(57)【要約】【課題】本発明は、これまで遺伝子導入による改変が困難とされてきた、形質転換が極めて難しい植物でも遺伝子導入法により新品種が作製出来、花の改良が出来る、種々の花卉園芸植物に適用可能な新品種作製方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、花器官形態形成遺伝子Ａ、Ｂ、Ｃの何れか一つ又は二つの発現を調整するように構築した発現ベクターを花粉に導入し、受粉させることを特徴とする花卉園芸植物の新品種作製方法に関する。本発明の方法によれば、これまで形質転換が極めて難しいとされていたユリやラン、エンレイソウ等、種々の花卉園芸植物の品種改変が可能となる。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
花器官形態形成遺伝子Ａ、Ｂ、Ｃの何れか一つ又は二つの発現を調整するように構築した発現ベクターを花粉に導入し、受粉させることを特徴とする花卉園芸植物の新品種作製方法。
【請求項２】
開葯前約２時間〜開葯後約２時間の花粉にパーティクルガンで発現ベクターを導入する請求項１に記載の方法
【請求項３】
パーティクルガンの加速圧力を２０ｋｇｆ／ｃｍ２を超える圧力に設定して発現ベクターの導入を行う請求項２に記載の方法。
【請求項４】
導入される発現ベクターをコーティングした、磁気に反応する金属又は金属化合物からなる微粒子を使用し、花粉にパーティクルガンで発現ベクターを導入後、ベクター導入花粉を磁力選抜する請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
磁気に反応する金属又は金属化合物が、鉄又は鉄化合物である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
磁気に反応する金属又は金属化合物が、非鉄金属又は非鉄金属化合物である請求項４に記載の方法。
【請求項７】
非鉄金属が、ニッケルである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
磁気に反応する金属又は金属化合物からなる微粒子の粒径が、０．１〜１μｍである請求項４〜７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
花粉に発現ベクター及びマーカー遺伝子としての蛍光タンパク遺伝子を導入し、蛍光を検出することによりベクター導入花粉を選抜する請求項２又は３に記載の方法。
【請求項１０】
蛍光タンパク遺伝子がクラゲ由来の合成蛍光遺伝子ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
レーザーを用いた蛍光励起セルソーターにより蛍光を検出する請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
レーザーとしてアルゴンレーザーを使用する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
クラスＢ遺伝子の発現を抑制するように構築した発現ベクターを用いる請求項１〜１２の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
クラスＢ遺伝子を、３５Ｓプロモーター及びアクチンプロモーターの下流にアンチセンス方向に結合させることにより構築した発現べクターをを用いる請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
新品種がビリジフローラタイプの花弁を有する花卉園芸品種である請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
クラスＣ遺伝子の発現を抑制するように構築した発現ベクターを用いる請求項１〜１２の何れかにに記載の方法。
【請求項１７】
クラスＣ遺伝子を、３５Ｓプロモーター及びアクチンプロモーターの下流にアンチセンス方向に結合させることにより構築した発現べクターをを用いる請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
新品種が八重咲の花を咲かせる花卉園芸品種である請求項１６又は１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子導入による花卉園芸植物の新品種作製方法に関する。詳しくは、これまで遺伝子導入による改変が困難とされてきた花卉園芸植物についても、遺伝子導入法により新品種が作製出来る画期的な方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
