(57)【要約】【課題】タンパク質の効率的かつ安全な製造方法を提供する。【解決手段】（ａ）目的タンパク質、（ｂ）プロテアーゼ切断部位、並びに（ｃ）細胞膜及び／又は細胞壁アンカータンパク質若しくはその一部を含む融合タンパク質を細胞表層にアンカリングした状態で発現させた酵母を該プロテアーゼ切断部位に特異的なプロテアーゼで処理する工程を含む目的タンパク質の製造方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）目的タンパク質、（ｂ）プロテアーゼ切断部位、並びに（ｃ）細胞膜及び／又は細胞壁アンカータンパク質若しくはその一部を含む融合タンパク質を細胞表層にアンカリングした状態で発現させた酵母を該プロテアーゼ切断部位に特異的なプロテアーゼで処理する工程を含む目的タンパク質の製造方法。
【請求項２】
目的タンパク質の製造方法であって、下記の工程：
（１）（ａ）目的タンパク質、（ｂ）プロテアーゼ切断部位、並びに（ｃ）細胞膜及び／又は細胞壁アンカータンパク質若しくはその一部を含むから構成される融合タンパク質を酵母の細胞表層にアンカリングした状態で発現させる工程；
（２）上記工程（１）で得られた酵母を培養する工程；及び
（３）工程（２）の培養により得られた酵母を該プロテアーゼ切断部位に特異的なプロテアーゼで処理する工程
を含む方法。
【請求項３】
プロテアーゼがファクターＸａ，エンテロキナーゼ、及びトロンビンからなる群から選ばれる請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
細胞膜及び／又は細胞壁アンカータンパク質がａ−アグルチニン、α−アグルチニン、及びＦＬＯ１からなる群から選ばれる請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
目的タンパク質の製造に用いるための酵母であって、（ａ）該目的タンパク質、（ｂ）プロテアーゼ切断部位、並びに（ｃ）細胞膜及び／又は細胞壁アンカータンパク質若しくはその一部を含む融合タンパク質を細胞表層にアンカリングした状態で発現させた酵母。
【請求項６】
請求項５に記載の融合タンパク質を酵母細胞表層に発現させることができる遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質の製造方法に関する。目的タンパク質とプロテアーゼ切断部位とを含み酵母の細胞表層にアンカリングした融合タンパク質をプロテアーゼで処理して目的タンパク質を効率的に製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子工学技術の発達により、多くの原核生物及び真核生物のタンパク質の生産が可能となった。その生産手法としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）をはじめとする微生物に目的タンパク質をコードする遺伝子を導入し、その遺伝子産物を回収する方法が一般的である。近年、多くの効率的な遺伝子発現系が開発されているが、最も重要な問題は、目的タンパク質の単離及び精製である。例えば、細胞内に目的タンパク質を発現させる場合には、多くの場合、封入体（インクルージョンボデイー）と呼ばれる非活性凝集体として目的タンパク質が得られるため、尿素等の処理による再活性化処理（リフォールデイング）が不可欠となる。また細胞外へ分泌生産させる場合には、同時に分泌されるプロテアーゼから目的タンパク質を保護する必要があり、さらに大量の培地成分を濃縮した後、目的タンパク質を精製する工程が必要である。この様な煩雑な単離及び精製工程はタンパク質生産の実用化において問題となっている。
【０００３】
上記の問題を回避するために、目的タンパク質を特定のタンパク質やアミノ酸配列との融合タンパク質として発現させ、特定のタンパク質やアミノ酸配列に特異的な精製手段を適用して融合タンパク質を得る方法が開発されている。特定のタンパク質の例としては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が挙げられ、ＧＳＴに特異的な抗体を用いるアフィニテイークロマトグラフィーにより融合タンパク質を精製することが可能である。また、特定のアミノ酸配列の例としては、ヒスチジンの６回繰り返し配列が挙げられ、ニッケル等の金属を固定化したアフィニテイークロマトグラフィーにより融合タンパク質を精製できる。
【０００４】
