(57)【要約】【課題】微生物反応を利用し安価で効率よく２−ヒドロキシアビエチン酸または２−ヒドロキシデヒドロアビエチン酸を提供すること。【解決手段】アビエチン酸またはその２位が水酸化されていないアビエチン酸誘導体を、該化合物の２−ヒドロキシ化体に変換する能力を有するＭｕｃｏｒ属に属する微生物を、アビエチン酸またはその２位が水酸化されていないアビエチン酸誘導体と接触させ、生成した２−ヒドロキシアビエチン酸または２−ヒドロキシアビエチン酸誘導体を採取することを特徴とする２−ヒドロキシアビエチン酸または２−ヒドロキシアビエチン酸誘導体の製造方法を提供する。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アビエチン酸またはその２位が水酸化されていないアビエチン酸誘導体を、該化合物の２−ヒドロキシ化体に変換する能力を有するＭｕｃｏｒ属に属する微生物。
【請求項２】
前記アビエチン酸誘導体がデヒドロアビエチン酸であることを特徴とする請求項１記載の微生物。
【請求項３】
Ｍｕｃｏｒ属に属する微生物が、　産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されたＭｕｃｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ　ｓｔｒａｉｎ２５（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９７２）またはＭｕｃｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ　ｓｔｒａｉｎ５４（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９７３）である請求項１記載の微生物。
【請求項４】
請求項１記載の微生物を、アビエチン酸またはその２位が水酸化されていないアビエチン酸誘導体と接触させ、生成した該化合物の２−ヒドロキシ化体を採集することを特徴とする２−ヒドロキシアビエチン酸または２−ヒドロキシアビエチン酸誘導体の製造方法。
【請求項５】
前記アビエチン酸誘導体がデヒドロアビエチン酸であることを特徴とする請求項４記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、水酸化されたアビエチン酸誘導体の製造方法に関する。水酸化されたアビエチン酸誘導体は、医薬や工業製品などに有用な化合物である。
【０００２】
【従来の技術】
天然樹脂の一つであるロジンは、マツ科植物から採取される松ヤニを原料とし、それに含まれる精油などの揮発性成分を留去したあとに残る琥珀色、無定型の樹脂である。その組成には若干のばらつきがあるものの、アビエチン酸とその異性体を主成分とする樹脂酸と少量の中性成分の混合物である。ロジンは天然に豊富に存在しており様々な化成品として用いられているが、化学修飾可能な官能基がカルボキシル基の１箇所しか存在しないことからその誘導体には限りがあった。一般的に化学修飾が容易な官能基としてはカルボキシル基の他に水酸基があげられるが、有機合成的手法でアビエチン酸の骨格に直接水酸基を導入することは非常に困難であった。Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（１９８９年、２９２７項）によれば、アビエチン酸のメチルエステルに４酢酸鉛や２酸化セレンを作用させて水酸化を試みているが、この方法では水酸化されるのは９位でありその収率も最大で３０％と非常に低い値であることが記載されている。また、大部分は脱水素反応が進行したデヒドロアビエチン酸メチルやその水酸化物の混合物であり、水酸化反応のみを選択的に実施することは非常に困難であり、その新規手法の開発が要望されていた。
【０００３】
製紙工場に於いては原木からのバージンパルプの製造時アビエチン酸を主成分とするピッチが生成し、いわゆるピッチトラブルの原因となるが、これを分解する微生物のスクリーニングが検討されてきた。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属（特開平０７−３１３１４３号）、Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ属（特開平０６−２４５７５８号）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属（特開平０９−１１９０８５号）またはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属（特開平１１−３４６７６３号）等の微生物を用いてロジンを分解除去する方法が記載されている。これらの方法はロジンを炭素源として生育する微生物を利用してピッチを分解除去するものであるが、ロジンの代謝中間体については記載はない。
