(57)【要約】【課題】ミオ−イノシトールの酸化で得られるシロ−イノソースを、Ｄ−キロ−イノソースに変換できる新しい酵素を発見し、またシロ−イノソースから出発してＤ−キロ−イノシトールを効率よく製造できる新しい方法を開発することが目的である。【解決手段】シロ−イノソースをＤ−キロ−イノソースに変換できる酵素活性をもつシロ−イノソースイソメラーゼ、特に配列表の配列番号１または２のアミノ酸配列をもつタンパク質からなるシロ−イノソースイソメラーゼが得られた。該イソメラーゼをコードする配列番号３または４のＤＮＡを包有するＤＮＡ断片が遺伝子工学的手法で得られた。さらに、該シロ−イノソースイソメラーゼをシロ−イノソースに作用させてＤ−キロ−イノソースを生成し、さらに後者を化学的に還元してＤ−キロ−イノシトールに転化することから成る、Ｄ−キロ−イノシトールの新しい製法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の特性（１）、（２）および（３）を有するシロ−イノソースイソメラーゼ。
（１）作用：下記の式（Ｉ）のシロ−イノソースを下記の式（ＩＩ）のＤ−キロ−１−イノソースへ変換させ且つ後者を前者に変換させる相互変換の平衡的反応を触媒する。
2004329081.tif 000013
（２）至適ｐＨ：ｐＨ  ５〜ｐＨ  ９、好ましくはｐＨ  ６〜ｐＨ  ８
（３）活性化因子：Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋またはＣｏ２＋である活性化因子によって活性化される。
【請求項２】
配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質である、請求項１に記載のシロ−イノソースイソメラーゼ。
【請求項３】
配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質である、請求項１に記載のシロ−イノソースイソメラーゼ。
【請求項４】
シロ−イノソースとＤ−キロ−１−イノソースとの相互変換の平衡的反応を触媒する作用を有する酵素であって、配列表の配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列のうちの１個ないし数十個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列をもつシロ−イノソースイソメラーゼ。
【請求項５】
シロ−イノソースを含有する水溶液に、請求項１、２または３あるいは請求項４に記載のシロ−イノソースイソメラーゼを作用させて、シロ−イノソースをＤ−キロ−１−イノソースへ異性化させる酵素反応を行う工程と、その酵素反応溶液から酵素を回収する工程と、酵素の回収後に得た残液からＤ−キロ−１−イノソースを回収する工程と、回収したＤ−キロ−１−イノソースを精製する工程からなる、Ｄ−キロ−１−イノソースの製造方法。
【請求項６】
シロ−イノソースを含有する水溶液に、請求項１、２または３あるいは請求項４に記載のシロ−イノソースイソメラーゼを作用させてシロ−イノソースをＤ−キロ−１−イノソースへ異性化させる酵素反応を行う工程と、その酵素反応溶液からシロ−イノソースイソメラーゼ酵素を回収する工程と、その酵素回収後に、未反応のシロ−イノソースとＤ−キロ−１−イノソースを含む残液を濃縮する工程と、その得られた濃縮液からシロ−イノソースを結晶化させてその結晶を分別する工程と、その母液として得たＤ−キロ−１−イノソース含有溶液に還元剤を加え、Ｄ−キロ−１−イノソースを還元し、Ｄ−キロ−イノシトールを生成する工程と、還元で生成したＤ−キロ−イノシトールを含む還元反応溶液からＤ−キロ−イノシトールを分離して精製する工程とからなる、Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法。
【請求項７】
配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡであって且つ配列表の配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡである、シロ−イノソースイソメラーゼ遺伝子。
【請求項８】
配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡであって且つ配列表の配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡである、シロ−イノソースイソメラーゼ遺伝子。
【請求項９】
請求項７または８に記載のＤＮＡであるシロ−イノソースイソメラーゼ遺伝子を導入された組換えベクター。
【請求項１０】
請求項７または８に記載のＤＮＡであるシロ−イノソースイソメラーゼ遺伝子を包有する請求項９に記載の組換えベクターを、導入することにより形質転換された細菌宿主細胞。
【請求項１１】
請求項７または８に記載のＤＮＡであるシロ−イノソースイソメラーゼ遺伝子を包有する組換えベクターの導入により形質転換された細菌宿主細胞、すなわち請求項１０に記載の細菌宿主細胞を培養し、その培養された細胞菌体の破砕物からまたは培養液から、請求項２または３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質のシロ−イノソースイソメラーゼを回収することを特徴とする、シロ−イノソースイソメラーゼの製造方法。
【請求項１２】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡであって且つ配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡであるシロ−イノソースイソメラーゼ遺伝子を、染色体中に持つ中度好熱性のバチルス  リッチェニフォーミスＯＫ３−２−２株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１８８として寄託）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、シロ−イノソースをＤ−キロ−１−イノソースへ変換させ且つＤ−キロ−１−イノソースをシロ−イノソースへ変換させる平衡的反応を触媒する酵素作用を有する酵素であるシロ−イノソースイソメラーゼに関する。さらに、本発明は、遺伝子組換えによりシロ−イノソースイソメラーゼ産生能を付与された細菌形質転換体からのシロ−イノソースイソメラーゼの製造方法に関する。本発明は、またシロ−イノソースイソメラーゼをシロ−イノソースに作用させてＤ−キロ−１−イノソースを生成し、次いでＤ−キロ−１−イノソースを化学的に還元することから成るＤ−キロ−イノシトールの製造方法に関する。
【０００２】
また、本発明は、シロ−イノソースイソメラーゼをコードするＤＮＡよりなる遺伝子を包含し、またシロ−イノソースイソメラーゼをコードするＤＮＡの導入で組換えたベクター、ならびに該ベクターで形質転換された細菌宿主細胞、特にバチルス属細菌宿主細胞に関する。
【０００３】
さらに、本発明は、シロ−イノソースイソメラーゼ遺伝子を染色体中にもつバチルスｓｐ．  ＯＫ−３−２−２株を包含する。
【０００４】
【従来の技術】
Ｄ−キロ−イノシトールは、経口的または非経口的に投与されると、細胞内情報伝達を活性化するイノシトールリン脂質系に作用して、ＩＩ型糖尿病に改善効果をもたらすこと（特許文献１：特表平４−５０５２１８号参照）、および、多嚢胞生卵巣症候群に改善効果をもたらすこと（特許文献２：ＵＳＰ５９０６９７９号参照、非特許文献１：Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｊ．  Ｅ．  Ｎｅｓｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ、１９９９年、３４０巻、１３１４頁参照）が提唱されている治療剤である。Ｄ−キロ−イノシトールは機能的には、広範な代謝系疾患に関与すると考えられ、今後その適応が拡大する可能性が期待される物質である。
【０００５】
Ｄ−キロ−イノシトール（ＤＣＩと略記することがある）は、９種類あるイノシトール立体異性体の一つである。それの製造方法は、これまで、抗生物質であるカスガマイシンの加水分解によりＤＣＩを製造する方法（特許文献３：ＵＳＰ５０９１５９６号参照、特許文献４：ＵＳＰ５４６３１４２号参照、特許文献５：ＵＳＰ５７１４６４３号参照、特許文献６：ＵＳＰ６３４２６４５号参照）、マメ科植物に含有されるＤ−ピニトールを加水分解してＤＣＩを製造する方法（特許文献７：ＵＳＰ５８２７８９６号参照、特許文献８：ＰＣＴ／ＵＳ０１／１５３５３参照、特許文献９：特開平１３−２６１６００号参照）、有機合成によりＤＣＩを製造する方法（特許文献１０：ＵＳＰ５４０６００５号、特許文献１１：ＷＯ９６／２５３８１号参照、特許文献１２：特表平８−５０２２５５号参照、特許文献１３：特開平１１−２８００６８号参照）、微生物をミオイノシトールに作用させることにより、ミオ−イノシトールから  Ｄ−キロ−イノシトールへ変換させるＤＣＩの製造方法（特許文献１４：特開平９−１４０３８８号参照）などが知られる。
【０００６】
しかしながら、カスガマイシンやＤ−ピニトールを出発原料として用いてＤＣＩを製造する場合、これらの原料物質が高価である。また、有機合成により製造する場合もＤＣＩの収率および光学純度が低く、最終産物であるＤＣＩは高価なものになる。さらに、ミオイノシトールへ微生物を作用させてＤ−キロ−イノシトールへ変換させる反応は、変換の制御が困難であり、微生物により他の代謝産物も同時に生産されるため、Ｄ−キロ−イノシトールの単離と精製が困難である。
【０００７】
また、近年、アグロバクテリウム属に属し且つミオ−イノシトールをＤ−キロ−イノシトールに変換できる構成酵素としてのＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼを生産できる性能を有する細菌を利用してミオ−イノシトールからＤ−キロ−イノシトールを製造する方法が知られている（特許文献１５：特開２００１−８６９４号および特許文献１６：ＷＯ  ０２／０５５７１５号パンフレット参照）。しかしながら、その細菌を培養しながらミオ−イノシトールに作用させてミオ−イノシトールをＤ−キロ−イノシトールに変換する方法では、高い基質濃度で細菌を作用させることが困難であり、そのため、膨大な培地の量を取り扱わなくてはならない。
【０００８】
また、ミオ−イノシトールにシュードモナスｓｐ．  ＡＢ１００６４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３３０）またはアセトバクターｓｐ．  ＡＢ１０２５３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８８６８）を作用させて、ミオ−イノシトールからシロ−イノソースを生成する方法が提案された（特許文献１７：２００２年６月２５日出願の特願２００２−１８４９１２号参照）。特許文献１７にも記載されるように、ミオ−イノシトールを酸化してシロ−イノソースへ変換する酵素、ミオ−イノシトール  ２−デヒドロゲナーゼは、自然界に広く存在しており、酵母、細菌にも存在することが知られる（例えば非特許文献２：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１３１巻８７２〜８７５頁（１９７７）参照）。
【０００９】
さらに、標準株として、バチルス  ズブチリスＡＴＣＣ  ６６３３が知られており、これの染色体ＤＮＡの全塩基配列が公開されている。公開された塩基配列のイノシトール代謝オペロン内に存在する１２種類のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の中のＤＮＡ配列の内部には、ｉｏｌ  Ｅ、ｉｏｌ  Ｆ、ｉｏｌ  Ｇ、ｉｏｌ  Ｈ、ｉｏｌ  Ｉのなどの幾つかの遺伝子があることが知られる。ｉｏｌ  Ｅ、ｉｏｌ  Ｈ、ｉｏｌ  Ｉの３つの遺伝子の機能は不明である。ｉｏｌ  Ｉ遺伝子でコードされる酵素は、２００２年に、Ｘ線構造解析されているが、その酵素の機能は不明のままである（非特許文献３：Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、２００２年、４８巻、４２３〜４２６頁）。
