(57)【要約】【課題】カチオン性抗菌ペプチドのような陰イオン性物質などに吸着して抗菌活性の低下がない抗菌ペプチドを提供し、当該抗菌ペプチドを用いた抗菌剤、消毒剤および保存剤に関する。【解決手段】古くから様々な生理活性を持つ生薬として珍重されてきたセイヨウミツバチ（Ａｐｉｓ　ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）の雄蛹に抗菌活性を持った成分が含まれること、およびこの抗菌成分が塩基性アミノ酸を含まないペプチド（サンプル２はＰｒｏ、Ｇｌｘ、Ｇｌｙ、ＡｌａおよびＴｈｒを、サンプル３はＩｌｅ、ＬｅｕおよびＴｙｒのアミノ酸を含有するもの）であること見出し、本発明を完成させた。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セイヨウミツバチの蛹抽出物由来でプロリン、グルタミン酸またはグルタミン、グリシン、アラニンおよびトレオニンを含有する抗菌ペプチド。
【請求項２】
セイヨウミツバチの蛹抽出物由来でイソロイシン、ロイシンおよびチロシンを含有する抗菌ペプチド。
【請求項３】
請求項１または請求項２にそれぞれ記載の抗菌ペプチドを成分とする抗菌剤または消毒剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、セイヨウミツバチ（Ａｐｉｓ　ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）由来の抗菌ペプチド、および抗菌剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
抗菌ペプチドは幅広い抗菌スペクトルを有し、薬剤耐性菌が出現し難いと考えられている。このことから、ヒトおよび動物の細菌感染性疾患の予防や治療、或いは、食材などの物品に抗菌性を付与する目的に抗菌ペプチドを利用することが考えられている。
【０００３】
これまでに多くの抗菌ペプチドが動植物から単離されている。例えば、タイワンカブトムシ由来の抗菌ペプチドおよび当該抗菌ペプチドを有効成分とする抗菌剤が開示されている（特許文献１参照。）。
サソリ毒由来の抗菌ペプチドおよび当該抗菌ペブチドを有効成分とする抗菌剤が開示されている（例えば特許文献２参照。）。
また、ミツバチなどのハチ類由来の抗菌ペプチドも、報告されている（例えば非特許文献１　参照。）。
【０００４】
上記記載の抗菌ペプチドは、いずれもリジン、アルギニンおよび／またはヒスチジンなどの塩基性アミノ酸を含むもので、ペプチド分子全体の電荷が正となるカチオン性抗菌ペプチドと呼ばれるものである。これら抗菌ペプチドの作用原理は、抗菌ペプチド中の正に荷電した塩基性アミノ酸部分が菌表面の膜と静電相互作用することによるものと考えられている（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００５】
このようなカチオン性抗菌ペプチドは、プラスチック製の容器や陰イオン性の物質に強く吸着し、抗菌活性が低下する場合があることが指摘されている（例えば非特許文献３参照。）。
【０００６】
カチオン性抗菌ペプチド以外の抗菌ペプチドについては、若干報告があるもののほとんど知られていない（例えば、非特許文献４参照。）。
【０００７】
○先行文献
【特許文献１】
特開２０００−０６３４００号公報（特許請求の範囲）
【特許文献２】
特開２００１−１８６８８７号公報（特許請求の範囲）
【非特許文献１】
Ｐ．Ｃａｓｔｅｅｌｓ，外３名，「Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，１９９３年，２６８巻，ｐ．７０４４−７０５４
【非特許文献２】
Ｍ．Ｚａｓｌｏｆｆ、「Ｎａｔｕｒｅ」，２００２年，４１５巻，ｐ．３８９−３９５
【非特許文献３】
Ａ．Ｇｉａｃｏｍｅｔｔｉ，外６名，「Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」，２０００年、４４巻，ｐ．１６９４−１６９６
【非特許文献４】
Ｋ．　Ｂｒｏｇｄｅｎ，外２名，「Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」，１９９７年，４１巻，ｐ．１６１５−１６１７
