(57)【要約】【課題】ＤＮＡの濃縮を促進し、ハイブリダイゼーション反応の効率を高め、反応時間を短縮することができ、さらに、検出感度を高めることができるハイブリダイゼーション法を実現する装置の提供。【解決手段】参照電極１と作用電極２と第一の対極３とを備えたポテンシオスタット７により、作用電極２上に修飾されたプローブＤＮＡ１１あるいはプローブＤＮＡ１１とハイブリダイゼーション反応をするターゲットＤＮＡ１２が電解反応を起こさないような電位に作用電極２の電極電位を制御し、さらにこの作用電極２と別途備えた第二の対極４との間の電場を制御して、作用電極２と第二の対極４との間で電気泳動を行う構成とした。【選択図】　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
電極と電解質溶液と電源からなる電場制御装置において、少なくとも参照電極と作用電極と第一の対極と第二の対極の４種類の電極を有することを特徴とする電場制御装置。
【請求項２】
請求項１記載の電場制御装置であって、ポテンシオスタットを用いて前記作用電極の電位を制御し、かつ、前記第二の対極と前記作用電極との間の電場を制御することを特徴とする電場制御装置。
【請求項３】
請求項１記載の電場制御装置であって、前記参照電極と前記作用電極と前記第一の対極の電位をポテンシオスタットを用いて制御し、かつ、前記第二の対極と前記作用電極との間の電場を制御することを特徴とする電場制御装置。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の電場制御装置であって、電場制御として、前記第二の対極と前記作用電極との間の電圧を制御することを特徴とする電場制御装置。
【請求項５】
請求項１から３のいずれかに記載の電場制御装置であって、電場制御として、前記第二の対極と前記作用電極との間の電流を制御することを特徴とする電場制御装置。
【請求項６】
請求項１から３のいずれかに記載の電場制御装置であって、電場制御として、前記第二の対極と前記作用電極との間の電圧を定電圧制御することを特徴とする電場制御装置。
【請求項７】
請求項１から３のいずれかに記載の電場制御装置であって、電場制御として、前記第二の対極と前記作用電極との間の電流を定電流制御することを特徴とする電場制御装置。
【請求項８】
請求項１から３のいずれかに記載の電場制御装置であって、電場制御として、前記第二の対極と前記作用電極との間の電圧をプログラム制御することを特徴とする電場制御装置。
【請求項９】
請求項１から３のいずれかに記載の電場制御装置であって、電場制御として、前記第二の対極と前記作用電極との間の電流をプログラム制御することを特徴とする電場制御装置。
【請求項１０】
請求項１から３のいずれかに記載の電場制御装置であって、電荷を持った物質を電気泳動させることを特徴とする電場制御装置。
【請求項１１】
請求項１から３のいずれかに記載の電場制御装置であって、ＤＮＡを電気泳動させることを特徴とする電場制御装置。
【請求項１２】
請求項１から３のいずれかに記載の電場制御装置であって、ハイブリダイズさせることを特徴とする電場制御装置。
【請求項１３】
請求項１から３のいずれかに記載の電場制御装置であって、前記作用電極上のＤＮＡと前記電解質溶液中のＤＮＡをハイブリダイズさせることを特徴とする電場制御装置。
【請求項１４】
請求項１から３のいずれかに記載の電場制御装置であって、デハイブリダイズさせることを特徴とする電場制御装置。
【請求項１５】
請求項１から３のいずれかに記載の電場制御装置であって、前記作用電極上の２本鎖ＤＮＡをデハイブリダイズさせることを特徴とする電場制御装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、電荷をもった物質の移動・濃縮方法を実現する装置に関する。とりわけ標的となるＤＮＡあるいはＲＮＡなどの遺伝物質を、これと相補的な配列を持つポリヌクレオチドであるプローブＤＮＡとのハイブリッド形成を用いて分析する方法を実現する装置に関する。特に非標識でＤＮＡあるいはＲＮＡを分析する方法を実現する装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ゲノムプロジェクトによってヒトゲノムを代表に原核生物から真核生物まで多種多様な生物のＤＮＡ塩基配列が解読され、膨大な情報が公開され続けている。これらの情報を診断等に有効利用するために、大量の遺伝子を一度に分析、解析する必要性が高まってきた。