【００１０】
また、枯草菌（バチルス  ズブチリス）の中には、ｉｏｌ  Ｇ遺伝子が存在し、ミオ−イノシトールを酸化してシロ−イノソースを生成させるミオ−イノシトール  ２−デヒドロゲナーゼが存在することが知られる（非特許文献４：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２５４巻７６８４〜７６９０頁（１９７９）参照）。
【００１１】
【特許文献１】
特表平４−５０５２１８号公報（全文：ＩＩ型糖尿病に対するＤ−キロ−イノシトールの効果）
【００１２】
【特許文献２】
ＵＳＰ５９０６９７９号明細書（全文：多嚢胞生卵巣症候群に対するＤ−キロ−イノシトールの効果）
【００１３】
【特許文献３】
ＵＳＰ５０９１５９６号明細書（全文：カスガマイシンの加水分解によりＤ−キロ−イノシトールを得る方法）
【００１４】
【特許文献４】
ＵＳＰ５４６３１４２号明細書（全文：カスガマイシンのアセチル化分解によりＤ−キロ−イノシトールを得る方法）
【００１５】
【特許文献５】
ＵＳＰ５７１４６４３号明細書（全文：カスガマイシンの加水分解によりＤ−キロ−イノシトールを得る方法）
【００１６】
【特許文献６】
ＵＳＰ６３４２６４５号明細書（全文：カスガマイシンの加水分解によりＤ−キロ−イノシトールを得る方法）
【００１７】
【特許文献７】
ＵＳＰ５８２７８９６号明細書（全文：ピニトールを加水分解してＤ−キロ−イノシトールを得る方法）
【００１８】
【特許文献８】
ＰＣＴ／ＵＳ０１／１５３５３号明細書（全文：大豆種皮から得られるピニトールを加水分解してＤ−キロ−イノシトールを得る方法）
【００１９】
【特許文献９】
特開平１３−２６１６００号公報（全文：食用資源から得られるピニトールを加水分解してＤ−キロ−イノシトールを得る方法）
【００２０】
【特許文献１０】
ＵＳＰ５４０６００５号明細書（全文：グルクロン酸から１０工程でＤ−キロ−イノシトールを合成する方法）
【００２１】
【特許文献１１】
ＷＯ９６／２５３８１号パンフレット（全文：ジアルドースから有機合成によりＤ−キロ−イノシトールを得る方法）
【００２２】
【特許文献１２】
特表平８−５０２２５５号公報（アセトニドから有機合成によりＤ−キロ−イノシトールを得る方法）
【００２３】
【特許文献１３】
特開平１１−２８００６８号公報（ミオ−イノシトールから有機合成によりＤ−キロ−イノシトールを得る方法）
【００２４】
【特許文献１４】
特開平９−１４０３８８号公報（全文：ミオ−イノシトールにアグロバクテリウム属細菌を培養しながら作用させることによりＤＣＩを製造する方法）
【００２５】
【特許文献１５】
特願２００１−８６９４号明細書（全文：（アグロバクテリウム）ｓｐ．  ＡＢ１０１２１株を培養しながら作用させることによりＤＣＩを製造する方法）
【００２６】
【特許文献１６】
ＷＯ  ０２／０５５７１５号パンフレット（全文：遺伝子組換でエピメラーゼ生産能を発現させた大腸菌を培養してミオ−イノシトールに作用させることによりＤＣＩを製造する方法）
【００２７】
【特許文献１７】
ＷＯ  ００／７５３５５号パンフレット（全文）
【００２８】
【特許文献１８】
特開２００２−２８５号公報（全文）
【００２９】
【特許文献１９】
特願２００２−１８４９１２号明細書（全文）
【００３０】
【非特許文献１】
Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｊ．  Ｅ．  Ｎｅｓｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ、１９９９年、３４０巻、１３１４頁（全文：多嚢胞生卵巣症候群に対するＤ−キロ−イノシトールの効果）
【００３１】
【非特許文献２】
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１３１巻８７２〜８７５頁（１９７７）（全文：バチルス  ズブチリスのイノシトール代謝オペロンに関する）
【００３２】
【非特許文献３】
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、２００２年、４８巻、４２３〜４２６頁（全文：バチルス  ズブチリスのイノシトールオペロンのｉｏｌ  Ｉ遺伝子に由来する酵素のＸ線構造解析）
【００３３】
【非特許文献４】
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２５４巻７６８４〜７６９０頁（１９７９）（全文がミオイノシトール  ２−デヒドロゲナーゼに関する）
【００３４】
【発明が解決しようとする課題】
安価な原料としてミオ−イノシトールを用いてＤ−キロ−イノシトールを製造する方法において、効率的にＤ−キロ−イノシトールを生成でき且つ生成されたＤ−キロ−イノシトールの単離と精製を容易に行い得るＤ−キロ−イノシトール製造の新しい方法が望まれていた。
【００３５】
本発明者らは、酵素を反応に用いることにより、高い基質濃度で酵素を作用させてＤ−キロ−イノシトールを効率的に製造することが可能であると考えた。そこで酵素を用いてミオ−イノシトールからＤ−キロ−イノシトールを製造する新しい方法を開発することを課題または目的として、研究を重ねた。また、ミオ−イノシトールからＤＣＩを製造する方法で利用できる新しい酵素を得るための研究も行った。
【００３６】
先ず、ミオ−イノシトールからＤＣＩを生成するのに利用できる１種または数種の酵素を産生する能力を有する新しい微生物を見出すための研究を行った。この研究の一環として、５５℃で生育できる中度好熱性の土壌細菌のうちから、ミオ−イノシトールをＤＣＩに変換できる一連の酵素を産生する能力をもつ細菌種を見出すための一連の実験を行った。これらの菌スクリーニング実験においては、滅菌した寒天１．５％を含む農研培地をシャーレに入れて固化させた培地に、各種の土壌サンプルの水懸濁液の希釈液をそれぞれプレーティングし、植菌された一連の培地をそれぞれ５５℃で培養し、増殖する菌をそれぞれ培地から分離した。次に、それぞれの単離した菌株を、ミオ−イノシトールを４％含有する基本液体培地（酵母エキス０．４％、グルコース０．５％、硫酸アンモニウム０．１％、ＭｇＳＯ４  ０．０１％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．０７％，Ｋ２ＨＰＯ４  ０．０２％）に植菌した。５５℃で４日間培養した後、それぞれの菌株の培養液を遠心し、それぞれの上清を得てＨＰＬＣ分析した。ＨＰＬＣの分析条件は、カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ  ＮＨ２、溶離液：８０％アセトニトリル、流速２．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出器：ＲＩ検出器であった。それぞれの上清からミオ−イノシトールと、Ｄ−キロ−イノシトールを分離して定量した。
【００３７】
これらの菌株スクリーニング実験を通して、ミオ−イノシトールをＤＣＩに変換できる能力を有するバチルス属新菌株を発見し、その菌学的性質を検査してバチルス  リッチェフォーミスの新菌株であると同定することに成功した。この新菌株をバチルス  リッチェフォーミスＯＫ３−２−２株と命名した。さらに、ミオ−イノシトール４％を含有する前記の基本液体培地中で５５℃で前記の新菌株、ＯＫ３−２−２株を４日間培養し、その培養液から菌体を分離し、得られた培養上清液中で生成されて存在する代謝生産物をＨＰＬＣを調べた結果、基質であるミオ−イノシトールが存在する他に、Ｄ−キロ−イノシトール（ＤＣＩ）が生成されたことが見出された。
【００３８】
バチルス属細菌は、ミオ−イノシトールを酸化してシロ−イノソースに変換するミオ−イノシトール  ２−デヒドロゲナーゼを産生することが既知である。このことを考えると、前記の新菌株ＯＫ  ３−２−２株は、ミオ−イノシトールをシロ−イノソースに酸化する酵素を産生し、しかもシロ−イノソースをＤ−キロ−１−イノソースに変換できる未知の酵素が前記の新菌株、ＯＫ３−２−２株によってミオ−イノシトール  ２−デヒドロゲナーゼの他に、産生されていることが想定され、また、この未知の酵素によって、一旦生産されたシロ−イノソースがＤ−キロ−１−イノソースに変換され且つＤ−キロ−１−イノソースがＤＣＩに変換されたと、本発明者らは想定した。
【００３９】
上記のＯＫ３−２−２株細菌中の未知の酵素が何であるか、その酵素の実体を調べて同定するために、本発明者は後記される考察と一連の遺伝子工学的実験を行った。
すなわち、前記の新菌株、ＯＫ３−２−２株はバチルス属に属するが、これと同じバチルス属に属しており且つ染色体ＤＮＡの全塩基配列が解明、公開されてある前記のバチルス  ズブチリス  ＡＴＣＣ  ６６３３は、前記の新菌株ＯＫ３−２−２株と同様に、ミオ−イノシトールから生成されたシロ−イノソースを、Ｄ−キロ−１−イノソースに変換できる未知の酵素を産生していると想定した。
【００４０】
この想定の下に、バチルス  ズブチリス  ＡＴＣＣ  ６６３３の染色体ＤＮＡのうちのイノシトール代謝オペロン中に存在する既知の１２種類のＯＲＦのうちに存在するところの、１２種類のタンパク質をそれぞれコードする１２個のＤＮＡ配列に着目した。これらのＤＮＡ配列の中にある前記のｉｏｌ  Ｅ遺伝子、ｉｏｌ  Ｈ遺伝子、ｉｏｌ  Ｉ遺伝子によりコードされる３種の酵素は、その機能が今まで未知であったが、それら３種の酵素を収得して且つそれらの機能を調べる研究を行った。なお、この際に、既知のキシロ−スイソメラーゼのアミノ酸配列と類似するアミノ酸配列を有し且つタンパク質３Ｄ推定構造の点でも類似するタンパク質をコードできるＤＮＡ配列が前記のバチルス  ズブチリス  ＡＴＣＣ  ６６３３の３種の遺伝子、ｉｏｌ  Ｅ、ｉｏｌ  Ｈ、ｉｏｌ  ＩのそれぞれのＤＮＡ配列と多くの点で共通する事実があることを参考にした。
【００４１】
そこで初めに、バチルス  ズブチリス  ＡＴＣＣ  ６６３３の染色体ＤＮＡのうちのｉｏｌ  Ｅ遺伝子、ｉｏｌ  Ｈ遺伝子およびｉｏｌ  Ｉ遺伝子にそれぞれ相当する３種のＤＮＡ断片を遺伝子工学的手法により収得し、さらにこれら３種のＤＮＡ断片をそれぞれ包有する組換えプラスミドを構築し、これらプラスミドをそれぞれ別々に細菌宿主細胞中に導入し、宿主細胞形質転換体を培養し、３種のそれぞれのＤＮＡ断片でコードされる酵素を発現、生成させる遺伝子工学的手法を行う後記の実施例１の実験を実施した。
【００４２】
後記の実施例１の実験の方法は、概説すると、バチルス  ズブチリス  ＡＴＣＣ  ６６３３の染色体ＤＮＡを抽出し、これを鋳型に用い且つ配列表の配列番号５および６のプライマーを用いるＰＣＲ法によって、ｉｏｌ  Ｅ、ｉｏｌ  Ｈ、ｉｏｌ  Ｉの遺伝子に相当するＤＮＡをそれぞれ作成し且つ単離し、それらＤＮＡを発現ベクターに組み込み、得られた組換えベクターを宿主細胞に導入した後に、その形質転換宿主細胞を培養し、導入ＤＮＡから酵素を発現させることから成る方法である。得られた酵素の活性を測定したところ、ｉｏｌ  Ｉ遺伝子に相当するＤＮＡのみがシロ−イノソースイソメラーゼ活性をもつ酵素をコードすることが証明された。
【００４３】
さらに、前記の新菌株、バチルス  リッチェニフォーミスＯＫ３−２−２株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１８８）の染色体ＤＮＡを鋳型に用い且つ配列表の配列番号７および８のプライマーを用いるＰＣＲ法によって、前記ｉｏｌ  Ｉ遺伝子のＤＮＡときわめて高い類似性をもつ、すなわち高い相同性のあるＤＮＡ断片を作成し、このＤＮＡ断片を宿主細胞に導入し、その形質転換宿主細胞の培養により導入ＤＮＡから酵素を発現、生成させる遺伝子工学的手法を行う後記の実施例２の実験を実施した。実施例２で遺伝子工学的に得られたＤＮＡも、シロ−イノソースイソメラーゼ活性をもつ酵素をコードすることを見出した。
【００４４】
