(57)【要約】【課題】誤判定の可能性が低く、かつ実用上十分な増幅効率と増幅特異性を有する、高性能なビブリオブルニフィカス検出・定量・同定用特異遺伝子増幅プライマーを作製すること。【解決手段】本発明者等は、ビブリオブルニフィカス及びその近縁種のｇｙｒＢ遺伝子、ｒｐｏＤ遺伝子、及びｒｅｃＡ遺伝子の部分塩基配列を決め、その系統関係を明らかにし、ビブリオブルニフィカスに特徴的塩基を同定し、これを含む高特異性を有するプローブ、及び高特異性を有しかつ増幅効率に優れた遺伝子増幅用プライマーを設計することを可能とした。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表中の配列番号１のＤＮＡジャイレースβサブユニットをコードする遺伝子（ｇｙｒＢ）中でビブリオ　ブルニフイカス菌群に特有な次の位置番号３、１５、６９、９５、１２１、１２３、１３２、１３６、１３８、１３９、２３１、４２４、５４９、５５７、６０３、７００、７０１、７２６、７２７、７２８、７３４、７３５、７３８、又は８０４のいずれかの塩基を含む、特異的な遺伝子増幅プライマー又はプロープの設計に用いることができる配列番号１で表される遺伝子の断片。
【請求項２】
配列表中の配列番号１のＤＮＡジャイレースβサブユニットをコードする遺伝子（ｇｙｒＢ）中で、ビブリオ　ブルニフイカス菌群に特有な次の位置番号３、１５、６９、９５、１２１、１２３、１３２、１３６、１３８、１３９、２３１、４２４、５４９、５５７、６０３、７００、７０１、７２６、７２７、７２８、７３４、７３５、７３８、又は８０４のいずれかの塩基を含む連続する１５塩基以上を含む鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー。
【請求項３】
請求項２で指定されたビブリオ　ブルニフイカスに特有な位置を高頻度で含む領域を用いることを特徴とする請求項２記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項４】
配列表中の配列番号１の位置番号３及び１５の位置の塩基を含む鎖又はその相補鎖を含む請求項３記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項５】
配列表中の配列番号１の位置番号１２１、１２３、１３２、１３６、１３８、又は１３９の位置のいずれか２以上の塩基を含む鎖又はその相補鎖を含む請求項３記戟の遺伝子増幅プライマー。
【請求項６】
配列表中の配列番号１の位置番号５４９及び５５７の位置の塩基を含む鎖又はその相補鎖を含む請求項３記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項７】
配列表中の配列番号１の位置番号７００及び７０１の位置の塩基を含む鎖又はその相補鎖を含む請求項３記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項８】
配列表中の配列番号１の位置番号７２６、７２７、７２８、７３４、７３５、又は７３８の位置のいずれか２以上の塩基を含む鎖又はその相補鎖を含む請求項３記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項９】
３｀末端の塩基が該ビブリオ　ブルニフイカスに特有な請求項２で特定される位置番号の塩基であることを特徴とする請求項２記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項１０】
５’−ｇｔｇｔｃｔｇｇｃｇｇｔｃｔｔ−３’及び対応する相補鎖を含む請求項２記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項１１】
５’−ｇａｔｇｃａｃｃｇｃｔｔｇｃｔａｔｃａｔｃ−３’及び対応する相補鎖を含む請求項２記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項１２】
５’・ｔｇｃｇｇａｃｔｔｙａｃｔｔｃｒｃｔ−３’及び対応する相補鎖を含む請求項２記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項１３】
５’・ｇｔｃｃａｔｇｔａｇｃｔｇｔｔｃａｒｔ−３’及び対応する相補鎖を含む請求項２記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項１４】
５’−ｔｔｇｔｃｔｇｃｃａｔｇａａｇｇａｔｔｃｃ−３’及び対応する相補鎖を含む請求項２記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項１５】
配列表中の配列番号１のＤＮＡジャイレースβサブユニットをコードする遺伝子（ｇｙｒＢ）中で、ビブリオ　ブルニフイカス菌群に特有な次の位置番号３、１５、６９、９５、１２１、１２３、１３２、１３６、１３８、１３９、２３１、４２４、５４９、５５７、６０３、７００、７０１、７２６、７２７、７２８、７３４、７３５、７３８、又は８０４のいずれかの塩基を含む連続する１５塩基以上を含むビブリオ　ブルニフイカス検出、定量又は同定用プローブ。
