(57)【要約】【課題】遺伝子治療において疾患と関連した蛋白質の発現を抑制する目的で使用するオリゴヌクレオチドの効果を高めるために、特別のキャリアーを用いて複合体化した治療剤を提供する。【解決手段】主鎖の一部または全部がβ−１，３−結合からなる多糖体と非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドとの複合体、特に糖の２本鎖とヌクレオチドの１本鎖間の主に水素結合を介して形成されている３重螺旋構造の複合体から成る遺伝子治療剤による。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患と関連した蛋白質の発現を抑制する目的で使用する、主鎖の一部または全部がβ−１，３−結合からなる多糖類と非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドとの複合体から成る、遺伝子治療剤。
【請求項２】
多糖類がシゾフィラン、カードラン、パーキマン、グリホラン、スクレログルカン、レンチナンまたはラミナランから選ばれたβ−１，３−グルカンであることを特徴とする請求項１の遺伝子治療剤。
【請求項３】
多糖類が核酸結合性官能基であるカチオン性官能基、ステロイド性官能基、アミノ酸官能基またはインターカレーター性官能基を有するβ−１，３−グルカン誘導体であることを特徴とする請求項１の遺伝子治療剤
【請求項４】
天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドの主鎖をなすホスホジエステル結合の、少なくとも一つがホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ボラノホスフェート、ホスホロセレネートおよびアミデート結合からなる群より選択された結合に修飾された、非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする請求項１の遺伝子治療剤。
【請求項５】
多糖類と非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドの複合体が、糖の２本鎖とヌクレオチドの１本鎖間の主に水素結合を介して形成されている３重螺旋構造体であることを特徴とする請求項１の遺伝子治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、疾患の原因遺伝子およびウイルス遺伝子のｍＲＮＡと配列特異的に対合し、それらの作用を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの治療効果を、より高く発現させるための技術分野に属し、特に遺伝子治療剤として有用な複合体を提供することに関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞の増殖などの機能はいろいろな機構により制御されている。最も重要な制御因子に、サイトカインと呼ばれるレセプター特異的な蛋白質がある。その蛋白質は特異的な膜結合受容体に結合し、細胞内にシグナルを伝達して、遺伝子の発現を制御することで、細胞の多くの機能を調節する。
【０００３】
アンチセンス療法は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチド（一般的にはｍＲＮＡ）の核酸機能の制御因子としての使用に関連している。アンチセンスオリゴヌクレオチド、即ち標的とされているセンス核酸の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドは、核酸の機能を調節するために、多くの異なった方法で機能することができる。標的核酸がｍＲＮＡである場合、ｍＲＮＡから蛋白質への翻訳を妨害、またはリボソームの結合もしくは転位を阻害することによって構能してもよい。標的核酸がＤＮＡであれば、ｍＲＮＡへの転写を妨害してもよい。配列特異的アンチセンス機構によるｍＲＮＡの産生、及び／または機能を阻害することに加えて、あるオリゴヌクレオチド、特にホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、部分的に非配列特異的機構に帰する作用も示すことがありうる。そのような機構は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの抗ウイルス作用としての影響のいくつかを説明するものとして、報告されている［Ｓｔｅｉｎ，　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃ．　Ｔｈｅｒ．　５２：　３６５−３８４（１９９１）　：　Ｍａｊｕｍｄａｒ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２８，
１３４０（１９８９）］。
【０００４】
近年、遺伝子工学の進歩に対応して、アンチセンス療法が盛んに研究されており、アンチセンス医薬に関する文献・特許が多数報告されつつある。既に開発段階に入っている医薬品の候補として、次のようなものが挙げられている［横山勇生他，　日経バイオビジネス，　２００２年，　１月号，　ｐ４０；大津敬他，　実験医学，　１８，　Ｎｏ．１２（増刊），　１７２（２０００）による］。
