(57)【要約】【課題】大腸菌の細胞抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系において、リボソーム上でのｍＲＮＡのコドンの読み取り効率を改善することによりタンパク質の生産性を向上させる。【解決手段】Ｓ１２リボソームタンパク質遺伝子に突然変異を有する大腸菌細胞から無細胞タンパク質合成用抽出液を調製する。好ましい態様において、前記突然変異はストレプトマイシンに対する耐性又は依存性を付与する変異である。このような変異体大腸菌より調製される無細胞タンパク質合成用抽出液は、エネルギー再生系、少なくとも一種のアミノ酸、ヌクレオチド三リン酸、及び／又はＲＮＡポリメラーゼを含む混合液をあらかじめ添加しておくか、あるいはタンパク質合成反応を行う際に前記混合液を添加して用いることができ、このような構成試薬からなる無細胞タンパク質合成キットが提供される。【選択図】          図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ１２リボソームタンパク質遺伝子に突然変異を有する大腸菌より調製されることを特徴とする無細胞タンパク質合成用抽出液。
【請求項２】
前記突然変異がＳ１２リボソームタンパク質遺伝子にストレプトマイシンに対する耐性又は依存性を付与することを特徴とする請求項１に記載の無細胞タンパク質合成用抽出液。
【請求項３】
前記突然変異が、Ｓ１２リボソームタンパク質にアミノ酸置換を引き起こす変異であって、前記アミノ酸置換が配列番号２に示すアミノ酸配列において４３番目の位置であることを特徴とする請求項１又は２に記載の無細胞タンパク質合成用抽出液。
【請求項４】
前記アミノ酸置換がリジンからスレオニンへの置換である請求項３に記載の無細胞タンパク質合成用抽出液。
【請求項５】
Ｓ１２リボソームタンパク質遺伝子に突然変異を有する大腸菌より調製される無細胞タンパク質合成用抽出液と、
エネルギー再生系、少なくとも一種のアミノ酸、ヌクレオチド三リン酸、及び／又はＲＮＡポリメラーゼを含む混合液と、を含む無細胞タンパク質合成キット。
【請求項６】
ストレプトマイシンに対する耐性又は依存性を付与する、Ｓ１２リボソームタンパク質遺伝子の突然変異を有する大腸菌より調製される無細胞タンパク質合成用抽出液と、
エネルギー再生系、少なくとも一種のアミノ酸、ヌクレオチド三リン酸、及び／又はＲＮＡポリメラーゼを含む混合液と、を含む無細胞タンパク質合成キット。
【請求項７】
前記突然変異が、Ｓ１２リボソームタンパク質にアミノ酸置換を引き起こす変異であって、前記アミノ酸置換が配列番号２に示すアミノ酸配列において４３番目の位置であることを特徴とする請求項５又は６に記載の無細胞タンパク質合成キット。
【請求項８】
前記アミノ酸置換がリジンからスレオニンへの置換である請求項７に記載の無細胞タンパク質合成キット。
【請求項９】
Ｓ１２リボソームタンパク質遺伝子に突然変異を有する大腸菌より調製される無細胞タンパク質合成用抽出液と、
エネルギー再生系、少なくとも一種のアミノ酸、ヌクレオチド三リン酸、及びＲＮＡポリメラーゼからなる群より選択される少なくとも一種と、を含む無細胞タンパク質合成のための混合物。
【請求項１０】
前記突然変異がＳ１２リボソームタンパク質遺伝子にストレプトマイシンに対する耐性又は依存性を付与することを特徴とする、請求項９に記載の混合物。
【請求項１１】
前記突然変異が、Ｓ１２リボソームタンパク質にアミノ酸置換を引き起こす変異であって、前記アミノ酸置換が配列番号２に示すアミノ酸配列において４３番目の位置であることを特徴とする請求項９又は１０に記載の混合物。
【請求項１２】
前記アミノ酸置換がリジンからスレオニンへの置換である請求項１１に記載の混合物。
【請求項１３】
タンパク質をコードするポリヌクレオチドを調製し、
前記ポリヌクレオチドを請求項１〜４の何れか一項に記載の無細胞タンパク質合成用抽出液を用いて発現させる工程を含むことを特徴とする無細胞系によるタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｓ１２リボソームタンパク質遺伝子に突然変異を有する変異体大腸菌細胞から調製された抽出液、及び該抽出液を用いる無細胞系でのタンパク質合成方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞抽出液を用いる無細胞系タンパク質合成システムは、おもに遺伝子産物の同定や、その働きを調べるために用いられている。例えば、合成されたタンパク質の酵素活性やＤＮＡ結合能等の機能を調べたり、放射性同位元素で標識して翻訳産物の分子量を決定することができる。また、近年その合成量が飛躍的に増大する技術が開発されたことから、Ｘ線結晶構造解析やＮＭＲ等によるタンパク質の構造解析等へも利用されるようになってきた。
【０００３】
