(57)【要約】【課　　題】本発明は、グルコース及びセロビオースを併行的に資化できるコリネ型細菌を提供することを目的とする。【解決手段】セロビオースの細胞外から細胞内への取り込みを可能とするホスホトランスフェラーゼ系セロビオース資化酵素ＩＩを有することを特徴とするセロビオース資化性コリネ型細菌。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セロビオースの細胞外から細胞内への取り込みを可能とするホスホトランスフェラーゼ系セロビオース資化酵素ＩＩを有することを特徴とするセロビオース資化性コリネ型細菌。
【請求項２】
セロビオースの細胞外から細胞内への取り込みを可能とするホスホトランスフェラーゼ系セロビオース資化酵素ＩＩが、配列番号１で表される野生型のコリネ型細菌が有するホスホトランスフェラーゼ系酵素ＩＩ蛋白のアミノ酸配列における、少なくとも一のバリンが、アラニンまたはメチオニンに置換されているものであることを特徴とする請求項１に記載のセロビオース資化性コリネ型細菌。
【請求項３】
配列番号１で表される野生型のコリネ型細菌が有するホスホトランスフェラーゼ系酵素ＩＩ蛋白のアミノ酸配列の３１７位のバリンが、アラニンまたはメチオニンに置換されている配列番号２または３で表されるホスホトランスフェラーゼ系セロビオース資化酵素ＩＩを有することを特徴とする請求項１または２に記載のセロビオース資化性コリネ型細菌。
【請求項４】
セロビオース資化性コリネ型細菌が、野生型のコリネ型細菌の自然突然変異により野生型のコリネ型細菌から取得されることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のセロビオース資化性コリネ型細菌。
【請求項５】
セロビオース資化性コリネ型細菌が、ホスホトランスフェラーゼ系酵素ＩＩ蛋白の発現をコードする遺伝子の組換えにより、野生型のコリネ型細菌から取得されることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のセロビオース資化性コリネ型細菌。
【請求項６】
配列番号１で表される野生型のコリネ型細菌が有するホスホトランスフェラーゼ系酵素ＩＩ蛋白のアミノ酸配列の３１７位のバリンを、アラニンまたはメチオニンに置換して、野生型のコリネ型細菌から取得されることを特徴とする請求項１〜５に記載のセロビオース資化性コリネ型細菌。
【請求項７】
配列番号２または３で表される塩基配列を含むＤＮＡを有する組換え発現プラスミドを、野生型のコリネ型細菌に導入して得られることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のセロビオース資化性コリネ型細菌。
【請求項８】
発現プラスミドに使用されるプロモーターがグルコースによる抑制作用を受けない請求項７に記載のセロビオース資化性コリネ型細菌。
【請求項９】
使用されるプロモーターがｌａｃプロモーターである請求項８に記載のセロビオース資化性コリネ型細菌。
【請求項１０】
配列番号２または３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白をコードするＤＮＡを有する組換え発現プラスミド。
【請求項１１】
使用されるプロモーターがグルコースによる抑制作用を受けない請求項１０に記載の組換え発現プラスミド。
【請求項１２】
使用されるプロモーターがｌａｃプロモーターである請求項１１に記載の組換え発現プラスミド。
【請求項１３】
炭素源としてグルコースとセロビオースを併行的にかつ同時に資化することができる微生物。
【請求項１４】
微生物がコリネ型細菌である請求項１３に記載の微生物。
【請求項１５】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ｐＣｂｇｌＦ３１７ＡＡ　（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ―１８９７９）。
【請求項１６】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　　Ｒ−ＣＥＬ（受託番号：ＦＥＲＭ　Ｐ―１８９７７）及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ−ＣＥＬ２（受託番号：ＦＥＲＭ　Ｐ―１８９７８）。
【請求項１７】
配列番号２または３で表されるＤＮＡの塩基配列によりコードされるホスホトランスフェラーゼ系セロビオース資化酵素ＩＩ蛋白。
【請求項１８】
ストリンジェントな条件下で配列番号２または３で表されるＤＮＡの塩基配列にハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるホスホトランスフェラーゼ系セロビオース資化酵素ＩＩ蛋白。
【請求項１９】
請求項１〜３のいずれかに記載のセロビオース資化性コリネ型細菌を、セロビオースまたは／およびグルコースを炭素源として含有する培地で培養し、培養物から発酵又は反応生産物を取得することを特徴とする発酵方法又は反応方法。
【請求項２０】
発酵又は反応生産物が、アミノ酸、有機酸、アルコール、核酸、生理活性物質または有機性ガスから選ばれる一または二以上であることを特徴とする請求項１９に記載の発酵方法又は反応方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はセロビオース資化性微生物に関する。より詳しくは、新規なセロビオース資化性コリネ型細菌に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在エネルギー源として主として利用されている石油や石炭などの化石燃料は、いずれ枯渇すると考えられ、２１世紀の人口増加及びそれに伴うエネルギー消費の増大を考えると、太陽エネルギーと大気中の炭酸ガスから生成される再生可能なバイオマス資源を有効利用することが、環境問題やエネルギー資源問題の観点より非常に重要な問題となっている。特に、地球環境保全（炭酸ガス増加抑制）の面から、また量的規模（賦存量及び年間生成量）から見て、セルロース系バイオマスを中心としたバイオマスの有効利用は必須の課題である。セルロース系バイオマス資源は澱粉資源とは異なり、セルロース系バイオマスを生物的方法により有用な化学品やエネルギー製品に変換するには、セルロース系バイオマスを先ず、生物が利用可能な物質にまで転換しておく必要がある。しかし、その変換の際にグルコース以外の糖（キシロース、マンノースやセロビオース等β−グルコシド等）が生成し、これを微生物が資化できないため、充分な利用が出来ていないのが現状である。
【０００３】
セルロース系バイオマスを生物が利用可能な物質にまで変換する方法として加圧熱水加水分解法（特開２０００−１８６１０２）、無機酸による酸加水分解法（特開平０８−２９９０００）、セルラーゼやリグニン分解酵素等の分解機能の異なる種々のセルラーゼ複合酵素系による酵素加水分解法（特開平０５−２２７９５８、特開平０８−０８９２７４）等がある。これらの加水分解処理によりセルロース系バイオマスはグルコース等の単糖類やグルコースの二量体であるセロビオースなどに部分分解される。グルコースは多くの微生物により容易に資化され、微生物の代謝システムに輸送されてエタノールや乳酸などのエネルギー製品や有用化学品に変換（発酵又は反応）することができるが、セロビオースは多くの微生物にとって資化そのものが困難である。しかし酸加水分解法において、部分的に生成してしまうセロビオース等のセルロースオリゴマーをさらに分解してグルコース収率を高めようとすれば、グルコースの過分解も生じてしまい返って逆効果となる。従って、グルコースだけでなくセロビオースをも同様に資化することができ、有用な各種の発酵又は反応産物等に併行的に変換することのできる単一の微生物が得られれば、セルロース酸加水分解時におけるグルコース収率を高める必要が無く、また酵素加水分解法では、セルラーゼ複合酵素系のうちの一種の酵素―セロビオース分解酵素（β―グルコシダーゼ）―を使用しなくてもよくなり、高価な加水分解酵素使用量を低減化できるため、セルロース系バイオマス資源のより経済的かつ合理的な利用効率の向上が図れる。
【０００４】
微生物による糖類の資化能に関しては、プロトンやＡＴＰをエネルギー源として特異的な膜タンパクが糖類の膜透過を仲介する能動輸送系と、ホスホエノールピルビン酸をエネルギー源として糖類をリン酸化して細胞内に取りこむホスホトランスフェラーゼ酵素輸送系（ＰＴＳ）がよく知られており、特にエネルギー的に効率の良いＰＴＳに関する研究が多くなされている　（　Ｐａｖｅｌ　Ｋｏｔｒｂａ，　Ｍ．　Ｉｎｕｉ，　Ｈ．　Ｙｕｋａｗａ，　（　２００１　）　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　（ＰＴＳ）　ｉｎ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｕｐｔａｋｅ　ａｎｄ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｃａｒｂｏｎ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．　Ｊ．　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　９２，　５０２−５１７　参照）。ＰＴＳは、細胞質性の酵素ＩとＨＰｒという２つの蛋白と酵素ＩＩ複合体蛋白からなる。酵素Ｉによりホスホエノールピルビン酸のリン酸がＨＰｒに受け渡される。該リン酸は酵素ＩＩ複合体を構成するＩＩＡ、ＩＩＢ及びＩＩＣドメインを介して最終的に細胞外に存在する糖をリン酸化して、糖を細胞内に取り込む。酵素ＩとＨＰｒは微生物一般に共通する蛋白であるが、酵素ＩＩは取り込む糖に対して基質特異性を有する蛋白である。
【０００５】
ＰＴＳを用いてセロビオースを資化する微生物に関連する公知技術として、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ及び組換え微生物にとって外来性のクレブシエラ・オキシトカ（　Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｏｘｙｔｏｃａ　）由来のホスホ−β−グルコシダーゼ及び（ホスホエノールピルビン酸―依存性ホスホトランスフェラーゼ系）セロビオース資化酵素ＩＩを発現する組換え微生物によるセロビオースからのエタノール生成技術（特表２００１−５１９６６２号公報）、土壌試料から単離された酵母―ブレタノミセス・クステルシィ（　Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ　ｃｕｓｔｅｒｓｉｉ　）（　ＡＴＣＣ　Ｎｏ．３４４４７　）−を用いるセロビオースやグルコースからのエタノール発酵技術（特開平０５−２０７８８５号公報）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　）菌株を用いるセロビオースや５単糖からのエタノール発酵技術（特許２７７９１９１号公報）そしてＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｌｌｏｂｉｏｖｏｒｕｓ　ＮＲＲＬ　Ｙ−１２５０９やＫｌｏｅｃｋｅｒａ　ａｐｉｃｕｌａｔａ　ＮＲＲＬＹ−１２５１０を用いるセロビオースやキシロースからのエタノール発酵技術（米国特許４，４７２，５０１号公報）等があるが、上記公知技術はセロビオース資化機能を有する微生物に関するものであり、本発明の如くセロビオース資化に関与する遺伝子の構造を解明し、工業的発酵及び反応による生産に適しているコリネ型細菌を用いて該遺伝子を発現させてセロビオースを資化できる技術はこれまで全く知られていない。また、本発明のセロビオース資化性コリネ型細菌ではセロビオースとグルコースを同時に同等の速度で資化することも出来るのでセルロース系バイオマスの加水分解物を非常に効率よく転換利用することを実現できる。従って、本発明によるセロビオース資化性コリネ型細菌にさらにエタノールや乳酸等の発酵又は反応機能を付与したり、あるいはその同化経路産物の一つであるコハク酸等をより選択的に生成する機能を付加的に発揮させれば、セルロース系バイオマス資源を高度に有効利用する経済的なバイオプロセスの構築が実現できる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、セロビオース資化性を有するコリネ型細菌を提供することを目的とする。また、本発明はグルコース及びセロビオースを併行的に資化できるコリネ型細菌を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意検討を行った結果、これまでセロビオース資化機能を有することが知られていなかったコリネ型細菌が、特定の条件下ではセロビオース資化能を有する微生物に変異することを見出した。さらに、そのセロビオース資化に関与する遺伝子の構造や発現機作を解明した結果、セロビオース資化性コリネ型変異株はその野生株のホスホトランスフェラーゼ系酵素ＩＩ蛋白のアミノ酸配列の一のバリンがアラニンまたはメチオニンに置換された構造の該酵素蛋白を有するという知見を発見し、更には該アミノ酸配列に、変異株の有するものとは異なる特定の遺伝子発現プロモーターを連結して構築した発現ベクターをコリネ型細菌に導入することによって、該形質転換体がグルコースとセロビオースを併行的にかつ同時に同等の速度で資化できることを見出し、本発明者らはさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、
