(57)【要約】【課題】食中毒原因菌検査、食品検査、臨床検査において、ベロトキシン産生腸管出血性大腸菌を迅速かつ正確に検出する。【解決手段】腸管出血性大腸菌のベロトキシン１遺伝子あるいはベロトキシン２遺伝子と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドよりなるプライマー、該プライマーを用いた増幅法、腸管出血性大腸菌ベロトキシン遺伝子の増幅を検出する事による腸管出血性大腸菌の同定方法および腸管出血性大腸菌を同定するキットを提供する。核酸増幅法としてはＬＡＭＰ法が望ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸管出血性大腸菌ベロトキシン１遺伝子配列の１１６２３５番から１１６５２１番の塩基配列（配列番号１）、またはそれらの相補鎖から選ばれた、標的領域の核酸配列を増幅するための以下のセグメントを含むプライマー
（ａ）第１のセグメントとして、腸管出血性大腸菌ベロトキシン１遺伝子にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列
（ｂ）第２のセグメントとして、第１のセグメントの３’側の塩基配列の相補鎖よりなり、第１のセグメントの５’側に位置する塩基配列
【請求項２】
腸管出血性大腸菌ベロトキシン２遺伝子配列の６５２３番から６８０４番の塩基配列（配列番号２）、またはそれらの相補鎖から選ばれた、標的領域の核酸配列を増幅するための以下のセグメントを含むプライマー
（ａ）　第１のセグメントとして、腸管出血性大腸菌ベロトキシン２遺伝子にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列
（ｂ）第２のセグメントとして、第１のセグメントの３’側の塩基配列の相補鎖よりなり、第１のセグメントの５’側に位置する塩基配列
【請求項３】
腸管出血性大腸菌ベロトキシン１遺伝子より選ばれた塩基配列
ＧＣＡＧＴＣＴＧＴＧＧＣＡＡＧＡＧＣ　　　　　配列番号３
ＣＡＴＴＣＧＴＴＧＡＣＴＡＣＴＴＣＴＴＡＴＣＴＧＧ　配列番号４
ＧＣＴＡＴＡＣＣＡＣＧＴＴＡＣＡＧＣＧＴＧ　　　配列番号５
ＣＴＧＴＧＡＣＡＧＣＴＧＡＡＧＣＴＴＴＡＣＧ　　　配列番号６
ＧＧＣＡＡＡＴＡＣＡＧＡＧＧＧＧＡＴＴＴＣＧ　　　配列番号７
ＧＡＡＣＴＧＧＧＧＡＡＧＧＴＴＧＡＧＴＡＧＴ　　　配列番号８
あるいはそれと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する１５塩基配列を有する核酸増幅のための請求項１のプライマー
【請求項４】
腸管出血性大腸菌ベロトキシン２遺伝子より選ばれた塩基配列
ＡＣＣＡＧＡＧＡＴＧＣＡＴＣＣＡＧＡＧＣ　　　　配列番号９
ＣＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴＴＴＣＡＴＣＡＴＡＴＣＴＧＧ　配列番号１０
ＣＡＧＴＴＡＴＡＣＣＡＣＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧ　　配列番号１１
ＣＴＧＴＣＡＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＴＴＡＣＧ　　　配列番号１２
ＧＧＣＡＧＡＴＡＣＡＧＡＧＡＧＡＡＴＴＴＣＧＴＣ　　配列番号１３
ＧＡＡＣＴＧＧＧＧＧＣＧＡＡＴＣＡＧ　　　　　配列番号１４
あるいはそれと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する１５塩基配列を有する核酸増幅のための請求項２のプライマー
【請求項５】
腸管出血性大腸菌ベロトキシン遺伝子を増幅するための以下の構造を持つ請求項３のプライマー。
（ａ）−（ｂ）−（ｃ）、ただし（ｂ）は塩基数０から５０の任意の塩基配列であり、
（ａ）は配列番号３より選ばれる塩基配列と相補的なオリゴヌクレオチド
（ｃ）は配列番号４より選ばれる塩基配列よりなるオリゴヌクレオチドである。
あるいは、
（ｄ）−（ｅ）−（ｆ）、ただし（ｅ）は塩基数０から５０の任意の塩基配列であり、
（ｄ）は配列番号５より選ばれる塩基配列よりなるオリゴヌクレオチド
（ｆ）は配列番号７と相補的なオリゴヌクレオチドである。
【請求項６】
腸管出血性大腸菌ベロトキシン遺伝子を増幅するため以下の構造を持つ請求項４のプライマー。
（ａ）−（ｂ）−（ｃ）、ただし（ｂ）は塩基数０から５０の任意の塩基配列であり、
（ａ）は配列番号９より選ばれる塩基配列と相補的なオリゴヌクレオチド、
（ｃ）は配列番号１０より選ばれる塩基配列よりなるオリゴヌクレオチドである。あるいは、
（ｄ）−（ｅ）−（ｆ）、ただし（ｅ）は塩基数０から５０の任意の塩基配列であり、
（ｄ）は配列番号１２より選ばれる塩基配列よりなるオリゴヌクレオチド、
（ｆ）は配列番号１３と相補的なオリゴヌクレオチドである。
【請求項７】
請求項１から６のプライマーを用いるＬＡＭＰ法による腸管出血性大腸菌ベロトキシン遺伝子の増幅法
【請求項８】
請求項７の腸管出血性大腸菌ベロトキシン遺伝子増幅の検出による腸管出血性大腸菌の同定方法
【請求項９】
請求項１から６のプライマーと、鎖置換型核酸合成酵素と、基質を含む腸管出血性大腸菌を同定するキット
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、食中毒に関する検査、例えば食中毒原因菌検査、食品の細菌汚染検査に関する検査、もしくは下痢症検査における臨床検査、獣医学分野における検査において、腸管出血性大腸菌（ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ，　ＥＨＥＣ）のベロトキシンを簡便かつ迅速に検出するためのプライマーおよびそれを用いた腸管出血性大腸菌の同定法に関するものである。
