(57)【要約】【課題】迅速にＣＹＰ２Ｃ１９中の点突然変異ｍ１及びｍ２を検出することができる方法並びにそのためのプライマー及びプローブを提供すること。【解決手段】特定の塩基配列を有するｍ１検出用のフォワードプライマーと、特定の塩基配列を有するｍ２検出用のフォワードプライマーと、特定の塩基配列を有するｍ２検出用のリバースプライマーと、特定の塩基配列を有する一組のｍ１検出用プローブと、特定の塩基配列を有する一組のｍ２検出用プローブとを提供し、これらを用いた核酸増幅法を駆使して迅速にｍ１及びｍ２を検出することができる方法を提供した。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、又は該核酸の１０％以下の塩基が置換した核酸から成る、核酸増幅法によるヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン５中の点突然変異ｍ１検出用フォワードプライマー。
【請求項２】
配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸から成る、請求項１記載のプライマー。
【請求項３】
前記核酸が、配列表の配列番号２に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸である請求項２記載のプライマー。
【請求項４】
前記核酸が、配列表の配列番号３に示す塩基配列を有する２３ｍｅｒの核酸から成る請求項３記載のプライマー。
【請求項５】
配列表の配列番号４に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、又は該核酸の１０％以下の塩基が置換した核酸から成る、核酸増幅法によるヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン４中の点突然変異ｍ２検出用フォワードプライマー。
【請求項６】
配列表の配列番号４に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸から成る、請求項５記載のプライマー。
【請求項７】
前記核酸が、配列表の配列番号５に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸である請求項６記載のプライマー。
【請求項８】
前記核酸が、配列表の配列番号６に示す塩基配列を有する１８ｍｅｒの核酸から成る請求項７記載のプライマー。
【請求項９】
配列表の配列番号７に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、又は該核酸の１０％以下の塩基が置換した核酸から成る、核酸増幅法によるヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン４中の点突然変異ｍ２検出用リバースプライマー。
【請求項１０】
配列表の配列番号７に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸から成る、請求項９記載のプライマー。
【請求項１１】
前記核酸が、配列表の配列番号８に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸である請求項１０記載のプライマー。
【請求項１２】
前記核酸が、配列表の配列番号９に示す塩基配列を有する２２ｍｅｒの核酸から成る請求項１１記載のプライマー。
【請求項１３】
ハイブリダイゼーションプローブ法によるＰＣＲ法用のプライマーである請求項１ないし１２のいずれか１項に記載のプライマー。
【請求項１４】
配列表の配列番号１０に示す塩基配列又はその相補鎖に、１〜５塩基の間隔を空けてハイブリダイズする、それぞれ１５塩基以上の一組の核酸であって、各核酸は、配列表の配列番号１０に示す塩基配列又はその相補鎖の領域と同一の塩基配列を有し、いずれか一方の核酸は、ヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン５中の点突然変異ｍ１が生じる部位を含む領域とハイブリダイズするものであり、かつ、ハイブリダイズした状態において各核酸の互いに近接する末端領域に、共働してＦＲＥＴ効果を生じる蛍光色素がそれぞれ結合されている、ヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン５中の点突然変異ｍ１検出用の一組のプローブ。
【請求項１５】
配列表の配列番号１１に示す塩基配列又はその相補鎖にハイブリダイズする請求項１４記載の一組のプローブ。
【請求項１６】
１つのプローブの核酸が、配列表の配列番号１２に示す塩基配列を有する２０ｍｅｒの核酸であり、他のプローブの核酸が、配列表の配列番号１３に示す塩基配列を有する３３ｍｅｒの核酸である請求項１５記載の一組のプローブ。
【請求項１７】
配列表の配列番号１４に示す塩基配列又はその相補鎖に、１〜５塩基の間隔を空けてハイブリダイズする、それぞれ１５塩基以上の一組の核酸であって、各核酸は、配列表の配列番号１４に示す塩基配列又はその相補鎖の領域と同一の塩基配列を有し、いずれか一方の核酸は、ヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン４中の点突然変異ｍ２が生じる部位を含む領域とハイブリダイズするものであり、ハイブリダイズした状態において各核酸の互いに近接する末端領域に、共働してＦＲＥＴ効果を生じる蛍光色素がそれぞれ結合されている、ヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン４中の点突然変異ｍ２検出用の一組のプローブ。
