(57)【要約】【課題】新規な精製ヒト蛋白質及びこの蛋白質を利用した癌診断剤等の提供。【解決手段】本発明は、新規な核酸分子、この核酸分子が存在するか否かを決定する方法及びその結果に基づいて行う癌の判別方法を提供する。また、本発明は当該核酸分子により発現される新規な精製ヒト蛋白質、この蛋白質を発現する組換え体ＤＮＡ、この組換え体ＤＮＡにより形質転換された形質転換体又は形質導入体、及び本発明の蛋白質に対する抗体、並びに本発明の蛋白質及び核酸分子の用途を提供する。本発明に係る上記核酸分子は、遺伝子診断用プローブや遺伝子治療用遺伝子源として用いることができる。また、被検試料中に当該核酸分子が存在するか否かを決定することにより、癌の判別を行うことが出来る。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列である核酸分子。
【請求項２】
配列番号３の塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列である核酸分子。
【請求項３】
核酸分子がＤＮＡである、請求項１又は２記載の核酸分子。
【請求項４】
請求項１〜３に記載の核酸分子の塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸分子。
【請求項５】
核酸分子がＤＮＡである、請求項４記載の核酸分子。
【請求項６】
ヒト細胞に由来する又はヒト細胞を含有する被検試料が、配列番号３の塩基配列を含有するか否かを決定する方法であって、下記の過程を含んで成る方法。
（１）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、前記被検試料を、
（ｉ）配列番号３の塩基配列を有する核酸又はその断片、
（ｉｉ）  （ｉ）の何れかの核酸に相補的な配列を有する核酸、
（ｉｉｉ）５０  ％  ホルムアミド中で４２〜７０℃でのハイブリダイゼーション、
その後の０．２〜２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で２５〜７０℃での洗浄後に、
（ｉ）又は（ｉｉｉ）の核酸にハイブリダイズする核酸、
から成る群から選択される核酸プローブと共にインキュベートすること；
（２）各試料における前記プローブによるハイブリダイゼーションが生じた量を決定すること、
（３）（２）の量に基づいて、配列番号３の塩基配列を含有するか否かを決定すること。
【請求項７】
予め別試料を用いて別試料のハイブリダイゼーションが生じた量を決定し、被検試料のハイブリダイゼーションが生じた量と比較することによって、被検試料中に、当該核酸が含まれるか否かを決定する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
配列番号３の塩基配列を有する核酸の断片が、配列番号２の塩基配列から選ばれたものである、請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
下記の何れかを含んで成る、ヒト細胞に由来する又はヒト細胞を含有する被検試料が配列番号３の塩基配列を含有するか否かを決定するためのキット。
（ｉ）配列番号３の塩基配列を有する核酸又はその断片、
（ｉｉ）  （ｉ）の何れかの核酸に相補的な配列を有する核酸、
（ｉｉｉ）  （ｉ）又は（ｉｉｉ）の核酸にハイブリダイズする核酸。
【請求項１０】
配列番号３の塩基配列を有する核酸の断片が、配列番号２の塩基配列から選ばれたものである、請求項９記載のキット。
【請求項１１】
請求項６又は７記載の方法によって、被検試料中に当該核酸が含まれるか否かを決定し、その結果に基づいて行う癌の判別方法。
【請求項１２】
下記の何れかを含んで成る、癌判別用キット。
（ｉ）配列番号３の塩基配列を有する核酸又はその断片、
（ｉｉ）  （ｉ）の何れかの核酸に相補的な配列を有する核酸、
（ｉｉｉ）  （ｉ）又は（ｉｉｉ）の核酸にハイブリダイズする核酸。
【請求項１３】
配列番号３の塩基配列を有する核酸の断片が、配列番号２の塩基配列から選ばれたものである、請求項１２記載のキット。
【請求項１４】
配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする蛋白質又はその塩。
【請求項１５】
配列番号１で表されるアミノ酸配列から成る蛋白質をコードする配列を有する核酸分子。
【請求項１６】
核酸分子がＤＮＡである、請求項１５記載の核酸分子。
【請求項１７】
請求項１５又は１６に記載の核酸分子の塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸分子。
【請求項１８】
核酸分子がＤＮＡである、請求項１７記載の核酸分子。
【請求項１９】
請求項１、２又は請求項１５に記載の核酸分子が組み込まれた組み換え体ＤＮＡ。
【請求項２０】
請求項１９記載の組み換え体ＤＮＡにより形質転換又は形質導入された形質転換体又は形質導入体。
【請求項２１】
請求項２０記載の形質転換体又は形質導入体を培養し、得られた培養物から蛋白質又はその塩を分離することを特徴とする、配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする蛋白質又はその塩の製造方法。
【請求項２２】
請求項１４記載の蛋白質又はその塩を含有して成る医薬組成物。
【請求項２３】
請求項１４記載の蛋白質又はその塩に対する抗体。
【請求項２４】
請求項２３記載の抗体を含有して成る癌診断剤。
【請求項２５】
請求項２３記載の抗体を含有して成る医薬組成物。
【請求項２６】
請求項２３記載の抗体を用いることを特徴とする、請求項１４記載の蛋白質又はその塩の測定法。
【請求項２７】
請求項２３記載の抗体を含んで成る、請求項１４記載の蛋白質又はその塩の測定用キット。
【請求項２８】
請求項２６記載の方法によって、被検試料中に当該蛋白質が含まれるか否かを決定し、その結果に基づいて行う癌の判別方法。
【請求項２９】
予め別試料を用いて別試料中の当該蛋白質量を測定し、被検試料中の当該蛋白質量と比較し、その結果に基づいて行う、請求項２８記載の判別方法。
【請求項３０】
請求項２３記載の抗体を含有して成る、癌判別用キット。
【請求項３１】
請求項１４記載の蛋白質又はその塩を用いることを特徴とする、請求項１４記載の蛋白質又はその塩の活性を促進若しくは阻害する化合物又はその塩のスクリーニング方法。
【請求項３２】
請求項１４記載の蛋白質又はその塩を含有して成る請求項１４記載の蛋白質又はその塩の活性を促進若しくは阻害する化合物又はその塩のスクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な塩基配列を有する核酸分子、並びに当該核酸分子の用途、特に癌の判別方法への使用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
現在までに、癌関連の遺伝子としては、細胞の増殖因子、或いは受容体の遺伝子として、脳腫瘍に関係するＰＤＧＦ（Ｒｏｓｓ，  Ｒ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ｖｏｌ．３６２，  ｐ．８０１，  １９９３）、乳癌に関係するｅｒｂ−Ｂ，ｅｒｂ−Ｂ２（Ｂｕｒｄｅｎ，  Ｓ．，  Ｙａｒｄｅｎ，  Ｙ．，  Ｎｅｕｒｏｎ，  ｖｏｌ．１８，  ｐ．８４７，  １９９７）等が見出されている他、シグナル伝達を促進する大腸癌に関係するＫｉ−ｒａｓ、白血病に関与するＮ−ｒａｓ、細胞の増殖促進遺伝子を活性化する転写因子の白血病，乳癌，胃癌等に関与するｃ−ｍｙｃ（Ｍａｈｅｓｗａｒａｎ，  Ｓ．，  Ｌｅｅ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ，  Ｅ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．１４，  Ｎｏ．２，  ｐ．１１４７  １９９４）、神経芽腫に関与するＮ−ｒａｓ（Ｓｃｈｗａｂ，Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，    Ｎａｔｕｒｅ，  ｖｏｌ．３０５，  ｐ．２４５，  １９８３）、肺癌に関与するＬ−ｍｙｃ（Ｎａｕ，  Ｍ．  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ｖｏｌ．３１８，  ｐ．６９，  １９８５）、さらにＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−１、ＭＤＭ２等の濾胞性Ｂ細胞性リンパ腫，乳癌，頭頚部癌，ｐ５３癌抑制蛋白質と拮抗する蛋白質等の蛋白類の遺伝子（Ｒｅｅｄ，  Ｊ．Ｃ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ｖｉｌ．３８７，  ｐ．７７３，  １９９７  ；Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒ，Ｌ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ｖｏｌ．３５６，  ｐ．２１５，  １９９２）等多数の遺伝子が見出されている。また、これらの遺伝子とは異なり、癌細胞の増殖を抑制するように働く遺伝子であるＡＰＣ、ＤＰＣ４、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＭＴＳ１、ＲＢ、Ｐ５３、ＷＴ１等も多数発見されている（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，  ｐ．３２，  １９９６）。これらの遺伝子は細胞、組織が癌化した時に見出された特異的な蛋白質を分析し、そのアミノ酸配列の情報を基にして同定された物であり、その発見の経緯は種々である。また、現在発見されているこれらの遺伝子だけでは、癌の発生、治癒を説明できるものではない。
【０００３】
また、最近のヒト遺伝子の解析から、機能が不明のＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇ）  の塩基配列が多数報告されてきている。
【０００４】
そこで、癌に特異的な蛋白質の遺伝子を見出し、それを利用した新たな癌の判別方法、また、予防・治療剤の開発が望まれていた。
【０００５】
【非特許文献】Ｒｏｓｓ，  Ｒ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ｖｏｌ．３６２，  ｐ．８０１  （１９９３）
【非特許文献】Ｂｕｒｄｅｎ，  Ｓ．，  Ｙａｒｄｅｎ，  Ｙ．，  Ｎｅｕｒｏｎ，  ｖｏｌ．１８，  ｐ．８４７  （１９９７）
