(57)【要約】【課題】安価で小型の簡易型培養装置を提供する。【解決手段】培養容器４０に、培養液を循環させて撹拌する撹拌装置１０、酸素を供給する酸素循環装置３０、及びパネルヒーター２０を備えた簡易型培養装置１。撹拌装置１０は、吸引口１４から培養液を吸い込み、吐出口１５から放出させて、培養液を循環させる。酸素循環装置３０は、酸素を循環させて供給すると共に、培養容器４０から取り出した炭酸ガスを含む酸素から、炭酸ガスを除いて、再度、培養容器４０に供給する。また、酸素循環装置３０は、培養容器４０の内圧を調節するガス排気部を備える。パネルヒーター２０は、センサー２４が、培養容器４０に収容された培養液の温度を感知し、液温コントローラー２８をオン・オフする。また、プレ温度コントローラー２２及びプレ温度センサー２６が、培養容器４０の内壁面の温度を制御する。培養容器４０はプラスチックで製造できる。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養容器に収容された培養液を吸い込む吸引口と、
前記吸い込まれた培養液を放出する吐出口と、
前記吸引口と前記吐出口を駆動するモーターとを具備し、
培養液を、前記吸引口と前記吐出口を通して循環させて撹拌する、培養装置に取り付けるための撹拌装置。
【請求項２】
酸素供給源と、
前記酸素供給源から供給される酸素を、培養容器に循環させるポンプと、
前記培養容器から取り出される炭酸ガスを含んだ酸素から、炭酸ガスを除く炭酸ガス除去装置とを具備し、
前記炭酸ガス除去装置により炭酸ガスが除かれた酸素が、再度、前記培養容器に供給される、培養装置に取り付けるための酸素循環装置。
【請求項３】
さらに、前記炭酸ガスを含んだ酸素を一部排気して、前記培養容器の内圧を調節する、ガス排気部を具備する請求項２に記載の酸素循環装置。
【請求項４】
培養容器の周囲の少なくとも一部に付着して、前記培養容器を加熱するヒーター本体と、
前記ヒーター本体の加熱をオン・オフする液温コントローラーと、
前記培養容器に収容された培養液の温度を感知し、前記液温コントローラーをオン・オフするセンサーと、
前記培養容器内壁面の温度を制御するプレ温度コントローラー及びプレ温度センサーとを具備する、培養装置に取り付けるためのパネルヒーター。
【請求項５】
請求項１に記載の撹拌装置、請求項２又は３に記載の酸素循環装置、及び請求項４に記載のパネルヒーターを、少なくとも１つ具備する簡易型培養装置。
【請求項６】
前記撹拌装置、前記酸素循環装置、及び前記パネルヒーターを、全て具備する請求項５に記載の簡易型培養装置。
【請求項７】
プラスチック製である請求項６に記載の簡易型培養装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子工学等に用いる、大腸菌等の培養に適した簡易型培養装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、大腸菌等の菌体を培養する際には、エアレーションにより酸素が供給されていた。このエアレーションでは、３Ｌ／ｍｉｎ程度の割合で空気が送り込まれ、同時に、培養液中の溶存酸素濃度を高めるため、撹拌翼による撹拌が行われていた。しかし、このような撹拌方法では、撹拌翼の回転に伴って、培養容器内に多量の泡が発生するという問題があった。また、エアレーションに用いる空気は安価ではあるが、培養液中の溶存酸素濃度を十分確保するためには、上記のように多量の空気を送り込む必要があるので、この点も泡の発生に大きな影響を与えていた。従って、撹拌翼を用いる場合には、このような多量の泡の発生を考慮して、その容積を培養液の容積よりも大きくせざるを得なかった。例えば、培養液を１５〜１８Ｌ用いる場合には、培養容器の容積を６０〜８０Ｌにする必要があった。
また、撹拌翼を用いる場合には、これを駆動させるための強力なモーターが必要とされた。
さらに、従来の大型の培養容器は、オートクレーブに入れて滅菌できないため、滅菌のために肉厚耐圧性のステンレス製にする必要があった。このようなステンレス製容器は非常に高価であった。
このように、従来の培養装置では、培養容器内の泡の発生による、容器の大型化と、これに伴う費用の高騰化が避けられない状況にあった。
