(57)【要約】【課題】虚血と再潅流の間における虚血性損傷等の病態生理学的過程を防止または低減させる保護溶液を提供する。【解決手段】アルカリイオン等の電解質、緩衝液、ポリオールおよび／または糖並びにヒドロキサム酸および／またはその誘導体を含有し、特定の浸透圧モル度（約２９０〜約３５０ｍｏｓｍ／ｌ）とｐＨ（約６．８〜約７．４）を有する保護溶液。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
潅流、手術、移植または凍結保存とその後の再潅流の後の臓器または単離された細胞系もしくは組織部分の貯蔵性損傷、虚血性損傷または再潅流性損傷を防止するための保護溶液であって、（ｉ）電解質としてのアルカリイオンおよび所望によるアルカリ土類イオン、緩衝剤並びにポリオールおよび／または糖を含有し、（ｉｉ）約２９０ｍｏｓｍ／ｌ〜約３５０ｍｏｓｍ／ｌの浸透圧モル濃度および約６．８〜約７．４のｐＨ値を有し、（ｉｉｉ）ヒドロキサム酸および／または１種もしくは複数種のヒドロキサム酸誘導体が添加されることを特徴とする該保護溶液。
【請求項２】
ヒドロキサム酸の窒素原子上の水素原子が、Ｃ１〜Ｃ２０のアルキルアリール基、アリール基またはアルキル基によって置換されたヒドロキサム酸誘導体が添加される請求項１記載の溶液。
【請求項３】
ヒドロキサム酸の炭素原子上の水素原子が、Ｃ１〜Ｃ２０のアルキルアリール基、アリール基またはアルキル基によって置換されたヒドロキサム酸誘導体（該置換基はヘテロ原子および／またはヒドロキシ基、アミノ基、メトキシ基を有していてもよい）が添加される請求項１または２記載の溶液。
【請求項４】
ヒドロキサム酸の窒素原子上の置換基がヒドロキサム酸の炭素原子上の置換基と共に環を形成するヒドロキサム酸誘導体が添加される請求項１から３いずれかに記載の溶液。
【請求項５】
下記の群から選択される１種もしくは複数種の化合物および／または該化合物の塩を含有する請求項１から４いずれかに記載の溶液：
アセトヒドロキサム酸、
アセト−Ｎ−メチルヒドロキサム酸、
Ｎ−ベンジルアセトヒドロキサム酸、
ヘキサンヒドロキサム酸、
ヘキサン−Ｎ−メチルヒドロキサム酸、
ベンズヒドロキサム酸、
Ｎ−メチルベンズヒドロキサム酸、
サリチルヒドロキサム酸、
サリチル−Ｎ−メチルヒドロキサム酸、
サリチル−Ｎ−ベンジルヒドロキサム酸、
２−フェニルアセトヒドロキサム酸、
２−フェニルアセト−Ｎ−メチルヒドロキサム酸、
３，４−ジメトキシベンズヒドロキサム酸、
３，４−ジメトキシ−Ｎ−メチル−ベンズヒドロキサム酸、
２，３−ジメトキシ−Ｎ−メチル−ベンズヒドロキサム酸、
２，４−ジメトキシ−Ｎ−メチル−ベンズヒドロキサム酸、
３，５−ジメトキシ−Ｎ−メチル−ベンズヒドロキサム酸、
２，４−ジヒドロキシベンズヒドロキサム酸、
２，３−ジヒドロキシベンズヒドロキサム酸、
３，４−ジヒドロキシベンズヒドロキサム酸、
３，４，５−トリメトキシ−ベンズヒドロキサム酸、
３，４，５−トリメトキシ−Ｎ−メチル−ベンズヒドロキサム酸、
４−ヒドロキシ−３−メトキシ−ベンズヒドロキサム酸、
２−ヒドロキシ−３−メトキシ−ベンズヒドロキサム酸、
２−ヒドロキシ−５−メトキシ−ベンズヒドロキサム酸、
２−ヒドロキシ−３−メチル−イソカルボスチリル、
４−クロル−Ｎ−メチル−ベンズヒドロキサム酸、および
６−シクロヘキシ−１−ヒドロキシ−４−メチル−２（１Ｈ）−ピリドン。
【請求項６】
デフェロキサミンが添加される請求項１から５いずれかに記載の溶液。
【請求項７】
６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸の誘導体、好ましくは対応するメチルエステルが添加される請求項１から６いずれかに記載の溶液。
【請求項８】
潅流、手術、移植または凍結保存とその後の再潅流の後の臓器または単離された細胞系もしくは組織部分の貯蔵性損傷、虚血性損傷または再潅流性損傷を防止するための保護溶液であって、（ｉ）電解質としてのアルカリイオンおよび所望によるアルカリ土類イオン、ヒスチジンおよび／または１種もしくは複数種のヒスチジン誘導体に基づく緩衝剤並びにポリオールおよび／または糖を含有し、（ｉｉ）約２９０ｍｏｓｍｏｌ〜約３５０ｍｏｓｍｏｌの浸透圧モル濃度および約６．８〜約７．４のｐＨ値を有する該保護溶液、特に請求項１から７いずれかに記載の保護溶液。
【請求項９】
Ｎ−アセチルヒスチジンに基づく緩衝剤を含有する請求項８記載の溶液。
【請求項１０】
Ｎ−アシル化ヒスチジンまたはこれと適当な有機塩基との組合せ、例えば、Ｎ−グリシルヒスチジン／Ｎ−グリシルヒスチジン塩酸塩あるいはＮ−アセチルヒスチジン／リシンおよび／またはアルギニンおよび／またはコリンに基づく緩衝剤を含有する請求項８または９記載の溶液。
【請求項１１】
カチオン源としてリシンおよび／またはリシン誘導体、好ましくはリシン含有ジペプチドを含有する請求項１から１０いずれかに記載の溶液。
【請求項１２】
アニオン源としてアスパラギン酸塩を含有する請求項１から１１いずれかに記載の溶液。
【請求項１３】
ヒドロキサム酸および／またはその誘導体を約１０ｍｍｏｌ／ｌまでの濃度で含有する請求項１から１２いずれかに記載の溶液。
【請求項１４】
デフェロキサムを約１０ｍｍｏｌ／ｌまでの濃度で含有する請求項６から１３いずれかに記載の溶液。
