(57)【要約】【課題】本発明は、ファージディスプレイに用いるファージに対し、その頭部に提示される目的ポリペプチドのコピー数を制御し、所望のコピー数を提示するファージを提供すること等を課題とする。【解決手段】ファージ外殻タンパク質をコードするＤＮＡと目的ポリペプチドをコードするＤＮＡの間にストップコドンを挿入し、該ストップコドンに対するサプレッサーｔＲＮＡであって、そのサプレッサー活性が温度感受性であるものを用いてファージ外殻タンパク質と目的ポリペプチドの融合タンパク質の発現量を制御する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のサプレッサーｔＲＮＡ。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列からなるサプレッサーｔＲＮＡ。
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列を含み、かつ少なくとも２４〜４２℃の範囲で温度依存的に変化するサプレッサー活性を有するサプレッサーｔＲＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のサプレッサーｔＲＮＡをコードすることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２に記載のＤＮＡを含むことを特徴とする組み換えベクター。
【請求項４】
ファージ外殻タンパク質をコードするＤＮＡと目的ポリペプチドをコードするＤＮＡとの間にストップコドンが挿入されている塩基配列を含むことを特徴とするファージディスプレー用組み換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを含むことを特徴とするファージ。
【請求項６】
請求項１に記載のサプレッサーｔＲＮＡを含み、かつ該サプレッサーｔＲＮＡが温度依存的に活性を有する温度範囲内のいずれの温度で培養しても２４時間以内にコロニーが形成されることを特徴とする微生物。
【請求項７】
微生物が、その細胞内でファージが増殖し得ることを特徴とする請求項６に記載の微生物。
【請求項８】
請求項５に記載のファージを請求項７に記載の微生物に感染させ、該微生物を温度を変えて培養し、各温度で増殖したファージについて、その頭部に提示される目的ポリペプチドのコピー数が所望のものを選択することを特徴とする多コピー提示ファージの製造方法。
【請求項９】
ファージの選択が、目的ポリペプチドのコピー数が最も高く、かつファージ外殻が形成されていることを指標として行われることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ファージ外殻の形成の解析が、プラークの形成を指標として行われることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
目的ポリペプチドが、該ポリペプチドまたはそれを含むタンパク質が結合する物質と、弱い結合力により結合するものであることを特徴とする請求項８〜１０に記載の方法。
【請求項１２】
目的ポリペプチドが、糖鎖結合タンパク質であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
目的ポリペプチドが、酵素であることを特徴とする請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
請求項８〜１３のいずれかに記載の方法により製造されたファージ。
【請求項１５】
アミノ酸１００残基以上からなる目的タンパク質が、ファージ外殻に２０〜１００コピー提示されていることを特徴とするファージ。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載のファージが固相化されていることを特徴とするファージチップ。
【請求項１７】
請求項１４または１５に記載のファージと被検物質を接触させ、該ファージが外殻に提示する目的ポリペプチドと被検物質との結合性を解析することを特徴とする目的ポリペプチドと相互作用する物質のスクリーニング方法。
【請求項１８】
少なくとも請求項３に記載のベクターおよび請求項４に記載のベクターを含むことを特徴とする多コピー提示ファージの製造用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は少なくとも２４〜４２℃の範囲で温度依存的に活性が変化するサプレッサーｔＲＮＡ、該サプレッサーｔＲＮＡをコードするＤＮＡ、および該サプレッサーｔＲＮＡを用いてファージ外殻に提示される目的タンパク質のコピー数を制御することによる多コピー提示ファージの製造方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ファージディスプレイ法は、ポリペプチドまたはタンパク質と結合する物質を解析するスクリーニング方法（以下、これを「アフィニティスクリーニング」と称することがある）に広く用いられる方法であり、目的ポリペプチドまたはタンパク質をファージ外殻タンパク質との融合タンパク質としてその尾部または外殻に提示させるものである。ファージディスプレイ法は、Ｔ７ファージ、またはＴ４ファージ、ラムダファージ等の繊維状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ　ｐｈａｇｅ）を用いて開発されている（Ｓｍｉｔｈ，　Ｇ．　Ｐ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２２８，　１３１５−１３１７（１９８５））が、特にＴ７ファージは増殖速度が早く、また過酷な条件下においても増殖が可能であるため、上記のアフィニティスクリーニングには特に好ましいと考えられている。
【０００３】
