(57)【要約】【課題】　人間または動物に安全かつ効果的に投与でき、種々の炎症性刺激に対して恒常性を維持でき、そして、単一の異性体に存在する活性を有するように鏡像異性体として純粋な効果的な治療用の化合物を発見すること。【解決手段】　患者への経口投与、非経口投与、ｅｘ　ｖｉｖｏ投与又は局所投与用に処方された、以下の一般式：【化１】2004002467.tif 000015　Ｒ１は独立に、ω−１第二アルコールで置換されたアルキル（Ｃ５−８）の実質的に他の鏡像異性体を含まない分離された鏡像異性体であり、　Ｒ２およびＲ３は独立に、所望により炭素原子の代りに１つ、又は隣接しない２つの酸素原子を含んでいてもよい、アルキル（Ｃ１−１２）である］で示される置換キサンチン化合物、および薬剤学的に受容される助剤とを含む薬剤組成物。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者への経口投与、非経口投与、ｅｘ　ｖｉｖｏ投与又は局所投与用に処方された、以下の一般式：
【化１】
2004002467.tif 000014
［式中、
　Ｒ１は独立に、ω−１第二アルコールで置換されたアルキル（Ｃ５−８）の実質的に他の鏡像異性体を含まない分離された鏡像異性体であり、
　Ｒ２およびＲ３は独立に、所望により炭素原子の代りに１つ、又は隣接しない２つの酸素原子を含んでいてもよい、アルキル（Ｃ１−１２）である］
で示される置換キサンチン化合物、および薬剤学的に受容される助剤とを含む薬剤組成物であって、細胞減少療法によって惹起される、造血毒性若しくは器官毒性、疾患、禿頭症、脱毛又はアロペシア（ａｌｏｐｅｃｉａ）を治療または予防するための薬剤組成物であって、但し該化合物が、Ｒ−１−（５−ヒドロキシヘキシル）テオブロミンではない、薬剤組成物。
【請求項２】
化合物の経口投与量が５００ｍｇ−１５００ｍｇ、１日２回または３回であり、静脈内注射、腹腔内投与、筋肉内投与又は皮下注射される場合の化合物の非経口投与量が２４時間の過程にわたって１．０ｇ−５．０ｇであり、局所製剤濃度が１重量％−４重量％であり、ｅｘ　ｖｉｖｏ培養濃度が１０μＭ−５００μＭである、請求項１に記載の薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、ヒドロキシル置換キサンチン化合物の異性体（ｉｓｏｍｅｒ）は立体特異的な細胞二次伝達経路を介した刺激に対する細胞応答を調節するのに有効な薬剤であるという発見に関する。具体的には、本発明の化合物は、３，７−ジ置換キサンチンの１位において置換された、直鎖アルキル（Ｃ５−８）のω−１アルコールのＲまたはＳ（好ましくはＲ）鏡像異性体（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ）である。本発明の化合物は、特異的なｓｎ−２不飽和ホスファチジン酸、および細胞増殖刺激に応答してホスファチジン酸（ＰＡ）経路を介して生産される対応するホスファチジン酸由来のジアシルグリセロールの細胞内レベルを制御するための有効な拮抗薬である。
【背景技術】
【０００２】
　ペントキシフィリン（１−（５−オキソヘキシル）−３，７−ジメチルキサンチン）（以下、ＰＴＸと呼ぶ）は、キサンチン誘導体で、血流増加のための医薬用途に広く使用されている。ＰＴＸは米国特許第３，４２２，３０７号および第３，７３７，４３３号に開示されている。ＰＴＸの代謝物については、ＤａｖｉｓらのＡｐｐｌｉｅｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４８：３２７，１９８４に総説が述べられている。ＰＴＸの代謝物の一つは１−（５−ヒドロキシヘキシル）−３，７−ジメチルキサンチン（以下、Ｍ１と呼ばれている）であり、ラセミ混合物（ｒａｃｅｍｉｃ　ｍｉｘｔｕｒｅ）として得られている。Ｍ１（ラセミ混合物）もまた、（単に血流を増加するというのではなく）大脳の血流を増加するものとして、米国特許第４，５１５，７９５号および第４，５７６，９４７号に開示されている。さらに、米国特許第４，８３３，１４６号および第５，０３９，６６６号は、大脳血流を増強するために、キサンチンのより短い炭素鎖を有する第三アルコール類似体の使用を開示している。続く代謝の研究では、ＰＴＸはＳ鏡像異性体に代謝されることが発見されている。
【０００３】
　さらに、米国特許第４，６３６，５０７号は、ＰＴＸおよびＭ１（ラセミ混合物）は走化性刺激因子に応答して多形核白血球に化学走性を引き起こす能力を有することが記載されている。ＰＴＸおよび関連する第三アルコール−置換キサンチンはある種のサイトカインの活性を抑制し、化学走性に影響を与える（米国特許第４，９６５，２７１号および米国特許第５，０９６，９０６号）。同種異系骨髄移植を受けた患者にＰＴＸおよびＧＭ−ＣＳＦを投与すると、患者の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のレベルが下がる（Ｂｉａｎｃｏら、Ｂｌｏｏｄ　７６：Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１（５２２Ａ），１９９０）。ＴＮＦの検出可能なレベルでの減少に伴い、骨髄移植に関連する合併症も減少した。しかし、健常な志願者では、ＰＴＸ投与を受けた者のＴＮＦレベルは高かった。従って、ＴＮＦレベルの上昇はこれらの合併症の主要な要因ではない。
【０００４】
　キラル中心を有する薬剤は、通常ラセミ化合物として販売される。どの開示を見てもＭ１代謝物は立体特異性である。実際、（人体内の代謝により）Ｍ１はＳ異性体のみまたは主にＳ異性体として生産されるようである。薬剤をラセミ混合物として製造し服用することは、薬剤の各服用量に、通常は治療上の価値がなく予想外の副作用を引き起こす可能性のある異性体が等量混ざっていることを意味する。例えば、鎮静剤のサリドマイドはラセミ混合物として販売された。望みの鎮静活性はＲ異性体が有していたが、混ざっているＳ異性体は催奇物質で、この薬剤を使用している母親から生まれた赤ん坊に先天的欠損症を引き起こす。結核菌抑制剤のエタンブトールのＲ，Ｒ−鏡像異性体は失明を引き起こす可能性がある。非ステロイド系抗炎症剤ベノキサプロフェン（ＯｒａｆｌｅｘＲ）の致死に至らしめる副作用は、もしこの薬剤が純粋な鏡像異性体として販売されていたならば避けられたかもしれない。
【０００５】
　鏡像異性体の純度の課題は医薬の分野に限られない。例えば、ＡＳＡＮＡ（ｉＰｒ＝イソプロピル）は二つの非対称中心を有する合成ピレスロイド殺昆虫剤である。有効な殺昆虫活性の大半は、可能性のある４種類の立体異性体のうちのただ一種類にのみ存在する。さらに、殺昆虫作用を有しない３種類の立体異性体はある種の植物種に対して細胞毒性を示す。従って、ＡＳＡＮＡは、立体異性体の混合物は適当でないので、単一の立体異性体としてのみ販売され得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
　従って、人間または動物に安全かつ効果的に投与でき、種々の炎症性刺激に対して恒常性（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）を維持でき、そして、単一の異性体に存在する活性を有するように鏡像異性体として純粋な効果的な治療用の化合物を発見することが、当該分野において必要である。本発明は、そのような化合物を探す過程において行われた。
【０００７】
　本発明者らは、本明細書中に記載されている化合物は、種々の炎症性および増殖刺激を受けた非常に多様な細胞において恒常性の維持に使用することができることを発見した。さらに、本発明の化合物および医薬組成物は、通常の薬剤投与経路（例えば、経口投与、局所投与、非経口投与など）に適しており、有効な投与量を提供することができることを発見した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
　本発明の化合物および医薬組成物は、３，７−ジ置換キサンチンの１位において置換された直鎖アルキル（Ｃ５−８）のω−１アルコールの、分離されたＲまたはＳ（好ましくはＲ）鏡像異性体である。本発明の化合物は、このような化合物を有効量投与する特定の投与方式と同様に、外部刺激またはｉｎ　ｓｉｔｕ　一次刺激に対する細胞応答を調節するのに有効である。
【０００９】
　本発明の化合物は、下記の式：
【００１０】
【化２】
2004002467.tif 000002
［式中、Ｒ１は独立に、ω−１第二アルコールで置換されたアルキル（Ｃ５−８）の実質的に他の鏡像異性体を含まない分離された鏡像異性体であり、Ｒ２およびＲ３は独立に、所望により炭素原子の代わりに１つ、または隣接しない２つの酸素原子を含んでいてもよいアルキル（Ｃ１−１２）である］のキサンチンコアから成る化合物および該化合物を有する医薬組成物を構成する。Ｒ１は、好ましくはＲ鏡像異性体として水酸基を有するＣ６アルキルである。
【００１１】
　本発明はさらに、本発明の化合物および薬学的に受容可能な助剤から成り、患者に経口的、非経口的、または局所的な投与により処方される、医薬組成物を提供する。
【００１２】
　本発明はさらに、外部からの若しくはｉｎ　ｓｉｔｕの一次刺激に対する免疫応答若しくは（細胞の細胞膜の内部葉状組織の隣接部で機能する、特異的なリン脂質ベースの第二メッセンジャーによって媒介される）細胞性応答が抑制されることにより特徴付けられる、または、そのような抑制により治療される、種々の病気を有する患者を治療する方法を提供する。第二伝達経路は、種々の病状に特徴的な種々の有毒なまたは増殖的な刺激に応答して活性化される。この第二伝達経路の生化学について本明細書に記載する。より具体的には、本発明は、ここに記載される第二伝達経路を介した細胞シグナルを抑制することによって、種々の病状の臨床上の症状を治療若しくは予防する、または他の治療による毒性を緩和する方法に関する。病状または治療による毒性は、下記のものからなるグループから選択される。
【００１３】
　活性化癌遺伝子に応答した癌細胞の増殖；細胞減少治療（ｃｙｔｏｒｅｄｕｃｔｉｖｅ　ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）又は微生物性病原体の感染による血球細胞欠損（ｈｅｍａｔｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）；Ｔ細胞応答若しくはＢ細胞応答、および抗体の生産による自己免疫疾患；敗血性ショック；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に対する間葉細胞の耐性；ＰＤＧＦ−ＡＡ，ＢＢ、ＦＧＦ、ＥＧＦ等の成長因子に応答した平滑筋細胞、内皮細胞、繊維芽細胞およびその他の細胞種の増殖のような、細胞増殖または細胞活性の脱制御（例えば、アテローム硬化、再狭窄、卒中および冠状動脈疾患）；ヒト免疫不全ウイルス感染（ＡＩＤＳおよびＡＩＤＳ関連合併症）；ＩＬ−１、ｍｉｐ−１α、ＰＤＧＦ、またはＦＧＦに応答した腎糸球体間質細胞の、種々の炎症性腎臓疾患を引き起こす増殖；炎症；シクロスポリンＡ（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ　Ａ）またはアムホテリシンＢ（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ　Ｂ）治療に応答する腎臓糸球体または腎臓管の毒性；細胞減少治療（例えば、細胞毒性薬剤または放射線）に反応した器官中毒（例えば、胃腸上皮または肺上皮）；非アルキル化抗癌剤の抗癌作用の増強；細胞表面メタロプロテアーゼの生産またはＩｇＥに反応したマスト細胞および好塩基球の脱顆粒反応（ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）を特徴とする、炎症性刺激（例えば、ＴＮＦ、ＩＬ−１およびこれらに類するもの）への反応したアレルギー；破骨細胞による破骨細胞活性化因子（ＯＡＦ）の過剰生産による骨の疾患；神経伝達物質エピネフリンおよびアセチルコリンによるシグナル伝達の減少による中枢神経系（ＣＮＳ）疾患；並びにこれらの組み合わせ。
【００１４】
　特定のサイトカインを発現するように、または、増殖刺激若しくは有毒な刺激に応答して増殖するように細胞が刺激される場合、この刺激は特異的なリン脂質ベースの第二メッセンジャーシグナル伝達経路を介して伝達される。この第二伝達経路により、ｓｎ−２非アラキドン酸不飽和化合物を含む一群のホスファチジン酸（ＰＡ）のレベルが上昇し、該ホスファチジン酸（ＰＡ）は対応するジアシルグリセロール（ＤＡＧ）に迅速に変換される。本発明の化合物および医薬組成物は、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）経路のような、細胞の正常な調節機能に関与する他の第二伝達経路に影響を与えることなく、この第二伝達経路に関与する立体特異的な酵素を特異的に抑制する。ここに記載する、該第二伝達経路に関与する１つまたは複数の酵素の抑制による効果は、刺激、特に有害な刺激に対する標的細胞の応答を”調節”することである。この生化学な現象（即ち、サイトカインのような一次刺激に応答する、第二伝達経路酵素の活性の抑制）は細胞シグナルに影響を与え、異常な、炎症性のまたは有害な細胞シグナル機構による多くの多様な病状に効果を及ぼす。
【００１５】
　本発明は以下を提供する：
　１．式：
【００１６】
【化２ａ】
2004002467.tif 000003
［式中、Ｒ１は独立に、ω−１第二アルコールで置換されたアルキル（Ｃ５−８）の実質的に他の鏡像異性体を含まない分離された鏡像異性体であり、Ｒ２およびＲ３は独立に、所望により炭素原子の代りに１つ、又は隣接しない２つの酸素原子を含んでいてもよい、アルキル（Ｃ１−１２）である］で示される化合物を含む置換キサンチン化合物。
【００１７】
　２．Ｒ１がＲ鏡像異性体として水酸基を含むＣ６アルキルである項１記載の化合物。
【００１８】
　３．Ｒ−１−（５−ヒドロキシヘキシル）テオブロミンである項２記載の化合物。
【００１９】
　４．Ｒ１が６−ヒドロキシヘプチル又は７−ヒドロキシオクチルのＲ異性体である項１記載の化合物。
【００２０】
　５．患者への経口投与、非経口投与、ｅｘ　ｖｉｖｏ投与又は局所投与用に処方された、項１記載の化合物と薬剤学的に受容される助剤とを含む薬剤組成物。
【００２１】
　６．化合物の経口投与量が約５００ｍｇ〜約１５００ｍｇ１日２回又は３回であり、非経口投与量が２４時間の過程にわたって投与される（静脈内注射、腹腔内投与、筋肉内注射又は皮下注射）約１．０ｇ〜約５．０ｇであり、局所製剤濃度が約１重量％〜約４重量％であり、ｅｘ　ｖｉｖｏ培養濃度が約１０μＭ〜約５００μＭである項５記載の薬剤組成物。
【００２２】
　７．増強した第二メッセンジャー活性によって仲介される疾患を治療する薬物を製造するための項１記載の置換キサンチン化合物の使用において、該疾患が外部の又はｉｎ　ｓｉｔｕの第１刺激に対する免疫応答又は細胞反応を抑制することを特徴とする又は抑制することによって治療されることができ、該細胞反応が細胞の細胞膜の内部リーフレットに隣接して作用する特異的なリン脂質ベースの第２メッセンジャーによって仲介される前記使用。
【００２３】
　８．活性化癌遺伝子に応答した癌細胞の増殖；細胞減少治療によって惹起される血球細胞欠損（ｈｅｍａｔｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）；Ｔ細胞応答若しくはＢ細胞応答、および抗体の産生によって惹起される自己免疫疾患；敗血症性ショック；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に対する間葉細胞の耐性；成長因子に応答した平滑筋細胞、内皮細胞、繊維芽細胞及びその他の種類の細胞の増殖；アテローム硬化症；再狭窄；冠状動脈疾患；血管疾患；ヒト免疫不全ウイルス感染症；ＩＬ−１、ｍｉｐ−１α、ＰＤＧＦもしくはＦＧＦに応答した、腎臓糸球体間質細胞の増殖；炎症；シクロスポリンＡ又はアンホテリシンＢ治療に反応した腎臓糸球体もしくは尿細管中毒；細胞減少治療に応答した臓器中毒；非アルキル化抗癌剤の抗癌作用の増強；細胞表面メタロプロテアーゼの産生又はＩｇＥに反応したマスト細胞および好塩基球の脱顆粒反応を特徴とする炎症刺激に反応したアレルギー；破骨細胞による破骨細胞活性化因子（ＯＡＦ）の過剰産生によって惹起される骨疾患；神経伝達物質のエピネフリン及びアセチルコリンのシグナル導入減少によって惹起される中枢神経系（ＣＮＳ）疾患；及びこれらの組合せ：から成る群から選択される疾患を治療するための薬剤の製造への項１記載の置換キサンチン化合物の使用。
