(57)【要約】【課題】有用な抗体、及び当該抗体を用いたスクリーニング方法の提供。【解決手段】本発明のポリクローナル抗体は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、（ａ）抗原ペプチド：Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（ｂ）前記抗原ペプチドの一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有する抗原ペプチドに対するポリクローナル抗体であることを特徴とする。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、又は（ｂ）に対するポリクローナル抗体。
（ａ）抗原ペプチド：Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ
（ｂ）前記抗原ペプチドの一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有する抗原ペプチド。
【請求項２】
前記抗原ペプチドにハプテンが結合していることを特徴とする請求項１記載のポリクローナル抗体。
【請求項３】
請求項１又は２項に記載のポリクローナル抗体を用いる免疫スクリーニング方法。
【請求項４】
請求項１又は２項に記載のポリクローナル抗体を用いてＥＬＩＳＡ法によって、レジスチン及び／又はレジスチン類縁体を検出する方法。
【請求項５】
さらに、レジスチン及び／又はレジスチン類縁体に対するポリクローナル抗体を用いる請求項３又は４項に記載の方法。
【請求項６】
請求項３〜５項のいずれか１項に記載の方法に使用するための標準物質及び／又は試料物質を調製する方法であり、界面活性剤の存在下、前記標準物質及び／又は前記試料物質を溶媒中で溶解し、前記標準物質及び／又は前記試料物質中のタンパク質を変性させることを特徴とする方法。
【請求項７】
界面活性剤が、ＳＤＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ヘプチルグルコシド、ヘプチルチオグルコシド、オクチルグルコシドからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項６項に記載の方法。
【請求項８】
溶媒が、メルカプトエタノール、尿素、ジチオスレイトールからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項６又は７項に記載の方法。
【請求項９】
請求項６〜８項に記載の方法によって調製された前記標準物質及び／又は試料物質の抽出液中のタンパク質又はペプチドを固定化し、前記界面活性剤及び前記溶媒を前記抽出液から除去し、前記タンパク質又はペプチドの定量を行なう方法。
【請求項１０】
前記定量を、前記タンパク質又はペプチドを染色することにより行なう請求項１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗体、当該抗体を用いたスクリーニング法、及び当該スクリーニングに用いることができる標準物質及び／又は試料物質の調製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病は、インスリン作用が不足し血糖値が上昇した病態であるが、その原因として、インスリン分泌の低下と、インスリン感受性の低下に大別できる。インスリン依存糖尿病（Ｉ型糖尿病）は膵インスリンの絶対的欠乏に由来する。インスリン非依存糖尿病（ＩＩ型糖尿病）は肝臓、筋肉、脂肪などの抹消組織においてインスリン抵抗性が生じ、膵臓β細胞からのインスリン分泌が追いつかなくなった状態である。インスリンの感受性の低下には、遺伝的な素因と後発的な要因がある。特に後発的要因として、生体内においての脂肪細胞の過剰蓄積、つまり、肥満がインスリン抵抗性の発症に対する重要なリスクファクターであることが知られている。しかし、インスリン抵抗性と肥満との関連については、不明な部分が多い。
【０００３】
また、脂肪組織は、主要なエネルギー貯蔵器官というだけでなく、他の臓器に比べて最も多くの内分泌タンパク質を発現している生体最大の内分泌臓器である。脂肪細胞から分泌されるＴＮＦ−α、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）はインスリンのシグナル伝達を抑制することで、インスリン抵抗性を誘発させると考えられている。レジスチンも、インスリン抵抗性の原因となる因子として報告されたが、その詳細については不明である。レジスチンとは、システインの富むアミノ酸配列を有する約１００アミノ酸の比較的小さい分泌タンパク質、ペプチドホルモンである。
【０００４】
このようなレジスチンの中で、マウスレジスチンに対する抗体がＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社により発売され、この抗体は、マウスレジスチンのアミノ酸残基８３から９１に相当する配列ＧＳＷＤＩＲＥＫのペプチドを免疫したものである事が知られている。
【０００５】
レジスチンが肥満とインスリン抵抗性を繋ぐ重要な因子であることが報告されている（Ｃ．Ｍ．Ｓｔｅｐｐａｎ，　Ｓ．Ｔ．Ｂａｉｌｅｙ，　Ｓ．Ｂｈａｔ，　Ｅ．Ｊ．Ｂｒｏｗｎ，　Ｒ．Ｒ．．Ｂａｎｅｒｊｅｅ，　Ｃ．Ｍ．Ｗｒｉｇｈｔ，　Ｈ．Ｒ．Ｐａｔｅｌ，　Ｒ．Ｓ．Ａｈｉｍａ，　Ｍ．Ａ．Ｌａｚａｒ，　“Ｔｈｅ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｒｅｓｉｓｔｉｎ　ｌｉｎｋｓ　ｏｂｅｓｉｔｙ　ｔｏ　ｄｉａｂｅｔｅｓ，”　Ｎａｔｕｒｅ　４０９　（２００１）　３０７−３１２）。この文献では、マウスを用いた実験により、大腸菌で発現させたレジスチンを抗原にして抗体を作製している。
【０００６】