一方、ポリペプチドおよびタンパク質（以下、これを「目的ポリペプチド」と称することがある）のアフィニティスクリーニングは、目的ポリペプチドと結合する物質（以下、これを「リガンド」と称することがある）とが様々な状態および結合力で結合している場合があるため、目的ポリペプチドおよびリガンドに適した解析条件を実現することが求められている。具体的には、糖鎖結合タンパク質と糖鎖などは、その結合力が非常に弱く、この結合力を高めるために糖鎖結合タンパク質の結合価が非常に重要である（Ｋｎｉｂｂｓ，　Ｒ．　Ｍ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　３７，　１６９５２−１６９５７（１９９８））ことがわかっている。従って、このような目的ポリペプチドおよびリガンドについてアフィニティスクリーニングを行う場合、ファージ外殻に提示される目的ポリペプチドのコピー数を高めることが必要であった。
【０００４】
しかし、Ｔ７ファージは、その頭部に外殻タンパク質であるｇｐ１０を４１５コピー有しているが、それらのうちあるコピー数以上が糖鎖結合タンパク質のような分子量の大きいタンパク質との融合タンパク質となった場合、外殻そのものの形成が困難となり、ファージが増殖しないという難点があった。そこで、現在までこの外殻に提示されたアミノ酸残基１００以上のポリペプチドは５〜１５コピーにとどまっており、上記のようなアフィニティスクリーニングを行うに十分なコピー数の外殻タンパク質への提示の実現には及んでいなかった。また、ファージディスプレイに用いるファージに対し、その頭部に提示される目的タンパク質のコピー数の制御方法も開発されていなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ファージディスプレイに用いるファージに対し、その頭部に提示される目的タンパク質のコピー数の制御方法を提供することなどを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者は、ストップコドンをファージ外殻タンパク質をコードするＤＮＡの３’下流にインフレームで連結し、さらにストップコドンの３’下流に目的タンパク質であるガレクチン１をコードするＤＮＡをインフレームで連結したファージディスプレー用組み換えベクターを構築した。また、少なくとも２４〜４２℃の間でその活性が温度依存的に変化し、かつ挿入したストップコドンに適したサプレッサーｔＲＮＡをクローニングし、上記サプレッサーｔＲＮＡを大腸菌ＢＬ２１で発現させた後、該大腸菌に上記ファージディスプレー用組み換えベクターを導入したＴ７ファージを感染させ、２４〜４２℃の様々な温度で培養したところ、その全てにおいてプラークが生じた。そこで、該プラークからファージ粒子を取得し、その頭部に提示されている目的タンパク質のコピー数を解析したところ、培養温度によりそのコピー数は変化していた。本発明は、これらの知見に基づいて成されたものである。
【０００７】
即ち、本発明によれば、
（１）以下の（ａ）または（ｂ）のサプレッサーｔＲＮＡ、
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列からなるサプレッサーｔＲＮＡ、
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列を含み、かつ少なくとも２４〜４２℃の範囲で温度依存的に変化するサプレッサー活性を有するサプレッサーｔＲＮＡ、
（２）上記（１）に記載のサプレッサーｔＲＮＡをコードすることを特徴とするＤＮＡ、
（３）上記（２）に記載のＤＮＡを含むことを特徴とする組み換えベクター、
（４）ファージ外殻タンパク質をコードするＤＮＡと目的ポリペプチドをコードするＤＮＡとの間にストップコドンが挿入されている塩基配列を含むことを特徴とするファージディスプレー用組み換えベクター、
（５）上記（４）に記載のベクターを含むことを特徴とするファージ、
（６）上記（１）に記載のサプレッサーｔＲＮＡを含み、かつ該サプレッサーｔＲＮＡが温度依存的に活性を有する温度範囲内のいずれの温度で培養しても２４時間以内にコロニーが形成されることを特徴とする微生物、
（７）微生物が、その細胞内でファージが増殖し得ることを特徴とする上記（６）に記載の微生物、
（８）上記（５）に記載のファージを上記（７）に記載の微生物に感染させ、該微生物を温度を変えて培養し、各温度で増殖したファージについて、その頭部に提示される目的ポリペプチドのコピー数が所望のものを選択することを特徴とする多コピー提示ファージの製造方法、
（９）ファージの選択が、目的ポリペプチドのコピー数が最も高く、かつファージ外殻が形成されていることを指標として行われることを特徴とする上記（８）に記載の方法、
（１０）ファージ外殻の形成の解析が、プラークの形成を指標として行われることを特徴とする上記（９）に記載の方法。
（１１）目的ポリペプチドが、該ポリペプチドまたはそれを含むタンパク質が結合する物質と、弱い結合力により結合するものであることを特徴とする上記（８）〜（１０）に記載の方法、
（１２）目的ポリペプチドが、糖鎖結合タンパク質であることを特徴とする上記（１１）に記載の方法、
（１３）目的ポリペプチドが、酵素であることを特徴とする上記（８）〜（１０）のいずれかに記載の方法、
（１４）上記（８）〜（１３）のいずれかに記載の方法により製造されたファージ、
（１５）アミノ酸１００残基以上からなる目的タンパク質が、ファージ外殻に２０〜１００コピー提示されていることを特徴とするファージ、
（１６）上記（１４）または（１５）に記載のファージが固相化されていることを特徴とするファージチップ、
（１７）上記（１４）または（１５）に記載のファージと被検物質を接触させ、該ファージが外殻に提示する目的ポリペプチドと被検物質との結合性を解析することを特徴とする目的ポリペプチドと相互作用する物質のスクリーニング方法、
（１８）少なくとも上記（３）に記載のベクターおよび上記（４）に記載のベクターを含むことを特徴とする多コピー提示ファージの製造用キット、
を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
（１）サプレッサーｔＲＮＡを用いたファージ外殻タンパク質と目的ポリペプチドの融合タンパク質のコピー数の制御
本発明は、ファージディスプレー法に用いるためのファージの頭部に外殻タンパク質との融合タンパク質として提示される目的タンパク質について、そのコピー数をサプレッサーｔＲＮＡの活性を利用して制御する方法を用いる点に一つの特徴を有するものである。この方法で用いられるファージの外殻タンパク質と目的ポリペプチドの融合タンパク質（以下、これを単に、「融合タンパク質と称することがある）の発現は、（ｉ）外殻タンパク質をコードするＤＮＡと目的ポリペプチドをコードするＤＮＡをインフレームで結合したＤＮＡを含むファージディスプレー用組み換えベクターを作製し、（ｉｉ）該ベクターをファージにパッケージングした後、（ｉｉｉ）該ファージを適当な宿主に感染させて増殖させることにより行うことができる。
