつ肺胞界面活性物質を形成することが示される。ポリペプチドを用いて典型的には１０〜８０％の低ΔＰ値が得られた。本発明の教示に当てはまらない８個のアミノ酸残基対照ペプチドｐ７４〜８１は、リン脂質のみより大きな活性をもつＰＳを形成せず、アミノ酸残基の長さが重要な特徴であることが示された。
本発明の他の具体的なポリペプチドの界面活性物質活性を上記の『気泡分析』を用いて実験した。結果を下記の表４に示す。
各ポリペプチドを、溶媒１mlあたりポリペプチド２．５mgの濃度で指定した溶媒と混合した。不溶性ポリペプチドの溶液又は懸濁液を生じるかを求めるために得られた混合物を観察した。懸濁液を生じる混合物を更に水浴音波処理で１０分間混合してガラスピペットを用いてとるのに十分な微細な懸濁液を生じた。
【００８７】
溶媒と混合した後、各ペプチドをガラス管でクロロホルム中リン脂質（ＰＬ）ＤＰＰＣ：ＰＧ、３：１と混合してポリペプチドの添加量がＰＬ添加量の１／１０（１０重量％）と等しくし、方法Ａ、Ｂ又はＣに従って界面活性物質を形成した。
次に、界面活性物質の各々について、上記のように行われる気泡分析において試験管内表面張力の低下能によって証明される界面活性物質活性を分析した。圧力勾配（ΔＰ）はポリペプチド−ＰＬ第３混合物の界面活性物質活性の尺度であり、上記のエンホーニングサーファクトメータを用いて求めた。１５秒（１５″）、１分（１′）及び５分（５′）の時点で測定値を求め、指定したポリペプチド−ＰＬ混合物の独立した３回の測定値の平均として表す。ＰＬのみ（ＰＬ）及び天然ヒト界面活性物質の匹敵する試料の圧力勾配測定値を対照として求めた。この実験の結果を表４に示す。
【００８８】
【表８】
2004250459.tif 000010
【００８９】
【表９】
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【００９０】
(1) 同定したペプチドは全て配列番号12の一部に対応するアミノ酸残基配列をもつ; 例えば、ペプチド p1-15は配列番号12のアミノ酸残基 No.1-15を含む。
(2) ペプチドの最初の混合が溶液か懸濁かを示す。
(3) 文字は使用した界面活性物質調製法を示す。方法は上に記載されている。『＋』は最終混合物が凍結と解凍の３サイクルの最終工程に供したことを示す。『−』は工程が行われなかったことを示す。
(4) 第３最終混合物のリン脂質(PL)の濃度 (『Conc. 』) は混合物１ミリリットルあたりのミリグラムで示される(mg/ml) 。
(5) 圧力勾配は、実施例３に記載されるエンホーニングサーファクトメータを用いて求めたポリペプチド−PL最終混合物の界面活性物質活性の尺度である。１５秒（１５″）、１分（１′）及び５分（５′）の３点で測定値を得、指定したポリペプチド−PL混合物の３回の独立した測定値の平均として表す。PLのみ(PL)及び天然ヒト界面活性物質の匹敵する試料の圧力勾配測定値も示す。
これらの結果から、本ポリペプチドが薬学的に許容しうるリン脂質と混合した場合に低い表面圧が得られたことによって示されるようにリン脂質のみより大きな界面活性物質活性を有する肺胞界面活性物質を生じることが示される。
【００９１】
４．ウサギモデルにおける界面活性物質活性の生体内評価
界面活性物質の調製  本ポリペプチドをまず実施例３に記載される溶媒と混合した。更に、得られた混合物を更にリン脂質（ＰＬ）と混合してポリペプチドの添加量が下記に示されるＰＬ添加量の３重量％、７重量％又は１０重量％とした。最終混合物が最終混合物１mlあたりリン脂質２０mgの濃度を有する以外は実施例３の『界面活性物質の調製』の項で詳細に記載される最終凍結融解工程を用いて方法Ｃに従って最終ポリペプチド、ＰＬ混合物（界面活性物質）を生成した。
点滴プロトコール
プロトコール１：  実施例４で調製した合成界面活性物質或いは米国特許第 5,260,273号 (この明細書の記載は本願明細書に含まれるものとする) の実施例１のように調製された２mgの天然界面活性物質或いは２mgのＰＬを含む０．１mlの溶液を気管に注入することにより胎児ウサギを処置した。
プロトコール２：  次の３成分を成分が次の順序で注射器を出るように１つの注射器から気管に注入することによりウサギ胎児肺に界面活性物質を点滴した：（１）空気０．０５ml;(２）実施例４で調製した合成界面活性物質０．１ml又はＰＬ２mg或いは天然界面活性物質２mg；及び（３）空気０．１mg。
【００９２】
プロトコール３：  第１注射器から実施例４のように調製された０．１mlの分割量の合成界面活性物質（又は２mgのＮＳ又はＰＬ）を上記のようにウサギ気管に点滴し、続いて第２注射器から乳酸リンゲル液０．０５ml及び空気０．２mlを注入した。
プロトコール４：  １つの注射器から実施例４のように調製された０．１mlの合成界面活性物質（又は２mgのＮＳ又はＰＬ）、空気０．１５ml、食塩水０．１ml、及び空気０．３mlを上記のように気管に注入した。続いて２分割量の空気０．３mlを投与した。
プロトコール５：  次の４成分を４成分が注入時に示した順序で出るように１つの注射器から気管に注入することにより胎児ウサギを処理した:(１）実施例４で調製した合成界面活性物質或いは４mlの天然界面活性物質或いはＰＬ４mgを含む溶液０．２ml;(２）０．１５ml容積の空気;(３）正常食塩水０．１ml；及び（４）０．３ml容積の空気。次に、上記注入を最初の注入の１５分後に繰り返した。
プロトコール６：  後続の２分割量の空気０．３mlを最初の点滴の後に投与することと追加の点滴を１５分で投与しない以外はプロトコール５に記載されたようにウサギを処置した。
【００９３】
界面活性物質活性を実験する胎児ウサギモデル
本発明の具体的なポリペプチドの界面活性物質活性を、下記に述べられることを除いて Revakら, Am. Rev. Respir. Dis., 134:1258-1256 (1986) に詳細に記載された方法を用いて実験した。
妊娠２７日の胎児ウサギを子宮切開で分娩し、自然呼吸を止めるためにノルクロン(Organon, Inc., ニュージャージー州) ０．０５mlを直接注入した。次に胎児ウサギの体重を量り、気管を切開して小さなカニューレを気管に挿入した。次に、上記のように調製した界面活性物質を上記点滴プロトコールの１つにより胎児ウサギ肺に点滴した。
点滴後、ウサギをベンチレータ(Baby Bird, Baby Bird Corp.,カリフォルニア州パームスプリング) に接続した特別に設計した血量計 (セレスコ変換器を含む) に入れ、点滴した肺をピーク吸気圧２５cmＨ2 Ｏ、呼気終末陽圧（ＰＥＥＰ）４cmＨ2 Ｏ及び吸気時間0.５秒により３０サイクル／分の速度で換気した。ある実験では、換気処置中個々の時間に動的コンプライアンス測定を行った。ある実験では、換気後に静的コンプライアンス測定を行った。
換気の３０分後に静的コンプライアンス測定を行った。ウサギをベンチレータから出し、肺を減圧下ベルジャー内で−２０cmＨ2 Ｏに脱ガスした。その後、気管切開チューブに付けたＴコネクタを介してまず肺にガスを吹き込み、次にガスを抜いた。５、１０、１５、２０、２５及び３０cmＨ2 Ｏの静圧に達するのに必要とされる気容積をガスの吹き込み及びガス抜きの双方の相で測定して静的コンプライアンスの尺度として容積に対する静圧曲線を作成した。
【００９４】
血量計を用いて、６０分の換気時間中個々の時間に動的コンプライアンス測定を行った。コンピュータアシストデータ分析により、各時点での空気ml／cmＨ2Ｏ／ｇ体重として表されるコンプライアンスデータが得られた。コンプライアンスを下記の式で算出した。
コンプライアンス＝ΔＶ／ΔＰ
ΔＰTP＝（Ｃ）-1・（ΔＶ）＋（Ｒ）・（Ｆ）
ＰTP ＝経胸郭圧Ｃ ＝コンプライアンス（弾性成分−圧に対する容積の変化に関係がある）
Ｒ ＝抵抗（圧に対するフローに関係がある）
Ｆ ＝フローＶ ＝容積＝時間に対する流量の積分
上記式をＣとＲについての多重直線回帰を用いて解いた。コンプライアンス（Ｃ）は肺の弾性の性質を表し、抵抗（Ｒ）は肺の中から外へのガスフローに対する抵抗に打ち勝つのに必要な圧を表す。
結果  静的コンプライアンスデータは、点滴プロトコール１と５を用いて集めた。リン脂質（ＰＬ）のみで処置した肺と比べて試験した天然界面活性物質又は本発明の界面活性物質で処置した肺の全部に肺コンプライアンスの改善が１つを除いて見られた。ｐ１−１５を用いて調製した界面活性物質は、静的コンプライアンスで測定した場合にＰＬのみより肺コンプライアンスの改善を生じなかった。
動的コンプライアンス実験の結果を表５に示す。
【００９５】
【表１０】
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【００９６】
１  ウサギに点滴する前に、試料を２５ミクロンフィルターでろ過した。
* コンプライアンスの経時低下は気胸の発生を示すことができる。
表５に示されるように、本発明の界面活性物質の各々及び天然界面活性物質は、リン脂質のみと比べて動的コンプライアンス値を改善した。
検討  生体内コンプライアンス実験から、本発明の多数の具体的な界面活性物質の使用により分析した界面活性物質の各々についてリン脂質のみに比べてコンプライアンスの増大が得られたことが証明される。従って、本発明のタンパク質及びポリペプチドは、薬学的に許容しうるリン脂質と混合した場合にリン脂質のみより界面活性物質活性が大きい界面活性物質を形成する。その界面活性物質の使用は、生体内コンプライアンス値の改善を生じるのに有利である。
【００９７】
