(57)【要約】【課題】スイゼンジノリの純粋培養技術の提供。【解決手段】スイゼンジノリ藻体を、金属元素として少なくともＣａ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｍｎ　及びＺｎを下記に示す重量比Ｃａ　　　　　　　　　　　　　１Ｃｕ　　　　　　　　　　　　　０．０００２５〜０．０００４９Ｆｅ　　　　　　　　　　　　　０．０１７〜０．０６８Ｍｇ　　　　　　　　　　　　　０．１６０〜０．３１３Ｍｎ　　　　　　　　　　　　　０．０６０Ｚｎ　　　　　　　　　　　　　０．００１２で含有し、且つ硫酸イオンを５．８ｍｇ／Ｌ〜１１．７ｍｇ／Ｌの濃度で、硝酸イオンを２．８ｍｇ／Ｌ〜５６．５ｍｇ／Ｌの濃度でそしてリン酸イオンを１．４ｍｇ／Ｌ〜２８．６ｍｇ／Ｌの濃度で含有する淡水性藻類培養培地で培養することを特徴とするＡｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ　ｓａｃｒｕｍの純粋培養方法。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スイゼンジノリ藻体を、金属元素として少なくともＣａ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｍｎ　及びＺｎを下記に示す重量比
Ｃａ　　　　　　　　　　　　　１
Ｃｕ　　　　　　　　　　　　　０．０００２５〜０．０００４９
Ｆｅ　　　　　　　　　　　　　０．０１７〜０．０６８
Ｍｇ　　　　　　　　　　　　　０．１６０〜０．３１３
Ｍｎ　　　　　　　　　　　　　０．０６０
Ｚｎ　　　　　　　　　　　　　０．００１２
で含有し、且つ硫酸イオンを５．８ｍｇ／Ｌ〜１１．７ｍｇ／Ｌの濃度で、硝酸イオンを２．８ｍｇ／Ｌ〜５６．５ｍｇ／Ｌの濃度でそしてリン酸イオンを１．４ｍｇ／Ｌ〜２８．６ｍｇ／Ｌの濃度で含有する淡水性藻類培養培地で培養することを特徴とするＡｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ　ｓａｃｒｕｍの純粋培養方法。
【請求項２】
Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ　ｓａｃｒｕｍの純粋培養物。
【請求項３】
配列表の配列番号１及び２に示すＡｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ　ｓａｃｒｕｍのフェレドキシン遺伝子の部分塩基配列。
【請求項４】
配列表の配列番号３に示すＡｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ　ｓａｃｒｕｍの１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は食用の淡水性ラン藻であるスイゼンジノリの純粋培養技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
淡水性の藻類を自然界から単離・純化する場合、目的の藻類の栄養要求性や他の細かな生育条件（例えば、水温、光等）を検討しなければならない。しかし、実際は目的とする藻類の栄養要求性や他の細かな生育条件を単離する前に検討することは難しく、目的の藻類を特異的に単離・純化することはできなかった。現在までに単離・純化された藻類の多くは、淡水藻類を培養するために考案された既存の培地（例えばＢＧ−１１、ＭＡ、ＭＤＭ、ＣＴ等）及び培養条件下で生育してきた藻類を積極的に選択して得られたものであり、目的とする藻類がある場合にその藻類が既存の培地及び培養条件で必ずしも得られるとは限らない。
【０００３】
例えば、食用の淡水性ラン藻スイゼンジノリは阿蘇山水系の湧水という限られた環境でしか生育できない特殊なラン藻であり、水質の悪化などにより絶滅の危機に瀕している。現在までに多くの研究者が淡水性藻類のための既存の培地（例えばＢＧ−１１、ＭＡ、ＭＤＭ、ＣＴ等）及び培養条件で単離及び純粋培養を試みたがいずれも成功には至っていない。
【０００４】
スイゼンジノリ（Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ　ｓａｃｒｕｍ）は淡水性の単細胞性ラン藻（シアノバクテリア）で、日本固有の種として知られている。Ａ．　ｓａｃｒｕｍはこの種に独特の不規則に広がった葉状体（ｓｔｒａｔｕｍ）を形成し、大きいものでは長さが１０ｃｍ以上にも達する。日本ではこの葉状体を古くから食用として利用しており、Ａ．　ｓａｃｒｕｍは天然記念物にも指定された貴重な淡水藻である。しかし、この淡水藻は阿蘇山水系の清らかな湧水でのみ生育可能で、自生地では水質の悪化に伴って絶滅してしまい、現在では福岡県甘木市で養殖されるのみとなっている。この貴重な淡水藻を保護する目的で、繁殖させるための地道な努力が払われているが、絶滅の危機を脱することができておらず、将来にわたって養殖が継続できるか疑問視される。
【０００５】
Ａ．　ｓａｃｒｕｍの存在は、Ｗ．　Ｆ．　Ｒ．　ＳｕｒｉｎｇａｒによるＩｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ　ｄｅｓ　Ａｌｇｕｓ　ｄｕ　Ｊａｐｏｎ（１８７２）中でＰｈｙｌｌｏｄｅｒｍａ　ｓａｃｒｕｍとして初めて世界に紹介された。しかし、その後岡田喜一（１９５３）によりＡｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ属に移されている。Ａ．　ｓａｃｒｕｍ藻体から抽出されたフェレドキシンに関する一連の研究（Ｗａｄａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９７４、Ｈａｓｅ　ｅｔａｌ．，１９７５、１９７６，１９７８）は、ラン藻の系統分類学的研究においてＡ．　ｓａｃｒｕｍが特殊な位置にあることを示した（Ｗｉｌｍｏｔｔｅ　１９９４）。しかし、Ａ．　ｓａｃｒｕｍが日本の限られた地域でしか生育できず、未だに純粋培養に成功していないことによって、その後の遺伝学的な研究並びに生理学的研究が妨げられてきた。
