(57)【要約】【課題】４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を優勢的に生産する微生物を用いて、その培養物に含まれる他の高度不飽和脂肪酸からの分離、精製を必要としない程度に純粋な４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸及びそれを含むトリグリセリドやリン脂質を大量に製造する方法を提供する。【解決手段】ラビリンチュラ科ラビリンチュラ属に属する４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸生産菌Ｌ５９株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９８７）であって、この微生物を培養し、菌体中に構成脂肪酸として４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を含む脂質を蓄積させたのち、菌体を分離し、分離した菌体から溶媒により前記脂質を抽出したのち、その抽出物を加水分解することにより製造する。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラビリンチュラ科ラビリンチュラ属に属する４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸生産菌Ｌ５９株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９８７）。
【請求項２】
請求項１記載の微生物を培養し、菌体中に構成脂肪酸として４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を含む脂質を蓄積させたのち、菌体を分離し、分離した菌体から溶媒により前記脂質を抽出したのち、その抽出物を加水分解することを特徴とする４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸の製造方法。
【請求項３】
炭素源として大豆レシチンを含む培地中で培養する請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
全高度不飽和脂肪酸の９０質量％以上が４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸である脂質を生成させる請求項２又は３記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラビリンチュラ科ラビリンチュラ属に属する新規な微生物及びそれを用いた４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸（通称ｎ‐６ＤＰＡ）は、高度不飽和脂肪酸の１種であって、近年、血液脳関門通過能が高いことから、血液脳関門通過性医薬組成物の成分として注目されている（特開昭６１−２０４１３６号公報）。また、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸は、ｎ‐３系必須脂肪酸欠乏時に、代替物質として増加することも報告されており、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を大量に生産することは、工業的に非常に大きな意義を有する。
【０００３】
その４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸は、イワシ油などの魚油にはほとんど含まれていないので、それを製造するには微生物の利用が考えられる。そして、これまで、ラビリンチュラ属に属する微生物が、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、ドコサヘキサエン酸などの高度不飽和脂肪酸とともに、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を構成脂肪酸とするトリグリセリドやリン脂質として生産することが知られている。
【０００４】
したがって、この微生物を培養し、その菌体から常法に従い、非水溶性有機溶媒で抽出処理し、抽出液から有機溶剤を蒸発除去することにより、高度不飽和脂肪酸を含む脂質成分を回収し、次いでこの高度不飽和脂肪酸を含む脂質成分を加水分解したのち、その分解生成物から４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を分離すれば、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を製造することができる。
【０００５】
しかしながら、上記の多数の高度不飽和脂肪酸を含む脂質の加水分解生成物中の４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸の含有割合が低く、さらにそれを分離するには、クロマトグラフィー処理を含む分離操作を必要とするため、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を大量に製造する方法としては不適当であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような事情のもとで、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を優勢的に生産する微生物を用いて、その培養物に含まれる他の高度不飽和脂肪酸からの分離、精製を必要としない程度に純粋な４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸及びそれを含むトリグリセリドやリン脂質を大量に製造する方法を提供することを目的としてなされたものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、高度不飽和脂肪酸を生産する微生物について鋭意研究を重ねた結果、ラビリンチュラ科ラビリンチュラ属に属する微生物中に、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を優勢的に生産する菌株が存在すること、そして、この菌株を用いれば、脂質