(57)【要約】【課題】透過型電子顕微鏡で観察された試料像の歪とボケを簡便に補正し、かつ、オングストロームレベルの分解能を実現可能な電子顕微鏡観察像の画像処理方法および画像処理プログラムを提供すること。【解決手段】観察試料のＴＥＭ観察を行うに際し、大きさと形態が既知の標準試料のＴＥＭ像を観察試料と同一条件下で撮影して電子データとして記録し、標準試料の観察画像電子データを基準画像電子データと比較して、Ｊａｃｏｂｉ反復法、最急降下法、共役勾配法の何れかの非線形最適化法により精度の高い点像分布関数を求め、観察試料の観察画像電子データにこの点像分布関数を逆畳込演算して画像形成することで観察試料の観察画像中に含まれている歪とボケを補正することとした。【選択図】　　　　図１
2004038362.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電子顕微鏡観察像を補正するための画像処理方法であって、
予め大きさおよび形態が既知の標準試料の画像を基準画像電子データとして記録するステップと、
観察試料と前記標準試料とを同一条件下で撮影して当該観察試料および標準試料の電子顕微鏡観察像を得るステップと、
当該観察試料および標準試料の各々の電子顕微鏡観察像を観察画像電子データとして記録するステップと、
当該標準試料の観察画像電子データを前記基準画像電子データと比較して点像分布関数を求めるステップと、
前記観察試料の観察画像電子データに前記点像分布関数を逆畳込演算して復元画像を形成するステップとを備えることを特徴とする電子顕微鏡観察像の画像処理方法。
【請求項２】
電子顕微鏡観察像を補正するための画像処理方法であって、
予め大きさおよび形態が既知の標準試料の画像を基準画像電子データとして記録するステップと、
観察試料と前記標準試料とを同一条件下で撮影して当該観察試料および標準試料の電子顕微鏡観察像を得るステップと、
当該観察試料および標準試料の各々の電子顕微鏡観察像を観察画像電子データとして記録するステップと、
前記標準試料の観察画像電子データからノイズ成分を除去するステップと、
当該ノイズ成分除去後の標準試料の観察画像電子データを前記基準画像電子データと比較して点像分布関数を求めるステップと、
前記観察試料の観察画像電子データに前記点像分布関数を逆畳込演算して復元画像を形成するステップとを備えることを特徴とする電子顕微鏡観察像の画像処理方法。
【請求項３】
前記点像分布関数および前記復元画像は、非線形最適化法により求められることを特徴とする請求項１または２に記載の電子顕微鏡観察像の画像処理方法。
【請求項４】
前記非線形最適化法は、Ｊａｃｏｂｉ反復法、最急降下法、共役勾配法の何れかであることを特徴とする請求項３に記載の電子顕微鏡観察像の画像処理方法。
【請求項５】
前記標準試料の観察画像電子データからノイズ成分を除去するステップが、
回転平均処理、加算平均処理またはフィルタリング処理のうちのいずれかの方法により実行されることを特徴とする請求項２に記載の電子顕微鏡観察画像の画像処理方法。
【請求項６】
前記標準試料の形態が、電子線の入射方向に対して回転対称であることを特徴とする請求項１又は２に記載の電子顕微鏡観察像の画像処理方法。
【請求項７】
電子顕微鏡観察像を画像処理するためのコンピュータが実行可能なプログラムであって、
予め大きさおよび形態が既知の標準試料の画像を基準画像電子データとして記録するステップと、
同一条件下で撮影された観察試料と前記標準試料の各々の電子顕微鏡観察像を観察画像電子データとして記録するステップと、
当該標準試料の観察画像電子データを前記基準画像電子データと比較して点像分布関数を求めるステップと、
前記観察試料の観察画像電子データに前記点像分布関数を逆畳込演算して復元画像を形成するステップとを備えることを特徴とする電子顕微鏡観察像の画像処理プログラム。
【請求項８】
電子顕微鏡観察像を画像処理するためのコンピュータが実行可能なプログラムであって、
予め大きさおよび形態が既知の標準試料の画像を基準画像電子データとして記録するステップと、
同一条件下で撮影された観察試料と前記標準試料の電子顕微鏡観察像を各々の観察画像電子データとして記録するステップと、
前記標準試料の観察画像電子データからノイズ成分を除去するステップと、
当該ノイズ成分除去後の標準試料の観察画像電子データを前記基準画像電子データと比較して点像分布関数を求めるステップと、