【請求項１５】
トロロックスを約１０ｍｍｏｌ／ｌまでの濃度で含有する請求項６から１３いずれかに記載の溶液。
【請求項１６】
Ｎ−アセチルヒスチジン／Ｎ−アセチルヒスチジン（−）を約２０〜約２６５ｍｍｏｌ／ｌの濃度で含有する請求項６から１５いずれかに記載の溶液。
【請求項１７】
電解質として、ナトリウムを目的に応じて約１０〜約１２０ｍｍｏｌ／ｌの濃度で含有する請求項１から１６いずれかに記載の溶液。
【請求項１８】
電解質として、カリウムを目的に応じて約５〜約２５ｍｍｏｌ／ｌの濃度で含有する請求項１から１７いずれかに記載の溶液。
【請求項１９】
マグネシウムを目的に応じて約３〜約２７ｍｍｏｌ／ｌの濃度で含有する請求項１から１８いずれかに記載の溶液。
【請求項２０】
カルシウムを目的に応じて約０．０００１〜約１．５ｍｍｏｌ／ｌの濃度で含有する請求項１から１９いずれかに記載の溶液。
【請求項２１】
カチオン源として、リシンおよび／またはその誘導体、好ましくはリシン含有ジペプチドを目的に応じて約１４０ｍｍｏｌ／ｌまでの濃度で含有する請求項１から２０いずれかに記載の溶液。
【請求項２２】
アスパラギン酸塩を約１４０ｍｍｏｌ／ｌまでの濃度で含有する請求項１から２１いずれかに記載の溶液。
【請求項２３】
塩化物を含有する請求項１から２２いずれかに記載の溶液。
【請求項２４】
アスパラギン酸塩を塩化物に比べて過剰に含有する請求項２２または２３記載の溶液。
【請求項２５】
α−ケトグルタレートを目的に応じて約１〜約９ｍｍｏｌ／ｌの濃度で含有する請求項１から２４いずれかに記載の溶液。
【請求項２６】
オスモライトを目的に応じて約１４０ｍｍｏｌ／ｌまでの濃度で含有する請求項１から２５いずれかに記載の溶液。
【請求項２７】
（ｉ）必要な水分量に対して合目的的に約９０％の過剰の水に電解質を撹拌下で溶解させ、（ｉｉ）得られた溶液に緩衝剤を添加した後、ヒドロキサム酸および／またはその誘導体を添加し、（ｉｉｉ）溶液のｐＨ値を調整し、（ｉｖ）１種もしくは複数種のオスモライトを添加し、次いで（ｖ）溶液の体積を水を用いて所要の体積まで増大させる、ことを含む請求項１から２６いずれかに記載の溶液の製造方法。
【請求項２８】
ヒドロキサム酸および／またはその誘導体を得るために、低級アルコールおよび／またはＤＭＦおよび／またはＴＨＦを溶剤として使用する請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
カルボン酸との反応を塩基触媒の存在下でおこなう請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
虚血性損傷および再潅流性損傷、例えば梗塞または炎症反応後のこれらの損傷を保護するための請求項１から２６いずれかに記載の溶液中におけるヒドロキサム酸誘導体の使用。
【請求項３１】
心筋梗塞、卒中発作、災害外科手術または手足の再潅流の後の再潅流損傷に対して使用するための請求項５記載の溶液。
【請求項３２】
高鉄血症（例えば、アルツハイマー）に原因がある病気の治療に使用するための請求項５記載の溶液。
【請求項３３】
ラジカル、酸素ラジカルまたはＨ２Ｏ２による細胞損傷に原因がある病気の治療に使用するための請求項５記載の溶液。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液が十分に供給されない虚血性臓器の長時間に及ぶこともある手術を実施できるようにするために、臓器、特に心臓、肺臓、腎臓、肝臓、膵臓および血管系を保護する溶液または輸送中もしくは貯蔵中の他の保存方法による組織の損傷を少なくしてこの種の臓器を移植するために該臓器を保存する溶液または虚血性臓器の再潅流（ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）のための溶液の改良された組成に関する。従って、本発明はＧＭＰ基準の要求に従う適当な溶液とその製造法を提供する。
【０００２】
【従来の技術】
１９５５年にメールローズによって高カリウム血症性心停止が発見されて以来、心臓外科医は、虚血性の不安定な心臓について複雑な手術を実施する立場に置かれていた。当時の心臓麻痺溶液を用いることによってわずかに４０分間までは手術をおこなうことができたが、最初は先天性の心臓奇形の手術による復元と心臓弁プロテーゼの移植が可能であった。心臓外科医の里程標は、１９６７年にバーナードによっておこなわれた心臓移植である。
【０００３】
別の研究の目標は、その時まで制限されていた手術時間を適当な溶液とその使用方法によって延長させることであった。既に６０年も前に、ブレットシュナイダーの研究グループは、心筋層の保護を改善するための新しい構想に従って、虚血時間を著しく長くすることを可能にした。最初は、ナトリウムを断つことによって心停止が誘発され、また、基質（例えば、タンパク質、アセチルコリンおよびノヴァカイン）を用いることにより細胞膜を保護し、これによって細胞内水腫の発生を阻害することができた。
【０００４】
心臓、腎臓およびその他の臓器の保護溶液であって、ヒスチジン＋ヒスチジン−ＨＣｌに基づく緩衝剤系によって特徴づけられ、さらにナトリウムイオン、カリウムイオンおよびマグネシウムイオン並びにポリオールまたは糖を含有する保護溶液が知られている（特許文献１参照）。この保護溶液を使用することによって、非処置心臓の場合に比べて約８倍の許容される虚血時間が得られる。
