(57)【要約】【課題】  ウイルス癌遺伝子であるｖ−Ｈ−ＲＡＳをもとに作製されているＲＡＳ遺伝子抑制変異体Ｎ１１６Ｙの、突然変異による癌遺伝子としての作用の再獲得の危険性を回避し、臨床に用いることが可能なより安全な癌治療遺伝子を提供すること。【解決手段】  Ｎ１１６Ｙ遺伝子配列のうち、細胞を癌化させるために必須なＮ１１６Ｙ遺伝子の１６６番目のコドンよりＣ末端の７２塩基を欠失させることにより、癌の増殖を抑える効果を保ち、かつ安全性が極めて高い遺伝子であるカルボキシル基末端欠失型ＲＡＳ遺伝子抑制変異体Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２遺伝子を構築する。Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２遺伝子の発現産物であるＲＡＳ抑制変異型タンパク質Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２は、細胞膜への付着能を欠失し、かつ、ＲＡＳ抑制能を保持している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＡＳ抑制変異体タンパク質のカルボキシル基末端側変異型のタンパク質であって、細胞膜への付着能を欠失し、かつ、ＲＡＳ抑制能を保持していることを特徴とするＲＡＳ抑制変異型タンパク質。
【請求項２】
ＲＡＳ抑制変異体タンパク質が、ＲＡＳ癌遺伝子によってコードされるタンパク質のグアニン・ヌクレオチド結合部位をコードする部位（塩基）の変異を有することを特徴とする請求項１記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質。
【請求項３】
ＲＡＳ抑制変異体タンパク質が、ＲＡＳ抑制変異体Ｎ１１６Ｙ、ＲＡＳ抑制変異体Ｎ１１６Ｉ、ＲＡＳ抑制変異体Ｓ１７Ｎ、ＲＡＳ抑制変異体Ｄ１１９Ｎ又はＲＡＳ抑制変異体Ｄ５７Ｙであることを特徴とする請求項１記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質。
【請求項４】
カルボキシル基末端側変異型のタンパク質が、ＲＡＳ抑制変異体タンパク質の１６６コドン以降のカルボキシル基末端側変異型のタンパク質であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質。
【請求項５】
カルボキシル基末端側変異型のタンパク質が、カルボキシル基末端の４個のコドンを含むカルボキシル基末端側のコドンの１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加による変異を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質。
【請求項６】
カルボキシル基末端側変異型のタンパク質が、カルボキシル基末端の５〜２４個のアミノ酸の欠失したカルボキシル基末端側変異型のタンパク質であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質。
【請求項７】
カルボキシル基末端の５〜２４個のアミノ酸の欠失したカルボキシル基末端側変異型のタンパク質が、カルボキシル基末端の２４個のアミノ酸を欠失していることを特徴とする請求項６記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質をコードすることを特徴とするＲＡＳ抑制変異型タンパク質遺伝子。
【請求項９】
配列番号５に示される塩基配列からなることを特徴とするＲＡＳ抑制変異型タンパク質遺伝子。
【請求項１０】
配列番号５に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＲＡＳ抑制活性を有するタンパク質をコードするＲＡＳ抑制変異型タンパク質遺伝子。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質遺伝子が動物細胞用ベクターにインテグレイトされていることを特徴とする動物細胞用発現ベクター。
【請求項１２】
動物細胞用ベクターがアデノウイルスベクターであることを特徴とする請求項１１記載の動物細胞用発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質を有効成分とすることを特徴とする活性型ＲＡＳタンパク質に起因する疾病の予防・治療薬。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質を有効成分とすることを特徴とする癌（悪性腫瘍）の予防・治療薬。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質を有効成分とすることを特徴とする良性腫瘍の予防・治療薬。
【請求項１６】
請求項１〜７のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質を有効成分とすることを特徴とする前癌性病変の予防・治療薬。
【請求項１７】
請求項１〜７のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質を有効成分とすることを特徴とする血管疾患などの細胞増殖に基づく疾患の予防・治療薬。
【請求項１８】
請求項１〜７のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質を有効成分とすることを特徴とする難治性炎症性疾患の予防・治療薬。
【請求項１９】
請求項８〜１０のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質遺伝子又は請求項１１若しくは１２記載の動物細胞用発現ベクターを有効成分とすることを特徴とする活性型ＲＡＳタンパク質に起因する疾病の予防・治療薬。
【請求項２０】
請求項８〜１０のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質遺伝子又は請求項１１若しくは１２記載の動物細胞用発現ベクターを有効成分とすることを特徴とする癌（悪性腫瘍）の予防・治療薬。
【請求項２１】