【従来の技術】
【０００２】
従来から、腸管出血性大腸菌は、出血性腸炎や溶血性尿毒素症症候群の原因菌として世界的に注目されている。特にわが国では、本菌感染症は指定伝染病とされ、腸管出血性大腸菌の迅速な検出および同定法の確立が急務とされている。
腸管出血性大腸菌として、菌表面のリポポリサッカライドＯ抗原の血清型Ｏ１５７が良く知られているが、他の血清型、例えばＯ２６、Ｏ１０４、Ｏ１１１等を持つ大腸菌も腸管出血性である事が知られ、またＯ１５７抗原を持ちながら腸管出血性でない大腸菌も知られているので、Ｏ抗原の血清型のみでは腸管出血性大腸菌の判定はできない。
【０００３】
腸管出血性大腸菌の病原遺伝子としてはベロトキシン遺伝子があり、すべての腸管出血性大腸菌がこの遺伝子を持つ。この遺伝子の産物は、アフリカミドリザル腎臓組織由来のベロ細胞に強い致死作用があるところからベロトキシン（ＶＴと省略する）と命名された。
ＶＴは赤痢菌の志賀毒素（Ｓｈｉｇａ　ｔｏｘｉｎ）と同じアミノ酸配列のＶＴ１と、赤痢菌の志賀毒素とアミノ酸配列で５０から６０％の相同性を示すＶＴ２に大別され、どちらも同様な細胞毒性を示す。ＶＴには塩基配列が変異した遺伝子と、アミノ酸配列が変異したトキシン（蛋白）が知られている。特にＶＴ２は変異が多く、ＶＴ２ｖｈａ、ＶＴ２ｖｈｂ、ＶＴ２ｖｐ１（ＶＴ２ｅあるいはＳｔｘ２ｅとも言う）、　ＶＴ２ｖｐ２などと命名された変異トキシンが知られている。　このうちＶＴ２ｖｐ２は、ヒトでの感染も、日本国内での菌株分離も報告されていない。そこで本特許ではＶＴ１およびその変異体をＶＴ１、ＶＴ２ｖｐ２以外のＶＴ２、ＶＴ２ｖｈａ、ＶＴ２ｖｈｂ、　ＶＴ２ｖｐ１およびそれらの変異体をＶＴ２と略称する。
【０００４】
腸管出血性大腸菌の同定は、通常、（１）検体からの原因菌の増殖培養と、（２）菌の同定の２段階に分けて行なわれる。培養法は、ｍＥＣブイヨンを用いた培養の後にＳＩＢ寒天平板培地またはＳＭＣ寒天平板培地で培養する（食品衛生研究１９９６　Ｖｏｌ．４６　１１７−１２１）。
菌の同定法としてはＶＴの検出が行われ、（１）ベロ細胞に対する毒性を調べる生物学的検出方法、（２）ＶＴを蛋白質として免疫学的に検出する方法（３）ＶＴ遺伝子の存在を確認する遺伝学的検出方法などが開発されている。
【０００５】
ベロ細胞に対する毒性を検出する方法は、ＶＴ検出の基本的な方法であるが、細胞培養の設備が必要な上、操作が煩雑であり、株の分離から検出までに約１週間を要する。また毒素源性大腸菌の産生する他の毒素による偽陽性もある。
【０００６】
ＶＴを蛋白質として免疫学的に検出する方法として、逆受身ラテックス凝集反応法（ＲＰＬＡと省略する）キットが市販されている。この方法は手技が簡単で一度に多数の検体の処理が可能であるため、日常のスクリーニング検査法として便利である。しかし、検出感度が不十分なので、被検菌の毒素産生量が低い場合には適さない。また変異型であるＶＴ２ｖｐ１（ＶＴ２ｅ）では検出できない事も知られている（感染症学雑誌第７１巻第３号２４８，１９９７）。
同様にＥＬＩＳＡ法のキットも市販されているが、試薬及び検体の調製が複雑で面倒であり、検出に長時間を要する。これらの抗体の特異性を基にして蛋白質を検出する免疫学的方法では、変異のある毒素に反応せず偽陰性となる事もある（Ｏｋｕ　Ｙ，　ｅｔ　ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８８；３２（８）：８０７）。
【０００７】
ＶＴ遺伝子を検出する方法として、ＶＴ遺伝子配列を特異的に認識するオリゴヌクレオチドを用いたＤＮＡプローブ法や、ＤＮＡプローブを用いたコロニーハイブリダイゼーション法が報告されている（特開平１１−２９００７７）。しかし、専用の反応装置を使用しなければならず、技術的にも高度であるため汎用性が乏しい。
また、ＶＴ遺伝子領域を認識し、結合する２種類のプライマーに挟まれる塩基配列を増幅し、増幅産物をアガロース電気泳動で確認するＰＣＲ法（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　；　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０，　１３５０　（１９８５），　Ｓａｉｋｉ　ｅｔ．ａｌ）も行われている（特開平４−２９７４８９、特開平７−８２８０、特開平１１−００９２８１、特開平１１−１３７２９８、特開平１１−３３２５９９、特開平１１−３４６７９８、特開２００１−０９５５７６、特開２００１−３１４１８６、特開２００１−３１４１８７）。ＰＣＲ法は確定培養法およびハイブリダイゼーション法と比較して、高い感度と簡便な操作性を実現しているが、増幅反応やアガロース電気泳動に長時間を要し、検体数が多くなると煩雑なゲル電気泳動を行うことが多大な労力と時間の浪費を伴い、効率よい検出操作を行う上での障害となっている。また、複雑な温度制御が不可欠であり、専用の反応装置を使用しなければならず、したがって設備の整った実験室で無ければ実施できない。
【０００８】
【発明が解決しようとしている課題】
本発明は、検疫、ヒトや動物の臨床検査、および食品検査の分野においてオリゴヌクレオチドを核酸合成反応のプライマーとして機能させる遺伝子増幅技術により、ＶＴ１遺伝子またはＶＴ２遺伝子、もしくはＶＴ１遺伝子とＶＴ２遺伝子のうち少なくともどちらかを保有する腸管出血性大腸菌を簡便、迅速かつ高感度に１回の反応で検出することができるプライマー、およびそれを用いた腸管出血性大腸菌の同定法を提供することを目的とする。
【０００９】
