(57)【要約】【課題】医薬品として供し得る高純度な化合物が得られ、かつベロ毒素中和活性の強いカルボシランデンドリマーの提供。【解決手段】次式（１）【化１】2004107230.tif 000015（式中、Ｒ１、Ｒ３及びＲ５は同一又は異なって炭化水素基を示し、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ６及びＲ７は同一又は異なって炭化水素鎖を示し、Ａはガラビオース残基を示し、ｌは０〜３の数を示し、ｍ及びｎは同一又は異なって０〜２の数を示し、ｋは０又は１の数を示し、ｋが０のとき３−ｎは１である）で表されるガラビオース結合カルボシランデンドリマー化合物。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（１）
【化１】
2004107230.tif 000014
（式中、Ｒ１、Ｒ３及びＲ５は同一又は異なって炭化水素基を示し、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ６及びＲ７は同一又は異なって炭化水素鎖を示し、Ａはガラビオース残基を示し、ｌは０〜３の数を示し、ｍ及びｎは同一又は異なって０〜２の数を示し、ｋは０又は１の数を示し、ｋが０のとき３−ｎは１である）
で表されるガラビオース結合カルボシランデンドリマー化合物。
【請求項２】
Ｒ１、Ｒ３及びＲ５が同一又は異なって炭素数１〜４のアルキル基又はフェニル基である請求項１記載のガラビオース結合カルボシランデンドリマー化合物。
【請求項３】
Ｒ２、Ｒ４、Ｒ６及びＲ７が同一又は異なって炭素数２〜８の直鎖アルキレン基である請求項１又は２記載のガラビオース結合カルボシランデンドリマー化合物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載のガラビオース結合カルボシランデンドリマー化合物を有効成分とする医薬。
【請求項５】
大腸菌Ｏ−１５７感染症予防治療薬である請求項４記載の医薬。
【請求項６】
ベロ毒素中和薬である請求項４又は５記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ベロ毒素中和活性を有するガラビオース結合カルボシランデンドリマー化合物及びそれを有効成分とする医薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７が産生するベロ毒素は、赤痢菌由来の志賀毒素と類似した細菌毒素のＡＢ５ファミリーに属するタンパク質である。これらの毒素は、腎臓細胞上のグロボトリオシルセラミド（Ｇｂ３、Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｃｅｒ）中のグロボ３糖部分を認識し、接着することにより細胞内に取込まれ毒性を示すことが知られている。
そこで、この毒素の接着過程を効果的に阻害し、毒素を中和する物質に関する研究、開発が精力的に行われてきている。
本発明者らは先に、当該グロボ３糖を担持したカルボシランデンドリマーをコア骨格とするクラスター化合物を合成し、それに強いベロ毒素阻害活性があることを報告している（非特許文献１及び２、並びに特許文献１参照）。
【０００３】
【非特許文献１】
松岡浩司，照沼大陽ら，テトラヘドロンレターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ），１９９９年，第４０巻，ｐ．７８３９−７８４２
【非特許文献２】
西川喜代孝，松岡浩司，照沼大陽ら，プロシーディング　オブ　ナショナル　アカデミー　オブ　サイエンス　オブ　ザ　ユナイテッド　ステイト　オブ　アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ），（米国），２００２年，第９９巻，ｐ．７６６９
【特許文献１】
国際公開第０２／０２５８８号パンフレット
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、これらのグロボ３糖担持カルボシランデンドリマーは、合成が困難であり、医薬品として供するのに十分高純度なものが得られ難い、さらにベロ毒素中和活性も十分でない等の欠点を有することが判明した。
