(57)【要約】　　　（修正有）【課題】耐熱性があり、常温環境下における活性が高い酵素であって、ＮＡＤを補酵素とするグルタミン酸脱水素酵素を得ること。【解決手段】下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質。（Ａ）特定の配列を有するタンパク質。（Ｂ）上記記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質。
（Ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において、先頭から１４４番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【請求項２】
下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において、先頭から１４４番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【請求項３】
下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質。
（Ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、先頭から２７番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【請求項４】
下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、先頭から２７番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【請求項５】
下記（Ｅ）又は（Ｆ）に示すタンパク質。
（Ｅ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｆ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、先頭から１４４番目と２７番目の２つのアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【請求項６】
下記（Ｅ）又は（Ｆ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｅ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｆ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、先頭から１４４番目と２７番目の２つのアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【請求項７】
請求項２、請求項４又は請求項６に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質が発現可能な形態で導入された微生物。
【請求項８】
請求項７に記載の微生物を培地で培養し、培養物中にグルタミン酸脱水素酵素を生成蓄積させ、該培養物よりグルタミン酸脱水素酵素を採取することを特徴とするグルタミン酸脱水素酵素の製造方法。
【請求項９】
グルタミン酸脱水素酵素ｙｗｅＢのアミノ酸残基を組み換えたグルタミン酸脱水素酵素であって、一対三組で六量体を形成する際に対を形成する相手方サブユニットのアミノ酸残基と水素結合するように、１若しくは数個のアミノ酸残基を組み換えて野生型ｙｗｅＢに比して耐熱性を備えたことを特徴とするグルタミン酸脱水素酵素。
【請求項１０】
配列番号２の先頭から１４４番目のアミノ酸残基をアルギニン残基に置換したことを特徴とする請求項９に記載のグルタミン酸脱水素酵素。
【請求項１１】
さらに、配列番号２の先頭から２７番目のアミノ酸残基をフェニルアラニン残基に置換したことを特徴とする請求項９又は１０に記載のグルタミン酸脱水素酵素。
【請求項１２】
請求項９、１０又は１１に記載のグルタミン酸脱水素酵素をコードするＤＮＡを含み、当該ＤＮＡによりコードされるグルタミン酸脱水素酵素が発現可能な形態で導入された微生物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の微生物を培地で培養し、培養物中にグルタミン酸脱水素酵素を生成蓄積させ、該培養物よりグルタミン酸脱水素酵素を採取することを特徴とするグルタミン酸脱水素酵素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グルタミン酸脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素をコードするＤＮＡ、グルタミン酸脱水素酵素が発現可能な形態で導入された微生物、および、グルタミン酸脱水素酵素の製造方法に関し、特に、耐熱性がありＮＡＤを補酵素とするグルタミン酸脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素をコードするＤＮＡ、グルタミン酸脱水素酵素が発現可能な形態で導入された微生物、および、グルタミン酸脱水素酵素の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−グルタミン酸（Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｃ　ａｃｉｄ）はタンパク質を構成するアミノ酸のうちの一つであり、生体内で極めて有用なアミノ酸である。実際に、グルタミン酸を含めて、アミノ酸はアミノ酸輸液などの医薬としても広く用いられている。
【０００３】
ここで、Ｌ−グルタミン酸と２−オキソグルタル酸（２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒｉｃ　ａｃｉｄ）との間に、グルタミン酸脱水素酵素（ＧｌｕＤＨ）とＧｌｕＤＨの補酵素（ＮＡＤ（Ｐ））とを介した次の反応が知られている。
【０００４】
【式１】
2004089097.tif 000002
なお、式１では、ＮＡＤ（Ｐ）を、ＮＡＤ（ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド）とＮＡＤＰ（ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドリン酸）をまとめた表現として示している。これは、ＧｌｕＤＨの補酵素要求性の違いによるものである。すなわち、ＧｌｕＤＨは３種類の型があり、第一に、ＮＡＤを特異的に要求する酵素で動物組織、植物、細菌に分布するもの（ＮＡＤ−ＧｌｕＤＨ：ＥＣ１．４．１．２）、第二に、ＮＡＤＰを特異的に要求する酵素で酵母、細菌に存在するもの（ＮＡＤＰ−ＧｌｕＤＨ：ＥＣ１．４．１．４）、第三に、ＮＡＤ，ＮＡＤＰのどちらも補酵素とすることができる酵素で動物の肝、腎などのミトコンドリアに局在するもの（ＮＡＤ（Ｐ）−ＧｌｕＤＨ：ＥＣ１．４．１．３）が知られている。
【０００５】
従来では、このようなグルタミン酸を含んだ反応系を触媒するＧｌｕＤＨとして、特開平６−３２７４７１「耐熱性グルタミン酸脱水素酵素及びその製造方法」に開示されるものが知られている。この公報では、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ　ＧｌｕＤＨが開示され、極めて高い耐熱性を備えることが報告されている。
