(57)【要約】【課題】　骨および軟骨の形成を誘導する新規蛋白およびそれを含む医薬組成物を提供する。【解決手段】　骨および軟骨の形成を誘導するための、ＢＭＰ−９蛋白および医薬上許容される担体を含有する医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　医薬上許容される担体との混合物となっている有効量の配列番号：９の１〜１１０番目のアミノ酸からなるＢＭＰ−９蛋白からなる骨および／または軟骨の形成を誘導するための医薬組成物。
【請求項２】
　さらに該組成物を支持し、骨および／または軟骨の成長のための表面を提供するためのマトリックスからなる請求項１記載の組成物。
【請求項３】
　該マトリックスが、ヒドロキシアパタイト、コラーゲン、ポリ乳酸およびりん酸三カルシウムからなる群より選択される物質よりなる請求項２記載の該組成物。
【請求項４】
　医薬上許容される担体中の有効量の配列番号：９の１〜１１０番目のアミノ酸からなるＢＭＰ−９蛋白からなる傷の治療および組織の修復のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、ＢＭＰ−９と命名された精製蛋白の新規な族およびその製法に関する。これらの蛋白を、骨および／または軟骨の形成を誘導するために用いることができ、さらに傷の治療ならびに組織の修復に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
　骨および／または軟骨の形成を誘導すると考えられる蛋白がいくつか見出され、傷の治療ならびに組織の修復に使用する試みがなされていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
　それゆえ、骨および／または軟骨の形成を誘導する有効な新規蛋白を見出し、傷の治療ならびに組織の修復ににおいて使用することが本の課題である。
【課題を解決するための手段および発明を実施するための最良の形態】
【０００４】
　ネズミ・ＢＭＰ−９のＤＮＡ配列（配列番号：１）およびアミノ酸配列（配列番号：２）を図１に示す。ヒト・ＢＭＰ−９の配列を図３（配列番号：８および９）に示す。ＢＭＰ−９蛋白は、軟骨および／骨の形成を誘導しうると考えられている。ＢＭＰ−９蛋白を、以下に記載したラットの骨形成試験における軟骨および／または骨の形成活性を示す能力によってさらに特徴づけてもよい。
　ネズミ・ＢＭＰ−９を、図１の３１９〜４２８番目からなるアミノ酸（配列番号：２、アミノ酸１〜１１０番目）により特徴づける。ネズミ・ＢＭＰ−９を、図１に示した６１０〜１８９３番目のヌクレオチドからなるＤＮＡ配列で形質転換された細胞を培養することにより生成させ、培養基から、同時に生成される蛋白性物質を実質的に含有しない図１（配列番号：２）に示す３１９〜４２８番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列により特徴づけられる蛋白を回収し、精製する。
【０００５】
　ヒト・ＢＭＰ−９は、ネズミ・ＢＭＰ−９と相同的であると期待され、図３（配列番号：９）の１番目のアミノ酸（Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）から１１０番目のアミノ酸（Ａｒｇ）に至るアミノ酸からなる配列により特徴づけられる。本発明は、ヒト・ＢＭＰ−９をコードしているＤＮＡ配列を得る方法を包含する。この方法は、ネズミ・ＢＭＰ−９のヌクレオチド配列またはその一部を用いることを必要とし、標準的方法を用いて、ヒト・遺伝子またはその断片について、ライブラリーを検索するためのプローブを設計するものである。ヒト・ＢＭＰ−９を、該ＢＭＰ−９のＤＮＡ配列で形質転換された細胞を培養することにより生成させ、培養基から回収して該ＢＭＰ−９を精製してもよい。発現した蛋白を単離、回収し、培養基中から精製する。精製された発現蛋白は、他の汚染源からの蛋白性物質のみならず同時に生成される他の蛋白性物質を実質的に含まない。該回収された精製蛋白は、軟骨および／または骨の形成能を示すと考えられる。さらに、本発明の蛋白を、以下に記載のラットの骨の形成試験における軟骨および／骨の形成能によって特徴づけてもよい。
　ヒト・ＢＭＰ−９を、配列番号：８に示した１２４〜４５３番目のヌクレオチドからなるＤＮＡ配列により形質転換した細胞を培養すること、および同時に生成される他の蛋白性物質を実質的に含んでいない配列番号：９の１〜１１０番目のアミノ酸からなる配列により特徴づけられる蛋白を、培養基から回収し精製することにより得てもよい。
【０００６】
　本発明のもう１つの態様は、治療に有効な量のＢＭＰ−９蛋白を医薬上許容される担体または賦形剤中に含む医薬組成物を提供する。本発明のＢＭＰ−９組成物を、軟骨の形成に用いてもよい。さらに、これらの組成物を、骨の形成に用いてもよい。ＢＭＰ−９組成物を、傷の治療および組織の修復に用いてもよい。本発明組成物は、さらに、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７（例えばＰＣＴ公開ＷＯ８８／００２０５号、ＷＯ８９／１０４０９号、ＷＯ９０／１１３６６号に開示）ならびにＢＭＰ−８蛋白（１９９１年１月１５日付け米国特許出願第０７／６４１，２０４号、１９９０年５月１６日付け第０７／５２５，３５７号および１９９１年１１月２０日付け第０７／８００，３６４号に開示）のごとき治療上有用な薬剤を少なくとも１種含有していてもよい。
　本発明組成物は、ＢＭＰ−９蛋白の他に、上皮成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）およびインシュリン様成長因子（ＩＧＦ）のごとき成長因子を含む他の治療上有用な薬剤からなっていてもよい。該組成物はまた、例えば、該組成物を支持し、骨および／または軟骨成長のための表面を提供するための適当なマトリックスを含有していてもよい。該マトリックスは、骨形成誘導性蛋白を徐々に遊離させ、そして／またはその機能発現のための適当な環境を提供しうるものである。
