(57)【要約】【課題】癌抑制遺伝子を新たに見出してこれを含有する癌抑制剤、ならびに該癌抑制遺伝子を用いる癌の検出及び診断方法を提供する。【解決手段】ＭＡＬ遺伝子又はその相同遺伝子を含有する癌抑制剤；ＭＡＬタンパク質又はその相同タンパク質を含有する癌抑制剤；ＭＡＬ遺伝子の全部又はその一部を含む一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを用いて検体試料中のＭＡＬ遺伝子を解析する工程を含む癌の検出及び診断方法；ならびにＭＡＬタンパク質に対する抗体又はその断片を用いて検体試料中のＭＡＬタンパク質を解析する工程を含む癌の検出及び診断方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＡＬ遺伝子又はその相同遺伝子を含有する癌抑制剤。
【請求項２】
前記遺伝子又はその相同遺伝子がベクターに組み込まれている、請求項１に記載の癌抑制剤。
【請求項３】
前記ベクターがウイルスベクター又は動物細胞発現用プラスミドベクターである、請求項２に記載の癌抑制剤。
【請求項４】
前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである、請求項３に記載の癌抑制剤。
【請求項５】
前記遺伝子又はその相同遺伝子がリポソームに封入されている、請求項１に記載の癌抑制剤。
【請求項６】
ＭＡＬタンパク質又はその相同タンパク質を含有する癌抑制剤。
【請求項７】
ＭＡＬ遺伝子の全部又はその一部を含む一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを用いて検体試料中のＭＡＬ遺伝子を解析する工程を含む、癌の検出及び診断方法。
【請求項８】
前記解析が遺伝子の変異の検出又は遺伝子の発現量の異常の検出である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＭＡＬタンパク質に対する抗体又はその断片を用いて検体試料中のＭＡＬタンパク質を解析する工程を含む、癌の検出及び診断方法。
【請求項１０】
前記解析がタンパク質の発現量の異常の検出である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１から６のいずれか１項に記載の癌抑制剤の有効量をヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、癌の抑制方法。
【請求項１２】
請求項１から６のいずれか１項に記載の癌抑制剤の予防及び／又は治療有効量をヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、癌の予防及び／又は治療方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、癌抑制遺伝子及び該遺伝子がコードするタンパク質の医薬用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌の発症は細胞のタンパク質の変異に起因することが多いことは古くから知られている。近年の遺伝子工学の発達は特定タンパク質をコードする遺伝子の増幅や癌細胞における遺伝子変異の解析を可能にし、癌研究の分野においても飛躍的な発展をもたらした。これまでに細胞の癌化や癌細胞の異常増殖に関与するいわゆる癌遺伝子の解析及び同定が進んでいる。一方、これと反対に変異あるいは発現低下により癌化につながる癌抑制遺伝子がここ数年脚光を浴びている。これまでに癌抑制遺伝子として網膜芽細胞腫のＲｂ遺伝子（Ｆｒｉｅｎｄ，　Ｓ．Ｈ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　８４，　９０９５，　１９８７）、大腸癌のｐ５３遺伝子（Ｌａｎｅ，　Ｄ．Ｐ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ，　２７８，　２６１，　１９７９）　及びＡＰＣ遺伝子（　Ｋｅｎｎｅｔｈ，　Ｗ．Ｋ．，　ｅｔａｌ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５３，　６６１，　１９９１）、Ｗｉｌｍｓ腫瘍のＷＴ１遺伝子（Ｃａｌｌ，　Ｋ．Ｍ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ，　６０，　５０９，　１９９０）　などが発見されている。また、癌の発生、進展悪性化、転移などには一つの遺伝子の異常だけでなく複数の遺伝子の異常が関与していることが次第に明らかになりつつあり、さらに多くの未同定の癌遺伝子、癌抑制遺伝子が存在するものと考えられている。
【０００３】
一方、ＭＡＬタンパク質（ｍｙｅｌｉｎ　ａｎｄ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ）は、１７ｋＤａのプロテオリピドで、オリゴデンドロ細胞やシュワン（Ｓｃｈｗａｎｎ）細胞に主に発現し、腎臓、胃、及び甲状腺の上皮細胞にも見出されている。本来ＭＡＬはＴリンパ球の分化誘導に関連するタンパク質として知られているほか、ゴルジ体と細胞膜間の輸送に関連し、様々なシグナルを伝達する役割を担うことが報告されている。
ＭＡＬ遺伝子は、ヒト２番染色体の近位長腕上の領域ｃｅｎ−−−ｑ１３に位置するが、この遺伝子座からはゲノム改変も癌抑制遺伝子も未だ同定されていない（Ａｌｏｎｓｏ，　Ｍ．Ａ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，　２７：　９１−９５，　１９８８）。２ｑ１３遺伝子座に関しては、若年性腎症性腎炎の主要な原因である大きなホモ接合性欠失について数例の研究がある　（Ｋｏｎｒａｄ，　Ｍ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｕｍ．　Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，　５：　３６７−３７１，　１９９６；　Ｓａｕｎｉｅｒ，　Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｍ．　Ｊ．　Ｈｕｍ．　Ｇｅｎｅｔ．，　６６：　７７８−７８９，　２０００）。Ｐｕｅｒｔｏｌｌａｎｏらは、ＭＡＬがＴリンパ球上皮及びＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ細胞、ならびにミエリン形成細胞における界面活性剤可溶化抵抗性の糖脂質豊富膜微小ドメイン（Ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ　Ｅｎｒｉｃｈｅｄ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｍｉｃｒｏｄｏｍａｉｎ；ＧＥＭ）の成分であると同定した（Ｐｕｅｒｔｏｌｌａｎｏ，　Ｒ．，ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，　２７２：　１８３１１−１８３１５，　１９９７；　Ｐｅｒｅｚ，　１９９７；　Ａｌｏｎｓｏ，　Ｍ．Ａ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），　８４：　１９９７−２００１，　１９８７）。先に、Ａｌｏｎｓｏらは、ＭＡＬ遺伝子の発現が主にＴ細胞の発達中に観察されたことを報告したが、上記研究は、遍在性ヒト固形癌組織、特に食道癌におけるＭＡＬの発現の減少についての最初の報告である（Ａｌｏｎｓｏ，　Ｍ．Ａ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），
８４：　１９９７−２００１，　１９８７）。
【０００４】
また、Ｍｉｌｌａｎらは、ＭＡＬがエンドサイトーシス及びシグナル伝達のための細胞質ゾルの機構によって細胞外刺激を輸送することを報告した（Ｍｉｌｌａｎ，　Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　２８：　３６７５−３６８４，　１９９８）。ＭＡＬを発癌と関連づける直接の証拠はないが、トランス−ゴルジネットワークと原形質膜との間のシグナル輸送機能から、ＭＡＬタンパク質のアポトーシス及び抗腫瘍活性との関連性の大きさが推測される（Ｐｕｅｒｔｏｌｌａｎｏ，　Ｒ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，　１０：　３４３５−３４４７，　１９９９）。
