(57)【要約】【課題】　安全かつ、抗原性の増強されたワクチン組成物の提供。【解決手段】　懸濁液内の鉱物上に吸着させた抗原およびアジュバント量のインターロイキンとを含んでなる安定なワクチン組成物。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的に許容される媒体中で懸濁状態にある鉱物上に吸着された抗原およびアジュバントとして有効量のインターロイキンとの混合物を含んで成り、場合によって、他のアジュバントおよび／または薬学的に許容される防腐剤を含んでいてもよい、ことを特徴とする安定なワクチン組成物。
【請求項２】
薬学的に許容される媒体中で懸濁状態にある鉱物上に吸着された抗原およびアジュバントとして有効量のインターロイキンとの混合物を含んでなり、場合によって、他のアジュバントおよび／または薬学的に許容される防腐剤を含んでいてもよい、ことを特徴とする個体の該抗原に対する免疫応答を引き出すためのワクチン組成物。
【請求項３】
インターロイキンがインターロイキン−１α、インターロイキン−１β、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７およびこれらの混合物から成る群から選択される請求項１または２に記載された組成物。
【請求項４】
鉱物が水酸化アルミニウムまたは燐酸アルミニウムの水性懸濁物である請求項１または２に記載された組成物。
【請求項５】
抗原がバクテリアのペプチド、ウイルスのペプチドまたは糖タンパク質である請求項１または２に記載された組成物。
【請求項６】
抗原がバクテリア、ウイルス、細胞のマクロ成分、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、炭水化物、パラサイト、糸状菌、ガン遺伝子産物およびガン細胞からなる群より選ばれる請求項１または２に記載された組成物。
【請求項７】
バクテリアの抗原がバクテリアの病原体に由来し、例えば、バクテリアの病原体がインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、大腸菌（Escherichia coli）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、カタル球菌（Branhamella catarrhalis）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、ジフテリア菌（Corynebacteria diphtheriae）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、百日咳菌（Bordetella pertussis)、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa)、黄色ぶどう球菌（Staphylococcus aureus）、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、肺炎かん菌（Klebsiella pneumoniae）および破傷風菌（Clostridium tetani）から成る群から選ばれる請求項６に記載された組成物。
【請求項８】
抗原がインフルエンザ菌、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、肺炎かん菌、緑膿菌または黄色ぶどう球菌に由来するバクテリアの皮膜ポリマーまたはそれらのオリゴマーもしくはそれらのフラグメントである請求項１または２に記載された組成物。
【請求項９】
抗原がジフテリア、破傷風、百日咳または交差反応材料（CRM）のバクテリアトキシン、或いはそれらのトキソイドに結合された糖接合体を形成している請求項１または２に記載されえた組成物。
【請求項１０】
糖接合体ガポリリボシルリビトールホスフェートおよびジフテリアトキシンのCRM197からなる請求項９に記載された組成物。
【請求項１１】
抗原がインフルエンザ菌、髄膜炎菌、淋菌またはカタル球菌の表面もしくは外膜蛋白質である請求項１または２に記載された組成物。
【請求項１２】
該表面蛋白質が化膿連鎖球菌からのＭ蛋白質である請求項１１に記載された組成物。
【請求項１３】
ウイルス抗原が、呼吸シンシチウムウイルスのＦ蛋白質、呼吸シンシチウムウイルスのＮ蛋白質、呼吸シンシチウムウイルスのＧ蛋白質、ロタウイルスのＶＰ４ポリペプチド、ロタウイルスのＶＰ６ポリペプチド、ロタウイルスのＶＰ７ポリペプチド、ヒト免疫不全ウイルスのエンベロープ糖蛋白質、ヘルペス糖蛋白質ＢおよびＤ、ならびにＢ型肝炎のＳおよびプレＳ抗原からなる群より選ばれる請求項６に記載された組成物。
【請求項１４】
防腐剤がチメロサール、フェノール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、エチルパラベン、２−フェノキシエタノール、またはｍ−クレゾールである請求項１または２に記載された組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、安定化されたインターロイキンを含有するワクチン組成物およびその調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
　免疫化すべき有機体内のより強い免疫応答を得る目的で、そして抗原含有剤に対する宿主の耐性を強化する目的で、抗原の免疫原性能力を増強することがしばしば望まれている。注入される抗原の免疫原性を増強する物質はアジュバントと呼ばれている。最も有効なアジュバントの１つはフロインドのアジュバント、即ち油中水エマルジョンである。抗原と一緒のエマルジョン（フロインド完全アジュバント）内に生存もしくは死滅ミコバクテリアを懸濁させたとき、フロインドのアジュバントが最も有効である。しかしながら、このエマルジョンが付着した回りに激しい慢性の炎症を生じるため、ヒトに対するこのアジュバントの使用は排除されている。ミコバクテリアが入っていないエマルジョン（不完全フロインドアジュバント）は刺激性が低いため、ヒトに対して用いられてきた。もう１つの種類のアジュバントは、抗原をその上に吸着させた鉱物の懸濁液である。