【０００６】
Ａ．　ｓａｃｒｕｍを純粋培養しようとする試みは、現在までに多くの研究者によってなされてきたが、それらの試みはいずれも成功には至っていない。例えば、本発明者らは以前ラン藻での培養に汎用されているＢＧ−１１培地を用いてスイゼンジノリから単細胞性のラン藻を単離し、ＫｕＸとして特許出願（特願平８−１９１６０５号）したが、その後の解析の結果、このラン藻はＡ．　ｓａｃｒｕｍではないことが判明した。その理由としては、Ａ．　ｓａｃｒｕｍが特殊な栄養要求性を有するラン藻であり、今日までに開発された淡水性藻類の培地、例えばＢＧ−１１、ＭＤＭ、ＭＡ、ＣＴ等では生育しないかもしくは生育したとしても夾雑するバクテリア及び他の藻類の生育が早く、Ａ．　ｓａｃｒｕｍの生育が妨げられ、その結果として、Ａ．　ｓａｃｒｕｍを単離することができなかったものと思われる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、特殊環境に生育する淡水性藻類を単離・純粋培養するためのオーダーメイドにより調製された培地を用いてスイゼンジノリを単離・純粋培養することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、Ａ．　ｓａｃｒｕｍ藻体に含まれる金属元素に着目し、そのうちの少なくともＣａ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｍｎ　及びＺｎの灰分当たりの重量比に基づいて基本培地を構築し、Ａ．　ｓａｃｒｕｍ細胞の生育に対する影響を考慮しながら各金属イオン及びその他の成分の量比を調整した結果、今回、Ａ．　ｓａｃｒｕｍの生育に適した培地（ＡＳＴ）を見出し、これを用いてＡ．　ｓａｃｒｕｍ細胞を純粋培養し単離することに成功した。
【０００９】
かくして、本発明によれば、スイゼンジノリ藻体を、金属元素としてＣａ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｍｎ　及びＺｎを下記に示す重量比
Ｃａ　　　　　　　　　　　　　１
Ｃｕ　　　　　　　　　　　　　０．０００２５〜０．０００４９
Ｆｅ　　　　　　　　　　　　　０．０１７〜０．０６８
Ｍｇ　　　　　　　　　　　　　０．１６０〜０．３１３
Ｍｎ　　　　　　　　　　　　　０．０６０
Ｚｎ　　　　　　　　　　　　　０．００１２
で含有し、且つ硫酸イオンを　５．８ｍｇ／Ｌ〜１１．７ｍｇ／Ｌの濃度で、硝酸イオンを　２．８ｍｇ／Ｌ〜５６．５ｍｇ／Ｌ　の濃度でそしてリン酸イオンを　１．４ｍｇ／Ｌ〜２８．６ｍｇ／Ｌの濃度で含有する淡水性藻類培養培地で培養することを特徴とするＡｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ　ｓａｃｒｕｍの純粋培養方法が提供される。
【００１０】
以下、本発明により提供される特殊な栄養要求性を示すラン藻Ａ．　ｓａｃｒｕｍの単離・純粋培養についてさらに詳細に説明する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、スイゼンジノリ藻体に含まれる金属元素に着目し、スイゼンジノリ藻体に含まれる金属元素のうちの少なくともＣａ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｍｎ　及びＺｎの灰分当たりの重量比に基づいて基本培地を構築し、Ａ．　ｓａｃｒｕｍ細胞の生育に対する影響を考慮しながら各金属イオン及びその他の成分の量比を調整し、Ａ．　ｓａｃｒｕｍの生育に適した培地（以下　ＡＳＴ　培地という）を調製した。
【００１２】
このＡＳＴ培地を用いて、福岡県甘木市で養殖された藻体から単細胞性のラン藻細胞を単離・純粋培養することに成功した。この単細胞性ラン藻がＡ．　ｓａｃｒｕｍであることを確認するために同定されている２種類のフェレドキシンのおのおののアミノ酸配列をもとに設計した遺伝子増幅のためのオリゴヌクレオチド（ＰＣＲプライマー）を用いてフェレドキシン遺伝子を単離し、その配列を決定することにより単離・純粋培養したラン藻がＡ．　ｓａｃｒｕｍであると同定した。
【００１３】
Ａ．　ｓａｃｒｕｍ　の純粋培養及び同定の手順を、以下、実施例によりさらに具体的に説明する。
【００１４】
【実施例】
実施例１：基本培地の調製
スイゼンジノリの乾燥藻体に含まれる灰分当たりの金属元素量については、既に報告されている（食総研報　技術報告３７：１６３〜１７３、１９８０）。この報告をもとに、Ｃａ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｚｎの各金属元素に関してはＣａの含有量を１（約２０ｍｇ／Ｌ：甘木のスイゼンジノリ養殖黄金川のＣａ濃度に等しい）としてその比が灰分当たり量比（後記表５参照）と等しくなるようにし、Ｆｅについては溶解性を考慮して沈殿が生じない濃度でＣａに対する比に近い値とした。また、藻類の培地に汎用されている金属塩を利用して添加し、Ｎａ、Ｋに関しては、細胞内に能動的に取込・排泄されることを考慮してＣａに対する比を重要視せずＮＯ３−、ＣＯ３２−−、ＰＯ４３−を金属塩として加えるための金属イオンとして培地の基本組成を構築した。さらに、藻類の培養に必要とされるＢ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｓｅ、Ｍｏ等の微量元素を他の藻類用培地にふくまれる量で加えて基本培地とした（ＡＳ−Ｉ培地）。