【０００５】
開発中の主なアンチセンス医薬（対象疾患；物質名・商品名；対象遺伝子等）
癌；Ｏｎｃｏｍｙｃ−ＮＧ；ｃ−ｍｙｃ、
大腸癌、固形癌；ＧＥＭ２３１；ＰＫＡ−ＲＩα、
固形癌；ＭＧ９８；ＤＮＡメチル・トランスフェラーゼ、
肺癌、卵巣癌、前立腺癌、大腸癌、乳癌、脳腫瘍、悪性黒色腫；ＩＳＩＳ３５２１；ＰＫＣ−α、
乳癌、肺癌、大腸癌、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌；ＩＳＩＳ５１３２；ｃ−ｒａｆ、
肺癌、直腸癌、膵臓癌；ＩＳＩＳ２５０３；Ｈ−ｒａｓ、
腎臓癌；ＧＴＩ２０４０；リボヌクレオチド還元酵素、
固形癌、放射線療法に耐性の癌；ＬＥ−ＡＯＮ；ｃ−ｒａｆ、
固形癌、リンパ腫；ＩＮＸ−３２８０；ｃ−ｍｙｃ、
固形癌、リンパ腫；ＧＴＩ２５０１；リボヌクレオチド還元酵素、
悪性黒色腫、リンパ腫、前立腺癌、大腸癌、肺癌、乳癌、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病；Ｇｅｎｅｓｅｎｓｅ；細胞死抑制遺伝子ＢＣＬ−２、
白血病；ＩＮＸ３００１；ｃ−ｍｙｂ
冠動脈手術後の再狭窄防止；Ｒｅｓｔｅｎ−ＮＧ；ｃ−ｍｙｃ、
血管再狭窄抑制；デコイ；Ｅ２Ｆ、
アンチセンス経口薬、クローン病、リウマチ、乾癬；ＩＳＩＳ１０４８３８；腫瘍壊死因子ＴＮＦ−α、
クローン病、リウマチ、乾癬、腎移植拒絶反応、潰瘍性大腸炎；ＩＳＩＳ２３０２；細胞接着因子ＩＣＡＭ−１、
サイトメガロウイルス性網膜炎（エイズ患者）；Ｖｉｔｒａｖｅｎｅ（欧米で認可済）；ＣＭＶ、
ＨＩＶ（エイズウイルス）；ＧＥＭ９２；ＨＩＶ、
ＨＩＶ（エイズウイルス）；ＨＧＴＶ４３；ＨＩＶ、
ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）；ＩＳＩＳ１４８０３；　ＨＣＶ、
ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）；ＨＥＰＴＡＺＹＭＥ；ＨＣＶ、
喘息；ＥＰＩ２０１０；アデノシンＡ１受容体、
薬物代謝酵素；ＡＶＩ−４５５７；Ｐ４５０、
上記のリストによると、各種の癌や白血病、エイズや肝炎などのウイルス性疾患、乾癬、クローン病、喘息、リウマチなど多岐に及んでいる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記のような各種の疾患に対してアンチセンス医薬を適用する場合に有効なオリゴヌクレオチドを、単独で適用するより、さらに効果を高める特別のキャリアーを用いて複合体化した治療剤を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明では、対象とする疾患の遺伝子配列に実質的に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを治療に適用するに際して、予めβ−１，３−結合を有する多糖もしくはその官能基置換体と複合体化して投与することにより、治療効果の向上を図るものである。
【０００８】
本発明は、疾患と関連したタンパク質の発現を抑制するために使用するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、予めβ−１，３−結合を有する多糖類と複合化して投与することにより、標的疾患の抑制を、より効率的に発揮させることに関する。
オリゴヌクレオチドを用いる治療方法の開発は、現在広く行われている。治療薬としてのオリゴヌレオチドの正確な作用機構の決定は困難であるが、多数の機構が提案されており、これらの異なる機構のいずれかまたはすべてが協調して作用し所望の結果を生じると考えられている。作用機構の一つはアンチセンスに基づいている。一般的に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ前駆体等の標的核酸に見いだされる特異的な配列に対し相補的な配列を有するように設計されている。標的核酸の特異的な配列とのハイブリッド形成により、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＤＮＡの蛋白質コード化機能を中断する。配列特異的アンチセンス機構に加え、ある修飾されたオリゴヌクレオチドは非配列特異的機構を介して核酸の機能を阻害することが可能である。いくつかの場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果と同じ塩基をランダム化された順序で含む「対照」オリゴヌクレオチドのそれとの比較の結果、対照オリゴヌクレオチドもまた蛋白質生産の阻害を示す。このような非配列特異的機構の正確な機構は未知であるが、これらの効果は対照オリゴヌクレオチドによる他の必須遺伝子の偶然阻害に起因すると考えられている［Ｍｉｌｌｉｇａｎ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，　Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＮｅｗＹｏｒｋ　Ａｋａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　ｐ．２２９−２４１］。