【０００３】
　特定のリンフホカイン類がアジュバント活性を有し、それが抗原に対する免疫応答を増強する、ことが示された。例えば、マラリア関連抗原に対する免疫応答を増強させるための、ミョウバン（alum）上に吸着させた組換えヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２）の使用を示している。この組成物は製造した後直ちに使用され、そして長時間に渡る安定性は確立されていなかった（非特許文献１参照。）。また、インターフェロン−ガンマがいくつかの抗原に対して２〜４倍から成る抗体生成の増強を誘発したことも公表されている（非特許文献２参照。）。さらにまた、インターロイキン類が他の抗原に対する免疫応答を増強することも公表されている（非特許文献３および特許文献１参照。）。
【０００４】
　なお、本願の優先権主張日（１９８９年７月１４日）後に出願公開された他人の先願には、ボツリヌストキシンＡ＋インターロイキン−２および水酸化アルミニウムからなるワクチンが記載されている（特許文献２参照。）。しかし、ボツリヌストキシンＡ＋水酸化アルミニウムからなるワクチンの方が、上記のインターロイキン−２が加えられたワクチンより有意に高い抗−ＨＢｓ力価を示し、実質的には、本発明にいう、抗原と、薬学的に許容される媒体中で懸濁状態にある鉱物上に吸着されたアジュバントとして有効量のインターロイキンとの混合物を含んでなる・・・安定なワクチン組成物を記載していない。
【特許文献１】欧州特許第２８５４４１号明細書
【特許文献２】特開平２−１１１７２７号公報（第６頁実施例６、第１図）
【非特許文献１】Good, M.F. et at., J. Immunol. 141：972−977(1988)
【非特許文献２】Nakamura, et at., Nature 307：381−382(1984)
【非特許文献３】Nencioni et at., J. Immunol. 139：800−804(1987)
【発明の開示】
【０００５】
　本発明は、抗原と懸濁液内の鉱物上に吸着させたアジュバント量のインターロイキンと、の混合物から成る、安定なインターロイキン含有ワクチン組成物に関する。この混合物は防腐剤を含有し得る。抗原に対する免疫応答を調節するため、抗原（特に糖接合体）と一緒に、ミョウバン（本願明細書では、「ミョウバン」の語は例えば、水酸化もしくは燐酸アルミニウムを意味する。）の如き鉱物懸濁物上に吸着させたアジュバントとしてインターロイキン類、例えばインターロイキン−１α、インターロイキン−１β、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６およびインターロイキン−７が使用できる。このワクチン組成物は貯蔵できる。
【０００６】
　本発明のワクチン組成物は、抗原と懸濁液内の鉱物上に吸着させたアジュバント量のインターロイキンおよび防腐剤から成る。好適には、この鉱物は、水系媒体内に懸濁しているミョウバンである。
【０００７】
　このインターロイキンは、抗原の免疫応答を調節し、一方ミョウバンは、このインターロイキンの生物学的活性を安定化させる働きをする。ミョウバンが存在していない場合、インターロイキン類は短い半減期を有する。従って、本発明のワクチン組成物は長期間貯蔵でき、そしてもしそれがなければ該インターロイキンの不安定化をもたらす。安定化により、ワクチン調剤を投与するに先立つこのワクチン調剤の製造、輸送および貯蔵許容時間を大きく延長する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
　いくつかの異なるインターロイキン類が使用できる。これらには、インターロイキン−１α、インターロイキン−１β、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、或はこれらの混合物が含まれる。免疫調節活性を有するインターロイキンの部分もまた使用できる。好適なインターロイキンはインターロイキン−２である。
【０００９】
　インターロイキンはいかなる適切な給源からも得られる。これらは組換えＤＮＡ方法によって製造され得る。例えば、いくつかのヒトのインターロイキン類をコード化する遺伝子をクローン化した後、種々の宿主系内で発現させることで、純粋なヒトのインターロイキンを多量に生産することができる。更に、特定のＴリンパ球系は高レベルのインターロイキンを生産し、従ってこのインターロイキンの給源と成り得る。
【００１０】
　この防腐剤は薬学的に許容されるいかなる防腐剤であってもよい。これらには、チメロサール、フェノール、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、メチルもしくはエチルパラベン、および２−フェノキシエタノールが含まれる。
【００１１】
　インターロイキンは数多くの異なる種類の抗原のためのアジュバントとして使用できる。一般に、これらの抗原は、バクテリア、ウイルスおよび細胞微細成分の如き粒子状抗原、蛋白質、ペプチド、糖蛋白質および炭水化物の如き可溶抗原であり得る。特に興味の持たれている抗原は、ウイルスもしくはバクテリアの抗原、アレルゲン、自己免疫関連抗原、腫瘍関連抗原、オンコジーン生産物、寄生虫抗原、菌・カビ抗原、或はこれらのフラグメントである。これらの抗原は、天然の給源から得られるか、或はこれらは、組換えＤＮＡ技術または他の人工手段によって製造できる。
【００１２】
