(57)【要約】　　　（修正有）【課題】安全、かつ、簡便に、所望の細胞又は組織を再生させるための方法、特に、糖尿病患者を治療するためのインスリン産生細胞を再生させるための方法を提供する。【解決手段】異なる二種の器官（Ａ）及び（Ｂ）由来の組織又は細胞を用いて、器官（Ａ）由来の組織又は細胞を再生させる方法であって、器官（Ａ）由来の組織又は細胞を、器官（Ｂ）由来の組織又は細胞に接触させることを特徴とする組織又は細胞の再生方法を提供する。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる二種の器官（Ａ）及び（Ｂ）由来の組織又は細胞を用いて、器官（Ａ）由来の組織又は細胞を再生させる方法であって、器官（Ａ）由来の組織又は細胞を、器官（Ｂ）由来の組織又は細胞に接触させることを特徴とする組織又は細胞の再生方法。
【請求項２】
ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、器官（Ａ）由来の組織又は細胞を、器官（Ｂ）由来の組織又は細胞に接触させることを特徴とする請求項１記載の組織又は細胞の再生方法。
【請求項３】
ｉｎ　ｖｉｖｏ　において、器官（Ａ）由来の組織又は細胞を、器官（Ｂ）由来の組織又は細胞に接触させることを特徴とする請求項１記載のる組織又は細胞の再生方法。
【請求項４】
器官（Ａ）が膵臓であり、器官（Ｂ）が肝臓であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の組織又は細胞の再生方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、再生させようとする器官由来の組織又は細胞を、他の器官由来の組織又は細胞に接触させて、再生させようとする器官由来の組織又は細胞を再生する方法に関する。とりわけ、膵臓由来の組織であるランゲルハンス島や膵臓に存在する膵管由来の細胞などを用いてインスリン産生細胞を再生する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病は、日本のみならず世界的に広がっている深刻な疾病である。１９９７年に旧厚生省が行った調査では、「糖尿病が強く疑われる人」約６９０万人、この値に「糖尿病の可能性を否定できない人」６８０万人を加えると、約１３７０万人がリスク群と推定されている。ＷＨＯの推定する全世界の糖尿病人口は、２０００年で１億５千万人あまりであり、２０２５年では約３億人に達すると予測されている。
【０００３】
近年、糖尿病の根治的治療法として、ランゲルハンス島移植が注目を浴びるようになってきている。ランゲルハンス島移植は、生理的な血糖コントロールを可能とし、手技も簡単で、ハイリスク例にも応用できる優れた糖尿病治療法として期待されている。
ランゲルハンス島移植は、糖代謝の改善による糖尿病性二次病変の進行阻止もしくは改善を目的としているが、強化インスリン療法やインスリン持続皮下注入療法でも血糖コントロールの難しいインスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）は、まさにランゲルハンス島移植の良い適応であると考えられている。ランゲルハンス島移植は局所麻酔で可能なほどで、手術侵襲が極めて小さいため糖尿病患者にとってより安全であり、血管吻合の必要がないため血管病変の進行により膵（臓器）移植の適応外になった患者でも実施可能である。また、門脈循環にインスリンが放出されるため生理学的にも有利である。さらに、分離ランゲルハンス島の凍結保存によるいわゆるｂａｎｋｉｎｇも可能であるなど膵（臓器）移植と比較して多くの利点を有している。
【０００４】
インスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）臨床の実際では、積極的にインスリン療法が用いられている。これは、インスリンを投与することで患者自身のランゲルハンス島β細胞を休息させ、それによりβ細胞の機能が回復してくるのを待つという考え方からであり、近年、積極的に導入され好結果が報告されている。このことは、ＮＩＤＤＭにおいても、ランゲルハンス島移植によって治療可能であることを示しており、ＮＩＤＤＭ例のβ細胞機能が低下してきている時期にランゲルハンス島を移植すれば、再びβ細胞機能が回復し、ＮＩＤＤＭの悪化を防止できる可能性も考えられている。
【０００５】
実験的医療の段階から始まったランゲルハンス島移植は、当初成績が芳しくなかったが、１９９９年３月よりカナダＥｄｍｏｎｔｏｎにあるＡｌｂｅｒｔａ大学において、新しい画期的なＥｄｍｏｎｔｏｎ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌが実施され、ランゲルハンス島移植施行７例全例が　ｉｎｓｕｌｉｎ　ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔとなったということが報告され（非特許文献１参照）、このｐｒｏｔｏｃｏｌによる多施設共同トライアルも準備されている。
