(57)【要約】【課題】シアンヒドリン化合物を原料として効率良く対応するヒドロキシカルボン酸を得る。【解決手段】本発明に係るヒドロキシカルボン酸の製造方法は、シアンヒドリン化合物と、ニトリルヒドラターゼ活性を示す微生物および／またはその処理物とを、０℃〜３０℃の温度範囲で接触させてアミドを得る水和工程、および前記水和工程によって得られたアミドと、アミダーゼ活性を示す微生物および／またはその処理物とを、３０℃を超えて５０℃以下の温度範囲で接触させてカルボン酸を得る加水分解工程を含むことを特徴としている。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シアンヒドリン化合物と、ニトリルヒドラターゼ活性を示す微生物および／またはその処理物とを、０℃〜３０℃の温度範囲で接触させてアミドを得る水和工程、および
前記水和工程によって得られたアミドと、アミダーゼ活性を示す微生物および／またはその処理物とを、３０℃を超えて５０℃以下の温度範囲で接触させてカルボン酸を得る加水分解工程を含むことを特徴とするヒドロキシカルボン酸の製造方法。
【請求項２】
前記水和工程における温度が０〜２５℃の範囲にあり、前記加水分解工程における温度が３５〜５０℃の範囲にあることを特徴とする請求項１に記載のヒドロキシカルボン酸の製造方法。
【請求項３】
前記ニトリルヒドラターゼ活性を示す微生物および前記アミダーゼ活性を示す微生物が、ロドコッカス属に属する微生物であることを特徴とする請求項１または２に記載のヒドロキシカルボン酸の製造方法。
【請求項４】
前記シアンヒドリン化合物が、α−ヒドロキシニトリル化合物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のヒドロキシカルボン酸の製造方法。
【請求項５】
前記シアンヒドリン化合物が、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタンニトリルであることを特徴とする請求項３または４に記載のヒドロキシカルボン酸の製造方法。
【請求項６】
前記ニトリルヒドラターゼ活性を示す微生物および／または前記アミダーゼ活性を示す微生物が、ニトリルおよび／またはアミドを誘導源として培養された微生物であることを特徴とする請求項１〜５いずれかに記載のヒドロキシカルボン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はシアンヒドリン化合物を原料としてヒドロキシカルボン酸を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
シアンヒドリンを加水分解してヒドロキシカルボン酸を製造する場合、工業的には加水分解触媒として硫酸を使用する方法が知られている。一方、ニトリルを微生物の作用により加水分解して対応するカルボン酸に変換する方法として、例えば特公昭５８−１５１２０号公報には、バチルス（バチラス）属、バクテリジウム属、ミクロコッカス属またはブレビバクテリウム属に属する微生物により、ラクトニトリル及びヒドロキシアセトニトリルから対応するカルボン酸を生成させることが記載されている。
【０００３】
また、ジャーナル　オブファーメンテンション　テクノロジー、第５１巻、第３９３頁（１９７３年）（Ｊ．　Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．　５１，　３９３（１９７３））には、トルロプシス属酵母により、α−ヒドロキシニトリルから光学活性なＬ−α−ヒドロキシバレリアン酸およびＬ−α−ヒドロキシイソカプロン酸を生産させる方法が記載されている。
【０００４】
さらに、特開昭６１−５６０８６号公報には、コリネバクテリウム属に属する微生物を用いて、グリコロニトリル、ラクトニトリルおよびアセトンシアンヒドリンから対応するα−ヒドロキシ酸を生成させる方法が開示され、特開平２−８４１９８号公報には、アルカリゲネス属、シュードモナス属、ロドシュードモナス属、コリネバクテリウム属、アシネトバクター属、バチルス属、マイコバクテリウム属、ロドコッカス属またはキャンディダ属に属する微生物を用いて、α−ヒドロキシニトリルから対応する光学活性なα−ヒドロキシ酸を生成させる方法が開示され、特開平４−４０８９８号公報には、カセオバクター属、シュードモナス属、アルカリゲネス属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ノカルジア属、ロドコッカス属またはアースロバクター属に属する微生物を用いて、α−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルをα−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸に変換する方法が開示されている。
【０００５】
しかし、加水分解触媒として硫酸を用いて、ニトリル化合物から対応するカルボン酸を製造する方法では、下記式に示されるように、ニトリル化合物と硫酸とが反応し、目的物であるカルボン酸と等モル量の重硫酸アンモニウムが副生する。
ＲＣＮ＋Ｈ２ＳＯ４＋Ｈ２Ｏ→ＲＣＯＮＨ２・Ｈ２ＳＯ４
ＲＣＯＮＨ２・Ｈ２ＳＯ４＋Ｈ２Ｏ→ＲＣＯＯＨ＋ＮＨ４ＨＳＯ４
【０００６】
副生した重硫酸アンモニウムは工業排水として河川等に廃棄されるが、この排水は環境影響の観点から好ましいとはいえない。また、この方法では、有用なアンモニアや硫酸が、回収されることなく廃棄されており、さらに回収するにしても煩雑な工程を要するため、製造コストが増大する上に資源の有効利用の観点からも問題がある。
【０００７】
また、微生物を用いてニトリル化合物から対応するカルボン酸を製造する方法では、ニトリラーゼ活性を有する微生物を用いる場合を除き、通常、ニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性の両方の活性を有する微生物を用いて、一工程でニトリル化合物からカルボン酸を生産している。しかしながら、この方法では、カルボン酸の収率が高くなりにくいという問題があった。
【０００８】
さらに、原料となるシアンヒドリン化合物は、不安定な化合物であるため、温度が高くなると分解が進み、分解により生成するシアンあるいはアルデヒドが、ニトリルヒドラターゼを阻害する傾向があるという問題があった。