【０００９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを実際に医薬として使用する場合、前記配列特異性の他にも、実際的な問題が幾つか挙げられる。まず、血清、細胞、組織由来のヌクレアーゼに耐性があること。次に、無毒性で、製造コストが安価であること。標的組織や細胞へ送達できるような適当な薬物動態を有すること。細胞膜、小胞オルガネラ膜、核膜を通過できること。高い特異性と親和性をもって高次構造を有するＲＮＡ分子の標的領域へ侵入すること。そして、標的蛋白質の翻訳過程を最大限、阻止できるようにすることなどである［横山和尚，　医学の歩み，　１８４，　Ｎｏ．３，　２２５（１９９８）］。
【００１０】
以上のような実際的な要求を満たすため、多角的な工夫が行なわれている。まず、基本のアンチセンスオリゴヌクレオチド自身の分子設計が重要であることは論をまたない。アンチセンスヌクレオチドは、一般に、疾患原因遺伝子およびウイルス遺伝子のｍＲＮＡと配列特異的にハイブリッド形成することにより、ｍＲＮＡの転写、翻訳を阻害するものであり、ＲＮＡとＤＮＡがある。その中で、医薬用にはＤＮＡの方が多く用いられている。天然型の核酸は、実用的には生物学的安定性などで問題が指摘されており、現在は、人工的に修飾した、修飾オリゴヌクレオチドが多く開発されている。安定性の改良で代表的なものに、ホスホジエステル結合の酸素の一部または全部を硫黄原子で置換したホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート型のオリゴヌクレオチドがある。そのほか、ボラノホスフェート、ホスホロセレネート、アミデート結合を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドやメチルホスホロエート（Ｍ−オリゴ）、ペプチド核酸型の修飾化合物（ＰＮＡ）も知られている。このような非天然型の修飾オリゴヌクレオチドを本発明では用いることができる。
【００１１】
本発明のポイントは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを各種ヌクレアーゼによる分解から保護し、細胞膜や核膜等の障壁を通過して標的ｍＲＮＡのところまで送達し、次いで、これをスムースに放出するような、実用性の高いキャリアーと複合化された治療剤を提供することである。
【００１２】
当初、レトロウイルス［Ｍｉｌｌｅｒ，　Ｎａｔｕｒｅ，　３５７，　４５５−４６０（１９９２）］またはアデノウイルス［Ｍｕｌｌｉｇａｎ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２６０，　９２６−９３２（１９９３）］が、遺伝子キャリアーとしてｉｎ　ｖｉｔｒｏでは極めて見込みのある結果を与えたが、これら天然由来のウイルスの炎症性、免疫原的性質、ならびに突然変異誘発および細胞ゲノム中への組み込みの危険性が原因して、これらのｉｎ　ｖｉｖｏにおける使用は制限されている［Ｃｒｙｓｔａｌ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２７０，　４０４−４１０（１９９５）］。そこで、天然由来の遺伝子キャリアーの代替物として、ウイルス系よりも取り扱いが簡単であるのみならず、細胞へＤＮＡを確実に効率良く集中させることが可能な人工材料の非ウイルスキャリアーの使用か提示された［Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｒｏｌｌａｎｄ，　Ｊ．　Ｃｏｎｔｒ．　Ｒｅｌ．，　３９，　３５７−３７２（１９９６）］。
【００１３】
現在、非ウイルス性の人工キャリアーとしてよく検討されているのはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。多数の異なった付着細胞および浮遊細胞ライン中では、３次元的分岐構造のカチオンポリマーであるＰＥＩは、ある場合には平均以上のトランスフェクション率を引き起こす結果になった［Ｂｏｕｓｓｉｆ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ，　３，　１０７４−１０８０（１９９６）］。例えば３Ｔ３繊維芽細胞の９５％形質転換がｉｎ　ｖｉｔｒｏで達成された。Ｉｎ　ｖｉｖｏでの遺伝子のマウス脳中へのＰＥＩ仲介伝達では、ニューロンおよびグリア細胞中のリポーター遺伝子およびＢｃ１２遺伝子の長期発現が起こる結果になり、アデノウイルスによる遺伝子伝達の場合と同じ程度のものであった［Ａｂｄａｌｌａｈ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｕｍ．　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．，　７，　１９４７−１９５４（１９９６）］。
【００１４】
