(57)【要約】【課題】本発明は、対象とするＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ属細菌に特異的な配列を選定すること、並びにＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ属細菌を迅速かつ特異的に検出または測定する方法を提供することを目的とする。すなわち本発明は、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅ細菌のａｍｏ遺伝子のＤＮＡ配列を標的とした、当該菌を特異的に検出する方法、および定量する方法を提供することにある。【解決手段】本発明はａｍｏ遺伝子に基づいたプライマー、および前記プライマー塩基配列を含む競合的ＤＮＡ断片を作製し、前記プライマーおよび前記競合的ＤＮＡ断片を使用して、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａを特異的に検出、並びに定量する方法を提供する。【選択図】　　図２
2004081013.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａを特異的に検出する方法であって、
（１）前記Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａのａｍｏ遺伝子をコードする核酸領域の中でａｍｏＡおよびａｍｏＣ間の非保存領域を含む核酸領域を増幅する工程と、
（２）増幅された前記核酸領域を検出する工程と、
を具備した方法。
【請求項２】
Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａを特異的に検出する方法であって、
（１）配配列番号１に記載される塩基配列からなるプライマーと配列番号２に記載される塩基配列からなるプライマーのプライマー対を用いて、前記Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａのａｍｏ遺伝子をコードする核酸領域の中でａｍｏＡおよびａｍｏＣ間の非保存領域を含む核酸領域を増幅する工程と、
（２）増幅された前記核酸領域を検出する工程と、
を具備したＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａを特異的に検出する方法。
【請求項３】
Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａを特異的に定量する方法であって、
（１）反応液に競合的ＤＮＡ断片を添加する工程と、
（２）前記競合的ＤＮＡ断片を添加した反応液において、前記競合的ＤＮＡ断片、並びにａｍｏ遺伝子をコードする核酸領域の中でａｍｏＡおよびａｍｏＣ間の非保存領域含む核酸領域を増幅する工程と、
（３）前記増幅された競合的ＤＮＡ断片由来配列、および核酸領域由来配列を検出する工程と、
（４）前記検出した競合的ＤＮＡ断片由来断片、および核酸領域由来断片の両者の比から、核酸領域由来断片の量を求める工程と、
を具備したＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａを特異的に定量する方法。
【請求項４】
Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａを特異的に定量する方法であって、
（１）反応液に配列番号３の塩基配列を含む競合的ＤＮＡ断片を添加する工程と、
（２）前記競合的ＤＮＡ断片を添加した反応液において、競合的ＤＮＡ断片、並びに配列番号１に記載される塩基配列からなるプライマーと配列番号２に記載される塩基配列からなるプライマーのプライマー対を用いて、ａｍｏ遺伝子をコードする核酸領域の中でａｍｏＡおよびａｍｏＣ間の非保存領域を含む核酸領域を増幅する工程と、
（３）前記増幅された競合的ＤＮＡ断片由来配列、および核酸領域由来配列を検出する工程と、
（４）前記検出した競合的ＤＮＡ断片由来断片、および核酸領域由来断片の両者の比から、核酸領域由来断片の量を求める工程と、
を具備したＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａを特異的に定量する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、対象とするＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ属に含まれる特定の細菌に特異的なポリヌクレオチドを用いてＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ属に含まれる特定の細菌を迅速、特異的、かつ簡便に検出、および定量する方法に関する。詳細には、ａｍｏ遺伝子をコードするＤＮＡ配列を標的としてＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅを特異的に検出し、および競合的ＰＣＲを使用してＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅを定量する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、微生物の多様な機能を利用した環境の修復・改善が注目されており、有効な手段として考えられている。生体にとって猛毒のアンモニアは、硝化菌により分解されるため、この硝化菌を廃水処理技術などへ利用する方法が研究されてきている。廃水（たとえば、活性汚泥：し尿処理プラントから出る活性汚泥、および廃プラ汚泥：廃プラスチック処理プラントからでる活性汚泥）の処理等に利用するにあたり、特定微生物を適切に制御することが必要であり、該特定微生物の挙動を追跡することが非常に重要となる。そのためには当該目的菌群だけを検出または測定することが必要となる。