一方、培養容器内に発生した泡を消すために、界面活性剤等の消泡剤を使用する方法も行われているが、その場合、培養後の培養液の精製がし難くなるという問題があった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、安価で小型の簡易型培養装置を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明の第一の態様によれば、培養容器に収容された培養液を吸い込む吸引口と、吸い込まれた培養液を放出する吐出口と、吸引口と吐出口を駆動するモーターとを具備し、培養液を吸引口と吐出口を通して循環させて撹拌する、培養装置に取り付けるための撹拌装置が提供される。
【０００５】
本発明の第二の態様によれば、酸素供給源と、酸素供給源から供給される酸素を培養容器に循環させるポンプと、培養容器から取り出される炭酸ガスを含んだ酸素から、炭酸ガスを除く炭酸ガス除去装置とを具備し、炭酸ガス除去装置により炭酸ガスが除かれた酸素が、再度、培養容器に供給される、培養装置に取り付けるための酸素循環装置が提供される。
尚、本発明において、循環させる「酸素」は、酸素を高濃度に含む気体も意味する。
【０００６】
本発明の第三の態様によれば、培養容器の周囲の少なくとも一部に付着して、培養容器を加熱するヒーター本体と、ヒーター本体の加熱をオン・オフする液温コントローラーと、培養容器に収容された培養液の温度を感知し、液温コントローラーをオン・オフするセンサーと、培養容器内壁面の温度を制御するプレ温度コントローラー及びプレ温度センサーとを具備する、培養装置に取り付けるためのパネルヒーターが提供される。
【０００７】
本発明の第四の態様によれば、培養容器に、上記の撹拌装置、酸素循環装置及びパネルヒーターを、少なくとも１つ具備する簡易型培養装置が提供される。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明を説明する。
図１は、本発明の簡易型培養装置の一実施形態を示す図である。
この簡易型培養装置１は、培養液を収容する培養容器４０、培養液を撹拌する撹拌装置１０、培養液を加温するパネルヒーター２０、培養容器４０に酸素を供給する酸素循環装置３０を備えている。
【０００９】
撹拌装置１０は、撹拌翼を用いないで、培養容器４０内で培養液を循環させることにより、培養液を撹拌する。即ち、モーター１１により、培養液を吸引口１４から吸い込み、吐出口１５から放出することにより、循環させて撹拌する。このような循環型撹拌装置を用いれば、撹拌翼により撹拌するより、泡の発生量を低減させることができる。これにより、泡の発生を考慮して、培養容器の容積を大きく見積もる必要がなくなるので、培養装置全体を小型化することができる。
【００１０】
撹拌装置を駆動させるモーターとして、撹拌翼の駆動に用いるような強力なモーターは必要とせず、弱モーターを用いることができる。例えば、本発明では、ＡＣ１００Ｖ、１５Ｗ程度の電力で駆動が可能なモーターを用いることができる。
また、培養容器内の総液量を２分以内で循環させることが可能な汲み上げ能力を有するモーターを用いることが好ましい。
【００１１】
従来、大腸菌の培養装置では、温度調節するために、高価で複雑なコンピュータ制御によるヒーターシステムを使用していた。即ち、培養には、培養液の温度を、特定温度±α℃に精密に制御することが必要と考えられていた。しかし、本発明者らは、培養液にこのような正確な温度調節は不要であり、より幅のある温度範囲でも十分菌を培養できることを見い出した。例えば、従来は、３７℃±約０．２℃に制御していたが、３７℃＋約０．５℃、３７℃−約２℃程度の温度調節で培養は可能である。好ましくは、３７℃＋約０．１℃、３７℃−約１．０℃、より好ましくは３７℃＋約０．１℃、３７℃−約０．５℃程度である。温度制御において、上限の温度を、下限の温度より、より正確にコントロールすることが好ましい。
従って、この簡易型培養装置１では、従来使用していたヒーターシステムより極めて簡易なパネルヒーター２０を用いている。パネルヒーター２０では、ヒーター本体２１により培養容器４０を外部から加熱する。センサー２４は、培養容器４０に収容された培養液の温度を感知し、液温コントローラー２８をオン・オフする。また、プレ温度コントローラー２２及びプレ温度センサー２６は、培養容器４０の内壁面の温度を制御する。
【００１２】
また、この培養装置では、酸素循環装置３０を用いる。従来は、培養液中の溶存酸素必要量を維持するために、培養槽に空気を供給していたため、大量の空気を供給する必要があった。そのため、泡が発生する原因となっていた。しかし、この培養装置では、酸素を供給するため、空気に比べて、供給容量を大幅に減らすことができ、その結果、泡の発生を減らすことができる。ただし、酸素は高価であるため、この酸素循環装置３０では、炭酸ガスを除いて、酸素を循環させて再使用している。