【０００９】
ここで、ファージ頭部を形成する外殻タンパク質のうち融合タンパク質となる頻度をサプレッサーｔＲＮＡを用いて制御するには、上記（ｉ）の工程で、外殻タンパク質をコードするＤＮＡと目的ポリペプチドをコードするＤＮＡとの間に、ストップコドンを挿入したファージディスプレー用組み換えベクターを作製し（後記（２）で詳述）、該ストップコドンに適したサプレッサーｔＲＮＡをコードするＤＮＡを含む組み換えベクターを取得し（後記（３）で詳述）、上記（ｉｉｉ）の工程で感染させる宿主体内にサプレッサーｔＲＮＡを導入発現させておき（後記（４）で詳述）、さらに、用いるサプレッサーｔＲＮＡのサプレッサー活性を適当な方法により制御する（後記（５）で詳述）ことにより行うことができる。ここで取得されるファージを本明細書においては、「多コピー提示ファージ」と称することがある。
【００１０】
（２）ストップコドンを挿入したファージディスプレー用組み換えベクターの作製および該ベクターのファージヘのパッケージング
上記（１）に記載したサプレッサーｔＲＮＡによりファージ外殻に提示される目的ポリペプチドのコピー数を制御する方法における、ファージディスプレー用組み換えベクターについて以下に詳細に説明する。
【００１１】
該ベクターは、ファージ外殻タンパク質をコードするＤＮＡと目的ポリペプチドをコードするＤＮＡとの間に、上記（２）で取得したサプレッサーｔＲＮＡに適したストップコドンが挿入された構造を有する。
ファージ外殻タンパク質は、ファージディスプレー用組み換えベクターを導入するファージに固有のものを用いる。ここで、用いられるファージとしては、特に制限はないが、その頭部の外殻タンパク質が多いことや、増殖速度の速さ、あるいは過酷な条件下での増殖能等から、Ｔ７バクテリオファージが好ましく用いられる。該ファージの頭部には、外殻タンパク質であるｇｐ１０、４１５コピーから形成されているので、上記ベクターにおいてはｇｐ１０をコードするＤＮＡが好ましい。
【００１２】
ファージディスプレー用組み換えベクターに挿入されるストップコドンとしては、用いられる温度感受性サプレッサーｔＲＮＡが適当なアミノ酸に対応するコドンに読み換えるストップコドンであり、それぞれのサプレッサーｔＲＮＡに適したものが用いられる。具体的には、例えば、後述する温度感受性サプレッサーｔＲＮＡを用いる場合には、オーカーストップコドン（ＴＡＡ）が用いられる。
【００１３】
また、目的ポリペプチドとしては、特に制限はなく、タンパク質の全体であってもよいし、タンパク質のある所望の一部分であってもよい。本発明のファージ外殻に提示される目的ポリペプチドのコピー数制御法の一つの課題である、多コピー提示ファージの作製においては、アミノ酸が１００残基以上のポリペプチドを目的タンパク質としたときに特に効果的である。また、本発明の多コピー提示ファージを用いたアフィニティスクリーニングにおいては、目的ポリペプチドと結合する物質（以下、これを「リガンド」と称することがある）との結合度が低いもの（弱い結合力により結合するもの）を選択したときに特に効果的である。このような目的ポリペプチドとしては、例えば、ガレクチン−１等の糖鎖結合タンパク質、あるいは酵素等が挙げられる。
【００１４】
ファージディスプレー用組み換えベクターを作製する方法としては、上記の構造を有するものが作製される方法であれば特に制限はないが、外殻タンパク質をコードするＤＮＡを含む市販の組み換え用ベクターに、ストップコドンを挿入し、さらに目的ポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入する方法が簡便である。上記市販のベクターとして具体的には、Ｔ７ファージのｇｐ１０をコードするＤＮＡを含むものとして、Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に含まれるＴ７Ｓｅｌｅｃｔ　Ｖｅｃｔｏｒｓ等が挙げられる。
【００１５】
このような外殻タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターにストップコドン及び目的のポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入する方法としては、例えば、ストップコドンＤＮＡを、上記ベクター内に外殻タンパク質をコードするＤＮＡの３’側にインフレームで結合するように連結させ、さらに、該ストップコドンの３’側に目的ポリペプチドをコードするＤＮＡをインフレームで連結する方法等が挙げられる。ストップコドンの挿入方法としては、それ自体既知の通常用いられる方法が挙げられるが、例えば、ＰＣＲによる変異の挿入等の方法が好ましく用いられる。
【００１６】
かくして得られるファージディスプレー用組み換えベクターは、これをファージに通常の方法によりパッケージングすることにより目的ポリペプチドをコードするＤＮＡを有するファージ粒子を取得することができる。パッケージングは、市販のキットを用いると簡便に行うことができる。例えばＴ７ファージを用いる場合、Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いることができる。
【００１７】
（３）温度感受性サプレッサーｔＲＮＡの取得
本発明で用いられるサプレッサーｔＲＮＡは、ｍＲＮＡ上の特定のストップコドンをあるアミノ酸に対応するコドンとして読むナンセンスサプレッサーであって、そのサプレッサー活性が培養温度を調節することにより制御可能なものである。このようなサプレッサーｔＲＮＡをコードするＤＮＡ（以下、これを「サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子」と称することがある）としては、温度感受性でない公知のサプレッサーｔＲＮＡに点変異等が入ったものと考えられるので、温度感受性サプレッサー活性が観察される大腸菌株などから染色体ＤＮＡを抽出し、温度感受性でない公知のサプレッサーｔＲＮＡをコードするＤＮＡの５’端および３’端の塩基配列を有するプライマーによりポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）を行うこと等によって取得することができる。このような大腸菌株として、例えば、ＣＡＧ５９７（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社製）等が挙げられる。
