(57)【要約】【課題】セラミドキナーゼ遺伝子の転写制御に関わるプロモーター領域を特定し、該プロモーターの活性を調節する物質のスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】下記のａ）乃至ｃ）のいずれか一つに記載されたＤＮＡ：ａ）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；ｂ）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ；ｃ）上記ａ）に記載のＤＮＡと９５％以上のヌクレオチド配列同一性を有し、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ。【選択図】なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のａ）乃至ｃ）のいずれか一つに記載されたＤＮＡ：
ａ）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
ｂ）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ；
ｃ）上記ａ）に記載のＤＮＡと９５％以上のヌクレオチド配列同一性を有し、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ。
【請求項２】
形質転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２　ＳＡＮＫ　７０８０２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０８７）が保有する組換えプラスミドにおいて、ホタルルシフェラーゼをコードするヌクレオチド配列の５’末端に連結されている２５１５ｂｐのＤＮＡ。
【請求項３】
下記のａ）乃至ｃ）のいずれか一つに記載されたＤＮＡ：
ａ）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１０８７で示されるヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号２５１５で示されるヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
ｂ）上記ａ）に記載のＤＮＡのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ；
ｃ）上記ａ）に記載のＤＮＡと９５％以上のヌクレオチド配列同一性を有し、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ。
【請求項４】
形質転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２　ＳＡＮＫ　７０８０２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０８７）が保有する組換えプラスミドにおいて、ホタルルシフェラーゼをコードするヌクレオチド配列の５’末端に連結されている２５１５ｂｐのＤＮＡ中の３’末端側の１４２９ｂｐからなるＤＮＡ。
【請求項５】
配列表の配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含み、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ。
【請求項６】
配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１０８７から２５１５で示されるヌクレオチド配列を含み、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ。
【請求項７】
下記のａ）乃至ｄ）に表される特徴を有するＤＮＡ：
ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１０８７から２５１５で示されるヌクレオチド配列を含み；
ｂ）ヌクレオチド番号２５１５で示されるヌクレオチドを３’末端とし；
ｃ）ヌクレオチド番号１０８７で示されるヌクレオチドの５’末端に少なくとも１ｂｐ、最長で１０８６ｂｐのポリヌクレオチドが付加し；
ｄ）哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有する。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか１つに記載のＤＮＡを含む組換えプラスミド。
【請求項９】
請求項１乃至７のいずれか１つに記載のＤＮＡの３’末端に、タンパク質をコードするＤＮＡが連結されていることを特徴とする、請求項８記載の組換えプラスミド。
【請求項１０】
タンパク質が、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、からなる群から選択されることを特徴とする、請求項９記載の組換えプラスミド。
【請求項１１】
タンパク質がルシフェラーゼであることを特徴とする、請求項９または１０記載の組換えプラスミド。
【請求項１２】
形質転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２　ＳＡＮＫ　７０８０２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０８７）が保有する組換えプラスミド、ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２。
【請求項１３】
請求項８乃至１２のいずれか１つに記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞。
【請求項１４】
宿主細胞が原核細胞である、請求項１３記載の宿主細胞。
【請求項１５】
宿主細胞が真核細胞である、請求項１３記載の宿主細胞。
【請求項１６】
宿主細胞が哺乳動物由来の細胞である、請求項１３または１５記載の宿主細胞。
【請求項１７】
形質転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２　ＳＡＮＫ　７０８０２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０８７）。
【請求項１８】
下記の工程ｉ）からｉｉｉ）からなる、セラミドキナーゼ遺伝子プロモーター活性調節作用を有する物質のスクリーニング方法：
ｉ）請求項８乃至１２のいずれか一つに記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞を被験物質の存在下、または非存在下で培養する工程；
ｉｉ）上記ｉ）の宿主細胞における、請求項８乃至１２のいずれか一つに記載の組換えプラスミド中の、請求項１乃至７のいずれか１つに記載のＤＮＡの３’末端に連結されているＤＮＡにコードされているタンパク質の発現量を検出する工程；
ｉｉｉ）上記ｉｉ）の検出結果を、被験物質の存在下で培養した細胞と被験物質非存在下で培養した細胞との間で比較する工程。
【請求項１９】
下記の工程ｉ）からｉｉｉ）からなる、神経性疾患、炎症、感染症、血栓症、免疫疾患、ＨＩＶ、２型糖尿病、肥満、敗血症、心疾患、脂質代謝異常および動脈硬化から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防効果を有する物質のスクリーニング方法：
ｉ）請求項８乃至１２のいずれか一つに記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞を被験物質の存在下、または非存在下で培養する工程；
ｉｉ）上記ｉ）の宿主細胞における、請求項８乃至１２のいずれか一つに記載の組換えプラスミド中の、請求項１乃至７のいずれか１つに記載のＤＮＡの３’末端に連結されているＤＮＡにコードされているタンパク質の発現量を検出する工程；
ｉｉｉ）上記ｉｉ）の検出結果を、被験物質の存在下で培養した細胞と被験物質非存在下で培養した細胞との間で比較し、発現量が増加している場合、該被験物質が該治療または予防効果を有すると判断する工程。
【請求項２０】
下記の工程ｉ）からｉｉｉ）からなる、癌およびその転移の治療または予防効果を有する物質のスクリーニング方法：
ｉ）請求項８乃至１２のいずれか一つに記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞を被験物質の存在下、または非存在下で培養する工程；
ｉｉ）上記ｉ）の宿主細胞における、請求項８乃至１２のいずれか一つに記載の組換えプラスミド中の、請求項１乃至７のいずれか１つに記載のＤＮＡの３’末端に連結されているＤＮＡにコードされているタンパク質の発現量を検出する工程；
ｉｉｉ）上記ｉｉ）の検出結果を被験物質の存在下で培養した細胞と被験物質非存在下で培養した細胞との間で比較し、発現量が減少している場合、該被験物質が該治療または予防効果を有すると判断する工程。
【請求項２１】
下記の工程ｉ）乃至ｉｉｉ）からなる、神経性疾患、炎症、感染症、血栓症、免疫疾患、ＨＩＶ、２型糖尿病、肥満、敗血症、心疾患、脂質代謝異常および動脈硬化から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防効果を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡを同定する方法：
ｉ）請求項８乃至１２のいずれか一つに記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞（以下「細胞Ａ」という）と、細胞Ａを被験ｃＤＮＡが哺乳動物用発現ベクターに組み込まれた組換えプラスミドで形質転換することにより該被験ｃＤＮＡを一過性または安定的に発現する細胞（以下「細胞Ｂ」という）と、細胞Ａを該被験ｃＤＮＡを含まない別の組換えプラスミドで形質転換した細胞（以下「細胞Ｃ」という）からなる群から選択される細胞を個別に培養する工程；
ｉｉ）上記ｉ）の細胞Ｂおよび細胞ＣまたはＡにおける、請求項８乃至１２のいずれか一つに記載の組換えプラスミド中の、請求項１乃至７のいずれか１つに記載のＤＮＡの３’末端に連結されているＤＮＡにコードされているタンパク質の発現量を測定する工程；
ｉｉｉ）上記ｉｉ）の測定結果を比較し、該タンパク質の発現量が細胞Ｂにおいて細胞ＣまたはＡよりも増加している場合、該ｃＤＮＡがコードするタンパク質が該治療または予防効果を有すると判断する工程。
