(57)【要約】【課題】硬組織と軟組織との界面を効果的に接合可能にする。【解決手段】生体高分子ゲル中に、含有率を傾斜させてカルシウム化合物を含有させたカルシウム傾斜材料を提供する。カルシウム化合物としては、ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）、αおよびβ型トリカルシウムフォスフェート（α、β−ＴＣＰ）、炭酸カルシウム、オクタカルシウムフォスフェート（ＯＣＰ）が挙げられる。このカルシウム傾斜材料は、生体高分子を溶解させた生理的緩衝溶液に、カルシウム化合物を均一に拡散させた状態で架橋剤を添加し、ゲル化する前に遠心分離により、カルシウム化合物の含有割合を遠心軸鉛直方向に分散させる製造方法等により製造される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体高分子ゲル中に、含有率を傾斜させてカルシウム化合物を含有させたカルシウム傾斜材料。
【請求項２】
前記カルシウム化合物が、ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）である請求項１に記載のカルシウム傾斜材料。
【請求項３】
前記カルシウム化合物が、αおよびβ型トリカルシウムフォスフェート（α、β−ＴＣＰ）である請求項１に記載のカルシウム傾斜材料。
【請求項４】
前記カルシウム化合物が、炭酸カルシウムである請求項１に記載のカルシウム傾斜材料。
【請求項５】
前記カルシウム化合物が、オクタカルシウムフォスフェート（ＯＣＰ）である請求項１に記載のカルシウム傾斜材料。
【請求項６】
前記生体高分子ゲルが、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、１−エチル３−（３−ジメチルアミノプロピカルボジイミド）、またはペンタエリトリトールポリエチレングリコールエーテルテトラスクシンイミジルグルタレートによって調整された請求項１に記載のカルシウム傾斜材料。
【請求項７】
生体高分子を溶解させた生理的緩衝溶液に、カルシウム化合物を均一に拡散させた状態で架橋剤を添加し、ゲル化する前に遠心分離により、カルシウム化合物の含有割合を遠心軸鉛直方向に分散させる請求項１に記載のカルシウム傾斜材料の製造方法。
【請求項８】
カルシウム化合物を含まない生体高分子と架橋剤を溶解させた生理的緩衝溶液を用いて、カルシウム化合物を含む生体高分子と架橋剤を溶解させた生理的緩衝溶液を連続的に希釈しながら容器に注入していく請求項１に記載のカルシウム傾斜材料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体高分子ゲル中に、含有率を傾斜させてカルシウム化合物を含有させたカルシウム傾斜材料とその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
関節症の手術においては、モザイクプラスティに代表されるように、関節の動きに対して力学的な負担のかかりにくい自家組織を抽出し患部に移植する方法が主流である。しかし、自家組織の使用は患者への負担が大きく、その際の採取量にも限界がある。このため、これに代わる手段として、他人の軟骨組織を用いた同種移植も試みられているが、拒絶反応や換算の問題から十分な結果は得られていない。
【０００３】
これまで、軟組織の再生においては、コラーゲンやヒアルロン酸等を架橋した材料が用いられていた。一方、硬組織の再生には、α及びβ−ＴＣＰに代表されるリン酸カルシウムを主成分とした材料が利用されていた。また、傾斜材料としては、熱可塑性の生体内分解吸収性ポリマー中にバイオセラミックスを傾斜化したインプラント材料が用いられていた（例えば、特許文献１〜１３参照。）。
【０００４】
【特許文献１】
特開平８−３４７４７号公報
【特許文献２】
特開平８−５３５４８号公報
【特許文献３】
特表平８−５０２０８２号公報
【特許文献４】
特開平９−２４９７５１号公報
【特許文献５】
特表平１０−５０１７０６号公報
【特許文献６】
特表平１１−５０９２５６号公報
【特許文献７】
特表２０００−５０１９７５号公報
【特許文献８】
特表２０００−５０２３８０号公報
【特許文献９】
特開２０００−１５７６２号公報
