(57)【要約】【課題】穏和な条件でのエンドトキシンの不活化を効果的に実行すること【解決手段】隔膜式電気分解法により生成され、有効塩素濃度が２００ｐｐｍ以上の酸性電解水によって、エンドトキシンを不活化する方法である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
隔膜式電気分解法により生成され、有効塩素濃度が２００ｐｐｍ以上の酸性電解水によって、エンドトキシンを不活化することを特徴とする、エンドトキシンの不活化方法。
【請求項２】
前記酸性電解水は、弱酸性であることを特徴とする、請求項１に記載のエンドトキシンの不活化方法。
【請求項３】
生物由来の天然医用材料をフィルター濾過し、菌体を除去した後に、前記エンドトキシンは、前記酸性電解水によって不活化されることを特徴とする、請求項２に記載のエンドトキシンの不活化方法。
【請求項４】
生物由来の天然医用材料を用意する工程と、
隔膜式電気分解法により生成され、有効塩素濃度が２００ｐｐｍ以上の酸性電解水によって、前記生物由来の天然医用材料を殺菌するとともに、前記天然医用材料に含まれているエンドトキシンを不活化する工程と
を包含する、天然医用材料の調製方法。
【請求項５】
前記生物由来の天然医用材料は、コラーゲンであることを特徴とする、請求項４に記載の天然医用材料の調製方法。
【請求項６】
前記酸性電解水は、弱酸性であることを特徴とする、請求項４または５に記載の天然医用材料の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酸性電解殺菌水によるエンドトキシンの不活化に関する。特に、有効塩素濃度が２００ｐｐｍ以上の酸性電解水によって、エンドトキシンを不活化する方法、ならびに、その不活化方法を利用して、生物由来の天然医用材料の殺菌および同材料中のエンドトキシンを不活化する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
コラーゲンやキチン・キトサンなどの生物由来の天然材料が医用材料として、数多く使用されている。しかし、生物由来の天然材料であるがゆえに、その材料がたとえ無菌であったとしても、エンドトキシン（微生物由来の毒素）を主とした微生物由来の免疫活性化物質が混入している場合がある。
【０００３】
エンドトキシン（「ＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）」と呼ぶ場合もある）は、グラム陰性細菌の耐熱性菌体抗原であり、代表的な発熱性物質として知られており、そして、微量で様々な生理活性を示す。細菌自体は各種の滅菌処理によって、殺菌または除去することができるが、菌体成分であるエンドトキシンは通例の滅菌条件では分解を受けず、その除去も困難である。エンドトキシンは、天然医用材料の中でも特にコラーゲンと結合親和性が強く、その分離は非常に困難となる。エンドトキシンを不活化するには、通常、２５０℃での１時間程度の加熱処理を行うが、実際の医療現場では、天然医用材料のエンドトキシン汚染に由来した発熱、細胞浸潤、腹水および胸水誘導による治癒の遅延などの不都合が報告されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上述のようにエンドトキシンを不活化するには、２５０℃での１時間程度の高温処理を行うのであるが、このような処理を生物由来の天然素材に対して行うと、その素材の機能を損ねてしまうので、実際には、そのような処理によってエンドトキシンを不活化することはできない。
【０００５】
