(57)【要約】【課題】糖尿病および糖尿病合併症の診断並びに治療薬の評価に有用なヒトの分類方法を提供する。【解決手段】ＡＬＤＨ２およびＡＤＨ２の活性の高低を基準にして、高活性型ＡＬＤＨ２および高活性型ＡＤＨ２（グループ１）と、高活性型ＡＬＤＨ２および低活性型ＡＤＨ２（グループ２）と、低活性型ＡＬＤＨ２および高活性型ＡＤＨ２（グループ３）と、低活性型ＡＬＤＨ２および低活性型ＡＤＨ２（グループ４）とに分類する。これらの分類により、細胞質およびミトコンドリアにおけるアルデヒド量を予測でき、これを基に、糖尿病および合併症の発症リスク等を予測できる。【選択図】　図１
2004081156.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病および糖尿病合併症の診断並びに治療薬の評価のための複合遺伝子マーカーであって、高活性型若しくは低活性型のアルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２）をコードする遺伝子および高活性型若しくは低活性型のアルコール脱水素酵素２（ＡＤＨ２）をコードする遺伝子を含む複合遺伝子マーカー。
【請求項２】
診断対象の個体を、下記表１の４つのグループに分類するための請求項１記載の複合遺伝子マーカー。
（表１）
グループ１：高活性型ＡＬＤＨ２および高活性型ＡＤＨ２を有するグループ
グループ２：高活性型ＡＬＤＨ２および低活性型ＡＤＨ２を有するグループ
グループ３：低活性型ＡＬＤＨ２および高活性型ＡＤＨ２を有するグループ
グループ４：低活性型ＡＬＤＨ２および低活性型ＡＤＨ２を有するグループ
【請求項３】
グループ１から４に分類された各個体の細胞質（厳密には細胞質内にミトコンドリアも含まれるため、ここで表現する細胞質とは細胞質サイトゾルの意味だが、以下では細胞質として簡略し表現する）およびミトコンドリアのアルデヒド量を、下記表２に記載のように予測するための請求項２記載の複合遺伝子マーカー。
2004081156.tif 000012
【請求項４】
高活性型ＡＬＤＨ２遺伝子は、４７８番目アミノ酸のコドンがＧＡＡ（Ｇｌｕ）であるＡＬＤＨ２１遺伝子のホモ接合体であり、
低活性型ＡＬＤＨ２遺伝子は、４７８番目のアミノ酸のコドンがＡＡＡ（Ｌｙｓ）であるＡＬＤＨ２２遺伝子のホモ接合体若しくはＡＬＤＨ２１遺伝子とＡＬＤＨ２２遺伝子のヘテロ接合体であり、
高活性型ＡＤＨ２遺伝子は、β２サブユニットをコードするＡＤＨ２２遺伝子のホモ接合体であり、
低活性型ＡＤＨ２遺伝子は、前記ＡＤＨ２２遺伝子のホモ接合体以外のＡＤＨ２遺伝子の接合体である請求項１から３のいずれかに記載の複合遺伝子マーカー。
【請求項５】
診断対象となる個体が、モンゴロイド民族である請求項２から４のいずれかに記載の複合遺伝子マーカー。
【請求項６】
糖尿病発症可能性および発症年齢の予測、ミトコンドリア遺伝子変異予測、神経障害の予測、網膜障害の予測、腎障害の予測、心臓障害の予測および脳機能障害の予測からなる群から選択されるいずれか一つの予測に使用される請求項１から５のいずれかに記載の複合遺伝子マーカー。
【請求項７】
アルドース還元酵素阻害剤、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｋｉｎａｓｅ　Ｃ阻害剤、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ｇｌｙｃａｔｉｏｎ　ｅｎｄ　　−ｐｒｏｄｕｃｔｓ　阻害剤、メチルコバラミン製剤、インスリン抵抗性改善薬、血糖降下剤および抗酸化剤からなる群の少なくとも一つの薬剤の各個体における薬効を予測するために使用される請求項１から６のいずれかに記載の複合遺伝子マーカー。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の複合遺伝子を検出するための複合プローブであって、
ＡＬＤＨ２遺伝子の塩基配列の一部若しくは全部と相補的な配列を有し、かつ前記遺伝子の高活性型と低活性型を区別して検出可能なＤＮＡプローブと、
ＡＤＨ２遺伝子の塩基配列の一部若しくは全部と相補的な配列を有し、かつ前記遺伝子の高活性型と低活性型とを区別して検出可能なＤＮＡプローブとを含む複合プローブ。
【請求項９】
請求項８記載の複合プローブを有するＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項１０】
請求項１から７のいずれかに記載の複合遺伝子マーカーを検出する方法であって、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析を利用した方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の検出方法に使用するキットであって、
ＡＤＬＨ２遺伝子およびＡＤＨ２遺伝子をＰＣＲで増幅する際に使用するプライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰと、
ＡＬＤＨ２遺伝子の高活性型と低活性型を区別できる制限酵素と、
ＡＤＨ２遺伝子の高活性型と低活性型を区別できる制限酵素とを含むキット。
【請求項１２】
糖尿病および糖尿病合併症の診断若しくは治療薬の評価のための複合酵素マーカーあって、高活性型若しくは低活性型のアルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２）および高活性型若しくは低活性型のアルコール脱水素酵素２（ＡＤＨ２）を含む複合酵素マーカー。
【請求項１３】
診断対象の個体を、上記表１の４つのグループに分類するための請求項１２記載の複合酵素マーカー。
【請求項１４】
グループ１から４に分類された各個体の細胞質およびミトコンドリアのアルデヒド量を、上記表２に記載のように予測するための請求項１３記載の複合酵素マーカー。
【請求項１５】
高活性型ＡＬＤＨ２のアミノ酸配列では、４７８番目アミノ酸がＧｌｕであり、
低活性型ＡＬＤＨ２のアミノ酸配列では、４７８番目のアミノ酸がＬｙｓであり、
高活性型ＡＤＨ２は、β２サブユニットのホモダイマーであり、
低活性型ＡＤＨ２は、β２サブユニットのホモダイマー以外のダイマーである請求項１２から１４のいずれかに記載の複合酵素マーカー。
【請求項１６】
診断対象となる個体が、モンゴロイド民族である請求項１２から１５のいずれかに記載の複合酵素マーカー。
【請求項１７】
糖尿病発症可能性および発症年齢の予測、ミトコンドリア遺伝子変異予測、神経障害の予測、網膜障害の予測、腎障害の予測、心臓障害の予測および脳機能障害の予測からなる群から選択されるいずれか一つの予測に使用される請求項１２から１６のいずれかに記載の複合酵素マーカー。
【請求項１８】