　興味の持たれているバクテリア抗原の中には、ヒトのバクテリア病原体に関連したものがあり、これらには例えば、分類可能および分類不可能なインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、大腸菌（Escherichia coli）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、カタル球菌（Branhamella catarrhalis）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、ジフテリア菌（Corynebacteria diphtheriae）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、黄色ぶどう球菌（Staphylococcus aureus）、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、肺炎かん菌（Klebsiella pneumoniae）および破傷風菌（Clostridium tetani）が含まれる。いくつかの特異的バクテリア抗原には、バクテリア表面および外膜蛋白質（例えばインフルエンザ菌、髄膜炎菌、淋菌またはカタル球菌からの）およびバクテリア表面蛋白質（例えば化膿連鎖球菌からのＭ蛋白質）が含まれる。
【００１３】
　病原性ウイルスからのウイルス抗原には、これに限定されるものではないが、ヒト免疫不全ウイルス（タイプＩおよびＩＩ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（タイプＩ、ＩＩおよびＩＩＩ）、呼吸シンシチウムウイルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、非Ａ型および非Ｂ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（タイプＩおよびＩＩ）、シトメガロウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、コロナウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、水痘、エプスタイン・バールウイルス、アデノウイルス、乳頭腫ウイルスおよび黄熱病ウイルスが含まれる。
【００１４】
　これらの病原性ウイルスのいくつかのの特異的ウイルス抗原には、呼吸シンシチウムウイルス（ＲＳＶ）のＦ蛋白質［特に、Paradiso, P.他の、表題が「呼吸シンシチウムウイルス：ワクチンおよび診断方法」（Respiratory Syncytial Virus: Vaccines and Diagnostic Assays)のWO89/02935内に記述されているＦペプチド２８３−３１５を含有している抗原］、ＮおよびＧ蛋白質、ロタウイルスのＶＰ４（従来ＶＰ３として知られている）、ＶＰ６およびＶＰ７ポリペプチド、ヒト免疫不全ウイルスのエンベロープ糖蛋白質、Ｂ型肝炎のＳおよびプレＳ抗原、そしてヘルペス糖蛋白質ＢおよびＤが含まれる。
【００１５】
　また、興味の持たれているものは、自己免疫病、例えばリウマチ様関節炎および紅斑性ろうそう、に関連した種々の抗原である。
【００１６】
　ワクチンにおける使用で特に興味の持たれているものは、バクテリア病原体によって生産される莢膜ポリマー類（ＣＰ）である。皮膜ポリマー類は、糖含有ポリマー類、例えば糖類、糖酸、アミノ糖類、多価アルコール類および燐酸糖類のポリマー類である。いくつかの莢膜ポリマー類およびオリゴマー類がワクチンとして有益である。
【００１７】
　これらの莢膜ポリマー類（ＣＰ）は数多くの異なる種類のバクテリアから誘導され得る。これらの種類には、インフルエンザ菌、肺炎連鎖球菌（特に血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ）、化膿連鎖球菌およびS. agalactiaeを含む連鎖球菌属の種、髄膜炎（例えばセログループａ、ｂおよびｃ）、肺炎かん菌、緑膿菌および黄色ぶどう球菌が含まれる。
【００１８】
　非バクテリアポリマー類は、酵母および菌・カビ、例えばクリプトコックス・ネオホルマンス（Cryptococcus neoformans）、或は癌細胞上にユニークに見いだされる炭水化物含有単位、或はアレルゲンに関連して見いだされるもの、から誘導され得る。
【００１９】
　本発明の抗原類は、脊椎動物（例えば哺乳動物宿主）内の抗原に対する免疫応答を引き出すために使用され得る。この方法は、抗原および懸濁液内の鉱物上に吸着させたアジュバント量のインターロイキンと、添加防腐剤と、の混合物から成るワクチン組成物の免疫学的有効量を動物に投与することから成る。このワクチン組成物は微生物感染の予防に対して有益である。これらの抗原は、薬学的に許容される媒体、例えば生理食塩水、或はエタノールポリオール類（例えばグリセロールまたはプロピレングリコール）中に入れて投与され得る。このワクチン組成物は、任意に、他のアジュバント、例えば植物油もしくはそれらのエマルジョン、界面活性剤、例えばヘキサデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、オクタデシルアミン、リソレシチン、臭化ジメチル−ジオクタデシルアンモニウム、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’ビス（２−ヒドロキシエチル−プロパンジアミン）、メトキシヘキサデシルグリセロール、およびプルロニック（pluronic）ポリオール類；ポリアミン類、例えばピラン、デキストランスルフェート、ポリＩＣ、カルボポル（carbopol）；ペプチド類、例えばムラミル（muramyl）ジペプチド、ジメチルグリシン、ツフツシン（tuftsin）；免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）；オイルエマルジョン；そして鉱物ゲルを含んでいてもよい。本発明の抗原はまた、リポソーム類またはＩＳＣＯＭＳに組み込まれていてもよい。補助的活性材料も利用され得る。
【００２０】
　これらのワクチン類は、種々の方法でヒトもしくは動物に投与され得る。これらには、皮内、経皮（例えば徐放ポリマー類の使用による）、筋肉内、腹膜内、静脈内、皮下、経口および鼻孔内投与ルートが含まれる。上記ワクチンで用いられる抗原量は、使用される抗原の本質に応じて変化し得る。本ワクチン類に適合させるための古典的担体抗原と一緒に用いられる確立された服用範囲を調節および操作することは、本分野の技術者の能力の範囲内である。本発明のワクチン類は、未成熟および成熟両方の温血動物、特にヒトの治療における使用を意図したものである。また、本組成物の使用は、予防用途に限定されるものでなく、治療用途もまた意図したものである（例えばエイズの予防および治療）。