また、マウスレジスチンのＮ末部分を抗原にして抗体を作製し、培養細胞での実験が報告されている。（Ｍ．Ｆａｓｓｈａｕｅｒ，　Ｊ．Ｋｌｅｉｎ，　Ｓ．Ｎｅｕｍａｎｎ，　Ｍ．Ｅｓｚｌｉｎｇｅｒ，　Ｒ．Ｐａｓｃｈｋｅ，　“Ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ　α　ｉｓ　ａ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｆ　ｒｅｓｉｓｔｉｎ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｉｎ　３Ｔ３−Ｌ１　ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ，”Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　２８８　（２００１）　１０２７−１０３１．）
【０００７】
【（非）特許文献１】Ｃ．Ｍ．Ｓｔｅｐｐａｎ，　Ｓ．Ｔ．Ｂａｉｌｅｙ，　Ｓ．Ｂｈａｔ，　Ｅ．Ｊ．Ｂｒｏｗｎ，　Ｒ．Ｒ．．Ｂａｎｅｒｊｅｅ，　Ｃ．Ｍ．Ｗｒｉｇｈｔ，　Ｈ．Ｒ．Ｐａｔｅｌ，　Ｒ．Ｓ．Ａｈｉｍａ，　Ｍ．Ａ．Ｌａｚａｒ，　“Ｔｈｅ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｒｅｓｉｓｔｉｎ　ｌｉｎｋｓ　ｏｂｅｓｉｔｙ　ｔｏ　ｄｉａｂｅｔｅｓ，”　Ｎａｔｕｒｅ　４０９　（２００１）　３０７−３１２．
【（非）特許文献２】Ｍ．Ｆａｓｓｈａｕｅｒ，　Ｊ．Ｋｌｅｉｎ，　Ｓ．Ｎｅｕｍａｎｎ，　Ｍ．Ｅｓｚｌｉｎｇｅｒ，　Ｒ．Ｐａｓｃｈｋｅ，　“Ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ　α　ｉｓ　ａ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｆ　ｒｅｓｉｓｔｉｎ　ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｉｎ　３Ｔ３−Ｌ１　ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ，”Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　２８８　（２００１）　１０２７−１０３１．
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これまでにマウスの脂肪組織や血清中のレジスチン量を測定する測定キットは存在しない。また、インスリン抵抗性は生活習慣病の基盤に存在する病態で、その究症メカニズムや予防方法など不明な点が多い。最初の報告では、レジスチンの発現は、高脂肪食を与えた、あるいは遺伝的肥満マウスで増加し、インスリン抵抗性改善薬であるチアゾリン誘導体によって発現抑制されたことが知られていたが、依然として詳細なところは不明である。
【０００９】
また、上述の配列ＧＳＷＤＩＲＥＫのペプチドを免疫した抗体においても、レジスチンのより正確な定量性に欠けるという欠点が存在し、脂肪組織や血清中のレジスチン量を測定する測定キットを開発させるほどには至っていなかった。
【００１０】
そこで、本発明は、より正確にレジスチンを定量でき、最終的には、脂肪組織や血清中のレジスチン量をより高感度で測定し得る抗体、及び当該抗体を用いたスクリーニング法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明者らは、まず、マウスレジスチンのより免疫原性の高い特異的配列を鋭意研究し、本発明の抗体、当該抗体を用いたスクリーニング方法を見出した。
【００１２】
本発明のポリクローナル抗体は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、（ａ）抗原ペプチド：Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ、又は（ｂ）前記抗原ペプチドの一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有する抗原ペプチド、に対するポリクローナル抗体であることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明のポリクローナル抗体の好ましい実施態様において、前記抗原ペプチドにハプテンが結合していることを特徴とする。
【００１４】
また、本発明のスクリーニング方法は、請求項１又は２項に記載のポリクローナル抗体を用いる事を特徴とする。
【００１５】
また、本発明のレジスチン及び／又はレジスチン類縁体の検出方法は、請求項１又は２項に記載のポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法によって、レジスチン及び／又はレジスチン類縁体を検出することを特徴とする。
【００１６】
また、本発明のレジスチン及び／又はレジスチン類縁体の検出方法の好ましい実施態様において、さらに、レジスチン及び／又はレジスチン類縁体に対するポリクローナル抗体を用いることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明の標準物質及び／又は試料物質を調製する方法は、請求項３〜５項のいずれか１項に記載の方法に使用するための標準物質及び／又は試料物質を調製する方法であり、界面活性剤の存在下、前記標準物質及び／又は前記試料物質を溶媒中で溶解し、変性させることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明の標準物質及び／又は試料物質を調製する方法の好ましい実施態様において、前記界面活性剤が、ＳＤＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ヘプチルグルコシド、ヘプチルチオグルコシド、オクチルグルコシドからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明の標準物質及び／又は試料物質を調製する方法の好ましい実施態様において、前記溶媒が、メルカプトエタノール、尿素、ジチオスレイトールからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。
【００２０】
本発明のタンパク質又はペプチドの定量方法は、請求項６〜８項に記載の方法によって調製された前記標準物質及び／又は試料物質の抽出液中のタンパク質又はペプチドを固定化し、前記界面活性剤及び前記溶媒を前記抽出液から除去し、前記タンパク質又はペプチドの定量を行なうことを特徴とする。
