(57)【要約】【課題】顕著に優れた抗酸化能を示す天然物由来の抗酸化剤を提供する。【解決手段】炭酸ナトリウムを０．５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌおよび炭酸水素ナトリウムを０．５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ含有する混合水溶液を用いて繭または生糸から抽出したセリシン加水分解物もしくはその同等物を抗酸化剤の有効成分として用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭酸ナトリウムを０．５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌおよび炭酸水素ナトリウムを０．５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ含有する混合水溶液を用いて抽出したセリシン加水分解物もしくはその同等物を有効成分とすることを特徴とする抗酸化剤。
【請求項２】
常圧で抽出したセリシン加水分解物もしくはその同等物を有効成分とすることを特徴とする請求項１記載の抗酸化剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、食品、化粧品、医薬部外品、医薬品などの分野において利用可能な天然物由来の抗酸化剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
油脂、とりわけ不飽和脂肪酸を含む油脂は酸化されやすく、自動酸化、あるいは活性酸素など種々の因子により酸化されて過酸化脂質となる。
この過酸化脂質が生体内において過剰に生成、蓄積されると、心筋梗塞、動脈硬化、糖尿病、癌、脳卒中などの生活習慣病（成人病）や、シミ、ソバカス、ニキビ、湿疹などの皮膚障害を招く恐れのあることが近年多数報告されている。また、食品、化粧品、医薬部外品、医薬品などにおいても、保存中や使用時に過酸化脂質を生成し、これによる品質低下や栄養低下、退色あるいは褐変、人体への毒性発現などが問題となっている。
【０００３】
このような過酸化脂質の作用が明らかになるにつれ、過酸化脂質の生成、蓄積を抑制する抗酸化剤は、前記各種疾患の予防および治療剤として、もしくは食品、化粧品、医薬部外品、医薬品などに含まれる油脂成分の酸化的劣化防御剤として注目され、実利的な利用が期待されているものである。
例えば、ＢＨＡ（ブチルヒドロキシアニソール）、ＢＨＴ（ブチルヒドロキシトルエン）などのフェノール系誘導体が、極めて高い抗酸化能を有することが知られている。しかしながら、これらは化学的に合成されるため、人体への副作用や変異原性など安全性の面で問題があり、食品や化粧品、医薬部外品、医薬品などではその使用を控える傾向にある。
【０００４】
一方、天然物由来の抗酸化剤は安全性については評価されるものの、一般に、抗酸化能は合成抗酸化剤よりも劣るという欠点がある。比較的優れた抗酸化能を有するものとして、ビタミンＥ（トコフェロール）、ビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸）、β−カロチン、グルタチオンなどが知られている。しかしながら、ビタミンＥやビタミンＣは安定性、特に耐熱性に乏しく失活しやすいという問題がある。ビタミンＣやグルタチオンは金属イオンの存在下でプロオキシダント（酸化促進剤）として作用し、条件によっては油脂の過酸化をむしろ促進する場合がある。ビタミンＥやβ−カロチンは油溶性のため水に溶けにくく適用範囲が制限される。
また、近年では、植物体に広く存在するカテキン、ケルセチン、エラグ酸のようなポリフェノール化合物の抗酸化能が注目を集め、様々な探索が行われている。しかしながら、これらは植物抽出物そのものを抗酸化剤として用いることが多く、前記したように抗酸化能が十分でないばかりか、特有の風味、色を有しており、その適用範囲は制限されているのが現状である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような現状に鑑みて行われたものであり、その目的とするところは、優れた過酸化脂質抑制効果を有し、しかも人体に対する安全性が高く、水溶性で熱を加えても失活せず、特有の風味、色がなく、食品、化粧品、医薬部外品、医薬品などの分野で利用可能な天然抗酸化剤を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本出願人は、繭または生糸から抽出したセリシンが、高い過酸化脂質抑制効果を有することを見出し特許出願した（特願平８−２９６０１５）。