【０００４】
アビエチン酸の無毒化等の観点からアビエチン酸やデヒドロアビエチン酸に水酸基を導入した例がいくつか報告されている。この中でアビエチン酸やデヒドロアビエチン酸の２位に水酸基を導入する微生物としてはカビの一種Ｍｏｒｔｉｅｌｌａ　ｉｓａｂｅｌｌｉｎａが唯一の報告例である（Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１０１５項、１９８８年、油化学、１９１項、１９９０年）。しかし、微生物反応時間が長い上に、２位が水酸化された化合物への変換率も低く、充分なものとは言えない。
【０００５】
アビエチン酸骨格に酸素官能基が導入された化合物は様々な薬理活性を有することが知られている。例えば、７−オキソデヒドロアビエチン酸メチルエステルは、抗ウイルス活性を有していることが知られている（特表２０００−５１０４６９号、特表２０００−５１０４６５号、特表２０００−５１０８３４号、特表２０００−５１１８８６号、特表２０００−５１１５１４号）。また、１−ヒドロキシデヒドロアビエチン酸は抗菌活性を有していることが知られている（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４６巻、１３１項、１９９７年）。また、そのほかにアビエチン骨格に水酸基が導入されたジテルペン類は、抗腫瘍活性（Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　９０巻、５９２３項、１９６８年）、抗白血病（Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ、３１巻、１３７項、１９７５年）、抗生物質（Ｐｕｒｅ　Ａｐｐｌ．　Ｃｈｅｍ．、１７巻、３３１項、１９６８年）、細胞分裂阻害活性（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、３３８５項、１９７２年）を有することが知られていた。また、アビエチン酸骨格の２位は有機合成的手法で直接水酸基を導入することは不可能であり、これらの化合物を効率よく調製する方法は非常に有効と考えられる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、安価で効率よく２−ヒドロキシアビエチン酸または２−ヒドロキシデヒドロアビエチン酸を製造する方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、工業的に有利な微生物によるアビエチン酸及びデヒドロアビエチン酸への水酸基の導入方法について鋭意検討した。その結果、　Ｍｕｃｏｒ属に属する新規微生物Ｍｕｃｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ　ｓｔｒａｉｎ２５株またはＭｕｃｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ　ｓｔｒａｉｎ５４株がアビエチン酸の２位に、またデヒドロアビエチン酸の２位に特異的に水酸基を導入することを見いだし、本発明に到達した。
【０００８】
すなわち、本発明は、アビエチン酸またはその２位が水酸化されていないアビエチン酸誘導体を、該化合物の２−ヒドロキシ化体に変換する能力を有するＭｕｃｏｒ属に属する微生物に関する。また、この微生物を、アビエチン酸またはその２位が水酸化されていないアビエチン酸誘導体と接触させ、生成した該化合物の２−ヒドロキシ化体を採集することを特徴とする２−ヒドロキシアビエチン酸または２−ヒドロキシアビエチン酸誘導体の製造方法に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を詳細に説明する。
Ｍｕｃｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ　ｓｔｒａｉｎ２５株及びＭｕｃｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ　ｓｔｒａｉｎ５４株は、土壌から分離した微生物である。同定は以下のようにして行った。２株をポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）、オートミール寒天（ＯＡ）及び２％麦芽寒天（ＭＥＡ）の各プレートに接種し、２５℃で最長４週間の培養を行い、コロニーの巨視的特徴の観察を肉眼及び実体顕微鏡で行った。ＰＤＡプレートについては３７℃での培養も行った。コロニー色調に関する記述はＭｅｔｈｕｅｎ　ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　ｃｏｌｏｕｒ（３ｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、１９７８年、Ｅｙｒｅ　Ｍｅｔｈｕｅｎ、　Ｌｏｎｄｏｎ）に従った。ＰＤＡスライド培養検体の微視的特徴の観察は光学顕微鏡にて行った。
（Ｍｕｃｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ　ｓｔｒａｉｎ２５株の同定結果）
全てのプレート上においてコロニーは羊毛状で当初ｗｈｉｔｅ（Ａ１）を示し、後にｇｒｅｙｉｓｈ　ｏｒａｎｇｅ（５Ｂ３）を呈した。以降４週間後までコロニー呈色に変化はなかった。生育速度は極めて速く、全てのプレートについて２５℃で４日目までに直径８５ｍｍのシャーレ全面に達した。ＰＤＡプレート３７℃では１週間に約４０ｍｍの生育を示した。また、全てのプレートにおいて可溶性色素の生成は認められず、ロゼットの形成も認められなかった。培養開始後２日目以降からは低倍率の実体顕微鏡にて観察可能な大きさの胞子嚢の形成が確認された。胞子嚢はｂｒｏｗｎｉｓｈ　ｇｒｅｙ−ｂｒｏｗｎｉｓｈ　ｏｒａｎｇｅ（６−７Ｃ２−３）を呈した。また、臭気の産生は確認されなかった。
【００１０】
光学顕微鏡による観察では、接合菌類に見られる特徴的な胞子嚢柄が観察された。隔壁は極めて少なく、仮根の形成は認められなかった。胞子嚢柄は気中菌糸より単生し、仮軸状の分枝が頻繁に観察された。柄は平滑で幅は１５〜２０μｍ、直線的または湾曲した生育を示した。胞子嚢は大半が球形を示し、多胞子性で大きさは最大でも８０μｍを越えなかった。アポフィシスの形成は認められず、コルメラ全体が胞子嚢膜に覆われた。コルメラは大半が亜球形を示し、頂端に突起は認められなかった。胞子嚢膜は消失性の薄膜で、表面はやや刺状であった。胞子嚢胞子は短い楕円形で表面はやや凹凸を示し無色で、大きさは４．５〜６．５×３．５〜４．５μｍで両端に付属糸の形成は認められなかった。また、長時間培養しても厚壁胞子および接合胞子の形成は認められなかった。「Ｔｈｅ　ｇｅｎｅｒａｏｆ　ｆｕｎｇｉ　ｓｐｏｒｕｌａｔｉｎｇ　ｉｎ　ｐｕｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ」（ｖｏｎ　Ａｒｘ，　Ｊ．　Ａ．著、Ａ．　Ｒ．　Ｇａｎｔｎｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ　ＫＧ，　Ｖａｄｕｚ）および「Ｍｏｕｌｄｓ−ｔｈｅｉｒ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ」（Ｍａｌｌｏｃｈ，　Ｄ著、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｏｒｏｎｔｏ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｔｏｒｏｎｔｏ）および「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　ｆｏｏｄ−ｂｏｒｎｅ　ｆｕｎｇｉ　５ｔｈ　ｅｄ．，　ＣＢＳ，　Ｂａａｒｎ」に記載されている分類体系に基づき属までの帰属分類群を推定すると、コロニー色調・無性生殖器官の形態からＭｕｃｏｒ属に帰属するものと考えた。Ｍｕｃｏｒ属に類似したコロニー形態及び多胞子性の胞子嚢を形成する属としてはＡｂｓｉｄｉａ属、Ｇｉｌｂｅｒｔｅｌｌａ属、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ属、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属が知られているが、仮根及びアポフィシスを持たないこと、胞子嚢柄の大きさが最大でも１００μｍを越えないこと、コルメラを有すること、胞子嚢胞子の両端に付属糸の形成が見られないことなどからこれらの属とは区別される。また、「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍｏｆ　ｓｏｉｌ　ｆｕｎｇｉ，　ｖｏｌ．