(57)【要約】【課題】核酸プローブと目標とする核酸分子とのハイブリッド体形成を行った際、目標とする核酸分子が核酸プローブを固定する支持体側に不必要に長い核酸鎖を有する形態となることに起因する立体的障害の発生を回避可能なハイブリダイゼーション・アッセイ方法を提供する。【解決手段】核酸プローブの塩基配列を固定される支持体側の末端に、例えば制限酵素による認識配列を含むものに選択し、目標とする核酸分子は、その核酸鎖末端に前記認識配列と相補的な部分塩基配列を有する、核酸分子断片に調製した上、核酸プローブとハイブリッド体形成を行うことで、支持体側に余剰な核酸鎖を持たないものとする。【選択図】　　図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリダイゼーション用の核酸プローブとして、複数種のオリゴヌクレオチドを支持体上の異なるスポットに固定化してなる核酸プローブマイクロアレイであって、
前記支持体上に固定化されるオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション反応に供せられる所定の塩基配列を有し、
該所定の塩基配列は、そのオリゴヌクレオチド鎖の支持体側末端部に、一つ又は複数の認識され得る予め既知の部分塩基配列を含むことを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチド鎖の支持体側末端部に含まれる、予め既知の部分塩基配列は、制限酵素により認識され得る塩基配列を含むことを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項３】
ハイブリダイゼーション用の核酸プローブとして、複数種のオリゴヌクレオチドを支持体上の異なるスポットに固定化してなる核酸プローブマイクロアレイを利用して、前記核酸プローブと検体中の核酸分子とのハイブリダイゼーション反応により、目標とする核酸分子の検出を行うアッセイ方法であって、
前記支持体上に固定化されるオリゴヌクレオチドは、目標とする核酸分子とのハイブリダイゼーション反応に供せられる所定の塩基配列を有し、
該所定の塩基配列は、そのオリゴヌクレオチド鎖の支持体側末端部に、一つ又は複数の認識され得る予め既知の塩基配列を含み、
前記ハイブリダイゼーション反応に先立ち、検体中の核酸分子を調製する工程を有し、
該検体中の核酸分子を調製する工程において、
目標とする核酸分子は、前記認識され得る予め既知の塩基配列において、その核酸鎖を切断し、その際、得られる核酸断片の切断末端に、前記既知の塩基配列と相補的な部分塩基配列を含んでなる核酸断片に調製されることを特徴とするハイブリダイゼーション・アッセイ方法。
【請求項４】
前記認識され得る予め既知の塩基配列における核酸鎖の切断が、該既知の塩基配列を認識し、切断する制限酵素を使って行われることを特徴とする請求項３に記載のハイブリダイゼーション・アッセイ方法。
【請求項５】
遺伝子多型の検出に、請求項３または４に記載のハイブリダイゼーション・アッセイ方法を利用することを特徴とする多型解析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ハイブリダイゼーション法に基づき、検出対象の核酸分子複数種の検出に利用する核酸プローブ複数を板状の媒体表面上にアレイ状に固相化された、所謂核酸プローブマイクロアレイ、ならびに該核酸プローブマイクロアレイを利用して、検出対象の核酸分子を固定検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ハイブリダイゼーション法を利用して、検出対象の核酸分子を検出する方法では、所定の塩基配列を有する核酸プローブを固相上に固定し、検出対象の核酸分子を核酸プローブとの結合により固定検出する。検出対象の核酸分子複数種の検出を行う際には、対応する核酸プローブ複数種を板状の媒体表面上にアレイ状に固相化し、所謂核酸プローブマイクロアレイとする。個々の核酸プローブは、検出対象の核酸分子の有する塩基配列の一部と相補的な塩基配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡなどが利用されている。
【０００３】