【００１５】
福岡県甘木市で養殖されたスイゼンジノリ藻体（長径約２〜４ｃｍ）を約５ｍｍ角の小塊（湿重量０．３１ｇ）とし、５　ｍＬの基本培地ＡＳ−Ｉ培地を含むプラスチック製のペトリディシュ（ファルコン）に植え付け、光照射（約２５０　ｌｕｘ）下、２５±２℃で藻体の生育を観察した。１ヶ月後、藻体中に細胞は存在していたが、藻体の湿重量はほとんど変化していなかった（０．３８　ｇ）。そこで、Ｃａ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｍｎ　及びＺｎ　の比を変えずにＡＳ−Ｉ培地を構成する成分の量比を変更し、スイゼンジノリ細胞の生育に対する影響を調べた。
【００１６】
Ｍｇとして加えている硫酸化塩の半量を塩化塩とした培地（ＡＳ−ＩＩ培地）、硫酸マグネシウムの半量を塩化マグネシウムに換え、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩等の量を２倍とした培地（ＡＳ−ＩＩＩ培地）、Ｍｇ、Ｃａ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｃｕ及びＣｏの量を半量とした培地（ＡＳ−ＩＶ培地）を調製した（下記表１参照）。これらの培地１００ｍＬを３００ｍＬ用三角フラスコにスイゼンジノリ藻体（約５ｍｍ角の小塊：湿重量約０．５ｇ）を入れ光照射（約２５０　ｌｕｘ）下、２５±２℃でゆっくりと振盪（５０ｒｐｍ）させながら８日間インキュベートして藻体の生育を比較した。藻体の生育状態を表２に示す。
【００１７】
【表１】
2004081022.tif 000002
【００１８】
【表２】
2004081022.tif 000003
【００１９】
上記の結果から、４種の培地の中ではＡＳ−ＩＩ培地がスイゼンジノリ細胞の生育にもっとも適しており、硫酸イオンがスイゼンジノリ細胞の生育に影響していること、並びに硝酸イオン、リン酸イオン量が多いほど夾雑するバクテリアの生育が著しいことが示唆された。また、ＡＳ−ＩＶ培地でも生育が認められることから、ＡＳ−ＩＶ培地での結果を加味してＡＳ−ＩＩ培地のＣａ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｍｎ　及びＺｎの量比をさらに調整した。
【００２０】
硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸銅及び酒石酸鉄の量を半量とした培地（ＡＳ−１／２ＭＦ）、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム及び硫酸銅の量を半量とし、さらに酒石酸鉄の量を１／４とした培地（ＡＳ−１／２Ｍ１／４Ｆ）を調製した（下記表３参照）。これらの培地１００ｍＬを３００ｍＬ用三角フラスコにスイゼンジノリ藻体（約５ｍｍ角の小塊：湿重量約０．５　ｇ）を入れ光照射（約２５０　ｌｕｘ）下、２５±２℃でゆっくりと振盪（５０ｒｐｍ）させながら８日間インキュベートして藻体の生育を比較した。藻体の生育状態を表４に示す。
【００２１】
【表３】
2004081022.tif 000004
【００２２】
【表４】
2004081022.tif 000005
【００２３】
上記結果から、ＡＳ−ＩＩ培地の硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム及び硫酸銅の量を１／２としてさらに酒石酸鉄の量を１／４としたＡＳ−１／２Ｍ１／４Ｆ培地がスイゼンジノリ藻体の生育に適していることが示唆された。
【００２４】
スイゼンジノリ藻体の生育が観察され、真核藻類の著しい生育が見られなかったＡＳ−ＩＩ　培地、ＡＳ−１／２Ｍ１／４Ｆ培地と自然状態のスイゼンジノリにおけるＣａの含有量を１　としたときの　Ｃａ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｚｎの重量比は表５のとおりであり、実質的に等しい比率であった。
【００２５】
【表５】
2004081022.tif 000006
【００２６】
スイゼンジノリ藻体の生育率の良かったＡＳ−１／２Ｍ１／４Ｆ培地をＡＳＴ培地と命名し、Ａ．　ｓａｃｒｕｍ純粋培養のための培地とした。
実施例２：Ａ．　ｓａｃｒｕｍ　の単離
原料のスイゼンジノリ（Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ　ｓａｃｒｕｍ　）は福岡県甘木市の遠藤金川堂のものを用いる。この藻体（約１．５ｇ）を無菌水でよく洗浄後、無菌水１００ｍｌと共に、Ａｃｅ　ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ　ＡＭ−９（Ｎｉｈｏｎｓｅｉｋｉ　Ｋａｉｓｈａ）で細かくすりつぶし、Ｇ１ガラスろ過器（細孔の大きさ：１００〜１２０μｍ）に通した。ヘマサイトメーターに一部をとり、顕微鏡で観察してスイゼンジノリの細胞が１つずつ分かれていることを確認すると共に細胞数を測定し、この菌数をもとに殺菌済みＡＳＴ液体培地５ｍｌ入った試験管に１個ずつ細胞が植菌できるように希釈、植菌し、２５℃、５，０００ｌｕｘ蛍光灯下で約１ヶ月間培養した。２１００本のサンプルを作成したうち、約７割の試験管にスイゼンジノリと思われる細胞が認められた。
【００２７】
