(57)【要約】　　　（修正有）【課題】常態ではホスホリル化しえない蛋白のホスホリル化蛋白の提供。【解決手段】常態にてホスホリル化しえないが、ホスホリル化しうる部位の導入により改変してホスホリル化したことを特徴とするホスホリル化蛋白の提供。および、蛋白キナーゼより認識しうるアミノ酸共通配列を含有し、常態にてホスホリル化しえない蛋白をコードする組換ＤＮＡ配列の提供。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
常態にてホスホリル化しえないが、ホスホリル化しうる部位の導入により改変してホスホリル化したことを特徴とするホスホリル化蛋白。
【請求項２】
ホスホリル化しうる部位が組織ＤＮＡ技術により形成される請求項１記載のホスホリル化蛋白。
【請求項３】
機能性蛋白である請求項２記載のホスホリル化蛋白。
【請求項４】
インタフェロン類似Ｈｕ−ＩＮＦ−α蛋白およびインタフェロン類似Ｈｕ−ＩＮＦ−β蛋白よりなる群から選択されるインタフェロン類似蛋白である請求項２記載のホスホリル化蛋白。
【請求項５】
請求項４記載のホスホリル化Ｈｕ−ＩＦＮ−α類似蛋白。
【請求項６】
請求項４記載のホスホリル化Ｈｕ−ＩＦＮ−β類似蛋白。
【請求項７】
第８図に示された３種のアミノ酸配列の群から選択され、かつαＡ−Ｐ１，αＡ−Ｐ２およびαＡ−Ｐ３として固定された請求項５記載のホスホリル化Ｈｕ−ＩＦＮ−α類似蛋白。
【請求項８】
インタフェロン類似Ｈｕ−ＩＦＮ−α蛋白がＨｕ−ＩＦＮ−αおよび／またはＨｕ−ＩＦＮ−γの生物学的性質を有する請求項４記載のホスホリル化Ｈｕ−ＩＦＮ−α。
【請求項９】
Ｈｕ−ＩＦＮ−αおよび／またはＨｕ−ＩＦＮ−βの生物学的性質を有する請求項４記載のホスホリル化Ｈｕ−ＩＦＮ−α類似蛋白。
【請求項１０】
蛋白キナーゼにより認識しうるアミノ酸共通配列を有する請求項４記載のホスホリル化Ｈｕ−ＩＦＮ−α類似蛋白もしくはＨｕ−ＩＦＮ−β類似蛋白。
【請求項１１】
安定な血清である請求項５記載のホスホリル化Ｈｕ−ＩＦＮ−α類似蛋白。
【請求項１２】
アミノ酸共通配列がｓｅｒを含有する請求項１０記載のホスホリル化Ｈｕ−ＩＦＮ−α類似蛋白。
【請求項１３】
蛋白キナーゼがｃＡＭＰ依存性蛋白キナーゼである請求項１０記載のホスホリル化Ｈｕ−ＩＦＮ−α類似蛋白。
【請求項１４】
放射性ラベルでホスホリル化された請求項４記載のホスホリル化Ｈｕ−ＩＦＮ−α類似蛋白。
【請求項１５】
請求項４〜１４のいずれか一項に記載のホスホリル化しうるＨｕ−ＩＦＮ−α類似蛋白またはＨｕ−ＩＦＮ−β類似蛋白。
【請求項１６】
蛋白キナーゼより認識しうるアミノ共通配列を含有し、常態にてホスホリル化しえない蛋白をコードする組換ＤＮＡ配列。
【請求項１７】
推定ホスホリル化部位を有するＨｕ−ＩＦＮ−α類似蛋白をコードするＤＮＡ配列を有し、ホスホリル化しうる蛋白がインタフェロン類似Ｈｕ−ＩＦＮ−α蛋白であって、コードされた蛋白がインタフェロン類似蛋白Ｈｕ−ＩＦＮ−αであることを特徴とする外来機能性蛋白を発現するのに有用な組換ＤＮＡクローン化ベクター。
【請求項１８】
プラスミドｐＸＺ−８，ｐＢＬ２８１，ｐＢＬ２９１もしくはｐＢＬ３０１よりなる群から選択される組換ＤＮＡベクターを含有することを特徴とする外来機能性蛋白を発現しうる形質転換宿主細胞。
【請求項１９】
宿主がイー・コリ（大腸菌）である請求項１８記載の形質転換宿主細胞。
【請求項２０】
生物学上許容しうるキャリアと生物学上有効量の請求項４〜１４のいずれか一項に記載のホスホリル化蛋白とからなる生物学上活性な細成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は組換ＤＮＡ技術の分野に関し、さらにこの技術を用いて放射能標識される１個もしくはそれ以上の燐酸（もしくはチオ燐酸）基を有する有用な機能性蛋白もしくはポリペプチドを合成する方法、並びに診断、予防および治療を包含する生物医学、医学および生化学の用途に有用なこれらおよびその他の各種の生産物に関するものである。
【０００２】
より詳細には、本発明は新規なインタフェロン類、特に１個もしくはそれ以上の放射性のホスホリル化された基を有する白血球インタフェロン（すなわちα−インタフェロン）および繊維芽細胞インタフェロン（すなわちβ−インタフェロン）、並びにこれら新規なインタフェロンをコードする推定のホスホリル化しうる部位をコードするＤＮＡ配列に関するものである。
【０００３】
【従来の技術】
放射性標識された蛋白は多くの医学、生物学、臨床、科学およびその他の用途を有する。特に１２５Ｉで標識されたインタフェロンは、結合および架橋の研究に用いられている。ヒトＩＦＮ−α，−βおよび−γは全て各種の方法により放射性沃素化されている。しかしながら、放射性沃素で標識された蛋白は周知の重大な欠点および危険性を有する。
【０００４】
インタフェロンに関する細胞表面リセプタの研究は、高い生物学的活性と高い放射線特異活性とを有するたとえば１２５Ｉで標識されたインタフェロンのような放射性標識されたインタフェロンを必要とする。数年前、γ−インタフェロンは生物学的活性を保持しながら極めて高い放射線特異活性までホスホリル化しうることが見出だされた。たとえば、それぞれヒトおよびネズミＩＦＮ−γリセプタを研究するため〔３２Ｐ〕Ｈｕ−およびＭｕ−ＩＦＮ−γが用いられた。これらの研究は、ヒトおよびネズミγ−インタフェロン（Ｈｕ−およびＭｕ−ＩＦＮ−γ）を牛心筋からの環式ＡＭＰ−依存性蛋白キナーゼおよび〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰでホスホリル化することにより行なわれた。これらホスホリル化されかつ３２Ｐ−標識されたインタフェロンは、細胞表面リセプタを研究しかつＨｕ−ＩＦＮ−γおよびＭｕ−ＩＦＮ−γリセプタに関する遺伝子をコードする染色体を同定するための高い放射線特異性を持った貴重な試薬を提供する。これらの研究および用途の全てにつき、ホスホリル化されるインタフェロンは特に有用である。幾つかの報告は、Ｈｕ−およびＭｕ−ＩＦＮ−γのホスホリル化部位をＣＯＯＨ末端に近いセリン残基として確認した。
【０００５】
しかしながら、ＩＦＮ−γのホスホリル化に使用された条件下にて、Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡおよびＨｕ−ＩＦＮ−βは環式ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）−依存性蛋白キナーゼによってホスホリル化しえないことが報告された。種々の種類または群のインタフェロンおよびその他の蛋白に関するホスホリル化の調査は、γ−インタフェロンをホスホリル化した条件下で研究者がＨｕ−ＩＦＮ−αもしくはＨｕ−ＩＦＮ−βのホスホリル化に成功しなかったことを確認している。事実、組換ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βはホスホリル化されなかったと報告されており、したがって利用しうる部位が存在するかどうか不確定であった。
【０００６】
沃素化された化合物に伴う問題および沃素化されたＩＦＮ−γの利用に対する制限に鑑み、多くの実用的、科学的および産業的用途のため標識しうるホスホリル化されたＨｕ−ＩＦＮ−αおよび−βを入手しうるようにする緊急の興昧およびニーズが存在する。
【０００７】
同様に、この種の化学構成ではまだ入手しえない他のホスホリル化された（標識された）ポリペプチドにつき興味およびニーズが存在する。たとえば、ホスホリル化しうる腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、ＴＮＦ用のリセプタを研究するのに貴重である。ＴＮＦは、ｃＡＭＰ−依存性の牛心臓キナーゼによりホスホリル化しえない。事実、蛋白ホスホリル化における興味が過去数年間にわたり著しく増大していると報告されている。
【０００８】
以下、詳細に説明する本発明は、これらおよびその他のニーズを満たすのに貢献する。
【０００９】
本明細書で使用する「Ｈｕ−ＩＦＮ−α」という用語は、全ゆる異なる種類のα−インタフェロンを包含することを意図する。種々の種類からのインタフェロンに対応する多数のＤＮＡ配列が分離されかつ同定されている。同様に、各種のＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γも開示されている。本発明は、これら全ての種類のインタフェロンを包含する。
【００１０】
本明細書で使用する「原」という用語は、天然に生産される蛋白（例えばインタフェロン）を意味し、「合成」および「非天然」という用語は、合成もしくはＤＮＡ−組換法により産生される蛋白を意味し、いずれの種類もホスホリル化しうる部位を持たず（或いはたとえば蛋白の構成によりホスホリル化しうる部位に到達しえず）、この蛋白を本発明にしたがってホスホリル化することができる。
【００１１】
ＩＦＮ−αにつき説明する場合、この用語は各種のα種類を包含することを意図する。
【００１２】
「改変」という用語は本明細書において広義に使用され、かつたとえば蛋白につき説明する場合はホスホリル化しうる部位を備えた或いは燐ラベル（もしくは同類のラベル）を備えた蛋白を意味する。推定ホスホリル化部位を有するこの種のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列も、必要に応じ改変」と称する。
【００１３】
「ホスホリル化しえない」蛋白という用語は、一般に何らかの理由で、たとえば推定のホスホリル化しうる部位を持たず、したがって蛋白をコードするＤＮＡ配列が推定アミノ酸認識配列をコードするＤＮＡ配列を持たない理由で、或いはこの種の部位がホスホリル化につき利用しえない利用で、ホスホリル化しえなかつた（或いはホスホリル化されなかつた）蛋白を意味する。
【００１４】
「与えた」もしくは「備えた」などの用語は、本明細書において広義に使用され「融合」および「挿入」の両者を意味する。その例は、それぞれハイブリッド融合Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ／γ（第１図に例示）およびＨｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１，−Ｐ２および−Ｐ３（第８図に例示）である。たとえば、ヌクレオチド挿入物は遺伝子のコード領域内にてその１端部に存在し或いはコード領域内のどこかに存在することができる。これら変種が全て「改変」という用語に包含されると考えられ、この用語は以下の説明から明らかとなるようにアミノ酸配列またはヌクレオチド配列につき使用することができる。
【００１５】
「からなる」または「含む」という用語は、アミノ酸認識配列（またはこれをコードするヌクレオチド配列）が存在する状況とは無関係に全ゆる状況を包含する。
【００１６】
本発明の好適方法に関する他の従来技術によれば、ホスホリル化は蛋白キナーゼを用いて行なわれる。蛋白キナーゼは、ＡＴＰのγ−ホスホリル基がアクセプタ蛋白基質へ移動するのを触媒する。しかしながら、本明細書中で説明するように、本発明はアクセプタ部位が特定アミノ酸（たとえばセリン）であるキナーゼに限定されず、この部位が配列中の他のアミノ酸であるようなものをも包含し、一般に蛋白キナーゼを、全体として包含する。
【００１７】
蛋白に関し本明細書中に使用する「生物学的活性」などの用語は、広義に解釈することを意図する。インタフェロン類似蛋白の場合、これはＨｕ−ＩＦＮ−αもしくはＨｕ−ＩＦＮ−βに対し特異的または両者に共通の性質を包含する全ゆる公知の（または将来見出される）性質、たとえばその抗ウィルス活性および主要細識適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）の抗原を変調させ、特にβ−マクログロブリンを包含する種類のＩのＭＨＣ杭原の表面発現における増加を誘発するその能力を包含する。
【００１８】
「機能性」蛋白は、生物学的もしくはその他の活性または用途を有する蛋白である。
【００１９】
「活性領域」もしくは「生物学的活性」領域もしくはセグメントという用語または均等な用語は、しばしば蛋白分子の特定の構成もしくは折畳の存在を意味し、たとえば配列内の特定アミノ酸の間における特定のジスルフィド架橋を意味するが、これに限定されないことは勿論である。
【００２０】
本明細書中に使用する「ベクター」という用語は、（１）宿主細胞内で複製することができ、（２）宿主細胞を形質転換することができ、かつ（３）形質転換細胞を同定するのに適した標識を有するようなプラスミド、ファージＤＮＡまたはその他のＤＮＡ配列を意味する。
【００２１】
本明細書の説明全体にわたり、「単数」は「複数」をも包含し、たとえばホスホリル化しうる部位またはホスホリル化部位は特記しない限り少なくとも１個この種の部位を意味する。
【００２２】
本明細書中に用いる他の用語は以下の説明から明らかとなるであろう。
【００２３】
本発明の主題については従来多くの文献並びにインタフェロンに関する多くの米国特許公報に開示されており、必要に応じ参照することができる。
【００２４】
【発明の実施の形態】
〔発明の要点〕
広義において本発明は、標識しうるおよび標識された蛋白、たとえば放射性標識しうるおよび放射性標識させた蛋白、並びにこれら放射性標識しうる蛋白をコードするＤＮＡおよびｃＤＮＡ分子を包含する。
【００２５】
本発明は、１個もしくはそれ以上の推定ホスホリル化部位を持った機能性蛋白をコードする組換ＤＮＡ配列；機能性蛋白を発現する発現ベクター；形質転換された宿主；改変蛋白を発現する方法；並びに改変された蛋白をも包含する。
【００２６】
１具体例において、本発明は放射性標識されたヒトインタフェロンおよび標識された蛋白；高放射線特異活性までホスホリル化しうると共に生物学的活性を保持するホスホリル化しうる改変Ｈｕ−ＩＦＮ−α（Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ）；燐の各同位元素（たとえば３２Ｐ，３３Ｐ）または硫黄（たとえば３５Ｓ，３８Ｓ）で改変された他のヒトインタフェロン；燐を有する標識蛋白もしくは同族体を提供する。本発明によれば、ヒトインタフェロンおよび改変蛋白は単一もしくは複数の放射性ラベルを有することができる。
【００２７】
さらに本発明は、燐もしくは硫黄で放射性標識されたＨｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐヒトインタフェロン並びに組換ＤＮＡで産生されかつ放射性標識されたポリペプチドおよび蛋白を包含する、組換ＤＮＡ技術により作成されたインタフェロンおよび蛋白を提供する。
【００２８】
さらに本発明は、１個もしくはそれ以上の標識用部位を有しかつ蛋白配列がインタフェロンの生物学的性質の少なくも１つ（たとえば抗ウィルス、細胞成長阻止および免疫調節特性）を有するよう充分にヒトインタフェロンを複製しうる機能性蛋白をコードするＤＮＡ配列をも提供する。さらに、キナーゼに関する推定認識部位のコード配列を有する組換ＤＮＡ；組換発現ベクター；ＤＮＡ配列を有する発現ベクターで形質転換された宿主生物；および発現された改変蛋白も提供される。本発明においては、適当な発現ベクターを作成するための部位特異性突然変異を含む方法と、ベクターで形質転換された宿主とを用い、かつ改変された蛋白、特に改変されたヒトインタフェロンを発現させる。
【００２９】
本発明は、その幾つかの実施態様の１つにおいて、１個もしくはそれ以上の推定ホスホリル化部位をコードするＤＮＡ配列を提供し、これら配列はそれぞれ少なくとも１個の推定ホスホリル化部位を有すると共にＨｕ−ＩＦＮ−αもしくは−βの生物学的性質の少なくとも１つを有する機能性蛋白をコードし；さらにたとえばλＰＬプロモータもしくはその他の下記するプロモータのような適するプロモータの制御下で機能性改変Ｈｕ−ＩＦＮ−αもしくは−βを発現するための発現ベクター、並びに生物学上活性なホスホリル化されたＨｕ−ＩＦＮ−αおよび−βを提供する。
【００３０】
これら改変されたヒトインタフェロンおよび蛋白の数種の興味ある有用な用途についても本出願によって開示する。
【００３１】
さらに本発明は、Ｈｕ−ＩＦＮ−αもしくは−β以外のインタフェロンもしくは蛋白をも包含し、これらは単一のホスホリル化部位を有する対応のインタフェロンよりも高い放射線特異活性まで標識されかつこれを許容するホスホリル化部位の付加によって改変される。ホスホリル化部位の「付加」という用語は、本発明においては従来得られなかった或いは得がたいホスホリル化部位が改変されて、このホスホリル化部位を利用しうるようにしたインタフェロンもしくは蛋白を包含することを意図する。
【００３２】
さらに本発明は、セリン残基以外のアミノ酸残基（たとえばスレオニンおよび／またはチロシン残基）が適するキナーゼによりホスホリル化されたインタフェロン、特にＨｕ−ＩＦＮ−α、並びに１個もしくはそれ以上の推定ホスホリル化部位をコードしかつ前記インタフェロンをコードするＤＮＡ配列をも包含する。
【００３３】
本発明によれば、ホスホリル化認識配列の１部（全配列でない）が付加されれば充分であり、ただし天然蛋白配列は前記認識配列の残余（または他の相補的）アミノ酸（たとえばＡｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ）を有する。本発明のこの具体例においては、配列における１〜４個のアミノ酸（Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌの場合）を蛋白に供給して、完成された必要なＳｅｒ−含有の認識配列を構成することができる。種類Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１および−Ｐ２の間の比較に１例を見ることができ（第８図）、ここで天然インタフェロン配列は本発明にしたがって作成される場合Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ２におけるホスホリル化認識配列に１個のＡｒｇを付与する。
【００３４】
Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ３において、コード化配列（すなわち追加アミノ酸配列）にはＨｕ−ＩＦＮ−αＡをコードする天然配列の下流に位置する認識配列をコードするヌクレオチド配列が供給されている。たとえばＨｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ３は、追加アミノ酸配列がＨｕ−ＩＦＮ−αＡの認識配列と天然アミノ酸配列との間に位置する例である。
【００３５】
これは、推定ホスホリル化部位を持ったアミノ酸認識配列をコードするヌクレオチド配列を位置決定するための本発明の有能性を示す。
【００３６】
すなわち本発明によれば、推定ホスホリル化部位を形成するのに要する必要個数の特定アミノ酸をコードするヌクレオチド配列が作成される。
【００３７】
上記の観察から、上記特定のアミノ酸認識配列以外の任意のアミノ酸配列を作成するためにも同じ原理を適用することができる。
【００３８】
ホスホリル化部位がセリン（上記の例）以外である場合、ＤＮＡ配列はスレオニン、チロシンなどを含有する推定認識部位を持った適するアミノ酸配列の１部もしくは全部をコードする。すなわち、任意特定の蛋白において１個もしくはそれ以上のアミノ酸（アミノ酸配列の任意の位置における）がキナーゼに関するアミノ酸認識配列のアミノ酸と同じである場合は、アミノ酸認識配列のこれら相補的アミノ酸を付加して（または改変して）その配列を完成すれば充分である。これは、所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を作成することにより達成される。事実、このような付加（または改変）が一層望ましい過程である場合も存在し、たとえば改変すべき蛋白分子の一体性を保持し（たとえば特定の活性、たとえば生物学的活性に影響を与える危険性を最小化させ）或いは遺伝子操作を単純化することが重要であり、或いはいずれかもしくは両末端またはその他の位置をより接近し易くすることが重要である。
【００３９】
キナーゼ認識配列は、特定のホスホリル化アミノ酸とは無関係に、ＤＮＡコード配列の末端もしくはその他の位置のいずれかに位置することができる。
【００４０】
本発明によれば、蛋白のホスホリル化しうる部位のホスホリル化は任意適当なホスホリル化手段で行なうことができる。蛋白キナーゼおよび蛋白ホスファターゼにより触媒される蛋白のホスホリル化および脱ホスホリル化は、多数の蛋白に影響を及ぼすことが知られている。多数の蛋白キナーゼが開示されており、かつ本発明に使用すべく当業者に入手することができる。この種の蛋白キナーゼは主として２つの群に分類することができる：すなわち蛋白およびペプチドにおけるセリンおよび／またはスレオニン残基のホスホリル化を触媒するもの、並びにチロシン残基のホスホリル化を触媒するものである。これら２つの主分類はさらに次の群にサブ分類することができる。たとえば、セリン／スレオニン蛋白キナーゼは環式ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）−依存性蛋白キナーゼと環式ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）−依存性キナーゼと環式ヌクレオチド依存性蛋白キナーゼとにサブ分類することができる。蛋白キナーゼの多くに関する認識部位が従来推定されている。
【００４１】
短い合成ペプチドにおいて、ｃＡＭＰ−依存性蛋白キナーゼは配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−Ｘｘｘ〔ここでＸｘｘはアミノ酸を示す〕を認識する。上記したように、ｃＡＭＰ−依存性蛋白キナーゼはアミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−Ｘｘｘを認識するだけでなく、その他の幾つかの特定配列、たとえばＡｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌをも認識することができる。その他多くの蛋白セリン／スレオニンキナーゼ、たとえばグリコーゲンシンセターゼキナーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、カゼインキナーゼＩおよびＩＩ、パイルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ、蛋白キナーゼＣおよびミオシン軽鎖（ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ）キナーゼが報告されている。
【００４２】
ペプチド基質におけるチロシン（セリン、スレオニンもしくはヒドロキシプロリンでない）をホスホリル化しかつそれに特異性を示す蛋白キナーゼは、蛋白チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）である。この種のＰＴＫは公知文献に起債されている。ＰＴＫは、本発明に使用すべく入手しうる他の種類のキナーゼである。
【００４３】
他の入手しうる種類のキナーゼは環式ＧＭＰ−依存性（ｃＧＭＰ−依存性）蛋白キナーゼである。ｃＧＭＰ−依存性蛋白キナーゼは、ｃＡＭＰ−依存性蛋白キナーゼにより示される特異性と同一ではないが類似した基質特異性を示す。ペプチドＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕは、ｃＡＭＰ−依存性蛋白キナーゼによるよりも、ｃＧＭＰ−依存性蛋白キナーゼによって一層良好にセリンでホスホリル化された。さらにｃＡＭＰ−依存性蛋白キナーゼは、合成ペプチドＬｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙにおけるヒドロキシプロリンをホスホリル化することができる。
【００４４】
真核性生物に広く分布しかつたとえばカゼインのような酸性蛋白を基質として優先的に使用するカゼインキナーゼは２つの群、すなわちカゼインキナーゼＩおよびＩＩに分類されている。カゼインキナーゼＩＩは合成ペプチドＳｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕをホスホリル化する。合成ペプチドおよび天然蛋白基質を用いた結果の評価は、燐酸アクセプタ部位を包囲する比較的短いアミノ酸配列がカゼインキナーゼＩＩの特異性に対する基礎を与えることを示した。したがって、セリンのカルボキシル末端側に対し位置３および５における酸性残基が最も重要であると思われる。セリンが、スレオニンと比較して優先的にホスホリル化された。他の研究において、ペブチドＡｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−ＧｌｕはカゼインキナーゼＩＩの特異的基質となることが判明した。しかしながら、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕは一層良好な基質であった。さらに、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−ＡｓｐはＡｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕよりも良好な基質であった。すなわち、アスパラギンはグルタミンよりも好適である。セリン（スレオニン）のＣＯＯＨ末端側における酸性残基は、現在知られている最も必要とされるものである。セリン（スレオニン）のアミノ末端側における酸性残基は、ホスホリル化を向上させるが絶対必要とされるものではない。すなわちＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−ＧｌｕはカゼインキナーゼＩＩの基質として作用するが、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）−ＧＩｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ〔ここで、記号Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）はセリンもしくはスレオニンを意味する〕よりも効果が低かった。カゼインＩおよびＩＩは多くの同じ基質をホスホリル化するが、カゼインキナーゼＩはここに示したいずれのデカマーペプチド基質をもホスホリル化しなかつた。各種の合成ペブチドを用いた研究から、配列Ｓｅｒ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｇｌｕ（および推論すればＳｅｒ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ａｓｐ）はカゼインキナーゼＩＩにより認識するための最小の要件を満たす配列の１種類を示しうるが、他のペプチドおよび配列でも充分であると結論された。
【００４５】
上記したように、他のキナーゼも開示されている。ミトゲン活性化Ｓ６キナーゼは、肝臓からのプロテアーゼ活性化キナーゼと同様に、合成ペブチドＡｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａをホスホリル化する。ロドプシンキナーゼは、ペプチドＴｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａのホスホリル化を触媒する。他の蛋白セリン／スレオニンキナーゼが開示されており、そのホスホリル化部位が説明されている。
【００４６】
チロシンキナーゼの基質特異性も報告されている。各種の合成もしくは天然ペプチド基質も開示されている。
【００４７】
したがって当業者は、認識過程に関し比較的高い特異性を有するがアミノ酸認識部位の特定配列に関し柔軟性を有する本発明に使用しうるキナーゼを充分選択することができる。これらキナーゼは、所望蛋白における推定ホスホリル化部位をホスホリル化するための手段を与える。
【００４８】
改変に最も適した分子の位置の選択は特定の蛋白（およびその構成）に依存する。複数の推定ホスホリル化部位（およびホスホリル化しうる部位）を改変蛋白に含ませる場合、アミノ酸認識配列を形成するため分子の一端部もしくは両端部およびその他の位置の潜在的利用性が考慮される。すなわち本発明によれば、ホスホリル化認識配列を天然蛋白配列における任意の個所に導入しうるが、ただしこの導入された配列が所望の生物学的活性に悪影響を与えないものとする。
【００４９】
特定の蛋白キナーゼに関する認識部位が確認されれば、本発明は対応の推定標識部位を含有すべき機能性蛋白をコードするＤＮＡ配列の内部に位置する或いは融合した或いは結合したキナーゼに対し認識部位をコードするＤＮＡ配列を組換ＤＮＡ技術により作成する方法を提供する。
【００５０】
本発明は、上記本発明の方法により放射性標識することができかつ対応の未標識（または標識しえない）蛋白の性質の少なくとも１つを有する蛋白を包含する。本発明によれば、ホスホリル化されてない（またはホスホリル化しえない）蛋白を改変して、推定のホスホリル化しうる部位をアミノ酸配列中に導入する。これは、推定ホスホリル化部位をコードするＤＮＡ配列（１部もしくは全部）により蛋白のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を改変した後に行なわれる。インタフェロンの場合、本発明は天然もしくは「非天然」インタフェロンの全インタフェロンを含包し、上記したように種々の刊行物に報告されたような構造上改変されたインタフェロン（たとえばハイブリッドインタフェロン、改変インタフェロンなど）、並びに将来報告されるであろう他の改変インタフェロンを包含する。
【００５１】
天然および「非天然」（改変を含む）種類のインタフェロンは種々の生物学的活性を有し、かつこの種の活性は種々異なる割合で生ずることが知られている。すなわち本発明は、これら性質のいずれか１つを任意の割合で有する放射性標識されたインタフェロンだけでなく、公知種類のインタフェロンにおいてまだ確認されてない生物学的もしくはその他の性質を有するものも包含する。ホスホリル化は、蛋白の性質の１つもしくはそれ以上を多かれ少なかれ改変しうることが認められている。事実、蛋白の改変前に検出しえなかったような性質を向上させ或いは発現させうる場合が存在する。
【００５２】
さらに本発明は、特に興味ある標識しうるおよび標識された蛋白類似のホスホリル化された抗体（特にモノクローナル抗体、ハイブリッド抗体、キメラ抗体または改変抗体）、ホルモンおよび「改変」ストレプトアビジンを提供する。改変ストレプトアビジンは個々のビオチニル化された抗体に結合することができ、各ストレプトアビジンは単一もしくは複数のホスホリル化された基により改変することができ、その生成物は極めて向上した放射線を有し、したがって診断および治療用途を有する。
【００５３】
さらに本発明は、Ｈｕ−ＩＦＮ−γのＣＯＯＨ一末端１６アミノ酸領域が融合したＨｕ−ＩＦＮ−αＡで構成されるハイブリッドインタフェロン蛋白Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ／γを供給し、これは推定ホスホリル化部位を有すると共にハイブリッドインタフェロン融合蛋白が燐で標識されている。融合蛋白は、オリゴヌクレオチド指向性突然変異により作成された発現ベクターで合成された。さらに本発明は、融合ハイブリッドインタフェロン蛋白のためのＤＮＡコード配列、発現ベクターおよび形質転換微生物、たとえばイー・コリ宿主およびその他の適する下記の荷主をも提供する。
【００５４】
以上、本発明の特徴および実施態様につき説明したが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。以下、本発明を一層詳細に説明する。
【００５５】
本発明の１部を構成する添付図面により、本発明の原理を説明すべく本発明を実施例につき詳細に説明する。
【００５６】
本発明によれば、常態にてホスホリル化しえない蛋白を改変して、これらをホスホリル化しうるようにすることができる。特に、本発明に関し極めて興味あることは、Ｈｕ−ＩＦＮ−γとは異なりホスホリル化しえなかった（上記した通り）特定の蛋白、すなわちインタフェロンＨｕ−ＩＦＮ−αＡのホスホリル化を達成しうるかどうかを確認することである。この結果を特にその生物学的活性の喪失なしに達成する方法は、他の蛋白を改変すると共にこれらをホスホリル化しうるようにする能力を与えた。すなわち、本発明によれば、Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡを一般に蛋白のホスホリル化に関するモデルとして用いた。
【００５７】
本発明によれば、Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡを改変して２種の具体例を得、これらにつき以下説明する。両具体例は一般に蛋白に適用することができ、当業者には特定の状況下で最も適するものを選択するであろう。
【００５８】
第１の具体例はホスホリル化しうるハイブリッドもしくは融合蛋白、すなわちＨｕ−ＩＦＮ−αＡ／γの作成であり、第２の具体例は以下詳細に説明する挿入物を持ったホスホリル化しうる改変Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡである。
【００５９】
以下限定はしないが特定例につき説明する。
【００６０】
Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ／γ、すなわちＨｕ−ＩＦＮ−αＡとＨｕ−ＩＦＮ−γのＣＯＯＨ末端１６アミノ酸とのハイブリッド蛋白
以下、Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡとＨｕ−ＩＦＮ−γとのハイブリッドもしくは融合蛋白につき説明する。オリゴヌクレオチド−指向性突然変異により作成された発現ベクターによって、融合−ハイブリッド蛋白を発現させた。発現ベクターの作成、蛋白の発現および精製、機能性ハイブリッド蛋白のホスホリル化、および細胞（ＭＤＢＫ）に対する〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ／γの結合につき以下説明する。ハイブリッド蛋白は抗ウィルス活性を有する。
【００６１】
本発明により作成された融合蛋白は、Ｈｕ−ＩＦＮ−γのＣＯＯＨ末端１６アミノ酸が融合したＨｕ−ＩＦＮ−αＡからなっている。この蛋白は，オリゴヌクレオチド指向性突然変異（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）により発現ベクターを構成して作成される。ハイブリッド蛋白Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ／γをファージλＰＬプロモータの制御下で発現させた。蛋白をモノクローナル抗体によりＨｕ−ＩＦＮ−αに対し或いはＨｕ−ＩＦＮ−γのＣＯＯＨ末端アミノ酸配列に対し精製した。精製された蛋白はドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電機泳動にて単の主バンドを示すと共に、ヒトおよび牛細胞に対し抗ウィルス活性を示す。Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡと異なるがＨｕ−ＩＦＮ−γと同様に、ハイブリッドＨｕ−ＩＦＮ−αＡ／γは〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰおよびｃＡＭＰ−依存性蛋白キナーゼによりホスホリル化しうることが判明した。ホスホリル化された分子はＩＦＮ−αＡ／βリセプタに結合する。
【００６２】
維定ホスホリル化部位を有するＨｕ−ＩＦＮ−γの領域の融合によるＨｕ−ＩＦＮ−αＡ中へのホスホリル化部位の導入は、標識インタフェロンが有用であるリセプタ結合、薬物動態学などの研究に関する新規な試薬を提供する。
【００６３】