特開平１０−１８０２５６号公報には、酸性電解水中のエンドトキシン濃度を低減した酸性電解水について記載されており、そして、ｐＨ２．７〜２．４で有効塩素濃度が１０〜４０ｐｐｍの強酸性の酸性電解水が、殺菌作用やエンドトキシン除去作用を有し、医療器具の殺菌や各種の殺菌用途に使用されることが述べられている。しかし、同公報には、コラーゲンやキチン・キトサンなどの生物由来の天然医用材料に含まれるエンドトキシンの不活化についての記述はない。　また、同公報に開示された技術は、ｐＨ２．７以下の強酸性の酸性電解水を用いた技術に関するものであり、そのような強酸性の酸性電解水を用いて、生物由来の医用材料の処理を行うと、医用材料の分解をもたらしたり、また、処理に用いる器具が腐食したり、錆びたりすることになり、不都合が多い。
【０００６】
本発明はかかる諸点に鑑みてなされたものであり、その主な目的は、穏和な条件でのエンドトキシンの不活化を効果的に実行可能な方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明のエンドトキシンの不活化方法は、隔膜式電気分解法により生成され、有効塩素濃度が２００ｐｐｍ以上の酸性電解水によって、エンドトキシンを不活化することを特徴とする。
【０００８】
前記酸性電解水は、弱酸性であることが好ましい。
【０００９】
また、生物由来の天然医用材料をフィルター濾過し、菌体を除去した後に、前記エンドトキシンは、前記酸性電解水によって不活化してもよい。
【００１０】
本発明の天然医用材料の調製方法は、生物由来の天然医用材料を用意する工程と、隔膜式電気分解法により生成され、有効塩素濃度が２００ｐｐｍ以上の酸性電解水によって、前記生物由来の天然医用材料を殺菌するとともに、前記天然医用材料に含まれているエンドトキシンを不活化する工程とを包含する。
【００１１】
ある実施形態において、前記生物由来の天然医用材料は、コラーゲンである。
【００１２】
前記酸性電解水は、弱酸性であることが好ましい。
【００１３】
本発明によると、隔膜式電気分解法により生成され、有効塩素濃度が２００ｐｐｍ以上の酸性電解水によってエンドトキシンの不活化を行うので、穏和な条件でのエンドトキシンの不活化を効果的に実行することができる。また、酸性電解水中の成分は、乾燥させるだけで、除去することができるという利点もある。
【００１４】
酸性電解水が弱酸性である場合には、生物由来の医用材料の分解を抑制したり、また、処理に用いる器具が腐食したり、錆びたりすることを抑制することができる。生物由来の天然医用材料をフィルター濾過し、菌体を除去した後に、酸性電解水によるエンドトキシンの不活化を行えば、さらに不活化の能力を上げることができる。
【００１５】
本発明のエンドトキシンの不活化方法を、天然医用材料の調製方法に利用すれば、高い生体適合性を持つ天然医用材料の安全性をより簡便に確保することができる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
エンドトキシンは、グラム陰性細菌の外膜表層に局在するリポ多糖体（ＬＰＳ）であり、基本的に、各種細菌の血清学的特異性を決定するＯ−特異糖鎖部分、様々な生物活性（発熱活性、マクロファージ活性化能、ショックなど）を発現するリピドＡ部分および両者を結合するコア部分の３つの部位から構成されている。グラム陰性細菌は、水中（河川水および海水）、大気中、土壌中に広く分布している。それゆえ、天然由来医用材料は原料自体がグラム陰性細菌により汚染されている可能性があることに加えて、その製造工程中での混入により、最終製品が同細菌により汚染されることも考えられる。
【００１７】
天然由来の医用材料は高い生体適合性を持つため、その用途は広く、血液に直接接触する医療用具やインプラント製品などの構成基材としても多用されている。しかし、ＬＰＳは極微量でも様々な生理活性を示すため、これらの製品に使用する天然医用材料の安全性は、ＬＰＳ汚染の観点からも、十分に確認しておく必要がある。
