(57)【要約】【課題】自然界に存在し、生きているが培養困難な状態の微生物（ＶＢＮＣ状微生物）の蘇生技術を開発し、これを自然界からの微生物の取得に応用することにより、産業上有用な新規な微生物のスクリーニング技術を提供する。更に、ＶＢＮＣ状微生物の蘇生技術と、ゲルマイクロドロップ法及びフローサイトメトリー法を組み合わせた自然界から微生物を取得する方法を開発する。【解決手段】低温処理してＶＢＮＣ状に誘導したＥ．ｃｏｌｉ　Ｋ−１２をカタラーゼを添加して培養するとＶＢＮＣ状Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋ−１２を蘇生できることが出来た。カタラーゼ添加培養法を自然界からの微生物の取得法に応用することが出来た。更に、カタラーゼ添加培養法を、ゲルマイクロドロップ法とフローサイトメトリー法と組み合わせることにより新しい微生物の取得方法を開発した。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
自然界に存在し、生きているが培養困難な状態の微生物をカタラーゼを含む栄養培地で培養し、培養した微生物を分離することを特徴とする微生物の取得方法。
【請求項２】
カタラーゼを含む栄養培地が平板培地である請求項１記載の方法。
【請求項３】
生きているが培養困難な状態の微生物が、ゲルマイクロドロップ（ゲル微小粒子）中に包括されている微生物である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
生きているが培養困難な状態の微生物が、その一個の微生物細胞が一個のゲルマイクロドロップ中に包括された微生物である請求項３記載の方法。
【請求項５】
生きているが培養困難な状態の微生物を包含するゲルマイクロドロップから遺伝子を抽出することを特徴とする微生物遺伝子の取得方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、自然界から産業上有用な微生物又は遺伝子を取得するためのスクリーニング技術に関し、更に詳細には、自然界に多く存在し、生存するが培養が困難な微生物群から培養可能な微生物又は遺伝子を効率良く取得する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
周知のように、従来より自然界から微生物を分離し、培養する方法としては、１８７６年にコッホが発明した平板培養法が知られている。この古くから知られている平板培養法は、多種多様の微生物が混在する試料を平板培地（プレート）に播き一定時間培養後プレート上に形成されたコロニーを単離する微生物の単一コロニーまたは単一細胞を分離する方法で、通常、単離した微生物（コロニー）の中から目的にかなった微生物が検索される。この平板培養法をベースとして様々な方法が開発され、それにより産業上有用な微生物が数多く分離され利用されてきた。
【０００３】
ところが、１９７０年代の後半に蛍光顕微鏡を用いる分離源中の全菌数計数法が確立され多種多様な微生物を計数する技術が開発され、一方で、自然界の分離源中の微生物に起因する生物活性を蛍光色素染色法で検出する技術が開発され、これらの技術開発によって、従来の平板培養法では培養できない微生物が自然界に多く存在することが解明されてきた。
【０００４】
要約すると、土壌、河水、汚泥等の自然界には多種多様な微生物が存在するが、その中には通常の栄養培地で培養可能な微生物群と生物活性を示すが培養の困難な微生物群が存在し、後者の生物活性を示すが培養困難な微生物はＶＢＮＣ状微生物（生きているが培養が困難な微生物）として知られるようになった。
【０００５】
ＶＢＮＣ状微生物に関する研究の例を挙げると、Ｃｏｌｗｅｌｌ等は、コレラ菌、赤痢菌、大腸菌等を滅菌水中に接種し静置することによって平板培養法でのコロニー形成菌数が顕著に減少することを指摘している（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｅｃｏｌ．８，３１３−３２３，１９８２）。これに対して蛍光染色法による全菌数は変化しないこと、及びコロニー形成菌数よりもはるかに多数の菌が蛋白質合成能力を有していることが確認されている（Ｋｏｇｕｒｅ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ；Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５，４１５−４２０，１９７９）。このような微生物の生理状態をＣｏｌｗｅｌｌ等はＶＢＮＣ（Ｖｉａｂｌｅ　Ｂｕｔ　Ｎｏｔ　Ｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ）と称した。
【０００６】
ＶＢＮＣ状態の微生物は、実験室的に調製できる微生物があるけれども自然界に多く存在することが示されている。例えば、Ｖ．Ｔｏｒｓｖｉｋらは、土壌中の微生物について、全菌数中に占めるコロニーを形成できる菌数は０．３％であったと報告している（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６，７８２−７８７（１９９０））。Ｍ．Ｗａｇｎｅｒらは、活性汚泥中の全菌数中、コロニーを形成できる菌数は、１ないし１５％にすぎないと報告している（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９，１５２０−１５２５（１９９３））。Ｊ．Ｔ．Ｓｔａｌｅｙらは、中性を示す湖水中の全菌数に占めるコロニーを形成できる菌数の割合は０．