(57)【要約】【課題】公知の方法よりも高感度にラミブジン耐性ＨＢＶを測定することができる方法を提供すること。【解決手段】（１）　所定のプライマーを用いて、野生型ウイルス由来の増幅産物に選択的にＮｄｅ　Ｉ部位を導入し、（２）　得られた増幅産物をＮｄｅ　Ｉで消化し、それによって野生型ウイルス由来の増幅産物を選択的に消化し、（３）　次いで、所定のＰＮＡの存在下において該ＰＮＡとオーバーラップする領域にハイブリダイズするプライマーであって、前記遺伝子のＹＶＤＤ変異型及びＹＩＤＤ変異型を増幅できるプライマーを一方のプライマーとして用いて核酸増幅法を行い、それによって、検体中に含まれるＹＶＤＤ変異型遺伝子及び／又はＹＩＤＤ変異型遺伝子を増幅し、（４）　（３）の工程により得られる増幅産物を測定する工程を含む、ラミブジン耐性Ｂ型肝炎ウイルスの測定方法を提供する。【選択図】　図１
2004081051.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）　Ｂ型肝炎ウイルスのゲノム遺伝子の増幅産物の７３６　ｎｔのｔをｃに変異させるプライマーであって、少なくとも該遺伝子の７３６ｎｔ〜７４１ｎｔに対応する領域を含むプライマーを一方のプライマーとして用いて、前記遺伝子の一部領域を鋳型として核酸増幅を行い、それによって野生型ウイルス由来の増幅産物に選択的にＮｄｅ　Ｉ部位を導入する工程と、
（２）　得られた増幅産物をＮｄｅ　Ｉで消化し、それによって野生型ウイルス由来の増幅産物を選択的に消化する工程と、
（３）　次いで、前記遺伝子の７３６ｎｔ〜７４１ｎｔに対応する領域を含むＰＮＡであって、野生型ウイルス由来の増幅産物中の対応領域の塩基配列と同一の塩基配列を有するＰＮＡの存在下において、該ＰＮＡとオーバーラップする領域にハイブリダイズするプライマーであって、前記遺伝子のＹＶＤＤ変異型及びＹＩＤＤ変異型を増幅できるプライマーを一方のプライマーとして用いて核酸増幅法を行い、それによって、検体中に含まれるＹＶＤＤ変異型遺伝子及び／又はＹＩＤＤ変異型遺伝子を増幅する工程と、
（４）　（３）の工程により得られる増幅産物を測定する工程を含む、ラミブジン耐性Ｂ型肝炎ウイルスの測定方法。
【請求項２】
前記（４）工程において、（３）工程により得られた増幅産物中のＹＶＤＤ変異型遺伝子及び／又はＹＩＤＤ変異型遺伝子を識別して測定する請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記（４）工程におけるＹＶＤＤ変異型遺伝子及びＹＩＤＤ変異型遺伝子の識別をＲＦＬＰにより行う請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記ＹＶＤＤ変異型遺伝子の測定は、該遺伝子の７３６ｎｔ〜７４１ｎｔに存在するＮｌａ　ＩＩＩ部位における開裂を利用したＲＦＬＰにより行う請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記ＹＩＤＤ変異型遺伝子の測定は、該ＹＩＤＤ変異型遺伝子の増幅産物中の７３６ｎｔのｃをａに変異させるプライマーを一方のプライマーとして用いて核酸増幅法を行い、得られた増幅産物中の７３６ｎｔ〜７４１ｎｔに存在するＳｓｐ　Ｉ部位における開裂を利用したＲＦＬＰにより行う請求項３又は４記載の方法。
【請求項６】
前記（３）工程における核酸増幅法における温度サイクル中のアニーリング工程は、前記ＰＮＡのハイブリダイゼーションに適したより高温下におけるアニーリング工程と、それに続く、前記プライマーのハイブリダイゼーションに適したより低温下におけるアニーリング工程の２段階で行われる請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記（１）工程で用いられる、前記Ｎｄｅ　Ｉ部位を導入するプライマーは、配列表の配列番号２に示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上から成る核酸であり、該核酸をフォワード側プライマーとして用いる請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記（１）工程で用いられる、前記Ｎｄｅ　Ｉ部位を導入するプライマーは、配列表の配列番号３に示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上から成る核酸である請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記（１）工程で用いられる、前記Ｎｄｅ　