翻訳反応を行わせる抽出液は、大腸菌由来のもの、コムギ胚芽由来のもの、ウサギ網状赤血球由来のものが市販されている。大腸菌の抽出液としては、ズベイら（例えば、非特許文献１参照。）により報告されたＳ−３０無細胞抽出液がよく用いられている。大腸菌Ｓ−３０抽出液の調製には、ＲＮａｓｅＩ欠損株のＡ１９、Ｄ１０などの菌株が用いられるが、目的タンパク質がプロテアーゼによる分解を受けやすい場合にはｏｍｐＴエンドプロテアーゼとｌｏｎプロテアーゼ活性の欠損した大腸菌Ｂ株が用いられる場合もある。
【０００４】
クローン化したｃＤＮＡからｍＲＮＡを合成するためには、種々のプロモーターを有する適当なベクターに組み込むことが必要である。タンパク質の発現効率を上げるために、現在では強力なプロモーターであるＴ７、Ｔ３やＳＰ６などのファージ由来のポリメラーゼが用いられており、鋳型ＤＮＡの種類に適した種々の系に用いるシステムが市販されている。このような無細胞系を用いることにより、極めて簡便な方法でクローン化ＤＮＡを発現させることができ、細胞毒性のあるタンパク質も合成可能となる。
【０００５】
しかしながら、近年のゲノム解析の結果得られた数多くの遺伝子を系統的、網羅的に発現させると、発現量が相対的に少ないか又は全く発現しない遺伝子も存在することが分かっている。これらの遺伝子の発現量が低いことは、大量に発現する遺伝子に比べてその塩基配列の相違に基づく翻訳段階での効率低下が原因と考えられる。
【０００６】
一方、従来より放線菌の抗生物質耐性株においては２次代謝産物（抗生物質等）の生産能の増強が起こることが知られ、これらはリボソームタンパク質遺伝子の点突然変異に由来することが報告されている。これらの変異株では、Ｓ１２やＳ４リボソームタンパク質の点突然変異によって、１６ＳリボソームＲＮＡ（以下「１６ＳｒＲＮＡ」という。）の高次構造が変化し、ｍＲＮＡの読み取り効率に影響を与えることが示唆されているが（例えば、非特許文献２参照。）、このようなリボソームタンパク質の変異が放線菌の２次代謝産物の生産量を増強する機構については明らかではない。ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、及びリファンピシンに対する耐性を示す放線菌では、特定の転写調節タンパク質の発現が、増殖期において著しく増加することが報告されている（例えば、非特許文献３、ＦＩＧ．５参照。）。しかし、当該放線菌の細胞抽出液中での外来タンパク質の合成能については明らかではない。また、放線菌は他の細菌に比べて増殖速度が遅く、至適培養温度が低いなど、大量の細胞抽出液を供給するためには困難な点がある。
【０００７】
【非特許文献１】
ジェフリー・ズベイ（Ｇｅｏｆｆｒｅｙ  Ｚｕｂａｙ）、「アニュアル・レビュー・オブ・ジェネティクス（Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」１９７３年、  第７巻、ｐ．２６７−２８７
【非特許文献２】
ヨシコ・ホソヤ（Ｙｏｓｈｉｋｏ  Ｈｏｓｏｙａ）外３名、「アンチマイクロバイアル・エイジェンツ・アンド・ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ    Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）」１９９８年、第４２巻、ｐ．２０４１−２０４７
【非特許文献３】
ハイフォン・フー（Ｈａｉｆｅｎｇ  Ｈｕ）外１名、「アプライド・アンド・エンバイアロンメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」２００１年、第６７巻、ｐ．１８８５−１８９２
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は大腸菌の細胞抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系において、リボソーム上でのｍＲＮＡのコドンの読み取り効率を改善することによりタンパク質の生産性を向上させることを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ストレプトマイシンに対して耐性となった大腸菌株の培養特性やその抽出液のタンパク質合成活性等を調べた結果、Ｓ１２リボソームタンパク質の特定の部位に突然変異を有する大腸菌から調製した細胞抽出液が極めて高いタンパク質合成活性を有することを見出し、この知見に基づいて本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、第一の視点において、本発明の抽出液は、Ｓ１２リボソームタンパク質遺伝子に突然変異を有する大腸菌細胞から調製されることを特徴とする。
【００１１】