１ないし１％であったと報告している（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９，６６−６８（１９８５））。また、Ｒ．Ｌ．Ｆｅｒｇｕｓｏｎらは、海水中の微生物について検討し、海水中の全菌数に対するコロニー形成能を有する菌数の割合は０．００１ないし０．１％であると報告している（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２，４９−５５（１９８４））、Ｋ．Ｋｏｇｕｒｅら（Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５，４１５−４２０（１９７９）、及びＣａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｏｒｏｂｉｏｌ．２６，３１８−３２３（１９８０））。さら、Ｊ．Ｇ．Ｊｏｎｅｓは、湖水とその沈澱物について、コロニー形成能を有する菌種の全菌種に対する割合はいずれも０．２５％であったと報告している（Ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ　Ｂｉｏｌ．７，６７−９１（１９９７））。
【０００７】
ＶＢＮＣ状微生物に関する報告を更に挙げると、河川水中の大腸菌Ｏ−１５７菌の検出（小暮ら、日本細菌学雑誌、５２、６０１−６０７、１９９７及び那須ら、日本細菌学会誌、５２、５１３−５１８、１９９７）、水処理系のＶＢＮＣ微生物の存在とその正体（平石、日本微生物生態学会・日本土壌微生物学会学際合同シンポジウム要旨集、６頁、１９９８年）及び土壌のＶＢＮＣ細菌の存在とその生理状態（染谷ら、日本微生物生態学会・日本土壌微生物学学際合同シンポジウム要旨集、９頁、１９９８年）等がある。
【０００８】
上述のように、自然界には平板培養法により単離される微生物は少なく、限られたものであり、一方のＶＢＮＣ状微生物は多数存在するにもかかわらず、コロニー形成能を欠くため容易に利用することが出来ない。従って自然界には、いまだかって分離されたことのない未知の微生物種、新種の微生物の存在が想定される。
【０００９】
更に、深海などの極端な環境、またはヒト等の高等動物、昆虫、土壌原生動物もしくは海洋生物等の生物体内或いは活性汚泥等の人工的環境から、平板培養法では単離できない、したがって未だ単離されていない未知の微生物種の存在も想定される。
【００１０】
ＶＢＮＣ状微生物は培養が困難ではあるが生きている細胞であるから、その中にはＤＮＡ遺伝子が存在している。ＶＢＮＣ状微生物のＤＮＡ遺伝子の中には、未だ知られていない機能を有する未知の遺伝子が存在すると想定される。
【００１１】
従って、ＶＢＮＣ状微生物から取得される微生物やＤＮＡ遺伝子は新規である可能性が高いものと期待できる。新規で有用な微生物又はＤＮＡ遺伝子の必要性は、食品産業、医薬品産業、水質等の環境保全、医療等において強く望まれている。新規微生物の可能性が高いと期待されるＶＢＮＣ状微生物は自然界に圧倒的に多いにも拘わらず、ＶＢＮＣ状微生物を新たな微生物資源として利用するのは容易なことではない。培地の成分や組成、温度、ｐＨ、浸透圧等の物理的条件を種々変えて平板培養法を繰り返し行なわざるをえないのが現状である。また、ＶＢＮＣ状微生物のＤＮＡ遺伝子を取得する方法は知られていない。
【００１２】
ＶＢＮＣ状微生物を新たな微生物資源として効率良く利用するためには、自然界に存在する通常の微生物とＶＢＮＣ状微生物が混在する微生物資源からＶＢＮＣ状微生物のみを分離する技術及び分離したＶＢＮＣ状微生物を、培養が可能な状態或いは平板培養でコロニーを形成する状態にする技術、換言すれば、仮死状態にあるＶＢＮＣ状微生物を通常の微生物に蘇生させる技術が必要であり、特にＶＢＮＣ状微生物を通常の微生物に蘇生させる技術の開発が必要である。
【００１３】
このうち、通常の微生物とＶＢＮＣ状微生物が混在する微生物資源からＶＢＮＣ状微生物のみを分離する方法を本発明者らはすでに開発し、この技術が活性汚泥から新規微生物を取得する方法として有効であることを示した（特開２０００−１９７４７９号公報参照）。この公報記載の微生物分離方法は、平板培養法ではなく、ゲルマイクロドロップ（ｇｅｌ　ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅｔ）法と称する微生物細胞をアガロースゲル微小粒子（ゲルマイクロドロップ）に包括する方法とゲルマイクロドロップをその物理的又は化学的差異をパラメーターとして分離するフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）法を用いた微生物の新規分離方法で、その概要は以下の通りである。
【００１４】
特開２０００−１９７４７９号公報記載の方法；
（１）ゲルマイクロドロップ法：試料液中の微生物細胞をアガロースゲルマイクロドロップ中に包括させ，一個のゲルマイクロドロップが一個の微生物細胞を有するアガロースゲルマイクロドロップ集団を得る。
（２）上記アガロースゲルマイクロドロップ集団を通常の微生物が増殖できるような増殖環境下におく（通常の微生物はゲル内で増殖しゲルは複数の細胞を含む、一方、ＶＢＮＣ化微生物は増殖しないのでゲル内の細胞は１個のままである）。
（３）フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）法：
上記増殖環境におかれたアガロースゲル微小粒子集団から、フローサイトメトリー法により一個の微生物細胞を有するアガロースゲル微小粒子（ＶＢＮＣ化微生物）をセルソーターにより識別して分離する。
【００１５】