前記観察試料の観察画像電子データに前記点像分布関数を逆畳込演算して復元画像を形成するステップとを備えることを特徴とする電子顕微鏡観察像の画像処理プログラム。
【請求項９】
請求項７又は８に記載のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、電子顕微鏡観察像の画像処理方法および画像処理プログラムに関し、より詳細には、透過型電子顕微鏡で撮影された電子顕微鏡観察像をオングストロームレベルの分解能を維持しつつ歪とボケの補正を簡便に実行可能な画像処理方法および画像処理プログラムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）は、観察試料の形態や大きさを高分解能で観察・計測するために古くから用いられてきた汎用的な装置であり、近年では、観察対象試料を液体ヘリウム温度といった極低温に冷却した状態でｉｎ−ｓｉｔｕ観察する技術も開発され、例えばタンパク質のように極めて熱的に不安定な微小試料の観測も可能となってきている。また、画像処理技術の高度化を背景として、このようなタンパク質試料の３次元構造を求めるために、粒子状のタンパク質試料を観察して得られたＴＥＭ画像から複数のタンパク質試料のＴＥＭ画像を切り出して、これらのＴＥＭ画像を加算平均することでノイズを低減させる、いわゆる「単粒子構造解析」といった画像処理方法も知られている。
【０００３】
タンパク質のような熱的に不安定な試料をＴＥＭ観測する場合は、照射電子線密度を低く設定して観察中の照射電子線損傷を回避することが必要となる。このため、対物レンズの励磁状態を観察試料にフォーカスするように設定する通常の観察条件（ジャスト・フォーカス条件）の下で得られる観察像は極めてＳ／Ｎの悪いものとならざるを得ない。
【０００４】
特に、無染色のタンパク質試料をＴＥＭ観察する場合には、薄い水のバッファ層に試料を凍結させて観察用試料とするが、タンパク質と水との密度差は極僅かであるために本来的にコントラストがつき難いという問題がある。このため、タンパク質の構造をＴＥＭ観察から解析するための充分なコントラストを得るためには、対物レンズの励磁状態を意識的にジャスト・フォーカス条件からアンダー側にずらしてアンダー・フォーカス条件とすることでコントラストを上げる必要がある。
【０００５】
図９は、一般的に使用されているＴＥＭの構造と観察試料から得られる画像の様子を説明するための図で、図９（ａ）はＴＥＭの光学系の概念図であり、図９（ｂ）はフォーカス条件による観察画像のコントラストの変化を説明する概念図である。
【０００６】
電子銃９１より飛び出した高速な電子線９２は、磁場により形成された集光レンズ９３を透過して観察試料９４に照射される（図９（ａ））。電子線９２は、観察試料９４中を透過・散乱しながら通過して、対物レンズ９５、中間レンズ９６、投影レンズ９７を経て写真乾板９８上に観察試料９４の拡大像が形成される。観察試料９４中を透過・散乱しながら通過する電子線９２は、観察試料９４の散乱係数（電位密度）が、この観察試料９４を保持しているカーボン膜または氷の薄層の素材電位密度よりも高い場合はより強く散乱される。散乱した電子線と透過した電子線とは、電子の波動特性によって干渉し合い観察像のコントラストが生じる。
【０００７】
図９（ｂ）に示すように、透過電子線９２ａと散乱電子線９２ｂの干渉の程度は、氷の薄層などに保持された観察試料９４にフォーカスしたジャスト・フォーカス条件下で最も弱く、フォーカスをこの条件からずらすと増大する。本来的にコントラストのつき難いタンパク質などの分子をジャスト・フォーカス条件で観察すると、分解能が高く歪の小さな像が得られるもののコントラストが極めて弱くなり粒子の認識そのものが困難となる。一方、フォーカスをジャスト・フォーカス条件からアンダー側にずらしてコントラストを強くすると像観察は容易となるものの、ＴＥＭ像中の明部と暗部が反転するなどしてＴＥＭ像が大きく歪み、かつ、ボケが強くなるために分解能が著しく低下する。このようなＴＥＭ像に加算平均による画像処理を施しても、ノイズを低減させることが可能なだけで歪とボケを補正することはできず、観察試料の詳細な構造解析が困難となる。
【０００８】