【請求項１８】
配列表の配列番号１５に示す塩基配列又はその相補鎖にハイブリダイズする請求項１７記載の一組のプローブ。
【請求項１９】
１つのプローブの核酸が、配列表の配列番号１６に示す塩基配列を有する１９ｍｅｒの核酸であり、他のプローブの核酸が、配列表の配列番号１７に示す塩基配列を有する３１ｍｅｒの核酸である請求項１８記載の一組のプローブ。
【請求項２０】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のフォワードプライマーと、該フォワードプライマーと共働して、ヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン５中の点突然変異ｍ１を含む増幅産物を生成するリバースプライマーとを用いて核酸増幅法により被検核酸を増幅することを含む、ヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン５中の点突然変異ｍ１の検出方法。
【請求項２１】
前記増幅産物と請求項１４ないし１６のいずれか１項に記載の一組のプローブとをハイブリダイズさせ、その融解温度を測定することを含む請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸増幅法を、請求項１４ないし１６のいずれか１項に記載の一組のプローブの存在下で行う請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
請求項５ないし８のいずれか１項に記載のフォワードプライマーと、請求項９ないし１２のいずれか１項に記載のリバースプライマーとを用いて核酸増幅法により被検核酸を増幅することを含む、ヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン４中の点突然変異ｍ２の検出方法。
【請求項２４】
前記増幅産物と請求項１７ないし１９のいずれか１項に記載の一組のプローブとをハイブリダイズさせ、その融解温度を測定することを含む請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記核酸増幅法を、請求項１７ないし１９のいずれか１項に記載の一組のプローブの存在下で行う請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のフォワードプライマーと、該フォワードプライマーと共働して、請求項１４ないし１６のいずれか１項に記載の一組のプローブがハイブリダイズする増幅産物を生成するリバースプライマーと、請求項５ないし８のいずれか１項に記載のフォワードプライマーと、請求項９ないし１２のいずれか１項に記載のリバースプライマーと、請求項１４ないし１６のいずれか１項に記載の一組のプローブと、請求項１７ないし１９のいずれか１項に記載の一組のプローブとの存在下において、被検核酸を増幅するとともに得られたそれぞれの増幅産物に前記それぞれの一組のプローブをハイブリダイズさせ、その融解温度を測定することを含む、ヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン５中の点突然変異ｍ１及び該遺伝子のエクソン４中の点突然変異ｍ２を同時に検出する方法。
【請求項２７】
核酸増幅反応をキャピラリーチューブ内で行う請求項２０ないし２６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子（以下、「ＣＹＰ２Ｃ１９」ということがある）の点突然変異の検出用核酸及びそれを用いたＣＹＰ２Ｃ１９の点突然変異の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
抗痙攣剤である（Ｓ）−メフェニトインの代謝能力には遺伝的多型が見られる。この遺伝的多型は（Ｓ）−メフェニトインの代謝だけではなく、臨床的に重要なジアゼパム、イミプラミン、オメプラゾール及びプロプラノロール並びに選択的セロトニン再取込み阻害剤（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ　ｒｅｕｐｔａｋｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）の酸化的代謝能力とともに遺伝的に分離するので、（Ｓ）−メフェニトインの代謝異常を調べることは臨床的に重要である。
【０００３】
従来、（Ｓ）−メフェニトインの代謝異常は、被検者に（Ｓ）−メフェニトインを経口投与し、８時間後に排泄される尿中に含まれる４’−ヒドロキシメフェニトインを定量することにより行われていた。しかしながら、この方法は時間がかかる上に被検者に無用の薬剤を投与しなければならない。
【０００４】