さらに、これらの目的タンパク質と特定のタンパク質やアミノ酸配列との間に、プロテアーゼ認識配列を組み込み、前記の手段により融合タンパク質を精製した後、該プロテアーゼ認識配列を切断可能なプロテアーゼで処理することにより目的タンパク質を得る方法も開発されている。例えば特開昭６１−１３５５９１号公報には、ファクターＸａにより融合タンパク質から目的タンパク質を回収する方法が開示されている。また、この様な融合タンパク質発現、及びプロテアーゼ処理による目的タンパク質の単離及び精製を行うためのキットが発売されている。例えばアマシャムファルマシア社からは、ＧＳＴ融合タンパク質発現用ベクター、ＧＳＴ融合タンパク質精製用アフィニテイーゲル、ＧＳＴ融合タンパク質切断用プロテアーゼが各々キットとして発売されている。しかしながら、細胞内発現におけるリフォールデイング、細胞外発現におけるプロテアーゼからの保護、及び培地からの濃縮操作の問題は依然として残ったままである。
【０００５】
これらの問題を解決する目的で、近年、様々な微生物の細胞表層に目的タンパク質を発現させる技術が開発されている。例えば特表平７−５０２６４０号公報には、細胞壁または細胞膜タンパク質と目的タンパク質との融合タンパク質をグラム陽性菌の細胞表層に発現させる技術が開示されている。目的タンパク質は細胞壁または細胞膜タンパク質との融合タンパク質として発現されるため、目的タンパク質を発現した細胞を遠心分離処理により容易に得ることが可能である。さらに、この様にして細胞表層に融合タンパク質を発現させた微生物をプロテアーゼで処理して目的タンパク質を回収する技術も開発されている。例えば、特表２０００−５１２１２１号公報には、細胞壁または細胞膜タンパク質、プロテアーゼ認識アミノ酸配列、及び目的タンパク質から構成される融合タンパク質をグラム陽性菌細胞表層に発現させた後、プロテアーゼで処理して目的タンパク質を得る技術が開示されている。しかしながら、原核生物であるグラム陽性菌では、糖タンパク質等の翻訳後に修飾を受けるタンパク質の発現は不可能であるという問題がある。また、グラム陰性菌を用いる場合、人体への感染も苦慮する必要があるという問題も残されている。
【０００６】
そのような問題を解決するためには、発現系として酵母、植物細胞、動物細胞などの真核生物を用いる必要がある。例えば、酵母の細胞表層に目的タンパク質を細胞壁または細胞膜タンパク質との融合タンパク質として発現させる技術が報告されており、植田等はグルコアミラーゼをα−アグルチニンとの融合タンパク質として酵母表層に発現させ、デンプンを唯一の炭素源として生育させ、エタノールを生産することに成功している　（Ｕｅｄａ　ｅｔ　ａｌ，　Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　６３，　１３３２−１３３６，　１９９７）。しかしながら、これまでに酵母を含む真核生物において、細胞壁または細胞膜タンパク質と目的タンパク質との融合タンパク質を発現させ、かつプロテアーゼ処理により目的タンパク質を回収する技術は知られていなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するための手段】
本発明の課題は、目的タンパク質のリフォールデイングや培地からの濃縮工程等の煩雑な単離及び精製工程を必要とせず、簡便かつ効率的に目的タンパク質を製造する方法をすることにある。本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、目的タンパク質とプロテアーゼ切断部位とを含み、かつ酵母の細胞表層にアンカリングした融合タンパク質を調製し、この融合タンパク質をプロテアーゼで処理することにより、目的タンパク質を簡便かつ効率的に製造できることを見出した。また、本発明により、グラム陰性菌に比べて人体への感染等の懸念が少なく安全性のより高い酵母での簡便なタンパク質生産が可能であることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成された。
【０００８】
すなわち、本発明は、（ａ）目的タンパク質、（ｂ）プロテアーゼ切断部位、並びに（ｃ）細胞膜及び／又は細胞壁アンカータンパク質若しくはその一部を含む融合タンパク質を細胞表層にアンカリングした状態で発現させた酵母を該プロテアーゼ切断部位に特異的なプロテアーゼで処理する工程を含む目的タンパク質の製造方法を提供するものである。
【０００９】
また、本発明により、目的タンパク質の製造方法であって、下記の工程：
（１）（ａ）目的タンパク質、（ｂ）プロテアーゼ切断部位、並びに（ｃ）細胞膜及び／又は細胞壁アンカータンパク質若しくはその一部を含む融合タンパク質を酵母の細胞表層にアンカリングした状態で発現させる工程；
（２）上記工程（１）で得られた酵母を培養する工程；及び