【０００３】
このようなニーズに応える一つの手法として、ＤＮＡチップ、マイクロアレイを用いた技術がここ数年で急速に発展してきた。ＤＮＡチップとはＤＮＡをスライドガラスもしくはシリコン基板等の上に固定化したものの総称で、このＤＮＡチップを用いたマイクロアレイシステムは遺伝子発現や変異あるいは多型などを効率良く短時間で解析することを可能にし、今やゲノムプロジェクトでの情報を活用して新たな情報を引き出すために欠かせない技術としても最も注目されているものの一つである。
【０００４】
ＤＮＡマイクロアレイシステムにおける遺伝子の検出の前処理として、ハイブリダイゼーション法が用いられている。まず、スライドガラスなどの基板上に種々のプローブＤＮＡを高密度に固定化してＤＮＡチップを作成する。次に、検出対象であるターゲットＤＮＡを標識する。このターゲットＤＮＡとＤＮＡチップ上の相補的なＤＮＡ断片（プローブＤＮＡ）とのハイブリダイゼーション後、未反応のターゲットＤＮＡを除去してターゲットＤＮＡに導入した標識の検出を行う。このように試料遺伝子を分析する。
【０００５】
ターゲットＤＮＡの標識には、ラジオアイソトープ（ＲＩ）による放射線被爆を避けるために非ＲＩによる標識法が報告されている。
【０００６】
羊土社、改訂遺伝子工学実験ノート、下巻、１８３〜１８４ページ（非特許文献１）に蛍光色素による標識法が報告されているが、この蛍光標識にはいくつかの課題がある。
【０００７】
一つには検出感度の問題がある。この蛍光標識法では蛍光色素をターゲットＤＮＡに直接組み込み、ＤＮＡチップ上のプローブＤＮＡとハイブリダイゼーションさせて検出する。プローブＤＮＡが非常に微量であるため必然的にシグナルは弱くなる。そこで、出来るだけ多くの蛍光色素をターゲットＤＮＡと結合させる必要が生じるが、一般に蛍光物質は分子量が大きく、ターゲットＤＮＡに組み込まれる際に立体障害が起こりやすいため、検出感度を向上させるため修飾量を増やすとハイブリダイゼーション時のＤＮＡ塩基対形成が阻害されるので、相補鎖の識別が困難となる。結果として従来使用されてきたＲＩ標識に比較して、検出感度と結果の正確性に劣ることになる。
【０００８】
二つめは蛍光色素の退色の問題である。蛍光物質は実験の際の外部光などに励起されて徐々に退色する。このため実験操作を行ったあとの蛍光の測定は、速やかに行う必要がある。
【０００９】
三つめはコストの問題である。検出には弱い蛍光を最大限に検出するため励起にレーザーを使用し、装置の低価格化の障害になっている。また、先に述べたように出来るだけ多くの蛍光物質をターゲットＤＮＡに組み込むため高濃度の蛍光色素が必要であるが、一般に蛍光色素は価格が高く、ランニングコストを押し上げる一因になっている。
【００１０】
上記の蛍光標識における問題を解決するため、縫い込み型インターカレータを利用して電気化学的に検出を行う方法がある（特許文献１参照）。
【００１１】
この電気化学活性物質標識による検出原理と測定装置について述べる。まず電極にプローブＤＮＡを結合させる。この電極とターゲットＤＮＡとのハイブリダイゼーションを行った後、縫い込み型インターカレータを含む溶液で測定を行う。二本鎖の形成量に応じて電極上の縫い込み型インターカレータの濃縮量が増加する。電気化学的手法としてディファレンシャルパルスボルタモグラフィー（ＤＰＶ）を用いることにより縫い込み型インターカレータの電極反応に伴う電流が流れ、この電流を測定することにより二本鎖形成量、すなわち目的の遺伝子ハイブリッド形成量を定量化する。この方法では、一本鎖状態での応答電流を検出し、プローブＤＮＡの修飾量がわかるようにすることもできる。一本鎖状態の電流応答値Ｉ０をまず測定し、つぎにハイブリダイゼーション後に２本鎖状態の電流応答値Ｉを測定する。ハイブリッド形成量は｛１００×（Ｉ−Ｉ０）／Ｉ０｝で表すことができる。
【００１２】
この方法では、二本鎖ＤＮＡへ縫い込み型インターカレータを挿入することによりＤＮＡ二重らせんの主溝と副溝の両方に縫い込み型インターカレータの置換基が飛び出す。これらの置換基部が分子鎹（かすがい）となってＤＮＡ二重らせんの安定化と同時に縫い込み型インターカレータのＤＮＡ二重らせんからの解離を難にする。一方、一本鎖ＤＮＡに対してはこのような効果はなく、二本鎖ＤＮＡに対する結合特異性が高い。
【００１３】