後記の実施例１および実施例２でそれぞれ得られた酵素は、該酵素を含む粗酵素液１００μｌ、１０％シロ−イノソース溶液１００μｌ、１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ  ７．５）１００μｌ、１００ｍＭ  ＭｎＣｌ２溶液１０μｌおよび１００ｍＭ  ＺｎＣｌ２溶液１０μｌを水と混ぜ、全容１ｍｌの混合物を調製した後、この混合物液を２７℃、１６時間反応させ、反応後、１Ｍリン酸  ｐＨ  ２．０  １０μｌを加えて、反応を停止させ、さらに、この反応溶液を７０℃、１０分加熱し、タンパク質を加熱変成により沈析させ、遠心分離し、得られた上清をＨＰＬＣ分析する実験において、シロ−イノソースを基質にするとシロ−イノソースをＤ−キロ−１−イノソースに異性化させる反応を触媒すると共に、また、Ｄ−キロ−１−イノソースを基質にするとシロ−イノソースに異性化させる反応を触媒する酵素活性をもつ酵素である、すなわち換言すれば、シロ−イノソースイソメラーゼ活性をもつ酵素であることが判明した。
【００４５】
すなわち、後記の実施例１または実施例２で粗酵素液中に得られた目的の酵素は、下記のシロ−イノソース（Ｉ）と下記のＤ−キロ−１−イノソース（ＩＩ）との平衡的変換反応
2004329081.tif 000002
を触媒する作用をもつ酵素であること、すなわちシロ−イノソースイソメラーゼであることが判明した。また酵素の性質を試験したところ該酵素はｐＨ  ５〜ｐＨ  ９、好ましくはｐＨ  ６〜ｐＨ  ８の至適ｐＨをもち、活性化因子としてＭｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋イオンによって活性化されることが判明した。
【００４６】
従って、第１の本発明においては、以下の特性（１）、（２）および（３）を有するシロ−イノソースイソメラーゼ、すなわち
（１）作用：下記の式（Ｉ）のシロ−イノソースを下記の式（ＩＩ）のＤ−キロ−１−イノソースへ変換させ且つ後者を前者に変換させる相互変換の平衡的反応を触媒する，
2004329081.tif 000003
（２）至適ｐＨ  ：ｐＨ  ５〜ｐＨ  ９、好ましくはｐＨ  ６〜ｐＨ  ８
（３）活性化因子：Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋またはＣｏ２＋である活性化因子によって活性化される
という特性を有するシロ−イノソースイソメラーゼが提供される。
【００４７】
実施例１において、バチルス  ズブチリス  ＡＴＣＣ  ６６３３のｉｏｌ  Ｉ遺伝子に相当するＤＮＡを包有するＤＮＡ断片として、ＰＣＲ法で作成された約８５０ｂｐのＤＮＡ断片は、配列表の配列番号３で示す塩基配列をもつ８３７  ｂｐのＤＮＡを包有するＤＮＡ断片であるから、実施例１で収得された目的の酵素シロ−イノソースイソメラーゼは、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列をもつタンパク質であると推定できる。
【００４８】
また、実施例２において、バチルス  リッチェニフォーミスＯＫ３−２−２株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１８８）のｉｏｌ  Ｉ遺伝子ホモログに相当するＤＮＡを包有するＤＮＡ断片として、ＰＣＲ法で作成された約８５０ｂｐのＤＮＡ断片は、配列表の配列番号４で示す塩基配列をもつ８３７  ｂｐのＤＮＡを包有するＤＮＡ断片であるから、実施例２で収得された目的の酵素、シロ−イノソースイソメラーゼは、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列をもつタンパク質であると推定できる。
【００４９】
従って、第１の本発明によるシロ−イノソースイソメラーゼの第１の具体例は、配列番号１に示すアミノ酸配列をもつタンパク質である酵素であり、またその第２の具体例は、配列番号２に示すアミノ酸配列をもつタンパク質である酵素であり、それら酵素は単離された形であることができる。
【００５０】
第１の本発明の酵素、具体的には、実施例１または２で得た本発明酵素は、シロ−イノソースとＤ−キロ−１−イノソースの相互変換を触媒する作用を有するが、この作用は、イソメラーゼ作用またはエピメラーゼ作用のどちらかである。しかしながら、本酵素は次式（ＩＩＩ）のＤ−（３−デオキシ）−２−ミオ−イノソースと次式（ＩＶ）のＤ−（３−デオキシ）−１−ミオ−イノソースの相互変換をも触媒することから、本発明酵素による変換反応は、ケトンの移動を伴うイソメラーゼ反応であることが判った。
2004329081.tif 000004
【００５１】
また、バチルス  ズブチリス  ＡＴＣＣ  ６６３３のｉｏｌ  Ｉ遺伝子の産物のＸ線構造解析（Ｐｒｏｔｅｉｎｅ  ２００２年、４８巻、４２３〜４２６頁）の結果に、本酵素を当てはめると、酵素の活性中心の金属イオン（Ｍｎイオン）にケトンの酸素原子とＯＨ基とが配位し、これによりケトンの移動を伴う遷移状態を安定化していると推定される。
【００５２】
さらに、配列表の配列番号１または２に示すアミノ酸配列と一部、僅かに異なるけれども、該アミノ酸配列に対して９０〜１００％相同性をもつタンパク質も、第１の本発明酵素と同じ酵素活性をもつと推定できる。
【００５３】
従って、第２の本発明においては、シロ−イノソースとＤ−キロ−１−イノソースとの相互変換の平衡的反応を触媒する作用を有する酵素であって、配列表の配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列のうちの１個ないし数十個のアミノ酸が欠失、置換または付加されて成るアミノ酸配列をもつシロ−イノソースイソメラーゼが提供される。
【００５４】
第１の本発明の酵素シロ−イノソースイソメラーゼは、バチルス  ズブチリス  ＡＴＣＣ  ６６３３、または本発明者らによって単離された前記のバチルス属ｓｐ．  ＯＫ３−２−２株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１８８）からｉｏｌ  Ｉ遺伝子またはｉｏｌ  Ｉ遺伝子ホモログをコードするＤＮＡを遺伝子工学的に作成し、該ＤＮＡの導入により細菌形質転換体を作り、その細菌形質転換体を培養し、その培養された細胞菌体から、または培養液から、既知の酵素分離法により回収することによって製造できる。
【００５５】
本発明によるシロ−イノソースイソメラーゼを製造する方法においては、ｉｏｌ  Ｉ遺伝子またはそのホモログのＤＮＡの導入で形質転換された細菌、特に大腸菌属の細菌を、既知の細菌培養用液体培地中で３０℃〜５５℃の培養温度で培養する。得られた培養液から、培養された形質転換細菌の細胞の菌体を濾過または遠心分離法に分離できる。分離されたペレット状の菌体を水で洗浄後、遠心分離し、洗浄菌体を得ることができる。この洗浄菌体を１％トライトンＸ−１００を含む１００ｍＭトリスバッファー（ｐＨ  ７．５）に懸濁させ、超音波によって菌体を破砕する。菌体の破砕後、遠心分離し、上清にある酵素抽出液を得る。その後に、酵素抽出液に５０％になるように硫酸アンモニウムを加えて、タンパク質を塩析させる。このようにして調製したタンパク質溶液を、さらに遠心分離し、タンパク質沈殿として目的の酵素を得る。これを１００ｍＭトリスバッファー（ｐＨ  ７．５）に溶解して保存できる。
【００５６】
菌体からの前記した酵素抽出液に硫酸アンモニウムを加えてタンパク質を析出させる方法の他に、酵素抽出液から目的の酵素を回収する方法としては、酵素抽出液を、イオン交換樹脂に吸着後、塩濃度による直線濃度勾配を利用したカラムクロマトグラフィーにかけて分離して、精製することができる。
【００５７】
また、上記の形質転換細菌の培養液から目的の酵素を回収する場合には、培養液から培養細胞の菌体を分離した後に、得られ培養液上清を濃縮し、その濃縮液から硫安分画法によって目的の酵素を回収し、さらに精製することができる。
【００５８】
前記のバチルス属ｓｐ．  ＯＫ３−２−２株は、以下の菌学的性質を以下に示した。
尚、本菌株の同定に当っては、新細菌培地学講座（第２版、近代出版）、医学細菌同定の手引き（第２版、近代出版）、細菌学実習提要（丸善）に準じて実験を行い、実験結果をＢｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ＶＯＬ．  １（１９８４）を参考にして本菌株を同定した。
【００５９】
ＯＫ３−２−２株の菌学的性質は次の通りである。
（ａ）形態的特徴
（１）細胞形態：桿菌、胞子を形成する
（２）運動性：                    ＋（懸滴法）
（３）普通寒天培地上での生育：５５℃での生育は速く、コロニー形態は薄く広がり不定形、色調は白色である。
【００６０】
（ｂ）生理生化学的性状
（１）グラム染色：                ＋
（２）ＯＦテスト：                  Ｏ  （Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ）
（３）好気条件での生育：          ＋
（４）嫌気条件での生育：          ＋
（５）生育温度：
２０℃                −
３０℃                ＋
４０℃                ＋
４５℃                ＋
５５℃                ＋
６５℃                −
（６）食塩耐性：
０％                ＋
５％                ＋
７％                ＋
１０％                −
（７）生育ｐＨ：
ｐＨ  ５．０              ＋
ｐＨ  ６．０              ＋
ｐＨ  ７．０              ＋
ｐＨ  ８．０              ＋
（８）チトクロームオキシダーゼ：  ＋
（９）カタラーゼ：              ＋
【００６１】
（１０）硝酸塩還元性：            ＋
（１１）硫化水素産生：            −
（１２）ゼラチンの液化：          ＋
（１３）カゼインの加水分解：      ＋
（１４）スターチの加水分解：      ＋
（１５）インドールの産生：        −
（１６）マロン酸の利用性：        ＋
（１７）ＯＮＰＧ分解性：            −
（１８）エスクリンの分解性：      ＋
（１９）クエン酸の利用性：        ＋
（２０）プロピオン酸の利用性：    ＋
（２１）デカルボキシラーゼ活性：
Ｌ−リジン              −
（２０）尿素の分解性：            −
（２１）各種糖から酸の生成：
Ｄ−グルコース        ＋
Ｄ−キシロース        ＋
Ｄ−マンニトール      ＋
Ｌ−アラビノース      ＋
（２２）Ｖ−Ｐテスト              ＋
（２３）フェニルアラニンデアミナーゼ  −
【００６２】
以上のとおり、ＯＫ３−２−２株の主性状は、グラム陽性の桿菌であり、生育適温は４５℃〜５５℃の中度好熱性微生物であって、本菌株の１６ＳリボゾームＲＮＡの塩基配列の相同性は、１６Ｓリボゾーム塩基配列決定用プライマーとして、以下の配列：
５’−ＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡ−３’
を有するプライマーを用いて、６２９塩基対までの範囲でシークエンスしたところ、バチルス  ズブチリス  （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバチルス  リッチェニフォーミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の２種類の菌株の１６ＳリボゾームＲＮＡ塩基配列と１００％一致した。
【００６３】
これらの菌学的性質と１６ＳリボゾームＲＮＡの塩基配列の相同性を総合して、ＯＫ３−２−２株はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属し、中度好熱性菌であるバチルス  リッチェニフォーミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）であると判断した。しかる後、本菌株をバチルス  リッチェニフォーミスＯＫ３−２−２株と命名し、産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１９１８８として寄託した（寄託日は平成１５年１月１７日）。
