(57)【要約】【課題】本発明は、煩雑な遠心操作を行わずに細胞培養、培地交換、蛋白質の抽出操作がオンチップ、オンラインで出来、更にこれに組み合わせて、蛋白質の濃縮、分離をもオンチップ、オンラインで行なうことにより、オンチップ、オンライン、ハイスループットの蛋白質発現解析システムズを確立することを目的とする。【解決手段】本発明は、１乃至複数個からなる、複数列のウェルを設けたマイクロチップと、培養細胞と培地とを分離し得る篩の機能を有し、且つそれぞれが該ウェルに装填し得る大きさであって、しかも着脱容易な１乃至複数個のメンブランインサートとを組み合わせてなる、細胞培養及び蛋白質抽出並びに蛋白質濃縮をオンラインで行うためのデバイスと、これを用いたオンチップ、オンラインによる細胞培養、蛋白質抽出並びに蛋白質濃縮方法に関する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１乃至複数個からなる、複数列のウェルを設けたマイクロチップと、培養細胞（又は培養組織）と培地とを分離し得る篩の機能を有し、且つそれぞれが該ウェルに装填し得る大きさであって、しかも着脱容易な１乃至複数個のメンブランインサートとを組み合わせてなる、組織培養及び蛋白質抽出並びに蛋白質濃縮をオンラインで行うためのデバイス。
【請求項２】
複数個からなる、複数列のウェルを設けたマイクロチップと、複数個のメンブランインサートとから成る、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
複数個のメンブランインサートが、これらを複数個のウェルに同時に装填し、且つ同時に取りだすことが出来るように各々が連結している、請求項２に記載のデバイス。
【請求項４】
マイクロチップが、組織培養及び培地交換用の少なくとも２列からなるウェルと、細胞からの蛋白質抽出操作を行うためのウェルと、蛋白質濃縮操作を行うための少なくとも２列からなるウェルとを備えたマイクロチップである、請求項１〜３の何れかに記載のデバイス。
【請求項５】
マイクロチップが、組織培養後、培養細胞（又は培養組織）を洗浄するためのウェルを更に有するマイクロチップである、請求項４に記載のデバイス。
【請求項６】
蛋白質濃縮操作を行うためのウェルの一つが濃縮試薬を充填するウェルで、別の一つが濃縮された蛋白質が収納されるウェルである請求項４又は５に記載のデバイス。
【請求項７】
蛋白質濃縮操作を行うための蛋白質濃縮試薬をウェルに組込んだ請求項６に記載のデバイス。
【請求項８】
蛋白質抽出操作後の抽出液を、蛋白質濃縮操作を行うための蛋白質濃縮試薬を充填したウェルを通って、濃縮された蛋白質が収納されるウェルに移行させるために、ウェルとウェルの間が流路（マイクロチャンネル）で接続されている請求項６又は７に記載のデバイス。
【請求項９】
更に、濃縮された蛋白質を別に作製されたマイクロチップ電気泳動用のマイクロチップ上で電気泳動に付すために、濃縮された蛋白質が収納されるウェルからマイクロチップの外に向かって流路（マイクロチャンネル）が設けられている。請求項８に記載のデバイス。
【請求項１０】
更に、濃縮された蛋白質を同じマイクロチップ上で、マイクロチップ電気泳動に付すために、マイクロチップ電気泳動用のマイクロチャンネルを当該マイクロチップに組込んだ請求項８に記載のデバイス。
【請求項１１】
更に、１乃至複数個のメンブランインサート又は／及び１乃至複数個のウェルに装填してこれらを加圧し得る加圧器を備えた請求項９又は１０に記載のデバイス。
【請求項１２】
メンブランインサートが、少なくともその底部がメンブランフィルターから成るものである請求項１〜１１の何れかに記載のデバイス。
【請求項１３】
メンブランフィルターが、孔径１０μｍ以下のものである請求項１２に記載のデバイス。
【請求項１４】
マイクロチップが、縦１０〜１２０ｍｍ、横１０〜１２０ｍｍ、厚さ６００〜５０００μｍのものである、請求項１〜１３の何れかに記載のデバイス。
【請求項１５】
マイクロチップに設けたウェルが、直径１．５〜１０ｍｍ、深さ５００μｍ〜１２ｍｍのものである請求項１〜１４の何れかに記載のデバイス。
【請求項１６】
請求項１〜１５の何れかに記載のデバイスを用いることを特徴とする、オンチップ、オンラインによる組織培養、蛋白質抽出並びに蛋白質濃縮方法。
【請求項１７】
以下の一連の操作を含んでなることを特徴とする、オンチップ、オンラインによる組織培養、蛋白質抽出並びに蛋白質濃縮方法。
（１）１乃至複数個からなる、複数列のウェルを設けたマイクロチップ上の１列目のウェルに、培養細胞（又は培養組織）と培地とを分離し得る篩の機能を有し、且つそれぞれが該ウェルに装填し得る大きさであって、しかも着脱容易な１乃至複数個のメンブランインサートを装填し、その中に培地及び細胞（又は組織）を入れて培養を行う。
（２）次いで、メンブランインサートを取りだしてこれを２列目のウェルに移し、新しい培地中で更に培養を行う（要すれば、メンブランインサートを更に３列目のウェルに移し、再度培地交換を行い培養を行う。）。
（３）培養後、メンブランインサートを取りだしてこれを細胞（又は組織）からの蛋白質抽出操作を行うためのウェル（３列目のウェル。但し、培地交換を２回行った場合は、４列目のウェル）に移し、蛋白質抽出試薬を加えて細胞（又は組織）を溶解して蛋白質を抽出した後、抽出液を残してメンブランインサートを外す。
（４）（３）で得られた蛋白質抽出液を、蛋白質濃縮試薬を充填したウェル（４列目のウェル。但し、培地交換を２回行った場合は、５列目のウェル）に移して蛋白質の濃縮を行ない、濃縮された蛋白質を、濃縮された蛋白質が収納されるウェル（５列目のウェル。但し、培地交換を２回行った場合は、６列目のウェル）に移行させる。
【請求項１８】
組織培養後又は／及び培地交換後にメンブランインサートをウェルから取り出す際に、要すればメンブランインサートに加圧器を装填し、加圧により培地を濾過した後、これをウェルから取り出す、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