【０００６】
同様に、グルタミン酸を含んだ反応系を触媒するＧｌｕＤＨとして、特開平６−３８７４４「新規な耐熱性グルタミン酸脱水素酵素及びその製造方法」に開示されるものが知られていた。この公報では、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ　ＧｌｕＤＨが開示され、こちらも極めて高い耐熱性を備えることが報告されている。
【０００７】
酵素が耐熱性を備えるということは、工業的な利便性が高いほか、保存性の観点からも好ましく定量試薬として用いるような場合でも操作性や取扱性に優れることを意味する。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
ここで、補酵素ＮＡＤとＮＡＤＰを比較すると、ＮＡＤがＮＡＤＰに比して１／３の価格で提供されるので、式１の反応を用いる系では、ＮＡＤを補酵素とするＧｌｕＤＨを用いることが好ましい。また、酵素は、一般に、長期間安定である（耐熱性がある）ことに加えて、加温や冷却が必要でないまたは僅かで済む温度領域、則ち、常温（１５℃〜４０℃）付近で高い活性をもつものが望まれる。
【０００９】
しかしながら、特開平６−３２７４１号公報に開示されるＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓは、生育温度が８８℃と極めて高温で、しかも嫌気環境を必要とするため、培養に特殊な装置が必要となり、大量に調製するのは困難であるという問題点があった。さらに、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ　ＧｌｕＤＨは、ＮＡＤＰ型であるという問題点もある。
【００１０】
一方、特開平６−３８７４４号公報に開示されるＢａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ　ＧｌｕＤＨはＮＡＤ型であるものの、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓの最適培養温度が５５℃であり、必ずしも簡便には培養できないという問題点があった。しかも、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ　ＧｌｕＤＨは、常温下での培養環境や試験環境で活性が低いという問題点があった。
【００１１】
本発明は上記に鑑みてなされたものであって、耐熱性があり、常温環境下における活性が高い酵素であって、ＮＡＤを補酵素とするグルタミン酸脱水素酵素、当該グルタミン酸脱水素酵素をコードするＤＮＡ、当該グルタミン酸脱水素酵素が発現可能な形態で導入された微生物、および、当該グルタミン酸脱水素酵素の製造方法を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記目的を達成するために鋭意検討を行った結果、定方向進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）に基づく戦略を用い、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ（バチルス　ズブチルス：枯草菌）由来のグルタミン酸脱水素酵素（ＧｌｕＤＨ）ｙｗｅＢの一部のアミノ酸残基を変異させることにより本発明を完成するに至った。なお、ｙｗｅＢはｒｏｃＧまたはｉｐａ−７５Ｄとも表現されるが、本願においてはｙｗｅＢと表記することとする。
【００１３】
すなわち本発明は以下のとおりである。
１．：
下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質。
（Ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において、先頭から１４４番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。ここで、先頭から１４４番目以外のアミノ酸を置換等するとは、配列番号３の先頭から数えて１４４番目に位置するアルギニンを据え置き、他のアミノ酸配列を置換等することを意味する。したがって、例えば欠失、付加により、このアルギニン残基の位置が１４４番目からシフトしたとしてもこのアルギニン残基は残存させておくことを意味する。
【００１４】
２．：
下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において、先頭から１４４番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。ここで、先頭から１４４番目以外のアミノ酸を置換等するとは、配列番号３の先頭から数えて１４４番目に位置するアルギニンを据え置き、他のアミノ酸配列を置換等することを意味する。したがって、例えば欠失、付加により、このアルギニン残基の位置が１４４番目からシフトしたとしてもこのアルギニン残基は残存させておくことを意味する。
【００１５】
３．：
下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質。
（Ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、先頭から２７番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。ここで、先頭から２７番目以外のアミノ酸を置換等するとは、配列番号４の先頭から数えて２７番目に位置するフェニルアラニンを据え置き、他のアミノ酸配列を置換等することを意味する。したがって、例えば欠失、付加により、このフェニルアラニン残基の位置が２７番目からシフトしたとしてもこのフェニルアラニン残基は残存させておくことを意味する。
【００１６】
４．：
下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、先頭から２７番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。ここで、先頭から２７番目以外のアミノ酸を置換等するとは、配列番号４の先頭から数えて２７番目に位置するフェニルアラニンを据え置き、他のアミノ酸配列を置換等することを意味する。したがって、例えば欠失、付加により、このフェニルアラニン残基の位置が２７番目からシフトしたとしてもこのフェニルアラニン残基は残存させておくことを意味する。
【００１７】
５．：
下記（Ｅ）又は（Ｆ）に示すタンパク質。
（Ｅ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｆ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、先頭から１４４番目と２７番目の２つのアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。ここで、先頭から１４４番目と２７番目の２つのアミノ酸以外のアミノ酸を置換等するとは、配列番号５の先頭から数えて１４４番目に位置するアルギニンと２７番目に位置するフェニルアラニンを共に据え置き、他のアミノ酸配列を置換等することを意味する。したがって、例えば欠失、付加により、このアルギニン残基とフェニルアラニン残基の位置がそれぞれ個別にシフトしたとしてもこのアルギニン残基とフェニルアラニン残基は残存させておくことを意味する。