好ましい態様において、前記突然変異はストレプトマイシンに対する耐性又は依存性を付与する変異であることを特徴とする。さらに好ましくは、前記突然変異は、Ｓ１２リボソームタンパク質にアミノ酸置換を引き起こす変異であって、前記アミノ酸置換が配列番号２に示すアミノ酸配列において４３番目の位置であることを特徴とする。前記アミノ酸置換がリジンからスレオニンへの置換であることがさらになお好ましい。このアミノ酸置換を有するＳ１２リボソームタンパクによって、当該変異株はストレプトマイシン存在下においても増殖することができ、その細胞抽出液は高いタンパク質合成活性を示す。
【００１２】
本発明の他の視点において、Ｓ１２リボソームタンパク質遺伝子の突然変異を有する大腸菌より調製される無細胞タンパク質合成用抽出液と、エネルギー再生系、少なくとも一種のアミノ酸、ヌクレオチド三リン酸、及び／又はＲＮＡポリメラーゼを含む混合液と、を含む無細胞タンパク質合成キットが提供される。前記混合液は、タンパク質合成反応を行う際に混合して用いるが、あらかじめ前記大腸菌抽出液と混合されていてもよい。従って、本発明の他の視点において、前記大腸菌より調製される無細胞タンパク質合成用抽出液と、エネルギー再生系、少なくとも一種のアミノ酸、ヌクレオチド三リン酸、及びＲＮＡポリメラーゼからなる群より選択される少なくとも一種と、を含む無細胞タンパク質合成のための混合物が提供される。
【００１３】
更に異なる視点において、本発明は無細胞系によるタンパク質の合成方法を提供する。この方法は、まずタンパク質をコードするポリヌクレオチドを調製し、前記ポリヌクレオチドをＳ１２リボソームタンパク質遺伝子に突然変異を有する大腸菌より調製される無細胞タンパク質合成用抽出液を用いて発現させることを特徴とする。所望のポリヌクレオチドを発現させようとする場合、その塩基配列によっては、例えば、リボゾーム上でのコドン−アンチコドン対合に何らかの障害が生じるために著しく発現効率の悪い場合がある。本発明の方法によれば、Ｓ１２リボソームタンパク質が特定の変異を有することによってこのような問題を解決し、発現しにくいポリヌクレオチドの発現効率を向上することができるのである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
（Ｓ１２リボソームタンパク質変異体と抗生物質耐性機構）
本発明の大腸菌細胞抽出液は、Ｓ１２リボソームタンパク質に突然変異を有する大腸菌変異株を培養し、その菌体細胞から抽出される。ここで、Ｓ１２リボソームタンパク質とは、リボソームを構成するタンパク質の１種であって、大腸菌では１６ＳｒＲＮＡと結合し、小サブユニットを形成することが知られている。例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴのＡｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０２３６７には、大腸菌の３０Ｓリボソームを構成するＳ１２タンパク質のアミノ酸配列が登録されており、このアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００１５】
タンパク質の翻訳段階における様々な過程を触媒しているのは、タンパク質とＲＮＡからなる大きな複合体、リボソームである。リボソームは原核生物でも真核生物でも、構造や機能がよく似ており、大小１個ずつのサブユニットが集合して数百万ダルトンの複合体を作っている。小サブユニットはｍＲＮＡとｔＲＮＡの結合をつかさどり、大サブユニットはペプチド結合の形成を触媒する。
【００１６】
リボソーム上でのポリペプチド鎖の伸長は、まず、アミノアシルｔＲＮＡがリボソーム上でいわゆるＡ部位に結合し、その位置に現れたｍＲＮＡの３つのヌクレオチドと塩基対合を起こす。次に、Ａ部位の隣のＰ部位のｔＲＮＡ分子についているポリペプチド鎖のカルボキシ末端がはずれ、Ａ部位のｔＲＮＡ分子に結合しているアミノ酸とぺプチジル転移酵素の働きによりペプチド結合を作る。最後に、リボソームがｍＲＮＡに沿って正確に３ヌクレオチド分移動して、Ａ部位に新しくできたぺプチジルｔＲＮＡをＰ部位へ移す。
【００１７】
ストレプトマイシンやハイグロマイシン等のアミノグリコシド系抗生物質は、リボソームの翻訳校正能力を特異的に減少させ、ｍＲＮＡコドンの読み違いを誘導することが知られている。本発明の一つの実施形態として、Ｓ１２リボソームタンパク質の突然変異はストレプトマイシン等の抗生物質の存在下で生育可能な変異株をスクリーニングすることによって得ることができる。その結果、当該変異株のリボソームは、その構造やタンパク質翻訳過程における機能が変化することによって、一方では抗生物質耐性能を獲得すると共に、他方ではタンパク質の翻訳効率や校正能力にも大きな影響を与えるのである。
【００１８】
