(57)【要約】【課題】ＣＦＵ−Ｅのコロニー形成を阻害する造血阻害因子含有組成物を得る。【解決手段】アルブミンの篩係数が０．０１以上の透析膜で血液を透析した透析液を、分子量分画が５，０００以下の膜で濃縮し、次いで、最大分子量が２０万以上、１５０万以下であるゲルでゲル濾過することにより素通り画分に得られる物質からなる、ＣＦＵ−Ｅのコロニー形成を阻害する造血阻害因子含有組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルブミンの篩係数が０．０１以上の透析膜で血液を透析した透析液から、２０万以上の分子量成分を分離することにより得ることのできる、造血阻害因子含有組成物。
【請求項２】
アルブミンの篩係数が０．０１以上の透析膜で血液を透析した透析液を、最大分子量分画が２０万以上のゲルで分離して高分子量側に得ることのできる、造血阻害因子含有組成物。
【請求項３】
アルブミンの篩係数が０．０１以上の透析膜で血液を透析した透析液を分子量分画が５，０００以下の膜で濃縮し、次いで、最大分子量分画が２０万以上、１５０万以下であるゲル濾過することにより素通り画分に得ることのできる赤芽球コロニー形成細胞のコロニー形成を阻害する造血阻害因子含有組成物。
【請求項４】
請求項１〜３において、該透析膜のアルブミンの篩係数が０．０２以上であることを特徴とする造血阻害因子含有組成物。
【請求項５】
請求項１〜３において、該透析膜のアルブミン篩係数が０．０３以上であることを特徴とする造血阻害因子含有組成物。
【請求項６】
請求項１〜５において、造血阻害因子が水溶性であることを特徴とする造血阻害因子含有組成物。
【請求項７】
請求項１〜６において、ドデシル硫酸ナトリウムを用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分子量３万以上、１０万以下の位置に泳動されることを特徴とする造血阻害因子。
【請求項８】
Ｎ末端から１９番目までのアミノ酸配列が、Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｌａであることを特徴とする請求項７記載の造血阻害因子。
【請求項９】
Ｎ末端から１０番目までのアミノ酸配列が、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕであることを特徴とする請求項７記載の造血阻害因子。
【請求項１０】
透析液の溶質のゲル濾過パターンを２８０ｎｍの吸光度値で表した場合において、請求項１〜６記載の造血阻害因子含有組成物の吸光度値の高さをＡＩ、そのゲル濾過パターンの最大吸光度値の高さをＡＡとした際、ＡＩ／ＡＡ≧１／５０となるようＡＩ成分を除去することを特徴とする血液の処理方法。
【請求項１１】
該ＡＩ／ＡＡが、ＡＩ／ＡＡ≧１／３０であることを特徴とする請求項１０記載の血液の処理方法。
【請求項１２】
アルブミンの篩係数が０．０１以上の透析膜で血液を透析した透析液から、２０万以上の分子量成分を分離することを特徴とする、造血阻害因子含有組成物の分離方法。
【請求項１３】
アルブミンの篩係数が０．０１以上の透析膜で血液を透析した透析液を、最大分子量分画が２０万以上のゲルで分離して高分子量側成分を分離することを特徴とする、造血阻害因子含有組成物の分離方法。
【請求項１４】
アルブミンの篩係数が０．０１以上の透析膜で血液を透析した透析液を、分子量分画が、５，０００以下の膜で濃縮し、次いで、最大分子量分画が２０万以上、１５０万以下であるゲルでゲル濾過することにより素通り画分に得られる成分を分離することを特徴とする、赤芽球コロニー形成細胞のコロニー形成を阻害する造血阻害因子含有組成物の分離方法。
【請求項１５】
請求項１２〜１４において、該透析膜のアルブミンの篩係数が０．０２以上であることを特徴とする造血阻害因子含有組成物の分離方法。
【請求項１６】
請求項１２〜１４において、該透析膜のアルブミンの篩係数が０．０３以上であることを特徴とする造血阻害因子含有組成物の分離方法。
【請求項１７】