特開２０００−１９７４７９号公報記載のゲルマイクロドロップ法とフローサイトメトリー法を用いた微生物の新規分離方法ではＶＢＮＣ状の単一細胞を分離できるが、分離した単一細胞は依然ＶＢＮＣ状微生物であり通常の培地では培養できない。したがって、その培養条件を検討し、培養できるようにする技術、換言すればＶＢＮＣ状微生物の蘇生技術が必要がある。更に、この技術は活性汚泥から新規微生物を取得する方法として有効であるが、侠雑物を多く含む土壌等を直接ゲルマイクロドロップすることは困難であるため、この技術を土壌等に応用するためには何らかの工夫が必要である。
【００１６】
ＶＢＮＣ状微生物の蘇生技術に関する従来の技術は少ない。天児ら（ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉａｌ，Ｌｅｔｔ．１３６，１８９−１９１，１９９６）は、実験室的にＶＢＮＣ状態に誘導したＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ　ＴＳＩ−４株に熱ショック（４５℃、１分）をかけることにより平板培養法でのコロニー形成能が復帰することを報告している。しかしながら、自然界に存在する多種多用なＶＢＮＣ状微生物を蘇生する技術に付いては知られていない。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
この発明の主要課題はＶＢＮＣ状微生物の蘇生技術を開発し、これを自然界からの微生物の取得に応用することにより、産業上有用な新規な微生物のスクリーニング技術を提供しようとするものである。また、すでに開発したゲルマイクロドロップ法とフローサイトメトリー法を土壌からのＶＢＮＣ状微生物の取得に応用する技術を開発し、これをＶＢＮＣ状微生物の蘇生技術と組み合わせ土壌からの微生物の取得の効率を上げることも主要課題である。更に、次の課題は、ＶＢＮＣ状微生物から産業上有用な遺伝子を取得する技術を提供することにも存する。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明の課題についての研究において、ＶＢＮＣ状微生物の蘇生技術を種々検討した。まず最初にＥ．ｃｏｌｉ　Ｋ−１２を栄養培地で培養し、４８時間培養後の菌体を１２０時間低温に晒してＶＢＮＣ状に誘導した。このＶＢＮＣ状に誘導したＥ．ｃｏｌｉ　Ｋ−１２を使用して、熱処理、低温処理、浸透圧処理、抗生物質等の薬剤処理など、種々の条件について検討した。その結果、低温処理してＶＢＮＣ状に誘導したＥ．ｃｏｌｉ　Ｋ−１２をカタラーゼを添加した培地で培養すると蘇生率が５〜１０倍に向上することを見出した。更に、このカタラーゼ添加培養法を、土壌からの微生物の分離に応用したところ、プレート上のコロニー数が７２％向上すること、プレートから分離した菌株は通常の培地で繰り返し培養することがでること、即ちカタラーゼ添加培養法はＶＢＮＣ状微生物を蘇生させる効果があること、を見出し最初の主要課題を解決することが出来た。
【００１９】
次に、ゲルマイクロドロップ法とフローサイトメトリー法を土壌からのＶＢＮＣ状微生物の取得に応用する方法について研究を行なった。その結果、土壌試料をホモジナイズした後、試料中に含まれるゲルマイクロドロップ化を阻害する侠雑物を遠心分離及び膜処理で除去すると土壌中の微生物をゲルマイクロドロップ化出来ること、ゲルマイクロドロップ化した微生物を通常の栄養培地で培養しゲルマイクロドロップに包括したＶＢＮＣ状微生物をフローサイトメトリー法で分離した後カタラーゼ添加して培養するとプレート上のコロニー数が３〜１４倍向上すること、更に、このようしてプレートから分離した菌株は、１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の塩基配列の解析から、新規微生物である可能性が高いこと、を夫々見出し、当該課題を達成できた。
【００２０】
最後に、ＶＢＮＣ状微生物からＤＮＡ遺伝子を取得する方法を検討した。その結果、土壌試料から侠雑物を除去後、ゲルマイクロドロップ化し、フローサイトメトリー法で分離したＶＢＮＣ状微生物を包括するゲルマイクロドロップからＤＮＡ遺伝子を抽出出来ること、ＶＢＮＣ状微生物からＤＮＡ遺伝子を取得することが出来ることを見出した。抽出ＤＮＡを鋳型として１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のユニバーサルプライマーを用いＰＣＲ反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ：複製連鎖反応）を行なったところ、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅産物が確認され、本方法で取得したＤＮＡ遺伝子がＤＮＡ資源として利用できることが示された。
【００２１】
上述したように、本発明は、自然界に存在し、生きているが培養困難な状態の微生物をカタラーゼを含む栄養培地で培養し、培養した微生物を分離することを特徴とする微生物の取得方法に存する。更に、本発明は、好ましい形態として、土壌中の微生物をゲルマイクロドロップ化しこれを通常の栄養培地で培養した後、ＶＢＮＣ状微生物を包括したゲルマイクロドロップをフローサイトメトリー法で分離し、カタラーゼを含む培地で培養することを特徴とする微生物の取得方法に存する。更に、土壌試料から調製したＶＢＮＣ状微生物を包括したゲルマイクロドロップから遺伝子を抽出することを特徴とする遺伝子の取得方法にも存する。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について具体的に説明する。微生物の分離はカタラーゼ添加した平板培養法による好ましい代表例を示して、これを中心に説明するが、本発明の好ましい代表例として説明するものであり、本発明がこの代表例に限定されることはない。