【００２１】
また、本発明のタンパク質又はペプチドの定量方法の好ましい実施態様において、前記定量を、前記タンパク質又はペプチドを染色することにより行なう事を特徴とする。
【００２２】
【発明の実施の形態】
まず、本発明のマウスレジスチンに対する抗ペプチド抗体について説明する。一般的に特異性の高い抗原特異的な抗体を得る場合の抗原ペプチドは抗原性の高いアミノ酸の連続した配列部位を用いるが、その場合、一般により長い配列の方が特異性の高い抗体ができる。そこで、本発明では、マウスレジスチンのアミノ酸配列のうち、ＰＩＤＥＡＩＤＫＫＩＫＱＤＦＮＳＬＦＣの１９残基のペプチド配列を合成し、これを抗原として用いて特異性の高い抗体を得ようとした。
【００２３】
本発明のポリクローナル抗体は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、（ａ）抗原ペプチド：Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ、又は（ｂ）前記抗原ペプチドの一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有する抗原ペプチド、に対するポリクローナル抗体である。当該抗原ペプチド：Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓは、レジスチンの一部に由来のものであり、本発明者らにより、抗原性の高い部分として見出されたものである。本発明において、当該ペプチド抗原のほか、前記抗原ペプチドの一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有する抗原ペプチドも含まれる。このような相同性を有する抗原ペプチドであっても高い抗原性を有するからである。
【００２４】
当該抗原ペプチドは、例えば、マウスレジスチンの全アミノ酸配列を参考に、アミノ酸配列を精査し、抗原性の高いと考えられる部分を合成することによって、得ることができる。アミノ酸配列の合成方法は、固相合成法など常法により行なうことができる。
【００２５】
また、本発明のポリクローナル抗体の好ましい実施態様において、前記抗原ペプチドにハプテンを結合させることができる。これは、本発明の抗体のように、タンパク質のある一部分に相当するペプチド（１５−２０アミノ酸程度）を抗原として抗体を得る場合は、ペプチド単独注射では、ほとんど抗体ができないおそれがあるからである。このような場合、合成したペプチドをハプテンと呼ばれるキャリアタンパク質に結合させ、その結合体をウサギなどに注射することで、ペプチドに対する抗体が出来易くなるという利点を有する。
【００２６】
ハプテンとしてよく用いられるタンパク質については、特に限定されるものではなく、例えば、ＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、アルブミン、ミオグロビン等を挙げることができる。汎用性が高いという観点から、ハプテンとしては、好ましくはＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）である。
【００２７】
本発明のレジスチンに対する抗体を得るには、まず、マウスレジスチンの部分アミノ酸配列に相当するペプチドをＫＬＨなどのキャリアタンパク質と融合させた後、例えばフロイント完全アジュバントなどの免疫助成剤とともに、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリなどの動物に数回免疫し、そこから抗血清を得ることができる。
【００２８】
動物から得られた抗血清は、まずプロティンＡやプロティンＧを固定化したカラムを用いる方法などにより、免疫グロブリン画分を精製することができる。その後、抗原を固定化したカラムに吸着後溶出処理するなどの方法により精製し、本発明のマウスレジスチンに対する特異的な抗体を得ることができる。得られた抗体は、場合によりさらにペプシン、パパイン等の酵素を用いる方法などで分解し、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆａｂ′、Ｆａｂなどの抗体機能を保持する部分分解物とすることもできる。勿論、本発明の抗体の定義には、これらの部分分解物も含まれる。このようにして得られる本発明のマウスレジスチンに対する抗体は、マウスレジスチンに特異的に反応する。
【００２９】
次に、本発明のスクリーニング法について説明する。本発明のスクリーニング方法は、（ａ）抗原ペプチド：Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ、又は（ｂ）前記抗原ペプチドの一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有する抗原ペプチド、に対するポリクローナル抗体、または、前記抗原ペプチドにハプテンが結合したものに対するポリクローナル抗体を用いる。前記抗体を用いて、標的タンパク質、すなわち、レジスチン及びその類縁体を免疫スクリーニングすることが可能となる。当該抗体を１つ少なくとも１つ用いることで免疫スクリーニングは可能であるが、より高精度の検出を可能とするという観点から、２つ以上の異なる抗体を用いることが好ましい。これは、２つの異なる抗体を用いる理由は、抗体が抗原に結合する部位（エピトープ）が別であれば、捕捉用抗体で抗原の結合した部分（エピトープ）が隠れてしまうことなく、ひいては、検出抗体が結合しやすくなるという利点を有するからである。
【００３０】
また、本発明のレジスチン及び／又はレジスチン類縁体の検出方法によれば、上記本発明のポリクローナル抗体を用いてＥＬＩＳＡ法によって、レジスチン及び／又はレジスチン類縁体を検出することができる。ＥＬＩＳＡには、２抗体法、サンドイッチ法等いくつかの方法があるが、本発明は特に限定されるものではない。最も広く用いられているという観点から、サンドイッチ型ＥＬＩＳＡ法が好ましい。これは、２つの抗体で抗原を挟むものである。より高精度の検出を可能とするという観点から、２つ以上の異なる抗体を用いることが好ましい。これは、２つの異なる抗体を用いる理由は、抗体が抗原に結合する部位（エピトープ）が別であれば、捕捉用抗体で抗原の結合した部分（エピトープ）が隠れてしまうことなく、ひいては、検出抗体が結合しやすくなるという利点を有するからである。