【００２１】
　インターロイキンのアジュバント活性は次のような数多くの重要な意味を有している：インターロイキンのアジュバント活性は、予防接種した有機体内の抗原に対して生産される保護抗体の濃度を上昇させ得る。その結果として、有効な（即ち保護する）予防接種が、通常必要とされるよりも少ない量の抗原を用いて達成され得る。抗原に関するこの必要量の減少は、製造が困難でありそしてコストのかかるワクチン類使用の拡大をもたらす可能性を有している。このことは特に、健康管理予算が非常に限定されておりそして呼吸病、下痢病およびマラリアが流行している発展途上国において事実である。これはまた、この抗原が有効な免疫化に通常必要とされている濃度では毒性を示す場合、より安全な予防接種を提供し得る。抗原の量を減少させることによって、毒性を示す反応の危険性が減少する。
【００２２】
　インターロイキン類は、それらが有する免疫調節活性により、免疫原性外もしくは非免疫原性抗原に対する保護免疫応答を引き出す補助を与える。このようにして、より大きい蛋白質、合成抗原、或は組換えＤＮＡ技術の生産物、のフラグメントを含有しているワクチン組成物は、それらをインターロイキン類と混合することによって、より活性のあるものにされ得る。
【００２３】
　典型的に、予防接種療法は、「保護」免疫応答を刺激するために数週間から数カ月の期間に渡る抗原投与を必要としている。保護免疫応答は、ワクチンに対して特異性を示す特別な病原体もしくは病原体類による生産力のある感染から、免疫化した宿主もしくは被験者を保護するに充分な免疫応答である。インターロイキンは、これを抗原と一緒に投与しそして懸濁液内の鉱物上に吸着させたとき、保護免疫応答の発生を促進し得る。このことにより、有効な予防接種処置期間を減少させることができる。ある場合には、これにより、１回の服用で保護免疫応答を生じさせることができる。更に、本発明のワクチン調剤は４℃で充分に安定であり、このワクチン調剤の製造、輸送および貯蔵を可能にする。
【００２４】
　以下に示す実施例により本発明を更に説明する。
【実施例１】
【００２５】
　ＨｂＯＣ抗原ワクチンを用いたミョウバン存在下でのｒｈＩＬ−１またはｒｈＩＬ−２のアジュバント効果
　ヘモフィルス属（Haemophilus）のタイプｂ ＣＲＭ接合体（ＨｂＯＣ）の低服用量（０．１μｇ／マウス）物を、ミョウバン（１００μｇ／マウス）の有り無し、そして１ｘ１０２〜５ｘ２０５単位／マウスから成る種々の濃度のｒｈＩＬ−２、ｒｈＩＬ−１αまたはｒｈＩＬ−１βと調合した。全てのワクチン類は、免疫化するその日に製造して、注射するまで４℃で保持した。これらのワクチンの製造で用いたインターロイキン類は、その調合日に再構成するか、或は−７０℃に保持した希釈ストック（２５μｇ／ｍＬ）から回収した。Swiss-Websterマウス（Taconic Farms、 Germantown、 NY）のグループに、０週および２週目に、０．１ｍＬのワクチン調剤を筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射した。種々の表の中に示されているように、血清サンプルを採取した。
Ａ．　アジュバントとしてのｒｈＩＬ−２
　表１は、ミョウバン無し［（−）で示されているコラム］およびミョウバンとの組み合わせ［（＋）で示されているコラム］の両方で、マウスの予防接種におけるアジュバントとしてｒｈＩＬ−２を投与したとき観察された結果を示している。抗体濃度はμｇ／ｍＬとして表されており、そして抗原を０．１μｇ投与した後２、４および６週間目に測定した。これらの試験で用いた抗原はＨｂＯＣであった。投与したｒｈＩＬ−２の用量範囲は１ｘ１０３〜１ｘ１０５単位／マウスの範囲であった。
【００２６】
表１
HbOC   単位　    　２週　       　４週　        　６週
μｇ　 rhIL    (+)     (-)     (+)     (-)     (+)     (-)
１組:
0.1    10３    4.70    0.28    7.89    3.46    8.16    3.62
0.1　　10４　  2.25　　0.51　　9.39　　5.01   17.77　　5.83
0.1　　10５　  0.37　　0.55　　4.71　　3.04　　5.31　　2.91
0.1　　--　    0.46  ＜0.10    3.53　　0.42　　5.46　　3.53
２組:
0.1　　10２　  1.02　   0.40  　6.32　　4.21　　5.90　　3.32
0.1　　10３　  0.54　 　0.75  　5.77　　4.73　　5.60　　4.61
0.1　　10４　  1.68   ＜0.10   12.99　　1.95   19.06　　1.25
0.1　　10５　  0.25   ＜0.10　　5.94　　5.46　　3.91　　3.82
0.1　　--      0.53　　 0.30  　7.09　　2.64　　8.30　　2.82
　上に（−）で示したコラムで見られるように、ミョウバン無しのｒｈＩＬ−２は抗体生産に対して刺激効果を有している。例えば、２つの異なる実験において、対照サンプル内に存在している抗体濃度は０．４２μｇ／ｍＬおよび２．６２μｇ／ｍＬであった。
【００２７】
　このアジュバント混合物にｒｈＩＬ−２と共にミョウバンが含まれているとき観察された結果が、表１の（＋）で表されているコラムに示されている。再び、有意な刺激効果が見られる。しかしながら、ミョウバンが存在していると、この抗体応答の大きさは、ミョウバン無しの同一サンプルで見られる応答よりも有意に上昇している（予防接種）。
【００２８】