【００２３】
本発明でいう自然界とは土壌、泥、湖水、河水、沼水、植物および動物等の温和な環境、或いは深海、深地下、高温多湿地、極寒地、火山地、強酸性地、強アルカリ性地、高塩地、乾燥地および腐敗などにより少数の微生物種が大量に存在する天然環境等の極端な環境を意味する。又、病院、食品工場における空気および活性汚泥、風味付け汁、果汁等の食品加工産業原料、更に金属表面等の人工的環境も自然界に含める。
【００２４】
本発明で使用する栄養培地は、通常の微生物分離法で使用される栄養培地であり、温和な環境から採取された試料については完全培地が使用される。具体的に培地について例示すれば、ＮＵＴＲＩＥＮＴ　ＢＲＯＴＨ　（ＤＩＦＣＯ社），ＬＢ−ＢＲＯＴＨ（Ｌｕｒｉａ−Ｂａｒｔａｎｉ−ｂｒｏｔｈ：カゼイン加水分解物　１．０％，酵母エキス　０．５％，食塩　１．０％，Ｄｉｆｃｏ社），ＴＯＲＹＰＴＩＣ　ＳＯＹ　ＢＲＯＴＨ　（ＤＩＦＣＯ社）、ＹＧ培地（グルコース　０．１％，酵母エキス０．１％，Ｋ２ＨＰＯ４　０．０３％，ＫＨ２ＰＯ４０．０２％，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．０２％、ｐＨ６．８）等が使用される。特定の微生物群、例えば乳酸菌の分離を目指す場合にはＧＹＰ−Ｓ培地（グルコース１％、酵母エキス１．０％、ペプトン０．５％、酢酸ナトリウム０．２％、Ｔｗｅｅｎ８００．５％、塩溶液０．５％、ｐＨ６．８）、酵母、酢酸菌、乳酸菌等の場合にはＧＹＭＰ培地（グルコース１％、酵母エキス０．５％、麦芽エキス０．３％、ペプトン０．５％、ｐＨ６．０）等がある。しかしながら、極端な環境から採取した試料の場合には、採取した試料の存在する環境を考慮し、その環境にあった培地を使用することが望ましい。例えば活性汚泥から採取した試料の場合には活性汚泥を培地の構成成分とした加えたり、海洋微生物を分離する際には、海水又は人工海水を培地成分として使用する等、培地についての配慮が必要である。
【００２５】
通常、自然界から微生物を分離するには、土壌等の特定の分離源から試料を採取し、採取した試料を段階的に希釈後、平板培地（プレート）に塗抹し、一定時間平板培養後、プレート上に形成されるコロニー（菌叢）を分取する方法、或いは一旦液体培地で集積培養（Ｅｎｒｉｃｈ　ｃｕｌｔｕｒｅ）を行なった後、平板培養法で分離する方法が行なわれる。この際、微生物の培養も当然のことながら分離源の環境を考慮した培養条件で培養される。例えば温泉から採取した試料の場合には高温で培養することが望ましい。
【００２６】
本発明の、自然界に存在し、生きているが培養困難な状態の微生物とは、、上記の方法では培養が困難な微生物群をいい、自然界に存在し生きているが培養困難な状態の微生物を以下ＶＢＮＣ状微生物と称する。
【００２７】
本発明で使用するカタラーゼはその起源を問わず、微生物起源のカタラーゼ、動物起源のカタラーゼ何れの起源のものでも使用されるが、微生物起源のカタラーゼが好ましい。例えば黒麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）の生産するカタラーゼ等を挙げることが出来る。本発明の実施例ではＳｉｇｍａ社の商品カタログに記載された黒麹菌のカタラーゼ（カタログの商品番号：Ｃ３５１５）を使用した。
【００２８】
栄養培地へのカタラーゼの添加量は２００〜６００単位／ｄｌ、平板培地の場合では１プレート当たり１００単位（１００ｕｎｉｔ／ｐｌａｔｅ）以上が望ましく、更に望ましくは２０００ｕｎｉｔ／ｐｌａｔｅ以上である。
【００２９】
カタラーゼを添加した液体培地又は平板培地で、ＶＢＮＣ状微生物を培養するとＶＢＮＣ状微生物が増殖し、平板培養の場合には、コロニーの出現数が増大することでＶＢＮＣ状微生物の増殖が確認される。カタラーゼの添加効果を人工的に誘導したＥ．ｃｏｌｉ　Ｋ−１２株で調べると蘇生率が５〜１０倍に向上する。
【００３０】
土壌から採取した試料をカタラーゼを添加した平板培地で培養するとカタラーゼ無添加に比べて、プレート上のコロニーの出現数が７２％程度向上する。プレート上のコロニーを分離し、分離した微生物をカタラーゼを含まない培地で培養するといずれの微生物も、繰り返し培養が出来ることから、ＶＢＮＣ状微生物が蘇生していることが示される。
【００３１】
プレートから分離した菌株は、１６ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡ遺伝子の塩基配列の解析を行なったところ、データーベース上における既知微生物との相同性が９７％以下を示す新規微生物である可能性が高い微生物が多く採取できることが確認された。
【００３２】
本発明のカタラーゼ添加培養法において採取される微生物はその分類学的位置に拘わることなく、また既知であるか未知（新種）であるかを問わずすべての微生物種が含まれる。例えば、真正細菌（細菌、放線菌等）、古細菌（好塩菌、高温好酸菌、メタン生成菌等）、真核生物（真菌、藻類、原生動物等）およびウイルス（ファージを含む）等である。
【００３３】
自然界から採取した試料にはＶＢＮＣ状微生物のほかに通常の培地で生育する微生物が含まれている。カタラーゼ添加培養の前にＶＢＮＣ状微生物と通常の微生物を分離し、分離したＶＢＮＣ状微生物をカタラーゼ添加培養法で培養することによって新規微生物を採取する確率を高めることが出来る。
【００３４】
