(57)【要約】【課題】酵素反応を直接観測可能なアミラーゼ活性測定方法を提供する。【解決手段】（１）色素で修飾したシクロデキストリンと被検試料とを接触させる工程、及び（２）色素の発する光の強度又は色素の吸光度を測定する工程を含むアミラーゼ活性の測定方法。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含むアミラーゼ活性の測定方法。
（１）色素で修飾したシクロデキストリンと被検試料とを接触させる工程
（２）色素の発する光の強度又は色素の吸光度を測定する工程
【請求項２】
色素が、蛍光色素である請求項１記載のアミラーゼ活性の測定方法。
【請求項３】
蛍光色素が、４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール又は５−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルホニルである請求項２記載のアミラーゼ活性の測定方法。
【請求項４】
シクロデキストリンが、β−シクロデキストリンである請求項１乃至３のいずれか一項記載のアミラーゼ活性の測定方法。
【請求項５】
色素で修飾されたシクロデキストリンを含有する、アミラーゼ活性測定用試薬。
【請求項６】
色素が、蛍光色素である請求項５記載のアミラーゼ活性測定用試薬。
【請求項７】
蛍光色素が、４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール又は５−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルホニルである請求項６記載のアミラーゼ活性測定用試薬。
【請求項８】
シクロデキストリンが、β−シクロデキストリンである請求項５乃至７のいずれか一項記載のアミラーゼ活性測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、シクロデキストリンを利用してアミラーゼ活性を測定する方法に関する。この方法は、従来のアミラーゼ活性測定方法のように多段階の反応を組み合わせたものではなく、酵素反応を直接観測するため、アミラーゼ活性を簡便に測定することができる。
【０００２】
【従来の技術】
自然界には種々の酵素が存在するが、その中でもアミラーゼは可溶性澱粉、アミロース、アミロペクチンなどの糖質を加水分解しマルトース、グルコースなどを産生する酵素であり、多くの生物においてエネルギー獲得という面で重要な役割を果たしている。食品工業、繊維工業、医薬品製造などの工業的分野においてアミラーゼは広く利用されているほか、体内でアミラーゼを産生する膵臓、唾液腺の疾患は血清中や尿中のアミラーゼ活性の測定により検査され、医学的分野においても活性測定は重要である。アミラーゼ活性を測定する方法は従来多くの研究がなされてきており、アミラーゼにより糖鎖を切断し、生成物を呈色する多段階の反応を組み合わせてきた系で主に検出してきた。それゆえ、酵素反応を直接観測できるより簡便な方法の開発が望まれる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
シクロデキストリンは、６個以上のＤ−グルコース単位がα−１，４結合した環状のオリゴ糖である。シクロデキストリンはグルコース由来のヒドロキシル基がすべて環の外縁に存在しているために親水的分子でありながら、分子の中心に疎水的な空洞を持ち、水溶液中において空孔のサイズに応じた様々な疎水性有機分子を取り込む性質を持つ。
【０００４】
本発明は、シクロデキストリンを利用して、アミラーゼ活性の簡便な測定方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（以下、「ＮＢＤ」という）で修飾されたシクロデキストリンに対し、シクロデキストリンを加水分解するアミラーゼを作用させると、シクロデキストリンが開裂し、それまでシクロデキストリンの空洞内に自己包接されていたＮＢＤが水溶液中に露出され（図１）、これによりＮＢＤの発する蛍光の強度が減少することを見出し、この知見に基づき本発明を完成した。