（１）　セロビオースの細胞外から細胞内への取り込みを可能とするホスホトランスフェラーゼ系セロビオース資化酵素ＩＩを有することを特徴とするセロビオース資化性コリネ型細菌、
（２）　セロビオースの細胞外から細胞内への取り込みを可能とするホスホトランスフェラーゼ系セロビオース資化酵素ＩＩが、配列番号１で表される野生型のコリネ型細菌が有するホスホトランスフェラーゼ系酵素ＩＩ蛋白のアミノ酸配列における、少なくとも一のバリンが、アラニンまたはメチオニンに置換されているものであることを特徴とする前記（１）に記載のセロビオース資化性コリネ型細菌、
（３）　配列番号１で表される野生型のコリネ型細菌が有するホスホトランスフェラーゼ系酵素ＩＩ蛋白のアミノ酸配列の３１７位のバリンが、アラニンまたはメチオニンに置換されている配列番号２または３で表されるホスホトランスフェラーゼ系セロビオース資化酵素ＩＩを有することを特徴とする前記（１）または（２）に記載のセロビオース資化性コリネ型細菌、
（４）　セロビオース資化性コリネ型細菌が、野生型のコリネ型細菌の自然突然変異により野生型のコリネ型細菌から取得されることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれかに記載のセロビオース資化性コリネ型細菌、
（５）　セロビオース資化性コリネ型細菌が、ホスホトランスフェラーゼ系酵素ＩＩ蛋白発現をコードする遺伝子の組換えにより、野生型のコリネ型細菌から取得されることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれかに記載のセロビオース資化性コリネ型細菌、に関する。
【０００９】
また本発明は、
（６）　配列番号１で表される野生型のコリネ型細菌が有するホスホトランスフェラーゼ系酵素ＩＩ蛋白のアミノ酸配列の３１７位のバリンを、アラニンまたはメチオニンに置換して、野生型のコリネ型細菌から取得されることを特徴とする前記（１）〜（５）に記載のセロビオース資化性コリネ型細菌、
（７）　配列番号２または３で表される塩基配列を含むＤＮＡを有する組換え発現プラスミドを、野生型のコリネ型細菌に導入して得られることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれかに記載のセロビオース資化性コリネ型細菌、
（８）　発現プラスミドに使用されるプロモーターがグルコースによる抑制作用を受けない前記（７）に記載のセロビオース資化性コリネ型細菌、
（９）　使用されるプロモーターがｌａｃプロモーターである前記（８）に記載のセロビオース資化性コリネ型細菌、
（１０）　配列番号２または３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白をコードするＤＮＡを有する組換え発現プラスミド、
（１１）　使用されるプロモーターがグルコースによる抑制作用を受けない前記（１０）に記載の組換え発現プラスミド、
（１２）　使用されるプロモーターがｌａｃプロモーターである前記（１１）に記載の組換え発現プラスミド、
に関する。
【００１０】
さらに本発明は、
（１３）　炭素源としてグルコースとセロビオースを併行的にかつ同時に資化することができる微生物、
（１４）　微生物がコリネ型細菌である前記（１３）に記載の微生物、
（１５）　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ｐＣｂｇｌＦ３１７ＡＡ　（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ―１８９７９）、
（１６）　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　　Ｒ−ＣＥＬ（受託番号：ＦＥＲＭ　Ｐ―１８９７７）及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ−ＣＥＬ２（受託番号：ＦＥＲＭ　Ｐ―１８９７８）、
（１７）　配列番号２または３で表されるＤＮＡの塩基配列によりコードされるホスホトランスフェラーゼ系セロビオース資化酵素ＩＩ蛋白、
（１８）　ストリンジェントな条件下で配列番号２または３で表されるＤＮＡの塩基配列にハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるホスホトランスフェラーゼ系セロビオース資化酵素ＩＩ蛋白、
（１９）　前記（１）〜（３）のいずれかに記載のセロビオース資化性コリネ型細菌を、セロビオースまたは／およびグルコースを炭素源として含有する培地で培養し、培養物から発酵又は反応生産物を取得することを特徴とする発酵方法又は反応方法、
（２０）　発酵又は反応生産物が、アミノ酸、有機酸、アルコール、核酸、生理活性物質または有機性ガスから選ばれる一または二以上であることを特徴とする前記（１９）に記載の発酵方法又は反応方法、
に関する。
【００１１】
【発明の実施の態様】
本発明にかかるセロビオース資化性コリネ型細菌は、コリネ型細菌の野生株をセロビオースを唯一の炭素源として含有する培地で培養し、該培地で増殖するコロニーを変異株として選択することにより、取得することができる。ここで、本発明における、「コリネ型細菌（　Ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ　ｂａｃｔｅｒｉａ　）」とはバージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔（　Ｂａｒｇｅｙｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）　、８　、５９９　（　１９７４　）　〕に定義されている一群の微生物であり、好気性、グラム陽性、非抗酸性、胞子形成能を有さない桿菌を意味し、その具体例として、例えばブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（　Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ　）　ＡＴＣＣ６８７１、ブレビバクテリウム・デイバリカタム　（　Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ　）　ＡＴＣＣ１４０２０、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム　（　Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ　）　ＡＴＣＣ１３８６９　、ブレビバクテリウム・リネンス　（　Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｉｎｅｎｓ　）　ＡＴＣＣ９１７４、ブレビバクテリウム・フラバム　（　Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ　）　ＡＴＣＣ１３８２６　、ブレビバクテリウム・フラバム　（　Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ　）　ＭＪ−２３３　（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１４９７）　、コリネバクテリウム・グルタミカム　（　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　）　ＡＴＣＣ１３０３２、同ＡＴＣＣ１３０６０、コリネバクテリウム・リリウム　（　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｉｌｉｕｍ　）　ＡＴＣＣ１５９９０、コリネバクテリウム・メラセコラ　（　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ　）　ＡＴＣＣ１７９６５　等を挙げることができる。
【００１２】
本発明における、野生型のコリネ型細菌からのセロビオース資化性コリネ型細菌変異株の取得方法は特に限定されないが、それ自体公知の手法を用いてよい。具体的には、野生型のコリネ型細菌を一定の条件下で培養することにより、自然突然変異を誘発し変異株を取得することが好ましい。更に具体的には、野生型コリネ型細菌を、変異株選択用培地に植菌後、２８〜３７℃、好ましくは３３℃で培養器内で好気的に培養し、本培地に増殖する自然突然変異株コロニーを取得することによって行われて良い。本発明で用いられる変異株選択用培地としては、セロビオースを唯一の炭素源として含有し、微生物の生育に必要な最小限の各種栄養源で構成される最少寒天培地例えばＢＴ培地、ＭＭ培地、Ｍ９培地等であることが好ましい。また、変異株取得率の向上を目的として、野生型コリネ型細菌をＸ線、γ線、または紫外線等で照射するか、あるいはＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異誘起剤等で変異処理を施した後、上記の変異株選択用寒天培地に増殖する変異株コロニーを取得しても良い。変異誘起剤による変異処理は、公知の手法に従ってよい。野生株および変異株を通常に培養および保存する場合は、通常の微生物の培養に用いられる培地、例えば硫酸アンモニウム、リン酸カリウム等の無機塩からなる組成に、必要に応じて肉エキス、酵母エキス等の天然栄養源を含む組成からなる一般寒天培地、例えばＮＡ、ＬＡ等を用いることができる。
【００１３】
得られたセロビオース資化性コリネ型細菌変異株のコロニーは、上記の一般寒天培地等に植菌され保存されてよいが、所望により、さらにセロビオースを唯一の炭素源として含有する最少寒天培地に植菌され、より安定な変異株が取得されても良い。セロビオース資化性コリネ型細菌変異株の保存方法は特に限定されず、それ自体公知の方法に従ってよい。具体的には、選択用寒天培地または一般寒天培地上に植菌された状態で５℃付近にて冷蔵保存、または変異株のコロニーを上記最少培地と同組成（寒天を除く）の液体培地、生理食塩水または蒸留水に懸濁し、保存剤である２５重量％の滅菌済みグリセロールと混合してねじ蓋付滅菌チューブ内に入れ−８０℃にて冷凍、または２４重量％のスクロースを保存剤として凍結乾燥され、５℃付近で保存されてもよい。
【００１４】