【請求項１６】
配列表中の配列番号２のＲＮＡポリメレースσ７０因子をコードする遺伝子（ｒｐｏＤ）中で、ビブリオ　ブルニフイカス菌群に特有な次の位置番号２１、３３、６０、１２０、１２６、２３５、２６０、３１２、３１５、３４０、３５４、３９６、４１４、４５９、４６２、５７０、６８６、６８９、７３２、７５０、又は７５６のいずれかの塩基を含む、特異的な遺伝子増幅プライマー又はプローブの設計に用いることができる配列番号２で表される遺伝子の断片。
【請求項１７】
配列表中の配列番号２のＲＮＡポリメレースσ７０因子をコードする遺伝子（ｒｐｏＤ）中で、ビブリオ　ブルニフイカス菌群に特有な次の位置番号２１、３３、６０、１２０、１２６、２３５、２６０、３１２、３１５、３４０、３５４、３９６、４１４、４５９、４６２、５７０、６８６、６８９、７３２、７５０、又は７５６のいずれかの塩基を含む連続する１５塩基以上を含む鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー。
【請求項１８】
請求項１７で指定されたビブリオ　ブルニフイカスに特有な位置を高頻度で含む領域を用いることを特徴とする請求項１７記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項１９】
配列表中の配列番号２の位置番号２１及び３３の位置の塩基を含む鎖又はその相補鎖を含む請求項１８記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項２０】
配列表中の配列番号２の位置番号１２０及び１２６の位置の塩基を含む鎖又はその相補鎖を含む請求項１８記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項２１】
配列表中の配列番号２の位置番号３１２及び３１５の位置の塩基を含む鎖又はその相補鎖を含む請求項１８記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項２２】
配列表中の配列番号２の位置番号３４０及び３５４の位置の塩基を含む鎖又はその相補鎖を含む請求項１８記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項２３】
配列表中の配列番号２の位置番号３９６及び４１４の位置の塩基を含む鎖又はその相補鎖を含む請求項１８記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項２４】
配列表中の配列番号２の位置番号４５９及び４６２の位置の塩基を含む鎖又はその相補鎖を含む請求項１８記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項２５】
配列表中の配列番号２の位置番号６８６及び６８９の位置の塩基を含む鎖又はその相補鎖を含む請求項１８記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項２６】
配列表中の配列番号２の位置番号７３２、７５０、又は７５６の位置のいずれか２以上の塩基を含む鎖又はその相補鎖を含む請求項１８記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項２７】
３’末端の塩基が該ビブリオ　ブルニフイカスに特有な請求項１７で特定される位置番号の塩基であることを特徴とする請求項１７記載の遺伝子増幅プライマー
【請求項２８】
５’−ａａｔｃｇａｃａｔｃｇｃｔａａｍｃｇａ−３’及び対応する相補鎖を含む請求項１７記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項２９】
５’−ｇｔｔｃｇａｃａａａｇｔａｃａａｇｃｇ−３’及び対応する相補鎖を含む請求項１７記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項３０】
５’−ｔｃａａｇｃａｇｙｇａｔｔｃａｇａｇ−３’及び対応する相補鎖を含む請求項１７記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項３１】
５’−ａａｔｇｇｃｇｃｔａｇａｇａａｇ−３’及び対応する相補鎖を含む請求項１７記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項３２】
５’−ｃｋｔｒａａｔｇａａｃａｔｇｇｔｃｇａ−３’及び対応する相補鎖を含む請求項１７記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項３３】
５’−ｇａａｃｔｇａｔｇｃｔｃｇａｔｇｔｇｔｔｔ−３’及び対応する相補鎖を含む請求項１７記戟の遺伝子増幅プライマー。
【請求項３４】
５’−ａａｔｇｔｃｔｔｃｔｔｃｇｔｇｍａｇｙｔ−３’及び対応する相補鎖を含む請求項１７記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項３５】