の構成成分である高度不飽和脂肪酸の９０質量％以上が４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸となるトリグリセリドやリン脂質を製造しうること、及び４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を９０質量％以上の割合で含む高度不飽和脂肪酸混合物を選択的に製造しうることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、ラビリンチュラ科ラビリンチュラ属に属する４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸生産菌Ｌ５９株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９８７）、及びこの微生物を培養し、菌体中に構成脂肪酸として４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を含む脂質を蓄積させたのち、菌体を分離し、分離した菌体から溶媒により前記脂質を抽出したのち、その抽出物を加水分解することを特徴とする４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸の製造方法を提供するものである。
本発明でいう高度不飽和脂肪酸とは、炭素数２０以上で３個以上の不飽和結合を有する脂肪酸を意味する。また、本発明における４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸生産菌とは、全高度不飽和脂肪酸における４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸の含有率が９０質量％以上の脂質を生産する菌株を意味する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の微生物、すなわちラビリンチュラ科ラビリンチュラ属に属する４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸生産菌Ｌ５９株は、北海道オホーツク海沿岸で採取された落葉から分離され、それらを培養した場合、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸が全高度不飽和脂肪酸の９０質量％以上を占めることで特徴づけられるものである。この菌株は受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９８７として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【００１０】
本発明の微生物を得るには、例えば北海道オホーツク海沿岸で採取した落葉樹の落葉を海水中に数日間放置したのち、落葉の表面に付着した微生物を集めることによって先ず原体を採取する。
【００１１】
次に採取した原体を、炭素源としてグルコースを含む合成培地中で培養する。このようにして得た菌株Ｌ５９株についての光学顕微鏡写真を図１に示す。次いで、培養後、培養培地から菌体を分離し、乳鉢で破砕し、この破砕物をクロロホルムで抽出し、ガスクロマトグラフィーにより脂肪酸組成の分析をした。このようにして得た脂肪酸組成パターンを図２に示す。
【００１２】
このようにして得られる本発明の微生物は、高度不飽和脂肪酸としてアラキドン酸やドコサヘキサエン酸を含まず、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を高い割合で菌体内に保有するが、これまで知られているラビリンチュラ属に属する微生物では、このような能力を示すものは存在しない。
【００１３】
本発明の微生物は、図１から分るように、ラビリンチュラ属の特徴である紡錘形状を有し、海中に広く存在する海生菌の１種である。そして、以下に示す菌学的性質から、容易に公知の微生物と区別される。
Ｉ．形態学的性質
（１）細胞の大きさは、約１０μｍで紡錘形である。
（２）ネットワークを形成し、その中で滑走運動している。
ＩＩ．培養的性質
（１）糖質寒天培地では培地表面のみに拡がる。
（２）糖質液体培養では、ほとんど生育しない。
（３）有機又は無機の窒素源を利用して増殖する。
（４）至適ｐＨは５〜９、至適温度は１８〜２５℃である。
（５）大豆レシチンの存在下で４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を多量に生産する。
【００１４】
次に、本発明の微生物を培養して４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を得るには、炭素源として糖類、窒素源として有機含窒素物質及び無機塩をそれぞれ０．１〜１０ｇ／リットルの濃度で含有する海水が基本培地として用いられる。
【００１５】
上記の糖類としては、例えばグルコース、ショ糖、フルクトース、水あめなどが、有機含窒素物質としては、ペプトン、酵母エキスなどが用いられる。また、無機塩としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＮＯ３、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、（ＮＨ４）２ＳＯ４などが用いられるが、もともと海水中に存在する成分については特に添加する必要はない。
培養温度としては、１５〜３０℃、好ましくは１８〜２５℃、培地ｐＨとしては５〜９、好ましくは６〜８が用いられる。
【００１６】
このようにして２時間ないし２０日間培養した培養物中の菌体には、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸がトリグリセリドとして多量に蓄積される。この際、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸の一部はリン脂質としても蓄積される。
【００１７】