【００１８】
６．：
下記（Ｅ）又は（Ｆ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｅ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｆ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、先頭から１４４番目と２７番目の２つのアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルタミン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。ここで、先頭から１４４番目と２７番目の２つのアミノ酸以外のアミノ酸を置換等するとは、配列番号５の先頭から数えて１４４番目に位置するアルギニンと２７番目に位置するフェニルアラニンを共に据え置き、他のアミノ酸配列を置換等することを意味する。したがって、例えば欠失、付加により、このアルギニン残基とフェニルアラニン残基の位置がそれぞれ個別にシフトしたとしてもこのアルギニン残基とフェニルアラニン残基は残存させておくことを意味する。
【００１９】
７．：
上記２．４．または６．に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質が発現可能な形態で導入された微生物。
【００２０】
８．：
上記７．に記載の微生物を培地で培養し、培養物中にグルタミン酸脱水素酵素を生成蓄積させ、該培養物よりグルタミン酸脱水素酵素を採取することを特徴とするグルタミン酸脱水素酵素の製造方法。
【００２１】
９．：
グルタミン酸脱水素酵素ｙｗｅＢのアミノ酸残基を組み換えたグルタミン酸脱水素酵素であって、一対三組で六量体を形成する際に対を形成する相手方サブユニットのアミノ酸残基と水素結合するように、１若しくは数個のアミノ酸残基を組み換えて野生型ｙｗｅＢに比して耐熱性を備えたことを特徴とするグルタミン酸脱水素酵素。ここで、組み換えるとは、アミノ酸配列の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位をいう。また、単にｙｗｅＢ又は野生型ｙｗｅＢと表現するときは、配列番号１又は２で表されるＧｌｕＤＨをいう。
【００２２】
１０．：
配列番号２の先頭から１４４番目のアミノ酸残基をアルギニン残基に置換したことを特徴とする上記９．に記載のグルタミン酸脱水素酵素。
【００２３】
１１．：
さらに、配列番号２の先頭から２７番目のアミノ酸残基をフェニルアラニン残基に置換したことを特徴とする上記９．又は１０．に記載のグルタミン酸脱水素酵素。
【００２４】
１２．：
上記９．１０．又は１１．に記載のグルタミン酸脱水素酵素をコードするＤＮＡを含み、当該ＤＮＡによりコードされるグルタミン酸脱水素酵素が発現可能な形態で導入された微生物。
【００２５】
１３．：
上記１２に記載の微生物を培地で培養し、培養物中にグルタミン酸脱水素酵素を生成蓄積させ、該培養物よりグルタミン酸脱水素酵素を採取することを特徴とするグルタミン酸脱水素酵素の製造方法。
【００２６】
なお、本発明では、耐熱性を有するとは、変異させる前、則ち野生型（ＷＴ）のＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ＧｌｕＤＨ（ｙｗｅＢ）に比して失活温度Ｔｍが上昇していることをいう。また、以降ではＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ＧｌｕＤＨ（ｙｗｅＢ）を単にｙｗｅＢとのみ表記する場合がある。
【００２７】
【発明の実施の形態】
【００２８】
以下、本発明の実施の形態を説明するが、本発明は記載した形態のみに限定されるものではなく、本明細書の記載およびび当分野で公知の技術に基づいて当業者が容易に修飾およびび改変し得る技術については本発明の範囲内に含まれるものである。なお、本明細書において、定方向進化とは、変異導入、選択、選択した変異体の増幅と、その変異体への更なる変異導入を繰り返し行うことにより、目的とする機能を向上させる手法をいう。
【００２９】
ここでは、まず、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ＧｌｕＤＨ遺伝子のクローニングについて述べ、続いて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ＧｌｕＤＨの精製について言及する。そして、従来明らかでなかったＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ＧｌｕＤＨ（ｙｗｅＢ）の性質について述べ、最後に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ＧｌｕＤＨ（ｙｗｅＢ）の耐熱化について詳細に述べる。なお、遺伝子の単離およびびこの遺伝子を含有する組み換えベクターの作成、組み換えベクターによる形質転換体の作成、並びに形質転換体の培養等に関しては公知の方法、例えばモレキュラー・クローニング（コールドスプリングハーバー出版社、１９８９年）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（ウィリー・インターサイエンス出版社、１９８９年）等に挙げられている方法を組み合わせて行うことができるので、その詳細な記載を省略する。
【００３０】
〔Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ＧｌｕＤＨ遺伝子のクローニング：染色体ＤＮＡの調製〕
まず、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来グルタミン酸脱水素酵素遺伝子をクローニングするため、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＡＴＣＣ　２３８５７をＬＢ培地２　ｍｌ　で３７℃、１８〜２０　ｈｒ振とう培養を行い、遠心（１５０００ｒｐｍ，　５分）にて集菌後、ＣＴＡＢ（ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ）法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　８，　４３２１−４３２５，　１９８０）を用いて染色体ＤＮＡの調製を行った。
【００３１】
〔Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ＧｌｕＤＨ遺伝子のクローニング：ＰＣＲ　によるＧｌｕＤＨ　遺伝子の増幅〕
次に、目的遺伝子（ｙｗｅＢ，　ｙｐｃａ）の塩基配列情報　（ＥＭＢＬ　Ｚ９９１２３，　ＥＭＢＬ　Ｌ４７６４８）に基づきプライマーをデザインし、ＰＣＲを用いてｙｗｅＢおよびｙｐｃＡを含むＤＮＡ断片の増幅を行った。ｙｗｅＢとｙｐｃＡは共に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＧｌｕＤＨである。