【０００６】
即ち、本発明は、以下の工程を含むアミラーゼ活性の測定方法である。
（１）色素で修飾したシクロデキストリンと被検試料とを接触させる工程
（２）色素の発する光の強度又は色素の吸光度を測定する工程
また、本発明は、色素で修飾されたシクロデキストリンを含有する、アミラーゼ活性測定用試薬である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本発明のアミラーゼ活性の測定方法は、以下の（１）及び（２）の工程を含むものである。
【０００９】
工程（１）は、色素で修飾したシクロデキストリンと被検試料とを接触させる工程である。
【００１０】
使用する色素は、シクロデキストリンの空洞内に自己包接された状態と水溶液中に露出された状態で、蛍光スペクトル又は吸収スペクトルが異なるものであればどのようなものでもよい。疎水性の色素は、一般にこのような性質を示すので、シクロデキストリンを修飾するための色素として用いることができる。使用可能な色素としては、ＮＢＤ、５−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルホニル（以下、「ダンシル」という）、ベンゾ［デフ］フェナンスレン（通称ピレン）、（９−（０−カルボキシフェニル）−６−ヒドロキシ−３Ｈ−キサンテン−３−オン（通称フルオレセイン）などの蛍光色素を例示できるが、メチルレッド、アリザリンイエロー、ｐ−ニトロフェノールなどの蛍光色素以外の色素を用いてもよい。
【００１１】
使用するシクロデキストリンは特に限定されず、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリンのいずれを用いてもよい。
【００１２】
測定対象とするアミラーゼは、シクロデキストリンを加水分解できるものであればどのようなものでもよく、例えば、タカアミラーゼ、ヒトの血清・尿中のα−アミラーゼ、シクロデキストリナーゼなどを活性測定の対象とすることができる。
【００１３】
被検試料としては、ヒトの血液、尿などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
【００１４】
シクロデキストリンと被検試料との接触は、被検試料中のアミラーゼがシクロデキストリンを加水分解できるような方法であればどのような方法でもよく、シクロデキストリンを被検試料中に添加してもよく、シクロデキストリン溶液に被検試料を添加してもよい。
【００１５】
工程（２）は、色素の発する光の強度又は色素の吸光度を測定する工程である。
【００１６】
測定対象とする光の波長は、使用した色素に応じて決めればよい。蛍光色素を用いた場合には、それぞれ蛍光スペクトルを測定し、ピークトップ付近の蛍光波長を測定対象とすればよい。例えば、ＮＢＤであれば５３０〜５６０　ｎｍ、ダンシルであれば５５０〜５８０　ｎｍの蛍光波長を測定する。メチルレッドのような非蛍光色素を用いた場合には、アミラーゼ存在下及び不在下での吸収スペクトルを測定し、両条件間で最も変化量の大きい波長を測定対象とすればよい。
【００１７】
ＮＢＤ、ダンシルといった蛍光色素では、アミラーゼ活性に応じて光の強度が減少するので、この減少量からアミラーゼ活性を算出することができる。また、メチルレッドのような非蛍光色素においても、アミラーゼ活性に応じて特定波長の吸光度が変化するので、その変化量からアミラーゼ活性を算出することができる。
【００１８】
【実施例】
最初に本実施例において使用した試薬、測定機材等について説明する。
【００１９】