【００２４】
　９．敗血症性ショックを含めた敗血症症状を治療又は予防するための薬剤の製造への項１記載の置換キサンチン化合物の使用。
【００２５】
　１０．細胞減少療法によって惹起される造血毒性又は器官毒性を治療又は予防するための薬剤の製造への項１記載の置換キサンチン化合物の使用。
【００２６】
　１１．シクロスポリンＡ及びＦＫ５０６を含めた免疫抑制剤療法によって惹起される副作用を治療又は予防するための薬剤の製造への項１記載の置換キサンチン化合物の使用。
【００２７】
　１２．細胞減少療法によって惹起される疾患、禿頭症、脱毛又はアロペシア（ａｌｏｐｅｃｉａ）を治療するための薬剤の製造への項１記載の置換キサンチン化合物の使用。
【００２８】
　１３．腫瘍に伴う苦痛、ホルモン関連障害、神経障害、自己免疫疾患、炎症、再狭窄、高血圧、好ましくない免疫反応、ウイルス感染症、腎炎、粘膜炎、アレルギー反応、及び中枢神経系の障害から成る群から選択される疾患を治療するための薬剤の製造への項１記載の置換キサンチン化合物の使用。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
　本発明は、第二メッセンジャー伝達系（Ｂｕｒｓｔｅｎら．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２０７３２，１９９１）の特定の段階において細胞の反応を制御することができる一群の特定化合物に向けられている。第二メッセンジャーは脂質またはリン脂質であり、以下の略語を使用する。
【００３０】
　ＰＥ＝ホスファチジルエタノールアミン
　ＬＰＥ＝リソホスフォエタノールアミン
　ＰＡ＝ホスファチジン酸
　ＬＰＡ＝リソホスファチジン酸
　ＤＡＧ＝ジアシルグリセロール
　ＬＰＬＤ＝リソホスフォリパーゼ−Ｄ
　ＬＰＡＡＴ＝リソホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ
　ＰＡＰＨ＝ホスファチジン酸ホスフォヒドロラーゼ
　ＰＬＡ２＝ホスフォリパーゼＡ−２
　ＰＬＤ＝ホスフォリパーゼＤ
　ＰＡＡ＝ホスフォアラキドン酸
　ＰＬＡ−２＝ホスフォリパーゼＡ２
　ＰＣ＝ホスファチジルコリン
　”再生成”ＰＡサイクリック経路＝所定のｓｎ−１及びｓｎ−２位置において，Ｌ飽和の２−リノレオイルまたは１，２−ジレオリル／１，２−ｓｎ−ジリノレオイルで置換されたＰＡＡ、ＬＰＡ、ＰＡおよびＤＡＧ中間体
　”古典的ＰＩ経路”＝１−ステアロイル，２−アラキドノイル脂肪酸アシル側鎖で置換されたＰＩ、ＤＡＧ、ＰＡ中間体
　”ＰＬＤによって生成されるＰＡ”＝例えば、１，２−ｓｎ−ジオレオイル、１−アルキル、２−リノレオイル、および１−アルキル，２−ドコサヘキサノイル側鎖によって置換されているＰＥ、ＰＣ、ＬＰＡ、ＰＡ、およびＤＡＧ中間体　リソホスファチジン酸トランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）は，アシルＣｏＡからアシル基を導入することによって、リソホスファチジン酸（ＬＰＡ）からのホスファチジン酸（ＰＡ）への合成に関与する。ＰＡホスフォヒドロラーゼ（ＰＡＰＨ）によるホスフェート部分の加水分解によってＤＡＧが生成される。経路のこれらの現象は、細胞表面上の受容体に働く一次刺激（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２またはＴＮＦなどのサイトカイン）による刺激によって直ちに（１分以内）誘導されると思われる。迅速な検出可能な効果としては、ＰＡおよびＤＡＧレベルの上昇がある。本発明の化合物の投与によってこの上昇が抑制される。
【００３１】
　本発明の化合物および医薬組成物は、１，２−ジ不飽和および１−アルキル，２−不飽和亜種を有する中間体に対する基質特異性を有する、ＰＡＰＨ酵素のＬＰＡＡＴ亜種のインヒビターを含む。そのようなインヒビターの代表的な例の１つは（本発明の化合物には含まれないが）ＰＴＸである。ＰＩは含まず、主に１，２−ジ不飽和および１−アルキル，２−不飽和亜種からなるＰＡに由来する特異的な活性経路において、ＰＴＸはＰＡＰＨをブロックする。これは、例えば、ＴＮＦで刺激されたヒト糸球体間質細胞はＰＩからＤＡＧを生産し、ＰＴＸ非存在下および存在下でＰＩを再生する現象によって示される。後者の機構でＰＡまたはＤＡＧがＰＩ以外のソース（ｓｏｕｒｃｅ）から由来することを示唆する証拠は何もない。本発明の化合物は、ｓｎ−２位置にアラキドン酸以外の不飽和脂肪酸を有する基質に関与する一群のＰＡＰＨおよびＬＰＡＡＴに影響を与えるが、これらの酵素のＰＩ経路に関与する調節機能型には与えないことを強調したい。
【００３２】
　膜リン脂質の各サブクラス（例えば、ＰＡ、ＰＩ、ＰＥ、ＰＣおよびＰＳ）は、各サブクラスの代謝回転（ｔｒｕｎｏｖｅｒ）と共に原形質膜の循環再生産によって、一定量の特徴的な脂肪性アシル側鎖を有する。ＰＡはおおむね安定であるが、比較的少量しか存在しない。休止細胞中のＰＡは、主に、通常ミリスチン酸、ステアリン酸およびパルミチン酸からなる飽和アシル側鎖から構成される。休止細胞では、ＰＣのアシル側鎖は、ｓｎ−１位置のアシルパルミチン酸およｓｎ−２位置のオレイン酸からなる。ＰＥおよびＰＩは主に、ｓｎ−１ステアリン酸およびｓｎ−２アラキドン酸からなる。
【００３３】
　このように特徴的アシル基をｓｎ−１およびｓｎ−２の位置に有することから、ＰＡ種の由来は、ｓｎ−１およびｓｎ−２の位置のアシル基の化学的性質から導き出すことができる。例えば、ＰＡが酵素ＰＬＤの働きによってＰＣに由来する場合には、第二伝達経路を経由したＰＣ基質に特徴的なアシル側鎖を含むであろう。さらに、全ての１，２ｓｎ−基質種の由来は、その由来に従って識別されるであろう。しかし、各リン脂質種がＤＡＧに加水分解される前にＰＡの型を経由するか否かを知ることが重要である。ＰＡに、続いてＤＡＧに変換されるリソ−ＰＡが示されるであろう。この第二伝達経路の複雑さについては、第二メッセンジャーの刺激の後、所定の時間経過後の細胞における中間体の脂肪性アシル側鎖化学（即ち、薄層クロマトグラフィーまたは高圧液体クロマトグラフィー）の適切な分析によって解決することができる。
【００３４】
　好中球、並びに、ラット若しくはヒト糸球体間質細胞のようなある種の糸球体間質細胞においては、数種のシグナル伝達経路が直列的に、同時に、またはその両方で活性化されると考えられる。例えば、好中球においては、Ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−ＰｈｅはＰＬＤの作用を介してＰＡの形成を刺激し、やがて、ひき続いてＰＡＰＨの作用を介してＤＡＧが形成される。数分後、古典的ホスフォイノシトール経路を通してＰＩからＤＡＧが生成される。多くの細胞では、ＤＡＧは、ＰＡＡがＰＬＡ−２によってｓｎ−２加水分解され続いてＬＰＡＡＴによってｓｎ−２トランスアシル化されるサイクルによって再生成されたＰＡ、並びにＰＬＤによってＰＥ、ＰＣまたはその双方の基質から生成されたＰＡからのＰＬＤ経路の両方から生成される。
【００３５】
　ここに記載される方法は、ＰＡおよびＤＡＧの多様な亜種をアシル鎖組成に基づいて識別することを可能にする。この方法によって、本発明の第二伝達経路を古典的ＰＩ経路のような他の経路と区別して活性化する（および活性を抑制する）化合物を区別することができる。本発明の第二伝達経路は、ｓｎ−２位置にアラキドン酸塩以外の不飽和脂肪酸を有する基質、並びに、古典的ＰＩ経路の一部である正常な細胞調節機構に関与しないＰＡＰＨおよびＬＰＡＡＴの亜種を含む。本発明の第二伝達経路に関与するＰＡＰＨおよびＬＰＡＡＴ酵素は、基質の異なるアシル側鎖および異性体型に対し精密に立体特異的である。従って、本発明の化合物は、実質的に純粋な鏡像異性体であり、好ましくは水酸基に結合したキラル炭素原子においてＲ鏡像異性体である。例えば、ＣＴ１５０１のＲとＳの異性体は、図１２に示したように異なるＬＰＡＡＴ抑制活性を持っている。さらに、ＣＴ１５０１のＲ鏡像異性体（例えば、ＣＴ１５０１Ｒ）は、ラセミ混合物（以下、Ｍ１と呼ぶ）より２−３倍、そして、対応するＳ鏡像異性体よりさらにその何倍もの効果を及ぼす。さらにまた、ＰＴＸはヒト体内で代謝されると、ほとんどがＭ１のＳエナチオマー、またはＣＴ１５０１Ｓに変換される。
【００３６】
　ＰＴＸ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）は（用量限度副作用を起こさずに患者に与えられる濃度を越えた）高い濃度において、ＬＰＡＡＴにおけるＰＡ亜種の生成を阻害することによってＰＡ／ＤＡＧ経路を介した再生成ＰＡの形成を阻害する。ＰＴＸの存在下においてさえも、細胞はＰＬＤの働きによってＰＡを生産し続け、またＤＡＧもホスフォリパーゼＣの作用によってＰＣおよびＰＩから生成される。後者の経路は本発明の化合物またはＰＴＸによって抑制されない。ＰＴＸ処理した細胞では、再生成またはＰＬＡによって生成されるＰＡに由来するＤＡＧ（例えば、１，２−ｓｎ−ジオレオイルＤＡＧ、１−アルキル，２−リノレオイルＤＡＧ、および１−アルキル，２−ドコサヘキサンオリルＤＡＧ）は消失する。従って、本発明の化合物およびＰＴＸは、有害な刺激によって細胞内で活性化されるが、正常な細胞調節機構のシグナル伝達には利用されない、特異的な第二伝達経路を選択的に抑制することによって、特定の種のＰＡおよびＤＡＧの生成のみを抑制する。
【００３７】
　本発明の化合物の治療上の用途
　主に種々の有害な刺激によって活性化される特異的な第二伝達経路の活性化の特異的な抑制は、本発明の化合物に多様な臨床適応症を治療するのに使用できる可能性を提供する。さらに、例えば炎症性サイトカインを介した有害刺激によって活性化されるが、本発明の化合物によって特異的に抑制される、特異的な第二メッセンジャーの活性化という共通点を共にする、多様な臨床適応症の予想データが、ここに示されたｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏのデータによって提供される。実際、本発明の化合物が多様な異なる臨床適応を有することができる理由は、本発明の化合物のこの活性機構によって説明される。本発明の第二伝達経路の活性化は、有害な刺激に対する応答の主要な媒体であり、例えば、炎症、免疫応答、血球細胞の再生の抑制および癌細胞の増殖を引き起こす細胞シグナルとなる。しかし、全てのインヒビターがこの第二伝達経路の全ての酵素を阻害するわけではない。本発明の化合物は、炎症および血球細胞再生抑制の最も効果的な媒体である。本発明の第二伝達経路によって伝達されるシグナルには、例えば、ＬＰＳによる直接の細胞応答、抗原によるＴ細胞活性化、抗原によるＢ細胞活性化、ＩＬ−１　タイプ１受容体によって伝達される（ＩＬ−１　タイプ２受容体によっては伝達されない）ＩＬ−１に対する細胞応答、ＴＮＦ　タイプ１受容体、活性化癌遺伝子（例えば、ｒａｓ，ａｂｌ，ｈｅｒ２−ｎｅｕ等）、低親和性ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）受容体、並びに、ＰＤＧＦ、ｂ−ＦＧＦおよびＩＬ−１によって刺激された平滑筋細胞増殖が含まれる。本発明の第二伝達経路を介しては伝達されないシグナルもあり、これらのシグナルには、例えば、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、ＳＣＦ（幹細胞因子）およびＧＭ−ＣＳＦによって誘導された造血細胞の増殖；インターロイキン−８（ＩＬ−８）またはロイコトリエンＢ４によって誘導された好中球活性；ＩＬ−２に応答したＴ細胞増殖；並びに酸性ＦＧＦ（繊維芽細胞成長因子）に応答した上皮細胞増殖、が含まれる。
【００３８】
　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏでは本発明の化合物は下記の機能を有する：
（１）例えば、ＩＬ−１、およびＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）を加えたＩＬ−１によって誘導される平滑筋細胞および腎臓糸球体間質細胞の増殖の抑制によって示されるように、ＩＬ−１シグナルのタイプ１　受容体を介した伝達を阻止する；
（２）例えば、好中球のＣＤ１８の上皮細胞における管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）の阻止によって示されるように、接着分子の調節を抑制する；
（３）ＴＮＦおよびＩＬ−１によって誘導されるメタロプロテアーゼを抑制する（炎症のモデル）；
（４）ＬＰＳ誘導細胞活性化を阻止する（敗血症ショックの予防および治療）；
（５）抗原または架橋ＣＤ複合体によるＴ細胞およびＢ細胞の活性化を抑制する；
（６）ＩｇＧによるマスト細胞活性化を抑制する；そして
（７）形質転換細胞および癌細胞系の悪性表現型を抑制する。
【００３９】
　前述のｉｎ　ｖｉｔｒｏ効果から、以下のようなｉｎ　ｖｉｖｏ生物学的効果が得られる。該ｉｎ　ｖｉｖｏ生物学的効果には、内毒素ショックの予防および治療、癌細胞増殖の抑制、細胞減少治療後の造血細胞の刺激、ＧＶＨＤ（移植細胞対宿主病）予防のための相乗的免疫抑制、および細胞枯死過程（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｐｒｏｃｅｓｓ）の抑制を介した育毛の刺激が含まれるがこれらに限られない。内毒素ショックの治療および予防、細胞減少治療後の造血細胞の刺激、およびヌードマウスにおける育毛の刺激に関するｉｎ　ｖｉｖｏのデータをここに示す。本発明の化合物、特にＣＴ１５０１Ｒは、造血の刺激、敗血症ショックの予防および治療、並びに局所的に育毛の刺激に利用するために適用した場合に最も効果がある。本発明の第二伝達経路の抑制剤は免疫抑制、急性炎症、慢性炎症およびＧＶＨＤに対しても活性を有するが、本発明の化合物は、これらに対しては前述の症状に対する程有効でなく、より高い分子濃度を必要とする。
【００４０】
　本発明の化合物はさらに、本発明の第二伝達経路を通じて伝達される薬剤の副作用を抑制する補助剤として有用である。これらの副作用には、例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）の副作用、シクロスポリンＡおよびＦＫ５０６の腎臓副作用、並びにアンホテリシンＢの副作用が含まれる。本発明の化合物は、抗原誘導されるＴ細胞の活性化を抑制する点はシクロスポリンまたはＦＫ５０６と共通するが、ＮＫおよびＬＡＫ細胞の生成を阻害せず、Ｔ細胞からのＩＬ−２の遊離およびＩＬ−８の遊離を抑制しない点は異なることに注目すべきである。
【００４１】
　メタロプロテアーゼは、腎糸球体疾患、関節炎による関節破壊、および気腫による肺破壊のような組織破壊を媒介し、癌転移に関与する。メタロプロテアーゼの３種類の例として、ＴＮＦ、ＩＬ−１、およびＰＤＧＦ＋ｂＦＧＦによって誘導される９２ｋＤタイプＶゼラチナーゼ、通常は構成酵素であり、ＴＮＦ若しくはＩＬ−１によって誘導もされる７２ｋＤタイプＩＶコラゲナーゼ、並びに、ＴＮＦ若しくはＩＬ−１によって誘導されるストロメリシン／ＰＵＭＰ−１が挙げられる。本発明の化合物は、ＴＮＦまたはＩＬ−１による９２ｋＤタイプＶゼラチナーゼ誘導性メタロプロテアーゼを抑制することができる。さらに、ＣＴ１５０１Ｒは１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−１によって誘導されたＰＵＭＰ−１活性をコントール値の１５％に減少させた。同じ実験によって対照してみると、ＰＴＸはコントール値の９５％にしか減少させず、この値は有意ではなかった。従って、本発明の化合物は、ＩＬ−１若しくはＴＮＦによって誘導されるある種のメタロプロテアーゼの誘導を阻害するが、正常な組織再生成に関与する構成性のプロテアーゼ（例えば、７２ｋＤタイプＩＶコラゲナーゼ）には関与しない。
