(57)【要約】      （修正有）【課題】種々のオリゴ糖を効率よく合成でき、自動合成方法にも適用することが可能な水溶性高分子プライマー及び該水溶性高分子プライマーを用いたオリゴ糖の製造方法を提供すること。【解決手段】単糖残基あるいはオリゴ糖残基が選択的に開裂可能な結合を含むリンカーを介し水溶性ポリマーの側鎖に結合したポリマーであって、該水溶性ポリマー中にアクリル酸残基を２０〜８０モル％含むことを特徴とした糖鎖合成用水溶性高分子プライマー。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単糖残基あるいはオリゴ糖残基が選択的に開裂可能な結合を含むリンカーを介し水溶性ポリマーの側鎖に結合したポリマーであって、該水溶性ポリマー中にアクリル酸残基を２０〜８０モル％含むことを特徴とした糖鎖合成用水溶性高分子プライマー。
【請求項２】
前記水溶性ポリマーがアクリルアミド類、メタクリルアミド類、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、スチレン類、脂肪酸ビニルエステル類からなる群から選ばれた１種または２種以上のビニル系単量体の重合体である請求項１に記載の糖鎖合成用水溶性高分子プライマー。
【請求項３】
前記リンカーに含まれる選択的に開裂可能な結合が、水素化分解あるいは２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノベンゾキノンによる酸化工程である請求項１又は２に記載の糖鎖合成用水溶性高分子プライマー。
【請求項４】
単糖残基あるいはオリゴ糖残基および選択的に開裂可能な結合を含むリンカーが一般式（Ｉ）（式中、Ｒ１は単糖あるいはオリゴ糖残基、Ｒ２はメチレン基４〜２０個分の長さを有するリンカー、ＸはＯ、ＳまたはＮＨを示す）で表された基である請求項１乃至３に記載の糖鎖合成用水溶性高分子プライマー。
【化１】
2004329117.tif 000017
【請求項５】
前記Ｒ１がＮ−アセチルグルコサミン残基、グルコース残基、ラクトース残基である請求項４に記載の糖鎖合成用水溶性高分子プライマー。
【請求項６】
前記Ｒ２がペンチレン基である請求項４又は５に記載の糖鎖合成用水溶性高分子プライマー。
【請求項７】
一般式（ＩＩ）（式中、Ｒ３は単糖残基あるいはオリゴ糖残基、Ｒ４はメチレン基４〜２０個分の長さを有するリンカーを示す）で表されるアクリルアミド誘導体とアクリル酸と少なくとも１種類のビニル系単量体とを、アクリル酸が全ビニル系共重合体中２０〜８０モル％になるように共重合することを特徴とする請求項１乃至４に記載のオリゴ糖合成用水溶性高分子プライマーの製造方法。
【化２】
2004329117.tif 000018
【請求項８】
前記Ｒ３がＮ−アセチルグルコサミン残基、グルコース残基、ラクトース残基である請求項７に記載の糖鎖合成用水溶性高分子プライマーの製造方法。
【請求項９】
前記Ｒ４がペンチレン基である請求項７又は８に記載の糖鎖合成用水溶性高分子プライマーの製造方法。
【請求項１０】
前記ビニル系単量体がアクリルアミド類、メタクリルアミド類、メタクリル酸、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、スチレン類、脂肪酸ビニルエステル類からなる群から選ばれたビニル系単量体である請求項７乃至９に記載の糖鎖合成用水溶性高分子プライマーの製造方法。
【請求項１１】
オリゴ糖を製造する方法であって、
（工程１）請求項１記載の水溶性高分子プライマーに糖ヌクレオチドの存在下に糖転移酵素と接触させることにより、糖ヌクレオチドより糖残基を該水溶性高分子プライマーに転移させる工程、
（工程２）工程１を１回または２回以上繰り返して糖鎖を伸長させる工程、
（工程３）必要に応じて、副生したヌクレオチド類や未反応の糖ヌクレオチド類を除去する工程、および、
（工程４）工程１〜工程３を複数回繰り返した後、複数の糖残基が転移して糖鎖が伸長した水溶性高分子プライマーから糖鎖を遊離させる工程、を含むことを特徴とする糖鎖化合物を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖鎖製造に有用な水溶性高分子プライマーおよび該水溶性高分子プライマーを用いた糖鎖の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖は核酸や蛋白質と並んで生体を構成する主要な成分であるが、核酸や蛋白質と比べ、その構造あるいは機能はあまりよく理解されていない。糖は、通常糖鎖と呼ばれる重合体を形成し、さらにそれらが蛋白質や脂質と結合して糖蛋白質、糖脂質あるいはプロテオグリカンと総称される極めて複雑な複合分子を形成している。さらに、核酸あるいは蛋白質がその構成単位であるヌクレオチドあるいはアミノ酸が直線的に結合した高分子であるのに対して、糖鎖は分子内に複数の分岐点があるばかりでなく、その構成単位である単糖の結合様式も多様であるため、その構造は核酸や蛋白質と比較にならないほど複雑である。これら構造の複雑さは、この分野の研究を遅らせている大きな原因の一つとなっている。
【０００３】
しかし、近年糖鎖が細胞認識、免疫、分化、受精、老化、ガン化などに関与することが徐々にわかってくるにつれて、非常に注目される研究分野となってきた。このような現状より、天然の構造を有する糖鎖や新規な糖鎖を合成する試みが盛んになされている。核酸や蛋白質については自動合成技術が確立されており、このことにより、この分野の研究が著しく進歩したことは誰もが認めるところであり、糖鎖についても、その自動合成技術の確立は切望されている。
【０００４】
これまでに糖鎖の自動合成を試みたいくつかの報告があり、その手法は大きく分けて２つある。１つは化学合成によるものであるが、糖残基と糖残基を立体選択的に結合させる方法が十分確立されておらず、さらに保護基を結合させたり、あるいは脱離させたりと工程が煩雑であるという問題がある。もう１つは酵素合成によるものであり、保護基を必要とせず、また糖残基と糖残基を立体選択的に結合させることができるので化学合成に比べ、非常に有利であり、近年いくつかの方法が提案されるようになってきた。これには、最近各種糖転移酵素の遺伝子が単離され、遺伝子組換え技術による糖転移酵素の大量生産が可能になってきたという背景がある。また、自動合成では通常反応開始点となる糖残基を特定の担体上に特定の条件で開裂することのできるリンカーを介して結合されたもの（プライマーとも呼ばれる）が出発物質として用いられる。リンカーの種類によって製造される糖鎖化合物は異なり、オリゴ糖、配糖体、糖ペプチド、糖脂質など種々の形で担体より遊離される。しかしながら、合成した糖鎖化合物を種々の用途に利用することを考えると、やはりオリゴ糖が最も好ましい。
【０００５】