５．胎便吸引症候群の治療剤としての肺胞界面活性物質の使用
実験的及び臨床的胎便吸引症候群（ＭＡＳ）の治療においてボラスとして投与された外因性界面活性物質を用いることにより達成された効能の変動性の観点から及び標準洗浄法が用いられる場合に達成されたいくぶん不明瞭な結果の観点から、代替的治療方法が必要であることは明らかである。従って、本明細書に開示された組成物及び方法は、ＭＡＳに関係のある当該技術において記載された治療及び組成物より正に改善するものである。
ヒト新生児のＭＡＳのモデルにおいては、成体ウサギ及び新生児赤毛サルにヒト胎便を気管内点滴して肺胞損傷を誘導した。ここに提示した結果から、重篤な胎便損傷の２つのモデルが希釈ＫＬ4 界面活性物質を含む気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）に対して記載されたように投与された場合に急速に応答することが示される。
【００９８】
ａ．材料及び方法
Ｉ．動物モデル
体重約２．５kgの成体ＮＺＷウサギ及び帝王切開によって満期に分娩した体重約５２０ｇの赤毛サル(Macaca mulatta)を用いた。
ウサギはスクリップス研究所（カリフォルニア州ラホーヤ）で実験し、赤毛サルはカリフォルニア霊長類リサーチセンター（カリフォルニア州デイヴィス）で試験した。実験は、スクリップス研究所の動物調査委員会及び動物使用保護委員会、カリフォルニア大学デイヴィスで承認されたものである。実験は、全て動物保護条例及び国立予防衛生研究所ガイドラインの要件に従ったものである。
ｉｉ．胎便調製
ヒト新生児の最初の便通を集め、プールが５〜１１新生児の胎便を表すようになるまで凍結保存した。攪拌可能なスラリーが得られるまで滅菌水を加えた。凍結後、混合物を凍結乾燥し、乾燥重量を得た。滅菌水を５０mg（乾燥重量)/mlの濃度を得る算出量で加えた。貯蔵液をブレンダーでホモジェナイズし、ガーゼでろ過して微粒子物質を除去し、使用するために希釈されるまで凍結保存した。ほとんどの試料について、乾燥重量は最初の湿潤重量の２５〜３０％であった。胎便量は乾燥重量として表される。
【００９９】
ｉｉｉ．ＫＬ4 界面活性物質
ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＰＯＰＧ）、パルミチン酸（ＰＡ）、及び配列 KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLKの合成ペプチドからなる合成ペプチド含有界面活性物質のＫＬ4 界面活性物質を以前に記載されたように調製した (Cochraneら, Am J Resp & Crit Care Med, 152:404-410, 1996; Revak ら, Ped. Res., 39:715-724, 1996)。
概要としては、ＫＬ4 を含む合成ペプチドは、固相ペプチドシンセサイザーを用いて合成し、R.W.ジョンソン製薬研究所( カリフォルニア州ラホーヤ) から供給された。ＤＰＰＣ、ＰＯＰＧ及びパルミチン酸は、アバンチポーラリピッズ(Avanti Polar Lipids, アラバマ州バーミンガム) から入手した。ＤＰＰＣとＰＯＰＧの３：１比と、脂質として１５％ w/wで存在するＰＡと混合し、その混合物を有機溶媒に溶解することによりペプチド含有界面活性物質を調製した。その後、ペプチドを有機溶媒に溶解し、リン脂質重量に対して３％ w/wのペプチド比で脂質混合物と混合した。有機溶媒を窒素下で蒸発することにより除去した。次に、トリスバッファーを添加してｐＨ７．２〜７．４及び２５０〜３５０モスモル／kgのリポソーム界面活性物質組成物を形成した。貯蔵液から必要な場合に食塩水で希釈した。
【０１００】
ｉｖ．生化学分析
製造業者の説明書に従ってＢＣＡ試薬キット (Pierce, イリノイ州ロックフォード) を用いてタンパク質分析を行った。セイヨウワサビペルオキシダーゼの測定についてSteiman & Cohnによって記載されたｏ−ジアニシジン法の変法を用いてミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）を測定した (steinmanら, J. Cell Biol.,55:186-204, 1972)。典型的には、１００mMクエン酸塩緩衝液ｐＨ６．０中２００μl の１２５μg/mlｏ−ジアニシジンを２０μl の試料に添加した。
２０μl の２mMＨ2 Ｏ2 の添加後の１０分間にわたる４０５nmにおける吸光度の変化は、ＭＰＯの存在量に比例した。約０．０７２単位／μl ／１０分の吸光度変化を生じる比較標準液を用いた。ＭＰＯ活性の１単位を１μl の標準液の活性として定義した。
洗浄洗剤中のウサギとサルのＩＬ−８を、以前に記載されたＥＬＩＳＡ法によって定量した (Schraufstatterら, J. Immunol., 151:6418-6428, 1993) 。
５分間、１０００ rpm回転からの（細胞及びデブリを除去した）上清を採取し、４０，０００ｇ、４℃で１時間回転させることにより、ウサギ又はサル肺洗浄液から界面活性物質を単離した。この高速回転からの沈殿を正常食塩水の最初の容量の１／２０に再懸濁し、Rouserら, Lipids, 5:494-496 (1970)の方法の変法によってリン脂質の存在量について定量した。
【０１０１】
胎便を分光光度法で定量した。試料を４０，０００×ｇで１時間遠心分離した。上清（又は食塩水で希釈）の２６０nm及び３００nmの光学濃度（ＯＤ）を読み取り、次式にあてはめた：ＯＤ300 −（０．１３)(ＯＤ260)。この式は、胎便を含む及び含まないウサギとサルの多回洗浄試料のスペクトル分析から実験的に誘導されたものである。胎便を含まない試料については約０値を得ることがわかり、胎便１〜１６００μg/mlを含有する溶液には直線関係があることがわかった。
顕微鏡で求めた肺胞性炎症に罹った動物の洗浄試料は、約４００〜４０５nmでユニークな吸収ピークがあり正常な動物の洗浄液には存在しないことがわかった。この所見を用いかつ＜３００nmのピークを有するタンパク質の吸収を補正して、任意の『炎症指数』をＯＤ400 −（０．４５)(ＯＤ305)として定義した。
洗浄洗剤試料に存在する細胞を標準細胞染色及び計数法で評価してＰＭＮ及びＲＢＣ（赤血球）を同定した。
ｖ．表面張力低下分析
空気−液体界面の表面張力を低下させる界面活性物質の能力を、以前に記載された脈動気泡サーファクトメータを用いて測定した(Revakら, Am. Rev. Respir.Dis., 134:1258-1265, 1986) 。分析前に試料をリン脂質３ mg/mlに希釈した。
ｖｉ．コンプライアンス分析
胎便点滴前、胎便点滴の０．９時間後、即ち、処置直前及び胎便点滴の約５時間後のウサギについてコンプライアンス分析を行った。ウサギを臭化ベクロニウム（０．１ ml/kg静脈内）で処置し、概要として圧／容積モニター回路に接続したベンチレータから出し、気容積の記録は５cmＨ2 Ｏ圧から３５cmＨ2 Ｏ圧までの増分に対応したものである。
【０１０２】
ｖｉｉ．剖検
ウサギと赤毛サルを静脈内バルビツール酸塩で犠牲にした。胸郭を切開し、気管を１０cmＨ2 Ｏ圧下で気管を閉じて心臓と肺を一塊として摘出した。１０cmＨ2 Ｏ圧及び大気圧の双方の気管圧で肉眼的試験を行った。一側肺をＺｎ−ホルマリンに入れた後、顕微鏡試験のために気管支を１０cmＨ2 Ｏ圧で同側結紮した。他の一側肺を滅菌食塩水各々約２ ml/kgを２回同じ区域に入れ洗浄した。
洗浄液を細胞計数用に０．１mlを取り出した後、１０００×ｇで５分遠心分離して細胞を除去し、次に４０，０００×ｇで６０分遠心分離して界面活性物質を単離し生化学実験用洗浄液を得た。肺の組織学的切片の多形核白血球（ＰＭＮ）の計数については、肺の断面として全断面を横切っている下葉の本幹気管支の２mm以内にカバーグラス上に直線を引いた。次に、一方の胸膜縁からもう一方までの線に沿って顕微鏡計数を行った。この方法は、下葉のその面積に胎便によって生じた損傷が一致することかつＫＬ4 界面活性物質又は食塩水による処置が肺のその領域に一致することの観点から選ばれた。
ｖｉｉｉ．統計的分析
対になっていない２グループのｔ検定を用いてグループを比較した。統計的差はｐ＜０．０５とした。
【０１０３】
ｂ．成体ウサギ洗浄モデル及び点滴プロトコール
ウサギを次のように４つの処置グループに分けた。グループ１のウサギに希釈ＫＬ4 界面活性物質による気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を施した。グループ２のウサギに同量の滅菌食塩水による洗浄を施した。グループ３のウサギにＫＬ4 界面活性物質の気管内ボラス、１００ mg/kgを１回投与した。グループ４のウサギは処置しなかった。即ち、洗浄もボラス投与も全くしなかった。
下記に記載されるように、非処理ウサギは拡張不全、コンプライアンスの低下及び約５００mmＨｇから＜１００mmＨｇへのＰａＯ2 の低下、及び胎便点滴の３〜５時間後に重篤な肺胞性炎症を生じた。希釈ＫＬ4 界面活性物質によるＢＡＬによって処置したウサギは、数分内に約４００mmＨｇまでＰａＯ2 の急速かつ持続した回復、正常コンプライアンスへの復帰及び炎症の消失を示した。食塩水によるＢＡＬを施したウサギは回復を示さず、界面活性物質ボラスで処置したウサギは処置後１〜２時間までに一時的な応答を示したが、その後最初の拡張不全虚脱に戻った。
