(57)【要約】【課題】低いバックグラウンドレベルで且つ簡便に、より多様なキメラ遺伝子（群）を効率よく作製する方法、さらには、よりバラエティーに富んだキメラ遺伝子ライブラリを構築する方法を提供する。【解決手段】２種以上のＤＮＡ分子を親分子として、これらのＤＮＡ分子の末端に付加配列を結合させておき、これらを鋳型として該付加配列を有するプライマーを特定の組み合わせで用い、アニール・伸長条件を調節してＰＣＲ法を実施することで、多様な組換えを起こす。【選択図】　図１
2004081020.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２種のＤＮＡ分子を鋳型としてＰＣＲ法によりキメラ遺伝子（群）を作製する方法であって、少なくとも５′側に固有配列（ａ）を付加させたＤＮＡ分子（Ｘ）と、少なくとも３′側に固有配列（ｄ）を付加させたＤＮＡ分子（Ｙ）とを鋳型として、ＤＮＡ分子（Ｘ）のセンス鎖側の固有配列（ａ）を有するプライマーと、ＤＮＡ分子（Ｙ）の非センス鎖側の固有配列（ｄ）を有するプライマーとを用いてＰＣＲ法を実施することを特徴とする、キメラ遺伝子（群）の作製方法。
【請求項２】
少なくとも２種のＤＮＡ分子を鋳型としてＰＣＲ法によりキメラ遺伝子（群）を作製する方法であって、５′側に固有配列（ａ）を付加させ３′側に固有配列（ｂ）を付加させたＤＮＡ分子（Ｘ）と、５′側に固有配列（ｃ）を付加させ３′側に固有配列（ｄ）を付加させたＤＮＡ分子（Ｙ）とを鋳型として、ＤＮＡ分子（Ｘ）のセンス鎖側の固有配列（ａ）を有するプライマーと、ＤＮＡ分子（Ｙ）の非センス鎖側の固有配列（ｄ）を有するプライマーとのプライマーセットを用いて、又は、ＤＮＡ分子（Ｘ）の非センス鎖側の固有配列（ｂ）を有するプライマーと、ＤＮＡ分子（Ｙ）のセンス鎖側の固有配列（ｃ）を有するプライマーとのプライマーセットを用いて、ＰＣＲ法を実施することを特徴とする、キメラ遺伝子（群）の作製方法。
【請求項３】
ＰＣＲの実施において９０〜９８℃　１０〜６０秒、４０〜５０℃　１〜５秒、及び７２℃　０〜５秒のサイクルを繰り返す請求項１又は２記載のキメラ遺伝子（群）の作製方法。
【請求項４】
鋳型とするＤＮＡ分子において、該各固有配列とＤＮＡ分子末端の間に制限酵素部位が挿入されている、請求項１〜３のいずれか１項記載のキメラ遺伝子（群）の作製方法。
【請求項５】
少なくとも２種のＤＮＡ分子を鋳型としてＰＣＲ法によりキメラ遺伝子（群）を作製する方法であって、少なくとも５′側に固有配列（ａ）を付加させたＤＮＡ分子（Ｘ）と、少なくとも３′側に固有配列（ｄ）を付加させたＤＮＡ分子（Ｙ）を、ＤＮａｓｅＩで消化し断片化した後、これらの断片を鋳型としてプライマーの非存在下でＰＣＲ法を実施し、再構成された分子を鋳型として、ＤＮＡ分子（Ｘ）のセンス鎖側の固有配列（ａ）を有するプライマーと、ＤＮＡ分子（Ｙ）の非センス鎖側の固有配列（ｄ）を有するプライマーとを用いてＰＣＲ法を実施することを特徴とする、キメラ遺伝子（群）の作製方法。
【請求項６】
少なくとも２種のＤＮＡ分子を鋳型としてＰＣＲ法によりキメラ遺伝子（群）を作製する方法であって、５′側に固有配列（ａ）を付加させ３′側に固有配列（ｂ）を付加させたＤＮＡ分子（Ｘ）と、５′側に固有配列（ｃ）を付加させ３′側に固有配列（ｄ）を付加させたＤＮＡ分子（Ｙ）とを、ＤＮａｓｅＩで消化し断片化した後、これらの断片を鋳型としてプライマーの非存在下でＰＣＲ法を実施し、再構成された分子を鋳型として、ＤＮＡ分子（Ｘ）のセンス鎖側の固有配列（ａ）を有するプライマーと、ＤＮＡ分子（Ｙ）の非センス鎖側の固有配列（ｄ）を有するプライマーとのプライマーセットを用いて、又は、ＤＮＡ分子（Ｘ）の非センス鎖側の固有配列（ｂ）を有するプライマーと、ＤＮＡ分子（Ｙ）のセンス鎖側の固有配列（ｃ）を有するプライマーとのプライマーセットを用いて、ＰＣＲ法を実施することを特徴とする、キメラ遺伝子（群）の作製方法。
【請求項７】
ＤＮａｓｅＩ消化を施すＤＮＡ分子において、該各固有配列とＤＮＡ分子末端の間に制限酵素部位が挿入されている、請求項５又は６記載のキメラ遺伝子（群）の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、キメラ遺伝子を作製する方法に関し、さらにはキメラ遺伝子ライブラリを作製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年酵素・蛋白質を分子レベルで育種し、より望ましい性質を獲得した変異体を選抜する様々な技術が研究・開発されており、これらの研究は、非常に効率の良い酵素・蛋白質の機能改良につながるものとして注目される。実際に、Ｒａｎｄｏｍｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（ランダムな変異導入技術）とそれに続いた、より望ましい特性を獲得した変異体のスクリーニングというステップを繰り返すことによって行なわれる蛋白質の指向進化は、望ましい特徴を持った蛋白質を短期間のうちに創り出すことが可能であることを示唆した。しかしながら、さらに優れた性質を獲得した蛋白質分子を取得するためには、アミノ酸配列の多様性が非常に重要である。このため、高度に多様化した配列レパートリーからなる初期変異体ライブラリを構築することに多くの力が注がれてきた。
【０００３】
１種類の遺伝子を親分子として初期変異体ライブラリを作製する手法として　Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ　ＰＣＲ、Ｃａｓｓｅｔｔｅ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓなどがある。さらに、多種類の相同性のある遺伝子を親分子としてキメラ遺伝子（群）を作製する手法として例えばＤＮＡ　Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ　（ＤＮＡシャフリング法）が知られ、このような手法から作られたキメラ遺伝子ライブラリは、１種類の分子から出発する　Ｒａｎｄｏｍ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　を用いて作られたライブラリよりも多く用いられてきた。この理由は、全く新規な特性を望む場合にはアミノ酸配列に劇的な変化が一般的に要されるからである。
【０００４】
ＤＮＡシャフリング法は、相同遺伝子をＤＮａｓｅ　Ｉで切断した断片同士が、保存された領域の間で組換えを起こすことを利用したものである。遺伝子ファミリー間でのＤＮＡシャフリング法はファミリー　シャフリング法とも呼ばれ、多くの蛋白質の機能改良に用いられてきた。例えば、ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎａｓｅ　（Ｃｒａｍｅｒｉ　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　ＤＮＡ　Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ　ｏｆ　ａ　Ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｄｉｖｅｒｓｅ　Ｓｐｅｃｉｅｓ　Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ　Ｄｉｒｅｃｔ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，　Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，　３９１，　２８８−２９１）、ｂｉｐｈｅｎｙｌ　ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ　（Ｋｕｍａｍａｒｕ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄ　Ｂｉｐｈｅｎｙｌｓ　ｂｙ　Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｐｈｅｎｙｌ　Ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ，　Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　１９９８，　１６，　６６３−６６６）、ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ　Ｆ．Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　Ｋｉｎａｓｅ　ｆｏｒ　ＡＺＴ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ＤＮＡ　Ｆａｍｉｌｙ　Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，　Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，　１９９９，　１７，　２５９−２６４）、ｃａｔｅｃｈｏｌ　２，３−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ　（Ｋｉｋｕｃｈｉ　Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｏｖｅｌ　Ｆａｍｉｌｙ　Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅｓ，　Ｇｅｎｅ，　１９９９，　２３６，　１５９−１６７）、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ４５０　（Ａｂｅｃａｓｓｉｓ　Ｖ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｉｇｈ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｆａｍｉｌｙ　Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ　Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　Ｍｕｌｔｉ−ｓｔｅｐ　ＰＣＲ　ａｎｄ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ＤＮＡＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｙｅａｓｔ：　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａ　ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｈｕｍａｎ　Ｐ４５０　１Ａ１　ａｎｄ　１Ａ２，　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄ．　Ｒｅｓ．，　２０００，　２８，　ｅ８８ｑ）、ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ（Ｎｅｓｓ　Ｊ．Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．，　ＤＮＡ　ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ　ｏｆ　ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ，　Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　１９９９，　１７，　８９３−８９６）、ｔｒｉａｚｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｌａｓｅ　（Ｒａｉｌｌａｒｄ　Ｓ−Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｏｖｅｌ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ　Ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｂｙ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎｉｎｇ　Ｈｉｇｈｌｙ　Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　Ｅｎｚｙｍｅｓ，　Ｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｌ．，２００１，　８，　８９１−８９８）などである。しかし、標準的なファミリー　シャフリング法では時々、高いバックグラウンドが見られることがある。組み換わらなかった親分子がそのまま高い割合でライブラリに含まれるのである。時には１００％親分子であることもある（Ｋｉｋｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９前出）。加えて、Ｓｔｅｍｍｅｒにより示されているように、ファミリー　シャフリング法において、親分子の塩基配列間で互いに連続して一致する配列が１５ｂｐ以下の場合には、その領域では組換えはめったに起こらない（Ｓｔｅｍｍｅｒ　Ｗ．Ｐ．Ｃ．　ＤＮＡ　Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ　ｂｙ　Ｒａｎｄｏｍ　Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄ　Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　１９９４，　９１，　１０７４７−１０７５１）。従って、高いバックグラウンドレベルを改善し、比較的短い配列一致領域でも組換えが起きる、簡便で且つ効率的にキメラ遺伝子を作製する手法が求められている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、低いバックグラウンドレベルで且つ簡便に、より多様なキメラ遺伝子（群）を効率よく作製する方法、さらには、よりバラエティーに富んだキメラ遺伝子ライブラリを構築する方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を達成するために、クラゲ由来の遺伝子である緑色蛍光発光蛋白質（ＧＦＰ：Ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子とその類縁遺伝子である黄色蛍光発光蛋白質（ＹＦＰ：Ｙｅｌｌｏｗ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子（両者の塩基配列相同性は７２％である。）とをモデル遺伝子として用い、これらをＰＣＲ法の最中にキメラ化させるというアプローチで鋭意検討を行った。その結果、ある程度の相同性を有する２種以上のＤＮＡ分子を親分子として、これらのＤＮＡ分子の末端に付加配列を結合させておき、これらを鋳型として該付加配列を有するプライマーを用い、アニール・伸長条件を調節してＰＣＲ法を実施することで、伸長途上の長さの異なるプライマーを利用して多様な組換えを起こし得、このような組換えを起こした断片が指数関数的に増幅し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
従って本発明は、少なくとも２種のＤＮＡ分子を鋳型としてＰＣＲ法によりキメラ遺伝子（群）を作製する方法であって、少なくとも５′側に固有配列（ａ）を付加させたＤＮＡ分子（Ｘ）と、少なくとも３′側に固有配列（ｄ）を付加させたＤＮＡ分子（Ｙ）とを鋳型として、ＤＮＡ分子（Ｘ）のセンス鎖側の固有配列（ａ）を有するプライマーと、ＤＮＡ分子（Ｙ）の非センス鎖側の固有配列（ｄ）を有するプライマーとを用いてＰＣＲ法を実施することを特徴とする、キメラ遺伝子（群）の作製方法である。
本発明はさらに、少なくとも２種のＤＮＡ分子を鋳型としてＰＣＲ法によりキメラ遺伝子（群）を作製する方法であって、５′側に固有配列（ａ）を付加させ３′側に固有配列（ｂ）を付加させたＤＮＡ分子（Ｘ）と、５′側に固有配列（ｃ）を付加させ３′側に固有配列（ｄ）を付加させたＤＮＡ分子（Ｙ）とを鋳型として、ＤＮＡ分子（Ｘ）のセンス鎖側の固有配列（ａ）を有するプライマーと、ＤＮＡ分子（Ｙ）の非センス鎖側の固有配列（ｄ）を有するプライマーとのプライマーセットを用いて、又は、ＤＮＡ分子（Ｘ）の非センス鎖側の固有配列（ｂ）を有するプライマーと、ＤＮＡ分子（Ｙ）のセンス鎖側の固有配列（ｃ）を有するプライマーとのプライマーセットを用いて、ＰＣＲ法を実施することを特徴とする、キメラ遺伝子の作製方法である。
本発明による上記の方法を本発明者らは“ＲＤＡ−ＰＣＲ法”（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、組換え依存性指数関数的増幅）と呼称する。