ＷＯ９９５５７１９号には、細胞内にニトリルヒドラターゼとアミダーゼとが共存している、Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ　Ｂａｃｉｌｌｕｓという微生物を用い、２０〜７０℃の範囲内でニトリル化合物をアミド化合物に変換することが記載されている。具体的には、シアンヒドリン化合物を５０℃という高温でＴｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ　Ｂａｃｉｌｌｕｓと接触させることが記載（ＷＯ９９５５７１９号中実施例７）されている。しかしながら、具体的に、このような条件下で、不安定なシアンヒドリン化合物からアミド化合物を有為な収率で得ることができたのかどうかについては、全く記載がない。
【０００９】
また、ＷＯ９７１２９６４号には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＮＲＲＬ−１８６６８のニトリルヒドラターゼとＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓＢ２３のアミダーゼ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで共発現した例が記載されている。ここでは、室温で反応を行っているが、シアンヒドリン化合物を原料とした具体的な例は記載がなく、たとえばアリル−２−アルカンニトリルから対応するアミドの生産などしか例示されておらず、更に生産量も非常に低い。
【００１０】
一方、ニトリラーゼはアンモニアに対する感受性が比較的高いが、通常、ニトリル化合物の加水分解には、必ずアンモニアの生成を伴うことから、アンモニア感受性の高いニトリラーゼを用いる限り、ニトリルからカルボン酸の産生量は制限されてしまうという問題があった。したがって、アンモニア耐性のニトリラーゼの提供が望まれており、一部にそのような性質のニトリラーゼも知られている（特願平１１−２２９１０９号）が、充分に生産性のレベルが高いとは言えない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、効率の良いヒドロキシカルボン酸の製造方法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記目的を達成するため鋭意検討した結果、特定の条件下で、微生物由来のニトリルヒドラターゼ活性を利用した水和工程と、微生物由来のアミダーゼ活性を利用した加水分解工程とを行うことによって、シアンヒドリン化合物から生産性良くヒドロキシカルボン酸を製造できることを見いだし、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明のヒドロキシカルボン酸の製造方法は、たとえば下記のとおりである。
本発明に係るヒドロキシカルボン酸の製造方法は、シアンヒドリン化合物と、ニトリルヒドラターゼ活性を示す微生物および／またはその処理物とを、０℃〜３０℃の温度範囲で接触させてアミドを得る水和工程、および
前記水和工程によって得られたアミドと、アミダーゼ活性を示す微生物および／またはその処理物とを、３０℃を超えて５０℃以下の温度範囲で接触させてカルボン酸を得る加水分解工程を含むことを特徴としている。
前記水和工程における温度は０〜２５℃の範囲にあり、前記加水分解工程における温度は３５〜５０℃の範囲にあることが好ましい。
前記ニトリルヒドラターゼ活性を示す微生物および前記アミダーゼ活性を示す微生物は、ロドコッカス属に属する微生物であることが好ましい。
前記シアンヒドリン化合物は、α−ヒドロキシニトリル化合物であることが好ましく、さらに２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタンニトリルであることが好ましい。
前記ニトリルヒドラターゼ活性を示す微生物および／または前記アミダーゼ活性を示す微生物は、ニトリルおよび／またはアミドを誘導源として培養された微生物であることが好ましい。
【００１４】
【発明の実施の形態】
＜シアンヒドリン化合物＞
本発明において原料として用いられるシアンヒドリン化合物は、水溶液中で微生物反応に供する点で、水溶性を示すシアンヒドリン化合物が好ましく、対応するヒドロキシカルボン酸の塩が水溶性となる化合物であることがさらに好ましい。
【００１５】
このような点からシアンヒドリン化合物の全炭素数は、好ましくは２〜１８程度、さらに好ましくは２〜１２、特に好ましくは２〜８程度であることが望ましい。
【００１６】
前記水溶性を示すシアンヒドリン化合物としては、たとえば、α−シアンヒドリン化合物、β−シアンヒドリン化合物、γ−シアンヒドリン化合物などが挙げられる。これらのうちでは、α−シアンヒドリン化合物を好ましく用いることができる。
【００１７】
前記α−シアンヒドリン化合物としては、例えば、下記式（Ｉａ）で表わされる化合物を例示することができる。
【化１】
2004081169.tif 000002
上記式（Ｉａ）中、Ｒ１とＲ２とは、互いに同一でも異なっていてもよく、それぞれ水素原子、又は置換基を有していてもよい炭化水素基を示し、Ｒ１　とＲ２とは隣接する炭素原子と共に環を形成していてもよい。但し、Ｒ１とＲ２とは同時に水素原子ではない。
【００１８】
前記Ｒ１、Ｒ２で示される炭化水素基としては、たとえば、脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基または芳香族炭化水素基などが挙げられる。
【００１９】
脂肪族炭化水素基としては、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基などが挙げられる。脂環式炭化水素基としてはシクロアルキル基などが挙げられる。芳香族炭化水素基としては、アリール基、アラルキル基などが挙げられる。
【００２０】
これらの炭化水素基は置換基を有していてもよく、置換基としては、たとえば、アルキル基、アルコキシ基、アシル基、アリール基、アリールオキシ基、塩素、臭素等のハロゲン原子、ヒドロキシ基、アミノ基、ニトロ基、チオール基などが挙げられる。
【００２１】
さらに、Ｒ１　、Ｒ２の炭化水素基としては、たとえば、炭素数が好ましくは１〜１２、さらに好ましくは１〜６程度のアルキル基；炭素数が好ましくは２〜１２程度、さらに好ましくは２〜６程度のアルケニル基；炭素数が好ましくは２〜１２程度、さらに好ましくは２〜６程度のアルキニル基；炭素数が好ましくは３〜１０程度、さらに好ましくは３〜６程度のシクロアルキル基；炭素数が好ましくは６〜１４程度、さらに好ましくは６〜１０程度のアリール基；フェニルメチル、２−フェニルエチル、１−フェニルエチル、３−フェニルプロピル、４−フェニルブチル基などの炭素数が好ましくは７〜１０程度のアラルキル基などが挙げられる。