５’−ｔｔｇａｔｇｔｔｇｙｔｙａｃｔｇａａａｇｃ−３’及び対応する相補鎖を含む請求項１７記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項３６】
配列表中の配列番号２のＲＮＡポリメレースσ７０因子をコードする遺伝子（ｒｐｏＤ）中で、ビブリオ　ブルニフイカス菌群に特有な次の位置番号２１、３３、６０、１２０、１２６、２３５、２６０、３１２、３１５、３４０、３５４、３９６、４１４、４５９、４６２、５７０、６８６、６８９、７３２、７５０、又は７５６のいずれかの塩基を含む連続する１５塩基以上を含むビブリオ　ブルニフイカス検出、定量又は同定用プローブ。
【請求項３７】
配列表中の配列番号３のＲｅｃＡをコードする遺伝子（ｒｅｃＡ）中で、ビブリオ　ブルニフイカス菌群に特有な次の位置番号９、８１、１３８、１５３、１７２、１８０、２０８、２２８、２３７、２８８、又は５４０のいずれかの塩基を含む、特異的な遺伝子増幅プライマー又はプローブの設計に用いることができる配列番号３で表される遺伝子の断片。
【請求項３８】
配列表中の配列番号３のＲｅｃＡをコードする遺伝子（ｒｅｃＡ）中で、ビブリオブルニフイカス菌群に特有な次の位置番号９、８１、１３８、１５３、１７２、１８０、２０８、２２８、２３７、２８８、又は５４０のいずれかの塩基を含む連続する１５塩基以上を含む鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー。
【請求項３９】
請求項３８で指定されたビブリオ　ブルニフイカスに特有な位置を高頻度で含む領域を用いることを特徴とする請求項３８記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項４０】
配列表中の配列番号３の位置番号１３８、１５３の位置の塩基を含む鎖又はその相補鎖を含む請求項３９記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項４１】
配列表中の配列番号３の位置番号１７２及び１８０の位置の塩基を含む鎖又はその相補鎖を含む請求項３９記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項４２】
配列表中の配列番号３の位置番号２０８、２２８、２３７の位置のいずれか２以上の塩基を含む鎖又はその相補鎖を含む請求項３９記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項４３】
３’末端の塩基が該ビブリオ　ブルニフイカスに特有な請求項３９で特定される位置番号の塩基であることを特徴とする請求項３９記載の遺伝子増幅プライマー
【請求項４４】
５’−ｃｃｔｇｔｇｔａｔｇｃｇａａｇａａｒｃｔｔ−３’及び対応する相補鎖を含む請求項３８記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項４５】
５’−ｔａｔｃｇａｃｃａｒｔｔｒｔｔｇｇｔａ−３’及び対応する相補鎖を含む請求項３８記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項４６】
５’−ａａｇｍｇｃａｔｃａｃａｇａｔｔｔｃｃａａ−３’及び対応する相補鎖を含む請求項３８記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項４７】
５’−ｔｃａａｃｃｇｃｍｃｃｔｇａｇｃｇａｇｃａ−３’及び対応する相補鎖を含む請求項３８記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項４８】
配列表中の配列番号３のＲｅｃＡをコードする遺伝子（ｒｅｃＡ）中で、ビブリオ　ブルニフイカス菌群に特有な次の位置番号９、８１、１３８、１５３、１７２、１８０、２０８、２２８、２３７、２８８、又は５４０のいずれかの塩基を含む連続する１５塩基以上を含むビブリオ　ブルニフイカス検出、定量又は同定用プローブ。
【請求項４９】
請求項２−１４、１７−３５、３８−４７のいずれか１項に記載のプライマーを用いるビブリオ　ブルニフイカスを検出、定量又は同定する方法。
【請求項５０】
請求２−１４、１７−３５、３８−４７のいずれか１項に記載のプライマーを用いるビブリオ　ブルニフイカスを検出、定量又は同定するキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、食品検査、疫学的環境検査、並びに臨床検査における、ビブリオ　ブルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ　ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）の検出・同定・計数方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ビブリオ　ブルニフィカスは、海水や汽水域に生息する好塩性グラム陰性細菌である。健康人への感染は稀であるが、肝硬変などの重度の基礎疾患を持つ患者には感染して重篤な感染症を起こすことがあり、死亡例を伴う感染菌として公衆衛生の立場から注目されている。本菌による感染症は１９７０年にＲｏｌａｎｄにより下肢壊疽から分離された（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．，、　２８２，　１３０６　、１９７０）のが最初の報告例であるが、当初は腸炎ビブリオの腸管外感染例とされていた。その後、この菌が大腸菌などと比較して反応が遅いが乳糖分解能をもつこと、８％食塩の存在下では増殖できないことなどが明らかになり、１９７９年Ｆａｒｍｅｒによりビブリオブルニフィカスと命名された（Ｌａｎｃｅｔ，　ｉｉ，　９０３　、１９７９）。