【００１８】
該大腸菌から染色体ＤＮＡを抽出する方法としては、既知の通常用いられる既知の方法が挙げられる。上記温度感受性サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子は、固有のプロモーターおよびターミネーターを含むＤＮＡ断片として取得することが好ましいので、ＰＣＲプライマーとしては、温度感受性でない公知のサプレッサーｔＲＮＡに固有のプロモーターの５’上流の塩基配列、および同ターミネーターの３’下流の塩基配列が好ましく用いられる。大腸菌株ＣＡＧ５９７の場合、具体的なプライマーとして、配列番号３および４に記載の塩基配列を有するもの等が挙げられる。また、ＣＡＧ５９７の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号３および４に記載の塩基配列を有するプライマーを用いたＰＣＲによって得られるＤＮＡ断片としては、例えば配列番号１に記載のもの等が挙げられる。
【００１９】
このようなＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ断片中に温度感受性サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子が含まれ、かつ適当な宿主に導入された際、該導入体中でサプレッサー活性が生じることを、例えば以下のようにして確認することができる。
（ａ）取得されたＤＮＡ断片を適当なベクターに挿入し組み換えベクターを作製し（以下、これを「ＳｕｐＣｔｓベクター」と称することがある）、適当な宿主に導入した後、（ｂ）該導入体を温度を変えて培養して、（ｃ）該導入体中のサプレッサー活性を測定する。
【００２０】
上記工程（ａ）で用いられる適当なベクターとしては、サプレッサーｔＲＮＡを挿入して組み換えベクターを作製し、これを適当な宿主に導入した場合、導入体内で該サプレッサーｔＲＮＡが発現し、かつその発現レベルが宿主の生育に影響しないものであれば如何なるものであってもよい。具体的にはｐＡＣＹＣ１８４（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社）等が好ましい。
【００２１】
サプレッサー活性を測定するための宿主としては、上記工程（ｃ）で測定するサプレッサー活性のマーカーとなる遺伝子型を有する微生物であれば特に制限はないが、大腸菌が好ましい。サプレッサー活性のマーカーとなる遺伝子型としては、適当なマーカーをコードする遺伝子の塩基配列中にストップコドンとなる変異を有するもの等が挙げられる。この場合、変異により生じたストップコドンが、導入するサプレッサーｔＲＮＡに適したものを宿主として選択する。このような遺伝子型を有する宿主にＳｕｐＣｔｓベクターを導入した場合、該導入体において、マーカーが発現されていればサプレッサー活性があると判断することができ、逆にマーカーが発現されない場合には、サプレッサー活性が無いと判断することができる。また、マーカーの発現量をサプレッサー活性度として測定することもできる。
【００２２】
上記のマーカーとなる遺伝子型およびそれを有する大腸菌株として、具体的には、ａｒｇＥａｍ（ＥＱ１６６：Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｔｒｐＡ９８２５ｏｃ（Ｍ５００４：ＣＧＳＣ＃５５３１）、ｈｉｓＧ４ｏｃ（ＡＢ１１５７△ｒｅｃＡ：ＣＧＳＣ＃１１５７）、ａｒｇＥ３ｏｃ（ＡＢ１１５７△ｒｅｃＡ：ＣＧＳＣ＃１１５７）、ｔｒｐＥ９８５１ｏｃ（Ｍｏｒｓｅ　Ｎｏ．２０３４：Ｍｏｒｓｅ，　Ｄ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　６３，　６０５（１９７２））、およびｉｌｖＤ１８８ｏｃ（ＧＥ１３２：ＣＧＳＣ＃２５７６）等が挙げられる。上記のマーカーは特定のアミノ酸生合成系の酵素にストップコドンが生じた変異遺伝子であるので、対応するアミノ酸を含まない培地を用いてＳｕｐＣｔｓベクターを含む大腸菌を培養した場合、その増殖活性をサプレッサー活性として測定することができる。
【００２３】
上記工程（ｂ）の導入体の培養温度としては、宿主およびファージが生育可能な範囲の温度が挙げられる。具体的には、２０〜４５℃の範囲で、例えば３０℃と４２℃で導入体を培養し、それぞれのマーカーの発現量を比較することによりサプレッサー活性を解析することができる。導入体の培養温度の違いにより導入体内のサプレッサー活性が異なれば、取得したＳｕｐＣｔｓベクターには温度感受性サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子が含まれていると確認することができる。ここで、特定の宿主において、特定のサプレッサーｔＲＮＡのサプレッサー活性が変化する培養温度の範囲、あるいは活性の変化を測定しておけば、後述する多コピー提示ファージを製造する際の導入体の培養温度の指標とすることができる。
【００２４】
このようにして温度感受性であることが確認されたサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子としては、例えば配列番号２に記載の塩基配列からなるもの等が挙げられる。配列番号２に記載の塩基配列を温度感受性でない公知のサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子の塩基配列と比較解析することにより、塩基配列の点変異等を同定することができる。大腸菌株ＣＡＧ５９７からＰＣＲで増幅したＤＮＡは、図１（Ａ）に示すとおり、温度感受性でない公知のサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子（Ｔｙｒ−ｔＲＮＡ−１：ＤＤＢＪ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｋ０１１９７）と点変異を有するサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子が固有のプロモーターおよびターミネーターに挟まれて並列している構造を有しているものである。この２つのサプレッサーｔＲＮＡの塩基配列を比較すると、温度感受性サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子は、図１（ｃ）に示すような点変異を有することがわかる。