【０００８】
本発明の好ましい実施態様として、鋳型とするＤＮＡ分子において、該各固有配列とＤＮＡ分子末端の間に制限酵素部位を挿入しておく態様がある。
また、本発明の好ましい実施態様として、ＰＣＲ法の実施において９０〜９８℃　１０〜６０秒、４０〜５０℃　１〜５秒、及び７２℃　０〜５秒のサイクルを繰り返す態様がある。
【０００９】
本発明者らはさらに、上記のような“ＲＤＡ−ＰＣＲ法”の手法を従来のシャフリング法と組み合わせることで、キメラ遺伝子がより効率よく作製できることを見出した。
従って本発明はまた、少なくとも２種のＤＮＡ分子を鋳型としてＰＣＲ法によりキメラ遺伝子を作製する方法であって、少なくとも５′側に固有配列（ａ）を付加させたＤＮＡ分子（Ｘ）と、少なくとも３′側に固有配列（ｄ）を付加させたＤＮＡ分子（Ｙ）を、ＤＮａｓｅＩで消化し断片化した後、これらの断片を鋳型としてプライマーの非存在下でＰＣＲ法を実施し、増幅された分子を鋳型として、ＤＮＡ分子（Ｘ）のセンス鎖側の固有配列（ａ）を有するプライマーと、ＤＮＡ分子（Ｙ）の非センス鎖側の固有配列（ｄ）を有するプライマーとを用いてＰＣＲ法を実施することを特徴とする、キメラ遺伝子の作製方法に向けられている。
本発明はさらに、少なくとも２種のＤＮＡ分子を鋳型としてＰＣＲ法によりキメラ遺伝子を作製する方法であって、５′側に固有配列（ａ）を付加させ３′側に固有配列（ｂ）を付加させたＤＮＡ分子（Ｘ）と、５′側に固有配列（ｃ）を付加させ３′側に固有配列（ｄ）を付加させたＤＮＡ分子（Ｙ）とを、ＤＮａｓｅＩで消化し断片化した後、これらの断片を鋳型としてプライマーの非存在下でＰＣＲ法を実施し、増幅された分子を鋳型として、ＤＮＡ分子（Ｘ）のセンス鎖側の固有配列（ａ）を有するプライマーと、ＤＮＡ分子（Ｙ）の非センス鎖側の固有配列（ｄ）を有するプライマーとのプライマーセットを用いて、又は、ＤＮＡ分子（Ｘ）の非センス鎖側の固有配列（ｂ）を有するプライマーと、ＤＮＡ分子（Ｙ）のセンス鎖側の固有配列（ｃ）を有するプライマーとのプライマーセットを用いて、ＰＣＲ法を実施することを特徴とする、キメラ遺伝子の作製方法に向けられている。
上記の方法の好ましい実施態様として、ＤＮａｓｅＩ消化を施すＤＮＡ分子において、該各固有配列とＤＮＡ分子末端の間に制限酵素部位を挿入しておく態様がある。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の方法を詳細に説明する。
本発明のキメラ遺伝子の作製方法を適用するのに適した少なくとも２種以上の親ＤＮＡ分子としては、ある程度の塩基配列相同性を持つことが必要である。それらの相同性は一般的に５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０〜９０％程度である。
そのような類縁遺伝子の例として、上記のＧＦＰ遺伝子とＹＦＰ遺伝子（各々７２０ｂｐ、塩基配列相同性７２％）、産業上有用な各種加水分解酵素（リパーゼやセルラーゼ等）あるいは各種の酸化還元酵素などが挙げられる。
本発明の方法は、上記のような互いに配列相同性のある２種の親ＤＮＡ分子、さらに３種以上の親ＤＮＡ分子に適用することができる。
【００１１】
［親ＤＮＡ分子の調製］
細胞、組織、臨床検体、あるいは土壌サンプルなどから、本発明の方法を適用するＤＮＡ分子を抽出してくる手法は、特に制限されるものではなく、常法に従って実施することができる。例えば、フェノール抽出法、プロテイナーゼＫ／フェノール抽出法、プロテイナーゼＫ／フェノール／クロロホルム抽出法、アルカリ溶解法、ボイリング法などがある。対象とする遺伝子ファミリー内で、高度に保存されている領域が予め分かっている場合には、雑居物を多く含む例えば土壌サンプルの希釈液などを鋳型としたＰＣＲ増幅によっても調製可能である。
また、市販されているＤＮＡ分子を使用することもできる。
【００１２】
［固有配列を付加させた親ＤＮＡ分子］
以下、二種の親ＤＮＡ分子（ＸとＹ）を用いてキメラ遺伝子を作製する場合を例にとり、本発明を説明する。
少なくとも５′側に固有配列（ａ）を付加させたＤＮＡ分子（Ｘ）と、少なくとも３′側に固有配列（ｄ）を付加させたＤＮＡ分子（Ｙ）とを用意する。さらに具体的には、５′側に固有配列（ａ）を付加させ３′側に固有配列（ｂ）を付加させたＤＮＡ分子（Ｘ）と、５′側に固有配列（ｃ）を付加させ３′側に固有配列（ｄ）を付加させたＤＮＡ分子（Ｙ）を用意する。
ここで各固有配列は、親ＤＮＡ分子にアニールせず且つ固有配列同士でアニールすることがないように選択する。固有配列の長さは１０〜５０ｂｐ程度が適当で、例えば２０ｂｐであり塩基の割合がＡ：Ｇ：Ｃ：Ｔ＝５：５：５：５となるような配列が選ばれる。
また、各固有配列と親ＤＮＡ分子の末端との間に制限酵素部位が挿入されていることが好ましい。使用できる制限酵素部位の例としては、Ｘｂａ　Ｉ部位、Ｂａｍ　ＨＩ部位、Ｅｃｏ　ＲＩ部位などがある。
【００１３】
上記のように５′側に固有配列を付加させ３′側に固有配列を付加させた親ＤＮＡ分子は、それぞれの親ＤＮＡ分子を鋳型として、該固有配列を含むプライマーを用いてＰＣＲ法を実施することで作製することができる。
５′側に固有配列（ａ）を付加させ３′側に固有配列（ｂ）を付加させたＤＮＡ分子（Ｘ）を調製するには、親ＤＮＡ分子（Ｘ）を鋳型として、付加させようとする固有配列（ａ）のセンス鎖側の配列に続けて親ＤＮＡ分子（Ｘ）のセンス鎖側の５′末端配列を有するプライマー、好ましくは付加させようとする固有配列（ａ）のセンス鎖側の配列に続けて制限酵素部位、さらに親ＤＮＡ分子（Ｘ）のセンス鎖側の５′末端配列を有するプライマーと、付加させようとする固有配列（ｂ）の非センス鎖側の配列に続けて親ＤＮＡ分子（Ｘ）の非センス鎖側の５′末端配列を有するプライマー、好ましくは付加させようとする固有配列（ｂ）の非センス鎖側の配列に続けて制限酵素部位、さらに親ＤＮＡ分子（Ｘ）の非センス鎖側の５′末端配列を有するプライマーとを用いてＰＣＲ法を実施することにより、所望の配列を付加させた親ＤＮＡ分子（Ｘ）を増幅させることができる。
【００１４】
また、５′側に固有配列（ｃ）を付加させ３′側に固有配列（ｄ）を付加させたＤＮＡ分子（Ｙ）を調製するには、親ＤＮＡ分子（Ｙ）を鋳型として、付加させようとする固有配列（ｃ）のセンス鎖側の配列に続けて親ＤＮＡ分子（Ｙ）のセンス鎖側の５′末端配列を有するプライマー、好ましくは付加させようとする固有配列（ｃ）のセンス鎖側の配列に続けて制限酵素部位、さらに親ＤＮＡ分子（Ｙ）のセンス鎖側の５′末端配列を有するプライマーと、付加させようとする固有配列（ｄ）の非センス鎖側の配列に続けて親ＤＮＡ分子（Ｙ）の非センス鎖側の５′末端配列を有するプライマー、好ましくは付加させようとする固有配列（ｄ）の非センス鎖側の配列に続けて制限酵素部位、さらに親ＤＮＡ分子（Ｙ）の非センス鎖側の５′末端配列を有するプライマーを用いてＰＣＲ法を実施することにより、所望の配列を付加させた親ＤＮＡ分子（Ｙ）を増幅させることができる。
上記のプライマーの配列中、親ＤＮＡ分子の５′末端配列に相当する配列の長さは１０〜５０ｂｐが適当であり、より好ましくは１５〜３０ｂｐである。
【００１５】
このようなＰＣＲプライマーの設計は常法に従って行うことができる。
具体例としてＹＦＰ遺伝子とＧＦＰ遺伝子とを親ＤＮＡ分子として使用する場合の、プライマーセットの一例を挙げる。以下に示す４種のプライマーは各々、配列番号１及び２がＹＦＰ遺伝子増幅用のプライマーであり、配列番号３及び４がＧＦＰ遺伝子増幅用のプライマーである。
【００１６】
【表１】
2004081020.tif 000003
上記配列において小文字部分は固有配列（ａ，ｂ，ｃ，ｄ）であり、下線付きの小文字部分はＸｂａＩ認識部位（制限酵素部位）であり、大文字部分はＹＦＰ遺伝子又はＧＦＰ遺伝子とのアニール部位である。これらのプライマーは上記名称で（株）ＦＡＳＭＡＣから入手することができる。
上記のプライマーにおける小文字部分の配列（固有配列）は、後述するＲＤＡ−ＰＣＲで用いるプライマーの配列となる。
【００１７】
【表２】
2004081020.tif 000004
【００１８】
上記ＰＣＲ法における、ＤＮＡの変性、プライマーのアニーリング、ＤＮＡ鎖伸長といった各ステップの反応温度と時間、サイクル数、反応溶液組成、使用ＤＮＡポリメラーゼなどは、常法に従って採用でき、また至適条件を適宜選択することもできる。
ここで用いるＰＣＲの好ましい反応条件として、例えば、反応時０．２　ｍＭ　デオキシヌクレオチド３リン酸、０．２μＭ　プライマー、１　ｎｇ／μｌ　鋳型ＤＮＡ、５０　ｍＵ／μｌ　ＥｘＴａｑ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社）、酵素に添付されているバッファー１／１０量からなる反応がある。