【０００３】
本菌は生物学的性状から生物型１〜３型に分類されている（Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　６３，　１４６０−１４６６　　１９９７、　Ｌａｎｃｅｔ，　３５４，　１４２１−１４２４　　２０００）。ヒトの感染症から分離されるのは主として１型であり、２型は主に魚の病原菌として分離される。また、３型は１９９６年〜１９９７年に起きたイスラエルでの集団感染の病原菌として分離された（Ｌａｎｃｅｔ，　３５４，　１４２１−１４２４　　２０００）。
本菌による感染様式には経口感染型と創傷感染型がある。経口感染は主として夏場に生の魚介類を喫食することにより感染し、２４時間以内に発熱、腹痛、下痢、嘔吐などの消化器病の症状を経た後に敗血症を併発し、平均４８時間で死に至る。死亡率は５０〜７０％と非常に高い。また、創傷感染は創傷への海水の接触により感染し、１２時間の潜伏期問を経て１週間以内に発症する。致死率は経口感染よりは低く２５％である。米国では１９８８年〜１９９６年までに２２州で４２２事例の報告があり、その感染源は、米国の食習慣から生牡蠣摂取による場合が多数を占めている。一方、我が国でも関東以西の太平洋側で約９０事例の報告があり、刺身、鮨など生の魚介類の喫食が感染の主な原因となっている。最近では、２００１年７月に熊本で、生のシャコ、コチの喫食により４名が感染し、うち２名が死亡するなど、魚介類の生食文化を有するわが国では、ビブリオブルニフィカス感染症は警戒すべき感染症であるといえる。
【０００４】
本菌の選択的分離には、主として腸炎ビブリオ同様ＴＣＢＳ寒天培地が用いられてきた。ビブリオブルニフィカスは、ＴＣＢＳ培地上で腸炎ビブリオとよく似た緑青色のコロニーを形成し、その判別のためには種々の生化学的性状の確認を行う必要があり、煩雑である上誤判定の危険を伴っている。一方で、ＳＰＳ　ａｇａｒ　（ＳＤＳ−ｐｏｌｙｍｉｘｉｎ　Ｂ　ｓｕｃｒｏｓｅ　ａｇａｒ）培地（ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｌｅｔｔ．，　１７，　２０５−２０９　１９８３）やｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ−ｃｏｌｌｉｓｔｉｎ　ａｇａｒ培地（Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　６４，　１７２１−１７２４　１９９８）などの改良選択分離培地も報告されているが、生化学的性状の確認作業を行うことに変わりは無い。
【０００５】
一方、これまでに、他の食中毒菌と同様に、遺伝子工学的手法を応用したビブリオブルニフィカスの検出法が幾つか開発されている。ｗｚａは、莢膜多糖ＣＰＳ（ｃａｐｓｕｌａｒ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）をペリプラズムから外膜へ移動させるのに必要なトランスポーターをコードする遺伝子としてＥ．ｃｏｌｉで見出された遺伝子である。ビブリオブルニフィカス　では莢膜の無い株がマウスに対する毒性を示さないこと、および、ｗｚａ欠損株がマウスに対する病原性を失うこと（Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．　６９，　６８９３−６９０１　　２００１）から、病原性の一つと考えられている。そこで、病原性を持つビブリオブルニフィカスを検出する手段としてｗｚａ遺伝子を標的としたプライマーがＷｒｉｇｈｔらによって開発された（Ｕ．Ｓ．　Ｐａｔｅｎｔ　６１８３９７３，　Ｆｅｂ．，　６，　２００１）。しかし、ビブリオブルニフィカスの病原因子はＣＰＳに限られないため、病原性を持つビブリオブルニフィカスを全て検出できるとは限らない。また、同じくビブリオブルニフィカスの病原性因子の一つとされているヘモリシン遺伝子（ｖｖｈ　：Ｖｉｂｒｉｏ　ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ　ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ）を標的としたプライマーが開発されている（Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　５７，　７０７−７１１　　１９９１）。このプライマーはｖｖｈ遺伝子がビブリオブルニフィカスに特異的な遺伝子であるものとして設計されているが、一方でＶ．　ｃｈｏｌｅｒａｅやＶ．　ｍｉｍｉｃｕｓが有するヘモリシン遺伝子もｖｖｈ遺伝子と相同性を示すことが報告されており（Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．　５８，　２７０６−２７０９　　１９９０、　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．　６５，　１８３０−１８３５　　１９９７）、さらにプライマーの設計にあたり、これらのヘモリシン遺伝子との比較が行われていないことから、特異性の検証が十分とは言えない。