【特許文献１０】
特開２００２−０８０５０１号公報
【特許文献１１】
特開２００２−０７８７９１号公報
【特許文献１２】
特開２００１−１９８２０８号公報
【特許文献１３】
特開平５−２３７１７８号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のような従来の材料では、硬組織および軟組織のそれぞれにおいては効果的に接合する効果を得ることができるものの、硬組織と軟組織との界面を接合することは困難であった。
本発明は、硬組織と軟組織との界面を効果的に接合する材料を提供し、これを利用することにより硬組織−軟組織欠損部を十分に補填できるカルシウム傾斜材料とその製造方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明者らは、生体高分子ゲル中のある一方向に沿ってカルシウム化合物の含有割合を単調増加させる方法を考案した。この手法を用いることにより、骨との接合がよく、かつ、軟組織再生機能に優れた材料が得られることを見出した。
【０００７】
すなわち、上記課題を解決するための手段として、本発明は、生体高分子ゲル中に、含有率を傾斜させてカルシウム化合物を含有させたカルシウム傾斜材料を提供する。また、カルシウム化合物としては、ＨＡＰ、α−ＴＣＰ、β−ＴＣＰ、ＯＣＰのようなリン酸カルシウムや炭酸カルシウムが挙げられる。
【０００８】
また生体高分子ゲルとしては、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピカルボジイミド）、またはペンタエリトリトールポリエチレングリコールエーテルテトラスクシンイミジルグルタレートによって調整されたものが挙げられる。
【０００９】
また、この発明は、生体高分子を溶解させた生理的緩衝溶液（例えば、ＰＢＳ溶液）にカルシウム化合物を均一に拡散させた状態で架橋剤を添加し、ゲル化する前に遠心分離により、カルシウム化合物の含有割合を遠心軸鉛直方向に分散させることにより、上記カルシウム傾斜材料を製造する製造方法を提供する。
【００１０】
また、この発明は、カルシウム化合物を含まない生体高分子と架橋剤を溶解させた生理的緩衝溶液を用いて、カルシウム化合物を含む生体高分子と架橋剤を溶解させた生理的緩衝溶液を連続的に希釈しながら容器に注入していくことにより、上記カルシウム傾斜材料を製造する製造方法を提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、この発明の一実施形態に係るカルシウム傾斜材料とその製造方法について説明する。
本実施形態で使用される生体高分子としては、生体内で分解・吸収される天然高分子材料であって、例えば、コラーゲン（タイプによらない）、コラーゲンの変性体であるゼラチン、ポリリジン、キトサン（脱アセチル化度）、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）（種類によらない）およびその誘導体あるいはこれらの二種以上からなる複合体等が挙げられる。これら生体高分子の分子量は、特に限定されるものではない。
【００１２】
特に、本実施形態においては、軟骨マトリックス等の軟組織構成成分であるコラーゲンおよびＧＡＧ、例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸あるいはこれらの二種以上からなる複合体を生体高分子材料として用いることが好ましい。
【００１３】
天然のコラーゲンの大部分は不溶性であるが、これをアルカリ処理あるいは酵素処理によって可溶化したコラーゲンを用いると、取り扱いやすく、しかも抗原性を有する部分が除去されているため好ましい。また、フタル化コラーゲンはどのようなｐＨのバッファーにでも溶解し、扱いやすいという点で好ましい。
【００１４】
生体高分子ゲルは、生体高分子を何らかの方法で架橋する必要があるが、架橋剤として、ペンタエリトリトールポリエチレングリコールエーテルテトラスクイシンイミジルグルタレート、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドを用いることが好ましい。また、縮合剤として、１−エチル３−（３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド）を用いることも好ましい。