ＶＢＮＣ状微生物と通常の微生物の分離は、既述した特開２０００−１９７４７９号公報記載のゲルマイクロドロップ法とフローサイトメトリー法を土壌試料等に応用することで達成できる。土壌等侠雑物を多く含む試料の場合には、ゲルマイクロドロップ化する前に前処理を行い侠雑物を除去する。以下、土壌を例に前処理法を説明する。
【００３５】
土壌試料を一定量採取し、純水に懸濁してホモゲナイズして微粒子化する。これを遠心分離して侠雑物（比較的大きなサイズの微粒子）を除去する。この際微生物を沈降させない程度の緩やかな条件（例えば１０００ｒｐｍ、１０分）で行なう。次に、４０μｍ程度のナイロンメッシュ及び５〜１０μｍの膜を用いて順次濾過して侠雑物を除去する。得られた濾過液を段階的に希釈し、希釈液中の菌数が１×１０７／ｍｌになる程度に希釈するのが好ましい。
【００３６】
上記の希釈液を試料溶液として微生物細胞ゲルマイクロドロップ化（ゲル微小粒子中に包括せしめる）する。ゲルマイクロドロップ化すると、通常は、一個のゲルマイクロドロップが一個又は複数の微生物細胞を包括したゲルマイクロドロップの集団が得られるが、本発明においては、一個のゲルマイクロドロップが一個の微生物細胞を包括するゲルマイクロドロップの集団が多いほど好ましく、一個の微生物細胞を包括するゲルマイクロドロップのみを作製することがより好ましい。そのようなゲルマイクロドロップの集団は以下の方法により得ることができる。
【００３７】
ゲルマイクロドロップを作製するために使用するゲルはゲル化する性質を有し微生物細胞に害を与えないものであれば種類を問わず使用できるが、その中でもアガロースを使用するのが好ましい。使用するアガロースについては、ゲル化温度が低いものが望ましく、例示すれば、Ｓｉｇｍａ社のＴｙｐｅ　ＶＩＩ　（Ｌｏｗ　Ｇｅｌｌｉｎｇ　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）、ＴｙｐｅＩＸ−Ａ（Ｇｅｌｐｏｉｎｔ　≦１７，Ｓｉｇｍａ）等が好ましい。高い温度でしか溶解しないアガロースを使用すると、以下の工程において試料中の微生物を死滅させるおそれがある。
【００３８】
アガロースゲルマイクロドロップを作製するには、先ず、上記試料溶液とアガロース溶液とを、アガロースのゲル化温度より高い温度下にて、混合する。溶液中アガロースの濃度は、使用するアガロース、特にそのゲル化温度と、分離する微生物等に依存しているが、通常２％前後が好ましい。
【００３９】
次に上記試料／アガロース混合液を乳化する。乳化は、どのような方法でもよく、例えば、内圧式超小型膜乳化モジュール（例えばＳＰＧテクノ株式会社製）を用いて行うことができる。
【００４０】
内圧式乳化モジュールによる乳化は次のようにして行う。アガロースがゲル化しない温度に予め調整した油分（例えばミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ社のＬｉｇｈｔ　Ｗｈｉｔｅ　Ｏｉｌ等））を入れた容器を適当な微細孔を有する膜にて二室に分割し、一方の部屋は加圧できるようにし、他方の部屋（加圧されていない）は攪拌できるようにする。アガロースがゲル化しない温度にした試料／アガロース混合液を加圧室に滴下し加圧すると、加圧室から非加圧室に膜の微細孔を通って液が通過し、攪拌されている非加圧室にて乳化液が生成される。
【００４１】
得られた乳化液をアガロースのゲル化温度以下に冷却するとアガロースゲルマイクロドロップが形成される。必要により、アガロースゲルマイクロドロップを例えば７０ミクロンナイロンメッシュに通し大きな粒子を除くことが望ましい。
【００４２】
このような方法により、集団中の大部分のアガロースゲルマイクロドロップが一個の微生物細胞しか有しないアガロースゲルマイクロドロップ集団が得られる。
【００４３】
上記微生物細胞を包み込んでいるアガロースゲルマイクロドロップ集団を、通常の栄養培地を使用し液体培養法で培養する。即ち、通常の微生物が増殖できるような増殖環境下におく。この処理により、通常の微生物はアガロースゲルマイクロドロップ中においても増殖してアガロースゲルマイクロドロップ中に複数の細胞が存在するようになる。一方、ＶＢＮＣ状微生物は、アガロースゲルマイクロドロップ中においても増殖することが困難なため、多くはアガロースゲルマイクロドロップ中の細胞数は、増殖前の一個に止まっている。
【００４４】
上記アガロースゲルマイクロドロップの培養は、通常完全培地を使用する等大多数の微生物にとって望ましい環境で行なわれる。しかし、古生物や極端な環境から採取された試料を取り扱う場合には、古生物やその試料中に含まれていることが予想される微生物にとって望ましいと考えられる環境を配慮する必要がある。さもなければ通常の微生物が殆ど全部が単細胞のままゲル中に止まることになるか、あるいはＶＢＮＣ状微生物が死滅するおそれさえもある。もちろん上記増殖環境は、すべての微生物種が増殖するような環境である必要はなく（そのような環境を整えることもできないが）、要するにある通常の微生物が増殖できる環境下に置いて、通常の微生物とＶＢＮＣ状微生物を区別できればよい。
【００４５】
このような、一個の微生物細胞を有するアガロースゲルマイクロドロップの、それ以外のアガロースゲルマイクロドロップからの識別は、セルソーターによって行なうことが出来る。セルソーターを使用して、上記増殖環境下においた後も一個の微生物細胞しか含まないアガロースゲルマイクロドロップを識別し分離すれば、ＶＢＮＣ状微生物種の単一細胞を高い確率で得ることができる。
【００４６】