【請求項２２】
下記の工程ｉ）乃至ｉｉｉ）からなる、癌およびその転移の治療または予防効果を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡを同定する方法：
ｉ）請求項８乃至１２のいずれか一つに記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞（以下「細胞Ａ」という）と、細胞Ａを被験ｃＤＮＡが哺乳動物用発現ベクターに組み込まれた組換えプラスミドで形質転換することにより該被験ｃＤＮＡを一過性または安定的に発現する細胞（以下「細胞Ｂ」という）と、細胞Ａを該被験ｃＤＮＡを含まない別の組換えプラスミドで形質転換した細胞（以下「細胞Ｃ」という）からなる群から選択される細胞を個別に培養する工程；
ｉｉ）上記ｉ）の細胞Ｂおよび細胞ＣまたはＡにおける、請求項８乃至１２のいずれか一つに記載の組換えプラスミド中の、請求項１乃至７のいずれか１つに記載のＤＮＡの３’末端に連結されているＤＮＡにコードされているタンパク質の発現量を測定する工程；
ｉｉｉ）上記ｉｉ）の測定結果を比較し、該タンパク質の発現量が細胞Ｂにおいて細胞ＣまたはＡよりも減少している場合、該ｃＤＮＡがコードするタンパク質が該治療または予防効果を有すると判断する工程。
【請求項２３】
セラミドキナーゼ遺伝子プロモーター活性を調節する物質を分離する方法であって、請求項１乃至７のいずれか一つに記載のＤＮＡに該物質を含む試料を接触させ、次いで、該ＤＮＡに結合した該物質を分離することを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１乃至７のいずれか一つに記載のＤＮＡにヒト細胞の核抽出液を含む試料を接触させ、次いで、該ＤＮＡに結合したタンパク質を分離することを特徴とする、セラミドキナーゼ遺伝子プロモーター活性調製因子の検出方法。
【請求項２５】
下記の工程ｉ）およびｉｉ）を含む、セラミドキナーゼ遺伝子プロモーター活性を調節する活性を有する物質を選抜する方法：
ｉ）請求項１乃至７のいずれか一つに記載のＤＮＡを標識したものに、ヒト細胞の核抽出液および被験物質を加えたもの、ならびにヒト細胞の核抽出液のみを加えたものをそれぞれ調製する；
ｉｉ）上記ｉ）の各混合物試料を電気泳動し、標識されたＤＮＡを含むバンドを検出し、ヒト細胞の核抽出液のみを加えた試料で見出されるバンドと被験物質を加えた試料で見出されるバンドの間で移動度を比較し、移動度が増大するものを選択する。
【請求項２６】
該標識が放射標識である請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
下記ａ）乃至ｂ）のいずれかで表される特徴を有し、セラミドキナーゼ遺伝子プロモーター活性を調節する活性を持つヌクレオチドまたはその誘導体：
ａ）配列表の配列番号１に記載のヌクレオチド配列中の、連続した少なくとも１０ヌクレオチドからなる；
ｂ）配列表の配列番号１に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列中の、連続した少なくとも１０ヌクレオチドからなる。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、各種セラミドおよびその各種光学異性体をリン酸化し、神経性疾患、炎症、感染症、血栓症、免疫疾患、ＨＩＶ、２型糖尿病、肥満、敗血症、心疾患、脂質代謝異常、動脈硬化、癌およびその転移の原因となりうるセラミドキナーゼのプロモーター活性を有する新規ＤＮＡおよび該プロモーター活性を調節する物質のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
スフィンゴ脂質は従来、グリセロリン脂質およびコレステロールとならぶ細胞膜の主要な構成成分の一つと考えられてきた。グリセロリン脂質は細胞膜構造の維持だけでなく、その代謝産物として多くの生理活性物質を産生させることが知られてきたが、スフィンゴ脂質についてはその代謝産物の生理活性については最近までほとんど知られていなかった。近年、いくつかのスフィンゴ脂質の代謝産物にアポトーシスの誘導や細胞増殖刺激作用などの生理活性が知られるようになり、スフィンゴ脂質の代謝酵素が生理的反応や種々の病態に密接に関連する可能性が示唆されるようになった。なかでも、セラミドは多くの細胞機能を調節するレギュレーターとして注目を集めている（Ｈａｎｎｕｎ，　Ｙ．　Ａ．　ａｎｄ　Ｏｂｅｉｄ，　Ｌ．　Ｍ．　（１９９５）　ＴＩＢＳ　２０，　７３−７７）。
【０００３】
例えば、セラミドはＴＮＦ−αやＩＬ−１βなどの炎症性サイトカインのセカンドメッセンジャーとして機能し、ホスホリパーゼＡ２等のアラキドン酸経路を活性化することが知られている（Ｓｐｉｅｇｅｌ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９６）　Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎｉ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　８，　１５９−１６７およびＭａｔｈｉａｓ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９３）　Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９，　５１９−５２２参照）。すなわち、セラミドを各種炎症性疾患の増悪因子として捕らえることができる。また、ＨＩＶに感染した患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞のアポトーシスを伴う減少や脳細胞への感染の際にもセラミドが増悪因子として機能しているという報告がある（Ｃｏｌｉｎｅ，　Ｍ．　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９７）　Ｐｒｏｃ．　Ａｓｓｏｃ．　Ａｍ．　Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ　１０９，　１４６−１５３およびＷｉｌｔ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９５）　Ａｎｎ．　Ｎｅｕｒｏｌ．　３７，　３８１−３９４参照）。さらには、２型糖尿病や肥満においてＴＮＦ−αがインシュリン抵抗性を引き起こすことが知られているが、セラミドはその下流においても増悪因子として機能していると考えられている（Ｂｅｇｕｍ，　Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９６）　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２３８，　２１４−２２０およびＨｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ，　Ｇ．　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９６）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７１，　６６５−６６８参照）。また、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）等が引き金になり起こる敗血症においてもセラミドがセカンドメッセンジャーとして機能していると報告されている（Ｂｅｕｔｌｅｒ，　Ｂ．　ａｎｄ　Ｋｒｕｙｓ，　Ｖ．　（１９９５）　Ｊ．　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　２５，　Ｓ１−Ｓ８　参照）。さらには、動脈硬化層形成の引き金となるＬＤＬの凝集反応においてもスフィンゴミエリナーゼの活性化に伴うセラミドの上昇が増悪因子として機能するという報告がある（Ｓｃｈｉｓｓｅｌ，　Ｓ．　Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９６）　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　９８，　１４５５−１４６４参照）。
【０００４】
またこれらとは逆に、癌治療における放射線療法や化学療法において、癌細胞のアポトーシスをセラミドが促進することが知られている（Ｍｉｃｈａｅｌ，　Ｊ．　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９７）　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　５７，　３６００−３６０５およびＢｏｓｅ，　Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９５）　Ｃｅｌｌ　８２，　４０５−４１４およびＪａｆｆｒｅｚｏｕ，　Ｊ．　Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９６）　ＥＭＢＯＪ．　１５，　２４１７−２４２４参照）。
【０００５】