【非特許文献】Ｍａｈｅｓｗａｒａｎ，  Ｓ．，  Ｌｅｅ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ，  Ｅ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．１４，  Ｎｏ．２，  ｐ．１１４７  （１９９４）
【非特許文献】Ｓｃｈｗａｂ，Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，    Ｎａｔｕｒｅ，  ｖｏｌ．３０５，  ｐ．２４５  （１９８３）
【非特許文献】Ｎａｕ，  Ｍ．  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ｖｏｌ．３１８，  ｐ．６９  （１９８５）
【非特許文献】Ｒｅｅｄ，  Ｊ．Ｃ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ｖｏｌ．３８７，  ｐ．７７３（１９９７）
【非特許文献】Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒ，Ｌ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ｖｏｌ．３５６，  ｐ．２１５  （１９９２）
【非特許文献】Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，  ｐ．３２  （１９９６）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、新規な塩基配列を有する核酸分子、この核酸分子を利用した癌の判別方法、この核酸分子を組み込んだ発現ベクター、この発現ベクターにより形質転換又は形質導入した形質転換体又は形質導入体、この形質転換体又は形質導入体を用いて得られる蛋白質、この蛋白質に対する抗体、等を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記した如き課題を解決するために、本発明は以下の如き構成より成る。
（１）配列番号２の塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列である核酸分子。
（２）配列番号３の塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列である核酸分子。
（３）上記（１）又は（２）記載の核酸分子の塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸分子。
（４）ヒト細胞に由来する又はヒト細胞を含有する被検試料が、配列番号３の塩基配列を含有するか否かを決定する方法であって、下記の過程を含んで成る方法。
▲１▼ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、前記被検試料を、
（ｉ）配列番号３の塩基配列を有する核酸又はその断片、
（ｉｉ）  （ｉ）の何れかの核酸に相補的な配列を有する核酸、
（ｉｉｉ）５０  ％  ホルムアミド中で４２〜７０℃でのハイブリダイゼーション、
その後の０．２〜２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で２５〜７０℃での洗浄後に、
（ｉ）又は（ｉｉｉ）の核酸にハイブリダイズする核酸、
から成る群から選択される核酸プローブと共にインキュベートすること；
▲２▼各試料における前記プローブによるハイブリダイゼーションが生じた量を決定すること、
▲３▼  ▲２▼の量に基づいて、配列番号３の塩基配列を含有するか否かを決定すること。
（５）下記の何れかを含んで成る、ヒト細胞に由来する又はヒト細胞を含有する被検試料が配列番号３の塩基配列を含有するか否かを決定するためのキット。
（ｉ）配列番号３の塩基配列を有する核酸又はその断片、
（ｉｉ）  （ｉ）の何れかの核酸に相補的な配列を有する核酸、
（ｉｉｉ）  （ｉ）又は（ｉｉｉ）の核酸にハイブリダイズする核酸。
（６）上記（４）記載の方法によって、被検試料中に当該核酸が含まれるか否かを決定し、その結果に基づいて行う癌の判別方法。
（７）下記の何れかを含んで成る、癌判別用キット。
（ｉ）配列番号３の塩基配列を有する核酸又はその断片、
（ｉｉ）  （ｉ）の何れかの核酸に相補的な配列を有する核酸、
（ｉｉｉ）  （ｉ）又は（ｉｉｉ）の核酸にハイブリダイズする核酸。
（８）配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする蛋白質又はその塩。
（９）配列番号１で表されるアミノ酸配列から成る蛋白質をコードする配列を有する核酸分子。
（１０）上記（９）に記載の核酸分子の塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸分子。
（１１）上記（１），（２）又は（９）に記載の核酸分子が組み込まれた組み換え体ＤＮＡ。
（１２）上記（１１）記載の組み換え体ＤＮＡにより形質転換又は形質導入された形質転換体又は形質導入体。
（１３）上記（１２）記載の形質転換体又は形質導入体を培養し、得られた培養物から蛋白質又はその塩を分離することを特徴とする、配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする蛋白質又はその塩の製造方法。
（１４）上記（８）記載の蛋白質又はその塩を含有して成る医薬組成物。
（１５）上記（８）記載の蛋白質又はその塩に対する抗体。
（１６）上記（１５）記載の抗体を含有して成る癌診断剤。
（１７）上記（１５）記載の抗体を含有して成る医薬組成物。
（１８）上記（１５）記載の抗体を用いることを特徴とする、上記（８）記載の蛋白質又はその塩の測定法。
（１９）上記（１５）記載の抗体を含んで成る、上記（８）記載の蛋白質又はその塩の測定用キット。
（２０）上記（１６）記載の方法によって、被検試料中に当該蛋白質が含まれるか否かを決定し、その結果に基づいて行う癌の判別方法。
（２１）上記（１５）記載の抗体を含有して成る、癌判別用キット。
（２２）上記（８）記載の蛋白質又はその塩を用いることを特徴とする、上記（８）記載の蛋白質又はその塩の活性を促進若しくは阻害する化合物又はその塩のスクリーニング方法。
（２３）上記（８）記載の蛋白質又はその塩を含有して成る上記（８）記載の蛋白質又はその塩の活性を促進若しくは阻害する化合物又はその塩のスクリーニング用キット。
【０００８】
即ち、本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、新規な塩基配列（配列番号２又は配列番号３で表される塩基配列）を有する核酸分子を見出し、そして更に検討を重ねた結果、それが癌細胞で特異的に検出されることを見出し、本発明を完成するに到った。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の配列番号２又は３の塩基配列と実質的に同一の塩基配列である核酸分子としては、例えば、配列番号２又は配列番号３で表される塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、更に好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有する核酸分子等が挙げられる。
【００１０】
また、当該核酸分子としては、例えばゲノムＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ又はこれらに対応するＲＮＡのいずれでもよいが、ＤＮＡが好ましい。
【００１１】
本発明に係る配列番号２又は配列番号３の塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸分子としては、具体的には、配列番号２又は配列番号３の塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する核酸分子等が挙げられる。また当該核酸分子はＤＮＡが好ましい。
【００１２】
尚、ここでいう「ハイストリンジェントな条件」とは、具体的には例えば５０％ホルムアミド中で４２〜７０℃で、好ましくは６０〜７０℃でのハイブリダイゼーション、その後の０．２〜２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で２５〜７０℃での洗浄という条件である。
【００１３】
本発明に係る、ヒト細胞に由来する又はヒト細胞を含有する被検試料が、配列番号３の塩基配列を含有するか否かを決定する方法としては、下記の過程、即ち、
（１）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、前記被検試料を、
（ｉ）配列番号３の塩基配列を有する核酸又はその断片、
（ｉｉ）  （ｉ）の何れかの核酸に相補的な配列を有する核酸、
（ｉｉｉ）５０  ％  ホルムアミド中で４２〜７０℃でのハイブリダイゼーション、
その後の０．２〜２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で２５〜７０℃での洗浄後に、
（ｉ）又は（ｉｉ）の核酸にハイブリダイズする核酸、
から成る群から選択される核酸プローブと共にインキュベートすること；
（２）各試料における前記プローブによるハイブリダイゼーションが生じた量を決定すること、
（３）（２）の量に基づいて、配列番号３の塩基配列を含有するか否かを決定すること。
を含んで成る方法が挙げられる。
【００１４】
上記方法に於いて、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションが生じる」とは、標準的なハイブリダイゼーション条件下に、２つの核酸断片が互いにハイブリダイズすることを意味する（尚、「標準的なハイブリダイゼーション条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＵＳＡに記載されている）。
【００１５】
尚、このようなハイブリダイゼーションを行う前に、ＰＣＲ法により目的の核酸分子を増幅させておいても良く、その際に用いられる二種類のプライマーとしては、目的の核酸分子を増幅させ得る組合せであれば特に限定されないが、例えば配列番号５及び配列番号６で示されるプライマーの組合せが挙げられる。
【００１６】
また、上記方法に於いて、配列番号３の塩基配列を有する核酸の断片とは、配列番号２の塩基配列から選ばれたものであることが好ましい。
【００１７】