以上のように、既存の遺伝子を用いたビブリオブルニフィカス検出方法は、特異性が十分とは言えないものであった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従来の遺伝子検査方法に共通している点は、細菌の「種」が遺伝的な多様性を内包する集団である事を無視していることである。ある細菌集団のメンバーと推測される１菌株の塩基配列を、その集団共通の、あるいは代表する配列として用いる事は、中立的変異を速やかに蓄積する遺伝子の分子進化の性質上大変危険である。即ち、本来検出されるべき菌株がプライマー領域の僅かな変異の為に増幅が阻害されて検出されなかったり、プライマーの特異性が十分でないために検出されるべきでない近縁株が検出されるといった誤判定の原因になる事が危惧される。そこで、特異性のバックグラウンドが証明されており、誤判定の可能性が低く、かつ実用上十分な増幅効率と増幅特異性を有する、高性能なビブリオブルニフィカスの検出・同定・定量用特異遺伝子増幅プライマー及びプローブの作成が必要とされていた。
【０００７】
【発明の実施の形態】
細菌のある系統群の遺伝子を特異的に検出する方法を作成する為には、検出しようとする生物群、ならびにその系統的に近縁な生物群の塩基配列をなるべく多数収集する必要がある。また、特異検出のターゲットとする遺伝子は、最も近縁の生物とも判別可能なように、十分に異なる塩基配列を有している必要がある。この為には、十分に早い進化速度を有していなくてはならない。また、高頻度に水平伝播する遺伝子（たとえば腸炎ビブリオの毒素遺伝子）の様に、系統とは無関係に存在する遺伝子は用いる事が出来ない。本発明でターゲットとして用いたｇｙｒＢ遺伝子、ｒｐｏＤ遺伝子及びｒｅｃＡ遺伝子がコードするタンパク質は、生存に必須なタンパク質である。この為、水平伝播し難く、また適度な進化速度を有しているため、細菌の系統解析に適している。発明者らは、既にｇｙｒＢ遺伝子及びｒｐｏＤ遺伝子のＰＣＲダイレクトシークエンス法による簡便な塩基配列の決定方法を開発している（特開平０７−２１３２２９、特開平０８−２５６７９８）。
【０００８】
さらに、発明者らは、既に多数のビブリオブルニフィカスを環境より単離しており、他方に、公知のビブリオブルニフィカス保存株及び、１６Ｓ　ｒＲＮＡ配列に基づく解析により本菌に近縁であることが報告されているＶ．ｎａｖａｒｒｅｎｓｉｓ，　Ｖ．ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ，　Ｖ．ｏｒｄａｌｉｉ，　Ｌｉｓｔｏｎｅｌｌａ　ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ，　Ｖ．ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｖｉｉ，　Ｖ．ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉｅｎｓｉｓ，　Ｖ．ｍｉｍｉｃｕｓ，　Ｖ．ｃｈｏｒｅｌａｅ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ａｎｄ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　５１，　１４４９−１４５６（２００１））　について、下記表１に示される菌株のｇｙｒＢ、ｒｐｏＤおよびｒｅｃＡ遺伝子の部分塩基配列を解析し、その配列に基づいた分子系統解析を行い、その系統関係を明らかとした。
【０００９】
【表１】
2004089076.tif 000002
【００１０】
即ち、上記表１に示される供試菌株を２％ＮａＣｌ添加ブレインハートインフュージョン培地で増菌培養した後に、ＰＵＲＥＧＥＮＥ　ＤＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（　Ｇｅｎｔｒａ　ＳＹＳＴＥＭＳ　）を用いて染色体ＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを鋳型として、ｇｙｒＢ増幅ユニバーサルプライマーＵＰ−１Ｅ（５’−ｃａｇｇａａａｃａｇｃｔａｔｇａｃｃａｙｇｓｎｇｇｎｇｇｎａａｒｔｔｙｒａ−３’）およびＡｐｒＵ（５’−ｔｇｔａａａａｃｇａｃｇｇｃｃａｇｔｇｃｎｇｇｒｔｃｙｔｔｙｔｃｙｔｇｒｃａ−３’）を用いて約９００ｂｐ（大腸菌Ｋ−１２株上の塩基配列上のポジション３３１　−　１２１２；　アミノ酸配列ではポジション１１１から　４０４に相当する領域）のｇｙｒＢ遺伝子断片をＰＣＲ増幅した。