すなわち本発明によれば、Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡのＣＯＯＨ末端にＨｕ−ＩＦＮ−γのＣＯＯ末端を融合させて推定ホスホリル化部位を有するハイブリッド蛋白を得ることにより、ハイブリッド蛋白を作成した。このホスホリル化された蛋白は生物学上活性であることが判明した。
【００６４】
ハイブリッドＨｕ−ＩＦＮ−αＡ／γを発現させるためのプラスミドの作成は次のように行なった。
【００６５】
第２図に示したように、Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡおよびＨｕ−ＩＦＮ−γのＤＮＡ配列をＭ１３ｍｐ１８中にクローン化した。融合蛋白をコードするプラスミドｐＸＺ−８を、図示したようにオリゴヌクレオチド指向性欠失（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ）により作成した。
【００６６】
プラスミドｐＸＺ−８は、ＡＴＣＣに受託番号４０５１０号として寄託し、かつｐＨｕ−ＩＦＮ−αＡ／γと称する。
【００６７】
適正な欠失を有するプラスミド組換体をスクリーニングするため、プローブとしてオリゴマーを用いることにより２００個のコロニーにつきコロニーハイブリッド化を行なって、５３個のコロニーが陽性であることを観察した。５３個の陽性コロニーのうち３６個をＥｃｏＲＩでの制限切断により分析した結果、２個のコロニーのみが予想の制限断片を含有した。ＤＮＡ配列決定は、Ｈｕ−ＩＦＮ−γの１６ＣＯＯＨ末端アミノ酸をコードする配列の５’末端がＨｕ−ＩＦＮ−αＡのコード配列の３’末端に融合したことを確認した（第１，２および３図）。７３２ｂｐ断片が正確な組換体にて欠失した。ハイブリッドＨｕ−ＩＦＮ−αＡ／γの遺伝子を作成し、かつλＰＬプロモータの制御下で発現させた。ハイブリッドＨｕ−ＩＦＮ−αＡ／γの配列は１８１個のアミノ酸で構成される（第３図）。
【００６８】
下記するように、種々の発現ベクターにおける他のプロモータも使用することができる。
【００６９】
ハイブリッドＨｕ−ＩＦＮ−αＡ／γの特性化およびホスホリル化を次のように行なった。
【００７０】
プラスミドｐＸＺ−８を有するイー・コリＲＲ１（ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ８５７）細胞またはイー・コリＡＲ６８（ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ８５７）細胞を４２℃で増殖させてＨｕ−ＩＦＮ−αＡ／γを誘発させ、かつ後記するようにモノクローナル抗体親和性クロマトグラフィーによりハイブリッド蛋白を精製した。精製された蛋白４×１６８単位／ｍｇの比活性を示した。２−メルカプトエタノールの存在下におけるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電機泳動にて、これはＨｕ−ＩＦＮ−αＡより遅く移動する単一の主バンドを示し、かつＨｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ３のほぼ同じ位置に第４図および第５図に示したように１８２個のアミノ酸を有する他のＨｕ−ＩＦＮ−αＡ誘導体を示した。Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ／γはＨｕ−ＩＦＮ−αＡほど安定でないことが観察された。実験過程と精製過程と貯蔵との間に、イー・コリＲＲ１から抽出された蛋白の減成が観察された。イー・コリＡＲ６８を宿主細胞として用いた場合は、ずっと少い減成が観察された。
【００７１】
ハイブリッドＨｕ−ＩＦＮ−αＡ／γは〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰと牛心筋ｃＡＭＰ−依存性蛋白キナーゼとによりホスホリル化しうることが判明した。〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ／γの比放射能はイー・コリＲＲ１から分離された調製物につき約５μＣｉ／μｇの蛋白であり、イー・コリＡＲ６８から分離されたＨｕ−ＩＦＮ−αＡ／γの調製物において比放射能は約１４１μＣｉ／μｇまで増大し、これは恐らくカルボキシル末端の一層大きい組込みを反映する。これらの数直は〔１２５Ｉ〕ＩＦＮ−αＡにつき得られた数値の範囲に近似する。〔３２Ｐ〕ＩＦＮ−αＡ／γは、ＳＤＳ一ポリアクリルアミドゲル電機泳動にて２−メルカプトエタノールの存在下に未標識ＩＦＮ−αＡ／γと同じ位置に単一物質として移動する（第５図）。
【００７２】
細胞に対する〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ／γの結合は、次のようにして行なった。
【００７３】
結合試験には牛ＭＤＢＫ細胞を使用した。何故なら、Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡはこの細胞ラインに対し高い抗ウィルス活性を示すと共にこれに結合するのに対し、Ｈｕ−ＩＦＮ−γはそうでないからである。Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ／γが牛ＭＤＢＫおよびヒトダウジ細胞に特異的に結合するかどうかを決定するため、これら細胞を種々の農薬〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ／γと共に未標識Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡの不存在下および存在下で培養した。ＭＤＢＫ細胞とダウジ細胞との両者に対する〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ／γの特定結合を第６図および第７図に示す。
【００７４】
〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ／γを用いたこれらの結果は、Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ（これ自身はホスホリル化することができない）のＣＯＯＨ末端に対するＨｕ−ＩＦＮ−γのホスホリル化部位の融合が蛋白の結合能力を破壊しなかったことを示す。さらに、Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ／γ蛋白もその活性を保持した。
【００７５】
本発明のこの第１実施例の説明は、推定ホスホリル化部位を有するアミノ酸配列をコードしうるハイブリッドＤＮＡ配列の作成と、適する発現ビークルおよび完全な推定ホスホリル化部位を有するハイブリッド蛋白を容易に発現する形質転換宿主の作成と、そのホスホリル化とに成功したことを示す。
【００７６】
本発明の第２の主たる実施例は若干異なる方法で初期の目的を達成し、しかもホスホリル化しうる改変インタフェロンをもたらした。
【００７７】
上記第１実施例においてはホスホリル化しえない全蛋白（この場合にはＨｕ−ＩＦＮ−αＡ）をコードするＤＮＡ配列を推定のホスホリル化しうるアミノ酸配列をコードする配列にその配列の末端を融合させて改変させるが、第２実施例は配列の末端における融合を必要とせず、実際に融合工程を必要としない。
【００７８】
すなわち第２実施例は、一般に蛋白に対する本発明の幅広い適用性を示す。
【００７９】
第２実施例においては、得られる蛋白を適当なホスホリル化しうる配列の挿入により改変した。以下、第２実施例につき説明する。
【００８０】
標識しうる部位を挿したＨｕ−ＩＦＮ−α
本発明の重要な特徴は、キナーゼ認識しうるアミノ酸配列を選択された蛋白中に組込み（或いは蛋白キナーゼにより認識しえないアミノ酸配列を、このように認識される配列に変換し）かつ推定のキナーゼ認識しうるホスホリル化部位を有する蛋白をキナーゼ触媒作用による選択された放射性ラベルの結合によって標識することである。
【００８１】
一般に、これらの工程は、ＤＮＡ組換法によりヌクレオチド配列のレベルで行なわれる。蛋白キナーゼにより認識しうるアミノ酸共通配列が同定された後、このアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を規定しかつ作成することができる。この開示の目的で、蛋白キナーゼにより認識しうるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を「ＰＫヌクレオチド配列」と称する。同様に、蛋白キナーゼにより認識しうるアミノ酸配列を「ＰＫアミノ配列と称する。ＰＫヌクレオチド配列は、任意の選択されたヌクレオチド配列（特に蛋白、ポリペプチドもしくはペプチドのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列）に導入することができる。好ましくは、ＰＫ配列を蛋白をコードするヌクレオチド配列に、蛋白生成物が生物学上生化学上などで活性となるよう挿入し或いは結合させる。「生物学上活性」という用語は、その一般的意味において使用する。すなわち、改変蛋白はホスホリル化可能であり、しかも生物学上活性である。さらに、ホスホリル化された改変蛋白も所望の用途に関し充分活性でなければならない。或る場合、ホスホリル化蛋白は生物学上不活性とすることもでき、それでもたとえば放射性免疫分析にて有用である。
【００８２】
本発明において唯一の必要なことは、ホスホリル化用の部位を含むまたは部位であるアミノ酸共通配列の大部分を組込むことである。同様に、ＤＮＡレベルにて唯一の必要なことは、キナーゼにより認識されるアミノ酸をコードするコドンを与えることである。蛋白キナーゼの一般的性質であると報告されている絶対的基質特異性の欠如は、ヌクレオチド配列または認識アミノ酸をコードするコドンの選択において他の手段を与える。
【００８３】
「組込む」、「組込み」または「挿入」などの用語は、必ずしもアミノ酸認識配列（またはこのアミノ酸配列もしくはその１部をコードするヌクレオチド配列）が実際に所望の蛋白（またはこれをコードするヌクレオチド配列）に存在することを意味せず、改変生成物をコードする改変蛋白の部分またはヌクレオチド配列の部分（もしくはその１部）とすれば充分である。
【００８４】
本発明の特定例は本発明による遺伝子処理されたＨｕ−ＩＦＮ−αＡであり、これは公知のＨｕ−ＩＦＮ−αＡ（原、天然もしくは遺伝子処理）とは異なりホスホリル化可能かつホスホリル化された改変Ｈｕ−ＩＦＮ−αである。ホスホリル化されたＨｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐは生物活性を保持すると共に、高放射性比活性をも有する（２，０００〜１２，０００Ｃｉ／ミリモル）。環式ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）−依存性キナーゼである触媒牛心臓キナーゼを用いてホスホリル化を行なった。ｃＡＭＰ−依存性蛋白キナーゼのアミノ酸認識（もしくは共通）配列は、特にＡｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−ＶａｌおよびＡｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−ＬｅｕおよびＡｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａであると同定された。一般に、ｃＡＭＰ−依存性蛋白キナーゼは配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−Ｘｘｘを認識する。Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡのアミノ酸およびヌクレオチド配列、並びにその対応コード配列が報告されている。
【００８５】
セリンは、ネズミおよびヒトＩＦＮ−γの両者に対するホスホリル化の標的アミノ酸であることが示された。さらに、Ｈｕ−ＩＦＮ一γにはｃＡＭＰ一依存性蛋白キナーゼによりホスホリル化しうる２個のセリン、すなわちセリン１３２および１４２が存在することも示された。
【００８６】
本発明によれば、ホスホリル化されたＨｕ−ＩＦＮ一αの３種の特定例（ここではＨｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１，−Ｐ２および−Ｐ３）において、ホスホリル化部位を含有するようカルボキシル末端アミノ酸を改変し、かつ推定ホスホリル化部位をコードするヌクレオチド配列を作成した。
【００８７】
部位特異性突然変異法（文献に記載されかつ以下さらに説明する）によりＨｕ−ＩＦＮ一αＡのカルボキシル末端にて挿入および置換を生ぜしめると共に適当なＤＮＡ配列をファージＭ１３ｍｐ１９中に挿入するよう設計したオリゴデオキシリホーヌクレオチドを用いて、改変インタフェロンを作成した。改変カルボキシル末端をＨｕ−ＩＦＮ−αにイー・コリで合成するために使用した一般的方法は従来技術で開示されている。
【００８８】
カルボキシル末端におけるアミノ酸は改変されるものとする必要はない。改変は配列のアミノ末端とすることができ、したがってヌクレオチド配列の５’末端とすることができる。改変は、ホスホリル化部位が完全蛋白においてキナーゼにより認識されうる限り、蛋白配列の任意の位置（および対応のコード領域）とすることができる。
【００８９】
Ｈｕ−ＩＦＮ一αに関し上記したように、蛋白キナーゼのような酵素により認識しうるアミノ酸配列をコードする１個もしくはそれ以上の推定部位をヌクレオチド配列中に導入すれば、この種の部位が存在しない或いは得にくい蛋白またはこの種の追加部位を導入することが望ましい蛋白を改変するための新たな幅広い重要な可能性を与える。
【００９０】
蛋白キナーゼのうち、アクセプタ蛋白基質のセリンおよび／またはスレオニンヒドロキシル基へのＡＴＰのγ−ホスフェートの移動を触媒する公知の環式ヌクレオチド−依存性蛋白キナーゼ、カルシウム−依存性蛋白キナーゼ、チロシン特異性蛋白キナーゼ、環式ヌクレオチド−およびカルシウム−非依存性蛋白キナーゼが存在する。本発明はこれら蛋白キナーゼ、ホスホリル化の対応推定部位の１個もしくはそれ以上をコードするヌクレオチド配列、およびこの選択された蛋白キナーゼにより認識しうるアミノ酸配列を持った改変蛋白、並びに放射性ラベルを有するホスホリル化蛋白の使用を包含する。この種のラベルは燐または硫黄、或いはここに説明する他の基とすることができる。さらに、これは放射性ラベルではなくてもよい。これは「同定しうる」ラベルであれば充分である。
【００９１】
広義において、本発明はホスホリル化しうる部位を導入した後の蛋白キナーゼによる種々の蛋白のホスホリル化を包含する。すなわち、従来ホスホリル化しえなかつた蛋白にホスホリル化用の適する部位を与える本発明の幅広い利用性が認められるであろう。
【００９２】
本明細書の全体にわたり「ホスホリル化しうる」（または「ホスホリル化された」）という用語を用いる。また、たとえばγ−チオホスフェート同族体のようなホスフェートドナーＡＴＰの同族体についてもこの用語を用いる。本明細書において「ホスホリル化」などの用語は一般的にたとえば３１Ｐ，３２Ｐもしくは３３Ｐが３５Ｓもしくは硫黄同族体により置換される「チオホスホリル化」をも包含することを意図する。
【００９３】
ここに説明したように、キナーゼはセリンだけでなくスレオニンもしくはチロシンにおいてもホスホリル化を触媒することが報告されている。すなわち、選択されたキナーゼを認識する推定部位をコードするヌクレオチド配列の作成、並びにこに開示したと同様な複製しうる発現ビークルの作成、適する宿主中へのその導入、および次いで改変されたホスホリル化しうる蛋白の発現も本発明の範囲内である。適する場合、改変されたホスホリル化しうる蛋白は外来性および成熟蛋白である。次いで、ホスホリル化しうる蛋白をホスホリル化することができる。勿論、同様にホスホリル化された蛋白の同族体（たとえば硫黄標識されたもの）も作成することができる。
【００９４】
ｃＡＭＰ−依存性蛋白キナーゼにより認識される改変Ｈｕ−ＩＦＮ−αの場合、推定ホスホリル化部位をコードするヌクレオチド配列は、第９図に示すようにＤＮＡのレベルにおけるオリゴデオキシリボヌクレオチド指向性挿入によって形成される。
【００９５】
改変インタフェロンの作成