セルソーター（Ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ａｎｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ，ＦＣ／ＣＳ）は、ここでは１５ｍＷの空冷アルゴンイオンレーザーを搭載したＥＰＩＣＳ　ＥＬＩＴＥ　ＥＳＰ（Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を使用したが、同様な機能を有するものであればどのようなものでもよい。ここでは、フローセルのノズル部分は直径１００μｍのものを使用し、サンプルは分離操作に入る前に孔径４０μｍのセルストライナーを用いて不要な凝集塊を除いた。しかしこの前処理は、必要により行えばよい。
【００４７】
アガロースゲルマイクロドロップに包括された微生物（粒子）の分別・識別は、大きさを表すレーザー光の前方散乱光強度（Ｆｏｒｗａｒｄ　ｓｃａｔｔｅｒ（ＦＳ））、粒子の内部構造の複雑性を表すレーザー光の側方散乱光強度（Ｓｉｄｅ　Ｓｃａｔｔｅｒ（ＳＳ））、および微生物が特定の蛍光染料により染色されることにより生ずる蛍光強度（ＦＬ）の三個のパラメーターの内、二個（二次元）または三個（三次元）の組み合わせにより行うことが出来る。
【００４８】
すなわち、一個しか微生物細胞を含まないアガロースゲルマイクロドロップと複数個の微生物細胞を含むアガロースゲルマイクロドロップとは、ＦＳとＳＳとを用いて識別することができる。また、必要があれば、生きている細胞と死滅した細胞とは、例えばＣＦＤＡ（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ　ｅｓｔｅｒ）やＣＦＤＡ―ＡＭ（ｃａｒｂｏｘｙｆｕｏｒｅｓｃｅｉｎｄｉａｃｅｔａｔｅ　ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ　ｅｓｔｅｒ）等の生菌を死滅させることなく蛍光染色できる色素を用いて識別（ＦＬシグナル）することができる。
【００４９】
ＦＳシグナルは、２°ないし２０°の散乱光をフォトダイオードで検出し、ＳＳおよびＦＬシグナルはレーザー光に対して９０°で集光し、４８８ｎｍ二色長経路フィルター（ｄｉｃｈｒｏｉｃ　ｌｏｎｇ−ｐａｓｓ　ｆｉｌｔｅｒ）によってスプリットした光をフォトマルチプライヤーチューブで検出出来る。又４８８ｎｍレーザーブロックフィルター（ｌａｓｅｒ　ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｆｉｌｔｅｒ）を用いることによって、自家蛍光から散乱光フラクションを除くことが望ましい。
【００５０】
蛍光は５５０ｎｍ二色長経路フィルターで分離し、５２５ｎｍパスフィルター（ｐａｓｓ　ｆｉｌｔｅｒ）を通過したものをＦＬ１シグナル（５２０―５３０ｎｍ）として測定し、６００ｎｍ二色長経路フィルターおよび５７５バンドパスフィルター（ｂａｎｄ　ｐａｓｓ　ｆｉｌｔｅｒ）を通過したものをＦＬ２（５７０―５８０ｎｍ）として測定し、６７５ｎｍバンドパスフィルターを通過したものをＦＬ３（６６５―６８５ｎｍ）として測定する方法が採用される。
【００５１】
かくしてＶＢＮＣ状微生物の単一細胞をアガロースゲルマイクロドロップの形で単離することが出来る。単離したゲルマイクロドロップ化したＶＢＮＣ状微生物を、カタラーゼを含む平板培養法で培養し、プレート上に生育したコロニーを分離することで、ＶＢＮＣ状微生物を微生物資源として新規であることの確率の高い微生物を取得することが出来る。
【００５２】
【実施例】
本発明を以下の実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５３】
（実施例１）
まず、ＶＢＮＣ状微生物を実験室的に多量取得するために、モデル微生物としてＥ．ｃｏｌｉ　Ｋ−１２株を選択した。Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋ−１２株をＬＢ−ＢＲＯＴＨ（Ｄｉｆｃｏ）を用いて培養し、その生理時期がＶＢＮＣ化に及ぼす影響を調べるために、培養開始後３時間目の対数増殖期中期の菌体（６００ｎｍにおける濁度、０．６１）、８時間目の転換期の菌体（６００ｎｍにおける濁度、１．７４）、及び４８時間目の定常期の菌体（６００ｎｍにおける濁度、１．６４）を夫々遠心分離により集菌した。次に、リン酸緩衝液（ｐＨ　７．０）で２回洗浄した後、同量のリン酸緩衝液（ｐＨ　７．０）に懸濁し、４℃に静置した。静置開始後、経時的に全菌数（Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ｃｅｌｌ）とコロニー形成菌数（ｃｏｌｏｎｙ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔｓ）を測定した。
【００５４】
全菌数の測定は、ＶｉａＧｒａｍ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｒａｍ　Ｓｔａｉｎ　ａｎｄ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）を使用した。コロニー形成菌数の測定はＬＢ−ＢＲＯＴＨ（ＤＩＦＣＯ）寒天培地を用いて実施した。その結果、培養開始後３時間目の菌体や８時間目の菌体では、４℃に静置後１２０日目でもＶＢＮＣ状態には不十分であったが、４８時間目の菌体では、４℃に静置後６６日間で約９９％、１３０日目で完全なＶＢＮＣ状態になることが確認された。
【００５５】
次に、ＶＢＮＣ状態にしたＥ．ｃｏｌｉ　Ｋ−１２菌体を使用して蘇生条件の検討（コロニー形成能の復活検討）を行なった。Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋ−１２をＶＢＮＣ状態に誘導するために３７℃で４８時間培養した後、４℃の低温下６６日間静置反応を行い、ＶＢＮＣ化が進行した状態の菌体を調製した。この菌体を使用し、培地にはＬＢ−ＢＲＯＴＨ（ＤＩＦＣＯ）寒天培地を使用して、種々の蘇生条件の実験を実施した。その結果、表１に示すようにカタラーゼの添加培養法によってのみコロニー形成菌数の増大が見出された。