【問題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行なった結果、腸管出血性大腸菌ＶＴ遺伝子に選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＬＡＭＰ法により増幅する事により、ＶＴを検体中から特異的、簡便、迅速、かつ高感度に検出する事を見出し本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は、
（１）腸管出血性大腸菌ベロトキシン１遺伝子配列の１１６２３５番から１１６５２１番の塩基配列（配列番号１）、またはそれらの相補鎖から選ばれた、標的領域の核酸配列を増幅するための以下のセグメント
（ａ）第１のセグメントとして、腸管出血性大腸菌ベロトキシン１遺伝子にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列
（ｂ）第２のセグメントとして、第１のセグメントの３’側の塩基配列の相補鎖よりなり、第１のセグメントの５’側に位置する塩基配列
を含むプライマーを提供する。
また、（２）腸管出血性大腸菌ベロトキシン２遺伝子配列の６５２３番から６８０４番の塩基配列（配列番号２）、またはそれらの相補鎖から選ばれた、標的領域の核酸配列を増幅するための以下のセグメント
（ａ）　第１のセグメントとして、腸管出血性大腸菌ベロトキシン２遺伝子にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列
（ｂ）第２のセグメントとして、第１のセグメントの３’側の塩基配列の相補鎖よりなり、第１のセグメントの５’側に位置する塩基配列
を含むプライマーを提供する。
【００１１】
また、（３）本発明は腸管出血性大腸菌ベロトキシン１遺伝子より選ばれた塩基配列
ＧＣＡＧＴＣＴＧＴＧＧＣＡＡＧＡＧＣ　　　　　　配列番号３
ＣＡＴＴＣＧＴＴＧＡＣＴＡＣＴＴＣＴＴＡＴＣＴＧＧ　　配列番号４
ＧＣＴＡＴＡＣＣＡＣＧＴＴＡＣＡＧＣＧＴＧ　　　　配列番号５
ＣＴＧＴＧＡＣＡＧＣＴＧＡＡＧＣＴＴＴＡＣＧ　　　　配列番号６
ＧＧＣＡＡＡＴＡＣＡＧＡＧＧＧＧＡＴＴＴＣＧ　　　　配列番号７
ＧＡＡＣＴＧＧＧＧＡＡＧＧＴＴＧＡＧＴＡＧＴ　　　　配列番号８
あるいはそれと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する１５塩基配列を有する核酸増幅のための（１）のプライマーを提供し、
（４）腸管出血性大腸菌ベロトキシン２遺伝子より選ばれた塩基配列
ＡＣＣＡＧＡＧＡＴＧＣＡＴＣＣＡＧＡＧＣ　　　　　配列番号９
ＣＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴＴＴＣＡＴＣＡＴＡＴＣＴＧＧ　　配列番号１０
ＣＡＧＴＴＡＴＡＣＣＡＣＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧ　　　配列番号１１
ＣＴＧＴＣＡＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＴＴＡＣＧ　　　　配列番号１２
ＧＧＣＡＧＡＴＡＣＡＧＡＧＡＧＡＡＴＴＴＣＧＴＣ　　　配列番号１３
ＧＡＡＣＴＧＧＧＧＧＣＧＡＡＴＣＡＧ　　　　　　配列番号１４
あるいはそれと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する１５塩基配列を有
する核酸増幅のための（２）のプライマーを提供する。
【００１２】
さらに、（５）腸管出血性大腸菌ベロトキシン遺伝子を増幅するための以下の構造を持つ（３）のプライマーを提供する。
（ａ）−（ｂ）−（ｃ）、ただし（ｂ）は塩基数０から５０の任意の塩基配列であり、
（ａ）は配列番号３より選ばれる塩基配列と相補的なオリゴヌクレオチド
（ｃ）は配列番号４より選ばれる塩基配列よりなるオリゴヌクレオチドである。
あるいは、
（ｄ）−（ｅ）−（ｆ）、ただし（ｅ）は塩基数０から５０の任意の塩基配列であり、
（ｄ）は配列番号５より選ばれる塩基配列よりなるオリゴヌクレオチド
（ｆ）は配列番号７と相補的なオリゴヌクレオチドである。
（６）腸管出血性大腸菌ベロトキシン遺伝子を増幅するため以下の構造を持つ（４）のプライマーを提供する。
（ａ）−（ｂ）−（ｃ）、ただし（ｂ）は塩基数０から５０の任意の塩基配列であり、
（ａ）は配列番号９より選ばれる塩基配列と相補的なオリゴヌクレオチド、
（ｃ）は配列番号１０より選ばれる塩基配列よりなるオリゴヌクレオチドである。あるいは、
（ｄ）−（ｅ）−（ｆ）、ただし（ｅ）は塩基数０から５０の任意の塩基配列であり、
（ｄ）は配列番号１２より選ばれる塩基配列よりなるオリゴヌクレオチド、
（ｆ）は配列番号１３と相補的なオリゴヌクレオチドである。
【００１３】
また、本発明は
（７）（１）から（６）のプライマーを用いるＬＡＭＰ法による腸管出血性大腸菌ベロトキシン遺伝子の増幅法を提供すし、
（８）（７）の腸管出血性大腸菌ベロトキシン遺伝子の増幅を検出する事による腸管出血性大腸菌の同定方法を提供し、
（９）（１）から（６）のプライマーと、鎖置換型核酸合成酵素と、基質を含む腸管出血性大腸菌を同定するキットを提供する。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
核酸増幅による腸管出血性大腸菌べロトキシン検出の検体としては、ヒトや動物の臨床検査材料、たとえば培養した菌体、糞便、吐瀉物、尿、血液、組織など、また食品材料や拭き取り検体でも良い。