【００２２】
Ｒ１とＲ２とが隣接する炭素原子と共に環を形成する場合の前記環としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル環などの炭素数３〜８程度のシクロアルカン環などが挙げられる。
【００２３】
このようなＲ１　、Ｒ２を有するシアンヒドリン化合物としては、具体的には、前記α−シアンヒドリン化合物としては、たとえば、
ヒドロキシアセトニトリル、
ラクトニトリル、
アセトンシアンヒドリン、
２−ヒドロキシブタンニトリル、
２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタンニトリル、
２−ヒドロキシ−２−メチルブタンニトリル、
２−ヒドロキシ−３−メチルブタンニトリル、
２−ヒドロキシ−３−ブテンニトリル、
２−ヒドロキシペンタンニトリル、
２−ヒドロキシヘキサンニトリル、
２−ヒドロキシオクタンニトリルなどの脂肪族α−シアンヒドリン；
２−ヒドロキシ−シクロヘキサンアセトニトリル、シクロペンタノンシアンヒドリン、シクロヘキサノンシアンヒドリンなどの脂環式α−シアンヒドリン；
マンデロニトリル、２−ヒドロキシ−３−フェニルブタンニトリルなどの芳香族α−シアンヒドリンなどが挙げられる。
【００２４】
これらのα−シアンヒドリン化合物のうちでは、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタンニトリル、ラクトニトリル、マンデロニトリルなどを好ましく用いることができる。
【００２５】
前記β−シアンヒドリン化合物としては、例えば、３−ヒドロキシプロパンニトリル、３−ヒドロキシブタンニトリル、３−ヒドロキシヘキサンニトリル、２−ヒドロキシシクロヘキサンカルボニトリル、３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルなどが挙げられる。
【００２６】
前記γ−シアンヒドリン化合物としては、例えば、４−ヒドロキシブタンニトリル、４−ヒドロキシヘキサンニトリル、３−ヒドロキシヘキサンカルボニトリル、４−ヒドロキシ−４−フェニルブタンニトリルなどが挙げられる。
【００２７】
これらのシアンヒドリン化合物は公知の方法で得ることができる。例えば、脂肪族シアンヒドリン化合物または脂環式シアンヒドリン化合物は、ハロゲン化アリル又は硫酸ジアルキルにシアン化カリウムなどのシアン化アルカリ等を反応させることにより製造できる。芳香族シアンヒドリン化合物は、例えば、アミンをジアゾ化した後、シアン化銅（Ｉ）を反応させる方法などにより製造することができる。
【００２８】
シアンヒドリン化合物のうち、特に、α−シアンヒドリン化合物は、アルデヒド又はケトンにシアン化水素を作用させる方法、あるいはアルデヒド又はケトンと亜硫酸水素ナトリウムとの付加物にシアン化カリウムなどのシアン化アルカリ等を作用させる方法などにより製造できる。また、β−シアンヒドリン化合物は、エポキシドとシアン化水素とを反応させることによって製造できる。
【００２９】
＜微生物およびその処理物＞
本発明で用いられる微生物は、ニトリルヒドラターゼ活性を示す微生物及びアミダーゼ活性を示す微生物である。
【００３０】
ここで、ニトリルヒドラターゼ活性とは、ニトリル化合物のニトリル基に作用し、ニトリル基を中和してアミド基とする活性をいう。また、アミダーゼ活性とは、アミド化合物のアミド基に作用し、アミド基を加水分解してカルボキシル基とする活性をいう。
【００３１】
本発明で用いることのできるニトリルヒドラターゼ活性を示す微生物としては、たとえば、ミクロコッカス属：ミクロコッカス　エスピー（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．）Ａ１１１（ＦＥＲＭ　Ｐ−２７２０）など、
バクテリヂウム属：バクテリヂウム　エスピー（Ｂａｃｔｅｒｄｉｕｍ　ｓｐ．）Ｒ３４１（ＦＥＲＭ　Ｐ−２７１９）、バクテリヂウム　エスピー（Ｂａｃｔｅｒｄｉｕｍ　ｓｐ．）Ｒ３４０（ＦＥＲＭ　Ｐ−２７１８）など、
【００３２】
バチラス属：バチラス　エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）Ｒ３３２（ＦＥＲＭＰ−２７１７）、バチラス　スミシー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｍｉｔｈｉｉ）ＳＣ−Ｊ０５−１（ＦＥＲＭ　Ｐ−１４０３７，ＦＥＲＭ　ＢＰ−４９３５）など、
ミクロバクテリウム属：ミクロバクテリウム　フラバム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌｏｖｕｍ）ＩＡＭ　１６４２など、
【００３３】
シュードモナス属：シュードモナス　エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）ＳＫ８７（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１３１１）、シュードモナス　クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）Ｂ２３（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１８７）、シュードモナス　エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）ＰＳ１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１８８）、シュードモナスエスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）ＭＹ−１（ＦＥＲＭ　Ｐ−９１７４）など、
アルカリゲネス属：アルカリゲネス　エスピー（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｓｐ．）ＢＣ１６−２（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１２７６）など、
