(57)【要約】【課題】高純度で均一な、分子量分散度が低いＮ−アセチルヘパロサンおよび該Ｎ−アセチルヘパロサンを高純度に含むＮ−アセチルヘパロサン画分を提供することができる。【解決手段】ゲルろ過クロマトグラフィー法によって測定した重量平均分子量が３５，０００〜４５，０００であり、分子量分散度が１．１〜１．９であるＮ−アセチルヘパロサン、該Ｎ−アセチルヘパロサンを含み、核酸含量が０．１％以下、かつ遊離アミン含量が０．０３μＭ／ｍｇ以下である高純度かつ均一なＮ−アセチルヘパロサン画分。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲルろ過クロマトグラフィー法によって測定した重量平均分子量が３５，０００〜４５，０００であり、分子量分散度が１．１〜１．９であるＮ−アセチルヘパロサン。
【請求項２】
核酸含量が０．１％以下、かつ遊離アミン含量が０．０３μＭ／ｍｇ以下であり、請求項１に記載のＮ−アセチルヘパロサンを含む高純度かつ均一なＮ−アセチルヘパロサン画分。
【請求項３】
Ｎ−アセチルヘパロサンと微生物由来成分を含有する溶液からＮ−アセチルヘパロサン画分を製造する方法であって、該培養液をアルカリ処理した後、中和処理し、有機酸塩存在下でアルコール分画することを特徴とするＮ−アセチルヘパロサン画分の製造法。
【請求項４】
Ｎ−アセチルヘパロサンと微生物由来成分を含有する溶液がＮ−アセチルヘパロサン生産能を有する大腸菌の培養液に由来する溶液である請求項３に記載のＮ−アセチルヘパロサン画分の製造法。
【請求項５】
Ｎ−アセチルヘパロサン生産能を有する大腸菌がＫ５菌株又は該菌株と実質的に同一の性質を有する菌株である請求項４に記載のＮ−アセチルヘパロサン画分の製造法。
【請求項６】
有機酸塩が酢酸ナトリウムである請求項３に記載の製造法。
【請求項７】
酢酸ナトリウムを溶液の終濃度が５〜１５％となるよう添加することを特徴とする請求項６に記載の製造法。
【請求項８】
アルコールがエタノールである請求項３に記載の製造法。
【請求項９】
エタノールを溶液の終濃度が３０〜５０％となるよう添加することを特徴とする請求項８に記載の製造法。
【請求項１０】
Ｎ−アセチルヘパロサン生産能を有する大腸菌の培養液からＮ−アセチルヘパロサン画分を製造する方法であって、該培養液を熱処理後、固液分離し、固液分離上清からＮ−アセチルヘパロサン画分を精製することを特徴とするＮ−アセチルヘパロサン画分の製造法。
【請求項１１】
培養液の熱処理温度が、８０〜２００℃である請求項１０に記載のＮ−アセチルヘパロサン画分の製造法。
【請求項１２】
下記工程により得られる高純度かつ均一なＮ−アセチルヘパロサンを含むＮ−アセチルヘパロサン画分。
（１）Ｎ−アセチルヘパロサン生産能を有する大腸菌の培養液を熱処理後、固液分離し、次いで固液分離上清を膜処理して溶液を得る工程。
（２）工程（１）で得られた溶液をアルカリ処理した後中和処理し、有機酸塩存在下でアルコール分画する工程。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＮ−アセチルヘパロサン生産能を有する大腸菌の培養液等の未精製または粗精製のＮ−アセチルヘパロサン溶液から得られる高純度で均一な、すなわち、分子量分散度が低いＮ−アセチルヘパロサン、該Ｎ−アセチルヘパロサンを高純度に含むＮ−アセチルヘパロサン画分およびその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
以下本明細書中の糖及び糖残基の表記においては特に明記しない限り光学異性体はすべてＤ体を示すものとする。
Ｎ−アセチルヘパロサンはβ−Ｄグルクロニル−１，４−α−Ｎ−アセチル−Ｄグルコサミニル（１，４））の二糖単位の繰り返し構造を特徴とするグリコサミノグリカンであり、大腸菌のある種の細菌によって産生され、抗原Ｋ５と呼ばれるきょう膜多糖としても知られている（Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｃｈｅｍ　１９８１，ｖｏｌ１１６，３５９−３６４）。この多糖はヘパリンの前駆物質であるとされており、Ｎ−アセチルヘパロサンが一部脱Ｎ−アセチル化された後に硫酸化され、グルクロン酸がイズロン酸に変換されたのち、イズロン酸、Ｎ−アセチルグルコサミンの特定の部分がランダムに硫酸化されることによりヘパリンとなる。ヘパリンは有用な抗凝固作用及び抗血栓作用をもち医薬品として用いられている。しかしながら、一般的には原料をウシやブタなどの動物の臓器に頼らざるを得ないため病原性ウイルスやプリオンタンパク質の汚染の危険性を避けがたいという難点がある。
【０００３】
動物臓器に頼らないヘパリンあるいはヘパリン類似物質は上記の通り有用性が高く、その工業的な製造について鋭意研究がなされている。例えば大腸菌Ｋ５の培養液よりＮ−アセチルヘパロサンを得たのち化学的に硫酸化を施し、抗凝固活性を有する擬似ヘパリンを作成する試みがなされている（特開平５−２７１３０５）。
【０００４】
