(57)【要約】【課題】２−デオキシ−シロ−イノサミンを酵素学的に生産するための新たな方法を提供することが本発明の課題である。【解決手段】本発明により、バチルス・サーキュランスに由来するＬ−グルタミン：２−デオキシ−シロ−イノソースアミノ基転移酵素のポリペプチド、および当該ポリペプチドをコードする遺伝子が与えられた。本発明の酵素を用いることにより、２−デオキシ−シロ−イノソースを原料として、多方面に有用である２−デオキシ−シロ−イノサミンを容易に大量に生産にすることが可能となる。また本発明の遺伝子を、他のアミノグリコシド産物をスクリーニングするためのツールとして用いることができる。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
（ａ）配列表の配列番号１に示す、アミノ酸番号１−４１８で示すアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
（ｂ）Ｌ−グルタミン：２−デオキシ−シロ−イノソースアミノ基転移酵素としての酵素活性を有し、（ａ）の一部が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１記載のポリペプチドから構成される、バチルスサーキュランスＳＡＮＫ７２０７３由来のＬ−グルタミン：２−デオキシ−シロ−イノソースアミノ基転移酵素。
【請求項３】
請求項１記載のポリペプチドをコードする、遺伝子。
【請求項４】
以下の（ｃ）または（ｄ）に示す塩基配列からなることを特徴とする、遺伝子。
（ｃ）配列表の配列番号２に示す、塩基番号１−１２５７で示される塩基配列からなることを特徴とする、遺伝子。
（ｄ）Ｌ−グルタミン：２−デオキシ−シロ−イノソースアミノ基転移酵素としての酵素活性を有するポリペプチドをコードし、（ｃ）の一部が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなることを特徴とする、遺伝子。
【請求項５】
２−デオキシ−シロ−イノソースを原料として、請求項２記載のＬ−グルタミン：２−デオキシ−シロ−イノソースアミノ基転移酵素を用いた触媒反応により２−デオキシ−シロ−イノサミンを製造する、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、２−デオキシ−シロ−イノソースを基質として、Ｌ−グルタミンのアミノ基を当該基質に転移して２−デオキシ−シロ−イノサミンを生成する、Ｌ−グルタミン：２−デオキシ−シロ−イノソースアミノ基転移酵素としての酵素活性を有するポリペプチド、および当該ポリペプチドをコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
２−デオキシ−シロ−イノサミンは、多数のアミノ配糖体抗生物質のアグリコンである２−デオキシストレプタミン生合成の重要中間体であり、またその不斉化学構造から、２−デオキシ−シロ−イノサミンは各種の医薬品製造に活用できると期待されている。従来の技術においては、上記のアミノ酸配糖体抗生物質の生合成研究の過程で、２−デオキシ−シロ−イノサミンが遮断変異体の培養液中に蓄積することが明らかにされていたが、その他の製造法は知られていなかった。また２−デオキシ−シロ−イノサミンは、２−デオキシ−シロ−イノソースのアミノ基転移反応で生成するものと考えられてきたが、その反応を触媒する酵素の構造及び性質に関する知見はほとんどなく、その酵素をコードする遺伝子も全く不明であった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
そのために、有用な２−デオキシ−シロ−イノサミンを製造する新たな方法を提供するために、２−デオキシ−シロ−イノソースのアミノ基転移反応を触媒する酵素を得ることが求められていた。そこで本発明の課題は、ブチロシン生産菌バチルス・サーキュランスに由来する、新規なＬ−グルタミン：２−デオキシ−シロ−イノソースアミノ基転移酵素、およびその酵素をコードする遺伝子を得ることである。バチルス種によって産生されるブチロシンの生合成経路を図１に示す。なお本願明細書においてＬ−グルタミン：２−デオキシ−シロ−イノソースアミノ基転移酵素とは、２−デオキシ−シロ−イノソースを基質として、アミノ基供与化合物であるＬ−グルタミンのアミノ基を転移させる反応を触媒することにより、２−デオキシ−シロ−イノソースを生成する酵素を意味する。
【０００４】
本発明の酵素の反応により生成する２−デオキシ−シロ−イノサミンは不斉な炭素六員環化合物であり、医薬をはじめとするさまざまな生理活性物質の構成要素及び合成原料として有用であると推定されている。本発明の目的は、このように多方面に有用である２−デオキシ−シロ−イノサミンをグルコースから短工程で製造する新規の方法として、ブチロシン生産菌であるバチルス・サーキュランス由来の生合成酵素による方法を明らかにし、その酵素反応の実施、酵素アミノ酸配列及び遺伝子塩基配列を解明することである。さらに本発明においては、類縁の２−デオキシストレプタミン含有抗生物質が他種類の放線菌によって生産されることから、それらの放線菌から類縁遺伝子を検索してその塩基配列を解明することも目指した。
【０００５】
