(57)【要約】      （修正有）【課題】昆虫におけるアセチルコリンエステラーゼの感受性を、昆虫１個体を用いて、手早く簡単に、しかも容易に判断できるように検査する方法および試験キットを提供する。【解決手段】中性から酸性の水溶性リン酸塩緩衝液中で昆虫１個体をホモジナイズし、昆虫のホモジネートをアッセイプレートのウェルに滴下し、上記ウェルの１群にはヨウ化アセチルコリン溶液と５，５−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）溶液とを滴下し、上記ウェルの残りの１群には５，５−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）溶液及びプロポクスール溶液を滴下して両群のセルにおける試料間の黄色の呈色の違いを検査する方法、および中性から酸性のリン酸塩緩衝液、ヨウ化アセチルコリン、５，５−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）、プロポクスール、水混和性有機溶媒、をそれぞれ別個に収容する複数の容器を収納する容器を含むキットの提供。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫１個体を用いてアセチルコリンエステラーゼの感受性を検査する方法であって、中性から酸性のリン酸塩緩衝液中で昆虫１個体をホモジナイズする工程と、中性から酸性のリン酸塩緩衝液で緩衝された水混和性有機溶媒中にヨウ化アセチルコリン溶液を作製する工程と、前記緩衝液中に５，５−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）溶液を作製する工程と、前記緩衝液中にプロポクスール溶液を作製し前記昆虫のホモジネートをアッセイプレートのウェルに滴下した後に前記ウェルのうちの１群にはヨウ化アセチルコリン溶液と５，５−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）溶液とを滴下し前記ウェルの残りの１群には５，５−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）溶液、ヨウ化アセチルコリン溶液及びプロポクスール溶液を滴下して両群のセルにおける試料間の黄色の呈色の違いを検査する工程と、を任意の順序で含む、検査方法。
【請求項２】
試験キットを用いる請求項１に記載の方法であって、当該試験キットは、
中性から酸性のリン酸塩緩衝液、
ヨウ化アセチルコリン、
５，５−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）、
プロポクスール、および
水混和性有機溶媒、
をそれぞれ別個に収容する複数の容器を収納する容器を含む、検査方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記緩衝液はｐＨ６〜７である、検査方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記緩衝液はｐＨ６．８である、検査方法。
【請求項５】
請求項１または２に記載の方法であって、前記緩衝液はリン酸カリウムである、検査方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の方法であって、前記プロポクスールは５〜２５ｍｇ／ｌのエタノール溶液である、検査方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の方法であって、前記プロポクスール溶液と前記ヨウ化アセチルコリン溶液とは予め混和されている、検査方法。
【請求項８】
昆虫１個体を用いて昆虫におけるアセチルコリンエステラーゼの感受性を検査する試験キットであって、
中性から酸性のリン酸塩緩衝液、
ヨウ化アセチルコリン、
５，５−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）、
プロポクスール、および
水混和性有機溶媒、
をそれぞれ別個に収容する複数の容器を収納する容器を含む、試験キット。
【請求項９】
請求項８に記載の試験キットであって、前記緩衝液はｐＨ６〜７である、試験キット。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の試験キットであって、前記緩衝液はｐＨ６．８である、試験キット。
【請求項１１】
請求項８に記載の試験キットであって、前記緩衝液はリン酸カリウムである、試験キット。
【請求項１２】
請求項８から１１のいずれかに記載の試験キットであって、前記プロポクスールは５〜２５ｍｇ／ｌのエタノール溶液である、試験キット。
【請求項１３】
請求項８から１２のいずれかに記載の試験キットであって、前記試験を実施するための器具をさらに含む、試験キット。
【請求項１４】
請求項１３に記載の試験キットであって、試験管、ピペット、およびマイクロアッセイプレートを含む、試験キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、昆虫の殺虫剤耐性の検査方法および試験キットに関し、より特定的には、昆虫の、有機リンおよびカルバメート系殺虫剤に対する耐性の検査方法および試験キットを提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】
マラリア、デング熱、フィラリア症など昆虫を媒介とする疾病においては、殺虫剤が最も重要な予防手段となっている。１９４０年代に初めて合成殺虫剤ＤＤＴが登場して以来、数え切れないほどの人命が救われている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、殺虫剤の長期使用は媒介昆虫、特に上記のような疾病を媒介する昆虫に耐性を獲得させることとなり、媒介昆虫の駆除効果、ひいてはそれらが媒介する疾病の予防効果が上がらないということになっている。耐性検査は主に世界保健機構（ＷＨＯ）の標準試験手順に基づいているが、この標準手順は使い勝手が良いとは到底言い難く、時間がかかり、数多くの検体昆虫を必要とし、試験キットの貯蔵寿命も短く、試験の実施および判定には熟練を要する。その結果、多くの媒介昆虫について、感受性についての情報がほとんど何も得られないということが非常にしばしばであり、これが伝染病対策の成果に影響しがちであった。
【０００４】
現場で使用できる試験キットが開発されれば、昆虫を媒介とする疾病の防除において大きな前進となろう。
一般に、耐性は生化学的に以下の３つの機序のうちのどれかに基づいている。