外にも大腸菌Ｋ５の培養液からＮ−アセチルヘパロサンを精製する試みは種々なされている。Ｖａｎｎらは培養液中にセタボロン（ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド　ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ）を加えＮ−アセチルヘパロサンを回収し、続いて塩化カルシウム溶液中でＮ−アセチルヘパロサンを抽出し、フェノール抽出を繰り返して精製する方法を報告している（Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１９８１）。この方法により５０Ｌの培養液から１〜３グラムのＮ−アセチルヘパロサンが精製される（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，　１９９４）。
【０００５】
又、Ｍａｎｚｏｎｉらは大腸菌Ｋ５の培養液を限外ろ過装置により濃縮し、エタノールを添加することによりＮ−アセチルヘパロサンを沈殿せしめ、プロナーゼで消化した後、透析とエタノールを添加することによる沈殿工程を繰り返して精製する方法を報告している（Ｊ．　Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ　ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ　ｐｏｌｙｍｅｒｓ　１９９６）。更に、彼らは培地組成と培養装置の改良をおこない１Ｌの培養液から３５０−４００ｍｇのＮ−アセチルヘパロサンの製造を可能にした。このＮ−アセチルヘパロサンは不純物であるタンパク質を１２−１６％含有していると報告されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｌｅｔｔｅｒｓ　２０００）。これら従来の精製例の中には、大腸菌を不活性化させる目的で熱処理を行っている場合もあるが、本発明のようなＮ−アセチルヘパロサンの回収率を増加させる意図で熱処理を行った例はない。
【０００６】
従来の方法では、培養液を精製した後、種々の複雑な工程によってのみＮ−アセチルヘパロサンを精製するより他になかった。精製しうるＮ−アセチルヘパロサンの量は培養液１Ｌあたり３５０−４００ｍｇ程度であるが、その精製品中にはタンパク質が１２−１６％と比較的大量に含まれ、例えば医薬品のような高純度を要求される用途には適さない。また、従来報告されているＮ−アセチルヘパロサンの分子量分布は特開平５−２７１３０５あるいはＪ．　Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ　ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ　ｐｏｌｙｍｅｒｓ（１９９６）　ｖｏｌ．１１　ｐ３０１に示されるごとく単分散ではなく、複数のピークを有する多分散の様相を呈している。分子量がある一定の範囲に限定されることはＮ−アセチルヘパロサンの物性をより一定に保てるという利点があり、また期待される生理活性がより均一のものとなる可能性を強める。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、分子量分散度が低いＮ−アセチルヘパロサンおよび該Ｎ−アセチルヘパロサンを高純度に含むＮ−アセチルヘパロサン画分を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記実状に鑑み鋭意検討を重ねた結果、比較的簡便な手法でもって分子量分散度の低いＮ−アセチルヘパロサンを高純度に含むＮ−アセチルヘパロサン画分を回収率よく精製することに成功し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、以下の通りである。
〔１〕ゲルろ過クロマトグラフィー法によって測定した重量平均分子量が３５，０００〜４５，０００であり、分子量分散度が１．１〜１．９であるＮ−アセチルヘパロサン。
〔２〕核酸含量が０．１％以下、かつ、遊離アミン含量が０．０３μＭ／ｍｇ以下であり、〔１〕のＮ−アセチルヘパロサンを含む高純度かつ均一なＮ―アセチルヘパロサン画分。
〔３〕Ｎ−アセチルヘパロサンと微生物由来成分を含有する溶液からＮ−アセチルヘパロサン画分を製造する方法であって、該培養液をアルカリ処理した後、中和処理し、有機酸塩存在下でアルコール分画することを特徴とするＮ−アセチルヘパロサン画分の製造法。
〔４〕Ｎ−アセチルヘパロサンと微生物由来成分を含有する溶液がＮ−アセチルヘパロサン生産能を有する大腸菌の培養液に由来する溶液である〔３〕のＮ−アセチルヘパロサン画分の製造法。
〔５〕Ｎ−アセチルヘパロサン生産能を有する大腸菌がＫ５菌株又は該菌株と実質的に同一の性質を有する菌株である〔４〕のＮ−アセチルヘパロサン画分の製造法。
〔６〕有機酸塩が酢酸ナトリウムである〔３〕の製造法。
〔７〕酢酸ナトリウムを溶液の終濃度が５〜１５％となるよう添加することを特徴とする〔６〕に記載の製造法。
〔８〕アルコールがエタノールである〔３〕の製造法。
〔９〕エタノールを溶液の終濃度が３０〜５０％となるよう添加することを特徴とする〔８〕の製造法。