従って、本発明の目的は、医薬品として供し得る高純度な化合物が得られ、かつベロ毒素中和活性の強いカルボシランデンドリマーを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は、種々検討した結果、グロボ３糖に代えてガラビオースを特定の骨格のカルボシランデンドリマーに結合させたところ、当該化合物は高純度のものが容易に得られ、かつ強いベロ毒素中和活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、次式（１）
【０００７】
【化２】
2004107230.tif 000002
【０００８】
（式中、Ｒ１、Ｒ３及びＲ５は同一又は異なって炭化水素基を示し、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ６及びＲ７は同一又は異なって炭化水素鎖を示し、Ａはガラビオース残基を示し、ｌは０〜３の数を示し、ｍ及びｎは同一又は異なって０〜２の数を示し、ｋは０又は１の数を示し、ｋが０のとき３−ｎは１である）
で表されるガラビオース結合カルボシランデンドリマー化合物、及びこれを有効成分とする医薬を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
式（１）中、Ｒ１、Ｒ３及びＲ５は、同一又は異なって炭化水素基を示すが、炭素数１〜１２の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、炭素数３〜６のシクロアルキル基、炭素数５〜１２のアリール基、炭素数７〜１２のアラルキル基等が好ましく、このうち炭素数１〜４のアルキル基、フェニル基がより好ましく、メチル基、エチル基、イソプロピル基又はフェニル基が更に好ましく、メチル基が特に好ましい。
【００１０】
Ｒ２、Ｒ４、Ｒ６及びＲ７は、同一又は異なって炭化水素鎖を示すが、炭素数２〜８の直鎖アルキレン基が好ましい。このうち、Ｒ２、Ｒ４及びＲ６については炭素数２〜４の直鎖アルキレン基が好ましく、Ｒ７については炭素数４〜８、特に炭素数５〜８の直鎖アルキレン基が好ましい。
【００１１】
Ａは特にガラビオース（Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ）残基である。
【００１２】
また、ｌは０〜３の数を示すが、１又は２がより好ましい。ｍは０〜２の数を示すが、１又は２が好ましく、特に２が好ましい。ｎは０〜２の数を示すが、０又は１が好ましい。またｋは０又は１を示し、ｋが０のとき、３−ｎは１である。
【００１３】
式（１）のカルボシランデンドリマー化合物は、ｌ、ｍ、ｎ及びｋの数により種々の構造をとり得るが、代表的な構造を示せば次のとおりである。
【００１４】
【化３】
2004107230.tif 000003
【００１５】
（式中、Ｒ１〜Ｒ７及びＡは前記と同じ）
【００１６】
上記の構造のうち、式（１ｃ）の構造が特に好ましい。
【００１７】
本発明化合物（１）は、例えば次の反応式に従って製造することができる。
【００１８】
【化４】
2004107230.tif 000004
【００１９】
（式中、Ｘ１はハロゲン原子を示し、Ｘ２は反応脱離性のメルカプト保護基を示し、Ａ１はガラビオース残基又は水酸基が保護されたガラビオース残基を示し、Ｒ１〜Ｒ７、ｌ、ｍ、ｎ及びｋは前記と同じ）
【００２０】
すなわち、式（２）で表されるハロゲン化カルボシランデンドリマーと式（３）で表されるスルフィド化合物とを反応させ、必要に応じてガラビオース残基の保護を脱離させることにより本発明化合物（１）が製造できる。
【００２１】
Ｘ１のハロゲン原子としては、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。Ｘ２のメルカプト保護基としてはアセチル基等のアルカノイル基、ベンジル基等が好ましい。また、Ａ１の水酸基の保護基としては、アセチル基等のアシル基、ベンジル基、トリメチルシリル基等の有機ケイ素等が挙げられるが、アセチル基が好ましい。
【００２２】
式（２）のハロゲン化カルボシランデンドリマーは、例えばトリクロロメチルシラン等のクロロシラン類を原料として、グリニャール反応によりアリル基を導入し、ヒドロケイ素化反応、グリニャール反応を繰り返すことにより式（２）に対応する骨格を形成する。得られたデンドリマーの末端アリル基は、ヒドロホウ素化反応により相当するアルコールへと変換し、次いで常法によりメシル化後、臭化ナトリウム等で処理することにより、末端がハロゲン原子で置換されたハライド化合物へと効率良く変換することができる。