【００３４】
コリネバクテリウム属：コリネバクテリウム　ニトリロフィラス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｉｔｒｉｌｏｐｈｉｌｕｓ）ＡＴＣＣ　２１４１９、コリネバクテリウム　エスピー（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ．）Ｎ−７７１（ＦＥＲＭ　Ｐ−４４４５）、コリネバクテリウム　エスピー（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ．）Ｎ−７７４（ＦＥＲＭ　Ｐ−４４４６）など、
ブレビバクテリウム属：ブレビバクテリウム　インペリアル（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｍｐｅｒｉａｌｅ）Ｂ−２２２（ＦＥＲＭ　Ｐ−２７２１）、ブレビバクテリウムエスピー（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ．）Ｒ３１２（ＦＥＲＭ　Ｐ−２７２２）、ブレビバクテリウム　エスピー（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ．）Ｃ２１１（ＦＥＲＭ　Ｐ−２７２３）など、
【００３５】
ノカルジア属：ノカルジア　エスピー（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ．）Ｎ−７７５（ＦＥＲＭ　Ｐ−４４４７）など、
ロドコッカス属：ロドコッカス　ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＡＴＣＣ　３３２７８、ロドコッカス　ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１４７８）、ロドコッカス　ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＩＦＭ　１５３、ロドコッカス　ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＤＳＭ４３１９８、ロドコッカス　エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＩＦＯ　１２３２０、ロドコッカス　エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＩＦＭ　１５５、ロドコッカス　エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＫ３１３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１０４０）、ロドコッカス　エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．）ｓ−６（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６８７）、ロドコッカス　エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．）ＡＫ　３３（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１０４７）、ロドコッカス　エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．）Ｃｒ４（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６５９６）、ロドコッカスルブロペルチンクタス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｕｂｒｏｐｅｒｔｉｎｃｔｕｓ）ＪＣＭ　３２０４など（３０）、
【００３６】
アースロバクター属：アースロバクター　エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．）ＨＲ１（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１３０１）、アースロバクター　グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｓｆｏｒｍｉｓ）ＩＦＯ　１２１３８、アースロバクター　オウレセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）ＩＡＭ　１２３４０など、
アグロバクテリウム属：アグロバクテリウム　ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＳＣ−Ｃ１５−１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−３８４３）など、
【００３７】
アスペルギルス属：アスペルギルス　ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇａｒ）ＪＣＭ１９２５，２２６１など、
ペニシリウム属：ペニシリウム　クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＩＦＯ　５４７３など、
【００３８】
コクリオボラス属：コクリオボラス　ミヤビアヌス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ　ｍｉｙａｂｅａｎｕｓ）ＯＵＴ　２０７４など、
フザリウム属：フザリウム　エスピー（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｓｐ．）ＭＹ−３（ＦＥＲＭ　Ｐ−９１８８）など、
【００３９】
エンテロバクター属：エンテロバクター　エスピー（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．）ＭＣ１２７０７（ＦＥＲＭ　Ｐ−１２８０１）など、
キサントバクター属：キサントバクター　フラブス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ　ｆｌａｖｕｓ）ＪＣＭ１２０４など、
【００４０】
エルウィニア属：エルウィニア　ニグリフルエンス（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｎｉｇｒｉｆｌｕｅｎｓ）ＭＡＦＦ０３−０１４３５など、