上記のようにＭＡＬの機能に関して幾つかの報告があるが、癌抑制機能についてはこれまで知られていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、癌抑制遺伝子を新たに見出してこれを含有する癌抑制剤を提供することを課題とする。本発明はまた、該癌抑制遺伝子がコードするタンパク質を含有する癌抑制剤、ならびに該癌抑制遺伝子を用いる癌の検出及び診断方法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく食道癌症例の癌組織と非癌組織間で発現パターンの異なる遺伝子をディファレンシャルディスプレイ法で同定することを精力的に行ってきた。その結果、該癌組織で発現が著しく抑制されている遺伝子を同定し、クローニングしたところ、ＭＡＬ遺伝子であることが明らかになった。さらに、ＭＡＬの欠失が食道扁平上皮癌だけではなく、胃癌、大腸癌などの腺癌組織においても起きていることを見出した。このＭＡＬ遺伝子を該遺伝子を発現していないＴＥ３細胞に導入した結果、インビトロ実験において細胞の浸潤性が低下し、またヌードマウスにおける腫瘍の成長が抑えられることを見出した。これらの実験結果により、ＭＡＬ遺伝子が癌抑制遺伝子として機能していること、さらにＭＡＬ遺伝子の導入によってＭＡＬタンパク質を発現させると癌を抑制できることが明らかとなった。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
【０００７】
すなわち、本発明は、ＭＡＬ遺伝子又はその相同遺伝子を含有する癌抑制剤を提供するものである。
本発明の好ましい態様によれば、上記遺伝子又はその相同遺伝子がベクター、好ましくはウイルスベクター又は動物細胞発現用プラスミドベクターに組み込まれている上記癌抑制剤が提供される。
本発明の別の好ましい態様によれば、上記遺伝子又はその相同遺伝子がリポソームに封入されている上記癌抑制剤が提供される。
本発明の別の態様によれば、ＭＡＬタンパク質又はその相同タンパク質を含有する癌抑制剤が提供される。
【０００８】
本発明のさらに別の態様によれば、ＭＡＬ遺伝子の全部又はその一部を含む一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを用いて検体試料中のＭＡＬ遺伝子を解析することを含む、癌の検出及び診断方法が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、ＭＡＬタンパク質に対する抗体又はその断片を用いて検体試料中のＭＡＬタンパク質を解析する工程を含む、癌の検出及び診断方法が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、上記癌抑制剤の有効量をヒトを含む哺乳動物に投与する工程を含む、癌の抑制方法；上記癌抑制剤の予防及び／又は治療有効量をヒトを含む哺乳動物に投与する工程を含む、癌の予防及び／又は治療方法が提供される。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施態様及び実施方法について詳細に説明する。
（１）本発明の癌抑制剤
本発明に一態様によれば、本発明の癌抑制剤は有効成分としてＭＡＬ遺伝子又はその相同遺伝子を含む。
本発明のもう一つの態様によれば、本発明の癌抑制剤は有効成分としてＭＡＬタンパク質又はその相同タンパク質を含む。
ＭＡＬ遺伝子の塩基配列及びＭＡＬタンパク質のアミノ酸配列は既に知られており（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　８４，　１９９７−２００１，　１９８７）、ＭＡＬ遺伝子の塩基配列はＮａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　のデータベースにＭ１５８００番にて、またＭＡＬタンパク質のアミノ酸配列は同データベースにＡＡＡ３９１９６番にて登録されている。ＭＡＬ遺伝子の塩基配列は配列番号１に記載する通りであり、ＭＡＬタンパク質は配列番号１の塩基配列の５５番目から５１３番目までの領域をコードし、そのアミノ酸配列は配列番号２に示される通りである。
本明細書において「ＭＡＬ遺伝子」というのは、上記塩基配列で特定されるヒト由来の遺伝子をいい、「ＭＡＬタンパク質」というのは、該ＭＡＬ遺伝子がコードし、上記アミノ酸配列で特定されるタンパク質をいう。
【００１０】
ＭＡＬ遺伝子は、当業者に公知の技術を用いて培養細胞などから取得したｃＤＮＡであってもよいし、又は本明細書の配列番号１に記載の塩基配列に基づいてＰＣＲ法などにより化学的に合成したものでもよい。ＰＣＲ法により配列番号１に記載した塩基配列を有するＤＮＡを取得する場合、ヒトの染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを使用してＰＣＲを行う。ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片は大腸菌などの宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００１１】
上記のブローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ，　２ｎｄ　Ｅｄ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　ＮＹ．，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１〜３８，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ
（１９８７−１９９７）などに記載された方法に準じて行うことができる。
【００１２】
本発明において、「ＭＡＬ遺伝子の相同遺伝子」とは、配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加又は置換されている塩基配列であって、癌抑制活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子；又は配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、癌抑制活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子いう。また、ＭＡＬ遺伝子の相同遺伝子にはＭＡＬ遺伝子の断片も含まれる。
【００１３】
上記の「配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加又は置換されている塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から６０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個程度を意味する。
【００１４】
上記の「癌抑制活性」の程度は特に限定はされないが、好ましくはＭＡＬタンパク質が有する癌抑制活性と実質的に同等又はそれ以上の癌抑制活性をいう（以下、本明細書における「癌抑制活性」は同じ意味を示す）。
【００１５】
従って、「ＭＡＬ遺伝子の相同遺伝子」は上記に定義される構造と機能を有する限り、由来は問わず、ヒト以外の哺乳動物由来であってもよいし、ヒトなどの哺乳動物由来の遺伝子に対して人工的に変異を導入したものであってもよい。ただし、該遺伝子を後記のごとく癌抑制剤に使用する場合は臨床上の安全性の観点からヒト由来ものが好ましい。
【００１６】
上記の「配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加又は置換されている塩基配列であって、癌抑制活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子」は、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。具体的には、上記遺伝子は配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡを利用し、これらＤＮＡに変異を導入することにより取得することができる。例えば、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法などを用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ，　２ｎｄ　Ｅｄ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　ＮＹ．，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１〜３８，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆Ｓｏｎｓ　（１９８７−１９９７）などに記載の方法に準じて行うことができる。
