(57)【要約】【課題】目的の細胞や組織に特異的に物質を導入する中空ナノ粒子であって、粒子構造を安定化し、効率よく物質導入することができる中空ナノ粒子、およびこれを用いた薬剤を提供する。【解決手段】肝細胞などの特定の細胞に対する認識能を有し、粒子形成能を有するタンパク質（例えば、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質）からなる中空ナノ粒子において、当該タンパク質のシステイン残基を他のアミノ酸に置換した中空ナノ粒子である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の細胞に対する認識能を有し、粒子形成能を有するタンパク質からなる中空ナノ粒子において、当該タンパク質に含まれる少なくとも１つのシステイン残基が改変されてなる中空ナノ粒子。
【請求項２】
上記タンパク質は、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質である請求項１記載の中空ナノ粒子。
【請求項３】
膜貫通領域に存在する少なくとも１つのシステイン残基が疎水性アミノ酸に置換され、及び／又は、粒子外部または内部に存在する少なくとも１つのシステイン残基が親水性アミノ酸に置換されている請求項１または２記載の中空ナノ粒子。
【請求項４】
膜貫通領域に存在する少なくとも１つのシステイン残基がアラニン残基に置換され、及び／又は、粒子外部または内部に存在する少なくとも１つのシステイン残基がセリン残基に置換されている請求項３記載の中空ナノ粒子。
【請求項５】
上記Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質の、Ｓタンパク質アミノ酸配列におけるＮ末端部分から数えて７６，９０，１３９，１４７，１４９，２２１番目のシステイン残基が置換され、かつ、１３７，１３８番目のシステイン残基から選ばれる少なくとも１つが置換されている請求項２〜４の何れか１項に記載の中空ナノ粒子。
【請求項６】
上記システイン残基の改変は、上記粒子形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子に変異を導入し、この変異遺伝子を発現させることにより行われることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載の中空ナノ粒子。
【請求項７】
上記変異遺伝子を含むベクターにて真核細胞を形質転換させ、当該真核細胞において上記変異遺伝子を発現させることにより得られることを特徴とする請求項６記載の中空ナノ粒子。
【請求項８】
上記真核細胞は、動物細胞または酵母であることを特徴とする請求項７記載の中空ナノ粒子。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか１項に記載の中空ナノ粒子に細胞導入物質が封入されていることを特徴とする薬剤。
【請求項１０】
上記細胞導入物質は、遺伝子であることを特徴とする請求項９記載の薬剤。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の薬剤を用いる疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、疾患治療用の細胞導入物質を封入することができる中空ナノ粒子に関し、より詳細には、粒子内部に封入された疾患治療用の細胞導入物質を特定細胞または組織内に特異的に導入可能な薬剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、医学の分野において、患部に直接作用し、高い効果を示す副作用の少ない薬品の開発が盛んに行われている。特に、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）と呼ばれる方法は、目的細胞、あるいは、目的組織に対して特異的に薬剤等の有効成分を運搬し、目的箇所で有効成分を作用させることのできる方法として注目されている。
【０００３】
目的細胞、あるいは、目的組織に対して特異的に薬剤となるタンパク質を送り込む方法としては、従来、当該タンパク質をコードする遺伝子が組み込まれた発現ベクターをエレクトロポレーション法等により目的細胞に導入して、この遺伝子を細胞内で発現させることによりタンパク質薬剤を細胞内に送り込むいわゆる遺伝子導入方法が開発されてきた。しかし、このような従来の遺伝子導入方法では、何れも、目的細胞、あるいは、目的組織に対して特異的にタンパク質薬剤を送り込む方法としては不十分なものであった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
以上のような状況に鑑み、本発明者らは、国際公開番号ＷＯ０１／６４９３０の国際出願（以下、「国際出願ＷＯ０１／６４９３０」という）において、粒子形成能を有するタンパク質に生体認識分子が導入された中空ナノ粒子を用いて、目的とする細胞や組織に、物質（遺伝子、タンパク質、化合物等）を特異的かつ安全に運搬、導入するための方法を提案しているが、この方法を応用しつつ目的の細胞または組織に対して物質をより効率的に導入するためのさらなる改良が課題となっていた。
【０００５】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、目的の細胞や組織に特異的に効率よく物質を導入するタンパク質中空ナノ粒子、およびこの中空ナノ粒子に細胞導入物質を包含させた薬剤を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、粒子を形成するタンパク質のシステイン残基を改変することにより、粒子による物質の細胞特異的導入効率が飛躍的に高まることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
即ち、本発明に係る中空ナノ粒子は、特定の細胞（例えば肝細胞など）に対する認識能を有し、粒子形成能を有するタンパク質からなる中空ナノ粒子において、当該タンパク質におけるシステイン残基を改変した中空ナノ粒子である。
【０００８】
上記「粒子形成能を有するタンパク質」としては、例えばＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を挙げることができる。このタンパク質は、真核細胞で発現させると、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積され、粒子として放出される。本発明の中空ナノ粒子は、このような粒子形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターによって真核細胞（例えば哺乳類等の動物細胞または酵母）を形質転換させ、当該真核細胞に遺伝子発現させることにより製造することができる。
【０００９】
上記Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を用いて形成された粒子は、肝細胞を認識し、肝細胞に対して特異的に粒子内の物質を運搬することができるので、肝臓疾患治療用の物質（遺伝子等）を包含させることにより、肝細胞に対して特異的かつ効果的に作用する有効な治療薬となる。
【００１０】