このような理由から、従来の画像処理方法では、観察試料画像をパワースペクトル解析して画像の歪の程度を推定しこれを基に対応する周波数成分を補正したり、推定した歪関数（ＣＴＦ：Ｃｏｎｔｒａｓｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）からウィナーインバースフィルタを用いて逆変換する等の方法が採用されていた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、撮影して得られた試料画像のスペクトルの歪からＣＴＦを推定する画像処理方法では、画像中の歪が、試料によるスペクトル成分に起因する歪なのか、装置に起因する歪なのかを分離することが極めて難しかった。また、歪に対応する周波数成分を補正する場合には、画像中のコントラスト（明部と暗部）を反転させることはできてもボケを補正することはできないため、得られた補正画像は本来の観察試料の形態を忠実に反映した画像と大きく異なる結果となってしまうという問題があった。
【００１０】
このような問題はウィナーインバースフィルタを用いた補正方法でも同様であって、この補正方法では、観察試料画像に対して、周波数領域において制約項を加えたＣＴＦにより除算するために補正されない周波数領域が存在することとなる。そのため、得られた補正画像には周波数領域の欠損による歪が生じ、観察試料画像に含まれる歪以上の歪を生じさせてしまう場合があり得るという問題があった。
【００１１】
これまでの画像処理方法がこのような問題を抱えているため、電子顕微鏡画像の歪成分補正はあまり採用されることがなく、画像のボケを補正するための手法も未だ確立されていないのが現状である。
【００１２】
本発明は、このような問題に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、透過型電子顕微鏡で観察された観察試料像の歪とボケを簡便に補正し、かつ、オングストロームレベルの分解能を実現可能な電子顕微鏡観察像の画像処理方法および画像処理プログラム並びにこのような画像処理を可能とするコンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明の電子顕微鏡観察像の画像処理方法では、このような目的を達成するために、観察試料のＴＥＭ観察を行うに際し、大きさと形態が既知の標準試料のＴＥＭ像を観察試料と同一条件下で撮影し、標準試料の観察画像を基に装置関数である点像分布関数を非線形最適化法により求め、観察試料の観察画像中に含まれている歪とボケを補正することとしている。従来の点像分布関数の算出は、周波数面において、既知画像を観察画像で割算することで行われていたが、その様な方法では、既知画像の周波数スペクトルに０近傍の値が多数存在するために「０割」となってしまいかえってノイズが増幅されるため正確な点像分布関数を求めることができない。そのため、本発明では、点像分布関数を共役勾配法などの非線形最適化法により算出することとして、得られる点像分布関数の精度を高めることとしている。
【００１４】
請求項１に記載の発明は、電子顕微鏡観察像を補正するための画像処理方法であって、予め大きさおよび形態が既知の標準試料の画像を基準画像電子データとして記録するステップと、観察試料と前記標準試料とを同一条件下で撮影して当該観察試料および標準試料の電子顕微鏡観察像を得るステップと、当該観察試料および標準試料の各々の電子顕微鏡観察像を観察画像電子データとして記録するステップと、当該標準試料の観察画像電子データを前記基準画像電子データと比較して点像分布関数を求めるステップと、前記観察試料の観察画像電子データに前記点像分布関数を逆畳込演算して復元画像を形成するステップとを備えることを特徴とする。
【００１５】
また、請求項２に記載の発明は、電子顕微鏡観察像を補正するための画像処理方法であって、予め大きさおよび形態が既知の標準試料の画像を基準画像電子データとして記録するステップと、観察試料と前記標準試料とを同一条件下で撮影して当該観察試料および標準試料の電子顕微鏡観察像を得るステップと、当該観察試料および標準試料の各々の電子顕微鏡観察像を観察画像電子データとして記録するステップと、前記標準試料の観察画像電子データからノイズ成分を除去するステップと、当該ノイズ成分除去後の標準試料の観察画像電子データを前記基準画像電子データと比較して点像分布関数を求めるステップと、前記観察試料の観察画像電子データに前記点像分布関数を逆畳込演算して復元画像を形成するステップとを備えることを特徴とする。
【００１６】