このようなＰＣＲ法の実施により、５′側に固有配列（ａ）及び制限酵素部位を付加させ３′側に固有配列（ｂ）及び制限酵素部位を付加させたＤＮＡ分子（Ｘ）、及び５′側に固有配列（ｃ）及び制限酵素部位を付加させ３′側に固有配列（ｄ）及び制限酵素部位を付加させたＤＮＡ分子（Ｙ）とを別々に増幅することができる。こうして増幅したＤＮＡ断片を各々、ａＸｂ、ｃＹｄと表す。
これらのＤＮＡ断片は、アガロースゲル電気泳動などで未反応のプライマーやプライマーダイマーなどと分離し、その後抽出して得ることができる。
【００１９】
［固有配列を持つ親ＤＮＡ分子を鋳型として用いたＲＤＡ−ＰＣＲ］
上記のようにして別々に得たａＸｂ、ｃＹｄを、混合し混合物を得る。ここでａＸｂとｃＹｄとを等モル混合した溶液を調製するのが好適である。
この混合物に、Ｘのセンス鎖側の固有配列（ａ）を有するプライマーと、Ｙの非センス鎖側の固有配列（ｄ）を有するプライマーとのプライマーセット▲１▼を用いて、又は、Ｘの非センス鎖側の固有配列（ｂ）を有するプライマーと、Ｙのセンス鎖側の固有配列（ｃ）を有するプライマーとのプライマーセット▲２▼を用いて、ＰＣＲ法を実施する。このような非対称のプライマーのセットを本発明者らは“ｓｋｅｗプライマー”又は“ｓｋｅｗプライマーセット”と呼称する。
例えば、ＹＦＰ遺伝子とＧＦＰ遺伝子とを親ＤＮＡ分子として使用し、上記表１に記載されたプライマーを用いて増幅されたＤＮＡ分子をこのＲＤＡ−ＰＣＲの鋳型とするとき、上記表２に記載されたプライマーをａ１＋ｄ１又はｂ１＋ｃ１の組み合わせで用いてＰＣＲ法を実施する。
【００２０】
ＰＣＲにおける反応条件は、アニール及び伸長反応時間を従来法より短くし、アニール温度を従来法より低くするような条件を採用する。こうすることによって伸長途上のプライマーが組換えに寄与し得、プライマーセット▲１▼の使用により遺伝子の前部がＸ及び後部がＹ由来の配列からなるキメラ遺伝子が作製され、プライマーセット▲２▼の使用により前部がＹ及び後部がＸ由来の配列からなるキメラ遺伝子を作成することが可能となる。
さらに詳しくいうと、アニール、伸長反応の時間を短くすると、添加したプライマーは１回のサイクルでは最後まで完全に伸長を行うことができない。加えて、比較的低いアニール温度を採用するため、伸長途中のプライマーは次のサイクルにおいてもとの鋳型とは異なる親分子にアニールしやすくなる。またＤＮＡポリメラーゼの活性が低下し、複数のサイクルにまたがるプライマー伸長反応が起こりやすくなる。ここで、同一の鎖上で伸長反応を完結した（途中で終っていても良いが）フラグメント自身は、以降のサイクルでは伸長反応の鋳型とはならない。それは、もう一方のプライマーがアニールする部分がないためである。このため、親ＤＮＡ分子の数は直線的にしか増幅されない。これに対して、もう一方のストランドとアニールし伸長したプライマー（組換えを起こしたプライマー）は、もう一方のｓｋｅｗ　プライマーとアニールできるため、以降のサイクルで伸長反応の鋳型となって、指数関数的に増幅されることとなる。この結果として、このシステムでは、奇数個のクロスオーバーポイントを持つキメラ遺伝子のみ選択的に蓄積されることになる。
【００２１】
使用するＤＮＡポリメラーゼとしては、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであれば特に制限されず、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼやＥｘＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。一般に、突然変異の導入を防ぎ最終産物の収量を増加させるために、ＥｘＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを使用するのが好ましい。その他の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用することも可能であって、例えば　Ｐｆｕ　ｔｕｒｂｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）などを使用することができるが、未熟な伸長途上のプライマーを発生させる必要があるため、低い伸長速度を持った耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好まれる。
ＰＣＲ反応溶液の組成は常法に従うことができる。例えば、反応時０．２　ｍＭ　デオキシヌクレオチド３リン酸、０．５μＭ　プライマー、５０　ｍＵ／μｌ　ＥｘＴａｑ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社）、酵素に添付されているバッファー　１／１０量である。
反応溶液における鋳型ＤＮＡ濃度は、それぞれの鋳型ＤＮＡ分子につき１０〜５００ｐｇ／μｌが適当であり、より好ましくは１０〜１００ｐｇ／μｌである。この濃度が５００ｐｇ／μｌを超えると、組換えを起こさなかったＤＮＡ断片と親分子との複合体や、元の親分子がかなりの割合で、生じてきたキメラ遺伝子に混入するからである。
【００２２】
ＲＤＡ−ＰＣＲ法における各ステップの反応時間・温度、サイクル数は適用する鋳型ＤＮＡ分子に応じて、またキメラ遺伝子の収量を上げるように適宜選択できる。変性ステップは、２本鎖ＤＮＡを１本鎖へと変性させるのに十分な条件を適宜選択し実施すればよい。一般に変性ステップは９０〜９８℃　１０〜６０秒の範囲で実施され、さらに９２〜９６℃　２０〜４０秒がより好ましい。
変性のステップに続くアニール及び伸長反応においては、一般に従来法よりも時間を短くし、アニール温度を従来法より低くするような条件を選択する。例えばアニール伸長ステップとして４０〜５０℃の温度、好ましくは４０〜４５℃の温度が選択でき、変性ステップ及びアニール伸長ステップのサイクルを繰り返す。また、アニール伸長ステップと変性ステップとの間にもう一段階の伸長ステップを設けてもよく、その伸長ステップは例えば７２℃で５秒まで、好ましくは３秒程度までである。従って、反応条件の典型的な例として９４℃　６０秒、その後、９４℃　３０秒、４０〜４５℃　１〜５秒、７２℃　０〜３秒を４０サイクル、続いて９４℃　３０秒、５０℃　３０秒、７２℃　３０秒を１０サイクルが挙げられる。後半の１０サイクルはキメラ遺伝子の収量を上げるための増幅ステップである。
【００２３】
こうして増幅された断片は制限酵素処理を行った後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などで解析することができ、プラスミドベクター等に挿入することでキメラ遺伝子ライブラリとすることができ、また、発現ベクターに挿入して、例えば大腸菌を形質転換して遺伝子を発現させることも可能である。
【００２４】
本発明の方法の一例の概要を図１に示す。（１）親遺伝子もしくは遺伝子グループ（ｇｅｎｅ　Ａ、Ｂ、ＣとＸ、Ｙ、Ｚ）を別々に遺伝子特異的なプライマーで通常のＰＣＲ法により増幅する。ただし、プライマーには任意に設定した配列が付加されている（図中ａ、ｂ、ｃ、ｄ）。図１中のａ、ｂ、ｃ、ｄには上記で説明してきた固有配列又は固有配列と制限酵素部位が含まれる。（２）２つの親ＤＮＡ分子グループを混合し、２つに分ける。（３）　ＲＤＡ−ＰＣＲを行う。キメラ遺伝子プールを産出するために、固有配列ａとｄもしくは固有配列ｂとｃの　ｓｋｅｗ　プライマーセットを用いる。こうすることで、左側のラインでは、遺伝子の前部がＡ／Ｂ／Ｃまたはそれらのキメラで、後部がＸ／Ｙ／Ｚまたはそれらのキメラを中心としたライブラリが構築し得、一方右側のラインでは、遺伝子の前部がＸ／Ｙ／Ｚまたはそれらのキメラであり、後部がＡ／Ｂ／Ｃまたはそれらのキメラを中心としたライブラリを構築し得る。（４）適切な発現ベクターにクローニングする。（５）さらにファミリー　シャフリング法を実施することもできる。
【００２５】
［ＲＤＡ−ＰＣＲのシャフリングとの組み合わせ］
上記説明してきた方法は、従来のシャフリング法と組み合わせて実施することもできる。
