(57)【要約】　　　（修正有）【課題】倍数性生物におけるＳＮＰ解析方法を提供する。【解決手段】ｃＤＮＡ群の塩基配列を、アセンブルして、複数種若しくはそれ以上のグループのコンティグを形成させ、ついで、前記コンティグを、類似配列に基づきクラスタリングして、複数種若しくはそれ以上のクラスタを得、その後、該クラスタ内において、コンティグを、アセンブルして、各コンティグ内におけるコンセンサス配列と、対応するコンティグとの間の塩基の差異をＳＮＰとして検出する、倍数性生物におけるＳＮＰ解析方法、並びに該ＳＮＰ解析方法で解析されたＳＮＰのＳＮＰアレル頻度を検出し、コンティグが由来したゲノムと染色体とを決定する、倍数性生物に由来する解析対象のｃＤＮＡが座乗する座乗染色体の識別方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）解析対象のｃＤＮＡ群の塩基配列を決定するステップ、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られたｃＤＮＡ群の塩基配列をアセンブルして、少なくとも２種のコンティグを形成させるステップ、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られたそれぞれのコンティグを、類似配列に基づきクラスタリングして、少なくとも１種のクラスタを得るステップ、ここで、各クラスタ内におけるコンティグは、ＢＬＡＳＴアルゴリズムで１ｅ−５以下の期待値で検出されるレベルの相同性を有するものである、及び
（ｄ）前記ステップ（ｃ）で形成されたクラスタ内においてコンティグをアセンブルしてコンティグを形成し、形成されたコンティグ間におけるコンセンサス配列と、該コンセンサス配列に対応するコンティグとの間の塩基の差異をＳＮＰとして検出するステップ、
を含む、倍数性生物におけるＳＮＰ解析方法。
【請求項２】
倍数性生物が、コムギ、洋種ナタネ、エンバク、タバコ及びイチゴからなる群より選ばれたものである、請求項１記載のＳＮＰ解析方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）が、前記ステップ（ａ）で得られたｃＤＮＡ群の塩基配列を、ｐｈｒａｐ、ＣＡＰ３及びＴＩＧＥＲ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒからなる群より選ばれた１種でアセンブルさせ、少なくとも２種のコンティグを形成させることにより行なわれる、請求項１又は２記載のＳＮＰ解析方法。
【請求項４】
ステップ（ｃ）が、前記ステップ（ｂ）で得られたそれぞれのコンティグを、ＢＬＡＳＴ及びｄ２−ｃｌｕｓｔｅｒからなる群より選ばれた１種でクラスタリングさせることにより行なわれる、請求項１〜３いずれか１項に記載のＳＮＰ解析方法。
【請求項５】
ステップ（ｄ）が、前記ステップ（ｃ）で形成されたクラスタ内において、コンティグを、ｐｈｒａｐ及びＣＡＰ３からなる群より選ばれた１種でアセンブルさせ、少なくとも１種のコンティグを形成させることにより行なわれる、請求項１〜４いずれか１項に記載のＳＮＰ解析方法。
【請求項６】
（ａ）解析対象のｃＤＮＡ群の塩基配列を決定するステップ、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られたｃＤＮＡ群の塩基配列をアセンブルして、少なくとも２種のコンティグを形成させるステップ、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られたそれぞれのコンティグを、類似配列に基づきクラスタリングして、少なくとも１種のクラスタを得るステップ、ここで、各クラスタ内におけるコンティグは、ＢＬＡＳＴアルゴリズムで１ｅ−５以下の期待値で検出されるレベルの相同性を有するものである、
（ｄ）前記ステップ（ｃ）で形成されたクラスタ内においてコンティグをアセンブルしてコンティグを形成し、形成されたコンティグ間におけるコンセンサス配列と、該コンセンサス配列に対応するコンティグとの間の塩基の差異をＳＮＰとして検出するステップ、及び
（ｅ）ゲノム中における前記ステップ（ｄ）で決定されたＳＮＰのＳＮＰアレル頻度を検出し、コンティグが由来したゲノムと染色体とを決定するステップ、
を含む、倍数性生物に由来する解析対象のｃＤＮＡが座乗する座乗染色体の識別方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＳＮＰ解析方法及びｃＤＮＡの識別方法に関する。より詳しくは、倍数性生物におけるＳＮＰを解析することができるＳＮＰ解析方法及び倍数性生物のｃＤＮＡを識別することができるｃＤＮＡの識別方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一塩基多型（ＳＮＰ）は、系統間、個体間等の区別化、特定形質の発現の予測等に有用なジェノタイピングマーカーとして注目されている。
【０００３】