【００６４】
前述したところから明らかなように、第１の本発明のシロ−イノソースイソメラーゼ、あるいは第２の本発明のシロ−イノソースイソメラーゼは、これをシロ−イノソースに作用させると、シロ−イノソースをＤ−キロ−１−イノソースに変換できるから、シロ−イノソースからＤ−キロ−１−イノソースを製造できる。
【００６５】
従って、第３の本発明においては、シロ−イノソースを含有する水溶液に、第１または第２の本発明のシロ−イノソースイソメラーゼを作用させて、シロ−イノソースをＤ−キロ−１−イノソースへ異性化させる酵素反応を行う工程と、その酵素反応溶液から酵素を回収する工程と、酵素の回収後に得た残液からＤ−キロ−１−イノソースを回収する工程と、回収したＤ−キロ−１−イノソースを精製する工程とから成る、Ｄ−キロ−１−イノソースの製造方法が提供される。
【００６６】
第３の本発明方法に使用するシロ−イノソースの水溶液は、ミオ−イノシトールから微生物的変換により生成したシロ−イノソースの水溶液、あるいは、ミオ−イノシトールを酸化白金により酸化したシロ−イノソースの水溶液であることができる。シロ−イノソース水溶液は、反応開始時のシロ−イノソース濃度が１％〜１５％、好ましくは１０％であるのが望ましい。
【００６７】
このシロ−イノソース水溶液に作用させるシロ−イノソースイソメラーゼは、第１の本発明による単離されたシロ−イノソースイソメラーゼであることもでき、またはこれを含む粗酵素液であることもできる。
【００６８】
さらに、使用されるシロ−イノソースイソメラーゼは固定化酵素としても使用可能である。酵素固定化法としては、ゲル抱埋法、イオン交換樹脂吸着法など、一般の酵素固定化方法が適用できる。
【００６９】
使用されるシロ−イノソースの水溶液のｐＨは、シロ−イノソースイソメラーゼの至適ｐＨであるｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ５〜９、さらに好ましくはｐＨ７．５に調整されてあるのが望ましい。また、活性化因子として、Ｍｎ２＋とＺｎ２＋イオンを最終濃度０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭになるようにＭｎ塩、Ｚｎ塩を添加、含有する方が望ましい。使用されるＭｎ塩、Ｚｎ塩は水溶性の塩であれば使用することができる。また、反応温度は、バチルス由来シロ−イノソースイソメラーゼを使用する場合、２０℃〜５０℃、好ましくは４０℃が望ましい。
【００７０】
シロ−イノソース水溶液に反応させるために抽出酵素液を使用する場合は、反応混合物が均一溶液のために攪拌する必要は無いが、温度を均一化するため攪拌した方が好ましい。反応はシロ−イノソースとＤ−キロ−１−イノソースが７０：３０の平衡値に達するまで進行させるのが好ましい。
【００７１】
反応終了後に、酵素回収は、酵素溶液を使用した場合、イオン交換樹脂カラムに反応溶液を通過させることにより酵素を回収することができる。固定化された酵素を使用した場合は、反応溶液を遠心分離、あるいはろ過操作することによって、固定化酵素を回収することができる。
【００７２】
このようにして、酵素を除いた後の残液である反応溶液は、未反応のシロ−イノソースと生成されたＤ−キロ−１−イノソースを含んでいる。次に、この溶液を、最初に加えたシロ−イノソースの重量の１．３倍〜２．５培、好ましくは１．７倍の重量までに濃縮し、その濃縮液を室温で静置する。この操作によりシロ−イノソースは、選択的に結晶化し、これを分別して、最初に加えたシロ−イノソースの２５％に相当する水で結晶を洗浄し、この操作により、最初に加えたシロ−イノソースの約７０％が回収される。結晶分別後の母液には、反応で生成したＤ−キロ−１−イノソースが溶解して居り、その生成量の内、約９０％が含まれる。該母液を濃縮乾固すると、Ｄ−キロ−１−イノソースの無色粉末を回収できる。
なお、回収したシロ−イノソース結晶は再利用できる。
【００７３】
第３の本発明方法で収得できたＤ−キロ−１−イノソースは、これを化学的還元剤、例えばＮａＢＨ４で還元すると、Ｄ−キロ−イノシトールに転化できることが本発明者らによって見出された。
【００７４】
従って、第４の本発明においては、シロ−イノソースを含有する水溶液に、第１または第２の本発明のシロ−イノソースイソメラーゼを作用させて、シロ−イノソースをＤ−キロ−１−イノソースへ異性化させる酵素反応を行う第１の工程と、その酵素反応溶液からシロ−イノソースイソメラーゼ酵素を回収する第２の工程と、酵素を回収した後に、生成したＤ−キロ−１−イノソースと未反応のシロ−イノソースを含有する残液を濃縮する第３の工程と、得られた濃縮液から未反応のシロ−イノソースを結晶化させて、その結晶を分別する第４の工程と、その母液として得たＤ−キロ−１−イノソース含有溶液に還元剤を加え、Ｄ−キロ−１−イノソースを還元してＤ−キロ−イノシトールを生成する第５の工程と、還元で生成したＤ−キロ−イノシトールを含む還元反応溶液からＤ−キロ−イノシトールを分離して精製する第６の工程とから成る、Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法が提供される。
【００７５】
第４の本発明方法において、水溶液中のシロ−イノソースにシロ−イノソースイソメラーゼを作用させてＤ−キロ−１−イノソースに異性化させる第１工程と、その第１工程で得られた反応溶液から酵素を分離して回収する第２工程とは、第３の本発明によるシロ−イノソース製造方法におけるそれぞれ対応の工程と同様な要領で実施できる。
【００７６】
第４の本発明方法におけるＤ−キロ−１−イノソース含有の残液の濃縮の第３工程と、その濃縮液からのシロ−イノソースの結晶化およびその結晶の分離の第４の工程は、既知の手法で実施できる。第４の本発明方法におけるＤ−キロ−１−イノソース含有の水溶液に還元剤を加えて還元反応によりＤ−キロ−イノシトール（ＤＣＩ）を生成する第５工程は、次の要領で実施できる。
すなわち、先行の第４工程で得られたＤ−キロ−１−イノソースを含有する母液は、そのまま第５工程の還元反応に使用することができる。しかし、該母液をｐＨ調節して、ｐＨ６〜７、好ましくはｐＨ６．５に調節するのが望ましい。この溶液に対して、還元剤、例えばＮａＢＨ４の粉末を直接にあるいは水溶液の形で添加する。還元剤はＤ−キロ−１−イノソースの０．２５〜０．５モル、好ましくは０．３モル当量の量で添加する。その際、ｐＨはｐＨ６〜７の範囲で調整して還元反応を行うのが望ましい。
【００７７】
この還元反応によって、還元反応液中ではＤ−キロ−１−イノソースのうちの約５０％が変換されてＤ−キロ−イノシトールが生成し、また残りはミオ−イノシトールに変換される。また、該母液中に共雑する残留のシロ−イノソースも還元され、シロ−イノソースの残留量のうちの６０％がミオ−イノシトールに変換され且つ残りはシロ−イノシトールに変換される。従って、還元反応液は主生成物のＤ−キロ−イノシトールの他に、ミオ−イノシトールとシロ−イノシトールとを含む混合物溶液として得られる。
【００７８】
第４の本発明方法の第６工程は、第５工程で得た還元反応液からＤ−キロ−イノシトールの単離精製をする工程である。Ｄ−キロ−イノシトールを、共存するミオ−イノシトールおよびシロ−イノシトールとの混合物から単離する方法としては、該混合物をカラムクロマトグラフィーにかける分離方法が利用でき、また分別結晶化による分離方法も使用できる。また、これらの方法を組み合わせることができる。
【００７９】
前述したように、第１の本発明によるシロ−イノソースイソメラーゼの第１の具体例は、配列番号１のアミノ酸配列をもつタンパク質からなるシロ−イノソースイソメラーゼであり、またその第２の具体例は配列番号２のアミノ酸配列をもつタンパク質からなるシロ−イノソースイソメラーゼである。これらの第１および第２の具体例のシロ−イノソースイソメラーゼは、それぞれに配列番号３の塩基配列をもつＤＮＡ、および配列番号４の塩基配列をもつＤＮＡによってコードされる（後記の実施例１および２、参照）。
【００８０】
従って、第５の本発明においては、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡであって且つ配列表の配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡである、シロ−イノソースイソメラーゼ遺伝子が提供される。
【００８１】
また、第６の本発明においては、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡであって且つ配列表の配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡである、シロ−イノソースイソメラーゼ遺伝子が提供される。
【００８２】
次に、第５の本発明による配列番号３の塩基配列をもつＤＮＡよりなるシロ−イノソースイソメラーゼ遺伝子を見出して単離することに成功した本発明者の研究の経緯を説明する。
【００８３】
（ａ）  シロ−イノソースイソメラーゼをコードする遺伝子の探索
（ｉ）  バチルス  ズブチリス染色体上にあるイノシトールオペロンを構成するＤＮＡ配列には、１２種類のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有することが知られる。またこの内に在るｉｏｌ  Ｇ遺伝子はミオ−イノシトール  ２−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１８）をコードするＤＮＡから成ることが知られていることに本発明者は先づ着目した。
【００８４】
次に、上記のＯＲＦの中に在ってミオ−イノシトール  ２−デヒドロゲナーゼ以外の他の酵素をコードする残り１１個の遺伝子の中から、イソメラーゼをコードする遺伝子またはＤＮＡを見出すために、それら１１個の遺伝子ＤＮＡを、代表的な糖のイソメラーゼであって、３Ｄ構造が良く知られているキシロースイソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．５）をコードする遺伝子のＤＮＡとそれらの相同性について比較した。しかしながら、塩基配列や、アミノ酸配列における相同性の点で比較を行ったところ、これらの点で高い相同性を有する遺伝子は認められなかった。
【００８５】
一方、インターネット３Ｄ−ＰＳＳＭサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｂｇ．ｂｉｏ．ｉｃ．ａｃ．ｕｋ／￣３ｄｐｓｓｍ  ／）において、コードされるアミノ酸配列から推定される推定３Ｄ構造の点でキシロースイソメラーゼに対して形の類似性がある遺伝子が、上記のＯＲＦ中の残り１１個の遺伝子のうちに３つ存在することを見出した。
【００８６】
これら３つの遺伝子はｉｏｌ  Ｅ（Ｅｎｔｒｙ  Ｎｏ．  ＢＧ１１１２１）、ｉｏｌ  Ｈ（Ｅｎｔｒｙ  Ｎｏ．  ＢＧ１１１２３）、ｉｏｌ  Ｉ（Ｅｎｔｒｙ  Ｎｏ．  ＢＧ１１１２４）の３種類である。これらの３つの遺伝子の中に、目的のシロ−イノソースイソメラーゼ活性を有する酵素をコードするものが存在すると本発明者らは推定した。
【００８７】
（ｉｉ）  ｉｏｌ  Ｅ、ｉｏｌ  Ｈおよびｉｏｌ  Ｉ遺伝子の単離
ｉｏｌ  Ｅ、ｉｏｌ  Ｈ、ｉｏｌ  Ｉの各遺伝子のそれぞれの単離のためには、バチルス  ズブチリス染色体から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にして用い且つ適当なプライマーを用いるポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法により、ｉｏｌ  Ｅ、ｉｏｌ  Ｈ、  ｉｏｌ  Ｉの各遺伝子にそれぞれ相当するＤＮＡを包有していると推定できる３種類の、約８５０ｂｐのＤＮＡ断片を単離した。この際には、制限酵素反応でＰＣＲ法のＤＮＡ断片を切断し且つ適当な方法、例えばアガロース電気泳動法で望みのＤＮＡ断片を選別する方法を利用した。
ＰＣＲ法により、ｉｏｌ  Ｉ遺伝子に相当するＤＮＡ断片を収得して、さらに単離する方法の詳細は、後記の実施例１に記載される。
【００８８】