糖転移酵素を用いた糖鎖の自動合成の例としては、Ｕ．  Ｚｅｈａｖｉらがアミノエチル基あるいはアミノヘキシル基を結合させたポリアクリルアミドゲルを固相担体とした糖転移酵素による固相合成を報告している（例えば、非特許文献１、２参照）。この方法は、適当な単糖を４−カルボキシ−２−ニトロベンジルグリコシドとした後、上記担体のアミノ基と結合させたものをプライマーとし、糖転移酵素により糖鎖伸長反応を行ない、その後光分解により伸長させた糖鎖をオリゴ糖として遊離させるというものである。しかし、糖転移酵素による糖転移収率は低く、１０％にも満たない。
【０００６】
また、これまで糖転移酵素は固相担体上に結合させた糖あるいはオリゴ糖とはあまり反応せず、糖鎖伸長反応を効率よく行うことは困難であるとされてきたが、Ｕ．  Ｚｅｈａｖｉらは４−カルボキシ−２−ニトロベンジルグリコシドと固相担体との間をヘキサメチレン基やオクタメチレン基など鎖長の長いリンカーで結合させることにより、糖転移収率を最大５１％まで向上したと報告している（例えば、非特許文献３、４参照）。しかしながら、この方法においても収率的には十分なレベルとは言えない。
【０００７】
その他の例として、Ｃ．−Ｈ．  Ｗｏｎｇらはアミノ化シリカに下記化３（式中、Ａｃはアセチル基、Ｂｏｃはｔ−ブトキシカルボニル基を示す）の基を結合させたものをプライマーとし、糖転移酵素を用いて糖鎖を伸長させた後、α−キモトリプシンの加水分解作用を利用し伸長させた糖鎖を糖ペプチドの形で切り出す方法を報告している（例えば、非特許文献５参照）。しかしながら、糖転移酵素による糖鎖伸長反応の収率は５５〜６５％であり、十分なものとは言えない。
【０００８】
【化３】
2004329117.tif 000002
【０００９】
また、Ｃ．−Ｈ．  Ｗｏｎｇらは、固相担体であるアミノ化シリカに結合させる基を下記化４（式中、Ａｃはアセチル基を示す）に改良し、糖転移酵素により糖鎖を伸長させた後、ヒドラジン分解により糖鎖を遊離させる方法を報告しており、酵素による糖転移反応をほぼ定量的に行うことができたとも報告している（例えば、非特許文献６参照）。この方法によれば、伸長した糖鎖は６−カルボヒドラジドヘキサノール配糖体として遊離される。
【００１０】
【化４】
2004329117.tif 000003
【００１１】
さらに、Ｃ．−Ｈ．  Ｗｏｎｇらは、アクリルアミド−アクリル酸−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド共重合体のアクリルアミド残基に下記化５（式中、Ａｃはアセチル基を示す）の基を結合させた水溶性のポリマーをプライマーとし、糖転移酵素により糖鎖を伸長させた後、硝酸二アンモニウムセリウム（ＩＶ）により遊離させる方法を報告している（例えば、非特許文献７参照）。この方法によれば、酵素による糖転移反応は８０〜９０％の収率で進行し、伸長した糖鎖はｐ−ホルミルフェノール配糖体として遊離される。
【００１２】
【化５】
2004329117.tif 000004
【００１３】
Ｍ．  Ｍｅｌｄａｌ  らは、ジアミノ化ポリエチレングリコールのモノおよびジアクリロイル化体の重合体ゲルに、下記化６（式中、Ａｃはアセチル基を示す）の基を結合させたものをプライマーとし、糖転移酵素を用いて糖鎖を伸長させた後、トリフロロ酢酸により糖鎖を糖ペプチドとして遊離させる方法を報告しており、糖転移反応もほぼ定量的に進行したと報告している（例えば、非特許文献８参照）。この方法で得られる糖ペプチドのペプチド鎖はＡｓｎ（アスパラギン）−Ｇｌｙ（グリシン）であり、Ｃ末側のグリシン残基はグリシンアミド残基となっており、通常の糖ペプチドとは異なる。
【００１４】
【化６】
2004329117.tif 000005
【００１５】
さらに、本発明者らがポリアクリルアミドのアミド態窒素原子に、下記化７（式中、Ａｃはアセチル基を示す）に示した基を結合させたものをプライマーとし、糖転移酵素を用いて糖鎖を伸長させた後、α−キモトリプシンの加水分解作用を利用して伸長させた糖鎖を遊離させる方法を報告している（例えば、非特許文献９、１０参照）。本方法によれば、酵素による糖転移反応は定量的に進行し、伸長した糖鎖は６−アミノヘキサノール配糖体として得られる。
【００１６】
【化７】
2004329117.tif 000006
【００１７】
上述したこれらの方法は、いずれも得られる糖鎖化合物がオリゴ糖ではないこと、必ずしも糖転移反応の収率が十分でないことが欠点として挙げられる。また、遺伝子組換えにより大量生産が可能になってきたとはいえ、まだまだ糖転移酵素は非常に高価であり、繰り返して使用できる固定化糖転移酵素の利用が望まれるが、上記の方法のうちのいくつかは不溶性担体上で糖鎖伸長反応を行うため、固定化糖転移酵素を利用できないという欠点もある。固定化糖転移酵素を利用するためには、不溶性担体ではなく、水溶性担体上で糖鎖伸長反応を行う必要がある。
【００１８】
Ｓ．  Ｒｏｔｈらは、まず、糖転移酵素の糖受容体を固相担体に結合させ、これをアフィニティ吸着体とし、この糖受容体と結合することのできる糖転移酵素を含む組織抽出液を接触させることにより、糖転移酵素をアフィニティ吸着体に結合させ、次いで、この糖転移酵素が結合したアフィニティ吸着体をこの糖転移酵素が糖供与体として利用できる糖ヌクレオチドを含む溶液と接触させることにより、糖転移酵素をアフィニティ吸着体から遊離させるとともに糖受容体に糖残基を一つ伸長させ、さらに、この糖残基が一つ伸長した糖受容体と結合することのできる糖転移酵素を含む組織抽出液を接触させ、同様のことを繰り返し所望の糖鎖を固相担体上に合成する方法を開示している。（例えば、特許文献１参照）しかしながら、この方法の有用性を示す具体的なデータは示されておらず、得られた糖鎖を固相担体から遊離させる方法も開示されていない。
【００１９】
糖転移酵素を用いた糖鎖の自動合成であり、得られる糖鎖化合物がオリゴ糖である例としては、Ｔ．  ＮｏｒｂｅｒｇらがＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６Ｂ（アマシャムファルマシア社製）に下記化８に示した基を結合させたものをプライマーとし、糖転移酵素を用いて糖鎖を伸長させた後、臭素あるいはアンモニア／硼酸アンモニウムにより伸長させた糖鎖を遊離させる方法を報告している（例えば、非特許文献１１参照）。酵素による糖転移反応は定量的に進行しており、収率的には問題はないが、プライマーを製造に高価な３，４−ジエトキシ−３−シクロブテン−１，２−ジオンを用いており、経済的ではない。また、不溶性担体上での糖鎖伸長反応を行うため、固定化糖転移酵素を利用できないという欠点もある。
【００２０】
【化８】
2004329117.tif 000007
【００２１】