　ＢＭＰ−９組成物を、多くの骨および／または軟骨の欠損、歯周疾患および種々の傷の治療方法に使用してもよい。本発明によれば、これらの方法は、骨および／または軟骨の形成、傷の治療あるいは組織の修復を必要とする患者に、ＢＭＰ−９蛋白の有効量を投与することを必要とする。これらの方法はまた、上記共同出願に開示された少なくとも１種の新規ＢＭＰ蛋白とともに本発明蛋白を投与することを必要とする。さらに、これらの方法はまた、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−βおよびＩＧＦを含む他の成長因子とともにＢＭＰ−９蛋白を投与することを包含する。
【０００７】
　本発明のさらにもう１つの態様は、ＢＭＰ−９蛋白の発現についてコードしているＤＮＡ配列である。かかる配列は、図１（配列番号：１）および図３（配列番号：８）に示した５’から３’方向へのヌクレオチド配列あるいは図１または図３のＤＮＡ配列と緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列を含んでおり、軟骨および／または骨の形成を誘導する能力のある蛋白をコードしている。結局、図１または図３の配列の相同遺伝子あるいは他の変化は、かかる核酸の変化が該ペプチド配列の変化を引き起こすか否かにかかわらず、本発明に包含される。
【０００８】
　本発明のさらなる態様は、発現調節配列に作動可能に連結した上記ＤＮＡ配列からなるベクターを包含する。これらのベクターを、本発明のＢＭＰ−９蛋白生成のための新規方法に用いてもよい。該新規方法においては、ＢＭＰ−９蛋白の発現調節配列に作動可能に連結したＢＭＰ−９蛋白配列をコードしているＤＮＡ配列で形質転換された細胞系を適当な培地で培養し、ＢＭＰ−９蛋白を回収し、精製する。この方法は多くの既知の原核細胞および真核細胞双方を、該ペプチド発現用宿主細胞として用いることができる。
　本発明の他の態様および利点は、以下の詳細な説明およびその好ましい具体例を考慮すれば明白である。
【０００９】
　ネズミ・ＢＭＰ−９のヌクレオチド配列（配列番号：１）およびコードされるアミノ酸配列（配列番号：２）を図１に示す。本発明の精製ネズミ・ＢＭＰ−９蛋白を、図１（配列番号：１）の６１０〜１８９３番目のヌクレオチドからなるＤＮＡ暗号配列で形質転換された宿主細胞を培養することにより生成させ、培養基から、当該アミノ酸配列または図１（配列番号：２）の３１９〜４２８番目のアミノ酸により表される配列と実質的に相同的な配列を有する蛋白を回収し精製する。培養基から回収したＢＭＰ−９蛋白を、同時に生成する他の蛋白性物質および存在する他の汚染物質から単離することにより精製する。
【００１０】
　ヒト・ＢＭＰ−９ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を配列番号：８および９に示す。成熟したヒト・ＢＭＰ−９は、１（Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）〜１１０番目（Ａｒｇ）のアミノ酸からなると考えられる。
　ヒト・ＢＭＰ−９を、配列番号：８に示した１２４〜４５３番目のヌクレオチドからなるＤＮＡ配列で形質転換された細胞を培養すること、および同時に生成される他の蛋白性物質を実質的に含まない配列番号：９の１〜１１０番目のアミノ酸配列により特徴づけられる蛋白を培地から回収し精製することにより得てもよい。
　ＢＭＰ−９蛋白を、軟骨形成誘導能により特徴づけてもよい。ＢＭＰ−９を、さらに、骨形成誘導能により特徴づけてもよい。さらに、ＢＭＰ−９を、下記のラットの骨形成試験における骨および／または軟骨形成活性を示す能力により特徴づけてもよい。
【００１１】
　また、本発明により提供されるＢＭＰ−９蛋白は、図１および図３(配列番号:１および８)の配列と同様の配列によりコードされている因子を含むが、その修飾は、その中へ自然に導入されるか（例えば、ポリペプチド中のアミノ酸の変化を生じるヌクレオチド配列中の相同的変異）または計画的に遺伝子操作により導入される。例えば、合成ポリペプチドが、図１または図３（配列番号：２または９）の全部または一部において重複した連続的なアミノ酸配列を有していてもよい。これらの配列は、１次、２次または３次構造およびコンフォーメーション上の特徴を図１および図３の骨成長因子のポリペプチドと共有することにより、それらに共通した骨成長因子の生物学的特性を持ちうる。よって、それらを、天然に存在するＢＭＰ−９および他のＢＭＰ−９ポリペプチドの生物学的活性のある代用物として、治療方法に用いてもよい。
【００１２】
　本明細書記載のＢＭＰ−９蛋白配列の他の特異的突然変異は、糖鎖付加部位の修飾を包含する。これらの修飾はＯ−結合型またはＮ−結合型糖鎖付加部位を含んでいてもよい。例えば、糖鎖付加がないこと、あるいはごく部分的な糖鎖付加は、アスパラギン結合糖鎖付加認識部位におけるアミノ酸の置換または欠失による。アスパラギン結合糖鎖付加認識部位は、細胞の適当な糖鎖付加酵素により特異的に認識されるトリペプチド配列からなる。これらのトリペプチド配列は、アスパラギン−Ｘ−スレオニンまたはアスパラギン−Ｘ−セリンのいずれかであり、ここにＸは通常いかなるアミノ酸であってもよい。糖鎖付加認識部位の１番目または３番目のアミノ酸のうちの１個または両方における種々のアミノ酸置換あるいは欠失（および／または２番目のアミノ酸の欠失）は、当該修飾トリペプチド配列において糖鎖付加を生じない。
【００１３】
　本発明はまた、他の蛋白性物質をコードしているＤＡＮ配列に連結していない新規ＤＮＡ配列を包含し、該配列は、ＢＭＰ−９蛋白の発現をコードしている。これらのＤＮＡ配列は、図１または図３（配列番号：１および８）に５'から３'方向に示されたものを含み、緊縮条件下でそれらとハイブリダイズし（ティー・マニアティス(T.Maniatis)ら，モレキュラー・クローニング（ア・ラボラトリー・マニュアル）(Molecular Cloning(A Laboratory Manual)，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)（１９８２年），３８７〜３８９頁参照）、かつ軟骨および／または骨誘導活性を有する蛋白をコードしている。