　４週の時点を再び考慮すると、ミョウバンが入っている（＋）抗体濃度は相当するミョウバンが入っていない（−）抗体濃度よりも１０倍大きいことが分かる。更に、明らかなｒｈＩＬ−２濃度依存性が存在しているが、これは、ミョウバンが入っていない（−）サンプルには見られない。特に、観察された相関関係は、このｒｈＩＬ−２濃度が１ｘ１０５未満に減少したとき抗体濃度が上昇することであった。ミョウバンと一緒に用いたｒｈＩＬ−２の場合、最大の抗体生産を刺激すると見られる用量はマウス当たりおおよそ１ｘ１０４単位であった。
Ｂ．　アジュバントとしてのｒｈＩＬ−１
　表２および３は、それぞれｒｈＩＬ−１αおよびｒｈＩＬ−１βをアジュバントとして用いた免疫化から得られる結果を示している。表２は、２週間の間隔での後免疫化で、抗ＰＲＰ抗体（ポリリビトールリボース燐酸に対する抗体）測定（μｇ／ｍＬで表す）から得られたデータを表している。再び、ミョウバン有り（＋）または無し（−）で行った。
【００２９】
表２
HbOC   rhIL-1α　  　２週　        　４週　        　６週
μｇ　  (単位)    (+)     (-)     (+)     (-)     (+)     (-)
１組:
0.1　　10３　　　1.96 　　1.02   14.63　　4.94   13.25　　4.93
0.1　　10４　　　0.70 　　2.54　　7.16　　5.11   12.44   11.17
0.1　　10５　　　0.33 　　1.49　　4.69　　7.02　　6.14　　8.73
0.1　　-IL　 　　0.46   ＜0.10　　3.53　　0.42　　5.46　　3.53
対照
２組:
0.1　　10２  　  ＜0.10  　1.02　　3.68　　4.36　　4.07　　3.00
0.1　　10３　　　　1.06　　1.17   12.31　　5.54　　8.74　　3.08
0.1　　10４　　　　0.47　　1.47　　4.73　　8.97　　5.98　　6.55
0.1　　10５　　　　0.34　　1.00　　8.55   16.74　　7.77   16.29
0.1　　-IL    　　 0.53　　0.30　　7.09　　2.64　　8.30　　2.82
対照
　ｒｈＩＬ−１αおよびｒｈＩＬ−１βアジュバント混合物から観察された結果は、全体として、該ｒｈＩＬ−２の組で観察されたのと同様である。例えば表２は、ｒｈＩＬ−１αをミョウバン無しでアジュバントとして投与したとき、リンフォカイン無しの同一ワクチンと比較して刺激効果が有ることを示している。
（−）で表されているコラムに示されているように、このアジュバント混合物内のｒｈＩＬ−１αの量をマウス当たり１ｘ１０５から１ｘ１０２単位に減少させると抗体生産を減少させる傾向が観察された。
【００３０】
　ミョウバンの存在下、ｒｈＩＬ−１αもまた刺激効果を有していた。驚くべきことに、ｒｈＩＬ−１αはその濃度を減少させたとき免疫応答を刺激する能力が上昇することが示された。ミョウバン存在下でのｒｈＩＬ−１αの最適アジュバント量は約１ｘ１０３であった。上記濃度での抗体濃度は、ミョウバン無し（−）の同一サンプルよりも２〜３倍大きいことが見いだされた。
【００３１】
　表３に示されているように、ｒｈＩＬ−１βをアジュバントとして用いたときも同様の結果が観察された。表３のデータは、ミョウバンの有り無しで、アジュバントとしてのｒｈＩＬ−１βの濃度を変化させたときの、２、４および６週目に行った抗体濃度測定の結果を要約したものである。２１個の実験グループの中で６を除く全てにおいて、ミョウバンを用いた（＋）ワクチンは、ミョウバン無し（−）のワクチンよりも高い抗体濃度を生じさせた。
【００３２】
表３
HbOC   rhIL-1β　  　２週　        　４週　        　６週
μｇ　            (+)     (-)     (+)     (-)     (+)     (-)
１組:
0.1　　10３　　　 0.41 　　0.96　　5.27　　4.09　　8.32　　5.22
0.1　　10４　　　 0.90 　　0.62　　4.13　　3.39　　8.15　　6.39
0.1　　10５　　　 1.46 　　0.46   13.35　　1.77　　8.60　　1.06
0.1　　-IL　　    0.46   ＜0.10　　3.53　　0.42　　5.46　　3.53
対照
２組:
0.1　　10２　　　　0.85　　0.16　　8.76　　0.04　　6.66　　1.91
0.1　　10３　　　　0.30　　0.40　　4.57　　0.68　　6.87   10.33
0.1　　10４　　　　1.08　　0.36　　5.75　　5.15　　5.17　　4.47
0.1　　10５　　　　0.19　　0.36　　2.34　　3.0　　 4.98　　3.92
0.1　　-IL　　  　0.53　　0.30　　7.09　　2.64　　8.30　　2.82
対照
【実施例２】
【００３３】
　ＲＳＶ Ｆ蛋白質ワクチンに対するｒｈＩＬ−１α、ｒｈＩＬ−１β、ｒｈＩＬ−２およびそれらの混合物のアジュバント効果
　インターロイキン類を用いて蛋白質ワクチンに対する抗体応答を増強させ得るか否かを測定するため、種々の濃度の呼吸シンシチウムウイルス（ＲＳＶ）のＦ蛋白質を、１ｘ１０４もしくは１ｘ１０５単位／マウスのｒｈＩＬ−２もしくはｒｈＩＬー１α有り無しで、ミョウバン（最終的に１００μｇ／マウス）と一緒に調合した。Swiss-Websterマウスのグループ（グループ当たり５匹の動物）を０週および２週目に筋肉内注射で免疫化させた。表４に示されているようにして動物から採血した。
【００３４】
　３種の服用量から成るＲＳＶ Ｆ蛋白質（１、０．１および０．０１μｇ／マウス）を投与した。これらの中で、０．０１μｇのみが使用した条件下で最適以下であった。ミョウバン単独で０．０１μｇの蛋白質が与えられた対照グループに対して、種々のインターロイキン類を含有しているワクチンを与えたグループで見られた応答を比較したとき、Ｆ蛋白質への抗体応答に対するｒｈＩＬ−２もしくはｒｈＩＬー１αの有意な効果（タイターで４倍の差）が見られた。しかしながら、このｒｈＩＬ−２で処理したグループにおける応答は、１ｘ１０４単位／マウス用量の対照よりも高く、これはＨｂＯＣにおける試験で得られた結果と同様である。ＩＬ−１αを用いたとき、両方の用量共、対照に比較していくらか改良された抗体応答を示しているように見られる。興味の持たれることには、１ｘ１０４単位／マウスから成るｒｈＩＬ−２およびｒｈＩＬ−１αの混合物は、いかなる相乗効果も示すことなくむしろ、対照に比較していくらか減少した応答を示していたが、これは、これらのインターロイキン類の起こり得る拮抗相互作用を示唆している。
