(57)【要約】      （修正有）【課題】ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ（ＰＬＣ／Ｄと略）の酵素活性を測定することにより試料中のカルシウムを測定する試薬及び方法において、更に他の酵素を用いなくとも測定を行うことができ、試料中のカルシウムを安価かつ正確に測定することができる測定試薬及び測定方法を提供する。【解決手段】試料と、ＰＬＣ／Ｄ、並びにＰＬＣ／Ｄの基質としての一般式（Ｉ）（Ｘ１は発色性基、Ｘ２とＸ３は、それぞれ独立に、水素原子、発色性基、あるいは置換されていないか若しくは置換されているアルキル基又はフェニル基）で表わされる化合物を混合し反応させ、前記の化合物から発色性基を遊離させる工程、及び、この遊離した発色性基を比色測定する工程よりなる試料中のカルシウム測定方法。2004329203.tif 000010【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤと、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤの基質としての下記の一般式（Ｉ）（式中、Ｘ１は発色性基であり、Ｘ２は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基であり、Ｘ３は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基である）で表される化合物を含有する、試料中のカルシウム測定試薬。
【化１】
2004329203.tif 000008
【請求項２】
ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭに調節する物質を含むことを特徴とする、請求項１記載の試料中のカルシウム測定試薬。
【請求項３】
金属イオン、キレート剤、又は含窒素化合物よりなる群から選択される少なくとも一つの物質を含むことを特徴とする、請求項１又は請求項２記載の試料中のカルシウム測定試薬。
【請求項４】
非イオン性界面活性剤及び／又は陰イオン性界面活性剤を含むことを特徴とする、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の試料中のカルシウム測定試薬。
【請求項５】
試料中のカルシウムを測定する方法であって、
ａ）  該試料と、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びにホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤの基質としての下記の一般式（Ｉ）（式中、Ｘ１は発色性基であり、Ｘ２は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基であり、Ｘ３は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基である）で表される化合物を混合し反応させ、前記の化合物から発色性基を遊離させる工程、及び
【化２】
2004329203.tif 000009
ｂ）  この遊離した発色性基を比色測定する工程、よりなる試料中のカルシウム測定方法。
【請求項６】
前記工程ａ）において、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭに調節する物質を共存させることを特徴とする、請求項５記載の試料中のカルシウム測定方法。
【請求項７】
前記工程ａ）において、金属イオン、キレート剤、又は含窒素化合物よりなる群から選択される少なくとも一つの物質を共存させることを特徴とする、請求項５又は請求項６記載の試料中のカルシウム測定方法。
【請求項８】
前記工程ａ）において、非イオン性界面活性剤及び／又は陰イオン性界面活性剤を共存させることを特徴とする、請求項５〜請求項７のいずれか１項に記載の試料中のカルシウム測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のカルシウムを測定するためのカルシウム測定試薬及び測定方法に関するものである。
本発明の試料中のカルシウム測定試薬及び測定方法では、安価に試料中のカルシウムを測定することが可能となり、更に測定感度を高めることが可能であって再現性良く正確にカルシウム濃度の測定を行うことができるものである。
本発明は、特に、化学、生命科学、分析化学及び臨床検査等の分野において有用なものである。
【背景技術】
【０００２】
カルシウムは、人体内に約１，２００ｇ存在しており、その約９９％が骨と歯に存在し、残りの約１％が血液などの体液や筋肉などに存在している。この１％のカルシウムが、出血を止めたり、神経の働きや筋肉運動など、生命の維持や活動に重要な役割を果たしている。血液中のカルシウム濃度は、カルシウムの吸収異常、骨疾患、内分泌疾患、高血圧、又は動脈硬化症等により変動し、その測定は臨床上極めて重要とされている。
【０００３】
現在、カルシウムの測定方法として使用されている方法としては、原子吸光法、電極法、ο−クレゾールフタレイン・コンプレクソン法（以下、ＯＣＰＣ法と略すこともある）がある。これらの方法は、高価な機器を必要としたり、試料の前処理を必要とする場合がある。特にＯＣＰＣ法ではマグネシウムイオンの影響を受けたり、温度や測定時間によって吸光度が変化するなどの欠点がある。
【０００４】
このため、最近では、カルシウムイオンによる酵素の活性化又は阻害を利用した測定方法として、カルシウムイオンによるホスホリパーゼＤの活性化を利用した測定（例えば、特許文献１及び２参照。）、カルシウムイオンによるピルビン酸キナーゼ活性の阻害を利用した測定（例えば、特許文献３参照。）、カルシウムイオンによるα−アミラーゼの活性化を利用した測定（例えば、特許文献４参照。）等が提案されている。
【特許文献１】特開昭６２−１９５２９７号公報
【特許文献２】特開平４−１８７０９８号公報
【特許文献３】特開平２−１４２４９８号公報
【特許文献４】特開平２−２７６５９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、これらの試料中のカルシウム測定方法（測定試薬）においては、カルシウムイオンによる阻害を利用したものでは測定範囲に限界があるという欠点を有していた。また、α−アミラーゼの活性化を利用したものでは試料中のα−アミラーゼの影響を受けやすいという問題を有していた。また、ホスホリパーゼＤのカルシウムイオンによる活性化を利用したものは特異性に優れ、測定感度も高いものであるが、ホスホリパーゼＤとホスホリパーゼＤの基質との反応によって生成した生成物を共役酵素の介在によって測定を行うため、ｐＨの調整等の繁雑な操作を必要としていた。
そして、これらのカルシウム測定試薬及び測定方法は、その測定コストが高いものであった。
【０００６】
よって、本発明の課題は、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤのカルシウムイオンによる活性化を利用した測定系において、測定コストを抑え安価に試料中のカルシウム濃度の測定を行うことを可能とし、更に測定感度を高めることが可能であって再現性良く正確にカルシウム濃度の測定を行うことができる測定試薬及び測定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記の問題点の解決を目指して鋭意検討を行った結果、カルシウムイオンによるホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤの活性化を利用した測定において、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤの基質としての下記の一般式（Ｉ）（式中、Ｘ１は発色性基であり、Ｘ２は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基であり、Ｘ３は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基である）で表される化合物を使用することにより、試料中のカルシウムを正確に測定できることを見出した。更に、測定系に金属イオン、キレート剤、又は含窒素化合物よりなる群から選択される少なくとも一つの物質を共存させることによって試料中のカルシウム濃度の測定範囲を拡大できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
【化１】
2004329203.tif 000002
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
（１）  少なくともホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤと、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤの基質としての下記の一般式（Ｉ）（式中、Ｘ１は発色性基であり、Ｘ２は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基であり、Ｘ３は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基である）で表される化合物を含有する、試料中のカルシウム測定試薬。
【００１０】
【化２】
2004329203.tif 000003
【００１１】
（２）  ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭに調節する物質を含むことを特徴とする、前記（１）の試料中のカルシウム測定試薬。
【００１２】
（３）  金属イオン、キレート剤、又は含窒素化合物よりなる群から選択される少なくとも一つの物質を含むことを特徴とする、前記（１）又は前記（２）記載の試料中のカルシウム測定試薬。
【００１３】
（４）  非イオン性界面活性剤及び／又は陰イオン性界面活性剤を含むことを 特徴とする、前記（１）〜前記（３）のいずれか一つに記載の試料中のカルシウム測定試薬。
【００１４】
（５）  試料中のカルシウムを測定する方法であって、
ａ）  該試料と、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びにホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤの基質としての下記の一般式（Ｉ）（式中、Ｘ１は発色性基であり、Ｘ２は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基であり、Ｘ３は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基である）で表される化合物を混合し反応させ、前記の化合物から発色性基を遊離させる工程、及び
【００１５】
【化３】
2004329203.tif 000004
【００１６】
ｂ）  この遊離した発色性基を比色測定する工程、よりなる試料中のカルシウム測定方法。
【００１７】
（６）  前記工程ａ）において、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭに調節する物質を共存させることを特徴とする、前記（５）記載の試料中のカルシウム測定方法。
【００１８】
（７）  前記工程ａ）において、金属イオン、キレート剤、又は含窒素化合物よりなる群から選択される少なくとも一つの物質を共存させることを特徴とする、前記（５）又は前記（６）記載の試料中のカルシウム測定方法。
【００１９】
（８）  前記工程ａ）において、非イオン性界面活性剤及び／又は陰イオン性界面活性剤を含むことを 特徴とする、前記（５）〜前記（７）のいずれか一つに記載の試料中のカルシウム測定方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の試料中のカルシウム測定試薬及びカルシウム測定方法では、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤの基質として前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を使用することにより、更に他の酵素を用いなくとも測定が行えるようになり、試料中のカルシウムを安価かつ正確に測定できるようになった。
【００２１】
更に、測定試薬又は測定反応時に、金属イオン、キレート剤、又は含窒素化合物よりなる群から選択される少なくとも一つの物質を含有又は共存させることによって、試料中のカルシウム濃度の測定範囲を高濃度域まで拡大することができるようになった。
【００２２】
また、測定試薬又は測定反応時に、非イオン性界面活性剤を含有又は共存させることによって、試料中のカルシウム濃度測定時の反応の進行（タイムコース）を安定化することができるようになった。