【０００６】
このように、ランゲルハンス島移植の臨床研究までに発展した理由としては、大動物膵よりの大量ランゲルハンス島分離法の研究がなされ、１９８４年Ｒｉｃｏｒｄｉらは独自の自動ランゲルハンス島分離装置を考案しブタ、ヒト膵よりの大量ランゲルハンス島分離に成功したことが大きい。しかしながら、臓器ドナー不足からくる移植用ランゲルハンス島細胞の絶対的不足が指摘されている。
そこで、膵臓の発生に関する知見を基に、再生医療学的アプローチによるインスリン産生細胞の確保に関する研究が盛んに行われている。発生過程における胎生期に内胚葉由来の前腸の一部から内分泌細胞、外分泌細胞、膵腺管上皮細胞（膵管細胞）が分化し、最終的に膵臓が形成される。生体のランゲルハンス島は、膵管に存在する幹細胞の分化又は膵管細胞そのものが脱分化することによって再生するといわれている。そこで、膵管細胞や発生途上の胎児から単離した膵臓細胞から移植用のβ細胞やランゲルハンス島類似構造体を作り出そうとする試みがなされている。
【０００７】
例えば、非特許文献２には、マウスより採取した膵管細胞をグルコース不含培地中で４〜５週間培養した後、２．５ｍＭグルコースを含む培地に移して培養を続けることによってグルコース濃度に依存してインスリンを産生するランゲルハンス島様のコロニーが形成されることが報告されている。そして、これをヒアルロン酸マイクロカプセルに封入して、糖尿病を発症したＮＯＤマウスに移植した結果、３ヶ月以上にわたって正常レベルに近い血中グルコース濃度を維持したことが報告されている。
【０００８】
非特許文献３には、膵臓内分泌細胞が基底膜と相互作用しながら形成される点に注目し、その主成分であるラミニン１の存在下でマウス胚から単離した膵臓組織を培養したことが記載され、ラミニン１を培地中に添加し、膵臓組織を培養することによって、ラミニン１非添加の場合に比べてβ細胞の割合が最大で６０倍上昇することが報告されている。特許文献１には、ラミニン５にも同様な効果があることが記載されている。
【０００９】
ランゲルハンス島移植のために必要な細胞ソースを確保するためのもう一つの方法は、ほぼすべての組織細胞に分化する能力を持つ胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いることである。ＥＳ細胞を利用した膵臓機能再生に関する研究は、１９９８年にヒトＥＳ細胞が樹立されたのを契機に大いに加速された。当初、ＥＳ細胞は、膵臓の組織のように内胚葉に由来する組織へ分化誘導することは難しいと考えられていたが、最近、複数のグループでＥＳ細胞からβ細胞への分化誘導に関する研究結果が報告されている。
【００１０】
非特許文献４には、インスリンのプロモーターの下流に抗生物質に対する耐性遺伝子を組み込み、これを未分化のマウスＥＳ細胞にトランスフェクションすることによって、インスリンを発現する細胞だけを効率よく選別することに成功したことが記載されている。このようにして得られた細胞株を、低グルコース濃度培地中で培養することによって、インスリン分泌促進物質の添加濃度に依存してインスリンを大量に産生する細胞が得られることが報告されている。
【００１１】
非特許文献５には、未分化状態のマウスＥＳ細胞からＥｍｂｒｙｙｏｎｉｃ　ｂｏｄｙを作製したことが記載されている。このとき、未分化維持のために加えておいたＬｅｕｋｅｍｉａ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒを培地から除き、これに伴って誘導されたネスチン陽性細胞だけを選別し、その後、繊維芽細胞増殖因子の存在下で増殖させ、最後に、ニコチンアミド含有培地で分化誘導をかけることによってクラスター内に多数のインスリン産生細胞が誘導されることが報告されている。
【００１２】
現在、ランゲルハンス島移植は、移植したランゲルハンス島が肝臓門脈内に生着し、そのランゲルハンス島内に存在するインスリン産生細胞であるβ細胞又はランゲルハンス島の中に存在する前駆／幹細胞がインスリン産生細胞（β細胞）へと分化し、その細胞からインスリンが産生されることにより、血糖値を正常化すると一般的に考えられている。
したがって、上記の先行技術として挙げたインスリン産生細胞を作る技術も、従来の移植すべきランゲルハンス島の代替物を目的としたものであり、移植されたインスリン産生細胞が肝臓の門脈内に生着し、その細胞からインスリンが産生することによって血糖値を正常化するものと考えられる。
