(57)【要約】      （修正有）【課題】ゲノムＤＮＡのＧ／Ｔミスマッチに起因する様々なヒト疾患を予防もしくは改善するための新規薬剤を提供する。【解決手段】ヒトの色素性乾皮症（ＸＰ）に関連する遺伝子に由来する特定のポリペプチドのアミノ酸配列またはその変異配列からなるポリペプチド、またはこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが細胞内に導入可能な形態を有する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列またはその変異配列からなるポリペプチドＸＰＣをコードするポリヌクレオチドが細胞内に導入可能な形態を有するＤＮＡ損傷修復剤。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列またはその変異配列からなるポリペプチドＸＰＣが細胞内に導入可能な形態を有するＤＮＡ損傷修復剤。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸配列またはその変異配列からなるポリペプチドＸＰＣと同等またはそれ以上のＤＮＡ損傷修復活性を有する物質を特定する方法であって、
（１）Ｇ／Ｔミスマッチ塩基対を含む２本鎖オリゴヌクレオチド集団に、チミンＤＮＡグリコシラーゼおよびポリペプチドＸＰＣを反応させた場合のミスマッチＴ塩基除去オリゴヌクレオチド量；および
（２）前記（１）と同一のオリゴヌクレオチド集団に、チミンＤＮＡグリコシラーゼおよび候補物質を反応させた場合のミスマッチＴ塩基除去オリゴヌクレオチド量、
をそれぞれ測定し、（１）量と（２）量が等量、または（１）量より（２）量が多くなる候補物質を目的物質とすることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸配列またはその変異配列からなるポリペプチドＸＰＣのＤＮＡ損傷修復活性を増強する物質を特定する方法であって、
（１）Ｇ／Ｔミスマッチ塩基対を含む２本鎖オリゴヌクレオチド集団に、チミンＤＮＡグリコシラーゼおよびポリペプチドＸＰＣを反応させた場合のミスマッチＴ塩基除去オリゴヌクレオチド量；および
（２）前記（１）と同一のオリゴヌクレオチド集団に、チミンＤＮＡグリコシラーゼ、ポリペプチドＸＰＣおよび候補物質を反応させた場合のミスマッチＴ塩基除去オリゴヌクレオチド量、
をそれぞれ測定し、（１）量より（２）量が多くなる候補物質を目的物質とすることを特徴とするスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、ＤＮＡ損傷修復剤とスクリーニング方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、チミンＤＮＡグリコシラーゼ（ＴＤＧ）が関与する塩基除去修復反応を促進することによってＤＮＡ損傷を修復する薬剤と、そのような薬剤の新規成分を特定するためのスクリーニング方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生物には様々なＤＮＡ損傷を除去する複数のＤＮＡ修復経路があり、これによってゲノムの安定性と細胞機能が維持されている（非特許文献１、２）。このようなＤＮＡ修復経路の一つである塩基除去修復（ＢＥＲ）は、自然発生的、または環境誘導性の様々な塩基損傷を修正する（非特許文献３、４、５）。ＢＥＲの開始はＤＮＡグリコシラーゼという酵素により行われるが、この酵素はＮ−グリコシド結合を加水分解することにより、ＤＮＡのリン酸−糖骨格から異常塩基、または不適切な塩基を切り離す。脊椎動物では、結果的に生じた脱プリン／脱ピリミジン部位（ＡＰ部位）が次にＡＰエンドヌクレアーゼ（ＡＰＥ、あるいはＨＡＰ１、ＡＰＥＸ、Ｒｅｆ−１とも呼ばれる）により切断され、５’−デオキシリボース−５−リン酸と３’−ヒドロキシル末端が残される（非特許文献６）。さらに、一部のＤＮＡグリコシラーゼは内因性のＡＰリアーゼ活性を持っており、この場合にはＡＰ部位の３’側が切断される（非特許文献７）。ＡＰＥはＡＰ部位の５’側を切断する活性に加えて、ＤＮＡ  ３’−ホスホジエステラーゼや３’−ホスファターゼなどの酵素活性を併せ持っており、後者のＡＰリアーゼ活性が働いた結果残された中間体の処理にも関係している。すなわちＡＰＥの後者の活性は、ＡＰリアーゼにより残された３’−末端をヒドロキシル基に変換し、それに続くＤＮＡ修復合成においてＤＮＡポリメラーゼがプライマーとして利用できるようにするのに寄与している（非特許文献６）。ＢＥＲ反応の最終段階であるＤＮＡ修復合成とＤＮＡ鎖再結合には、ＤＮＡポリメラーゼβが関与するショートパッチ修復経路と、ＰＣＮＡ依存性のロングパッチ修復経路の少なくとも２種類のメカニズムが存在することが示されている（非特許文献８）。
【０００３】
加水分解による脱アミノ化は、ＤＮＡ塩基に対して最も頻繁に生じる自然発生的な損傷の一つである。脊椎動物のゲノムでは、ＣｐＧジヌクレオチド部位のシトシンがＣ５部位でメチル化されることが多く、その結果生じた５−メチルシトシンの脱アミノ化の結果、チミンがグアニンに対して誤った塩基対を形成することになる（非特許文献１）。このようなＧ／Ｔミスマッチが修正される前にＤＮＡが複製されてしまうと、本来のＧ：Ｃ塩基対がＡ：Ｔに変化することになる。このためＣｐＧ部位は変異に対して非常に感受性が高い。これらの変異は、チミンＤＮＡグリコシラーゼ（ＴＤＧ；概説は非特許文献９を参照）によって開始されるＢＥＲ経路を介したＧ／Ｔミスマッチ修正により抑制される。
【０００４】
ＤＮＡ修復のもう一つの重要な経路はヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）である。ＮＥＲによって除去可能なＤＮＡ損傷は、二重らせん構造に歪みを与えるような各種の塩基損傷（例えば、紫外線（ＵＶ）によって誘導されたシクロブタン型ピリミジン二量体（ＣＰＤ）や（６−４）光産物など、あるいは種々の化学物質により誘導されたＤＮＡ鎖内架橋、およびかさの大きな塩基付加物など）である（非特許文献１０）。ＮＥＲ活性の欠損は、色素性乾皮症（ＸＰ）を含む幾つかのヒト遺伝性疾患に関係している。ＸＰの臨床症状はＵＶ曝露に対する皮膚の様々な過敏症状、および皮膚癌発症率の亢進により特徴づけられる。ＮＥＲに欠損を示すＸＰの遺伝的相補性群が現在まで７種類同定されており（ＸＰ−Ａ群からＧ群）、それぞれの群の原因となる遺伝子がクローニングされている。ＸＰ−Ｃ群の患者はそれ以外の大多数のＸＰ群とは異なり、２種類のＮＥＲ副経路のうちゲノム全体で働くグローバルゲノムＮＥＲだけに欠損が見られる。もう一方の経路である転写と共役したＮＥＲ（活性遺伝子の転写鎖上にある損傷を特異的に除去する）はＸＰ−Ｃ群患者では正常に機能している。ＸＰ−Ｃ群の責任遺伝子産物であるＸＰＣタンパク質は、細胞内においてセントリン２、および出芽酵母Ｒａｄ２３ｐに相同な２種類の哺乳類ホモローグのうちの一つであるＨＲ２３Ｂと結合し、ヘテロ３量体として存在している（非特許文献１１、１２、１３）。複合体中でのセントリン２の役割は未解決であるが、ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ複合体の形成が無細胞ＮＥＲ反応の再構成に必要であることが示されている（非特許文献１４、１５、１６、１７）。生化学的な研究から、ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂがある種のＤＮＡ損傷に特異的に結合し、ＮＥＲ反応を開始させることが明らかになっている（非特許文献１５、１８、１９）。このため、ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂはゲノム全体で働くＮＥＲ機構において損傷認識因子として機能していると考えられている。そしてこの出願の発明者らは、ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂが、損傷そのものの構造特性を認識するのではなく、むしろ損傷により二重鎖ＤＮＡに誘起された構造異常を認識すること、さらには二重鎖および一本鎖ＤＮＡの境界を含む特異的なＤＮＡ構造が選択的に認識される可能性がある点を示している（非特許文献２０、２１）。
【０００５】
ただし、このＸＰＣタンパク質が、ＮＥＲ経路ではなく、ＢＥＲ経路（特にＴＤＧが関与するＧ／Ｔミスマッチの修復経路）に関与することは、従来、全く知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
前記のとおり、ゲノムＤＮＡにおけるＧ／Ｔミスマッチは生理的条件下で高頻度に発生するものであり、このＤＮＡ損傷によって誘起される突然変異は細胞の機能低下やがん化、老化、遺伝病等の様々なヒト疾患に関係していると考えられる。そこで、このＧ／Ｔミスマッチを認識して解消するためのＤＮＡ修復反応を開始する酵素ＴＤＧを人為的に賦活化することができれば、Ｇ／Ｔミスマッチに起因する様々なヒト疾患を予防もしくは改善することが可能になるものと期待される。
【０００７】
