(57)【要約】【課題】臨床検査の分野における体液中の過酸化水素の定量測定において、非常に優れた過酸化水素測定法および過酸化水素測定装置を提供する。【解決手段】この発明の過酸化水素測定法は、アルカリ環境下で固定化ホースラディシュ・ペルオキシダーゼと過酸化水素とイミダゾール類との反応により生ずる化学発光強度を測定するものとしている。この発明の過酸化水素測定装置は、クロマトグラフィー用ポンプ１１、オートサンプラー１２を設けた体液の移動相流路Ｆ１　と、クロマトグラフィー用ポンプ２１を設けたイミダゾール類の溶液およびアルカリ性緩衝液の移動相流路Ｆ２　を合流させ、これら移動相流路の合流路Ｆ３　をホースラディシュ・ペルオキシダーゼ固定化固相を充填したフローセル付き化学発光検出器３１に接続し、さらにこの化学発光検出器３１のフローセル３２の前面に近接して、化学発光検出器３１の光電子増倍管３３を設置したものとしている。【選択図】　　　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルカリ環境下で固定化ホースラディシュ・ペルオキシダーゼと過酸化水素とイミダゾール類との反応により生ずる化学発光強度を測定することを特徴とする体液中の過酸化水素測定法。
【請求項２】
移動相流路へ体液を注入し、別の移動相流路よりイミダゾール類の溶液およびアルカリ性緩衝液を注入して、これらの液をフローセル中のホースラディシュ・ペルオキシダーゼ固定化固相の充填部位で混合させて化学発光させ、その発光強度を化学発光測定システムにより測定することを特徴とする体液中の過酸化水素測定法。
【請求項３】
クロマトグラフィー用ポンプ（１１）、オートサンプラー（１２）を設けた体液の移動相流路（Ｆ１　）と、クロマトグラフィー用ポンプ（２１）を設けたイミダゾール類の溶液およびアルカリ性緩衝液の移動相流路（Ｆ２　）を合流させ、これら移動相流路の合流路（Ｆ３　）をホースラディシュ・ペルオキシダーゼ固定化固相を充填したフローセル付き化学発光検出器（３１）に接続し、さらにこの化学発光検出器（３１）のフローセル（３２）の前面に近接して、化学発光検出器（３１）の光電子増倍管（３３）を設置したことを特徴とする体液中の過酸化水素装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、新規な化学発光法を用いた体液中の過酸化水素測定法および過酸化水素測定装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来から臨床検査の分野において、体液中の過酸化水素を測定することは、酸化ストレス、オキシダーゼ酵素の基質物質の測定（例えば、グルコース、コレステロールなどの測定）に必要である。
【０００３】
過酸化水素の化学発光測定は、その簡便、迅速、高感度などの点から、臨床検査には適している。過酸化水素の化学発光測定法に通常用いられる化学発光物質には、ルミノール、イソルミノール、ロフィン、ルシゲニン、過シュウ酸エステルなどがある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来の過酸化水素の化学発光測定法や測定装置では、過酸化水素を含む化学発光試薬の迅速で効率の良い自動混合ができない、光電子倍増管などの光電子検出器に近接した位置で化学発光反応の開始および検出ができないなどの点で、測定精度の再現性の不良、有機溶媒の廃液の問題、検出感度の低下などにおける不利、不便であるという課題を有していた。
【０００５】
また、従来の過酸化水素の化学発光測定法に用いられる化学発光物質は、その化学発光検出に必須である水に比較的難溶性であったり、不純物の混入があったり、調整試薬が保存中に劣化するなどの点で、不利、不便であるという課題を有していた。
【０００６】
さらに、個別の化学発光物質の問題点として、ルミノールおよび過シュウ酸エステルでは、高濃度溶液調整にアセトニトリルなどの有機溶媒による溶解が必要であるという課題を有していた。ルシゲニンはその発光持続時間が短く、バックグラウンドノイズが多いという課題を有していた。また、ロフィン化学発光では、水難溶性と共にその発光収率が良くないという課題を有していた。