【０００５】
この溶液の改良法が知られている（特許文献２参照）。この方法によれば、保護溶液を用いる臓器の持続的な潅流の間（約８〜１０分間）におけるＡＴＰ−損失のクエン酸塩サイクルの有利な影響による好気性物質代謝が、α−ケトグルタレートの添加によって低減される。
【０００６】
その後、臨床医と生理学者の注目は、低温で低酸素の臓器を暖めることと血液の再潅流によって、該臓器の機能を完全に回復させる虚血の終了時期に向けられた。このような研究によれば次のことが判明した。即ち、所謂「再潅流段階」においては、再潅流損傷（Ｉ−Ｒ−損傷）という概念によって一緒に把握される種々の病態生理学的過程がおこなわれる。この場合、特に、炎症性過程の一部は原因と考えられ、一部は結果と考えられる内皮細胞損傷がもたらされ、また、これらの病因においては、反応性の酸素種が重要な意義を持つと考えられている。最近になって、臓器の保護するために使用される低温化も特有の損傷要因になることが判明した。現在使用されている保存溶液は、このような損傷に対して保護能を発揮しない。
【０００７】
【特許文献１】
ヨーロッパ特許第１２２７２号明細書
【特許文献２】
ヨーロッパ特許第５４６３５号明細書
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、虚血と再潅流の間における下記の病態生理学的過程を防止または低減させることである：
（ｉ）虚血性損傷
（ｉｉ）低温損傷（低温誘発性アポプトシス）
（ｉｉｉ）再潅流損傷
（ｉｖ）炎症性過程。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この課題は、本願の請求項の特に１または８記載の臓器保護溶液によって解決された。
即ち本発明は、潅流、手術、移植または凍結保存とその後の再潅流の後の臓器または単離された細胞系もしくは組織部分の貯蔵性損傷、虚血性損傷または再潅流性損傷を防止するための保護溶液であって、（ｉ）電解質としてのアルカリイオンおよび所望によるアルカリ土類イオン、緩衝剤並びにポリオールおよび／または糖を含有し、（ｉｉ）約２９０ｍｏｓｍ／ｌ〜約３５０ｍｏｓｍ／ｌの浸透圧モル濃度および約６．８〜約７．４のｐＨ値を有し、（ｉｉｉ）ヒドロキサム酸および／または１種もしくは複数種のヒドロキサム酸誘導体が添加されることを特徴とする該保護溶液に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
心臓麻痺と臓器保存における細胞と組織の損傷に関する前記メカニズムからは、臓器保護溶液の組成に対してはかなりの数の要求があることが明らかである。このような要求を満たすために、本発明者は、請求項１および／または８に記載の有効に作用する新規な臓器保護溶液の着想を可能にする物質を見出した。この溶液の組成は、上記の損傷過程が発生する前に有効な保護作用が得られるように選択される。
【００１１】
保護機構に方向づける非毒性成分を使用することにより、保存損傷は明確に低減する。偶発的または吻合時に発生する臓器の昇温の際に従来から使用されている保存溶液によってもたらされる有毒性は低減される。この方法により、該臓器の組織の機能と活力が改善され、また、虚血と低温保存の許容度が高くなるので、臓器の保存時間の延長化が可能となる。このことは、移植のための臓器の取り扱い性を改善する理論にも寄与する。
【００１２】
ヒドロキサム酸の窒素原子上の水素原子が炭素原子数が１〜２０のアルキル基、アリール基またはアルキルアリール基によって置換されたヒドロキサム酸誘導体の使用が有利であることが実証された。
【００１３】
さらに、ヒドロキサム酸誘導体においては、ヒドロキサム酸の炭素原子上の水素原子が炭素原子数が１〜２０のアルキル基、アリール基またはアルキルアリール基によって置換されていることが推奨され、この場合、これらの置換基はヘテロ原子および／またはヒドロキシ基、アミノ基、メトキシ基を有していてもよい。
【００１４】
また、ヒドロキサム酸の窒素原子上の置換基とヒドロキサム酸の炭素原子上の置換基は環を形成していることも有利である。
【００１５】
本発明においては、下記の１種もしくは複数種の化合物および／またはこれらの塩類を含有させることが推奨される；
アセトヒドロキサム酸、
アセト−Ｎ−メチルヒドロキサム酸、
Ｎ−ベンジルアセトヒドロキサム酸、
ヘキサンヒドロキサム酸、
ヘキサン−Ｎ−メチルヒドロキサム酸、
ベンズヒドロキサム酸、
Ｎ−メチルベンズヒドロキサム酸、
サリチルヒドロキサム酸、
サリチル−Ｎ−メチルヒドロキサム酸、
サリチル−Ｎ−ベンジルヒドロキサム酸、
２−フェニルアセトヒドロキサム酸、
２−フェニルアセト−Ｎ−メチルヒドロキサム酸、
３，４−ジメトキシベンズヒドロキサム酸、
３，４−ジメトキシ−Ｎ−メチル−ベンズヒドロキサム酸、
２，３−ジメトキシ−Ｎ−メチル−ベンズヒドロキサム酸、
２，４−ジメトキシ−Ｎ−メチル−ベンズヒドロキサム酸、
３，５−ジメトキシ−Ｎ−メチル−ベンズヒドロキサム酸、
２，４−ジヒドロキシベンズヒドロキサム酸、
２，３−ジヒドロキシベンズヒドロキサム酸、
