(57)【要約】【課題】培養液を攪拌しながら担子菌の菌糸体を培養する際に、菌糸体に与えるストレスをできるだけ少なくすると共に、培養液中に酸素が十分に供給されるような担子菌の培養容器を提供することである。【解決手段】容器本体３と、この容器本体３の底部に設けられたエアー供給管４と、このエアー供給管４に設けられた複数のエアー噴射ノズル６とを備えた担子菌の培養容器１である。前記エアー噴射ノズル６は焼結金属によって形成され、また前記エアー噴射ノズル６は容器本体３に対して斜め上方に向けてエアー供給管４に取り付けられている。【選択図】　　　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器内の培養液を撹拌しながら担子菌を培養する方法において、前記培養液中にエアーを噴射することで培養液に旋回流を与えて撹拌することを特徴とする担子菌の培養方法。
【請求項２】
前記エアーが容器の下部から斜め上方に向けて培養液中に噴射されてなる請求項１記載の担子菌の培養方法。
【請求項３】
前記旋回流が反時計回りに発生する請求項１記載の担子菌の培養方法。
【請求項４】
前記エアーが微細な泡状となって培養液中に噴射されてなる請求項１記載の担子菌の培養方法。
【請求項５】
前記エアーの噴射量が１００〜１５０Ｌ／ｍｉｎである請求項１又は２記載の担子菌の培養方法。
【請求項６】
前記エアーの噴射圧力が０．０１〜０．２ＭＰａである請求項１又は２記載の担子菌の培養方法。
【請求項７】
容器本体と、この容器本体の底部に設けられたエアー供給管と、このエアー供給管に設けられた複数のエアー噴射ノズルとを備えたことを特徴とする担子菌の培養容器。
【請求項８】
前記エアー噴射ノズルが焼結金属によって形成されてなる請求項７記載の担子菌の培養容器。
【請求項９】
前記エアー噴射ノズルが容器本体に対して斜め上方に向けてエアー供給管に取り付けられてなる請求項７記載の担子菌の培養容器。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、担子菌類の培養方法およびその培養に用いられる培養容器に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、キノコ類に代表される担子菌類の培養では、主に子実体を形成させてそれを食することを目的としていた。しかしながら、担子菌類の一種であるアガリクスブラゼイ（Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｌａｚｅｉ）が抗腫瘍性のβ−グルカンを多量に含有していることが分かったために需要が飛躍的に増大した。一方、菌糸体の中にも機能性の高いβ−グルカンが多量に含まれているため、最近ではアガリクスブラゼイの菌糸体を得るための液体培養方法が行われるようになっている（特開平１０−２８７５８４）。
【０００３】
前記の液体培養方法では、アガリクスブラゼイが好気性菌であることから酸素の供給が必要となるが、従来は酸素を満遍なく供給できるように、液体培養の容器内に回転羽根を設け、培養液を撹拌しながら酸素を供給する方法が提案されていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、アガリクスブラゼイの液体培養では、培養が進むにつれて菌糸がペレット状に凝集する傾向がある。そのために、培養が進むほどペレットの内部に酸素が供給されにくくなり、その結果菌糸が壊死するという現象が生じていた。それに対して従来は、回転羽根で培養液を撹拌することで、酸素供給を満遍なく行うと共に、液攪拌の効果によりペレットの凝集を防ぐ方法が用いられていた。ところが、同方法では培養液中で成長したアガリクスブラゼイの菌糸体を回転羽根で剪断することになるため、菌糸体にストレスを与える原因となり、β−グルカンを多量に含む菌糸体の成長を妨げてしまう他、剪断された菌糸体同士がさらに凝集して大きなペレットを形成してしまうおそれがあった。大きなペレットの形成は、ペレット内部に酸素供給がなされない部分を多く作り出し、その結果菌の溶菌を招き、菌体収量の減収へとつながる原因となる。更に、同菌は壁面を成長基盤として増殖する性質があるため、培養槽内壁や回転羽根のような突起部分を土台として菌が増殖し、十分な菌体収量が得られない原因となっていた。
【０００５】
そこで本発明では、アガリクスブラゼイの菌糸体にストレスを与えないような手段で撹拌すると共に、撹拌方法を工夫することでペレット一つ一つの粒子サイズを小さくして、ペレット内部にも酸素が十分に供給されるような担子菌の培養方法および培養容器を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、培養液にエアー圧による旋回流を発生させることで、菌糸体に攪拌によるストレスを与えることなく培養液を撹拌できることを見出し、本発明に到達した。