また、例えば上記Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を、本来の肝細胞に対する感染能を欠失するように改変し、さらに増殖因子や抗体を提示するように改変し、このように改変されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を用いて粒子を形成することで、肝細胞以外の特定の細胞に対して特異的に粒子内の物質を運搬することができる。例えば、ある癌細胞を特異的に認識する抗体を提示させることで、その癌細胞を認識し、その癌細胞に対して特異的に粒子内の物質を運搬することができる。
【００１１】
上記Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質における後述のＳタンパク質は、タンパク質の酸化還元に関与するシステイン（Ｃｙｓ）残基を合計１４個有している。これらのＣｙｓ残基は形成された粒子の構造を制御していると考えられるが、粒子の精製過程あるいは保存中にＣｙｓ残基同士の過剰なジスルフィド結合により、タンパク質の分子間および分子内に不規則なジスルフィド架橋が生じてポリマー化し安定性に欠ける。そこで、これらＣｙｓ残基のうち上記構造の制御に重要でないものを改変することによって（あるいは、これらＣｙｓ残基以外で粒子形成能や細胞認識能に実質的な影響を与えないＣｙｓ残基を改変することによって）ポリマー化を防ぎ、これにより、粒子に安定性が付与され、また、中空ナノ粒子への物質の封入効率が向上するので、包含する物質を効率よく細胞に導入することができる。
【００１２】
具体的には、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を例に挙げると、Ｓタンパク質アミノ酸配列におけるＮ末端部分から数えて７６，９０，１３９，１４７，１４９，２２１番目のシステイン残基を置換し、かつ、１３７，１３８番目のシステイン残基から選ばれる少なくとも１つを置換するのが好ましい。
【００１３】
Ｃｙｓ残基の改変は、他のアミノ酸への置換が好ましいが、Ｃｙｓ残基を欠失させるような改変を行ってもよい。Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質は膜貫通型の膜タンパク質であるので、粒子外、脂質二重層膜内部および粒子内の各部にまたがって存在するが、Ｃｙｓ残基を置換するアミノ酸は、脂質二重層膜内部に存在すると予測されるＣｙｓ残基は疎水性のアミノ酸（例えばアラニン（Ａｌａ）残基）に、粒子外部および内部に存在すると予測されるＣｙｓ残基は親水性のアミノ酸（例えばセリン（Ｓｅｒ）残基）に置換するのが好ましい。
【００１４】
システイン残基の改変は、上記粒子形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子に変異を導入し、例えば、変異遺伝子を含むベクターにて真核細胞を形質転換させ、当該真核細胞において上記変異遺伝子を発現させる等の方法で改変された中空ナノ粒子を作製することができる。
【００１５】
また、本発明の中空ナノ粒子に治療物質を包含させた薬剤では、静脈注射という簡便な方法で特定の細胞または組織における疾患を効果的に治療することができ、従来の治療方法と大きく異なり、多量の薬剤の投与や遺伝子治療等における外科手術を必要とせず、副作用の心配も極めて低く、そのまま臨床応用可能なものである。
【００１６】
本発明の治療方法は、本発明の薬剤を投与することによる疾患の治療方法である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明の中空ナノ粒子は、粒子形成能を有するタンパク質のシステイン残基を改変してなるものであるが、その粒子形成能を有するタンパク質に生体認識分子（換言すれば、特定の細胞を認識する分子）を導入することによって、目的細胞あるいは目的組織に特異的に物質を運搬することができる。このような粒子形成能を有するタンパク質としては、種々のウィルスから得られるサブウィルス粒子を適用することができる。具体的には、Ｂ型肝炎ウィルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　Ｖｉｒｕｓ：ＨＢＶ）表面抗原タンパク質等が例示される（以下、このＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を「ＨＢｓＡｇ」と略記する場合がある）。
【００１８】
また、このような粒子形成能を有するタンパク質からなるタンパク質粒子としては、真核細胞でタンパク質を発現させることにより得られるものが挙げられる。つまり、真核細胞で粒子形成能を有するタンパク質を発現させると、同タンパク質は、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積され、粒子として放出されるのである。このとき、真核細胞としては、哺乳類等の動物細胞、酵母等が適用できる。
【００１９】
本発明者らは、遺伝子組換え酵母で上記ＨＢｓＡｇのＬタンパク質（後述の実施例参照）を発現させることにより、発現されたＨＢｓＡｇのＬタンパク質から酵母由来の脂質二重膜に多数の同タンパク質が埋め込まれた短径約２０ｎｍ、長径約１５０ｎｍの楕円状中空粒子が形成されることを見出し、報告している（Ｊ．Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　Ｖｏｌ．２６７，　Ｎｏ．３，　１９５３−１９６１，　１９９２）。このような粒子は、ＨＢＶゲノムを全く含まないので、ウィルスとしては機能せず、人体への安全性が極めて高い。また、ＨＢＶの肝細胞への極めて高い感染力を担う肝細胞特異的レセプターを粒子表面に提示しているため、肝細胞に対して特異的に物質を運搬する運搬体としての効果も高いのである。
【００２０】
このように遺伝子組換え酵母を用いてタンパク質粒子を形成する方法は、菌体内の可溶性タンパク質から高効率で粒子が生産される点で好適である。
【００２１】
上記ＨＢｓＡｇのＳタンパク質（後述の実施例参照）は、タンパク質の酸化還元に関与するシステイン（Ｃｙｓ）残基を合計１４個有している。これらのＣｙｓ残基は形成された粒子の構造を制御していると考えられるが、粒子の精製過程あるいは保存中にＣｙｓ残基同士の過剰なジスルフィド結合によりポリマー化し安定性に欠ける。そこで、これらＣｙｓ残基のうち上記構造の制御に重要でないものを改変することによって、粒子に安定性を付与して保存を容易にし、また、中空ナノ粒子への物質の封入効率が向上するので、包含する物質を効率よく細胞に導入することができる。
【００２２】
改変されるＣｙｓ残基の部位は特に限定されるものではないが、ＨＢｓＡｇ粒子の機能を損なわないように改変する必要がある。ＨＢｓＡｇのＬタンパク質は肝細胞認識部位であるＰｒｅＳ１やＰｒｅＳ２と、Ｓタンパク質とからなるが、Ｓタンパク質においてはアミノ酸を改変してもＨＢｓＡｇ粒子の機能への影響が少ないと考えられる。そこで、Ｓタンパク質に含まれているシステイン（Ｃｙｓ）残基１４個（図１の模式図中に「Ｃ」でその位置が示されている）の一部を改変することによって、ＨＢｓＡｇ粒子がその肝細胞認識能や粒子形成能を失わずにジスルフィド結合を解くことができると考えられる。
【００２３】
