(57)【要約】      （修正有）【課題】シクラメンの花色合成にかかわる酵素、特にフラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡを提供する。【解決手段】シクラメンから調製したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、逆転写ＰＣＲ法によってフラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼの一部をコードするＤＮＡを増幅し、得られたＤＮＡ断片をプローブにシクラメンのｃＤＮＡライブラリーから特定の塩基配列のＤＮＡを単離する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であって、フラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
配列表の配列番号１の塩基番号９０〜１６１３からなる塩基配列を有する請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、フラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
配列表の配列番号１の塩基番号９０〜１６１３からなる塩基配列と部分的に異なる塩基配列を有するが、配列番号１に記載の塩基配列に対して相同性を示すＤＮＡであって、かつ、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつ、フラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである請求項３に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であって、フラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項６】
配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、フラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、シクラメンの花色合成酵素のタンパク質をコードする新規なＤＮＡに関する。詳しく言えば、本発明は、シクラメンのフラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ活性を有する新規なタンパク質、及びそれをコードする新規なＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】
フラボノイドの一種であるアントシアニンは花の色素として重要な役割を担っており、アントシアニンは黄色から赤、紫、青色までの幅広い花色を作り出している化合物である。アントシアニン分子から配糖体部分を除いたアグリコンとしての色素本体であるアントシアニジンは、フラボノイドの基本骨格のＢ環に結合する水酸基の部位及び数に応じてペラルゴニジンと、シアニジンとデルフィニジンとの３つのタイプに分類される。
【０００３】
前記のＢ環の３’、４’及び５’位のすべてが水酸化された化合物であるデルフィニジンは、青紫系の色を呈することが知られている。特に、アントシアニン合成経路においてフラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ（以下「Ｆ３’，５’Ｈ」と略する）は、フラボノイドＢ環の３’と５’位を水酸化する酵素であって、青色系色素であるデルフィニジン生合成の鍵（Ｋｅｙ）酵素と考えられている。Ｆ３’，５’Ｈは、近年の遺伝子工学技術を利用することから成る花卉植物の花色の改良研究分野において、重要な役割を持っている。
【０００４】
これまで花卉植物のＦ３’，５’Ｈをコードする遺伝子の塩基配列については次のものが知られている。
【０００５】
（１）ペチュニアのＦ３’，５’Ｈ遺伝子（特許文献１参照）
（２）ナスのＦ３’，５’Ｈ遺伝子（特許文献２参照）
（３）シネラリアのＦ３’，５’Ｈ遺伝子（特許文献３参照）
（４）トレニアのＦ３’，５’Ｈ遺伝子（非特許文献１参照）
（５）ニチニチソウのＦ３’，５’Ｈ遺伝子（非特許文献２参照）
（６）りんどうのＦ３’，５’Ｈ遺伝子（非特許文献３参照）
しかしながら，シクラメン植物からのＦ３’，５’Ｈをコードする遺伝子については知られていない。
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−２３６８６公報
【特許文献２】特開平５−１８４３７０公報
【特許文献３】特願２００１−３６２４５９公報
【非特許文献１】Ｍｏｌ．Ｂｒｅｅｄ．６，２３９−２４６  ２０００年
【非特許文献２】Ｐｌａｎｔ    Ｊ．    １９（２），１８３−１９３  １９９９年
【非特許文献３】Ｐｌａｎｔ    Ｃｅｌｌ    Ｐｈｙｓｉｏｌ．    ３７（５），７１１−７１６  １９９６年
