(57)【要約】【課題】２型豚サーコウイルス特異的抗体を検出するための精製度の高いＥＬＩＳＡ抗原を提供する。【解決手段】組換えバキュロウイルスで発現させ、ニッケルカラムで精製した２型豚サーコウイルスのキャプシドタンパク質であることを特徴とする２型豚サーコウイルス特異的抗体検出用ＥＬＩＳＡ抗原。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えバキュロウイルスで発現させ、ニッケルレジンカラムで精製した２型豚サーコウイルスのキャプシドタンパク質であることを特徴とする２型豚サーコウイルス特異的抗体検出用ＥＬＩＳＡ抗原。
【請求項２】
組換えバキュロウイルスを作製するために用いたバキュロウイルストランスファーベクターがｐＢｌｕｅＢａｃ４．５／Ｖ５−ＨｉｓまたはｐＡｃＹＭ１であることを特徴とする請求項１に記載の２型豚サーコウイルス特異的抗体検出用ＥＬＩＳＡ抗原。
【請求項３】
ニッケルレジンカラムの精製を、変性条件下または非変性条件下で行うことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の２型豚サーコウイルス特異的抗体検出用ＥＬＩＳＡ抗原。
【請求項４】
２型豚サーコウイルスのキャプシドタンパク質を組換えバキュロウイルスで発現させ、発現した２型豚サーコウイルスのキャプシドタンパク質をニッケルレジンカラムで精製することを特徴とする２型豚サーコウイルス特異的抗体検出用ＥＬＩＳＡ抗原の製造方法。
【請求項５】
組換えバキュロウイルスを作製するために用いたバキュロウイルストランスファーベクターがｐＢｌｕｅＢａｃ４．５／Ｖ５−ＨｉｓまたはｐＡｃＹＭ１であることを特徴とする請求項４に記載の２型豚サーコウイルス特異的抗体検出用ＥＬＩＳＡ抗原の製造方法。
【請求項６】
ニッケルレジンカラムの精製を、変性条件下または非変性条件下で行うことを特徴とする請求項４または請求項５に記載の２型豚サーコウイルス特異的抗体検出用ＥＬＩＳＡ抗原の製造方法。
【請求項７】
組換えバキュロウイルスで発現させ、ニッケルレジンカラムで精製した２型豚サーコウイルスのキャプシドタンパク質を抗原として使用することを特徴とする２型豚サーコウイルス特異的抗体検出用ＥＬＩＳＡキット。
【請求項８】
組換えバキュロウイルスを作製するために用いたバキュロウイルストランスファーベクターがｐＢｌｕｅＢａｃ４．５／Ｖ５−ＨｉｓまたはｐＡｃＹＭ１であることを特徴とする請求項７に記載の２型豚サーコウイルス特異的抗体検出用ＥＬＩＳＡキット。
【請求項９】
請求項６または請求項７に記載された２型豚サーコウイルス特異的抗体検出用ＥＬＩＳＡキットを用いて検体中の２型豚サーコウイルス特異的抗体の有無を検出することを特徴とする２型豚サーコウイルス特異的抗体の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、２型豚サーコウイルス特異的抗体検出用のＥＬＩＳＡ抗原、該ＥＬＩＳＡ抗原の製造方法、ＥＬＩＳＡキットおよび２型豚サーコウイルスの検出方法に関し、詳しくは、高い特異性と優れた感度を有する抗体検出用のＥＬＩＳＡ抗原、該ＥＬＩＳＡ抗原の製造方法、ＥＬＩＳＡキットおよび２型豚サーコウイルスの検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
【非特許文献１】Ｗｅｌｌｅｎｂｅｒｇ  Ｇ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｖｅｔ．  Ｑ．  Ｖｏｌ．  ２２  Ｎｏ．  ３  １６７−１７２  （２０００）
【非特許文献２】Ｗａｌｋｅｒ  Ｉ．  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｄｉａｇｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １２  ４００−４０５  （２０００）
【非特許文献３】Ｎａｗａｇｉｔｇｕｌ  Ｐ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｊａｎ．  ３３−４０  （２００２）
【０００３】
