(57)【要約】【課題】短時間での高いタンパク質合成量が得られ、且つコンパクトで簡便な無細胞タンパク質合成方法、合成装置及び試薬キットを提供する。【解決手段】リボゾーム、ｍＲＮＡ、基質のアミノ酸、ＡＴＰ及びＧＴＰを水性緩衝液中に含む無細胞タンパク質合成系にてタンパク質を合成する方法であって、リボゾーム、ｍＲＮＡ、目的とするタンパク質の合成に必要な全ての種類の基質アミノ酸を含む合成反応液と、ＡＴＰ及びＧＴＰを含むエネルギー源とを混合して、合成反応を開始させ、合成反応の開始後無細胞合成系を維持する間に、ＡＴＰ及びＧＴＰを前記反応液に添加する添加操作と、半透性膜を通過し得る成分を除去する除去操作を行うことによってタンパク質の連続合成を行う、無細胞タンパク質合成方法。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボゾーム、ｍＲＮＡ、基質のアミノ酸、ＡＴＰ及びＧＴＰを水性緩衝液中に含む無細胞タンパク質合成系にてタンパク質を合成する方法であって、目的とするタンパク質の合成に必要な全ての種類の基質アミノ酸を、目的とするタンパク質合成に必要な量に応じて用いる、無細胞タンパク質合成方法。
【請求項２】
リボゾーム、ｍＲＮＡ、基質のアミノ酸、ＡＴＰ及びＧＴＰを水性緩衝液中に含む無細胞タンパク質合成系にてタンパク質を合成する方法であって、
リボゾーム、ｍＲＮＡ、目的とするタンパク質の合成に必要な全ての種類の基質アミノ酸を含む合成反応液と、ＡＴＰ及びＧＴＰを含むエネルギー源とを混合して、合成反応を開始させ、
合成反応の開始後無細胞合成系を維持する間に、ＡＴＰ及びＧＴＰを前記反応液に添加する添加操作と、半透性膜を通過し得る成分を除去する除去操作を行うことによってタンパク質の連続合成を行う、無細胞タンパク質合成方法。
【請求項３】
半透性膜を通過し得る成分には、合成中に形成された減成生産物が含まれる、請求項２に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【請求項４】
合成反応の開始から所定時間経過後に、半透性膜を通過し得る成分の除去操作、及び前記反応液へのＡＴＰ及びＧＴＰの添加操作を行う、請求項２又は３に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【請求項５】
合成反応の開始から所定時間経過後に、半透性膜を介して前記反応液を濃縮して半透性膜を通過し得る成分の除去操作を行い、その後、前記反応液へのＡＴＰ及びＧＴＰの添加操作を行う、請求項４に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【請求項６】
合成反応の開始から所定時間経過後に、前記反応液へのＡＴＰ及びＧＴＰの添加操作を行い、その後、半透性膜を介して前記反応液を濃縮して半透性膜を通過し得る成分の除去操作を行う、請求項４に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【請求項７】
前記除去操作及び添加操作を繰り返す、請求項４〜６のうちのいずれか１項に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【請求項８】
前記反応液へのＡＴＰ及びＧＴＰの添加を、分注機を用いて行う、請求項２〜７のうちのいずれか１項に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【請求項９】
前記半透性膜は、透析膜、半透膜、限外濾過膜、限外濾過バリア、及び化学的又は生物的に目的物質を捕捉できる膜からなる群から選ばれる、請求項２〜８のうちのいずれか１項に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【請求項１０】
前記合成反応液は、合成反応の開始時において、目的とするタンパク質合成に必要な全ての種類の基質アミノ酸を、目的とするタンパク質合成に必要な量に応じて含む、請求項２〜９のうちのいずれか１項に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【請求項１１】