（ｉｉｉ）  ｉｏｌ  Ｅ、ｉｏｌ  Ｈおよびｉｏｌ  Ｉの各遺伝子に相当するＤＮＡをそれぞれ連結された３つの組換えベクターの構築と、組換えプラスミドの構築
上記の（ｉｉ）で得た３つの遺伝子にそれぞれ相当する３種のＤＮＡ断片（約８５０ｂｐのサイズ）は、各々別々に発現プラスミドベクターに組み込むため、あらかじめそれぞれのＤＮＡ断片の末端に、適切な制限酵素サイトを設定してある。これらＤＮＡ断片をそれぞれプラスミドベクターの同じ制限酵素サイトへ挿入して連結後、得られた組換えベクターをライゲートさせることによって、組換えプラスミドを構築できる。
【００８９】
この際に使用するプラスミドベクターとしては、好ましくは、マルチクローニングサイトを有する発現プラスミドベクターが使用される。酵素を発現させることが可能であり、かつ、適当な制限酵素サイトを有する他のプラスミドベクターも使用できる。
【００９０】
また、組換えプラスミドに組み込まれた遺伝子を発現させるために使用されて該プラスミド中に挿入されるプロモーターは、該プラスミドで形質転換した宿主微生物中で該遺伝子が発現することを可能にするプロモーターであれば、特に制限はない。例えばｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーターなどが使用できる。
【００９１】
（ｉｖ）  上記３つの遺伝子に相当する各ＤＮＡを組み込まれた３種の組換えプラスミドによりそれぞれ形質転換された宿主細細胞の作製
（ｉｉｉ）のように調製された組換えプラスミドを、宿主細菌に導入するのは常法で行う。この際用いられる宿主細菌としては、組換えプラスミドが安定でかつ自律的に増殖可能である細菌であれば特に制限されず、通常の遺伝子組換えに用いられているもの、例えばエッシェリヒア属細菌またはバチルス属細菌などが好ましく使用される。
【００９２】
宿主細菌に（ｉｉｉ）で得た組換えプラスミドを導入する方法としては、例えば宿主細菌がエシェリヒア属に属するの場合には、カルシウムイオンの存在下に組換えプラスミドの導入を行ってもよい。コンピテントセル法を用いてもよく、またバチルス属に属する微生物の場合には、コンピテントセル法またはプロトプラスト法などを用いることができるし、エレクトロポレーション法あるいはマイクロインジェクション法を用いてもよい。宿主細菌への所望の組換えプラスミド導入の有無の検定については、組換えプラスミドを構成するベクターの薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で、プラスミド導入反応後の宿主微生物を培養し、選択培地上で生育できた宿主微生物を選択すればよい。
【００９３】
（ｂ）  形質転換された宿主細菌中の導入遺伝子のＤＮＡの発現による酵素の産生の検定
（ｉ）  上記の（ａ）（ｉｖ）で得た形質転換細菌を培地上で培養すると、該細菌の形質転換のため導入された遺伝子（ＤＮＡ）は発現して、その遺伝子（ＤＮＡ）でコードされる酵素を産生する。酵素を発現誘導するために使用される培地は、形質転換細菌が安定して増殖する培地であれば、特に限定されない。例えば、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ、Ｌ−Ｂｒｏｔｈ、などを使用することができる。また、プラスミドベクターの種類によっては、培地中に遺伝子を発現させるためにイソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）のようなインデューサーを加えてもよいし、培養の途中にインデューサーを加えても良い。
【００９４】
（ｉｉ）  上記の形質転換細菌の培養により、導入した遺伝子からの酵素の発現は次のようにして確認できる。ｉｏｌ  Ｅ、ｉｏｌ  Ｈ、ｉｏｌ  Ｉの各遺伝子に相当するＤＮＡをそれぞれもつ組換えプラスミドを導入した３種の形質転換株の細胞を別々に培養する。これにより、３つの酵素がそれぞれ発現される。発現した酵素を含有する細菌菌体は、遠心分離され、培地を除去し、さらに、ペレット状の菌体を水で洗浄後、遠心分離し、洗浄菌体を得ることができる。この洗浄菌体を１％トライトンＸ−１００を含む１００ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．５）に懸濁させる。超音波によって菌を破砕する。破砕後、遠心分離し、上清液として粗酵素溶液を得る。その後に、５０％になるように硫酸アンモニウムを加えて、タンパク質を塩析させる。このようにして調製したタンパク質溶液を、さらに遠心分離し、タンパク質沈殿を得る。これを１００ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．５）に溶解すると、ｉｏｌ  Ｅ、ｉｏｌ  Ｈ、ｉｏｌ  Ｉの各遺伝子からそれぞれ発現誘導されたリコンビナート酵素を含む３種の粗酵素溶液を得ることができる。
【００９５】
これらの酵素液の各々と１０％シロ−イノソース溶液または１０％Ｄ−キロ−１−イノソース溶液をそれぞれ混合し、２７℃、１６時間反応させる。得られた酵素反応液を前述したＨＰＬＣ条件で分析したところ、ｉｏｌ  Ｅとｉｏｌ  Ｈとの各遺伝子に由来するリコンビナート酵素は、シロ−イノソースをＤ−キロ−１−イノソースに変換される活性をもたないことが確認された。ｉｏｌ  Ｉ遺伝子に由来するリコンビナート酵素は、シロ−イノソースからＤ−キロ−１−イノソースへ変換させ且つＤ−キロ−１−イノソースからシロ−イノソースへ変換させる活性を有することが確認された。従って、バチルス  ズブチリスのｉｏｌ  Ｉ遺伝子に相当するＤＮＡの発現に由来するリコンビナート酵素は、シロ−イノソースとＤ−キロ−１−イノソースとを相互変換する酵素、すなわち本発明のシロ−イノソースイソメラーゼであることが判明した。
【００９６】
更に、第６の本発明による配列番号４の塩基配列をもつＤＮＡよりなるシロ−イノソースイソメラーゼ遺伝子を見出して単離することに成功した本発明者の研究の経緯を説明する。
【００９７】
前記に説明するように、バチルス  ズブチリスのｉｏｌ  Ｉ遺伝子（配列番号３のＤＮＡ）にコードされる酵素がシロ−イノソースイソメラーゼと証明された。このことから、他のバチルス属細菌もｉｏｌ  Ｉ遺伝子に似る遺伝子を有し、これによってシロ−イノソースイソメラーゼを産生することが推定できる。
【００９８】
上記の知見に基づいて、本発明者が分離したバチルス属ｓｐ．  ＯＫ３−２−２株からのｉｏｌ  Ｉ遺伝子ホモログを得るために実験を行った。すなわち、該ＯＫ３−２−２株のゲノムＤＮＡを単離し精製し、そのゲノムＤＮＡを鋳型として用い且つ配列表の配列番号５のプライマーおよび配列番号６のプライマーと同様な塩基配列をもつ配列番号７のプライマーおよび配列番号８のプライマーを用いるＰＣＲ法を行うことによって、全く同様の操作によって、該ＯＫ３−２−２株上にあるｉｏｌ  Ｉ遺伝子ホモログに相当するＤＮＡ断片を得ることができた。
【００９９】
このようにＰＣＲ法によって、ＯＫ３−２−２株のｉｏｌ  Ｉ遺伝子ホモログに相当するＤＮＡを包有するＤＮＡ断片を収得して単離する方法の詳細は、後記の実施例２に記載される。
【０１００】
このＯＫ  ３−２−２株のｉｏｌ  Ｉ遺伝子ホモログに相当するＤＮＡの塩基配列は、配列表の配列番号４に記載される塩基配列を有していることが認められた。
【０１０１】
配列表の配列番号３の塩基配列をもつＤＮＡ（バチルス  ズブチリス由来）と、配列番号４の塩基配列をもつＤＮＡ（バチルス  リッチェニフォーミスＯＫ３−２−２株由来）との違いは、塩基の位置番号７８、１０２、１０５、１９２、２３４、２９５、４２６、４８０、５１０、６９６、７１１、７２９および８１０の１３個所で塩基の種類が異なることである。その相違点を下記の表１に示す。
【０１０２】
【表１】
2004329081.tif 000005
【０１０３】
配列番号３のＤＮＡの塩基配列と配列番号４のＤＮＡとの塩基配列の相同性は９８％である。配列番号３のＤＮＡでコードされるアミノ酸配列（配列番号１）の１８番目はロイシンで９９番目はリジンであるが、配列番号４のＤＮＡでコードされるアミノ酸配列（配列番号２）の１８番目はグルタミンで９９番目がグルタミンである点で２個所で異なって居り、アミノ酸配列の相同性は９９％であった。
【０１０４】
配列番号４のＤＮＡ（ＯＫ３−２−２株由来）の導入により形質形換された細菌による酵素の発現も、前記と同様の操作によって行うことができた。酵素活性の測定から、このリコンビナント酵素もまた、シロ−イノソースイソメラーゼであることが証明された（実施例２、参照）。
【０１０５】
また、本酵素の至適ｐＨはｐＨ７〜８にあり、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋イオンの存在下に活性化されることが判った。本酵素の熱安定性は４５℃１０ｍｉｎの熱処理で活性は１００％であり、１０分間の熱処理で活性が５０％になる温度は５４℃であった。
【０１０６】
さらにまた、第７の本発明においては、配列表の配列番号３または４に示す塩基配列をもつＤＮＡであるシロ−イノソースイソメラーゼ遺伝子を導入された組換えベクターが提供される。
【０１０７】
配列番号３または４に記載のＤＮＡは、その末端に適切な制限酵素、例えばＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩによる切断サイトが設定されてある。ここで使用されるベクターは、既知の発現用ベクター、例えばプラスミドベクターｐＵＣ１１９であることができ、これに対して、配列番号３または４のＤＮＡを遺伝子工学的手法の常法で結合して導入できる。
【０１０８】
プラスミドベクターに組み込むためには、あらかじめＤＮＡ断片の末端を適切な制限酵素で切断しておき、これをプラスミドベクター上にある同じ制限酵素サイトへ挿入し連結して組換えベクターを作成できる。また、適当なプロモーター等もライゲートさせることによって、組換えプラスミドを構築できる。この際に使用するプラスミドは、好ましくは、マルチクローニングサイトを有する発現プラスミドベクターが使用される。
【０１０９】
さらに、第８の本発明においては、配列表の配列番号３または４に示す塩基配列をもつＤＮＡであるシロ−イノソースイソメラーゼ遺伝子を包有する第７の本発明の組換えベクターを、導入することにより形質転換された細菌宿主細胞が提供される。
【０１１０】
使用される宿主細菌は、大腸菌、例えばコンピーテントセルである大腸菌ＪＭ１０９株であることができ、組換えベクターの導入は既知の遺伝子工学的手法で行いうる。
【０１１１】
また、第９の本発明においては、配列表の配列番号３または４に示す塩基配列をもつＤＮＡであるシロ−イノソースイソメラーゼ遺伝子を包有する組換えベクターの導入により形質転換された宿主細菌、すなわち第８の本発明の形質転換した細菌宿主細菌を培養し、その培養された細胞菌体の破砕物からまたは培養液から配列表の配列番号１または２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質のシロ−イノソースイソメラーゼを回収することを特徴とする、シロ−イノソースイソメラーゼの製造方法が提供される。
【０１１２】
さらにまた、第１０の本発明においては、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡであって且つ配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡであるシロ−イノソースイソメラーゼ遺伝子を、染色体中に持つ中度好熱性のバチルス  リッチェニフォーミスＯＫ３−２−２株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１８８として寄託）が新規微生物として提供される。
【０１１３】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を実施例について具体的に説明する。
【０１１４】
【実施例１】バチルス  ズブチリス由来シロ−イノソースイソメラー
ゼの発現
（ａ）バチルス  ズブチリスのゲノムＤＮＡの調製