ＴＤＧ活性を促進する因子の候補としてはＡＰＥを挙げることができる。ＡＰＥがＴＤＧの酵素学的な代謝回転を促進することが知られているからである（非特許文献２２）。しかしながら、ＡＰＥがＤＮＡ上でＴＤＧと相互作用してＴＤＧの活性そのものを促進しているという証拠は存在しない。また、ＡＰＥはそれ自身が塩基除去修復に必須な因子であることに加え、もともと細胞内での発現レベルが高いため、外来性ＡＰＥの細胞内導入や外来性ＡＰＥ遺伝子の細胞内発現による顕著な効果は期待できない。さらに、ＡＰＥは動物個体の生存に必須であり、塩基除去修復以外にも転写因子の活性調節等にも関与することが知られているので、外来性ＡＰＥの人為的導入や外来性ＡＰＥ遺伝子の強制発現は動物個体や細胞の正常な遺伝子発現調節に影響を及ぼすなどの弊害をもたらす危険性が高い。
【０００８】
この出願の発明者らは、ＴＤＧ活性を促進する因子を探索した結果、従来はヌクレオチド除去修復機構（ＮＥＲ）に関与する因子として知られていたＸＰＣタンパク質が、ＴＤＧと相互作用してその活性を促進させ、Ｇ／Ｔミスマッチを極めて効果的に修復することを見出した。
【０００９】
この出願の発明は、発明者らによるこの新規な知見に基づき、Ｇ／ＴミスマッチによるＤＮＡ損傷を効果的に修復する新しい薬剤を提供することを課題としている。
【００１０】
またこの出願の発明は、ＴＤＧとＸＰＣタンパク質との相互作用を指標として、ＴＤＧ酵素の活性をＸＰＣタンパク質と同等またはそれ以上に促進する新規物質、またはＴＤＧ酵素とＸＰＣタンパク質との相互作用をさらに増強することのできる新規物質をスクリーニングする方法を提供することを課題としている。
【００１１】
【非特許文献１】
Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ，  Ｅ．  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，  ＡＳＭ  ｐｅｒｓｓ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．  Ｄ．  Ｃ．
【非特許文献２】
Ｈｏｅｉｊｍａｋｅｒｓ，  Ｊ．  Ｈ．  Ｊ．  （２００１）  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１１，  ３６６−３７４．
【非特許文献３】
Ｋｒｏｋａｎ，  Ｈ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ４７６，  ７３−７７．
【非特許文献４】
ＭｃＣｕｌｌｏｕｇｈ，  Ａ．  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ６８，  ２５５−２８５．
【非特許文献５】
Ｎｉｌｓｅｎ，  Ｈ．  ａｎｄ  Ｋｒｏｋａｎ，  Ｈ．  Ｅ．  （２００１）  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，  ２２，  ９８７−９９８．
【非特許文献６】
Ｗｉｌｓｏｎ  ＩＩＩ，  Ｄ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ｂａｒｓｋｙ，  Ｄ．  （２００１）  Ｍｕｔａｔ．  Ｒｅｓ．，  ４８５，  ２８３−３０７．
【非特許文献７】
ＭｃＣｕｌｌｏｕｇｈ，  Ａ．  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ６８，  ２５５−２８５．
【非特許文献８】
Ｎｉｌｓｅｎ，  Ｈ．  ａｎｄ  Ｋｒｏｋａｎ，  Ｈ．  Ｅ．  （２００１）  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，  ２２，  ９８７−９９８．
【非特許文献９】
Ｈａｒｄｅｌａｎｄ，  Ｕ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ２１，  １４５６−１４６４．
【非特許文献１０】
ｄｅ  Ｌａａｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，  １３，  ７６８−７８５．
【非特許文献１１】
Ａｒａｋｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７６，  １８６６５−１８６７２．
【非特許文献１２】
Ｍａｓｕｔａｎｉ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １３，  １８３１−１８４３．
【非特許文献１３】
Ｓｈｉｖｊｉ，  Ｍ．  Ｋ．  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６９，  ２２７４９−２２７５７．
【非特許文献１４】
Ａｒａｕｊｏ，  Ｓ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）    Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，  １４．  ３４９−３５９．
【非特許文献１５】
Ｂａｔｔｙ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ３００，  ２７５−２９０．
【非特許文献１６】
Ｍｕ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７０，  ２４１５−２４１８．
【非特許文献１７】
Ｓｕｇａｓａｗａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １７，  ６９２４−６９３１．
【非特許文献１８】
Ｋｕｓｕｍｏｔｏ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｍｕｔａｔ．  Ｒｅｓ．，  ４８５，  ２１９−２２７．
【非特許文献１９】
Ｓｕｇａｓａｗａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ，  ２，  ２２３−２３２．
【非特許文献２０】
Ｓｕｇａｓａｗａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，  １５，  ５０７−５２１．
【非特許文献２１】
Ｓｕｇａｓａｗａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ，  １，  ９５−１０７．
【非特許文献２２】
Ｗａｔｅｒｓ，  Ｔ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７４，  ６７−７４．
【００１２】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するための第１の発明として、配列番号２のアミノ酸配列またはその変異配列からなるポリペプチドＸＰＣをコードするポリヌクレオチドが細胞内に導入可能な形態を有するＤＮＡ損傷修復剤を提供する。
【００１３】
この出願はまた、第２の発明として、配列番号２のアミノ酸配列またはその変異配列からなるポリペプチドＸＰＣが細胞内に導入可能な形態を有するＤＮＡ損傷修復剤を提供する。
【００１４】
さらにこの出願は、第３の発明として、配列番号２のアミノ酸配列またはその変異配列からなるポリペプチドＸＰＣと同等またはそれ以上のＤＮＡ損傷修復活性を有する物質を特定する方法であって、
（１）Ｇ／Ｔミスマッチ塩基対を含む２本鎖オリゴヌクレオチド集団に、チミンＤＮＡグリコシラーゼおよびポリペプチドＸＰＣを反応させた場合のミスマッチＴ塩基除去オリゴヌクレオチド量；および
（２）前記（１）と同一のオリゴヌクレオチド集団に、チミンＤＮＡグリコシラーゼおよび候補物質を反応させた場合のミスマッチＴ塩基除去オリゴヌクレオチド量、
をそれぞれ測定し、（１）量と（２）量が等量、または（１）量より（２）量が多くなる候補物質を目的物質とすることを特徴とするスクリーニング方法を提供する。
【００１５】
またさらにこの出願は、第４の発明として、配列番号２のアミノ酸配列またはその変異配列からなるポリペプチドＸＰＣのＤＮＡ損傷修復活性を増強する物質を特定する方法であって、
（１）Ｇ／Ｔミスマッチ塩基対を含む２本鎖オリゴヌクレオチド集団に、チミンＤＮＡグリコシラーゼおよびポリペプチドＸＰＣを反応させた場合のミスマッチＴ塩基除去オリゴヌクレオチド量；および
（２）前記（１）と同一のオリゴヌクレオチド集団に、チミンＤＮＡグリコシラーゼ、ポリペプチドＸＰＣおよび候補物質を反応させた場合のミスマッチＴ塩基除去オリゴヌクレオチド量、
をそれぞれ測定し、（１）量より（２）量が多くなる候補物質を目的物質とすることを特徴とするスクリーニング方法を提供する。
【００１６】
この出願の前記発明において、「ＤＮＡ損傷修復」とは、ゲノムＤＮＡ中の５−メチルシトシンの脱アミノ化によって生じるＧ／Ｔミスマッチの修復を意味する。さらに詳しくは、チミンＤＮＡグリコシダーゼ（ＴＤＧ）が関与するミスマッチ塩基除去修復を意味する。
