(57)【要約】【課題】被検化学物質のホルモン受容体への結合性及びホルモン活性の有無を同時に試験することができるアッセイを提供する。【解決手段】女性ホルモン受容体と被検化学物質とを反応させた後、女性ホルモン受容体の第１２へリックスを抗原とするセンシング抗体を添加して、前記抗体の女性ホルモン受容体第１２へリックスに対する結合割合を検出する受容体コンホメーションセンシングアッセイ。センシング抗体の結合割合の検出はＥＬＩＳＡ法により行う。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
女性ホルモン受容体の第１２へリックスを抗原とするセンシング抗体。
【請求項２】
女性ホルモン受容体と被検化学物質とを反応させた後、請求項１記載のセンシング抗体を添加して、前記抗体の女性ホルモン受容体第１２へリックスに対する結合割合を検出する受容体コンホメーションセンシングアッセイ。
【請求項３】
センシング抗体の女性ホルモン受容体への結合割合の検出をＥＬＩＳＡ法により行う請求項２記載の受容体コンホメーションセンシングアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リガンド結合に起因する女性ホルモン受容体の構造変化をセンシング抗体を用いて検知することにより、被検化学物質の受容体への結合能及びホルモン活性の有無を同時に試験するセンシング抗体及び受容体コンホメーションセンシングアッセイに関する。
【０００２】
【従来の技術】
環境中に存在する化学物質あるいは化学製品から漏出する化学物質で、生体内においてホルモンに類似した作用を示すものは、いわゆる「環境ホルモン」と呼ばれる。環境ホルモンはヒトや生物の内分泌系に影響を及ぼし、生殖障害等を引き起こすことが明らかになっている。
【０００３】
環境ホルモンは、ホルモン受容体（エストロゲン、アンドロゲン、甲状腺ホルモン受容体等）に結合してそれらのホルモンの支配下に置かれている遺伝子を転写活性化するホルモン様作用を有している。このホルモン様作用は、環境ホルモンが環境生物の内分泌攪乱を引き起こす主要な作用メカニズムであると考えられている。
【０００４】
このように環境ホルモンが生物に有害であることが明らかになるに伴い、種々の化学物質から内分泌攪乱作用が懸念される化学物質を迅速にスクリーニングする方法が必要とされている。化学物質をスクリーニングする方法としては、ホルモン受容体への結合試験法（例えば、非特許文献１参照）やホルモン受容体への結合を介したレポーター遺伝子転写活性化試験方法（例えば、非特許文献２参照）がある。
【０００５】
しかしながら、これらの方法はホルモン受容体への結合性、ホルモン活性についてそれぞれ別々に試験を行うものであり、きわめて非効率的である。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｓａｔｏ，　ＡＭ．，　Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ，　ＣＬ．，　Ｐｒｅｃｈｔｌ，　ＮＶ．，　Ｗｅｉｌｌ，　ＢＣ．，　Ｓｏｎｎｅｎｓｃｈｅｉｎ，　Ｃ．，　Ｏｌｅａ−Ｓｅｒｒａｎａ，　Ｆ．　ａｎｄ　Ｏｌｅａ，　Ｎ．　（１９９８）　Ａｓｓａｙｓ　ｔｏ　ｍｅａｓｕｒｅ　ｅｓｔｒｏｇｅｎ　ａｎｄ　ａｎｄｒｏｇｅｎ　ａｇｏｎｉｓｔｓ　ａｎｄ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ，　Ａｄｖ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．　Ｂｉｏｌ．，　４４４，　９−２３．
【非特許文献２】
Ｓｕｍｉｄａ，　Ｋ．，　Ｏｏｅ，　Ｎ．，　Ｎａｇａｈｏｒｉ，　Ｈ．，　Ｓａｉｔｏ，　Ｋ．，　Ｉｓｏｂｅ，　Ｎ．，　Ｋａｎｅｋｏ，　Ｈ．，　Ｎａｋａｔｓｕｋａ，　Ｉ．　（２００１）　Ａｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｇｅｎｅ　ａｓｓａｙ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｈｕｍａｎ　ａｎｄ　ｒａｔ　Ｓ９　ｏｒ　ｌｉｖｅｒ　ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　２８０，　８５−９１．
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、被検化学物質のホルモン受容体への結合性及びホルモン活性の有無を同時に試験することができるアッセイを提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
