(57)【要約】　　　（修正有）【課題】２４時間未満で液化環境又は生物試料中の標的微生物を検出するための培地の提供。【解決手段】標的微生物の生存および生殖を維持できるように有効量のビタミン、アミノ酸、微量元素および塩を含有する標的微生物の特異的培地の提供。さらに代謝損傷細菌の回収を助けるためにピルビン酸ナトリウムの使用、熱平衡期間の使用、少量の塩化ナトリウムの使用、適切な量の他の代謝物の提供、および検出可能な特性シグナルを発生する化合物の提供を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１．液化環境又は生物試料中の標的微生物の有無の検出を可能にする標的微生物特異的培地であって、ａ）１００ｍｌ当たり１０個未満の微生物を含む試料で１８時間以内に試料中の検出可能な変化を観察できるような速度で前記標的微生物の生存及び生殖を可能にするように作用し得る有効量のビタミン、アミノ酸、元素及び塩成分と、（ｂ）標的微生物の増殖中に培地中に検出可能な特性シグナルを発生するために十分な量で提供され、標的微生物により代謝されると試料の検出可能な特性を変化させ、試料中の標的微生物の有無を確認できるように作用し得る有効量の１種以上の栄養指標を含む前記標的微生物特異的培地。
【発明の詳細な説明】
【発明の技術分野】
　本発明は化学、生物学及び微生物学の分野であり、汚染している可能性のある材料の試料中の標的微生物を検出するための新規手段に関する。発明の背景　微生物は生物試料やその増殖に適した環境媒体に偏在する。しかし、微生物には高等生物に有害なものもあり、公衆衛生を維持するためにはその存在の検出手段が重要である。速度と特異性に関して種々の利点を提供する多数の手段が種々の微生物の検出手段として利用可能である。　全微生物は所定の増殖及び生殖要件をもつ。一般に、微生物が増殖するためには、光又は炭素化合物等のエネルギー源と、炭素、窒素、硫黄及びリン並びに微量の他の無機質を含む原料源が必要である。更に、微生物は適当な温度、ｐＨ、塩分及び酸素濃度を維持した適切な環境に存在していなければならない。　微生物の存在を検出するために使用されている一般方法は、増殖を維持するために必要な全成分を含む培地に試料を加えることにより実施される。試料は未処理でもよいし、培地に加える前に膜濾過等の方法により前処理してもよい。培地は標的微生物以外の微生物の増殖を抑制する抗微生物剤又は抗生物質等の薬剤を加えてもよいし、加えなくてもよい。通常は、これらの培地は汚染性微生物から干渉阻害されないように滅菌され、微生物を検出可能な濃度まで増殖させるためには２４〜４８時間といったかなり長時間のインキュベーションが通常必要である。更に、これらの方法では一旦増殖を検出してから標的微生物に固有の種々の物性又は生化学的特性に特異的な１種以上の試験を使用して標的微生物を同定しなければならない。従って、これらの方法は労働集約的で時間消費的である。　検出方法を簡単且つ迅速にするために努力が払われている。例えば、個々の微生物の特異的代謝副生物を測定する試みがなされている。これらの方法は、電気インピーダンスアッセイ、ＡＴＰアッセイ、抗体系アッセイ及び炭素１４標識基質アッセイを含む。標的微生物の増殖をモニターするために、標的微生物の増殖の検出後のみに変色する微生物増殖指標も使用されている。これらの指標は一般に標的微生物により産生される代謝副生物と化学的に反応し、培地中で変色する。増殖に伴うｐＨ変化の存在下で変色する薬剤の例としては、フェノールレッド、ブロモクレゾールブルー及びニュートラルレッドが挙げられる。例えば、Ｇｏｌｂｅｒの米国特許第３，２０６，３１７号は、標的微生物により産生される酸性老廃物の存在下で変色する薬剤であるフェノールレッドを使用している。Ｂｅｒｇｅｒらの米国特許第３，４９６，０６６号は細菌を色素に変換する化合物（例えばトロピノン及びジオキサン）を使用しており、Ｂｏｃｈｎｅｒの米国特許第４，１２９，４８３号は化学的に還元されると変色を生じる非生物分解性物質（テトラゾリウ厶）の使用を記載している。これらの例のいずれにおいても指標は必要栄養源として機能しない化合物である。　Ｅｄｂｅｒｇの米国特許第４，９２５，７８９号は、栄養源として機能するだけでなく、代謝されると変色する栄養指標の使用を記載している。その開示内容を参考資料として本明細書の一部とするこの特許は、標的細菌により代謝されると、培地に変色又は他の検出可能な変化をもたらす部分を遊離する栄養指標を含有する培地を提供する。この方法は特定種又は群の細菌に固有の酵素特異性を利用している。標的微生物の増殖を選択するために抗生物質の使用が示唆されており、液体系アッセイの具体例が挙げられている。Ｋｉｌｉａｎら，Ａｃｔａ．Ｐａｔｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｅｃｔ．Ｂ　§７　２７１−２７６（１９７９）及びＤａｍａｒｅら，Ｊ．Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　５０：１７３６（１９８５）等の従来使用されている他の方法は抗生物質を含まない寒天系培地の使用を報告している。発明の要約　本発明は１８〜２４時間といった短時間で液化環境又は生物試料中の標的微生物の有無の検出が可能な培地に関する。例えば、インキュベーション時間の開始から約１８時間以内に大腸菌及び他の大腸菌群を高特異性で検出することができる。従って、本発明の培地は大腸菌の試験結果を得るために約２４時間を要した従来の培地と区別される。このような培地は、栄養源と増殖指標の両者の量を種々に変えて調製することができる。但し、本発明は従来使用されているよりも多量のアミノ酸、ビタミン及び元素成分を提供する。本発明の培地の他の特徴は、代謝損傷細菌の回収を助けるピルビン酸ナトリウムの使用、熱平衡期間の使用、少量の塩化ナトリウムの使用、適切な量の他の代謝物の提供等である。　培地は、栄養指標の存在下で標的微生物の生存及び生殖を維持するように作用し得る有効量のビタミン、アミノ酸、微量元素及び塩を含有する。