【００２３】
そして、測定試薬又は測定反応時に、陰イオン性界面活性剤を含有又は共存させることによって、カルシウム濃度測定の感度を上昇させ、微量濃度のカルシウムさえも測定することができるようになった。
【００２４】
また、測定試薬又は測定反応時に、陰イオン性界面活性剤を含有又は共存させることによって、試料中にホスフォジエステラーゼが混在している場合であっても、このホスフォジエステラーゼが前記の一般式（Ｉ）で表される化合物よりなる基質の発色性基を遊離させる反応を抑制することができ、測定値に正の誤差が生じることを防ぐことができるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
（１）  ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤの基質
本発明においては、下記の一般式（Ｉ）（式中、Ｘ１は発色性基であり、Ｘ２は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基であり、Ｘ３は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基である）で表される化合物を、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤの基質として使用する。
【００２６】
【化４】
2004329203.tif 000005
【００２７】
前記の一般式（Ｉ）で表される化合物において、発色性基としては、リン酸基にエステル結合した状態と、加水分解によりリン酸基より遊離した状態での吸光度又は透過率等のシグナルに差がある発色性基であればどのようなものでもよい。
【００２８】
なお、この発色性基としては、リン酸基にエステル結合した状態と、リン酸基から遊離した状態での吸光度又は透過率等のシグナルの差が大きいものが好ましい。
【００２９】
そして、発色性基Ｘ１と、発色性基Ｘ２と、発色性基Ｘ３とは、それぞれ全て同じものであってもよく、一部異なるものであってもよく、又は全て異なるものであってもよい。
この発色性基Ｘ１と、発色性基Ｘ２と、発色性基Ｘ３とが、一部異なるものである場合、又は全て異なるものである場合には、各々の測定波長域、すなわち極大吸収波長が同一であるか又は近傍にあるものであることが好ましい。
【００３０】
前記の一般式（Ｉ）で表される化合物における発色性基としては、例えば、４−ニトロフェニル基、２−クロロ−４−ニトロフェニル基、２，６−ジクロロ−４−ニトロフェニル基、２，６−ジクロロ−アセチルフェニル基、又はアセチルフェニル基等を挙げることができる。
【００３１】
また、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物において、アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、又はイソプロピル基等を挙げることができる。
更に、置換アルキル基及び置換フェニル基の置換基としては、同一又は異なる、置換数１〜３の、例えば、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基、アミノ基、又はハロゲン基等を挙げることができる。
【００３２】
また、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物のうち、Ｘ２及びＸ３のいずれも発色性基でない場合の化合物としては、例えば、４−ニトロフェニルリン酸〔以下、４−ＮＰＰということもある〕、４−ニトロフェニルフェニルリン酸〔以下、４−ＮＰＰＰということもある〕、２−クロロ−４−ニトロフェニルリン酸〔以下、４−ＣＮＰＰということもある〕、２−クロロ−４−ニトロフェニルフェニルリン酸〔以下、４−ＣＮＰＰＰということもある〕、２，６−ジクロロ−４−ニトロフェニルリン酸〔以下、２，６−ＤＣＮＰＰということもある〕、２，６−ジクロロ−４−ニトロフェニルフェニルリン酸〔以下、２，６−ＤＣＮＰＰＰということもある〕、２，６−ジクロロ−アセチルフェニルリン酸〔以下、２，６−ＤＣＡＰＰということもある〕、２，６−ジクロロ−アセチルフェニルフェニルリン酸〔以下、２，６−ＤＣＡＰＰＰということもある〕、アセチルフェニルリン酸〔以下、ＡＰＰということもある〕、若しくはアセチルフェニルフェニルリン酸〔以下、ＡＰＰＰということもある〕、又はこれらの塩等を挙げることができる。
【００３３】
更に、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物のうち、Ｘ２が発色性基であり、かつＸ３が発色性基でない場合の化合物としては、例えば、ビス（４−ニトロフェニル）リン酸〔以下、Ｂｉｓ−４−ＮＰＰということもある〕、ビス（２−クロロ−４−ニトロフェニル）リン酸〔以下、Ｂｉｓ−４−ＣＮＰＰということもある〕、ビス（２，６−ジクロロ−４−ニトロフェニル）リン酸〔以下、Ｂｉｓ−２，６−ＤＣＮＰＰということもある〕、ビス（２，６−ジクロロ−アセチルフェニル）リン酸〔以下、Ｂｉｓ−２，６−ＤＣＡＰＰということもある〕、若しくはビスアセチルフェニルリン酸〔Ｂｉｓ−ＡＰＰ〕、又はこれらの塩等を挙げることができる。
【００３４】
そして、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物のうち、Ｘ２が発色性基であり、かつＸ３も発色性基である場合の化合物としては、例えば、トリス（４−ニトロフェニル）リン酸〔以下、Ｔｒｉｓ−４−ＮＰＰということもある〕、トリス（２−クロロ−４−ニトロフェニル）リン酸〔以下、Ｔｒｉｓ−４−ＣＮＰＰということもある〕、トリス（２，６−ジクロロ−４−ニトロフェニル）リン酸〔以下、Ｔｒｉｓ−２，６−ＤＣＮＰＰということもある〕、トリス（２，６−ジクロロ−アセチルフェニル）リン酸〔以下、Ｔｒｉｓ−２，６−ＤＣＡＰＰということもある〕、若しくはトリスアセチルフェニルリン酸〔Ｔｒｉｓ−ＡＰＰ〕、又はこれらの塩等を挙げることができる。
【００３５】
本発明における前記の一般式（Ｉ）で表される化合物としては、ビス（４−ニトロフェニル）リン酸、ビス（２−クロロ−４−ニトロフェニル）リン酸、ビス（２，６−ジクロロ−４−ニトロフェニル）リン酸、ビス（２，６−ジクロロ−アセチルフェニル）リン酸、若しくはビスアセチルフェニルリン酸、又はこれらの塩等のＸ１に加えてＸ２もが発色性基であるものが好ましい。
それは、カルシウムにより活性化されるホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤの触媒作用によりリン酸基から遊離する発色性基が、Ｘ２及びＸ３が発色性基でない場合にはＸ１だけであるのに対し、Ｘ１及びＸ２が発色性基である場合にはＸ１とＸ２の両方がリン酸基より遊離し、得られるシグナルが２倍となるので、これにより高感度に測定を行うことが可能となるからである。
【００３６】
同じ理由により、本発明における前記の一般式（Ｉ）で表される化合物としては、トリス（４−ニトロフェニル）リン酸〔以下、Ｔｒｉｓ−４−ＮＰＰということもある〕、トリス（２−クロロ−４−ニトロフェニル）リン酸〔以下、Ｔｒｉｓ−４−ＣＮＰＰということもある〕、トリス（２，６−ジクロロ−４−ニトロフェニル）リン酸〔以下、Ｔｒｉｓ−２，６−ＤＣＮＰＰということもある〕、トリス（２，６−ジクロロ−アセチルフェニル）リン酸〔以下、Ｔｒｉｓ−２，６−ＤＣＡＰＰということもある〕、若しくはトリスアセチルフェニルリン酸〔Ｔｒｉｓ−ＡＰＰ〕、又はこれらの塩等のＸ１に加えてＸ２及びＸ３ともが発色性基であるものが好ましい。
【００３７】
なお、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を、試料並びにホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤと混合し反応させる際の濃度は、０．０２〜２００ｍＭの範囲にあることが好ましく、０．１〜１００ｍＭの範囲にあることが特に好ましい。
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させる前記の一般式（Ｉ）で表される化合物の濃度は、試料並びにホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤと混合し反応させる際の濃度が０．０２〜２００ｍＭとなるように、好ましくは０．１〜１００ｍＭとなるように設定すればよい。
例えば、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を、０．０２〜２００ｍＭとなるように、好ましくは０．１〜１００ｍＭとなるように含有させればよい。
【００３８】
なお、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物は、市販品として容易に入手することができるが、当業者に周知の合成方法を適宜組み合わせることにより、容易に製造することもできる。
【００３９】
（２）  ホスホリパーゼＣ
本発明において、ホスホリパーゼＣ（ＥＣ３．１．４．３）とは、グリセロリン脂質のジアシルグリセロ基とホスフォコリン基との間のエステル結合を加水分解してジアシルグリセロールおよびホスフォコリンを遊離させる酵素である。
【００４０】
本発明に用いられるホスホリパーゼＣとしては、いずれの由来のものも使用でき、例えば、ストレプトマイセス属、クロストリジウム属、バチルス属又はシュードモナス属等の微生物由来、若しくは、高等動物の脳、肝臓、脾臓又は赤血球等の動物組織由来のものなどを挙げることができる。
なお、このホスホリパーゼＣとしては、微生物等の遺伝子を大腸菌等の微生物等に組み込む遺伝子組み換え技術により調製したもの、又は遺伝子の改変等により性質を改良した微生物等から調製したホスホリパーゼＣ等も含まれる。
【００４１】
このホスホリパーゼＣを、試料及び前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の活性値は、０．０１〜１０単位／ｍＬの範囲にあることが好ましく、０．０１〜５単位／ｍＬの範囲が特に好ましい。
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させるホスホリパーゼＣの活性値は、試料並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の活性値が０．０１〜１０単位／ｍＬとなるように、好ましくは０．０１〜５単位／ｍＬとなるように設定すればよい。
例えば、ホスホリパーゼＣを、０．０１〜１０単位／ｍＬとなるように、好ましくは０．０１〜５単位／ｍＬとなるように含有させればよい。
【００４２】
（３）  ホスホリパーゼＤ
本発明において、ホスホリパーゼＤ（ＥＣ３．１．４．４）とは、グリセロリン脂質のホスファチジル基と塩基との間のエステル結合を加水分解してホスファチジン酸および塩基を遊離させる酵素である。
【００４３】
本発明に用いられるホスホリパーゼＤとしては、いずれの由来のものも使用でき、例えば、キャベツ、ニンジン、ホウレンソウ、綿実若しくは落花生等の植物組織由来、ブタ膵臓等の動物組織由来、又はストレプトマイセス属、ミクロノスポラ属、ノカルディオプシス属、アクチノマデューラ属若しくはノカルディア属等の微生物由来のものなどを挙げることができる。
なお、このホスホリパーゼＤとしては、微生物等の遺伝子を大腸菌等の微生物等に組み込む遺伝子組み換え技術により調製したもの、又は遺伝子の改変等により性質を改良した微生物等から調製したホスホリパーゼＤ等も含まれる。
本発明においては、ストレプトマイセス属微生物由来のホスホリパーゼＤを使用することが好ましい。
【００４４】
このホスホリパーゼＤを、試料及び前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の活性値は、０．０１〜１０単位／ｍＬの範囲にあることが好ましく、０．０１〜５単位／ｍＬの範囲が特に好ましい。
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させるホスホリパーゼＤの活性値は、試料並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の活性値が０．０１〜１０単位／ｍＬとなるように、好ましくは０．０１〜５単位／ｍＬとなるように設定すればよい。
例えば、ホスホリパーゼＤを、０．０１〜１０単位／ｍＬとなるように、好ましくは０．０１〜５単位／ｍＬとなるように含有させればよい。
【００４５】
（４）  ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭに調節する物質