また同様にｒｐｏＤ増幅ユニバーサルプライマー７０Ｆ−Ｍ１３（５’−ｃａｇｇａａａｃａｇｃｔａｔｇａｃｃｙａｔｇｍｇｎｇａｒａｔｇｇｇｎａｃｎｇｔ−３’）および７０Ｒ−Ｍ１３（５’−ｔｇｔａａａａｃｇａｃｇｇｃｃａｇｔｎｇｃｙｔｃｎａｃｃａｔｙｔｃｙｔｔｙｔｔ−３’）を用いて約８００ｂｐ（大腸菌Ｋ−１２株上の塩基配列上のポジション３３４　−　１１２５；　アミノ酸配列ではポジション１１２から　３７６に相当する領域）のｒｐｏＤ遺伝子断片をＰＣＲ増幅した。さらに、ｒｅｃＡ遺伝子増幅ユニバーサルプライマーｒｅｃＵＦおよびｒｅｃＵＲ（ｒｅｃＵＦ　：　ｃａｇｇａａａｃａｇｃｔａｔｇａｃｃａｔｇｇａｙｇｔｎｇａｒａｃｎａｔ，ｒｅｃＵＲ：ｔｇｔａａａａｃｇａｃｇｇｃｃａｇｔｔａｎｓｗｒｔａｃｃａｎｇｃｎｃｃ　）を用いて６４８ｂｐ（大腸菌Ｋ−１２株上の塩基配列ポジション１７２−８１９；アミノ酸配列ではポジション５８−２７３に相当する領域）のｒｅｃＡ遺伝子断片をＰＣＲ法により増幅した。増幅反応は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏ１：Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用い、ＧＥＮＥ　ＭＡＴＥサーマルサイクラー（ＩＳＣ　ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ）を使用して行った。反応液はＤＮＡ１μｇ，５０ｍＭＫＣｌ，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．３，１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．０１％ゼラチン、各０．２ｍＭのｄＮＴＰ，２．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ、プライマー各１μＭを含む溶液を５０μｌに調製した。反応条件は、ＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄの活性化（９５℃・１０分間）に続いて、９４℃・１分間、アニール（ｇｙｒＢ、ｒｐｏＤは５６℃、ｒｅｃＡは５４℃）１分問、７２℃・２分聞の反応を４０サイクル行った後に、７２℃・１０分間の伸長反応を行った。得られたＰＣＲ産物は、１％アガロースゲル（ＳｅａＰｌａｑｕｅ　ＧＴＧ　ａｇａｒｏｓｅ：ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ製）で電気泳動（Ｏ．５ｘＴＡＥ、１００Ｖ・３０分間）後、臭化エチジウムで１０分間染色した。紫外線照射下で増幅産物の存在を確認し、ゲルより切り出した後、Ｗｉｚａｒｄ　ＰＣＲ　Ｐｒｅｐｓ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いて精製し、シーケンス反応の鋳型とした。シーケンス反応は、ユニバーサルプライマーに予め付加してあるＭ１３Ｒ（５’−ＣＡｇｇＡＡＡＣＡｇＣＴＡＴｇＡＣＣ−３’）、Ｍ１３−２１配列（５’−ＴｇＴＡＡＡＡＣｇＡＣｇｇＣＣＡｇＴ−３’）をプライマーとして、ＡＢＩ　ＰＲ１ＳＭ　ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用い、ＧＥＮＥ　ＭＡＴＥサーマルサイクラー（ＩＳＣ　ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ）を使用して行った。反応液は、ＤＮＡ２０ｎｇ、プライマー３．２ｐｍｏ１、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｉｘ８μｌを混合し、最終体積２０μｌに調製した。サイクルシーケンス反応は、９２℃・１０分聞の加熱後、９６℃・１０秒、５０℃・５秒、６０℃・４分の反応を２５サイクル行った。塩基配列の解析にはＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３１０　ＧＥＮＥＴＩＣ　ＡＮＡＬＹＺＥＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いた。得られた塩基配列を用いて分子系統解析を行うにあたり、ビブリオブルニフイカスの近縁種をより正確に把握するために、ｇｙｒＢ、ｒｐｏＤおよびｒｅｃＡ遺伝子部分配列を結合させた後に解析を実施した。即ち、上記３遺伝子配列を結合した上でＣ１ｕｓｔａｌ　Ｗコンピュータプログラムを用いて多重アラインメント解析を行った後、ＰＨＹＬＩＰコンピュータプログラムパッケージを用い、木村の２パラメーターモデル（Ｊ．Ｍｏ１．Ｅｖｏｌ、（１９８０）Ｖｏ１．１６，Ｎｏ．２，ｐ．１１１−２０）で算出した遺伝的距離に基づいて近隣結合法（Ｍｏ１．Ｂｉｏ１．Ｅｖｏ１．Ｖｏ１．４，Ｎｏ，４，４０６−４２５）により分子系統樹を作製した。
【００１１】
この結果、ビブリオブルニフイカスは解析に供した全ての株が、ビブリオ属菌株中で独立した単系統をなすことが明らかとなった（図１）。即ち、この系統に属する細菌群がビブリオブルニフイカスと判定されるべきことが示唆された。
