(57)【要約】【課題】特定の状態にある細胞内の核酸成分の分布あるいは組織細胞集団中の各細胞内の核酸成分の分布を明らかにするために、特定の細胞状態の各細胞の特定領域の核酸成分を選択的に分離し、回収する手段を提供する。【解決手段】特定の波長に対して透明なガラス基板上に、積層した前記特定の波長に対して吸収を持つ領域と、前記領域が電気伝導性を持ち、前記領域に電位を印加する手段と、前記領域の上に核酸を結合させる手段と、前記領域の上に細胞を収容する容器と、その容器で細胞を培養する手段と、前記細胞を観察する手段と、前記領域に前記特定の波長の集束光が照射されることで集束光近傍のみで局所的に発熱し、その熱によって前記領域上に結合した核酸成分を局所的に解離・回収する手段とを有する。【選択図】　　　　図１
2004081087.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明基板上に電気伝導性領域が配置され、この領域の上に核酸結合部と細胞収容容器部が配設された細胞中の核酸回収チップであって前記の電気伝導性領域に電位を印加する手段と、細胞収容容器部中で細胞が培養される手段とが具備されているとともに、前記の電気伝導性領域は、特定の波長の光に対して吸収を有し、この特定波長の光が照射されることで局所的に発熱し、電気伝導性領域上に結合した核酸成分が局所的に解離・回収されるようにしたことを特徴とする核酸回収チップ。
【請求項２】
電気伝導性領域に電位を印加する手段として、電気伝導性領域とこれに対向配置された上部電気伝導性部とを有していることを特徴とする請求項１の核酸回収チップ。
【請求項３】
細胞収容容器部中で細胞が培養される手段として、細胞収容容器部を内包して、細胞培養液の流通を可能とした箱体容器部が具備されていることを特徴とする請求項１または２の核酸回収チップ。
【請求項４】
一細胞を収容する細胞収容容器部が１以上配設されていることを特徴とする請求項１ないし３のいずれかの核酸回収チップ。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれかの核酸回収チップを備えた核酸回収装置であって、核酸回収チップの電気伝導性領域に特定波長の光を照射して局所的に加熱させる光学系とともに、この領域に電位を印加する電源系を有していることを特徴とする核酸回収装置。
【請求項６】
細胞の状態を観察する観察系を有していることを特徴とする請求項５の核酸回収装置。
【請求項７】
細胞の培養液の流通系を有していることを特徴とする請求項５または６の核酸回収装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、細胞を培養しながら観察し、細胞が特定の状態になったところで細胞中の特定領域の核酸成分を選択的に分離し、回収する核酸回収チップと核酸回収装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生体関連試料としてのＤＮＡ　や核酸、さらにはタンパク質についての効率的で、しかも高精度な分離、分析のための手法、手段の開発が急速に進展している。
【０００３】
たとえば周知のＤＮＡ　チップはマイクロパターニングの技術とＤＮＡ　の相補性とを利用し、特定の塩基配列を検出する手法である。このものは、基板上に様々な配列を持つオリゴヌクレオチドをアレー上にパターニングしておき、ＤＮＡ　試料が基板上の結合位置を検出し、試料中のＤＮＡ　の持つ配列を解析するものである。また、ＰＣＲ反応はＤＮＡ　二本鎖の解離（９５℃、３０秒間）、オリゴヌクレオチドとのアニーリング（３７℃、２０秒間）、ＤＮＡ　ポリメラーゼによる相補鎖合成（７２℃、２分間）の三反応の繰り返しからなり、微量なＤＮＡ　断片を数十万倍に増幅させる技術であることがよく知られている。一方、流体中の局所領域において温度上昇を発生させる技術として光を用いる方法がある。光吸収を持つ微粒子をレーザートラップすることにより微粒子周辺のμｍオーダーの微小領域に局所的温度上昇を発生させ、タンパクサブユニット会合体を切断する技術について、鷲津らが静電気学会講演論文集（１９９４年）１１１頁から１１４頁に報告している。またこの出願の発明者らは、先に特願平１０−１６３２１４として、基板上の複数の領域に、各々異なった核酸プローブを固定し、これに試料ＤＮＡ中の相補鎖ＤＮＡを結合させた後、集束光の熱によって局所的に相補鎖ＤＮＡを解離させ回収する装置と方法を提案している。
【０００４】