従来、かかる核酸プローブは、検出対象の核酸分子の有する塩基配列中、特異的な部分塩基配列を選択した上、その相補的な塩基配列とされるものの、前記特異的な部分塩基配列の存在位置は、特に考慮されてはいなかった。従って、核酸プローブ用塩基配列の選択の仕方によって、検出対象の核酸分子とのハイブリッド体の形態は様々なものとなっている。より具体的には、図１に例示するように、支持体１上に、リンカー４を介して、アレイ状の固定されている複数種のプローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとのハイブリッド体は、プローブＤＮＡ５とのハイブリダイゼーション部位が、ターゲットＤＮＡ２の末端部に位置し、結果的に支持体側に長い核酸鎖を持った状態となる場合もあり、あるいは、プローブＤＮＡ６とのハイブリダイゼーション部位が、ターゲットＤＮＡ３の中央部に位置し、結果的に支持体側に短い核酸鎖を残す状態となる場合もある。仮に、ハイブリッド体が、支持体側に長い核酸鎖を持った状態となっている場合、かかる長い核酸鎖に起因して、立体障害を引き起こすこともあり、ハイブリダイゼーション反応を阻害する要因となる場合もあった。また、通常、核酸プローブマイクロアレイにおいては、支持体上に、アレイ状に配置固定される個々のスポットでは、核酸プローブは緻密に固定されるため、前記の支持体側に長い核酸鎖を持った状態では、図１に例示するように、支持体による立体障害に加えて、隣接する核酸プローブに形成されたハイブリッド体相互間でも立体障害の誘起されることもある。
【０００４】
この立体障害に起因するハイブリダイゼーション反応の阻害が存在する場合には、検体試料中に含有されている、検出対象の核酸分子濃度自体が低く、形成されるハイブリッド体量が少なく場合や、あるいは、核酸プローブの塩基配列と僅かにミスマッチを有する核酸分子しか存在してなく、ミスマッチではあるものの、若干の確率で弱い結合を形成したものが少量検出された場合と、単に、マイクロアレイ上に固定された核酸分子量を測定するのみでは、その区別が非常に困難であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上述するように、プローブＤＮＡとハイブリッド体を形成した際、目標とする核酸分子の端部が、プローブＤＮＡを固定する支持体側に不必要に長い核酸鎖を有する場合には、既にハイブリッド体を形成したプローブＤＮＡの近傍に存在する、別のプローブＤＮＡに更なるハイブリッド体形成がなされる際、前記の不必要に長い核酸鎖に起因する立体的障害のため、そのハイブリダイゼーション反応を阻害することが、目標とする核酸分子を高い定量性で検出する際に大きな問題となっていた。加えて、支持体側に存在する長い核酸鎖と支持体との間で立体的障害を引き起こすと、形成されるハイブリッド体自体の安定性、あるいは、ハイブリダイゼーションを起こす際に、プローブＤＮＡと目標とする核酸分子との適正な配向の達成できる頻度・確率などの低下を誘起する懸念もある。
【０００６】
本発明は前記の課題を解決するものであり、本発明の目的は、ハイブリダイゼーション反応を利用して、核酸プローブと目標とする核酸分子とのハイブリッド体形成を行った際、形成されるハイブリッド体において、目標とする核酸分子が核酸プローブを固定する支持体側に不必要に長い核酸鎖を有しない形態となることが可能とする塩基配列を選択した核酸プローブ、ならびに、目標とする核酸分子自体も、かかる核酸プローブとハイブリッド体を形成した際、核酸プローブを固定する支持体側に不必要に長い核酸鎖を生じることのない、核酸鎖の末端にハイブリダイゼーション反応部位に利用する相補的な塩基配列を備えたものとできる目標とする核酸分子へと調製する工程を有するハイブリダイゼーション・アッセイ方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、前記の課題を解決すべく鋭意検討を進めたところ、核酸プローブに利用するオリゴヌクレオチドの塩基配列として、固定化する支持体側の末端部に、例えば、制限酵素など、特定の塩基配列において核酸鎖の切断が可能な手段により認識可能な既知の部分塩基配列を設け、一方、目標とする核酸分子に関しては、前記認識可能な既知の部分塩基配列に対して、相補的な部分塩基配列をその核酸鎖の末端に有する一本鎖核酸断片に予め調製した上で、核酸プローブとかかる核酸断片とのハイブリッド体形成を行うと、得られるハイブリッド体においては、目標とする核酸分子自体、核酸プローブを固定する支持体側に余剰の核酸鎖を有しない形態となることを見出した。加えて、本発明者は、前記の核酸プローブと核酸断片の目標とする核酸分子とのハイブリダイゼーション反応性は、前記末端の認識可能な既知の部分塩基配列に続く、目標とする核酸分子に特異的な部分塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸プローブとすることで、十分に高い特異性を保持でき、更に、ハイブリダイゼーション反応自体の阻害要因となる立体的障害が無いので、定量性と再現性に寄与し、異なるマイクロアレイ間においても、定量的な比較が容易となることを確認し、これらの知見に基づき、本発明を完成するに至った。加えて、本発明のアッセイ方法においては、検体中の核酸分子調製の際、制限酵素を利用した特異的な塩基配列での切断を行うので、各個人の検体間で、かかる切断のされ方に相違が存在する場合、支持体との立体障害に起因する見かけ上の反応性の低下を抑制する結果、多型に由来するミスマッチに起因する反応性の低下が、より高い確度で弁別できるようになり、ＳＮＰｓ等、遺伝子多型の解析にも有用であることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明にかかる核酸プローブマイクロアレイは、