　同様に、図１または図３の配列によりコードされたＢＭＰ−９蛋白についてコードしているが、遺伝暗号の縮重あるいは相同的変異（特定の遺伝子におけるアミノ酸変化を生じない自然に生じる塩基変化）によりコドンに相違を生じたＤＮＡ配列もまた、本明細書記載の新規因子をコードしている。点突然変異または誘導的修飾（挿入、欠失および置換を含む）を生じさせて、その活性、半減期あるいはコードされたポリペプチド生産を増加させた図１または図３（配列番号：１および８）のＤＮＡ配列の変化もまた本発明の範囲内である。
【００１４】
　本発明の別の態様は、ＢＭＰ−９蛋白の新規製法を提供する。本発明方法は、既知の調節配列の制御下、本発明のＢＭＰ−９蛋白をコードしているＤＮＡ配列により形質転換された適当な細胞系を培養することを包含する。形質転換された細胞を培養し、ＢＭＰ−９蛋白を培養基から回収し精製する。該精製蛋白は、他の汚染物質のみならず同時に生成される他の蛋白を実質的に含有しない。
　適当な細胞または細胞系は、チャイニーズ・ハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）のごとき哺乳動物細胞であってよい。適当な哺乳動物宿主細胞の選択および形質転換、培養、増幅、検索、生成物の生産ならびに精製のための方法は、当該分野において知られている。ゲシング(Gething)およびサムブルック(Sambrook)，ネイチャー(Nature)，第２９３巻，６２０〜６２５頁（１９８１年）あるいはその代わりにカウフマン(Kaufman)ら，モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Mol.Cell.Biol.)，第５巻，第７号，１７５０〜１７５９頁（１９５８年）またはハウリー(Howley)らの米国特許第４，４１９，４４６号参照。以下の実施例記載のもう１つの適当な哺乳動物細胞系は、サル・ＣＯＳ−１細胞系である。哺乳動物細胞ＣＶ−１もまた適当である。
　細菌細胞もまた適当な宿主である。例えば、種々のイー・コリ(E.coli)株（例えば、ＨＢ１０１株、ＭＣ１０６１株）は、バイオテクノロジーの分野ではよく知られた宿主細胞である。種々のバシルス・ズブチリス(B.subtilis)、シュードモナス(Pseudomonas)、他のバシルス属およびそれに類する菌株もまた本方法に使用できる。
　当業者に知られた多くの酵母細胞菌株もまた、本発明ポリペプチド発現用宿主細胞として入手可能である。さらに、所望であれば、昆虫細胞も本発明方法の宿主細胞として用いることができる。ミラー(Miller)ら，ジェネティック・エンジニアリング(Genetic Engineering)，第８巻，２２７〜２９８頁（プレナム・プレス(Prenum Press)（１９８６年））およびその中で引用された文献参照。
【００１５】
　本発明のもう１つの態様は、これらの新規ＢＭＰ−９ポリペプチドの発現方法に用いるベクターを提供する。好ましくは、該ベクターが、本発明の新規因子をコードしている上記新規ＤＮＡ配列全体を含むものとする。さらに、該ベクターもまた、ＢＭＰ−９蛋白配列を発現させる適当な発現調節配列を含むものとする。別法として、上述のごとき修飾配列を含むベクターもまた、本発明の具体例である。該ベクターを細胞系の形質転換に用いてもよく、該ベクターが、選択された宿主細胞における複製および発現をつかさどることができる本発明のＤＮＡ暗号配列に作動可能に連結した選択された調節配列を含んでいてもよい。かかるベクターの調節配列は当業者に知られており、宿主細胞に応じて選択することができる。かかる選択は通常のものであって、本発明の一部を形成するものではない。
【００１６】
　骨が正常に形成されない環境において、軟骨および／または骨の形成を誘導する本発明蛋白を、ヒトや他の動物における骨折および軟骨欠損の治療に適用する。ＢＭＰ−９を用いたかかる組成物を、解放骨折のみならず閉鎖骨折ならびに人工関節の固定化の改善において、予防的に利用してもよい。骨形成性物質により誘導されるデ・ノボ(de novo)骨形成は、先天的に、外傷によりあるいは腫瘍切除により誘発される頭蓋と顔の中隔欠損の修復に貢献し、また整形・形成外科においても有用である。ＢＭＰ−９蛋白を、歯周病の治療および他の歯の治療方法に用いてもよい。かかる物質は、骨形成細胞を引き寄せ、骨形成細胞の成長を刺激し、あるいは骨形成細胞の前駆細胞の分化を誘導するための環境を提供しうる。本発明のＢＭＰ−９ポリペプチドは骨粗鬆症の治療にも有用である。種々の骨形成性、軟骨誘導性および骨誘導性因子が記載されている。それを検討するには欧州特許出願第１４８，１５５号および第１６９，０１６号を参照。
　本発明蛋白を、傷の治療および関連組織の修復に用いてもよい。傷の形態は熱傷、切開および潰瘍を含むが、これらに限定されない（例えば、傷の治療および関連組織の修復の議論のためにはＰＣＴ公開ＷＯ８４／０１１０６号参照）。
　さらに、本発明蛋白は、神経の生存を増加させ、それゆえ、移植および神経の生存の減少を示す症状の治療に有用であると考えられている。
【００１７】
　本発明のさらなる態様は、骨折および軟骨および／または骨の欠損あるいは歯周病に関連する他の症状の治療のための方法ならびに組成物である。本発明はさらに、傷の治療および組織の修復のための治療方法および組成物を包含する。かかる組成物は、医薬上許容される担体、賦形剤またはマトリックスとの混合物としての少なくとも１種の本発明ＢＭＰ−９蛋白の治療的有効量からなる。
【００１８】
　本発明蛋白が、他の関連蛋白および成長因子と関連してあるいはおそらく共同的に作用しうると期待される。それゆえ、本発明のさらなる治療方法および組成物は、上記共同出願に開示された他のＢＭＰ蛋白の治療的有効量を伴った少なくとも１種の本発明ＢＭＰ−９蛋白の治療的有効量からなる。かかる混合物が、ＢＭＰ蛋白の個々の分子あるいは異なるＢＭＰ分子の一部分からなる異形分子からなっていてもよい。例えば、本発明方法および組成物が、ＢＭＰ−９蛋白サブユニットおよび上記「ＢＭＰ」蛋白の１つに由来するサブユニットからなるジスルフィド結合した二量体からなっていてもよい。さらなる具体例は、ＢＭＰ−９の一部分のヘテロ二量体を包含する。さらに、対象となる骨／および／または軟骨欠損、傷あるいは組織の治療に有益である他の薬剤とＢＭＰ−９蛋白とを組み合わせてもよい。これらの薬剤は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）およびインシュリン様成長因子（ＩＧＦ）のごとき種々の成長因子を包含する。