本発明の１つの実施形態において、タンパク質の翻訳効率が向上するような突然変異を有するＳ１２リボソームタンパク質の変異株が提供される。このような変異株としては、ストレプトマイシンに対する耐性又は依存性を付与するものでも、或いはそのような耐性又は依存性を付与しないものであっても、細胞抽出液のタンパク質合成活性が向上するものであれば何れでもよいが、好ましくは配列番号２に示すアミノ酸配列の４３番目のリジン、８６番目のアルギニン、８７番目のバリン、８８番目のリジン、８９番目のアスパラギン酸、９０番目のロイシン、９１番目プロリン、９２番目のグリシン、及び９４番目のアルギニンの何れかに置換が起こる場合に有利な効果が得られる。例えば４３番目のリジンの場合には、他の１９種類の天然のアミノ酸への置換が考えられるが、好ましくは親水性アミノ酸、特に好ましくはスレオニンに置換された場合に高いタンパク質合成活性が得られる。また、８８番目のリジンの場合についても他の１９種類の天然アミノ酸への置換、好ましくは親水性アミノ酸等が挙げられ、特にアルギニンへの置換は有利な効果を挙げる。９０番目のロイシンや９４番目のアルギニンに置換が起こった場合はストレプトマイシンに対する耐性は付与されないがタンパク質合成活性が向上する可能性がある。抗生物質の存在下でスクリーニングされた場合のＳ１２リボソームタンパク質の突然変異は、一般的には単一のアミノ酸置換変異であるが、複数の抗生物質を用いてスクリーニングすることにより２箇所以上のアミノ酸置換を同時に有する変異体を取得することができる。また、後述する部位特異的な変異導入と染色体ＤＮＡへの相同的組換えによって、Ｓ１２リボソームタンパク質に所望のアミノ酸置換を有する変異体大腸菌を作成することもできる。
【００１９】
これらの変異体大腸菌のうち、ストレプトマイシン存在下でも増殖可能なものは、リボソームの翻訳校正能力の向上、即ち、ｍＲＮＡコドンの認識がより正確になっている可能性がある。一般的にはコドン認識の正確性はｔＲＮＡとの親和性の低下を意味し、これによってリボソームのＡ部位へ競争的に結合する類似のｔＲＮＡから正しいｔＲＮＡをより厳しく選択できると考えられる。従って、本発明に係る変異体大腸菌の細胞抽出液は翻訳効率の向上によりタンパク質の合成量が増えると共に、コドン認識の正確性も向上すると考えられる。
【００２０】
（Ｓ１２リボソームタンパク質遺伝子に突然変異を有する大腸菌株のスクリーニング）
Ｓ１２リボソームタンパク質をコードする遺伝子（ｒｐｓＬ）に突然変異を有する大腸菌株は種々の方法によりスクリーニングすることができる。１つの方法としては、高濃度のストレプトマイシン存在下で増殖可能な大腸菌変異株を選択することによって得られる。このような大腸菌株は、例えば、大腸菌の溶液をそのまま、或いは紫外線処理した後に、最小生育阻止濃度の５〜１００倍（５０〜１０００μｇ／ｍｌ）のストレプトマイシンを含む寒天培地に塗布し、２〜７日以内に生じたコロニーとして得ることができる。大腸菌の菌株としては、大腸菌Ａ１９（ｒｎａ，ｍｅｔ）、ＢＬ２１、ＢＬ２１ｓｔａｒ、ＢＬ２１ｃｏｄｏｎｐｌｕｓ株等を使用することができる。
【００２１】
第２の方法としては、部位特異的変異の導入により所望のアミノ酸置換を生ずるようなｒｐｓＬ遺伝子を作製し、これをプラスミドＤＮＡにクローン化して大腸菌の染色体ＤＮＡに相同的組換え反応を利用して導入することができる。大腸菌のｒｐｓＬ遺伝子はすでに公知であり、その塩基配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋやＤＤＢＪ等のデータベースにＡｃｃ．Ｎｏ．Ｖ００３５５として登録されており、そのコード領域に対応する塩基配列を配列番号１に示す。大腸菌の染色体ＤＮＡからＰＣＲによりクローン化したｒｐｓＬ遺伝子に部位特異的に変異を導入して、Ｓ１２リボソームタンパク質の所望の位置にアミノ酸置換変異を導入することができる。クローン化したＤＮＡを試験管内において部位特異的に変異を導入する方法としては、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，  Ｔ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５４，  ３６７−３８２  （１９８７））、ダブルプライマー法（Ｚｏｌｌｅｒ，  Ｍ．  Ｊ．  ａｎｄＳｍｉｔｈ，  Ｍ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５４，  ３２９−３５０  （１９８７））、カセット変異法（Ｗｅｌｌｓ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ３４，  ３１５−３２３  （１９８５））、メガプライマー法（Ｓａｒｋａｒ，  Ｇ．  ａｎｄ  Ｓｏｍｍｅｒ，  Ｓ．  Ｓ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ８，  ４０４−４０７  （１９９０））等が挙げられる。次に、変異が導入されたＤＮＡ断片を相同的組換え用プラスミドベクターにクローン化する。このベクターは、例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子等を選択マーカーとして有する。部位特異的な変異を導入したｒｐｓＬ遺伝子が組み込まれたプラスミドをＤＮＡ組換え能力を持った大腸菌、例えば、ＢＬ２１株等に導入すると相同的組換えが生じる。導入したプラスミドと染色体ＤＮＡとの間で、２ヶ所において組換えが生じた２回組換え体は、ストレプトマイシン耐性能が付与されると共にクロラムフェニコールに対しては感受性を示す。このような２段階選択を行うことによって、所望のｒｐｓＬ遺伝子が染色体ＤＮＡに組み込まれた大腸菌を取得することができる（例えば、ホソヤら（前掲）参照）。