（Ｓ）−メフェニトインの代謝異常の遺伝的な原因は、少なくとも日本人については明らかになっている。すなわち、ＣＹＰ２Ｃ１９のエクソン５中のＧがＡになる点突然変異（部位は、ＣＹＰ２Ｃ１９のｃＤＮＡの６８１ｎｔ（すなわち、図１の塩基配列の１１７ｎｔ）、本明細書においてこの点突然変異を「ｍ１」という）（Ｓｏｎｉａ　Ｍ．Ｆ．　ｄｅ　Ｍｏｒａｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ．２６９，　Ｎｏ．　２２，　ｐｐ．１５４１９−１５４２２，　１９９４及びＣＹＰ２Ｃ１９のエクソン４中のＧがＡになる点突然変異（部位は、ＣＹＰ２Ｃ１９のｃＤＮＡの６３６ｎｔ（すなわち、図２の塩基配列の２３４ｎｔ）、本明細書においてこの点突然変異を「ｍ２」という）（Ｓｏｎｉａ　Ｍ．Ｆ．　ｄｅ　Ｍｏｒａｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｈａｒｍａｏｃｌｏｇｙ，　４６：５９４−５９８，１９９４の少なくともどちらかによって（Ｓ）−メフェニトインの代謝異常が起きることがわかっている。従って、ＣＹＰ２Ｃ１９のエクソン５及び４中の上記ｍ１及びｍ２を調べることにより、（Ｓ）−メフェニトインの代謝異常を検査することができ、さらには、その遺伝子型を分類（ジェノタイピング）することもできる。
【０００５】
上記各文献には、それぞれ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によりｍ１及びｍ２を検出する方法が記載されている。すなわち、エクソン５及びエクソン４のそれぞれについて各一対のプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を制限酵素で消化して電気泳動で分離することにより、突然変異の有無に応じて異なるサイズの断片が検出される。
【０００６】
さらに、本出願人の先の出願である特開平１０−１４５８５号公報には、プライマーを改良することにより、ｍ１とｍ２とを単一のＰＣＲにより検出可能にしたＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によるｍ１とｍ２の同時検出方法が記載されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、制限酵素による消化及び電気泳動による増幅断片の分離等の操作が必要であり、多数の検体について限られた時間内に検査を行わなければならない病院や臨床検査センター等では、より迅速に検査を行うことができる方法が望まれる。
【０００８】
従って、本発明の目的は、迅速にＣＹＰ２Ｃ１９中の点突然変異ｍ１及びｍ２を検出することができる方法並びにそのためのプライマー及びプローブを提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、最近用いられ始めた、キャピラリーチューブ内でＰＣＲによる増幅を行うと共に、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ））を利用した一組のプローブを増幅産物にハイブリダイズさせ、該ハイブリッドの融解温度を測定することにより、点突然変異を検出する方法を用いて、ｍ１及びｍ２を検出できないかと考えた。キャピラリーチューブ内でのＰＣＲによる増幅は、変性、アニーリング、伸長の各工程が従来のＰＣＲよりもはるかに短時間に行われ、全体として増幅反応が従来のＰＣＲの数分の１の時間で行える点が有利な特徴である。しかしながら、各工程が短時間であるので、適切にプライマーを設定しないと増幅がほとんど起きず、点突然変異の検出を行うことができない。本願発明者らは、ｍ１及びｍ２検出用の公知のプライマーや、市販のコンピューターソフトにより推奨されるプライマーを用いてｍ１及びｍ２の検出を試みたが、成功しなかった。そこで、鋭意研究の結果、独自にキャピラリーチューブ内でのＰＣＲを用いても、鋭敏にｍ１及びｍ２を検出できる、増幅効率の極めて優れたプライマー、及び検出感度の高い一組のプローブを見つけ出すことに成功し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、又は該核酸の１０％以下の塩基が置換したから成る、核酸増幅法によるヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン５中の点突然変異ｍ１検出用フォワードプライマーを提供する。また、本発明は、配列表の配列番号４に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、又は該核酸の１０％以下の塩基が置換したから成る、核酸増幅法によるヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン４中の点突然変異ｍ２検出用フォワードプライマーを提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号７に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、又は該核酸の１０％以下の塩基が置換したから成る、核酸増幅法によるヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン４中の点突然変異ｍ２検出用リバースプライマーを提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号１０に示す塩基配列又はその相補鎖に、１〜５塩基の間隔を空けてハイブリダイズする、それぞれ１５塩基以上の一組の核酸であって、各核酸は、配列表の配列番号１０に示す塩基配列又はその相補鎖の領域と同一の塩基配列を有し、いずれか一方の核酸は、ヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン５中の点突然変異ｍ１が生じる部位を含む領域とハイブリダイズするものであり、ハイブリダイズした状態において各核酸の互いに近接する末端領域に、共働してＦＲＥＴ効果を生じる蛍光色素がそれぞれ結合されている、ヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン５中の点突然変異ｍ１検出用の一組のプローブを提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号１４に示す塩基配列又はその相補鎖に、１〜５塩基の間隔を空けてハイブリダイズする、それぞれ１５塩基以上の一組の核酸であって、各核酸は、配列表の配列番号１４に示す塩基配列又はその相補鎖の領域と同一の塩基配列を有し、いずれか一方の核酸は、ヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン４中の点突然変異ｍ２が生じる部位を含む領域とハイブリダイズするものであり、ハイブリダイズした状態において各核酸の互いに近接する末端領域に、共働してＦＲＥＴ効果を生じる蛍光色素がそれぞれ結合されている、ヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン４中の点突然変異ｍ２検出用の一組のプローブを提供する。さらに、本発明は、上記本発明のｍ１検出用フォワードプライマーと、該フォワードプライマーと共働して、ヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン５中の点突然変異ｍ１を含む増幅産物を生成するリバースプライマーとを用いて核酸増幅法により被検核酸を増幅することを含む、ヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン５中の点突然変異ｍ１の検出方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明のｍ２検出用フォワードプライマーと、上記本発明のリバースプライマーとを用いて核酸増幅法により被検核酸を増幅することを含む、ヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン４中の点突然変異ｍ２の検出方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明のｍ１検出用フォワードプライマーと、該フォワードプライマーと共働して、上記本発明のｍ１検出用の一組のプローブがハイブリダイズする増幅産物を生成するリバースプライマーと、上記本発明のｍ２検出用フォワードプライマーと、上記本発明のリバースプライマーと、上記本発明のｍ１検出用の一組のプローブと、上記本発明のｍ２検出用の一組のプローブとの存在下において、被検核酸を増幅するとともに得られたそれぞれの増幅産物に前記それぞれの一組のプローブをハイブリダイズさせ、その融解温度を測定することを含む、ヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン５中の点突然変異ｍ１及び該遺伝子のエクソン４中の点突然変異ｍ２を同時に検出する方法を提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の、ｍ１検出用のフォワードプライマーは、配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、又は該核酸の１０％以下の塩基が置換した核酸、好ましくは、配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、さらに好ましくは、配列表の配列番号２に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、さらに好ましくは、配列表の配列番号３に示す塩基配列を有する２３ｍｅｒの核酸（以下、「フォワードプライマー１」ということがある）から成る。なお、上記した置換は、できるだけ少ない方が好ましく、置換がないことが最も好ましく、置換がある場合でも１塩基、とりわけ、５’末端又はその近傍に置換があることが比較的好ましい。このことは、置換を許容している後述のｍ２検出用のフォワードプライマー及びリバースプライマーにもあてはまる。ｍ１検出用のフォワードプライマーのサイズは、１５塩基以上４３塩基以下（配列番号１は４３塩基）であるが、１８塩基〜３０塩基程度が好ましい。なお、図１に、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子中の、イントロン４とエクソン５の境界近傍の塩基配列並びにフォワードプライマー１及び後述する他のプライマー並びにプローブがハイブリダイズする領域を示す（図１に示される塩基配列は配列番号１８に示す）。
【００１２】