シトロバクター属：シトロバクター　フロンディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ）ＭＣ１２６１５（ＦＥＲＭ　Ｐ−１２３９０）など、
【００４１】
エアロモナス属：エアロモナス　エスピー（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）ＭＣ１２６１５（ＦＥＲＭ　Ｐ−１２３９０）など、
ゴルドナ属：ゴルドナ　ルブロペルチンクタス（Ｇｏｒｄｏｎａ　ｒｕｂｒｏｐｅｒｔｉｎｃｔｕｓ）ＪＣＭ３２０４などが挙げられる。
【００４２】
ニトリルヒドラターゼ活性を示すこれらの微生物のうちでは、ロドコッカス属、シュードモナス属、バチラス属に属する微生物を用いることが好ましく、ロドコッカス属に属する微生物を用いることがさらに好ましい。特に、ロドコッカス属に属する微生物は、シアンヒドリン化合物として、好ましくはα−ヒドロキシニトリル化合物、より好ましくは２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタンニトリルを用いる場合に、シアンヒドリン化合物からアミドの生成に関し、後述する水和工程における温度との関連において優れた生産性を発揮することができる。
なおロドコッカス属に属する微生物のうちでは、ロドコッカス　ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＤＳＭ４３１９８、ロドコッカス　ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１４７８）、ロドコッカス　エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．）Ｃｒ４（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６５９６）を用いることが好ましい。
【００４３】
アミダーゼ活性を示す微生物としては、たとえば、
ロドコッカス属：ロドコッカス　ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１４７８）、ロドコッカス　ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＤＳＭ４３１９８　など、
【００４４】
シュードモナス属：シュードモナス　クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）Ｂ２３（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１８７）などが挙げられる。
【００４５】
アミダーゼ活性を示すこれらの微生物のうちでは、ロドコッカス属に属する微生物を用いることが好ましい。特に、ロドコッカス属に属する微生物は、シアンヒドリン化合物として、好ましくはα−ヒドロキシニトリル化合物、より好ましくは２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタンニトリル、ラクトニトリル、マンデロニトリル、特に好ましくは２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタンニトリルを用いる場合に、これらのシアンヒドリン化合物に対応するアミドからのカルボン酸生成に関し、後述する加水分解工程における温度との関連において優れた生産性を発揮することができる。
なおロドコッカス属に属する微生物のうちでは、ロドコッカス　ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＤＳＭ４３１９８を用いることが好ましい。
【００４６】
なお、ＩＦＯ番号の付された微生物は（財）発酵研究所（ＩＦＯ）から、ＡＴＣＣ番号の付された微生物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）から、ＩＡＭ番号の付された微生物は東京大学応用微生物研究所（ＩＡＭ）から、ＩＦＭ番号の付された微生物は千葉大学生物活性研究所（ＩＦＭ）から、ＪＣＭ番号の付された微生物は理化学研究所微生物系保存施設からそれぞれ入手できる。また、ＦＥＲＭ番号の付された微生物は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（旧工業技術院生命工学工業技術研究所）に寄託されている。
【００４７】
本発明では、これらの微生物のうち、少なくとも１種を用いることができる。また、本発明では、上記微生物（菌株）より誘導された変異株（突然変異体）、細胞融合株、及び遺伝子組み替え体等を用いることもできる。
【００４８】
このような前記ニトリルヒドラターゼ活性を示す微生物および／またはその処理物と、前記アミダーゼ活性を示す微生物および／またはその処理物とは、その組み合わせは特に限定されず、両者が異なっていても、同じであってもよい。
【００４９】
前記微生物は、通常、培地で培養してシアンヒドリン化合物との反応に供される。微生物を培養するための培地は、微生物が増殖し得る培地であれば特に制限はない。培地としては、通常、炭素源、窒素源、その他の養分などを含む液体培地が使用される。
【００５０】
培地の炭素源としては、例えば、グルコース、シュクロース、デンプンなどの糖類；ソルビトール、メタノール、エタノール、グリセロールなどのアルコール類；フマル酸、クエン酸、酢酸などの有機酸類及びその塩類；パラフィンなどの炭化水素類；これらの混合物などが挙げられる。
【００５１】
培地の窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機酸のアンモニウム塩；フマル酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム塩；肉エキス、酵母エキス、尿素などの有機又は無機含窒素化合物；これらの混合物などが挙げられる。
【００５２】
また培地には、塩化マグネシウム、塩化第二鉄などの無機塩類；微量金属塩；ビタミン類などの通常の培養に用いられる栄養源を適宜添加しても良い。また、必要に応じて、微生物の増殖を促進する因子、培地のｐＨ保持に有効な緩衝物質、反応生成物であるアミド又はカルボン酸の生成能力を高める因子（誘導源）などを添加してもよい。
【００５３】