３，４−ジヒドロキシベンズヒドロキサム酸、
３，４，５−トリメトキシ−ベンズヒドロキサム酸、
３，４，５−トリメトキシ−Ｎ−メチル−ベンズヒドロキサム酸、
４−ヒドロキシ−３−メトキシ−ベンズヒドロキサム酸、
２−ヒドロキシ−３−メトキシ−ベンズヒドロキサム酸、
２−ヒドロキシ−５−メトキシ−ベンズヒドロキサム酸、
２−ヒドロキシ−３−メチル−イソカルボスチリル、
４−クロル−Ｎ−メチル−ベンズヒドロキサム酸、および
６−シクロヘキシ−１−ヒドロキシ−４−メチル−２（１Ｈ）−ピリドン。
【００１６】
さらに、デフェロキサミンの添加も考慮に値し、有利であり、その濃度は約１０ｍｍｏｌ／ｌまでにすることが推奨される。
【００１７】
６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸の誘導体または対応するメチルエステルを添加することが推奨される。
【００１８】
Ｎ−アセチルヒスチジン（Ａｃ−Ｎ−Ｈｉｓ）、特にＮ−アシル化ヒスチジンまたはこれらと適当な有機塩基との組合せ、例えば、Ｎ−グリシルヒスチジン／Ｎ−グリシルヒスチジン−ヒドロクロリドあるいはＮ−アセチルヒスチジン／リシンおよび／またはアルギニンおよび／またはコリンに基づく緩衝剤の使用が有効である。
【００１９】
本発明による溶液は、リシンおよび／またはリシン誘導体、好ましくはリシン含有ジペプチドのようなカチオン源並びに所望によるアスパラギン酸塩のようなアニオン源を含有するのが有利である。
【００２０】
ヒドロキサム酸および／またはその誘導体の溶液中の濃度は、約１０ｍｍｏｌ／ｌまでにするのが有利である。
【００２１】
また、トロロックスは、約１０ｍｍｏｌ／ｌまでの濃度で溶液中に含有させるのが有効である。
【００２２】
Ｎ−アセチルヒスチジン／Ｎ−アセチルヒスチジン（−）の濃度は約２０〜約２６５ｍｍｏｌ／ｌにするのが有利である。
【００２３】
さらに、溶液中には電解質としてナトリウムを約１０〜約１２０ｍｍｏｌ／ｌの濃度で添加することが推奨される。選択的または補充的なカリウムを約５〜約２５ｍｍｏｌ／ｌの濃度で含有させるのが有利である。
【００２４】
さらにまた、マグネシウムを約３〜約２７ｍｍｏｌ／ｌの濃度で含有させるのが有利である。
【００２５】
最後に、カルシウムを約０．０００１〜約１．５ｍｍｏｌ／ｌの濃度で含有させるのが有利である。
【００２６】
特に、リシンおよび／またはその誘導体、好ましくはリシン含有ジペプチドを約１４０ｍｍｏｌ／ｌまでの濃度で含有させることが推奨される。
【００２７】
アスパラギン酸塩の溶液中の濃度は約１４０ｍｍｏｌ／ｌまでにするのが有利である。
【００２８】
溶液中に塩化物を含有させる場合、塩化物に対してアスパラギン酸塩を過剰に使用することが推奨される。
【００２９】
α−ケトグルタレートの含有量は約１〜約９ｍｍｏｌ／ｌの濃度にするのが有利であることが実証された。
【００３０】
オスモライト（Ｏｓｍｏｌｙｔ）は溶液中に約１４０ｍｍｏｌ／ｌまでの濃度で含有させるのが有利である。
【００３１】
前記の請求項に記載の溶液を調製するためには、次の製法が推奨される：（ｉ）過剰な水（必要な水分量の約９０％の水が有効）に電解質を撹拌下で溶解させ、（ｉｉ）次いで緩衝剤を添加し、さらにヒドロキサム酸および／またはその誘導体を添加し、（ｉｉｉ）溶液のｐＨ値を調整し、（ｉｖ）１種もしくは複数種のオスモライトを添加し、（ｖ）溶液の体積を水を用いて所要の体積まで増大させる。
【００３２】
ヒドロキサム酸および／またはその誘導体を得るためには、低級アルコールおよび／またはＤＭＦおよび／またはＴＨＦを溶剤として使用するのが有利である。
【００３３】
この方法は、カルボン酸との反応を塩基触媒の存在下でおこなうときに特に有効である。
【００３４】
特に請求項５に記載の本発明は、心筋梗塞、卒中発作、災害外科手術または手足の再潅流の後の再潅流損傷の緩和もしくは防止のために適用される。さらに、該発明は、病因が高鉄血症（例えば、アルツハイマー）あるいはラジカル、酸素ラジカルもしくはＨ２Ｏ２による細胞損傷にあるような病気の治療に適用することが推奨される。
【００３５】
鉄キレート化剤は鉄依存性の低温損傷および低温誘発性のアポプトシスを阻止する。この細胞損傷を低減させるための化合物としては、全ての錯体形成剤が適しているわけではない。例えば、ＥＤＴＡは、強い鉄錯体を形成するが、このリガンドはカストジオール（Ｃｕｓｔｏｄｉｏｌ）中に含まれるヒスチジンのように、ここでは有効ではない。それどころか、鉄は特殊な方法によってリガンドによって結合されなければならず、また、該リガンドは細胞内のコンパートメント内へ迅速かつ十分な濃度で到達しなければならない。
【００３６】
デフェロキサミン中には３倍含まれるヒドロキサム酸ＩおよびＩＩの構造要素は、鉄に対しては適当な構造要素およびリガンドとして特別な意義を有する（次式参照）：
【化１】
2004002418.tif 000002
【００３７】