本発明の、ｍ２検出用のフォワードプライマーは、配列表の配列番号４に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、又は該核酸の１０％以下の塩基が置換した核酸、好ましくは、配列表の配列番号４に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、さらに好ましくは、配列表の配列番号５に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、さらに好ましくは、配列表の配列番号６に示す塩基配列を有する１８ｍｅｒの核酸（以下、「フォワードプライマー２」ということがある）から成る。ｍ２検出用のフォワードプライマーのサイズは、１５塩基以上３８塩基以下（配列番号４は３８塩基）であるが、１８塩基〜３０塩基程度が好ましい。なお、図２に、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子中の、エクソン４とイントロン４の境界近傍の塩基配列並びにフォワードプライマー２及び後述する他のプライマー並びにプローブがハイブリダイズする領域を示す（図２に示される塩基配列は配列番号１９に示す）。
【００１３】
本発明の、ｍ２検出用のリバースプライマーは、配列表の配列番号７に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、又は該核酸の１０％以下の塩基が置換した核酸、好ましくは、配列表の配列番号７に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、さらに好ましくは、配列表の配列番号８に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、さらに好ましくは、配列表の配列番号９に示す塩基配列を有する２２ｍｅｒの核酸（以下、「リバースプライマー２」ということがある）から成る。ｍ２検出用のリバースプライマーのサイズは、１５塩基以上４２塩基以下（配列番号７は４２塩基）であるが、１８塩基〜３０塩基程度が好ましい。
【００１４】
上記したｍ１又はｍ２検出用フォワードプライマー並びにｍ２検出用リバースプライマーは、核酸増幅法におけるプライマーとして用いられるものである。核酸増幅法自体はこの分野において周知であり、代表的なものとしてＰＣＲ法を挙げることができる。ＰＣＲ法自体は周知であり、そのためのキット及び装置も市販されているので、容易に実施することができる。なお、本発明のプライマーは、キャピラリーチューブ（内径が通常０．５ｍｍ〜１ｍｍ程度、内容積が通常１０〜２０μｌ程度の毛管）内でＰＣＲを行う、迅速なＰＣＲ法に用いる場合に最も威力を発揮するが、核酸増幅法による増幅効率が極めて高いプライマーであるので、必ずしも、キャピラリーチューブ内で行うＰＣＲに限定されるものではなく、通常のＰＣＲにも適用できる。また、核酸増幅法は、ＰＣＲ法に限定されるものではなく、他の核酸増幅法に用いることも可能である。
【００１５】
核酸増幅法は、また、増幅産物をリアルタイムで測定する、リアルタイム核酸増幅法によっても行うことができる。リアルタイム核酸増幅法の代表例はリアルタイム検出ＰＣＲ法であり、被検ｍＲＮＡのｃＤＮＡを鋳型として、周知の方法により行うことができる。リアルタイム検出ＰＣＲ法には、インターカレーション法、ＴａｑＭａｎ（商品名）プローブ法、Ｓｕｎｒｉｓｅユニプライマー（商品名）（モレキュラービーコン法）及びハイブリダイゼーションプローブ法等があるが、上記本発明のプライマーは、これらのいずれにも用いることができ、好ましくは、ハイブリダイゼーションプローブ法に用いることができる。これらのリアルタイム検出ＰＣＲ法自体は、周知であり、そのためのキット及び装置も市販されているので容易に行うことができる。ＰＣＲ反応は、マイクロチューブ内で行ってもよいが、より容積の小さいキャピラリーチューブ内で行うと、反応液の温度変更をより迅速、的確に行うことができ好ましい。キャピラリーチューブ及びこれを用いてリアルタイム検出ＰＣＲを行うための装置は、ライトサイクラーの商品名でＲｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社から市販されている。
【００１６】
本発明は、さらに、上記本発明のプライマーを用いて増幅された増幅産物の測定に有用なプローブをも提供する。本発明のｍ１検出用の一組のプローブは、配列表の配列番号１０に示す塩基配列又はその相補鎖に、１〜５塩基の間隔を空けてハイブリダイズする、それぞれ１５塩基以上の一組の核酸であって、各核酸は、配列表の配列番号１０に示す塩基配列又はその相補鎖の領域と同一の塩基配列を有し、いずれか一方の核酸は、ヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン５中の点突然変異ｍ１が生じる部位を含む領域とハイブリダイズするものであり、ハイブリダイズした状態において各核酸の互いに近接する末端領域に、共働してＦＲＥＴ効果を生じる蛍光色素がそれぞれ結合されているものであり、好ましくは、配列表の配列番号１１（配列番号１１に示す塩基配列は、配列番号１０に示す塩基配列の一部である）に示す塩基配列又はその相補鎖にハイブリダイズする一組のプローブであり、さらに好ましくは、１つのプローブの核酸が、配列表の配列番号１２に示す塩基配列を有する２０ｍｅｒの核酸（以下、「プローブ１」ということがある）であり、他のプローブの核酸が、配列表の配列番号１３に示す塩基配列を有する３３ｍｅｒの核酸（以下、「プローブ２」というこがある）一組のプローブである。