美しい花を持つ植物は、園芸植物として人々に親しまれている。同じ種でも、様々な色や形の花があり、それらの多くは自然に見つかった変わり種をもとにして育種されてきた。その歴史は長く、八重咲のペチュニアやアサガオは１９世紀頃、八重咲のチューリップは中世の頃から人々の目を楽しませている。
これらの八重咲品種は栽培している中で偶然発見されてきたものであり、それはすべての植物種にあるわけではない。例えばユリやランなどは様々な色や形の品種はあるが、八重咲品種は知られていない。もし花の形を自在に変え、八重咲品種などを自由に育成することができれば、世界の花卉園芸業界に多大な影響を与える事は間違いない。
【０００３】
なぜ八重咲品種のような花ができるのかは、遺伝子レベルの研究ですでに明らかにされている。ペチュニアやアサガオのような双子葉植物の花はがく、花弁、雄蕊、雌蕊という４つの器官から構成されており、これらはＡ、Ｂ、Ｃという３つのクラスの遺伝子群によって決定されている［図１（ａ）：ＡＢＣモデル］。クラスＡ遺伝子だけが働くとそこにはがくができ、クラスＡ、Ｂ遺伝子が共に働くと花弁が、クラスＢ、Ｃ遺伝子が共に働くと雄蕊が、クラスＣ遺伝子だけが働くと雌蕊ができる。このＡＢＣモデルはシロイヌナズナとキンギョソウというモデル植物を使った分子遺伝学的、分子生物学的手法によって明らかにされ、このＡＢＣモデルは双子葉植物全般の花器官形成に適用できると考えられている。
【０００４】
ユリやチューリップのようにがくと花弁の区別がない同花被花では、クラスＢ遺伝子が一番外側まで働くために、がくではなく花弁ができていると考えられている［図１（ｂ）：改変ＡＢＣモデル］。チューリップには八重咲や花弁に緑色の筋が入ったビリジフローラタイプの品種があるが、これらの花を改変ＡＢＣモデルで説明すると図２のようになる。もしチューリップのクラスＣ遺伝子が壊れて働かなくなると、クラスＡ遺伝子の発現が延び、もともと雄蕊のあったところまで発現するために雄蕊が花弁化する。八重咲のチューリップはこのようにしてできたと考えられている。またクラスＢ遺伝子が壊れて働かなくなると、花弁ががく化するため、花弁に緑色の筋が入ることにより、ビリジフローラタイプのチューリップができると考えられている。
【０００５】
花器官形態形成の仕組みが遺伝子レベルで判ったので、形質転換が可能な植物では八重咲品種育成など、花の形の改良が理論的に可能になった。しかし形質転換系が確立されている植物は、これまで実験植物としてよく用いられてきた植物に限られ、ユリやラン、エンレイソウといった多くの花卉園芸植物では従来の方法では遺伝子を導入することが不可能である。
【０００６】
一方、花粉に遺伝子を導入し受粉により遺伝子導入種子を得る花粉ベクター法は公知である（例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、特許文献１、特許文献２、特許文献３等参照。）。しかし、花卉園芸植物において花粉に遺伝子を導入し、例えば八重咲きの形質転換体等を作製した例はこれまでにない。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｌｅｅｄｅ−Ｐｌｅｇｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４，  ７７−８６  （１９９５）
【非特許文献２】
堀川・角田、日本草地学会誌，４４（別），１２４頁（１９９８）
【非特許文献３】
堀川ら、日本草地学会誌，４６（別），１２４頁（２０００）
【特許文献１】
特開２０００−２３２８７９号公報
【特許文献２】
特願２００１−２１７９４７号明細書
【特許文献３】
特許第３１３５９６９号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した如き現状に鑑みなされたもので、これまで遺伝子導入による改変が困難とされてきた、形質転換が極めて難しい植物でも遺伝子導入法により新品種が作製出来、花の改良が出来る、種々の花卉園芸植物に適用可能な新品種作製方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、花器官形態形成遺伝子Ａ、Ｂ、Ｃの何れか一つ又は二つの発現を調整するように構築した発現ベクターを花粉に導入し、受粉させることを特徴とする花卉園芸植物の新品種作製方法に関する。
【００１０】
