(57)【要約】      （修正有）【課題】ｍＫａｎｋ遺伝子の疾病治療及び診断並びに創薬への利用を提供すること。【解決手段】ヒトの癌抑制遺伝子であるＫａｎｋ遺伝子の診断・治療・創薬への利用のため、マウスにおける同遺伝子の探索を行い、ヒトのＫａｎｋ遺伝子のマウス相同遺伝子であるｍＫａｎｋ遺伝子を見出した。ｍＫａｎｋ遺伝子の遺伝子構造を明らかにし、癌細胞に対する増殖抑制能を明らかにした。該遺伝子を利用した、癌の診断、創薬の試験検定さらに遺伝子治療法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質。
（ａ）  配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）  配列番号３で表わされるアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつｍＫａｎｋタンパク質の有する機能と同等の機能を有するタンパク質
【請求項２】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）  配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）  配列番号３で表わされるアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつｍＫａｎｋタンパク質の有する機能と同等の機能を有するタンパク質
【請求項３】
以下の（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ｃ）  少なくとも配列番号１で表される塩基配列のうちｍＫａｎｋ遺伝子のエキソン１の塩基配列および配列番号２で表される塩基配列のうちｍＫａｎｋ遺伝子のエキソン２からエキソン１０の塩基配列を含むＤＮＡ
（ｄ）  上記（ｃ）のＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつｍＫａｎｋタンパク質の有する機能と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
請求項２または３に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
請求項１に記載のタンパク質またはその一部断片であってｍＫａｎｋタンパク質の有する機能と同等の機能を有するタンパク質を有効成分とする癌治療薬。
【請求項７】
請求項２または３に記載のＤＮＡもしくはそれに対応するＲＮＡまたはそれらの一部断片であってｍＫａｎｋタンパク質の有する機能と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを有効成分とする癌治療薬。
【請求項８】
請求項１に記載のタンパク質またはその一部断片であってｍＫａｎｋタンパク質の有する機能と同等の機能を有するタンパク質を含む癌検出薬。
【請求項９】
請求項２または３に記載のＤＮＡもしくはそれに対応するＲＮＡまたはそれらの一部断片であってｍＫａｎｋタンパク質の有する機能と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含む癌検出薬。
【請求項１０】
請求項１に記載のタンパク質に対する抗体を含む癌検出薬。
【請求項１１】
請求項２または３に記載の遺伝子を含有する癌治療用ベクター。
【請求項１２】
請求項２または３に記載の遺伝子を含有する癌検出用ベクター。
【請求項１３】
請求項１に記載のタンパク質またはその一部断片であってｍＫａｎｋタンパク質の有する機能と同等の機能を有するタンパク質を被検体と接触させる工程を含む癌検出法。
【請求項１４】
請求項２または３に記載のＤＮＡもしくはそれに対応するＲＮＡまたはそれらの一部断片であってｍＫａｎｋタンパク質の有する機能と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを被検体と接触させる工程を含む癌検出法。
【請求項１５】
請求項１に記載のタンパク質に対する抗体を被検体と接触させる工程を含む癌検出法。
【請求項１６】
ｍＫａｎｋ遺伝子が導入された、ｍＫａｎｋ遺伝子トランスジェニック動物。
【請求項１７】
ｍＫａｎｋ遺伝子が破壊された、ｍＫａｎｋ遺伝子ノックアウトマウス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、癌細胞増殖抑制機能を有するｍＫａｎｋ遺伝子の疾病治療及び診断並びに創薬への利用を提供する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトにおいて、染色体９ｐ２４にマップされるアンキリンリピートを含み、癌抑制遺伝子であると推測されるＫａｎｋ遺伝子が報告されている（非特許文献１を参照）。該Ｋａｎｋ遺伝子は、特に腎癌組織において転写が減少しており、腎臓癌との関係が推測されている。
【０００３】
該Ｋａｎｋ遺伝子は、ヒトの癌の診断、治療、創薬へ利用できる可能性があるが、ヒト遺伝子を直接ヒト細胞に導入して治療等に用いようとした場合、様々なヒト特異的な制御による機能発現の制約を受ける可能性があり、このような制約なしに治療等に用いることができる遺伝子が望まれていた。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｓａｒｋｅｒ  Ｓら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７７（３９）、２００２  Ｓｅｐ  ２７、ｐ．３６５８５−９１
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、マウス由来の新規遺伝子であるｍＫａｎｋ遺伝子の疾病治療及び診断並びに創薬への利用を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヒトの癌抑制遺伝子であるＫａｎｋ遺伝子の診断・治療・創薬への利用を効果的に行うために、Ｋａｎｋ遺伝子あるいはその関連遺伝子を改変したモデル動物（特にマウス）作成と個体における癌化のメカニズムの解明を加速するためにマウスにおける同遺伝子の探索を行ない、ヒトのＫａｎｋ遺伝子のマウス相同遺伝子であるｍＫａｎｋ遺伝子を見出した。該ｍＫａｎｋ遺伝子は、１２０２アミノ酸残基よりなるタンパク質（分子量約１４０ｋＤａ）をコードしていた、本発明者らは、まずｍＫａｎｋ遺伝子の遺伝子構造を明らかにし、さらに同遺伝子の癌細胞に対する増殖抑制能及び形質転換能を解析した。これらの解析の結果、同遺伝子を利用することにより、ヒトでは行うことのできない癌化機構の解明が可能になり、ノックアウトマウス、トランスジェニックマウスの作出、あるいはマウス個体を用いた癌の診断のための基礎試験、創薬の試験検定さらには癌増殖抑制機能を利用した遺伝子治療が可能になる。また、同遺伝子は、マウスの多くの組織において発現が確認されており、それらの組織細胞においても細胞増殖調整機能を有すると考えられた。従って、該遺伝子を多くの種類の癌細胞において利用することが可能であると考えられた。さらに、上述のようにｍＫａｎｋ遺伝子のヒト相同遺伝子は既に報告されているが、ヒトの遺伝子をヒトの細胞に導入して治療に用いようとした場合、様々なヒト特異的な制御による機能発現の制約がある。マウスの遺伝子ならば、ヒト特異的な制御は受けないので、より優れた治療効果が期待できる。
【０００７】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）  以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質、