【０００７】
すなわち、本発明の請求項１に係る担子菌の培養方法は、容器内の培養液を撹拌しながら担子菌を培養する方法において、前記培養液中にエアーを噴射することで培養液に旋回流を与えて撹拌することを特徴とする。
【０００８】
上記の培養方法によれば、エアー圧による旋回流を利用して攪拌を行うために、菌糸体にストレスを与える原因となる剪断力が、従来の回転羽根による攪拌と比べて著しく小さくなる。そのため、攪拌によって菌糸体に与えるストレスが小さくなり、菌糸体の成長を妨げることがない。
【０００９】
また、上記の旋回流は、エアーを容器の下部から斜め上方に向けて培養液中に勢いよく噴射することで、大容量の培養容器であっても培養液を十分に撹拌することができる。
【００１０】
また、前記培養液の旋回流を反時計回りに発生させることで、菌糸体に与えるストレスが小さくなり、成長がより一層促進されることになる。
【００１１】
また、前記エアーが微細な泡状となって培養液中に噴射されると共に、前記エアーの噴射量を１００〜１５０Ｌ／ｍｉｎに、エアーの噴射圧力を０．０１〜０．２ＭＰａに設定することで、培養液中に供給される溶存酸素量が十分に確保され、好気性菌の生育にとってはより好ましい培養環境が得られる。
【００１２】
本発明の請求項７に係る担子菌の培養容器は、容器本体と、この容器本体の底部に設けられたエアー供給管と、このエアー供給管に設けられた複数のエアー噴射ノズルとを備えたことを特徴とする。
【００１３】
また、前記エアー噴射ノズルに焼結金属を用いることで、エアーを微細な泡状で噴射することができる。
【００１４】
また、前記エアー噴射ノズルが容器本体に対して斜め上方に向けてエアー供給管に取り付けられることで旋回流を発生させ易くなり、大容量の培養容器であっても培養液を十分に撹拌することができる。
【００１５】
上記の培養容器を用いることで、エアー供給管に設けた複数のエアー噴射ノズルから、燒結金属を介してエアーを噴射することで培養液中への溶存酸素濃度を増やすことができる。また、エアー噴射ノズルの取り付け向きに角度を持たせることで、培養液に旋回流を起こさせ、満遍なく攪拌することが可能となった。
【００１６】
本発明の担子菌には、一般にキノコと称される菌類の大部分が含まれ、上述のアガリクスブラゼイの他、抗腫瘍性が高いとされるメシマコブ、ハナビラタケ、カンゾウタケ、カバノアナタケなどの菌糸体培養に適用される。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、添付図面に基づいて本発明に係る担子菌の培養方法および培養容器を詳細に説明する。ここで、図１は本発明に係る培養容器の内部構造を示す図、図２はエアー噴射ノズルの取付位置を示す斜視図、図３はエアー噴射ノズルの先端構造を示す断面図である。
【００１８】
図１に示したように、本発明の培養容器１は、外周部がウォータージャケット２によって覆われた円筒状の容器本体３と、この容器本体３内の下部に配管されたリング状のエアー供給管４と、外部のコンプレッサ（図示せず）から前記エアー供給管４にエアーを圧送するために、容器本体３の上部から内周壁に沿って縦方向に配管されたエアー導管５とを備える。
【００１９】
前記エアー供給管４は、アルミニウム製のチューブを容器本体３の内周壁に沿って配管したもので、このエアー供給管４には多数のエアー噴射ノズル６が一定間隔ごとに全周に亘って取り付けられている。これらのエアー噴射ノズル６は、図２（ａ）に示したように、エアー供給管４の接線方向に対して角度θ１で内方に向かって、また、図２（ｂ）に示したように、水平方向に対して角度θ２で斜め上方に向かって取り付けられている。エアー噴射ノズル６が、このような角度に設定されることで、エアー噴射ノズル６から噴射されたエアーが容器本体３内に収容された培養液に旋回流を発生させることができる。なお、これらθ１，θ２は容器本体３の大きさや培養液の容量などによって最適な角度に設定される。また、この実施形態に係るエアー噴射ノズル６は、図３に示したように、先端噴出部７が金属粉末を圧縮成形して焼き固めた焼結金属によって形成されている。この焼結金属には網目のような微細な孔が多数形成されているため、この微細な孔を通ってエアーが噴射されることでエアーが微細な泡状となって噴き出され、培養液中への空気の溶け込みが容易になると共に、培養液中に供給される溶存酸素量も多くなる。
【００２０】