式中、Ｒ１は直鎖状または分枝鎖状のＣ１〜Ｃ２０アルキル、アリールまたはアルキル−アリールを示し、ヘテロ原子および／または他の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＮＨ２等）を有していてもよい。また、Ｒ２はＨを示すか、またはＲ１の場合と同じ意義を有していてもよい。この場合、Ｒ１とＲ２は閉環していてもよく、および／または他の置換基を有していてもよい（例えば、２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシドおよびその誘導体）。このような環状化合物は、Ｒ１とＲ２が共役二重結合を有する環を形成する場合には、別の互変異性体構造を有する。デフェロキサミンに比べて小さくて親油性の物質を用いることによって、強い鉄キレート化剤の細胞内への迅速な適用法が実現される。
【００３８】
簡単なヒドロキサム酸は有利な作用を示すが、良好な効能を得るためには、一定の親水性／親油性比が必要である。さらに、次のことが判明した。即ち、ヒドロキサム酸の窒素原子にアルキル基が置換した化合物（Ｒ２＝アルキル）は非置換化合物（Ｒ２＝Ｈ）に比べて一般により効果的である。Ｒ２が強い電子吸引性基、例えば、−ＣＯ−Ｒ３（Ｒ３はＲ１と同意義である）である場合には、該置換基を有する化合物は効力のないものとなるが、このような化合物（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン）は弱い鉄錯体を形成する。
【００３９】
２種類の例示化合物の効能を図１および図２において例証する。
本発明による溶液には、ヒドロキサム酸および／またはその誘導体を、目的に応じて約１０ｍｍｏｌ／ｌまでの濃度で含有させてもよい。
【００４０】
図１は、肝臓の内皮細胞の低温損傷に対するサリチル−Ｎ−メチルヒドロキサム酸の抑制効果を示すグラフである。培養したラットの肝臓の内皮細胞をウィスコンシン大学−溶液（ＵＷ）中（４℃）、１ｍＭサリチル−Ｎ−メチルヒドロキサム酸の存在下または不存在下において、好気性条件下で７２時間培養させた後、細胞培養培地中（３７℃）で３時間加温した。細胞損傷のパラメーターとしては、細胞質ゾルの乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の遊離（％）を用いた。
【００４１】
図２は、肝細胞の低温損傷に対する３，４−ジメトキシ−Ｎ−メチル−ベンズヒドロキサム酸の抑制効果を示すグラフである。培養したラットの肝細胞をウィスコンシン大学−溶液（ＵＷ）中（４℃）、１ｍＭ　３，４−ジメトキシ−Ｎ−メチル−ベンズヒドロキサム酸の存在下または不存在下において、好気性条件下で２４時間培養させた後、細胞培養培地中（３７℃）で３時間加温した。細胞損傷のパラメーターとしては、細胞質ゾルの乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の遊離（％）を用いた。
【００４２】
デフェロキサミンは強い鉄キレート化剤であって、鉄に対しては、６座リガンドとして非レドックス活性形態で結合する。従って、デフェロキサミンは、低温条件下に比較的長時間さらされる場合に最適な保護手段を提供する。しかしながら、デフェロキサミンは比較的大きな親水性分子であるために、限定的な膜透過性を有する。従って、デフェロキサミンは、完全な保護手段を提供するために十分な濃度と速度で全ての細胞内コンパートメント内へは到達できない。デフェロキサミンは溶液中へ、好ましくは約１０ｍｍｏｌ／ｌまでの濃度で含有させることができる。
【００４３】
本発明による臓器保護溶液へ合目的的に添加することができるその他の化合物は請求項５および６に記載された化合物である。
【００４４】
本発明の別の実施態様においては、本発明による溶液には６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸（「トロロックス（Ｔｒｏｌｏｘ）」）またはその誘導体が添加される。低温損傷と再酸素供給損傷に際して発生する細胞内ラジカルを捕獲するために、比較的親水性であるが膜透過性のラジカル捕獲剤であるトロロックスおよびその誘導体が添加される。本発明による溶液中のトロロックス誘導体の濃度は合目的的に約１０ｍｍｏｌ／ｌまでである。
【００４５】
全ての臓器保護溶液は、虚血中の不可避的なアシドーシスを阻止する緩衝剤を用いて処理される。この場合、リン酸塩または重炭酸塩は多くの場合に使用される無機緩衝剤系である。緩衝能とｐＨの安定性に関しては「カストジオール（Ｃｕｓｔｏｄｉｏｌ）」（登録商標）に使用されている有機緩衝剤系のヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌが優れていることが判明している。緩衝剤系として、ヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌの代わりに、前述の溶液や他の既知の保護溶液に配合されるヒスチジン誘導体、例えば、Ｎ−アセチルヒスチジンを使用するときには、特別な利点が得られる。
【００４６】
図３は、ヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌおよびＮ−アセチルヒスチジンの中和曲線を示す。生理学的なｐＨ値の範囲内における利用可能な緩衝能は、基質に対する使用塩基の割合に基づいて、Ｎ−アセチルヒスチジンの場合は約６０％であり、また、ヒスチジンの場合は約３０％である。
【００４７】
本発明による溶液中の上記の緩衝剤系の濃度は、好ましくは約２０〜約２６５ｍｍｏｌ／ｌにすることができる。