【００１７】
「ポリペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）によって直線的配列で互いに結合した２１個以上のアミノ酸残基の直線的配列から構成された分子を意味する。
【００１８】
「ポリヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジンが糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ；またはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）が１０１個以上結合した分子を言い、「オリゴヌクレオチド」とは２−９９個連結した分子を言う。
【００１９】
この発明における「ポリペプチドＸＰＣ」とは、公知のヒトＸＰＣタンパク質（Ｍａｓｕｔａｎｉ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １３（８）：  １８３１−１８４３，  １９９４；  ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ＿００４６２８）と同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドであある。また、このポリペプチドＸＰＣの「変異体」とは、ポリペプチドＸＰＣをコードするポリヌクレオチドにおける一塩基多型（ＳＮＰｓ）の結果として生じたアミノ酸置換を含むタンパク質である。ポリペプチドＸＰＣの配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ＿００４６２８）には複数のＳＮＰｓが開示されており、これらのうち、表１に示すタンパク質変異が公知である（例えば、表１の第１段は、配列番号１の第６１番目ｃがｇに置換した結果、配列番号２に示したアミノ酸配列における第１６番目Ｌｅｕ残基がＶａｌ残基に置換することを示す。また塩基置換によってもアミノ酸置換を伴わないもの［サイレント変異］は括弧内に示した）。また「変異体をコードするポリヌクレオチド」とは、表１に示したＳＮＰｓを含むポリヌクレオチドを意味する。
【００２０】
【表１】
2004173599.tif 000002
【００２１】
第３発明および第４発明において、「同等」および「等量」とは、比較測定された数値が±５％以内であることを意味し、「同等以上」および「多い」とは比較測定された数値が６％以上であることを意味する。
【００２２】
この発明におけるその他の用語については、発明の実施形態および実施例において適宜に説明する。
【００２３】
なお、この発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、薬剤の調製はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｅｄ．  Ａ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ，  １９９０、遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９；  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ，  １９９５）等に記載されている。
【００２４】
以下、各発明の実施形態を詳しく説明する。
【００２５】
【発明の実施の形態】
第１発明のＤＮＡ損傷修復剤は、ゲノムＤＮＡ上で塩基除去修復酵素ＴＤＧと相互作用することによってＴＤＧ活性を促進させ、Ｇ／Ｔミスマッチを効率よく修復することのできるポリペプチドＸＰＣをコードするポリヌクレオチドを含有する薬剤である。具体的には、この薬剤は、配列番号２のアミノ酸配列またはその変異配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが細胞内に導入可能な形態を有することを特徴としている。
【００２６】
このポリヌクレオチドは、好ましくはＸＰＣタンパク質をコードするｃＤＮＡであり、その配列は配列番号１のとおりである。ｃＤＮＡは例えば、配列番号１の塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて既存のヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。またオリゴヌクレオチドプライマーとヒト細胞から抽出したＲＮＡ分子を用いたＲＴ−ＰＣＲ法によっても目的とするｃＤＮＡ断片を得ることができる。
【００２７】
ポリヌクレオチドは、発現ベクターに組み込むようにすることができる。発現ベクターは、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する公知の真核細胞用発現ベクターを使用することができ、この発現ベクターのクローニングサイトに、ポリペプチドＸＰＣをコードするポリヌクレオチドを挿入することによってポリペプチドＸＰＣ発現ベクターを構築することができる。またｃＤＮＡを使用する場合、配列番号１のタンパク質コード領域を構成する塩基配列（１６−２８３８番塩基）からなるＤＮＡ断片を使用することもできる。
【００２８】
薬剤形態としては、ポリペプチド発現ベクターを、例えば生体認識分子を提示した中空ナノ粒子、または公知のウイルスベクター（レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等）に組み込むようにすればよい。このような薬剤を遺伝子治療の手法により生体内に導入することによって、細胞内でポリペプチドＸＰＣを発現させることができる。発現したＸＰＣは細胞内でＨＲ２３Ｂタンパク質と複合体を形成し、ＴＤＧによるＧ／Ｔミスマッチ修復活性を促進する。なお、ポリペプチドＸＰＣは核移行シグナル（核局在性ドメイン）を有するため、細胞内で発現したＸＰＣは核内に移行し、ゲノムＤＮＡ上で酵素ＴＤＧと相互作用する。
【００２９】
第２発明のＤＮＡ損傷修復剤は、ポリペプチドＸＰＣそれ自体が細胞内に導入可能な形態を有することを特徴とする。例えば、このポリペプチドの構造や機能を変更することなく、かつ薬理学的に許容される担体溶液にこのポリペプチドを混合して製剤化することができる。そしてこのような薬剤は、例えばマイクロインジェクション法により細胞内に導入することができる。あるいは脂質による細胞内導入法（ＢｉｏＰＯＲＴＥＲ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）、Ｃｈａｒｉｏｔ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ社、米国）等）を採用することもできる。
【００３０】
ポリペプチドＸＰＣは、配列番号２のアミノ酸配列に基づいてペプチドを化学合成する方法や、前記の発現ベクターからのインビトロ転写翻訳系や、発現ベクターによる形質転換細胞の発現産物としてポリペプチドを単離精製する方法等によって取得することができる。例えば、ポリペプチドＸＰＣをインビトロ翻訳で発現させる場合には、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する発現ベクターを、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すれば、ポリペプチドをインビトロで生産することができる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７  １８、ｐＴ７／３  １９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩなどが例示できる。また、ポリペプチドＸＰＣを、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに前記のＤＮＡ断片を組込んで発現ベクターを作成する。この発現ベクターで宿主細胞を形質転換すれば、ポリペプチドＸＰＣを発現する形質転換体細胞を得ることができ、この形質転換体を培養すれば、その培養物から目的のポリペプチドＸＰＣを大量生産することができる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。さらに、ポリペプチドＸＰＣを真核細胞で発現させる場合には、前記のＤＮＡ断片を、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作製する。このベクターを真核細胞内に導入すれば、目的のポリペプチドＸＰＣを発現する形質転換真核細胞を得ることができる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。真核細胞としては、ヒト胎児腎臓細胞ＨＥＫ２９３、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、あるいはヒト臓器から単離した初代培養細胞などが使用できる。出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞なども使用できる。発現ベクターを細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。形質転換細胞で発現させたポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００３１】