アミノ配糖体抗生物質の中心アグリコンは、グルコースから２−デオキシ−シロ−イノソース及び２−デオキシ−シロ−イノサミンを経て生合成される２−デオキシストレプタミンであり、近縁のイノソース等を用いて、２−デオキシ−シロ−イノサミンを生合成するアミノ基転移反応が試みられてきた。しかしこれまで、アミノ基転移反応を触媒する酵素が具体的に精製単離されたことはない。この酵素を採取するにより新規のイノサミン類縁体が合成できる可能性があり、更には新規抗生物質を創製する途も開けるものと思われる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明の第一の観点として、配列表の配列番号１に示す、アミノ酸番号１−４１８で示すアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチドを提供する。Ｌ−グルタミン：２−デオキシ−シロ−イノソースアミノ基転移酵素としての酵素活性を有し、その一部が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチドもまた、本発明の範囲内である。更に、上記のポリペプチドをコードする遺伝子もまた、本発明の範囲内である。
【０００７】
本発明の第二の観点として、上記のポリペプチドから構成される、バチルス・サーキュランスＳＡＮＫ７２０７３由来のＬ−グルタミン：２−デオキシ−シロ−イノソースアミノ基転移酵素を提供する。
【０００８】
本発明の第三の観点として、配列表の配列番号２に示す、塩基番号１−１２５７で示される塩基配列からなることを特徴とする遺伝子を提供する。Ｌ−グルタミン：２−デオキシ−シロ−イノソースアミノ基転移酵素としての酵素活性を有するポリペプチドをコードし、その一部が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなることを特徴とする遺伝子もまた、本発明の範囲内である。
【０００９】
本発明の第四の観点として、２−デオキシ−シロ−イノソースを原料として、上記のＬ−グルタミン：２−デオキシ−シロ−イノソースアミノ基転移酵素を用いた触媒反応により、２−デオキシ−シロ−イノサミンを製造する方法を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
抗生物質ブチロシンを生産する菌であるバチルス・サーキュランス　ＳＡＮＫ７２０７３から明らかにした２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ）を基にして、染色体上のブチロシン生合成遺伝子クラスターを順次解析した。ｂｔｒＣ遺伝子は本発明者により同定されて、特許登録番号３１２２７６２号として登録されている。その結果、下記の実施例において述べられているように、新規な遺伝子であるｂｔｒＳを発見した。またその機能を研究するために、該遺伝子を異種細菌である大腸菌にて発現させた。
【００１１】
遺伝子塩基配列を基にしてｂｔｒＳ遺伝子産物のアミノ酸配列の相同性からその機能を推定した。その結果、ｂｔｒＳ遺伝子の産物はＬ−グルタミン：２−デオキシ−シロ−イノソースアミノ基転移酵素であると推定され、上記発現大腸菌から調製した無細胞酵素系を用いてその反応を実施し、その機能を確認した。このＬ−グルタミン：２−デオキシ−シロ−イノソースアミノ基転移酵素は新規な酵素であり、酵素蛋白質そのものが物質としても電気泳動的にも確認されたことはこれまで全くない。なお、バチルス・サーキュランスのＬ−グルタミン：２−デオキシ−シロ−イノソースアミノ基転移酵素のアミノ酸配列を図２と配列表の配列番号１に、それをコードする遺伝子の塩基配列を図３と配列表の配列番号２に示す。
【００１２】
更に、ｂｔｒＳに類似した遺伝子がアミノ配糖体抗生物質生産性の各種放線菌に存在しているか検索を行った。その結果、４種の放線菌、即ち（１）ストレプトミセス・フラディアエＩＦＯ１２７７３、（２）ストレプトミセス・フラディアエＩＦＯ１３１４７、（３）ストレプトミセス・カナマイセティカスＪＣＭ４４３３、（４）ストレプトミセス・リボシディフィカスＪＣＭ４９２３において、相同性を有する部分配列が存在していることが認められた。この知見は、医薬生産に寄与する微生物である各種の放線菌類において、本酵素遺伝子又はそれに類似した遺伝子が見出される可能性を強く示唆するものであり、抗生物質生合成遺伝子群の更に同定を可能ならしめるものである。よって、この相同部分の知見をもとにして、更に新たな抗生物質を探索するための強力なツールとすることができるであろう。
【００１３】
ストレプトミセス・フラディアエＩＦＯ１２７７３の酵素部分のアミノ酸配列を配列表の配列番号３に、それをコードする遺伝子を配列表の配列番号４に示す。また、ストレプトミセス・カナマイセティカスＪＣＭ４４３３の酵素部分のアミノ酸配列を配列表の配列番号５に、それをコードする遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号６に示す。また、ストレプトミセス・リボシディフィカスＪＣＭ４９２３のアミノ酸配列を配列表の配列番号７に、それをコードする遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号８に示す。なお、ストレプトミセス・フラディアエＩＦＯ１２７７３とストレプトミセス・フラディアエＩＦＯ１３１４７を比較したところ、酵素部分のアミノ酸配列と、それをコードする遺伝子の塩基配列が一致していた。
【００１４】
さらに、本発明者らは、既知の２−デオキシ−シロ−イノソースから、本酵素を用いて２−デオキシ−シロ−イノサミンを生成することに成功した。反応は、原料である２−デオキシ−シロ−イノソース、アミノ基供与化合物であるＬ−グルタミン、補酵素としてピロドキサールリン酸の存在下において行われ、緩衝液中で本発明の酵素を触媒として反応させることにより、不斉炭素六員環アミンである２−デオキシ−シロ−イノサミンが調製できる。そのダンシル誘導体あるいは２、４−ジニトロベンゼン誘導体として液体クロマトグラフィーによる分析で、本物質の生成を確認した。さらに核磁気共鳴分析及び質量分析によって２−デオキシ−シロ−イノサミン自身の確認を行った。不斉炭素六員環アミンである２−デオキシ−シロ−イノサミンは既知の物質であるが、上記で述べたように有機合成の原料として有用性がある。
【００１５】
本発明者らは既に、グルコースをヘキソキナーゼとアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を同一容器内で作用させてグルコース−６−リン酸を生成せしめ、これと２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素を反応させることにより、２−デオキシ−シロ−イノソースを調製できることを確認している。この２−デオキシ−シロ−イノソース生産系に、本発明のＬ−グルタミン：２−デオキシ−シロ−イノソースアミノ基転移酵素を追加することにより、グルコースを出発原料として２−デオキシ−シロ−イノサミンを直接生産することができる可能性があり、短い工程で容易に２−デオキシ−シロ−イノサミンを得ることができる。
【００１６】
また、本発明のＬ−グルタミン：２−デオキシ−シロ−イノソースアミノ基転移酵素のポリペプチドは、配列表の配列番号１に示す、アミノ酸番号１−４１８で示すアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチドである。配列表の配列番号１記載のポリペプチドはバチルス・サーキュランスＳＡＮＫ７２０７３由来のＬ−グルタミン：２−デオキシ−シロ−イノソースアミノ基転移酵素である。この酵素は上述した様に、２−デオキシ−シロ−イノソースを基質として、アミノ基供与化合物であるＬ−グルタミンのアミノ基を転移させる反応を触媒することにより、２−デオキシ−シロ−イノソースを生合成する反応を触媒する。
【００１７】
配列表の配列番号１に示すポリペプチドの一部が欠失、置換若しくは付加されたポリペプチドとは、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１０個以下、好ましくは５個以下、更に好ましくは２個以下の塩基が置換されたポリペプチドである。また、その様なポリペプチドと配列番号１に示すアミノ酸配列とは、９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましく９９％以上の相同性を有する。その様なポリペプチドも、Ｌ−グルタミン：２−デオキシ−シロ−イノソースアミノ基転移酵素としての活性を有する限り、本発明の範囲内である。
【００１８】
本発明のＬ−グルタミン：２−デオキシ−シロ−イノソースアミノ基転移酵素遺伝子は、配列表の配列番号２に示す、塩基番号１−１２５７で示される塩基配列からなることを特徴とする遺伝子である。
【００１９】
遺伝子組み換え技術によれば、基本となるＤＮＡの特定の部位に、当該ＤＮＡの基本的な特性を変化させることなく、あるいはその特性を改善する様に、人為的に変異を起こすことができる。本発明により提供される天然の塩基配列を有する遺伝子、あるいは天然のものとは異なる塩基配列を有する遺伝子に関しても、同様に人為的に挿入、欠失、置換を行う事により、天然の遺伝子と同等のあるいは改善された特性を有するものとすることが可能であり、本発明はそのような変異遺伝子を含むものである。
【００２０】
即ち、配列表の配列番号２に示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号２に示す塩基配列において、１０個以下、好ましくは５個以下、更に好ましくは２個以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列番号２に示す塩基配列とは、９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有する。その様な遺伝子も、Ｌ−グルタミン：２−デオキシ−シロ−イノソースアミノ基転移酵素としての活性を有するポリペプチドをコードしている限り、本発明の範囲内である。またその様な遺伝子は、配列番号２に示す塩基配列の遺伝子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【００２１】
【実施例】
（微生物）
バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）ＳＡＮＫ７２０７３　を培養した。大腸菌ＪＭ１０９　をＬＢ培地中で、又は必要に応じて５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んでいるＬＢ培地中で培養した。
【００２２】
（インバースＰＣＲ　によるｂｔｒＭの上流領域のクローニング）