一方、セラミドの代謝産物であるセラミド−１−リン酸およびその生成酵素であるセラミドキナーゼに関してもいくつかの生理活性が知られている。例えば、脳のシナプスにおいて、カルシウム刺激に応答してセラミドキナーゼが活性化され、生成したセラミド−１−リン酸がシナプスからの神経伝達物質の放出を調節している（Ｂａｊｊａｌｉｅｈ，　Ｓ．　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８９）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６４，　１４３５４−１４３６０およびＳｈｉｎｇｈａｌ，　Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９３）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．　６１，　２２７９−２２８５参照）。したがって、薬剤やプロモーター等によりセラミドキナーゼの活性を調節することは、アルツハイマー病を含めた各種神経性疾患の治療法となる可能性がある。また、セラミド−１−リン酸は上述した各種セラミドの機能をブロックする作用があると考えられている（Ｄｒｅｓｓｌｅｒ，　Ｋ．　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９０）Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６５，　１４９１７−１４９２１参照）。すなわち、慢性関節炎等の各種炎症性疾患、ＨＩＶ、インシュリン抵抗性が引き金となる２型糖尿病や肥満、さらには敗血症、動脈硬化といったセラミドが増悪因子として作用する疾患をセラミド−１−リン酸により抑制できると考えられる。さらに、セラミドキナーゼは好中球の貪食作用・活性化に関与していることから（Ｈｉｎｋｏｖｓｋａ−Ｇａｌｃｈｅｖａ　ＶＴｅｔ　ａｌ．　（１９９８）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７３，　３３２０３−３３２０９参照）、各種感染症の進展や虚血後の臓器障害に関与する可能性が考えられる。したがって、プロモーター活性調節等によりセラミドキナーゼを活性化することは、神経性疾患、炎症、感染症、ＨＩＶ、２型糖尿病、肥満、敗血症、脂質代謝異常および動脈硬化の治療法となる可能性がある。逆に、癌の放射線療法や化学療法においてはセラミドキナーゼ活性を抑制する事により、セラミド量を保ち、治療効果を向上させる可能性も考えられる。さらに、セラミドキナーゼは心臓や脾臓、血小板、末梢白血球で遺伝子の発現量が高いため、心疾患や血栓症、免疫疾患に関与する可能性も考えられる（Ｓｕｇｉｕｒａ，　Ｍ．，　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７７，　２３２９４−２３３３０参照）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、セラミドキナーゼ遺伝子の転写制御に関わるプロモーター領域を特定し、該プロモーターの活性を調節する物質のスクリーニング方法を提供することにある。より具体的には、神経性疾患、炎症、感染症、血栓症、免疫疾患、ＨＩＶ、２型糖尿病、肥満、敗血症、心疾患、脂質代謝異常、動脈硬化、癌およびその転移等の予防薬および治療薬の候補物質を探索するための新規な手段を提供することにある。治療または予防薬を試験するための新規な方法および該方法において用いられるＤＮＡが提供される。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
（１）　下記のａ）乃至ｃ）のいずれか一つに記載されたＤＮＡ：
ａ）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
ｂ）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ；
ｃ）上記ａ）に記載のＤＮＡと９５％以上のヌクレオチド配列同一性を有し、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ。
（２）　形質転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２　ＳＡＮＫ　７０８０２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０８７）が保有する組換えプラスミドにおいて、ホタルルシフェラーゼをコードするヌクレオチド配列の５’末端に連結されている２５１５ｂｐのＤＮＡ。
（３）　下記のａ）乃至ｃ）のいずれか一つに記載されたＤＮＡ：
ａ）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１０８７で示されるヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号２５１５で示されるヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
ｂ）上記ａ）に記載のＤＮＡのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ；
ｃ）上記ａ）に記載のＤＮＡと９５％以上のヌクレオチド配列同一性を有し、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ。
（４）　形質転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２　ＳＡＮＫ　７０８０２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０８７）が保有する組換えプラスミドにおいて、ホタルルシフェラーゼをコードするヌクレオチド配列の５’末端に連結されている２５１５ｂｐのＤＮＡ中の３’末端側の１４２９ｂｐからなるＤＮＡ。
（５）　配列表の配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含み、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ。
（６）　配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１０８７から２５１５で示されるヌクレオチド配列を含み、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ。
（７）　下記のａ）乃至ｄ）に表される特徴を有するＤＮＡ：
ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１０８７から２５１５で示されるヌクレオチド配列を含み；
ｂ）ヌクレオチド番号２５１５で示されるヌクレオチドを３’末端とし；
ｃ）ヌクレオチド番号１０８７で示されるヌクレオチドの５’末端に少なくとも１ｂｐ、最長で１０８６ｂｐのポリヌクレオチドが付加し；
ｄ）哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有する。
（８）　（１）乃至（７）のいずれか１つに記載のＤＮＡを含む組換えプラスミド。
（９）　（１）乃至（７）のいずれか１つに記載のＤＮＡの３’末端に、タンパク質をコードするＤＮＡが連結されていることを特徴とする、（８）記載の組換えプラスミド。
（１０）　タンパク質が、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、からなる群から選択されることを特徴とする、（９）記載の組換えプラスミド。
（１１）　タンパク質がルシフェラーゼであることを特徴とする、（９）または（１０）記載の組換えプラスミド。
（１２）　形質転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２　ＳＡＮＫ７０８０２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０８７）が保有する組換えプラスミド、ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２。
（１３）　（８）乃至（１２）のいずれか１つに記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞。
（１４）　宿主細胞が原核細胞である、（１３）記載の宿主細胞。
（１５）　宿主細胞が真核細胞である、（１３）記載の宿主細胞。
（１６）　宿主細胞が哺乳動物由来の細胞である、（１３）または（１５）記載の宿主細胞。
（１７）　形質転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２　ＳＡＮＫ７０８０２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０８７）。
（１８）　下記の工程ｉ）からｉｉｉ）からなる、セラミドキナーゼ遺伝子プロモーター活性調節作用を有する物質のスクリーニング方法：
ｉ）（８）乃至（１２）のいずれか一つに記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞を被験物質の存在下、または非存在下で培養する工程；
ｉｉ）上記ｉ）の宿主細胞における、（８）乃至（１２）のいずれか一つに記載の組換えプラスミド中の、（１）乃至（７）のいずれか１つに記載のＤＮＡの３’末端に連結されているＤＮＡにコードされているタンパク質の発現量を検出する工程；
ｉｉｉ）上記ｉｉ）の検出結果を、被験物質の存在下で培養した細胞と被験物質非存在下で培養した細胞との間で比較する工程。
（１９）　下記の工程ｉ）からｉｉｉ）からなる、神経性疾患、炎症、感染症、血栓症、免疫疾患、ＨＩＶ、２型糖尿病、肥満、敗血症、心疾患、脂質代謝異常および動脈硬化から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防効果を有する物質のスクリーニング方法：
ｉ）（８）乃至（１２）のいずれか一つに記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞を被験物質の存在下、または非存在下で培養する工程；
ｉｉ）上記ｉ）の宿主細胞における、（８）乃至（１２）のいずれか一つに記載の組換えプラスミド中の、（１）乃至（７）のいずれか１つに記載のＤＮＡの３’末端に連結されているＤＮＡにコードされているタンパク質の発現量を検出する工程；
ｉｉｉ）上記ｉｉ）の検出結果を、被験物質の存在下で培養した細胞と被験物質非存在下で培養した細胞との間で比較し、発現量が増加している場合、該被験物質が該治療または予防効果を有すると判断する工程。
（２０）　下記の工程ｉ）からｉｉｉ）からなる、癌およびその転移の治療または予防効果を有する物質のスクリーニング方法：
ｉ）（８）乃至（１２）のいずれか一つに記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞を被験物質の存在下、または非存在下で培養する工程；
ｉｉ）上記ｉ）の宿主細胞における、（８）乃至（１２）のいずれか一つに記載の組換えプラスミド中の、（１）乃至（７）のいずれか１つに記載のＤＮＡの３’末端に連結されているＤＮＡにコードされているタンパク質の発現量を検出する工程；
ｉｉｉ）上記ｉｉ）の検出結果を被験物質の存在下で培養した細胞と被験物質非存在下で培養した細胞との間で比較し、発現量が減少している場合、該被験物質が該治療または予防効果を有すると判断する工程。