上記プローブによるハイブリダイゼーションが生じた量を決定するより具体的な方法としては、自体公知のＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを行い、得られた結果を発光に基づいて決定する方法、イメージングアナライザーによる方法等がある。
【００１８】
ハイブリダイゼーションが生じた量に基づいて配列番号３の塩基配列を含有するか否かを決定するには、被検試料について、上記測定を行う方法の他、例えば、予め別試料として正常試料を用いて同様に測定を行い、正常試料のハイブリダイゼーションが生じた量を決定し、被検試料のハイブリダイゼーションが生じた量と比較することによって、当該被検試料中に当該核酸が含まれるか否かを決定する方法が挙げられる。
【００１９】
これら被検試料が配列番号３の塩基配列を含有するか否かを決定する方法に用いられる試薬中には、通常この分野で用いられる試薬類、例えば緩衝剤等の安定化剤、防腐剤等であって、共存する試薬等の安定性を阻害したり、ハイブリダイゼーション反応を阻害しないものが含まれていてもよい。また、その濃度も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。
【００２０】
本発明の決定する方法において用いられる緩衝液の具体例を挙げると、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等、通常のハイブリダイゼーション反応を利用した測定法に用いられている緩衝液は全て挙げられ、そのｐＨも特に限定されないが、通常５〜９の範囲が好ましい。
【００２１】
本発明に係る、被検試料が配列番号３の塩基配列を含有するか否かを決定する方法に於いて用いられる被検試料としては、血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分抽出液、組織切片、糞便、尿等の生体由来試料が挙げられる。また、上記の各種組識（好ましくはヒト等）由来の正常細胞又は上記の癌細胞等も挙げられる。
【００２２】
本発明に係る、被検試料が、配列番号３の塩基配列を含有するか否かを決定するためのキットとしては、少なくとも下記の何れかを構成試薬として含んで成るものである。
（ｉ）配列番号３の塩基配列を有する核酸又はその断片、
（ｉｉ）  （ｉ）の何れかの核酸に相補的な配列を有する核酸、
（ｉｉｉ）  （ｉ）又は（ｉｉｉ）の核酸にハイブリダイズする核酸。
【００２３】
上記キットに於いて、配列番号３の塩基配列を有する核酸断片とは、配列番号２の塩基配列から選ばれたものであることが好ましい。
【００２４】
また、これらの試薬中には、緩衝剤、防腐剤等が含まれていてもよく、これらの具体例、濃度等の好ましい態様は、通常この分野で通常用いられる試薬、及び濃度範囲から適宜選択すればよい。
【００２５】
また、上記した如き方法により被検試料中に当該核酸が含まれるか否かを決定し、その結果に基づいて癌の判別をすることが可能である。
【００２６】
即ち、被験者から得られた被検試料中の当該核酸を検出し、当該核酸が存在する場合には、被験者に癌組織が存在すると判定する。
【００２７】
その他に、まず上記の方法によって被検試料中に当該核酸が含まれる量を決定する。次いでその結果を予め別試料として正常試料を用いて同様に行った結果と比較し、被検試料中の当該核酸が含まれる量が正常試料中に含まれる量より多い場合に、被験者に癌組織が存在すると判定する方法が挙げられる。
【００２８】
具体的には、例えば、被検試料から常法により総ＲＮＡを抽出し、市販のキット等を用いてＲＴ−ＰＣＲを行う。得られたＰＣＲ産物について電気泳動を行い、配列番号３の塩基配列を有するｃＤＮＡをビオチン等でラベリングしたものをプローブとして用いて公知のＳｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを行う。次いでラベルを検出することによって、本発明の配列番号３の塩基配列を有する被検試料を選択し、この被検試料中に癌組織が存在すると判定する。
【００２９】
上記判別方法に於いて用いられる被検試料としては、血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分抽出液、組織切片、糞便、尿等の生体由来試料が挙げられる。また、上記の各種組識（好ましくはヒト等）由来の各種細胞等も挙げられる。
【００３０】
本発明の配列番号３の塩基配列を有する核酸を含有するか否かを決定し、その結果に基づいて行う癌診断のためのキットとしては、例えば少なくとも下記の何れかを構成試薬として含んで成るものである。
（ｉ）配列番号３の塩基配列を有する核酸又はその断片、
（ｉｉ）  （ｉ）の何れかの核酸に相補的な配列を有する核酸、
（ｉｉｉ）  （ｉ）又は（ｉｉｉ）の核酸にハイブリダイズする核酸。
【００３１】
上記キットに於いて、配列番号３の塩基配列を有する核酸の断片とは、配列番号２の塩基配列から選択されたものであることが好ましい。
【００３２】
また、これらの試薬中には、緩衝剤、防腐剤等が含まれていてもよく、これらの具体例、濃度等の好ましい態様は、通常この分野で通常用いられる試薬、及び濃度範囲から適宜選択すればよい。
【００３３】
本発明の配列番号１で表わされるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質（以下、本発明の蛋白質とする。）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル等）の細胞、特にその癌細胞に由来するものであり、合成蛋白質であってもよい。
【００３４】
その具体例としては、例えばヒトや温血動物（例えばモルモット，ラット，マウス，ニワトリ，ウサギ，ブタ，ヒツジ，ウシ，サル等）の癌細胞［例えば肝細胞，脾細胞，神経細胞，グリア細胞，膵臓β細胞，骨髄細胞，メサンギウム細胞，ランゲルハンス細胞，表皮細胞，上皮細胞，内皮細胞，繊維芽細胞，繊維細胞，筋細胞，脂肪細胞，免疫細胞（例えばマクロファージ，Ｔ細胞，Ｂ細胞，ナチュラルキラー細胞，肥満細胞，好中球，好塩基球，好酸球，単球等），巨核球，滑膜細胞，軟骨細胞，骨細胞，骨芽細胞，破骨細胞，乳腺細胞，肝細胞若しくは間質細胞等に由来する癌細胞等］、若しくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば，脳，脳の各部位（例えば嗅球，扁桃核，大脳基底球，海馬，視床，視床下部，大脳皮質，延髄，小脳等），脊髄，下垂体，胃，膵臓，腎臓，肝臓，生殖腺，甲状腺，胆のう，骨髄，副腎，皮膚，筋肉，肺，消化管（例えば大腸，小腸等），血管，心臓，胸腺，脾臓，顎下腺，末梢血，前立腺，睾丸，卵巣，胎盤，子宮，骨，関節，骨格筋等，又は血球系の細胞］若しくはその培養細胞（例えばＡ５４９，ＮＣＩ−Ｈ４６０，  ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ，  ＭＥＬ，Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，ＨＬ−６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯＬＴ−３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−ＣＥＭ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵＴ−１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，ＪＫ−１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ−０１等）に由来する蛋白質が挙げられる。
【００３５】
配列番号１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号１で表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列等が挙げられる。
【００３６】
また、本発明の配列番号１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、前記の配列番号１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質等が挙げられる。
【００３７】
より具体的に述べれば、例えば、
▲１▼配列番号１で表わされるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
▲２▼配列番号１で表わされるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
▲３▼配列番号１で表わされるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
▲４▼配列番号１で表わされるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、又は
▲５▼それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質等のいわゆるムテインであって、且つ配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質等である。
【００３８】
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失又は置換されている場合、その挿入、欠失又は置換の位置としては、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同質の活性を失わない位置であればよく特に限定されない。
【００３９】
本明細書における蛋白質のアミノ酸配列は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質をはじめとする、本発明の蛋白質は、Ｃ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）又はカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ２）又はエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。
【００４０】