【００３１】
また、好ましい実施態様において、さらに、レジスチン及び／又はレジスチン類縁体に対するポリクローナル抗体を、上述の免疫スクリーニング法、ＥＬＳＡ法に用いることができる。当該抗体は、タンパク質を丸ごとウサギ等に注射し、抗血清を得ることにより作製することができる。この場合、一般に抗体価の高い抗体が得ることができる。本発明において、所謂野生型のレジスチンを用いて抗体を得てもよく、精製が容易等のために大量に調製しやすい組み換え体レジスチンを用いて抗体を得てもよい。
【００３２】
要約すれば、得られた本発明の抗体は、種々の用途に使用することができる。好ましくは、マウスレジスチンを抗原抗体反応によって測定する測定方法及び測定キットの構成成分として使用される。測定方法としては酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ法）、蛍光標識免疫測定法（ＦＩＡ法）、ポリスチレン粒子にこの抗体を感作したラテックス凝集法等の方法が適用できる。また、得られた抗体はウエスタンブロッティングなどの方法にも適用できる。
【００３３】
ＥＩＡ法を適用する場合の標識酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシターゼ、グルコースオキシターゼ、β―ガラクトシダーゼなどを用いることができる。ＲＩＡ法では、標識するアイソトープとしてヨウ素１２５、ヨウ素１３１などが用いられる。ＦＩＡ法では、標識する螢光物質としてＦＩＴＣなどが用いられる。本発明においては、ＥＩＡ法が好ましい測定法としてあげられ、サンドイッチＥＬＩＳＡ法が特に好ましい測定法としてあげられる。この場合、固相抗体としては後に述べる組み換え体マウスレジスチンを抗原として得た抗体を用いた。標識抗体に用いる抗体として前記の本発明の抗体を用いることが好ましい。
【００３４】
さらに詳細に説明すれば、以下のようである。すなわち、この場合の測定キットについての一例を説明すると以下のようである。まず、前記マウスレジスチンに対する抗体（以下、抗マウスレジスチン抗体とする）を固相担体に固定化する（固相抗体）。固相担体としては、各種ポリスチレン製イムノプレート等があげられる。固相抗体を作成する際の抗体は、０．１〜１０００μｇ／ｍｌの濃度で固定化に使用できるが、１〜１００μｇ／ｍｌの濃度が好ましい。ついで、非特異的反応を防ぐためにこの固相を蛋白質含有液で処理（ブロッキング処理）し洗浄して、固相とすることができる。ブロッキング処理に用いる蛋白質としては、ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略す）のほか、各種アルブミン、ミルク、ゼラチン等の蛋白質があり、これらを単独又は組合せで使用できる。これらの蛋白質は、０．１〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度で使用するのが好ましく、１〜５％（ｗ／ｖ）の濃度で使用するのがより好ましい。以上により、固相抗体ができる。
【００３５】
一方の検出用の抗体として酵素標識をした標識抗体を用意する。測定感度を上げるためには公知のアビジン−ビオチン法を用いることも可能である。例えば、ビオチン等の反応基を持つ抗マウスレジスチン抗体と、アビジン等の反応基を持つ酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）を用いることができる。酵素活性の検出手段は、用いる酵素及び基質により異なるが、化学発光系による検出、比色系による検出などが好ましい。検出抗体の標識法には公知の各種方法が適用できる。例えばペルオキシダーゼで標識するには、マレイミド・ヒンジ法、サクシンイミド法等により直接両者を結合させることができる。検出抗体は、測定時に０．０１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で使用するのが好ましく、０．１〜１０μｇ／ｍｌの濃度で使用するのがより好ましい。
【００３６】
アビジン−ビオチン法を用いる場合、ビオチン等の反応基をもつ抗体は、０．０１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で使用するのが好ましく、０．１〜１０μｇ／ｍｌの濃度で使用するのがより好ましい。また、アビジン等の反応基をもつ酵素（例えばペルオキシダーゼ）は、０．０１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で使用するのが好ましく、０．１〜１０μｇ／ｍｌの濃度で使用するのがより好ましい。アビジン−ビオチン法を用いる場合、あらかじめビオチン等の反応基を持つ抗体とアビジン等の反応基を持つ酵素を反応させ、複合体を調製しておき、これを用いてもよい。この複合体は、０．０１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で使用できるが、０．１〜１０μｇ／ｍｌの濃度が好ましい。試薬キットには、その他、反応用緩衝液、洗浄液、酵素反応基質等が組み合わされる。
【００３７】
比色系の場合には、例えば、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）等が基質としてよく用いられる。化学発光系の場合には、例えば、ルミノール類と過酸化水素の組合せが発光基質として用いられる。発光基質を含む発光試薬に含まれる脱脂粉乳又は卵白アルブミンは、最終濃度で０．００１〜１％（ｗ／ｖ）の濃度で使用するのが好ましいが、０．０１〜０．２％（ｗ／ｖ）の濃度で使用するのがより好ましい。また、過酸化水素は、最終濃度で０．４〜５．０ｍＭの濃度で使用するのが好ましい。また、ルミノール類としてはルミノールのほか、イソルミノール等も使用できる。ルミノール類は最終濃度で０．１〜１００ｍＭの濃度で使用するのが好ましいが、１〜１０ｍＭの濃度で使用するのがより好ましい。また、必要に応じてさらに増感剤が用いられるがこれは、ルミノールの一電子酸化を助けて増感作用を有するもので、４―ヨードフェノール、４―ブロモフェノール、４―フェニルフェノール、２―クロロ―４―フェニルフェノール、４―（２′―チエニル）フェノール、６―ヒドロキシベンゾチアゾール、４―［４′―（２′―メチル）チアゾリル］フェノール、４―［２′―（４′―メチル）チアゾリル］フェノール、４―（２′―ベンゾチアゾリル）フェノール、３―（１０―フェノチアジル）―ｎ―プロピル―スルホン酸塩等が使用できる。増感剤は最終濃度で０．００１〜１０ｍＭの濃度で使用するのが好ましいが、０．０１〜１ｍＭの濃度で使用するのがより好ましい。発光試薬中には、安定性等の性能を上げるために、グリセリン、マンニトール、ソルビトール等の糖アルコール等や界面活性剤を添加してもよい。