この方法では電気化学活性を持つ縫い込み型インターカレータが２本鎖ＤＮＡに特異的に結合することを利用してハイブリダイゼーション後の２本鎖ＤＮＡの検出を行うので、ターゲットＤＮＡを標識する必要はない。また、電気化学活性は減衰の心配がないだけでなく、現在の蛍光検出に比べて高い検出感度が期待できる。さらに、高価な蛍光物質を使用しない、装置のコンパクト化、などの利点がある。
【００１４】
なお、この方法では縫い込み型インターカレータの電気活性を検出するため、プローブＤＮＡを固定化する支持体は電極の役割を果たすものが使用される。
【００１５】
上述したように遺伝子の検出手段に関してはいくつかの方法があるが、いずれの場合においてもプローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとのハイブリダイゼーションを行う過程は必須である。
【００１６】
従来のハイブリダイゼーション反応は、スライドガラスなどの基板あるいは電極などの上にプローブＤＮＡを固定化したＤＮＡチップを作成し、そのプローブＤＮＡ上から標識したターゲットＤＮＡを含むハイブリダイゼーション反応溶液を滴下しカバーガラスをのせ、一定時間恒温に保つ方法で行っていた（非特許文献２参照）。その後，恒温槽からＤＮＡチップを取り出して洗浄液でＤＮＡチップを洗浄し、検出器によって標識からのシグナルを読み取っていた。
【００１７】
しかし、この方法でハイブリダイゼーション反応を行うと、反応時間が一昼夜にわたる等、長時間を要していた。このため、高価な多数のハイブリダイゼーション装置を並べておいて、多数のハイブリダイゼーション反応を同時併行して行うのが普通であり、そのための広い設置スペースを確保しなければならなかった。このため、研究開発用としては用いることができても、診断用としてはその適用が困難とされていた。検出に要する時間の大部分はハイブリダイゼーションの時間であり、この点を解決するためにハイブリダイゼーション反応の短時間化が要求されていた。
【００１８】
また、非特異的なＤＮＡ結合を回避し、特異的なＤＮＡ結合を優先化することのできるＤＮＡ挙動の制御法構築なども必要とされていた。
【００１９】
このように、遺伝子診断におけるハイブリダイゼーション反応においては、ハイブリダイゼーション効率の向上、反応時間の短縮が大きな技術課題となっている。これを解決するため、プローブＤＮＡ近傍にターゲットＤＮＡを濃縮しハイブリダイゼーション効率を向上させる手段として、電気化学制御方式を用いる方法が報告されている。この方法はプローブＤＮＡを固定する支持体を電極とし、別途設けた対極との間に電圧あるいは電流を印加する方法である。この方法により−（マイナス）に帯電するターゲットＤＮＡは＋（プラス）に帯電する支持体に引き寄せられ、支持体上のプローブＤＮＡとの反応機会が増え、反応効率が高くなる。これによりハイブリダイゼーション反応の短時間化を可能にする。
【００２０】
この方法では、電極表面での電解反応によるプローブＤＮＡあるいはターゲットＤＮＡの分解を防ぐことが課題となっている。そのために電極表面に特殊な透過膜を配置して電極反応によるＤＮＡの電解反応を抑制している（特許文献２、非特許文献３参照）。
【００２１】
【特許文献１】
特開２０００−１２５８６５号公報
【００２２】
【特許文献２】
特表２００１−５２５１９３号公報
【００２３】
【非特許文献１】
羊土社、改訂遺伝子工学実験ノート、下巻、１８３〜１８４ページ
【００２４】
【非特許文献２】
羊土社、改訂遺伝子工学実験ノート、下巻、１８４〜１８６ページ
【００２５】
【非特許文献３】
ＷＩＬＥＹ−ＶＣＨ　Ｖｅｒｌａｇ　ＧｍｂＨ社　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２０００，２１，１５７−１６４ページ
【００２６】
【発明が解決しようとする課題】
従来技術４および従来技術５の従来技術においては、ハイブリダイゼーション反応を蛍光法で検出する場合には問題とならないが、縫い込み型インターカレータによる電気化学検出法においては透過膜による電解反応の阻害のために検出感度等に問題の起こる可能性がある。
【００２７】
本発明は、上記問題を解決し、電極近傍におけるターゲットＤＮＡの濃縮を促進し、ハイブリダイゼーション反応の効率を高め、反応時間を短縮することができ、さらに、検出感度を高めることができるハイブリダイゼーション法を実現する装置を提供することにある。