また、本発明者らはポリアクリルアミド中のアミド態窒素原子の５個に１個の割合で、下記化９（式中、Ａｃはアセチル基を示す）に示した基を結合させたものをプライマーとし、糖転移酵素を用いて糖鎖を伸長させた後、水素化分解により伸長させた糖鎖を遊離させる方法を報告している（例えば、特許文献１２、１３参照）。本方法によれば、酵素による糖転移反応は定量的に進行するが、後述するようにそれは遊離酵素の場合であり、固定化酵素では必ずしもそのようには進行しない。
【００２２】
【化９】
2004329117.tif 000008
【００２３】
【特許文献１】
特表平５−５００９０５号公報
【００２４】
【非特許文献１】
Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．，  １２４，  ２３  （１９８３）
【００２５】
【非特許文献２】
Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．，  ２２８，  ２５５  （１９９２）
【００２６】
【非特許文献３】
Ｒｅａｃｔ．  Ｐｏｌｙｍ．，  ２２，  １７１  （１９９４），
【００２７】
【非特許文献４】
Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．，  ２６５，  １６１  （１９９４）
【００２８】
【非特許文献５】
Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １１６，  １１３６  （１９９４）
【００２９】
【非特許文献６】
Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １１６，  １１３１５  （１９９４）
【００３０】
【非特許文献７】
Ａｄｖ．  Ｓｙｎｔｈ．  Ｃａｔａｌ．，  ３４３，  ６７５  （２００１）
【００３１】
【非特許文献８】
Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  １８４９  （１９９４）
【００３２】
【非特許文献９】
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ３６，  ９４９３  （１９９５）
【００３３】
【非特許文献１０】
Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．，  ３０５，  ４４３  （１９９８）
【００３４】
【非特許文献１１】
Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．，  ３１９，  ８０  （１９９９）
【００３５】
【非特許文献１２】
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ３５，  ５６５７  （１９９４）
【００３６】
【非特許文献１３】
Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．，  ３０５，  ４４３  （１９９８）
【００３７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、オリゴ糖の自動合成に適したプライマーを提供することにある。
【００３８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは前記問題点を解決するために鋭意検討した結果、アクリル酸残基を２０〜８０％を含む水溶性ポリマーの側鎖に選択的に開裂可能な結合を含むリンカーを介して単糖残基あるいはオリゴ糖残基を結合させることにより、上記問題点を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００３９】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
【００４０】
（１）単糖残基あるいはオリゴ糖残基が選択的に開裂可能な結合を含むリンカーを介し水溶性ポリマーの側鎖に結合したポリマーであって、該水溶性ポリマー中にアクリル酸残基を２０〜８０モル％含む糖鎖合成用水溶性高分子プライマー。
【００４１】
（２）水溶性ポリマーがアクリルアミド類、メタクリルアミド類、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、スチレン類、脂肪酸ビニルエステル類からなる群から選ばれた１種または２種以上のビニル系単量体の重合体である（１）の糖鎖合成用水溶性高分子プライマー。
【００４２】
（３）リンカーに含まれる選択的に開裂可能な結合が、水素化分解あるいは２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノベンゾキノンによる酸化工程である（１）又は（２）の糖鎖合成用水溶性高分子プライマー。
【００４３】
（４）単糖残基あるいはオリゴ糖残基および選択的に開裂可能な結合を含むリンカーが一般式（Ｉ）（式中、Ｒ１は単糖あるいはオリゴ糖残基、Ｒ２はメチレン基４〜２０個分の長さを有するリンカー、ＸはＯ、ＳまたはＮＨを示す）で表された基である（１）乃至（３）の糖鎖合成用水溶性高分子プライマー。
【００４４】
【化１０】
2004329117.tif 000009
【００４５】
（５）Ｒ１がＮ−アセチルグルコサミン残基、グルコース残基、ラクトース残基である（４）の糖鎖合成用水溶性高分子プライマー。
【００４６】
（６）Ｒ２がペンチレン基である（４）又は（５）の糖鎖合成用水溶性高分子プライマー。
【００４７】
（７）一般式（ＩＩ）（式中、Ｒ３は単糖残基あるいはオリゴ糖残基、Ｒ４はメチレン基４〜２０個分の長さを有するリンカーを示す）で表されるアクリルアミド誘導体とアクリル酸と少なくとも１種類のビニル系単量体とを、アクリル酸が全ビニル系共重合体中２０〜８０モル％になるように共重合することによる（１）乃至（４）の糖鎖合成用水溶性高分子プライマーの製造方法。
【００４８】
【化１１】
2004329117.tif 000010
【００４９】
（８）Ｒ３がＮ−アセチルグルコサミン残基、グルコース残基、ラクトース残基である（７）の糖鎖合成用水溶性高分子プライマーの製造方法。
【００５０】
（９）Ｒ４がペンチレン基である（７）又は（８）の糖鎖合成用水溶性高分子プライマーの製造方法。
【００５１】
（１０）ビニル系単量体がアクリルアミド類、メタクリルアミド類、メタクリル酸、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、スチレン類、脂肪酸ビニルエステル類からなる群から選ばれたビニル系単量体である（７）乃至（９）の糖鎖合成用水溶性高分子プライマーの製造方法。
【００５２】
（１１）オリゴ糖を製造する方法であって、
