(57)【要約】【課題】  マクロファージコロニー刺激因子の結晶および結晶化方法を提供すること。【解決手段】  結晶化マクロファージコロニー刺激因子α（Ｍ−ＣＳＦα）であって、該Ｍ−ＣＳＦαは２つのＭ−ＣＳＦαポリペプチドモノマーのダイマーであり、該モノマーは同一または異なり、かつ成熟Ｍ−ＣＳＦαポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有し、そして該モノマーが異なる場合、該モノマーが少なくとも１つの、しかし５つより少ないアミノ酸残基によって他方と異なる、結晶化Ｍ−ＣＳＦα。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶化マクロファージコロニー刺激因子α（Ｍ−ＣＳＦα）であって、該Ｍ−ＣＳＦαは２つのＭ−ＣＳＦαポリペプチドモノマーのダイマーであり、該モノマーは同一または異なり、かつ成熟Ｍ−ＣＳＦαポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有し、そして該モノマーが異なる場合、該モノマーが少なくとも１つの、しかし５つより少ないアミノ酸残基によって他方と異なる、結晶化Ｍ−ＣＳＦα。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に記載される研究は、政府の援助により資金供与された。本研究より生まれる発明に関する確定した権利は、政府が所有する。
【０００２】
本願は、１９９２年６月９日に出願された米国特許出願第０７／８９６，５１２号の一部継続出願である。
【０００３】
本発明は、一般に、マクロファージコロニー刺激因子「Ｍ−ＣＳＦ」の結晶の組成に関するものであり、特に、アゴニストおよびアンタゴニスト作成、ならびにこれらの検出アッセイのための結晶Ｍ−ＣＳＦの構造上の情報（Ｘ線回折パターンを含む）の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
単球−マクロファージコロニー刺激因子は、マクロファージ、内皮細胞、および線維芽細胞を包含する種々の細胞により産生される（本明細書中に参考として援用されている、非特許文献１を参照せよ）。Ｍ−ＣＳＦは、二つの「モノマー」ポリペプチドからなり、生物学的に活性な二量体のＭ−ＣＳＦタンパク質を形成する（以下、「Ｍ−ＣＳＦダイマー」という）。Ｍ−ＣＳＦは血液細胞の産生を増進する生物学的アゴニストのグループに属する。特に、Ｍ−ＣＳＦは、単核食細胞系の骨髄前駆細胞についての成長および分化因子として機能する。さらにＭ−ＣＳＦは、応答細胞の特異なレセプターを介する成熟したマクロファージの増殖および機能を刺激する。臨床試験においてＭ−ＣＳＦは、癌の化学療法または放射線療法の副作用として生じる血液細胞の欠乏の矯正における薬剤として有望であり、骨髄移植に関連した真菌感染の治療に有益であり得る。Ｍ−ＣＳＦはまた、妊娠、ブドウ膜炎、およびアテローム性動脈硬化症において、生物学的に重要な役割を演じている。Ｍ−ＣＳＦアゴニストまたはアンタゴニストの開発は、上記健康状態に伴う生物学的事象の緩和において価値を見いだし得る。
【０００５】
Ｍ−ＣＳＦは、少なくとも３種の成熟形態が存在する：短形（Ｍ−ＣＳＦα）、中間形（Ｍ−ＣＳＦγ）、および長形（Ｍ−ＣＳＦβ）。成熟Ｍ−ＣＳＦは、アミノ末端からプロセッシングによりリーダー配列が除去され、カルボキシル末端からプロセッシングにより推定膜貫通領域を含むドメインが除去された分泌Ｍ−ＣＳＦ中に含まれるポリペプチド配列を含有することで定義される。上記３種の成熟形態の変動は選択されるｍＲＮＡスプライシングによる（非特許文献２を参照せよ）。上記３種の形態のＭ−ＣＳＦは、アミノ末端の３２アミノ酸からなるシグナル配列およびカルボキシル末端近傍のおよそ２３アミノ酸からなる推定膜貫通領域を含む、２５６〜５５４のアミノ酸からなるポリペプチドモノマーをコードする、異なるｍＲＮＡ前駆体から翻訳される。前駆体ペプチドは次いでアミノ末端およびカルボキシル末端の加水分解開裂によりプロセスされ、成熟Ｍ−ＣＳＦが遊離される。Ｍ−ＣＳＦの３種の成熟形態のいずれもが有するアミノ酸残基１〜１４９番目は同定され、Ｍ−ＣＳＦの生物学的活性に重要な配列を含んでいると考えられている。インビボではＭ−ＣＳＦモノマーは、ジスルフィド結合を介してダイマー化され、グリコシル化されている。Ｍ−ＣＳＦのいくつかの形態（全てではなくても）は、膜に結合した形態で回収され得る。このような膜結合Ｍ−ＣＳＦは開裂され得、分泌Ｍ−ＣＳＦが放出され得る。膜に結合したＭ−ＣＳＦは、そうでないＭ−ＣＳＦと同様の生物学的活性を有すると考えられるが、細胞同士の結合または活性化を包含する他の機能を有し得る。
【０００６】
ポリペプチド（上記Ｍ−ＣＳＦも含めて）は、アミノ酸一次配列およびそのポリペプチドをとりまく環境によって決定される三次元構造を有する。この三次元構造は、ポリペプチドの活性、安定性、結合親和性、結合特異性、およびその他の生物学的属性を確立する。従って、あるタンパク質の三次元構造の情報は、可溶または膜結合形態におけるそのタンパク質の生物学的活性を模倣し、阻害し、または向上させる薬剤の設計に多くの指標を提供し得る。
【０００７】
ポリペプチドの三次元構造は、多くの方法により決定し得る。非常に精密な方法の多くは、Ｘ線結晶学を用いる（一般的な総説として、参考として本明細書中に援用されている、非特許文献３を参照せよ）。この技法は、Ｘ線または他の型の放射線を回折する結晶格子の能力に依存する。巨大分子の三次元構造決定に適した回折実験には、高品質の結晶体が必要である。残念ながら、このような結晶は、Ｍ−ＣＳＦおよび他の重要なタンパク質に関して入手不可能であった。従って、高品質な、Ｍ−ＣＳＦの回折結晶は、その三次元構造の決定を助力する。
【０００８】
結晶化タンパク質およびポリペプチドを調製する種々の方法は、当該分野で周知である（例えば、非特許文献４〜５および特許文献１〜２；これらは、全ての目的のために本明細書中に参考として援用されている）。ポリペプチドを結晶化する多くのアプローチがあるにも関わらず、特にＸ線回折試験に適する必要がある結晶体の場合に、道理にかなう成功が予想されるような単一セットの条件は提供されていない。従って、重要な研究であるにも関わらず、多くのタンパク質が結晶化されないままである。
【０００９】
構造上の情報の提供に加えて、結晶化ポリペプチドは、その他の利益も提供する。例えば、結晶化のプロセスは、それ自体、ポリペプチドをさらに精製し、そして均質性に関する古典的基準の一つを満足する。実際に結晶化は、しばしば並ぶもののないほどの高純度を提供し、ＨＰＬＣ、透析、一般的なカラムクロマトグラフィーなどのような他の精製方法では除去されない不純物を除去する。さらに、結晶化ポリペプチドは、通常、室温で安定であり、プロテアーゼの夾雑物がなく、溶液保存に関連した他の分解もない。結晶化ポリペプチドはまた、製薬上の調製物として有用であり得る。結局、結晶化技法は一般的に、他の安定化方法（例えば、凍結乾燥）に関連した変性のような問題がない。従って、結晶化形態のＭ−ＣＳＦの組成を調製すること、およびそれらの三次元構造を決定することは、非常に重要である。本発明は、上記のおよびその他の要求を充足する。いったん結晶化が達成されれば、結晶学上のデータは、有益な構造上の情報を提供し、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得るペプチドの設計を補助し得る。さらに、結晶構造は、アンタゴニストまたはアゴニストとして作用し得る小さい非ペプチド分子により模倣され得るような、レセプター結合ドメインを位置づけるのに有用な情報を提供する。
【特許文献１】米国特許第４，６７２，１０８号
【特許文献２】米国特許第４，８３３，２３３号
【非特許文献１】Ｒａｌｐｈら、「ヒトおよびハツカネズミのＣＳＦ−１ファミリーの分子生物学的特性」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  Ａｃｔｉｏｎ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．刊、（１９８７）
【非特許文献２】Ｃｅｒｒｅｔｔｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２５：７６１（１９８８）
【非特許文献３】Ｖａｎ  Ｈｏｌｄｅ、Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ、Ｎ．Ｊ．、２２１〜２３９頁（１９７１）
【非特許文献４】ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、「タンパク質の結晶の調製および解析」、Ａ．  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｅ．  Ｋｒｉｅｇｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍａｌａｂａｒ、Ｆｌｏｒｉｄａ（１９８９）
【非特許文献５】Ｗｅｂｅｒ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４１：１−３６（１９９１）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、Ｍ−ＣＳＦダイマーの結晶化形態を提供する。好ましくは、ダイマーは成熟Ｍ−ＣＳＦのＮ−末端からあるいはその近く（例えばｇｌｕ１  ｇｌｕ２  ｖａｌ３．．．）からの１４６から１６２の間のアミノ酸残基を有するポリペプチドから形成される。特定の実施態様においては、ポリペプチドは成熟Ｍ−ＣＳＦαポリペプチドの残基４から１５８を含み、好ましくは、非グリコシル化の形態である。
【００１１】
他の面では、本発明はＭ−ＣＳＦの結晶化方法を提供する。本発明によれば、好ましい結晶化方法は、以下の工程を包含する：予め選択した、実質的に純粋なＭ−ＣＳＦダイマーと沈澱剤とを混合してＭ−ＣＳＦ混合物を形成する工程；該混合物から結晶化Ｍ−ＣＳＦを沈澱させる工程；および、Ｍ−ＣＳＦを結晶化形態で単離する工程。ある特定の実施態様においては、この沈澱剤はポリエチレングリコールを含む。他の成分、例えば、硫酸アンモニウムおよび／または他のイオン性化合物を、その溶液に加え得る。Ｘ線結晶学においては、本発明の方法で生産されたＭ−ＣＳＦは、例えば、Ｐ２１２１２１の空間群に結晶化され得る。
【００１２】
種々の結晶化方法がまた、提供され得る。例えば、Ｍ−ＣＳＦ混合物から結晶を沈澱させる工程は、Ｍ−ＣＳＦ混合物を第二の混合物と平衡化する工程を含み得る。第二の混合物は、典型的には、第一のＭ−ＣＳＦ混合物よりも高い濃度の沈澱剤からなる溶液である。平衡化させる工程は、好ましくはＭ−ＣＳＦ混合物を第二の沈澱剤表面に添加し、該添加したＭ−ＣＳＦ混合物を前記第二の混合物槽で平衡になるようにする工程からなる。他の実施態様では、Ｍ−ＣＳＦ結晶を沈澱させる工程は、Ｍ−ＣＳＦ混合物に、種結晶を添加するか、あるいはＭ−ＣＳＦ混合物の温度を変化させて開始する。他の面では、本発明は、種々の程度でＭ−ＣＳＦの三次元構造のレセプター結合領域に類似し、多くの場合Ｍ−ＣＳＦのアゴニストあるいはアンタゴニストとして機能し得る構造を有する化合物を同定する工程を含む。Ｍ−ＣＳＦのレセプター結合領域と相互作用をする化合物は、アンタゴニストであり得る。短縮形のＭ−ＣＳＦダイマーの三次元のα炭素座標は、添付書類１に示されている。本発明の１つの実施態様においては、Ｍ−ＣＳＦの三次元構造は、まず、Ｍ−ＣＳＦダイマー（Ｍ−ＣＳＦレセプター結合残基）を結晶化して少なくとも１つのＭ−ＣＳＦ結晶を形成することによって得られる。次に照射源を用いてＭ−ＣＳＦ結晶を照射し、Ｍ−ＣＳＦ結晶の回折パターンを得る。最後に、Ｍ−ＣＳＦの三次元構造が、回折パターンから得られる。ほとんどの実施態様では、三次元構造はＭ−ＣＳＦレセプター結合領域を含む。
【００１３】
本発明は、また、構造上の情報に基づいて、タンパク質中でのアミノ酸置換の候補を選択する方法に関し、さらに詳しくは、Ｍ−ＣＳＦにおいて、本発明の方法によって、Ｍ−ＣＳＦの三次元構造を決定する工程；タンパク質中の溶剤に接近可能なアミノ酸残基を決定した後で、どの残基がダイマーの形成に関与していないかを決定する工程を包含する。これらの基準を適用して、溶剤が接近可能で、ダイマー形成に関与しないＭ−ＣＳＦ中のアミノ酸は、非保存性のアミノ酸と置換するために選択される。Ｍ−ＣＳＦβはチェーン間で１５７および／または１５９位のシステインが関与するジスルフィド結合を有しているので、Ｍ−ＣＳＦのＣ末端領域は、我々が解明した構造の「後ろ」から広がり、Ｍ−ＣＳＦの膜結合形態への可変長の「つなぎ」を提供する。従って、「前面」すなわちＭ−ＣＳＦのレセプター結合領域は、その分子の反対側にあり、ヘリックスＡ、Ｃ、およびＤ中のあるいはその近くの、溶剤が接近可能な残基からなる。ヘリックスＡ、Ｃ、およびＤは、天然型のＭ−ＣＳＦのそれぞれ約６から２６、７１から９０、および１１０から１３０由来の残基を含んでいる。置換のための好適なアミノ酸および好適な置換するアミノ酸は、以下のものを含むが、これらに限定されない：Ｈ１５→ＡあるいはＬ；Ｑ７９→ＡあるいはＤ；Ｒ８６→ＥあるいはＤ；Ｅ１１５→Ａ；Ｅ４１→ＫあるいはＲ；Ｋ９３→ＡあるいはＥ；Ｄ９９→ＫあるいはＲ；Ｌ５５→ＱあるいはＮ；Ｓ１８→ＡあるいはＫ；Ｑ２０→ＡあるいはＤ；Ｉ７５→ＫあるいはＥ；Ｖ７８→ＫあるいはＲ；Ｌ８５→ＥあるいはＮ；Ｄ６９→ＫあるいはＲ；Ｎ７０→ＡあるいはＥ；Ｈ９→ＡあるいはＤ；Ｎ６３→ＫあるいはＲ；およびＴ３４→ＱあるいはＫ。最も好適なこれらの置換から、新規なＭ−ＣＳＦアゴニストあるいはＭ−ＣＳＦアンタゴニストが生じる。さらに、本発明は、Ｍ−ＣＳＦモノマーあたり少なくとも１つ、好ましくは５よりも少ない、溶剤に接近可能な残基を置換することにより、アゴニストおよびアンタゴニストを生産する方法に関する。
