(57)【要約】【課題】有用なビセニスタチンを酵素学的に生産するために、ビセニスタチンの生合成に関与する酵素とその遺伝子を提供することが本発明の課題である。【解決手段】本発明により、ビセニスタチンの生合成酵素群をコードする遺伝子群であるｖｉｎクラスターの塩基配列が与えられた。更に本発明により、ｄＴＤＰ−ビセニサミンを基質としてビセニスタチンを生成する反応を触媒する糖転移酵素（ＶｉｎＣ酵素）、およびそれをコードする遺伝子である遺伝子（ｖｉｎＣ遺伝子）が与えられた。ＶｉｎＣ酵素は、有用なビセニサミンを酵素的に合成する目的で有用である。更にＶｉｎＣ酵素を用いることにより、これまでにないポリケチド配糖体を合成できる可能性も示された。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示す、塩基番号１−６４９９２で示す塩基配列からなることを特徴とする，遺伝子クラスター。
【請求項２】
以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
（ａ）配列表の配列番号４に示す、アミノ酸番号１−４１９で示すアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
（ｂ）糖転移酵素としての酵素活性を有し、（ａ）の一部が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項３】
請求項２記載のポリペプチドをコードする、遺伝子。
【請求項４】
以下の（ｃ）または（ｄ）に示す塩基配列からなることを特徴とする、遺伝子。
（ｃ）配列表の配列番号１に示す、塩基番号２７９０−４０４９で示される塩基配列からなることを特徴とする、遺伝子。
（ｄ）糖転移酵素としての酵素活性を有するポリペプチドをコードし、（ｃ）の一部が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなることを特徴とする、遺伝子。
【請求項５】
配列表の配列番号２に示す、アミノ酸番号１−３５５で示すアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項６】
配列表の配列番号３に示す、アミノ酸番号１−３２３で示すアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項７】
配列表の配列番号５に示す、アミノ酸番号１−２２６０で示すアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項８】
配列表の配列番号６に示す、アミノ酸番号１−３３６２で示すアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項９】
配列表の配列番号７に示す、アミノ酸番号１−３８０８で示すアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項１０】
配列表の配列番号８に示す、アミノ酸番号１−２３６で示すアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項１１】
配列表の配列番９に示す、アミノ酸番号１−３９７で示すアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項１２】
配列表の配列番号１０に示す、アミノ酸番号１−４９３で示すアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項１３】
配列表の配列番号１１に示す、アミノ酸番号１−３３０で示すアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項１４】
配列表の配列番号１２に示す、アミノ酸番号１−１５８で示すアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項１５】
配列表の配列番号１３に示す、アミノ酸番号１−４６９で示すアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項１６】
配列表の配列番号１４に示す、アミノ酸番号１−２９９で示すアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項１７】
配列表の配列番号１５に示す、アミノ酸番号１−３２７で示すアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項１８】
配列表の配列番号１６に示す、アミノ酸番号１−８２で示すアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項１９】
配列表の配列番号１７に示す、アミノ酸番号１−５２４で示すアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項２０】
配列表の配列番号１８に示す、アミノ酸番号１−４７８で示すアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項２１】
配列表の配列番号１９に示す、アミノ酸番号１−４１４で示すアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項２２】
配列表の配列番号２０に示す、アミノ酸番号１−５８３６で示すアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項２３】
ｄＴＤＰ−ビセニサミンを原料として、請求項２記載のポリペプチドからなる糖転移酵素を用いた触媒反応によりビセニスタチンを製造する、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビセニスタチンの生合成酵素クラスターおよびそれをコードする酵素遺伝子クラスターに関する。特に本発明は、ｄＴＤＰ−ビセニサミンを基質としてビセニスタチンを生成する反応を触媒する糖転移酵素であるＶｉｎＣ酵素、およびそれをコードする遺伝子であるｖｉｎＣ遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般にポリケチド化合物の生合成遺伝子については世界的に活発に研究されており、遺伝子の欠失、挿入などによる新物質創製研究も精力的に行われている。この状況にあって、新たな多様性を求めるために、単純ポリケチドだけだなく、複合型ポリケチドの生合成遺伝子が新規遺伝子資源として注目されて、幅広く検索されている。
【０００３】
ビセニスタチン（ｖｉｃｅｎｉｓｔａｔｉｎ）は、放線菌であるストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．　）ＨＣ−３４株により生産される抗腫瘍性抗生物質である。ヌードマウスによるヒト実験ガン試験により、ビセニスタチンはヒト大腸ガン細胞の増殖を顕著に抑制することが知られている。化学構造については、先ず平面構造及び糖部であるビセニサミン（ｖｉｃｅｎｉｓａｍｉｎｅ）の絶対配置について報告され、その後アグリコンの絶対立体配置が決定された。先ず本放線菌が同定されたが、本生産菌はストレプトミセス・ハルステディー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈａｌｓｔｅｄｉｉ）ＨＣ−３４とであると同定された。
【０００４】
その生合成経路としては、先ずグルタミン酸を原料として転移反応を含む一連の変換でポリケチドスターターが生合成され、その後、プロピオン酸及び酢酸を前駆体とする通常のポリケチド伸長反応により、特徴的な２０員環アグリコン部が生成されることが解明された。ビセニスタチンはグルコースに由来し、他のアミノ糖に近縁の反応により官能基変換され、メチオニン由来のＮ−メチル基の導入により生合成されることが明らかにされた。
【０００５】
更なる生合成工学的構造変換による新物質創製を行うために、ビセニスタチンの生合成遺伝子の同定が求められてきた。ラクタム型ポリケチド抗生物質は我が国を中心にいくつか発見されており、上記のような生合成前駆体に関する研究の報告例はあるが、遺伝子レベル・酵素レベルでの研究は全くなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
特異な２０員環ラクタム配糖体構造を有するビセニスタチンは、ヒト固形ガン細胞の増殖を実験ガンで顕著に抑制することからも注目すべき抗生物質である。現在までのところ、溶解性の問題及び若干の毒性の問題で実用化には到っていないが、今後化学的及び生合成工学的研究でこれらを克服すれば有用な医薬となりうると思われる。生合成工学的な有用物質の創製を目指して、特異な化学構造を生合成するシステムの解明と改変のために、最も基本となる生合成遺伝子であるビセニスタチン生合成遺伝子を得てその機能を解明することが本発明の課題である。
【０００７】
ビセニスタチンはアミノ糖を有する配糖体であり、全く同一のビゼニサミンを糖部に持つ化合物は存在しないが、類似アミノ糖の生合成遺伝子と近縁の遺伝子が機能しているであろうことが推定される。また、アグリコン部はその大部分を酢酸・プロピオン酸を原料とするポリケチドであることが公表されているので、いわゆるポリケチド合成酵素（ＫＳ）に類似の遺伝子の関与が推定できる。しかし、ポリケチドスターター部はグルタミン酸から由来する特異なアミノ酸であることが解明されており、そこには従来のポリケチド合成系の生合成遺伝子にはない遺伝子が関与していると推定される。
【０００８】
本発明においては、ポリケチド生合成に必須であり、各種のポリケチドで高い相同性が知られるケトシンターゼ（ＰＫＳ）、アミノ糖の類縁性、ならびにスターターの特異性を鍵として、ＰＣＲとハイブリダイゼーションを中心とする方法により、ビセニスタチンの生合成酵素遺伝子を探索した。その結果、ビセニスタチン最終構造を与えるのに必要な酵素群をコードする遺伝子群の同定と遺伝子塩基配列の解明に成功した。これは今後、遺伝子の改変、欠失、重複化、外部遺伝子導入等々の方法による、生合成工学的改変に大きな可能性を提供するものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の第一の観点として、配列表の配列番号１に示す、塩基番号１−６４９９２で示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子クラスターを提供する。
【００１０】
本発明の第二の観点として、配列表の配列番号４に示す、アミノ酸番号１−４１９で示すアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチドを提供する。糖転移酵素としての酵素活性を有し、その一部が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチドもまた、本発明の範囲内である。更に、上記のポリペプチドをコードする遺伝子もまた、本発明の範囲内である。
【００１１】
本発明の第三の観点として、配列表の配列番号１に示す、塩基番号２７９０−４０４９で示される塩基配列からなることを特徴とする遺伝子を提供する。糖転移酵素としての酵素活性を有するポリペプチドをコードし、その一部が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなることを特徴とする遺伝子もまた、本発明の範囲内である。
【００１２】
本発明の第四の観点として、ｄＴＤＰ−ビセニサミンを原料として、上記のポリペプチドからなる糖転移酵素を用いた触媒反応によりビセニスタチンを製造する、製造方法を提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