（２１）　下記の工程ｉ）乃至ｉｉｉ）からなる、神経性疾患、炎症、感染症、血栓症、免疫疾患、ＨＩＶ、２型糖尿病、肥満、敗血症、心疾患、脂質代謝異常および動脈硬化から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防効果を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡを同定する方法：
ｉ）（８）乃至（１２）のいずれか一つに記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞（以下「細胞Ａ」という）と、細胞Ａを被験ｃＤＮＡが哺乳動物用発現ベクターに組み込まれた組換えプラスミドで形質転換することにより該被験ｃＤＮＡを一過性または安定的に発現する細胞（以下「細胞Ｂ」という）と、細胞Ａを該被験ｃＤＮＡを含まない別の組換えプラスミドで形質転換した細胞（以下「細胞Ｃ」という）からなる群から選択される細胞を個別に培養する工程；
ｉｉ）上記ｉ）の細胞Ｂおよび細胞ＣまたはＡにおける、（８）乃至（１２）のいずれか一つに記載の組換えプラスミド中の、（１）乃至（７）のいずれか１つに記載のＤＮＡの３’末端に連結されているＤＮＡにコードされているタンパク質の発現量を測定する工程；
ｉｉｉ）上記ｉｉ）の測定結果を比較し、該タンパク質の発現量が細胞Ｂにおいて細胞ＣまたはＡよりも増加している場合、該ｃＤＮＡがコードするタンパク質が該治療または予防効果を有すると判断する工程。
（２２）　下記の工程ｉ）乃至ｉｉｉ）からなる、癌およびその転移の治療または予防効果を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡを同定する方法：
ｉ）（８）乃至（１２）のいずれか一つに記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞（以下「細胞Ａ」という）と、細胞Ａを被験ｃＤＮＡが哺乳動物用発現ベクターに組み込まれた組換えプラスミドで形質転換することにより該被験ｃＤＮＡを一過性または安定的に発現する細胞（以下「細胞Ｂ」という）と、細胞Ａを該被験ｃＤＮＡを含まない別の組換えプラスミドで形質転換した細胞（以下「細胞Ｃ」という）からなる群から選択される細胞を個別に培養する工程；
ｉｉ）上記ｉ）の細胞Ｂおよび細胞ＣまたはＡにおける、（８）乃至（１２）のいずれか一つに記載の組換えプラスミド中の、（１）乃至（７）のいずれか１つに記載のＤＮＡの３’末端に連結されているＤＮＡにコードされているタンパク質の発現量を測定する工程；
ｉｉｉ）上記ｉｉ）の測定結果を比較し、該タンパク質の発現量が細胞Ｂにおいて細胞ＣまたはＡよりも減少している場合、該ｃＤＮＡがコードするタンパク質が該治療または予防効果を有すると判断する工程。
（２３）　セラミドキナーゼ遺伝子プロモーター活性を調節する物質を分離する方法であって、（１）乃至（７）のいずれか一つに記載のＤＮＡに該物質を含む試料を接触させ、次いで、該ＤＮＡに結合した該物質を分離することを特徴とする方法。
（２４）　（１）乃至（７）のいずれか一つに記載のＤＮＡにヒト細胞の核抽出液を含む試料を接触させ、次いで、該ＤＮＡに結合したタンパク質を分離することを特徴とする、セラミドキナーゼ遺伝子プロモーター活性調節因子の検出方法。
（２５）　下記の工程ｉ）およびｉｉ）を含む、セラミドキナーゼ遺伝子プロモーター活性を調節する活性を有する物質を選抜する方法：
ｉ）（１）乃至（７）のいずれか一つに記載のＤＮＡを標識したものに、ヒト細胞の核抽出液および被験物質を加えたもの、ならびにヒト細胞の核抽出液のみを加えたものをそれぞれ調製する；
ｉｉ）上記ｉ）の各混合物試料を電気泳動し、標識されたＤＮＡを含むバンドを検出し、ヒト細胞の核抽出液のみを加えた試料で見出されるバンドと被験物質を加えた試料で見出されるバンドの間で移動度を比較し、移動度が増大するものを選択する。
（２６）　該標識が放射標識である（２５）記載の方法。
（２７）　下記ａ）乃至ｂ）のいずれかで表される特徴を有し、セラミドキナーゼ遺伝子プロモーター活性を調節する活性を持つヌクレオチドまたはその誘導体：
ａ）配列表の配列番号１に記載のヌクレオチド配列中の、連続した少なくとも１０ヌクレオチドからなる；
ｂ）配列表の配列番号１に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列中の、連続した少なくとも１０ヌクレオチドからなる；
に関する。
【０００８】
本発明者らは、ヒトゲノムにおけるセラミドキナーゼ遺伝子の転写開始点と予測される部位（配列表の配列番号１のヌクレオチド番号２３９７）を「１」として、その５’末端側上流２３９６ヌクレオチドの部位から、３’末端側下流１１９ヌクレオチド（以下、「−２３９６〜＋１１９」のように表記する。配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１〜２５１５）のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、および「−１３１０〜＋１１９」のヌクレオチド配列からなるＤＮＡにルシフェラーゼをコードするＤＮＡを連結したレポーター遺伝子をヒトＨＥＫ２９３細胞に導入し、ルシフェラーゼの産生量を測定することにより、セラミドキナーゼ遺伝子の「−２３９６〜＋１１９」領域がプロモーター活性を有することを見出した。また本発明者らは、ルシフェラーゼ遺伝子に連結するセラミドキナーゼ遺伝子の５’末端側領域を「−１３１０〜＋１１９」（配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１０８７〜２５１５）に短縮しても、同等のプロモーター活性があることも見いだした。また、プロモーター配列解析ソフトを用いて、プロモーター活性の発現により重要な領域を絞り込む予測をした結果、−１１１０〜−８６１（配列番号１のヌクレオチド番号１２８６〜１５３５）の領域が予測された。この領域にはＭＬＴＦ（Ｍａｊｏｒ　ｌａｔｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ）の結合配列として予測される配列などが含まれていた。本発明者らは、さらに、上記プロモーター活性を有するＤＮＡを用いることにより、該プロモーター活性を調節する化合物をスクリーニングできることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
本発明のＤＮＡは、哺乳動物由来の細胞においてプロモーター活性を有する限り、セラミドキナーゼ遺伝子の５’末端側上流域のいかなるヌクレオチド配列を含んでいてもよい。好適には、配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡを挙げることができるが、本発明はこれに限定されず、配列表の配列番号１に記載のヌクレオチド配列の少なくとも一部を含む。また、より好適には、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１０８７〜２５１５に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡを挙げることができ、哺乳動物由来の細胞においてプロモーター活性を有する限り、このＤＮＡの５’末端側に任意のヌクレオチド配列が付加していても良い。好適には１乃至１０８６塩基長の任意のヌクレオチド配列からなるＤＮＡが付加したものが挙げられるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のＤＮＡは、ヒトゲノムより作成した遺伝子ライブラリーから、例えば、ヒトセラミドキナーゼｃＤＮＡのヌクレオチド配列（Ｓｕｇｉｕｒａ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　（２００２）　２７７，　２３２９４−２３３３０）の５’末端側をプローブとして利用したスクリーニングにより単離することができる。または、この配列の情報もしくはヒトゲノムプロジェクトにより公開された配列情報に基いて、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）により、ライブラリーのスクリーニングの工程を経ずに直接本発明のＤＮＡを増幅することもできる。
【００１１】
なお、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から２５１５に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡが挿入されている組換えプラスミドｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２で形質転換した大腸菌、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２　ＳＡＮＫ　７０８０２は、２００２年（平成１４年）６月２１日付で独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに国際寄託され、受託番号　ＦＥＲＭＢＰ−８０８７が付されている。したがって、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から２５１５に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡは、当該大腸菌から取得することもできる。また、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１０８７から２５１５に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡは、ＳＡＮＫ７０８０２が保有する組換えプラスミドｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２から、ＰＣＲ法を利用して取得することができる。
【００１２】
なお、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、天然型のプロモーターＤＮＡのヌクレオチド配列の一部を他のヌクレオチドへの置換やヌクレオチドの欠失、付加などの改変により、天然型のプロモーターＤＮＡと同等のプロモーター活性を有するＤＮＡを調製することが可能である。このように天然型のヌクレオチド配列においてヌクレオチドが置換、欠失、もしくは付加したヌクレオチド配列を有し、天然型のプロモーターＤＮＡと同等のプロモーター活性を有するＤＮＡもまた本発明のＤＮＡに含まれる。ヌクレオチド配列の改変は、例えば、制限酵素あるいはＤＮＡエキソヌクレアーゼによる欠失導入、部位特異的変異誘発法による変異導入、変異プライマーを用いたＰＣＲ法によるプロモーター配列の改変、合成変異ＤＮＡの直接導入などの方法により行うことができる。これらのうち好適なものは、配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列または配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１０８７からヌクレオチド番号２５１５で示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡである。