前記ＳＮＰの同定方法としては、例えば、配列整列化プログラムｐｈｒａｐ　［フィル　　グリーン（Ｐｈｉｌ　Ｇｒｅｅｎ）ら、ワシントン大学；　例えば、コドンコード（ＣｏｄｏｎＣｏｄｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）　社（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｄｏｎｃｏｄｅ．ｃｏｍ／）　により配給］　でＥＳＴを整列化し、整列化されたコンテイグを系統毎に比較することにより、ＳＮＰを検出する方法等が知られている　［例えば、Ｎａｔ．　Ｇｅｎｅｔ．　１９９９，　２３（４），　４５２−４５６，　Ａ　ｇｅｎｅｒａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ：　Ｍａｒｔｈ　ｅｔ　ａｌ．等］　。
【０００４】
しかしながら、コムギ等の多倍数性生物では、ゲノム配列が重複しているため、前記ｐｈｒａｐによりコンティグを作製した場合、各ゲノム由来のＥＳＴが混在した状態でコンティグが形成される。あるいは、ある遺伝子の配列について単純にシーケンスを比較しても、ホメオログ間のＳＮＰと系統間のＳＮＰが識別できない。したがって、前記ｐｈｒａｐによる方法によるコムギ等の多倍数性生物のＳＮＰの検出方法には、系統間で相同なコンティグについて単純に比較しても、実際には、ゲノム間のＳＮＰにより系統間でのＳＮＰの比較が妨げられ、核内のどの配列についてのＳＮＰを検出しているかが不明であるという欠点がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、コムギ等の多倍数性生物において、ＳＮＰの起源となるゲノムを同定すること、各ゲノム毎にＳＮＰを検出すること、系統間におけるＳＮＰを検出すること等の少なくとも１つを可能にする、倍数性生物におけるＳＮＰ解析方法を提供することを目的とする。また、本発明は、コムギ等の多倍数性生物に由来する解析対象のｃＤＮＡ群について、起源となるゲノム毎に識別すること、系統間におけるＳＮＰを検出すること等の少なくとも１つを可能にする、倍数性生物のｃＤＮＡの識別方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕　（ａ）解析対象のｃＤＮＡ群の塩基配列を決定するステップ、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られたｃＤＮＡ群の塩基配列をアセンブルして、少なくとも２種のコンティグを形成させるステップ、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られたそれぞれのコンティグを、類似配列に基づきクラスタリングして、少なくとも１種のクラスタを得るステップ、ここで、各クラスタ内におけるコンティグは、ＢＬＡＳＴアルゴリズムで１ｅ−５以下の期待値で検出されるレベルの相同性を有するものである、及び
（ｄ）前記ステップ（ｃ）で形成されたクラスタ内においてコンティグをアセンブルしてコンティグを形成し、形成されたコンティグ間におけるコンセンサス配列と、該コンセンサス配列に対応するコンティグとの間の塩基の差異をＳＮＰとして検出するステップ、
を含む、倍数性生物におけるＳＮＰ解析方法、
〔２〕　倍数性生物が、コムギ、洋種ナタネ、エンバク、タバコ及びイチゴからなる群より選ばれたものである、前記〔１〕記載のＳＮＰ解析方法、
〔３〕　ステップ（ｂ）が、前記ステップ（ａ）で得られたｃＤＮＡ群の塩基配列を、ｐｈｒａｐ、ＣＡＰ３及びＴＩＧＥＲ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒからなる群より選ばれた１種でアセンブルさせ、少なくとも２種のコンティグを形成させることにより行なわれる、前記〔１〕又は〔２〕記載のＳＮＰ解析方法、
〔４〕　ステップ（ｃ）が、前記ステップ（ｂ）で得られたそれぞれのコンティグを、ＢＬＡＳＴ及びｄ２−ｃｌｕｓｔｅｒからなる群より選ばれた１種でクラスタリングさせることにより行なわれる、前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載のＳＮＰ解析方法、
〔５〕　ステップ（ｄ）が、前記ステップ（ｃ）で形成されたクラスタ内において、コンティグを、ｐｈｒａｐ及びＣＡＰ３からなる群より選ばれた１種でアセンブルさせ、少なくとも１種のコンティグを形成させることにより行なわれる、前記〔１〕〜〔４〕いずれか１項に記載のＳＮＰ解析方法、並びに
〔６〕　（ａ）解析対象のｃＤＮＡ群の塩基配列を決定するステップ、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られたｃＤＮＡ群の塩基配列をアセンブルして、少なくとも２種のコンティグを形成させるステップ、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られたそれぞれのコンティグを、類似配列に基づきクラスタリングして、少なくとも１種のクラスタを得るステップ、ここで、各クラスタ内におけるコンティグは、ＢＬＡＳＴアルゴリズムで１ｅ−５以下の期待値で検出されるレベルの相同性を有するものである、
（ｄ）前記ステップ（ｃ）で形成されたクラスタ内においてコンティグをアセンブルしてコンティグを形成し、形成されたコンティグ間におけるコンセンサス配列と、該コンセンサス配列に対応するコンティグとの間の塩基の差異をＳＮＰとして検出するステップ、及び
（ｅ）ゲノム中における前記ステップ（ｄ）で決定されたＳＮＰのＳＮＰアレル頻度を検出し、コンティグが由来したゲノムと染色体とを決定するステップ、