〔１０〕Ｎ−アセチルヘパロサン生産能を有する大腸菌の培養液からＮ−アセチルヘパロサン画分を製造する方法であって、該培養液を熱処理後、固液分離し、固液分離上清からＮ−アセチルヘパロサン画分を精製することを特徴とするＮ−アセチルヘパロサン画分の製造法。
〔１１〕培養液の熱処理温度が、８０〜２００℃である〔１０〕のＮ−アセチルヘパロサン画分の製造法。
〔１２〕下記工程により得られる高純度かつ均一なＮ−アセチルヘパロサンを含むＮ−アセチルヘパロサン画分。
（１）Ｎ−アセチルヘパロサン生産能を有する大腸菌の培養液を熱処理後、固液分離し、次いで固液分離上清を膜処理して溶液を得る工程。
（２）工程（１）で得られた溶液をアルカリ処理した後中和処理し、有機酸塩存在下でアルコール分画する工程。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）Ｎ−アセチルヘパロサン
Ｎ−アセチルヘパロサンは天然の多糖類であり、他の多糖類と同様、一定範囲の分子量を有する分子の集合体である。このため、その重量平均分子量の測定は、多糖類の分子量測定の通常の方法、例えば、ゲルろ過、光散乱、立体排除クロマトグラフィー、極限粘度、沈降平衡などの方法を用いて行うことができる。本発明のＮ−アセチルヘパロサンの重量平均分子量は、後述する高速液体クロマトグラフィーを用いたゲルろ過クロマトグラフィー法で測定を行った場合、３５、０００〜４５，０００の範囲を示す。
【００１１】
以下、本明細書中において、重量平均分子量（Ｍｗ）は、特に、高速液体クロマトグラフィーを用いたゲルろ過クロマトグラフィー法を用いて測定を行った場合の分子量（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ．，　１１１７，　６０−７０，　１９９２）を表す。
また、後述する多角度光散乱法で測定した場合、重量平均分子量の範囲は、５０，０００〜７０，０００である。
【００１２】
本発明のＮ−アセチルヘパロサンの分子量分散度を示す方法としては、ゲルろ過クロマトグラフィー法による重量平均分子量（Ｍｗ）を同様の方法で測定した数平均分子量（Ｍｎ）で割る（重量平均分子量／数平均分子量；Ｍｗ／Ｍｎ）方法、積分値を用いる方法などが挙げられる。
【００１３】
本発明のＮ−アセチルヘパロサンの分子量分散度は、重量平均分子量／数平均分子量で計算した場合、１．１〜１．９である。
尚、数平均分子量はゲルろ過クロマトグラフィ法による重量平均分子量の測定と同様の方法を用いて行い、得られた数値をデータ解析ソフトウェア　にて解析を行うことにより得られる。
【００１４】
（２）Ｎ−アセチルヘパロサン画分
本発明のＮ−アセチルヘパロサン画分は、（１）に記載した特定の平均分子量および特定の分子量分散度を示す本発明のＮ−アセチルヘパロサンを含む高純度かつ均一な調製物であり、核酸含量は０．１％以下、かつ、遊離アミン含量は０．０３μＭ／ｍｇ以下である調製物である。
【００１５】
核酸含量の測定は、紫外および可視部の分光光度測定法やエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）比色定量法などを用いて行うことができるが、ＥｔＢｒ比色定量法を用いた測定法によることが好ましい。遊離アミンの定量はＹｏｓｈｉｚａｗａらに報告された２，４，６−ＴＮＢＳ方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ．（１９６７）１４１，　３５８−３６５）を用いて測定することができる。
【００１６】
（３）Ｎ−アセチルヘパロサン画分の製造法
本発明の特定の物性を有するＮ−アセチルヘパロサン画分は、下記段階Ａ〜Ｅによって製造することができる。
（段階Ａ）大腸菌の培養
Ｎ−アセチルヘパロサン画分を調製するには、例えばＮ−アセチルヘパロサン生産能を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）を培養し、培養物から精製する方法によることができる。本発明で用いるＮ−アセチルヘパロサン生産能を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）は特に限定されるものではないが、例えば、Ｋ５菌株もしくは該菌株と実質的に同一の性質を有する菌株などが挙げられ、Ｋ５菌株としては、当業者が容易に入手可能な標準菌株を使用することができる。
【００１７】
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ．　ＳＥＢＲ３２８２株（ＣＮＣＭ　Ｎｏ．Ｉ−１０１３）、Ｂｉ６２６−４２株；０１２：Ｋ５（Ｌ）：ＮＭ）（ＡＴＣＣ　（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）Ｎｏ．２３５０８）、Ｏ１０：Ｋ５（Ｌ）：Ｈ４（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．　２３５０６）などが挙げられ、Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｏ１０：Ｋ５（Ｌ）：Ｈ４（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．２３５０６）を用いることが特に好ましい。