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、新規なシクラメンのＦ３’，５’ＨをコードするＤＮＡをシクラメンから取得することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した。そして後述される遺伝子工学の手法によって配列表の配列番号１に記載される１７４５ｂｐのサイズのＤＮＡ断片をシクラメンのｃＤＮＡライブラリーから取得する事に成功した。
【０００９】
さらに、この１７４５ｂｐのサイズのＤＮＡ断片中の５’側の塩基番号９０のａから塩基番号１６１３のｔまでの領域の塩基配列を有する１５２４ｂｐのサイズのＤＮＡ配列が、シクラメンＦ３’，５’ＨをコードするＤＮＡ配列であることを知見した。その結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の要旨とするところは、以下のとおりである。
【００１０】
（１）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であって、Ｆ３’，５’Ｈ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（２）配列表の配列番号１の塩基番号９０〜１６１３からなる塩基配列を有する（１）のＤＮＡ。
（３）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、フラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４）配列表の配列番号１の塩基番号９０〜１６１３からなる塩基配列と部分的に異なる塩基配列を有するが、配列番号１に記載の塩基配列に対して相同性を示すＤＮＡであって、かつ、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつ、Ｆ３’，５’Ｈ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである（３）のＤＮＡ。
（５）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であって、Ｆ３’，５’Ｈ活性を有するタンパク質。
（６）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、フラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質。
【００１１】
なお、本発明においては、「Ｆ３’，５’Ｈ活性」とは、フラボノイドのＢ環の３’及び５’位を水酸基に転化し、デルフィニジンを生成する反応を触媒する活性を意味する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下に、シクラメンから本発明によるＤＮＡを取得する方法を詳細に説明する。
【００１３】
本発明のＤＮＡの第一の形態は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であって、Ｆ３’，５’Ｈ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。このアミノ酸配列をコードする本発明のＤＮＡの一例を、配列番号１に示す。この本発明ＤＮＡは、本発明を完成するに際しては、後述されるようにして、シクラメンｃＤＮＡライブラリーから取得されたものである。本発明のＤＮＡの塩基配列が明らかにされたので、配列番号２に示すアミノ酸配列、又は配列番号１に示す塩基配列に基づいて化学合成することによっても取得することができる。また、前記の配列番号１の塩基配列に基づいて工夫、作成した合成オリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーを用いると、公知の方法でシクラメンのｃＤＮＡライブラリーから、ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）により取得することも可能である。
【００１４】
以下に、シクラメンの全ＲＮＡから、ＲＴ（逆転写）−ＰＣＲの方法によって本発明のＤＮＡの一部領域をなすＤＮＡ断片を取得し、さらに該ＤＮＡ断片をプローブとして用いたプラーク・ハイブリダイゼーション法によって、本発明のＤＮＡを取得する方法を例示的に説明する。
【００１５】
（１）シクラメンのｍＲＮＡの調製およびシクラメンｃＤＮＡライブラリーの構築
（ｉ）  シクラメン（Ｃｙｃｌａｍｅｎ  ｐｅｒｓｉｃｕｍ）の花弁から、常法により全ＲＮＡを抽出した後、その全ＲＮＡの抽出物からタンパク質、多糖類、その他の夾雑物を取り除く。さらに夾雑物を含まない全ＲＮＡを、オリゴｄＴセルロースを充填したカラムを用いて処理するとＰｏｌｙ（Ａ）＋  ＲＮＡを精製することができ、これによって、ｍＲＮＡを得ることができる。
【００１６】
（ｉｉ）次に、上記のｍＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージベクター、例えばλＺＡＰＩＩなどに組み込み、組換えファージを得る。得られた組換えファージを宿主である大腸菌（エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ））に感染させ、この組換えファージのプラークを多数得ることができる。このプラークのファージは、シクラメンのｃＤＮＡライブラリーとして用いる。これら一連の操作はｃＤＮＡクローニングキットが市販されているので、このキットを使用してもよい。