ハイブリダイゼーション用の核酸プローブとして、複数種のオリゴヌクレオチドを支持体上の異なるスポットに固定化してなる核酸プローブマイクロアレイであって、
前記支持体上に固定化されるオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション反応に供せられる所定の塩基配列を有し、
該所定の塩基配列は、そのオリゴヌクレオチド鎖の支持体側末端部に、一つ又は複数の認識され得る予め既知の塩基配列を含むことを特徴とするマイクロアレイである。その際、前記オリゴヌクレオチド鎖の支持体側末端部に含まれる、予め既知の塩基配列は、制限酵素により認識され得る塩基配列であることが好ましい。
【０００９】
加えて、本発明は、上記の核酸プローブマイクロアレイを利用するハイブリダイゼーション・アッセイ方法をも提供し、
すなわち、本発明にかかるハイブリダイゼーション・アッセイ方法は、
ハイブリダイゼーション用の核酸プローブとして、複数種のオリゴヌクレオチドを支持体上の異なるスポットに固定化してなる核酸プローブマイクロアレイを利用して、前記核酸プローブと検体中の核酸分子とのハイブリダイゼーション反応により、目標とする核酸分子の検出を行うアッセイ方法であって、
前記支持体上に固定化されるオリゴヌクレオチドは、目標とする核酸分子とのハイブリダイゼーション反応に供せられる所定の塩基配列を有し、
該所定の塩基配列は、そのオリゴヌクレオチド鎖の支持体側末端部に、一つ又は複数の認識され得る予め既知の塩基配列を含み、
前記ハイブリダイゼーション反応に先立ち、検体中の核酸分子を調製する工程を有し、
該検体中の核酸分子を調製する工程において、
目標とする核酸分子は、前記認識され得る予め既知の塩基配列において、その核酸鎖を切断し、その際、得られる核酸断片の切断末端に、前記既知の塩基配列と相補的な部分塩基配列を含んでなる核酸断片に調製されることを特徴とするハイブリダイゼーション・アッセイ方法である。その際、前記認識され得る予め既知の塩基配列にける核酸鎖の切断が、該既知の塩基配列を認識し、切断する制限酵素を使って行われることが好ましい。加えて、遺伝子多型の検出に、本発明にかかるハイブリダイゼーション・アッセイ方法は好適に利用することができる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明について、より詳細に説明する。
【００１１】
本発明にかかるハイブリダイゼーション・アッセイ方法では、支持体上に固定化された核酸プローブを用いて、この核酸プローブの有する核酸配列と相補的な部分塩基配列を有する目標とする核酸分子とハイブリダイゼーションを行う際、例えば、核酸プローブがその３’側末端において、支持体上に固定化される場合、ハイブリダイゼーションを起こす相補的な部分塩基配列をその５’側末端に有する一本鎖核酸分子の形態に目標とする核酸分子を予め調製することによって、形成されるハイブリッド体においては、目標とする核酸分子自体、核酸プローブを固定する支持体側に余剰の核酸鎖を有しない形態とすることで、支持体側で余剰な核酸鎖に起因する立体的障害の発生を防止している。
【００１２】
より具体的には、ハイブリダイゼーション・アッセイに利用される核酸プローブの塩基配列は、検出対象であるＤＮＡまたはＲＮＡの既知である一連の塩基配列中、特徴的な部分塩基配列を選択し、その相補的な塩基配列とされる。その際、この核酸プローブの塩基配列の一端に、例えば、制限酵素による切断部位に相当する既知の塩基配列が存在するように、その塩基配列を選択する。一方、目標とする核酸分子は、検出対象であるＤＮＡまたはＲＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素を利用し、相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製し、更に、二本鎖ＤＮＡとした上で、対応する制限酵素による断片化処理を施し、切断末端には、当該制限酵素による切断部位に相当する相補的な部分塩基配列を有するように調製し、二本鎖の解離処理により、一本鎖核酸分子断片とする。
【００１３】