豚離乳後全身性消耗症候群（以下「ＰＭＷＳ」と略記する）は、２型豚サーコウイルス（以下「ＰＣＶ２」と略記する）の感染により引き起こされる。ＰＭＷＳ症状の発現はＰＣＶ２の感染だけではなく他の病原体との複合感染、抗体の保有状況、あるいは環境要因に影響され、発症率は低い。しかしながら、発症した場合の死亡率は高く、養豚経営上多大な経済的被害をもたらしている。なお、近縁のウイルスに１型豚サーコウイルス（以下「ＰＣＶ１」と略記する）があるが、豚に対する病原性は無いとされている。
【０００４】
ＰＭＷＳは、移行抗体の消失する離乳後に多発することから、本病の感染防御には液性免疫が有効であることが推測される。このようなことから、本病の発生を予測し対策を立てるためには、抗体の保有率の測定が重要である。
【０００５】
従来、ＰＣＶ２特異的抗体の検出には、ＰＣＶ２感染細胞を抗原とした間接蛍光抗体法、あるいはＩＰＭＡ法（ｉｍｍｕｎｏ  ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ  ｍｏｎｏｌｙａｒ  ａｓｓａｙ）などが用いられてきた（非特許文献１）。しかしながら、これらの方法ではウイルス感染細胞を用いるため特殊な施設と技術が必要であり、また多検体の処理には適していない。このような理由から、ＥＬＩＳＡによる抗体の測定は有効な方法である。しかしながら、抗原の精製度が十分でないことから、これまでは、モノクローナル抗体を用いた競合ＥＬＩＳＡ法や陽性抗原と陰性抗原を用いて測定値の差を求めるような方法が用いられてきた（非特許文献２，非特許文献３）。しかしながら、このような方法はＥＬＩＳＡ法としてはその操作又は成績の解析が煩雑であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、上記のような現在報告されているＥＬＩＳＡの煩雑さを解消するために、高い精製度の抗原を用いたＥＬＩＳＡキット及び該ＥＬＩＳＡキットに用いる抗原を開発することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を進め、上記のような問題を解決できることを見いだし、本究明を完成させた。
【０００８】
第１の問題点は、ＰＣＶ２の培養細胞での抗原産生量が低い点にある。そのため、ＰＣＶ２感染細胞をＥＬＩＳＡ抗原の供給源とした場合、十分な量の抗原を得ることが難しい。本発明では、組換えバキュロウイルスを用いてウイルス抗原を大量に産生させることに特徴がある。なお、当業者にとって、組換えバキュロウイルスに代えて、組換え大腸菌あるいは組換え酵母等の大量発現系を選択することは容易なことである。ＥＬＩＳＡ抗原の候補としては、キャプシドタンパク質とｒｅｐタンパク質が挙げられる。これらのうち、キャプシドタンパク質はウイルス粒子の外側に存在するため、本抗原に対する抗体が豚において形成されやすいことが想定される。一方、ｒｅｐタンパク質内には、１型と２型ウイルス間の共通抗原エピトープが存在することから、２型特異的なＥＬＩＳＡの抗原としては適していないと考えられる。以上のことから本発明では、キャプシドタンパク質をＰＣＶ２特異抗体検出のための抗原とした。組換えバキュロウイルスを用いて発現された抗原は、発現量が高く、その発現量は細胞の全タンパク質の１５％に達した。また、本タンパク質は水溶性であるという特徴を有していた。
【０００９】
第２の問題点は、抗原の精製方法である。本タンパク質の精製法を鋭意比較検討した結果、公知の精製法であるニッケルレジンアフィニティーカラムによる精製法が最も適しているという結論に達した。本カラムによる１回の精製で、精製後のＳＤＳ−ＰＡＧＥのタンパク質染色でほぼ単一のバンドが認められ、この染色像をスキャンして計測したところ、その純度は９３％と算出された。本抗原を固相化したプレートを用いたＥＬＩＳＡでは、感度、特異性ともに優れた性能を示した。
【００１０】
すなわち、本発明は次の通りである。
（１）組換えバキュロウイルスで発現させ、ニッケルレジンカラムで精製した２型豚サーコウイルスのキャプシドタンパク質であることを特徴とする２型豚サーコウイルス特異的抗体検出用のＥＬＩＳＡ抗原。