他方、培養細胞の溶液環境と、細胞間の物理的接触を制御しながら培養する公知例は無い。そこで発明者らは、これらの問題点を解決し、新たに特定の一細胞のみを選択し、その一細胞を細胞株として培養する技術、および細胞を観察する場合に、細胞の溶液環境条件を制御し、かつ、容器中での細胞濃度を一定に制御する技術、あるいは相互作用する細胞を特定しながら培養観察する技術を発明し特願２０００−３５６８２７として出願している。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来のＤＮＡ　チップによる遺伝子解析技術では、基板上に形成された２０塩基ほどのプライマーと試料中のＤＮＡ　／　ＲＮＡ　の一本鎖を相補的に結合させることにより捕獲し、観察することに重点が置かれてきており、特定の細胞状態（細胞周期内の特定の時期）におけるｍＲＮＡの細胞内分布や組織中の各細胞単位での細胞内の核酸成分の分析技術については考慮されていないのが実情である。そして、このことは、従来の各種の生体関連試料の分離、分析方法（装置）について同様であった。
【０００６】
生命体の構成やその活動等について解析するためには、前記のとおりの、特定の細胞状態での特定領域の核酸成分の分離、分析が欠かせないのであるが、このための手段についての検討はほとんど進んでいない。
【０００７】
そこで、この出願の発明は、特定の状態にある細胞内の核酸成分の分布あるいは組織細胞集団中の各細胞内の核酸成分の分布を明らかにするために、特定の細胞状態の各細胞の特定領域の核酸成分を選択的に分離し、回収することのできる新しい技術手段を提供することを課題としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、第１には、透明基板上に電気伝導性領域が配置され、この領域の上に核酸結合部と細胞収容容器部が配設された細胞中の核酸回収チップであって前記の電気伝導性領域に電位を印加する手段と、細胞収容容器部中で細胞が培養される手段とが具備されているとともに、前記の電気伝導性領域は、特定の波長の光に対して吸収を有し、この特定波長の光が照射されることで局所的に発熱し、電気伝導性領域上に結合した核酸成分が局所的に解離・回収されるようにしたことを特徴とする核酸回収チップを提供する。
【０００９】
また、この出願の発明は、第２には、電気伝導性領域に電位を印加する手段として、電気伝導性領域とこれに対向配置された上部電気伝導性部とを有していることを特徴とする核酸回収チップを提供し、第３には、細胞収容容器部中で細胞が培養される手段として、細胞収容容器部を内包して、細胞培養液の流通を可能とした箱体容器部が具備されていることを特徴とする核酸回収チップを、第４には、一細胞を収容する細胞収容容器部が１以上配設されていること特徴とする請求項１ないし３のいずれかの核酸回収チップを提供する。
【００１０】
そして、この出願の発明は、第５には、前記にいずれかの核酸回収チップを備えた核酸回収装置であって、核酸回収チップの電気伝導性領域に特定波長の光を照射して局所的に加熱させる光学系とともに、この領域に電位を印加する電源系を有していることを特徴とする核酸回収装置を提供し、第６には、細胞の状態を観察する観察系を有していることを特徴とする核酸回収装置を、第７には、細胞の培養液の流通系を有していることを特徴とする核酸回収装置を提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
この出願は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。
【００１２】
まず、この出願の発明の核酸回収チップの基本構成の一例を図１　の実施例を用いて説明する。核酸回収チップ１００で、スライドガラス等の光学的に透明な基板１０１上に、クロムの蒸着層などの光学吸収を持つ薄膜層１０２が配置されている。透過光で観察をする場合には、薄膜層１０２の膜厚は、光を完全に吸収しない程度でかつむらの無い程度の薄いものであることが望ましい。例えば、クロムの場合には、膜厚５０Åで蒸着すれば可視領域の透過光７０％程度であり、この発明の用途に用いるのに支障ない。その他、Ｔｉ，Ｖ　，Ｆｅ，Ｃｏ，Ｎｉ，　Ｍｏ　，Ｗ　のいずれかの金属を用いてもよい。これらの金属は、金属層の表面にできた酸化物層がシラノール基と共有結合することで、基板表面に核酸プローブ層１１３を固定することができる。吸光薄膜層１０２の上には、細胞１０４を培養するための容器の壁１０３が積層されている。容器の大きさや配置は、細胞の種類に応じて適宜選択するが、たとえば、神経細胞の場合、幅５０μｍ程度以上であることが望ましい。また、各容器の間に細胞は移動できないが、軸索等が他の細胞に接合できるように経路１１０を空けておいてもよい。また、容器の壁１０３の高さは細胞が乗り越えない程度の高さを持つ必要がある。たとえば神経細胞の場合には、高さ２０μｍ以上あればよい。特に容器の壁１０３の素材がアガロースを用いた場合には、細胞との接着性も無く、また、細胞に対してのシグナル物質でもないことから細胞にとっては無害なだけでなく、培養実験データへの影響が小さく最適である。