【００４２】
　本発明の化合物はタイプＩ　ＩＬ−１受容体を介したシグナル伝達を阻害するので、ＩＬ−１アンタゴニストであると考えられる。”疾患におけるインターロイキン−１の機能”（ＤｉｎａｒｅｌｌｏとＷｏｌｆｆ　Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２８，１０６，Ｊａｎ．１４，１９９３）という題名の最近の総説には、ＩＬ−１の機能は”疾患の重要、迅速かつ直接的な決定因子”であると記載されている。”例えば、敗血症では、ＩＬ−１は血管に直接働きかけて血小板活性化因子および一酸化窒素の迅速な生産を介して血管拡張を誘導する。一方、自己免疫疾患では、他の細胞を刺激して標的細胞に働くサイトカインまたは酵素を生産させる。”この総説は、ＩＬ−１によって媒介される一群の病気について記載している。それらには、敗血症症候群、関節リウマチ、炎症性腸疾患、急性および骨髄性白血病、インシュリン依存性真性糖尿病、アテローム硬化、並びに、移植拒絶、移植細胞対宿主病（ＧＶＨＤ），乾癬、ぜん息、オステオポローシス、歯根膜疾患、自己免疫甲状腺炎、アルコール性肝炎、子宮感染に伴う早期分娩、さらに睡眠障害までも含むその他の病気、が含まれる。本発明の化合物はＩＬ−１　タイプＩ受容体を介した細胞シグナルを抑制するＩＬ−１アンタゴニストなので、上述した全ての疾患の治療に有用である。
【００４３】
　例えば、敗血症症候群では、「ＩＬ−１誘導ショックの機構は、血小板活性化因子、プロスタグランジンおよび一酸化窒素のような小さな媒介分子の原形質濃度を増加させることができるＩＬ−１の機能によると思われる。これらは、効果的な血管拡張因子であり、研究用動物にショックを引き起こす。ＩＬ−１の活性を阻止するとこれらの媒介分子の合成および放出が防止される。動物では、ＩＬ−１を一回静脈注入すると、平均動脈圧が減少し、全身血管抵抗が下がり、そして白血球減少および血小板減少が引き起こされる。ヒトにおいても、ＩＬ−１を静脈投与すると、同様に急速に血圧が下がり、１日に体重１ｋｇあたり３００ｎｇ以上服用すると著しい低血圧が引き起こされる。」「ＩＬ−１活性を阻止する治療上の利点は、恒常性に関与する分子の生成に影響を与えずに、有害な生物学的作用を防止できる点にある。」本発明の化合物は、ＩＬ−１　タイプＩＩ受容体を介した細胞シグナルに影響を与えずに、ＩＬ−１　タイプＩ受容体を介した細胞シグナルのみを抑制することによって、Ｄｉｎａｒｅｌｌｏによって見いだされた要求を満たしている。
【００４４】
　関節リウマチについては、Ｄｉｎａｒｅｌｌｏは以下のように述べている；「インターロイキン−１が、関節リウマチの患者の滑膜（ｓｙｎｏｖｉａｌ　ｌｉｎｉｎｇ）および滑液に存在し、そのような患者由来の滑膜組織の組織片はｉｎｖｉｔｒｏでＩＬ−１を生産する。関節内にインターロイキン−１を注入すると、白血球浸潤、軟骨破壊、および関節周囲の骨の再生が動物に誘導される。単離された軟骨細胞および骨細胞においてｉｎ　ｖｉｔｒｏで、インターロイキン−１は、ホスフォリパーゼおよびシクロオキシゲナーゼの遺伝子、並びにコラゲナーゼの遺伝子の発現の引き金となり、その活性を阻止することによって、ラットの細菌−細胞壁誘導関節炎が減少される。」　従って、本発明の化合物はＩＬ−１アンタゴニストとして関節リウマチの治療および予防に有用である。
【００４５】
　炎症性腸疾患については、潰瘍性大腸炎およびクローン病（限局性回腸炎）は、活性化された好中球およびマクロファージを含む、腸の浸潤性病巣によって特徴付けられる。ＩＬ−１は、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）およびロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）のような炎症性エイコサノイド（ｅｉｃｏｓａｎｏｉｄ）、並びにＩＬ−８（好中球化学誘因機能および好中球刺激機能を有する炎症性サイトカイン）の生成を誘導することができる。ＰＧＥ２およびＬＴＢ４の組織内濃度は潰瘍性大腸炎を病む患者の重病度と関連し、炎症性腸疾患を病む患者ではＩＬ−１およびＩＬ−８の組織内濃度が高い。従って、本発明の化合物のようなＩＬ−１アンタゴニストは炎症性腸疾患の治療に効果的であろう。
【００４６】
　急性および慢性の骨髄性白血病については、ＩＬ−１がこのような癌細胞に対する増殖因子として機能することを示す証拠が次々と得られている。従って、本発明の化合物は、急性および慢性の骨髄性白血病が悪化するのを防止するのに効果的であると思われる。
【００４７】
　インシュリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、ランゲルハンス島のβ細胞の破壊による自己免疫疾患で、免疫担当細胞によって媒介されると考えられている。自然発生のＩＤＤＭ動物（ＢＢラットまたはＮＯＤマウス）のランゲルハンス島は、ＩＬ−１を含む炎症性細胞を有する。従って、本発明の化合物は、ＩＤＤＭの予防および治療に有用であると思われる。
【００４８】
　ＩＬ−１はアテローム硬化症の発生にも関与している。内皮細胞はＩＬ−１の標的である。ＩＬ−１は管状平滑筋細胞の増殖を刺激する。高コレステロール症ウサギ由来の脂肪性動脈プラークから単離された気泡細胞は、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１βメッセンジャーＲＮＡを含んでいる。末梢血液単球に取り込まれると、これらの細胞によるＩＬ−１が生産が開始される。ＩＬ−１はＰＤＧＦの生産も刺激する。これらのことを合わせて考えると、ＩＬ−１はアテローム硬化病変の進行に関与しているといえる。従って、本発明の化合物のようなＩＬ−１アンタゴニストは、アテローム硬化の予防および治療に有用であると思われる。
【００４９】
　本発明の化合物の生理学的および薬理学的効果のＩｎ　ｖｉｔｒｏアッセイ
　本発明の化合物の、免疫活性を調節し抗癌活性を有する作用についての測定には、様々の細胞系を用いた多様なｉｎ　ｖｉｔｒｏ分析を用いることができる。例えば、混合白血球反応（ＭＬＲ）は本発明の各化合物の生物学的活性を決定するための有効なスクリーニング法を提供する。ＭＬＲにおいて、ＰＢＭＣｓ（末梢血液単球細胞）は、健常な志願者の全血液を凝血防止のためにヘパリンを含んだ容器に採血し、等量のハンクス塩平衡化溶液（ＨＢＳＳ）で希釈することによって得る。この混合物をＦｉｃｏｌｌ−ＨｙｐａｑｕｅＲ勾配（比重１．０８）のようなショ糖密度勾配に上層し、室温または冷却して１０００×ｇで２５分間遠心する。ＰＢＭＣを血漿−フィコール界面のバンドから得て分離し、ＨＢＳＳなどの塩溶液で少なくとも２回は洗浄する。混入している赤血球細胞をＡＣＫ溶解（３７℃、１０分）などによって溶解し、ＰＢＭＣｓをＨＢＳＳ中で２回洗浄する。精製ＰＢＭＣｓのペレットを完全培地、例えばＲＰＭＩ１６４０に２０％ヒト不活性化血清を加えたもの、に再懸濁する。９６穴マイクロタイタープレート中で行う２種類のＭＬＲによって、同種異系刺激に対するＰＢＭＣの増殖反応を決定する。簡単に述べると、完全培地２００μｌ中の約１０５個のテスト用精製ＰＢＭＣ細胞を、約１０５個の自己由来（コントロール培養物）またはＨＬＡの異なる個体に由来する同種異系（刺激培養物）のＰＢＭＣ細胞と共培養する。細胞をマイクロタイタープレートに加える時に、種々の用量の化合物（薬剤）を添加する。培養物を５％ＣＯ２条件下、３７℃で６日間インキュベートする。インキュベーションの最後にトリチウム−チミジンを加え（例えば、４０−６０Ｃｉ／ｍｍｏｌｅのものを１μＣｉ／ウェル）、液体シンチレーションカウンターで増殖を調べる。
【００５０】
　ＣｏＡとインターロイキン−１（ＩＬ−１）またはインターロイキン−２（ＩＬ−２）の刺激によって誘導された胸腺細胞の活性化および増殖の、本発明の化合物による抑制効果を評価するために胸腺細胞共刺激因子分析を行う。マウス（例えば、Ｂａｌｂ／Ｃマウスのメス）の胸腺を回収し、培養培地（例えば血清を加えないＲＰＭＩ１６４０）に分離する。分離された胸腺組織および細胞懸濁液を遠心管に移して静置し、ＨＢＳＳ洗浄し、血清を加えた培養培地（例えば、１０％胎児ウシ血清を加えたＲＰＭＩ１６４０）に再懸濁する。混入している赤血球細胞を全て溶解させ、生存している細胞を再懸濁して数を数える。胸腺細胞をプレートし（例えば、９６穴プレートに密度２×１０５細胞／穴）、刺激剤、例えば、Ｃｏｎ　Ａ、ＩＬ−１（例えばＩＬ−１α）またはＩＬ−２、をウェルに加える。細胞を３７℃で４日間インキュベートする。４日目に細胞をトリチウム−チミジンでパルスし、増殖を調べる。本発明の化合物は刺激剤添加と共に加える。
【００５１】
　生物学的活性測定に適当な用量を決定し、活性の性質を調べるときのｉｎ　ｖｉｔｒｏ分析における細胞毒性反応を防ぐために、本発明の各化合物の細胞毒性について調べた。細胞（例えば、ＮＩＨ−３Ｔ３、Ｒａｓ形質転換３Ｔ３細胞、悪性メラノーマＬＤ２細胞等）をマイクロタイタープレートに加え、プレートの２日後に薬剤を加えた。薬剤添加の２４、４８または７２時間後に、蛍光生存力染色（例えば、２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（および−６）−カルボキシフルオレセイン　アセトキシメチルエステル、ＢＣＥＣＦ励起４８８ｎｍおよび発光５２５ｎｍ）によって細胞生存力を調べる。
【００５２】
　本発明の化合物の活性の別の測定法は、ヒト由来の間質細胞を用いたＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）増殖反応を調べることを含む。ヒト間質細胞を所定の培地（例えば、６９％マックコイ培地、１２．５％胎児ウシ血清、１２．５％ウマ血清。１％抗生物質、１％グルタミン、１％添加ビタミン、０．８％必須アミノ酸、１％ピルビン酸ナトリウム、１％重炭酸ナトリウム、０．４％非必須アミノ酸、および０．３６％ヒドロコルチゾン）にプレートする（例えば、２０００細胞／穴）。２−３日後、間質細胞を血清を含まない培地で枯渇させる。２４時間後に、ＩＬ−１α若しくはＴＮＦを加えた、若しくは加えていないＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢまたは塩基性ＦＧＦ（繊維芽細胞成長因子）のような増殖因子、およびトリチウム　チミジンで細胞を処理する。液体シンチレーションカウンターで細胞増殖を測定する。
【００５３】
　Ｂ細胞増殖アッセイによって、抗ミュー抗体（４０μｇ／ｍｌ）、ＩＬ−４またはＰＭＡ（２．５ｎＭ）で刺激されたＢ細胞の増殖を抑制する本発明の化合物の効果を調べることができる。ラモス（Ｒａｍｏｓ）Ｂ細胞腫瘍細胞、またはマウス脾細胞を刺激剤、本発明の化合物およびトリチウム　チミジンと共にインキュベートし、刺激剤によって誘導された細胞増殖の抑制を測定することができる。
【００５４】
　薬剤抑制活性は、刺激された細胞中の管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）のレベルを調べることによって測定することもできる。初期継代ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（Ｃｅｌｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．またはＣｌｏｎｅｔｉｃｓのような企業から入手した）を１０％胎児ウシ血清を含む培地（例えば、Ｈｅｐｅｓ緩衝培地、Ｃｅｌｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）に、繊維芽細胞成長因子（酸性ＦＧＦ、Ｃｅｌｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）またはＴＮＦのような刺激剤を添加したもので培養する。細胞をマイクロタイタープレートのウェルにプレートし（例えば、５×１０４／穴）、３７℃で７２時間インキュベートする。休止細胞を回収し（例えば、０．４％　ＥＤＴＡで２０−３０分処理）、培地中（例えば、０．０１％ナトリウムアジドを含む、０．１％ウシ血清アルブミンを加えたリン酸塩緩衝液）で洗浄し、氷冷下、ヒトＶＣＡＭを認識するモノクローナル抗体（”一次抗体”）（例えば、ヒトＶＣＡＭを認識するマウスモノクローナル抗体１μｇ、Ｇｅｎｚｙｍｅ）で標識する。６０分の氷冷後、細胞を冷却洗浄培地で洗浄し（好ましくは２回）、一次抗体を認識する抗体（例えば、フィコエリトリンを結合したヤギ抗マウスＩｇＧ　１μｇ、ＣａｌＴａｇ，Ｉｎｃ．）と共にインキュベートする。氷冷３０分後、細胞を２回洗浄し、フローサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ　ＥｌｉｔｅＲ）を用い、適当な励起波長および発光波長で（例えば、フィコエリトリンを用いた場合は、励起が４８８ｎｍ，発光が５２５ｎｍ）分析する。
【００５５】
　関連する２種の酵素、リソホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）とホスファチジン酸ホスフォリルヒドロラーゼ（ＰＡＰＨ）の抑制を、１つのｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイによって調べることができる。このアッセイは、一次刺激（例えば、種々のサイトカイン、成長因子、癌遺伝子産物、推定される治療剤、放射線照射、ウイルス感染、毒素、細菌感染およびその産物、並びに標的細胞に（妨害まではしないとしても）有害な影響を与えるあらゆる刺激）を加えた標的細胞を、種々の用量の本発明の化合物の存在下または非存在下でインキュベートすることを含む。標的細胞には、例えば、以下のような亜細胞性物質が含まれる。
【００５６】
　間葉細胞および／または外胚葉由来のミクロソーム、特に骨髄間質細胞または、ヒト若しくはラット糸球体細胞由来のミクロソーム；脳由来のミクロソームまたはシナプトソーム；富原形質膜ミクロソーム、Ｂｕｒｓｔｅｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２６：２０７３２−２０７４３，１９９１）に記載されたようにして得られた原形質膜、または界面活性剤で溶解させたミクロソーム；シナプトソーム、および、例えば、ＮＰ−４０、ミラナル（Ｍｉｒａｎａｌ）、ＳＤＳ若しくはその他の中性界面活性剤を用いて溶解された膜またはその他の細胞調製品；そして界面活性剤で溶解され、組み換えられ、または、さらに精製された細胞蛋白質の調製品（ＬＰＡＡＴおよび／またはＰＡＰＨ蛋白質を含む）　短時間インキュベートした後、細胞脂質を抽出し、標準的な方法に従って薄層クロマトグラフィーで分析する。簡単に述べると、例えばクロロホルム／メタノール　２：１（ｖ／ｖ）を用いて脂質を抽出し、抽出物を、Ｂｕｒｓｔｅｎ　ａｎｄＨａｒｒｉｓ，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３０：６１９５−６２０３，１９９１に記載されたようにＨＰＬＣにかける。ＲａｉｎｉｎＲ　ｍｕ−Ｐｏｒａｓｉｌカラムを使用し、３：４　ヘキサン：プロパノール有機担体を用い、および、分離の初めの１０分間は１−１０％水勾配を用いて行った。溶出パターンのピークの検出は離れた二重結合を検出する紫外線範囲で行った。不飽和ＰＡおよびＤＡＧに相当するピークが抽出パターンに示される。この方法はＰＡおよびＤＡＧの多様な型を区別できるので、本発明の（Ｒ）または（Ｓ）化合物によって影響を受ける経路における相当する型も直接測定できることが重要である。これらの化合物のアシル置換体の性質の確認は、ファスト−アトム　ボンバード　マス　スペクトロスコピー（ｆａｓｔ−ａｔｏｍ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）によって行うことができる。このようにして、関連する不飽和（非アラキドン酸）ＰＡおよびＤＡＧ亜種を検出できる。使用する時間は、サイトカインなどの一次刺激による活性化から５−６０秒である。この技術によって、種々の脂質成分のレベルを時間の関数として調べることができる。