【００２８】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するための本発明による電場制御装置は、参照電極と作用電極と第一の対極とをポテンシオスタットを用いて電位制御し、かつ、第二の対極と前記作用電極との間の電場を制御する電気化学的二重制御を特徴とする。
【００２９】
本発明での電場制御装置では、参照電極と作用電極と第一の対極とを備えたポテンシオスタットにより、作用電極上に修飾されたプローブＤＮＡあるいはプローブＤＮＡとハイブリダイゼーション反応をするターゲットＤＮＡが電解反応を起こさないような電位に作用電極の電極電位を制御し、さらにこの作用電極と別途備えた第二の対極との間の電場を制御して、作用電極と第二の対極との間で電気泳動を行わせることを特徴とする。
【００３０】
そのため作用電極近傍におけるターゲットＤＮＡの濃度が高くなり、作用電極上に修飾されたプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応が短時間で効率的に行われる。
【００３１】
ここで、作用電極上に修飾されているプローブＤＮＡや作用電極近傍に濃縮されたターゲットＤＮＡが電解反応をして分解されることがないように、電解反応が起こらないような電位に作用電極の電極電位を制御する。
【００３２】
また、作用電極と第二の対極との間に発生させる電場の極性を逆転させることによって、作用電極上に修飾されたプローブＤＮＡと結合しなかった分析物や反応物を速やかに除去することができる。これにより非特異的ハイブリダイゼーションによる阻害影響を軽減し、測定の信頼性を高めることができる。
【００３３】
また、電場の強度調整によって非相補的塩基を含む非特異的ＤＮＡの結合などを選択的に排除することも可能である。
【００３４】
特に、縫い込み型インターカレータを用いる検出法では電気化学的測定を手法原理としていることから、本発明での電気化学的なＤＮＡの制御は非常に合理的な手法である。
【００３５】
【実施例】
本願発明を図１に基づいて詳細に説明する。図１は本発明を実施した実施例の電場制御装置の概略構成を説明する図である。なお、図１において、図２に書かれている部品で、ほぼ同一の機能を有するものは、ここでは説明を省略することもある。１は参照電極、２は作用電極、３は第一の対極、４は第二の対極、５は容器（電解セル）、６は電解質溶液、７はポテンシオスタット、８は直流電圧電流電源である。容器５は電気的制御を行うため絶縁性が求められ、かつ耐薬品性が求められる。容器５の中には電解質溶液６が入っており、参照電極１、作用電極２、第一の対極３、第二の対極４はこの電解質溶液６に浸され、この電解質溶液６によってそれぞれの電極は導通を持っている。図示していないが、作用電極２はセラミックなどの絶縁性基板の上に複数本取り付けられており、電極毎に異なるプローブＤＮＡを固定化できるようになっている。参照電極１にはＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用い、第一の対極３と第二の対極４には白金電極を用いた。
【００３６】
最初に作用電極２の上にプローブＤＮＡ１１を固定化する。作用電極２には表面の均一性が求められ、更に電極としての安定性が求められるので、本実施の形態では金電極を用いた。
【００３７】
作用電極２を水洗後、容器５に５０ｍＭ縫い込み型インターカレータを含む電解質溶液６を入れ、参照電極１、作用電極２、第一の対極３を電解質溶液６に浸す。ポテンシオスタット７をコンピュータ（図示せず）で制御することにより参照電極１を基準として作用電極２の電極電位を変化させ、ディファレンシャルパルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）にて一本鎖における電流値（Ｉ０）を測定する。この際得られたＩ０は電極表面に固定化された一本鎖ＤＮＡ量に相関するものである。
【００３８】
次いで、容器５を洗浄し、所定濃度のターゲットＤＮＡ反応溶液（電解質溶液６）を容器５に満たし、ハイブリダイゼーションを行う。このとき、コンピュータ制御によりポテンシオスタット７を操作し、作用電極２の電位を電解電流の流れない平衡電極電位に固定する。さらに直流電圧電流電源８によって、作用電極２を高電位側、第二の対極４を低電位側にして作用電極２と第二の対極４との間に電圧を印加することにより反応溶液６に電界を印加する。これにより−（マイナス）に帯電するターゲットＤＮＡ１２は容器内で＋（プラス）に帯電する作用電極２に引き寄せられ、作用電極２上のプローブＤＮＡ１１との反応機会が増え、反応効率が高くなる。これによりハイブリダイゼーション反応の短時間化を可能にする。反応中はペルチェ素子（図示せず）により容器５を下部より加熱し、反応温度を一定に保つ。直流電圧電流電源８はコンピュータに繋がっていて、電源のＯＮ／ＯＦＦと印加電圧値をコンピュータで制御できる。
