(57)【要約】【課題】　ＨＩＶ−Ｉポリヌクレオチドを提供する。【解決手段】　少なくとも２１ｂｐのフラグメントを含有するポリヌクレオチドであって、該フラグメントはＡＲＶ−２（７Ｄ）（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．４０１４３）またはＡＲＶ−２（８Ａ）（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．４０１４４）に由来し、かつ該フラグメントは特定のヌクレオチド配列から得られる、ポリヌクレオチド（ただし、少なくとも２１ｂｐの該フラグメントは、特願昭６０−５０３９３７号（特表昭６１−５０１４３１）に開示されたｉ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩ組換えクローンＢＨ５からの３．５ｋｂウイルス挿入体ではなく、ｉｉ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩ組換えクローンＢＨ８からの５．５ｋｂウイルス挿入体ではなく、また、ｉｉｉ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩ組換えクローンＢＨ１０からの９．０ｋｂウイルス挿入体ではない）。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２１ｂｐのフラグメントを含有するポリヌクレオチドであって、該フラグメントはＡＲＶ−２（７Ｄ）（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．４０１４３）またはＡＲＶ−２（８Ａ）（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．４０１４４）に由来し、かつ該フラグメントは以下のヌクレオチド配列から得られる、ポリヌクレオチド：
【化１】
2004081219.tif 000026
【化２】
2004081219.tif 000027
【化３】
2004081219.tif 000028
【化４】
2004081219.tif 000029
【化５】
2004081219.tif 000030
【化６】
2004081219.tif 000031
（ただし、少なくとも２１ｂｐの該フラグメントは、特願昭６０−５０３９３７号（特表昭６１−５０１４３１）に開示された
ｉ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩ組換えクローンＢＨ５からの３．５ｋｂウイルス挿入体ではなく、
ｉｉ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩ組換えクローンＢＨ８からの５．５ｋｂウイルス挿入体ではなく、また、
ｉｉｉ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩ組換えクローンＢＨ１０からの９．０ｋｂウイルス挿入体ではなく、
　更に、少なくとも２１ｂｐの該フラグメントは特願昭６０−５０４３２７（特表昭６２−５００２８２）に開示された
ａ）ＬＡＶ７５と命名されたＬＡＶからの０．６ｋｂｐウイルス挿入体ではなく、
ｂ）ＬＡＶ８２と命名されたＬＡＶからの０．８ｋｂｐウイルス挿入体ではなく、
ｃ）ＬＡＶ１３と命名されたＬＡＶからの２．５ｋｂｐウイルス挿入体ではなく、
ｄ）ＬＡＶファージλＪ１９からの９．１ｋｂｐウイルス挿入体ではなく、
ｅ）λＪ１９のほぼＫｐｎＩ（６１００）からほぼＢｇｌＩＩ（９１５０）に至るＤＮＡフラグメントではなく、
ｆ）λＪ１９のほぼＫｐｎＩ（３５００）からほぼＢｇｌＩＩ（６５００）に至るＤＮＡフラグメントではなく、
ｇ）λＪ１９のほぼＰｓｔＩ（８００）からほぼＫｐｎＩ（３５００）に至るＤＮＡフラグメントではなく、また、
ｈ）λＪ１９を図２に示される任意の制限部位で消化することにより得られたＤＮＡフラグメントではなく、
　更に、少なくとも２１ｂｐの該フラグメントは、特願昭６０−２２６６５８号（特開昭６２−２６３００）に開示された
（Ｉ）２．３ｋｂｐＫｐｎＩ−ＫｐｎＩフラグメントではなく、
（ＩＩ）１．０ｋｂｐＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントではなく、また、
（ＩＩＩ）２．４ｋｂｐＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントではない）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、遺伝子工学分野に属する。より詳細には、本発明はリンパ節疾患症候群（ＬＡＳ）および／または後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ：エイズ）に関連する組換えウィルスポリヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
　ヒトＴ細胞リンパ趨行性ウイルス−Ｉ（ＨＴＬＶ−Ｉ）が、ヒトにおける感染作用物質であることが発見されたことにより、レトロウィルスがヒトに感染し、疾病の病因となり得ることが立証されるに至った。ＨＴＬＶ−Ｉの発見後、それと同じ科に属する第２のレトロウィルス、ＨＴＬＶ−ＩＩが、毛状細胞白血病（ｈａｉｒｙ　ｃｅｌｌ　ｌｅｕｋｅｍｉａ）の確立された株から発見された。それ以来、そのほかにも、リンパ節疾患症候群（ＬＡＳ）および／または後天性免疫不全症候群（エイズ）罹患者に関連しているヒト・レトロウィルス類が単離された。種々のレトロウィルスが、エイズ（これらは、ＨＴＬＶ−ＩＩＩとも呼ばれる）またはＬＡＳ（これらは、ＬＡＶとも呼ばれる）の患者から単離された〔例えば、非特許文献１；および非特許文献２（印刷中）；非特許文献３；非特許文献４および非特許文献５、参照〕。また、フェオリノ（Ｆｅｏｒｉｎｏ）らは、ＨＴＬＶ−ＩＩＩとＬＡＶとの比較を行っている（上記）。そのほか、非特許文献６、および非特許文献７（前掲）ならびにこれらの文献中で引用されているこの分野の調査資料も参考にせよ。Ｔ細胞白血病ウイルスに関する総説は、非特許文献８に掲載されている。また、レビー（Ｌｅｖｙ）らはＡＲＶ（エイズに関係しているレトロウィルス）を単離したことを報告している〔非特許文献９〕。
【０００３】
　本明細書においては、これらのウイルス類（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶおよびＡＲＶ）を、ヒト・Ｔ細胞リンパ趨行性レトロウィルス（ｈＴＬＲ）と総称する。これらのｈＴＬＲは、前記の参考諸文献を参照すればわかるように、形態学、血清学、逆転写酵素の最適条件、および細胞病理学上類似しているので、同一の網に属していることがわかる。例えば、それらの逆転写酵素にはＭｇ＋２が好ましく、その最適ｐＨは約７．８である。
【非特許文献１】バーレ・シヌーシ（Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２０巻、８６８〜８７１（１９８３年）
【非特許文献２】モンタニエル（Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ）ら、コールド・スプリング・ハーバー・シンポジウム（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）、１９８４年
【非特許文献３】ビルマー（Ｖｉｌｍｅｒ）ら、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）、１９８４年、１、７５３
【非特許文献４】ポポビック（Ｐｏｐｏｖｉｃ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２４巻、４９７（１９８４年）
【非特許文献５】ガロ（Ｇａｌｌｏ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２４巻、５００（１９８４年）
【非特許文献６】クラッツマン（Ｋｌａｔｚｍａｎ）らのサイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２５巻、５９〜６２（１９８４年）
【非特許文献７】モンタニエル（Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ）らの文献（１９８４年）
【非特許文献８】サイエンス誌〔マークス（Ｍａｒｘ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２４巻、４７５〜４７７（１９８４年）〕
【非特許文献９】サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２５巻、８４０〜８４２（１９８４年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
　本発明は、ｈＴＬＲタンパク質を暗号化しているｈＴＬＲ・ＤＮＡ配列を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
　本発明の具体的態様は以下の通りである。
【０００６】
　単細胞微生物によって認識される複製系と、オープン・リーディング・フレーム（読取り枠）を有する少なくとも２１ｂｐのＤＮＡ配列、を含んでいる組換え体ＤＮＡ組立物であって、該配列が、プロウィルスのｈＴＬＲ・ＤＮＡのｇａｇ、ｅｎｖ、またはｐｏｌ領域にある配列と実質的に相補的であり、かつ、ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩと免疫学的に非交差反応性であってｈＴＬＲと反応し得るポリペプチド、を暗号化している配列を含んでいることを特徴とする組換え体ＤＮＡ組立物：上記のＤＮＡ組立物を含んでいる単細胞微生物を増殖させ、それによって該ＤＮＡ配列を複製することから成るｈＴＬＲに特異的なＤＮＡのクローン化方法：
　以下の工程、（ａ）単細胞微生物宿主内で有効に機能する転写および翻訳の開始ならびに停止調節シグナルおよび、読取り枠を有する少なくとも２１ｂｐのＤＮＡ配列であって、プロウィルスのｈＴＬＲ・ＤＮＡのｇａｇ、ｅｎｖまたはｐｏｌ領域に存在する配列と実質的に相補的であり、ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩと免疫学的に非交差反応性であってｈＴＬＲとは反応し得るポリペプチドをコードしている、該シグナルの調節コントロール下にある配列、を含んでいるＤＮＡ組立物を該宿主に導入し、次いで（ｂ）この宿主を栄養培地中で増殖させ、所期の発現生産物を製造する、ことから成るｈＴＬＲの発現生産物の製造方法：および抗原性組換えＡＲＶ−２ｇａｇ、ｐｏｌまたはｅｎｖポリペプチドの少なくとも１つをｈＴＬＲに対する抗体との結合に使用することを特徴とする、該抗体の存在が疑われる試料中のｈＴＬＲ抗体を検出するための免疫測定法：組換え体ポリペプチドが（ａ）ＡＲＶ−２　ｐ１６ｇａｇ、（ｂ）ＡＲＶ−２　ｐ２５ｇａｇ、（ｃ）ＡＲＶ−２　ｅｎｖ、（ｄ）ＡＲＶ−２　ｐ３１ｐｏｌ、（ｅ）ＡＲＶ−２　ｐ１６ｇａｇとＡＲＶ−２　ｐ２５ｇａｇとの融合タンパク質、または（ｆ）スーパーオキシド・ジスムターゼとＡＲＶ−２　ｐ３１ｐｏｌとの融合タンパク質であることを特徴とする組換えポリペプチド：および固形支持体と結合している上記の組換え体ポリペプチドを、少なくとも１つ含有していることから成るｈＴＬＲ抗体の免疫測定に用いる製造物。
【０００７】
　１つの局面において、本発明は、少なくとも２１ｂｐのフラグメントを含有するポリヌクレオチドであって、該フラグメントはＡＲＶ−２（７Ｄ）（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．４０１４３）またはＡＲＶ−２（８Ａ）（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．４０１４４）に由来し、かつ該フラグメントは以下のヌクレオチド配列から得られる、ポリヌクレオチドを提供する：
【０００８】
【化７】
2004081219.tif 000002
【０００９】
【化８】
2004081219.tif 000003
【００１０】
【化９】
2004081219.tif 000004
【００１１】
【化１０】
2004081219.tif 000005
【００１２】
【化１１】
2004081219.tif 000006
【００１３】
【化１２】
2004081219.tif 000007
（ただし、少なくとも２１ｂｐの該フラグメントは、特願昭６０−５０３９３７号（特表昭６１−５０１４３１）に開示された
ｉ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩ組換えクローンＢＨ５からの３．５ｋｂウイルス挿入体ではなく、
ｉｉ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩ組換えクローンＢＨ８からの５．５ｋｂウイルス挿入体ではなく、また、
ｉｉｉ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩ組換えクローンＢＨ１０からの９．０ｋｂウイルス挿入体ではなく、
　更に、少なくとも２１ｂｐの該フラグメントは特願昭６０−５０４３２７（特表昭６２−５００２８２）に開示された
ａ）ＬＡＶ７５と命名されたＬＡＶからの０．６ｋｂｐウイルス挿入体ではなく、
ｂ）ＬＡＶ８２と命名されたＬＡＶからの０．８ｋｂｐウイルス挿入体ではなく、
ｃ）ＬＡＶ１３と命名されたＬＡＶからの２．５ｋｂｐウイルス挿入体ではなく、
ｄ）ＬＡＶファージλＪ１９からの９．１ｋｂｐウイルス挿入体ではなく、
ｅ）λＪ１９のほぼＫｐｎＩ（６１００）からほぼＢｇｌＩＩ（９１５０）に至るＤＮＡフラグメントではなく、
ｆ）λＪ１９のほぼＫｐｎＩ（３５００）からほぼＢｇｌＩＩ（６５００）に至るＤＮＡフラグメントではなく、
ｇ）λＪ１９のほぼＰｓｔＩ（８００）からほぼＫｐｎＩ（３５００）に至るＤＮＡフラグメントではなく、また、