細胞１０４を培養するとき、培養液の循環が必要な場合には、容器の壁１０３を含む細胞培養領域をすべて覆う構造の光学的に透明な容器１０６を被せて、管１０７から溶液を導入し、管１０８から廃液を回収すればよい。このとき、電極となる領域１０２と対になるように、導電性を持つ領域１０９を容器１０６内上面に付加する。この領域１０９の厚さは、領域１０２と同様に光透過性を有する程度に薄く蒸着する。ここで容器１０５内の細胞の様子は対物レンズ１１２を用いて連続観察することができる。また、対物レンズを通じて近赤外光の集束光を基板表面に照射することで、局所的に加熱して、前記核酸プローブ層１１３と結合した核酸成分を選択的に熱変性させて回収することができる。電源モジュール１１１を用いて領域１０２と領域１０９の間に電界を印加することができる。またこの実施例では、領域１０２が１枚の電極として構成されているが、各細胞容器ごとに独立して動作する複数の電極アレイを用いてもよい。
【００１３】
図２は、この出願の発明の核酸回収チップを用いた細胞中の核酸回収手順を例示した模式図である。図２（１）は、細胞を導入する前の基板表面の状態を示した模式図である。基板表面２０１には核酸成分を捕獲するために核酸プローブ２０２が固定されている。ここで、核酸プローブ２０２としては、ｍＲＮＡを選択的に回収するためにｐｏｌｙ−Ｔを中心とした配列で構成してもよいし、特定の核酸成分を回収したい場合は、特定の核酸成分に相補的な配列で構成してもよいし、あるいは、複数の異なる配列の核酸プローブを混合して配列させてもよい。図２（２）は、前記基板表面２０１上に細胞２０３が配置されている様子を示した模式図である。細胞２０３の状態を顕微鏡観察しながら特定の細胞状態となったときに、顕微鏡対物レンズを通じて照射した赤外線集束光によって細胞を破砕してもよいし、各細胞培養容器の電極が独立している場合は、電極に直流あるいは交流の電場を印加して細胞を破砕してもよい。あるいは一斉にすべての容器の細胞を破砕する場合は、界面活性剤等の薬剤を導入することで細胞を破砕してもよい。図２（３）は、細胞破砕後の細胞内タンパク質と核酸成分との分離手順を示した模式図である。基板表面２０１と対極との間に直流電界を印加することで、タンパク質成分と核酸成分とを分離する。タンパク質と核酸成分とで等電点が大きく異なっているため、核酸成分のみを基板表面２０１に引き寄せ、基板表面からタンパク質成分２０４を遊離させて溶液を流して排除することができる。また、細胞中の核酸成分を、基板表面２０１上に２次元に射影したかたちで固定することができる。図２（４）は、その後、先ほどとは反対の直流電界を印加して、基板表面の核酸プローブ２０５と結合しなかった核酸成分２０６を除去することができることを示している。図２（５）は、次に集束光加熱によって核酸プローブと結合した細胞内核酸成分を局所的に解離させ回収する手順を示した模式図である。対物レンズ２０７によって照射した集束光によって加熱した領域２０８の核酸プローブに結合した核酸試料２０９のみが選択的に溶液中に解離することから、この領域の解離した核酸成分を含む溶液を回収することで細胞内の特定領域の核酸成分の選択回収が可能となる。
【００１４】
図３は、この出願の発明の核酸回収チップを用いる光学系および溶液送液系の１実施例としての装置構成を模式的に例示したものである。この装置では細胞等の試料を核酸回収チップ１００で培養しながらその状態変化を観察するために、顕微鏡観察系、培養液循環系を、同時に核酸回収チップ１００上の核酸を選択回収させるために集束光照射系を持っている。図３からもわかるように顕微観察光学系の光路上に核酸回収チップ１００を配置しており、この核酸回収チップ１００に溶液を供給する培養液供給・廃棄部が連結されている。まず、顕微観察光学系は、以下のような構成になっている。光源３０１から照射された光は、フィルター３０２で特定の波長に調整され、コンデンサレンズ３０３によって集光されて、核酸回収チップ１００に照射される。照射された光は、透過光として対物レンズ３０５での観察に用いられる。核酸回収チップ１００内部の透過光像は、ミラー３１１によってフィルタ３１２通過後、カメラ３１３に誘導され、カメラの受光面に結像する。従って、核酸回収チップ１００の素材は、フィルタ３０２で選択された波長の光に対して、光学的に透明な素材であることが望ましい。具体的には、ホウケイ酸ガラス、石英ガラス等のガラスや、ポリスチレン等の樹脂やプラスチック、あるいはシリコン基板等の固体基板および、アガロース等の高分子を用いる。また特にシリコン基板を用いる場合は波長９００ｎｍ以上の波長の光を観測に用いる。また、図１　の吸光層１０２のところで述べたように、光の吸収が前記特定の波長において８０％未満となるような膜厚あるいは吸収を持たない波長を選択的に用いることが望ましい。
【００１５】