【０００７】
そこで、この発明は、上記従来の過酸化水素の化学発光測定法や測定装置、またはその化学発光測定法に用いられる化学発光物質が有する課題を解決するためになされたものであり、フローセルを用いた過酸化水素の化学発光測定法おいて、従来からの化学発光物質を必要としない新規な定量性のある化学発光系を見いだし、この発明の過酸化水素測定法および過酸化水素測定装置に至ったものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この発明の体液中の過酸化水素測定法は、アルカリ環境下で固定化ホースラディシュ・ペルオキシダーゼと過酸化水素とイミダゾール類との反応により生ずる化学発光強度を測定するものとしている。
【０００９】
また、この発明の体液中の過酸化水素測定法は、移動相流路へ体液を注入し、別の移動相流路よりイミダゾール類の溶液およびアルカリ性緩衝液を注入して、これらの液をフローセル中のホースラディシュ・ペルオキシダーゼ固定化固相の充填部位で混合させて化学発光させ、その発光強度を化学発光測定装置により測定するものとしている。
【００１０】
この発明の体液中の過酸化水素測定装置は、クロマトグラフィー用ポンプ１１、オートサンプラー１２を設けた体液の移動相流路Ｆ１　と、クロマトグラフィー用ポンプ２１を設けたイミダゾール類の溶液およびアルカリ性緩衝液の移動相流路Ｆ２　を合流させ、これら移動相流路の合流路Ｆ３　をホースラディシュ・ペルオキシダーゼ固定化固相を充填したフローセル付き化学発光検出器３１に接続し、さらにこの化学発光検出器３１のフローセル３２の前面に近接して、化学発光検出器３１の光電子増倍管３３を設置したものとしている。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、この発明の体液中の過酸化水素測定法およびその過酸化水素測定装置を詳細に説明する。
【００１２】
先ず、この発明の体液中の過酸化水素測定法は、マイクロフローインジェクション化学発光システムを用いて、アルカリ環境下で固定化ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰという）と過酸化水素とイミダゾール類との反応により生ずる化学発光強度を測定するものとしている。すなわち、過酸化水素測定試料である体液をオートサンプラーから移動相流路へ注入し、別の移動相流路よりイミダゾール類の溶液およびアルカリ性緩衝液を注入し、これら試薬をフローセルの中に送入し、フローセル中のＨＲＰ固定化固相の充填部位で自動混合させる。すると、ＨＲＰ固定化固相の位置で化学発光が生じる。そこで、その発光強度を化学発光測定システムの光電子増倍管で測定する。そして、その測定データは、データ処理機で計算するものとしている。
【００１３】
次に、この発明の体液中の過酸化水素測定装置は、図１に示したように、二台の高速液体クロマトグラフィー用ポンプ１１、２１、オートサンプラー１２、フローセル付き化学発光検出器３１およびデータ処理機４１より構成されている。そして、前記クロマトグラフィー用ポンプ１１、オートサンプラー１２を設けた体液の移動相流路Ｆ１　と、クロマトグラフィー用ポンプ２１を設けたイミダゾール類の溶液およびアルカリ性緩衝液の移動相流路Ｆ２　を合流させ、これら移動相流路の合流路Ｆ３　をＨＲＰ固定化固相を充填したフローセル付き化学発光検出器３１に接続し、さらにこの化学発光検出器３１のフローセル３２の前面に近接して、化学発光検出器３１の光電子増倍管３３を設置したものとしている。そして、化学発光検出器３１にはデータ処理機４１を電気接続したものとしている。
【００１４】
この発明における体液の種類としては、汗、涙、血液、尿の他に唾液、リンパ液などが用いられる。また、その体液の使用量は、５〜５０μＬ程度の少量でよい。
【００１５】