（ａ）  配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）  配列番号３で表わされるアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつｍＫａｎｋタンパク質の有する機能と同等の機能を有するタンパク質
（２）  以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子、
（ａ）  配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）  配列番号３で表わされるアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつｍＫａｎｋタンパク質の有する機能と同等の機能を有するタンパク質
（３）  以下の（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含む遺伝子、
（ｃ）  少なくとも配列番号１で表される塩基配列のうちｍＫａｎｋ遺伝子のエキソン１の塩基配列および配列番号２で表される塩基配列のうちｍＫａｎｋ遺伝子のエキソン２からエキソン１０の塩基配列を含むＤＮＡ
（ｄ）  上記（ｃ）のＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつｍＫａｎｋタンパク質の有する機能と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（４）  （２）または（３）の遺伝子を含有する組換えベクター、
（５）  （４）の組換えベクターを含む形質転換体、
（６）  （１）のタンパク質またはその一部断片であってｍＫａｎｋタンパク質の有する機能と同等の機能を有するタンパク質を有効成分とする癌治療薬、
（７）  （２）または（３）のＤＮＡもしくはそれに対応するＲＮＡまたはそれらの一部断片であってｍＫａｎｋタンパク質の有する機能と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを有効成分とする癌治療薬、
（８）  （１）のタンパク質またはその一部断片であってｍＫａｎｋタンパク質の有する機能と同等の機能を有するタンパク質を含む癌検出薬、
（９）  （２）または（３）のＤＮＡもしくはそれに対応するＲＮＡまたはそれらの一部断片であってｍＫａｎｋタンパク質の有する機能と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含む癌検出薬、
（１０）  （１）のタンパク質に対する抗体を含む癌検出薬、
（１１）  （２）または（３）の遺伝子を含有する癌治療用ベクター、
（１２）  （２）または（３）の遺伝子を含有する癌検出用ベクター、
（１３）  （１）のタンパク質またはその一部断片であってｍＫａｎｋタンパク質の有する機能と同等の機能を有するタンパク質を被検体と接触させる工程を含む癌検出法、
（１４）  （２）または（３）のＤＮＡもしくはそれに対応するＲＮＡまたはそれらの一部断片であってｍＫａｎｋタンパク質の有する機能と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを被検体と接触させる工程を含む癌検出法、
（１５）  （１）のタンパク質に対する抗体を被検体と接触させる工程を含む癌検出法、
（１６）  ｍＫａｎｋ遺伝子が導入された、ｍＫａｎｋ遺伝子トランスジェニック動物、および
（１７）  ｍＫａｎｋ遺伝子が破壊された、ｍＫａｎｋ遺伝子ノックアウトマウス。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
１．ｍＫａｎｋ遺伝子の取得
ｃＤＮＡライブラリーの作製、遺伝子のクローニング及びスクリーニング、塩基配列の決定等の技術はＪ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ  （１９８９）：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ及び  Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｃ  （１９８８）：  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ等の当業者に良く知られた文献に記載された方法に従って行えばよい。
【０００９】
本発明の遺伝子は、ｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成して単離することができる。ｍＲＮＡの供給源としては腎臓等のマウス組織を用いることができる。ｍＲＮＡの調製は、グアニジンチオシアネート／塩化セシウム法などにより全ＲＮＡを抽出した後、オリゴｄＴ−セルロースやポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法により、あるいはバッチ法によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得ることにより行える。このようにして得られたｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、該一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成する。
【００１０】
合成した二本鎖ｃＤＮＡを適当なベクターに組み込んで、該ベクターを用いて大腸菌等を形質転換してｃＤＮＡライブラリーを作製して本発明の遺伝子の一部を取得することができる。選択方法として、本遺伝子のヒトの相同遺伝子であるヒトＫａｎｋ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ＮＭ＃０１５１５８）の塩基配列情報に基づいて合成したプローブを用いてのプラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法やイムノスクリーニング法等の方法を用いることができる。得られたｃＤＮＡ断片はＰＣＲ法で増幅し、マキサム・ギルバート法（Ｍａｘａｍ，  Ａ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ，    Ｗ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．，  ７４，  ５６０，  １９７７）又はジデオキシ法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ９，  ３０９，  １９８１）等により塩基配列を決定することができる。
【００１１】
ｍＫａｎｋ遺伝子は、１０エキソンよりなるが、エキソンの解析はエキソントラッピング法によって行うことができる。
【００１２】
全長ｃＤＮＡは、ｃＤＮＡ断片より作製したプライマーを用いたＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）法、特に５’  ＲＡＣＥにより取得することができる。
【００１３】
本願明細書の開示に基づけば、ｍＫａｎｋ遺伝子の全長配列を得ることができる。配列番号１に本発明のｍＫａｎｋ遺伝子のエキソン１の全長配列およびイントロン１の一部配列を含む塩基配列を示す。配列番号２にエキソン２から１０の配列を含む塩基配列を示す。図１には、イントロン部分を省略した形でｍＫａｎｋ遺伝子の配列を示す。配列番号１、配列番号２、図１および図２に示したエキソン・イントロン構造を参照することによりｍＫａｎｋ遺伝子のほぼ全長の塩基配列およびエキソン１から１０の塩基配列がわかる。
【００１４】
２．本発明のｍＫａｎｋ遺伝子