請求項１〜６の造血阻害因子含有組成物から、ドデシルナトリウムを用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分子量３万以上、１０万以下の位置に泳動される成分を分離することを特徴とする造血阻害因子の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、赤芽球コロニー形成細胞（以下、ＣＦＵ−Ｅと略す）のコロニー形成を阻害する造血阻害因子含有組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
血液透析患者の大多数の血球率（ヘマトクリット）は２０〜３０％であって、健常者における血球率４０〜５０％に比べると極めて貧血状態にあるといわれている。一方、造血を促進するエリスロポエチンが開発され、これを健常者の血中濃度の３０倍もの量を大量投与することで貧血が改善することが知られてきた。このエリスロポエチンの大量投与によって、多数の患者の貧血は改善するが、一部には、貧血が改善しない患者もいることが、最近明らかになっている。
【０００３】
このように、造血を促進するエリスロポエチンの大量投与が必要なこと、さらに、これほどの大量投与でも貧血改善効果のない患者がいることなどから考えると、透析患者には造血を阻害する物質が溜まっており、エリスロポエチンの効果を妨げていることが考えられる。
【０００４】
この造血を阻害する物質については、例えば、斎藤らの報告（Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　Ａ．　Ｓａｉｔｏら（１９８６）　Ｐ１９３８）があり、この造血阻害因子の分子量は１，０００〜１０，０００であるとしている。しかしながら、造血阻害因子がこの分子量であるとすると、現在の血液透析療法で用いられている中分子量物質が除去できる透析膜を用いた透析によって十分に血液透析患者の貧血が改善されるはずであるが、まだ十分に改善されないのが現状である。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　Ａ．　Ｓａｉｔｏら（１９８６）　Ｐ１９３８
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本願発明は、上記のとおりの従来技術における課題を解決しようとするものであり、正確なＣＦＵ−Ｅのコロニー形成を阻害する造血阻害因子含有組成物を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本願発明は、篩係数が０．０１以上の透析膜で血液を透析した透析液から、２０万以上の分子量成分を分離することにより得られる、造血阻害因子含有組成物に関する。具体的には、アルブミンの篩係数が０．０１以上の透析膜で血液を透析した透析液を、分子量分画が５，０００以下の膜で濃縮し、次いで、最大分子量分画が２０万以上、１５０万以下であるゲルでゲル濾過することにより素通り画分に得られる組成物からなる、ＣＦＵ−Ｅのコロニー形成を阻害する造血阻害因子含有組成物に関する。
【０００８】
さらに、透析液の溶質のゲル濾過パターンを２８０ｎｍの吸光度値で表した場合において、請求項１〜５記載の造血阻害因子含有組成物の吸光度値の高さをＡＩ／ＡＡ≧１／５０となるようＡＩ成分を除去することを特徴とする血液の処理方法、また、透析液の溶質のゲル濾過パターンを２８０ｎｍの吸光度値で表した場合において、請求項１〜５の造血阻害因子含有組成物の吸光度値の高さをＡＩ、そのゲル濾過パターンの最大吸光度値の高さをＡＡとした際、ＡＩ／ＡＡ≧１／５０であることを特徴とする透析膜に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明においては、アルブミンの篩係数が０．０１以上の透析膜であればいかなる素材からなるものでも限定されることなく用いることができるが、かかる透析膜としては、例えば、特開昭６３−１０９８７１号に記載されている膜を用いることができる。
【００１０】
