(57)【要約】【課題】アスタキサンチン及びカンタキサンチンはその広い用途が期待できるにも拘わらず、天然物からの抽出による生産方法のため、価格が高く、その用途が限定されていた。従って、アスタキサンチン及びカンタキサンチンを如何に低価格で供給できるかが当業界の課題であった。【解決手段】アスタキサンチン及びカンタキサンチンを産生する新種の放線菌を見出すことにより、該放線菌を培養することによって、アスタキサンチン及びカンタキサンチンを従来より安価に生産することができた。本放線菌はゴードニア属に属し、淡水無機栄養培地又は海水無機栄養培地で生育が可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゴードニア属（Ｇｏｒｄｏｎｉａ属）放線菌を培養することを特徴とするアスタキサンチン及びカンタキサンチンの生産方法。
【請求項２】
ゴードニア属（Ｇｏｒｄｏｎｉａ属）放線菌を淡水無機栄養培地で培養することを特徴とするアスタキサンチン及びカンタキサンチンの生産方法。
【請求項３】
ゴードニア属（Ｇｏｒｄｏｎｉａ属）放線菌を海水無機栄養培地で培養することを特徴とするアスタキサンチン及びカンタキサンチンの生産方法。
【請求項４】
前記ゴードニア属放線菌が、Ｇｏｒｄｏｎｉａ　ｓｐ．　ＫＡＮＭＯＮＫＡＩ−１１２９（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９６９）であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載のアスタキサンチン及びカンタキサンチンの生産方法。
【請求項５】
ゴードニア属（Ｇｏｒｄｏｎｉａ属）放線菌を培養することにより生産されたアスタキサンチン及びカンタキサンチンを、該放線菌の菌体より溶剤により抽出した後、溶剤を除去することを特徴とするアスタキサンチン及びカンタキサンチンの混合物の製造方法。
【請求項６】
上記溶剤がアセトン及びエタノールの混合溶剤であることを特徴とする請求項５に記載のアスタキサンチン及びカンタキサンチンの混合物の製造方法。
【請求項７】
上記混合溶剤のアセトン及びエタノールの比率が、アセトン：エタノール＝２：１であることを特徴とする請求項６に記載のアスタキサンチン及びカンタキサンチンの混合物の製造方法。
【請求項８】
前記ゴードニア属放線菌が、Ｇｏｒｄｏｎｉａ　ｓｐ．　ＫＡＮＭＯＮＫＡＩ−１１２９（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９６９）であることを特徴とする請求項５乃至７のいずれか１項に記載のアスタキサンチン及びカンタキサンチンの混合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ゴードニア属（Ｇｏｒｄｏｎｉａ属）放線菌を培養することによりアスタキサンチン及びカンタキサンチンを生産する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
アスタキサンチン及びカンタキサンチンはカロテノイドとよばれる黄色ないし赤色の天然色素であって、アスタキサンチンは、緑藻、エビ、カニ、オキアミ、ホタテ貝、ヒトデ、サケ、タイどに含まれており、最近ではその抗酸化力により、生体内における活性酸素の除去機能、ＬＤＬコレステロールの抑制作用、ガンに対する予防効果などの作用により健康食品として注目されている。更には、家畜、家禽の飼料や養魚用餌料の添加剤としての利用も行われてきた。また、カンタキサンチンは、キノコ、ミカン、サケ、マスなどに含まれており、アスタキサンチンと同様な効果をもつものと期待されている。
【０００３】
従来より、アスタキサンチン及びカンタキサンチンは上述の天然物より、抽出することにより生産されており、例えばアスタキサンチンは緑藻より、カンタキサンチンはマッシュルームより生産されていた。しかし、最近になってアスタキサンチンを含有するファフィア酵母（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）が見出され、酵母より生産する方法が注目されてきた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