抗生物質ビセニスタチン生産菌であるストレプトミセス・ハルステディー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈａｌｓｔｅｄｉｉ　ｓｐ．）ＨＣ−３４のゲノムからほぼ４０ｋｂｐの挿入断片を持つコスミドライブラリーを、常法に従って構築した。構成糖であるビセニサミンの生合成では、アミノ糖生合成に関する周知の事実からｄＴＤＰ−グルコース−４，６−デヒドラターゼ及びｄＴＤＰ−４−ケト−６−デオキシグルコース−２，３−デヒドラターゼの両者が関与していると推定し、該酵素遺伝子の既知塩基配列からプローブを設計してＰＣＲを中心に検討し、２種のコスミドを見つけ出した。
【００１４】
さらにこの２種のコスミドの遺伝子塩基配列を解析することにより、一般的に知られる抗生物質生合成遺伝子はクラスターを形成し、ひとかたまりで存在するとの知見に照らして何れが求められる本酵素遺伝子であるか考察した。ここでは既に報告している生合成反応機構の知見が有効であり、特にポリケチド生合成におけるケトシンターゼ（ＫＳ）遺伝子の保存性から、ビセニスタチンの生合成酵素遺伝子を含む候補を、コスミドＫ１Ｂ１０及びＫ１Ｄ１１に絞り込むことができた。さらにこのコスミド周辺について塩基配列を解析し、各読み枠（ＯＲＦ）について既存のデータベースとの相同性解析から機能を推定した。
【００１５】
ここでも再度、ビセニスタチンのラクタム部スターターがグルタミン酸由来であり、転位反応を経てスターターとなっているとの研究成果が有効であり、既知のグルタミン酸ムターゼと相同性の高い読み枠（ＯＲＦ）を発見すると共に、ポリケチド部についても、ＯＲＦ内の各モジュールの推定機能が生合成過程によく一致することを確認した。ここでこのクラスター全容、ならびに糖部及びラクタムアグリコン部の各読み枠に対し、ビセニスタチンに因み、ｖｉｎ遺伝子と命名することにした。
【００１６】
さらに、このｖｉｎ遺伝子クラスターの機能を確認するため、ｄＴＤＰ−ビセニサミンをアグリコンと結合させる糖転移酵素（グリコシルトランスフェラーゼ）ｖｉｎＣを大腸菌において発現させ、合成化学的に調製したｄＴＤＰ−ビセニサミンとビセニサミンから化学的に誘導したアグリコンとの間の反応を検討した。その結果、このｖｉｎＣ遺伝子が本糖転移反応を効率よく触媒することを確認した。これにより、ｖｉｎ遺伝子クラスターがビセニスタチン生合成遺伝子であることが確定できた。これまでに、大環状ラクタム型抗生物質として生合成遺伝子が同定されたケースはアンサマイシン群抗生物質であるリファマイシンを除いて他にはない。リファマイシンとは化学構造や生物活性などさまざまな点で違いがあり、本発明の遺伝子群は今後生合成工学的手法による新規物質の創製における資源として極めて重要な価値を持つものと思われる。
【００１７】
本発明で機能を確認したｖｉｎＣ遺伝子について、大腸菌でＶｉｎＣ蛋白質の大量生産を電気泳動により確認した。またその機能について、合成化学的に調製したｄＴＤＰ−ビセニサミンとビセニスタチンアグリコンとの間の糖転移反応を確認した。さらにＶｉｎＣ酵素は合成化学的に調製したｄＴＤＰ−マイカロースおよびｄＴＤＰ−２−デオキシグルコースをビセニスタチンアグリコンに転移することも検出した。よって本発明の酵素を活用することにより、従来にないポリケチド配糖体が合成できる可能性が示された。本発明により、抗腫瘍性抗生物質ビセニスタチンの生合成酵素遺伝子を特定し、そのうち特に糖転移酵素（グリコシルトランスフェラーゼ）であるＶｉｎＣの機能が確認された。
【００１８】
配列表の配列番号１記載の遺伝子は、コスミドＫ１Ｂ１０周辺の塩基配列を解読することにより取得された、ビセニスタチン生合成遺伝子群の全域である。ビセニスタチン生合成遺伝子群はクラスターを形成しており、配列表の配列番号１記載の遺伝子はグリコシルトランスフェラーゼのみならず、ビセニスタチンの生合成に関与する種々の酵素をコードしている。
【００１９】
即ち配列表の配列番号１記載の遺伝子において、塩基番号２７９０−４０４９に対応する部分は、ビセニサミンを基質としてビセニスタチンを生合成する、糖転移酵素をコードしている。ビセニサミンの糖転移酵素は、配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチドである。
【００２０】
配列表の配列番号４に示すポリペプチドの一部が欠失、置換若しくは付加されたポリペプチドとは、配列番号４に示すアミノ酸配列において、１０個以下、好ましくは５個以下、更に好ましくは２個以下のアミノ酸が置換されたポリペプチドである。また、その様なポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号４に示すアミノ酸配列とは、９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましく９９％以上の相同性を有する。その様なポリペプチドも、ビセニサミンを基質としてビセニスタチンを生成する糖転移酵素としての活性を有する限り、本発明の範囲内である。
【００２１】
なお、遺伝子組み換え技術によれば、基本となるＤＮＡの特定の部位に、当該ＤＮＡの基本的な特性を変化させることなく、あるいはその特性を改善する様に、人為的に変異を起こすことができる。本発明により提供される天然の塩基配列を有する遺伝子、あるいは天然のものとは異なる塩基配列を有する遺伝子に関しても、同様に人為的に挿入、欠失、置換を行う事により、天然の遺伝子と同等のあるいは改善された特性を有するものとすることが可能であり、本発明はそのような変異遺伝子を含むものである。
【００２２】
即ち、配列表の配列番号１に示す、塩基番号２７９０−４０４９で示される塩基配列からなることを特徴とする遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列表の配列番号１に示す、塩基番号２７９０−４０４９で示される塩基配列において、１０個以下、好ましくは５個以下、更に好ましくは２個以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列表の配列番号１に示す、塩基番号２７９０−４０４９で示される塩基配列は、９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有する遺伝子である。その様な遺伝子も、ビセニサミンを基質としてビセニスタチンを生成する糖転移酵素としての酵素活性を有するポリペプチドをコードしている限り、本発明の範囲内である。またその様な遺伝子は、配列表の配列番号１に示す、塩基番号２７９０−４０４９で示される塩基配列からなることを特徴とする遺伝子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【００２３】
配列表の配列番号１において示すビセニスタチン生合成遺伝子群において糖転移酵素以外にも複数の読み枠が存在することが判っており、それらの読み枠によりコードされる推定アミノ酸配列が得られている。そして種々の酵素のアミノ酸配列とホモロジー検索を行った結果から、それらのアミノ酸配列により規定される酵素蛋白質の機能を推定することができる。
【００２４】
配列表の配列番号１の塩基配列において、塩基番号６９５−１７６２は読み枠であり、その読み枠に対応する遺伝子（ｖｉｎＡ）は３５５アミノ酸からなる蛋白質をコードしている。そして、配列表の配列番号２はｖｉｎＡから得られた推定アミノ酸配列である。後に詳しく述べるように、その蛋白質はｄＴＤＰ　−グルコ−ス合成酵素であると推定される。
【００２５】
配列表の配列番号１の塩基配列において、塩基番号１７５９−２７３０は読み枠であり、その読み枠に対応する遺伝子（ｖｉｎＢ）は３２３アミノ酸からなる蛋白質をコードしている。そして、配列表の配列番号３はｖｉｎＢから得られた推定アミノ酸配列である。後に詳しく述べるように、その蛋白質はｄＴＤＰ−グルコ−ス４，６−デヒドラターゼであると推定される。
【００２６】
配列表の配列番号１の塩基配列において、塩基番号４４１２−１１１９４は読み枠であり、その読み枠に対応する遺伝子（ｖｉｎＰ２）は２２６０アミノ酸からなる蛋白質をコードしている。そして、配列表の配列番号５はｖｉｎＰ２から得られた推定アミノ酸配列である。後に詳しく述べるように、その蛋白質はポリケチド合成酵素モジュールであると推定される。
【００２７】
配列表の配列番号１の塩基配列において、塩基番号１１２６０−２１３４８は読み枠であり、その読み枠に対応する遺伝子（ｖｉｎＰ３）は３３６２アミノ酸からなる蛋白質をコードしている。そして、配列表の配列番号６はｖｉｎＰ３から得られた推定アミノ酸配列である。後に詳しく述べるように、その蛋白質はポリケチド合成酵素モジュールであると推定される。
【００２８】
配列表の配列番号１の塩基配列において、塩基番号２１４１１−３２８３７は読み枠であり、その読み枠に対応する遺伝子（ｖｉｎＰ４）は３８０８アミノ酸からなる蛋白質をコードしている。そして、配列表の配列番号７はｖｉｎＰ４から得られた推定アミノ酸配列である。後に詳しく述べるように、その蛋白質はポリケチド合成酵素モジュールであると推定される。
【００２９】
配列表の配列番号１の塩基配列において、塩基番号３３２６２−３３９７２（相補鎖）は読み枠であり、その読み枠に対応する遺伝子（ｖｉｎＧ）は２３６アミノ酸からなる蛋白質をコードしている。そして、配列表の配列番号８はｖｉｎＧから得られた推定アミノ酸配列である。後に詳しく述べるように、その蛋白質はｄＴＤＰ−Ｎ−ジメチルデソサミン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼに近縁のＮ−メチル化酵素であると推定される。
【００３０】
配列表の配列番号１の塩基配列において、塩基番号３３９８０−３５１７３（相補鎖）は読み枠であり、その読み枠に対応する遺伝子（ｖｉｎＦ）は３９７アミノ酸からなる蛋白質をコードしている。そして、配列表の配列番号９はｖｉｎＦから得られた推定アミノ酸配列である。後に詳しく述べるように、その蛋白質はｄＴＤＰ−ヘキソース−アミノトランスフェラーゼであると推定される。
【００３１】
配列表の配列番号１の塩基配列において、塩基番号３５３２０−３６８０１は読み枠であり、その読み枠に対応する遺伝子（ｖｉｎＤ）は４９３アミノ酸からなる蛋白質をコードしている。そして、配列表の配列番号１０はｖｉｎＤから得られた推定アミノ酸配列である。後に詳しく述べるように、その蛋白質はｄＴＤＰ−４−ケト−６−デオキシグルコース２，３−デヒトラターゼであると推定される。
【００３２】
配列表の配列番号１の塩基配列において、塩基番号３６８４９−３７８４１は読み枠であり、その読み枠に対応する遺伝子（ｖｉｎＥ）は３３０アミノ酸からなる蛋白質をコードしている。そして、配列表の配列番号１１はｖｉｎＥから得られた推定アミノ酸配列である。後に詳しく述べるように、その蛋白質はｄＴＤＰ−４−ケト−６−デオキシヘキソース２，３−リダクターゼであると推定される。
【００３３】
配列表の配列番号１の塩基配列において、塩基番号３８０２２−３８４９８は読み枠であり、その読み枠に対応する遺伝子（ｖｉｎＨ）は１５８アミノ酸からなる蛋白質をコードしている。そして、配列表の配列番号１２はｖｉｎＨから得られた推定アミノ酸配列である。後に詳しく述べるように、その蛋白質はグルタミン酸ムターゼＳサブユニットであると推定される。
【００３４】