【００１７】
上記の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニー又はプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡなどを挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ，　２ｎｄ　Ｅｄ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　ＮＹ．，１９８９などに記載されている方法に準じて行うことができる。
【００１８】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００１９】
上記の「配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、癌抑制活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子」は、上述の通り、一定のハイブリダイゼーション条件下でコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法などを行うことにより得ることができる。
【００２０】
本発明において、「ＭＡＬタンパク質の相同タンパク質」とは、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は挿入したアミノ酸配列であって、癌抑制活性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質；又は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、癌抑制活性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をいう。
【００２１】
上記した「配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は挿入したアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００２２】
上記した「配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、該アミノ酸配列と配列番号２に記載のアミノ酸配列との相同性が少なくとも７０％以上であり、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上であることを意味する。
【００２３】
ＭＡＬタンパク質は、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。比較的容易な操作でかつ大量に製造できるという点では、組み換えタンパク質が好ましい。
【００２４】
天然由来のタンパク質は、該タンパク質を発現している細胞又は組織からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせて単離することができる。化学合成タンパク質は、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法に従って合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。組み換えタンパク質は、該タンパク質をコードする塩基配列（例えば、配列番号１に記載の塩基配列）を有するＤＮＡを好適な発現系に導入することにより生産することができる。
【００２５】
なお、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換又は挿入したアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の一例示す配列番号１に記載の塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜製造又は入手することができる。
【００２６】
本発明の癌抑制剤の好ましい態様としては、有効成分として上記のＭＡＬ遺伝子又はその相同遺伝子をベクターに組み込んだ組換えベクターを含む。ベクターとしてはウイルスベクター又は動物細胞発現用ベクター、好ましくはウイルスベクターが用いられる。
【００２７】
ウイルスベクターとしてはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。中でも、レトロウイルスベクターは、細胞に感染後、ウイルスゲノムが宿主染色体に組み込まれ、ベクターに組み込んだ外来遺伝子を安定にかつ長期的に発現させる可能であるからレトロウイルスベクターを使用することが特に望ましい。
【００２８】
動物細胞発現用ベクターとしては例えばｐＣＸＮ２（Ｇｅｎｅ，　１０８，　１９３−２００，　１９９１）、ＰＡＧＥ２０７（特開平６−４６８４１号公報）又はその改変体などを用いることができる。
【００２９】
上記組換えベクターは適当な宿主に導入して形質転換し、得られた形質転換体を培養することによって生産することができる。組換えベクターがウイルスベクターの場合、これを導入する宿主としてはウイルス生産能を有する動物細胞が用いられ、例えば、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞などが挙げられる。レトロウイルスベクターの宿主としては、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、ＭＬＶなどが、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターの宿主としては、ヒト胎児腎臓由来の２９３細胞などが用いられる。ウイルスベクターの動物細胞への導入はリン酸カルシウム法などで行うことができる。また、組換えベクターが動物細胞発現用ベクターの場合、これを導入する宿主としては大腸菌Ｋ１２株、ＨＢ１０１株、ＤＨ５α株などを使用でき、大腸菌の形質転換は当業者に公知である。
【００３０】
得られた形質転換体はそれぞれに適した培地、培養条件により培養する。例えば、大腸菌の形質転換体の培養は、生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他を含有するｐＨ５〜８程度の液体培地を用いて行うことができる。培養は通常１５〜４３℃で約８〜２４時間程度行う。この場合、目的とする組み換えベクターは、培養終了後、通常のＤＮＡ単離精製法により得ることができる。
【００３１】
また、動物細胞の形質転換体の培養は、例えば約５〜２０％のウシ胎児血清を含む１９９培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地などの培地を用いて行うことができる。培地のｐＨは約６〜８が好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１８〜６０時間行う。この場合、目的とする組み換えベクターは、それを含有するウイルス粒子が培養上清中に放出されるので、ウイルス粒子の濃縮、精製を塩化セシウム遠心法、ポリエチレングリコール沈澱法、フィルター濃縮法などにより得ることができる。
【００３２】
本発明の癌抑制剤のうち、有効成分としてＭＡＬ遺伝子又はその相同遺伝子を含む癌抑制剤（以下、遺伝子治療剤という）は、有効成分であるＭＡＬ遺伝子又はその相同遺伝子を遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合することにより製造することができる。また、ＭＡＬ遺伝子又はその相同遺伝子をウイルスベクターに組み込んだ場合は、組換えベクターを含有するウイルス粒子を調製し、これを遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合する。
【００３３】