ｈ）λＪ１９を図２に示される任意の制限部位で消化することにより得られたＤＮＡフラグメントではなく、
　更に、少なくとも２１ｂｐの該フラグメントは、特願昭６０−２２６６５８号（特開昭６２−２６３００）に開示された
（Ｉ）２．３ｋｂｐＫｐｎＩ−ＫｐｎＩフラグメントではなく、
（ＩＩ）１．０ｋｂｐＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントではなく、また、
（ＩＩＩ）２．４ｋｂｐＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントではない）。
【００１４】
　好ましい実施形態において、前記フラグメントは、ｅｎｖ領域に由来する。
【００１５】
　好ましい実施形態において、前記フラグメントは、ｇａｇ領域に由来する。
【００１６】
　好ましい実施形態において、前記フラグメントは、ｐｏｌ領域に由来する。
【００１７】
　別の局面において、本発明は、少なくとも２１ｂｐのフラグメントを含有するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドプローブであって、該フラグメントはＡＲＶ−２（７Ｄ）（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．４０１４３）またはＡＲＶ−２（８Ａ）（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．４０１４４）に由来し、かつ該フラグメントは以下のヌクレオチド配列から得られる、ポリヌクレオチドプローブを提供する：
【００１８】
【化１３】
2004081219.tif 000008
【００１９】
【化１４】
2004081219.tif 000009
【００２０】
【化１５】
2004081219.tif 000010
【００２１】
【化１６】
2004081219.tif 000011
【００２２】
【化１７】
2004081219.tif 000012
【００２３】
【化１８】
2004081219.tif 000013
（ただし、少なくとも２１ｂｐの該フラグメントは、特願昭６０−５０３９３７号（特表昭６１−５０１４３１）に開示された
ｉ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩ組換えクローンＢＨ５からの３．５ｋｂウイルス挿入体ではなく、
ｉｉ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩ組換えクローンＢＨ８からの５．５ｋｂウイルス挿入体ではなく、また、
ｉｉｉ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩ組換えクローンＢＨ１０からの９．０ｋｂウイルス挿入体ではなく、
　更に、少なくとも２１ｂｐの該フラグメントは特願昭６０−５０４３２７（特表昭６２−５００２８２）に開示された
ａ）ＬＡＶ７５と命名されたＬＡＶからの０．６ｋｂｐウイルス挿入体ではなく、
ｂ）ＬＡＶ８２と命名されたＬＡＶからの０．８ｋｂｐウイルス挿入体ではなく、
ｃ）ＬＡＶ１３と命名されたＬＡＶからの２．５ｋｂｐウイルス挿入体ではなく、
ｄ）ＬＡＶファージλＪ１９からの９．１ｋｂｐウイルス挿入体ではなく、
ｅ）λＪ１９のほぼＫｐｎＩ（６１００）からほぼＢｇｌＩＩ（９１５０）に至るＤＮＡフラグメントではなく、
ｆ）λＪ１９のほぼＫｐｎＩ（３５００）からほぼＢｇｌＩＩ（６５００）に至るＤＮＡフラグメントではなく、
ｇ）λＪ１９のほぼＰｓｔＩ（８００）からほぼＫｐｎＩ（３５００）に至るＤＮＡフラグメントではなく、また、
ｈ）λＪ１９を図２に示される任意の制限部位で消化することにより得られたＤＮＡフラグメントではなく、
　更に、少なくとも２１ｂｐの該フラグメントは、特願昭６０−２２６６５８号（特開昭６２−２６３００）に開示された
（Ｉ）２．３ｋｂｐＫｐｎＩ−ＫｐｎＩフラグメントではなく、
（ＩＩ）１．０ｋｂｐＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントではなく、また、
（ＩＩＩ）２．４ｋｂｐＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントではない）。
【００２４】
　好ましい実施形態において、前記フラグメントは、ｅｎｖ領域に由来する。
【００２５】
　好ましい実施形態において、前記フラグメントは、ｇａｇ領域に由来する。
【００２６】
　好ましい実施形態において、前記フラグメントは、ｐｏｌ領域に由来する。
【００２７】
　好ましい実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。
【００２８】
　別の局面において、本発明は、少なくとも２１ｂｐのフラグメントを含有するポリヌクレオチドを製造する方法であって、該ポリヌクレオチドの少なくとも一部を化学的に合成する工程を包含し、該フラグメントはＡＲＶ−２（７Ｄ）（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．４０１４３）またはＡＲＶ−２（８Ａ）（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．４０１４４）に由来し、かつ該フラグメントは以下のヌクレオチド配列から得られる、方法を提供する：
【００２９】
【化１９】
2004081219.tif 000014
【００３０】
【化２０】
2004081219.tif 000015
【００３１】
【化２１】
2004081219.tif 000016
【００３２】
【化２２】
2004081219.tif 000017
【００３３】
【化２３】
2004081219.tif 000018
【００３４】
【化２４】
2004081219.tif 000019
（図面の説明）
　図１は、プロウィルスＤＮＡ（ＡＲＶ−２）の制限酵素切断地図を示している。
【００３５】
　図２および図３は、ＡＲＶ−２（９Ｂ）のヌクレオチド配列を示す。ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子による生産物のアミノ酸配列も示してある。また、ＬＴＲのＵ３、ＲおよびＵ５領域も示してある。キャップ（ｃａｐ）部位は＋１の位置である。ＬＴＲの終末にある３ｂｐの逆方向反復配列、−２９位のＴＡＴＡボックス、１８３位にあるｔＲＮＡｌｙｓの３’−終末と相補的な配列、および９１７４位にあるポリアデニル化シグナルには、下線を引いてある。上線はウィリオン（ウイルス粒子）タンパク質から決定されたアミノ配列を示す。各列毎の最初にヌクレオチド番号を付し、また各列の終わりにアミノ酸番号を示した。
【００３６】
　図４は、プラスミドｐＧＡＧ２５−１０の製造方法を示した工程系統図である。
【００３７】
　図５は、プラスミドｐＧＡＧ２５−１０にクローンしたｐ２５ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列と、この遺伝子によって暗号化されているアミノ酸配列を示す。
【００３８】
　図６は、融合タンパク質ｐ４１ｇａｇを生産するためのｐＧＡＧ４１−１０にクローンしたヌクレオチド配列の暗号鎖と、それに対応するアミノ酸を示す。
【００３９】
　図７は、ＡＲＶ−２　ｐ１６ｇａｇタンパク質を暗号化しているヌクレオチド配列を示している。このものをプラスミドｐｔａｃ５にクローンし、細菌内中でｐ１６ｇａｇタンパク質を生産するための発現プラスミドを作成する。
【００４０】
　図８は、プラスミドｐＤＰＣ３０３を調製するために使用されたＡＲＶ−２　ｅｎｖタンパク質を暗号化しているヌクレオチド配列を示している。
【００４１】
　図９および図１０は、ＡＲＶ−２　ｐ３１タンパク質を暗号化しており、プラスミドｐＴＰ３１に含まれているヌクレオチド配列を示している。
【発明の効果】
【００４２】
　本発明により、ｈＴＬＲタンパク質を暗号化しているｈＴＬＲ・ＤＮＡ配列が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
　ｈＴＬＲ・ＤＮＡ配列は、プロウィルスＤＮＡまたはそのｃＤＮＡから分離し、クローンしたものであっても、もしくは合成したものでも、いずれも、切断によってさらに操作する前駆体タンパク質の形の、または完全な成熟タンパク質またはその断片の形のポリペプチドの発現に用いることができる。受容体、例えば免疫グロブリンと特異的結合を行うことが可能なアミノ酸配列を暗号化している配列を得るための最も小さい配列は、開始コドンを除けば２１ｂｐであり、通常、少なくとも４５ｂｐである。その配列は完全なポリペプチドまたはそれより大きい部分をコードしていてもよく、また、２個またはそれ以上の異なった成熟ポリペプチドを暗号化している配列の一部または全配列を含むように、その配列は前駆体ポリペプチドの周辺領域を含んでいてもよい。通常、配列は約５ｋｂｐを超えることはなく、さらに、約３ｋｂｐを超えないのが普通である。
【００４４】
　読取り枠（図６）を有する特に重要な配列は、ｇａｇタンパク質（ｐ１６およびｐ２５）、ｅｎｖタンパク質およびｐｏｌタンパク質（ｐ３１）の構造遺伝子である。上記の配列は、その配列の５’−終末が発現生産物のＮ−末端アミノ酸を暗号化しないようにレトロウィルスに存在している他の配列にスプライス（接合）できるということを理解すべきである。スプライス部位は読取り枠の５’−末端であってもよく、または読取り枠の内側にあってもよい。上に挙げた全配列を使用すると伸張したタンパク質が得られるので、タンパク質に対する開始コドンは最初のメチオニンに対するコドンではなく、次のメチオニンまたは３番目のメチオニンに対するコドンであることもある。ところが、哺乳類細胞にはｇａｇまたはｅｎｖ遺伝子に関してタンパク質分解的プロセシングがあるらしい。このプロセシングには、余分なアミノ酸の除去が含まれる。
【００４５】
　種々のドメインを単離するには、プロウィルスを制限エンドヌクレアーゼで消化し、断片を電気泳動して、適切な大きさを有し、プローブが使用できる場合にはこのプローブで２本鎖とした断片を単離し、クローニングベクターでクローンし、ベクターからこれを切り取る。次いで、この断片を発現用に手術する。余分なヌクレオチドは、Ｂａｌ３１の消化によって一方または両末端から除去する。制限酵素切断地図を作成することにより、都合のよい制限部位を暗号化領域の外側または内側に位置付ける。アミノ酸を変化させたり、あるいは変えることなく（隠れた変化）、コドンを変化させ得る場合、制限部位を導入したり除去するために、末端を決めたり、挿入、欠失、点または多重突然変異等を行うためにプライマー修復、または試験管内突然変異誘発を行うことができる。遺伝子を先端切断（ｔｒｕｎｃａｔｅ）した場合、アダプターを用いて失われたヌクレオチドと置き換える。暗号化領域を結合して好適な読取り枠を確保するのにアダプターは特に有用である。
【００４６】
　ｈＴＬＲゲノムのｅｎｖ領域は、プロウィルスをＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化し、３３００塩基対（ｂｐ）断片を精製することによって得ることができる。この断片には、約４００ｂｐの５’−非暗号化領域と約２００ｂｐの３’−非暗号化領域が含まれている。読取り枠の５’−末端の配列によって暗号化されている３個のメチオニンは、翻訳開始部位として役立つ。
【００４７】
　プロウィルス配列をＳａｃＩおよびＥｃｏＲＶで消化すると、ｇａｇドメイン（領域）と、ｇａｇ領域の３’−末端側に第２の小さい読取り枠を含んでいる約２３００ｂｐの断片が得られる。このｇａｇドメインは約１５００ｂｐであって、プロセシングにより約２５，０００（ｐ２５）、１６，０００（ｐ１６）および１２，０００（ｐ１２）ダルトンのタンパク質を与える大きい前駆体タンパク質を暗号化している。また、ＳａｃＩおよびＢｇｌＩＩで消化を行ってもよく、この場合はｐ１２およびｐ２５ならびにｐ１６の一部を含んでいるｇａｇドメインのみが得られる。
【００４８】
　上記のものをＫｐｎＩおよびＳｓｔＩにより消化すると、ｐ３１を暗号化しているｐｏｌドメイン部分を含んでいる断片が得られる。
【００４９】
　上記のＤＮＡ配列群によって発現されるポリペプチド類は、多方面にわたって利用できる。これらのポリペプチドまたは免疫的活性を有するその断片は、標識し、または標識していない形で、または固定化（即ち、固体表面と結合させて）して診断試薬として使用でき、また、例えば阻止抗体等のモノクローナル抗体の生産により、ワクチンとして使用することができる。
【００５０】
　ＤＮＡ配列を、ウイルスのような他の配列（例えば、ワクチニアウィルスやアデノウィルス等）と結合させて、ワクチン化に使用することができる。具体的に言うと、宿主によって免疫原として認識されるｈＴＬＲ抗原を与えるように、ワクチニアウィルスに該ウイルス抗原のＤＮＡ配列を、それが発現され得る部位へと挿入する。ｇａｇ、ｐｏｌまたはｅｎｖ遺伝子、免疫原性を暗号化しているそれら遺伝子の断片が使用できる。
【００５１】
　もう１つの別法は、ｇａｇ、ｅｎｖまたはｐｏｌ領域またはそれらの一部を、ＨＢｓＡｇ遺伝子、またはｐｒｅ−Ｓ　ＨＢｓＡｇ遺伝子、または免疫原性を有し、例えば酵母のような単細胞微生物宿主または哺乳動物中で粒子を形成し得るそれらの一部分と結合させる方法である。このようにして、組立てられた粒子を宿主に接種すると宿主にとってｈＴＬＲ免疫原となる粒子が生成する。
【００５２】
　該免疫原は、ワクチンとして種々の形で、経口、非経口、静脈内、動脈内、皮下等、様々の経路で投与することができる。通常、これらは生理学的に許容し得る担体、即ち一般に、蒸留水、リン酸緩衝食塩液、生理食塩液等に加えて投与する。水酸化アルミニウムのような種々のアジュバントを加えることができ、投与量、投与回数および投与方法は経験的に決定する。
【００５３】