基質アミノ酸の少なくとも１種として、ラベル化された前記アミノ酸を用い、ラベル化された前記アミノ酸をタンパク質に導入する、請求項２〜１０のうちのいずれか１項に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【請求項１２】
合成反応の開始、前記除去操作、及び前記添加操作が、自働制御されている、請求項２〜１１のうちのいずれか１項に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【請求項１３】
半透性膜を備えた合成反応槽と、合成反応槽にリボゾーム、ｍＲＮＡ及び基質アミノ酸を添加する手段と、合成反応槽にＡＴＰ及びＧＴＰを添加する手段と、半透性膜を通過し得る成分を半透性膜を介して除去する手段とを備えた無細胞タンパク質連続合成装置。
【請求項１４】
リボゾーム、ｍＲＮＡ、基質アミノ酸、ＡＴＰ及びＧＴＰを含む、請求項１〜１２のうちのいずれか１項に記載の無細胞タンパク質合成方法を行うための試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、無細胞タンパク質合成方法に関し、より詳しくは、短時間での高いタンパク質合成量が得られる、コンパクトで簡便な無細胞タンパク質合成方法に関する。また、本発明は、前記タンパク質合成方法に用いるための合成装置及び試薬キットにも関する。本発明において、タンパク質にはポリペプチドも含まれる。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質合成方法として、無細胞タンパク質合成系が知られている。無細胞タンパク質合成系では、生細胞を用いる場合のような細胞培養の必要がなく、利便性に優れる。また、生細胞を用いる場合には、生細胞が自己の細胞機能を維持するために外来タンパク質を排除する傾向が強いため、発現が困難なタンパク質も多いが、無細胞タンパク質合成系では、このような生体維持機構の制約を受けにくく、この観点からも優れている。
【０００３】
しかしながら、無細胞タンパク質合成系では、反応時間が１〜２時間程度と短く、生細胞を用いた場合に比べ合成量が低いという欠点があった。このため、バッチ法による無細胞タンパク質合成系は、タンパク質の大量合成には用いることができなかった。
【０００４】
スピリン（Ａ．Ｓ．Ｓｐｉｒｉｎ）らは、限外濾過装置に無細胞反応液を入れ、基質アミノ酸、ＡＴＰ及びＧＴＰを含む溶液をポンプを用いて反応液に連続的に供給し、同時に、基質の分解物や合成されたタンパク質を含む反応産物を反応液から除くことにより、十数時間にわたって無細胞タンパク質合成が持続し、従来の２０倍を超えるタンパク質合成量を達成した（Ａ．Ｓ．Ｓｐｉｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４２，  １１６２−１１６４  （１９８８）  ，特公平７−１１０２３６号公報）。しかしながら、このフロー法によれば、装置が大掛かりとなり、また、アミノ酸の供給量も多くなり、コストの点で不利である。
【０００５】
横山らは、タンパク質合成に必要な基質アミノ酸やＡＴＰ、ＧＴＰ等を含む基質溶液を入れた試験管中に、濃縮した大腸菌抽出液、基質アミノ酸、ＡＴＰ及びＧＴＰ等を含む反応液を内部に入れた使い捨て透析装置  Ｄｉｓｐｏ／Ｄｉａｌｙｚｅｒ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）  を収め、インキベートして、連続無細胞タンパク質合成を行った。無細胞タンパク質合成が６時間以上持続し、１ｍｌの反応液当たり３ｍｇ以上の目的タンパク質ＣＡＴが得られた。反応開始６時間後に前記基質溶液を新しいものと交換すると、合成反応はさらに持続し、最終的に６ｍｇの目的タンパク質が得られた（Ｋｉｇａｗａ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ４４２，  １５−１９，  １９９９）。この透析法によれば、合成の間に、反応液中に、ＡＴＰ及びＧＴＰのエネルギー源のみならず、基質アミノ酸も追加供給される。また、目的タンパク質のＣＡＴは、比較的小分子のものである。
【０００６】