上記基剤としては、通常注射剤に用いる基剤を使用することができ、例えば、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物などの塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコースなどの溶液、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液などが挙げられる。あるいはまた、当業者に既知の常法に従って、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、植物油、界面活性剤などの助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製することもできる。これらの注射剤は、粉末化、凍結乾燥などの操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。
【００３４】
また、本発明の遺伝子治療剤は、常法により調製されたリポソームの懸濁液にＭＡＬ遺伝子を添加し凍結した後融解することにより製造することもできる。リポソームを調製する方法は、薄膜振とう法、超音波法、逆相蒸発法、界面活性剤除去法などがある。リポソームの懸濁液は超音波処理した後、遺伝子を添加するのが遺伝子の封入効率を向上させる上で好ましい。遺伝子を封入したリポソームはそのまま、又は水、生理食塩水などに懸濁して静脈投与することができる。
【００３５】
上記遺伝子治療剤の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内などの全身投与でもよいし、あるいは癌原病巣又は予想転移部位に対して、局所注射又は経口投与などの局所投与を行ってもよい。さらに、遺伝子治療剤の投与にあたっては、カテーテル技術、遺伝子導入技術、又は外科的手術などと組み合わせた投与形態をとることもできる。
【００３６】
上記遺伝子治療剤の投与量は、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日当たり組み換え遺伝子の重量として１μｇ／ｋｇ体重から１０００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。
【００３７】
また、本発明の癌抑制剤のうち、有効成分としてＭＡＬタンパク質又はその相同タンパク質を含む癌抑制剤（以下、タンパク質製剤という）は、有効成分であるＭＡＬタンパク質又はその相同タンパク質に製剤用添加物（例えば、担体、賦形剤など）を含む医薬組成物の形態で提供される。
【００３８】
上記タンパク質製剤の形態は特に限定されず、経口投与のための製剤としては例えば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤などが挙げられ、非経口投与のための製剤としては例えば、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、経粘膜吸収剤、経皮吸収剤などが挙げられる。
【００３９】
上記タンパク質製剤の投与経路は特に限定されず、経口投与又は非経口投与（例えば、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与などへの粘膜投与、又は吸入投与など）の何れでもよい。
【００４０】
上記タンパク質治療剤の投与量は、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日あたり０．００１μｇ／ｋｇ体重から１０００μｇ／ｋｇ体重程度の範囲であり、好ましくは０．００１μｇ／ｋｇ体重から１００μｇ／ｋｇ体重程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。
【００４１】
上記癌抑制剤（遺伝子治療剤及びタンパク質製剤の両形態を含む）は、その有効量をヒトを含む哺乳動物に投与することによって癌を抑制するのに使用することができる。上記癌抑制剤はまたその予防及び／又は治療有効量をヒトを含む哺乳動物に投与することによって癌の予防及び／又は治療をするのに使用することができる。
【００４２】
本明細書でいう「癌抑制」とは、癌の発生又は転移・着床を防止するという予防的作用、ならびに癌細胞の増殖を抑制したり、癌を縮小することによって癌の進行を阻止したり、症状を改善させるという治療的作用の両方を含む最も広い意味を有し、いかなる場合においても限定的に解釈されるものではない。
【００４３】
本発明の癌抑制剤の適用対象となる癌の具体例としては、例えば悪性黒色腫、悪性リンパ腫、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、尿管腫瘍、胆嚢癌、胆管癌、胆道癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、睾丸腫瘍、上顎癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、甲状腺癌、脳腫瘍、カポジ肉腫、血管腫、白血病、真性多血症、神経芽腫、網膜芽腫、骨髄腫、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚癌、基底細胞癌、皮膚付属器癌、皮膚転移癌、皮膚黒色腫などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、上記のうち特に好ましい適用対象となる癌は、食道癌、胃癌、大腸癌、乳癌である。
【００４４】
（２）ＭＡＬ遺伝子を用いた癌の検出及び診断方法
本発明の癌の検出及び診断方法は、ＭＡＬ遺伝子の全部又はその一部を含む一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを用いて検体試料中のＭＡＬ遺伝子を解析する工程を含む。
ここで、ＭＡＬ遺伝子の一部とは、配列番号１に記載するＭＡＬ遺伝子の塩基配列のうち、例えば約１０〜３０個の連続する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを意味する。検体試料としては、腫瘍が疑われる組織切片、血液、リンパ液、喀痰、肺洗浄液、尿、便、組織培養上清などを用いることができる。
【００４５】
上記の「癌の検出」とは組織等における癌の存在の有無を知ることをいい、「癌の診断」には癌の進行度を知ることのみならず、癌の治療、例えば癌切除などの外科的療法、放射線療法、化学的療法など予後の予測をも含む。
【００４６】
癌の検出及び診断は、ＭＡＬ遺伝子の全部又はその一部を含む一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡをプライマー又はプローブとして用いて検体試料中のＭＡＬ遺伝子を解析することにより行う。ここで「ＭＡＬ遺伝子を解析する」とは、具体的には遺伝子の変異の検出又は遺伝子の発現量の異常の検出を行うことをいう。
【００４７】
遺伝子の変異の検出は、上記ＤＮＡ又はＲＮＡをプライマーとして用いる場合では、例えば選択した２種の配列のプライマーによりＰＣＲ法で検体試料より調製したＤＮＡの部分配列を増幅させ、増幅産物の塩基配列を直接解析するか、あるいはこの増幅産物を前記と同様にプラスミドに組み込み、宿主細胞を形質転換させて培養し、得られるクローンの塩基配列を解析することにより行う。あるいは、Ｌｉｇａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　法（Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　４，　５６０−５６９，　１９８９）、変異配列特異的ＰＣＲ法（Ｒｕａｎｏ　ａｎｄ　Ｋｉｄｄ，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　１７，　８３９２，　１９８９）　よって検体試料中の該遺伝子の特定の変異の有無を直接検出することができる。また上記ＤＮＡ又はＲＮＡをプローブとして用いる場合では、ＳＳＣＰ法、ＲＮａｓｅ−Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ法によって検体試料中の該遺伝子の点突然変異の検出を行うことができる。あるいは、サザンハイブリダイゼーション法によって検体試料中の該遺伝子の変異の検出を行うこともできる。
一方、遺伝子の発現量の異常の検出は、上記ＲＮＡ配列を含むプローブを用いてノーザンハイブリダイゼーション法又はＲＴ−ＰＣＲ法によって行うことができる。
【００４８】
（３）ＭＡＬタンパク質抗体又はその断片を用いた癌の検出及び診断方法
本発明の癌の検出及び診断方法は、ＭＡＬタンパク質に対する抗体又はその断片を用いて検体試料中のＭＡＬタンパク質を解析する工程を含む。