Ｉ部位を導入するプライマーは、配列表の配列番号３に示される塩基配列を有する２４ｍｅｒの核酸から成る請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記（３）工程で用いられるＰＮＡは、配列表の配列番号５に示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上から成るＰＮＡである請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記（３）工程で用いられるＰＮＡは、配列表の配列番号６に示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上から成るＰＮＡである請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記（３）工程で用いられるＰＮＡは、配列表の配列番号７又は１９に示される塩基配列を有する１８ｍｅｒの核酸から成る請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記（３）工程で用いられるプライマーは、配列表の配列番号８で示される塩基配列の３’末端から連続する１５塩基以上から成る核酸であり、該核酸をフォワード側プライマーとして用いる請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記（３）工程で用いられるプライマーは、配列表の配列番号９で示される塩基配列の３’末端から連続する１５塩基以上から成る核酸である請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記（３）工程で用いられるプライマーは、配列表の配列番号１０で示される塩基配列を有する１９ｍｅｒの核酸から成る請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
請求項７ないし９に記載された、前記（１）工程で用いられる、前記Ｎｄｅ　Ｉ部位を導入するプライマー。
【請求項１７】
請求項１０ないし１２に記載された、前記（３）工程で用いられるＰＮＡ。
【請求項１８】
請求項１３ないし１５に記載された、前記（３）工程で用いられるプライマー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラミブジン耐性Ｂ型肝炎ウイルスの測定方法及びそれに用いられる核酸に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ラミブジン（（−）２’−デオキシ−３’−チアシチジン）は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを阻害するヌクレオシド類似体である。ラミブジンによりＨＢＶは、そのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが阻害されて増殖できなくなるので、ラミブジンは慢性Ｂ型肝炎の治療薬として用いられている（英国Ｇｌａｃｏ　ｗｅｌｃｏｍｅ社より市販）。しかしながら、長期間に亘ってラミブジンを投与すると、ラミブジン耐性ＨＢＶが生じる場合があることが知られている。ラミブジン耐性ＨＢＶでは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの活性中心であるアミノ酸配列Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　（一文字表記ではＹＭＤＤ、以下、このＹＭＤＤ配列を有するウイルスを「野生型」と言うことがある）がＴｙｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　（以下、この変異を「ＹＶＤＤ変異型」と言うことがある）又はＴｙｒ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　（以下、この変異を「ＹＩＤＤ変異型」と言うことがある）に変異していることが知られている。
【０００３】
ラミブジン治療中にラミブジン耐性ＨＢＶが患者の体内で生じると、ラミブジン耐性ＨＢＶはラミブジンによる増殖阻害を受けないため、急速に増殖し、治療効果がなくなり病状は悪化する。従って、ラミブジン耐性ＨＢＶの出現は、できるだけ早い段階で検出できることが好ましい。ラミブジン耐性ＨＢＶの出現を早期に検出することができれば、ラミブジンに代えて、あるいはラミブジンと共に他の治療薬を投与する等の適切な処置をとることが可能であり、治療上有用である。
【０００４】