【００２５】
上記サプレッサーｔＲＮＡは配列番号２に記載の塩基配列からなるものに限定されず、例えば少なくとも２４〜４２℃の範囲で温度依存的に変化するサプレッサー活性を有するものであれば、１又は数個の塩基の置換、欠失、挿入などがあるものでもよい。また、プロモーターおよびターミネーターもサプレッサーｔＲＮＡに固有のものに限定されず、宿主内でサプレッサーｔＲＮＡが発現され得るものであれば如何なるものであってもよい。
【００２６】
（４）サプレッサーｔＲＮＡを含む微生物の作製
上記（１）に記載したサプレッサーｔＲＮＡによりファージ外殻に提示される目的ポリペプチドのコピー数を制御する方法における、温度感受性サプレッサーｔＲＮＡを導入発現している宿主について以下に詳細に説明する。
【００２７】
宿主微生物としては、上記（２）で取得されたサプレッサーｔＲＮＡを含み、かつ該サプレッサーｔＲＮＡが温度依存的に活性を有する温度範囲内のいずれの温度で培養しても２４時間以内にコロニーが形成される特徴を有するものであれば如何なるものでもよい。また、ファージディスプレイに用いる場合には、ファージがその菌体内で増殖し得るものを選択する。微生物種としては、大腸菌が挙げられる。具体例として、Ｔ７ファージを感染させる場合、大腸菌株ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ＥＱ１６６（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等が挙げられるが、このうちＢＬ２１が最も好ましい。
【００２８】
このような微生物に上記（２）で取得された温度感受性サプレッサーｔＲＮＡを導入する方法としては、該サプレッサーｔＲＮＡをコードするＤＮＡをプラスミドベクターにクローン化して、これを微生物に導入する方法が好ましく用いられるが、これに限られるものではない。
かくして得られる温度感受性サプレッサーｔＲＮＡをコードするＤＮＡが導入された宿主微生物内で、該サプレッサーｔＲＮＡが発現し、かつサプレッサー活性が温度依存的に変化するか否かは、上記（２）に記載の方法により確認することができる。また、後述するファージ外殻に提示される目的タンパク質のコピー数が温度依存的に変化するか否かを指標として確認することもできる。
【００２９】
（５）ファージの宿主微生物への感染、融合タンパク質のコピー数の制御および多コピー提示ファージの取得
上記（４）で得られる温度感受性サプレッサーｔＲＮＡを有する宿主微生物に、上記（３）で得られるファージディスプレー用組み換えベクターを保有するファージを感染させ、該微生物（以下、これを「ファージ感染微生物」と称することがある）を適当な異なる温度で培養し、出現したプラークからファージ粒子を取得することにより、外殻に提示される目的ポリペプチドのコピー数が異なるファージを取得することができる。
【００３０】
ここで、所望のコピー数を提示するファージが得られた培養温度を同定することにより、特定の目的ポリペプチドが特定コピー数外殻に提示されたファージの製造条件を求めることができる。また、外殻が形成され、かつ外殻に提示される目的ポリペプチドのコピー数が最も高いファージが増殖したファージ感染微生物の培養温度を同定することにより、特定の目的ポリペプチドを最も多くその外殻に提示したファージの製造条件を求めることができる。
【００３１】
温度感受性サプレッサーｔＲＮＡを有する宿主微生物への、ファージディスプレー用組み換えベクターを保有するファージの感染方法としては、通常用いられる公知の方法が挙げられる。特に市販のキットを用いる場合は、そのキットのマニュアルに記載の方法に準じて行うことが好ましい。ファージ感染微生物の培養温度は、ファージ感染微生物が生育でき、ファージが該微生物体内で増殖可能で、かつ微生物が有しているサプレッサーｔＲＮＡのサプレッサー活性が温度依存的に変化する範囲内の温度であればよく、特に限定されない。具体的には、例えば、Ｔ７ファージの外殻タンパク質とマウス・ガレクチン−１タンパク質の融合タンパク質をコードするＤＮＡを有するファージを、ＳｕｐＣｔｓを有する大腸菌株ＢＬ２１に感染させた場合、２０〜４５℃の範囲で、２〜３℃ごとに異なる温度で培養することが好ましい。
【００３２】
外殻に提示される目的ポリペプチドのコピー数は、取得されたファージ粒子からタンパク質をそれ自体既知の方法で精製し、外殻タンパク質に反応する抗体、あるいは目的ポリペプチドに反応する抗体によるウェスタンブロッティングを行うことにより解析することができる。ウェスタンブロッテングの各バンドのシグナル量を測定し、コントロールとして同様にブロットした標準タンパク質または標準ファージ外殻タンパク質により作成した標準曲線からｇｐ１０または融合タンパク質の量を測定することができる。
【００３３】
具体的には、例えば、Ｔ７ファージの外殻タンパク質とマウス・ガレクチン−１タンパク質の融合タンパク質をコードするＤＮＡを有するファージを、ＳｕｐＣｔｓを有する大腸菌株ＢＬ２１に感染させて、３０〜４２℃の異なる温度で培養し、増殖したファージ粒子からタンパク質を精製し、上記ウェスタンブロッティングを行ったところ、３３℃で培養したファージ感染微生物中で増殖したファージにおいては、その外殻に約８０コピーのガレクチン−１タンパク質が提示されていることがわかる。また、上記の３３℃で培養されたファージ感染微生物中で増殖したファージは、異なるいくつかの温度で培養されたものの中で、最も高い融合タンパク質の発現量を示したので、Ｔ７ファージの外殻タンパク質とマウス・ガレクチン−１タンパク質の融合タンパク質をコードするＤＮＡを有するファージを、ＳｕｐＣｔｓを有する大腸菌株ＢＬ２１に感染させた場合、最も高いコピー数を提示させるためには、ファージ感染微生物を３３℃で培養する方法が用いられることがわかる。