ホルモンが細胞核内の受容体に結合すると、受容体のリガンド結合部位のＣ端部で自由にしていたα−ヘリックスは「フタ」をするように大きくコンホメーション変化を起こす。このフタが正しく閉まると、受容体に別のタンパク質（コアクチベーター）が結合して転写活性発現へと機能する。
【０００９】
環境ホルモンには、本来のホルモンと同じ作用をするアゴニストと、受容体の結合部位に結合してホルモンの作用を阻害するアンタゴニストがあることが知られている。最近、リガンド−女性ホルモン受容体複合体のＸ線結晶解析から、そのコンホメーション変化の内容はアゴニストとアンタゴニストでは異なることが明らかとなった。
【００１０】
即ち、アゴニストはα−へリックスのコンホメーションを変化させ、リガンド−受容体複合体を転写活性が発現する活性型へと導く。一方、アンタゴニストはリガンド結合部位に結合してホルモンの結合を阻害するが、アゴニスト結合型複合体と同様な構造変化を起こさず転写活性は発現しないことが知られている。
【００１１】
本発明者は、被検化学物質を反応させた女性ホルモン受容体に、コンホメーション変化をおこす前のα−ヘリックスに結合するセンシング抗体を反応させて前記抗体の結合割合を測定することにより、被検化学物質がホルモン活性型か非活性型かを区別して検出できることを見出した。更に、抗体応答の強さから被検化学物質の女性ホルモン受容体への結合能が評価できることを見出した。
【００１２】
上記目的を達成する本発明は、以下に記載するものである。
【００１３】
〔１〕　女性ホルモン受容体の第１２へリックスを抗原とするセンシング抗体。
【００１４】
〔２〕　女性ホルモン受容体と被検化学物質とを反応させた後、〔１〕記載のセンシング抗体を添加して、前記抗体の女性ホルモン受容体第１２へリックスに対する結合割合を検出する受容体コンホメーションセンシングアッセイ。
【００１５】
〔３〕　センシング抗体の女性ホルモン受容体への結合割合の検出をＥＬＩＳＡ法により行う〔２〕記載の受容体コンホメーションセンシングアッセイ。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明のセンシング抗体は、女性ホルモン受容体の第１２へリックスを抗原とする抗体である。このセンシング抗体は、女性ホルモン受容体の第１２へリックスに相当する断片ペプチドを合成し、このペプチドを抗原として免疫することにより得られる。第１２へリックスに相当する断片ペプチドのアミノ酸配列は、以下に示すものである（配列番号１）。
Ｈ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−ＮＨ２
ペプチドの合成は、液相法、固相法等公知の方法を用いることができるが、Ｆｍｏｃ固相法が好適に用いられる。
【００１７】
Ｆｍｏｃ固相法を用いた具体的な断片ペプチドの合成は、以下のように行う。
【００１８】
側鎖官能基を３級ブチルアルコール型等の保護基で、また、Ｎ末端アミノ基をＦｍｏｃ基で保護したアミノ酸を、塩基（ピペリジン）でＦｍｏｃ基の除去を行いながら樹脂上にペプチド鎖を延長し、最終的に側鎖の保護基の脱保護及び合成したペプチドの樹脂からの切り離しをトリフルオロ酢酸により行う。これをゲルろ過及び逆相液体クロマトグラフィーにより精製して目的のペプチドを得る。
【００１９】
第１２へリックスに相当するペプチドは抗原性が低いため、タンパク質担体（キャリアータンパク質）に結合して十分な大きさの抗原としてから免疫を行うことが好ましい。タンパク質担体への結合は、上記のアミノ酸配列を有する断片ペプチドのＮ末端にＣｙｓを加えてから行う。
【００２０】
得られた合成ペプチド粗生成物は、ゲルろ過およびＨＰＬＣによる精製を行う。システイン含有ペプチドの精製は困難を伴うことが多いが、ゲルろ過及びＨＰＬＣにより高純度のものを得ることができる。
【００２１】
次に、合成ペプチドをキャリアータンパク質に結合する。この結合はトリス−（２−シアノエチル）ホスフィン等を添加してシステインのＳＨ基を完全に遊離した合成ペプチドに、架橋試薬を反応させたキャリアータンパク質を添加することにより行う。架橋試薬としては、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−ヨードアセチルアミノ安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ε−マレイミドカプロイルオキシ−Ｎ−スクシンイミドエステル等を挙げることができる。キャリアータンパク質としては、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシサイログロブリン（ＢｔｈＧ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ニワトリ卵白アルブミン（ＯＶＡ）等を用いることができる。これらは市販品として入手できる。