Ｓタンパク質に含まれる１４個のＣｙｓ残基は、Ｓタンパク質のアミノ酸配列のＮ末端部分から数えて、４８，６５，６９，７６，９０，１０７，１２１，１２４，１３７，１３８，１３９，１４７，１４９，２２１番目に位置する（図２下線部）。図１の模式図に示すとおり、ＨＢｓＡｇタンパク質は膜貫通タンパク質であり、Ｎ末端側のＰｒｅＳ領域が粒子外部にあり、それに続くＳタンパク質部分では膜を貫通して粒子内部へ入った後、再び膜を貫通して粒子外部に出、もう一度膜に入ってＣ末端部分は膜内に留まっている。つまり、Ｓタンパク質は、３つの膜貫通部位と粒子内部分と粒子外に露出した部分からなる。上述した１４個のＣｙｓ残基は、４８，６５，６９番目が粒子内に存在し、７６，９０，１０７番目が第２の膜貫通領域に位置し、１２１，１２４，１３７，１３８，１３９，１４７番目が粒子外部に露出し、１４９，２２１番目が第３の膜貫通部位に位置すると予測されている。
【００２４】
この１４個のＣｙｓ残基の中で改変されるＣｙｓ残基は特に限定されるものではないが、膜貫通部位および粒子外部に存在するＣｙｓ残基でＣ末端に近い位置にあるものが好ましい。具体的には、７６，９０，１３７，１３８，１３９，１４７，１４９，２２１番目を置換したものが好ましく、これらの８つのＣｙｓ残基から選ばれた複数のＣｙｓ残基を置換したものがより好ましい。その中でも、上記８つのＣｙｓ残基をすべて置換したもの、あるいは上記８つのＣｙｓ残基のうち１３７番目以外または１３８番目以外のＣｙｓ残基以外を置換したもの、が特に好ましい。
【００２５】
上記Ｃｙｓ残基を置換する場合に、Ｃｙｓ残基を置換するアミノ酸は特に限定しないが、膜貫通部位に存在するアミノ酸は脂質２重膜の疎水性の層に存在することとなるので疎水性であることが好ましい。疎水性のアミノ酸は、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、バリンがあり、この中でもアラニン残基に置換するのが好ましい。一方、粒子外部および内部に存在すると予測されるＣｙｓ残基は親水性のアミノ酸に置換することが好ましい。親水性のアミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、リシン、セリン、スレオニンがあり、この中でもセリン残基に置換するのが好ましい。
【００２６】
Ｃｙｓ残基の改変は、一般的に用いられる、部位特異的突然変異導入法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異タンパク質を作製する方法や、部位特異的突然変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｇｅｎｅ　１５２，２７１−２７５（１９９５）他）等が挙げられる。また、文献「細胞工学別冊　新細胞工学実験プロトコール　秀潤社　２４１−２４８　（１９９３）」に記載の方法、さらには、市販のキット（例えば、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ　Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ　ストラタジーン社製）を利用する方法も可能である。
【００２７】
この中でも、アミノ酸置換には、特にＰＣＲ法を用いて変異を導入する方法が好ましい。これは具体的に説明すると、置換したいＣｙｓ残基をコードする塩基配列部分に、変異を導入したプライマーをハイブリダイズさせてＰＣＲ法によって増幅させる方法である。これにより、Ｃｙｓ残基が他のアミノ酸に置換されたＬタンパク質をコードする遺伝子を増幅することができる。この遺伝子を上述したように、真核生物等を用いて発現させることで、Ｃｙｓ残基が置換されたタンパク質からなる中空ナノ粒子を作成することができる。
【００２８】
また、本発明のタンパク質中空ナノ粒子では、以上のような方法によって得られた粒子表面のレセプターを任意の生体認識分子に改変することにより、肝細胞以外にも、任意の細胞及び組織に極めて高い特異性で物質を運搬、導入することが可能となる。
【００２９】
もちろん、粒子形成能を有するタンパク質は、上記のＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質に限られるものではなく、粒子を形成することができるタンパク質であれば、どのようなものでもよく、動物細胞、植物細胞、ウィルス、菌類等に由来する天然タンパク質や、種々の合成タンパク質等が考慮される。また、例えばウィルス由来の抗原タンパク質等が生体内において抗体を惹起する可能性がある場合などは、改変して抗原性を減少させたものを粒子形成能を有するタンパク質として用いてもよい。例えば、粒子形成能を有するタンパク質としては、国際出願ＷＯ０１／６４９３０に開示される抗原性を減少させたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質であってもよいし、同国際出願に開示されるその他の改変型タンパク質（Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を、遺伝子操作技術を用いて改変したタンパク質）であってもよい。また、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質や同タンパク質を改変した改変型タンパク質に、さらに増殖因子や抗体などの他のタンパク質を付加したものを、粒子形成能を有するタンパク質として用いてもよい。
【００３０】
粒子形成能を有するタンパク質に導入される生体認識分子（粒子形成能を有するタンパク質に生体認識分子が含まれる場合と、粒子形成能を有するタンパク質に生体認識分子を融合（または直接間接に結合）させる場合とを両方含む）としては、例えば成長因子、サイトカイン等の細胞機能調節分子、細胞表面抗原、組織特異的抗原、レセプターなどの細胞および組織を識別するための分子、ウィルスおよび微生物に由来する分子、抗体、糖鎖、脂質などが好ましく用いられる。具体的には、癌細胞に特異的に現れるＥＧＦ受容体やＩＬ−２受容体に対する抗体やＥＧＦ、またＨＢＶの提示するレセプターも含まれる。これらは、目的とする細胞、あるいは組織に応じて適宜選択される。なお、ここで「生体認識分子」とは、特定の細胞を認識する分子（換言すれば、特定の細胞に対する認識能を本発明の中空ナノ粒子に付与する分子）のことをいう。
【００３１】
以上のように作製された本発明の中空ナノ粒子は、特定の細胞に対して特異的に細胞導入物質を送り込むものとして有用である。例えば、本発明の中空ナノ粒子として、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質からなる粒子を用い、これに細胞導入物質を包含した薬剤を静脈注射などによって体内に投与すれば、当該粒子は体内を循環し、粒子表面に提示した肝細胞特異的レセプターにより肝細胞に導かれ、感染する。そして、細胞導入物質が肝細胞中に送り込まれ、細胞導入物質の肝臓組織特異的な導入が行われる。
【００３２】
このタンパク質中空ナノ粒子に内包される細胞導入物質としては、例えばＤＮＡ、ＲＮＡなどの遺伝子、天然あるいは合成タンパク質、オリゴヌクレオチド、ぺプチド、薬剤、天然あるいは合成化合物など、どのようなものであってもよい。
【００３３】
