(57)【要約】【課題】軟骨細胞や未分化間葉系細胞などを軟骨細胞の状態に分化、維持させる作用を有し、培養操作の簡便化と培養コストの低減化が実現可能な軟骨欠損部又は軟骨損傷部への充填材料を提供する。【解決手段】本発明の軟骨欠損部又は軟骨損傷部への充填材料は、Ｃａ／Ｐモル比が１．４０〜１．６７の組成を有し、比表面積が０．０５ｍ２／ｇ〜５０ｍ２／ｇであるリン酸カルシウム系化合物を主成分として含むことを特徴とする。リン酸カルシウム系化合物に軟骨細胞又は未分化間葉系細胞のいずれか一方又はその双方を更に含むことが好ましく、リン酸カルシウム系化合物を担体とし、前記担体において培養された前記軟骨細胞又は前記未分化間葉系細胞のいずれか一方又はその双方を含むことがより好ましい。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃａ／Ｐモル比が１．４０〜１．６７の組成を有し、比表面積が０．０５ｍ２／ｇ〜５０ｍ２／ｇであるリン酸カルシウム系化合物を主成分として含むことを特徴とする軟骨欠損部又は軟骨損傷部への充填材料。
【請求項２】
リン酸カルシウム系化合物に軟骨細胞又は未分化間葉系細胞のいずれか一方又はその双方を更に含む請求項１記載の充填材料。
【請求項３】
リン酸カルシウム系化合物を担体とし、前記担体において培養された前記軟骨細胞又は前記未分化間葉系細胞のいずれか一方又はその双方を含む請求項２記載の充填材料。
【請求項４】
緻密体、多孔体、顆粒状体、軟骨欠損部形状又は軟骨損傷部形状に成形される請求項１ないし３いずれか１項に記載の充填材料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、外傷、変形性関節症、慢性関節リウマチ等による関節軟骨疾患の治療において、損傷部位を補填する軟骨欠損部又は軟骨損傷部への充填材料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
関節軟骨は、血管が組織内に存在しないため、また、その細胞外基質により軟骨細胞の移動が妨げられるという組織学的な特色を有するため、骨と異なり関節軟骨組織の修復は非常に困難であり、外傷、変形性関節症、慢性関節リウマチ等による関節軟骨損傷部位の臨床的治療には、重度の損傷の場合は人工関節置換術が用いられている。しかしながら、比較的軽度或いは限定された部位の損傷に対する治療法は未だ確立されていない。
このような比較的軽度或いは限定された部位の損傷に対する治療法として、損傷をうけていない患者自身の非荷重部の軟骨を取出し、この取出した軟骨を損傷部位にモザイク状に移植するモザイクプラスティと呼ばれる治療方法が有望視されている。この治療法は、患者の損傷部位以外の組織を採取する必要があるため患者の苦痛が増すだけでなく、移植用の軟骨の採取量に限界があるという欠点があった。
【０００３】
また別の治療法としては、軟骨形成活性及び／又は硬骨形成活性を有し、２つの成分Ａ及びＢを含有する骨交換用生体活性移植体材料であり、Ａは、骨形成誘発性のタンパク質もしくはタンパク質混合物又は１種もしくは数種の該タンパク質をコードするＤＮＡであり、Ｂ上に適用され、Ｂは、内因性骨形成活性を有するリン酸カルシウムを含んでなるマトリックス材料である移植体材料が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。この特許文献１の移植体材料は、軟骨又は硬骨誘発性材料のＡのタンパク質と、骨形成誘発性担体マトリックスのＢの作用機構が組み合わさって患者が疾患を患う期間が著しく短縮される。しかし未分化間葉系細胞を軟骨細胞に分化させるには、細胞を軟骨に誘導させるサイトカイン類が必要であった。
【０００４】