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
カチオン性抗菌ペプチドのような陰イオン性物質などに吸着して抗菌活性の低下がない抗菌ペプチドを提供し、当該抗菌ペプチドを用いた抗菌剤、消毒剤および保存剤に関する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、課題を解決するため鋭意研究を行った結果、古くから様々な生理活性を持つ生薬として珍重されてきたセイヨウミツバチ（Ａｐｉｓ　ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）の雄蛹（ハチの子、食用としても使用）に抗菌活性を持った成分が含まれること、そしてこの抗菌成分は塩基性アミノ酸を含まないペプチド（サンプル２はＰｒｏ、Ｇｌｘ、Ｇｌｙ、ＡｌａおよびＴｈｒを、サンプル３はＩｌｅ、ＬｅｕおよびＴｙｒのアミノ酸を含有するもの）であること見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
凍結したセイヨウミツバチの蛹をドライアイスで冷却したアセトンで抽出し（アセトン可溶画分）、このアセトン可溶画分について、０．１％トリフルオロ酢酸／４０％アセトニトリル水溶液で抽出した（アセトニトリル可溶画分）。このアセトニトリル可溶画分について逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと称する）で分画を行った。そして各画分について抗菌活性を調べ、抗菌活性を持つ画分を得た（サンプル１）。
【００１１】
当該サンプル１について１２株の細菌（グラム陽性菌４株、グラム陰性菌８株）で抗菌活性を調べた結果、全てに抗菌活性が認められた。また、サンプル１についてペプチド分解酵素処理を行ったところ、抗菌活性の低下が認められた。このことから、サンプル１の抗菌活性成分は、ペプチド結合を有しているものであることが分かった。
【００１２】
このサンプル１を更に逆相カラムを用いたＨＰＬＣで精製を行い、サンプル２およびサンプル３と称する抗菌ペプチドを得た。
サンプル２を加水分解してアミノ酸分析を行った結果、プロリン、グルタミン酸、グリシン、アラニンおよびトレオニンが検出された。また、サンプル３についても同様の操作を行い、イソロイシン、ロイシンおよびチロシン（１：２：１の比率）で検出された。なお、サンプル２で検出されたグルタミン酸は、塩酸加水分解を行った検体を用いてアミノ酸分析を行っているため、ペプチド中での存在がグルタミン酸かグルタミンかは不明である。
サンプル２およびサンプル３ともに、一般的な抗菌ペプチドにおいて抗菌活性の作用点となる塩基性アミノ酸が検出されなかった。また、従来報告されている非カチオン性の抗菌ペプチドとは異なるアミノ酸組成を有し、且つより高い抗菌活性を有していた。
【００１３】
サンプル３の分子量を飛行時間型−質量分析計（ＴＯＦ−Ｍａｓｓ）を用いて測定したところ約ｌ０６５であることが分かった。
【００１４】
本発明の抗菌ペプチドは、各当該ペプチドのアミノ酸配列に従って合成することができる。この合成したペプチドは、セイヨウミツバチの雄蛹から得たサンプル２およびサンプル３と同じ構造および活性を有することは明らかであり、同じ用途に用いることができる。
【００１５】
本発明の抗菌ペプチドは、広い抗菌スペクトルを有していることから、抗菌剤、殺菌剤、消毒剤、防腐剤、防臭剤などの成分として好適に用いられる。例えば、細菌感染症の治療、創傷面の消毒、眼病予防、ロ腔内洗浄（例えばうがい）や練り歯磨き用の抗菌剤または殺菌剤、化粧品の防腐剤、コンタクトレンズの保存、食品の防腐剤や鮮度保持剤、台所用品、浴室用品およびトイレ用品などの静菌剤または殺菌剤、家具や衛生機器表面の殺菌剤または静菌剤などに用いることができる。また、衣類やカーテンなどの繊維製品の静菌剤または殺菌剤、壁や床の静菌剤または殺菌剤、さらには各種用水例えば工業用水、ビル管理用水および浴用水などの殺菌剤、静菌剤または防腐剤などに用いることができる。また、抗菌または殺菌作用から防臭効果も期待できる。更に、農業分野での静菌剤または殺菌剤として、例えば作物や農業資材に対する農薬などとして使用できる。また、畜産・養蜂業分野での静菌剤または殺菌剤として、例えば畜産飼料の防腐剤として、養蜂箱の静菌剤または殺菌剤などに用いることができる。また、漁業分野での静菌剤または殺菌剤として、例えば養魚場において細菌に感染した魚の治療、網や手袋などの資材の殺菌などに用いることができる。