【００２３】
一方、式（３）の化合物は、例えばω−アルケニルグルコシドとガラクトース等の単糖との一段階グリコシデーション後、保護、脱保護し、ω位の二重結合へチオ酢酸等を反応させて式（３）の化合物を得ることができる。
【００２４】
式（２）の化合物と式（３）の化合物の反応は、例えばナトリウムメトキシド等の塩基の存在下に行うことができる。また、Ａ１の保護基の脱離は、例えばナトリウムメトキシド等の塩基を用いた加水分解により行うことができる。
【００２５】
得られた本発明化合物（１）は、洗浄、各種クロマトグラフィー、ゲル濾過等により精製することができる。
【００２６】
得られた本発明化合物（１）は、大腸菌Ｏ−１５７が産生するベロ毒素に対する中和活性を有し、ベロ毒素中和薬、大腸菌Ｏ−１５７感染症予防治療薬として有用である。
本発明化合物（１）を有効成分とする医薬は、投与法に応じて薬学的に許容される種々の担体を用いて医薬組成物とすることができる。本発明化合物（１）を有効成分とする医薬組成物の剤形としては例えば錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等の固形製剤や、液剤、シロップ剤、エリキシル剤、油性ないし水性の懸濁液の液体製剤等の経口用製剤；注射剤等が挙げられる。注射剤とするには、安定剤、防腐剤、溶解補助剤等を用いることができる。これらの補助剤を含むこともある溶液を容器に収納後、凍結乾燥等によって固形製剤として用時調製の製剤としてもよい。また一回投与量を一の容器に収納してもよく、また多投与量を一の容器に収納してもよい。固形製剤とするには、例えば充填剤や増量剤、結合剤、崩壊剤、溶解促進剤、湿潤剤、潤滑剤等を必要に応じて用いることができる。液体製剤とするには、懸濁化剤、乳化剤等を用いることができる。
本発明の医薬の投与量は、本発明化合物（１）として成人１日当たり１ｍｇから３ｇ、好ましくは１０ｍｇから１５００ｍｇである。これらは１〜４回に分けて投与することもできる。
【００２７】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００２８】
参考例１
（１）ｎ−ペンタニル−Ｏ−（４−Ｏ−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−ガラクトピラノシド（ｂ）の合成
【００２９】
【化５】
2004107230.tif 000005
−７８℃の液体アンモニア（１５０ｍＬ）へ金属ナトリウム（４．５６ｇ，１９８．３ｍｍｏｌ）を加え、そこへ化合物（ａ）（５．１６ｇ，４．９６ｍｍｏｌ）の１，２−ジメトキシエタン（３０ｍＬ）溶液を滴下し、４５分撹拌し、塩化アンモニウム（１０．６ｇ，１９８．３ｍｍｏｌ）を加え一晩撹拌した。溶媒を減圧留去後、残渣を乾燥−ピリジン（３３．５ｍＬ）に懸濁し、無水酢酸（１９．７ｍＬ）を加え、室温で１２時間撹拌した。反応終了後、反応液を氷水にあけ、クロロホルムで抽出し、１Ｎ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶液を濾過して濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製し、化合物（ｂ）を得た。
収量　１．３ｇ（３８％）
Ｒｆ値　０．３６（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）
【００３０】
（２）アセチルチオ−ブタニル−Ｏ−（４−Ｏ−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−ガラクトピラノシド（ｃ）の合成
【００３１】
【化６】
2004107230.tif 000006
【００３２】
アルゴン雰囲気下化合物（ｂ）（８９９．２ｍｇ，１．２８ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（０．２ｍＬ）に溶かしチオ酢酸（３．６ｍＬ，５１．０４ｍｍｏｌ）を加え、４０℃に加熱し、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）（８４７．７ｍｇ，５１．０４ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で３時間撹拌した。その後過剰なＡＩＢＮを潰すためシクロヘキセン（５ｍＬ，５．１６ｍｍｏｌ）を加え室温で１０分撹拌した。反応液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製し化合物（ｃ）を得た。