なお、検体から調製される、目標とするＤＮＡは、検体中のＤＮＡを出発点とする場合と、検体中のｍＲＮＡを出発点とする場合と、いずれも可能であるが、いずれの場合も制限酵素による特異的切断を可能とするには、一度は二本鎖ＤＮＡの状態とする過程を経なければならない。検体から調製した二本鎖ＤＮＡのサンプル量が少ない場合には、ＰＣＲによる増幅過程を加えて、サンプル量の増大を図る工程としても構わない。かかるＰＣＲによる増幅過程は、制限酵素による切断の後でも、逆に、予めＰＣＲ増幅を行った後に、制限酵素による切断を行う順序の、いずれを選択してもよい。予めＰＣＲ増幅を行った後、制限酵素による切断を行う場合は、ＰＣＲプライマー配列中に切断部位を存在させることも可能である。制限酵素による切断の後にＰＣＲ増幅を行う場合は、末端部分の塩基配列は、制限酵素の認識配列と同じである必要があるが、さらに、予めその末端に蛍光標識をした、標識プライマーを用いて、標識されたＤＮＡに調製しても構わない。なお、標識部位は、ハイブリダイゼーションした状態において、核酸プローブのリンカー側であっても、その反対側であっても構わない。リンカー側に付加される標識が、支持体と立体障害を引き起こすことが懸念される場合には、リンカーを長くすることで、かかる立体障害を回避しても良い。リンカーを長くする手段は、例えば、直鎖のアルキル鎖などをリンカー分子中に挿入することによって実現できる。
【００１４】
核酸プローブを支持体上に固定化する際、前記制限酵素による切断部位に相当する既知の部分塩基配列が存在する末端を、リンカーを介して支持体上に固定した上で、切断末端には、当該制限酵素による切断部位に相当する相補的な部分塩基配列を有する核酸分子断片に調製された目標とする核酸分子とハイブリダイゼーション反応を行う。この方法で得られるハイブリッド体では、目標とする核酸分子は、前記切断部位に相当する相補的な部分塩基配列に続く核酸鎖を予め除去したものとなっており、支持体側に不必要な核酸鎖が残余する状態を回避できている。
【００１５】
本発明では、核酸プローブには、上述するように、リンカーを介して支持体上に固定する際、その支持体側の末端に、例えば、制限酵素による切断部位に相当する既知の塩基配列が存在するように、その塩基配列を選択されたオリゴヌクレオチドを利用する。その際、末端に設ける認識可能な既知の塩基配列は、少なくとも一つの制限酵素による切断部位に相当する塩基配列とされるが、隣接して、あるいは、部分的に重複するように、複数の制限酵素による切断部位をかかる末端部に含むことも可能である。複数の制限酵素による切断部位を含む場合、目標とする核酸分子の調製では、それら複数の制限酵素の何れかを利用して、断片化処理を施し、切断末端を形成することができる。例えば、隣接して、あるいは、部分的に重複するように存在する切断部位の内、最末端以外の切断部位を利用した場合、ハイブリッド体を形成した際、核酸プローブの支持体側末端の数塩基は、ハイブリダイゼーション反応には関与しないものの、得られるハイブリッド体の安定性、反応性は、実質的には遜色がないものとできる。勿論、その場合も、得られるハイブリッド体では、目標とする核酸分子は、前記切断部位に相当する相補的な塩基配列に続く核酸鎖を予め除去したものとなっており、支持体側に不必要な核酸鎖が残余する状態を回避できている。
【００１６】
なお、ハイブリダイゼーション反応に利用される核酸プローブにおいて、ハイブリダイゼーション反応に関与する塩基長は、実際に得られるハイブリッド体において測定されるＴｍ値からある程度推定可能である。得られるハイブリッド体の熱的安定性を考慮して、関与する塩基長の下限を適宜選択できるが、しいて言えば、核酸プローブにおいてハイブリダイゼーション反応に関与する塩基長は、少なくとも、９塩基以上と選択することが望ましい。これ以下では、室温でさえ、ハイブリッド体の熱的な解離が生じ、定量的なハイブリダイゼーション反応を実施することが困難となる。一方、上限については、特異性を表現する上で必要な塩基長で、かつ他の核酸プローブとの交差反応を引き起こすほどの不必要に長い塩基配列を含まない範囲で、適宜選択できる。加えて、核酸プローブに用いるオリゴヌクレオチド合成のコスト、収率、ならびに、ミスフィット・ハイブリダイゼーション反応の排除等の観点で選択される反応温度をも考慮すると、長くとも、２００塩基程度以下に選択することが望ましい。従って、仮に、その支持体側の末端部に、複数の制限酵素による切断部位を設ける場合であっても、ハイブリダイゼーション反応に関与する塩基長が最短となる際でも、前記の塩基数下限値を下回らないように、核酸プローブの塩基配列塩基長を選択することが好ましい。
【００１７】