これらの細胞導入物質を上記の中空ナノ粒子に封入する方法としては、通常の化学的、分子生物学的実験手法で用いられる様々な方法が適用される。たとえば、エレクトロポレーション法、超音波法、単純拡散法、あるいは電荷を有する脂質を用いる方法等が好ましく例示される。また、細胞導入物質としてタンパク質を用いる場合は、粒子形成能を有するタンパク質に細胞導入物質を融合させて粒子形成する方法もある。粒子形成能を有するタンパク質に細胞導入物質を融合させる方法とは、例えば、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質をコードする遺伝子と、その下流側に上記タンパク質薬剤をコードする遺伝子とが挿入されたプラスミドを作製し、このプラスミドを用いて真核細胞に粒子を形成させることによって、粒子を形成するＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質にタンパク質薬剤が融合した薬剤を製造する方法である。
【００３４】
なお、薬剤の投与方法としては、静脈注射による投与のほかに、経口投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与等が挙げられる。
【００３５】
このように、本発明の薬剤を用いれば、ｉｎ　ｖｉｖｏあるいはｉｎ　ｖｉｔｒｏで細胞、または組織に特異的に物質を導入することができ、特定細胞または組織に物質を導入することを各種疾患の治療法あるいは治療法の１ステップとして行うことも可能になるのである。
【００３６】
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【００３７】
【実施例】
以下の実施例において、ＨＢｓＡｇとは、ＨＢＶの外被タンパク質であるＢ型肝炎ウィルス表面抗原（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ　ｓｕｒｆａｃｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ）を示す。ＨＢｓＡｇは、図２に示すように２２６個のアミノ酸から構成されるＳタンパク質を含んでいる。Ｓタンパク質のＮ末端側に５５アミノ酸（ｐｒｅ−Ｓ２　ｐｅｐｔｉｄｅ）が付加したものがＭタンパク質、Ｍタンパク質のＮ末端側に、１０８もしくは１１９アミノ酸（ｐｒｅ−Ｓ１　ｐｅｐｔｉｄｅ）が付加したものがＬタンパク質である。
【００３８】
ＨＢｓＡｇ　Ｌタンパク質の上記Ｐｒｅ−Ｓ領域（ｐｒｅ−Ｓ１，　ｐｒｅ−Ｓ２）は、ＨＢＶが肝細胞に結合する際に、それぞれ重要な役割を担うことが知られている。Ｐｒｅ−Ｓ１は、肝細胞に直接結合する部位を持ち、ｐｒｅ−Ｓ２は、血中の重合アルブミンを介して肝細胞に結合する重合アルブミンレセプターを有するのである。
【００３９】
真核細胞でＨＢｓＡｇを発現させると、同タンパク質は、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積される。ＨＢｓＡｇのＬタンパク質は、分子間で凝集を起こし、小胞体膜を取り込みながら、出芽様式でルーメン側に粒子として放出される。
【００４０】
以下の実施例では、ＨＢｓＡｇのＬタンパク質を用いた。
【００４１】
（実施例１）Ｃｙｓ残基が置換されたＨＢｓＡｇ　Ｌタンパク質をコードする遺伝子プラスミドの作成
発明者らによって報告されたＪ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　Ｖｏｌ．３３：，　Ｎｏ．２，　１５７−１７４，　１９９４記載の方法に基づいて、ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴに組み込まれたＨＢｓＡｇＬタンパク質をコードする遺伝子断片を、動物細胞発現用プラスミドｐＴＢ１４５５のＳＲα’プロモーターの下流に組み込んで、ｐＢＯ４４２プラスミドを得た。ＨＢｓＡｇ　Ｌタンパク質の塩基配列は配列番号１に示され、アミノ酸配列は配列番号２に示されている。得られたｐＢＯ４４２プラスミドにより、ＤＮＡをメチル化する大腸菌Ｋ１２株（ＤＨ　５αまたはＸＬ−１　Ｂｌｕｅ）を形質転換し、メチル化されたｐＢＯ４４２プラスミドを精製した。
【００４２】
ｐＢＯ４４２プラスミドのＨＢｓＡｇ　Ｌタンパク質をコードする領域において、Ｃｙｓ残基をコードする塩基配列を、Ａｌａ残基もしくはＳｅｒ残基をコードする塩基配列に改変するために、ｐＢＯ４４２プラスミドを鋳型としてＰＣＲ法を用いた部位特異的突然変異導入法により変異を導入した。以下に図３を用いて４８番目のＣｙｓ残基がＳｅｒ残基に置換されたＨＢｓＡｇ　Ｌタンパク質遺伝子プラスミドの作成方法を例に挙げて詳細に説明する。
【００４３】
鋳型プラスミドとしてのｐＢＯ４４２プラスミドは図３に示すように、ＳＲα’プロモーターとその下流にＨＢｓＡｇ　Ｌタンパク質をコードする領域を有している。このプラスミドにおけるＨＢｓＡｇ　Ｌタンパク質の４８番目のＣｙｓ残基をコードするコドン（ｔｇｔ）を含む領域に、変異を導入した合成オリゴヌクレオチド（プライマー）をハイブリダイズさせて、当該プラスミドを鋳型としてＰＣＲ反応により、鎖を伸長させた。ここで、変異を導入したプライマーは、鋳型の４８番目のＣｙｓ残基のコドンとミスマッチ（鋳型がｔｇｔ、プライマーがａｇａ）となるように設計した。これによって、４８番目のＣｙｓコドン（ｔｇｔ）がＳｅｒコドン（ｔｃｔ）に置換されたプラスミドを増幅することができる。
【００４４】
表１に、以上と同様の方法で、１４個の各Ｃｙｓ残基を１つ置換することができるミスマッチプライマーセット（１〜１４行目）、および近隣の２つまたは３つのＣｙｓ残基を同時に置換するミスマッチプライマーセット（１５〜１７行目）の塩基配列を示す。置換位置は置換されるＣｙｓ残基の位置（Ｓタンパク質アミノ酸のＮ末端から数えた数）を示し、対応するプライマー（センス側とアンチセンス側との一組）のサイズと配列、およびＰＣＲ反応におけるアニーリング温度を示した。置換位置の表記は、「Ｃ／４８／Ｓ」が４８番目のＣｙｓ残基をＳｅｒ残基に置換させることを意味し、「Ｃ／７６／Ａ」が７６番目のＣｙｓ残基をＡｌａ残基に置換させることを意味するものとする。
【００４５】
【表１】
2004081210.tif 000002
【００４６】
また、これら１７組３４個のプライマーの塩基配列は、表１の順番どおりに配列番号３〜３６に示されている。すなわち、配列番号１および２には４８番目のＣｙｓ残基を１つ置換するプライマーセットの塩基配列が示され、以下同様に、配列番号３および４が６５番目、配列番号５および６が６９番目、配列番号７および８が７６番目、配列番号９および１０が９０番目、配列番号１１および１２が１０７番目、配列番号１３および１４が１２１番目、配列番号１５および１６が１２４番目、配列番号１７および１８が１３７番目、配列番号１９および２０が１３８番目、配列番号２１および２２が１３９番目、配列番号２３および２４が１４７番目、配列番号２５および２６が１４９番目、配列番号２７および２８が２２１番目のＣｙｓ残基を１つ置換するプライマーセットの塩基配列を示している。そして、配列番号２９および３０が１４７，１４９番目、配列番号３１および３２が１３８，１３９番目のＣｙｓ残基、配列番号３３および３４が１３７，１３８，１３９番目のＣｙｓ残基を置換するプライマーセットの塩基配列を示している。
【００４７】