１」（Ｄｏｍｓｃｈ，　Ｋ．　Ｈ．　等著、１９９３年、ＩＨＷ−Ｖｅｒｌａｇ，　Ｅｃｈｉｎｇ，　Ｒｅｐｒｉｎｔｅｄ）または「Ａｔｒａｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｕｓ　Ｍｕｃｏｒ　ｆｒｏｍ　Ｔａｉｗａｎ」（Ｌｉｏｕ，　Ｇ．Ｙ．等著、１９９３年、ＦＩＲＤＩ，　Ｈｓｉｎｃｈｕ，　Ｔａｉｗａｎ）によるＭｕｃｏｒ属の分類指標に基づき、種までの帰属分類群を推定すると、胞子嚢の直径は８０μｍを越えず、柄は２０μｍ程度、コルメラ頂端部に突起は認められず、胞子嚢膜は消失性で表面はやや刺状、仮軸状の分岐が頻繁に観察され、胞子嚢胞子は無色で大きさが４〜６μｍ程度であることからＭｕｃｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ　ｓｔｒａｉｎ２５と同定した。本菌株は産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ　Ｐ−１８９７２株として寄託されている。
（Ｍｕｃｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ　ｓｔｒａｉｎ５４株の同定結果）
全てのプレート上においてコロニーは羊毛状で当初ｗｈｉｔｅ（Ａ１）を示し、後にｇｒｅｙｉｓｈ　ｙｅｌｌｏｗ（４Ｂ３）を呈した。以降４週間後までコロニー呈色に変化はなかった。生育速度は極めて速く、全てのプレートについて２５℃で４日目までに直径８５ｍｍのシャーレ全面に達した。　ＰＤＡプレート３７℃では１週間に約４０ｍｍの生育を示した。また、全てのプレートにおいて可溶性色素の生成は認められず、ロゼットの形成も認められなかった。培養開始後２日目以降からは低倍率の実体顕微鏡にて観察可能な大きさの胞子嚢の形成が確認された。胞子嚢はｂｒｏｗｎｉｓｈｇｒｅｙ−ｂｒｏｗｎｉｓｈ　ｏｒａｎｇｅ（６−７Ｃ２−３）を呈した。また、臭気の産生は確認されなかった。
【００１１】
光学顕微鏡による観察では、接合菌類に見られる特徴的な胞子嚢柄が観察された。隔壁は極めて少なく、仮根の形成は認められなかった。胞子嚢柄は気中菌糸より単生し、仮軸状の分枝が頻繁に観察された。柄は平滑で幅は１５〜２０μｍ、直線的または湾曲した生育を示した。胞子嚢は大半が球形を示し、多胞子性で大きさは最大でも８０μｍを越えなかった。アポフィシスの形成は認められず、コルメラ全体が胞子嚢膜に覆われた。コルメラは大半が亜球形を示し、頂端に突起は認められなかった。胞子嚢膜は消失性の薄膜で、表面はやや刺状であった。胞子嚢胞子は短い楕円形で表面はやや凹凸を示し無色で、大きさは４．５〜６．５×３．５〜４．５μｍで両端に付属糸の形成は認められなかった。また、長時間培養しても厚壁胞子および接合胞子の形成は認められなかった。「Ｔｈｅ　ｇｅｎｅｒａｏｆ　ｆｕｎｇｉ　ｓｐｏｒｕｌａｔｉｎｇ　ｉｎ　ｐｕｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ」（ｖｏｎ　Ａｒｘ，　Ｊ．　Ａ．著、Ａ．　Ｒ．　Ｇａｎｔｎｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ　ＫＧ，　Ｖａｄｕｚ）および「Ｍｏｕｌｄｓ−ｔｈｅｉｒ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ」（Ｍａｌｌｏｃｈ，　Ｄ著、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｏｒｏｎｔｏ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｔｏｒｏｎｔｏ）および「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　ｆｏｏｄ−ｂｏｒｎｅ　ｆｕｎｇｉ　５ｔｈ　ｅｄ．，　ＣＢＳ，　Ｂａａｒｎ」に記載されている分類体系に基づき属までの帰属分類群を推定すると、コロニー色調・無性生殖器官の形態からＭｕｃｏｒ属に帰属するものと考えた。Ｍｕｃｏｒ属に類似したコロニー形態及び多胞子性の胞子嚢を形成する属としてはＡｂｓｉｄｉａ属、Ｇｉｌｂｅｒｔｅｌｌａ属、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ属、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属が知られているが、仮根及びアポフィシスを持たないこと、胞子嚢柄の大きさが最大でも１００μｍを越えないこと、コルメラを有すること、胞子嚢胞子の両端に付属糸の形成が見られないことなどからこれらの属とは区別される。