【００１６】
本発明の抗菌ペプチドを含有する抗菌剤の形態に関して特に限定はない。例えば、内用剤および外用剤の典型的な形態として、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏、クリームなどが挙げられる。また、注射などに用いるため、使用直前に生理食塩水などに溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
【００１７】
本発明の抗菌ペプチドを含有する抗菌剤などの製剤において、他の担体すなわち副次的成分（製薬上許容されるもの）としては、抗菌剤などの用途や形態に応じて適宜異なり得るが、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、賦形剤、色素、香料など一般的に製剤として製造するときに用いるものが使用できる。
なお、本発明の抗菌ペプチドおよび種々の担体を材料にして上記形態の各種薬剤を調製するプロセス自体は公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本発明を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。
【００１８】
本発明の抗菌ペプチドによって提供される抗菌剤は、その形態および目的に応じた方法や用量で使用することができる。例えば、液剤は、静脈内、筋肉内、皮下、皮内若しくは腹腔内への注射によって投与することができる。また、錠剤などの固体形態のものは経口投与することができる。このときの投与量は、目的とする菌に対する抗菌活性から算出することができる。
また、衛生陶器表面の消毒（殺菌）や食品の防腐目的に使用する場合は、比較的多量（例えば１〜１００ｍｇ／ｍｌ）の本発明の抗菌ペプチドを含有する液剤を対象物の表面に直接スプレーするか、或いは、当該液剤で濡れた布や紙で対象物の表面を拭くことにより行うことができる。これらは例示にすぎず、従来の抗菌剤による農薬、医薬部外品などの抗菌剤や消毒剤と同じ形態、使用方法を適用することができる。
【００１９】
例えば、放射線治療を受けているガン患者やエイズ患者は、免疫不全症を合併症として発症し、本来の疾病それ自体の原因であることよりも細菌感染により重篤な症状をきたすことがある。本発明によって提供される抗菌ペプチドは、細菌に選択的に抗菌作用を示すとともにヒトなどの哺乳動物に対しては毒性を有しない。このため、本発明に係る抗菌ペプチドは、抗菌剤の成分として有用であり、本発明によって提供される抗菌剤は人体に対して安全に適用することができる。
【００２０】
再生医療の分野において、皮膚、骨、各種の臓器などの培養時における細菌感染を防止することを目的として本発明の抗菌ペプチドを用いることができる。例えば、適当な濃度で本発明の抗菌ペプチド単独または当該ペプチドを成分の一つとする抗菌剤を培養液中に添加することにより、培養中の組織や臓器などの細菌感染を防止することができる。
【００２１】
また、培養細胞や培養組織に対して、本発明の抗菌ペプチドをコードするポリヌクレオチドを遺伝子治療に使用する素材として用いることができる。例えば、本発明の抗菌ペプチドをコードする遺伝子（ＤＮＡセグメントまたはＲＮＡセグメント）を適当なベクターに組み込み、目的とする培養組織（細胞）に導入することにより、常時或いは所望する時期に培養組織（細胞）内で、本発明の抗菌ペプチドを発現させることが可能となる。従って、本発明の抗菌ペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡセグメントまたはＲＮＡセグメント）は、培養組織（細胞）の細菌感染を防止する薬剤として有用である。
【００２２】
本発明の抗菌ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、いわゆる遣伝子治療に使用する素材として用いることができる。例えば、本発明の抗菌ペプチドをコードする遺伝子（ＤＮＡセグメントまたはＲＮＡセグメント）を適当なベクターに組み込み、目的とする部位に導入することにより、常時生体（細胞）内で本発明の抗菌ペプチドを発現させることが可能となる。従って、本発明の抗菌ペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡセグメントまたはＲＮＡセグメント）は、上述した患者などに対し、細菌感染を予防または治療する薬剤として有用である。