上記のように少なくとも２種の親ＤＮＡ分子に付加配列を結合させた、例えばａＸｂとｃＹｄとを、等モル混合した溶液を調製する。ファミリー　シャフリング法は常法により実施することができ、例えば　Ｓｔｅｍｍｅｒ　Ｗ．Ｐ．Ｃ．　ＤＮＡ　Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ　ｂｙ　Ｒａｎｄｏｍ　Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　１９９４，　９１，　１０７４７−１０７５１に報告されているような手法を用いることができる。上記溶液にＤＮａｓｅ　Ｉによるランダム消化を施し、プライマーを入れないＰＣＲを実施し、再構築されたフラグメントを得る。
ＤＮａｓｅ　Ｉによる消化は、一般的にはマグネシウムイオンを含んだ緩衝液に溶解させた鋳型混合液に対し１　ＵのＤＮａｓｅ　Ｉを加え、適当な時間保温することによってなされる。ファミリーシャフリングに用いる断片は、２０−１００ｂｐの断片長であることが好ましいので、このような断片長が得られるよう、反応時間と酵素量を調節する必要がある。
プライマーを加えないＰＣＲ様の反応は、一般的なＰＣＲの反応条件と同一であり、例えば９４℃３０秒、５０℃３０秒、７２℃３０秒からなる温度サイクルを３０回繰り返すことによってなされる。
こうして得られたフラグメントを鋳型として更なるＰＣＲを実施し、このＰＣＲにおいて、上記に説明したプライマーセット▲１▼又はプライマーセット▲２▼のようなｓｋｅｗプライマーを用いて増幅する。Ｓｋｅｗプライマーセットを用いれば、ＲＤＡ−ＰＣＲと同様に組換えを起こして生じたキメラ遺伝子のみ指数関数的な増幅が起こる。このＰＣＲの反応条件は上記のプライマーなしのＰＣＲと同様にすることができる。
【００２６】
このように、従来法であるシャフリング法にｓｋｅｗプライマーを組み合わせることで、組換えを起したキメラ遺伝子をより効率的に取得することが可能となる。また、ＲＤＡ−ＰＣＲと、ｓｋｅｗプライマーを用いたファミリーシャッフリング法を組み合わせて使用する（ＲＤＡ−ＰＣＲにより作出されたキメラ遺伝子ライブラリを用いてファミリーシャッフリングを行う場合や、またその逆の場合）ことにより、多様な組換えを起こすことが可能となり、より多様なキメラ遺伝子、より多様なキメラ遺伝子ライブラリを作製することができるようになる。
こうして増幅された断片は制限酵素処理を行った後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などで解析することができ、プラスミドベクター等に挿入することでキメラ遺伝子ライブラリとすることができ、また、発現ベクターに挿入して、例えば大腸菌を形質転換して遺伝子を発現させることも可能である。
【００２７】
［キメラ遺伝子ライブラリの構築］
上記のようにして増幅された断片は制限酵素処理を行った後、プラスミドベクター、あるいはファージ、コスミドなどのベクターに挿入することによって、キメラ遺伝子ライブラリを作ることができる。
遺伝子ライブラリの作製に用いるベクターは取得した遺伝子断片を挿入できるものであればどのようなものでも可能であるが、より望ましくは、挿入した遺伝子を発現できるように設計されたものを用いるほうが良い。つまり遺伝子発現に必要なＲＮＡポリメラーゼの認識部位（プロモーター、ターミネーター）、リボソームの認識部位などを組み込んだベクターである。また正しい向きで遺伝子が挿入され、挿入した遺伝子の遺伝暗号（コドン）の読み枠（フレーム）がずれないように設計されたものであることも重要である。遺伝子をこれらのようなベクターに挿入し、遺伝子ライブラリを構築する方法は通常のどのような方法を用いても良い。
例えば、キメラ遺伝子の増幅断片を好ましい制限酵素で処理を行い、電気泳動で断片のみを分離した後精製を行い、あらかじめ同じ制限酵素で処理を行ったプラスミドベクターと混合する。このＤＮＡ溶液にＤＮＡリガーゼを加えて１６℃に保温することでキメラ遺伝子断片とベクターを連結する。宿主となる菌体溶液と混合する（この場合大腸菌）し、３０分間程度氷冷した後、４２℃で、４０秒から５０秒程度加熱し、急冷を行う。この菌液を１時間程度前培養してから適切な抗生物質を含むプレート倍地に植菌し、３７℃で培養することによって遺伝子ライブラリが構築される。
【００２８】
【実施例】
以下に実施例をもって、本発明を詳細に説明する。本発明はこれらの記載に限定されるものではない。
１．材料
ｇｆｐ（ＧＦＰ遺伝子）とｙｆｐ（ＹＦＰ遺伝子）はクロンテック（株）より購入した。組換えＴａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（ｒＴａｑ）とＥｘ　Ｔａｑは宝酒造（株）より購入した。ＰＣＲ、シーケンスに用いるプライマーは（株）ＦＡＳＭＡＣより購入した。該プライマーの配列とその名前は次のとおりである。
ａｘ／ＹＦ１：ｇｃｔａｃｇｃａｔｇａａｔｇｃｇｔａｃｔｔｃｔａｇａｔＡＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡ
ｂｘ／ＹＲ１：ｇｇａｔｔｃｃａｃａｔａｇｔｃｔｃａｇｇｔｃｔａｇａｔＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡ
ｃｘ／ＧＦ１：ｇａｃｇｃｔｔｃｔｇａａｇａａｇｔｃｃｔｔｃｔａｇａｔＡＴＧＡＧＴＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＴＴＴ
ｄｘ／ＧＦ１：ｔｇｃｃｇｇａｔａｃｔｔｇａａｔａｇｃｃｔｃｔａｇａｃＣＴＡＴＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴＣＡＴＣＣＡＴＧＣ
小文字部分は　ｓｋｅｗ　プライマーのアニール部位（固有配列）、下線部で示したところは　Ｘｂａ　Ｉ部位、大文字はｙｆｐもしくはｇｆｐのアニール部位である。
ｓｋｅｗ　プライマーの名前と配列は次のようになっている。
ａ：ｇｃｔａｃｇｃａｔｇａａｔｇｃｇｔａｃｔ
ｂ：ｇｇａｔｔｃｃａｃａｔａｇｔｃｔｃａｇｇ
ｃ：ｇａｃｇｃｔｔｃｔｇａａｇａａｇｔｃｃｔ
ｄ：ｔｇｃｃｇｇａｔａｃｔｔｇａａｔａｇｃｃ
これらの４つのプライマーは何れの親分子とミスアニールせず、且つプライマーダイマーを形成しないように注意して設計したものである。
【００２９】
２．親分子の調製
ｙｆｐとｇｆｐは、ＰＣＲ法にて、それぞれ上記のプライマーのセット　ａｘ／ＹＦ１＋　ｂｘ／ＹＲ１　及び　ｃｘ／ＧＦ１＋ｄｘ／ＧＦ１　を用いて増幅した。増幅した断片（ａＹｂとｃＧｄと表記する）はアガロースゲル電気泳動で未反応のプライマーや、プライマーダイマーと分離し、その後抽出し、エタノールを加えて沈殿した。
ここで用いたＰＣＲの条件は、一般的に行われているものであり、９４℃３０秒、５０℃３０秒、７２℃３０秒の温度サイクルを２５回繰り返すことによって増幅を行った。アガロースゲル電気泳動は、一般的な緩衝液系で行った。アガロースゲルの濃度は１％であった。エチジウムブロマイド染色を行うことで増幅産物を可視化し、その領域のアガロースゲルをナイフで切り取った。アガロースゲルからの増幅断片の抽出は、アガロースゲルを凍結融解した後に圧潰し、さらにフェノール抽出を行うことで達成した。得られた抽出液に対し、終濃度３００　ｍＭとなるように酢酸ナトリウムを加え、さらに２．５　倍容のエタノールを加えることにより増幅断片を沈殿として回収した。
【００３０】
３．ファミリーシャフリング
ａＹｂとｃＧｄのファミリーシャフリングは基本的には、Ｓｔｅｍｍｅｒ　Ｗ．Ｐ．Ｃ．　ＤＮＡ　Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ　ｂｙ　Ｒａｎｄｏｍ　Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　１９９４，　９１，　１０７４７−１０７５１　の報告にしたがって行った。以下略記する。ａＹｂとｃＧｄの溶液を等量混合し、ＤＮａｓｅ　Ｉによるランダム消化を行った。１００　ｂｐ以下の消化断片を２％　アガロースゲルにより分離し、鋳型として用いた。シャフリング反応は、宝酒造（株）のｒＴａｑとプレミックスバッファーを用いてオリジナルのプロトコルにしたがって行った（上記　Ｓｔｅｍｍｅｒ，　１９９４）。プライマーを入れないＰＣＲは次に記すサイクル条件で行った。９４℃　６０秒のあと、９４℃、３０秒、５０℃　３０秒、７２℃　３０秒を２５サイクル行った。再構築されたフラグメントはフェノール抽出した後、エタノールを用いて沈殿した。その後、これを次のＰＣＲの鋳型とした。再構築した断片のＰＣＲ増幅はプライマーの平行セット（ａ＋ｂ，　ｃ＋ｄ）またはｓｋｅｗプライマーセット（ａ＋ｄ，ｂ＋ｃ）を用いた。サイクル条件はプライマーなしのＰＣＲと同じ条件で行った。合成した産物は、ゲル電気泳動のあと精製して、滅菌水中に最終濃度が２０ｎｇ／μｌになるように溶解した。