　ｈＴＬＲ配列を得るために、感染宿主細胞の上清からウイルスをペレット化することができる。低融点アガロースゲル中で、ウイルスＲＮＡの電気泳動を行った後、フェノール抽出により、９ｋｂのＲＮＡ種を精製する。次に、この精製ＲＮＡを鋳型として使用し、ランダム・プライヤーと共に逆転写酵素反応にかける。次いで、得られたｃＤＮＡを、感染細胞および非感染細胞からのポリＡ＋ＲＮＡとのハイブリダイゼーションによってスクリーニングする。感染細胞のものとはハイブリダイゼーションする非感染細胞からのものとはハイブリダイズしないものがｈＴＬＲに関係している。
【００５４】
　感染細胞から得られるゲノムＤＮＡを制限酵素で消化し、これを使用してバクテリオファージ・ライブラリーを作成することができる。先に得られたレトロウィルス断片の制限分析に基づいて、ウィルス・ゲノムをＥｃｏＲＩで部分消化し、９ｋｂ〜１５ｋｂ　ＤＮＡ断片を単離し、ライブラリーの作成に使用する。得られた組換え体ファージを、ウイルスｃＤＮＡプローブを使用する二重リフト・スクリーニング法によってスクリーニングし、次いでこれを、例えばプラーク精製などによりさらに精製し、大型液体培養により増殖させる。このライブラリーから、ウイルスの完全配列を得ることができ、前記のプローブで検出できる。
【００５５】
　ｈＴＬＲ・ＤＮＡ（それがプロウィルスであっても、ｃＤＮＡであっても）は、都合よい任意のベクターでクローンすることができる。ｈＴＬＲ・ＤＮＡは、それが完全なｈＴＬＲであっても、あるいはその断片であっても、微生物宿主内で（それは哺乳類、酵母、節足動物、植物等、原核細胞または真核細胞の何れであってもよい）機能し得る複製系に連結できる場合であれば、組立物は、環状または線状の何れにも調製することができる。微生物宿主には、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチラス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｅｎｏｓａ）、エス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、エヌ・クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）等が含まれる。複製系は、Ｃｏｌ　Ｅ１、２ｍμ、プラスミド、λ、ＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルス等、即ち、プラスミドおよびウイルスの何れのものであってもよい。組立物は、複製系およびｈＴＬＲ・ＤＮＡ以外に、形質転換またはトランスフェクトされた宿主を選択し得る、通常、１またはそれ以上のマーカーを含んでいる。マーカーとしては、例えば抗生物質、重金属に対する耐性のような微生物殺滅剤に対する抵抗性、栄養素要求性宿主（オークソトロフィー）に原栄養体（プロトトロフィー）を与える相補性等が含まれる。
【００５６】
　発現のためには、発現ベクターが使用される。微生物における発現では、発現ベクターはクローニングベクターと異なり、転写および翻訳の開始および停止の調節シグナルを有しており、発現宿主において機能し得る複製系を含むこともあり、含んでいないこともある。暗号配列は、調節コントロールを受けるように開始および停止の両調節シグナルの間に挿入する。さらに発現ベクターは、例えば、温度に鋭敏な、または化学薬品により誘導される調節可能なプロモーター、または、ｔｋ、ｄｈｆｒ、金属チオネイン等のような、ベクターとｈＴＬＲ・ＤＮＡの組込みおよび増幅を可能にする遺伝子等を含んでいることもある。
【００５７】
　発現ベクターは、調節機能が宿主内で機能する適切な宿主へ導入する。発現宿主を好適な栄養培地中で増殖させ、所望のポリペプチドを生産させる。ポリペプチドが分泌されたら、細胞または培地からこれを単離する。
【００５８】
　転写および翻訳の調節シグナルが機能し得る宿主を使用する場合、ｈＴＬＲ・ＤＮＡを操作し、調節シグナルに並置させて所望のポリペプチドが発現されるようにする。
【００５９】
　ポリペプチド生産物は、特にヒト細胞に由来する残渣を含まない、実質的に純粋な形で得ることができる。この残渣は、タンパク質、多糖類、脂質、核酸、ウイルス、細菌類、真菌類等、およびその組合せのような汚染物から成っている。一般に、該ポリペプチド生産物の有する発現宿主からの夾雑物は０．１（重量）％より少なく、通常は０．０１％より少ない。所望のポリペプチドが、細胞質内で生産されたか、または分泌されたかによって、単離の方法は変わってくる。生産物が細胞質内にある場合は、細胞を回収し、酸素分解し、生産物を抽出し、溶媒抽出、クロマトグラフィー、ゲル排除、電気泳動等によって精製する。分泌されている場合は、所望の生産物を栄養培地から抽出し、上記の方法に従って精製する。
【００６０】
　ｅｎｖ、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子、および免疫原性部位を有するそれらの免疫原性断片の発現生産物は、ｈＴＬＲ抗原に結合する抗体存在の有無を測定する患者血液の抗血清スクリーニングに使用することができる。１またはそれ以上の組換え体抗原が、この血清学的測定に使用できる。好ましい測定の態様は、ｇａｇ、ｅｎｖおよびｐｏｌ抗原の組合せを使用する。ｐ２５、ｐ３１およびｅｎｖ組換え体抗原の組合せが特に好ましい。標識した、または標識しない抗原、または固定化抗原を含め、極めて多様な免疫測定手法を使用することができる。標識物としては、蛍光体、放射性核種酵素、化学発光体、磁気粒子、酵素基質、補助因子または阻害物質、配位子（リガンド）等を挙げることができる。
【００６１】
　特に都合のよい手法は、測定管の表面または測定板のウェル（井戸）、またはニトロセルロースまたはナイロンのような物質のようにタンパク質を結合する支持体に抗原を結合し、試料をこの固定化抗原と接触させる方法である。支持体を洗浄して、非特異的結合抗血清を除去した後、標識したヒトＩｇ（免疫グロブリン）抗体を加える。次いで、支持体をもう一度洗浄して、結合していない標識抗ヒトＩｇを除去する。次いで、標識物を検出することにより、結合している被検物質の存在量を測定する。
【００６２】
　イライサ法（ＥＬＩＳＡ）および「ドット・ブロット（ｄｏｔ−ｂｌｏｔ）」測定法は、抗ｈＴＬＲ抗体について血液または血清試料をスクリーニングするのに特に有用である。イライサ測定法は、抗原性ｈＴＬＲポリペプチドで被覆してあるウェル（井戸）を有する微量滴定皿を使用する。ウェルはまた、試料中の抗体がウェル表面と非特異的結合をすることを避けるため、上からさらに非抗原性タンパク質で被覆してある。試料をウェルに加え、抗原−抗体結合に好ましい条件下で、好適な時間、インキュベートする。
【００６３】
　試料中に存在している抗ｈＴＬＲ抗体は、ウェル壁の抗原または抗原群と結合する。次いで、試料を除き、ウェルを洗浄して残っている未結合試料を除く。酵素標識をしてあるヒト免疫グロブリンを含有している試薬をウェルに加え、標識した抗ヒトＩｇ抗体と、ウェル壁に結合しているｈＴＬＲ抗原−ヒト抗体複合体との間に結合が生じるように、インキュベートする。インキュベーション完了後、試薬を除去し、ウェルを洗浄して未結合の標識試薬を除く。次いで、基質試薬をウェルに加え、インキュベートする。基質に対する酵素活性を、肉眼的または分光学的に測定し、ウェル表面に結合している抗ｈＴＬＲ抗体含有免疫複合体の存在および量の測定値（ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）とする。
【００６４】
　「ドット・ブロット」法は、抗原被覆した微量滴定皿を使うより、むしろニトロセルロース濾紙またはナイロン膜のような吸水性の支持材料小片の１個または１枚に固定化したｈＴＬＲ抗原を使用する。支持体はまた、抗体と支持体との非特異的結合を防ぐため、さらに非抗原性タンパク質で処理しておく。抗原を保有している支持体を試料中に浸し、そのままインキュベートする。この場合も、試料中にある抗ｈＴＬＲ抗体は、支持体に固定化してある抗原と結合する。好適なインキュベーション時間を経過した後、支持体を試料から取り出し、これを洗浄用緩衝液に繰り返し浸して、結合しなかった試料を濾紙から除く。次いで、支持体を酵素標識ヒトＩｇ抗体試薬に浸し、好適な時間、インキュベートする。標識試薬で処理した後、支持体を洗浄用緩衝液に浸し、次いで、基質液中でインキュベートする。支持体上の抗ｈＴＬＲ抗体含有複合体の存在を示す酵素活性によって支持体上に色の変化が起こり、これは光学的に検出できる。
【００６５】
　これらの手法の何れの場合でも、酵素以外の標識を用いて修飾することができる。それに伴って読取り相または検出相を変える。
【００６６】
　また、ｈＴＬＲの抗原性ポリペプチド類は、それ自体または他のポリペプチドと結合させることにより、免疫原として、治療または診断に使用し得る抗血清またはモノ・クローナル抗体の生産に使用することができる。免疫グロブリンは、任意の哺乳類供給源、例えば、ラットまたはマウスのようなゲッ歯類、ヒヒ、サル、またはヒトのような霊長類等から得ることができる。診断のためには、臨床試料中のｈＴＬＲを通常の方法で検出するのに、この抗体を使用できる。
【００６７】
　また、ｈＴＬＲ、ＤＮＡ配列を、同位元素または非同位元素の標識またはマーカーで標識し、天然のｈＴＬＲヌクレオチド配列を含有していることが予測される試料中の該ヌクレオチド配列を検出するＤＮＡプローブとして使用することができる。
【００６８】
　本発明より詳細に説明するため、以下に実施例を挙げる。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６９】
１．エイズ関連ウイルス−２（ＡＲＶ−２）の精製およびウイルスＲＮＡの作成
　ＡＲＶ−２に感染させたＨＵＴ−７８細胞（ＡＴＣＣ受理番号、ＣＲＬ８５７９、１９８４年８月７日、寄託）は、カリホルニア大学（サンフランシスコ）のジェイ・レビー（Ｊａｙ　Ｌｅｖｙ）博士から入手した。培養は、１０％ウシ胎児血清を含んでいるＲＰＭＩ培地で２週間、増殖させた。ＳＷ−２８ローターを使用して、２Ｋｒｐｍで１時間、４℃で培養を遠心した。ウイルスを含有している得られたペレットを、氷上で、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に再浮遊させた。再浮遊させた該ペレットを１０μｇ　ＤＮＡエース〔ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）〕で処理し、直線状ショ糖勾配（１５〜５０％、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、２０ｍＭ　ＮａＣｌ中〕で層化した。ショ糖勾配をＳＷ−４１ローターで、４℃で４時間、３４Ｋｒｐｍで回転した。２．５ｍｌずつの５画分を採取し、それぞれその一部を、１％アガロース＋５ｍＭ水酸化メチル水銀ゲルで電気泳動し〔ベイリー（Ｂａｉｌｅｙ）およびダビッドソン（Ｄａｖｉｄｓｏｎ）、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、７０巻、７５〜８５（１９７６年）〕、９ｋｂのウイルスＲＮＡが含まれていることを測定した。ウイルスＲＮＡを含有している画分を１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡで１０ｍｌに希釈し３４Ｋｒｐｍで、２時間４℃で遠心した。ペレットを２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳおよび２００μ／ｍｌのプロティナーゼＫに再び浮遊した。室温で１５分間インキュベートした。混合物をフェノールで抽出し、水相にＮａＣｌを加えて４００ｍＭ濃度とし、エタノールで沈澱させた。ペレットを再び水に浮遊し、−７０℃で貯蔵した。上記のごとくして得られた核酸ペレットに含まれているウィルスＲＮＡを精製するため、試料を５ｍＭ水酸化メチル水銀を含有している低融点１％アガロースゲルで電気泳動した。電気泳動後、ゲルを０．１％臭化エチジウムで染色し、核酸バンドを紫外光下で観察した。９ｋｂに対応する領域をゲルから切り出し、アガロースを３容量の０．３Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ中で、７０℃で２〜３分間溶融した。混合物を等量のフェノールで抽出した。もう一度、水相をフェノールで抽出し、エタノールで沈澱させた。ペレットを９５％冷エタノールで洗浄し、空気乾燥し、もう一度水に浮遊させ、使用時まで−７０℃で貯蔵した。１００ｍｌの培地から０．５〜１μｇの精製ＲＮＡが得られた。
２．標識したホモローガス（相同）ウィルス・プローブの合成
　マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら〔ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）、１９８２年〕の記載のごとく作成したランダム・プライマー（ウシ胸線プライマー）を使用して、ゲル精製を行ったウイルスＲＮＡに対して３２Ｐ−標識ｃＤＮＡを作成した。反応混合物は、５０μｌの反応容量中に、０．５Ｍ　ＭｇＣｌ２　２μｌ、０．１Ｍジチオスレイトール５μｌ、各２．５μｌずつの１０ｍＭ　ｄＡＴＰ、１０ｍＭ　ｄＧＴＰおよび１０ｍＭ　ｄＴＴＰ、２．５μｌウシ胸線プライマー（１００Ａ２６０／ｍｌ）、０．５μｌウィルスＲＮＡ、５μｌアクチノマイシンＤ（２００μｇ／ｍｌ）、１０μｌ　３２Ｐ−ｄＣＴＰ（＞３０００Ｃｉ／ミリモル、１ｍＣｉ／ｍｌ）および１μｌ　ＡＮＶ逆転写酵素（１７単位／μｌ）を含有していた。反応を３７℃で１時間インキュベートした。プローブを、遊離ヌクレオチド類からセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ５０カラムを用いるゲル濾過により分離精製した。ボイド（空）容量をプールし、ＮａＣｌの最終濃度が４００ｍＭ、またはキャリアー１本鎖濃度が１００μｇ／ｍｌとなるように加え、エタノールでｃＤＮＡを沈澱させた。ペレットを水に再浮遊させ、取り込まれた。３２Ｐのカウントを測定した。
３．感染ＨＵＴ−７８細胞から作成したポリＡ＋ＲＮＡ中のＡＲＶ配列の検出