試料中の全大腸菌群及び大腸菌の検出に本発明で最適であることが判明した培地は、アンモニウムイオン源（例えば最終試料濃度約４．５〜５．５ｇ／ｌの硫酸アンモニウム）、緩衝液（例えば約６．０〜７．５ｇ／ｌのＨＥＰＥＳ遊離酸及び４．７〜５．８ｇ／ｌのＨＥＰＥＳナトリウム塩）、約０．１３〜０．１６ｇ／ｌのＤ−グルコン酸、亜硫酸源（例えば約０．０３６〜０．０４４ｇ／ｌの亜硫酸ナトリウム）、抗真菌剤（例えば約０．０００９〜０．００１１ｇ／ｌのアンホテリシンＢ）、マグネシウムイオン源（例えば約０．０９〜０．１１ｇ／ｌの硫酸マグネシウム）、栄養指標（例えば約０．４５０〜０．５５０ｇ／ｌのオルトニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）及び約０．０６７〜０．０８５ｇ／ｌの４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ））、亜鉛イオン源（例えば約０．０００４５〜０．０００５５ｇ／ｌの硫酸亜鉛）、及びマンガンイオン源（例えば約０．０００４５〜０．０００５５ｇ／ｌの硫酸マンガン）を含む。　更に、下記成分が下記最少量で提供される。各成分の最大又は最適量は下記量の数倍（例えば３〜１０倍、更には２０倍）であり得る。具体的には、このような培地は少なくとも約１．１〜１．７ｇ／ｌの総窒素分をもつ。標的微生物の増殖に必要なアミノ酸を提供する。全アミノ酸を提供する必要はなく、各アミノ酸の相対量は可変である。当業者であれば、純粋源でなく天然源のこのようなアミノ酸を使用できることが理解されよう。アミノ酸は種々の源から提供できる。一般には、標的微生物により内因的に合成できない必須アミノ酸のみを提供しなければならない。これらのアミノ酸は天然源（例えば完全生物の抽出物）から混合物として提供してもよいし、精製形態で提供してもよい。天然混合物は様々な量のこのようなアミノ酸及びビタミンを含有し得る（下記参照）。一般参考として、このようなアミノ酸及びビタミンの特定量を下記に示す。これらの量は参考に過ぎず、本発明を制限するものではない。当業者であれば、アミノ酸とビタミンの多種多様の組み合わせを本発明の培地で使用できることが理解されよう。下記一覧はこのような例の一例に過ぎない。アミノ酸含量は、少なくとも下記アミノ酸を少なくともほぼ指定量で含むことが好ましい。アラニン（０．０２５ｇ／ｌ）、アルギニン（０．０３ｇ／ｌ）、アスパラギン酸（０．０５６ｇ／ｌ）、グルタミン酸（０．１ｇ／ｌ）、グリシン（０．０１５ｇ／ｌ）、プロリン（０．０９ｇ／ｌ）、シスチン（０．００２ｇ／ｌ）、ヒスチジン（０．００６ｇ／ｌ）、イソロイシン（０．０１ｇ／ｌ）、ロイシン（０．０３ｇ／ｌ）、リシン（０．０３ｇ／ｌ）、メチオニン（０．０１ｇ／ｌ）、フェニルアラニン（０．０１８ｇ／ｌ）、セリン（０．０２９ｇ／ｌ）、トレオニン（０．０１８ｇ／ｌ）、トリプトファン（０．００３ｇ／ｌ）、チロシン（０．００６４ｇ／ｌ）及びバリン（０．０２３ｇ／ｌ）。　標的微生物の増殖を助けるために他の無機化合物を配合してもよい。これらの化合物は（上記種々の化学物質源で提供されない程度までの）下記成分、即ち鉄（例えば少なくとも約０．００１６５μｇ／ｌ）、カルシウム（例えば少なくとも約０．０００３ｇ／ｌ）、リン酸塩（例えば少なくとも約０．１ｇ／ｌ）、カリウ厶（例えば少なくとも約０．００７ｇ／ｌ、好ましくは約０．０５ｇ／ｌ）、ナトリウム（例えば少なくとも約０．０３ｇ／ｌ）、並びに微量のコバルト、銅、鉛、マグネシウム、マンガン、塩化物、錫及び亜鉛を含む。　標的微生物の増殖に必要なビタミンも提供し得る。これらのビタミンは純粋形態でもよいし、より複雑な培地の一部として提供してもよい。このようなビタミンは少なくとも下記量で存在し得る。ビオチン（０．００００５ｍｇ／ｌ）、シアノコバラミン（微量）、コリン（０．０５ｍｇ／ｌ）、イノシトール（０．０６０ｍｇ／ｌ）、ニコチン酸（０．０１４ｍｇ／ｌ）、ナイアシン（０．００３８５ｍｇ／ｌ）、ＰＡＢＡ（０．０２ｍｇ／ｌ）、葉酸（０．００００７５ｍｇ／ｌ）、パントテン酸（０．０１０９５ｍｇ／ｌ）、ピリドキシン（０．００１５ｍｇ／ｌ）、リボフラビン（０．００２８ｍｇ／ｌ）、チアミン（０．００３７ｍｇ／ｌ）及びチミジン（０．０１０ｍｇ／ｌ）。　当業者であれば、有機炭素、窒素、微量元素、ビタミン及びアミノ酸を多数の形態で提供できることが理解されよう。一般に、ビタミン及びアミノ酸の量を少なくとも上記特定量程度にすると好適であるが、当業者であれば、各成分の実際の濃度を変更し、ある成分の量の減少を別の成分の量の増加により相殺できることが理解できよう。特定標的微生物の増殖要件が分かっている場合には特にこのようにできる。標的微生物により内因的に合成される成分は量を減らすか又は削除してもよい。このような成分の合計量が上記例に示した合計量を著しく上回ることが最も好ましい。検出特異性を維持しながら短時間（１８時間）で微生物を検出できるようにする���は、上記量の約５〜１０倍の量が特に有効である。　このような培地の他の成分としては、グラム陽性非標的微生物に作用する抗生物質、グラム陰性非標的微生物に作用する抗生物質、栄養指標の代謝を触媒する酵素インデューサー、ＤＮＡ前駆物質、アミノ酸前駆物質、並びにカリウム及びリンの補充源が挙げられる。　栄養指標は、増殖中に検出可能な特性シグナルが培地で発生するまで標的微生物の増殖を維持するのに十分な量で培地中に存在する。ビタミン、アミノ酸、微量元素、塩及び栄養指標成分の組み合わせにより標的微生物の十分な増殖が可能になり、約２４時間未満で試料に検出可能な変化を観察することができる。栄養指標は標的微生物により代謝される場合のみに試料の検出可能な特性を変化させる。従って、栄養指標は試料中の微生物の有無を確認するために使用することができる。栄養指標は培地中で標的微生物によってのみ代謝されなければならない。栄養指標を代謝することが可能な他の微生物が試料中に存在する場合には、特異的抗生物質を使用してその増殖を抑制しなければならない。