【００２２】
（変異体大腸菌細胞からの抽出液の調製）
大腸菌の抽出液としては、ズベイら（前掲）の報告と同様の方法により調製されたＳ−３０抽出液を用いることができる。大腸菌Ｓ−３０抽出液は、転写及び翻訳に必要な大腸菌の全ての酵素と因子を含んでいる。更に補充的な混合液を添加することができる。具体的な調製方法としては、まず最初に大腸菌を培養し、菌体を遠心分離等により回収する。回収された菌体は、洗浄後、緩衝液に再懸濁し、フレンチプレスやガラスビーズ、ワーリングブレンダー等を用いて破砕する。破砕された大腸菌の不溶物質を遠心分離で除去し、プレインキュベーション混合液と混合してインキュベーションする。この操作によって内在性のＤＮＡ、ＲＮＡが分解されるが、更に、カルシウム塩やマイクロコッカスのヌクレアーゼ等を添加して内在性の核酸を分解させてもよい。続いて、透析により内在性のアミノ酸、核酸、ヌクレオシド等を除き、適量ずつ分注して液体窒素又は−８０℃にて保存する。
【００２３】
タンパク質合成反応を行う際には、上記Ｓ−３０抽出液に、Ｔｒｉｓ−酢酸、ＤＴＴ、ＮＴＰｓ（ＡＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰ，及びＵＴＰ）、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、少なくとも一種のアミノ酸（天然の２０種類のアミノ酸の外それらの誘導体を含む。放射性同位元素でタンパク質を標識する場合には標識アミノ酸を除いた残りを添加する。）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、葉酸、ｃＡＭＰ、ｔＲＮＡ、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、グルタミン酸カリウム、及び至適濃度の酢酸マグネシウム等の一部あるいは全部を添加する。これらの補充的な混合液は、通常Ｓ−３０抽出液とは別に保存しておき、使用直前に混合するが、これらをＳ−３０抽出液とあらかじめ混合して凍結融解を行い、ＲＮＡ分解酵素複合体を除去することもできる（国際公開ＷＯ０１８３８０５号パンフレット参照）。
【００２４】
本発明において、エネルギー再生系としては好ましくは０．０２〜５μｇ／μｌのクレアチンキナーゼ（ＣＫ）と１０〜１００ｍＭのクレアチンホスフェート（ＣＰ）の組合せや、１〜２０ｍＭのホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）と０．０１〜１μｇ／μｌのピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）の組合せ等によるＡＴＰ再生系が使用可能であるが、これらに限定されない。上記ＰＫ及びＣＫは何れもＡＤＰをＡＴＰに再生する酵素であり、それぞれＰＥＰおよびＣＰを基質として必要とする。
【００２５】
これらの細胞抽出液又は補充的な混合液は、使用しやすいように一定量ごと分注して製品として配送することができる。これらの製品は凍結又は乾燥状態で保存することができ、保存及び輸送に適した容器に収容してキットとして販売される。キットには取扱説明書や陽性コントロールＤＮＡ、ベクターＤＮＡ等を添付することができる。
【００２６】
（無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質の合成）
無細胞タンパク質合成系でタンパク質を合成する方法としては、真核細胞の核と細胞質のように転写反応と翻訳反応を別の試験管で行う系と、両者を同時に行う転写翻訳共役系とがある。本発明のタンパク質の製造方法によれば、原核細胞である大腸菌の抽出液を用いるため何れの反応系も可能であるが、不安定なｍＲＮＡを直接扱わなくてすむ転写翻訳共役系が好ましい。
【００２７】
まず最初に、発現させたいタンパク質をコードするポリヌクレオチドを調製する。本発明において「タンパク質」とは、生物学的に活性を有する完全長のタンパク質、又はその一部のポリペプチド断片の何れでもよい。多くのタンパク質、特に真核生物のタンパク質は、遺伝子重複による進化の結果複数のドメイン構造を有するものが多く、各ドメインごとに特徴的な構造や機能を有することから、本発明の方法により発現させることが極めて有効である。目的のタンパク質をコードする核酸はＤＮＡでもＲＮＡでも良く、真核生物又は原核生物の細胞又は組織から公知の方法を用いて抽出することができる。ｃＤＮＡライブラリー等から公知の方法によりクローン化したＤＮＡでも良い。