本方法に用いるＭＡＬタンパク質に対する抗体（以下、ＭＡＬ抗体という）は、ＭＡＬタンパク質の全部又は一部を抗原として、通常の方法で作成することができる。ＭＡＬタンパク質の一部とは、配列番号２に記載するＭＡＬタンパク質のアミノ酸配列のうち、例えば連続する少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは、少なくとも約１１〜２０個のアミノ酸からなるポリペプチドをいう。抗原とするＭＡＬタンパク質の全部又は一部の調製法は生物学的手法、化学合成手法いずれでもよい。
【００４９】
ポリクローナル抗体は、例えば上記抗原をマウス、モルモット、ウサギなどの動物の皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内などに複数回接種し十分に免疫した後、該動物から採血、血清分離して作製することができる。モノクローナル抗体は、例えば上記抗原で免疫したマウスの脾細胞と市販のマウスミエローマ細胞との細胞融合により得られるハイブリドーマを作成後、該ハイブリドーマ培養上清、又は該ハイブリドーマ投与マウス腹水から作成することができる。
【００５０】
上記のようにして調製したＭＡＬタンパク質抗体又はその断片を用いることによって検体試料中のＭＡＬタンパク質の発現量を知ることができる。測定には、例えばイムノブロット法、酵素抗体法（ＥＩＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光抗体法、免疫細胞染色などの免疫学的方法、又はウェスタンブロット法などが利用できる。ここで、ＭＡＬタンパク質抗体の断片とは当該抗体の一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）などをいう。また、検体試料としては、腫瘍が疑われる組織切片、血液、リンパ液、喀痰、肺洗浄液、尿、便、組織培養上清などを用いることができる。測定した検体試料中のＭＡＬタンパク質の発現量が低い場合は、検体とした組織や細胞においてＭＡＬ遺伝子の発現が抑制されていることになり、癌の存在を疑うことができる。
【００５１】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
【００５２】
【実施例】
（Ａ）材料及び方法
Ａ−１．腫瘍源及び細胞株
一次腫瘍組織は食道癌３９例、大腸癌２０例、胃癌２０例、乳癌２０例の患者からそれぞれ採取した。新鮮な腫瘍を外科的切除により入手し、ＤＮＡ及びＲＮＡ分析に使用するまで−８０℃で保存した。
１３の食道癌細胞株（ＴＥ１、ＴＥ２、ＴＥ３、ＴＥ４、ＴＥ５、ＴＥ６、ＴＥ７、ＴＥ８、ＴＥ９、ＴＥ１１、ＴＥ１２、ＴＥ１３、及びＴＥ１４）についてＭＡＬ遺伝子の発現を調べた。これらの細胞株を３７℃に設定した５％ＣＯ２インキュベーター内でＴ−７５フラスコ（Ｃｏｓｔａｒ　Ｉｎｃ．，　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，　ＭＡ）に入れたＲＰＭＩ１６４０で増殖させた。ＫＹＳＥ１５０（食道上皮癌）、ＫＡＴＯＩＩＩ（胃癌）、ＣＯＬＯ２０１（大腸癌）及びＭＣＦ７細胞株（乳癌）も同様に分析した。
【００５３】
Ａ−２．組織試料からのｃＤＮＡの調製
総ＲＮＡを、酸・グアニジニウムチオシアネート／フェノール／クロロホルム抽出法（ＡＧＰＣ）により抽出した　（Ｍｉｍｏｒｉ，　Ｋ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，　７６：　５３１−５３６，１９９７）。ＲＮＡｓｅの混入を防ぐために、全てのサンプルをエッペンドルフチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）　に入れて処理し、手袋をつけて扱った。抽出した総ＲＮＡ１μｇをオリゴ−ｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡに逆転写した。
【００５４】
Ａ−３．ディファレンシャルディスプレイ
ディファレンシャルディスプレイのアッセイは文献（Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ，　Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，　７９：　１７５−１７８，　１９９８）に記載の方法に従い、以下のようにして行った。まず、５例の食道癌組織と対応する正常組織から抽出した２．５μｇの総ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。アンカープライマーｇＴ１５Ｘは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，　Ｂｅｖｅｒｌｙ，　ＭＡ）　を用いて３２Ｐ−アデノシン　５’−三リン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ，　Ｔｏｋｙｏ　Ｊａｐａｎ）　により末端標識した。ＰＣＲ増幅条件は文献　（Ｓｈｉｂａｔａ，Ｋ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　５９：　１０９６−１１０１，　１９９９；　Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ，　Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，　７９：　１７５−１７８，　１９９８）に記載の条件に従った。増幅された産物（ｃＤＮＡ）を６％シークエンスゲル上で電気泳動し、目的のバンド、すなわち正常組織からの増幅産物にのみ、また腫瘍組織からの増幅産物にのみ存在するバンドを切り出して９４℃で加熱した。この混合物を再度増幅して、ＴＡクローニング法（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，　ＳａｎＤｉｅｇｏ，　ＣＡ）　によりクローニングした。
正常な食道組織においてのみ検出されたクローンの一つの配列はヒトＭＡＬｃＤＮＡ配列　（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ１５８００）　と同一であり（Ａｌｏｎｓｏ，　Ｍ．Ａ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），　８４：　１９９７−２００１，　１９８７）、さらなる研究のために選択した。
【００５５】
Ａ−４．ＭＡＬ遺伝子の検出のためのプライマー
ＭＡＬ　ｃＤＮＡ特異的プライマーセットを以下に示す：
ＣＡＧ／ＴＧＧ／ＣＴＴ／ＣＴＣ／ＧＧＴ／ＣＴＴ／ＣＡＣ（フォーワードプライマー：配列番号３）
ＧＴＣ／ＴＴＧ／ＣＡＴ／ＣＧＴ／ＧＡＴ／ＧＧＴ／ＧＧＣ（リバースプライマー：配列番号４）
ＭＡＬ　ＯＲＦの３’部位の増幅産物の長さは、ＭＡＬ　ＯＲＦのエキソン１からエキソン３までにわたる３０７ｂｐである。
【００５６】
Ａ−５．半定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイによるＭＡＬ遺伝子発現の分析
ＭＡＬ　ｃＤＮＡの増幅は、１０×ＰＣＲバッファー（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５００ｍＭ　ＫＣｌ、１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）、２５ｍＭ　ｄＮＴＰ（それぞれ１００ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰの混合物）、１０ｐｍｏｌ　のフォーワード及びリバースＭＡＬプライマー、ならびに１ユニットのＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，　Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷＩ，　ＵＳＡ）を含む総量２５μｌ中で行った。ＭＡＬ増幅のための反応は、サーマルサイクラー　９６００（Ｒｏｃｈｅ，　Ｊａｐａｎ）内で９４℃で１５秒、５７℃で３０秒、及び７２℃で３０秒を２４サイクル行った。一方、ＧＡＰＤＨの増幅は文献に記載されているプロトコールにより実施した（Ｍｏｒｉ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，　５５：　３４１７−３４２０，　１９９５）。増幅されたＤＮＡ断片を比較のためのＤＮＡ分子量マーカーを用いて臭化エチジウムを含む１．５％アガロースゲル上で電気泳動した。増幅産物をＮＩＨ　Ｉｍａｇｅ分析、ＰＣＲ増幅産物の発現測定のためのソフトウェアプログラム（Ａｂｂｏｔｔ，　Ｂ．Ｄ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｓｃｉ．，　４７：　７６−８５，　１９９９　；　Ｗａｄｌｅｒ，　Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　２６７：　２４−２９，　１９９９　；　ＭｃＣａｒｒｅｙ，　Ｊ．Ｒ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．，　９：　１１７−１２３，　１９９２）により定量した。臨床病理因子におけるＭＡＬ　ｍＲＮＡ発現の有意性についての統計的分析をＦｉｓｈｅｒの直接確率検定により判定した。