【００５７】
　ＴＮＦを介した細胞毒性に対する、本発明の化合物による抑制活性を調べることができる。この分析では、Ｌ９２９マウス繊維芽細胞（１０４細胞／穴）を種々の用量の各化合物および培地コントロールと共に２時間インキュベートする。ＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）を５００ｐｇ／ｍｌの濃度（ＴＮＦのＬＤ５０（１２５ｐｇ／ｍｌ）の４倍）で添加する。細胞＋薬剤（または−薬剤）＋ＴＮＦを３７℃で４０時間インキュベートする。培地を取り除いて２％血清および１０μｇ／ｍｌのＢＣＥＣＦ蛍光色素を含む新たな培地と交換し、３０分間インキュベートする。蛍光色素を含む培地を取り除き、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝液）と交換し、各ウェルの蛍光を分析した。
【００５８】
　さらに別の方法により、ＴＮＦ−活性化ＨＵＶＥＣ細胞に対するＵ９３７細胞の接着の、薬剤による抑制の効果を調べることができる。この実験では、ＨＵＶＥＣ細胞をヒトＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍｌ）および種々の濃度の薬剤と共に１４−１６時間インキュベートする。Ｕ９３７細胞（ヒト単核細胞系）を、蛍光色素、ＢＣＥＣＦ（１０μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートして標識する。Ｕ９３７細胞調製品（２．５×１０４細胞／穴）を活性化ＨＵＶＥＣ細胞の上に上層する。細胞を逆遠心して、部分的に接着していたり、全く接着していないＵ９３７細胞を取り除く。蛍光プレートリーダーを用い、接着したＵ９３７細胞の蛍光を測定する。
【００５９】
　本発明の化合物
　本発明の化合物および医薬組成物は、３，７−ジ置換キサンチンの１位において置換された直鎖アルキル（Ｃ５−８）のω−１アルコールの分離されたＲまたはＳ（好ましくはＲ）鏡像異性体である。本発明の化合物は、このような化合物を有効量投与する特定の投与方式と同様に、外部刺激またはｉｎ　ｓｉｔｕ　一次刺激に対する細胞応答を調節するのに有効である。
【００６０】
　本発明の化合物は、下記の式：
【００６１】
【化３】
2004002467.tif 000004
［式中、Ｒ１は独立に、ω−１第二アルコールで置換されたアルキル（Ｃ５−８）の実質的に他の鏡像異性体を含まない分離された鏡像異性体であり、Ｒ２およびＲ３は独立に、所望により炭素原子の代わりに１つ、または隣接しない２つの酸素原子を含んでいてもよいアルキル（Ｃ１−１２）である］のキサンチンコアから成る化合物および医薬組成物を構成する。Ｒ１は、好ましくはＲ鏡像異性体として水酸基を有するＣ６アルキルである。
【００６２】
　本発明はさらに、本発明の化合物および薬学的に受容可能な助剤から成り、患者に経口的、非経口的、または局所的な投与により処方される、医薬組成物を提供する。
【００６３】
　本発明はさらに、１つまたは複数の本発明の化合物および薬学的に受容可能な担体若しくは賦形剤からなる医薬組成物を含む。本発明の化合物または医薬組成物を用いて患者を治療するには、体外療法としてｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養で患者に接触させるか、または、治療すべき細胞を有する患者に本発明の化合物または医薬組成物を（経口的、非経口的、または局部的に）投与する。
【００６４】
　１−（５−ヒドロキシ−ｎ−ヘキシル）−３，７−ジメチルキサンチンの（Ｒ）または（Ｓ）鏡像異性体は周知であり、以下のような当該分野において知られている慣用技術によって調製される。
【００６５】
　Ｄａｖｉｓら．，Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ，１５：１００１，１９８５およびＤａｖｉｓら．，Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　４８：３２７，１９８４に記載されている、例えばＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｒｕｂｒａを用いた微生物学的技術；Ｄａｖｉｓら（１９８４）（前述）の（Ｒ）−アルファ−メトキシ−アルファ−トリフルオロメチル−フェニル酢酸（（ｒ）−ＭＴＦＰＡ）のような光学活性化酸、その他の光学活性化酸から形成させたジアステレオマーエステルのラセミ体を分離する；ヨーロッパ特許公開第０４３５１５３号に記載されているように、（Ｒ）または（Ｓ）−５−ヒドロキシ−ｎ−ヘキシル基をジメチルキサンチンの１位に導入することによる直接的化学合成；鏡像異性体選択的変換（例えば、鏡像異性体エステルを第三ホスフィン、アゾジカルボン酸ジアルキルエステルおよびカルボン酸と共に加熱するか、または鏡像異性体アルコールを、所望により塩基を含んだ中性溶媒中で有機スルホン酸エステルに変換する。）：得られた脂肪族カルボン酸エステルを加熱し、塩基を含むアルコール性または水性の溶媒で加溶媒分解（例えば、炭酸カリウムを含むメタノール分解）を行い、ヨーロッパ特許公開第４３５１５３号または第４３５１５２号に記載されたような鏡像異性体アルコールを得る。
【００６６】
　（Ｒ）または（Ｓ）鏡像異性体を得るための特に好ましい方法は、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：２２７４，１９９０に記載された方法の変型に基づく直接合成である（図９）。この方法では、４−ブロモ−１−ブテンを、ボロントリクロライドおよびトリエチルシランと共にペンタンのような不活性炭化水素溶媒中で約−１０℃から−７８℃の低温条件下で熱し、４−ブロモ−１（ジクロロ）ボロブタンを得る。この産物を同程度の低温下でジエチルエーテルまたはジグリム（ｄｉｇｌｙｍｅ）のような不活性溶媒中、（Ｒ）−または（Ｓ）−ピナンジオールで処理し、（Ｒ）−または（Ｓ）−ピナンジオール　４−ブロモブチルボレートを得る。この産物を、アルゴンのような不活性な雰囲気下、−１００℃（またはもう少し高い温度）において、テトラヒドロフランのような不活性な溶媒中、ＬｉＣＨＣｌ２で処理し、つづいて無水塩化亜鉛を加えて（Ｒ）−または（Ｓ）−ピナンジオール　５−ブロモ−１−クロロペンチルボレートを得る。この産物を、テトラヒドロフラン中、約−１０℃から約−７８℃において、メチルマグネシウム臭化物で処理し、ＲまたはＳ−ピナンジオール　５−ブロモ−１−メチルペンチルボレートを得る。この産物を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中、約−１０℃から約０℃において、テオブロミンで処理し、続いて約２８℃、５トルにおいてＤＭＳＯを留去し、約９５％の非常に高い収率で相当する１−Ｎ−アルキル化キサンチンを得る。続いて過剰量の水酸化ナトリウム溶液のように強い塩基性溶液中で酸化加水分解を行うと、ホウ素原子および（Ｒ）−または（Ｓ）−ピナンジオール残基が取り除かれる。イソプロパノール等の溶媒からの再結晶化といった慣用の回収法によって産物を得ることができる。下記にこの好ましい合成法を図示する。
【００６７】
【化４】
2004002467.tif 000005
【００６８】
【化５】
2004002467.tif 000006
【００６９】
【化６】
2004002467.tif 000007
【００７０】
【化７】
2004002467.tif 000008
【００７１】
【化８】
2004002467.tif 000009
【化９】
2004002467.tif 000010
　反応５−９についての参考文献　Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｖｏｌ．１０８，Ｎｏ．４，１９８６　Ｍａｔｔｅｓｏｎ，Ｓａｄｈｕ＆Ｐｅｔｅｒｓｏｎ　前述の合成法においてはピナンジオールをキラルディレクターとして使用する。ピナンジオールは以下の合成工程に従って合成できる。
【００７２】
【化１０】
2004002467.tif 000011
　合成過程は−（−）−α−ピネンを利用するが、これは商業的スケールの量で入手できない場合がしばしばある。しかし、下記の工程に従って、−（−）−β−ピネンから−（−）−α−ピネンを合成することができる。
【００７３】
【化１１】
2004002467.tif 000012
　反応１０においてピナンジオールを再生成し、この重要な、出発材料およびキラルディレクターを再循環させて何回もの反応で繰り返し用いることが重要である。ピナンジオールを再生成するための望ましい再循環法を以下に示す：
【００７４】
【化１２】
2004002467.tif 000013
　本発明の化合物と薬剤組成物の用途
　本発明の化合物は一次刺激が接触する細胞中のホメオスタシスを、一次刺激後の数秒以内に招来される第２シグナル伝達経路に対するこれらの一次刺激の影響を和らげることによって、維持する機構を提供する。例えば、ｉｎ　ｖｉｖｏ又はｅｘ　ｖｉｖｏでの本発明の化合物の投与は、その挙動を改良すべき細胞を本発明の化合物又はその薬剤組成物の有効量と接触させることを含む細胞挙動の改良方法を提供する、前記方法は：
（１）腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であり、前記量は前記増殖を抑制するために充分である；又は（２）造血幹細胞から赤血球、血小板、リンパ球及び顆粒球への分化を促進する方法であり、前記量は前記増殖を抑制するために充分である；又は（３）抗原もしくはＩＬ−２刺激によるＴ細胞の活性化を抑制する方法であり、前記量は前記活性化を促進するために充分である；又は（４）内毒素、ＴＮＦ、ＩＬ−１もしくはＧＭ−ＣＳＦ刺激による単球／マクロファージ細胞の活性化を抑制する方法であり、前記量は前記活性化を抑制するために充分である；又は（５）腫瘍壊死因子の細胞毒性効果に対する間葉細胞の耐性を強化する方法であり、前記量は前記耐性を強化するために充分である；又は（６）抗原、ＩＬ−４もしくはＣＤ４０リガンドに反応したＢ細胞の抗体産生を抑制する方法であり、前記量は前記抗体産生を抑制するために充分である；又は（７）平滑筋細胞の増殖を刺激することができる成長因子に反応した平滑筋細胞の増殖を抑制する方法であり、前記量は前記増殖を抑制するために充分である；又は（８）内皮細胞によって与えられる全身血管の抵抗を弱める方法であり、前記量は高血圧誘導物質の放出を減ずるために充分である；又は（９）内皮細胞によって与えられる全身血管の抵抗を弱める方法であり、前記量は抗高血圧性誘導物質の放出を強化するために充分である；又は（１０）そのエンハンサーによって誘導される接着分子の発現を減ずる方法であり、前記量は前記発現を減ずるために充分である；又は（１１）ＨＩＶによるＴ細胞の活性化を抑制する方法であり、前記量は前記活性化を抑制し、従ってウイルス複製を抑制するために充分である；又は（１２）ＩＬ−１及び／又はｍｉｐ−１α及び／又はＰＤＧＦ及び／又はＦＧＦによる刺激に反応した腎臓糸球体間質細胞の増殖を抑制する方法であり、前記量は前記増殖を抑制するために充分である；又は（１３）シクロスポリンＡもしくはアンホテリシンＢに対する腎臓糸球体細胞又は尿細管細胞の抵抗を強化する方法であり、前記量は前記抵抗を強化するために充分である；又は（１４）ＴＮＦ処理骨髄間質細胞における成長刺激因子産生の抑制を防止する方法であり、前記量は前記抑制を防止するために充分である；又は（１５）ＩＬ−１、ＴＮＦ、もしくは内毒素刺激単球及びマクロファージによるｍｉｐー１α放出を防止する方法である；又は（１６）ＩＬ−１、ＴＮＦ、もしくは内毒素処理巨核球、繊維芽細胞及びマクロファージによる血小板活性化因子の放出を防止する方法である；又は（１７）ＴＮＦ処理造血前駆細胞中のサイトカイン受容体のダウンレギュレーションを防止する方法であり、前記量が前記ダウンレギュレーションを防止するために充分である；又は（１８）ＩＬ−１刺激されたもしくはＴＮＦ刺激された糸球体上皮細胞又は滑膜細胞におけるメタロプロテアーゼの産生を抑制する方法であり、前記量は前記産生を強化するために充分である；又は（１９）細胞毒性薬物もしくは放射線に対する胃腸もしくは肺の上皮細胞の抵抗を強化する方法であり、前記量は前記抵抗を強化するために充分である；又は（２０）非アルキル化抗腫瘍剤の抗腫瘍効果を強化する方法であり、前記量は前記効果を強化する��めに充分である；又は（２１）ＩＬ−１に反応した破骨活性化因子の産生を抑制する方法であり、前記量は前記産生を抑制するために充分である；又は（２２）ＩｇＥに反応した脱顆粒を抑制する方法であり、前記量は前記脱顆粒を抑制するために充分である；又は（２３）アドレナリン作動性神経伝達物質、ドーパミン、ノルエピネフリンもしくはエピネフリン、又は神経伝達物質であるアセチルコリンの放出を強化する方法であり、前記量は前記放出を強化するために充分である；又は（２４）アドレナリン作動性神経伝達物質、ドーパミン、ノルエピネフリンもしくはエピネフリン、又は神経伝達物質であるアセチルコリンのシナプス後の“遅い電流（ｓｌｏｗ　ｃｕｒｒｅｎｔ）”効果を調節する方法であり、前記量はこのような遅い電流を調節するために充分である。
【００７５】
　例えば、本発明の化合物は骨髄移植（ＢＭＴ）を受ける患者に関して、ＢＭＴが適合同種異系、不適合同種異系又は自己由来のいずれであるかに関係なく、用いられる。自己由来移植片を受容する患者は、対宿主移植片病（ＧＶＨＤ）を発現しないので必ずしも免疫抑制剤を投与される必要がないとしても、本発明の化合物による治療によって援助される。しかし、移植を実施した対象の疾患に関連して用いられる化学療法又は放射線療法の有害な効果は、患者の細胞に対する負の刺激を構成する。
【００７６】
　一般に、ＢＭＴを受ける患者は全て、全身照射の有無に拘わらず、正常な骨髄回復のために致死量を越える化学療法の投与を必要とする。このことは患者を救うために貯蔵された患者骨髄又はドナー骨髄を用いることに合理的根拠を与える。一般に、新しい又は貯蔵された骨髄を注入する前の連続した７〜１０日間、患者に化学療法又は放射線療法を行う。患者に骨髄を投与する日は移植の０日と表される。患者が化学／放射線療法（ｃｈｅｍｏ／ｒａｄｉａｔｉｏｎ）を受容する、その前の日々は負数で表される。その後の日々は正数で表される。
【００７７】
　ＢＭＴ受容者にマイナスの応答が生ずる時間の中央値（ｍｅｄｉａｎ　ｔｉｍｅ）は移植後の最初の１００日間内である。それ故、統計的には、患者が１００日目まで生存するならば、これらの患者が生存し続けるチャンスは有意に強化される。本発明の化合物は患者の生存率を高めることができる。受容可能と考えられる、最初の１００日間の致死率は“良好な危険性（ｇｏｏｄ　ｒｉｓｋ）”患者の１５〜２０％であり、“高危険性”患者の３０〜４０％である。これらの致死率は化学／放射線療法の高い投与量の直接的な影響によるものである。さらに、ＧＶＨＤは同種異系の骨髄受容者における死亡率にも寄与する。
【００７８】