請求項８〜１０のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質遺伝子又は請求項１１若しくは１２記載の動物細胞用発現ベクターを有効成分とすることを特徴とする良性腫瘍の予防・治療薬。
【請求項２２】
請求項８〜１０のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質遺伝子又は請求項１１若しくは１２記載の動物細胞用発現ベクターを有効成分とすることを特徴とする前癌性病変の予防・治療薬。
【請求項２３】
請求項８〜１０のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質遺伝子又は請求項１１若しくは１２記載の動物細胞用発現ベクターを有効成分とすることを特徴とする血管疾患などの細胞増殖に基づく疾患の予防・治療薬。
【請求項２４】
請求項８〜１０のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質遺伝子又は請求項１１若しくは１２記載の動物細胞用発現ベクターを有効成分とすることを特徴とする難治性炎症性疾患の予防・治療薬。
【請求項２５】
請求項１３又は１９記載の活性型ＲＡＳタンパク質に起因する疾病の予防・治療薬を投与することを特徴とする活性型ＲＡＳタンパク質に起因する疾病の予防・治療方法。
【請求項２６】
請求項１４又は２０記載の癌（悪性腫瘍）の予防・治療薬を直接病変部位に投与することを特徴とする癌（悪性腫瘍）の予防・治療方法。
【請求項２７】
請求項１５又は２１記載の良性腫瘍の予防・治療薬を直接病変部位に投与することを特徴とする良性腫瘍の予防・治療方法。
【請求項２８】
請求項１６又は２２記載の前癌性病変の予防・治療薬を直接病変部位に投与することを特徴とする癌の予防・治療方法。
【請求項２９】
請求項１７又は２３記載の血管疾患などの細胞増殖に基づく疾患の予防・治療薬を直接病変部位に投与することを特徴とする血管疾患などの細胞増殖に基づく疾患の予防・治療方法。
【請求項３０】
請求項１８又は２４記載の難治性炎症性疾患の予防・治療薬を直接病変部位に投与することを特徴とする難治性炎症性疾患の予防・治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞膜への付着能を欠失し、かつ、ＲＡＳ抑制能を保持しているＲＡＳ抑制変異型タンパク質や、かかるＲＡＳ抑制変異型タンパク質をコードする遺伝子や、それらを有効成分とする癌や血管疾病の予防・治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＡＳ遺伝子はヒトの癌において、最も高頻度に異常が認められる癌遺伝子であり、ヒトの発癌原因の一つとして、しばしばＲＡＳ遺伝子の異常が報告されている。ＲＡＳ遺伝子は、齧歯類のウイルス癌遺伝子（ｖ−ＲＡＳ）としてクローニングされ、その後哺乳類一般に同様の遺伝子が存在することが見い出された（例えば、非特許文献１参照。）。ヒトにおいて対応する遺伝子として、ｃ−Ｈ−ＲＡＳ、ｃ−Ｋ−ＲＡＳ、Ｎ−ＲＡＳの３種類のファミリーが見いだされ、それぞれヒトの第１１染色体、第１２染色体、第１染色体に存在していることが知られている（例えば、非特許文献２参照。）。ＲＡＳ遺伝子は分子量２１ｋＤａのＧＴＰ結合タンパク質をコードしており、いずれも成長因子の受容体を介してＧＤＰ結合型からＧＴＰ結合型へと活性化され、ＭＡＰキナーゼカスケードにシグナルを伝達して細胞の増殖や分化に関与している。
【０００３】
ＲＡＳ遺伝子はそのままでは発癌活性を持たない癌原遺伝子であり、ＲＡＳ遺伝子が変異することにより発癌活性を獲得することが知られている（例えば、非特許文献３参照。）。これまでにも数多くのヒトの癌細胞においてＲＡＳ遺伝子の突然変異が報告されている（例えば、非特許文献４参照。）。Ｈ−ＲＡＳ遺伝子はヒトの膀胱癌から見いだされた遺伝子で第１１染色体短腕上に存在するＲＡＳ遺伝子ファミリーの一つである。Ｈ−ＲＡＳ遺伝子は、口腔癌においてはコドン１２、６１の点突然変異が比較的高頻度で検出されることが報告されている（例えば、非特許文献５参照。）。この点突然変異が起きるとＲＡＳ遺伝子は細胞癌化（トランスフォーム）活性を獲得する。これがＲＡＳ癌遺伝子の活性化である。また、Ｋ−ＲＡＳ遺伝子は第１２染色体短腕上に位置し、膵臓癌のほぼ１００％、大腸癌の約５０％、肺癌の約２０％でＫ−ＲＡＳ遺伝子の点突然変異による活性化が報告されており（例えば、非特許文献６参照。）、前癌状態あるいは良性腫瘍においても同じ傾向で変異が見つかっている（例えば、非特許文献７参照。）。これらのことはＫ−ＲＡＳ遺伝子の活性化変異が癌進展の初期に起こることを示唆している。Ｎ−ＲＡＳ遺伝子はヒトの神経芽細胞腫から見いだされた遺伝子でヒトの第１染色体短腕上に存在するＲＡＳ遺伝子ファミリーの一つである。Ｎ−ＲＡＳ遺伝子は、造血器腫瘍においてはコドン１２、１３、６１の点突然変異が比較的高頻度で検出されることが報告されている（例えば、非特許文献８参照。）。
【０００４】
本発明者らは、このウイルス性ＲＡＳ癌遺伝子の２塩基を改変し、すなわち、ウイルス癌遺伝子であるｖ−Ｈ−ＲＡＳにおける１１６番目のコドンをアスパラギンからチロシンに置換し、Ｎ１１６Ｙを作製し、癌遺伝子としての性格を失わせ、逆に細胞内に元からあるＲＡＳタンパク質の働きを抑えるタンパク質の産生を指令し、細胞内に元々あるＲＡＳ遺伝子ｃ−Ｈ−ＲＡＳの活性化を抑えることを確認している（例えば、非特許文献９参照。）。また、膵臓癌細胞株などＫ−ＲＡＳ遺伝子の変異を伴う癌細胞株においても、Ｎ１１６Ｙタンパク質が関わる細胞内シグナル伝達系の阻害により、これらの癌細胞が寒天培地やマウス生体内で増殖する能力を抑制することが確認されている（例えば、非特許文献１０参照。）。さらに、Ｎ１１６Ｙを組み込んだアデノウイルス・ベクターが免疫不全マウスに移植したヒトの食道癌や膵臓癌の増殖を抑えることも証明されている（例えば、非特許文献１１、１２参照。）。
【０００５】