【００１２】
そこで、ビブリオブルニフィカス菌群のみを検出可能な遺伝子検査法を確立するために、まず、近縁種間の塩基配列の差異を明らかとした。即ち、ビブリオブルニフィカス群内では保存され、他のビブリオ属細菌とは異なっている塩基の位置を同定した。具体的には、ビブリオブルニフィカスが属する系統群のコンセンサス配列を求めると共に、分子系統解析の結果から本系統に近縁であることが判明した図１中Ｃ１〜Ｃ３の系統のコンセンサス配列を比較し、系統特異的情報図を作成した（図２、３、４）。図２〜４より、ｇｙｒＢ遺伝子においては、配列表中の配列番号１の位置番号３、１５、６９、９５、１２１、１２３、１３２、１３６、１３８、１３９、２３１、４２４、５４９、５５７、６０３、７００、７０１、７２６、７２７、７２８、７３４、７３５、７３８又は８０４の位置、ｒｐｏＤ遺伝子においては配列中の配列番号２の位置番号２１、３３、６０、１２０、１２６、２３５、２６０、３１２、３１５、３４０、３５４、３９６、４１４、４５９、４６２、５７０、６８６、６８９、７３２、７５０又は７５６の位置、さらにｒｅｃＡ遺伝子においては配列表中の配列番号３の位置番号９、８１、１３８、１５３、１７２、１８０、２０８、２２８、２３７、２８８又は５４０の位置がビブリオブルニフィカスが属する系統に特異的であることが明らかとなった。これら特徴的塩基を含む本系統に特異的な配列を用いることにより、高特異性を有するプローブ及び高特異性を有しかつ増幅効率に優れた遺伝子増幅プライマーを設計することが可能となる。例えば、近縁種と塩基が相違する位置を必ず含むように、当該近縁種と相違する塩基を含む連続する１５塩基以上のｇｙｒＢ、ｒｐｏＤおよびｒｅｃＡ遺伝子の塩基配列、好適には２０塩基以上、更に好適には２０塩基以上４０塩基以下の連続するｇｙｒＢ、ｒｐｏＤおよびｒｅｃＡ遺伝子の塩基配列を用いてプライマーを設計することが可能となる。同様に、近縁種と塩基が相違する位置を必ず含むように、当該近縁種と相違する塩基を含む連続する１５塩基以上のｇｙｒＢ、ｒｐｏＤおよびｒｅｃＡ遺伝子の塩基配列、好適には２０塩基以上、更に好適には２０塩基以上で１００塩基以下の連続するｇｙｒＢ、ｒｐｏＤおよびｒｅｃＡ遺伝子の塩基配列を用いて、プローブを設計することが可能となる。さらに、当該プライマーおよびプローブの作成には、上記相違塩基を高頻度で含む領域、例えば、ｇｙｒＢ遺伝子においては、１２１、１２３、１３２、１３６、１３８、１３９のいずれかの位置を２以上含む領域、７２６、７２７、７２８、７３４、７３５、７３８のいずれかの位置を２以上含む領域、ｒｐｏＤ遺伝子においては、４５９、４６２を含む領域、７３２、７５０、７５６のいずれかの位置を２以上含む領域、さらにｒｅｃＡ遺伝子においては１３８、１５３を含む領域、２２８、２３７を含む領域が好適に使用できる。また、プライマーの場合、３末端がビブリオブルニフィカスに特異的な塩基であることが望ましい。本件発明は、これらプライマーおよびプローブを他の試薬と組み合わせたビブリオブルニフィカスの検出、定量又は同定用のキットを包含するものである。
【００１３】
本発明のプライマーの遺伝子増幅方法は、ＰＣＲ法に限定されない。プライマーの特異性に基づく特異増幅方法、あるいは増幅の特異的阻害方法に用いる事が可能である。また、同様に特異増幅プライマーと標識特異プローブの組み合わせによる定量増幅反応にも用いる事が出来る。また、本件発明のプローブは単独で用いる事も可能である。その使用方法は、固相あるいは液相に限定されない。
【００１４】
サイバーグリーンなどの増幅した二本鎖ＤＮＡを検出する試薬を用いて行なうリアルタイムＰＣＲやＦＲＥＴ等を応用したリアルタイムＰＣＲを行なう際のプライマー及びプローブとしても利用可能である。
【００１５】
【実施例】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。実施例はその一態様であり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
本発明により得られた、ビブリオブルニフィカスに特異的である領域を用いて設計した表２に示される遺伝子増幅用プライマーを用いた実施例を示す。
【００１６】
【表２】
2004089076.tif 000003
【００１７】
尚、請求項１１、１４、３３、３５、４４および４７に記載のプライマーはそれぞれ表２中のＶＦ１、ＶＲ１、ＶｒＦ２、ＶｒＲ２、ＶＶｒｅｃＦ２およびＶＶｒｅｃＲ２にあたる。