　本発明の化合物の投与が有用である他の適応症には、腫瘍に伴う苦痛の存在、ホルモン関連障害、神経障害、自己免疫疾患、炎症、再狭窄、冠状動脈疾患、アテローム硬化症、高血圧、望ましくない免疫応答、ウイルス感染症、腎炎、粘膜炎（ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）、及び種々なアレルギー反応がある。アレルギー反応の予防は急性アレルギー反応の予防、並びに、鼻漏、シナスドレナージ（ｓｉｎｕｓ　ｄｒａｉｎａｇｅ）、散在性組織浮腫及び全身化そう痒症の緩和又は予防を含む。慢性アレルギー反応の他の症状は、上記症状の他に、めまい感、下痢、組織充血及び、局在化白血球浸潤を伴う涙腺腫脹（ｌａｃｒｉｍａｌ　ｓｗｅｌｌｉｎｇ）を含む。アレルギー反応はまた、ロイコトリエン放出とその遠位効果をも付随し、気道閉塞の発現を含む喘息症状、ＦＥＶＩの減少、生体能力の変化及び大量の粘液産生を含む。
【００７９】
　本発明の化合物の投与に適した、他の対象は例えば化学療法剤又は照射療法のような腫瘍の治療のための細胞減少（ｃｙｔｏｒｅｄｕｃｔｉｖｅ）剤を投与され、並びに例えばＩＬ−２のような生物学的反応調節剤及び例えばリンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）と腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ細胞）とのような腫瘍抑制細胞による治療を受ける患者；他の方法で治療されたか否かに拘わらず、急性及び慢性の骨髄性白血病、ヘアリー・セル白血病、リンパ種、巨核球白血病等を含めた、一般に新生物に罹患した患者；細菌、真菌類、原生動物もしくはウイルス感染によって生ずる疾患状態に罹患した患者；心臓手術を受けた患者のような、例えば再狭窄としての不快な平滑筋細胞増殖を示す患者；自己免疫疾患に罹患し、Ｔ細胞及びＢ細胞の不活化を必要とする患者；及び神経障害を有する患者を含む。
【００８０】
　本発明の化合物はさらに、アセチルコリン及び／またはエピネフリンによるシナプトソームの刺激に起因する関連したＰＡ及びＤＡＧの強化されたレベルを減ずることができる。このことは、本発明の化合物の効果が例えばドーパミンのような抑制的神経伝達物質の放出を強化することと、このような神経伝達物質の遠位の“遅い電流”効果を調節することの両方であることを示唆する。
【００８１】
　このように、本発明の薬物は発作閾値を高め、例えばストリキニーネのような神経毒に対してシナプスを安定化し、例えばＬ−ドーパのような抗パーキンソン病薬の効果を強化し、催眠性化合物の効果を強化し、トランキライザーの投与に起因する運動障害を軽減し、例えば発作（ｓｔｒｏｋｅ）のような脳血管イベント後の進行性神経死を付随するニューロン過度燃焼を軽減又は防止するためにも有用である。さらに、本発明の化合物はノルエピネフリン欠乏うつ病及び内因性グルココルチコイドの放出に関連したうつ病の治療に有用であり、デキサメタゾン又はメチルプレドニソロンの中枢神経系に対する毒性を防止し、この薬物への嗜癖なしに慢性疼痛を治療することができる。さらに、本発明の化合物は学習及び注意力欠陥を有する小児の治療に有用であり、一般に、例えばアルツハイマー病患者を含めた器官的欠陥を有する対象における記憶を改良する。
【００８２】
　投与量は変化するが、本発明の化合物をこのような治療を必要とするヒト対象に、患者の体重に依存して、約２００ｍｇ〜約５０００ｍｇ／日の、有効な経口、非経口、又は静脈内の致死下投与量として投与する場合には、治療効果が達せられる。白血病の治療における特に好ましい使用計画（ｒｅｇｉｍｅｎ）は４〜５０ｍｇ／体重ｋｇである。しかし、如何なる特定の対象に対しても、個人のニーズと、本発明の化合物を投与する又は本発明の化合物の投与を指図する人の専門的判定とに合わせて特定の投与計画を調節しなければならないことを理解すべきである。
【００８３】
　Ｐ−４５０抑制剤の同時投与
　本発明の化合物をＰ−４５０抑制剤と共にｉｎ　ｖｉｖｏ同時投与することは、本発明の化合物の長い半減期による効果の強化を生ずる。このｉｎ　ｖｉｖｏ効果は本発明の化合物の分解経路の阻害による；特に、キサンチン環のＮ７位置における脱アルキル化によるものである。例えば、ＮＩＨ３Ｔ３−Ｄ５Ｃ３細胞を用いて、形質転換の表現型制御、本発明の化合物単独によるインキュベーション、及び本発明の化合物とＰ−４５０抑制剤との同時インキュベーションを比較することによって、本発明の化合物単独又はＰ−４５０抑制剤との併用との効果を比較することができる。
【００８４】
　Ｐ−４５０を抑制する化合物には、例えば、（ｍｇ範囲の一日投与量）で、プロプラノール（２０−１００）、メタプロロール（２０−１００）；ヴェラパミル（１００−４００）、ディルチアゼム（１００−４００）、ニフェジピン（６０−１００）；シメチジン（４００−２，４００）；シプロフロキサシン（５００−２，０００）、エノキサシン（５００−２，０００）、ノルフロキサシン（５００−２，０００）、オフロキサシン（５００−２，０００）、パーフロキサシン（５００−２，０００）；エリスロマイシン（１００−１，０００）、トロレアンドマイシン（１００−１，０００）；ケトコニゾール（１００−２，０００）、チアベンザドール（１００−１，０００）；イソニアジド（１００−１，０００）；メキシレチン（１００−１，０００）及びデキサメタゾン（１−１００ｍｇ）がある。
【００８５】
　適当な処方は治療すべき障害の性質、選択した薬物の性質、及び主治医（ａｔｔｅｎｄｉｎｇ　ｐｈｙｓｉｃｉａｎ）の判定に依存する。一般に、本発明の化合物は注射用又は経口投与用のいずれかのために処方されるが、例えば経粘膜もしくは経皮経路のような、他の投与形式も使用可能である。これらの化合物の適当な処方は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ（最新版），マック　パブリッシュイング　カンパニー（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ）、イーストン、ＰＡに見い出すことができる。
【００８６】
　選択した本発明の化合物に依存して、例えばキノロンのようなＰ−４５０抑制剤の同時投与によって、投与量レベルをかなり減ずることができる。或いは、このようなキノロンによって強い相乗効果を得ることができる。
【００８７】
　下記実施例によって本発明を説明するが、これらの実施例を、本発明を限定するものと見なすべきではない。これらの実施例において、ＰＴＸはペントキシフィリンを意味する。
【実施例】
【００８８】
　実施例１
　この実施例はラセミＭＩの分解によるＣＴ１５０１Ｒの合成を説明する。反応バイアル中のＭＩによって飽和されたエーテルに、３．０当量のピリジン（水素化カルシウムから新たに蒸留したもの）及び３．０当量のＲ−（＋）−１−メトキシ−１−トリフルオロメチル−フェニル酢酸（（＋）−ＭＴＦＰＡ）の酸塩化物を加えた。この反応バイアルを密封し、５０℃に１時間加温し、乾燥するまで窒素流下に置き、次に７５％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ中で再構成した。（７５％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ）９０％、アセトニトリル（ＡｃＮ）３％、水７％から成るイソクラチック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）系を３．０ｍｌ／分の流量で２５０ｘ１０ｍｍウルトレメックス（Ｕｌｔｒｅｍｅｘ）５Ｃ−１８カラム［フェノメネックス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ），カリフォルニア州，トーランス，９０５０１］に通すことによって、分離を行った。サンプルを７５％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ中のＭＴＦＰＡーＭＩの１０％溶液として調製して、１００μｌアリコートを７分間毎に２１分間注入した（４回注入）。化合物は２９．８分間目［（Ｓ−ＭＩ）−ＭＴＦＰＡ］、及び３１．４分間目［（Ｒ−ＭＩ）−ＭＴＦＰＡ］に溶離して、９５％分離した。ダール（Ｄａｌｅ）等が述べているように（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３４：２５４３，１９６９年）、ＮＭＲに基づいて無水構造を割り当てた。回収された画分を一緒にし、回転蒸発（ｒｏｔｏｖａｐ）によって量を減じた。最初に、サンプルをＭｅＯＨとＡｃＮとを除去するためにのみ蒸発させ、その後にこれらをクロロホルムによって抽出した。この溶媒を乾燥させ、真空下で除去した。後に、該エステルが水の除去に必要な軽度の（ｍｉｎｏｒ）温度上昇に安定であることが研究によって示された後に、この抽出工程は省略した。
【００８９】
　（＋）−ＭＴＦＰＡ−ＭＩ立体異性体の加水分解　ＭＴＦＰＡエステルの加水分解の進行を監視するために、直接ＭＩと、存在する総エステルとを定量する分析法を開発することが必要であった。傾斜プログラムを用いて、注入後１．０〜８．０分間から可動相を（７５％ＭｅＯＨ／水）４０％，ＡｃＮ４０％，水１０％から（７５％ＭｅＯＨ／水）４０％，ＡｃＮ６０％までに変えた。最終条件を３分間維持し、その後、カラムを再平衡化した。溶出液を２８０ｎｍにおいて監視し、遊離ＭＩと誘導体化ＭＩとの保持時間はそれぞれ６．５分間と１２．３分間であった。この系を用いて、誘導体化ＭＩの立体異性体は分離されなかったので、この系はＭＴＦＰＡエステルの加水分解を監視するための分析手段として用いることができた。
【００９０】
　ＥｔＯＨ４．０ｍｌ中の純粋なＭＴＦＰＡ−ＭＩエステル（Ｒ又はＳ誘導体）３０ｍｇに、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ）約４０ｍｇを加え、この混合物を油浴中で７０℃に加熱した。日中４時間毎にさらに水素化ホウ素ナトリウム（２０ｍｇ）を加えた。５４時間後に反応は、ＭＩ＋ＭＩエステルの総ピーク面積の損失なく、約９０％完成した（ＨＰＬＣによる）。反応を一塩基性リン酸ナトリウム／水によって停止させ、ＨＣｌによってｐＨ３．５に調節し、ＥｔＯＨを真空下で除去し、未反応エステルとＭＩとをクロロホルム中に抽出した。このクロロホルムを硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空下で除去した。粗生成物を分取クロマトグラフィーを用いて、２５０ｘ１０ｍｍカラムによって３．０ｍｌ／分の流量を用いる、ＭＩに関して上述した溶媒傾斜法（ｓｏｌｖｅｎｔ　ｇｒａｄｉｅｎｔ）によって、精製した。回収した画分を真空下で蒸発乾固させ、エーテルを加えて磨砕し、鏡像異性体の過剰度（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ　ｅｘｃｅｓｓ）に関して分析した（両異性体に関して＞９５％）。エーテルを窒素下で除去し、得られた結晶を最少量の標準生理食塩水中に溶解した。この標準化溶液を標準生理食塩水によって希釈して、各鏡像異性体の１０ｍＭ溶液を調製した。再形成ＭＴＦＰＡエステルのＨＰＬＣによって鏡像異性体のアイデンティティ（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を確認した。
【００９１】
　実施例２
　この実施例は、実験室規模でのキラル　ディレクター（ｃｈｉｒａｌ　ｄｉｒｅｃｔｏｒ）としてＲピナンジオールを用いる（Ｒ）−１−（５−ヒドロキシヘキシル）−３，７−ジメチルキサンチン（ＣＴ１５０１Ｒ）の製造方法を説明する。５００ｍｌ丸底フラスコ中でトリエチルシラン（８３．４９ｇ，０．７１８モル）と４−ブロモー１−ブテン（９７ｇ，０．７１８モル）とを混合し、−７８℃に冷却した。１リットル丸底フラスコ中で三塩化ホウ素（８４．１３ｇ，０．７１８モル）ガスを−７８℃において凝縮させ、ペンタン４００ｍｌを加えた。シラン／ブテン混合物を三塩化ホウ素溶液に、アルゴン下で撹拌しながら、カニューレを介して滴加し、この間内部温度を−７８℃に維持した。添加の終了時に、３当量のメタノールを溶液に滴加した。次に、溶液を室温に加温し、ペンタン、ＨＣｌ及び過剰なメタノールを大気圧においてアルゴン下で留去した。残渣を真空蒸留して、ジメチル　４−ブロモブチルボロネート（０．９ｔｏｒｒにおいてｂｐ７０−７９℃，収量１２７．５ｇ，収率８５％）を得た。
【００９２】
　５００ｍｌ丸底フラスコ中で、（Ｒ）−ピナンジオール（６２ｇ，０．３６５モル）とジメチル　４−ブロモブチルボロネート（７５ｇ，０．３５９モル）とを２００ｍｌのジエチルエーテルと共に撹拌した。３０分間後に、エーテルを真空下で除去して、残渣を蒸留して、（Ｒ）−ピナンジオール−４−ブロモブチルボロネート（１．６−１．９ｔｏｒｒにおいてｂｐ１３４−１４１℃，１１０．８５ｇ，収率９８％）を得た。
【００９３】
　同族体化反応を実施するために、塩化メチレン（３１．４７ｇ，０．３７０モル）と無水ＴＨＦ５００ｍｌとをサイドアーム付き１リットル丸底フラスコ中でアルゴン下において、撹拌しながら−１００℃に冷却した。この冷却した溶液に、アルゴン下で撹拌しながら、ｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中１．４Ｎ）２１２ｍｌをフラスコの側面に沿って４５分間かけて滴加し、この間内部温度を−１００℃に維持した。添加の終了後、溶液を２０分間撹拌させた。ピナンジオール−４−ブロモブチルボロネート（７７．８２ｇ，０．２４７モル）に、無水ＴＨＦ１００ｍｌを混合し、−７８℃に冷却し、次に内部温度を１００℃に維持しながら、リチウムメチルジクロリド溶液に加えた。添加の終了時に、完全に乾燥した塩化亜鉛（３０．２９ｇ，０．２２２モル）を加えた。この溶液をアルゴン下で１０時間撹拌し、室温に加温した。溶媒を真空下で除去した。この残渣に、石油エーテル５００ｍｌと飽和塩化アンモニウム水溶液３００ｍｌとを加えた。有機相を分離し、飽和塩化アンモニウム溶液（２ｘ２５０ｍｌ）によって洗浄した。水層を一緒にし、石油エーテル（２ｘ２５０ｍｌ）で洗浄した。有機相を一緒にし、硫酸ナトリウムによって乾燥させ、濾過し、蒸発させて、粗ピナンジオール（Ｒ）ブロモペンチルボロネート，粗重量９２．１３ｇ（１０２％）を得た。
【００９４】
　５００ｍｌ丸底フラスコ中で、無水ＴＨＦ３００ｍｌと前の反応からの粗ピナンジオール（Ｒ）−１−クロロー５−ブロモペンチルボロネート（推定８９ｇ，０．２４７モル）とを混合し、アルゴン下で撹拌しながらー７８℃に冷却した。この溶液に臭化メチルマグネシウム（３．２６Ｎ，７９．６ｍｌ）を加えた。この溶液を一晩かけて室温に加温した。石油エーテル（５００ｍｌ）と飽和塩化アンモニウム（２５０ｍｌ）とを加えて、エマルジョンを形成した。水相を分離した。有機相を飽和塩化アンモニウム溶液（２ｘ２５０ｍｌ）で洗浄し、エマルジョンを消失させた。一緒にした水相を石油エーテル（２ｘ２５０ｍｌ）によって洗浄した。一緒にした有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させて、粗ピナンジオール（Ｒ）−５−ブロモ−１−メチルペンチルボロネート８５．８５ｇを得た。
【００９５】
　５リットル−フラスコ中で、ＤＭＳＯ　２リットルのＤＭＳＯとテオブロミン（４４．５１ｇ，０．２４７モル）とをアルゴン下で撹拌しながら混合した。この溶液に水素化ナトリウム（９．９ｇ，０．２４７モル）を２アリコートとして加え、テオブロミンが溶解するまで撹拌させた。３時間後に、この溶液に前の反応からのピナンジオール（Ｒ）−５−ブロモー１−メチルペンチルボロネート（８４．７５ｇ，０．２４７モル）を正確に（ｎｅａｔ）滴加し、１２時間撹拌させた。
【００９６】
　溶液からＤＭＳＯを蒸留した（再循環可能）。残渣を塩化メチレン５００ｍｌと水５００ｍｌとによって処理した。水相を除去し、有機相を水（３ｘ７５０ｍｌ）によって洗浄した。水相を一緒にし、塩化メチレン２ｘ５００ｍｌによって洗浄した。有機相を一緒にして、硫酸ナトリウムによって乾燥させ、濾過して、溶媒を真空下で除去し、ピナンジオール（Ｒ）−５−（３，７−ジメチルキサンチン）−１−メチルペンチルボロネート（８８．１４ｇ，収率８０％）を得た。