従来、ラミブジン耐性ＨＢＶの検出は、ＰＣＲ等の核酸増幅法により、上記ＹＭＤＤ配列をコードする遺伝子領域を含む断片を増幅し、ダイレクトシーケンシングにより塩基配列を調べたり、あるいは、野生型と変異型の塩基配列の相違を利用した制限断片長多型（ＲＦＬＰ）法等により行われている。しかしながら、これらの方法は、耐性ウイルス検出の感度が低く、野生型ウイルスのコピー数に対する耐性ウイルスのコピー数の比率が、かなり大きくならないと耐性ウイルスを検出することができず、耐性ウイルスの出現をできるだけ早期に検出するという観点からは満足することができない。また、耐性ウイルスの検出感度を高めた方法として、野生型の増幅産物にのみ選択的にＦｏｋ　Ｉ部位を導入するプライマーを用いて核酸増幅法を行い、次いで、増幅産物をＦｏｋ　Ｉで処理して野生型ウイルスを選択的に消化した後、耐性ウイルスを核酸増幅法により増幅し、ＲＦＬＰによりＹＶＤＤ変異型とＹＩＤＤ変異型を識別して検出する方法も公知である（特開平１１−１２７８６０号公報）。しかしながら、この方法でも、耐性ウイルスのコピー数の、野生型ウイルスのコピー数に対する比率が１／１００程度以上なければ耐性ウイルスの検出が困難であり、耐性ウイルスの検出感度のさらなる向上が望まれる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、公知の方法よりも高感度にラミブジン耐性ＨＢＶを測定することができる方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、野生型ウイルス遺伝子の増幅産物にのみ選択的にＮｄｅ　Ｉ部位を導入するプライマーを用いて核酸増幅法を行い、次いで、ＮｄｅＩで増幅産物を処理して野生型ウイルス遺伝子の増幅産物のみを選択的に消化し、さらに、野生型ウイルス遺伝子の増幅産物の領域と同一の塩基配列を有するＰＮＡの存在下において、該ＰＮＡとオーバーラップする領域にハイブリダイズするプライマーであって、前記遺伝子のＹＶＤＤ変異型及びＹＩＤＤ変異型を増幅できるプライマーを一方のプライマーとして用いて核酸増幅法を行い、それによって、検体中に含まれるＹＶＤＤ変異型遺伝子及び／又はＹＩＤＤ変異型遺伝子を増幅することにより、野生型ウイルスの増幅を可及的に抑制して耐性ウイルスを選択的に増幅することが可能であり、これを利用して耐性ウイルスを極めて高感度に検出することができることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、（１）　Ｂ型肝炎ウイルスのゲノム遺伝子の増幅産物の７３６ｎｔのｔをｃに変異させるプライマーであって、少なくとも該遺伝子の７３６ｎｔ〜７４１ｎｔに対応する領域を含むプライマーを一方のプライマーとして用いて、前記遺伝子の一部領域を鋳型として核酸増幅を行い、それによって野生型ウイルス由来の増幅産物に選択的にＮｄｅ　Ｉ部位を導入する工程と、
（２）　得られた増幅産物をＮｄｅ　Ｉで消化し、それによって野生型ウイルス由来の増幅産物を選択的に消化する工程と、
（３）　次いで、前記遺伝子の７３６ｎｔ〜７４１ｎｔに対応する領域を有するＰＮＡであって、野生型ウイルス由来の増幅産物中の対応領域の塩基配列に完全に対応する塩基配列を有するＰＮＡの存在下において、該ＰＮＡとオーバーラップする領域にハイブリダイズするプライマーであって、前記遺伝子のＹＶＤＤ変異型及びＹＩＤＤ変異型を増幅できるプライマーを一方のプライマーとして用いて核酸増幅法を行い、それによって、検体中に含まれるＹＶＤＤ変異型遺伝子及び／又はＹＩＤＤ変異型遺伝子を増幅する工程と、
（４）　（３）の工程により得られる増幅産物を測定する工程を含む、ラミブジン耐性Ｂ型肝炎ウイルスの測定方法を提供する。また、本発明は、上記本発明の方法に用いられるプライマー及びＰＮＡを提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
配列表の配列番号１に、野生型ＨＢＶゲノミック遺伝子の塩基配列の一例を示す（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｖ００８６７）。上記ＹＭＤＤ配列は、塩基配列では第７３６番目（以下、「７３６ｎｔ」のように記載する）〜７４７ｎｔの領域によりコードされるものである。ＹＶＤＤ変異型では、７４１ｎｔのｇがｔに変異しており、ＹＩＤＤ変異型では、７３９ｎｔのａがｇに変異している。これらは公知である。なお、ＨＢＶゲノミック遺伝子は、環状であり、配列番号１に示す塩基配列の下流の部分と上流の部分が融合してＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼをコードしており、また、フレームシフトにより同一領域で異なるアミノ酸配列をコードしているので、配列番号１には塩基配列のみを示す。なお、塩基のナンバリングは、クローニングに用いる制限酵素の種類や、ウイルス遺伝子の欠失や挿入等の変異のため、ずれることがしばしばあるが、本明細書における「７３６　ｎｔ」とは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのＹＭＤＤモチーフのＹをコードするコドンｔａｔの最初のｔの位置を意味し、現実のウイルス遺伝子の塩基番号がこれとはずれている場合でも上記の位置にずらして解釈する。
