(57)【要約】【課題】培地交換時における塵埃の発生を低減し、簡易に培地交換を行うことを可能とし、かつ、培地交換の自動化を容易にする。【解決手段】培地を貯留可能な容器本体２と、該容器本体２の底面５と略同等の面積を有し、該容器本体２内に取り出し可能に挿入される平面状の培養面６を有する培養面部材４とを備える培養容器１を提供する。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地を貯留可能な容器本体と、
該容器本体の底面と略同等の面積を有し、該容器本体内に取り出し可能に挿入される平面状の培養面を有する培養面部材とを備える培養容器。
【請求項２】
前記培養面部材が、前記容器本体内に貯留される培地の液面上に露出する把持部を備える請求項１に記載の培養容器。
【請求項３】
前記培養面に貫通孔が設けられている請求項１または請求項２に記載の培養容器。
【請求項４】
前記容器本体の底面に傾斜面を備え、
前記培養面部材が前記傾斜面に沿って容器本体内に取り出し可能に挿入されている請求項１または請求項２に記載の培養容器。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、細胞を培養するために用いられる培養容器に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、移植に必要充分な量の細胞を患者から採取することが困難であるために、患者から採取した少量の細胞を培養して、移植に必要充分な量まで増殖させることが行われている。この場合において、細胞の培養は、適当な培地内に細胞を混合して、所定の培養条件下に配した状態で、例えば、１〜２週間程度の期間にわたって行われる。
【０００３】
細胞は、この間、培地内に含有されている各種成分を栄養源として成長する。したがって、細胞の成長とともに培地内の栄養源が減少し、排出物が増大するので、培養途中においてこれを補う必要がある。
このため、従来より、培養途中における定期的な培地交換作業が行われている。培地交換により、失われた栄養源が補給され、細胞の成長が継続的に行われることになる。
【０００４】
従来、細胞の培養は、クリーンルーム内において、所定の培養容器内に細胞と培地とを投入することにより行われ、培地交換は、作業者がアスピレータ等を用いて、培養容器内部の培地を培養容器の開口から流し出すことにより行われていた。
【０００５】
【特許文献１】
特公平３−６９５０８号公報（第１頁、第１図）
【特許文献２】
特公平３−５７７４４号公報（第７頁、第４図）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、アスピレータを用いる交換方法では、塵埃等が混入する可能性が高く、培地を培養容器の開口から流し出す方法による培地交換では、流れ出た培地の微細な飛沫が散乱するので、クリーンルーム内の清浄度が低下する不都合がある。したがって、培養容器からの廃培地の放出は、クリーンルーム外で行うことが好ましい。しかしながら、細胞をクリーンルーム外へ持ち出すことは、細菌等による汚染防止の観点から好ましくない。
また、培地交換を人手によることなく自動的に行うことが考えられるので、自動化容易であることも必要である（例えば、特許文献１、特許文献２参照。）。
【０００７】
この発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、培地交換時における塵埃の発生を低減し、簡易に培地交換を行うことを可能とし、かつ、培地交換の自動化を容易にすることができる培養容器を提供することを目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、この発明は、以下の手段を提供する。
請求項１に係る発明は、培地を貯留可能な容器本体と、該容器本体の底面と略同等の面積を有し、該容器本体内に取り出し可能に挿入される平面状の培養面を有する培養面部材とを備える培養容器を提供する。
【０００９】
この発明によれば、容器本体に培養面部材を挿入することで、培養面によって容器本体内部の底面全体が覆われる。この状態で、容器本体内に培地を貯留し、細胞を培養することにより、培養面上において細胞を成長させることが可能となる。そして、培地を交換する際には、細胞の付着した培養面部材を容器本体から取り出し、例えば、新たな培地を貯留した新たな容器本体に浸漬することにより、培養を継続することが可能となる。また、廃棄する培地を容器本体内に残すことができるので、廃棄する培地を貯留した容器本体をクリーンルーム外に移動させて培地を廃棄することにより、クリーンルーム内における塵埃の発生を防止することが可能となる。
【００１０】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の培養容器において、前記培養面部材が、前記容器本体内に貯留される培地の液面上に露出する把持部を備える培養容器を提供する。
この発明によれば、培地交換の際に培地の液面上に露出する把持部を把持して培養面を培地内から引き出すことが可能となる。その結果、培地や培養面上の細胞に外部部材を接触させることなく、培地交換を容易に行うことが可能となる。
【００１１】
請求項３に係る発明は、請求項１または請求項２に記載の培養容器において、前記培養面に貫通孔が設けられている培養容器を提供する。
この発明によれば、培養面を容器本体から引き出す際に、培養面に設けた貫通孔を通して培地を流通させることにより、廃棄すべき培地を容器本体内に残しながら、細胞の付着した培養面を容易に取り出すことが可能となる。