これら増殖の認められた試験管のサンプルを用い、ポリペプトン（０．１％）と酵母抽出物（０．１％）を含む有機物入りＡＳＴ培地に増殖の認められた試験管から０．１ｍｌずつ植菌した。もし、従属栄養細菌がコンタミネーションしていたら、２〜３日でこれらの試験管は白濁する。約１０日たっても白濁しないサンプルの試験管を第１次純粋スイゼンジノリと考え、同様な操作を最低２回行なったのち、残った試験管（１本）から株分けを２回行なった。最終的に４本の試験管を用い、従属栄養細菌の混在のテストを行ない、白濁しないサンプルを選抜した。
【００２８】
以上の処理を行った藻体約　４〜５ｇ　に　ＡＳＴ　培地を　３０ｍｌ　加え、ホモジェナイザーで細かくすりつぶした。これを　Ｇ２ガラスろ過器（細孔の大きさ：４０〜５０μｍ）に通した後に容量　５０ｍｌ　のスクリューキャップのチューブに移し、遠心機（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ　０５Ｐ−２１、Ｈｉｔａｃｈｉ）で遠心分離して沈殿を回収した。この沈殿を容量　２ｍｌのマイクロチューブに移し、ソニケーター（ＳｏｎｉｃａｔｏｒＴＭ　Ｗ−２２０、Ｈｅａｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ−　Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ）を用いて超音波処理し、卓上遠心機（ＭＴＸ−１５０、ローター：ＴＭＡ−Ｓ２６、ＴＯＭＹ）で遠心分離して細胞のみの沈殿を回収した。沈殿を　ＡＳＴ　培地にとかし、ヨードキサノールの濃度で４０〜４５％　の　ＯｐｔｉＰｒｅｐＴＭ　（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ）の密度勾配に重層し、超遠心機（７０Ｐ−７２、ローター：ＳＲＰ２８ＳＡ−１６５、Ｈｉｔａｃｈｉ）で　２５，０００ｒｐｍ、２時間超遠心した。中心付近に見られた細胞層をマイクロチューブに回収し、等量〜９倍量の　ＡＳＴ　培地を加え、卓上遠心機で遠心分離して細胞のみの沈殿を回収した。沈殿を適当量の　ＡＳＴ　培地にとかし、ヘマサイトメーターに一部をとり、顕微鏡で観察してスイゼンジノリの細胞が１つずつ分かれていることを確認すると共に細胞数を測定し、この菌数をもとに　０．６％　のアガロースを含むＡＳＴ培地のプレートに１６，０００個の細胞をまき、２５〜２７℃、２，０００〜３，０００ｌｕｘの蛍光灯下で約１ヶ月間培養した。
【００２９】
形成されたコロニーの内、付近にコンタミネーションのコロニーが観察されなかったコロニーを選択し、その中から　ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ　ＢａｃＬｉｇｈｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ）で染色して蛍光顕微鏡で観察したときに細胞間にコンタミネーションのシグナルが見られなかったクローンを選抜した。
【００３０】
このクローン化された藻体を先の有機物入りＡＳＴ培地の他、ＡＳＴ　培地に牛肉抽出物（０．３％）とペプトン（０．５％）を加えた培地（Ｂ−ＩＩＩ　ｍｅｄｉｕｍ）、ＡＳＴ　培地に酢酸ナトリウム（０．０５％）、グルコース（０．０５％）、トリプトン（０．０５％）、酵母抽出物（０．０３％）を加えた培地（Ｂ−Ｖ　ｍｅｄｉｕｍ）、ＡＳＴ　培地に酵母抽出物（０．１％）とトリプトン（０．２％）を加えた培地（ＹＴ　ｍｅｄｉｕｍ）を用いて２５〜２７℃、６０ｒｐｍ、２，０００〜３，０００ｌｕｘの蛍光灯下で１週間培養し、コンタミネーションが増殖してこないことを確認した。
実施例３：Ａ．　ｓａｃｒｕｍ　の単離
原料のスイゼンジノリ（Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ　ｓａｃｒｕｍ　）は福岡県甘木市の遠藤金川堂のものを用いる。この藻体約　４〜５ｇ　に　ＡＳＴ　培地を　３０ｍｌ　加え、ホモジェナイザーで細かくすりつぶした。これを　Ｇ２ガラスろ過器（細孔の大きさ：４０〜５０μｍ）に通した後に容量　５０ｍｌ　のスクリューキャップのチューブに移し、遠心機（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ　０５Ｐ−２１、Ｈｉｔａｃｈｉ）で遠心分離して沈殿を回収した。この沈殿を容量　２ｍｌのマイクロチューブに移し、ソニケーター（ＳｏｎｉｃａｔｏｒＴＭ　Ｗ−２２０、Ｈｅａｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　−　Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ）を用いて超音波処理し、卓上遠心機（ＭＴＸ−１５０、ローター：ＴＭＡ−Ｓ２６、ＴＯＭＹ）で遠心分離して細胞のみの沈殿を回収した。沈殿を　ＡＳＴ　培地にとかし、ヨードキサノールの濃度で４０〜４５％　の　ＯｐｔｉＰｒｅｐＴＭ　（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ）の密度勾配に重層し、超遠心機（７０Ｐ−７２、ローター：ＳＲＰ２８ＳＡ−１６５、Ｈｉｔａｃｈｉ）で　２５，０００ｒｐｍ、２時間超遠心した。中心付近に見られた細胞層をマイクロチューブに回収し、等量〜９倍量の　ＡＳＴ　培地を加え、卓上遠心機で遠心分離して細胞のみの沈殿を回収した。沈殿を適当量の　ＡＳＴ　培地にとかし、ヘマサイトメーターに一部をとり、顕微鏡で観察してスイゼンジノリの細胞が１つずつ分かれていることを確認すると共に細胞数を測定し、この菌数をもとに　０．６％　のアガロースを含むＡＳＴ培地のプレートに１６，０００個の細胞をまき、２５〜２７℃、２，０００〜３，０００ｌｕｘの蛍光灯下で約１ヶ月間培養した。