を含む、倍数性生物に由来する解析対象のｃＤＮＡが座乗する座乗染色体の識別方法、
に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＥＳＴ整列化プログラムｐｈｒａｐでコムギのＥＳＴ配列を整列化させ、整列化されたコンテイグをＢＬＡＳＴによりクラスタリングし、それにより得られたクラスタ内でＥＳＴ配列を、再度ｐｈｒａｐにより整列化することで、ゲノム間における一塩基多型（ＳＮＰ）を識別することができ、反復した配列をもつゲノムを有する異質倍数性生物の同一遺伝子のｃＤＮＡを、Ａ、Ｂ、Ｄの各ゲノム間で識別することができるという本発明者らの驚くべき知見に基づく。
【０００８】
本発明の倍数性生物におけるＳＮＰ解析方法は、（ａ）解析対象のｃＤＮＡ群の塩基配列を決定するステップ、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られたｃＤＮＡ群の塩基配列をアセンブルして、少なくとも２種のコンティグを形成させるステップ、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られたそれぞれのコンティグを、類似配列に基づきクラスタリングして、少なくとも１種のクラスタを得るステップ、ここで、各クラスタ内におけるコンティグは、ＢＬＡＳＴアルゴリズムで１ｅ−５以下の期待値で検出されるレベルの相同性を有するものである、及び
（ｄ）前記ステップ（ｃ）で形成されたクラスタ内においてコンティグをアセンブルしてコンティグを形成し、形成されたコンティグ間におけるコンセンサス配列と、該コンセンサス配列に対応するコンティグとの間の塩基の差異をＳＮＰとして検出するステップ、
を含む方法である。
【０００９】
本発明のＳＮＰ解析方法は、ｃＤＮＡ群の塩基配列を、アセンブルして、複数種若しくはそれ以上のグループのコンティグを形成させ、ついで、前記コンティグを、類似配列に基づきクラスタリングして、複数種若しくはそれ以上のクラスタを得、その後、該クラスタ内において、コンティグを、アセンブルして、各コンティグ内におけるコンセンサス配列と、対応するコンティグとの間の塩基の差異をＳＮＰとして検出することに１つの特徴がある。したがって、本発明のＳＮＰ解析方法によれば、反復した配列をもつゲノムを有する異質倍数性生物の同一遺伝子のｃＤＮＡをゲノム間で識別することができるという優れた効果を発揮する。より詳しくは、本発明のＳＮＰ解析方法によれば、倍数性生物において、ＳＮＰの起源となるゲノムを同定すること、各ゲノム毎にＳＮＰを検出すること、系統間におけるＳＮＰを検出すること等が可能になるという優れた効果を発揮する。
【００１０】
本明細書において、「倍数性生物」とは、２組より多くの染色体を有する生物個体をいい、特に限定されないが、具体的には、例えば、コムギ、洋種ナタネ、エンバク、タバコ、イチゴ等が挙げられる。
【００１１】
本発明のＳＮＰ解析方法においては、まず、解析対象のｃＤＮＡ群の塩基配列を決定する〔ステップ（ａ）、図１のフローチャートにおける１〕。ステップ（ａ）において、塩基配列は、慣用の塩基配列決定法により決定されうる。本発明においては、前記塩基配列は、以下に続くステップにおける処理を円滑に行なう観点から、グアニン、アデニン、シトシン及びチミンのそれぞれの塩基に対応するシグナル情報、又は該塩基の一文字表記等の文字情報として得ることが望ましい。
【００１２】
前記ｃＤＮＡは、慣用の方法により適宜作製されうる。
【００１３】
なお、本発明の他の態様としては、解析対象のｃＤＮＡ群として、塩基配列が予め知られているもの、例えば、ゲノムデータベース、ＤＮＡデータベース等を用いることが挙げられる。かかる態様においては、前記ステップ（ａ）を、省略されうる。
【００１４】
ついで、前記ステップ（ａ）で得られたｃＤＮＡ群の塩基配列をアセンブルして、少なくとも２種のコンティグを形成させる〔ステップ（ｂ）、図１のフローチャートにおける２〕。
【００１５】
ステップ（ｂ）において、ｃＤＮＡ群の塩基配列のアセンブルには、ｃＤＮＡ群の塩基配列を、１〜数塩基の違いでも別個のコンティグとして整列化させることが可能な処理を実施すればよく、特に限定されないが、ｃＤＮＡ群の塩基配列を、例えば、ｐｈｒａｐ　［ワシントン大学：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈｒａｐ．ｏｒｇ］　、ＣＡＰ３［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｃｓ．ｍｔｕ．ｅｄｕ／ｃａｐ／ｃａｐ３．ｈｔｍｌ供給］　、ＴＩＧＥＲ　　ＡＳＳＥＭＢＬＥＲ　［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ供給］　等に与えて、該ｃＤＮＡ群の塩基配列をアセンブルさせることにより行なわれうる。
【００１６】
前記ステップ（ｂ）におけるアセンブルの際の条件は、各ゲノムに由来するＥＳＴが、ゲノムの違いをこえてアセンブルしない条件であればよく、例えば、パンコムギ品種ＣＳ（Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｐｒｉｎｇ）のＳＮＰを解析する場合の条件の一例としては、該ＣＳのｃＤＮＡの塩基配列をｐｈｒａｐにより、−ｐｅｎａｌｔｙ−５−ｍｉｎｍａｔｃｈ　５０−ｍｉｎｓｃｏｒｅ　１００　の条件でアセンブルさせること等が挙げられる。