ＰＣＲ反応は、５０μｌ中に鋳型ＤＮＡ　５０ｎｍｏｌ、合成ＤＮＡプライマー（変異導入プライマー）各１５ｐｍｏｌ、ｄＡＴＰ　４０ｎｍｏｌ，　ｄＣＴＰ　４０ｎｍｏｌ，　ｄＧＴＰ　４０ｎｍｏｌ，　ｄＴＴＰ　４０ｎｍｏｌ，　Ｐｆｕｔｕｒｂｏ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　２．５単位、１０　ｍＭ　ＫＣｌ、１０　ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ　８．７５）、２　ｍＭ　ＭｇＳＯ４、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）　Ｘ−１００，　１００　μｇ／ｍｌ　ＢＳＡ中で、９５℃３０秒加熱後、９５℃３０秒、アニーリング１分、６８℃２０分の反応を１８サイクル行なった。アニーリングの温度はプライマーにより異なり、表１に記載したとおりとした。
【００４８】
反応終了後、メチル化されたＤＮＡを消化する制限酵素ＤｐｎＩ（１０，０００　単位／ｍＬ）を１μｌ加えて３７℃で１時間処理した。鋳型として用いた、Ｃｙｓ残基が置換されていないプラスミドＤＮＡは、上記したようにＤＮＡをメチル化する大腸菌を形質転換して得ているので、鋳型ＤＮＡはメチル化されている。一方、Ｃｙｓ残基が置換されたものはメチル化されていない。したがって、制限酵素ＤｐｎＩ処理により、鋳型ＤＮＡのみが消化される。残ったＤＮＡ、即ちＣｙｓ残基が置換されたＬタンパク質ＤＮＡにより大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅを形質転換し、得られたコロニーからプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡは、制限酵素地図および塩基配列により、目的の変異が導入されていることを確認した。
【００４９】
また、以上のようにして作成したＣｙｓ残基置換型Ｌタンパク質プラスミドを鋳型として再度他のミスマッチプライマーによってＰＣＲ反応を行うことにより、さらに多くのＣｙｓ残基を置換したＬタンパク質遺伝子プラスミドを作成した。
【００５０】
このようにして、１〜９個のＣｙｓ残基が改変された、２７個のプラスミドを作成した。２７個のプラスミド番号（Ｎｏ．）および名前（ＰＢＯ＊＊＊）、その発現タンパク質における置換位置を表２に示した。また、図４にＨＢｓＡｇＬタンパク質の１次構造を直線で示し、Ｓタンパク質におけるシステインの位置（矢印）と、各プラスミドの遺伝子がコードするＳタンパク質のアミノ酸置換位置（Ｓ（セリン）またはＡ（アラニン）が示す位置）を図示した模式図を示した。
【００５１】
【表２】
2004081210.tif 000003
【００５２】
（実施例２）変異導入ＨＢｓＡｇ粒子のＣＯＳ７細胞による発現と検出
（１）変異導入ＨＢｓＡｇ粒子のＣＯＳ７細胞による発現
サル腎由来細胞株ＣＯＳ７をウシ胎児血清（ＦＢＳ）５％を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で３７℃，５％ＣＯ２下で培養し、Ｔ−７５フラスコ（ファルコン社製）１枚あたり４ｘ１０６個の細胞を得た。一方、ＲＰＭＩ１６４０培地１０Ｍｌにグルコース１８．５ｍｇを加え、さらにこの溶液１Ｍｌに２μｌの５０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を加えた溶液を用意した。この溶液０．３Ｍｌに上記の４ｘ１０６個のＣＯＳ７細胞と実施例１で得られたプラスミドＤＮＡ５μｇを懸濁し、エレクトロポレーションキュベット（電極間距離４ｍｍ）に移した後、エレクトロポレーター（バイオラッド社製）を用いて９５０μＦ、０．３ｋＶの条件で遺伝子導入を行なった。キュベット中の細胞を６０ｍｍディッシュ（ファルコン社製）へ移し、５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ６Ｍｌ中にて３７℃，５％ＣＯ２の条件下で１４から１５時間培養を行なった後、培地を６Ｍｌの無血清培地ＣＨＯ−ＳＦＭ　ＩＩ　（インビトロジェン社製）に交換し、さらに４日間培養を継続して培地を回収した。
（２）変異導入ＨＢｓＡｇ粒子の抗原性による検出
回収した培地９０μｌに１％ＦＢＳを含むダルベッコリン酸緩衝液（ＰＢＳ）９０μｌを加えて、ＩＭＸ　ＨＢｓＡｇアッセイシステム（ダイナボット社製）により抗原性を検出した。ここで、抗原性を有している場合、ＨＢｓＡｇ粒子が形成されたと判断し、これにより培養液中に変異型ＨＢｓＡｇ粒子の存在を確認した。図５にプラスミド番号１〜２５のプラスミドにより変異を導入された２５個の変異型ＨＢｓＡｇの発現を検出した結果を示した。抗原性は野生型を１００とした場合の相対値で示しており、プラスミドによる形質転換を行わず、粒子形成が行われていない培養液を検出した結果を陰性対照（ネガティブ）とした。なお、３回以上行なった実験に関しては偏差値をバーで示してある。
【００５３】
１４個の各Ｃｙｓ残基を１箇所置換した結果（１〜１４行目）によると、膜貫通領域に存在するＣｙｓ残基を置換したものが良好な抗原性を有していた。特に、７６，９０，１４９，２２１番目を置換したものが野生型と同等かそれ以上の抗原性を有していた。また、粒子外部に存在するＣｙｓ残基でもＣ末端に近い部位を置換したものは、良好な抗原性が保たれていた。特に、１３９，１４７番目を置換したものが野生型と同等かそれ以上の抗原性を有していた。以上の特に抗原性が良好なＣｙｓ残基置換位置をさらに組み合わせた、２〜９個のＣｙｓ残基を置換したＨＢｓＡｇＬタンパク質を作成した（１５〜２５行目）。これについては、すべて野生型と同等かそれ以上の抗原性を有していた。
（３）変異導入ＨＢｓＡｇ粒子のウェスタンブロッティングによる検出
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）とウェスタンブロット法（Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を用いて、変異型粒子分子量および二量体化した粒子の有無を検討した。
【００５４】
詳しくは、回収した培地１８０μｌにＩＭＸ　ＨＢｓＡｇアッセイシステムの抗ＨＢｓマウスモノクローナル抗体固定化マイクロパーティクルを６０μｌ加えて、ゆっくりチューブを回転させながら１晩、４℃においた。３分間卓上型高速遠心機を用いてマイクロパーティクルと共に培地中の粒子を沈降させ、得られた沈澱を０．５ＭｌのＴＢＳＴ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５，　　１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，　０．１　Ｔｗｅｅｎ２０）を加えて懸濁し、さらに遠心を行なって沈澱を回収する洗浄操作を５回くり返した。
【００５５】
この沈澱を２等分して、１つは還元条件下、もう１つは非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。還元条件下とは、上記沈殿をメルカプトエタノールを加えて９５℃、５分間処理してからＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったもので、システイン残基同士のジスルフィド結合は防がれ、タンパク質がポリマー化されていない状態で検出される。一方、非還元条件とはメルカプトエタノールを加えず熱処理もしない沈殿でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったもので、タンパク質はポリマー化された状態で検出される。得られた電気泳動ゲルを１次抗体にＩＭＸ　ＨＢｓＡｇアッセイシステムの抗ＨＢｓヤギ抗体・ビオチン結合体、２次抗体にアルカリホスファターゼ標識抗ビオチンウサギ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行なった（図６（ａ）〜（ｈ））。（ａ）〜（ｄ）は還元条件での結果を、（ｅ）〜（ｈ）は非還元条件での結果を示し、レーン上の数字はＣｙｓ置換位置を示している。これによれば、すべての変異導入ＨＢｓＡｇ粒子において、還元条件では５３ｋＤａ付近にバンドが見られ、非還元条件においては１００ｋＤａ付近にバンドが見られた。よって、変異型ＨＢｓＡｇが５３ｋＤａの分子量を持ち、粒子形成時には２量体で存在していることが確認された。ＨＢｓＡｇが２量体で存在することは、粒子形成能と相関すると考えられる。