本発明者はかかる知見に基づいて更に研究を進めた結果、特定の条件で繭または生糸から抽出したセリシン加水分解物が特に優れた抗酸化能を発揮することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、繭または生糸から、０．５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの炭酸ナトリウムおよび０．５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの炭酸水素ナトリウムの混合水溶液で加水分解して得られたセリシン加水分解物を有効成分とすることを特徴とする抗酸化剤に関する。また、本発明によれば、前記抗酸化剤を配合してなる食品、化粧品、医薬部外品、医薬品が提供される。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明に使用されるセリシン加水分解物は、繭または生糸に存在する天然タンパク質セリシンを炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムの混合水溶液で加水分解し、これを精製して得られるものである。ここで繭とは蚕繭のことをいい、また生糸とは所謂蚕糸のことである。
【０００８】
本発明において蚕は、人間に飼育されて生育する家蚕、および自然環境の中で生育する野蚕、いずれであってもよく特殊な種類に限定されない。繭は蛹が入っている状態のもの、繭の一部を切開して蛹を取り出した状態のもの、もしくは粉砕処理したもの、また生糸についても製糸したもの、織り、編み等により布帛化したもの、縫製したもの、もしくは粉砕処理したものなどいずれも使用できる。
【０００９】
特に高い安全性が要求される食品、化粧品、医薬部外品、医薬品などの用途に用いる場合には、高純度のセリシンを得る必要性から、不純物の分離作業を極力要しない繭、生糸を選定して使用する。例えば、重金属などの有害物質を含まない人工飼料を用いて無菌飼育した家蚕を用い、蛹が入っていない状態の繭からセリシンを抽出する手法が挙げられる。
目的とするセリシン加水分解物は、上記材料から炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムの混合水溶液を用いて次のように抽出する。
【００１０】
繭または生糸と混合水溶液との重量比は、繭または生糸１に対し、抽出溶媒２０〜３０が好ましい。混合水溶液の重量が繭または生糸１に対し２０未満では繭または生糸の容積が抽出溶媒のそれ以上になり、繭または生糸全体が浸からない、あるいは撹拌操作が不可能となる。その結果、加水分解が不十分となってセリシン加水分解物の水溶性が低下し、抗酸化能が十分に発揮されない、不安定で再現性が低下する、などの不具合が発生する。混合水溶液の重量が繭または生糸１に対し３０を超えると、精製時の負荷が大きく効率が悪くなる。抽出温度は８０〜１００℃、時間は３０分〜２時間が好ましい。抽出温度が８０℃未満、あるいは抽出時間が３０分未満では加水分解が不十分となってセリシン加水分解物の水溶性が低下し、抗酸化能が十分に発揮されない。また、抽出温度が１００℃を超えると、あるいは抽出時間が２時間を超えるとセリシンに対するダメージが大きく、抗酸化能が低下する。
【００１１】
ここで、炭酸ナトリウムの濃度を０．５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ、炭酸水素ナトリウムの濃度を０．５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌとすることが重要であり、より好ましくは炭酸ナトリウムの濃度を１〜５ｍｍｏｌ／Ｌ、炭酸水素ナトリウムの濃度を１〜５ｍｍｏｌ／Ｌとすること、さらに好ましくは両濃度を等モル量とすることが重要である。本発明において、炭酸ナトリウムの濃度が０．５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ、炭酸水素ナトリウムの濃度が０．５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲外の水溶液で抽出したセリシン加水分解物を用いることができないわけではないが、セリシンの持つ抗酸化能を最大限に引き出し、本発明の目的を効果的に達成するためには、混合水溶液の濃度が上記特定の値を有することが必要である。炭酸ナトリウムの濃度、あるいは炭酸水素ナトリウムのどちらかが濃度が０．５ｍｍｏｌ／Ｌ未満では水溶性が低下しセリシン本来の抗酸化能を有効に発揮させることが困難となる。一方で、炭酸ナトリウムの濃度、あるいは炭酸水素ナトリウムの濃度のどちらかが１０ｍｍｏｌ／Ｌを超える量ではセリシンに対するダメージが大きく優れた抗酸化能が得られない。