【００３２】
センスプライマーは図１に示す要領でデザインした。センスプライマー（配列番号６、７参照）の５’末端にはＢａｍＨＩサイトを、アンチセンスプライマー（配列番号８、９参照）にはＰｓｔＩサイトをつけてデザインした。
【００３３】
図２に、実験に用いたＰＣＲ反応液の成分構成を示す。また、図３に、ＰＣＲサーマールサイクラー条件を示す。なお、実験では、Ｔａｋａｒａ　ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　ＣｙｃｌｅｒのＰＣＲ装置を用いた。
【００３４】
〔Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ＧｌｕＤＨ遺伝子のクローニング：形質転換大腸菌の作製〕以上の手段ないし工程により、ＣＴＡＢ　法によるゲノムＤＮＡの調製を行い、ＰＣＲ　により増幅させたｙｗｅＢ、ｙｐｃＡを得た。得られたＰＣＲ増幅産物（ｙｗｅＢ，　ｙｐｃＡ共に約１．４ｋｂ）をアガロースゲル電気泳動で分離した後、そのバンドを切り出し、ＧＥＮＥ　ＣＬＥＡＮ　ＩＩ（フナコシ社製）により精製した。これらのＤＮＡ断片は、それぞれｐＵＣ１８ベクター（タカラ酒造社製）のＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩサイトにライゲーションし組み換えＤＮＡを得た。得られた組み換えＤＮＡを大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ）　ＭＶ１１８４コンピテントセル（日本ジーン社製）に導入し形質転換した。　形質転換株はＬＢプレート（アンピシリン、Ｘ−Ｇａｌ、ＩＰＴＧ含有）上でホワイトコロニーを形成することで選択した。この形質転換株からアルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを調製し、一部をＢａｍＨＩとＰｓｔＩで制限酵素処理し、電気泳動によりインサートＤＮＡを確認した。これらの形質転換体の保持していたプラスミドを、ｙｗｅＢ形質転換体についてはｐＹＷＥ、ｙｐｃＡについてはｐＹＰＣと命名した。ｙｗｅＢ形質転換株については、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク発現が確認でき、ＧｌｕＤＨ　活性も確認された。ｙｐｃＡ形質転換株についてはＳＤＳ−ＰＡＧＥでの発現確認はできたが、ＧｌｕＤＨ活性は全く検出されなかった。
【００３５】
〔ＧｌｕＤＨの活性測定〕
還元型補酵素ＮＡＤＨ　は３４０　ｎｍ　に吸収極大をもつ。このことを利用して反応時の３４０ｎｍ　におけるＮＡＤＨ（分子吸光係数６．２　ｍｍｏｌ−１・ｃｍ−１）の吸収の増減を追跡することにより活性測定を行った。活性（Ａｃｔｉｖｉｔｙ）の表示は、１　分間に１　μｍｏｌ　のＮＡＤ＋あるいはＮＡＤＨの生成を触媒する酵素量を１　ｕｎｉｔ　と定義し、比活性は１　ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　当たりのｕｎｉｔ　数でｕｎｉｔｓ／（ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）　と表した。
【００３６】
活性の評価式を式２に示す。
【式２】
2004089097.tif 000003
また、アミノ化反応の概要を図４に、脱アミノ反応の概要を図５に示した。なお、タンパク量は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，　ＣＡ）を用い、牛血清アルブミンを標準タンパク質として検量線を作成し、そのタンパク量を求めた。
【００３７】
〔Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　由来ＧｌｕＤＨ（ｙｗｅＢ）の精製〕
精製にあたっては、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＶ１１８４／　ｙｗｅＢ　ｃｌｏｎｅ　を、５０　ｍｇ／ｍｌ　Ａｍｐ　３　μｌ　を含むＬＢ培地３　ｍｌ　で３７℃、１８〜２０　ｈｒ振とう培養を行い、次いで５０　ｍｇ／ｍｌ　Ａｍｐ　７５０μｌ、１　Ｍ　ＩＰＴＧ　１５０　μｌ　を含むＬＢ　培地７５０　ｍｌ　にスケールアップし、１８〜２０　ｈｒ、３７℃で振とう培養し、遠心８，０００　ｒｐｍ　１０　ｍｉｎ　で集菌した。最終的には、図６に示した方法（３０〜４０％飽和硫安沈殿工程、イオン交換（ＤＥＡＥ）カラム工程、疎水性（Ｂｕｔｙｌ）カラム工程）で精製した。最終精製倍率は約１９　倍であり、図７に示したように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ　の結果からもほぼ均一に精製されていることが確認された。なお、精製表を図８に示した。
【００３８】
〔Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　由来ＧｌｕＤＨ（ｙｗｅＢ）の性質〕
次に、精製されたＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　由来ＧｌｕＤＨ（ｙｗｅＢ）の主な物理化学的および酵素化学的性質を調べた。
【００３９】
〔Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　由来ＧｌｕＤＨ（ｙｗｅＢ）の性質：　Ｎ　末端アミノ酸配列決定〕
タンパク質の精製後、データベースに登録されている配列（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ；　Ｐ３９６３３）と確認するためにＮ　末端アミノ酸配列の確認を行った。方法として、ＰＶＤＦ膜を用いたエレクトロブロッティングによる調製を行った。サンプルを調製後、プロテインシーケンサー（島津製作所ＰＰＳＱ−１０）による解析を行った。
【００４０】
１５　ｃｙｃｌｅｓ　行った結果、Ｎ　末端より１５　残基についてデータベースに登録されている配列と同じであることを確認できた。なお、データベースに登録されている配列を、配列番号２に示す。
【００４１】
〔Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　由来ＧｌｕＤＨ（ｙｗｅＢ）の性質：項分子量の検討〕
Ｎａｔｉｖｅ　酵素の分子量は、ゲル濾過クロマトグラフィーを用い、分子量マーカー（オリエンタル酵母工業社製：Ｇｌｕｔａｍａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；２９０，０００、Ｌａｃｔａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；１４２，０００、Ｅｎｏｌａｓｅ；６７，０００、Ｍｙｏｋｉｎａｓｅ；３２，０００、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ；１２，４００）を流し、その溶出時間より作製したキャリブレーションカーブから換算した。サブユニット分子量は、最終精製酵素標品を１２．５％　ＳＤＳ−ＰＡＧＥ　で泳動し、分子量マーカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ：Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅβ；９４，０００、Ａｌｂｕｍｉｎ；６７，０００、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ；４３，０００、Ｃａｒｂｏｎｉｃ　Ａｎｈｙｄｒａｓｅ；３０，０００）との相対移動度の比較およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−Ｍａｓｓ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ　Ｖｏｙａｇｅｒ　ＤＥ−ＲＰ）　スペクトル分析により算出した。