以上に述べた本発明にかかるセロビオース資化性コリネ型細菌変異株の取得の好ましい態様として、コリネ型細菌の野生株Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒからの取得が挙げられる。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒは、ブタペスト条約に基づいて、平成１４年８月２０日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）に受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９７６として寄託されている。
コリネ型細菌の中でも、例えばＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３０３２やＡＴＣＣ１３８６９は、セロビオースは勿論のこと他のサリシン（　Ｓａｌｉｃｉｎ；２　−　（　Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ　）　ｐｈｅｎｙｌ−β−Ｄ−　ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ　）やアルブチン（　Ａｒｂｕｔｉｎ；４　−　Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ−β−Ｄ−　ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ　）等いずれのβ―グルコシドも資化できないが、一方　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒはセロビオースの資化能は有しないものの、サリシンやアルブチンを資化する能力を有している。このことから、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒにはβ―グルコシドの資化に関与する遺伝子が存在することが示唆され、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒからのセロビオース資化性コリネ型細菌変異株が効率よく取得できることを期待できる。
【００１５】
以上に述べた本発明における、野生型のコリネ型細菌から取得される、最も好ましいセロビオース資化性コリネ型細菌変異株の態様として、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ−ＣＥＬおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ−ＣＥＬ２が挙げられる。かかる細菌は、実施例に記載の方法で得ることができる。またこれらの細菌は、ブタペスト条約に基づいて、平成１４年８月２０日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）に受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９７７およびＦＥＲＭ　Ｐ−１８９７８として寄託されている。
【００１６】
野生型のコリネ型細菌および野生型のコリネ型細菌から取得したセロビオース資化性コリネ型細菌変異株からの染色体ＤＮＡの抽出・単離は、それ自体公知の方法に従ってよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　ｅｔ．　ａｌ．　１９８９．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ：　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ，　２ｎｄ　ｅｄ．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　ＮＹ　に記載の方法、あるいはこれに準じた方法によって行われてよい。
【００１７】
野生型のコリネ型細菌から取得したセロビオース資化性コリネ型細菌変異株の染色体ＤＮＡからのセロビオース資化能に関与するＤＮＡ領域を含むＤＮＡ断片を以下に述べる手法により単離することができる。まず適当な制限酵素で処理した該染色体ＤＮＡを、同じ制限酵素あるいは同じ接着末端を生じさせる制限酵素で処理したプラスミドＤＮＡあるいはファージＤＮＡ等のベクターに組み込んでプラスミドバンクを作成する。プラスミドバンクのベクターを微生物に導入し、目的とするＤＮＡ断片を有するベクターを形質転換された形質転換体のみを選択する。該形質転換体から目的のＤＮＡ断片を有するベクターを抽出し、このベクターから目的とするＤＮＡ断片を分離することによって達成される。また、該領域を含むＤＮＡ断片は、既知のホスホトランスフェラーゼ系酵素ＩＩの塩基配列に基づいて適当に設計された合成ＤＮＡプライマーを鋳型として用いてハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法などにより取得することもできる。
【００１８】
野生型のコリネ型細菌から取得したセロビオース資化性コリネ型細菌変異株の染色体ＤＮＡを制限酵素処理する場合、制限酵素の種類および数は特に限定されないが、既知のホスホトランスフェラーゼ系酵素ＩＩをコードするＤＮＡの塩基配列中に切断サイトを有しない制限酵素のうち、一または二種類が選択されるのがよい。選択された制限酵素によるセロビオース資化性コリネ型細菌変異株の染色体ＤＮＡの制限酵素処理、および切断ＤＮＡ断片と、同じ制限酵素あるいは同じ接着末端を生じさせる制限酵素で処理したプラスミドＤＮＡあるいはファージＤＮＡとの連結は、それ自体公知の方法、例えば、モレキュラー・クローニング第２版に記載の方法に従ってよい。
【００１９】
上記の制限酵素処理により切断したＤＮＡ断片を連結するプラスミドＤＮＡあるいはファージＤＮＡとしては、コリネ型細菌中で自律複製可能で、かつコリネ型細菌間およびコリネ型細菌と他の細菌間で移動可能なシャトルベクターであればいかなるものでもよい。例えばブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム２２５６由来のｐＡＭ３３０（特開昭５８−６７６９９　、Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　ｖｏｌ．　４８，　　２９０１−２９０３　（　１９８４　）　及びＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｓｙｍｐ　Ｓｅｒ．　ｖｏｌ．　１６，　２６５−２６７　（　１９８５　）、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０５８由来のｐＨＭ１５１９（　Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　ｖｏｌ．　４８，　２９０１−２９０３　（　１９８４　））、ｐＣＲＹ３０（　Ａｐｐｌ．　　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｖｏｌ．　５７，　７５９−７６４　（　１９９１　））、コリネバクテリウム・グルタミカムＴ２５０由来のｐＣＧ４（特開昭５７−１８３７９９、Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　Ｖｏｌ．　１５９，　３０６−３１１（　１９８４　））、ｐＡＧ１、ｐＡＧ３、ｐＡＧ１４、ｐＡＧ５０（　特開昭６２−１６６８９０　）、ｐＥＫ０、ｐＥＣ５、ｐＥＫＥｘ１（　Ｇｅｎｅ　ｖｏｌ．　１０２，　９３−９８（　１９９１　））等、あるいはそれらから誘導されるプラスミド等が使用可能である。
本発明においては、コリネ型細菌と大腸菌（　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）のシャトルベクターで、ｐＨＳＧ３９８（宝酒造製）から誘導されたｐＫＰ１（ＷＯ０１／９６５７３参照）を用いるのが好ましい。
【００２０】
上記に述べる本発明の最も好ましい態様としては、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ−ＣＥＬ及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ−ＣＥＬ２から抽出した染色体ＤＮＡを、既知のホスホトランスフェラーゼ系酵素ＩＩの塩基配列中に切断サイトが存在しない制限酵素ＳａｌＩで切断し、同様にＳａｌＩで切断したシャトルベクターｐＫＰ１に連結し、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ−ＣＥＬ及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ−ＣＥＬ２の各々に対応した組換えベクターＤＮＡのＳａｌＩプラスミドバンクを作成することが好ましい。
【００２１】
組換えベクターＤＮＡの宿主は、特に限定されず、コリネ型細菌、エシェリシア（　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　）属、バチルス（　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）属、エンテロバクター（　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　）属等の原核生物、サッカロミセス（　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　）属等の酵母や糸状菌等の真核生物など、微生物による発酵技術における発酵又は反応生産物生産菌として産業上有用な微生物が挙げられるが、好ましくはコリネ型細菌、特に好ましくはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍが挙げられる。このようにコリネ型細菌を宿主として用いることにより、上述の作成した組換えベクターＤＮＡを宿主内で有効に発現することができ、さらに宿主としてＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍを用いることにより、該組換えベクターＤＮＡが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ染色体ＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を有するセルフクローニングベクターとなることから、より有効な組換えベクターＤＮＡの発現を期待することができる。宿主の培養条件は、宿主の種類に応じて当業界で通常行われている条件に従って行われてよい。
【００２２】
目的とするセロビオース資化能獲得に関与する蛋白をコードするＤＮＡ断片を有する組換えベクターを形質転換された形質転換体を選択する方法は、特に限定されないが、目的とするＤＮＡ断片を含むベクターを形質転換された形質転換体のみを、容易に選択できる手法によるものが好ましい。また形質転換体の培養条件は、宿主として用いる微生物の種類に応じて当業界で通常行われている条件に従って行われてよいが、その際、導入された組換えベクターの形質転換体からの脱落を防ぐため、形質転換体を培養する培地はセロビオースを唯一の炭素源として含有することが望ましい。
【００２３】
上記における本発明における好ましい実施の態様としては、組換えベクターＤＮＡを導入する宿主としては、コリネ型細菌の中でもβ−グルコシドの資化性を示さないＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３８６９　を用いて目的とする形質転換体を得ることが望ましい。これは、本株自体はセロビオースを唯一の炭素源として含有する最少寒天培地（形質転換体選択用培地）で増殖することができないため、本株を宿主として用いることにより、セロビオース資化能獲得に関与する蛋白をコードする挿入ＤＮＡ断片を有する組換えベクターを形質転換された形質転換体のみが該培地で増殖することができ、該形質転換体を容易に選択できるからである。
【００２４】