【００１２】
抽出は常圧で行うことが好ましい。常圧においてはセリシンに対するダメージがなく、かつ安定に再現性よく抽出できる。加圧下で行った場合は、セリシンに対するダメージが大きく優れた抗酸化能が得られない、不安定で再現性が悪い、など不具合が発生する虞がある。また、設備や抽出にかかる費用が大きくなり、コストアップにつながる。低圧下で行った場合は、前述の好ましい抽出温度８０〜１００℃を維持するのが難しく、かつ不安定で再現性が悪くなる虞がある。同様に設備や抽出にかかる費用が大きくなり、コストアップにつながる。
【００１３】
ここで得られた抽出液は、ろ過、遠心分離などにより固形物を除去し、さらに分離精製することにより、目的とするセリシン加水分解物を回収することができる。抽出液中のセリシン加水分解物の分子量は、通常５０００〜１０００００の範囲内にあって、しかもブロードに分布している。ここで用いられる分離精製法は特に限定されるものでなく、例えば塩析、有機溶媒沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、逆浸透、限外ろ過、超遠心分離、電気透析など分子量による分画処理が可能な公知の方法、ペプチドのみを高純度で得られる公知の方法、塩分を効率よく除去できる公知の方法を単独で、あるいは組み合わせて用いることができる。
以上のような過程を経て、抗酸化能が特に優れたセリシン加水分解物を含有する水溶液を得ることができる。これをそのまま、あるいは適当な濃度に調整して使用しても良いし、凍結乾燥、噴霧乾燥などにより乾燥してから使用しても良い。
【００１４】
本発明において「優れた抗酸化能」とは、後述するＴＢＡ法測定試験に従って測定した場合に、本発明以外の炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムの混合水溶液以外で加水分解したセリシン加水分解物と比較し過酸化脂質生成量が１０分の１以下となること、およびビタミンＣと比較し過酸化脂質生成量が１０分の１以下となることを意味するものとする。
【００１５】
上記のようなセリシン加水分解物は、食品、化粧品、医薬部外品、医薬品などへ添加した場合、従来の炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムの混合水溶液以外で加水分解したセリシン加水分解物に比べ、効果が１０倍以上であり、また、同じ効果を期待するのであれば、添加量は１０分の１以下ですむ。加水分解物であるので親水性が高く冷水にも容易に溶解し、水溶液がゲル化せず、低粘度で取り扱いが容易である。また、特有の風味や色がなく、食品、化粧品、医薬部外品、医薬品などに添加しても官能特性に影響を与えず、かつ他の原料との混合性が良好である。
【００１６】
本発明の抗酸化剤は、化粧品、食品、医薬部外品、医薬品などに従来の抗酸化剤と同様に適用することができる。本発明の抗酸化剤は、毒性が無く、多量に摂取しても特段の問題は生じない。食品、化粧品、医薬部外品、医薬品などへの添加量は、効果や製剤安定性などの観点から適宜決定すればよい。
【００１７】
例えば、皮膚に外用する化粧品、医薬部外品、医薬品に適用する場合、その添加量は通常０．０１〜１０重量％、より好ましくは０．１〜２重量％、さらに好ましくは０．５〜１重量％であり、適用量は１日、皮膚５００ｃｍ２あたり通常１〜１００ｍｇ、より好ましくは１０〜５０ｍｇ、さらに好ましくは１０〜３０ｍｇである。外用する形態としては、例えばクリーム、乳液、ファウンデーション、パック、化粧水、パウダーオイル、軟膏などを挙げることができる。
【００１８】
また、経口摂取する食品、医薬部外品、医薬品などに適用する場合、その添加量は通常０．０１〜１００重量％、より好ましくは０．１〜５０重量％、さらに好ましくは０．５〜１０重量％であり、人体への投与量は１日、体重１ｋｇあたり通常１〜２０００ｍｇ、より好ましくは１０〜５００ｍｇ、さらに好ましくは５０〜２００ｍｇである。食品や医薬部外品、医薬品における形態としては、例えば粉末状、溶液状、ゲル状、スティック状、顆粒状、カプセル状、錠剤などを挙げることができる。
【００１９】
本発明で用いるセリシン加水分解物が近似するセリシン加水分解物に比し、顕著に優れた抗酸化性能を示す学術的理由は未だ明らかではないが、分子量分布等も含めた分子量とミクロ構造の特異性に由来するものと推測される。
【００２０】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