【００１３】
また、本発明のＤＮＡとしては、配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列または配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１０８７からヌクレオチド番号２５１５で示されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを含むものが挙げられる。このようにハイブリダイズし得るＤＮＡは、プロモーター活性を有するものであればよい。このようなＤＮＡは、配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列または配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１０８７からヌクレオチド番号２５１５で示されるヌクレオチド配列と、通常、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９５％以上のヌクレオチド配列の同一性を有する。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見される変異型ＤＮＡ、人為的に改変した変異型ＤＮＡ、異種生物由来の相同ＤＮＡ等が含まれる。
【００１４】
本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションを、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ　塩化ナトリウム、０．０７５Ｍ　クエン酸ナトリウム）またはこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、３７℃乃至４２℃の温度条件下、約１２時間行い、５×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。また、さらに０．１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行なっても良い。
【００１５】
このようにして得られた本発明のＤＮＡがプロモーター活性を有するか否かは、下記に説明するように、本発明のＤＮＡの３’末端側下流にルシフェラーゼ等のマーカー遺伝子を連結したもの（以下「レポーター遺伝子」という）で哺乳動物細胞を形質転換し、この形質転換細胞におけるマーカー遺伝子の発現が亢進されるか否かを調べることによって確認することができる。
【００１６】
以下、本発明のＤＮＡを含んだレポーター遺伝子により哺乳動物細胞を形質転換する方法について記載する。
【００１７】
この方法において、本発明のＤＮＡの３’末端側に連結されるマーカー遺伝子にコードされるマーカータンパク質は、宿主である哺乳動物細胞が本発明の方法の一連の過程において産生し得る他のいかなるタンパク質とも区別可能なもの（好ましくは、形質転換前の哺乳動物細胞が該マーカータンパク質と同一または類似のタンパク質をコードする遺伝子を持たないようなもの）であればよい。例えば、マーカータンパク質が該細胞に対して毒性を有するようなものや、該細胞が感受性を有する抗生物質の耐性を付与するものであるような場合でも、マーカー遺伝子の発現の有無は細胞の生存率で判定することが可能である。しかしながら、本発明で用いられるマーカー遺伝子としてより好ましいものは、発現量を特異的かつ定量的に検出することができる（例えば該マーカー遺伝子にコードされるタンパク質に対する特異的抗体が取得されているような）構造遺伝子である。さらに好ましくは、外来の基質と特異的に反応することにより定量的測定が容易な代謝産物を生じるような酵素等をコードする遺伝子である。そのようなものとして、以下に挙げるようなタンパク質をコードする遺伝子を例示することができるが、本発明はそれらに限定されない：
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ：　クロラムフェニコールにアセチル基を付加する。いわゆるＣＡＴアッセイ等で検出可能。プロモーターを組み込むだけでレポーターアッセイ用のベクターを調製できるベクターとしてｐＣＡＴ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社製）が市販されている；
ホタルルシフェラーゼ：　ルシフェリンを代謝した際に生じる生物発光を測定することにより定量する。同じくレポーターアッセイ用のベクターとしてｐＧＢ−Ｂ２ベクター（東洋インキ製造株式会社製）が市販されている；
β−ガラクトシダーゼ：　呈色反応、蛍光または化学発光でそれぞれ測定可能な基質がある。レポーターアッセイ用のベクターとしてｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）が市販されている；
分泌型アルカリホスファターゼ：　呈色反応、生物発光または化学発光でそれぞれ測定可能な基質がある。レポーターアッセイ用のベクターとしてｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ（クロンテック社製）が市販されている；
緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）：　酵素ではないが、自らが蛍光を発するので直接定量できる。同じくレポーターアッセイ用のベクターとしてｐＥＧＦＰ−１（クロンテック社製）が市販されている。
【００１８】
培養細胞株に発現プラスミドを導入する方法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，　Ｇ．　（１９８３）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１１，　１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，　Ｆ．　Ｌ．　ａｎｄｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ，　Ａ．　Ｊ．　（１９７３）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２，　４５６−４５７）、電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８２）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１，　８４１−８４５）、リポフェクション法（Ｌｏｐａｔａ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８４）　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１２，　５７０７−５７１７，　Ｓｕｓｓｍａｎ　ａｎｄ　Ｍｉｌｍａｎ　（１９８４）　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　４，　１６４１−１６４３）等を挙げることができるが、これらに限定されず、本発明の属する技術分野において汎用される他の方法も採用することができる。ただし、培養細胞株がいわゆる浮遊細胞である場合は、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法以外の方法を用いることが好ましい。いずれの方法においても、用いる細胞に応じて、至適化されたトランスフェクション条件を用いる。
【００１９】
このようにして本発明のＤＮＡを含むレポーター遺伝子をトランスフェクションした細胞を培養すると、マーカー遺伝子の転写が促進される。培養の条件としては、細胞が生存して、タンパク質の生産が可能な条件であればよいが、好ましくは、使用される細胞株に適合した培地（ウシ胎児血清等の血清成分を添加してもよい）を使用し、４乃至６％（最も好適には５％）の炭酸ガスを含む空気存在下、３６乃至３８℃（最も好適には３７℃）で２乃至３日間（最も好適には２日間）培養する。
【００２０】
以下、本発明のＤＮＡの使用方法について述べる。
１）誘導型発現ベクターとしての利用
本発明のＤＮＡが、ある特異的な刺激によりプロモーター活性を表すことが判明した場合、所望の遺伝子の上流に本発明のＤＮＡを挿入したベクターなどを作製して体細胞に導入し、該刺激を与えることにより、該所望の遺伝子を誘導的に発現させることができる。
２）ＤＮＡによる拮抗阻害を利用したＤＮＡのプロモーター活性調節
本発明のＤＮＡのプロモーター活性の調節には、該プロモーターＤＮＡのヌクレオチド配列と同一の配列、または該プロモーターＤＮＡのヌクレオチド配列と相補的な配列、の少なくとも一部を含むＤＮＡ（その誘導体を含む。以下「部分配列」という）を用いることができる。このような部分配列を用いることにより、該部分配列自体がプロモーター活性を有するか否かを問わず、上記プロモーターＤＮＡとこれに結合しうるタンパク質（例えば、転写因子）との結合を拮抗阻害する方法を実施することが可能である。例えば、該部分配列が、本発明のＤＮＡ配列上においてそのプロモーター活性を阻害するタンパク質の結合部位に相当する場合には、この方法によりプロモーター活性を促進することができ、逆にプロモーター活性を促進するタンパク質（転写因子を含む）の結合部位に相当する場合には、プロモーター活性を阻害することができる。このような拮抗阻害に用いる部分配列ＤＮＡは、通常少なくとも６ヌクレオチド以上、好ましくは１０ヌクレオチド以上の鎖長を有する。また、拮抗阻害に用いるために選択される部分配列の種類としては、例えば、プロモーター上の転写因子の結合コンセンサス部位を含む配列が挙げられる。また、そうした部分配列ＤＮＡの誘導体としては、いくつかの部分配列を連結したものや、それをアデノウイルスベクター等に組み込んで動物細胞への遺伝子導入を可能にしたもの、また、ＤＮＡの３’末端もしくは５’末端にビオチンを連結したもの等が用いられ得る。