【００１７】
（２）クローニング用プローブＤＮＡの作成およびｃＤＮＡライブラリーからの所要な組換えファージのスクリーニング
（ｉ）上記のようにして得たシクラメンｃＤＮＡライブラリーの中から、目標とするシクラメンのＦ３’，５’ＨのｃＤＮＡを内含する組換えファージを単離する操作を次に行う。このためにペチュニア植物等の既知のＦ３’，５’ＨをコードするＤＮＡ中で保存されている既知の塩基配列を基本にして設計したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い且つ上記（１）（ｉ）で抽出したシクラメンＲＮＡを鋳型として用いるＲＴ‐ＰＣＲ法によって、シクラメンのＦ３’，５’ＨをコードするＤＮＡの一部領域をコードするｃＤＮＡ断片をプローブＤＮＡとして得る。
【００１８】
（ｉｉ）次に、このＤＮＡプローブと上記（１）（ｉｉ）で作成した組換えファージのプラークとを、ハイブリダイズさせることにより、シクラメンｃＤＮＡライブラリー（組換えファージ）の中から、目的とするＦ３’，５’ＨをコードするＤＮＡを内部に含有する組換えファージをポジチブクローンとして選抜して単離することができる。
【００１９】
（３）ポジチブクローンからのプラスミド（ファージミド）ＤＮＡの回収
上記のハイブリダイゼーションで選抜され単離されたプラークから、ファージを採取する。更にその採取ファージ（ポジチブクローン）をヘルパーファージとともに、宿主である大腸菌に感染させる。このことにより、ファージＤＮＡからシクラメンＦ３’，５’Ｈをコードすると思われるｃＤＮＡが挿入されたファージミドＤＮＡを大腸菌内で切出せる（ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍによる）。更にこのファージミドＤＮＡを別の大腸菌に導入して形質転換し、この大腸菌の培養物よりファージミドＤＮＡを回収する。
【００２０】
（４）シークエンシングによる塩基配列の決定
上記の回収したファージミドＤＮＡを、挿入ＤＮＡ断片が切断されるように制限酵素処理して、その消化液をアガロースゲルで電気泳動を行い、得られたＤＮＡ断片を調査する。その結果をもとに、ファージミドＤＮＡがＦ３’，５’Ｈの全長を保持すると思われる挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法で決定する事ができる。
【００２１】
その挿入断片の決定された塩基配列中にある翻訳開始コドンと終止コドンの位置を調べる事によって、タンパク質のコード領域（すなわちオープンリーディングフレーム）を決定する事ができる。ついで、これから規定されるアミノ酸配列を調べる事により、挿入ＤＮＡ断片の保持するシクラメンのｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列を決定する事ができる。更にこの塩基配列及びアミノ酸配列を既知のペチュニアなどのＦ３’，５Ｈ  ｃＤＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列と比較して相同性を確認すると、挿入ＤＮＡ断片が目的とするシクラメンＦ３’，５’ＨをコードするｃＤＮＡ断片であるかを確認する事ができる。
【００２２】
なお、他方、一般に、特定の機能や生理活性を有するタンパクをコードするアミノ酸配列において、１個または複数のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換された場合であっても、その機能や生理活性が維持される場合であることは当業者において広く認識されているところである。本発明のＤＮＡは、このような修飾が加えられ、かつＦ３’，５’Ｈ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するものであってもよい。すなわち、本発明のＤＮＡの第２の形態は、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、Ｆ３’，５’Ｈ活性を有するタンパク質をコードする改変ＤＮＡである。そのような改変ＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されるように本発明のＤＮＡの塩基配列を改変することによって得られる。
【００２３】
前記「数個」としては、好ましくは２〜１００個、より好ましくは２〜５０個、特に好ましくは２〜２０個である。あるいは、前記「数個」は、配列番号２のアミノ酸配列との相同性が、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上となるような値である。
【００２４】
また、本発明のＤＮＡの第１の形態またはこれを含有する細胞に対して変異処理を行い、その後に、変異されたＤＮＡ若しくはこれらを含む細胞から、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基番号９０〜１６１３の塩基配列を有するＤＮＡに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを選択的に分離することによっても、本発明の改変ＤＮＡの断片を得ることができる。