これらの検体をＬＡＭＰ法の試料に用いる場合、検体中に存在する菌の濃縮、分離、あるいは菌体から核酸を遊離や濃縮、精製などの操作を前処理として行うこともできる。菌の分離の方法としては濾過、遠心分離、担体を用いた分離などが、菌体からの核酸の遊離には物理的破砕、酵素、界面活性剤、カオトロピック剤、アルカリ、熱による処理などが、菌体からの核酸の分離、濃縮としては有機溶媒による沈殿、核酸吸着剤による処理などが知られていて、その中から適宜選択できる。
【００１５】
本発明において標的配列とは、増幅すべきポリヌクレオチドの塩基配列を意味する。一般にポリヌクレオチドの塩基配列は、５’側から３’側に向けてセンス鎖の塩基配列を記載する。本発明において、連続的に新たな標的塩基配列が合成される事を増幅と呼ぶ。更に本発明において、相補鎖合成の起点を与えることとは、鋳型となるポリヌクレオチドに対して、相補鎖合成に必要なプライマーとして機能するポリヌクレオチドの３’末端をハイブリダイズさせることを言う。また本発明において、３’末端、あるいは５’末端とは、単にいずれかの末端の１塩基のみならず、末端の１塩基を含み、かつ末端に位置する領域を意味する。
【００１６】
ＰＣＲ法は、標的配列の両端の一方のセンス鎖を認識するオリゴヌクレオチドと、両端の他方のアンチセンス鎖を認識するオリゴヌクレオチドよりなる２種類のプライマーを用いた核酸増幅法である。まず熱変性により一本鎖状態になった試料核酸に対し、プライマーが相補的に結合し、鋳型依存性核酸合成酵素により核酸合成反応を行ない、これにより二本鎖核酸を生成するまでの工程を１サイクルとし、このサイクルを繰り返し行なう事により標的配列を増幅する方法であり、反応温度は反応の段階に応じて変更しなくてはならない。
【００１７】
これに対してＬＡＭＰ法は、プライマーとして少なくとも４種類のオリゴヌクレオチドを用いる核酸増幅法で、２種類はインナープライマー（Ｉｎｎｅｒ　Ｐｒｉｍｅｒ）、残りの２種類はアウタープライマー（Ｏｕｔｅｒ　Ｐｒｉｍｅｒ）と呼ぶ。ＬＡＭＰ法はこれらのプライマーと、鎖置換合成活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素と基質を用いて、熱変性を必要とせず終始等温で速やかに特異性の高い遺伝子増幅反応が進行することを特徴とする。
【００１８】
標的塩基配列の３’末端から当該ポリヌクレオチド鎖の３’末端方向に向かって順に第１の任意配列Ｆ１ｃ、第２の任意配列Ｆ２ｃ、第３の任意配列Ｆ３ｃをそれぞれ選択し、標的塩基配列の５’末端から当該ポリヌクレオチド鎖の５’末端方向に向かって順に第４の任意配列Ｒ１、第５の任意配列Ｒ２、第６の任意配列Ｒ３それぞれ選択する。Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ３ｃの相補配列をそれぞれＦ１、Ｆ２、Ｆ３またＲ１、Ｒ２、Ｒ３の相補鎖をＲ１ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ３ｃと呼ぶ。
【００１９】
インナープライマー（Ｉｎｎｅｒ　Ｐｒｉｍｅｒ）は、標的遺伝子上の「ある特定のヌクレオチド配列領域」を認識しかつ合成起点を与える塩基配列を３’末端に有し、同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を５’末端に有することを特徴としたオリゴヌクレオチドである。Ｆ２より選ばれた塩基配列および、Ｆ１ｃより選ばれた塩基配列を含むプライマーをインナープライマーＦ、Ｒ２より選ばれた塩基配列およびＲ１ｃより選ばれた塩基配列を含むプライマーをインナープライマーＲと呼ぶ。
【００２０】
アウタープライマー（Ｏｕｔｅｒ　Ｐｒｉｍｅｒ）は、標的塩基配列上の「ある特定のヌクレオチド配列領域」の下流に存在するある特定のヌクレオチド配列領域を認識かつ合成起点を与える塩基配列を有することを特徴としたオリゴヌクレオチドである。Ｆ３より選ばれた塩基配列を含むプライマーをアウタープライマーＦ、Ｒ３より選ばれた塩基配列を含むプライマーをアウタープライマーＲと呼ぶ。
インナープライマー及びアウタープライマーにおいて、Ｆとは標的遺伝子のセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマーの表示であり、Ｒとは標的遺伝子のアンチセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマーの表示である。
【００２１】
標的遺伝子に選択的にアニールしたインナープライマーからの核酸合成反応が進行すると同時に、アウタープライマーを起点とするその下流からの核酸合成反応によって鎖置換反応が起こる。そのためにインナープライマーを起点とする伸長鎖が鋳型である標的遺伝子から分離し、自身の５’末端でループ構造を形成する。インナープライマーの３’末端を起点とした伸長鎖に、もうひとつのインナープライマーが選択的にアニールし、合成起点となり核酸合成が進行する。同時にもうひとつのアウタープライマーを起点とする核酸合成反応によって鎖置換反応が起こる。その結果、自己を鋳型としながら合成起点となる３’末端を有し、両端にそれぞれループ構造を有することを特徴とする「ダンベル型」ヌクレオチドが形成される。
【００２２】
上述の「ダンベル型」ヌクレオチドのループの塩基配列は、３’末端側のループの一本鎖部分にインナープライマーが相補的にアニールし合成起点を与えるので、ループ構造を有する中間産物は連続的にインナープライマーの鋳型として機能し、核酸合成が進行する。特に、ループ構造を複数有する中間産物は、複数の核酸合成反応が同時多発的に進行する鋳型となりながら、鎖置換反応によってまた新たなループ構造を有する中間産物を生成させる。このように等温条件下で連続的かつ大量に標的遺伝子の特定のヌクレオチド配列を増幅することを可能にしたのがＬＡＭＰ法である。