【００１８】
また、培養に用いる培地は、大腸菌の培養に適した炭素源、窒素源、その他消泡剤等を含むものであればよく、特にグリセリンに富んだ培地を使用することが好ましい。
【００１９】
大腸菌の培養条件は培養液中にＮ−アセチルヘパロサンが蓄積される条件であれば特に限定されないが、通常、１５〜４０℃で１５〜２４時間、好ましくは３７℃、１５時間の条件が挙げられる。
【００２０】
（段階Ｂ）熱処理および固液分離
段階Ａで得られた培養液をそのまま熱処理し、次いで固液分離を行う。この熱処理は、Ｎ−アセチルヘパロサンが分解せず、収率向上に寄与する方法および温度条件で行う限り限定されないが、通常、８０〜２００℃の温度条件で加熱すればよく、例えば、オートクレーブで行うことがで出来る。オートクレーブで熱処理する場合、熱処理条件は、９０−１２１℃で５−３０分間が好ましく、１２１℃で５−２０分間がより好ましい。この熱処理によって培養液からより多くのＮ−アセチルヘパロサン画分を精製することが可能となる。
【００２１】
熱処理後、通常は常温となるまで冷却または放冷し、固液分離処理を行う。固液分離は菌体等の固形物を除去できる方法であれば限定されず、遠心分離によっても良いし、適当なろ過助剤を用いたろ過に依っても良い。
【００２２】
（段階Ｃ）膜処理
培養液に含まれる不必要なアミノ酸や塩類などの低分子成分を除去するため、膜処理を行う。本発明においては、膜処理はＮ−アセチルヘパロサン画分と培養液中の低分子成分を分離できる膜および処理方法を用いて行えばよく、例えば、限外ろ過により行うことができ、分子量１００００カットの膜を用いた限外ろ過が好ましい。場合によっては市販のセルロース製等の透析チューブによる透析によっても同様の効果を得られる。
【００２３】
（段階Ｄ）アルカリ処理
Ｎ−アセチルヘパロサン生産能を有する大腸菌の培養液等に段階Ａ〜Ｃの処理を施した粗精製のＮ−アセチルヘパロサン画分を含む溶液などのＮ−アセチルヘパロサンと微生物由来成分を含有する溶液をアルカリ溶液に接触させる。この処理によりＮ−アセチルヘパロサン画分の純度が格段に上昇する。
【００２４】
アルカリ溶液は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウムなどが挙げられ、これらをＮ−アセチルヘパロサン画分を含む溶液に添加することにより溶液のｐＨを１３以上にする。この中でも、水酸化ナトリウム溶液を用いることが特に好ましい。
【００２５】
アルカリ溶液の濃度は終濃度０．１Ｎ以上が好ましく、０．５Ｎがより好ましい。又、アルカリ処理する際に４０℃になるように加熱しかつ、十分に撹拌されることが好ましい。又、ｐＨ１３以上の強塩基性条件下ではβエルミネーション反応によってＮ−アセチルヘパロサン構造が破壊されるおそれがあるため、反応時間は１時間以下とすることが好ましい。１時間以上の反応を行っても得られるＮ−アセチルヘパロサン画分の純度に変化はないが、収率が低下する恐れがある。
【００２６】
このように処理されたＮ−アセチルヘパロサン画分を含む溶液は速やかに塩酸などの酸溶液で中和する。ここで、難溶解性の不純物が生じる場合には、ろ過、遠心等の固液分離手段によって不純物の除去を行うか、もしくはラジオライト（昭和化学工業（株））などの珪藻土をろ過助剤とする加圧または減圧ろ過を実施する。
【００２７】
（段階Ｅ）エタノール分画
上記段階Ｄで得られた溶液について、アルコール分画を行いタンパク質、核酸等の不純物を除去する。アルコール分画は、多糖類の分画法として公知の方法、すなわち、一定濃度の塩を添加溶解した後、その塩を含む溶液を撹拌しつつアルコールを徐々に添加することによって行われる。
【００２８】
この際添加する塩は有機酸塩であれば特に限定されないが、とりわけ酢酸ナトリウムが好ましい。特に、酢酸ナトリウムの場合、溶液の終濃度が５〜１５％（重量／容量％）となるように添加することが好ましい。これよりも低い塩濃度では不純物の除去程度が低下する傾向にある。
【００２９】
又、使用するアルコールはエタノール、メタノール、イソアミルアルコールなどが挙げられるが、特にエタノールが好ましい。さらに、エタノールを用いる場合、溶液の終濃度が３０〜５０％（容量／容量％）となるように添加することが好ましく、３０％が更に好ましい。これ以上のエタノールを添加すると、回収量は多くなるが分子量分散度並びに蛋白質含有量、核酸含有量が高くなる傾向にある。
エタノール分画後、遠心分離等の固液分離手段により上清と沈殿部分を分離し、沈殿部分を適当量の水に溶解して脱塩を行う。
【００３０】
大量処理に適した脱塩方法としては、適当な濃度のアルコールでの分画、すなわち終濃６０％−８０％になるように前述の沈殿溶解液にアルコールを添加し、遠心分離して上清を除去する工程を繰り返す方法が挙げられる。通常この操作を２〜３回繰り返すことにより、十分な脱塩効果が得られる。