また、タンパク質合成に必要な基質アミノ酸やＡＴＰ、ＧＴＰ等を含む基質溶液を収容した供給槽の上に、無細胞タンパク質合成反応液を収容した反応槽を半透膜を介して設けたいわゆる重層法も知られている。例えば、ラピッドトランスレーションシステムＲＴＳ５００（ロシュ・タイアグノスティックス株式会社）、プロテイオス（ＰＲＯＴＥＩＯＳ、東洋紡績株式会社製）が挙げられる。
【０００７】
上記透析法や重層法では、ＡＴＰ及びＧＴＰのエネルギー源のみならず基質アミノ酸を半透膜を介して合成反応液に追加供給するので、反応時間が長くかかってしまう。生成した目的タンパク質を反応系に長く滞留させておくのは、タンパク質の活性劣化などのため好ましいことではない。
【０００８】
【非特許文献１】
Ａ．Ｓ．Ｓｐｉｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４２，  １１６２−１１６４  （１９８８）
【特許文献１】
特公平７−１１０２３６号公報
【非特許文献２】
Ｋｉｇａｗａ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ４４２，  １５−１９，  １９９９
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
このような背景から、バッチ法よりも高いタンパク質合成量が比較的短い時間で得られる無細胞タンパク質合成方法が望まれる。
【００１０】
本発明の目的は、短時間での高いタンパク質合成量が得られ、且つコンパクトで簡便な無細胞タンパク質合成方法を提供することにある。また、本発明の目的は、前記タンパク質合成方法に用いるための合成装置及び試薬キットを提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明には、以下の発明が含まれる。
（１）    リボゾーム、ｍＲＮＡ、基質のアミノ酸、ＡＴＰ及びＧＴＰを水性緩衝液中に含む無細胞タンパク質合成系にてタンパク質を合成する方法であって、目的とするタンパク質の合成に必要な全ての種類の基質アミノ酸を、目的とするタンパク質合成に必要な量に応じて用いる、無細胞タンパク質合成方法。
【００１２】
無細胞タンパク質合成方法において、目的とするタンパク質の合成に必要な全ての種類の基質アミノ酸を、目的とするタンパク質合成に必要な量に応じて用いると、最適な合成が行われ、且つ不必要なアミノ酸のロスを避けることができ、合成コストが低減される。従来いずれの無細胞タンパク質合成法においても、２０種類のアミノ酸が等量用いられていた。このため、アミノ酸のロスが起こり、コストアップの一因となっていた。
【００１３】
（２）  リボゾーム、ｍＲＮＡ、基質のアミノ酸、ＡＴＰ及びＧＴＰを水性緩衝液中に含む無細胞タンパク質合成系にてタンパク質を合成する方法であって、
リボゾーム、ｍＲＮＡ、目的とするタンパク質の合成に必要な全ての種類の基質アミノ酸を含む合成反応液と、ＡＴＰ及びＧＴＰを含むエネルギー源とを混合して、合成反応を開始させ、
合成反応の開始後無細胞合成系を維持する間に、ＡＴＰ及びＧＴＰを前記反応液に添加する添加操作と、半透性膜を通過し得る成分を除去する除去操作を行うことによってタンパク質の連続合成を行う、無細胞タンパク質合成方法。
【００１４】
（３）  半透性膜を通過し得る成分には、合成中に形成された減成生産物が含まれる、（２）  に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【００１５】
（４）  合成反応の開始から所定時間経過後に、半透性膜を通過し得る成分の除去操作、及び前記反応液へのＡＴＰ及びＧＴＰの添加操作を行う、（２）  又は（３）  に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【００１６】
（５）  合成反応の開始から所定時間経過後に、半透性膜を介して前記反応液を濃縮して半透性膜を通過し得る成分の除去操作を行い、その後、前記反応液へのＡＴＰ及びＧＴＰの添加操作を行う、（４）  に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【００１７】