しかしながら、移植されたランゲルハンス島やインスリン産生細胞自身にも当然のことながら寿命があり、移植したすべての細胞がインスリン産生能力を失ってしまった時に、再度、頻繁にインスリン産生細胞を移植しなければならなくなるという問題点があった。
【００１３】
【特許文献１】
特表平１１−５１３２５３号公報
【非特許文献１】
Ｓｈａｐｉｒｏ　ＡＭ，Ｌａｋｅｙ　ＪＲＴ，Ｒｙａｎ　ＥＡ，Ｋｏｒｂｕｔｔ　ＧＳ，Ｔｏｔｈ　Ｅ，Ｗａｒｎｏｃｋ　ＧＬ，Ｋｎｅｔｅｍａｎ　ＮＭ，Ｒａｊｏｔｔｅ　ＲＶ：　Ｎ　Ｅｎｇ　Ｊ　Ｍｅｄ，３４３，２３０−２３８（２０００）
【非特許文献２】
Ｒａｍｉｙａ，Ｖ．Ｋ．，Ｍａｒａｉｓｔ，Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．６，２７８−２８２，２０００．
【非特許文献３】
Ｊｉａｎｇ，Ｆ．−Ｘ．，Ｃｒａｍ，Ｄ．Ｓ．ｅｔ　ａｌ．：Ｄｉａｂｅｔｅｓ　４８，７２２−７３０，１９９９．
【非特許文献４】
Ｓｏｒｉａ，Ｂ．，Ｒｏｃｈｅ，Ｅ．ｅｔ．ａｌ．：Ｄｉａｂａｔｅｓ　４９，１５７−１６２，２０００．
【非特許文献５】
Ｌｕｍｅｌｓｋｙ，Ｎ．，Ｂｌｏｎｄｅｌ，Ｏ．ｅｔ．ａｌ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ　２９２，１３８９−１３９４．２０００．
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】コメントメール
本発明の課題は、安全、かつ、簡便に、所望の細胞又は組織を再生させるための方法、特に、糖尿病患者を治療するためのインスリン産生細胞を再生させるための方法を提供することにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、鋭意検討を進めた。まず、ランゲルハンス島の中にインスリンを産生するベータ細胞以外にインスリン産生細胞へと分化増殖する幹細胞が存在し、それが各種組織・臓器に生着してインスリン産生細胞に分化し、再生しているという、当業界の一般的な見解に対して疑問を呈することから始め、ランゲルハンス島に存在する組織・臓器の幹又は前駆細胞ではなく、ランゲルハンス島は、組織・臓器にもともと微量存在する組織・臓器幹／前駆細胞に何らかの働きかけをしており、その結果としてインスリン産生細胞が再生しているのではないかという、極めて大胆な仮説を打ち立てた。その結果、ランゲルハンス島をｉｎ　ｖｉｖｏにおいて肝臓の門脈に移植又はｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて肝臓細胞と共に培養することによって、ランゲルハンス島に存在していた幹／前駆細胞がインスリン産生細胞に分化増殖しているのではなく、肝臓細胞にごく微量存在していた（膵）臓器・組織の幹及び／又は前駆細胞の分化を、移植したランゲルハンス島（組織・細胞）により促進させ、その結果、組織・細胞（インスリン産生細胞）の再生につながることを究明し、本発明を完成させた。
【００１６】
すなわち、本発明は、異なる二種の器官（Ａ）及び（Ｂ）由来の組織又は細胞を用いて、器官（Ａ）由来の組織又は細胞を再生させる方法であって、器官（Ａ）由来の組織又は細胞を、器官（Ｂ）由来の組織又は細胞に接触させることを特徴とする組織又は細胞の再生方法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の方法は、器官（Ａ）由来の組織又は細胞を再生させるに際して、器官（Ａ）由来の組織又は細胞を、器官（Ｂ）由来の組織又は細胞に接触させることことが必要である。本明細書では、具体的に説明するために、器官（Ａ）を再生させようとする器官とし、器官（Ｂ）を他の器官とする。すなわち、本発明は、再生させようとする器官由来の組織又は細胞を、他の器官由来の組織又は細胞に接触させることを特徴とする。
【００１７】
器官とは、生物個体の示す特定の機能が個体内の特定の部分に局在して営まれ、その部分が形態的に独立性をもっている部分のことである。一般に、多細胞生物においては、器官は特定の空間的配置をもついくつかの組織からなり、組織は多数の細胞からなる。例えば、高等動物の心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、副腎、脾臓、胆嚢、胎盤、食道、胃、腸、大腸、十二指腸等の臓器も器官の一つである。これらの器官は、脊椎動物由来であることが好ましい。このような器官として、例えば、円口類、棘魚類、板皮類、軟骨魚類、硬骨魚類、両性類、爬虫類、鳥類、哺乳類に属する動物のものが挙げられる。
【００１８】