（３）工程（２）の培養により得られた酵母を該プロテアーゼ切断部位に特異的なプロテアーゼで処理する工程
を含む方法が提供される。
【００１０】
これらの方法の好ましい態様によれば、プロテアーゼがファクターＸａ，エンテロキナーゼ、及びトロンビンからなる群から選ばれる上記の方法；および細胞膜及び／又は細胞壁アンカータンパク質がａ−アグルチニン、α−アグルチニン、及びＦＬＯ１からなる群から選ばれる上記の方法が提供される。
【００１１】
別の観点からは、本発明により、（ａ）目的タンパク質、（ｂ）プロテアーゼ切断部位、並びに（ｃ）細胞膜及び／又は細胞壁アンカータンパク質若しくはその一部を含む融合タンパク質を細胞表層にアンカリングした状態で発現させた酵母；目的タンパク質の製造のために用いる上記の酵母；上記の融合タンパク質をコードする遺伝子；上記の融合タンパク質を酵母細胞表層に発現させることができる遺伝子が提供される。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の方法に用いられる酵母は、（ａ）目的タンパク質、（ｂ）プロテアーゼ切断部位、並びに（ｃ）細胞膜及び／又は細胞壁アンカータンパク質若しくはその一部を含む融合タンパク質を細胞表層にアンカリングした状態で発現していることを特徴としている。上記の融合タンパク質は、一般的には、目的タンパク質をコードする遺伝子配列、プロモーター配列、分泌シグナル配列、並びに細胞膜及び／又は細胞壁アンカータンパク質をコードする配列を含む組換えベクターを酵母に導入して発現させることにより、該酵母の酵母表層にアンカリングした状態で発現させることができる。以下、この構造を有する組換えベクターについて説明するが、本発明の酵母の製造に用いることができる組換えベクターの構造は上記の特定の態様に限定されることはなく、当業者が適宜選択可能であることは言うまでもない。なお、プロテアーゼ切断部位は、目的タンパク質と細胞膜及び／又は細胞壁アンカータンパク質若しくはその一部との間に挿入する必要がある。
【００１３】
プロモーターは、酵母での発現に通常利用されるプロモーターであれば特に限定されないが、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のグリセロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のプロモター（Ｓａｗａｉ−Ｈａｔａｎａｋａ，　Ｈ．，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ，　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　５９，　１２２１−１２２８，　１９９５）、及びガラクトキナーゼ（Ｇａｌａｃｔｏｋｉｎａｓｅ）のプロモーター（ＧＡＬ１）（Ｄａｖｉｓ，　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，　４，　１４４０−１４４８，　１９８４）、キャンデイダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）のイソクエン酸リアーゼ（ＩＣＬ）のプロモーター（ＵＰＲ−ＩＣＬ）（Ｋａｎａｉ　ｅｔ　ａｌ，　Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　４４，　７５９−７６５，　１９９６）などを用いることができる。
【００１４】
分泌シグナルとしては、通常の酵母の発現及び分泌に利用されるシグナル領域、例えば、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）由来のグルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル領域や、酵母のα−ファクターのプレプロ配列（Ｗａｌｋｅｒ，　Ｇ．　Ｍ．，ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　ｐ２６５，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　Ｌｔｄ．，　Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，　１９９８）などを利用できる。これらのプロモーター及び分泌シグナルは、既知の方法、例えば既知配列を基にして作成されたプライマーを用い、前記微生物のゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲ法や、Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　５１，　６５−７０　，　１９９５やＡｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　５７，　６９７−７０１，　２００１に記載のプラスミドｐＧＡ１１及びｐＧＰＭ６を適当な制限酵素反応により切り出す方法などにより得ることができる。