収量　９１０ｍｇ（９１％）
Ｒｆ値　０．２２（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）
【００３３】
実施例１
（１）デンドリマーへの糖鎖導入（１）
【００３４】
【化７】
2004107230.tif 000007
【００３５】
アルゴン雰囲気下、デンドリマー（ｄ）（２２．１ｍｇ，０．０３３ｍｍｏｌ）と糖鎖化合物（ｃ）（１５２．６ｍｇ，０．１９５ｍｍｏｌ）を乾燥−ＤＭＦ（０．２５ｍＬ）に溶かし、乾燥−メタノール（０．２５ｍＬ）を加え、室温で１時間撹拌した。そこへ、ナトリウムメトキシド（１１．６ｍｇ，０．２１５ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌した。反応終了後、酢酸（０．２５ｍＬ）を加え１０分間撹拌した後、濃縮し、残渣にピリジン（３ｍＬ）に懸濁し、無水酢酸（３ｍＬ）を加え、室温で５時間撹拌した。反応終了後、反応液を氷水にあけ、クロロホルムで抽出し、有機層を１Ｎ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶液を濾過して濃縮した。ＧＰＣ分取精製を行ない化合物（ｅ）を得た。
収量　７５．６ｍｇ（８６％）
【００３６】
（２）デンドリマーへの糖鎖導入（２）
【００３７】
【化８】
2004107230.tif 000008
【００３８】
アルゴン雰囲気下、デンドリマー（ｆ）（２３．３ｍｇ，０．０２５ｍｍｏｌ）と糖鎖化合物（ｃ）（１６５．０ｍｇ，０．２１１ｍｍｏｌ）を乾燥−ＤＭＦ（０．２５ｍＬ）に溶かし、乾燥−メタノール（０．２５ｍＬ）を加え、室温で１時間撹拌した。そこへ、ナトリウムメトキシド（１３．１ｍｇ，０．２１１ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌した。反応終了後、酢酸（０．２５ｍＬ）を加え１０分間撹拌した後、濃縮し、残渣にピリジン（３ｍＬ）に懸濁し、無水酢酸（３ｍＬ）を加え、５０度で３時間撹拌した。反応終了後、反応液を氷水にあけ、クロロホルムで抽出し、有機層を１Ｎ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶液を濾過して濃縮した。ＧＰＣ分取精製を行ない化合物（ｇ）を得た。
収量　５０．１ｍｇ（５５％）
【００３９】
（３）デンドリマーへの糖鎖導入（３）
【００４０】
【化９】
2004107230.tif 000009
【００４１】
アルゴン雰囲気下、デンドリマー（ｈ）（４０．７ｍｇ，０．０３６ｍｍｏｌ）と糖鎖化合物（ｃ）（４０３．２ｍｇ，０．５１６ｍｍｏｌ）を乾燥−ＤＭＦ（０．３０ｍＬ）に溶かし、乾燥−メタノール（０．３０ｍＬ）を加え、室温で１時間撹拌した。そこへ、ナトリウムメトキシド（３０．７ｍｇ，０．５６８ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌した。反応終了後、酢酸（０．３０ｍＬ）を加え１０分間撹拌した後、濃縮し、残渣にピリジン（５ｍＬ）に懸濁し、無水酢酸（５ｍＬ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応終了後、反応液を氷水にあけ、クロロホルムで抽出し、有機層を１Ｎ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶液を濾過して濃縮した。ＧＰＣ分取精製を行ない化合物（ｉ）を得た。
収量　７８．１ｍｇ（４２％）
【００４２】
実施例２
（１）Ｆａｎ１（３）−Ｇａｌａｂｉｏｓｅ（化合物（ｊ））の合成
【００４３】
【化１０】
2004107230.tif 000010
【００４４】
化合物（ｅ）（６４．６ｍｇ，０．０２４ｍｍｏｌ）にナトリウムメトキシドの０．１Ｍメタノール溶液（１．０ｍＬ）を加え室温で７時間撹拌した後、０．０２５ＭＮａＯＨ水溶液（５ｍＬ）加え室温で一晩撹拌した後、イオン交換樹脂ＩＲ１２０Ｂ（Ｈ＋）を加え中和した。綿線ろ過後濃縮し、ゲルろ過を行なうことにより無機塩を取り除き目的物（ｊ）を得た。