Ｏｔａらの述べた（Ｏｔａ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ，　Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　５３：１１５８−１１６７，　２０００）配列に基づいて、２つのオリゴヌレオチドプライマーである、ＨＨ５−１　（ＧＴＣＡＴＴＧＹＧＣＣＡＧＡＴＡＴＣＣＧＡＡＡＴＡＴＧＣＴ）とｂｔｒＭｆ−１　（ＧＧＴＴＴＧＡＴＣＣＧＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＴＧＣＡ）を設計した。バチルス・サーキュランスのＤｒａ−Ｉ　で消化した染色体ＤＮＡ　をフェノール、クロロフォルムで抽出し、その混合液を自己ライゲーションにかけた。得られた環状ＤＮＡ　を増幅のための鋳型として用いた。ＰＣＲ　の条件は、９５℃で１０分間を１サイクル、続いて９５℃で１分間、５５℃で１分間と７２℃で５分間を３０サイクル、そして７２℃で７分間であり、ＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ（アプライドバイオシステム）を使用した。ＰＣＲ　産物をｐＴ７−ｂｌｕｅ　Ｔベクター（ノバゲン）にサブクローニングし、得られたプラスミド（ｐＤＳ１６　）の配列決定を行った。少なくとも３つの個別クローンを、そのようにして解析した。
【００２３】
（大腸菌中でのｂｔｒＳの発現）
ｂｔｒＳ−ｆプライマー（ＴＴＣＡＴＡＴＧＡＣＣＡＴＴＣＣＡＴＴＴＧＡＣＣＡ）とｂｔｒＳ−ｒプライマー（ＡＡＧＧＡＴＣＣＴＴＣＧＴＴＡＡＴＧＡＧＴＣＡＣＧ）を設計し、ＰＣＲ　に使用した。ＰＣＲ　は、９８℃で５分間を１サイクル、続いて９８℃で１０秒間、７２℃で１．５　分間を３０サイクル、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡポリメラーゼ（タカラ、東京）を用いて行った。ＰＣＲ　産物を５’−　リン酸化し、ｐＵＣ１１９にサブクローニングしてｐＵＣｂｔｒＳ　を得た。ｐＵＣｂｔｒＳ　を有している大腸菌ＪＭ１０９　を、ＯＤ６００　が０．６　になるまで５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んでいるＬＢ培地中で培養し、β−Ｄ−　チオガラクトピラノシドを最終濃度が１ｍＭ　になるまで添加した。４時間後に遠心分離（１０，０００ｘｇ，　１０分）によって細胞を回収し、使用するまで−３０　℃貯蔵した。
【００２４】
（酵素アッセイ）
大腸菌ｐＵＣｂｔｒＳ　と大腸菌ｐＵＣ１１９（コントロールとして）を別々に５０ｍＭ　ＢＥＳ−ＮａＯＨ　（ｐＨ　７．７）緩衝液の中に懸濁し（１５０ｍｌ　中に５ｇの湿細胞）、ブランソンソニファイアーＴｙｐｅ−２５０を用いて、その懸濁液を氷浴中で２分間１０回超音波破砕した（０℃）。破砕物を１２，０００ｘｇで３０分間遠心分離し、得られた無細胞抽出液を酵素解析のために使用した。反応混合液は、５０ｍＭ　ＢＥＳ−ＮａＯＨ　（ｐＨ　７．７）、２５ｍＭ　Ｌ−　グルタミン、０．５ｍＭ　ピリドキサールリン酸、５ｍＭ　ＤＯＩ　と１００　μｌ　の無細胞抽出液を含み、全量を２００　μｌ　とした。混合液を３７℃で３時間インキュベートし、マイクロコンＹＭ−１０　（ミリポア、ＵＳＡ　）を通じて濾過し、蛋白を除去した（１０，０００ＭＷ以上）。
【００２５】
ダンシルクロライド（ＣＨ３ＣＮ　中に５ｍｇ／ｍｌ、７５μｌ　）と２Ｎ　ＮａＯＨ　（１５μｌ　）を、同量の各々の酵素反応混合液に添加した。誘導体化を３７℃で１．５　時間行い、５μｌ　の反応混合液を、センシューパック　ＯＤＳ　１２５１Ｎカラム（内径１．６ｍｍ　ｘ　２５ｃｍ，　センシュウ化学、日本）を備えたＨＰＬＣシステムに注入した。溶出液は、０．２Ｍの酢酸ナトリウムに溶解した２０％　ＣＨ３ＣＮ　であり、１ｍｌ／分の流速を有する。ヒタチＬ−７４８５ＦＬ　検出器、ヒタチカラムオーブンＬ−７３００とヒタチＤ−２５００インテグレーターを備えたヒタチＬ−７１００ポンプで、ＨＰＬＣを行った。蛍光検出器を用いて溶出を検出した（励起：３３１ｎｍ　、蛍光発光：　５２３ｎｍ　）。
【００２６】
（２−デオキシ−シロ−イノサミンの大量調製）
大腸菌ｐＵＣｂｔｒＳ　（１０ｍｌ）の無細胞抽出液、０．５ｍＭ　ピリドキサールリン酸、２５ｍＭＬ−　グルタミン、５ｍＭ　ＤＯＩ　と５０ｍＭ　ＢＥＳ−ＮａＯＨ　（ｐＨ　７．７）緩衝液の混合液を、全量を２０ｍｌとして３７℃で３日間インキュベートした。反応産物を、Ｄｏｗｅｘ　５０Ｗ　Ｘ−８　（Ｈ＋　）　上で、０．１Ｎ　ＨＣｌから０．７Ｎ　ＨＣｌまでグラジエント溶出しながらクロマトグラフィー解析し、１．３ｍｇ　の精製された２−デオキシ−シロ−イノサミンを塩酸塩として得た。１３Ｃ−ＮＭＲ　（Ｄ２Ｏ）：３３．３，　５０．７，　６９．５，　７３．８，　７５．２，　７７．１
【００２７】
（試薬と材料）
ＤＮＡ　の操作は文献中で述べられた様に行った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ　ｅｄｓ．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。ＤＮＡ　配列解析は、ＬＯＮＧ　ＲＥＡＤＩＲ　４２００　（Ｌｉ−Ｃｏｒ）　を用いてプロトコールに従って行った。ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲシステム９７００（アマシャムファルマシア）を用いてＰＣＲ　を行った。ＰＣＲ　プライマーのためのオリゴＤＮＡ　は、アマシャムファルマシアに注文して合成した。プラスミドの精製はＧＦＸ　Ｍｉｃｒｏ　プラスミドキット（アマシャムファルマシア）を用いて行った。制限分解と修飾の酵素はタカラ（日本）より購入した。ゲノムＤＮＡ　抽出は「Ｇｅｎとるくん」（タカラ）で行った。遺伝解析はＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ　ｖｅｒ．３　（ソフトウェアディベロップメント、日本）により行い、データベース検索はインターネット上でＦＥＳＴＡ　とＢＬＡＳＴ２により行った。