ホスホリル化部位を有するＨｕ−ＩＦＮ−αの発現プラスミドの作成を次のように行なった。Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡのコード配列を持ったｐＩＦＬγＡからのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片をＭ１３ｍｐ１９のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ部位に挿入してＭ１３・ＢＬ２７を形成し、これを第９図に示したように部位特異性改変の雛型として使用した。Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１および−Ｐ２のコード配列を作成するため、２種のオリゴデオキシリホ−ヌクレオチドを合成してＭ１３ＢＬ２７に融合させると共に、ヌクレオチドの挿入を可能にスルーループを形成して、ＣＯＯＨ−末端にホスホリル化部位のコード配列を生ぜしめた（枠内の残基、第８図）。それぞれＨｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１および−Ｐ２を作成するために使用したオリゴヌクレオチドは次の通りである。ＡＧＴ−ＴＴＡ−ＡＧＡ−ＡＧＴ−ＡＡＧ−ＡＧＡ−ＡＧＧ−ＧＣＡ−ＡＧＴ−ＧＴＴ−ＧＣＡ−ＴＧＡ−ＡＡＡ−ＣＴＧ−ＣＴＴ−ＣＡＡ；およびＡＣＡ−ＡＡＣ−ＴＴＧ−ＣＡＡ−ＡＧＡ−ＡＧＴ−ＴＴＡ−ＡＧＡ−ＡＧＧ−ＧＣＡ−ＡＧＴ−ＴＴＡ−ＧＣＡ−ＴＧＡ−ＡＡＡ−ＣＴＧ−ＣＴＴ−ＣＡＡ。下線を施こしたヌクレオチドはＨｕ−ＩＦＮ−αＡをコードするｃＤＮＡのコード配列および３’非コードヌクレオチド配列と同類である。下線を施してないヌクレオチドはＰ１およびＰ２のための他の残基を挿入するループを形成する。部位特異性突然変異、並びに挿入をＰ２オリゴヌクレオチドを用いて行なった。オリゴヌクレオチドをＭ１３ＢＬ２７からの一本鎖ＤＮＡに融合させた後、第２のヌトランドを合成し、次いでこれを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩで切断した。次いで、得られたＥｃｏＲ１−ＰｓｔＩ断片を第９図に示したようにファージＭ１３ｍｐ１９のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ部位を再挿入し、次いでイー・コリを二本鎖ＤＮＡで形質転換させた。不完全二木鎖分子（第９図の右上）はＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ二本鎖断片を形成しない。この切断および再結合工程を行なって、部位特異性突然変位の効率を増大させることにより約４０％の陽性クローンの全収率を与えた。個々のファージＭ１３プラークから作成されたＲＦ　ＤＨＡ試料を挿入ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片の存在につきスクリーニングした。陽性クローン（すなわち挿入物を有するもの；プラークの約７５〜９０％）を公知のサンガー・ジデオキシヌクレオチド法により配列決定して、適正に突然変異した組換体を同定すると共に配列を確認した。この方法により、配列決定された形質転換体の約５０％がホスホリル化部位を有する突然変異したコード配列を有した。次いで、ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片をファージ（Ｍ１３ＢＬ２８，Ｍ１３ＢＬ２９およびＭ１３ＢＬ３０）からの各ＲＦ　ＤＮＡ調製物より切断し、かつｐＲＣ２３ｔのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ部位に再結合して第９図に示すように発現ベクターｐＢＬ２８１，ｐＢＬ２９１およびｐＢＬ３０１を得た。ｐＲＣ２３ｔから得られた２種のＥｃｏＲ１−ＰｓｔＩ断片は、ＩＦＮ−βコード配列の直ぐ下流にｔｒｐターミネータを有するＭｕ−ＩＦＮ−βの発現プラスミドの制限エンドヌクレアーゼ切断によって得られた。
【００９６】
Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１発現ベクターの作成に際し、Ｐ１−オリゴヌクレオチドの重復と、Ｌｙｓに関するコドン１６４の１個のＡの単一ヌクレオチド欠失と、下流Ｐ１オリゴヌクレオチドからの１１個の３’末端残基（ＡＡ−ＣＴＧ−ＧＴＴ−ＣＡＡ）の第２欠失とを有するクローンを分離した。この一連の工程は、僅かに大きいＨｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ３と称する分子に新たなホスホリル化部位のための同相コード配列を形成した（第８図および第９図）。
【００９７】
ここで用いた一般的な組換ＤＮＡ法は従来開示されている。これらの方法を参考のためここに引用する。組換体のクローン化および蛋白の発現に関するファージλＰＬプロモータを含むベクターの使用については多くの刊行物に開示されている。野性型および突然変異型ファージλに対しリソゲニックであるか或いはファージλリプレッサをコードするプラスミドを含んだ各種のイー・コリ菌株が、プラスミドの増殖および／またはプラスミドでコードされた蛋白の発現につき使用されている。たとえば、特に次のイー・コリ菌株がプラスミドの複製および／またはファージλＰＬプロモータの制御下における蛋白の発現につき使用されている：イー・コリ２９４，ＡＲ１３，ＡＲ５８，ＡＲ６８，ＡＲ１２０，Ｃ６００，Ｎ９９，ＲＲ１，Ｗ３１１０。感温性リプレッサを有するイー・コリ菌株（ｃＩ８５７）を用い、この菌体を３０℃で増殖させてプラスミドを作成することができる。温度を４２℃まで移行させると、リプレッサが失活しかつファージλＰＬプロモータの制御下でＤＮＡ配列が発現される。かくして、菌体を３０℃で高密度まで増殖させ、次いで、興味ある蛋白を４２℃で発現させた。或いは、野性型ファージλリプレッサ（ｃＩ￣）を用い、ナリジキ酸を使用することによりファージλＰＬプロモータの制御下で遺伝子の発現を誘発することができる。本発明に関する研究において、感温性リプレッサ（ｃＩｔｓ８５７）を用いてファージλＰＬプロモータの制御下に遺伝子の発現を制御することが望ましいと判明した。プロテアーゼを欠乏した菌株を用いてイー・コリで組換蛋白の高度産生を達成する必要はないと判明したが、プロテアーゼを欠失する菌株が或る場合に有利であると判明した。
【００９８】
Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡのヌクレオチド配列を有する細菌プラスミドの作成および同定は従来公知である。Ｈｕ−ＩＦＮ−αの種類に対応するＤＮＡ配列を持った組換プラスミドの分離についても従来記載されている。イー・コリ菌株Ｋ−１２誘導体ＲＲ１が、本発明に有用な宿主であると考えられる。
【００９９】
本発明の目的に適した部位特異性突然変異は種々の刊行物に記載されており、これを本明細書に引用することができる。さらに、本発明の方法に関する従来技術はたとえば米国特許第４，７５１，０７７号公報に見られ、これを参考のためここに引用する。
【０１００】
本発明によれば、アミノ酸共通配列（これは推定ホスホリル化部位を有する）をコードするヌクレオチド配列を、Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡのヌクレオチド配列中のどこでも挿入することができる。これは、第８図に示したオリゴヌクレオチド配列から見ることができる。しかしながら、ヌクレオチド配列の挿入は、好ましくはＨｕ−ＩＦＮ−αＡをコードするヌクレオチド配列の部位で行なわれ、得られる組換蛋白の生物学的活性に対し（この種の生物学的活性が重要である場合）望ましくない作用を最少化させる。
【０１０１】
細菌によるＨｕ−ＩＦＮ−αＡ−ｐの発現
Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ蛋白をコードする発現プラスミドにて形質転換されたイー・コリにおける改変インタフェロンの発現、およびＨｕ−ＩＦＮ−αＡ−ｐ蛋白の精製を次のように行なった。上記３種のベクターのそれぞれを、プラスミドｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ８５７を有するイー・コリ菌体に導入した。それぞれｐＢＬ２８１，ｐＢＬ２９１およびｐＢＬ３０１プラスミドを有する適合性プラスミドｐＲＫ２４８ｃｌｔｓ８５７を持ったイー・コリＡＲ６８菌体およびイー・コリＲＲ１菌体はそれぞれＨｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１，−Ｐ２および−Ｐ３をＰＬプロモータおよびｔｒｐターミネータの制御下に４２℃で発現した。イー・コリＡＲ６８（ｐＲＫ２４８）におけるＨｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１，−Ｐ２および−Ｐ３の収率は同じプラスミドを有するイー・コリＲＲＩ（ｐＲＫ２４８）におけるよりも高かった。４２℃にてイー・コリＡＲ６８で発現された産生物を用いて、下記するように免疫親和性クロマトグラフィーによりＨｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１，−Ｐ２および−Ｐ３蛋白を精製した。下記第１表におけるデータは、抗ウィルス活性の５０％以上が回収されたことを示している。Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−ｐ１，−Ｐ２および−Ｐ３をそれぞれ蛋白１ｍｇ当り、１．２×１０８，１．１×１０８および１．５×１０８単位の比活性まで精製した。
【０１０２】
プラスミドｐＢＬ２８１をＡＴＣＣに受託番号４０５０９号として寄託し、かつｐＨｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１と称する。
【０１０３】
【表１】
2004089184.tif 000002
Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐおよびその３２Ｐ−標識生成物の特性化を次のように行なった。精製されたＨｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１，−Ｐ２およびＰ−Ｐ３蛋白を、２−メルカプトエタノールの存在下にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した（第１０図）。Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１もしくはＰ２につき銀染色されたゲルに、単一のバンドが観察された。Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ２は、Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１よりも僅かに早くかつＨｕ−ＩＦＮ−αＡよりも僅かに遅く移動した。Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ３は２つのバンドを生じ、遅く移動するバンドは完全分子である。
【０１０４】
Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１，−Ｐ２および−Ｐ３を、ｃＡＭＰ−依存性蛋白キナーゼにより〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰを用いて２，０００〜１２，０００Ｃｉ／ミリモルの比放射能までホスホリル化した。ホスホリル化の後、〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１および−Ｐ２はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて２−メルカプエタノールの存在下に単一バンドとして移動すると共に、１９，０００〜２０，０００の見掛け分子量（第１１図）は銀染色された未標識バンドと同じ位置に対応する。標識されたＨｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ３は、予想通り−Ｐ１もしくは−Ｐ２生成物よりも遅く移動した。より急遠に移動するＰ３バンドは未標識であるため（第１０図および第１１図参照）、ホスホリル化部位を有する−Ｐ３のＣ００Ｈ末端延長部は全長生成物から切断されて、より急速に移動する形態をもたらすと思われる。未標識Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡおよび〔１２５Ｉ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡを分子量標準および比較として用いた（第１０図および第１１図）。
【０１０５】
新規なインタフェロンの抗ウィルス活性
Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１，−Ｐ２および−Ｐ３の抗ウィルス活性に対するホスホリル化の作用を並行実験で決定した。ホスホリル化は、牛ＭＤＢＫ細胞およびヒトＷＩＳＨ細胞の両者を用いて測定されるＨｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１，−Ｐ２および−Ｐ３の抗ウィルス活性に対し殆んどまたはまったく作用を示さないことが判明した。
【０１０６】
下記第２表は、ホスホリル化されてない並びにホスホリル化されたインタフェロンα蛋白の抗ウィルス活性を示している。
【０１０７】
【表２】
2004089184.tif 000003
リセプタに結合する能力
リセプタに結合する〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐの能力を次のように示した。〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１およびＰ２は牛ＭＤＢＫ細胞およびヒトダウジ細胞（第１２図）に結合すると共に、特異結合はより高い濃度で飽和に近づく。データのスカッチャード分析は次の推定を与えた。牛ＭＤＢＫ細胞は、それぞれ〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１および−Ｐ２の結合から計算して細胞１個当り約３，８００および９，４５０個のリセプタを含有し、ダウジ細胞は細胞１個当り約１，６５０および４，９００個のリセプタを含有する。解離恒数（Ｋ）はヒトおよび牛の両細胞に対する〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１の結合につき１．４×１０−１０Ｍであると計算され、かつそれぞれヒトおよび牛の細胞に対する〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ２の結合につき、３．５×１０−１０Ｍおよび２．２×１０−１０Ｍであると計算された。同様な結果が〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ３についても得られた。
【０１０８】
これら全てのホスホリル化された〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ誘導体は、ダウジ細胞に対するその結合がＨｕ−ＩＦＮ−αＡおよびＨｕ−ＩＦＮ−βにより競合的に阻止されたがＨｕ−ＩＦＮ−γでは阻止されなかつたので、Ｈｕ−ＩＦＮ−α／βリセプタに結合する。
【０１０９】
リセプタに対する〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐの架橋
リセプタに対する〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐの架橋を次のように行なった。〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１，−Ｐ２および−Ｐ３をそれぞれ、細胞に結合させた後にスベリン酸ジスクシンイミジルとの反応によりリセプタに共有架橋させた（第１３図）。放射性複合体は分子量１００Ｋ〜２００Ｋを有する数種のバンドとしてダウジ細胞から移動し、或いは約１５０Ｋの見掛け分子量を有する幅広バンドとしてＭＤＢＫ細胞からＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析に際し移動した。〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１，−Ｐ２および−Ｐ３による細胞に対するリセプタの架橋複合体はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにて同じであると思われるが、ヒトダウジ細胞で形成された〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−γの架橋複合体とは相違する。結合反応の際に過剰の非放射性Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡを含ませれば、架橋複合休も遊離〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１，−Ｐ２および−Ｐ３も見られない（第１２図および第１３図）。
【０１１０】
ホスホリル化部位を有するＨｕ−ＩＦＮ−β
Ｈｕ−ＩＦＮ−β類似蛋白をコードしかつｃＡＭＰ−依存性蛋白キナーゼにより認識しうる推定ホスホリル化部位を持った同様なヌクレオチド配列を作成した。
【０１１１】
次の手順は、牛心臓からのｃＡＭＰ−依存性蛋白キナーゼにより認識しうる部位を持った改変Ｈｕ−ＩＦＮ−βを発生する。Ｈｕ−ＩＦＮ−βをコードするｃＤＮＡからのＰｓｔＩ−Ｂｇ１ＩＩ３６３ｂｐ断片を、発現ベクターｐＦＩＦｔｒｐ６９から切除した。この３６３ｂｐ断片をファージＭ１３ｍｐ１８のＰｓｔＩおよびＸｍａＩ部位に挿入した。先ず最初にＰｓｔＩ−Ｂｇ１ＩＩ断片のＰｓｔＩ末端を、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩおよびＸｍａＩで切断されたＭ１３ｍｐ１８のｄｓＤＮＡに結合させた。次いで、断片のＢｇ１ＩＩ末端を、ＭＬ３ｍｐ１８ベクターにＢｇｌＩＩ−ＸｍａＩリンカーを用いて結合させ：
ＧＡＴＣＴＧＣＧＣＧＣＧＣ
ＡＣＧＣＧＣＧＣＧＧＧＣＣ
これはＢｇ１ＩＩおよびＸｍａＩ部位を制限する。Ｍ１３ｍｐ１８のポリリンカー領域にはＢｇｌＩＩ部位が存在しないので、このＢｇｌＩＩ−ＸｍａＩリンカーを用いてＢｇｌＩＩ部位を保持すると共に、ＸｍａＩで切断することにより中間組換体の１種を作成した（下記および第８図の同様な作成を参照）。Ｈｕ−ＩＦＮ−βのコード領域における５’末端からの３６３ｂｐ断片を有するＭ１３ｍｐ１８は、部位特異性突然変異の雛型として使用されるＭ１３−Ａを次のように形成した。部位特異性挿入を上記と同様に行なって、Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１を作成した。Ｈｕ−ＩＦＮ−β−Ｐ、すなわち改変Ｈｕ−ＩＦＮ−βのコード配列を作成するため、オリゴデオキシリボヌクレオチド（ＣＴＴ−ＡＣＡ−ＧＧＴ−ＴＡＣ−ＣＴＣ−ＣＧＡ−ＡＧＧ−ＧＣＡ−ＡＧＴ−ＧＴＴ−ＧＣＡ−ＴＧＡ−ＡＧＡ−ＴＣＴ−ＧＣＧ−ＣＧＣ−ＧＣＣ−ＣＧＧ）を合成してＭ１３−Ａに融合させると共に、ヌクレオチドを挿入してＣＯＯＨ末端にホスホリル化部位のコード配列を生ぜしめるループを形成した。上記オリゴヌクレオチドの下線部分はＨｕ−ＩＦＮ−βをコードするｃＤＮＡ断片を含んだファージＭ１３−Ａのヌクレオチドと同類である。
【０１１２】
Ｈｕ−ＩＦＮ−βとＨｕ−ＩＦＮ−β−Ｐとの比較を下記に示す。
【０１１３】
2004089184.tif 000004