まず、本発明に係る抗酸化剤の有効成分、セリシン加水分解物の製造について説明する。
【００２１】
実施例１
繭１００ｇを蒸留水３０００ｇに加え、還流器を付けた５Ｌ容量のナスフラスコ内で、マントルヒーターを用いて常圧９５℃で１時間加熱した。次に炭酸ナトリウムを２ｍｍｏｌ／Ｌ、および炭酸水素ナトリウムを２ｍｍｏｌ／Ｌとなるように加え、さらに常圧８０℃１時間加熱して加水分解を行った。溶解していない繭の残渣を除去し、抽出液を室温で放置、冷却した後、０．２μｍのフィルターでろ過した。これをゲルろ過クロマトグラフィーにかけて精製、凍結乾燥し、セリシン加水分解物固体を得た。このセリシン加水分解物のＧＰＣ分析を行ったところ、重量平均分子量は４００００であることがわかった。
【００２２】
比較例１
繭１００ｇを蒸留水３０００ｇに加え、還流器を付けた５Ｌ容量のナスフラスコ内で、マントルヒーターを用いて常圧９５℃で１時間加熱した。次に炭酸ナトリウムを２００ｍｍｏｌ／Ｌとなるように加え、さらに常圧８０℃１時間加熱して加水分解を行った。溶解していない繭の残渣を除去し、抽出液を室温で放置、冷却した後、０．２μｍのフィルターでろ過した。これをゲルろ過クロマトグラフィーにかけて精製、凍結乾燥し、セリシン加水分解物固体を得た。このセリシン加水分解物のＧＰＣ分析を行ったところ、重量平均分子量は５０００であることがわかった。
【００２３】
比較例２
繭１００ｇを蒸留水３０００ｇに加え、還流器を付けた５Ｌ容量のナスフラスコ内で、マントルヒーターを用いて常圧９５℃で１時間加熱した。次に炭酸ナトリウムを０．０５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように加え、さらに常圧８０℃１時間加熱して加水分解を行った。溶解していない繭の残渣を除去し、抽出液を室温で放置、冷却した後、０．２μｍのフィルターでろ過した。これをゲルろ過クロマトグラフィーにかけて精製、凍結乾燥し、セリシン加水分解物固体を得た。このセリシン加水分解物のＧＰＣ分析を行ったところ、重量平均分子量は８００００であることがわかった。
【００２４】
比較例３
繭１００ｇを蒸留水３０００ｇに加え、還流器を付けた５Ｌ容量のナスフラスコ内で、マントルヒーターを用いて常圧９５℃で１時間加熱した。次にクエン酸を０．１ｍｍｏｌ／Ｌとなるように加え、さらに常圧９５℃２時間加熱して加水分解を行った。溶解していない繭の残渣を除去し、抽出液を室温で放置、冷却した後、０．２μｍのフィルターでろ過した。これをゲルろ過クロマトグラフィーにかけて精製、凍結乾燥し、セリシン加水分解物固体を得た。このセリシン加水分解物のＧＰＣ分析を行ったところ、重量平均分子量は５００００であることがわかった。
【００２５】
油脂の酸化には、多数の反応段階があり、それぞれについての抗酸化試験が確立されている。ここでは、代表的な２つの試験法にて抗酸化性の確認を行った。
【００２６】
抗酸化試験１　ＴＢＡ法
（１）ラット脳ホモジネート液の調製
冷凍保存したラット脳１ｇに０．０７５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を９ｍｌ加え、氷冷下でホモジナイズした（以下、ホモジネート液）
【００２７】
（２）抗酸化試験
このホモジネート液０．５ｍｌに、最終０．１％となるよう調製した実施例１のセリシン加水分解物を含む０．０７５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を３．５ｍｌ加え、３７℃で２時間インキュベートした。比較として、比較例１〜３のセリシン加水分解物、およびビタミンＣをそれぞれ最終０．１％となるよう含む０．０７５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）３．５ｍｌを、同様にホモジネート液０．５ｍｌに加え３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション直前と２時間インキュベーション後の液を、それぞれ０．５ｍｌ採取し、ＴＢＡ（Ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ　ａｃｉｄ）法によって、過酸化脂質の指標であるＴＢＡＲＳ（Ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ　ａｃｉｄ　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ）を測定した。
【００２８】
（３）ＴＢＡ法