【００１５】
本実施形態で使用されるリン酸カルシウム（カルシウム化合物）は、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２，  Ｃａ３（ＰＯ４）２などの化学式で示される一群の化合物である。これらのリン酸カルシウムは、水溶液中に浸漬しておくと複合体中で熱力学的に安定なＨＡＰに変化する。
【００１６】
ＨＡＰは、一般組成をＣａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２とする化合物であり、コラーゲンとともに哺乳類の硬組織（骨や歯）の主要構成成分である。生体硬組織中のＨＡＰのＰＯ４およびＯＨ成分は、大気中のＰＯ３と置換していることが多い。本実施形態の複合材料においても、かかる置換がある程度（０〜１０ｗｔ％程度）含まれていても良い。
【００１７】
本実施形態において使用されるリン酸カルシウムは、生体高分子ゲル内に傾斜化して含有される。ここで、「傾斜化」とは、一定の勾配で変化することを意味する。すなわち、リン酸カルシウムは、生体高分子材料の一方の側から他方の側に向けて、一定の勾配で密から疎へと、その含有率を変化して含有されている。
【００１８】
リン酸カルシウムの傾斜化には、遠心法を用いることが可能である。すなわち、生体高分子を生理的緩衝溶液（ｐＨ６．０〜８．０、終濃度１〜１０ｗｔ％）中にリン酸カルシウム顆粒（平均粒径１０〜１０００μｍ、０．１〜１０ｗｔ％）および架橋剤（０．１ｍＭ〜１０ｍＭ）を添加し、撹拌後、遠心分離（０〜３０，０００Ｇ）をすることにより得られる。
【００１９】
また、生体高分子ゲル中へのリン酸カルシウムの傾斜化には、濃度希釈法を用いることも可能である。すなわち、リン酸カルシウムを含まない生体高分子溶液（ｐＨ６．０〜８．０、終濃度１〜１０ｗｔ％、架橋剤濃度０．１ｍＭ〜１０ｍＭ）によりリン酸カルシウム（平均粒径１０〜１０００μｍ、０．１〜１０ｗｔ％）を含む生体高分子溶液（ｐＨ６．０〜８．０、終濃度１〜１０ｗｔ％、架橋剤濃度０．１ｍＭ〜１０ｍＭ）を一定の速度（０．１〜５．０ｍＬ／ｓｅｃ）で経時的に希釈しながら別の容器に一定の速度（０．１〜５．０ｍＬ／ｓｅｃ）で流していき、架橋反応を行うことにより、傾斜化が得られる。
【００２０】
前項の方法によって作製された傾斜材料中におけるリン酸カルシウムの分布は、電子顕微鏡観察および元素分析等の各種分析を単独あるいは組み合わせることにより確認することができる。
【００２１】
図１には、リン酸カルシウムとしてβ−ＴＣＰ粒子、生体高分子としてＩＩ型コラーゲンを用いて、傾斜材料を遠心法により種々の遠心力で作成した後の傾斜度（＝（線分析による縦軸成分の最大値と最小値との差）／（線分析による縦軸成分の最大値と最小値をとる横軸成分の値との差））を示す。遠心力が増加するにつれて傾斜度が上がっていることから傾斜化が進んでいることが分かる。しかしながら、遠心力が２０，４００Ｇ以上になると傾斜度が急激に下がるため好ましくない。よって、好ましい遠心力は、２０，４００Ｇ以下である。
【００２２】
図２は、遠心法によるβ−ＴＣＰ粒子の粒径とＩＩ型コラーゲンゲル中における傾斜度の関係を調べた結果を示している。遠心力は、２，３００Ｇと固定して傾斜化を行った。β−ＴＣＰ粒子の粒径が１００μｍ以上になると、傾斜度が下がるため好ましくない。よってβ−ＴＣＰ粒子の粒径は、１〜１００μｍが好ましい。
【００２３】
図３は、濃度希釈法によるβ−ＴＣＰ粒子の含有量とＩＩＩ型コラーゲンゲル中における傾斜度の関係を調べた結果を示している。β−ＴＣＰ粒子の含有量を増加させると傾斜度は増加する。よって、β−ＴＣＰ粒子の含有量は０．１０〜１０ｗｔ％以下が好ましい。
【００２４】
なお、本実施形態においては、カルシウム化合物としてリン酸カルシウム、特に、β−ＴＣＰを例に挙げて説明したが、これに限定されるものではなく、ＨＡＰ，α−ＴＣＰ，ＯＣＰのような他のリン酸カルシウムや、ＣａＣＯ３のような炭酸カルシウムを含有させることにしてもよい。
【００２５】
【実施例】
実施例１：遠心法によるリン酸カルシウム傾斜材料の作成（その１）