その他、ファルネシルアミン、ゲラニルゲラニルアミンまたはそれらの誘導体の有効量を膵癌細胞に反応させることにより、膵癌由来のＫ−ＲＡＳ癌遺伝子（オンコジーン）の突然変異能を有する膵癌細胞に対して、翻訳後修飾の段階におけるＣ−末端配列でのＣｙｓ残基における、ファルネシル基あるいはゲラニルゲラニル基の導入を阻害し、活性型ＲＡＳ蛋白の癌化能を消失させることにより、膵癌細胞に対するアポトーシスを誘導させることによる膵癌治療剤が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【特許文献１】特開平１０−２１８７６４号公報
【非特許文献１】Ellis RW et al. Mol. Cell. Biol. 2: 1339-1345, 1982
【非特許文献２】Hall A et al. Nature 303: 396-400, 1983
【非特許文献３】Storer RD et al. Cancer Res. 46: 1458-1464, 1986
【非特許文献４】Minamoto T et al. Cancer Detection and Prevention 24: 1-12, 2000
【非特許文献５】Saranath D et al. Br. J. Cancer 63 573-578, 1991
【非特許文献６】Almoguera C et al. Cell 53: 549-554, 1998
【非特許文献７】Zauber NP et al. Cancer 86: 31-36, 1999
【非特許文献８】Itoyama T et al. Cancer 67: 2103-2110, 1991
【非特許文献９】Ogiso Y et al. Exp. Cell Res. 208: 415-421, 1993
【非特許文献１０】Shichinohe, T. et al. J. of Surgical Res., 66, 125-130, 1996
【非特許文献１１】Senmaru, N. et al. Int. J. Cancer, 78, 366-371, 1998
【非特許文献１２】Takeuchi, M. et al. Gene Therapy, 7, 518-525, 2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＲＡＳ抑制変異体Ｎ１１６Ｙ遺伝子は、発現することにより、癌細胞増殖を抑える強い効果を持つ。しかしながら、Ｎ１１６Ｙ遺伝子は癌遺伝子由来のため、臨床での遺伝子治療にＲＡＳ遺伝子抑制変異体Ｎ１１６Ｙを用いる治療用ウイルスベクターを作製する場合など、突然変異により癌遺伝子への変換（復帰変異）が生じる可能性がある。つまり、Ｎ１１６Ｙはウイルス癌遺伝子であるｖ−Ｈ−ＲＡＳをに対し１アミノ酸の変異を追加して作製されているため、特定部位に突然変異が生じた際、癌遺伝子としての作用を再度獲得する危険性が、極めて低い頻度ではあるが想定される。そのため、この遺伝子を臨床に用いる際にはこの危険性を排除することが必要である。すなわち本発明の課題は、このＮ１１６Ｙ等のＲＡＳ抑制変異体の突然変異の危険性を回避し、臨床に用いることが可能なより安全な癌等の治療遺伝子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、Ｎ１１６Ｙ遺伝子の突然変異の危険性を回避するため、細胞を癌化させるために必須なＮ１１６Ｙ遺伝子の１６６番目のコドンよりＣ末端（カルボキシル基末端）側の２４アミノ酸（７２塩基）を欠失させることにより、癌の増殖を抑える効果を保ち、かつ安全性が極めて高い遺伝子であるカルボキシル基末端欠失型ＲＡＳ遺伝子抑制変異体Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２を構築し、該遺伝子をアデノウイルス・ベクターに組み込み、ＲＡＳ遺伝子の発現が高まっているヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ、及び、ＲＡＳ癌遺伝子の変異を持つ膵臓癌細胞株ＰＣＩ４３に感染させ、試験管内での増殖抑制効果を観察し、Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２がこれらの両方の癌細胞に対して増殖を強く抑制することを見い出した。また、ヌードマウスに移植したヒト大腸癌細胞株ＬｏＶｏに、Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２遺伝子を挿入したプラスミドを投与した結果、明らかに腫瘍増殖を抑制することを見い出し、本発明を完成するに至った。ＲＡＳタンパク質はカルボキシル基末端のファルネシル化による修飾により細胞膜に付着して発癌性を発揮するため、ファルネシル化酵素の抑制により細胞膜への付着を阻害すると、ＲＡＳタンパク質の活性化が抑制されることが既に確認されている。つまり、活性化（変異）ＲＡＳ癌遺伝子によって作られるタンパク質が細胞を癌化するためには、Ｃ末端（カルボキシル基末端）部分（ファルネシル化部位）が必須であり（例えば、上記特許文献１参照。）、この意味において、Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２は、遺伝子変異が加わった場合においても癌遺伝子としての作用を再び獲得する可能性は限りなく低いということができる。
【０００８】
すなわち本発明は、ＲＡＳ抑制変異体タンパク質のカルボキシル基末端側変異型のタンパク質であって、細胞膜への付着能を欠失し、かつ、ＲＡＳ抑制能を保持していることを特徴とするＲＡＳ抑制変異型タンパク質（請求項１）や、ＲＡＳ抑制変異体タンパク質が、ＲＡＳ癌遺伝子によってコードされるタンパク質のグアニン・ヌクレオチド結合部位をコードする部位（塩基）の変異を有することを特徴とする請求項１記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質（請求項２）や、ＲＡＳ抑制変異体タンパク質が、ＲＡＳ抑制変異体Ｎ１１６Ｙ、ＲＡＳ抑制変異体Ｎ１１６Ｉ、ＲＡＳ抑制変異体Ｓ１７Ｎ、ＲＡＳ抑制変異体Ｄ１１９Ｎ又はＲＡＳ抑制変異体Ｄ５７Ｙであることを特徴とする請求項１記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質（請求項３）や、カルボキシル基末端側変異型のタンパク質が、ＲＡＳ抑制変異体タンパク質の１６６コドン以降のカルボキシル基