組換えベクターＤＮＡの宿主への導入方法としては、上記宿主細胞にベクターＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、電気パルス法（Ｙ．　Ｋｕｒｕｓｕ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　５４：　４４３−４４７，１９９０）、カルシウムイオンを用いる方法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　６９，　２１１０　（１９７２））、プロトプラスト法（　特開昭６３−２４８３９４２　）、エレクトロポレーション法（　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１６，　６１２７　（１９８８））等をあげることができる。
【００２５】
目的とするセロビオース資化性コリネ型細菌変異株のセロビオース資化能獲得に関与する蛋白をコードするＤＮＡ断片を有する組換えベクターＤＮＡを形質転換された形質転換体から、該組換えベクターＤＮＡを抽出し、該組換えベクターＤＮＡに含まれるセロビオース資化能獲得に関与する蛋白をコードする挿入ＤＮＡ断片を単離することによって、該ＤＮＡ断片の解析及び塩基配列を決定することができる。該組換えベクターＤＮＡの形質転換体からの抽出は、それ自体公知の方法に従ってよく、例えば、アルカリ−ＳＤＳ法等（　Ｔ．　　Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｅ．　Ｆ．　Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ，　ｐ．　９０−９１　（　１９８２　）　参照）を用いるのが良い。
【００２６】
上記形質転換体から抽出された組換えベクターに含まれるセロビオース資化能獲得に関与する蛋白をコードする挿入ＤＮＡ断片の大きさに関する解析は、該組換えベクターＤＮＡを、連結に用いたのと同じ制限酵素の存在下で完全分解し、分解物をそれ自体公知の方法に従いアガロースゲル電気泳動に供して行ってよい。アガロースゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒア・コリのラムダファージ（λｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、切断ＤＮＡ断片の各ＤＮＡ断片の大きさが算出される。アガロースゲルの濃度は、０．２〜１．０重量％であることが望ましく、大きさを決定される切断ＤＮＡ断片の大きさに応じて変更されるのが好ましい。なお、大きさを決定される切断ＤＮＡ断片の大きさが１ｋｂ未満である場合には、４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を採用しても良い。
大きさが決定されたＤＮＡ断片を上記泳動ゲルより抽出することにより、特定の大きさを有するＤＮＡ断片を取得することができる。
【００２７】
塩基配列の決定は、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシヌクレオチド酵素法（　ｄｉｄｅｏｘｙｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　法）〔　Ｓａｎｇｅｒ　Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７４，　５４６３　（　１９７７　）］、例えばパーキン・エルマー社製のダイプライマーサイクルシーケンスキット等用い、更にこれらの決定された個々の配列の連結を、パーキン・エルマー社製のシークエンス解析ソフト　オートアッセンブラー（Ａｕｔｏａｓｓｅｍｂｌｅｒ）等を用いて行うのが好ましい。
また、上記において決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、ＰＣＲ法を用いて合成することによっても目的とするＤＮＡ断片を調製することもできる。
【００２８】
上記における本発明の好ましい実施の態様としては、形質転換体より抽出した、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ−ＣＥＬまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ−ＣＥＬ２のセロビオース資化能獲得に関与する蛋白をコードする挿入ＤＮＡ断片を含む組換えベクターＤＮＡをＳａｌＩで切断して挿入ＤＮＡ断片部分を単離し、アガロース電気泳動に供して挿入ＤＮＡ断片の大きさを決定し、塩基配列を決定するのが好ましい。ついで、決定された該塩基配列と相同性を有し、かつ該挿入ＤＮＡ断片と同じ大きさを有するＳａｌＩ切断ＤＮＡ断片を、野生株のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒの染色体ＤＮＡから単離して塩基配列を決定し、該塩基配列とＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ−ＣＥＬまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ−ＣＥＬ２由来のセロビオース資化能獲得に関与する蛋白をコードするＤＮＡ断片の塩基配列とを比較することにより、セロビオース資化能獲得に関与する蛋白をコードするＤＮＡ断片における塩基配列の変異点の解析を行うことができる。
【００２９】
決定されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ−ＣＥＬまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ−ＣＥＬ２由来のＤＮＡの塩基配列と相同性を有し、かつ該挿入ＤＮＡ断片と同じ大きさを有するＳａｌＩ切断ＤＮＡ断片を、野生株のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒの染色体ＤＮＡから単離する方法としては、該塩基配列を鋳型として、ＰＣＲ法により行われるのが好ましく、具体的にはパーキンエルマーシータス社製のＤＮＡサーマルサイクラー等を用いて行われるのが好ましい。
【００３０】
本発明に係る野生型のコリネ型細菌から得られたセロビオース資化性コリネ型細菌変異株のセロビオース資化能獲得に関与する蛋白をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片における最も好ましい塩基配列の態様としては、配列番号２または配列番号３を挙げることができる。また、該ＤＮＡ断片と相同性を有する野生型のコリネ型細菌由来のＤＮＡ断片における最も好ましい塩基配列の態様としては、配列番号１の塩基配列を挙げることができる。これらの塩基配列と、公知のホスホトランスフェラーゼ系酵素の遺伝子の塩基配列との相同性を比較することにより、上記のＤＮＡ断片らがホスホトランスフェラーゼ系酵素をコードする遺伝子であることが確認され、また配列番号２または３で表されるアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列中のホスホトランスフェラーゼ系酵素ＩＩのアミノ酸配列の３１７位のバリンが、アラニンまたはメチオニンに置換されたものであることが確認された。
【００３１】
配列番号１、２または３で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片は、３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）から成るオペロンを有し、それぞれｂｇｌＦ，ｂｇｌＡ、ｂｇｌＧと名づけ、その構成図を模式的に図１および詳細に図６〜１０に示した。既知のホスホトランスフェラーゼ系酵素との比較により、ｂｇｌＦは、ホスホトランスフェラーゼ系酵素ＩＩ（　ＰＴＳ　ＥｎｚｙｍｅＩＩ（酵素ＩＩ））遺伝子，ｂｇｌＡはホスホ−β−グルコシダーゼ（　ｐｈｏｓｐｈｏ−β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ　）遺伝子、ｂｇｌＧはトランスクリプショナルアンチターミネーター（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｎｔｉｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　）と推定され、配列番号２または３で表される塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列中のｂｇｌＦ（ホスホトランスフェラーゼ系酵素ＩＩ）の一塩基置換誘導体であることが確認される。
【００３２】
本発明にかかるホスホトランスフェラーゼ系セロビオース資化酵素ＩＩ蛋白をコードするＤＮＡ断片は、細菌染色体ＤＮＡ、具体的にはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ−ＣＥＬ及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ−ＣＥＬ２から分離されたもののみならず、配列番号１〜３のいずれかで表される塩基配列を基にして、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばベックマン社製システム−１プラス（　Ｓｙｓｔｅｍ−１　Ｐｌｕｓ　）等を用いて合成されたものであってもよい。また、本発明にかかるホスホトランスフェラーゼ系セロビオース資化酵素ＩＩ蛋白をコードするＤＮＡ断片は、コリネ型細菌等の細胞内での複製開始能を実質的に損なうことがない限り、上記の配列番号２または３であらわされる塩基配列の一以上数個以下の塩基が他の塩基と置換されていても、欠失されていてもよく、新たに一以上数個以下の塩基が挿入されていてもよく、あるいは塩基配列の一以上数個以下が転移されているものであってもよく、さらにそれらのＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよく、これらの誘導体のいずれもが包含されるものである。
【００３３】
塩基配列からの塩基の欠失・置換等は、モレキュラー・クローニング第２版、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　（　１９８７−１９９７　）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１０，　６４８７　（１９８２）、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，　７９，　６４０９　（１９８２）、Ｇｅｎｅ，　３４，　３１５　（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１３，　４４３１　（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，　８２，　４８８　（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号２または３で表される塩基配列からなるＤＮＡに変異を導入することにより取得することができる。
【００３４】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列番号２または３で表される塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、配列番号２または３で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１：　Ｃｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　（　１９９５　）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３５】