本願発明で利用するｍＫａｎｋ遺伝子はその全長配列であってもよいし、コードされるタンパク質がｍＫａｎｋ遺伝子のコードするタンパク質の有する機能と同等の機能を有するｍＫａｎｋ遺伝子の一部配列を有する断片であってもよい。イントロンを含む全長ＤＮＡ配列も、エキソン部分のみを含むＤＮＡ配列も本願発明に利用するｍＫａｎｋ遺伝子に含まれる。一部配列の例としては、本遺伝子の機能部位と考えられるアンキリン（ａｎｋｙｒｉｎ）配列を含む配列が挙げられる。また、少なくとも配列番号１で表される塩基配列のうちｍＫａｎｋ遺伝子のエキソン１の塩基配列および配列番号２で表される塩基配列のうちｍＫａｎｋ遺伝子のエキソン２からエキソン１０の塩基配列を含むＤＮＡまたはその一部配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつコードされるタンパク質がｍＫａｎｋ遺伝子のコードするタンパク質の有する機能と同等の機能を有する変異体ＤＮＡも本発明の遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高いＤＮＡ同士、すなわち６０％以上、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それにより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム濃度が１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭであり、温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃での条件をいう。
【００１５】
さらに、少なくとも配列番号１で表される塩基配列のうちｍＫａｎｋ遺伝子のエキソン１の塩基配列および配列番号２で表される塩基配列のうちｍＫａｎｋ遺伝子のエキソン２からエキソン１０の塩基配列を含むＤＮＡの塩基配列またはその一部塩基配列と相同性が７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有し、コードされるタンパク質がｍＫａｎｋ遺伝子のコードするタンパク質の有する機能と同等の機能を有する変異体ＤＮＡも本発明の遺伝子に含まれる。
【００１６】
さらに、少なくとも配列番号１で表される塩基配列のうちｍＫａｎｋ遺伝子のエキソン１の塩基配列および配列番号２で表される塩基配列のうちｍＫａｎｋ遺伝子のエキソン２からエキソン１０の塩基配列を含むＤＮＡの塩基配列またはその一部塩基配列の１個または複数の塩基に欠失、置換、付加等の変異が生じた塩基配列を有し、コードされるタンパク質がｍＫａｎｋ遺伝子のコードするタンパク質の有する機能と同等の機能を有する変異体ＤＮＡも本発明の遺伝子に含まれる。ここで、全長塩基配列の場合、欠失、置換または付加している塩基の数は、１〜１０８０個、好ましくは１〜７２０個、さらに好ましくは１〜３６０個、さらに好ましくは１〜１８０個、さらに好ましくは１〜９０個、さらに好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜１０個である。
【００１７】
さらに、少なくとも配列番号１で表される塩基配列のうちｍＫａｎｋ遺伝子のエキソン１の塩基配列および配列番号２で表される塩基配列のうちｍＫａｎｋ遺伝子のエキソン２からエキソン１０の塩基配列を含むＤＮＡの塩基配列の一部配列からなるポリヌクレオチドを含む、本発明の遺伝子の検出・診断に用い得るプローブまたはプライマーも本発明に含まれる。ここで、プローブまたはプライマーとして用い得るポリヌクレオチドの塩基の数は、１５個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは１００個以上、特に好ましくは２００個以上である。
【００１８】
ここで、ｍＫａｎｋ遺伝子のコードするタンパク質の有する機能とは、癌細胞に認められる無制御な増殖を抑制する機能をいい、例えばＨＥＫ２９３細胞等の株化腎癌細胞にｍＫａｎｋ遺伝子を導入して、細胞の時間当たりの分裂頻度の減少及び／または細胞の接着面積の増加等の細胞の形態変化を観察することにより該機能を有しているかどうかがわかる。ＨＥＫ２９３細胞は、ＡＴＣＣから入手可能である。
【００１９】
遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ  （ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ  （ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて、あるいは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  シリーズキットを用いて変異導入が行われる。
【００２０】
さらに、本発明ではｍＫａｎｋ遺伝子配列を含むＤＮＡだけではなく、該遺伝子配列をコードするＲＮＡも含まれ、これらＤＮＡまたはＲＮＡの修飾体も含まれる。ここで修飾体とはｍＫａｎｋ遺伝子の機能を妨げない程度に塩基配列中の任意の塩基が修飾されたもの等を含む。
【００２１】
一旦遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又はクローニングされたｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、本発明の遺伝子を得ることができる。
【００２２】
３．ｍＫａｎｋタンパク質の取得
得られたｍＫａｎｋ遺伝子を入手可能な適当な発現ベクターに組み込んで、さらに適当な宿主細胞に形質転換し、適当な培地中で培養、発現させ、目的蛋白質を回収、精製することができる。この際のベクターとして、プラスミド、ファージ、ウイルス等の宿主細胞において複製可能である限りいかなるベクターも用いることができる。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＫＣ３０、ｐＣＦＭ５３６等の大腸菌プラスミド、ｐＵＢ１１０等の枯草菌プラスミド、ｐＧ−１、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等の酵母プラスミド、λｇｔ１１０、λＺＡＰＩＩ等のファージのＤＮＡ等が挙げられ、哺乳類細胞用のベクターとしては、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等のウイルスＤＮＡ、ＳＶ４０とその誘導体等が挙げられる。ベクターは、複製開始点、選択マーカー、プロモータを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。
【００２３】
宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌等の細菌細胞、アスペルギルス属菌株等の真菌細胞、パン酵母、メタノール資化性酵母等の酵母細胞、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、３Ｔ３、Ｃ１２７等の哺乳類細胞等が挙げられる。
【００２４】
形質転換は、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、エレクトロポーレーション等の公知の方法で行うことができる。
【００２５】
得られたリコンビナントタンパク質は、各種の分離精製方法により、分離・精製することができる。例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組合せて用いることができる。
【００２６】