【００９７】
　このボロネートを次にＴＨＦ／水（各３００ｍｌ）中に溶解し、混合物をアルゴン下で撹拌しながら０℃に冷却した。内部温度を０℃に維持しながら、３Ｎ水酸化カリウム９５ｍｌを滴加し、その後に３０％過酸化水素３２．３ｍｌを滴加した。混合物を２時間撹拌し、固形物を濾別した。水と塩化メチレン（各３００ｍｌ）を加えた。相を分離し、水相を塩化メチレン（４ｘ１００ｍｌ）によって洗浄した。一緒にした有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残渣を少量の塩化メチレンとそれより多量のエーテルとによって再結晶させた。収量は（Ｒ）−１−（５−ヒドロキシヘキシル）−３，７−ジメチルキサンチン（ｍ．ｐ．１０５−１０８℃）４６．３ｇ（８７％）であった、［α］Ｄ＝−５．６３，約９６％ｅｅ。
【００９８】
　実施例３
　この実施例はキラル　ディレクターとしてＤＩＣＨＥＤを用いる（Ｒ）−１−（５−ヒドロキシヘキシル）−３，７−ジメチルキサンチン（ＣＴ１５０１Ｒ）の製造方法を説明する。実施例２に述べたピナンジオール　キラル　ディレクターの代わりに（１Ｓ，２Ｓ）−（１，２）−ジシクロヘキシルエタンジオール（ＤＩＣＨＥＤ）を用いることができる。このキラル　ディレクターはピナンジオールよりも容易に回収される（９５％）。ＤＩＣＨＥＤはシャープレス（Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ）等，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５７：２７６８，１９９２年に述べられている方法に従って製造することができる。上述したように製造されたジメチル−４−ブロモブチルボロネート（１０．１ｇ，４８．０６ミリモル）に、エーテル１００ｍｌ中の（Ｓ，Ｓ）−ＤＩＣＨＥＤ　１０．５４ｇ（４６．６ミリモル）を混合した。３０分間後に、エーテルを除去し、残渣をシリカゲル１０ｇの短いカラムに通し、石油エーテル／エーテル（９：１）で溶出し、（Ｓ，Ｓ）ＤＩＣＨＥＤ類似体４−ブロモブチルボロネート１７．８ｇを得た。
【００９９】
　実施例２に述べたように、下記量：ＤＩＣＨＥＤ４−ブロモブチルボロネート１７．８ｇ；塩化メチレン６．１１ｇ；１．４Ｎ　ｎ−ブチルリチウム４１．２ｍｌ；ＴＨＦ１００ｍｌ及び無水塩化亜鉛５．８９ｇを用いて、同族体化反応を実施した。
【０１００】
　実施例２におけるように、下記量：ＤＩＣＨＥＤ（Ｒ）−１−クロロー５−ブロモペンチルボロネート２０．０４ｇ；３．０Ｎ臭化メチルマグネシウム１６．７ｍｌ；及びＴＨＦ１５０ｍｌを用いて、グリニャール反応を実施した。
【０１０１】
　５０ｍｌフラスコにおいてＴＨＦ（１０ｍｌ）中にＤＩＣＨＥＤ５−ブロモー１−メチルペンチルボロネートを溶解することによって、（Ｒ）−６−ブロモヘキサン−２−オールを得るためのＤＩＣＨＥＤボロネートの酸化を実施した。水（１０ｍｌ）を溶液に加えた。この溶液をアルゴン下で撹拌しながら０℃に冷却した。炭酸ナトリウム（３Ｍ溶液１６．５ｍｌ）を加えた後に、３０％過酸化水素　８ｍｌを加えた。溶液を濾過し、ペンタン２０ｍｌを加え、再び濾過した。水相を分離し、ペンタン（２ｘ１０ｍｌ）によって洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒を蒸発させて、（Ｒ）−６−ブロモーヘキサンー２−オールを粗収量８．９ｇで得た。真空蒸留によって、旋光度−１３．８９［α］５４９を有する純粋物質を収量７．１ｇ（８４％）で得た。
【０１０２】
　（Ｒ）−ブロモアルコールをテオブロミンに加えた。テオブロミン（２．０２ｇ，１１．２ミリモル）の混合物をＤＭＳＯ（３０ｍｌ）中で撹拌し、水素化ナトリウム２８２ｍｇ（１１．８ミリモル）を加えた。この反応混合物を８０分間、激しく撹拌した。ブロモアルコール（２．０３ｇ，１１．２ミリモル）を滴加し、撹拌を２１時間続けた。ＤＭＳＯを完全なポンプ真空下で留去した。水（１００ｍｌ）を加えた。混合物を２５％エタノール／塩化メチレン（３ｘ５０ｍｌ）によって抽出し、一緒にした抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、蒸発させた。残渣を塩化メチレン２０ｍｌ中に入れ、エーテル１５０ｍｌを加えた。（Ｒ）−１−（５−ヒドロキシヘキシル）−３，７−ジメチルキサンチン（１．５ｇ，５．３６ミリモル，収率４７．８％）のベージュ色結晶が形成された。生成物の他の５００ｍｇを次の２４時間にわたって結晶化させて、キラル　クロマトグラフィーによって９４％より大きいｅｅを有する総収量２ｇ（全体で６４％）を得た。
【０１０３】
　実施例４
　この実施例は（ＲもしくはＳ）−１−（６−ヒドロキシヘプチル）−３，７−ジメチル−１０−キサンチン又は（ＲもしくはＳ）−７−ヒドロキシオクチル−３，７−ジメチルキサンチンの合成法を説明する。これらの化合物は上述の適当なピナンジオール／ＤＩＣＨＥＤ方法を用いて、出発物質として長鎖ブロモーオレフィン，５−ブロモ−１−ペンテン及び６−ブロモー１−ヘキセン，１５をそれぞれ用いることによって、製造した。
【０１０４】
　実施例５
　この実施例はＣＴ１５０１ＲとＰＴＸとの混合リンパ球反応を説明する。この混合リンパ球反応は、ツーウェイ（ｔｗｏ−ｗａｙ）混合リンパ球反応において測定される、同種異系刺激に対するＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）の増殖反応を示す。ＣＴ１５０１ＲとＰＴＸとの両方は図１に示した、この免疫調節活性分析法において活性を示した。
【０１０５】
　実施例６
　この実施例は架橋した抗マウス（ａｎｔｉ−ｍｕ）抗体及び／又はインターロイキン−４（ＩＬ−４）によって刺激されたマウスＢ細胞増殖の抑制に対するＣＴ１５０１Ｒの効果を示す。図２は、指示された増殖シグナルによって惹起されるＢ細胞増殖をＣＴ１５０１Ｒが抑制したことを示す。
【０１０６】
　図３は、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）及びインターロイキンー１α（ＩＬ−１α）若しくはインターロイキン−２（ＩＬ−２）によって惹起される増殖を抑制するＣＴ１５０１Ｒの効果を示す。ＣＴ１５０１ＲはＣｏｎＡ及びＩＬ−１α若しくはＩＬ−２による活性化の２時間前に指示用量で細胞に加えた。ＣＴ１５０１Ｒは、図３に示した用量−反応関係で胸腺細胞増殖を抑制した。バックグラウンド　カウントは２００ｃｐｍ未満であった。
【０１０７】
　図４は、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）及びＩＬ−１によって刺激された平滑筋増殖の抑制に対するＣＴ１５０１ＲとＰＴＸとの効果を示す。ＰＤＧＦとＩＬ−１とによる活性化の２時間前に、ＣＴ１５０１ＲとＰＴＸとを別々に細胞に加えた。両方の薬物は図４に示したように高い試験用量で平滑筋細胞増殖を抑制し、ＣＴ１５０１ＲはＰＴＸよりも高活性であった。
【０１０８】
　実施例７
　この実施例はサイトカイン放出と細胞接着との抑制を含めた、ＣＴ１５０１Ｒのｉｎ　ｖｉｔｒｏ効果を説明する。我々は内毒素、ＴＮＦ−α又はＩＬ−１αによって刺激された、サイトカイン放出と活性化ヒト臍（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ）内皮細胞への接着とに対するＣＴ１５０１Ｒの効果を測定した。
【０１０９】
　マウス腹腔滲出細胞マクロファージ（ＰＥＣ）をマウス腹腔の灌流によって単離し、９６孔トレー中において５ｘ１０５細胞／孔で培養した。刺激物の添加の１時間前に培養物にＣＴ１５０１Ｒを添加して又は添加せずに、細胞をサルモネラ　アボルタス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ａｂｏｒｔｕｓ）に等しく由来する（ｅｑｕｉ−ｄｅｒｉｖｅｄ）内毒素［ＬＰＳ；シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．），Ｌ−１８８７］５μｇ／ｍｌ又はＩＬ−１α［ゲンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）；マサチューセッツ州，ケンブリッジ］５０ｎｇ／ｍｌによって刺激した。その後の種々な時間に、上澄み液を取り出して、市販用の９６孔マイクロタイター免疫検定キット［ゲンザイム；ＴＮＦ；エンドゲン（Ｅｎｄｏｇｅｎ），マサチューセッツ州，ボストン；ＩＬ−１α］を用いて、製造者の仕様書に従ってＴＮＦ−α又はＩＬ−１αのレベルを分析した。接着検査のためには、早期継代（ｅａｒｌｙ　ｐａｓｓａｇｅ）ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を商業的供給者［クローネチックス（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ），カリフォルニア州，サンジエゴ又はセル　システムズ（Ｃｅｌｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ），ワシントン州，シアトル］から入手して、酸性ＦＧＦ（セル　システムズ　ｃａｔ４０１−１１１）を補充した、一定のヘペス（Ｈｅｐｅｓ）緩衝化無血清培地（セル　システムズ　ｃａｔ３０１−１８０）中で培養した。９６孔マイクロタイタープレートの各孔中で４０００細胞を培養し、３７℃において７２時間インキュベートさせた。組織球白血病細胞ラインＵ９３７を１０％ウシ胎児血清補充ＲＰＭＩ　１６４０培地中で刺激した。ＨＵＶＥＣ又はＵ９３７細胞をＬＰＳ、ＩＬ−１α又はＴＮＦ−αによって１２時間刺激した。接着分析のために、Ｕ９３７細胞を蛍光生死判別（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）ステイン、２’，７’−ビスー（２−カルボキシエチル）−５−（及びー６）−カルボキシフルオレセインアセトキシメチルエステル（ＢＣＥＣＦ）によって標識した。簡単には、細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地＋１０％ウシ胎児血清中でＢＣＥＣＦ１０μｇ／ｍｌによって３７℃において３０分間標識した。細胞を完全培地によって１回洗浄し、ＨＵＶＥＣ培養物に５０，０００細胞／孔を加えた。サンプルを３７℃において３０分間インキュベートし、インバートし（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）、４００ｘｇで１０分間遠心した。ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋ’ｓ　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＨＢＳＳ）１００ｍｌを添加した後に、このマイクロタイタープレートを次にミリポアーサイトフルオール（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ）蛍光プレートリーダー上で分析した（励起４８８ｎｍ；発光５２５ｎｍ）。細胞の連続希釈物の蛍光は２０〜１００，０００細胞／孔の広範囲な細胞濃度にわたって直線的な濃度関係を示した（データを示さず）。全ての実験は少なくとも２回繰り返し、全ての結果は上述の実験の結果を実証した。
【０１１０】
　ＣＴ１５０１ＲはＬＰＳ刺激ＰＥＣ細胞からのＴＮＦ−α放出を抑制した。細胞は２５０ｍＭ　ＣＴ１５０１Ｒによって前処理し、上澄み液をＥＬＩＳＡによってＬＰＳ刺激後の時間の関数としての放出ＴＮＲ−αに関して分析した。ＣＴ１５０１Ｒは、６〜２４時間目におけるＬＰＳ誘導レベルの約５０％から４８時間目における約７０％までの範囲にわたって、あらゆる時点においてＴＮＦ−α放出を有意に抑制した。図１８には、放出ＴＮＦに対するＣＴ１５０１Ｒの効果の用量−反応を示す。種々な濃度のＣＴ１５０１Ｒによる処理の１時間後に、ＰＥＣ細胞をＬＰＳによって刺激した。５０％抑制のＣＴ１５０１Ｒ濃度は約３０μＭであった。５００μＭでは、ＣＴ１５０１Ｒの抑制効果は最大ＬＰＳ刺激（１４２８ｐｇ／ｍｌ）の約４０％であった。
【０１１１】
　ＬＰＳは腹腔マクロファージにおけるＩＬ−１α放出を刺激し、ＩＬ−１α放出はＬＰＳ刺激後１２時間までに２４ｐｇ／ｍｌレベルに増加し、４８時間までに３１ｐｇ／ｍｌに増加する（図１９）。ＣＴ１５０１Ｒの添加は１２〜４８時間目にＩＬ−１α放出を有意に減じ、２４時間目に約５０％の最大抑制を示した。腹腔マクロファージをＬＰＳではなくＩＬ−１α５０ｎｇ／ｍｌによって刺激した場合には（図２０）、ＣＴ１５０１ＲはＴＮＦ−αの放出をも抑制した（図２０）。ＣＴ１５０１Ｒの添加は試験した時点におけるＴＮＦ−αの誘導レベルの５０〜７０％抑制を生じた。
【０１１２】
　免疫系統の細胞は血管内皮細胞を識別し、結合することによって血液から出る。その後、免疫細胞は内皮細胞と周囲の組織との間を移動する。免疫細胞の内皮細胞接着と血管外溢出とのモデルは、炎症とアテローム発生反応とのｉｎ　ｖｉｖｏ処理（ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）の予測モデルを提供する。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１α又はＬＰＳによる内皮細胞の活性化はある種の接着分子をアップーレギュレート（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅ）して、リンパ球、単球、好酸球及び好中球へのそれらの接着性を高める。細胞ラインＵ９３７を用いて、活性化ＨＵＶＥＣへの接着の抑制に対するＣＴ１５０１Ｒの効果を試験した。Ｕ９３７細胞は、内皮細胞上に表現される免疫グロブリン　スーパーファミリー（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）のメンバーである血管接着分子１（ＶＣＡＭ）を介する内皮細胞への単球接着を仲介するインテグリンＶＬＡ−４の発現を含む、単球の特徴的な、多くの表現型を表現する。ＨＵＶＥＣをＴＮＦ−α、ＩＬ−１α又はＬＰＳから選択した活性剤によって、活性剤の添加の１時間前に２５０μＭ　ＣＴ１５０１Ｒを添加して又は添加せずに、処理した。図２１に示すように、ＣＴ１５０１Ｒの添加によってＨＵＶＥＣへのＵ９３７細胞のバックグラウンド結合に対する有意な影響は存在しなかった。しかし、ＣＴ１５０１Ｒによって前処理した活性化ＨＵＶＥＣの相対的接着性には顕著な抑制が存在した。ＣＴ１５０１Ｒによるこの抑制はＴＮＦ−α、ＩＬ−１α又はＬＰＳのいずれかによるＨＵＶＥＣの刺激によって観察された。
【０１１３】
　逆にいえば、ＩＬ−１αによるＵ９３７細胞の活性化は非刺激ＨＵＶＥＣへのそれらの接着性をも高めた（図２２）。２５０μＭ　ＣＴ１５０１ＲによるＵ９３７細胞の前処理はＨＵＶＥＣへの接着のＩＬ−１α仲介増加をバックグラウンド　レベル近くまで効果的に阻止した。
【０１１４】
　ＣＴ１５０１Ｒは、腹腔マクロファージ、ヒトＵ９３７組織球性白血病細胞ライン、及びヒト臍静脈内皮細胞において、ＬＰＳ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１αー仲介炎症シグナル形成経路と、同時に生ずる細胞反応とを抑制した。ＣＴ１５０１ＲはＬＰＳによって刺激された腹腔マクロファージからの炎症前サイトカインのＴＮＦ−α及びＩＬ−１αの放出を有意に減少させた。
【０１１５】
　ＬＰＳ　１０μｇ／ｍｌ刺激を用いたＴＮＦ−α抑制のＩＣ５０は約３０μＭであった。ＣＴ１５０１ＲはＩＬ−１α活性化ＰＥＣからのＴＮＦ−α放出を阻止した。ＣＴ１５０１ＲはＴＮＦ−α、ＩＬ−１α又はＬＰＳ活性化ＨＵＶＥＣへのＵ９３７細胞の接着増加を阻止した。最後に、ＣＴ１５０１Ｒは、ＩＬ−１α誘導活性化とＵ９３７細胞の非刺激ＨＵＶＥＣへの接着性上昇とを阻止した。