また、「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍｏｆ　ｓｏｉｌ　ｆｕｎｇｉ，　ｖｏｌ．１」（Ｄｏｍｓｃｈ，　Ｋ．　Ｈ．　等著、１９９３年、ＩＨＷ−Ｖｅｒｌａｇ，　Ｅｃｈｉｎｇ，　Ｒｅｐｒｉｎｔｅｄ）または「Ａｔｒａｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｕｓ　Ｍｕｃｏｒ　ｆｒｏｍ　Ｔａｉｗａｎ」（Ｌｉｏｕ，　Ｇ．Ｙ．等著、１９９３年、ＦＩＲＤＩ，　Ｈｓｉｎｃｈｕ，　Ｔａｉｗａｎ）によるＭｕｃｏｒ属の分類指標に基づき、種までの帰属分類群を推定すると、胞子嚢の直径は８０μｍを越えず、柄は２０μｍ程度、コルメラ頂端部に突起は認められず、胞子嚢膜は消失性で表面はやや刺状、仮軸状の分岐が頻繁に観察され、胞子嚢胞子は無色で大きさが４〜６μｍ程度であることからＭｕｃｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ　ｓｔｒａｉｎ５４と同定した。本菌株は産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ　Ｐ−１８９７３株として寄託されている。
【００１２】
本発明で使用するのは、アビエチン酸またはその２位が水酸化されていないアビエチン酸誘導体である。２位が水酸化されていないアビエチン酸誘導体とは、アビエチン酸骨格を有し、その２位が水酸基以外の官能基を有するものであり、その例として、デヒドロアビエチン酸、ジヒドロアビエチン酸、テトラヒドロアビエチン酸、ネオアビエチン酸、パラストリン酸、レボピマル酸などが挙げられるが、反応性の点から、デヒドロアビエチン酸、ネオアビエチン酸、パラストリン酸、レボピマル酸が好ましく、安定性の点からデヒドロアビエチン酸が特に好ましい。アビエチン酸、デヒドロアビエチン酸の構造式を下記に示す。
【００１３】
【化１】
2004081008.tif 000002
アビエチン酸
【００１４】
【化２】
2004081008.tif 000003
デヒドロアビエチン酸
本発明で使用するアビエチン酸またはその２位が水酸化されていないアビエチン酸誘導体としては、それらを含むものであれば特に制限はないが、それらの含量が高いものほど生産量の面から有利のことは明らかである。また、微生物菌体と接触するときはアビエチン酸の酸の形のままで何ら問題はないが、より微生物菌体と接触しやすいようにアビエチン酸の塩として用いても良く、２位が水酸化されていないアビエチン酸誘導体が塩でない場合、その塩として用いても良い。使用できるアビエチン酸または２位が水酸化されていないアビエチン酸誘導体の塩としては、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、バリウム等のアルカリ金属塩、アンモニア、メチルアミン、エチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン等のアンモニウム塩等が用いられる。
【００１５】
本発明方法において、アビエチン酸の２位を、または２位が水酸化されていないアビエチン酸誘導体の２位を特異的に水酸化する能力を有するＭｕｃｏｒ属微生物の為の培養培地は、その微生物が増殖し得るものである限り特に限定されない。例えば、炭素源として、グルコース、シュークロース等の糖質、エタノール、グリセロール等のアルコール類、オレイン酸、ステアリン酸等の脂肪酸及びそのエステル類、菜種油、大豆油等の油類；窒素源として、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、ふすま、酵母エキスなど；無機塩類として、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、燐酸１水素カリウム、燐酸２水素カリウムなど；他の栄養源として、麦芽エキス、肉エキス等を含有する通常の液体培地が使用され得る。培養は好気的に行い、通常、培養時間、１〜１０日間程度、培地のｐＨ、３〜９、培養温度、１０〜５０℃で行い得る。
【００１６】