ＬＢフラスコ培地１００ｍｌ（１％バクト−トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中に、ＬＢスラント培地（１％バクト−トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、１．５％寒天）で培養したバチルス  ズブチリスＡＴＣＣ  ６６３３を一白金耳接種し、４時間、３６℃で好気的に培養し、培養液から集菌した。得られた菌体ペレットに、１５ｍｌのＳａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ溶液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）とリゾチーム５０ｍｇを加えて菌体を懸濁し、菌体にリゾチームを３７℃、２時間作用させた。処理後、得られた菌体溶解液に２５％ＳＤＳ溶液０．５ｍｌを加えて完全に溶菌させた。次に、フェノールを３ｍｌ加えて、タンパク質を変成させた後に、遠心分離した。上清を取り出し、この上清液に２０ｍｌの２−プロパノールを加えて、粗ゲノムＤＮＡを析出させた。析出した粗ゲノムＤＮＡを遠心分離により沈殿させ、上清を取り除いた後、減圧下で乾燥させた。
【０１１５】
乾燥した粗ゲノムＤＮＡは、さらに３ｍｌＴＥ液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解後、その溶液に０．０１ｍｇのＲＮＡａｓｅを加え、３６℃、２時間反応させてＲＮＡを分解させた。さらに、０．０１ｍｇのプロテイナーゼＫを加えて、３６℃、２時間反応させてタンパク質を分解させた。次に、そのタンパク質分解反応液に１ｍｌのフェノール−クロロホルム（１：１）混液を加えて、得られた混合物をゆっくりと攪拌し、ＲＮＡａｓｅと、プロテイナーゼＫを変成させた。次いで、混合物を遠心分離した。２相に分離したうちの、水性の上層を取り出した。これに３Ｍ酢酸Ｎａ溶液を０．３ｍｌ加えて、ｐＨ５．２に調整した。これに３ｍｌの２−プロパノールを加えて、ゲノムＤＮＡを析出させた。
【０１１６】
析出したゲノムＤＮＡを遠心分離により沈殿させ、上清を取り除いた後、減圧下で乾燥させた。乾燥したゲノムＤＮＡは、３ｍｌＴＥ液に溶解させ、さらにその溶液に１ｍｌのフェノール−クロロホルム（１：１）混液を加える操作から、３ｍｌＴＥ液に溶解させる過程までを、再度繰り返した後に、遠心分離を行い、同様にｐＨ５．２にて、上清に等量の２−プロパノールを加えて、バチルス  ズブチリスのゲノムＤＮＡの溶液を調製した。このようにして得られたゲノムＤＮＡを、ＰＣＲ反応のための鋳型として用いるＤＮＡの溶液とした。
【０１１７】
（ｂ）バチルス  ズブチリス由来シロ−イノソースイソメラーゼに相当するＤＮＡ配列のクローニング
バチルス  ズブチリス由来シロ−イノソースイソメラーゼに相当するＤＮＡ配列のクローニングを行うために、配列番号５と６との塩基配列を有する下記の２つのプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
ｉｏｌＩＢ．ｓｕｂ．−Ｆプライマー：  ５’−ｃｃｃｃａａｇｃｔｔｇａｔｇａａａｃｔｔｔｇｔｔｔｔａａｔｇａａｇ−３’（配列Ｎｏ．５）
ｉｏｌＩＢ．ｓｕｂ．−Ｒプライマー：  ５’−ｃｇｇｇａｔｃｃｔｔａｃａｔｇｃｔｇａａｇｔａｔｔｔｔｇ−３’’（配列Ｎｏ．６）
【０１１８】
ＰＣＲ反応は次のように行った。すなわち宝酒造社のＥｘ  ｔａｑ反応用溶液を使用し、該溶液の組成はＴａｋａｒａ  ＥｘＴａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ×１０倍液  ５μｌ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ４μｌ、鋳型ＤＮＡ  ３０ｎｇ、１０μＭ  プライマー溶液  各１μｌ、Ｔａｋａｒａ  ＥｘＴａｑ  ０．５μｌを全体が５０μｌになるように水を加えて混合し、さらに３０μｌのミネラルオイルを重層することにより調製した。反応条件は、ＰＣＲ増幅装置（ＡＳＴＥＣ社  ＰＣ−７００）を用い、変成を９４℃，３０秒、アニ―リングを４０℃，１分、伸長を７２℃，１分、の３段階の反応を３５回繰返し行った。上記のＰＣＲ反応によって、約０．８５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片が増幅した。
【０１１９】
増幅反応後、重層したミネラルオイルを０．３ｍｌのヘキサンで抽出し且つヘキサン層を除去する操作を３回繰返し、１分間減圧することにより、ミネラルオイルを除去した。この様にして得られた増幅反応液５０μｌから、ジーンクリーンキット（Ｂｉｏ１０１社製）を用いてＰＣＲ法で得たＤＮＡ断片を分離し精製した。すなわち、ジーンクリーンキット添付のＮａＩ溶液の３００μｌを増幅反応液に加えて混合し、１０μｌガラスビーズ溶液を加えて混合し、得られた混合物を４℃、１５分静置した後に、遠心分離した。こうして、増幅されたＤＮＡ断片の吸着したガラスビーズを沈殿させ、上清を除去した。さらに、キット添付のＮｅｗ  ｗａｓｈ溶液５００μｌを該ガラスビーズに加えて、ガラスビーズを懸濁させ、遠心分離し、上清を除去した。このＮｅｗ  ｗａｓｈ溶液によるガラスビーズ洗浄操作は３回繰り返した。次に、ガラスビーズを減圧下で乾燥させ、乾燥後、１５μｌの滅菌水を加えて、混合することにより懸濁した。得られたガラスビーズ懸濁液を５５℃で、１５分加温した後、遠心分離を行い、増幅された約０．８５  ｋｂｐのＤＮＡ断片を含む上清１２μｌを得た。
【０１２０】
（ｃ）バチルス  ズブチリス由来シロ−イノソースイソメラーゼをコードするＤＮＡを含有する組換えベクターの調製と、それによる大腸菌の形質転換
（ｉ）上記（ｂ）で増幅され且つ精製されたＤＮＡ断片を、発現ベクターに組み込む操作は以下のように行った。すなわち、上記のＤＮＡ断片溶液１０μｌに対して、発現用プラスミドベクターとしてのベクターｐＵＣ１１９の０．５μｇと、宝酒造社製の制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＢａｍ  ＨＩの各１μｌと、宝酒造社製の制限酵素用緩衝液Ｋ  ｂｕｆｆｅｒ×１０倍液  ２μｌとを加え、全体が２０μｌになるように滅菌水を加え、混合した。得られた混合液を３６℃、１６時間保って制限酵素を反応させた。
【０１２１】
（ｉｉ）上記の制限酵素反応を行った後、ジーンクリーン・キットを用いて、ＤＮＡ断片と発現ベクターとを単離させた。すなわち、得られた制限酵素反応液２０μｌにキット添付のＮａＩ溶液を３００μｌ加えて混合し、次いで１０μｌガラスビーズ溶液を加えて混合し、さらに４℃、１５分静置した後に、遠心分離し、ＤＮＡ断片と発現ベクターの吸着したガラスビーズが沈殿させられた。上清を除去した。さらに、キット添付のＮｅｗ  ｗａｓｈ溶液５００μｌを加えて、ガラスビーズを懸濁させ、遠心分離し、上清を除去した。このＮｅｗ  ｗａｓｈ溶液によるガラスビーズ洗浄操作は３回繰り返した。次に、ガラスビーズを減圧下で乾燥させ、乾燥後、１５μｌの滅菌水を加えて、懸濁し、５５℃で、１５分加温した後、遠心分離を行うと、ＤＮＡ断片と発現ベクターとを含む上清１２μｌを得た。この操作により、制限酵素によって生じた約５０ｂｐ以下の不要な小さなＤＮＡ断片は取り除かれ、目的とするＤＮＡ断片と、発現ベクターとが得られた。
【０１２２】
（ｉｉｉ）このようにして得たＤＮＡ断片と発現ベクターとを連結（ライゲーション）させるために、上記で調製したＤＮＡ断片とベクターとの溶液１０μｌにＴａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ−Ｉ溶液（宝酒造社）を１０μｌ加えた。次いで、１６℃、１時間反応させた。生成された組換えベクターを含むライゲーション反応溶液を用いて、コンピテントセルとして大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を行った。すなわち、４℃で解凍したコンピテントセル溶液６０μｌに前記のライゲーション反応溶液を５μｌ加え、混合した。その混合物を、０℃，３０分後、４２℃，４５秒、０℃，２分の処理にかけ、次いで、これに５００μｌのＳＯＣ溶液（２％バクト−トリプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を加えて、３６℃で１時間回復培養させた。この培養液１００μｌを、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、４０μｇ／ｍｌ  Ｘ−ｇａｌ（５−Ｂｒｏｍｏ−４−Ｃｈｌｏｒｏ−３−Ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトピラノシド）を含むＬＢ寒天培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、１．５％寒天）に塗布した。さらに３７℃、１６時間培養した。この培養により、白色に発色したコロニーとして、前記の組換えプラスミドベクターの導入で形質転換された大腸菌が得られたので、これを選択した。
【０１２３】
こうして分離した形質転換大腸菌コロニーを、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地で培養した。増殖した形質転換大腸菌の菌体から、プラスミド精製キット（ＱＩＡ  ｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ，  ＱＩＡＧＥＮ社）によりプラスミドＤＮＡの分離および精製を行った。こうして得られたプラスミドＤＮＡは、目的とするシロ−イノソースイソメラーゼをコードする配列番号３の塩基配列をもつＤＮＡを包有する約０．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を含有することが確認された。
【０１２４】
（ｄ）バチルス  ズブチリス由来シロ−イノソースイソメラーゼの発現
（ｉ）上記の（ｃ）で白色発色したコロニーとして単離した大腸菌形質転換菌株を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む１００ｍｌＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に移植し、３６℃７時間培養した。この培養液に２００ｍＭイソプロピルチオガラクトピラノシド溶液を０．３ｍｌ加え、さらに３６℃３時間培養した。培養終了後、遠心分離により、菌体を集めた。菌体を生理食塩水で１回洗浄した。さらに、洗浄菌体を０．６％トライトンＸ１００溶液３ｍｌに懸濁し、４℃で超音波により菌体を破砕した。この溶液を遠心分離し、上清としての酵素溶液２．８ｍｌを取り出した。上清に１．２ｇ硫安を加え、４℃でタンパク質を塩析させた。塩析したタンパク質を遠心分離で集め、上清を除去した。この沈殿したタンパク質を２．５ｍｌの２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させ、再度、遠心分離を行い、上清を２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＳｈｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（１４ｍｌ）にアプライし、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出させ、脱塩を行なった。この操作により、シロ−イノソースイソメラーゼの粗酵素液３．５ｍｌを得た。
【０１２５】
（ｉｉ）シロ−イノソースイソメラーゼ活性の測定は、次のように行った。すなわち、上記の粗酵素液１００μｌ、１０％シロ−イノソース溶液１００μｌまたは１０％Ｄ−キロ−１−イノソース１００μｌ、１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１００μｌ、１００ｍＭ  ＭｎＣｌ２溶液  １０μｌ、１００ｍＭ  ＺｎＣｌ２溶液  １０μｌを全体が１ｍｌになるように水を加えて混合した後、このように得た基本反応液を２７℃、１６時間反応させ、反応後、１Ｍリン酸（ｐＨ２．０）１０μｌの添加により反応を停止させた。さらに、この反応後の溶液は７０℃１０分加熱し、タンパク質を加熱変成させ、次いで遠心分離によりタンパク質沈殿を除き、上清をＨＰＬＣ分析した。ＨＰＬＣ条件としては、ＷａｋｏｓｉｌＮＨ２カラム（内径４．６ｍｍ×２５ｃｍ）を用い、移動相は８０％アセトニトリル水溶液、カラム温度２０℃、流速２ｍｌ／ｍｉｎ、検出器はＵＶ検出器、ＯＲ検出器を用いた。