蛋白抽出液が入ったウェル（３列目のウェル。但し、培地交換を２回行った場合は、４列目のウェル）と蛋白質濃縮試薬を充填したウェル（４列目のウェル。但し、培地交換を２回行った場合は、５列目のウェル）及び濃縮された蛋白質が収納されるウェル（５列目のウェル。但し、培地交換を２回行った場合は、６列目のウェル）の間が流路（マイクロチャンネル）で接続されているマイクロチップを使用し、加圧により、蛋白質抽出液を蛋白質濃縮試薬を充填したウェルを通って、濃縮された蛋白質が収納されるウェルに移行させる、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
組織培養後、メンブランインサートを培養細胞（又は培養組織）を洗浄するためのウェル（３列目のウェル。但し、培地交換を２回行った場合は、４列目のウェル）に移して、培養細胞（又は培養組織）を洗浄した後、メンブランインサートを該ウェルから取りだしてこれを蛋白質抽出操作を行うためのウェル（４列目のウェル。但し、培地交換を２回行った場合は、５列目のウェル）に移し、蛋白質抽出試薬を加えて細胞を溶解して蛋白質を抽出し、５列目及び６列目のウェル（但し、培地交換を２回行った場合は、６列目及び７列目のウェル）を使用して濃縮操作を行う［但し、この場合は、４列目のウェルと５列目のウェルの間及び５列目のウェルと６列目のウェルの間（培地交換を２回行った場合は、５列目のウェルと６列目のウェルの間及び６列目のウェルと７列目のウェルの間）が流路（マイクロチャンネル）で接続されているマイクロチップを使用する。］請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
培養細胞（又は培養組織）洗浄後に、メンブランインサートをウェルから取り出す際に、要すればメンブランインサートに加圧器を装填し、加圧により洗浄液を濾過した後、これをウェルから取り出す、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
複数個からなる、複数列のウェルを設けたマイクロチップと、複数個のメンブランインサートを用いる請求項１７〜２１の何れかに記載の方法。
【請求項２３】
複数個のメンブランインサートが、これらを複数個のウェルに同時に装填し、且つ同時に取りだすことが出来るように各々が連結しているメンブランインサートである請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
メンブランインサートが、少なくともその底部がメンブランフィルターから成るものである請求項１７〜２３の何れかに記載の方法。
【請求項２５】
使用するマイクロチップが、縦１０〜１２０ｍｍ、横１０〜１２０ｍｍ、厚さ６００〜５０００μｍのものである、請求項１７〜２４の何れかに記載の方法。
【請求項２６】
使用するマイクロチップに設けたウェルが、直径１．５〜１０ｍｍ、深さ５００μｍ〜１２ｍｍのものである請求項１７〜２５の何れかに記載の方法。
【請求項２７】
（１）１乃至複数個からなる、複数列のウェルを設けたマイクロチップと、（２）培養細胞（又は培養組織）と培地とを分離し得る篩の機能を有し、且つそれぞれが該ウェルに装填し得る大きさであって、しかも着脱容易な１乃至複数個のメンブランインサートと、（３）培地と、（４）蛋白質抽出試薬と、（５）蛋白質濃縮試薬とを含んでなるキット。
【請求項２８】
更に、培養細胞（又は培養組織）の洗浄液を含んでなる、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
更に、１乃至複数個のメンブランインサート又は／及び１乃至複数個のウェルに装填してこれらを加圧し得る加圧器を含んでなる、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
加圧器がシリンジ、ピペット、ポンプ又はマルチチャンネルピペットである請求項２９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、組織培養、蛋白質抽出並びに蛋白質濃縮という一連の操作をマイクロチップ上でオンラインで行う方法に関する。
なお、本発明における組織培養とは広義の組織培養のことで、組織片培養と細胞培養の両者を包含する。
【０００２】
【従来の技術】
従来の組織培養、培地交換、蛋白質の抽出操作は、必ず遠心操作を必要とする。例えば、培養用のディシュ等に入っている細胞と古い培地を一緒に遠心管に移しかえ、遠心機で遠心後、細胞を遠沈させ、上清の古い培地をデカンテーションにより除く。次いで、遠心管の底に沈んでいる細胞に新しい培地を加え、サスペンドして新しいディシュ等へ移す。同様に、培養後のタンパクの抽出にも遠心操作が必要である。従って、操作が煩雑で、手間がかかると同時に、複数の検体を同時に処理することは現実には不可能といっても良かった。
一方、微量の蛋白質を迅速に解析するための手段として、マイクロチップ型電気泳動が近時注目されているが（例えば、非特許文献１、非特許文献２及び特許文献１参照）、組織培養における上記した如き現状下では、必然的に、蛋白質の発現、抽出、濃縮等の操作をオンチップ、オンラインで行うシステムの開発等は到底思いも寄らなかった。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｙａｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．  １９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．９６，５３７２−５３７？
【非特許文献２】
Ｂｏｕｓｓｅ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．  ２００１，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３，１２０７−１２１２