ここで、ＦＲＥＴは、蛍光共鳴エネルギー転移（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）であり、ＦＲＥＴ効果を生じる蛍光色素の組み合わせは周知であり、市販もされている。ドナー蛍光色素の例として、フルオレッセイン、アクセプター蛍光色素の例として、ＬＣ　Ｒｅｄ６４０、ＬＣ　Ｒｅｄ７０５等を挙げることができる。これらの蛍光色素は、ハイブリダイゼーションプローブ法のための市販のキットに含まれている。各蛍光色素は、増幅産物とハイブリダイズした状態において、各核酸の互いに近接する末端領域、好ましくは末端のヌクレオチドに結合される。例えば、プローブがアンチセンス鎖とハイブリダイズする場合、上流の領域（センス鎖を基準として）にハイブリダイズするプローブの３’末端にドナー色素（又はアクセプター色素）を結合し、下流の領域にハイブリダイズするプローブの５’末端にアクセプター色素（又はドナー色素）を結合する。このようにすることにより、一組のプローブが増幅産物にハイブリダイズした状態では、ドナー色素とアクセプター色素とが近接して存在するので、これらが共働してＦＲＥＴ効果が起きるので、プローブ、ひいては増幅産物の測定が可能になる。各プローブのサイズは１５塩基以上であるが、１８塩基〜３５塩基程度が好ましい。本発明の一組のプローブは、特に、ハイブリダイゼーションプローブ法によるリアルタイム検出ＰＣＲ法に好ましく用いられるが、リアルタイム検出ではない核酸増幅法による増幅産物の測定に用いることもできる。
【００１７】
本発明のｍ２検出用の一組のプローブは、配列表の配列番号１４に示す塩基配列又はその相補鎖に、１〜５塩基の間隔を空けてハイブリダイズする、それぞれ１５塩基以上の一組の核酸であって、各核酸は、配列表の配列番号１４に示す塩基配列又はその相補鎖の領域と同一の塩基配列を有し、いずれか一方の核酸は、ヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン４中の点突然変異ｍ２が生じる部位を含む領域とハイブリダイズするものであり、ハイブリダイズした状態において各核酸の互いに近接する末端領域に、共働してＦＲＥＴ効果を生じる蛍光色素がそれぞれ結合されているものであり、好ましくは、配列表の配列番号１５（配列番号１５に示す塩基配列は配列番号１４に示す塩基配列の一部である）に示す塩基配列又はその相補鎖にハイブリダイズする一組のプローブであり、さらに好ましくは、１つのプローブの核酸が、配列表の配列番号１６に示す塩基配列を有する１９ｍｅｒの核酸（以下、「プローブ３」ということがある）であり、他のプローブの核酸が、配列表の配列番号１７に示す塩基配列を有する３１ｍｅｒの核酸（以下、「プローブ４」というこがある）一組のプローブである。他の説明については、上記したｍ１検出用の一組のプローブと同様である。
【００１８】
本発明のｍ１の検出方法は、上記本発明のｍ１検出用フォワードプライマーと、該フォワードプライマーと共働して、ｍ１を含む増幅産物を生成するｍ１検出用リバースプライマーとを用いて核酸増幅法により被検核酸を増幅することを含む。ｍ１検出用リバースプライマーとしては、公知のものを用いることができ、例えば、配列番号２０に示す２２ｍｅｒの核酸から成るリバースプライマー（以下、「リバースプライマー１」と言うことがある）を用いることができる。増幅産物は、公知のＲＦＬＰ法に付して突然変異の有無を調べたり、ダイレクトシークエンスによることも可能であるが、上記した本発明のｍ１検出用の一組のプローブとハイブリダイズさせ、得られたハイブリッドの融解温度を測定する方法が簡便で好ましい。上記した本発明のｍ１検出用の一組のプローブのうちの一方のプローブは、ｍ１の部位を含む、野生型の遺伝子の領域と同一の塩基配列を有しているので、野生型の遺伝子とのハイブリッドの融解温度は、該プローブとのミスマッチを含む、変異型の遺伝子とのハイブリッドの融解温度よりも高くなる。従って、この融解温度を測定することにより点突然変異の検出を行うことができる。しかも、遺伝子が、野生型と変異型のヘテロ接合になっている場合には、２つの融解温度が測定されるので、ヘテロ接合かホモ接合かの区別もできる。従って、この方法によれば、ジェノタイプをも調べることができる。なお、融解温度の測定は、温度を徐々に上げながら蛍光を測定することにより行うことができる。一組のプローブのうち、少なくともいずれか一方のプローブが、増幅産物から離れるとＦＲＥＴが起きなくなるので、蛍光が出なくなる。温度を横軸に取り、蛍光を縦軸に取って得られる曲線の傾きを測定し、温度を横軸に取り、該傾きを縦軸に取ってプロットするとピークが描かれる。そのピークの温度が融解温度である。ヘテロ接合の場合には、このピークが２つ描かれる。なお、ＦＲＥＴ効果を発揮する一組のプローブを用いて、増幅産物とのハイブリッドの融解温度を測定することにより点突然変異を検出する手法自体は周知であり、上記したライトサイクラー（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）のような市販のキット及び装置を用いて容易に行うことができる。
【００１９】