更に、栄養指標は標的微生物に特異的な型の唯一の栄養源であることが好ましいが、培地は培地の特異性を低下させないような量であれば他の特異的栄養源を含んでいてもよい。例えば、栄養指標は標的微生物の唯一の炭素源であり得る。あるいは、標的微生物により優先的に使用されない他の炭素源（例えばアミノ酸）が存在していてもよい。所望により、標的微生物により優先的に使用される少量の別の炭素源が存在していてもよいが、提供量はこのような炭素源の不在下よりも培地の特異性を低下させないような量とする。　「標的微生物」なる用語は、存在の有無を判定しようとする１種以上の微生物を意味する。この用語は単一微生物（例えば大腸菌、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、微生物属、複数の関連微生物種（例えば大腸菌群）、又は共通の特性をもつ更に大きい微生物群（例えば全グラム陰性菌）を指すことができる。本発明は、固有の酵素特異性又は種々の群、科もしくは種の微生物に固有の他の特性を利用するように培地と方法を構成するものである。従って、栄養指標は標的としてどの微生物を選択するかによって変化し得る。但し、「標的微生物」なる用語が全微生物を含む訳ではない。　「１８時間」なる用語は、１００ｍｌ当たり約１〜１０個の大腸菌群細菌を含む液体試料の約９５％が検出可能な特性変化を示すために必要な時間を意味する。温度、存在する酵素インデューサーの量及び種類、培地に提供される栄養源の量、並びに細菌の相対健康状態は、いずれも検出時間に影響する。アミノ酸、ビタミン及び微量元素等の栄養源の供給量は標的微生物の増殖速度、従って検出時間に影響し得る。培地を添加後に約３５℃のインキュベーション温度まで試料を熱平衡させると、検出に必要な時間を短縮することができる。酵素インデューサーの量も検出時間を短縮できる。培地中に存在する酵素インデューサーは、栄養指標を代謝する酵素の活性又は発現を誘導するように機能する物質である。このよ���なインデューサーとしては、β−Ｄ−チオガラクトシダーゼ活性を誘導するイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）と、β−グルコシダーゼ活性を誘導するエチル−β−Ｄ−チオグルコシドが挙げられる。微生物の相対健康状態も検出に必要な時間に影響する。従って、損傷生物の回収を助けることができるピルビン酸塩等の物質を加えると、検出を速めることができる。試料中に多数の標的微生物（即ち１００ｍｌ試料当たり微生物１０未満）が存在する場合にも、より迅速な検出が可能である。本発明で提供される培地は、少量の標的微生物（即ち１００ｍｌ当たり１０未満）を１８〜２４時間以内に少なくとも９５％検出することができる。このような能力は標準方法を使用して測定することができる。　「培地」なる用語は、標的微生物の増殖及び生殖を維持するために必要な栄養源の全部又は実質的に全部を含む固体、粉末又は液体混合物を意味する。本発明は滅菌培地（即ちこのような培地では、培地を単独又は無菌希釈剤と共にインキュベーション後に増殖が生じない）と非滅菌培地の両者を含む。　「液化」なる用語は実質的に液体形態を意味するが、液体分が少なくとも１０％の固体物質の微粉砕又は均質化試料も含む。この用語は寒天で形成されるようなゲル化培地は除外する。　「環境」及び「生物」なる用語は、藻類、真菌類及び細菌類を含む１種以上の生命形態を生息させることが可能な物質から抽出するか又はこのような物質に由来することを意味する。非限定的な例としては、リクレーション設備用水、海水、飲料水、下水及び食品が挙げられる。　「接種」なる用語は、液化環境又は生物試料を本発明の培地と混合する時点又はその付近を意味する。２種の物質を実質的に混合する時点を意味する。　「有効量」なる用語は、特定時間内で標的微生物の増殖及び生殖を可能にするか又は助長する範囲内の量である。即ち、微生物を培地に適応させ、生殖に必要な成分を合成させ、その後、生殖させる量である。この量は特定量ではなく、試料寸法や標的微生物の濃度等の因子に応じて変化し得る。一般に、この用語は１ｍｌ試料当たり標的微生物１００個未満、より好ましくは１００ｍｌ試料当たり微生物１００個未満、更には１００ｍｌ試料当たり微生物１個を検出するために必要な量を示す。　「ビタミン」、「アミノ酸」、「微量元素」及び「塩」なる用語は、有機であるか無機であるかを問わずに当業者により各範疇で分類される全分子、化合物及び物質を意味し、前記範疇は生命を維持するために必要であるか又は生命の維持を誘導し得る如何なる物質も除外しない。　「抗生物質」なる用語は、１種以上の種又は群の非標的微生物の増殖及び生殖を阻止又は阻害する分子又はペプチドを意味する。例は当業者に周知であるが、この用語は、細菌増殖を特異的又は非特異的に阻害又は阻止し得る洗剤を除外する。本発明で有用であり得る特定抗生物質の例としては、コリスチン、ナリジキシン酸及びアンシオマイシンが挙げられる。　「栄養指標」なる用語は、標的微生物の必須栄養源である部分と、培地又は試料中に観察可能な特性変化を誘導又は発生する部分を含む分子又は物質を意味する。栄養指標は色原体に結合した栄養源を含む。栄養源は必須ビタミン、無機質��例えばリン酸）、微量元素、アミノ酸又は炭水化物エネルギー源（例えばラクトース）を提供し得る。微生物の栄養要求は、生殖に備えて栄養源が蓄積される相（遅滞期）から比較的速い速度で実際に生殖が行われる相（対数期）まで微生物が進行するにつれて増加する。従って、栄養指標は試料中に検出可能な特性変化を生じる増殖期間中に最適に代謝される。好ましくは、栄養指標は栄養部分と色原体を含む。色原体は、適正なエネルギー源により適正に励起されると、可視域で観察可能な変色又は蛍光を生じる任意の部分を含む。非限定的な例としては、オルトニトロフェニル、フェノールフタレイン及び４−メチルウンベリフェロン部分が挙げられる。栄養指標は単独の必須栄養源を提供してもよいが、培地の適切な選択性及び感受性が維持される限り、他のこのような栄養源も提供してもよい。　「検出可能な特性シグナル」なる用語は、人体感覚の１種以上により検出可能な試料中の任意の変化を含む。