【０００３】
しかし、廃水処理の多くはオープンな環境で行われるため、廃水由来のさまざまな微生物が流入し、雑多な微生物が混在しているために特定の微生物の制御を行うことは困難であった。そのための手法として、菌群特有の核酸またはリボ核酸領域を用いる遺伝子工学的手法が考えられている。その他、特定微生物を検出または定量するために、選択培地による分離、増殖用培地を用いた菌の増殖状態、抗原抗体反応の利用、生化学的性状の観察、顕微鏡観察など様々な分析が行われてきた。しかし、これらの操作には、検出および定量に時間のかかるものが多く、また熟練を要するため、これに代わる手段が期待されていた。
【０００４】
また、核酸を増幅するＰＣＲを応用した手法は、一般に検出感度が高いため、目的菌が単一種または単一菌株のときには、核酸の増幅曲線解析による方法や競合核酸を用いる測定方法を使用する場合もある。しかし、これらの手法を使用して、属レベルなど、複数種の菌を測定するために適用することは困難であり、実用化されたものはない。
【０００５】
その他にも、これまでに、１６Ｓや２３Ｓ　ｒＲＮＡの特異的配列を標的とした核酸プローブを用いた検出法が提案されているが、同一の属に対して使用するとなると、多くの場合検出および定量が困難であった。
【０００６】
一方、汚泥や土壌などの複合微生物系中では、単一種または単一菌株レベルでは存在比率が非常に低いことを考慮すると、菌のモニタリングは、通常、属レベルで行われる。しかしこれまでのところ、複合微生物系において核酸を増幅するＰＣＲを応用した手法を使用して、属レベルで菌群を検出、または定量する方法は上記事情により実用化されていない。
【０００７】
Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ属細菌は、硝化菌の中でもアンモニアを酸化する働きを持ち、アンモニア酸化細菌と呼ばれている。そこで我々は、アンモニアを酸化する際に不可欠と考えられているアンモニアモノオキシゲナーゼ酵素（ａｍｏ）をコードする遺伝子の配列、特にａｍｏＣおよびａｍｏＡ間の非保存領域を含む配列に着目し、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅを特異的に検出することが可能であると考えた。また、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅを特異的に定量することができれば、汚水、廃水処理における当該菌の挙動を詳細に把握することが可能となり、処理工程における制御に重要な情報を与えるものと考えられる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
上記事情に鑑み、本発明は、対象とするＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ属細菌に特異的な配列を選定し、その配列を使用してＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ属細菌を迅速かつ特異的に検出または測定する方法を提供することを目的とする。すなわち本発明は、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅ細菌を特異的に検出する方法、および定量する方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、アンモニアモノオキシゲナーゼ酵素（ａｍｏ）をコードする遺伝子の配列に着目し、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ａｍｏＣおよびａｍｏＡ間の非保存領域が、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅに固有の非常にユニークな領域となっていることを見出した。そして、本発明者らは、かかる知見に基づいて、対象とするＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅに特異的なポリヌクレオチドを作成し、これを用いてＰＣＲ法を行うことにより、複合微生物系中で、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ属細菌を検出することに成功し、本発明を完成させるに至った。また、標的のａｍｏ遺伝子のＤＮＡ配列に対する競合的ＤＮＡ断片を用いて競合的ＰＣＲを行うことにより、複合微生物系中で、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅの定量を行うことが可能な方法を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａを特異的に検出する方法であって、