【００４２】
その結果、Ｎａｔｉｖｅ　分子量は約２７０，０００と算出された。サブユニット分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥ　で約４６，０００、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−Ｍａｓｓ　スペクトルで４６，５８７であり、アミノ酸配列より予想される分子量４６，６３８と極めて近い値が得られた。この結果、他の多くのＧｌｕＤＨ　同様、本酵素は六量体であると考えられる。なお、図９に、分子量の検討結果を示した。
【００４３】
〔Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　由来ＧｌｕＤＨ（ｙｗｅＢ）の性質：最適ｐＨ　の測定〕
本酵素の最適ｐＨ　を、アミノ化、脱アミノ反応のそれぞれで活性測定を行うことにより決定した。Ｂｕｆｆｅｒ　は、ｐＨ　６．３〜７．６　でＫＰ　Ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ　７．０〜８．８　でＴｒｉｓ−ＨＣｌ　Ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ　８．８〜９．６　でＣａｒｂｏｎａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒ　を使用した。図１０に示したように、ｙｗｅＢの最適ｐＨ　はアミノ化反応ではｐＨ　７．３　付近、脱アミノ反応ではｐＨ　７．７付近であった。
【００４４】
〔Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　由来ＧｌｕＤＨ（ｙｗｅＢ）の性質：反応速度論的解析〕
本酵素について、Ｋｉｎｅｔｉｃ　Ｐａｒａｍｅｔｅｒ　の解析を行った。具体的には、ｋｃａｔと　Ｋｍを求めた。また、ｋｃａｔ　値は、酵素の代謝回転数（ｔｕｒｎ　ｎｕｍｂｅｒ）または触媒定数と呼ばれ、酵素の活性部位が単位時間（通常１秒）ごとに触媒する反応回数（回転数）を表す。
【００４５】
ｋｃａｔと比活性と酵素の分子量の関係は式３で与えられる。
【式３】
2004089097.tif 000004
なお、ｋｃａｔ　／　Ｋｍ　値は見かけの二次反応速度定数であり、遊離の酸素と基質との間の反応性を示すため、酸素の触媒効率を表す指標となる。
【００４６】
Ｋｍ　値は、アミノ化反応、脱アミノ反応の両反応でそれぞれの基質を様々な濃度で測定し、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ　の逆数プロットから求めた。ｋｃａｔ　値は、サブユニットあたりの１分間１　ｍｇ　の酵素により触媒される生成量として表した。結果を図１１に示す。他の多くのアミノ酸脱水素酵素と同様、アミノ化反応の２−オキソグルタル酸に対するｋｃａｔ値は対応するＬ−グルタミン酸の脱アミノ反応に比べてかなり高いことが認められたが、その比率は２０　分の１　と他のＧｌｕＤＨ　と比較して脱アミノ反応が低くなった。Ｋｍ値においても、ほぼ他のＧｌｕＤＨ　同様の値でアンモニアに対する値がかなり高くなることが確認できた。
【００４７】
〔Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　由来ＧｌｕＤＨ（ｙｗｅＢ）の性質：基質特異性〕
本酵素の基質特異性は、様々な補酵素、アミノ酸、ケト酸を指定濃度になるように加えて行った。反応はそれぞれのアミノ化、脱アミノ反応で行った。図１２に示したように、本酵素はＮＡＤＨ　およびＮＡＤ＋を補酵素とし、２−オキソグルタル酸とＬ−グルタミン酸に対して高い特異性を示すことが確認された。
【００４８】
〔Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　由来ＧｌｕＤＨ（ｙｗｅＢ）の性質：耐熱性の検討〕
酵素を各温度で２０　分間熱処理した後、アミノ化反応における残存活性を熱未処理の活性を１００　としたときの相対活性として示した。また各酵素を様々な温度で２０　ｍｉｎの熱処理後、５０　％の残存活性を示す温度を失活温度Ｔｍ　値（Ｍｅｌｔｉｎｇ　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）として求めた。また、ＮＡＤＨ　を０．４　ｍＭ　加えて同様の処理を行い各酵素の残存活性を求めた。タンパク質濃度による保護効果の耐熱性への影響に考慮し、タンパク質濃度をほぼ等しくして実験を行った。図１３に示したように、３０℃付近より失活が認められた。５０％の失活温度（Ｔｍ）は４１℃であった。ＮＡＤＨ　添加においても大幅な増強は見られなかった。
【００４９】
さらに、本酵素を様々な温度でインキュベート後の残存活性を検討した。図１４に示したように、野生型のｙｗｅＢは非常に不安定であり、３７℃　３０　ｍｉｎ　で、２０％程度にまで残存活性が低下することが確認された。また４５℃以上では、最初の１０ｍｉｎ　で急激な失活が起こり、その後時間と共に緩やかに低下してゆくという、二相性も観察された。なお、図では、各温度の０　ｍｉｎ　での活性を１００　としたときの相対活性を対数で表示している。
【００５０】
また、ここでは詳述しないが、本発明者は、別途検討により、尿素や塩酸グアニジンといったタンパク質の変性剤に対しても低い濃度で変性失活が生じることを確認している。また、酵素濃度の低下にしたがって、四次構造がくずれ、六量体から三量体あるいは二量体、単量体（サブユニット）となり、失活するという知見を得ている。
【００５１】
〔Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　由来ＧｌｕＤＨ（ｙｗｅＢ）の耐熱化と解析：定方向進化戦略による耐熱化クローンの獲得〕
次に、ｙｗｅＢを定方向進化に基づく戦略を用い耐熱化を図った。定方向進化法としてＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ　ＰＣＲ　によるランダム変異導入法を用いた。ランダム変異導入はＬｅｎｇ　らの方法に基づき、低濃度ｄＡＴＰ　でのＥｒｒｏｒ　ｐｒｏｎｅ　ＰＣＲ　法で行った。まず、各０．２５　ｍＭ　ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ　と４　μΜの低濃度ｄＡＴＰ　の状態で１０　ｃｙｃｌｅｓのミスセンスエラー誘発ＰＣＲ　を行った。引き続き、０．２５　ｍＭ　ｄＡＴＰ　の添加により２５　ｃｙｃｌｅｓの増幅ＰＣＲ　を行った。Ｐｒｉｍｅｒ　はｐＵＣ１８　に対するＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｐｒｉｍｅｒｓ　Ｍ１３−ＲＶ（タカラ酒造社製）、Ｍ１３−Ｍ４（タカラ酒造社製）を用いた。