【００２３】
ＬＡＭＰ法においては、インナープライマーとアウタープライマーに加え、他のプライマーを用いる事ができる。ダンベル構造の５’末端側のループの一本鎖部分の塩基配列に相補的な塩基配列を持つプライマーをループプライマー（Ｌｏｏｐ　Ｐｒｉｍｅｒ）と言う。これを用いると核酸合成の起点を増やす事により、反応時間の短縮と検出感度の上昇ができる（ＷＯ０２／２４９０２）。ループプライマーの塩基配列は上述のダンベル構造の５’末端側のループの１本鎖部分の塩基配列に相補的であれば、標的遺伝子の塩基配列あるいはその相補鎖から選ばれても良く、他の塩基配列でも良い。またループプライマーは１種類でも２種類でも良い。
【００２４】
本発明でインナープライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、３０塩基以上、望ましくは３５塩基以上の長さを持ち、化学合成あるいは天然のどちらでも良い。Ｆ側のインナープライマーはその塩基配列として、標的遺伝子配列のある配列よりなるオリゴヌクレオチドを３’側に持ち、それより下流の別の塩基配列の相補鎖よりなるオリゴヌクレオチドを５’側に持ち、その間には０から５０塩基よりなる任意のオリゴヌクレオチドを持っても良い。Ｒ側のインナープライマーの塩基配列は、Ｆ側のインナープライマーより下流の、標的遺伝子配列のある配列の相補鎖よりなるオリゴヌクレオチドを３’側に持ち、それより上流の別の塩基配列を５’側に持ち、その間には０から５０塩基よりなる任意の塩基配列を持っても良い。また、プライマーは特に検出用として標識されていても良い。
【００２５】
またアウタープライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、同様な理由から１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さを持ったヌクレオチドで、化学合成あるいは天然のどちらでも良い。またループプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、同様な理由から１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さを持ったヌクレオチドで、化学合成あるいは天然のどちらでも良い。
【００２６】
ＬＡＭＰ法で使用する各プライマーは単一のオリゴヌクレオチドであっても良く、複数のオリゴヌクレオチドの混合物であっても良い。
【００２７】
本発明者は、塩基配列の知られているすべての腸管出血性大腸菌のＶＴ１遺伝子とＶＴ２遺伝子を特異的にかつ迅速に増幅できるＬＡＭＰ法のプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの塩基配列と、その組み合わせを鋭意研究した結果、ＶＴ１遺伝子を増幅するためには、ＧｅｎｅＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＰ００２５６０の１１６５２１番から１１６２３５番の塩基配列を元に一部改変した配列番号１の領域から、変異のある遺伝子も増幅できる次のプライマーを選定した。
インナープライマーＦ　：　ＧＣＴＣＴＴＧＣＣＡＣＡＧＡＣＴＧＣＡＣＡＴＴＣＧＴＴＧＡＣＴＡＣＴＴＣＴＴＡＴＣＴＧＧ　　配列番号１５
インナープライマーＲ：　ＣＴＧＴＧＡＣＡＧＣＴＧＡＡＧＣＴＴＴＡＣＧＣＧＡＡＡＴＣＣＣＣＴＣＴＧＡＡＴＴＴＧＣＣ　　配列番号１６
アウタープライマーＦ：　ＧＣＴＡＴＡＣＣＡＣＧＴＴＡＣＡＧＣＧＴＧ　　配列番号１７
アウタープライマーＲ：　ＡＣＴＡＣＴＣＡＡＣＣＴＴＣＣＣＣＡＧＴＴＣ　　配列番号１８
ループプライマーＦ：　ＡＧＧＴＴＣＣＧＣＴＡＴＧＣＧＡＣＡＴＴＡＡＡＴ　　配列番号１９
また、ＶＴ２遺伝子を増幅するためには、ＧｅｎｅＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＥ００５２９６の６５２３番から６８０４番の塩基配列を元に一部改変した配列番号２の領域から、変異のある遺伝子も増幅できる次のプライマーを選定した。
インナープライマーＦ　：　ＧＣＴＣＴＴＧＡＴＧＣＡＴＣＴＣＴＧＧＴＡＣＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴＴＴＣＡＴＣＡＴＡＴＣＴＧＧ
配列番号２０
インナープライマーＲ：　ＣＴＧＴＣＡＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＴＴＡＣＧＧＡＣＧＡＡＡＴＴＣＴＣＣＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＣ　配列番号２１
アウタープライマーＦ：　ＣＡＧＴＴＡＴＡＣＣＡＣＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧ　　配列番号２２
アウタープライマーＲ：　ＣＴＧＡＴＴＣＧＣＣＧＣＣＡＧＴＴＣ　　配列番号２３
ループプライマーＦ１：　ＴＧＴＡＴＴＡＣＣＡＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＴＴＡＡＣＧ　　配列番号２４
ループプライマーＦ２：　ＧＧＣＡＴＴＴＣＣＡＣＴＡＡＡＣＴＣＣＡＴＴＡＡＣＧ　　配列番号２５
【００２８】
本発明のプライマーは、腸管出血性大腸菌のベロトキシン遺伝子配列から選ばれた核酸配列からなるオリゴヌクレオチドである。ベロトキシン遺伝子を増幅しうるプライマーはいくつか知られている。