【００１８】
ＬＰＳの不活化法または除去法としては、２５０℃での加熱処理の他、逆浸透、カチオン性メンブランフィルター濾過、活性炭フィルター濾過およびポリミキシンＢ固定化アガロースゲルアフィニティクロマトグラフィーなどがあるが、いずれの方法も適用範囲が限られている。なお、ここで「ＬＰＳの不活化」とは、生理活性を持つ菌体の成分（物質）であるＬＰＳの化学構造を変化させる等して、その活性を消滅させることを意味する。また、「殺菌（除菌）」とは、微生物を殺滅（除去）することを意味する。
【００１９】
そこで、本願発明者は、天然医用材料に混入しているＬＰＳを簡易且つ効率良く不活化する方法を鋭意研究し、酸性電解水を用いることによって、簡易且つ効率良く、ＬＰＳを不活化するできることを見出し、本発明に至った。以下、図面を参照しながら、本発明の実施の形態を説明する。
【００２０】
本発明の実施形態に係るエンドトキシンの不活化方法は、有効塩素濃度が２００ｐｐｍ以上の酸性電解水によって、エンドトキシンからなる免疫活性化物質を不活化するものである。本実施形態の酸性電解水は、隔膜式電気分解法により生成されるものであり、そして、その有効塩素濃度は、３００ｐｐｍ以上であることが好ましい。
【００２１】
まず、隔膜式電気分解法による酸性電解水の生成方法について説明する。最初に、酸性電解水の調製、次いで、有効塩素濃度およびｐＨの測定について述べる。
【００２２】
図１は、隔膜式電気分解法を行うための装置および酸性電解水の生成方法を説明するための図である。図１に示すように、酸性電解水は隔膜を介して食塩水を電気分解することにより生成することができる。酸性電解水が殺菌力に優れていること、および、その製造装置についての詳細は、例えば特開２０００−１８５２８５号公報に開示されている。ここでは、簡単に説明する。
【００２３】
隔膜式電気分解法を実行すると、アノード側では塩素イオン（Ｃｌ−）からＣｌ２が生成され、生成したＣｌ２は水と反応して、次亜塩素酸（ＨＣｌＯ）と塩酸（ＨＣｌ）とを生じ、それにより、酸性のＨＣｌＯ溶液が生成する。一方、カソード側には、強アルカリ性の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液が生成する。
【００２４】
アノード側の強酸性水には、次亜塩素酸イオン（ＣｌＯ−）よりも殺菌力が高い次亜塩素酸が含まれており、そして、カソード側の強アルカリ水を任意の割合で混合することにより、ｐＨ２〜７の、有効塩素濃度が高い酸性電解水を調製することができる。本実施形態では、有効塩素濃度１０００ｐｐｍ前後の強酸性（ｐＨ２）および弱酸性（ｐＨ６）電解水を調製した。
【００２５】
調製した酸性電解水は密封容器（スミロンチューブ：住友ベークライト社製）中、冷暗所において保管し、可能な限り早急に実験に供した。ＮａＣ１（試薬特級品）、ガラス製および金属製実験器具類は２５０℃（乾熱状態）で１時間加熱して脱パイロジェン処理した。また、プラスチック製実験器具類にはパイロジェンフリーの製品を使用した。
【００２６】
次に、有効塩素濃度およびｐＨの測定について説明する。ＭｉＬｉ−Ｑ水３０ｍｌにヨウ化カリウム２ｇおよび酢酸３ｍｌを溶解し、被測定液である酸性電解水０．５ｍｌを加え、次いで、撹拌下、自動滴定装置（平沼産業製ＣＯＭ−４５０）を使用して、０．００２ｍｏｌ／ｌチオ硫酸ナトリウムによる滴定分析を行って有効塩素濃度を測定した。ｐＨはガラス電極式水素イオン濃度計（堀場製作所製ｐＨ　ＭＥＴＥＲＤ−１３）を用いて計測した。
【００２７】
次に、菌体およびＬＰＳの調製、ならびにリムルス活性の測定について説明する。
【００２８】