したがって、培養物から菌体を分離し、分離した菌体を有機溶剤、例えばクロロホルムで抽出すると、高度不飽和脂肪酸として４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を高い割合で含む脂質を得ることができる。そして、この脂質は、シリカカラムクロマトグラフィーにより、トリグリセリド及びリン脂質に分離することができる。次に、このようにして得られた４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸のグリセリド及びリン脂質を常法により加水分解すると、所望の４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸が得られる。
【００１８】
本発明の微生物を培養するに際して、培地中に大豆レシチンを添加すれば、その培養効率を著しく向上させることができるので有利である。この添加濃度としては、２．０〜４．５ｇ／リットル、好ましくは２．５〜４．０ｇ／リットルの範囲内で選ぶのがよい。
【００１９】
また、培養物を加水分解したのち、尿素付加法を用いて濃縮すれば、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸以外の脂肪酸を効率よく除去しうるので、容易に高純度の４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を得ることができる。
【００２０】
この尿素付加法は以下のようにして行われる。
すなわち、菌体を有機溶剤で抽出し、加水分解後、得られた脂肪酸混合物５０ｇをメチルアルコール１リットルに溶解し、メチルアルコール１リットル当り、尿素２００ｇを加えて溶解したのち、低温で静置し、析出してくる尿素を濾去する。このようにして得た濾液には飽和脂肪酸は含まれておらず、９０質量％以上が４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸である。
【００２１】
【実施例】
次に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによってなんら限定されるものではない。
【００２２】
実施例１
人工海水にポリペプトン１ｇ／リットル、酵母エキス０．５ｇ／リットル、寒天１０ｇ／リットル、ツイーン８０（Ｔｗｅｅｎ８０）１．２５ｇ／リットルを加えたのち、１００℃に加熱し滅菌することにより基本培地を調製した。この基本培地に、炭素源として大豆油、大豆レシチン、リノール酸又はリノレン酸を３０ｇ／リットル添加したのち、ラビリンチュラＬ５９株を植菌し、２５℃において１４日間培養した。
次いで、培養物の一部を採取し、ガスクロマトグラフィーにより、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸の定量分析を行い、寒天１ｇ当りの生成量（ｍｇ）すなわちｍｇ／ｇ−ａｇａｒを求めた。その結果を表１に示す。
【００２３】
【表１】
2004089048.tif 000002
【００２４】
この表から分るように、大豆油又は大豆レシチンを添加した場合、特に大豆レシチンを添加した場合にドコサペンタエン酸の収量が向上する。
【００２５】
実施例２
実施例１の基本培地に、２０、２５、３０、４０又は４５ｇ／リットルの割合で大豆レシチンを添加した培地を調製し、これに、ラビリンチュラＬ５９株を植菌し、実施例１と同様にして２５℃において１４日間培養し、得られた培養物について実施例１と同様にして４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸のガスクロマトグラフィー分析を行った。その結果を表２に示す。
【００２６】
【表２】
2004089048.tif 000003
【００２７】
この表から分るように、大豆レシチン添加量２．５〜４．０質量％において、ドコサペンタエン酸が高い収率で得られる。
【００２８】
実施例３
実施例１の基本培地に大豆レシチン４０ｇ／リットルを添加し、ラビリンチュラＬ５９株を植菌し、１０〜３０℃の範囲内で温度を変えて１４日間培養した。得られた培養物について、実施例１と同様にしてガスクロマトグラフィー分析を行った結果を表３に示す。
【００２９】
【表３】
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【００３０】
この表から分るように、培養温度としては１８〜２５℃の範囲、特に２０℃付近が最適である。
【００３１】
実施例４
実施例３の培養温度２０℃で得た培養物を加水分解したのち、１０％塩酸−メチルアルコール溶液を加えて反応させ、脂肪酸をすべてメチルエステルに変換し、それを尿素付加法を用いて精製した。このものについてガスクロマトグラフィー分析を行った結果をチャートとして図３に示す。
また、同じものについて、ガスクロマトグラフィー質量分析計で分離、分析した場合のピーク成分のチャートを図４に示す。
これらの結果は、ラビリンチュラＬ５９株が高度不飽和脂肪酸として４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸のみを含み、それは尿素付加法により容易にその他の脂肪酸から分離できることを示す。
【００３２】
【発明の効果】
本発明によると、生理活性物質として期待される４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を選択的にかつ９０質量％以上の高収率で得ることができ、さらに脂質の構成成分である高度不飽和脂肪酸の９０質量％以上が４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸であるトリグリセリド及びリン脂質が得られ、その結果、これまで実現できなかった食品、家畜飼料、医薬品の添加剤を工業的規模で製造しうるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明微生物Ｌ５９株の光学顕微鏡写真。
【図２】本発明微生物の菌株中に蓄積された脂肪酸のガスクロマトグラフィーによる組成パターン。
【図３】実施例４で得た生成物のガスクロマトグラフィー分析のチャート。
【図４】実施例４で得た生成物のガスクロマトグラフィー質量分析計で測定したピーク成分の分析チャート。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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