末端側変異型のタンパク質であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質（請求項４）や、カルボキシル基末端側変異型のタンパク質が、カルボキシル基末端の４個のコドンを含むカルボキシル基末端側のコドンの１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加による変異を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質（請求項５）や、カルボキシル基末端側変異型のタンパク質が、カルボキシル基末端の５〜２４個のアミノ酸の欠失したカルボキシル基末端側変異型のタンパク質であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質（請求項６）や、カルボキシル基末端の５〜２４個のアミノ酸の欠失したカルボキシル基末端側変異型のタンパク質が、カルボキシル基末端の２４個のアミノ酸を欠失していることを特徴とする請求項６記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質（請求項７）に関する。
【０００９】
また本発明は、請求項１〜７のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質をコードすることを特徴とするＲＡＳ抑制変異型タンパク質遺伝子（請求項８）や、配列番号５に示される塩基配列からなることを特徴とするＲＡＳ抑制変異型タンパク質遺伝子（請求項９）や、配列番号５に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＲＡＳ抑制活性を有するタンパク質をコードするＲＡＳ抑制変異型タンパク質遺伝子（請求項１０）や、請求項８〜１０のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質遺伝子が動物細胞用ベクターにインテグレイトされていることを特徴とする動物細胞用発現ベクター（請求項１１）や、動物細胞用ベクターがアデノウイルスベクターであることを特徴とする請求項１１記載の動物細胞用発現ベクター（請求項１２）に関する。
【００１０】
さらに本発明は、請求項１〜７のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質を有効成分とすることを特徴とする活性型ＲＡＳタンパク質に起因する疾病の予防・治療薬（請求項１３）や、請求項１〜７のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質を有効成分とすることを特徴とする癌（悪性腫瘍）の予防・治療薬（請求項１４）や、請求項１〜７のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質を有効成分とすることを特徴とする良性腫瘍の予防・治療薬（請求項１５）や、請求項１〜７のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質を有効成分とすることを特徴とする前癌性病変の予防・治療薬（請求項１６）や、請求項１〜７のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質を有効成分とすることを特徴とする血管疾患などの細胞増殖に基づく疾患の予防・治療薬（請求項１７）や、請求項１〜７のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質を有効成分とすることを特徴とする難治性炎症性疾患の予防・治療薬（請求項１８）や、請求項８〜１０のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質遺伝子又は請求項１１若しくは１２記載の動物細胞用発現ベクターを有効成分とすることを特徴とする活性型ＲＡＳタンパク質に起因する疾病の予防・治療薬（請求項１９）や、請求項８〜１０のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質遺伝子又は請求項１１若しくは１２記載の動物細胞用発現ベクターを有効成分とすることを特徴とする癌（悪性腫瘍）の予防・治療薬（請求項２０）や、請求項８〜１０のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質遺伝子又は請求項１１若しくは１２記載の動物細胞用発現ベクターを有効成分とすることを特徴とする良性腫瘍の予防・治療薬（請求項２１）や、請求項８〜１０のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質遺伝子又は請求項１１若しくは１２記載の動物細胞用発現ベクターを有効成分とすることを特徴とする前癌性病変の予防・治療薬（請求項２２）や、請求項８〜１０のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質遺伝子又は請求項１１若しくは１２記載の動物細胞用発現ベクターを有効成分とすることを特徴とする血管疾患などの細胞増殖に基づく疾患の予防・治療薬（請求項２３）や、請求項８〜１０のいずれか記載のＲＡＳ抑制変異型タンパク質遺伝子又は請求項１１若しくは１２記載の動物細胞用発現ベクターを有効成分とすることを特徴とする難治性炎症性疾患の予防・治療薬（請求項２４）や、請求項１３又は１９記載の活性型ＲＡＳタンパク質に起因する疾病の予防・治療薬を投与することを特徴とする活性型ＲＡＳタンパク質に起因する疾病の予防・治療方法（請求項２５）や、請求項１４又は２０記載の癌（悪性腫瘍）の予防・治療薬を直接病変部位に投与することを特徴とする癌（悪性腫瘍）の予防・治療方法（請求項２６）や、請求項１５又は２１記載の良性腫瘍の予防・治療薬を直接病変部位に投与することを特徴とする良性腫瘍の予防・治療方法（請求項２７）や、請求項１６又は２２記載の前癌性病変の予防・治療薬を直接病変部位に投与することを特徴とする癌の予防・治療方法（請求項２８）や、請求項１７又は２３記載の血管疾患などの細胞増殖に基づく疾患の予防・治療薬を直接病変部位に投与することを特徴とする血管疾患などの細