【００５２】
実験概要を図１５に示した。耐熱化クローンのスクリーニングにはＮｉｔｒｏ　ｂｌｕｅｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＮＢＴ）の還元による発色法を用いた。ＮＢＴ　の還元は一般的にＮＡＤＨ　からＰｈｅｎａｚｉｎｅ　ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ（ＰＭＳ）を介して好気的条件下でＯ２‐の形成を通して起こる。ＧｌｕＤＨ　の反応によりＬ−グルタミン酸（Ｌ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ）　から２−オキソグルタル酸（２−ＯＧ）を生成する際にＮＡＤ＋がＮＡＤＨ　に還元し、図１６に示した発色系が進行する。
【００５３】
ＰＣＲ　産物を電気泳動で確認後、増幅産物をＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩで制限酵素処理し、ｐＵＣ１８　にライゲーション後、得られた組み換えＤＮＡを大腸菌ＭＶ１１８４コンピテントセル（日本ジーン社製）に導入し形質転換した。ＬＢプレート（アンピシリン、Ｘ−Ｇａｌ、ＩＰＴＧ含有）上のホワイトコロニーをピックアップし、５０　ｍｇ／ｍｌ　Ａｍｐ　３　μｌ、１Ｍ　ＩＰＴＧ　３　μｌ　を含むＬＢ　培地３　ｍｌで３７℃、一晩振とう培養を行い、遠心１５，０００　ｒｐｍ　５　ｍｉｎ　で集菌した。０．５　ｍｇ／ｍｌ　Ｌｙｓｏｚｙｍｅを含む抽出バッファー［５０　ｍＭ　ＫＰ　ｂｕｆｆｅｒ　ｐＨ　７．２（２　ｍＭ　ＥＤＴＡ）］５０　μｌ　を加えＶｏｌｔｅｘ　で撹拌した。３７℃　３０　分間インキュベート後、遠心（１５，０００　ｒｐｍ　５　ｍｉｎ）し、上清１０　μｌ　を９６−ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに添加した。続いて、抽出バッファー１４０　μｌ　を添加し、６０℃で、２０　ｍｉｎ間インキュベートした。その後、ＧｌｕＤＨ反応液（１００　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ　ｐＨ　７．７、０．５　ｍＭ　ＮＡＤ＋、１０　ｍＭ　Ｌ−Ｇｌｕ、０．１５％　ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．３　ｍＭ　ＮＢＴ、０．１　ｍＭ　ＰＭＳ）を添加し、３７℃　２０　ｍｉｎ　インキュベート後のブルーフォルマザンの発色で耐熱化変異体を選択した。
【００５４】
最も耐熱性の見られた変異体を選択し、Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ　ＰＣＲ　によるランダム変異導入処理および耐熱化ｙｗｅＢのスクリーニングを計５回繰り返して行った。２回目以降のスクリーニングは、それぞれ７０℃、２０　ｍｉｎ、７５℃、２０　ｍｉｎ、８０℃、２０　ｍｉｎ、８０℃、　４０　ｍｉｎ　で行った。
【００５５】
最終的に６０℃　２０　ｍｉｎ　の処理で残存活性約６０％を示す変異体を獲得した。図１７に組み換え変異体と耐熱性の関係を示す。図示したように、野生型の残存活性は約０．８％であった。得られたすべての変異体の全塩基配列決定を行い、明らかにした変異部位を図１８に示す。表の左側の二つの数字（Ａ−Ｂ）は変異体の識別に用いたものであり、Ａはラウンド回数を、Ｂはコロニーナンバーを示す。表に示したように、１−１４　はＥ２７Ｖ、２−２６　はＥ２７Ｖ　とＷ１００Ｒ、３−５０　はＥ２７Ｖ　とＲ３２４Ａ、４−１８はＥ２７Ｖ　とＱ１４４Ｒ、５−１２　はＥ２７Ｖ　とＱ１４４Ｒ　とＧ２５５Ａ　の変異が起こっていることが確認された。すべての変異体にＥ２７Ｖ　変異が保存されており、急激な耐熱性の増加が見られる４−１８　ではＱ１４４Ｒ　の変異が確認されている。
【００５６】
〔Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　由来ＧｌｕＤＨ（ｙｗｅＢ）の耐熱化と解析：変異酵素の作成〕
続いて、変異の確認されたＥ２７Ｖ、Ｗ１００Ｒ、Ｒ３２４Ａ、Ｑ１４４Ｒ、Ｇ２５５Ａ　それぞれの耐熱性への関与を検討するためにシングルミュータントの作製を行った。
【００５７】
変異導入するにあたり、プラスミドｐＹＷＥを制限酵素ＢａｍＨＩとＰｓｔＩで切断し、アガロースゲル電気泳動でｙｗｅＢを分離した後、そのバンドを切り出し、ＧＥＮＥ　ＣＬＥＡＮ　ＩＩ（フナコシ社製）により精製した。このＤＮＡ断片を、ｐＫＦ１８ｋベクター（タカラ社製）のＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩサイトにライゲーションし組み換えＤＮＡを得た。この際の宿主はＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９を使用しカナマイシン含有培地を用いてブルー／ホワイト　セレクションにより組み換え体を選択した。また、変異導入用合成オリゴヌクレオチド（Ｍｕｔａｇｅｎｉｃ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）はＳｅｌｅｃｔｉｏｎ　Ｐｒｉｍｅｒとは反対側の鎖にアニーリングさせなければならないので、ｌａｃＺ　遺伝子の−鎖と相補的になるよう設計した。変異導入に用いた合成オリゴヌクレオチドを、Ｅ２７Ｖ　に対しては配列番号１０に、Ｗ１００Ｒに対しては配列番号１１に、Ｒ３２４Ａに対しては配列番号１２に、Ｑ１４４Ｒに対しては配列番号１３に、Ｇ２５５Ａに対しては配列番号１４にそれぞれ示す。
【００５８】
変異導入はＭｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍ　（　タカラ酒造社製　）　を用いて行った。このＰＣＲについて図１９に示した。これをＥ．ｃｏｌｉ　ＭＶ１１８に形質転換し、カナマイシン含有培地を用いて変異組み換え体を選択した。選択したシングルコロニーからプラスミドＤＮＡ　を調製してＤＮＡ塩基配列決定により変異の導入を確認した。
【００５９】
変異の確認には、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ，　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ　（ＡＢＩ）を用いるＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７７　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　（ＡＢＩ）を使用した。変異確認用Ｐｒｉｍｅｒは、ベクタープラスミドに対するＰｒｉｍｅｒ　ＲＶ、および本酵素遺伝子の配列確認のために作製されたオリゴヌクレオチドより、Ｅ２７Ｖ　にはＭ１３　Ｐｒｉｍｅｒ　ＲＶ（タカラ酒造社製）、Ｗ１００Ｒ　にはＹｗ　５（配列番号１５参照）、Ｒ３２４Ａ　にはＹｗ　６（配列番号１６参照）、Ｑ１４４Ｒ　にはＹｗ　２（配列番号１７参照）、Ｇ２５５Ａ　にはＹｗ　３（配列番号１８参照）　を選んで使用した。