【００３９】
ハイブリダイゼーション終了後、容器５内の反応溶液６を捨てる。この際、未反応のターゲットＤＮＡ１２はハイブリダイゼーション反応溶液６と一緒に排出される。次いで容器５を軽く洗浄後、５０ｍＭ縫い込み型インターカレータを含む電解質溶液６を入れ、再度ＤＰＶにて二本鎖における電流値（Ｉ）を測定する。そして、得られたＩおよびＩ０から電流増加割合ΔＩを算出｛ΔＩ＝１００×（Ｉ−Ｉ０）／Ｉ０｝し、このΔＩからハイブリッド形成量を算出する。
なお、本発明は上記実施の形態に限定されるものではない。
【００４０】
実施例では作用電極２を複数本備える構造を例に説明したが、単一の作用電極２の場合でもよい。また、第一の対極３、第二の対極４としては、白金以外の材質でも良い。金属によって良導電体となっているものであればよく、例えば、ガラスのような絶縁体の基板に金属を被覆したものでもよい。さらに、表面に金属が露出している必要はなく、金属を溶液から守るため金属の表面に薄い誘電体を被覆する等していても、金属支持体から溶液に電荷を供給することができる程度の良導電体となっているものであればよい。さらに、参照電極においてはＡｇ／ＡｇＣｌ電極以外である場合もある。
【００４１】
また、ＤＮＡ量の測定は、縫い込み型インターカレータを用いたＤＰＶ以外の電気分析法の場合もある。
【００４２】
また、ここでは支持体上に固定したプローブＤＮＡと、ターゲットＤＮＡとをハイブリダイゼーション反応させる場合を例にして説明するが、本発明はこれに限られない。支持体上にターゲットＤＮＡを固定し、ハイブリダイゼーション反応溶液中の標識したプローブＤＮＡとハイブリダイゼーション反応をさせる場合もある。また、ＤＮＡとＲＮＡとのハイブリダイゼーションの場合もある。さらにはＤＮＡあるいはＲＮＡ以外の生体物質である場合もある。
【００４３】
【発明の効果】
本発明は、参照電極と作用電極と第一の対極とをポテンシオスタットを用いて電位制御し、特に作用電極の電位を制御し、その状態で第二の対極と作用電極との間の電場を制御し、作用電極と第二の対極との間で電気泳動を行う構造としたことによって、下記の効果を有する。
（１）作用電極近傍におけるターゲットＤＮＡの濃度が高くなり、作用電極上に修飾されたプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応が短時間で効率的に行われる。
（２）電解反応が起こらないような電位に作用電極の電極電位を制御しているため、作用電極上に修飾されているプローブＤＮＡや作用電極近傍に濃縮されたターゲットＤＮＡが電解反応をして分解されることがない。
（３）作用電極と第二の対極との間に発生させる電場の極性を逆転させることによって、作用電極上に修飾されたプローブＤＮＡと結合しなかった分析物や反応物を速やかに除去することができ、測定の信頼性を高めることができる。
（４）電場の強度調整によって非相補的塩基を含む非特異的ＤＮＡの結合などを選択的に排除することができ、測定の信頼性を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明を実施した実施例の電場制御装置の概略構成を説明する図である。
【図２】従来例の電場制御装置の概略構成を説明する図である。
【図３】図１の実施形態における作用電極部分を説明する図である。
【図４】従来例の電場制御装置の作用電極部分を説明する図である。
【符号の説明】
１　参照電極
２　作用電極
３　第一の対極
４　第二の対極
５　容器（電解セル）
６　電解質溶液（反応液）
７　ポテンシオスタット
８　直流電圧電流電源
９　参照電極を基準にして設定された作用電極の電位
１０　対極
１１　プローブＤＮＡ
１２　ターゲットＤＮＡ
１３　特異的な二本鎖結合
１４　蛍光標識
１５　金属酸化物層
１６　透過膜
【図１】
2004089186.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
2004089186.tif 000006