また、上記の配列番号２または３で表される塩基配列及びこれらの誘導体により決定されるアミノ酸配列により構成される蛋白も、細菌、具体的にはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ−ＣＥＬ及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ−ＣＥＬ２から分離されたもののみならず、配列番号２または３のいずれかで表される塩基配列及びこれらの誘導体を鋳型として、通常用いられるペプチド合成装置を用いて合成されたものであってもよく、かつホスホトランスフェラーゼ系セロビオース資化酵素ＩＩの活性を有する蛋白質であれば、配列番号２または３で表されるアミノ酸配列のうち、一以上数個以下のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質であってもよい。アミノ酸配列からのアミノ酸の欠失・置換等は、上述の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号２または３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに変異を導入することにより取得することができる。
【００３６】
また、配列番号２または３で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片は、ホスホトランスフェラーゼ系セロビオース資化酵素ＩＩ蛋白の機能的な発現がされるような様式であれば、制限酵素やＤＮＡリガーゼ等を使用してのＤＮＡ断片の好適なサイズへの縮小化、適当なプロモーターやターミネーター等の制御配列の削除・連結等の操作を施こされてもよい。ＤＮＡ断片のサブクローニングは、上述したそれ自体公知の技術に従って行ってよい。
【００３７】
上記のサブクローニングに使用されるプロモーターとしては、コリネ型細菌内でホスホトランスフェラーゼ系セロビオース資化酵素ＩＩの遺伝子の転写を開始させる機能を有するものであればいかなるものであっても良いが、グルコースにより遺伝子の転写が抑制を受けない構成的なプロモーター、例えばコリネ型細菌内で構成的に発現が可能なｌａｃプロモーターであることが望ましい。これは、ホスホトランスフェラーゼ系セロビオース資化酵素ＩＩの遺伝子の転写を制御するプロモーターを、該プロモーターに変換することにより、ホスホトランスフェラーゼ系セロビオース資化酵素ＩＩの遺伝子の発現が、グルコースによる転写抑制を受けなくなり、更に該プロモーターに連結したホスホトランスフェラーゼ系セロビオース資化酵素ＩＩの遺伝子を有するＤＮＡ断片を宿主となる微生物に導入することによって、グルコースとセロビオースの同時資化能を有する形質転換体を得ることを期待するものである。
【００３８】
本発明において、配列番号２で表される塩基配列を含むＤＮＡ断片を有する組換えベクターＤＮＡ（ｐＲｂｇｌＦ３１７ＡＡＧ）を、セロビオース資化能を有しないＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒに導入することにより得られたセロビオース資化能を獲得した形質転換体は、セロビオースを資化できるが、グルコースがセロビオースとともに培地中に含まれる場合、セロビオースの資化はグルコース資化後に開始される逐次的なものであることが判明した。従って、上述のように配列番号２で表される塩基配列を含むＤＮＡ断片をｐＫＰ１に既に存在し、かつグルコースにより遺伝子の転写が抑制を受けない構成的なｌａｃプロモーターに直接連結したサブクローニング組換えプラスミドを、セロビオース資化能を有しないＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒに導入することにより、グルコースとセロビオースを同時に併行的に資化できるセロビオース同時資化能を獲得した形質転換体を取得することを期待することができる。
【００３９】
本発明におけるサブクローニングされるＤＮＡ断片の好ましい態様としては、配列番号２または３で表される塩基配列から、ｂｇｌＦ，ｂｇｌＡ、ｂｇｌＧの３つのＯＲＦのうち、ｂｇｌＧを欠失させることにより得られる塩基配列からなるＤＮＡ断片が挙げられる。これはｂｇｌＧが、野生型コリネ型細菌が元来有するプロモーターの調節遺伝子であることから、ホスホトランスフェラーゼ系セロビオース資化酵素ＩＩの発現に不要と推定されるためである。
【００４０】
本発明における、配列番号２または３で表される塩基配列から、ｂｇｌＦ，ｂｇｌＡ、ｂｇｌＧの３つのＯＲＦのうち、ｂｇｌＧを欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片の取得方法は、特に限定されないが、以下に述べる技術によるものが好ましい。
配列番号２または３で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片を有する組換えベクターＤＮＡを鋳型として、適当な２種類のプライマーを用いてのＰＣＲ法により、ｂｇｌＦ及びｂｇｌＡ領域を含む遺伝子断片を増幅することが好ましい。ＰＣＲは、それ自体公知の方法で行われて良く、より詳しくは鋳型としてｐＲｂｇｌＦ３１７ＡＡＧを用い、また、適当な２種類のプライマーとして、プライマー塩基配列中にＢｇｌＩＩ制限酵素部位を付加したＦＢＦプライマー：５’−ＧＡＴＡＧＡＴＣＴＧＧＴＡＧＡＴＧＣＡＣＡＣＧＡＧＣ−３’及びＢａｍＨＩ制限酵素部位を付加したＡＢＢプライマー：５’−ＴＴＧＧＡＴＣＣＡＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＡＡＣＣＴＣＣ−３’を用いて行われることが好ましい。
上記手段により得られた、配列番号２で表される塩基配列から、ｂｇｌＦ，ｂｇｌＡ、ｂｇｌＧの３つのＯＲＦのうち、ｂｇｌＧを欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片を、ｐＫＰ１のＢａｍＨＩ切断部位に連結することにより、ｐＫＰ１内に存在し、コリネ型細菌内で構成的に発現が可能なｌａｃプロモーターの下流に該ＤＮＡ断片が接続されたプラスミドｐＣｂｇｌＦ３１７ＡＡを構築することができる。
このｐＣｂｇｌＦ３１７ＡＡを野生型Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒに導入することにより、グルコースとセロビオースを同時に併行的に資化できるセロビオース資化性獲得を有する形質転換体を得ることができる。
【００４１】
以上に述べた本発明にかかるグルコースとセロビオースを同時に併行的に資化できるセロビオース資化性獲得を有する形質転換体の好ましい態様として、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ｐＣｂｇｌＦ３１７ＡＡ株が挙げられる。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ｐＣｂｇｌＦ３１７ＡＡ株は、ブタペスト条約に基づいて、平成１４年８月２０日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）に受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９７９として寄託されている。
【００４２】
野生株および得られた形質転換体等のセロビオース資化能試験は、セロビオースを含有する培地で、これらの微生物を培養し、セロビオースの取り込み速度及び微生物細胞量の変化を追跡することにより行うのが好ましい。特に微生物によるセロビオース及びグルコースの併行的資化能を調べる場合は、培地中に同等量のセロビオース及びグルコースを含有させ、これらの取り込み速度と微生物細胞量の変化を追跡することにより行うのが好ましい。
微生物による糖の取り込み速度の測定は、培地中に残存する糖の濃度をＨＰＬＣ分析法等を用いて、また微生物細胞量の変化の測定は、分光光度計による５９０ｎｍでの光学密度の変化の測定により行うのが好ましい。
【００４３】
本発明におけるセロビオースまたはセロビオース及びグルコースの微生物による資化能の測定は、対象とする微生物を、各々の糖を０．５％（　ｖｏｌｕｍｅ／ｗｅｉｇｈｔ　）含有する培地で培養し、培養中の糖の取り込み速度及び微生物細胞量の変化を、ＨＰＬＣ、例えば東ソー（株）社製ＬＣ−８０２０　ＭｏｄｅｌＩＩ等、及び分光光度計、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ　ｐｈａｒｍａｃｉａ　ｂｉｏｔｅｃｈ社製　ＮｏｖａｓｐｅｃＩＩ機器等にて経時的に測定することにより行われるのが好ましい。
【００４４】
本発明におけるグルコースと同様にセロビオースをも資化することができる微生物、具体的にはホスホトランスフェラーゼ系セロビオース資化酵素ＩＩを有するコリネ型細菌に、更なる機能を育種等により付与することにより、具体的には、該コリネ型細菌に、更にアミノ酸、有機酸、アルコール、核酸、生理活性物質または有機性ガス等の有用な発酵物質又は反応物質の生産機能を付与し、セルロース系バイオマス資源を栄養源として該微生物を大量培養して微生物発酵又は反応を行わせて、有用な発酵又は反応物を生産させることにより、セルロース系バイオマス資源を効率よく転換利用することができる。
【００４５】
【実施例】
以下、実施例等を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例になんら限定されるものではない。
【００４６】
（実施例１）セロビオース資化能を獲得したコリネ型細菌変異株の取得
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ菌体を、セロビオースを唯一の炭素源として０．５％含有する最少ＢＴ寒天培地上に約１０９〜１０１０個塗抹し、３３℃にて培養器内で好気的に培養した。最少ＢＴ培地の組成は、蒸留水１Ｌ中、尿素：２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４：７ｇ，ＫＨ２ＰＯ４：０．５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４：０．５ｇ，　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：６ｍｇ，ＭｎＳＯ４・ｎＨ２Ｏ：４．２ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ及び寒天１５ｇ（ｐＨ６．６）を含むものである。該寒天培地上で生育した自然突然変異株コロニーを複数個取得した。自然突然変異率は２〜５×１０−９であった。
【００４７】
（実施例２）セロビオース資化能を獲得したコリネ型細菌変異株の変異点解析
（Ａ）セロビオース資化能を獲得したコリネ型細菌変異株からの全染色体ＤＮＡの抽出：
Ａ培地１Ｌ［組成：　尿素：２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４：７ｇ，ＫＨ２ＰＯ４：０．５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４：０．５ｇ，　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：６ｍｇ，ＭｎＳＯ４・ｎＨ２Ｏ：４．２ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス２ｇ、カザミノ酸７ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（ｐＨ６．６）］に、上記変異株の取得方法により得られる野生株Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒからのセロビオース資化能を獲得したコリネ型細菌変異株（８コロニー）それぞれを、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期後期まで３３℃で振とう培養し、菌体を集めた。
【００４８】