【００３８】
次に、本発明の標準物質及び／又は試料物質を調製する方法について説明する。本発明の標準物質及び／又は試料物質を調製する方法は、請求項３〜５項のいずれか１項に記載の方法に使用するための標準物質及び／又は試料物質を調製する方法であり、界面活性剤の存在下、前記標準物質及び／又は前記試料物質を溶媒中で溶解し、変性させることを特徴とする。界面活性剤としては、特に限定されるものではなく、例えば、ＳＤＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ヘプチルグルコシド、ヘプチルチオグルコシド、オクチルグルコシドからなる群から選択される少なくとも１種とすることができる。
【００３９】
また、溶媒としては、特に限定されるものではないが、メルカプトエタノール、尿素、ジチオスレイトールからなる群から選択される少なくとも１種とすることができる。
【００４０】
なお、ここでは、タンパク質として、レジスチン及び／又はレジスチン類縁体を用いて説明するが、本発明の調整方法は、不溶性のタンパク質、不溶性凝集体を形成するタンパク質であれば、適用することができる。このような不溶性タンパク質としては、例えば、脂肪組織中に存在するタンパク質、レプチン、アディポネクチン、ＰＡＩ−Ｉ、あるいは種々の膜タンパク質、さらにインクルージョンボディーを形成した発現タンパク質等を挙げることができる。
【００４１】
標準物質である組み換え体レジスチンはポリヒスチジンタグを融合させたものを用いることができる。これを用いることによって、組み換え体の精製が容易となり、純度が高くなるという利点がある。精製した組み換え体レジスチン分子を５〜３０％、好ましくは約２０％メルカプトエタノール含有ＳＤＳサンプルバッファーに一定濃度となるように溶解し、１〜１０分間、好ましくは約５分間煮沸処理を行うことによって完全に変性させることができる。検体である脂肪組織や血清に関しても同様の処理を行い、生体由来サンプルに含まれるレジスチン分子に関しても同様に完全に変性させることができる。こうして変性したサンプルをＰＢＳにて、５〜３０、好ましくは１０〜２５、より好ましくは約２０倍に希釈して得た検体サンプル１００マイクロＬを捕捉用の固相抗体で処理されたたとえば９６穴のエライザプレートに加えることができる。こうして標準物質および生体由来のレジスチン分子を捕捉したのち洗浄し、検出用抗体を加え、反応させることができる。こうして固相抗体・レジスチン分子・検出用標識抗体の３つの複合体が形成されるが、その量を標識抗体に存在するＨＲＰなどの酵素反応によって生成した反応生成物の発色度、蛍光度、または発光度を測定することによって見積もることができる。
【００４２】
また、脂肪組織は脂肪分を細胞・組織中に多量に含む特殊な組織である。レジスチンはこの脂肪組織で特異的に生合成され、血中へと分泌されホルモン様作用を起こすと考えられている。そこで、この脂肪組織に含まれるレジスチン量を測定するにはこの組織から定量的にレジスチンを含むタンパク質を抽出する必要がある。
【００４３】
そこで、脂肪組織重量０．２５ｇ当たり０．５ｍｌの１０〜３０、好ましくは約２０％メルカプトエタノール含有ＳＤＳサンプルバッファーをくわえ、超音波処理またはポリトロンにて脂肪組織を完全に破砕することができる。このサンプル溶液をＰＢＳにて２０倍希釈し前述したようにエライザに供することができる。また脂肪組織中の総タンパク質量を測定し、最終的に脂肪組織に含まれるタンパク質量当たりどれだけのレジスチンタンパク質が存在するかを算出することができる。
【００４４】
次に、本発明のタンパク質又はペプチドの定量方法を説明する。本発明のタンパク質又はペプチドの定量方法は、請求項６〜８項に記載の方法、すなわち、前述の調製方法によって調製された前記標準物質及び／又は試料物質の抽出液中のタンパク質又はペプチドを固定化し、前記界面活性剤及び前記溶媒を前記抽出液から除去し、前記タンパク質又はペプチドの定量を行なうことを特徴とする。
【００４５】
タンパク質又はペプチドは、標的となるタンパク質が、例えば脂肪組織中に存在しているならば、当該存在しているタンパク質すべてを意味する。
【００４６】
なお、ここでは、標的として、レジスチン及び／又はレジスチン類縁体を用いて、また、総タンパク質として脂肪組織中に存在する全タンパク質を用いて説明するが、本発明は、これに限定されることを意図するものではない。というのは、本発明の定量方法は、上述の調製方法と同様に、不溶性のタンパク質、不溶性凝集体を形成するタンパク質であれば、適用することができるからである。このようなタンパク質についての説明は、調製方法で上述したものをそのまま当てはめることができる。
【００４７】
また、タンパク質又はペプチドの固定化としては、特に限定されないが、例えば、ニトロセルロース膜やＰＶＤＦ膜などの膜に固定化することができる。
【００４８】
そして、好ましい実施態様において、前記定量を、前記タンパク質又はペプチドを染色することにより行なう。これによって、総タンパク質量と標的タンパク質量との比較がより容易となるからである。
【００４９】
【実施例】
ここで、本発明の一実施例を説明するが、本発明は、下記の実施例に限定して解釈されることを意図するものではない。以下の実施例は、本発明の一実施態様を説明するための用いたものであり、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨及び範囲を逸脱しない限り、いかなる変更等を排除するものではない。
【００５０】
実施例１
本実施例において、本発明の抗体及び当該抗体と異なる抗体を用いて、ＥＬＩＳＡ法による免疫スクリーニングを行なった。