　ＡＲＶ−２、ＡＲＶ−３またはＡＲＶ−４（３人の異なるエイズ患者から、それぞれ単離した３種の異株）で感染させたＨＵＴ−７８細胞と、非感染ＨＵＴ−７８細胞から、それぞれポリＡ＋ＲＮＡを作成した。ポリＡ＋ＲＮＡを、５ｍＭ水酸化メチル水銀含有０．１％ゲルで電気泳動し（ベイリーおよびダビッドソン、前掲）、これをニトロセルロース・フィルターヘ移し、第２項に記載した相同プローブを用いてハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミド、３×ＳＳＣ中で、４２℃で行った。洗浄は０．２×ＳＳＣ中で、５０℃で行った。感染ＨＵＴ−７８細胞の３つの試料すべてに、９ｋｂバンドが存在した。非感染細胞から得たポリＡ＋には、このバンドは存在していなかった。
４．感染、および非感染ＨＵＴ−７８細胞内のＡＲＶ配列の検出
　ルシウ（Ｌｕｃｉｗ）らの方法〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ）、４巻、１２６０〜１２６９（１９８４年）〕に従って、ＡＲＶ−２感染ＨＵＴ細胞の培養、および非感染ＨＵＴ−７８細胞から高分子量ＤＮＡ（染色体性）を作成した。このＤＮＡを、サザーンの記載の方法（１９７５年、前掲）に従って、制限酵素で消化し、１％アガロースゲルで電気泳動し、ニトロセルロースにブロットした。ブロットを３２Ｐ−標識プローブ（１０６ｃｐｍ／ブロット）と共に、５０％ホルムアミド、３×ＳＳＣ、１０ｍＭヘペス　（Ｈｅｐｅｓ）　（ｐＨ７．０）　１００μｇ／ｍｌの変性したキャリアーＤＮＡ、１００μｇ／ｍｌ酵母ＲＮＡおよび１×デンハート液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）を含有する混合液中で、４２℃で３６時間、ハイブリッド化した。フィルターを室温で１回、２×ＳＳＣで洗浄し、次いで、２回４２℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄した。フィルターを空気乾燥し、増感スクリーンを用い、Ｘ−オーマット（Ｘ−Ｏｍａｔ）、フィルムに露出した。
【００７０】
　ＡＲＶ−２と相同である３２Ｐ−プローブは、ＳａｃＩで制限消化した感染細胞から、２本のバンドを特異的にＤＮＡにハイブリッド化した。非感染細胞のＤＮＡを使用した場合、これらのバンドは存在しなかった。このことから、プローブは染色体ＤＮＡに組み込まれて、特異的に感染細胞にハイブリッド化し、結局プロウィルスにハイブリッド化されることが分かる。これらのバンドの分子量は、ほぼ５ｋｂおよび３ｋｂである。
【００７１】
　プロウィルスの配列を別の酵素で切断した場合を検討するため、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｈＩまたはＫｐｎＩまたはそれらの２つを使用する二重消化を用い、細胞ＤＮＡのいろいろな制限消化を行った。サザーン・ハイブリダイゼーションの成績から、感染細胞のＤＮＡを使用した場合は、特異的なバンドがハイブリッド化されることが分かる。図１はプロウィルス配列における制限酵素部位の位置を示した模式的地図であり、断片部位を示している。
５．プロウィルスＡＲＶ−２　ＤＮＡのクローン化
　ルシウらの方法（前掲）に従って、感染ＨＵＴ−７８細胞から高分子量細胞ＤＮＡを作成した。このＤＮＡをＥｃｏＲＩ（これはプロウィルスを１回切断する）で消化して、ショ糖勾配で遠心し、８〜１５ｋｂに対応する画分をプールし、これを透析し、エタノール沈澱によって濃縮した。バクテリオファージλ誘導体をクローン化したベクターＥＭＢＬ−４〔カーン（Ｋａｒｎ）ら、メソッズ・オブ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ）、１０１巻、３〜１９（１９８３年）〕を、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ制限酵素の混合物で完全に消化し、次いで、フェノール−クロロホルム抽出によって該ＤＮＡを除タンパクし、冷エタノールで沈澱させ、ライゲーション緩衝液に再浮遊させた。このＥＭＰＬ−４ファージＤＮＡと、細胞ＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化物を混合し、連結（ライゲート）し、得られた組換え体ファージゲノムをイン・ビトロ（試験管内）でパッケージした。λ−感受性イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＰ５０−ＳｕｐＦ）にファージを感染した後、約５００，０００個のファージ・プラックをニトロセルロース上に移入し、ＤＮＡを固定して、第２項の記載のごとく作成した相再３２Ｐ−プローブで該フィルターをスクリーニングした。５００，０００ファージの中から選ばれた１１個の組換え体ファージを最初の二重リフト・スクリーニング法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、１９８２年〕によって、ウイルスｃＤＮＡプローブにアニーリングし、これらをさらにプラック精製し、次いで、組換え体ＤＮＡを作成するため、大型液体培養で増殖させた。プラック精製したＡＲＶ・ＤＮＡを含んでいるファージは、液体培養で、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＰ５０−ｓｕｐＦに繁殖させた。ファージ粒子を回収し、ＣｓＣｌ勾配中でバンドをとり、フェノール抽出後、エタノール沈澱によって組換え体ファージＤＮＡを作成した（マニアティスら、前掲）。精製ファージＤＮＡ１μｇを制限酵素で消化し、１％アガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで紫外光下に視覚化した。これらのゲルから得られたＤＮＡをニトロセルロースに移し、ウイルスのｃＤＮＡプローブとアニーリングした。
【００７２】
　１１個のファージのうち、λＡＲＶ−２（９Ｂ）と命名された１つは、１９８５年１月２５日にＡＴＣＣに寄託され、受入れ番号４０１５８が与えられた。λＡＲＶ−２（９Ｂ）は周辺細胞配列と共にプロウィルスＤＮＡの完全鎖長の挿入を含んでいた。λＡＲＶ−２（９Ｂ）をＳａｃＩで消化すると、３．８ｋｂおよび５．７ｋｂウイルスＤＮＡ断片が得られた。λＡＲＶ−２（９Ｂ）のＥｃｏＲＩ消化では、６．４ｋｂおよび８．０ｋｂに、ＤＮＡ種（ｓｐｅｃｉｅｓ）を含んでいるウイルスを生成した。ＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩの二重消化では、３．８ｋｂおよび５．４ｋｂにウイルスＤＮＡ断片が得られた。このパターンは、細胞ＤＮＡと連結しているプロウィルスのパターンとよく一致している。
【００７３】
　λＡＲＶ−２（９Ｂ）以外にも、（１）周辺細胞ＤＮＡへ伸長しているウイルスＤＮＡのＥｃｏＲＩ部位から左半分のウィルス・ゲノムを有するファージ（λＡＲＶ−２（８Ａ））、および周辺細胞ＤＮＡへ伸長しているウイルスＤＮＡのＥｃｏＲＩ部位から右半分のウィルス・ゲノムを有するファージ（λＡＲＶ−２（７Ｄ））が得られた。バクテリオファージλＡＲＶ−２（７Ｄ）（右側）およびλＡＲＶ−２（８Ａ）（左側）は、１９８４年１０月２６日に共にＡＴＣＣに寄託され、それぞれ、受入れ番号４０１４３および４０１４４が与えられた。
６．多形現象
　独立したＡＲＶ分離体の関連度を調べるため、ＡＲＶ−３およびＡＲＶ−４で感染させたＨＵＴ−７８細胞から制限酵素で消化して得たＤＮＡ消化物を、クローンしたＡＲＶ−２　ＤＮＡから作成したプローブで分析した。ＡＲＶ−３　ＤＮＡのＳａｃＩ消化物はＡＲＶ−２の同様の消化物と相似しているが、一方、ＨｉｎｄＩＩＩの消化物は異なったパターンを示していた。ＡＲＶ−４　ＤＮＡのＳａｃＩ消化物およびＰｓｔＩ消化物は、ＡＲＶ−２　ＤＮＡの対応する消化物と異なっている。ＡＲＶ−３およびＡＲＶ−４試料で得られたアニーリング・シグナル強度は、ＡＲＶ−２　ＤＮＡの場合よりもはるかに低い（約１０倍低い）多分、このことはＡＲＶ−３およびＡＲＶ−４培養において感染した細胞が、比較的少ない事実によるものであろう。ＡＲＶ−３およびＡＲＶ−４のＤＮＡをＳａｃＩで処理することによって生成したウイルス特異性ＤＮＡは、総計して９．０〜９．５ｋｂｐであり、これはＡＲＶ−２の値と相似した値であり、該ＲＮＡゲノムの大きさとよく一致している。
７．プロウィルスＤＮＡの配列決定
　λファージ９ＢからのＡＲＶ−２の断片および下位断片（サブフラグメント）を作成し、通常の方法（マニアティスら、前掲）によりＭ１３へとクローンした。配列決定は、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら〔プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ）、７４巻、５４６３（１９７７年）〕に従い、共通のＭ１３プライマー、または化学的に合成したＡＲＶ−２配列に相補的なプライマーを使用して実施した。その配列を図２および図３に示す。
８．ｐ２５およびｐ１６ｇａｇが暗号化しているタンパク質のアミノ酸配列
　第１項に記載のごとく、ＡＲＶ−２を作成し、精製した。ウイルスのタンパク質をアクリルアミドゲルで電気泳動し、２４，０００ダルトンおよび１６，０００ダルトンのタンパク質に対応しているバンドをゲルから切り取り、配列決定に使用した。アプライド・バイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）４７０Ａ型タンパク質アミノ酸配列分析装置を使用し、ヒューイック（Ｈｅｗｉｃｋ）ら〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．）、２５６巻、７９９０〜７９９７（１９８１年）〕の記載と同様にして、微量配列分析を行った。フェニルチオヒダントイン・アミノ酸は、ホーケ（Ｈａｗｋｅ）ら〔アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１２０巻、３０２〜３１１（１９８２年）〕の報告のごとく、ベックマン・ウルトラスフェア・ＯＤＳ・カラム（Ｂｅｃｋｍａｎ　ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ　ＯＤＳ　ｃｏｌｕｍｎ）を使用し、トリフルオロ酢酸−アセトニトリル・バッファー系を使用するＨＰＬＣにより、同定した。表１はｐ２５−ｇａｇタンパク質について測定したアミノ末端からの最初の２０アミノ酸を示しており、表２はｐ１６−ｇａｇの最初の３０アミノ酸を示している。
【００７４】
【表１】
2004081219.tif 000020
【００７５】
【表２】
2004081219.tif 000021
　表１のアミノ酸配列は、表２のＡＲＶ−２　ＤＮＡ配列から予見される。従って、これらの結果から、提示されたｇａｇの読取り枠が実際に翻訳されているということ、およびそれがｐ２５およびｐ１６のＮ−末端を確定しているということが確かめられた。
９．細菌内ＡＲＶ−２のｐ２５ｇａｇタンパク質の発現
Ａ．宿主ベクター系
　ｐ２５タンパク質はプラスミドｐＧＡＧ２５−１０を導入したイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＤ１２１０株によって合成する。
【００７６】
　プラスミドｐＧＡＧ２５−１０はｐＢＲ３２２誘導体であって、ｔｒｐとｌａｃ　ＵＶ５プロモーター配列から誘導されたハイブリッドｔａｃプロモーター〔デ・ボア（ＤｅＢｏｅｒ）ら、プロシーティングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズＵＳＡ（ＰＮＡＳ）、８０巻、２１〜５５（１９８３年）〕の転写コントロールの支配下にあるｐ２５暗号配列を含んでいる。ｐ２５ｇａｇの発現は、イソプロピルチオガラクシド（ＩＰＴＧ）によって細菌性形質転換株に誘発される。
【００７７】
　イー・コリＤ１２１０は、ラクトースリプレッサー過剰生産株で、染色体にｌａｃＩｑおよびｌａｃＹ＋の対立遺伝子を持っているが、それ以外は、その誘導されたもとのイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（Ｆ−ｌａｃＩ＋、ｌａｃＯ＋、ｌａｃＺ＋、ｌａｃＹ−、ｇａｌ−、ｐｒｏ−、ｌｅｕ−、ｔｈｉ−、ｅｎｄ−、ｈｓｍ−、ｈｓｒ−、ｒｅｃＡ−、ｒｐｓＬ−）と同一である。
Ｂ．ｐＧＡＧ２５−１０の組立て
　プラスミドｐＧＡＧ２５−１０は、図４の模式図に示したように、ｐ２５ｇａｇを暗号化している６９９ｂｐのＤＮＡをプラスミドｐｔａｃ５へクローンすることにより組立てられる。ベクターｐｔａｃ５は、ｔａｃプロモーター、シャイン・ダルガルノの配列、およびＥｃｏＲＩおよびＰｖｕＩＩの制限部位の間にもとのｐＢＲ３２２の置換物として含まれているポリリンカーを含んでいるｐＢＲ３２２の誘導体である。
【００７８】
　６９９ｂｐ断片は、完全なｐ２５ｇａｇタンパク質を含んでいるが（図２および図３、１３９番から３６９番までのアミノ酸残基）、但し、翻訳開始を行わせるため、メチオニンを最初のアミノ酸としてｐＧＡＧ２５−１０に付け加えている点だけが異なっている。この変更だけでなく、下記に示したヌクレオチド配列における他の変化も、該ＤＮＡ断片の各部分の化学合成を用いることによって達成した。また、該ＤＮＡは配列の３’末端に２つの停止コドンを含んでいる。
【００７９】
　図５は、ｐＧＡＧ２５−１０にクローンしたヌクレオチドと、それから誘導されるアミノ酸配列を示している。ＤＮＡは、この図では下線を引いて示してないが、ＡＲＶ−２（９Ｂ）ｃＤＮＡから直接誘導した。その他の配列は、すべて化学的に合成するか、ベクターｐｔａｃ５から誘導した。もとになるｃＤＮＡに関連して、制限部位を新たに設け、または欠失し、プロリンの前にメチオニンを加え（ｐ２５の最初の残基）、またはｐ２５の最終コドンの後に停止コドンを含める等の変化を、このＤＮＡ配列に導入した。但し、予め示したように、最初のコドンの場合を除き、該ＤＮＡ配列におけるすべての変化はｐ２５ｇａｇのアミノ酸配列を変化させるものではない。
Ｃ．Ｄ１２１０（ｐＧＡＧ２５−１０）株の作成と、形質転換株によって発現されるｐ２５ｇａｇタンパク質の形質決定
　イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｄ１２１０細胞は、標準プロトコールに照らして形質転換に適格なものを作成する〔コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズＵＳＡ（ＰＮＡＳ）、６９巻、２１１０（１９７２年）〕。形質転換は、ｐＧＡＧ−２５−１０の２５〜５０ｎｇを用い、プロトコールの指示のごとく遂行する。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有しているＬ−ブロス内で調製した寒天平板上に形質転換混合物を置く。平板を３７℃で１２時間、インキュベートする。
【００８０】
　単集落アンピシリン耐性コロニーを１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有Ｌ−ブロス１ｍｌに移し、３７℃で増殖させる。１００ｍＭ　ＩＰＴＧ〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）〕１０μｌを最終濃度１ｍＭとなるように加え、３７℃で２時間インキュベートすることにより、ｐ２５ｇａｇタンパク質の発現を誘導する。
【００８１】
　誘導培養の１ｍｌから細胞をペレットとし、これをラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）サンプル・バッファー１００μｌに再浮遊させる。煮沸と凍結を３回反復した後、得られた分解物の一部を標準変性アクリルアミドゲル上で分析する。タンパク質はクーマシー・ブルーで染色することによって視覚化する。
【００８２】
　発現の程度はまず、誘導検体試料によって新しく出現するタンパク質バンドを、対照と比較することにより測定する。
【００８３】
　発現した遺伝子から予想される分子量のタンパク質は、既知量の標準タンパク質を対照とする肉眼的検査による測定で、最高に発現している組換え体の場合でも、細胞タンパク質合計の２％〜５％であった。
【００８４】
　発現されたタンパク質の信頼性は、標準的ウェスタン法によってタンパク質をニトロセルロースに移し、好適なヒトまたは家兎の免疫血清、またはマウスの単クローン性抗体で分析するか（下記のＥ．４．ａを参照）、またはエイズ患者から得られたヒト免疫血清を使用する。易溶性イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質のイライサ（ＥＬＩＳＡ）測定法（下記のＥ．４．ｂ）により測定した。
Ｄ．発酵工程
Ｄ．１．形質転換されたマスター・シード・ストックの調製
　ｐ２５ｇａｇを高レベル（３％）に発現している培養物から得た形質転換細胞をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含んだＬ−ブロス平板上に画線接種し、この平板を一夜、３７℃でインキュベートする。単一のコロニーをアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含んだＬ−ブロス１０ｍｌに接触し、３７℃で一夜増殖させる。その一部を用い、ＳａｌＩおよびＰｓｔＩによる制限マッピングによってプラスミド構造を確かめる。さらに培養物の一部を用いてｐ２５ｇａｇの発現を誘導し、残りの培養物に１／４容量の７５％滅菌グリセリンを加えて１５％グリセリン濃度に調製する。グリセリン細胞ストックを１ｍｌずつに分けて、液体窒素またはドライアイス−エタノール浴中で素早く凍結させる。これらのマスター・シード・ストックを−７０℃で保存する。
Ｄ．２．マスタープレート／単一コロニーおよびその一夜培養物
　マスター・シード・ストックを滅菌したアプリケーターで削り取り、これをアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含んだＬ−ブロス平板に画線接種する。この平板から得た単一のコロニーを２０〜５０ｍｌのＬ−ブロス／アンピシリンに接重し、３７℃で一夜インキュベートする。
Ｄ．３．発酵槽接種
　一夜培養物の一部を、より多量（１〜６リットル）のＬ−ブロス／アンピシリンに接種する。細胞を３７℃で、Ｏ．Ｄ．６５０が約５になるまで一夜培養した後、発酵用の接種物として使用する。
Ｄ．４．発酵および収穫
　Ｌ−ブロス１０リットルと消泡剤１ｍｌとを含有する発酵槽（容量：１．６リットル）に、接種培養物１００〜５００ｍｌを接種する。３７℃で、Ｏ．Ｄ．が約１になるまで細胞を培養する。発酵槽に最終濃度が１ｍＭになるよう、ＩＰＴＧ溶液（１００ｍＭ）１００ｍｌを加えて、ｐ２５ｇａｇの発現を誘導する。さらに３時間、細胞を増殖させ、次いで、連続的な浮遊遠心法（ｆｌｏｗ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）によって収穫する。この段階で細胞を凍結し、ｐ２５ｇａｇの純化が進行するまで−２０℃に保持する。あるいは、接種培養物１〜５リットルを２５０リットルの発酵槽に接種する。増殖、誘導および発酵は先に記載したようにして行う。
Ｅ．ｐ２５ｇａｇの精製および特性化
Ｅ．１．細胞の破壊
　凍結大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を解凍し、２．５容量の溶菌バッファー〔０．１Ｍリン酸ナトリウム（ＮａＰｉ）、ｐＨ７．５、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１Ｍ　ＮａＣｌ〕に懸濁する。ダイノ・ミル（Ｄｙｎｏ　Ｍｉｌｌ）の３００ｍｌガラス・ユニット（３０００ｒｐｍ）と、酸で洗浄したガラスビーズ１４０ｍｌを用いて細胞を非連続的な系で破壊する。ジャケットでくるんだ容器を、−２０℃のエチレングリコール溶液で冷やしてやく。破壊された細胞を２７，０００ｘｇで２５分間遠心し、残骸とガラスビーズを除く。上清を回収し、４℃に保つ。
Ｅ．２．タンパク質の選択沈澱
　４℃で硫酸アンモニウムをゆっくり加えることにより、細胞抽出物（エキス）を３０％（ＮＨ４）２ＳＯ４に調製する。この最終濃度に達した後、該抽出物を２７，０００ｘｇで２０分間遠心する。得られたペレットを、１Ｍ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１％トリトンＸ−１００および５％ＳＤＳに再懸濁した後、５分間煮沸する。
Ｅ．３．ゲル濾過
　選択沈澱で得たフラクションを、０．０３Ｍ　ＮａＰｉ（ｐＨ６．８）で平衡化したＧ５０セファデックスカラムを用いてゲル濾過する。同じ溶液中でクロマトグラフィーを展開させる。フラクションを集め、２８０ｎｍにおける吸収を測定する。タンパク質含有フラクションをプールし、タンパク質ゲル電気泳動（ウェスタン・アナリシス）およびＥＬＩＳＡ法によって特性化する。
Ｅ．４．組換えｐ２５ｇａｇの特性化
ａ．タンパク質ゲル電気泳動
　ｐＧＡＧ２５含有細胞と対照細胞から得られるタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分析（１０％〜２０％のグラディエントゲル）にかけたところ、分析結果は、ｔａｃＩプロモーターをＩＰＴＧで脱抑制した後のｐ２５ｇａｇ発現プラスミド含有細胞において、分子量約２５，０００の様々なレベルのタンパク質が明確に誘導されていることを示していた。ｐ２５ｇａｇ遺伝子産物の同定は、いずれも、ＡＩＤＳ患者の血清およびウイルス性ｐ２５ｇａｇに対するモノクローナル抗体を用いた、酵素−結合イムノアブソーバント・アッセイ（ＥＬＩＳＡ、Ｅ．４．ｃ．参照）およびウェスタン・イムノブロット・アナリシス（Ｅ．４．ｂ．参照）で行った。
ｂ．ウェスタン分析
　試料を、１０％〜２０％ポリアクリルアミドグラディエントゲル上、変性条件下で電気泳動させた。試料をニトロセルロース上に電気的にブロットした。このニトロセルロースペーパーを、ＡＩＤＳ患者の標準血清〔ＥＷ５１１１、Ｐ．フェオリノ（Ｐ．Ｆｅｏｒｉｎｏ）、センターズ・フォ・ディディーズ・コントロール（Ｃｅｎｔｅｒｓ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ）、アトランタ、ジョージア〕の１：２５０希釈液、次いで、ＨＲＰと、ヒト−イムノグロブリンに対するヤギ抗血清との複合物（コンジュゲート）〔カペル（ｃａｐｐｅｌ）、Ｎｏ．３２０１−００８１〕の１：５００希釈液で洗浄した。別法として、ニトロセルロースを、７６Ｃ、即ち、ＡＲＶ−２　ｐ２５ｇａｇに対するネズミ−モノクローナル抗体の希釈されていない培養上清、次いでＨＲＰと、マウス−イムノグロブリンに対するヤギ抗血清とのコンジュゲート（ＴＡＧＯ　Ｎｏ．６４５０）の１：５００希釈液で洗浄してもよい。このイムノブロットの基質は４−クロロ−１−ナフトールを含有する、ＨＲＰ発色剤であった。
【００８５】
　ｐ２５ｇａｇタンパク質はＡＩＤＳ患者の標準血清およびモノクローナル抗体のいずれとも反応したが、非−免疫血清との反応性は示さなかった。
ｃ．ＥＬＩＳＡ
　前記のごとくにして細菌抽出物からｐ２５ｇａｇを精製した。精製（純化）タンパク質と血清との反応性を、微量力価検定用プレートの凹み（ウェル）を０．２５μｇ／ｍｌでコートし、試験血清（ヒト−負血清の正標準血清ＥＷ５１１１）の希釈液を加え、次いで、ＨＲＰとヒト−イムノグロブリンに対するヤギ抗血清とのコンジュゲートの１：１０００希釈液を加えることにより、分析した。ｐ２５ｇａｇタンパク質は正血清と反応し、その滴定曲線の中点は約１：８００であった。健常人からの血清とは反応性を示さなかった。
１０．ＥＬＩＳＡにおける天然のｐ２５ｇａｇタンパク質と組換えｐ２５ｇａｇタンパク質との比較
　精製した、組換えｐ２５ｇａｇの様々な血清に対する反応性を、プレパラティブ・ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって精製された天然のｐ２５ｇａｇタンパク質のそれと、ＥＬＩＳＡ法により、比較した。破壊し、グラディエント精製したウィルス（５μｇ／ｍｌ）を用いて分析し、対照とした。
【００８６】
　ＰＶＣ微量力価検定用プレートを、ネズミ抗−ｐ２５ｇａｇモノクローナル抗体７６Ｃから導かれた腹水のＩｇフラクション１０μｇ／ｍｌ、（０．１Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．０）中、５０μｌ／ウェル）と共に３７℃で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで洗浄した後、各ウェルを、ＰＢＳ中に入れた１０％正常ヤギ血清で満たした。室温で３０分間インキュベートした後、プレートを０．０５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（ＳＴ）を含有する通常の食塩水で洗浄し、ウェルに、被検ＡＲＶタンパク質（１０％ヤギ血清を含有するＳＴ〔ＳＴＧＳ〕中、５０μｌ／ウェル）を加えた。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、ＳＴで洗浄した後、破壊されたＡＲＶに対して惹起されたウサギ抗血清（ＳＴＧＳ中、１：１０００希釈液）５０μｌ／ウェルと共に３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを洗浄し、ＨＲＰとウサギ−イムノグロブリンに対する抗血清とのコンジュゲートのＳＴＧＳ中、１：１５００希釈液５０μｌと１時間インキュベートし、洗浄し、次いで、ウェルに基質溶液（２，２’−アジノ−ジ−〔３−エチルベンズチアゾレンスルホン酸〕１５０μｇ／ｍｌ、０．００１％　Ｈ２Ｏ２、０．１Ｍクエン酸ｐＨ４）を５０μｇ／ウェルの割合で加えた。３７℃で３０分間インキュベートした後、１０％ＳＤＳを５０μｌ／ウェルの割合で加えることにより、反応を止めた。４１４ｎｍにおける吸収は、フロー・タイターテク（Ｆｌｏｗ　Ｔｉｔｅｒｔｅｃｈ）ＥＬＩＳＡリーダーにより、測定した。試料は、まず最初１：１０に希釈して始め、以後、連続的に２倍希釈する方法で、２回、測定した。以下の表は、破壊ウイルスを用いた分析で正に採点された８人からのＡＩＤＳ血清、および破壊ウイルス分析で負に採点された６人の健常人の血清に関する測定結果を示すものである。
【００８７】
【表３】
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ａ．最大値の５０％と同等なシグナルを与える血清希釈率の逆数で示してある。
ｂ．前記のごとく、イムノフルオレスセインおよびイムノブロッテングにより、結果を確認した。
ｃ．血液希釈率１：２５では、シグナルを検出しなかった。
【００８８】
　以上の結果は、細菌から精製されたｐ２５ｇａｇが、ＡＩＤＳウイルスから同様に精製されたｐ２５ｇａｇと、８人のＡＩＤＳ患者の血清のＥＬＩＳＡにおいて同様な作用を表すことを示している。ＥＬＩＳＡの結果は、抗−ｐ２５ｇａｇ抗体のレベルには広範な変動があること、さらに、いくつかの、ウイルスにコードされているタンパク質は、従来からのウイルスに基づく分析系によっては検出されないことを示している。
１１．細菌内でのＡＲＶ−２のｐ４１ｇａｇタンパク質の発現
　ＡＲＶ−２のｐ２５ｇａｇタンパク質とｐ１６ｇａｇタンパク質との融合物（ｐ４１ｇａｇと命名）を、プラスミドｐＧＡＧ４１−１０で形質転換された大腸菌株Ｄ１２１０形質転換体中で合成した。ｐＧＡＧ４１−１０は、図４に示すごとく、ｐ５３ｇａｇ前駆体ポリタンパク質のＣ末端ｐ１６ｇａｇ部分の配列と、ｐ２５ｇａｇタンパク質の配列の一部を含む、ＡＲＶ−２ゲノムのＳｐｈＩ−ＨｐａＩフラグメントを、ｐＧＡＧ２５−１０のＳｐｈＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間に挿入することにより、プラスミドｐＧＡＧ２５−１０から組立てられた。ｐＧＡＧ４１−１０にクローンされたＤＮＡ配列の暗号鎖を図６に示す。形質転換および発現の誘導は、上記の方法で行われた。細胞を処理し、上記のごとく、クーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）染色ゲル上で観察した。観察されたタンパク質の分子量の概略値は４１，０００ダルトンであった。このタンパク質は、上記のごとくにして行ったウェスタン分析およびＥＬＩＳＡ分析において、ＡＩＤＳ血清および、ｐ２５ｇａｇに対するモノクローナル抗体と反応した。