この用語の例としては、可視又は非可視波長域における変色、固体、液体及び気体等の状態変化、ガス発生、又は臭いの変化等が挙げられる。　好適態様において、培地は代謝損傷細胞の増殖を助けるために十分なピルビン酸ナトリウムを含む。「代謝損傷」なる用語は、細胞代謝が外傷により最適又は生体恒常状態から変化する場合を含む。「代謝損傷」の例としては、過剰の熱、冷温、塩素化又は乾燥条件への細胞暴露の場合が挙げられる。　別の好適態様では、栄養指標は微生物特異的培地を変色させる。変色は可視波長域に現れてもよいし、外部紫外線源の照射後に可視波長域に出現する蛍光でもよい。変色は一般に栄養指標からの色原部分の酵素遊離に起因する。この部分は栄養指標の栄養部分と結合すると呈色し、非結合形態の場合（即ち栄養部分ともはや結合していない場合）には無色である。栄養部分と結合し得る色原部分の非限定的な例としては、栄養指標から遊離すると黄変するオルトニトロフェニル部分、栄養指標から遊離すると赤変するフェノールフタレイン部分、栄養指標から遊離すると、約３６６ｎｍで励起時に蛍光になる４−メチルウンベリフェロン部分、及び栄養指標から遊離すると青変するブロモクロロインドール部分が挙げられる。　「微生物特異的培地」なる用語は、標的微生物のみを実質的に増殖させることができる培地を意味する。これは、標的微生物以外の微生物の増殖を阻害するために特異的な１種以上の抗生物質を含有する培地と、このような抗生物質の代わり又はそれに加えて、標的微生物以外の微生物により実質的な程度まで代謝されないことが好ましい１種以上の栄養指標を含有する培地を含む。この関連で使用する「実質的」なる用語は、標準方法により測定した場合に培地が標的微生物をまだ特異的（即ち少なくとも９５％、更には９８％の精度）且つ高感度（即ち少なくとも９５％、更には９８％の検出レベル）で検出できることを意味する。　更に別の好適態様では、微生物は大腸菌群細菌であり、又はより特定的には標的微生物は大腸菌である。他の好適態様は栄養指標の選択を含む。１好適態様では、栄養指標はβ−Ｄ−グルクロニダーゼ基質であり、例えばオルトニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド、β−ナフタルアミド−β−Ｄ−グルクロニド、α−ナフトール−β−Ｄ−グルクロニド及び４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドである。あるいは、栄養指標はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ基質であり、例えばオルトニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド及び４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドである。栄養指標はβ−Ｄ−グルコシダーゼ基質でもよく、例えばオルトニトロフェニル−β−Ｄ−グルコースである。更に別の態様では、栄養指標は例えばオルトニトロフェニル−β−Ｌ−ピロニドニル、β−ナフタルアミド−β−Ｌ−ピロニドニル、α−ナフトール−β−Ｌ−ピロニドニル及び４−メチルウンベリフェリル−β−Ｌ−ピロニドニル等のＬ−ピロニドニルアミノペプチダーゼ基質でもよいし、栄養指標は例えばＬ−アラニン−β−Ｌ−オルトニトロフェニル、β−ナフタルアミド−β−Ｌ−アラニン、α−ナフトール−β−Ｌ−アラニン及び４−メチルウンベリフェリル−β−Ｌ−アラニン等のＬ−アラニンアミノペプチダーゼ基質でもよい。　「大腸菌群」なる用語は、β−ガラクトシダーゼ活性を示し、一般にヒトの胃腸管に生息する非胞子形成グラム陰性、オキシダーゼ陰性桿菌群の任意のものを意味する。この群は、これらの菌が水中に存在していると、当業者が糞便汚染の推定証拠であるとみなす肺炎桿菌及び大腸菌や、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ及びＳｅｒｒａｔｉａ　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａを含む。　好ましくは、培地は標的微生物以外の微生物が栄養指標を代謝するのを阻止する１種以上の抗生物質も含有する。即ち、培地は標的微生物以外の微生物の増殖の特異的阻害剤であり、このような微生物の少なくとも数種の増殖を有効に阻止する抗生物質を含有する。より好ましくは、これらの抗生物質は１種以上のグラム陽性及びグラム陰性非大腸菌群細菌に作用する。他の細菌及び酵母に対して有用であり得るこのような抗微生物剤の例としては、コリスチン、ナリジキシン酸、アンシオマイシン及びアンホテリシンＢが挙げられる。　本発明の別の特徴は、環境又は生物液体試料中の標的微生物の有無の検出方法であり、該方法は好ましくは、微生物特異的培地の添加後に試料を液体インキュベーター中でインキュベーション温度まで加温する段階を含む。より好ましくは、インキュベーション温度は約３５℃である。「液体インキュベーター」なる用語は特定温度又は温度範囲まで加温した液体を意味する。これは例えば任意形態の水浴を含み得る。培地は空気インキュベーターよりも液体インキュベーターのほうが迅速に最適インキュベーション温度に到達することができるので、このようなインキュベーターは従来使用されていた空気インキュベーターよりも有利である。　本発明は更に、２４時間以内に環境又は生物液体試料中の標的微生物の有無を検出する方法にも関する。本方法を使用すると、僅か約１８時間以内に大腸菌及び他の大腸菌群を検出することができる。本方法では、まず試料を本発明の培地と混合し、試料と培地の混合物をインキュベーション温度、好ましくは３５℃まで約２０分間加温する。次に試料を空気インキュベーターに移して好ましくは３５℃で約１８時間保温する。培地は、大腸菌群微生物が増殖及び生殖できるように有効量のビタミン、アミノ酸、微量元素及び塩を含有する。更に、培地は大腸菌群細菌の増殖を維持し、標的微生物により代謝されると検出可能な特性シグナルを発生する有効量の栄養指標を含有する。