しかしながら最終精製品の用途に応じて透析、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィーなどの方法適宜組み合わせて脱塩を行うこともできる。
【００３１】
尚、上述の個々の工程は上述の順序で行うことがもっとも好ましいが、目的に応じて順序を入れ替えることも可能である。
【００３２】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
＜大腸菌Ｋ５菌株の培養＞
菌株は、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｓｅｒｏｔｙｐｅ　０１０：Ｋ５（Ｌ）：Ｈ４（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．２３５０６）を用い、下記の条件にて培養を行った。
【００３３】
カザミノ酸２％、酵母エキス０．５％、グルコース０．２％、アデカノールＬＧ−１０９（商品名；旭電化工業（株））１００ｐｐｍになるように水道水３Ｌに溶解し１２１℃、２０分間、１．２気圧の滅菌を行い、培地を調製した。この培地に２０％グリセロール保存菌液を１ｍｌ植え付け通気量１ｖｖｍ　、撹拌速度５００ｒｐｍ、３７℃で１５時間培養した。
【００３４】
＜熱処理工程＞
１５時間培養後、培養液を１２１℃、１５分、１．２気圧でオートクレーブし、常温になるまで自然放冷させ、１００００×ｇ、４℃で３５分間遠心分離し、熱処理培養上清約２．７Ｌを得た。
【００３５】
＜限外ろ過工程＞
熱処理培養上清を分画分子量１００００のスパイラルフィルターカートリッジ（日本ミリポア（株））に通液して限外ろ過し、更に上清の１０倍容の水を追加しながら限外ろ過を継続し、熱処理培養上清の濃縮並びに低分子画分の除去を行った。
【００３６】
＜アルカリ処理工程＞
培養上清６ロット分（約１６Ｌ）を前記工程で処理して約９００ｍＬに濃縮したものに３９分の１容量の２０Ｎ　水酸化ナトリウム水溶液を加え、４０℃に保温しつつ撹拌を続けた。１時間後濃塩酸で中和し、不溶性の不純物をラジオライト＃５００（昭和化学工業（株））を用いてろ過してろ液を回収した。
【００３７】
＜エタノール分画工程＞
ろ液に終濃度１５％となるように酢酸ナトリウム（特級；和光純薬工業（株））を溶解した。この溶液を撹拌しつつ、終濃度３０％になるようにエタノール（特級；和光純薬工業（株））を少量ずつ滴下し、Ｎ−アセチルヘパロサン画分の沈殿を得た。
滴下終了後から更に５分間撹拌した後、５０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清をデカンテーションによって分離し、沈殿を得た。
【００３８】
＜脱塩工程＞
沈殿を少量の水に溶解し、終濃度６０％になるようにエタノールを撹拌しながら加えた。更に５分間撹拌した後、５０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清をデカンテーションによって分離し、Ｎ−アセチルヘパロサン画分の沈殿を得た。この作業を更にもう一回繰り返した。
【００３９】
更に終濃度８０％になるようにエタノールを撹拌しながら加えた。更に５分間撹拌した後、５０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清をデカンテーションによって分離し沈殿を得た。
沈殿を適当量の水に溶解し、凍結乾燥に付し、４ｇのＮ−アセチルヘパロサン画分凍結乾燥品を得た。
【００４０】
［実施例２］
〈更に高純度のＮ−アセチルヘパロサン画分を得るための工程〉
痕跡量混入しているおそれのある金属イオン等の遊離イオンを除去するため、実施例１で得たＮ−アセチルヘパロサン画分凍結乾燥品を以下の工程によって更に精製した。
【００４１】
すなわち、陽イオン交換樹脂ダイヤイオンＰＫ２２０および陰イオン交換樹脂ダイヤイオンＳＡ−１２Ａ（いずれも三菱化学（株））各３０ｍｌをそれぞれ２Ｎ塩酸および２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で再生し、十分量の純水で洗浄した。
【００４２】
次いで、実施例１で得たＮ−アセチルヘパロサン画分凍結乾燥標品を１％になるように純水で溶解し、上記の陰イオン交換樹脂および陽イオン交換樹脂のカラムに、この順に連続して流速１０ｍｌ／ｍｉｎで通液し、通過後の溶液を速やかに水酸化ナトリウム水溶液で中和し、０．２２μｍのフィルターでろ過し、凍結乾燥した。高純度Ｎ−アセチルヘパロサン画分の回収率は９６％であった。
【００４３】
［実施例３］
〈Ｎ−アセチルヘパロサンの物性試験〉
実施例２で得られた高純度のＮ−アセチルヘパロサン画分及び該画分中に含まれるＮ−アセチルヘパロサンの物性を以下の方法で測定した。
【００４４】
（ゲルろ過クロマトグラフィーによる重量平均分子量および数平均分子量の測定）