収量　３２．８ｍｇ（７８％）
【００４５】
１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：４．９１（ｓ，３Ｈ），　４．３０（ｍ，６Ｈ），　３．４７−４．１０（ｍ，３９Ｈ），　２．５１（ｔ，１２Ｈ），　１．５０−１．６７（ｍ，２４Ｈ），　１．３７（ｍ，６Ｈ），　０．５９（ｍ，１８Ｈ），　−０．０２（ｓ，１８Ｈ），　−０．０６（ｓ，３Ｈ）
１３Ｃ　ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：１０５．１５（Ｃ−１’），　１０２．５１（Ｃ−１），　７８．９６，　７６．０８，　７４．７０，　７２．８２，７２．５９，　７１．３７，　７１．５８，　７１．０５，　７０．７９，　６２．６３，　６０．８９，　３６．７９，　３５．０８，　３２．８５，　３０．７６，　３０．４８，　２６．３７，　２５．５７，　２１．０４，　１９．７８，　１４．４６，　−２．９７
【００４６】
（２）Ｄｕｍｂｂｅｌｌ２（４）−Ｇａｌａｂｉｏｓｅ（化合物（ｋ））の合成
【００４７】
【化１１】
2004107230.tif 000011
【００４８】
化合物（ｇ）（５０．１ｍｇ，０．０１４ｍｍｏｌ）にナトリウムメトキシドの０．１Ｍメタノール溶液（１．０ｍＬ）を加え室温で４時間撹拌した後、０．０２５ＭＮａＯＨ水溶液（５ｍＬ）加え室温で一晩撹拌した後、イオン交換樹脂ＩＲ１２０Ｂ（Ｈ＋）を加え中和した。綿線ろ過後濃縮し、ゲルろ過を行なうことにより無機塩を取り除き目的物（ｋ）を得た。
収量　３１．６ｍｇ（定量的）
【００４９】
１Ｈ　ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ：５．０１（ｂｒ，４Ｈ），　４．３６（ｂｒ，４Ｈ），　４．０３（ｂｒ，４Ｈ），　３．５４−３．９０（ｂｒ　ｍ，５２Ｈ），　２．５５（ｂｒ，１６Ｈ），　１．０８−１．６２（ｂｒ　ｍ，４０Ｈ），　０．６１（ｂｒ，２４Ｈ），　−０．０１（ｂｒ，２４Ｈ）
【００５０】
（３）Ｄｕｍｂｂｅｌｌ２（６）−Ｇａｌａｂｉｏｓｅ（化合物（ｌ））の合成
【００５１】
【化１２】
2004107230.tif 000012
【００５２】
化合物（ｉ）（３２．５ｍｇ，０．０６４ｍｍｏｌ）にナトリウムメトキシドの０．１Ｍメタノール溶液（１．０ｍＬ）を加え室温で４時間撹拌した後、０．０２５ＭＮａＯＨ水溶液（５ｍＬ）加え室温で一晩撹拌した後、イオン交換樹脂ＩＲ１２０Ｂ（Ｈ＋）を加え中和した。綿線ろ過後濃縮し、ゲルろ過を行なうことにより無機塩を取り除き目的物（ｌ）を得た。
収量　２５．１ｍｇ（定量的）
【００５３】
１Ｈ　ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ：４．９７（ｂｒ，６Ｈ），　４．３２（ｂｒ，１２Ｈ），　３．５０−４．００（ｂｒ　ｍ，９０Ｈ），　２．５２（ｂｒ，　２４Ｈ），　１．４０−１．６１（ｂｒ　ｍ，５６Ｈ），　０．５７（ｂｒ，２８Ｈ），　−０．０３（ｂｒ，１８Ｈ）
１３Ｃ　ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ：１０３．２９（Ｃ−１’），　１００．３４（Ｃ−１），　７６．８４，　７４．６９，　７２．６４，　７０．９２，　７０．２４，　６９．３０，　６９．０５，　６８．８１，　６０．６７，　５９．６１，　３５．８１，　３１．８７，　２９．４９，　２９．０８，　２５．１１，　２４．２９，　２０．２９，　２０．１３，　１８．５９，　１１．８９，　−２．６０
【００５４】
試験例（ベロ毒素中和活性）
（１）準備
（ａ）材料
試験に際しては、公知の方法（例えばＭｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．　２，３３９−３４９（１９８７））によりベロ毒素１及び２（リコンビナントＳｔｘ１及びＳｔｘ２）を調製した。
リコンビナントグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合Ｓｔｘ１（Ｓｔｘ１−Ａ２Ｂ５−ＧＳＴ）は、次の方法により得た：Ｓｔｘ１をコードする配列を有するｐＵＣ１１８ベクター（Ｍｉｃｒｏｂ．　Ｌｅｔｔ．　４４，　２３−２６（１９８７））を用いてＰＣＲにより配列番号１及び２のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを得た。得られたフラグメントを、ｐＧＥＸ−２Ｔベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩサイトに結合させた。