次に試料をモニターし、検出可能な特性が変化したか否かを調べる。好ましくは、培地は試料中に潜在的に存在する非大腸菌群の増殖を阻害又は阻止するために十分な量の１種以上の抗生物質も含有する。　他の態様では、本発明はその開示内容を参考資料として本明細書の一部とするＮａｑｕｉらの米国特許出願第０８／２０１，１１０号に記載されている装置を使用する。定量段階は、環境又は生物試料を液体形態で提供する段階を含む。Ｎａｑｕｉらに記載されている試料保持袋に試料を分配し、培地と混合して標的細菌の増殖を可能にし、助長する。混合物をインキュベートし、変色の量及び品質を検出する。得られた量及び品質を細菌濃度が分かっている一連の試料と比較する。　本発明は標的微生物の存在を判定するための最適化培地を提供する。ビタミン及びアミノ酸の供給量を増加した結果、微生物、例えば細菌は本発明の培地のほうが現在入手可能な培地よりも著しく迅速に増殖する。従って、より迅速に試験結果を入手できる。迅速に結果が得られるため、実験室の費用と時間の両者を節約できる。速度が増すため、公衆衛生への脅威も緩和され、飲料水源及びリクレーション設備用水等の場所で所定の微生物の存在に対処する早期警戒及び救済対策が可能になる。更に、本発明の方法は微生物特異的栄養指標を使用できるので、一般に確認試験が不要になる。更に、本発明は滅菌培地を使用する必要がない。　本発明の他の特徴及び利点は、好適態様に関する以下の説明及び請求の範囲から容易に理解されよう。好適態様の説明の簡単な説明　以下の記載では、化学、生物学及び微生物学分野の当業者に公知の種々の方法を引用する。引用するこのような公知方法を掲載している刊行物及び他の資料は、その開示内容全体を参考資料として本明細書の一部とする。本発明の組成物、方法及び生成物は生物及び環境試料に適用することができ、化学、生物学及び微生物学分野で微生物を検出するために有用である。酵素特異性に基づく微生物の検出　特定微生物は多数の栄養源からその栄養を摂取する。他方、特定の資源を代謝する能力は特定微生物又は特定群の微生物に固有であり得る。複数の科、群又は種の微生物が、他の微生物には欠損している所定の栄養に対する酵素特異性を共有する場合もある。特定微生物の代謝特性を利用することにより、これらの酵素系、従って、これらの酵素系自体を示す微生物の存在を試験することができる。Ｅｄｂｅｒｇ，前出参照。特定群の微生物に特異的な多数の酵素が同定されており、今後も更に同定されると思われる。グラム陰性菌　グラム陰性菌はその外側細胞膜の一部として内毒素を含む。グラム陰性菌は環境又は生物試料と医薬品及び他の医療品を汚染する恐れがある。従って、グラム陰性菌が存在するか否かを試験するために有効なスクリーニング法を利用できることが重要である。　グラム陰性菌にはＬ−アラニンアミノペプチダーゼ酵素活性をもつ１群がある。グラム陰性菌の有無を試験するためには、Ｌ−アラニン−β−オルトニ���ロフェニル、β−ナフタルアミド−β−Ｌ−アラニン、α−ナフトール−β−Ｌ−アラニン及び４−メチルウンベリフェリル−β−Ｌ−アラニン等の栄養指標を培地中で栄養指標として使用することができる。培地から全グラム陽性菌を除去するために有用な抗生物質は当業者に周知である。従って、グラム陽性菌を除去する抗生物質を含有する培地中でＬ−アラニンアミノペプチダーゼ活性の栄養指標を使用することにより、任意のグラム陰性菌の存在を検出することができる。腸球菌　酵素β−Ｄ−グルコシダーゼは腸球菌群の細菌に存在する。この酵素はβ−グルコシドに結合した色原又は蛍光原部分を含む適当な栄養指標の加水分解を触媒することができる。この性質を利用して試料中の腸球菌の有無を指示することができる。腸球菌の存在を指示するには、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコピラノシド等の栄養指標を使用することができる。β−Ｄ−グルコシダーゼ活性を発現する他の微生物の増殖は、これらの非標的微生物の増殖を維持し且つ腸球菌の増殖を実質的に阻害しない抗生物質を含有する培地を提供することにより阻害することができる。このような抗生物質の例は硫酸アミカシン、バシトラシン及びアンホテリシンＢである。更に、約９．６の高ｐＨ又は約４５℃の高温の増殖環境を提供することによっても、他の生物の増殖を阻害することができる。腸球菌はこの高ｐＨ及び高温で増殖することができるので、このような条件下で腸球菌を特異的に検出することができる。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）　この種はリン酸オルトニトロフェニルを代謝することができる。従って、増殖培地が唯一のリン酸源としてこの栄養指標を含む場合、黄色ブドウ球菌は増殖するが、リン酸オルトニトロフェニルを代謝することができない微生物は増殖しない。オルトニトロフェニル部分の遊離により変色が生じる。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ　この種はその硫黄源としてＳＯ４を必要とし、この種は硫酸フェノールフタレインを代謝することができる。従って、この種は硫酸フェノールフタレインを唯一の硫黄源とする選択培地中で増殖し、着色部分の遊離により特徴的変色を生じる。大腸菌検出　酵素β−Ｄ−グルクロニダーゼは大腸菌に存在する。大腸菌を検出するために培地で使用可能な栄養指標の例は、オルトニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド、β−ナフタルアミド−β−Ｄ−グルクロニド、α−ナフトール−β−Ｄ−グルクロニド又はメチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド等の栄養指標である。グラム陰性菌及び酵母から大腸菌を選択するために、約０．０００１重量％〜０．０１重量％の抗生物質バンコマイシン及びアンシオマイシンを加えてもよい。　Ｅｄｂｅｒｇの米国特許第４，９２５，７８９号は、約２４時間インキュベーション後に試料中で大腸菌を特異的に検出することができる液体系細菌増殖培地について報告している。