【００１４】
本発明はまた、このヘテロダイマーは１つのサブユニットのみが、シグナル伝達に関与する、溶剤に接近可能な置換されたアミノ酸を有するヘテロダイマーのＭ−ＣＳＦに関し、さらに、それぞれのサブユニットが、シグナル伝達に関与する、異なる置換された溶剤に接近可能なアミノ酸を有するヘテロダイマーに関する。本発明はまた、Ｍ−ＣＳＦレセプターへの結合を損なわないアミノ酸置換を有するＭ−ＣＳＦに関する。アゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニングは、次いで、以下の実施例に記載される方法を含めて、当業者に周知の方法を用いるバイオアッセイおよびレセプター結合アッセイを用いて達成される。
【００１５】
さらに、本発明は、単離され、精製され、可溶性の機能的なＭ−ＣＳＦレセプターに関する。本発明はまた、可溶性のＭ−ＣＳＦレセプターを用いるＭ−ＣＳＦアゴニストおよびＭ−ＣＳＦアンタゴニストをスクリーニングする方法に関する。
【００１６】
（好適な実施形態）
本願明細書において「Ｍ−ＣＳＦポリペプチド」とは、以下の文献に記載された成熟Ｍ−ＣＳＦα、Ｍ−ＣＳＦβ、またはＭ−ＣＳＦγポリペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す：Ｋａｗａｓａｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：２９１（１９８５）、Ｃｅｒｒｅｔｔｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２５：７６１（１９８８）、またはＬａｄｎｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６：２６９３（１９８７）。これらの文献はいずれも、本願において参照として援用される。このような用語は、上述のように、３つの成熟Ｍ−ＣＳＦが異なるアミノ酸配列を有するという理解を反映する。
【００１７】
Ｍ−ＣＳＦの一次配列のある種の修飾は、周知の組み換えＤＮＡ技術に従って、所望の構造（例えば、Ｍ−ＣＳＦのレセプター結合能）を損ねることなく、ＤＮＡ配列にコードされたアミノ酸の欠失、付加、または変更によってなし得る。さらに、当業者は、個々のアミノ酸を酸化、還元、または他の誘導化によって置換または修飾し得ること、および、ポリペプチドを切断して活性な結合部位および構造的情報を保持した断片を入手し得ることを理解するだろう。このような置換および変更は「成熟Ｍ−ＣＳＦα、Ｍ−ＣＳＦβ、またはＭ−ＣＳＦγポリペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を有する」ポリペプチドの定義内に入るアミノ酸配列を有するポリペプチドを与える。
【００１８】
結晶化のために、Ｍ−ＣＳＦα、β、またはγモノマーの好ましい長さは、（成熟アミノ末端から数えて）約１４５および１８０アミノ酸の間であり、より好ましくは約１４５および１６２アミノ酸長の間である。結晶化可能なダイマー中に存在し得る特定のモノマーはＭ−ＣＳＦαであり、Ｎ’３Ｍ−ＣＳＦαＣ’１５８（アミノ末端から３アミノ酸が欠失し、全長が１５５アミノ酸）である。あらゆる長さが含まれる。本願明細書において、用語「Ｍ−ＣＳＦα（４−１５８）」は、プロセッシングされた成熟Ｍ−ＣＳＦαポリペプチドの４位から１５８位のアミノ酸残基を有するＭ−ＣＳＦを意味する。天然型Ｍ−ＣＳＦのＣ−末端およびＮ−末端での短縮についての他の命名法は、米国特許第４，９２９，７００号に記載される。この米国特許は、本願において参照として援用される。
【００１９】
Ｍ−ＣＳＦポリペプチドの結晶化可能なグリコシル化変異体は、本願発明の範囲に含まれる。これらの変異体には、全くグリコシル化されていないポリペプチド、および成熟型よりも少なくとも１つ少ないグリコシル化部位を有する変異体、ならびにグリコシル化のパターンが天然型とは異なる変異体が含まれる。また、脱グリコシル化および非グリコシル化アミノ酸配列変異体、ならびに、成熟アミノ酸配列を有する、脱グリコシル化および非グリコシル化Ｍ−ＣＳＦサブユニットも含まれる（米国特許第５，０３２，６２６号を参照）。
【００２０】
「Ｍ−ＣＳＦ」ダイマーとは、ダイマー化した２つのＭ−ＣＳＦポリペプチドモノマーを指す。Ｍ−ＣＳＦダイマーは、２つの同一のポリペプチドモノマーを含み得（ホモダイマー）、または２つの異なるポリペプチドモノマーを含み得る（ヘテロダイマー、例えば、Ｍ−ＣＳＦα−Ｍ−ＣＳＦβダイマー、Ｍ−ＣＳＦ長クローンおよび短クローンダイマー）。Ｍ−ＣＳＦモノマーは、米国特許第４，９２９，７００号に記載されたようにして、インビトロでＭ−ＣＳＦダイマーに変換し得る。この米国特許は、本願において参照として援用される。組み換えにより発現されるＭ−ＣＳＦはまた、インビボで存在する場合のように種々にグリコシル化され、または部分的にグリコシル化され、または全くグリコシル化されないもの（非グリコシル化）であり得る。グリコシル化Ｍ−ＣＳＦは、インビボで炭化水素鎖を伴って生産され得、その後インビトロで酵素的に脱グリコシル化され得る。
【００２１】
生物学的に活性なＭ−ＣＳＦは、当該分野で理解された活性スペクトルを示す。例えば、Ｍ−ＣＳＦは、応答細胞の特定のレセプターを通じて、成熟マクロファージの増殖および機能を刺激する。さらに、Ｍ−ＣＳＦは、単核食細胞前駆体の成長因子として作用する。Ｍｅｔｃａｌｆ、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ７６：８９（１９７０）  （これは本願において参照として援用される）の標準的なインビトロでのコロニー刺激アッセイにおいて、Ｍ−ＣＳＦを幹細胞に与えたとき、主としてマクロファージコロニーの形成がもたらされる。他の生物学的アッセイは、ＮＦＳ−６０細胞系のようなＭ−ＣＳＦ依存性の細胞の、Ｍ−ＣＳＦにより誘発される増殖に基づく。本願明細書において「生物学的活性を有するＭ−ＣＳＦ」とは、生物学的システムについて当該分野で認識されている活性スペクトルを示すＭ−ＣＳＦ（本願明細書に記載のように、Ｍ−ＣＳＦの断片および配列変異体を含む）を指す。このような生物学的活性を有するＭ−ＣＳＦは、典型的には、レセプター結合部位の三次構造など、成熟Ｍ−ＣＳＦ型と共通する特定の構造的特性を有する。
【００２２】
アゴニストは、天然型のリガンドと比べてそれ自体が大きい活性を示す物質であり、一方、アンタゴニストは、天然型のリガンドの生物学的活性を抑制、阻害、または干渉する物質である。アゴニストおよびアンタゴニストは、疾病の治療に使用するために、本願発明の方法により生産され得る。対象となる疾病は、Ｍ−ＣＳＦが潜在的な治療剤として（例えば、骨髄移植等と関連する真菌の感染を治療する化学療法の副作用として生じる血液細胞欠乏症の治療のために）、またはＭ−ＣＳＦが当該疾病の病因において役割を有するとして（例えば、卵巣癌、ブドウ膜炎、アテローム性動脈硬化症）のいずれかに関連づけられてきたものである。
【００２３】
本願発明によるＭ−ＣＳＦ種の結晶化は、４つの一般的工程を含む：発現、精製、結晶化、および単離である。
【００２４】
（組み換えＭ−ＣＳＦの発現）
Ｍ−ＣＳＦの結晶化は、比較的均一な型で単離され得るＭ−ＣＳＦの豊富なソースを必要とする。様々な発現系および宿主がＭ−ＣＳＦの発現に適切であり、それらは当業者には明らかである。ある種の真核宿主で生産されるＭ−ＣＳＦは様々なグリコシル化および翻訳後の修飾を受けているため、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現が、結晶化に関して有利な性質をＭ−ＣＳＦに与え得る。典型的なインビトロでのＭ−ＣＳＦ発現系は、例えば、米国特許第４，９２９，７００号に記載される。
【００２５】
本願発明に用いるために、様々なＭ−ＣＳＦポリペプチドをまた、当業者に周知の組み換えＤＮＡ技術を利用して、容易に設計し製造し得る。例えば、Ｍ−ＣＳＦアミノ酸配列は、アミノ酸の置換、挿入、欠失などにより、一次構造レベルで天然に存在する配列とは異なったものであり得る。これらの修飾を多くの組み合わせで用いて、最終的な修飾ポリペプチド鎖を生産し得る。本願発明は、このようなポリペプチドおよびそのダイマーの結晶化に有用である。
【００２６】
一般的に、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドをコードする遺伝子の修飾は、周知の様々な技術によって容易になし得る。そのような技術の例として、部位特異的突然変異がある（ＧｉｌｌｍａｎおよびＳｍｉｔｈ、Ｇｅｎｅ  ８：８１−９７（１９７９）、およびＲｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：７３１−７３４（１９８７）、および米国特許第５，０３２，６７６号を参照。これらはすべて本願において参照として援用される。）。大抵の修飾物は、所望の特徴を有するかどうかについて、適切なアッセイでのスクリーニングによって評価される。例えば、ポリペプチドのＭ−ＣＳＦレセプター結合特性の変化は、適当なリファレンスポリペプチドとの競合アッセイによって、または米国特許第４，８４７，２０１号（これは、本願において参照として援用される。）に記載のバイオアッセイによって検出され得る。
【００２７】
本願発明の挿入変異体は、Ｍ−ＣＳＦの特定の部位に１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が導入されたものである。例えば、挿入変異体は、サブユニットのアミノまたはカルボキシル末端への異種タンパク質またはポリペプチドの融合物であり得る。置換変異体は、少なくとも１つの残基が除去され、代わりに異なる残基が挿入されたものである。非天然アミノ酸（すなわち、通常は天然型タンパク質中に見い出されないアミノ酸）ならびに等立体（ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ）アナログ（アミノ酸またはそれ以外のもの）もまた本願発明への使用に適切である。適切な置換の例は当該分野で周知であり、例えば、Ｇｌｕ→Ａｓｐ、Ｓｅｒ→Ｃｙｓ、Ｃｙｓ→Ｓｅｒ、Ｈｉｓ→アラニンなどである。他のクラスの変異体は欠失変異体であり、Ｍ−ＣＳＦから１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が除去されていることを特徴とする。
【００２８】
本願発明の他の変異体は、天然型タンパク質のアミノ酸を化学的に修飾すること（例えば、ヒスチジン残基を修飾するジエチルピロカルボネート処理）によって生産し得る。好ましい化学的修飾は、ある種のアミノ酸側鎖に対して特異的なものである。特異性はまた、保護されるべき側鎖に対する抗体で他の側鎖をブロックすることによっても達成し得る。化学的修飾は、酸化、還元、アミド化、脱アミド化、または多糖もしくはポリエチレングリコールのようなかさ高い基の置換などの反応を含む（例えば、米国特許第４，１７９，３３７号および国際公開ＷＯ９１／２１０２９を参照。これらは本願において参照として援用される。）。
【００２９】
修飾の例として、コハク酸または他のカルボン酸の無水物との反応による、リジン残基およびアミノ末端残基の修飾が含まれる。これらの試薬での修飾は、リジン残基の電荷を逆転させる効果がある。アミノ含有残基を修飾するための他の適切な試薬に含まれるものとして、メチルピコリンイミデートなどのイミドエステル；ピリドキサールリン酸；ピリドキサールクロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素，２，４−ペンタンジオン；およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒による反応、およびポリエチレングリコールまたは他のかさ高い置換基のＮ−ヒドロキシコハク酸アミドエステルがある。
【００３０】
アルギニン残基（ａｒｇｉｎｙｌ  ｒｅｓｉｄｕｅ）は、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンを含む多数の試薬との反応によって修飾し得る。アルギニン残基の修飾においては、グアニジン官能基のｐＫａが高いため、反応をアルカリ性条件で行うことが必要とされる。さらに、これらの  試薬はリジン基ならびにアルギニンのイプシロン−アミノ基と反応し得る。