菌体およびＬＰＳの調製は次の通りにして行った。大腸菌Ｏ１１１株を普通ブイヨン培地中、３７℃、１６時間振とう培養後、培養液のｐＨを中性に調整し、１００℃、１０分間加熱して殺菌した。同加熱死菌体を遠心分離により集菌し、蒸留水で３回洗浄した後、アセトン乾燥菌体とした。大腸菌Ｏ３：Ｋ２ａ，Ｋ２ｂ：Ｈ３　ＡＴＣＣ株由来ＬＰＳは、同様の方法で調製したアセトン乾燥菌体からフェノール／水法により抽出し、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ処理後、超遠心分離の反復によって精製した。
【００２９】
リムルス活性は、第１４改正日本薬局方「エンドトキシン試験法」に準拠し、カイネティック比色法によって測定した。測定試薬としてエンドスペシーＥＳ−５０Ｍ（エンドトキシン特異的リムルス試薬：生化学工業）を用い、標準品として日本薬局方エンドトキシン標準品（大腸菌Ｏ５５：Ｂ５株ＬＰＳ〉を用いた。
【００３０】
以下、本願発明者が行った実験およびその結果について説明する。
【００３１】
リムルス反応は一連の酵素反応であるため、温度およびｐＨにより大きく影響されると共に、プロテアーゼ阻害剤、金属、界面活性剤、高濃度の塩類および糖質などによる阻害または促進効果を受けることが知られている。そこで、本願発明者は、種々の濃度の有効塩素を含有する酸性電解水に既知量のエンドトキシンをスパイクしてリムルス活性を測定し、リムルス反応に影響を及ぼさない酸性電解水濃度を求めた。スパイクしたエンドトキシンのリムルス活性の回収率は、注射用蒸留水にスパイクした既知量のエンドトキシンが示すリムルス活性を１００％として算出した。
【００３２】
図２は、リムルス試薬の反応性に対する酸性電解水の影響を示すグラフである。図２から分かるように、強酸性水（ｐＨ１．７２、有効塩素濃度３５２ｐｐｍ）および弱酸性水（ｐＨ６．２９、有効塩素濃度３４８ｐｐｍ）原液にスパイクしたエンドトキシンのリムルス活性強度は、対照の４０〜６０％前後であり、両原液共にリムルス反応の阻害作用を示した。しかし、強酸性および弱酸性のいずれの電解水も、希釈により有効塩素濃度を３ｐｐｍ程度まで減少させると、リムルス反応に対する阻害効果を示さないことが明らかとなった。本結果を踏まえて、各サンプルのリムルス活性は有効塩素濃度が３ｐｐｍ以下になるように希釈した後、測定することとした。
【００３３】
次に、ＬＰＳおよび菌体に対する酸性電解水の影響について述べる。酸性電解水によりＬＰＳを不活化することが可能か判断するための予備試験として、ＬＰＳおよび菌体を種々の濃度の酸性電解水中、室温にてインキュベートし、２４時間および４８時間後にリムルス活性を測定した。
【００３４】
図３は、ＬＰＳレベルのリムルス活性に対する酸性電解水の影響を示すグラフであり、図４は、菌体レベルのリムルス活性に対する酸性電解水の影響を示すグラフである。
【００３５】
図３に示したように、強酸性水（ｐＨ１．９６、有効塩素濃度１，０００ｐｐｍ）および弱酸性水（ｐＨ６．５０、有効塩素濃度１，２５０ｐｐｍ）共に、原液を使用した場合、ＬＰＳレベルのリムルス活性は２４時間の処理でほぼ完全に失活した。一方、１０倍および１００倍希釈液を使用した場合は、４８時間処理においてもＬＰＳに対する不活化効果が認められなかった。
【００３６】
また、図４に示したように、菌体レベルのリムルス活性に対する影響を検討した結果でも同様の成績が得られた。本実験により、一定濃度以上の有効塩素を含有する酸性電解水はＬＰＳ活性を不活化する効力を持つことが明らかとなった。
【００３７】
次に、リムルス活性の消失と有効塩素濃度との相関性について説明する。
【００３８】
本願発明者は、ＬＰＳおよび菌体を種々の濃度の酸性電解水で処理（室温、２４時間）し、両サンプルのリムルス活性を不活化させるために必要な有効塩素濃度について検討した。その結果を図５（ａ）および（ｂ）に示す。図５（ａ）および（ｂ）は、それぞれ、ＬＰＳおよび菌体についての結果を示すグラフである。なお、１Ｅ＋Ｘは、１×１０のＸ乗を意味し、例えば、１Ｅ＋２は、１×１０２を意味する。