【００５７】
Ａ−６．５−アザ−２’−デオキシシチジンによるＭＡＬ遺伝子発現の誘導
脱メチル化を誘導するために腫瘍細胞を５−アザ−２’−デオキシシチジン（ＤＡＣ）処理した。ＤＡＣ処理の手順は、既報（Ｍｏｒｉ，　Ｍ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ，　２２４：　１８３−１８８，　１９９６）に記載されるようにＭＡＧＥのような公知のメチル化制御遺伝子の使用によって確認した。すなわち、食道癌細胞株を１μＭのＤＡＣで７２時間（Ｍｏｒｉ，　Ｍ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ，　２２４：　１８３−１８８，　１９９６）、又はＤＡＣに加えてＭＡＬ発現の誘導評価に先立ってジメチル化を誘導するヒストンデアセチラーゼ（Ｃａｍｅｒｏｎ，　Ｅ．Ｅ．，　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，　２１：　１０３−１０７，　１９９９）の特異的インヒビターであるトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）で処理した。
【００５８】
Ａ−７．トランスフェクションアッセイ
全長のＭＡＬ　ｃＤＮＡを増幅するためのプライマーとして、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を有するＴＣＣ／ＣＡＡ／ＧＣＴ／ＴＧＡ／ＣＧＣ／ＣＡＧ／ＣＡＣ／ＧＣＣ（配列番号５）及びＥｃｏＲＩ部位を有するＴＣＡ／ＴＴＡ／ＡＧＣ／ＣＧＣ／ＡＧＧ／ＡＡＴ／ＴＣＴ／ＴＧＡ／ＧＣＴ／Ｇ（配列番号６）を用いた。５１１ｂｐの全長の増幅されたＭＡＫ遺伝子産物を精製し、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化した後、これを応答ベクターｐＴＲＥ２　（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，　ＣＡ）　のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位にライゲートした。調節プラスミドｐＴｅｔ−ＯｆｆのＴＥ３細胞へのトランスフェクション及びクローン選択の後、ＭＡＬ−ｐＴＲＥ２プラスミドをｐＴｅｔ−Ｏｆｆを有するクローンにリポフェクタミン（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｉｎｃ．，　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，　ＭＤ）　を用いてトランスフェクトした。安定にトランスフェクトされたコロニーを選択し、野生型ＭＡＬを発現するコロニーをさらに分析した。ＭＡＬ　ｍＲＮＡの発現はウェスタンブロット分析により確認した。２４のクローンのうち、ＭＡＬ発現が１μＭドキサイクリンを用いた処理によって調節されたクローン＃２２及び＃１２をさらなる研究のために選択した。
【００５９】
Ａ−８．ウエスタンブロット分析
Ｔ−７５フラスコからの細胞　（５×１０７〜１０×１０７／ｍｌ）　をリン酸緩衝化生理食塩水　（ＰＢＳ）　で洗浄し、２ｍｌの溶液（２５ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ　ｐＨ７．５、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）に入れて４℃で２０分間溶解した後、サンプルを２２ゲージの針に通すことにより溶解物をホモジナイズした。次いで、Ｍｉｌｌａｎらによる先の研究（Ｍｉｌｌａｎ，　Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　２８：　３６７５−３６８４，　１９９８）に従い、抗ＭＡＬ　６Ｄ９　モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｍｉｌｌａｎ，　Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．，　同上）用いたウェスタンブロット分析を次のようにして行った。まず、平衡遠心分離により糖脂質豊富膜　（ＧＥＭ）　を単離した。イムノブロット分析のために、ＧＥＭ試料を還元条件下の１５％　アクリルアミドゲルにおけるＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，　Ｂｅｄｆｆｏｒｄ，　ＭＡ）に転写した。５％脱脂粉乳、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ溶液でブロッキングした後、ブロットを培養上清として用いる２倍希釈の抗６Ｄ９　ｍＡｂと共にインキュベートした。数回洗浄した後、ブロットを５０００倍希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と共に１時間インキュベートし、よく洗浄し、化学発光ウエスタンブロッティングキット（ＥＣＬ，　Ａｍｅｒｓｈａｍ，　Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，　ＵＫ）を用いて現像した。
【００６０】
アポトーシス関連タンパク質をＰ５３　（Ｄａｋｏ，　Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）、Ｂｃｌ２　（Ｄａｋｏ，　Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）、Ｂａｘ　（Ｄａｋｏ，　Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）　及びＳｒｃ様キナーゼのＬｃｋ　（Ｄａｋｏ，　Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に対する特異的抗体を用いて検出した。Ｌｃｋは、Ｍａｌと会合するＧＥＭ中のＳｒｃ様キナーゼとして知られており　（Ｍｉｌｌａｎ，　Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　２８：　３６７５−３６８４，　１９９８）、Ｇ２Ｍチェックポイントの必須の分子の１つであることが知られている（ａｌ−Ｒａｍａｄｉ，　Ｂ．Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　１５７：　４７５１−４７６１，　１９９６　；　ａｌ−Ｒａｍａｄｉ，　Ｂ．Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），　９５：　１２４９８−１２５０３，　１９９８）。
【００６１】
Ａ−９．腫瘍形成アッセイ
ヌードマウスにおける腫瘍の増殖は、１×１０７細胞のＴＥ３−ｍｏｃｋ細胞（以下、ＴＥ３−ｍｏｃｋ細胞とはＭＡＬ遺伝子を含まないベクターのみを導入したＴＥ３細胞をいう）又はＴＥ３−ＭＡＬ細胞（トランスフェクタントクローン＃２２及び＃１２）のいずれかをそれぞれ６匹のヌードマウスに皮下接種することによりアッセイした。接種の１２日後及び１６日後に３次元で腫瘍サイズを測定した。腫瘍体積の差をＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により分析した。
【００６２】
Ａ−１０．ミクロ細孔固有運動性