供試菌株から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行った。増幅反応は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏ１ｄ：Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用い、ＧＥＮＥ　ＭＡＴＥサーマルサイクラー（ＩＳＣ　ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ）を使用して行った。反応液はＤＮＡ　０．１μｇ、５０ｍＭ　ＫＣ１，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．３、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．０１％　ゼラチン、各０．２ｍＭのｄＮＴＰ、２．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ、プライマー（濃度は表３参照）を含む溶液を最終体積２０μｌに調製した。反応条件は、ＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄの活性化（９５℃・１０分間）に続いて、９４℃１分、アニール（ｇｙｒＢ遺伝子の場合６５℃、ｒｐｏＤ遺伝子の場合６３℃、ｒｅｃＡ遺伝子の場合６５℃）１分、７２℃１分を３５サイクル行い、最後に７２℃１０分の伸長反応を行った。プライマーの組み合わせと増幅反応条件を表３に示した。
【００１８】
【表３】
2004089076.tif 000004
【００１９】
増幅後の反応液５μｌを、１％アガロースゲル（アガロースＳ：（株）ニッポンジーン製）で電気泳動後（０．５ｘＴＡＥ、１００Ｖ・３０分間）、臭化エチジウムで染色し、紫外線照射下で遺伝子の増幅の有無を確認した。ｇｙｒＢ遺伝子を標的としたプライマーＶＦ１とＶＲ１、ｒｐｏＤ遺伝子を標的としたＶｒＦ２とＶｒＲ２、及びｒｅｃＡ遺伝子を標的としたＶＶｒｅｃＦ２とＶＶｒｅｃＲ２の組み合わせを用いて、表１に示した菌株由来のＤＮＡをＰＣＲ法によりスクリーニングした結果を表４に示す。図１においてビブリオブルニフィカスに属するとされた菌株由来のＤＮＡのみから増幅産物が確認され、共にビブリオブルニフィカスのみを検出可能であることが判明した。
【００２０】
【表４】
2004089076.tif 000005
【００２１】
【発明の効果】
本件発明のｇｙｒＢ、ｒｐｏＤ、及びｒｅｃＡ遺伝子プライマー及びプローブは、ビブリオブルニフィカスとの系統関係を把握した上で設計したものであるため、特異性を向上させる検討が行われており、検出精度という点で優れている。従って、食品、臨床検体などから菌を単離せず、近縁細菌種が夾雑している状況で直接検出する場合に有利になる。
【００２２】
【配列表】
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【００２３】
【配列表フリーテキスト】
配列番号４−２０は、プライマーである。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｇｙｒＢ、ｒｐｏＤおよびｒｅｃＡ遺伝子の部分配列を繋ぎ合わせた後に分子系統解析を行った結果を示した図。この図が近隣結合法による分子系統樹であり、ビブリオブルニフィカスが他のビブリオ属細菌とは異なった単一の系統に属していることを示しており図中にＶ．ｖ．という標記で記した。また、ビブリオブルニフィカス以外の系統をＣ１〜Ｃ４に分類した。Ｅ．　ｃｏｌｉ　Ｋ１２　及びＶ．　ｃｈｏｌｅｒａｅ　Ｎ　１６９６１株の遺伝子データはそれぞれＧｅｎ　ＢａｎｋデータベースのアクセションナンバーＮＣ００９１３，ＮＣ００２５０５を用いた。
【図２】図１で示したビブリオブルニフィカスが属するクラスターのｇｙｒＢ遺伝子のコンセンサス配列（上段）と近縁のクラスター（図１中のＣ１，２，３）のｇｙｒＢ遺伝子のコンセンサス配列（下段）を決定し比較した図。●で示した部位がビブリオブルニフィカスに特異的な塩基であることを示す。Ｄ＝Ａ又はＧ又はＴ、Ｈ＝Ａ又はＣ又はＴ、Ｖ＝Ａ又はＣ又はＧ、Ｒ＝Ａ又はＧ、Ｙ＝Ｃ又はＴ、Ｋ＝Ｇ又はＴ、Ｍ＝Ａ又はＣ、Ｓ＝Ｇ又はＣ、Ｗ＝Ａ又はＴ、Ｎ＝Ａ又はＧ又はＴ又はＣを示す。
【図３】図１で示したビブリオブルニフィカスが属するクラスターのｒｐｏＤ遺伝子のコンセンサス配列（上段）と近縁のクラスター（図１中のＣ１，２，３）のｒｐｏＤ遺伝子のコンセンサス配列（下段）を決定し比較した図。●で示した部位がビブリオブルニフィカスに特異的な塩基であることを示す。Ｄ＝Ａ又はＧ又はＴ、Ｈ＝Ａ又はＣ又はＴ、Ｖ＝Ａ又はＣ又はＧ、Ｒ＝Ａ又はＧ、Ｙ＝Ｃ又はＴ、Ｋ＝Ｇ又はＴ、Ｍ＝Ａ又はＣ、Ｓ＝Ｇ又はＣ、Ｗ＝Ａ又はＴ、Ｎ＝Ａ又はＧ又はＴ又はＣを示す。
【図４】図１で示したビブリオブルニフィカスが属するクラスターのｒｅｃＡ遺伝子のコンセンサス配列（上段）と近縁のクラスター（図１中のＣ１，２，３）のｒｅｃＡ遺伝子のコンセンサス配列（下段）を決定し比較した図。●で示した部位がビブリオブルニフィカスに特異的な塩基であることを示す。Ｄ＝Ａ又はＧ又はＴ、Ｈ＝Ａ又はＣ又はＴ、Ｖ＝Ａ又はＣ又はＧ、Ｒ＝Ａ又はＧ、Ｙ＝Ｃ又はＴ、Ｋ＝Ｇ又はＴ、Ｍ＝Ａ又はＣ、Ｓ＝Ｇ又はＣ、Ｗ＝Ａ又はＴ、Ｎ＝Ａ又はＧ又はＴ又はＣを示す。
【図１】
2004089076.tif 000016
【図２】
2004089076.tif 000017
【図３】
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【図４】
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