また、請求項３に記載の発明は、請求項１または２に記載の電子顕微鏡観察像の画像処理方法において、前記点像分布関数および前記復元画像は、非線形最適化法により求められることを特徴とする。
【００１７】
また、請求項４に記載の発明は、請求項３に記載の電子顕微鏡観察像の画像処理方法において、前記非線形最適化法は、Ｊａｃｏｂｉ反復法、最急降下法、共役勾配法の何れかであることを特徴とする。
【００１８】
また、請求項５に記載の発明は、請求項２に記載の電子顕微鏡観察画像の画像処理方法において、前記標準試料の観察画像電子データからノイズ成分を除去するステップが、回転平均処理、加算平均処理またはフィルタリング処理のうちのいずれかの方法により実行されることを特徴とする。
【００１９】
更に、請求項６に記載の発明は、請求項１又は２に記載の電子顕微鏡観察像の画像処理方法において、前記標準試料の形態が、電子線の入射方向に対して回転対称であることを特徴とする。
【００２０】
請求項７に記載の発明は、電子顕微鏡観察像を画像処理するためのコンピュータが実行可能なプログラムであって、予め大きさおよび形態が既知の標準試料の画像を基準画像電子データとして記録するステップと、同一条件下で撮影された観察試料と前記標準試料の各々の電子顕微鏡観察像を観察画像電子データとして記録するステップと、当該標準試料の観察画像電子データを前記基準画像電子データと比較して点像分布関数を求めるステップと、前記観察試料の観察画像電子データに前記点像分布関数を逆畳込演算して復元画像を形成するステップとを備えることを特徴とする。
【００２１】
また、請求項８に記載の発明は、電子顕微鏡観察像を画像処理するためのコンピュータが実行可能なプログラムであって、予め大きさおよび形態が既知の標準試料の画像を基準画像電子データとして記録するステップと、同一条件下で撮影された観察試料と前記標準試料の電子顕微鏡観察像を各々の観察画像電子データとして記録するステップと、前記標準試料の観察画像電子データからノイズ成分を除去するステップと、当該ノイズ成分除去後の標準試料の観察画像電子データを前記基準画像電子データと比較して点像分布関数を求めるステップと、前記観察試料の観察画像電子データに前記点像分布関数を逆畳込演算して復元画像を形成するステップとを備えることを特徴とする。
【００２２】
更に、請求項９に記載の発明は、コンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、請求項７又は８に記載のプログラムを記録したものであることを特徴とする。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下に、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。
【００２４】
図１０は、観察試料をＴＥＭ観察して得られる観察画像が形成されるまでの概念図である。図１０（ａ）は、観察試料の本来の構造を忠実に反映した画像ｆであり、この観察試料をＴＥＭ観察すると観察時のノイズ以外の諸条件を反映する関数である装置関数（点像分布関数）ｈ（図１０（ｂ））の畳込みを受けてノイズがない理想的な観察画像［Ｈ］ｆに相当する画像が得られる（図１０（ｃ））。実際のＴＥＭ観察で得られる観察画像には図１０（ｄ）に示すようなノイズ画像ｎが重なるため、実際のＴＥＭ観察画像ｇは、理想的な観察画像［Ｈ］ｆに相当する図１０（ｃ）に図１０（ｄ）のノイズ画像ｎが重ね合わされた画像である図１０（ｅ）に示す画像（ｇ＝［Ｈ］ｆ＋ｎ）となる。
【００２５】
すなわち、実際のＴＥＭ観察画像ｇは、［Ｈ］を点像分布関数ｈの畳込演算のための演算子として、
【００２６】
【数１】
2004038362.tif 000003
【００２７】
で与えられることになる。実際のＴＥＭ観察画像ｇに含まれている歪とボケを補正して観察試料の本来の構造を忠実に反映する像ｆを得るためには、実際のＴＥＭ観察画像ｇからノイズ像ｎを除去し、さらに、点像分布関数ｈの逆畳込演算を実行すればよい。従って、この演算を高精度で行うためには、電子顕微鏡の観察条件等の装置関数に相当する点像分布関数ｈを正確に求める必要がある。
【００２８】
本発明の電子顕微鏡観察像の画像処理方法では、観察試料と予め大きさおよび形態が既知の標準試料のＴＥＭ観察像を同一の条件下で撮影し、標準試料のＴＥＭ観察像がこの標準試料の本来の構造を忠実に反映する像となるように点像分布関数ｈを求め、この点像分布関数ｈ関数を用いて観察試料のＴＥＭ観察画像を画像処理することにより歪とボケを補正することとしている。