【００２５】
ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このストリンジェントな条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い２つの核酸同志、例えば７０％以上、好ましくは８０％、より好ましくは９５％以上の相同性を有する２つのＤＮＡ同志がハイブリダイズするが、他方ではそれより相同性の低い２つの核酸同志がハイブリダイズしないという条件が挙げられる。より具体的には、例えば６８℃以上のハイブリダイゼーション溶液（５００ｍＭ  ＮａＰｉバッファー（ｐＨ７．２）、７％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中において、核酸同士がハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００２６】
さらにシクラメン染色体それ自体から、本発明のＤＮＡまたはその一部領域のＤＮＡ断片をプローブＤＮＡとして用いると、定法によってＦ３’，５’ＨをコードするＤＮＡ断片を取得することが可能である。しかし、シクラメン染色体から由来したＦ３’，５’ＨをコードするＤＮＡ断片は、イントロンを含むことが予想される。このようなイントロンで分断されているＤＮＡ断片も、Ｆ３’，５’ＨをコードするＤＮＡである限り、本発明のＤＮＡに含まれる。
【００２７】
なお、後記の実施例で得られた、組換えラムダファージＤＮＡにクローニングされたシクラメンのＦ３’，５’ＨのｃＤＮＡ断片は、Ｂｌｕｅｓｋｒｉｐｔプラスミドベクターに連結され、それにより得られた組換えプラスミドを導入された大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ＣｐＦＨ−１）と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１４年１１月８日より、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０９３として寄託されている。
【００２８】
Ｆ３’，５’Ｈをコードする本発明のＤＮＡを適当な宿主、例えば大腸菌で発現させることにより、タンパク質Ｆ３’，５’Ｈを製造することができる。前記宿主としては、大腸菌、枯草菌などの細菌、酵母、昆虫培養細胞、動物培養細胞、植物培養細胞等が挙げられる。宿主細胞内で機能するプロモーター等の発現調節配列の下流に発現可能に連結されたＦ３’，５’Ｈをコードする本発明ＤＮＡを、宿主細胞に導入することにより宿主細胞を形質転換させる。このような形質転換は、本発明のＤＮＡをプラスミドに連結して組換えプラスミドを構築し、そして、その得られた組換えプラスミドを宿主に導入することによって行うことができる。あるいは、相同組換え等によって本発明ＤＮＡを宿主内の染色体ＤＮＡに組込むことによって宿主を形質転換することもできる。得られる形質転換細胞を、前記プロモーター発現調節配列が機能する条件で培養する事によって、タンパク質Ｆ３’，５’Ｈが産出される。
【００２９】
また、Ｆ３’，５’Ｈをコードする本発明ＤＮＡは、花卉又は他の植物体に、単独または組み合わせて導入することにより、植物体を形質転換させ、これによってそれらの植物中での色素合成に関与する酵素反応が調節されるようにすることができる。植物に本発明のＤＮＡを導入するには、（ａ）アグロバクテリウム法（Ｄｒａｐｅｒ，Ｊら編集、「Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，６９〜１６０頁、１９８８年）；（ｂ）ウイスカ導入法（米国特許第５３０２５２３号、米国特許第７４７２５３８号、日本国特許第３３１２８６７号、Ｋａｅｐｐｅｒ，Ｈ．Ｆ．ら、１９９２年、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，第８４巻、５６０〜５６６頁、Ａｓａｎｏ，Ｙ．ら、１９９１年、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，第７９巻、２４７〜２５２頁）；（ｃ）植物細胞に超音波を照射して、細胞を部分的に損傷させ、損傷個所を通して遺伝子を導入する方法（Ｊｏｅｒｓｂｏ，Ｍ．ら、１９９０年、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，第９巻、２０７〜２１０頁、Ｊｏｅｒｓｂｏ，Ｍ．ら、１９９２年、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，第８５巻、２３０〜２３４頁）；（ｄ）パーティクルガン法（Ｓａｎｆｏｒｄ，Ｊ．Ｃ．米国特許第５１００７９２号）等が挙げられる。
【００３０】
本発明のタンパク質の第１の形態は、シクラメンのＦ３’，５’Ｈ活性を有し、配列表の配列番号２に示す５０８個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するタンパク質である。
【００３１】