ゲルろ過クロマトグラフィーによる重量平均分子量の測定は、Ａｒａｉらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　１１１７，　６０−７０，　１９９２）に準拠して測定した。分子量が既知のコンドロイチン硫酸ナトリウム（重量平均分子量３９１００、１８０００、８０５０；いずれも生化学工業（株））およびヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量１０４０００；生化学工業（株））を標準品として高速液体クロマトグラフィーを用いたゲルろ過クロマトグラフィーでの溶出時間により重量平均分子量を決定した。
【００４５】
カラムは、ＴＳＫ　ｇｅｌ　Ｇ４０００ＰＷＸＬ、Ｇ３０００ＰＷＸＬおよびＧ２５００ＰＷＸＬ（各φ７．８×３００ｍｍ、東ソー（株））を連結したものを用いた。溶媒は０．２ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液を用い、流速は０．６ｍｌ／分とし、検出器は示差屈折率検出器（ＲＩ−８０２０、東ソー（株））を用いた。その結果得られたクロマトグラフィーのパターンを図１に示す。得られた数値をデータ解析ソフトウェア　（ＧＰＣ−８０２０　東ソー（株））で解析した結果、ゲルろ過クロマトグラフィー法によって測定した重量平均分子量（Ｍｗ）は４４，７１０、また、数平均分子量（Ｍｎ）は３６，７１４であった。
【００４６】
（分子量分散度の計算）
図１の結果をもとにデータ解析ソフトウェア　（ＧＰＣ−８０２０；東ソー（株））で解析した結果、分子量分散度（重量平均分子量／数平均分子量（Ｍｗ／Ｍｎ））は１．２１２であった。
【００４７】
（多角度光散乱による重量平均分子量測定）
多角度光散乱法による分子量は、検出器に示差屈折率検出器（Ｓｈｏｄｅｘ　ＲＩ−７１、昭和電工（株））及び多角度光散乱検出器（ＷｙａｔｔＤＤＡＷＮ　ＥＯＳ；Ｗｙａｔｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用し、ＡＳＴＲＡソフトウエア（Ｗｙａｔｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のジムプロットモジュールを用いて解析を行い決定した。
【００４８】
カラムはＳＢ−８０６ＨＱ（φ８×３００ｍｍ；昭和電工（株））２本を連結し、溶媒は０．２ｍｏｌ／Ｌ硝酸ナトリウム溶液を用いて、流速は０．６ｍｌ／分とした。データ取り込み間隔は１秒間に二回とした。
【００４９】
光散乱検出器の測定電圧値（ＬＳ）は
（ＬＳ）＝（ｄｎ／ｄｃ）２　　Ｘ　　濃度　Ｘ　重量平均分子量　Ｘ　ＫＬＳ
→重量平均分子量＝（ＬＳ）　／　｛（ｄｎ／ｄｃ）２　　Ｘ　　濃度　Ｘ　ＫＬＳ｝
ｄｎ／ｄｃ＝試料１ｇあたりの屈折率増加分（ｍｇｌ／ｇ）
ＫＬＳ＝装置定数（トルエンにより校正）
【００５０】
濃度は示差屈折率検出器の測定電圧値（ＲＩ）より以下の式により求めた。
（ＲＩ）＝　（ｄｎ／ｄｃ）　　Ｘ　濃度　Ｘ　ＫＲＩ
→濃度＝　（ＲＩ）　／　｛（ｄｎ／ｄｃ）　　Ｘ　ＫＲＩ｝
ここでＫＲＩは示差屈折率検出器の装置定数でプルランにより校正した。
【００５１】
Ｎ−アセチルヘパロサンのｄｎ／ｄｃはヒアルロン酸により求められた定数０．１５９ｍｌ／ｇを用いて計算した。
その結果、多角度光散乱法によって測定したＮ−アセチルヘパロサンの重量平均分子量は約６３０００であった。
【００５２】
（核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルによる構造解析）
Ｎ−アセチルヘパロサンのプロトンおよび１３Ｃ炭素ＮＭＲスペクトルの結果を図２および図３に示す。これらの結果は実施例２で得られた高純度Ｎ−アセチルヘパロサン画分に含まれるＮ−アセチルヘパロサンがＮ−アセチルヘパロサン構造を有することを強く指示するものであった。
【００５３】
（セルロースアセテート膜電気泳動）
セルロースアセテート膜電気泳動をＨａｔａらの方法（Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　４５，４６２−４６８　（１９７２）　）に準じて行い、Ｎ−アセチルヘパロサンの純度を確認した。
【００５４】
すなわち、セルロースアセテート膜（富士写真フィルム（株））に実施例２で得られたＮ−アセチルヘパロサン画分１０ｍｇ／ｍｌ水溶液１μＬを１ｃｍの長さの線上に塗布し、０．１Ｍピリジン−蟻酸水溶液（ｐＨ３）を泳動用緩衝液として電流０．５ｍＡ／ｃｍで３０分間泳動した。泳動後、セルロースアセテート膜を２％酢酸を含む０．５％アルシアンブルー水溶液で１５分間染色し、２％酢酸で脱色した。
このようにして得られたＮ−アセチルヘパロサンのバンドの位置はヒアルロン酸（生化学工業（株））の泳動位置とほぼ同一かつ単一バンドであった。
【００５５】
（カルバゾール定量）
Ｄ−グルクロノラクトン　２０μｇ／ｍｌ水溶液を標準品として使用し、カルバゾール硫酸法（Ｂｉｔｔｅｒ−Ｍｕｉｒ法，Ｔ．　Ｂｉｔｔｅｒ，　Ｈ．　Ｍｕｉｒ，　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ，　４，　３３０−３３４　（１９６２））でウロン酸含量を測定した。Ｎ−アセチルヘパロサンの呈色値は同量のヒアルロン酸の呈色値を１００％としたとき８９．５％であった。