【００５１】
まず、Ｓｔｅｐｐａｎらのマウスレジスチンに関する報告（Ｎａｔｕｒｅ，４０９，３０７−３１２，２００１）を参考にしてアミノ酸配列を精査し、抗原性が高いと考えられる部分アミノ酸配列（ＰＩＤＥＡＩＤＫＫＩＫＱＤＦＮＳＬＦＣ）を合成し、これをキャリアタンパク質ＫＬＨに結合させてウサギに免疫し、性能に優れたポリクローナル型抗ペプチド抗体が得られた。
【００５２】
すなわち、マウスレジスチンの部分アミノ酸配列（ＰＩＤＥＡＩＤＫＫＩＫＱＤＦＮＳＬＦＣ）を合成し、キャリアタンパク質ＫＬＨと縮合させた。これをウサギ２羽に免疫し９週間後抗血清を得た。全採血して得られた血清からプロテインＧカラムを用いてＩｇＧ画分を精製した。得られた抗血清をベプチド抗原カラムによってアフィニティー精製した。この抗体をＨＲＰ標識し、検出用抗体とした。
【００５３】
次に、捕捉用の抗体を以下の手順で作成した。まず、マウスレジスチンにポリヒスチジンタグを融合させて大腸菌内で発現させた。具体的には、マウスレジスチンのヌクレオチド配列を参考にして、大腸菌発現用のプラスミドであるｐＥＴベクターに組み込み、これを大腸菌に形質転換させた。大腸菌にＩＰＴＧを加えることによって組み込まれたベクターにコードされた組み換え体レジスチンタンパク質を誘導発現させた。
【００５４】
誘導発現した菌体を遠心集菌し、懸濁バッファーに懸濁した後、超音波処理によって菌体を破砕した。破砕後、遠心分離によって可溶性画分と不溶性画分に分画した。両画分ともＳＤＳ―ＰＡＧＥに供したところ、発現タンパク質は不溶性画分に存在した。
【００５５】
得られた組み換え体は不溶性凝集体を形成したので、これを６Ｍ尿素を含むバッフアーにて可溶化しニッケルカラムにてアフィニティー精製した。得られた組み換えレジスチンタンパク質をウサギに免疫し、抗体を得た。この抗体を捕捉用抗体とした。このようにして得られた２つの抗体がレジスチン分子を認識することをウエスタンブロッティング法にて確認した。そののち、これらの２つの抗体を用いてサンドイッチ型ＥＬＩＳＡを構築した。
【００５６】
不溶性画分を尿素（塩酸グアニジン）にて可溶化しニッケルカラムを用いてポリヒスチジンタグの結合したマウスレジスチン分子を精製した。
【００５７】
マウスレジスチン部分ペプチドの免疫と抗血清の調製
合成したマウスレジスチン部分ペプチドをＫＬＨと結合させ、得られた結合物を等容量のフロイント完全アジュバントと混和し、ウサギ（ニュージランドホワイト種）に３週間に１回の割合で計４回皮下免疫し、最終免疫日より１週間後に採血し、抗血清を得た。
【００５８】
抗血清から総ＩｇＧの精製
抗血清をプロテインＡ固定化カラムに加え、カラム容積の５倍量ＰＢＳで洗浄後、１００ｍＭクエン酸緩衝液（１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む、ｐＨ４．０）で溶出し、総ＩｇＧ画分を得た。
【００５９】
組み換え体マウスレジスチンの発現
マウスレジスチンのｃＤＮＡを得るために、マウス脂肪細胞由来ｍＲＮＡからＲｅｖｅｒ　Ｔｒａ　Ｄａｓｈ　（商標、Ｔｏｙｏｂｏ）を用いてＲＴ−ＰＣＲ法でクローニングした。即ち、マウス脂肪組織から、ｍＭＡＣＳ　ｍＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（商標、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてｍＲＮＡを抽出し、このｍＲＮＡから逆転写法で一本鎖ｃＤＮＡを調製した。この一本鎖ｃＤＮＡを鋳型に、マウスレジスチンｃＤＮＡを増幅するため、プライマー１（５’−ＡＣＴＧＡＧＴＴＧＴＧＴＣＣＴＧＣＴＡＡＧＴＣＣＴＣＴＧＣＣ−３’）とプライマー２（５’ＧＡＡＣＧＧＧＴＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＣＡＣＧＣＴ−Ｃ−３’）を用いてこれを増幅した。得られたＰＣＲ産物をｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ　Ａｍｐ　ＳＫ（＋）（商標、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングした。レジスチンのシグナル配列を除いたＯＲＦの５’末端にＮｄｅＩ認識部位とメチオニンをコードする配列を付加するために、プライマーＮｏ．３（５’−ＣＴＧＡＡＣＴＧＣＡＴＡＴＧＴＣＣＡＧＣＡＴＧＣＣＡＣＴＧＴＧＴＣＣＣＡＴＣＧ−３’）を用意し、３’末端にＸｈｏＩ認識部位を付加するためのプライマーＮｏ．４（５’−ＣＴＴ−ＣＣＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＧＡＡＧＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＴＴＡＣＡＧＣＡＧ−３’）を用意して、上記プラスミドを鋳型としたＰＣＲ増幅を行った。この項で示した配列では、開始コドンを強調文字、制限酵素認識部位を下線で示した。このＰＣＲ産物をＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化し、プラスミドｐＥＴ−３０Ｘａ−ＬＩＣ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩとＸｈｏＩ認識部位に挿入した。このようにして構築した組み換え体レジスチンの発現プラスミドで大腸菌ＢＬ２１株を形質転換し、これを発現させた。
【００６０】
組み換え体マウスレジスチンの精製