【特許文献１】
特願２００２−３１５０２７号明細書
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、煩雑な遠心操作を行わずに組織培養、培地交換、蛋白質の抽出操作がオンチップ、オンラインで出来、更にこれに組み合わせて、蛋白質の濃縮、分離をもオンチップ、オンラインで行なうことにより、オンチップ、オンライン、ハイスループットの蛋白質発現解析システムズを確立することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、１乃至複数個からなる、複数列のウェルを設けたマイクロチップと、培養細胞（又は培養組織）と培地とを分離し得る篩の機能を有し、且つそれぞれが該ウェルに装填し得る大きさであって、しかも着脱容易な１乃至複数個のメンブランインサートとを組み合わせてなる、組織培養及び蛋白質抽出並びに蛋白質濃縮をオンラインで行うためのデバイスに関する。
【０００６】
また、本発明は、上記デバイスを用いることを特徴とする、オンチップ、オンラインによる組織培養、蛋白質抽出並びに蛋白質濃縮方法に関する。
【０００７】
更に、本発明は、以下の一連の操作を含んでなることを特徴とする、オンチップ、オンラインによる組織培養、蛋白質抽出並びに蛋白質濃縮方法に関する。
（１）１乃至複数個からなる、複数列のウェルを設けたマイクロチップ上の１列目のウェルに、培養細胞（又は培養組織）と培地とを分離し得る篩の機能を有し、且つそれぞれが該ウェルに装填し得る大きさであって、しかも着脱容易な１乃至複数個のメンブランインサートを装填し、その中に培地及び細胞（又は組織）を入れて培養を行う。
（２）次いで、メンブランインサートを取りだしてこれを２列目のウェルに移し、新しい培地中で更に培養を行う（要すれば、メンブランインサートを更に３列目のウェルに移し、再度培地交換を行い培養を行う。）。
（３）培養後、メンブランインサートを取りだしてこれを細胞（又は組織）からの蛋白質抽出操作を行うためのウェル（３列目のウェル。但し、培地交換を２回行った場合は、４列目のウェル）に移し、蛋白質抽出試薬を加えて細胞（又は組織）を溶解して蛋白質を抽出した後、抽出液を残してメンブランインサートを外す。
（４）（３）で得られた蛋白質抽出液を蛋白質濃縮試薬を充填したウェル（４列目のウェル。但し、培地交換を２回行った場合は、５列目のウェル）に移して蛋白質の濃縮を行ない、濃縮された蛋白質を、濃縮された蛋白質が収納されるウェル（５列目のウェル。但し、培地交換を２回行った場合は、６列目のウェル）に移行させる。
【０００８】
更にまた、本発明は、（１）１乃至複数個からなる、複数列のウェルを設けたマイクロチップと、（２）培養細胞（又は培養組織）と培地とを分離し得る篩の機能を有し、且つそれぞれが該ウェルに装填し得る大きさであって、しかも着脱容易な１乃至複数個のメンブランインサートと、（３）培地と、（４）蛋白質抽出試薬と、（５）蛋白質濃縮試薬とを含んでなるキットに関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明に係るマイクロチップの一例を、複数個からなる、複数列のウェルを設けたマイクロチップの場合について図示すると図１のようになる。
図１中の１，２，３，４，５，６，・・・は、１は１列目、２は２列目、３は３列目・・・というようにそれぞれ列を表す。また、１ａ、１ｂ、１ｃ、・・・、１ｊ、２ａ、２ｂ、２ｃ、・・・、２ｊ、３ａ、３ｂ、３ｃ、・・・・・、６ｊはそれぞれウェルを表す。１０はマイクロチップの基板を表す。
本発明に係るメンブランインサートは複数個の場合、これらを複数個のウェルに同時に装填し、且つ同時に取りだすことが出来るように各々が連結していることが望ましいが、そのような場合について図示すると図２のようになる。ここで、１２は連結手を表す。
また、本発明に係る連結している複数個のメンブランインサートを、本発明に係る複数個、複数列のウェルを設けたマイクロチップの第一列目のウェルに装填した場合について図示すると図３のようになる。
【００１０】
以下、本発明の実施の形態の一例を、複数個からなる、複数列のウェルを設けたマイクロチップと複数個のメンブランインサートを用いた場合について、図面に基づいて説明する。
【００１１】
先ず、図２に示される如く、複数個のウェルに同時に装填し、且つ同時に取りだすことが出来るように各々が連結手１２で連結している、底部のみがメンブランフィルターからなるメンブランインサート１１を図１に示される如きマイクロチップの基板１０上の１列目のウェルに装填し、その中に各々培地及び細胞（又は組織片）を入れて培養する。ここで用いられるメンブランインサートは、培養細胞（又は培養組織）と培地とを分離し得る篩の機能を有するものであることが必須であるが、その要件を備えたものとして、通常は、少なくともその底部がメンブランフィルターからなるものが用いられる（勿論メンブランインサート全体がメンブランフィルターからなるものであっても良い。）。メンブランフィルターの孔径は、通常１０μｍ以下、好ましくは０．０２〜１０μｍである。また、メンブランフィルターの材質は、通常用いられるポリカーボネート、ポリプロピレン、セルロースアセテート，セルロースナイトレート等のセルロース誘導体やバクテリアセルロースの誘導体、ポリエステル、四フッ化エチレン、ナイロン６、ナイロン６，６、ケブラーＴＭ（ポリアミド、ｄｕ  Ｐｏｎｔ社）、アノポアーメンブランＴＭ（ＡｎｏｐｏｒｅＴＭ、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ロープロダイン（ポールコーポレーション社）、バイオダインＴＭ（ポールコーポレーション社）等何れのものでも良い。