【００５６】
（核酸）
ＥｔＢｒ比色定量法によって実施例２のＮ−アセチルヘパロサン画分の核酸含量を測定したところ、０．０９％であった。
【００５７】
（タンパク質定量）
ウシ血清アルブミンを標準物としたＬｏｗｒｙ法（Ｌｏｗｒｙ　Ｊ．ら，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　１９３，　２６５−２７５，　（１９５１））によって実施例２のＮ−アセチルヘパロサン画分中のタンパク質の含量を測定したところ、２．３８％であった。
【００５８】
（遊離アミンの定量）
遊離アミンの定量はＹｏｓｈｉｚａｗａらにより報告された２，４，６−ＴＮＢＳ法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ．　（１９６７）１４１，　３５８−３６５　）により行った。標準品としてＮ−アセチルＤ−グルコサミンを用いた。実施例２のＮ−アセチルヘパロサン画分中に含まれる遊離アミンのモル数は０．０２６μＭ／ｍｇであった。
【００５９】
［実施例４］
〈熱処理を行った場合と行わなかった場合の培養上清中に含まれるＮ−アセチルヘパロサン量〉
熱処理を行った場合と行わなかった場合の培養上清中に含まれるＮ−アセチルヘパロサン量を比色定量法により比較した。
【００６０】
すなわち培養液を４等分し、１２１℃　５分、９０℃　３０分、８０℃　３０分の熱処理を行ったもの、および熱処理をしなかったものを同様に遠心分離して培養上清を得た。これら培養上清中のヘパロサン量をＨｏｍｅｒ　Ｋ．　Ａ．　ら（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２１４，４３５−４４１　１９９３）の方法に準じて比色定量した。標準品は実施例２の高純度Ｎ−アセチルヘパロサン画分を用いた。
結果を以下の表１に示す。
【００６１】
【表１】
2004018840.tif 000002
【００６２】
熱処理、特に１２１℃　５分間の熱処理を行った場合において、多くのＮ−アセチルヘパロサン画分を培養上清中に回収できることが確認された。該上清中に含まれるＮ−アセチルヘパロサン量は熱処理しない場合の約１．７倍であった。
【００６３】
［実施例５］
〈アルカリ処理を行った場合と行わなかった場合におけるＮ−アセチルヘパロサンの分子量分散度の比較〉
アルカリ処理を行った場合と行わなかった場合におけるＮ−アセチルヘパロサンの分子量分散度の比較は以下の様におこなった。すなわち、大腸菌Ｋ５菌株を実施例１に準じて培養し、その培養液を１２１℃　５分間熱処理した後、遠心分離し熱処理培養上清を得、次いで分子量１万カットの膜を用いた限外ろ過に供し、低分子画分を除去した。この溶液を２等分し、片方には最終濃度０．５Ｎになるように２０Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、４０℃で一時間攪拌した。１時間後室温に冷却し塩酸で中和した。
【００６４】
次に、培養液量に対し１５％重量の酢酸ナトリウム（和光純薬（株））を溶解した後４等分し、それぞれに終濃度３０％、４０％、５０％、６０％になるようにエタノールを攪拌しながら添加し、Ｎ−アセチルヘパロサン画分を沈殿せしめた（表２中、２−Ａ、２−Ｂ、２−Ｃ、２−Ｄに対応）。
【００６５】
また、２等分したもう一方についてはアルカリ処理は行わず、上記と同様に培養液量に対し１５％重量の酢酸ナトリウムを溶解し、同様の操作を行い、Ｎ−アセチルヘパロサン画分を沈殿せしめた（表２中、１−Ａ、１−Ｂ、１−Ｃ、１−Ｄに対応）。
【００６６】
沈殿物を回収し適当量の水に溶解し、上述の分子量分布を求める際と同条件で高速液体クロマトグラフィーにより分子量分布を調べた。結果を図４に示す。
尚、それぞれのサンプルの名称は表２の通りである。
【００６７】
【表２】
2004018840.tif 000003
【００６８】
０．５Ｎの水酸化ナトリウムに培養液を接触させるいわゆる、アルカリ処理を実施した後、１５％重量／容量の酢酸ナトリウムで中和し、終濃度３０％のエタノールを添加して回収した沈殿物（２−Ａ）は、単分散の示差屈折率を与えた。
【００６９】
２−Ａをへパリナーゼ（生化学工業（株））で分解し、同様に液体クロマトグラフィー（ＴＳＬｇｅｌ　Ｇ４０００ＰＷＸＬ、Ｇ３０００ＰＷＸＬおよびＧ２５００ＰＷＸＬ（各φ７．８×３００ｍｍ、東ソー（株））を連結したもの）で分析したところ約２７分から３３分にかけてのピークが消失したことから２−Ａの本態はヘパリン骨格を有する物質であることが証明された。
【００７０】
［実施例６］
〈アルカリ処理条件ならびに分画条件によるＮ−アセチルヘパロサンの分子量分散度の変化〉
アルカリ処理条件ならびに分画条件によるＮ−アセチルヘパロサンの分子量分散度を比較するために以下の実験を行った。
【００７１】
実施例１に準じて得た大腸菌Ｋ５菌株の培養液を１２１℃　５分間熱処理した後、遠心分離し培養上清を得た。この培養上清を実施例１に準じて分子量１万カットの限外ろ過に供し、低分子画分を除去した。この溶液を３画分に分け、うち２画分には最終濃度０．５Ｎ、０．１Ｎになるように２０Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、残り１画分には何も添加せずに４０℃で一時間攪拌した。