ヒスチジン・タグを付加した組み換え体レジスチンの発現プラスミドで形質転換した大腸菌ＢＬ２１株を１５０μｇ／ｍｌ　カナマイシンを含むＬＢ液体培地［１％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム］に接種した。これを３７℃で培養し、対数増殖期（Ａ６００が０．４−０．６）に達した時点で、最終濃度０．４ｍＭになるようにイソプロピル−１−チオ−ｂ−ｄ−ガラクトシドを添加し、３０℃で３時間培養を続けた。以後の遠心は０−４　℃で、カラム操作は室温で行った。遠心により集めたＢＬ２１菌体１容量をトリス緩衝液（ｐＨ７．９）５容量に懸濁し、ソニケーターにて破砕した。ホモジネートを１２０００×ｇで３０分間遠心した。組み換え型レジスチンは不溶性だったので、ペレットを溶解用緩衝液［２０　ｍＭ　トリス（ｐＨ７．９）、５００　ｍＭ　塩化ナトリウム、５　ｍＭ　イミダゾール、６　Ｍ　尿素、１　ｍＭ　ｂ−メルカプトエタノール］に溶かし、溶解用緩衝液で平衡化したＨｉｓ　Ｂｉｎｄ　Ｒｅｓｉｎ　カラム（商標、Ｎｏｖａｇｅｎ）に結合させ、カラムを洗浄用緩衝液［２０　ｍＭ　トリス（ｐＨ７．９）、５００　ｍＭ　塩化ナトリウム、７０　ｍＭ　イミダゾール、６　Ｍ　尿素、１　ｍＭ　ｂ−メルカプトエタノール］で洗浄した。Ｈｉｓ　Ｂｉｎｄ　Ｒｅｓｉｎ　カラムに吸着したタンパク質を、溶出用緩衝液［２０　ｍＭ　トリス（ｐＨ７．９）、５００　ｍＭ　塩化ナトリウム、１　Ｍ　イミダゾール、６　Ｍ　尿素、１　ｍＭ　ｂ−メルカプトエタノール］で溶出した。純粋な組み換え型レジスチンを含んだこの溶出液をセントリプラス−３（商標、Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮し、ＮＡＰ２５　カラム（商標、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用い緩衝液を０．１％　トリフルオロ酢酸に交換した。最終的に真空中で凍結乾燥し、組み換え体レジスチン標品とした。
【００６１】
精製組み換え体マウスレジスチンの免疫と抗血清の調製
抗原には組み換え体レジスチンを用いた。初回免疫はフロイントの完全アジュバンドと抗原溶液を混合し、ウサギに皮下注射した。以後、２、５、７週間後の免疫は不完全アジュバンドと混合して行った。最終的に全採血を行い、抗マウスレジスチン血清を調製した。
【００６２】
組み換え体マウスレジスチン抗体の精製
抗原として用いた組み換え体レジスチンをカラムに固定化し、抗血清中のマウスレジスチン抗体を吸着溶出処理することで、その精製を行った。
以上のようにして、本発明の抗体を得た。
【００６３】
実施例２
次に、本発明の抗体の有用性を評価した。具体的に比色系サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて評価した。ＥＬＩＳＡのプロトコールを図３に示す。レジスチンＥＬＩＳＡ用の標準品には組み換え型レジスチンを用いた。脂肪組織は２％　ＳＤＳ、２０％　ｂ−Ｍ．Ｅ．を含むバッファー中でホモジネートおよび煮沸し、遠心後、水層を回収し、これを脂肪組織ホモジネートとした。ＥＬＩＳＡ用の試料には、この脂肪組織ホモジネートをＰＢＳで２０倍希釈したものを使用した。
【００６４】
具体的に、実施例１で得た精製抗マウスレジスチン抗体を１０μｇ／ｍｌになるようにＰＢＳにて希釈し、これをポリスチレン製９６穴イムノプレート（旭テクノグラス社製）の各ウェルに１００μｌ加え、４℃で１晩静置した。この液を吸引除去し、ブロッキング剤であるゼプトブロック（商標、ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ社製）を各ウェルに２００μｌ加え、室温で２時間静置し、固相担体上の未反応部分をブロックした。各ウェルを０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ　２０（商標、ＩＣＩ社製）含有ＰＢＳ（以下ＰＢＳ―Ｔと略す）で３回洗浄し、変性マウスレジスチンをＰＢＳで希釈して調製した５ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌのマウスレジスチンの標準液を各ウェルに１００μｌ加え、４℃で一晩静置した。各ウェルをＰＢＳ―Ｔで５回洗浄し、上記８．で得たＨＲＰ標識抗マウスレジスチン抗体（ペプチド抗体）をＰＢＳ（以下希釈液と略す）で１０００倍希釈に調製し、各ウェルに１００μｌ加え室温で１時間静置した。各ウェルをＰＢＳ―Ｔで７回洗浄し、０．０２％（ｖ／ｖ）過酸化水素と０．０４％（ｗ／ｖ）ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）を等量混合した基質液を各ウェルに１００μｌ加えた。発色が見られたところ（約５分）で、反応停止液として各ウェルに１Ｍリン酸を１００μｌ加えた。マイクロプレートリーダー（パーキンエルマー社製、ＡＲＶＯ）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。横軸にマウスレジスチン量をとり、縦軸に４５０ｎｍの吸光度をとり、グラフにプロットしてマウスレジスチンの標準曲線とした。このグラフを図１に示す。
この結果、きれいな検量線が得られ、レジスチンの定量、分析に極めて有用であることが判明した。
【００６５】
実施例３
次に、総タンパク質濃度の測定を行なった。定量的な解析のためには、脂肪組織に含まれるタンパク質のうちのどれだけがレジスチンタンパク質であるかを評価する必要がある。したがって、脂肪組織抽出液の総タンパク質濃度を測定することが必要となる。しかしながら、界面活性剤ＳＤＳが高濃度に含まれ、また２０％メルカプトエタノールが含まれるような本抽出溶液中のタンパク質濃度の測定は従来の汎用タンパク質測定キット等では不可能であった。
【００６６】
そこで、今回は本抽出溶液をニトロセルロース膜にドットプロットした。アルブミンなどの標準タンパク質液（同抽出液に溶解）の希釈系列も同様にしてサンプルと同じ膜にドットプロットした。この膜を酢酸−メタノールで固定後、蛍光試薬であるＳｙｐｒｏ　Ｒｕｂｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社製）にて染色し、蛍光スキャナＴｙｐｈｏｏｎ８６００（アマシャムファルマシア社製）にて検出し、スポットの強度を画像解析ソフトＩｍａｇｅＱｕａｎｔにて定量した。標準タンパク質の希釈系列を定量した蛍光強度から換量線（図２）を作成し、サンプル中の総タンパク質濃度を算出した。この方法によってはじめて２０％メルカプトエタノールを含むＳＤＳサンプルバッファーからなるサンプル抽出液中の総タンパク質濃度が測定可能となった。これらの一連の手法によって、マウスにおける血清および脂肪組織中のレジスチン量を測定した。
【００６７】
実施例４
次に実際に動物を用いて実験を行なった。動物実験のプロトコールを図４に示す。
【００６８】