底部のみがメンブランフィルターからなるメンブランインサートの場合、底部以外の部分の材質としては、例えば、ポリカーボネート、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリプロピレン共重合体（ＰＰＣＯ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリエチレン（ＰＥ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、架橋高密度ポリエチレン（ＸＬＰＥ）、ポリエステル、ポリテレフタル酸エチレン（ＰＥＴ）、ポリエーテル、シリコン、ポリオレフィン、ポリサルフォン（ＰＳＦ）、アセタール（ＡＣＬ）、ポリエチレンテレフタレート共重合体（ＰＥＴＧ）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、テトラフルオロエチレン（ＴＦＥ）、ポリアミド、フッ化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）、サーマノックス（ＴＭＸ）、パーマノックスＴＭ（ＰＭＸ）、アルミ、石英ガラス、ホウケイ酸ガラス、ソーダガラス等、種々の材質が使用可能なものとして挙げられるが、通常は、メンブランフィルターと同じ材質が用いられる。
なお、連結手１２の材質は、特に限定されるものではないが、通常は、メンブランインサートと同じ材質のものが用いられ、複数個のメンブランインサートが連結手で繋がった状態で一体化成型されるのが一般的である。
それぞれにメンブランインサートを装填した複数個のウェルには、それぞれ異なる検体（細胞又は組織）を入れても良いし、また、同じ検体（細胞又は組織）を入れても良い。
前者の場合は、複数の検体（細胞又は組織）を同時に処理出来るし、また、後者の場合には、再現性を見ることが出来る。
【００１２】
一定時間培養後、メンブランインサートを連結している状態で取り出し、２列目のウェルに装填し、培地交換を行って更に培養を続ける。
メンブランインサートの移動に際しては、メンブランフィルターは培地は通すが細胞（又は組織）は通さないので、細胞（又は組織）のみがメンブランインサートと一緒に２列目のウェルに移動し、古い培地は１列目に残る。新しい培地は予め２列目のウェルに入れておいても良いし、メンブランインサートの移動後にメンブランインサートの中に加えても良い。
なお、組織培養後、メンブランインサートをウェルから取り出す際に、メンブランフィルターの孔径が２μｍ以下、若しくは細胞密度が２×１０６ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ以上、若しくはウェルのサイズが直径３ｍｍ以下の場合は、表面張力やメンブランフィルターの孔径の目詰まりにより、培地がメンブランフィルターを通過しないことがある。その際には、適宜、例えば、シリンジ、ピペット、ポンプ、或いは複数個を同時に加圧出来るマルチチャンネルピペット等を加圧器として用いて加圧濾過を行えばよい。
シリンジ加圧、ピペット加圧、マルチチャンネルピペット加圧等による場合は、当然のことながら、これらの加圧器自体がメンブランインサートに装填し得るものであることが望ましい。また、ポンプ加圧の場合は、チューブの先端がメンブランインサートに装填し得るものであることが望ましい。
参考までに、シリンジのよる加圧及びマルチチャンネルピペットによる加圧の例を図４に示す。図４中の（ａ）はシリンジによる加圧の例、（ｂ）はマルチチャンネルピペットによる加圧の例である。
【００１３】
培養後は、最初の培養時と同様に、メンブランインサートを連結している状態で２列目のウェルから取りだし、３列目のウェルに移動させれば、古い培地は２列目に残り、細胞のみがメンブランインサートと一緒に３列目のウェルに移動する。要すれば、ここで再度培地交換を行ない更に培養を続けても良いが、ここでは培地交換を１回として、３列目のウェルで培養細胞（又は培養組織）の洗浄を行う場合について説明する。培養細胞（又は培養組織）の洗浄は通常、例えば、ＦＢＳ（牛胎仔血清）不含で、１０〜２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ含有のＰＰＭＩ−１６４０培地、ＦＢＳ不含、ＨＥＰＥＳ含有のＨａｍＦ−１２培地、ＦＢＳ不含、ＨＥＰＥＳ含有の最小必須培地イーグル（ＭＥＭ）、ＦＢＳ不含、ＨＥＰＥＳ含有の基礎培地イーグル（ＢＭＥ）、ＦＢＳ不含、ＨＥＰＥＳ含有の１９９培地、ＦＢＳ不含、ＨＥＰＥＳ含有のＩｓｃｏｖｅ’ｓ等の培地や、リン酸バッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、トリシンバッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ホウ酸バッファー等の緩衝液、或いは生理食塩水等を用いて行われる。
洗浄後は、メンブランインサートを連結している状態で３列目のウェルから取りだし、４列目のウェルに移動させれば、洗浄液は３列目に残り、細胞（又は組織）のみがメンブランインサートと一緒に４列目のウェルに移動する。この中に蛋白質抽出試薬を入れて細胞（又は組織）を溶解し、蛋白質を抽出する。抽出後、メンブランインサートを連結している状態で４列目のウェルから取り出せば、抽出液に不溶の細胞（又は組織）のカス等はメンブランインサートと一緒に除かれ、蛋白質抽出液のみが４列目に残る。なお、培養細胞（又は培養組織）の洗浄操作は必須ではないが行う方が望ましい。
培地交換後や洗浄後にメンブランインサートをウェルから取り出す際にも、培養後の取り出しと同様に培地や洗浄液がメンブランフィルターを通過しないことがある。その際には、培養後の取り出しと同様に加圧器を用いて加圧濾過すればよい。この場合に用いる加圧器は培養後の取り出しの際に用いられるものと全く同じものでよい。
【００１４】
次いで、蛋白質の濃縮に移る。
５列目のウェルには、予め蛋白質濃縮試薬を充填しておく。
４列目から５列目、及び５列目から６列目は、マイクロチャンネル８で接続しておき、４列目のサンプルを加圧により５列目に移行し、更に、５列目の充填剤を通って６列目のサンプル溜（濃縮された蛋白質が収納されるウェル）に移行させることにより、蛋白質は濃縮される。