チロシン残基もまた修飾し得る。特にチロシン残基にスペクトルラベルを導入することに興味が持たれる。芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応を用いて、それぞれＯ−アセチルチロシン種および３−ニトロ誘導体が形成される。チロシン残基はまた、１２５Ｉまたは１３１Ｉを用いてヨード化して、ラジオイムノアッセイに用いるためのラベルしたタンパク質を調製し得る。
【００３１】
カルボキシル側鎖基（アスパラギン酸またはグルタミン酸）は、カルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ１）との反応によって選択的に修飾され得る。ここで、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である。例として、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドがある。さらに、アスパラギン酸およびグルタミン酸の残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギンおよびグルタミンの残基に変換される。
逆に、アスパラギンおよびグルタミンの残基は、穏やかな酸性条件下で、それぞれ対応するアスパラギン酸およびグルタミン酸の残基へと脱アミド化し得る。これらの残基のいずれの型も本願発明の範囲に入る。
【００３２】
他の修飾に含まれるものとして、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリンまたはトレオニンの残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のαアミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、サンフランシスコ、ｐｐ．７９−８６［１９８３］）、Ｎ−末端アミンのアセチル化、および任意のＣ−末端カルボキシル基のアミド化がある。
【００３３】
Ｍ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ配列が入手できることは、所望のポリペプチドを生産するための種々の発現系の使用を可能にする。発現ベクターの構築および適当なＤＮＡ配列からの組み換え生産は、当該分野で周知の方法によってなされる。これらの技術および種々の他の技術は、一般に以下の文献に従ってなされる：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８９）、およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９９０）。これらは両方とも本願において参照として援用される。
【００３４】
（Ｍ−ＣＳＦの精製）
結晶化の前に、相対的に均一な状態でＭ−ＣＳＦが単離されることを確実にするような精製工程が援用される。一般に、より高度な精製溶液は次の結晶化工程の成功の可能性を増大する。代表的な精製法は、遠心分離、塩または有機化合物を用いる部分分画、透析、従来のカラムクロマトグラフィー（イオン交換、分子サイジングクロマトグラフィーなど）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、およびゲル電気泳動法（例えば、Ｄｅｕｔｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９９０）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｅｒｋｅｌｙ、ＣＡ、中の「タンパク質精製のための指針」を参照、この文献は本明細書中に、全ての目的に参考として援用される）の使用を含む。通常、均一なＭ−ＣＳＦ分子（ｓｐｅｃｉｅｓ）を生成する好適な精製条件、およびこれら分子の精製は、例えば、本明細書に参考として援用される米国特許第４，９２９，７００号に開示されている。他の精製方法は公知でありそして当業者に明らかであり得る。
【００３５】
（Ｍ−ＣＳＦの結晶化）
多くの同一の物理学原理が、ポリペプチド（Ｍ−ＣＳＦダイマーを含む）および小分子の結晶化を支配するけれども、実際の結晶化機構は顕著に異なる。例えば、小分子結晶の格子は溶媒を除外するが、ポリペプチド結晶の格子は溶媒分子を実質的な数で含む。それ故、代表的には、ポリペプチドを結晶化するには特別の技術が適用されなければならない。
【００３６】
溶液中のポリペプチド結晶化は、ポリペプチド濃度が、その最大溶解度を超えた時点で起こる（即ち、ポリペプチド溶液は過飽和である）。このような「熱動力学的に準安定な」溶液は、ポリペプチド濃度を減少することにより、好適にはポリペフチド結晶の沈澱を経て、平衡へ回復され得る。しばしばポリペプチドは、ポリペプチドの表面荷電を変え、またはポリペプチドとバルク水との間の相互作用を乱し、結晶化に導く会合を促進する薬剤を添加することにより過飽和溶液から結晶化することが引き起こされ得る。
【００３７】
「沈澱剤」として知られる化合物がしばしば使用され、濃縮溶液中のポリペプチドの溶解度を減少させる。沈澱剤は、ポリペプチド分子の周囲にエネルギー的に不都合な沈澱剤による枯渇層を形成することにより結晶化を誘導する。この枯渇層の相対量を最小化するため、ポリペプチドは、先に本明細書に参考として援用された、Ｗｅｂｅｒ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：１−３６  （１９９１）中で説明されるように、会合そして最後には結晶を形成する。沈澱剤に加えて、他の物質がしばしばポリペプチド結晶化溶液に添加される。これらは、溶液のｐＨ（そしてそれ故ペプチドの表面荷電）を調整するための緩衝液、およびポリペプチドの溶解度を減少する塩類を含む。種々の沈澱剤が、当該技術で公知であり、そして以下を含む：エタノール、３−エチル−２，４ペンタンジオール；およびポリエチレングリコールなどの多くのポリグリコール。Ｍ−ＣＳＦ結晶化のための適切な沈澱剤は、塩類および他の有機沈澱剤のいくつかの特性を組み合わせたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である（例えば、すべての目的に、本明細書に参考として援用される、Ｗａｒｄら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ９８：１６１［１９７５］、および、先に参考として援用された、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５１：６３００［１９７６］を参照）。
【００３８】
一般に使用されるポリペプチドの結晶化法は以下の技術を含む：回分法、滴下法（ｈａｎｇｉｎｇ  ｄｒｏｐ）、種（ｓｅｅｄ）開始法、および透析。これら方法のそれぞれにおいて、核化の後に、過飽和溶液を維持することにより継続する結晶化を促進することが重要である。回分法では、ポリペプチドは沈澱剤と混合され過飽和を達成し、容器をシールして結晶が現れるまで静置する。透析法では、ポリペプチドは、沈澱剤を含む溶液中に置かれたシールされた透析膜中に保持される。膜を越えた平衡は、ポリペプチドおよび沈澱剤濃度を増加させ、それによって、ポリペプチドが過飽和レベルに到達する。
【００３９】
滴下技術では、初期のポリペプチド混合物を、沈澱剤を濃ポリペプチド溶液に添加することにより作成する。ポリペプチドおよび沈澱剤の濃度は、この初期形態ではポリペプチドが結晶化しない濃度である。この混合物の小滴をスライドグラス上に置き、逆にし（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）、そして第２の溶液のリザーバー中に浮遊させる。この系を次いでシールする。代表的には、第２の溶液は、より高濃度の沈澱剤または他の脱水剤を含む。沈澱剤の濃度差により、タンパク質溶液が溶液より高い蒸気圧を有する。２つの溶液を含むこの系は、シールされ、平衡化され、そしてポリペプチド混合物からの水は第２の溶液に移る。この平衡は、ポリペプチド溶液中のポリペプチドおよび沈澱剤濃度を増加させる。ポリペプチドおよび沈澱剤の臨界濃度で、ポリペプチドの結晶が形成される。滴下法は当該技術で周知である（先に、本明細書に参考として援用された、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５１：６３００  ［１９７６］を参照）。
【００４０】
別の結晶化方法は、濃縮ポリペプチド質溶液中に核化部位を導入する。一般に、濃縮ポリペプチド溶液が調製され、そしてポリペプチドの種結晶がこの溶液中に導入される。ポリペプチドおよび任意の沈澱剤の濃度が正しければ、種結晶は、その周りにより大きい結晶を形成する核化部位を提供する。    好適な実施態様では、本発明の結晶は、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドのダイマーから形成され得る。好適な結晶は、代表的には、少なくとも約０．２  ｘ  ０．２  ｘ  ０．０５  ｍｍ、より好適には、０．４  ｘ  ０．４  ｘ  ０．４  ｍｍより大きく、そして最も好適には、０．５  ｘ  ０．５  ｘ  ０．５  ｍｍより大きい。結晶化の後、タンパク質は、標準技術により結晶化混合物から分離され得る。
【００４１】
このように生成された結晶は広範な用途を有する。例えば、高品質結晶は、Ｘ線または中性子回折分析に適し、Ｍ−ＣＳＦの３次元構造、そして特に、そのレセプター結合部位の同定を助ける。Ｍ−ＣＳＦレセプターとの接触に有効な、結合部位領域および溶媒接近可能残基の知識は、Ｍ−ＣＳＦに対するアゴニストおよびアンタゴニストの合理的な設計および構築を許容する。改変されたレセプター結合能力または生物活性を有する、Ｍ−ＣＳＦの変異タンパク質の結晶化および構造決定は、そのような変化が一般的な構造変形により、または置換部位での側鎖改変により生じるか否かの評価を可能とする。
【００４２】
さらに、結晶化自体が精製法として使用され得る。いくつかの例では、ポリペプチドまたはタンパク質が、不均一な混合物から結晶に結晶化され得る。そのような結晶の、濾過、遠心分離などによる単離に続いてポリペプチドを再溶解し、回折研究に必要な高品質結晶成長の使用に適した精製溶液が得られる。これらの高品質結晶はまた、水中に溶解され得、次いで調製されて、薬学的目的を含む当該技術で公知の種々の使用法に用いられる水性Ｍ−ＣＳＦ溶液を提供する。
【００４３】
勿論、Ｍ−ＣＳＦのアミノ酸配列変異体も結晶化され得、そして使用され得る。これらの変異体の使用目的は種々あるが、その中で、Ｍ−ＣＳＦレセプターに対する結合親和性の修飾に関して有用な構造上の情報を得るのに使用され得る。天然に存在する形態については、修飾されたＭ−ＣＳＦ形態は、本発明の治療での使用において、骨髄増殖の刺激、化学療法により誘導される免疫抑制および真菌症の克服、治療効率の改善、および副作用の程度または発生の低減のための薬学的薬剤として有用であり得る。さらに、修飾Ｍ−ＣＳＦは、可溶性または膜結合Ｍ−ＣＳＦが、疾病状態を起こすまたは悪化する疾病の治療に有用であり得る。
【００４４】
（Ｍ−ＣＳＦの特徴付け）
精製、結晶化および単離の後、本発明の結晶は、当該技術で公知の技術により分析され得る。代表的な分析は、ペプチドについて構造上、物理的、および機構上の情報を生じる。上記のように、Ｘ線結晶学は、詳細な構造上の情報を提供し、その情報は、広く入手可能な分子モデリングプログラムと組み合わせて使用され得、ペプチド中の原子３次元配列に到達する。例示のモデリングプログラムは、Ｂｉｏｓｙｍ  （Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の「Ｈｏｍｏｌｏｇｙ」、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎの「Ｂｉｏｇｒａｆ」、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒの「Ｎｅｍｅｓｉｓ」、Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓの「ＳＹＢＹＬ」および「Ｃｏｍｐｏｓｅｒ」、Ｐｏｌｙｇｅｎ  （Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）の「ＣＨＡＲＭ」、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ大学、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏの「ＡＭＢＥＲ」、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ，  Ｌｔｄ．の「ＭＭ２」および「ＭＭＰ２」を含む。  ペプチドモデリングは、目的ペプチドの活性を修飾し得る種々の薬剤を設計するために使用され得る。例えば、活性部位の３次元構造を用いて、相補的構造を有するアゴニストおよびアンタゴニストが、Ｍ−ＣＳＦ処理の治療上の有用性を高めるために、またはＭ−ＣＳＦの生物学的活性をブロックするために設計され得る。さらに、Ｍ−ＣＳＦの構造上の情報は、Ｍ−ＣＳＦリガンドおよびそのレセプター間の接触残基の知見に基づき、タンパク質性または非タンパク質性のＭ−ＣＳＦアゴニストおよびアンタゴニストの設計に関して有用である。このような残基は、Ｍ−ＣＳＦ結晶構造により、溶媒接近可能である残基として同定され、ダイマー界面安定化に含まれないカルボキシ末端膜係留領域に対して遠位にあり、そしておそらくヒトおよびマウスＭ−ＣＳＦ（ヒトＭ−ＣＳＦレセプターを認識しない）間で保存されていない残基を含む。