【００５６】
（実施例３）変異導入ＨＢｓＡｇ粒子を用いたＨｅｐＧ２細胞への遺伝子導入ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴに組み込まれたＨＢｓＡｇ　Ｌタンパク質をコードする遺伝子断片を、実施例１で作成された変異型ＨＢｓＡｇ遺伝子と入れ換えて、酵母での発現のための変異型ＨＢｓＡｇ遺伝子プラスミドを作成した。この変異型ＨＢｓＡｇ遺伝子プラスミドの酵母による発現（粒子作成方法）は国際出願ＷＯ０１／６４９３０に開示される方法に従った。
【００５７】
以下に、得られた変異型ＨＢｓＡｇ粒子を用いて、ＧＦＰ遺伝子をヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２に導入する方法を説明する。
【００５８】
まず、３．５ｃｍガラス底皿シャーレにヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２を１×１０５　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように植菌し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で１０％ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭを用いて一晩培養し、指数増殖期となるようにした。変異導入型ＨＢｓＡｇ粒子は、緑色蛍光タンパク質発現プラスミド（ＧＦＰ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＴＢ７０１−ｈＧＦＰ）と混合して、間隔４ｍｍのキュベットを使用して、１１０Ｖ、９５０μＦの条件でエレクトロポレーションを行なうことで、ＧＦＰ発現プラスミドを封入された。ＧＦＰ発現プラスミドを包含するＨＢｓＡｇ粒子をＨｅｐＧ２培養液へ混合し、３７℃、５％ＣＯ２存在下でＤ−ＭＥＭを用いて４日間培養した後、ＨｅｐＧ２内でのＧＦＰの発現の様子を共焦点レーザー蛍光顕微鏡にて観察した（図７（ａ））。比較例として、野生型ＨＢｓＡｇ粒子についても、同様の方法でほぼ同数のＨｅｐＧ２細胞が培養されたシャーレに、等量のＧＦＰ遺伝子プラスミドを包含させた粒子を等量ＨｅｐＧ２培養液に混合し、３７℃、５％ＣＯ２存在下でＤ−ＭＥＭを用いて４日間培養した後、ＨｅｐＧ２内でのＧＦＰの発現の様子を共焦点レーザー蛍光顕微鏡にて観察した（図７（ｂ））。
【００５９】
図７によると、変異導入型ＨＢｓＡｇによる物質導入を行った方が蛍光を発する細胞が多く、つまり、ＨＢｓＡｇ粒子を形成するタンパク質に変異を導入することで、細胞に遺伝子を導入する効率が向上したと言える。
【００６０】
以上より、この発明のＣｙｓ残基を置換したＨＢｓＡｇ粒子を用いて、培養細胞レベルで、ヒト肝細胞に対してより高い効率で特異的に遺伝子を導入できることが示された。
【００６１】
（実施例４）Ｃｙｓ残基７個および８個を変異させた変異型ＨＢｓＡｇ遺伝子による、変異型ＨＢｓＡｇ粒子を用いたＨｅｐＧ２細胞への遺伝子導入
さらに、変異型ＨＢｓＡｇ遺伝子のうち、７個、または８個のシステインを置換したものを使用して、ＨｅｐＧ２細胞への遺伝子導入を試みた。変異型ＨＢｓＡｇ遺伝子としては、野生型のＨＢｓＡｇ遺伝子のうち、７６，９０，１４９，２２１番目のＣｙｓ残基をＡｌａ残基に置換し、１３８，１３９，１４７番目のＣｙｓ残基をＳｅｒ残基に置換したプラスミドｐＢＯ　５３９と、７６，９０，１４９，２２１番目のＣｙｓ残基をＡｌａ残基に置換し、１３７，１３９，１４７番目のＣｙｓ残基をＳｅｒ残基に置換したプラスミドｐＢＯ　５５２と、７６，９０，１４９，２２１番目のＣｙｓ残基をＡｌａ残基に置換し、１３７，１３８，１３９，１４７番目のＣｙｓ残基をＳｅｒ残基に置換したプラスミドｐＢＯ　５４０とを使用した（表３）。なお、それぞれプラスミドｐＢＯ　５３９、ｐＢＯ　５５２　、ｐＢＯ　５４０から生成されるＨＢｓＡｇ粒子は、それぞれＢＮＰ−Ｌｍ７ａ、ＢＮＰ−Ｌｍ７ｂ、ＢＮＰ−Ｌｍ８と称する。
【００６２】
【表３】
2004081210.tif 000004
【００６３】
（１）変異型ＨＢｓＡｇ粒子の作製
変異型ＨＢｓＡｇ粒子を得るために、エレクトロポレーション法でＣＯＳ７細胞に変異型ＨＢｓＡｇ粒子発現ベクターＤＮＡを導入し、４日間培養後、細胞培養上清を集め、遠心濾過濃縮し、粒子を回収した。実験操作を以下に詳しく説明する。
【００６４】
まず、サンプル数に合わせて、５％ＦＣＳ−ＭＥＭ培地でＣＯＳ７細胞を培養しておき、８０％コンフルエントに達した細胞を用意する。培地を新しいものに交換し、６〜８時間後にトリプシン処理して細胞を集め血球計算盤で計算した。計数後、１．５ｍｌチューブ１本につき細胞が４×１０６個になるように分注し遠心した。遠心条件は、３０秒、１２０００ｒｐｍである。遠心後、上清を吸引除去し、エレクトロポレーション溶液（Ｅｐｍｅｄｉｕｍ：ＲＰＭＩ−１６４０＋１０ｍＭ　グルコース＋０．１ｍＭ　ＤＤＴ）を３００μｌ加え細胞を懸濁した。
【００６５】
この細胞懸濁液に上述した表３のプラスミドＤＮＡｐＢＯ　５３９　、ｐＢＯ　５５２　、あるいはｐＢＯ　５４０を５μｇを加え、氷上であらかじめ冷やしておいたキュベット（４ｍｍギャップ）に移した。これに０．３ＫＶ、９５０μＦの条件で電圧を印加（エレクトロポレーション）後、すぐに氷冷した。そして、キュベット内の細胞を８ｍｌの培地に再懸濁し、６ｃｍシャーレ２枚に二等分して播種した。
【００６６】
３７℃で１４〜１５時間培養した後、培地を６ｃｍシャーレ一枚につきＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ（ＧＩＢＣＯ）３ｍｌに交換し、さらに４日間培養した。４日後、細胞と培養上清を別々に回収し、細胞は−２０℃で保存し、培養上清は４℃で保存した。それぞれのプラスミドＤＮＡについて４回ずつエレクトロポレーションを行った。
【００６７】
（２）ＩＭｘＨＢｓＡｇアッセイシステムによる粒子濃度の測定
上記培養上清を用いて以下のＩＭｘによる解析を行った。
【００６８】
ＩＭｘＨＢｓＡｇアッセイシステム（ダイナボット社）は、サンドイッチ法を利用したＥＩＡにより培養上清中のＨＢｓ抗原を検出する全自動イムノアッセイシステムである。これを用いて培養上清中に検出された抗原性は「ＲＡＴＥ値」として表現されるが、必要に応じてシステムに添付されている標準ＨＢｓＡｇ（ヒト血清由来ＨＢｓＡｇ粒子）が示す抗原性と比較して、発現した粒子濃度をＨＢｓＡｇ当量に換算した。測定試料は、培養上清９０μｌと１％牛胎児血清含有ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（希釈液）９０μｌを混合したものを使用した。測定する時は、常にポジティブコントロール（すなわち、標準ＨＢｓＡｇ）と、ネガティブコントロール（すなわち、希釈液のみ）と、をセットし、検量線を作成してＨＢｓＡｇ当量を算出した。また、野生型ＨＢｓＡｇ遺伝子ベクター（ｐＢＯ４１１）を導入したＣＯＳ７細胞の培養液上清とも比較した。その結果を表４に示す。