【００３４】
このようにして調製される多コピー提示ファージは、アミノ酸残基１００以上からなる目的ポリペプチドをファージ外殻に２０〜１００コピー提示しているものを含む。また、該ファージにおける外殻に提示される目的ポリペプチドのコピー数は５０〜８０程度が好ましい。
【００３５】
（６）多コピー提示ファージの利用
上記（５）で得られる多コピー提示ファージは、これを目的ポリペプチドと結合する物質（リガンド）のスクリーニング、即ち目的ポリペプチドと相互作用する物質のスクリーニングに用いることができる。具体的には、多コピー提示ファージに目的ポリペプチドとリガンドが結合する条件下で被検物質を接触させ、これをよく洗浄した後に、結合している物質を解析する（目的ポリペプチドと被検物質との結合性を解析する）ことにより行うことができる。このような解析を行う場合、多コピー提示ファージは適当な基板に結合（固相化）したものを用いることができる。また、被検物質を適当な基板に固定して行うこともできる。
【００３６】
ここで、被検物質としては、ポリペプチド、タンパク質、多糖（糖鎖）、脂質、低分子化合物等の天然物か合成物の何れの物質であってもよい。また、本発明のファージや被検物質を固相化する基板としては、例えば、ナイロン膜やポリプロピレン膜等の樹脂性の膜、ニトロセルロース膜、ガラス、シリコン樹脂等のそれ自体既知の素材を目的に応じて使い分ければよい。また、固相化の方法は、特に限定されず、それ自体既知の方法を用いればよい。上記基板上に本発明の多コピー提示ファージを固定化（固相化）することによりファージチップが調製できる。
【００３７】
（７）多コピー提示ファージ製造用キット
本発明によれば、多コピー提示ファージ製造用キットも提供される。該キットには、少なくとも上記（３）に記載した温度感受性サプレッサーｔＲＮＡを含む組み換えベクター、および上記（２）に記載したファージディスプレー用組み換えベクターが含まれる。また、ファージディスプレー用組み換えベクターを導入するためのファージ粒子、該ファージを感染させる大腸菌等の宿主をキットに含有することもできる。本発明のキットには、上記以外に、界面活性剤、適当な緩衝液等が含まれる。しかし、これら限られるものではなく、多コピー提示ファージを作製するためのキットであれば如何なる試薬の組み合わせのものであってもよい。さらに、該キットは、多コピー提示ファージを用いたアフィニティスクリーニング等のスクリーニングを行うためのキットとして用いることもできる。
【００３８】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
実施例１　ストップコドンと目的ポリペプチド遺伝子を挿入したファージディスプレー用組み換えベクターの構築および該ベクターのファージヘのパッケージング
（１）ストップコドンを挿入したファージディスプレー用組み換えベクターの構築
Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ　４１５−１ｂベクター　（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）の　マルチクローニングサイトをＥｃｏＲＶサイトを含むＴ７Ｓｅｌｅｃｔ　１−２ａ　ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のマルチクローニングサイトにいれかえる過程でＴ７ファージの外殻タンパク質ｇｐ１０をコードするＤＮＡの３’下流でマルチクローニングサイトの５’上流にストップコドンを挿入する塩基置換を起こした変異体を得た。実際に行った操作は、下記のとおりである。
【００３９】
Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ　１−２ａ　ＤＮＡをテンプレートとし、配列番号３に記載のプライマー、および配列番号４に記載のプライマーを用いて、Ｖｅｎｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂａ社製）を用いてＰＣＲを行った。このＰＣＲによりＴ７Ｓｅｌｅｃｔ　１−２ａのマルチクローニングサイトを含むＤＮＡ断片を増幅し、これを精製した。該ＤＮＡ断片を制限酵素ＰｓｔＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社製）とＸｈｏＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社製）により切断し、精製後、Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ　４１５−１ｂ　ＤＮＡのマルチクローニングサイトの．ＰｓｔＩとＸｈｏＩサイトの間に挿入した。
【００４０】
取得したベクターをＴ７Ｓｅｌｅｃｔ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｋｉｔ　（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して、該キットに添付のマニュアルに記載された方法により大腸菌ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に感染させて培養した。出現した複数のプラークにつき、配列番号５および６に記載のプライマーを用いたＰｌａｑｕｅ　ＰＣＲ法により、外殻タンパク質ｇｐ１０をコードするＤＮＡの３’下流付近を含むＤＮＡを増幅した。増幅したＤＮＡ断片をＴＡクローニングベクター（プロメガ社製）に挿入し、挿入ＤＮＡ配列を決定した。目的とするクローニングサイトの置換以外に、Ｔ７　ｇｅｎｅ１０　の３’下流にｇｐ１０の３４３番目のセリン残基に相当する位置にＴＣＡ→ＴＡＡとなる塩基置換がおきたクローンが得られた。　これをＴ７オーカー（ｏｃｈｒｅ）　ベクターとした。
【００４１】
（２）目的ポリペプチドをコードするＤＮＡの取得