（ａ）  見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭに調節する物質
本発明の試料中のカルシウム測定試薬においては、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭに調節する物質を含むことが好ましい。
そして、見掛けのＫｍ値を０．１〜３ｍＭに調節する物質を含むことがより好ましい。
【００４６】
また、本発明の試料中のカルシウム測定方法では、試料と、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させ、前記の化合物から発色性基を遊離させる工程において、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭに調節する物質を共存させることが好ましい。
そして、前記の見掛けのＫｍ値を０．１〜３ｍＭに調節する物質を共存させることがより好ましい。
【００４７】
前記の見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭ（より好ましくは０．１〜３ｍＭ）に調節する物質を測定試薬に含ませ、又は共存させて測定を行うことにより、試料中のカルシウム測定の直線性を高濃度域まで伸ばすことが可能となる。
【００４８】
前記の見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭ（より好ましくは０．１〜３ｍＭ）に調節する物質としては、例えば、金属イオン、キレート剤、又は含窒素化合物等を挙げることができる。
すなわち、前記の見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭ（より好ましくは０．１〜３ｍＭ）に調節する物質として、金属イオン、キレート剤、又は含窒素化合物等よりなる群から選択される少なくとも一つの物質を、本発明の試料中のカルシウムの測定試薬に含ませ、又は本発明の測定方法における基質から発色性基を遊離させる工程において共存させる。
前記の見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭ（より好ましくは０．１〜３ｍＭ）に調節する物質は、１種類だけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
なお、本発明においては、前記の金属イオン、キレート剤、及び／又は含窒素化合物を同時に用いてもよい。
【００４９】
（ｂ）  金属イオン
本発明においては、前記のホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭ（より好ましくは０．１〜３ｍＭ）に調節する物質として、金属イオンを使用することができる。
この金属イオンとしては、例えば、コバルトイオン、ニッケルイオン、又は亜鉛イオン等を挙げることができる。
この金属イオンは１種類だけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
【００５０】
なお、この金属イオンを、試料、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と共存させる際の濃度は、０．００５〜５０ｍＭの範囲にあることが好ましい。
例えば、コバルトイオンにおいては、０．１〜５０ｍＭの範囲にあることが好ましく、ニッケルイオンにおいては、０．０５〜２５ｍＭの範囲にあることが好ましく、そして、亜鉛イオンにおいては、０．００５〜２．５ｍＭの範囲にあることが好ましい。
【００５１】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させる前記の金属イオンの濃度は、試料、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の濃度が０．００５〜５０ｍＭとなるように設定すればよい。
例えば、前記の金属イオンを、０．００５〜５０ｍＭとなるように含有させればよい。
例としては、コバルトイオンにおいては、０．１〜５０ｍＭとなるようにすることが好ましく、ニッケルイオンにおいては、０．０５〜２５ｍＭとなるようにすることが好ましく、そして、亜鉛イオンにおいては、０．００５〜２．５ｍＭとなるようにすることが好ましい。
【００５２】
（ｃ）  キレート剤
また、本発明においては、前記のホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭ（より好ましくは０．１〜３ｍＭ）に調節する物質として、キレート剤を使用することもできる。
【００５３】
ここで、キレート剤としては、例えば、クエン酸、酒石酸、シュウ酸、マロン酸、フマル酸、コハク酸、若しくはリンゴ酸などのカルボン酸又はその塩等を挙げることができる。
このキレート剤は１種類だけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
【００５４】
なお、このキレート剤を、試料、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と共存させる際の濃度は、０．１〜２００ｍＭの範囲にあることが好ましく、５〜１５０ｍＭの範囲にあることが特に好ましい。
【００５５】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させる前記のキレート剤の濃度は、試料、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の濃度が０．１〜２００ｍＭとなるように、特に５〜１５０ｍＭとなるように設定すればよい。
例えば、前記のキレート剤を、０．１〜２００ｍＭとなるように、特に５〜１５０ｍＭとなるように設定すればよい。
【００５６】
（ｄ）  含窒素化合物
そして、本発明においては、前記のホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭ（より好ましくは０．１〜３ｍＭ）に調節する物質として、含窒素化合物を使用することもできる。
【００５７】
ここで、含窒素化合物としては、例えば、アミン類、塩基性アミノ酸、複素環化合物、若しくはグアニジン、又はこれらの誘導体等を挙げることができる。
より具体的には、アミン類としては、例えば、アンモニア、アンモニウム若しくはその誘導体、又はこれらの塩等を挙げることができる。このアンモニウム塩としては、例えば、塩化アンモニウム、又は硫酸アンモニウム（硫安）等を挙げることができる。
また、塩基性アミノ酸としては、例えば、アルギニン、リジン、ヒスチジン若しくはその誘導体、又はこれらの塩等を挙げることができる。
また、複素環化合物としては、例えば、イミダゾール若しくはその誘導体、又はこれらの塩等を挙げることができる。
また、グアニジン又はその誘導体としては、例えば、グアニジン塩酸塩、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン硫酸塩、グアニジン硝酸塩、グアニジン炭酸塩、若しくはグアニジン燐酸塩などのグアニジン塩、アミノグアニジン、又はフェニルグアニジン等を挙げることができる。
なお、これらの含窒素化合物は１種類だけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
【００５８】
なお、この含窒素化合物を、試料、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と共存させる際の濃度は、１ｍＭ〜２Ｍの範囲にあることが好ましく、１０ｍＭ〜１Ｍの範囲にあることが特に好ましい。
【００５９】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させる前記の含窒素化合物の濃度は、試料、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の濃度が、１ｍＭ〜２Ｍとなるように、特に１０ｍＭ〜１Ｍとなるように設定すればよい。
例えば、前記の含窒素化合物を、１ｍＭ〜２Ｍとなるように、特に１０ｍＭ〜１Ｍとなるように設定すればよい。
【００６０】
（５）  金属イオン
本発明の試料中のカルシウム測定試薬においては、金属イオンを含むことが好ましい。
また、本発明の試料中のカルシウム測定方法では、試料と、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させ、前記の化合物から発色性基を遊離させる工程において、金属イオンを共存させることが好ましい。
【００６１】
前記の金属イオンとしては、例えば、コバルトイオン、ニッケルイオン、又は亜鉛イオン等を挙げることができる。
この金属イオンは１種類だけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
【００６２】
前記の金属イオンを測定試薬に含ませ、又は共存させて測定を行うことにより、試料中のカルシウム測定の直線性を高濃度域まで伸ばすことが可能となる。
【００６３】
なお、この金属イオンを、試料、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と共存させる際の濃度は、０．００５〜５０ｍＭの範囲にあることが好ましい。
例えば、コバルトイオンにおいては、０．１〜５０ｍＭの範囲にあることが好ましく、ニッケルイオンにおいては、０．０５〜２５ｍＭの範囲にあることが好ましく、そして、亜鉛イオンにおいては、０．００５〜２．５ｍＭの範囲にあることが好ましい。
【００６４】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させる前記の金属イオンの濃度は、試料、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の濃度が、０．００５〜５０ｍＭとなるように設定すればよい。
例えば、コバルトイオンにおいては、０．１〜５０ｍＭとなるように含有させればよく、ニッケルイオンにおいては、０．０５〜２５ｍＭとなるように含有させればよく、そして、亜鉛イオンにおいては、０．００５〜２．５ｍＭとなるように含有させればよい。
【００６５】
（６）  キレート剤
本発明の試料中のカルシウム測定試薬においては、キレート剤を含むことが好ましい。
【００６６】
また、本発明の試料中のカルシウム測定方法では、試料と、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させ、前記の化合物から発色性基を遊離させる工程において、キレート剤を共存させることが好ましい。
【００６７】
このキレート剤を測定試薬に含ませ、又は共存させて測定を行うことにより、試料中のカルシウム測定の直線性を高濃度域まで伸ばすことが可能となる。
【００６８】
ここで、キレート剤としては、例えば、クエン酸、酒石酸、シュウ酸、マロン酸、フマル酸、コハク酸、若しくはリンゴ酸などのカルボン酸又はその塩等を挙げることができる。
【００６９】
このキレート剤は１種類だけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
【００７０】
なお、このキレート剤を、試料、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と共存させる際の濃度は、０．１〜２００ｍＭの範囲にあることが好ましく、５〜１５０ｍＭの範囲にあることが特に好ましい。
【００７１】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させるこのキレート剤の濃度は、試料、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の濃度が０．１〜２００ｍＭとなるように、特に５〜１５０ｍＭとなるように設定すればよい。
例えば、このキレート剤を、０．１〜２００ｍＭとなるように、特に５〜１５０ｍＭとなるように設定すればよい。
【００７２】
（７）  含窒素化合物
本発明の試料中のカルシウム測定試薬においては、含窒素化合物を含むことが好ましい。
【００７３】
また、本発明の試料中のカルシウム測定方法では、試料と、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させ、前記の化合物から発色性基を遊離させる工程において、含窒素化合物を共存させることが好ましい。
【００７４】
この含窒素化合物を測定試薬に含ませ、又は共存させて測定を行うことにより、試料中のカルシウム測定の直線性を高濃度域まで伸ばすことが可能となる。
【００７５】
ここで、含窒素化合物としては、例えば、アミン類、塩基性アミノ酸、複素環化合物、若しくはグアニジン、又はこれらの誘導体等を挙げることができる。