アルドース還元酵素阻害剤、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ｇｌｙｃａｔｉｏｎ　ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ　阻害剤、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｋｉｎａｓｅ　Ｃ阻害剤、メチルコバラミン製剤、インスリン抵抗性改善薬、血糖降下剤および抗酸化剤からなる群の少なくとも一つの薬剤の各個体における薬効を予測するために使用される請求項１２から１７のいずれかに記載の複合酵素マーカー。
【請求項１９】
請求項１２から１８のいずれかに記載の複合酵素マーカーを検出するための試薬であって、
高活性型若しくは低活性型ＡＬＤＨ２と特異的に反応する抗体と、
高活性型若しくは低活性型ＡＤＨ２と特異的に反応する抗体とを含む試薬。
【請求項２０】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１９記載の試薬。
【請求項２１】
糖尿病および糖尿病合併症の診断若しくは治療薬の評価のための個体分類方法であって、請求項１から２０のいずれかに記載のマーカーを用いて、個体を上記表１の４つのグループに分類する方法。
【請求項２２】
グループ１から４に分類された各個体の細胞質およびミトコンドリアのアルデヒド量を、上記表２に記載のように予測するための請求項２１記載の分類方法。
【請求項２３】
分類対象となる個体が、モンゴロイド民族である請求項２１または２２に記載の分類方法。
【請求項２４】
糖尿病発症可能性および発症年齢の予測、ミトコンドリア遺伝子変異予測、神経障害の予測、網膜障害の予測、腎障害の予測、心臓障害の予測および脳機能障害の予測からなる群から選択されるいずれか一つの予測のために使用される請求項２１から２３のいずれかに記載の分類方法。
【請求項２５】
アルドース還元酵素阻害剤、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ｇｌｙｃａｔｉｏｎ　ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ　阻害剤、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｋｉｎａｓｅ　Ｃ阻害剤、メチルコバラミン製剤、インスリン抵抗性改善薬、血糖降下剤および抗酸化剤からなる群の少なくとも一つの薬剤の各個体における薬効を予測するために使用される請求項２１から２４のいずれかに記載の分類方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖尿病および糖尿病合併症の診断並びに治療薬の評価のための複合遺伝子マーカー、複合酵素マーカーおよび個体分類方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病は、慢性の全身性代謝障害を引き起こす疾患であり、高血糖、糖尿、体タンパク質の崩壊、ケトーシス（ケトン血症）およびアシドーシスを呈し、病状が進行すると、神経障害、網膜障害、腎障害若しくは心臓障害等の合併症がおこる。糖尿病は、現代の飽食の時代を反映して、国民的疾患となっており、その有効な予防法および治療法の確立が望まれている。糖尿病の診断方法としては、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）が、一般的であり、その他、１，５−ＡＧ、フルクトサミン（糖化アルブミン）、ＨｂＡ１ｃ等が診断の指標とされている。他方、近年のゲノム研究の進展と相俟って、疾患を遺伝子レベルで理解するための研究が盛んになっており、そのなかでも遺伝子の多型を分析して、個体レベルでの発症リスク等を予測する試みがなされている。例えば、アルコール性疾患では、その病因の理解を深めるために、アルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２）遺伝子とアルコール脱水素酵素２（ＡＤＨ２）遺伝子の多型の組み合わせが利用されている（参考文献：　Ａｒｕｋｏｒｕ　Ｋｅｎｋｙｕｔｏ　Ｙａｋｕｂｕｔｓｕ　Ｉｓｏｎ　１９９５　Ｆｅｂ；３０（１）：３３−４２　等）。また、非活性型ＡＬＤＨ２遺伝子の多型分析により、アルコールを多量に摂取する人のガン発生のリスクを予測できることが報告されている（参考文献：Ｃａｎｃｅｒ　Ｅｐｉｄｅｎｉｏｌ　Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ　＆　Ｐｒｅｙ　１９９６；　５：９９−１０２等）。この他にも、アルコール摂取の心筋梗塞への影響がＡＤＨ３遺伝子の多型分析で調べられている（Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ，Ｖｏｌ．３４４，Ｎｏ．８　ｐ５４９−５５５）。アルツハイマー病については、本発明者により、ＡＬＤＨ２遺伝子とアポリポブロテインＥ（ＡＰＯＥ）遺伝子の多型により、発症リスクを予測することが提案されている（特開２００１−２９９３９７号公報）。しかしながら、糖尿病については、遺伝子レベルでの理解が十分とはいえず、糖尿病および合併症の診断や治療薬の評価等の遺伝子レベルでの実施は、十分ではない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような事情に鑑みなされたもので、遺伝子レベルでの糖尿病の理解に基づいたマーカーであって、糖尿病および糖尿病合併症の診断並びに治療薬の評価等に有用なマーカーの提供を、その目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、糖尿病を遺伝子レベルで理解するために、ＡＬＤＨ２遺伝子およびＡＤＨ２遺伝子の多型をそれぞれ高活性型と低活性型に分け、個体を下記の表１に記載の４つのグループに分類するという着想を得た。そして、この着想をさらに発展させ、各グループについて、細胞質およびミトコンドリアのアルデヒド濃度を下記表２に示すように予想する理論を構築した。そして、この理論の検証を行ったところ、後述のように、糖尿病のメカニズム等を理論的に説明することが可能であることを突き止めた。そして、この理論に基づき、ＡＬＤＨ２遺伝子およびＡＤＨ２遺伝子の多型およびこれらの多型に応じて発現した酵素自身が、糖尿病および糖尿病合併症の診断並びに治療薬の評価のマーカーとして有用であることを見出し、本発明に到達した。遺伝子多型は、個体が存在する間（生まれてから死ぬまで）、変化しないから、本発明の基礎となる前記理論によれば、糖尿病発症以前の体の状態も予測でき、さらには、先祖若しくは子孫への遺伝的な予測も可能である。
【０００５】
（表１）
グループ１：高活性型ＡＬＤＨ２および高活性型ＡＤＨ２を有するグループ
グループ２：高活性型ＡＬＤＨ２および低活性型ＡＤＨ２を有するグループ
グループ３：低活性型ＡＬＤＨ２および高活性型ＡＤＨ２を有するグループ