試料０．５ｍｌに８％トリクロル酢酸溶液２．５ｍｌと０．６７％チオバルビツール酸溶液２．０ｍｌを加え、十分混和した後、沸騰水浴中で１５分加熱した。ついで、２０００Ｇで１０分間遠心分離した後、その上清の５３５ｎｍにおける吸光度を測定し、ＴＢＡＲＳ量を求めた。標準として、１，１，３，３−テトラエトキシプロパンを用いた。
【００２９】
各試料の抗酸化能は、各試料を添加したときのＴＢＡＲＳ量と、添加しないときのＴＢＡＲＳ量から次式１によって計算し、過酸化脂質生成量として示した。試験は３回繰り返し、得られた値の平均値で結果を示した。
式１　過酸化脂質生成量（コントロールを１００としたときの相対値）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ；過酸化脂質抑制剤を添加したときのＴＢＡＲＳ量の増加値
Ｂ；過酸化脂質抑制剤を添加しないときのＴＢＡＲＳ量の増加値
（試料）　　　　　　　　　　　　　　　（過酸化脂質生成量）
実施例１）セリシン加水分解物　　　　　　　　０．９
比較例１）セリシン加水分解物　　　　　　　　　２５
比較例２）セリシン加水分解物　　　　　　　　　２１
比較例３）セリシン加水分解物　　　　　　　　　１６
ビタミンＣ　　　　　　　　　　　　　　　　　　２２
無添加（コントロール）　　　　　　　　　　　１００
実施例１のセリシン加水分解物の過酸化脂質生成量は、比較例１〜３のセリシン加水分解物、およびビタミンＣに比べて、１０分の１以下であり、優れた抗酸化能を示すことが確認できた。
【００３０】
抗酸化試験２　共役ジエンの定量による方法
（１）ラット脳ホモジネート液の調製
抗酸化試験１と同様に行った。
（２）抗酸化試験
ホモジネート液０．５ｍｌに、最終０．１％となるよう調製した実施例１のセリシン加水分解物を含む０．０７５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を３．５ｍｌ加え、３７℃で２時間インキュベートした。比較として、比較例１〜３のセリシン加水分解物、およびビタミンＣそれぞれを最終０．１％となるよう含む０．０７５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）３．５ｍｌを、同様にホモジネート液０．５ｍｌに加え３７℃で２時間インキュベートした。２時間インキュベーション後の液を、それぞれ０．５ｍｌ採取し、これに２．５ｍｌのエチルエーテル／エタノール（１：３）を加えて、１分間激しく振とうした。ついで、１０００Ｇで５分間遠心分離し、上清の２３４ｎｍにおける吸光度＝共役ジエン量を測定して過酸化脂質生成量の指標とした。
【００３１】
各試料の抗酸化能は、各試料を添加したときの共役ジエン量と、添加しないときの共役ジエン量から次式２によって計算し、過酸化脂質生成量として示した。試験は３回繰り返し、得られた値の平均値で結果を示した。
式２　過酸化脂質生成量（コントロールを１００としたときの相対値）＝Ｃ／Ｄ×１００
Ｃ；過酸化脂質抑制剤を添加したときの共役ジエン量の増加値
Ｄ；過酸化脂質抑制剤を添加しないときの共役ジエン量の増加値
（試料）　　　　　　　　　　　　　　　（過酸化脂質生成量）
実施例１）セリシン加水分解物　　　　　　　　１．５
比較例１）セリシン加水分解物　　　　　　　　　２９
比較例２）セリシン加水分解物　　　　　　　　　３０
比較例３）セリシン加水分解物　　　　　　　　　３０
ビタミンＣ　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５
無添加（コントロール）　　　　　　　　　　　１００
抗酸化試験１と同様、実施例１のセリシン加水分解物の過酸化脂質生成量は、比較例１〜３のセリシン加水分解物、およびビタミンＣに比べて、１０分の１以下であり、優れた抗酸化能を示すことが確認できた。
異なる両者指標において、実施例１のセリシン加水分解物は、強力な抗酸化能を示すことが確認された。抗酸化試験１〜２にて、同様な傾向であったことから、より信頼性の高いものであり、特定の実験系でのみ見られる現象ではないことを示唆している。
【００３２】
【発明の効果】
本発明のセリシン加水分解物は、食品、化粧品、医薬品などへ添加した場合、従来のセリシン加水分解物に比べ、抗酸化能効果が１０倍以上であり、また、同じ効果を期待するのであれば、添加量は１０分の１以下ですむ。加水分解物であるので親水性が高く冷水にも容易に溶解し、水溶液がゲル化せず、低粘度で取り扱いが容易である。また、特有の風味や色がなく、食品、化粧品、医薬部外品、医薬品などに添加しても官能特性に影響を与えず、かつ他の原料との混合性が良好である。