さらには、次の方法で得られる膜が特に好ましい。高分子重合体を該重合体の溶媒に溶解し、環状口金から水系凝固浴中に紡糸して透過性中空糸をつくるに際して、高分子溶液濃度、凝固・硬化に際しての冷却条件、脱溶媒速度を調整して膜組織を形成させる。たとえばポリメチルメタクリレート系重合体を膜素材として用いて、中空糸状の膜を製造する場合は、アイソタクチックポリメチルメタクリレートと懸濁重合法により作られたシンジオタクチックポリメチルメタクリレートをポリマー濃度が１５重量％ないし２７重量％になるようにジメチルスルホキシドなどの溶媒に溶解する。この溶液を環状紡糸口金から吐出して中空繊維を形成せしめるに際し、内側から乾燥窒素ガスを導入し、外側から冷却気体を吹きつけて、中空繊維を形成せしめる。この際、冷却気体は乾球温度５〜１７℃、含有水分の尺度である露点は−５〜５℃であることが好ましい。次いで、水を主体とした凝固浴に導いて、固化、脱溶媒する。このときの凝固浴温度は２０℃ないし４０℃とすることが好ましい。
【００１１】
濃縮に用いる分子量分画５，０００以下の膜としては、一般に用いられる分子量分画５，０００以下の膜であれば特に限定されることなく用いられるが、例えば、セルロース膜、酢酸セルロース膜、ポリアクリロニトリル膜、ポリスルホン膜などが挙げられる。本発明においては、濃縮倍数は特に限定されないが、分画、分取、生理活性評価を行うなどの点から、２００倍以上の高濃度に濃縮することが好ましい。ＡＩ／ＡＡを分析するには１００倍の濃縮でよい。
【００１２】
本発明の最大分子量が２０万以上、１５０万以下であるゲルとは、三次元編目構造をとるようにデキストランなどの高分子化合物の化学架橋によって構成された、化学的、物理的な安定性を持つマトリクスからなるものである。具体的にはファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社製の“Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００ＨＲ”（最大分子量分画２５万）、“Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−３００ＨＲ”（最大分子量分画５０万）などを用いて、ゲル濾過する方法が好ましく用いられ、特に好ましくは“Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００ＨＲ”を用いることが、ＣＦＵ−Ｅのコロニー形成阻害の比活性を上げる点でよい。
【００１３】
先の濃縮液を、酢酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、トリス塩酸などの溶出液を用いて、上記のゲルによりゲル濾過し、続いて、２８０ｎｍの吸光度を測定して、素通り分画に相当する画分を採取し、さらに、これを脱塩および凍結乾燥することにより、造血阻害分画が得られる。
【００１４】
本発明でいう造血阻害因子の用途として最も重要なものは、本造血阻害因子を抗原として抗体を作製することである。この抗体を固定化して分析用のキットをつくり、貧血の原因を特定化するための診断に用いることができる。また、この抗体を固定化したカラムを作製して造血阻害因子の除去療法を行なうこともできる。さらに、これを単品で用いて赤血球増加症における赤血球の過剰な産生を抑制することができる。造血阻害因子の作用を抑制もしくは無害化するような医薬品を投与して貧血を改善することも可能である。
【００１５】
さらに本発明においては、前述した透析膜を用いて、透析液の溶質のゲル濾過パターンを２８０ｎｍの吸光度値で表した場合において、造血阻害因子含有組成物の吸光度値の高さをＡＩ、そのゲル濾過パターンの最大吸光度値の高さをＡＡとした際、ＡＩ／ＡＡ≧１／５０となるようＡＩ成分を除去することができる。さらには、ＡＩ／ＡＡ≧１／３０となるようＡＩを除去することもできる。ここで、ＡＩ／ＡＡは、患者、２０人に対し、血液流量２００ｍｌ／ｍｉｎ、透析液流量５００ｍｌ／ｍｉｎで透析した際の平均値とする。
【００１６】
また、本発明においては、前述の造血阻害因子を有効成分とする医薬組成物、さらには、赤血球増加症治療剤を得ることもできる。
【００１７】
造血阻害因子をかかる医薬組成物、あるいは、赤血球増加症治療剤として用いる場合、そのままもしくはそれ自体公知の薬理学的に許容されうる担体、賦形剤などと混合した医薬組成物、あるいは赤血球増加症治療剤として使用に供される。投与は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤等の経口投与、注射剤、シロップ剤、軟膏剤、座剤等の非経口投与のいずれであってもよい。投与量は投与対象、投与ルート、症状等によって異なるが通常成人１人当たり約０．１ｍｇ〜５ｇ程度、好ましくは約１ｍｇ〜２ｇ程度であり、これを１日１〜４回に分けてまたは１回／１日〜７日間隔で経口または非経口投与する。