【００２９】
図１は、本発明の電子顕微鏡観察像の画像処理方法の一連の手順を説明するためのフローチャートで、図２は、この方法における点像分布関数ｈの推定方法を説明するための概念図である。
【００３０】
先ず、予めその大きさと形態が分っている標準試料の基準画像を取得する（Ｓ１０１）。ここで、標準試料としては、以降の演算により点像分布関数を正確に求め易くするために電子線の入射方向に回転対称な形状を有することが好ましく、例えば、図３（ａ）に示すような極めて真球に近い形状が比較的容易に得られるポリスチレンビーズ球やＣｄＳｅ微粒子などが適当である。また、その大きさは、観察対象の試料の数分の１から数倍程度であることが好ましく、例えば、タンパク質のアポフェリチン粒子を観察試料とする本実施例の場合には、直径約２４０Å程度のポリスチレンビーズ球を用いている。
【００３１】
次に、観察試料と標準試料を同一条件下でＴＥＭ撮影する（Ｓ１０２）。この撮影用試料の作成は、例えば、図３（ｂ）に示すように、４００区画の銅メッシュグリッドに、直径１〜２μｍ程度の穴を有する厚さ約２００Åのカーボン膜を形成して親水化し、この状態のメッシュに、観察試料であるアポフェリチン粒子と標準試料とを混合させた水溶液をカーボン膜に滴下する。標準試料と観察試料はカーボン膜の穴の中に水の表面張力で保持され、この状態でカーボン膜の穴に形成される水の層の厚さが１００Å程度となるようにろ紙で吸い取った後にメッシュごと直ちに液体エタン中で凍結すると、図３（ｃ）に示すように、標準試料と観察試料とが１視野中に複数個ずつ観察される状態のメッシュが得られる。このメッシュを液体Ｈｅ温度に冷却した試料ステージにセットしてＴＥＭ観察する。
【００３２】
なお、標準試料は、上述したように観察試料に混合させても良いが、観察試料を保持するカーボングリッドなどの淵部に予め付着させておくこととしてもよい。また、標準試料の既知画像である基準画像は、標準試料の直径や電子の散乱係数などから予め予想される画像をコンピュータ上で作成したものを用いることとしてもよく、電子顕微鏡でジャスト・フォーカス条件下での標準試料の観察画像を記録し、この標準試料の観察画像を基準画像として用いることとしてもよい。
【００３３】
観察像の撮影は、観察試料と標準試料とが１視野に入るように適当に倍率を選択して、観察試料に応じて決定された加速電圧（例えば３００ｋｅＶ）と試料温度で行われるが、本実施例では、電子線照射時の試料損傷を回避するために、液体Ｈｅ冷却を行いながら試料温度が８Ｋ以下の極低温となるようにし、かつ、３〜５万倍程度の低倍率で撮影している。また、撮影時のフォーカス条件は、アポフェリチン粒子の観察画像のコントラストが充分に得られるように、数μｍ程度アンダー側に大きくずらして撮影している。
【００３４】
このようにして撮影したネガフィルムは、現像後に高精度スキャナーで１ピクセルが５μｍ×５μｍサイズでスキャンしてコンピュータに画像電子データとして取り込み（Ｓ１０３）以降の画像処理が実行される。また、解析に求められる観察像の分解能によっては、ＴＥＭ観察像をネガフィルム上に撮影することなくＣＣＤやイメージングプレート上に形成してその画像電子データを直接コンピュータに取り込むこととしてもよく、この場合にはステップＳ１０３が省略可能である（すなわち、ステップＳ１０３はステップＳ１０２で同時に実行される）。
【００３５】
このようにして取り込まれた観察画像（図２中のｇおよびｇｓ）の電子データを基にして点像分布関数ｈ関数を求めるために、先ず、標準試料の観察画像電子データに含まれるノイズ成分を除去する（Ｓ１０４）。標準試料から得られる複数の観察画像電子データを多数重ね合わせることで回転平均や加算平均を求めたりフィルタリング処理を行うことにより、理想的には図４（ａ）に示すようなノイズ除去後の標準試料の画像電子データが得られる。なお、極めてコントラストの高い標準試料の場合は、ノイズ除去工程（Ｓ１０４）は省略可能である。
【００３６】