【００５６】
【表１】
2004089106.tif 000002
【００５７】
（実施例２）
次にカタラーゼの濃度とＶＢＮＣ状Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋ−１２の蘇生効果の関係を調べた。その結果を表２に示す。
【００５８】
【表２】
2004089106.tif 000003
【００５９】
表２に示すように、カタラーゼ添加によるＶＢＮＣ状Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋ−１２の蘇生効果は、ＬＢ−ＢＲＯＴＨ（ＤＩＦＣＯ）寒天培地でプレート当たり２００ｕｎｉｔ／ｐｌａｔｅ以上、好ましくは２０００ｕｎｉｔ／ｐｌａｔｅ以上のカタラーゼ添加により、顕著な蘇生効果が見出された。
【００６０】
（実施例３）
次に、人工的に誘導したＶＢＮＣ状Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋ−１２の蘇生に対するカタラーゼの添加効果を、自然分離源の例として、ＶＢＮＣ状微生物が多いことが知られている土壌からの分離に応用した。作物土壌から２種類のサンプルを採取し（サンプルＡ，サンプルＢと称する）、サンプルＡ及びサンプルＢを夫々希釈した後、カタラーゼを２，０００ｕｎｉｔｓ／ｐｌａｔｅ添加した１／２ＹＧ寒天培地に希釈液を塗抹した。２５℃で平板培養し、１週間後及び２週間後にプレート上に形成したコロニー数をカウントした。その結果を表３に示す。表３のように、Ａ，Ｂサンプル共にカタラーゼの添加によってコロニー形成菌数が増大し、新らたなコロニー形成菌の出現が認めれた。
【００６１】
【表３】
2004089106.tif 000004
【００６２】
次に、サンプルＡからカタラーゼ添加法で取得した微生物２０株と、カタラーゼ無添加法で取得した微生物１０株を選択し、選択した微生物について新規性を調べた。選択した微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の解析を行い、データーベース上での相同性が９７％以下を示す微生物を新規性有りと判定した。その結果を表４に示す。
【００６３】
【表４】
2004089106.tif 000005
【００６４】
表４に示すように、培地へのカタラーゼ添加により新規微生物の取得率が向上することが認められた。
【００６５】
さらに、作物土壌サンプルＡからカタラーゼ添加法で取得した新規性を有する微生物の中で、代表的な２株（ＣＦＣ２−６、ＣＦＣ２−１３株）について系統学的解析を行なった。ＣＦＣ２−６の系統学的解析結果を図１に、ＣＦＣ２−１３株の系統学的解結果を図２に示す。ＣＦＣ２−６、ＣＦＣ２−１３株共に系統樹上で新規なポジションに位置づけられ、系統樹における解析では新規な微生物であることが示された。
【００６６】
（実施例４）
次に、カタラーゼ添加法と、ゲルマイクロドロップ法及びフローサイトメトリー法を組み合わせた土壌資料からの微生物の取得法を検討した。相模原市東京農大圃場の畑作物土壌２ｇ（生土）を採取し、滅菌水１８ｍｌを添加し、ポリトロンでホモジナイズ（１５，００ｒｐｍ×１０分）した。次に遠心分離（１，０００ｒｐｍ×１０分）して未分解有機物等の侠雑物を沈降・除去した。得られた上清を４０μｍのナイロンメッシュで濾過して侠雑物を除去し、滅菌水で希釈後、処理試料を更に５μｍのメンブレンで濾過して濾過液を調製した。
【００６７】
得られた濾過液を細胞数が１ｘ１０７／ｍｌとなるように顕微鏡下で観察しながらリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した。一方、Ｓｉｇｍａ社製アガロースＴｙｐｅＩＸ−Ａ（Ｇｅｌ　ｐｏｉｎｔ　≦１７度）の２％水溶液を電子レンジにて３０秒間処理し、溶解させて３０℃に保温してアガロース溶液を調製した。
【００６８】
上記微生物含有希釈液１ｍｌと上記アガロース溶液１ｍｌとを混合し、３０℃にてボルテックスミキサーを用いてよく攪拌・混合した。次にミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ社、Ｌｉｇｈｔ　ｗｈｉｔｅ　ｏｉｌ）を満たしたＳＰＧ膜（膜乳化モジュール、ＳＰＧテクノ社）中に上記混合液をシリンジを用いて加圧下に同じミネラルオイル中に押し出して乳化させた。得られた乳化物を氷冷下に５分おきアガロースをゲル化させゲルマイクロドロップを得た。これにＰＢＳを加えて遠心場にて二回過剰してミネラルオイルを洗い落とし、更にこれを７０μｍのストレーナーに通した。
【００６９】
ストレーナーを通過したゲルマイクロドロップ画分を１／１０ＹＧ液体培地で、２５℃、４８時間通気・攪拌（１５０ｒｐｍ）培養した（増殖環境下に置いた）。培養終了後のゲルマイクロドロップはＴｒｉｃｏｎＸ−１００水溶液（最終濃度　０．０５％）中でよく攪拌し、３０μｍナイロンメッシュで濾過し、生理食塩水で十分に洗浄し、次にＣＦＤＡにより蛍光染色した。ＣＦＤＡ染色後、アガロースゲル微小粒子を含む試料を、孔径４０μｍのセルストレイナーに通して凝集塊を除いた後、セルソーターにチャージした。
【００７０】