加えて、前記核酸プローブの塩基配列の選択に合わせて、目標とする核酸分子の調製工程では、一旦、二本鎖ＤＮＡとした上で、対応する制限酵素による断片化処理を施し、切断末端には、当該制限酵素による切断部位に相当する相補的な部分塩基配列を有するように調製する手法を利用するのが通常である。その制限酵素による断片化処理条件は、当該制限酵素による切断部位を有する二本鎖ＤＮＡにおいて、未反応の二本鎖ＤＮＡの残留が生じないように、十分な制限酵素処理時間とし、必要に応じて、適正な反応速度が得られるように、基質の二本鎖ＤＮＡならびに制限酵素の濃度を調整することが望ましい。仮に、未反応の二本鎖ＤＮＡの残留が生じると、その後、二本鎖の解離処理により、一本鎖核酸分子とした際、前記切断末端を形成していない一本鎖核酸分子も少量混在している検体試料となる。
【００１８】
汎用の制限酵素として、例えば、ＥｃｏＲ　Ｉ、Ｎｏｔ　Ｉ、Ａａｔ　ＩＩ、Ａｃｃ　ＩＩ、Ａｃｃ　ＩＩＩ、Ａｆａ　Ｉ、　Ａｆｌ　ＩＩ、Ａｌｕ　Ｉ、Ａｏｒ１３ＨＩ、Ａｏｒ５１ＨＩ、Ａｐａ　Ｉ、ＡｐａＬ　Ｉ、　Ａｖｉ　ＩＩ、Ｂａｌ　Ｉ　ＢａｍＨ　Ｉ、Ｂｂｅ　Ｉ、Ｂｇｌ　ＩＩ、Ｂｌｎ　Ｉ、Ｂｓｐ１４０７　Ｉ、ＢｓｓＨ　ＩＩ、Ｂｓｔ１１０７　Ｉ、Ｃｌａ　Ｉ、Ｄｒａ　Ｉ、ＥｃｏＲ　Ｖ、ＥｃｏＴ２２　Ｉ、Ｅｃｏ５２　Ｉ、Ｆｂａ　Ｉ、Ｆｓｅ　Ｉ、Ｈａｅ　ＩＩＩ、Ｈａｐ　ＩＩ、Ｈａｅ　Ｉ、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ、Ｈｐａ　Ｉ、Ｋｐｎ　Ｉ、Ｍｂｏ　Ｉ、Ｍｌｕ　Ｉ、Ｍｓｐ　Ｉ、Ｍｕｎ　Ｉ、Ｎａｅ　Ｉ、Ｎｃｏ　Ｉ、Ｎｄｅ　Ｉ、Ｎｈｅ　Ｉ、Ｎｏｔ　Ｉ、Ｎｒｕ　Ｉ、ＰｍａＣ　Ｉ、ＰｓｈＢ　Ｉ、Ｐｓｐ１４０６　Ｉ、Ｐｓｔ　Ｉ、Ｐｖｕ　Ｉ、Ｐｖｕ　ＩＩ、Ｓａｃ　Ｉ、Ｓａｃ　ＩＩ、Ｓａｌ　Ｉ、Ｓａｕ３Ａ　Ｉ、Ｓｃａ　Ｉ、Ｓｍａ　Ｉ、ＳｎａＢ　Ｉ、Ｓｐｅ　Ｉ、Ｓｐｈ　Ｉ、Ｓｓｅ８３８７　Ｉ、ＳｓｐＩ、Ｓｔｕ　Ｉ、Ｓｗａ　Ｉ、Ｔａｐ　Ｉ、Ｘｂａ　Ｉ、Ｘｈｏ　Ｉ、ＸｓｐＩなどを挙げることができる。これら例示される制限酵素を参考としつつ、検出対象であるＤＮＡまたはＲＮＡの全塩基配列を参照し、その中に存在する前記制限酵素の切断部位を確認した上、かかる複数個存在する、各制限酵素の切断部位に続く部分塩基配列のうち、より特異的なハイブリダイゼーション反応特性を示すものを選択することが更に好ましい。
【００１９】
図２は、本発明にかかる核酸プローブを使用するマイクロアレイに対して、上述する調製工程で得られる目標とする核酸分子をハイブリダイゼーション・アッセイした状態を模式的に示す。所定の塩基配列を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドからなる二種のプローブＤＮＡ５、６が、それぞれリンカー４を介して、支持体１の表面にアレイ状にスポットされたＤＮＡマイクロアレイとされている。制限酵素による断片化処理を施し、切断末端に、当該制限酵素による切断部位に相当する相補的な部分塩基配列を有するＤＮＡ分子に調製されたターゲットＤＮＡ２、３は、プローブＤＮＡ５、６の支持体側末端の制限酵素による切断部位に相当する塩基配列と、切断末端の相補的な部分塩基配列とを一致させる状態でハイブリッド体を形成する。この状態では、ターゲットＤＮＡ２、３は、支持体１側に伸びる核酸鎖を有してなく、また、隣接するハイブリッド体相互間でも、立体的障害を誘起することもない。
【００２０】
本発明にかかる核酸プローブにおいては、支持体の表面に固定化する核酸鎖の末端には、予め固定化に利用するリンカー分子に対する反応性を有する修飾を施す合成オリゴヌクレオチドを利用することが好ましい。かかる合成オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ鎖あるいはＲＮＡ鎖とすることができるが、取り扱いの簡便さや合成コスト等を考慮すると、ＲＮＡ分解酵素（Ｒｎａｓｅ）の混入により、分解を受ける懸念に対する防止策が必須であるＲＮＡ鎖と比較して、ＤＮＡ鎖とすることがより好ましい。マイクロアレイの作製に利用される支持体の材質は、ハイブリダイゼーション反応後、その表面の洗浄が容易なガラス、プラスチックなどの有機系高分子材料などが利用でき、プローブ用のオリゴヌクレオチドの固定化が可能な固相表面処理が可能ならは、何れの材質でも構わない。ハイブリッド体を蛍光検出する際、インターカレータによる蛍光標識法を使用する場合には、ガラス材質の使用を避けると、支持体表面からのバックグラウンド蛍光量を抑制する上で望ましい。なお、別途作製したプローブ用のオリゴヌクレオチドを、アレイ状にスポットし、かかる支持体の表面に固定化する手法として、固相法によるマイクロアレイ化の一例である、特開平１１−１８７９００号公報に記載される手順などが利用できる。
【００２１】