ウサギを筋肉内（ＩＭ）キシラジン及びケトアミンで麻酔した。気管切開を行い、３．０mm内径気管内チューブを分岐櫛より少なくとも１cm上の位置に挿入した。血液試料の動脈ラインを心房動脈に入れた。次に、ウサギを加圧循環ベンチレータに入れた (Bird; 3M, ミネソタ州セントポール) 。肺胞性損傷を誘導するために、胎便を気管内に点滴した。適量の胎便を２等分し、１つ目を頭部の上４５°にウサギの右側を下に維持したウサギに投与し、２つ目の半量を前のように投与したが左側を下に維持した。
胎便を、気管内チューブを介して気管内チューブの尖端を＜０．５cm超えるカニューレを介して点滴した。胎便を点滴する前の１０〜１５分間ウサギに１００％Ｏ2 をかけ、実験期間の間１００％Ｏ2 を吸入した。胎便点滴後、機械的換気を、通常は吸気ピーク圧（ＰＩＰ）２５cmＨ2 Ｏ、及び呼気終末陽圧（ＰＥＥＰ）２cmＨ2 Ｏ及び換気速度呼吸２０回／分で開始した。血中ガスの定量は、胎便点滴の約１０分、３０分及び５０分後に行った。１時間後、ウサギを次のように４処置グループの１つに入れた。
【０１０４】
グループ１のウサギには２〜５ mg/mlに希釈したＫＬ4 界面活性物質による気管支肺胞洗浄を施し、２等分した２０ ml/kgを注入し、１つ目を右肺に洗浄し、２つ目を左肺に洗浄した。ウサギに静脈内（ＩＶ）臭化ベクロニウム０．１ ml/kgを投与して麻痺を誘導し、洗浄処置の適切な流出が不可欠であることがわかった。ＫＬ4 界面活性物質を８cmＨ2 ＯのＰＥＥＰのみによるベンチレータで、即ち、空気運動を含めずに点滴した。右肺に界面活性物質を点滴するために頭部ドを約４５°上に、まず、右側を下にウサギを保持した。希釈界面活性物質の点滴直後に、間欠的換気（ＩＭＶ）をＰＩＰ２５cmＨ2 Ｏ及びＰＥＥＰ５cmＨ2 Ｏで呼吸５回を開始した。
次に、ウサギをベンチレータから離し、頭部の３０〜４５°下に先端を付けて洗浄液−界面活性物質及び胎便を流出させた。全洗浄量を処置に要した時間と共に記録した。フローがかなり緩慢になるまで胸を穏やかにマッサージしながら流出を続けた。洗浄処置に要した時間は約９０秒であった。ウサギを直ぐに同じ設定（ＰＩＰ、２５及びＰＥＥＰ、５）で２〜５分間ＩＭＶに戻した。次に、左肺を洗浄するために下に維持した左側で洗浄処置を繰り返した。これにより最初の洗浄が構成された。同様に洗浄を繰り返し、各々を右肺と左肺とに分けた。本文に述べられるように、ＫＬ4 界面活性物質による最終洗浄は１０又は１５ mg/mlのＫＬ4 界面活性物質濃度を用い、あるウサギでは、良好な肺機能を維持するのに十分なレベルの界面活性物質の保持を得るために３０ mg/ml（１００〜１５０mg/kg）のＫＬ4 界面活性物質をボラス投与した。
グループ２のウサギには滅菌食塩水による気管支肺胞洗浄を施し、同量の滅菌食塩水を用いた以外は（１）のように行った。
グループ３のウサギには３０ mg/mlの濃度のＫＬ4 界面活性物質ボラス（即ち、洗浄しない）を点滴し、１００ mg/kgを右と左の肺に等分した。
グループ４のウサギには胎便損傷の処置をしなかった。
【０１０５】
Ｉ．種々の用量のヒト胎便の気管内投与に対する成体ウサギの応答
最初の実験は、気管内に投与したヒト胎便の種々の用量に対する成体ウサギの応答を求めるために行った。ウサギに次の用量の胎便を投与した (５〜７．５ ml/kgでのmg/kg): ９３．８（ｎ＝３);１２５（ｎ＝４);１８７．５（ｎ＝７);２８１．３（ｎ＝２);３７５（ｎ＝１）。９３．８ mg/kg及び１２５ mg/kgの用量はＰａＯ2 及び肺の部分的拡張不全の低下を生じるが、その効果は一致せず、７１％のウサギが胎便点滴後５時間までにＰａＯ2 の自発的回復の徴候を示した。１８７．５ mg/kgの用量では、胎便点滴の１時間以内にＰａＯ2 の一致した低下が生じ、５時間までのＰａＯ2 の自発的回復は見られなかった（図３）。１８７．５ mg/kgより大きい用量は、ＰａＯ2 の低下を誘起するが、３匹のウサギのうち２匹が死亡した。
７．５ ml/kgでの１８７．５ mg/kgの用量を実験に選んだ。これらのウサギにおいては、胎便点滴の５〜６時間の剖検により肺の顕著な拡張不全が示され、肺の少なくとも８０％に暗赤色の拡張しない領域があった。拡張した肺の小さな縁やキャップは、上葉、ある場合には下葉の尖端領域におそらく胎便がこれらの面に達することができないために存在した。組織学的には、胎便投与の１〜２時間後に肺胞が虚脱するが炎症の証拠はほとんど見られなかった。ＰＡＳ染色により、胎便が明るいバイオレット色で検出され、肺胞隙に微細な無定形の凝集塊を形成し、通常は隔膜と接している。気管支にはおそらく胎便標品のろ過の結果として胎便の閉塞は見られなかった。胎便投与の５〜６時間後に、肺は、赤血球（ＲＢＣ）と共に浮腫及び炎症細胞、主に多形核白血球（ＰＭＮ）のち密な浸潤をもつ広範な拡張不全を示した（示されていない）。
【０１０６】
肺を胎便で損傷し次のように処置した後にウサギ肺の全体の外観と顕微鏡の外観を分析した：Ａ．処置せず；Ｂ．ＫＬ4 界面活性物質洗浄；Ｃ．滅菌食塩水洗浄；Ｄ．ＫＬ4 界面活性物質ボラス。暗赤色の拡張不全虚脱はＡ、Ｃ及びＤのグループに見られたが、全体の拡張がＢに見られた（示されていない）。Ａ、Ｃ及びＤの上葉の淡い色の領域は胎便がなく損傷しなかった。顕微鏡切片を下葉の上の中間を採取した。ＫＬ4 界面活性物質洗浄肺の肺胞のほとんどが浮腫及びＰＭＮが最小のガス拡張を示したが、処置しない肺、滅菌食塩水洗浄肺又は界面活性物質ボラス投与肺の肺胞は多量の浮腫、ＰＭＮ及びＲＢＣを有した（示されていない）。界面活性物質ボラスを投与した肺組織の肺胞のみガス気泡を含み、ＫＬ4 界面活性物質によるボラス処置から保持されていると考えられる（示されていない）。
静的コンプライアンス分析を、胎便点滴前、１時間後及び４〜５時間後に行った。図４及び表６に示されるように、胎便の点滴前に見られる正常なコンプライアンス曲線は、１時間後にフラットな曲線に変わり、５時間までフラットなままであった。
【０１０７】
表６に示されたデータを生じる実験は、実質的に本明細書に記載されるように、特に次の通り行われる。成体ウサギを胎便１８７．５ mg/kg（２５ mg/mlの胎便７．５ ml/kg）で損傷させた。損傷前及び損傷０．９時間後に静的コンプライアンス測定を行った。損傷の約１．１時間後にＫＬ4 界面活性物質洗浄（２〜５mg/mlの濃度のＫＬ4 界面活性物質による洗浄２〜４回に続いて１０〜１５ mg/mlの濃度の界面活性物質による洗浄１回）、１００ mg/kgＫＬ4 界面活性物質ボラス１回、又は食塩水洗浄により処置した。
静的コンプライアンスを損傷の５．１時間後に再び測定した（即ち、処置の４時間後に始めた）。コンプライアンス値は、拡張部分の測定で３０cmＨ2 Ｏ圧で行われた測定値の平均±ＳＥＭであり、ml空気／３０cmＨ2 Ｏ／kgとして示される。損傷前又は損傷後０．９時間値のグループ間に統計的差はなかった。ＫＬ4界面活性物質洗浄グループのみ損傷５．１時間の非処理対照グループと顕著に異なった。
【０１０８】
【表１１】
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【０１０９】
ウサギ界面活性物質に関する生体内胎便の影響を試験するために、更に１８７．５ mg/kgヒト胎便を投与したウサギを１時間後に食塩水で気管支肺胞洗浄を行って界面活性物質を得た。界面活性物質を上記のように高速遠心分離で単離し、残留天然界面活性物質の活性を３ mg/mlリン脂質の脈動気泡サーファクトメータを用いて求めた。表７に示されるように、界面活性物質の活性は著しく減少した。
【０１１０】
【表１２】
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【０１１１】
各数値は、２匹のウサギから回収した洗浄液から単離した３ mg/mlの濃度の界面活性物質で得られた表面張力の分析６回の平均±ＳＥＭを表す。１８７．５ mg/kgの胎便を肺に点滴した１時間後に食塩水洗浄を行った。表面張力をダイン／cmで示し、気泡生成の１分後に脈動気泡サーファクトメータで測定した。
対照として、胎便の代わりに同量（５〜７．５ ml/kg）の滅菌食塩水を３匹のウサギに気管内投与した。ＰａＯ2 レベルに関する影響を図３に示す。平均ＰａＯ2 は５時間にわたって４００〜５５０mmＨｇのままであったが、１匹のウサギが５．５時間までにＰａＯ2 が２４９mmＨｇに徐々に下がった。≧１．０時間の全てに時点で食塩水対照と胎便処置ウサギ間にＰａＯ2 値の統計的差（ｐ＜０．０５）は見られなかった。これらのウサギのコンプライアンス測定値は、０．９時間で１４．２から８．０に下がり、５．１時間までに部分的に回復した。剖検の肺は、広く拡張しており、下葉では２〜５個の小さな（＜０．５cm）区域の拡張不全があり、ＰａＯ2 の漸次低下を示すウサギにおいてはサイズが１〜２cmの２つの大きな区域の拡張不全があった。顕微鏡的には、＞９０％の肺は拡張した肺胞を示したが、肺胞の虚脱及び炎症細胞の軽度の浸潤を含む拡張不全区域が見られた。
【０１１２】
ｉｉ．胎便損傷成体ウサギにおける肺拡張、ガス交換及び肺胞性炎症応答に関する希釈ＫＬ4 界面活性物質による気管支肺胞洗浄の影響
１７匹のウサギに１８７．５ mg/kgの胎便を投与して（ａ）肺胞の虚脱を随伴した肺の界面活性物質活性の低下及び（ｂ）胎便点滴の３〜５時間後の炎症の発生を誘導した。１２匹のウサギを次のようにＫＬ4 界面活性物質で洗浄した：２〜５ mg/mlに希釈したＫＬ4 界面活性物質で２〜４回及び上記のように右側と左側に等分した２０ ml/kgを用いて１０〜１５ mg/kgで１回。残りの５匹のウサギはＫＬ4 界面活性物質ではなく同量の滅菌食塩水で同様に洗浄した。後続洗浄の回収容量を測定し、個々の洗浄液を胎便含量の分析用にとっておいた。ＦｉＯ2を１．０に維持し、十分な換気を維持するのに必要とされる換気速度２０〜３２／分と共にベンチレータをＰＩＰ２５〜２８及びＰＥＥＰ２〜１０に調整した。