【００６０】
変異確認ができたコロニーよりプラスミドを調製し、ＢａｍＨＩとＰｓｔＩで制限酵素処理、発現ベクターｐＵＣ１８　へライゲーションし、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＶ１１８４　を形質転換した。このときＬＢ−プレート（アンピシリン、Ｘ−Ｇａｌ、ＩＰＴＧ含有）でブルー／ホワイトセレクションにより選択する。生育してきたコロニーからプラスミドを調製し、アガロースゲル電気泳動により、サイズ確認を行った。得られた形質転換株についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて発現確認を行ったところ、すべてに発現が確認され、ＧｌｕＤＨ活性も認められたので耐熱性を含めて性質を調べた。
【００６１】
〔Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　由来ＧｌｕＤＨ（ｙｗｅＢ）の耐熱化と解析：変異酵素の耐熱性検討〕
各変異酵素の耐熱性をＣｒｕｄｅ　ｅｘｔｒａｃｔで検討した。ＬＢ　培地４０　ｍｌ（５０　ｍｇ／ｍｌ　Ａｍｐ　４０　μｌ、１　Ｍ　ＩＰＴＧ　４０　μｌ）で１８〜２０　ｈｒ、３７℃で振とう培養後、超音波破砕し、遠心分離によりＣｒｕｄｅ　ｅｘｔｒａｃｔを調製した。５０、６０℃　２０　ｍｉｎ　の熱処理後の残存活性を検討した。ここで、熱未処理のものの活性を１００　としたときの相対活性で示した。図２０に結果を示す。
【００６２】
図に示したように、Ｑ１４４Ｒ変異体について顕著な耐熱性の上昇が確認された。統合計算化学システムＭＯＥ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ　Ｇｒｏｕｐ　Ｉｎｃ．　）のホモロジーモデリング機能で、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ　ＧｌｕＤＨの三次元座標をテンプレートとしてｙｗｅＢおよびこれらの変異酵素の三次元構造モデル並びに四次構造モデルを作製した。図２１は、作製したｙｗｅＢ四次構造モデルの概観図である。なお、図は、二量体を示しており、上下のサブユニットが上下対称となっていることがわかる。また、図の中央にＱ（グルタミン）を明示したように、本酵素は１４４番目のアミノ酸残基がきわめて近接した場所に位置している。六量体はこの上下の対が三組束になった構造をとる。
【００６３】
解析の結果、Ｑ１４４　は構造上でサブユニット間のインターフェース部分（上下のサブユニット対の境界面部分）に位置しており、この部位が塩基性残基のＡｒｇ　に置換されることで、相手方のサブユニットの主鎖とＡｒｇのグアニジノ基との間で水素結合が形成され、サブユニットインターフェースが安定化したと思料される。また、Ｅ２７Ｖ　についても僅かながら耐熱性の増加が見られた。Ｅ２７　は構造上で二つのドメイン間のヒンジ領域に位置している。この部位が疎水性アミノ酸に置換され、疎水性コアパッキングが増すことで安定化に影響を与えたと思料される。
【００６４】
〔Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　由来ＧｌｕＤＨ（ｙｗｅＢ）の耐熱化と解析：変異酵素の作製〕
次に、より高い熱安定性をもった変異体を獲得するために、さらに変異体の作製を行った。Ｑ１４４　に関しては、正電荷を与えるＫ、Ｈ、負電荷を与えるＤ、Ｅ、疎水性残基であるＬ、サブユニット間のスペースを大きくするＡ、Ｎ、そしてサブユニット間のジスルフィド結合が期待されるＣ　への置換を行った。Ｅ２７　に関しては、疎水性残基であるＦ、正電荷を与えるＫ、Ｒ、そして構造上サイズの小さくなるＡへの置換を行った。変異体の作製については前述のシングルミュータントの作製と同様に行った。
【００６５】
変異導入に用いた合成オリゴヌクレオチドを、Ｑ１４４Ｄに対しては配列番号１９に、Ｑ１４４Ｅに対しては配列番号２０に、Ｑ１４４Ｋに対しては配列番号２１に、Ｑ１４４Ｈに対しては配列番号２２に、Ｑ１４４Ｎに対しては配列番号２３に、Ｑ１４４Ａに対しては配列番号２４に、Ｑ１４４Ｌに対しては配列番号２５に、Ｑ１４４Ｃに対しては配列番号２６に、Ｅ２７Ｋに対しては配列番号２７に、Ｅ２７Ｒに対しては配列番号２８に、Ｅ２７Ａに対しては配列番号２９に、Ｅ２７Ｆに対しては配列番号３０にそれぞれ示す。
【００６６】
〔Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　由来ＧｌｕＤＨ（ｙｗｅＢ）の耐熱化と解析：変異酵素の耐熱性検討〕
得られた各変異酵素の耐熱性をＣｒｕｄｅ　ｅｘｔｒａｃｔで検討した。ＬＢ　培地４０　ｍｌ（５０　ｍｇ／ｍｌ　Ａｍｐ　４０　μｌ、１　Ｍ　ＩＰＴＧ　４０　μｌ）で１８〜２０　ｈｒ、３７℃で振とう培養後、超音波破砕し、遠心分離によりＣｒｕｄｅ　ｅｘｔｒａｃｔを調製した。５０、６０、７０℃　２０　ｍｉｎ　の熱処理後の残存活性を検討した。ここで熱未処理のものの活性を１００　としたときの相対活性で示した。
【００６７】
図２２および図２３に結果を示す。図に示したように、Ｑ１４４　に関しては、元々の変異体であるＱ１４４Ｒ　が最も高い熱安定性を示した。Ｅ２７　に関しては、Ｅ２７Ｆ　が５０℃での残存活性が約６６％と最も高い値を示した。
【００６８】
よって、Ｑ１４４　については、５０℃での残存活性が３０％以上を示したＱ１４４Ｒ、Ｃ、Ｄ、および正電荷を与えるものとしてＫ　を選び、Ｅ２７　については、５０℃での残存活性が３０％以上を示したＥ２７Ｆ、Ｋ　および元々の変異体であるＶ　を選び更なる検討を行った。検討に際しては、変異酵素Ｑ１４４Ｒ、Ｃ、Ｄ、Ｋ、Ｅ２７Ｆ、Ｋ、Ｖ　そして変異体獲得における最終産物５−１２　の培養を行い、硫安沈殿、ＤＥＡＥ　カラムまでの部分精製（純度６０％以上）を行い、耐熱性の検討、および反応速度論的解析を行った。Ｑ１４４ＲおよびＥ２７Ｆについては、上記精製工程の後にＢｕｔｙｌカラム工程を加え純度９５％以上にまで精製したものを用いた。耐熱性の検討については、様々な温度で２０　ｍｉｎ　インキュベート後の残存活性を検討し、それぞれの５０　％の残存活性を示す温度をＴｍ　値（ＭｅｌｔｉｎｇＴｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）として求めた。熱未処理のものの活性を１００　としたときの相対活性で示した。反応速度論的解析については、アミノ化反応における各基質のＫｍ　値の測定を行った。また、変異酵素Ｑ１４４Ｒ、Ｅ２７Ｆ　について、酵素を様々な濃度の下で４℃　３０　ｍｉｎ　放置した前後の残存活性を検討した。
【００６９】
図２４〜図２７に結果を示す。図示したように、Ｑ１４４　については、Ｑ１４４Ｒ　がＴｍ値約６２℃と野生型と比べて約２０℃の上昇が見られた。他の変異酵素についても、多少の上昇が見られた。前述のように、Ｑ１４４　は構造上でサブユニット間のインターフェース部分に位置しており、この部位が塩基性残基のＡｒｇ　に置換されることで、対を形成する相手方のサブユニットの主鎖とＡｒｇ　のグアニジノ基との間で水素結合が形成され、イオン対ネットワーク（ｉｏｎ−ｐａｉｒ　ｎｅｔ−ｗｏｒｋ）効果によりサブユニットインターフェースが安定化したと思料される。