【００３１】
形成されたコロニーの内、付近にコンタミネーションのコロニーが観察されなかったコロニーを選択し、その中から　ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ　ＢａｃＬｉｇｈｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ）で染色して蛍光顕微鏡で観察したときに細胞間にコンタミネーションのシグナルが見られなかったクローンを選抜した。
【００３２】
このクローン化された藻体を先の有機物入りＡＳＴ培地の他、ＡＳＴ　培地に牛肉抽出物　（０．３％）とペプトン（０．５％）を加えた培地（Ｂ−ＩＩＩ　ｍｅｄｉｕｍ）、ＡＳＴ　培地に酢酸ナトリウム（０．０５％）、グルコース（０．０５％）、トリプトン（０．０５％）、酵母抽出物（０．０３％）を加えた培地（Ｂ−Ｖ　ｍｅｄｉｕｍ）、ＡＳＴ　培地に酵母抽出物（０．１％）とトリプトン（０．２％）を加えた培地（ＹＴ　ｍｅｄｉｕｍ）を用いて２５〜２７℃、６０ｒｐｍ、２，０００〜３，０００ｌｕｘの蛍光灯下で１週間培養し、コンタミネーションが増殖してこないことを確認した。
実施例４：自然状態のスイゼンジノリのフェレドキシン遺伝子の部分塩基配列の決定
自然状態のスイゼンジノリを滅菌水で十分水洗いしたものから　ＩＳＯＰＬＡＮＴＴＭ（日本ジーン）を用い、以下のようにして　ＤＮＡ　を抽出した。
【００３３】
藻体約１ｇ　に対してキットの　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｉ　を３倍量加えて撹拌後、キットの　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ＩＩ　を藻体の１．５倍量加えて５０℃で１５〜１２０分反応させた。キットの　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ＩＩＩ　を藻体の１．５倍量加えて氷上に１５分置き、遠心機（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ　０５Ｐ−２１、Ｈｉｔａｃｈｉ）を用いて　３，０００ｒｐｍ　で　１０分間遠心分離した後、水層を別のチューブに移した。２倍量のエタノールを加えて遠心機（ＳＣＲ　２０ＢＡ、ローター：ＲＰＲ　２０−２、Ｈｉｔａｃｈｉ）で　７，０００ｒｐｍ　で　１０分間遠心分離して沈殿を回収した。沈殿を　ＴＥ　バッファー　０．５ｍｌ　に溶かし、フェノール・クロロフォルム（１：１）を等量加えてよく撹拌した。１２，０００ｒｐｍ　で　５分間遠心分離した後、水層を別のマイクロチューブに移した。水層とフェノール・クロロフォルム層の間にゲルに由来する中間層が見られなくなるまでフェノール・クロロフォルム処理を繰り返した。水層の１０分の１量の酢酸ナトリウムと、２倍量の　１００％エタノールを加えて混合した後、−２０℃で１０分間放置した。卓上遠心機（ＭＴＸ−１５０、ローター：ＴＭＡ−Ｓ２６、ＴＯＭＹ）で　４℃、１５，０００ｒｐｍ　で　１０分間遠心分離した後、上清を廃棄した。１００μｌ　の滅菌水を加えよく撹拌し、５０℃　で１０分加温して、これを以下の　ＰＣＲ　によるスイゼンジノリのフェレドキシン遺伝子の増幅反応の鋳型　ＤＮＡ　溶液とした。
【００３４】
スイゼンジノリのフェレドキシンタンパク質として既に報告されている２種類のアミノ酸配列を元に次の配列のプライマーを設計して、以下の配列を持つＤＮＡを合成した。
2004081022.tif 000007
この配列をプライマーに、スイゼンジノリから調製した　ＤＮＡ　を鋳型に用いて　ＰＣＲ　によるスイゼンジノリのフェレドキシン　Ｉ　及びフェレドキシン　ＩＩ　遺伝子の増幅行った。反応液の組成および反応条件は下記のとおりである。
Ａ：
反応液組成
鋳型　ＤＮＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１μｇ
ＴａＫａＲａ　Ｔａｑ　　　　　　（ＴａＫａＲａ）　　　　　　　　０．２５μｌ
１０ｘ　ＰＣＲ　バッファー　　（ＴａＫａＲａ）　　　　　　　　５μｌ
ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ　　　　　　　（ＴａＫａＲａ）　　　　　　　　４μｌ
プライマー　１＊　　　　　（０．０１ｍＭ）　　　　　　　　１μｌ
プライマー　２＊＊　　　　　（０．０１ｍＭ）　　　　　　　　１μｌ
滅菌水　　　　　　　　　　　　　ｕｐ　ｔｏ　５０μｌ
＊　ＡｓＦｄ−ＩＮ　　：ＧＡＣＴＣＣＣＧＡＴＧＧＡＧＡＣＡＡＴＧ
または
ＡｓＦｄ−ＩＩＮ　：ＧＡＧＧＴＡＧＣＡＧＡＴＧＡＴＣＡＧＡＣＣ
＊＊ＡｓＦｄ−ＩＣ　　：ＴＣＴＣＣＧＧＴＡＧＧＡＴＡＡＧＣＣＡＣ
または
ＡｓＦｄ−ＩＩＣ　：ＣＴＣＣＴＧＴＡＧＧＡＴＡＡＧＣＡＡＣＧＣ
2004081022.tif 000008
この反応により増幅された　ＤＮＡ　断片を　ＳＵＰＲＥＣＴＭ−０２（Ｔａｋａｒａ）を用いて濃縮し、１ｘ　ＴＡＥ　−　２％　アガロースゲルを用いた電気泳動で、目的とする約　０．３ｋｂ　のＤＮＡ　断片をプライマーなどと分離した後、目的の位置のゲルを切り出して細かく刻んで　ＳＵＰＲＥＣＴＭ−０１（Ｔａｋａｒａ）に移して、卓上遠心機で遠心して増幅された　ＤＮＡ　断片を回収した。
【００３５】
回収した断片を「ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、下記の反応液の組成および反応条件で　ｐＣＲ２．１　ベクターと連結させた。