（工程１）（１）の水溶性高分子プライマーに糖ヌクレオチドの存在下に糖転移酵素と接触させることにより、糖ヌクレオチドより糖残基を該水溶性高分子プライマーに転移させる工程、
（工程２）工程１を１回または２回以上繰り返して糖鎖を伸長させる工程、
（工程３）必要に応じて、副生したヌクレオチド類や未反応の糖ヌクレオチド類を除去する工程、および、
（工程４）工程１〜工程３を複数回繰り返した後、複数の糖残基が転移して糖鎖が伸長した水溶性高分子プライマーから糖鎖を遊離させる工程、を含む糖鎖化合物を製造する方法。
【００５３】
【発明の実施の形態】
本発明の糖鎖合成用水溶性高分子プライマーは、単糖残基あるいはオリゴ糖残基が選択的に開裂可能な結合を含むリンカーを介し水溶性ポリマーの側鎖に結合したポリマーであって、該水溶性ポリマー中にアクリル酸残基を２０〜８０％含む糖鎖合成用水溶性高分子プライマーである。
【００５４】
本発明に用いられる水溶性ポリマーは、特に制限されるものではないが、例えばアクリルアミド類、メタクリルアミド類、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、スチレン類、脂肪酸ビニルエステル類からなる群から選ばれた１種または２種以上のビニル系単量体の重合体などが好適に用いられる。
【００５５】
前記アクリルアミド類としては、例えばアクリルアミドやＮ−メチルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドなどのＮ−アルキルアクリルアミド類などが好適に用いられる。
【００５６】
前記メタクリルアミド類としては、例えばメタクリルアミド、Ｎ−メチルメタクリルアミドやＮ−イソプロピルメタクリルアミドなどのＮ−アルキルメタクリルアミド類などが好適に用いられる。
【００５７】
前記アクリル酸エステル類としては、例えばアクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ヒドロキシエチル、アクリル酸ジメチルアミノエチルなどが好適に用いられる。
【００５８】
前記メタクリル酸エステル類としては、例えばメタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ヒドロキシエチル、メタクリル酸ジメチルアミノエチルなどが好適に用いられる。
【００５９】
前記スチレン類としては、例えばスチレン、ｐ−ヒドロキシスチレンなどが好適に用いられる。
【００６０】
脂肪酸ビニルエステル類としては、例えば酢酸ビニル、酪酸ビニルなどが好適に用いられる。
【００６１】
選択的に開裂可能な結合は、糖鎖部分を分解することなく開裂することのできる結合であれば、特に限定されないが、例えば水素化分解あるいは２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノベンゾキノンによる酸化などが挙げられる。
【００６２】
水溶性ポリマーの側鎖に選択的に開裂可能な結合を含むリンカーを介し結合した単糖残基あるいはオリゴ糖残基として、具体的には、一般式（Ｉ）（式中、Ｒ１は単糖あるいはオリゴ糖残基、Ｒ２はメチレン基４〜２０個分の長さを有するリンカー、ＸはＯ、ＳまたはＮＨを示す）で表される基を挙げることができる。
【００６３】
【化１２】
2004329117.tif 000011
【００６４】
Ｒ１の単糖残基あるいはオリゴ糖残基としては、特に制限はなく、グルコース残基、ガラクトース残基、マンノース残基、Ｎ−アセチルグルコサミン残基、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基、キシロース残基、ラクトース残基、Ｎ−アセチルラクトサミン残基、キトビオース残基などが挙げられる。
【００６５】
Ｒ２のリンカーとしては、例えばブチレン基、ペンチレン基、ヘプチレン基、ドデシレン基などが挙げられる。
【００６６】
本発明の糖鎖合成用水溶性高分子プライマーは、一般式（ＩＩ）で表されるアクリルアミド誘導体とアクリル酸と少なくとも１種類のビニル系単量体とを共重合することにより製造することができる。そのときのアクリル酸の全ビニル系共重合体中に占める割合は２０〜８０モル％であり、好ましくは４０〜６０モル％である。
【００６７】
前記共重合は、例えばラジカル重合、カチオン重合、アニオン重合などの手法を好適に用いることができ、中でもペルオキソ二硫酸アンモニウムなどを触媒とするラジカル重合がより好適に用いることができる。
【００６８】
前記ビニル系単量体としては、例えばアクリルアミド類、メタクリルアミド類、メタクリル酸、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、スチレン類、脂肪酸ビニルエステル類が挙げられる。
【００６９】
アクリルアミド類としては、アクリルアミドやＮ−メチルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドなどのＮ−アルキルアクリルアミド類などが例示される。
【００７０】
メタクリルアミド類としてはメタクリルアミド、Ｎ−メチルメタクリルアミドやＮ−イソプロピルメタクリルアミドなどのＮ−アルキルメタクリルアミド類などが例示される。
【００７１】
アクリル酸エステル類としてはアクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ヒドロキシエチル、アクリル酸ジメチルアミノエチルなどが例示される。
【００７２】
メタクリル酸エステル類としてはメタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ヒドロキシエチル、メタクリル酸ジメチルアミノエチルなどが例示される。
【００７３】
スチレン類としてはスチレン、ｐ−ヒドロキシスチレンなどが例示される。脂肪酸ビニルエステル類としては酢酸ビニル、酪酸ビニルなどが例示される。
【００７４】
共重合体の一般的な分子量は約１００００〜約５００００００であり、好ましくは２００００〜２００００００、より好ましくは５００００〜１００００００である。
【００７５】
一般式（ＩＩ）で表されるアクリルアミド誘導体は、通常用いられている各種有機合成化学的な手法により合成することができる。例えば、一般式（ＩＩＩ）で表される糖オキサゾリン誘導体や一般式（ＩＶ）で表されるハロゲン化糖あるいはトリクロロアセトイミデート誘導体とｐ−ニトロベンジルアルコールとを適当な触媒存在下で縮合させた後、ニトロ基を還元してアミノ基へと変換する。その後、一般式（Ｖ）で表されるω−アミノ脂肪酸と塩化アクリロイルとの縮合により得られる一般式（ＶＩ）で表されるアクリルアミド誘導体と上記化合物とを適当な縮合剤存在下、縮合させることにより得られる。
【００７６】
【化１３】