グループ４：低活性型ＡＬＤＨ２および低活性型ＡＤＨ２を有するグループ
【０００６】
2004081156.tif 000003
【０００７】
すなわち、本発明の複合遺伝子マーカーは、糖尿病および糖尿病合併症の診断並びに治療薬の評価のための複合遺伝子マーカーあって、高活性型若しくは低活性型のＡＬＤＨ２をコードする遺伝子および高活性型若しくは低活性型のＡＤＨ２をコードする遺伝子を含む複合遺伝子マーカーである。
【０００８】
また、本発明の複合酵素マーカーは、糖尿病および糖尿病合併症の診断若しくは治療薬の評価のための複合酵素マーカーあって、高活性型若しくは低活性型のＡＬＤＨ２および高活性型若しくは低活性型のＡＤＨ２を含む複合酵素マーカーである。
【０００９】
さらに、本発明の個体分類方法は、前記本発明のマーカーを用いて、個体を上記表１の４つのグループに分類する方法である。
【００１０】
前記の両複合マーカーにより、診断対象の個体を、上記表１の４つのグループに分類することができ、分類された各個体の細胞質およびミトコンドリアのアルデヒド量を、上記表２に記載のように予測することができる。前記分類はモンゴロイド民族に適しており、特に日本人に最適であるから、本発明において、前記個体は、モンゴロイド民族が好ましく、より好ましくは日本人である。また、前記個体は、例えば、健康人、糖尿病患者あるいはブドウ糖負荷試験における境界型領域に属する人等である。この予測に基づけば、糖尿病および糖尿病合併症の診断並びに治療薬の評価を行うことが可能となる。前記診断としては、例えば、糖尿病発症可能性および発症年齢の予測、ミトコンドリア遺伝子変異予測、神経障害の予測、網膜障害の予測、腎障害の予測、心臓障害の予測および脳機能障害の予測等がある。前記治療薬の評価としては、例えば、アルドース還元酵素阻害剤、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ｇｌｙｃａｔｉｏｎ　ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ　阻害剤、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｋｉｎａｓｅ　Ｃ阻害剤、メチルコバラミン製剤、インスリン抵抗性改善剤、経口血糖降下剤（スルフォニルウレア系薬剤を含む）およびα−ｌｉｐｏｉｃ　ａｃｉｄなどを含む抗酸化剤等の医薬の薬効を各個体毎に予測すること等がある。前記インスリン抵抗性改善薬としては、ＰＰＡＲγ受容体に作用をもつと考えられサイアゾリジン系の薬剤等がある。本発明のマーカーや分類方法により、個体の体質を評価すれば、薬剤についての感受性を予測でき、その個体が、ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ、ｍｉｌｄ　ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ若しくはｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒであるかを判断して薬剤を投与できる。したがって、本発明により、糖尿病および糖尿病合併症においてテーラーメイド医療が実施可能となる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
つぎに、本発明について詳しく説明する。
【００１２】
ＡＬＤＨ２は、細胞のミトコンドリア内に存在するアルデヒド脱水素酵素のアイソザイムの一つである。ＡＬＤＨ２遺伝子はヒト染色体の１２ｑ２４に存在し、そのｅｘｏｎ１２に位置する４７８番アミノ酸（Ｇｌｕ）のコドンＧＡＡにおいて、ＧからＡへの点変異（ＡＡＡ；Ｌｙｓ）の多型があり、正常なタイプ（Ｇ）をＡＬＤＨ２１遺伝子といい、活性欠損遺伝子（Ａ）をＡＬＤＨ２２という。本発明において、ＡＬＤＨ２の高活性型および低活性型の基準は、特に制限されず、マーカーの用途等に応じ適宜決定できる。例えば、ＡＬＤＨ２１遺伝子にコードされた酵素はアセトアルデヒドを酢酸に変換する活性が高く、これに対して、ＡＬＤＨ２２遺伝子にコードされた酵素はアセトアルデヒドを酢酸に変換する酵素活性がほとんどない。また、この酵素はテトラマー（４量体）を形成し、そのうちＡＬＤＨ２２遺伝子にコードされるタンパク質が一つでもが含まれると酵素活性を失う。したがって、本発明のマーカーにおいて、例えば、ＡＬＤＨ２１遺伝子のホモ接合体およびその酵素（４７８番目のアミノ酸がＧｌｕ）を高活性型と定義することができ、それ以外の場合、すなわち、ＡＬＤＨ２２遺伝子／ＡＬＤＨ２１遺伝子のヘテロ接合体およびＡＬＤＨ２２遺伝子／ＡＬＤＨ２２遺伝子のホモ接合体と、それらの酵素（４８７番目のアミノ酸がＬｙｓ）とを、低活性型と定義することができる。但し、この定義は、本発明において一例に過ぎない。
【００１３】
ＡＤＨは、分子量が約４０ｋＤａのサブユニット２個からなるダイマーであり、構成するサブユニットの違いから複数のアイソザイムが知られている。これまで同定されたヒトＡＤＨ遺伝子は、Ｉ第４染色体（４ｑ２１−２５）に存在する。ＡＤＨは、生化学的特性からＩからＩＶ型に分類される。一般に、経口摂取されるアルコールの代謝にかかわるのはＩ型であり、これはエタノールなどの短鎖のアルコールを加水分解し、ピラゾールで不活化されるという特徴を持つ。Ｉ型ＡＤＨには、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＡＤＨ３の３つのアイソザイムが存在し、これらは独立した遺伝子座の産物である。本発明のＡＤＨ２は、Ｉ型であり細胞質に存在する。日本人における遺伝子多型は、ＡＤＨ２、ＡＤＨ３双方の遺伝子に存在する。ＡＤＨ２のサブユニットにはβ１、β２、β３の３つがあり、β１はＡＤＨ１遺伝子、β２はＡＤＨ２遺伝子、β３はＡＤＨ３遺伝子にそれぞれコードされている。ＡＤＨ２の多型は、一塩基点変異により、補酵素との相互作用部位であるＺｎとＮＡＤ結合部位のアミノ酸が変化することによって生じる。アミノ酸レベルで見ると、β２は、β１の４７番目のアルギニンがヒスチジンに変異したものである。これらの酵素活性には違いがあり、β２β２のホモ接合体は、β１β１のホモ接合体より、生理的条件下で高い活性を示す。特にβ２β２は、β１β１に対してｉｎ　ｖｉｔｒｏで４０倍のＶｍａｘ値を持ち、ｓｕｐｅｒａｃｔｉｖｅＡＤＨと言われている。日本人においては、ｓｕｐｅｒａｃｔｉｖｅＡＤＨが一般的である。本発明のＡＤＨ２の高活性型および低活性型を区別する基準は、特に制限されず、マーカーの用途等により適宜決定される。例えば、高活性型は、前記ｓｕｐｅｒａｃｔｉｖｅＡＤＨをコードする遺伝子（β２サブユニットをコードするＡＤＨ２２遺伝子のホモ接合体）およびその酵素（β２のホモダイマー）と定義し、低活性型は、前記遺伝子以外の遺伝子（ＡＤＨ２２遺伝子のホモ接合体以外のＡＤＨ２遺伝子）およびその酵素（β２ホモダイマー以外のダイマー）と定義できる。但し、この基準は、本発明の一例に過ぎない。