Ｂ：
反応液組成
ＰＣＲ　ｐｒｏｄμｃｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　１μｌ
ｐＣＲ２．１ＴＭ　ｖｅｃｔｏｒ　　　　　　　　（２５ｎｇ／μｌ）　　　２μｌ
１０ｘ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　バッファー　　　　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）　　１μｌ
Ｔ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ　　　　　　　　　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）　　１μｌ
滅菌水　　　　　　　　　　　　　　　　ｕｐ　ｔｏ　１０μｌ
反応条件
１６℃ｘ　　一晩
大腸菌　ＩＮＶαＦ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５０μｌ　に、ＩＮＶαＦ’　に付属していた　０．５　Ｍβ−メルカプトエタノール　２μｌ　と連結反応液　２μｌ　を加えて氷上に３０分置いた。この大腸菌液を４２℃で３０秒処理して形質転換させた後、氷上に２分置いた。ＩＮＶαＦ’　に付属していた　ＳＯＣ　培地を　２００μｌ　加えて３７℃、１７０ｒｐｍ　で１時間振盪培養した。５０μｇ　／μｌ　のアンピシリンを含む　ＬＢ　寒天培地上に　４０ｍｇ／ｍｌ　の　Ｘ−Ｇａｌ　ＤＭＦＡ溶液を４０μｌ　塗布した後に１００μｌ　の大腸菌液をまき、３７℃で一晩培養した。
【００３６】
プレート上に形成されたいくつかの白いコロニーを拾い、Ｌｙｓｉｓ　バッファー（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ　８．０、５０ｍＭ　ＫＣｌ、０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０）１０μｌ　に溶かした。これを９５℃で５分処理したもの　５μｌ　を鋳型に、ベクター上の配列をプライマーにしてＰＣＲ　を行った。反応液の組成および反応条件は下記のとおりである。
Ｃ：
反応液組成
鋳型　ＤＮＡ　　　　　　　　　　　　　　　　５μｌ
ＴａＫａＲａ　Ｔａｑ　　　　　　（ＴａＫａＲａ）　　　　　０．２５μｌ
１０ｘ　ＰＣＲ　バッファー　　（ＴａＫａＲａ）　　　　　５μｌ
ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ　　　　　　　（ＴａＫａＲａ）　　　　　４μｌ
ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｔＡ＊　　　　　（０．０１ｍＭ　ｅａｃｈ）　　　１μｌ
滅菌水　　　　　　　　　　　　ｕｐ　ｔｏ　５０μｌ
2004081022.tif 000009
ＰＣＲ　産物を電気泳動し、目的とするサイズの　ＤＮＡ　断片が含まれた　ＰＣＲ　産物を鋳型に　Ｄｙｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｃｏｒｅ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてシーケンシング反応を行った。反応液の組成および反応条件は下記のとおりである。
Ｄ：
反応液組成
鋳型　ＤＮＡ　　　　　　　（１０ｎｇ／μｌ）　　　　　　　１μｌ
５ｘ　Ｓｅｑ　バッファー　　　　　　　　　　　　　　　１μｌ
ｄ／ｄｄＮＴＰ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１μｌ
Ｄｙｅ　ｐｒｉｍｅｒ　　　　　　（０．４μＭ）　　　　　　　　１μｌ
Ｄｉｌｕｔｅｄ　Ｅｎｚｙｍｅ＊　　　　　　　　　　　　　　　　１μｌ
＊Ｄｉｌｕｔｅｄ　ＥｎｚｙｍｅＡｍｐｌｉＴａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，　ＦＳ　　１μｌ
５ｘ　Ｓｅｑ　バッファー　　　　　　　　　　　　　　　１μｌ
滅菌水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５μｌ
2004081022.tif 000010
この反応産物を　ＤＮＡ　シーケンサー（ＤＳＱ−１、Ｓｈｉｍａｚｕ）にかけて塩基配列を決定し、この部分塩基配列（配列表の配列番号１及び２参照）から推定される部分アミノ酸配列が、既報のフェレドキシンタンパク質の部分アミノ酸配列と一致したことを確認した（図１及び図２参照）。
実施例５：単離した藻体の同定
実施例２または３でクローン化された藻体がスイゼンジノリの本体である　Ａ．　ｓａｃｒｕｍ　かどうかを同定する。藻体の外観は、細胞の長径が約６μｍの桿形である点、細胞はゲルに埋まった状態にある点など、自然状態のスイゼンジノリの外観と一致する。また、以下の方法で単離した藻体からスイゼンジノリのフェレドキシン遺伝子の部分塩基配列が検出されるかどうかを確認した。
【００３７】
実施例２または３で単離した藻体に対して　ＩＳＯＰＬＡＮＴ　ＩＩ　ＴＭ（日本ジーン）を用いて以下のように　ＤＮＡ　を抽出した。
【００３８】