配列番号３の塩基配列は特開平４−２９７４８９に記載された塩基配列と一部重複している。しかし該公報に規定するヌクレオチド配列は少なくとも連続した１５塩基であるので、本特許プライマーとは異なる。
配列番号１２と配列番号１３は特開平４−２９７４８９に記載された領域と一部重複している。しかし該公報に規定するヌクレオチド配列は少なくとも連続した１５塩基であるので、本特許プライマーとは異なる。
配列番号１０、配列番号１１と配列番号１２は特許第２７７５６６３に記載された領域と一部重複している。しかし該特許の権利範囲は、記載している塩基配列と完全に一致する物のみであるので、本特許プライマーとは異なる。
配列番号１０と配列番号１２特開平１１−００９２８１に記載された領域と一部重複している。しかし該特許の権利範囲は、記載している塩基配列と完全に一致する物のみであるので、本特許プライマーとは異なる。
配列番号１０と配列番号１２は特開平１１−３３２５９９に記載された領域と一部重複している。しかし該特許は他の塩基配列を持ったオリゴヌクレオチドとの混合物が特許請求の範囲であるので、本特許プライマーとは異なるは。
配列番号３と配列番号９は特開２００１−３１４１８６　記載配列と一部重複している。しかし該特許に規定するヌクレオチド配列は少なくとも連続した１５塩基であるので、本特許プライマーとは異なる。
配列番号３と配列番号９は特開２００１−３１４１８７と一部重複している。しかし該特許は増幅物の同定の方法を限定しているので、本特許プライマーとは異なる。
【００２９】
鋳型依存性核酸合成反応を行なう酵素は、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば起源については特に規定しない。このような酵素としてＢｓｔ　ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ　ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ＤｅｅｐＶｅｎｔ　ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。好ましくはＢｓｔ　ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）であり、当酵素を用いる場合、当酵素の反応至適温度である６５℃付近で反応を行うのが望ましい。
【００３０】
増幅産物の検出には公知の技術が適用できる。たとえば増幅された遺伝子配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドを用いて検出ができる。あるいは、反応終了後の反応液をそのままアガロース電気泳動にかけることでも容易に検出できる。ＬＡＭＰ法では塩基長の異なる多数のバンドがラダー（はしご）状となる。
【００３１】
さらに、ＬＡＭＰ法による遺伝子増幅は加速度的かつ効率的に行なわれるので、反応液中にあらかじめ二本鎖核酸の分子内に特異的に取り込まれるインターカレーターであるエチジウムブロマイドやＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ　社製）などを添加することにより増幅を確認できる。（特開２００１−２４２１６９）また、経時的に蛍光強度を観察することができるＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）などの連続蛍光光度計で、増幅の有無の確認や速度論的解析をすることも可能である。
【００３２】
そのほか、ＬＡＭＰ法では核酸の合成により基質が大量に消費され、副生物であるピロリン酸がマグネシウムと反応してピロリン酸マグネシウムとなり、肉眼でも確認できるほど白濁する。この白濁を反応終了後の観察、もしくは反応中の濁度の上昇を経時的に光学的に観察できる測定機器、例えば４００ｎｍの吸光度の変化を通常の分光光度計を用いて増幅の確認が可能である（ＷＯ０１／８３８１７）。
【００３３】
また、増幅された遺伝子配列を特異的に認識する担体固相オリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションまたはそれを起点とした伸長反応により、増幅の確認が可能である。（特願２００１−１６１４８６）
【００３４】
本発明のＶＴ検出試薬では、ＶＴ１遺伝子を増幅するプライマーを用いてＶＴ１を保有する菌株のみを検出する事も、ＶＴ２遺伝子を増幅するプライマーを用いてＶＴ２のみを保有する菌株を検出する事もできる。また、ＶＴ１遺伝子を増幅するプライマーとＶＴ２遺伝子を増幅するプライマーを同時に用いて両者のうち少なくともどちらかを保有する菌株を検出する事もできる。それにより、Ｏ１５７を含む腸管出血性大腸菌の簡便、迅速かつ高感度な検査方法を提供する。
【００３５】
【実施例】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３６】
実施例１　検体の調製
ＶＴ産生株を含む大腸菌１４４株と、食品中の大腸菌を検出する際用いるｍＥＣブイヨン培地で増殖する可能性のある、大腸菌以外の細菌２１菌種３７株をそれぞれハートインフージョン培地（栄研化学社製）で培養した。
【００３７】
比較例１　逆受身ラテックス凝集法
ＲＰＬＡは、ＶＥＴＣ−ＲＰＬＡ「生研」（デンカ生研社製）を用い、添付の能書記載の方法に準じてＶＴ１遺伝子検出と、ＶＴ２遺伝子検出を別々に行った。