【００２８】
ＤＯＩ（２−デオキシ−シロ−イノソース）　は過去に述べた様（Ｙａｍａｕｃｈｉ　Ｎ．　ｅｔ　ａｌ，　Ｊ．　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　４５：７５６−７６６，　１９９２）にして合成した。１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲ　スペクトルをＪＥＯＬ　ＡＬ−４００　分光計に記録した。ＮＭＲ　の化学シフトを、対照である内部ＴＭＳ　（０ｐｐｍ）又は溶媒シグナル（ＣＤＣｌ３　δＣ＝７７．０；　Ｄ２Ｏ　δＨ＝４．６５；　ＣＤ３ＯＤδＨ＝３．３０，δＣ＝４９．０）に基づいてδ値を得た。Ｄ２Ｏ　が溶媒であるとき、ジオキサンを内部標準（δＣ＝６７．４）として使用した。メルクのキーゼルゲル６０（商品番号７７３４）を用いて、カラムクロマトグイラフィーを行った。調製用薄層クロマトグラフィーを、メルクのキーゼルゲル６０　Ｆ２５４　プレート（商品番号５７４４）を用いて行った。他の全ての試薬は市販の最高品質を用いた。
【００２９】
（（±）−２−デオキシ−シロ−イノサミンの合成）
触媒による水素化反応を除いて、全ての反応を不活性ガス（アルゴン又は窒素）の雰囲気下で行った。なお下記の化合物番号は、図７における番号である。
【００３０】
ＤＬ−１，２，４／３，５−テトラベンジルオキシシクロヘキサン−１−オール（２）
乾燥したＴＨＦ（３ｍｌ）に溶解した２−デオキシ−シロ−イノソース（１）の溶液（２１７ｍｇ，　０．４１６ｍｍｏｌ）に、Ｓｕｐｅｒ−Ｈｙｄｒｉｄｅ（登録商標、１．０Ｍ　ＴＨＦ溶液０．７０ｍｌ，　０．６４ｍｍｏｌ）を、−７８℃でゆっくりと添加した。その混合液を−７８℃で２時間攪拌した。その混合液を水と２ｍｌの２Ｎ　ＨＣｌで希釈し、ＥｔＯＡｃ（５０ｍｌ　ｘ　２）で抽出した。抽出した有機層を混合してＮａＣｌで飽和した水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過をして溶媒を除去した後にシリカゲルクロマトグラフィーで残査を精製し（ヘキサン−ＥｔＯＡｃ、７：１）、２が２０２ｍｇ得られた（収率９３％）。ＩＲ（ＣＨＣｌ３）ｃｍ−１　３０６６，２９２７，１４５４，１３６５，１０７０，１０２８；　１Ｈ−Ｍ　（ＣＤＣ１３）　δ　１．３４　（１Ｈ，　ｔ，Ｊ＝　１０　Ｈｚ），　２．３５　（１Ｈ，　ｄｔ，Ｊ＝　４．０　ａｎｄ　１０　Ｈｚ），　２．４４　（ＯＨ，　ｂｒ），　３．４８　（２Ｈ，　ｍ），　３．８３　（１Ｈ，　ｔ，　Ｊ＝　９．６　Ｈｚ），　３．９４　（１Ｈ，　ｄｄｄ，Ｊ＝４．ｉ，　９．２　ａｎｄ　１２　Ｈｚ），　４．ｌｌ　（１Ｈ，　ｍ），　４．８０　（８Ｈ，　ｍ，　ＰｈＣＨ２０−），　７．３３　（２０Ｈ，　ａｒｏｍａｔｉｃ）；　１３Ｃ−ＮＭＲ　（ＣＤＣｌ３）　δ３２．４，　６５．８，　７２．７，　７２．８，　７５．６，　７６．６，　８１．５，　８２．７，　８５．７，　１２７．４，　１２７．４，　１２７．７，　１２７．８，　１２７．９，　１２８．２，　１２Ｓ．２，　１２Ｓ．４，　１３７．９，　１３８．６，　１３８．７，　１３８．８　Ａｎａｌ．　Ｃａｌｃｄ．　ｆｏｒ　Ｃ３４Ｈ３６０５：　Ｃ，７７．８４；　Ｈ，６．９２．　Ｆｏｕｎｄ：　Ｃ，　７８．０４；　Ｈ　６．９２
【００３１】
ＤＬ−１，２，４／３，５−テトラベンジルオキシシクロヘキシルメタン　スルフホナート（３）
ＤＬ−１，２，４／３，５−テトラベンジルオキシシクロヘキサン−１−オール（２）（１５１ｍｇ，０．２８８ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（２．５ｍｌ）にＤＭＡＰ（１０ｍｇ，　０．０８２ｍｍｏｌ）とメタンスルフォニルクロライド（ＭｓＣｌ，　４９μｌ，　０．６３ｍｍｏｌ）を添加した。その混合液を室温で１９時間攪拌した。その混合液に更にＭｓＣｌ（２５μｌ，　０．３２ｍｍｏｌ）とピリジン（１．５ｍｌ）を添加し、攪拌を３時間継続した。その混合液を０℃において水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した（４０ｍｌ　ｘ　２）。抽出した有機層を混合して、２Ｎ　ＨＣｌ、ＮａＨＣＯ３で飽和した水とＮａＣｌで飽和した水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過をして溶媒を除去した後にヘキサン−ＥｔＯＡｃから結晶化し、３が１２７ｍｇ得られた（収率７３％）。ｍｐ　７６〜７８　℃；　ＩＲ　（ＣＨＣｌ３）　ｃｍ−１　２９２７，　２８７１，　１４５４，　１３６３，　１１７３；　ｌＨ−ＮＭＲ　（ＣＤＣｌ３）δ１．５４　（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝２．０　ａｎｄ　１２　Ｈｚ），　２．４７　（１Ｈ，　ｄｔ，Ｊ＝４．４　ａｎｄ　１２Ｈｚ），２．９７　（３Ｈ，ｓ），３．５１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），３．５３　（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），　３．８０　（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），　３．９０　（１Ｈ，　ｄｄｄ，　Ｊ＝　４．４，　９．２　ａｎｄ　１２　Ｈｚ），　４．６８　（４Ｈ，　ｍ，　ＰｈＣＨ２０−），　４．８７　（４Ｈ，　ｍ，　ＰｈＣＨ２０−），　５．１６　（１Ｈ，　ｍ）　７．３１　（２０Ｈ，　ａｒｏｍａｔｉｃ）；　１３Ｃ−Ｍ　（ＣＤＣｌ３）　δ３２．４，　３８．７，　７２．８，　７３．２，　７５．８，　７６．４，　７６．５，　８０．３，　８０．８，　８５．１，　１２７．３，　１２７．４，　１２７．５，　１２７．５，　１２７．６，　１２７．７，　１２７．８，　１２７．９，　１２８．１，　１２８．１，　１２８．２，　１３７．０，　１３７．９，１３Ｓ．１，　１３８．３　Ａｎａｌ．　Ｃａｌｃｄ．　ｆｏｒ　Ｃ３５Ｈ３８０７Ｓ：　Ｃ，　６９．７９；　Ｈ．６．３５；　Ｓ，５．３２　Ｆｏｕｎｄ：　Ｃ，６９．５４；　Ｈ，６．０９；　Ｓ　５．ｌ６