【０１１６】
　実施例８
　この実施例は、ＣＴ１５０１Ｒの局所塗布を含む、ヌードマウスのヘア試験を説明する。チャールス　リバー　ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からの生後６〜８週間の雌のｎｕ／ｎｕマウスをバイオサポート　リサーチ　サポート　サービス（Ｂｉｏｓｕｐｐｏｒｔ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｓｕｐｐｏｒｔ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）（ワシントン州，シアトル）において加圧滅菌したマイクロアイソレーター（ｍｉｃｒｏ　ｉｓｏｌａｔｏｒ）装置に収容して、高塩素処理した加圧滅菌水、照射した齧歯類食餌を与え、層流フード下に保持した。ケージ（ｃａｇｉｎｇ）は毎週交換し、水は週２回交換した。各試験の開始前、５日間マウスを順化させた。
【０１１７】
　加熱した親水性軟膏（ＵＳＰ）にＣＴ１５０１Ｒを１％濃度で加えることによって、最初の局所製剤を調製し、凝固させた。
【０１１８】
　この最初のＣＴ１５０１Ｒ局所製剤をヌードマウスの左わき腹に１日に２回、１６日間滅菌アプリケーターによって塗布し、右わき腹には同じ基剤中の別の化合物を塗布した。マウスは層流フード下で、顔面マスクと滅菌手袋を着用した塗布者によって取り扱った。１６日間後に、マウス１匹を頚部脱臼によって殺し、肩／わき腹の処置部分と背側骨盤（臀部）の非処置部分とから皮膚生検材料（ｂｉｏｐｓｙ）を採取した。試験片を１０％緩衝化ホルマリン中に入れた。生検材料は組織病理学のために獣医の皮膚病理学者に送った。この処置の６週間後に、第２マウスを安楽死させ、第１マウスと同様に生検材料を採取した。組織病理学のためにサンプルを送った。
【０１１９】
　第１実験からの結果は、処置部分が非処置部分よりも有意により正常な外観の毛包を有することを示す。ＣＴ１５０１Ｒと他方の化合物との両方に関して、処置部分では無数の毛鞘が毛包から出ているのが見られ、これに対して非処置部分では毛鞘が全く見られなかった。
【０１２０】
　第２実験では、育毛適応に関して認可されている、市販の局所ミノキシジル（ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ）製剤［ロゲイン（Ｒｏｇａｉｎｅ）（登録商標），アプジョーン（Ｕｐｊｏｈｎ）］と共に、ＣＴ１５０１Ｒの局所塗布を実施した。バンチン　アンド　キングマン　ユニバーサル（Ｂａｎｔｉｎ　ａｎｄ　Ｋｉｎｇｍａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）からの生後５〜６週間の雌のｎｕ／ｎｕマウスをバイオサポート　リサーチ　サポート　サービス（ワシントン州，シアトル）において加圧滅菌したマイクロアイソレーター装置に収容して、高塩素処理した加圧滅菌水、照射した齧歯類食餌を与え、層流フード下に保持した。ケージは毎週交換し、水は週２回交換した。試験の開始前、７日間マウスを順化させた。
【０１２１】
　ＣＴ１５０１Ｒと他の２種の化合物とをＥＴＯＨ６０％、水１０％及びＰＥＧ３０％の局所製剤として、ビヒクルのみと共に調製した。ミノキシジルは地方の薬局から市販製剤ロゲイン（登録商標）として購入した。ロゲイン（登録商標）は同一の製剤ベース（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ　ｂａｓｅ）で販売されている。マウスは各供試品に特有の、固有尾標識によって確認した。マウス２匹／群はＣＴ１５０１Ｒと他の１種の化合物によって処置した。マウス１匹はビヒクルとミノキシジルの各々によって処置した。マウスは層流フード下で、顔面マスクと滅菌手袋を着用した塗布者によって取り扱った。溶液又はマウスの汚染を避けるために、各マウスは別々の滅菌アプリケーターによって１日に２回処置した。全てのマウスに頭蓋骨の基部から尾の基部まで背中の中心線に沿って、約１．５ｃｍ幅に、適当な供試品をストリップ状に塗布した。３４日間後に、全てのマウスをハロタン麻酔薬の過剰量によって安楽死させた。皮膚生検材料を肩甲骨の間の頚部の首筋に沿ってマウス７匹の各々から採取した（およそのサイズは１ｘ１．５ｃｍであった）。全ての試験片をガーゼ上に置いて血液と流体を除去し、木製舌圧子の切片に固定し、側面を下にして試験片を１０％緩衝化ホルマリンを含む、別々に標識した容器に入れた。定性的組織病理学的検査のために、試験片を獣医の皮膚病理学者に送った。
【０１２２】
　主観的検査は、ビヒクル処置マウス（対照）が最低に毛包を発現させたことを明らかにした。ミノキシジル処置マウスでは処置に対するヘア反応が明らかであった。ＣＴ１５０１Ｒと他方の化合物によって処置されたマウスは毛包の最大濃度を有した。さらに、マウスの目視検査は、ＣＴ１５０１ＲマウスはＣＴ１５０１Ｒ、ミノキシジル及び対照から成る群の中で最大に“毛深い”ことを示した。それ故、ＣＴ１５０１Ｒはこのモデルにおける育毛促進に少なくともミノキシジルと同程度に良好であった。従って、１〜４％ＣＴ１５０１Ｒ（重量による）の局所製剤は禿頭症を治療し、育毛を促進するための有効な治療組成物である。
【０１２３】
　実施例９
　この実施例は内毒素の致死量を投与されたマウスの生存率（ｓｕｒｖｉｖａｌ）に対するＣＴ１５０１Ｒの効果を説明する。我々は、ＣＴ１５０１Ｒがマウス　モデルにおける内毒素誘導致死を防止するかどうかを判定した。バイオメンブラン　インスチチュート（Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ワシントン州，シアトル）のアニマルユーズ　コミティ（Ａｎｉｍａｌ　Ｕｓｅ　Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって認可されたプロトコール下で、既に発表された報告［アシュケナジ（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ）等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：１０５３５−１０５３９，１９９１年］と同様に、生後６〜８週間の雌のＢａｌｂ／ｃマウスに内毒素を注入することによって、敗血症性ショックをモデル化した。リン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のサルモネラ　アボルタス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ａｂｏｒｔｕｓ）に等しく由来する内毒素（シグマケミカル社，Ｌ−１８８７）の約ＬＤ１００量（１０μｇ／ｇ）を動物に静脈内注入（ｉ．ｖ．）した。１００μｇ／ｋｇの用量のＣＴ１５０１Ｒを１日３回腹腔内に注入した（１００ｍｌ／注入）。対照マウスには同時に同量のビヒクル対照（ＰＢＳ）を注入した。生存率を少なくとも７２時間追跡した。
【０１２４】
　血漿中のサイトカイン　レベルのＥＬＩＳＡ測定のために、麻酔したマウスの眼窩後方（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌ）又は心臓穿刺によって血液を回収し、直ちに遠心し、ＥＤＴＡ血漿を−７０℃において貯蔵した。粒子を含まない血漿を氷上で解凍し、標準マウス血漿を用いて標準曲線を形成して、商業的ＥＬＩＳＡ検定法を用いてサイトカイン　レベルを測定した。マウス腫瘍壊死因子αキットとインターロイキン−１αキットとは、ゲンザイム（マサチューセッツ州，ケンブリッジ）とエンドゲン（マサチューセッツ州，ボストン）とからそれぞれ購入した。各データ点はマウス３匹からプールしたＥＤＴＡ血清から得た、２つのＥＬＩＳＡ測定値の平均値であった。表３に要約したデータは独立した２回の実験から集めたものであり；表４と５からのデータは１データ点につきマウス３匹の単回実験から得たものである。
【０１２５】
　マウス１０匹を実験マウスと同じスケジュールでＰＢＳ単独又はＣＴ１５０１Ｒ単独でそれぞれ処置した。不利な効果は認められず、生存率は実験の過程を通して１００％であった（データは示さず）。内毒素の生存率データは全体で６回の独立した実験から要約した。要約の表１は６回の実験の各々の結果を列挙する。累積生存率を表２に示し、図５としてプロットする。図５において、各時点はマウス少なくとも２０匹／群を含む、少なくとも３回の実験を表す。フィッシャーの完全片側検定を用いた生存データの確率分析は表３として示す。ＬＰＳ処置の直後にＣＴ１５０１Ｒを投与した場合には、有意な保護が与えられた。ＬＰＳ処置後７２時間目の累積生存率は、ＬＰＳ単独処置動物の７％に比べて、６０％であった（ｐ＝＜０．０００５；表３）。
【０１２６】
　ＬＰＳ処置後のＣＴ１５０１Ｒ投与時間遅延の効果も図５に示す。動物をＬＰＳで処置し、このＬＰＳ処置の２時間後又は４時間後に、ＣＴ１５０１Ｒを投与した。この場合にも、ＣＴ１５０１Ｒは有意な保護を与えた。ＣＴ１５０１Ｒ処置マウスの生存率は、ＬＰＳ単独処置動物の７％に比べて、２時間目に５５％であり、４時間目には３７％であった（それぞれ、ｐ＝０．０００５とｐ＝０．００１；表３）。
【０１２７】
　Ｓ．アボルタス内毒素による処置後の時間の関数として、マウスの血漿内のＴＮＦ−α、ＩＬ−１α及びＩＬ−６のレベルを測定した。これらのデータを内毒素による処置直後にＣＴ１５０１Ｒの単回ｉ．ｐ．注入によって処置した動物と比較した。ＴＮＦ−αレベルは内毒素処置の１時間以内にピークに達した（表４と図６）。ＣＴ１５０１Ｒによるマウス処置は、測定したあらゆる時点において内毒素処置マウスのＥＤＴＡ血漿中のＴＮＦ−αレベルを減じた。特に、内毒素後の０．５時間目及び１時間目のＴＮＦ−αピークレベルは、ＣＴ１５０１Ｒ処置マウスではそれぞれ２．５分の１と２．６分の１に減少した。
【０１２８】
　ＩＬ−１αの血漿レベルも内毒素直後のＣＴ１５０１Ｒ処置によって減少した（表５；図７）。特に、内毒素後の６、１２及び１８時間目に観察されたピークレベルは、それぞれ１．２分の１、４．３分の１及び３．２分の１に減少した。最後に、ＩＬ−６測定を同じやり方で実施した（表６；図８）。３、６及び１２時間目におけるピーク血漿レベルもＣＴ１５０１Ｒ処置動物では減少した（それぞれ、１．７分の１、２．０分の１及び４．１分の１に減少）。
【０１２９】
　マウス４４匹中の４１匹には致死量であった内毒素量を受容したマウスの生存率を，ＣＴ１５０１Ｒは有意に強化した。ＣＴ１５０１Ｒを内毒素と同時に、又は内毒素処置の２時間後又は４時間後に投与した場合には、対照と比べて、生存率が改良された。内毒素直後のＣＴ１５０１Ｒの１回量の投与は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１α及びＩＬ−６のピーク血漿レベルを有意に減少した。
（表１）　
表1.独立したマウス敗血症実験6回からの生存率データ　
実験.#   LPS後の        LPS後の時間(生存数/全体)　
CT1501R投与時間 24時間 48時間 72時間　
1         LPSのみ         2/4     0/4    0/4　
t=0時間         4/5     4/5    4/5　
t=2時間         4/5     3/5    3/5　
2         LPSのみ         0/5     0/5    0/5　
t=0時間         5/5     5/5    5/5　
t=2時間         5/5     5/5    5/5　
3         LPSのみ         1/5     1/5    1/5　
t=4時間         5/5     3/5    3/5　
4         LPSのみ         1/10    1/10   1/10　
t=4時間         7/10    5/10   5/10　
5         LPSのみ         0/10    0/10   0/10　
t=0時間          9/10   7/10   3/10　
t=2時間         5/10    3/10   3/10　
t=4時間         7/10    4/10   2/10　
6         LPSのみ         3/10    1/10   1/10　
t=4時間         3/10    3/10   3/10　
（表２）　
表２.表1に基づくデータからの累積マウス生存率　
実験回数   LPS後の         LPS後の時間(生存数/全体)　
CT1501R投与時間 24時間 48時間 72時間　
n=6       LPSのみ          7/44      3/44      3/44　
n=3       t=0時間         18/20     16/20     12/20　
n=3       t=2時間         14/20     11/20     11/20　
n=4       t=4時間         22/35     15/35     13/35　
（表３）
表３.表2のマウス敗血症生存率データに対するフィッシャー完全P値(片側)　
実験回数CT1501R         P値(LPS後の時間)　
投与時間 24時間 48時間 72時間　
n=6     LPSのみ　
n=3     t=0時間     <0.0005  <0.0005    <0.0005　
n=3     t=2時間     <0.0005    0.0005    0.0005　
n=4     t=4時間     <0.0005   0.0002     0.001　
（表４）
表４.マウス血漿ＴＮＦ−αＥＬＩＳＡ測定値からの平均化データ　
LPS後の時間 血漿TNF(pg/ml)　
LPSのみ LPS+CT1501R　
0                 0            0　
0.17              8            6　
0.5             990          390　
1              4480         1728　
2              1585          940　
4               655          400　
6               545          350　
（表５）　
表5.マウス血漿ＩＬ−１αＥＬＩＳＡ測定値からのデータ　
LPS後の時間 血漿IL-1(pg/ml)　
LPSのみ LPS+CT1501R　
0             0              0　
0.17          0              0　
0.5           0.01           22　
1             2.25           10.8　
3            41.3            33.2　
6           166             133　
12           139             32.3　
18           150             46.7　
24            16.6            43.5　
36         全て死亡           18.8　
48         全て死亡            0　
（表６）
表６．マウス血漿ＩＬ−６ＥＬＩＳＡ測定値からのデータ　
LPS後の時間 血漿IL-6(pg/ml)　
LPSのみ LPS+CT1501R　
0             0          0　
0.17          0.2        0.14　
0.5           3.86       1　
1            24         31.8　
3           317        183　