【００３１】
４．ＲＤＡ−ＰＣＲ
ＲＤＡ−ＰＣＲには、ａＹｂとｃＧｄを等モル混合した溶液を鋳型として用いた。ＲＤＡ−ＰＣＲには、ｒＴａｑの代わりにＥｘＴａｑ（宝酒造（株））を用いた。これは突然変異の導入を防ぎ、最終産物の収量を増加させるためである。反応溶液の組成は酵素に添付されている反応液組成を参考にした。典型的なＲＤＡ−ＰＣＲの反応条件は下記のとおりである。９４℃　６０秒、その後、９４℃　３０秒、４５℃　５秒、７２℃　３秒を４０サイクル、続いて９４℃　３０秒、５０℃　３０秒、７２℃　３０秒を１０サイクルである。キメラ遺伝子の生産は最初の４０サイクルの中で行われると考えられ、後半の１０サイクルはキメラ遺伝子の収量を上げるための増幅ステップである。
【００３２】
５．ＲＦＬＰ分析（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：制限酵素切断片長多型分析）
こうしてクローン化したキメラ遺伝子を通常のＰＣＲ法（５μｌ／ｒｅａｃｔｉｏｎ、９４℃　６０秒のあと、９４℃、３０秒、５０℃　３０秒、７２℃　３０秒を２５サイクル）にて増幅し、増幅された産物を８０ｎｇ以上含む反応混合物２μｌを、０．５ＵのＡｌｕ　Ｉを含む制限酵素含有反応系１０μｌ（３３　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ　（ｐＨ７．９），　１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，６６　ｍＭ　酢酸カリウム、１ｍＭ　ＤＴＴ，　０．０１％　ＢＳＡ）（宝酒造（株））に直接加えて、３７℃、２時間インキュベートした。得られた　Ａｌｕ　Ｉ消化フラグメントを６％のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により解析した。
【００３３】
６．ＲＤＡ−ＰＣＲの成否と最適化
ＲＤＡ−ＰＣＲ法の結果を図２に示す。図２の上部に示すように反応系に添加するプライマー（ａ，ｂ，ｃ）及び親ＤＮＡ分子（鋳型）（ａＹｂ，ｃＧｄ）を変動させた。５μｌの反応混合物を１％アガロースゲル電気泳動にかけた。右側にある矢印は親分子の移動度を表している。レーンＭはサイズマーカーである。モデル親分子として、野生型ＧＦＰ遺伝子とその派生体であるＹＦＰ遺伝子を用いた。ｙｆｐのコドン使用頻度は哺乳類での発現用に最適化されているため、ＤＮＡ配列レベルでのｇｆｐとｙｆｐのホモロジーは７４％である。しかも、連続して一致する塩基数は平均すると３ｂｐである。これはシャフリング法のテストケースに用いられたｍｕｒｉｎｅ　とｈｕｍａｎ　ＩＬ−１β遺伝子よりも低い値である（Ｓｔｅｍｍｅｒ，　１９９４前出）。図２に示されるデータは、７６０ｂｐ付近のＤＮＡ増幅を示している。これはｓｋｅｗ　プライマーセット（ｂとｃ）と２つの親遺伝子（ａＹｂとｃＧｄ）に依存的に増幅されていることがはっきりと示されている。同じ結果が、もう１つのｓｋｅｗ　プライマーセット（ａとｄ）でも得られた（図示していない）。
【００３４】
さらにＲＤＡ−ＰＣＲの最適化を検討した。まず増幅におけるアニール・伸長の温度条件プログラムが、産出されるキメラ遺伝子の収量に与える影響を調べた。
図３Ａの実験ではＳｋｅｗ　プライマーセットにｂとｃを用いた。１２μｌの反応液を４つのチューブに分け、次の条件でＲＤＡ−ＰＣＲを行った。９４℃　６０秒のあと、９４℃、２０秒、Ｘ℃　５秒を４０サイクル行った。その後、９４℃、３０秒、５０℃　３０秒、７２℃３０秒を１０サイクル行った。該Ｘ℃（アニール・伸長温度）を５５℃、５０℃、４５℃、４０℃で変動させた。その結果は５５℃（レーン１）、５０℃（レーン２）、４５℃（レーン３）、４０℃（レーン４）となった。
図３Ｂの実験ではＳｋｅｗ　プライマーセットにａとｄを用いた。アニールステップの後にさらに７２℃で３秒間伸長するステップを導入した効果を観察した。各反応の温度条件は次のとおりである。レーン１及び２：９４℃、１分の後、９４℃　２０秒、５０℃（レーン２は４５℃）　５秒、７２℃　３秒を４０サイクル、その後、９４℃　３０秒、５０℃　３０秒、７２℃　３０秒を１０サイクル、レーン３：９４℃、１分の後、９４℃　２０秒、４５℃　５秒を６０サイクル、９４℃　３０秒、５０℃　３０秒、７２℃　３０秒を１０サイクル、レーン４：９４℃、１分の後、９４℃　３０秒、５０℃　３０秒、７２℃　３０秒を２５サイクル（従来ＰＣＲ法の典型的な温度プログラム）。右側の矢印は親／キメラ遺伝子断片の移動点を示す。レーンＭはサイズマーカーである。
【００３５】
以前に報告されているように、２つの似た配列同士の相同組換えはアニール／伸長温度が５５℃以上では効率的に起こらないことがわかっている（ＫａｗａｒａｓａｋｉＹ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ａ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｍａｐｐｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｄｏｍａｉｎ　ｂｙ　Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｈｏｒｔｅｓｔ　Ａｍｐｌｉｃｏｎ　Ｕｓｉｎｇ　ＰＣＲ．　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　２００２，　３０３，　３４−４）。ｙｆｐとｇｆｐのキメラ遺伝子創出の場合、効率的に行うためにはアニール・伸長は４５℃以下で行うのが好ましい（図３Ａ）。しかし、温度をさらに下げても（３７℃以下）、改善効果は見られなかった。これはおそらく、プライマーのアニールの厳密性が低くなったこと、そしてＴａｑ　ＤＮＡ　ポリメラーゼが低い温度ではうまく機能しないことが原因であると考えられる。
キメラ遺伝子の収量を増加するために、アニール伸長ステップと変性ステップの間にさらに７２℃で数秒間伸長させるステップを導入してみたところ、サイクル数を増やした場合よりも効果があった（図３Ｂ）。しかしながら、反応条件を通常のＰＣＲで用いられる条件（伸長反応７０℃、３０秒）で行うと、キメラ遺伝子が増幅されなかった。これはおそらく、プライマーが同一鋳型上で伸長を完結するのに十分な時間があったためであると考えられる。この結果より、未熟なプライマーを創り出すことが、相同組換えには不可欠であるということがわかった。
【００３６】
ここで、ｙｆｐとｇｆｐにおいて至適化されたこの反応条件は、他の全ての場合にも適用できるというわけではない。一般的に、温度と、アニール・伸長時間はケースごとに至適化する必要がある。これらは親分子の全体的、もしくは局所的な相同性（配列類似性）、またはｓｋｅｗ　プライマーのＴｍ値や厳密性、親分子の長さに依存するからである。実際、親分子を同一のもの（ａＧｂとｃＧｄ）にした場合、相同性のある２種類の親分子を用いた場合に比べて、キメラ遺伝子の合成量は多かった。そして、組換え反応はより高いアニール伸長反応（５５℃以上）において観察できた。
【００３７】
さらに、反応液中における鋳型とする親ＤＮＡ分子の濃度を検討した。親分子濃度も、最終的なキメラ遺伝子の収量に影響を与えることが示された（図４）。親ＤＮＡ分子、ａＹｂとｃＧｄの濃度を変えて反応に加え、最終濃度を図４の上部に示した。ＲＤＡ−ＰＣＲの反応条件は先の「４．ＲＤＡ−ＰＣＲ」に記載したものに従った。図４中、レーンＭはサイズマーカーである。このデータによれば効率的にキメラ遺伝子を産出するには、それぞれ約１３ｐｇ／μｌ以上の親分子が必要であることを示している。しかしながら、５００ｐｇ／μｌ以上の鋳型濃度は避けるべきであると考えられる。なぜなら、組換えを起さなかったＤＮＡ断片と親分子との複合体や、元の親分子がかなりの割合で、生じてきたキメラ遺伝子に混入するからである。
【００３８】
７．キメラ遺伝子のクロスオーバーポイントのＲＦＬＰ解析