【実施例】
【００４５】
（実施例１）
滴下法を用いて、Ｍ−ＣＳＦの系統的な結晶化を行った。顕微鏡カバーグラスの下側から母液（ｍｏｔｈｅｒ  ｌｉｑｕｏｒ）の小滴（５μｌ）を浮遊し、カバーグラスを、１ｍｌの沈殿溶液を含有するウェルの上に置いた。ｐＨ、温度、対イオン、および沈殿剤を変えて、６０〜７０回の初期試験を行った。これらの試験から、より注意深い検査のために、有望な微結晶を与える試験をピックアップした。
【００４６】
１０ｍｇ／ｍｌ  タンパク質、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  トリスＣｌ（ｐＨ  ８．５）、および１２％  ＰＥＧ  ４０００を含有する２０μｌの液滴から、好適な結晶が生長し得ることを発見した。この液滴は、２４％  ＰＥＧ  ４０００を含有するリザーバーで平衡化した。２〜３日で、小さな針状の結晶が現れ、これを１０μｌの水に再溶解し、そして室温で再結晶化した。７〜９日で、０．３×０．３×０．３ｍｍ〜０．５×０．５×１．０ｍｍの範囲の大きさの良質のずんぐりした結晶が現れた。
【００４７】
プレセッション写真は、空間群が、ａ＝３３．５３オングストローム、ｂ＝６５．１１オングストローム、ｃ＝１５９．７７オングストロームの単位セルディメンジョンを有するＰ２１２１２１であることを示した。これは、３４９０８４．５立法オングストロームの単位セル体積を与え、それは、結晶学的に非対称単位であるダイマーと一致し、そして単位セル体積の５２％が、溶媒で占められている。結晶を、５０ｋＶおよび６０ｍＡで操作されたＲｉｇａｋｕ  ｒｏｔａｔｉｎｇ  ａｎｏｄｏ  Ｘ−ｒａｙ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（Ｄａｎｖｅｒｓ，  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）上で３オングストロームの解像度まで、およびシンクロトロン放射で２．６オングストロームの解像度まで回折した。
【００４８】
重金属塩類の溶液中に結晶を浸漬することにより、重原子誘導体のスクリーニングを行った。浸漬物のゼロレベル歳差図（ｐｒｅｃｅｓｓｉｏｎ  ｐｉｃｔｕｒｅ）を用いて、可能な誘導体を同定した。約３０の異なる浸漬条件を試験し、４つの可能性のある誘導体を同定した。不幸なことに、浸漬により結晶が非−同形性（ｎｏｎ−ｉｓｏｍｏｒｐｈｉｓｍ）を示すものがあった（すなわち、重原子の浸漬でセルディメンジョンに変化を誘発し、位相計算にそれらを使用できなくした）。
【００４９】
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ，  ＢｒｏｏｋｈａｖｅｎのＸ線ビーム回線上の振動カメラを用いて、３次元の強度のデータをフィルム上に集めた。天然型（非誘導化Ｍ−ＣＳＦ）および可能性のある誘導体の結晶のいくつかの他のデータ群を、Ｒｉｇａｋｕ  Ｘ線発生機上に集めた。以下のデータ群を集めた。
【００５０】
【表１】
2004285076.tif 000002
（実施例２）
米国特許第４，９２９，７００号に記載のように、組み換えＭ−ＣＳＦポリペプチドをＥ．ｃｏｌｉから精製し、そして復元してジスルフィド結合ダイマータンパク質を形成した。得られた非グリコシル化Ｍ−ＣＳＦαタンパク質（ホモダイマー型中の４位〜１５８位のアミノ酸）の結晶化を、滴下法により行った。ガラスの顕微鏡プレートを、使用前にオルガノシラン化合物Ｐｒｏｓｉｌ−２８（ＰＣＲ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，  Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ，  Ｆｌｏｒｉｄａ，  ３２６０２）の１％（容積：容積）溶液中へ浸漬することによりシリコン化し、処理したガラスプレートを水で洗浄し、そして１８０度でベーキングした。
【００５１】
精製ヒト組み換えＭ−ＣＳＦの２ｍｇ／ｍｌの水溶液を、１０ｋＤの分子量カットの透析チューブを用いて、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ  ８．５）で透析し、濃縮した。ポリペプチド（１０ｍｇ／ｍｌ）の最終濃度を、２８０ｎｍで紫外線分光測光法により測定した。
【００５２】
約７μｌの濃縮溶液を、スポットプレートのそれぞれのウェル中で、２０％（ｖ／ｖ）  ＰＥＧ  ４０００、０．２Ｍ  ＭｇＣｌ２、０．１Ｍ  トリスＨＣｌ（ｐＨ  ８．５）の７μｌと混合した。次いで、スポットプレートを、２０ｍｌの２３％  ＰＥＧ  ４０００、０．２Ｍ  ＭｇＣｌ２、０．１Ｍ  トリスＨＣｌ（ｐＨ  ８．５）を含有する透明なプラスチックサンドウィッチボックスの中に置いた。そして、ボックスを直ちにシールして、室温で保存した。異なる緩衝液条件など、この手順における狭い範囲の改変は、本発明の範囲内にある。例えば、本発明の好ましい実施態様では、緩衝液条件は、１５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および２４％  ＰＥＧ  ４０００を含有するように変えた。
【００５３】
３〜５日後、０．１×０．１×０．０５ｍｍの大きさを有する微結晶が、それぞれのウェル中に現れた。これらの微結晶を単離し、２５μｌの５０ｍＭ  トリスＨＣｌに再溶解し、そして室温に放置した。精製Ｍ−ＣＳＦは、溶液から０．３×０．３×０．３ｍｍ〜１ｍｍ×２ｍｍ×０．５ｍｍの大きさの範囲の大きな六角プリズム型の結晶へと結晶化した。これらの結晶は、少なくとも３ヶ月間室温で安定であった。いくつかの場合、２３％  ＰＥＧ  ４０００、および１５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を用いて人工母液を調製し、次いで、結晶をこの母液に添加した。これらの場合、分析の直前に結晶を母液から取り出した。
【００５４】
還元、および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いて、結晶中のＭ−ＣＳＦが、生物学的に活性な出発物質と分子量が一致することが示された。従って、結晶から得られたＭ−ＣＳＦ構造は、生物学的に活性なＭ−ＣＳＦの構造と本質的に同一のようである。
【００５５】
（実施例３）
ガラス顕微鏡スライドを、実施例２に記載のように調製した。７μｌの同じ濃縮されたＭ−ＣＳＦαタンパク質溶液を、スポットプレートのそれぞれのウェル中で、７μｌの３０％（ｖ／ｖ）  ＰＥＧ  ４０００、０．２Ｍ  酢酸アンモニウム、０．１Ｍ  酢酸緩衝液（ｐＨ  ７．５）と混合した。次いで、スポットプレートを、２０ｍｌの３０％  ＰＥＧ  ４０００、０．２Ｍ  酢酸アンモニウム、０．１Ｍ  酢酸緩衝液（ｐＨ  ７．５）を含有する透明なプラスチックサンドウィッチボックス中に置き、そしてボックスを直ちにシールし、そして室温で保存した。３〜５日後、約０．３×０．３×０．０５ｍｍの大きさを有する、薄くて板状のもろい結晶が現れた。
【００５６】
（実施例４：予備Ｘ線解析）
プレセッション写真を用いるＸ線結晶解析は、実施例２で生成した結晶が、セルディメンジョンがａ＝３３．５４、ｂ＝６５．２６、ｃ＝１５９．６３、ｄ＝９０．０、ｃ＝９０．０、およびｆ＝９０．０オングストロームであるＰ２１２１２１空間群に、斜方結晶格子を有し、そしてシンクロトロン放射を用いて、２．６オングストロームの見かけの解像度まで回折することを示した。これらのデータより、３４８０８４．５立方オングストロームの単位セル体積が提供され、それは、単位セル体積の５２％が溶媒により占められている結晶学的に非対称単位であるダイマーと一致した。図１は、Ｍ−ＣＳＦ結晶のＯｋｌゾーンセクションの１２度のプレセッション写真である。５０ｋＶおよび５０ｍＡで操作されたＲｉｇａｋｕ  ＲＵ−２００  Ｘ線発生機に据え付られた、Ｅｎｒａｆ−Ｎｏｎｉｕｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｄｅｌｆｔ，  Ｈｏｌｌａｎｄ）により製造されたプレセッションカメラを用いて写真を撮った。
【００５７】
（実施例５：可溶性Ｍ−ＣＳＦレセプターを用いるＭ−ＣＳＦレセプター結合能力の試験）
インビボでＭ−ＣＳＦの生物学的機能における必須の工程は、Ｍ−ＣＳＦレセプターへの結合であり、Ｍ−ＣＳＦレセプターは、ｃ−ｆｍｓ遺伝子産物とも呼ばれる。２０位−５１１位のアミノ酸を表す組換えヒト可溶性Ｍ−ＣＳＦレセプター（ｒｈｓＭ−ＣＳＦＲ）（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ，  Ｌら、Ｎａｔｕｒｅ，  ３２０：２７７  （１９８６））をインビトロアッセイ試薬として用いて、Ｍ−ＣＳＦタンパク質のレセプター結合能力を試験した。可溶性型のトランスメンブレンレセプターを生成するために、ヒトＭ−ＣＳＦレセプターの細胞外ドメインだけを、バキュロウイルス／昆虫細胞組換え発現系で発現させた。三次および四次構造に逆に作用することなく可溶性レセプターを精製するために、以下に記載のように、非変性クロマトグラフィー法を選択した。組換えレセプターの精製のためには、他の選択もある。レセプターに対する適切な抗体、またはリガンドのどちらかが利用可能であれば、アフィニティークロマトグラフィーを使用し得る。あるいは、アフィニティークロマトグラフィーで用いるために、「ｔａｇ」を組換えレセプター（すなわち、ＫＴ３抗体組換え配列）のＣ末端に加え、そして抗ｔａｇ抗体（すなわち、ＫＴ３）カラムにより精製する。発現系では、ｒｈｓＭ−ＣＳＦＲをグリコシル化し、レクチンクロマトグラフィーを用いて、特異的にグリコタンパク質を濃縮し得る。
【００５８】
ｒｈｓＭ−ＣＳＦＲを用いて、リガンド／レセプター相互作用、およびリガンド−誘発レセプターダイマー化を研究し得る。サイズ排除ＨＰＬＣを用いて行ったリガンド／レセプター結合を検出するために用いたアッセイは、本質的には、欧州特許出願ＷＯ９２／２１０２９、Ｃ．  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、に記載の通りであるが、以下のように改変してある：用いたカラムは、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．）であり、そして移動相は、０．５ｍｌ／分のＰＢＳであり、そしてｒｈｓＭ−ＣＳＦＲに対するＭ−ＣＳＦの比は１：２であった。この比では、Ｍ−ＣＳＦ／ｒｈｓＭ−ＣＳＦＲ複合体を、Ｍ−ＣＳＦ（ｒｈｓＭ−ＣＳＦＲ）２複合体に対して予想される分子量である、１９，０００分子量の見かけの流体力学範囲でクロマトグラフされた。リガンド／レセプター結合、あるいはレセプターダイマー化を測定するために、化学的架橋およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または、免疫沈降およびＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの、他のアッセイが用いられ得る。レセプターダイマー化を阻害するがリガンド結合は阻害しない分子は、Ｍ−ＣＳＦ作用を拮抗する他の方法を提供する。
【００５９】
ｒｈｓＭ−ＣＳＦＲをコードするＤＮＡを、以下の一般的な戦略を用いて昆虫細胞中で発現させるためにクローニングした。１位〜５１１位のアミノ酸に相当するｃ−ｆｍｓ遺伝子部分を、上流プライマー：
【００６０】
【化１】
2004285076.tif 000003
を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ヒトマクロファージｃＤＮＡから増幅した。下線を引いた配列は、ｐＡｃＣ５ベクター中にＰＣＲ生成物をサブクローニングするために用いたＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ制限部位である（Ｌｕｃｋｏｖら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７−５５）。前述したように、バキュロウイルスヘルパーベクターを用いて、ｐＡｃＣ５：ｈｓＭ−ＣＳＦＲベクターを、ＳＦ９昆虫細胞中で発現させた（Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（１９８７））。