今回使用したβ−シクロデキストリン（以下、「β−ＣＤ」という）は、日本食品加工（株）から提供されたものを精製せずに用いた。７−クロロ−４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３，−ジアゾール（以下、「７−クロロ‐ＮＢＤ」という）および１−アダマンタノールは、東京化成（株）から購入したものをさらに精製することなく用いた。また、蛍光分析を行う際のイオン交換水にはＭｉｌｌｉ−Ｑを用い、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は分光分析用の関東化学（株）から購入したものを用いた。１Ｈ　　ＮＭＲを測定した際に用いた重水はＭｅｒｃｋ社の重水素化率９９．９５％であるものを用いた。使用した酵素は三共（株）のタカヂアスターゼＢである。
【００２０】
高速液体クロマトグラフィーは、（株）島津製作所のＬＣ−１０Ａｖｐシステムを用いた。薄相クロマトグラフィーは、メルク社の薄相クロマトグラフィーシリカゲル６０Ｆ２５４である。マトリックス介助レーザーイオン化−飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）は、（株）島津製作所のＫＲＡＴＯＳ　ＫＯＭＰＡＣＴ　ＭＡＬＤＩ　ＩＩＩマススペクトロメーターを用いた。マトリックスはα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸を用いた。１Ｈ　ＮＭＲの測定はＶａｒｉａｎ　ＶＸＲ　５００Ｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（５００　ＭＨｚ）を用いて行い、この際の内部基準はＨＤＯ　（δ　＝　４．７）とした。蛍光スペクトルの測定は、（株）日立製作所のＦ−２５００型分光蛍光光度計を用い、セルは光路長１０　ｍｍの石英セルを使用した。
【００２１】
〔実施例１〕　ＮＢＤ−β−ＣＤの合成
既に報告されている方法（参考文献１）に従ってシクロデキストリンをトシル化し、６−Ｏ　−（ｐ−トルエンスルホニル）−β‐シクロデキストリン（１．０　ｇ，　０．７８　ｍｍｏｌ）を得た。
【００２２】
次に、合成した　６−Ｏ−（ｐ　−トルエンスルホニル）−β−シクロデキストリンを、エチレンジアミン（１０　ｍｌ）中で８０℃、３．５時間窒素雰囲気下において攪拌することによりエチレンジアミンと反応させた。反応混合物を２００　ｍｌのアセトンに注いで、６−デオキシ−６−（２−アミノエチルアミノ）−β−シクロデキストリン（以下、「エチレンジアミン−β−シクロデキストリン」という）の粗生成物（１．０　ｇ）を得た。この粗生成物はＣＭ　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｃ−２５による陽イオン交換クロマトグラフィーで精製を行った。溶出液を減圧濃縮したのち、凍結乾燥を行って、エチレンジアミン−β‐シクロデキストリン　６８５　ｍｇ（０．５８　ｍｍｏｌ，　収率７５　％）を得た。
【００２３】
さらに、ＤＭＦ（１．０　ｍｌ）中にエチレンジアミン−β‐シクロデキストリン（５０　ｍｇ，　０．０４２　ｍｍｏｌ）、７−クロロ−ＮＢＤ（２５．５　ｍｇ，　０．１２８　ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（７．４　μｌ，　０．０４２　ｍｍｏｌ）を加え、８０℃、窒素環境下において攪拌させることにより、反応させた。反応は、薄相クロマトグラフィーで追跡した（展開溶媒，　２８％アンモニア水　：　酢酸エチル　：　２−プロパノール　：　水＝１：３：５：４）。１４時間反応させた後、反応液を２０　ｍｌのアセトンに注いで、ＮＢＤ修飾β−ＣＤ（以下、「ＮＢＤ−β−ＣＤ」という）の粗生成物（４７．２　ｍｇ）を得た。この粗生成物は逆相Ｃ１８高速液体クロマトグラフィーにより精製を行った。使用したカラムはＹＭＣ−ｐａｃｋ　ＯＤＳ−Ａ（１０×２５０　ｍｍ）で、展開溶媒は水−アセトニトリル系、アセトニトリル２０％から５０％までのグラジエントによって濃度勾配をかけた。溶出液を減圧濃縮したのち、凍結乾燥を行って、ＮＢＤ−β−ＣＤを１．７　ｍｇ（１．３　μｍｏｌ，　収率３．０％）得た。
【００２４】