第２発明の薬剤の別の態様として、ポリペプチドＸＰＣのＮ末端側に細胞膜通過ペプチドを連結させた融合ポリペプチドを使用することもできる。この細胞膜通過ペプチドを備えることによって、生体内に注入されたポリペプチドＸＰＣは細胞膜を通過して細胞内に取り込まれ、核内に移行し、酵素ＴＤＧと相互作用してＧ／Ｔミスマッチを効率的に修復する。細胞膜通過ペプチドとしては、ＨＩＶ−１・ＴＡＴのＰＴＤ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）（Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８５：１５６９−１５７２，  １９９９；  ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ．  Ｕ３９３６２  Ｍ９６１５５）、またはショウジョウバエのホメオボックスタンパク質アンテナペディアのＰＴＤ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＥ００１５７３）を採用することができる。融合ポリペプチドは、ＰＴＤをコードするＤＮＡ断片とポリペプチドＸＰＣ  ｃＤＮＡを連結して融合ＤＮＡ断片を作成し、この融合ＤＮＡ断片を大腸菌等の宿主細胞で発現させることによって作成することができる。また、２価の架橋剤（例えば、ＥＤＣやβ−アラニン等）を介して、ポリペプチドＸＰＣとＰＴＤペプチドを結合させる方法によって細胞膜通過ペプチドを連結した融合ポリペプチドを作成することもできる。
【００３２】
第３発明は、ポリペプチドＸＰＣと同等またはそれ以上のＤＮＡ損傷修復活性を有する物質を特定するスクリーニング方法である。この方法では、
（１）Ｇ／Ｔミスマッチ塩基対を含む２本鎖オリゴヌクレオチド集団に、ＴＤＧおよびポリペプチドＸＰＣを反応させた場合のミスマッチＴ塩基除去オリゴヌクレオチド量；および
（２）前記（１）と同一のオリゴヌクレオチド集団に、ＴＤＧおよび候補物質を反応させた場合のミスマッチＴ塩基除去オリゴヌクレオチド量、
をそれぞれ測定し、（１）量と（２）量が等量、または（１）量より（２）量が多くなる候補物質を目的のＤＮＡ損傷修復物質として特定する。
【００３３】
「Ｇ／Ｔミスマッチ塩基対を含む２本鎖オリゴヌクレオチド」は、２−９９塩基からなる相補的な合成オリゴヌクレオチドがアニールしており、その配列中の中央付近に１箇所のＧ／Ｔミスマッチ塩基対を有する分子（以下「ＤＮＡ基質」と記載することがある）であり、例えば図２（ｂ）に示した６０塩基対の２本鎖オリゴヌクレオチドを例示することができる（図２（ｂ）の上段は配列番号３、下段は配列番号４に示す）。この図２（ｂ）の２本鎖オリゴヌクレオチドは、上段５’側から２７番目のＧに対して下段３’側から２７番目がＴである（Ｇ／Ｔミスマッチ）。
【００３４】
このようなＧ／Ｔミスマッチを含むＤＮＡ基質は、ＴＤＧによってミスマッチＴ塩基が除去されて「Ｔ塩基除去オリゴヌクレオチド」となるが、後記の実施例に示したように、ＴＤＧとＸＰＣとが作用することによって、Ｔ塩基除去オリゴヌクレオチドの量は増加する。従って、［ＴＤＧ＋ＸＰＣ］によって得られるＴ塩基除去オリゴヌクレオチドの量（１）と、［ＴＤＧ＋候補物質］の作用によって得られるＴ塩基除去オリゴヌクレオチドの量（２）を比較し、（１）量と（２）量が等量、または（１）量より（２）量が多くなる候補物質は、ＸＰＣと同等またはそれ以上のＤＮＡ損傷修復活性を有する物質と判定することができる。
【００３５】
また第４の発明では、［ＴＤＧ＋ＸＰＣ］によって得られるＴ塩基除去オリゴヌクレオチドの量（１）と、［ＴＤＧ＋ＸＰＣ＋候補物質］の作用によって得られるＴ塩基除去オリゴヌクレオチドの量（２）を比較し、（１）量より（２）量が多くなる候補物質は、ＸＰＣの活性を増強する物質であると判定することができる。
【００３６】
第３発明および第４発明の方法において使用する「候補物質」は、例えば有機または無機の化合物（特に低分子量の化合物）、タンパク質、ペプチド等が含まれる。またポリペプチドＸＰＣの一部連続配列からなるオリゴペプチドも第３発明の候補物質に含まれる。
【００３７】
なお、この第３発明および第４発明で使用するポリペプチドＸＰＣは、ＨＲ２３Ｂタンパク質との複合体として使用することが好ましい。細胞内において、ＸＰＣはＨＲ２３Ｂタンパク質との複合体として機能するからである。ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ複合体は、それぞれのタンパク質をコードするＤＮＡ断片からなる融合ＤＮＡを用いた遺伝子工学的方法によって取得することができる。
【００３８】
また、Ｔ塩基除去オリゴヌクレオチド量は、例えば後記の実施例と同様にして測定することができる（ニッキングアッセイ）。すなわち、ＤＮＡ基質のうち、ミスマッチＴ塩基を含むオリゴヌクレオチドの一端を放射標識した状態で［ＴＤＧ＋ＸＰＣ］および［ＴＤＧ＋候補物質］または［ＴＤＧ＋ＸＰＣ＋候補物質］を作用させる。次いでミスマッチＴ塩基が除去されたオリゴヌクレオチドを熱アルカリ処理により切断し、電気泳動によって切断されたＤＮＡ基質を確認する。
【００３９】
以下、実施例として、ポリペプチドＸＰＣの機能を確認するために行った実験例を示すが、この発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００４０】
【実施例】
１．方法
１−１．酵母２−ハイブリッドスクリーニング
ＸＰＣと相互作用するタンパク質の同定のため、Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ  ＬｅｘＡ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて酵母２−ハイブリッドスクリーニングを行った。ヒトＸＰＣの全長をコードするｃＤＮＡを、バイトベクターｐＬｅｘＡ中のＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインにインフレームで融合させた。その結果得られたプラスミドｐＬｅｘＡ−ＸＰＣおよびレポータープラスミドｐ８ｏｐ−ｌａｃＺを用いて酵母株ＥＧＹ４８を同時形質転換し、ヒスチジンおよびウラシルを欠いたＳＤ培地上で形質転換体を選別した。
【００４１】
次にマウス胚線維芽細胞ＬｅｘＡマッチメーカーライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて形質転換したＥＧＹ４８酵母をさらに形質転換することによりスクリーニングを行った。このライブラリ中でのＧＡＬ４活性化ドメインに融合されたｃＤＮＡの発現はＧＡＬ１プロモーターにより調節されている。ガラクトースおよびラフィノースを含み、ヒスチジン、ロイシン、トリプトファン、およびウラシルを欠いた培地上で、およそ７×１０６個の形質転換体が選別された。２週間にわたる３０℃でのインキュベーション後に現れたコロニーを、β−ガラクトシダーゼ活性の有無でさらに選別した。ポジティブクローンをトリプトファンを欠いたＳＤ培地中で生育させ、ｐｒｅｙ  ｐｌａｓｍｉｄを回収し、大腸菌ＫＣ８株にエレクトロポーレションし、回収したＤＮＡの配列分析を行い、ＸＰＣと相互作用するタンパク質の候補を同定した。
１−２．組換えタンパク質の精製
組換えヒトＸＰＣおよびＨｉｓタグを融合したＨＲ２３Ｂ（ＨＲ２３Ｂ−Ｈｉｓ）タンパク質の精製は文献（Ｍａｓｕｔａｎｉ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １７，  ６９１５−６９２３；  Ｓｕｇａｓａｗａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １６，  ４８５２−４８６１）の記載に従って行った。すなわち、ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ−Ｈｉｓヘテロダイマーを試験管内で再構成し、文献（Ｓｕｇａｓａｗａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，  １５，  ５０７−５２１）の記載に従って精製した。Ｈｉｓ−ＴＤＧは、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株中でｐＥＴ２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて発現させ、これを文献（Ｈａｒｄｅｌａｎｄ，  Ｕ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５，  ３３４４９−３３４５６）の記載に従って精製した。