本発明において注目すべき点は、容器本体３内に収容された培養液に反時計回り（左方向）の旋回流を与えることである。旋回流の回転方向によって菌糸体の成長速度に差が生ずることが、発明者らの実験によって確かめられている。北半球では培養液を反時計回りに回転させることで旋回流が無理なく発生して菌糸体へのストレスが少なくなる。上記の実施形態では、エアー噴射ノズル６を図２に示したような角度に取り付けることによって反時計方向への旋回流を発生させている。
【００２１】
前記エアー噴射ノズル６から培養液中に噴射されるエアーの噴射量は１００〜１５０Ｌ／ｍｉｎが望ましく、エアーの噴射圧力は０．０１〜０．２ＭＰａが望ましい。噴射量や噴射圧力はエアーコンプレッサからのエアー供給量やエアー噴射ノズルの絞りを調整することで設定され、容器本体３の大きさや培養液の容量などによって最適値に調整される。また、培養液の温度管理は、前述したウォータージャケット２内の水温を制御することで行なわれる。
【００２２】
したがって、上述のような構成からなる培養容器１にあっては、図１に示したように、容器本体３の内周壁に沿って設けられた多数のエアー噴射ノズル６から所定の角度θ１，θ２でエアーが噴射されるので、容器本体３内の培養液はその噴射圧力によって旋回流が発生する。そして、この旋回流によって培養液が撹拌され、酸素が培養液全体に満遍なく供給されることになる。さらに、エアー噴射ノズル６からは、エアーが微細な泡状となって培養液内に噴射されるので、供給される溶存酸素量も多くなると共に、培養液に酸素が溶け込み易くなる。
【００２３】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２４】
（実施例１）
攪拌ストレスの数値化及び、攪拌ストレスが菌体収量に及ぼす影響についての試験
菌糸体の収量及び有効成分であるβ−グルカン量と攪拌ストレスとの間には密接な関係がある。それを確かめるための試験を行った。アガリクスブラゼイの菌子体の収量及びβ−グルカンの含有量に及ぼす攪拌ストレスの影響は、５００ｍｌ容三角フラスコ中の培養液量を変え、同一振とう速度で振とうさせることによって攪拌ストレスを変化させる方法で評価を行った。攪拌ストレスは、ラボスケール及びプラントスケールの両方に共通して適用できるようにするため、物質溶解速度定数Ｋとして数値化した。同定数は、文献（Ｈ．Ｔａｎａｋａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｅｎｇ．，Ｖｏｌ．ＸＸＩＩＩ，ｐ１２０７−１２０８（１９８１））を用いて、β−ナフトールの溶解速度定数から算出される。Ｋが大きいほど攪拌ストレスが大きいとみなすことができる。
【００２５】
そこでまず、三角フラスコ中の各培地量における物質溶解速度定数Ｋの測定を行った。測定は先に述べた文献中の定法に従って行った。その結果を表１に示した。培養液量が１００〜２００ｍｌでは違いがほとんど見られなかったが、３００ｍｌより増えると物質溶解速度係数の値が下がる傾向が見られた。すなわち、攪拌による物理的ストレスが低下することを示した。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
そこで、実際に菌を培養する際の菌体収量に及ぼす物質溶解速度係数Ｋ（攪拌ストレス）の影響を調べた。試験は、５００ｍｌ容三角フラスコ中に１００ｍｌ〜５００ｍｌまで１００ｍｌ刻みでＭＹＳ培地（１％モルトエキス、０．４％イーストエキス、１％サッカロース）を添加し、滅菌後に任意量の種菌を植菌して、２５℃で２１日間培養を行った。その後、濾過により菌糸体を集菌し、１０５℃の乾燥機で２日間乾燥後にその重量を求めた。
【００２８】
その結果を表２に示した。それによれば、乾燥菌体重量は、培養液量が３００ｍｌ〜４００ｍｌの際に最も高い値を示した。これらの結果を総合して考えると、物質溶解速度係数Ｋを約１〜１．５×１０−３（ｃｍ／ｓｅｃ）に制御した培養を行うことで、より高い菌体収量を得ることが可能になった。
【００２９】
【表２】
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【００３０】
（実施例２）
攪拌ストレスが菌体ペレットの大きさに及ぼす影響についての試験
実施例１で、攪拌ストレスが菌体収量に及ぼす影響についての検討を行ったが、高い菌体収量が得られる攪拌条件が実際のプラントレベルに適用可能であるかどうかは分からない。特にペレットの大きさについては、サイズが大きいと均一な攪拌が行われずに培養槽壁面に付着し、菌体増殖の妨げとなる原因となる。従ってスケールアップ時には、ペレットが大きくなるのではなく、ペレットのサイズは小さいがペレット数は増える状態にあることが望ましい。
【００３１】