（２）  ２型豚サーコウイルスのキャプシドタンパク質を組換えバキュロウイルスで発現させ、発現した２型豚サーコウイルスのキャプシドタンパク質をニッケルレジンカラムで精製し、２型豚サーコウイルスの抗原とすることを特徴とする２型豚サーコウイルス特異的抗体検出用ＥＬＩＳＡ抗原の製造方法。
（３）  組換えバキュロウイルスで発現させ、ニッケルレジンカラムで精製した２型豚サーコウイルスのキャプシドタンパク質を抗原として使用することを特徴とする２型豚サーコウイルス特異的抗体検出用ＥＬＩＳＡキット。
（４）  上記２型豚サーコウイルス特異的抗体検出用ＥＬＩＳＡキットを用いて検体中の２型豚サーコウイルス特異的抗体の有無を検出することを特徴とする２型豚サーコウイルス特異的抗体の検出方法。
【００１１】
但し、本発明でいうＥＬＩＳＡキットとは、該抗原を使用したＥＬＩＳＡ抗体検出試薬を指し、必要に応じて標準血清、酵素標識抗体、酵素標識抗体希釈液、血清希釈液、基質発色液、反応停止液および洗浄液などの反応液を添付したものを包含する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明により提供されるＥＬＩＳＡキットの特徴は、ニッケルレジンカラムで精製したＰＣＶ２の発現キャプシドタンパク質を抗原とすることにあり、特に、本ＥＬＩＳＡキットの目的がＰＣＶ２に特異的な抗体を検出することにある。
【００１３】
ＰＣＶ２のウイルス分離は、公知の方法によりＰＭＷＳ発症豚のリンパ組織乳剤を豚腎由来の樹立細胞に接種することにより実施可能である。豚腎由来細胞としては、たとえばＰＫ１５細胞を用いることが出来る。分離ウイルスがＰＣＶ２であることの証明には、たとえば、既知の免疫血清との反応性を調べる方法、部分的に塩基配列を決定して既知のＰＣＶ２の配列と比較する方法等がある。
【００１４】
キャプシドタンパク質遺伝子のクローニングは、定法に従い実施可能である。すなわち、既知の塩基配列（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ等から入手可能）よりプライマーを設計し、ＰＣＲ法により増幅して適当なバキュロウイルストランスファーベクターに組み込むことにより得られる。
【００１５】
本発明におけるバキュロウイルストランスファーベクターとは、組換えバキュロウイルス作製のために用いられるベクターである。通常、バキュロウイルスのポリヘロリン遺伝子のプロモーター部分を有し、その下流に外来遺伝子挿入部位を導入したプラスミドが用いられる。また、同様の目的でポリヘドリンプロモーターに換えて、Ｐ１０プロモーターやＢａｓｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎプロモーターを使用することも知られており、これらのプロモーターを有するバキュロウイルストランスファーベクターを用いて組換えバキュロウイルスを作出することも可能である。これらのバキュロウイルストランスファーベクターには必要に応じて組換えバキュロウイルスの選択を容易にするために、例えば、β−ガラクトシダーゼ発現単位等のマーカー遺伝子が付加される場合がある。
【００１６】
本発明の発現タンパク質遺伝子の構築に際し、該タンパク質に連続した６残基のヒスチジンが付加されるように構築する。この目的のためには６残基のヒスチジンが、発現を目的とするタンパク質に付加されるバキュロウイルストランスファーベクターを選択し、使用するか、あるいは該タンパク質の遺伝子を増幅するための合成ＤＮＡプライマーにヒスチジンヘキサマーに相当する配列を付加して目的遺伝子を増幅させることが必要である。上記のように構築した目的遺伝子断片をバキュロウイルストランスファーベクター、例えばｐＢｌｕｅＢａｃ４．５／Ｖ５−ＨｉｓやｐＡｃＹＭ１等の外来遺伝子挿入部位に挿入する。しかし本発明は、その好適な例として上述したバキュロウイルストランスファーベクターであるｐＢｌｕｅＢａｃ４．５／Ｖ５−ＨｉｓやｐＡｃＹＭ１により作製された組換えバキュロウイルスによるＰＣＶ２キャプシドタンパク質の発現に限定されるものではなく、該タンパク質を大量に発現するという目的を達成するバキュロウイルストランスファーベクターであれば何れのトランスファーベクターでも本発明を成し得る。
【００１７】