【００１５】
細胞膜及び／又は細胞壁アンカータンパク質は、細胞表層に発現する融合タンパク質の機能に悪影響を与えなければいかなる種類のタンパク質であってもよい。細胞膜及び／又は細胞壁アンカータンパク質の一部を用いることもできる。例えば、細胞膜及び／又は細胞壁アンカータンパク質としてａ−アグルチニン、α−アグルチニン、ＦＬＯ１、インベルターゼなどを用いることができ、融合タンパク質の製造のために、これらをコードする遺伝子を含む組換えベクターを調製することができる。
【００１６】
例えば、アグルチニン遺伝子またはその断片は酵母から得らことができるが、好ましくはサッカロミセス属に属する酵母（例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　ＭＴ８−１株：Ｔａｊｉｍａ，　Ｍ．，　Ｙｅａｓｔ，　１，　６７−７７，　１９８５）に由来するａ−アグルチニンのＡＧＡ２配列をコードする配列が用いられる。このＡＧＡ２は、ＧＰＩアンカーを介して細胞壁に固定化されているＡＧＡ１に２つのジスルフィド結合で結合することにより細胞表層に固定化される。また、好ましくはサッカロミセス属由来のα−アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸の配列をコードする配列が用いられる。このアミノ酸配列中には４個所の糖鎖結合部位がある。グリコシルフォスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーがフォスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼ（ＰＩ−ＰＬＣ）で切断された後に、この糖鎖と細胞壁を構成するペプチドグリカンとが共有結合することにより、α−アグルチニンのＣ末端配列部分が細胞壁と結合して保持される。上記ａ−アルグチニンを用いる場合は、ＡＧＡ１配列の３’末端側に目的タンパク質の配列を融合させることが可能であり、この場合、該タンパク質のＮ末端がａ−アルグチニンに融合する。一方、上記α−アグルチニンを用いる場合には、α−アグルチニンの５’末端側に目的タンパク質配列を融合させることが可能であり、該タンパク質のＣ末端がα−アルグチニンに融合する。
【００１７】
本発明の方法に用いるプロテアーゼの種類は特に限定されないが、選択的な切断を行うために認識配列ができるだけ長く、かつ該認識配列が特異的配列であるプロテアーゼを選択することができる。好ましくは、ファクターＸａ、エンテロキナーゼ、トロンビンなどのプロテアーゼを用いることができる。例えば、ファクターＸａの認識配列としてはＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを用いることができ、エンテロキナーゼの認識配列としてはＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓを用いることができ、トロンビンの認識配列としては（疎水性アミノ酸）−（疎水性アミノ酸）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ／Ｌｙｓを用いることができる。
【００１８】
該融合タンパク質を酵母の細胞表層に発現させるためのＤＮＡはプラスミドの形態又は染色体に組み込まれた形態のいずれの形態で酵母に導入されていてもよい。ＤＮＡの取得の簡易化の点からは、大腸菌とのシャトルベクターであることが好ましい。該ＤＮＡの出発材料は、例えば、酵母の２μｍプラスミドの複製開始点（２μｍ）とＣｏｌＥ１の複製開始点（ｏｒｉ）を有することが好ましく、さらに酵母選択マーカー（例えばＴＲＰ、ＵＲＡ３等）及び大腸菌の選択マーカー（薬剤耐性遺伝子等）を有することがさらに好ましい。また、融合タンパク質を効率的に発現させるために、この遺伝子の発現を調節するオペレーター、プロモーター、ターミネーター、及びエンハンサー等のいわゆる調節配列を１種以上含んでいることが望ましい。
【００１９】