但しニッケル−ＮＴＡアガロースの代わりにＴａｌｏｎ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用した。ＧＳＴ−ＴＤＧおよびＧＳＴは、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株中でｐＧＥＸ４Ｔ−３ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて発現させた。発現誘導は、ＧＳＴ−ＴＤＧに対しては１６℃で１９時間にわたり０．２ｍＭ  ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を用いて、またＧＳＴに対しては３７℃で３時間にわたり１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて行った。バクテリア細胞の沈殿は緩衝液Ａ［２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．５），  １ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ２５ｍＭ  ＮａＣｌ，  ０．０１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０，  １ｍＭ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ  （ＤＴＴ），  ０．２５ｍＭｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ  （ＰＭＳＦ），  およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（１ｘＣｏｍｐｌｅｔｅ；  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）］中で超音波処理し、３０分間にわたり１００，０００ｘｇで遠心分離した。この上清を、０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ｂ［２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．５），  １ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  １０％グリセロール，  １ｍＭ  ＤＴＴ，  ０．２５ｍＭ  ＰＭＳＦ］で平衡化したＧＳＴｒａｐカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に供した。続いてカラムを０．５および１Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ｂで洗浄した後、結合したタンパク質の溶出を０．１Ｍ  ＮａＣｌと１０ｍＭグルタチオンを含む緩衝液Ｂを用いて行った。さらにＧＳＴ−ＴＤＧを含む分画を、０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ｃ［２５ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０），  １ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  １０％グリセロール，  １ｍＭ  ＤＴＴ，  ０．２５ｍＭ  ＰＭＳＦ］で平衡化したＭｏｎｏ  Ｓ  ＰＣ  １．６／５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に供し、結合タンパク質の溶出を緩衝液Ｃ中の０．１−０．８Ｍ  ＮａＣｌの線形勾配を用いて行った。ＧＳＴ−ＴＤＧは０．４Ｍ  ＮａＣｌ周辺の溶出分画に現れた。最後にＧＳＴ−ＴＤＧとＧＳＴの両方を、０．２Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ｂで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ＰＣ  ３．２／３０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーに供した。Ｈｉｓ−ＡＰＥは、ｐＥＴ２８ａベクターを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株中で行い、バクテリア細胞の溶解物を文献（Ｃｈｏｕ，  Ｋ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ｃｈｅｎｇ，  Ｙ．  Ｃ．  （２００２）  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１５，  ６５５−６５９）の記載にに従って調製した。試料を０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ｄ［２０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．８），  １０％グリセロール，  ０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  および０．２５ｍＭ  ＰＭＳＦ］で平衡化したホスホセルロース（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｐ１１）カラムに供し、結合タンパク質の溶出を０．２、０．６および１Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ｄを用いて段階的に行った。１Ｍ  ＮａＣｌを用いて溶出したタンパク質を、０．１Ｍ  ＮａＣｌと５ｍＭ  イミダゾールを含む緩衝液Ｄを用いて平衡化してあるＴａｌｏｎ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を詰めたカラム上に供した。同じ緩衝液で十分に洗浄を行った後、イミダゾール濃度を２０、１００、および２５０ｍＭに増加させることにより結合タンパク質の溶出を行った。次にＨｉｓ−ＡＰＥを含む１００ｍＭイミダゾール溶出画分を、０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ｅ［５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ  （ｐＨ７．６），  １ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  １０％グリセロール，  １ｍＭ  ＤＴＴ，  ０．２５ｍＭ  ＰＭＳＦ］で平衡化したＭｏｎｏ  Ｓ  ＰＣ  １．６／５カラム上に供した。このカラムの展開を緩衝液Ｅ中の０．１〜０．７Ｍ  ＮａＣｌの線形勾配を用いて行い、Ｈｉｓ−ＡＰＥは０．２５Ｍ  ＮａＣｌ周辺で溶出された。
１−３．ＧＳＴプルダウンアッセイ
Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ：  ２０μｌ）を、０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ｆ［２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５），  １０％グリセロール，  ０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  １ｍＭ  ＤＴＴ］中の組換えＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ（１ｐｍｏｌ）、およびＧＳＴまたはＧＳＴ−ＴＤＧのいずれか（それぞれ１ｐｍｏｌ）と混合した。指定箇所では、Ｈｉｓ−ＴＤＧも競合剤として含めた。時々撹拌しつつ氷上で１時間インキュベーションした後、ビーズの洗浄を０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ｆ  ５００μｌを用いて７回行い、ビーズ上に保持されたタンパク質の溶出を０．３Ｍ  ＮａＣｌと１０ｍＭグルタチオンを含む緩衝液Ｆ  ２０μｌを用いて行った。精製ＸＰＣはＳＤＳ存在下で煮沸すると凝集する傾向があるため、それぞれの溶出物を変性させる前に、内因性ＸＰＣを発現していないＸＰ４ＰＡＳＶ細胞の全細胞抽出物（０．４μｇタンパク質）と混合した。この処理によって、ＸＰＣの凝集が妨げられ、タンパク質のより定量的な評価が可能になる。それぞれの溶出物をＸＰ４ＰＡＳＶ細胞の抽出物と混合したものを８％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ポリクローナル抗ＸＰＣ抗体を用いた免疫ブロッティングにより分析した。
１−４．ゲルシフトアッセイ