より具体的には、アミン類としては、例えば、アンモニア、アンモニウム若しくはその誘導体、又はこれらの塩等を挙げることができる。このアンモニウム塩としては、例えば、塩化アンモニウム、又は硫酸アンモニウム（硫安）等を挙げることができる。
また、塩基性アミノ酸としては、例えば、アルギニン、リジン、ヒスチジン若しくはその誘導体、又はこれらの塩等を挙げることができる。
また、複素環化合物としては、例えば、イミダゾール若しくはその誘導体、又はこれらの塩等を挙げることができる。
また、グアニジン又はその誘導体としては、例えば、グアニジン塩酸塩、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン硫酸塩、グアニジン硝酸塩、グアニジン炭酸塩、若しくはグアニジン燐酸塩などのグアニジン塩、アミノグアニジン、又はフェニルグアニジン等を挙げることができる。
【００７６】
なお、これらの含窒素化合物は１種類だけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
【００７７】
なお、この含窒素化合物を、試料、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と共存させる際の濃度は、１ｍＭ〜２Ｍの範囲にあることが好ましく、１０ｍＭ〜１Ｍの範囲にあることが特に好ましい。
【００７８】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させる前記の含窒素化合物の濃度は、試料、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の濃度が、１ｍＭ〜２Ｍとなるように、特に１０ｍＭ〜１Ｍとなるように設定すればよい。
例えば、前記の含窒素化合物を、１ｍＭ〜２Ｍとなるように、特に１０ｍＭ〜１Ｍとなるように設定すればよい。
【００７９】
（８）  試料中のカルシウム測定時のｐＨ
本発明の試料中のカルシウム測定方法においては、試料、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させる際のｐＨとして、ｐＨ５．０〜ｐＨ９．０を挙げることができる。
【００８０】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬のｐＨとしては、試料、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させる際のｐＨがｐＨ５．０〜ｐＨ９．０となるように設定すればよい。
【００８１】
ところで、試料が体液等の場合、この試料中にホスフォジエステラーゼが混在する可能性があり、そうすると例え試料中にカルシウムが存在しなくともこのホスフォジエステラーゼが前記の一般式（Ｉ）で表される化合物より発色性基を遊離させ、シグナルを生じさせ、測定値に正の誤差を与えてしまうことになる。
そして、このホスフォジエステラーゼの酵素活性の至適ｐＨ域は、ｐＨ８．０〜ｐＨ９．０である。
【００８２】
よって、前記の混合し反応させる際のｐＨを、ｐＨ５．５〜ｐＨ８．０に設定することにより、より好ましくはｐＨ５．５〜ｐＨ７．５に設定することにより、前記のホスフォジエステラーゼによる誤差を抑制することができる。
【００８３】
なお、前記のｐＨ範囲となるように使用する緩衝液としては、前記のｐＨ範囲に緩衝能がある従来公知の緩衝液を適宜使用することができる。
このような緩衝液としては、例えば、リン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、イミダゾール、グリシルグリシン、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ等の各緩衝液を挙げることができる。
【００８４】
（９）  非イオン性界面活性剤
本発明の試料中のカルシウム測定方法においては、反応のタイムコースを安定化するため、試料、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させる際に、非イオン性界面活性剤を共存させることが好ましい。
また、同じ理由により、本発明の試料中のカルシウム測定試薬においては、非イオン性界面活性剤を含ませることが好ましい。
【００８５】
このような非イオン性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ）  ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリスチリルフェニルエーテル、又はポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレンエーテル化合物。
【００８６】
（ｂ）  グリセリン脂肪酸部分エステル、ソルビタン脂肪酸部分エステル、ペンタエリスリトール脂肪酸部分エステル、プロピレングリコールモノ脂肪酸エステル、又はショ糖脂肪酸部分エステルなどの多価アルコール部分エステル化合物。
【００８７】
（ｃ）  ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸部分エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸部分エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸部分エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸部分エステル、又はポリオキシエチレン化ひまし油などのポリオキシエチレン化多価アルコール脂肪酸エステル。
【００８８】
（ｄ）  脂肪酸ジエタノールアミド、Ｎ，Ｎ−ビス−２−ヒドロキシアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルキルアミン、トリエタノールアミン脂肪酸エステル、又はトリアルキルアミンオキシドなどのアミド若しくはアミン化合物。
【００８９】
なお、この非イオン性界面活性剤としては、例えば、トライトンＸ−１００（和光純薬工業社）又はＢＯ−１０ＴＸ（日光ケミカルズ社）等が好ましい。
【００９０】
そして、この非イオン性界面活性剤を、試料、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と共存させる際の濃度は、０．０００１〜１％の範囲にあることが好ましく、０．００１〜０．５％の範囲にあることが特に好ましい。
【００９１】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させる前記の非イオン性界面活性剤の濃度は、試料、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の濃度が０．０００１〜１％となるように、特に０．００１〜０．５％となるように設定すればよい。
例えば、前記の非イオン性界面活性剤を、０．０００１〜１％となるように、特に０．００１〜０．５％となるようにカルシウム測定試薬に含有させればよい。
【００９２】
（１０）  陰イオン性界面活性剤
本発明の試料中のカルシウム測定方法においては、試料、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させる際に、陰イオン性界面活性剤を共存させることが好ましい。
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬においては、陰イオン性界面活性剤を含ませることが好ましい。
【００９３】
このような陰イオン性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ）  脂肪族モノカルボン酸塩、Ｎ−アシロイルサルコシン塩、Ｎ−アシロイル−β−アラニン塩、若しくはＮ−アシロイルグルタミン酸塩などの脂肪族化合物カルボン酸塩；又はアビエチン酸塩などの環式化合物カルボン酸塩。
【００９４】
（ｂ）  ジアルキルスルホコハク酸塩、アルカンスルホン酸塩、若しくはヒドロキシアルカンスルホン酸塩などの脂肪族化合物スルホン酸塩；直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル（分岐鎖）ベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルキルフェノキシポリオキシエチレンプロピルスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルフェノールスルホン酸塩、若しくはナフタレンスルホン酸塩−ホルムアルデヒド縮合物などの環式化合物スルホン酸塩；又はＮ−メチル−Ｎ−オレイルタウリンナトリウム、若しくはＮ−アルキルスルホコハク酸モノアミド二ナトリウム塩などの含窒素化合物スルホン酸塩。
【００９５】
（ｃ）  硫酸化ひまし油、硫酸化牛脚油、脂肪酸アルキルエステル・硫酸エステル塩、アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、脂肪酸モノグリセリド硫酸エステル塩、若しくはポリオキシエチレンアルキロイルアミド硫酸塩などの脂肪族化合物硫酸エステル塩；又はポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、若しくはポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル硫酸エステル塩などの環式化合物硫酸エステル塩。
【００９６】
（ｄ）  アルキルリン酸エステル塩、若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸エステル塩などの脂肪族化合物リン酸エステル塩；又はポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルリン酸エステル塩などの環式化合物リン酸エステル塩。
【００９７】
（ｅ）  スチレン−無水マレイン酸共重合物の部分けん化物、又はオレフィン−無水マレイン酸共重合物の部分けん化物などの重合型高分子化合物のけん化物。
【００９８】
（ｆ）  ナフタレンスルホン酸塩−ホルマリン縮合物などの重縮合型高分子化合物。
【００９９】
（ｇ）  ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル酢酸塩。
【０１００】
本発明の試料中のカルシウム測定方法において、試料、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させる際に、陰イオン性界面活性剤を共存させることにより、また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬において、陰イオン性界面活性剤を含ませることにより、カルシウム測定の感度を向上させることができ、試料中の微量濃度のカルシウムさえも正確に測定を行うことができるようになる。
【０１０１】
更に、本発明の試料中のカルシウム測定方法において、試料、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させる際に、陰イオン性界面活性剤を共存させることにより、また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬において、陰イオン性界面活性剤を含ませることにより、ホスフォジエステラーゼの酵素活性を抑制することができ、例え、試料中にホスフォジエステラーゼが混在したとしても、このホスフォジエステラーゼに由来する測定値の誤差を防ぐことができる。
すなわち、この陰イオン性界面活性剤を共存させること又は含ませることにより、前述のようにｐＨをｐＨ５．５〜ｐＨ８．０（より好ましくはｐＨ５．５〜ｐＨ７．５）に設定しなくとも、ホスフォジエステラーゼによる誤差を防ぐことができるようになる。
【０１０２】
なお、この陰イオン性界面活性剤を共存又は含ませることにより、カルシウム測定の感度を向上させるには、陰イオン性界面活性剤としては、例えば、スルホン酸塩化合物、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、又はＮ−アシルタウリン塩等が好ましい。
より具体的には、例えば、このスルホン酸塩化合物としてはスルホコハク酸ジオクチルナトリウム（ＯＴＰ−１００）〔日光ケミカルズ社〕等を、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩としてはＳＢＬ−２Ｎ−２７〔日光ケミカルズ社〕等を、そして、Ｎ−アシルタウリン塩としてはＣＭＴ−３０又はＬＭＴ〔日光ケミカルズ社〕等を挙げることができる。
【０１０３】