【００１３】
培養容器の大きさは特に制限されず、適宜調整することができる。ただし、この実施形態では、上述したような撹拌装置及び酸素循環装置を用いることにより、泡の発生が大幅に低減されるので、従来よりも、小型の培養容器を用いることができる。例えば、１５〜１８Ｌの培養液を用いる場合、収容容積２０Ｌの培養容器を用いることができる。
このような小型の容器であれば、既存のオートクレーブに入れて滅菌することが可能となる。従って、高価なステンレスで製造する必要が無くなり、プラスチック製にすることが可能となる。好ましくは、培養容器内の様子を外部から観察できるように、透明性を有するプラスチックを用いる。
従来の大型でステンレス製の培養装置は、数千万円もするような高価なものであるが、本実施形態の培養装置は、数十万円で製造することも可能である。
【００１４】
尚、この実施形態では、撹拌装置、パネルヒーター、酸素循環装置を備えているが、少なくとも、これらいずれか１つを備えていれば、それぞれ所定の効果が得られる。例えば、いずれか１つを備えるように、従来の培養装置を改良することもできる。
【００１５】
次に、各装置についてさらに説明する。
撹拌装置１０の詳細を図２に示す。この図において、１１はモーター、１２は回転軸、１３は回転部、１４は吸引口、１５は吐出口、１６は回転羽、１７はグリスシール、１８はシールをそれぞれ示す。
この撹拌装置１０では、モーター１１に回転軸１２が連結しており、さらに、回転軸１２の先端に、複数の回転羽１６からなる回転部１３が取り付けられている。この回転部１３を撹拌装置１０の下方から見た模式図を図３に示す。この図に示すように、回転部１３は、彎曲した６枚の回転羽１６から構成されている。ただし、本発明では、回転羽１６の形状や枚数は特に制限されず、撹拌装置１０の大きさや使用条件等に応じて適宜調整することができる。
【００１６】
また、この撹拌装置１０の上部には、培養容器内の気体を外部に出さないため、グリスシール１７が設けられている。グリスとしては、例えば、シリコングリスを用いることができる。グリスは、充填口（図示せず）から充填することができる。
さらに、この撹拌装置１０の下部には、回転軸受け、回転の安定性のため、シール１８が設けられている。このようなシールとしては、例えば、テフロン（登録商標）シールを用いることができる。
【００１７】
次に、この撹拌装置１０の動作について説明する。
まず、モーター１１が駆動することにより、回転軸１２が回転し、これに伴って、回転軸１２の先端に取り付けられた回転部１３が回転する。回転部１３が回転すると、培養液の液面よりも下部に位置する吸引口１４から培養液が汲み上げられる。汲み上げられた培養液は、撹拌装置１０の内部を通過して、吐出口１５から外に放出される。モーター１１が駆動している間は、回転軸１２及び回転部１３は回転し続ける。吸引口１４からの培養液の汲み上げと、吐出口１５からの培養液の放出とにより、培養容器内で培養液が循環する。その結果、培養容器内では、培養液の対流が発生し、培養液は培養容器内で穏やかに撹拌される。
【００１８】
吸引口１４は、培養液全体が十分に撹拌されるように、好ましくは、培養容器の中央底部に位置させる。尚、本発明では、吸引口１４の位置を、図２中のＡの部分の長さを伸縮させることによって調整することが可能である。
【００１９】
吐出口１５は、培養液の液面よりも上部又は下部のいずれに位置させてもよいが、好ましくは、液面よりも上部に位置させる。吐出口１５を液面よりも上部に位置させると、吐出口１５から放出された培養液が液面に落下することにより、培養液中の溶存酸素濃度を上昇させることができる。尚、本発明では、吐出口１５の位置を、吸引口１４の長さを上記のように調節したり、また、図２中のＢの部分の長さを伸縮させることによって調整することが可能である。
【００２０】
パネルヒーター２０の詳細を図４に示す。この図において、２１はヒーター本体、２２はプレ温度コントローラー、２４はセンサー、２６はプレ温度センサー、２８は液温コントローラーをそれぞれ示す。この図では、プレ温度コントローラー２２及びプレ温度センサー２６が、ヒーター本体２１に直接取り付けられている。プレ温度コントローラー２２は、プレ温度センサー２６と接続している。また、プレ温度コントローラー２２及びセンサー２４は、液温コントローラー２８と接続している。
【００２１】