図２Ａに示した共有結合閉環状ＤＮＡと、３２Ｐ標識された平滑末端ＤＮＡ断片は、文献（Ｓｕｇａｓａｗａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，  １５，  ５０７−５２１）の記載に正確に従って調製した。ゲルシフトアッセイは基本的に文献（Ｓｕｇａｓａｗａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，  １５，  ５０７−５２１）に従って行ったが、結合反応からＭｇＣｌ２を除外し、また非特異的な結合を吸収するために添加する二本鎖閉環状ＤＮＡの量を８ｎｇに増やした。スーパーシフトアッセイは、標準的な結合反応を行った後で、アフィニティー精製したポリクローナル抗体を添加し、氷上で１５分間インキュベートしてからグルタルアルデヒド固定を行った。
１−５．ニッキングアッセイ
組換えＨｉｓ−ＴＤＧとＨｉｓ−ＡＰＥタンパク質の酵素活性のモニタリングは、「ニッキングアッセイ」を用いて、文献（Ｎｅｄｄｅｒｍａｎｎ，  Ｐ．  ａｎｄ  Ｊｉｒｉｃｎｙ，  Ｊ．  （１９９３）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６８，  ２１２１８−２１２２４）記載の方法にいくつかの修正を加えて行った。
【００４２】
単一のＧ／Ｔミスマッチを含むＤＮＡ基質は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼと［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ処理により、Ｔ鎖オリゴヌクレオチド（図２Ｂの下段配列）の５’−末端を標識した。６５℃で１時間にわたり酵素を熱で不活性化した後、等モル量のＧ鎖オリゴヌクレオチドを添加し、６５℃で１時間加熱した後、徐々に室温まで冷やすことによってアニーリングした。アニーリングした６０ｂｐの２本鎖ＤＮＡは未変性ＰＡＧＥにより精製した。ニッキング反応は、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、ウシ血清アルブミン（９μｇ）および基質ＤＮＡ（４０ｆｍｏｌ）を含む混合液（２５μｌ）中で行った。３０℃で１時間にわたりインキュベートした後、精製Ｈｉｓ−ＴＤＧを添加し、３０℃でさらにインキュベートした。またＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ−ＨｉｓおよびＨｉｓ−ＡＰＥを個別、あるいは同時に様々な時点で添加した。反応の停止は等量の停止緩衝液［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．５），  ２５ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．３ｍｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ、２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．８ｍｇ／ｍｌプロテインキナーゼＫ］を添加して行い、さらに３０℃で１時間以上にわたりインキュベートした。結果として生じたＡＰ部位を単鎖切断に変換するため、ＮａＯＨを添加して最終濃度９０ｍＭとし、１０分間にわたり１００℃で加熱した。ＤＮＡの精製はフェノール／クロロフォルム抽出とエタノール沈殿により行い、１６％変性ＰＡＧＥに供した後、オートラジオグラフィーを行った。またＡＰＥによる切断も同様の方法で測定したが、反応停止は１μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡの添加により行った。次に９０％ホルムアミド、０．０４％ブロモフェノールブルー、および０．０４％キシレンシアノールＦＦを含む等量の溶液を反応液に混合し、６５℃で３分間加熱し、１６％変性ＰＡＧＥによる分析後、オートラジオグラフィーにより分析した。どちらの分析でも、切断および非切断オリゴヌクレオチドの放射活性の定量は、ＢＡＳ２５００  ｂｉｏｉｍａｇｉｎｇ  ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）を用いて行った。
１−６．抗体
ＸＰＣに対するポリクローナル抗体は、文献（Ｓｕｇａｓａｗａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １６，  ４８５２−４８６１）の記載のとおり作製した。抗ＴＤＧ抗体は、アミノ末端にＦＬＡＧ−タグを融合させた組換えＴＤＧ（ＦＬＡＧ−ＴＤＧ）を大腸菌中で発現させ、これを免疫化したウサギより得た抗血清を硫酸アンモニウム沈殿（５０％飽和）に供し、続いてＮＨＳ−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対して共有結合によりカップリングしたＧＳＴ−ＴＤＧを用いて、アフィニティ精製を行った。
２．結果
２−１．ＴＤＧとＸＰＣとの相互作用
ＸＰＣと相互作用する因子を検索するため、全長ヒトＸＰＣをバイト（ｂａｉｔ）として、マウス胚線維芽細胞ｃＤＮＡライブラリーに対する酵母２−ハイブリッドスクリーニングを行った。７×１０６個の形質転換体から単離したポジティブクローンの一つがマウスＴＤＧをコードしていることが判明した。また、ヒトＴＤＧ  ｃＤＮＡを用いた酵母２−ハイブリッドアッセイを行い、ヒトＴＤＧもヒトＸＰＣと相互作用しうることを確認した。
【００４３】
ＸＰＣとＴＤＧが物理的に相互作用していることを確認するため、ＧＳＴタグを融合させた組換えヒトＴＤＧタンパク質（ＧＳＴ−ＴＤＧ）を大腸菌内で発現させて、ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ複合体を用いたプルダウンアッセイに供するため精製した。ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ、およびＧＳＴまたはＧＳＴ−ＴＤＧのいずれかを含むアッセイにグルタチオン−セファロースビーズを添加した後、ビーズを遠心分離して十分に洗浄した。次に結合したタンパク質を１０ｍＭグルタチオンを含む緩衝液を用いて溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してから、抗−ＸＰＣ抗体を用いたイムノブロッティングを行った（図１）。対照のＧＳＴへの結合はほとんど検出されなかったが（レーン３）、ＧＳＴ−ＴＤＧを用いた場合には有意な量のＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂが同時に沈殿した（レーン４）。アミノ末端にヒスチジンタグを融合したＴＤＧ（Ｈｉｓ−ＴＤＧ）を過剰量添加すると、容量依存的に結合が失われた（レーン５および６）。これらの条件下でＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂの代わりに組換えＸＰＣタンパク質を用いた場合にも同様な結果が得られたことから、ＸＰＣとＴＤＧの間の直接的な相互作用が確認された。
２−２．ＸＰＣ−ＨＲ２３ＢとＴＤＧのＤＮＡ上での複合体形成
ＴＤＧがＧ／Ｔミスマッチを修正するＢＥＲ反応の開始に関与していることから、ＸＰＣ−ＨＲ２３ＢがＮＥＲ以外に、ＴＤＧに依存したＢＥＲに関与しているかどうかを確認するため、部位特異的Ｇ／Ｔミスマッチを含む、３２Ｐ標識された二本鎖ＤＮＡ断片を用いてゲルシフトアッセイを行った（図２Ａ）。ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂは二重鎖ＤＮＡ中の様々な構造異常を認識するが（Ｓｕｇａｓａｗａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，  １５，  ５０７−５２１；Ｓｕｇａｓａｗａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ，  １，  ９５−１０７）、ここで用いた条件下ではＧ／Ｔミスマッチ基質への特異的に結合はほとんど検出できなかった（図３Ａ、レーン１−８）。対照的に、ＴＤＧはＧ／ＴミスマッチＤＮＡと共にインキュベートした場合にバンドシフトを示す一方、対応する位置に正常なＧ／Ｃペアを含む対照ＤＮＡを用いた場合には有意な結合性を示さなかった（図３Ａ、レーン９−１６；Ｎｅｄｄｅｒｍａｎｎ，  Ｐ．  ａｎｄ  Ｊｉｒｉｃｎｙ，  Ｊ．  （１９９３）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６８，  ２１２１８−２１２２４も参照）。特記すべき点として、ＴＤＧがグリコシラーゼ活性を発揮しうるような条件下でこの結合反応が行われている事実を挙げることができる。このため、観察されたＴＤＧ／ＤＮＡ複合体の少なくとも一部はＧ／Ｔミスマッチではなく、グアニンを反対側に持つＡＰ部位を含んでいる可能性が高い。
【００４４】