１６５〜１７０からの改変Ｈｕ−ＩＦＮ−β−Ｐの下線部分は、ｃＡＭＰ−依存性蛋白キナーゼ認識部位を示す。上記オリゴオチドにおける下線を施こしてないヌクレオチドは、Ｈｕ−ＩＦＮ−β−Ｐの残基１６６〜１７０を挿入するためのループを形成するＭ１３−Ａからの一本鎖ＤＮＡにオリゴヌクレオチドを融合させた後、第２ストランドを合成し、次いで制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩおよびＸｍａＩで切断した。次いで、得られたＰｓｔＩ−ＸｍａＩ断片を第８図に示したと同様にファージＭ１３ｍｐ１８のＰｓｔＩ−ＸｍａＩ部位に再挿入し、次いでイー・コリを二本鎖ＤＮＡで形質転換させた。この切断および再結合工程を行なって、部位特異性突然変異の効率を増大させた。個々のファージＭ１３プラークからのＲＦ　ＤＮＡ調製物を、挿入ＰｓｔＩ−ＸｍａＩ断片の存在につきスクリーニングした。陽性クローン（すなわち挿入物を有するもの）をサンガー・ジデオキシヌクレオチド法により配列決定して、適正に突然変異した組換体を同定すると共に配列を確認した。この方法により、配列決定された数種の形質転換体はホスホリル化部位を有する突然変異したコード配列を有する（Ｍｌ３−Ｂ）。次いで、ＰｓｔＩ−ＢｇｌＩＩ断片をファージＭ１３−ＢからのＲＦ　ＤＮＡより切除し、かつｐＦＩＦｔｒｐ６９のＰｓｔＩ−Ｂｇ１ＩＩ部位に再結合させて、原ベクターと同様な発現ベクターを得た。用いた一般的な組換ＤＮＡ法は従来の刊行物に記載されている。
【０１１４】
ホスホリル化しうる改変インタフェロンは公知のように発現することができ、かつ対応するＨｕ−ＩＦＮ−βのための手順にしたがって精製することができる。
【０１１５】
〔実施例〕
以下、限定はしないが例示の目的で本発明を実施例につき説明する。
【０１１６】
細菌菌株、酵素および薬品
ファージλＰＬプロモータの感温性リプレッサを有するプラスミドｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ８５７を持ったイー・コリＲＲ１をロバート・クラウルから入手した。プラスミドｐＰＲＫ２４８ｃＩｔｓ８５７を、形質転換によりイー・コリＡＲ６８中に導入した。
【０１１７】
制限エンドヌクレアーゼおよびポリヌクレオチドキナーゼはニュー・イングランド・ビオラブス社から入手した。用いた緩衝条件は製造業者により説明された通りである。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片およびＴ４ＤＮＡリガーゼはインターナショナル・バイオテクノロジース・インコポレーション社から入手した。牛腸ホスファターゼ（ｃ．ｉ．ｐ．）はベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルス社から入手した。結合反応は、低融点アガロースゲルの存在下で行なった。
【０１１８】
２０，０００単位／ｍｌの比活性を有する牛心筋からの触媒単位のｃＡＭＰ−依存性蛋白キナーゼをシグマ社から入手した。５，０００Ｃｉ／ミリモルの比放射能を有する〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰはアメルシャム社から入手し、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）はベセスダ・リサーチ・ラボラトリース社から入手し、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）はマイルズ・ラボラトリース社から入手し、アクリルアミドおよびＮ，Ｎ１−メチレンビスアクリルアミドはインターナショナル・バイオテクノロジース・インコーポレーション社（ＩＢＩ）から入手し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）はシグマ社から入手し、かつスベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）はピアス・ケミカル・カンパニー社から入手した。
【０１１９】
インタフェロンおよび蛋白の分析
インタフェロン活性は、水胞性口内炎ウィルスおよび牛ＭＤＢＫ細胞を用いる細胞病理作用抑制分析により決定した。インタフェロンの測定値は全て、ナショナル・インスティチュート・オブ・アレルギー・アンド・インフェクチャス・ディジーズ、ナショナル・インスティチュート・オブ・ヘルス、ミズーリ州、ベセスダの抗ウィルス物質プログラムから得られたヒト白血球インタフェロン（Ｇ−０２３−９０１−５２７）の比較標準に対し検量された比較単位／ｍｌで表わす。蛋白濃度は、標準として牛血濃度アルブミンを用いるブラッドフォードの方法により決定した。
【０１２０】
以下は融合ハイブリッドＨｕ−ＩＦＮ−αＡ／γの製造を例示する。
【０１２１】
オリゴヌクレオチドの合成およびホスホリル化
オリゴヌクレオチド指向性突然変異およびハイブリッド化スクリーニングに用いたオリゴデオキシリボヌクレオチドＣＴＧＡＣＴＣＣＴＴＴＴＴＣＧＣＴＴＴＴＣＣＴＴＡＣＴＴＣＴＴＡＡＣは、従来開示されているように合成しかつホスホリル化した。ホスホリル化反応の後、反応混合物を３．５ｍｌの６×ＳＳＣ（０．９ＭのＮａｃ１，９０ｍＭのクエン酸ナトリウム）で希釈し、かつハイブリッド化によるスクリーニングのため直接使用した。
【０１２２】
オリゴヌクレオチド指向性欠失
約１００ｐモルのホスホリル化されたオリゴマーを１０μｌの３０ｍＭトリスーＨｃＩ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２中にて１ＰモルのｓｓＤＮＡ雛型と８０℃で５分間融合させ、かつ除々に３０℃まで３０分間かけて冷却し、次いで氷上に置いた。容積を２０μｌの３０ｍＭトリス−Ｈｃ１（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ，０．５ｍＭ　ｄＡＴＰ，０．５ｍＭ　ｄＣＴＰ，０．５ｍＭ　ｄＧＴＰ，０．５ｍＭ　ｄＴＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）に調整した。このオリゴマーを２．５単位のＤＮＡポリマーゼＩのクレノー断片により６単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼの存在下に１６℃にて２４時間にわたり延長させた。次いで、反応混合物を同容積のフェノールおよびクロロホルム（１：１）で１回抽出し、かつ１／１０容積の２．５Ｍ酢酸ナトリウムおよび２容量の９５％エタノールで沈澱させた。７５％エタノールで洗浄した後、ＤＮＡをＳｐｅＩで切断して突然変異ＤＮＡを増加させ、次いでＲＲ１（λ−ｃＩｔｓ８５７）を形質転換させた。スクリーニングするため、コロニーハイブリッド化法を公知のように用いた。Ｍ１３ｍｐ１８／Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ／γからの６００ｂｐ　ＨｉｎｃＩＩ／ＰｓｔＩ断片をＭ１３ｍｐ１９のＨｉｎｃＩＩおよびＰｓｔＩ部位に挿入した後に、ジデオキシ配列決定法によりＤＮＡ配列決定を行なった。
【０１２３】
Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ／γの作成および精製
Ｈｕ−ＩＦＮ一αＡ／γを有するイー・コリＲＲ１（ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ８５７）菌体をＬＢブロスにて３０℃で１晩増殖させた。４０ｍｌの一晩培養物を、０．４％のカザミノ酸と５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ａｐ）と２５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンとを含有する２００ｍｌのＭ９培地まで希釈した。細菌を６００ｍｍにおける菌体密度が１．０に達するまで３０℃にて増殖させ、この時点で菌体を４２℃に２〜３時間移した。菌体を７，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離することにより回収し、かつ−２０℃にて使用するまで貯蔵した。
【０１２４】
精製するため、全ての工程を４℃で行なった。凍結した菌体（１０ｇ）を、２５ｍＭトリス−ＨＣ１（ｐＨ７．５）における３容量（４０ｍｌ）の７Ｍグアニジン塩酸塩に懸濁させた。この懸濁物を１時間混合し、かつ１７，０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離した。上澄液を１０容量の燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）で希釈した。固体硫酸アンモニウムを６５％飽和になるまで激しく撹拌しながら添加した。懸濁物を４℃にて２時間保ち、次いで１０，０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離した。ペレットを２０ｍｌのＰＢＳに懸濁させ、かつＰＢＳに対し徹底的に透析した。得られた懸濁物を１０，０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、かつ上澄液をアフィゲル１０に結合したＨｕ−ＩＦＮ−αＡ（ＬＩ−８）に対するモノクローナル抗体０．３ｍｌと１時間混合した。次いで、混合物を１ｍｌの使い捨て注射器に入れた。４倍カラム容積（０．３ｍｌ）の０．５Ｍ　ＮａＣ１，２５ｍＭトリス−ＨＣ１（ｐＨ７．５）で洗浄した後、カラムを４カラム容積の０．１５Ｍ　ＮａＣ１で濯ぎ、次いで４カラム容積の０．２Ｎ酢酸および０．１５Ｍ　ＮａＣ１（ｐＨ２．５）で溶出させた。抗ウィルス活性は最初の２つのフラクションに溶出した。これを牛ＭＤＢＫ細胞に対する細胞病理作用抑制分析により測定した。蛋白の濃度は、牛血清アルブミンを標準として用いるラウリーもしくはブラッドフォードの方法により決定した。これら２つの方法により得られた濃度は一致した。この方法により４×１０８単位／ｍｇの比活性を有する２４０μｇのＨｕ−ＩＦＮ一αＡ／γが得られた。
【０１２５】
発現プラスミドｐＸＺ−８を有するイー・コリＡＲ６８（ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ８５７）からのＨｕ−ＩＦＮ−αＡ／γ蛋白の作成、およびＨｕ−ＩＦＮ−αに対するモノクローナル抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによる精製は、Ｈｕ−ＩＦＮ−α−Ｐ蛋白につき下記する通りである。５０ｍｌの細菌培養物からの収量は、２．３×１０７単位／ｍｇの比活性を有するＨｕ−ＩＦＮ−αＡ／γの３８８μｇであった。Ｈｕ−ＩＦＮ−γのＣＯＯＨ末端配列に対するモノクローナル抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによる精製法は上記と同じである。酸による溶出は、５０ｍｌの細菌培養物から１．３６×１０７単位／ｍｇの比活性を有する２８１μｇのＨｕ−ＩＦＮ−αＡ−γを与えた。
【０１２６】
Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ／γのホスホリル化
Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ／γを、Ｈｕ−ＩＦＮ−γにつき記載したように若干の改変を加えてホスホリル化した。約１μｇのＨｕ−ＩＦＮ−αＡ／γを０．５ｍＣｉの〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰ（＞５，０００Ｃｉ／ミリモル、アメルシャム・コーポレーション社）および１０単位の牛心臓ｃＡＭＰ−依存性蛋白キナーゼ（シグマ社）の触媒単位と共に３０μ１の２０ｍＭトリスーＨＣＩ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ　ＮａＣ１，１２ｍＭ　ＭｇＣｌ２および３ｍＭＤＴＴにて３０℃で６０分間培養し、次いで氷上で冷却して反応を停止させた。１０ｍＭのピロ燐酸ナトリウム（ｐＨ６．７）における５ｍｇ／ｍｌの牛の血清アルブミン０．３ｍｌを添加した後、反応混合物を１０ｍＭのピロ燐酸ナトリウム（ｐＨ６．７）に対し４℃で徹底的に透析した。Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ／γ中への放射能の組込みを、トリクロル酢酸で蛋白を沈澱させた後に液体シンチレーションスペクトロメータで測定した。
【０１２７】
細胞に対するＨｕ−ＩＦＮ−αＡ／γの結合
牛ＭＤＢＫ細胞を結合試験に使用した。ＭＤＢＫ細胞を、１０％胎児牛血清と５０μｇ／ｍｌのゲンタマインンとが補充された培地（ギブコＦ−１１）における６−ウェル組織培養プレートにて融合するまで清澄させた。培地を取出し、かつ１ｍｌの新たな培地を各ウェルに添加した。２０分間後、〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ／γを０．６μｇの未標識Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ（１０８単位／ｍｇ）の存在下または不存在下に添加した。室温にて１時間培養した後、これらプレートを氷上に載置しかつ各ウェルを１ｍｌづつの冷ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、１ｍｌの１％ＳＤＳを添加して細胞をウエルから除去した。１０ｍｌのシンチレーションフルオル中に１ｍｌの試料を入れることにより液体シンチレーションカウンタで放射能を測定した。ヒトダウジ細胞に対する〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ／γの結合については、Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ蛋白に関し下記に説明する。
【０１２８】
以下は「挿入」による改変インタフェロンの製造を例示する。
【０１２９】
改変インタフェロンの作成
上記したハイブリッド−融合法および生産物には或る種の限界が存在するため、他の作成法を開発した。その際、推定ホスホリル化部位をＨｕ−ＩＦＮ−αのヌクレオチド配列中に導入しうることが突き止められた。
【０１３０】
ｃＡＭＰ−依存性蛋白キナーゼに対するアミノ酸認識もしくは共通配列は、特にＡｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−ＶａｌおよびＡｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕとして同定されている。Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡのアミノ酸配列およびその対応のコード化配列も報告されている。Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ並びにその他のインタフェロンは、ｔｒｐおよびファージλＰＬプロモータの制御下でイー・コリ発現ベクターにて発現されている。Ｈｕ−ＩＦＮ−αにおける最後の１０個のカルボキシル末端アミノ酸に対応する末端ヌクレオチドを第８図に示し、さらに推定ホスホリル化部位を有する改変分子Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１，−Ｐ２および−Ｐ３に対応する配列も示す。これらの分子を作成するため、オリゴデオキシリボヌクレオチドを合成して、部位特異性突然変異法によりＨｕ−ＩＦＮ−αＡのカルボキシル末端にて示したように挿入および置換を行なうと共に（第８図）、適当なＤＮＡ配列をファージＭ１３ｍｐ１９中に挿入した。ｃＡＭＰ−依存性蛋白キナーゼにより認識されるＨｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１，−Ｐ２および−Ｐ３（第８図）におけるホスホリル化部位は、第８図に示したように、ＤＮＡのレベルでオリゴデオキシリボヌクレオチド指向性挿入によって形成された。
【０１３１】
それぞれＨｕ−ＩＦＮ−αＡ−ｐ１，−Ｐ２および一Ｐ３をコードする発現プラスミドｐＢＬ２８１，ｐＢＬ２９１およびｐＢＬ３０１を、第８図に要約したように作成した。改変インタフェロンをコードする配列を、同様に第８図に示したようにファージλＰＬプロモータの制御下で発現ベクター中に挿入した。適合性プラスミドｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ８５７を含有するイー・コリＡＲ６８を、第８図に示すＣＯＯＨ末端配列を持ったＨｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ蛋白をコードする各発現プラスミドで形質転換させた。ホスホリル化しうる改変インタフェロンを、さらに下記するように発現させかつ精製した。
【０１３２】
Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐの発現および作成
Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１，−Ｐ２および−Ｐ３コード配列を有するｐＢＬ２８１，ｐＢＬ２９１もしくはｐＢＬ３０１プラスミドを持ったイー・コリＲＲ１（ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ８５７）菌体を、次のように改変した所定濃度の或る種の成分を有するＭ９ＣＡ培地にて３０℃で１晩増殖させた：１％のカザミノ酸、１％のグリコース、１０ｍＭのＭｇＳ０４および１ｍＭのＣａＣ１２。さらに、２μｇ／ｍｌのチアミンと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンと１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンとを含有した。Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡおよび改変蛋白を発現させるため、１００ｍｌのＭ９ＣＡ培地に３〜５ｍｌの１晩培養物を接種した。細菌を菌体混度が６００ｎｍにて０３〜０．５の光学密度に達するまで３０℃にて２〜３時間増殖させ、この時点で培養物を４２℃にさらに２時間移した。細菌の菌体を遠心分離により集め、かつ８Ｍグアニジン塩酸塩と５０ｍＭトリスーＨＣ１（ｐＨ７．６）とで０℃にて１０分間溶菌させた。１４，０００ｒｐｍ（ＳＡ−６００ソルバール型ロータ）にて３０分間遠心分離した後に得られた上澄液を用いて、抗ウィルス活性を分析し或いはＨｕ−ＩＦＮ−αＡおよび改変インタフェロンを精製した。