希釈ＫＬ4 界面活性物質による３連続洗浄による胎便除去を図８に示す。示されたように１回目の洗浄で点滴胎便の約２９％、２回目の洗浄で７．５％以上及び３回目の洗浄で５％未満が除去された。下記に述べられるように、これは洗浄されないウサギに見られたものより剖検で採取された肺切片に顕微鏡的に見られた胎便消失と相関した。希釈ＫＬ4 界面活性物質による洗浄後、十分に機能する界面活性物質が肺に存在することを確かめるために１０〜１５ mg/mlのＫＬ4 界面活性物質を用いて分割洗浄を１回行った。この最終洗浄後に肺に残存しているＫＬ4 界面活性物質の算出平均量は７７±１２ mg/kgであった。
ＫＬ4 界面活性物質による気管支肺胞洗浄に対するウサギのＰａＯ2 の応答は、急速に、たいてい最初の洗浄後２分以内に現れた（図９）。ＰａＯ2 が＜１００mmＨｇから約４００mmＨｇに上昇し、ウサギをＦｉＯ2 １．０で換気した。ＰａＯ2 は５時間まで上昇したままであったが、胎便点滴の３〜５時間後に平均約３００mmＨｇまで低下したことが見られた。
【０１１３】
希釈ＫＬ4 界面活性物質の代わりに食塩水による洗浄を受けたウサギは、ガス交換の改善を示さなかった（図９）が、匹敵する量の胎便が除去された。食塩水洗浄ウサギにおいては、ＰＥＥＰの増加はＰａＯ2 を明らかに上昇させなかった。ＫＬ4 界面活性物質洗浄で処置したウサギと食塩水で洗浄したウサギ間のＰａＯ2 値の差は、処置後の全ての時点で統計的に顕著であった。
胎便点滴の０時間、０．９時間（洗浄処置の直前）、及び胎便による損傷の約５時間後（即ち、洗浄処置後約４時間）に行われた静的コンプライアンス分析を図４〜図７及び表６に示す。前述したように、コンプライアンス値は胎便点滴後に低下した。ＫＬ4 界面活性物質による洗浄処置（図５）により、示されたように５時間の時点でコンプライアンスの顕著な改善が得られ、食塩水による洗浄（図６）は胎便のみを受けたウサギよりコンプライアンス変化を回復しなかった。４匹のウサギにおいて中間点（界面活性物質洗浄後２．６時間）で行われたコンプライアンス分析により、３０cmＨ2 Ｏ圧で平均５．３ ml/kgまで胎便損傷の０．９時間後の平均２．４ ml/kgから増加した値が示された。５時間におけるこれらの４匹のウサギについての平均値は７．１ ml/kgであった。
胎便点滴後の５〜６時間で行われたＫＬ4 界面活性物質洗浄ウサギの剖検から、肺全体の拡張が示され、所々部分的拡張不全区域がたいてい下葉にあった（示されていない）。しかし、これらの拡張不全区域は小さな空気拡張領域を含まなかった。顕微鏡的に肺は透明な拡張した肺胞を示したが、部分的拡張不全領域はピンクに染色された肺胞液の存在を示し、中程度の数のＰＭＮを有したが赤血球はほとんどなかった。拡張した肺胞は、拡張不全肺胞よりタンパク質を多く含んだ液体が少なく驚くべきことにＰＭＮをほとんど含まなかった（表８）。顕微鏡レベルで定量しなかったが、非洗浄ウサギより肺胞に胎便が著しく少ないことがわかった。
【０１１４】
【表１３】
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【０１１５】
ＫＬ4 界面活性物質（２mg/ml)による洗浄２回に続いて１００〜１５０mgのボラス（３０ mg/mlの濃度で）を受けた７匹のウサギは、上記ＫＬ4 洗浄グループに匹敵するＰａＯ2 の応答を示した。コンプライアンス値と病理学的知見は同じであった（データは示されていない）。
ＫＬ4 界面活性物質ではなくて食塩水による洗浄を受けたウサギの肺は、上葉の尖端部分の拡張した肺の小さなキャップ以外は全体に拡張不全であった（示されていない）。顕微鏡的には、肺胞はち密に詰まっており、空気拡張はなかった。肺胞隙は、タンパク質を多く含む液及び多量のＰＭＮと赤血球を有した（表８）。界面活性物質洗浄ウサギに見られたのと同様な少量の胎便が見られた。
表８に示されるように、ＫＬ4 界面活性物質で洗浄されたウサギから剖検の時点で採取された気管支肺胞洗浄液の分析により、洗浄を受けないウサギからの液より低いレベルのタンパク質、ミエロペルオキシダーゼ及び赤血球並びに低い炎症指数が示された。ＫＬ4 界面活性物質洗浄ウサギのこれらの数値は、ＩＬ−８レベル以外食塩水洗浄ウサギより小さかった。
更に、７匹の胎便損傷ウサギに上記のように２ mg/mlのＫＬ4 界面活性物質による洗浄を行ったが、続いて３０ mg/mlの濃度のＫＬ4 界面活性物質１００ mg/kg又は１５０ mg/kgをボラス投与した。ＰａＯ2 、コンプライアンス及び剖検知見の改善は、ＫＬ4 界面活性物質洗浄グループにおけるものと同様であった（データは示されていない）。
【０１１６】
ｉｉｉ．ＫＬ4 界面活性物質のボラス点滴による胎便損傷ウサギ肺の処置の効能
５匹のウサギに前のように気管内に胎便１８７．５mgを投与し、１時間後に各々に３０ mg/mlのＫＬ4 界面活性物質ボラス１００ mg/kgを投与した。結果を図１０に示す。
ＫＬ4 界面活性物質の点滴の１〜２時間後にＰａＯ2 が５６mmＨｇから約２００mmＨｇにかなり上昇した。しかしながら、この後ＰａＯ2 は徐々に止まり、処置後３時間までに１００mmＨｇより下がった。胎便損傷の５．１時間後のコンプライアンス値は、胎便損傷の０．９時間後、即ち、ＫＬ4 界面活性物質ボラスによる前とほぼ同じであった（表６）。剖検の肺は、胎便に明らかに曝露されない上葉の尖端の関係していない拡張した肺の小さなキャップを以外はほとんど完全に虚脱した（示されていない）。顕微鏡的には、肺胞の約８０％がタンパク質性液と白血球（表８）、及び多量の胎便で塞がれているが、点在した肺胞群は拡張を示した。終末気管支肺胞洗浄液の分析により、顕著な炎症応答が示された（表８）。
従って、ボラス点滴とは反対の洗浄によるＫＬ4 界面活性物質処理の効能の測定により、ガス交換改善及び炎症応答改善の双方の見地から洗浄法が優れていることがわかった。データから、洗浄を含まないボラス点滴により最初の２時間かけてＰａＯ2 のわずかな増加が得られるが効果はつかの間であって約２時間以内に１００mmＨｇ以下のレベルにＰａＯ2 値が戻ることがわかった。この一時的な効果は、肺の点滴ＫＬ4 界面活性物質（及び天然界面活性物質）を直接不活性化した肺の胎便の持続した存在によって説明される。更に、ＫＬ4 界面活性物質によるボラス処置は、３〜５時間で胎便に対する炎症応答を減少させず、炎症が界面活性物質を不活性化させかつ界面活性物質による作用の独立した肺機能を妨げることができる。
【０１１７】
ｃ．霊長類洗浄レベル及び点滴プロトコール
本モデル、新生児赤毛サルにおいては、最初の呼吸の前に気管内にヒト胎便を投与した後、肺機能の重篤な低下を生じた。分娩の１〜５時間後のこれらのサルをＫＬ4 界面活性物質による洗浄を含むＢＡＬで処置すると胸のラジオグラフの透明化及び肺機能の急速な改善を生じ、ａ／Ａ比は正常な範囲に上昇し、実験中そのままであった。
霊長類実験を１０匹の新生児赤毛サルに限定した。赤毛サルを妊娠満期（１５７〜１６０日）時に帝王切開で分娩し、カリフォルニア大学の霊長類センター、デイヴィスの獣医スタッフで行った。頭と頸が娩出した後、臭化ベクロニウムを静脈内に注射し、気管切開して内径２．０mmの気管内チューブを入れ、尖端が分岐櫛の０．５〜１cm上にあり、その後に胴体を娩出して臍帯を切った。あえぎ呼吸を防止するために気管内チューブを締め、分娩を完了した。
各新生児赤毛サルの体重を量り、輻射保温器に入れ、最初の呼吸の前に液を満たした肺に気管内チューブを介して胎便を点滴した。次に、各サルをＩＭＶ：ＦｉＯ2 ０．８〜１．０、ＰＩＰ３０〜３５cmＨ2 Ｏ、ＰＥＥＰ４cmＨ2 Ｏ、及び吸気時間０．４ｓの４０呼吸／分に設定した機械的ベンチレータに入れた。
【０１１８】
動脈血試料を得るために及び液を投与するために３．５フレンチ臍帯動脈カテーテルを大動脈に（Ｌ４まで）挿入した。実験を通して０．５U/mlヘパリンを含む水中８．３ml/kg/hrの５％デキストロースを投与した。
心搏数、動脈血圧、動脈血酸素飽和度及び直腸温度の連続測定を実験を通して維持した。血液ガス及びｐＨ分析用に２０〜６０分毎に動脈血試料を得た。機械的換気及びＦｉＯ2 を、ＰａＯ2 ５０〜７０mmＨｇ、ＰａＯ2 ４０〜５０mmＨｇ及びｐＨ＞７．２５を維持するように調整した。分娩及び胎便投与の１時間以内、界面活性物質処置の１時間以内及び指摘したその後の種々の間隔で胸のラジオグラフを得た。臭化ベクロニウムで実験を通して麻痺を維持した。
希釈ＫＬ4 界面活性物質による洗浄を、気管内チューブに挿入し尖端がチューブの尖端に対して丁度末端であるように切断した３．５フレンチ臍帯カテーテルを介して行った。サルに１００％Ｏ2 を処置を通して投与した。洗浄を２ mg/mlに希釈したＫＬ4 界面活性物質で１０〜２０ ml/kgを用いて行い、右側と左側に等分しウサギ（上記）について記載したように投与した。サルに、２ mg/mlのＫＬ4 界面活性物質を用いて後続洗浄１〜３回及び１５ mg/mlの最終洗浄或いは３０ mg/mlの１００mgボラスを投与した。処置を通して血液の皮膚飽和度をモニターした。
【０１１９】