本発明のｍ２の検出方法は、上記本発明のｍ２検出用フォワードプライマーと、上記本発明のｍ２検出用リバースプライマーとを用いて核酸増幅法により被検核酸を増幅することを含む。増幅産物は、公知のＲＦＬＰ法に付して突然変異の有無を調べたり、ダイレクトシークエンスによることも可能であるが、上記した本発明のｍ２検出用の一組のプローブとハイブリダイズさせ、得られたハイブリッドの融解温度を測定する方法が簡便で好ましい。他の説明は、上記したｍ１の検出方法と同様である。
【００２０】
本発明の好ましい方法では、上記本発明のｍ１検出用フォワードプライマー、ｍ１検出用リバースプライマー、上記本発明のｍ２検出用フォワードプライマー、上記本発明のｍ２検出用リバースプライマー、上記本発明のｍ１検出用の一組のプローブ及び上記本発明のｍ２検出用の一組のプローブの存在下において被検核酸を増幅するとともに得られたそれぞれの増幅産物に前記それぞれの一組のプローブをハイブリダイズさせ、その融解温度を測定する。この方法によれば、１つの操作で、ｍ１及びｍ２の検出を行うことができる。なお、この場合、ｍ１検出用プローブとｍ２検出用プローブのアクセプター色素として、識別可能な異なる色素を用いれば、ｍ１及びｍ２を区別して検出することができる。単一の操作で、ｍ１及びｍ２の両者の検出が可能なようにプライマー及びプローブを設定するのは容易なことではなく、本発明の１つの顕著な効果である。
【００２１】
なお、本発明の方法は、用いるプライマー又は用いるプライマーとプローブに特徴があり、核酸増幅法自体は、市販のキット及び装置を用いて周知の方法により行うことができる。とりわけ、キャピラリーチューブ内でＰＣＲを行う方法が、迅速で好ましい。この方法は、上記のように、ライトサイクラー（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）のような市販のキット及び装置を用いて容易に行うことができる。また、チトクロム遺伝子は、種々の細胞に普遍的に存在するので、被検試料は、ヒトの任意の組織由来のＤＮＡであってよい。
【００２２】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２３】
実施例１、比較例１〜４
（１）　概要
上記したフォワードプライマー１（配列番号３）、リバースプライマー１（配列番号２０）、フォワードプライマー２（配列番号６）、リバースプライマー２（配列番号９）をプライマーとして用い、さらに上記したプローブ１（配列番号１２、３’末端にドナー色素であるフルオレッセインを結合）、プローブ２（配列番号１３、５’末端にアクセプター色素であるＬＣ　Ｒｅｄ７０５を結合、３’末端はリン酸化）プローブ３（配列番号１６、３’末端にドナー色素であるフルオレッセインを結合）、プローブ４（配列番号１７、５’末端にアクセプター色素であるＬＣ　Ｒｅｄ６４０を結合、３’末端はリン酸化）をハイブリダイゼーションプローブとして用いた、ハイブリダイゼーションプローブ法によるリアルタイム検出ＰＣＲを行い、さらにプローブと増幅産物とのハイブリッドの融解温度測定した（実施例１）。被検試料は、ｍ１及びｍ２を含む、ヘテロ接合体であることがわかっているヒトＤＮＡであった。一方、比較のため、市販のコンピューターソフトを駆使し、該コンピューターソフトが推奨する適切なプライマー及びプローブを用いたことを除き、実施例１と全く同様にして測定を行った（比較例１〜４）。比較例で用いたｍ１検出用フォワードプライマー（以下、「フォワードプライマー１’」）、ｍ２検出用フォワードプライマー（以下、「フォワードプライマー２’」）及びｍ２検出用リバースプライマー（以下、「リバースプライマー２’」）の塩基配列を、配列番号２１、２２及び２３にそれぞれ示す。比較例１〜４では、これらのプライマーを、実施例１で用いたプライマー及びプローブと組み合わせて用いた。各例で用いたプライマー及びプローブの組み合わせを下記表１に示す。
【００２４】
【表１】
表１
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【００２５】
（２）　具体的な方法
（ｉ）　被検ＤＮＡの調製
ヒトの血液及び組織から、常法により全ＤＮＡを抽出し、被検ＤＮＡとして用いた。
（ｉｉ）　ライトサイクラー（商品名）を用いたハイブリダイゼーションプローブ法によるリアルタイム検出ＰＣＲ
下記表２に示す組成を有するＰＣＲマスター混合物を調製した。
【００２６】
【表２】
表２
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【００２７】
ライトサイクラー（商品名）に付属するキャピラリーに、上記ＰＣＲマスター混合物１５μｌを入れ、（ｉ）で得られたｃＤＮＡ溶液又はネガティブコントロールとして水５μｌを加えた。キャピラリーチューブに栓をし、ライトサイクラー（商品名）装置にセットして、９５℃、１０秒間の変性工程後、９５℃、１０秒間の変性工程、６０℃、１０秒間のアニーリング工程、及び６５℃、１５秒間の伸長工程から成るサイクルを繰り返した。増幅反応中、蛍光をリアルタイムで測定し、ＣＰ値を測定した。なお、ＣＰ値は、横軸にサイクル数、縦軸に蛍光強度をプロットした場合に、蛍光強度が急激に立ち上がるサイクル数を意味し、被検核酸の量が同一である場合には、これが小さいほど増幅効率が高い。
【００２８】