表４
ＲＳＶ Ｆ蛋白質ワクチンに対するｒｈＩＬ−２のアジュバント効果
μgF 蛋白質 rhIL 単位 2週 週 6週
　　0.1　　　 -IL
　　　　　　　対照　　 --　    141,657　　2,341,756　　2,454,512
0.1       IL-2     10４    191,935    2,045,327    2,101,951
　　0.1　　　 Il-2　　 10５　　309,797　　2,275,311　　2,311,326
　　0.01　　　-IL
　　　　　　　対照　　 --　　  68,627　　　802,611　　　687,334
　　0.01　　　IL-2　　 10４　 145,467　　1,580,552　　1,699,135
　　0.01　　　IL-2　　 10５ 　 60,134　　　722,396　　　815,351
　　0.1　　　 -IL
　　　　　　　対照　　 --　　141,657　　2,341,756　　2,454,512
　　0.1　　　 IL-1α　 10４　123,446　　1,861,917　　1,771,952
　　0.1　　　 IL-1α　 10５　 79,386　　1,185,475　　1,214,008
　　0.01　　　-IL
　　　　　　　対照　　 --　   68,627　　　802,611　　　687,334
　　0.01　　　IL-1α　 10４　 54,081　　1,003,110　　1,094,459
　　0.01　　　IL-1α　 10５　 59,566　　　708,009　　1,178,056
　　0.1　　　 -IL
　　　　　　　対照　　 --　　 141,657　　2,341,756　　2,451,512
　　0.1　　　 混合　　 10４　 207,410　　2,593,957　　2,353,912
　　0.01　　　-IL
　　　　　　　対照　　 --　    68,627 　　802,611　　　687,334
　　0.01　　　混合　　 10４　  15,947 　　367,224　　　532,050
　　1.0　　　 --　　　 --　　 211,662　 2,269,615　　2,899,079
【実施例３】
【００３５】
　単一投与予防接種
　表１は、ミョウバン有り無しでｒｈＩＬ−２を用いたときの、ＨｂＯＣに対する免疫応答を示す実験結果を示している。ミョウバン存在下での１ｘ１０３単位濃度のｒｈＩＬ−２では、単一投与後、ＨｂＯＣを基としたワクチンは４．７μｇ／ｍＬから成る抗体応答を刺激した。上記抗体濃度は、保護に必要な量として一般的に許容される閾レベル以上である。
【実施例４】
【００３６】
　アジュバントの安定性
　　Ａ．　ｒｈＩＬ−２安定性に関するインビトロ分析
　ミョウバン含有組成物内でのｒｈＩＬ−２安定性を試験する目的で、ＨｂＯＣ抗原（２．５μｇ／マウス）を、１０４単位のｒｈＩＬ−２と混合し、燐酸アルミニウム上に吸着させた後４℃で保存した。表５はインビトロ安定性分析で観察された結果を示している。この分析において、種々の濃度のｒｈＩＬ−２標準およびＨｂＯＣワクチンと一緒に５ｘ１０３個のＣＴＬＬ−２細胞（細胞障害性Ｔリンパ球系）を培養した。１０％のＦＢＳが入っているＲＰＭＩ培地内で細胞を３７℃で２４時間培養した後、ウエル当たり１．０μＣｉの［３Ｈ］チミジンで１６時間標識した。ミョウバンに吸着したｒｈＩＬ−２の量を見積もる目的で、この調合物を遠心分離してミョウバンをペレット化し、そしてｒｈＩＬ−２活性に関して上澄み液を分析した。ミョウバン上に該ｒｈＩＬ−２の約２／３が吸着されていることが確認された。表５に示されるように、燐酸アルミニウム吸収の後でｒｈＩＬ−２活性を試験したとき、このリンフォカインはその活性を２週間に渡って保持していることが認められた。
【００３７】
表５
ｒｈＩＬ−２安定性に関するインビトロ分析（１．０Ｕ／ｍＬ ＩＬ−２ Ａ±
ＣＰＭ±ＳＤ（１分間当りのカウント±標準偏差）の［３Ｈ］チミジン組み込
み）
　   ０週　　　　　１週　　 　　　２週
ベースライン:
培地
(x cpm)               303±41       1,540±67    　  135±49
インターロイキン-2:
BM生産物           16,179±491     10,056±689   　 13,323±1428
　Cetus生産物　　　　28,300±2250　　25,681±135　　　25,992±868
HbOC ワクチン類:
　rhIL-2　　　　　　 24,188±783　　 31,989±2252　　 36,312±3102
　ミヨウバン rhIL-2　19,419±1330　　28,785±1691　　 35,091±690
　ミヨウバン/
　  rhIL-2 supt　　　 4,460±205　　  5,716±211　　　13,460±1231
　rhIL-2+50μg
ミヨウバン　　　      ND             ND　　　　　 35,627±2503
　　　Ｂ．　ｒｈＩＬ−２安定性に関するインビボ分析
　ｒｈＩＬ−２の安定性に関するインビボ分析を設計した。上述したようにして予め保存したＨｂＯＣ／ミョウバン／ＩＬ−２ワクチンを用いてマウスを免疫化した。２匹のＤＢＡ／２マウスから成る４つのグループを、連続して３週間、ＣＦＡ、ミョウバン、ｒｈＩＬ−２／ミョウバン、またはｒｈＩＬ−２、内の１０μｇ（蛋白質）ＨｂＯＣで免疫化した。注射後１週間でリンパ節を取り出した後、単一細胞の懸濁液を得た。分裂促進因子および種々の濃度のＤＴ（ジフテリア毒素）、ＣＲＭおよびＴＴ（破傷風菌毒素）と一緒に３ｘ１０５のＬＮＣ（リンパ節細胞）を培養した。１．０％のＮＭＳ（正常マウス血清）が入っているＲＰＭＩ培地内で細胞を３７℃で３日間培養し、ウエル当たり１．０μＣｉの［３Ｈ］チミジンで１６時間標識した後、ＬＳカウンターを用いて数を数えるために収穫した。ＨｂＯＣ−ＣＦＡグループで有意なＴ細胞応答が観察された。しかしながら、２週および３週目で、ｒｈＩＬ−２は増大したＴ細胞応答を誘発した。更に、ＨｂＯＣ単独でも明らかにｒｈＩＬ−２を劣化から保護している。