しかし、ポリエチレンイミンなどのカチオン性高分子の安全性は確認されていない。カチオン性を有するには、アミノ基の存在か不可欠であるが、アミノ基は生理活性か高く、体内毒性等の危険がある。事実、今まで検討されたいかなるカチオン性ポリマーも未だ実用に供されておらず、事実「医薬品添加物辞典」［日本医薬品添加剤協会縄集、薬事日報社］に記載されていない。
【００１５】
一方、筋肉内注射製剤として臨床薬として実際に使用されている多糖として、β−１，３−グルカンが存在する。この多糖は天然では３重螺旋構造をとっていることが古くから知られている［例えば、Ｔｈｅｒｅｓａ　Ｍ．　ＭｃＩｎｔｉｒｅ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｄ　Ａ．　Ｂｒａｎｔ，　Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　１２０，　６９０９（１９９８）］。さらに、この多糖は、既に生体内での安全性が確認されており、筋肉内注射薬として約２０年の使用実績がある［清水，　陳，　荷見，　増淵，　Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，　４，　１３９０（１９９０）；長谷川，　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ
Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，　８，　２２５（１９９２）］。
【００１６】
ＰＣＴ／ＵＳ９５／１４８００には、このようなβ−１，３−グルカンを化学修飾して、ＤＮＡ等の生体材料とのコンジュゲイトを作成し、これを遺伝子キャリアーに使用できることが述べられている。この先行技術には、天然のβ−１，３−グルカン、すなわち、３重螺旋構造を有するβ−１，３−グルカンをそのまま使用し、これと生化学活性のある材料を、共有結合を介して、β−１，３−グルカン／生体材料のコンジュゲイトを製造する方法が述ベられている。
【００１７】
最近、本発明者らにより、β−１，３−グルカン系多糖類を人工的に処理することで、各種の核酸と新しいタイブの複合体を形成することが見出された［ＰＣＴ／ＪＰ００／０２２２８；櫻井，　新海，　Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　１２２，　４５２０（２０００）；木村，　甲元，　櫻井，　新海，　Ｃｈｅｍ．　Ｌｅｔｔ．，　１２４２（２０００）］。もともと天然で３重螺旋として存在するこの多糖を、極性溶媒に溶解してばらばらの１本鎖にした後に、１本鎖の核酸を加え、溶媒を水に戻すこと（再生過程）によって、核酸１本・多糖２本からなる、３重螺旋型の複合体が形成されるのである。図１の模式図に示されるように、当該多糖と遺伝子の複合体は主として水素結合に因ると考えられる［櫻井和朗，　井口律子，　木村太郎，　甲元一也，　水雅美，　新海征治，　Ｐｏｌｙｍ．　ＰｒｅｐｒｉｎｔｓＪｐｎ．，　４９，　４０５４（２０００）］。天然の多糖類を使用した場合の核酸との複合体における結合エネルギーは、ケースによってはさほど強くなく、比較的容易に複合体が解離する。また、予め多糖類に各種官能基を導入して核酸との複合体の安定性をより強くする方法も開発されている［ＰＣＴ／ＪＰ００／０７８７５］。
【００１８】
さらに、これらの多糖類と核酸の３重螺旋型複合体は、細胞膜の透過性およびヌクレアーゼ耐性があり、遺伝子キャリアーとして使える可能性が高いことが本発明者らによって明らかにされていた。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明は、３重螺旋構造を呈するβ−１，３−結合含有多糖類とアンチセンスオリゴヌクレオチドとを特定の処理によって該当する糖の２本鎖とアンチセンスオリゴヌクレオチドの１本鎖とを複合体化させた新しいタイブの遺伝子治療剤を提供するものである。
【００２０】
本発明のβ−１，３−結合を有する多糖類の２本鎖と非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドの１本鎖から成る、主として水素結合に因る３重螺旋構造の複合体を形成する調製法は、一般的な核酸を対象に開発された本発明者らによる先行特許出願［ＰＣＴ／ＪＰ００／０７８７５およびＰＣＴ／ＪＰ０２／０２２２８］に、詳細に開示されている方法で可能である。β−１，３−結合を有する多糖は、β−１，３−グルカンが代表的なもので、シゾフィラン、カードラン、パーキマン、グリホラン、スクレログルカン、レンチナンまたはラミナランなどが属し、これらが本発明に使用される。また、多糖類の化学修飾は、核酸と結合性のある官能基が選ばれ、アミノ基で代表されるカチオン性官能基、ステロイド性官能基、アミノ酸官能基、インターカレーター性官能基などの導入法が詳細に提示されている［ＰＣＴ／ＪＰ０２／０２２２８］。
【００２１】
生成する複合体は、通常、水溶液として得られるので、限外ろ過法などの比較的簡単な方法で必要な純度に精製された後、治療向けに効果的に使用される。治療剤としての調製法、キャラクタリゼーションおよびｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験における投与の方法と細胞増殖抑制の評価は、実施例において詳細に例示する。