５匹のサルにおいて、胎便の第２点滴を投与した。増加用量の胎便を投与した：２匹のサルに１８７．５ mg/kgを投与し、５匹に５６３ mg/kgを投与し、２匹に７５０ mg/kgを投与し、１匹に８４３．８ mg/kgを投与した（平均＝５５３．１mg/kg)。十分量の胎便の点滴後１時間以内に全胎便処置サルのａ／Ａ比は約０．２以下に低下した。胸のラジオグラフは、ＭＡＳに特有の散在性不透明を示した。取り扱いに対するサルの顕著な感受性は注目すべきであり、酸素飽和度のはっきりした減少を生じ２〜１０分続いた。７匹のサルを、分娩及び胎便点滴後の１．６〜５．４時間の時点で希釈ＫＬ4 界面活性物質による洗浄によって処置した。他の３匹は、対照として働き、換気の助けで２０〜２４時間維持した。最少量の胎便（１８７．５ mg/kg）で２回投与して処置した対照サルは、胎便の第２点滴の約２時間後に認められた正常範囲（＞０．４）にａ／Ａが上昇して回復した。従って、このサル及び同量を投与した洗浄処置サルに用いられた胎便量は、２０時間にわたる重篤な肺胞性欠乏を誘発及び維持するのに不十分であるとみなされた。これらの２匹のサルからのデータは下記に述べられる結果が含まれなかった。
【０１２０】
図１１は、≧５６３ mg/kg（平均＝６５６mg/kg)の胎便を投与し希釈界面活性物質による洗浄で処置した６匹のサルについて経時平均ａ／Ａ比を示す図である。匹敵量の胎便で処置した２匹の対照サルのうち１匹については動脈系を確立する能力がないためにａ／Ａは得ることができなかった。もう１匹の対照サルのａ／Ａ比は、１８時間にわたって約０．１のままであった（図１１）。更に、５６３mg、７５０mg及び８４３．８mg胎便／kgを投与した３匹のサルを界面活性物質洗浄による処置前の２．６時間、３．２時間及び５．４時間各々モニターした。ａ／Ａ比は、界面活性物質洗浄処置の開始まで約０．１〜０．２５のままであった。
希釈ＫＬ4 界面活性物質による洗浄を行った処置グループにおいては、洗浄直後にａ／Ａ比の急激な上昇が見られた（図１１）。洗浄時間中ＦｉＯ2 を１．０に維持し、処置後のＰａＯ2 は典型的には＞３００mmＨｇであった。これにより異常に高いａ／Ａ比が得られ、ＰａＯ2 が５０〜７０mmＨｇの範囲にある点までＦｉＯ2 を低下させた場合に図１１に界面活性物質洗浄の１時間後が示されるようにａ／Ａ比は低下した。数匹のサルにおいては、ａ／Ａ比は胸のラジオグラフの透明化の存在下でさえ一時的に＜０．２に低下した（下記参照）。ＫＬ4 界面活性物質による洗浄処置後約４〜８時間までにａ／Ａ比は正常な範囲に上昇した。処置した全サルは、実験終了まで自然呼吸した（ＦｉＯ2 ＝０．２１までの平均時間は１１．２時間であった）。
【０１２１】
胸のラジオグラフの顕著な透明化は、界面活性物質洗浄の開始後３０分以内に見られた（示されていない）。ほぼ完全な透明化は１８〜２０時間以内に見られた。２匹の対照サルにおいては、胸のラジオグラフは１８時間にわたって全体が不透明のままであり、約１０時間後に末梢的透明化を証明するものがあった。
１８〜２４時間齢のサルを安楽死させた。ＫＬ4 界面活性物質で洗浄したサルの胎便損傷肺の肉眼的検査により全体の拡張を示し、暗赤色の拡張不全の小さな区域がたいてい下葉の背側（従属）領域に点在した。これらの拡張不全の切片から、１〜２mmの表面を含み下に淡いピンク色の拡張した肺があることがわかった。対照的に、胎便を投与したがＫＬ4 界面活性物質処置をしない２匹のサルの肺は＞８０％拡張不全であった。顕微鏡的には、ＫＬ4 界面活性物質洗浄で処置したサルの肺は拡張し、肺胞は透明であり、胎便、浮腫及び白血球は少量であった。拡張不全の区域においては、ＰＭＮ及び少量の浮腫液と共に胎便が多量に存在した。界面活性物質で処置しなかったサルの肺は、虚脱しており、胎便、好中球及び若干の浮腫で塞がれていた。拡張はほとんどなかった。顕微鏡分析用に採取しなかった肺葉を、炎症反応の分析用に食塩水で２回洗浄した。これらの分析の結果を表９に示す。データから、ＫＬ4 界面活性物質洗浄サルにおける炎症マーカーの減少がわかる。
【０１２２】
【表１４】
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【０１２３】
ｄ．ＫＬ4 界面活性物質を用いる胎便損傷肺の洗浄処置の影響
本実験のデータから、ウサギ及び新生児サルの胎便吸引症候群（ＭＡＳ）のモデルにおいて希釈ＫＬ4 界面活性物質による肺の洗浄に続いて維持用量の点滴により数分内に肺機能が著しく改善されることが示される。ＰａＯ2 、ａ／Ａ比、肺コンプライアンス及び胸のラジオグラフは全て急速な改善を示した。
２種類の種を用いた。成体ウサギはヒト胎便の点滴に対して活発で顕著な炎症応答を示し、新生児霊長類(Macaca mulatta)は帝王切開時で最初の呼吸の前の肺の羊水に気管内でヒト胎便を投与した。
霊長類モデルは、分娩直前子宮内で胎便を吸引するヒト新生児に状態が密接に似ている。赤毛サルの肺機能の改善が持続しかつ胸のラジオグラフの透明化が実験過程にわたって、約２０時間持続することは特に興味深い。サルは、ＫＬ4 界面活性物質洗浄の約１１時間後に自然呼吸した。
ウサギ及び赤毛サル共に、点滴胎便は拡張不全の発生と関連があるガス交換（図３、図１１）及び肺コンプライアンス（図４〜図７）の急速な低下を誘発した。
【０１２４】
肺機能の胎便誘導低下を説明するために３つの機序が提唱された：１）胎便粒子が肺の小さな細気管支を閉塞する；２）胎便が直接界面活性物質を阻害する；及び３）胎便誘導炎症が界面活性物質を阻害するように働く。本実験は、界面活性物質の胎便誘導機能障害がＭＡＳの肺機能低下の主な要因であるという理論を支持している。ウサギにおける肺機能の低下は、肺から除去された界面活性物質の機能障害と関連がある拡張不全によって証明されるように界面活性物質活性の低下と関連があった（表７）。これらのデータは、混合胎便、又は胎便と界面活性物質との有機及び水性抽出液が界面活性物質機能障害をまねくことを示す前の試験管内データと一致する。不活性化の機序及び関与する胎便の成分は不明のままである。対照的に、微粒子胎便による肺機能低下は、胎便をろ過したこと、栓塞が顕微鏡的に気管支に見られなかったこと及び食塩水のみによる洗浄が肺胞の拡張及び肺機能の改善をしなかったことを示した本実験ではありそうもないと考えられる。
本データから、希釈ＫＬ4 界面活性物質による洗浄がウサギ及びサル共に十分量の胎便を除去してＫＬ4 界面活性物質、おそらく残留天然界面活性物質と結合したものが肺胞を拡張させ、肺機能及びコンプライアンスを改善させかつ炎症の発生を消失させることが示される。最初の呼吸の前に気管内にヒト胎便を投与した後の新生児赤毛サルは重篤な肺機能低下を生じた。分娩の１〜５時間後のこれらのサルを希釈ＫＬ4 界面活性物質を含むＢＡＬで処理すると胸のラジオグラフの透明化及び肺機能の急速な改善を生じ、ａ／Ａ比が正常な範囲に上昇し、実験を通してそのままであった。
対照的に、界面活性物質ではなく食塩水による肺の洗浄は肺機能の改善をせず、実際には肺に大きな炎症反応を生じた。食塩水洗浄又は食塩水のボラス点滴の有害な作用が報告された。
【０１２５】
ｅ．胎便損傷肺における炎症発生に関するＫＬ4 界面活性物質洗浄の影響
胎便損傷成体ウサギの肺胞性炎症量を４つの処置グループで比較した：ＫＬ4界面活性物質洗浄ウサギ、食塩水洗浄ウサギ、ボラス点滴によるＫＬ4 界面活性物質で処置したウサギ、及び胎便のみを投与したウサギ（表８）。データから、ＫＬ4 界面活性物質による洗浄処置を受けた胎便損傷ウサギが非処理対照、食塩水洗浄ウサギ又はボラス界面活性物質処置ウサギより肺胞性炎症が少ないことが示される。これは、終末洗浄液及び肺の顕微鏡切片の双方に見られた。炎症の減少はＫＬ4 界面活性物質洗浄ウサギの肺の顕微鏡切片に著しく、拡張不全の小さな区域は多量の浮腫及びＰＭＮ及びＲＢＳを含むが、隣接の拡張した肺は各々がほとんどない。界面活性物質洗浄ウサギと食塩水洗浄ウサギの炎症量を比較すると、ほぼ同量の残留胎便が２つのグループの肺に存在するとしてもＫＬ4 界面活性物質洗浄が炎症反応を減少させることが示される。
界面活性物質による炎症に対する阻害作用の機序は明らかではない。１つの可能な説明は、炎症細胞の機能を阻害することがわかったＫＬ4 界面活性物質を含む界面活性物質が炎症反応への寄与を減少させることができることである。 (Hayakawaら, Am. Rev. Respir. Dis., 140:1390-1397, 1989; Geertsmaら, J. Immunol., 150:2391-2400, 1993; Suzikiら, Am. Rev. Respir. Dis., 145:A876 (Abstr.), 1992; Yoshida ら, Life Sci., 49:1359-1365, 1991; Chao ら, J. Clin. Invest., 96:2654-2660, 1995; Ahuja ら, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 14:496-503, 1996 参照) 。同様に、肺胞の拡張及びＫＬ4 界面活性物質洗浄による肺機能の回復は浮腫の形成を減少させることができ、炎症の伝達物質の潜在的基質量を減少させる。
【０１２６】
６．界面活性物質活性を評価する未熟児赤毛サルモデル
肺機能不全を治療する界面活性物質の効能を評価するために未熟児サルモデルを用いた。
赤毛サル(Macaca mulatta)を妊娠１２７〜１３１日に帝王切開で分娩し、天然肺胞界面活性物質が欠乏していることがわかる。サルを、気管切開について実施例５に記載されたように準備し、ベンチレータに接続し、記載されたように機械的換気で維持した。