このパネルヒーター２０は、液温コントローラー２８がオンになると、プレ温度コントローラー２２で設定された温度になるまで加温を続ける。このとき、設定温度は、特定の範囲をもって設定される。上限温度を厳しく、下限温度を緩く制御するためには、プレ温度コントローラー２２を上限温度付近に設定し、培養容器内壁面温度が上限温度にならないようにする。培養容器内の温度が設定温度の上限直前に到達すると、培養容器内のセンサー２４がこれを感知し、液温コントローラー２８がオフになる。液温コントローラー２８がオフになると、培養容器内の温度が低下し、その温度が設定温度の下限を下回ると、センサー２４がこれを感知し、再び液温コントローラー２８がオンになり、パネルヒーター２０は加温を開始する。このとき、プレ温度センサー２６は、培養容器の壁面が上限温度を超えない範囲でパネルヒーター２０の温度を制御する。これら一連の動作が繰り返されることにより、培養容器内は一定の範囲の温度に保たれる。
このように、本発明では、プレ温度コントローラー２２及びプレ温度センサー２６で、培養容器４０の内壁面の温度が上限温度を超えないように制御し、また、センサー２４及び液温コントローラー２８で、上限温度以下で、例えば、設定温度±０．５℃の温度コントロールを行う。
例えば、大腸菌の培養において、上限温度を３７℃、下限温度を３６．０℃と設定したい場合には、プレ温度コントローラー２２を３７℃＋１〜５℃にする（培養容器の内壁面は、熱伝導率の関係で物理的に３７℃に達しない。）。また、液温コントローラー２８を３６．５℃にする。このように設定すると、±０．５℃の精度で、３７℃を超えない範囲で温度制御ができる。
同様に、酵母の培養において、上限温度を３０℃、下限温度を２９．０℃と設定したい場合には、プレ温度コントローラー２２を３０℃＋１〜５℃、液温コントローラー２８を２９．５℃に設定すると、±０．５℃の精度で、３０℃を超えない範囲で温度制御ができる。
【００２２】
酸素循環装置３０の詳細を図５に示す。図５は、本発明の簡易型培養装置１を２つ接続している状態を示す。
この図において、３１はローラーポンプ、３２は炭酸ガス除去装置、３３はガス排気部、３４は酸素ボンベ（酸素供給源）、３５はエアーポンプ、３６は流量計、３７は酸素等の逆流を防ぐための逆流防止弁、３８はバルブをそれぞれ示す。尚、明細書において、同一の部材については同じ参照番号を付してその説明は省略する。
【００２３】
まず、酸素ボンベ３４のバルブ３８を開くことにより、酸素が流路に流れる。また、エアーが必要な場合は、エアーポンプ３５を作動させることにより、エアーが流路に流れる。即ち、バルブ３８のみを開き、エアーポンプ３５を作動させなければ、流路には酸素のみが流れ、バルブ３８を閉じ、エアーポンプ３５のみを作動させれば、流路にはエアーのみが流れる。尚、本発明では、バルブ３８を開き、かつ、エアーポンプ３５を作動させることにより、酸素とエアーとを、混合して使用することができる。酸素の流量は、流量計３６で調整される。このとき、左の流路計が、左側の装置に供給される酸素の流量を調整し、右の流路計が右側の装置に供給される酸素の流量を調整する。流量が調整された酸素は、流路を通って、培養容器４０内に供給され培養液中に溶け込む。
同時に、培養容器４０内では、菌体から発生した炭酸ガスを含む排出ガスを除去するため、ローラーポンプ３１によって、培養容器４０内の気体の吸引が行われる。吸引した気体は、炭酸ガス除去装置３２を通過することにより、気体中の炭酸ガスが除去される。この気体が、ポンプ３１によって、再び培養容器４０内に供給される。本実施形態の酸素循環装置３０では、このような閉鎖循環系で、酸素の再利用が行われる。
培養容器４０の内圧が一定の基準を超えた場合には、吸引した気体の一部を、余剰ガスとして、ガス排気部３３を通して系外に排気する。即ち、余剰ガスを次亜塩素酸等で滅菌し、さらに水中を通し、最終的にヘパフィルター（滅菌フィルター）を経由して排気する。ヘパフィルターは、０．２２μｍ程度のものを用いることができる。組み替え体培養時は、閉鎖系での培養が必要となるため、このようなヘパフィルターを経由しての培養は特に重要である。
尚、エアレーションを大量にすると、ヘパフィルターも大きなものが必要となるが、その場合、発泡に伴ってフィルターに水が入り、その結果、フィルターが詰まって、フィルター機能が発揮できなくなることがある。そのような場合は、例えば、大型ジャーファーメンターの排気側に、ヒーターチャンバーを置いて水分を抜けばよい。