前記誘導源としては、例えば、ニトリル及びアミドから選択された少なくとも１種の化合物などを使用できる。好ましい誘導源としては、たとえばイソバレロニトリル、イソブチロニトリルなどの炭素数が好ましくは２〜８程度、さらに好ましくは４〜６程度の脂肪族ニトリル；ベンゾニトリルなどの炭素数が好ましくは７〜１１の芳香族ニトリル；アセトアミド、プロピオアミドなどの炭素数が好ましくは２〜８程度、さらに好ましくは２〜６程度の脂肪族アミド；ベンズアミドなどの炭素数が好ましくは７〜１１の芳香族アミドなどが挙げられる。これらのうちでは、誘導源としては、イソバレロニトリルなどを好ましく用いることができる。
【００５４】
微生物の培養は、生育に適した条件下、例えば、培地のｐＨ２〜１２、好ましくはｐＨ４〜１０、温度５〜５０℃、好ましくは２０〜５０℃で行うことができる。微生物の培養は、微生物の種類にもよるが、嫌気性又は好気性条件下の何れで行うことができるが、好気性条件下で行うことがより好ましい。培養時間は、例えば、１〜２４０時間程度、好ましくは５〜１２０時間程度、さらに好ましくは１２〜７２時間程度である。
【００５５】
本発明で用いられる微生物の処理物とは、微生物に種々の処理を施したもの、例えば、微生物の破砕物、凍結乾燥物、微生物からの抽出物及び酵素（粗酵素又は精製酵素）などが含まれる。
【００５６】
前記抽出物は、超音波法、凍結融解法、リゾチーム法などの慣用の方法を利用することにより得ることができる。また、酵素も慣用の方法により得ることができる。
【００５７】
例えば、培養液から遠心分離などにより分離した微生物を、水などで洗浄した後、ｐＨ値が酵素の安定領域にある緩衝液に懸濁し、低温下にフレンチプレスまたは超音波等で処理して微生物を破砕する。そして、遠心分離などにより微生物の破片を分離除去し、得られた微生物抽出液を常法により硫安分割し、透析して粗酵素液を得る。この粗酵素液を、例えばセファデックスＧ−２００などを用いたカラムクロマトグラフィーに付す方法等により精製して精製酵素を得ることができる。
【００５８】
また、微生物の処理物として、界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒によって、細胞膜の透過性を変化させた微生物などを用いることもできる。
【００５９】
微生物またはその処理物は、ポリアクリルアミドゲル法などの慣用の方法により固定化し、例えば、固定化微生物、固定化酵素として用いてもよい。
【００６０】
＜水和工程および加水分解工程＞
本発明に係るヒドロキシカルボン酸の製造方法では、シアンヒドリン化合物と、ニトリルヒドラターゼ活性を示す微生物および／またはその処理物とを、０℃〜３０℃の温度範囲で接触させてアミドを得る水和工程、および
前記水和工程によって得られたアミドと、アミダーゼ活性を示す微生物および／またはその処理物とを、３０℃を超えて５０℃以下の温度範囲で接触させてカルボン酸を得る加水分解工程を含んでいる。
【００６１】
水和工程
本発明における水和工程おいて、シアンヒドリン化合物（以下「基質」ということがある）の水和反応は、前記ニトリルヒドラターゼ活性を示す微生物および／またはその処理物を、水性媒体中でシアンヒドリン化合物と接触させることにより実施することができる。なお、本発明において水和とは、ニトリル基に水分子が付加する反応をいう。この結果、シアンヒドリン化合物に対応するアミドが生成する。
【００６２】
水性媒体としては、たとえば、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液などの中性付近に緩衝能を有する緩衝液が挙げられる。また塩酸とアルカリとを用いて反応中のｐＨ変化を好ましい範囲にとどめることが可能であれば、緩衝液を用いなくてもよい。
【００６３】
また、シアンヒドリン化合物の溶解性を高め、反応を円滑に進行させるため、系内に有機溶媒を添加することもできる。したがって、たとえば、水性媒体中、水性媒体と水可溶性の有機溶媒との混合系中、あるいは水性媒体と水不溶性の有機溶媒との２相系中において、シアンヒドリン化合物と、前記ニトリルヒドラターゼ活性を示す微生物および／またはその処理物とを接触させることができる。
【００６４】
水に溶解しにくい有機溶媒としては、たとえば、酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル；ｎ−ヘキサン、イソオクタン、トルエンなどの炭化水素；クロロホルムなどハロゲン化合物などを用いることができる。また、メタノール、エタノールなどのアルコール；アセトンなどのケトン；ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル等の有機溶媒と水性媒体の混合系とする有機溶媒を用いることもできる。
【００６５】
シアンヒドリン化合物の水性媒体に対する溶解度が著しく小さい場合には、水性媒体に界面活性剤を加えることもできる。界面活性剤としては、０．１〜５．０重量％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、あるいはＴｗｅｅｎ６０などを用いることができる。
【００６６】
なお、水性媒体または水性媒体と有機溶媒、さらには界面活性剤などとの混合液（以下「反応溶媒」ということがある）には、コバルトイオン、ニッケルイオンなどの２価の金属イオンを共存させてもよい。このような２価の金属イオンを共存させることにより、ニトリルヒドラターゼ活性の低下を抑制することができる。
【００６７】
本発明において、シアンヒドリンを対応するアミドに変換する水和工程で用いる水性媒体における水の量は、例えば、シアンヒドリン１モルに対して、アミドを、好ましくは０．５モル以上（例えば、０．５〜３００モル程度）、さらに好ましくは１モル以上（例えば、１〜１５０モル程度）であることが望ましい。
【００６８】
基質であるシアンヒドリン化合物の濃度は、反応溶媒の重量に対して、例えば好ましくは０．０１〜８０重量％程度、さらに好ましくは０．０５〜５０重量％程度、特に好ましくは０．１〜２０重量％程度であることが望ましい。
【００６９】
前記ニトリルヒドラターゼ活性を示す微生物および／またはその処理物の濃度は、微生物の乾燥重量に換算して、反応溶媒に対して、好ましくは０．０１〜７０重量％、さらに好ましくは０．１〜３０重量％程度であることが望ましい。
【００７０】
反応溶媒のｐＨは、例えば、好ましくは３〜１２、さらに好ましくは６〜１０程度であることが望ましい。反応時間は例えば、好ましくは５分〜１００時間程度であればよい。