【０１２６】
その結果として、バチルス  ズブチリスのｉｏｌＩ遺伝子から遺伝子工学的手法で得た配列番号３のＤＮＡでコードされたリコンビナント酵素は、シロ−イノソースを基質にすると、Ｄ−キロ−１−イノソースに異性化させる反応を触媒することが判明した。また、反応は可逆的で、Ｄ−キロ−１−イノソースを基質にするとシロ−イノソースに異性化させることが判明した。平衡状態では１％のシロ−イノソースを基質にすると、シロ−イノソース：Ｄ−キロ−１−イノソース＝７０：３０の平衡に達することが判った。
【０１２７】
（ｅ）バチルス  ズブチリス由来シロ−イノソースイソメラーゼの諸性質
上記の（ｄ）（ｉｉ）に示した基本反応液組成の内、１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１００μｌに代えて、ｐＨ４．０、５．０、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５の１Ｍリン酸緩衝液１００μｌ、あるいは、ｐＨ７．０、８．５、９．０の１Ｍトリス緩衝液１００μｌを用いて、変換活性を測定したところ、ｐＨ７．０〜８．０に最大活性を有していたことから、上記（ｄ）のシロ−イノソースイソメラーゼの至適ｐＨはｐＨ７．０〜８．０であることが判った。
【０１２８】
さらに、上記の基本反応液組成の内、１００ｍＭ  ＭｎＣｌ２溶液  １０μｌ、１００ｍＭ  ＺｎＣｌ２溶液  １０μｌの合計２０μｌの重金属塩溶液の添加に代えて、重金属塩無添加、あるいは５０ｍＭ  ＭｎＣｌ２溶液  ２０μｌ、５０ｍＭ  ＺｎＣｌ２溶液  ２０μｌ、５０ｍＭ  ＣｏＣｌ２溶液  ２０μｌ、５０ｍＭ  ＰｂＣｌ２溶液  ２０μｌ、５０ｍＭ  ＣｕＳＯ４溶液  ２０μｌ、５０ｍＭ  ＦｅＳＯ４溶液  ２０μｌ、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液  ２０μｌ、５０ｍＭ  ＳｎＣｌ２溶液  ２０μｌ、５０ｍＭ  ＣｄＣｌ２溶液  ２０μｌ、５０ｍＭ  ＮｉＣｌ２溶液  ２０μｌ、もしくは、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２溶液  ２０μｌを用いて変換活性を測定したところ、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋を含有する試験区で、それぞれ対象となる重金属塩無添加区よりも、１２０〜１５０％酵素活性が増加することから、本酵素はＭｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋を要求する金属酵素であることが判明した。
【０１２９】
【実施例２】バチルス  リッチェニフォーミスＯＫ３−２−２株由来シロ−イノソースイソメラーゼの発現
（ａ）バチルス  リッチェニフォーミスＯＫ３−２−２株のゲノムＤＮＡの調製
ＬＢフラスコ培地１００ｍｌ（１％バクト−トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中に、ＬＢスラント培地（１％バクト−トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、１．５％寒天）で培養したバチルス  リッチェニフォーミスＯＫ３−２−２株を一白金耳接種し、４時間、５５℃で好気的に培養し、培養液から集菌した。この菌体ペレットに、１５ｍｌのＳａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ溶液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）とリゾチーム５０ｍｇを加えて菌体を懸濁し、菌体にリゾチームを３７℃、２時間作用させた。処理後、得られた菌体溶解液に２５％ＳＤＳ溶液を０．５ｍｌ加えて完全に溶菌させた。次にフェノールを３ｍｌ加えて、タンパク質を変成させた後に、遠心分離した。上清を取り出し、この上清に２０ｍｌの２−プロパノールを加えて、粗ゲノムＤＮＡを析出させた。析出した粗ゲノムＤＮＡを遠心分離により沈殿させ、上清を取り除いた後、減圧下で乾燥させた。
【０１３０】
乾燥した粗ゲノムＤＮＡは、さらに３ｍｌＴＥ液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解後、その溶液に０．０１ｍｇのＲＮＡａｓｅを加え、３６℃、２時間反応させ、ＲＮＡを分解させた。さらに、０．０１ｍｇのプロテイナーゼＫを加えて、３６℃、２時間反応させ、タンパク質を分解させた。次に、そのタンパク質分解反応液に１ｍｌのフェノール−クロロホルム（１：１）混液を加えて、得られた混合物をゆっくりと攪拌し、ＲＮＡａｓｅと、プロテイナーゼＫを変成させた。その変成混合物を遠心分離し、２相に分離した内の水相である上層を取り出した。、これに３Ｍ酢酸Ｎａ溶液を０．３ｍｌ加えて、ｐＨ５．２に調整した。これに３ｍｌの２−プロパノールを加えて、ゲノムＤＮＡを析出させた。
【０１３１】
析出したゲノムＤＮＡを遠心分離により沈殿させ、上清を取り除いた後、減圧下で乾燥させた。乾燥したゲノムＤＮＡは、３ｍｌＴＥ液に溶解させ、さらにその溶液に１ｍｌのフェノール−クロロホルム（１：１）混液を加える操作から、３ｍｌＴＥ液に溶解させる過程までを、再度繰り返した後に、遠心分離を行い、同様にｐＨ５．２にて、上清に等量の２−プロパノールを加えて、バチルス  リッチェニフォーミスＯＫ３−２−２株のゲノムＤＮＡの溶液を調製した。このようにして得られたゲノムＤＮＡを、ＰＣＲ反応のための鋳型として用いるＤＮＡの溶液とした。
【０１３２】
（ｂ）バチルス  リッチェニフォーミスＯＫ３−２−２株由来シロ−イノソースイソメラーゼに相当するＤＮＡ配列のクローニング
バチルス  リッチェニフォーミスＯＫ３−２−２株由来シロ−イノソースイソメラーゼ配列のクローニングを行うために、配列番号７と８の塩基配列を有する下記の２つのプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
ｉｏｌＩＯＫ３−２−２−Ｆプライマー：  ５’−  ｃｃｃｃａａｇｃｔｔｇａｔｇａａａｃｔｔｔｇｔｔｔｔａａｔｇａａｇ  −３’（配列Ｎｏ．７）
ｉｏｌＩ  ＯＫ３−２−２−Ｒプライマー：  ５’−  ｃｇｇｇａｔｃｃｔｔａｃａｔｇｃｔｇａａｇｔａｔｔｔｔｇ  −３’（配列Ｎｏ．８）
【０１３３】
ＰＣＲ反応は次のように行った。すなわち宝酒造社のＥｘ  ｔａｑ反応用溶液を使用し、該溶液の組成はＴａｋａｒａ  ＥｘＴａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ×１０倍液  ５μｌ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ４μｌ、鋳型ＤＮＡ  ３０ｎｇ、１０μＭ  プライマー溶液  各１μｌ、Ｔａｋａｒａ  ＥｘＴａｑ  ０．５μｌを全体が５０μｌになるように水を加えて混合し、さらに３０μｌのミネラルオイルを重層することにより調製した。反応条件は、ＰＣＲ増幅装置（ＡＳＴＥＣ社  ＰＣ−７００）を用い、変成を９４℃，３０秒、アニーリングを４０℃，１分、伸長を７２℃，１分、の３段階の反応を３５回繰返し行った。上記のＰＣＲ反応によって、約０．８５  ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片が増幅した。
【０１３４】
増幅反応後、重層したミネラルオイルを０．３ｍｌのヘキサンで抽出し且つヘキサン層を除去する操作を３回繰返し、１分間減圧することにより、ミネラルオイルを除去した。この様にして得られた増幅反応液５０μｌから、ジーンクリーンキット（Ｂｉｏ１０１社製）を用いてＰＣＲ断片を分離して精製した。すなわち、キット添付のＮａＩ溶液を増幅反応液に３００μｌ加えて混合し、１０μｌガラスビーズ溶液を加えて混合し、得られた混合物を４℃、１５分静置した後に、遠心分離した。こうして増幅したＤＮＡ断片の吸着したガラスビーズを沈殿させ、上清を除去した。さらに、キット添付のＮｅｗ  ｗａｓｈ溶液５００μｌを該ガラスビーズに加えて、ガラスビーズを懸濁させ、遠心分離し、上清を除去した。このＮｅｗ  ｗａｓｈ溶液によるガラスビーズ洗浄操作は３回繰り返した。次に、ガラスビーズを減圧下で乾燥させ、乾燥後、１５μｌの滅菌水を加えて、懸濁し混合することにより５５℃で、１５分ガラスビーズ懸濁液を加温した後、遠心分離を行い、増幅された約０．８５  ｋｂｐのＤＮＡ断片を含む上清１２μｌを得た。
【０１３５】
（ｃ）バチルス  リッチェニフォーミスＯＫ３−２−２株由来シロ−イノソースイソメラーゼをコードするＤＮＡを含有する組換えベクターの調製と大腸菌の形質転換
（ｉ）上記（ｂ）で得た精製されたＤＮＡ断片を、発現ベクターに組み込む操作は以下のように行った。すなわち、上記のＤＮＡ断片溶液１０μｌに対して、発現用プラスミドベクターとしてベクターｐＵＣ１１９の０．５μｇと、宝酒造社製の制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩとＢａｍ  ＨＩの各１μｌと、宝酒造社製の制限酵素用緩衝液Ｋ  ｂｕｆｆｅｒ×１０倍液  ２μｌとを加え、全体が２０μｌになるように滅菌水を加え、混合した。得られた混合液を３６℃、１６時間保って制限酵素反応を行った。
【０１３６】
（ｉｉ）上記の制限酵素反応の後、ジーンクリーン・キットを用いて、ＤＮＡ断片と発現ベクターとを単離した。すなわち、得られた制限酵素反応液２０μｌにキット添付のＮａＩ溶液を３００μｌ加えて混合し、次いで１０μｌガラスビーズ溶液を加えて混合し、４℃、１５分静置した後に、遠心分離すると、ＤＮＡ断片と発現ベクターの吸着したガラスビーズが沈殿させられた。上清を除去した。さらに、キット添付のＮｅｗ  ｗａｓｈ溶液５００μｌをガラスビーズに加えて、ガラスビーズを懸濁させ、遠心分離し、上清を除去した。このＮｅｗ  ｗａｓｈ溶液によるガラスビーズ洗浄操作は３回繰り返した。次に、ガラスビーズを減圧下で乾燥させ、乾燥後、１５μｌの滅菌水を加えて、懸濁し、５５℃で、１５分加温した後、遠心分離を行うと、ＤＮＡ断片と発現ベクターを含む上清１２μｌを得た。この操作により、制限酵素によって生じた約５０ｂｐ以下の小さなＤＮＡ断片は取り除かれ、目的とするＤＮＡ断片と、発現ベクターとが得られた。
【０１３７】
（ｉｉｉ）上記で得たＤＮＡ断片と発現ベクターとをライゲートするために、上記で調製したＤＮＡ断片とベクターとの溶液１０μｌにＴａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ−Ｉ溶液（宝酒造社）を１０μｌ加え、１６℃、１時間反応させた。生成された組換えベクターを含むライゲーション反応溶液を用いて、コンピテントセルとしての大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を行った。すなわち、４℃で解凍したコンピテントセル溶液６０μｌに前記のライゲーション反応溶液を５μｌ加え、混合し、０℃，３０分、４２℃，４５秒、０℃，２分の処理にかけ、次いで、これに５００μｌのＳＯＣ溶液（２％バクト−トリプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を加えて、３６℃で１時間回復培養させた。
【０１３８】
この培養液１００μｌを、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、４０μｇ／ｍｌ  Ｘ−ｇａｌ（５−Ｂｒｏｍｏ−４−Ｃｈｌｏｒｏ−３−Ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトピラノシド）を含むＬＢ寒天培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、１．５％寒天）に塗布した。さらに３７℃、１６時間培養した。この培養により、白色に発色したコロニーとして前記の組換えベクターの導入で形質転換された大腸菌が得られたため、これを選択した。
【０１３９】