組換えバキュロウイルスは、定法に従い作出可能である（Ｍａｔｓｕｕｒａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  ６８，  ５，  １２３３−１２５０  （１９８７））。すなわち、上記の目的遺伝子断片を挿入したバキュロウイルストランスファーベクターを、野生型バキュロウイルスＤＮＡあるいは組換えバキュロウイルスの選択の効率を上げるために改変され、制限酵素による消化により直鎖状としたバキュロウイルスＤＮＡと共にバキュロウイルスの宿主細胞である昆虫細胞に導入し、細胞内で生成し細胞外に放出された組換えバキュロウイルスをプラッククローニング法により選択する。
【００１８】
バキュロウイルスの一種であるＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓを母体とした組換えウイルスの場合、ＭＯＩ≒１０でウイルスを宿主昆虫細胞、例えばＳｆ２１ＡＥ細胞やＳｆ９細胞に接種すると、感染後２〜５日で発現タンパク質が昆虫細胞内に蓄積し、これを回収することが可能となる。
【００１９】
本発明は、発現した２型豚サーコウイルスのキャプシドタンパク質をニッケルレジンカラムで精製して、２型豚サーコウイルス特異的抗体検出用ＥＬＩＳＡ抗原とすることを特徴とする。
【００２０】
本発明で用いられるニッケルレジンカラムとは、ニッケルイオン捕獲能を特徴とする支持体（レジン）に該イオンを捕獲させ、適当な容器に充填して作製したカラムである。目的の発現タンパク質に付加した連続した６残基のヒスチジンは、適当な条件下でカラム上のニッケルイオンと結合する。ニッケルカラムを用いたタンパク質の精製はこの性質を利用したものである。なお、ニッケルレジンカラムとしては、公知のニッケルレジンカラム（例えば、ＰｒｏＢｏｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））を用いることができる
ニッケルレジンカラムを用いた精製は、大別して２つに分けられる。一つは、変性条件下での精製法である。変性条件下での精製では、通常６Ｍ塩酸グアニジン溶液または８Ｍ尿素溶液で抗原を可溶化する。この場合には、ヒスチジンタグを付加された発現タンパクは、ｐＨ８．０付近の緩衝液を用いてカラムに結合させ、ｐＨ４．０付近の緩衝液で溶出させることができる。溶出前に、目的のタンパク質が溶出しない最も低いｐＨでカラムを洗浄することにより該カラムに非特異的に結合したタンパク質を除去すると精製度が高まり有利である。
【００２１】
もう一つの精製方法は非変性条件下での精製法である。この方法を用いるためには、発現タンパクが変性剤を加えなくても可溶化されることが条件となる。非変性条件下での精製では、ヒスチジンと似た構造を持つイミダゾールの濃度を上げることによりヒスチジンとカラムの間の結合を競合的に阻害してタンパク質を溶出させることができる。この場合にも、溶出前に目的のタンパク質が溶出しない最大濃度のイミダゾールで洗浄し、該カラムに非特異的に結合したタンパク質を除去すると精製度が高まり有利である。
【００２２】
本発明のバキュロウイルス発現キャプシドタンパク質は、変性剤を加えないバッファーで溶解することが出来るため基本的に、変性条件下および非変性条件下のいずれでも精製可能である。両方の方法で精製を試みた結果、変性条件においてより精製度の高いタンパク質を得ることが出来た。
【００２３】
本発明の２型豚サーコウイルス特異的抗体検出用ＥＬＩＳＡキットを調製するには、上記のように調整した２型豚サーコウイルス特異的抗体検出用ＥＬＩＳＡ抗原をＥＬＩＳＡ用プレートに吸着させればよい。抗原をＥＬＩＳＡ用プレートに吸着させる方法としては、至適濃度に調整した抗原溶液をＥＬＩＳＡ用プレートに分注し、４℃で一晩静置することにより吸着させる方法、分注した液を凍結乾燥させる方法等がある。一般に凍結乾燥により抗原を吸着させ、水分が通過しないような袋、例えばアルミ蒸着袋等に乾燥剤とともに封入して保存した場合に抗原の安定性が高く、かつ、簡便な使用が可能である。
【００２４】