【００６１】
約２リットルの無血清７２時間調整培地を、上記のｐＡｃＣ５：ｈｓＭ−ＣＳＦＲ構築物で感染したＳＦ９細胞から遠心分離および濾過により収集した。この物質をＤＥＡＥ緩衝液Ａ［以下のプロテアーゼ阻害剤を含有する（これは、精製中は全ての緩衝液に添加される）１０ｍＭ  トリス（ｐＨ  ８．８）：１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２μｇ／ｍｌ  ロイペプチン、および１００μＭ  ＰＭＳＦ］で濾過（ｄｉａｆｉｌｔｅｒｅｄ）し、そして２０、０００分子量カットオフＰｙｒｏｓｔａｔ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で２０倍に濃縮した。保持物質を、１００ｍｌのベッド体積を有し、ＤＥＡＥ緩衝液Ａで平衡化した、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）にかけた。溶出は、５ｍｌ／分で、５００ｍｌのＤＥＡＥ緩衝液Ａ中の０−０．８Ｍ  ＮａＣｌの濃度勾配で行った。ｒｈｓＭ−ＣＳＦＲが濃縮された画分を、抗−ｃ−ｆｍｓモノクローナル抗体を用いて、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｂｕｒｎｅｔｔ，  Ｒ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １１２：１９５（１９８１）］、および順次希釈画分のドットブロット分析で検出した。精製の間ドットブロットアッセイを用いて、ｒｈｓＭ−ＣＳＦ含有画分を同定した。濃縮画分をプールし、硫酸アンモニウム  ０．８Ｍとし、ｐＨ  ７．０に調整し、そしてＰｈｅｎｙｌ  ＴＳＫ−５−ＰＷ  ＨＰＬＣカラム（７．５×７５ｍｍ）（ＢｉｏＲａｄ）にかけた。カラムを、１ｍｌ／分の４５分にわたる硫酸アンモニウムの減少濃度勾配で溶出し、ピーク画分をプールし、そしてＹＭ３０  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ａｍｉｃｏｎ）を用いる撹拌細胞濃縮器で１０倍に濃縮した。３ｍｌ／分のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を移動相に用いて、保持物質を、ＦＧ３０００ＸＬサイズ排除カラム（ＤＵ  ＰＯＮＴ，  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  Ｄｅｌａｗａｒｅ）でクロマトグラフィーを行った。精製レセプターをプールし、上記のように１ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、４℃で保存した。この手順により、６５０μｇのｒｈｓＭ−ＣＳＦＲが回収され、２００倍に精製された。調製物は、クーマジーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥによりアッセイされるように約９５％の純度であった。
【００６２】
（実施例６：Ｍ−ＣＳＦ／可溶性Ｍ−ＣＳＦレセプター複合体の結晶化）
Ｍ−ＣＳＦ／ｒｈｓＭ−ＣＳＦＲ複合体を結晶化させるために、実施例２に記載されるようにガラスマイクロスコープスライドを調製する。用いられるＭ−ＣＳＦ組成物を、膜内外領域の前の残基で切り出された、精製した可溶性形態のＭ−ＣＳＦレセプターと共にインキュベートし、Ｍ−ＣＳＦ／レセプター複合体を形成する。いくつかの場合においては、大きさ排除の段階の前に、製造業者の指示に従って、Ｎ−グリカナーゼ（Ｇｅｎｚｙｍｅ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）とのインキュベートによりｒｈｓＭ−ＣＳＦＲを脱グリコシル化する。少量のＭ−ＣＳＦ／レセプター溶液を、ほぼ同量の滴下溶液（例えば、約２０％（ｖ／ｖ）のＰＥＧ  ４０００、０．２Ｍ  ＭｇＣｌ２、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．５））と、スポットプレートの各ウェル中で混合する。次いで、スポットプレートを、少量の沈殿剤溶液（例えば、約２３％のＰＥＧ  ４０００、０．２Ｍ  ＭｇＣｌ２、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．５））を含む透明なプラスチックサンドイッチボックス中に配置する。ボックスをすぐにシールし、そして室温で保存する。
【００６３】
数日後、Ｍ−ＣＳＦ−レセプター複合体の結晶を単離し、約５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを含む溶液に再び溶解させ、そして室温で放置する。精製したＭ−ＣＳＦ−レセプター複合体は、溶液から結晶化し、Ｘ線構造解析用の結晶を形成する。このような複合体の結晶構造の溶液化（ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を促進するために、Ｍ−ＣＳＦ結合能力を保持する、短縮された非グリコシル化形態のｒｈｓＭ−ＣＳＦＲ（上記）が、Ｍ−ＣＳＦ−レセプター複合体の結晶を生じるために用いられ得る。
【００６４】
（実施例７）
実施例２および３で用いた非グリコシル化の短縮された配列の生物学的活性は、ヒトの尿から精製した成熟タンパク質の活性と等しいことが示された（Ｈａｌｅｎｂｅｃｋ，  Ｒ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ７：７１０〜７１５（１９８９））。示したように、得られた結晶は、Ｐ２１２１２１空間群の斜方晶結晶格子を有し、セルのディメンジョンは、ａ＝３３．５４、ｂ＝６５．２６、およびｃ＝１５９．６３Åであった。Ｐｈｏｔｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｙ（つくば、日本）で、高分子結晶学用に改造したＷｅｉｓｓｅｎｂｅｒｇカメラにマウントした画像プレートを用い、強度データを収集した。２．０Åのみかけの解像力に対する固有データを収集し、そして１．０Åの照射を用いて水銀および白金誘導体のデータを収集した。固有データを収集するために、２つの結晶設定値を用いた（全ての測定を用いて、合計（Ｒｍｅｒｇｅ）（Ｉ）＝７．０％、Ｉ＞０．０で行う）。
【００６５】
リザーバー溶液中に溶解させた重原子化合物中に結晶を浸すことにより、Ｍ−ＣＳＦ結晶の重原子誘導体を調製した。同形かつ異常な差パターソン図形は、水銀に対して１つのサイトおよび白金誘導体に対して２つのサイトを明瞭に示した。異常および同形位相情報は、ＰＲＯＴＥＩＮプログラムパッケージによる初期位相の精密化（ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）に用いられた。重要な最終値（ｆｉｎａｌ  ｆｉｇｕｒｅ  ｏｆ  ｍｅｒｉｔ）は０．６２であった（８．０〜３．０Å、６９６０  反射）。溶媒のフラットニング（ｆｌａｔｔｅｎｉｎｇ）（Ｂ．Ｃ．Ｗａｎｇ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，  １１５：９０（１９８５））の後、近似２回軸（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅ  ｔｗｏ−ｆｏｌｄ  ａｘｉｓ）と関連した４つのαヘリックスの２つの束を、電子密度分布図に見ることができた。この非結晶学的な軸の回転および並進のパラメーターを、密度相関方法により精密化した（Ｊ．Ｍ．  Ｃｏｘ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２８：１５１（１９６７））。次いで、４つのヘリックスの束中の全ての原子の周りに５Åの球を当てて求めた包絡線を用い、分子アベレージング（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｖｅｒａｇｉｎｇ）および溶媒フラットニング（Ｇ．Ｂｒｉｃｏｇｎｅ，  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．，  ３２：８３２（１９７６））により位相を繰り返し精密化した。プログラムＦＲＯＤＯを用い、チェイントレーシング（ｃｈａｉｎ  ｔｒａｃｉｎｇ）およびモデル構築（ｍｏｄｅｌ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ）を得られた図形に行い（Ｔ．Ａ．Ｊｏｎｅｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，  １１５：１５７（１９８５））、このときオリジナルのＭＩＲ分布図をリファレンスとした。
精密化のための最初の部分モデルは、２つの束をつくる８つのヘリックスに対して、ポリアラニンの骨格のみを含んでいた。プログラムＸＰＬＯＲ，  Ａ．Ｔ．Ｂｒｕｎｇｅｒ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２０３：８０３（１９８５）を用いた位置精密化により、０．４９〜３．０ÅのＲ因子が得られた。精密化したＭＩＲ位相との位相の組み合わせにより、充分な質を有する図形が得られ、４つのヘリックスの束を横切る２本の長いループおよび２つのヘリックスを結合する１本の短いループをトレースすることが可能になった。密度の濃い２つのピーク（１つは第一のヘリックスの頂上にあり、そして２つめは、分子の２回軸に直接載っている）を、ジスルフィド結合したシステインとして特定した。これらの２つのピークの間にある残基の数により、配列中のこれらのシステインの位置が唯一つに同定され、従って、介在している残基の配列が同定された。この最初の記録は、配列中の芳香族側鎖に対応する、密度の濃い多くの領域の存在により確かめられた。追加のループおよび目に見える上記の側鎖を用いて部分モデル位相を組み合わせることにより、残基が記録され、従って分子全体のトポロジーが決定された。ダイマー中の７つのジスルフィド結合の存在は、トレースを正確にするための重要な「限界点（ｔｅｔｈｅｒ  ｐｏｉｎｔｓ）」として機能した。
【００６６】
図２に示すように、Ｍ−ＣＳＦのこの形態の全体のトポロジーは、逆平行の４つのα−ヘリックスからなるの束のトポロジーである。ここで、ヘリックスは上向−上向−下向−下向であり、より一般に観察される４つのヘリックスの束の上向−下向−上向−下向の連接とは異なる。長い連結部は、ヘリックスＡとヘリックスＢとをつなぎ、そして類似の連結部がヘリックスＣとＤの間に見い出される。
【００６７】
他のサイトカインと他の４つのヘリックスからなる束構造との驚くべき差違は、短縮したＭ−ＣＳＦαがジスルフィドで結合したダイマーを形成することである。ここで、この束は、エンド−エンドでつながれ、図３および４に示すように、極端に平坦な伸長構造（およその長さは、８５×３５×２５Å）を形成する。各モノマーには３つの分子内ジスルフィド結合があり（Ｃｙｓ７−Ｃｙｓ９０、Ｃｙｓ４８−Ｃｙｓ１３９、Ｃｙｓ１０２−Ｃｙｓ１４６）、これらの全ては分子の遠位端に存在する。図３および４に示すように、１つの鎖間ジスルフィド結合（Ｃｙｓ３１−Ｃｙｓ３１）はダイマーの界面に位置し、非結晶学的２回対称軸がそこを横切っている。突然変異実験は、Ｍ−ＣＳＦのこの形態での全てのシステイン残基が、完全な生物学的活性に必要であり得ることを示している。本明細書中に記載される構造は、システイン残基の役割がレセプターの認識に関連しているのではなく、主に構造的であることを示唆している。
【００６８】
添付書類１は、配列中のアミノ酸残基のα炭素の位置により同定されるように、短縮した組換えＭ−ＣＳＦαダイマーの三次元構造を提供する。これは、各ダイマーのポリペプチドのカルボキシ末端の５つのアミノ酸は含まれなかった。当業者に理解されるように、添付書類１の情報は、Ｂｒｏｏｋｈｅａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋで使用されるフォーマットで提供される。
【００６９】
示すように、分子は、Ｍ−ＣＳＦレセプターの結合に関してＭ−ＣＳＦの重要な領域を同定する通常でないトポロジーを有する。ヘリックスＡ、Ｃ、およびＤ中の特異的な残基は、相互作用の特異性にかかわっていると考えられる。側鎖とレセプターとの相互作用を増大または低下させるために、部位特異的突然変異によってこれらの領域の溶媒受容性な残基を変更することは、Ｍ−ＣＳＦアゴニストまたはアンタゴニストを発生させるのに有用であり得る。例えば、１つまたはそれ以上のヒスチジンを同様の大きさの非水素供与性アミノ酸に変更することで、レセプターとの結合能力の変化したＭ−ＣＳＦを産生し得る。
【００７０】
（実施例８：Ｍ−ＣＳＦヘテロダイマーの調製）
（Ｍ−ＣＳＦモノマーの精製）