【００１２】
請求項４に係る発明は、請求項１または請求項２に記載の培養容器において、前記容器本体の底面に傾斜面を備え、前記培養面部材が前記傾斜面に沿って容器本体内に取り出し可能に挿入されている培養容器を提供する。
この発明によれば、培養面部材は容器本体の傾斜面に沿うように配置され、その傾斜した培養面部材に細胞が付着する。そして、培養面部材を容器本体から取り出す際に、傾斜面に沿って取り出すことにより、培養面部材の上方に存在する培地を培養面部材に沿って流しながら取り出すことが可能となる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
この発明の各実施形態に係る培養容器について説明する前に、生体組織補填体としての骨補填体の製造工程について概略的に説明する。骨補填体を製造するには、図８に示されるように、まず、患者の腸骨等から骨髄液を採取する。採取された骨髄液は遠心分離機にかけられて、旋回されることにより、比重の重い骨髄細胞を抽出される。
【００１４】
抽出された骨髄細胞は、予め調製されている培地とともに培養容器内に投入され混合される。培地の一部は取り出されて感染検査に回される。
この後に、混合された骨髄液および培地を所定の温度（例えば、３７±０．５℃）およびＣＯ２濃度（例えば５％）等の培養条件に維持することにより、所定時間にわたって一定培養条件下で細胞が一次培養される。細胞の培養途中の所定の交換時期には、培養容器内から培地が廃棄される。そして、再度培地を混合されて培養工程が繰り返し継続される。廃棄された培地の一部は感染検査に回される。
【００１５】
所定の培養期間が終了すると、培養容器内から培地が廃棄された後に、培養容器内にトリプシンのような蛋白質分解酵素が投入・混合される。これにより、培養容器の底面に付着して成長していた間葉系幹細胞が、主培養容器の底面から剥離される。そして、このように剥離された間葉系幹細胞は、遠心分離機にかけられることにより抽出される。
【００１６】
抽出された間葉系幹細胞は、細胞数調整が行われた後に、骨補填材と適当な培地が投入された培養容器内に混合される。実際には、間葉系幹細胞を骨補填材に付着させ、培地内に投入する。そして、上記と同様にして、混合された間葉系幹細胞と培地を所定の温度（例えば、３７±０．５℃）およびＣＯ２濃度（例えば５％）等の培養条件に維持することにより、所定時間にわたって一定培養条件下で細胞が二次培養される。
【００１７】
二次培養工程においても、一次培養工程と同様にして、定期的に培地の交換が行われ、投入される培地の一部および廃棄される培地の一部がそれぞれ、感染検査に回される。そして、所定の培養期間が経過したところで、出荷用の品質検査と感染検査のための検体抽出が行われ、製造された骨補填材は密封されて製品として提供される。
【００１８】
以下に説明するこの発明の一実施形態に係る培養容器は、主に、上述した培養工程の内、一次培養工程において使用されるものであるが、二次培養工程において使用してもよい。
この発明の一実施形態に係る培養容器について、図１から図４を参照して、以下に説明する。
本実施形態に係る培養容器１は、図１および図２に示されるように、上方に開口し、底面を有する比較的浅く広い円筒状の容器本体２と、該容器本体２の上部開口３から容器本体２内に挿入される培養面部材４とから構成されている。
【００１９】
前記培養面部材４は、図１に示されるように、容器本体２の底面５とほぼ同等の大きさおよび形状を有する平板状の培養面６と、該培養面６から立ち上がる把持部７とを備えている。前記培養面６は、前記容器本体２内に挿入されたときに、容器本体２の底面５全体を覆うように構成されている。前記把持部７は、図３に示されるように、培養面部材４を容器本体２内に挿入し、培養面６が容器本体２の底面に接触する位置に配置されたときに、容器本体２に貯留される培地８の液面よりも上方に突出する程度の長さ寸法に形成されている。
【００２０】
このように構成された本実施形態に係る培養容器１の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係る培養容器１を用いて細胞の培養を行うには、培養面部材４を容器本体２内に挿入して、容器本体２内に適当な培地８および培養すべき細胞を混合して投入する。これにより、培養面部材４の培養面６が容器本体２の底面５を被覆するように配置されるとともに、培養面部材４の把持部７が培地８の液面から上方に突出して配置される。
【００２１】
この状態で、所定の培養条件、例えば、３７±０．５℃、５％ＣＯ２濃度に維持することにより、培地８内において細胞が培養される。細胞、特に幹細胞は、底面５に付着して成長する性質を有しており、培養中に底面５を構成している培養面部材４の培養面６に付着して成長する。
【００２２】
そして、所定の培地交換時期に、図４に示されるように、他の容器本体９に新たな培地１０を貯留して用意するとともに、作業者またはマニピュレータが把持部７を把持して、細胞が付着した培養面部材４を培地８内から取り出す。その後に、図４に矢印で示されるように、新たな培地１０が貯留されている容器本体９内に、細胞が付着した培養面部材４を投入する。これにより、培地交換が行われ、細胞の培養を継続して行うことが可能となる。
【００２３】