【００１７】
なお、ステップ（ｂ）において形成されるコンティグの種類の数は、解析対象となるｃＤＮＡの起源となる生物の倍数性等により異なるが、少なくとも２種、具体的には、２種以上である。
【００１８】
ついで、前記ステップ（ｂ）で得られたそれぞれのコンティグを、類似配列に基づきクラスタリングして、少なくとも１種のクラスタを得る〔ステップ（ｃ）、図１のフローチャートにおける３〕。ここで、各クラスタ内におけるコンティグは、ＢＬＡＳＴアルゴリズムで１ｅ−５以下の期待値で検出されるレベルの相同性を有するものである。
【００１９】
本発明においては、前記ステップ（ｂ）でコンティグを形成させた後に、該コンティグのクラスタリングを行なうため、倍数性生物の各ゲノム毎にＳＮＰを検出することが可能になるという優れた効果を発揮する。
【００２０】
前記ステップ（ｃ）において、類似配列とは、ＢＬＡＳＴによってクラスタリングされるもので、１ｅ−５以下の期待値で検出される相同性をもつものをいう。
【００２１】
前記ステップ（ｃ）において、コンティグのクラスタリングには、類似配列に基づいて、コンティグのクラスターを形成させることが可能な処理を実施すればよく、例えば、前記ステップ（ｂ）で得られたそれぞれのコンティグを、ＢＬＡＳＴ、ｄ２ｃｌｕｓｔｅｒ等でクラスタリングさせることにより行なわれる。
【００２２】
前記ステップ（ｃ）におけるクラスタリングの際の条件は、同祖遺伝子を１つのクラスタとして分類するものであればよく、例えば、パンコムギ品種ＣＳ（Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｐｒｉｎｇ）のＳＮＰを解析する場合の条件の一例としては、前記ｐｈｒａｐで、−ｐｅｎａｌｔｙ−５−ｍｉｎｍａｔｃｈ　５０−ｍｉｎｓｃｏｒｅ　１００　の条件で得られた少なくとも２種のコンティグを、ＢＬＡＳＴにより、期待値１ｅ−５の条件でクラスタリングすること等が挙げられる。
【００２３】
ついで、前記ステップ（ｃ）で形成されたクラスタ内においてコンティグをアセンブルしてコンティグを形成し、形成されたコンティグ間におけるコンセンサス配列と、該コンセンサス配列に対応するコンティグとの間の塩基の差異をＳＮＰとして検出する〔ステップ（ｄ）、図１のフローチャートにおける４〕。
【００２４】
前記ステップ（ｄ）において、クラスタ内におけるコンティグのアセンブルには、クラスタ内におけるコンティグを、アセンブルすることによって、コンティグを形成、すなわち、同祖遺伝子を並べ直し、コンティグ間の多型の判別が可能な処理を実施すればよく、特に限定されないが、ステップ（ｄ）が、前記ステップ（ｃ）で形成されたクラスタ内において、コンティグを、ｐｈｒａｐ、ＣＡＰ３、ＴＩＧＥＲ　　ＡＳＳＥＭＢＬＥＲ等や、各社より販売される商用ソフト、例えば、ＤＮＡＳＴＡＲ社製ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ等に与えて、該コンティグをアセンブルさせ、クラスタ内において、少なくとも１種のコンティグを形成させることにより行なわれうる。
【００２５】
ここで、クラスタ内におけるコンティグのアセンブルの条件としては、例えば、前記ステップ（ｂ）における条件と同様の条件が挙げられ、具体的には、パンコムギ品種ＣＳのＳＮＰを解析する場合の条件の一例としては、該ＣＳのｃＤＮＡの塩基配列をｐｈｒａｐにより、−ｐｅｎａｌｔｙ−５−ｍｉｎｍａｔｃｈ　５０−ｍｉｎｓｃｏｒｅ　１００　の条件でアセンブルさせること等が挙げられる。
【００２６】
前記ステップ（ｄ）においては、アセンブルにより形成されたコンティグ間におけるコンセンサス配列と、該コンセンサス配列に対応するコンティグとの間の塩基の差異がＳＮＰとして検出され、ゲノム間ＳＮＰの位置をも同定できる。したがって、例えば、パンコムギ品種ＣＳのＳＮＰを解析する場合、Ａ、Ｂ、Ｄの各ゲノム間のＳＮＰを検出することができる。
【００２７】
本発明によれば、前記ＳＮＰの検出方法における前記ステップ（ａ）〜（ｄ）を行なった後に、ゲノム中における前記ステップ（ｄ）で決定されたＳＮＰのＳＮＰアレル頻度を検出し、コンティグが由来したゲノムと染色体とを決定するステップ〔ステップ（ｅ）、図１のフローチャートにおける５〕を行なうことにより、倍数性生物に由来する解析対象のｃＤＮＡが座乗する座乗染色体を識別することができる。したがって、本発明により、倍数性生物に由来する解析対象のｃＤＮＡが座乗する座乗染色体を識別することができる。かかる倍数性生物に由来する解析対象のｃＤＮＡが座乗する座乗染色体の識別方法も本発明の範囲に含まれれる。
【００２８】
本発明の倍数性生物に由来する解析対象のｃＤＮＡが座乗する座乗染色体の識別方法は、
（ａ）解析対象のｃＤＮＡ群の塩基配列を決定するステップ、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られたｃＤＮＡ群の塩基配列をアセンブルして、少なくとも２種のコンティグを形成させるステップ、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られたそれぞれのコンティグを、類似配列に基づきクラスタリングして、少なくとも１種のクラスタを得るステップ、ここで、各クラスタ内におけるコンティグ間の配列同一性は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムでの期待値１ｅ−５以下である、