【０１３３】
Ｈｕ−ＩＦＮ一αＡ−Ｐコード配列を含有するプラスミドｐＢＬ２８１，ｐＢＬ２９１もしくはｐＢＬ３０１を持ったイー・コリＡＲ６８（ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ８５７）菌体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンと１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンとを含有するＬＢ培地にて３２℃で１晩増殖させた。１晩培養物を、上記と同濃度の抗生物質を含有する新たなＬＢ培地で５倍に希釈し、次いで３２℃にて２〜３時間増殖させた。Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−ｐ蛋白を発現させ、菌体を収穫しかつ上澄液を作成するため、イー・コリＲＲ１菌体につき使用した上記の手順を用いた。
【０１３４】
Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ蛋白の精製は次のように行なった。Ｈｕ−ＩＦＮ一αＡ−Ｐ物質の精製に関する全ての工程は４〜８℃で行なった。１００ｍｌの発現培養物から得られた１０ｍｌのグアニジン塩酸塩上澄液を冷燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）で１０倍希釈し、かつ硫酸アンモニウムの６５％飽和により４℃で１晩沈澱させた。沈澱物を１０，０００ｒＰｍ（ソルバールＧＳＡロータ）で５℃にて２０分間遠心分離することにより回収した。上澄液をデカントして集めた。残留ペレットを再び１０ｍｌの冷ＰＢＳに溶解させ、かつ溶液を上記と同様に遠心分碓した。合した上澄液３０ｍｌを１ｍｌのアフィゲル１０と混合し、これにモノクローナル抗体ＬＩ−８（Ｈｕ−ＩＦＮ−αに対する）を結合させかつ懸濁物を４℃で１時間振とうした。免疫吸着剤を２ｍｌの使い捨て注射器の本体に入れ、かつ２０倍容積もしくはそれ以上の次の低温溶液のそれぞれで順次に洗浄した：ＰＢＳ、綬衝液Ｆ（０．５Ｍ　ＮａＣ１，２５ｍＭトリスーＨＣ１（ｐＨ７．５）および０．２％トリトンＸ−１００）；および０．１５Ｍ　ＮａＣｌ。次いで、インタフェロンを緩衝液Ｈ（０．２Ｍ酢酸、０．１５Ｍ　ＮａＣＩ（ｐＨ２．６））で溶出させ、かつ０．４ｍｌのフラクションを集めた。溶出されたフラクションを１Ｍトリス塩基でｐＨ７．０まで中和し、かつピーク抗ウィルス活性のフラクションを集めた。
【０１３５】
Ｈｕ−ＩＦＮ−γおよびＨｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ蛋白のホスホリル化を次のように行なった：Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−ＰもしくはＨｕ−ＩＦＮ−γを、Ｈｕ−ＩＦＮ−γにつき記載したように若干の改変を伴って〔γ−３２ｐ〕ＡＴＰおよびｃＡＭＰ−依存性蛋白キナーゼで標識した。約０．２５〜０，６５μｇのＨｕ−ＩＦＮ−γもしくはＨｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐを、上記したような成分を含有する３０μｌにおいて０．２５ｍＣｉの〔γ−３２ｐ〕ＡＴＰ（５０００Ｃｉ／ミリモル、アメルシャム社）および７．５触媒単位のｃＡＴＭＰ−依存性蛋白キナーゼと共に３０℃で１時間培養した。次いで、反応混合物を氷浴中で冷却し、かつ１０ｍＭのピロ燐酸ナトリウム（ＨａＰＰｉ）（ｐＨ６．７）における５ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミン２７０μ１を添加した後に１０ｍＭのＮａＰＰｉに対し４℃で徹底的に透析した。〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−ｐと結合した放射能をベックマンモデルＬＳ３８０１型シンチレーションスペクトロメータで測定した。このホスホリル化されたＨｕ−ＩＦＮ−αＡ一Ｐを液体窒素中で小容量にて貯蔵した。
【０１３６】
３２Ｐでホスホリル化されたＨｕ−ＩＦＮ−γは〔１２５Ｉ〕ＩＦＮ−γにつき報告されているよりも１０倍高い比放射能を有すると報告されている。
【０１３７】
本発明によるホスホリル化インタフェロンは、生物学的活性を保持しながら従来得られているよりも高い放射線比活性（１，０００〜１２，０００Ｃｉ／ミリモル）を有する分子を与える。したがって、Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ中にＣＯＯＨ末端にて挿入されたホスホリル化部位は生物学的活性（抗ウィルス活性）に対し悪影讐を与えず、かつｃＡＭＰ−依存性蛋白キナーゼにより効果的に認識することができる。
【０１３８】
さらにＨｕ−ＩＦＮ−αＡ−ｐ１および−Ｐ２は精製およびホスホリル化の際に安定である。第８図に示したようにＣＯＯＨ末端に追加セプチデシルペプチドを有するＨｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ３を少なくとも２種の断片に分裂させた。
【０１３９】
或る種の生物学的用途につき、ホスホリル化された改変インタフェロンおよびたとえばＳを含有するような燐酸同族体で標識されたものは血清中にて安定にすべきであることは明らかである。
【０１４０】
牛ＭＤＢＫ細胞およびヒトダウジ細胞に対する〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１，−Ｐ２および−Ｐ３の結合を行なった。細胞に架橋した〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ一αＡ−Ｐ１，−Ｐ２および−Ｐ３は、牛ＭＤＢＫ細胞に対し約１５０Ｋの１種の複合体を示すと共にヒトダウジ細胞に対し１００〜２００Ｋの数種の複合体を示した。
【０１４１】
細胞に対する〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐの結合を次のように行なった：牛ＭＤＢＫ細胞の融合した単層をトリプシン処理し、かつ１０％の失活した胎児牛血清と１％のペニシリン−ストレプトマイシン溶液（ギプコ社）とを有するデュルベッコ改変イーグル培地（ギブコ社）における細胞懸濁物１ｍｌ（１×１０６細胞）を、６−ウェループレートの各ウェルに添加した。細胞単層は融合に通し、かつ３７℃での１晩の培養に際し約２倍となり、この時点でこれらを用いて〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐの結合を測定した。結合を開示させるため、培地を除去し、次いで〔３２ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐを指示濃度で含有する１ｍｌの新鮮培地を各ウェルに添加し、その際拮抗体として過剰の非放射性Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ（添加した〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐよりも５００倍以上）を存在させ（＋）または存在させなかつた（−）。これらプレートを振とうしながら室温（２４℃）で６０分間培養し、次いでこれらを氷上に載置して冷却した。各ウェルを１ｍｌづつの冷ＰＢＳで３回洗浄して、未結合の放射性配位子を除去した。洗浄した後、１．５ｍｌの水中の１％ドデシル硫酸ナトリウムを各ウェルに添加し、さらに細胞を溶解させかつ放射能を結合させた後、全体で１．５ｍｌを２ｍｌのハイドロフルオル・シンチレーンヨン液にてベックマン・モデルＬＳ３８０１型シンチレーションカウンターにて計数した。
【０１４２】
ヒトダウジ細胞に対する〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐの結合を、着干の改変を伴なって従来開示されているように行なった。ダウジ細胞を１，０００×ｇにて１０分間遠心分離することにより回収し、増殖培地（ＲＰＭＩ一１６４０、ギブコ−Ｈ１８，１２．５ｍＭのナトリウムＨＥＰＥＳ，１０％の胎児牛血清および５０μｇ／ｍｌのゲントマイシンを補充）にて２回洗浄し、かつ１×１０７細胞／ｍｌの濃度まで培地中に再懸濁させた。全容積１２５μ１における１．２５×１０６個のダウジ細胞に対する示した濃度における〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐの結合を、拮抗体としての非放射性Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡの不存在下もしくは存在下で室温（２４℃）にて６０分間にわたり１５分間毎に緩和に再懸濁しながら進行させた。６０分間の培養時間の終了後、１００μ１の細胞懸濁物を試料カップにおけるＰＢＳ中１０％蔗糖のクッション３００μ１に層状化させ、かつ２分間遠心分離（ベックマン・ミクロフュージ・タイプＢ型）でペレット化させた。チューブをドライアイス−エタノール浴で凍結させ、次いで細胞ペレットを含有するチューブ先端を切除し、かつ上記と同様に計数した。〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐの所定濃度における比結合は、過剰の非放射性Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡの不存在下で培養した試料（全体）と存在下（非特異性）との間の結合放射能の差として規定される。
【０１４３】
リセプタに対する〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐの共有架橋を次のように行なった：７５ｍｌの組織培養フラスコにおける牛ＭＤＢＫ細胞の単層をデュルベッコ燐酸塩緩衝塩水で２回洗浄し、２ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（１×燐酸塩緩衝塩水、ギブコ・ラボラトリース社）により３７℃で細胞が組織培養フラスコから放出されるまでトリプシン処理した。１０％の失活した胎児牛血清と１％のペニシリン−ストレプトマイシン（ギブコ社）とを含有するデュルベッコ改変イーグル培地（ギブコ・ラボラトリース社）の１０〜２０ｍｌを添加した後、細胞を５００×ｇにて５〜１０分間遠心分離することにより集め、かつ同じ培地中に約１×１０７細胞／ｍｌの濃度まで再懸濁させた。約５×１０５ｃｐｍの〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ（２，０００〜１２，０００Ｃｉ／ミリモル）を、拮抗体としての１μｇの非放射性Ｈｕ−ＩＦＮ一αＡと共に或いはそれなしに０．５ｍｌの細胞に添加した。室温（２４℃）にて振とうしながら１時間培養した後、細胞をエッペンドルフ・ミクロフュージにて１４，０００ｒｐｍで２０秒間ペレット化させ、１ｍｌの冷ＰＢＳで２回洗浄し、次いで０．５ｍＭのスベリン酸ジスクシンイミジル（ジメチルスルホキシド中で新たに作成）の最終濃度で４℃にて２０分間処理した。細胞リセプタ蛋白に対する〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐの架橋をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、従来技術で詳細に開示されているように８％アクリルァミドを含有する厚さ１．５ｍｍのスラブゲルにて分析した。このようにして架橋が確認された。
【０１４４】
上記と同様にして、３５Ｓ−標識蛋白がＨｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１と同様に得られる。
【０１４５】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
蛋白、標識生成物および共有架橋複合体を、レムリの方法により厚さ１．０もしくは１．５ｍｍのＳＤＳ−ポリアクリルアミドスラブゲルでの電気泳動により分析した。電気泳動の後、蛋白を銀またはクーマシ−ブリリアントブルーで染色した。放射性試料を含有するゲルを減圧下で乾燥させ、かつ標識された配位子については室温で、また共有架橋された複合体については−１７０℃にてコダックＸ−Ｏマットフィルムおよび強化スクリーンを用いて放射能写真処理した。
【０１４６】
他の発現ベクター、宿主細胞など
改変インタフェロンを発現させ、各種のヌクレオチド配列を作成し、かつ特定宿主を形質転換させるのに現在好適な方法につき説明したかが、本発明は決してこれらのみに限定されないことが明らかである。真核性および原核性の両宿主細胞を用いることができる。遺伝子分離、並びに細菌菌体および異質細胞におけるインタフェロンの発現は、本発明の改変インタフェロンの製造に全く適している。たとえば、酵母によりヒトインタフェロンを産生しかつ分泌させるための酵母ベクターの使用に関し、幾つかの従来技術が存在する。イー・コリの他の微生物菌株を用いることができ、或いは異質遺伝子配列を複製しかつ発現しうるプラスミドを持った細菌類、たとえば枯草菌、腸チフス菌も使用することができる（米国特許第４，７２７，１３８号に開示されている）。他の発現ベクターがたとえば米国特許第４，５５９，３００号公報に示されている。さらに、多くの他のプロモータ系（ここに開示したもの以外）、たとえばｔｒｐおよびｌａｕプロモータなども使用することができる。これら全ての従来技術を参考のため本明細書中に含ませる。
【０１４７】
同様に、改変インタフェロンは脊権動物の細胞培養物から製造することができ、たとえばサル腎臓繊維芽細胞のＣＯＳ−７ラインを改変インタフェロンの製造につき適する発現ベクターと共に宿主として使用することができる。他の細胞ラインも適しており、かつ公知である。真核細胞で発現されるためのレトロウィルス系ベクターの使用の例も従来技術で示されている。真核発現ベクターの他の多くの例も従来示されている。
【０１４８】
形質転換宿主細胞にて複製するのに本発明で有用なベクターは、機能的複製のオリジン（レプリコン）を含有したＤＮＡ断片を有する。プラスミドおよびファージＤＮＡは、その性質により宿主細胞における複製を促進するレプリコンを有する。ベクターは、形質転換細胞を未形質転換細胞から選択するのに有用な性質を形質転換可能な宿主細胞に移行させるＤＮＡ断片を有する。選択目的には、広範囲の性質を用いることができる。最も一般的に用いられる性質の１つは抗生物質耐性、たとえばテトラサイクリン耐性もしくはアンピシリン耐性である。
【０１４９】
上記２種の要素は一般に容易に入手しうる認識されたクローンベクターに存在する。適するクローン化ベクターの例は細菌プラスミド、たとえばｐＢＲ３２２，ｐＭＢ８９，Ｃｏ１Ｅ１，ｐＣＲ１を包含するイー・コリからのプラスミド；ＲＰ４を包含する広範な宿主範囲のプラスミド；たとえばλのようなファージＤＮＡなどである。必ずしも全てでないが殆んどの上記ベクターは、既に上記した２種の要素を有する。勿諭、公知のように或る種の組換体において、ＤＮＡはレプリコンも付着標識も含有する必要がない。
【０１５０】
すなわち、任意適当な発現ベクターを用いて、本発明により推定ホスホリル化部位を有する改変インタフェロンを発現することができる。
【０１５１】
公知方法によれば、ＤＮＡは制御セグメントとコード領域とを含む。すなわち本発明は、例として開示した遺侯子組換体を作成する特定の手段に限定されず、さらに当業者は余計な実験を行なうことなくこの目的に最も適した方法を採用し、変化させ或いは選択しうることが明らかである。
【０１５２】
技術および追加材料（分子クローン化、ｃＤＮＡの合成およびクローン化、イー・コリ中へのプラスミドおよびバクテリオファージλＤＮＡの導入などに使用するベクター、宿主系、プラスミド、酵素など）についても従来公知であり、これら従来技術を参考のためここに含ませる。
【０１５３】
補足の一般的観察
上記したようにＨｕ−ＩＦＮ−αＡおよびＨｕ−ＩＦＮ−βはホスホリル化できない（ｃＡＭＰ−依存性牛心臓キナーゼにより）のに対し、Ｈｕ−ＩＦＮ−γおよび対応のＲａ−およびＭｕ−ＩＦＭ−γはＤＮＡ配列の改変なしにホスホリル化しうることが示されている。
【０１５４】
すなわち、本発明によれば、追加ホスホリル化部位をＨｕ−ＩＦＮ−γ中に導入して、１個のみのホスホリル化部位しか持たない蛋白（たとえばインタフェロン）よりも高い放射性比活性まで標識しうるインタフェロン蛋白を得ることができる。
【０１５５】
すなわち、既に１個（または多数）のこの種の部位を有する蛋白に部位（ホスホリル化、チオホスリル化）の個数を増加させることも本発明の靹囲内である。
【０１５６】
ホスホリル化しうるヌクレオチド配置のオリジンをさらに変化させることができる。Ｈｕ−ＩＦＮ−γに対応するＰＫヌクレオチド配列を使用する代りに、その他任意のインタフェロン（たとえばネズミインタフェロン）に対応するＰＫ配列を使用することができ、或いはこの点に関しＰＫヌクレオチド配列をホスホリル化可能なことが知られた蛋白をコードする他の任意のヌクレオチド配列から誘導することもできる。このようにして、極めて興味あるホスホリル化しうる蛋白（およびホスホリル化された蛋白）を実用に供することができる。
【０１５７】