この場合において、本実施形態に係る培養容器１では、ピペットのような外部部材によって廃棄する培地８を吸引する必要がなく、培地８の液面上に露出している把持部７を把持して引き上げるだけで細胞を培地８内から取り出すことができる。その結果、外部部材から細胞に、塵埃や細菌が移る機会を低減し、細胞の健全性を維持することができる。
【００２４】
また、培養容器１から培地８を流し出すのではなく、培地８を容器本体２内に残すので、培養面部材４を取り去った後の培地８を容器本体２ごとクリーンルーム内から持ち出すことができる。したがって、クリーンルーム内において培養容器１から流し出す必要がないので、クリーンルーム内に廃棄する培地８の飛沫が散乱することを防止し、クリーンルーム内の清浄度を維持することができる。
【００２５】
なお、本実施形態に係る培養容器１では、上方に開口した有底円筒状の容器本体２に、培養面部材４を上方から挿入するものを例に挙げて説明したが、容器本体２内への上方からの塵埃の降下による汚染を効果的に防止することが望まれる場合には、例えば、図５および図６に示されるような容器本体２の側壁に設けた開口１１から培養面部材４を挿入する構造を採用してもよい。このように構成することにより、上方から降下する塵埃等が容器本体２内に入る機会を低減することができる。
【００２６】
また、容器本体２の底面全域を覆う培養面６を有する培養面部材４を容器本体２から取り出す際に、培地８が容器本体２内に残り易くするために、培養面６に貫通孔１２を形成しておいてもよい。この場合に、培養された細胞が付着し難い箇所、例えば、外周近傍に形成すればよい。また、貫通孔１２に代えて切欠を形成してもよい。
【００２７】
また、図７に示されるように、容器本体１３の底面１４を水平面に対して一定の角度で傾斜した傾斜面により構成し、該容器本体１３内に挿入される培養面部材１５の培養面１６を、容器本体１３の底面１４に沿う方向（図６に矢印で示す方向）に移動させるように構成されていてもよい。
このように構成された培養容器１７によれば、細胞が付着した培養面１６を容器本体１３から抜き出す際に、培養面１６上に配されている培地８を持ち上げることがなく、培地８を流動させずに、培養された細胞を容器本体１３から取り出すことができる。したがって、培地交換にあたって培地８の飛沫が散乱することをより低減することが可能となる。
【００２８】
また、この発明においては、生体組織として骨を例に挙げ、骨髄液から抽出した間葉系幹細胞を培養する場合について説明したが、骨髄液のみならず末梢血や臍帯血から抽出することにしてもよい。また、間葉系幹細胞に限定されるものではなく、ＥＳ細胞、体性幹細胞、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞等の体細胞の培養にも使用できる。
【００２９】
また、培養面部材４，１５に付着した細胞は、トリプシンのような蛋白質分解酵素を用いて剥がされた後に２次培養されるが、これに代えて、培養面部材４，１５の培養面６，１６に、所定の温度を境界として疎水性と親水性とが切り替わる温度応答性処理を施すことにしてもよい。
【００３０】
温度応答性処理は、温度応答性高分子ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を共有結合で固定することにより行われる。温度応答性処理された領域は、３２℃を境界温度として、それ以上では、市販の細胞用培養容器と同程度の弱い疎水性を呈するが、温度を境界温度以下に冷却することにより高い親水性を呈するようになる領域である。したがって、例えば、３７℃で培養した後に３２℃以下に冷却することにより、培養面６，１６を高い親水性を呈するように変化させ、容易に間葉系幹細胞を剥離させることができる。このようにすれば、トリプシン処理や遠心分離工程を行う必要がなく、細胞を健全な状態で回収することができる。
【００３１】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明によれば、容器本体から細胞の付着した培養面部材を引き出すだけで、廃棄する培地を激しく流動させることなく、培地と細胞とを分離することができる。その結果、簡易な構成で、周囲に廃棄する培地の飛沫を散乱させることなく培地交換等を行うことができるという効果を奏する。
また、培地の液面から露出する把持部を把持して容器本体から培養面部材を取り出すという簡易な操作によって、培地と細胞との分離が行われるので、自動化が容易であり、省力化、作業の高速化を容易に図ることができるという効果もある。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の一実施形態に係る培養容器を示す斜視図である。
【図２】図１の培養容器の容器本体から培養面部材を取り出した状態を示す縦断面図である。
【図３】図１の培養容器の容器本体に培養面部材を挿入した状態を示す縦断面図である。
【図４】図１の培養容器において培地を入れ替えるステップを説明する図である。
【図５】図１の培養容器の変形例を示す斜視図である。
【図６】図５の培養容器を示す縦断面図である。
【図７】図１の培養容器の他の変形例を示す縦断面図である。
【図８】この発明の一実施形態に係る培養容器が使用される培養工程を説明する模式図である
【符号の説明】
１，１７　培養容器
２，１３　容器本体
４，１５　培養面部材
５　底面
６，１６　培養面
７　把持部
８　培地
１２　貫通孔
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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