配列表の配列番号１の塩基配列において、塩基番号３８４９５−３９９０４は読み枠であり、その読み枠に対応する遺伝子（ｖｉｎＩ）は４６９アミノ酸からなる蛋白質をコードしている。そして、配列表の配列番号１３はｖｉｎＩから得られた推定アミノ酸配列である。後に詳しく述べるように、その蛋白質はグルタミン酸ムターゼＥサブユニットであると推定される。
【００３５】
配列表の配列番号１の塩基配列において、塩基番号３９９９０−４０８８９は読み枠であり、その読み枠に対応する遺伝子（ｖｉｎＪ）は２９９アミノ酸からなる蛋白質をコードしている。そして、配列表の配列番号１４はｖｉｎＪから得られた推定アミノ酸配列である。後に詳しく述べるように、その蛋白質はプロリンイミノペプチダーゼであると推定される。
【００３６】
配列表の配列番号１の塩基配列において、塩基番号４０８８６−４１８６９は読み枠であり、その読み枠に対応する遺伝子（ｖｉｎＫ）は３２７アミノ酸からなる蛋白質をコードしている。配列表の配列番号１５はｖｉｎＫから得られた推定アミノ酸配列である。後に詳しく述べるように、その蛋白質はマロニルＣｏＡ−ＡＣＰトランスアシラーゼに近縁のアシルＣｏＡ−ＡＣＰトランスアシラーゼであると推定される。
【００３７】
配列表の配列番号１の塩基配列において、塩基番号４１９８７−４２２３５は読み枠であり、その読み枠に対応する遺伝子（ｖｉｎＬ）は８２アミノ酸からなる蛋白質をコードしている。配列表の配列番号１６はｖｉｎＬから得られた推定アミノ酸配列である。後に詳しく述べるように、その蛋白質はアシルキャリア蛋白質であると推定される。
【００３８】
配列表の配列番号１の塩基配列において、塩基番号４２２８９−４３８６３は読み枠であり、その読み枠に対応する遺伝子（ｖｉｎＭ）は５２４アミノ酸からなる蛋白質をコードしている。配列表の配列番号１７はｖｉｎＭから得られた推定アミノ酸配列である。後に詳しく述べるように、その蛋白質は非リボソーム型ペプチド合成酵素であると推定される。
【００３９】
配列表の配列番号１の塩基配列において、塩基番号４４１５６−４５５９２は読み枠であり、その読み枠に対応する遺伝子（ｖｉｎＮ）は４７８アミノ酸からなる蛋白質をコードしている。配列表の配列番号１８はｖｉｎＮから得られた推定アミノ酸配列である。後に詳しく述べるように、その蛋白質は長鎖脂肪酸−ＣｏＡリガーゼであると推定される。
【００４０】
配列表の配列番号１の塩基配列において、塩基番号４５５８９−４６８３３は読み枠であり、その読み枠に対応する遺伝子（ｖｉｎＯ）は４１４アミノ酸からなる蛋白質をコードしている。配列表の配列番号１９はｖｉｎＯから得られた推定アミノ酸配列である。後に詳しく述べるように、その蛋白質はＰＬＰ−依存性デカルボキシラーゼであると推定される。
【００４１】
配列表の配列番号１の塩基配列において、塩基番号４６９８２−６４４９２は読み枠であり、その読み枠に対応する遺伝子（ｖｉｎＰ１）は５８３６アミノ酸からなる蛋白質をコードしている。配列表の配列番号２０はｖｉｎＰ１から得られた推定アミノ酸配列である。後に詳しく述べるように、その蛋白質はポリケチド合成酵素モジュールであると推定されている。
【００４２】
これらの遺伝子群がｖｉｎ遺伝子クラスターを構成しており、これらの遺伝子群がコードする蛋白質群はビセニスタチン生合成に関与している。この一連の遺伝子群の知見は、ビセニスタチンの効率的な生産に資するのみならず、新規抗生物質を得るためのツールとして有用である。よって本発明は、有用物質を創製するための大きな可能性を提供するものである。
【００４３】
【実施例】
（実施例１：４，６−デヒドラクターゼ遺伝子のスクリーニング）
デオキシ糖はバクテリアの細胞壁や二次代謝産物の構成要素として様々なところに存在する。マクロライドやアンスラサイクリンなど多数の抗生物質などで見つかっているデオキシ糖には、エリスロマイシンに含まれるマイカロース、デソサミン、ダウノルビシンのダウノサミン、タイロシンに含まれるマイカミノース、バンコマイシンに含まれるバンコサミンなどが知られており、デオキシ糖が抗生物質の活性に重要な役割を果たしているものも多い。
【００４４】
２，６−デオキシ糖の生合成は最近多くの研究が行われており、一般にグルコース−１−リン酸からＮＤＰ−グルコース合成酵素によりＮＤＰ−グルコースに代謝され、ＮＤＰ−グルコース合成酵素、ＮＤＰ−グルコース−４，６−デヒドラターゼによる６位デオキシ化、ＮＤＰ−４−ケト−６−デオキシグルコース、２，３−デヒドラターゼによる２位デオキシ化が起こる共通の経路を経てその後の修飾により様々な２，６−デオキシ糖が生合成されると考えられている。
【００４５】
様々なデオキシ糖生合成遺伝子も数多くクローニングされた結果、２，６−デオキシ糖の生合成において、４，６−デヒドラクターゼおよび２，３−デヒドラクターゼは遺伝子間の相同性が高いことが明らかとなり、二次代謝産物のクローニングのツールとしても用いられるようになってきている。
【００４６】
ビセニサミンについても、グルコース由来であることが標識前駆体の投与実験により確認されており、他の２，６−デオキシ糖と同様な経路で生合成されることが予想される。デオキシ糖生合成遺伝子をプロ−ブとすることで、ビセニスタチン生合成遺伝子がクローニングできると考え、はじめに遺伝子間の相同性が非常に高い４，６−デヒドラターゼをプローブに用いてゲノムライブラリーのスクリーニングを行うこととした。
【００４７】
（プライマーの設計）
４，６−デヒドラターゼは、遺伝子間の相同性が非常に高い。この中でも、４６ＤＨ−１、４６ＤＨ−２の領域については配列がよく保存されている。４６ＤＨ１と４６ＤＨ２の配列を利用してそれぞれセンスとアンチセンスのプライマーを設計し、ＰＣＲを行えば、５３０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅されてくることが期待できる。
４６ＤＨ−１　：　５’−ＡＣＳＧＧＹＣＳＢＧＣＣＧＣＨＴＴＣＡＴＣＧＧ−３’
４６ＤＨ−２　：　５’−ＧＲＷＲＣＴＧＲＴＲＳＧＧＣＣＧＴＡＧＴＴＧＴＴ−３’
（ＳはＣ又はＧ、ＹはＣ又はＴ、ＢはＣ又はＧ又はＴ、ＨはＡ又はＣ又はＴ、　ＲはＡ又はＧ、ＷはＡ又はＴ）
【００４８】
（ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ）
ゲノムライブラリーから、４，６−デヒドラターゼをコードする遺伝子を含むクローンのスクリーニングを行う場合、はじめに設計したプライマーを用いて、４，６−デヒドラターゼ遺伝子が特異的に増幅されることを確認する必要がある。このため、はじめにストレストミセス・ハルステディー（Ｓ．ｈａｌｓｔｅｄｉｉ）　ＨＣ３４ゲノムをテンプレートとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９４℃で７分、続いて９４℃で３０秒、５２℃で３０秒、７２℃で６０秒を３０サイクル、更に７２℃で７分である。そのＰＣＲの結果、予測されたサイズ（約５３０ｂｐ）の断片が増幅された。
【００４９】
（ＰＣＲ産物の配列解析）
ＰＣＲで増幅した断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ　Ｔベクターにサブクローニングし、大腸菌を形質転換した。得られた形質転換体についてプラスミドを精製し、シークエンスを確認したところ３種類の配列（４６ＤＨ−Ａ、４６ＤＨ−Ｂ、４６ＤＨ−Ｃ）を確認することができた。データベースによる相同性検索の結果、これらの配列は共に既知の４，６−デヒドラターゼと高い相同性を示した。このことから設計したプライマーは、４，６−デヒドラターゼを特異的に増幅し、ゲノムライブラリーのスクリーニングに用いることができることが示された。なお、３種類の配列のうちいずれかがビセニスタチン生合成遺伝子から増幅したものであると考えられる。次に、４６ＤＨ−１、４６ＤＨ−２プライマーを用いてゲノムライブラリーのスクリーニングを行った。
【００５０】
（ゲノムライブラリーのスクリーニング）
ストレストミセス・ハルステディー（Ｓ．ｈａｌｓｔｅｄｉｉ　）ＨＣ３４のゲノムライブラリーを以下のように構築した。ゲノムライブラリーとは、単一生物の染色体ＤＮＡを適当な長さに切断して、その断片をベクターにサブクローニングしたＤＮＡクローンの集団である。それぞれの断片はゲノムのあらゆる部分をランダムに含んでいる。ストレストミセス・ハルステディー（Ｓ．ｈａｌｓｔｅｄｉｉ）　ＨＣ３４のゲノムライブラリーは、ゲノムをＳａｕ３ＡＩでランダム消化し、約４０ｋｂｐの断片をコスミドベクターｐＯＪ４４６にサブクローニングしたもの６０４８クローンの集団である。また、このままではスクリーニングの際に６０４８個の中から目的のクローンを探す必要があるため、９６クローンをひとつのプールとしてまとめ、６３個のプールとして保存してある。
【００５１】
（一次スクリーニング）
はじめに一次スクリーニングとして６３個のプールより４，６−デヒドラターゼを含むプールをＰＣＲによりスクリーニングした。それぞれのライブラリープールをテンプレートにして前出の４６ＤＨ−１，　４６ＤＨ−２プライマーを用いたＰＣＲを行い、目的の５３０ｂｐの増幅が見られたプールをポジティブプールとした。その結果、３０個のポジティブプールを取得することができた。また、同様な手法を用いて遺伝子間の相同性が高いことが知られているｄＴＤＰ−４−ケト−６−デオキシグルコース２，３−デヒドラターゼについて同様にＰＣＲプライマー２３ＤＨ−１及び２３ＤＨ−２をそれぞれ設計し、ゲノムをテンプレートにＰＣＲを行った。この結果、２種類の配列（２３ＤＨ−Ａ，　２３ＤＨ−Ｂ）を確認することができ、いずれも既知の２，３−デヒドラターゼと高い相同性を示した。また、このプライマーを用いてライブラリーのスクリーニングを行ったところ、１７個のポジティブクローンを取得することができた。なお、２３ＤＨ−１及び２３ＤＨ−２を以下に示す。
２３ＤＨ−１　５’−ＡＧＧＣＣＡＣＣＣＧＳＡＧＣＡＡＣＴＡＣＡＣ−３’
２３ＤＨ−２　５’−ＧＡＡＳＣＧＳＣＣＧＣＣＣＴＣＣＴＣＳＧＡ−３’
【００５２】
一般的に微生物ニ次代謝物の生合成遺伝子はクラスターをなしており、ビセニスタチン生合成に関与する４，６−デヒドラターゼおよび２，３−デヒドラターゼの遺伝子は近傍にあることが予想され、目的の２つの遺伝子は１つのコスミド上にあると考えられる。そこで２つの遺伝子を含む９個のプールをポジティブプールとした。
【００５３】
（二次スクリーニング）
一次スクリーニングと同様にＰＣＲを用いて行うことにより二次スクリーニングを行った。二次スクリーニングにおいて、４，６−デヒドラターゼと２，３−デヒドラターゼの２つの遺伝子を含むものをポジティブとした。その結果、２つのコスミドクローン（Ｋ１Ｂ１０，　Ｋ１Ｄ１１）を取得することができた。
【００５４】
（ポジティブクローンの分類）
上記で述べたように、Ｋ１Ｂ１０およびＫ１Ｄ１１の２つのコスミドは、４，６−デヒドラターゼおよび２，３−デヒドラターゼを含んでいた。ＰＣＲ産物の配列解析の結果ではゲノム上に４，６−デヒドラターゼは３種類（４６ＤＨ−Ａ，　４６ＤＨ−Ｂ，　４６ＤＨ−Ｃ）、２，３−デヒドラターゼは２種類（２３ＤＨ−Ａ，　２３ＤＨ−Ｂ）が存在することが示唆されている。そこで、Ｋ１Ｂ１０およびＫ１Ｄ１１に含まれる４，６−デヒドラターゼや２，３−デヒドラターゼがそれぞれどの種類であるか確認した。それぞれのコスミドをテンプレートにＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物についてベクターにサブクローニングし、その配列を確認した結果、Ｋ１Ｂ１０に含まれる４，６−デヒドラターゼは４６ＤＨ−Ａ、２，３−デヒドラターゼは２３ＤＨ−Ａであることが確認された。また、同様にＫ１Ｄ１１に含まれる４，６−デヒドラターゼは４６ＤＨ−Ｂ、２，３−デヒドラターゼは２３ＤＨ−Ｂであることが明らかとなった。