（１）前記Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａのａｍｏ遺伝子をコードする核酸領域の中でａｍｏＡおよびａｍｏＣ間の非保存領域を含む核酸領域を増幅する工程と、
（２）増幅された前記核酸領域を検出する工程と、
を具備した方法を提供する。
【００１１】
また、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａを特異的に検出する方法であって、
（１）配列番号１に記載される塩基配列からなるプライマーと配列番号２に記載される塩基配列からなるプライマーのプライマー対を用いて、前記Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａのａｍｏ遺伝子をコードする核酸領域の中でａｍｏＡおよびａｍｏＣ間の非保存領域を含む核酸領域を増幅する工程と、
（２）増幅された前記核酸領域を検出する工程と、
を具備した方法を提供する。
【００１２】
さらに、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａを特異的に定量する方法であって、
（１）反応液に競合的ＤＮＡ断片を添加する工程と、
（２）前記競合的ＤＮＡ断片を添加した反応液において、前記競合的ＤＮＡ断片、並びにａｍｏ遺伝子をコードする核酸領域の中でａｍｏＡおよびａｍｏＣ間の非保存領域含む核酸領域を増幅する工程と、
（３）前記増幅された競合的ＤＮＡ断片由来配列、および核酸領域由来配列を検出する工程と、
（４）前記検出した競合的ＤＮＡ断片由来断片、および核酸領域由来断片の両者の比から、核酸領域由来断片の量を求める工程と、
を具備したＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａを特異的に定量する方法を提供する。
【００１３】
また、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａを特異的に定量する方法であって、
（１）反応液に配列番号３の塩基配列を含む競合的ＤＮＡ断片を添加する工程と、
（２）前記競合的ＤＮＡ断片を添加した反応液において、競合的ＤＮＡ断片、並びに配列番号１に記載される塩基配列からなるプライマーと配列番号２に記載される塩基配列からなるプライマーのプライマー対を用いて、ａｍｏ遺伝子をコードする核酸領域の中でａｍｏＡおよびａｍｏＣ間の非保存領域を含む核酸領域を増幅する工程と、
（３）前記増幅された競合的ＤＮＡ断片由来配列、および核酸領域由来配列を検出する工程と、
（４）前記検出した競合的ＤＮＡ断片由来断片、および核酸領域由来断片の両者の比から、核酸領域由来断片の量を求める工程と、
を具備したＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａを特異的に定量する方法を提供する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に記載する。
【００１５】
本発明のＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａを検出するための方法に使用するプライマーは、ＧｅｎＢａｎｋより得られた塩基配列データを基に、ａｍｍｍｏｎｉａ　ｍｏｎｏｏｘｇｅｎａｓｅ（ａｍｏ）遺伝子を標的として設計すればよい。Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａを特異的に検出するためには、ａｍｏ遺伝子をコードするａｍｏＡおよびａｍｏＣ間の非保存領域を含むＤＮＡ配列が最適であると考えられ、このような領域が得られるようにプライマーを設計すすればよい。　具体的には、図１に示した塩基配列が得られるように、プライマーとして、該配列の両端の配列のオリゴヌクレオチドを作成した。オリゴヌクレオチドの作製は、通常のＤＮＡ合成方法を使用して行えばよい。
【００１６】
プライマー１　　５’−ＧＣＴＴＡＡＴＣＴＧＧＴＡＴＧＴＡＣＴＣＣ−３’（配列番号１）
プライマー２　　５’−ＡＧＡＴＡＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＴＣＣ−３’（配列番号２）
ａｍｏＡおよびａｍｏＣ間の非保存領域を含むＤＮＡ配列が増幅されればＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａを特異的に検出することが可能であるため、本発明のプライマーは、該領域を含むＤＮＡ配列を増幅できればよいことになる。したがって、前記プライマーは、配列番号１、および配列番号２のそれぞれの配列が前後に１もしくは数塩基ずれた塩基配列でもよく、前後に１もしくは数塩基が欠失または付加された塩基配列でもよいことは当業者には明らかであろう。
【００１７】
すなわち、本発明のプライマーは、配列番号１、および配列番号２に記載される塩基配列からなるプライマーにおいて、該配列が前後に１もしくは数塩基ずれた塩基配列、または前後に１もしくは数塩基が欠失または付加された塩基配列のプライマーであって、ａｍｏ遺伝子に由来するプライマーであればよい。
【００１８】