（ｄ）前記ステップ（ｃ）で形成されたクラスタ内においてコンティグをアセンブルしてコンティグを形成し、形成されたコンティグ間におけるコンセンサス配列と、該コンセンサス配列に対応するコンティグとの間の塩基の差異をＳＮＰとして検出するステップ、及び
（ｅ）ゲノム中における前記ステップ（ｄ）で決定されたＳＮＰのＳＮＰアレル頻度を検出し、コンティグが由来したゲノムと染色体とを決定するステップ、
を含むことを１つの大きな特徴とする。
【００２９】
前記ステップ（ｅ）において、ＳＮＰアレル頻度は、例えば、慣用の塩基配列決定法；アレル特異的ＰＣＲ（東洋紡社カタログ）；ＳＮＰ座の直前までの配列を有するプライマーと、蛍光標識アシクロターミネータ塩基とを用いて一塩基伸長を行ない、伸長した塩基に対応する色を定量しアレルを決定するＡｃｙｃｒｏＰｒｉｍｅＦＰ検出（パーキンエルマー社カタログ）；ＳＮＰ直前までのプライミングから一塩基伸張をおこないＨＰＬＣにより塩基の違いをウェーブまたはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳにより識別する方法（Ｈｕｍ　Ｍｕｔａｔ．，　２００２，　Ａｕｇ；２０（２）：１３３−１３８　）；蛍光色素とクエンチャーを有するＴａｑｍａｎプローブと、ＳＮＰを含む領域とをハイブリダイズさせ、得られた産物を鋳型とし、その外側に設計したプライマーとＴａｑポリメラーゼとを用いたＰＣＲを行なうＴａｑｍａｎアッセイ（Ｈｕｍ　Ｍｕｔａｔ．，　２００２，　Ａｐｒ；１９（４）：３１５−３２３　）；ＳｎａｐＳｈｏｔＴＭ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　２００１，　Ｄｅｃ；３１（６）：１３７４−１３８０）；ＰＹＲＯＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　３２：５９２−６０３　（２００２，　Ｍａｒｃｈ）；Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　ｏｆ　ＳＮＰｓ　ｉｎ　ａ　Ｐｏｌｙｐｌｏｏｄ　Ｇｅｎｏｍｅ　ｂｙ　ＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇＴＭ）　等により評価されうる。なお、テトラアレル以上の場合の判別には、ＳｎａｐＳｈｏｔＴＭ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳによる方法、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇのいずれかが望ましい。例えば、コムギの場合、ナリテトラソーミクス系統におけるアレル頻度を評価すればよい。
【００３０】
ついで、得られたアレル頻度を基に、ナリテトラソーミックス系統での遺伝子型から規定されるアレル頻度比に対応するＳＮＰｓハプロタイプをもつコンティグを同定することにより、座乗染色体が同定されうる。また、ナリテトラソーミクス系統がない生物種の場合、コンティグ間のＳＮＰを使ってアレル特異的ＰＣＲを行ない、各ゲノムごとのＰＣＲ産物を得、それらについて、各ＰＣＲ産物をＳＮＰタイピングすればよい。
【００３１】
本発明によれば、系統間ＳＮＰのゲノムアサイン、ハイブリダイゼーションでは困難であった配列同定、染色体特異的マーカーの開発等への応用が期待される。
【００３２】
【実施例】
実施例１
（１）倍数性生物のＳＮＰの検出のための条件検討
倍数性生物として、パンコムギ品種Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｐｒｉｎｇを用いた。前記パンコムギ品種Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｐｒｉｎｇの１０組織よりｃＤＮＡライブラリーを作製し、該ｃＤＮＡライブラリーの塩基配列を決定し、２５９７１個のＥＳＴを構築した。
【００３３】
ついで、配列整列化プログラム「ｐｈｒａｐ」により、「ｐｅｎａｌｔｙ−５−ｍｉｎｍａｔｃｈ５０　−ｍｉｎｓｃｏｒｅ　１００　」の設定条件下、前記ＥＳＴを整列化して、ＥＳＴのコンティグを形成させた。
【００３４】
形成されたコンティグにおいて、メンバ数が５以上である５１９９コンティグについて、解析を行なった。
【００３５】
前記５１９９コンティグについて、一般的なＵｎｉｇｅｎｅ　構築法としても用いられる配列相同性検出プログラム「ＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｎ）」により、しきい値ｅ−ｖａｌｕｅ＝１ｅ−５の設定条件下、クラスタリングして、クラスタを形成させた。その結果、２４７８のクラスタに分類された。
【００３６】
ついで、前記２４７８のクラスタについて、各クラスタに属するコンティグの配列データ（マルチＦＡＳＴＡファイル）Ｉを、前記「ｐｈｒａｐ」により、「ｐｈｎａｌｔｙ−５−ｍｉｎｍａｔｃｈ　５０　−ｍｉｎｓｃｏｒｅ　１００　」の設定条件下、整列化し、前記コンティグ間のコンセンサス配列の算出を行なった。整列化状況を図２に示す。