【００２８】
クローニングされたｃＤＮＡからｍＲＮＡを試験管で合成するには、例えば、Ｔ７、Ｔ３やＳＰ６などのファージ由来の転写反応系、大腸菌由来の転写反応系等が挙げられる。この系を用いたｍＲＮＡ合成は、市販のキット、例えばＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ社）、ＲｉｂｏＭＡＸ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ社）などを利用して実施することができる。翻訳開始コドン（ＡＴＧ）とプロモーター間の５’非翻訳領域の距離と塩基配列は重要であり、大腸菌のＳＤ配列を含む必要がある。所望の遺伝子を適当なベクターに組み込んだ後、プラスミドＤＮＡはアルカリ−ＳＤＳ法、又はＤＮＡ結合樹脂などを用いて精製する。或いはこれらのプロモーターを含むプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片を鋳型として用いることもできる。多検体を同時に処理する場合にはきわめて簡便で迅速な方法として有用である。転写翻訳共役反応を用いる場合には、ここで調製したプラスミドＤＮＡ又はＰＣＲ産物は無細胞タンパク質合成系の鋳型として直接用いることができる。
【００２９】
反応液に透析膜、限外ろ過膜などを介してＡＴＰ、ＧＴＰ、アミノ酸、クレアチンリン酸などの小分子基質を供給し、あわせて老廃物を除去するセミバッチ方式、或いは膜を介して生産物も除去する連続式が報告されている。これらの手法により反応時間は５〜数十倍にも延長することができ、大量のタンパク質を合成することも可能である。例えば、木川ら（Ｋｉｇａｗａ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９９９，  ４４２：１５−１９）及び特開２０００−１７５６９５号公報に記載される方法では、上記反応液を分画分子量１００００以上、好ましくは５００００以上の透析膜の内部に入れ、反応液の５〜１０倍容量の透析外液（アミノ酸、エネルギー源等を含む。）に対して透析する。透析は、通常２０〜４０℃、好ましくは２３〜３０℃にて攪拌しつつ行い、反応速度の低下が認められる時点で新しい外液と交換する。最適化した無細胞タンパク質合成系での生産性は大腸菌などの細胞内における生産性をはるかに超えるものである。
【００３０】
【実施例】
本発明は以下の実施例においてより具体的に説明される。実施例は大腸菌ＢＬ２１を親株としてストレプトマイシン存在下で生育するコロニーをスクリーニングした結果得られた９種類の変異株について、タンパク質合成活性等の種々の性質を調べたものである。
【００３１】
（実施例１）大腸菌ＢＬ２１株からの変異株の取得
大腸菌ＢＬ２１株を親株として、ストレプトマイシン存在下で生育する変異株をスクリーニングした。自然突然変異によるストレプトマイシン耐性株を１５０株取得してｒｐｓＬ遺伝子全長のシーケンシングを行った。その結果、約８０％の耐性株がｒｐｓＬ遺伝子に変異を有することを確認した。これらのｒｐｓＬ変異は９種類であり、それぞれの代表株を表１に示した。表１において、表現型欄のＳｍＲはストレプトマイシン耐性を、ＳｍＤはストレプトマイシン依存性を表す。突然変異の位置は、配列番号１に示した塩基配列の位置における塩基置換を、アミノ酸置換は、配列番号２に示したアミノ酸配列の位置におけるアミノ酸置換を示す。なお、塩基及びアミノ酸を表す記号は一文字の略号を用いた。
【００３２】
【表１】大腸菌ＢＬ２１株から得られた変異株リスト
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【００３３】
（実施例２）抗生物質存在下での培養
実施例１で得られた大腸菌の変異株（Ｋ４３Ｔ、Ｋ４３Ｒ、及びＫ８８Ｒ）と親株（野生型ＢＬ２１）のそれぞれを２ｘＹＴ培地中、３７℃で培養したときの増殖曲線を図１に示した。図１には、培養開始後２時間から９時間までの間にサンプリングした試料の濁度（６００ｎｍの吸光度）を測定して菌体量を推定した。図１に示した何れの変異株も野生型であるＢＬ２１とほとんど変わらない増殖特性を示したが、培養８時間経過後の菌体量はＫ４３Ｔ変異株が最も多かった。
【００３４】
（実施例３）各種変異体大腸菌からの細胞抽出液の調製とＣＡＴアッセイによるタンパク質合成活性の比較