１２．細菌内での、ＡＲＶ−２のｐ１６ｇａｇタンパク質の発現
　図７に示した、ｐ１６ｇａｇタンパク質をコードしている配列は、酵母にとって好ましいコドンを用いて化学合成された。平滑末端ＳａｌＩフラグメント（３２１ｂｐ）を、ＰｖｕＩＩ−ＳａｌＩで消化し、ゲルで単離したｐｔａｃ５にクローンした（上記９および１１参照）。得られたプラスミドを用いて上記９のごとくにしてＤ１２１０細胞を形質転換した。ＩＰＴＧによって発現を誘導し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウェスタン分析法により、タンパク質を分析した。約１６，０００ダルトンのバンドは、形質転換細胞中で、ＩＰＴＧにより誘導されたものである。このタンパク質は、ウェスタンブロット法において、ＡＩＤＳ患者の免疫血清と反応性を有することが分かった。健常人からの血清とは反応をしなかった。組換えｇａｇタンパク質はＣｏｓ（哺乳類）細胞内でも発現した。
１３．酵母によるＡＲＶ−２　ｅｎｖタンパク質の生産
Ａ．宿主−ベクター系
　プラスミドｐＤＰＣ３０３で形質転換されたＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）２１５０−２−３により、ｅｎｖタンパク質の一部を合成した。プラスミドｐＤＰＣ３０３は、ｅｎｖタンパク質の２／３に関する暗号配列と、酵母ｌｅｕ２−０４遺伝子を含んでいる２−ミクロン配列およびａｍｐＲ遺伝子を含んでいるｐＢＲ３２２配列を含有している。ｅｎｖの発現は、酵母のピルビン酸キナーゼプロモーターおよび終止配列の制御下で行われる。酵母Ｓ．セレビシエ２１５０−２−３株は、以下の遺伝子型を有する：Ｍｅｔ　ａ、ａｄｅ　１、ｌｅｕ　２−１１２、ｃｉｒＯ。この菌株は、Ｄｒ．レランド・ハートウェル（Ｌｅｌａｎｄ　Ｈａｒｔ　ｗｅｌｌ、ワシントン大学）から入手した。
Ｂ．ｅｎｖタンパク質のための酵母発現ベクター、ｐＤＰＣ３０３の組立て
　プラスミドｐＤＰＣ３０３は、ベクターｐＣ１／１のＢａｍＨＩ部位にクローンされた、ｅｎｖのための「発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃａｓｓｅｔｔｅ、下記）」を含有している。ベクターｐＣ１／１はａｍｐＲマーカーと酵母ｌｅｕ２−０４マーカーとを含む、ｐＢＲ３２２および２ミクロン配列を含有している。これは、ｐＪＤＢ２１９ｄ〔ベッグス（Ｂｅｇｇｓ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（１９７８）、２７５：１０４〕のｐＭＢ９領域をｐＢＲ３２２配列で置き換えることにより導かれた。
【００８９】
　ｅｎｖのための「発現カセット」は、以下の配列をこの順序（５’から３’ヘ）で融合している：酵母のピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ）プロモーター、ｅｎｖ　ｃＤＮＡおよびＰＹＫターミネーター。ＰＹＫプロモーターおよびターミネーター領域は、バーク（Ｂｕｒｋｅ）らが記載したごとくにして単離されたｃＤＮＡから導かれた〔ジャーナル・オブ・ザ・バイオロジカル・ケミストリィ（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．）（１９８３）２５８：２１９３〜２２０１〕。
【００９０】
　発現カセットにクローンされているｅｎｖフラグメントはＡＲＶ−２　ｃＤＮＡから導かれており、該フラグメントは、ｎｔ　５８５７からｎｔ　７２５１のヌクレオチドによってコードされているｅｎｖアミノ酸残基をコードしている１３９５ｂｐのｃＤＮＡフラグメントから成る（図２および図３）。さらに、リーディングフレーム内で、メチオニンに相当する、５’末端の最初のコドンに５個の余分な（エキストラ）コドンが、また、終止コドンが後続している、リーディングフレーム（解読相）内の３’末端に４個の余分のコドンが融合している。余分なコドンは、もっぱら、クローニング工程を容易にするために挿入されたものである。
【００９１】
　図８はｐＤＰＣ３０３にクローンされているヌクレオチド配列の暗号鎖、ならびにそれから導かれるアミノ酸配列を示している。図中、下線の付されていないＤＮＡ配列は上記のＡＲＶ−２（９Ｂ）ｃＤＮＡから直接導かれた。その他の配列は全て、化学合成されたか、またはＰＹＫベクターに由来する。
Ｃ．２１５０（ｐＤＰＣ３０３）鎖の調製
　ハイネン（Ｈｉｎｎｅｎ）らの記載〔ＰＮＡＳ（１９７８）７５：１９２９〜１９３３〕に従って酵母細胞Ｓ．セレビシエ２１５０−２−３（Ｍａｔ　ａ、ａｄｅ　１、ｌｅｕ２−０４、ｃｉｒＯ）を形質転換し、ｌｅｕ−選択プレート上で平板培養した。単一のコロニーをｌｅｕ−選択培地に接種し、飽和するまで増殖させた。細胞を収穫し、下記のごとく、ｅｎｖタンパク質の精製および特性化を行った。
Ｄ．ｅｎｖタンパク質の精製および特性化
Ｄ．１．細胞の破壊
　凍結Ｓ．セレビシエ２１５０−２−３（ｐＤＰＣ３０３）を解凍し、１容量の溶菌バッファー（１μｇ／ｍｌペプスタチン、０．０１Ｍ　ＰＭＳＦ、０．００１Ｍ　ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ　ｐＨ８．０）に懸濁し、１容量の酸で洗浄したガラスビーズを加える。ダイノ・ミルの３００ｍｌガラスユニット（３０００ｒｐｍ）内で３０００ｒｐｍで１０分間処理することからなる非連続的な系で細胞を破壊する。ジャケットを、−２０℃のエチレングリコール溶液中で保冷する。この混合物を氷上に３分間放置することにより、ガラスビーズをデカントする。細胞抽出物を回収し、１８，０００ｒｐｍ（３９，２００ｘｇ）で３５分間遠心する。上清を捨て、沈澱（ペレット１）を、以下に示すごとく、引き続いて処理する。
Ｄ．２．不溶性物質のＳＤＳ抽出
　ペレット１を４容量のトリス−ＨＣｌバッファー（０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ　ｐＨ８．０、０．０１Ｍ　ＮａＣｌ、０．００１Ｍ　ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌペプスタチン、０．００１Ｍ　ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ）に再懸濁し、撹拌下、４℃で２時間抽出する。この溶液を６，３００ｘｇで１５分間遠心する。不溶性のフラクション（ペレット２）を４容量（３６０ｍｌ）のＰＢＳ（１リットル当たり、０．２ｇ　ＫＣｌ、０．２ｇ　ＫＨ２ＰＯ４、８．０ｇ　ＮａＣｌ、２．９ｇ　Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ）、０．１％ＳＤＳ、０．００１Ｍ　ＥＤＴＡ、０．００１Ｍ　ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌペプスタチンに再懸濁し、６，３００ｘｇで１５分間遠心する。得られたペレット（ペレット３）を、４容量のＰＢＳ、０．２％ＳＤＳ、０．００１Ｍ　ＥＤＴＡ、０．００１Ｍ　ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌペプスタチンに懸濁し、これをチューブ・ロッカー（試験管揺動装置）上で撹拌しながら、４℃において１２時間抽出する。溶液を６，３００ｘｇで１５分間遠心する。可溶性画分を回収し、下記のごとくにして精製する。（ペレットは、それを４容量の２．３％ＳＤＳ、５％β−メルカプトエタノールに再懸濁し、５分間煮沸することによって抽出してもよい。煮沸後、溶液を６，３００ｘｇで１５分間遠心する。次いで、可溶性画分を回収し、以後の精製に充てる。）
Ｄ．３．選択沈澱およびゲル濾過
　可溶性画分を、４℃において３０％硫酸アンモニウム溶液にすることにより、濃縮する。得られたペレット（ペレット４）を２．３％ＳＤＳ、５％β−メルカプトエタノールに再懸濁し、ＡＣＡ３４（ＬＫＢプロダクツ）のゲル濾過用カラムにより、クロマトグラフする。このカラムは、室温で、ＰＢＳ、０．１％ＳＤＳによって平滑化されている。同じ溶液を用い、流速０．３ｍｌ／分でクロマトグラフィーを展開させる。５ｍｌの画分を集め、プールしてタンパク質ゲル電気泳動法、ウェスタン分析、およびＥＬＩＳＡ法で特性化する。必要ならば、プールしたフラクションをスペクトラポア（Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ）＃２〔ＭＷカットオフ（ｃｕｔ　ｏｆｆ）１２−１４Ｋ〕を用いて真空透析（ｖａｃｕｕｍ　ｄｉａｌｙｓｉｓ）することにより、濃縮する。
Ｄ．４．組換えｅｎｖの特性化
　ＳＤＳポリアクリルアミドゲル分析（１２％アクリルアミドゲル）により、ｅｎｖ−含有ベクターで形質転換された酵母細胞内で、新たに５５，０００ダルトンのタンパク質が合成されていることが示された。この５５，０００ダルトンのタンパク質は、対照プラスミド（ｅｎｖ挿入物を有しないベクター）で形質転換された細胞中には存在していない。ＡＩＤＳ患者の血清を用いる、ＥＬＩＳＡ（９、Ｅ．４．ｃ．参照）およびウェスタン分析法でｅｎｖを同定した。両分析法において、５５，０００ダルトンのタンパク質は免疫反応性を示した。健常人から得た血清とは反応しなかった。組換えｅｎｖは哺乳類（Ｃｏｓ）細胞内でも発現した。
１４．細菌内でのＡＲＶ−２のｐ３１ｐｏｌタンパク質の発現
Ａ．宿主ベクター系
　ポリメラーゼ遺伝子（ｐ３１ｐｏｌ）のＣ末端領域を、プラスミドｐＴＰ３１．２で形質転換した大腸菌株Ｄ１２１０を用いて合成した。プラスミドｐＴＰ３１．２はハイブリッドｔａｃプロモーター（９．Ａ．に記載）の転写コントロール下で、ｐ３１の暗号配列を含有しているｐＢＲ３２２誘導体である。ｐ３１は、細菌性形質転換体をＩＰＴＧによって誘導することにより、発現される。
Ｂ．ｐＴＰ３１．２の組立て
Ｂ．１．Ｍ１３テンプレート（鋳型）０１１００４８４の組立て
　ｐｏｌ遺伝子の３’末端、ｏｒｆ−１、ｅｎｖおよびｏｒｆ−２の５’末端を含有しており、予め、１％の低融点アガロース〔シーパック（Ｓｅａ−Ｐａｋ）〕ゲル電気泳動にかけ、６５℃においてフェノール抽出し、１００％エタノールで沈澱させた後、ＴＥに懸濁しておいた、ＡＲＶ−２（９Ｂ）のＫｐｎＩ消化物から、５．２ｋｂ　ＤＮＡフラグメントを単離した。この物質８μｌを終容量１０μｌでＳｓｔＩにより、３７℃でさらに１時間消化した。酵素を熱的に不活化した後、この消化物１．２５μｌを、予めＫｐｎＩとＳｓｔＩで切断しておいたＭ１３ｍｐ１９（２０ｎｇ）に、ＡＴＰの存在下、終容量２０μｌでライゲートした。室温で２時間反応を続けた。この混合物５μｌを用い、コンピテントな大腸菌ＪＭ１０１を形質転換した。澄明なプラークが成長し、次いで、メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）およびビエイラ（Ｖｉｅｉｒａ）の方法〔ジーン（Ｇｅｎｅ）（１９８２）１９：２６９〜２７６〕に従った１本鎖ＤＮＡを調製した。
Ｂ．２．０１１００４８４のインビトロでの突然変異誘発
　部位特異的突然変異誘発により、０１１００４８４のＤＮＡ配列を変化させ、ＮｃｏＩによって認識される制限部位（ＣＣＡＴＧＧ）を生成させた。４２９９位（図２および図３）のＡがＣで置換され、４３０５位（図２および図３）のＴがＡに置き換えられているオリゴデオキシヌクレオチドを、固相ホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）の化学を利用して合成した。上記の変化はいずれも、アミノ酸配列においてサイレントであり、第２の置換は、ヘテロローガスな分子の安定性を減ずるために行われた。このオリゴマーはＡＲＶ−２１６と命名され、配列：５’−ＴＴＡＡＡＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＡＴＧＧＣＴＣＴＣＣＡＡＴＴＡＣＴＧを有する。これは、Ｍ１３誘導体であるテンプレート０１１００４８４が１本鎖であり、暗号鎖を含有していることから、該配列は非暗号鎖である。５’をリン酸化したオリゴマーを、５’脱リン酸化Ｍ１３シーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎｇ）プライマー、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）、２０ｍＭ　ＫＣｌ、７ｍＭ　ＭｇＣｌ２および０．１ｍＭ　ＥＤＴＡの存在下、５５℃において、０１１００４８４　Ｍ１３テンプレートにアニールした。重合反応は、５０ｎｇ／μｌの二重螺旋ＤＮＡ、１５０μＭのｄＮＴＰ類、１ｍＭ　ＡＴＰ、３３ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．８）、６６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、５ｍＭ　ＤＴＴ、１２．５単位のＴ４ポリメラーゼ、１００μｇ／ｍｌのＴ４遺伝子３２タンパク質および５単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼを含む混合物１００μｌ中で行った。３０℃で３０分間インキュベートして反応させ、ＥＤＴＡとＳＤＳ（終濃度を、それぞれ１０ｍＭおよび０．２％とする）を加えて反応を止めた。重合産物の１：１０希釈液１，２および４μｌを用いてコンピテントＪＭ１０１大腸菌細胞を形質転換し、ＹＴプレート上で平板培養した。プラークをニトロセルロースフィルターに吸着させて拾い上げ、０．２Ｍ　ＮａＯＨ、１．５Ｍ　ＮａＣｌ中で変性させ、次いで、０．５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、３Ｍ　ＮａＣｌで中和し、６×ＳＳＣ中に平衡させた。フィルター上のブロットを乾かし、８０℃で２時間乾燥させ、３７℃で、０．２％ＳＤＳ、１０×デンハーツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）、６×ＳＳＣ中においてプレアニールした。１時間後、フィルターに標識したＡＲＶ−２１６（７．５×１０６ＣＰＭ）を加え、３７℃で２時間インキュベートした。フィルターを、４２℃で２０分間、６×ＳＳＣ中で洗浄し、ブロットを乾燥し、これを−７０℃で１時間、増感スクリーンを用いてフィルムに感光させた。強くハイブリダイズしたプラークが増殖し、それから１本鎖ＤＮＡを調製し、配列決定におけるテンプレートとして用いた。配列決定の結果、テンプレート０１０２１７８５が上記の第２の置換と、ＮｃｏＩ部位とを含有していることが分かった。