【００３７】
その結果、図２に示すように、約半数（４９．６％）のコンティグがメンバ数１、ｓｉｎｇｌｅｔであった。メンバ数１のコンティグは、ｃＤＮＡからのコンティグ形成の段階で、既に、自身以外の相同配列がないものを示す。また、４４．５％のコンティグが、メンバ数２〜３であった。メンバ数２〜３のコンティグは、シーケンスに用いられたパンコムギが異質倍数性であることから反復したゲノムに由来する、ゲノムあたりの単一遺伝子を示す。さらに、メンバ数４以上のコンティグは、配列がかなり保存的な多重遺伝子を示す。
【００３８】
したがって、メンバ数２以上のコンティグがゲノム間ＳＮＰの検出に有効であると考えて、該メンバ数２以上のコンティグを以下の検討に用いた。
【００３９】
前記コンセンサス配列の算出の際に用いたａｃｅファイルから、メンバ数２〜３であり、長さがコンセンサス配列の長さに対して７０％以上をカバーするもの、８１７配列、すなわち、２〜３のコンティグとしてのメンバが存在する８１７遺伝子ファミリーを選別した。
【００４０】
各コンセンサス配列のコンティグメンバの各配列をマルチＦＡＳＴＡ形式で得、ｐｈｒａｐにより再整列化した。その一例を図３に示す。
【００４１】
その結果、図３に示すように、コンティグ間のＳＮＰが整列化されたコンティグ間で数多く見られた。そこで、かかるＳＮＰをコンティグ間ＳＮＰとした。
【００４２】
ついで、確実にエクソン内にあるｃＳＮＰを算定するために、インディカイネのゲノムシーケンスデータ（Ｒｉｃｅ　ＧＤ）の全配列に対して各コンセンサス配列をＱｕｅｒｙ　としたＢＬＡＳＴサーチ（プログラムｂｌａｓｔｎ，ｅ−ｖａｌｕｅ＝１ｅ−５）を行なった。
【００４３】
その結果、約９５％のコンセンサス配列が、何らかのイネゲノム配列コンティグと合致した。同一のイネ配列が複数のＳｕｂｊｅｃｔ　として検索され、かつＱｕｅｒｙ　の配列が重複しない場合、ｃＤＮＡのＱｕｅｒｙ　が、イネのゲノム配列上にイントロンとエクソンの領域を検出したことになる。つまり、相同性があった場所がイネとコムギとの間で保存されたエクソン領域となる。そこで、前記保存されたエクソン領域に存在するｃＳＮＰの数からＳＮＰの出現頻度を決定したところ、１４４．９ｂｐに１回であった。
【００４４】
ついで、検出されたＳＮＰについて、各ｃＤＮＡクローンの配列が忠実にコンティグの配列として反映されているかを確認するため、ＤＹＮＡＣＯＭにより、各コンティグの形成に寄与したすべてのメンバをコンセンサス配列のものに整列化した。かかる結果の一例を図４に示す。
【００４５】
なお、図４中、各コンティグに整列化されたメンバをそれぞれ「Ｉ群」、「ＩＩ群」及び「ＩＩＩ　群」で示し、配列中のＳＮＰを網かけ部分で示し、コンセンサス配列を矢印で示す。
【００４６】
図４の結果より、コンティグのメンバは、そのＳＮＰの塩基が保存的であることがわかる。これは、コンティグ作製時に、ｐｈｒａｐが一塩基の多型を識別して整列化できたことを示し、遺伝子ファミリのメンバを個々のコンティグとして識別できたことを示す。
【００４７】
また、図４の結果より、各コンティグ間は、アラインメントされた配列の２０７番目、２１９番目、２３３番目、２３４番目、２３９番目及び２４１番目の塩基、すなわち、Ｉ群においては、「Ｇ」、「Ｔ」、「Ａ」、「Ｃ」、「Ｃ」及び「Ｇ」、ＩＩ群においては、「Ｃ」、「Ｔ」、「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」及び「Ｔ」、ＩＩＩ　群においては、「Ｃ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｇ」、「Ａ」及び「Ｔ」により、区別化されうることがわかる。したがって、本方法によれば、各コンティグ配列について、ＳＮＰがハプロタイプのアレルの場合、各コンティグを該ＳＮＰで識別することができることがわかる。すなわち、各遺伝子ファミリーをｃＳＮＰで同定できることがわかる。
【００４８】
実施例２　コンティグの染色体への対応づけ
パンコムギのナリテトラソーミクス系統を用い、すでにＡ、Ｂ、Ｄゲノム由来の遺伝子配列が決定されているパンコムギチオニン遺伝子（Ｐｕｒ−Ａ１、Ｐｕｒ−Ｂ１、Ｐｕｒ−Ｄ１）それぞれに対応するコンティグについて、ＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇＴＭによるＳＮＰアレル頻度解析により、ＳＮＰアレルに基づくコンティグの各染色体への対応づけを試みた。
【００４９】
コンティグデータより、前記チオニン遺伝子ファミリーは、図６に示される２０７７−１（Ｃｏｎｔｉｇ１　；配列番号：１　）　　に整列化されていた。そこで、ＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇＴＭにおいては、２０７７−１のＲｅｖｅｒｓｅ　鎖を用い、Ｆｏｒｗａｒｄ　側のアレルを測定した。図５及び図６に解析対象のＳＮＰ領域、シークエンス用プライマー、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ用プライマーを示す。図５中、四角で囲まれた領域が、解析対象のＳＮＰ領域を示す。また、「Ｆ」は、Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（図６中のＰＣＲ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｆ）、「１」は、シークエンス用プライマー１（図６中のＳｅｑ　ｐｒｉｍｅｒ　１）、「２」は、シークエンス用プライマー２（図６中のＳｅｑ　ｐｒｉｍｅｒ　２）、「Ｒ」は、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー（図６中のＰＣＲ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｒ）を示す。