また、本発明では、エアー、酸素等の培養容器への入力ラインや、炭酸ガス吸収装置の培養容器への入力ラインもヘパフィルターを経由することが好ましい。
【００２４】
本発明の酸素循環装置では、このように装置全体を閉鎖循環系にして酸素を再利用することにより、空気を用いたエアレーションに比べて、酸素の供給量を１０分の１〜５０分の１程度まで減少させることができる。これにより、泡の発生による培養物の飛散消失量を激減することができる。その結果、培養容器の容積の８０〜９０％を使って培養することが可能となる。
尚、ガスの循環量は、炭酸ガスの除去量に応じて適宜調整することができる。また、除去された炭酸ガス量は、酸素又は空気を供給することによって補完することができる。
【００２５】
尚、図５では、２つの培養装置が接続しているが、接続する培養装置の数は特に制限されない。
【００２６】
また、本発明の簡易型培養装置を用いて培養した菌体（例えば、大腸菌や酵母等）は、培養液を、濃縮、バッファー交換その等の工程を経ることにより精製することができる。本発明では、好ましくは、培養液の濃縮やバッファー交換を行うに際して、ＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）濾過膜を有する装置を用いる。これらＴＦＦ濾過膜を備えた濃縮装置や交換装置の詳細については、特開２００２−２６２８５５号公報に記載されている。
【００２７】
【実施例】
実施例１
図１に示す簡易型培養装置１を用いて、大腸菌の培養を行った。尚、本実施例では、図１のエアーポンプ３５からエアーのみを供給し、酸素ボンベ３４からの酸素の供給は行わなかった。
培養条件は、以下の通りである。
培地：バクトトリプトン  １０ｇ
イーストエクストラクト  ５ｇ
ＮａＣｌ  １０ｇ
上記各成分を混合し、ＮａＯＨにて、ｐＨ７．０に調整した。
培養時間：２０ｈｒ
培養温度：３７℃
培養規模：１０Ｌ
菌体収量：２９．７ｇ
酸素循環装置：２００ｍｌ／ｍｉｎ（エアー循環量）
【００２８】
尚、本実施例では、培養時の上限温度を３７℃、下限温度を３６．０℃とするため、パネルヒーター２０のプレ温度コントローラー２２を３７℃＋１℃、液温コントローラー２８を３６．５℃にそれぞれ設定し、±０．５℃の精度で、３７℃を超えない範囲で温度制御を行った。
【００２９】
実施例２
図１に示す簡易型培養装置１を用いて、酵母の培養を行った。尚、本実施例では、図１の酸素ボンベ３４から酸素のみを供給し、エアーポンプ３５からのエアーの供給は行わなかった。
培養条件は、以下の通りである。
培地：バクトトリプトン  ２００ｇ
イーストエクストラクト  １００ｇ
グリセロール  １００ｍｌ
１０×ＹＮＢ（１０倍濃縮のＹＮＢ培地）  １Ｌ
ビオチン  ４ｍｇ
Ｋ２ＨＰＯ４  ２３ｇ
ＫＨ２ＰＯ４  １１８ｇ
培養時間：２４ｈｒ
培養温度：３０℃
培養規模：１０Ｌ
菌体収量：１８０ｇ
酸素供給量：０．１Ｌ／ｍｉｎ
酸素循環装置：２００ｍｌ／ｍｉｎ（酸素循環量）
【００３０】
尚、本実施例では、培養時の上限温度を３０℃、下限温度を２９．０℃とするため、パネルヒーター２０のプレ温度コントローラー２２を３０℃＋１℃、液温コントローラー２８を２９．５℃にそれぞれ設定し、±０．５℃の精度で、３０℃を超えない範囲で温度制御を行った。
【００３１】
【発明の効果】
本発明によれば、安価で小型の簡易型培養装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の簡易型培養装置の一実施形態を示す図である。
【図２】撹拌装置を示す図である。
【図３】撹拌装置の回転部を示す図である。
【図４】パネルヒーターを示す図である。
【図５】酸素循環装置を示す図である。
【符号の説明】
１  簡易型培養装置
１０  撹拌装置
１１  モーター
１４  吸引口
１５  吐出口
２０  パネルヒーター
２１  ヒーター本体
２２  プレ温度コントローラー
２４  センサー
２６  プレ温度センサー
２８  液温コントローラー
３０  酸素循環装置
３１  ローラーポンプ
３２  炭酸ガス除去装置
３３  ガス排気部
３４  酸素ボンベ（酸素供給源）
３５  エアーポンプ
４０  培養容器
【図１】
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【図２】
2004329145.tif 000004
【図３】
2004329145.tif 000005
【図４】
2004329145.tif 000006
【図５】
2004329145.tif 000007