【００９２】
　第２のオリゴマーは、ｐｏｌ遺伝子の終止コドンの直後（図２および図３における５１０１位）にＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩのための部位を挿入するために合成された。このオリゴマーはＡＲＶ−２４８と命名され、配列：５’−ＧＧＴＧＴＴＴＴＡＣＴＡＡＡＧＡＡＴＴＣＣＧＴＣＧＡＣＴＡＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣで示される。テンプレート０１０２０７８５を用い、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、フィルターを洗浄することを除き、上記の方法と同様にして部位特異的突然変異誘発を行った。上記のごとく、８個の強くハイブリダイズしたプラークが増殖し、これから、１本鎖ＤＮＡの配列を決定した。テンプレート０１０３１９８５の配列は、ＳａｌＩ、およびＥｃｏＲＩ部位を、意図通りに含有していることが示された。
Ｂ．３．ｐ３１を含有しているＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ　ＤＮＡフラグメントおよびＮｃｏＩ−ＳａｌＩ　ＤＮＡフラグメントの単離
　６個の透明なプラークを１．５ｍｌずつの２×ＹＴ中で、３７℃において５時間増殖させることにより、０１０３１９８５テンプレートの複製型（ＲＦ）を調製した。マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らの記述したごとくにして〔モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリィ・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）１９８２〕２本鎖ＤＮＡを得、プールして終容量１００μｌになるよう懸濁した。終容量２０μｌにしてＲＦ１０μｌをＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。得られたフラグメントを用いて細菌内でｐ３１を直接発現させた。さらにＲＦ２０μｌを、４０μｌ中で、ＮｃｏＩおよびＳａｌＩで消化した。このフラグメントを酵母内でｐ３１を発現させるために用いた。これらの試料を１％の低融点アガロース（シーパック）ゲル上で泳動させ、臭化エチジウムを用い、蛍光により観察した。８００ｂｐのバンドを切り取り、上記のごとくにしてＤＮＡ（類）をゲルから抽出し、ＴＥ１０μｌに再懸濁した。これらのフラグメントをそれぞれＡＲＶ２４８　ＮＲ＃２およびＡＲＶ２４８ＮＬと命名した。
Ｂ．４．ｐ３１のｐｌｏｔ７へのクローニング
　ベクターｐｌｏｔ７〔ホールウェル（Ｈａｌｌ　ｗｅｌｌ）ら、ヌクレイック・アシッズ・リチーサ（１９８５）１３、Ｎｏ．６、ｐｐ．２０１７〜２０３４〕３μｇを終容量４０μｌとし、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、３時間後にこれらの酵素を熱的に不活化した。この消化物２μｌを２μｌのＡＲＶ２４８　ＮＲ＃２と混合し、ＡＴＰとＴ４　ＤＮＡリガーゼの存在下、２０μｌ中で、１４℃において一夜ライゲートし、得られた混合物１０μｌを用いてコンピテントＤ１２１０細胞を形質転換した。２ｍＭ　ＩＰＴＧおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンに耐性を有するコロニーを選択し、その各々からスーパーコイルＤＮＡを抽出した。次いで、これらのＤＮＡをＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで制限消化し、アガロース電気泳動にかけて分析した。約８００ｂｐの挿入物を有するクローンを選択し、以後の使用に供した。これらをｐＲＳＰ２４８のＮｏ．３およびＮｏ．４と命名した。
Ｂ．５．ｐＴＰ３１の組立て
　０１１００４８５に導入されたＮｃｏＩ部位はｐ３１の推定の開始部位から５２ｂｐ下流である。ｐ３１の最初の１８アミノ酸をコードしている３つのオリゴマーを上記のごとくに合成し、この分子の３’末端にＮｃｏＩ粘着末端を生成させた。この分子の５’末端は、開始コドンを越えて伸長しており、リボゾーム結合部位を含有している。合成されたオリゴマーは、配列：
【００９３】
【化２５】
2004081219.tif 000023
で示される。
【００９４】
　脱リン酸化ＡＲＶ−２１１、リン酸化ＡＲＶ−２２２およびＡＲＶ−２２３の各１５０ピコモルを、予めＮｃｏＩで切断しておいた２０μｇのｐＲＳＰ２４８に、終容量６２μｌで、１４℃において１８時間ライゲートした。フェノール抽出、エタノール沈澱の後、ＤＮＡを水４０μｌに再懸濁し、０．５ｍＭのｄＮＴＰ類の存在下、室温で１時間、クレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントと一緒にインキュベートした。試料をフェノール抽出し、エタノール沈澱に付した後、水４０μｌに再懸濁し、ＥｃｏＲＩで消化した。次いで、このＤＮＡを低融点のアガロースゲルで泳動させ、上記のごとくにして約８２０ｂｐのフラグメントを抽出し、水に懸濁し、終容量を２０μｌとした。末端をリン酸化した後、該試料５μｌを、ＰｖｕＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、末端を脱リン酸化しておいたｐｌｏｔ７（１５０ｎｇ）と一緒に、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼおよびＡＴＰの存在下、終容量３１μｌとして、１４℃において１８時間、インキュベートした。このライゲーション産物５μｌを用いてＲＲ１ｄｅｌｔａＭ１５を形質転換した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンに耐性を示すクローンを選択し、そこから、スーパーコイルＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ（類）をＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、１％アガロースゲルによって分離した。適当な大きさの挿入体を含有しているコロニーを得、ｐＴＰ３１と命名した。この挿入体部分に含まれているｐ３１配列を図９および図１０に示す。下線を付した配列は化学合成された部分である。他はＤＮＡから得られた配列である。
Ｃ．ＡＩＤＳ血清と反応する特異的なタンパク質を含有する形質転換体のスクリーニング
　ベクターのみ、あるいはｐ３１　ＤＮＡを有するベクター（ｐＴＰ３１．２）を含有している細菌性形質転換体を０．０２％アンピシリン含有Ｌ−ブロス中でＯ．Ｄ．６５０が０．５になるまで増殖させた。ＩＰＴＧを終濃度が２ｍＭになるように加えて培養物を誘導し、さらに３時間増殖させた。培養物１ｍｌ中の細菌をペレット化し、ゲル標本バッファー２００μｌ中に再懸濁した。凍結−解凍サイクルを３回行うことにより細胞を破壊し、煮沸して得た抽出物を１２．５％のポリアクリルアミド−ＳＤＳミニゲルに適用した。タンパク質を電気泳動させ、ニトロセルロース上に電気的に移し、ブロットした。このニトロセルロースフィルターをＥＷ５１１１血清（ウイルス性ｐ３１と強く反応するＣＤＣから得られた正の基準血清、１：１００に希釈）、西洋ワサビのペルオキシダーゼとコンジュゲートしたヤギの抗−ヒトＩｇＧならびにＨＲＰ基質と反応させた。ｐ３１　ＤＮＡによる形質転換体から得た抽出物のゲル中には、〜３０，０００ｄにおいて優勢な１つのバンド、ならびにさらに低分子量の種の存在を示すいくつかのバンドが見られたが、ベクターのみで形質転換された細菌形質転換体から得た抽出物にはそのようなバンドが見られなかった。
Ｄ．ｐｏｌ遺伝子のＣ末端領域からのポリペプチドがウイルス性ｐ３１タンパク質とアナローガス（構造類似性）であることの証明
　ｐＴＰ３１．２またはベクター単独で形質転換された細菌からリゾチーム−ＮＰ４０を調製した。５ｍｌの培養物を増殖させ、細胞をペレット化し、１ｍｌの５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌリゾチームに再懸濁し、０℃で１５分間インキュベートし、ＮａＣ１、ＭｇＣｌ２およびＮＰ４０をそれぞれ、終濃度が０．４ｍＭ、５ｍＭおよび０．５％となるように加えて混合し、ＤＮＡｓｅＩ（１００μｇ／ｍｌ）と一緒に０℃で３０分間インキュベートした。ＥＷ５１１１血清（希釈率１：１００）と、ｐＴＰ３１．２で形質転換した細菌から得た細胞抽出物の１：１０希釈液とをプレインキュベートしてからウイルス性ブロットと反応させると、ウイルス性ｐ３１のバンドは完全に消失したが、他のウイルス性タンパク質との反応性は残存していた。これに対して、ベクターのみで形質転換された細菌から得た抽出物は、ｐ３１反応性抗体を吸収し、除去する作用を有していなかった。このように、ウイルス性ｐ３１タンパク質は、ＡＲＶ−２のｐｏｌ遺伝子のＣ末端領域、またはエンドヌクレアーゼ領域からの産物であることが分かった。
１５．酵母内でのｐ３１ｐｄタンパク質の発現
Ａ．酵母ベクターｐ３１／ＧＡＰ−ＡＤＨ２の組立て：ｐ３１のｐＡＢ２４へのクローニング
　ＡＲＶ２４８ＮＬフラグメントを、予めＮｃｏＩおよびＳａｌＩで切断しておいたｐＢＳ１００にクローンした。ｐＢＳ１００はｐＡＢ１２から導かれ、ＧＡＰ−ＡＤＨ２プロモーター、ＮｃｏＩ−ＳａｌＩフラグメントであるＡＲＶ−ｅｎｖ遺伝子、およびＧＡＰターミネーターからなるＢａｍＨＩカセットを有する。ｐＢＳ１００／ｐ３１／ＧＡＰ−ＡＤＨ２の２個の陽性クローンから得られたＢａｍＨＩカセットを、ｕｒａおよびｌｅｕの両者に関する選択能力を有する酵母ベクターである、ｐＡＢ２４にクローンした。ベクター内でのカセットの方向性を、両方向についてスクリーンし、それらを用いて酵母のＡＢ１１０株（Ｍａｔ　ａ　ｕｒａ３−５２　ｌｅｕ２−０４または、ｌｅｕ２−３とｌｅｕ２−１１２の両者、ｐｅｐ４−３、ｈｉｓ４−５８０、ＣｉｒＯ）を形質転換した。これらの細胞を、ｕｒａ−およびｌｅｕ−両プレート上で平板培養した。また、ｕｒａ−細胞をｌｅｕ−プレート上で平板培養した。
Ｂ．ｐ３１の発現の誘導
　３種類の異なる誘導法を行った。１．ｕｒａ−プレート上に貼り付いたｕｒａ−コロニーを、ＹＥＰ／１％グルコース中で１時間誘導した。これらの試料に関して、ウェスタン分析と、ポリアクリルアミドゲル法を適用した。結果はいずれも陰性であった。２．ｌｅｕ−プレートに貼り付いたｕｒａ−プレートから得たコロニーをｌｅｕ−／３％エタノールまたはＹＥＰ／１％グルコース中で２４時間誘導した。これらの試料に関してウェスタン分析法とポリアクリルアミドゲル法を適用したところ、結果はこれもまた陰性であった。３．ｌｅｕ−プレート上に貼り付いているｌｅｕ−プレートからのコロニーを、ｌｅｕ−／３％エタノールまたはＹＥＰ／１％グルコース中で２４時間誘導した。ポリアクリルアミドゲル法の結果は陰性であった。これらの試料に関しては、ウェスタン分析法を適用しなかった。
１６．酵母内における超過酸化物不均化酵素（スーパーオキシドジスムターゼ）（ＳＯＤ）−ｐ３１融合タンパク質の発現
Ａ．ｐＣ１／１−ｐＳＰ３１−ＧＡＰ−ＡＤＨ２誘導体の組立て
　ＳＯＤ−ｐ３１融合タンパク質を酵母内で発現させるための遺伝子を組立てる目的で、プラスミド（ｐＳ１４／３９−２）を用いた。このプラスミドは、ＡＤＨ−２／ＧＡＰプロモーターの制御下にある、プロインシュリン遺伝子と融合したＳＯＤ遺伝子を含有している。このプロインシュリン遺伝子は、ＥｃｏＲＩ制限部位とＳａｌＩ制限部位との間に位置する。このプロインシュリン遺伝子をＡＲＶ２４８ＮＬフラグメントで置き換えるために、それぞれＡＲＶ−３００およびＡＲＶ−３０１と称する２個のオリゴマーを、ホスホラミダイトの化学を利用して合成した。これらの２個のオリゴマーをアニールすると、分子の両側にＥｃｏＲＩおよびＮｃｏＩ粘着末端を有する配列が得られる。ＡＲＶ−３００およびＡＲＶ−３０１は、配列：
【００９５】
【化２６】
2004081219.tif 000024
で示される。
【００９６】
　ＥｃｏＲＩで線状化されたｐＳＩ４／３９−２（２μｇ）を１００ピコモルずつの、リン酸化ＡＲＶ−３００および脱リン酸化ＡＲＶ−３０１と、ＡＴＰおよびＴ４　ＤＮＡリガーゼの存在下、終容量３５μｌでライゲートした。反応は、１４℃で１８時間行った。ＤＮＡをＳａｌＩでさらに消化し、得られたフラグメントを１％の低融点アガロースゲル上で分離（割）し、ＳＯＤ遺伝子（〜６．５ｋｂ）を伴ったベクターを含有するフラグメントを前記のごとくにして精製し、ＴＥ５０μｌに再懸濁した。この標品５μｌをＡＲＶ２４８　ＮＬ５μｌと、終容量２０μｌで、１４℃において１８時間ライゲートした後、その５μｌを用いてコンピテントＨＢ１０１細胞を形質転換した。得られたプラスミドをｐＳＰ３１と命名した。このプラスミド２０μｇをＢａｍＨＩで消化し、ゲル電気泳動によって約２９００ｂｐのフラグメントを単離し、ＴＥに再懸濁した後、予めＢａｍＨＩで切断しておいたｐＣ１／１にライゲートした。このＤＮＡを用いてＨＢ１０１を形質転換し、ＢａｍＨＩカセットを有する形質転換体を得た。酵母株、２１５０、ＰＯ１７、およびＡＢ１１０をこのｐＣ１／１−ｐＳＰ３１−ＧＡＰ−ＡＤＨ２誘導体を用い、短い方向性と長い方向性の両者により、形質転換した。２１５０株は、形質転換体を与えなかった。その他の形質転換体は全てｌｅｕ−プレート上に貼り付けられた。
Ｂ．ｐＣ１／１−ｐＳＰ３１−ＧＡＰ−ＡＤＨ２の誘導