表６
　　ＨｂＯＣワクチンを用いたＩＬ−２のインビボ安定性ＳＩ±ＳＤ（刺激
　　インデックス±標準偏差）としての最大組み込み［３Ｈ］チミジン
ＨｂＯＣ開始１週目：
インビトロ
チヤレンジ:        CFA   ミヨウバン*  IL-2/ミヨウバン  IL-2*   
培地(x cpm)    454  ±22   190  ±19     386  ±35    125  ±8
CA 1.0μg/ml　  43.3±3.9　 89.7±3.9　　 58.4±5.1　 136.9±2.4
LPS 50μg/ml　 129.4±8.7　186.9±7.7　 　69.0±4.5　 103.9±6.6
DT　 　　　　　 17.5±1.2　　4.4±0.04　　 1.4±0.3　 　1.8±0.1
CRM　　　　　　162.0±14.9 　9.8±0.3　　　0.8±0.1　 　0.8±0.1
TT　　　　　　　 0.8±0.07　 0.4±0.03　 　0.1±0.0　　 0.6±0.05　
２週
培地         1,185  ±175　590  ±42　　 552  ±48  　187  ±11
CA 1.0μg/ml 　 40.6±3.4 　57.5±1.8　 　53.1±0.9　 165.1±11.5
LPS 50μg/ml　　71.5±1.2 　89.9±3.7　　142.1±8.7　 203.5±17.8
DT   　　　　　 16.5±0.4　　1.1±0.0　　　1.3±0.2 　　2.9±0.0
CRM　　　　　　 50.6±0.5　　1.3±0.0　　 10.5±0.3　　 1.6±0.0
TT　　　　　　　 0.6±0.1　　0.1±0.0　　　0.1±0.0 　　0.4±0.0　
３週
培地　　　　　 519  ±59　 416  ±9　  　442  ±63　　966  ±51
CA 1.0μg/ml　　45.9±0.3 　41.0±2.8 　　46.4±0.9　　27.5±2.1
LPS 50μg/ml　 129.2±7.6　119.4±5.3　　126.5±6.3　　81.9±3.1
DT　　　　　　　 5.6±0.8　    NA　　　　　2.2±0.2　     NA
CRM　　　　　　 98.1±8.1 　17.9±1.4　　 25.2±1.6 　31.4±2.6
TT　　　　　　　 0.4±0.1　　0.2±0.0　  　0.51 0.0　　0.1±0.0　
＊　これらのグループは、１．０％の代わりに２．０％のＮＭＳが与えられている。
【００３８】
　以下、本発明の主な態様を挙げる。
【００３９】
　１．　抗原と、薬学的に許容される媒体中で懸濁状態にある鉱物上に吸着されたアジュバントとして有効量のインターロイキンとの混合物を含んで成り、そして、場合によって、他のアジュバントおよび／または薬学的に許容される防腐剤を含んでいてもよい、安定なワクチン組成物。
【００４０】
　２．　抗原と、薬学的に許容される媒体中で懸濁状態にある鉱物上に吸着されたアジュバントとして有効量のインターロイキンとの混合物を含んでなり、そして、場合によって、他のアジュバントおよび／または薬学的に許容される防腐剤を含んでいてもよい、個体の該抗原に対する免疫応答を引き出すためのワクチン組成物。
【００４１】
　３．　インターロイキンがインターロイキン−１α、インターロイキン−１β、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７およびこれらの混合物から成る群から選択される上記１または２に記載された組成物。
【００４２】
　４．　鉱物が水酸化アルミニウムまたは燐酸アルミニウムの水性懸濁物である上記１〜３のいずれかに記載された組成物。
【００４３】
　５．　抗原が、バクテリア、ウイルス、細胞微細成分、蛋白質、ペプチド、糖蛋白質、炭水化物、寄生虫、菌・カビ、オンコジーン生産物、および癌細胞から成る群から選択される未処理または粒状抗原である上記１〜４のいずれかに記載された組成物。
【００４４】
　６．　抗原がインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、大腸菌（Escherichia coli）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、カタル球菌（Branhamella catarrhalis）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、ジフテリア菌（Corynebacteria diphtheriae）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、百日咳菌（Bordetella pertussis)、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa)、黄色ぶどう球菌（Staphylococcus aureus）、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、肺炎かん菌（Klebsiella pneumoniae）および破傷風菌（Clostridium tetani）から成る群から選択される上記５記載の組成物。
【００４５】
　７．　抗原がインフルエンザ菌、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、肺炎かん菌、緑膿菌または黄色ぶどう球菌に由来するバクテリアの皮膜ポリマーまたはそれらのオリゴマーもしくはそれらのフラグメントである上記１〜４のいずれかに記載された組成物。
【００４６】