３）プロモーター活性を調節するタンパク質のスクリーニング
本発明のＤＮＡのプロモーター活性の調節には、上記のような部分配列等を用いた拮抗阻害の他に、本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節するタンパク質を利用する方法を用いることもできる。本発明のＤＮＡは、そのプロモーター活性を調節するタンパク質のスクリーニングに利用することが可能である。したがって、本発明は、下記に示すような、該ＤＮＡのプロモーター活性を調節するタンパク質のスクリーニング方法に関する。そのようなタンパク質としては、直接本発明のＤＮＡに結合してそのプロモーター活性を促進あるいは阻害するタンパク質の他に、細胞膜受容体や細胞内タンパク質に作用して間接的に本発明のＤＮＡのプロモーター活性を促進あるいは阻害するタンパク質が含まれる。
【００２１】
３−１）プロモーターＤＮＡに結合するタンパク質のスクリーニング
この方法は、本発明のＤＮＡに被験タンパク質試料を接触させ、本発明のＤＮＡに結合するタンパク質を選択する工程を含む。このような方法としては、例えば、本発明のプロモーターＤＮＡを用いた、これに結合するタンパク質のアフィニティー精製が挙げられる。具体的な方法の一例を示せば、本発明のプロモーターＤＮＡをビオチン化し、ストレプトアビジンを結合した磁気ビーズに結合させてＤＮＡアフィニティービーズを作製する。次いで、これを細胞の核抽出液とインキュベートして本発明のＤＮＡと特異的に結合する核抽出液中のタンパク質を精製し、この構造を決定する。これにより、直接本発明のＤＮＡと結合するタンパク質、およびＤＮＡ結合活性は持たないがサブユニットとして該タンパク質と複合体を形成し本発明のＤＮＡに結合するタンパク質が精製できる（Ｇａｂｒｉｅｌｓｅｎ，　Ｏ．　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９８９）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１７，　６２５３−６２６７、Ｓａｖｏｙｓｋｙ，　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９４）　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　９，　１８３９−１８４６）。
【００２２】
３−２）プロモーター活性を指標にしたタンパク質のスクリーニング
この方法は、レポーター遺伝子を保持する細胞に被験ＤＮＡを導入し、マーカー遺伝子の発現を調節する発現産物を選択する工程を含む。このような方法には、例えば、酵母や動物細胞を用いたｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ法が含まれる。具体的には、本発明のＤＮＡとマーカー遺伝子を挿入したレポーター遺伝子を細胞に安定に導入し、次いでこれに遺伝子ライブラリーを導入して、レポーター遺伝子の発現促進あるいは発現阻害を示すようなクローンを選択し、本発明のＤＮＡに結合するタンパク質を選択する。この方法により、直接本発明のＤＮＡと結合するタンパク質の他に、細胞内の内在性タンパク質に作用して間接的に本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節するタンパク質を得ることができる。なお、酵母のｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ法（Ｌｉ，　Ｊ．　Ｊ．　ａｎｄ　Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，　Ｉ．，　（１９９３）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６２，　１８７０−１８７３、Ｗａｎｇ，　Ｍ．　Ｍ．　ａｎｄ　Ｒｅｅｄ，　Ｒ．　Ｒ．，　（１９９３）　Ｎａｔｕｒｅ　３６４，　１２１−１２６）などで、「Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ　ｓｙｓｔｅｍ（クロンテック社）」等がキットとして発売されている。
【００２３】
さらに他の一つの態様は、本発明のＤＮＡを含むレポーター遺伝子を保持する細胞に被験試料を接触させ、マーカー遺伝子の発現を調節するタンパク質を選択する工程を含む。具体的な方法の一例としては、本発明のＤＮＡとマーカー遺伝子が挿入されたレポーター遺伝子を安定に導入した細胞と、被験試料（例えば、遺伝子ライブラリーを導入した細胞の培養上清）とをインキュベートして、マーカー遺伝子の発現促進あるいは発現阻害を示すようなタンパク質を選択する。この方法では、細胞膜受容体などを介して間接的に本発明のＤＮＡのプロモーター活性に影響を与えるタンパク質が得られる。
４）プロモーター活性を調節するタンパク質をコードするｃＤＮＡのスクリーニング方法
本発明のＤＮＡを用いて、そのプロモーター活性を調節するタンパク質をコードするＤＮＡを直接単離することも可能である。本発明は、また、本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節するタンパク質をコードするｃＤＮＡのスクリーニング方法に関する。このスクリーニング方法の一つの態様は、本発明のＤＮＡに被験ＤＮＡの発現産物を接触させ、本発明のＤＮＡに結合するタンパク質をコードするｃＤＮＡを選択する工程を含む。このような方法には、例えば、サウスウエスタン法が含まれる。具体的には、遺伝子ライブラリーを導入した大腸菌で各タンパク質を発現させ、これらをフィルター膜に転写した後、本発明のＤＮＡをプローブとして直接ブロットし、該ＤＮＡプローブと結合するタンパク質を発現するクローンを選択して、これをコードする遺伝子を単離する。この方法により本発明のＤＮＡに結合する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を得ることができる（実験医学別冊　バイオマニュアルシリーズ「転写因子研究法」（株）羊土社刊、１７７−１８８頁参照）。
【００２４】
他の一つの態様は、本発明のＤＮＡを含むレポーター遺伝子を保持する細胞に被験ｃＤＮＡを導入し、マーカー遺伝子の発現を調節する発現産物をコードするｃＤＮＡを選択する工程を含む。このような方法には、例えば、上記した酵母や動物細胞を用いたｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ法が含まれる。
【００２５】
すなわち、本発明のＤＮＡとマーカー遺伝子を挿入したレポーター遺伝子を哺乳動物由来の培養細胞に安定に導入した細胞（以下「細胞Ａ」という）に、さらに該細胞に哺乳動物細胞用発現ベクターに被験ｃＤＮＡが挿入された組換えプラスミドを導入した細胞（以下「細胞Ｂ」という）を培養する。比較対照としては、細胞Ａをそのまま培養するか、あるいは、細胞Ａに被験ｃＤＮＡを含まない哺乳動物細胞用発現ベクターや、被験ｃＤＮＡを含んでいてもそれが発現しない組換えプラスミドを導入した細胞（以下「細胞Ｃ」という）を培養する。細胞Ｂと、細胞Ａまたは細胞Ｃとの間で、マーカー遺伝子の発現量を比較し、マーカー遺伝子の発現を促進するかまたは阻害するようなｃＤＮＡクローンを選択する。この方法では、本発明のＤＮＡと直接結合するタンパク質をコードするｃＤＮＡだけでなく、細胞内の内在性タンパク質に作用して間接的に本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節するタンパク質をコードするｃＤＮＡも得ることができる。
【００２６】
さらに他の一つの態様は、本発明のＤＮＡを含むレポーター遺伝子を保持する細胞に被験ｃＤＮＡの発現産物を接触させ、マーカー遺伝子の発現を調節する発現産物をコードするｃＤＮＡを選択する工程を含む。具体的な方法の一例を示せば、本発明のＤＮＡとマーカー遺伝子を挿入したレポーター遺伝子を安定に導入した細胞と、被験ｃＤＮＡの発現産物（例えば、ｃＤＮＡライブラリーを導入した細胞の培養上清）とをインキュベートして、マーカー遺伝子の発現促進あるいは発現阻害を示すようなタンパク質あるいはそれをコードするｃＤＮＡを単離する。この方法により細胞膜受容体などを介して間接的に本発明のＤＮＡのプロモーター活性に作用するタンパク質をコードするｃＤＮＡを得ることができる。
５）プロモーター活性を調節する化合物のスクリーニング
本発明のＤＮＡを用いて、そのプロモーター活性を調節する化合物のスクリーニングを行うことも可能である。すなわち本発明は、下記に示すような、該ＤＮＡのプロモーター活性を調節する化合物のスクリーニング方法に関する。
【００２７】
５−１）プロモーターとタンパク質との結合を指標としたスクリーニング
この方法は、被験化合物の存在下で本発明のＤＮＡと被験試料とを接触させ、本発明のＤＮＡと被験試料中のタンパク質との結合を促進または阻害する化合物を選択する工程を含む。具体的には例えば、細胞の核抽出液を、本発明のＤＮＡを検出可能な標識を付したプローブと結合させ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、核抽出液中のタンパク質と本発明のＤＮＡとの複合体のバンドをゲルシフト法により検出する（実験医学別冊　バイオマニュアルシリーズ「転写因子研究法」（株）羊土社刊、１０７−１１２頁参照）という方法が挙げられる。検出可能な標識としては、放射性同位元素標識、蛍光色素標識、ビオチン標識等を挙げることができるが、好適には放射性同位元素標識である。ＤＮＡプローブ添加の際、被験化合物も添加し、核抽出液中のタンパク質と本発明のＤＮＡとの複合体のバンドの形成を促進あるいは阻害する化合物を選択する。この方法では、直接本発明のＤＮＡに作用する化合物および本発明のＤＮＡに結合するタンパク質に作用する化合物が得られる。例えば、本発明のＤＮＡに結合するタンパク質が生体内で本発明のＤＮＡのプロモーター活性を阻害するような場合、このタンパク質と本発明のＤＮＡとの結合を阻害するような化合物は、本発明のＤＮＡのプロモーター活性を促進できると考えられる。なお、本発明のＤＮＡに結合するタンパク質が既に単離されていれば、細胞の核抽出液に代えて、該タンパク質の組み換えタンパク質を利用することも可能である。
【００２８】
５−２）プロモーター活性を指標としたスクリーニング