また、この陰イオン性界面活性剤を共存又は含ませることにより、ホスフォジエステラーゼの酵素活性を抑制して、試料中に混在するホスフォジエステラーゼに由来する測定値の誤差を防ぐには、陰イオン性界面活性剤としては、例えば、Ｎ−アシロイルサルコシン塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩、コール酸若しくはその塩、又はデオキシコール酸若しくはその塩等が好ましい。
より具体的には、例えば、このＮ−アシロイルサルコシン塩としてはココイルサルコシンナトリウム（サルコシネートＣＮ−３０）〔日光ケミカルズ社〕若しくはラウロイルサルコシンナトリウム（サルコシネートＬＮ）〔日光ケミカルズ社〕等を、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩としてはポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル硫酸トリエタノールアミン（ＳＮＰ−４Ｔ）〔日光ケミカルズ社〕等を、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩としてはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸ナトリウム（ＥＣＴＤ−６ＮＥＸ）〔日光ケミカルズ社〕等を、コール酸塩としてはコール酸ナトリウム等を、デオキシコール酸塩としてはデオキシコール酸ナトリウム等を挙げることができる。
【０１０４】
前記の陰イオン性界面活性剤を、試料、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と共存させる際の濃度は、０．０００１〜１％の範囲にあることが好ましく、０．００１〜０．５％の範囲にあることが特に好ましい。
【０１０５】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させる前記の陰イオン性界面活性剤の濃度は、試料、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の濃度が０．０００１〜１％となるように、特に０．００１〜０．５％となるように設定すればよい。
例えば、前記の陰イオン性界面活性剤を、０．０００１〜１％となるように、特に０．００１〜０．５％となるように設定すればよい。
【０１０６】
（１１）  カルシウムの添加
本発明の試料中のカルシウム測定試薬又はカルシウム測定方法においては、カルシウムイオン又はその塩等を、必要に応じて、前記測定試薬又は測定反応液に添加し、共存させてもよい。
前記のカルシウムイオン又はその塩の添加、共存により、試料中のカルシウム測定における検量線のもぐり込み現象を改善することができる。
【０１０７】
（１２）  測定試薬等の構成成分
本発明の試料中のカルシウム測定試薬又はカルシウム測定方法においては、前記の成分の他に、ケーソンＣＧ等の抗菌剤、又はゲンタマイシン等の抗生剤等の公知の防腐剤等を必要に応じて適宜含ませ又は共存させることができる。
【０１０８】
（１３）  試薬等の構成
本発明の試料中のカルシウム測定方法及びカルシウム測定試薬は、１ステップ法（１試薬系）で実施、構成することもできるが、測定試薬を長期間保存して用いる場合には２ステップ法（２試薬系）等の多ステップ法（多試薬系）で実施、構成することが測定試薬の安定性の面からより好ましい。
【０１０９】
なお、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤと、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物とは、別々の測定試薬に含有させておくことが好ましい。
それは、共存させた場合、微量でもカルシウムが混入することにより、長期保存されるうちに、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物がホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤにより分解されてしまうからである。
【０１１０】
（１４）  リン酸モノエステル化合物に作用する酵素
本発明の試料中のカルシウム測定方法において、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物のＸ２若しくはＸ３が発色性基である場合、又は前記の一般式（Ｉ）で表される化合物のＸ２及びＸ３が発色性基である場合、試料、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させる際に、リン酸ジエステル化合物及びリン酸トリエステル化合物には作用せずにリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素を共存させることが好ましい。
【０１１１】
それは、試料中にカルシウムが存在する場合、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤが、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物のＸ１とともに、Ｘ２及び／又はＸ３を加水分解して遊離させるのであるが、反応時の条件によっては、一つ目（又は二つ目）の発色性基の加水分解から二つ目（又は三つ目）の発色性基の加水分解までに時間が掛かることがある。
【０１１２】
このときにリン酸ジエステル化合物及びリン酸トリエステル化合物には作用せずにリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素が共存していると、一つ目（又は二つ目）の発色性基の加水分解により生成したリン酸モノエステル化合物に、前記のリン酸ジエステル化合物には作用せずにリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素が作用して、二つ目（又は三つ目）の発色性基を短時間のうちに加水分解することができるからである。
【０１１３】
なお、前記の酵素はリン酸ジエステル化合物及びリン酸トリエステル化合物には作用しないので、試料中にカルシウムが存在せず、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤが前記の一般式（Ｉ）で表される化合物に作用しない（加水分解しない）場合には、この酵素も発色性基を加水分解することはないので、測定値に正の誤差を生じさせることはない。
【０１１４】
同じ理由により、本発明の試料中のカルシウム測定試薬においては、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物のＸ２若しくはＸ３が発色性基である場合、又は前記の一般式（Ｉ）で表される化合物のＸ２及びＸ３が発色性基である場合、リン酸ジエステル化合物及びリン酸トリエステル化合物には作用せずにリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素を含ませることが好ましい。
【０１１５】
このリン酸ジエステル化合物及びリン酸トリエステル化合物には作用せずにリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素としては、例えば、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）又は酸性ホスファターゼ（ＡＣＰ）等を挙げることができる。
【０１１６】
このリン酸ジエステル化合物及びリン酸トリエステル化合物には作用せずにリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素を、試料、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の活性値は、０．０１〜１０単位／ｍＬの範囲にあることが好ましく、０．１〜５単位／ｍＬの範囲が特に好ましい。
【０１１７】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させる、リン酸ジエステル化合物及びリン酸トリエステル化合物には作用せずにリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素の活性値は、試料、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の活性値が０．０１〜１０単位／ｍＬとなるように、好ましくは０．１〜５単位／ｍＬとなるように設定すればよい。
例えば、このリン酸ジエステル化合物及びリン酸トリエステル化合物には作用せずリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素を、０．０１〜１０単位／ｍＬとなるように、好ましくは０．１〜５単位／ｍＬとなるように含有させればよい。
【０１１８】
（１５）  試料中のカルシウム測定の一例
本発明の試料中のカルシウム測定方法は、
ａ）  試料と、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ、並びにホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤの基質としての前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させ、前記の化合物から発色性基を遊離させる工程、及び
ｂ）  この遊離した発色性基を比色測定する工程、よりなるものである。
【０１１９】
なお、本発明の試料中のカルシウム測定方法は、コリンオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、又は酸性ホスファターゼ等の共役酵素を介在させなくとも測定が行えるという点で特徴的である。
【０１２０】
本発明の試料中のカルシウム測定方法及び測定試薬を用いて試料中のカルシウムを測定する場合の一例をより具体的に説明すると、例えば、試料中に含まれるカルシウムとホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤとが接触すると、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤがこのカルシウムによって活性化される。
【０１２１】
このカルシウムによって活性化されたホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤが、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と接触すると、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤは、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物の発色性基（Ｘ１、場合により更にＸ２及び／又はＸ３）を加水分解して遊離させる。
【０１２２】
すなわち、４−ニトロフェニル基、２−クロロ−４−ニトロフェニル基、２，６−ジクロロ−４−ニトロフェニル基、２，６−ジクロロ−アセチルフェニル基、又はアシルフェニル基等の発色性基が遊離される。
【０１２３】
ここで遊離した４−ニトロフェノール、２−クロロ−４−ニトロフェノール、２，６−ジクロロ−４−ニトロフェノール、２，６−ジクロロ−アセチルフェノール、又はアシルフェノール等が吸収を示す任意の波長において、分光光度計等を用いて吸光度などを測定すること等により、遊離した発色性基の量を求め、これよりホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤの活性値を求める。更に、カルシウム濃度既知の標準液を測定したときの吸光度との比例計算により、試料中のカルシウム濃度の算出を行うことができる。
【０１２４】
本発明の測定原理を、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物としてビス（４−ニトロフェニル）リン酸を用いた場合を例として示すと下記のようになる。
【０１２５】
【化５】
2004329203.tif 000006
【０１２６】
本発明において前記の一般式（Ｉ）で表される化合物として基質としてビス（４−ニトロフェニル）リン酸を用いた場合は、試料中のカルシウムイオンによって活性化されたホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤが、ビス（４−ニトロフェニル）リン酸のリン酸基と２つの４−ニトロフェニル基との間のエステル結合をそれぞれ加水分解して、２分子の４−ニトロフェノールを遊離させる。
【０１２７】
この遊離した４−ニトロフェノールの吸光度を測定波長４０５ｎｍ等において分光光度計などを用いて測定することによって、試料中のカルシウム濃度を測定することが可能となる。
【０１２８】
（１６）  試料
本発明において、試料とは、カルシウム、カルシウムイオン又はその塩等を含む可能性があるものであって、試料中のカルシウム濃度の測定を行おうとするものであり、このようなものであれば特に限定されない。