更に別の治療法としては、患者の軟骨細胞や未分化間葉系細胞を生体外へと取出し、取出した細胞を担体を用いて三次元的に培養して増殖、分化させ、培養した細胞を患者の損傷部位に補填する方法も実施されつつある。この治療法では、担体の良し悪しが、軟骨再生、軟骨欠損の修復に大きく影響を及ぼす。しかし、軟骨細胞や骨髄細胞の培養に効果的な担体は、未だ見出されていない。また、患者の軟骨細胞を培養して移植する方法では、軟骨細胞が脱分化を起こしやすい性質を有することから、細胞が移植に適さない状態に変化する問題があった。更に、患者の骨髄等から未分化間葉系細胞を採取し、未分化間葉系細胞を軟骨細胞に分化させて移植する方法では、この未分化間葉系細胞を軟骨細胞に分化させることは困難であった。
【０００５】
上記問題を解決する方策として、移植の際に骨内への埋植部となるβ−リン酸三カルシウム多孔体と、軟骨欠損部に相当する部分となる、コラーゲンゲル、アルギン酸、ポリ乳酸、及びポリグリコール酸からなる群から選ばれた少なくとも１種からなる培養担体とを一体化してなり、培養担体において培養された軟骨細胞或いは骨髄細胞を含む骨軟骨移植材が開示されている（例えば、特許文献２参照。）。
【０００６】
【特許文献１】
特表２００１−５０５０９７号公報
【特許文献２】
特開２００３−０３８６３５号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記特許文献２に示される軟骨細胞を高分子系材料担体中で培養する三次元培養法や未分化間葉系細胞を分化させる細胞成長因子を培地に添加して培養する方法では、これらの培養法の操作が煩雑で培養コストが高くなるという問題があった。
【０００８】
本発明の目的は、軟骨細胞や未分化間葉系細胞などを軟骨細胞の状態に分化、維持させる作用を有する、軟骨欠損部又は軟骨損傷部への充填材料を提供することにある。
本発明の別の目的は、培養操作の簡便化と培養コストの低減化が実現可能な軟骨欠損部又は軟骨損傷部への充填材料を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、従来よりリン酸カルシウム系化合物自体には細胞を増殖、分化させる細胞成長因子としての作用を有していないと考えられていたが、所定の組成を有するリン酸カルシウム系化合物が軟骨細胞の脱分化を抑制し、未分化間葉系細胞を軟骨細胞に分化させる作用を有することを見出した。
請求項１に係る発明は、Ｃａ／Ｐモル比が１．４０〜１．６７の組成を有し、比表面積が０．０５ｍ２／ｇ〜５０ｍ２／ｇであるリン酸カルシウム系化合物を主成分として含むことを特徴とする軟骨欠損部又は軟骨損傷部への充填材料である。
請求項１に係る発明では、上記組成を有するリン酸カルシウム化合物を主成分とする充填材料は、軟骨細胞の脱分化を抑制し、未分化間葉系細胞を軟骨細胞に分化させる作用を有することから、この材料を軟骨欠損部又は損傷部に補填することにより、周囲の軟骨や未分化間葉系細胞を軟骨細胞に維持、分化させ軟骨損傷部位を効果的に修復できる。
【００１０】
請求項２に係る発明は、請求項１に係る発明であって、リン酸カルシウム系化合物に軟骨細胞又は未分化間葉系細胞のいずれか一方又はその双方を更に含む充填材料である。
請求項２に係る発明では、リン酸カルシウム系化合物を充填する前に軟骨細胞、未分化間葉系細胞を混合して欠損部又は損傷部に充填すると、早期の修復が可能となる。
【００１１】
請求項３に係る発明は、請求項２に係る発明であって、リン酸カルシウム系化合物を担体とし、前記担体において培養された前記軟骨細胞又は前記未分化間葉系細胞のいずれか一方又はその双方を含む充填材料である。
請求項３に係る発明では、軟骨細胞や未分化間葉系細胞を生体外へと取出し、取出した軟骨細胞や未分化間葉系細胞をリン酸カルシウム系化合物とともに生体外で培養して増殖分化させた後に、欠損部又は損傷部に充填すると、軟骨修復期間を更に短縮することが可能になる。
【００１２】
請求項４に係る発明は、請求項１ないし３いずれか１項に係る発明であって、緻密体、多孔体、顆粒状体、軟骨欠損部形状又は軟骨損傷部形状に成形される充填材料である。
請求項４に係る発明では、充填箇所である軟骨欠損部又は軟骨損傷部にあわせて、その形状を緻密体、多孔体、顆粒状体、軟骨欠損部形状又は軟骨損傷部形状に容易に成形することができ、簡便な取扱いを可能にする。
【００１３】
【発明の実施の形態】