入手した動物は、１週間予備飼育を行った。正常マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊについては、平均体重が一定になるように２群に分け、通常食または高脂肪食を与えた。遺伝性肥満マウスｄｂ／ｄｂとＫＫ−Ａｙについては予備飼育後、高脂肪食を与えた。２週間後、採血、脂肪組織（精巣周囲）摘出を行い、種々の解析に供した。
【００６９】
図５は、高脂肪食を与えたマウスにおける脂肪組織及び血清中のレジスチン量を示す図である。通常食または高脂肪食を２週間与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脂肪組織中のレジスチンをＥＬＩＳＡで定量した（Ａ　グラフ）。血清中のレジスチンはウエスタンブロットで得られたシグナルをイメージスキャナーで読み取り、相対的に比較した（Ｂ　グラフ）。Ｂ　グラフ上のウエスタンブロットは、各群の血清を等量混合して行った。
【００７０】
図６は、通常食群と高脂肪食群の各種血清パラメーターの比較を示す図である。さきほどの通常食または高脂肪食与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスについて、インスリン抵抗性や脂質代謝に関連する血清中のパラメーターを測定した。データには示していないが、通常食群に対して高脂肪食群の体重、脂肪重量は有意に増加していた。
また、血清中のＴＮＦ−αも測定したが両群とも検出できなかった。
【００７１】
図７は、遺伝的肥満マウスにおける脂肪組織及び血清中のレジスチン量を示す図である。図５の場合と同様に、Ａグラフが各群の脂肪組織中のレジスチン量、Ｂグラフが血清レジスチンを相対的に比較した結果を示している。　Ｂ　グラフ上のウエスタンブロットの結果も同様である。データには示していないが、ＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現レベルで各群を比較したところ、正常マウス群に較べ、遺伝的肥満マウス両群でその発現が有意に減少していた。従って、ＥＬＩＳＡでのレジスチンの測定結果は信頼に値するものと言える。
【００７２】
図８は、正常マウスと遺伝的肥満マウスの各種血清パラメーターの比較を示す図である。さきほどの正常マウス群と遺伝的肥満マウス２群について、血清中の各種パラメーターを測定した。血清中のＴＮＦ−αも測定したが３群とも検出できなかった。
【００７３】
以上のように、正常マウスにおいては高脂肪食を与えた場合、肥満傾向を示し、それに伴って脂肪組織及び血清中のレジスチンレベルが有意に低下することが本発明の抗体及び当該抗体を用いたスクリーング方法によって明らかになった。これは、高脂肪食によってレジスチンの発現が低下することを遺伝子解析の手法（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法）で確認した文献（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２８９，５６４−５６７，（２００１））と同様の結果を与え、ひいては本発明のレジスチンタンパク質の定量方法が正しいことを支持する。
【００７４】
さらに、遺伝的肥満マウスにおいて、正常マウスに比べて顕著な肥満傾向を示し、その場合の脂肪組織及び血清中のレジスチンレベルが有意に低いことが本発明の抗体及び当該抗体を用いたスクリーング方法によって明らかになった。これは、遺伝的肥満マウスにおいてレジスチンの発現が著しく抑制されることを遺伝子解析の手法（ノーザンブロット解析）によって確認した文献（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７６，２５６５１−２５６５３，　（２００１））と同様の結果を与え、ひいては本発明のレジスチンタンパク質の定量方法が正しいことを支持する。
【００７５】
【発明の効果】
本発明の抗体、及び当該抗体を用いたスクリーング方法によれば、マウス脂肪組織中の全タンパク質当たりのレジスチン量や血清でのレジスチン濃度を正確に測定することが可能となるという有利な効果を有する。
【００７６】
本発明の調製方法によれば、脂肪組織等の不溶性凝集体タンパク質であっても容易に調製することができ、免疫スクリーング等に供することができるという有利な効果を奏する。
【００７７】
また、本発明のタンパク質又はペプチドの定量法によれば、界面活性剤等の混入した不溶性のタンパク質又はペプチドであっても、効率的に当該界面活性剤を除去できるので、高精度でタンパク質又はペプチドを定量化できるという有利な効果を奏する。
【００７８】
また、本発明の抗体は、マウス脂肪組織又は血清などの体液中のレジスチンに対して高感度かつ交差反応性がほとんどなくレジスチンに特異的であるので、比色系及び化学発光系ＥＬＩＳＡ法などのＥＩＡ法、ＲＩＡ系、他の蛍光系、生物発光系の測定法において使用することにより高感度な測定が可能となる。さらに、研究用としてウエスタンブロッティング用にも使用できる。本発明の測定キット及び測定方法は、血清をはじめ、その生合成場所である脂肪組織中のレジスチンを高感度にかつ高濃度まで定量することが可能である。これらのことから、本発明はマウスを用いたレジスチン分子の変動等の解析において有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】マウスレジスチン標準物質を用いたＥＬＩＳＡ検量線を示す。
【図２】ドットプロッティングと蛍光スキャナを用いた方法によるタンパク質量測定のための検量線
【図３】本発明の１実施態様におけるＥＬＩＳＡプロトコールを示す。
【図４】動物実験のプロトコールを示す図である。
【図５】高脂肪食を与えたマウスにおける脂肪組織及び血清中のレジスチン量を示す図である。
【図６】通常食群と高脂肪食群の各種血清パラメーターの比較を示す図である。
【図７】遺伝的肥満マウスにおける脂肪組織及び血清中のレジスチン量を示す図である。
【図８】正常マウスと遺伝的肥満マウスの各種血清パラメーターの比較を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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