配列番号３にｍＫａｎｋ遺伝子のコードするタンパク質（ｍＫａｎｋタンパク質）のアミノ酸配列を例示するが、このアミノ酸配列を含むタンパク質がｍＫａｎｋ遺伝子のコードするタンパク質の有する活性と同等の機能を有する限り、当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。欠失、置換または付加しているアミノ酸の数は、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１〜３６０個、好ましくは１〜２４０個、さらに好ましくは１〜１２０個、さらに好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１個若しくは２個である。
【００２７】
さらに、配列番号３に示すｍＫａｎｋタンパク質のアミノ酸配列と、相同性が７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有し、ｍＫａｎｋタンパク質の有する機能と同等の機能を有するタンパク質も本発明のタンパク質に含まれる。
【００２８】
本明細書に記載される相同性の数値は、特に明示した場合を除き、ＢＬＡＳＴ［Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２１５，  ４０３−４１０  （１９９０）］、ＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １８３，  ６３−９８  （１９９０）］等の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよい。好ましくはＢＬＡＳＴにおいてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値あるいは、ＦＡＳＴＡにおいてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値である。
【００２９】
ここで、ｍＫａｎｋタンパク質の有する機能とは、癌細胞に見られる無制御な増殖を抑制する機能をいい、例えば、ＨＥＫ２９３細胞等の株化腎癌細胞にｍＫａｎｋ遺伝子を導入して、細胞の時間あたりの分裂頻度の減少及び／あるいは細胞の接着面積の増加等の細胞の形態変化を観察することにより該機能を有しているかどうかがわかる。
【００３０】
本発明のタンパク質には、上述のタンパク質の断片であってｍＫａｎｋタンパク質の有する機能と同等の機能を有するタンパク質も含まれる。
【００３１】
４．ｍＫａｎｋタンパク質に対する抗体の取得
ｍＫａｎｋ遺伝子のコードするタンパク質（ポリペプチド、本明細書においてタンパク質とポリペプチドは区別されない）に対する抗体は、通常の方法で動物をｍＫａｎｋ遺伝子発現産物で免疫することにより得られる。抗体は、マウス抗体、ラット抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体抗体のいずれも用い得るが、ヒトの治療用に用いる場合は、ヒト抗体、キメラ抗体またはヒト型化抗体が望ましい。抗体はポリクローナル抗体もモノクローナル抗体も含むが、モノクローナル抗体が望ましい。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマによって産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。モノクローナル抗体は、公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．  Ｇ．  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，  ３−４６）等により作製することができる。抗体作製の際、免疫原としてはｍＫａｎｋタンパク質全体を用いてもよいし、ｍＫａｎｋタンパク質の断片を用いてもよい。免疫原として用いるｍＫａｎｋタンパク質またはその断片は、アミノ酸配列情報に基づいて化学合成により作製することもできるし、遺伝子工学的に作製することもできる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒトリンパ球を免疫原に感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞と融合させることにより、ヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子座を有するトランスジェニック動物に免疫原を投与して抗体産生細胞を取得し、不死化させた細胞からヒト抗体を得ることもできる（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／２５５８５  号公報、ＷＯ  ９３／１２２２７  号公報、ＷＯ  ９２／０３９１８  号公報、ＷＯ  ９４／０２６０２  号公報参照）。さらに、人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体も使用することができ、これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
【００３２】
キメラ抗体は、非ヒト動物由来抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡとヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡとを連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。ヒト型化抗体は、非ヒト動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植することにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ  １２５０２３号公報、ＷＯ  ９６／０２５７６  号公報参照）。抗体は、完全抗体であっても、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等の抗原結合部位を有する断片であってもよい。
【００３３】
５．癌の治療
本発明のｍＫａｎｋ遺伝子配列を含むＤＮＡ若しくはＲＮＡまたはその断片であってｍＫａｎｋタンパク質の有する機能と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを、遺伝子治療の技術を用いて癌の治療に利用することができる。例えば、生体の癌細胞でｍＫａｎｋ遺伝子のコードするタンパク質を発現させ、癌細胞の増殖を抑制することができる。この際、ｍＫａｎｋ遺伝子配列を含むＤＮＡ等をアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等の遺伝子治療に用い得るベクターに導入して投与することもできるし、またＤＮＡ等を注射等により直接導入することも、遺伝子銃法で導入することもできる。本発明は、これらの癌治療に用い得る治療用ベクターも包含する。投与は、経口的にも注射によってもよく、体内にＤＮＡを導入できる方法ならばいかなる投与法も利用することができる。さらに、ｍＫａｎｋ遺伝子を含むベクターを直接体内に投与してもよいし（ｉｎ  ｖｉｖｏ方式）、一旦癌細胞を取り出してｍＫａｎｋ遺伝子を組み込んだ後に体内に戻してもよい（ｅｘ  ｖｉｖｏ方式）。また、本発明のｍＫａｎｋタンパク質に対する抗体も、免疫化学的な治療に使用することが可能である。
【００３４】
ｍＫａｎｋ遺伝子のアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡも癌治療に利用し得る。
ｍＫａｎｋ遺伝子のコードするタンパク質またはその一部を癌患者に投与して、癌細胞の増殖を抑えることにより癌を治療することもできる。さらに、ｍＫａｎｋタンパク質に対する抗体を癌治療に利用することもできる。
【００３５】