アスタキサンチン及びカンタキサンチンはその広い用途が期待できるにも拘わらず、天然物からの抽出による生産方法では、その原料に制限があり、価格も高価となるため、その用途が限定されていた。従って、アスタキサンチン及びカンタキサンチンを如何に容易に、しかも低価格で供給できるかが当業界の課題であった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、微生物によるアスタキサンチン及びカンタキサンチンの生産方法について、鋭意検討を行った結果、アスタキサンチン及びカンタキサンチンを産生する放線菌を見出すことにより、本発明を提案するに至った。すなわち、ゴードニア属（Ｇｏｒｄｏｎｉａ属）放線菌を培養することを特徴とするアスタキサンチン及びカンタキサンチンの生産方法であって、その培地が淡水無機栄養培地又は海水無機栄養培地であることが好ましく、ゴードニア属放線菌が、Ｇｏｒｄｏｎｉａ　ｓｐ．　ＫＡＮＭＯＮＫＡＩ−１１２９（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９６９）であることが特に好ましい。
【０００６】
本発明の第二は、ゴードニア属（Ｇｏｒｄｏｎｉａ属）放線菌を培養することにより生産されたアスタキサンチン及びカンタキサンチンを、該放線菌の菌体より溶剤により抽出した後、溶剤を除去することを特徴とするアスタキサンチン及びカンタキサンチンの混合物の製造方法であって、溶剤がアセトン及びエタノールの混合溶剤であることが好ましく、混合溶剤のアセトン及びエタノールの比率が、アセトン：エタノール＝２：１であることが特に好ましい。また、ゴードニア属放線菌が、Ｇｏｒｄｏｎｉａ　ｓｐ．　ＫＡＮＭＯＮＫＡＩ−１１２９（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９６９）であることが特に好ましい。
【０００７】
【発明の実施の形態】
ゴードニア属（Ｇｏｒｄｏｎｉａ属）放線菌とは、従来ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属）といわれていた細菌の一部であって、放線菌に分類されたものである。すなわち、桿状のグラム陰性菌であって、鞭毛により運動性を有し、カロチノイドを含有している。
【０００８】
本発明にいうＧｏｒｄｏｎｉａ　ｓｐ．　ＫＡＮＭＯＮＫＡＩ−１１２９（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９６９）は、大阪府岬町し尿処理センターの返送汚泥を採取し、海水にて馴養した海水性硝化汚泥より分離したグラム陰性の放線菌であって、亜硝酸無機培地（独立栄養培地）、アンモニア無機培地（独立栄養培地）及び有機培地（従属栄養培地）のいずれにも生育するので、通性化学合成独立栄養細菌ということがいえる。以下に本菌の菌学的な性質を記載する。
【０００９】
（１）形態的性質
グラム陰性であり、長さ約２〜３μｍ、幅約０．５μｍの桿菌である。運動性を有し、鞭毛は周毛である。コロニー色はゴードニア属放線菌によく見られる赤橙色（ｐａｌｅ　ｙｅｌｌｏｗ−ｇｒｅｅｎ）である。コロニー形状は円形で高く盛り上がり（ｐｕｌｖｉｎａｔｅ　ｃｉｒｃｕｌａｒ　ｃｏｌｏｎｙ）、コロニー縁部はきれいに縁取られており、鞭毛運動による広がりの弱いことが示唆される。
【００１０】
（２）培養的性質
亜硝酸無機培地（独立栄養培地）、アンモニア無機培地（独立栄養培地）及び有機培地（従属栄養培地）のいずれにも生育する。亜硝酸無機培地の組成の１例を表１に、アンモニア無機培地の組成の１例を表２に、示した。イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ　培地　Ｎｏ．２）での生育は良好であるが、菌糸形成及び拡散性色素生成はなかった。オートミール寒天培地（ＩＳＰ　培地　Ｎｏ．３）、スターチ無機塩寒天培地（ＩＳＰ　培地　Ｎｏ．４）及びグリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ　培地　Ｎｏ．５）では生育しなかった。また、淡水及び海水のいずれでも生育可能であり、暗室においても培養が可能である。
【００１１】
【表１】
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【００１２】
【表２】
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【００１３】
（３）生理学的性質
生育温度範囲は、１８〜３５℃であって、ペプトン・イースト・鉄寒天培地（ＩＳＰ　培地　Ｎｏ．６）でのメラニン様色素の生成は無かった。炭素源の利用性は、表３に示したとおりである。
【００１４】
【表３】
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【００１５】
（４）化学分類学的性質