【００５５】
このことから２つのコスミドはゲノム上で異なる部分を含んでいる事が明らかとなった。２，３−デヒドラターゼはゲノム上に２種類存在し、それぞれの２，３−デヒドラターゼを含むコスミドをクローニングできたから、ビセニスタチン生合成酵素遺伝子はＫ１Ｂ１０およびＫ１Ｄ１１のいずれかのコスミドに含まれていることが予想される。そこで次にこれらのコスミドの解析を行うことにした。
【００５６】
（ポジティブクローンに含まれる遺伝子の推定）
２つのコスミドはいずれも４，６−デヒドラターゼと２，３−デヒドラターゼの異なる遺伝子を含んでおり、それぞれ別の２，６−デオキシ糖の生合成に関与していると考えられる。このうちどちらかの２，６−デオキシ糖はビセニサミンであろうと予想され、Ｋ１Ｂ１０、Ｋ１Ｄ１１のいずれかのコスミドに含まれる４，６−デヒドラターゼと２，３−デヒドラターゼの周辺には、ビセニサミン生合成に関与していると考えられる他の酵素の遺伝子が存在することが予想される。そこでいずれのコスミドにビセニスタチン生合成系のデオキシ糖生合成酵素遺伝子が含まれているか確認することにした。
【００５７】
一つのコスミドはインサートサイズが約４０ｋｂｐとなるように作られており、全配列を簡単に読むことはできない。そこで、はじめにそれぞれのコスミドにどのような遺伝子が含まれているか推定するため、コスミドを制限酵素処理し、得られたＤＮＡ断片をベクターにサブクローニングしてその塩基配列を確認することにした。
【００５８】
はじめにＫ１Ｂ１０をＢａｍＨＩ，　ＢｇｌＩＩ，　ＥｃｏＲＩで切断していくつかの断片をサブクローニングした。Ｋ１Ｂ１０には、ＮＤＰ−グルコース４，６−デヒドラターゼ、ＮＤＰ−４−ケト−６−デオキシグルコース２．３−デヒドラターゼのほか、ＮＤＰ−ヘキソースアミノ基転移酵素、ＮＤＰ−アミノヘキソース−Ｎ−メチル基転移酵素と相同性を示す配列が確認できた。またＩ型ＰＫＳやグルタミン酸ムターゼと相同性を示す配列も確認できた。一方Ｋ１Ｄ１１にはＩ型ＰＫＳや糖転移酵素などと相同性を示す配列が確認できた。またチトクロムＰ４５０と相同性を示す配列も確認できた。
【００５９】
２つのコスミドに含まれる遺伝子を比較した結果、Ｋ１Ｂ１０にはビセニサミン生合成に関わると考えられるアミノ基転移酵素やメチル基転移酵素、またビセニスタチンのスターター生合成に関与すると予想されていたグルタミン酸ムターゼが含まれており、Ｋ１Ｂ１０の周辺領域がビセニスタチン生合成に関与していることが示唆された。
【００６０】
（実施例２：遺伝子クラスターの配列解析）
そこで、コスミドＫ１Ｂ１０およびその周辺の塩基配列を確認し、ビセニスタチン生合成酵素遺伝子全域の取得を試みた。即ち、Ｋ１Ｂ１０の近傍の領域にある別なコスミドクローンを取得すると共に、それらのシークエンスを確認した。また得られた塩基配列データからこれをアミノ酸に翻訳し、公共データベースによるホモロジー解析検索（ＢＬＡＳＴ）を行うことでそれぞれの遺伝子の機能を推定した。
【００６１】
（コスミドの塩基配列解析）
ＤＮＡシークエンサーを用いて一回に解析できる長さは約６００〜７００ｂｐである。ストレストミセス・ハルステディーＨＣ３４ゲノムライブラリーのコスミドは、インサートが約４０ｋｂｐになるように作られており、これだけ巨大な長さの全塩基配列を決定するためにはコスミドＤＮＡを適当な長さの断片に切断後、他のベクターにサブクローニングする必要がある。しかし、一度両鎖の塩基配列が読める５００ｂｐ程度の小さな断片に切断して配列を決定しようとすると、適当な制限酵素サイトを見つけるのが難しく、またそれぞれの断片をつなげるのが大変な作業になる。そこではじめに４０ｋｂｐのインサートを適当な制限酵素を用いて２〜１０ｋｂｐ程度の断片に切断してベクターにサブクローニングし、それぞれの断片についてそれぞれ配列決定を行い、これらをつなげることにした。
【００６２】
ＥＺ：：ＴＮ＜ＫＡＮ−２＞Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　Ｋｉｔはプラスミドに対してランダムにトランスポゾンを挿入できるキットである。トランスポゾンの両端にそれぞれ特異的なプライマーを用いることによりトランスポゾンを挿入した部分の周辺についてシークエンスを読むことができる。
【００６３】
鋳型となるプラスミドＤＮＡとトランスポゾンの共存下トアンスポザーゼによりトランスポゾンを挿入し、大腸菌を形質転換する。トランスポゾン上にはカナマイシン耐性遺伝子がコードされておりトランスポゾンが挿入された鋳型プラスミドを保持している場合にはカナマイシン耐性を示すため、この性質を利用して目的の形質転換体を選択する。プラスミドを保持した形質転換体を培養し、そこから精製したプラスミドを鋳型としてシークエンスを行う。この方法は２〜１０ｋｂｐ程度の断片を解析するのに用いることができる。そこでＫ１Ｂ１０を制限酵素処理して得られるそれぞれの断片の全配列を確認し、これらをつなげることにした。
【００６４】
（Ｋ１Ｂ１０周辺のコスミドの取得）
Ｋ１Ｂ１０の配列を解析したところ、その両端にはそれぞれ、ＴＤＰ−グルコース合成酵素、グルタミン酸ムターゼと相同性のある配列が存在した。これらの酵素はいずれもビセニスタチン生合成に関わっていると予想され、この外側の領域にもビセニスタチン生合成遺伝子群が存在していると考えられる。
【００６５】
そこでＫ１Ｂ１０近傍の領域にある別なコスミドクローンを取得することにした。はじめにＫ１Ｂ１０の左側を含むコスミドを取得するため、Ｋ１Ｂ１０のインサートの左端にあるＫ１Ｂ１０Ｃ１の塩基配列をもとに、特異的なＰＣＲプライマー（Ｋ１Ｂ１０−ｌｅｆｔＦ，　Ｋ１Ｂ１０−ｌｅｆｔＲ）を設計し、これを用いてゲノムライブラリーのスクリーニングを再度行った。先と同様に一次、二次スクリーニニングを行いコスミドＹ３Ｄ４を取得した。また、左端と同様にしてＫ１Ｂ１０の右端でもＫ１Ｂ１０Ａ５の塩基配列をもとに設計したＰＣＲプライマー（Ｋ１Ｂ１０−ｒｉｇｈｔＦ，　Ｋ１Ｂ１０−ｒｉｇｈｔＲ）を用いてスクリーニングを行い、コスミドＫ７Ｇ３を得、このＫ７Ｇ３をもとにしてさらにプライマーを設計して探索を行いＬ６Ｄ５を取得した。
【００６６】
（実施例３：ＯＲＦのホモロジー解析）
コスミドＫ１Ｂ１０周辺の領域約６０ｂｐについて塩基配列を決定した。塩基配列をアミノ酸配列に翻訳する場合、正方向と逆方向でそれぞれ３通り、計６通りのフレームが考えられる。通常、原核生物において開始コドンの約１０ｂｐほど上流にはＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列というＡ，Ｇに富んだ５ｂｐ程度の領域が見られる。この領域にリボソームが結合して翻訳が始まることが知られており、これをもとにアミノ酸をコードするＯＲＦ（読み枠）の解析を行った。
【００６７】
しかし放線菌においては通常ＳＤ配列が存在しないことが知られており、その代わりにＧＣ含量を計算することによりそのフレームを解析する方法が知られている。放線菌では染色体ＤＮＡのＧＣ含量が平均７０％以上と高いが、ＧＣのみからなるコドンに対応するアミノ酸であるアルギニン、グリシン、プロリン、アラニンの含量が他の原核生物と比較してそれほど高いわけではない。このため、アミノ酸を決定するのにほとんど関係しないトリプレット３文字目のＧＣ含量が非常に高く９０％以上であり、２文字目は非常に低く約５０％、１文字目が７０％程度であることが知られている。また、プロモーターなどアミノ酸に翻訳されない領域についてはＧＣ含量が５０％程度である。例えば、Ｋ１Ｂ１０の左端約５ｋｂｐの領域についてコンピュータープログラムＦｒａｍｅ　Ｐｌｏｔを用いてＧＣ含量を解析したところ、４つのＯＲＦ（ｏｒｆＡ，　ｏｒｆＢ，　ｏｒｆＣ，　ｏｒｆＰ２）が存在することが判った。
【００６８】
さらに、同様にすべての領域についてフレーム解析を行ったところ、１８個のＯＲＦが確認された。本実験で得られた遺伝子の遺伝子地図を図１に示す。それぞれのＯＲＦについてその推定アミノ酸配列をもとに公共データベース（ＢＬＡＳＴ）によるホモロジー検索を行い、最も高い相同性を示したタンパクを図２にまとめた。
【００６９】
（ｏｒｆＡのホモロジー解析）
ｏｒｆＡは１０６８ｂｐからなり、遺伝子産物は３５５ａａ（ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　：　アミノ酸残基数）、分子量約３８ｋＤａのタンパク質であることが推定された。なおこのｏｒｆＡは先に述べたｖｉｎＡ遺伝子に対応する。データベース検索（ＢＬＡＳＴ）によるホモロジー解析では、ストレストミセス・アルギラセウス（Ｓ．ａｒｇｉｌｌａｃｅｕｓ）のミスラマイシン生合成遺伝子クラスターに含まれるＭｔｍＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＩＤ　Ｔ４８８６６　：　グルコース−１−ホスフェートチミジリルトランスフェラーゼ）と６９％、ストレストミセス・グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）のストレプトマイシン生合成に関わるＳｔｒＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＩＤ　Ａ２６９８４　：　グルコース−１−ホスフェートチミジリルトランスフェラーゼ）と６７％の相同性を示したほか、様々な二次代謝物のｄＴＤＰ−グルコース合成酵素と相同性が見られた。
【００７０】
（ｏｒｆＢのホモロジー解析）
ｏｒｆＢは９７２ｂｐからなり、遺伝子産物は３２３ａａ、分子量約３６ｋＤａのタンパク質であることが推定された。なおこのｏｒｆＢは先に述べたｖｉｎＢ遺伝子に対応する。データベース検索によるホモロジー解析では、様々なストレストミセス属のｄＴＤＰ−グルコース−４，６−デヒドラターゼと高い相同性を示した。この酵素は糖の６位デオキシ化に関わる酵素である。
【００７１】
（ｏｒｆＣのホモロジー解析）
ｏｒｆＣは１２６０ｂｐからなり、遺伝子産物は４１９ａａ、分子量約４６ｋＤａのタンパク質であることが推定された。なおこのｏｒｆＣは先に述べたｖｉｎＣ遺伝子に対応する。データベース検索によるホモロジー解析では、様々な糖転移酵素（グリコシルトランスフェラーゼ）と良い相同性を示した。
【００７２】
相同性を示したのは、いずれも抗生物質生合成に関わる２，６−デオキシ糖の糖転移酵素であり、これらの酵素にはＤＸＤおよびＬＰＸＣＸＸｈｈＨＨＧＧＸＧＸＸＸｈＡｈｂＸＧｈＰＱｂｂＰ（Ｘは任意の残基、ｈは疎水性の残基）の配列が保存されていることが知られている。ＯｒｆＣにおいてもこの配列が存在し、このことからＯｒｆＣが２，６−デオキシ糖の糖転移酵素であることが予想される。また、２，６−デオキシ糖の中でも特にアミノ糖の糖転移酵素と相同性が高いことからＯｒｆＣがビセニサミンの糖転移酵素として働くことが示唆された。
【００７３】
（ｏｒｆＤのホモロジー解析）
ｏｒｆＤは１４８２ｂｐからなり、その遺伝子産物は４９３ａａ、５５ｋＤａのタンパク質であると推定された。なおこのｏｒｆＤは先に述べたｖｉｎＤ遺伝子に対応する。データベースによるホモロジー解析の結果、既知のｄＴＤＰ−４−ケト−６−デオキシグルコース２，３−デヒドラターゼと良い相同性を示した。例えば、ストレプトミセス・ノガレーター由来のＳｎｏｇＨ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＩＤ　ＣＡＡ１２００９：推定上の２，３−デヒドラターゼ）と６１％の相同性を示した。
【００７４】
（ｏｒｆＥのホモロジー解析）