同特許は、容量１００ｍｌ中で１ＣＦＵ（コロニー形成単位）の存在を検出する特異性を報告している。他方、Ｅｄｂｅｒｇの具体例に対比すると、本発明に記載の他の培地又は方法を使用する場合には大腸菌等の細菌を含む全大腸菌群を約１８時間以内に検出することができ、しかも��くべきことに容量１００ｍｌ当たり１ＣＦＵを検出する特異性を維持することができる。具体的には、本発明は細胞増殖を助長するためにビタミン及びアミノ酸の配合量を増加した培地に関する。例えば、ビタミン及びアミノ酸の量をＥｄｂｅｒｇにより記載されている培地の量よりも増加すると、より短い検出時間が得られる。大腸菌を検出するためには以下の化合物を含有する培地が特に有用であり、より迅速な増殖速度と優れた特異性により、２４時間以内の検出が可能である。指定量の５〜１０倍のレベルの量の配合剤Ｉを提供すると、１８時間以内に大腸菌を検出することができる。　特定アミノ及びビタミンと数種の元素を記載するが、当業者であれば特異性を低下させずに各成分の相対量を大幅に変更できることが理解されよう。2004089196.tif 000002
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　本発明の培地の更に特定的な例では、配合剤Ｉは表Ｉに示す量の１０倍の量（±１０％）で配合剤ＩＩと共に提供される。これを本明細書では培地２と呼ぶ。全大腸菌群細菌　酵素に基づく栄養指標検出システムは、１８時間以内に容量１００ｍｌ中に１個の大腸菌群細菌を検出する特異性をもつ。培地中で一次炭水化物源としてオルトニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を使用する場合には、１８時間後に試験培地中に強い黄変が出現するか否か培地をモニターすることにより、全大腸菌群細菌を検出することができる。酵素β−Ｄ−ガラクトシダーゼは全大腸菌細菌に存在し、オルトニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの加水分解を触媒するように作用する。この反応は不可逆的であると共に、大腸菌群細菌の存在に極めて感受性である。全大腸菌群のうちで大腸菌が存在する場合には、３６６ｎｍ域の紫外線ランプを試料の近くに置くと培地は蛍光青変する。この蛍光は、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ）の加水分解により蛍光化合物４−メチルウンベリフェロン（ＭＵ）を生じるためであり、反応は９７％を上回る大腸菌株に存在する酵素β−Ｄ−グルクロニダーゼにより触媒される。　最高速度の細菌増殖と酵素活性を生じるように培地を最適化すると、最大速度且つ最低費用で検出を達成することができる。更に、代謝損傷細菌の回収及び増殖を助けるために、ピルビン酸ナトリウムを培地に添加してもよい。通常は約０．０００５重量％の量で十分である。また、試料を乾燥インキュベーターに入れる前に約３５℃の水浴に２０分間浸して試料と培地の混合物を約３５℃まで熱平衡させると、検出所要時間は著しく短縮する。水中の大腸菌群細菌の分析　飲料水及びリクレーション設備用水中の大腸菌群細菌の存在を検出することは重要である。水中に抗菌剤が存在する場合には、チオ硫酸ナトリウム又はＥＤＴＡナトリウム等の中和剤を加えると有用な場合もある。あるいは、標準方法に従って試料を調製することにより、大腸菌群細菌の存在を検出することもできる。水試料１００ｍｌを収集し、試料に増殖培地を加え、細菌増殖を誘導する温度（通常は３５℃）で試料をインキュベートすると、約１８時間後に試料の変色により大腸菌群細菌の存在が示される。試料と培地の混合後２２時間までの任意の時点で陽性結果が生じることもある。比較的高濃度の大腸菌群細菌の存在下では著しく迅速に結果が表れる場合もある。本発明に記載の培地及び方法を使用すると、容量１００ｍｌ中大腸菌群細菌１個の存在を測定することができる。色原部分　色原部分を含む多数の基質が特異的酵素活性を示す標的微生物を含む試料中で特徴的変色を示すことは立証されている。例えばβ−Ｄ−グルクロニダーゼの存在下では、大腸菌が存在する場合にはオルトニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニドは黄変し、４−メチルウンベリフェリルグルクロニドは３６６ｎｍで励起後に蛍光を発生し、ブロモクロロインドール−β−Ｄ−グルクロニドは青変する。β−Ｄ−ガラクトシダーゼの存在下では、オルトニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドは黄変し、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドは３６６ｎｍで励起後に蛍光を発生する。　所定の組み合わせは大腸菌と全大腸菌群細菌の存在を検出するのに有効であることが立証されている。４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドはオルトニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドと併用することができる。大腸菌群細菌が存在する場合には、溶液は可視波長域内で黄変する。大腸菌と他の大腸菌群細菌が存在する場合には、試料溶液は黄変すると共に、３６６ｎｍで励起後に蛍光を発生する。　栄養指標は当業者に周知の方法により製造することができる。方法は一般に栄養部分を色原部分に結合して栄養指標とすることを特徴とする。このような方法の例はＥｄｂｅｒｇの米国特許第４，９２５，７８９号に記載されている。現在利用可能な検出方法　飲料水中の微生物の存在を調査するために広く受け入れられている２種の標準方法は、多重管発酵を最高確率数分析（ＭＰＮ）試験及び膜濾過（ＭＦ）試験と組み合わせた方法である。大腸菌群細菌を検出するためのこれらの方法のプロトコルは、推定試験と確認試験を併用し、完了までにおよそ４８〜９６時間を要する。