【００３２】
ＤＬ−１，２，５／２，４−１−アジド−２，３，４，５−テトラベンジルオキシシクロヘキサン（４）
ＤＬ−１，２，４／３，５−テトラベンジルオキシシクロヘキシルメタンスルフォン酸（３）（１２７ｍｇ，　０．２１０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（３ｍｌ）にアジ化ナトリウム（１４１ｍｇ，　２．１７ｍｍｏｌ）を添加した。その混合液を５０℃で４時間、そして７０℃で１４時間攪拌した。その混合液にアジ化ナトリウム（５２．７ｍｇ，　．８１１ｍｍｏｌ）を更に添加し、攪拌を７０℃で５時間継続した。その混合液を水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した（３０ｍｌ　ｘ　２）。抽出した有機層を混合してＮａＣｌで飽和した水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過をして溶媒を除去した後にシリカゲルクロマトグラフィーで残査を精製し（ヘキサン−ＥｔＯＡｃ、７：１）、４が１０９ｍｇ得られた（収率９４％）。Ｍｐ　７３−７６℃，ＩＲ（ＣＨＣｌ３）　ｃｍ−１　２８７３，　２１０３，　１４５４，　１３６３，　１０６８，　ｌＯ２７；　１Ｈ−Ｍ　（ＣＤＣｌ３）　δ１．３４　（１Ｈ，　ｔ，Ｊ＝　１０　Ｈｚ），　２．３５　（１Ｈ，　ｄｔ，Ｊ＝４．０　ａｎｄ．　１０　Ｈｚ），　２．４４　（ＯＨ，　ｂｒ），　３．４８　（２Ｈ，ｍ），　３．８３　（１Ｈ，　ｔ，　Ｊ＝　９．６Ｈｚ），　３．９４　（１Ｈ，　ｄｄｄ，　Ｊ＝　４．８，　９．２，　ａｎｄ　１２Ｈｚ），　４．ｌｌ（１Ｈ，　ｍ），　４．８０　（８Ｈ，　ｍ，　ＰｈＣＨ２０−），　７．３３　（２０Ｈ，　ａｒｏｍａｔｉｃ）；　１３Ｃ−ＮＭＲ　（ＣＤＣｌ３）　δ３３．９，　６１．２，　７３．８，　７７．９，　７８．２，　７８．５，　７８．７，　８４．９，　８５．６，　８６．３，　１２８．７，　１２８．８，　１２８．９，　１２８．９，　１２９．０，　１２９．３，　１２９．５，　ｌ２９．５，　１２９．５，　ｌ３８．８，　１３９．２，　１３９．４，　１３９．５，　Ａｎａｌ．　Ｃａｌｃｄ．　ｆｏｒ　Ｃ３４Ｈ３５０４Ｎ３：　Ｃ，　７４．７９；Ｈ，　６．４２；　Ｎ，　７．６４．　Ｆｏｕｎｄ：　Ｃ，　７４．０１；　Ｈ，　６．４９；　Ｎ，　７．６５．
【００３３】
（±）−２−デオキシ−シロ−イノサミンＨＣｌ（５）
最小量のＥｔＯＡｃに溶解したＤＬ−１，２，５／２，４−１−アジド−２，３，４，５−テトラベンジルオキシシクロヘキサン（４）（３０４ｍｇ，　０．５５３ｍｍｏｌ）の溶液に、ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ−１Ｎ　ＮＣｌ（１．０ｍｌ−０．３９ｍｌ−０．１５ｍｌ）と１．１１ｇの１０％Ｐｄ−Ｃ（アルドリッチ、ＵＳＡ）を添加し、その混合液を圧力反応容器中に置いた。その雰囲気を最初は水素ガスに置き換え、そして加圧した水素ガスを充填した（５０ｋｇｆ／ｃｍ２）。これらの条件下で、室温で４日間、その混合液を激しく攪拌した。触媒を除去した後、同じ操作を繰り返した。その触媒を濾過で除去し、濾液を真空下でエバポレートし、５の黄色い固体を得た。その固体をアセトン中に懸濁して濾過した。沈殿物を更にメタノールで洗浄し、白い固体として５が得られた（１０８ｍｇ，　９８％）。以下、上記の方法により得られた実験結果を示す。１Ｈ−ＮＭＲ　（４００　ＭＨｚ，　Ｄ２０）　δ１．４５　（１Ｈ，　ｄｄｄ，　Ｊ＝　１２．４，　１２．４　ａｎｄ　４．４　Ｈｚ），　２．１４　（１Ｈ，　ｄｄｄ，　Ｊ＝　１２．４，　４．４　ａｎｄ　４．４　Ｈｚ），　３．０６　（１Ｈ，　ｄｄｄ，　Ｊ＝　１２．４，　１０．６　ａｎｄ　４．４　Ｈｚ），　３．０７　（１Ｈ，　ｑ，　Ｊ＝　９．６　Ｈｚ），　３．１６　（２Ｈ，　ｍ），　３．３２　（１Ｈ，　ｍ），　３．４７　（１Ｈ，　ｍ）；　１３Ｃ−ＮＭＲ　（Ｄ２０）　３３．２，　５０．８，　６９．４，　７３．７，　７５．２，　７７．０
【００３４】
（ｂｔｒＭの上流領域の同定）