【００３９】
図５（ａ）に示すように、強酸性電解水（ｐＨ２．５６）は有効塩素濃度２５０〜３００ｐｐｍ付近でＬＰＳレベルのリムルス活性を顕著に不活化することが判明した。また、図５（ａ）からわかるように、弱酸性電解水（ｐＨ６．３７）もＬＰＳの不活化能力を示す。ただし、弱酸性電解水の効果は、強酸性電解水と比較して若干低く、ＬＰＳのリムルス活性を消失させるためには４００〜５００ｐｐｍ以上の有効塩素濃度が必要である。
【００４０】
図５（ｂ）に示したように、強酸性電解水（ｐＨ２．５６）は、ＬＰＳの場合と同様に、有効塩素濃度３００ｐｐｍ程度で菌体レベルのリムルス活性を顕著に不活化することができた。一方、弱酸性電解水（ｐＨ６．３７）は有効塩素濃度を５００ｐｐｍまで上昇させても菌体レベルのリムルス活性強度に影響を与えなかった。
【００４１】
次に、図６を参照しながら、リムルス活性の消失と酸性電解水による処理時間との相関性について説明する。図６（ａ）および（ｂ）は、それぞれ、室温下での、ＬＰＳレベルおよび菌体レベルにおけるリムルス活性の強度変化を示すグラフである。
【００４２】
図６（ａ）に示すように、ＬＰＳレベルのリムルス活性は、室温下、有効塩素濃度１，１２０ｐｐｍの強酸性電解水（ｐＨ２．３８）中で、８時間インキュベートすることによって検出限界以下となった。そして、未処理時のリムルス活性強度と比較して４桁以上低下することが明らかとなった。また、リムルス活性の消失速度は有効塩素濃度に依存しており、同濃度２８０ｐｐｍの強酸性電解水では、ＬＰＳレベルのリムルス活性を完全に消失させるまでに４８時間のインキュベートを要した。
【００４３】
図６（ｂ）に示したように、有効塩素濃度１，１２０ｐｐｍの強酸性電解水は、ＬＰＳレベルと同様に、菌体レベルのリムルス活性も顕著に不活化することができた。２時間の処理によって、同活性を検出限界以下まで低下させることができた。一方、低濃度の強酸性電解水（有効塩素濃度２８０ｐｐｍ）処理の場合、菌体レベルのリムルス活性は４８時間インキュベート後でも１桁減少するのみであり、同活性の消失速度は、ＬＰＳレベルの場合と比較して、有効塩素濃度に対する依存性がより高いことが明らかとなった。
【００４４】
同様の実験を弱酸性電解水（ｐＨ６．３７）を用いて行った。その結果を図７に示す。図７（ａ）および（ｂ）は、それぞれ、室温下での、ＬＰＳレベルおよび菌体レベルにおけるリムルス活性の強度変化を示すグラフである。
【００４５】
図７（ａ）に示すように、ＬＰＳレベルのリムルス活性は、有効塩素濃度９３０ｐｐｍの弱酸性電解水中、２時間程度処理することによって低下し始め、２４時間後に５桁減少し、４８時間後には検出限界以下となった。弱酸性電解水によるりムルス活性の消失速度も有効塩素濃度に依存しており、同濃度３１０ｐｐｍの弱酸性電解水中で処理した場合、ＬＰＳレベルのリムルス活性強度は８時間後まで変化せず、２４時間処理で２桁減少したのみであり、４８時閤処理しても検出限界以下まで同活性を低下させることはできなかった。
【００４６】
一方、図７（ｂ）に示すように、菌体レベルのリムルス活性は、９３０ｐｐｍの有効塩素を含む弱酸性電解水中で２４時間処理しても１桁減少するにとどまった。また、有効塩素濃度３１０ｐｐｍの弱酸性電解水処理の場合、リムルス活性強度は殆ど変化せず、菌体レベルのリムルス活性は２４時間までの弱酸性電解水処理によっては大きな影響を受けないことがわかった。
【００４７】
以上のことから、精製ＬＰＳレベルのリムルス活性は、有効塩素濃度３００ｐｐｍ以上の強酸性および弱酸性電解水によって効率良く不活化されることが明らかとなった。
【００４８】