【００１４】
つぎに、本発明の複合遺伝子マーカーは、例えば、プローブ、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、ミスマッチＰＣＲ法を利用した方法により検出できる。
【００１５】
前記プローブは、例えば、ＡＬＤＨ２遺伝子の塩基配列の一部若しくは全部と相補的な配列を有し、かつ前記遺伝子の高活性型と低活性型を区別して検出可能なＤＮＡプローブと、ＡＤＨ２遺伝子の塩基配列の一部若しくは全部と相補的な配列を有し、かつ前記遺伝子の高活性型と低活性型とを区別して検出可能なＤＮＡプローブとを含む複合プローブ等がある。また、この複合プローブを、ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップを含む）に適用すれば、多数の個体サンプルにおいて、本発明の複合遺伝子マーカーを効率よく検出できる。
【００１６】
前記ＲＦＬＰ分析を利用した方法は、例えば、所定のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ等を用いて、ＡＤＬＨ２遺伝子およびＡＤＨ２遺伝子をＰＣＲで増幅し、増幅産物を、制限酵素で処理し、アガロース電気泳動等で断片長を比較する方法である。この方法は、キット化することができる。このキットは、ＡＤＬＨ２遺伝子およびＡＤＨ２遺伝子をＰＣＲで増幅する際に使用するプライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰと、ＡＬＤＨ２遺伝子の高活性型と低活性型を区別して切断する制限酵素と、ＡＤＨ２遺伝子の高活性型と低活性型を区別して切断する制限酵素とを含む。
【００１７】
ＡＬＤＨ２遺伝子のＰＣＲのためのプライマーとしては、例えば、５’−ＣＡＡＡＴＴＡＣＡＧＧＧＴＣＡＡＧＧＧＣＴ−３’（ｓｅｎｓｅ）と５’−ＣＣＡＣＡＣＴＣＡＣＡＧＴＴＴＴＣＴＣＴＴ−３’（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）の組み合わせ等があり、前記制限酵素としては、例えば、ＭｂｏＩＩ等がある。
【００１８】
ＡＤＨ２遺伝子のＰＣＲのためのプライマーとしては、例えば、５’−ＡＡＴＣＴＴＴＴＣＴＧＡＡＴＣＴＧＡＡＣＡＧ−３’（ｓｅｎｓｅ）と５’−ＧＡＡＧＧＧＧＧＧＴＣＡＣＣＡＧＧＴＴＧ　−３’（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）の組み合わせ等があり、前記制限酵素としては、例えば、ＭａｅＩＩＩ等がある。
【００１９】
この他に、本発明の遺伝子マーカーは、Ａｌｌｅｌｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＰＣＲ増幅法（ミスマッチＰＣＲ法）あるいはＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法等によっても検出できる。
【００２０】
本発明の複合酵素マーカーは、抗体を含む試薬で検出可能である。この試薬としては、例えば、高活性型若しくは低活性型ＡＬＤＨ２と特異的に反応する抗体と、高活性型若しくは低活性型ＡＤＨ２と特異的に反応する抗体とを含む試薬等がある。前記抗体としては、モノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体がある。抗体は、通常の方法で作成できる。例えば、抗体を作成するには、アミノ酸配列が異なる領域のペプチドを化学合成し、蛋白などの高分子に共有結合で結合し、家兎やマウスなどに免疫することによって、ＡＬＤＨ２１とＡＬＤＨ２２にそれぞれコードされる蛋白を識別する抗体、あるいはＡＤＨ２β１とＡＤＨ２β２にそれぞれコードされる蛋白を識別する抗体を作成することができる。免疫したマウスの脾臓細胞とミエローマ細胞を融合すると、それぞれの前記蛋白を識別するモノクローナル抗体を作成することができる。ただし、この作成法は一例をしめしたものであって、この方法にかぎらずそれぞれを識別できる抗体は作成できる。
【００２１】
（本発明の分類方法の基礎理論）
つぎに、本発明の基礎となる前記分類について、前記表１、表２および図１〜５を参照して詳しく説明する。
【００２２】
（本発明の分類概念）
前記表１の４つのグループは、前記表２に示すような細胞質およびミトコンドリアのアルデヒド量をとると推察される。まず、アルデヒドの代謝に着目すると、グループ４では、ＡＬＤＨ２およびＡＤＨ２の双方とも低活性であるため、アルデヒド体が代謝をうけにくくなり、ミトコンドリア内および細胞質内に蓄積しやすくなる。これに対し、グループ１では、前記両酵素共に高活性であるため、アルデヒドが代謝を受けやすく、細胞質内およびミトコンドリア内にアルデヒドが蓄積し難い。グループ２では、ＡＬＤＨ２が高活性であるから、ミトコンドリア内のアルデヒドの蓄積は少なく、ＡＤＨ２が低活性であるから、細胞質のアルデヒドの蓄積が多い。グループ３は、アルデヒドの蓄積において、グループ２と反対の傾向を示す。つぎに、図１に示すように、高血糖により脂質の過酸化が起こると、アルデヒド（図１では、４−ｈｙｄｒｏｘｙ　２　ｎｏｎｅｎａｌ：４−ＨＮＥ）が細胞内に蓄積する。アルデヒドは、ＡＬＤＨ２およびＡＤＨ２によりカルボン酸（図１では、４−ｈｙｄｒｏｘｙ　２　ｎｏｎａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ：ＨＮＡ）とアルコール（図１では、１，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｎｏｎｅｎｅ：１，４ＤＨＮ）に代謝され、その際、ＡＬＤＨ２ではＮＡＤ＋が消費されてＮＡＤＨが生じ、ＡＤＨ２ではＮＡＤＨが消費されＮＡＤ＋が生成する。ＡＤＨ２が触媒する反応は可逆反応であり、ＮＡＤＨが高濃度の条件下であってはじめて、４？ＨＮＥは１，４ＤＨＮに変換される。ＡＤＨ２の酵素反応の際に必要となるＮＡＤＨは、高血糖によりポリオール代謝が亢進する際に生じるＮＡＤＨで賄われる。
【００２３】
（グループ４の特徴）