ｍＫａｎｋ遺伝子配列を含むＤＮＡ若しくはＲＮＡまたはｍＫａｎｋ遺伝子のコードするタンパク質を含む治療用製剤は、医薬上許容できる担体を含んでいてもよい。担体としては、懸濁剤及びシロップ剤のような経口液体調製物は、水、シュクロース、ソルビトール、フラクトース等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤等を使用できる。粉剤、丸剤、カプセル剤及び錠剤は、ラクトース、グルコース、シュクロース、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ソーダ等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の表面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いることができる。また、注射剤の溶液は、蒸留水、塩溶液、グルコース溶液等からなる担体を用いて調製することができる。この際、定法に従い適当な溶解補助剤および懸濁剤を用いて、溶液、懸濁液または分散剤として調製できる。
【００３６】
これらの治療薬を被検体に投与することを含む、癌治療法も本発明に包含される。また、本発明のＤＮＡ、ＲＮＡもしくはその修飾物、本発明のタンパク質または本発明の抗体の癌治療薬の製造への使用も本発明に包含される。
【００３７】
６．癌の検出
さらに、ｍＫａｎｋ遺伝子配列を含むＤＮＡ、ＲＮＡヌクレオチドを利用したノーザンハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法、定量的ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法等により、ｍＫａｎｋ遺伝子の各組織における存在、発現、変異を定性的にまたは定量的に検出することにより癌を検出することができる。この場合、ｍＫａｎｋ遺伝子配列の一部をＰＣＲのプライマーとして用いることもできるし、検出用プローブとして用いることもできる。これらの遺伝子配列はニックトランスレーション等により適宜標識して用いる。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法によりｍＫａｎｋ遺伝子の発現を調べ、癌の検出または癌の進行度を検出することができ、ｍＫａｎｋ遺伝子ＤＮＡの存在をＰＣＲや定量的ＰＣＲにより調べることができる。また、ｍＫａｎｋ遺伝子配列の一部または総てを含むＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いたｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法により組織切片、細胞、染色体等を用いてｍＫａｎｋ遺伝子配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡを検出し、癌を検出することができる。ｍＫａｎｋ遺伝子を含むベクターを癌の検出に用いることもできる。本発明は、癌検出に用い得る癌検出用ベクターも包含する。
【００３８】
ｍＫａｎｋ遺伝子のコードするポリペプチドを認識する抗体を癌の検出に利用することもできる。例えば、ｍＫａｎｋ遺伝子のコードするタンパク質を認識する抗体を用いてｍＫａｎｋ遺伝子の発現産物をＥＩＡ、ＲＩＡ等のイムノアッセイ技術により測定し癌を検出することができる。この際、該変異遺伝子によりコードされるアミノ酸配列が変化したタンパク質を認識するが、アミノ酸配列の変化していないタンパク質を認識しない抗体を用いて変異遺伝子の産生するタンパク質を測定して癌の検出を行うこともできる。
【００３９】
これらの検出はｍＫａｎｋ遺伝子のコードするタンパク質、ｍＫａｎｋ遺伝子を含むＤＮＡ等を癌か否かを診断しようとする対象から採取した体液、組織片、細胞、染色体等の試料と接触することにより行うことができる。また、対象中にこれらのＤＮＡ、タンパク質等を投与して検出することも可能である。
【００４０】
ｍＫａｎｋ遺伝子配列またはその一部断片を含むヌクレオチド、ｍＫａｎｋタンパク質またはその断片、ｍＫａｎｋ遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体等を含むキットを作製することもできる。この際、定量標準物質をキット内に含むことが望ましい。
【００４１】
７．ｍＫａｎｋ遺伝子トランスジェニック動物およびｍＫａｎｋ遺伝子ノックアウトマウスの作成
本発明のｍＫａｎｋ遺伝子を動物に組込むことにより、ｍＫａｎｋ遺伝子発現モデル動物として利用できるトランスジェニック動物を作成することができる。導入する遺伝子は、野生型ｍＫａｎｋ遺伝子でもよいし、変異ｍＫａｎｋ遺伝子でもよい。正常遺伝子を導入することにより、ｍＫａｎｋタンパク質の発現量をコントロールすることができる。また、Ｃｒｅ−ｌｏｘシステムを用いて組織特異的な遺伝子発現をさせることも可能である。変異遺伝子はドミナントネガティブの形で導入することにより、ｍＫａｎｋ遺伝子の機能を阻害することができる。この際、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法により、ｍＫａｎｋタンパク質の機能を阻害するような変異を導入すればよい。具体的には、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ  （ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ  （ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて、あるいは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  シリーズキットを用いて変異導入が行われる。
【００４２】
トランスジェニック動物は、ｍＫａｎｋ遺伝子を動物の全能性細胞にマイクロインジェクション法もしくはレトロウイルスベクターを用いて導入し、この細胞を個体へと発生させ、体細胞および生殖細胞染色体中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別することによって作成することができ、例えば、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：７３８０−７３８４，  １９８０の方法等に従って作成可能である。トランスジェニック動物作成に用いられる動物種は限られないが、マウス、ラット、ハムスターなどのげっ歯類が好ましく、特に近交系が多数作出されており、しかも受精卵の培養、体外受精等の技術が確立しているマウスが好ましい。ｍＫａｎｋ遺伝子を導入する全能性細胞として、受精卵、初期胚、多分化能を有するＥＳ細胞のような培養細胞を用いることが可能であるが、ＥＳ細胞が好ましい。培養細胞への遺伝子導入法としては、公知の静電パルス法、リポソーム法、リン酸カルシウム法、レトロウイルスベクターを用いた方法等が挙げられる。ＥＳ細胞を胚盤胞の中に注入すると、宿主胚の内部細胞塊と混ざりあってマウス胚と胎仔の形成に寄与してキメラマウスができる。また、胎仔本体がＥＳ細胞だけからなるマウスができることもある。キメラマウスの中でＥＳ細胞が将来卵や精子を形成する始原生殖細胞の形成に寄与した場合、生殖系列キメラができ、このキメラマウスを交配することにより、ＥＳ細胞由来のマウス個体を得ることができる。
【００４３】
トランスジェニック動物は、遺伝子を導入した細胞を初期胚と集合、あるいは胚盤胞腔に注入してキメラ胚を得、得られたキメラ胚を偽妊娠させた雌の子宮に移植し、個体まで発生させることによって作成することが可能である。得られた動物の中からｍＫａｎｋ遺伝子を有しているものを選択することにより、本発明のｍＫａｎｋ遺伝子導入トランスジェニック動物を得ることができる。トランスジェニック動物を癌化のメカニズム等の研究に用いることができる。また、モデル動物として癌治療薬、癌治療法、癌診断薬、癌診断法のスクリーニングに用いることもできる。