このような試料としては、例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、汗等の体液、ヒト若しくは動物の腎臓、心臓、肺、脳等の臓器等の抽出液；骨格筋、骨髄、皮膚、又は神経組織等の抽出液；毛髪等の抽出液、ヒト又は動物の糞便の抽出液又は懸濁液；細胞の抽出液；植物の抽出液；食品又はこれの抽出液；農林水産物又はこれの抽出物；飲料水；飲料；環境試料（土壌、海水、河川水、湖沼水、地下水など）；あるいは薬剤等が挙げられる。
【０１２９】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【０１３０】
（試料中のカルシウムの測定）
本発明の試料中のカルシウム測定試薬及びカルシウム測定方法により、試料中のカルシウム濃度を測定した。
【０１３１】
１．  試薬の調製
（１）  第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを６．５（２０℃）に調整し、第１試薬を調製した。
ＰＩＰＥＳ（オリエンタル酵母工業社）    ８０ｍＭ
ＢＯ−１０ＴＸ（日光ケミカルズ社）      ０．１％
ケーソンＣＧ（ロームアンドハース社）    ０．０５％
酢酸ニッケル      ５ｍＭ
ホスホリパーゼＤ〔ストレプトマイセス・クロモフスカス由来〕（旭化成社）    ２単位／ｍＬ
【０１３２】
（２）  第２試薬Ａの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを６．５（２０℃）に調整し、第２試薬Ａを調製した。
ＰＩＰＥＳ（オリエンタル酵母工業社）      ５ｍＭ
ビス（４−ニトロフェニル）リン酸〔基質〕（和光純薬工業社）      ２４ｍＭ
【０１３３】
（３）  第２試薬Ｂの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを６．５（２０℃）に調整し、第２試薬Ｂを調製した。
ＰＩＰＥＳ（オリエンタル酵母工業社）      ５ｍＭ
４−ニトロフェニルフェニルリン酸〔基質〕（シグマ社）      １０ｍＭ
【０１３４】
（４）  第２試薬Ｃの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを６．５（２０℃）に調整し、第２試薬Ｃを調製した。
ＰＩＰＥＳ（オリエンタル酵母工業社）      ５ｍＭ
４−ニトロフェニルリン酸〔基質〕（第一化学薬品社）      ９６ｍＭ
【０１３５】
２．  試料の調製
カルシウム標準液〔１，０００ｍｇ／ｍＬの炭酸カルシウムを含む０．１Ｍ硝酸水溶液；原子吸光用〕（和光純薬工業社）を純水で希釈して、下記の濃度のカルシウムを含む試料をそれぞれ調製した。
【０１３６】
・２０．０ｍｇ／ｄＬ
・１７．５ｍｇ／ｄＬ
・１５．０ｍｇ／ｄＬ
・１２．５ｍｇ／ｄＬ
・１０．０ｍｇ／ｄＬ
・７．５ｍｇ／ｄＬ
・５．０ｍｇ／ｄＬ
・２．５ｍｇ／ｄＬ
【０１３７】
また、純水を、カルシウムを含まない試料すなわち「カルシウム濃度０ｍｇ／ｄＬの試料」とした。
以上９種類の試料を調製した。
【０１３８】
３．  試料中のカルシウム濃度の測定
日立製作所社製７１７０Ｓ形自動分析装置にて試料中のカルシウム濃度の測定を行った。
【０１３９】
（１）  前記２で調製した９種類の試料をそれぞれ試料とし、この６μＬに前記１の（１）で調製した第１試薬Ａを１８０μＬ添加して、混和後３７℃で５分間反応させた。
【０１４０】
（２）  その後、これに前記１の（２）で調製した第２試薬Ａの６０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
【０１４１】
（３）  そして、主波長４０５ｎｍ及び副波長６６０ｎｍにおける吸光度を、第２試薬Ａ添加後１分５５秒目（２３ポイント目）から５分８秒目（３４ポイント目）まで測定した。
【０１４２】
（４）  前記（３）において測定した吸光度より、１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を算出した。
【０１４３】
（５）  なお、第２試薬Ａに変えて前記１の（３）で調製した第２試薬Ｂを用いること以外は、前記（１）〜（４）の通りに操作を行い、１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を求めた。
【０１４４】
（６）  また、第２試薬Ａに変えて前記１の（４）で調製した第２試薬Ｃを用いること以外は、前記（１）〜（４）の通りに操作を行い、１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を求めた。
【０１４５】
４．  測定結果
以上の測定結果を図１に示した。
なお、この図において横軸は試料中のカルシウム濃度（ｍｇ／ｄＬ）を表し、縦軸は測定により得られた１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を表す。
【０１４６】
この図から明らかなように、試料中のカルシウム濃度の増加に伴って各吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）はほぼ直線的に増加していることが分かる。
これより、試料中のカルシウムを定量的に測定できることが確かめられた。
【０１４７】
また、基質としてビス（４−ニトロフェニル）リン酸を用いた場合には、４−ニトロフェニルフェニルリン酸、又は４−ニトロフェニルリン酸を用いた場合に比べて得られるシグナル（吸光度変化量）が非常に高いことが分かる。
【０１４８】
このことより、基質としてビス（４−ニトロフェニル）リン酸を用いた場合、すなわち、前記の一般式（Ｉ）の化合物においてＸ１及びＸ２の両方が発色性基の場合には、高感度に測定を行えることが確認できた。
【実施例２】
【０１４９】
（金属イオンによる直線性向上効果の確認）
本発明の試料中のカルシウム測定試薬及びカルシウム測定方法において、金属イオンを測定試薬に含有させた場合の直線性向上効果を確かめた。
【０１５０】
１．  試薬の調製
（１）  コバルトイオン含有第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを６．５（２０℃）に調整し、６種類の第１試薬を調製した。
ＰＩＰＥＳ（オリエンタル酵母工業社）    ８０ｍＭ
ＢＯ−１０ＴＸ（日光ケミカルズ社）      ０．１％
ケーソンＣＧ（ロームアンドハース社）    ０．０５％
ホスホリパーゼＤ〔ストレプトマイセス・クロモフスカス由来〕（旭化成社）    ２単位／ｍＬ
塩化コバルト      １６ｍＭ、８ｍＭ、４ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、又は含有しない（０ｍＭ）
【０１５１】
（２）  ニッケルイオン含有第１試薬の調製
それぞれ下記の濃度の酢酸ニッケルを含有する（又は含有しない）こと以外は前記（１）のコバルトイオン含有第１試薬と成分及び濃度が同じである６種類の第１試薬を調製した。
【０１５２】
・  ８ｍＭ
・  ４ｍＭ
・  ２ｍＭ
・  １ｍＭ
・  ０．５ｍＭ
・  ０ｍＭ
【０１５３】
（３）  亜鉛イオン含有第１試薬の調製
それぞれ下記の濃度の酢酸亜鉛を含有する（又は含有しない）こと以外は前記（１）のコバルトイオン含有第１試薬と成分及び濃度が同じである６種類の第１試薬を調製した。
【０１５４】
・  ０．８ｍＭ
・  ０．４ｍＭ
・  ０．２ｍＭ
・  ０．１ｍＭ
・  ０．０５ｍＭ
・  ０ｍＭ
【０１５５】
（４）  第２試薬
前記実施例１の１の（２）で調製した第２試薬Ａを、第２試薬として用いた。
【０１５６】
２．  試料の調製
前記実施例１の２で調製した９種類の試料を、試料として用いた。
【０１５７】
３．  試料中のカルシウム濃度の測定
第１試薬に変えて前記１の（１）、（２）及び（３）で調製した計１８種類の第１試薬をそれぞれ用いること以外は、前記実施例１の３の（１）〜（４）の通りに操作を行い、１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を求めた。
【０１５８】
（４）  測定結果
測定試薬にコバルトイオンを含有させた場合の測定結果を図２に、ニッケルイオンを含有させた場合の測定結果を図３に、そして、亜鉛イオンを含有させた場合の測定結果を図４に示した。
【０１５９】
なお、この図において横軸は試料中のカルシウム濃度（ｍｇ／ｄＬ）を表し、縦軸は測定により得られた１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を表す。
【０１６０】
また、各々の場合の見掛けのＫｍ値を表１に示した。
なお、見掛けのＫｍ値の算出は、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋのプロットにおいて、Ｖｍａｘを固定し、傾きより算出した。
【０１６１】
【表１】
2004329203.tif 000007
【０１６２】
以上の測定結果より、次のことが分かる。
測定試薬にコバルトイオンを含有させたときは、含有させないときに比べて、試料中のカルシウム濃度と吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）との関係〔検量線〕がより直線的となり、検量線の直線性が向上していることが確かめられた。そして、これにより測定の定量性が向上していることが分かる。
【０１６３】
また、測定試薬にニッケルイオンを含有させたときも、含有させないときに比べて、試料中のカルシウム濃度と吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）との関係〔検量線〕がより直線的となり、検量線の直線性が向上していることが確かめられた。そして、これにより測定の定量性が向上していることが分かる。
【０１６４】
更に、測定試薬に亜鉛イオンを含有させたときも、含有させないときに比べて、試料中のカルシウム濃度と吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）との関係〔検量線〕がより直線的となり、検量線の直線性が向上していることが確かめられた。そして、これにより測定の定量性が向上していることが分かる。
【実施例３】
【０１６５】
本発明の試料中のカルシウム測定試薬及びカルシウム測定方法において、キレート剤であるクエン酸を測定試薬に含有させた場合の直線性向上効果を確かめた。
【０１６６】
１．  試薬の調製
（１）  第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを７．０（２０℃）に調整し、５種類の第１試薬を調製した。
ＰＩＰＥＳ（オリエンタル酵母工業社）    ８０ｍＭ
ＢＯ−１０ＴＸ（日光ケミカルズ社）      ０．１％
ケーソンＣＧ（ロームアンドハース社）    ０．０５％
ホスホリパーゼＤ〔ストレプトマイセス・クロモフスカス由来〕（旭化成社）    １単位／ｍＬ
クエン酸      ４ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、又は含有しない（０ｍＭ）
【０１６７】
（２）  第２試薬
前記実施例１の１の（２）で調製した第２試薬Ａを、第２試薬として用いた。
【０１６８】
２．  試料の調製
カルシウム標準液〔１，０００ｍｇ／ｍＬの炭酸カルシウムを含む０．１Ｍ硝酸水溶液；原子吸光用〕（和光純薬工業社）を純水で希釈して、下記の濃度のカルシウムを含む試料をそれぞれ調製した。
【０１６９】
・  ２０．０ｍｇ／ｄＬ
・  １５．０ｍｇ／ｄＬ
・  １０．０ｍｇ／ｄＬ
・  ５．０ｍｇ／ｄＬ
・  ２．５ｍｇ／ｄＬ
【０１７０】
また、純水を、カルシウムを含まない試料すなわち「カルシウム濃度０ｍｇ／ｄＬの試料」とした。
以上６種類の試料を調製した。
【０１７１】
３．  試料中のカルシウム濃度の測定
第１試薬に変えて前記１の（１）で調製した計５種類の第１試薬をそれぞれ用いること、及び試料として前記２で調製した計６種類の試料を用いること以外は、前記実施例１の３の（１）〜（４）の通りに操作を行い、１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を求めた。
【０１７２】
４．  測定結果
測定結果を図５に示した。
【０１７３】
なお、この図において横軸は試料中のカルシウム濃度（ｍｇ／ｄＬ）を表し、縦軸は測定により得られた１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を表す。
【０１７４】
この図より、次のことが分かる。