胞増殖に基づく疾患の予防・治療方法（請求項２９）や、請求項１８又は２４記載の難治性炎症性疾患の予防・治療薬を直接病変部位に投与することを特徴とする難治性炎症性疾患の予防・治療方法（請求項３０）に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＮ１１６／Ｃｄｅｌ−２は、Ｎ１１６Ｙ遺伝子の突然変異による癌遺伝子としての機能の再獲得の危険性を回避することができるため、より安全な癌治療遺伝子を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のＲＡＳ抑制変異型タンパク質とは、ＲＡＳ抑制変異体タンパク質のカルボキシル基末端側変異型のタンパク質であって、細胞膜への付着能を欠失し、かつ、ＲＡＳ抑制能を保持しているタンパク質であれば特に制限されるものではなく、上記ＲＡＳ抑制変異体タンパク質としては、ＲＡＳ抑制変異体Ｎ１１６Ｙ（ウイルス性（ｖ）−Ｈ−ＲＡＳの１１６番目のコドンをアスパラギンからチロシンに置換した変異体）、ＲＡＳ抑制変異体Ｎ１１６Ｉ（ｖ−Ｈ−ＲＡＳの１１６番目のコドンをアスパラギンからイソロイシンに置換した変異体）、ＲＡＳ抑制変異体Ｓ１７Ｎ（細胞性（ｃ）−Ｈ−ＲＡＳの１７番目のコドンをセリンからアスパラギンに置換した変異体）、ＲＡＳ抑制変異体Ｄ５７Ｙ（ｃ−Ｈ−ＲＡＳの５７番目のコドンをアスパラギン酸からチロシンに置換した変異体）、ＲＡＳ抑制変異体Ｄ１１９Ｎ（ｖ−Ｈ−ＲＡＳの１１９番目のコドンをアスパラギン酸からアスパラギンに置換した変異体）等の、ＲＡＳ癌遺伝子によってコードされるタンパク質のグアニン・ヌクレオチド結合部位やＲａｆ−１結合部位をコードする部位（塩基）の変異を有するＲＡＳ抑制変異体の他、ＲＡＳ抑制変異体Ｎ１１６Ｙ、ＲＡＳ抑制変異体Ｎ１１６Ｉ、ＲＡＳ抑制変異体Ｓ１７Ｎ、ＲＡＳ抑制変異体Ｄ５７Ｙ、ＲＡＳ抑制変異体Ｄ１１９Ｎ等のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するＮ１１６Ｙ等の変異体であって、かつＮ１１６Ｙ等と同様なドミナントネガティブ活性を有するＲＡＳ抑制変異体を挙げることができる。例えば、ＲＡＳ抑制変異体Ｎ１１６Ｙは、ドミナントネガティブな活性を有しており、そのアミノ酸配列（配列番号２）が図２に示されている。
【００１３】
上記ＲＡＳ抑制変異体タンパク質のカルボキシル基末端側変異型のタンパク質としては、上記のように、細胞膜への付着能を欠失し、かつ、ＲＡＳ抑制能を保持しているタンパク質であれば特に制限されるものでないが、ＲＡＳ抑制変異体がＮ１１６Ｙの場合など、上記ＲＡＳ抑制変異体の１６６コドン以降のカルボキシル基末端側変異型のタンパク質や、カルボキシル基末端の４個のコドンを含むカルボキシル基末端側のコドンの１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加による変異を含むカルボキシル基末端側変異型のタンパク質であることが好ましく、特に、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加による変異を含むカルボキシル基末端側変異型のタンパク質が、カルボキシル基末端の５〜２４個のアミノ酸の欠失したカルボキシル基末端側変異型のタンパク質であることが好ましく、具体的には、図２に示されるカルボキシル基末端の２４個のアミノ酸の欠失したカルボキシル基末端側変異型のタンパク質Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２（配列番号６）を特に好適に例示することができる。なお、図２に示されるＮ１１６Ｙのカルボキシル基末端の４個のアミノ酸の欠失したカルボキシル基末端側変異型のタンパク質Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−１（配列番号４）のように、ＲＡＳ抑制能を保持していないものは、本発明から除かれる。
【００１４】
本発明のＲＡＳ抑制変異型タンパク質遺伝子としては、Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２等の本発明のＲＡＳ抑制変異型タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡであれば特に制限されるものではなく、具体的には、図１に示されるＮ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２をコードする遺伝子ＤＮＡ（配列番号５）を挙げることができる。また、配列番号５に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部をプローブとして、各種アポトーシス生起細胞由来のＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行ない、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを単離することにより、本発明のＲＡＳ抑制変異型タンパク質と同効な目的とする、細胞膜への付着能を欠失しかつＲＡＳ抑制能を保持しているタンパク質をコードするＤＮＡを得ることもできる。こうして得られるＤＮＡも本発明の範囲内である。かかる本発明のＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００１５】
本発明の動物細胞用発現ベクターとしては、上記本発明のＲＡＳ抑制変異型タンパク質遺伝子が動物細胞用ベクターにインテグレイトされているものであればどのようなものでもよく、かかる動物細胞用ベクターとしては、上記本発明のＲＡＳ抑制変異型タンパク質を宿主細胞内で発現させることができる発現系であれば特に制限されず、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。これら発現系は、発現を起こさせるだけでなく、発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。また、本発明の動物細胞用発現ベクターには、リポソームも含まれる。これら動物細胞用ベクターの中でも、アデノウイルスベクターが、安全性や使用の便からして好ましい。