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル，エチル，ｎ−プロピル，イソプロピル若しくはｎ−ブチル等のＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル，シクロヘキシル等のＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル，α−ナフチル等のＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル，フェネチル等のフェニル−Ｃ１−２アルキル基若しくはα−ナフチルメチル等のα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基等のＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基等が用いられる。
【００４１】
本発明の蛋白質がＣ末端以外にカルボキシル基（又はカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化又はエステル化されているものも本発明の蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステル等が用いられる。
【００４２】
さらに、本発明の蛋白質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例えばメチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基等のＣ１−６アルカノイル等のＣ１−６アシル基等）で保護されているもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基等）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基等のＣ１−６アルカノイル基等のＣ１−６アシル基等）で保護されているもの、或いは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質等の複合蛋白質等も含まれる。
【００４３】
本発明の蛋白質の具体例としては、例えば、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するヒト由来の蛋白質等が用いられる。
【００４４】
また、本発明の蛋白質はヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル等）の癌細胞（肺細胞、乳腺細胞、子宮細胞、直腸細胞等）で特異的に発現されるという特徴を有する。
【００４５】
本発明の蛋白質の塩としては、生理学的に許容される酸（例えば無機酸、有機酸）や塩基（例えばアルカリ金属塩）等との塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、或いは有機酸（例えば酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩等が挙げられる。
【００４６】
本発明の配列番号１で表されるアミノ酸配列から成る蛋白質をコードする配列を有する核酸分子としては、例えば、配列番号２、又は配列番号３の塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列である核酸分子、等が含まれるが、これに限定されない。尚、配列番号２の塩基配列である核酸分子は、配列番号１で表されるアミノ酸配列そのものをコードしており、配列番号３の塩基配列である核酸分子は、その塩基配列の１７１位のアデニンから４０１位のシトシンまでが、配列番号１で表されるアミノ酸配列から成る蛋白質をコードしている。
【００４７】
また、本発明の配列番号１で表されるアミノ酸配列から成る蛋白質をコードする配列を有する核酸分子としては、例えばゲノムＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ又はこれらに対応するＲＮＡのいずれでもよいが、ＤＮＡが好ましい。
【００４８】
本発明に係る配列番号２又は配列番号３の塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列である核酸分子、又は本発明の蛋白質をコードする核酸分子をＤＮＡを得るには、ＤＮＡを合成する常法の他、下記の方法でも得ることができる。
【００４９】
即ち、本発明の配列番号２又は配列番号３の塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列である核酸分子、又は本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを単離（クローニング）する手段としては、Ｏｌｉｇｏ−Ｃａｐｐｉｎｇ  法  （  Ｇｅｎｅ  １３８：１７１−１７４，１９９４  ）  を参考にして  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  を作製し、その中から目的とするＤＮＡを選択すればよい。ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  を作製する際に使用するクローニングベクターとしては、例えばプラスミドベクター，ファージミドベクター，ファージベクター及びウイルスベクターが使用できる。特に、大腸菌由来のプラスミドベクター（例えばｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９、ｐＮＥＢ１９３）が好ましい。
【００５０】
また、前記した細胞・組織より総ＲＮＡ又はｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  −  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅する方法でも目的のＤＮＡをクローニングできる。
【００５１】
ＤＮＡの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎｔＴＭ−Ｇ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎｔＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、Ｇｕｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法等の自体公知の方法或いはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
【００５２】
本発明の配列番号２又は配列番号３の塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列である核酸分子、又は本発明の蛋白質をコードする核酸を単離（クローニング）する一手段を説明すると、例えば前記した細胞，組織より常法（例えばａｃｉｄ／ｇｕａｎｉｄｉｕｍ／  ｐｈｅｎｏｌ／ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ法等）によって総ＲＮＡを抽出する。オリゴ（ｄＴ）２０プライマーまたは配列番号３の３’−末端側領域から選ばれた任意の位置から設計したアンチセンスプライマーを用いた逆転写反応、次いで配列番号３の、５’−末端から開始コドンまでの間の任意の位置から設計したセンスプライマー、および終止コドンから上記逆転写反応用アンチセンスプライマーまでの間の任意の位置から設計したアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲ反応から成るＲＴ−ＰＣＲにより、目的とするｃＤＮＡ断片を増幅する。これを適当なクローニングベクターに挿入し、組み込まれたｃＤＮＡの塩基配列を解析し、目的とする遺伝子が組み込まれていることを確認する。
【００５３】
クローン化された本発明の配列番号２又は配列番号３の塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列であるＤＮＡ、又は本発明の蛋白質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、又は所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡ又はＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
【００５４】
本発明の核酸分子が組み込まれた組換え体ＤＮＡとしては、例えば配列番号２又は配列番号３の塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列である核酸分子、又は本発明の蛋白質をコードする配列を有する核酸分子等を挿入したベクターＤＮＡ、若しくはこれら核酸分子の塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸分子等を導入したベクターＤＮＡ等が挙げられる。
【００５５】
当該組換え体ＤＮＡは、例えば、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することもできる。
【００５６】
そのような発現ベクターとしては、例えばプラスミドベクター，ファージベクター及びウイルスベクターが包含される。
【００５７】
発現ベクターの具体例としては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＴｒｃ９９Ａ，ｐＫＫ２２３，ｐＥＴ３ａ）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例えばｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージ等のバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルス等の動物ウイルス等の他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ、ｐ３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１４等が用いられる。
【００５８】
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター等が挙げられる。
【００５９】
これらのうち宿主が哺乳動物細胞である場合は、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーター等を用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーター等が、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター等が好ましい。