即ち、本発明者らは、近年、トウモロコシで確立された花粉べクター法を用いれば、ユリやラン、エンレイソウといった形質転換が極めて難しい植物でも遺伝子を導入することが可能となり、花の改良ができるのではないかと考え、鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに到った。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明は、花器官形態形成遺伝子（ＡＢＣモデル）を利用して構築した発現ベクターを花粉に導入し、受粉させることからなる花卉園芸品種の作製・育成方法に関する。
即ち、例えばシンテッポウユリのクラスＢ及びクラスＣ遺伝子を３５Ｓプロモーター及びアクチンプロモーターの下流にセンス或いはアンチセンス方向に結合させたプラスミド（発現ベクター）を作製して花粉に導入し、受粉によりシンテッポウユリの形質転換体を作製すると、Ｂ遺伝子の発現抑制（Ｂ遺伝子をアンチセンス方向に結合）した形質転換体はビリジフローラタイプの花弁、Ｃ遺伝子を抑制（Ｃ遺伝子をアンチセンス方向に結合）した場合は、八重咲きのシンテッポウユリが得られる。
【００１２】
本発明の花卉園芸植物の新品種作製方法は、開葯前約２時間〜開葯後約２時間の花粉にパーティクルガンで花器官形態形成遺伝子Ａ、Ｂ、Ｃの何れか一つ又は二つの発現を抑制するように構築した発現ベクターを導入することにより効果的に実施される。この方法をより効果的に実施するには、パーティクルガンの加速圧力を市販の装置の圧力である２０ｋｇｆ／ｃｍ２を超える圧力、例えば、３０ｋｇｆ／ｃｍ２に設定して発現ベクター導入を行うことが望ましい。
【００１３】
発現ベクター導入花粉の選抜方法としては、種々の方法が知られているが、本発明においてより好ましい方法としては、例えば、本発明者らが先に特許出願している磁力選抜法（特許文献１参照。）が挙げられる。この方法は、導入される発現ベクターをコーティングした、磁気に反応する金属又は金属化合物からなる微粒子を使用し、花粉にパーティクルガンで発現ベクターを導入後、発現ベクター導入花粉を磁力選抜する方法である。
磁気に反応する金属又は金属化合物としては、鉄又は鉄化合物、及び非鉄金属又は非鉄金属化合物が挙げられ、非鉄金属の中では、ニッケルが特に好ましい。
これら磁気に反応する金属又は金属化合物からなる微粒子の粒径は、通常０．１〜１μｍ、より好ましくは０．３〜０．８μｍ程度である。
発現ベクター導入花粉の磁力選抜法についてのより具体的な手法等については、前記特許文献１に記載があるのでこれを参考にして行えばよい。
【００１４】
また、他の好ましい選抜方法としては、同じく本発明者らが先に特許出願している、蛍光を検出することにより発現ベクター導入花粉を選抜する方法（特許文献２参照。）が挙げられる。この方法は、花粉に外来遺伝子及びマーカー遺伝子としての蛍光タンパク遺伝子を導入し、蛍光を検出することにより遺伝子導入花粉を選抜する方法である。
蛍光タンパク遺伝子としては、例えば、クラゲ由来の合成蛍光遺伝子ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）等が好ましいものとして挙げられる。
蛍光の検出は、例えば、レーザーを用いた蛍光励起セルソーター等により行われる。
レーザーとしては、通常アルゴンレーザーが用いられる。
蛍光遺伝子とレーザーを用いた発現ベクター導入花粉の選抜法についてのより具体的な手法等については、前記特許文献２に記載があるのでこれを参考にして行えばよい。
【００１５】
本発明の方法により得られた遺伝子導入花粉を受粉させることによって、遺伝子組換え種子（形質転換種子）を作出することが出来る。受粉操作及びその後の種子を得るまでに必要な操作等は当該技術分野で公知の方法に従って実施することが出来る。
【００１６】
発現ベクターが導入される花粉としては、未成熟花粉及び成熟花粉のいずれも使用することが可能である。
【００１７】
本発明で得られた遺伝子組換え種子を育成することによって、目的とする形質転換された遺伝子組換え植物を作出することが出来る。育成自体は、当該技術分野で公知の方法に従って実施することが出来る。
【００１８】
かかる形質転換の対象となる花卉園芸植物としては、既に八重咲やビリジフローラタイプの品種が知られているペチュニア、アサガオやチューリップ等はもとより、これまで形質転換が極めて難しいとされていたユリやラン、エンレイソウといった植物等、種々の植物が挙げられる。
【００１９】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００２０】
実施例１  シンテッポウユリを用いた花の改変
（１）  花器官形態形成遺伝子の単離