【００４８】
図３から明らかなように、Ｎ−アセチルヒスチジンは、ヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌに比べて約２倍の改善された緩衝能を示す。ヒスチジン誘導体の添加によって、良好な緩衝能を損なうことなく、ヒスチジンの望ましくないいくつかの副作用（いくつかの細胞型、例えば肝細胞における特に温熱時または低温時の毒性）も回避される（図４参照）。
【００４９】
図４は、温暖条件下におけるヒスチジンの毒性に対する実例およびヒスチジン誘導体によるこの毒性の低減効果を示すグラフである。
【００５０】
培養した肝細胞を１９８ｍＭのＬ−ヒスチジンまたは１９８ｍＭのＮ−アセチルヒスチジンの存在下または不存在下において、好気性条件下、３７℃で５時間温置した。基礎溶液としては、細胞の培養に常用されている生理的塩溶液であるクレブス−ヘンセライト緩衝液（ＫＨ）を使用した。ヒスチジンまたはその誘導体を含有する溶液においては、ＮａＣｌ濃度は約９９ｍＭに低下させ、またｐＨ値はＨＣｌまたはＮａＯＨの添加によって７．２に調整した。
【００５１】
これらのさらに発展させた溶液を用いることによって、保存後の細胞の機能をさらに改善された状態に維持することが可能となる。
【００５２】
カチオンの１種としては、ナトリウムが好適である。低ナトリウム濃度は、細胞膜の電気機械的脱結合（心停止）に対して好ましく、また、該低ナトリウム濃度は、低酸素によって誘発されるナトリウム流の回避／低減化に起因して、低酸素損傷を低減させる。さらに、他の物質（例えば、緩衝剤等）に対する浸透予備力（ｏｓｍｏｔｉｃ　ｒｅｓｅｒｖｅ）が保持される。溶液のナトリウム濃度が低い場合でも、ナトリウム（１４０ｍＭ）の間質での増加が迅速におこなわれるので、再潅流段階におけるホメオスタシスの迅速な調整が可能である。従って、本発明による溶液におけるナトリウムの濃度を約１０〜約１２０ｍｍｏｌ／ｌにすることが推奨される。
【００５３】
比較的低い濃度であるが、生理学的に細胞外の濃度値の範囲にあるカリウム濃度は細胞膜の電気機械的脱結合（心停止）を支持するが、強い高カリウム性（ｈｙｐｅｒｋａｌｅｍｉｃ）溶液の欠点を回避する。（強い高カリウム性溶液は迅速な心停止を誘発するが、再酸素供給段階においては律動障害および場合によっては再潅流損傷の増大の原因となる。再潅流段階においては、間質のカリウム濃度の調整が経時的に遅延するので、このような溶液の存在下での臓器の遅延した初期機能の役割分担は高くなる。）弱い高カリウム性溶液は次の利点を有する。即ち、被移植臓器の再潅流前の該溶液による洗浄は不要であり（該溶液はその保護特性を虚血時間の終りまで発揮することができる。）、また、高い全身的許容度を示す。従って、本発明による溶液中のカリウム濃度を約５〜約２５ｍｍｏｌ／ｌにすることが推奨させれる。
【００５４】
血清の基準値に比べてマグネシウムの濃度は明らかに高くなっているが、これは、マグネシウムは多数の糖分解酵素系の補因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）として嫌気性物質代謝を支持し、低温虚血の間もＡＴＰの形成のために寄与する。さらに、マグネシウムは、Ｎａ＋−Ｋ＋−ＡＴＰアーゼの活性を維持するために寄与し、イオンのホメオスタシスの変化を阻止する。生理学的なＣａ２＋−拮抗体として、マグネシウムは、細胞内のカルシウム蓄積の有害な効果に対しても阻止作用を示す。再潅流段階においては、好気性エネルギー物質代謝を刺激するために、マグネシウムの貯蔵が必要となる。マグネシウムの血管拡張特性は、再潅流損傷における括約効果も阻止する。従って、本発明による溶液中のマグネシウムの濃度を約３〜約２７ｍｍｏｌ／ｌにすることが推奨される。
【００５５】
虚血並びにこれに関連する細胞内アジドーシスおよびナトリウムのホメオスタシス妨害の条件下においては、細胞質ゾルのカルシウム増大の危険がある。これによって望ましくない活性、例えば、プロテアーゼとホスホリパーゼの刺激活性の増大がもたらされ、また、心臓の場合には、ＡＴＰの多量の消費を伴う高収縮が付随する。従って、虚血中のカルシウムの生理学的機能は最大限に抑制されなければならないので、溶液中のカルシウム濃度は細胞質の濃度範囲内にすべきである。このため、本発明による溶液中のカルシウムの濃度を約０．０００１〜約１．５ｍｍｏｌ／ｌにすることが推奨される。
【００５６】
塩基性アミノ酸であるリシン、アルギニンおよびこれらの誘導体は、グリシンを含むジペプチド（Ｌｙｓ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ａｒｇ）として、不足する塩基等価物を補充するために添加される。これはカチオン（ナトリウム、カリウム、マグネシウムおよびカルシウム）の濃度と割合が、上記の理由に基づいて一定の範囲に維持されるからである。本発明による溶液中のリシンおよび／またはリシン誘導体並びにアルギニンおよび／またはアルギニン誘導体の濃度はそれぞれ約１４０ｍｍｏｌ／ｌまでにすることができる。
【００５７】
生理学的な細胞外アニオンである塩化物は、低温虚血中のイオンのホメオスタシスの妨害を低減させるために、生理学的な値に比べて低い濃度で使用される。これは、ナトリウムのようなカチオンの低酸素誘発性流入に対して有効である。電子的中性の理由から、このカチオン流入は並行しておこなわれるアニオン（好ましくは塩化物アニオン）の流入によって左右される。多くの研究者は、塩化物の高濃度は細胞内水腫の程度を促進すると推論していることを考慮することができる。従って、本発明による溶液中の塩化物の濃度は、できる限り生理学的な水準よりも低い値（最大で９０ｍｍｏｌ／ｌまで）に維持することが推奨される。塩化物と共に、不透過性アニオンとしてラクトバイオネート（Ｌａｃｔｏｂｉｏｎａｔ）を約１４０ｍｍｏｌ／ｌまでの濃度で添加することができる。
【００５８】
臓器保護溶液に使用されるアニオンの濃度は、一般にカチオンと使用される有機緩衝剤の選択によって左右される。不透過性アニオン（例えば、ラクトバイオネート）を使用することによって、細胞内水腫の発生は阻止される。アスパラギン酸塩は優れた代替物であり、特にアスパラギン酸塩を用いることによって多くの目的が達成される：
（ａ）アスパラギン酸塩は酸等価物として好ましくない塩化物と代替する。
（ｂ）アスパラギン酸は膜における物質交換を有効に支持すると共に、ホメオスタシスの回復を促進する。
（ｃ）アスパラギン酸塩は、臓器の再潅流と再酸素供給の臨界段階において、α−ケトグルタレートと共に好気性物質交換を補助すると共に、臓器の初期機能を促進する。
【００５９】
特に再酸素供給の段階においては、臓器の増大する加温に伴ってエネルギー需要が著しく高くなると、エネルギーの強制的な供給が必要となり、また、この加温段階におけるＡＴＰの不足は臓器の機能を著しく阻害し、再潅流損傷の程度を増大させる。本発明による溶液中のアスパラギン酸塩の濃度を約１４０ｍｍｏｌ／ｌまでにすることが推奨される。本発明による溶液においては、アスパラギン酸塩は塩化物に比べて過剰に存在させるのが有効である。
【００６０】
アミノ酸であるグリシンは比較的高いミリモル濃度で使用する。この理由は、このような濃度のグリシンは原形質膜の安定化（拡散配向性物質交換の回避）によって低酸素誘発性ナトリウム流入を阻害し、さらにマクロファージの活性化を阻止するからである。本発明による溶液中のグリシンの濃度を約３０ｍｍｏｌ／ｌまでにすることが推奨される。
【００６１】
低温虚血中の臓器のエネルギー需要は非常に少ないわけではないので、これを補充するために、エネルギー放出性物質またはエネルギー物質交換促進性物質が溶液に添加される。この場合、種々の添加物が考慮されるが（前述のアスパラギン酸塩およびα−ケトグルタレート等）、例えば、グルコースが添加される。
【００６２】
溶液の生理学的なグルコース濃度は、比較的低濃度のグリコーゲン調製物に基づく外因性グルコース供給がおこなわれる細胞（例えば、内皮細胞）が、虚血中の嫌気性糖分解によってエネルギーを獲得することを可能にする。このグルコース濃度は、他の細胞、特に肝細胞によるグルコースの過剰摂取が回避されるように選択される（従来の保存溶液の場合には、非常に高いグルコース濃度が問題となっていた）。従って、本発明による溶液中のグルコースの濃度を約１０ｍｍｏｌ／ｌまでにすることが推奨される。
【００６３】
α−ケトグルタレートはアスパラギン酸塩と共に、低酸素条件下における物質代謝を支持する。この濃度は約１〜約９ｍｍｏｌ／ｌにするのが有効である。
【００６４】
浸透性物質の添加は、約３００ｍｏｓｍ／Ｌの必要な生理学的浸透圧が得られるようにしておこなうことが必要である。このためには、一般に、ポリオール／糖（例えば、マンニトール）または高分子量物質（例えば、ＨＥＳ、デキストラン）が使用される。しかしながら、後者は好ましくはない。何故ならば、ＨＥＳとデキストランを用いたときにもたらされる高い粘度は保護特性を損うという欠点があるからである。
「カストジオール」（登録商標）およびＵＷ−溶液の４℃における粘度はそれぞれ１．８ｃＰおよび４．８ｃＰである。
【００６５】
オスモライトとしては、臓器に応じて、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、サッカロースまたはラフィノースを使用することができる。本発明による溶液中のオスモライトの濃度は１００ｍｍｏｌ／ｌまでにするのが有効である。
【００６６】
間質水腫の発生を回避するためには、いくつかの臓器／組織の場合には、コロイド浸透性物質、例えば、デキストラン−４０／デキストラン−７０等を添加するのが有効である。このような添加物質は特に肺臓や膵臓の保護に有効である。
【００６７】
細胞と組織の凍結に対しては、付加的な抗凍結剤、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）をさらに添加するのが有利である。
【００６８】
図５は、過酸化水素による肝細胞の細胞損傷および種々のヒドロキサム酸を用いる該細胞損傷の保護効果を示すグラフである。Ｎ４は以下の実施例２で調製した溶液（但し、トロロックスおよびヒドロキサム酸誘導体は含有しない）を意味する。
グラフ１）はＮ４＋Ｈ２Ｏ２（２０ｍＭ／ｌ）の場合を示し、
グラフ２）はＮ４＋Ｈ２Ｏ２（２０ｍＭ／ｌ）＋４−クロル−Ｎ−メチル−ベンズヒドロキサム酸（１ｍＭ／ｌ）の場合を示し、
グラフ３）はＮ４＋Ｈ２Ｏ２（２０ｍＭ／ｌ）＋２−ヒドロキシ−３−メチル−イソカルボステリリル（１ｍＭ／ｌ）の場合を示し、