米国特許第４，９２９，７００号に記載のＮΔ３ＣΔ１５８Ｍ−ＣＳＦαに対するｐＬ−Ｍ−ＣＳＦベクターまたはＮΔ３ＣΔ２２１  Ｍ−ＣＳＦβ  Ｃ１５７Ｓ、Ｃ１５９Ｓ（Ｋａｗａｓａｋｉら、ｉｎ  Ｃｏｌｏｎｙ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒｓ，  Ｄｅｘｔｅｒ，  Ｔ．，  Ｇａｒｌａｎｄ，  Ｊ．およびＴｅｓｔａ，  Ｎ．編［１９９０］）を含むＥ．ｃｏｌｉを、グルコースおよび適切な抗生物質を含有する１リットルの最少塩培地中で培養した。２％のカザミノ酸を添加後、温度をシフトし３９℃、４時間、Ｍ−ＣＳＦの発現を誘発した。細胞を遠心分離により採取し、５０ｍＭ  トリス（ｐＨ  ８．５）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中で超音波処理して溶解し、細胞残査を遠心分離で回収し、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する３０％スクロースで洗浄し、そして、屈折体ペーストの一部を還元条件下で８Ｍの尿素に溶解した。３７℃で３０分インキュベートした後、溶解したＭ−ＣＳＦを遠心分離により清澄にし、濾過した。次いで、８Ｍ尿素を含む１０ｍＭ  トリス  （ｐＨ  ８．５）、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ中で平衡化したＢｉｏ−Ｇｅｌ  ＴＳＫ−ＤＥＡＥ−５−ＰＷカラム（７．５×７５ｍｍ）（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にロードした。モノマー性のＭ−ＣＳＦは、４５分の０〜０．６Ｍ  ＮａＣｌ勾配で溶離した。Ｍ−ＣＳＦのピーク画分をプールし、そしてＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  １０マイクロコンセントレーター（Ａｍｉｃｏｎ）で１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。
【００７１】
（活性なＭ−ＣＳＦヘテロダイマーの形成および分析）
Ｍ−ＣＳＦホモダイマーは、予め冷却した５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭの還元型グルタチオン、および１ｍＭの酸化型グルタチオンを含む溶液に、０．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に希釈することにより再生し、次いで４℃でインキュベートした。ヘテロダイマーは、同緩衝液中で１５８モノマーおよび２２１Ｆモノマーのプールを１ｍｇ／ｍｌに希釈することにより再生した。再生をモニターするために、ＰＢＳ（ｐＨ６．８）で平衡化したＧ３０００ＳＷ  Ｕｌｔｒｏｐａｃｋ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）サイズ排除カラム（７．５×６００ｍｍ）に、直ちに反応サンプルを注入することにより、サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）分析を行った。
【００７２】
分画した生成物を、Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ（Ｃａｎａｄａ）２２７：（６８０−６８５（１９７０）の方法に従って、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、クマシー染色した。生物学的活性を、Ｍ−ＣＳＦ依存性ＮＦＳ−６０バイオアッセイ（下記の実施例１０参照のこと）を用いて測定した。抗体中和実験は、バイオアッセイの前に、約５，０００ユニットのＭ−ＣＳＦダイマーを種々の希釈の中和Ｍ−ＣＳＦ  ５Ｈ４１０  Ｍａｂ（再生されたＥ．ｃｏｌｉ  ＣΔ  １５０  Ｍ−ＣＳＦαダイマーに対して作製された）とプレインキュベートしてから行った（Ｈａｌｅｎｂｅｃｋら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：７１０（１９８９））。
【００７３】
ヘテロダイマーのＭ−ＣＳＦ生成物を、短クローンの１本の鎖（４位のアミノ酸から１５８位のアミノ酸）および長クローンの１本の鎖（４位のアミノ酸から２２１位のアミノ酸）からなるように設計した。長クローン鎖（２１１Ｆ）はまた、高次オリゴマーの形成の可能性を減少させるために、２つの必須ではないシステイン（１５７位および１５９位）のセリンへの置換を含んでいる。
【００７４】
Ｍ−ＣＳＦ１５８および２２１Ｆの溶解された屈折体（ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ  ｂｏｄｉｅｓ）は、８Ｍ尿素中でＤＥＡＥ−ＨＰＬＣにより別個にクロマトグラフ分析された。単一のタンパク質のピークが各場合で溶出され、非還元のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色（データは示さない）による純度の分析に基づいてピーク画分を集めた。得られたモノマーは、各場合で９０％を超える純度であった。モノマーは、それぞれ１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮され、再生緩衝液で希釈され、そして４℃で再生された。
【００７５】
短クローンＭ−ＣＳＦおよび長クローンＭ−ＣＳＦのダイマー化の割合を比較するために、２０μｌの、０時間、２時間、１８時間、および７２時間の各再生反応物をＳＥ−ＨＰＬＣカラムに注入した。形成されたダイマーＭ−ＣＳＦの量を、ダイマーと予測された分子量でのピーク領域から測定した。両方の再生反応において、Ｍ−ＣＳＦは、０時間においてモノマーとほとんど等しく、２時間までに約４０％ダイマーになり、１８時間までに７５％近くがダイマーになった。再生された１５８および２２１Ｆの間のモノマーに対するダイマーの割合が良く似ていることから、ダイマー形成の割合は長クローンＭ−ＣＳＦおよび短クローンＭ−ＣＳＦで同じであることが示唆された。従って、再生反応において等モルの１５８および２２１Ｆが存在する場合、１５８ホモダイマーと２２１Ｆホモダイマーと１５８／２２１Ｆヘテロダイマーの最終相対的割合は、１：１：２と予測される（類似の分布が、インビボで乳酸脱水酵素のアイソザイムについて観察されている）。
【００７６】
（再生したホモダイマーおよびヘテロダイマーの生物学的活性）
上記の再生したホモダイマーおよびヘテロダイマーの生物学的活性をインビトロのＭ−ＣＳＦ−依存性ＮＦＳ−６０バイオアッセイを用いて試験した（下記の実施例１０を参照のこと）。図５Ａ−Ｃにこれらの結果を示す。７２時間再生後に分析したこれらのＳＥ−ＨＰＬＣおよび生物学的活性の特性（ｐｒｏｆｉｌｅ）で、ヘテロダイマー（図５Ｃ）が２つのホモダイマーの活性と類似した活性を示すことが示された（図５ＡおよびＢ）。ホモダイマーからのヘテロダイマーの分離はほぼ完全であるとすれば、ヘテロダイマーはインビトロで生物学的に充分活性であると考えられ得る。
【００７７】
これらのカラムで、予測されたヘテロダイマーの位置（２つのホモダイマーの間）に溶出されるＭ−ＣＳＦタンパク質が、実際には等モルの短クローンおよび長クローンのモノマーから構成されることを確認するために、１５８／２２１Ｆヘテロダイマーの予備精製の分析を行った。フェニルＨＰＬＣを上記のように行い、図６Ａに示すように１５８ホモダイマーおよび２２１Ｆホモダイマーからヘテロダイマーが完全に分離されることが示された。
【００７８】
（Ｍ−ＣＳＦヘテロダイマーの予備精製）
再生したＭ−ＣＳＦを１ＮのＨＣｌでｐＨ７．０に調整し、硫酸アンモニウムを加えて１．２Ｍにした。タンパク質を、１．２Ｍの硫酸アンモニウム、１００ｍＭ  リン酸（ｐＨ７．０）で平衡化したＢｉｏ−Ｇｅｌ  ＴＳＫ−フェニル−５−ＰＷカラム（７．５×７５ｍｍ）（ＢｉｏＲａｄ，  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に添付した。Ｍ−ＣＳＦを、硫酸アンモニウムの濃度勾配を４０％から８０％に減少させた緩衝液Ｂ（１０ｍＭ  リン酸、ｐＨ７．０）で２４分で溶出した。
【００７９】
還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図６ＢおよびＣ）で、内部対照（１５８のダイマーおよび２２１Ｆのダイマー）が、このカラムにより約９５％の均質性にまで精製され、そして各々が単一の予期されたモノマーバンドからなっていることが示された。ゲル分析でも、ヘテロダイマーが約９５％の均質性まで精製されたこと、および等量の１５８モノマーおよび２２１Ｆモノマーからなることが示された。屈折体ペーストから精製された１５８／２２１Ｆヘテロダイマーの最終生成物収量は、１５％より多かった。
【００８０】
ダイマーＭ−ＣＳＦ種の生物活性を測定し、図６ＡのＡ２８０特性と比較した場合に、ヘテロダイマーが完全に活性であるという所見を確認する。ピーク画分を用いて計算した１５８／２２１Ｆヘテロダイマーの比活性は、それぞれ、１５８ホモダイマーおよび２２１Ｆホモダイマーの９．０×１０７ユニット／ｍｇおよび６．８×１０７ユニット／ｍｇに対して８．０×１０７ユニット／ｍｇであった。
【００８１】
３つ全てのダイマー種の生物学的活性を、ＮＦＳ−６０バイオアッセイにおいて、５Ｈ４１０  Ｍ−ＣＳＦ  Ｍａｂを用いる系列希釈の中和実験と同程度まで中和した。この抗体はまた、同様に「天然型に再生された」チャイニーズハムズター卵巣細胞（ＣＨＯ）で発現したＭ−ＣＳＦを中和する。さらにこの結果は、新規のＭ−ＣＳＦヘテロダイマーの再生した立体配座が、少なくともインビトロ活性に応答可能な最初の１５０アミノ酸内の領域に関しては、本質的に天然型様であることを示唆した。
【００８２】
（実施例９：結晶学的データに基づくＭ−ＣＳＦのアミノ酸置換の選択）
上記のＸ線結晶学的データは、Ｍ−ＣＳＦレセプター結合および生物学的活性を決定づけると考えられる、タンパク質中のアミノ酸の限定されたサブセットを同定し得る、Ｍ−ＣＳＦに関する十分な構造情報を提供し、従って、生物学的活性が変化したＭ−ＣＳＦ変異タンパク質（すなわち、アゴニストまたはアンタゴニスト）を与えるという最終目的を有する突然変異誘発の候補体を示した。この情報に基づいて、いくつかの基準を用いて、置換の可能な標的アミノ酸のリストを作成した。
【００８３】
第一の基準は、溶媒にさらされること、または溶媒に接近可能なことであった。これはタンパク質の表面にあるアミノ酸残基に関連する。約０．２５より大きい、そして好ましくは約０．４より大きい、溶媒が接近可能な表面領域を有する残基は、トリペプチドｇｌｙ−ｘ−ｇｌｙにあるときに接近可能なアミノ酸の表面領域の正規化に基づき、好ましい（Ｋａｂｓｃｈ，  Ｗ．ら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：２５７７（１９８３））。モノマーの相対的配向を維持し、そしてタンパク質折り畳みのプロセスの妨害を避けるために、ダイマー界面のような、タンパク質の他の部分と相互作用しない残基が選択された。候補アミノ酸物質の選択において、ある場合に用いたさらに別の基準は、これらの残基とマウスＭ−ＣＳＦの対応する残基との関係である。別の重要な選択基準は、Ｍ−ＣＳＦレセプター残基との可能な水素結合または疎水的相互作用を妨害しようとするように、置換が非保存的であることであった。
【００８４】
表１は、アミノ酸残基および置換の例を示す。上記の置換のための候補を選択する基準を用いて、当業者は置換の可能な他の候補を容易に確かめ得る。
【００８５】
【表２】
2004285076.tif 000004
表に挙げたすべての置換候補が、Ｍ−ＣＳＦのアゴニストまたはアンタゴニストを生成することは期待されない（以下の実施例１２を参照のこと）。むしろ、上記の選択基準に基づくと、それらは、アゴニストまたはアンタゴニストを生成すると思われる候補の唯一のリストではないことを示す。たとえ、天然型Ｍ−ＣＳＦと比較したときに変異体がアゴニストまたはアンタゴニストとして作用しなくても、その変異体はリガンドの従来の使用（リガンドと同様の活性を保持する場合）、または例えば診断試薬として有用であることはまた、注目されるべきことである。
【００８６】
（実施例１０：Ｈ９Ａ、Ｈ１５Ａ  Ｍ−ＣＳＦ変異タンパク質の調製）
Ｍ−ＣＳＦ成熟Ｎ末端およびヘリックスＡ、Ｃ、およびＤの領域由来の溶媒に接近可能な残基が変化している種々のＭ−ＣＳＦ突然変異体は、当該分野で公知の技術を用いて構築された。例えば、Ｎ末端／Ａヘリックス領域の２つのヒスチジンを、Ｍ−ＣＳＦαの短縮型（ｐＬＣＳＦ１５８Ａによりコードされている）の部位特異的突然変異誘発によりアラニンに置換した。３つのＭ−ＣＳＦヒスチジン残基のうち１つがＭ−ＣＳＦレセプター相互作用に関わっていることは、（Ｍｅｔｈ．  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ４７：４３１  （１９７７）に記載のように）１：１００のＤＥＰＣ：ヒスチジン比でのＭ−ＣＳＦにおけるヒスチジンのジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）修飾が生物活性を顕著に低下させたという本発明者らの観察結果により示された。