【００１６】
本発明の活性型ＲＡＳタンパク質に起因する疾病の予防・治療薬としては、上記本発明のＲＡＳ抑制変異型タンパク質や、上記本発明のＲＡＳ抑制変異型タンパク質遺伝子や、上記本発明の動物細胞用発現ベクターを有効成分とするものであれば特に制限されるものではなく、上記活性型ＲＡＳタンパク質に起因する疾病としては、上記本発明のＲＡＳ抑制変異型タンパク質や、上記本発明のＲＡＳ抑制変異型タンパク質遺伝子や、上記本発明の動物細胞用発現ベクターを予防・治療のために必要とする疾病であれば特に制限されないが、膵臓癌、食道癌、大腸癌、肝臓癌、腎臓癌、肺癌、膀胱癌等の各種癌（悪性腫瘍）や、神経線維腫症等の良性腫瘍、骨髄異形成症候群等の前癌性病変、動脈硬化症を初めとする血管疾患などの細胞増殖に基づく疾患や、増殖性腎疾患等の難治性炎症性疾患などを挙げることができる。
【００１７】
上記本発明の膵臓癌等の癌（悪性腫瘍）の予防・治療薬、神経線維腫症等の良性腫瘍の予防・治療薬、骨髄異形成症候群などの前癌性病変の予防・治療薬、動脈硬化症などの細胞増殖に基づく疾患の予防・治療薬、増殖性腎疾患などの難治性炎症性疾患などの活性型ＲＡＳタンパク質に起因する疾病の予防・治療薬を医薬品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。またこれら予防若しくは治療剤は、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできるが、癌などの予防・治療においては病変部位に直接（インサイチュウ）投与することが好ましい。例えば、アデノウイルス発現ベクターを利用する場合は、癌組織等の病変部位に該ベクターの懸濁液を直接接種することができる。また、ＲＡＳ抑制変異型タンパク質遺伝子を収納したリポソームを用いる場合も、癌組織等の病変部位に該リポソームの懸濁液を直接接種することができる。さらに、ＲＡＳ抑制変異型タンパク質を癌などの予防・治療に用いる場合は、タンパク質、ペプチド又は抗体などの巨大分子と非共有結合体を形成し、タンパク質等の巨大分子の構造を変化させ、タンパク質等の巨大分子を細胞内にデリバリーすることができるChariot（Active Motif社製）等の細胞毒性のない試薬を用い、ＲＡＳ抑制変異型タンパク質を癌細胞に直接接種することができる。なお、投与量は、疾病の種類、患者の体重、投与形態等により適宜選定することができる。このように、上記本発明の予防・治療薬を投与する、好ましくは病変部位に直接投与する、膵臓癌等の癌（悪性腫瘍）、神経線維腫症等の良性腫瘍、骨髄異形成症候群などの前癌性病変、動脈硬化症などの細胞増殖に基づく疾患、増殖性腎疾患などの難治性炎症性疾患などの活性型ＲＡＳタンパク質に起因する疾病の予防・治療方法も本発明に含まれる。
【００１８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１９】
（Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌベクターの構築）
カルボキシル基末端を欠失させたＮ１１６Ｙ由来のＮ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ遺伝子を作製するため、Ｈ−ＲＡＳ遺伝子とＫ−ＲＡＳ遺伝子の融合遺伝子(Cancer Lett.75:19-26, 1993)の制限酵素EcoRI切断部位(１３９番目のコドン)のＫ−ＲＡＳ部位下流に、一定の長さのＣ末端（カルボキシル基末端）を削った制限酵素EcoRI/XbaI siteを両端に持つｖ−Ｈ−ＲＡＳ遺伝子由来の断片を挿入し、置換することによって、カルボキシル基末端欠失型ＲＡＳ遺伝子抑制変異体Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ遺伝子を作製した。Ｎ１１６Ｙ遺伝子（配列番号１）、Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−１遺伝子（配列番号３；１２塩基＝４アミノ酸を欠失させたもの）、Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２遺伝子（配列番号５；７２塩基＝２４アミノ酸を欠失させたもの）の塩基配列を図１に、Ｎ１１６Ｙタンパク質（配列番号２）、Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−１タンパク質（配列番号４；４アミノ酸を欠失させたもの＝癌化に必要なファルネシル化部位）、Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２タンパク質（配列番号６；２４アミノ酸を欠失させたもの＝癌化に必要な部位及びＲＡＳ蛋白質多様性部位を欠失させたもの）のアミノ酸配列を図２にそれぞれ示す。
【００２０】
Ｈ−ＲＡＳ、Ｋ−ＲＡＳ融合遺伝子 (Cancer Lett.75:19-26, 1993)が挿入されているプラスミド・ベクターｐＺＩＰＮ１１６Ｙ（Ｈ／Ｋ）の切断酵素EcoRI切断部位(１３９番目のコドン)以降のＫ−ＲＡＳ下流部位すべてを、Ｃ末端（カルボキシル基末端）の４アミノ酸、あるいは２４アミノ酸分削ったEcoRI/XbaI切断部位を両端に持つＨ−ＲＡＳ ＰＣＲ断片に挿入置換し、ｐＺＩＰＮ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−１(４アミノ酸欠失体)及びｐＺＩＰＮ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２(２４アミノ酸欠失体)を作製した。ＰＣＲは、ｐＺＩＰＮ１１６Ｙをテンプレートとし、センスプライマーに５'−ＧＧＡＡＴＴＣＣＣＴＡＣＡＴＴＧＡＡＡＣＡＴＣＡＧＣＣ−３'（配列番号７）の配列をもつオリゴヌクレオチドを用い、アンチセンスプライマーに、４アミノ酸欠失体に対し５'−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＣＴＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＡＧＣＣ−３'（配列番号８）、２４アミノ酸欠失体に対し５'−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＣＴＧＣＣＧＡＡＴＣＴＣＡＣＧＴＡＣ−３'（配列番号９）の配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれ用いた。