アビエチン酸または２位が水酸化されていないアビエチン酸誘導体を変換する反応は、上記Ｍｕｃｏｒ属微生物の培養物またはその処理物等およびアビエチン酸または２位が水酸化されていないアビエチン酸誘導体およびその塩を水性媒体中で接触させることにより行うことが出来る。ここで、「Ｍｕｃｏｒ属微生物の培養物」とは、菌体を含む培養液あるいは培養菌体を意味し、「その処理物」とは、例えば、粗抽出液、凍結乾燥微生物体、アセトン乾燥微生物体、またはそれら菌体の磨砕物等を意味する。さらにそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化されて用いられ得る。固定化は、当業者に周知の方法（例えば架橋法、物理的吸着法、包括法等）で行い得る。
【００１７】
水性媒体としては、水、燐酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノール、などのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類及びアセトアミドなどのアミド類などの有機溶媒を含有した水溶液、及び本発明のＭｕｃｏｒ属微生物の培養液、菌体または菌体処理物を得るために用いる培地などがあげられる。
【００１８】
反応は通常、反応温度１０〜５０℃、ｐＨ＝５〜８で行う。反応時間は培養物、菌体または菌体処理物の量及び用いるアビエチン酸またはデヒドロアビエチン酸の量により異なるが１〜２４０時間である。反応に用いるアビエチン酸または２位が水酸化されていないアビエチン酸誘導体は１〜１００ｇ／Ｌの範囲で用いられる。
【００１９】
反応で生じた２−ヒドロキシアビエチン酸または２−ヒドロキシアビエチン酸誘導体は、常法により精製され得る。例えば、２−ヒドロキシアビエチン酸または２−ヒドロキシデヒドロアビエチン酸は、必要に応じ遠心分離、濾過等の処理を施して菌体を除去し、塩酸等で酸性とし次いで酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒で抽出し、有機溶媒を減圧下で除去し、そしてクロマトグラフィー等の処理を行うことにより、精製され得る。
【００２０】
以上のようにして得られる２−ヒドロキシアビエチン酸は以下に示す物理化学的性質を有する。本発明の２−ヒドロキシアビエチン酸の理化学的性状は、次の通りである。
１．色および形状：白色粉末
２．分子式：Ｃ２０Ｈ３０Ｏ３
３．マススペクトル（ＧＣ−ＭＳ、ｍｅｔｈｙｌ　ｅｓｔｅｒ）：３３２，　３１４，　２５５，　２３９，　２１１
４．１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：主要なピークを以下に示す。
δＴＭＳ（ｐｐｍ）：０．８６（３Ｈ，　ｓ），　１．００（３Ｈ，　ｄ，　Ｊ＝６．６），　１．１０（３Ｈ，　ｄ，　Ｊ＝７．０），　１．２１−１．２９（６Ｈ，　ｍ），　１．２７（３Ｈ，　ｓ），　１．７８（１Ｈ，　ｔ，　Ｊ＝１１．７），　１．８３（２Ｈ，　ｄ，　Ｊ＝１１．７），　１．９２−２．０８（２Ｈ＋１Ｈ，　ｍ），　２．１０（１Ｈ，　ｂｒｓ），　２．２１（１Ｈ，　ｄｄ，　Ｊ＝１３．６，　６．２），　３．９３（１Ｈ，　ｔ，　Ｊ＝１１．４），　５．３７（１Ｈ，　ｄ，　Ｊ＝３．３），　５．７８（１Ｈ，　ｓ）
５．１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：主要なピークを以下に示す。
δＴＭＳ（ｐｐｍ）：１７．６６，　２０．７８，　２１．３５，　２２．５０，　２５．０７，　２７．２８，　２９．６３，　３４．８０，　３６．３２，　４４．４５，　４５．２６，　４７．５０，　５０．８８，　６４．５９，　１２０．２９，　１２２．１４，　１３５．０７，　１４５．３９，　１８２．９１
以上のようにして得られる２−ヒドロキシデヒドロアビエチン酸は以下に示す物理化学的性質を有する。本発明の２−ヒドロキシデヒドロアビエチン酸の理化学的性状は、次の通りである。
１．色および形状：白色粉末
２．分子式：Ｃ２０Ｈ２８Ｏ３
３．１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：主要なピークを以下に示す。
δＴＭＳ（ｐｐｍ）：１．２２（６Ｈ，　ｄ，　Ｊ＝７．０），　１．２５（３Ｈ，　ｓ），　１．３２（３Ｈ，　ｓ），　１．４８（１Ｈ，　ｔ，　Ｊ＝１１．７），　１．５７−１．６５（１Ｈ，　ｍ），　１．７７（１Ｈ，　ｔ，　Ｊ＝１１．７），　１．７７−１．９０（１Ｈ，　ｍ），　２．０７（１Ｈ，　ｄｄ，　Ｊ＝１２．１，　２．２），　２．２５（１Ｈ，　ｄｄ，　Ｊ＝１２．６，　２．０），　２．６７（１Ｈ，　ｄ，　Ｊ＝１０．６），　２．７９−２．８６（１Ｈ，　ｍ），　２．８８−２．９６（２Ｈ，　ｍ），　４．０８−４．１６（１Ｈ，　ｍ）