単一炭素源としての基質資化性の判定を米国バイオログ社（Ｂｉｏｌｏｇ社）のＧＮ　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅにより、９５種類の単一炭素源について調べた結果、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０および臭化コハク酸を単一炭素源として資化することがわかった。Ｔｗｅｅｎ２０およびＴｗｅｅｎ４０は、エステラーゼが作用するものと考えられる。他の基質については、複数の基質の組合せ、あるいはビタミンなどの補助栄養が必要であるものと思われる。また、全脂肪酸の組成分析を米国ＭＩＤＩ社の標準法により行った。その結果は表４に示したとおりであって、ゴードニア属を含むノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属目の放線菌に分類されることが示唆されている。また、表４よりＧｏｒｄｏｎｉａ　ｓｐ．ＫＡＮＭＯＮＫＡＩ−１１２９（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９６９）のリン脂質脂肪酸には１６：０パルミチン酸と１８：１ω９ｃオレイン酸が共に約３０％と多いことがわかる。なお、表４においては、Ｇｏｒｄｏｎｉａ　ｓｐ．ＫＡＮＭＯＮＫＡＩ−１１２９（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９６９）はサンプル名としてＵＮ−ＨＳＵ１（ＮＩＯ−３　＃３）で表示されている。
【００１６】
【表４】
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【００１７】
（５）特徴付ける性質
微生物の分類・同定に汎用される１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を遺伝子ほぼ全長の１５１７塩基について解析し、その結果を配列表に示した。この配列表をもとに、系統樹を作成し、表５に示した。なお、表５においては、Ｇｏｒｄｏｎｉａ　ｓｐ．ＫＡＮＭＯＮＫＡＩ−１１２９（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９６９）はサンプル名として　Ｃ１１９５３−ＮＩＯ−３で表示されている。
【００１８】
【表５】
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【００１９】
本発明にいうアスタキサンチンとは、化学式１に示した化学構造をもつ　３，３’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−４，４’−ｄｉｋｅｔｏ−β−ｃａｒｏｔｅｎｅ　をいい、緑藻、エビ、カニ、オキアミ、ホタテ貝、ヒトデ、サケ、タイどに含まれている。
【００２０】
【化１】
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【００２１】
本発明にいうカンタキサンチンとは、化学式２の化学構造をもつ　４，４’−ｄｉｏｘｏ−β−ｃａｒｏｔｅｎｅをいい、キノコ、ミカン、サケ、マスなどに含まれている。
【００２２】
【化２】
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【００２３】
本発明にいう淡水無機栄養培地とは、精製水又は上水などの淡水に無機化合物を添加した独立栄養培地であって、その１例が表６に示した組成の培地であるが、必ずしもこの組成に限定されるものではない。また、海水無機栄養培地とは、海水又は人工海水に無機化合物を添加した独立栄養培地であって、その例を表１及び表２に示したが、必ずしもこの組成に限定されるものではない。
【００２４】
【表６】
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【００２５】
【実施例】
次に実施例に基づき、本発明を具体的に説明するが、本発明の趣旨はこれに限定されるものではない。
【００２６】
アスタキサンチンの含有量の測定は、総カロテノイドの含有量及び黄色色素の含有量を測定した後、総カロテノイドの含有量から黄色色素の含有量を差し引いた値としている。具体的には、遠心分離により集積した菌体をアセトン：エタノール＝２：１の溶媒により抽出した試料３〜６ｇを５０ｍｌ容ナス形フラスコに採取し、図１のフローシートにしたがってアスタキサンチンの分析を行った。
【００２７】
カンタキサンチンの含有量の測定は、抽出溶媒を留去した後の試料をエタノールに溶解し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した。具体的には図２に示したように、遠心分離により集積した菌体をアセトン：エタノール＝２：１の溶媒により抽出した試料１〜２ｇを５０ｍｌ容ナス形フラスコに採取し、溶媒を留去した後、エタノールに溶解し、ＨＰＬＣにてカンタキサンチンの分析を行った。