また、光源３０８から照射された光も、フィルター３０９で波長選択された後に、ダイクロイック・ミラー３１０によって対物レンズ３０５に誘導され、核酸回収チップ１００内部の蛍光観察の励起光として用いられる。核酸回収チップ１００から発した蛍光は再度対物レンズ３０５によって集光され、フィルター３１２によって励起光をカットした後の蛍光と透過光のみをカメラ３１３で観察することができる。このとき、フィルター３０２、３０９、３１２の組み合わせを調整することで、透過光のみをカメラ３１３で観察したり、あるいは蛍光のみを観察したり、透過光像と蛍光像を同時に観察することも出来る。光路内には、レーザー光源３０７で発生させたレーザー光を可動ダイクロイック・ミラー３０６によって対物レンズ３０５に導入する機構も備わっている。このレーザーは対物レンズ３０５によって集束光となり、核酸回収チップ１００を局所的に加熱することができる。集光点を移動させる場合には、可動ダイクロイック・ミラーを移動させることで、核酸回収チップ１００内でのレーザーの集束位置を動かすことが可能である。このレーザーの波長としては、水の吸収を持たず、光化学作用を持たない波長が望ましい。たとえばＮｄ：ＹＡＧレーザーの１０６４ｎｍなどでは、水、ガラス、アガロース等に対して顕著な吸収はなく、選択的にクロム薄膜層のみでレーザー光吸収が起こり、光が吸収されたクロム薄膜層の光集束点近傍のみで局所的に発熱する。
【００１６】
カメラで得られた画像データは画像処理解析装置３１４によって解析され、さまざまな解析結果を基に可動ダイクロイック・ミラー３０６や、核酸回収チップ１００が載っている温調機能付可動ＸＹステージ３０４の位置を制御するためにＸ−Ｙ　方向に自在に移動させるステージ移動用モーター３１５を駆動することができる。これによって細胞の形状を認識したり、認識後にその細胞を追跡し、つねに画像の中心に位置させたり、対物レンズとの距離を調節することで画像のピントを特定の細胞に合わせたりすることが可能となる。あるいは、一定時間の周期で可動ダイクロイック・ミラー３０６や、培養マイクロチャンバ１００が載っている温調機能付ステージ３０４を制御したり、一定間隔でステージ移動用モーター３１５を駆動することができる。
【００１７】
培養液供給・廃棄部について説明すると、。核酸回収チップ１００に複数の種類の種類、濃度の異なる培養液あるいは細胞破砕用の試薬等を細胞の状態に応じて溶液槽３１６から供給装置３１７によって供給された培養液は、供給装置内の温度調節機構によって液温を調節され、さらに溶存空気交換機構によって溶存気体の成分が調整され、流速を調節されながら核酸回収チップ１００に培養液等の試薬を供給する構造になっている。容器１００の培養液はまたＰＣＲ反応機能つき分配器３１８によってＰＣＲ反応増幅した後にキャピラリー電気泳動装置３１９に導入して核酸回収チップ１００から供給された試料核酸の配列を調べたり、あるいは廃液を廃液溜３２０におくることができる。
【００１８】
もちろん、この出願の発明は以上の例に限定されることなしに、その細部について様々な形態が可能であることは言うまでもない。
【００１９】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、培養している細胞の特定の状態での核酸成分の空間分布を解析することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この出願の発明の核酸回収チップの基本構成の一例を示す実施例の模式図である。
【図２】この出願の発明の核酸回収チップを用いた細胞中の核酸回収手順を例示した模式図である。
【図３】この出願の発明の核酸回収チップを用いる光学系および溶液送液系の１実施例を例示したの模式図である。
【符号の説明】
１００　核酸回収チップ
１０１　光学的に透明な基板
１０２　光学吸収を持つ薄膜層
１０３　光学的に透明で、細胞等に対して毒性を持たない物質の壁
１０４　細胞等の試料
１０５　細胞容器
１０６　光学的に透明な容器
１０７、１０８　管
１０９　導電性を持った層
１１０　トンネル
１１１　電源モジュール
１１２、２０７、３０５　対物レンズ
１１３　核酸プローブ
２０１　基板表面
２０２　核酸プローブ
２０３　細胞
２０４　タンパク質
２０５　核酸プローブ
２０６　２０９　核酸
２０８　局所加熱領域
３０１　光源
３０２、３０９、３１２　フィルター
３０３　コンデンサレンズ
３０４　温調機能付ステージ
３０６　可動ダイクロイック・ミラー
３０８　光源
３１０　ダイクロイック・ミラー
３１１　ミラー
３１３　カメラ
３１５　ステージ移動用モーター
３１６　溶液槽
３１７　供給装置
３１８　ＰＣＲ反応機能つき分配器
３１９　キャピラリー電気泳動装置
３２０　廃液溜
【図１】
2004081087.tif 000003
【図２】
2004081087.tif 000004
【図３】
2004081087.tif 000005