一方、菌体レベルのリムルス活性を不活化するためには、精製ＬＰＳレベルの場合よりも高い有効塩素濃度が必要であることが判明した。また、高濃度の強酸性電解水は菌体レベルの活性を不活化する効力を持つが、同活性に対する弱酸性電解水の影響は比較的少ないことも明らかとなった。
【００４９】
したがって、酸性電解水によりＬＰＳの活性を不活化する際は、事前に試料をメンブランフィルター濾過し、菌体を除去した後に処理を行うことが望ましい。特に、ｐＨ４．５〜６．５程度の弱酸性電解水は、ｐＨ１．５〜３程度の強酸性電解水と比べると、リムルス活性の不活化能力が多少低いものの、処理に用いる器具が腐食したり、錆びたりするのを抑制することができるので、実用的な観点からメリットが大きい。それゆえ、酸性電解水が弱酸性である場合で、生物由来の天然医用材料（例えば、コラーゲン、キチン・キトサン、アルギン酸塩など）に含まれているエンドトキシンを不活化するときには、当該天然医用材料をフィルタリング（例えば、メンブランフィルター濾過）した後、弱酸性電解水による処理を行うことが好ましい。この場合の弱酸性電解水の有効塩素濃度は、例えば、３００ｐｐｍ以上、もしくは、３００〜２０００ｐｐｍとすればよい。
【００５０】
なお、酸性電解水に含まれる有効塩素は、チオ硫酸ナトリウムなどにより容易に中和することができる。また、中和処理を施さなくとも、凍結乾燥などにより、酸性電解水由来成分を容易に除去することも可能である。したがって、酸性電解水によるＬＰＳの不活化は天然医用材料の脱パイロジェン法として利用できる可能性が高いと言える。
【００５１】
また、本実施形態では、ＬＰＳまたは菌体のみの存在下で酸性電解水によるエンドトキシンの不活化を確認したが、マトリクス（コラーゲン等）存在下でもエンドトキシンの不活化を確認している。以上、本発明を好適な実施形態により説明してきたが、こうした記述は限定事項ではなく、種々の改変が可能であることは勿論である。つまり、上述したエンドトキシンの不活化方法は、例示であって、本発明の精神および本質を逸脱することのない範囲の改変も本発明の範囲に含まれるものである。
【００５２】
【発明の効果】
本発明によれば、隔膜式電気分解法により生成され、有効塩素濃度が２００ｐｐｍ以上の酸性電解水によってエンドトキシンの不活化を行うことにより、穏和な条件でのエンドトキシンの不活化を効果的に実行することができるので、高い生体適合性を持つ天然医用材料の安全性をより簡便に確保することができ、その結果、天然医用材料の利用を増大させることができ、また、コスト低減を図ることができる。
【００５３】
酸性電解水が弱酸性である場合には、処理に用いる器具が腐食したり、錆びたりすることを抑制することができるので、天然医用材料の調製方法として、より実用的な処理を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】隔膜式電気分解法による酸性電解水の生成を説明するための図である。
【図２】リムルス試薬に対する酸性電解水の影響を示すグラフである。
【図３】ＬＰＳレベルのリムルス活性に対する酸性電解水の影響を示すグラフである。
【図４】菌体レベルのリムルス活性に対する酸性電解水の影響を示すグラフである。
【図５】（ａ）および（ｂ）は、それぞれ、ＬＰＳおよび菌体についての結果を示すグラフである。
【図６】（ａ）および（ｂ）は、それぞれ、室温下での、ＬＰＳレベルおよび菌体レベルにおけるリムルス活性の強度変化を示すグラフである。
【図７】（ａ）および（ｂ）は、それぞれ、室温下での、ＬＰＳレベルおよび菌体レベルにおけるリムルス活性の強度変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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