ｏｒｆＥは９９３ｂｐからなり、遺伝子産物は３３０ａａ、３６ｋＤａのタンパク質であると推定された。なおこのｏｒｆＥは先に述べたｖｉｎＥ遺伝子に対応する。データベースによるホモロジー解析の結果、マイカロース生合成に関わるＴｙｌＣＶＩ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＩＤ　ＡＡＤ４１８２１：ストレプトミセス・フラディアエ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｄｉａｅ）と６０％の相同性を示すなど、既知のｄＴＤＰ−４−ケト−６−デオキシヘキソース２，３−リダクターゼと良い相同性を示した。この酵素は糖３位の還元に関わっており、ビセニスタチン生合成においても糖３位の還元に関わっていると考えられる。
【００７５】
（ｏｒｆＦのホモロジー解析）
ｏｒｆＦは１１９４ｂｐからなり、その遭伝子産物は３９７ａａ、４３ｋＤａと推定された。なおこのｏｒｆＦは先に述べたｖｉｎＦ遺伝子に対応する。データベース検索の結果、様々なアミノ糖生合成に関わるアミノ基転移酵素と良い相同性を示した。例えばサッカロポリスポラ・エリスラエア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔｈｒａｅａ）が生産するエリスロマイシンに含まれるアミノ糖、デソサミン生合成に関わるＥｒｙＣＩＶ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＩＤＣＡＡ７２０８４　）アミノトランスフェラーゼとは４８％、大腸菌の４−ａｍｉｎｏ−２，６−ジデオキシグルコースの生合成に関わるＶｉｏＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＩＤ　ＡＡＤ４４１５４）と３７％の相同性がみられた。このことからＯｒｆＦはビセニサミンにおけるアミノ基導入に関わる酵素であると考えられる。
【００７６】
（ｏｒｆＧのホモロジー解析）
ｏｒｆＧは７１１ｂｐからなり、その遺伝子産物は２３６ａａ、２６ｋＤａのタンパクであることが推定された。なおこのｏｒｆＧは先に述べたｖｉｎＧ遺伝子に対応する。データベース検索によるホモロジー解析の結果、ストレプトミセス・ガリラエウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇａｌｉｌａｅｕｓ）のメチル基転移酵素ＡｋｎＸ２（Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＩＤ　ＡＡＦ７３４６０）とは４５％、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔｈｒａｅａ）由来のデソサミン生合成に関わるメチル基転移酵素ＥｒｙＣＶＩ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＩＤ　ＣＡＡ７２０８２）とは４４％の相同性を示すなど、Ｓ−アデノシルメチオニンをメチル基供与体とするメチル基転移酵素と良い相同性がみられた。なお、ビセニサミンのＮ−メチル基についてはＳ−アデノシルメチオニン由来であることが標識メチオニンの投与実験により確認されている。このことからＯｒｆＧがビセニサミン生合成のメチル基転移酵素と考えられる。
【００７７】
（ＯｒｆＨ，Ｉのホモロジー解析）
ｏｒｆＨは４７７ｂｐからなり、その遺伝子産物は１５８ａａ、１７ｋＤａのタンパク質であることが推定された。また、ｏｒｆ　Ｉは１４１０ｂｐからなり、その遺伝子産物は４６９ａａ、５０ｋＤａのタンパク質であると推定された。なおこのｏｒｆＨは先に述べたｖｉｎＨ遺伝子に、ｏｒｆＩは先に述べたｖｉｎＩ遺伝子に対応する。データベースによるホモロジー検索の結果、ＯｒｆＨはグルタミン酸ムターゼのＳサブユニットと、Ｏｒｆ　Ｉはグルタミン酸ムターゼのＥサブユニットと良い相同性を示した。グルタミン酸ムターゼはビタミンＢ１２（アデノシルコバラミン）を補酵素としてグルタミン酸を３−メチルアスバラギン酸に異性化する特異な酵素である。
【００７８】
クロストリジウウム・コクレアリウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｃｏｃｈｌｅａｒｉｕｍ）のＧｌｍＥ，Ｓ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　Ｘ８０９９７）においてはＸ線結晶解析および部位特異的変異酵素の研究が行なわれ、ＳサブユニットのＨｉｓ１６が補酵素との結合部位であり、ＥサブユニットのＧｌｕ１７１がグルタミン酸のアミノ基を認識することが明らかとなっている。ＯｒｆＩにおいてもこのアミノ酸が保存されている。ビセニスタチンにおいて、前述のようにグルタミン酸と３−メチルアスバラギン酸が生合成中間体であることが明らかとなっており、ＯｒｆＨ，Ｉが上記の反応を触媒していると考えられる。
【００７９】
（ｏｒｆＪのホモロジー解析）
ｏｒｆＪは９００ｂｐからなり、その遺伝子産物は２９９ａａ、３４ｋＤａのタンパク質であることが推定された。なおこのｏｒｆＪは先に述べたｖｉｎＪ遺伝子に対応する。データベース検索によるホモロジー解析の結果ではメソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｏｔｉ）由来のプロリンイミノペプチダーゼと５４％の相同性を示したほか、様々な微生物由来のプロリンイミノペプチダーゼと相同性を示した。ホモロジー検索の相同性からのみではビセニスタチン生合成への関与は予測できないが、一般的に微生物の二次代謝産物の遺伝子はクラスターをなしており、ビセニスタチン生合成に何らかの関与をしていると考えられる。この機能を明らかにするためには、今後ｏｒｆＪの遺伝子破壊実験が必要であると考えられる。
【００８０】
（ｏｒｆＫのホモロジー解析）
ｏｒｆＫは９８４ｂｐからなり、その遺伝子産物は３２７ａａ、３６ｋＤａのタンパクであると推定された。なおこのｏｒｆＫは先に述べたｖｉｎＫ遺伝子に対応する。データベースによるホモロジー検索の結果、さまざまな生物由来のＩＩ型脂肪酸合成酵素のアシル−ＣｏＡ：アシルキャリア蛋白質トランスアシラーゼと相同性がみられた。ビセニスタチン生合成のスターターのアミノ酸がポリケチド合成酵素に取り込まれる際、アミノ酸のＣｏＡ誘導体をＡＣＰに転移する反応を触媒すると考えられる。
【００８１】
（ｏｒｆＬのホモロジー解析）
ｏｒｆＬは２４９ｂｐからなり、その遺伝子産物は８２ａａ、９．６ｋＤａのタンパク質であることが推定された。なおこのｏｒｆＬは先に述べたｖｉｎＬ遺伝子に対応する。データベースによるホモロジー検索の結果、既知のアシルキャリア蛋白質（ＡＣＰ）と相同性がみられた。このタンパクはグルタミン酸誘導体がＰＫＳに取り込まれる際グルタミン酸誘導体が結合するＡＣＰとして用いられると考えられる。
【００８２】
（ｏｒｆＭのホモロジー解析）
ｏｒｆＭは１５７５ｂｐからなり、その遺伝子産物は５２４ａａ、５６ｋＤａのタンパク質をコードしていることが推定される。なおこのｏｒｆＭは先に述べたｖｉｎＭ遺伝子に対応する。ホモロジー解析の結果、Ｉ型非リボソーム型ペプチド合成酵素のアデニル化ドメイン（Ａ　ｄｏｍａｉｎ）と相同性を示した。ビセニスタチン生合成においてもアミノ酸の活性化に関わっていると考えられ、スターター部生合成における異性化やマクロラクタム化に関わっていることが予想される。今後、遺伝子破壊実験や発現酵素を用いた実験による更なる酵素機能の解明に興味が持たれる。
【００８３】
（ｏｒｆＮのホモロジー解析）
ｏｒｆＮは１４３７ｂｐからなりその遺伝子産物は４７８ａａ、５２ｋＤａのタンパク質であることが推定された。なおこのｏｒｆＮは先に述べたｖｉｎＮ遺伝子に対応する。データベースによるホモロジー解析の結果、シノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）由来のＳＭｂ２０６５０（Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＩＤ　ＣＡＣ４９７５８：推定上の長鎖脂肪酸−ＣｏＡリガーゼ蛋白質）と３３％の相同性を示すなど、いくつかのＣｏＡリガーゼと相同性を示した。スターターの標織前駆体の投与実験により、３−メチルアスパラギン酸がＰＫＳに取り込まれてから脱炭酸、異性化を受けると考えられており、３−メチルアスパラギン酸がＣｏＡリガーゼの働きでＣｏＡ誘導体、さらに前述のＯｒｆＫによりＡＣＰ誘導体となることでＰＫＳに取り込まれると考えられる。
【００８４】
（ｏｒｆＯのホモロジー解析）
ｏｒｆＯは１２４５ｂｐからなり、その遺伝子産物は４１４ａａのタンパクであることが推定される。なおこのｏｒｆＯは先に述べたｖｉｎＯ遺伝子に対応する。データベースによるホモロジー検索の結果、ピリドキサールリン酸（ｐｙｒｉｄｏｘａｌ−５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＰＬＰ）を補酵素として用いる脱炭酸酵素と相同性を示した。その中でも、プチロシン生合成に関与していることが示唆されるＢｔｒＫ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＩＤ　ＢＡＢ１８４７３：バチルス・サーキュランス）と最も類似性が高く（ｉｄｅｎｔｉｔｙ　３１％　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　５１％）、他には一次代謝に関わるジアミノピメリン酸脱炭酸酵素やオルニチン脱炭酸酵素などと相同性を示した。相同性の数値から、ＯｒｆＯはアミノ酸を基質とするが、一次代謝系の脱炭酸酵素とは異なり、二次代謝産物の生合成に関わる脱炭酸酵素であることが推定される。これにより、ＯｒｆＯがビセニスタチンの生合成のスターター生合成において予想される脱炭酸を触媒していると考えられる。
【００８５】
（ｏｒｆＰ１，Ｐ２，Ｐ３，Ｐ４のホモロジー解析）
ｏｒｆＰ１，Ｐ２，Ｐ３，Ｐ４は、データベースによるホモロジー解析の結果、それぞれＩ型のポリケチド合成酵素と相同性を示した。なおこのｏｒｆＰ１は先に述べたｖｉｎＰ１遺伝子に、ｏｒｆＰ２は先に述べたｖｉｎＰ２遺伝子に、ｏｒｆＰ３は先に述べたｖｉｎＰ３遺伝子に、ｏｒｆＰ４は先に述べたｖｉｎＰ４遺伝子に対応する。それぞれのアミノ酸配列を他のＰＫＳ遺伝子と比較し解析した結果、ｏｒｆＰ１に３モジュール、ｏｒｆＰ２に１モジュール、ｏｒｆＰ３に２モジュール、ｏｒｆＰ４に２モジュールの伸長単位がコードされていると推測できた。
【００８６】
それぞれの機能ドメインのうち、ＡＴドメインはその配列を解析することにより、伸長単位が酢酸であるかプロピオン酸あるか区別できることが知られている。酢酸を伸長単位とするマロニル基転移酵素（ＭＴ）は活性部位のアミノ酸周辺にＸＹＡＱＸＸＸＸＸＸＱＸＡＬ、ＧＨＳＩ（Ｘ：任意のアミノ酸残基）の２つのモチーフが保存されており、プロピオン酸を伸長単位とするメチルマロニル基転移酵素（ＭＭＴ）は同様な位置にＶＤＶＶＱＸＸＸＸＸＸＭＸＳＬＡ、ＧＨＳＱの２つのモチーフが存在する。ｏｒｆＰ１の各モジュールのＡＴドメインはそれぞれＭＴ，ＭＴ，ＭＭＴが、ｏｒｆＰ２にはＭＭＴが、ｏｒｆＰ３にはＭＴ，ＭＭＴが、ｏｒｆＰ４にはＭＴ，ＭＴが順に並んでいた。
【００８７】
ＯｒｆＰｌ，Ｐ２，Ｐ３，　Ｐ４の順番に酵素が作用して炭素鎖が伸長したと考えると、各モジュールにおける機能ドメインの並び方はビセニスタチンのアグリコンの炭素骨格と一致しており、最後にＯｒｆＰ４上にあるＴＥドメインにより生成したポリケチドが酵素から離れ、環化すると考えられる（図３）。このことより、このＰＫＳ遺伝子がビセニスタチン生合成系のＰＫＳであることが強く示唆された。また、図４に各ｖｉｎ酵素により触媒される反応をまとめた。