　ｐＨ、等張性、安定性等に関するかかる生理学的に許容される蛋白組成物の調製および処方は、当該分野の技術的範囲内である。該治療用組成物は、ＢＭＰ蛋白の種特異性が乏しいために、目下、獣医学的な応用にも重要となっている。ヒトの他には、特に、家畜およびサラブレッドの馬が、本発明ＢＭＰ−９蛋白でのかかる治療の望ましい対象である。
【００１９】
　該治療方法は、移植片または器具による該組成物の局所的、全身的あるいは局部的投与を包含する。投与の際には、本発明で使用する該治療用組成物は、勿論、発熱原がなく生理学的に許容される形態である。さらに、該組成物を、望ましくは、カプセルに入れるか、または粘性のある形態として注入して骨、軟骨あるいは組織損傷部位に到達させる。局所的投与は傷の治療および組織修復に適するであろう。ＢＭＰ−９以外の治療上有用な薬剤を、所望により上記組成物に含有させてもよく、本発明方法において、別法としてあるいは付加的に該ＢＭＰ組成物とともに同時または連続的に投与してもよい。
　好ましくは、骨および／または軟骨形成のためには、該組成物が、骨および／または軟骨損傷部位にＢＭＰ−９あるいは他のＢＭＰ蛋白を送達し、骨および軟骨の成長に適した構造を提供し、最適に体内に再吸収されるマトリックスを含有するものとする。該マトッリックスは、ＢＭＰ−９を徐々に放出し、そして／あるいはその機能発現に適した環境を提供しうるものである。かかるマトリックスを、他の体内移植用外用薬に直ちに用いる材料の形態としてもよい。
【００２０】
　マトリックス材料の選択を、生体適合性、生分解性、機械的特性、美容的外観および界面特性に基づいて行う。ＢＭＰ−９組成物の特殊な応用は，適当な処方を決定するであろう。当該組成物に都合のよいマトリックスは、生分解性であり化学的に性質の分かっている硫酸カルシウム、りん酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ無水物である。他の都合のよい材料は、骨または皮膚コラーゲンのごとき生分解性であり生物学的に性質のよく分かっているものである。さらに、マトリックスは純粋な蛋白または細胞外マトリックス成分からなる。他の都合のよいマトリックスは、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオグラス、アルミン酸塩あるいは他のセラミックスのごとき非生分解性であり化学的に性質の分かっているものである。マトリックスが、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイト、またはコラーゲンおよびりん酸三カルシウムのごとき上述したいずれかの形態の材料の混合物からなっていてもよい。カルシウム−アルミン酸塩−りん酸中のごとき組成物中においてバイオセラミックスを変更し、孔のサイズ、粒子のサイズ、粒子の形態および生分解性を変化させてもよい。
　担当医師は、ＢＭＰ−９蛋白の作用を調節する種々の因子、例えば、形成されることが望まれる骨の重量、骨の損傷部位、損傷した骨の状態、傷の大きさ、損傷組織の形態、患者の年令、性別、食事、何等かの感染症の重篤性、投薬期間および他の医療上の因子を考慮したうえで投薬規則を決定する。再構成に使用するマトリックスの形態および組成物中のＢＭＰ蛋白の形態により薬用量を変更してもよい。最終組成物へのＩＧＦ−Ｉ（インシュリン様成長因子Ｉ）のごとき他の知られた成長因子の添加もまた、薬用量に影響しうる。骨の成長および／または修復を、例えば、Ｘ線、組織形態的分析およびテトラサイクリン標識のごとき定期的な分析により、経過をモニターする。
【００２１】
　後で示す実施例は、ネズミ・ＢＭＰ−９蛋白の回収ならびに特徴付け、およびネズミ・ＢＭＰ−９蛋白を用いてヒトおよび他のＢＭＰ−９蛋白を回収すること、そして該蛋白を組換え手法により発現させることにおける本発明の実施を説明する。
【実施例１】
【００２２】
ネズミ・ＢＭＰ−９
　ラムダＺＡＰベクター（ストラタジーン社製／カタログ番号９３５３０２）中に構築された７５０，０００個のマウス・肝臓ｃＤＮＡライブラリーをプレーティングし、複製ニトロセルロースレプリカを作成する。図２（配列番号：３）（ヒト・ＢＭＰ−４配列）の１３３０〜１６２７番目のヌクレオチドに相当するヒト・ＢＭＰ−４　ＤＮＡを、ランダムプライミング法（ファインベルグ(Feinberg)ら，アナリティカル・バイオケミストリー(Anal.Biochem.)，第１３２巻，６〜１３頁（１９８３年））により３２Ｐで標識し、６０℃のＳＨＢ中で双方の組のフィルターに２〜３日ハイブリダイズさせる。双方の組のフィルターを、緊縮条件下（４ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，６０℃）で洗浄する。多くの移し取られた種々の強度のハイブリダイズしている組み換え体（約９２個）が観察される。５０個の最も強くハイブリダイズしている組み換えバクテリオファージをプラーク精製し、その挿入物を、製造者（ストラタジーン社）により記載されたインビボ切形法に従いブルースクリプト(Bluescript)ＳＫ（＋／−）プラスミドに移行させる。数種の組み換え体のＤＮＡ配列分析は、それらが他のＢＭＰ蛋白および他のＴＧＦ−β族の蛋白と相同性のある蛋白をコードしていることを示す。ＭＬ１４ａと命名した１個の組み換え体のＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を図１(配列番号:１)に示す。