【００２８】
（実施例１）
１Ｌ容のフラスコに表６の組成の淡水無機栄養培地２００ｍｌを入れ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ　ｓｐ．　ＫＡＮＭＯＮＫＡＩ−１１２９（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９６９）の菌体１ｇをフラスコに投入し、３０日間振盪培養を行った。培養後、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、菌体を集積して、アセトン：エタノール＝２：１の溶剤でアスタキサンチン及びカンタキサンチンを抽出し、その分析を行った。その結果、アスタキサンチンの生産量は９０μｇ／１００ｇ、カンタキサンチンの生産量は１５μｇ／１００ｇであった。
【００２９】
（実施例２）
１Ｌ容のフラスコに表１の組成の海水無機栄養培地２００ｍｌを入れ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ　ｓｐ．　ＫＡＮＭＯＮＫＡＩ−１１２９（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９６９）の菌体１ｇをフラスコに投入し、３０日間振盪培養を行った。培養後、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、菌体を集積して、アセトン：エタノール＝２：１の溶剤でアスタキサンチン及びカンタキサンチンを抽出し、その分析を行った。その結果、アスタキサンチンの生産量は１０８μｇ／１００ｇ、カンタキサンチンの生産量は３４μｇ／１００ｇであった。
【００３０】
（実施例３）
グルコース２０ｇ、ペプトン１０ｇ及び酵母エキス５ｇを精製水に溶解し１Ｌとした淡水従属栄養培地を１Ｌ容のフラスコに２００ｍｌを入れ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ　ｓｐ．　ＫＡＮＭＯＮＫＡＩ−１１２９（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９６９）の菌体１ｇをフラスコに投入し、３０日間振盪培養を行った。培養後、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、菌体を集積して、アセトン：エタノール＝２：１の溶剤でアスタキサンチン及びカンタキサンチンを抽出し、その分析を行った。その結果、アスタキサンチンの生産量は８８μｇ／１００ｇ、カンタキサンチンの生産量は１８μｇ／１００ｇであった。
【００３１】
（実施例４）
グルコース２０ｇ、ペプトン１０ｇ及び酵母エキス５ｇを人工海水（富田製薬株式会社製、マリンアート）に溶解し１Ｌとした海水従属栄養培地を１Ｌ容のフラスコに２００ｍｌを入れ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ　ｓｐ．　ＫＡＮＭＯＮＫＡＩ−１１２９（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９６９）の菌体１ｇをフラスコに投入し、３０日間振盪培養を行った。培養後、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、菌体を集積して、アセトン：エタノール＝２：１の溶剤でアスタキサンチン及びカンタキサンチンを抽出し、その分析を行った。その結果、アスタキサンチンの生産量は１１６μｇ／１００ｇ、カンタキサンチンの生産量は２９μｇ／１００ｇであった。
【００３２】
【発明の効果】
本発明によるアスタキサンチン及びカンタキサンチンの生産方法は、放線菌を培養することによる生産方法であるため、従来の天然物から抽出して採取する方法に較べて、任意の量を効率的に生産できるので、計画的に安価に供給することができる。従って、家畜、家禽の飼料や養魚用餌料の添加剤として利用する場合、必要量を確保し、しかも飼料や餌料のコストを抑えることが可能となった。
【００３３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】アスタキサンチンの分析法フローシート
【図２】カンタキサンチンの分析法フローシート
【図１】
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【図２】
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