【００１８】
【実施例】
実施例１
以下の方法で透析膜を作成した。
【００１９】
グリニア試薬で重合したアイソタクチックポリメチルメタクリレート１５重量部と、懸濁重合法で得たシンジオタクチックポリメチルメタクリレート７５重量部を、２６０重量部のジメチルスルホキシドに溶解した紡糸原液を環状紡糸口金の外部から吐出し、乾燥温度１２℃、露点温度０℃の湿潤空気を吹きつけて中空糸を形成した。この糸条を３８℃の水中で凝固脱溶媒させることによって内径２４５μ、外径３０５μの中空糸を得た。この中空糸を７５００本重ねて有効面積１．０ｍ２のモジュールを作成した。膜構造は、均一膜に属しており平均最高半径は１００オングストロームであった。また、細孔体積空孔率（以下ＶＰと略す）は６２％であった。さらに、アルブミン篩係数は０．０３であった。
【００２０】
上記により得られたアルブミンの篩係数が０．０３である透析膜で、血液流量２００ｍｌ／ｍｉｎ、透析液流量５００ｍｌ／ｍｉｎの条件で血液透析を受けている２人の透析患者から、透析液出口側の透析液を合計２０ｌ採取した。採取した２０ｌの透析液を分子量分画５，０００以下のセルロース膜で濃縮倍率が約２００倍になるまで、すなわち残量が１００ｍｌになるまで濃縮した。次いで濃縮液１００ｍｌの中の５０ｍｌを“Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００ＨＲ”を充填した容量２ｌのゲル濾過カラムで、酢酸アンモニウム５０ｍＭ水溶液を溶出液として２ｍｌ／ｍｉｎの溶出速度で分画し、２８０ｎｍの吸光度で検出すると主に３つのピークを得ることができた。分子量の大きい方から最初のピークとなる素通り画分をＡとし、ＩｇＧを主体とした次の画分をＢ、さらにアルブミンを主体とした最も大きいピークからなる画分をＣとし、Ａ、Ｂ、Ｃそれぞれを凍結乾燥してサンプルとした。次に、Ａ、Ｂ、ＣについてＣＦＵ−Ｅのコロニー形成阻害を、一般に用いられているメチルセルロース法に準じて行なった。
【００２１】
まず、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の大腿骨から骨髄細胞を取り出し、壁着性の細胞（ａｄｈｅｒｅｎｔ）を取り除いた後、細胞数が１０７個／ｍｌとなるように調製した。メチルセルロースは４，０００ｃｐｓのものを１．８％になるようにα−ミニマムエッセンシャルメジューム（以下、α−ＭＥＭと略す）に溶解した。牛胎小仔血清（以下、ＦＢＳと略す）は予めロットチェックをしておいた。牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略す）は脱イオン化して１０％濃度になるようにα−ＭＥＭに溶解した。２ｍｍグリット付３５ｍｍシャーレに１．８％メチルセルロース液を０．５ｍｌ、ＦＢＳを０．３ｍｌ、１０％ＢＳＡを０．１ｍｌ、細胞懸濁液を０．１ｍｌ、人尿エリスロポエチンを０．５Ｕ、α−ＭＥＭに溶解したサンプルを０．１ｍｌ加え、３７℃、５％ＣＯ２下で４８時間培養した後、１ｃｍ２あたりのＣＦＵ−Ｅコロニー数で、サンプル添加時のコロニー数を除してコロニー形成率とした。Ａ、Ｂ、Ｃそれぞれのコロニー形成率を表１に示す。素通り画分に相当するＡのコロニー形成率が低いことにより、Ａに造血阻害因子含有組成物が得られていることがわかった。
【００２２】
【表１】
2004107325.tif 000002
【００２３】
上記により得られた造血阻害因子含有組成物について、以下のとおり評価した。
まず、造血阻害因子の溶解性は次のようにして調べた。まず、酢酸アンモニウム１０ｍＭ水溶液に、造血阻害因子組成物を溶解し、これにブタノールを加えて振とうし静置した後、２相に分離したそれぞれの相を分別して凍結乾燥した。それぞれの物質のＣＦＵ−Ｅのコロニー形成阻害を評価すると、水溶液の方に阻害作用が残り、ブタノールへ移行した物質には阻害作用は全くなかった。このことから、造血阻害因子はブタノールには溶解しない水溶性であることがわかる。同様に、クロロホルム−メタノール−酢酸アンモニウムによる抽出法を用いてコロニー形成阻害を評価したが、クロロホルムへ移行した物質には阻害作用は全くなかった。またｎ−ヘキサンへの移行についてもテストしたが阻害作用は全くなかった。これらのことから、造血阻害因子は水溶性であり、ブタノール、クロロホルム、ｎ−ヘキサンなどには溶解しない性質を持つ物質であることがわかる。