目的ポリペプチドはマウスのガレクチン１タンパク質（Ｍｏｕｓｅ　ｇａｌｅｃｔｉｎ−１）とした。マウス肝臓からｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを精製し、これを鋳型として、配列番号７および８に記載の塩基配列を有するプライマーでＳｕｐｅｒ　Ｓｃｒｉｐｔ　ＯＮＥ−ＳＴＥＰ　ＲＴ−ＰＣＲ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて逆転写ＰＣＲを行った。このＰＣＲにより得られた０．４ｋｂのＤＮＡ断片（マウス　ガレクチン１　ＤＮＡ）をｐＢＳＫＩＩ（−）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）のＥｃｏＲＶサイトに挿入した。
【００４２】
（３）ガレクチン−１遺伝子ＤＮＡを組み込んだＴ７オーカーベクターおよび該ベクターを有するファージ粒子の取得
上記（２）で得られたプラスミドを鋳型として、配列番号９および１０に記載のプライマーでＶｅｎｔ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社製）を用いて挿入ＤＮＡ部分を増幅した。得られたＤＮＡ断片を精製し、上記（１）で得られたＴ７オーカーベクターのＥｃｏＲＶサイトに挿入した。これにより、マウスのガレクチン−１タンパク質が、Ｔ７外殻タンパク質ｇｐ１０のＣ末端に結合する融合タンパク質をコードする塩基配列を含むＴ７ベクターが構築された。
Ｔ７ファージ（Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｋｉｔ　：Ｎｏｖａｇｅｎ社製）への上記Ｔ７ベクターのパッケージングは、Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｋｉｔに添付のマニュアルに従って行った。
【００４３】
実施例２　大腸菌温度感受性サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子の取得
（１）サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子の単離
温度感受性サプレッサー変異（ＳｕｐＣｔｓ）をもつ大腸菌Ｋ１２株（ＣＡＧ５９７：Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社製）より、染色体ＤＮＡを調製し、これをテンプレートＤＮＡとして、５ｔｙｒＴ２プライマー（配列番号１１）、および３ＴｙｒＴ３プライマー（配列番号１２）を用いて、ＰＣＲを行った。このＰＣＲにより１．３　ｋｂ　のＤＮＡ断片を得た。
【００４４】
（２）ＳｕｐＣｔｓプラスミドの構築
上記（１）で取得したサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素ＳｃａＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社製）とＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社製）で切断後、得られた１ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、低コピー数プラスミド　ｐＡＣＹＣ１８４（Ｔｃ、Ｃｍ耐性：Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社製）のＣｍ耐性遺伝子内のＳｃａＩとＥｃｏＲＩの間に挿入した。この組み換えプラスミド（ＳＥ４）を大腸菌　（ｓｕｓ，　ａｒｇＥａｍ変異株：ＥＱ１６６（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に導入し、Ｔｃ耐性により選択してコロニーを取得した。この組み換え大腸菌を、ａｒｇ（−）、ｐｒｏ（＋）のＭ９培地により３０℃で培養し、コロニーが出現すること（ａｒｇ＋）で、サプレッサー活性を有するクローンを取得した。
【００４５】
選択された大腸菌クローンに含まれる組み換えプラスミドを精製し、挿入ＤＮＡの塩基配列を決定した。上記した１ｋｂのＤＮＡ断片は、図１Ａに示すとおり野生型Ｔｙｒ−ｔＲＮＡ−１（図中、ｔｙｒＴで示す）と変異型Ｔｙｒ−ｔＲＮＡ−１（図中、ＳｕｐＣｔｓで示す）、固有のプロモータ（図中、Ｐで示す）およびターミネーター（図中、ｔｅｒで示す）を含むＤＮＡ断片であることを確認した。変異型Ｔｙｒ−ｔＲＮＡ−１（ＳｕｐＣｔｓ）遺伝子の塩基配列を配列番号２に示す。また、野生型Ｔｙｒ−ｔＲＮＡ−１遺伝子と変異型Ｔｙｒ−ｔＲＮＡ−１（ＳｕｐＣｔｓ）遺伝子の塩基配列の比較は図１Ｃに示すとおりであり、ＳｕｐＣｔｓは、２塩基の変異を有することがわかった。
【００４６】
（３）ＳｕｐＣｔｓの温度感受性の解析
上記（１）で取得したＳｕｐＣｔｓの温度感受性を解析するために、上記（１）で作製したプラスミドＳＥ４を、次の大腸菌株（括弧内は、サプレッサー活性のマーカーとなる遺伝子型）：ＥＱ１６６（ａｒｇＥａｍ）、Ｍ５００４（ｔｒｐＡ９８２５ｏｃ）、ＡＢ１１５７△ｒｅｃＡ（ｈｉｓＧ４ｏｃ、ａｒｇＥ３ｏｃ）、Ｍｏｒｓｅ　Ｎｏ．２０３４（ｔｒｐＥ９８５１ｏｃ）、およびＧＥ１３２（ｉｌｖＤ１８８ｏｃ）に導入した。これら導入体について、マーカーアミノ酸を含まない培地で３０℃および４２℃で培養し、大腸菌の増殖活性を解析した。この結果を表１に示す。表から明らかなように、上記（１）で取得したＳＥ４を導入することにより、ＥＱ１６６、Ｍ５００４、ＡＢ１１５７△ｒｅｃＡにおいては、温度感受性のサプレッサー活性を確認した。
【００４７】
【表１】
2004089069.tif 000002
【００４８】
実施例３　ＳｕｐＣｔｓを発現する大腸菌へのファージの感染、培養、ガレクチン−１を提示するファージ粒子の取得および解析
（１）ファージ感染大腸菌の培養
実施例２で取得したプラスミドＳＥ４で大腸菌株ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に導入した。またコントロールとして、ベクターｐＡＣＹＣ１８４のみも同様に導入した。これらの導入体に実施例２で作製したＴ７ベクターを有するファージを感染させ、それぞれ３０℃、３３℃、３７℃、および４２℃で培養した。ファージの感染および大腸菌の培養方法は、Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｋｉｔに添付のマニュアルに従って行った。
【００４９】
（２）ファージ粒子の精製およびタンパク質の解析