測定試薬にキレート剤であるクエン酸を含有させたときは、含有させないときに比べて、試料中のカルシウム濃度と吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）との関係〔検量線〕がより直線的となり、検量線の直線性が向上していることが確かめられた。そして、これにより測定の定量性が向上していることが分かる。
【実施例４】
【０１７５】
（キレート剤による直線性向上効果の確認−２）
本発明の試料中のカルシウム測定試薬及びカルシウム測定方法において、キレート剤であるシュウ酸、酒石酸、又はクエン酸を測定試薬に含有させた場合の直線性向上効果を確かめた。
【０１７６】
１．  試薬の調製
（１）  シュウ酸含有第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを６．５（２０℃）に調整し、シュウ酸を含有する第１試薬を調製した。
ＰＩＰＥＳ（オリエンタル酵母工業社）    ８０ｍＭ
ＢＯ−１０ＴＸ（日光ケミカルズ社）      ０．１％
ケーソンＣＧ（ロームアンドハース社）    ０．０５％
ホスホリパーゼＤ〔ストレプトマイセス・クロモフスカス由来〕（旭化成社）    ０．６６単位／ｍＬ
シュウ酸      ５ｍＭ
【０１７７】
（２）  酒石酸含有第１試薬の調製
５ｍＭシュウ酸に変えて２０ｍＭの酒石酸を含有すること以外は前記（１）のシュウ酸含有第１試薬と成分及び濃度が同じである、酒石酸を含有する第１試薬を調製した。
【０１７８】
（３）  クエン酸含有第１試薬の調製
５ｍＭシュウ酸に変えて１ｍＭのクエン酸を含有すること以外は前記（１）のシュウ酸含有第１試薬と成分及び濃度が同じである、クエン酸を含有する第１試薬を調製した。
【０１７９】
（４）  第２試薬
前記実施例１の１の（２）で調製した第２試薬Ａを、第２試薬として用いた。
【０１８０】
２．  試料の調製
カルシウム標準液〔１，０００ｍｇ／ｍＬの炭酸カルシウムを含む０．１Ｍ硝酸水溶液；原子吸光用〕（和光純薬工業社）を純水で希釈して、下記の濃度のカルシウムを含む試料をそれぞれ調製した。
【０１８１】
・  ２０．０ｍｇ／ｄＬ
・  １０．０ｍｇ／ｄＬ
・  ５．０ｍｇ／ｄＬ
・  ２．５ｍｇ／ｄＬ
【０１８２】
また、純水を、カルシウムを含まない試料すなわち「カルシウム濃度０ｍｇ／ｄＬの試料」とした。
以上５種類の試料を調製した。
【０１８３】
３．  試料中のカルシウム濃度の測定
第１試薬に変えて前記１の（１）、（２）及び（３）で調製した計３種類の第１試薬をそれぞれ用いること、及び試料として前記２で調製した計５種類の試料を用いること以外は、前記実施例１の３の（１）〜（４）の通りに操作を行い、１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を求めた。
【０１８４】
４．  測定結果
測定結果を図６に示した。
【０１８５】
なお、この図において横軸は試料中のカルシウム濃度（ｍｇ／ｄＬ）を表し、縦軸は測定により得られた１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を表す。
【０１８６】
この図より、次のことが分かる。
測定試薬にキレート剤であるシュウ酸、酒石酸、又はクエン酸を含有させたときは、試料中のカルシウム濃度と吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）との関係〔検量線〕がほぼ直線的となり、検量線の直線性が向上していることが確かめられた。そして、これにより測定の定量性が向上していることが分かる。
【実施例５】
【０１８７】
（非イオン性界面活性剤による反応のタイムコース安定化効果の確認）
本発明の試料中のカルシウム測定試薬及びカルシウム測定方法において、非イオン性界面活性剤であるＢＯ−１０ＴＸを測定試薬に含有させた場合の反応のタイムコース安定化効果を確かめた。
【０１８８】
１．  試薬の調製
（１）  第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを６．５（２０℃）に調整し、５種類の第１試薬を調製した。
ＰＩＰＥＳ（オリエンタル酵母工業社）    ８０ｍＭ
ケーソンＣＧ（ロームアンドハース社）    ０．０５％
ホスホリパーゼＤ〔ストレプトマイセス・クロモフスカス由来〕（旭化成社）    ２単位／ｍＬ
ＢＯ−１０ＴＸ（日光ケミカルズ社）      ０．１０％、０．０１％、０．００１％、０．０００１％、又は含まない（０％）
【０１８９】
（２）  第２試薬
前記実施例１の１の（２）で調製した第２試薬Ａを、第２試薬として用いた。
【０１９０】
２．  試料の調製
カルシウム標準液〔１，０００ｍｇ／ｍＬの炭酸カルシウムを含む０．１Ｍ硝酸水溶液；原子吸光用〕（和光純薬工業社）を純水で希釈して、カルシウム濃度１０．０ｍｇ／ｄＬの試料を調製した。
【０１９１】
３．  反応のタイムコースの確認
日立製作所社製７１７０Ｓ形自動分析装置にて試料中のカルシウム濃度測定反応のタイムコース（進行）を確認した。
【０１９２】
（１）  前記２で調製した試料の６μＬに、前記１の（１）で調製した計５種類の第１試薬のそれぞれを１８０μＬ添加して、混和後３７℃で５分間反応させた。
【０１９３】
（２）  その後、これに前記１の（２）で調製した第２試薬Ａの６０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
【０１９４】
（３）  そして、主波長４０５ｎｍ及び副波長６６０ｎｍにおける吸光度を、試料と第１試薬の混合時より測定し、反応のタイムコースを記録した。
【０１９５】
４．  測定結果
測定結果を図７に示した。
【０１９６】
なお、この図において横軸は試料と第１試薬の混合後の経過時間を表し、縦軸は測定により得られた吸光度（Ａｂｓ．）を表す。
【０１９７】
この図より、次のことが分かる。
測定試薬に非イオン性界面活性剤であるＢＯ−１０ＴＸを含有させたときは、含有させないときに比べて、反応の進行（タイムコース）にばらつきがなく直線的であり、測定の定量性が向上していることが確かめられた。
【実施例６】
【０１９８】
（陰イオン性界面活性剤による感度向上効果の確認）
本発明の試料中のカルシウム測定試薬及びカルシウム測定方法において、陰イオン性界面活性剤であるＬＭＴを測定試薬に含有させた場合の測定感度の向上効果を確かめた。
【０１９９】
１．  試薬の調製
（１）  第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを７．２５（２０℃）に調整し、４種類の第１試薬を調製した。
ＰＩＰＥＳ（オリエンタル酵母工業社）    ８０ｍＭ
ＢＯ−１０ＴＸ（日光ケミカルズ社）      ０．１％
ケーソンＣＧ（ロームアンドハース社）    ０．０５％
ホスホリパーゼＤ〔ストレプトマイセス・クロモフスカス由来〕（旭化成社）    １単位／ｍＬ
ＬＭＴ（日光ケミカルズ社）      ０．１％、０．０５％、０．０２５％、又は含まない（０％）
【０２００】
（２）  第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを６．５（２０℃）に調整し、第２試薬を調製した。
ＰＩＰＥＳ（オリエンタル酵母工業社）      ５ｍＭ
ビス（４−ニトロフェニル）リン酸〔基質〕（和光純薬工業社）    １ｍＭ
クエン酸    １２ｍＭ
【０２０１】
２．  試料の調製
カルシウム標準液〔１，０００ｍｇ／ｍＬの炭酸カルシウムを含む０．１Ｍ硝酸水溶液；原子吸光用〕（和光純薬工業社）を純水で希釈して、下記の濃度のカルシウムを含む試料をそれぞれ調製した。
【０２０２】
・  ２０．０ｍｇ／ｄＬ
・  １５．０ｍｇ／ｄＬ
・  １０．０ｍｇ／ｄＬ
・  ５．０ｍｇ／ｄＬ
・  ２．５ｍｇ／ｄＬ
【０２０３】
また、純水を、カルシウムを含まない試料すなわち「カルシウム濃度０ｍｇ／ｄＬの試料」とした。
以上６種類の試料を調製した。
【０２０４】
（３）  試料中のカルシウム濃度の測定
第１試薬に変えて前記１の（１）で調製した計４種類の第１試薬をそれぞれ用いること、第２試薬Ａに変えて前記１の（２）で調製した第２試薬を用いること、及び試料として前記２で調製した計６種類の試料を用いること以外は、前記実施例１の３の（１）〜（４）の通りに操作を行い、１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を求めた。
【０２０５】
４．  測定結果
測定結果を図８に示した。
【０２０６】
なお、この図において横軸は試料中のカルシウム濃度（ｍｇ／ｄＬ）を表し、縦軸は測定により得られた１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を表す。
【０２０７】
この図より、次のことが分かる。
測定試薬に陰イオン性界面活性剤であるＬＭＴを含有させたときは、含有させないときに比べて、得られる１分間当たりの吸光度変化量（シグナル）が顕著に高くなっており、測定の感度が上昇することが確かめられた。これより、微量濃度のカルシウムでさえも測定することができることが確認できた。
【実施例７】
【０２０８】
（陰イオン性界面活性剤によるホスフォジエステラーゼ活性抑制効果の確認）
本発明の試料中のカルシウム測定試薬及びカルシウム測定方法において、陰イオン性界面活性剤を測定反応時に共存させた場合の、ホスフォジエステラーゼ活性抑制の効果を確かめた。
【０２０９】
１．  試薬の調製
（１）  第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを７．７５（２０℃）に調整し、第１試薬を調製した。
ＨＥＰＥＳ（オリエンタル酵母工業社）      ６０ｍＭ
トライトン  Ｘ−１００（日光ケミカルズ社）      ０．１％
ケーソンＣＧ（ロームアンドハース社）    ０．０５％
ビス（４−ニトロフェニル）リン酸〔基質〕（和光純薬工業社）      ４ｍＭ
【０２１０】
（２）  第２試薬の調製
図９に記載の３１種類の界面活性剤それぞれを、５％の濃度となるように純水に溶解して、３１種類の第２試薬を調製した。
【０２１１】
（３）  対照・第２試薬の調製
純水を対照・第２試薬とした。
【０２１２】
２．  試料の調製
ヒト血清、及び生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）を各々試料とした。
【０２１３】
３．  試料ブランク値（血清ブランク値）の測定
日立製作所社製７１５０形自動分析装置にて試料ブランク値（血清ブランク値）の測定を行った。
【０２１４】
（１）  前記２のヒト血清試料の１０μＬに前記１の（１）で調製した第１試薬を１８０μＬ添加して、混和後３７℃で５分間反応させた。
【０２１５】
（２）  その後、これに前記１の（２）で調製した第２試薬の２０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
【０２１６】
（３）  そして、主波長４０５ｎｍ及び副波長６６０ｎｍにおける吸光度を、第２試薬添加後２分５８秒目（４０ポイント目）から４分５７秒目（５０ポイント目）まで測定した。
【０２１７】
（４）  前記（３）において測定した吸光度より、１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を算出した。
【０２１８】
（５）  なお、ヒト血清に変えて前記２の生理食塩水を試料として用いること以外は、前記（１）〜（４）の通りに操作を行い、１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を求めた。
【０２１９】
（６）  前記（４）で求めた１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）から前記（５）で求めた１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を差し引いて、試料ブランク値（血清ブランク値）を求めた。
【０２２０】
（７）  前記１の（２）で調製した３１種類の第２試薬の全てにおいて、前記（１）〜（６）の操作を行い、各々の試料ブランク値（血清ブランク値）を求めた。また、第２試薬を前記１の（３）の対照・第２試薬に代えて同様に対照の試料ブランク値（血清ブランク値）を求めた。
【０２２１】
４．  測定結果
以上の測定結果を図９に示した。
なお、この図において横軸は、測定試薬にホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤを含有させず、本発明のカルシウムの測定反応を起こさせない場合の吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）、すなわち試料ブランク値（血清ブランク値）を表し、縦軸は第二試薬に用いた界面活性剤を表す。
【０２２２】