2004329117.tif 000012
【００７７】
【化１４】
2004329117.tif 000013
【００７８】
【化１５】
2004329117.tif 000014
【００７９】
【化１６】
2004329117.tif 000015
【００８０】
本発明のオリゴ糖製造方法の第１工程は、水溶性高分子プライマーに糖ヌクレオチドの存在下に糖転移酵素と接触させることにより、糖ヌクレオチドより糖残基を該水溶性高分子プライマーに転移させる。
【００８１】
糖ヌクレオチドより水溶性高分子プライマーへの糖の転移は、通常水溶性高分子プライマーと糖ヌクレオチドとを含む中性の緩衝液中で、１０〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃で、１〜１２０時間、好ましくは２〜７２時間、糖転移酵素と接触させることにより行われる。
【００８２】
また、反応液中には必要に応じて金属塩を添加してもよい。添加できる金属イオンとしては、例えば、マグネシウム、マンガン、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛などがあり、通常塩化物等の形で添加することができる。
【００８３】
本発明で用いる糖転移酵素は、糖ヌクレオチド類を糖供与体として利用できるものであればよく特に限定されない。このような酵素としてＬｅｌｏｉｒ経路の糖転移酵素類を挙げることができる。例えば、ガラクトース転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、フコース転移酵素、シアル酸転移酵素、マンノース転移酵素、キシロース転移酵素、グルクロン酸転移酵素などが挙げられる。なお、これらの酵素は遊離酵素であっても、固定化酵素であっても構わないが、固定化酵素が好ましい。
【００８４】
本発明で用いる糖ヌクレオチド類は、上記酵素が利用できるものであれば特に限定されない。例えば、ウリジン−５’−ジリン酸ガラクトース、ウリジン−５’−ジリン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、ウリジン−５’−ジリン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ウリジン−５’−ジリン酸グルクロン酸、ウリジン−５’−ジリン酸キシロース、グアノシン−５’−ジリン酸フコース、グアノシン−５’−ジリン酸マンノース、シチジン−５’−モノリン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸およびこれらのナトリウム塩などが挙げられる。
【００８５】
本発明のオリゴ糖製造方法の第２工程は、工程１を１回または２回以上繰り返して、複数の糖残基を転移させることにより、糖鎖を伸長させる。
【００８６】
本発明のオリゴ糖製造方法の第３工程は、必要に応じて、副生したヌクレオチド類や未反応の糖ヌクレオチド類を除去する。副生したヌクレオチド類や未反応の糖ヌクレオチド類などを除去する方法は、水溶性高分子プライマーとヌクレオチド類および糖ヌクレオチド類などとを分離できる方法であれば特に限定されない。例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、透析、限外ろ過などにより除去することができる。
【００８７】
本発明のオリゴ糖製造方法の第４工程は、工程１〜工程３を複数回繰り返した後、複数の糖残基が転移して糖鎖が伸長した水溶性高分子プライマーからオリゴ糖を遊離させる。本発明の水溶性高分子プライマーより、伸長した糖鎖を遊離させる方法としては、伸長した糖鎖を分解することなく、遊離させることのできる方法であれば、特に制限はないが、例えば接触水素化分解や２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノベンゾキノンによる酸化反応などが挙げられる。
【００８８】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲はかかる実施例に何ら限定されるものではない。
【００８９】
参考例１  ２−メチル−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−α−Ｄ−グルコピラノ）−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリンの合成
２−アセトアミド−１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド６．０ｇを１，２−ジクロロエタン４０ｍｌに溶かし、ここにトリメチルシリルトリフロロメタンスルホン酸３．２ｍｌを加え、５０℃で７時間撹拌しながら反応させた。反応後、室温まで冷却した後、トリエチルアミン１０．８ｍｌを加えた。反応液を減圧濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；トルエン：酢酸エチル：トリエチルアミン＝１００：２００：１）で目的物を分離し、目的物を５．０ｇ得た。
【００９０】
参考例２  ｐ−ニトロベンジル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシドの合成
参考例１で得た２−メチル−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−α−Ｄ−グルコピラノ）−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン２．８ｇをジクロロエタン４０ｍｌに溶解し、ここにｐ−ニトロベンジルアルコール１０．４ｇとＤ−カンファー−１０−スルホン酸０．２ｇを加え、８０℃で２時間撹拌しながら反応させた。反応後、室温まで冷却し、トリエチルアミン４．０ｍｌを加えた。反応液を減圧濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：酢酸エチル：メタノール＝２００：４０：５）で目的物を分離し、目的物を３．７ｇ得た。
【００９１】
参考例３  ６−アクリロイルアミノカプロン酸の合成
６−アミノカプロン酸１０．０ｇを１．２７Ｍ水酸化ナトリウム水溶液６０ｍｌに溶解し、塩化アクリロイル７．８ｍｌを２０ｍｌのテトラヒドロフランに溶かしたものを氷冷下で滴下した。このとき、ｐＨ８〜９になるように４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いて調整した。滴下後、徐々に室温に戻しながら２時間撹拌した。次いで、反応液に１Ｎ塩酸をｐＨ３になるまで加えた後、酢酸エチルで生成物を抽出した。抽出液を水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。硫酸マグネシウムをろ別し、ろ液を減圧濃縮した。残渣を少量の酢酸エチルに溶かし、ヘキサンで再結晶し、目的物９．６ｇを得た。