再生させようとする器官由来の組織又は細胞と、他の器官由来の組織又は細胞との組み合わせは任意である。細胞と細胞との接触及び細胞と組織との接触のいずれでもよい。最近の糖尿病治療として劇的な成功を収めているランゲルハンス島移植を考慮すると、再生させようとする器官由来の組織又は細胞が、インスリンを産生することができる組織であるところのランゲルハンス島又は細胞であるところのβ細胞であることが好ましい。その場合、他の器官由来の組織又は細胞は、膵臓以外の器官由来の組織又は細胞を用いることができるが、膵臓の発生学的な観点から考慮すると、肝臓、腸、十二指腸及び胆嚢が好ましく、肝臓がより好ましい。
【００１９】
再生させようとする器官由来の組織又は細胞を、他の器官由来の組織又は細胞に接触させる方法としては、ｉｎ　ｖｉｖｏ　における移植による接触方法、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　における培養による接触方法等が挙げられる。
例えば、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて再生させようとする器官由来の組織又は細胞を、他の器官由来の組織又は細胞に接触させる方法としては、再生させようとする器官由来の組織又は細胞がランゲルハンス島であり、他の器官由来の組織又は細胞が肝臓由来の場合、ランゲルハンス島を肝臓の門脈内に注入することによって、ランゲルハンス島を肝臓組織／細胞に接触させることができる。
【００２０】
ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて再生させようとする器官由来の組織又は細胞を、他の器官由来の組織又は細胞に接触させる方法としては、再生させようとする器官由来の組織又は細胞がランゲルハンス島であり、他の器官由来の組織又は細胞が肝臓由来の場合、肝臓の細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養しておき、ランゲルハンス島をその培養された肝臓細胞や肝臓組織に添加し、接触させて培養することができる。
本発明において、必要に応じて、免疫抑制剤や、ＨＧＦやＦＧＦなどの成長因子、ＩＬ−１，ＩＬ−３などの各種インターロイキンやインターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、エリスロポエチンなどのサイトカイン、抗生物質などの薬剤を併用してもよい。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００２２】
【実施例１】
糖尿病モデルラットの（肝臓の）門脈内に、他のラットの膵臓から分離したランゲルハンス島を注入し、４週間飼育した後に犠牲死させ、肝臓を取り出し、その肝臓組織切片を抗インスリン抗体で染色した。その結果、肝実質細胞の間にインスリンを産生している細胞があることが確認された。すなわち、本来、肝臓組織であった細胞がインスリン細胞へと変化していることが確認された。
【００２３】
【実施例２】
ラット肝細胞をコラーゲナーゼ潅流法を用いて、Ｓｅｇｌｅｎらの方法（Ｓｅｇｌｅｎ，Ｐ．Ｏ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，１３，２９−８３，１９７６）に準じてＳＤ系雄性ラット（体重約２００−２５０ｇ）から調製し、市原らの方法（Ｉｃｈｉｈａｒａ，　Ａ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．，Ｔａｎａｋａ，Ｋ．，Ａｏｙａｍａ，Ｋ．，Ｋａｔｏ，Ｓ．ａｎｄ　Ｓｈｉｎｎｏ，Ｈ．：Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３４９，７７−８４，１９８０）にしたがって培養を行った。すなわち、調製した肝細胞をインスリン及びデキサメサゾンを１０−９Ｍ添加した無血清培地（ウィリアムズＥ液）中で、２４時間、３７℃、５％炭酸ガス、３０％酸素存在下で培養した。その後、下記実験群に示したようにアミノ酸を添加した培地で上記と同じ条件で培養を１週間継続した。
【００２４】
ラットの肝細胞を培養しておき、その上に他のラットの膵臓から分離したランゲルハンス島を８週間静置培養した。その後、肝細胞の上にあるランゲルハンス島を除去し、肝細胞を十分に洗浄し、抗ラットインスリン抗体で染色した。その結果、肝細胞内にインスリンを産生している細胞があることが確認された。すなわち、本来、肝臓組織であった細胞がインスリン細胞へと変化していることが確認された。
【００２５】
【発明の効果】
本発明によれば、安全、かつ、簡便に所望の細胞又は組織を再生させることができる。とりわけ、糖尿病患者を治療するためのインスリン産生細胞を再生させることができるので、糖尿病患者を治療することができる。