得られた菌体を菌体濃度が１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう、１０ｍｇ／ｍｌリゾチーム、１０ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ　ＥＤＴＡ・２Ｎａの各成分を含有する溶液１５ｍｌ（各成分の濃度は最終濃度である）に懸濁した。次にプロテナーゼＫを最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ，　２０分間，１０〜１２℃）し、上清画分を分取した。この上清に酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるよう添加した後、２倍量のエタノールをゆっくりと加えた。水層とエタノール層の間に存在するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、以後の実験に用いた。
【００４９】
（Ｂ）セロビオース資化性遺伝子のクローン化
上記（Ａ）項で得たセロビオース資化能を獲得したコリネ型細菌変異株の全染色体ＤＮＡ溶液９０μｌを、制限酵素ＳａｌＩ５０Ｕ（　ｕｎｉｔｓ　）を用い、３７℃で１時間反応させ分解した。このＳａｌＩで分解したＤＮＡに、コリネ型細菌内で複製可能なシャトルベクターｐＫＰ１（詳細な本シャトルベクターの構築法は本発明出願人による国際公開特許番号：ＷＯ０１／９６５７３に記載されている）をＳａｌＩで切断した後、脱リン酸化処理をしたものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ　ＡＴＰ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２　、及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１Ｕの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、４℃で１５時間反応させ、両者を結合させ、各変異株（８株）に対応したＳａｌＩプラスミドバンクを作製した。このそれぞれのＳａｌＩプラスミドバンクを、同じコリネ型細菌でもβ−グルコシドの資化性を示さないＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３８６９に、常法である電気パルス法（例えば、Ｙ．　Ｋｕｒｕｓｕ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　５４　：　４４３−４４７．　１９９０）により形質転換し、クロラムフェニコール５μｇ／ｍｌ（最終濃度）を含み、セロビオースを唯一の炭素源とする最少ＢＴ培地に塗布した。
【００５０】
その結果、すべてＳａｌＩプラスミドバンクの形質転換において、セロビオースを唯一の炭素源とする最少ＢＴ培地上で増殖するコロニーを得た。それぞれの形質転換株をクロラムフェニコール５μｇ／ｍｌ（最終濃度）を含む上記Ａ培地にて培養後、プラスミドＤＮＡを常法（　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　ｅｔ．　　ａｌ．　１９８９．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　：　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ，　２ｎｄ　ｅｄ．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　ＮＹ　）にて抽出した。抽出した該プラスミドをＳａｌＩにより切断し、０．８重量％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、ｐＫＰ１のＳａｌＩ部位への挿入断片を調べたところ、いずれの形質転換株においても５．８−ｋｂＳａｌＩ遺伝子断片が挿入されていた。
【００５１】
（Ｃ）５．８−ｋｂＳａｌＩ遺伝子断片の塩基配列の決定
上記（Ｂ）で得られた挿入５．８−ｋｂＳａｌＩ遺伝子断片を制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを用いて３７℃で処理して部分分解した。また、ｐＵＣ１１８ベクター（宝酒造製）を制限酵素ＢａｍＨＩで完全に分解した。得られたベクターＤＮＡ断片と部分分解ＤＮＡ断片とを混合し、この混合液に、それぞれ最終濃度が、５０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．９），１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２　，２０ｍＭ　ジチオスレイトール，１ｍＭ　ＡＴＰ，Ｔ４ＤＮＡリガーゼ　１ｕｎｉｔ／５０μｌとなるように各成分を添加し、ベクターＤＮＡ断片と部分分解ＤＮＡ断片とを結合させた。
【００５２】
同様に（Ｂ）で得られた挿入ＤＮＡ断片を制限酵素ＴａｑＩを用いて３７℃で処理して部分分解した。また、ｐＵＣ１１８ベクター（宝酒造製）を制限酵素ＡｃｃＩで完全に分解した。得られたベクターＤＮＡ断片と部分分解ＤＮＡ断片とを混合し、この混合液に、それぞれ最終濃度が、５０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．９），１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２　，２０ｍＭ　ジチオスレイトール，１ｍＭ　ＡＴＰ，Ｔ４ＤＮＡリガーゼ　１ｕｎｉｔ／５０μｌとなるように各成分を添加し、ベクターＤＮＡ断片と部分分解ＤＮＡ断片とを結合させた。
ついで、常法［　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　５３，　１５９　（　１９７０　）　参照］に従って、得られた溶液を各々用いて大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換した。得られた形質転換菌を選択培地［組成：トリプトン　１０ｇ，酵母エキス　５ｇ，ＮａＣｌ　５ｇ，寒天　１５ｇ，アンピシリン　５０ｍｇを蒸留水に溶解して１Ｌとする］に塗抹し、３７℃で１６時間培養した。
選択培地上に生育した菌株を、アンピシリンを最終濃度で５０μｇ／ｍｌ含有するＬ培養液［トリプトン　１０ｇ，酵母エキス　５ｇ，ＮａＣｌ　５ｇを蒸留水に溶解して１Ｌとする］に植菌し、これを３７℃で７時間培養した。培養液を４℃で１０分間８，０００×ｇの遠心分離にかけて菌体を回収した。回収した菌体からアルカリ−ＳＤＳ法［　Ｔ．　　Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｅ．　Ｆ．　Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ，　ｐ．　９０−９１　（　１９８２　）　参照］によりプラスミドを抽出した。
【００５３】
抽出したプラスミドＤＮＡを用いて、ベクターｐＵＣ１１８に挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。ｐＵＣ１１８に挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列の決定には、パーキン・エルマー社製のダイプライマーサイクルシーケンスキットを用いて行った。そして、これらの決定された個々の配列の連結を、パーキン・エルマー社製のシークエンス解析ソフト　オートアッセンブラー（Ａｕｔｏａｓｓｅｍｂｌｅｒ）を用いて行った。
この結果、上記（Ｂ）で得られた５．８ｋｂＳａｌＩ遺伝子断片内には、既知のエシェリヒア・コリ由来のホスホトランスフェラーゼ系酵素ＩＩ（ＰＴＳ　ＥｎｚｙｍｅＩＩ（酵素ＩＩ））遺伝子、ｐｈｏｓｐｈｏ−β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ遺伝子、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｎｔｉｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ遺伝子と相同性を有する３つのＯＲＦ（　ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ　）を含有することが判明した。それぞれの遺伝子をｂｇｌＦ、ｂｇｌＡ、ｂｇｌＧと名づけ、その構成図を模式的に図１に、詳細を図６〜１０および配列番号２または３で表される塩基配列およびアミノ酸配列に示した。
【００５４】
（Ｄ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ野生株のｂｇｌＦ、ｂｇｌＡ、ｂｇｌＧ遺伝子を含む５．８−ｋｂ　ＳａｌＩ遺伝子断片のクローニングと全塩基配列の決定
上記（Ｃ）項の遺伝子情報から、プライマーＡ−１、Ｂ−１を合成し、下記のＰＣＲに用いた。
Ａ−１；　５’−ＧＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＡＧＧＣＧＡＣＣＡＧＡＧＴＡＴＧ−３’
Ｂ−１；　５’−ＧＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＣＧＣＡＧＣＡＣＴＴＣＧＧ−３’
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ野生株から（Ａ）項と同様の方法にて全染色体ＤＮＡを抽出し、ＰＣＲにおける鋳型ＤＮＡとして用いた。
【００５５】
ＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、タカラ・イーエックスタック（　ＴａｑＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ　）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。
反応液：（１０×）ＰＣＲ緩衝液　１０μｌ、２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ混合液　８μｌ　鋳型ＤＮＡ　１０μｌ（ＤＮＡ　含有量　１μＭ以下）、上記記載のＡ−１，Ｂ−１プライマー　各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ）イーエックス・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ　０．５μｌ　滅菌蒸留水　６９．５μｌ以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけた。
ＰＣＲサイクル：デナチュレーション過程：９４℃　６０秒アニーリング過程　：５２℃　６０秒エクステンション過程　：７２℃　１２０秒、以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約５．８ｋｂＰＣＲ増幅断片が検出できた。得られた５．８−ｋｂ　ＰＣＲ増幅断片を（Ｃ）項と同様の方法で全塩基配列の決定を行った。
【００５６】
この結果、上記（Ｃ）項と同様に、本項で得られた５．８ｋｂＰＣＲ増幅遺伝子断片内には、既知のエシェリヒア・コリ由来のホスホトランスフェラーゼ系酵素ＩＩ（ＰＴＳ　ＥｎｚｙｍｅＩＩ）遺伝子、ｐｈｏｓｐｈｏ−β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ遺伝子、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｎｔｉｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ遺伝子と相同性を有する３つのＯＲＦ（　ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ　）を含有することが判明した。本ＤＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号１に示した。
【００５７】