４．１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：主要なピークを以下に示す。
δＴＭＳ（ｐｐｍ）：１７．２５，　２０．９３，　２３．９６，　２３．９５，　２６．０５，　２９．７８，　３３．４６，　３８．４６，　４４．３１，　４５．１９，　４７．１０，　４８．１７，　６５．１２，　１２３．８７，　１２４．０６，　１２７．００，　１３４．１７，　１４５．７７，　１４６．１１，　１８２．８０
２−ヒドロキシアビエチン酸、２−ヒドロキシデヒドロアビエチン酸の構造式を下記に示す。
【００２１】
【化３】
2004081008.tif 000004
２−ヒドロキシアビエチン酸
【００２２】
【化４】
2004081008.tif 000005
２−ヒドロキシデヒドロアビエチン酸
【００２３】
【実施例】以下に実施例を示すが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定されるものではない。
【００２４】
（実施例１）
アビエチン酸種母用培地（アビエチン酸０．０２％、酵母エキス０．２％、ペプトン０．５％、燐酸水素２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０５％、硫酸鉄７水塩０．００１％を含みｐＨ７．５に調整した培地）を試験管に５ｍｌずつ分注し、１２０℃で２０分間殺菌した。この培地にＭｕｃｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ　ｓｔｒａｉｎ２５株を一白金耳植菌し２８℃で２４時間振とう培養し種培養液として用いた。
【００２５】
アビエチン酸水酸化用培地（アビエチン酸０．２％、肉エキス２％、酵母エキス０．２％、シュークロース６％、リン酸水素２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０５％、硫酸鉄７水塩０．００１％を含みｐＨ７．５に調製した培地）３０ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに入れ１２０℃で２０分間殺菌した。これに種培養液（１ｍｌ）を加えて２８℃で１日間振とう培養を行った。培養終了後、坂口フラスコ１０本分（培地３００ｍｌ分）の培養液に６規定塩酸を加えてｐＨ１に調製した後に酢酸エチルを加えて抽出し酢酸エチル層を分離した。得られた有機層は無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した後に、減圧濃縮した。得られた抽出濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝２／１）で精製し、２−ヒドロキシアビエチン酸３００ｍｇ（変換率４８％）で得た。
（実施例２）
デヒドロアビエチン酸種母培地（デヒドロアビエチン酸０．０２％、酵母エキス０．２％、ペプトン０．５％、燐酸水素２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０５％、硫酸鉄７水塩１ｐｐｍを含みｐＨ７．５に調整した培地）を試験管に５ｍｌずつ分注し、１２０℃で２０分間殺菌した。この培地にＭｕｃｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ　ｓｔｒａｉｎ２５株を一白金耳植菌し２８℃で２４時間振とう培養し種培養液として用いた。
【００２６】
デヒドロアビエチン酸水酸化用培地（デヒドロアビエチン酸０．２％、肉エキス２％、酵母エキス０．２％、シュークロース６％、リン酸水素２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０５％、硫酸鉄７水塩０．００１％を含みｐＨ７．５に調製した培地）３０ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに入れ１２０℃で２０分間殺菌した。これに種培養液（１ｍｌ）を加えて２８℃で１日間振とう培養を行った。培養終了後、坂口フラスコ１０本分（培地３００ｍｌ分）の培養液に６規定塩酸を加えてｐＨ１に調製した後に酢酸エチルを加えて抽出し酢酸エチル層を分離した。得られた有機層は無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した後に、減圧濃縮した。得られた抽出濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝２／１）で精製し、２−ヒドロキシデヒドロアビエチン酸３５０ｍｇ（変換率５５％）で得た。