【００７０】
Ｅ２７　については、Ｅ２７Ｆ　がＴｍ　値約４８℃と野生型と比べて約７℃の上昇が見られた。Ｅ２７は構造上で分子表面に位置している。始めに見つかったＥ２７Ｖ　よりもＥ２７Ｆの方がＴｍ　値の増加（約７℃）が見られることから、同じ疎水性残基でも構造的に大きいサイズのものになることによって分子内の空洞（Ｃａｖｉｔｙ）をなくし、このスペースを最密充填に近づけ安定性の増加につながったのではないかと示唆される。
【００７１】
Ｋｍ　値について野生型のものと比較して大幅な変化は見られなかった。精製標品としてＱ１４４Ｒ、Ｅ２７Ｆ　についてのｋｃａｔ　値を算出した結果、野生型よりも増加が見られた（図２４および図２５参照）。これは安定性が増加したことで、反応速度に影響を及ぼしたためと考えられる。また、これらの変異部位では模型図の観察などから酵素活性に与える影響は少ないと思料された。
【００７２】
注目すべきは比活性である。ここで、Ｑ１４４Ｒタイプが、耐熱性を有する従来のＧｌｕＤＨと比較し、常温で著しく高活性であることを示す。図２５で示したｋｃａｔはアミノ化の際の値であるが、Ｑ１４４Ｒの脱アミノ（ｄｅａｍｉｎａｔｉｎｇ）のｋｃａｔは３７℃で２２．８であった。これを式３に当てはめると、Ｑ１４４Ｒの脱アミノの比活性が２９．８Ｕ／（ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）であることが分かる。一方、従来技術で挙げた特開平６−３８７４４号に開示されるＢａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ　ＧｌｕＤＨの３７℃における脱アミノの比活性は２．１　Ｕ／（ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）である。したがって、どちらのＧｌｕＤＨもＮＡＤ型で、著しい耐熱性を示すが、本変異酵素は３７℃で比活性が２９．８／２．１≒１４倍高いことが確認された。
【００７３】
また、Ｑ１４４Ｒ、Ｅ２７Ｆ　について、タンパク濃度の影響を検討してみたところ、低タンパク濃度下で野生型に比して安定性の増強が見られる（図２７参照）。この結果からも、変異によりサブユニット間の相互作用が安定化され、四次構造の解離を防ぐ結果となったと思料される。
【００７４】
なお、図２８に二量体構造を、図２９に六量体構造の概念図を示した。計算機上で二量体を回転させたところ、Ｑ１４４は二量体の二回軸近傍に位置していることが確認できた。二回軸とは二量体を１８０度回転させたときに一致する対象軸である。Ｑ１４４ＲがＴｍ値の著しい上昇をもたらす一因として、二回軸近傍に上下のサブユニットの橋渡しをする水素結合が形成されたことが挙げられる。したがって、本発明では、適宜Ｑ１４４前後のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入、付加などして、サブユニット間の境界面付近または回転軸付近に水素結合の数を増やすように設計した酵素としても良い。
【００７５】
【発明の効果】
以上説明したように、グルタミン酸脱水素酵素ｙｗｅＢの耐熱化を目的として、ランダムＰＣＲ　とＮＢＴ　の還元発色によるスクリーニングとを組み合わせ、合計５　ラウンドの変異導入を行い、最終的に６０℃　２０　ｍｉｎ　の処理で残存活性約６０％を示す変異体が獲得できた。これは、野生型と比較してＴｍ　値が２２℃も上昇した変異体であり、酵素の耐熱化が種々報告されている中、類を見ないほどの上昇であることが確認できた。
【００７６】
また、全塩基配列決定し変異確認を行ったところ、Ｑ１４４およびＥ２７の変異が耐熱性に貢献していたので、この部位のアミノ酸残基を種々置換して検討を行った結果、Ｑ１４４Ｒ　変異体のＴｍ　値が野生型と比べて２０℃上昇し、Ｅ２７Ｆ　変異体のＴｍ値は野生型と比べて約７℃上昇することが確認できた。
【００７７】
Ｑ１４４Ｒ、Ｅ２７Ｆ　変異体について、タンパク濃度の影響を検討してみたところ、野生型と比して明らかに低タンパク濃度下で安定性の増強が見られた。
【００７８】
また、耐熱性を備えＮＡＤ型のＧｌｕＤＨであるＢａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ　ＧｌｕＤＨと比較しても、３７℃における脱アミノの比活性が１４倍高く、高い活性を示すことが確認できた。
【００７９】
したがって、本発明によれば、耐熱性があり、常温（１５−４０℃）程度の温度環境下における活性が高い酵素であって、ＮＡＤを補酵素とするグルタミン酸脱水素酵素、当該グルタミン酸脱水素酵素をコードするＤＮＡ、当該グルタミン酸脱水素酵素が発現可能な形態で導入された微生物、および、当該グルタミン酸脱水素酵素の製造方法を提供できた。
【００８０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】プライマーのデザインを示した図である。
【図２】実験に用いたＰＣＲ反応液の成分構成を示した図である。
【図３】ＰＣＲサーマールサイクラー条件を示した図である。
【図４】アミノ化反応の概要を示した図である。
【図５】脱アミノ反応の概要を示した図である。
【図６】精製法の手順を示した図である。
【図７】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ　により精製の確認を示した図である。
【図８】精製表を示した図である。
【図９】分子量の検討結果を示した図である。
【図１０】最適ｐＨの検討結果を示した図である。
【図１１】ＧｌｕＤＨのカイネティックスパラメーターを示した図である。
【図１２】基質特異性の検討結果を示した図である。
【図１３】耐熱性の検討結果を示した図である。
【図１４】ＧｌｕＤＨ安定性における熱と時間効果の検討結果を示した図である。
【図１５】耐熱化クローンを得るための実験概要を示した図である。
【図１６】活性染色法によるスクリーニング系を示した図である。
【図１７】野生型（ＷＴ）および変異体ＧｌｕＤＨの耐熱性検討結果を示した図である。
【図１８】変異酵素の変異部位を示した図である。
【図１９】変異導入ＰＣＲのプロトコルを示した図である。
【図２０】変異酵素の残存活性について示した図である。
【図２１】ｙｗｅＢ四次構造モデルの概観図である。
【図２２】Ｑ１４４の変異酵素の耐熱性を示した図である。
【図２３】Ｅ２７の変異酵素の耐熱性を示した図である。
【図２４】野生型および変異酵素のカイネティックスパラメーターとＴＭ値を示した図である。
【図２５】野生型および変異酵素のカイネティックスパラメーターを示した図である。
【図２６】野生型および各変異酵素の耐熱性を示した図である。
【図２７】野生型および変異酵素のタンパク濃度の関係を示した図である。
【図２８】四次構造（二量体）の変異部位を拡大した図である。
【図２９】六量体構造の概念図を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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