ここで、前後に１もしくは数塩基ずれたとは、たとえばａｍｏ遺伝子の第Ｘ〜第Ｙ塩基からなる配列番号１のプライマー配列が１塩基ずれた場合、第Ｘ＋１〜第Ｙ＋１塩基、または第Ｘ−１〜第Ｙ−１塩基となることをいう。前後に１もしくは数塩基欠失されたとは、たとえばａｍｏ遺伝子の第Ｘ〜第Ｙ塩基からなる配列番号１のプライマー配列が１塩基欠失された場合、第Ｘ〜第Ｙ−１塩基、または第Ｘ＋１〜第Ｙ塩基となることをいう。前後に１もしくは数塩基付加されたとは、たとえばａｍｏ遺伝子の第Ｘ〜第Ｙ塩基からなる配列番号１のプライマー配列に１塩基付加された場合、第Ｘ〜第Ｙ＋１塩基、または第Ｘ−１〜第Ｙ塩基となることをいう。
【００１９】
このような配列の変更は当業者であれば容易に行うことができるであろう。
【００２０】
Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａを検出したいサンプルにおいて、上記プライマーを使用したＰＣＲを行えば、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａを特異的に検出することが可能である。
【００２１】
したがって、本発明は、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａを特異的に検出する方法であって、
前記Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａのａｍｏ遺伝子をコードする核酸領域の中でａｍｏＡおよびａｍｏＣ間で保存されていないを含む核酸領域を増幅する工程と、
増幅された前記核酸領域を検出する工程と、
を具備した方法を提供する。
【００２２】
前記保存されていない領域を含む核酸領域の増幅は、上述したように、配列番号１に記載される塩基配列からなるプライマーと配列番号２に記載される塩基配列からなるプライマー対、または配列番号１および配列番号２に記載される塩基配列からなるプライマー対において、該配列がそれぞれ、前後に１もしくは数塩基ずれた塩基配列、または前後に１もしくは数塩基が欠失または付加された塩基配列のプライマーであってａｍｏ遺伝子に由来するプライマー対を使用して、かつ培養液、し尿汚泥、または廃プラ汚泥中から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として使用して、ＰＣＲを行えばよい。
【００２３】
前記ゲノムＤＮＡの調整は当業者に周知の方法で行うことができるが、たとえば以下の方法で行えばよい。液体培養したＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａ　ＩＦＯ株（ＩＦＯ−１４２９８）、及びＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ＭＫ株（ＦＥＲＭ−Ｐ１２５５５）などであれば、それぞれの培養液から遠心分離により菌体を回収する。また、し尿汚泥、廃プラ汚泥中のＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａを検出するのであれば、そのまま遠心分離してペレットを回収する。この回収した菌体およびペレットからゲノムＤＮＡ調整する。たとえばＧｅｎｏｍｉｃ−Ｐｒｅｐ　ｃｅｌｌ　ａｎｄ　ｔｉｓｓｕｅ　ＤＮＡ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用い、該ｋｉｔの手順書に従って操作すればよい。
【００２４】
前記ＰＣＲは、当業者に周知の通常の反応条件で行えばよいが、たとえばＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡）を使用して、ゲノムＤＮＡを各１μｌに、ＫＯＤｐｌｕｓ　１μｌ、ｄＮＴＰｍｉｘ　５μｌ、ＫＯＤｐｌｕｓ　Ｂｕｆｆｅｒ　５μｌ、ＭｇＳＯ４　２μｌ、２０ｍＭに調整したプライマーを２．５μｌずつ加え、これに滅菌水を加えて５０μｌに調整し、反応液の上層に１０μｌのミネラルオイル（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた後、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（宝酒造）により「９４℃・１５秒の変性、６３℃・３０秒のプライマーのアニーリング、６８℃・３０秒の合成反応」のサイクルを３０サイクル行えばよい。
【００２５】
前記増幅された前記核酸領域を検出は、ＰＣＲ反応終了後、各反応液から５μｌを、２％アガロースゲル（Ｅ−ｇｅｌ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて電気泳動を行い、ｖｉｓｔｒａ　ｇｒｅｅｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｐｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｌｓｎ／２１／ｐ４．１．ｈｔｍｌ）でＤＮＡを染色、またはエチジウムブロマイド染色等によって、増幅されたＤＮＡを確認すればよいが、当業者に既知のいずれの方法を使用して行ってもよい。
【００２６】
本方法によれば、ＩＦＯ株のゲノムＤＮＡを鋳型にした場合のみ、目的ＤＮＡのサイズ（配列番号１、および配列番号２のプライマーを使用した場合、約６００ｂｐ）に、ＤＮＡ断片の増幅が認められる。他のゲノムＤＮＡを鋳型にした場合は、ＤＮＡ断片の増幅はみられない。