【００２７】
（実施例３）
アビエチン酸種母用培地（アビエチン酸０．０２％、酵母エキス０．２％、ペプトン０．５％、燐酸水素２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０５％、硫酸鉄７水塩０．００１％を含みｐＨ７．５に調整した培地）を試験管に５ｍｌずつ分注し、１２０℃で２０分間殺菌した。この培地にＭｕｃｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ　ｓｔｒａｉｎ５４株を一白金耳植菌し２８℃で２４時間振とう培養し種培養液として用いた。
【００２８】
アビエチン酸水酸化用培地（アビエチン酸０．２％、肉エキス２％、酵母エキス０．２％、シュークロース６％、リン酸水素２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０５％、硫酸鉄７水塩０．００１％を含みｐＨ７．５に調製した培地）３０ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに入れ１２０℃で２０分間殺菌した。これに種培養液（１ｍｌ）を加えて２８℃で１日間振とう培養を行った。培養終了後、坂口フラスコ１０本分（培地３００ｍｌ分）の培養液に６規定塩酸を加えてｐＨ１に調製した後に酢酸エチルを加えて抽出し酢酸エチル層を分離した。得られた有機層は無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した後に、減圧濃縮した。得られた抽出濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝２／１）で精製し、２−ヒドロキシアビエチン酸４００ｍｇ（変換率６３％）で得た。
（実施例４）
デヒドロアビエチン酸種母培地（デヒドロアビエチン酸０．０２％、酵母エキス０．２％、ペプトン０．５％、燐酸水素２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０５％、硫酸鉄７水塩１ｐｐｍを含みｐＨ７．５に調整した培地）を試験管に５ｍｌずつ分注し、１２０℃で２０分間殺菌した。この培地にＭｕｃｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ　ｓｔｒａｉｎ５４株を一白金耳植菌し２８℃で２４時間振とう培養し種培養液として用いた。
【００２９】
デヒドロアビエチン酸水酸化用培地（デヒドロアビエチン酸０．２％、肉エキス２％、酵母エキス０．２％、シュークロース６％、リン酸水素２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０５％、硫酸鉄７水塩０．００１％を含みｐＨ７．５に調製した培地）３０ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに入れ１２０℃で２０分間殺菌した。これに種培養液（１ｍｌ）を加えて２８℃で１日間振とう培養を行った。培養終了後、坂口フラスコ１０本分（培地３００ｍｌ分）の培養液に６規定塩酸を加えてｐＨ１に調製した後に酢酸エチルを加えて抽出し酢酸エチル層を分離した。得られた有機層は無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した後に、減圧濃縮した。得られた抽出濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝２／１）で精製し、２−ヒドロキシデヒドロアビエチン酸４３０ｍｇ（変換率６８％）で得た。
【００３０】
【発明の効果】
本発明によれば、アビエチン酸を水酸化して２−ヒドロキシアビエチン酸を生産する能力を有するＭｕｃｏｒ属微生物を培養しアビエチン酸またはデヒドロアビエチン酸と接触させ、生成した２−ヒドロキシアビエチン酸または２−ヒドロキシデヒドロアビエチン酸を採集するという極めて簡便な分離精製方法によって、従来製造することが困難であった２−ヒドロキシアビエチン酸または２−ヒドロキシデヒドロアビエチン酸を容易に得ることが出来る。従って本発明はＭｕｃｏｒ属微生物による２−ヒドロキシアビエチン酸または２−ヒドロキシデヒドロアビエチン酸の工業的生産の効率向上およびコストの低減に大きく寄与するものである。