ファミリー　シャフリングまたはＲＤＡ−ＰＣＲによって産出されたキメラ遺伝子の違いを明らかし、この２つの手法の互換性について検討した。これら２つの方法を比較するために、通常のプロトコル（前記Ｓｔｅｍｍｅｒ，　１９９４）にしたがって、ｙｆｐとｇｆｐのファミリー　シャフリングを行った。しかし、ｇｆｐ特異的プライマーを使ってランダムに選択した、ファミリー　シャフリングにより作られた２０クローンには組み換わった遺伝子は全くなかった。この場合、取得したライブラリはシャッフルされていないｇｆｐのみから構成されているものであった。これはおそらく、ｇｆｐとｙｆｐの間には連続して一致する塩基数の平均が３ｂｐであることが原因であると考えられる。前記Ｓｔｅｍｍｅｒ，　１９９４が、ｍｕｒｉｎとｈｕｍａｎ　ＩＬ−１β（連続して一致する塩基数の平均は４ｂｐ）との間のキメラ創出ではうまく行かず、Ｔａｑ　ＤＮＡ　ポリメラーゼの代わりに、Ｋｌｅｎｏｗ　ｆｒａｇｍｅｎｔ（クレノウ断片）を低い温度で使用することが必要であったと報告していることからも推察される。他の研究グループの報告では、２種類のｃａｔｅｃｈｏｌ　２，３−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ由来のキメラ遺伝子は、アミノ酸配列レベルでのホモロジーが８４％であるにもかかわらず、ほとんど産出されなかった（１％以下）ということを報告している。
【００３９】
一方、ｓｋｅｗ　プライマー（ｂとｃ）を利用することにより、シャフリングにおいて、組換えの効率を劇的に改善することができた。アニールステップにおける温度や時間の変更は全く影響がなかったにも関わらずである。このデータは、ＤＮａｓｅ　Ｉで消化された断片では親分子と全く同じ配列間での集合が起こりやすいということを示している。この結果、取得したＰＣＲ産物は組換えすることなしに再構築された親分子が大部分を占めることになる。一方　ｓｋｅｗ　プライマーは、シャッフルされない分子、すなわち親分子と同じ配列になるように複製された分子は、以降のサイクルで鋳型として認識されないので、組換えを起したキメラ遺伝子のみが指数関数的に増幅される。従って、ｓｋｅｗ　プライマーをファミリー　シャフリングの際に用いることが提案される。
【００４０】
シャフリングによって得た断片をＴ−ｖｅｃｔｏｒ（ｐＧＥＭ−Ｔ，　Ｐｒｏｍｅｇａ）につなぎあわせ、その後、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５αＦＴに形質転換した。
組換えが起こったキメラ遺伝子をＡｌｕ　Ｉ処理して得られる電気泳動パターンは、２つの親分子をそれぞれＡｌｕ　Ｉ処理して得られる電気泳動パターンとは異なる。また、組換えの起こった部位によっても泳動のパターンは異なってくる。このことを利用して、組換えが起こったキメラ遺伝子クローンと組換えが起こった部位の同定を簡便に行うことができる評価系を構築した。
図５は２つの方法で得たキメラ遺伝子クローンをランダムに選択してＡｌｕ　Ｉを用いて解析したＲＦＬＰの比較を表す。図５ＡはａＹｂとｃＧｄのＡｌｕ　Ｉ認識部位を示す。挿入断片はコロニーＰＣＲで増幅し、ＲＦＬＰ解析に用いた。ｙｆｐとｇｆｐはＡｌｕ　Ｉにより認識される部位がそれぞれ１個所と９個所ある（図５Ａ）。図５Ａの上のパネルでは、親遺伝子を２つの長方形として、Ａｌｕ　Ｉ　認識部位の位置とならべて並べて示してある。ａ、ｂ、ｃ、ｄと表記した小さい長方形はｓｋｅｗ　プライマーのアニール部位を示す。ローマ数字付きのかぎで示された領域（この領域は２つの親分子のＡｌｕ　Ｉ認識部位間で区切っている）で組換えが起こった場合のＡｌｕ　Ｉ消化断片の典型的な電気泳動パターンをその下のパネルに示す（ただし１つの遺伝子につきクロスオーバーは１回しか起こらなかったと仮定している）。断片のパターンのローマ数字は上のパネルのものと一致する。白と黒のバーはそれぞれ、ｙｆｐ由来、ｇｆｐ由来のものを示す。キメラ遺伝子特異的Ａｌｕ　Ｉ　断片はアスタリスク付きの平行線の入ったバーで示す。その下にあるテーブルは親分子全長に対するフラグメントサイズのパーセンテージ（頭としっぽにつけた配列は除く）、そのフラグメント内における親分子間の配列の類似性、連続して一致する塩基配列のうち最も長い部分の塩基数、そして６塩基以上連続して一致する配列が出てくる頻度を示す。ＲＦＬＰによって明らかになったクロスオーバーポイントの実際の分布も表にしてある。図５Ｂは　ＲＤＡ−ＰＣＲによって産出されたキメラ遺伝子（上）と、ファミリーシャフリング法（下）によって得られたキメラ遺伝子クローンのＲＦＬＰ分析結果を表す。クローンの番号がレーンの上に記されている。レーンＭはマーカーである。ＲＤＡ−ＰＣＲにより構築されたキメラ遺伝子ライブラリのＡｌｕ　Ｉ　消化の結果をレーン　ｌｉｂ．に示す。レーン　ｌｉｂ．のアスタリスク付きローマ数字は、図５Ａのパネルの下のフラグメントと一致する。各レーンの下のローマ数字は、それぞれのフラグメントパターンの解析結果から得られた、それぞれのクロスオーバーポイントの位置（図５Ａ）を示す。レーン　１７のＮ．Ｉ．　（ｎｏｔ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ）はフラグメントパターンからクロスオーバーポイントを同定できなかったことを示す。
【００４１】
ＲＤＡ−ＰＣＲによって得たキメラ遺伝子はファミリー　シャフリングによって得たものと明らかに異なるＲＦＬＰとして検出された。ＲＤＡ−ＰＣＲによって得た全てのクローンと、ファミリー　シャフリングによって得た２０クローンのうち１９クローンは、１回のクロスオーバーが起こったときに期待される泳動パターン（図５Ａ）のうちの１つと一致した（つまり大部分のものは１回の組換えしかおこしていない）。このテストをした限りでは、ファミリー　シャフリング法で得たクローンの１つだけが例外であった（図５Ｂの１７番目）。このクローンのＡｌｕ　Ｉ断片パターンは１回のクロスオーバーだけでは説明できない。この事実は、キメラ遺伝子は複数のクロスオーバーポイントを持っている可能性を示している。これらのデータは両方法ともに、得られたキメラ遺伝子は１回のクロスオーバーのみのキメラ遺伝子がライブラリの大部分を占めていることを示している。
【００４２】
両手法のクロスオーバーポイントの分布は類似したものだったが、全く同じというわけでもなかった。両ライブラリにおいて、ランダムに選択したキメラクローンには領域（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）にクロスオーバーポイントを持ったものはなかった（図５Ａ）。大部分のクロスオーバーポイントは親分子の領域（ｉｖ）〜（ｘｉ）の間にあった。シャフリングにより得たクローンのクロスオーバーポイントは、おもに領域（ｖ）、（ｖｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘ）のような、親分子間で６塩基以上が連続して一致する頻度が高く、かつ比較的長い連続一致塩基長を有する領域に集中した。一方、ＲＤＡ−ＰＣＲでは連続して一致している配列に対する依存性というものはあまり顕著ではなかった。むしろＲＤＡ−ＰＣＲでは、連続して一致する配列と言うよりも、その領域全体における配列の類似性が影響を与えているようであった。
しかし、２０個のうち、３つのクローンが、親分子の最後の１２塩基のところにクロスオーバーポイントがあった（領域（ｘｉ）、ただし、Ｘｂａ　Ｉ部位は遺伝子の外の領域となるため除いてある）。この位置でのクロスオーバーの頻度は、配列の類似性や、連続して一致する配列の出現頻度や長さから期待される頻度よりも高いものだった。しかしながら、余分に付加した配列（ｓｋｅｗ　プライマーのアニール部位）の分までカウントに入れると、領域（ｘｉ）の局所的な配列同一性は８１％まで高まる。これは未熟な（完全に最後まで伸長していない）プライマー（ｂプライマー）が、片割れのｇｆｐストランドにアニールするのに十分であるのかもしれない。シャフリングではこの領域にクロスオーバーポイントを持ったクローンが見られなかった。
各クローンのＲＦＬＰ解析により、親分子の前半にクロスオーバーポイントをもつキメラの頻度がかなり低いということが示された。これらがライブラリ中に低頻度ながらも存在することは、ライブラリのＡｌｕ　Ｉ消化により明らかにされた（図５Ｂ　レーン　ｌｉｂ．、これらのクロスオーバーに相当するバンドにはアスタリスクが付与してある）。しかしながら、これらに相当する断片は強度が弱く、これらの領域でのクロスオーバーはやはり低頻度であることを示している。
【００４３】
８．キメラ遺伝子のシーケンス解析
クロスオーバーポイントを正確に特定するために、両方のライブラリからランダムに１０クローンを選び、シーケンシング解析を行った。決定されたクロスオーバーポイントを図６に示す。クロスオーバーポイントは親分子のＤＮＡ配列アライメントの上にかぎつきの四角で囲ってある。ファミリーシャフリングのクロスオーバーポイントには１〜１０の番号をふり、ＲＤＡ−ＰＣＲのクロスオーバーポイントには１１〜２０の番号をふってある。Ａｌｕ　Ｉの認識部位には下線が施してある。配列の左に記してある数字はヌクレオチドの番号である（親分子の開始コドンの最初の塩基を＋１としている）。