この発明における体液の移動相流路、イミダゾール類の溶液およびアルカリ性緩衝液の移動相流路、これら移動相流路の合流路としては、ステンレス管、テフロンチューブなどが用いられ、これら移動相流路、合流路における流速は、１００μＬ／ｍｉｎ以下の低速度が好ましい。
【００１６】
この発明におけるイミダゾール類としては、イミダゾール、２−メチルイミダゾール、４−メチルイミダゾール、４−メチル−５−ヒドロキシメチルイミダゾール、アラントイン、エチレンウレア、ヒスチジン、ピラゾ−ルなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、そのイミダゾール類の濃度は、１００ｍｍｏｌ／Ｌ程度が好ましい。
【００１７】
この発明におけるアルカリ性緩衝液としては、トリシン緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、そのアルカリ性緩衝液の濃度は、緩衝液の種類によって相違するが、トリシン緩衝液では５０ｍｍｏｌ／Ｌとし、この場合のｐＨ値は９．２であった。
【００１８】
この発明におけるＨＲＰ固定化固相としては、キトサンゲル、ガラスビーズ、ポリスチレンゲル、アクリルゲルなどのアミノ基導入ゲルなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
そして、この発明における試薬類の調製、ＨＲＰの固定化、フローセルの調製は、以下のようにして行った。
〔試薬類〕
（１）　ＨＲＰ（ＥＣ１．１１．１．７，１００　Ｕ／ｍＬ以上）、過酸化水素（Ｈ２　Ｏ２　）およびイミダゾール（１，３−ｄｉａｚａ−２，４−ｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｄｉｅｎｅ）は、和光純薬社製を用いた。
（２）　水は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ装置（日本ミリポア社製）を用いて脱イオン精製した精製水を用いた。
（３）　固定化固相として、キトパールビーズ（フジボー社製）およびアミノ基導入無孔性ガラスビーズ（ケムコ社製）用いた。
〔ＨＲＰの固定化〕
ＨＲＰ（１５ｍｇ／ｍＬ）をリン酸緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６．５）に希釈して、中根法（糖鎖酸化法）に従って固相に固定化した。
〔フローセル〕
テフロンチューブ（直径０．９６ｍｍ）へＨＲＰ固定化固相を長さ３ｃｍに渡って充填して、フローセルとした。
【００２０】
この発明における高速液体クロマトグラフィー用ポンプとしては、例えば、日本分光社製のクロマトグラフィー用ポンプＰＵ−９８０などを用いることができる。
【００２１】
この発明におけるオートサンプラーとしては、例えば、日本分光社製のオートサンプラーＡＳ−９５０などを用いることができる。
【００２２】
この発明におけるフローセル付き化学発光検出器としては、例えば、日本分光社製の化学発光検出器８２３−ＣＬなどを用いることができる。
【００２３】
さらに、この発明におけるデータ処理機としては、例えば、日本分光社製のデータ処理機ＬＣＳＳ−９０５などを用いることができる。
【００２４】
次に、この発明における化学発光と、従来のルミノール化学発光およびロフィン化学発光とを比較検討した結果について説明する。
【００２５】
先ず、この発明における化学発光の反応機構は、以下のように考えられる。すなわち、固定化ＨＲＰと過酸化水素とアルカリ性溶液中の溶存酸素が、イミダゾールを酸化し、イミダゾール過酸化物を生成する。このイミダゾール過酸化物はさらに酸化して、イミダゾールジオキセタンになり、そのイミダゾールジオキセタンが崩壊するときに発光を生ずると考えられる。
【００２６】
この発明における過酸化水素より生ずる化学発光の強度は、ルミノール化学発光による過酸化水素より生ずる化学発光の強度と同等であった。すなわち、この発明における化学発光による過酸化水素（１．９、３．９、５．６、７．８、９．７μｍｏｌ／Ｌ）の検量線の回帰式は、以下の通りであった。
Ｙ＝９８６０Ｘ２　＋３８３０Ｘ＋１１７００