加圧時の圧力は、通常１０〜１００ｋＰａ／ｍｍ３，好ましくは３０〜８０ｋＰａ／ｍｍ３、より好ましくは５０〜７０ｋＰａ／ｍｍ３で、加圧時間は通常０．１〜５秒、好ましくは０．５〜２秒、より好ましくは１秒位である。
このとき用いられる加圧器は、上記培養後のメンブランインサートの取り出し時や、培地交換後或いは洗浄後のメンブランインサートの取り出し時に要すれば用いられる加圧器と全く同じものが挙げられる。
但し、この場合は、加圧器は１乃至複数個のウェルに装填して使用される。
【００１５】
更に、図１には記載されていないが、予め同じマイクロチップ上に、濃縮された蛋白質をマイクロチップ電気泳動に付すためのマイクロチップ電気泳動用のマイクロチャンネルを組込んでおけば（電気泳動用のマイクロチャンネルを作製しておけば）、この後、濃縮された蛋白質を同じマイクロチップ上に作製したマイクロチップ型電気泳動のマイクロチャンネルに導くことにより、引き続き分離へ移行することができる（なお、マイクロチップ型電気泳動の通常のマイクロチャンネルに関しては、例えば、前記非特許文献１及び非特許文献２等参照。）。
【００１６】
なお、分離操作は、濃縮された蛋白質を、他の別に作製されたマイクロチップ型電気泳動のマイクロチャンネルに送り込む（他の別に作製されたマイクロチップ型電気泳動のマイクロチャンネルと接続させる）ことにより行っても良い。
この場合、即ち、濃縮された蛋白質を別のマイクロチップ電気泳動用のマイクロチップ上で電気泳動に付す場合は、濃縮された蛋白質が収納されるウェルからマイクロチップの外に向かって流路（マイクロチャンネル）が設けられているものを用いればよい。濃縮された蛋白質の、これらが収納されているウェルからマイクロチップ電気泳動用のマイクロチップ上の試料リザーバーへの移送は、通常、加圧により行われる。このとき用いられる加圧器も上記したものと全く同じである。
勿論、マイクロチップ上での蛋白質の分離操作を考慮しない場合には、濃縮された蛋白質が収納されるウェルには、マイクロチップの外に向かった流路（マイクロチャンネル）は設ける必要はない。
【００１７】
マイクロチップ型電気泳動用のマイクロチャンネルとしては、通常の電気泳動法で用いられるものの他、二次元電気泳動法用のものや、ナノチャンネル型電気泳動法用のものも、当然のことながら、本発明のデバイスに適用、或いは本発明のデバイスに組み合わせて使用可能であり、例えば、本発明者らが先に特許出願した特殊な二次元電気泳動法（特許文献１）のマイクロチャンネル等も勿論適用乃至使用可能である。
本発明に係る複数個からなる、複数列のウェルを設けたマイクロチップと連続した複数個のメンブランインサートを用いた場合には、このようにして、多チャンネルで、タンパクの発現から抽出、濃縮までの一連の操作ができ、更にはこれにマイクロチップ電気泳動を組み合わせることにより分離操作までの一連の操作ができる。
【００１８】
本発明で用いられるマイクロチップの材質としては、マイクロチップ型電気泳動で用いられるものと同じものが挙げられ、より具体的には、例えば、石英ガラス、ホウケイ酸ガラス、ソーダガラス、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ジメチルシロキサン等が挙げられる。中でも、試料の吸着が少なく、チップ加工が容易なガラス類やポリメチルメタクリレート等がより好ましいものとして挙げられる。
マイクロチップの大きさとしては、マイクロチップ型電気泳動の場合と同様、例えば、縦１０〜１２０ｍｍ、横１０〜１２０ｍｍ、厚さ６００〜５０００μｍのものが通常用いられる。。
マイクロチップに設けたウェルのサイズは、通常、直径１．５〜１０ｍｍ位、深さ５００μｍ〜１２ｍｍ位である。
なお、ウェルの深さがマイクロチップの厚さよりも深いものを使用したい場合は、例えば、マイクロチップ基板上のウェルを設けたい部分に基板と同じ材質の然るべき厚さの板を、例えば熱圧着等により接着し、この部分にウェル用の穴をくり抜き、しかる後、マイクロチップ基板の底面にフィルムを貼り付けて穴を塞げばよい。
【００１９】
本発明で用いられる細胞としては、例えば、Ｔ細胞リンパ腫  Ｊｕｒｋａｔ細胞、前骨髄性白血病  ＨＬ−６０細胞、子宮頸部癌  ＨｅＬａ細胞、慣性骨髄性白血病  Ｋ−５６２細胞、各種バクテリア細胞、各種酵母細胞等、通常の細胞培養において用いられる細胞が全て挙げられる。
本発明で用いられる組織片としては、例えば、正常又は癌由来又は病変由来の肺、心臓、脳、子宮等の臓器の組織片が挙げられる。
本発明で用いられる培地としては、例えば、ＲＰＭＩ−１６４０＋ＦＢＳ（１０％）、基礎培地イーグル（ＢＭＥ）＋ＦＢＳ（１０％）、最小必須培地イーグル（ＭＥＭ）＋ＦＢＳ（１０％）、ＨａｍＦ−１２培地＋ＦＢＳ（１０％）、１９９培地＋ＦＢＳ（１０％）、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ培地＋ＦＢＳ（１０％）等通常の組織培養において、それぞれの細胞や組織片との組み合わせにおいて好適なものとして用いられている培地が全て挙げられる。
【００２０】
細胞を溶解して蛋白質を抽出するための蛋白質抽出試薬としては、例えば、哺乳類細胞用では、ＣｅｌＬｙｔｉｃＴＭ  Ｍ（Ｓｉｇｍａ社）、Ｍ−ＰＥＲＴＭ（Ｐｉｅｒｃｅ社）、バクテリア細胞用ではＣｅｌＬｙｔｉｃＴＭＢ、ＣｅｌＬｙｔｉｃＴＭＢＩＩ（Ｓｉｇｍａ社）、酵母細胞用では、ＣｅｌＬｙｔｉｃＴＭＹ（Ｓｉｇｍａ社）等が挙げられる。また、細胞培養ではなく組織片培養の場合は、例えば、ＣｅｌＬｙｔｉｃＴＭＭＴ（Ｓｉｇｍａ社）やＴ−ＰＥＲＴＭ（Ｐｉｅｒｃｅ社）等が挙げられる。
イオン性界面活性剤０．５〜１．０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００やＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（コスモバイオ社）等も、通常、蛋白質抽出用試薬として用いられるが、これらは、ペンシルミキサー等を用いてホモジナイズすることにより効果が上がる。