増幅後、反応液の温度を４０℃まで冷却し、次いで、蛍光を測定しながら、０．２℃／秒の速度で昇温した。商品に添付のコンピューターソフトを用いて、温度を横軸、蛍光強度を縦軸にした曲線を描き、同ソフトを用いて各温度における該曲線の傾きを求め、各温度と該傾きとの関係を描く曲線のピークから、プローブと増幅産物とのハイブリッドの融解温度を測定した。
【００２９】
（３）　結果
結果を下記表３に示す。
【００３０】
【表３】
表３
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【００３１】
表３から明らかなように、コンピューターソフトが推奨するｍ１検出用フォワードプライマー、ｍ２検出用フォワードプライマー及びｍ２検出用リバースプライマーを１つでも用いたものは、ｍ１を含むエクソン５領域又はｍ２を含むエクソン４領域の増幅が認められず、点突然変異の検出もできなかった。これに対し、本発明のｍ１検出用フォワードプライマー、ｍ２検出用フォワードプライマー及びｍ２検出用リバースプライマーを用いた実施例１では、野生型と変異型のヘテロ接合であることが明確に検出された。
【００３２】
【発明の効果】
本発明のプライマーは、増幅効率が極めて高いので、キャピラリーチューブ内でＰＣＲを行う場合でも、被検核酸を増幅することができる。よって、本発明により、迅速にｍ１及びｍ２の検出を行うことが可能になった。
【００３３】
【配列表】
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【００３４】
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【００３５】
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【００３６】
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【００３７】
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【００３８】
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【００３９】
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【００４０】
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【００４１】
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【００４２】
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【００４３】
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【００４４】
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【００４５】
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【００４６】
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【００４７】
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【００４８】
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【００４９】
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【００５０】
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【００５１】
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【００５２】
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【００５３】
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【００５４】
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【００５５】
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【００５６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子中の、イントロン４とエクソン５の境界近傍の塩基配列並びに塩基配列並びに実施例及び比較例で用いたプライマー及びプローブがハイブリダイズする位置を示す図である。
【図２】ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子中の、エクソン４とイントロン４の境界近傍の塩基配列並びに塩基配列並びに実施例及び比較例で用いたプライマー及びプローブがハイブリダイズする位置を示す図である。
【図１】
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【図２】
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