【０００９】
本発明の方法に供せられる検体としては、ＨＢＶが存在し得る患者由来のいずれの体液や組織であってもよく、好ましくは、血液や血清等の体液を挙げることができる。本発明の方法の第１工程では、ＨＢＶのゲノム遺伝子の増幅産物の７３６　ｎｔのｔをｃに変異させるプライマーであって、少なくとも該遺伝子の７３６ｎｔ〜７４１ｎｔに対応する領域を含むプライマーを一方のプライマーとして用いて、前記遺伝子の一部領域を鋳型として核酸増幅を行い、それによって野生型ウイルス由来の増幅産物に選択的にＮｄｅ　Ｉ部位を導入する。なお、Ｎｄｅ　Ｉ部位は、ｃａｔａｔｇであり、野生型の７３６ｎｔ〜７４１ｎｔの塩基配列は、ｔａｔａｔｇである。従って、野生型の７３６ｎｔのｔをｃに変えたプライマーであって、７３６ｎｔ〜７４１ｎｔに対応する領域を含むプライマーを一方のプライマーとして用いて核酸増幅法を行うことにより、野生型の増幅産物中にＮｄｅ　Ｉ部位を導入することができる。このようなプライマーをフォワード側プライマーとして用いる場合の好ましいプライマーの例として、配列表の配列番号２に示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上から成る核酸、さらに好ましくは、配列表の配列番号３に示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上から成る核酸、さらに好ましくは、配列表の配列番号４に示される塩基配列を有する２４ｍｅｒ（塩基数が２４を意味する。以下、同様に記載する）の核酸を挙げることができる（ただし、いずれの場合も７３６ｎｔ〜７４１ｎｔに対応する領域を含む）。ＰＣＲ法のような核酸増幅法自体はこの分野において周知であり、そのためのキット及び装置も市販されているので、容易に実施することができる。他方のプライマーは、何ら限定されるものではなく、増幅産物のサイズが好ましくは約５０〜５００ｂｐ程度、さらに好ましくは約１００〜４００ｂｐ程度になる位置にハイブリダイズする任意のプライマーを用いることができる。なお、プライマー（他の工程で用いられるものを包含し、フォワード側でもリバース側でも））は、ＤＮＡが好ましく、サイズは、１５塩基〜５０塩基程度、特には１８塩基〜３０塩基程度が好ましい。
【００１０】
上記第１工程により、野生型の増幅産物はＮｄｅ　Ｉ部位であるｃａｔａｔｇを含むが、ＹＶＤＤ変異型では、７４１ｎｔのｇがｔに変異しており、ＹＩＤＤ変異型では、７３９ｎｔのａがｇに変異しているため、増幅産物中にＮｄｅ　Ｉ部位が含まれない。従って、上記第１工程により、野生型の増幅産物にのみ選択的にＮｄｅ　Ｉ部位を導入することができる。
【００１１】
続く第２工程では、増幅産物をＮｄｅ　Ｉで処理する。これにより、野生型遺伝子のみが選択的に消化され、続く第３工程において鋳型として利用されない。
【００１２】
続く第３工程では、７３６ｎｔ〜７４１ｎｔに対応する領域を含むＰＮＡであって、野生型ウイルス由来の増幅産物中の対応領域の塩基配列と同一の塩基配列を有するＰＮＡの存在下において、該ＰＮＡとオーバーラップする領域にハイブリダイズするプライマーであって、前記遺伝子のＹＶＤＤ変異型及びＹＩＤＤ変異型を増幅できるプライマーを一方のプライマーとして用いて核酸増幅法を行い、それによって、検体中に含まれるＹＶＤＤ変異型遺伝子及び／又はＹＩＤＤ変異型遺伝子を増幅する。
【００１３】
ＰＮＡは、ペプチド核酸（ｐｅｐｔｉｄｅ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）と呼ばれるもので、ＤＮＡのデオキシリボースとリン酸から成る主鎖が２−アミノエチル−グリシン結合により構成されているＤＮＡ類似体（人工核酸）である。ＰＮＡ自体は既にこの分野において周知であり、市販もされており、任意の配列のＰＮＡを合成することも周知の方法により行うことができる。ＰＮＡは、相補的なＤＮＡと対合する強さが、ＤＮＡ−ＤＮＡ間よりも強く、しかし、１つでもミスマッチ塩基が入ると、ＤＮＡ−ＤＮＡ間の対合の強さよりも弱くなる性質を有している。ここで用いるＰＮＡは、７３６ｎｔ〜７４１ｎｔに対応する領域を含むＰＮＡであって、野生型ウイルス由来の増幅産物中の対応領域の塩基配列と同一の塩基配列を有するものである。このようなＰＮＡの好ましい例として、配列表の配列番号５に示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上から成るＰＮＡ、さらに好ましくは、配列表の配列番号６に示される塩基配列のうち連続する１５塩基以上から成るＰＮＡ、さらに好ましくは、配列表の配列番号７に示される塩基配列を有する１８ｍｅｒの核酸及び配列番号１９に示される塩基配列を有する２１ｍｅｒの核酸を挙げることができる（ただし、いずれの場合も７３６ｎｔ〜７４１ｎｔに対応する領域を含む）。なお、他方のプライマーとしては、何ら限定されないが、第１工程の増幅産物中にハイブリダイズ可能なものが好ましく、第１工程の核酸増幅法で用いたものと同じプライマーを用いることもできる。