また、蛋白質濃縮試薬としては、例えば、セファデックス、バイオゲル、アガロースゲル等のゲル濾過用担体や、例えば、粒子径が５〜１０５μｍを持つＣ４やＣ１８充填剤等が挙げられ、商品名としてはホンダパック、ホンダパックＨＣ１８、プレップＣ１８（ウォーターズ社）やＺｉｐＴｉｐ（ミリポア社）等が挙げられる。
また、ゲルアブソーバント（商品名：スペクトラゲルアブソーバント（ＳＰＥＣＴＲＵＭ社）、透析チューブ、コットンセルロース透析膜、再生セルロース透析膜、セルロースエステル透析膜等も使用可能であり、商品名としてはＣｅｌｌｕ−Ｓｅｐ  Ｔ  Ｔｕｂｕｌａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）、スペクトラバイオテックメンブラン（ＳＰＥＣＴＲＵＭ社）、スペクトラ／ポアＣＥ  透析チューブ（ＳＰＥＣＴＲＵＭ社）等が挙げられる。
【００２１】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【００２２】
実施例１
（１）１０個×６列から成る、直径３ｍｍ、深さ５０００μｍのウェルを有する、８０ｍｍ×７５ｍｍ、厚さ５０００μｍの、図１に示される如きマイクロチップ（材質：ポリメチルメタクリレート）と、孔径８μｍのポリカーボネート製メンブランフィルターを底部に有する（その他の部分の材質もポリカーボネート）、図２に示される如き１０連のメンブランインサートを使用。
（２）培養する細胞として、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ジャルカット細胞）（新日本薬品）を２×１０６ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌずつ使用し、これらを、連結したメンブランインサートを装填した１列目のウェルの中のメンブランインサートに入れて培養を行った。
（３）培地は、ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社）−１０％牛胎仔血清（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ，Ｉｎｃ，Ｉｎｇｒａｍ，ＴＸ，ＵＳＡ）を用いた。
（４）培地交換は先に述べたように、メンブランインサートを連結している状態で１列目のウェルから取り出し、２列目のウェルに装填することにより行った。
（５）培養細胞の洗浄は、ＰＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社）−１０ｍＭＨＥＰＥＳを用いて、前述した方法により行った。
（５）蛋白質抽出は、抽出試薬としてＣｅｌＬｙｔｉｃＴＭ−Ｍ（Ｓｉｇｍａ社）を用いて、前述した方法により行った。
（６）蛋白質濃縮は、蛋白質濃縮試薬としてホンダパック充填剤Ｃ１８（ウオーターズ）２０ｍｇを用いて、前述した方法により行った。
なお、蛋白質抽出液の蛋白質濃縮試薬が充填されたウェルを通ってのサンプル溜（濃縮された蛋白質が収納されるウェル）への移行（即ち、蛋白質抽出液の蛋白質濃縮操作）は、シリンジ加圧により行った。
（７）分離は日立マイクロチップ（ｉ−チップ１２）及び、日立マイクロチップ電気泳動装置（ｃｏｓｍｏ−ｉ  ＳＶ１２００、日立電子エンジニアリング社製）を用い、特許文献１に記載の二次元電気泳動法により行った。
蛍光試薬とバッファーは（アジレントプロテインチップキット）を用いた。
なお、濃縮された蛋白質の、電気泳動用マイクロチップの試料リザーバーへの移送は、シリンジ加圧により行った。
（８）得られたエレクトロフェログラムを図５に示す。
図５中、チャンネル番号１〜５はコントロールサンプルで、Ｊｕｒｋａｔ細胞を３７℃で培養したものである（１〜５は同一サンプル）。また、チャンネル番号６〜１０は５１℃で３０分の熱ショックを与えたサンプルである（６〜１０は同一サンプル）。
図中の三角でマークされたシグナルはマーカープロテインであり、低い方が７ｋＤａ、それより高いほうは１８ｋＤａのピークである。熱ショックを与えている５〜１０のピーク強度の増加が認められている。
図５から明らかなように１〜５及び６〜１０は、それぞれ、ほぼ同じ結果を示しており、本発明の方法は、再現性が極めて良好であることが判る。
なお、培地交換、細胞洗浄、回収、蛋白質抽出及び蛋白質濃縮を本発明のオンラインシステムズ行ない、更に分離を特許文献１に記載の方法によるマイクロチップ電気泳動法で行った本実施例においては、培地交換〜分離に要した所要時間は全ての工程を含めて僅か１０分であった。
従って本発明により、分析時間の大幅な短縮が達成された。
【００２３】
比較例１
Ｊｕｒｋａｔ細胞を３７℃で培養したものを従来の細胞回収法（培地交換及び細胞の洗浄）及び蛋白質の抽出法により蛋白質を回収し、従来法の二次元ゲル電気泳動法により解析した。解析結果を図６に示す。
尚、従来の細胞回収法及び蛋白質の抽出法は以下のとおりである。Ｊｕｒｋａｔ細胞２×１０６ｃｅｌｌｓは１００ｍｍ培養シャーレ中で、培地Ａ：培地組成２ｍＭグルタミン含有ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ社），０．００５％ゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ社），１０％牛胎仔血清（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ，Ｉｎｃ，Ｉｎｇｒａｍ，ＴＸ，ＵＳＡ）の培養液１０ｍＬを用いて培養した。増殖後の細胞２×１０６ｃｅｌｌｓを含む培養液１０ｍＬをピペットで１５ｍＬ遠心管に回収し、遠心１７０×ｇ、５分間を行った。遠心後の上清はデカンテーションにより除き、ペレットに別の新しい培地、培地Ｂ：培地組成ＲＰＭＩ−１６４０（日水（株）製），０．