【００４４】
さらに、ｍＫａｎｋ遺伝子を破壊したノックアウトマウスを作成することができる。ノックアウトマウスは、例えば村松正實・山元雅編、実験医学別冊  新遺伝子工学ハンドブック  改定第３版、羊土社、１９９９年９月１０日発行、ｐ．２３９−２４５に従って作成することができる。例えば、以下の方法でｍＫａｎｋ遺伝子ノックアウトマウスを作成することができる。ｍＫａｎｋ遺伝子の一部又は全部を、組換えＤＮＡ技術により、例えばネオマイシン耐性遺伝子等マーカー遺伝子で置換し、３′末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子等を導入してターゲティングベクターを作製し、この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション法によって受精卵やＥＳ細胞に導入し、培養する。培養後、Ｇ４１８等の抗生物質を用いて相同的組換えを起こした細胞を選択する。選択された、組換えＥＳ細胞をマイクロインジェクション法等によりマウスの胚盤胞内に導入し、仮親の子宮に戻すことによってキメラマウスを得ることができる。このキメラマウスを交配することにより、ｍＫａｎｋ遺伝子ノックアウトマウスを得ることができる。得られたマウスにおいてｍＫａｎｋ遺伝子がノックアウトされているかどうかは、例えば、得られたマウスの血清細胞からＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べるか、またはマウスのｍＫａｎｋ遺伝子の発現をウエスタンブロット法等により調べることにより決定できる。
【００４５】
ｍＫａｎｋ遺伝子をノックアウトすることにより癌が高頻度に発生するマウスが得られ、癌化のメカニズムの研究、癌治療薬、癌治療法、癌診断薬、癌診断法のスクリーニングに用いることもできる。ｍＫａｎｋ遺伝子ノックアウトマウスに候補癌治療薬を投与し、既に発症している癌が退行するか否か、あるいは癌の発症が抑えられるか否かを調べることにより、抗癌剤のスクリーニングを行うことができる。
【００４６】
【実施例】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲がこれらの実施例により限定されるものではない。
【００４７】
〔実施例１〕  ｍＫａｎｋ遺伝子の構造解析
ｍＫａｎｋ遺伝子の取得および遺伝子構造の決定は、以下のようにして行った。
ヒトＫａｎｋ遺伝子と有意の相同性を有する３種類のマウスＥＳＴクローン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、ＢＧ２９２９２０、ＡＷ７６３２６７およびＡＡ１０５０８０）を用いてマウスｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ＥＳＴクローンＢＧ２９２９２０のセンスプライマーおよびＥＳＴクローンＡＡ１０５０８０のアンチセンスプライマーを設計し、マウス腎臓由来ｃＤＮＡを用いて８０９ｂｐ  ＰＣＲ増幅産物を得た。この８０９ｂｐ増幅産物は後でファージライブラリーのスクリーニングに用いた。８０９ｂｐ産物のコード配列に含まれるマウスｃＤＮＡ断片をプローブとして約２５０，０００クローンをスクリーニングした。Ａｌｋ  Ｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて膜上の陽性スポットを可視化した。ハイブリダイゼーションは、６５℃で１６時間以上行い、３回のスクリーニングの後に陽性クローンを単離した。その後、これらのクローンからファージＤＮＡを単離し、陽性クローンについて制限酵素マッピングおよび特定のｃＤＮＡをプローブとして用いたサザンブロット分析によりキャラクタライズした。陽性クローンは両方向に向かって配列決定した。陽性クローンは、１３．５ｋｂのサイズを有し、イントロン１の一部分とエキソン１の全配列を含んでいた（配列番号１）。マウスＫａｎｋ遺伝子の下流の他のプローブを用いて遺伝子構造解析を完遂した。２セット目のファージのスクリーニングを行い、３回のスクリーニングの後に約１４ｋｂ長のクローンを得た。このクローンは、エキソン２からエキソン１０までをカバーし、ポリＡ部位（ＡＡＡＴＡＡＡＡ）を含んでいた（配列番号２）。最後に、エキソン１およびエキソン２から１０までのそれぞれを含むマウスＫａｎｋ遺伝子の配列を決定した。
【００４８】
イントロンサイズを決定するため、マウスゲノムＤＮＡを用いてエキソン付近のプライマーを用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲはＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分析した。エキソン・イントロン境界を決定するために、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｒｅ  ｋｉｔ  およびモデル３１０ＤＮＡシーケンサーを用いて配列決定を行った。得られた配列をマウスＫａｎｋ遺伝子と比較した。結果は、典型的スプライシングドナーおよびアクセプターモチーフＧＴ−ＡＧ規則に基づいて修正した。エキソン・イントロン境界の決定に用いたプライマーは以下の通りであった。
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【００４９】
ｍｏｕｓｅ  ｋｉｄｎｅｙ  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｅｘ  ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型として、フォワードプライマーとして遺伝子特異的プライマー（５’−ＣＡＧＣＡＣＣＧＣＴＣＴＣＴＣＣＡＴＡＧＣ−３’、  配列番号２０）をリバースプライマーとしてＭ１３  ユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲを行った。その後、セミネスティッドＰＣＲを内部プライマー（フォワードプライマー５’−ＧＧＧＴＣＴＡＴＧＧＡＧＧＣＡＧＡＧＴＧ−３’（  配列番号２１）及び  リバースプライマー  Ｍ１３  ユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲ産物を鋳型として行った。セミネスティッドＰＣＲ産物を得て、これらの産物をＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、ユニバーサルおよび遺伝子特異的プライマーの両方向から塩基配列決定を行い、最後にマウスＫａｎｋ遺伝子のポリＡテイルを決定した。
【００５０】
遺伝子コード領域の全長を含むｃＤＮＡは、ＥｃｏＲＩ  部位（下線部）を有する５’−ＧＣＧＡＡＴＴＣＣＣＡＡＧＡＣＧＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＣＣＣＧ−３’  （配列番号２２）をフォワードプライマーとして、Ｎｏｔ  Ｉ部位（下線部）を有する５’−ＡＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＣＣＴＣＧＧＴＧＡＧＴＧＧＧＡＣＣ−３’（  配列番号２３）をリバースプライマーとして用い、マウス腎臓総ＲＮＡから調製したマウス腎臓ｃＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲを行って得た。ＰＣＲ条件は、９４℃  ４５秒、６０℃  １分、７２℃  ３分を３０サイクルであった。ＰＣＲ中の誤挿入を防ぐため高フィデリティーＤＮＡポリメラーゼであるＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、３．６ｋｂ産物を増幅した。得られたＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋ベクター中にクローニングし、その後ＬＩＣＯＲシークエンスアナライザーを用いて配列決定を行った。