【００２７】
さらに、本発明は、配列番号１に記載される塩基配列、および配列番号２に記載される塩基配列を含む競合的ＤＮＡ断片を使用して、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａを特異的に定量する方法を提供する。
【００２８】
ここで、競合的ＤＮＡ断片とは、競合的ＰＣＲにおいて使用するためのＤＮＡ断片をいう。すなわち、配列番号１および配列番号２に記載される塩基配列のプライマーを使用したＰＣＲによって増幅されるＤＮＡ断片、および配列番号１および配列番号２に記載される塩基配列からなるプライマーにおいて、該配列がそれぞれ前後に１もしくは数塩基ずれた塩基配列または前後に１もしくは数塩基が欠失または付加された塩基配列のプライマーであって、ａｍｏ遺伝子に由来するプライマーを使用したＰＣＲによって増幅されるＤＮＡ断片を意味する。上記プライマーで増幅されるＤＮＡ断片は、配列番号１に記載される塩基配列と配列番号２に記載される塩基配列の間に任意の長さのＤＮＡ配列が含まれ、前記プライマーによるＰＣＲでその配列が増幅されるように含まれていることになる。配列番号１の配列と配列番号２の配列の間には、任意の長さのＤＮＡ配列を含むことができる。前記ＤＮＡ配列は、競合的ＰＣＲで標的とする配列の長さ（本発明においては約４００ｂｐ）と異なった長さであることが好ましい。このような競合的ＤＮＡ断片の例としては、たとえば本発明の配列番号３に記載される塩基配列（配列番号１の配列と配列番号２の配列の間に、λＤＮＡ由来の約４００ｂｐの塩基配列を含む全４３９塩基）からなる競合的ＤＮＡ断片が好ましい。上記のような競合的ＤＮＡ断片は、以下の実施例に示したように作製することができる。
【００２９】
配列番号１のプライマーの３’側にλＤＮＡ由来配列を連結させたｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒプライマー３　５’−ＧＣＴＴＡＡＴＣＴＧＧＴＡＴＧＴＡＣＴＣＣＧＴＡＣＧＧＴＣＡＴＣＡＴＣＴＧＡＣＡＣ−３’（配列番号４）と、
配列番号２のプライマーの３’側にλＤＮＡ由来配列を連結させたｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒプライマー４　５’−ＡＧＡＴＡＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＴＣＣＧＣＧＴＧＡＧＴＡＴＴＡＣＧＡＡＧＧＴＧ−３’（配列番号５）、
をプライマーとして使用し、λＤＮＡを鋳型に使用して、通常のＰＣＲ法で増幅すればよい。
【００３０】
上記のような競合的ＤＮＡ断片を使用して、競合的ＰＣＲを行えばＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａを特異的に定量することが可能となる。
【００３１】
ここで、競合的ＰＣＲ法（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ＰＣＲ）とは、定量的ＰＣＲの中で最も多く用いられている方法であり、分子量などで区別可能な２種類のＤＮＡ断片を同じ反応液で同時に増幅する方法である。この方法には様々なバリエーションがあるが、そのうちの一つとして、定量の内部標準となる競合的ＤＮＡ断片を人工合成して添加する方法がある。この競合的ＤＮＡ断片を目的のＤＮＡ断片と同じプライマー対で増幅し、かつ目的ＤＮＡとは分子量が異なるようにデザインしておくと、プラトーに達した後の両者の比から初期鋳型量の比を求めることができるという方法である。
【００３２】
したがって、本発明のプライマーで増幅のみられた鋳型ゲノムＤＮＡの量を推定するためにも、競合的ＰＣＲ法が有効であると考えられる。本発明の競合的ＤＮＡ断片を反応液中に添加して、標的のａｍｏ遺伝子を含む反応液において競合的ＰＣＲ法を行えば、ａｍｏ遺伝子だけでなく競合的ＤＮＡ断片も増幅される。また、競合的ＤＮＡ断片は、増幅されるａｍｏ遺伝子とは分子量が異なるようにデザインされているので、プラトーに達した後の両者の量をそれぞれ測定することができ、その比から初期鋳型量を求めることができる。
【００３３】
すなわち、本発明は、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａを特異的に定量する方法であって、
反応液に競合的ＤＮＡ断片を添加する工程と、
前記競合的ＤＮＡ断片を添加した反応液において、前記競合的ＤＮＡ断片、並びにａｍｏ遺伝子をコードする核酸領域の中でａｍｏＡおよびａｍｏＣ間の非保存領域を含む核酸領域を増幅する工程と、
前記増幅された競合的ＤＮＡ断片由来配列、および核酸領域由来配列を検出する工程と、
前記検出した競合的ＤＮＡ断片由来断片、および核酸領域由来断片の両者の比から、核酸領域由来断片の量を求める工程と、
を具備したＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａを特異的に定量する方法を提供する。
【００３４】
前記競合的ＤＮＡを添加する工程では、本発明の、配列番号１に記載される塩基配列、および配列番号２に記載される塩基配列を含む競合的ＤＮＡ断片を使用すればよく、好ましくは、配列番号３に記載の競合的ＤＮＡ断片を使用すればよい。