【００２３】
【実施例】
以下に説明する実施例によって、本発明を更に詳細に説明するが、本発明は実施例に示すものに限定するものではない。
【００２４】
＜実施例１＞
○抗菌ペプチド成分の抽出
孵化２０日後のセイヨウミツバチの雄蛹１１５匹を採取し、エタノール／ドライアイスで凍結した。この凍結蛹にドライアイスで冷却したアセトンを添加し、乳鉢中で粉砕した。粉砕したサンプルについて４℃で１０分間遠心分離（２５００×ｇ）を行い、上清を得た（アセトン可溶画分）。このアセトン可溶画分について、減圧濃縮（７０℃）を行った後、氷冷下で残留物に０．１％トリフルオロ酢酸／４０％アセトニトリル水溶液を入れて撹拌・抽出した。この抽出物を４℃で５分間遠心分離（２２５００×ｇ）を行い、上清を得た（アセトニトリル可溶画分）。このアセトニトリル可溶画分について逆相カラムを用いたＨＰＬＣで分画を行った。ＨＰＬＣの条件は、Ｃ１８逆相プレカラム（Ｇｕａｒｄ−Ｐａｋ社製品、製品名Ｄｅｌｔａｐａｋ　Ｃ１８Ａ３００）およびＣ１８逆相カラム（ダイソー社製、ＤＡＩＳＯＰＡＫ　ＳＰ−１２０−５−ＯＤＳ−ＡＰ、２０ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ）を使用し、Ａ液：０．１％トリフルオロ酢酸／２０％アセトニトリル水溶液とＢ液：０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル溶液によるグラジエントクロマトグラフィーである。グラジエント条件は、最初の３分間はＡ液のみを流し、その後、２４分間かけてＢ液の比率を１００％になるようなリニアグラジエントである。また、５ｍｌ／分の流速で、２２０ｎｍ検出で分画を実施した。
溶出時間および２２０ｎｍ吸収により分画を行い、各画分は減圧下で溶媒を留去した。得られた各画分についてＳｔａｐｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ＩＦＯ−１２７３２（以下Ｓ．　ａｕｒｅｕｓと称する）に対する抗菌活性を調べた。この結果、溶出時間が１０〜１４分の画分に抗菌が認められた（サンプル１）。
【００２５】
○サンプル１の抗菌活性
サンプル１について１２種類の細菌に対する抗菌活性を下記記載の試験法を用いて調べた。この結果を下記表１に示す。
【００２６】
○抗菌活性試験法
１．供試菌をＬ−ｂｒｏｔｈ　５ｍｌに植菌し、３７℃で２４時間前培養した。
２．前培養した菌液がＯＤ６６０の吸光度（濁度）が０．１になるようにＮＢ溶液で調製した。
３．滅菌シャーレに標準寒天培地を入れて固化させたものに、２で調製した菌液１００μｌを入れて、滅菌綿棒（栄研器材（株）製）で均一に塗布した。
４．３で作製したプレートにペニシリンカップ（内径６ｍｍ、外径８ｍｍ、高さ１０ｍｍ）を置き、この中に検定試料を１０μｌ入れた。
５．４のプレートを３７℃で２４時間培養し、阻害直径（ペニシリンカップの外径を減じて表示）を測定した。
【００２７】
○使用培地
Ｌ−ｂｒｏｔｈ：１．０質量％のバクトトリプトン（商品名、Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５質量％の酵母抽出物（ＯＸＯＩＤ社製）、０．５質量％の塩化ナトリウム（関東化学社製）を含有するように蒸留水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．０〜７．２に調整した後、オートクレーブ（１２１℃、２０分間）で滅菌した。
ＮＢ溶液：ＮＵＴＲＩＥＮＴ　ＢＲＯＴＨ　ＤＥＨＹＤＲＡＴＥＤ（Ｄｉｆｃｏ社製）。
標準寒天培地：日水製薬社製の標準寒天培地
【００２８】
○供試菌
・グラム陽性菌
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ＩＦＯ１２７３２
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ＮＩＨ　ＪＣ１（ＭＲＳＡ）