【００５１】
図１に、ＤＮＡ塩基配列の決定の結果を示した。図１には、ｍＫａｎｋ遺伝子の構造をエキソン１の途中で分け、図１Ａと図１Ｂの２つの図に表している。図１Ａが前半部の構造を表し、図１Ｂが後半部の構造を表している。両図に記載の配列は連続している。遺伝子構造としては、キャップ部位及びポリ（Ａ）付加部位、ポリ（Ａ）付加シグナルの位置をそれぞれ示した（詳細は図２〜図４に示した）。同遺伝子は、１０のエキソンからなり、９のイントロン（ＩＶＳ１〜９）を持っていることが解った。
【００５２】
図２に、ｍＫａｎｋ遺伝子のエキソン・イントロン構造の詳細を模式図として示した。２つのクローン（それぞれ、エキソン１とエキソン２〜１０を含む）の塩基配列を決定して明らかにした。エキソン配列はマウスより得たｃＤＮＡクローンをもとにゲノムＤＮＡ配列と比較することにより決定した。全てのスプライシングは「エキソン／ＧＴ．．．ＡＧ／エキソン」の規則に従っていた。キャップ部位（Ｃａｐ）、翻訳開始部位（ＡＴＧ）、翻訳終結部位（ＴＧＡ）、ポリ（Ａ）付加シグナル（Ｐｏｌｙ（Ａ）  ｓｉｇｎａｌ）及びポリ（Ａ）付加部位（Ｐｏｌｙ（Ａ）  ｔａｉｌ）を決定した。
【００５３】
さらに、以下のようにプライマー伸長反応を利用してプライマー伸長反応を行い、ゲル上でのバンドの位置からキャップ部位を決定した。
【００５４】
転写開始部位を特定するために、プライマー伸長アッセイを行った。オリゴヌクレオチドアンチセンスプライマー（５’−  ＧＧＣＣＣＴＧＡＣＴＴＣ  ＴＧＧＡＣＡＴＧ  −  ３’、  配列番号２４）をＴ４ポリメラーゼを用い３２Ｐ  ＡＴＰで末端標識した。３７℃で標識した後、反応混液を９０℃  ２分でインキュベートし酵素を失活させた。オリゴヌクレオチドをＱｉａｇｅｎカラムで精製した。標識プライマーを８０％ホルムアミド含有４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳバッファー６０μＬ中のマウス腎臓総ＲＮＡ２０μｇと４５℃  １２時間ハイブリダイズさせた。産物をエタノール沈降させ、各０．５ｍＭ  のｄＮＴＰ群を含むＲＴバッファー２０μＬに再懸濁させ、３７℃  ２時間Ｍ−Ｍｕｌｖ逆転写酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）とインキュベートした。産物をＴｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ  ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）バッファー中、７Ｍ尿素を含む６％ポリアクリルアミドゲルに溶解させた。配列決定は、Ｔｈｅｒｍｏ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（ＵＳＢ）を用いてリバースプライマーとともに行った。１つの転写物が得られ、アンチセンスプライマー位置からおおよそ８１ヌクレオチドであった。
【００５５】
図３に、プライマー伸長反応によるｍＫａｎｋ  ｍＲＮＡのキャップ部位および塩基配列の決定の結果を示した。
さらに、キャップ部位を含む領域にプロモーター活性が有ることを以下のようにルシフェラーゼ遺伝子を用いたレポーター遺伝子アッセイにより確認した。確認は、キャップ部位を含む−１６０／＋４０及び−４３０／＋４０領域の配列をｐＧＬ３プラスミドのルシフェラーゼ遺伝子の上流にクローニングしてルシフェラーゼ遺伝子の発現をルシフェラーゼ活性を検出する方法により解析した。
【００５６】
ルシフェラーゼ融合遺伝子を用いたレポーター遺伝子アッセイによりキャップ部位の位置を特定した。キャップ部位に対して−１６０／＋４０および−４３０／＋４０の領域を含むプラスミドを構築しレポーター遺伝子アッセイを行い空ベクターと比較した。構築物をＨＥＫ２９３（ヒト）およびＭＫＯＣ細胞（マウス）にウェル当たり２×１０５個の細胞密度でリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクトした。その後、２４時間培養しＰＢＳで洗浄し溶解させた。プロモーターアッセイをＤｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行った。用いたプライマーは以下の通りであった。
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どちらも対照として用いたｐＧＬプラスミドに比べて高い活性が検出され、特に−４３０／＋４０領域を含んだ場合により高い活性が見られた。
【００５７】
図４に結果を示す。これによりプライマー伸長反応によって決定したキャップ部位を含む−４３０／＋４０領域にプロモーター活性が有ることが示された。
【００５８】
図５には、ｍＫａｎｋ遺伝子構造より導き出されるタンパク質のアミノ酸配列を示した。同タンパク質ｍＫａｎｋは１２０２アミノ酸残基からなり、機能ドメイン解析により１００−３５５アミノ酸残基にコイルドコイル部位を有し、１０１４−１１７０アミノ酸残基にアンキリンリピート部位を持ちタンパク質間の相互作用を行っていることが推測された。
【００５９】
次いで、ｍＫａｎｋタンパク質のアミノ酸配列をヒトの相同タンパク質であるＫａｎｋタンパク質のアミノ酸配列と、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ）により比較した。結果を図６に示す。この結果により、コイルドコイル部位及びアンキリンリピート部位のヒト・マウス間での相同性が高いことが判明した。同様にｍＫａｎｋタンパク質の構造をヒトおよびショウジョウバエの相同配列との比較を行った。結果を図７に示す。マウスのタンパク質は１２０２アミノ酸残基からなり、特徴としては、コイルドコイル部位を１００６アミノ酸残基から１１６２アミノ酸残基の間に、アンキリンリピート部位を１００６アミノ酸残基から１１６２アミノ酸残基の間に有している。この特徴を抗体産生等に利用することが可能である。この比較の結果、Ｋａｎｋタンパク質は、ヒト、マウス、ショウジョウバエの間で、全体の長さとコイルドコイル部位及びアンキリンリピート部位の位置及び相同性について極めて高い種間保存性を示すことが解った。
【００６０】
〔実施例２〕  ｍＫａｎｋ遺伝子の機能解析
マウスの各組織から、ｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを用いて各組織でのｍＫａｎｋ遺伝子の発現状態を調べた。総ＲＮＡをマウス肝臓、腎臓、心臓、脳、肺、脾臓および胃からＩｓｏｇｅｎ  ＲＮＡ単離キットを用いて抽出した。ｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ用ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用い総ＲＮＡから逆転写して作製した。第１鎖ｃＤＮＡの１０分の１をＰＣＲの鋳型として用いた。マウスＫａｎｋ  ｃＤＮＡを遺伝子特異的プライマー（フォワードプライマー５’−  ＣＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＡＣＡＧＡＴＧＡＣＣＡＧＡ−３’  （配列番号２９）およびリバースプライマー  ５’−ＧＧＡＡＣＣＴＧＣＡＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＡＣＣ−  ３’（配列番号３０））を用いて増幅させ、種々の組織でマウスＫａｎｋの下流域に設計した産物を得た。４１０ｂｐのＧ３ＰＤＨ断片をＲＴ−ＰＣＲの対照として増幅させ、ｍＲＮＡ精製及びＲＴ−ＰＣＲ反応が正しく行われたことを確認した。