００５％ゲンタマイシン，２ｍＭグルタミン，１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ社）を１０ｍＬ加えてピペットで細胞をサスペンジョンし、細胞を洗浄し、再度遠心１７０×ｇ、５分間を行って細胞をペレットとした。細胞ペレットに培地Ｂを１０ｍＬ添加し、ピペットで細胞をサスペンジョンし、１００ｍｍ培養シャーレに移し３７℃、３０分間培養した。培養後の培養液を含む細胞はピペットで、１５ｍＬ遠心管へ回収し、再度遠心１７０×ｇ、５分間行い、細胞をペレットとし、上清はデカンテーションにより除いた。ペレットに洗浄用バッファーとして１０ｍＭリン酸緩衝液（Ｓｉｇｍａ社）１０ｍＬを加え、ピペットでサスペンジョンし、再度遠心１７０×ｇ、５分間行い、上清を除去し、ペレットを回収した。更にペレットに１％Ｎｏｒｉｄｅｔ  Ｐ−４０（コスモバイオ社製）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）を２ｍＬ添加し、細胞をホモジナイズした。細胞溶解液を、２００００×ｇで１０分間遠心分離後、上清を蛋白質の混合物サンプルとして二次元ゲル電気泳動用サンプルとして供した。
【００２４】
また、従来法の二次元ゲル電気泳動は以下のとおりである。二次元ゲル電気泳動はＯ’Ｆａｒｒｅｌｌの改良法（Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｐ．Ｈ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７５，２５０，４００７−４０２１）により行った。ポリアクリルアミドキャピラリーゲル（４％Ｔ，５．４％Ｃ，２％ＡｍｐｈｏｌｉｎｅｐＨ３．５−１０；  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）６２ｍｍ長、１．２ｍｍ直径、を１次元電気泳動の等電点電気泳動（以下、ＩＥＦという）として用いた。５０マイクログラムの蛋白質を含むサンプルをＩＥＦゲルにロードし１６℃で徐々に電圧を増加させて（２００Ｖで１５分、４００Ｖで１５分、８００Ｖで３０分、２５００Ｖで２８８分）二次元めの電気泳動、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動は８５ｍｍ（Ｗ）×６０ｍｍ（Ｈ）×１ｍｍ（Ｔ）のスラブゲル（１５％Ｔ，２．６７％Ｃ）、１プレートあたり１５ｍＡで泳動を行った。二次元目の電気泳動終了後、０．５％ＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー  Ｒ−２５０；日本バイオラット・ラボラトリーズ社製）を用いて染色を行った。ＩＥＦ中のｐＨ勾配はＩＥＦゲルの５ｍｍ各から抽出したｐＨをマイクロｐＨメーター（ｐＨ  Ｂｏｙ  Ｐ−２；Ｓｈｉｎ  ｄｅｎｇｅｎ社製）で測定することで決定した。
【００２５】
図６中のスポット  Ｉ、スポットＩＩａ、スポットＩＩｂはマーカープロテインである。尚、それぞれのスポットはアミノ酸シークエンサーで同剃スポット  Ｉ  はサイモシンベータ４（７ｋＤａ）、スタスミン（Ｍｗ１８．０ｋＤａ、ｐＩ  ５．９）、リン酸化スタスミン（Ｍｗ１８．５ｋＤａ、ｐＩ  ５．６）である。
同定は以下のように行った。分離が完了し二次元ゲル電気泳動を、ポリビニリデンフルオロライド（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ；Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社製）メンブランにセミドライプロッター（ＫＳ−８４６０；Ｍａｒｙｓｏｌ社製）を用いて１０ｍＭ  ＣＡＰＳバッファーｐＨ１１、１５０ｍＡで２時間転写した。メンブラン上のペプチドをガスフェイズプロテインシークエンサー（ＰＰＳＱ−２１；島津社製）に供した。ペプチドのアミノ酸シークエンサーのホモロジーサーチはインターネットホモロジーサーチプログラムＭＰサーチ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｈｔｄｏｃｓ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ．ｈｔｍｌ）を用いた。
【００２６】
比較例２
Ｊｕｒｋａｔ細胞２×１０６ｃｅｌｌｓをマイクロチップ上で５１℃、３０分間、熱ショックを与えたあとに比較例１記載の従来の細胞回収法（培地交換及び細胞の洗浄）及び蛋白質の抽出法により蛋白質を回収し、比較例１記載の従来法の二次元ゲル電気泳動法により測定解析した。解析結果を図７に示す。熱ショックにより、スポットＩとスポットＩＩｂの蛋白質の発現量の増加が認められた。
比較例１、比較例２で行われた従来法による分析所要時間は、細胞の培地交換、細胞の洗浄、回収、蛋白質抽出までの操作で１時間、二次元電気泳動及び解析まで含めたトータルの所要時間が２４時間であった。
【００２７】
比較例３
比較例１の検体を比較例１記載の従来の細胞回収法及び蛋白質抽出法により蛋白質を回収し、マイクロチップを用いた既存の蛋白質解析法［Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）使用］により分離及び測定解析を行った。泳動用緩衝液及びマイクロチップはマイクロチップキット（ｐｒｏｔｅｉｎ２００  Ｐｌｕｓ；Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いた。電気泳動の条件はＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒに添付のマニュアルに従った。測定解析結果を図８に示す。７ｋＤａ及び１８ｋＤａのそれぞれのピークが分子量マーカー又はシステムピークと重なるためスポット  Ｉ  とスポットＩＩａ及びスポットＩＩｂはこのＡｇｉｌｅｎｔの系では測定できなかった。
【００２８】
比較例４