精製したＮＢＤ−β−ＣＤの同定は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ　，　１Ｈ　ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）を用いて行った。質量分析の結果は、［Ｍ＋Ｎａ］＋　＝　１３６２．７　（理論値は１３６３．１）　であった。１Ｈ　ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ　，５００　ＭＨｚ）の化学シフト値は、δ　：　３．３６−４．００　（ｍ）　，　４．９７−５．０３　（ｍ，　７Ｈ，　Ｃ１Ｈ）　，６．４３−６．４６　（ｄ，　１Ｈ，　ａｒｏｍａｔｉｃ）　，　８．６２−８．６４　（ｄ，　１Ｈ，　ａｒｏｍａｔｉｃ）であった。
【００２５】
〔実施例２〕　１−アダマンタノール添加による蛍光スペクトルの変化
現在まで多くの蛍光色素修飾シクロデキストリンが合成されてきており、水溶液中において蛍光性分子認識指示薬として報告されてきた（参考文献２〜７）。本実施例においてもゲストとして１−アダマンタノールの添加による、ＮＢＤ−β−ＣＤの蛍光スペクトル変化を測定した。
【００２６】
ＮＢＤ−β−ＣＤ（１．０　μＭ）の蛍光スペクトルは、励起波長を４６６　ｎｍとし、２５℃における酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ　５．５　，　ＣａＣｌ２　１．０×１０−２　Ｍ）中で測定した。１−アダマンタノールの濃度は、１−アダマンタノールＤＭＳＯ溶液（０．００３　Ｍ）の添加により、０μＭから３００μＭの範囲（０，２０，４０，６０，８０，１００，１５０，２００，３００　μＭ）に調整し、各濃度ごとの蛍光スペクトルを測定した。この結果を図２に示す。
【００２７】
１−アダマンタノールを添加しない場合の蛍光スペクトル（図の一番上の曲線）では、ピークトップが５３８　ｎｍであるスペクトルを示した。１−アダマンタノールＤＭＳＯ溶液（０．００３　Ｍ）の添加に伴い、蛍光強度は減少した。最終的にゲスト濃度を３００μＭにした時（図の一番下の曲線）では、ピークトップは５４４　ｎｍになりレッドシフトの傾向を示した。また、波長５３９　ｎｍにおける蛍光強度の減少率はホストであるＮＢＤ−β−ＣＤとゲストである１−アダマンタノールが１：１で結合することを仮定したモデルにより近似され（図３、参考文献８）、結合定数は３８０００　Ｍ−１であった。以上の結果より、ゲストである１−アダマンタノールの添加により、疎水性蛍光プローブであるＮＢＤ単位がシクロデキストリンの疎水的空洞から親水的環境下へと追い出されたことが示された。こうして、水溶液中ではＮＢＤ−β−ＣＤはＮＢＤ単位を自己包接し、蛍光性の指示薬として有用であることが確認された。
【００２８】
〔実施例３〕　酵素添加による蛍光強度の経時変化
ＮＢＤ−β−ＣＤ　を基質として酵素活性の測定を行った。５５℃の酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ　５．５　，　ＣａＣｌ２　１．０×１０−２　Ｍ）中のＮＢＤ−β−ＣＤにタカヂアスターゼＢ溶液を添加し、［ＮＢＤ−β−ＣＤ］　＝　１　μＭの５３９　ｎｍにおける蛍光強度（励起波長　４６６　ｎｍ）の経時変化を観測した。また、既に合成並びに蛍光性分子認識指示薬としての報告がされている６−デオキシ−６−（Ｎ−ダンシル）アミノ−β‐シクロデキストリン（１０　μＭ）（以下「Ｄｎｓ−β−ＣＤ」という）についても（参考文献９）、タカヂアスターゼＢによる酵素添加実験を行った。この際、温度・緩衝液は同条件で、励起波長は３３６　ｎｍ、蛍光波長は５６６　ｎｍを観測した。ここで酵素活性を表す単位として、１ＵＮＩＴを「２０℃において可溶性澱粉から生成物マルトース単位を１分間あたり１　μｍｏｌ生成する酵素量」とした。測定に利用した酵素のＵＮＩＴ数は、アミラーゼの活性の測定法として一般的な３，５−ジニトロサリチル酸を用いた従来法に従って測定した（参考文献１０）。また、これらの対照実験として、同条件の酵素を添加しない場合においてもＮＢＤ−β−ＣＤ（１　μＭ）、Ｄｎｓ−β‐ＣＤ（１０　μＭ）ともに蛍光の経時変化を測定した。ＮＢＤ−β−ＣＤ及びＤｎｓ−β‐ＣＤの蛍光強度の経時変化をそれぞれ図４及び図５に示す。これらの図に示すように、酵素を添加した場合と酵素を添加しなかった場合とを比較すると、酵素を添加した場合において明らかな蛍光強度の減衰が観察された。