図２に、グループ４のアルデヒド代謝を中心とした糖尿病の代謝図を示す。上述のように、このグループでは、アルデヒド（図２では、４−ＨＮＥ）が高濃度で存在する。高血糖であれば、ポリオール代謝が亢進してＮＡＤＨが産生されるが、ＡＤＨ２が低活性であるため、ＮＡＤＨをあまり消費することができず、これが活性酸素種（ＲＯＳ）発生の一要因となる。また、アルデヒドが高濃度で存在することは、ミトコンドリア膜に障害を与え、ミトコンドリア内での酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）が減少することになり、ＡＴＰが低下してしまう。また、ＲＯＳの発生は、ミトコンドリアＤＮＡに損傷を起こし、アポトーシスを誘導し、エネルギー生成（ＡＴＰ）が低下し、代謝に悪影響を及ぼす。さらに、ミトコンドリア膜からのフリーラジカル産生を亢進させ、膵臓のβ細胞からのインスリン分泌を低下させる。また、これらのミトコンドリの特性（体質）は、母系遺伝によって子孫に遺伝され、また糖尿病の発症年齢が若くなるという現象が生じる。また、グループ４では、アルデヒドが細胞質およびミトコンドリアに高濃度で蓄積することから、他の毒性物質（アルコール等）に対する感受性が増加する。４−ＨＮＥの神経内蓄積は、Ｎａ−Ｋ　ＡＴＰａｓｅを阻害し、神経の酸化的ストレスに対する感受性を高め、神経に対し障害を惹起しやすくなる。その結果、糖尿病の患者において、末梢神経障害のような神経障害がおきやすくなる。
【００２４】
（グループ１の特徴）
図３に、グループ１のアルデヒド代謝を中心とした糖尿病の代謝図を示す。上述のように、このグループでは、アルデヒド（図３では、４−ＨＮＥ）が低濃度となる。高血糖であれば、ポリオール代謝が亢進してＮＡＤＨが産生されるが、ＡＤＨ２が高活性であるため、ＮＡＤＨが消費され、活性酸素種（ＲＯＳ）もあまり発生しない。また、アルデヒドが低濃度であるため、ミトコンドリア内での酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）にもあまり影響はない。また、ＲＯＳがあまり発生しないため、ミトコンドリアＤＮＡの損傷も少なく、損傷したとしても修復され、正常細胞が増殖することとなる。一方、アルデヒドが低濃度であることは、４？ＨＮＥが低濃度になりやすく、低濃度の４？ＨＮＥは、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｋｉｎａｓｅ　Ｃ（アイソザイムであるβＩ、βＩＩ）の活性を増加させ、これによって虚血（血管障害）を起こし、網膜症や腎症（タンパク尿等）等の合併症が生じやすくなる。
【００２５】
（アルコール代謝と糖尿病との関係）
糖尿病患者においては、アルコールを日常的に飲み続けている患者が多い。そうした患者においては、アルコールがアセトアルデヒドに代謝され、さらにアセタルデヒドが酢酸に代謝される際に、ＮＡＤ＋が補酵素として利用され、ＮＡＤＨに還元される事により、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比が上昇しやすくなる。しかも、糖尿病患者は高血糖を有しているため、図２に示すように、肝臓や末梢神経内などにおいてＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比が上昇し、それが維持される。したがって、糖尿病患者がアルコールを摂取すると、高血糖の影響とアルコール摂取の影響とは、相乗効果をもって現れる。その結果、末梢神経細胞内において、図２で示すような４−ＨＮＥの代謝分解が抑制された均衡状態（アルデヒドの高濃度蓄積状態）になりやすい。本発明の分類を基に考えると、グループ３と４とでは、ミトコンドリア内にアルデヒド体が蓄積する傾向となる。４−ＨＮＥはアルコールを飲む量に比例して蓄積されることが考えられるため、グループ３と４において、飲酒をしている糖尿病患者では、アルコール摂取量に比例して、末梢神経に障害が起こると予測できる。
【００２６】
（ポリオール代謝と遺伝子多型）
ポリオール代謝は、グルコースからソルビトールを経てフルクトースに変換される経路である。図４に示すように、高血糖状態では、ポリオール代謝が亢進し、神経細胞内において、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比が上昇し、また、ＮＡＤＰＨが減少して、ＮＡＤＰが増加する。その結果、一酸化窒素（ＮＯ）が減少して組織が虚血状態になりやすく、還元型グルタチオン（ＧＳＤ）が減少し、酸化型グルタチオンが増加する傾向となる。このことは、酸化的ストレスを亢進させ、フリーラジカルの発生を高めることになる。このフリーラジカル産生増加が脂質過酸化を亢進させ、４−ＨＮＥやその他の脂質過酸化による毒性アルデヒドを増やし、これが細胞毒性を起こし、またミトコンドリア機能に対して障害を及ぼす。図４に示すように、ＡＬＤＨ２およびＡＤＨ２が毒性アルデヒドを消去するため、糖尿病により高血糖状態になっても、生体的平衡（ホメオスターシス）を維持できる。しかし、ＡＬＤＨ２遺伝子およびＡＤＨ２遺伝子は多型を示すため、毒性アルデヒドの消去にも個体によって程度に差が生じ、これが糖尿病および糖尿病合併症の発症等に影響を及ぼす。本発明の分類方法やマーカーは、ＡＬＤＨ２遺伝子およびＡＤＨ２遺伝子の多型から、細胞質およびミトコンドリアにおけるアルデヒド量を予測するから、この予測を基に、さらに糖尿病および糖尿病合併症の発症等を予測できる。
【００２７】
（アルドース還元酵素）
アルドース還元酵素は、アルデヒド還元酵素の一種であり、ポリオール代謝では、ブドウ糖をソルビトールに変換する。高血糖によるポリオール代謝の亢進は、神経障害を引き起こすおそれがある。したがって、アルドース還元酵素の阻害剤（インヒビター）は、糖尿病性神経障害に対する治療薬として有効であり、実際に臨床で使用されている。図４に示すように、アルデヒド還元酵素阻害剤は、グルコースからソルビトールへの代謝を阻害し、それによって、ソルビトールが減少し、結果として、フルクトースも減少する。その結果、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比等の酸化還元状態が変わる。また、ＮＡＤＰの生成も抑制するから、一酸化窒素の低下も抑制し、組織が虚血に陥ることを防止すると考えられている。一方、アルドース還元酵素は、図４に示すように、アルデヒドの代謝にも関与する。したがって、高血糖状態になってポリオール代謝の亢進によりアルドース還元酵素の需要が高まったり、またインヒビターによってアルドース還元酵素が阻害されたりすると、毒性アルデヒドの代謝に悪影響がでるおそれがある。実際、様々な種類のアルドース還元酵素阻害剤が、開発され、臨床応用が試みられたが、臨床治験の段階で副作用が確認されるなどから、開発が中止されている薬剤も多い。その副作用が特定臓器において、なぜ起こるのかの原因は解明されていない。しかし、アルドース還元酵素阻害剤が、上記で論じた毒性アルデヒドの影響を、ある特定臓器において強めたり、弱めたりしている可能性もある。また、一方、本発明者等が論文で報告している糖尿病患者の２例においては、アルドース還元酵素阻害剤を服薬すると、四肢のしびれを強く感じることがあった（鈴木吉彦，　松岡健平．「Ａｌｄｏｓｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ投与後下肢異常感覚が出現した症例　Ｅｐａｌｒｅｓｔａｔ　Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒか？」．現代医療２７巻増刊ＩＶ　Ｐａｇｅ３４１７−３４２０（１９９５．１１））。この２例は、グループ４に属しており、このようにＡＬＤＨ２の低活性およびＡＤＨ２の低活性の組み合わせが、アルドース還元酵素阻害剤の作用に対して強く影響を及ぼしうる群は、本分類のなかのいずれかの分類に傾向として集中しうる可能性がある。つまり、このように、アルドース還元酵素阻害剤の生体への作用を考える上でも、ＡＬＤＨ２遺伝子およびＡＤＨ２遺伝子の多型によりアルデヒドの代謝を考慮した本発明の分類方法およびマーカーは重要な意義を有する。本発明の分類方法およびマーカーを使用すれば、アルドース還元酵素阻害剤の生体への感受性を予め予測することができる。あるいは、副作用がおこりやすい患者を予め予測し、投薬の対象から除外することによって、アルドース還元酵素阻害剤は、副作用の少ない安全な薬剤として、糖尿病患者に服薬を勧めることができるようになる。