ＭＡＬをトランスフェクトした細胞の湿潤能力をマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）浸潤アッセイ（Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ，　Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，　７９：　１７５−１７８，　１９９８）により決定した。すなわち、２４−ウェルトランスウェル培養チャンバーの上部チャンバーのポリカーボネート膜　（孔径８．０μｍ）をＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ　ＢｉｏＣｏａｔＴＭ　ＭａｔｒｉｇｅｌＴＮ　ＩｎｖａｓｉｏｎＣｈａｍｂｅｒ，　ＢＥＣＴＯＮ　ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）で被覆した。サブコンフルエントな細胞（ＴＥ３−ｍｏｃｋ細胞及びトランスフェクタントクローン＃２２細胞）を２４時間飢餓状態にした後、０．０２％　ＥＤＴＡを含む０．０５％トリプシンを用いて回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、０．１％　画分Ｖ　ＢＳＡを含み血清を含まない培地に５×１０４細胞／ｍｌで再懸濁した。５００μｌの腫瘍細胞懸濁液を上部チャンバーに入れ、その直後に化学誘引物質として５％　ＦＢＳを加えた７５０μｌのＲＰＭＩ　１６４０を下部チャンバーに注入した。３７℃で２４時間インキュベートした後、膜をメイ−グリュンヴァルド及びギムザ溶液で染色した。膜を通って下側表面に移動した浸潤性細胞を、×４００倍の光学顕微鏡を用いて９つの異なる視野で計数した。それぞれの実験を３つのウェルで行い３回繰り返した。
【００６３】
Ａ−１１．ＦＡＣＳ及びＥＬＩＳＡ分析
▲１▼細胞周期の分析
細胞周期の分析をＤＮＡ−ヨウ化プロビジウム（ＰＩ）結合とＦＡＣＳフローサイトメトリーを用いた分析によって行った。１×１０６のＴＥ３−ｍｏｃｋ細胞又はＴＥ３−ＭＡＬ細胞（トランスフェクタントクローン＃２２及び＃１２）を４８時間無血清培地で飢餓状態にした後、１０％のウシ胎児血清　（ＦＢＳ）　を含むＤＭＥＭによって刺激した。１８時間後、細胞を０．０５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡで剥がし、遠心分離によって集め、計数し、細胞周期分析のために調製した。細胞をトリプシン処理し、７０％エタノールで固定し、ヨウ化プロピジウム　（ＰＩ）　（５０μｇ／ｍｌ）　で染色して、ＥＰＩＣＳ　ＸＬ　（ＢＥＣＫＭＡＮ　ＣＯＵＬＴＥＲ
Ｃｏｒｐ．，　Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，　ＣＡ）　により分析した。
【００６４】
▲２▼細胞増殖の分析
細胞増殖の分析については、ＢｒｄＵ　ＥＬＩＳＡキット　（Ｒｏｓｃｈ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｃｏｒｐ．，　Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）　を用いてＥＬＩＳＡを行った。１×１０４のＴＥ３−ｍｏｃｋ細胞又はＴＥ３−ＭＡＬ細胞（トランスフェクタントクローン＃２２及び＃１２）、９６−ウェルプレート上の３％　ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で７２時間飢餓状態にした後、ＥＧＦ　（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｏｒｐ．，　Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，　Ｍｏ）　で刺激した。１８時間後に、ＢｒｄＵを５時間パルスして、精密マイクロプレートリーダーＥｍａｘ　（Ｗａｋｏ，　Ｏｓａｋａ，　Ｊａｐａｎ）　により分析した。
【００６５】
▲３▼アポトーシスの分析
アポトーシスの分析のために、１×１０６のＴＥ３−ｍｏｃｋ細胞又はＴＥ３−ＭＡＬ細胞（トランスフェクタントクローン＃２２及び＃１２）を１０％　ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中２４時間培養し、ＣＤ９５　（Ｆａｓ）　抗体　（１００ｎｇ／ｍｌ）　（ＣＨ１１：　ＢＥＣＫＭＡＮ　ＣＯＵＬＴＥＲ　Ｃｏｒｐ．）にて処理した。４８時間後、細胞をトリプシン処理して、ＦＩＴＣ　（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｃｏｒｐ．，　Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ，　ＣＡ）　とコンジュゲートしたアネキシンＶで染色した。分析はＦＡＣＳｃａｎ　（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｃｏｒｐ．）　によって行った。Ｆａｓ発現を評価するために、散在して成長状態にある１×１０６の細胞をＦＩＴＣ　（ＵＢ２：　ＢＥＣＫＭＡＮ　ＣＯＵＬＴＥＲ　Ｃｏｒｐ．）　とコンジュゲートしたマウス抗Ｆａｓ抗体と共にインキュベートし、ＦＡＣＳｃａｎにより分析した。
【００６６】
（Ｂ）結果
Ｂ−１．食道癌症例などにおけるＭＡＬ　ｍＲＮＡの発現
図１はＭＡＬ遺伝子のタンパク質コード領域のＣ末端側から３０７ｂｐの領域のｍＲＮＡ発現を、１６例の食道癌患者の癌組織部及び正常部に対してＲＴ−ＰＣＲ法により検出した結果を示す。その結果、陽性バンドは正常試料（Ｎ）にだけ現われ、全ての腫瘍組織試料（Ｔ）においては消失又は実質的に減退していた。
図２は、種々のヒト癌腫におけるＭＡＬ遺伝子の発現を上記と同様にして検出した結果を示す。調べたヒト癌細胞株は、ＫＡＴＯＩＩＩ（胃癌）、ＣＯＬＯ２０１（大腸癌）、及びＭＣＦ７細胞株（乳癌）であり、それぞれレーン１、２、３、４及び５において電気泳動した。ＰＣレーンにおけるバンドは正常な食道上皮から増幅した陽性コントロールである。他の癌腫においてもＭＡＬ遺伝子は正常部でのみ検出されるか、あるいは正常部、癌組織部ともに検出されなかった。このことから、ＭＡＬ遺伝子は複数の臓器に共通して癌抑制遺伝子としての機能を持つ可能性が示唆された。
【００６７】
Ｂ−２．５−アザ−２’−デオキシシチジン（ＤＡＣ）によるＭＡＬ遺伝子発現の誘導
図３Ａは、ＭＡＬをトランスフェクトしたＴＥ３トランスフェクタントクローン（＃２２，＃１２，＃８）におけるＭＡＬ遺伝子の発現を示す。ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞を陽性コントロールとし、ＴＥ３細胞を陰性コントロールとした。図３Ｂ及びＣは、ＤＡＣ処理によるＭＡＬ遺伝子の発現誘導を示す。ＫＹ１０７及びＣＯＬＯ２０５においてＤＡＣ処理はＭＡＧＥ遺伝子の発現を誘導した（図３Ｂ）。このＤＡＣ処理と同条件にて食道癌細胞株１３株をＤＡＣ処理したところ、ＴＥ１，　ＴＥ３，　及びＴＥ５の３株においてＭＡＬ発現の誘導が確認された（図３Ｃ）。また、ＴＳＡとＤＡＣの両処理によって４株にＭＡＬ発現の誘導が確認された。ＭＡＬは腫瘍細胞においてＴＳＡだけでは転写的に再活性化されない。しかしながらＴＳＡに続いてＤＡＣ処理を行うと１３株のうち１２株にＭＡＬの強い発現をアップレギュレートすることができる。ＴＥ７はＴＳＡ及びＤＡＣ処理なしにＭＡＬｍＲＮＡのベースラインの発現が確認された。データを下記表１に示す。
【００６８】
【表１】
2004018484.tif 000002
【００６９】
Ｂ−３．ＭＡＬをトランスフェクトした細胞における腫瘍形成の阻害
図４は、ＭＡＬをトランスフェクトしたＴＥ３トランスフェクタントクローン（＃２２，＃１２，＃８）におけるＭＡＬタンパク質発現をウェスタンブロットによって確認した結果を示す。ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞及びＴＥ３（親細胞）をそれぞれ陽性コントロール及び陰性コントロールとして用いた。ＴＥ３（親細胞）では、ＭＡＬタンパク質が予想したサイズで観察された。
【００７０】
図５Ａは、ヌードマウスにおけるＭＡＬトランスフェクタント（ＴＥ３−ＭＡＬ細胞）とＴＥ３−ｍｏｃｋ細胞の腫瘍成長の比較を示す。それぞれの曲線は、６つの腫瘍の平均　（±ＳＤ）　体積を表す。ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（図５Ｂ）において、第１２日　（ｐ＝０．０００１８、ｔ検定）及び第１６日　（ｐ＝０．００１６）　にＴＥ３−ＭＡＬ細胞の腫瘍の増殖がＴＥ３−ｍｏｃｋ細胞と比較して有意に抑制された。また第１６日に、ＴＥ３−ＭＡＬ細胞の腫瘍は平均２１９．２±８７．８ｍｍ３であったのに対して、ＴＥ３−ｍｏｃｋ細胞の腫瘍は平均５５４．０±１７０．７ｍｍ３であった（図５Ａ参照）。