【００３５】
前記増幅する工程は、上述のように、配列番号１に記載される塩基配列からなるプライマーと配列番号２に記載される塩基配列からなるプライマー対、または配列番号１および配列番号２に記載される塩基配列のプライマー対において、該配列がそれぞれ前後に１もしくは数塩基ずれた塩基配列または前後に１もしくは数塩基が欠失または付加された塩基配列のプライマーであってａｍｏ遺伝子に由来するプライマー対を使用して、かつ培養液、し尿汚泥、または廃プラ汚泥中から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として使用して、ＰＣＲを行えばよい。
【００３６】
前記ＰＣＲは、たとえばＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａ　ＩＦＯ株のゲノムＤＮＡ　１μｌ、ＫＯＤｐｌｕｓ　１μｌ、ｄＮＴＰｍｉｘ　５μｌ、ＫＯＤｐｌｕｓ　Ｂｕｆｆｅｒ　５μｌ、ＭｇＳＯ４　２μｌ、２０ｍＭに調整したプライマーを２．５μｌずつ加え、これに滅菌水を加えて５０μｌに調整し、該反応液の上層に１０μｌのミネラルオイルを加えた後、「９４℃・１５秒の変性、６３℃・３０秒のプライマーのアニーリング、６８℃・３０秒の合成反応」のサイクルを、９〜２３サイクル行えばよいが、上述の検出方法と同様に、当業者に既知のいずれの方法を使用してもよい。
【００３７】
前記増幅された競合的ＤＮＡ断片、および核酸領域を検出する工程は、反応終了後の各反応液を６％ＴＢＥポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて電気泳動後、ｖｉｓｔｒａ　ｇｒｅｅｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｐｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｌｓｎ／２１／ｐ４．１．ｈｔｍｌ）でＤＮＡを染色し、蛍光イメージアナライザーにて画像解析を行うことによってその量が検出可能となるが、当業者に既知のいずれの方法を使用してもよい。
【００３８】
本発明の配列番号１、配列番号２のプライマー、および配列番号３の競合的ＤＮＡ断片を使用して、あらかじめ競合的ＰＣＲを行った結果から、約４００ｂｐの競合的ＤＮＡ断片を示すバンド、および約６００ｂｐの標的のａｍｏ遺伝子を示すバンドが得られ、その画像解析の結果、競合的ＤＮＡ断片と核酸領域の増幅効率に大差はなく、約１５サイクルまでは指数関数的に生成物が増加していることが確認できている（図５）。従って、競合的ＤＮＡ断片とａｍｏ遺伝子の比から、もとのａｍｏ遺伝子の定量が可能であると判断される。
【００３９】
したがって、前記蛍光イメージアナライザーにて画像解析を行うことによって検出した両者の量から、前記増幅された競合的ＤＮＡ断片および核酸領域の比を求め、その比から増幅された核酸領域のコピー数を見積もり、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａの数が求められる。
【００４０】
具体的には、添加した競合的ＤＮＡ断片の量は明らかであるので、ａｍｏ遺伝子／競合的ＤＮＡ断片＝１となる値から、ａｍｏ遺伝子のコピー数が推定でき、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａの数がわかることとなる。
【００４１】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本実施例は、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００４２】
【実施例】
実施例１
Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａ用プライマー作成
タンパク質をコードしている領域においては、タンパク質の構造を維持させる（例えば酵素では酵素としての活性を維持させなど）ために、その遺伝子配列は異種間でも配列が高度に維持されている。しかし、非コード領域においては異種間では非常にバラエティに富んでおり、塩基配列はもちろんのことながら、その長さにおいても異なっていることが多い。したがって、このような配列を見出して、検出することができれば、対象の種を特異的に検出可能であると考えた。
【００４３】
そこで、ａｍｏ遺伝子をコードする、ａｍｏＡおよびａｍｏＣ間の非保存領域が、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａに特徴的であるという知見から、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａの特異的な検出に最適であると考えた。
【００４４】
Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａを検出するために、ＧｅｎＢａｎｋより得られた塩基配列データを基に、ａｍｍｍｏｎｉａ　ｍｏｎｏｏｘｇｅｎａｓｅ（ａｍｏ）遺伝子を標的とし、ＰＣＲプライマーを設計した。　具体的には、ａｍｏＡおよびａｍｏＣ間の非保存領域を含むＤＮＡ配列である図１に示した塩基配列が得られるように、その両端をプライマーとするオリゴヌクレオチドを作成した。プライマーは、通常の方法で作製した。