ハートインフュージョン培地で前培養した菌体をマッチ棒の頭の３倍程度を掻き取り、１ｍｌのポリミキシンＢ溶液に浮遊させ、３７℃で１０分毎に振とうしながら３０分間反応させ、９００ｇで１５分間遠心した上清を抽出液とした。これを添付の希釈液で２倍に希釈し、２５μｌずつ９６ウエルＶ型マイクロプレートに３３ウエルに入れた。３ウエルにはそれぞれ、ＶＴ１用感作ラテックス、ＶＴ２用感作ラテックス、対照用ラテックスを２５μｌずつ添加した。マイクロプレート用ミキサーで十分振とう後、室温に２４時間静置後、Ｖ型プレートに凝集像が観察された場合を陽性、沈降像が観察された場合を陰性と判定した。
【００３８】
実施例２　核酸増幅のための検体の調製法
ハートインフージョン培地で培養し、増殖した大腸菌１４４株と大腸菌以外の細菌３７株のコロニーを滅菌した綿棒で採取後、生理食塩水に懸濁し、６２０ｎｍでの吸光度で、菌の濃度を３．０ｘ　１０８　ｃｆｕ／ｍｌになるように調製した。この懸濁液をＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ　８．０）で３ｘ　１０７　ｃｆｕ／ｍｌに希釈し、９５℃で５分間熱処理を行ない、１２，０００　ｒｐｍ、４℃、１０分間の遠心分離し、上清を回収した。これを核酸増幅のための検体とした。
【００３９】
比較例２　ＰＣＲ法
ＰＣＲ法は食品・環境分析用Ｏ−１５７（ベロ毒素１型、２型遺伝子）ＰＣＲ　Ｔｙｐｉｎｇ　Ｓｅｔ（宝酒造社製）を、添付の能書記載の方法で使用した。
１　ＰＣＲ反応液
実施例２で作成した検体をＴＥ緩衝液で希釈し、キットのチューブに１．２Ｘ１０５ｃｆｕになるように添加した。
２　ＰＣＲ反応条件
ＤＮＡサーマルサイクラーＢｉｏｍｅｔｒａ　Ｔ３　Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社製）を用いて下記のようにＰＣＲ反応を行った。
変性反応：９４℃、１分
アニーリング反応：５５℃、１分
伸長反応：７２℃、１分
変性反応からアニーリング反応を経て伸長反応に至る過程を１サイクルとし、これを３５サイクル総所要時間約３時間行った。
【００４０】
３　電気泳動による検出
特異的に増幅されたＰＣＲ産物を検出するため、２％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル電気泳動を行った。ゲルには１レーン当たりＰＣＲ反応液５　μｌと６倍濃度Ｌｏａｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（ニッポンジーン社製）１　μｌを混合したものを全量アプライした。１００Ｖの定電圧で、５０分電気泳動を行い、電気泳動後のゲルを０．５　μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド溶液で染色した。検出はＵＶトランスイルミネーター下でバンドの有無と、ＤＮＡサイズマーカーから増幅産物の塩基長を確認した。ＶＴ１の特異的増幅産物は３４６ｂｐ、ＶＴ２の特異的増幅産物は４０４ｂｐであり、これらのバンドが認められた場合には陽性、認められない場合には陰性とした。
【００４１】
実施例３　ＬＡＭＰ法プライマーの合成
以下の配列のオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ合成を専門に取り扱う機関に委託し、慣用された方法で合成した。合成後の精製は、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで行った。
2004081054.tif 000002
【００４２】
実施例４　ＬＡＭＰ法
ＬＡＭＰ法はＶＴ１遺伝子検出と、ＶＴ２遺伝子検出、さらにＶＴ１とＶＴ２遺伝子の検出の３種の実験を別々に行った。
１　ＬＡＭＰ各試薬濃度
使用した各試薬の内容は次の通りである。
検体：実施例２で作成した検体
緩衝液：ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ　（　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製）
Ｂｅｔａｉｎｅ溶液：５Ｍ　Ｂｅｔａｉｎｅ
ＭｇＳＯ４溶液：１００ｍＭ　ＭｇＳＯ４
ＥｔＢｒ溶液：６．２５　μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド溶液
基質溶液：ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ各濃度１０ｍＭ
プライマー：各プライマー単独でそれぞれ１００　ｐｍｏｌ／μｌ　水溶液
ＢＳＡ溶液：２０％Ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）
ＤＮＡポリメラーゼ：Ｂｓｔ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｌａｒｇｅ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ（８　ｕｎｉｔｓ／μｌ、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製）
【００４３】
２　ＬＡＭＰ反応液組成
ＶＴ１検出用反応組成
検体：５　μｌ
緩衝液：２．５　μｌ
Ｂｅｔａｉｎｅ溶液：２μｌ
ＭｇＳＯ４溶液：０．５　μｌ
ＥｔＢｒ溶液：１　μｌ
基質溶液１　μｌ
ＢＳＡ溶液：５μｌ
ＤＮＡポリメラーゼ：１　μｌ
インナープライマーＶＴ１−ＦおよびインナープライマーＶＴ１−Ｒ：各０．４μｌ
アウタープライマーＶＴ１−ＦおよびアウタープライマーＶＴ１−Ｒ：各０．１　μｌ
ループプライマーＶＴ１−Ｆ：０．２　μｌ
滅菌蒸留水：５．８　μｌを加え、全量２５μｌとした
【００４４】
ＶＴ２検出用反応組成
反応組成１と同じ組成を用いた。ただしプライマーと滅菌蒸留水は以下の通りである