6           247        121　
12           119         29.6　
18            59         19.8　
24            31         25.6　
36             0          1.64　
48             2          0.4
　実施例１０
　この実施例はマウスにおける５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）誘導骨髄抑圧に対するＣＴ１５０１Ｒの効果を説明する。我々は、マウスモデルにおける細胞毒性化学療法後の造血再形成のために必要な時間にＣＴ１５０１Ｒが影響するか否かを判定した。雌のＢａｌｂ／Ｃマウス［ＶＡＦ，チャールス　リバー　ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），生後６〜８週間，約１７．３〜１８．５ｇ］を５−ＦＵによって、実験１では２００ｍｇ／ｋｇ又は実験２では１９０μｇ／ｋｇの用量で、腹腔内（ｉ．ｐ．）処置した。ＣＴ１５０１Ｒ又はビヒクル対照を５−ＦＵ投与の１日前から出発して１００μｇ／ｋｇの用量でｉ．ｐ．投与して、実験１では１３日目に、実験２では１５日目に最後のマウスを殺すまで続けた。対照には、５−ＦＵを含まないＣＴ１５０１Ｒ又はビヒクルによって処置したマウスを含めた。５−ＦＵ投与の２日間後から出発して、マウス（４匹／群）をハロタン麻酔下での心臓穿刺後の頚部脱臼によって殺し、総白血球算定と血球分画（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｃｏｕｎｔ）を実施した。血小板算定は位相対比顕微鏡を用いて２回実施した。大腿骨を回収し、大腿骨あたりの顆粒球−マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）数を成長因子としてポークウィードマイトジェン（ｐｏｋｅｗｅｅｄ　ｍｉｔｏｇｅｎ）脾臓ならし培地を用いる標準検定法［テリー　フォックス　ラボラトリーズ（Ｔｅｒｒｙ　Ｆｏｘ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）；ブリティッシュコロンビア州，ヴァンクーバー］を用いて測定した。各大腿骨は別々に３回培養し、各実験時点の平均値を算出した。統計分析に用いた標準偏差は各大腿骨に関して測定された平均コロニー数の偏差であった。
【０１３０】
　ビヒクル対照又はＣＴ１５０１Ｒによって処置したマウスは明らかな不利な影響を受けなかった。ビヒクル対照のみで処置されたマウスは、時間と共に、絶対好中球数（ＡＮＣ）及び白血球数（ＷＢＣ）の増加を示したが、これはＣＴ１５０１Ｒ処置マウスでは見られなかった。これらの差は０日目の値と４日目及び８日目の値とは有意に異なった（それぞれ、ｐ＝０．０１２とｐ＝０．０１６；両側スチューデント検定）。ＣＴ１５０１Ｒ投与マウスに比較した場合に、対照処置マウスは４日目に有意に高い白血球数を有し（ｐ＝０．００９）、１２日目に有意に高い好中球数を有した（ｐ＝０．０２８）。対照処置マウスは０日目の値に比べて、１２日目の顆粒球数の有意な上昇を示した（ｐ＝０．０２８）。ＣＴ１５０１Ｒ処置マウスのＷＢＣとＡＮＣは対照値の１ＳＤ内に留まった。
【０１３１】
　５−ＦＵ処置マウスのＷＢＣは、６日目及び１０日目に、ＣＴ１５０１Ｒ処置マウスにおけるよりもビヒクル処置対照マウスにおいて有意に低かった（それぞれ、ｐ＝０．０１９とｐ＝０．０３６）（図１０）。血球分画では、全ての血球（ｃｅｌｌ）は６日目と８日目に両群においてリンパ球の形状を有した。ＣＴ１５０１Ｒ処置マウスでは１０日目に幾つかの単球が認められ、顆粒球は稀に認められた。１３日目に、４４０±１７／ｍｍ３の平均値±ＳＤ　ＡＮＣを有したが、対照マウスは１８０±１０／ｍｍ３を有した（ｐ＝０．０５）（図１０）。
【０１３２】
　造血前駆細胞の回復はＣＦＵ−ＧＭ数／大腿骨の測定によって推定される。５−ＦＵ処置後に、ビヒクル対照とＣＴ１５０１Ｒ処置マウスの両方は、回復の開始時の８日目までに測定不能なレベル近くにＣＦＵ−ＧＭを抑圧した（図１３）。１３日目までに、有意な分散が存在した。ＣＴ１５０１Ｒ処置マウスはビヒクル対照動物（ｐ＝０．０２４）及び０日目に処置前に殺した動物（ｐ＝０．０５）よりも有意に多いＣＦＵ−ＧＭ数／大腿骨を１３日目に有し、このことは前駆細胞回復のオーバーシュート（ｏｖｅｒｓｈｏｏｔ）が存在することを実証した。
【０１３３】
　実験２は下記事項：（１）５−ＦＵ用量を１８５ｍｇ／ｋｇに減じた；（２）１０日目から１５日目まで毎日採血（ｂｌｏｏｄ　ｄｒａｗ）を実施した；及び（３）血小板算定を実施したことを除いて、実験１と同様であった。実験２からの結果は、図１０〜１３にグラフとして示す。第１実験と同様に、ＣＴ１５０１Ｒによって処置したマウスは有意に高いＷＢＣを有した（図１０）。ＣＴ１５０１Ｒ処置マウスでは、好中球回復が増進された（図１２）。血小板最低数（ｎａｄｉｒ）と回復率もビヒクル対照動物に比べて増加した（図１１）。細胞数／大腿骨は造血回復中に、ＣＦＵ−ＧＭ数／大腿骨と同様に、対照動物に比べて増加した（図１３)。
【０１３４】
　５−ＦＵの高度骨髄抑圧量を受容したマウスでは、ＣＴ１５０１Ｒ処置が好中球数の上昇率と、関連する骨髄性前駆細胞による骨髄再集団（ｍａｒｒｏｗ　ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）率とを増加させた。ＣＴ１５０１Ｒは各測定時点において総ＷＢＣの５−ＦＵ誘導抑制を阻止した。しかし、１０日目までに、小リンパ球の形態学的出現によって細胞は増加した。実験１では１３日目に、実験２では１０日目にＣＴ１５０１Ｒ処置マウス中の好中球はビヒクル対照処置マウスにおけるよりも有意に増加した。ＣＴ１５０１Ｒによる造血回復の刺激は巨核球系統にも影響を与えた。試験動物は対照動物よりも有意に高い血小板最低数を有し、ビヒクル対照よりも迅速な血小板数上昇と大きなオーバーシュートとを示した。
【０１３５】
　造血の刺激は骨髄細胞充実性（ｍａｒｒｏｗ　ｃｅｌｌｕｒａｌｉｔｙ）の回復と骨髄前駆細胞の定量化との両方によっても証明された。ＣＴ１５０１Ｒ処置マウスは造血回復中に、対照動物に比べて、ＣＦＵ−ＧＭ数／大腿骨の約２倍の増加を示した。
【０１３６】
　５−ＦＵを受容しなかった動物では、ＣＴ１５０１Ｒによる処置がビヒクル対照に付随するＡＮＣ上昇とＣＦＵ−ＧＭ／大腿骨上昇の両方を阻止した。ＣＴ１５０１Ｒ処置動物の全てが非注入対照の１標準偏差以内にＡＮＣを維持した。ＣＴ１５０１Ｒが１日２回のｉ．ｐ．注入に対するストレス誘導反応と恐らくサイトカイン誘導反応をも阻止したように思われる。
【０１３７】
　総合的に、上記データは細胞毒性薬物又は細胞減少治療後の造血再構成を促進するためのＣＴ１５０１Ｒと本発明化合物との使用方法を支持する。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】図１は、ＣＴ１５０１Ｒ（Ｒ−（−）（５−ヒドロキシヘキシル）テオブロミン）およびＰＴＸに対する混合リンパ球反応を示す。混合リンパ球反応は、ツーウェイ方式の混合リンパ球反応によって調べたところ、同種異系刺激に対してＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）の増殖反応を示す。ＣＴ１５０１ＲおよびＰＴＸは共に、この免疫調節活性測定方法において用量作用活性を示した。
【図２】図２は、抗ミュー抗体、ＩＬ−４、または抗ミュー抗体にＩＬ−４をクロスリンクしたものによって刺激されたマウスＢ細胞の増殖のＣＴ１５０１Ｒによる抑制効果を示す。
【図３】図３は、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）とインターロイキン−１α（ＩＬ−１α若しくはインターロイキン−２（ＩＬ−２）による増殖のＣＴ１５０１Ｒによる抑制効果を示す。ＣｏｎＡとＩＬ−１α若しくはＩＬ−２による活性化の２時間前に、ＣＴ１５０１Ｒを示した用量だけ加えた。図３に示されるように、ＣＴ１５０１Ｒは胸腺細胞の増殖を用量依存的に抑制した。バックグランドは２００ｃｐｍより小さかった。
【図４】図４は、ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）およびＩＬ−１によって刺激された平滑筋の増殖のＣＴ１５０１ＲおよびＰＴＸによる抑制効果を示す。ＰＤＧＦおよびＩＬ−１による活性化の２時間前にＣＴ１５０１ＲおよびＰＴＸを別々に加えた。図４に示されるように、両薬剤共、テストした中で高い用量を用いた場合に平滑筋細胞の増殖を抑制した。ＣＴ１５０１ＲはＰＴＸよりも活性が高かった。
【図５】図５は、マウスのエンドトキシンによる致死のＣＴ１５０１Ｒによる抑制を、最大６回の独立した実験における生存マウスの累積パーセントで示す（Ｎ＝実験回数）。動物に１０μｇ／ｇｍのＬＰＳを投与した（静脈注射）。ＬＰＳを与えた直後（ｔ＝０）、２時間後（ｔ＝２）、または４時間後（ｔ＝４）にマウスにＣＴ１５０１Ｒ（１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）の１回目の投与を行った。その後、マウスにＣＴ１５０１Ｒを１日に３回投与し、動物の生存率をモニターした。
【図６】図６は、エンドトキシン処理後のマウス血清ＴＮＦ−αレベルを示す。各値は、２回のＥＬＩＳＡ測定の平均からなる、２回の実験の平均値を示しており、各点は３匹のマウスからプールした血漿について価を示す。
【図７】図７は、マウス血漿ＩＬ−１αＥＬＩＳＡ測定のデータを示す。データは、２回のＥＬＩＳＡ測定の平均からなる、１回の実験の平均値を示しており、各点は３匹のマウスからプールした血漿について価を示す。
【図８】図８は、マウス血漿ＩＬ−６ＥＬＩＳＡ測定のデータを示す。データは、２回のＥＬＩＳＡ測定の平均からなる、１回の実験の平均値を示しており、各点は３匹のマウスからプールした血漿について価を示す。
【図９】図９は、ＣＴ１５０１Ｒの大量合成工程の流れ図（フローチャート）を示す。
【図１０】図１０は、５−フルオロウラシルで処理した後（０日目）、１日目からＣＴ１５０１Ｒまたは媒体コントロールを２回／日投与したマウスの平均ＷＢＣを示す。この実験は、図１０−１３で述べられるように造血のｉｎ　ｖｉｖｏモデルである。各時点において４匹のマウスのグループを瀉血した。グラフの各値は平均値±１ＳＤを示す。
【図１１】図１１は、５−フルオロウラシルで処理した後（０日目）、０日目からＣＴ１５０１Ｒまたは媒体コントロールを２回／日投与したマウスの平均血小板数を示す。各時点において４匹のマウスのグループを瀉血した。グラフの各値は平均値±１ＳＤを示す。
【図１２】図１２は、０日目からＣＴ１５０１Ｒまたは媒体コントロールを２回／日投与したマウスの平均好中球数を絶対値で示す。各時点において４匹のマウスのグループを瀉血した。グラフの各値は平均値±１ＳＤを示す。
【図１３】図１３は、５−フルオロウラシルで処理した後（０日目）、０日目からＣＴ１５０１Ｒまたは媒体コントロールを２回／日投与したマウスの平均ＣＦＵ−ＧＭ／大腿骨を示す。各時点において４匹のマウスのグループを殺し、一本の大腿骨を採集する。グラフの各値は、三回の培養でテストした各個体当たりのコロニー数の平均値±１ＳＤを示す。
【図１４】図１４は、化学治療後の生存率に対するＣＴ−１５０１Ｒの効果を示す。
【図１５】図１５は、ＣＴ１５０１Ｒを、別の敗血症ショック薬剤である、二官能性ＴＮＦ受容体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）（Ａｓｈｋｅｎａｚｉら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８：１０５３５，１９９１）の公表されている値と比較したものである。両薬剤は、致死量のＬＰＳ（エンドトキシン）投与とほぼ同時に投与した。このｉｎ　ｖｉｖｏ実験の比較シリーズでは、薬剤投与の時間に関係なく、ＣＴ１５０１Ｒの方がＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社製ＴＮＦ受容体よりも一貫して生存率の増加を促進した。
【図１６】図１６は、ＣＴ１５０１Ｒを、別の敗血症ショック薬剤である、二官能性ＴＮＦ受容体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）（Ａｓｈｋｅｎａｚｉら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８：１０５３５，１９９１）の公表されている値と比較したものである。両薬剤は、致死量のＬＰＳ（エンドトキシン）投与から２時間後に（図１６）投与した。このｉｎ　ｖｉｖｏ実験の比較シリーズでは、薬剤投与の時間に関係なく、ＣＴ１５０１Ｒの方がＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社製ＴＮＦ受容体よりも一貫して生存率の増加を促進した。
【図１７】図１７は、ＣＴ１５０１Ｒ、そのＳ異性体であるＣＴ１５０１Ｓ、およびＰＴＸのリソホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）（第二メッセンジャーシグナル伝達に関与する酵素）に対するｉｎ　ｖｉｖｏ抑制についての比較を示している。図からわかるように、臨床現場で達成可能なＩＣ５０濃度においてＣＴ１５０１Ｒのみが酵素活性を著しく阻害した。ＬＰＡＡＴ活性はＩＬ−１βで刺激した３Ｔ３　Ｒａｓ形質転換繊維芽細胞を用いて決定した。
【図１８】図１８は、ＬＰＳ活性化マウス腹腔マクロファージからのＴＮＦ−αの遊離のＣＴ１５０１Ｒによる抑制の用量作用曲線を示す。細胞を単離し、ＬＰＳ活性化（１０ｍｇ／ｍｌ）の１時間前に種々の濃度のＣＴ１５０１Ｒの処理をするか、または処理を行わなかった。２４時間後に上清を集め、ＥＬＩＳＡによってＴＮＦ−αについて分析した（＋／−ＳＤ）。
【図１９】図１９は、ＬＰＳ活性化ＰＥＣにおけるＩＬ−１αの遊離のＣＴ１５０１Ｒによる抑制を示す。細胞を単離し、ＬＰＳ活性化（１０μｇ／ｍｌ）の１時間前にＣＴ１５０１Ｒ（２５０μＭ）の処理するか、または処理を行わなかった。所定の時間経過後に上清を集め、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−１αについて分析した（＋／−ＳＤ）。
【図２０】図２０は、ＩＬ−１α活性化マウス腹腔マクロファージからのＴＮＦ−αの遊離の抑制を示す。細胞を単離し、ＩＬ−１α活性化の１時間前にＣＴ１５０１Ｒ（２５０μＭ）の処理をするか、または処理を行わなかった。活性化から２４、４８、または７２時間経過後に上清を集め、ＥＬＩＳＡによってＴＮＦ−αについて分析した（＋／−ＳＤ）。
【図２１】図２１は、Ｕ９３７細胞の活性化ＨＵＶＥＣへの接着の抑制を示す。ＨＵＶＥＣに２５０μＭ　ＣＴ１５０１Ｒを加えた後１時間後に、または加えずに、ＩＬ−１α（１００ｎｇ／ｍｌ）；ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）若しくはＬＰＳ（１０ｍｇ／ｍｌ）で刺激した。１２時間後に、細胞のＢＣＥＣＦラベルしたＵ９３７細胞への接着について分析した。図２１は、各処理グループの相対ＢＣＥＣＦ蛍光（＋／−ＳＤ）を示す。
【図２２】図２２は、活性化Ｕ９３７細胞のＨＵＶＥＣへの接着の抑制を示す。Ｕ９３７細胞に２５０μＭ　ＣＴ１５０１Ｒを加えた後１時間後に、または加えずに、種々の濃度のＩＬ−１αで刺激した。１２時間後に、Ｕ９３７細胞をＢＣＥＣＦで標識し、ＨＵＶＥＣへ接着させた。図２１は、各処理グループの相対ＢＣＥＣＦ蛍光（＋／−ＳＤ）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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