また、支持体自体の形状は、ハイブリダイゼーション・アッセイに際して、アッセイ結果の測定手段、すなわち、読取装置の形態に応じて、適宜選択でき、例えば、マイクロプレートリーダであれば、ウェル状、マイクロアレイスキャナであれば、板状、また、フローサイトメータのような装置であれば、粒状が、それぞれ最も適合する支持体形状である。
【００２２】
本発明にかかるハイブリダイゼーション・アッセイ方法では、核酸プローブとハイブリダイゼーションした目標とする核酸分子の検出は、二本鎖ＤＮＡに結合して、蛍光を発するインターカレータの利用、あるいは、ハイブリッド体を形成した目標とする核酸分子に予め付される標識を利用する測定方法が利用される。この目標とする核酸分子に付される標識として、例えば、蛍光標識などが好適に利用できる。
【００２３】
また、本発明にかかるハイブリダイゼーション・アッセイ方法では、一次試料中に含有される検出対象であるＤＮＡまたはＲＮＡ自体とハイブリダイゼーション反応する代わりに、これら検出対象であるＤＮＡまたはＲＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素を利用し、相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製し、更に、二本鎖ＤＮＡとする。その際、二本鎖ＤＮＡは、作製された相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）と対応する、両末端が平滑末端とされた二本鎖ＤＮＡに調製することが好ましい。平滑末端とされた二本鎖ＤＮＡとすることにより、制限酵素による断片化処理を施す際、仮に、当該制限酵素による切断部位が末端近傍に位置する場合にも、より確実に制限酵素による断片化処理を実施することが可能となる。
【００２４】
なお、目標とする核酸分子に対する標識付与は、常法に従って、蛍光標識−ｄＵＴＰや蛍光標識−ｄＣＴＰを利用して、ＰＣＲ増幅反応において該蛍光標識塩基を取り込むＤＮＡ鎖としてもよく、あるいは、予め標識を付与したＰＣＲプライマーを利用するＰＣＲ増幅産物とする手法を利用することも可能である。
【００２５】
一方、核酸プローブの支持体、例えば、スライドガラス上に固定する際に利用されるリンカーとしては、アミノ修飾オリゴヌクレオチドの場合は、ポリ−Ｌ−リジンの利用がよく知られている。ポリ−Ｌ−リジンコート済スライドガラスは、（株）松浪ガラスで市販されているし、他にも、Ｅｘｉｑｏｎ社（デンマーク）のＥｕｒａｙ　Ｉｍｏｂｉｌｉｚｅｒ（商標）などもある。また、ＳＨ基修飾オリゴヌクレオチドの場合は、例えば、スライドガラス表面をアミノシランカップリング剤により処理した上で、ＥＭＣＳ（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）などの二価性試薬を介して、固相化することができる。その他、核酸プローブ固相化の公知例は、「ＤＮＡチップ技術とその応用」、「蛋白質　核酸　酵素　４３（１３）」、（１９９８年）、君塚房夫、加藤郁之進著、共立出版（株）発行、２００４頁〜２０１１頁にも紹介されている。また、合成オリゴヌクレオチド末端修飾用の試薬は、ＧＬＥＮ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ社のカタログ・ホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）に紹介されている。
【００２６】
本発明にかかるハイブリダイゼーション・アッセイ方法を用いることで、検体となす核酸分子を予め制限酵素等で処理することによって断片化し、しかもその切断化部分の末端配列に相補的な塩基配列を、支持体側の末端からの塩基配列に含んだ核酸プローブを固定化したマイクロアレイを利用して、ハイブリダイゼーション反応を行うことによって、ハイブリッド体を形成した目標とする核酸分子に由来する余剰な核酸鎖に起因する立体的障害を防止できる。従って、従来のＤＮＡマイクロアレイにおけるハイブリダイゼーション方法で発生していた、図１に例示される、プローブＤＮＡ５とターゲットＤＮＡ２とハイブリッド体に示されるように、仮に、支持体側に長い核酸鎖を持った状態でハイブリダイゼーションが起こる場合には、この長い核酸鎖の立体的障害のために、ハイブリダイゼーション反応自体が阻害され、あるいは、隣接するハイブリッド体の形成を阻害するという問題は、本発明を利用することでは効果的に解消される。その結果として、立体的障害に起因する反応性の濃度依存的な低下に付随する定量性の低下も、本発明を利用することでは本質的に解消される。さらには、立体的障害に起因するハイブリダイゼーション反応性の低さが、目標とする核酸分子と核酸プローブの塩基配列の不一致、ミスマッチの存在と誤認されるという問題も、本発明を利用することでは本質的に解消される。