【００６０】
発現ベクターには、以上の他に、必要に応じてエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン等を含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子、等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をプロリンを含まない培地によっても選択できる。
【００６１】
また、必要に応じて、宿主に合った分泌シグナル配列を、本発明の蛋白質のＮ末端側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列等が、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列等が、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列等、宿主が動物細胞である場合には、プレプロトリプシン・シグナル配列、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列等がそれぞれ利用できる。
【００６２】
また、検出や精製を容易にするために、他のタグペプチドや蛋白質との融合タンパクとして発現させても良い。融合させるタグペプチドとしてはＦＬＡＧタグ、３×ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓ６タグなど、蛋白質としてはβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）等が挙げられる。
【００６３】
実際には、オープンリーディングフレームの前後に上記したようなタグペプチドをコードする配列を設計したプライマーを用いてＰＣＲ反応を行ったものを発現ベクターにサブクローニングしたり、当該遺伝子と発現ベクターとの間にタグペプチドをコードする配列のリンカーを挿入したり、あらかじめタグペプチドや蛋白質をコードする配列を含む発現ベクターを用いることにより、本発明に係る蛋白質は、これらのペプチドや蛋白質との融合蛋白質として発現する。
【００６４】
本発明に係る形質転換体又は形質導入体は、以上のようにして構築された本発明の配列番号２又は配列番号３の塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列である核酸分子、又は本発明の蛋白質をコードする核酸分子が組み込まれた組換え体ＤＮＡを用いて、以下のようにして製造することができる。
【００６５】
形質転換体又は形質導入体を得るために用いる宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞等が用いられる。
【００６６】
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ），６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）〕，１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９巻，４４０（１９５４）〕，ＸＬ−１０  Ｇｏｌｄ等が用いられる。
【００６７】
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），９５巻，８７（１９８４）〕等が用いられる。
【００６８】
酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１等が用いられる。
【００６９】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ  ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞又はＥｓｔｉｇｍｅｎａ  ａｃｒｅａ由来の細胞等が用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｎ  細胞；ＢｍＮ細胞）等が用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，  Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィボ（Ｉｎ  Ｖｉｖｏ），１３，  ２１３−２１７，（１９７７））等が用いられる。
【００７０】
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫等が用いられる〔前田ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１５巻，５９２（１９８５）〕。
【００７１】
動物細胞としては、例えば、アフリカミドリザル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞等が用いられる。さらに、各種の正常ヒト細胞、例えば肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞若しくは間質細胞、又はこれら細胞の前駆細胞、幹細胞若しくは癌細胞等）等を用いることも可能である。
【００７２】
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ），６９巻，２１１０（１９７２）やジーン（Ｇｅｎｅ），１７巻，１０７（１９８２）等に記載の方法に従って行なうことができる。
【００７３】
エシェリヒア属菌を形質導入するには、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）等に記載の方法に従って行なうことができる。
【００７４】
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），１６８巻，１１１（１９７９）等に記載の方法に従って行なうことができる。
【００７５】
酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）等に記載の方法に従って行なうことができる。
【００７６】
昆虫細胞又は昆虫を形質導入するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，  ４７−５５（１９８８））等に記載の方法に従って行なうことができる。
【００７７】
動物細胞を形質導入するには、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。また、市販の形質導入用試薬を用い、そのプロトコルに従って行うこともできる。
【００７８】
以上のようにして、本発明の配列番号２又は配列番号３の塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列であるＤＮＡ又は本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換又は形質導入された、本発明に係る形質転換体又は形質導入体を得ることができる。
【００７９】
本発明の蛋白質又はその塩を製造する方法としては、（１）前述したヒトや温血動物の癌細胞又は培養細胞等から精製単離する方法、（２）ペプチド合成する方法、又は（３）遺伝子組替え技術を用いて製造する方法、などが挙げられるが、工業的には後述する（３）の方法が好ましい。
【００８０】
例えば上記のようにして得られた本発明に係る形質転換体又は形質導入体を培養し、形質転換体又は形質道入体の細胞内又は細胞外に本発明の蛋白質を生成せしめることにより得ることができる。
【００８１】
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体又は形質導入体、又はバチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖等、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、酵母エキス、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液等の無機又は有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム等が挙げられる。また、ビタミン類、生長促進因子等を添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００８２】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、ＬＢ培地、２×ＹＴ培地、Ｍ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），４３１−４３３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９７２〕等が挙げられる。また必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
【００８３】
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
【００８４】
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
【００８５】
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，  Ｋ．  Ｌ．  ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ），７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ，  Ｇ．  Ａ．  ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００８６】
宿主が昆虫細胞又は昆虫である形質導入体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，  Ｔ．Ｃ．Ｃ．，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２））に非働化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたもの等が用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００８７】