【００１４】
第３工程で用いられる核酸増幅用のプライマーは、前記ＰＮＡとオーバーラップする領域にハイブリダイズするプライマーであって、前記遺伝子のＹＶＤＤ変異型及びＹＩＤＤ変異型を増幅できるプライマーである。フォワード側プライマーとして用いられるこのようなプライマーの好ましい例として、配列表の配列番号８で示される塩基配列の３’末端から連続する１５塩基以上から成る核酸、さらに好ましくは、配列表の配列番号９で示される塩基配列の３’末端から連続する１５塩基以上から成る核酸、さらに好ましくは、配列表の配列番号１０で示される塩基配列を有する１９ｍｅｒの核酸を挙げることができる（ただし、いずれの場合も前記ＰＮＡとオーバーラップする領域にハイブリダイズするものである必要がある）。
【００１５】
上記ＰＮＡの存在下で核酸増幅法を行うと、野生型遺伝子の増幅産物の一方の鎖とＰＮＡは、塩基配列が完全に一致しているので強力にハイブリダイズし、その結果、核酸増幅用のプライマーがハイブリダイズできず、増幅が起きない。一方、耐性型ウイルスでは、７３９ｎｔ又は７４１ｎｔに変異を有するので、ＰＮＡがハイブリダイズせずに核酸増幅用のプライマーがハイブリダイズすることができ、増幅が起きる。従って、野生型は増幅されずに、ＹＶＤＤ変異型及びＹＩＤＤ変異型のみが増幅される（検体中にＹＶＤＤ変異型が含まれている場合にはＹＶＤＤ変異型が増幅され、ＹＩＤＤ変異型が含まれている場合にはＹＩＤＤ変異型が増幅され、両方含まれている場合には両方が増幅される）。これにより、ラミブジン耐性ＨＢＶのみを選択的に増幅することができる。なお、核酸増幅法の温度サイクル中のアニーリング工程は、前記ＰＮＡのハイブリダイゼーションに適したより高温下におけるアニーリング工程と、それに続く、前記プライマーのハイブリダイゼーションに適したより低温下におけるアニーリング工程の２段階で行うことが好ましい。これにより、野生型の増幅産物に対しては、先ず、ＰＮＡをハイブリダイズさせることができ、プライマーがハイブリダイズすることをさらに確実に防止することができる。図１のａ）には第３工程の原理を示す模式図を、ｂ）には、好ましい温度サイクルの一例を示す。
【００１６】
続く第４工程では、第３工程により得られる増幅産物を測定する。第３工程までにラミブジン耐性ＨＢＶの選択的な増幅が完了しているので、第４工程における増幅産物の測定は、任意のいずれの方法をも採用することができる。なお、本明細書における「測定」には、検出と定量の両者が含まれる。ＹＶＤＤ変異体とＹＩＤＤ変異体の識別をすることを望まない場合（とにかくいずれかのタイプのラミブジン耐性ＨＢＶが出現しているのか否かを知りたい場合）は、増幅産物の生成を常法により電気泳動等で確認することによって行うことができるし、バンドの染色強度に基づき定量又は半定量することも可能である。また、プローブを用いた測定も可能であり、これはＤＮＡチップ等を用いて行うことも可能である。この場合、第３工程の核酸増幅法を、標識ヌクレオチドの存在下で行うことにより、あるいは、少なくともいずれか一方のプライマーとして標識プライマーを用いることにより、増幅産物を標識し、固相化プローブに結合する標識増幅産物を測定することもできる。また、第３工程での核酸増幅法をリアルタイムＰＣＲ等のリアルタイム核酸増幅法により行うことにより定量を行うこともできる。この場合には、第３工程と第４工程が同時並行的に行われる。
【００１７】