本発明の２型豚サーコウイルス特異的抗体検出用ＥＬＩＳＡキットを用いて、２型豚サーコウイルス特異的抗体を検出するには、通常のＥＬＩＳＡの術式に従えばよい。本発明の該ＥＬＩＳＡキットの特徴は、抗原の精製度が高く非特異反応がおこりにくいために、陰性抗原対照等を置く必要がなく、最も単純なＥＬＩＳＡの術式により特異的抗体の検出及び測定が可能な事である。さらに、抗原の精製度が高いため、より多量の抗原を用いることによるＥＬＩＳＡキットの高感度化が可能である。以下に、ＥＬＩＳＡ法の概略の一例を示すが、これにより本ＥＬＩＳＡキットの形態及び使用法が制限されるものではない。
【００２５】
１．ＥＬＩＳＡプレートのブロッキング
ＥＬＩＳＡプレートの表面は、タンパク質が吸着しやすい構造をしている。そのため、特異抗原を吸着後にプレート表面にタンパク質が吸着していない領域があると、その後の反応において、被験血清中のイムノグロブリン（以下「Ｉｇ」と略記する）がその部位に結合してしまう危険がある。このことは、非特異反応の原因となるため、そのような部位をあらかじめ塞いでおく、すなわちブロッキングの操作を行う必要がある。このような目的のために、１〜５％程度の牛血清アルブミン、ゼラチン、スキムミルク等が用いられる。反応条件としては、例えば３７℃で１時間程度で実施される。
【００２６】
２．被験血清の反応
被験血清を血清希釈液で希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに添加する。希釈率は、１０倍から１０００倍程度である。これよりも低い希釈率では、非特異反応が問題となり、これよりも高い希釈率では、感度が問題となる。多くの場合、５０〜２００倍程度が望ましい希釈率となる。
抗体の力価を測定する場合には、上記の希釈からさらに被験血清を希釈し、血清希釈列を作る。通常２倍階段希釈列を作る。
希釈被検血清を添加した後の反応条件は様々だが、例えば３７℃で１時間とする。
【００２７】
３．酵素標識タンパク質の反応
プレートを洗浄後、酵素で標識した豚Ｉｇと特異的に反応するタンパク質を加える。タンパク質としては、抗豚Ｉｇ抗体やプロテインＡ等が、標識酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリ性フォスファターゼ等が用いられる。
酵素標識タンパク質を添加した後の反応条件は様々だが、例えば３７℃で１時間とする。
【００２８】
４．発色
プレートを洗浄後、３で用いた酵素に対応する基質発色液を加え、酵素反応を利用して発色させる。
【００２９】
５．反応の測定と判定
基質発色液に応じた波長で吸光度（以下「ＯＤ値」と記載する）を測定し、記録する。
【００３０】
判定方法は、以下のように大別して２つ考えられる。
【００３１】
１）絶対ＯＤ値による判定
被験血清のＯＤ値が、ある一定の値を越えた場合を陽性とする。この一定の値の設定には、例えば充分な数の陰性血清を測定しその平均値＋標準偏差の３倍の値を用いることを一つの例としてあげることができる。ここでいう、陰性血清とは他の測定方法でＰＣＶ２に対する抗体が陰性であることが確認されている血清のことである。
希釈列を作って測定を行なった場合には、この基準値を越えるＯＤ値を示した最大希釈倍数の逆数を抗体価とすることができる。
【００３２】
２）相対ＯＤ値による判定
常に同じ血清を標準血清として、測定を行い、被験血清のＯＤ値と標準血清のＯＤ値の比により判定を行なう。この比が、一定の値を越えたとき陽性とする。この比の値の設定には、例えば充分な数の陰性血清の標準血清に対する比を求め、その平均値＋標準偏差の３倍の値を用いることを一つの例としてあげることができる。
【００３３】
被検血清の希釈列を作って測定を行なった場合には、この基準値を越える比を示した最大希釈倍数の逆数を抗体価とすることができる。
以上のようにして、抗ＰＣＶ２特異的抗体価の測定が可能となる。
【００３４】
以下、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３５】
【実施例】
【００３６】
＜実施例１＞  ＰＣＶ２の分離
（１）ＰＭＷＳ発症豚のリンパ組織乳剤の調製
ＰＭＷＳ発症豚のリンパ組織（脾臓、腸間膜リンパ節および鼠径リンパ節）を乳鉢ですりつぶし、ＰＢＳに浮遊して１０％に調製した。臓器浮遊液を高速遠心した上清を０．４５μｍのフィルターで濾過し、さらにクロロホルム処理したものを１０％リンパ組織乳剤とした。