ｂｔｒＭ（推定上のグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子）の上流領域をインバースＰＣＲにより解析した（図４）。図４は、ｂｔｒＭの上流領域の遺伝地図であり、矢印はインバースＰＣＲのプライマーの位置を示す。ＢｔｒＭ遺伝子のすぐ上流に位置するＢｔｒＮ遺伝子は、ＦＥＳＴＡとＢＬＡＳＴ２の解析において、いずれの既知の配列とも相同性を示さなかった。ＢｔｒＮの更に上流にＢｔｒＳ遺伝子が見出された。図５に示される通り、ＢｔｒＳ遺伝子はストレプトマイセス・グリセウスのｓｔｓＣと顕著な相同性を示した（ＦＥＳＴＡにおいて４０％相同性）。なお、ストレプトマイセス・グリセウスのｓｔｓＣは、ストレプトマイシンの生合成におけるＬ−グルタミン−シロ−イノソースアミノトランスフェラーゼの遺伝子をコードしている。ＢｔｒＳはブチロシン生合成酵素クラスターの構成成分であることが示され、ＢｔｒＳの機能は、図６に示す反応を触媒しているＬ−グルタミンＤＯＩアミノトランスフェラーゼであると推定された。図６において、（Ａ）はＢｔｒＳの機能を、（Ｂ）はＳｔｓＣの機能を示す。過去において、ＤＯＳを含んでいるいくつかのアミノグリコシド産物の無細胞抽出物中において、Ｌ−グルタミン由来のケトサイクリトールのトランスアミネーション活性が述べられてきた。しかし、酵素も対応する遺伝子も同定されていない。
【００３５】
（Ｌ−グルタミン　ＤＯＩアミノトランスフェラーゼの確認）
ＢｔｒＳの機能を確立するために、提案された基質であるオーセンティックな（±）−２−デオキシ−シロ−イノサミンを合成した（図７）。図７は２−デオキシ−シロ−イノサミンの化学合成の過程を示す図である。アミンをダンシルクロライドにて誘導とし、蛍光検出のために使用した。大腸菌を用いてＢｔｒＳ遺伝子を発現させた。対応するＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅し、発現ベクターｐＵＣ１１９に挿入し、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した。大腸菌／ｐＵＣｂｔｒＳ由来の無細胞抽出液のＬ−グルタミン　ＤＯＩアミノトランスフェラーゼ活性を、上記に記載した方法で検討した。酵素反応生成物をダンシルアミドに誘導し、合成した（±）−２−デオキシ−シロ−イノサミンの真性誘導体とＨＰＬＣで比較した。
【００３６】
図８は、無細胞抽出物（Ａは大腸菌／ｐＵＣｂｔｒＳ由来、Ｂは大腸菌／ｐＵＣ１１９由来）を用いた酵素反応由来のダンシル誘導体と、オーセンティックなダンシル化２−デオキシ−シロ−イノサミン（図８Ｃ）のＨＰＬＣプロファイルを示す。図８において矢印は、２−デオキシ−シロ−イノサミンのピークである。酵素反応産物と真性サンプルの両者は同様に約１４分に溶出し、大腸菌／ｐＵＣ１１９の無細胞システムを用いたところ、ピークは検出されなかった。更に、大規模のインキュベーションもまた上記の方法で行われた。２−デオキシ−シロ−イノサミン産物を１Ｈと１３Ｃ−ＮＭＲのみならず、ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ　１６４［Ｍ＋Ｈ＋］）を用いて同定した。全てのデータはオーセンティックなスタンダードと同じであった。これらの結果は明らかに、ＢｔｒＳはブチロシンの生合成に必要とされるＬ−グルタミン　ＤＯＩアミノトランスフェラーゼであることを示している。
【００３７】
また、ＰＣＲに基づいたアプローチによって、ＤＯＳ（２−デオキシストレプトアミン）を含んでいるアミノグリコシドを産生するいくつかのストレプトミセスにおいて、ＢｔｒＳに相同な遺伝子の同定を行った。
【００３８】
ストレプトミセス・フラディアエＩＦＯ１２７７３（ネオマイシン産生菌）、ストレプトミセス・フラディアエＩＦＯ１３１４７（ネオマイシン産生菌）、ストレプトミセス・カナマイセティカスＪＣＭ４４３３（カナマイシン産生菌）、ストレプトミセス・リボシディフィカスＪＣＭ４９２３（リボスタマイシン産生菌）およびストレプトミセス・リビダンスＴＫ２４（非産生菌）をベネットの培地（１Ｌの水に１ｇ　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、１ｇＢｅｅｆ　ｅｘｔｒａｃｔ、２ｇのＮＺアミン、１０ｇのグルコース、ｐＨ７．３）中で別々に培養した。大腸菌ＪＭ１０９株を、ＬＢ培地又は必要に応じて５０μｇのアンピシリンを含むＬＢ培地中で培養した。
【００３９】
ＤＮＡの配列決定は、ＬＯＮＧ　ＲＥＡＤＩＲ　４２００（Ｌｉ−Ｃｏｒ）を用いて、製造業者のプロトコールに従って行った。ＰＣＲは、ＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ　ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲシステムにより行った。ＰＣＲプライマーのためのオリゴＤＮＡは、アマシャムファルマシアに受託合成させた。プラスミドの精製は、ＧＥＦマイクロプラスミドプレップキット（アマシャム）を用いて行った。制限酵素と修飾酵素は、タカラ（日本）から購入した。ゲノム調製は「Ｇｅｎとるくん」により行った（タカラ）。ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ　ｖｅｒ３（ソフトウェアディベロップメント、日本）を用いて遺伝解析を行い、データベース検索はインターネット上で、ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴ２によって行った。インターネット上でＣＬＵＳＴＡＬＷプログラムを用いて、ネイバージョイニング法により、進化系統樹を構築した。他の全ての試薬は市販の最高級品であった。
【００４０】