【００２２】
ゲルろ過等による精製後、合成ペプチドを架橋したキャリアータンパク質をウサギ等に免役し、数週間〜数ヶ月後に血液を採取する。採取した血液の血清を精製し、本発明のセンシング抗体を得る。
【００２３】
血清の精製は、キャリアータンパク質に対する抗体を免疫沈降により除去した後、合成ペプチドを用いたアフィニティ精製を行うことが好ましい。
【００２４】
免疫沈降は、血清にキャリアータンパク質水溶液を加え、キャリアータンパク質と当該キャリアータンパク質に作用する抗体の複合体を遠心分離して取り除くことにより行う。この操作は、キャリアータンパク質水溶液を加えても沈殿物が析出しなくなるまで繰り返し行うことが好ましい。
【００２５】
アフィニティ精製は、センシング抗体の抗原である合成ペプチドを架橋したアフィニティ担体を用いて行うクロマトグラフィーである。例えばアガロース担体にヨードアセチルを架橋したゲルにＣｙｓ（ＳＨ）−ペプチドを反応させて担体を調製し、アフィニティ担体とする。
【００２６】
以下、上記のように調製したセンシング抗体を用いた受容体コンホメーションセンシングアッセイにつき説明する。
【００２７】
まず、女性ホルモン受容体に対して被検化学物質を室温で反応させ、リガンド−受容体複合体を調製する。その後、リガンド−受容体複合体を含む溶液にセンシング抗体を添加し、女性ホルモン受容体の第１２へリックスに対するセンシング抗体の結合量を測定する。
【００２８】
センシング抗体は、コンホメーション変化を起こしていない第１２へリックスに結合する。一方、コンホメーション変化をおこしてフタが閉じた状態となった第１２へリックスに対しては結合しない。
【００２９】
センシング抗体の第１２へリックスに対する結合量の測定は、ＥＬＩＳＡ法により行うことが好ましい。
【００３０】
ＥＬＩＳＡ法は、キャリアータンパク質以外のタンパク質（例えば、ウシサイログロブリン（ＢｔｈＧ）等）に結合した抗原ペプチドをコートしたイムノプレート（ＥＬＩＳＡプレート）を用いて行う方法である。プレートの調製は、例えば、タンパク質に結合した抗原ペプチドを９６穴プレートに吸着させ、インキュベート、洗浄後、１％ＢＳＡによりブロッキングすることにより行う。抗原ペプチドは、上記のように合成した断片ペプチドを用いることができる。
【００３１】
ＥＬＩＳＡ法によるセンシング抗体の結合量の測定は、次のように行う。被検化学物質、女性ホルモン受容体を含む溶液を９６穴ＥＬＩＳＡプレートに移し、センシング抗体溶液を加えてインキュベートする。プレートを洗浄後、センシング抗体に反応する別の抗体（２次抗体）をプレートに添加する。この２次抗体には定量のため予め酵素等で標識を行う。更にプレートを洗浄後、抗体応答からプレートに残存する２次抗体量と、更に第１２へリックスに対するセンシング抗体の結合量を測定できる。
【００３２】
２次抗体に行う標識としては、酵素、ラジオアイソトープ、蛍光等による標識を挙げることができるが、酵素による標識が好ましい。標識に用いる酵素としては、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ（βＧａｌ）等を挙げることができる。
【００３３】
ＨＲＰを標識として用いた場合には、ＨＲＰ標識２次抗体をプレート上のセンシング抗体に反応させ、洗浄した後、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）を基質として反応させる。反応したＡＢＴＳは発色するので、プレートの吸光度から酵素活性を測定できる。
【００３４】
受容体のコンホメーション変化量（抗体応答）は、基準の女性ホルモンに対する相対値として、プレートに残存する二次抗体の酵素活性等の測定値から下記式（１）により算出できる。
Ｄ（％）＝（Ａ−Ｂ）×１００／（Ｃ−Ｂ）　　　（１）
Ｄ：コンホメーション変化量（抗体応答）
Ａ：受容体及び化学物質を添加したときの測定値
Ｂ：受容体のみ添加したときの測定値
Ｃ：受容体及び過剰の基準女性ホルモンを添加したときの測定値