【００２７】
【実施例】
以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。なお、かかる実施例は本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるものの、本発明はかかる形態に限定されるものではない。
【００２８】
（実施例１）
１．　核酸プローブの合成、ならびにマイクロアレイの作製
マイクロアレイの作製に利用する核酸プローブは、オリゴヌクレオチドＤＮＡ鎖の３’側末端で支持体上に固定する形態とし、その塩基配列は、３’側末端に、制限酵素として、ＥｃｏＲ　ＩおよびＮｏｔ　Ｉの認識配列を有するオリゴヌクレオチドとした。各制限酵素の認識配列は、
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であり、それぞれ、前記制限酵素の認識配列に続き、塩基長６のＸＸＸＸＸＸの部分に、（４）６＝４０９６個のランダムな塩基配列全てを持つ、全塩基長１２からなるＸＸＸＸＸＸＧＡＡＴＴＣ−固相（ＥｃｏＲ　Ｉ）、ならびに全塩基長１４からなるＸＸＸＸＸＸＧＣＧＧＣＣＧＣ−固相（Ｎｏｔ　Ｉ）、計８１９２種のオリゴヌクレオチド・プローブを合成した。これらのＤＮＡプローブをアレイ基板上に、マトリックス・アレイ状に、市販のアレイヤーを使ってスポッティングした。前記ＤＮＡプローブは、固相側との結合させる３’末端に、チオール化修飾試薬：チオールモディファイア（グレンリサーチ）を用いて、予めスルファニル基（ＳＨ）を導入した形態とし、全て、オリゴヌクレオチド合成メーカーより入手した。ここで利用する、予め合成したＤＮＡプローブをアレイ基板上に、スポッティングしてマイクロアレイ化を行う固相方法の詳細は、特開平１１−１８７９００号公報の実施例に記載される手順に従った。
【００２９】
２．　ハイブリダイゼーション・アッセイ用の検体調製
検体として、下記する手順に従って、ブタの肝臓から採取したｔｏｔａｌ　ＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡライブラリーを調製した。
【００３０】
ブタの肝臓２００ｍｇを入手し、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（キアゲン社）でホモジナイズし、Ｒｎｅａｓｙ　Ｍｉｄｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を使って、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを分離した。採取したｔｏｔａｌ　ＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素により相補的な一本鎖ｃＤＮＡを作製するため、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡに対して、逆転写プライマーのＴ７−（ｄＴ）２４　プライマーと、逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＲＴ、ならびにｄＮＴＰｍｉｘを加え、４２℃１時間反応させることによって、Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡを得た。このＦｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡは、鋳型となるＲＮＡの３’末端にｐｏｌｙＡ配列を保有するｍＲＮＡに対して、その相補的な塩基配列を有するものとなる。
【００３１】
次に、逆転写で作製されたＦｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡに対して、ＤＮＡｌｉｇａｓｅ、ＲｎａｓｅＨ、ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩ　ｄＮＴＰｍｉｘを１６℃２時間反応させ、その後Ｔ４ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１６℃５分反応させることにより、混在していたＲＮＡの分解除去、ならびに、一本鎖ｃＤＮＡのＦｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡから二本鎖ＤＮＡを形成し、平滑末端を有するＳｅｃｏｎｄ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡを得た。さらに、Ｒｎｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を使って、エタノール沈澱処理を二回繰り返し、二本鎖ＤＮＡをペレットとして分離した。この単離したペレット中のＤＮＡを２０μｌの純水に溶かし、各１０μｌを、それぞれＰｒｅｍｉｘ　Ｎｏｔ　Ｉ（宝酒造）、およびＰｒｅｍｉｘ　ＥｃｏＲ　Ｉ（宝酒造）に添加し、３７℃２時間反応させた。制限酵素切断の終了したサンプルを一つに混ぜ、スピンカラム（ファルマシアバイオテック）にてＴＥにＢｕｆｆｅｒ交換した。