上記（１）のＹＴプレートによる培養によりプラークを観察したので、ファージ粒子をプレート上清（コンフルエントライセート）として取得し、ポリエチレングリコール６０００（ナカライテスク社製）で沈殿させて回収した。この沈殿をＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０）に溶解し、該溶液２ｍｌに対し１．４６ｇセシウムを添加した。これを超遠心機（ＴＬＳ−５５：Ｂｅｃｋｍａｎ社製）でＴＬ１００ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）を用いて２０℃、４２ｋｒｐｍで終夜遠心を行った。精製したファージ粒子よりタンパク質を抽出し、これをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ＰｒｏＢｌｏｔｔメンブレン（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にＯｗｌ’ｓ　ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔ　ｂｕｆｆｅｒ　ｋｉｔ（Ｏｗｌ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて転写した。これを、ガレクチン−１及びＴ７　ｇｐ１０をウサギに免疫して作製したポリクローナル抗体を用いてブロッティングを行った。この結果を図２Ａに示す。図中レーン１〜４はコントロール（ベクターｐＡＣＹＣ１８４のみを導入したＢＬ２１に感染させて増殖させたファージ中のタンパク質）を示し、５〜８は、ＳｕｐＣｔｓを導入したＢＬ２１にストップコドンとガレクチン−１遺伝子を含むＴ７ファージを感染させて増殖させたファージのタンパク質の結果を示す。また、レーン１，５は３０℃で培養したもの、レーン２，６は３３℃で、レーン３、７は３７℃で、またレーン４、８は４２℃で培養した大腸菌から取得されたファージの結果を示す。図から明らかなように、ＳｕｐＣｔｓを有さない大腸菌内で増殖したファージでは、ガレクチン−１の発現は見られない。また、ＳｕｐＣｔｓを有する大腸菌体内で増殖したファージでは、その培養温度によってファージ外殻タンパク質とガレクチン−１の融合タンパク質（図中、ｇｐＤ＋ｇａｌｅｃｔｏｎ１で示す）の発現量が変化している。これらの結果から、ファージ外殻に提示されたガレクチン１のコピー数を解析した結果を図２Ｂに示す。図から明らかなように、培養温度によってファージ外殻に提示されるガレクチン１のコピー数は異なり、３０〜８０コピーの間で制御が可能であることがわかった。また、３３℃で培養した場合に、ファージ外殻に提示されるガレクチン１のコピー数が最も高く、約８０コピーであった。
【００５０】
実施例４　アフィニティバインディング解析
（１）ファージ粒子の精製
上記実施例３（１）のファージ感染大腸菌のＹＴプレートによる培養でプラークを観察したので、ファージ粒子をプレート上清として取得し、ポリエチレングリコール６０００（ナカライテスク社製）で沈殿させて回収した。この沈殿をＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０）に溶解し、該溶液２ｍｌに対し１．４６ｇセシウムを添加した。これを超遠心機（ＴＬＳ−５５：Ｂｅｃｋｍａｎ社製）でＴＬ１００ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）を用いて２０℃、４２ｋｒｐｍで終夜遠心を行った。
【００５１】
（２）アフィニティバインディング解析
精製されたファージ粒子は、Ｎ−アセチルラクトサミン　アガロース（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製）／ＰＢＳ／１％ＢＳＡに懸濁し、４℃で終夜静置した。該溶液１ｍｌをＴ型ストップコックを有するシリンジ内へ移し、同量のＰＢＳＴでカラムを洗浄した後に２０ｍＭラクトース／ＰＢＳで溶出した。得られた画分に含まれるファージ粒子の数をタイトレーションにより解析した。また、画分を１０−４倍希釈した後に、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ　ＰＣＲ　ｂｅａｄ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いた半定量的ＰＣＲ（プライマー：配列番号１３、１４）によっても、ファージ粒子の数を解析した。この結果を図３に示す。図中、点線と×で示すグラフは、ＰＣＲの増幅された断片量を示し、実線と●はタイトレーションの値を示す。図から明らかなように、ラクトース溶出によって溶出されるファージ粒子ピークがあり、Ｎ−アセチルラクトサミンに結合するガレクチン−１がファージの外殻に提示されており、本実施例で作製されたガレクチン−１提示ファージは、アフィニティバインディング解析に用いられ得るものであることが確認された。
【００５２】
【発明の効果】
本発明によれば、弱い結合力で結合するために従来のファージディスプレイ法では解析できなかった糖結合タンパク質と糖とのアフィニティスクリーニングを可能とするファージディスプレイ用ファージが提供された。また、ファージ外殻に提示される目的ポリペプチドのコピー数の微妙な制御が可能となったことから、目的ペプチドとリガンドにあわせた様々なに応じてフレキシブルに対応できるファージディスプレイの系が提供された。
【００５３】
【配列表】
2004089069.tif 000003
2004089069.tif 000004
2004089069.tif 000005
2004089069.tif 000006
2004089069.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳｕｐＣｔｓ遺伝子の構造を示す図である。
【図２】多コピー提示ファージの外殻に提示される目的ポリペプチドの量を示すウェスタンブロッティングの結果を示す写真（Ａ）および図（Ｂ）である。
【図３】ガレクチン−１提示ファージのアフィニティバインディング解析の結果を示す図である。
【図１】
2004089069.tif 000008
【図２】
2004089069.tif 000009
【図３】
2004089069.tif 000010