また、本発明のタンパク質は、Ｆ３’，５’Ｈ活性が実質的に損なわれない限り、１個または複数のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されるような修飾が加えられたものであってもよい。すなわち、本発明の第２の形態は、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる改変タンパク質であって、シクラメンのＦ３’，５’Ｈ活性を有する改変タンパクである。
【００３２】
上記本発明のタンパク質は、前記したような方法で本発明のＤＮＡを適当な宿主で発現させることによって、製造することができる。
【００３３】
【実施例】
以下に、本発明の実施例の例示により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００３４】
以下の実験操作の手順は特に記述しない限り、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ    Ｃｌｏｎｉｎｇ  第２版」（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ    Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ    ｐｒｅｓｓ，１９８９年）に記載されている方法に従った。
【００３５】
【実施例１】
（１）シクラメンｍＲＮＡの調製
シクラメン（品種：フレグランスミニ）の開花中の花弁４ｇを液体窒素存在下で凍結後、凍結した花弁を乳棒乳鉢を用いて粉砕した。この粉砕物に２×ＣＴＡＢ溶液（２％臭化セチルトリメチルアンモニウム、０．１Ｍ    Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．４Ｍ  ＮａＣｌと４％  β−メルカプトエタノール）４０ｍｌを加えた。得られた混合物を撹拌した後、６５℃で１０分間インキュベートした。次にインキュベートした該混合物をクロロフォルム抽出に２回かけた。抽出した水相にイソプロパノールを加えて転倒混和後、室温に１０分間放置し、核酸を析出させた。核酸の沈澱を８０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離を行い、核酸を回収した。その核酸をＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）４ｍｌに溶解し、得られた溶液に１０Ｍ  塩化リチウム溶液１ｍｌを加えた。得られた混合液を氷上に２時間置いた後、１９０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離すると、ＲＮＡが沈澱した。そのＲＮＡを蒸留水に溶解し、さらにそのＲＮＡ溶液をフェノール抽出およびエタノール沈殿することによりＲＮＡを精製した。こうして０．４ｍｇの精製全ＲＮＡを得た。さらに、これで得られた全ＲＮＡの精製品から、ｍＲＮＡの単離をｍＲＮＡ精製キット（タカラバイオ（株）製、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−Ｍａｇ    ｍＲＮＡ    ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ    Ｋｉｔ）により行い、シクラメンのｍＲＮＡを約６μｇ得た。
【００３６】
（２）シクラメンｃＤＮＡライブラリーの作製
上記（１）で得られたシクラメンｍＲＮＡからｃＤＮＡ合成キット（アマシャム  ライフサイエンス社製、ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ    ｍｏｄｕｌｅ）により、シクラメンの２本鎖ｃＤＮＡを得た。このシクラメンの２本鎖ｃＤＮＡにＥｃｏＲＩサイトを粘着末端として持つアダプターＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ  Ａｄａｐｔｏｒ（タカラバイオ（株）製）を連結し、アダプター部分のリン酸化処理を行った。このようにリン酸化処理されたアダプター部分を連結して保有するシクラメンの２本鎖ｃＤＮＡをλＺＡＰＩＩファージベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰ  Ｐｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄ  ＥｃｏＲＩ／ＣＩＡＰ−Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ）のＥｃｏＲＩサイトに連結した。得られた連結ベクターをイン・ビトロパッケージングキット（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ）を用いてシクラメンｃＤＮＡを内含する組換えラムダファージを再構築した（パッケージング）。このように得られた組換えラムダファージを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に感染させ増殖させ、前記の組換えラムダファージの多数を得た。この組換えラムダファージをシクラメンのｃＤＮＡライブラリーとして以下に使用した。
【００３７】
（３）クローニング用プローブ作製