ＹＶＤＤ変異体とＹＩＤＤ変異体の識別して測定する場合には、ダイレクトシーケンシングによっても行うことができるし、ＲＦＬＰにより行うこともできる。例えば、ＹＶＤＤ変異型遺伝子の測定は、該遺伝子の７３６ｎｔ〜７４１ｎｔに存在するＮｌａ　ＩＩＩ部位（ｃａｔｇ）における開裂を利用したＲＦＬＰにより行うことができる。この場合、特定の変異型にのみ所望の制限酵素部位を導入することもできる。例えば、第３工程で増幅されるＹＩＤＤ変異体にはＮｌａ　ＩＩＩ部位が存在しないので、増幅産物をＮｌａ　ＩＩＩで処理することにより、ＹＶＤＤ変異型の増幅産物のみが開裂され、特徴的なサイズの断片を生じる。この場合、ＲＦＬＰを行う前に再度核酸増幅を行ってより感度を高めることも好ましい（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ等）。一方、ＹＩＤＤ変異型遺伝子の測定は、例えば、該ＹＩＤＤ変異型遺伝子の増幅産物中の７３６ｎｔのｃをａに変異させるプライマーを一方のプライマーとして用いて核酸増幅法を行い、得られた増幅産物中の７３６ｎｔ〜７４１ｎｔに存在するＳｓｐ　Ｉ部位（ａａｔａｔｔ）における開裂を利用したＲＦＬＰにより行うことができる。これらの具体例が下記実施例１に詳細に記載されている。また、ＹＶＤＤ変異型及びＹＩＤＤ変異型のそれぞれに相補的な配列を有する、各変異型検出用のプローブを用いてこれらを識別して測定することもできる。さらに、各変異型に特異的な配列を有するプライマーを用いて核酸増幅を行うこともでき、増幅産物の測定にさらに各変異型検出用のプローブを用いることもできる。この場合、第３工程の核酸増幅法を、標識ヌクレオチドの存在下で行うことにより、あるいは、少なくともいずれか一方のプライマーとして標識プライマーを用いることにより、増幅産物を標識し、固相化プローブに結合する標識増幅産物を測定することもできる。下記実施例にはこの方法の具体例も記載されている。
【００１８】
なお、上記説明では、７３６ｎｔ〜７４１ｎｔ又はこの近傍の領域にハイブリダイズするプライマーがフォワード側プライマーである場合について主として説明したが、該領域にハイブリダイズするプライマーをリバース側にして、該領域の上流側に位置する部分を増幅することも可能であり、本発明の方法に含まれる。従って、請求項１における「対応する領域」という語は、センス鎖及びアンチセンス鎖のいずれの鎖中の領域を意味する場合も包含する。
【００１９】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２０】
（１）　ＤＮＡ抽出
ＹＶＤＤ変異型又はＹＩＤＤ変異型ＨＢＶ陽性の各血清０．２ｍｌに、０．５ｍｌのＫ　ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２％ＳＤＳ、１０ｍｇ／ｍｌ　Ｐｒｏｔｅｎｅｓｅ　Ｋ）を加え、５５℃、２時間、インキュベーとした。フェノール・クロロフォルム抽出を行った後、クロロフォルム抽出を行い、エタノール沈殿ののち、１０μｌ　ＴＥ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に溶解した。
【００２１】
（２）　第１工程のＰＣＲを以下の条件で行った。
（ｉ）　反応混合物組成
１ｘ　ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ、０．２　ｍＭ　ｅａｃｈ　ｄＮＴＰ、２５　ｐｍｏｌ　Ｆ１プライマー（配列番号４）、２５　ｐｍｏｌ　Ｒ１プライマー（配列番号１１）、１．２５Ｕ　ＦａｓｔＴａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名；ロッシュダイアグノステックス）、１μｌ　ＤＮＡ
【００２２】
（ｉｉ）　ＰＣＲ条件
９５℃　３分、そして、９５℃　３０秒、５８℃　３０秒、７２℃　３０秒、１０サイクル、そして７２℃　１０分。
【００２３】
次いで、第２工程の制限酵素（Ｎｄｅ　Ｉ）処理を行った。５μｌの２のＰＣＲ産物、４Ｕ　Ｎｄｅ　Ｉ（ＴＡＫＡＲＡ　Ｃｏ．，　Ｏｔｓｕ，　Ｊａｐａｎ）、２μｌ　１０Ｘ制限酵素バッファー、総体積２０μｌで１時間、３７℃、インキュベーとした。
【００２４】
（３）　第３工程（ＰＮＡを用いたＰＣＲ）
（ｉ）　反応混合物組成
１μｌ　（２）のＮｄｅ　Ｉ処理液
１ｘ　ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ
０．２　ｍＭ　ｅａｃｈ　ｄＮＴＰ
２５　ｐｍｏｌ　Ｆ２プライマー（配列番号１０）
２５　ｐｍｏｌ　Ｒ１プライマー
５０　ｐｍｏｌ　ＰＮＡ１（配列番号７）
１．２５Ｕ　ＦａｓｔＴａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名；ロッシュダイアグノステックス）
総体積　５０μ１
【００２５】
（ｉｉ）　ＰＣＲ条件
９５℃　３分
次いで、
９５℃　１分
７６℃　１分
６０℃　３０秒
７２℃　３０秒
のサイクルを２５サイクル、
最後に
７２℃　１０分
【００２６】
（４）　第４工程
（ｉ）　ＹＶＤＤの検出
（ａ）　反応混合物組成
１μｌ　（３）のＰＣＲ産物
１ｘ　ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ
０．２　ｍＭ　ｅａｃｈ　ｄＮＴＰ