【００８８】
塩基配列を解析した結果、ｏｒｆＡ，Ｂ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇがビセニサミン生合成に関与していること、また、ｏｒｆＣはデオキシ糖の糖転移酵素であることが示唆された。また、ｏｒｆＨ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｎ，Ｏ，Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３，Ｐ４がビセニスタチンのアグリコン生合成に関与していることが示唆された。これらの酵素が順番に働くとビセニスタチンが生合成されることが予想され、このことから今回解析した遺伝子がビセニスタチン生合成系のものであることが強く示唆された。この結果をまとめるとビセニスタチン生合成は図４のようになっていると推定される。
【００８９】
今回配列解析した１８個のＯＲＦ中には３−メチルアスバラギン酸の異性化酵素と考えられるものは存在していないが、活性化を担う酵素がこの機能を持つ可能性が高い。機能を明確には推定できなかったＯｒｆＭまたはＯｒｆＪが関与している可能性がある。あるいは、今回配列解析した領域の外側にこの反応に関わるＯＲＦが存在しているとも考えられる。
【００９０】
（実施例４：大腸菌による組み換えｖｉｎＣの発現）
ｖｉｎＣを２種類のオリゴヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏ　ＥＸＰＲＥＳＳ　ＳＥＬＥＣＴ）ｖｉｎＣ−Ｎｔｅｒｍ（５’−ＡＡＧＧＴＡＣＣＡＴＡＴＧＣＧＣＧＴＣＣＴＧＡＴＧＡ−３’）と、ｖｉｎＣ−Ｃｔｅｒｍ（５’−ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＴＧＧＧＣＧＧＡＧＴＧＣＴＡＣ−３’）を用いてＰＣＲ法によりコスミドＫ１Ｂ１０から増幅した。なお、オリゴヌクレオチドに導入したＮｄｅＩとＢａｍＨＩサイトを下線で示した。ＤＮＡポリメラーゼはＴＡＫＡＲＡ　Ｅｘ−Ｔａｑ（タカラ）を使用した。採用したＰＣＲの条件は、９５℃で７分、続いて９５℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で９０秒を３０サイクル、更に７２℃で７分であった。
【００９１】
ＰＣＲ産物をｐＴ７Ｂｌｕｅ　Ｔ−ベクターにクローニングした後、塩基配列を確認し、正しい塩基配列を持っているクローンを選択した。このクローンからＮｄｅＩとＢａｍＨＩサイトを利用してｖｉｎＣをｐＥＴ３０ｂ（＋）にクローニングしてｐＥＴ−ｖｉｎＣを得た。得られたｐＥＴ−ｖｉｎＣで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、ｖｉｎＣ発現用の組み換え大腸菌を得た。ここで得た組み換え大腸菌をＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴｖｉｎＣと名づけた。なお一般的な遺伝子操作についてはＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｊｏｓｅｐｈ　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｄａｖｉｄ　Ｗ，　Ｒｕｓｓｅｌｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）を参照した。
【００９２】
（実施例５：組み換えＶｉｎＣの酵素活性の確認）
上記で得たＶｉｎＣ発現用の組み換え大腸菌の無細胞抽出液を粗な酵素溶液として用いて、ｄＴＤＰ−ビセニサミンを基質として糖転移酵素活性を確認した。酵素活性の実験に用いる原料の製造方法と酵素活性の測定結果を以下に示す。なお図５は、酵素反応の基質として用いるｄＴＤＰ−ビセニサミン、ｄＴＤＰ−マイカロース、ｄＴＤＰ−２−デオキシグルコースを合成したスキームを示す図である。
【００９３】
（ｄＴＤＰ−Ｎａ　ｓａｌｔ　の精製）
ｄＴＤＰ−Ｎａ　ｓａｌｔ（１００ｍｇ）を冷水に溶かし、その溶液をＤＯＷＥＸ　ＡＧ−５０　Ｘ８のＨ＋型を詰めたカラムに通した。ｐＨが１〜２程度の目的物を含む画分に、４％の水酸化テトラブチルアンモニウム（Ｂｕ４Ｎ−ＯＨ）水溶液を加え、ｐＨを５〜６とした。それを凍結乾燥することにより白色結晶が得られた。
【００９４】
（ｄＴＤＰ−ビセニサミンの合成）
合成により得た化合物（１）（４１．５ｍｇ，　１．４１×１０−４モル）をＣＨ２Ｃｌ２２ｍｌに溶かし、−１０℃にしたアセトンードライアイスバスに入れた。その溶液に、Ｅｔ３Ｎ（０．３９２ｍｌ、２．８１×１０−３モル、２０モル当量）を加え、さらに、ＴＭＳ−Ｃｌ（０．２１３ｍｌ，　１．６８×１０−３モル、１２モル当量）を加えた。途中、３０分後にＥｔ３Ｎ　０．４ｍｌ、ＴＭＳ−Ｃｌ　０．２ｍｌを加え、更に３０分後にＥｔ３Ｎ　０．２ｍｌ、ＴＭＳ−Ｃｌ　０．１ｍｌを加え、１．８時間後にエバポレーターで濃縮した。
【００９５】
その残りにペンタン／酢酸エチル（ＥＡ）＝４の溶液を加え、濾過と濃縮の後にベンゼンで共沸乾固した。これに対して１．２ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２を加えた後に−７８℃とし、ＴＭＳ−Ｉ（０．０２６ｍｌ、１．８３×１０−４、１．３モル当量）を加えた。４５分後に、ｄＴＤＰ−Ｂｕ４Ｎ　ｓａｌｔ、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）２０μｌをＣＨ２Ｃｌ２　１．５ｍｌに溶かした混合液を入れた。
【００９６】
１．５時間攪拌した後に徐々に昇温し、その１．３時間後にフッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）１２０μｌを加えた。５５分後に濃縮し、逆相のシリカゲルカラムクロマトグラフィー（水：メタノール＝１：１→１：５）で精製し、１０３ｍｇの部分精製試料を得た。これに対し、水：メタノール＝１：１（計７ｍｌ）の溶液を加え、さらに１１．３ｍｇのＰｄ／Ｃを加え水素雰囲気下で加水素分解した。反応終了後、濾過した後に濃縮した。それを３０ｍｌのＮＨ４ＨＣＯ３溶液で充填したＤＥＡＥセファデックスＡ−２５により精製した。それによりｄＴＤＰ−ビセニサミン二アンモニウム塩：化合物（３）の白色粉末を１３．２ｍｇ（２段階、１６％）を得た。
ＭＳ　データ：［Ｃ１７Ｈ２９Ｎ３Ｏ３Ｐ２−Ｈ］−　：　Ｃａｌｃｄ．　５４４．１１　ｆｏｕｎｄ　５４４．２　（ｂａｓｅ　ｐｅａｋ）なお、ＡＤＰ−ビセニサミン、ＵＤＰ−ビセニサミンの合成を上に準じて行った。
【００９７】
（ｄＴＤＰ−マイカロースの合成）
化合物（４）（４６．４ｍｇ，　２．８６×１０−４モル）をピリジン１ｍｌに入れ０℃とした後に、ＴＭＳ−Ｃｌ（０．８ｍｌ、２２モル当量）を加えた。１１．５時間後にペンタン７ｍｌを加え、冷水で分液した。ＴＬＣでピリジンが見えなくなるまで洗浄した後にその上清を濃縮し、残査をそのまま次に使用した。この粗製物（５）を１ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２に溶かし、−７８℃にした。次に、ＴＭＳ−Ｉ（０．０５２９ｍｌ，　１．３モル当量）を加え、４５分後にｄＴＤＰ−Ｂｕ４Ｎｓａｌｔ，　ＤＩＥＡ　４０μｌをＣＨ２Ｃｌ２に溶かした混合溶液を加えた。３時間攪拌した後、ＴＢＡＦを４８０μｌを加え、４０分後に濃縮した。それをそのままＤＥＡＥにより精製し、ｄＴＤＰ−マイカロース：化合物（６）を２１．５ｍｇ得た。
【００９８】
（２−デオキシグルコースのｄＴＤＰ体合成）
２−デオキシグルコース（７）（３１．３ｍｇ，　１．９１×１０−４モル）を１ｍｌのピリジンに溶かし、室温でＴＭＳ−Ｃｌ（０．５ｍｌ，　３．９４×１０−３モル、２０モル当量）を加えた。１．５時間後、ペンタン５ｍｌを加えた後に、冷水を使って分液をした。上清を濃縮し、ベンゼン共沸することによりＴＭＳ体（８）を得た。
【００９９】
このクルードに対して、ＣＨ２Ｃｌ２を１ｍｌ加え、−７８℃に冷やした。次にＴＭＳ−Ｉ（０．３４ｍｌ，　２．４８×１０−４，　１．３モル当量）を加えた。４０分後に混合溶液（ｄＴＤＰ−Ｂｕ４Ｎ　ｓａｌｔ，　ＤＩＥＡ　４０μｌをＣＨ２Ｃｌ２に溶かしたもの）を加え、ゆっくりと昇温しながら、３．４時間後にＴＢＡＦ０．１ｍｌを加えた。５０分後に濃縮し、ＤＥＡＥセファデックスＡ−２５で精製した。
【０１００】
（酵素反応）
先に述べた組み換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴｖｉｎＣを用いて、カナマイシンを含むＬＢ培地４ｍｌ中で前培養を行った。次いで、ＬＢ培地１００ｍｌ、カナマイシン３０μｇ／ｍｌ、上記の前培養物１ｍｌの混合液を本培養した。本培養は２２０ｒｐｍの振盪速度で、３７℃でおよそ２時間行った。ＯＤ６００が約０．６に達するまで培養を行い、終濃度が０．２ｍＭに達するまでＩＰＴＧを添加した。その後更に１８０ｒｐｍの振盪速度で、３７℃でおよそ３時間培養した。培養した組み換え大腸菌の菌体を約４００ｍｇ採取し、バッファー（５０ｍＭトリス−塩酸　ｐＨ７．５，　１ｍＭ　ＭｎＣｌ２，　１ｍＭ　ＭｇＣｌ２）を菌体の１０倍（４００ｍｇならば４ｍｌ）加えた。２分間１０回の超音波処理により菌体を破砕し、１２０００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行った。上清（無細胞抽出液）を採取し、粗酵素溶液として使用した。
【０１０１】
蒸留水に溶解したｄＴＤＰ−ビセニサミン（３．３ｍｇ／７００μｌを１４μｌ）及びアグリコン（飽和ＤＭＳＯ溶液）３．６μｌを氷上でエッペンドルフチューブに入れ、それに対して１００μｌの上記の粗酵素溶液を添加して攪拌することにより、酵素反応を行った。２４時間後に蒸留したＥＡおよび２Ｎ−ＮａＯＨでｐＨ１０以上に調整し、次いで酢酸エチルで抽出した。抽出上清をエバポレーターで濃縮した後、メタノールを３０μｌ添加した。ｄＴＤＰ−マイカロースとアグリコンの反応と、ｄＴＤＰ−２−デオキシ−グルコースとアグリコンの反応も同様に行った。
【０１０２】
なお、酵素反応産物は、カラムＯＤＳ（関東マイティシルＲＰ−１８　ＧＰ）を用いたＨＰＬＣを連結したＬＳ−ＭＳ装置（フィニガンＬＣＱ型）システムによって検出した。酵素反応物を先ずＵＶ２５４ｎｍで検出し、同時にその構造をマススペクトルにより解析した。その結果、ｄＴＤＰ−ビセニサミンとアグリコンを酵素存在下で反応させることにより糖転移反応が起こり、ビセニスタチンが生成することが確認された。
マススペクトル：［Ｍ＋Ｈ］＋　Ｃａｌｃ．　５０１．３６　　ｆｏｕｎｄ　５０１．２
【０１０３】
同様の方法により、ｄＴＤＰ−マイカロースとビセニスタチンアグリコンの間の糖転移反応も確認された。
マススペクトル：［Ｍ＋Ｈ］＋　Ｃａｌｃ．　５０２．３５　　ｆｏｕｎｄ　５０２．３
更に、ｄＴＤＰ−２−デオキシグルコースとビセニスタチンアグリコンの間の糖転移反応も確認された。
マススペクトル：［Ｍ＋Ｈ］＋　Ｃａｌｃ．　５０４．３２　　ｆｏｕｎｄ　５０４．１
これらの知見は、大腸菌により産生された組み換えＶｉｎＣ酵素が糖転移酵素（グリコシルトランスフェラーゼ）としての活性を有することを示しており、ＶｉｎＣ酵素がビセニスタチン生合成酵素クラスターにおいて糖転移酵素としての役割を担っていることが証明された。
【０１０４】
【発明の効果】