宿主が動物細胞である形質導入体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Ｓｅｉｅｎｃｅ），１２２巻，５０１（１９５２）〕，タルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥ培地〔ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８巻，３９６（１９５９）〕），ＲＰＭＩ１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３巻，１（１９５０）〕等が用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜１２０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００８８】
上記培養物から本発明の蛋白質を分離精製するには、具体的には例えば、下記の方法により行なうことができる。
【００８９】
本発明の蛋白質を培養菌体或いは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体或いは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／又は凍結融解等によって菌体或いは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る方法等が適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン等の蛋白質変性剤や、ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、トリトンＸ−１００ＴＭ等の界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に蛋白質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体或いは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
【００９０】
このようにして得られた培養上清、或いは抽出液中に含まれる蛋白質の精製は、自体公知の分離・精製法を適宜組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法等の溶解度の差を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方法等が用いられる。
【００９１】
かくして得られる蛋白質が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法或いはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法或いはそれに準じる方法により、遊離体又は他の塩に変換することができる。
【００９２】
尚、組換え体が産生する蛋白質を、精製前又は精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼ等が用いられる。
【００９３】
かくして生成する本発明の蛋白質又はその塩の存在又は活性は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ等により測定することができる。
【００９４】
本発明の医薬組成物は、本発明の蛋白質又はその塩を含有して成る。
【００９５】
本発明に係る、本発明の蛋白質又はそれらの塩に対する抗体は、本発明の蛋白質、部分ペプチド又はそれらの塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
【００９６】
本発明の蛋白質又はその塩に対するモノクローナル抗体は、本発明の蛋白質を抗原として用い、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６、４９５  （１９７５）〕に従って製造することができる。また、本発明の蛋白質又はその塩に対するポリクローナル抗体も、本発明の蛋白質を抗原として用い、それ自体公知或いはそれに準じる抗体又は抗血清の製造法に従って製造することができる。
【００９７】
本発明に係る抗体を用いることを特徴とする、本発明の蛋白質又はその塩の測定法としては、本発明の蛋白質又はその塩に対する抗体を用いて、いわゆる酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる測定法（特開平９−３０１９９５号公報等）等の自体公知の免疫学的測定法に準じて行えばよい。また、その測定原理も、サンドイッチ法、競合法、二抗体法等のいずれにてもよい。
【００９８】
上記した如き自体公知の免疫学的測定に於いて、標識物質を用いる測定を行う場合、本発明に係る蛋白質又はその塩や、本発明に係る蛋白質又はその塩に対する抗体を標識するために用いられる標識物質としては、例えばＥＩＡに於いて用いられるアルカリホスファターゼ，β−ガラクトシダーゼ，ペルオキシダーゼ，マイクロペルオキシダーゼ，グルコースオキシダーゼ，グルコース−６−リン酸脱水素酵素，アセチルコリンエステラーゼ，リンゴ酸脱水素酵素，ルシフェラーゼ等の酵素類、例えばＲＩＡで用いられる９９ｍＴｃ，１３１Ｉ，１２５Ｉ，１４Ｃ，３Ｈ等の放射性同位元素、例えばＦＩＡで用いられるフルオレセイン，ダンシル，フルオレスカミン，クマリン，ナフチルアミン或はこれらの誘導体等の蛍光性物質、例えばルシフェリン，イソルミノール，ルミノール，ビス（２，４，６−トリフロロフェニル）オキザレート等の発光性物質、例えばフェノール，ナフトール，アントラセン或はこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、例えば４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル，３−アミノ−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル，２，６−ジ−ｔ−ブチル−α−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−オキソ−２，５−シクロヘキサジエン−１−イリデン）−ｐ−トリルオキシル等のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質等が挙げられる。
【００９９】
また、上記した如き標識物質を、本発明の蛋白質又はその塩や、本発明の蛋白質又はその塩に対する抗体に結合させる（標識する）方法としては、自体公知のＥＩＡ、ＲＩＡ或はＦＩＡ等に於いて一般に行われている自体公知の標識方法に準じて行えばよい。また、標識方法として、アビジン（又はストレプトアビジン）とビオチンの反応を利用した常法を利用しても良い。
【０１００】
上記した如き自体公知の免疫学的測定法に於いて、本発明に係る蛋白質又はその塩や、本発明に係る蛋白質又はその塩に対する抗体の何れか一方を不溶性担体に固定化したものを用いる場合の、不溶性担体としては、上記した如き免疫学的測定法の分野で通常用いられるものでよく、例えばアガロース、金属、ガラス、セラミック、シリコンラバー、例えばポリスチレン，ポリ塩化ビニル，ポリプロピレン，アクリル樹脂，ポリメチルメタクリレート等の合成高分子等で調製された、ビーズ、チューブ、多数のチューブが一体成形された専用のトレイ、マイクロタイタープレート等が挙げられ、固定化方法としても、上記した如き免疫学的測定法の分野で通常用いられる、例えば物理的吸着法、化学的結合法等が挙げられる。
【０１０１】
また、上記した如き自体公知の免疫学的測定法による測定に於いて、例えば各濃度に希釈した本発明に係る蛋白質又はその塩に対する抗体を吸収性担体しみこませておいたものと、上記した如き標識物質で標識した本発明に係る蛋白質又はその塩に対する抗体を用い、試験紙片を採取した検出対象の試料（例えば血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分抽出液、組織切片、糞便、尿等の生体由来試料等）に浸した後、第二抗体溶液と反応させ、標識の発色等を検出することによっても、本発明に係る蛋白質又はその塩の検出を行うことが出来る。この場合、用いられる吸収性担体としては、ドライケミストリーの分野で通常用いられている例えば濾紙、不織布、ガラス繊維等が好ましく挙げられ、フィルムとしては厚さ３００μｍ前後のポリスチレンシート等が好ましい。
【０１０２】
これら試薬中には、通常この分野で用いられる試薬類、例えば緩衝剤、反応促進剤、糖類、蛋白質、塩類、界面活性剤等の安定化剤、防腐剤等であって、共存する試薬等の安定性を阻害したり、本発明の蛋白質又はその塩と、本発明の蛋白質又はその塩に対する抗体との反応を阻害しないものが含まれていてもよい。また、その濃度も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。
【０１０３】
本発明の測定法において用いられる緩衝液の具体例を挙げると、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等通常抗原抗体反応を利用した測定法に用いられている緩衝液は全て挙げられ、そのｐＨとしては抗原抗体反応を抑制しない範囲であれば特に限定されないが、通常５〜９の範囲が好ましい。
【０１０４】
本発明の測定法を実施するに際しての測定条件等（反応温度、反応時間、測定波長、測定装置等）はすべて自体公知の上記した如き免疫学的測定法におけるそれらに準じて選択すれば足り、自体公知の免疫学的測定法の測定操作法に準じて実施すれば良く、使用する自動分析装置、分光光度系等も通常この分野で使用されているものは何れも例外なく使用し得る。
【０１０５】
また、本発明の蛋白質等に対するモノクローナル抗体を用いて本発明の蛋白質等の定量を行う以外にも、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、或いはＦａｂ画分を用いてもよい。
【０１０６】
本発明に係る、本発明の蛋白質又はその塩の測定用キットとしては、本発明の蛋白質又はその塩に対する抗体を構成試薬として含んで成るものである。また、これらの試液中の構成要素の具体例、濃度等の好ましい態様は、上記した通りである。
【０１０７】
上記した如き方法により本発明に係る蛋白質又はその塩を検出し、当該測定法により得られた本発明に係る蛋白質又はその塩の値に基づいて、癌の判別をすることが可能である。
【０１０８】
即ち、被験者から得られた被検試料中の本発明に係る蛋白質を検出し、当該蛋白質が存在する場合には、被験者に癌組織が存在すると判定する。
【０１０９】
また、被検試料中の、本発明に係る蛋白質の濃度を測定し、その濃度が、正常検体中の本発明に係る蛋白質の濃度に対して有意に高い場合を癌組織が存在すると判定する。