【００２８】
（ＡＧＥに対する影響）
細胞質内やミトコンドリア内で蓄積されたアルデヒド体は、他の物質と結合し、ａｄｖａｎｃｅｄ　ｇｌｙｃａｔｉｏｎ　ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ　（以下、ＡＧＥと略す）を生じやすくなる。あるいは、例えば、上記で示した４−ＨＮＥは、システインなどが有するＳＨ基と結合し、そのＳＨ基を有するたんぱく質の機能を低下させる場合もある。本分類によって、毒性アルデヒドが、組織内で及ぼすＡＧＥ作成あるいは、特定の部位への攻撃を、あらかじめ予測し、それによって治療法の選択に役立てることが可能である。また、ＡＧＥ阻害剤は、体内に蓄積したＡＧＥの生成を抑制することを目的として、糖尿病性合併症の予防薬として開発中であるが、それら薬剤の効果判定において、上記で示したグループ１から４の分類は、薬剤効果の反応性を決定する要因になりうるものである。
【００２９】
（酸化還元状態）
ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比等の酸化還元状態は、ミトコンドリア内のＭｎ−ＳＯＤの活性に影響を及ぼす。また、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ比等も、脂質過酸化などの誘導に影響を及ぼす。すなわち、細胞内の酸化還元状態は、様々な酵素反応や酵素活性を調節し、それによって酸化的ストレスを調節することが知られている。例えば、Ｍｎ−ＳＯＤはミトコンドリア内における酸化的ストレスを消去するのに重要な酵素である。また、スーパーオキシドと一酸化窒素は容易に反応しペルオキシナイトライトという反応性の高い物質にかわるが、Ｍｎ−ＳＯＤはミトコンドリア内のペルオキシナイトライトの生成を阻止している可能性も示唆されている。また、Ｍｎ−ＳＯＤの転写や翻訳の両段階においては酸化還元調節を受けており、外的刺激に対応してＭｎ−ＳＯＤの酵素活性は速やかに上昇し、このメカニズムによりミトコンドリアを保護している。一方、グルタチオンペルオキシダーゼの一種についても、その酵素に結合する蛋白質の中には、酸化還元状態によって、核に移行し転写因子として働くものがある。このようなことから、アルデヒド体の多少で規定されるミトコンドリア内のＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比の高低は、Ｍｎ−ＳＯＤの転写や翻訳、グルタチオンペルオキシダーゼ等の過酸化物無毒化酵素などの作用に影響を及ぼすと推定される。
【００３０】
（ピルビン酸および乳酸の産生と、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比）
ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比の変化は、ピルビン酸と乳酸との産生に影響を及ぼす。一般に、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比の上昇は、乳酸を増やしピルビン酸を減少させる（図４参照）。ピルビン酸は、細胞膜を自由に通過できるので、ミトコンドリア機能の低下した細胞は、ピルビン酸が供給されることによって、過還元状態を是正されていると推察できる。また、ピルビン酸は、過酸化水素と非酵素的に反応し、脱炭酸されて酢酸となるので、抗酸化剤としての作用もある。糖尿病においては、ポリオール代謝系の亢進によってピルビン酸が低下するため、このような作用が障害されやすいと考えられる。このピルビン酸の産生を左右するのが、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比、つまり酸化還元状態であるが、図４に示すように、この酸化還元状態が、ＡＬＤＨ２遺伝子とＡＤＨ２遺伝子との多型によりアルデヒド量の多少を介して調節を受けるとすると、糖尿病患者における高血糖の程度と併行する可能性があるといえる。ピルビン酸は、ミトコンドリア内のエネルギー代謝における重要な物質であり、ミトコンドリア内におけるピルビン酸の低下は、ＡＴＰ産生の低下にもつながる。
【００３１】
（高血糖状態および正常血糖状態）
糖尿病患者では、高血糖状態を長期間持続している場合が多い。このような患者において、糖尿病に関する正しい教育指導をうけ、食事療法や運動療法を遵守し、また血糖降下剤などの経口糖尿病治療薬などを治療的介入を受けると、血糖値は下がり、正常人と同じレベル（空腹時血糖値が１００ｍｇ／１００ｍｌ前後）に落ちつくものである。こうした治療介入を急激に起こすことにより、それまで高血糖状態で均衡を保っていた状態（高血糖時のホメオスターシス：図４参照）が、正常血糖のホメオスターシス（図５参照）に変化することになる。血糖値が正常レベルになることは、良いことであるが、それが急激であると、様々な不都合が生じると予測される。例えば、ポリオール代謝が低下してＮＡＤＰが低下し、一酸化窒素（ＮＯ）が増加するが、これがきっかけとなって、酸化的ストレスが増加することが考えられる。すなわち、ＮＯは、血管拡張作用を有するため、それまでの高血糖状態による組織内の低酸素状態あるいは虚血状態などが改善されるが、ＮＯは、スーパーオキシドと容易に反応し、ペルオキシナイトライト（ＯＮＯＯ−）という反応性の高い物質に変わる。ペルオキシナイトライトは、ミトコンドリアを損傷させたり、ラジカルを発生させ脂質過酸化を促進させる。また、虚血再潅流説（Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　Ｉｎｊｕｒｙ　Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ）によれば、低酸素あるいは虚血状態が急激に改善した場合には、フリーラジカルの産生も高まることが示唆されている。