【００４５】
プライマー１　　５’−ＧＣＴＴＡＡＴＣＴＧＧＴＡＴＧＴＡＣＴＣＣ−３’
プライマー２　　５’−ＡＧＡＴＡＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＴＣＣ−３’
実施例２
ＰＣＲによるＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａの特異的検出
ゲノムＤＮＡの調整は以下の方法で行った。Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａ　ＩＦＯ株（ＩＦＯ−１４２９８）、及びＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ＭＫ株（ＦＥＲＭ−Ｐ１２５５５）をそれぞれ液体培養し、遠心分離により菌体を回収した。また、し尿汚泥、廃プラ汚泥は、そのまま遠心分離し、ペレットを回収した。その回収した菌体およびペレットからのゲノムＤＮＡ調整には、Ｇｅｎｏｍｉｃ−Ｐｒｅｐ　ｃｅｌｌ　ａｎｄ　ｔｉｓｓｕｅ　ＤＮＡ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用い、操作はｋｉｔの手順書に従った。
【００４６】
上記４種のゲノムＤＮＡを鋳型にして、ＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡）を用いたＰＣＲ法により、図１に示した領域のＤＮＡ配列の増幅を試みた。反応液は、上記４種ゲノムＤＮＡを各１μｌに、ＫＯＤｐｌｕｓ　１μｌ、ｄＮＴＰｍｉｘ　５μｌ、ＫＯＤｐｌｕｓ　Ｂｕｆｆｅｒ　５μｌ、ＭｇＳＯ４　２μｌ、さらに実施例１で作成し、２０ｍＭに調整したプライマー１、２を２．５μｌずつ加え、これに滅菌水を加えて５０μｌに調整した。
【００４７】
上記反応液の上層に１０μｌのミネラルオイル（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた後、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（宝酒造）により増幅反応を行った。反応条件は、「９４℃・１５秒の変性→６３℃・３０秒のプライマーのアニーリング→６８℃・３０秒の合成反応」のサイクルを３０サイクル行った。
【００４８】
ＣＲ反応終了後、各反応液から５μｌを、２％アガロースゲル（Ｅ−ｇｅｌ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて電気泳動を行い、増幅されたＤＮＡを確認した。その結果を図２に示す。ＩＦＯ株のゲノムＤＮＡを鋳型にした場合のみ、目的ＤＮＡのサイズである約６００ｂｐに、ＤＮＡ断片の増幅が認められた。他のゲノムＤＮＡを鋳型にした場合は、ＤＮＡ断片の増幅はみられなかった。
【００４９】
実施例３
競合的ＤＮＡ断片を作製するためのプライマーの作成
次に、実施例２で増幅のみられた鋳型ゲノムＤＮＡの量を推定するために、競合的ＰＣＲ法が有効であると考え、競合的ＤＮＡ断片の作成を行った。この競合的ＤＮＡ断片と目的のＤＮＡを同じ反応液中において、同じプライマーで同時に増幅させると、プライマーの奪い合いにより、両者の増幅が競合的に起こり、増幅産物の比がもとの鋳型量の比を反映したものとなる。
【００５０】
λＤＮＡの塩基配列データに基づいて、約４００ｂｐの断片が得られるようなプライマー対を設計した。その配列を、実施例１で作成したプライマーの３’側につなげ、図３に示した塩基配列が得られるように、下記配列のオリゴヌクレオチドを作成した。
【００５１】
ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒプライマー３　５’−ＧＣＴＴＡＡＴＣＴＧＧＴＡＴＧＴＡＣＴＣＣＧＴＡＣＧＧＴＣＡＴＣＡＴＣＴＧＡＣＡＣ−３’
（配列番号４）
ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒプライマー４　５’−ＡＧＡＴＡＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＴＣＣＧＣＧＴＧＡＧＴＡＴＴＡＣＧＡＡＧＧＴＧ−３’（配列番号５）
実施例４
競合的ＤＮＡ断片の作成
λＤＮＡを鋳型とし、実施例２と同様にＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡）を用いたＰＣＲ法により、図３に示した領域のＤＮＡ配列の増幅を試みた。反応液は、λＤＮＡを１μｌに、ＫＯＤｐｌｕｓ　１μｌ、ｄＮＴＰｍｉｘ　５μｌ、ＫＯＤｐｌｕｓ　Ｂｕｆｆｅｒ　５μｌ、ＭｇＳＯ４　２μｌ、さらに実施例３で作成し、２０ｍＭに調整したそれぞれのプライマー３、４を２．５μｌずつ加え、これに滅菌水を加えて５０μｌに調整した。この反応液の上層にミネラルオイル１０μｌを加え反応に用いた。
【００５２】
反応条件は、実施例２と同様の条件で行った。反応終了後、２％アガロースゲル（Ｅ−ｇｅｌ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて電気泳動を行い、増幅されたＤＮＡ断片を確認した。その結果、約４００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められた。