前述のようにＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ複合体そのものはＧ／ＴミスマッチＤＮＡに結合できないが、ＸＰＣ−ＨＲ２３ＢはＴＤＧが結合したＤＮＡに結合する。ＴＤＧをＧ／ＴミスマッチＤＮＡと共にインキュベートした後でＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂを添加した場合、ＴＤＧ／ＤＮＡ複合体の総量が用量依存的に減少し、代わってＴＤＧ／ＤＮＡ複合体より移動度が低い新しいシフトバンドが現れた（図３Ｂの星印により示す）。この新しいバンドのタンパク質成分を決定するため、ＸＰＣとＴＤＧに対して作成したポリクローナル抗体を用いてスーパーシフトアッセイを行った（図３Ｃ）。予想通り、抗ＸＰＣ抗体はＴＤＧ／ＤＮＡ複合体をスーパーシフトさせず、抗ＴＤＧ抗体によりＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ／ＤＮＡ複合体はスーパーシフトしなかった。しかしながら抗ＴＤＧ抗体を添加すると、ＴＤＧ／ＤＮＡ複合体と新しいバンドの両方がスーパーシフトした（レーン１−４）。さらに、この新規バンドは抗ＸＰＣ抗体によってもスーパーシフトした（レーン５−８）。このため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで基質ＤＮＡに結合したＴＤＧは、ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂとの三成分複合体を形成していることが判明した。
２−３．ＴＤＧ活性に対するＸＰＣの作用
ＸＰＣ−ＨＲ２３ＢがＴＤＧ活性に影響を及ぼすかどうかを調べるため、単一のＧ／Ｔミスマッチを含み、Ｔ鎖の５’−末端を３２Ｐ標識した６０塩基対ＤＮＡ断片を用いて「ニッキングアッセイ」を行った（図２Ｂ）。このアッセイでは、ＴＤＧ処理したＤＮＡを熱アルカリ処理し、次に変性ＰＡＧＥを用いて切断Ｔ鎖と非切断Ｔ鎖を分離することによりＴＤＧによって生成されたＡＰ部位数の測定を行った。
【００４５】
このアッセイにおいて、精製ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂそれ自体は、Ｇ／Ｔミスマッチに対する検出可能なＤＮＡグリコシラーゼ活性を示さなかった。一方、ＴＤＧを同じＤＮＡ基質と共にインキュベートすると、反応開始後１５分間である程度のミスマッチＴ残基が切除されたが、その後反応は著しく減速した（図４ＡおよびＢ）。これはおそらく、ＴＤＧがいったんＧ／Ｔミスマッチに結合してＴ残基を切除した後、結果的に生じたＡＰ部位に結合し続けるため（Ｗａｔｅｒｓ，  Ｔ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７４，  ６７−７４：Ｗａｔｅｒｓ，  Ｔ．  Ｒ．  ａｎｄ  Ｓｗａｎｎ，  Ｐ．  Ｆ．  （１９９８）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７３，  ２０００７−２００１４）、最終的に１サイクルのＴＤＧ酵素反応の終了後には、ほとんどのＴＤＧ分子がＡＰ部位によってトラップされるためと思われる。しかしながら、ＸＰＣ−ＨＲ２３ＢをＴＤＧと同時にＤＮＡに添加した場合には、ＴＤＧ活性はＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂの用量に依存して増加した。１０７ｆｍｏｌのＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂと共にインキュベートした結果、１２０分のインキュベーション後に３倍のＴＤＧ活性が得られた（図４ＡおよびＢ）。ＸＰＣかＨＲ２３Ｂのいずれのサブユニットがこの促進の原因になっているのか調べるため、反応混合液中へサブユニットを個別に添加した。図４Ｃに示すように、ＸＰＣ単独（レーン３−６）の場合には、ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ複合体（レーン２）と同レベルの促進が得られたが、ＨＲ２３Ｂ単独（レーン７−１０）の場合は同様な条件下でもＴＤＧ活性に対する影響は全く見られなかった。
【００４６】
ＸＰＣがＴＤＧ活性を促進する際のメカニズムについて調べるため、さまざまな時点でＸＰＣ−ＨＲ２３ＢをＧ／ＴミスマッチＤＮＡに添加した。ＴＤＧ添加前にＧ／ＴミスマッチＤＮＡをＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂと共にインキュベートしても、全ての成分を同時に混合した場合と比較して、ＴＤＧ反応のタイムコースは変化しなかった。ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ自体はＧ／Ｔミスマッチに結合できないため、これは予想通りの結果である（図３Ｂ）。ＤＮＡ基質への添加前に、ＴＤＧとＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂをインキュベートした場合にも、初期反応速度の増加は生じなかったが、これはＴＤＧ／ＸＰＣ複合体を予め構築してもＧ／Ｔミスマッチの認識が促進されないことを示唆している。しかしながら、ＴＤＧをＧ／ＴミスマッチＤＮＡと予めインキュベートして反応が頭打ちになった後でＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂを添加したところ、その時点から反応産物の劇的な再増加が見られた（図５）。ＴＤＧがミスマッチＴ塩基を除去した後に結果的に生じたＡＰ部位に結合し続けることを考えると、これらの観察結果から、ＸＰＣ−ＨＲ２３ＢがＡＰ部位からのＴＤＧの解離を促進し、これによって自由になったＴＤＧの新たなＧ／Ｔミスマッチ基質との反応を可能にしていることが強く示唆される。
２−４．  ＡＰＥ存在下でのＴＤＧ活性に対するＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂの作用
ＡＰＥはＢＥＲ経路中でＤＮＡグリコシラーゼの直後に働くと考えられるが、一方でＴＤＧをＡＰ部位から排除することによりＴＤＧの酵素学的な代謝回転を促進する作用を示すことが報告されている（Ｗａｔｅｒｓ，  Ｔ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７４，６７−７４）。このため、ＡＰＥとＸＰＣ−ＨＲ２３ＢがＴＤＧの代謝回転の促進に関して機能的に相互作用する可能性について調べた。様々な量のＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂの存在下、あるいは非存在下で、ＴＤＧを含むニッキングアッセイ反応にＡＰＥ（５３ｆｍｏｌ）を添加した。文献（Ｗａｔｅｒｓ，  Ｔ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７４，  ６７−７４）の記述どおりＡＰＥの添加によってＴＤＧ活性の有意な促進が生じ、ＡＰＥ存在下で１２０分インキュベートした後には２倍以上の数のＡＰ部位が生じた（図４Ａ、レーン２−５を図６Ａ、レーン２−５と比較せよ）。次にＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂを添加するとＴＤＧ活性がさらに促進されたが、これはＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ用量に依存的であった（図６ＡおよびＢ）。このため、５３ｆｍｏｌのＡＰＥと１０７ｆｍｏｌのＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂを同時に添加した結果、１２０分後に生成したＡＰ部位の総量が６倍増加することになり、この事実から２種類の因子がＴＤＧ活性に対して相加的な促進効果を有することが示される。しかしながら添加したＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂが、例えばＴＤＧによる処理後に生成したＡＰ部位に結合することによって、後に続くＡＰＥの酵素反応に影響を与える可能性は除外できない。実際に、特定の部位に３−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ（合成ＡＰ部位アナログ；Ｆｕｊｉｗａｒａ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７４，  ２００２７−２００３３）を含むＤＮＡ基質を用いたゲルシフトアッセイにより、ＸＰＣ−ＨＲ２３ＢがＡＰ部位に結合しうることが判明した。図７Ａに示すように、結合親和性はＡＰ部位の反対にある塩基によって変化し、その順はＡＰ／Ｃ＞ＡＰ／Ｔ＞ＡＰ／Ｇ＞ＡＰ／Ａである。グアニンがＡＰ部位の反対にある場合にはこの結合は比較的弱いものの、これらの知見からＸＰＣ−ＨＲ２３ＢがＡＰ部位からＴＤＧを押し出し、酵素学的な代謝回転を促進している可能性が示唆される。ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂの存在がＡＰＥのエンドヌクレアーゼ活性に影響するかどうかを調べるため、ニッキングアッセイを図６で行ったものと同様に行った。ただしここではＡＰＥにより切断された標識化オリゴヌクレオチド量を測定するため、変性ＰＡＧＥの前のアルカリ処理を除外することにより行った。ＡＰＥによる切断はＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂの添加により増加したが、ＡＰＥにより処理されたのは、ＴＤＧにより生成したＡＰ部位のごく一部（５０％未満）のみであった（図６Ｂと図７Ｃを比較せよ）。さらに、反応からＡＰＥを除外した場合には、切断したオリゴヌクレオチドはほとんど検出されず、このことから検出された切断の大部分がＡＰ部位の自発的なβ脱離ではなくＡＰＥ活性に起因することが示された。特記すべきなのは、ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂの有無に関わらず、ＴＤＧ��よって生成したＡＰ部位の一部しかＡＰＥで処理されない点である。この事実から、ここで用いた条件下においてはＸＰＣ−ＨＲ２３ＢがＡＰＥ活性を促進も阻害もしていないことが示唆される。