１）有機リンおよびカルバメートを対象とする非特異性エステラーゼのレベルが上昇する。
２）ピレスロイドに対する混合機能オキシダーゼの活性が上昇する。
３）有機リンおよびカルバメートに対するアセチルコリンエステラーゼの感受性喪失。
本発明は、昆虫におけるアセチルコリンエステラーゼの感受性を、昆虫１個体を用いて、手早く簡単に、しかも容易に判断できるように検査する方法および試験キットを提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、試験キットは、中性から酸性のリン酸塩緩衝液、ヨウ化アセチルコリン（ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｉｏｄｉｄｅ）、５，５−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）、プロポクスール（ｐｒｏｐｏｘｕｒ：カルバメート系殺虫剤）、および水混和性有機溶媒、をそれぞれ別個に収容する複数の容器を収納する容器を含む。
【０００６】
フィールドでの使用のために、このキットは上記試験を実施するための器具、例えば混合用の容器やエッペンドルフチューブなどの試験管、ピペットやマイクロアッセイプレートをさらに含む。これらの器具はそれぞれ複数用いられてもよい。
好ましくは、緩衝液はｐＨ６〜７であり、より好ましくはｐＨ約６．８である。
好ましくは、緩衝液はリン酸カリウムである。
好ましくは、プロポクスールは７０％エタノールに対して５〜２５ｍｇ／ｌ溶解したものである。
好ましくは、水混和性有機溶媒はアセトンである。
【０００７】
本発明の方法は、中性から酸性のリン酸塩緩衝液中で昆虫１個体を好ましくはエッペンドルフチューブのような小型のチューブ内で粉砕用乳棒（ｐｅｓｔｌｅ）を用いて粉砕することによりホモジナイズする工程と、中性から酸性のリン酸塩緩衝液で緩衝された水混和性有機溶媒中にヨウ化アセチルコリン溶液を作製する工程と、上記緩衝液中に５，５−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）溶液を作製する工程と、上記緩衝液中にプロポクスール溶液を作製したのち上記昆虫のホモジネートをアッセイプレートのウェルに滴下し上記ウェルのうちの１群にはヨウ化アセチルコリン溶液と５，５−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）溶液とを滴下し上記ウェルの残りの１群には５，５−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）溶液、ヨウ化アセチルコリン溶液及びプロポクスール溶液を滴下して両群のセルにおける試料間の黄色の呈色の違いを検査する工程と、を任意の順序で含む。
【０００８】
プロポクスール溶液とヨウ化アセチルコリン溶液とは予め混和されていてもよい。
【０００９】
その結果は、肉眼によりまたはより正確な結果を必要とする場合には免疫アッセイリーダー（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｒｅａｄｅｒ）による４１０ｎｍでのスキャニングにより判定することが可能である。
インキュベーション後、プロポクスールを含むセルにおける黄色の呈色の方が薄ければ、その昆虫はアセチルコリンエステラーゼの感受性が高く、従って有機リン系およびカルバメート系殺虫剤に対する耐性を持たない。
【００１０】
【発明の実施の形態】
８つの容器にそれぞれ、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）１０ｍｌ×２、アセトン１ｍｌ、ヨウ化アセチルコリン７．５ｍｇ、リン酸カリウム緩衝液９  ｍｌ、５，５−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）１．３ｍｇ、７０％のエタノール１０ｍｌにプロポクスール２５μｇを溶解した溶液として１ｍｇ、及びリン酸カリウム緩衝液４ｍｌを用意した。
上記ヨウ化アセチルコリンに上記アセトンを加えて十分混合して溶液とし、これを上記９ｍｌの緩衝液に加えた。上記１０ｍｌの緩衝液のうちの一つを５，５−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）に加え、十分混合して溶液とした。上記ヨウ化アセチルコリン溶液１．８ｍｌを、上記４ｍｌの緩衝液に混合し、その後０．２ｍｌを加えて十分に混合した。
【００１１】
蚊一匹をエッペンドルフチューブに入れ、粉砕用乳棒で緩衝液一滴中にホモジナイズし、さらにエッペンドルフチューブの０．５ｍｌのマークまで緩衝液で希釈した。このホモジネートを５分間静置して固形分（ｄｅｂｒｉｓ）を沈殿させた後、ホモジネート１滴づつを４ウェルマイクロアッセイプレートのそれぞれのウェルに滴下した。希釈されていないヨウ化アセチルコリン溶液１滴および５，５−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）溶液１滴を２つのウェルに加えた。他の２つのウェルにはプロポクスール溶液を１滴加えた後、５，５−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）溶液を１滴加えた。このプレートに対して３０分間のインキュベーションを行い、２組のウェルにおける試料の色を検討した。プロポクスール溶液を含む第二組のウェルにおける黄色の方が第一組のウェルの色よりも薄ければ、この蚊はアセチルコリンエステラーゼ感受性が高く、従って有機リン系およびカルバメート系殺虫剤に対する耐性を持たない。
色は肉眼または免疫アッセイリーダーによる４１０ｎｍでのスキャニングにより判定することが可能である。
【００１２】
【発明の効果】
本発明は、昆虫におけるアセチルコリンエステラーゼの感受性を、わずか１個体の昆虫を用いて手早く（通常は３０分以内で判定可能である）しかも装置を必要とせず肉眼による比色によって判断でき、フィールドでの使用が可能な初めての試験キットを提供するものである。また、この試験キットと方法は使用に際して従来ほどの熟練も特殊な訓練も必要としない。さらに、この試験キットは長い貯蔵寿命を有しかつ室温で数週間保存できる安定性を有している。
また、このキットの使用により以下の効果が得られる。
耐性検査を大幅に簡略化することができる。
疾病予防や媒介昆虫の駆除に使用される殺虫剤の有効性を保証することが可能になり、したがって、生命を救い費用や人手を節約することができる。
対象昆虫の薬剤耐性について恒常的かつ定期的なモニタリングが可能となる。
新しい駆除剤の開発や対抗策の立案、さらには殺虫剤の作用態様の解明に役立つ。