長期間の高血糖を放置した症例において、急激な血糖調節を行うと、時に、下肢のしびれ、下腿の浮腫、眼底出血などが起こる患者の群がいることが知られている。例えば、ミトコンドリア性糖尿病というミトコンドリア遺伝子異常（例えば塩基番号３２４３部位の変異）を有する糖尿病患者において、血糖調節後に下肢に疼痛が起こる例が多い（これについては、本発明者等は、米国糖尿病学会会誌に報告している。文献名：Ｓｕｚｕｋｉ，　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．　（１９９４）　Ｐｏｓｔｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ　ｉｎ　ｄｉａｂｅｔｉｃｓ　ｗｉｔｈ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｔＲＮＡ（Ｌｅｕ）　ｍｕｔａｔｉｏｎ．　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｃａｒｅ　１７：　７７７−７７８）。これらの症状は、高血糖時のホメトスターシスから正常血糖時のホメオスターシスへ（図４から図５）急激に変化することによって起こると推察される。このような場合、細胞質内およびミトコンドリアにおいて、アルデヒド量も急激に変化し、それに伴いＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比も変化すると推察される。この調節には、ＡＬＤＨ２およびＡＤＨ２が関与しているため、それらの遺伝子多型は、前記の治療後神経障害の発症や状態を予測する上で重要な意義を持つ。
【００３２】
（ミトコンドリ遺伝子の異常）
ミトコンドリア遺伝子異常（例えば塩基番号３２４３部位の変異）は、通常、末梢血の白血球や、筋肉で検出することができる。ＡＬＤＨ２およびＡＤＨ２は、末梢血内の白血球内に検出されるミトコンドリア遺伝子の変異量を制御するため、それらの多型が、ミトコンドリア遺伝子異常に関与していると推察できる。したがって、ＡＬＤＨ２遺伝子およびＡＤＨ２遺伝子の多型を基礎にした本発明の分類およびマーカーは、ミトコンドリア遺伝子異常を診断する上で有用である。
【００３３】
【実施例】
つぎに、本発明の実施例について説明する。
【００３４】
２型糖尿病患者１５８名について、以下の方法により、ＡＬＤＨ２遺伝子とＡＤＨ２遺伝子の多型を調べ、前記表１の４つのグループに分類した。そして、前記患者１５８名につき、性別、遺伝的特性、糖尿病発症年齢、身体的データ（身長、体重等）、神経障害および網膜障害の各項目について、前記４つのグループで比較した。その結果を、下記の表３に示す。
【００３５】
（分析手法）
研究内容を説明した後、糖尿病患者から血液を研究に使用することに同意を得て、抹消血を採取した。血液の白血球より常法によって全ＤＮＡを抽出した。
【００３６】
ＡＤＨ２遺伝子多型はエクソン３部分をＰＣＲ法によって遺伝子断片を増幅し、制限酵素ＭａｅＩＩＩで切断後、２％アガロース電気泳動によって塩基配列の違いを判定した。ＭａｅＩＩＩで切断されたＤＮＡ断片は、ＡＤＨ２β２遺伝子配列を含み、切断されないＤＮＡ断片はＡＤＨ２β１遺伝子配列を含む。
【００３７】
（ＰＣＲの具体的条件）
溶液：５０μＬ
ＤＮＡ：１００ｎｇから２００ｎｇ程度
プライマー：各５ｐｍｏｌｅ
（５’−ＡＡＴＣＴＴＴＴＣＴＧＡＡＴＣＴＧＡＡＣＡＧ−３’、５’−ＧＡＡＧＧＧＧＧＧＴＣＡＣＣＡＧＧＴＴＧ−３’）
ｄＮＴＰ：５０μＭのｄＡＴＰ，　ｄＧＴＰ，　ＴＴＰ，　ｄＣＴＰ
ＭｇＣｌ２：１．５ｍＭ
ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：１ｕｎｉｔ
反応条件：９４℃３０秒、５８℃２分、７２℃３０秒のサイクルを３５回くり返した。
【００３８】
ＡＬＤＨ２遺伝子多型は、エクソン１２部分をミスマッチＰＣＲ法によって遺伝子断片を増幅し、制限酵素ＥａｒＩで切断後、２．５％アガロース電気泳動によって塩基配列の違いを判定した。切断されたＤＮＡ断片はＡＬＤＨ２１遺伝子配列を含み、切断されないＤＮＡ断片はＡＬＤＨ２２遺伝子配列を含む。
【００３９】
（ＰＣＲの具体的条件）
溶液：５０μＬ
ＤＮＡ：１００ｎｇから２００ｎｇ程度
プライマー：５ｐｍｏｌｅ
（５’−ＴＴＡＣＡＧＧＧＴＣＡＡＣＴＧＣＴＡＴＧ−３’、５’−ＣＣＡＣＡＣＴＣＡＣＡＧＴＴＴＴＣＴＣＴＴ−３’）
ｄＮＴＰ：５０μＭのｄＡＴＰ，　ｄＧＴＰ，　ＴＴＰ，　ｄＣＴＰ
ＭｇＣｌ２：１．５ｍＭ
ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：１　ｕｎｉｔ
反応条件：９４℃１５秒、５８℃１分３０秒、７２℃３０秒のサイクルを３５回くり返した。
【００４０】
【表３】
2004081156.tif 000004
【００４１】
前記表３に示すように、各グループ（１〜４）間で、さまざまな特徴が確認できた。まず、末梢神経障害の知覚異常の頻度が、グループ４とそれ以外のグループとで有意な差があり、グループ４が顕著に高かった。また、糖尿病の母親をもつ患者の頻度や、３５歳未満で糖尿病を発病する患者の頻度が、グループ４では、他のグループと比較すると高値であった。これらの結果から、グループ４に分類された人は、母系遺伝により、ミトコンドリア遺伝子異常に関係した糖尿病の疾患表現形が遺伝しやすく、発症年齢も低いことが予測でき、また末梢神経障害がおこりやすと予測できる。一方、グループ１の場合は、糖尿病の血管障害に関係した合併症において特徴があった。すなわち、グループ１は、それ以外のグループよりも、タンパク尿や増殖性網膜症の頻度が高かった。
【００４２】
（実施例２）
糖尿病患者１４名について、ミトコンドリア遺伝子異常（３２４３変異）を、以下に示すＰＣＲ−ＲＥＦＰ法およびＡｌｌｅｌｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＰＣＲ法で検出すると共に、前述の方法により、前記表１の４つのグループに分類した。その結果を、下記の表４に示す。なお、前記ミトコンドリア遺伝子以上は、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法によっても検出した。
【００４３】
（ＰＣＲ？ＲＦＬＰ法を用いたミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異の検出法）