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＡＴＣＣ６６３３
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ　ＩＦＯ１５３０
・グラム陰性菌
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＩＦＯ１２７１３
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｏ１５７：Ｈ７　ｓａｋａｉ
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ＡＴＣＣ２７５８３
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　ＡＴＣＣ４３５２
Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｍｉｒａｂｉｌｉｓ　ＩＦＯ３８４９
Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　ＡＴＣＣ１３３１５
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　ＩＦＯ１３２４
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ　ＩＦＯ３３１３
【００２９】
【表１】
2004107275.tif 000002
【００３０】
＜実施例２＞
○抗菌活性に対するペプチド分解酵素の影響
実施例１で得たサンプル１についてペプチド分解酵素であるｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ（酵素濃度１ｍｇ／ｍｌ、３７℃、６時間処理）で処理した。そして、ペプチド分解酵素処理前後の検体についてＳ．　ａｕｒｅｕｓに対する抗菌活性を調べた。この結果、ペプチド分解酵素処理により抗菌活性が低下することが認められた。
このことから、サンプル１中の抗菌成分がペプチドであることが示唆された。
【００３１】
＜実施例３＞
○抗菌ペプチドの精製
実施例１で得たサンプル１を更に逆相カラムを用いたＨＰＬＣで活性成分の精製を行った。このＨＰＬＣの条件は、Ｃ１８逆相プレカラム（Ｇｕａｒｄ−Ｐａｋ社製品、製品名Ｄｅｌｔａｐａｋ　Ｃ１８Ａ３００）およびＣ１８逆相カラム（ダイソー社製、ＤＡＩＳＯＰＡＫ　ＳＰ−１２０−５−ＯＤＳ−ＡＰ、２０ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ）を使用し、Ａ液：０．１％トリフルオロ酢酸／２０％アセトニトリル水溶液とＢ液：０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル溶液によるグラジエントクロマトグラフィーである。グラジエント条件は、最初の３分間はＡ液のみを流し、その後、４３分間かけてＢ液の比率を１００％になるようなリニアグラジエントである。また、流速は３．０ｍｌ／分で、検出は２２０ｎｍの波長で実施した。溶出液の分画は、２２０ｎｍの吸収に従って行った。
得られた各画分についてＳ．　ａｕｒｅｕｓを用いた抗菌活性を調べた結果、サンプル２と称する活性画分（約１６〜１８分のピーク）とサンプル３と称する活性画分（約２０〜２２分のピーク）を得た。このＨＰＬＣの溶出パターンとサンプル２（図１の矢印２の溶出位置）およびサンプル３（図１の矢印３の溶出位置）の溶出位置を図１に示す。
【００３２】
＜実施例４＞
○サンプル２およびサンプル３のアミノ酸組成
サンプル２およびサンプル３をそれぞれ真空密封管内で加水分解（６Ｍ−塩酸、１１０℃、２４時間）を行った後、各試料を自動アミノ酸分析機でアミノ酸の分析を行った。
この結果、サンプル２からは、プロリン、グルタミン酸、グリシン、アラニンおよびトレオニンの、サンプル３からは、イソロイシン、ロイシンおよびチロシン（１：２：１の比率）のアミノ酸が検出された。
サンプル２およびサンプル３には、一般的な抗菌ペプチドにおいて抗菌活性の作用点となる塩基性ペプチドが含まれていなかった。
【００３３】
＜実施例５＞
○サンプル３の分子量測定
サンプル３の分子量についてＴＯＦ−Ｍａｓｓを用いて測定したところ、ｌ０６５にピークが観察され、これを分子量ピークと推定した。