このＳｔｘ１−Ａ２Ｂ５−ＧＳＴをバクテリアに発現し、グルタチオン−セファローズビーズを用いた公知の方法（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７３，　２３１２６−２３１３３（１９９８））により精製した。
更にＳｔｘ１のＢサブユニットに対してモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマー１３Ｃ４をＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得た。
また、１２５Ｉで標識したＳｔｘ１（１２５Ｉ−Ｓｔｘ１）及びＳｔｘ２は公知のヨウ素モノクロリド法（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６５，　５２２６−５２３１（１９９０））により調製した。
【００５５】
（ｂ）細胞
ベロ細胞（アフリカミドリザルの腎臓由来細胞）は、１０％ウシ胎児血清を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）を培地として、２４ウェル（結合性試験用）プラスチックマイクロプレートで培養した。
マウス腹膜マクロファージは公知の手法（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６５，　５２２６−５２３１（１９９０））により調製した。
【００５６】
（ｃ）薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）免疫染色アッセイ
ＳｔｘのＧｂ３への結合アッセイは、公知の方法により行った（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　４４２，　２３１−２３４（１９９９））。すなわち、ブタ赤血球Ｇｂ３（５００ｎｇ、和光純薬社）をＨＰＴＬＣプレート（Ｗｈａｔｍａｎ社）に施し、クロロホルム／メタノール／水６０／３５／８（ｖ／ｖ）混合溶媒で展開した。ブロッキングを行った後、Ｓｔｘ１（１００ｎｇ／ｍＬ）と任意の量のガラビオース結合カルボシランデンドリマーともに培養した。洗浄後モノクローナル抗体１３Ｃ４を用いてＳｔｘ１を検出した。
【００５７】
（２）結合阻害活性試験方法
ベロ細胞を、１２５Ｉ−Ｓｔｘ１又は１２５Ｉ−Ｓｔｘ２（７×１０６ｃｐｍ／μｇ又は２×１０６ｃｐｍ／μｇ）と任意の量のガラビオース結合カルボシランデンドリマー化合物の存在下、４℃で３０分間処理し、洗浄した後、細胞を溶解液（０．１Ｍ
ＮａＯＨ、０．５％　ＳＤＳ）に溶解した。
γカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ　Ｉｎｓｔ．　Ｃｏｍｐ．社）により放射線量を測定し、ベロ細胞に結合した１２５Ｉ−Ｓｔｘ１又は１２５Ｉ−Ｓｔｘ２の量からガラビオース結合カルボシランデンドリマー化合物の結合阻害活性を求めた。
【００５８】
（３）結果
ガラビオース結合カルボシランデンドリマー化合物の結合阻害活性試験から得られた５０％抑制濃度を表１に示した。
表１より、本発明のガラビオース結合カルボシランデンドリマー化合物は、いずれもベロ毒素１（Ｓｔｘ１）及び２（Ｓｔｘ２）に対して高い結合阻害活性を示すことがわかる。
ガラビオース結合カルボシランデンドリマー化合物が存在しない場合には、１２５Ｉ標識Ｓｔｘは１００％ベロ細胞に結合した。また、ガラビオース結合カルボシランデンドリマー化合物の替わりに非標識Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２（５０μｇ／ｍＬ）を用いた場合にも、１２５Ｉ標識Ｓｔｘのベロ細胞への結合が完全に阻害されることから、１２５Ｉ標識Ｓｔｘがベロ細胞に特異的に結合することが確認された。
【００５９】
【表１】
2004107230.tif 000013
【００６０】
【発明の効果】
本発明のガラビオース結合カルボシランデンドリマー化合物は、優れたベロ毒性中和活性を有し、かつ高純度のものが容易に得られるので、大腸菌Ｏ−１５７感染症予防治療用の医薬として有用である。