ＤＯＳを含んでいるアミノグリコシドを産生するいくつかのストレプトミセスにおいてＢｔｒＳに相同物を同定するために、異なった５つのプライマー（ｂｔｒＳ１ｆ，ｂｔｒＳ２ｆ，ｂｔｒＳ３ｒ，ｂｔｒＳ４ｒ）を、ＢｔｒＳとｓｔｓＣの良く保存された領域から設計した。それらプライマーの２つを用いて、アミノグリコシド産生菌（ストレプトミセス・フラディアエＩＦＯ１２７７３、ストレプトミセス・フラディアエＩＦＯ１３１４７、ストレプトミセス・カナマイセティカスＪＣＭ４４３３、ストレプトミセス・リボシディフィカスＪＣＭ４９２３）又は非産生菌（ストレプトミセス・リビダンスＴＫ２４）の染色体を鋳型として用いて、宿重ＰＣＲ（９５℃で１０分を１サイクル、続いて９５℃で１分、３０℃又は３５℃で１分、そして７２℃で１分を４０サイクル、そして７２℃で７分）を行った。
【００４１】
ストレプトミセス・フラディアエＩＦＯ１２７７３、ストレプトミセス・フラディアエＩＦＯ１３１４７、ストレプトミセス・リボシディフィカスＪＣＭ４９２３の染色体を鋳型として用いて、ｂｔｒＳ１ｆとｂｔｒＳ４ｒをプライマーとして用いてＰＣＲ増幅が観察された。アミドグリコシド産生菌の全ての場合において、ｂｔｒＳ３ｆとｂｔｒＳ４ｒをプライマーとして用いところ同様であった。対照的に、アミドグリコシド非産生菌であるストレプトミセス・リビダンスＴＫ２４の染色体を鋳型として用いて類似の実験を行ったが、全ての場合において増幅は起こらなかった。各ＰＣＲ産物はｐＴ７−ｂｌｕｅ　Ｔベクター（ノバジェン）にサブクローニングされ、そのようにして得られたプラスミドの配列決定を行った。ＰＣＲでのミスマッチが入ることを避けるために、少なくとも３つの個々のクローンを解析した。
【００４２】
それらの産物を配列決定することにより、これらのストレプトミセス属のｂｔｒＳホモログが明確に同定された（図９）。図９において、Ｓｆｒａはストレプトミセス・フラディアエを、Ｓｋａｎａはストレプトミセス・カナマイセティカスを、Ｓｒｉｂｏはストレプトミセス・リボシディフィカスを、ＢｔｒＳはバチルス・サーキュランスを、ＳｔｓＣ（Ｙ０８７６３）はストレプトミセス・グリセウスを示す。ストレプトミセス・フラディアエＩＦＯ１２７７３とストレプトミセス・フラディアエＩＦＯ１３１４７のゲノム由来のＰＣＲ断片は、同一のものであった。その結果に基づき系統発生樹が構築され、それは、ＤＯＳを含んでいるアミノグリコシドを産生する生物は近縁の関係にあることが示した。
【００４３】
加えて、ストレプトマイシン及びスペクチノマイシン生合成遺伝子を含む他の関連した遺伝学的情報と、ストレプトミセス・セリカラー由来の推定上の読み枠も比較した（図１０）。図１０において、ＢｔｒＳ、Ｓｆｒａ、Ｓｋａｎａ、Ｓｒｉｂｏ、ＳｔｓＣ（Ｙ０８７６３）は図９と同じであり、ＳｐｃＥ（Ｕ７０３７６）はストレプトミセス・フラボペルシカス、ＳｐｃＳ２（ＡＦ１４５０３９）はストレプトミセス・スペクタビリス、Ｓｃｏｅｌｉはストレプトミセス・コエリカラー由来のＳＣ７Ｃ７．０１を示す。結果として、バチルス・サーキュランスのＢｔｒＳと比較して、ストレプトマイシンおよびスペクチノマイシン生合成酵素において、これらの遺伝子がより近い関係にあることが観察された。これらの二次的な代謝特異的遺伝子は比較的古い遺伝子に由来するようであり、垂直又は水平に複雑に進化したようである。
【００４４】
本発明において、バチルス・サーキュランスに由来するブチロシン生合成遺伝子クラスターのＬ−グルタミン　ＤＯＩアミノトランスフェラーゼ遺伝子（ｂｔｒＳ）が同定され、発現した蛋白質の酵素活性を確認した。ケトサクリトールへのトランスアミネーションは、アミノグリコシド抗生物質の生合成経路において特異であるから、ＤＯＳを含んでいる他のアミノグリコシド産物において類似の遺伝子が見出されることが期待される。そこで、この遺伝子はアミノグリコシド産物をスクリーニングするための有用な遺伝子マーカーとなり得ると思われる。
【００４５】
【発明の効果】
本発明により、バチルス・サーキュランスに由来するＬ−グルタミン：２−デオキ４−シロ−イノソースアミノ基転移酵素のポリペプチド、および当該ポリペプチドをコードする遺伝子が与えられた。本発明の酵素を用いることにより、２−デオキシ−シロ−イノソースを原料として、多方面に有用である２−デオキシ−シロ−イノサミンを容易に大量に生産にすることが可能となる。また本発明の遺伝子を、他のアミノグリコシド産物をスクリーニングするためのツールとして用いることができる。
【００４６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、バチルス種のブチロシン生合成の経路を示す図である。
【図２】図２は、バチルス・サーキュランスのＬ−グルタミン：２−デオキシ−シロ−イノソースアミノ基転移酵素のアミノ酸配列を示す図である。
【図３】図３は、バチルス・サーキュランスのＬ−グルタミン：２−デオキシ−シロ−イノソースアミノ基転移酵素をコードする遺伝子の塩基配列を示す図である。
【図４】図４は、ｂｔｒＭの上流領域の遺伝地図の模式図である。
【図５】図５は、ＢｔｒＳとストレプトマイセス・グリセウスのｓｔｓＣの推定アミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図６】図６は、ＢｔｒＳの機能（Ａ）とＳｔｓＣの機能（Ｂ）を示す図である。
【図７】図７は、２−デオキシ−シロ−イノサミンの化学合成の過程を示す図である。
【図８】図８は、無細胞抽出物を用いた酵素反応に由来するダンシル誘導体のＨＰＬＣプロファイルを示す図である。
【図９】図９は、ＢｔｒＳホモログのアラインメントを示す図である。
【図１０】図１０は、ＢｔｒＳホモログの系統発生樹を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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