２５　ｐｍｏｌ　Ｆ２　プライマー
２５　ｐｍｏｌ　Ｒ２　プライマー（配列番号１２）
１．２５Ｕ　ＦａｓｔＴａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名；ロッシュダイアグノステックス）
総体積　５０μ１
【００２７】
（ｂ）　ＰＣＲ条件
９５℃　３分
次いで、
９５℃　３０秒
５８℃　３０秒
７２℃　３０秒
のサイクルを３５サイクル、
最後に
７２℃　１０分
【００２８】
このＰＣＲ産物５μｌを１０Ｕ　Ｎｌａ　ＩＩＩ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｒｅｒｌｙ，　ＭＡ）１ｘ　制限酵素バッファー　総体積　２０μｌで、３７℃、１時間インキュベートし、さらに、３％アガロースゲル（ＴＢＥ　ブッファー）で電気泳動を行ったところ、ＹＶＤＤ変異型ＨＢＶを含む血清では、約１３５ｂｐのバンドを検出した。
【００２９】
（ｉｉ）　ＹＩＤＤの検出
（ａ）　反応混合物組成
１μｌ　３のＰＣＲ産物
１ｘ　ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ
０．２　ｍＭ　ｅａｃｈ　ｄＮＴＰ
２５　ｐｍｏｌ　Ｆ３プライマー（配列番号１３）
２５　ｐｍｏｌ　Ｒ２プライマー
１．２５Ｕ　ＦａｓｔＴａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名；ロッシュダイアグノステックス）
総体積　５０μ１
【００３０】
（ｂ）　ＰＣＲ条件
９５℃　３分、
次いで、
９５℃　３０秒
５８℃　３０秒
７２℃　３０秒
のサイクルを３５サイクル、
最後に
７２℃　１０分
【００３１】
このＰＣＲ産物５μｌを１０Ｕ　Ｓｓｐ　Ｉ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｒｅｒｌｙ，　ＭＡ）１ｘ制限酵素バッファー　総体積　２０μｌ、３７℃、１時間インキュベートし、さらに、３％アガロースゲル（ＴＢＥ　ブッファー）で電気泳動を行った。ＹＩＤＤ変異型ＨＢＶを含む血清では、約１３１ｂｐバンドを検出した。
【００３２】
実施例２
ＹＭＤＤ変異型ＨＢＶとＹＶＤＤ変異型ＨＢＶの血清を、１０９コピー／ｍｌ対１０９、１０８、１０７、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２、１０１コピー／ｍｌ対となるようにした。実施例１と同様に検出し、ＹＭＤＤ株１０９コピー／ｍｌ対、ＹＶＤＤ株１０４　コピー／ｍｌまでＹＶＤＤ株を検出可能であった。ＡｌｌｅｎらのＲＦＬＰ法（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　１９９８　Ｊｕｎ；２７（６）：１６７０−７、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｔｏ　ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ．　Ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　Ｇｒｏｕｐ．、Ａｌｌｅｎ　ＭＩ，　Ｄｅｓｌａｕｒｉｅｒｓ　Ｍ，　Ａｎｄｒｅｗｓ　ＣＷ，　Ｔｉｐｐｌｅｓ　ＧＡ，　Ｗａｌｔｅｒｓ　ＫＡ，　Ｔｙｒｒｅｌｌ　ＤＬ，　Ｂｒｏｗｎ　Ｎ，　Ｃｏｎｄｒｅａｙ　ＬＤ．）では、１０９コピー／ｍｌまで検出が可能であった。
【００３３】
実施例３
野生型ＨＢＶとＹＩＤＤ変異型ＨＢＶの血清を、１０５コピー／ｍｌ対１０５、１０４、１０３、１０２、１０１となるようにした。野生型株１０５コピー／ｍｌに対し、ＹＩＤＤ変異型株１０１コピー／ｍｌまで検出可能であった。すなわち、コピー数の比率で１／１００００以上で、変異型を検出可能であった。一方、ＡｌｌｅｎらのＲＦＬＰ法では、１０５まで検出が可能であった。
【００３４】
実施例４
ＲＦＬＰで耐性株変異を検出できなかった、未治療の３６例のＢ型慢性肝炎患者３６例を実施例１記載の方法により測定した結果、４例で耐性株が検出された。
【００３５】
実施例５
５４歳、女性、慢性Ｂ型肝炎患者は、ラミブジン治療開始１４ヶ月でＨＢＶ　ＤＮＡがブレークスルーを起こした。ＡｌｌｅｎらのＲＦＬＰ法では、この２ヶ月前でＹＶＤＤ変異型を検出したが、実施例１の方法（ただし、第３工程で用いたＰＮＡは、配列番号７記載の上記ＰＮＡ１の３’末端側３塩基が欠失した２０ｍｅｒのもの）では７ヶ月前にすでに耐性株ＹＩＤＤを検出した。
【００３６】
実施例６
第１工程から第３工程までは実施例１と同様に行った。ＹＶＤＤの検出をつづけて行った。
（ｉ）　反応混合物組成
１μｌ　第３工程のＰＣＲ産物