【００３２】
この混合サンプルは、制限酵素Ｎｏｔ　Ｉによる認識配列、ならびに、制限酵素ＥｃｏＲ　Ｉによる認識配列を、その末端に有する核酸分子断を含んでいる。
【００３３】
３．　ハイブリダーゼーション・アッセイ
２の検体調製工程で得られる混合サンプル４０μｌを９５℃でｄｅｎａｔｕｒｅし、一本鎖ＤＮＡとした。その後、１の工程で作製したマイクロアレイと、前記一本鎖ＤＮＡ化した検体核酸分子を４５℃で一晩反応させた。その後、未反応の核酸分子を除去するため、４×ＳＳＣ　Ｂｕｆｆｅｒ含０．２％ＳＤＳで二回洗浄した後、１×ＳＳＣ一回洗浄し、ＴＥ　Ｂｕｆｆｅｒに置換した。更に、核酸プローブとハイブリダーゼーションしているＤＮＡに対して、２００倍希釈のｐｉｃｏｇｒｅｅｎ（フナコシ）で、室温１５分反応させ、ＴＥ　Ｂｕｆｆｅｒで軽く濯いだ。このハイブリッド体を形成している二本鎖ＤＮＡに付された蛍光標識を利用して、ＧｅｎｅＰｉｘ　４０００Ｂで、蛍光測定を行った。
【００３４】
すなわち、マイクロアレイに固定化されている核酸プローブ、ＸＸＸＸＸＸＧＡＡＴＴＣ−固相（ＥｃｏＲ　Ｉ）、またはＸＸＸＸＸＸＧＣＧＧＣＣＧＣ−固相（Ｎｏｔ　Ｉ）に対して、上記制限酵素による切断で断片化された核酸分子に由来する、その切断末端の部分塩基配列として、各制限酵素による認識配列を含む相補的ＤＮＡがハイブリダーゼーション反応を起こし、図２に例示するように、核酸プローブの支持体側には余剰の核酸鎖を持たない形態でハイブリッド体を構成する。その際、ハイブリッド体を形成する相補的ＤＮＡ断片の他方の末端は、支持体に対して立体的障害を引き起こさない、液相に向いた配置をとっており、高い再現性、反応性で蛍光標識化が達成されている。
【００３５】
【発明の効果】
本発明にかかるハイブリダイゼーション・アッセイ方法を用いることで、検体となす核酸分子を予め制限酵素等で処理することによって断片化し、しかもその切断化部分の末端配列に相補的な配列を、支持体側の末端からの配列に含んだ核酸プローブを固定化したマイクロアレイを利用して、ハイブリダイゼーション反応を行うことによって、ハイブリッド体を形成した目標とする核酸分子に由来する余剰な核酸鎖に起因する立体的障害を防止できる。従って、従来のＤＮＡマイクロアレイにおけるハイブリダイゼーション方法で発生していた、仮に、支持体側に長い核酸鎖を持った状態でハイブリダイゼーションが起こる場合には、この長い核酸鎖の立体的障害のために、ハイブリダイゼーション反応自体が阻害され、あるいは、隣接するハイブリッド体の形成を阻害するという問題は、本発明を利用することでは効果的に解消される。その結果として、立体的障害に起因する反応性の濃度依存的な低下に付随する定量性の低下も、本発明を利用することでは本質的に解消される。さらには、立体的障害に起因するハイブリダイゼーション反応性の低さが、目標とする核酸分子と核酸プローブの塩基配列の不一致、ミスマッチの存在と誤認されるという問題も、本発明を利用することでは本質的に解消される。以上の各利点が相俟って、本発明にかかるハイブリダイゼーション・アッセイ方法においては、目標とする核酸分子の検出が、高い定量性、再現性で行うことが可能となり、それに伴い、検出の対象が別目的とされている異なるマイクロアレイ間においても、互いの検出結果の定量的な比較が容易となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】従来のオリゴヌクレオチドを用いたＤＮＡマイクロアレイを利用する核酸分子の検出において、対象の核酸分子上のハイブリダイゼーション部位に起因するハイブリッド体相互間、あるいは、ハイブリッド体と基板間での立体障害発生の様子を模式的に示す図である。
【図２】本発明にかかるＤＮＡマイクロアレイにおける、プローブＤＮＡと、対象の核酸分子に、対応する制限酵素による切断部位において断片化処理を施した核酸分子断片とのハイブリッド体の基板上における固定様式を模式的に示す図である。
【符号の説明】
１　支持体
２、３　ターゲットＤＮＡ
４　リンカー
５、６　プローブＤＮＡ
【図１】
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【図２】
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