【００９２】
参考例４  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシドの合成
参考例２で得たｐ−ニトロベンジル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド１．６ｇをメタノール５０ｍｌに溶解し、ここにギ酸アンモニウム２．１ｇおよび１０％パラジウム−炭素１７０ｍｇを加えた。室温で５分間撹拌した後、触媒をろ別し、ろ液を減圧濃縮した。残渣をクロロホルムで溶解した。蒸留水で有機層を洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥後、硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を減圧濃縮した。残渣をジクロロエタン：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド＝１０：１の混合溶媒４４ｍｌで溶かし、ここに参考例３で得た６−アクリロイルアミノカプロン酸０．６ｇを加えた。さらに、トリエチルアミン０．４６ｍｌと１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩６５ｍｇを０℃で撹拌しながら加えた。撹拌しながら室温まで戻し、２２時間反応させた。反応液にクロロホルム６０ｍｌを加え、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水の順で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナトリウムをろ別し、ろ液を減圧濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：エタノール＝３０：１）で目的物を分離し、目的物を１．１ｇ得た。
【００９３】
実施例１  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシドの合成
参考例４で得たｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド６６０ｍｇをメタノール７０ｍｌに溶解し、ここにナトリウムメトキシド５０ｍｇを加え、室温で撹拌しながら１５時間反応させた。反応後、Ｈ＋型の陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ５０ＷＸ−８（ダウケミカル社製）をｐＨ７になるまで加えた。イオン交換樹脂をろ別し、ろ液を減圧濃縮し、目的物を５２０ｍｇ得た。
【００９４】
実施例２  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリル酸−アクリルアミド共重合体（共重合比１：２：７、プライマーＡ）の合成
実施例１で得たｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド６１．７ｍｇ、アクリル酸１８．０ｍｇ、アクリルアミド６２．２ｍｇをジメチルスルホキシド：蒸留水＝３：１の混合溶媒１ｍｌに溶解し、アスピレーターで十分に脱気した後、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（以下、ＴＥＭＥＤと略する）１１．６μｌと過硫酸アンモニウム８．６ｍｇを加え、室温で２４時間撹拌し重合させた。反応後、反応液に蒸留水２ｍｌを加え、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０（アマシャムファルマシア社製）を用いたカラムクロマトグラフィー（溶出液：５０ｍＭ酢酸アンモニウム）により目的物を分離した。得られた目的物画分を凍結乾燥し、目的物１３８ｍｇを得た。
【００９５】
実施例３  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリル酸−アクリルアミド共重合体（共重合比１：４：５、プライマーＢ）の合成
アクリル酸３６．０ｍｇ、アクリルアミド４４．４ｍｇを用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１３８ｍｇを得た。
【００９６】
実施例４  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリル酸−アクリルアミド共重合体（共重合比１：６：３、プライマーＣ）の合成
アクリル酸５４．０ｍｇ、アクリルアミド２６．７ｍｇを用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１３９ｍｇを得た。
【００９７】
実施例５  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリル酸−アクリルアミド共重合体（共重合比１：８：１、プライマーＤ）の合成
アクリル酸７２．１ｍｇ、アクリルアミド８．９ｍｇを用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１３９ｍｇを得た。
【００９８】
参考例５  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリルアミド共重合体（共重合比１：９、プライマーＥ）の合成
アクリル酸を用いずに、アクリルアミド８０．０ｍｇを用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１３８ｍｇを得た。
【００９９】
参考例６  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリル酸共重合体（共重合比１：９、プライマーＦ）の合成
アクリルアミドを用いずに、アクリル酸８１．１ｍｇを用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１３９ｍｇを得た。
【０１００】
実施例６  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリル酸−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド共重合体（共重合比１：２：７、プライマーＧ）の合成
アクリルアミドの代わりにＮ−イソプロピルアクリルアミドを９９．０ｍｇ用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１７４ｍｇを得た。
【０１０１】