（Ｅ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ野生株及びセロビオース資化能を獲得したコリネ型細菌変異株由来ｂｇｌＦ、ｂｇｌＡ、ｂｇｌＧ遺伝子の塩基配列の比較
上記（Ｄ）項で決定したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ野生株由来ｂｇｌＦ、ｂｇｌＡ、ｂｇｌＧ遺伝子を含む５．８ｋｂＰＣＲ増幅断片と、上記（Ｃ）項で決定したセロビオース資化能を獲得したコリネ型細菌変異株由来ｂｇｌＦ、ｂｇｌＡ、ｂｇｌＧ遺伝子を含む５．８−ｋｂ　ＳａｌＩ遺伝子断片を比較したところ、２種の１塩基変異が見いだされ、その他の変異は見出されなかった。（図６〜１０および配列番号１〜３で表される塩基配列及びアミノ酸配列参照）
すなわち、セロビオース資化能を獲得したコリネ型細菌変異株８株のうちの５株に関しては、該５．８−ｋｂ　ＳａｌＩ遺伝子断片中の１塩基の置換によりｂｇｌＦ遺伝子内の３１７番目のアミノ酸であるバリンがアラニンに変異（　ＧＴＧ→ＧＣＧ　、Ｖ３１７Ａ　）しており、３株は、１塩基の置換により同じ位置のｂｇｌＦ遺伝子内の３１７番目のアミノ酸であるバリンがメチオニンに変異（　ＧＴＧ→ＡＴＧ　、Ｖ３１７Ｍ　）していた。
【００５８】
上記結果より、セロビオース資化性を獲得したコリネ型細菌変異株は、２種存在することが明らかとなり、ｂｇｌＦ遺伝子内のＶ３１７Ａ変異株をＲ−ＣＥＬ、Ｖ３１７Ｍ変異株をＲ−ＣＥＬ２と名づけて、ブタペスト条約に基づいて、平成１４年８月２０日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）に受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９７７および受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９７８として寄託されている。
【００５９】
（実施例３）セロビオース資化性を有する組換え株の構築
（実施例２）の（Ｄ）項でＰＣＲにより増幅したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＲ野生株由来で、ｂｇｌＦ、ｂｇｌＡ、ｂｇｌＧ遺伝子を含む５．８−ｋｂＳａｌＩ遺伝子断片１０μｌを、制限酵素ＳａｌＩ５０Ｕ（ｕｎｉｔｓ）を用い、３７℃で１時間反応させた。このＳａｌＩで分解したＤＮＡに、コリネ型細菌内で複製可能なシャトルベクターｐＫＰ１（詳細な本シャトルベクターの構築法は本発明出願人による国際公開特許番号：ＷＯ０１／９６５７３に記載されている）をＳａｌＩで切断した後、脱リン酸化処理をしたものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ　ＡＴＰ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２　、及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１Ｕの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、４℃で１５時間反応させ、両者を結合させた。ついで、常法［　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　５３，　１５９　（　１９７０　）　参照］に従って、得られた溶液を各々用いて大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換した。得られた形質転換菌を選択培地［組成：トリプトン　１０ｇ，酵母エキス　５ｇ，ＮａＣｌ　５ｇ，寒天　１５ｇ，クロラムフェニコール　５０ｍｇを蒸留水に溶解して１Ｌとする］に塗抹し、３７℃で１６時間培養した。
【００６０】
選択培地上に生育した菌株を、クロラムフェニコールを最終濃度で５０μｇ／ｍｌ含有するＬ培養液［トリプトン　１０ｇ，酵母エキス　５ｇ，ＮａＣｌ　５ｇを蒸留水に溶解して１Ｌとする］に植菌し、これを３７℃で７時間培養した。培養液を４℃で１０分間８，０００×ｇの遠心分離にかけて菌体を回収した。回収した菌体からアルカリ−ＳＤＳ法［　Ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｅ．　Ｆ．　Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ，　ｐ．　９０−９１　（　１９８２　）参照　］によりプラスミドを抽出した。抽出した該プラスミドをＳａｌＩにより切断し、０．８重量％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、ｐＫＰ１のＳａｌＩ部位への挿入断片を調べたところ、５．８−ｋｂＳａｌＩ遺伝子断片が挿入されていた。このプラスミドをｐＲｂｇｌＦＡＧと命名した。
【００６１】
また、（実施例２）の（Ｂ）項でクローン化し、同（Ｃ）及び（Ｅ）項でその変異点を確認したセロビオース資化性を有する組換え株Ｒ−ＣＥＬ（ｂｇｌＦ遺伝子内にＶ３１７Ａ変異を有する）由来５．８−ｋｂＳａｌＩ遺伝子断片をｐＫＰ１に連結したプラスミドをｐＲｂｇｌＦ３１７ＡＡＧと命名した。
これらプラスミドｐＲｂｇｌＦＡＧ及びｐＲｂｇｌＦ３１７ＡＡＧを各々２μｌ（０．５μｇ）、セロビオース資化能を有していない野生型Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒに、常法である電気パルス法（例えば、Ｙ．　Ｋｕｒｕｓｕ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　５４　：　４４３−４４７．　１９９０　）により形質転換し、クロラムフェニコール５μｇ／ｍｌ（最終濃度）及びグルコース２％を含むＡ寒天培地［組成：　尿素：２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４：７ｇ，ＫＨ２ＰＯ４：０．５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４：０．５ｇ，　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：６ｍｇ，ＭｎＳＯ４・ｎＨ２Ｏ：４．２ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス２ｇ、カザミノ酸７ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（ｐＨ６．６）］に塗布した。
【００６２】
この培地上で生育したそれぞれの形質転換株をクロラムフェニコール５μｇ／ｍｌ（最終濃度）を含む上記Ａ培地にて培養後、プラスミドＤＮＡを常法（　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　ｅｔ．　ａｌ．　１９８９．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　：　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ，　２ｎｄ　ｅｄ．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　ＮＹ　）にて抽出した。抽出した該プラスミドをＳａｌＩにより切断し、０．８重量％アガロースゲルを用いて電気泳動で確認したところ、プラスミドｐＲｂｇｌＦＡＧ及びｐＲｂｇｌＦ３１７ＡＡＧをそれぞれ含有する形質転換株であることが確認できた。
これら２種の形質転換株のセロビオース資化能を調べるため、グルコース及びセロビオースをそれぞれ０．５％（Ｗ／Ｖ）を含む最少ＢＴ液体培地中での糖類資化取り込み速度及び細胞量の変化を追跡した。培地の糖類濃度はＨＰＬＣ分析法、培地中の微生物細胞量変化は５９０ｎｍでの光学密度の変化より知ることが出来る。（ＯＤ５９０）
プラスミドｐＲｂｇｌＦＡＧを使用した形質転換体は、セロビオース資化性は全く示さなかったが、プラスミドｐＲｂｇｌＦ３１７ＡＡＧを使用した形質転換体は図２に示した如くグルコース資化後の逐次的なセロビオース資化性を示した。尚、培養培地中の糖類濃度（％）および細胞量（ＯＤ５９０）は、東ソー（株）社製ＬＣ−８０２０　ＭｏｄｅｌＩＩ及びＡｍｅｒｓｈａｍ　ｐｈａｒｍａｃｉａ　ｂｉｏｔｅｃｈ社製　ＮｏｖａｓｐｅｃＩＩ機器により測定した。また以下に記載する培養培地中の糖類濃度（％）および細胞量（ＯＤ５９０）の測定も同様に行った。
この結果より、ｂｇｌＦ遺伝子内のＶ３１７Ａなる１塩基変異によりセロビオース資化性を獲得したことが確認できた。
【００６３】
（実施例４）グルコース、セロビオース同時資化能を有する組換え体の構築とその資化性
（実施例２）の組換え体はセロビオース資化性を示すがグルコースを含む培地ではセロビオースの資化は同時資化性ではなく、逐次資化性であった。
本発明者等は各種の多面的検討より、セロビオース資化に関する遺伝子発現系のプロモーターを、グルコース抑制を受けない構成的（恒常的に抑制を受けない）プロモーターに交換すれば同時資化性が発現するのではないかとの結論に到達した。
そこで、以下の実験を行いグルコースとセロビオースの同時資化性を検証した。
【００６４】
（実施例２）の（Ｃ）及び（Ｄ）項における解析より、５．８−ｋｂ遺伝子断片内のｂｇｌＦ、ｂｇｌＡ、ｂｇｌＧ遺伝子は、塩基配列よりオペロンを形成（上流のひとつのプロモーターより転写されている）していることが推察されたことより、上記遺伝子のプロモーター交換を次のように行った。
ｂｇｌＦ、ｂｇｌＡ、ｂｇｌＧの３種の遺伝子のうち、ｂｇｌＧ遺伝子は、アミノ酸ホモロジー解析によりｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｎｔｉｔｅｒｍｉｎａｔｏｒと推定され、すなわち、元来存在するプロモーターの調節遺伝子であることから、プロモーターを交換した場合、セロビオース資化能の発現には不要と考えた。
そこで、セロビオースの資化能に関与するｂｇｌＦ（ホスホトランスフェラーゼ系酵素ＩＩ（ＰＴＳ　ＥｎｚｙｍｅＩＩ））遺伝子、ｂｇｌＡ　（　ｐｈｏｓｐｈｏ−β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ　）遺伝子を含む遺伝子断片を取得するため、プラスミドｐＲｂｇｌＦ３１７ＡＡＧをテンプレートとして、二種のプライマー（ＢｇｌＩＩ制限酵素部位を付加したＦＢＦプライマー：５’−ＧＡＴＡＧＡＴＣＴＧＧＴＡＧＡＴＧＣＡＣＡＣＧＡＧＣ−３’、ＢａｍＨＩ制限酵素部位を付加したＡＢＢプライマー：５’−ＴＴＧＧＡＴＣＣＡＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＡＡＣＣＴＣＣ−３’）を用いてＰＣＲを行った。
【００６５】
ＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、タカラ・イーエックスタック（　ＴａｑＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ　）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。
反応液：（１０×）ＰＣＲ緩衝液　１０μｌ、２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ混合液　８μｌ　鋳型ＤＮＡ　１０μｌ（ＤＮＡ　含有量　１μＭ以下）、上記記載のＦＢＦ，ＡＢＢプライマー　各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ）イーエックス・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ　０．５μｌ　滅菌蒸留水　６９．５μｌ以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけた。