（式中、Ｙは発光強度、Ｘは過酸化水素濃度μｍｏｌ／Ｌ）
この過酸化水素濃度域は、ルミノール化学発光での過酸化水素濃度域と同じで、また両者の過酸化水素最低検出域もほぼ同じであった（この発明における化学発光では０．１μｍｏｌ／Ｌ、ルミノール化学発光では０．２μｍｏｌ／Ｌ；いずれもＳ／Ｎ＝２、Ｈ２　Ｏ２　量は５０μＬ）。
【００２７】
この発明における化学発光では、過酸化水素測定値の再現性が優れていた。すなわち、発光強度の同時再現性の検討では、過酸化水素９．７μｍｏｌ／Ｌで変動係数０．３％、４．９μｍｏｌ／Ｌで変動係数０．４％、２．４μｍｏｌ／Ｌで変動係数０％（何れもｎ＝５）であった。
【００２８】
この発明における化学発光では、ＨＲＰ固定化固相の材質（キトサンビーズとガラスビーズを使用）は、化学発光に影響しなかった。しかし、キトサンビーズはガラスビーズよりＨＲＰ結合量が多い点において優れていた。
【００２９】
さらに、この発明における化学発光は、ルミノール化学発光と同等の感度を有しており、また水溶解性において優れていた。同様に過酸化水素測定においてロフィン化学発光より、水溶解性において優れていた。
【００３０】
【発明の効果】
よって、この発明の体液中の過酸化水素測定法および過酸化水素測定装置は、臨床検査の分野における体液中の過酸化水素の定量測定において、非常に優れたものとなった。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の体液中の過酸化水素測定装置の概略図である。
【符号の説明】
１１　クロマトグラフィー用ポンプ
１２　オートサンプラー
２１　クロマトグラフィー用ポンプ
３１　化学発光検出器
３２　フローセル
３３　光電子増倍管
Ｆ１　　移動相流路
Ｆ２　　移動相流路
Ｆ３　　合流路
【図１】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年11月12日(2002.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルカリ環境下で固定化ホースラディシュ・ペルオキシダーゼと過酸化水素とイミダゾール類との反応により生ずる化学発光強度を測定することを特徴とする体液中の過酸化水素測定法。
【請求項２】
移動相流路へ体液を注入し、別の移動相流路よりイミダゾール類の溶液およびアルカリ性緩衝液を注入して、これらの液をフローセル中のホースラディシュ・ペルオキシダーゼ固定化固相の充填部位で混合させて化学発光させ、その発光強度を化学発光測定システムにより測定することを特徴とする体液中の過酸化水素測定法。
【請求項３】
クロマトグラフィー用ポンプ（１１）、オートサンプラー（１２）を設けた体液の移動相流路（Ｆ１　）と、クロマトグラフィー用ポンプ（２１）を設けたイミダゾール類の溶液およびアルカリ性緩衝液の移動相流路（Ｆ２　）を合流させ、これら移動相流路の合流路（Ｆ３　）をホースラディシュ・ペルオキシダーゼ固定化固相を充填したフローセル付き化学発光検出器（３１）に接続し、さらにこの化学発光検出器（３１）のフローセル（３２）の前面に近接して、化学発光検出器（３１）の光電子増倍管（３３）を設置したことを特徴とする体液中の過酸化水素測定装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来の過酸化水素の化学発光測定法や測定装置では、過酸化水素を含む化学発光試薬の迅速で効率の良い自動混合ができない、光電子倍増管などの光電子検出器に近接した位置で化学発光反応の開始および検出ができないなどの点で、測定精度の再現性の不良、有機溶媒の廃液の問題、検出感度の低下などにおいて不利、不便であるという課題を有していた。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
また、従来の過酸化水素の化学発光測定法に用いられる化学発光物質は、その化学発光検出に必須であるが、水に比較的難溶性であったり、不純物の混入があったり、調整試薬が保存中に劣化するなどの点で、不利、不便であるという課題を有していた。