本発明の電子顕微鏡観察像の画像処理方法では、標準試料の大きさ及び形態が既に知られているため、ノイズ除去後の標準試料の観察画像（図４（ａ））の電子データ（ノイズ除去工程を省略可能な場合には観察画像電子データそのもの）と標準試料の既知の基準画像（図２中のｆ）を用いて、Ｊａｃｏｂｉ反復法、最急降下法、共役勾配法などの非線形最適化法により電子顕微鏡の装置関数（点像分布関数）ｈの計算を行い（Ｓ１０５）、点像分布関数を決定する（Ｓ１０６）。こうして得られた点像分布関数ｈを基に、非線形最適化法により観察試料の本来の画像を演算により算出し（Ｓ１０７）、この演算を繰り返し行って観察試料の復元画像を決定する（Ｓ１０８）。なお、この復元画像の算出も、Ｊａｃｏｂｉ反復法、最急降下法、共役勾配法などの非線形最適化法による繰り返し演算によって実行される。これらの一連の演算は、上述したステップからなるプログラムをコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録し、この記録媒体を備えるコンピュータにより容易かつ迅速に実行することが可能である。
【００３７】
以下に、ノイズ除去工程（Ｓ１０４）が省略可能な場合に、非線形最適化法の一手法である最急降下法により点像分布関数ｈ関数を求める際の演算手順を説明する。ここで採用した最急降下法では、標準試料の観察画像ｇと標準試料の既知画像［Ｆ］を基に修正ベクトルｑとその長さα求め、式（７）により修正後の点像分布関数ｈ´を算出する。この演算を繰り返すことで、図４（ｂ）に示すような最適化された点像分布関数ｈを求めることができる。
【００３８】
透過型電子顕微鏡により観察される標準試料の観察画像ｇは、既知の標準試料画像ｆに点像分布関数ｈ関数の演算子［Ｈ］を作用させて得られる畳込画像［Ｈ］ｆに、ノイズ成分の画像ｎを加えた（２）式により求まる。しかしここでは、装置関数［Ｈ］は未知であるため、既知の標準試料画像ｆを演算子［Ｆ］として未知の装置関数ｈに畳み込んだ（３）式としてｈを求める必要がある。
【００３９】
【数２】
2004038362.tif 000004
【００４０】
【数３】
2004038362.tif 000005
【００４１】
点像分布関数ｈを求めるためには、次式で与えられる２乗誤差ｅ（標準試料の観察画像ｇと、既知の標準試料の画像［Ｆ］を点像分布関数ｈに畳込演算して得られる画像［Ｆ］ｈの誤差の２乗）が減少する方向に点像分布関数ｈを修正する必要がある。
【００４２】
【数４】
2004038362.tif 000006
【００４３】
２乗誤差ｅが減少する修正ベクトルｑは、ｅをｈで変微分した次式で与えられる。
【００４４】
【数５】
2004038362.tif 000007
【００４５】
さらに、次式で与えられる修正ベクトルｑの長さαを最適化する。
【００４６】
【数６】
2004038362.tif 000008
【００４７】
このような演算の結果得られる修正後の点像分布関数ｈ´は、次式のように、修正前の点像分布関数ｈと修正ベクトルｑとαの積の和で求まる。
【００４８】
【数７】
2004038362.tif 000009
【００４９】
図５は、このようにして求めた点像分布関数ｈを基に、観察画像を補正して本来の画像を形成するプロセスを説明するための図で、図２で説明した点像分布関数ｈの算出と同様に、非線形最適化法による繰り返し演算を実行して補正を行う。
【００５０】
観察試料の観察画像をｇｓとすると、この画像は、観察試料の本来の画像（補正画像）ｆｓに点像分布関数ｈの演算子［Ｈ］を作用させて得られる畳込画像［Ｈ］ｆｓとノイズ画像ｎとの和である次式で与えられる。
【００５１】
【数８】
2004038362.tif 000010
【００５２】
最適な補正画像ｆｓを得るためには、次式で与えられる２乗誤差ｅが減少する方向にｆｓを繰り返し修正し、最適な補正画像ｆｓを求める。
【００５３】
【数９】
2004038362.tif 000011
【００５４】
２乗誤差ｅを最小とするための補正画像ｆｓを求めるためには、式（９）をｆｓで変微分して次式で与えられる修正ベクトルｑｓを求め、
【００５５】
【数１０】
2004038362.tif 000012
【００５６】
さらに、次式で与えられる修正ベクトルｑｓの長さαｓを求める。
【００５７】
【数１１】
2004038362.tif 000013
【００５８】
修正後の観察画像ｆｓ´は、次式のように、修正前の観察画像ｆｓと修正ベクトルｑｓとその長さαｓの積の和で与えられ、
【００５９】
【数１２】
2004038362.tif 000014
【００６０】
得られた修正観察画像ｆｓ´から再度修正ベクトルｑｓとその長さαｓを求め、さらに補正画像を修正する。