【００７２】
１時間後室温に冷却し、水酸化ナトリウムを添加した画分については塩酸で中和した。各画分をさらに２つに分割し、０．４％（重量／容量）の塩化ナトリウム（和光純薬工業（株））あるいは１５％（重量／容量）の酢酸ナトリウム（和光純薬工業（株））を溶解した。
【００７３】
０．４％（重量／容量）の塩化ナトリウムを添加した場合には３０％、４０％、５０％、６６％、１５％（重量／容量）の酢酸ナトリウムを添加した場合には２０％、３０％、４０％、５０％の終濃度になるようにエタノールを攪拌しながら添加し、Ｎ−アセチルヘパロサン画分を沈殿させた。
【００７４】
沈殿物を遠心分離にて回収し、適当量の水に溶解して高速液体クロマトグラフィー分析（上述の分子量分布を求める際と同条件）により、Ｎ−アセチルヘパロサン画分に含まれるＮ−アセチルヘパロサンの分子量分散度を求めた。コントロールとしてエタノールを添加しない検体を同様に分析した。結果を表３に示す。
【００７５】
【表３】
2004018840.tif 000004
【００７６】
表中、ＮａＯＨは水酸化ナトリウムを、ＮａＣｌは塩化ナトリウムを、ＡｃＯＮａは酢酸ナトリウムを、ＥｔＯＨはエタノールをそれぞれ示す。
【００７７】
アルカリを添加する工程を実施しなければ、いずれの塩あるいはエタノール濃度でも分子量分散度は５以上となった。
表３中で分子量分散度が２以下となるのは０．１Ｎあるいは０．５Ｎのアルカリ処理工程を実施したもので、かつ１５％（重量／容量）の酢酸ナトリウムを添加し終濃度３０〜５０％エタノールで分画した場合である。
【００７８】
特開平５−２７１３０５（先行技術）で開示されているＮ−アセチルヘパロサンの製造法は本発明と同じくアルカリ処理工程とエタノールにより分画する工程を含むが、アルカリ処理工程は終濃度０．１Ｎの水酸化ナトリウムを添加するものであり、エタノール分画によりＮ−アセチルヘパロサンを回収する工程は０．４％（重量／容量）の塩化ナトリウムを添加し、終濃度６６％のエタノールを添加する条件である。
【００７９】
表３に示されるごとく、前記先行技術の条件で得られるＮ−アセチルヘパロサンの分子量分散度は２．１０３であり、本発明の１５％（重量／容量）酢酸ナトリウムを添加してＮ−アセチルヘパロサン画分を回収せしめる工程では終濃度３０〜５０％の少量の添加エタノールによって、画分中のＮ−アセチルヘパロサンの分子量分散度２以下を達成できるのに対し、塩化ナトリウムを添加塩とする場合には他のエタノール濃度、あるいは０．５Ｎアルカリ処理工程を実施することによっても分子量分散度２以下を達成することはできなかった。
【００８０】
［実施例７］
〈酢酸ナトリウム添加量とＮ−アセチルヘパロサンの分子量分散度の比較〉
実施例５と同様の実験を、酢酸ナトリウム添加量を変化させて行った。
実施例５と同様にして培養上清をアルカリ処理後中和し、Ｎ−アセチルヘパロサン画分を得た。各画分をさらに３つにわけ５，１０，１５％（重量／容量）の酢酸ナトリウム（和光純薬工業（株））を溶解した。続けて３０％，４０％，５０％の終濃度になるようにエタノールを攪拌しながら添加し、Ｎ−アセチルヘパロサン画分を沈殿させた。
【００８１】
沈殿物を遠心分離にて回収し、適当量の水に溶解して高速液体クロマトグラフィー分析（上述の分子量分布を求める際と同条件）により、Ｎ−アセチルヘパロサン画分に含まれるＮ−アセチルヘパロサンの分子量分散度を求めた。結果を表４に示す。
【００８２】
【表４】
2004018840.tif 000005
【００８３】
終濃度０．５Ｎのアルカリ処理を実施した場合においては１５％（重量／容量）酢酸ナトリウム添加でかつ終濃度３０〜５０％エタノール添加する条件においてはもちろんのこと、１０％あるいは５％（重量／容量）酢酸ナトリウム添加によっても終濃度３０〜５０％エタノール添加によって分子量分散度２以下のＮ−アセチルヘパロサン含む画分を回収できることが示された。
【００８４】
【発明の効果】
本発明により、従来の煩雑な手法を簡略化でき、コストを引き下げ、回収量を増大し、分子量分散度が低いＮ−アセチルヘパロサンおよび該Ｎ−アセチルヘパロサンを高純度に含むＮ−アセチルヘパロサン画分を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例３によるＮ−アセチルヘパロサンの高速液体クロマトグラフィーによる分子量分布を示す図である。
【図２】Ｎ−アセチルヘパロサンのプロトン１３Ｃ−ＮＭＲを示す図である。
【図３】Ｎ−アセチルヘパロサンの１３Ｃ−ＮＭＲを示す図である。
【図４】実施例５によるＮ−アセチルヘパロサンの高速液体クロマトグラフィーによる分子量分布を示す図である。
【図１】
2004018840.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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