実施例７  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリル酸−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド共重合体（共重合比１：４：５、プライマーＨ）の合成
アクリル酸３６．０ｍｇ、アクリルアミドの代わりにＮ−イソプロピルアクリルアミドを７０．７ｍｇ用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１６４ｍｇを得た。
【０１０２】
実施例８  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリル酸−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド共重合体（共重合比１：６：３、プライマーＩ）の合成
アクリル酸５４．０ｍｇ、アクリルアミドの代わりにＮ−イソプロピルアクリルアミドを４２．４ｍｇ用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１５４ｍｇを得た。
【０１０３】
実施例９  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリル酸−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド共重合体（共重合比１：８：１、プライマーＪ）の合成
アクリル酸７２．１ｍｇ、アクリルアミドの代わりにＮ−イソプロピルアクリルアミドを１４．１ｍｇ用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１４４ｍｇを得た。
【０１０４】
参考例７  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド共重合体（共重合比１：９、プライマーＫ）の合成
アクリル酸を用いずに、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド１２７．３ｍｇを用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１８３ｍｇを得た。
【０１０５】
参考例８  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリルアミド−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド共重合体（共重合比１：５：４、プライマーＬ）の合成
アクリル酸を用いずに、アクリルアミド４４．４ｍｇ、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド５６．６ｍｇを用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１５８ｍｇを得た。
【０１０６】
実施例１０  β１，４−ガラクトース転移酵素による各種プライマーへのガラクトース転移
β１，４−ガラクトース転移酵素（東洋紡績社製）１Ｕ、ウリジン−５’−ジホスホガラクトース１０ｍＭ、塩化マンガン１０ｍＭ、α−ラクトアルブミン０．２６ｍｇ／ｍｌを含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）２．０ｍｌに実施例２〜９および参考例５〜８で得たプライマーＡ〜Ｌをそれぞれ２０ｍｇ加え、３７℃で２４時間反応させた。反応後、１００℃で３分間加熱することにより反応を停止させた。反応液を遠心分離して得られた上清より、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムクロマトグラフィー（溶出液：蒸留水）で生成物画分を分離し、凍結乾燥することにより生成物１９ｍｇを得た。得られた生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、そのスペクトルよりガラクトースの転移がいずれも定量的に進行していることを確認した。
【０１０７】
参考例９  固定化α２，３−シアル酸転移酵素の調製
ＮＨＳ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アマシャムファルマシア社製）０．５ｇをとり、１ｍＭ塩酸１００ｍｌを３回に分けて洗浄した。これにブタ肝臓由来α２，３−シアル酸転移酵素１Ｕ、シチジン−５’−ジホスフェート１ｍＭを含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）５ｍｌを加え、４℃で一晩、穏やかに振とうした。固定化α２，３−シアル酸転移酵素をガラスフィルターでろ別し、α２，３−シアル酸転移酵素を除く上記緩衝液５ｍｌで洗浄した。０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）５ｍｌを加え、担体中の未反応の活性化基をブロックし、さらに洗浄した後、α２，３−シアル酸転移酵素をシチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（以下、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃと略する）１ｍＭを含む２５ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に浸漬し、４℃で保存した。得られた固定化酵素の活性は１１０ｍＵ／ｍｌであった。
【０１０８】
実施例１１  固定化α２，３−シアル酸転移酵素による各種プライマーへのシアル酸転移
参考例９で得た固定化α２，３−シアル酸転移酵素０．０５ｍｌ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ５０ｍＭ、塩化マンガン１０ｍＭ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  ＣＦ−５４を含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）０．５ｍｌに実施例１０で得たガラクトシル化されたプライマーＡ〜Ｌをそれぞれ６．５ｍｇ（プライマーＡ〜Ｆ）、８．０ｍｇ、７．５ｍｇ、７．１ｍｇ、６．７ｍｇ、８．４ｍｇ、７．３ｍｇ（Ｎ−アセチルラクトサミン残基で５μｍｏｌｅに相当）加え、３０℃で２４時間振とうしながら反応させた。反応後、遠心分離することにより反応液を上清として得た後、実施例１０と同様の方法で生成物を分離し、生成物をそれぞれ６．０ｍｇ（プライマーＡ〜Ｆ）、７．５ｍｇ、７．０ｍｇ、６．５ｍｇ、６．２ｍｇ、７．８ｍｇ、６．８ｍｇ得た。生成物をそれぞれ１ｍｇとり、蒸留水：エタノール＝３：１の混合溶媒１ｍｌに溶かし、ここに１０％パラジウム−炭素１ｍｇを加え、常圧下水素ガスにより室温で２４時間接触還元した。触媒をろ別した後、ろ液を限外ろ過ユニットウルトラフリーＭＣ（分画分子量１０，０００、ミリポア社製）でろ過し、通過液画分として遊離させたオリゴ糖を集めた。通過液画分を凍結乾燥し、得られた固形分を定法に従い、ピリジルアミノ化し、ＨＰＬＣにてシアリルラクトサミン、ラクトサミンの存在比を分析することにより、糖転移収率を求めた。