【０１１０】
本発明に係る、本発明の蛋白質又はその塩の測定法及び癌の判定方法に於いて用いられる被検試料としては、血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分抽出液、組織切片、糞便、尿等の生体由来試料が挙げられる。また、上記の各種組識（好ましくはヒト等）由来の正常細胞又は上記の癌細胞等も挙げられる。
【０１１１】
本発明の蛋白質又はその塩に対する抗体を含有して成る癌診断剤及び癌判定用キットとしては、例えば上記の方法により得られた本発明の蛋白質又はその塩に対する抗体を含有して成る。また、これらの試液中の構成要素の具体例、濃度等の好ましい態様は、上記した免疫学的測定法に於いて記載した通りである。
【０１１２】
本発明の蛋白質又はその塩に対する抗体を含有して成る医薬組成物としては、例えば上記の方法により得られた本発明の蛋白質又はその塩に対する抗体を含有して成る。また、これらの試液中の構成要素の具体例、濃度等の好ましい態様は、免疫学的測定法に於いて記載した通りである。
【０１１３】
また、本発明は
（１）本発明の蛋白質、その部分ペプチド又はそれらの塩を用いることを特徴とする本発明の蛋白質又はその塩の機能を促進する化合物若しくはその塩（以下、促進剤と略記する場合がある）、又は本発明の蛋白質又はその塩の機能を阻害する化合物（以下、阻害剤と略記する場合がある）のスクリーニング方法を提供し、より具体的には、例えば、
（２）（ｉ）本発明の蛋白質又はその塩に細胞（例、上記の各種組識（好ましくはヒト等）由来の正常細胞又は上記の癌細胞等）を接触させた場合と（ｉｉ）本発明の蛋白質又はその塩に細胞（例、上記の各種組識（好ましくはヒト等）由来の正常細胞又は上記の癌細胞等）及び試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする促進剤又は阻害剤のスクリーニング方法を提供する。
【０１１４】
具体的には、上記スクリーニング方法においては、例えば、（ｉ）と（ｉｉ）の場合における、本発明の蛋白質等の活性等を測定して、比較することを特徴とするものである。
【０１１５】
尚、本発明の蛋白質の具体的活性又は機能等はまだ明らかではないが、癌細胞にて発現していることから、「細胞増殖などの活性」を持つことが予測される。今後本発明の蛋白質の具体的活性又は機能が明らかになれば、その活性又は機能を測定する自体公知の方法或いはそれに準じる方法等に従って測定することができる。
【０１１６】
上記スクリーニング方法に用いられる細胞としては、例えば、上記の各種組識（好ましくはヒト等）由来の正常細胞又は上記の癌細胞等が用いられる。
【０１１７】
また、試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等があげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【０１１８】
上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明の蛋白質等を、スクリーニングに適した緩衝液に懸濁することにより本発明の蛋白質等の標品を調製する。緩衝液には、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液等の、本発明の蛋白質等と基質との反応を阻害しない緩衝液であればいずれでもよい。
【０１１９】
例えば、上記（ｉｉ）の場合における活性が上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上上昇させる試験化合物を本発明の蛋白質等の活性を促進する化合物として、一方、上記（ｉｉ）の場合における活性が上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を本発明の蛋白質等の活性を阻害する化合物として選択することができる。
【０１２０】
本発明のスクリーニング方法又はスクリーニング用キットを用いて得られる化合物又はその塩は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿等から選ばれた化合物であり、本発明の蛋白質等の機能を促進又は阻害する化合物である。
【０１２１】
該化合物の塩としては、前記した本発明の蛋白質の塩と同様のものが用いられる。
【０１２２】
従って、本発明の蛋白質等は、本発明の蛋白質等の機能を促進又は阻害する化合物又はその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
【０１２３】
本発明に係る本発明の蛋白質又はその塩の活性を促進若しくは阻害する化合物又はその塩のスクリーニング用キットとしては、本発明の蛋白質又はその塩を含有するものが挙げられる。また、これらの試液中の構成要素の具体例、濃度等の好ましい態様は、上記した通りである。
【０１２４】
以下に、実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものでない。
【０１２５】
【実施例】
以下の実施例に於いて、一般的な遺伝子操作法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載されている方法に従った。
【０１２６】
実施例１  ｃＤＮＡクローニング
肺癌細胞  （Ｌｕｎｇ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ａ５４９  ：  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．  ＣＣＬ−１８５  ）  より総ＲＮＡをａｃｉｄ  ／  ｇｕａｎｉｄｉｕｍ  ／  ｐｈｅｎｏｌ  ／  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ  法によって抽出した。抽出した  総  ＲＮＡ  から、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０  （タカラバイオ（株）製）を使用してＰｏｌｙ  （  Ａ  ）＋  ＲＮＡ  を単離した。
単離したＰｏｌｙ  （  Ａ  ）＋  ＲＮＡ  を鋳型とし、菅野らのオリゴキャッピング  ｃＤＮＡ  ライブラリー作製方法  （  Ｇｅｎｅ，  １３８，  １７１−１７４  （１９９４））  を参考にしてオリゴキャッピングした第１鎖  ｃＤＮＡ  を合成し、これをもとに第２  鎖も合成したのち、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（タカラバイオ（株）製）を用いてクローニングベクターｐＮＥＢ１９３（第一化学薬品（株）製）にライゲーションしたものをｃＤＮＡライブラリーとした。このｃＤＮＡライブラリーで、定法によりＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１０  Ｇｏｌｄ株（  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を形質転換し、培養することによりコロニーを得た。得られたコロニーについて、ベクターｐＮＥＢ１９３に相補的なＭ１３  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆｏｒｗａｒｄ  および  ＲｅｖｅｒｓｅプライマーならびにＧｅｎｅ  Ｔａｑ  ＮＴ  （（株）ニッポンジーン製）を使用したＰＣＲ  （  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ）反応を行い、得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、複数のバンドがみられるコロニーを選択した。選択したコロニーを定法通り培養し、プラスミドを精製した。次にこのプラスミドに組み込まれたｃＤＮＡ（目的遺伝子）の塩基配列を、Ｍ１３  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆｏｒｗａｒｄ  および  Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー、ならびにＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アプライド・バイオシステム社製）を用いて、ＡＢＩ３７７ＸＬ蛍光ＤＮＡシークエンサー（アプライド・バイオシステム社製）で解析した。解析して得られた遺伝子の塩基配列をＢＬＡＳＴ  （  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ）検索し、全長配列で一致しない  １  クローンを選択した。
この遺伝子をＷＴＣ０７７遺伝子と名付け、この遺伝子を組み込んだプラスミドをｐＮＥＢ１９３／ＷＴＣ０７７と名付けた。この遺伝子の大きさは、塩基配列から０．８２ｋｂであることが明らかになり、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで処理して目的遺伝子を切出し、アガロースゲル電気泳動により大きさを確認した結果の約０．９ｋｂとほぼ一致した。
次にこの遺伝子を解析して得られた塩基配列（配列番号３）と該塩基配列から推定されるアミノ酸配列（配列番号１）を図１に示す。
図１より明らかな如く、この遺伝子は７７のアミノ酸残基を有する蛋白質（配列番号１）をコードしていることが明らかとなった。この蛋白質をＷＴＣ０７７タンパクと名付けた。
また、本クローンＷＴＣ０７７  ｃＤＮＡの塩基配列について、ＢＬＡＳＴ検索したところ、ＥＳＴの中に一部相同性を有するもの（例えば、アクセッション番号ＡＷ６７５２１０）が登録されていたが、部分配列なので同じ蛋白質をコードしているがどうかは判別できない。
【０１２７】
実施例２  遺伝子の発現確認
実施例１で得られた遺伝子の機能を予測するために、ヒトの各正常及び癌組織での発現の有無を検討した。