以上より癌細胞にＭＡＬ遺伝子を導入することによって増殖抑制効果が発揮され、ＭＡＬは癌抑制遺伝子として機能することが明らかとなった。
【００７１】
Ｂ−４．ＭＡＬをトランスフェクトしたＴＥ３細胞における固有運動性の抑制
図６は、ＴＥ３−ｍｏｃｋ細胞（Ａ→Ａ’）及びＴＥ３−ＭＡＬ細胞（Ｂ→Ｂ’）の浸潤の比較を示す。ＴＥ３−ｍｏｃｋ細胞についてはフィールド当たり６１細胞がミクロ細孔の観察されたが２４時間後には６１細胞中２８細胞がミクロ細孔を通りぬけた。一方、ＴＥ３−ＭＡＬ細胞（クローン＃２２）についてはフィールド当たり４０細胞がミクロ細孔にあり、２４時間後には４０細胞中３細胞しかミクロ細孔を通りぬけなかった。従ってミクロ細孔を通り抜けた細胞の数は、ＴＥ３−ＭＡＬ細胞に比べてＴＥ３−ｍｏｃｋ細胞が有意に高く、ＴＥ３−ＭＡＬ細胞は細胞の固有運動性が減少し膜湿潤性が低下した。
【００７２】
Ｂ−５．Ｇ１／Ｓの移行の阻止及びＭＡＬに影響を受けたアポトーシス
図７Ａは、ＴＥ３−ｍｏｃｋ細胞（ＴＥ３／ＭＡＬ（−））及びＴＥ３−ＭＡＬ細胞（ＴＥ／ＭＡＬ（＋））の細胞周期を示す。細胞周期の分析において、飢餓状態及び増殖状態の両方で、ＴＥ３−ｍｏｃｋ細胞とＴＥ３−ＭＡＬ細胞（クローン＃２２、＃１２）との間に顕著な差違があった。増殖状態ではＴＥ３−ＭＡＬ細胞（クローン＃２２、＃１２）はＴＥ３−ｍｏｃｋ細胞（５５．６％）と比較してＳ期の細胞数が著しく減少した（それぞれ１４．８％、３４．５％）。また、ＴＥ３−ＭＡＬ（クローン＃１２）細胞はＴＥ３−ｍｏｃｋ細胞（６３．４％）に比較してＧ１期の細胞集団がずっと多く含まれていた（８３．７％）。これはＴＥ３−ＭＡＬがＧ１／Ｓ移行を阻止したことを示しており、癌細胞にＭＡＬ遺伝子を導入することにより細胞周期の回転が安定化し、増殖が抑制されることがわかった。
【００７３】
図７Ｂは、ＴＥ３−ｍｏｃｋ細胞及びＴＥ３−ＭＡＬ細胞におけるブロモデオキシチミジン（ＢｒｄＵ）取り込みを示す。細胞増殖の分析において、ＴＥ３−ＭＡＬ細胞（クローン＃２２、＃１２）は、ＴＥ−ｍｏｃｋ細胞（０．９３１±０．０５３）と比較してＢｒｄＵ取り込みが顕著に減少し（それぞれ０．５８７±０．１１４、０．７２０±０．１２５）、この差は統計的に有意である（それぞれｐ＝０．００４３、ｐ＝０．００５５）。
【００７４】
図７ＣはＴＥ３−ＭＡＬ細胞におけるアポトーシスを示す。表面に近いＦａｓの発現が、ＴＥ３−ＭＡＬ細胞ではＴＥ３−ｍｏｃｋ細胞と比較して顕著に誘導されることが確認された。この知見と一致してＦａｓ抗体の刺激後にアネキシンＶが劇的に右にシフトした。これらの結果は、ＴＥ３−ＭＡＬ細胞がＴＥ３−ｍｏｃｋ細胞と比較して、Ｆａｓリガンド刺激によってより顕著なアポトーシスを行うことを示している。
一方、ＴＥ３−ＭＡＬ細胞及びＴＥ３−ｍｏｃｋ細胞の間には、Ｐ５３、Ｂｃｌ２、Ｂａｘ及びＬｃｋタンパク質のようなアポトーシス関連タンパク質の発現には差違がなかった。
従ってＭＡＬ−ＴＥ３上のアポトーシスはＦａｓシグナル伝達経路により観察され、Ｐ５３、Ｂａｘ、Ｂｃｌ２及びＬｃｋとは無関係であるといえる。すなわちＭＡＬタンパク質は、アポトーシスの誘導過程でＦａｓ受容体を増大させるか、又はその代謝回転を活性化したと考えられる。
【００７５】
（Ｃ）結論
（１）ＭＡＬ遺伝子のタンパク質コード領域のＣ末端側から３０７ｂｐの領域のｍＲＮＡ発現を、１６例の食道癌患者の癌組織部および正常部に対してＲＴ−ＰＣＲ法により検出した。その結果、ＭＡＬ遺伝子は正常部では１０例で検出されたのに対し、癌組織では検出されないかまたは発現が弱かった。
（２）胃癌、大腸癌、乳癌の各５例につき、癌組織部および正常部に対して同様の試験を行ったが、ＭＡＬ遺伝子は正常部でのみ検出されるか、あるいは正常部、癌組織部ともに検出されなかった。このことから、ＭＡＬ遺伝子は複数の臓器に共通して癌抑制遺伝子としての機能を持つ可能性が示唆された。
（３）癌におけるＭＡＬ発現抑制機構を調べたところ、ＬＯＨや突然変異は認められなかった。そこで、食道癌細胞１３株についてＤＡＣ処理したところ、３株はＤＡＣのみで発現誘導を認め、９株はトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）をＤＡＣ処理前に加えたことによってＭＡＬ発現誘導された。このことは脱アセチル化およびメチル化がＭＡＬ発現制御において重要であることが示す。
（４）ヌードマウスの皮下にＴＥ３−ＭＡＬ細胞、ＴＥ３−ｍｏｃｋ細胞を移植してその増殖を調べた。ＴＥ３−ｍｏｃｋ細胞を移植した場合、移植１６後の腫瘍径が５５０ｍｍであったのに対し、ＴＥ３−ＭＡＬ細胞は２２０ｍｍと増殖が抑制されていることがわかった。
（５）ＭＡＬの癌抑制遺伝子としての機能を確認するために、ＭＡＬを発現していないＴＥ３細胞にＭＡＬ遺伝子組み込み（ＴＥ３−ＭＡＬ細胞）、そのｍＲＮＡおよび蛋白の発現を確認した。ＴＥ３−ＭＡＬ細胞はトランスウェルチャンバーを用いたインビトロの細胞浸潤実験で、ＭＡＬを組み込んでいないＴＥ３−ｍｏｃｋ細胞より浸潤性が低下した。
（６）インビトロ細胞培養においても、ブロモデオキシチミジン（ＢｒｄＵ）取り込み実験によれば、ＴＥ３−ｍｏｃｋ細胞に比べＴＥ３−ＭＡＬ細胞細胞はＢｒｄＵ取り込みが顕著に減少し、増殖が抑えられることが明らかになった。
（７）ＭＡＬ導入株は非導入株に比しＦａｓ受容体を多く有することが明らかとなり、ＭＡＬはＦａｓシグナル経路を介してアポトーシスを起こすことで抗腫瘍効果を発揮することが示された。
【００７６】
【発明の効果】
本発明によれば、新たに癌抑制機能を見出したＭＡＬ遺伝子又は該遺伝子がコードするＭＡＬタンパク質を含有する癌抑制剤、ＭＡＬ遺伝子又はＭＡＬタンパク質を用いた癌の検出及び診断方法が提供される。これらの薬剤及び方法は癌の診断や癌の予後の予測などの臨床上の観点から、あるいは癌の基礎的研究の観点から非常に有用である。
【配列表】
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【００７７】
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2004018484.tif 000005
【００７８】
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【００７９】
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【００８０】
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【００８１】
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【００８２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、食道癌１６例におけるＭＡＬ遺伝子のタンパク質コード領域のＣ末端側から３０７ｂｐの領域のｍＲＮＡ発現を示す。
【図２】
図２は、種々のヒト癌腫（胃癌、大腸癌、乳癌）におけるＭＡＬ遺伝子の発現を示す。
【図３】
図３Ａは、ＭＡＬをトランスフェクトしたＴＥ３トランスフェクタントクローン（＃２２，＃１２，＃８）におけるＭＡＬ遺伝子の発現を示す。図３Ｂ及び図３Ｃは、ＤＡＣ処理によるＭＡＬ遺伝子の発現誘導を示す。
【図４】
図４は、ＭＡＬをトランスフェクトしたＴＥ３トランスフェクタントクローン（＃２２，＃１２，＃８）におけるＭＡＬタンパク質発現をウェスタンブロットによって確認した結果を示す。
【図５】
図５Ａは、ヌードマウスにおけるＭＡＬトランスフェクタント（ＴＥ３−ＭＡＬ細胞）とＴＥ３−ｍｏｃｋ細胞の腫瘍成長の比較を示す。図５Ｂはヌードマウスの写真を示す。
【図６】
図６は、ＴＥ３−ｍｏｃｋ細胞（Ａ→Ａ’）及びＴＥ３−ＭＡＬ細胞（Ｂ→Ｂ’）の浸潤の比較を示す。
【図７】
図７Ａは、ＴＥ３−ｍｏｃｋ細胞（ＴＥ３／ＭＡＬ（−））及びＴＥ３−ＭＡＬ細胞（ＴＥ／ＭＡＬ（＋））の細胞周期を示す。図７Ｂは、ＴＥ３−ｍｏｃｋ細胞及びＴＥ３−ＭＡＬ細胞におけるＢｒｄＵ取り込みを示す。図７ＣはＴＥ３−ＭＡＬ細胞におけるアポトーシスを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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