次に、肺胞酸素圧に対する動脈酸素圧の比（ａ／Ａ）０．２２未満及び胸のラジオグラフによる散在性粒状肺胞放射線不透性の臨床及びラジオグラフ基準を観察することにより肺不全を診断した。その後、各サルに気管内チューブ内の臍帯カテーテルを介して気管内に試験組成物を投与し、投与量の１／２をサルの右側臥位に及び１／２を左側臥位に及び投与量点滴のために約１０〜３０秒間換気を一時的に止めて投与した。
実施例４に記載されるように調製されたＫＬ4 界面活性物質を約５．０〜５．７ ml/kgで点滴した。非ペプチド含有界面活性物質、Exosurf Neonatal(Burroghs Wellcome Co., ノースカロライナ州リサーチトライアングルパーク) を１mlあたり0.１N ＮａＣｌ中ＤＰＰＣ１３．５mg、セチルアルコール１．５mg及び１．０mgチロキサポールを含むように水と再構成し、５．０ ml/kgの用量で点滴した。３０匹のサルに１００ mg/kg（２４匹）又は９９ mg/kg（６匹）の用量のＫＬ4 界面活性物質を平均齢１．４５時間で投与し、９匹のサルに Exosurfを平均齢２．２時間で投与し、ａ／Ａ肺機能測定値を図２に示した種々の時間に算出した。ＫＬ4 界面活性物質を投与したサルの肺（黒い棒）は、 Exosurfで処理したサルの肺（斜線の棒）より劇的に良好に機能した。
【０１２７】
７．ウサギ炎症モデルにおける炎症伝達物質を除去しかつ肺機能を回復させる洗浄剤としての肺胞界面活性物質の使用
炎症伝達物質に付随する肺不全のモデルとして成体ウサギ肺へのリポ多糖（ＬＰＳ）の直接点滴を用いた。希釈界面活性物質洗浄法を用いてこのモデルを評価した。
１３匹の成体ウサギの内在肺界面活性物質を部分的に欠乏させ、０．７５μg/kgの細菌性ＬＰＳボラスを全量３ ml/kgで気管内点滴投与した。次に、炎症応答が生じるようにウサギを実施例５に記載されたベンチレータ装置で約３時間維持した。
３〜４時間後、６匹のウサギに実施例５のように調製された５ mg/mlのＫＬ4界面活性物質を用いて１サイクルあたり１０分で３０分かけて２０ ml/kgの洗浄液を３回投与した。処置を通してベンチレレータによって１００％Ｏ2 を投与した。７匹は対照として非処理のままにした。
図１２は、ウサギにおいてＬＰＳ損傷後に肺胞洗浄を用いた肺機能を示すグラフである。ＬＰＳの点滴後数分以内に肺がＬＰＳによって損傷されるのでＰａＯ2 レベルが低下する。肺胞界面活性物質組成物による洗浄は肺機能及びＰａＯ2レベルを劇的に改善したが、非処置対照は肺機能の改善を示さなかった。
本ＬＰＳ損傷モデルにおいて炎症成分に関する影響を求めるために、上記３回の洗浄サイクルの各回に洗浄液をウサギから採取し、その採取した洗浄液を実施例５に記載されたように全タンパク質、ミエロペルオキシダーゼ、多形核細胞（ＰＭＮ）及び赤血球を測定することにより炎症過程の成分の存在を評価した。図１３〜図１６に示されるように、４成分のレベルは全て漸次低下し、各連続洗浄により洗浄法が炎症成分を除去するのに効果的であることが示された。
【０１２８】
肺胞性炎症に関して希釈界面活性物質洗浄治療の長時間の影響を評価するために、同じウサギについて処置の約４時間後の炎症成分の含量を分析した。それを目的として、界面活性物質洗浄の開始後約3.５時間ウサギをモニターし、ＰａＯ2 レベルが対照ウサギで改善されないが界面活性物質洗浄ウサギについては改善されることが認められた。その後、ウサギを犠牲にし、肺を回収し、１０mlの正常食塩水を下葉に加えると共に洗浄液を吸引して肺胞内容物を集めることにより肺下葉を生体外で洗浄した。吸引した洗浄液を図１３〜図１６について記載されたように分析し、結果を図１７〜図２０に示す。炎症成分の減少は長時間であった。即ち、ＫＬ4 界面活性物質による処置の3.５時間後に炎症反応の戻りがほとんどなかったことから洗浄は進行中の炎症応答を減少させる点で効果的であった。
これらの結果から、種々の炎症成分及び伝達物質は本発明の希釈界面活性物質洗浄を用いて除去されかつその処置が進行中の炎症を減少させることが示される。従って、本発明は、タンパク質、酵素、細胞及び類似の伝達物質の形で存在する炎症伝達物質を含む肺不全の病態に用いられる。
【０１２９】
８．ブタ洗浄モデル及び点滴プロトコール
胎便吸引後の肺機能の修復のモデルとして仔ブタを評価した。
４日齢の仔ブタを入手し、実施例７に記載されたように機械的ベンチレータに取り付けた。実施例５に記載されたように調製したヒト胎便を１時間かけてボラス点滴で３回投与し、各回のボラスは胎便を３０％ (w/v)含有し、３ ml/kgの用量で投与された。ＦｉＯ2 を１．０に維持し、処置を通して連続して加えた。仔ブタ全体の第１グループ（図２２）及び仔ブタの第２グループではＰＥＥＰを６cmＨ2 Ｏに維持し、胎便点滴中はＰＥＥＰを６cmＨ2 Ｏに維持したが、最初の希釈界面活性物質洗浄の３０分前に８cmＨ2 Ｏに上げ、最後の洗浄後の約２時間８cmＨ2 Ｏに維持した（図２１）。処置を通してＰａＯ2 をモニターし、結果を経時ＰａＯ2 として示した（図２１、図２２）。希釈界面活性物質洗浄は、実施例７に記載されたように調製したＫＬ4 界面活性物質を用い、次のような用量の一連の点滴で１回の点滴あたり８ ml/kgで投与した：１回目の点滴（矢印１Ａ及び１Ｂ）２．５ mg/ml；図２２の２回目の点滴（矢印２Ａ及び２Ｂ）２．５ mg/ml；図２１の２回目の点滴（矢印２Ａ及び２Ｂ）１０ mg/ml；及び図２２の３回目の点滴（矢印３Ａ及び３Ｂ）１０ mg/ml、点滴のタイミングは図の矢印の位置で示され、Ａは仔ブタの右肺か左肺への点滴を示し、Ｂは仔ブタのもう一方の肺への点滴を示す。各洗浄後の肺胞液の除去は、ＰａＯ2 の平衡を可能にするために吸引せずに１〜５分間で分けられた短時間（１０秒）の陰圧（８０mmＨｇ）吸引を用いて２回以上吸引することにより行った。
８cmＨ2 Ｏの高ＰＥＥＰを用いると、胎便損傷肺モデルにおいて希釈界面活性物質洗浄後の動脈Ｏ2 の回復速度が著しく高くなった。一方、洗浄液と組合わせて６cmＨ2 ＯのＰＥＥＰを用いると、ＰａＯ2 が緩慢であるが徐々に高くなり、８cmＨ2 ＯのＰＥＥＰを用いるとＰａＯ2 が急速に及び著しく高くなり、胎便誘導肺不全からの速い回復が示された。
【０１３０】
同じ仔ブタについて脈動オキシメータを用いて末梢血酸素飽和度をモニターした。図２３に見られるように、８cmＰＥＥＰによる洗浄を受けた仔ブタは健常レベルの末梢酸素を維持したが、６cmＰＥＥＰによる洗浄を受けた仔ブタは末梢酸素レベルの劇的な低下を示した。
肺不全の場合の好ましい希釈洗浄処置を確認するために、洗浄点滴後の肺胞液を除去するための吸引時間を評価した。同じ仔ブタモデルにおいては、記載されたベンチレータ装置を仔ブタに取り付け、胎便で同様に処置した。ＦｉＯ2 を１．０に維持し、処置を通してＰＥＥＰを８cmＨ2 Ｏに維持した。末梢血酸素飽和度を処置を通して脈動オキシメータを用いてモニターし、Ｓａ酸素として示した。ＫＬ4 界面活性物質の洗浄点滴を2.５ mg/mlで投与し、洗浄点滴を終えた直後に肺胞液を除去するために陰圧８０mmＨｇの吸引をかけた。肺胞液を除去するために１０秒（図２４）か約６０秒（図２５）の吸引をかけた。動脈血の酸素飽和に関する吸引時間の影響は劇的であり、長時間の吸引は血液酸素レベルを低下させることが示された。従って、好適実施態様においては、吸引時間は３０秒未満、好ましくは２０秒を超えず、更に好ましくは１０秒未満にしなければならない。多回連続吸引がかけられるべきである場合には、血液酸素レベルを最適化する十分な時間（２０分に対して２０分）の短い回復時間で分けられなければならない。
個々の実施態様及び実施例を含む上記の詳細な説明は、本発明を具体的に説明するものであり、限定するものとされるべきではない。本発明の真意及び範囲から逸脱することなく多くの変更及び修正が行われる。
【０１３１】
配列表
配列番号：1 
配列の長さ： 21 
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Lys Leu Leu Leu Leu Lys Leu Leu Leu Leu Lys Leu Leu Leu Leu Lys
1               5                   10                  15     
Leu Leu Leu Leu Lys
20     
【０１３２】
配列番号：2 
配列の長さ： 21 
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Lys Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Lys Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1               5                   10                  15     
Leu Leu Lys Leu Leu
20     
【０１３３】
配列番号：3 
配列の長さ： 21 
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Lys Lys Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Lys Lys Leu Leu Leu Leu Leu
1               5                   10                  15     
Leu Leu Lys Lys Leu
20     
【０１３４】
配列番号：4 
配列の長さ： 21 