【００２２】
【実施例】
以下、本発明の特徴をさらに明らかにするため実施例および比較例を示すが、これらの例は本発明を例示するためのものであり、本発明を制限するためのものではない。
実施例１：β−１，３−グルカン（シゾフィラン）と複合体化したアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｓ−オリゴ）遺伝子治療剤の調製
３重螺旋構造のシゾフィランを文献［Ｇｒｅｇｏｒｙ　Ｇ．　Ｍａｒｔｉｎ，　Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｆ．　Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，　Ｇｏｒｄｏｎ　Ｃ．　Ｃａｎｎｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｌ．　ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｐｒｅｐｒ．　３８（１），　２５３−２５４（１９９７）；Ｋｅｎｇｏ　Ｔａｂａｔａ，　Ｗａｔａｒｕ　Ｉｔｏ，　Ｔａｋｅｍａｓａ　Ｋｏｊｉｍａ，　Ｓｈｏｚｏ　Ｋａｗａｂａｔａ　ａｎｄ　　Ａｋｉｒａ　Ｍｉｓａｋｉ，　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　８９，　１２１−１３５（１９８１）］記載の定法に従って製造した。すなわち、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手したＳｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ　ｃｏｍｍｕｎｅ．　Ｆｒｉｅｓ（ＡＴＣＣ　４４２００）を、最小培地を用いて７日間静置培養した後、細胞成分および不溶残渣を遠心分離して得られた上清を超音波処理して分子量４５万の３重螺旋シゾフィランを得た。このシゾフィランをジメチルスルホキシドに溶解させ、濃度を１９．８　ｍｇ／ｍｌに調整し、この溶液１μｌ、３μｌの純水、１０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）１μｌと、１ｍｇ／ｍｌのアンチセンスオリゴヌクレオチド溶液５μｌを混合した。得られた溶液はすべて透明で、均一であった。
【００２３】
使用したアンチセンスオリゴヌクレオチド（固相合成品）は、前癌遺伝子として報告されているｃ−ｍｙｂ遺伝子［Ｂａｒｂａｒａ　Ｍａｊｅｌｌｏｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　８３，　９６３６（１９８６）；　Ａｌａｎ　Ｍ．　Ｇｅｗｉｒｔｚ　ａｎｄ　Ｂｒｕｎｏ　Ｃａｌａｂｒｅｔｔａ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２４２，　１３０３（１９８８）］のセンス配列に相補的なホスホロチオエート結合を持つアンチセンス配列であるＧＴＧ　ＣＣＧ　ＧＧＧ　ＴＣＴ　ＴＣＧ　ＧＧＣ（配列番号：１）の３’末端に４０のｄＡをつけたシークエンスをｃ−ｍｙｂホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドとした。
【００２４】
実施例２：β−１，３−グルカン（シゾフィラン）の２本鎖とアンチセンスオリゴヌクレオチドの１本鎖からなる３重鎖複合体形成の確認
本発明に従うアンチセンスオリゴヌクレオチドとシゾフィラン（Ｓ−オリゴ）の複合体が、シゾフィランの２本鎖とアンチセンスオリゴヌクレオチドの１本鎖からなる３重鎖の複合体を形成するか確認試験を行った。
実施例１に示した方法で、アンチセンスオリゴヌクレオチドとシゾフィランをＭＳＰＧ／（ＭＳＰＧ　＋　ＭＯＤＮ）＝　０、０．１、０．２５、０．４、０．５、０．６６、０．８のモル比で加えた。ＭＯＤＮはアンチセンスオリゴヌクレオチドのモル濃度を、ＭＳＰＧはシゾフィランの繰り返し単位のモル濃度である。ここで利用したシゾフィランの繰り返し単位は、主鎖グルコース３個と側鎖グルコース１個の繰り返しを１単位とした。
【００２５】
これらをＭＯＰＳ緩衝液（２０ｍＭ　ＭＯＰＳ　（ｐＨ　７．０）、５ｍＭ　酢酸ナトリウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、３％ジメチルスルホキシド）中で２％アガロースゲル用いて２Ｖ／ｃｍで１時間電気泳動させ、Ｇｅｌ　Ｓｔａｒ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｓｔａｉｎ（ＢＭＡ）で染色後、トランスイルミネーター下でその移動度を評価した。その結果を示したものが図２である。