基準とする女性ホルモンは、１７β−エストラジオール、エストリオール等のアゴニストとして知られる女性ホルモンから選択する。
【００３５】
ＥＣ５０の算出は以下の手順で行う。まず、被検化学物質の濃度に対し抗体応答をプロットしたグラフ（図１）からプラトーに達した抗体応答値Ｐを読み取る。次に、その５０％値Ｐ’に対応する化学物質濃度Ｍをグラフから読み取る。この読み取った値をＥＣ５０とする。
【００３６】
より便利な手法としては、以下のものがある。
【００３７】
被検化学物質の濃度に対し抗体応答をプロットしたグラフから得た曲線を、例えば解析プログラムＡＬＬＦＩＴ等を用いて数理解析すると、プラトーに達した抗体応答値の５０％の抗体応答値を得るために必要な被検化学物質の濃度（ＥＣ５０）を算出することができる。
【００３８】
このように算出したＥＣ５０値は、化学物質の受容体への結合率を表すパラメータとなる。
【００３９】
また、上記のようにして求めた抗体応答値Ｐは、被検化学物質が受容体を活性型コンホメーションに転化できる割合の最大値を示し、被検化学物質のホルモン活性を表すパラメータとなる。
【００４０】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。実施例において、女性ホルモン受容体、ＥＬＩＳＡキット、プレートリーダーは下記のものを用いた。
女性ホルモン受容体：Ｅｓｔｒｏｇｅｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ａｌｐｈａ　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（ＰＡＮＶＥＲＡ社製、カタログ番号：Ｐ２５０３）
ＥＬＩＳＡキット：ＥＬＩＳＡｍａｔｅ（ＫＰＬ社製、カタログ番号：５４−６２−００）
プレートリーダー：ＩｍｍｕｎｏＭｉｎｉ　ＮＪ−２３００（Ｉｎｔｅｒ　Ｍｅｄ社製）
合成例１
（抗原ペプチドの合成）
女性ホルモン受容体の第１２ヘリックスに相当する断片ペプチド（配列番号１）をエピトープとして設定し、このペプチドをＦｍｏｃ固相法により合成した。タンパク質担体との結合のために、合成したペプチドのＮ末端にＣｙｓを加えた。合成粗生成物をゲルろ過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５，　φ＝１．８ｃｍ，　ｌ＝７５ｃｍ：アマシャムバイオサイエンス社製）およびＨＰＬＣ（Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ　ＲＰ−１８（ｅ），　φ＝２５ｃｍ　ｘ　２５０ｍｍ：ＭＥＲＫ社製）により精製し、純粋な目的ペプチドを得た。目的物の確認は質量分析により行った。
【００４１】
合成例２
（架橋試薬のキャリアタンパク質ＫＬＨへの結合）
タンパク質担体としてキーホールリンペットヘモシアニン　（ＫＬＨ：Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）、架橋試薬として二価性のｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ：Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いた。
【００４２】
ＫＬＨの１０　ｍＭ　リン酸バッファー　（ｐＨ７．２）　溶液（１６　ｍｇ／ｍｌ）に、ＭＢＳのＤＭＦ溶液　（３．６　ｍｇ／１２　μｌ）を９．３　μｌ　添加し、室温で３０分撹拌した。反応液を遠心後、上清をＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５を用いたゲルろ過により精製し、目的物を得た。
【００４３】
合成例３
（エピトープペプチドのＫＬＨへの結合）
合成例１で得られたペプチド　１　ｍｇ　を添加した水溶液　５００　μｌ　に、トリス−（２−シアノエチル）ホスフィン水溶液（５　ｍｇ／ｍｌ）を２００　μｌ　加えてシステインのＳＨ基を完全に遊離させた。これに合成例２で調製したＫＬＨ−ＭＢＳ複合体溶液（２３０　μｌ）　および０．２　Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４（１１５　μｌ）　を加え、室温で３時間撹拌した。遠心後、上清をＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５を用いたゲルろ過により精製し、目的物を得た。
【００４４】
合成例４
（ウサギへの免疫）