この図より、ＢＤ−６ＳＹからＢＰＳ−３０までの非イオン性界面活性剤においては、試料ブランク値（血清ブランク値）が１０×１０４（ΔＡｂｓ．／分）を超えており、反応液中にホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤが存在しないにもかかわらず、基質であるビス（４−ニトロフェニル）リン酸から４−ニトロフェノールが遊離する反応が生じていることが分かる。すなわち、血清試料中に混在するホスフォジエステラーゼにより基質から４−ニトロフェノールが遊離させられ、測定値に正の誤差が生じる状況となっていることが分かる。
【０２２３】
これに対して、陰イオン性界面活性剤であるコール酸、ＥＣＴＤ−６ＮＥＸ、デオキシコール酸ナトリウム、ＳＮＰ−４Ｎ、サルコシネートＬＮ、及びサルコシネートＣＮ−３０においては、試料ブランク値（血清ブランク値）はいずれも１０×１０４（ΔＡｂｓ．／分）以下であり、基質であるビス（４−ニトロフェニル）リン酸から４−ニトロフェノールが遊離する反応が抑えられており、血清試料中に混在するホスフォジエステラーゼの活性が抑制されていることがわかる。
以上のことより、測定試薬又は測定反応時に、陰イオン性界面活性剤を含有又は共存させることにより、血清試料中に混在するホスフォジエステラーゼの活性を抑えて、測定値に正の誤差が生じるのを防ぐことができることが確かめられた。
【実施例８】
【０２２４】
（含窒素化合物による直線性向上効果の確認−１）
本発明の試料中のカルシウム測定試薬及びカルシウム測定方法において、含窒素化合物である硫安（硫酸アンモニウム）を測定試薬に含有させた場合の直線性向上効果を確かめた。
【０２２５】
１．  試薬の調製
（１）  第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを７．７５（２０℃）に調整し、６種類の第１試薬を調製した。
ＨＥＰＥＳ（オリエンタル酵母工業社）      ６０ｍＭ
トライトン  Ｘ−１００（日光ケミカルズ社）      ０．１％
ホスホリパーゼＤ〔ストレプトマイセス・クロモフスカス由来〕（旭化成社）    ０．５単位／ｍＬ
サルコシネートＬＮ（日光ケミカルズ社）    ０．５％
硫安（硫酸アンモニウム）      １Ｍ、０．８Ｍ、０．６Ｍ、０．４Ｍ、０．２Ｍ、又は含有しない（０Ｍ）
【０２２６】
（２）  第２試薬
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを７．７５（２０℃）に調整し、６種類の第２試薬を調製した。
ＨＥＰＥＳ（オリエンタル酵母工業社）      ６０ｍＭ
トライトン  Ｘ−１００（日光ケミカルズ社）      ０．１％
ビス（４−ニトロフェニル）リン酸〔基質〕（和光純薬工業社）      ４ｍＭ
サルコシネートＬＮ（日光ケミカルズ社）      ０．５％
硫安（硫酸アンモニウム）      １Ｍ、０．８Ｍ、０．６Ｍ、０．４Ｍ、０．２Ｍ、又は含有しない（０Ｍ）
【０２２７】
２．  試料の調製
カルシウム標準液〔１，０００ｍｇ／ｍＬの炭酸カルシウムを含む０．１Ｍ硝酸水溶液；原子吸光用〕（和光純薬工業社）を純水で希釈して、下記の濃度のカルシウムを含む試料をそれぞれ調製した。
【０２２８】
・  ４０．０ｍｇ／ｄＬ
・  ３５．０ｍｇ／ｄＬ
・  ３０．０ｍｇ／ｄＬ
・  ２５．０ｍｇ／ｄＬ
・  ２０．０ｍｇ／ｄＬ
・  １５．０ｍｇ／ｄＬ
・  １０．０ｍｇ／ｄＬ
・  ５．０ｍｇ／ｄＬ
・  ２．５ｍｇ／ｄＬ
【０２２９】
また、純水を、カルシウムを含まない試料すなわち「カルシウム濃度０ｍｇ／ｄＬの試料」とした。
以上１０種類の試料を調製した。
【０２３０】
３．  試料中のカルシウム濃度の測定
日立製作所社製７１５０形自動分析装置にて試料の測定を行った。
【０２３１】
（１）  前記２で調製した試料の９μＬに前記１の（１）で調製した第１試薬を１８０μＬ添加して、混和後３７℃で５分間反応させた。
【０２３２】
（２）  その後、これに前記１の（２）で調製した第２試薬の１８０μＬを添加し、３７℃で反応させた。（なお、第１試薬と第２試薬は、各々同じ硫安濃度のものを用いた。）
【０２３３】
（３）  そして、主波長４０５ｎｍ及び副波長６６０ｎｍにおける吸光度を、第２試薬添加後２分５８秒目（４０ポイント目）から４分５７秒目（５０ポイント目）まで測定した。
【０２３４】
（４）  前記（３）において測定した吸光度より、１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を算出した。
【０２３５】
４．  測定結果
以上の測定結果を図１０に示した。
【０２３６】
なお、この図において横軸は試料中のカルシウム濃度（ｍｇ／ｄＬ）を表し、縦軸は測定により得られた１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を表す。
【０２３７】
この図より、次のことが分かる。
測定試薬に含窒素化合物である硫安（硫酸アンモニウム）を含有させたときは、含有させないときに比べて、試料中のカルシウム濃度と吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）との関係〔検量線〕がより直線的となり、検量線の直線性が向上していることが確かめられた。そして、これにより測定の定量性が向上していることが分かる。
【実施例９】
【０２３８】
（含窒素化合物による直線性向上効果の確認−２）
本発明の試料中のカルシウム測定試薬及びカルシウム測定方法において、含窒素化合物であるアルギニン（塩基性アミノ酸）、又はイミダゾール（複素環化合物）を測定試薬に含有させた場合の直線性向上効果を確かめた。
【０２３９】
１．  試薬の調製
（１）  アルギニン含有第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを７．０（２０℃）に調整し、５種類の第１試薬を調製した。
ＨＥＰＥＳ（オリエンタル酵母工業社）      ６０ｍＭ
トライトン  Ｘ−１００（日光ケミカルズ社）      ０．１％
ＬＭＴ（日光ケミカルズ）      ０．５％
酢酸カルシウム    ０．１５ｍＭ
ホスホリパーゼＤ〔ストレプトマイセス・クロモフスカス由来〕（旭化成社）      ０．７５単位／ｍＬ
アルギニン（和光純薬工業社）    １Ｍ、０．７５Ｍ、０．５Ｍ、０．２５Ｍ、又は含有しない（０Ｍ）
【０２４０】
（２）  イミダゾール含有第１試薬の調製
それぞれアルギニンに代えて下記の濃度のイミダゾール（半井化学社）を含有する（又は含有しない）こと以外は前記（１）のアルギニン含有第１試薬と成分及び濃度が同じである５種類の第１試薬を調製した。
【０２４１】
・  １Ｍ
・  ０．７５Ｍ
・  ０．５Ｍ
・  ０．２５Ｍ
・  ０Ｍ
【０２４２】
（３）  第２試薬
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを７．０（２０℃）に調整し、第２試薬を調製した。
ＨＥＰＥＳ（オリエンタル酵母工業社）      ６０ｍＭ
トライトン  Ｘ−１００（日光ケミカルズ社）      ０．１％
ビス（４−ニトロフェニル）リン酸〔基質〕（和光純薬工業社）      ６ｍＭ
【０２４３】
２．  試料の調製
カルシウム標準液〔１，０００ｍｇ／ｍＬの炭酸カルシウムを含む０．１Ｍ硝酸水溶液；原子吸光用〕（和光純薬工業社）を純水で希釈して、下記の濃度のカルシウムを含む試料をそれぞれ調製した。
【０２４４】
・  ２０．０ｍｇ／ｄＬ
・  １７．５ｍｇ／ｄＬ
・  １５．０ｍｇ／ｄＬ
・  １２．５ｍｇ／ｄＬ
・  １０．０ｍｇ／ｄＬ
・  ７．５ｍｇ／ｄＬ
・  ２．５ｍｇ／ｄＬ
【０２４５】
また、純水を、カルシウムを含まない試料すなわち「カルシウム濃度０ｍｇ／ｄＬの試料」とした。
以上８種類の試料を調製した。
【０２４６】
３．  試料中のカルシウム濃度の測定
日立製作所社製７１５０形自動分析装置にて試料の測定を行った。
【０２４７】
（１）  前記２で調製した試料の９μＬに前記１の（１）で調製したアルギニン含有第１試薬を２４０μＬ添加して、混和後３７℃で５分間反応させた。
【０２４８】
（２）  その後、これに前記１の（３）で調製した第２試薬の１２０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
【０２４９】
（３）  そして、主波長４０５ｎｍ及び副波長６６０ｎｍにおける吸光度を、第２試薬添加後１分４７秒目（３４ポイント目）から４分５７秒目（５０ポイント目）まで測定した。
【０２５０】
（４）  前記（３）において測定した吸光度より、１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を算出した。
【０２５１】
（５）  また、アルギニン含有第１試薬に代えて前記１の（２）で調製したイミダゾール含有第１試薬を用いる以外は前記（１）〜（４）の通りに操作を行い、これも１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を算出した。
【０２５２】
４．  測定結果
第１試薬としてアルギニン含有第１試薬を用いた時の測定結果を図１１に示し、第１試薬としてイミダゾール含有第１試薬を用いた時の測定結果を図１２に示した。
【０２５３】
なお、これらの図において横軸は試料中のカルシウム濃度（ｍｇ／ｄＬ）を表し、縦軸は測定により得られた１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を表す。
【０２５４】
これらの図より、次のことが分かる。
測定試薬に含窒素化合物であるアルギニン（塩基性アミノ酸）を含有させたときは、含有させないときに比べて、試料中のカルシウム濃度と吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）との関係〔検量線〕がより直線的となり、検量線の直線性が向上していることが確かめられた。そして、これにより測定の定量性が向上していることが分かる。
【０２５５】
また、測定試薬に含窒素化合物であるイミダゾール（複素環化合物）を含有させたときは、含有させないときに比べて、試料中のカルシウム濃度と吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）との関係〔検量線〕がより直線的となり、検量線の直線性が向上していることが確かめられた。そして、これにより測定の定量性が向上していることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【０２５６】
【図１】ホスホリパーゼＤの基質として、ビス（４−ニトロフェニル）リン酸、４−ニトロフェニルフェニルリン酸、又は４−ニトロフェニルリン酸を用いて試料中のカルシウムを測定した結果を示したグラフである。
【図２】測定試薬にコバルトイオンを含有させて試料中のカルシウムを測定した結果を示したグラフである。
【図３】測定試薬にニッケルイオンを含有させて試料中のカルシウムを測定した結果を示したグラフである。
【図４】測定試薬に亜鉛イオンを含有させて試料中のカルシウムを測定した結果を示したグラフである。
【図５】測定試薬にキレート剤であるクエン酸を含有させて試料中のカルシウムを測定した結果を示したグラフである。
【図６】測定試薬にキレート剤であるシュウ酸、酒石酸、又はクエン酸を含有させて試料中のカルシウムを測定した結果を示したグラフである。
【図７】測定試薬に非イオン性界面活性剤であるＢＯ−１０ＴＸを含有させたときの測定反応のタイムコースを示したグラフである。
【図８】測定試薬に陰イオン性界面活性剤であるＬＭＴを含有させて試料中のカルシウムを測定した結果を示したグラフである。
【図９】測定試薬に各種の界面活性剤を含有させて試料ブランク値（血清ブランク値）を測定した結果を示したグラフである。
【図１０】測定試薬に含窒素化合物である硫安を含有させて試料中のカルシウムを測定した結果を示したグラフである。
【図１１】測定試薬に含窒素化合物であるアルギニンを含有させて試料中のカルシウムを測定した結果を示したグラフである。
【図１２】測定試薬に含窒素化合物であるイミダゾールを含有させて試料中のカルシウムを測定した結果を示したグラフである。
【図１】
2004329203.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2004329203.tif 000017
【図８】
2004329203.tif 000018
【図９】
2004329203.tif 000019
【図１０】
2004329203.tif 000020
【図１１】
2004329203.tif 000021
【図１２】
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