【００６９】
【表４】
2004081210.tif 000005
【００７０】
この結果より、粒子の標準ＨＢｓＡｇ当量（ＲＡＴＥ値）がＢＮＰ−Ｌｍ７ａで１５．７、ＢＮＰ−Ｌｍ７ｂで１５．４、ＢＮＰ−Ｌｍ８で１０．６と、ネガティブコントロールと比べて高い値を示しており、全ての変異導入ＨＢｓＡｇ蛋白質が、培養上清へ分泌発現されていることが確認されたと言える。
【００７１】
（３）遠心限外濾過濃縮法による濃縮
しかし、このＩＭｘＨＢｓＡｇアッセイシステムら求めたシステイン置換型の粒子濃度は低く、粒子発現量が少量であるため、使用の際には濃縮する必要があると考えられる。そこで、以下に示す遠心限外濾過濃縮を行った。
【００７２】
培養上清１６ｍｌを遠心濾過濃縮用デバイス（Ｖｉｖａ　ｓｐｉｎ　１，０００，０００ＭＷＣＯ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）に移し、３５００ｒｐｍ、４５分、４℃の遠心条件で液量が８００μｌになるまで濃縮した。８００μｌのうち９０μｌ分を用いてＩＭｘでＨＢｓＡｇ当量を測定し、検量線から算出された抗原量をもとに回収率を計算したところ、回収率は４０％前後であった。
【００７３】
（４）Ｌ，Ｓ共発現粒子のＩＭｘによるＳ抗原性の測定
５％ＦＣＳ−ＭＥＭ培地でＣＯＳ７細胞を培養しておき、８０％コンフルエントに達した細胞を用意する。培地を新しいものに交換し、６〜８時間後にトリプシン処理して細胞を集め、１．５ｍｌチューブ１本につき細胞が４×１０６個になるように分注し遠心した。遠心条件は、３０秒、１２０００ｒｐｍである。遠心後、上清を吸引除去し、エレクトロポレーション溶液（Ｅｐ　ｍｅｄｉｕｍ：ＲＰＭＩ−１６４０＋１０ｍＭ　グルコース＋０．１ｍＭ　ＤＤＴ）を３００μｌ加え細胞を懸濁した。
【００７４】
この細胞懸濁液に野生型のＬ粒子（ＨＢｓＡｇＬタンパク質からなる粒子）発現用プラスミドＤＮＡ（ｐＢＯ４４１）あるいはシステイン改変型のＬ粒子発現用プラスミドＤＮＡ５μｇ　と野生型Ｓ粒子（ＨＢｓＡｇＳタンパク質からなる粒子）発現用プラスミドＤＮＡ（ｐＢＯ６０３）あるいはシステイン改変型のＳ粒子発現用プラスミドＤＮＡ１μｇとを同時に加え、キュベット（４ｍｍギャップ）に移した。これに０．３ＫＶ、９５０μＦの条件で電圧を印加（エレクトロポレーション）後、すぐに氷冷した。そして、キュベット内の細胞を８ｍｌの培地に再懸濁し、６ｃｍシャーレ２枚に二等分して播種した。
【００７５】
３７℃で１４〜１５時間培養した後、培地を６ｃｍシャーレ一枚につきＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ（ＧＩＢＣＯ）３ｍｌに交換し、さらに４日間培養した。４日後、細胞と培養上清を別々に回収し、細胞は−２０℃で保存し、培養上清は４℃で保存した。培養上清の粒子濃度（ＨＢｓＡｇ当量）をＩＭｘＨＢｓＡｇアッセイシステムを用いて測定した。
【００７６】
【表５】
2004081210.tif 000006
【００７７】
この結果より、粒子のＨＢｓＡｇ当量（ＲＡＴＥ値）が、ＢＮＰ−Ｌｍ７ｂで５８．０、ＢＮＰ−Ｌｍ８で４７．６であり、変異導入ＨＢｓＡｇ粒子において（２）の実験より飛躍的に高い粒子濃度（ＨＢｓＡｇ当量）を示した。
【００７８】
（５）変異型ＨＢｓＡｇ粒子へのＤＮＡ導入
（３）で得た、濃縮した変異型ＨＢｓＡｇ粒子（ＢＮＰ−Ｌｍ８）と、ＧＦＰ発現ベクターＤＮＡ５００ｎｇとを加え、すべてについて全量を５００μｌに調整した。エレクトロポレ−ション用４ｍｍギャップキュベット中、５０Ｖ、７５０μＦでエレクトロポレーションし、５分間室温で放置した。これにより、ＧＦＰ発現ベクターＤＮＡが封入された変異導入ＨＢｓＡｇ粒子が作製された。
【００７９】
（６）ＧＦＰ発現ベクターＤＮＡを封入したＬ粒子によるＨｅｐＧ２細胞への遺伝子導入
６ｃｍシャーレ１枚分のＨｅｐＧ２細胞をトリプシン処理して細胞を集め、血球計算盤で計数した。細胞数を確認し、８ｗｅｌｌチャンバースライドに９０００個／ｗｅｌｌとなるように分注し、３７℃で一晩培養した。このＨｅｐＧ２細胞に、（５）のＧＦＰ発現ベクターＤＮＡを封入した変異型ＨＢｓＡｇ粒子（ＧＦＰ−ＢＮＰ−Ｌｍ８）、およびＧＦＰ発現ベクターＤＮＡを封入した野生型ＨＢｓＡｇ粒子を添加した。また、ポジティブコントロールとしてＨｅｐＧ２細胞にＧＦＰ発現ベクターＤＮＡとＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社）との複合体を添加したもの、ネガティブコントロールとして粒子もベクターも含まないエレクトロポレーション用緩衝液のみ、あるいはＧＦＰ発現ベクターＤＮＡのみを添加したものを用意した。３日後、共焦点顕微鏡で細胞の蛍光を観察した。なお、ＧＦＰ発現ベクターＤＮＡを封入したＨＢｓＡｇ粒子は、種々の割合のＧＦＰ発現ベクターを内包したものを作製した。
【００８０】
図８は、その共焦点顕微鏡図を示し、各図面の上の写真が透過像であり、下の写真が蛍光像である。（ａ）はポジティブコントロール、（ｂ）は粒子もベクターも含まないエレクトロポレーション用緩衝液のみのネガティブコントロール（ｃ）はＧＦＰ発現ベクターＤＮＡのみのネガティブコントロール、（ｄ）は野生型ＨＢｓＡｇ粒子（ＨＢｓＡｇ粒子（６９ｎｇ）＋ＧＦＰ発現ベクターＤＮＡ（２００ｎｇ）を添加したもの、（ｅ）はＧＦＰ−ＢＮＰ−Ｌｍ８粒子（ＢＮＰ−Ｌｍ８（１２ｎｇ）＋ＧＦＰ発現ベクター（２００ｎｇ））を添加したもの、（ｆ）はＧＦＰ−ＢＮＰ−Ｌｍ８粒子（ＢＮＰ−Ｌｍ８（２４ｎｇ）＋ＧＦＰ発現ベクター（２００ｎｇ）を添加したものである。
【００８１】
また図９は、図８を拡大した図面である。なお、図９（ａ）が図８（ａ）を拡大したものであり、図９（ｂ）が図８（ｅ）を拡大したものであり、図９（ｃ）が図８（ｆ）を拡大したものである。
【００８２】
これによれば、ＧＦＰ発現ベクターを封入した野生型粒子よりもＧＦＰ−ＢＮＰ−Ｌｍ８粒子を添加した方が細胞にはるかに強い緑色蛍光が認められ、ＧＦＰ−ＢＮＰ−Ｌｍ８粒子を添加したものは、添加した粒子量が１０ｎｇと少量でも蛍光を観察することができた。また、実験を繰り返し、ＢＮＰ−Ｌｍ８粒子のＤＮＡ導入効率の再現性を確認した。
【００８３】
（７）ＢＮＰ−Ｌｍ８粒子の保存性
次に、回収直後の粒子の遺伝子導入能力が長期間保持されるのかを確認するために、粒子を回収した後１週間４℃で保存したあと、ＧＦＰ発現ベクターＤＮＡを導入し、ＨｅｐＧ２細胞の培地中に添加して、３日後共焦点顕微鏡で蛍光を観察した。結果を図１０に示す。各図面の左の写真が透過像であり、右の写真が蛍光像である。
【００８４】
図１０は、（ａ）がポジティブコントロール（ＧＦＰ発現ベクターＤＮＡ（２００ｎｇ）とＦｕＧｅｎｅ６（０．５μｌ）との複合体を添加したもの）、（ｂ）がネガティブコントロール（ＧＦＰ発現ベクターＤＮＡ２００ｎｇのみを添加したもの）、（ｃ）が回収直後の（左側の２つ）、または１週間後の（右側２つ）、野生型ＨＢｓＡｇ粒子にＧＦＰ発現ベクターを導入して（野生型ＨＢｓＡｇ（ＷＴ）６．４ｎｇ＋ＧＦＰ発現ベクター２００ｎｇ）添加したもの、（ｄ）は回収直後の（左側２つ）、または１週間後の（右側２つ）、ＢＮＰ−Ｌｍ８粒子にＧＦＰ発現ベクターを導入して、（ＢＮＰ−Ｌｍ８（６．４ｎｇ）＋ＧＦＰ発現ベクター（２００ｎｇ））添加したものである。