【００５０】
ビオチン化したＲｅｖｅｒｓｅプライマーとＦｏｒｗａｒｄプライマーとを用い、ナリテトラソーミクス系統のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なった。ついで、ＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇＴＭＰＳＱ９６ＭＡＳｙｓｔｅｍによりＰｙｒｏｇｒａｍＴＭ（図７）を得た。得られたＰｙｒｏｇｒａｍＴＭより、アレル頻度比を算定した。その結果を表１に示す。表中、ナリ系統では、０になる（ＣＳに比べて頻度比が１減る）塩基が、そのナリ系統の染色体に座乗することを示し、ＣＳ系統に比べて頻度比が１増える塩基が、テトラ系統の染色体に座乗することを示し、変化しないものは、ナリテトラ両染色体に座乗し過不足がないことを示す。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
表１に示される結果より、ＳＮＰによりハプロタイプを組んだ結果、図６中のＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．６のそれぞれのＳＮＰが、順に、Ｃ、Ｇ、Ｃであるコンティグは、１Ａ染色体＝Ｃｏｎｔｉｇ１５０３２　（配列番号：２）であり、Ｎｏ．３、Ｎｏ．５のそれぞれのＳＮＰが、順にＣ、Ｇであるコンティグは、１Ｂ染色体＝Ｃｏｎｔｉｇ１４１０４　（配列番号：４）であり、Ｎｏ．４のＳＮＰが、Ｃであるコンティグは、１Ｄ染色体＝Ｃｏｎｔｉｇ１５３０８　（配列番号：３）であることがわかる。
【００５３】
実施例３
実施例１及び２と同様の方法により、未知の配列についてコンティグを形成させ、アレレ頻度比を調べ、ついで、Ｎ４ＡＴ４Ｂ系統（４Ａ染色体をもたず、４Ｂ染色体が２本多い系統）　、Ｎ４Ｂ／４Ｈ系統　（４Ｂ染色体をもたず、４Ｈ　染色体で置換された系統）及びＮ４ＤＴ４Ａ系統　（４Ｄ染色体をもたず、４Ａ染色体が２本多い系統）　を用い、該コンティグの各染色体への対応づけを行なった。ここで、コムギ４Ｂ染色体のナリテトラソーミックス系統は維持できないため、オオムギ４Ｈ染色体との染色体置換系統を用いた。
【００５４】
コンティグのアライメントを図８に示す。その結果、各コンティグは、図９に示される８７４−３（配列番号：５）に整列化されていることがわかった。
【００５５】
ＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇＴＭにおいては、図９に示されるシークエンス用プライマー１（図９中のＳｅｑ．ｐｒｉｍｅｒ　１）、シークエンス用プライマー２（図９中のＳｅｑ．ｐｒｉｍｅｒ　２）、Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（図９中のＰＣＲ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｆ）、ビオチン標識プライマー（図９中のｂｉｏｔｉｎ　ｌａｂｅｌｅｄ　ｐｒｉｍｅｒ）を用いた。図９中、解析対象のＳＮＰに、Ｎｏ．１〜Ｎｏ．５の番号を付した。
【００５６】
ＳＮＰ座Ｎｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．５についてＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇＴＭによるアレル頻度比を図１０に示す。なお、ＳＮＰ座４はＴＣの繰り返しになるため、判別には用いなかった。ナリ系統で無くなる塩基を有するコンテイグにより、各コンティグの座乗染色体を評価した結果、Ｃｏｎｔｉｇ１２１００　（配列番号：６）は、４Ｄ染色体に、Ｃｏｎｔｉｇ１２２０６　（配列番号：７）は、４Ａ染色体に、Ｃｏｎｔｉｇ１３３０７　（配列番号：８）は、４Ｂ染色体に座乗していることがわかった。したがって、本発明の方法により、倍数性生物における未知の配列の座乗染色体を調べることができることが示される。
【００５７】
配列表フリーテキスト
配列番号：１は、２０７７−１の配列である。
【００５８】
配列番号：２は、Ｃｏｎｔｉｇ１５０３２の配列である。
【００５９】
配列番号：３は、Ｃｏｎｔｉｇ１５３０８の配列である。７０１位、７０５位のｎは任意のヌクレオチド残基である。
【００６０】
配列番号：４は、Ｃｏｎｔｉｇ１４１０４の配列である。
【００６１】
配列番号：５は、８７４−３の配列である。
【００６２】
配列番号：６は、Ｃｏｎｔｉｇ１２１００の配列である。
【００６３】
配列番号：７は、Ｃｏｎｔｉｇ１２２０６の配列である。
【００６４】
配列番号：８は、Ｃｏｎｔｉｇ１３３０７の配列である。
【００６５】
【発明の効果】