次に本発明の実施の形態を説明する。
本発明の充填材料は、軟骨欠損部又は軟骨損傷部への充填材料であり、その特徴ある構成は、Ｃａ／Ｐモル比が１．４０〜１．６７の組成を有し、比表面積が０．０５ｍ２／ｇ〜５０ｍ２／ｇであるリン酸カルシウム系化合物を主成分として含むところにある。上記組成を有するリン酸カルシウム化合物は軟骨細胞の脱分化を抑制し、未分化間葉系細胞を軟骨細胞に分化させる作用を有することから、このリン酸カルシウム系化合物を主成分として含む充填材料をそのまま直接軟骨欠損部又は軟骨損傷部に充填すると、周囲の軟骨細胞や未分化間葉系細胞を軟骨細胞に維持、分化させることで、軟骨損傷部位を修復することができる。また、軟骨欠損部又は軟骨損傷部に充填したときに速やかに軟骨基質が形成されるので、患者の他部位から軟骨を移植する必要がなくなる。
【００１４】
Ｃａ／Ｐモル比を１．４０〜１．６７に規定したのは、Ｃａ／Ｐモル比が上記範囲外になると、充填材料から酸又はアルカリ成分が溶出し、生体に障害を及ぼす不具合を生じるためである。好ましいＣａ／Ｐモル比は１．４５〜１．６５である。より好ましくは１．５０〜１．６３である。
比表面積を０．０５ｍ２／ｇ〜５０ｍ２／ｇに規定したのは、この範囲内であれば細胞の吸着性が良好だからである。好ましい比表面積は０．１ｍ２／ｇ〜４０ｍ２／ｇである。より好ましくは１ｍ２／ｇ〜３０ｍ２／ｇである。
【００１５】
本発明の充填材料の主成分であるリン酸カルシウム系化合物の製造方法を説明する。
先ず、水酸化カルシウムとリン酸をＣａ／Ｐモル比が１．４０〜１．６７となるように秤量する。次いで、純水に懸濁させた水酸化カルシウムに純水で希釈したリン酸を反応させて、非晶質リン酸カルシウムスラリーを調製する。次に得られたスラリーを乾燥させ、この乾燥物を６００〜１０００℃で１〜５時間焼成することにより、Ｃａ／Ｐモル比が１．４０〜１．６７の組成を有し、比表面積が０．０５ｍ２／ｇ〜５０ｍ２／ｇであるリン酸カルシウム化合物が得られる。焼成温度が６００℃未満であると材料強度が低下する不具合を生じる。焼成温度が１０００℃を越えると軟骨分化活性が低下する。８００℃〜９００℃で１〜３時間焼成するのが好ましい。
【００１６】
また、本発明の充填材料は、リン酸カルシウム系化合物に軟骨細胞又は未分化間葉系細胞のいずれか一方又はその双方を更に含む。軟骨細胞や未分化間葉系細胞を更に含ませて混合した充填材料を軟骨欠損部又は軟骨損傷部に充填すると、早期の軟骨修復が可能になる。
更に、本発明の充填材料は、リン酸カルシウム系化合物を担体とし、この担体において培養された軟骨細胞又は未分化間葉系細胞のいずれか一方又はその双方を更に含む。軟骨細胞、未分化間葉系細胞をいったん生体外へと取出し、この軟骨細胞や未分化間葉系細胞をリン酸カルシウム系化合物を担体として培養し、増殖、分化させた後に軟骨欠損部又は軟骨損傷部に充填すると、軟骨修復期間を更に短縮することが可能になる。この本発明の充填材料を用いることで、三次元培養法や細胞成長因子添加等の操作をしなくても軟骨細胞の状態を維持、分化させることが可能となり、これらの細胞を培養してから軟骨欠損部に移植する治療において、培養操作の簡便化と培養コストの低減化が実現できる。また本発明のリン酸カルシウム系化合物は、軟骨細胞の脱分化を抑制し、未分化間葉系細胞を軟骨細胞に分化させる作用を有することから、従来担体として用いられていた材料よりも培養効率が大幅に高い。
【００１７】
本発明の充填材料は、充填箇所である軟骨欠損部又は軟骨損傷部にあわせて、その形状を緻密体、多孔体、顆粒状等に成形することができるだけでなく、必要に応じて軟骨欠損部の形状に合うように加工することもできる。このように、形状を容易に成形できることから取扱いが簡便である。多孔体形状に成形した場合、多孔体表面及びその内部に細胞を含ませることで細胞分化を促進することが可能となる。多孔体に成形したときの密度は０．５ｇ／ｃｍ３〜２．０ｇ／ｃｍ３である。好ましくは１．０ｇ／ｃｍ３〜１．５ｇ／ｃｍ３である。０．５ｇ／ｃｍ３未満であると、材料強度が低下する不具合を生じ、２．０ｇ／ｃｍ３を越えると孔内へ細胞が侵入できない不具合を生じる。また、顆粒状に成形した場合、顆粒間隙に細胞を含ませることで細胞分化を促進することが可能となる。更に、緻密体形状に成形した場合、緻密体表面に細胞を付着させることで細胞分化を促進することが可能となる。緻密体に成形したときの密度は１．６ｇ／ｃｍ３〜３．２ｇ／ｃｍ３である。好ましくは２．２ｇ／ｃｍ３〜３．１ｇ／ｃｍ３である。１．６ｇ／ｃｍ３未満であると、材料強度が低下する不具合を生じ、３．２ｇ／ｃｍ３を越えると材料の成形が困難になる不具合を生じる。