藻体約１ｇ　に対してキットの　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｉ　を３倍量加えて撹拌後、キットの　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ＩＩ　を藻体の１．５倍量加えて５０℃で１５〜２０分反応させた。キットの　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ＩＩＩ−Ａ　を藻体の１倍量、キットの　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ＩＩＩ−Ｂ　を藻体の１．２倍量加えて氷上に１５分置き、遠心機（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ　０５Ｐ−２１、Ｈｉｔａｃｈｉ）を用いて　３，０００ｒｐｍ　で　１０分間遠心分離した後、水層を別のチューブに移した。２倍量のエタノールを加えて遠心機（ＳＣＲ　２０ＢＡ、ローター：ＲＰＲ　２０−２、Ｈｉｔａｃｈｉ）で　７，０００ｒｐｍ　で　１０分間遠心分離して沈殿を回収した。沈殿を　ＴＥ　バッファー　０．５ｍｌ　に溶かし、フェノール・クロロフォルム（１：１）を等量加えてよく撹拌した。１２，０００ｒｐｍ　で　５分間遠心分離した後、水層を別のマイクロチューブに移した。水層とフェノール・クロロフォルム層の間にゲルに由来するとみられる中間層が見られなくなるまでフェノール・クロロフォルム処理を繰り返した。水層に１０分の１量の酢酸ナトリウムと、２〜２．５倍量の　１００％　エタノールを加えて混合した後、−２０℃で１０分間放置した。卓上遠心機（ＭＴＸ−１５０、ローター：ＴＭＡ−Ｓ２６、ＴＯＭＹ）で　４℃、１５，０００ｒｐｍ　で　１０分間遠心分離した後、上清を廃棄した。上清を十分除いた後、１００μｌ　の滅菌水を加えよく撹拌し、５０℃　で１０分加温して以下の　ＰＣＲ　によるフェレドキシン遺伝子の増幅反応の鋳型　ＤＮＡ　溶液とした。
【００３９】
実施例４に記載のプライマーを用いて、単離した藻体の　ＤＮＡ　からフェレドキシン遺伝子の部分塩基配列を増幅した。反応液の組成および反応条件は実施例４のＡとおりである。
【００４０】
この反応により増幅された　ＤＮＡ　断片を「ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、実施例４のＢの反応液の組成および反応条件で　ｐＣＲ２．１　ベクターと連結させた。大腸菌　ＩＮＶαＦ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５０μｌ　に、ＩＮＶαＦ’　に付属していた　０．５　Ｍβ−メルカプトエタノール　２μｌ　と連結反応液　２μｌ　を加えて氷上に３０分置いた。この大腸菌液を４２℃で３０秒処理した後、氷上に２分置いた。ＩＮＶαＦ’　に付属していた　ＳＯＣ　培地を　２００μｌ　加えて３７℃、１７０ｒｐｍ　で１時間振盪培養した。５０μｇ　／μｌ　のアンピシリンを含む　ＬＢ　寒天培地上に　４０ｍｇ／ｍｌ　の　Ｘ−Ｇａｌ　ＤＭＦＡ溶液を４０μｌ　塗布した後に５０μｌ　の大腸菌液をまき、３７℃で一晩培養した。
【００４１】
プレート上に形成されたいくつかの白いコロニーを拾い、Ｌｙｓｉｓ　バッファー（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ　８．０、５０ｍＭ　ＫＣｌ、０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０）１０μｌ　に溶かした。これを９５℃で５分処理したもの　５μｌ　を鋳型に、ｐＣＲ２．１　ベクター上の配列をプライマーにして　ＰＣＲ　を行った。反応液の組成および反応条件は実施例４の　Ｃ　のとおりである。ＰＣＲ　産物を電気泳動して目的とするサイズの　ＤＮＡ　断片が含まれた　ＰＣＲ　産物を選択し、これを鋳型に　Ｄｙｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｃｏｒｅ　Ｋｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてシーケンシング反応を行った。反応液の組成および反応条件は実施例４の　Ｄ　の通りである。この反応産物を　ＤＮＡ　シーケンサー（ＤＳＱ−１、Ｓｈｉｍａｚｕ）にかけて塩基配列を決定し、この部分塩基配列から推定される部分アミノ酸配列が、既報のフェレドキシンタンパク質の部分アミノ酸配列と一致したことを確認した（図３参照）。
【００４２】
今回クローン化された藻体は自然状態のスイゼンジノリが持つ塩基配列を持ち、外観が自然状態のスイゼンジノリに似ていることから、スイゼンジノリの本体である　Ａ．　ｓａｃｒｕｍ　であると同定し、これをＡ．　ｓａｃｒｕｍ　ＫｕＸ　３と命名した。この藻体は、経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所に、ブダペスト条約のもとで国際寄託されている（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７３１５）。
実施例６：Ａ．　ｓａｃｒｕｍ　ＫｕＸ　３　の１６Ｓ　ｒＲＮＡ　遺伝子の部分塩基配列の解析
対象とする藻体が実施例２または３でクローン化された藻体　Ａ．　ｓａｃｒｕｍ　　ＫｕＸ　３　かどうかを同定するための指標として　１６Ｓ　ｒＲＮＡ　遺伝子の部分塩基配列を解析した。
【００４３】
実施例５で抽出した単離した藻体の　ＤＮＡ　を以下の　ＰＣＲ　による１６Ｓ　ｒＲＮＡ　遺伝子の増幅反応の鋳型　ＤＮＡ　溶液とした。
【００４４】
１６Ｓ　ｒＲＮＡ　遺伝子を増幅するためのユニバーサルプライマーを用いて、単離した藻体の　ＤＮＡから　１６Ｓ　ｒＲＮＡ　遺伝子の部分塩基配列を増幅した。反応液の組成および反応条件は下記のとおりである。
反応液組成