【００８７】
プラスミドＤＮＡ  ｐＬＣＳＦ１５８Ａを、プラスミドｐＬＣＳＦ１５８Ａを保持するＥ．ｃｏｌｉ  ＨＷ２２株から調製した（米国特許第４，９２９，７００号、実施例６、「ａｓｐ５９ＳＣＳＦ／ＮΔ３ＣΔ１５８遺伝子を含むｐＪＮ６５３で形質転換したＥ．ｃｏｌｉＨＷ２２株」）。この株を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３５０ｍｌのＲ２培地（１％塩化ナトリウムを含み、グルコースを含まない２Ｘ  Ｌブロス、Ｊ．  Ｂａｃｔ．，  ７４：４６１  （１９５７））で、一晩振盪させて生育させた。プラスミドＤＮＡを、製造者の指示に従ってＱｉａｇｅｎチップ１００カラムを用いて細胞から調製した。
【００８８】
２０μｇのｐＬＣＳＦ１５８Ａ  ＤＮＡを、２００μｌの１Ｘ  Ｎｅｗ  Ｅｎｄｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＮＥバッファー  ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）中で、６６単位のＨｉｎｄＩＩＩおよび６６単位のＳｔｕＩで、３７℃で３時間２０分消化した。ＤＮＡをフェノールおよびクロロホルムで抽出し、次いでエタノール沈殿を行った。このＤＮＡを、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  Ｉｎｄｉａｎａ）により供給された、１００μｌの１Ｘ脱ホスホリル化緩衝液中の１単位の仔ウシ腸アルカリホスファターゼで、３７℃で３０分間処理した。仔ウシ腸アルカリホスファターゼをこの反応にさらに１単位加え、そして５０℃で１時間インキュベーションを続けた。
【００８９】
得られたＤＮＡを、次いで、１％ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，  Ｍａｉｎｅ）Ｓｅａ  ＫＥＭＲ  ＧＴＧＲアガロースゲル上に流した。５．７ｋｂのｐＬＣＳＦ１５８Ａフラグメントをゲルから切り取り、製造者の指示に従ってＱｉａｇｅｎ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）  Ｑｉａｅｘビーズ上で精製した。
【００９０】
次いで、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、９位および１５位のヒスチジン（成熟Ｎ末端から数えた）がアラニンに置換されているような突然変異Ｍ−ＣＳＦ配列を含むＰＣＲ産物を作製した（Ｈ９Ａ、Ｈ１５Ａ  ＰＣＲフラグメントを作製）。Ｍ−ＣＳＦ遺伝子の５’部分を、プライマーＬＦ７３およびＬＦ７４を用いるＰＣＲ反応で、プラスミドｐＬＣＳＦ１５８Ａから増幅した。ＰＣＲの詳細は、Ｍｕｌｌｉｓ，  Ｋ．ら、米国特許第４，６８３，２０２号；Ｅｈｒｌｉｃｈ，  Ｈ．、米国特許第４，５８２，７８８号；Ｓａｉｋｉら、米国特許第４，６８３，１９５号；Ｍｕｌｌｉｓ，  Ｋ．Ｂ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．  Ｑｕａｎｔ．  Ｂｉｏｌ．  ５１：２６３−２７３（１９８６）；Ｓａｉｋｉら，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：１００８−１００１２（１９８５）；およびＭｕｌｌｉｓ，  Ｋ．Ｂ．ら，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １５５：３３５−３５０（１９８７）に提供されており、これらのすべては、本明細書中に参考として援用されている。これらのプライマーの配列を以下に示す：
【００９１】
【化２】
2004285076.tif 000005
ＰＣＲ期待産物は、クローニングのために、産物の各末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＳｔｕＩ部位が位置しており、そして、Ｈｉｓ９およびＨｉｓ１５のヒスチジンコドンＣＡＣがアラニンのコドンＧＣＣに突然変異している３３７ｂｐのｐＬＣＳＦ１５８Ａ配列を含むように設計した。
【００９２】
この産物を、４つの独立したＰＣＲ反応で増幅した。反応は、それぞれ１００ｎｇのｐＬＣＳＦ１５８Ａ  ＤＮＡ、５０ｐｍｏｌｅのＬＦ７３、５０ｐｍｏｌｅのＬＦ７４、３７．５μＭのｄＮＴＰＳ、５％グリセロール、１Ｘ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  ＰＣＲバッファー、および２．５単位のＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  ＡｍｐｌｉＴａｑＲ  ＤＮＡポリメラーゼを１００μｌ容量で含む。増幅は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  ＤＮＡ熱サイクラーで行った。ＡｍｐｌｉＴａｑＲを加える前に、反応物を９５℃にした。増幅は、変性温度９５℃に１秒で移行して、９５℃で１分間変性させ、アニーリング温度６８℃に１秒で移行して、６８℃で１分間アニールし、伸長温度７２℃に３０秒で移行して７２℃で１分３０秒間伸長させることを１サイクルとして２５サイクルで行った。最後の伸長は、７２℃で１０分間行った。
【００９３】
各反応物５μｌを、３％アガロースゲル上に流した（トリスホウ酸緩衝液中１．５％  ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＳｅａＫｅｍＲ  ＧＴＧＲアガロース、１．５％  ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＮｕＳｅｉｖｅＲ  ＧＴＧＲアガロース）（ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｒｏｃｋｌａｎｄ，  Ｍａｉｎｅ）。次いでゲルをエチジウムブロミドで染色した。各反応について、約３３７ｂｐで主要なバンドが可視化された。
【００９４】
４つの反応物をプールし、フェノールおよびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、再懸濁して、最終容量５００μｌの１Ｘ  ＮＥバッファー  ２中の２５０単位のＳｔｕＩで３７℃で２時間消化し、５００単位のＨｉｎｄＩＩＩを反応物に加え、容量を１Ｘ  ＮＥバッファー  ２で１ｍｌにまで増加して、消化を３７℃でさらに２．５時間続けた。ＤＮＡを３％アガロースゲル上で電気泳動した。３００ｂｐ消化産物をゲルから切り取り、製造者の指示に従ってＱｉａｇｅｎ  Ｑｉａｅｘビーズ上で精製した。
【００９５】
次いで、約６８ｎｇのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｔｕＩ消化ＰＣＲ産物を、約２８ｎｇの５．７ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｔｕＩ消化ｐＬＣＳＦ１５８ＡベクターＤＮＡに、約５：１の挿入断片：ベクター比で連結した。連結は、製造者により供給された、１Ｘ  連結緩衝液中１単位のＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで、２０μｌ容量で１６℃で一晩行った。コントロールとして、２８ｎｇの５．７ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｔｕＩ消化ｐＬＣＳＦ１５８ＡベクターＤＮＡを、挿入断片のない同じ条件下で、それ自身に連結した。
【００９６】
各連結混合物の半分を用いて、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＤＧ１１６（ＡＴＣＣ番号５３６０６）細胞を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｍａｎｉａｔｉｓら，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｉｒａｔｏｒｙ（１９８２）に記載の塩化カルシウム法に類似のプロトコルを用いて形質転換した。形質転換細胞を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＲ２−４（１リットル中１０ｇトリプトン、５ｇ酵母抽出物、５ｇＮａＣｌ、２滴の消泡剤Ａ、４ｍｌの５０％グルコース、および１５ｇ寒天）プレート上に塗沫し、３０℃で９０分間選択なしで発現させた。このプレートを室温で７２時間インキュベートした。各形質転換体の４分の１をプレート塗沫した。挿入断片を含む連結物について、６６のアンピシリン耐性コロニーがプレート上でみられた。挿入断片を含まない連結物については、コロニーはみられなかった。
【００９７】
これらのコロニーの１つ（ＴＡＦ１７２−２株と称する）を採取し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを有する３５０ｍｌのＲ２ブロス中で３０℃で一晩振盪しながら培養した。４０％グリセロール中の凍結保存株を、この培養物から作製し、−７０℃で貯蔵した。ＤＮＡは、上記のように、Ｑｉａｇｅｎチップ１００カラムを用いて培養物から単離した。
【００９８】
精製ＤＮＡ、ｐＴＡＦ１７２−２をジデオキシ法を用いて配列決定し、Ｈｉｓ９およびＨｉｓ１５がアラニンをコードするように突然変異した、Ｍ−ＣＳＦ  ＮΔ３ＣΔ１５８をコードするｐＬＣＳＦ１５８Ａの配列を含むことを示した。
【００９９】
ｐＴＡＦ１７２−２によりコードされるＭ−ＣＳＦ変異タンパク質ＮΔ３ＣΔ１５８  Ｈ９Ａ、Ｈ１５Ａを、本質的に米国特許第４，９２９，７００号の実施例５の記載に従って、変性剤として８Ｍ尿素を用いて、そしてＤＥＡＥ精製段階において、発現させ、精製し、再生してダイマータンパク質を形成し、そしてアッセイを行った。
【０１００】
精製変異タンパク質のＮ末端配列を、標準の自動化エドマン分解法を用いて２０サイクルで決定し、そしてＨｉｓ９およびＨｉｓ１５がＡｌａに置換されたことを除いて、親のＮΔ３ＣΔ１５８  Ｍ−ＣＳＦαリファレンスタンパク質の配列と同一であることを示した。タンパク質濃度は、Ａ２８０および吸光係数０．６８を用いて測定した。
【０１０１】
精製変異タンパク質ダイマーを、ＮＦＳ−６０細胞を用いるバイオアッセイにかけた。この細胞は、活性Ｍ−ＣＳＦの存在下でコロニーを形成するＭ−ＣＳＦ依存細胞系である。標準および精製変異タンパク質試料を、９６ウエルマイクロタイタープレートの中で５０μｌ容量のＲＰＭＩ培地（１０％ウシ胎児血清）で１：２に連続希釈した。４０００Ｕ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ中に維持し、２回洗浄し、そして１×１０５個／ｍｌの細胞濃度に希釈した５０μｌのＮＦＳ−６０細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ  １８３８）を、各試料ウェルに加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で４４時間インキュベートした。５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ染料を各試料に加え、インキュベーションを４時間続けた。２０％  ＳＤＳを各試料に加えた。このプレートをホイルに包み、一晩静置した。各試料の吸光度を５７０ｎｍで読み取り、既知のＭ−ＣＳＦ濃度の標準と比較した。Ｈ９Ａ、Ｈ１５Ａ変異タンパク質は、７．６×１０３Ｕ／ｍｇの比活性を示した。対して、同じアッセイで親のＭ−ＣＳＦ  ＮΔ３ＣΔ１５８リファレンスは６．９×１０７Ｕ／ｍｇの比活性であった。このことは、変異タンパク質は、生物学的活性がほとんど１０，０００倍低下していることを示す。同じＭ−ＣＳＦ変異タンパク質調製物が、実施例９に記載のＮＳＦ−６０レセプター競合アッセイを用いて、かなり低いＭ−ＣＳＦレセプター結合能力を有することが示された。Ｈ９Ａ、Ｈ１５Ａ  Ｍ−ＣＳＦ変異タンパク質は、結晶化可能度および空間群を含めて、親Ｍ−ＣＳＦαとあまり異ならなかったので（実施例１２参照）、生物学的活性の低下は、構造の大きな変形によるものではなく、重要なＭ−ＣＳＦレセプター接触の変化を示したものである。
【０１０２】
本質的に同じ方法を用いて、９位および１５位のそれぞれ置換したヒスチジンと接触する２つのＭ−ＣＳＦ変異タンパク質を生成した（例えば、Ｈ９ＡおよびＨ１５Ａ）。Ｈ９Ａ構築物は、ＰＣＲプライマーとして、以下のＬＦ８０、およびＬＦ７３（実施例９に記載）を用いた：
【０１０３】
【化３】
2004285076.tif 000006