【００１８】
【実施例】
次に本発明の実施例を詳しく説明する。
＜実施例１＞
先ず、水酸化カルシウムとリン酸をＣａ／Ｐモル比が１．５０となるように秤量した。次いで、純水に懸濁させた水酸化カルシウムと純水で希釈したリン酸を反応させて、非晶質リン酸カルシウムスラリーを調製した。次に得られたスラリーを乾燥させ、この乾燥物を９００℃で３時間焼成することによりＣａ／Ｐモル比１．５０のリン酸カルシウム化合物緻密体を得た。得られたＣａ／Ｐモル比１．５０のリン酸カルシウム化合物緻密体の比表面積を測定したところ、３．５ｍ２／ｇであった。同様に、秤量割合を変化させてＣａ／Ｐモル比１．６７のリン酸カルシウム化合物緻密体を得た。得られたＣａ／Ｐモル比１．６７のリン酸カルシウム化合物緻密体の比表面積を測定したところ、１２ｍ２／ｇであった。これらのリン酸カルシウム化合物緻密体（１０×１０×１ｍｍ）を充填材料として２４ウェル培養シャーレに入れ、ヒト間葉系幹細胞を２×１０４個／２ｍｌシャーレ播種した。比較としてアルミナ板、ガラス板を充填材料として２４ウェル培養シャーレに入れ、ヒト間葉系幹細胞を２×１０４個／２ｍｌシャーレ播種した。また充填材料を入れないシャーレにも同細胞を播種した。
先ず、これら５種類のシャーレを３７℃、５％ＣＯ２、加湿雰囲気下に２４日間保持してシャーレ内で細胞を培養した。次いで、細胞を培養したシャーレ内にアルシアンブルー試薬を滴下して培養した細胞をアルシアンブルー試薬で染色させた。次に、染色させた染料をグアニジン塩酸で抽出した。得られた抽出物に６２０ｎｍの波長を当ててその波長における吸光度を測定した。得られた測定結果を図１にそれぞれ示す。
【００１９】
図１より明らかなように、アルミナ板やガラス板を充填材料として入れたシャーレから抽出された抽出物は、充填材料を入れないシャーレから抽出された抽出物とほぼ同程度の吸光度を示す結果が得られた。これに対してＣａ／Ｐモル比１．５０、Ｃａ／Ｐモル比１．６７のリン酸カルシウム化合物緻密体を充填材料として入れたシャーレから抽出された抽出物は、高い吸光度を示す結果が得られた。この波長における吸光度は、軟骨細胞分化指標であるグリコサミノグリカンを検出したことを表すため、高い吸光度が得られたリン酸カルシウム化合物緻密体は、アルミナ板やガラス板を充填材料に用いる場合や充填材料を入れない場合に比べて培養した細胞が顕著にアルシアンブルー試薬で染色されており、リン酸カルシウム化合物緻密体が細胞成長因子として作用し、ヒト間葉系幹細胞から軟骨細胞への分化を促進させたことが判る。
【００２０】
＜実施例２＞
先ず、水酸化カルシウムとリン酸をＣａ／Ｐモル比を１．５０となるように秤量した。次いで、純水に懸濁させた水酸化カルシウムと純水で希釈したリン酸を反応させて、非晶質リン酸カルシウムスラリーを調製した。次に得られたスラリーを８等分した後に乾燥させ、これらの乾燥物を５００℃、６００℃、７００℃、８００℃、９００℃、１０００℃、１１００℃及び１２００℃で３時間それぞれ焼成することにより、８種類のＣａ／Ｐモル比１．５０のリン酸カルシウム化合物緻密体を得た。得られた８種類のＣａ／Ｐモル比１．５０のリン酸カルシウム化合物緻密体の比表面積を測定したところ、５００℃焼成では６０ｍ２／ｇであり、６００℃〜１０００℃焼成では１．２〜３０ｍ２／ｇであり、１１００℃及び１２００℃焼成では０．０４ｍ２／ｇであった。また同様に、秤量割合をＣａ／Ｐモル比１．６７に代えて、８種類のＣａ／Ｐモル比１．６７のリン酸カルシウム化合物緻密体を得た。得られた８種類のＣａ／Ｐモル比１．６７のリン酸カルシウム化合物緻密体の比表面積を測定したところ、５００℃焼成では５６ｍ２／ｇであり、６００℃〜１０００℃焼成では５．４〜４４ｍ２／ｇであり、１１００℃及び１２００℃焼成では０．０４ｍ２／ｇであった。この１６種類のリン酸カルシウム化合物緻密体を用いた以外は実施例１と同様の条件で試験を行い、軟骨細胞への分化能を評価した。得られた測定結果を図２にそれぞれ示す。