大腸菌Ｓ−３０抽出液はズベイら（前掲）の方法に従って、表１に示したそれぞれの菌株から調製した。タンパク質合成反応は下記の表２に示した組成の溶液に、ｐＫ７−ＣＡＴ（ＣＡＴ発現ベクター；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２３９，  ８８１−８８６，  １９９６参照）を１２０ｎｇ（４ｎｇ／μｌｘ３０μｌ）添加し、上記各大腸菌のＳ−３０抽出液７．２μｌを加えて全量を３０μｌとした反応溶液中で、３７℃、１時間バッチ法により行った。合成されたＣＡＴタンパク質の定量はＳｈａｗらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ７３５−７５５，  １９７５参照）に従い、その結果を図２に示した。
【００３５】
【表２】
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【００３６】
図２に示したように、Ｓ１２リボソームタンパク質の４３番目のアミノ酸の置換は、タンパク質合成活性に大きな影響を与えていることが分かる。特に、Ｋ４３Ｔの変異株は、野生型であるＢＬ２１の約１．３倍のタンパク質合成活性を示した。図２の下部に示した表には、それぞれの大腸菌株から調製した抽出液のタンパク質濃度と２６０ｎｍにおける吸光度（主に核酸の濃度を示す。）を示した。これらの結果より、各抽出液中のタンパク質量や核酸量のばらつきは、タンパク質合成活性とは直接関係ないことが分かる。
【００３７】
（実施例４）各種大腸菌変異株の特性評価
Ｍｇ２＋濃度を２０ｍＭと５ｍＭのそれぞれに設定して実施例３と同様の方法により野生型及び変異株大腸菌（Ｋ４３Ｔ，Ｋ４３Ｒ）のＳ−３０抽出液を調製した。これらの抽出液を６〜３８％のショ糖を含む緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，２０ｍＭ又は５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１００ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ，４．５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）の上にのせベックマンＳＷ２８ロータを用いて１７０００ｒｐｍ、１７時間超遠心分離を行った後、０．８ｍｌずつのフラクションに分画した。縦軸は２６０ｎｍの吸光度を測定してリボソームの存在画分を推定した。その結果を図３に示した。
図３の結果によれば、野生型大腸菌では、Ｍｇ２＋濃度が５ｍＭに低下すると７０Ｓリボソームの一部が解離して３０Ｓサブユニットが出現していることが分かる。Ｋ４３Ｒ変異体はこの傾向が大きく、低Ｍｇ２＋濃度でかなりの割合で７０Ｓリボソームが５０Ｓと３０Ｓのサブユニットに分離していた。これに対し、Ｋ４３Ｔ変異体は、低Ｍｇ２＋濃度においてもほとんど７０Ｓリボソームの解離が起こっていないことが分かる。この結果より、Ｓ１２リボソームタンパク質にＫ４３Ｔの変異が起こることによって、リボソーム全体の構造が安定化していることが示唆される。
【００３８】
（実施例５）種々のマウスｃＤＮＡからのタンパク質合成
種々のマウスｃＤＮＡを鋳型として、野生型及びＫ４３Ｔ変異体大腸菌のＳ−３０抽出液を用いて無細胞タンパク質合成反応を行い、タンパク質合成活性を評価した。マウスｃＤＮＡライブラリーから得られた３種類のクローン（ＤＤＢＪＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＫ００３６２２，  ＡＫ０１０３９９，  ＡＫ０１９４８７）を鋳型として、２段階ポリメラーゼ連鎖反応（２段階ＰＣＲ）法により、これらのｃＤＮＡにＴ７プロモーター、ＳＤ配列、Ｔ７ターミネーターを付加したＤＮＡ断片を調製した。まず、表３に示した塩基配列のプライマー対を用いて第１次ＰＣＲを行った。
【００３９】
【表３】
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【００４０】
各プライマー濃度はそれぞれ０．２５μＭとし、ＤＮＡポリメラーゼ（ロッシュ社製）を添加後、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２分間のサイクルを１０回、続いて９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２分＋１サイクルごとに５秒間延長したサイクルを２０回、最後に７２℃で７分間の伸長反応を１回行った。
【００４１】