セルソーターとして、１５ｍＷの空冷アルゴンイオンレーザーを搭載したＥＰＩＣＳ　ＥＬＩＴＥ　ＥＳＰ（Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を用いた（フローセルのノズル部分は直径１００μｍであった）。ＦＳシグナルとして２°ないし２０°の散乱光をフォトダイオードを用いて検出した。ＦＬシグナルはレーザー光に対して９０°で集光し、４８８ｎｍ二色長経路フィルターによってスプリットした５１７ｎｍの光をフォトマルチプライヤーチューブで検出した。また、４８８ｎｍレーザーブロックフィルターを用いて自家蛍光から散乱光部分を除いた。
【００７１】
セルソーターを操作して、セルソーターサイトグラムでＦＬシグナルの大きい集団と小さい集団に分離した。顕微鏡観察したところＦＬシグナルの小さい集団のアガロースゲルドロップは、一つのアガロースゲルドロップ中に一個の細胞が存在していることが観察された。この一つの細胞を含むアガロースゲル微小粒子中の細胞は、ＣＦＤＡ染色により生きている細胞であることがわかった。一方、ＦＬシグナルの大きい集団は、顕微鏡観察の結果１つのアガロースゲルドロップ中に複数の細胞を含んでいた。
【００７２】
このように、フローサイトメトリー解析とソーティングを行い、ゲルマイクロドロップ内でコロニーを形成したゲルマイクロドロップをフローサイトメーターにより除去し、残りのＧＭＤを取得した。
【００７３】
この取得したゲルマイクロドロップをカタラーゼ（２０００ｕｎｉｔｓ／ｐｌａｔｅ）を添加した１／２ＹＧ寒天培地及び１／１０ＹＧ寒天培地にプレートに対して夫々３，６００個ずつ塗抹し、２５℃で２週間培養後、プレート上に生育したコロニー数を計測した。その結果、表５に示すようにいずれの培地においてもカタラーゼを添加した場合、カタラーゼ無添加の対照区と比較して、コロニー形成数の顕著な増加が認められた。
【００７４】
【表５】
2004089106.tif 000006
【００７５】
（実施例５）
実施例４に記載した方法でＶＢＮＣ状微生物を包括したアガロースゲルマイクロドロップを調整した。調製したアガロースゲルマイクロドロップ溶液を４，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離にかけ、上清を除去後、重量が２００ｍｇになるように滅菌した超純水を加えた。７０℃で１０分間インキュベートした後、ＱＩＡａｍｐＤＮＡ　Ｓｔｏｏｌ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、ＤＮＡの抽出を行なった。
【００７６】
抽出したＤＮＡが新しい遺伝子資源として利用可能であるかどうかを判断し、かつ、この方法が新しい遺伝子資源を取得できる方法として有効であるかを判断するために、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のユニバーサルプライマーとして（５′−ＧＴＧＣＣＡＧＣＭＧＣＣＧＣＧＧ（ｂｐ５１５−５３０　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅ．ｃｏｌｉ　１６　ＳｒＲＮＡＧｅｎｅ），５′−ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３′（ｂｐ　１４９２−１５１０　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅ．ｃｏｌｉ　１６　ＳｒＲＮＡ　ｇｅｎｅ），ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を用い、抽出ＤＮＡを鋳型としてｉｎ　ｖｉｔｒｏでのＤＮＡ複製法であるＰＣＲ反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｔｉｏｎ：複製連鎖反応）を行なった（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ　ａｌ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３−５４６７，１９７７）。その結果、図３に示すように１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅産物が確認された。このことは、本発明の方法がＶＢＮＣ状微生物を新しいＤＮＡ遺伝子資源として利用できることを示すものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】カタラーゼ添加培養法で分離したＣＦＣ２−６株及びその近縁微生物の発生系統樹を示す図である。縦棒は各微生物種の系統樹上の位置関係を示す。横棒は、各微生物種間の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列の相同性を示す。目盛り（０．０５）は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の相同性について１００個の塩基中５個が相違した時の横棒の長さ（１．２ｃｍ）を示す。例えば数字［１００］は、相同性が同一とでた計算結果が１００回の内、１００回でたことを示す。
【図２】カタラーゼ添加培養法で分離したＣＦＣ２−１３株及びその近縁微生物の発生系統樹を示す図である。図面の内容は図１と同じである。
【図３】アガロースゲルマイクロドロップ化したＶＢＮＣ状微生物から抽出したＤＮＡを鋳型とした１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ反応の増幅産物を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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