本発明の倍数性生物におけるＳＮＰ解析方法によれば、コムギ等の多倍数性生物において、ＳＮＰの起源となるゲノムを同定し、各ゲノム毎にＳＮＰを検出し、系統間におけるＳＮＰを検出することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の倍数性生物のｃＤＮＡの識別方法によれば、コムギ等の多倍数性生物に由来する解析対象のｃＤＮＡ群について、起源となるゲノム毎に識別し、系統間におけるＳＮＰを検出することができるという優れた効果を奏する。
【００６６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の倍数性生物におけるＳＮＰ解析方法及び倍数性生物に由来する解析対象のｃＤＮＡが座乗する座乗染色体の識別方法の概略を示すフローチャートを示す。
【図２】図２は、図１中の２のステップにおける整列化の状態を示す図である。
【図３】図３は、図１中の４のステップにおいて、各コンセンサス配列のコンティグメンバの各配列をマルチＦＡＳＴＡ形式で得、ｐｈｒａｐにより再整列化した結果を示す図である。
【図４】図４は、コンティグの形成に寄与したすべてのメンバをコンセンサス配列のものに整列化した結果を示す図である。図４中、各コンティグに整列化されたメンバをそれぞれ「Ｉ群」、「ＩＩ群」及び「ＩＩＩ　群」で示し、配列中のＳＮＰを網かけ部分で示し、コンセンサス配列を矢印で示す。
【図５】図５は、解析対象のＳＮＰ領域、シークエンス用プライマー、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ用プライマーを示す図である。図５中、四角で囲まれた領域が、解析対象のＳＮＰ領域を示す。また、「Ｆ」は、Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（図６中のＰＣＲ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｆ）、「１」は、シークエンス用プライマー１（図６中のＳｅｑ　ｐｒｉｍｅｒ　１）、「２」は、シークエンス用プライマー２（図６中のＳｅｑ　ｐｒｉｍｅｒ　２）、「Ｒ」は、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー（図６中のＰＣＲ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｒ）を示す。
【図６】図６は、解析対象のＳＮＰ領域、シークエンス用プライマー、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ用プライマーを示す図である。図９中、「Ｓｅｑ　ｐｒｉｍｅｒ１」は、シークエンス用プライマー１、「Ｓｅｑ　ｐｒｉｍｅｒ　２は、シークエンス用プライマー２、「ＰＣＲ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｆ」は、Ｆｏｒｗａｒｄプライマー、「ＰＣＲ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｒ」は、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを示す。また、解析対象のＳＮＰに、Ｎｏ．１〜Ｎｏ．１０の番号を付す。
【図７】図７は、ＰｙｒｏｇｒａｍＴＭを示す。図７中、Ｎ１ＡＴ１Ｄは、ナリ１Ａテトラ１Ｄ系統を示し、Ｎ１ＢＴ１Ｄは、ナリ１Ｂテトラ１Ｄ系統を示し、Ｎ１ＤＴ１Ａは、ナリ１Ｄテトラ１Ａ系統を示し、ＣＳは、Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｐｒｉｎｇを示す。
【図８】図８は、図１中の４のステップにおいて、コンティグメンバの各配列をマルチＦＡＳＴＡ形式で得、ｐｈｒａｐにより再整列化した結果を示す図である。
【図９】図９は、解析対象のＳＮＰ領域、シークエンス用プライマー、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ用プライマーを示す図である。図９中、「Ｓｅｑ．ｐｒｉｍｅｒ１」は、シークエンス用プライマー１、「Ｓｅｑ．ｐｒｉｍｅｒ　２は、シークエンス用プライマー２、「ＰＣＲ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｆ」は、Ｆｏｒｗａｒｄプライマーを示す。また、解析対象のＳＮＰに、Ｎｏ．１〜Ｎｏ．５の番号を付す。
【図１０】図１０は、ＰｙｒｏｇｒａｍＴＭを示す。図中、「Ｎ４ＡＴ４Ｂ」は、４Ａ染色体をもたず、４Ｂ染色体が２本多いＮ４ＡＴ４Ｂ系統、「Ｎ４Ｂ／４Ｈ」は、４Ｂ染色体をもたず、４Ｈ染色体で置換されたＮ４Ｂ／４Ｈ系統、「Ｎ４ＤＴ４Ａ」は、４Ｄ染色体をもたず、４Ａ染色体が２本多いＮ４ＤＴ４Ａ系統を示す。
【符号の説明】
１　塩基配列のデータを得るステップ
２　アセンブルを行なうステップ
３　クラスタを形成させるステップ
４　クラスタ内のコンティグをアセンブルし、ＳＮＰを検出するステップ
５　ＳＮＰ頻度を検出し、座乗染色体を決定するステップ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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