そこで、物質溶解速度係数Ｋと菌体ペレットの大きさ・数の関係を調べた。実施例１と同様の組成の培養液を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００〜５００ｍｌまで１００ｍｌ刻みで５種類の用量で添加し、滅菌後に任意量の種菌を植菌して２１日間振とう培養を行った。培養終了後、フラスコ毎に菌体ペレットを集菌し、数とサイズをノギスで測定した。
【００３２】
その結果を表３に示した。物質溶解速度係数が高い、すなわち攪拌ストレスが強いＫ＝１．９５や２．０１の時には、菌体はほとんど成長しない。一方、Ｋ＝１．６６から１．０８にかけては、他よりも細かい径のペレットが数多く出てきている。従って、攪拌ストレスが弱くなるとペレットの数は増え、かつサイズが小さいものが生じていることがわかった。実施例１の結果も踏まえて考察した結果、物質溶解速度係数Ｋが１〜１．５の時に菌体収量、ペレットの形状共に優れた成績が得られることがわかった。
【００３３】
【表３】
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【００３４】
（実施例３）
菌体収量の比較試験
本発明に係る培養容器を用いた培養法と従来の培養法との菌体収量の比較を、担子菌であるアガリクスブラゼイを用いて行った。前培養は実施例１と同じ組成の培地を作成し、ｐＨ無調整で使用した。前々培養により直径約１０ｍｍに成長した菌糸体ペレットを機械的に分散し、２５℃で振とう培養を増殖期に達するまで行った。
【００３５】
本実施例では、直径約２．５ｍ、高さ約３ｍの円筒形の培養容器（１５トン容）に約１２トンの培地を入れて滅菌を行った。その後、前培養菌体懸濁液３００Ｌを培養容器に植菌した。さらに、フィルタでろ過した無菌エアーを培養容器内に設けた１４個のエアー噴射ノズルから噴射し、培養液に反時計回りの旋回流を発生させた。エアー噴射ノズルからのエアー噴射量は１００Ｌ／ｍｉｎ、エアー噴射圧力は０．０１ＭＰａである。培養液の温度を２５〜２８℃に保ち、その状態で１４日間培養を行った。培養終了後に固液分離して菌体を全て回収し、乾燥機で２〜３日乾燥させたのち菌体の重量を求め、さらに全培養液に対する菌体収量割合を求めた。
【００３６】
一方、比較例では通気攪拌型培養を行い、培養容器として東京理科器械株式会社製のＭＩＮＩ　ＪＡＲＦＥＲＭＥＮＴＯＲ　Ｍ１００を用いた。攪拌翼として変形パドル翼（Ｌｉ＝５０ｍｍ、Ｄｉ＝６５ｍｍ：中空の長方形で辺の幅は１０ｍｍ）を取り付け、邪魔板を外して培養を行った。培養容器内に上記組成の培地１．７Ｌと消泡剤数滴を入れて滅菌後、前培養菌体件濁液３００ｍｌを植菌し、培地総量を２Ｌとした。培養液を２５℃に保ち、攪拌翼の回転数を１００ｒｐｍ、通気量を０．１Ｌ／ｍｉｎに調整して通気攪拌培養を行った。培養終了後は前記実施例と同様、菌体を全て回収し、乾燥機で２〜３日乾燥させたのち菌体の重量を求め、さらに全培養液に対する菌体収量割合を求めた。
【００３７】
上記の実施例および比較例の結果を表４に示した。それによれば、全培養液に対する菌体収量割合が本実施例の場合は、比較例の約２．３倍であった。
【００３８】
【表４】
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【００３９】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明に係る担子菌の培養方法によれば、培養液中にエアーを所定の角度で噴射することによって旋回流を発生させ、それによって培養液を撹拌すると共に酸素を十分に供給するようにしたので、培養液中の溶存酸素濃度を高めることができると共に、従来のような回転羽根による撹拌とは異なって菌糸体にストレスを与えることがないので、菌糸体の成長が飛躍的に伸びる。
【００４０】
また、本発明に係る培養容器によれば、エアー供給管に設けた複数のエアー噴射ノズルからエアーを噴射することで培養液に十分な旋回流を発生させ、それによって培養液中の溶存酸素濃度を増やすことのできるような撹拌が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る培養容器の内部構造を示す図である。
【図２】エアー噴射ノズルの取付角度を示す斜視図である。
【図３】エアー噴射ノズルの先端部の構造を示す断面図である。１　培養容器
２　ウォータージャケット
３　容器本体
４　エアー供給管
５　エアー導管
６　エアー噴射ノズル
７　先端噴出部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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