この方法は、本発明のＤＮＡを含むレポーター遺伝子を保持する細胞に被験化合物を接触させ、マーカー遺伝子の発現を調節する化合物を選択する工程を含む。このような方法には、例えば、上記した酵母や動物細胞を用いたｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ法が含まれる。
【００２９】
すなわち、本発明のＤＮＡとマーカー遺伝子を挿入したレポーター遺伝子を哺乳動物由来の培養細胞に導入した細胞をマーカー遺伝子が発現可能な条件で培養する。培養するにあたって、培地中に任意の被験物質を添加した条件および添加しない条件を設定し、培養後マーカー遺伝子の発現量を測定し、被験物質の添加によりマーカー遺伝子の発現量に変化が生じるか否かを検定する。この方法では、直接、間接的に本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節する化合物が得られる。
【００３０】
このような系において、本発明のＤＮＡを含むレポーター遺伝子を導入した際のマーカー遺伝子の発現誘導を促進するような被験物質は、神経性疾患、炎症、感染症、血栓症、免疫疾患、ＨＩＶ、２型糖尿病、肥満、敗血症、心疾患、脂質代謝異常および動脈硬化の治療または予防薬として有用な物質として選択され、また、該マーカー遺伝子の発現を抑制するような被験物質は、癌およびその転移の治療または予防薬として有用な物質として選択される。
【００３１】
なお、本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節するタンパク質が同定された場合には、被験化合物の存在下で該タンパク質（またはその誘導体）と本発明のＤＮＡとを接触させ、該タンパク質（またはその誘導体）と本発明のＤＮＡとの結合を促進または阻害する化合物を選択して、本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節する化合物をスクリーニングすることが可能である。具体的には、例えば、本発明のＤＮＡに結合するタンパク質（ＤＮＡ結合ドメインのみでもよい）とグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質を精製して、抗グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ抗体で覆ったマイクロプレートに結合させた後、ビチオン化した本発明のＤＮＡをこのタンパク質と接触させ、該タンパク質と本発明ＤＮＡとの結合をストレプトアビジン化アルカリホスファターゼで検出する。本発明のＤＮＡ添加の際、被験化合物も添加し、該タンパク質と本発明のＤＮＡとの結合を促進あるいは阻害する化合物を選択する。この方法では、直接本発明のＤＮＡに作用する化合物および本発明のＤＮＡに結合するタンパク質に作用する化合物が得られる。例えば、本発明のＤＮＡに結合するタンパク質が生体内で本発明のＤＮＡのプロモーター活性を阻害する場合、このタンパク質と本発明のＤＮＡとの結合を阻害するような化合物は本発明のＤＮＡのプロモーター活性を促進できると考えられる。
【００３２】
【実施例】
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、下記実施例において、遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．，　Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｅ．　Ｆ．および　Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．　著、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊）に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には、特に明示がない限りは該市販品の指示書に従って使用した。
実施例１．　ヒトセラミドキナーゼ遺伝子プロモーター領域の解析
１）ヒトセラミドキナーゼ５’側上流域の検索
既知のヒトセラミドキナーゼ配列を基に、ＮＣＢＩのヒトゲノムＤＮＡのデータベースよりヒトセラミドキナーゼの５’側末端上流域を含む配列（ＧｅｎＢａｎｋＴＭａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　ＮＴ０１１５２３）を見出した。解析の結果、配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡが目的のプロモーターＤＮＡとして選択された。ヒトセラミドキナーゼをコードする遺伝子の転写開始点（エクソン１の５’末端境界部位）はＧｅｎＢａｎｋデータベースに登録されているヒトセラミドキナーゼの配列であるＡＢ０７９０６６を参照して決定した。すなわち、ＡＢ０７９０６６のヌクレオチド配列のうち、ベクター部分を除いた最初のヌクレオチドを転写開始点と判断し、その位置を「１」と定義した。このようにして、ヒトセラミドキナーゼ遺伝子の転写開始点より上流の５’末端側２３９６ｂｐから転写開始点の下流の３’末端側１１９ｂｐまでの領域に相当するヌクレオチド配列からなるＤＮＡを同定した。
【００３３】
２）コンピュータープログラムによるプロモーター領域の予測
１）で同定したＤＮＡ配列をもとに、プロモーター配列予測プログラム（ＰＲＯＭＯＴＥＲ　ＳＣＡＮ　Ｐｒｅｓｔｒｉｄｇｅ，　Ｄ．　Ｓ．　（１９９５）　ＪＭＢ　２４９，　９２３−３２）を用いて解析した。その結果、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１２８６から１５３５の領域がプロモーター領域として予測された。この領域の中には、ＭＬＴＦ（ｍａｊｏｒ　ｌａｔｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ）の結合領域として予測される配列などが含まれている。
実施例２．　ルシフェラーゼ発現プラスミドベクターの構築
１）プラスミドｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ１およびｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２の構築実施例１の結果を基に、ヒトセラミドキナーゼをコードする遺伝子の５’末端側上流域のｃＤＮＡを有するレポータープラスミドを構築した。５’末端側上流域を特異的に増幅するために、下記のオリゴヌクレオチドプライマー：
５’−ＴＣＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＣＡＧＡＧＴＣＡＴＧＧ−３’　（ＣＫｐ−１、配列表の配列番号２）；
５’−ＡＴＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＣＴＣＧＴＣＣＧＣ−３’　（ＣＫｐ−２、配列表の配列番号３）；および
５’−ＡＴＣＣＡＣＡＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣＣＴＣＡＧＡＧＣ−３’　（ＣＫｐ−３、配列表の配列番号４）；
を合成した。
【００３４】
次いで、市販ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、ＬＡ　ＰＣＲキット・バージョン２．１（宝酒造（株）社製）を用いて、１回目のＰＣＲ反応を行なった。すなわち、ヒトゲノムＤＮＡ（クロンテック社製）５μｌとプライマーセット　ＣＫｐ−１とＣＫｐ−２、およびＣＫｐ−２とＣＫｐ−３各０．４μＭ、ならびにｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ各４００μＭ、２．５ｍＭ　塩化マグネシウムを含む１×ＬＡＰＣＲ　ＧＣ　Ｉ緩衝液、０．０５単位のＬＡ　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（以上キットに添付）からなる５０μｌの反応液を調製した。この反応液を９４℃で２分間加熱した後、９４℃で３０秒、６８℃で３０秒、７２℃で４分の温度サイクルで３０サイクル繰り返してから、７２℃で１０分保温した（タカラ　ＰＣＲ　サーマルサイクラー　ＭＰ（宝酒造（株）社製）を使用。以下において同じ）。ＰＣＲ産物をゲルよりＱＩＡクイックゲルエクストラクションキット（キアゲン社製）を用いて回収し、Ｔ／Ａクローニング法（Ｃｌａｒｋ，　Ｊ．　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８８）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．　１６，　９６７７−９６８６）によりｐＣＲ２．１ベクター（オリジナル　ＴＡ　クローニングキット（インビトロゲン社製）に添付）に連結し、大腸菌ＩＮＶαＦ’株（キットに添付）に導入した。陽性のクローンにつき、挿入されたｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列をジデオキシヌクレオチド鎖終結法により解析し、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から配列番号２５１５に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡが挿入されたプラスミドをｐＣＲ２．１‐ｈｃｅｒｋｐ２、１０８７〜２５１５に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡが挿入されたプラスミドをｐＣＲ２．１‐ｈｃｅｒｋｐ１と命名した。ｐＣＲ２．１‐ｈｃｅｒｋｐ２を制限酵素Ｘｂａ　ＩとＨｉｎｄ　ＩＩＩで消化し、挿入ｃＤＮＡを含む約２．５ｋｂｐの断片を単離した。一方、ルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＶ‐Ｂ２（東洋インキ製造株式会社製）を制限酵素ＮｈｅＩとＨｉｎｄ　ＩＩＩで消化し、アルカリホスファターゼで脱リン酸化した。上記２．５ｋｂｐ断片およびｐＧＶ‐Ｂ２ベクターをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造（株）社製）を用いた反応により連結し、大腸菌ＪＭ１０９株に導入した。得られた形質転換株よりプラスミドＤＮＡ　ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２を抽出し、挿入されているｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列をジデオキシヌクレオチド鎖終結法により確認した。同様に、ｐＣＲ２．１‐ｈｃｅｒｋｐ１よりＳａｃ　ＩとＮｈｅ　Ｉで挿入ｃＤＮＡ約１．５ｋｂｐを単離し、Ｓａｃ　ＩとＮｈｅ　Ｉで消化したｐＧＶ‐Ｂ２に連結し、プラスミドＤＮＡ　ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ１を得た。