次に、上記反応によって得られたそれぞれの第１次ＰＣＲ産物と、Ｔ７プロモーター配列の下流にヒスチジンタグ配列を有する５’プライマー：５’−ＧＣＴＣＴＴＧＴＣＡＴＴＧＴＧＣＴＴＣＧＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴＣＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＧＡＴＴＡＣＧＡＴＡＴＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＧＡＡＡＡＣＣＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＧＧＧＡＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＣＣＴＣＧＧＧ−３’（Ｔ７Ｐ−ＤＭ５−ＫＨ６、配列番号９）、Ｔ７ターミネーター配列を有する３’プライマー：５’−ＣＧＧＧＧＣＣＣＴＣＧＴＣＡＧＧＡＴＡＡＴＡＡＴＴＧＡＴＴＧＡＴＧＣＴＧＡＧＴＴＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＡＣＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＴＡＡＣＴＡＧＣＡＴＡＡＣＣＣＣＴＴＧＧＧＧＣＣＴＣＴＡＡＡＣＧＧＧＴＣＴＴＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＧＣＴＧＡＡＡＧＧＡＧＧＡＡＣＴＡＴＡＴＣＣＧＧＡＴＡＡＣＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＧＡＡＧＣＡＣＡＡＴＧＡＣＡＡＧＡＧＣ−３’（Ｔ７Ｔ−ＤＭ３−Ｔｅｒｍ、配列番号１０）、及びユニバーサルプライマー：５’−ＧＣＴＣＴＴＧＴＣＡＴＴＧＴＧＣＴＴＣＧ−３’Ｕ２、配列番号１１）とを用いて第２次ＰＣＲを行った。第２次ＰＣＲ溶液中での５’プライマーと３’プライマーの濃度はそれぞれ０．０５μＭ，ユニバーサルプライマーの濃度は１μＭとし、第１次ＰＣＲと同じ増幅反応条件を用いた。続いて、これらのＤＮＡ断片をＴＯＰＯ  ＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｐＰＣＲ２．１にクローン化し、各発現ベクター（クローンＡ：Ｐ０１１１１４−１０、クローンＢ：Ｐ０２０１０７−１７、クローンＣ：Ｐ０２０４０８−０１）を構築した。
【００４２】
実施例３と同様の方法により、表２に示した組成の反応溶液３０μｌに、クローンＡ〜Ｃの各発現ベクターを、表４に示した濃度となるように添加し、３７℃で１時間、バッチ法によりタンパク質合成反応を行った。合成反応終了後、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビーズで粗精製を行った後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、蛍光色素ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎｓ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）でタンパク質を染色した。合成タンパク質の分子量に相当するバンドをルミノイメージアナライザーＬＡＳ−１０００（富士写真フィルム社製）により検出、定量した。このようにして測定した３種類のタンパク質の合成量を、野生型に対するＫ４３Ｔ変異株の比で表した結果を以下の表４に示した。Ａ、Ｂ、Ｃのいずれのクローンも野生型の大腸菌抽出液中での発現量よりも、Ｋ４３Ｔ変異株から調製した抽出液中での発現量の方が１．５〜２倍以上も多いことが分かった。
【００４３】
【表４】種々のマウスｃＤＮＡを用いた合成活性の比較
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【００４４】
【発明の効果】
本発明に係る変異体大腸菌より調製した細胞抽出液は、Ｓ１２リボソームタンパク質に特定の変異を有しており、野生型と比較して有意に高いタンパク質合成活性を示す。この変異体Ｓ１２リボソームタンパク質は、翻訳段階でのｍＲＮＡのコドンの読み取り効率に影響を与えている可能性があることから、従来の方法では合成量の少なかったｍＲＮＡの発現効率を飛躍的に高める可能性がある。特に、本発明に係る変異体大腸菌のうち、ストレプトマイシンの存在下でも増殖する株は、培養中に他の菌体の夾雑を防ぐことが容易になり、効率よく無細胞タンパク質合成のための抽出液を調製することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】野生型及びＳ１２リボソームタンパク質に変異を有する大腸菌の増殖特性を、培養時間に対する培養液の濁度（ＯＤ６００）で示した図である。全ての株について２ｘＹＴ培地中、３７℃で培養した。
【図２】野生型及びＳ１２リボソームタンパク質に変異を有する大腸菌の抽出液を用いてＣＡＴ合成量を測定した結果である。ＣＡＴの合成は、バッチ法にて３７℃、１時間行った。
【図３】野生型及びＳ１２リボソームタンパク質に変異を有する大腸菌のＳ−３０抽出液を異なる濃度のＭｇ２＋存在下でショ糖密度勾配超遠心分離により分画した結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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