図２に例示したとおり、アガロースゲル電気泳動の結果、ＭＳＰＧ／（ＭＳＰＧ　＋　ＭＯＤＮ）　が増加するにしたがってバンドの移動度が低下していき、ＭＳＰＧ／（ＭＳＰＧ　＋　ＭＯＤＮ）　＝　０．４からアンチセンスオリゴヌクレオチドとシゾフィランの複合体のバンドが確認できた。図２下部の複合体モデル３に示すように、ＭＳＰＧ／（ＭＳＰＧ　＋　ＭＯＤＮ）＝　０．４のときがシゾフィラン２本鎖とアンチセンスオリゴヌクレオチド１本鎖からなる３本鎖の複合体を形成する化学量論比であり［Ｋ．　Ｓａｋｕｒａｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，　２，　６４１−６５０（２００１）］、その結果、アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｓ−オリゴ）とシゾフィランは本発明に従う複合体を形成していることが明らかである。
【００２６】
実施例３：カチオン性誘導体の合成（アミノ基修飾シゾフィラン）
図３のスキームに従い、カチオン性誘導体を合成した。アミノ基の導入率の制御は過ヨウ素酸酸化に使用する過ヨウ素酸ナトリウムの当量数により制御することが可能である。従って、あらゆる導入率に対して合成法には相違は生じない。ここでは、シゾフィランへ４．６、１７、２０および３６％のアミノ基を導入したカチオン修飾シゾフィランの合成例を示す。また、導入するアミノ基として２−アミノエタノール、スペルミンおよびスペルミジンを使用した。アミノ基の導入率は側鎖グルコースに対する過ヨウ素酸ナトリウムの当量数によって制御することが可能であり、その実験結果は実施例４に示した。実施例１に記された方法にて分子量４５万のシゾフィランを得た。このシゾフィラン１００　ｍｇを水１００　ｍｌに溶解させた。そこへ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（シゾフィラン側鎖グルコースに対して１０％および４０％、８０％の当量数若しくは、過剰量である５００％）をゆっくりと加え、４℃で２日間攪拌した。反応溶液を透析膜（排除限界１２０００）で透析後、凍結乾燥した。得られた白色個体をジメチルスルホキシド２０　ｍｌに溶解させ、２−アミノエタノールおよびスペルミン、スペルミジン２　ｍｌ（大過剰、１００００等量以上）を加え、室温で２日間攪拌を続けた。過剰の水素化ホウ素ナトリウムを酢酸で失括させた後、反応溶液を透析膜（排除限界１２０００）で透析（酸性水溶液、塩基性水溶液、蒸留水）し、凍結乾燥することでカチオン性誘導体を調製した。
【００２７】
実施例４：カチオン性誘導体のキャラクタリゼーション
実施例３により得られたカチオン性誘導体多糖のキャラクタリゼーション（分子量、導入率測定）を行った。分子量についてはゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）および粘度測定から検討し、原料と一致した分子量を示すことを明らかとした。導入率の決定については元素分析による窒素の微量分析（検出下限０．０５％）により行った。窒素の微量分析実験は全て３回の測定を行った結果を表１に示した。
【００２８】
【表１】
2004107272.tif 000002
【００２９】
実施例５：アミノ酸誘導体の合成（アルギニン修飾シゾフィラン）
図３のスキームに従い、アミノ酸誘導体を合成した。アミノ酸の導入率の制御は実施例３と同様の方法で制御した。ここでは、シゾフィランへ４．６、１７、２０、および３６％のアルギニンを導入したアルギニン修飾シゾフィランの合成例を示す。
【００３０】
実施例１に記された方法にて分子量４５万のシゾフィランを得た。このシゾフィラン１００　ｍｇを水１００　ｍｌに溶解させた。そこへ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（シゾフィラン側鎖グルコースに対して１０、４０および７０％の当量数）をゆっくりと加え、４℃で２日間攪拌した。反応溶液を透析膜（排除限界１２０００）で透析後、凍結乾燥した。得られた白色個体をジメチルスルホキシド２０　ｍｌに溶解させ、アルギニンメチルエステル２　ｍｌ（大過剰、１００００当量以上）を加え、室温で２日間攪拌を続けた。過剰の水素化ホウ素ナトリウムを酢酸で失括させた後、反応溶液を透析膜（排除限界１２０００）で透析（酸性水溶液、塩基性水溶液、蒸留水）し、凍結乾燥することでアルギニン修飾シゾフィランを調製した。
アルギニンの導入率の決定については元素分析による窒素の微量分析（検出下限０．０５％）により行った。窒素の微量分析実験は全て３回の測定を行った結果を表２に示した。
【００３１】
【表２】
2004107272.tif 000003
【００３２】
実施例６：カチオン化シゾフィランおよびアミノ酸修飾シゾフィランとアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）との複合体化遺伝子治療剤の調製
１７、２０および３６％のアミノ基修飾シゾフィラン、４．６および４．７％のスペルミン修飾シゾフィラン、ならびに３．６、９．３および１３．５％のアルギニン修飾シゾフィランをそれぞれジメチルスルホキシドに溶解させ、濃度を１９．８　ｍｇ／ｍｌに調整し、この溶液１μｌ、純水３μｌ、１０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）１μｌと、実施例１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド溶液（１ｍｇ／ｍｌ）５μｌを混合した。得られた溶液はすべて透明で、均一であった。