（ｉ）逆転写（ＲＴ）‐ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用いて、Ｆ３’，５’ＨのｃＤＮＡ断片のクローニング用のプローブを作製するために、プローブＤＮＡ作製に用いられるべきプライマーの設計を先ず行った。すなわち、下記に示す塩基配列を有する２種類のオリゴヌクレオチドをプライマーＮｏ．１およびＮｏ．２として設計して、化学合成により作製した。
【００３８】
（ａ）プライマーＮｏ．１（配列番号３に示す）
５’−ｇｃｋｇｇｗａｃｒｇａｙａｃｗｔｃｗｔｃｗａ−３’
（ｂ）プライマーＮｏ．２（配列番号４に示す）
５’−  ａａｙｃｃａａｔｃａａａｗｇｍｗｔｇｎａｃｃａａ  −３’
但し、上記の２つの塩基配列においてｋ＝ｇまたはｔ；ｗ＝ａまたはｔ；ｒ＝ｇまたはａ；ｙ＝ｔまたはｃ；ｎ＝イノシンを意味する。
【００３９】
なお、上記のプライマーＮｏ．１およびＮｏ．２のオリゴヌクレオチドの作製は、ＤＮＡ合成装置（Ｍｏｄｅｌ  ３９１、アプライドバイオシステムズ社製）を用いてオリゴヌクレオチドを合成し、さらにその合成品をイオン交換ＨＰＬＣで精製することにより行った。
【００４０】
（ｉｉ）次に、シクラメンｃＤＮＡの生成のために、上記（１）で得た全ＲＮＡ１μｇをテンプレートとして用いて、この全ＲＮＡを逆転写反応液〔１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）混合物、２．５μＭオリゴ（ｄＴ）プライマー（Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８  ｐｒｉｍｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製））、ＲＮａｓｅ阻害剤（ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ（株）製）２０単位）および逆転写酵素（ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＸＬ（タカラバイオ（株）製）５単位）〕に加えることによって液量を２０μｌとし、逆転写反応を行った。逆転写反応は３０℃１０分間、５０℃  ３０分間、９９℃  ５分間、４℃  ５分間インキュベートする条件で行い、生成されたシクラメンのｃＤＮＡを含む反応液を得た。
【００４１】
（ｉｉｉ）更に上記のプライマーＮｏ．１及びＮｏ．２として構築された２種類の合成オリゴヌクレオチドの各０．３μＭをプライマーとし、上記で得られたシクラメンのｃＤＮＡを含む逆転写反応液１μｌをテンプレートとして、ＰＣＲ反応液〔１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭノｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）混合物およびＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（タカラバイオ（株）製）１単位）〕に加え、総量を５０μｌとし、ＤＮＡの増幅反応を行った。
【００４２】
上記したＰＣＲ法によるシクラメンｃＤＮＡの増幅反応は、ＰＣＲ反応装置（ＡＳＴＥＫ社製、Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｔｅｍｐ  Ｃｏｎｔｏｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＰＣ−７００）を用いて、変性を９４℃で３０秒間行い、アニーリングを５２℃で１分間行い、また伸張（Ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ）を７２℃で１分間行う３つの反応操作を３５回繰り返すことによって実施した。
【００４３】
上記で得られた増幅反応産物をＴＡベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎａｖａｇｅｎ社製）のＴＡサイトに連結した。得られた連結ベクターで大腸菌ＤＨ５αを形質転換することにより、増幅反応産物であるＤＮＡを保持する形質転換された大腸菌を得た。このように形質転換した大腸菌の細胞それぞれから、クローニングされたプラスミドＤＮＡをアルカリＳＤＳ法を用いて抽出した。
【００４４】
得られたＤＮＡ１μｌを１０μｌのＨバッファー中で制限酵素ＥｃｏＲＩ  ５単位及び制限酵素ＰｓｔＩ  ５単位で消化した。消化反応液をアガロースゲル電気泳動により分析し、増幅反応産物のＤＮＡサイズを確認した。既知のペチュニアＦ３’，５’Ｈより設計されたプライマーから予想されたサイズの増幅反応産物であるＤＮＡ断片がクローニングされた大腸菌を選抜し、この大腸菌が保持するプラスミドＤＮＡの塩基配列解析を行った。この塩基配列の解析は、プラスミド精製キット（ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ    ＰｌａｓｍｉｄＭｉｄｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製））およびＤＮＡシークエンス受託サービス（北海道システム・サイエンス（株））を用い、自動ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００  Ｇｅｎｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製））で決定した。その結果、前記の増幅反応産物のＤＮＡ断片は５５０個の塩基よりなるｃＤＮＡの一部であると決定された。塩基配列より予想されるアミノ酸配列をこれまで明らかにされているペチュニアのＦ３’，５’Ｈのアミノ酸配列と比較することにより、上記の増幅反応産物であるＤＮＡ断片はシクラメンのＦ３’，５’ＨをコードするｃＤＮＡの一部領域を含むＤＮＡ断片である事を確認した。