【００３７】
（２）ウイルス分離
豚サーコウイルス１型および２型陰性の豚腎初代細胞を３０代程度継代して試験に供した。単層を形成した豚腎細胞に上記乳剤を培養液でさらに１０倍に希釈して接種した。ウイルス接種後、接種液を除去し、ＰＢＳで１回細胞洗浄して３００ｍＭグルコサミンで細胞を処理した（Ｔｉｓｃｈｅｒ，  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｒｃｈ．  Ｖｉｒｏｌ．  ９６  （１−２）  ３９−５７  （１９８７））。その後、細胞維持用培地に置換して３日間培養した。
【００３８】
３日目に細胞を消化し、継代した。培養３日目にグルコサミン処理をし、５日目に継代した。
【００３９】
３代目以降は、グルコサミン処理を行なわず、継代し持続感染細胞を樹立した。
【００４０】
＜実施例２＞  キャプシドタンパク質遺伝子の発現
キャプシドタンパク質遺伝子の５’末端および３’末端に下記のプライマー（配列番号１、配列番号２）を設計し、持続感染死亡から抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によりキャプシドタンパク質遺伝子を増幅した。ＰＣＲ産物をバキュロウイルストランスファーベクターｐＢｌｕｅＢａｃ４．５／Ｖ５−Ｈｉｓ  （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入した。定法に従い、組換えバキュロウイルスを得た。
組換えウイルスをＭＯＩ≒１０でＳｆ２１ＡＥ細胞に接種し、キャプシドタンパク質の発現を継時的に追った。４８時間から、約３０キロダルトンのタンパク質の発現が認められ、９６時間でその発現量がプラトーとなったことから４日目に回収した。キャプシドタンパク質の発現を示す電気泳動写真を図１に示した。
【００４１】
５’−ＰＣＲプライマー：ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＴＡＴ  ＣＣＡ  ＡＧＧ  ＡＧＧ  ＣＧ
３’−ＰＣＲプライマー：ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＡＡＧ  ＴＧＧ  ＧＧＧ  ＧＴＣ  ＴＴＴ
【００４２】
＜実施例２＞キャプシドタンパク質の精製
キャプシドタンパク質の精製は、ＰｒｏＢｏｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、添付のマニュアルに従って実施した。ウイルス感染細胞を軽遠心により回収し、１ｘ１０８個の細胞を得た。これに、８ｍｌのグアニジン緩衝液（６Ｍ  Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ  ＨＣｌ，  ２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ  ７．８，  ５００ｍＭ  ＮａＣｌ）を加えて可溶化し、１８ゲージの注射針を通した。
【００４３】
発現タンパク質の精製は、いわゆるバッチ法で行った。以下にその方法を詳述する。レジン浮遊液４ｍｌを量り取り１０ｍｌ容量のカラム容器に充填した。上清を除去後６ｍｌの滅菌蒸留水を加えて転倒撹拌し、混和した。軽遠心によりレジンを落とした後、上清を除去した。変性結合緩衝液（８Ｍ  Ｕｒｅａ，  ２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ  ７．８，  ５００ｍＭ  ＮａＣｌ）６ｍｌを加えて転倒撹拌後、軽遠心をし、上清を除去した。これを２回繰り返し緩衝液の置換を行なった。
【００４４】
サンプル８ｍｌをカラムに加え、室温で３０分間転倒撹拌してキャプシドタンパク質をカラムに結合させた。遠心して、レジンを沈殿させた後、サンプルを除去した。
【００４５】
４ｍｌの変性結合緩衝液（８Ｍ  Ｕｒｅａ，  ２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ  ７．８，  ５００ｍＭ  ＮａＣｌ）加えて２分間撹拌した後、軽遠心をし、上清を除去した。これを、２回繰り返した。