１ｘ　ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ
０．２　ｍＭ　ｅａｃｈ　ｄＮＴＰ
２５　ｐｍｏｌ　ＦＭＶプライマー（配列番号１４）
２５　ｐｍｏｌ　ＦＭＩプライマー（配列番号１５）
２５　ｐｍｏｌ　ＲＭプライマー（配列番号１６、ただし、５’末端にビオチンを結合）
１．２５Ｕ　ＦａｓｔＴａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名；ロッシュダイアグノステックス）
総体積　５０μ１
【００３７】
（ｉｉ）　ＰＣＲ条件
９５℃　３分、
次いで、
９５℃　３０秒
５８℃　３０秒
７２℃　３０秒
のサイクルを３５サイクル、
最後に、
７２℃　１０分
【００３８】
このＰＣＲ産物を５０μｌの０．１Ｎ　ＮａＯＨで変性し、ＹＶＤＤ検出用プローブＰＭＶ（配列番号１７、アミノ基を介して５’末端を固相に結合）とＹＩＤＤ検出用プローブＰＭＩ（配列番号１８、アミノ基を介して５’末端を固相に結合）がそれぞれ固相化されたマイクロタイタープレートに、１００μｌのハイブリダイゼーション溶液とともに加え、３７℃１時間、インキュベーションした。２ｘＳＳＣ（ＮａＣｌ　８７．７５ｇ，クエン酸ナトリウム４４．１ｇを１Ｌの水に溶かす）、２００μｌで４回洗浄し、ＨＲＰ−アビジンを加え、３７℃、１５分インキュベーションし、２ｘＳＳＣ、２００μｌで４回洗浄した。さらに、ＨＲＰの基質のＴＭＢ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｅ）を加えて発色反応を行い、プレートリーダーによって４５０　ｎｍの吸光度を測定し、ＹＶＤＤまたはＹＩＤＤを検出した。野生型ＨＢＶとＹＩＤＤ変異型ＨＢＶの血清を、１０５コピー／ｍｌ対１０１コピー／ｍｌとなるように混合しＹＩＤＤを検出可能であった。
【００３９】
【発明の効果】
本発明により、公知の方法よりも高感度にラミブジン耐性ＨＢＶを測定することができる方法が提供された。本発明の方法を適用することにより、ラミブジン治療中のＢ型肝炎患者におけるラミブジン耐性ＨＢＶの出現を従来よりも早期に検出することができるので、早期に適切な処置を行うことが可能になる。従って、本発明の方法は、慢性Ｂ型肝炎治療に大いに貢献するものと期待される。
【００４０】
【配列表】
2004081051.tif 000003
2004081051.tif 000004
2004081051.tif 000005
【００４２】
2004081051.tif 000006
【００４３】
2004081051.tif 000007
【００４４】
2004081051.tif 000008
【００４５】
2004081051.tif 000009
【００４６】
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【００４７】
2004081051.tif 000011
【００４８】
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【００４９】
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【００５０】
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【００５１】
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【００５２】
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【００５３】
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【００５４】
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【００５５】
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【００５６】
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【００５７】
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【００５８】
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【００５９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法の第３工程の原理を示す模式図及び第３工程で採用される温度サイクルの例を示す図である。
【図１】
2004081051.tif 000024