本発明により、ビセニスタチンの生合成酵素群をコードする遺伝子群であるｖｉｎクラスターの塩基配列が与えられた。更に本発明により、ｄＴＤＰ−ビセニサミンを基質としてビセニスタチンを生成する反応を触媒する糖転移酵素（ＶｉｎＣ酵素）、およびそれをコードする遺伝子である遺伝子（ｖｉｎＣ遺伝子）が与えられた。ＶｉｎＣ酵素は、有用なビセニサミンを酵素的に合成する目的で有用である。更にＶｉｎＣ酵素を用いることにより、これまでにないポリケチド配糖体を合成できる可能性も示された。
【０１０５】
【配列表】
2004089156.tif 000002
2004089156.tif 000003
2004089156.tif 000004
2004089156.tif 000005
2004089156.tif 000006
2004089156.tif 000007
2004089156.tif 000008
2004089156.tif 000009
2004089156.tif 000010
2004089156.tif 000011
2004089156.tif 000012
2004089156.tif 000013
2004089156.tif 000014
2004089156.tif 000015
2004089156.tif 000016
2004089156.tif 000017
2004089156.tif 000018
2004089156.tif 000019
2004089156.tif 000020
2004089156.tif 000021
2004089156.tif 000022
2004089156.tif 000023
2004089156.tif 000024
2004089156.tif 000025
2004089156.tif 000026
2004089156.tif 000027
2004089156.tif 000028
2004089156.tif 000029
2004089156.tif 000030
2004089156.tif 000031
2004089156.tif 000032
2004089156.tif 000033
2004089156.tif 000034
2004089156.tif 000035
2004089156.tif 000036
2004089156.tif 000037
2004089156.tif 000038
2004089156.tif 000039
2004089156.tif 000040
2004089156.tif 000041
2004089156.tif 000042
2004089156.tif 000043
2004089156.tif 000044
2004089156.tif 000045
2004089156.tif 000046
2004089156.tif 000047
2004089156.tif 000048
2004089156.tif 000049
2004089156.tif 000050
2004089156.tif 000051
2004089156.tif 000052
2004089156.tif 000053
2004089156.tif 000054
2004089156.tif 000055
2004089156.tif 000056
2004089156.tif 000057
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本研究で得られた遺伝子の遺伝子地図を示す模式図である。
【図２】図２は、各読み枠の相同性解析の結果を示す図である。
【図３】図３は、ビセニスタチンアグリコンの生合成経路を示す図である。
【図４】図４は、ビセニスタチンの生合成経路を示す図である。
【図５】図５は、酵素反応の基質（ｄＴＤＰ−ビセニサミン、ｄＴＤＰ−マイカロース、２−デオキシグルコース）の合成経路を示す図である。
【図１】
2004089156.tif 000058
【図２】
2004089156.tif 000059
【図３】
2004089156.tif 000060
【図４】
2004089156.tif 000061
【図５】
2004089156.tif 000062
【手続補正書】
【提出日】平成14年11月12日(2002.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示す、塩基番号１−６４４９２で示す塩基配列からなることを特徴とする，遺伝子クラスター。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の第一の観点として、配列表の配列番号１に示す、塩基番号１−６４４９２で示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子クラスターを提供する。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
【配列表】
2004089156.tif 000063
2004089156.tif 000064
2004089156.tif 000065
2004089156.tif 000066
2004089156.tif 000067
2004089156.tif 000068
2004089156.tif 000069
2004089156.tif 000070
2004089156.tif 000071
2004089156.tif 000072
2004089156.tif 000073
2004089156.tif 000074
2004089156.tif 000075
2004089156.tif 000076
2004089156.tif 000077
2004089156.tif 000078
2004089156.tif 000079
2004089156.tif 000080
2004089156.tif 000081
2004089156.tif 000082
2004089156.tif 000083
2004089156.tif 000084
2004089156.tif 000085
2004089156.tif 000086
2004089156.tif 000087
2004089156.tif 000088
2004089156.tif 000089
2004089156.tif 000090
2004089156.tif 000091
2004089156.tif 000092
2004089156.tif 000093
2004089156.tif 000094
2004089156.tif 000095
2004089156.tif 000096
2004089156.tif 000097
2004089156.tif 000098
2004089156.tif 000099
2004089156.tif 000100
2004089156.tif 000101
2004089156.tif 000102
2004089156.tif 000103
2004089156.tif 000104
2004089156.tif 000105
2004089156.tif 000106
2004089156.tif 000107
2004089156.tif 000108
2004089156.tif 000109
2004089156.tif 000110
2004089156.tif 000111
2004089156.tif 000112
2004089156.tif 000113
2004089156.tif 000114
2004089156.tif 000115
2004089156.tif 000116
2004089156.tif 000117
2004089156.tif 000118
2004089156.tif 000119
2004089156.tif 000120
2004089156.tif 000121
2004089156.tif 000122
2004089156.tif 000123
2004089156.tif 000124
2004089156.tif 000125
2004089156.tif 000126
2004089156.tif 000127
2004089156.tif 000128
2004089156.tif 000129
2004089156.tif 000130
2004089156.tif 000131
2004089156.tif 000132
2004089156.tif 000133
2004089156.tif 000134
2004089156.tif 000135
2004089156.tif 000136
2004089156.tif 000137
2004089156.tif 000138
2004089156.tif 000139
2004089156.tif 000140
2004089156.tif 000141
2004089156.tif 000142
2004089156.tif 000143
2004089156.tif 000144
2004089156.tif 000145
2004089156.tif 000146
2004089156.tif 000147
2004089156.tif 000148
2004089156.tif 000149
2004089156.tif 000150
2004089156.tif 000151
2004089156.tif 000152
2004089156.tif 000153
2004089156.tif 000154
2004089156.tif 000155
2004089156.tif 000156
2004089156.tif 000157
2004089156.tif 000158
2004089156.tif 000159
2004089156.tif 000160
2004089156.tif 000161
2004089156.tif 000162
2004089156.tif 000163
2004089156.tif 000164
2004089156.tif 000165
2004089156.tif 000166
2004089156.tif 000167
2004089156.tif 000168
2004089156.tif 000169
2004089156.tif 000170
2004089156.tif 000171
2004089156.tif 000172
2004089156.tif 000173
2004089156.tif 000174
2004089156.tif 000175
2004089156.tif 000176
2004089156.tif 000177
2004089156.tif 000178
2004089156.tif 000179
2004089156.tif 000180
2004089156.tif 000181
2004089156.tif 000182
2004089156.tif 000183
2004089156.tif 000184
2004089156.tif 000185
2004089156.tif 000186
2004089156.tif 000187
2004089156.tif 000188
2004089156.tif 000189
2004089156.tif 000190
2004089156.tif 000191
2004089156.tif 000192
2004089156.tif 000193
2004089156.tif 000194
2004089156.tif 000195
2004089156.tif 000196
2004089156.tif 000197
2004089156.tif 000198
2004089156.tif 000199