【００４６】
４ｍｌの変性洗浄液（８Ｍ  Ｕｒｅａ，  ２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ  ６．０，  ５００ｍＭ  ＮａＣｌ）加えて２分間撹拌した後、軽遠心をし、上清を除去した。これを、２回繰り返した。
【００４７】
４ｍｌの変性洗浄液（８Ｍ  Ｕｒｅａ，  ２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ  ５．３，  ５００ｍＭ  ＮａＣｌ）加えて２分間撹拌した後、軽遠心をし、上清を除去した。これを、２回繰り返した。
【００４８】
５ｍｌの変性溶出液（８Ｍ  Ｕｒｅａ，  ２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ  ４．０，  ５００ｍＭ  ＮａＣｌ）を加え、重力により滴下させて、約１．２ｍｌずつ分画を採取した。
【００４９】
電気泳動（図２参照）により、４つの分画を確認した後、プールしてトリス緩衝液（１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０，  ０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）での透析により緩衝液の置換を行い、同時に変性剤を除去した。
【００５０】
変性剤の除去後も、タンパク質の沈殿が殆ど認められなかった。
【００５１】
図２に示したように１回のカラム精製で非常に純度の高いキャプシドタンパク質を得た。電気泳動したゲルの染色度から純度は９３％と算出された。
【００５２】
＜実施例３＞ＥＬＩＳＡプレートの作製と陰性限界の設定
精製キャプシドタンパク質を５０  ｍＭ炭酸重炭酸バッファー（ｐＨ  ９．６）で希釈し、４８０ｎｇ  ／穴となるようにＥＬＩＳＡ用プレートに分注した。４℃で１晩静置して抗原をプレートに吸着させた。
【００５３】
ＰＣＶ２陰性の豚群から採取した血清５０例についてＥＬＩＳＡを実施した。被験血清を５％スキムミルク入りＰＢＳで１００倍希釈し、１穴当り１００μｌ入れて３７℃で６０分間反応させた。プレートを洗浄後、濃度調製した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗豚イムノグロブリンを１００μｌ／穴入れて３７℃で６０分間反応させた。プレートを洗浄後、基質発色液である過酸化水素添加ＯＰＤ溶液を１００μｌ／穴で分注し室温で３０分間反応させた。反応終了後、硫酸溶液を添加して反応を停止させ４９０ｎｍの波長で吸光度を測定した。吸光度の平均値は０．０３８、標準偏差は０．０２０であったことから平均値＋標準偏差ｘ３を算出して吸光度値０．１を陰性限界とし、０．１を越える吸光度値を示す検体を陽性とすることとした。
【００５４】
＜実施例４＞本ＥＬＩＳＡのＰＣＶ２に対する特異性
各種豚免疫血清について、本ＥＬＩＳＡで測定した。表１に示すように抗ＰＣＶ２免疫血清のみで陽性反応が認められたことから、ＰＣＶ２に対する特異性が確認された。
【００５５】
【表１】
2004250385.tif 000002
【００５６】
＜実施例５＞本ＥＬＩＳＡのＩＰＭＡ抗体価との相関性
野外血清１０２例について、本ＥＬＩＳＡキットとＩＰＭＡ法で抗ＰＣＶ２抗体を検出し、その一致率を調べた。両者の間の一致率は８９．２％であり、高い相関性が認められた。
【００５７】
【表２】
2004250385.tif 000003
【００５８】
【発明の効果】
本発明の２型豚サーコウイルス特異的抗体検出用ＥＬＩＳＡ抗原及びそれを用いたＥＬＩＳＡキットは、感度、特異性ともに高く、多検体処理が可能な抗ＰＣＶ２抗体の検出方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】２型豚サーコウイルスのキャプシドタンパク質の発現を示す電気泳動写真。
【図２】２型豚サーコウイルスのキャプシドタンパク質の精製を示す電気泳動写真。
【配列表】
2004250385.tif 000004
【図１】
2004250385.tif 000005
【図２】
2004250385.tif 000006