本発明の方法に用いられる酵母の種類は特に限定されず、いなかる種類の酵母を用いてもよい。例えば、サッカロミセス類、ジゾサッカロミセス属、キャンデイダ属に属する酵母などが挙げられるが、これらのうち、サッカロミセス属に属する酵母を使用することが好ましく、より好ましくはサッカロミセス・セレビシエを用いることができる。特に好ましくはサッカロミセス・セレビシエ・ＭＴ８−１株を用いることができる　（Ｔａｊｉｍａ，　Ｍ．，　Ｙｅａｓｔ，　１，　６７−７７，　１９８５）。
【００２０】
発現ベクターによる酵母の形質転換法は特に限定されず、通常用いられる方法に従って行うことができ、例えば、酢酸リチウム法、電気パルス法、又はプロトプラスト法などにより形質転換体を得ることができる。形質転換体の培養方法も公知であり、例えば「Ｍ．　Ｄ．　Ｒｏｓｅ　ｅｔ　ａｌ，”Ｍｅｔｈｏｄ　Ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”，　Ｇｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂａｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１９９０」等に記載された方法に従って培養を行うことにより、細胞表層に該融合タンパク質を発現した酵母を含む培養液を得ることができる。培養により得られた酵母は、例えば、遠心分離操作により容易に培地成分から分離することができる。また、凝集性を有する酵母を用いれば、遠心分離操作も必要とせず、自然放置するのみで酵母のみを分離することも可能である。そのような凝集性酵母の例としてはサッカロミセス・セレビシエ・ＹＦ２０７が挙げられる。さらに、このような凝集性酵母はポリウレタンフォーム等の多孔性の菌体保持粒子とともに培養することによって該粒子内に高密度に集積化することも可能であり、工業レベルでの生産に有用である。
【００２１】
単離された酵母をプロテアーゼ処理に適するバッファーに懸濁して、プロテアーゼを加えて２５−３７℃で３０分から２４時間反応させた後、酵母を遠心分離により除くことにおり、目的タンパク質を含む上清を得ることができる。上清からの目的タンパク質の分離及び精製は常法に従って各種のクロマトグラフィーなどの手段を適宜用いて行うことが可能である。プロテアーゼによる融合タンパク質の処理及び目的タンパク質の分離及び精製については、例えば特表２０００−５１２１２１号公報に記載された方法を参照することができる。なお、プロテアーゼ処理した酵母を再度培養し、得られた酵母をプロテアーゼ処理することにより目的タンパク質を再度調製することもでき、このような操作を繰り返し行うことも可能である。
【００２２】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されることはない。
実施例１：酵母表層に発現させたＧＦＰの回収
Ａ：ファクターＸａ認識配列を含むプラスミドＤＮＡの作成
配列番号１及び２に示す２つの配列の５’末端リン酸化オリゴＤＮＡをアニーリングさせて、ファクターＸａの認識配列Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを含み、かつアミノ酸Ｎ末端側が制限酵素Ｅｃｏ５２Ｉで、アミノ酸Ｃ末端側が制限酵素ＢｇｌＩＩで切断された形態となっている５’末端リン酸化２本鎖オリゴＤＮＡを調製した。プラスミドｐＩＣＳ：ＧＦＰｕｖ　（Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　５４，　９０−９６，　２０００：Ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｌｅｓｃｅｎｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｕｖ（ＧＦＰｕｖ）をα−アグルチニンのＣ末端３２０アミノ酸との融合タンパク質として細胞表層に発現させるプラスミドである）のＧＦＰｕｖをコードする遺伝子の６７４番目から６７９番目の配列ＣＴＧＣＴＧをＣＧＧＣＣＧに変異させて制限酵素Ｅｃｏ５２１配列を導入し、このプラスミドのＧＦＰとα−アグルチニンとの融合部位を制限酵素Ｅｃｏ５２Ｉ及びＢｇｌＩＩで切断したベクターに上記の２本鎖オリゴＤＮＡ　を挿入し、ＧＦＰとα−アグルチニンとの間にファクターＸａ認識配列を導入したプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡ中のファクターＸａ認識配列はシークエンスにより確認し、このプラスミドをｐＩＣＳ：ＧＦＰｕｖ（ＦａｔｏｒＸａ）と命名した。
【００２３】
Ｂ：ｐＩＣＳ：ＧＦＰｕｖ（ＦａｔｏｒＸａ）を含む酵母の調製