【００８５】
これによれば、１週間４℃で保存したＢＮＰ−Ｌｍ８粒子にＧＦＰ発現ベクターを導入したものを添加しても、細胞にＧＦＰ発現ベクターによる緑色の蛍光を確認することができ、ＧＦＰ発現ベクターを細胞内に良好に導入できた。つまり、ＢＮＰ−Ｌｍ８は良好な保存性を有していた。
【００８６】
（８）ＢＮＰ−Ｌｍ８の肝細胞特異的な遺伝子導入
また、同様の実験をＨｅｐＧ２細胞に対して行ったもの（図１１）と、ＨｅｐＧ２細胞の代わりにヒト大腸ガン由来細胞ＷｉｒＤｒを用いて行ったもの（図１２）とで比べた。ここで、図１１、図１２の各図面の左が位相差像であり、右が蛍光像である。また、（ａ）はポジティブコントロール（ＧＦＰ発現ベクターＤＮＡ（２００ｎｇ）とＦｕＧｅｎｅ６（０．５μｌ）との複合体を添加したもの）、（ｂ）はネガティブコントロール（ＧＦＰ発現ベクターＤＮＡのみを添加したもの）、（ｃ）はＧＦＰ発現ベクターを内包する野生型ＨＢｓＡｇ粒子（野生型ＨＢｓＡｇ（ＷＴ）１４ｎｇ＋ＧＦＰ発現ベクター２００ｎｇ）を添加したもの、（ｄ）はＧＦＰ発現ベクターを内包するＢＮＰ−Ｌｍ８粒子（ＢＮＰ−Ｌｍ８（５ｎｇ）＋ＧＦＰ発現ベクター（２００ｎｇ））を添加したものである。
【００８７】
これによれば、ＧＦＰ発現ベクターを内包する野生型ＨＢｓＡｇ粒子を添加したＨｅｐＧ２細胞、ＧＦＰ発現ベクターを内包するＢＮＰ−Ｌｍ８粒子を添加したＨｅｐＧ２細胞では、ＧＦＰ発現ベクターが導入されたが、ヒト大腸ガン由来細胞ＷｉｒＤｒには導入されなかった。したがって、ＢＮＰ−Ｌｍ８粒子でもヒト肝細胞特異的な遺伝子導入が行われることが分かった。
【００８８】
（９）ＢＮＰ−Ｌｍ８とＢＮＰ−Ｌｍ７ｂとの遺伝子導入効率
次に、ＧＦＰ−ＢＮＰ−Ｌｍ８とＧＦＰ−ＢＮＰ−Ｌｍ７ｂとにおけるＧＦＰの細胞への導入効率を調べるため、同様の実験をＧＦＰ−ＢＮＰ−Ｌｍ８を用いて行ったものと、ＧＦＰ−ＢＮＰ−Ｌｍ７ｂを用いて行ったものとで比べた（図１３）。ここで、図１３の（ａ）はポジティブコントロール（ＧＦＰ発現ベクターＤＮＡ（２００ｎｇ）とＦｕＧｅｎｅ６（０．５μｌ）との複合体を添加したもの）、（ｂ）はネガティブコントロール（ＧＦＰ発現ベクターＤＮＡのみを添加したもの）、（ｃ）はＧＦＰ発現ベクターＤＮＡを内包する野生型ＨＢｓＡｇ粒子（野生型ＨＢｓＡｇ（ＷＴ）３．２ｎｇ＋ＧＦＰ発現ベクターＤＮＡ２００ｎｇ）を添加したもの、（ｄ）はＧＦＰ発現ベクターＤＮＡを内包する野生型ＨＢｓＡｇ粒子（野生型ＨＢｓＡｇ（ＷＴ）６．４ｎｇ＋ＧＦＰ発現ベクターＤＮＡ２００ｎｇ）を添加したもの、（ｅ）はＧＦＰ発現ベクターＤＮＡを内包するＢＮＰ−Ｌｍ８粒子（ＢＮＰ−Ｌｍ８（３．２ｎｇ）＋ＧＦＰ発現ベクターＤＮＡ（２００ｎｇ）を添加したもの、（ｆ）はＧＦＰ発現ベクターＤＮＡを内包するＢＮＰ−Ｌｍ７ｂ粒子（ＢＮＰ−Ｌｍ８（６．４ｎｇ）＋ＧＦＰ発現ベクターＤＮＡ（２００ｎｇ）を添加したもの、（ｇ）はＧＦＰ発現ベクターＤＮＡを内包するＢＮＰ−Ｌｍ７ｂ粒子（ＢＮＰ−Ｌｍ８（３．２ｎｇ）＋ＧＦＰ発現ベクターＤＮＡ（２００ｎｇ）を添加したもの、（ｈ）はＧＦＰ発現ベクターＤＮＡを内包するＢＮＰ−Ｌｍ８粒子（ＢＮＰ−Ｌｍ８（６．４ｎｇ）＋ＧＦＰ発現ベクター（２００ｎｇ）を添加したものである。
【００８９】
これによれば、ＧＦＰ発現ベクターＤＮＡを内包するＢＮＰ−Ｌｍ７ｂ粒子の添加によっても細胞内に強い蛍光が観察されたが、ＧＦＰ発現ベクターＤＮＡを内包するＢＮＰ−Ｌｍ８粒子の添加で、より強い蛍光が観察された。
【００９０】
以上の結果をまとめると、システインを置換したＨＢｓＡｇ粒子、特に、ＢＮＰ−Ｌｍ８が、野生型ＨＢｓＡｇ粒子より蛍光が強く観察され、ヒト肝細胞、動物細胞等の細胞へのＤＮＡ導入効率あるいは粒子内包能が高いということが分かった。さらに、肝細胞特異性も保持されていた。また、７個のシステインを置換したＢＮＰ−Ｌｍ７ｂ粒子と、ＢＮＰ−Ｌｍ８とは、共に野生型粒子より蛍光が強く観察されたが、ＢＮＰ−Ｌｍ８の方がＢＮＰ−Ｌｍ７ｂ粒子より強い蛍光が観察された。つまり、粒子形成に不要と考えられるシステインを全て置換したＢＮＰ−Ｌｍ８は野生型粒子よりも細胞へのＤＮＡ導入効率が高い事がわかった。
【００９１】
【発明の効果】
本発明の中空ナノ粒子は、以上のように、物質を細胞特異的に運搬するという機能を保ちつつ、粒子構造を安定化し、さらに効率よく物質を細胞へ導入させることができるという効果を奏する。
【００９２】
このようにして作成した薬剤は、静脈注射などといった簡便な方法で、特定の細胞または組織に対して選択的かつ効率的に疾患治療用の細胞導入物質を送り込むことができるので、従来の遺伝子治療と大きく異なり、外科手術を必要とせず、副作用の心配も極めて低く、そのまま臨床応用可能なものである。
【００９３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る中空ナノ粒子を構成するＨＢｓＡｇＬタンパク質であって、Ｃｙｓ残基が置換される前の状態のタンパク質の概略模式図である。
【図２】本発明に係る中空ナノ粒子を構成するＨＢｓＡｇＳタンパク質であって、Ｃｙｓ残基が置換される前の状態のタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図３】本発明に係る中空ナノ粒子を構成するＨＢｓＡｇＬタンパク質をコードする遺伝子プラスミドの作成方法を示した図である。
【図４】本発明に係る中空ナノ粒子を構成するＨＢｓＡｇタンパク質の１次構造を直線で表した模式図であり、（ａ）はＣｙｓ残基を１箇所置換したＨＢｓＡｇタンパク質を、（ｂ）は２ヶ所以上置換したＨＢｓＡｇタンパク質を示している。
【図５】本発明に係る中空ナノ粒子の抗原性を野生型を１００として算出した相対値として示した図面である。
【図６】本発明に係るＨＢｓＡｇ粒子を還元条件（（ａ）〜（ｄ））、または非還元条件（（ｅ）〜（ｈ））でウェスタンブロッティングした電気泳動写真を示す図面である。
【図７】本発明に係るＨＢｓＡｇ粒子を用いてＨｅｐＧ２細胞へ遺伝子を導入した場合の導入効率を示す図面である。
【図８】本発明に係るＨＢｓＡｇ粒子であるＢＮＰ−Ｌｍ８を用いてＨｅｐＧ２細胞へ遺伝子を導入した場合の導入効率を示す図面である。
【図９】本発明に係るＨＢｓＡｇ粒子であるＢＮＰ−Ｌｍ８を用いてＨｅｐＧ２細胞へ遺伝子を導入した場合の導入効率を示す、図８を拡大した図面である。
【図１０】本発明に係るＨＢｓＡｇ粒子であるＢＮＰ−Ｌｍ８を１週間４℃で保存したものを用いてＨｅｐＧ２細胞へ遺伝子を導入した場合の導入効率を示す図面である。
【図１１】本発明に係るＨＢｓＡｇ粒子であるＢＮＰ−Ｌｍ８を用いてＨｅｐＧ２細胞へ遺伝子を導入した場合の導入効率を示す図面である。
【図１２】本発明に係るＨＢｓＡｇ粒子であるＢＮＰ−Ｌｍ８を用いてＷｉＤｒ細胞へ遺伝子を導入した場合の導入効率を示す図面である。
【図１３】本発明に係るＨＢｓＡｇ粒子であるＢＮＰ−Ｌｍ８と、ＢＮＰ−Ｌｍ７ｂと用いてＨｅｐＧ２細胞へ遺伝子を導入した場合の導入効率を比較した図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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