（６）  合成反応の開始から所定時間経過後に、前記反応液へのＡＴＰ及びＧＴＰの添加操作を行い、その後、半透性膜を介して前記反応液を濃縮して半透性膜を通過し得る成分の除去操作を行う、（４）  に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【００１８】
（７）  前記除去操作及び添加操作を繰り返す、（４）  〜（６）  のうちのいずれかに記載の無細胞タンパク質合成方法。
【００１９】
（８）  前記反応液へのＡＴＰ及びＧＴＰの添加を、分注機を用いて行う、（２）  〜（７）  のうちのいずれかに記載の無細胞タンパク質合成方法。
【００２０】
（９）  前記半透性膜は、透析膜、半透膜、限外濾過膜、限外濾過バリア、及び化学的又は生物的に目的物質を捕捉できる膜からなる群から選ばれる、（２）  〜（８）  のうちのいずれかに記載の無細胞タンパク質合成方法。
【００２１】
（１０）  前記合成反応液は、合成反応の開始時において、目的とするタンパク質合成に必要な全ての種類の基質アミノ酸を、目的とするタンパク質合成に必要な量に応じて含む、（２）  〜（９）  のうちのいずれかに記載の無細胞タンパク質合成方法。
【００２２】
（１１）    基質アミノ酸の少なくとも１種として、ラベル化された前記アミノ酸を用い、ラベル化された前記アミノ酸をタンパク質に導入する、（２）  〜（１０）のうちのいずれかに記載の無細胞タンパク質合成方法。
【００２３】
（１２）    合成反応の開始、前記除去操作、及び前記添加操作が、自働制御されている、（２）  〜（１１）のうちのいずれかに記載の無細胞タンパク質合成方法。
【００２４】
（１３）    半透性膜を備えた合成反応槽と、合成反応槽にリボゾーム、ｍＲＮＡ及び基質アミノ酸を添加する手段と、合成反応槽にＡＴＰ及びＧＴＰを添加する手段と、半透性膜を通過し得る成分を半透性膜を介して除去する手段とを備えた無細胞タンパク質連続合成装置。
【００２５】
（１４）    リボゾーム、ｍＲＮＡ、基質アミノ酸、ＡＴＰ及びＧＴＰを含む、（１）  〜（１２）のうちのいずれかに記載の無細胞タンパク質合成方法を行うための試薬キット。
【００２６】
【発明の実施の形態】
本発明の無細胞タンパク質合成系には、大腸菌、胚芽、家兎網状赤血球等の既知の無細胞タンパク質合成系を用いることができる。小麦、大麦、いね、コーン、ほうれん草等の胚芽、大腸菌を好ましく用いることができる。これらは公知の方法によって、無細胞タンパク質合成用細胞抽出物として調製される。
【００２７】
本発明において、まず、リボゾーム、ｍＲＮＡ、目的とするタンパク質の合成に必要な全ての種類の基質アミノ酸を含む合成反応液と、ＡＴＰ及びＧＴＰを含むエネルギー源とを混合して、合成反応を開始させる。合成反応は、半透性膜を備えた合成反応槽中において行うとよい。
【００２８】
合成反応液には、合成反応の開始時において、目的とするタンパク質の合成に必要な全ての種類及び量の基質アミノ酸が含まれている。これら基質アミノ酸は、目的とするタンパク質合成に必要な量に応じて含まれていることが好ましい。タンパク質合成は、ＤＮＡ、それから転写されるｍＲＮＡの塩基配列に基づいて行われる。すなわち、合成に必要なアミノ酸の種類及び量は、ＤＮＡの配列によって大きく左右される。例えば、トリプトファンは、１つのタンパク質に１〜数個程度しか含まれない。このようなことから、予めＤＮＡの配列に基づいてアミノ酸の組成の比率を求め、その組成から、合成に必要な各アミノ酸の量を算出し、必要な量の各アミノ酸を準備する。この手法を採用することによって、最適な合成が行われ、且つ不必要なアミノ酸のロスを避けることができ、合成コストが低減される。
【００２９】
このコスト低減効果は、ラベル化されたアミノ酸を導入する場合にはさらに大きくなる。例えば、タンパク質をＮＭＲ解析に用いるとき、同位体ラベル化されたアミノ酸をタンパク質に導入するが、同位体ラベル化されたアミノ酸は高価である。また、タンパク質をＸ線解析に用いるとき、セレノメチオニンや重原子メチオニンをタンパク質に導入するが、これらは高価である。また、アミノ酸の変異体（例えばＬアミノ酸、Ｄアミノ酸）を導入したい場合、及び蛍光ラベルなど修飾基をつけたアミノ酸を導入したい場合にも、これらのアミノ酸は高価である。本手法を採用することによって、不必要な高価なアミノ酸のロスを避けることができ、合成コストが低減される。