【００２９】
〔実施例４〕　酵素及び１−アダマンタノールの添加による蛍光スペクトルの変化
２５℃の酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ　５．５　，　ＣａＣｌ２　１．０×１０−２　Ｍ）中で、ＮＢＤ−β−ＣＤに対しタカヂアスターゼＢによる酵素反応（８．７３×１０３　ＵＮＩＴ／Ｌ）をさせた。２０分後、反応溶液にゲストである１−アダマンタノールのＤＭＳＯ溶液（０．００３　Ｍ）を添加し、蛍光スペクトル（励起波長　４６６　ｎｍ）の変化を測定した。また、酵素未添加溶液についても同条件の２０分後、同様のゲスト添加実験を行い、蛍光スペクトル（励起波長　４６６　ｎｍ）の変化を測定した。それぞれゲスト濃度３００μＭにおいて蛍光強度の減少は飽和した。酵素を添加した場合の蛍光スペクトルの変化を図６に、酵素を添加しない場合の蛍光スペクトルの変化を図７に示す。また、蛍光波長５３９　ｎｍにおける蛍光強度の減少量を棒グラフに示したものが図８である。酵素添加をしない場合では蛍光強度は大きく減少したのに対し、酵素添加した後では蛍光強度の減少はわずかにとどまった。この結果は、酵素を添加させた場合、酵素反応によってシクロデキストリン環のグルコシド結合が切断され、ゲストを取り込む疎水的空洞を失ったことが原因であると推察される。
【００３０】
〔実施例５〕　アミラーゼ活性の検量線の作成（反応を擬１次反応と仮定）
５５℃の酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ　５．５　，　ＣａＣｌ２　１．０×１０−２　Ｍ）中で、ＮＢＤ−β−ＣＤに関して酵素量を変化させ、それぞれの蛍光強度の減衰を３０分間測定した。それぞれに対し反応速度論的解析を行うため、図１２に示すフローチャートに従い、反応が進行するとした。時間に対して蛍光強度の減衰をフィッティングし、それぞれにおいて擬１次反応速度定数を求めた。求められた各速度定数の逆数と、各酵素ＵＮＩＴ数の逆数とをＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットしたところ、検量線が得られた（図９、参考文献１１）。よって、蛍光の減衰の様子を擬１次反応によって近似し、その速度定数を求めることによって酵素活性が測定することができることが確認された。
【００３１】
〔実施例６〕　アミラーゼ活性の検量線の作成（酵素濃度が低く反応を０次反応と仮定）
酵素濃度が低い場合、酵素濃度が基質濃度に対して過剰という条件が成立しなくなり、擬１次反応という仮定ができないため、別の解析法が必要となる。そのフローチャートを図１３に示す。
【００３２】
５５℃の酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ　５．５　，　ＣａＣｌ２　１．０×１０−２　Ｍ）中で、ＮＢＤ−β−ＣＤの濃度を１０００分の１の１　ｎＭにして、酵素を添加した場合と酵素を添加しなかった場合の蛍光強度の変化を２０分間測定した。蛍光強度の経時変化の様子を図１０に示す。ここでも酵素を添加させた場合、その蛍光強度は減衰していき、その減衰は０次反応で仮定される直線になった。こうして、活性が低い条件において酵素濃度を振り、その傾きを酵素濃度に対し、プロットしたものが図１１になる。検量線が得られたことで、経時変化の傾きより酵素濃度が低濃度であったとしても酵素活性を測定できることがわかった。
【００３３】
〔参考文献〕
参考文献１：戸田不二緒　監修・上野昭彦　編集　「シクロデキストリン＜基礎と応用＞」　産業図書
参考文献２：Ｕｅｎｏ，　Ａ．　Ｓｕｐｒａｍｏｌ．ｃｈｅｍ．　１９９６，　３，　３１−３６
参考文献３：Ｄｕｎｂａｒ，　Ｒ．　Ａ．；　Ｂｒｉｇｈｔ，　Ｆ．　Ｓｕｐｒａｍｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　１９９４，　３，　９３−９９