【００６１】
図６は、最終的な復元試料観察画像が得られるまでの一連の演算を繰り返すことにより得られる画像を纏めた図である。補正後の観察画像ｆｓ´は徐々に本来の観察画像へと収束するとともに最適化された点像分布関数ｈの算出後は観察試料のノイズなし画像も自動的に求まり、一連の画像処理演算が完了する（Ｓ１０８）。
【００６２】
図７は、標準試料のＴＥＭ像と最終的に算出された点像分布関数の様子を説明するための図で、標準試料であるポリスチレンビーズのＴＥＭ像（図７（ａ））は極めてノイズの多い画像であるが、ポリスチレンビーズが極めて真球に近い形態を有することを仮定してこのＴＥＭ像のビーズの中心を軸として回転させて平均画像を求めると図７（ｂ）のようなノイズを低減させた画像を得ることができる。この回転平均画像（図７（ｂ））と標準試料であるポリスチレンビーズの既知画像（図７（ｃ））を用いて上述した最急降下法による演算を実行して図７（ｄ）に示すような点像分布関数が得られる。
【００６３】
図８は、このようにして求めた点像分布関数を基に、タンパク質のアポフェリチンのＴＥＭ像を補正して得られた観察画像の例を説明するための図で、ＴＥＭ像（図８（ａ））は、極めてＳ／Ｎの悪い画像であり辛うじてアポフェリチン粒子の輪郭が認識できる程度であるが、点像分布関数を用いてこの画像を補正するとノイズが減少するとともに分解能が向上しアポフェリチン粒子内部の構造までもが確認できるようになる（図８（ｂ））。この補正画像は、タンパク質の結晶構造を基にコンピュータ・シミュレーションにより求めたアポフェリチンの画像（図８（ｃ））とほぼ一致する画像となっている。
【００６４】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の電子顕微鏡観察像の画像処理方法では、観察試料のＴＥＭ観察を行うに際し、大きさと形態が既知の標準試料のＴＥＭ像を観察試料と同一条件下で撮影し、標準試料の観察画像を基に精度の高い点像分布関数を非線形最適化法により求め、観察試料の観察画像中に含まれている歪とボケを補正することとしたので、透過型電子顕微鏡で観察された試料像の歪とボケを簡便に補正し、かつ、オングストロームレベルの分解能を実現可能な電子顕微鏡観察像の画像処理方法および画像処理プログラム並びにそのような画像処理を可能とするコンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の電子顕微鏡観察像の画像処理方法の一連の手順を説明するためのフローチャートである。
【図２】本発明の電子顕微鏡観察像の画像処理方法における点像分布関数ｈの推定方法を説明するための概念図である。
【図３】標準試料の既知の基準画像（ａ）、ＴＥＭ観察用メッシュ（ｂ）、および、標準試料と観察試料とが１視野中に複数個ずつ観察される状態（ｃ）を説明するための図である。
【図４】ノイズ除去後の標準試料画像（ａ）および点像分布関数の画像（ｂ）を説明するための図である。
【図５】点像分布関数ｈを基に、観察画像を補正して本来の画像を形成するプロセスを説明するための図である。
【図６】最終的な復元試料観察画像が得られるまでの一連の演算を繰り返すことにより得られる画像を纏めた図である。
【図７】標準試料のＴＥＭ像と最終的に算出された点像分布関数の様子を説明するための図である。
【図８】本発明の電子顕微鏡観察像の画像処理方法で求めた点像分布関数を基に、タンパク質のアポフェリチンのＴＥＭ像を補正して得られた観察画像の例を説明するための図である。
【図９】一般的に使用されている透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）の構造と観察試料から得られる画像の様子を説明するための図で、（ａ）はＴＥＭの光学系の概念図であり、（ｂ）はフォーカス条件による観察画像のコントラストの変化を説明する概念図である。
【図１０】観察試料からＴＥＭ観察画像が形成されるまでの概念図である。
【符号の説明】
９１　電子銃
９２　電子線
９２ａ　透過電子線
９２ｂ　散乱電子線
９３　集光レンズ
９４　観察試料
９５　対物レンズ
９６　中間レンズ
９７　投影レンズ
９８　写真乾板
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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