また、１ｍｌ当たり５００個を越える非大腸菌群細菌が存在する場合には偽陽性又は偽陰性示度を生じる恐れがあるので、試験の結果が混乱する。　Ｅｄｂｅｒｇの米国特許第４，９２５，７８９号に記載されているＣＯＬＩＬＥＲＴ（登録商標）試験の発明は、従来利用可能であった方法よりも著しく前進した。この方法を使用すると、試料１００ｍｌ当たり微生物１個程度の低濃度の試料中の大腸菌群細菌を検出することができる。この方法は、微生物同定のために推定段階と確認段階の併用を特徴とする。従って、検出速度が著しく速く、非大腸菌群細菌の増殖を著しく制限する種々の選択物質が培地中に存在するため、偽陰性又は偽陽性示度を得る可能性が著しく低下する。他方、本発明の培地は従来使用されている培地の少なくとも２倍の濃度のアミノ酸、ビタミン、微量元素及び塩を使用するものである。驚くべきことに、このように培地を変更すると、特異性を低下せずに著しく迅速な検出が得られる。　本発明は、試料中の大腸菌群細菌及び大腸菌を検出する既存方法と同等の性能であった。検出方法　液体試料を上記培地と混合し、培地を含む液体試料を適当なインキュベーション用容器に入れ、液体試料と培地の混合物をインキュベートし、検出可能な特性シグナルの量及び品質を観察し、検出可能な特性シグナルの量及び品質を最高確率数値と比較することにより、液体試料中に存在する標的微生物の数を定量することができる。この定量方法は、変化した特性の量及び品質、好ましくは変色を最高確率数値と比較することを特徴とし、最高確率数値は既知細菌濃度の試料と濃度及び特性変化を相関させておいた試料から得られる。例えばＶａｎｄｅｒｚａｎｔとＳｐｌｉｔｔｓｔｏｅｓｓｅｒ編，Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｏｏｄｓ，第３版，１９９２参照。最高確率数法は、他の方法の検出可能な限界を下回る細菌濃度を定量することができる。最高確率数は、試料の１種以上の希釈液中で結果が陽性又は陰性として報告される応答から推定される。この方法は、全試料が陽性結果��提供する必要はなく、通常は各希釈液の少なくとも３個の試料が必要である。多数の最高確率数値表が入手可能である。このような系列の１例は、その開示内容を参考資料として本明細書の一部とするｄｅ　Ｍａｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　１：６７　（１９７５）に記載されている。最高確率数の推定は、Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｗａｔｅｒ　Ｗｏｒｋｓ　Ａｓｓｏｃ．　３４：５７２（１９４２）に報告されている一般式：ＭＰＮ／ｇ＝Ｐ／（ＮＴ）を使用して実施することができ、式中、Ｐは陽性試験管数であり、Ｎは全陰性試験管中の試料の合計量であり、Ｔは全試験管中の試料の合計量である。量はグラムで表される。　Ｎａｑｕｉらはその開示内容を参考資料として本明細書の一部とする係属米国特許出願第０８／２０１，１１０号において、液体試料中の細菌数の精密定量法を記載している。同発明は、液体試料を保持する新規装置を使用している。同装置は、液体試料を収容するように設計された袋から構成されることを特徴とし、１種以上の寸法の各アリコートを試験できるように、袋の内側の分離した区画に液体試料を分配する。同出願に記載されている発明は更に、培地を加えて微生物の増殖を助長し、約２５０°Ｆ〜３５０°Ｆの温度で約５秒間同発明の袋をヒートシールし、試料を適当な温度で適当な時間インキュベートして微生物を増殖させ、結果を記録及び分析することにより、試料中に存在する微生物を定量することができる。定量段階は、変色の量及び品質を検出し、生存可能な合計細菌の濃度が分かっている一連の試料で得られた結果と前記量及び品質を比較することにより行われる。実験１損傷生物プロトコル　下記プロトコルは米国ＥＰＡ手順による。この手順に従い、損傷微生物の試料を収集した。この手順は、本発明の培地と従来技術の培地で結果を得るために必要な特異性及び時間を比較するのに使用する試料の適正なサンプリング及び管理を確保するための手段として記載する。　１．外部源（例えば廃水処理施設）から新鮮な一次排水２リットルを得る。　２．排水をＷｈａｔｍａｎ−４０（１５０ｍｍ直径）フィルターに通す。　３．塩素損傷に先立って濾液を室温にする。　４．排水のｐＨと温度を調べた後、チオ硫酸ナトリウムを含まない２１個のポリスチレン容器に４９．５ｍｌアリコートを分配する。　５．試料をＲｏｔｏ−Ｍｉｘ　５０８００プラットフォーム（設定２）に載せて室温で震盪する。　６．ＮａＯＣｌ（次亜塩素酸ナトリウム）溶液（５〜６％）を最終濃度５ｐｐｍで各試料に分注する。すぐに１個の試料の合計及び遊離塩素濃度を調べる。　７．２分後に１０％チオ硫酸ナトリウム溶液２５μｌを第１の試料に加える。最初の添加後２分間隔で同一量のチオ硫酸ナトリウムを残りの試料に加える。　８．チオ硫酸ナトリウムの添加の直前に損傷の中間点及び最後の試料中の合計及び遊離塩素濃度を測定する。　９．ｍＥｎｄｏプレートで膜濾過により各試料中の生存大腸菌群細菌の数を測定し、ｍＥｎｄｏプレートで膜濾過（希釈必要）により未処理排水中の大腸菌群細菌の原濃度を測定する。　１０．インキュベーションから２２〜２４時間後に各ｍＥｎｄｏプレート（大腸菌の選択培地）上の大腸菌群細菌の数を計数��る。合計大腸菌群細菌濃度が２Ｌｏｇ１０〜４Ｌｏｇ１０低下した適当な試料を選択し、この試料の２倍系列希釈液を調製する。実施する希釈回数は存在する生存大腸菌群細菌の数に依存し、大腸菌群細菌を含まない少なくとも２種の希釈液が必要である。損傷生物の有無の検出　本実験の趣旨は、培地２及びＣｏｌｉｌｅｒｔ（登録商標）培地が塩素化一次排水からの損傷大腸菌群細菌及び大腸菌の存在を検出する相対性能を比較することである。２種の培地を比較するために実施した手順は、まず各希釈塩素化排水試料を試験培地に接種することから出発し、各希釈液１ｍｌを３本のＣｏｌｉｌｅｒｔ（登録商標）試験管に接種し、各希釈液１ｍｌを３本の培地２試験管に接種した。次に、培地２試験管を３５℃±０．５℃水浴中で２０分間熱平衡させ、Ｃｏｌｉｌｅｒｔ試験管は３５℃±０．５℃乾燥インキュベーターに入れた。２０分後に培地２試験管を３５℃乾燥インキュベーターに入れた。その後、色と蛍光をモニターした処、培地２では１８時間、Ｃｏｌｉｌｅｒｔ（登録商標）培地では２４時間で結果が記録された。無作為抽出した陽性培地２試料をＥＭＢ寒天に画線培養し、単離し、ＡＰＩ　２０Ｅを用いて更に同定した。結果　これらの試験ではジョージア州、メーン州、コネクティカット州及びカリフォルニア州の４種の別々の地理的に多様な地点からの７種の排水を使用した。合計２０１本の培地２試験管と２０１本のＣｏｌｉｌｅｒｔ（登録商標）試験管に処理済み排水希釈液を接種した。次の結果が得られた。2004089196.tif 000005