さらに、沃素標識よりも有利である放射性ラベルでは従来ホスホリル化しえなかったＨｕ−ＩＦＮ一αＡおよび−βのような蛋白を放射性標識することも本発明の範囲内である。したがって、硫黄を燐の代りに用いる放射性ＡＴＰの硫黄同族体を使用することも本発明の範囲内である。たとえば、ＡＴＰのγ−３５Ｓ同族体を、通当な認識部位にて蛋白中に組込むことができる。すなわち本発明は、たとえば３５Ｓ，３８Ｓ，３１Ｐ，３２Ｐおよび３３Ｐのような硫黄および燐の同位元素の使用を包含する。これら同位元素の幾種かは、容易に入手しえず或いはその半減期のため、まだ広く使用されていない。同位元素のリストは勿論入手することができる。標識すべき化合物中に導入しうる同位元素も本発明に包含される。
【０１５８】
下記第３表から見られるように、２．８７時間の半減期と１．１Ｍｅｖのエネルギーとを有する３８Ｓは、照射が適当であると思われる場合、腫瘍およびその他の組織の理想的な照射線源となりうる。２．９時間という短い半減期を持ったこの種の同位元素でホスホリル化された蛋白は、３２Ｐで得られる比活性の約１００倍の比活性を有する。さらに、同位元素の短い半減期は、同位元素が数日間以内に患者から除去されるという利点をも有する。さらに、３２Ｐよりも１００倍の比活性を発生する能力はより少量の蛋白の使用を可能にする結果、抗原副作用（すなわち、これら蛋白に対する抗体生産）が最小化される。３２Ｐ燐酸化合物は、３２Ｐの約１／７のエネルギーを有するＢ粒子を生成する。同位元素は２４．２日間の半減期を有し、３３Ｐを含有する燐酸同族体でホスホリル化された蛋白は３２Ｐで標識された同族体に比べ約半分の比活性（１４．２日間の半減期）を有する。３３Ｐの照射は、３２Ｐを含有する誘導体よりも腫瘍細胞を包囲する領域に対し低い作用を示す。すなわち、本発明による生産物の使用は重要かつ有利な利点をもたらしうる。
【０１５９】
改変蛋白の追加用途および使用
本発明により１種もしくはそれ以上のホスホリル化された基またはその同族体（たとえば硫黄）の存在により改変されたインタフェロンおよび同様に改変された蛋白は、生物学、医学、生物医学（治療および診断を含む）並びにその他の科学にて多くの用途を有する。
【０１６０】
本発明により改変された蛋白はさらに特定の用途を有すると考えられる。これら用途の２〜３の例を以下に説明する。
【０１６１】
１．蛋白の薬物動物学
動物および患者における注射された蛋白の経過を追跡するのがしばしば有用である。幾種かのこれら蛋白に結合した燐はヒトおよび胎児牛の血清にて比較的安定である。したがって、蛋白の薬物動力学を便利に検討することができる。すなわち、ホスホリル化された蛋白は特にこの種の用途に適している。
【０１６２】
蛋白がヒトもしくは動物の血清に接触すると予想される本発明によるホスホリル化蛋白もしくは同族体の使用については、蛋白誘導体がヒトもしくは動物の血清にて安定であることが必要である。薬物動力学の研究（または応用）を行なうべき種類の動物の血清、或いは生物学的観点から研究を行なうべき動物の種類の血清と同等な血清において、蛋白誘導体は安定でなければならない。
【０１６３】
たとえば、上記研究において、Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１，−Ｐ２および−Ｐ３に結合したホスフェートは胎児牛血清中で３７℃にて安定である。ヒト血清の存在下では、Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１およびＨｕ−ＦＮ−αＡ−Ｐ３に結合したホスフェートは３７℃にて安定であるが、Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ２に結合したホスフェートは不安定であった。３７℃にて６時間および１６時間の後、ホスフェートの約６２％および７４％が〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ２から加水分解された。かくして、ホスホリル化誘導体の安定性が重要である用途の場合、血清−安定性の誘導体が使用される。同様な配慮が、改変Ｈｕ−ＩＦＮ−βにも適用される。血清における安定性が必須でない用途については、血清−不安定なホスホリル化同族体も使用することができる。
【０１６４】
ここに説明した用途は、セリン残基にてホスホリル化された蛋白に限定されない。たとえばスレオニンもしくはチロシンのような他のアミノ酸をどのようにキナーゼがホスホリル化するかについて上記した。すなわち、これらアミノ酸にて改変された蛋白は本発明の範囲内である。この種の誘導された標識蟹白の構成により、対応のセリンーホスホリル化誘導体が充分に血清安定性でなければ、血清中のその安定性を向上させうることも排除するものでない。
【０１６５】
２．一般的な診断試薬薬
本発明による改変蛋白の他の特定用途につき説明する価値がある。ここに説明したように、ほぼ全ての蛋白は単一もしくは複数のホスホリル化（もしくは類似）部位を導入するよう処理することができる。この種の蛋白は広範な種類の科学目的、すなわち動物もしくはヒトにおけるこれら蛋白の経過の研究、その安定性の研究、または放射性蛋白が有益である実験室試薬としての使用などに用いることができる。
【０１６６】
たとえば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動には分子量標準が一般的に使用される。ホスホリル化部位を有する蛋白はたとえば分子量標識、等電点集中標識もしくはその他の標識など便利な放射能写真標識となる。この種の用途の場合、血清安定性は一般に重要でなく、蛋白（たとえばインタフェロン）の生物学的活性の保持も重要でない。したがって、或る種の用途の場合、本発明によるホスホリル化しうる蛋白が生物活性を有することは必須でない。
【０１６７】
３，抗癌治療「ボンプ」
本発明により可能となる特に貴重かつ興味ある用途は、いわゆる治療上もしくはより詳細には抗腫瘍性の「治療照射ポンプ」である。この種の生物学上活性な組成物は、腫瘍特異性のモノクローナル抗体（Ｍａｂ）（またはより好適にはＦａｂもしくはＦａｂ´断片）に結合したビオチンおよび各Ｍａｂ結合ビオチンに結合した複数の「改変」ストレプトアビジンを使用し、各ストレプトアビジンは複数のホスホリル化された基を有する点で改変されている。ストレプトアビジン自身は四量体であるため、複数の放射性基がかくして与えられる。これらの複数の放射性基は、著しく増幅されかつしたがってより容易に検出しうると共に一眉大きい腫瘍破壊力をもたらす照射線を腫瘍に露出する。高度にホスホリル化しうる場合、これはずっと容易に検出することができる。したがって、各腫瘍特異性Ｍａｂに結合したビオチンの各１個が複数のストレプトアビジン分子に堅固に結合し、これらストレプトアビジン分子は複数の標識燐原子またはその同等な同位元素を有する。
【０１６８】
治療もしくは診断目的に応じて、ストレプトアビジンは全て放射性燐で標識し或いは部分的もしくは全体的に放射性チオ燐で標識し或いは照射線エネルギーの異なる減衰モードもしくはレベルを有する異なる燐もしくは硫黄同位元素で標識しうることが明らかである。この種の同位元素につき下記に説明する。
【０１６９】
抗体分子自身は複数鎖分子であるため、本発明の方法により多くの部位を直接に抗体またはＦａｂ断片に導入することができる。
【０１７０】
４．ホルモン・サイトキン・リンホキン・成長因子
放射性燐もしくは硫黄で標識されたホルモンが、本発明の範囲内における他の種類の生物学的物質である。たとえば、ホスホリル化（たとえば３３Ｐ，３２Ｐ）ホルモンは、他の組織に対し特定の細胞種類に種々異なって結合することができる。この種のホルモンに対するリセプタの個数が増加した癌組織を適当にホスホリル化されたホルモンで処理することができ、これらホルモンは上記細胞に特異的に結合し、かくして治療が顕著に改書される。
【０１７１】
さらに、標識されたホルモンは、細胞表面リセプタ、可溶性リセプタまたはその他の試薬および材料へのその結合を検査するためのリセプタ研究に一般的に使用される。
【０１７２】
本発明に含まれる標識ホルモン（３３Ｐ，３２Ｐ）の典型例は成長ホルモン、インシュリン、ＦＳＨ、ＬＨなどである。遺伝的に形成されるこの種のホルモンは１個もしくはそれ以上の推定のホスホリル化しうるもしくはチオホスホリル化しうる基の導入を可能にすることが明らかである。
【０１７３】
ホルモンにつき上記したように、同じことがサイトキン、リンホキン、成長因子（すなわちＩＬ−１，１Ｌ−２，ＩＬ−３，ＴＮＦ−α，ＴＮＦ−β、各種のＣＳＦ分子、エリスロポイエチンＥＧＦ，ＮＧＦなど）、並びに多かれ少なかれ細胞および、または組織特異性を有する蛋白についても当てはまる。
【０１７４】
５．抗体
ホスホリル化により標識されたストレプトアビジンを、未標識ストレプトアビジンまたは酵素結合した末標識ストレプトアビジンの置換体として免疫分析を向上させるべく直接使用することができる。さらに、本発明は遺伝子操作された抗体、より詳細にはＭａｂまたはＦａｂもしくはＦａｂ´断片に燐もしくは同族体ラベルを導入することも包含する。この種のＭａｂは診断および治療目的に有用である。ホスホリル化されたＭａｂは特定の腫瘍関連抗原または各種の腫瘍、たとえば乳癌、大腸癌の細胞、悪性黒色腫細胞、卵巣癌細胞およびその他の悪性腫瘍を標的とすることができる。
【０１７５】
６．他の治療用途
本発明に包含される他の用途は次の通りである：抗体および／または抗体断片（たとえばＦａｂもしくはＦａｂ´断片）のモノクローナルもしくは適するカクテルは、本発明によりホスホリル化またはその他の標識しうる部位を導入しうる価値ある分子である。治療における３２Ｐの使用が真性多血球血症およびその他の悪性病につき示されている。すなわち、抗細胞剤として高エネルギーβ粒子が有効であることは明らかである。Ｍａｂもしくはその適する断片（ＦａｂおよびＦａｂ´）におけるホスホリル化部位の導入を介する３２Ｐの結合も、これらモノクローナル抗体が特異性である腫瘍の治療に有効である。乳癌、大腸癌、卵巣癌およびその他の腺癌、悪性黒色腫およびその他多くの腫瘍からの腫瘍関連性抗原に対し、多数のモノクローナル抗体が開発されている。たとえば、これら腫瘍の腫瘍関連性抗原に指向するＭａｂは、３２Ｐで標識すれば高度に効果的となることが予想される。標識は、ホスホリル化部位のカセットを用いて或いは完全蛋白もしくは適当な断片中への遺伝子操作を介する複数ホスホリル化部位の導入により直接に増加させることができる。「カセット」という用語は多機能成分を意味する。
【０１７６】
複数の標識されたホスホリル化部位を本発明によりＭａｂに導入すれば、これは標的とされる特定エピトープに対する改変Ｍａｂの結合特異性および／または親和性を低下させる。この種の状態にて、複数ホスホリル化ストレプトアビジンに結合したビオチニル化Ｍａｂの使用（上記した通り）は明確な利点を与えることが判るであろう。Ｍａｂの特異性は変化せず、しかも診断剤の放射能が何倍にも増大する。
【０１７７】
さらに本発明は、患者が悪抗原反応を発生すると思われる治療剤の製造をも包含する。すなわち、モノクローナル抗体を、種々異なるホスホリル化部位により本発明にしたがって好適に処理することができる。ホスホリル化部位のため、注射された抗体に対し敏感となった或いは抗体を生成するようになった患者に導入すれば、異なるホスホリル化部位に変化することにより蛋白の抗原特性を改変することができる。かくして、この種の抗体を上記種類の抗体と反応する患者における複数の順次の治療食餌中に使用することができる。この目的で、種々のホスホリル化部位を有する一連の杭体を開発することができる。各シリーズは異なるエピトープ構造を有するよう設計され、かつ順次に使用されるであろう。或いは、この種の異なる抗体のカクテルを、いずれか一つが全体の１部に存在するよう最初に使用することもできる。これは、新たな部位のいずれか一つに抗体形成を量小化させるであろう。
【０１７８】
７．種々の同位元素
本発明によれば、上記したようにホスホリル化誘導体は或る種の用途につき血清安定性とせねばならない。特定の治療目的で他のものよりも効果的である各種の同位元素を用いることができる。たとえば、ホスホリル化反応にて３２Ｐの代りに３３Ｐを用いることができる。約８９日間の半減期を有する３５Ｓは、一般に低いエネルギーβ放出体であるため、抗細胞剤として有用であるとは思われない。しかしながら、恐らく治療および／または診断において、３５Ｓ標識モノクローナル抗体につき特定用途が存在すると恩われる。
【０１７９】
下記第３表は、本発明により蛋白中に導入するのに特に有用である各種の同位元素（並びに他の適切な詳細）を示している。
【０１８０】
【表３】
2004089184.tif 000005
所定時点における減衰ファクターおよび放射能は、文献から得ることができる。たとえば、１２５Ｉおよび１３１Ｉと他方では３２Ｐおよび３５Ｓとの間の比較につき、公知文献を参照することができる。
【０１８１】
したがって本発明は、特定の生物学的目的に、処理された蛋白を提供する。
【０１８２】
本発明の重要な特徴は、低いエネルギー放出レベルおよび放射線放出の性質に基づき、標識Ｍａｂの高い安定性である。特に、３２Ｐもしくは３３Ｐで標識されたＭａｂは、蛋白に対する樌用の放射性ラベル（たとえば１２５Ｉ）よりも顕著に低いエネルギー放出レベルを有する。さらに、燐および硫黄同位元素（３２Ｐ，３３Ｐ，３５Ｐおよび３８Ｓ）の崩壊放出は、現存する標識プロトコールに共通である１２５Ｉのγ線と比較してβ粒子である。
【０１８３】
本発明によるβ−標識された蛋白（たとえばＭａｂもしくはストレプトアビジン）の安定性の特徴（上記した通り）は、本発明の診断および治療用途に極めて重要である。β線は腫瘍に滲透するが、γ線ほど容易には患者から周囲の医療スタッフおよび付添人まで放出されない。
【０１８４】
３５Ｓ（これは８７日間の半減期を有する）および３２Ｐに同族である３５Ｓ燐酸ＡＴＰを選択することにより、治療剤の有効放射性寿命を顕著に増大させることができる。
【０１８５】
かくして、本発明により標識された蛋白は、従来容易には得られなかつた種類の極めて有利な性質を有する。
【０１８６】
本発明は、不安定な同位元素の使用に限定されない。将来はＮＭＲ、核活性化または将来開発される方法により検出するのに適した安定な同位元素で蛋白を標識するのが有利となろう。同定しうるラベルである限り、標識は「放射性」ラベルである必要はない。
【０１８７】
８．標識された抗原を用いる放射性免疫分析
本発明によれば、放射性標識された成分としてホスホリル化蛋白を一般に使用することができる。これら放射性免疫分析はポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体と共に使用することができる。蛋白中への新たなホスホリル化部位の導入がホスホリル化部位の領域にて或は蛋白の遠隔直線位置でさえ蛋白の抗原構造を変化させかつ抗原特製をも変化させれば、本発明による蛋白を異なる位置でホスホリル化部位を導入するよう改変して、抗原特性を安定に維持すると共に蛋白を興味あるポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体に結合させることができる。
【０１８８】
したがって、本発明はラベルを導入しうる位置に関し相当の多様性を与える。一般に、燐（またはその他の放射性ラベル）は抗原一抗体結合を破壊しない部位に導入するが好適である。
【０１８９】
９．サインドイッチ放射性免疫分析
モノクローナル抗体を用いるサンドイッチ放射性免疫分析において、本発明による抗体中へのホスホリル化部位の導入は、第２の抗体の結合を追跡するため鋭敏な方法である。したがって、この種のサンドイッチ放射性免疫分析の感度を相当に増大させることができる。特に、複数のホスホリル化部位を本発明により蛋白中へ直接に或いは融合ホスホリル化カセットの追加により導入する場合、この種の分析の感度は何倍にも増大するであろう。
【０１９０】
本発明の他の利点に注目すべきである。ホスホリル化反応は緩徐であるため、沃素もしくはその他の試薬で蛋白を放射性標識するのに必要な沃素化またはその他の化学的改変とは異なり、化学過程もしくは沃素化過程により失活されるモノクローナル抗体がホスホリル化法では失活されないと思われる。したがって、本発明の方法は、一般に沃素での標識に対し敏感過ぎる蛋白のホスホリル化を可能にする。３５Ｓ同族であるホスフェートの導入は、長い半減期を有する放射性標識された蛋白誘導体を与える（１２５Ｉより１．５倍長くかつ３２Ｐより６倍長い）。たとえば、Ｍａｂを３５Ｓで標識すれば、３２Ｐもしくは１２５Ｉ放射性標識された誘導体と対比して相当長い寿命を有する。
【０１９１】
上記したように、本発明はたとえば１２５Ｉと比べて最も適する標識用同位元素の選択を可能にする。
【０１９２】
１０．影像処理
一般に動物もしくは患者における腫瘍もしくは組織の影像処理には、一般に多量に組織によって吸収される高エネルギーβ線よりも高エネルギーγ線が好適である。しかしながら、動物もしくは息者における或る種の影像研究においては３２Ｐ、３３Ｐもしくは３５Ｓを本発明により導入されたホスホリル化部位を介して結合させるＭａｂが有用である。
【０１９３】
たとえば３２Ｐ，３３Ｐもしくは３５Ｓで標識されたＭａｂは、生検試料を検査せねばならない生体内試験において有用である。手術の際の腫瘍の範囲は、この腫瘍の局部的範囲を追跡すると共に手術の範囲を調べる放射性同位元素検出プローブを用いて追跡することができる。さらに、固定され或いは凍結される組織試料を採取して、これに上記蛋白（すなわち腫瘍関連性抗原もしくはその他の配位子）を結合させ続けることができる。したがって、組織断片の放射能写真は腫瘍広がりの程度に関する情報を与えることができ、さらに腫瘍関連性抗原に対する特異的モノクローナル抗体の結合程度を完全に測定することができる。さらに、細胞もしくは組織スライスと共にインビトロ試薬として、この種の標識された抗体は通常の種類の分析法を用いることにより腫瘍関連性抗原もしくはその他の抗原を検出するための極めて敏感な試薬となる。
【０１９４】
１１．抗−抗体
たとえば抗−ネズミ、抗−ヒト、抗−羊および抗−山羊抗体などの抗−抗体または単一体もしくはカクテルとしてのモノクローナル抗体につき多くの用途が知られている。この種の抗体を本発明により処理して単一もしくは複数のホスホリル化部位を導入することができ、したがって上記したように各種の同位元素で標識することができる。これらは、抗−抗体が必要とされる分野、特に放射性免疫分析、放射能写真または抗−抗体が有益であるその他任意の反応に一般的試薬を供給する。