【００４５】
上記のようにして一連の操作を行い、シクラメンＦ３’，５’ＨのｃＤＮＡの一部領域を含むＤＮＡ断片をプローブとして取得した。このプローブＤＮＡは、シクラメンｃＤＮＡライブラリー（前記の（ｉｉ）に示す組換えラムダファージである）から、目標とするシクラメンＦ３’，５’ＨをコードするｃＤＮＡをスクリーニングするために利用した。
【００４６】
（４）シクラメンｃＤＮＡライブラリーからのシクラメンＦ３’，５’ＨをコードするｃＤＮＡのスクリーニングとクローニング
上記の（２）で作製したシクラメンのｃＤＮＡライブラリー（すなわち、前記の組換えラムダファージ）から、上記（３）で作製したプローブＤＮＡを用いるプラークハイブリダイゼーション法により、シクラメンのＦ３’，５’ＨをコードするＤＮＡ配列を有するクローンをスクリーニングする操作を行った。このプラークハイブリダイゼーション法は下記の通りに行った。
【００４７】
（ｉ）上記（３）、（ｉｉｉ）で得られたプローブＤＮＡを、ＤＮＡラベリングキット（ロッシュ・ダイアグノスティックス社製、ＤＩＧ−ＥＬＩＳＡ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ＆  ＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ）を用いて、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）でラベルした。これによって標識プローブＤＮＡを得た。
【００４８】
（ｉｉ）次に上記（２）で得られたシクラメンｃＤＮＡライブラリーである組換えラムダファージを、１．５％寒天培地上で培養した宿主の大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’に感染させ、増殖させた。こうして、該ファージのプラークを培地上に形成させた。
【００４９】
シクラメンｃＤＮＡライブラリーを構成する前記の組換えファージのプラークをナイロン膜（Ｇｅｎｅ  Ｓｃｒｅｅｎ（パーキンエルマーライフサイエンス社製））に転写した。該ファージプラークが転写されたナイロン膜を、アルカリ変性液（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  ＮａＯＨ）と、中和液（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））と、２×ＳＳＣ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）とでそれぞれ次々に１０分間処理した後、風乾し、さらに８０℃、２時間ベーキングを行うことにより、前記の組換えラムダファージのプラークに含まれているファージＤＮＡを前記ナイロン膜上に固定した。
【００５０】
（ｉｉｉ）このファージＤＮＡが固定されたナイロン膜を、ハイブリダイゼーション溶液（５００ｍＭ    ＮａＰｉバッファー（ｐＨ７．２）、７％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に浸し、６８℃、２時間の浸漬処理を行った。
【００５１】
次に前記のＤＩＧラベルした標識プローブＤＮＡを１００℃  ５分間インキュベートした（ディネイチャー処理）。次いでこれをハイブリダイゼーション溶液に、ハイブリダイゼーション溶液中のプローブＤＮＡ濃度が１０ｎｇ／ｍｌになるように加えた。標識プローブＤＮＡを添加され、含有するハイブリダイゼーション溶液に前記ナイロン膜を浸し、さらに６８℃で１５時間浸漬処理することによって、前記の標識プローブＤＮＡとナイロン膜上に固定された目的のファージＤＮＡの間に所要のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成させた。
【００５２】
そのプラークハイブリダイゼーションの反応終了後に、６８℃に保温した洗浄液（４０ｍＭ  ＮａＰｉバッファー（ｐＨ７．２）、１％  ＳＤＳ）で前記のナイロン膜を２０分ずつ３回洗浄した。その後、上記のＤＩＧ−ＥＬＩＳＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ＆  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて、シクラメンのＦ３’，５’ＨをコードするＤＮＡ配列を含有した所要の組換えファージを検出できた。
【００５３】
（ｉｖ）その結果、６０万個の組換えラムダファージ・プラークから、シクラメンＦ３’，５’ＨをコードするＤＮＡ配列を内部に組み込み、内含すると思われるファージプラークの４個を、ポジチブクローンとして選抜できた。