【００２１】
Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌが元のＲＡＳ抑制変異体Ｎ１１６Ｙと相同の配列を保持していることを確かめるために、プラスミドベクターｐＺＩＰ−Ｎ１１６ＹをテンプレートとしてＰＣＲ法を行い、Ｎ１１６Ｙ、Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−１及びＮ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２の各ＤＮＡのサイズを比較した。ＰＣＲにおけるセンス・プライマーにはEcoRI認識部位を組み込んだ５'−ＧＧＡＡＴＴＣＣＣＴＡＣＡＴＴＧＡＡＡＣＡＴＣＡＧＣＣ−３'（配列番号７）を用い、アンチセンス・プライマーには終止コドンとXbaI認識部位を組み込んだ５'−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＣＴＧＣＣＧＡＡＴＣＴＣＡＣＧＴＡＣ−３'（配列番号９）を用いた。この結果、Ｎ１１６Ｙより短いＮ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−１やＮ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２が確認された(図３)。図３中、第１レーンはコントロールとしてのＧＦＰ（green fluorescent protein）、第２レーンはＮ１１６Ｙ、第３レーンはＮ１１６Ｙ（アンチセンス鎖）、第４レーンはＮ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−１、第５レーンはＮ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２の各ＤＮＡに由来するバンドを示す。
【実施例２】
【００２２】
（インビトロにおけるＮ１１６Ｙｄｅｌベクターの癌増殖抑制効果）
カルボキシル基末端を欠失させたＮ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌが癌に対する増殖抑制作用を保っているかをインビトロレベルで検討した。すなわち、安全性を改善しかつ制癌作用を保つ部位を同定した。Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２は、カルボキシル基末端の２４個のアミノ酸を欠失させたものである。このＮ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２より欠失させたアミノ酸が少ない欠失体（例えばＮ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−１）であっても、欠失させたアミノ酸が多い欠失体であっても、より高い安全性と癌増殖を抑える有効性を満足しなかった。
【００２３】
Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌの癌増殖抑制能を証明するために、これらの遺伝子をアデノウイルス・ベクター（pAd-YFG）に組み込み（図４）、ＲＡＳ遺伝子発現の高い子宮頚癌細胞株ＨｅＬａ、及び、Ｋ−ＲＡＳ遺伝子の変異を持つ膵臓癌細胞株ＰＣＩ４３に感染させ、試験管内での増殖抑制効果を検討した。アデノウイルスの作製にはAd Easy system（He, et. al. PNAS,1998）を用い、シャトル・プラスミドである、pAdTrackCMVのmulti-cloning site（制限酵素切断部位）に、先に作製したpZIP/N116Y/Cdel-1及びpZIP/N116Y/Cdel-2より得られた、Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−１遺伝子及びＮ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２遺伝子を含む制限酵素BamHI/NotI断片を挿入し、pAdN116YCdel-1、pAdN116YCdel-2というシャトルプラスミドを得て、カルボキシル基末端欠失型ＲＡＳ遺伝子抑制変異体Ｎ１１６ＹＣｄｅｌ−１遺伝子、ｐＡｄＮ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２遺伝子を含むアデノウイルス・ベクターを得た。
【００２４】
子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ細胞に対しては濃度ＭＯＩ＝１００のウイルス液を用い、膵臓癌細胞株ＰＣＩ４３細胞に対してはＭＯＩ＝８００のウイルス液を用いた。それぞれ、２ｘ１０4個の細胞に対し感染させ、一週間後までの細胞数を数えた。なお、コントロールとして、マーカータンパク質ＧＦＰのみを発現するアデノウイルス（Ad-GFP）を用いた。その結果、Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２のみがこれらの癌細胞株Ｈｅｌａ、ＰＣＩ４３に対して増殖を強く抑制することが証明された（図５、図６）。また、この結果により、アデノウイルス・ベクター（pAd-GFP）に組み込んだＮ１１６／Ｃｄｅｌ−２による遺伝子治療法が可能であることが示唆された。
【実施例３】
【００２５】
（インビボにおけるＮ１１６Ｙｄｅｌベクターの癌増殖抑制効果）