　クローンＭＬ１４ａのヌクレオチド配列は、４２８個のアミノ酸からなるＢＭＰ−９蛋白をコードしている１２８４ｂｐのオープン・リーディング・フレームを有する。３つのリーディング・フレームすべてにおける終止コドンを伴う６０９ｂｐの５’非翻訳配列が当該暗号配列の前に存在するために、コードされている４２８個のアミノ酸からなるＢＭＰ−９蛋白は、１次翻訳産物であると考えられる。該４２８個のアミノ酸配列は、４８，０００ダルトンの分子量のＢＭＰ−９蛋白を予測させる。
　他のＢＭＰ蛋白およびＴＧＦ−β族の他の蛋白に関する知見に基づいて、前駆体ポリペプチドが、提案されて意見が一致している蛋白分解プロセッシング配列Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇと一致した多重塩基性配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇにおいて開裂されるものと予測される。この位置でのＢＭＰ−９前駆体ポリペプチドの開裂が、３１９番目のＳｅｒの位置から始まる１１０個のアミノ酸からなる成熟ペプチドを生じるのであろう。ＢＭＰ−９の成熟形態へのプロセッシングは、関連蛋白ＴＧＦ−βのプロッセシング（エル・イー・ジェントリー(L.E.Gentry)ら，モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Moll.Cell.Biol.)，第８巻，４１６２頁（１９８８年）；アール・デリンク(R.Derynck)ら，ネイチャー(Nature)，第３１６巻，７０１頁（１９８５年））と類似の機構による二量体化およびＮ−末端領域の除去を含むものと考えられる。
　それゆえ、ネズミ・ＢＭＰ−９の成熟活性種は、そのサブユニットのそれぞれが３１９〜４２８番目のアミノ酸からなり、推定分子量約１２，０００ダルトンの２個のポリペプチドサブユニットのホモ二量体からなると考えられる。さらなる活性種は、１個目の保存されたシイステイン残基を含む３２６〜４２８番目のアミノ酸からなると考えられる。ＢＭＰおよびＴＧＦ−β族の蛋白の他の構成種と同様、ＢＭＰ−９蛋白のカルボキシ末端領域は、多くのアミノ末端部分よりも高い配列保存性を示す。対応する他のヒト・ＢＭＰ蛋白および他のＴＧＦ−β族に属する蛋白に対する、システインに富むＣ末端領域（３２６〜４２８番目のアミノ酸）におけるネズミ・ＢＭＰ−９蛋白のアミノ酸の同一性のパーセント値は以下のごとくである。ＢＭＰ−２　５３％、ＢＭＰ−３　４３％、ＢＭＰ−４　５３％、ＢＭＰ−５　５５％、ＢＭＰ−６　５５％、ＢＭＰ−７　５３％、Ｖｇｌ　５０％、ＧＤＦ−１　４３％、ＴＧＦ−β１　３２％、ＴＧＦ−β２　３４％、ＴＧＦ−β３　３４％、インヒビンβ(Ｂ)　３４％、インヒビンβ(Ａ)４２％。
【実施例２】
【００２３】
ヒト・ＢＭＰ−９
　ネズミおよびヒトの骨誘導因子遺伝子は、有意に相同性のあるものと推定される。それゆえ、ネズミの暗号配列またはその一部をプローブとして用いて、類似のヒト・軟骨および／または骨蛋白を合成するヒト・細胞系または組織を検索する。ヒト・ゲノムライブラリー（トール(Toole)ら、上記）を、かかるプローブで検索してもよく、推定上の可能性のある検体を単離し、ＤＮＡ配列を得てもよい。この組み換え体がヒト・ＢＭＰ−９の一部をコードしているという証拠は、ネズミ／ヒト蛋白および遺伝子構造の相同性に基づく。
　ヒト・軟骨および／または骨誘導因子分子の一部をコードしているＤＮＡを有する組換えバクテリオファージを得たならば、該ヒト・暗号配列をプローブとして用いて、ＢＭＰ−９を合成するヒト・細胞系または組織を確認できる。別法として、ネズミの暗号配列をプローブとして用いて、かかるヒト・細胞系または組織を確認できる。簡単に記載すると、ＲＮＡを選択して細胞または組織から抽出し、ホルムアルデヒドアガロースゲル上で電気泳動してニトロセルロース上に移行させるかまたはホルムアルデヒドと反応させてニトロセルロース上に直接スポットする。ついで、ニトロセルロースを、ネズミまたはヒト・ＢＭＰ−９暗号配列由来のプローブとハイブリダイズさせる。オリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィーによりｍＲＮＡを選択し、ｃＤＮＡを合成し、確立されている手法（トール(Toole)ら、上記）により、ラムダｇｔ１０またはラムダＺＡＰ中にクローン化する。
　当業者に知られたさらなる方法を用いて本発明のヒトあるいは他の種のＢＭＰ−９蛋白を単離してもよい。
【００２４】
Ａ．ヒト・ＢＭＰ−９　ＤＮＡの単離
　λＦＩＸベクター（ストラタジーン社、カタログ番号９４４２０１）中に構築された１００万個のヒト・ゲノムライブラリーの組み換え体をプレーティングし、複製ニトロセルロースレプリカを作成する。図１（配列番号：１）に示した１６６５〜１７０４番目および１８３７〜１８７６番目のヌクレオチド配列に基づく２種のオリゴヌクレオチドプローブを、自動ＤＮＡ合成装置で合成する。これら２種のオリゴヌクレオチド配列は以下のごとし。
#1: CTATGAGTGTAAAGGGGGTTGCTTCTTCCCATTGGCTGAT
#2: GTGCCAACCCTCAAGTACCACTATGAGGGGATGAGTGTGG
　これら２種のオリゴヌクレオチドプローブをγ３２Ｐ−ＡＴＰで放射性標識し、それぞれを、ＳＨＢ中、６５℃で、１組の移し取られたニトロセルロースレプリカにハイブリダイズさせ、ついで、６５℃で１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにて洗浄する。両方のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするこれらの組み換え体を記録する。３種の可能性のあるハイブリダイズしている組み換え体すべてをプラーク精製し、バクテリオファージのプレート・ストックを調製し、それぞれからバクテリオファージＤＮＡを単離する。これらの組み換え体のうち１種のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする領域（ＨＧ１１１と命名）を、１．２ｋｂのＰｓｔＩ／ＸｂａＩ断片に挿入する。この断片をプラスミドベクター（ｐＧＥＭ−３）中にサブクローニングし、ＤＮＡ配列分析を行う。ＨＧ１１１を、米国