１．２５ｗｔ％のＩＩ型コラーゲンリン酸緩衝液（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）にβ−ＴＣＰ（平均粒径７５〜１００μｍ）を９．１ｗｔ％入れ、十分撹拌した。その後、１．０ｍＭの架橋剤を添加し十分攪拌した後、遠心分離６００Ｇを２５℃、１５分間行った。架橋剤として、ポリエチレングリコール（ユニット数ｎ＝５６）のカルボキシル基末端にスクシンイジミル基をもつペンタエリトリトールベースの４官能性架橋剤を用いた。
【００２６】
ＩＩ型コラーゲンゲル中にリン酸カルシウム（β−ＴＣＰ）が傾斜化されたリン酸カルシウム傾斜材料を合成した。得られた傾斜材料の傾斜度は、０．３０であった。
【００２７】
実施例２：遠心法によるリン酸カルシウム傾斜材料の作成（その２）
遠心分離の遠心力を９，１００Ｇとした以外は、実施例１と同様に合成を行った。実施例１と同様のリン酸カルシウム傾斜材料が得られた。得られた傾斜材料の傾斜度は、１３．４であった。
【００２８】
実施例３：遠心法によるリン酸カルシウム傾斜材料の作成（その３）
遠心分離の遠心力を２０，４００Ｇとした以外は、実施例１と同様に合成を行った。実施例１と同様のリン酸カルシウム傾斜材料が得られた。得られた傾斜材料の傾斜度は、５．０１であった。
【００２９】
実施例４：遠心法によるリン酸カルシウム傾斜材料の作成（その４）
β−ＴＣＰの含有量を２．０ｗｔ％とした以外は、実施例１と同様に合成を行った。実施例１と同様のリン酸カルシウム傾斜材料が得られた。得られた傾斜材料の傾斜度は、０．３２であった。
【００３０】
実施例５：濃度希釈法によるリン酸カルシウム傾斜材料の作成（その１）
β−ＴＣＰを含まない１．２５ｗｔ％のＩＩ型コラーゲンＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４、架橋剤濃度１．０ｍＭ、４．０ｍＬ）（溶液Ａ）およびβ−ＴＣＰを１．２０ｗｔ％含む１．２５ｗｔ％のＩＩ型コラーゲンＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４、架橋剤濃度１．０ｍＭ、４．０ｍＬ）（溶液Ｂ）を調製した。
【００３１】
溶液Ａにより溶液Ｂを一定速度（０．８ｍＬ／ｓｅｃ．）で希釈しながら、同時にその混合溶液を単位時間あたり一定量（０．８ｍＬ／ｓｅｃ．）で別の容器に流し込み、リン酸カルシウム傾斜材料（最終リン酸カルシウム濃度０．６０ｗｔ％）を合成した。得られた傾斜材料の傾斜度は、０．５３であった。
【００３２】
実施例６：濃度希釈法によるリン酸カルシウム傾斜材料の作成（その２）
溶液Ａの重量を８．０ｍＬとし、最終リン酸カルシウム濃度が０．４０ｗｔ％とした以外は、実施例５と同様に合成を行った。実施例５と同様のリン酸カルシウム傾斜材料が得られた。得られた傾斜材料の傾斜度は、０．２７であった。
なお、カルシウム化合物としてＨＡＰを使用した場合においても、同様の効果が得られた。
【００３３】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明に係るカルシウム傾斜材料によれば、カルシウム化合物の含有率が多い側を硬組織に、少ない側を軟組織に接合させることにより、硬組織と軟組織の界面を効果的に接合することができるという効果を奏する。また、この発明に係るカルシウム傾斜材料の製造方法によれば、上記カルシウム傾斜材料を簡易に製造することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】遠心法による種々の遠心力とリン酸カルシウム（β−ＴＣＰ）のＩＩ型コラーゲンゲル中における傾斜度の関係を示すグラフである。
【図２】遠心法によるリン酸カルシウム（β−ＴＣＰ）の粒径とＩＩ型コラーゲンゲル中における傾斜度の関係を示すグラフである。
【図３】濃度希釈法によるリン酸カルシウム（β−ＴＣＰ）の含有量とＩＩ型コラーゲンゲル中における傾斜度の関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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