ファミリーシャフリングのクローンでは、クロスオーバーポイントにおける連続一致配列長の平均塩基数は７．２ｂｐであった。これに対して、ＲＤＡ−ＰＣＲのクローンでは５．３　ｂｐであった。このことは、ＲＤＡ−ＰＣＲにおけるクロスオーバーは、ファミリーシャフリングよりも比較的短い連続一致配列の領域で起こることを示している。ファミリーシャフリングで得られたクローンでは、クロスオーバーに長い連続一致配列が必要であることは、図５の結果と非常に良く一致する。
さらに、ＲＤＡ−ＰＣＲでは１０クローンのうち、３つのクローンにおいて、完全に一致する塩基が２ｂｐのみのところにクロスオーバーポイントがあった。このことは、ＲＤＡ−ＰＣＲをもちいれば、わずか２ｂｐの連続一致配列が有ればキメラ遺伝子を創出することができることを意味する。もちろん親分子間にはその両側、もしくは片側には高度に類似性がある配列が必要ではある。でなければ、伸長途中のプライマーは別の親のストランドにアニールすることができないからである。
【００４４】
クロスオーバー領域の長さに加えて、ＲＤＡ−ＰＣＲ由来の１０クローンの中には重複するものはなかった。これに対してファミリー　シャフリングでは、いくつかのクローンが同一のクロスオーバーポイントを持っていた。このことは、クロスオーバーの位置という点においては、ＲＤＡ−ＰＣＲはファミリー　シャフリングよりも、より高い多様性を持っているということを示している。この点については別の解析によっても確かめた（図７）。
任意に設定したクロスオーバーポイントで組換えを起したキメラ遺伝子がライブラリ中にあるか調べた。このために、任意に設定したクロスオーバーポイントにアニールするようにデザインした短いプライマー（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ　ｐｒｉｍｅｒ、１７−１９　ｂｐ，　Ｔｍ＝４５−４８℃）（図７に示す）を用意した。図７Ａは任意に設定したクロスオーバーポイントと、その領域にアニールするように設計したプライマーの位置を示す。プライマーは一続きの四角で示している。黒色、斜線入り、白抜きの四角はそれぞれ、ｇｆｐ、任意に設定したクロスオーバーポイント、ｙｆｐの配列を示している。四角の上の矢印はプライマーの向き（５′→３′）である。図７Ｂはこれらのプライマーを用いたＰＣＲの結果を表す。ＲＤＡ−ＰＣＲ由来のキメラ遺伝子ライブラリ（レーンＲ）、ファミリー　シャフリング由来のライブラリ（レーンＳ）を希釈して鋳型溶液として最終濃度２０　ｐｇ／μｌとなるようにＰＣＲ反応液に加えた。コントロールとして、等量のａＹｂとｃＧｄの混合液（それぞれ濃度１０ｐｇ／μｌ）をキメラ遺伝子ライブラリの代わりに鋳型として用いた（レーンＣ）。一連のＰＣＲにおけるアニール温度をそれぞれの電気泳動写真の左側に示す。
【００４５】
Ａｒｂｉｔｒａｒｙ　ｐｒｉｍｅｒがその位置にクロスオーバーを起こしていないクローンにミスアニールするのを防ぐために、アニール温度を６４℃まで上げ、アニーリングの厳密性を高めて行う必要があった。あらかじめ決定した任意のクロスオーバーポイントは２つの親分子配列によく似ているので、５０℃ではプライマーがミスアニールし、親分子の鎖を増幅してしまった。しかし、６０℃以上ではシャッフルされていない親分子のストランドは増幅されなかった。６４℃にまで温度を上げることによって、プライマーは決められた位置にクロスオーバーポイントをもつキメラ遺伝子のみにアニールすることが許される。ＲＤＡ−ＰＣＲにより構築されたライブラリは、どのケースにおいてもファミリー　シャフリングライブラリよりも、多くの産物が得られた（レーンＲ参照）。このことは伸長途中のプライマーと親分子との間の相同組換えは、ＲＤＡ−ＰＣＲを用いれば、いたるところで行われるということを示しており、ＲＤＡ−ＰＣＲライブラリはファミリー　シャフリングに比べて、よりクロスオーバーポイントに多様性を持っているということが示された。
【００４６】
興味深いことに、ファミリー　シャフリングライブラリの中では、ｒｅｃ　２プライマー（連続した５塩基のところにアニールするように設計した）を用いた反応において、他のプライマーの組み合わせで行ったものよりも相対的に濃いバンドが見られた。このことは、他の任意で設定したクロスオーバーポイント（連続した塩基数が２または３）よりも、より高い頻度でキメラ遺伝子が産出されると言うことを示している。
このことはファミリー　シャフリングにおいては、連続して一致する塩基数が長いほど相同組換えが起こりやすいということを示しており、ＲＦＬＰを用いた解析（図５）や、ＤＮＡシーケンシングの結果と一致している（図６）。
今回試験したものに関して言えば、ＲＤＡ−ＰＣＲクローンでは、突然変異は見られなかった。これに対してファミリー　シャフリングではいくつかのクローンに突然変異が見られた（３０００ｂｐで６個の変異）。他の研究グループで報告されているのと同様に、シャフリングにおけるほとんどの突然変異はプリン間またはピリミジン間の塩基置換であった。
【００４７】
ＲＤＡ−ＰＣＲにおける現状での問題点は、１遺伝子あたりのクロスオーバーポイントの数が制限されていることである。ＲＤＡ−ＰＣＲにおいて構築されたライブラリ中のキメラ遺伝子の大多数は１個のクロスオーバーポイントしか持たない（図５及び６）。キメラ遺伝子のバリエーションを豊富にするために、より多くのクロスオーバーポイントを持つことが望まれる。そのため、シャフリング法及びＲＤＡ−ＰＣＲ法を併用することによって、より複雑なキメラ遺伝子ライブラリを構築できると考えられる。今回試験したＲＤＡ−ＰＣＲのクローンはフレームシフトを全く起こしていなかった。このことは、ファミリー　シャフリングと組み合わせて更なるキメラ遺伝子の産出を行う上で、不可欠な性質である。両方の手法とも、親分子の局所的な配列類似性に基づいた組換えを起こす手法であるが、クロスオーバーポイントの分布は異なっている。そのため、この２つの手法を組み合わせることによって、配列の多様性がさらに増加することが期待される。
【００４８】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、低いバックグラウンドレベルで、すなわち親ＤＮＡ分子の増幅を極めて低く抑えて且つ簡便に、より多様なキメラ遺伝子を効率よく作製することができる。さらには、よりバラエティーに富んだキメラ遺伝子ライブラリを構築することできる。本発明の方法によれば、２種以上の相同遺伝子間でわずかに２塩基が連続して一致しているところでも組換えを起こすことが可能であり、遺伝子全体にわたってクロスオーバーポイントが多様にあるといえる。ここで実施したＲＤＡ−ＰＣＲによって作製されたキメラ遺伝子は突然変異やフレームシフトを起していなかった。このため、ＲＤＡ−ＰＣＲによるキメラ遺伝子ライブラリは、ファミリー　シャフリング法と組み合わせることによって、より多様で、複雑なキメラ遺伝子ライブラリを生み出すことができる。
【００４９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法の一例の概要を表す図である。
【図２】ＲＤＡ−ＰＣＲ法により得られたキメラ遺伝子をアガロースゲル電気泳動にかけた結果を示す。
【図３】ＲＤＡ−ＰＣＲの最適化を検討するため、増幅におけるアニール・伸長の温度条件プログラムを変動させた結果を表す。
【図４】ＲＤＡ−ＰＣＲにおける反応液中の鋳型とするＤＮＡ分子の濃度を検討した結果を表す。
【図５】図５ＡはａＹｂとｃＧｄのＡｌｕ　Ｉ認識部位を示し、さらに１個のクロスオーバーポイントをもつキメラ遺伝子のＡｌｕ　Ｉ消化断片のパターンを表す。図５ＢはＲＤＡ−ＰＣＲによって産出されたキメラ遺伝子（上）と、ファミリー　シャフリング法によって得られたキメラ遺伝子（下）のＲＦＬＰ分析の結果を表す。
【図６】ファミリー　シャフリング法及びＲＤＡ−ＰＣＲ法の両方のライブラリからランダムに選んだクローンのシーケンシング解析の結果、決定されたクロスオーバーポイントを表す。
【図７】任意に設計したプライマーを用いたクロスオーバーポイントの多様性に関する解析の結果を表す。図７Ａは任意に設定したクロスオーバーポイントと、その領域にアニールするように設計したプライマーの位置を示す。図７Ｂは任意に設計したプライマーを用いたＰＣＲの結果を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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