インナープライマーＶＴ２−ＦおよびインナープライマーＶＴ２−Ｒ：各０．４μｌ、
アウタープライマーＶＴ２−ＦおよびアウタープライマーＶＴ２−Ｒ：０．１　μｌ、
ループプライマーＶＴ２−Ｆ１およびループプライマーＶＴ２−Ｆ２各０．２　μｌ、
滅菌蒸留水：５．６　μｌを加え、全量２５μｌとした
ＶＴ１およびＶＴ２検出用反応組成
反応組成１と同じ組成を用いた。ただしプライマーと滅菌蒸留水は以下の通りである
インナープライマーＶＴ１−Ｆ、インナープライマーＶＴ１−Ｒ、インナープライマーＶＴ２−ＦおよびインナープライマーＶＴ２−Ｒ：各０．４μｌ
アウタープライマーＶＴ１−Ｆ、アウタープライマーＶＴ１−Ｒ、アウタープライマーＶＴ２−ＦおよびアウタープライマーＶＴ２−Ｒ：各０．１　μｌ
ループプライマーＶＴ１−Ｆ、ループプライマーＶＴ２−Ｆ１およびループプライマーＶＴ２−Ｆ２：各０．２　μｌ
滅菌蒸留水：４．４　μｌを加え、全量２５μｌとした
【００４５】
３　ＬＡＭＰ反応条件
ＬＡＭＰ反応は６５℃の等温で３０分間行った。連続蛍光光度計ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて蛍光強度を反応開始から経時的に観察し、蛍光強度が上昇するものを陽性、蛍光強度の上昇が認められないものを陰性とした。ＶＴ１用プライマーを用いるとＶＴ１遺伝子が存在すると陽性に、ＶＴ２用プライマーを用いるとＶＴ２遺伝子が存在すると陽性になり、ＶＴ１用プライマーとＶＴ２用プライマーを同時に用いると、どちらかの遺伝子が存在すると陽性になる。
【００４６】
比較例３　ベロ細胞に対する毒性試験
ＲＰＬＡとＰＣＲ法の結果が乖離した検体について、ベロ細胞に対する毒性試験を行った。
比較例１で作成した抽出液１０μｌを９６ウエルプレートのウエルに分注し、２％子牛血清、０．０１％硫酸ゲンタマイシン、０．４％グルコース添加グルタミン含有ＭＥＭアール培地に浮遊させたＶｅｒｏ細胞を各ウエル約１００００個／１５０μｌづつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で１週間培養し、細胞の生死を鏡検で確認し、細胞が死んだ場合ベロ毒性陽性とした。
【００４７】
結果
ＲＰＬＡでＶＴ１を産生し、ＶＴ２を産生していない事を確認した大腸菌２５株を表１に、ＲＰＬＡでＶＴ１を産生せず、ＶＴ２を産生している事を確認した大腸菌１３株を表２に、ＲＰＬＡでＶＴ１、ＶＴ２共に産生している事を確認した大腸菌１９株を表３に、ＲＰＬＡでＶＴ１、ＶＴ２共に産生していない事を確認した大腸菌８９株を表４に、大腸菌以外の細菌３７株を表５に示した。
結果はＲＰＬＡでは凝集で、ＰＣＲ法では増幅で存在を確認できたＶＴの番号を示した。ＬＡＭＰ法では増幅を、ベロ細胞に対する毒性試験では毒性が確認できたものを＋、できなかったものを−とした。またＮＤはその試験を行わなかった事を示す。
【００４８】
表１のＶＴ１産生、ＶＴ２非産生大腸菌、表２のＶＴ１非産生、ＶＴ２産生大腸菌、表３のＶＴ１産生、ＶＴ２産生大腸菌、表５の大腸菌以外の細菌では、ＲＰＬＡ、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法の結果は一致した。表４のＲＰＬＡでＶＴ１非産生、ＶＴ２非産生大腸菌と評価された大腸菌８６株のうち８株は、ＰＣＲ法およびＬＡＭＰ法ではＶＴ２遺伝子が存在するという結果だった。そこで確認のため結果の乖離した８株についてベロ細胞に対する毒性試験を行った。その結果８株全部で細胞毒性が確認され、ＬＡＭＰ法とＰＣＲ法の結果と一致し、本発明はＲＰＬＡよりも信頼性が高いことが証明された。
さらに本発明のプライマーは、ＶＴ１とＶＴ２に対するプライマーを混合して使っても、ＶＴ１あるいはＶＴ２プライマー単独使でと同じ結果を示し、１回の試験でＶＴ１とＶＴ２の少なくともどちらかが存在するか否かを確認できる。
【００４９】
【表１】ＶＴ１産生、ＶＴ２非産生大腸菌
2004081054.tif 000003
2004081054.tif 000004
【００５０】
【表２】ＶＴ１非産生、ＶＴ２産生大腸菌
2004081054.tif 000005
【００５１】
【表３】ＶＴ１産生、ＶＴ２産生大腸菌
2004081054.tif 000006
【００５２】
【表４】ＶＴ１非産生、ＶＴ２非産生大腸菌
2004081054.tif 000007
2004081054.tif 000008
2004081054.tif 000009
2004081054.tif 000010
【００５３】
【表５】大腸菌以外の細菌
2004081054.tif 000011
2004081054.tif 000012
【００５４】
【発明の効果】
本発明は、オリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＬＡＭＰ法により腸管出血性大腸菌ＶＴ遺伝子の増幅を確認する事により、ＶＴ産生腸管出血性大腸菌を検出するものである。従来のＰＣＲ法は電気泳動を必要とし、検出までの総所要時間が約４．５時間かかるのに対し、本発明のプライマーを用いたＬＡＭＰ法は、電気泳動を必要とせず操作は簡便で、検出までに３０分と迅速である。
【００５５】
【配列表】
2004081054.tif 000013
2004081054.tif 000014
2004081054.tif 000015
2004081054.tif 000016
2004081054.tif 000017
2004081054.tif 000018
2004081054.tif 000019
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