こうして分離した形質転換大腸菌コロニーを、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地で培養した。増殖した形質転換大腸菌の菌体からプラスミド精製キット（ＱＩＡ  ｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ，  ＱＩＡＧＥＮ社）によりプラスミドＤＮＡの分離および精製を行った。こうして得られたプラスミドＤＮＡは、目的とするシロ−イノソースイソメラーゼをコードする配列番号４のＤＮＡを包有する約０．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を有することが確認された。
【０１４０】
（ｄ）バチルス  リッチェニフォーミス（ＯＫ３−２−２）由来シロ−イノソースイソメラーゼの発現
（ｉ）上記で白色発色したコロニーとして単離した大腸菌形質転換菌株を、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む１００ｍｌＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に移植し、３６℃７時間培養した。この培養液に２００ｍＭイソプロピルチオガラクトピラノシド溶液を０．３ｍｌ加え、さらに３６℃３時間培養した。培養終了後、遠心分離により、菌体を集めた。これを生理食塩水で１回洗浄した。さらに、洗浄菌体を０．６％トライトンＸ１００溶液３ｍｌに懸濁し４℃で超音波により菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、上清としての酵素溶液２．８ｍｌを取り出した。上清に１．２ｇ硫安を加え、４℃でタンパク質を塩析させた。塩析したタンパク質を遠心分離で集め、上清を除去した。この沈殿したタンパク質を２．５ｍｌの２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させ、再度、遠心分離を行い、上清を２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＳｈｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（１４ｍｌ）にアプライし、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出させ、脱塩を行なった。この操作により、シロ−イノソースイソメラーゼの粗酵素液３．５ｍｌを得た。
【０１４１】
（ｉｉ）シロ−イノソースイソメラーゼ活性の測定は、次のように行った。すなわち上記の粗酵素液１００μｌ、１０％シロ−イノソース溶液１００μｌまたは１０％Ｄ−キロ−１−イノソース１００μｌ、１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１００μｌ、１００ｍＭ  ＭｎＣｌ２溶液  １０μｌ、１００ｍＭ  ＺｎＣｌ２溶液  １０μｌを全体が１ｍｌになるように水を加えて混合した後、このように得た基本反応液を２７℃、１６時間反応させ、反応後、１Ｍリン酸（ｐＨ２．０）１０μｌを加えて、反応を停止させた。さらに、この反応溶液は７０℃１０分加熱し、タンパク質を加熱変成させ、遠心分離によりタンパク質を除いた。上清をＨＰＬＣ分析した。ＨＰＬＣ条件としては、ＷａｋｏｓｉｌＮＨ２カラム（内径４．６ｍｍ×２５ｃｍ）を用い、移動相は８０％アセトニトリル水溶液、カラム温度２０℃、流速２ｍｌ／ｍｉｎ、検出器はＵＶ検出器、ＯＲ検出器を用いた。
【０１４２】
その結果として、バチルス  リッチェニフォーミスＯＫ３−２−２株のｉｏｌＩ遺伝子ホモログから得た配列番号４のＤＮＡでコードされたリコンビナント酵素は、シロ−イノソースを基質にすると、Ｄ−キロ−１−イノソースに異性化させる反応を触媒することが判明した。また、反応は可逆的で、Ｄ−キロ−１−イノソースを基質にすると、シロ−イノソースに異性化させることが判明した。平衡状態では１％のシロ−イノソースを基質にすると、シロ−イノソース：Ｄ−キロ−１−イノソース＝７０：３０の平衡に達することが判った。
【０１４３】
（ｅ）バチルス  リッチェニフォーミスＯＫ３−２−２株由来シロ−イノソースイソメラーゼの諸性質
上記の基本反応液組成の内、１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１００μｌに代えて、ｐＨ４．０、５．０、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５の１Ｍリン酸緩衝液１００μｌ、あるいはｐＨ７．０、８．５、９．０の１Ｍトリス緩衝液１００μｌを用いて変換活性を測定したところ、ｐＨ７．０〜８．０に最大活性を有していたことから、本酵素の至適ｐＨはｐＨ７．０〜８．０であることが判った。
【０１４４】
さらに、上記基本反応液組成の内、１００ｍＭ  ＭｎＣｌ２溶液  １０μｌ、１００ｍＭ  ＺｎＣｌ２溶液  １０μｌの合計２０μｌの重金属塩溶液の添加に代えて、重金属塩無添加、あるいは５０ｍＭ  ＭｎＣｌ２溶液  ２０μｌ、５０ｍＭ  ＺｎＣｌ２溶液  ２０μｌ、５０ｍＭ  ＣｏＣｌ２溶液  ２０μｌ、５０ｍＭ  ＰｂＣｌ２溶液  ２０μｌ、５０ｍＭ  ＣｕＳＯ４溶液  ２０μｌ、５０ｍＭ  ＦｅＳＯ４溶液  ２０μｌ、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液  ２０μｌ、５０ｍＭ  ＳｎＣｌ２溶液  ２０μｌ、５０ｍＭ  ＣｄＣｌ２溶液  ２０μｌ、５０ｍＭ  ＮｉＣｌ２溶液  ２０μｌ、もしくは５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２溶液  ２０μｌを用いて変換活性を測定したところ、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋を含有する試験区で、それぞれ対象となる重金属塩無添加区よりも、１２０〜１５０％酵素活性が増加することから、本酵素はＭｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋を要求する金属酵素であることが判明した。
【０１４５】
【実施例３】シロ−イノソースイソメラーゼの調製
実施例２で調製した組換えプラスミドを有する大腸菌形質転換菌株をＬＢ培地１Ｌに移植し、好気条件で３６℃，７時間培養した。得られた培養液に２００ｍＭイソプロピルチオガラクトピラノシド３ｍｌを加え、同様に好気条件で３６℃，３時間培養した。その培養後、得られた培養液を遠心分離し、菌体を集め、この菌体を０．６％トライトンＸ１００溶液５０ｍｌに懸濁し、その菌体懸濁液を４℃で超音波処理して菌体を破砕した。得られた菌体破砕液を分離し、得られた上清のｐＨをｐＨ７．５に調整し、上清を粗酵素液として得た。この粗酵素液は、配列表の配列番号２のアミノ酸配列をもつタンパク質からなるシロ−イノソースイソメラーゼを含有するものである。
【０１４６】
前記の粗酵素液に対して、硫安濃度が８０％になるように硫安を加え、タンパク質を塩析させた。塩析したタンパク質を遠心分離で集め、集めたタンパク質を２０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．０に溶解させると、シロ−イノソースイソメラーゼを含む粗酵素液が調製された。
【０１４７】
【実施例４】シロ−イノソースからＤ−キロ−１−イノソースの製造
シロ−イノソース１００ｇを熱水９００ｍｌに溶解して得られた水溶液を３６℃まで冷却した。得られたシロ−イノソース水溶液をＮａＯＨ溶液で、ｐＨ７．５に調整した後、１００ｍＭ  ＭｎＣｌ２の水溶液５０ｍｌを加えた。さらに、このシロ−イノソース水溶液に、実施例３で調製したトリス緩衝液中の粗酵素液を加え、最終的に１Ｌになるように水を加えて、混合した。得られた混合液を３６℃で２４時間反応させた。
反応中に、経時的に反応溶液をサンプリングし、採取したサンプル液のＨＰＬＣ分析を行ったところ、反応溶液中のシロ−イノソースの当初の量のうちの２２％がＤ−キロ−１−イノソースになった時点で平衡に達した。
【０１４８】
反応終了後、６Ｎ硫酸５ｍｌを加え、反応溶液をｐＨ２．０に調整し、８０℃まで加熱し、タンパク質を変成させた。この変成溶液を遠心分離してタンパク質を除いた。Ｄ−キロ−１−イノソースを含有する上清を、強酸性陽イオン交換樹脂５０ｍｌ（Ｄｕｏｌｉｔｅ−Ｃ２０（Ｈ＋タイプ））カラムと弱塩基性陰イオン交換樹脂１００ｍｌ（Ｄｕｏｌｉｔｅ−Ａ３６８Ｓ（ＯＨ−タイプ））カラムとを通して連続的に通過させた。その後にこれらカラムに蒸留水２５０ｍｌを通過させて交換樹脂カラム内に残留するイノソース異性体を溶出させて各画分を分離し、精製した。
【０１４９】
陰イオン交換樹脂カラムから溶出液として得られた透明な画分の溶液１．２５Ｌを、エバポレーターを用いて溶液重量が１８０ｇになるまで減圧下に濃縮した。この段階で濃縮液からシロ−イノソースが析出し、濃縮液はスラリー状になった。このスラリーを１６時間放置した後、ろ過操作を行い、固体とろ液に分別した。固体とろ液中に含まれるイノソース異性体は、ＨＰＬＣ分析によって、それらの組成分析および定量を行ったところ、ろ液中にＤ−キロ−１−イノソース１９．２ｇ、シロ−イノソース１７．６ｇが含まれていた。また、固体（５８．２ｇ）中にはＤ−キロ−１−イノソース１．７ｇ、シロ−イノソース５６．５ｇが含まれていた。
【０１５０】
【実施例５】
実施例４で得られたところの、Ｄ−キロ−１−イノソースおよびシロ−イノソース含有のろ液のｐＨを６．５に調整し、攪拌しながら該ろ液にＮａＢＨ４粉末２．４５ｇを１０回に分けて、添加した。添加する際には、５Ｎ  ＨＣｌの滴下によりｐＨを６．５〜７．０に保ち、また、温度は５０℃以下に保って還元反応をさせた。反応溶液は室温まで冷却後、沈殿してくるシロ−イノシトール固体をろ過により除去した。
【０１５１】
得られたろ液を強酸性陽イオン交換樹脂５０ｍｌ（Ｄｕｏｌｉｔｅ−Ｃ２０（Ｈ＋タイプ））カラムと強塩基性陰イオン交換樹脂５０ｍｌ（Ｄｕｏｌｉｔｅ−Ａ１１６（ＯＨ−タイプ）カラムとに連続的に通過させた後に、さらにイオン交換樹脂カラムに蒸留水１００ｍｌを通過させた。樹脂カラム内に残留するイノシトール異性体が溶出した。得られた溶出液中に含まれるイノシトール異性体は、ＨＰＬＣ分析によって、それらの組成分析を行ったところ、溶出液中にＤ−キロ−イノシトール１２．５ｇ、ミオ−イノシトール１７．３ｇ、シロ−イノシトール１．７ｇが含まれていた。
【０１５２】
上記の還元反応により、使用したシロ−イノソースの１００ｇ当りにＤ−キロ−イノシトール１２．５ｇが得られた。従って、反応収率は１２．５％と見積もられた。
【０１５３】
前記の溶出液は、エバポレーターを用いて、減圧濃縮すると結晶化し始め、最終的にＤ−キロ−イノシトールとミオ−イノシトールとシロ−イノシトールとの混合結晶（３１．５ｇ）が得られた。
【０１５４】
【実施例６】Ｄ−キロ−イノシトールの単離と精製
実施例５で得られた混合結晶からのＤ−キロ−イノシトールの単離は、次のようにして行った。すなわち、混合結晶３１．５ｇに３０ｍｌの水を加え、８０℃に加熱溶解させ、この溶液を４℃に１６時間放置し、結晶を析出させた。次に、この結晶を含む溶液をろ過して母液を得た。母液中にはＤ−キロ−イノシトール１２．１ｇ、ミオ−イノシトール４．３ｇ、シロ−イノシトール０．７ｇが含まれていた。
次に、この母液４５ｍｌを、強塩基性陰イオン交換樹脂アンバーライト（登録商標）ＣＧ−４００（ＯＨ―型）３０００ｍｌを充填したカラム（内径５．５ｃｍ、長さ８５ｃｍ）に流し、さらにカラムを蒸留水で溶出し、溶出液を分画して集めた。Ｄ−キロ−イノシトールを含む画分を集め、これらを減圧下で濃縮した。その濃縮液２０ｍｌに室温でエタノール４０ｍｌを加え、その混合液を、徐々に冷却するとともに、結晶を析出させた。結晶を乾燥し、Ｄ−キロ−イノシトールの結晶１１．２ｇを得た。このようにして得られたＤ−キロ−イノシトールの物理的性質は、比旋光度［α］Ｄ２５が＋６５°（ｃ＝１．０、Ｈ２Ｏ）であり、光学純度９９％以上および融点２３８℃であり、Ｄ−キロ−イノシトール純品であると確認できた。
【０１５５】
【配列表】
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