　８．　抗原がジフテリア、破傷風、百日咳または交差反応材料（ＣＲＭ）のバクテリアトキシン、或はそれらのトキソイドに結合された糖接合体を形成している上記１〜４のいずれかに記載された組成物。
【００４７】
　９．　糖接合体がポリリボシルリビトールホスフェートおよびジフテリアトキシンのＣＲＭ１９７から成る上記８記載の組成物。
【００４８】
　１０．　抗原がインフルエンザ菌、髄膜炎菌、淋菌またはカタル球菌の表面もしくは外膜蛋白質である上記１〜４のいずれかに記載された組成物。
【００４９】
　１１．　バクテリア表面蛋白質が化膿連鎖球菌からのＭ蛋白質である上記１０記載の組成物。
【００５０】
　１２．　抗原が、呼吸シンシチウムウイルスのＦ蛋白質、呼吸シンシチウムウイルスのＮ蛋白質、呼吸シンシチウムウイルスのＧ蛋白質、ロタウイルスのＶＰ４ポリペプチド、ロタウイルスのＶＰ６ポリペプチド、ロタウイルスのＶＰ７ポリペプチド、ヒト免疫不全ウイルスのエンベロープ糖蛋白質、ヘルペス糖蛋白質ＢおよびＤ、ならびにＢ型肝炎のＳおよびプレＳ抗原から成る群から選択される上記５記載の組成物。
【００５１】
　１３．　防腐剤がチメロサール、フェノール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、エチルパラベン、２−フェノキシエタノール、またはｍ−クレゾールである上記１〜４のいずれかに記載された組成物。
【００５２】
　１４．　抗原を懸濁状態にある鉱物上に吸着されたアジュバントとして有効量のインターロイキンと混合し、貯蔵条件下でインターロイキンを安定化することを特徴とするワクチン組成物中のインターロイキンの安定化方法。
【００５３】
　１５．　抗原を薬学的に許容される媒体中で懸濁状態にある鉱物上に吸着されたアジュバントとして有効量のインターロイキンと混合し、さらに混合に際し、場合により、他のアジュバントおよび／または薬学的に許容される防腐剤を混合してもよいことを特徴とする安定なワクチン組成物の調製方法。
【００５４】
　１６．　インターロイキンがインターロイキン−１α、インターロイキン−１β、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７およびこれらの混合物から成る群から選択される上記１４または１５に記載された方法。
【００５５】
　１７．　鉱物が水酸化アルミニウムまたは燐酸アルミニウムの水性懸濁物である上記１４〜１６のいずれかに記載された方法。
【００５６】
　１８．　抗原が、バクテリア、ウイルス、細胞微細成分、蛋白質、ペプチド、糖蛋白質、炭水化物、寄生虫、菌・カビ、オンコジーン生産物、および癌細胞から成る群から選択される未処理または粒状抗原である上記１４〜１７のいずれかに記載された方法。
【００５７】
　１９．　抗原がインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、大腸菌（Escherichia coli）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、カタル球菌（Branhamella catarrhalis）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、ジフテリア菌（Corynebacteria diphtheriae）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、百日咳菌（Bordetella pertussis)、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa)、黄色ぶどう球菌（Staphylococcus aureus）、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、肺炎かん菌（Klebsiella pneumoniae）および破傷風菌（Clostridium tetani）から成る群から選択される上記１４〜１７のいずれかに記載された方法。
【００５８】
　２０．　該抗原がインフルエンザ菌、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、肺炎かん菌、緑膿菌または黄色ぶどう球菌に由来するバクテリアの皮膜ポリマーまたはそれらのオリゴマーもしくはそれらのフラグメントである上記１４〜１７のいずれかに記載された方法。
【００５９】
　２１．　該抗原がジフテリア、破傷風、百日咳または交差反応材料（ＣＲＭ）のバクテリアトキシン、或はそれらのトキソイドに結合された糖接合体を形成している上記１４〜１７のいずれかに記載された方法。
【００６０】
　２２．　該糖接合体がポリリボシルリビトールホスフェートおよびジフテリアトキシンのＣＲＭ１９７から成る上記２１記載の方法。
【００６１】
　２３．　該抗原がインフルエンザ菌、髄膜炎菌、淋菌またはカタル球菌の表面もしくは外膜蛋白質である上記１４〜１７のいずれかに記載された方法。
【００６２】
　２４．　該バクテリア表面蛋白質が化膿連鎖球菌からのＭ蛋白質である上記２３記載の方法。
【００６３】
　２５．　該抗原が、呼吸シンシチウムウイルスのＦ蛋白質、呼吸シンシチウムウイルスのＮ蛋白質、呼吸シンシチウムウイルスのＧ蛋白質、ロタウイルスのＶＰ４ポリペプチド、ロタウイルスのＶＰ６ポリペプチド、ロタウイルスのＶＰ７ポリペプチド、ヒト免疫不全ウイルスのエンベロープ糖蛋白質、ヘルペス糖蛋白質ＢおよびＤ、ならびにＢ型肝炎のＳおよびプレＳ抗原から成る群から選択される上記１８記載の方法。
【００６４】
　２６．　該防腐剤がチメロサール、フェノール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、エチルパラベン、２−フェノキシエタノール、またはｍ−クレゾールである上記１４〜１７のいずれかに記載された方法。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
　本発明によれば、抗原の免疫応答を有意に調節し、かつ、長期間貯蔵できる安定なワクチン組成物が提供されるので、例えば、医薬または動物薬の製造業で利用できる。