　３種類の異なる誘導法を行った。１．−ＰＯ１７コロニーを、ＹＥＰ／１％グルコース培養物またはｌｅｕ−／３％エタノール培養物のいずれか１０ｍｌ中で２４時間誘導した。酵母ペレットをポリアクリルアミドゲル法およびウェスタン法の両方法で分析したところ、クーマシー染色ゲルによる結果は陰性であったが、ウェスタン法の場合は、両誘導法によって、正しい分子量のバンドが示された。２．−ＰＯ１７コロニーをＹＥＰ／１％エタノール培養物３０ｍｌ中で４８時間誘導した。このインキュベーション期間中、様々な時間に、一部を採ってＰＡＧＥにより分析した。クーマシー染色ゲルによると、ＹＥＰ／１％エタノール中に入れてから１４時間後に正しい分子量域（４７−５０ｋｂ）にバンドが現れ始め、誘導開始から２４時間後に強度は最大になった。ウェスタン法の結果は、このクーマシー染色ゲルによる結果と良く相関しており、２４および４８時間目に強いバンドが現れた。３．−ＡＢ１１０コロニーを、ｌｅｕ−／３％エタノールまたはＹＥＰ／１％グルコース中で２４時間誘導した。ＰＡＧＥおよびウェスタン法の両方法を適用したところ、これら両誘導法において、ＰＡＧＥの結果は陰性であったが、ウェスタン法の結果は陽性であった。
１７．細菌または酵母からのＳＯＤ−ｐ３１の精製および特性化
　凍結細菌（酵母）細胞を室温で解凍し、１．５容量の溶菌バッファー〔２０ｍＭトリス−ＨＣｌ　ｐＨ８．０、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＰＭＳＦ　（細菌用）；５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　ｐＨ８．０、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＰＭＳＦ（酵母用）〕に懸濁し、１容量の酸で洗浄したガラスビーズを混合した。
【００９７】
　−２０℃の冷却装置と連結されているダイノミル・ユニットのガラス室（３，０００ｒｐｍ）を用いて１５分間処理することにより、非連続的な方法で細胞を破壊した。氷上に２〜３分置いてガラスビーズをデカントし、細胞リゼイト（溶菌液）を除いた。デカントしたガラスビーズを溶菌バッファー３０ｍｌによって４℃で２回洗浄した。細胞溶菌液を３９，０００ｘｇで３０分間遠心した。
【００９８】
　上記の遠心により得たペレットを溶菌バッファーで１回洗浄し、ボルテックスした後、４℃で懸濁した（遠心処理は上記と同じ）。洗浄したペレットを０．２％ＳＤＳ（細菌用）および０．１％ＳＤＳ（酵母用）により、溶菌バッファー中で処理し、４℃で１０分間、揺動させて撹拌した。溶菌液を３９，０００ｘｇで３０分間遠心した。試料バッファー（６７．５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、５％β−メルカプトエタノール、２．３％ＳＤＳ）中で煮沸し、３９，０００ｘｇで１０分間遠心した。上清を回収し、さらに６０分間、１００，０００ｘｇで遠心した（６０Ｔｉローター）。酵母の場合には、この工程を行う代わりに０．４５μｍの濾過を行った。上記の遠心で得た上清をゲル濾過カラム（２．５×９０ｃｍ、ＡＣＡ３４ＬＫＢ）にかけ（最大タンパク質量５０ｍｇ）、流速０．３〜０．４ｍｌ／分の速度で、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、０．１％ＳＤＳにより平衡化した。ＳＯＤ−ｐ３１を含む画分をプールし、真空透析またはＹＭ５アミコン膜を４０ｐｓｉで用いて透析することにより、濃縮した。タンパク質を濃縮液として、−２０℃で保存した。
【００９９】
　ゲル電気泳動の結果、ＳＯＤ−ｐ３１タンパク質は分子量約４６ｋｂとして誘導し、純度は９０％以上であることが分かった。
１８．組換えＡＲＶ−２ポリペプチドを用いた、ｈＴＬＲに対する抗体のためのＥＬＩＳＡ
　純化ｐ２５ｇａｇタンパク質〔２０ｍＭリン酸ナトリウム（０．１％ＳＤＳ）ｐＨ７．２中、１．２５ｍｇ／ｍｌ〕、純化ｅｎｖタンパク質〔２０ｍＭリン酸ナトリウム（０．１％ＳＤＳ）ｐＨ７．２中、２ｍｇ／ｍｌ〕、および純化ＳＯＤ−ｐ３１融合タンパク質〔２０ｍＭリン酸ナトリウム（０．１％ＳＤＳ）ｐＨ７．２中、２ｍｇ／ｍｌ〕の、各ストック溶液を調製した。
【０１００】
　微量力価検定プレート〔ダイナテクイムロン（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｉｍｍｕｌｏｎ）Ｉ〕を被覆するために、ｐ２５ｇａｇ、ｅｎｖおよびＳＯＤ−ｐ３１のストック溶液を１部ずつ取り、９９７部のホウ酸被覆バッファー（０．０５Ｍホウ酸塩ｐＨ９．０）に加えた。各ウェルにこの被覆溶液１００μｌを入れ、プレートに覆いをして３７℃で２時間、または４℃で１２時間インキュベートした。次いで、被覆溶液をウェルから吸い上げ、プレートを洗浄液（０．１３７Ｍの０．８％ＮａＣｌ、０．０５％のトリトンＸ−１００）で６回洗った。
【０１０１】
　希釈溶液（０．１％カゼイン、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１％トリトンＸ−１００、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０１％チメローサル（Ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ）、ｐＨ７．５）中で１：１００に希釈し、この希釈液に、酵母タンパク質（ＡＢ１０３．１株）の抽出物（１％トリトンＸ−１００、２ｍＭ　ＰＭＳＦ、０．０１％チメローサルを含んだＰＢＳ中で１：４０に希釈、タンパク質約２ｍｇ／ｍｌ）および大腸菌タンパク質抽出物（１％トリトンＸ−１００、２ｍＭ　ＰＭＳＦ、０．０１％チメローサル中で１：４０に希釈、タンパク質約１ｍｇ／ｍｌ）を加えた。抽出方法は、非組換え株を用いる外は前記の１３および１４の記載と同様である。各ウェルに希釈した血清１００μｌを加え、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄液で６回洗った。このプレートに、酵母および大腸菌抽出物を加えてない希釈溶液によって１：８０００に希釈された西洋ワサビのペルオキシダーゼ（カペル）で標識したヤギの抗−ヒトＩｇを１００μｌ／ウェルの割合で加え、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、洗浄液でプレートを６回洗った。次いで、プレートに、基質溶液〔クエン酸バッファー１０ｍｌ、（クエン酸１０．５ｇ／ｌ（ｄＨ２Ｏ）に６Ｍ　ＮａＯＨを加えてｐＨを４．０に調節）、０．１ｍｌのＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ジ−（３−エチルベンズチアゾレン・スルホン酸）１５ｍｇ／ｍｌ　ｄＨ２Ｏ溶液）、および３．３３μｌのＨ２Ｏ２〕を１００μｌ／ウェルの割合で加え、プレートをホイルで包み、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、１０％ＳＤＳを５０μｌ／ウェルの割合で加えて反応を止めた。読み取りは、二重波長読取り用のダイナテクＥＬＩＳＡ読取り装置（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　ＥＬＩＳＡ　ｒｅａ−ｄｉｎｇｓｅｔ）を
使用して行った：吸収波長は１（４１０ｎｍ）であり、基準波長は４である。
結果
　次の血清を試験した：
　Ａ．カンサスシティ血液銀行から得た８９の連続的な血液供給者（「正常な血液供給者」）からの血清：ｌｏｇ　Ｎｏ．１００１〜１０８１、１０８５〜１０９２。
【０１０２】
　Ｂ．リンパ腺症候群（ＬＡＤ）またはＡＩＤＳ患者、あるいはＬＡＤまたはＡＩＤＳの性的パートナー（「接触者」と称する）から得た血清…これらは全てＵＣＳＦ　ＡＩＤＳ血清銀行パネル（Ｓｅｒｕｍ　Ｂａｎｋ　Ｐａｎｅｌ）から得た：ｌｏｇ　Ｎｏ．４６０１〜４６５２。
【０１０３】
　陽性／陰性の判断の境界として、５×（バックグラウンドシグナルの平均値−希釈液のみによるシグナル）を採用し、その値を０．１９５と決定した。即ち、０．１９５以下のシグナルを示す血清は（−）と評価され；それ以上のものは（＋）と評価される。各試料はまた、市販品から購入可能なＡＢＢＯＴＴＨＴＬＶ　ＩＩＩ　ＥＩＡキット〔アボット・ラボラトリィズ（Ａｂｂｏｒｒ　Ｌａｂｓ）〕およびウェスタン分析法により評価した。
【０１０４】
　正常な血清供給者試料に関する、本発明のＥＬＩＳＡ試験では、１例を除き全て陰性であることが示された。この正常な血清はＡＢＢＯＴＴＨＴＬＶ　ＩＩＩ　ＥＩＡ試験でも陰性の値を示したが、ウェスタン分析法では、実際上、陽性であることが確認された。
【０１０５】
　ＬＡＤおよびＡＩＤＳ患者、ならびに接触者達から得た５２の血清に関する試験の結果を次の表に示す。
【０１０６】
【表４】
2004081219.tif 000025
　上記の結果は、組換えＡＲＶタンパク質を用いる本発明のＥＬＩＳＡが少なくともＡＢＢＯＴＴＨＴＬＶ　ＩＩＩ　ＥＩＡ試験またはウェスタン分析法と同様に優れた方法であることを示している。
【０１０７】
　この実施例で報告した本発明のＥＬＩＳＡ法では、酵母または細菌または細菌に対する血清抗体が組換えＡＲＶ−２タンパク質と結合するのを阻止するために、血清に、酵母および細菌抽出物を加えてこれら血清抗体と結合させる。組換えポリペプチドは酵母内で発現されるポリペプチド、および細菌内で発現されるポリペプチドを含有しているので、酵母および細菌の抽出物両者が必要である。もしも、あらゆるポリペプチドが同じ型の生物内で発現されるならば、１個の抽出物しか必要としないであろう。例えば、酵母内で発現されたｐ２５ｇａｇを実施例の、細菌によって生産されたｐ２５ｇａｇポリペプチドと置き換えることができれば、血清試料中には酵母抽出物だけを加えればよい。
１９．組換えＡＲＶ−２ポリペプチド類を用いた、ｈＴＬＲに対する抗体のためのドット・ブロット・アッセイ
　ニトロセルラー・ストリップ（０．５×０．５ｃｍ）に、ＰＢＳ中に含有させたポリペプチド５０ｎｇをスポットした（スポットの容量、２μｌ）。スポットした後、ストリップを室温で１時間またはそれ以上乾燥させた。次いで、このストリップをカーネーション（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）脱脂（ｎｏｎ−ｆａｔ）ドライミルクのＰＢＳ中５％溶液、０．０１％チメローサル中で、室温において１５〜６０分間、後被覆処理（ポスト・コーティング）に付した。各被検体液試料を試験管内でポスト−コーティング溶液０．５ｍｌ中で１：５０に希釈した。次いで、ポスト−コートしたストリップを試験管内に入れ、試料中で揺動しながら３７℃で１時間インキュベートした。次いで、このストリップをポスト−コーティング溶液で１：５００に希釈した西洋ワサビのペルオキシダーゼで標識したヤギ抗−ヒトＩｇ試薬中、室温で１５分間インキュベートした。標識した抗体中でインキュベートした後、ストリップをＰＢＳ、１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、および蒸留水で順次洗浄した。これらのストリップを基質溶液中で、室温において１５分間インキュベートすることにより、展開させた（上記２３参照）。
【０１０８】
　試料が陽性であれば、スポットの位置に連続的な色の変化が生じ、それを観察することができる。正常な（陰性）試料の場合には、色の変化がないか、あるいは陽性シグナルと識別し得る、かすかなシグナルを呈する。かすかなシグナルを与える血清に関しては、競合的な分析を行い、それらが陰性であることを明確にすることもできる。競合法の場合には、ストリップを試料中でインキュベートする前に、ポリペプチド（１０〜２５μｇ／ｍｌ）を被検試料に加え、３７℃で１時間〜インキュベートする。真に陽性の血清の場合には、シグナルは添加したポリペプチドによって完全にブロックされるが、正常な（陰性の）血清の場合には、シグナルに変化が生じない。
【０１０９】
　上記のＡＲＶ−２　ｐ２５ｇａｇポリペプチドおよびＡＲＶ−２　ｅｎｖポリペプチド、ならびにＡＲＶ−２　ｐ３１をＳＯＤとの融合タンパク質を発現する生物の標本はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ）、１２３０１、パークローンドライブ、ロックビル、メアリーランド（Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）にブタペスト条約に則し、寄託された。これらの寄託番号および日付は下記の通りである。
【０１１０】
　　　発現産物　　　　　ＡＴＣＣ寄託番号　　　　　　寄託日　　
　　ＡＲＶ−２　ｐ２５ｇａｇ　５３２４６　　　　　１９８５年８月２７日
　　ＡＲＶ−２　ｅｎｖ　２０７６９　　　　　１９８５年８月２７日
　　ＡＲＶ−２　ｐ３１／ＳＯＤ　２０７６８　　　　　１９８５年８月２７日
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】プロウィルスＤＮＡ（ＡＲＶ−２）の制限酵素切断地図の模式図である。
【図２】ＡＲＶ−２のヌクレオチド配列を示す模式図である。
【図３】図２の続きである。
【図４】プラスミドｐＧＡＧ２５−１０の製造工程系統図である。
【図５】プラスミドｐＧＡＧ２５−１０にクローンしたｐ２５ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列と、この遺伝子によって暗号化されているアミノ酸を示す模式図である。
【図６】融合タンパク質ｐ４１ｇａｇを生産するためのｐＧＡＧ４１−１０にクローンしたヌクレオチド配列の暗号鎖と、それに対応するアミノ酸を示す模式図である。
【図７】ＡＲＶ−２　ｐ１６ｇａｇタンパク質を暗号化しているヌクレオチド配列を示す模式図である。
【図８】ＡＲＶ−２　ｅｎｖタンパク質を暗号化しているヌクレオチド配列を示す模式図である。
【図９】ＡＲＶ−２　ｐ３１タンパク質を暗号化しており、プラスミドｐＴＰ３１に含まれているヌクレオチド配列を示す模式図である。
【図１０】図９の続きである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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