　カイ二乗検定試験による分析の結果、これらの値は９５％信頼性指数限界内で有意差ゼロであった。ＡＰＩ　２０Ｅキットを使用して合計４３個の陽性培地２試料を分析した処、４３個の試料はいずれも大腸菌群細菌を含んでいた。これらのデータから明らかなように、培地２は１８時間インキュベーション後に、２４時間インキュベーション後のＣｏｌｉｌｅｒｔ（登録商標）培地と同等数の損傷大腸菌群細菌及び大腸菌を検出した。従って、本発明の培地はＣｏｌｉｌｅｒｔ（登録商標）培地と同等の特異性であり、Ｃｏｌｉｌｅｒｔ（登録商標）培地は検出に２４時間かかるが、本発明の培地は１８時間で微生物を検出することができる。実験２損傷生物ＭＰＮ法とＬＴＢ法の比較　本実験の趣旨は、培地２が塩素化一次排水から損傷大腸菌群細菌及び大腸菌の存在を検出する性能をラウリルトリプトースブロス（ＬＴＢ）（ＥＰＡリファレンス）法と比較することである。まず各希釈液１００μｌを１０本の培地２試験管（各１０ｍｌ）に加え、各希釈液１００μｌを１０本のＬＴＢ試験管（１倍濃度）に加えて各希釈試料を試験培地に接種することにより試験結果を得た。次に、培地２試験管を３５℃水浴中で２０分間熱平衡させた。ＬＴＢ試験管は直接３５℃乾燥インキュベーターに入れた。２０分後に培地２試験管を３５℃乾燥インキュベーターに入れた。その後、色と蛍光をモニターした処、培地２では１８時間で結果が記録された。無作為抽出陽性培地２試料をＥＭＢ寒天に画線培養し、単離し、ＡＰＩ　２０Ｅを用いて更に同定した。次に、２４及び４８時間インキュベーション後にＬＴＢ試料にガスが存在するか否かを調べた。ガスが存在していた場合には、試料をＢＧＬＢ（ブリリアントグリーンラクトースブロス）１０ｍｌ及び大腸菌と４−メチルウンベリフェロングルクロニドブロス（ＥＣ−ＭＵＧ）１０ｍｌに接種した。ＢＧＬＢ試験管を３５℃乾燥インキュベーターで２４〜４８時間インキュベートした。ＥＣ−ＭＵＧ試験管は４４．５℃水浴中で２４時間インキュベートした。ＢＧＬＢ試験管にガスが存在するならば、大腸菌群細菌が存在する。ＥＣ−ＭＵＧ試験管にガスと蛍光が存在するならば、大腸菌が存在する。ＢＧＬＢ及びＥＣ−ＭＵＧ試験管がインキュベーションを終了後に実験は完了する。結果　本試験ではメーン州とカリフォルニア州の２種の一次排水地点からの２種の排水を使用した。合計２４０本の培地２ＭＰＮ試験管を２４０本のＬＴＢ試験管と比較した。結果は以下の通りである。2004089196.tif 000006
　カイ二乗検定試験による分析の結杲、これらの値は９５％信頼性指数限界内で有意差ゼロであった。ＡＰＩ　２０Ｅキットを使用して合計４６個の陽性培地２試料を分析した処、４６個の試料はいずれも大腸菌群細菌を含んでいた。従って、培地２はＬＴＢ法よりも一次排水から損傷大腸菌群細菌及び大腸菌を回収する性能が優れている。実験３従属栄養干渉　本実験の趣旨は、培地２及びＣｏｌｉｌｅｒｔ（登録商標）培地が高濃度の従属栄養細菌の存在下で非損傷大腸菌群細菌及び大腸菌を検出する性能を試験することである。以下の手順に従った。まず各１００ｍｌの培地２及びＣｏｌｉｌｅｒｔ（登録商標）試験管に１〜１０ＣＦＵの下記細菌：大腸菌（ＡＴＣＣ２５９２２）、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ（ＡＴＣＣ８０９０）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ１３８８３）及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ（ＡＴＣＣ３３４５７）を接種した。第２組の試料でこの段階を繰り返した。第２組の試験管にはＡｅｒｏｍｏｎａｓ　ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ（ＡＴＣＣ３５６５４）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＡＴＣＣ１０１４５）又はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ（天然単離体）を１６，０００〜１０，０００ＣＦＵ／ｍｌの濃度範囲で接種した。培地２及びＣｏｌｉｌｅｒｔ（登録商標）試験管にＡ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ又はＰ．ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ単独を接種し、偽陽性結果を試験した。培地２試験管を３５℃水浴中で２０分間熱平衡させ、Ｃｏｌｉｌｅｒｔ（登録商標）試験管は３５℃乾燥インキュベーターに入れた。２０分後に培地２試験管を３５℃乾燥インキュベーターに入れた。その後、色と蛍光をモニターした処、培地２では１８時間、Ｃｏｌｉｌｅｒｔ（登録商標）では２４時間で結果が記録された。結果　下記結果が得られた。2004089196.tif 000007
　本試験では合計３６本の培地２及び３６本のＣｏｌｉｌｅｒｔ試験管を試験した。各３６本の試験管のうち９本が大腸菌を含んでいた。2004089196.tif 000008
　本試験では合計２４本の培地２と２４本のＣｏｌｉｌｅｒｔ試験管を試験した。　下記請求の範囲には他の態様も含まれる。