【００３３】
実施例７：アンチセンスオリゴヌクレオチドとシゾフィラン類との複合体形成のゲル電気泳動法による確認
アンチセンスオリゴヌクレオチドは負に帯電したリン酸基が正電荷方向に電気泳動する。さらにゲルマトリックスの網目の隙間を泳動するためアンチセンスオリゴヌクレオチドがシゾフィランと複合体を形成することにより分子量が大きくなるほど移動度は減少する。そこで、アンチセンスオリゴヌクレオチドにシゾフィランおよびカチオン化シゾフィラン、アルギニン修飾シゾフィランを添加して実施例１、３および５に記載の方法で複合体を形成させた後、ＭＯＰＳ緩衝液（２０ｍＭ　ＭＯＰＳ　（ｐＨ　７．０）、５ｍＭ　酢酸ナトリウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、３％ジメチルスルホキシド）中で２％アガロースゲル用いて２Ｖ／ｃｍで１時間電気泳動させ、Ｇｅｌ　Ｓｔａｒ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｓｔａｉｎ（ＢＭＡ）で染色後、トランスイルミネーター下でその移動度を評価した。
【００３４】
図４に例示したアガロースゲル電気泳動の結果によると、シゾフィランおよびカチオン化シゾフィラン、アルギニン修飾シゾフィランの添加に伴って、アンチセンスオリゴヌクレオチドの移動度は減少しており、複合体の形成が確認された。
【００３５】
実施例８：シゾフィランおよびアミノ基修飾シゾフィランと複合体を形成させたヒトｃ−ｍｙｂホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ　ｃ−ｍｙｂ）によるヒト由来白血病細胞ＨＬ６０の増殖抑制の効果
９６穴プレートに１００μｌの１０％仔牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した２×１０３個のヒト由来白血病細胞ＨＬ６０を播種し３７℃、５％ＣＯ２下で一晩前培養後に、ヒトｃ−ｍｙｂホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（以下ＡＳ　ｃ−ｍｙｂと表記）および実施例１と実施例３で調製したＡＳ　ｃ−ｍｙｂとシゾフィランおよびアミノ基修飾シゾフィランとの複合体を限外ろ過膜（排除限界３０００）でろ過してジメチルスルホキシドを除去し濃度を再調整したものを添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で９６時間培養後、細胞数をＣｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所）を利用し、付属のプロトコールに従って測定した。ＡＳ　ｃ−ｍｙｂ無添加の穴の細胞数を生存率１００％として細胞増殖を評価した。その結果を図５に示した。
【００３６】
図５に例示したように、ＡＳ　ｃ−ｍｙｂ単独投与よりもＡＳ　ｃ−ｍｙｂとシゾフィランおよびアミノ基修飾シゾフィランの複合体である本発明の遺伝子治療剤の方が、１０から１５％程度細胞の生存率が低下している。また、同じ条件でシゾフィランおよびアミノ基修飾シゾフィランのみを投与してもＨＬ６０細胞の生存率にはほとんど影響を与えていない。
【００３７】
実施例９：シゾフィランおよびアミノ基修飾シゾフィランと複合体を形成させたヒトｃ−ｍｙｃホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドによるヒト由来白血病細胞ＨＬ６０の増殖抑制の効果
実施例８のＡＳ　ｃ−ｍｙｂの代わりにヒトｃ−ｍｙｃホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（以下ＡＳ　ｃ−ｍｙｃと表記）を用いた以外は、実施例７と同様の方法でヒト由来白血病細胞ＨＬ６０の増殖抑制の効果を評価した。その結果を示したものが図６である。
【００３８】
使用したＡＳ　ｃ−ｍｙｃは、前癌遺伝子として報告されているｃ−ｍｙｃ遺伝子［Ｓｈｉｎｙａ　Ｋｉｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　５５，　１３７９（１９９５））のセンス配列に相補的なホスホロチオエート結合を持つアンチセンス配列であるＡＡＣ　ＧＴＴ　ＧＡＧ　ＧＧＧ　ＣＡＴ（配列番号：２）の３’末端に４０のｄＡをつけたシークエンスを利用した。
【００３９】
図６に例示したように、本発明に従う遺伝子治療剤のＡＳ　ｃ−ｍｙｃとシゾフィランおよびアミノ基修飾シゾフィランの複合体を投与することにより、ＡＳ　ｃ−ｍｙｃ　単独投与よりも細胞の生存率を低下させていることが明らかである。
【００４０】
実施例１０：シゾフィラン、アミノ基修飾シゾフィランおよびアルギニン修飾シゾフィランと複合体を形成させたヒトｃ−ｍｙｂホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドによるヒト由来黒色腫瘍細胞Ａ３７５の増殖抑制の効果