前記Ａにより得られたプラスミドＤＮＡ、ｐＩＣＳ：ＧＦＰｕｖ（ＦａｔｏｒＸａ）を酢酸リチウム法により酵母ＭＴ８−１に形質転換し、酵母ＭＴ８−１／ｐＩＣＳ：ＧＦＰｕｖ（ＦａｔｏｒＸａ）を調製した。得られた酵母ゲノム中にｐＩＣＳ：ＧＦＰｕｖ（ＦａｔｏｒＸａ）由来の配列が組み込まれていることを配列番号３及び４に記載された２つのプライマーを用いる直接ＰＣＲ法により確認した。得られた酵母ＭＴ８−１／ｐＩＣＳ：ＧＦＰｕｖ（ＦａｔｏｒＸａ）を０．６７％　Ｙｅａｓｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ　ｗ／ｏ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ、２％　グルコース、２％　カザミノ酸を含むＳＤ培地で１８時間培養した後、得られた酵母を遠心分離　（３０００ｒｐｍ、５分間）により分離し、さらにリン酸バッファー（ｐＨ　７．４）で２回洗浄した。
【００２４】
Ｃ：酵母表層からＧＦＰの回収
前記Ｂにより得られた酵母ＭＴ８−１／ｐＩＣＳ：ＧＦＰｕｖ（ＦａｔｏｒＸａ）を６００ｎｍでの濁度が１６になる様に１　ｍＭ　ＣａＣｌ２，　１００　ｍＭ　ＮａＣｌ，　５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ　８．０）　１００μｌに懸濁させた。この懸濁液にファクターＸａ（１μｇ／μｌ）　４μｌを加え、２５℃で２４時間反応させた。反応前後の酵母をリン酸バッファー（ｐＨ　７．４）で２回洗浄し、１％　ＢＳＡリン酸バッファー（ｐＨ　７．４）３００μｌ中、室温で３０分間ブロッキングした。さらにＧＦＰｕｖに対するポリクローナル抗体１．５μｌ（クロンテック）を加えて室温で１時間反応させた後、リン酸バッファー（ｐＨ　７．４）で洗浄した。これにアルカリフォスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧマウスモノクロナール抗体１．５μｌ（シグマ）を含むリン酸バッファー（ｐＨ　７．４）中、室温で１時間反応させた後、リン酸バッファーで洗浄した。得られた酵母に対し、アルカリフォスファターゼの基質であるＢＭ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ＥＬＩＳＡ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　（ＡＰ）　（Ｒｏｃｈｅ）を加え、化学発光強度をＡｓｃｅｎｔ（大日本製薬製）により測定した。
【００２５】
同様の実験を、実施例のＡにおいて示した文献に記載のＧＦＰｕｖとファクターＸａ認識配列を含まないプラスミドｐＩＣＡＳ１を含む酵母ＭＴ８−１／　ｐＩＣＡＳ１についても行った。また、両酵母に対して、比較のためにファクターＸａを添加しない条件で同様の実験を行った。結果を表１に示す。酵母ＭＴ８−１／ｐＩＣＳ：ＧＦＰｕｖ（ＦａｔｏｒＸａ）では、ファクターＸａ処理により酵母表層からＧＦＰｕｖが切断されていることが確認された。さらに、得られた上清を凍結乾燥した後、１０％　ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いたウエスタンブロッテイングを行うことにより、約２７ｋＤａにＧＦＰｕｖのバンドが検出されることを確認した〔図１：図中、レーン１及び２はＭＴ８−１／ｐＩＣＡＳ１（レーン１：６時間、レーン２：２４時間）、レーン３及び４はＭＴ８−１／ｐＩＣＳ：ＦＶＰｕｖ（ＦａｃｔｏｒＸａ）（レーン３：６時間、レーン４：２４時間）、及びレーン５はｒＧＦＰｕｖ標品（クロンテック）の結果を示す〕。
【００２６】
【表１】
2004089127.tif 000002
【００２７】
【発明の効果】
本発明の方法によればプロテアーゼ処理により目的タンパク質を高濃度かつ簡便に製造することができる。また、本発明の方法では、翻訳後に修飾を受ける糖タンパク質やリン酸化タンパク質等の真核生物由来のタンパク質の製造を安全に行うこともでき、さらに、例えば凝集性酵母を用いることによって酵母の分離が非常に容易になり、高い生産性を必要とする工業レベルでのタンパク質製造が可能になる。
【配列表】
2004089127.tif 000003
2004089127.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１ＣにおいてファクターＸａで処理した上清を凍結乾燥した後、１０％　ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いたウエスタンブロッテイングを行った結果を示した図である。
【図１】
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