ＰＣＲサイクル：デナチュレーション過程：９４℃　６０秒アニーリング過程　：５２℃　６０秒エクステンション過程　：７２℃　１２０秒、以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。上記で生成した反応液１０μｌを０．８重量％アガロースゲルにより電気泳動を行い、３．４ｋｂ　ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ遺伝子断片を確認した。
【００６６】
このｂｇｌＦ（Ｖ３１７Ａ）とｂｇｌＡ遺伝子を含む３．４ｋｂ　ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ　ＤＮＡ断片１０μｌを、制限酵素ＢｇｌＩＩ５０Ｕ（ｕｎｉｔｓ）及びＢａｍＨＩ５０Ｕ（ｕｎｉｔｓ）を用い、３７℃で１時間反応させた。このＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ分解ＤＮＡに、コリネ型細菌内で複製可能なシャトルベクターｐＫＰ１（詳細な本シャトルベクターの構築法は本発明出願人による国際公開特許番号：ＷＯ０１／９６５７３に記載されている）をＢａｍＨＩで切断した後、脱リン酸化処理をしたものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ　ＡＴＰ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２　、及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１Ｕの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、４℃で１５時間反応させ、両者を結合させた。ついで、常法［　Ｊ．　　Ｍｏｌ．　　Ｂｉｏｌ．，　５３，　１５９　（　１９７０　）参照　］に従って、得られた溶液を各々用いて大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換した。得られた形質転換菌を選択培地［組成：トリプトン　１０ｇ，酵母エキス　５ｇ，ＮａＣｌ　５ｇ，寒天　１５ｇ，クロラムフェニコール　５０ｍｇを蒸留水に溶解して１Ｌとする］に塗抹し、３７℃で１６時間培養した。
【００６７】
選択培地上に生育した菌株を、クロラムフェニコールを最終濃度で５０μｇ／ｍｌ含有するＬ培養液［トリプトン　１０ｇ，酵母エキス　５ｇ，ＮａＣｌ　５ｇを蒸留水に溶解して１Ｌとする］に植菌し、これを３７℃で７時間培養した。培養液を４℃で１０分間８，０００×ｇの遠心分離にかけて菌体を回収した。回収した菌体からアルカリ−ＳＤＳ法［　Ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｅ．　Ｆ．　Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ，　ｐ．　９０−９１　（　１９８２　）参照　］によりプラスミドを抽出した。抽出した該プラスミドをＢａｍＨＩにより切断し、０．８重量％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、ｐＫＰ１のＢａｍＨＩ部位への挿入断片を調べたところ、３．４−ｋｂ　ＢａｍＨＩ遺伝子断片が挿入されていた。これにより、ｐＫＰ１内に存在し、コリネ型細菌内で構成的に発現が可能なｌａｃプロモーターの下流にｂｇｌＦ（Ｖ３１７Ａ）及びｂｇｌＡ遺伝子を接続したこのプラスミドをｐＣｂｇｌＦ３１７ＡＡと命名した。
【００６８】
このプラスミドｐＣｂｇｌＦ３１７ＡＡを２μｌ（０．５μｇ）、セロビオース資化能を有していない野生型Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒに、常法である電気パルス法（例えば、Ｙ．　Ｋｕｒｕｓｕ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　５４　：　４４３−４４７．　１９９０　）により形質転換し、クロラムフェニコール５μｇ／ｍｌ（最終濃度）及びグルコース２％を含むＡ寒天培地［組成：　尿素：４ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４：１４ｇ，ＫＨ２ＰＯ４：０．５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４：０．５ｇ，　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：２０ｍｇ，ＭｎＳＯ４・ｎＨ２Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、酵母エキス１ｇ、カザミノ酸１ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（ｐＨ６．６）］に塗布した。
この培地上で生育した形質転換株をクロラムフェニコール５μｇ／ｍｌ（最終濃度）を含む上記Ａ培地にて培養後、プラスミドＤＮＡを常法（　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　ｅｔ．ａｌ．　１９８９．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　：　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ，　２ｎｄ　ｅｄ．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　ＮＹ　）にて抽出した。抽出した該プラスミドをＢａｍＨＩにより切断し、０．８％アガロースゲルを用いて電気泳動で確認したところ、プラスミドｐＣｂｇｌＦ３１７ＡＡを含有する形質転換株であることが確認できた。（本形質転換株はブタペスト条約に基づいて、平成１４年８月２０日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）に受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９７９として寄託されている。）
【００６９】
得られた形質転換株を０．５％グルコースと０．５％セロビオースが共存する最少ＢＴ液体培地において、その増殖とグルコース、セロビオースの資化経時変化を示したものが図３である。
図３に示されているように、本実施例の形質転換株はグルコースとセロビオースが共存する条件下、両者を同時にしかも同等の速度で資化する能力を有することが明確である。
【００７０】
（実施例５）変異株の資化性能
（実施例２）で取得された変異株Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ―ＣＥＬ２を用いて、セロビオース０．５％を含むＢＴ培地でのセロビオース資化性と変異株の増殖挙動を示したものが図４である。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ―ＣＥＬ２はセロビオース資化性は示すが、実施例３や実施例４の組換え体に比してその資化性能は低位のものである。
【００７１】
（比較例１）野生株の糖類資化性能
野生株Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒによる、グルコースとセロビオースをそれぞれ０．５％含むＢＴ培地での糖類資化挙動を示したものが図５である。
グルコース資化性は有しているがセロビオース資化性は全く示さないことが明確である。
【００７２】
【発明の効果】
本発明に基づく単一の微生物により、グルコースのみならずセロビオースも併行して資化することが出来、セルロース系バイオマス資源を効率的、経済的に高度有効利用できる。
【００７３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ由来ののｂｇｌＦＡＧオペロンの模式図を示すものである。
【図２】プラスミドｐＲｂｇｌＦ３１７ＡＡＧを導入したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ由来形質転換体をグルコース（０．５％）およびセロビオース（０．５％）を含有する培地で培養した際の、その増殖速度と両糖類の資化速度の経時変化を、培養培地中の細胞量（ＯＤ５９０）および糖類濃度（％）により示したものである。
【図３】プラスミドｐＣｂｇｌＦ３１７ＡＡを導入したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ由来形質転換体をグルコース（０．５％）およびセロビオース（０．５％）を含有する培地で培養した際の、その増殖速度と両糖類の資化速度の経時変化を、培養培地中の細胞量（ＯＤ５９０）および糖類濃度（％）により示したものである。
【図４】Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ−ＣＥＬ２をセロビオース（０．５％）を含有する培地で培養した際の、その増殖速度と糖類の資化速度の経時変化を、培養培地中の細胞量（ＯＤ５９０）および糖類濃度（％）により示したものである。
【図５】Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒをグルコース（０．５％）およびセロビオース（０．５％）を含有する培地で培養した際の、その増殖速度と両糖類の資化速度の経時変化を、培養培地中の細胞量（ＯＤ５９０）および糖類濃度（％）により示したものである。
【図６】Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ由来ののｂｇｌＦＡＧオペロンを含むＤＮＡ断片の塩基配列（４４９０ｂｐ）中、１番目塩基から１０８０番目塩基まで、及び該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を示したものである。
【図７】Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ由来ののｂｇｌＦＡＧオペロンを含むＤＮＡ断片の塩基配列（４４９０ｂｐ）中、１０８１番目塩基から２１００番目塩基まで、及び該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を示したものであり、ｂｇｌＦ領域のアミノ酸配列中の３１７位のバリンがＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ−ＣＥＬ株由来のものではアラニンに、　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ−ＣＥＬ２株由来のものではメチオニンに各々置換されていることを表すものである。
【図８】Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ由来ののｂｇｌＦＡＧオペロンを含むＤＮＡ断片の塩基配列（４４９０ｂｐ）中、２１０１番目塩基から３２４０番目塩基まで、及び該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を示したものである。
【図９】Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ由来ののｂｇｌＦＡＧオペロンを含むＤＮＡ断片の塩基配列（４４９０ｂｐ）中、３２４１番目塩基から４３８０番目塩基まで、及び該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を示したものである。
【図１０】Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｒ由来ののｂｇｌＦＡＧオペロンを含むＤＮＡ断片の塩基配列（４４９０ｂｐ）中、４３８１番目塩基から４４９０番目塩基まで、及び該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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