合成例３で調製した抗原溶液をフロイントのアジュバント（Ｄｉｆｃｏ社製）と混合してエマルジョンとし、ペプチド０．１　ｍｇ／匹となるように２匹のウサギ（ニュージーランドホワイト）に免疫した。約３ヶ月後、耳静脈から採血し十分な抗体価が得られていることをＥＬＩＳＡにより確認した。
〔ＥＬＩＳＡによる抗体価の確認〕
合成例１で調製したペプチドを抗原ペプチドとして用い、９６穴プレートに吸着（２．５　μｇ／ｍｌ，　５０　μｌ／ｗｅｌｌ）した後、４％　ＢＳＡ（ＥＬＩＳＡキット（ＥＬＩＳＡｍａｔｅ）付属のＢＳＡ　Ｄｉｌｕｅｎｔ／Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを１０倍に希釈したもの）によるブロッキング、洗浄を行い、９６穴ＥＬＩＳＡプレートを調製した。その後、血清（希釈率：１／１００〜１／１００，０００）を反応させた。洗浄後、ＨＲＰ標識の２次抗体を反応させ、再び洗浄後、基質（Ｈ２Ｏ２，　ＡＢＴＳ）を反応させて発色させ、４０５　ｎｍの吸光度を測定した。１／１０，０００希釈の血清でこの吸光度が陽性であれば十分な抗体価があるとした。
【００４５】
合成例５
（抗体の精製）
まず、合成例４で採血した血液　３０　ｍｌ　を３７℃で１時間、その後、４℃で終夜インキュベートした。遠心分離により血清と血餅を分画し、血清画分を抗血清とした。得られた抗血清を次に示す２段階で精製した。まず、キャリアータンパク質ＫＬＨに対する抗体を免疫沈降により除去し、次いで合成ペプチドを用いてアフィニティ精製した。
〔免疫沈降〕
終濃度０．５　ｍｇ／ｍｌとなるように５　ｍｇ／ｍｌのＫＬＨ水溶液を粗血清に加えて４℃で終夜インキュベートし、沈殿したＫＬＨ−抗ＫＬＨ抗体複合体を遠心分離した。この操作をＫＬＨ水溶液を加えても沈殿が析出してこなくなるまで繰り返し行った。
〔アフィニティ精製〕
アガロース担体にヨードアセチルが架橋したゲル（ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ　Ｃｏｕｐｌｉｎｇ　Ｇｅｌ、Ｐｉｅｒｃｅ社製）　に合成例１で調製したＣｙｓ（ＳＨ）−ペプチドを反応させ、抗原ペプチドを架橋したゲル担体を調製した。これをアフィニティ担体とし、アフィニティクロマトグラフィーにより抗体を精製した。
【００４６】
試験例１
調製した抗体の女性ホルモン受容体に対する応答をＥＬＩＳＡにより調べた。
〔ＥＬＩＳＡによる操作法〕
女性ホルモン受容体　（１０−７〜１０−１２　Ｍ，　９０　μｌ）を１７β−エストラジオール（１０−６〜１０−１０　Ｍまたは０　Ｍ，　１０　μｌ）と反応させた。この溶液を合成例４と同様にしてあらかじめ調製しておいた９６穴ＥＬＩＳＡプレートに全量移し、作製した抗体溶液　（１０　μｌ）　を加えて４℃で終夜インキュベートした。洗浄後、ＨＲＰ標識の２次抗体を反応させた。更に洗浄後、基質　（Ｈ２Ｏ２，　ＡＢＴＳ）　を反応させて発色させ、４０５　ｎｍの吸光度を測定した。
【００４７】
その結果、合成例５で得られた抗体は、リガンド非存在下で女性ホルモン受容体を強く認識し、結合した。一方、天然のエストロゲン及び１７β−エストラジオールを受容体に結合させた状態で調べたところ、抗体は受容体に結合できなくなることが判明した。
【００４８】
受容体を加えていない系の吸光度と比較して、吸光度が小さいほど抗体は受容体に結合したことを意味する。リガンド未処理時（リガンド非存在下）では女性ホルモン受容体の濃度依存的に吸光度が小さくなった。一方、１０−６　Ｍの１７β−エストラジオール処理時（１７β−エストラジオールを受容体に結合させた状態）では、受容体の有無に関わらず吸光度はほぼ一定であった。
【００４９】
実施例１
女性ホルモン受容体　（４０　ｎＭ，　９０　μｌ）　に対して、表１に示す各化学物質　（１０−１１〜１０−５　Ｍ，　１０　μｌ）　を室温で１時間反応させ、リガンド−受容体複合体を調製した。この溶液をあらかじめ調製した抗原ペプチドをコートした９６穴ＥＬＩＳＡプレートに移した。ＥＬＩＳＡプレートの調製は、ウシサイログロブリン（ＢｔｈＧ）に結合した抗原ペプチドをプレートに吸着（２．５　μｇ／ｍｌ，　５０　μｌ／ｗｅｌｌ）させ、室温で１．５時間インキュベート後、洗浄し、ＥＬＩＳＡキット（ＥＬＩＳＡｍａｔｅ）付属のＢＳＡ　Ｄｉｌｕｅｎｔ／Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを１０倍に希釈したものによるブロッキングにより行った。リガンド−受容体複合体溶液を移した９６穴ＥＬＩＳＡプレートに合成例１〜４で調製したセンシング抗体溶液　（１０　μｌ／ｗｅｌｌ）　を加えて４℃で終夜反応させた。