【００５４】
（５）ｃＤＮＡのサブクローニング
前記（４）（ｉｖ）で単離した４個のプラークから、ファージをそれぞれＳＭバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、８ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．０１％ゼラチン）に溶出し、採取した。前記のＬａｍｂｄａ  ＺＡＰＩＩ  Ｐｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄ  ＥｃｏＲＩ／ＣＩＡＰ−Ｔｒｅａｔｅｄ  ＶｅｃｔｏｒＫｉｔに従い、これら４種類のファージを別々にヘルパーファージＥｘＡｓｓｉｓｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）と共に、宿主である大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’に感染させることにより、大腸菌内でファージＤＮＡから、シクラメンＦ３’，５’Ｈをコードすると思われるｃＤＮＡが挿入されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）ファージミドＤＮＡ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を切り出した。さらにこの大腸菌を培養することにより、該ファージミドＤＮＡを持つファージを培養上清中に得た。これらのファージを含む培養上清液を大腸菌ＳＯＬＲ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に感染させ、形質転換された大腸菌を得た。このように形質転換した４種類の大腸菌の細胞それぞれから、サブクローニングされたファージミドＤＮＡをアルカリＳＤＳ法を用いて抽出した。得られたＤＮＡ１μｌを１０μｌのＨバッファー中で制限酵素ＥｃｏＲＩ  ５単位で消化した。消化反応液をアガロースゲル電気泳動により分析した結果、４種類のファージミドＤＮＡは何れも約１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を保持することが確認された。
【００５５】
（６）シクラメンＦ３’，５’ＨをコードするｃＤＮＡのシークエンシング
上記（５）でファージミドＤＮＡとしてサブクローニングした４つのｃＤＮＡ断片はいずれもシクラメンＦ３’，５’Ｈ  ｃＤＮＡの全長を含むことが予想されたため、１．７ＫｂｐのｃＤＮＡを保持するファージミドＤＮＡのうちの１つ（ＣｐＦＨ−１と命名した）を選択し、これの塩基配列解析を行った。この塩基配列の解析は、プラスミド精製キット（ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製））およびＤＮＡシークエンス受託サービス（北海道システム・サイエンス（株））を用い、自動ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００  Ｇｅｎｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製））で決定した。その結果、前記の１．７ＫｂｐのサイズのＤＮＡ断片は１７４５個の塩基よりなるｃＤＮＡであると決定された。この１７４５ｂｐのサイズのｃＤＮＡは１５２４個の塩基よりなる単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＤＮＡ配列を含む。この１７４５ｂｐサイズのｃＤＮＡの塩基配列を配列表の配列番号１に示す。前記のＯＲＦは８９個の塩基よりなる５’非翻訳領域と、１２７個の塩基よりなるＤＮＡ配列の３’非翻訳領域とにはさまれて存在する。
【００５６】
上記配列番号２のアミノ酸配列をこれまで明らかにされているペチュニアのＦ３’，５’Ｈと比較する７６％の相同性が認められるが、他の領域ではペチュニアのＦ３’，５’Ｈと明らかに異なることが認められ、シクラメン特有の配列であることがわかる。
【００５７】
尚、シクラメンのＦ３’，５’Ｈをコードする本発明ＤＮＡとペチュニアのＦ３’，５’Ｈ遺伝子との塩基配列の相同性は、６１％であることが認められた。相同性の算出は、Ｇｅｎｅ  Ｗｏｒｋｓ  ２．５．１ソフトウェア（（株）帝人システムテクノロジー）を用い、本発明のシクラメンのＦ３’，５’ＨとペチュニアのＦ３’，５’ＨのＰｒｏｔｅｉｎ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔファイルをソフトウェアの初期設定条件で作成することによって行った。
【００５８】
【発明の効果】
本発明により提供される、シクラメンのＦ３’，５’Ｈをコードする遺伝子は、シクラメンと同種または異種の植物体に単独または他のＤＮＡと組み合わせて導入すると、該植物中でのアントシアニン合成に関与する酵素反応を調節することができる。本発明ＤＮＡは、植物の花色の多様性を計るための植物の育種と開発に利用できる。
【００５９】
【配列表】
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