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Asp Leu Leu Leu Leu Asp Leu Leu Leu Leu Asp Leu Leu Leu Leu Asp
1               5                   10                  15     
Leu Leu Leu Leu Asp
20     
【０１３５】
配列番号：5 
配列の長さ： 21 
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Arg Leu Leu Leu Leu Arg Leu Leu Leu Leu Arg Leu Leu Leu Leu Arg
1               5                   10                  15     
Leu Leu Leu Leu Arg
20     
【０１３６】
配列番号：6 
配列の長さ： 21 
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1               5                   10                  15     
Leu Leu Arg Leu Leu
20     
【０１３７】
配列番号：7 
配列の長さ： 21 
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Arg Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Leu Leu
1               5                   10                  15     
Leu Leu Arg Arg Leu
20     
【０１３８】
配列番号：8 
配列の長さ： 19 
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Arg Leu Leu Leu Leu Cys Leu Leu Leu Arg Leu Leu Leu Leu Cys Leu
1               5                   10                  15     
Leu Leu Arg
【０１３９】
配列番号：9 
配列の長さ： 21 
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Arg Leu Leu Leu Leu Cys Leu Leu Leu Arg Leu Leu Leu Leu Cys Leu
1               5                   10                  15     
Leu Leu Arg Leu Leu
20     
【０１４０】
配列番号：10
配列の長さ： 28 
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Arg Leu Leu Leu Leu Cys Leu Leu Leu Arg Leu Leu Leu Leu Cys Leu
1               5                   10                  15     
Leu Leu Arg Leu Leu Leu Leu Cys Leu Leu Leu Arg
20                  25             
【０１４１】
配列番号：11
配列の長さ： 750
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： cDNA 
配列の特徴：
特徴を表す記号： sig peptide
存在位置： 1..186 
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 187..729 
配列：
CACCTGGGCC TGTGCAAATC CCGGCAGCCA GAGCCAGAGC AGGAGCCAGG GATGTCAGAC   60
CCCCTGCCCA AACCTCTGCG GGACCCTCTG CCAGACCCTC TGCTGGACAA GCTCGTCGTC  120
CCTGTGCTGC CCGGGGCCCT CCAGGCGAGG CCTGGGCCTC ACACACAGGA TCTCTCCGAG  180
CAGCAA TTC CCC ATT CCT CTC CCC TAT TGC TGG CTC TGC AGG GCT CTG     228
Phe Pro Ile Pro Leu Pro Tyr Cys Trp Leu Cys Arg Ala Leu  
1               5                  10                  
ATC AAG CGG ATC CAA GCC ATG ATT CCC AAG GGT GCG CTA GCT GTG GCA    276
Ile Lys Arg Ile Gln Ala Met Ile Pro Lys Gly Ala Leu Ala Val Ala 
15                  20                  25                  30 
GTG GCC CAG GTG TGC CGC GTG GTA CCT CTG GTG GCG GGC GGC ATC TGC    324
Val Ala Gln Val Cys Arg Val Val Pro Leu Val Ala Gly Gly Ile Cys 
35                  40                  45     
CAG TGC CTG GCT GAG CGC TAC TCC GTC ATC CTG CTC GAC ACG CTG CTG    372
Gln Cys Leu Ala Glu Arg Tyr Ser Val Ile Leu Leu Asp Thr Leu Leu 
50                  55                  60         
GGC CGC ATG CTG CCC CAG CTG GTC TGC CGC CTC GTC CTC CGG TGC TCC    420
Gly Arg Met Leu Pro Gln Leu Val Cys Arg Leu Val Leu Arg Cys Ser 
65                  70                  75             
ATG GAT GAC AGC GCT GGC CCA AGG TCG CCG ACA GGA GAA TGG CTG CCG    468
Met Asp Asp Ser Ala Gly Pro Arg Ser Pro Thr Gly Glu Trp Leu Pro 
80                  85                  90                 
CGA GAC TCT GAG TGC CAC CTC TGC ATG TCC GTG ACC ACC CAG GCC GGG    516
Arg Asp Ser Glu Cys His Leu Cys Met Ser Val Thr Thr Gln Ala Gly 
95                 100                 105                 110 
AAC AGC AGC GAG CAG GCC ATA CCA CAG GCA ATG CTC CAG GCC TGT GTT    564
Asn Ser Ser Glu Gln Ala Ile Pro Gln Ala Met Leu Gln Ala Cys Val 
115                 120                 125     
GGC TCC TGG CTG GAC AGG GAA AAG TGC AAG CAA TTT GTG GAG CAG CAC    612
Gly Ser Trp Leu Asp Arg Glu Lys Cys Lys Gln Phe Val Glu Gln His 
130                 135                 140         
ACG CCC CAG CTG CTG ACC CTG GTG CCC AGG GGC TGG GAT GCC CAC ACC    660
Thr Pro Gln Leu Leu Thr Leu Val Pro Arg Gly Trp Asp Ala His Thr 
145                 150                 155             
ACC TGC CAG GCC CTC GGA GTG TGT GGG ACC ATG TCC AGC CCT CTC CAG    708
Thr Cys Gln Ala Leu Gly Val Cys Gly Thr Met Ser Ser Pro Leu Gln 
160                 165                 170                 
TGT ATC CAC AGC CCC GAC CTT TGATGAGAAC TCAGCTGTCC A                750