溶液を捨て、プレートを洗浄（洗浄液としてＥＬＩＳＡキット（ＥＬＩＳＡｍａｔｅ）付属のＷａｓｈ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ，　２００Ｘを２００倍に希釈したものを使用）後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識２次抗体（５０　μｌ）を室温で１時間反応させた。溶液を捨て、プレートを洗浄後、過酸化水素／２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）を基質とした酵素反応により溶液を発色させた。基質は、ＥＬＩＳＡキット（ＥＬＩＳＡｍａｔｅ）付属のＡＢＴＳ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ＳｕｂｓｔｒａｔｅとＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ａ及びＢを使用直前に当量体積ずつ混合して調製し、添加量は１００　μｌ／ｗｅｌｌとした。プレートリーダーを用い、４０５　ｎｍの吸光度を測定してプレート上のペプチドに結合した抗体量を定量した。
【００５０】
受容体に１７β−エストラジオール（Ｅ２）が結合すると受容体が構造変化し、抗体の受容体への結合量が減少した。この減少の程度を１７β−エストラジオールの濃度を変えて測定すると、用量依存的な相関曲線が描かれた（図２）。これは、１７β−エストラジオールの受容体結合能とそれが引き起こす受容体構造変化の程度を定量的に相関させた受容体結合活性試験の構築が可能であることを示す。また、天然の女性ホルモンのエストリオール（Ｅ３）や合成女性ホルモンのジエチルスチルベストロール、エチニルエストラジオールについても同様の結果が得られた。しかし、エストロン（Ｅ１）は応答性が低く、エストロンの実際の受容体結合性および転写活性の結果とよく符合することが判明した。
【００５１】
さらに、アンタゴニストであるヒドロキシタモキシフェンについて検討したところ、エストロン、１７β−エストラジオール、エストリオール、そしてこれらの合成女性ホルモンのいずれの場合とも異なる低い抗体応答を示した。ジエチルスチルベストロール及び４−ヒドロキシタモキシフェンの濃度に対して抗体応答をプロットした結果を１７β−エストラジオールと併せて図２に示す。
【００５２】
この結果より本発明は、化学物質が結合して引き起こした構造変化が活性型か、不活性型の判別により、ホルモン活性の有無を、また、その抗体応答の強さで受容体結合の強さを同時に判定できるアッセイであることが判明した。
【００５３】
さらに、一連のアルキルフェノールやジフェニルメタンについて調べたところ、化学物質により様々なパターンの抗体応答を示した。
【００５４】
表１に示す各化学物質について、１７β−エストラジオール未処理のときの抗体応答を０、１０　μＭの１７β−エストラジオール処理によって活性化型コンホメーションに１００％変化させたときの抗体応答を１００として各化学物質の濃度に対して抗体応答をプロットし、抗体応答がプラトーに達したときの値をグラフより算出した。さらに、得られたシグモイド様曲線を解析プログラムＡＬＬＦＩＴで数理解析し、ＥＣ５０を算出した。算出した各化学物質の抗体応答とＥＣ５０の値を表１に示す。
【００５５】
【表１】
2004131419.tif 000002
【００５６】
評価としては、抗体応答（縦軸）はホルモン活性の強さを示し、ＥＣ５０化学物質濃度は化学物質と受容体との結合の強さを表す。
【００５７】
【発明の効果】
本発明は、被検化学物質のホルモン活性をリガンド結合前後のα−へリックスのコンホメーション変化の差異として抗体でセンシングし、抗体応答の強さから被検化学物質の受容体結合能を試験するものである。本発明によれば、被検化学物質の女性ホルモン受容体に対する結合能とホルモン活性を同時にしかも簡便に測定することができる。従って、本発明は女性ホルモン系に影響を及ぼす環境ホルモンのプレスクリーニング法として有用である。
【００５８】
【配列表】
2004131419.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】化学物質の濃度と抗体応答の関係を示すグラフである。
【図２】実施例１における被検化学物質の濃度と抗体応答の関係を示すグラフである。
【図１】
2004131419.tif 000004
【図２】
2004131419.tif 000005