【００７１】
水和工程においては、シアンヒドリン化合物とニトリルヒドラターゼ活性を示す微生物および／またはその処理物とを接触させる温度は、０〜３０℃、好ましくは０〜２５℃、さらに好ましくは５〜２５℃、特に好ましくは１０〜２０℃であることが望ましい。このような温度範囲とすることにより、シアンヒドリン化合物の分解を抑制することができ、また、上記範囲の温度に設定することにより、工業的レベルにおいても収率よく対応するアミドを得ることができる。
【００７２】
微生物やその処理物などは、反応溶媒に溶解、あるいは分散させることにより、基質であるシアンヒドリン化合物と接触させることができる。あるいは、化学結合や包括などの手法によって固定化した処理物を用いることもできる。更に、基質は透過できるが、酵素分子や微生物の透過を制限する多孔質膜で基質溶液と微生物中の酵素を隔てた状態で接触させることもできる。
【００７３】
反応形式としては、固定床式、流動床式等の何れであってもよく、また回分式、流通式の何れの方式で行うこともできる。生成物濃度を高めるため、例えば反応混合液循環ラインなどを備えることにより、得られた反応混合液を反応系にリサイクルすることもできる。
【００７４】
水和反応後の反応溶媒、生成物であるアミド、さらには副生物などを含有する反応混合液は、通常、遠心分離、濾過などの慣用の分離手段により、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物又はその処理物を除去して、次工程に供してもよい。この場合、加水分解工程において新たにアミダーゼ活性を有する微生物またはその処理物を添加することができる。
また、たとえば、ニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性をともに有する微生物またはその処理物を用いる場合、水和工程をたとえば上記温度範囲で行った後、微生物またはその処理物を除去することなく、加水分解工程における温度をたとえば後述する特定の温度範囲に上昇させて該加水分解工程を行うこともできる。
さらに、水和工程と加水分解工程とで、異なる微生物またはその処理物を用いる場合でも、水和工程で微生物またはその処理物を除去せずに、次の加水分解工程でさらに微生物を添加することもできる。
【００７５】
水和工程で生成したアミドを含む反応混合液は、必要に応じてアミドを抽出するアミド抽出工程に供される。アミドの抽出は、慣用の方法、例えば、前記水和工程で得られた反応混合液に有機溶媒を加えて混合又は振盪することにより行うことができる。抽出は、回分式、連続式の何れの方式で行うこともできる。アミドを含む有機層は、そのまま、又は適当に濃度を調整した後、加水分解工程に供給することができる。
【００７６】
後述するように有機溶媒の存在下で加水分解を行うと、反応が円滑に進行して収率よくカルボン酸の塩が得られる場合が多い。このため、水和工程の後、水和工程における有機層からアミドを分離して加水分解工程に供給してもよいが、有機溶媒とアミドとを分離せずそのまま加水分解工程に供してもよい。
【００７７】
アミド抽出工程で得られる水層は、水和工程に循環することにより再利用できる。また、前記水層は廃棄することもできる。水層を廃棄しても、硫酸を触媒とする場合と異なり、重硫酸アンモニウムなどの副生物を含まないので、環境に悪影響を及ぼすことがない。
【００７８】
加水分解工程
本発明において、シアンヒドリン化合物の水和反応の結果得られるアミドの加水分解反応は、前記水和工程で得られたアミドとアミダーゼ活性を示す微生物および／またはその処理物とを、特定の温度範囲で接触させて行うことができる。このような加水分解工程は、水または緩衝液などの水性媒体中で行うことができる。なお、本発明において加水分解とは、アミドに水分子が付加するとともに、Ｃ−Ｎ結合か切断されて、対応するカルボン酸とアンモニアが生成する反応をいう。
【００７９】
水性媒体としては、たとえば、前記水和工程と同様に、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液などの中性付近に緩衝能を有する緩衝液が挙げられる。また塩酸とアルカリとを用いて反応中のｐＨ変化を好ましい範囲にとどめることが可能であれば、緩衝液を用いなくてもよい。
【００８０】
また、さらにアミドの溶解性を高め、反応を円滑に進行させるため、系内に有機溶媒を添加することもできる。したがって、たとえば、水性媒体中、水性媒体と水可溶性の有機溶媒との混合系中、あるいは水性媒体と水不溶性の有機溶媒との２相系中において、アミドと、前記アミダーゼ活性を示す微生物および／またはその処理物とを接触させることができる。
【００８１】
前記有機溶媒としては、前記水和工程において例示した化合物と同様の有機溶媒を例示することができる。
【００８２】
また、前記アミドの水性媒体に対する溶解度が小さい場合には、水性媒体に界面活性剤を加えることもできる。界面活性剤としては、０．１〜５．０重量％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、あるいはＴｗｅｅｎ６０などを用いることができる。
なお、前記水和工程と同様に、水性媒体または水性媒体と有機溶媒、さらには界面活性剤などとの混合液を反応溶媒ということがある。
【００８３】
反応溶媒は、前記水和工程において用いた反応溶媒をそのまま活用してもよいし、新らしい反応溶媒中で加水分解反応を行ってもよい。
【００８４】
アミドをカルボン酸に変換する加水分解工程で用いる水の量は、例えば、アミド１モルに対して、好ましくは０．５モル以上（例えば、０．５〜３００モル程度）、さらに好ましくは１モル以上（例えば、１〜１５０モル程度）であることが望ましい。
【００８５】
前記アミダーゼ活性を示す微生物および／またはその処理物の濃度は、例えば、微生物の乾燥重量に換算して、反応溶媒に対して、好ましくは０．０１〜７０重量％、さらに好ましくは０．１〜３０重量％程度であることが望ましい。
【００８６】
前記アミドの濃度は、反応溶媒に対して、例えば好ましくは０．０１〜８０重量％程度、さらに好ましくは０．０５〜５０重量％程度、特に好ましくは０．１〜２０重量％程度であることが望ましい。
【００８７】
反応溶媒のｐＨは、例えば、好ましくは３〜１２、さらに好ましくは６〜１０程度であることが望ましい。反応時間は、例えば、好ましくは５分〜１００時間程度である。