Cys Ile His Ser Pro Asp Leu                         
175                 180                             
【０１４２】
配列番号：12
配列の長さ： 181
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
Phe Pro Ile Pro Leu Pro Tyr Cys Trp Leu Cys Arg Ala Leu Ile Lys 
1               5                  10                  15     
Arg Ile Gln Ala Met Ile Pro Lys Gly Ala Leu Ala Val Ala Val Ala 
20                  25                  30         
Gln Val Cys Arg Val Val Pro Leu Val Ala Gly Gly Ile Cys Gln Cys 
35                  40                  45             
Leu Ala Glu Arg Tyr Ser Val Ile Leu Leu Asp Thr Leu Leu Gly Arg 
50                  55                  60                 
Met Leu Pro Gln Leu Val Cys Arg Leu Val Leu Arg Cys Ser Met Asp 
65                  70                  75                  80 
Asp Ser Ala Gly Pro Arg Ser Pro Thr Gly Glu Trp Leu Pro Arg Asp 
85                  90                  95     
Ser Glu Cys His Leu Cys Met Ser Val Thr Thr Gln Ala Gly Asn Ser 
100                 105                 110         
Ser Glu Gln Ala Ile Pro Gln Ala Met Leu Gln Ala Cys Val Gly Ser 
115                 120                 125             
Trp Leu Asp Arg Glu Lys Cys Lys Gln Phe Val Glu Gln His Thr Pro 
130                 135                 140                 
Gln Leu Leu Thr Leu Val Pro Arg Gly Trp Asp Ala His Thr Thr Cys 
145                 150                 155                 160 
Gln Ala Leu Gly Val Cys Gly Thr Met Ser Ser Pro Leu Gln Cys Ile 
165                 170                 175     
His Ser Pro Asp Leu 
180     
【０１４３】
配列番号：13
配列の長さ： 21 
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
His Leu Leu Leu Leu His Leu Leu Leu Leu His Leu Leu Leu Leu His
1               5                   10                  15     
Leu Leu Leu Leu His
20     
【産業上の利用可能性】
【０１４４】
本発明は、呼吸窮迫症候群の治療；肺組織炎症からの炎症滲出液の除去；及び新生児における胎便吸引症候群の治療を含む種々の治療的使用に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】本発明の界面活性物質ペプチドの合成に用いられるメリフィールド法を示すスキームである。
【図２】未熟児サルにおける肺機能に関するＫＬ4 含有界面活性物質と非ペプチド界面活性物質の投与の影響を比較したグラフである。
【図３】気管内胎便を投与したウサギのＰａＯ2 応答を示すグラフである。
【図４】圧（cmＨ2 Ｏ）の関数として気容積(ml/kg) の変化の変化として示した処置を受けない胎便損傷動物のコンプライアンス曲線を示すグラフである。
【図５】圧（cmＨ2 Ｏ）の関数として気容積(ml/kg) の変化の変化として示したＫＬ4 界面活性物質で洗浄した胎便損傷動物のコンプライアンス曲線を示すグラフである。
【図６】圧（cmＨ2 Ｏ）の関数として気容積(ml/kg) の変化の変化として示した食塩水で洗浄した胎便損傷動物のコンプライアンス曲線を示すグラフである。
【図７】圧（cmＨ2 Ｏ）の関数として気容積(ml/kg) の変化の変化として示したＫＬ4 界面活性物質をボラス点滴した胎便損傷動物のコンプライアンス曲線を示すグラフである。
【図８】ＫＬ4 界面活性物質洗浄による胎便除去を示すグラフである。
【図９】希釈ＫＬ4 界面活性物質による洗浄後の胎便損傷ウサギの肺機能の変化を示すグラフである。
【図１０】ＫＬ4 界面活性物質のボラス点滴後の胎便損傷ウサギにおける肺機能の変化を示すグラフである。
【図１１】胎便損傷新生児赤毛サルのＫＬ4 界面活性物質洗浄による処置の影響を示すグラフである。
【図１２】ＡＲＤＳのモデルとして細菌性ＬＰＳ誘導肺損傷による処置で内在界面活性物質が部分的に欠乏した成体ウサギにおいてＰａＯ2 として測定した肺機能を示すグラフである。
【図１３】成体ウサギにおけるＬＰＳ損傷後の連続洗浄液に存在する炎症滲出液中のタンパク質の量を示す棒グラフである。
【図１４】成体ウサギにおけるＬＰＳ損傷後の連続洗浄液に存在する炎症滲出液中のミエロペルオキシダーゼの量を示す棒グラフである。
【図１５】成体ウサギにおけるＬＰＳ損傷後の連続洗浄液に存在する炎症滲出液中のＰＭＮの量を示す棒グラフである。
【図１６】成体ウサギにおけるＬＰＳ損傷後の連続洗浄液に存在する炎症滲出液中の赤血球の量を示す棒グラフである。
【図１７】成体ウサギにおけるＬＰＳ損傷後希釈界面活性物質で処置した３時間後の肺胞洗浄液に存在する炎症滲出液中のタンパク質の量を示す棒グラフである。
【図１８】成体ウサギにおけるＬＰＳ損傷後希釈界面活性物質で処置した３時間後の肺胞洗浄液に存在する炎症滲出液中のミエロペルオキシダーゼの量を示す棒グラフである。
【図１９】成体ウサギにおけるＬＰＳ損傷後希釈界面活性物質で処置した３時間後の肺胞洗浄液に存在する炎症滲出液中の赤血球の量を示す棒グラフである。
【図２０】成体ウサギにおけるＬＰＳ損傷後希釈界面活性物質で処置した３時間後の肺胞洗浄液に存在する炎症滲出液中のＰＭＮの量を示す棒グラフである。
【図２１】胎便損傷ブタにおける希釈界面活性物質洗浄による肺機能改善に関するＰＥＥＰ８cmＨ2 Ｏの影響を示すグラフである。
【図２２】胎便損傷ブタにおける希釈界面活性物質洗浄による肺機能改善に関するＰＥＥＰ６cmＨ2 Ｏの影響を示すグラフである。
【図２３】界面活性物質洗浄処置でのＯ2 飽和度（ＳａＯ2)に関する経時ＰＥＥＰの影響を示すグラフである。
【図２４】胎便損傷ブタにおける希釈界面活性物質洗浄による肺機能の改善に関する吸引間隔１０秒の影響を示すグラフである。
【図２５】胎便損傷ブタにおける希釈界面活性物質洗浄による肺機能の改善に関する吸引間隔６０秒の影響を示すグラフである。
【図１】
2004250459.tif 000017
【図２】
2004250459.tif 000018
【図３】
2004250459.tif 000019
【図４】
2004250459.tif 000020
【図５】
2004250459.tif 000021
【図６】
2004250459.tif 000022
【図７】
2004250459.tif 000023
【図８】
2004250459.tif 000024
【図９】
2004250459.tif 000025
【図１０】
2004250459.tif 000026
【図１１】
2004250459.tif 000027
【図１２】
2004250459.tif 000028
【図１３】
2004250459.tif 000029
【図１４】
2004250459.tif 000030
【図１５】
2004250459.tif 000031
【図１６】
2004250459.tif 000032
【図１７】
2004250459.tif 000033
【図１８】
2004250459.tif 000034
【図１９】
2004250459.tif 000035
【図２０】
2004250459.tif 000036
【図２１】
2004250459.tif 000037
【図２２】
2004250459.tif 000038
【図２３】
2004250459.tif 000039
【図２４】
2004250459.tif 000040
【図２５】
2004250459.tif 000041
【配列表】
2004250459000001.app