メリーランド州、ロックビル(Rockville)、パークローン・ドライブ(Parklawn Drive)１２３０１番地のＡＴＣＣに、１９９２年６月１６日に、ブタペスト条約の要請に基づき寄託し、受託番号ＡＴＣＣ　７５２５２を与えられた。このサブクローンをｐＧＥＭ−１１１と命名する。クローンｐＧＥＭ−１１１のＤＮＡ配列の一部を図３（配列番号：８／ヒト・ＢＭＰ−９配列）に示す。この配列はヒト・ＢＭＰ−９の成熟領域全部とそのプロペプチドの一部をコードしている。この配列が予備的なデータからなることに注意すべきである。詳細には、該プロペプチド領域をさらなる分析および特徴付けに供する。例えば、１〜３番目のヌクレオチド（ＴＧＡ）は、該配列の予備的な性質であるため正しくないかもしれない翻訳終止をコードする。ｐＧＥＭ−１１１（ｐＧＥＭ中にサブクローン化されたＨＧ１１１の１．２ｋｂのＰｓｔＩ／ＸｂａＩ断片）およびＨＧ１１１の両方に存在するさらなる配列が、ヒト・プロペプチド領域のさらなるアミノ酸をコードしていると予想される。他のＢＭＰおよびＴＧＦ−βに属する他の蛋白の関する知見に基づいて、該前駆体ポリペプチドが、提案されている蛋白分解プロセッシング配列Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇ（配列番号：９の−４〜−１番目のアミノ酸）と一致した多重塩基性配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇにおいて開裂されるものと予測される。この位置でのヒト・ＢＭＰ−９前駆体の開裂は、配列番号：９の１番目のＳｅｒ（配列番号：９の１２４〜１２６番目のヌクレオチドによりコードされる）から始まる１１０個のアミノ酸の成熟ペプチドを生じるであろう。ヒト・ＢＭＰ−９の成熟形態へのプロセッシングは、関連蛋白ＴＧＦ−βのプロッセシング（エル・イー・ジェントリー(L.E.Gentry)ら，モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Mol.Cell.Biol.)，第８巻，４１６２頁(１９８８年)；アール・デリンク(R.Derynck)ら，ネイチャー(Nature)，第３１６巻，７０１頁（１９８５年））と類似の機構による二量体化およびＮ−末端領域の除去を含むと考えられる。
　それゆえ、ヒト・ＢＭＰ−９の成熟活性種は、それぞれが配列番号：９の１〜１１０番目のアミノ酸からなり、推定分子量約１２，０００ダルトンの２個のポリペプチドサブユニットのホモ二量体からなると考えられる。さらなる活性種は、１個目の保存されたシイステイン残基が含まれている８〜１１０番目のアミノ酸からなると考えられる。ＢＭＰおよびＴＧＦ−β族の蛋白の他の構成種と同様、ヒト・ＢＭＰ−９蛋白のカルボキシ末端領域は、多くのアミノ末端部分よりも高い配列保存性を示す。対応する他のヒト・ＢＭＰ蛋白および他のＴＧＦ−β族に属する蛋白に対する、システインに富むＣ末端領域（８〜１１０番目のアミノ酸）におけるヒト・ＢＭＰ−９蛋白のアミノ酸の同一性のパーセント値は以下のごとくである。ＢＭＰ−２　５２％、ＢＭＰ−３　４０％、ＢＭＰ−４　５２％、ＢＭＰ−５　５５％、ＢＭＰ−６　５５％、ＢＭＰ−７　５３％、ネズミ・ＢＭＰ−９　９７％、Ｖｇｌ　５０％、ＧＤＦ−１　４４％、ＴＧＦ−β１　３２％、ＴＧＦ−β２　３２％、ＴＧＦ−β３　３２％、インヒビンβ(Ｂ)　３５％、インヒビンβ(Ａ)　４１％。
【実施例３】
【００２５】
ローゼン(Rosen)改変サムパス(Sampath)−レディ(Reddi)試験
　サムパス(Sampath)およびレディ(Reddi)，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，第８０巻，６５９１〜６５９５頁（１９８３年）記載のラットの骨形成分析の改変版を用いて、ＢＭＰ蛋白の骨および／または軟骨活性を評価する。この改変法を、本明細書ではローゼン改変サムパス−レディ試験と称す。サムパス−レディ法のエタノール沈澱ステップを、分析すべきフラクションを水に対して透析（成分が溶液ならば）または限外濾過（成分が懸濁液ならば）することに置き換える。ついで、該溶液または懸濁液を０．１％ＴＦＡに再溶解し、得られた溶液を２０ｍｇのラット・マトリックスに添加する。該蛋白で処理していない処理をしたと見なしたラットのマトリックス試料が対照として役立つ。この物質を凍結し、凍結乾燥し、得られた粉末を＃５ゼラチンカプセルに封入する。該カプセルを、生後２１〜４９日目のオスのロング・エバンズ(Long Evans)・ラットの胸腹部の皮下に移植する。７〜１４日目に移植物を除去する。それぞれの移植物の半分をアルカリホスファターゼ分析（エイ・エイチ・レディ(A.H.Reddi)ら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，第６９巻，１６０１頁（１９７２年））に用いる。
　移植物のもう半分を固定し、形態学的分析用に処理する。１μｍのメタクリル酸グリコール切片をフォン・コッサ(Von Kossa)および酸性フクシンで染色し、各移植物中に存在する誘導された骨および軟骨形成量を記録する。＋１ないし＋５なる記号は、新たな骨および／または軟骨細胞およびマトリックスにより占有された移植物の各形態学的切片の面積を表す。評点＋５は、移植物の５０％以上が、該移植物中の蛋白の直接的な結果として生産された新たな骨および／または軟骨であることを示す。＋４、＋３、＋２および＋１は、それぞれ４０％、３０％、２０％および１０％以上の移植物が、新たな軟骨および／または骨を含んでいることを示す。改変評点法においては、各植物からの３つの隣接していない切片を評価し、平均する。「＋／−」は、軟骨または骨がはっきりと確認されないことを示す。「＋１」は、各切片の１０％以上が新たな軟骨または骨であることを示し、「＋２」は２５％以上、「＋３」は５０％以上、「＋４」は７５％まで、「＋５」は８０％以上であることを表す。「−」は、移植物が回収されないことを示す。
　マトリックス試料に対するＢＭＰ−９含有試料の投薬応答特性は、形成された骨および／または軟骨量が、試料中のＢＭＰ−９量に応じて増加するということを示すと考えられる。対照試料は、何ら骨および／または軟骨を生じないと考えられる。