【００３０】
次に、合成反応の開始後無細胞合成系を維持する間に、ＡＴＰ及びＧＴＰを前記反応液に添加する添加操作と、半透性膜を通過し得る成分を半透性膜を介して除去する除去操作を行い、タンパク質の連続合成を行う。
【００３１】
半透性膜を通過し得る成分には、合成中に形成された減成生産物、すなわちＡＤＰ、ＡＭＰ、ＧＤＰ、ＧＭＰ、リン酸塩、ピロリン酸塩等が含まれる。これらの成分はタンパク質合成の阻害物質であり、無細胞合成系を維持する間に合成反応液から半透性膜を介して除去する。これら阻害物質を除去することにより、タンパク質の連続合成が行われる。また、半透性膜を通過し得る成分には、合成された比較的小さな目的タンパク質が含まれることもある。
【００３２】
半透性膜を通過し得る成分の除去操作は、合成反応液に例えば遠心力を負荷して、合成反応液を濃縮すると共に半透性膜を通過し得る成分を除去することにより行うことができる。
【００３３】
また、無細胞合成系を維持する間に、ＡＴＰ及びＧＴＰを合成反応液中に追加添加する。エネルギー源であるＡＴＰ及びＧＴＰを追加添加することにより、タンパク質合成反応が速くなると共に、連続合成が行われる。合成反応液へのＡＴＰ及びＧＴＰの添加操作は、ペリスターポンプ、シリンジポンプ等の分注機を用いて行うことができる。
【００３４】
半透性膜を通過し得る成分の除去操作、及び合成反応液へのＡＴＰ及びＧＴＰの添加操作は、目的タンパク質の種類によって、合成反応の開始から所定時間経過後に行うとよい。このタイミングは、適宜決定される。
【００３５】
半透性膜を通過し得る成分の除去操作、及び合成反応液へのＡＴＰ及びＧＴＰの添加操作は、次の２つの方法のいずれかで行うとよい。
【００３６】
１つは、合成反応の開始から所定時間経過後に、半透性膜を介して合成反応液を濃縮して半透性膜を通過し得る成分の除去操作を行い、その後、前記反応液へのＡＴＰ及びＧＴＰの添加操作を行う方法である。
【００３７】
他の１つは、合成反応の開始から所定時間経過後に、合成反応液へのＡＴＰ及びＧＴＰの添加操作を行い、その後、半透性膜を介して前記反応液を濃縮して半透性膜を通過し得る成分の除去操作を行う方法である。
【００３８】
この除去操作及び添加操作を１回のみ行って、目的タンパク質の所望量が得られる場合もあるかも知れないが、除去操作及び添加操作を繰り返すことが、タンパク質の連続合成及び高い合成量を得るために好ましい。除去操作及び添加操作の繰り返しの間隔も、適宜決定される。
【００３９】
前記半透性膜は、透析膜、半透膜、限外濾過膜、限外濾過バリア、及び化学的又は生物的に目的物質を捕捉できる膜から選ばれる。それぞれ、孔の大きさが異なるので、目的タンパク質の種類に応じて選択するとよい。
【００４０】
本発明において、合成反応の開始、前記除去操作、及び前記添加操作が、自働制御されていると、合成反応操作が確実且つ簡便になるので好ましい。
【００４１】
本発明の無細胞タンパク質連続合成は、半透性膜を備えた合成反応槽と、合成反応槽にリボゾーム、ｍＲＮＡ及び基質アミノ酸を添加する手段と、合成反応槽にＡＴＰ及びＧＴＰを添加する手段と、半透性膜を通過し得る成分を半透性膜を介して除去する手段とを備えた無細胞タンパク質連続合成装置を用いて行うことができる。合成反応槽中へのリボゾーム、ｍＲＮＡ及び基質アミノ酸の添加は、これら各成分を予め水性緩衝液中に混合しておいて、その水性緩衝液を添加することにより行ってもよく、あるいは、リボゾーム及びｍＲＮＡを含む水性緩衝液と、基質アミノ酸を含む水性緩衝液とを別々に添加することにより行ってもよい。
【００４２】
本発明には、リボゾーム、ｍＲＮＡ、基質アミノ酸、ＡＴＰ及びＧＴＰを含む、無細胞タンパク質合成方法を行うための試薬キットも含まれる。タンパク質合成者は、予めＤＮＡの配列に基づいてアミノ酸の組成の比率を求め、その組成から、合成に必要な各アミノ酸の量を算出し、試薬キットを用いて、必要な量の各アミノ酸を準備する。
【００４３】
【発明の効果】
本発明によれば、短時間での高いタンパク質合成量が得られ、且つコンパクトで簡便な無細胞タンパク質合成方法が提供される。さらに、本発明によれば、前記タンパク質合成方法に用いるための合成装置及び試薬キットが提供される。