グラフ４）はＮ４＋Ｈ２Ｏ２（２０ｍＭ／ｌ）＋３，４，５−トリメトキシ−Ｎ−メチル−ベンズヒドロキサム酸（１ｍＭ／ｌ）の場合を示し、
グラフ５）はＮ４＋Ｈ２Ｏ２（２０ｍＭ／ｌ）＋３，４−ジメトキシ−Ｎ−メチル−ヒドロキサム酸（１ｍＭ／ｌ）の場合を示す。
【００６９】
図６は、肝細胞の低温損傷に対する新規な保存溶液の抑制効果を示すグラフである。培養したラットの肝細胞を本発明による溶液［緩衝剤としてのＮ−アセチルヒスチジンのほかに、トロロックス（１ｍＭ／ｌ）およびヒドロキサム酸誘導体であるベラトリル−Ｎ−メチルヒドロキサム酸（０．５ｍＭ／ｌ）を含有する溶液］または比較のためのクレブス−ヘンセライト緩衝液（ＫＨ）中において、４℃で２４時間温置した。この低温での温置は好気性条件下でおこなった。２４時間後、再潅流の模擬実験のために、処理細胞を３７℃の細胞培養培地中において再び温めた。細胞損傷の指標として、細胞質ゾルの乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の遊離（％）を用いた。
【００７０】
実施例
以下、本明細書において権利請求される発明の保護範囲に包含される溶液例について説明する。
実施例１〜５
本発明に従って調製した臓器保護溶液の配合処方を以下の表１〜表５に示す。
【００７１】
【表１】
2004002418.tif 000003
【００７２】
【表２】
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【００７３】
【表３】
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【００７４】
【表４】
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【００７５】
【表５】
2004002418.tif 000007
【００７６】
本発明による溶液は、臓器保護用溶液の機能性成分、即ち緩衝剤系、電解質、保護作用性物質およびオスモライトを用いて調製した。先ず第一に、緩衝剤を必要量の水の約９０％に溶解させた。ついで、電解質として必要なカチオン、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウムおよびカルシウムの中性塩を前述の生理学的に有意な濃度で添加し、撹拌下で溶解させた。次いで、該溶液に添加すべき保護作用性物質はその他の成分として加えた。溶液のｐＨ値を調べ、必要に応じて、請求項１に記載の値に調整した。最後に所定量のオスモライトを添加し、得られた溶液を所定の体積まで希釈した後、適当な容器へ移し、殺菌処理に付した。
【００７７】
環状ヒドロキサム酸、例えば、２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシドから誘導される化合物の調製法は、例えば、「オーガニック・シンセシス」、総集巻Ｖ、第６２３頁以降に記載されている。カルボン酸誘導体からのヒドロキサム酸の調製法は、フーベン−ヴェイル著、「メトーデン・デア・オーガニッシェン・ケミー」、第６８６頁以降に記載されている。この場合、溶剤としては、低級アルコール、ＤＭＦ、またはＴＨＦ等が使用される。相当するカルボン酸との反応は、塩基性触媒（例えば、ＮａＯＣＨ３、Ｋ２ＣＯ３、ＣａＯ等）を用いておこなうことができる。さらに、環状ヒドロキサム酸の調製に関しては、次の文献を参照することができる：Ａ．クレーマンおよびＪ．エンジェル著、「薬学的作用物質」、第２版（１９８２年）、第２０６頁以降。
【図面の簡単な説明】
【図１】肝臓の内皮細胞の低温損傷に対するサリチル−Ｎ−メチルヒドロキサム酸の抑制効果を示すグラフである。
【図２】肝細胞の低温損傷に対する３，４−ジメトキシ−Ｎ−メチル−ベンズヒドロキサム酸の抑制効果を示すグラフである。
【図３】ヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌおよびＮ−アセチルヒスチジンの中和曲線を示す。
【図４】温暖条件下におけるヒスチジンの毒性に対する実例およびヒスチジン誘導体によるこの毒性の低減効果を示すグラフである。
【図５】過酸化水素による肝細胞の細胞損傷および種々のヒドロキサム酸を用いる該細胞損傷の保護効果を示すグラフである。
【図６】肝細胞の低温損傷に対する新規な保存溶液の抑制効果を示すグラフである。
【符号の説明】
１）はＮ４＋Ｈ２Ｏ２（２０ｍＭ／ｌ）の場合を示す。
２）はＮ４＋Ｈ２Ｏ２（２０ｍＭ／ｌ）＋４−クロル−Ｎ−メチル−ベンズヒドロキサム酸（１ｍＭ／ｌ）の場合を示す。
３）はＮ４＋Ｈ２Ｏ２（２０ｍＭ／ｌ）＋２−ヒドロキシ−３−メチル−イソカルボステリリル（１ｍＭ／ｌ）の場合を示す。
４）はＮ４＋Ｈ２Ｏ２（２０ｍＭ／ｌ）＋３，４，５−トリメトキシ−Ｎ−メチル−ベンズヒドロキサム酸（１ｍＭ／ｌ）の場合を示す。
５）はＮ４＋Ｈ２Ｏ２（２０ｍＭ／ｌ）＋３，４−ジメトキシ−Ｎ−メチル−ヒドロキサム酸（１ｍＭ／ｌ）の場合を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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