シンテッポウユリ（Ｌｉｌｉｕｍ  Ｘ  ｆｏｒｍｏｌｏｎｇｉ）の花芽からｍＲＮＡを単離し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡプールとした。シンテッポウユリと同じユリ属のリーガルリリー（Ｌｉｌｉｕｍ  ｒｅｇａｌｅ）からは、すでにクラスＢ（ＬＲＧＬＯＡ、ＬＲＧＬＯＢ、ＬＲＤＥＦ）及びクラスＣ（ＬＲＡＧ）遺伝子のｃＤＮＡが単離されている（クラスＢ；Ｗｉｎｔｅｒ，Ｋ．Ｕ．  ｅｔ  ａｌ．  ２００２，  クラスＣ；Ｋａｎｎｏ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  未発表）。これらの塩基配列をもとに各遺伝子ｃＤＮＡ特異的なプライマーを合成し、シンテッポウユリの花芽から作成したｃＤＮＡプールからクラスＢ及びクラスＣ遺伝子のｃＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅させ、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒにクローニングした。
クラスＢ遺伝子であるＧＬＯ−ｌｉｋｅ及びＤＥＦ−ｌｉｋｅ遺伝子、クラスＣ遺伝子であるＡＧ−ｌｉｋｅ遺伝子の断片がＰＣＲにより増幅でき、この断片をクローニングして塩基配列を決定した（図３）。その結果、これらの遺伝子をそれぞれＬＦＧＬＯＡ、ＬＦＧＬＯＢ、ＬＦＤＥＦ、ＬＦＡＧと名付けた。
（２）遺伝子導入
シンテッポウユリから単離したクラスＢ及びクラスＣ遺伝子を、３５Ｓプロモーター及びアクチンプロモーターの下流にセンス・アンチセンス方向に結合させた発現べクターを構築した。このプラスミドを花粉べクター法を用いてシンテッポウユリに形質転換させ、花の形態の変化の有無を調べた。
なお、発現ベクターの花粉への導入及びそれ以降の操作は、堀川、角田が先に開発した「微粒子発射装置」（特許文献３）のパーティクルガンを用いて、ニッケル微粒子にコーティングした発現ベクターを花粉に撃ち込み、その花粉を堀川、角田が開発した「遺伝子導入細胞の磁力選抜法」（特許文献１）を用いてベクター導入花粉を選抜することにより行った。
パーティクルガンによる花粉への発現ベクターの導入はパーティクルガンの加速圧力を、ヘリウムガス圧３０ｋｇｆ／ｃｍ２に設定して行った。また、花粉は開葯２時間後のものを使用した。
（３）結果
クラスＢ遺伝子をアンチセンス方向に結合させた発現べクターを用いた場合、シンテッポウユリの花弁は緑色の筋がはいり、ビリジフローラタイプのシンテッポウユリが作出できた。
またクラスＣ遺伝子をアンチセンス方向に結合させた発現べクターを用いた場合、シンテッポウユリの雄蕊は花弁に変わり、雌蕊は新しい花になって、八重咲のシンテッポウユリが作出できた。
なお、本実施例において、シンテッポウユリを用いた理由は、花粉を得やすいこと、交配により種子が得やすいこと、播種から花が咲くまでの期間が短いこと等の理由により、実験がし易いと考えたからであり、他の種々の花卉園芸植物についても、同じ方法により、同様の結果が得られるはずである。
【００２１】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、これまで形質転換が極めて難しいとされていたユリやラン、エンレイソウ等、種々の花卉園芸植物の品種改変が可能となり、実用化の可能性は高く、市場性も高い。
本発明の方法は、花器官形態形成遺伝子を利用した新しい花卉園芸植物の育種方法であり、従来のものが植物ウイルスをベクターとしているのに対し、花粉をベクターとしている点で安全性、効率性が高い技術である。
本発明の方法により、八重咲のランやビリジフローラタイプのユリが自在に育成できれば、花卉園芸植物のカタログを一新する画期的な業績となる。
【００２２】
【配列表】
2004329087.tif 000002
2004329087.tif 000003
2004329087.tif 000004
2004329087.tif 000005
2004329087.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】図１（ａ）は、花器官形態形成遺伝子ＡＢＣモデルを示す。
図１（ｂ）は、改変ＡＢＣモデルを示す。
【図２】図２は、各種チューリップの品種と改変ＡＢＣモデルを示す。
【図３】図３は、シンテッポウユリのクラスＣ遺伝子ＬＦＡＧの塩基配列を示す。
【図１】
2004329087.tif 000007
【図２】
2004329087.tif 000008
【図３】
2004329087.tif 000009