発現解析は下記のＲＴ−ＰＣＲ  （Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  −  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）−  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法で行った。ヒト肺、乳房、子宮、肝臓、結腸、直腸の腫瘍及び正常組織由来の総ＲＮＡ  （ＢｉｏＣｈａｉｎ社製）を鋳型とし、アンチセンスプライマー（配列番号４：５’−ＣＴＡＴＴＴＴＡＧＧＴＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＧＣＡＡＧ−３’）ならびにＲｅｖｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（（株）ニッポンジーン製）を用いて  ４２  ℃  ３０  分  逆転写反応を行い、次いでセンスプライマー（配列番号５：５’−ＧＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＧＣＣＡＣＧＴＧＡＴＣ−３’）、アンチセンスプライマー（配列番号６：５’−ＣＡＧＧＣＴＧＣＴＴＧＴＡＣＡＧＧＡＣＡＧ−３’）  ならびにＧｅｎｅ  Ｔａｑ  ＮＴ  （（株）ニッポンジーン製）を用いて、  ９５  ℃  ２  分後  ９５  ℃  ２０  秒、６０  ℃  ２０  秒、７２  ℃  ２０  秒を１６サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。
得られたＰＣＲ産物について  １．２  ％  アガロースゲル電気泳動を行い、ナイロンメンブラン  （  Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋：アマシャム  ファルマシア（株）製）  に転写した。次いでＢｒｉｇｈｔＳｔａｒＴＭ  Ｐｓｏｒａｌｅｎ  −  Ｂｉｏｔｉｎ  （Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いて実施例１で得られたＷＴＣ０７７  ｃＤＮＡをラベリングしたものをプローブとして用い、上記で得たナイロンメンブランに転写したＰＣＲ産物と、ホルムアミド  ５０  ％  、４２  ℃  １６  時間の条件でＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  を行った。次いでＢｒｉｇｈｔＳｔａｒＴＭ  ＢｉｏＤｅｔｅｃｔＴＭ  （  Ａｍｂｉｏｎ社製  ）  を使用して、ＷＴＣ０７７遺伝子を発現している組織を検出した。
結果を図２に示す。図２に於いて、４９５ｂｐと３９２ｂは分子量マーカー（φＸ１７４  ＤＮＡ／ＨｉｎｃＩＩ分解物、（株）ニッポンジーン製）、４２８ｂｐは検出されたＷＴＣ０７７遺伝子の断片を夫々示す。
図２から明らかな如く、このＷＴＣ０７７遺伝子は正常のヒトの組織ではほとんど発現が認められず、癌細胞でのみ特異的な発現が認められた。以上のことより、本発明に係る遺伝子の発現を確認することにより、癌の判別が行えることが判った。
【０１２８】
実施例３  ヒトＷＴＣ０７７遺伝子の動物細胞用発現プラスミドの構築
下記の方法により、ヒトＷＴＣ０７７遺伝子を発現させることにより得られるヒトＷＴＣ０７７タンパクを動物細胞中で発現させるための発現プラスミドを構築した。
その際、後に行う発現産物の検出並びに精製を容易にすることを目的として、タンパクのＣ末端側に３×ＦＬＡＧタグペプチド配列（配列番号７：ＡｓｐＴｙｒＬｙｓＡｓｐＨｉｓＡｓｐＧｌｙＡｓｐＴｙｒＬｙｓＡｓｐＨｉｓＡｓｐＩｌｅＡｓｐＴｙｒＬｙｓＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓ）が付加するように、設計した。
まず、ＷＴＣ０７７遺伝子のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の５’−末端側の２０塩基の前にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を設計したセンスプライマー（配列番号８：５’−ＴＡＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＧＣＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＧＴＡＣ−３’）、並びにＯＲＦの３’−末端側の２３塩基の後にＢａｍＨ  Ｉ制限酵素部位を設計したアンチセンスプライマー（配列番号９：  ５’−ＡＴＧＧＡＴＣＣＧＣＴＴＴＧＣＡＧＡＣＡＧＣＡＣＴＧＴＴＴＴＣ−３’）を合成した。
プラスミドｐＮＥＢ１９３／ＷＴＣ０７７を鋳型とし、上記で合成したセンスプライマーとアンチセンスプライマーならびにＧｅｎｅ  Ｔａｑ  ＮＴ  （（株）ニッポンジーン製）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＯＲＦ全長の前後にそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ部位、ＢａｍＨ  Ｉ部位が付加したＷＴＣ０７７遺伝子から成るＤＮＡ断片を増幅した。この断片を、アガロースゲル電気泳動により精製した。
この断片をＴＡクローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（プロメガ（株）製）に挿入し、ｐＧＥＭ−Ｔ／ＷＴＣ０７７を得た。この塩基配列を、Ｍ１３  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆｏｒｗａｒｄおよび  Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー、ならびにＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アプライド・バイオシステム社製）を用いて、ＡＢＩ３７７ＸＬ蛍光ＤＮＡシークエンサー（アプライド・バイオシステム社製）で解析し、ＰＣＲ反応による塩基配列の誤りがないことを確認した。
次いで得られたｐＧＥＭ−Ｔ／ＷＴＣ０７７を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨ  Ｉで二重消化して挿入断片を回収した後、この断片を動物細胞用発現ベクターｐ３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１４（Ｓｉｇｍａ社）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨ  Ｉ部位に挿入して、ＷＴＣ０７７−３×ＦＬＡＧ融合タンパクの動物細胞用発現プラスミド、ｐ３ＦＣ／ＷＴＣ０７７−３Ｆを得た。
【０１２９】
実施例４  ヒトＷＴＣ０７７タンパクのＣＯＳ７細胞による一過性発現
アフリカミドリザル腎由来ＣＯＳ７細胞による一過性発現を行った。
６ウェルプレートの１ウェルに５×１０５個のＣＯＳ７細胞を播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥ）で２４時間培養した。次いでリポフェクトアミン試薬（ライフテックオリエンタル（株）製）を用い、実施例３で得られた発現プラスミドｐ３ＦＣ／ＷＴＣ０７７−３Ｆ  １．５μｇをＣＯＳ７細胞に形質導入した。２４時間後に、０．１ｍＭの（４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド）クロリドを含むＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（ライフテックオリエンタル（株）製）１ｍＬに交換し、４８時間培養した。
培養終了後の細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ処理してウェルから剥離し、リン酸緩衝化生理食塩水で遠心洗浄を行った後、２５μＬの１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０を含むリン酸緩衝化生理食塩水に懸濁することにより、細胞膜を破壊して細胞質タンパクを可溶化した。これに、２５μＬの２×ＳＤＳサンプルバッファーを添加して、得られた溶液を試料とした。
上記で得られた試料２０μＬをＴｒｉｓ／Ｔｒｉｃｉｎｅ／ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した後、ポリビニリデンフェニルクロリド膜ハイボンド−Ｐ（アマシャムファルマシア（株）製）にセミドライブロッティングし、ブロックエース（雪印乳業（株）製）でブロッキングを行った後、１次抗体としてマウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２（シグマ社製）、２次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を順次反応させ、発色剤としてジアミノベンジジンを用いて検出を行った。
その結果、バンドが検出されたことにより、ＷＴＣ０７７−３×ＦＬＡＧ融合タンパクが発現したことが確認された。
【０１３０】
【発明の効果】
本発明は、新規な核酸分子、この核酸分子が存在するか否かを決定する方法及びその結果に基づいて行う癌の判別方法を提供する。
本発明は当該核酸分子により発現される新規な精製ヒト蛋白質、この蛋白質を発現する組換え体ＤＮＡ、この組換え体ＤＮＡにより形質転換された形質転換体又は形質導入体、及び本発明の蛋白質に対する抗体、並びに本発明の蛋白質及び核酸分子の用途を提供する。
本発明に係る上記核酸分子は、遺伝子診断用プローブや遺伝子治療用遺伝子源として用いることができる。また、被検試料中に当該核酸分子が存在するか否かを決定することにより、癌の判別を行うことが出来る。更に、この核酸分子を用いることにより、本発明の蛋白質を大量に発現することができる。この核酸分子を導入して本発明の蛋白質を発現させた細胞は、この蛋白質及びその修飾蛋白質を得るのに用いることが出来る。更にまた、この核酸分子が被検試料中に含まれるか否かを決定することにより、癌の判別を行うことができる。
更に、本発明の蛋白質は、本発明の蛋白質に対する抗体を作成するための抗原として用いることが出来る。またこの蛋白質に対する抗体を用いた、この蛋白質の測定、当該蛋白質を測定する癌診断剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で得られた本発明の蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列及び該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を示す。
【図２】実施例２で得られた、ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎの結果を示す。
【０１３１】
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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