【００３５】
なお、このルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２を保持する形質転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２　ＳＡＮＫ　７０８０２は、２００２年（平成１４年）６月２１日付けで産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに国際寄託され、受託番号、ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０８７が付された。
【００３６】
ルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＶ−Ｂ２（東洋インキ製造株式会社製）ＤＮＡでも同様にして大腸菌ＪＭ１０９のコンピテント細胞（宝酒造（株）社製）を形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを培養し、ＤＮＡを回収し精製した。このプラスミドＤＮＡをネガティブコントロールとして使用した。
【００３７】
２）プラスミドｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ１の構築
ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ１は、ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２を用いて作成することもできる。形質転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２　ＳＡＮＫ　７０８０２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０８７）から抽出した組換えプラスミドｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２を鋳型とし、ＣＫｐ−２とＣＫｐ−３をプライマーとして、ＬＡ　ＰＣＲキット・バージョン２．１（宝酒造（株）社製）を用いてＰＣＲ反応を行なう。すなわち、ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２　１ｎｇとプライマーＣＫｐ−２とＣＫｐ−３各０．４μＭ、ならびにｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ各４００μＭ、２．５ｍＭ　塩化マグネシウムを含む１×ＬＡ　ＰＣＲ　ＧＣ　Ｉ緩衝液、０．０５単位のＬＡ　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（以上キットに添付）からなる５０μｌの反応液を調製する。この反応液を９４℃で２分間加熱した後、９４℃で３０秒、６８℃で３０秒、７２℃で４分の温度サイクルで３０サイクル繰り返してから、７２℃で１０分保温する（タカラ　ＰＣＲ　サーマルサイクラー　ＭＰ（宝酒造（株）社製）を使用。以下において同じ）。ＰＣＲ産物をゲルよりＱＩＡクイックゲルエクストラクションキット（キアゲン社製）を用いて回収し、Ｔ／Ａクローニング法（Ｃｌａｒｋ，　Ｊ．　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８８）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．　１６，　９６７７−９６８６）によりｐＣＲ２．１ベクター（オリジナル　ＴＡ　クローニングキット（インビトロゲン社製）に添付）に連結し、大腸菌ＩＮＶαＦ’株（キットに添付）に導入する。陽性のクローンにつき、挿入されたｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列をジデオキシヌクレオチド鎖終結法により解析し、１０８７〜２５１５に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡが挿入されたプラスミドがｐＣＲ２．１‐ｈｃｅｒｋｐ１である。ｐＣＲ２．１‐ｈｃｅｒｋｐ１よりＳａｃ　ＩとＮｈｅ　Ｉで挿入ｃＤＮＡ約１．５ｋｂｐを単離し、Ｓａｃ　ＩとＮｈｅ　Ｉで消化したｐＧＶ‐Ｂ２に連結し、プラスミドＤＮＡ　ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ１を作製することが出来る。
実施例３．　プロモーター活性
実施例２で単離したＤＮＡのプロモーター活性について評価するため、レポーターアッセイを実施した。すなわち、実施例２で構築したプロモーターＤＮＡを含んだホタルルシフェラーゼ発現プラスミド（ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ１およびｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２）およびプロモーターＤＮＡを含まないホタルルシフェラーゼ発現プラスミドｐＧＶ−Ｂ２のそれぞれを、ヒト胎児腎由来細胞株ＨＥＫ２９３にトランスフェクションして、各プラスミドをトランスフェクションした細胞の細胞抽出液中のホタルルシフェラーゼ活性を測定し、その結果を比較した。なお、細胞へのトランスフェクション効率についての各プラスミド間の実験ロット差を補正するための内部標準として、ウミシイタケルシフェラーゼ発現プラスミドｐＲＬ−ＴＫ（東洋インキ製造株式会社製）を用いた。まず、ヒト胚子腎臓細胞ＨＥＫ２９３に、リポフェクタミン　プラス（ライフテクノロジー社製）を用いて、添付のプロトコールにしたがって、トランスフェクションした。すなわち、１ウェルあたり６×１０５個のＨＥＫ２９３細胞に、０．９３μｇの被験プラスミド（ｐＧＶ−Ｂ２、ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ１またはｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２）と０．０７μｇのｐＲＬ−ＴＫ　ＤＮＡを混合して、トランスフェクションした。３７℃で２日間培養した後、培地を除去して１０００μｌ／ウエルの細胞溶解剤（ＰＬＤ−３０（東洋インキ製造株式会社製））に溶解して、細胞抽出液を調製した。次に、その細胞抽出液を１００倍希釈し、その希釈溶液２０μｌを用いて、デュアル−ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ・システム（東洋インキ製造株式会社製）を添付のプロトコールに従って用いることにより、ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した（ルミナスＣＴ−９０００Ｄ、ダイアヤトロン社製を使用）。実験結果については、内部標準のウミシイタケルシフェラーゼ活性で補正したホタルルシフェラーゼ活性として表した。
【００３８】
その結果、ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ１を導入したＨＥＫ２９３細胞では、ｐＧＶ−Ｂ２を導入した細胞に比べて約２７倍、ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２では２４倍のルシフェラーゼ活性が観察されたことから、ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ１およびｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２に組み込まれた配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡにはプロモーターとしての活性が存在することが明らかとなった。以上の結果より、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１〜２５１５に示されるＤＮＡ、すなわちヒトセラミドキナーゼ遺伝子の５’末端側上流−２３９６〜＋１１９に相当する領域にプロモーター活性が存在することが明らかとなった。また、５’末端側上流を短縮した−１３１０〜＋１１９に相当する領域でも同等のプロモーター活性が存在することも示された。
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ルシフェラーゼ相対活性＊：ホタルルシフェラーゼ活性／ウミシイタケルシフェラーゼ活性（内部標準）を計算し、コントロールベクター（ｐＧＶ−Ｂ２）を１として算出した。
本実施例の方法において、例えばｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ１およびｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２で形質転換したＨＥＫ２９３細胞を被験物質存在下で培養したときのルシフェラーゼ活性を測定することにより、本発明のＤＮＡのプロモーター活性を阻害する物質の試験を行うことができる。このプロモーター活性を阻害する物質は、神経性疾患、炎症、感染症、血栓症、免疫疾患、ＨＩＶ、２型糖尿病、肥満、敗血症、心疾患、脂質代謝異常、動脈硬化、癌およびその転移の治療または予防薬となりうる。
【００３９】
【発明の効果】
上記のごとく、本発明により、プロモーター活性を有する新規ＤＮＡが提供された。本発明のＤＮＡは、セラミドキナーゼの発現量を促進または抑制する物質を試験するための方法に用いることができるので、新しい作用機作を有する神経性疾患、炎症、感染症、血栓症、免疫疾患、ＨＩＶ、２型糖尿病、肥満、敗血症、心疾患、脂質代謝異常、動脈硬化、癌およびその転移の治療または予防薬の開発に有用である。
【００４０】
【配列表フリーテキスト】
配列番号２：　ＰＣＲプライマー　ＣＫｐ−１
配列番号３：　ＰＣＲプライマー　ＣＫｐ−２
配列番号４：　ＰＣＲプライマー　ＣＫｐ−３
【００４１】
【配列表】
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