【００２１】
図２より明らかなように、Ｃａ／Ｐモル比では、１．５０と１．６７ともに同様の傾向が得られ、５００℃、１１００℃及び１２００℃で焼成したリン酸カルシウム化合物緻密体に比べて６００℃〜１０００℃で焼成したリン酸カルシウム化合物緻密体は吸光度が高く、細胞成長因子として分化を促進させる作用が高い結果が得られた。
【００２２】
＜実施例３＞
先ず、Ｃａ／Ｐモル比を１．３０、１．４０、１．５０、１．５４、１．５８、１．６３、１．６７及び１．７０となるようにそれぞれ秤量した。次いで純水に懸濁させた水酸化カルシウムと純水で希釈したリン酸を反応させて非晶質リン酸カルシウムスラリーを調製した。次に得られたスラリーを乾燥させ、これらの乾燥物を１０００℃で３時間それぞれ焼成することにより、８種類のＣａ／Ｐモル比の異なるリン酸カルシウム化合物緻密体を得た。得られた８種類のＣａ／Ｐモル比の異なるリン酸カルシウム化合物緻密体の比表面積を測定したところ、Ｃａ／Ｐモル比が１．３０の場合では０．６４ｍ２／ｇであり、Ｃａ／Ｐモル比が１．４０〜１．６７の場合では０．８５ｍ２／ｇ〜５．４ｍ２／ｇであり、Ｃａ／Ｐモル比が１．７０の場合では１１ｍ２／ｇであった。この８種類のリン酸カルシウム化合物緻密体を用いた以外は実施例１と同様の条件で試験を行い、軟骨細胞への分化能を評価した。得られた測定結果を図３にそれぞれ示す。
【００２３】
図３より明らかなように、Ｃａ／Ｐモル比が１．３０及び１．７０のリン酸カルシウム化合物緻密体に比べて１．４０〜１．６７のリン酸カルシウム化合物緻密体は吸光度が高く、細胞成長因子として分化を促進させる作用が高い結果が得られた。
【００２４】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明の軟骨欠損部又は軟骨損傷部への充填材料は、Ｃａ／Ｐモル比が１．４０〜１．６７の組成を有し、比表面積が０．０５ｍ２／ｇ〜５０ｍ２／ｇであるリン酸カルシウム系化合物を主成分として含むことを特徴とする。充填材料の主成分である上記組成を有するリン酸カルシウム化合物は、軟骨細胞の脱分化を抑制し、未分化間葉系細胞を軟骨細胞に分化させる作用を有することから、この材料を軟骨欠損部又は損傷部に補填することにより、周囲の軟骨や未分化間葉系細胞を軟骨細胞に維持、分化させ軟骨損傷部位を効果的に修復できる。
また、リン酸カルシウム系化合物に軟骨細胞又は未分化間葉系細胞のいずれか一方又はその双方を更に含ませることもできる。リン酸カルシウム系化合物を充填する前に軟骨細胞、未分化間葉系細胞を混合して欠損部又は損傷部に充填すると、早期の修復が可能となる。
更に、リン酸カルシウム系化合物を担体とし、担体において培養された軟骨細胞又は未分化間葉系細胞のいずれか一方又はその双方を含むこともできる。軟骨細胞や未分化間葉系細胞を生体外へと取出し、取出した軟骨細胞や未分化間葉系細胞をリン酸カルシウム系化合物とともに生体外で培養して増殖分化させた後に、欠損部又は損傷部に充填すると、軟骨修復期間を更に短縮することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の軟骨細胞への分化能の指標となる吸光度を示す図。
【図２】実施例２の軟骨細胞への分化能の指標となる吸光度を示す図。
【図３】実施例３の軟骨細胞への分化能の指標となる吸光度を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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