参考文献４：Ｎａｒｉｔａ，　Ｍ，；　Ｈａｍａｄａ，　Ｆ．　Ｊ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　Ｐｅｒｋｉｎ．　ｔｒａｎｓ．２　　２０００，　２，　８２３−８３２
参考文献５：　Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，　Ｓ．；　Ｓａｋａｍｏｔｏ，　Ｓ．；　Ｕｅｎｏ，　Ａ．；　Ｍｉｈａｒａ，　Ｈ．　　Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．　Ｊ．　２０００，　１０，　１７８１−１７８８
参考文献６：　Ｈｏｓｓａｉｎ，　Ａ．；　Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，　Ｓ．；　Ｋａｎａｉ，　Ｔ．；　Ｈａｍａｓａｋｉ，　Ｋ．；　Ｍｉｈａｒａ，　Ｈ．；　Ｕｅｎｏ，　Ａ．　　Ｊ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　Ｐｅｒｋｉｎ．　Ｔｒａｎｓ．２　　２０００，　７，　１５２７−１５３３
参考文献７：Ｙｕ，　Ｌ．；　Ｂａｏ−Ｈａｎｇ，　Ｈ．；　Ｓｈｉ−Ｘｉｎ，　Ｓ．；　Ｔａｋｅｈｉｋｏ，　Ｗ．；　Ｙｏｓｈｉｈｉｓａ，　Ｉ．　　Ｊ．　Ｏｒｇ．　Ｃｈｅｍ．　１９９９，　６４，　１４８７−１４９３
参考文献８：Ｋｕｗａｂａｒａ，　Ｔ．；　Ｎａｋａｍｕｒａ，　Ａ．；　Ｕｅｎｏ，　Ａ．；　Ｔｏｄａ，　Ｆ．　　Ｊ．　Ｐｈｙｓ．　Ｃｈｅｍ．　１９９４，　９８，　６２９７−６３０３
参考文献９：Ｈａｍａｓａｋｉ，　Ｋ．；　Ｕｓｕｉ，　Ｓ．；　Ｉｋｅｄａ，　Ｈ．；　Ｉｋｅｄａ，　Ｔ．；　Ｕｅｎｏ，　Ａ．　　Ｓｕｐｒａｍｏｌ．　ｃｈｅｍ．　１９９７，　８，　１２５−１３５
参考文献１０：Ｂｅｒｎｆｅｌｄ，　Ｐ．　　Ｍｅｔｈ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　１９５５，　１，　１４９−１５８
参考文献１１：Ｂｅｎｄｅｒ，　Ｍ．Ｌ．；　Ｋｏｍｉｙａｍａ，　Ｍ．　　　シクロデキストリンの化学
学会出版センター
【００３４】
【発明の効果】
本発明のアミラーゼ活性の測定方法は、従来のアミラーゼ活性測定方法のように多段階の反応を組み合わせたものではなく、酵素反応を直接観測するため、簡便にアミラーゼ活性の測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の測定方法の概要を示す図。
【図２】１−アダマンタノールを添加した場合のＮＢＤ−β−ＣＤの蛍光スペクトルの変化を示す図。
【図３】１−アダマンタノールの濃度とＮＢＤ−β−ＣＤの蛍光強度の減少率との関係を示す図。
【図４】酵素存在及び不在下におけるＮＢＤ−β−ＣＤの蛍光強度の経時的変化を示す図。
【図５】酵素存在及び不在下におけるＤｎｓ−β−ＣＤの蛍光強度の経時的変化を示す図。
【図６】１−アダマンタノール存在及び不在下におけるＮＢＤ−β−ＣＤの蛍光スペクトルを示す図（酵素存在下）。
【図７】１−アダマンタノール存在及び不在下におけるＮＢＤ−β−ＣＤの蛍光スペクトルを示す図（酵素不在下）。
【図８】酵素存在下及び不在下における１−アダマンタノールの添加による蛍光強度の減少量を示す図。
【図９】反応を擬１次反応と仮定した場合のアミラーゼ活性の検量線を示す図。
【図１０】酵素存在及び不在下におけるＮＢＤ−β−ＣＤ（１ｎＭ）の蛍光強度の経時的変化を示す図。
【図１１】反応を０次反応と仮定した場合のアミラーゼ活性の検量線を示す図。
【図１２】酵素反応（擬１次反応）解析のための数式を示す図。
【図１３】酵素反応（０次反応）解析のための数式を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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