Ｈ１５Ａ構築物は、ＰＣＲプライマーとして、以下のＬＦ８１、およびＬＦ７３（実施例９に記載）を用いた：
【０１０４】
【化４】
2004285076.tif 000007
上記の再生工程のすぐ後に行った精製変異タンパク質の生物学的アッセイは、ほぼ以下のような生物学的比活性を示した：Ｈ９Ａは４×１０６Ｕ／ｍｇ、Ｈ１５Ａは３×１０３Ｕ／ｍｇ未満、あるアッセイでは、親Ｍ−ＣＳＦ構築物は８×１０７Ｕ／ｍｇを示した。この情報は、上記と組み合わせて、Ｈ１５Ａおよび可能なＨ９Ａは、Ｍ−ＣＳＦレセプター結合に重要な構築物を代表することを示唆する。すぐ近くの溶媒に接近可能な残基（例えばＹ６およびＳ１３）（表１参照）は、Ｍ−ＣＳＦレセプター接触残基を代表もし得る。Ｈ９、Ｈ１５の側鎖のタンパク質様でない模擬物、およびすぐ近くの溶媒に接近可能な側鎖は、Ｍ−ＣＳＦアゴニストまたはアンタゴニストを代表し得る。このような残基は、十分なＭ−ＣＳＦレセプター結合を保持するがＭ−ＣＳＦアンタゴニスト特性を有するように設計されたＭ−ＣＳＦ変異タンパク質構築物では置換されずにおかれるべきである。なぜなら、これらは顕著なＭ−ＣＳＦ生物活性を有さないからである。十分なレセプター結合能力を保持し、そして顕著に低下した生物活性を示す変異タンパク質のホモダイマーは、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストを代表する。Ｍ−ＣＳＦ生物活性およびレセプター結合能力の両方が、かなり低下したＭ−ＣＳＦ変異タンパク質（例えばＨ１５Ａ）は、一般的にＭ−ＣＳＦ免疫アッセイ適用において有用であり得、Ｍ−ＣＳＦに対する自己抗体を有する患者のための有用な治療薬を代表し得る。
【０１０５】
（実施例１１：Ｑ２０Ａ、Ｖ７８Ｋ  Ｍ−ＣＳＦ変異タンパク質）
実施例１０に記載した方法と、本質的に同一の方法を用いて、Ｍ−ＣＳＦの二重変異体（Ｑ２０Ａ、Ｖ７８Ｋ）を構築し、ＡおよびＣヘリックスの中央部にある、溶媒が接近可能な残基の重要性を試験した。以下のＰＣＲプライマーを用いた。
【０１０６】
【化５】
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得られた変異タンパク質を、実施例８に記載のように発現し、再生し、精製し、そしてアッセイした。特異的生物学的活性は１．４×１０７Ｕ／ｍｇであり、元のＭ−ＣＳＦαの参照スタンダードより約８から１０倍低かった。この変異タンパク質のレセプター結合活性もまた低下した。
【０１０７】
この結果もまた、重要なＭ−ＣＳＦレセプター接触残基はＡおよび／またはＣおよび／またはＤヘリックス中の溶媒が接近可能な残基中に存在すると結論づけられた、短縮されたＭ−ＣＳＦαを用いた結晶学的研究による予測を裏付ける。
これら変異体の相当数は、本発明者が示したように、より低い生物学的活性およびより低いＭ−ＣＳＦレセプター結合能を有する。これらのいくつかはレセプター結合能の減少を伴わない、より低い生物学的活性を有し得る。これらのいくつかは、増大した生物学的活性およびレセプター結合能を有し得る。また、これらのいくつかは、上記いずれの活性についても影響され得ない。
【０１０８】
以下の２つの例はＱ１７Ａ、Ｒ２１Ａ（ＰＣＲプライマーＬＦ７２を用いて生成）である：
【０１０９】
【化６】
2004285076.tif 000009
これら構築物はいずれも、問題の領域内にある、溶媒が接近可能なアミノ酸の側鎖の性質を変更しているが、元の関連分子と比べて、生物学的活性には影響していなかった。これらの結果は、Ｍ−ＣＳＦアゴニストおよびアンタゴニスト活性を有するように設計された変異タンパク質において、残基Ｑ１７、Ｒ２１、Ｅ１１５、およびＮ１１９を変更する必要はないことを示している。実際、Ｍ−ＣＳＦベースのタンパク質性薬剤を潜在的に投与された場合に、抗体が形成される可能性を少なくするためには、溶媒が接近可能な元のＭ−ＣＳＦ内の残基（天然型分子に類似の）をできる限る保持することが好ましい。
【０１１０】
Ｑ１７、Ｒ２１、Ｅ１１５、およびＮ１１９の変更を含む変異タンパク質の残存活性は、近傍の残基（例えばＨ１５）が寄与する、活性への大きな影響を妨げない。実際、我々が変更した領域はレセプター結合および／またはシグナリングのために重要であることが、その結晶構造から予測される。アンタゴニストとしてのＭ−ＣＳＦ変異タンパク質は変異タンパク質１個あたり複数の残基の変更を用いること、または各ポリペプチド鎖に１つまたはそれ以上の変異を含むヘテロダイマー分子を用いることを必要とし得る。なぜなら、レセプターシグナリングに重要なＭ−ＣＳＦ残基は、Ｍ−ＣＳＦ中の不連続領域を構成していると考えられているからである。
【０１１１】
（実施例１２：減少したレセプター結合能および／または減少した生物学的特異的活性を有するＭ−ＣＳＦヘテロダイマーの形成）
実施例８に示したように、Ｍ−ＣＳＦはインビトロで折りたたまれ得、完全に活性なヘテロダイマーを生成し得る。Ｍ−ＣＳＦシグナル能が変更されたＭ−ＣＳＦ変異タンパク質を取り込んだＭ−ＣＳＦヘテロダイマーを作成することで、Ｍ−ＣＳＦ介在疾病の患者の治療のために有用なＭ−ＣＳＦアンタゴニストを生成することが可能である。Ｍ−ＣＳＦαＮ’３／Ｃ’１５８、Ｈ９Ａ／Ｈ１５Ａのうちの１つのサブユニットおよびＭ−ＣＳＦβＮ’３／Ｃ’２２１、Ｃ１５７Ｓ／Ｃ１５９Ｓのうちの１つのサブユニットを有するヘテロダイマーを生成するために、各変異タンパク質をＥ．Ｃｏｌｉ中で発現させ、そして、実施例８に記載の変性および還元条件下のＤＥＡＥセファロースでそれぞれ精製した。この２つの変異サブユニットを、再生の前に混合し、    変異タンパク質を最終モル比１：１で含有する溶液を生成し、次いで、この溶液を実施例８に記載の再生緩衝液で０．２ｍｇ／ｍｌに希釈した。再生の後に、実施例８に記載のように、フェニルＴＳＫ−５−ＰＷ  ＨＰＬＣカラムによる２つの連続した経路で上記ヘテロダイマー分子をホモダイマーから分離した。精製したヘテロダイマー調製物を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＢｉｏＳｉｌ  ＳＥＣ２５０カラム（ＢｉｏＲａｄ製）を用いるサイズ排除ＨＰＬＣで試験したとき、夾雑物は検出されなかった。
【０１１２】
精製したヘテロダイマーを、実施例８に記載のＮＦＳ６０細胞ベースのバイオアッセイに付した。特異的活性の計算値は２．９×１０６Ｕ／ｍｇであり、これは実施例１０に記載の、元のＭ−ＣＳＦヘテロダイマーの活性と比べると３５倍の減少に当たる。細胞表面のＭ−ＣＳＦレセプターへの相対結合親和性を放射性リガンド置換によって測定した。ここでＭ−ＣＳＦ変異タンパク質によるＭ−ＣＳＦレセプターから１２５Ｉ−Ｍ−ＣＳＦへの置換は、当業者に周知の方法によって測定される。簡単にいえば、９６ウェル細胞培養プレートの各ウェルに、最終容量が１００μｌとなるように、以下を添加した：１２５Ｉで（製造者であるＰｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬの記載のように、Ｉｏｄｏｂｅａｄｓを用いて）ラベルした精製組換えヒトＭ−ＣＳＦを約８０，０００ｃｐｍ相当分、洗浄された３００，０００個のＮＦＳ−６０細胞。次いで、正常維持レベルのＭ−ＣＳＦを除いた増殖培地中で１８時間培養し、同じ培地で連続希釈された、ラベルされていないＭ−ＣＳＦを加えた。このプレートを４℃で２０時間インキュベートし、細胞をグラスファイバーフィルター上に採取した。最大結合は、ラベルされていないＭ−ＣＳＦが存在しない条件下で測定し、そして非特異的結合は（ラベルしたＭ−ＣＳＦと比較して）、１０００倍高濃度のラベルされていないＭ−ＣＳＦの存在下で測定した。ラベルされたＭ−ＣＳＦの細胞への結合を５０％阻害するために必要とされるＭ−ＣＳＦの濃度（ＩＣ５０）を、親和性の違いを測定するために利用した。結果は、変異タンパク質濃度に対する、放射活性Ｍ−ＣＳＦの置換パーセントで表した（図７）。ヘテロダイマーのＩＣ５０（図７の黒四角）は、Ｍ−ＣＳＦαＮ’３／Ｃ”１５８（１５８）（図７の黒四角）についてのＩＣ５０が約１７ｐＭであるのに比べて３０倍減少して約５００ｐＭであった。ヘテロダイマーの特異的活性およびレセプター親和性における減少の間の類似は、生物活性の減少がレセプター結合能の低下に依存していることを示している。同様に、Ｑ２０Ａ／Ｖ７８ＫＦ（図７の白丸）およびＨ９Ａ／Ｈ１５Ａ（白四角）変異タンパク質の結合親和性もまた、この放射性リガンド置換アッセイで測定した。Ｑ２０Ａ／Ｖ７８Ｋ変異タンパク質は約１００ｐＭのＩＣ５０を有し、そしてＨ９Ａ／Ｈ１５Ａ変異タンパク質は約１μＭのＩＣ５０を有し、これらはそれぞれ、結合親和性の５倍の低下および５０，０００倍の低下に対応する。各変異タンパク質について、レセプター親和性の減少は特異的活性の減少と同様であり、やはり、生物活性の減少がレセプター結合能に依存していることを示している。
【０１１３】
（実施例１３：Ｍ−ＣＳＦ  Ｈ９Ａ、Ｈ１５Ａ変異タンパク質の結晶化および定性）
実施例９に記載のＨ９８、Ｈ１５Ａ変異タンパク質を、実施例１および２に記載の滴下法を用い、以下の緩衝液条件を用いて結晶化した：３０％ポリエチレングリコール４０００；１００ｍＭ  Ｌｉ２ＳＯ４；およびｐＨ８．５の１００ｍＭトリス。この条件下で生成した結晶は０．７ｍｍ×０．２ｍｍ×０．２ｍｍの寸法の菱面体プリズムであった。プレセッション写真を用いたＸ線結晶学的分析は、ａ＝３３．９９、ｂ＝６５．３７、ｃ＝１５９．９０、ｄ＝９０、ｅ＝９０、およびｆ＝９０オングストロームのセルディメンジョンを有するＰ２，２，２空間群の結晶を示し、見かけの解像力で３オングストロームまで回折した。これら物理特性は元のＮΔ３ＣΔ１５８Ｍ−ＣＳＦα分子で観測される物理特性と本質的に同じであり、そしてＨ９Ａ、Ｈ１５Ａの変更の生物学的効果はＭ−ＣＳＦ構造の全体の変更の総和の結果ではなく、むしろＭ−ＣＳＦレセプターとの相互作用に重要な側鎖の変更の結果であることを示唆している。これらのヒスチジン側鎖の変更は、レセプター結合またはコンフォメーション上の変化を安定化し、または促進するのに影響する原子を変えることにより、レセプター結合に影響し得る。Ｈ１５Ａのような変化は、Ｍ−ＣＳＦの側鎖近傍（もっともありそうなのはＡおよび／またはＣヘリックス領域）の位置を変更することにより、その機能に影響を与え得る。
上記実施例は例示のために提示され、添付の請求項に記載の本発明の範囲を限定することを意図しない。
【０１１４】
【化７】
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【０１１５】
【化８】
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本発明は、図面および特定の実施態様における議論を参照して、さらによく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】図１は、本発明に従って調製されたＭ−ＣＳＦα結晶体の回折パターンの一部分である。
【図２】図２は、短縮型ダイマーＭ−ＣＳＦのジスルフィド結合を示す幾何学的ダイアグラムである。
【図３】図３は、１０残基毎にラベルした残基番号および点線によって示した非結晶対称軸を伴う、Ｃ−アルファ骨格のステレオダイアグラムである。
【図４】図４および４ａは、Ｍ−ＣＳＦの二次構造上のエレメントを強調したリボンダイアグラムの二つの視野を示す。システイン残基は、ボールおよびスティックモデルで表記し、非結晶対称軸は、点線で表記している。
【図５】図５Ａ〜Ｃは、ＮΔ３ＣΔ１５８  Ｍ−ＣＳＦ短形クローンホモダイマー（１５８）（Ａ）、ＮΔ３ＣΔ２２１  Ｃ１５７Ｓ、Ｃ１５９Ｓ  長形クローンホモダイマー（２２１Ｆ）（Ｂ）、および上記短形クローン／長形クローンのヘテロダイマー（１５８／２２１Ｆ）（Ｃ）についてのサイズ排除ＨＰＬＣ解析およびそれらに対応する生物学的活性を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、サイズ排除ＨＰＬＣを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、分取精製Ｍ−ＣＳＦの非還元のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（６解析物）を示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、分取精製Ｍ−ＣＳＦの還元下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（６解析物）を示す。
【図７】図７は、Ｍ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦ変異タンパク質のＮＦＳ６０細胞Ｍ−ＣＳＦレセプターへの結合を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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