【００８８】
前記加水分解工程において、アミドとアミダーゼ活性を示す微生物および／またはその処理物とを接触させる温度は、３０℃を超えて５０℃以下、好ましくは３５〜５０℃、より好ましくは４０〜５０℃、特に好ましくは４０〜４５℃程度であることが望ましい。
加水分解の温度を上記範囲とすることにより、加水分解工程の原料となるアミドの反応溶媒中への溶解性を向上させるとともに、収率よく対応するカルボン酸を得ることができる。
【００８９】
なお、アミドを有機溶媒と共に加水分解工程に供する場合、加水分解により生成するカルボン酸の塩は水層に移行するので、有機溶媒と前記カルボン酸の塩とを容易に分離できる。
【００９０】
カルボン酸の塩は通常の手段で脱塩し、目的のカルボン酸とすることができる。カルボン酸塩をカルボン酸とする方法としては、たとえば、硫酸等の鉱酸を用いる方法、イオン交換樹脂を用いて遊離のヒドロキシカルボン酸を得る方法、アルコールを添加してエステル化にしてから酸触媒を用いて加水分解する方法、水酸化ナトリウム等の無機塩基を添加して電気透析を行う方法、カルボン酸アンモニウム塩の水溶液に酸性条件下で有機溶媒抽出し、加熱してアンモニアを遊離除去する方法等が挙げられる。
【００９１】
以上のとおり本発明に係るヒドロキシカルボン酸の製造方法では、前記水和工程と前記加水分解工程とを含むが、これらの各工程においては、ニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性が効率的に発揮されるように温度等が設定されているので、シアンヒドリン化合物を原料として、対応するカルボン酸をトータルで効率的に生産することができる。
すなわち、本発明では、水和工程および加水分解工程は、経時的には実質的に重複することなく進行することが好ましい。シアンヒドリン化合物の水和工程が進行している間は、実質的に水和反応の生成物であるアミドの加水分解反応を抑制して、水和反応を効率的に行い、その後加水分解反応においては、アミダーゼ活性を有効に発揮させてアミドからカルボン酸を効率的に生産することができる。
【００９２】
なお、上記各工程が実質的に重複しないとは、たとえば、水和工程の終了時において、原料となるシアンヒドリン化合物に対応するアミドが、好ましくは９０モル％以上、さらに好ましくは９５モル％以上、特に好ましくは９９モル％以上の割合で存在し、対応するカルボン酸が、好ましくは１０モル％未満、さらに好ましくは５モル％未満、特に好ましくは１モル％未満の割合で存在することを意味する。（ただし、アミド＋カルボン酸＝１００モル％）
【００９３】
【発明の効果】本発明の方法によれば、化学工業において極めて重要な物質であるカルボン酸を効率的かつ安全に製造することができる。
【００９４】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００９５】
（反応１）
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ　ＤＳＭ４３１９８の保存スラントから一白金耳を５００ｍＬ容の坂口フラスコに入った２５ｍＬＨＭＢＡ（２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタン酸）培地（グリセロール　２％、酵母エキス　０．３％、塩化ナトリウム０．１％、リン酸一カリウム　０．５％、リン酸二カリウム　０．５％、硫酸マグネシウム７水塩　０．０５％、塩化カルシウム２水塩　０．００５％、硫酸亜鉛　１０ｐｐｍ、硫酸マンガン４水塩　１０ｐｐｍ、硫酸第一鉄　１０ｐｐｍ、イソバレロニトリル　１ｐｐｍ、ｐＨ７．２）に接種した。そして３０℃で２日間、振盪培養を行った。培養終了液を冷却遠心分離して、微生物を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５ｍＬで一回洗浄後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に縣濁した。２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタンニトリル（ＨＭＢＮ）（株式会社ナード研究所製）３．０％（Ｗ／Ｖ）濃度、反応をそれぞれの温度（５〜４０℃）で開始し、反応１０分後に反応を停止した。分析は反応液を５０μＬサンプリングして１０００μＬの０．１％リン酸水溶液に添加し、よく混合した後に遠心分離機にかけ、上清をＨＰＬＣ分析した。
【００９６】
ＨＰＬＣ条件
カラム　ＵＮＩＳＩＬ−ＰＡＣ　５Ｃ１８−２５０Ａ
移動相　０．１％リン酸：アセトニトリル＝９：１
カラム温度　４０℃
検出　２１０ｎｍ
各温度における２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタンアミド（ＨＭＢＡｍ）の蓄積量は表１の通りであり、ニトリルヒドラターゼ活性の最適温度は２０℃で最もＨＭＢＡｍの蓄積量は高かった。
【００９７】
【表１】
2004081169.tif 000003
【００９８】
（反応２）
反応１と同様の方法でＨＭＢＡｍ３．０％（Ｗ／Ｖ）濃度で反応をそれぞれの温度（５−５０℃）で開始した。反応１０分後に反応を停止した。各温度における２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタン酸（ＨＭＢＡ）の蓄積量は表２の通りであり、アミダーゼ活性の最適温度は４０℃で最もＨＭＢＡの蓄積量は高かった。
【００９９】
【表２】
2004081169.tif 000004
【０１００】
（反応３）
反応１と同様な方法でＨＭＢＮ３．０％（Ｗ／Ｖ）濃度、反応をそれぞれの温度（５−４０℃）で開始し、反応１時間後に反応液を遠心分離して微生物を除いた。その反応液に再度、微生物を縣濁して反応をそれぞれ同じ温度（５−４０℃）で開始し、反応１時間後に反応を停止した。各温度における蓄積量は表３の通りであった。３０℃が最も高く１０．０ｍｇ／ｍＬを示した。
【０１０１】
【表３】
2004081169.tif 000005
【０１０２】（反応４）反応３と同様にＨＭＢＮ３．０％（Ｗ／Ｖ）濃度、反応をニトリルヒドラターゼ活性の最適温度２０℃で開始し、反応１時間後に反応液を遠心分離して微生物を除いた。その反応液に再度、微生物を縣濁して、今度は反応をアミダーゼ活性の最適温度４０℃で開始し、反応１時間後に反応を停止した。ＨＭＢＡ蓄積量は２８．２ｍｇ／ｍＬであり、これまでの最高値を示した。