鋳型　ＤＮＡ　　　　　　　　　　　　５μｌまたは１μｇ
ＴａＫａＲａ　Ｔａｑ　　　　　　　　（ＴａＫａＲａ）　　　　　　０．２５μｌ
１０ｘ　ＰＣＲ　バッファー　　　　（ＴａＫａＲａ）　　　　　　５μｌ
ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ　　　　　　　　　（ＴａＫａＲａ）　　　　　　４μｌ
プライマー　１６Ｓ−２７ｆ＊　　　　（０．０１ｍＭ）　　　　　　１μｌ
プライマー　１６Ｓ−１５２５ｒ＊＊　　（０．０１ｍＭ）　　　　　　１μｌ
滅菌水　　　　　　　　　　　　　ｕｐ　ｔｏ　５０μｌ
＊　１６Ｓ−２７ｆ　　　：　ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ
＊＊１６Ｓ−１５２５ｒ　：　ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＷＴＣＣＡＲＣＣ
2004081022.tif 000011
この反応により増幅された　ＤＮＡ　断片を「ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、実施例４のＢの反応液の組成および反応条件で　ｐＣＲ２．１　ベクターと連結させた。大腸菌　ＩＮＶαＦ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５０μｌ　に、ＩＮＶαＦ’　に付属していた　０．５　Ｍβ−メルカプトエタノール　２μｌ　と連結反応液　２μｌ　を加えて氷上に３０分置いた。この大腸菌液を４２℃で３０秒処理した後、氷上に２分置いた。ＩＮＶαＦ’　に付属していた　ＳＯＣ　培地を　２００μｌ　加えて３７℃、１７０ｒｐｍ　で１時間振盪培養した。５０μｇ　／μｌ　のアンピシリンを含む　ＬＢ　寒天培地上に　４０ｍｇ／ｍｌ　の　Ｘ−Ｇａｌ　ＤＭＦＡ溶液を４０μｌ　塗布した後に５０μｌ　の大腸菌液をまき、３７℃で一晩培養した。
【００４５】
プレート上に形成されたいくつかの白いコロニーを拾い、Ｌｙｓｉｓ　バッファー（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ　８．０、５０ｍＭ　ＫＣｌ、０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０）１０μｌ　に溶かした。これを９５℃で５分処理したもの　５μｌ　を鋳型に、ｐＣＲ２．１　ベクター上の配列をプライマーにして　ＰＣＲ　を行った。反応液の組成および反応条件は実施例４のＣのとおりである。ＰＣＲ　産物を電気泳動して目的とするサイズの　ＤＮＡ　断片が含まれた　ＰＣＲ　産物を選択し、これを鋳型に　Ｄｙｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｃｏｒｅ　Ｋｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてシーケンシング反応を行った。反応液の組成および反応条件は実施例４のＤのとおりである。この反応産物を　ＤＮＡ　シーケンサー（ＤＳＱ−１、Ｓｈｉｍａｚｕ）にかけて塩基配列を決定し、この部分塩基配列（配列表の配列番号３参照）がラン藻の　１６Ｓ　ｒＲＮＡ　遺伝子の部分塩基配列に相同性があることを確認した（図４参照）。
実施例７：Ａ．　ｓａｃｒｕｍ　の純粋培養
クローン化されたＡ．　ｓａｃｒｕｍ　の純粋培養条件を確立するため、ＡＳＴ　培地の特徴である硝酸塩及びリン酸塩の塩濃度の有効範囲を検討した。
【００４６】
硝酸カリウムとリン酸水素二カリウムを除いた　ＡＳＴ　培地を１００ｍｌ　の三角フラスコに　３０ｍｌ　ずつ分注した。これに、終濃度がそれぞれ　０．１ｘＮＰ、０．５ｘＮＰ、１ｘＮＰ、５ｘＮＰ、１０ｘＮＰ、５０ｘＮＰ（硝酸カリウム：　９．２１６ｍｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム：　５．２４８ｍｇ／Ｌ　を１ｘ　ＮＰ　とする）となるようにＮＰ　の溶液を　３０ｍｌ　ずつ混合した後、オートクレーブ滅菌した。十分冷めたところでオートクレーブ滅菌した　１００ｍｌ　の三角フラスコに　２０ｍｌ　ずつ分注した。これに今回単離した細胞塊　０．０２ｇ　を加えて　８００ｌｕｘ　の連続明条件、２５℃、６０ｒｐｍ　の培養条件で振盪培養を行い１週間ごとの細胞塊の湿重量を量った。
【００４７】
２週間培養した結果　０．５ｘＮＰ〜１０ｘＮＰ（硝酸イオン濃度　２．８ｍｇ／Ｌ〜５６．５ｍｇ／Ｌ　リン酸イオン濃度１．４ｍｇ／Ｌ〜２８．６ｍｇ／Ｌ）において湿重量の増加が見られた（下記表６参照）。
【００４８】
【表６】
2004081022.tif 000012
【００４９】
【配列表】
2004081022.tif 000013
2004081022.tif 000014
2004081022.tif 000015
【図面の簡単な説明】
【図１】自然状態のスイゼンジノリのフェレドキシン　Ｉ　遺伝子の部分塩基配列。
【図２】自然状態のスイゼンジノリのフェレドキシン　ＩＩ　遺伝子の部分塩基配列。
【図３】自然状態のスイゼンジノリと単離した細胞（ＫｕＸ　３）のフェレドキシン遺伝子の部分塩基配列の比較。
【図４】単離した細胞（ＫｕＸ　３）の１６Ｓ　ｒＲＮＡ　遺伝子の部分塩基配列とその相同性検索の結果。
【図１】
2004081022.tif 000016
【図２】
2004081022.tif 000017
【図３】
2004081022.tif 000018
【図４】
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