【００２４】
次いで、造血阻害因子の熱安定性は次のようにして調べた。造血阻害因子を酢酸アンモニウム１０ｍＭ水溶液に１ｍｇ／ｍｌ濃度で溶解したものを、１００℃で１０分、２０分および３０分処理した後、凍結乾燥した。それぞれについてＣＦＵ−Ｅのコロニー形成阻害を評価すると、１００℃、１０分処理は阻害作用があったが、２０分処理では阻害作用が半減し、１００℃、３０分処理では阻害作用は全くなくなった。すなわち造血阻害因子は１００℃、１０分の熱処理では安定な物質であることがわかった。
【００２５】
造血阻害因子のＮ末端からのアミノ酸配列は次のようにして調べた。造血阻害因子組成物をドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳと略す）を含む緩衝液に溶解した後、１００℃で２分間加熱したものを、通常のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分離した。次に転写装置を用いて電気泳動ゲルから疎水性膜（フッ化ビニリデン膜）へタンパク質を転写した。クマシーブリリアントブルーで膜に転写されたタンパク質をバンドとして染色し、それぞれのバンドをエドマン分解法のアミノ酸配列自動分析装置（プロティンシークエンサー）によって分析した。造血阻害因子のＮ末端から１９番目までがＡｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｌａであるアミノ酸配列は、分子量４万近傍の位置に電気泳動されたバンドから得られたものである。造血阻害因子のＮ末端から１０番目までのアミノ酸配列が、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕであるアミノ酸配列は、分量７万近傍の位置に電気泳動されたバンドから得られたものである。
実施例２
実施例１と同様に透析して、３人の患者で透析開始４時間目に、透析出口側の透析液を各１００ｍｌ採り、１００倍に濃縮後、それぞれ’ＨｉＬｏａｄ　Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００ＨＲ’１６／６０でゲル濾過し、２８０ｎｍの吸光度値を測定した。患者３人についてのＡＩ／ＡＡの値は、それぞれ１／１４、１／４７、１／２１であった。１／１４の場合のゲル濾過パターンを図１に示す。
実施例３
実施例１において、透析膜作成過程における凝固脱溶媒温度３８℃を２５℃に変更して得た膜のアルブミンの篩係数は０．０１であった。
【００２６】
この透析膜を用いて実施例２と動揺にして得たＡ、Ｂ、Ｃの２８０ｎｍの吸光度値は、実施例１の半分以下であった。このとき実施例２と同様にして得たＡＩ／ＡＡは１／４０であった。
【００２７】
【発明の効果】
ＣＦＵ−Ｅのコロニー形成を阻害する造血阻害因子含有組成物を得ることができる。
【００２８】
さらに、透析液の溶質のゲル濾過パターンを２８０ｎｍの吸光度値で表した場合において、上記造血阻害因子含有組成物の吸光度値の高さをＡＩ、そのゲル濾過パターンの最大吸光度値の高さをＡＡとした際、ＡＩ／ＡＡ≧１／５０となるようＡＩ成分を除去することができる血液の処理方法、また、透析液の溶質のゲル濾過パターンを２８０ｎｍの吸光度値で表した場合において、上記の造血阻害因子含有組成物の吸光度値の高さをＡＩ、そのゲル濾過パターンの最大吸光度値の高さをＡＡとした際、ＡＩ／ＡＡ≧１／５０である透析膜を提供することができる。さらに、かかる造血阻害因子を有効成分とする医薬組成物、あるいは赤血球増加症治療剤を提供することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本願発明実施例２におけるゲル濾過パターンを示す図面である。
【図１】
2004107325.tif 000003