ＴＯＦ−Ｍａｓｓは、ＫＲＡＴＯＳ質量分折装置　ＫＯＭＰＡＣＴ　ＭＡＬＤＩ　ＩＩＩ（島津製作所社製）を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｌａｓｅｒ　Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ　Ｔｉｍｅ　ｏｆ　Ｆｌｉｇｈｔ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：マトリックス支援レーザーイオン化−飛行時間型−質量分析）を用いた。
【００３４】
＜比較例１〜３＞
○比較例用の抗菌ペプチドの合成
抗菌活性の比較対象物とするため、Ｋ．Ｂｒｏｇｄｅｎらが報告した（Ｋ．Ｂｒｏｇｄｅｎ，外２名，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，１９９７年，４１巻，ｐ．１６１５−１６１７）アニオン性の抗菌ペプチドを３種類合成した。すなわち、比較例１の抗菌ペプチドとしては６アミノ酸残基（Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）のものを、比較例２の抗菌ペプチドとしては７アミノ酸残基（Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）のものを、および比較例３の抗菌ペプチドとしては９アミノ酸残基（Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）のものを合成した。
上述した各ペプチドは、市販のペプチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＡＢＩ　４３３Ａ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いてＦａｓｔ　ＭｏｃＴＭ　ｐｒｏｔｏｃｏｌに従い固相合成法（Ｆｍｏｃ法）により合成した。
【００３５】
＜実施例６＞
○最小発育阻止試験
サンプル２およびサンプル３並びに比較例１、比較例２および比較例３の検定薬剤について、Ｓ．　ａｕｒｅｕｓに対する最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を液体培地希釈法により求めた。
検定薬剤は、ＮＢ溶液を用いて１段２倍希釈で１０段階行った希釈系列を作製した。ただし、水溶性の低いものは、あらかじめ５０％エチルアルコール／無菌水または８０％エチルアルコール／無菌水を用いて調製した薬剤溶液を用い、最終的にアルコール濃度が菌の成長に影響しない１％以下となるように希釈系列を作製した。
Ｓ．　ａｕｒｅｕｓをＬ−ｂｒｏｔｈ　５ｍｌに植菌し、３７℃で１８時間静置培養（前培養）を行った。当該菌液は、電子冷熱式恒温セルホルダ付き分光光度計を用いて、菌濃度が２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにＮＢ溶液で調製した（検定菌液）。
各所定濃度の希釈系列の薬剤溶液を９６ｗｅｌｌマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１５０μｌずつ分注し、これに検定菌液を１５０μｌずつ加えて、３７℃で２４時間静置培養した。培養後、各検定薬剤における菌の増殖を濁度により測定（６６０ｎｍ）し、ＭＩＣを算出した。この結果を表２示す。なお、表２のＭＩＣの単位はμｇ／ｍｌである。
【００３６】
【表２】
2004107275.tif 000003
【００３７】
【発明の効果】
本発明の抗菌ペプチドは、食用として用いられるハチの子由来であることから本質的に人体に対して安全と考えられる。また、本発明の抗菌ペプチドは、非カチオン性のため負に帯電した共存物への吸着が生じない新しいタイプの抗菌剤として、食品保存料、抗菌剤、抗菌物質として広い範囲での応用が可能である。
【００３８】
【図面の簡単な説明】
【図１】サンプル２およびサンプル３の逆相ＨＰＬＣ溶出パターン
横　軸：溶出時間（分）
左縦軸：２２０ｎｍの吸光度を示す
右縦軸：アセトニトリルの濃度（％）を示す
実　線：２２０ｎｍ吸収における溶出パターン
点　線：アセトニトリルの濃度
２：サンプル２の溶出位置
３：サンプル３の溶出位置
【図１】
2004107275.tif 000004