【００５３】
反応終了後の反応液５０μｌ×４本分を１．５ｍｌエッペンチューブに移し、等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで処理し、遠心分離した。上清を回収し、１／１０量の１０ｍＭ酢酸ナトリウム、等量のイソアミルアルコールを加え遠心分離した。沈殿を７０％エタノールで洗浄後、脱気乾燥し、４００μｌのＴＥに溶解した。さらにＳＵＰＲＥＣ−０２（宝酒造）を用いて精製を行った。操作は添付の手順書に従った。
【００５４】
上記にて精製したＤＮＡを希釈し、２６０ｎｍの吸光度を測定し、濃度およびコピー数を算出した。濃度は約０．１４μｇ／μｌ、コピー数は１．８×１０１３コピーであった。
【００５５】
上記のＤＮＡを１００倍希釈したものを、競合的ＤＮＡ断片とし、以下の実験に用いた。
【００５６】
実施例５
競合的ＰＣＲによる定量
実施例４にて作成した競合的ＤＮＡ断片を１、１／１０、１／１００、１／１０００、１／１００００の１０倍間隔で希釈列を作った。各希釈濃度の競合的ＤＮＡ断片　１μｌずつと、標的として実施例２にて回収したＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａ　ＩＦＯ株のゲノムＤＮＡ　１μｌ、ＫＯＤｐｌｕｓ　１μｌ、ｄＮＴＰｍｉｘ　５μｌ、ＫＯＤｐｌｕｓ　Ｂｕｆｆｅｒ　５μｌ、ＭｇＳＯ４　２μｌ、さらに実施例１で作成し、２０ｍＭに調整したプライマー１、２を２．５μｌずつ加え、これに滅菌水を加えて５０μｌに調整した。
【００５７】
▽上記反応液の上層に１０μｌのミネラルオイルを加えた後、実施例２と同様にＰＣＲ反応を行った。反応条件は、「９４℃・１５秒の変性、６３℃・３０秒のプライマーのアニーリング、６８℃・３０秒の合成反応」のサイクルを、９・１５・１９・２３サイクルそれぞれ行った。
【００５８】
反応終了後の各反応液を６％ＴＢＥポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて電気泳動後、ｖｉｓｔｒａ　ｇｒｅｅｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｐｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｌｓｎ／２１／ｐ４．１．ｈｔｍｌ）でＤＮＡを染色し、蛍光イメージアナライザーにて画像解析を行った。その結果を図５に示す。約４００ｂｐのバンドは競合的ＤＮＡ断片を、約６００ｂｐのバンドは標的核酸断片を示すバンドである。その画像解析の結果、競合的ＤＮＡ断片と標的核酸断片の増幅効率に大差はなく、約１５サイクルまでは指数関数的に生成物が増加しており、標的核酸断片の定量が可能であると判断した。標的核酸断片／競合的ＤＮＡ断片＝１となる競合的ＤＮＡ断片の量から、標的核酸断片は１０９コピーに相当すると推定された。
【００５９】
本発明において作成した競合的ＤＮＡ断片を用いることで、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ属細菌に含まれるＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａ細菌を検出すること、および定量することが可能となった。
【００６０】
【発明の効果】
本発明のＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａ　のａｍｏ遺伝子をコードするａｍｏＣおよびａｍｏＡ間の非保存領域を含む塩基配列のプライマーを使用することによって、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａ　ＩＦＯ株を特異的に検出することが可能になった。また、本発明の競合的ＤＮＡ断片を使用することにより、競合的ＰＣＲでＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａの定量を行うことが可能になった。すなわち、本発明はＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａを特異的に検出し、かつ正確な定量を行うための有用なツールを提供するものである。
【００６１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　ｅｕｒｏｐａｅａのａｍｏＣおよびａｍｏＡ間の非保存領域を含むＤＮＡ配列を示す図。
【図２】配列番号１、および配列番号２のプライマーを使用してＰＣＲを行った結果を示す図。
【図３】本発明の競合的ＤＮＡ断片を示す図。
【図４】配列番号４、および配列番号５のプライマー、並びにλＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行った結果を示す図。
【図５】配列番号１、および配列番号２のプライマー、並びに配列番号３の競合的ＤＮＡ断片を使用して、競合的ＰＣＲを行った結果を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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