【００４７】
以上の結果から、ＸＰＣ−ＨＲ２３ＢはＴＤＧの活性を促進することにより、ＡＰＥに影響を及ぼさずにＴＤＧ依存性ＢＥＲ反応を促進することが確認された。
【００４８】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、ゲノムＤＮＡのＧ／Ｔミスマッチに起因する様々なヒト疾患を予防もしくは改善するための新規薬剤が提供される。また、この発明によって、さらに新しいＤＮＡ損傷修復剤を開発するための有効物質スクリーニング方法が提供される。
【００４９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＸＰＣ−ＨＲ２３ＢとＴＤＧの物理的相互作用を調べた結果である。グルタチオン−セファロースビーズを１ｐｍｏｌのＧＳＴ（レーン３）またはＧＳＴ−ＴＤＧ（レーン４から６）のいずれかと共に、ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ（１ｐｍｏｌ）の存在下でインキュベートした。またレーン５と６では、表示された量のＨｉｓ−ＴＤＧを競合剤として含めた。十分に洗浄を行った後、結合タンパク質を１０ｍＭグルタチオンを含む緩衝液で溶出した。それぞれの溶出液の１／４量を、ＸＰＣを発現していないＸＰ４ＰＡＳＶ細胞の全細胞抽出物と共に混合し、８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、抗ＸＰＣ抗体を用いたイムノブロッティングを行った。レーン１：入力ＸＰＣの０．４％、レーン２：ＸＰ４ＰＡＳＶ細胞の細胞抽出物のみ。
【図２】
ゲルシフトアッセイ（Ａ）およびニッキングアッセイ（Ｂ）に使用したＤＮＡ基質を示す。ＸはＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴ。
【図３】ＸＰＣ−ＨＲ２３ＢがＴＤＧ結合ＤＮＡと相互作用し、三成分複合体を形成することを確認した結果である。（Ａ）表示された量のＸＰＣ−ＨＲ２３ＢまたはＴＤＧを、単一のＧ／Ｔミスマッチを含む３２Ｐ標識された３．５ｆｍｏｌのＤＮＡ断片、あるいは対照として完全に対になった二重鎖ＤＮＡ（Ｇ／Ｃ）と混合し、３０°Ｃで３０分間にわたりインキュベーションした。結果として得られたＤＮＡ−タンパク質複合体はグルタルアルデヒドを用いて固定し、未変性ＰＡＧＥにより分離した。（Ｂ）単一のＧ／Ｔミスマッチ（３．５ｆｍｏｌ）を含むＤＮＡ基質のインキュベーションを、３０℃で１５分間にわたり、Ｈｉｓ−ＴＤＧ（１６４ｆｍｏｌ）の存在下または非存在下で行った。続いて表示された量のＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂを添加し、さらに３０℃で１５分間インキュベートし、グルタルアルデヒド固定後に未変性ＰＡＧＥに供した。星印（＊）が示すのは、ＴＤＧとＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂの両方が存在する場合に新しく現れたバンドである。（Ｃ）ＴＤＧ、ＸＰＣ−ＨＲ２３ＢおよびＤＮＡを含む三成分複合体を同定するためのスーパーシフトアッセイ。１６４ｆｍｏｌのＴＤＧ、６７ｆｍｏｌのＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ、および単一のＧ／Ｔミスマッチを含む３．５ｆｍｏｌのＤＮＡ基質を使用して（Ｂ）と同様に結合反応を行った後、様々な量の抗ＴＤＧまたは抗ＸＰＣ抗体を添加して、さらに氷上で１５分間インキュベートし、ＤＮＡ−タンパク質複合体をグルタルアルデヒドで架橋させた。
【図４】ＸＰＣ−ＨＲ２３ＢがＴＤＧ活性を促進することを確認した結果である。（Ａ）ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂの存在下におけるＴＤＧ活性を測定するためのニッキングアッセイ。単一のＧ／Ｔミスマッチを含む６０塩基対のＤＮＡ基質でＴ鎖の５’−末端が標識されたものを、１０ｆｍｏｌのＨｉｓ−ＴＤＧと共に、様々な量のＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂの存在下または非存在下で、指定時間にわたり３０℃でインキュベートした。このＤＮＡ試料を精製し、アルカリ処理によってＡＰ部位を化学的に切断した後、変性ＰＡＧＥに供した。（Ｂ）３２Ｐ標識されたＤＮＡ基質中の切断されたオリゴヌクレオチドの比率を（Ａ）の各レーン毎に計算し、グラフにプロットした。平均値と標準誤差の計算は、少なくとも２回の独立した実験を基におこなった。（Ｃ）表示した様々な量のＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ（レーン２）、ＸＰＣ単独（レーン３と６）、あるいはＨＲ２３Ｂ単独（レーン７から１０）の存在下において、１０ｆｍｏｌのＨｉｓ−ＴＤＧを用いて行ったニッキングアッセイ。全ての反応は３０℃で１２０分間にわたりインキュベートし、精製したＤＮＡ試料はアルカリ処理および変性ＰＡＧＥに供した。
【図５】ＸＰＣ−ＨＲ２３ＢがＴＤＧの酵素学的な代謝回転を促進することを確認した結果である。（Ａ）単一のＧ／Ｔミスマッチを含む３２Ｐ標識されたＤＮＡ基質を、３０℃で１０ｆｍｏｌのＨｉｓ−ＴＤＧと共に、表示にある様々な時間にわたりインキュベートした（レーン１−５）。１２０分後に表示量のＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂを添加し、さらに３０℃で１５、３０、または６０分間にわたりインキュベートした（総インキュベーション時間を各レーン上に表示した）。精製ＤＮＡ試料は、アルカリ処理と変性ＰＡＧＥに供した。（Ｂ）３２Ｐ標識されたＤＮＡ基質中の切断されたオリゴヌクレオチドの比率を、（Ａ）の各レーン毎に計算した。平均値と標準誤差の計算は、少なくとも２回の独立した実験を基におこなった。
【図６】ＸＰＣ−ＨＲ２３ＢがＡＰＥの存在下でＴＤＧの活性を促進することを確認した結果である。（Ａ）単一のＧ／Ｔミスマッチを含む３２Ｐ標識されたＤＮＡ基質を、１０ｆｍｏｌのＨｉｓ−ＴＤＧ、５３ｆｍｏｌのＨｉｓ−ＡＰＥ、および表示量のＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂの存在下、３０℃で指定時間にわたりインキュベートした。精製ＤＮＡ試料は、アルカリ処理と変性ＰＡＧＥに供した。ＡＰＥの３’（５’エクソヌクレアーゼ活性のため、開裂したオリゴヌクレオチドのバンドは梯子状に現れる。（Ｂ）３２Ｐ標識されたＤＮＡ基質中の切断されたオリゴヌクレオチドの比率を、（Ａ）の各レーン毎に計算した。平均値と標準誤差の計算は、少なくとも２回の独立した実験を基におこなった。
【図７】ＸＰＣ−ＨＲ２３ＢはＡＰＥの酵素反応を阻害しないことを確認した結果である。（Ａ）４種類の異なる塩基を反対に持つ、あるいは対応位置に正常なＧ／Ｃペアを持つ合成ＡＰ部位アナログを含む３２Ｐ標識されたＤＮＡ基質（それぞれ３．５ｆｍｏｌ）を、表示量のＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂの存在下、３０℃で３０分間インキュベートした。結果として得られたＤＮＡ−タンパク質複合体はグルタルアルデヒドで固定し、未変性ＰＡＧＥで分離した。（Ｂ）単一のＧ／Ｔミスマッチを含む３２Ｐ標識されたＤＮＡ基質を、１０ｆｍｏｌのＨｉｓ−ＴＤＧ、５３ｆｍｏｌのＨｉｓ−ＡＰＥ、および表示量のＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂの存在下、３０℃で指定時間にわたりインキュベートした。反応停止はＥＤＴＡ添加により行い、アルカリ処理を行わずに変性ＰＡＧＥに供した。（Ｃ）３２Ｐ標識されたＤＮＡ基質中の切断されたオリゴヌクレオチドの比率を、（Ｂ）の各レーン毎に計算した。平均値と標準誤差の計算は、少なくとも２回の独立した実験を基におこなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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