９６穴プレートに１００マイクロＬの１０％　ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に懸濁した２×１０３個のヒト由来黒色腫瘍細胞Ａ３７５を播種し３７℃、５％ＣＯ２下で一晩前培養後に、ＡＳ　ｃ−ｍｙｂ、実施例７で調製したＡＳ　ｃ−ｍｙｂとシゾフィランとの複合体、ならびにＡＳ　ｃ−ｍｙｂとアミノ基修飾シゾフィランおよびアルギニン修飾シゾフィランとの複合体を添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で７２時間培養後細胞数をＣｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所）を利用し、付属のプロトコールに従って測定した。ＡＳ　ｃ−ｍｙｂ無添加の穴の細胞数を生存率１００％として細胞増殖を評価した。図７に結果を例示した。
【００４１】
図７より、本発明に従う遺伝子治療剤のＡＳ　ｃ−ｍｙｃとシゾフィラン、アミノ基修飾シゾフィランおよびアルギニン修飾シゾフィランとの複合体を投与することにより、細胞の生存率がＡＣ　ｃ−ｍｙｂ単独投与による場合よりも低い値に抑制されている。
【００４２】
比較例１：シゾフィランおよびアミノ基修飾シゾフィランと複合体を形成させたヒトｃ−ｍｙｂホスホロチオエートのセンス鎖オリゴヌクレオチドによるヒト由来黒色腫瘍細胞Ａ３７５の増殖抑制
実施例１０で用いたヒトｃ−ｍｙｂホスホロチオエートアンチセンスオリゴオチドの代わりにヒトｃ−ｍｙｂの配列の一部でありアンチセンス効果（治療効果を示さない）のないヒトｃ−ｍｙｂホスホロチオエートのセンス鎖オリゴヌクレオチド［Ａｌａｎ　Ｍ．Ｇｅｗｉｒｔｚ　ａｎｄ　Ｂｒｕｎｏ　Ｃａｌａｂｒｅｔｔａ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２４２，　１３０３（１９８８）］に記載のセンス配列ＣＡＣ　ＧＧＣ　ＣＣＣ　ＡＧＡ　ＡＧＣ　ＣＣＧ（配列番号：３）の３’末端に４０のｄＡをつけたシークエンス、以下Ｓ　ｃ−ｍｙｂと表記）を用いて実施例８と同様の方法でヒト由来黒色腫瘍細胞Ａ３７５の増殖への影響を評価した。この結果を図８に例示した。
【００４３】
図８のように、Ｓ　ｃ−ｍｙｂ単独投与区およびシゾフィランまたはアミノ基修飾シゾフィランとの複合体投与区においても細胞の生存率はほとんど低下せず、治療効果のないオリゴヌクレオチドとの複合体形成物は、治療効果が無いことが示された。
【００４４】
【発明の効果】
本発明は、遺伝子治療において用いるアンチセンスオリゴヌクレオチドを、予めβ−１，３−結合を有する多糖類と複合化して投与することにより、単独で適用する場合に比べて標的疾患の抑制率が向上した結果を与える。本発明の複合体の原料となる多糖類は本来、医薬として安全に使用できるものをベースとしており、価格も実用的なものである。また、必要に応じて、種々の官能基で修飾することにより、効能アップの可能性が期待できる。
【００４５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の遺伝子治療剤が調製される過程を模式的に示したものである。
【図２】本発明の遺伝子治療剤が、β−１，３−グルカン（シゾフィラン）の２本鎖とアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｓ−オリゴ）の１本鎖からなる３重鎖の複合体であることの電気泳動による確認を示している。
【図３】本発明に従う、β−１，３−グルカン（シゾフィラン）のカチオン性誘導体およびアミノ酸誘導体の合成スキームの例を示す。
【図４】本発明に従う遺伝子治療剤のシゾフィラン、アミノ基修飾シゾフィランおよびアルギニン修飾シゾフィランとアンチセンスオリゴヌクレオチドとの複合体化を示すアガロースゲル電気泳動パターンを示している。
【図５】本発明に従う遺伝子治療剤のシゾフィランおよびアミノ化シゾフィランとヒトｃ−ｍｙｂホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドとの複合体使用によるヒト白血病細胞ＨＬ６０の増殖抑制試験の結果を示す。
【図６】本発明に従う遺伝子治療剤のシゾフィランおよびアミノ化シゾフィランとヒトｃ−ｍｙｃホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドとの複合体使用によるヒト白血病細胞ＨＬ６０の増殖抑制試験の結果を示す。
【図７】本発明に従う遺伝子治療剤のシゾフィラン、アミノ化シゾフィランおよびアルギニン修飾シゾフィランとヒトｃ−ｍｙｂホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドとの複合体使用によるヒト黒色腫瘍細胞Ａ３７５の増殖抑制試験の結果を示す。
【図８】本発明に従う遺伝子治療剤のシゾフィラン、アミノ化シゾフィランおよびアルギニン修飾シゾフィランと治療効果を示さないヒトｃ−ｍｙｂホスホロチオエートのセンス鎖オリゴヌクレオチドとの複合体使用によるヒト黒色腫瘍細胞Ａ３７５の増殖への影響の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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