【０１０９】
【表１】
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【０１１０】
参考例１０  ｐ−ニトロベンジル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクトシル−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルコピラノシドの合成
１−ブロモ−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクトシル−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルコピラノシド５．０ｇをジクロロエタン５０ｍｌに溶解し、ここにｐ−ニトロベンジルアルコール２３．５ｇとモレキュラーシーブス４Ａを５．０ｇ加え０℃で撹拌した。窒素気流下で銀トリフレートを２．９ｇ加えで徐々に室温に戻しながら１２時間撹拌しながら反応させた。反応液をクロロホルムで希釈してセライトパッド上で濾過したのち、ろ液を飽和食塩水で洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させた。ろ過により硫酸マグネシウムを除去し、ろ液を減圧下で濃縮したのち、シリカゲルクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール＝５０：１）で目的物を分離し、目的物を５．６ｇ得た。
【０１１１】
参考例１１  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）−ベンジル−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクトシル−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルコピラノシドの合成
参考例１０で得たｐ−ニトロベンジル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクトシル−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルコピラノシ３．０ｇをメタノール５０ｍｌに溶解し、ここにギ酸アンモニウムを１．８ｇおよび１０％パラジウム−炭素を２００ｍｇを加えた。室温で５分間撹拌した後、触媒をろ別し、ろ液を減圧濃縮した。残渣をクロロホルムで溶解した。蒸留水で有機層を洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥後、硫酸マグネシウムをろ別した後、ろ液を減圧濃縮した。残渣をジクロロエタン：Ｎ，Ｎ，−ジメチルホルムアミド＝１０：１の混合溶媒４０ｍｌで溶かし、ここで参考例３で得た６−アクリロイルアミノカプロン酸を０．８５ｇ加えた。続いてトリエチルアミン６３４μｌと１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩８７０ｍｇを加えて氷冷から室温に戻しながら２２時間撹拌した。反応液をクロロホルムで希釈し、１Ｎ硫酸および飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させた。濾過により硫酸マグネシウムを除去し、ろ液を減圧下で濃縮したのち、シリカゲルクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：エタノール＝２０：１）で目的物を分離し、目的物を１．１ｇ得た。
【０１１２】
実施例１２  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）−ベンジル−Ｄ−ガラクトシル−Ｄ−グルコピラノシドの合成
参考例１１で得たｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）−ベンジル−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクトシル−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルコピラノシド１．０ｇをメタノール１０ｍＬに溶解させた。そこにナトリウムメトキシド２４ｍｇを加え室温で１５時間撹拌した。反応終了後、反応液をイオン交換樹脂ダウエックス５０Ｗ−Ｘ８（Ｈ＋）で中和した。樹脂をろ別し、ろ液を減圧濃縮し、目的物を６５０ｍｇ得た。
【０１１３】
実施例１３  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）−ベンジル−Ｄ−ガラクトシル−Ｄ−グルコピラノシド−アクリル酸−アクリルアミド共重合体（共重合比１：４：５、プライマーＭ）の合成
実施例１２で得たｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）−ベンジル−Ｄ−ガラクトシル−Ｄ−グルコピラノシド７６．８ｍｇ、アクリル酸３６．０ｍｇ、アクリルアミド４４．４ｍｇを用いて、実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１５１ｍｇを得た。
【０１１４】
実施例１４  固定化α２，３−シアル酸転移酵素によるプライマーＭへのシアル酸転移
参考例６で得た固定化α２，３−シアル酸転移酵素０．３ｍｌ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ５０ｍＭ、塩化マンガン１０ｍＭを含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）１．０ｍｌに実施例１３で得たプライマーＭを６．３ｍｇ（ラクトース残基で５μｍｏｌｅに相当）加え、３０℃で２４時間振とうしながら反応させた。反応後、遠心分離することにより反応液を上清として得た後、実施例１０と同様の方法で生成物を分離し、生成物を５ｍｇ得た。生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、そのスペクトルよりシアル酸転移反応の収率を求めたところ、８８％であった。
【０１１５】
【発明の効果】
本発明の糖鎖合成用高分子プライマーを用いることにより、種々のオリゴ糖を効率よく合成でき、自動合成にも適用することができる。