2004089156.tif 000200
2004089156.tif 000201
2004089156.tif 000202
2004089156.tif 000203
2004089156.tif 000204
2004089156.tif 000205
2004089156.tif 000206
2004089156.tif 000207
2004089156.tif 000208
2004089156.tif 000209
2004089156.tif 000210
2004089156.tif 000211
2004089156.tif 000212
2004089156.tif 000213
2004089156.tif 000214
2004089156.tif 000215
2004089156.tif 000216
2004089156.tif 000217
2004089156.tif 000218
2004089156.tif 000219
2004089156.tif 000220
2004089156.tif 000221
2004089156.tif 000222
2004089156.tif 000223
2004089156.tif 000224
2004089156.tif 000225
2004089156.tif 000226
2004089156.tif 000227
2004089156.tif 000228
2004089156.tif 000229
2004089156.tif 000230
2004089156.tif 000231
2004089156.tif 000232
2004089156.tif 000233
2004089156.tif 000234
2004089156.tif 000235
2004089156.tif 000236
2004089156.tif 000237
2004089156.tif 000238
2004089156.tif 000239
2004089156.tif 000240
2004089156.tif 000241
2004089156.tif 000242
2004089156.tif 000243
2004089156.tif 000244
【手続補正書】
【提出日】平成15年10月10日(2003.10.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
【従来の技術】
一般にポリケチド化合物の生合成遺伝子については世界的に活発に研究されており、遺伝子の欠失、挿入などによる新物質創製研究も精力的に行われている。この状況にあって、新たな多様性を求めるために、単純ポリケチドだけでなく、複合型ポリケチドの生合成遺伝子が新規遺伝子資源として注目されて、幅広く検索されている。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
その生合成経路としては、先ずグルタミン酸を原料として転位反応を含む一連の変換でポリケチドスターターが生合成され、その後、プロピオン酸及び酢酸を前駆体とする通常のポリケチド伸長反応により、特徴的な２０員環アグリコン部が生成されることが解明された。ビセニサミンはグルコースに由来し、他のアミノ糖に近縁の反応により官能基変換され、メチオニン由来のＮ−メチル基の導入により生合成されることが明らかにされた。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
ビセニスタチンはアミノ糖を有する配糖体であり、全く同一のビゼニサミンを糖部に持つ化合物は存在しないが、類似アミノ糖の生合成遺伝子と近縁の遺伝子が機能しているであろうことが推定される。また、アグリコン部はその大部分を酢酸・プロピオン酸を原料とするポリケチドであることが公表されているので、いわゆるポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）に類似の遺伝子の関与が推定できる。しかし、ポリケチドスターター部はグルタミン酸から由来する特異なアミノ酸であることが解明されており、そこには従来のポリケチド合成系の生合成遺伝子にはない遺伝子が関与していると推定される。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本発明においては、ポリケチド生合成に必須であり、各種のポリケチドで高い相同性が知られるケトシンターゼ（ＫＳ）、アミノ糖の類縁性、ならびにスターターの特異性を鍵として、ＰＣＲとハイブリダイゼーションを中心とする方法により、ビセニスタチンの生合成酵素遺伝子を探索した。その結果、ビセニスタチン最終構造を与えるのに必要な酵素群をコードする遺伝子群の同定と遺伝子塩基配列の解明に成功した。これは今後、遺伝子の改変、欠失、重複化、外部遺伝子導入等々の方法による、生合成工学的改変に大きな可能性を提供するものである。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
さらに、このｖｉｎ遺伝子クラスターの機能を確認するため、ｄＴＤＰ−ビセニサミンをアグリコンと結合させる糖転移酵素（グリコシルトランスフェラーゼ）ｖｉｎＣを大腸菌において発現させ、合成化学的に調製したｄＴＤＰ−ビセニサミンとビセニスタチンから化学的に誘導したアグリコンとの間の反応を検討した。その結果、このｖｉｎＣ遺伝子が本糖転移反応を効率よく触媒することを確認した。これにより、ｖｉｎ遺伝子クラスターがビセニスタチン生合成遺伝子であることが確定できた。これまでに、大環状ラクタム型抗生物質として生合成遺伝子が同定されたケースはアンサマイシン群抗生物質であるリファマイシンを除いて他にはない。リファマイシンとは化学構造や生物活性などさまざまな点で違いがあり、本発明の遺伝子群は今後生合成工学的手法による新規物質の創製における資源として極めて重要な価値を持つものと思われる。


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
様々なデオキシ糖生合成遺伝子も数多くクローニングされた結果、２，６−デオキシ糖の生合成において、４，６−デヒドラクターゼおよび２，３−デヒドラクターゼは遺伝子間の相同性が高いことが明らかとなり、二次代謝産物生合成遺伝子のクローニングのツールとしても用いられるようになってきている。


【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
（ゲノムライブラリーのスクリーニング）
ストレプトミセス・ハルステディー（Ｓ．ｈａｌｓｔｅｄｉｉ　）ＨＣ３４のゲノムライブラリーを以下のように構築した。ゲノムライブラリーとは、単一生物の染色体ＤＮＡを適当な長さに切断して、その断片をベクターにサブクローニングしたＤＮＡクローンの集団である。それぞれの断片はゲノムのあらゆる部分をランダムに含んでいる。ストレプトミセス・ハルステディー（Ｓ．ｈａｌｓｔｅｄｉｉ）　ＨＣ３４のゲノムライブラリーは、ゲノムをＳａｕ３ＡＩでランダム消化し、約４０ｋｂｐの断片をコスミドベクターｐＯＪ４４６にサブクローニングしたもの６０４８クローンの集団である。また、このままではスクリーニングの際に６０４８個の中から目的のクローンを探す必要があるため、９６クローンをひとつのプールとしてまとめ、６３個のプールとして保存してある。


【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
（コスミドの塩基配列解析）
ＤＮＡシークエンサーを用いて一回に解析できる長さは約６００〜７００ｂｐである。ストレプトミセス・ハルステディーＨＣ３４ゲノムライブラリーのコスミドは、インサートが約４０ｋｂｐになるように作られており、これだけ巨大な長さの全塩基配列を決定するためにはコスミドＤＮＡを適当な長さの断片に切断後、他のベクターにサブクローニングする必要がある。しかし、一度両鎖の塩基配列が読める５００ｂｐ程度の小さな断片に切断して配列を決定しようとすると、適当な制限酵素サイトを見つけるのが難しく、またそれぞれの断片をつなげるのが大変な作業になる。そこではじめに４０ｋｂｐのインサートを適当な制限酵素を用いて２〜１０ｋｂｐ程度の断片に切断してベクターにサブクローニングし、それぞれの断片についてそれぞれ配列決定を行い、これらをつなげることにした。


【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
鋳型となるプラスミドＤＮＡとトランスポゾンの共存下トランスポザーゼによりトランスポゾンを挿入し、大腸菌を形質転換する。トランスポゾン上にはカナマイシン耐性遺伝子がコードされておりトランスポゾンが挿入された鋳型プラスミドを保持している場合にはカナマイシン耐性を示すため、この性質を利用して目的の形質転換体を選択する。プラスミドを保持した形質転換体を培養し、そこから精製したプラスミドを鋳型としてシークエンスを行う。この方法は２〜１０ｋｂｐ程度の断片を解析するのに用いることができる。そこでＫ１Ｂ１０を制限酵素処理して得られるそれぞれの断片の全配列を確認し、これらをつなげることにした。


【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
（ｏｒｆＯのホモロジー解析）
ｏｒｆＯは１２４５ｂｐからなり、その遺伝子産物は４１４ａａのタンパクであることが推定される。なおこのｏｒｆＯは先に述べたｖｉｎＯ遺伝子に対応する。データベースによるホモロジー検索の結果、ピリドキサールリン酸（ｐｙｒｉｄｏｘａｌ−５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＰＬＰ）を補酵素として用いる脱炭酸酵素と相同性を示した。その中でも、ブチロシン生合成に関与していることが示唆されるＢｔｒＫ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＩＤ　ＢＡＢ１８４７３：バチルス・サーキュランス）と最も類似性が高く（ｉｄｅｎｔｉｔｙ　３１％　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　５１％）、他には一次代謝に関わるジアミノピメリン酸脱炭酸酵素やオルニチン脱炭酸酵素などと相同性を示した。相同性の数値から、ＯｒｆＯはアミノ酸を基質とするが、一次代謝系の脱炭酸酵素とは異なり、二次代謝産物の生合成に関わる脱炭酸酵素であることが推定される。これにより、ＯｒｆＯがビセニスタチンの生合成のスターター生合成において予想される脱炭酸を触媒していると考えられる。


【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
今回配列解析した１８個のＯＲＦ中には３−メチルアスパラギン酸の異性化酵素と考えられるものは存在していないが、活性化を担う酵素がこの機能を持つ可能性が高い。機能を明確には推定できなかったＯｒｆＭまたはＯｒｆＪが関与している可能性がある。あるいは、今回配列解析した領域の外側にこの反応に関わるＯＲＦが存在しているとも考えられる。


【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本研究で得られた遺伝子の遺伝子地図を示す模式図である。
【図２】図２は、各読み枠の相同性解析の結果を示す図である。
【図３】図３は、ビセニスタチンアグリコンの生合成経路を示す図である。
【図４】図４は、ビセニスタチンの生合成経路を示す図である。
【図５】図５は、酵素反応の基質（ｄＴＤＰ−ビセニサミン、ｄＴＤＰ−マイカロース、ｄＴＤＰ−２−デオキシグルコース）の合成経路を示す図である。