【００６１】
図８に結果を示す。腎臓などでの発現が高いものの、調べたほぼ全ての組織で発現が見られることが解った。
【００６２】
さらに、ＨＥＫ２９３細胞を用いて、ｍＫａｎｋ遺伝子の細胞増殖抑制効果をコロニーアッセイを用いて調べた。増殖抑制実験は以下の方法により行った。当該遺伝子の塩基配列３４０から４６５８までをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐｃＤＮＡ３．１  ベクター（ｐＣＭＶ−ｖｅｃ）に導入し、発現用のプラスミド（ｐＣＭＶ−Ｋａｎｋ）を作成した。本ベクターは、ＣＭＶプロモーターを持ち、その下流に挿入された遺伝子の発現を強制的に行う。また、ネオマイシン耐性遺伝子を含んでいるため、抗生物質ネオマイシンによる選択が可能である。挿入した当該遺伝子領域は、翻訳開始メチオニンから翻訳終了のコドンを含み、当該遺伝子産物タンパク質全長が発現される。
【００６３】
６ｃｍシャーレに５．１×１０５個のＨＥＫ２９３細胞をまき、トランスフェクション実験を行った。ｍＫａｎｋ発現ベクター（５μｇ）はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いてＨＥＫ２９３細胞へトランスフェクションさせた。コントロールとして空ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１（＋））をトランスフェクションさせた。トランスフェクション後、細胞は５×１０３細胞になるまで培養した。２週間  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ  （５００  μｇ／ｍｌ）で処理した後、コロニーの形成を確認した。得られたコロニーを固定し、ギムザ液で染色したのち、細胞数を計測した。安定ＨＥＫ２９３細胞株は、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎによる選択の後コロニーを単離した。これらの細胞がｍＫａｎｋ遺伝子を発現していることは、ＲＴ−ＰＣＲにより確認した。
【００６４】
まず、ＨＥＫ２９３細胞では、当該遺伝子を発現していないことをＲＴ−ＰＣＲにより確認した。次に、当該遺伝子を発現ベクターに結合して、株化腎癌細胞であるＨＥＫ２９３細胞に導入し、同細胞の中において当該遺伝子を発現させたところ、同細胞の増殖抑制が見られた。図９に結果を示す。図上は、コロニーの図を示し、図下はコロニーの数を示している。
【００６５】
さらに、抗ｍＫａｎｋ抗体を用いて正常組織および腎癌組織について免疫染色を行った。ｍＫａｎｋ遺伝子産物タンパク質に対するウサギ抗体を作製するために、同蛋白質の４０６〜５８０アミノ酸残基に相当するｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、ｐＧＥＸベクター（ファルマシア社）中のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子下流にフレームを合わせてクローニングし、融合蛋白質を作成した。そして、大腸菌細胞へ上記クローンを導入した後、ＩＰＴＧにより誘導し、得られた蛋白質をグルタチオンセファロース（ファルマシア社）により精製した。この精製蛋白質はウサギを免疫感作するのに用いた。免疫血清はセファロースにＧＳＴ融合蛋白質抗原を結合させたカラムを用いることによってアフィニティー精製を行った。腎癌とその周辺の正常腎組織の組織切片を作成し、抗ｍＫａｎｋタンパク質抗体（１次抗体）を用いて免疫染色を行った結果である。ＨＥ染色結果からそれぞれの組織を確認し、ローダミンラベルした２次抗体を用いて蛍光検出した。
【００６６】
図１０及び図１１は、抗ｍＫａｎｋ抗体を用いた免疫染色による、ヒトの正常及び腎癌組織を免疫化学染色したものである。正常組織では、糸球体、血管壁及び血管内皮細胞は染色されていないが、遠位尿細管の細胞質及び近位尿細管の一部の細胞質が染色されているが、クリアーセルタイプの腎細胞癌では染色されないことが解った。図は、抗ｍＫａｎｋ抗体を用いてヒトの正常（図１０）及び腎癌（淡明細胞亜型：クリアーセルタイプ：図１１）組織をＤＡＢ染色（茶色に染まる）したものである。細胞核はメチルグリーン染色（青く染まる）した。正常組織では、糸球体、血管壁及び血管内皮細胞は染色されていないが、遠位尿細管の細胞質及び近位尿細管の一部の細胞質が染色されており、抗ｍＫａｎｋ抗体を用いた組織染色におり癌の状態に関する知見が得られることがわかる。
【００６７】
【発明の効果】
本発明の治療薬により癌の治療が可能になり、また本発明の検出薬により癌を検出することが可能になる。
【００６８】
【配列表】
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【００６９】
【配列表フリーテキスト】
配列番号４〜３０：プライマー
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】ｍＫａｎｋ遺伝子のゲノム構造の前半部を表す図であり、エキソン１の途中までの配列を含む。図１Ａの配列と図１Ｂの配列は連続している。図中、矢印はキャップ部位及びポリ（Ａ）付加部位を示す。
【図１Ｂ】ｍＫａｎｋ遺伝子のゲノム構造の後半部を表す図であり、エキソン１の途中からの配列を含む。図１Ｂの配列と図１Ａの配列は連続している。図中、矢印はキャップ部位及びポリ（Ａ）付加部位を示し、下線を引いた部分の塩基配列は、ポリ（Ａ）付加シグナルを示す。
【図２】ｍＫａｎｋ遺伝子の構造（エキソン・イントロン構造）を表す図である。図には、エキソンごとにエキソンサイズ、５’スプライシング部位、イントロンサイズ、３’スプライシングサイトを示した。
【図３】ｍＫａｎｋ遺伝子の構造（プライマー伸張反応によるキャップ部位の決定）を表す図である。図３Ａは、キャップ部位の塩基配列決定のための電気泳動の結果（シーケンスゲルのパターン）を示す図であり、図３Ｂは、キャップ部位（図中では矢頭で示す）及びその周辺の塩基配列を示す図である。図３Ａと図３Ｂの矢印の方向は図３Ａと図３Ｂで同じ方向を示す。図３Ａの横線を付した部分の塩基配列が図３Ｂに示されている。
【図４】ｍＫａｎｋ遺伝子の構造（プロモーター活性）を表す図である。図４上図が構造を示し、図４左下図がＨＥＫ２９３細胞におけるプロモーター活性を示し、図４右下図がＭＫＯＣ細胞におけるプロモーター活性を示す。
【図５】ｍＫａｎｋタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。図中１００−３５５アミノ酸残基部分がコイルドコイル部位であり、１０１４−１１７０アミノ酸残基部分がアンキリンリピート部位を示す。
【図６】ｍＫａｎｋタンパク質のアミノ酸配列をヒト相同タンパク質との相同性比較を示す図である。
【図７】ｍＫａｎｋタンパク質のアミノ酸配列をヒト相同タンパク質およびショウジョウバエ相同タンパク質との相同性比較を示す図である。
【図８】ｍＫａｎｋ遺伝子の組織別発現状態を示す図である。
【図９】ＨＥＫ２９３細胞を用いたｍＫａｎｋ遺伝子の細胞増殖抑制能を示す図である。
【図１０】抗ｍＫａｎｋ抗体を利用しての、正常腎組織切片の染色を示す写真である。
【図１１】抗ｍＫａｎｋ抗体を利用しての、癌組織切片の染色を示す写真である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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