【０１９５】
１２．ホスホリル化蛋白の迅速精製
さらに、本発明は蛋白を分離しかつ精製する用途をも有する。ホスホリル化された蛋白をホスホリル化されないものから分離することができ、また他のものよりも一層ホスホリル化された蛋白を分離することもできる。
【０１９６】
たとえば、蛋白をホスホリル化しうる場合、分子の極く僅かをホスホリル化するのが一般的である。勿論、本発明にしたがって僅かな分子がホスホリル化を逃れるよう複数のホスホリル化部位を蛋白に導入することにより全ホスホリル化を向上させうることは勿論である。ホスホリル化蛋白を非ホスホリル化蛋白から分離しうることは、ホスホリル化分子と非ホスホリル化分子とが集団中に存在する場合、単一のホスホリル化部位を有する分子につき特に有用である。このようにして、ホスホリル化誘導体の効果が増大する。非ホスホリル化分子からのホスホリル化分子の分離は、誘導された燐酸基を用いてまたは用いずにホスホリル化部位に対するポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を発生させて達成することができる。この種のポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、蛋白を精製する際に相当な価値を有することが期待され、かつ従来記載されている。
【０１９７】
１３．蛋白の脱ホスホリル化
本明細書中にて、ホスホリル化の面に関しかなり強調した。ラベルの除去が容易化されるホスホリル化（燐酸基もしくはチオ燐酸基による）の場合は蛋白から１２５Ｉを除去するための従来技術における方法よりも蛋白分子の破壊性が低い傾向を有するため、脱ホスホリル化がより緩和な過程となる。すなわち、放射性同位元素を除去するのが有益である場合、これは酵素反応により比較的容易かつ緩和に達成することができる。この目的で、各種のホスファターゼを使用することができる。大抵のホスファターゼは比較的低い特異性を有するが、たとえば糖ホスファターゼに作用するもの並びにグリコーゲンシンセターゼｂおよびホスホリラーゼｂを脱ホスホリル化する酵素のような極めて特異性の高いものも存在する。さらに、ホスホリル化された蛋白の特異的脱ホスホリル化は、蛋白−セリンおよび−チロシンキナーゼの反応の逆転により達成することができる。実際に老化、変成もしくはその他の操作でなくホスフェート付加が蛋白の活性に変化をもたらすかどうかを確認する必要があれば、ホスフェートを除去して蛋白の活性を再び測定することができる。このようにして、蛋白の活性に対するホスホリル化の効果を明確に評価することができる。これは、各種のホスホリル化インタフェロンの活性を決定する際に有用である。
【０１９８】
「脱ホスホリル化」の概念は、ここに教示したとは実質的に「逆」の興味ある用途を有する。天然状態の蛋白における部位が自然にホスホリル化しうるものであれば、この部位の除去は自然にホスホリル化しうる蛋白が望ましくない結果をもたらすことが知られている場合に特に望ましい。１例は、たとえばラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）および細胞オンコゲンのような発癌性ウィルスに関連した蛋白である。
【０１９９】
１４．ホスホリル化カセット
さらに本発明は、ホスホリル化部位（もしくはカセット）のコード配列を蛋白のヌクレオチドコード配列に挿入しないが本発明を用いて蛋白を標識するための他の方法を包含する。この方法は、各種の分析に使用するたとえば免疫グロブリンのような大型蛋白につき特に有用である。この種の代薬方法は、ホスホリル化されて大型蛋白に化学結合するポリペプチドを要求する。結合は、当業界で知られているように、任意の二官能性試薬または活性化誘導体（たとえばＮ−ヒドロキシースクシンイミド）によることができる。
【０２００】
この技術は、蛋白内部またはその１端部に導入しうる直列の或いは「カセット」としての複数のホスホリル化部位を有するポリペプチドを使用する。直列ホスホリル化部位をコードするＤＮＡを制限部位と整列させて、容易に切断すると共に大型蛋白に結合すべき蛋白のコード配列を持ったＤＮＡに挿入することができる。この種のホスホリル化カセットは小型ポリペプチドとして発現することができ、次いでホスホリル化し、次いで大型蛋白に化学結合させることができる。
【０２０１】
１５．ホスホリル化しうるヒト、もしくは動物のドナー遺伝子
さらに、適するベクターもしくは細胞ライン中に或いは動物中にさえトランスゲニック技術によりＤＮＡ配列を組込むことも本発明の範囲である。すなわち細胞もしくは動物は、ホスホリル化部位が本発明の方法により蛋白中に導入された後に、たとえば免疫グロブリンのようなホスホリル化しうる（および／またはホスホリル化された）蛋白を生成することができる。ネズミ可変領域およびヒト−定領域を有するホスホリル化しうるキメラ抗体を開発することができる。ドナー分子として用いられるヒト抗体を、単一もしくは複数のホスホリル化部位を有するよう処理することができる。同様に、これは免疫グロブリン以外の蛋白にも応用することができる。
【０２０２】
１６．蛋白の第三構造を地図化するためのホスホリル化部位の使用
小さいホスホリル化認識部位を全蛋白線状鎖に沿ってランダムに蛋白中へ導入することにより、蛋白の第三構造に関する情報を得ることができる。ホスホリル化部位をコードする配列は、興味ある蛋白をコードするＤＮＡ配列の内部にランダムに挿入される。この挿入は、ホスホリル化配列が上流および下流のコドンと整列するように行なってホスホリル化部位のための挿入が翻訳期を中断せずに行なわれるようにしなければならない。したがって、発現された蛋白は初期蛋白と同一の線状配列を有し、ホスホリル化部位は連鎖に沿った所定位置に挿入される。多数の挿入（理想的には蛋白連鎖の各アミノ酸位置の後）を行なうことにより、簡単な分析でその位置におけるホスホリル化の割合および程度を決定する意味において、キナーゼが配列を認識するか、どうかを決定することができる。ホスホリル化の割合および程度は、第三構造における位置（外側、内側、埋設など）を反映するホスホキナーゼに対するその位置のアクセス性に依存する。全連鎖に沿ったホスホリル化部位のアクセス性の完全な線状マップは、第三構造配置における外側および内側の蛋白の構造の概略を示す。アミノ酸の挿入は、混乱を最小化するよう設計すべきである。或る場合には、ホスホリル化部位の挿入は、ホスホリル化認識部位を含む数個のアミノ酸を挿入するのでなく、１個もしくはそれ以上のアミノ酸を単に変化させるだけで生じうる。
【０２０３】
挿入しうる突然変異蛋白の適当な種類を作成すべくこの種のＤＮＡ挿入を行なうには多くの方法がある。挿入は、飽和突然変異に匹敵する方法により系続的もしくはランダムに蛋白連鎖に沿って導入することができる。或いは、ホスホリル化部位をコードする配列をＤＮＡ中に挿入することにより所定のＤＮＡ配列から突然変異種を生ぜしめる代りに、全ＤＮＡ連鎖が新たに合成されるよう合成オリゴヌクレオチドを生ぜしめることができる。これらの方法および一般的クローン化技術を組み合わせることにより、新たな突然変異蛋白の全保存物を容易に供給することができ、ホスホリル化部位を連鎖に沿って直線分布させることができる。
【０２０４】
この方法は、溶液における蛋白の第三構造および折畳みに関する情報を与える。結晶における蛋白の第三構造に関する情報を与える推奨しうる方法は、たとえばＸ線結晶写真技術である。さらに、この方法は、Ｘ線結晶写真構造を決定するのに適した結晶を得るための努力を妨げるような蛋白の第三構造を決定するのに有用である。
【０２０５】
この分野は、理想的には蛋白の配列における各アミノ酸の後に多数の推定ホスホリル化部位を有する蛋白、および対応のホスホリル化蛋白の例である。同様に、これは興味ある選択された蛋白をコードするＤＮＡ配列に挿入された推定ホスホリル化部位をコードするＤＮＡ配列の例である。
【０２０６】
１７．他の用途
本発明による標識蛋白には他の用途もある。一般に、ラベル（放射性ラベル、蛍光ラベル、化学ラベル、酵素ラベルなどを有する任意の蛋白を、本発明にしたがい代薬としてホスホリル化部位の導入によりホスフェートで標識することができる。この種の蛋白の精製は、鋭敏な分析により酵素活性を追跡せずに燐酸基を受入れる能力を単に測定するだけで追跡することができる。したがって、本発明により処理されたこれら蛋白を容易に精製して、これを類似する他の蛋白の精製を追跡するためトレーサーとして使用することができる。たとえば、蛋白構造自身を極めて僅かに改変して処理された単一のホスホリル化部位を有する蛋白は、未改変蛋白と同様に精製されると思われる。
【０２０７】
実際に、ホスホリル化しうる蛋白もしくは一連のマーカーを貯蔵することにより、所望に応じて単にホスホリル化反応を行なうことにより、標識された誘導体を便利に作成することができる。したがって、ホスホリル化しうる本発明の蛋白は、対応する標識蛋白の有用な在庫を与える。
【０２０８】
１８．医薬および生物学上活性な組成物
本発明の改変蛋白は、医薬上有用な組成物を製造するため公知方法にしたがって処方することができる。たとえば、本発明によるヒトα−インタフェロン類似蛋白は、医薬上許容しうるキャリヤビークル混合される。適するビークルおよびその組成はたとえばＥ．Ｗ．マーチンによるレミントン・ファーマスーチカル・サイエンスに記載されており、これを参考のためここに引用する。この種の組成物は有効量のインタフェロン類似蛋白もしくはその他の蛋白を適当量のビークルと一緒に含有して、宿主に対し有効投与するのに適した医薬上許容しうる組成物を製造する。宿主は哺乳動物であってもなくてもよい。キャリヤは液体、固体などとすることができる。勿論、本発明の生物学上活性な組成物については、ヒトおよび動物の治療用途が目的とされる。本発明の生物学上活性な組成物は生物学上または治療上有効な量で投与することができ、この量は当業者により容易に決定することができる。一般に、これは実用上の目的またはその他の目的には過剰である量に対し所望の反応が得られる最少量である。
【０２０９】
本発明の生物学上活性な組成物は、さらに所望の活性（特に本発明の改変蛋白の活性もしくは使用）に悪影響を与えない任意その他の生物学上活性な物質を含むこともできる。
【０２１０】
本発明の改変蛋白は、組換ＤＮＡ技術によるのでなく、化学的および／または酵素的合成によって得られることも理解される。
【０２１１】
以上、本発明により可能となる特定の好適実施例および幾つかの用途につき説明したが、本発明はこれらのみに限定されず、本発明の思想および範囲内において多くの改変をなしうることが当業者には了解されよう。
【図面の簡単な説明】
第１〜７図は融合−ハイブリッドインタフェロンを示し、第８〜１３図は本発明により作成された他の改変インタフェロンを示すものである。
【図１】第１図は、Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡとＨｕ−ＩＦＮ−γとのハイブリッドインタフェロンＨｕ−ＩＦＮ−αＡ／γの略図であり、Ｈｕ−ＩＦＮ−γセグメントは１６個のＣＯＯＨ−端末アミノ酸を示すと共に推定ホスホリル化部位を有する。
【図２】第２図は、Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡとＨｕ−ＩＦＮ−γとからの融合蛋白、すなわちＨｕ−ＩＦＮ−αＡ／γの作成概略を示す工程図である〔ここで、ｐＲＣ２３／ＩＦＮ−γからのＥｃｏＲＩ断片をｐＸＺ−６（ｐＩＦＮ−αＡ）のＢｓｔＥＩＩに対し平滑末端結合により結合させてｐＸＺ−７を得た。ｐＸＺ−７のＥｃｏＲＩ断片をＭ１３ｍＰｌ８に挿入してＭ１３ｍｐ１８／ＩＦＮ−αＡ／ＩＦＮ−γを得た。オリゴヌクレオチド指向性欠失を後者の生成物につき図示したオリゴヌクレオチドで行なって、適正な欠失を有する組換体（Ｍ１３ｍＰ１８／ＩＦＮ−αＡ／γ）を得た。このＭ１３組換体からのＥｃｏＲＩ断片でｐＸＺ−６のＥｃｏＲＩ挿入物を交換してｐＸＺ−８（ｐＩＦＮ−αＡ／γ）を得、この発現プラスミドはＨｕ−ＩＦＮ−αＡ／γ融合蛋白をコードする。適正な構造は、組換体の配列決定により確認された。Ｔ４−ｔはファージＴ４転写ターミネータを示し、ＡＰはアンピシリンを示し、ｃｉｐは牛腸ホスファターゼを示す〕。
【図３】第３図は、ハイブリッドＨｕ−ＩＦＮ−αＡ／γのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
【図４】第４図は、精製蛋白のポリアクリルアミドゲル電気泳動図である〔ここで、レーン１はＨｕ−ＩＦＮ−αＡを示し、レーン２は融合蛋白Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ／γを示し、かつレーン３はＨｕ−ＩＦＮ−γを示し、分子量標準（ＳＴＤ）は右側の欄に示され、ゲルは銀染色で発色させた〕。
【図５】第５図は、ホスホリル化されたＨｕ−ＩＦＮ−γおよび融合蛋白Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ／γのポリアクリルアミドゲル電気泳動図である〔ここで、図面の左側パネルはクーマシー青で染色されたゲルを示し、右側パネルは左側パネルで示したと同じゲルの放射線写真図を示し、ＭＷ６９，０００における重染色バンドはホスホリル化反応に添加された牛血清アルブミンを示す〕。
【図６】第６図は、ダウジ細胞に対する〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ／γの結合を示す説明図である〔ここで、ダウジ細胞に対する〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ／７の結合は「実験手順」に記戟したように行なった。特定の結合（【０２１２】）は全結合（Ｏ）と非特異的結合（△）との間の差を示す。非特異的結合は、過剰の未標識Ｈｕ−ＩＦＮ−α／Ａ存在下における結合を示す。〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ／γの特異活性は約１４１μＣｉ／μｇであった〕。
【図７】第７図は、ＭＤＢＫ細胞に対する〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ／γの結合を示す〔ここで、記号および説明は第６図と同様である〕。
【図８】第８図は、Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ，Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１，−Ｐ２および−Ｐ３のＣＯＯＨ末端のヌクレオチドおよびアミノ酸配列図である〔ここで、Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１，−Ｐ２および−Ｐ３で形成されたｃＡＭＰ−依存性蛋白キナーゼにより認識されるホスホリル化部位を矩形内に示す。これら部位は追加アミノ酸と一緒にｃＡＭＰ−依存性牛心臓キナーゼに対する認識配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−ＬｅｕもしくはＡｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ（このＳｅｒをホスホリル化するため）を有する。インタフェロンのヌクレオチド配列とアミノ酸配列とを比較のため整列させた〕。
【図９】第９図は、ホスホリル化部位を有するＨｕ−ＩＦＮ−αＡのための発現プラスミドの作成図である。
【図１０】第１０図は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるＨｕ−ＩＦＮ−αＡ−ｐ蛋白の分析図である〔ここで、ゲルは銀染色した。分子量標準を１番左側のレーンに示す〕。
【図１１】第１１図は、ホスホリル化された蛋白のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の放射線写真図である〔ここで、Ｈｕ−ＩＦＮ−γは第１０図における同様な内部分子量標準として役立つ〕。
【図１２】第１２図は、細胞に対する〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ蛋白の結合を示す説明図である〔ここで、挿入図は特定結合データのスカッチャード分折を示し、「Ｂ」は細胞に結合した配位子の放射能を示し、かつ「下」は遊離もしくは未結合配位子の放射能を示し、「Ａ」および「Ｂ」はそれぞれダウジ細胞およびＭＤＢＫ細胞に対する〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１の結合を示し、「Ｃ」および「Ｄ」はそれぞれダウジ細胞およびＭＤ８Ｋ細胞に対する〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ２の結合を示す〕。
【図１３】第１３図は、架橋した〔３２Ｐ〕Ｈｕ−ＩＦＮ−αＡ−Ｐ１，−Ｐ２および−Ｐ３リセプタ複合体の電気泳動分析図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年7月25日(2003.7.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
常態にてホスホリル化しえないが、ホスホリル化しうる部位の導入により改変してホスホリル化したことを特徴とするホスホリル化蛋白。
【請求項２】
蛋白キナーゼより認識しうるアミノ共通配列を含有し、常態にてホスホリル化しえない蛋白をコードする組換ＤＮＡ配列。
【請求項３】
推定ホスホリル化部位を有するＨｕ−ＩＦＮ−α類似蛋白をコードするＤＮＡ配列を有し、ホスホリル化しうる蛋白がインタフェロン類似Ｈｕ−ＩＦＮ−α蛋白であって、コードされた蛋白がインタフェロン類似蛋白Ｈｕ−ＩＦＮ−αであることを特徴とする外来機能性蛋白を発現するのに有用な組換ＤＮＡクローン化ベクター。
【請求項４】
プラスミドｐＸＺ−８，ｐＢＬ２８１，ｐＢＬ２９１もしくはｐＢＬ３０１よりなる群から選択される組換ＤＮＡベクターを含有することを特徴とする外来機能性蛋白を発現しうる形質転換宿主細胞。