カルボキシル基末端を欠失させたＮ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌがインビボで癌に対する増殖抑制作用を有しているかどうかを、ヒト大腸癌細胞株ＬｏＶｏ（財団法人・がん研究振興財団から供与  １９９４年）とヒトの癌細胞増殖を観察できるＫＳＮ／Ｓｌｃヌードマウス（５週齢、雌）を用いて検討した。また、プラスミドとして、pN116Y/Cdel-2（ＲＡＳ癌遺伝子抑制変異体Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２）及び対照としてpβgal（β-galactosidase遺伝子：Clontech製pCMV-betaを搭載）を用い、ベクターとして、市販の非ウイルスベクターGenomeONE-Neo（石原産業株式会社製  大阪）を用いた。GenomeONE-Neoは、センダイウイルスＨＶＪの膜（エンベロープ）からなるベクターであり、センダイウイルスの膜エンベロープが持つ細胞膜融合活性に着目して開発されたベクターであって、細胞接着活性を残したままウィルス増殖活性は完全に不活化されており、エンドサイトーシスにより治療用遺伝子と共に細胞に取り込まれる。
【００２６】
１×１０7個のＬｏＶｏ癌細胞株を培養液ＤＭＥＭ２００μＬに縣濁させた。そしてこの縣濁液を１５匹のＫＳＮ／Ｓｌｃヌードマウスの背部皮下に２５Ｇの注射針で移植した。癌細胞株の移植から３日後と１０日後に、１５匹を３匹ずつ３群に分けて１群（系列１）には生理食塩水ＰＢＳを、２群（系列２）にはpβgalとGenomeONE-Neoの混合物を、３群（系列３）にはpN116Y/Cdel-2とGenomeONE-Neoの混合物を、それぞれ腫瘍周辺に２７Ｇの注射針で注入した。２群と３群での実験は２回繰り返し、計６匹ずつ使用した。それぞれのマウスに注入したプラスミドＤＮＡの量は一回当たり７５μｇであり、液量は２００μＬであった。
【００２７】
腫瘍抑制効果についての結果を図７に示す。系列２の対照群では、ＰＢＳのみを注射した系列１群と差がなく、腫瘍は進行性に増殖した。これに対しｐＮ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２で治療した系列３群では、明らかな腫瘍増殖の抑制がみられ、この結果は２回の実験で確認された。以上の成績から、ｐＮ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２遺伝子がヒト癌の治療遺伝子として用いられる可能性が示された。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】Ｎ１１６Ｙ遺伝子、Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−１遺伝子、Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２遺伝子の塩基配列を示す図である。
【図２】Ｎ１１６Ｙ、Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−１、Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２のアミノ酸配列を示す図である。
【図３】ＰＣＲ法でみたＮ１１６Ｙ、Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−１、Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２のサイズの比較を示す図である。
【図４】本発明のＮ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２を組み込んだアデノウイルス・ベクター（pAd-YFG）を示す図である。
【図５】本発明のＮ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２のヒト子宮頚癌ＨｅＬａ細胞に対する試験管内での増殖抑制を示す図である。
【図６】本発明のＮ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２のヒト膵臓癌ＰＣＩ４３細胞に対する試験管内での増殖抑制を示す図である。
【図７】本発明のＮ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２によるヒト大腸癌細胞株ＬｏＶｏ（によるトルツメ）腫瘍に対するヌードマウス生体内での増殖抑制を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年1月6日(2004.1.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
【図１】Ｎ１１６Ｙ遺伝子、Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−１遺伝子、Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２遺伝子の塩基配列を示す図である。
【図２】Ｎ１１６Ｙ、Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−１、Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２のアミノ酸配列を示す図である。
【図３】ＰＣＲ法でみたＮ１１６Ｙ、Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−１、Ｎ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２のサイズの比較を示す図である。
【図４】本発明のＮ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２を組み込んだアデノウイルス・ベクター（pAd-YFG）を示す図である。
【図５】本発明のＮ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２のヒト子宮頚癌ＨｅＬａ細胞に対する試験管内での増殖抑制を示す図である。
【図６】本発明のＮ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２のヒト膵臓癌ＰＣＩ４３細胞に対する試験管内での増殖抑制を示す図である。
【図７】本発明のＮ１１６Ｙ／Ｃｄｅｌ−２によるヒト大腸癌細胞株ＬｏＶｏ腫瘍に対するヌードマウス生体内での増殖抑制を示す図である。