１００から　２００　ｎｇ　の　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　を、　５　ｐｍｏｌ　の各プライマーとミックスさせた。各プライマーは、（５‘−ＣＡＡＡＴＴＡＣＡＧＧＧＴＣＡＡＧＧＧＣＴ−３’　ｓｅｎｓｅ）および（５‘−ＣＣＡＣＡＣＴＣＡＣＡＧＴＴＴＴＣＴＣＴＴ−３‘　ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）であり、５０μＭのｄＮＴＰ、１．５　ｍＭのＭｇＣｌ２、１　Ｕ　のＴａｇ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（Ｐｒｏｍｅｇａ，　Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷＩ）をミックスさせ増幅させた。ＰＣＲ条件は、商品名ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９６００　（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，　Ｏａｋ　Ｂｒｏｏｋ，　ＩＬ）を用い、９４　℃１５　秒、５８　℃１分３０秒、７２℃３０　秒のサイクルを３５回繰り返した（Ｊ　Ｊａｐａｎ　Ｄｉａｂ　Ｓｏｃ　３８：４０１−４０４，　１９９５）。
【００４４】
（Ａｌｌｅｌｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＰＣＲ増幅法を用いたミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異の検出および定量法）
末梢白血球から全ＤＮＡを抽出し、Ｈ鎖側に変異特異的プライマー３２４３Ｇ３’（５’−ＴＴＴＴＡＴＧＣＧＡＴＴＡＣＣＧＧＧＣＣ−３’）を用い、対となるプライマーｃｏｍｍｏｎ　５’　（５’−ＡＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＡＡＴＡＡＧＧＣＣ−３’）とでＰＣＲで増幅した。この方法はプライマー３’末端塩基にマッチした変異ＤＮＡは増幅されるが、ミスマッチの正常ＤＮＡは増幅されないという原理を利用した方法である。あらかじめＰＣＲ条件を検討し、９４℃１分、５７℃２分、７２℃３０秒のサイクルを３５回繰り返した。反応系は、合計５０μｌで行い、プライマー各２５ｐｍｏｌ，　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　１００　ｎｇ，　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（宝酒造）１．２５　Ｕを用いた（Ｊ　Ｊａｐａｎ　Ｄｉａｂ　Ｓｏｃ　３８：４０１−４０４，　１９９５）。
【００４５】
（ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲを用いたミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異の検出および定量法）
ミトコンドリア遺伝子３２４３変異の検出において、プライマーは、ＡＴＴＡＡＡＧＴＣＣＴＡＣＧＴＧＡＴＣ　（３，０４８−３，０６６）　と　ＡＴＧＣＧＡＴＴＡＣＣＧＧＧＣＣ　（３，２５８−３，２４３）　を用いた。ミトコンドリアＤＮＡの定量については、ＧＣＣＴＴＣＣＣＣＣＧＴＡＡＡＴＧＡＴＡＴ　（３，１６３−３，１８３）　と　ＧＡＡＧＡＧＧＡＡＴＴＧＡＡＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧ　（３，２９８−３，２７５）　を用いた。ＴａｇＭａｎ　プローブの塩基配列は、ＴＧＣＣＡＴＣＴＴＡＡＣＡＡＡＣＣＣＴＧＴＴＣＴＴＧＧＧＴＴ　（３，２４１−３，２１３）である。オリゴヌクレオチドは、ＨＰＬＣで純化し、コンタミネーションを防いだ。ＰＣＲ条件は、　９５℃１５秒、５１℃１０秒、５７℃１分の４０サイクルである。反応液には、　ＡＢＩ　ＴａｑＭａｎ　ｂｕｆｆｅｒ　Ａ，　０．０５％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ，　２．５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２，　ｄＡＴＰ，　ｄＧＴＰ，　ｄＣＴＰ，　ｄＴＴＰを各　０．１６ｍＭ，　Ａｍｐｌｉ　Ｔａｑ　Ｇｏｌｄ　（ＡＢＩ）を０．６　ｕｎｉｔｓ，　１００　ｎＭ　ＴａｑＭａｎ　プローブ、２００ｎＭ　の　ｆｏｒｗａｒｄ　と　ｒｅｖｅｒｓｅ　プライマーを、あるいは、３００　ｎＭ　のｆｏｒｗａｒｄ　プライマーと　１００　ｎＭ　のｒｅｖｅｒｓｅ　プライマーを含ませ、ミトコンドリアＤＮＡの定量のために用いた。（野見山、他。Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ，　２００２）。
【００４６】
【表４】
2004081156.tif 000005
【００４７】
前記表４に示すように、糖尿病患者１４名において、ミトコンドリア遺伝子異常（３２４３変異）をＰＣＲ−ＲＦＬＰ法およびＡｌｌｅｌｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＰＣＲ増幅法の両方で検出できる患者８名中（ヘテロプラスミーは約１％以上と考えられる）、グループ１および３に属する患者は８名であった。また、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法では検出しにくいがＡｌｌｅｌｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＰＣＲ増幅法では検出できた患者６名中、グループ１および３に属する患者は、３名であった。これらの結果は、ＡＤＨ２遺伝子の多型が、末梢血白血球内のミトコンドリア遺伝子異常のヘテロプラスミーと関係する事を示す。したがって、本発明の分類方法およびマーカーにより、ミトコンドリア性糖尿病か否かを判断できるといえる。
【００４８】
【発明の効果】
以上のように、本発明のマーカーおよび分類方法は、糖尿病および糖尿病合併症の診断並びに治療薬の評価等に有用である。したがって、本発明のマーカーおよび分類方法を用いれば、例えば、糖尿病の発症リスク、発症年齢、合併症の予測、体質にあわせた治療薬の投与（テーラーメード医療）等が可能となる。
【００４９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】高血糖状態のアルデヒドの代謝を示す図である。
【図２】アルデヒドが高濃度の場合の代謝を示す図である。
【図３】アルデヒドが低濃度の場合の代謝を示す図である。
【図４】高血糖状態のポリオール代謝を示す図である。
【図５】高血糖を長く続けていた糖尿病患者が、インスリン療法や経口血糖降下薬他、糖尿病治療薬などによって、短期間に、急激に血糖コントロールが改善した場合の、ポリオール代謝を上流として考えた影響を示す図である。
【図１】
2004081156.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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