比較例２の検体を比較例１記載の従来の組織培養法及び蛋白質抽出法により蛋白質を回収し、比較例３記載の従来のマイクロチップ電気泳動法により測定解析した結果を図９に示す。比較例３の実験結果と同様に、７ｋＤａ及び１８ｋＤａのそれぞれのピークが分子量マーカー又はシステムピークと重なるためスポットＩ  とスポットＩＩａ及びスポットＩＩｂはこのＡｇｉｌｅｎｔの系では測定できなかった。
【００２９】
比較例５
比較例１の検体を比較例１記載の従来の細胞回収法及び蛋白質抽出法により蛋白質を回収し、分離び測定解析は日立マイクロチップ（ｉ−チップ１２）及び、日立マイクロチップ電気泳動装置（ｃｏｓｍｏ−ｉ  ＳＶ１２００、日立電子エンジニアリング社製）を用い、特許文献１に記載の二次元電気泳動法により行った。  測定解析結果を図１０に示す。図中の  Ｉ（７ｋＤａ）、ＩＩａ及びＩＩｂ（１８ｋＤａ）はマーカープロテインである。
【００３０】
比較例６
比較例２の検体を比較例１記載の従来の細胞回収法及び蛋白質抽出法により蛋白質を回収し、分離及び測定解析は日立マイクロチップ（ｉ−チップ１２）及び、日立マイクロチップ電気泳動装置（ｃｏｓｍｏ−ｉ  ＳＶ１２００、日立電子エンジニアリング社製）を用い、特許文献１に記載の二次元電気泳動法により行った。  測定解析結果を図１１に示す。図中の  Ｉ（７ｋＤａ）、ＩＩａ及びＩＩｂ（１８ｋＤａ）はマーカープロテインである。熱ショックによるマーカープロテインの検出が認められた。
【００３１】
従来の細胞回収法及び蛋白質抽出法により蛋白質を回収し、分離及び測定解析を実施例１と同じ方法で行った比較例５及び６では、実施例１の結果である図５と比べてみると、ほぼ同等の結果が得られていることが判る。このことから、本発明に係る、マイクロチップ上での培地交換、細胞の洗浄、蛋白質の抽出操作は、既存の細胞回収法及び蛋白質抽出法と、得られる結果自体には大差のないことが判る。従って、本発明に係る方法は既存の方法と置き換えることが可能であり、既存の方法を本発明に係る方法に置き換えることにより、操作性を簡便化でき、細胞の処理時間を短縮することができることが判る。因みに、従来法による細胞の洗浄、培地交換、蛋白質の抽出工程にかかる時間は１時間であるのに対し、本発明に係る方法では上記した如く１０分以下（分離工程を含めても１０分）であった。
【００３２】
【発明の効果】
本発明によれば、組織培養の分野で、遠心機を用いた培地交換が不要になり、培養操作が簡略化できる。また、マイクロチップ上に濃縮試薬を組み込むことにより、濃縮もマイクロチップ上で行える。更に、これにマイクロチップ電気泳動に付すためのマイクロチャンネルを組込ませるか、或いは、他の別に作製されたマイクロチップ型電気泳動のマイクロチャンネルと接続させることにより、一連の蛋白質の発現から抽出、濃縮、分離までが、マイクロチップ上で行える。更にまた、同時に多チャンネルをマイクロチップ上に作製することにより、蛋白質の発現解析が同時に多サンプル行え、プロテオーム解析のハイスループット化が達成される。
本発明によれば、このように蛋白質の発現解析、機能解析が簡易に高速に行えるばかりでなく、医療診断用としても、手間のかかる遠心操作が省け、分析のオンライン化が可能となり、分析時間が短縮出来ると共に、細胞（又は組織）やタンパクが多くの器具に触れることがなくなるために蛋白質の吸着を最小限にとどめることも可能となるので、その効果は極めて大である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明に係るマイクロチップの一例である。
【図２】図２は、本発明に係る、複数個が連結している、底部のみがメンブランフィルターからなるメンブランインサートの一例である。
【図３】図３は、本発明に係る、複数個が連結している、底部のみがメンブランフィルターからなるメンブランインサートを、本発明に係る複数個、複数列のウェルを設けたマイクロチップの第一列目のウェルに装填した場合を真上から見た図である。
【図４】図４は、本発明で用いられる加圧方法の例で、（ａ）はシリンジを用いた加圧の例、（ｂ）はマルチチャンネルピペットを用いた加圧の例である。
【図５】図５は、実施例１で得られたエレクトロフェログラムである。
【図６】図６は、比較例１で得られた、従来の細胞回収法、蛋白質抽出法により得られた試料を従来の二次元電気泳動法により測定した結果である。
【図７】図７は、比較例２で得られた、従来の細胞回収法、蛋白質抽出法により得られた試料を従来の二次元電気泳動法により測定した結果である。
【図８】図８は、比較例３で得られた、従来の細胞回収法、蛋白質抽出法により得られた試料をＡｇｉｌｅｎｔの系でのマイクロチップ型電気泳動法により測定した結果である。
【図９】図９は、比較例４で得られた、従来の細胞回収法、蛋白質抽出法により得られた試料をＡｇｉｌｅｎｔの系でのマイクロチップ型電気泳動法により測定した結果である。
【図１０】図１０は、比較例５で得られた、従来の細胞回収法、蛋白質抽出法により得られた試料を実施例１と同じマイクロチップ型電気泳動法により測定した結果である。
【図１１】図１１は、比較例６で得られた、従来の細胞回収法、蛋白質抽出法により得られた試料を実施例１と同じマイクロチップ型電気泳動法により測定した結果である。
【符号の説明】
１ａ、１ｂ，・・・２ａ、２ｂ、・・・・６ｊ  ウェル
８  流路（マイクロチャンネル）
１０  マイクロチップの基板
１１  複数個が連結しているメンブランインサート
１２  連結手
【図１】
2004173595.tif 000003
【図２】
2004173595.tif 000004
【図３】
2004173595.tif 000005
【図４】
2004173595.tif 000006
【図５】
2004173595.tif 000007
【図６】
2004173595.tif 000008
【図７】
2004173595.tif 000009
【図８】
2004173595.tif 000010
【図９】
2004173595.tif 000011
【図１０】
2004173595.tif 000012
【図１１】
2004173595.tif 000013