　上記「ＢＭＰ」蛋白のごとき他の軟骨および／または骨誘導蛋白によるのと同様に、形成された骨および／または軟骨は、マトリックスによって占有される空間により物理的に制限されると考えられる。試料を、オートラジオグラフィーにより追跡するＳＤＳゲル電気泳動および等電点フォーカシングによっても分析する。活性は蛋白バンドおよびｐＩに対応している。特定のフラクション中の蛋白の純度を測定するために、吸光係数１ ＯＤ／ｍｇ−ｃｍを蛋白測定基準として用い、蛋白をＳＤＳ　ＰＡＧＥ上で泳動し、ついで、銀染色あるいは放射ヨウ素化してオートラジオグラフィーを行う。
【実施例４】
【００２６】
ＢＭＰ−９の発現
　ネズミ、ヒトまたは他の哺乳動物のＢＭＰ−９蛋白を生産するために、該蛋白をコードしているＤＮＡを適当な発現ベクターに導入し、慣用的な遺伝子工学の手法により、哺乳動物細胞または他の好ましい真核あるいは原核宿主に導入する。生物学的に活性のある組換えヒト・ＢＭＰ−９のための好ましい発現系は、安定に形質転換された哺乳動物細胞であると考えられている。
　当業者は、図１（配列番号：１）もしくは図３（配列番号：８）またはＢＭＰ−９あるいは他の修飾配列をコードしている他のＤＮＡ配列およびｐＣＤ（オカヤマ(Okayama)ら，モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Mol.Cell.Biol.)，第２巻，１６１〜１７０頁（１９８２年））、ｐＪＬ３、ｐＪＬ４（ゴウ(Gough)ら，エムボー・ジャーナル(EMBO.J.)，第４巻，６４５〜６５３頁（１９８５年））ならびにｐＭＴ２　ＣＸＭのごとき既知ベクターを用いることにより、哺乳動物発現ベクターを構築できる。
　哺乳動物発現ベクターｐＭＴ２　ＣＸＭは、ｐ９１０２３（ｂ）(ウォン(Wong)ら，サイエンス(Science)，第２２８巻，８１０〜８１５頁（１９８５年））の誘導体であり、ｐ９１０２３（ｂ）とは異なり、テトラサイクリン耐性遺伝子のかわりにアンピシリン耐性遺伝子を有し、さらにｃＤＮＡクローン挿入用にＸｈｏＩ部位を有する。ｐＭＴ２　ＣＸＭの機能的構成要素が記載されており（カウフマン，アール・ジェイ(Kaufman,R.J.)，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，第８２巻，６８９〜６９３頁（１９８５年））、アデノウイルスＶＡ遺伝子、７２ｂｐのエンハンサーを含むＳＶ４０複製開始点、５’スプライシング部位を含むアデノウイルス大後期プロモーターならびにアデノウイルス後期ｍＲＮＡ上に存在するアデノウイルス三分節リーダー配列の大部分、３’−スプライス受容部位、ＤＨＦＲ挿入断片、ＳＶ４０初期ポリアデニレーション部位およびイー・コリ中で増殖するのに必要なｐＢＲ３２２配列を含んでいる。
　プラスミドｐＭＴ２　ＣＸＭを、米国メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)に受託番号ＡＴＣＣ　６７１２２の下で寄託されたｐＭＴ２−ＶＷＦをＥｃｏＲＩ消化することにより得る。ＥｃｏＲＩ消化によりｐＮＴ−ＶＷＦに存在するｃＤＮＡ挿入断片が切除され、直鎖状のｐＭＴ２が得られ、これをライゲーションしてイー・コリＨＢ１０１またはＤＨ−５を形質転換するのに用い、アンピシリン耐性とすることができる。プラスミドｐＭＴ２ＤＮＡを慣用的方法により調製できる。ついで、ｐＭＴ２　ＣＸＭを、ループアウト／イン変異種生成法（モリナガ(Morinaga)ら，バイオテクノロジー(Biotechnology)，第８４巻，６３６頁（１９８４年））により構築する。この方法で、ＳＶ４０複製開始点およびｐＭＴ２エンハンサー配列近傍のＨｉｎｄIII部位に関連した１０７５〜１１４５番目の塩基を除去する。さらに以下の配列
5' PO-CATGGGCAGCTCGAG-3'　（配列番号：５）
を１１４５番目のヌクレオチド部位に挿入する。この配列は制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩの認識部位を有する。ｐＭＴ２３と命名したｐＭＴ２ＣＸＭ誘導体は、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩの認識部位を有する。プラスミドｐＭＴ２　ＣＸＭおよびｐＭＴ２３ＤＮＡを、慣用的方法で調製してもよい。
　ｐＭＴ２１から誘導されたｐＥＭＣ２ｂ１もまた本発明の実施に適当である。ｐＭＴ２１を、ｐＭＴ−ＶＷＦ由来のｐＭＴ２から誘導する。上記のごとく、
ＥｃｏＲＩ消化によりｐＭＴ−ＶＷＦ中に存在するｃＤＮＡ挿入断片を切除し、直鎖状のｐＭＴ２を得、これをライゲーションしてイー・コリＨＢ１０１またはＤＨ−５を形質転換するのに用い、アンピシリン耐性とすることができる。プラスミドｐＭＴ２ＤＮＡを慣用的方法により調製できる。
　ｐＭＴ２１を、以下の２つの修飾によりｐＭＴ２から誘導する。最初に、
ｃＤＮＡクローニングのためにＧ／Ｃ尾部由来の一連の１９個のＧ残基を含む
ＤＨＦＲｃＤＮＡの７６ｂｐの５’非翻訳領域を欠失させる。この方法において、ＸｈｏＩ部位を挿入してＤＨＦＲのすぐ上流の下記配列
5' -CTGCAGGCGAGCCTGAATTCCTCGAGCCATCATG-3'　（配列番号：６）
　　　PstI 　　　  Eco RI XhoI
を得る。次に、ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩによる消化、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントによる処理およびＣｌａＩリンカー（ＣＡＴＣＧＡＴＧ）に対するライゲーションにより単一ＣｌａＩ部位を導入する。この方法により、アデノウイルス関連ＲＮＡ（ＶＡＩ）領域から２５０ｂｐが除去されるが、この方法は、ＶＡＩ　ＲＮＡ遺伝子の発現または機能を妨害しない。ｐＭＴ２１を
ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、ｐＥＭＣ２Ｂ１を誘導するのに用いる。
　ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ消化により、ｐＭＴ２−ＥＣＡＴ１（エス・ケイ・ジュング(Jung)ら，ジャーナル・オブ・ウイロロジー(J.Virol)，６３巻，
１６５１〜１６６０頁（１９８９年））からＥＭＣＶリーダーの一部を得、
２７５２ｂｐの断片を生じさせる。この断片をＴａｑＩで消化し、５０８ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＴａｑＩ断片を得、これを低融点アガロースゲル電気泳動で精製する。６８ｂｐのアダプターおよび５’側に突出したＴａｑＩ部位および３’側に突出したＸｈｏＩ部位を有するその相補的ストランド（下記配列）
5'-CGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTT
TaqI
GAAAAACACGATTGC-3'
　            XhoI    
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（配列番号：７）
を合成する。この配列は、７６３〜８２７番目のヌクレオチドのＥＭＣウイルスリーダー配列に合致する。それは、ＥＭＣウイルスリーダー中の１０番目の位置のＡＴＧをＡＴＴに変更し、ついで、ＸｈｏＩ部位を導入したものである。ｐＭＴ２１ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片、ＥＭＣウイルスＥｃｏＲＩ−ＴａｑＩ断片および６８ｂｐのオリゴヌクレオチドアダプターＴａｑＩ−ＸｈｏＩアダプターについての３種のライゲーションによりベクターｐＥＭＣ２β１を得る。
　このベクターは、哺乳動物細胞における所望のｃＤＮＡの直接的高レベル発現に適切に関連しているＳＶ４０複製開始点ならびにエンハンサー、アデノウイルス大後期プロモーター、アデノウイルス三分節リーダ配列の大部分のｃＤＮＡコピー、小さなハイブリッド介在配列、ＳＶ４０ポリアデニレーションシグナルならびにアデノウイルスＶＡ　Ｉ遺伝子、ＤＨＦＲならびにβ−ラクタマーゼマーカーおよびＥＭＣ配列を含んでいる。
　ベクターの構築がＢＭＰ−９ＤＮＡ配列の修飾を包含してもよい。例えば、暗号領域の５’および３’末端の非暗号ヌクレオチドを除去ることによりＢＭＰ−９　ｃＤＮＡを修飾できる。該欠失非暗号ヌクレオチドを、発現に有利であることが知られている他の配列により置換してもよく、しなくてもよい。これらのベクターを、ＢＭＰ−９蛋白発現のための適当な宿主細胞中に形質転換する。
　当業者は、細菌の配列を伴う暗号配列の横にある哺乳動物の調節配列を除去あるいは置換することにより、図１または図３（配列番号：１および８）の配列を処理し、細菌細胞による細胞内または細胞外発現用細菌ベクターを調製できる。例えば、該暗号配列をさらに処理することができる（例えば、他の既知のリンカーにライゲーションする、または他の知られた手法で、それより非暗号配列を除去しあるいはその中のヌクレオチドを変更することにより修飾する）。ついで、ティー・タニグチ(T.Taniguchi)ら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，第７７巻，５２３０〜５２３３頁（１９８０年）記載のごとき方法を用いて、既知の細菌ベクター中に該修飾したＢＭＰ−９暗号配列を挿入できる。ついで、この代表的な細菌のベクターを細菌宿主細胞中に形質転換し、それによりＢＭＰ−９蛋白を発現させることができる。細菌細胞中のＢＭＰ−９蛋白を細胞外に発現させる方法に関しては、例えば、欧州特許出願ＥＰＡ１７７，３４３号参照。
　昆虫細胞における発現のための昆虫ベクターの構築のために、同様の処理を行うことができる（例えば、公開された欧州特許出願１５５，４７６号記載の方法参照）。酵母細胞による本発明因子の細胞内または細胞外発現のために、酵母の調節配列を用いて酵母ベクターを構築することもできる（例えば、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ８６／００６３９号および欧州特許出願ＥＰＡ１２３，２８９号記載の方法参照）。
　哺乳動物における本発明ＢＭＰ−９蛋白の高レベルの生産方法は、異種のＢＭＰ−９遺伝子の多重コピーを有する細胞の構築を包含していてもよい。該異種遺伝子は、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子のような増幅可能なマーカーに連結しており、そのマーカーに関しては、カウフマン(Kaufman)およびシャープ(Sharp)，ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mol.Biol.)，第１５９巻，６０１〜６２９頁（１９８２年）の方法に従い、増加しつつある遺伝子のコピーを有する細胞を、メトトレキサン（ＭＴＸ）濃度を増加させながら行う増殖に関して選択することができる。このアプローチを、多くの異なる細胞形態に用いることができる。
　例えば、その発現を可能ならしめている他のプラスミド配列と作動可能に連結した本発明のＢＭＰ−９に関するＤＮＡ配列を有するプラスミドおよびＤＨＦＲ発現プラスミドｐＡｄＡ２６ＳＶ（Ａ）３（カウフマン(Kaufman)およびシャープ(Sharp)，モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Mol.Cell.Biol.)，第２巻，１３０４頁（１９８２年））を、りん酸カルシウム共沈およびトランスフェクション、エレクトロポーレーションまたはプロトプラスト融合をはじめとする種々の方法により、ＤＨＦＲ−欠損ＣＨＯ細胞、ＤＵＫＸ−ＢII中に同時形質導入できる。ＤＨＦＲ発現形質転換体を、透析ウシ胎児血清を含有するアルファ培地中での増殖に関して選択し、ついで、カウフマン(Kaufman)ら，モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Mol.Cell.Biol.)，第５巻，１７５０頁（１９８３年）記載のごとく、ＭＴＸ（例えば、０.０２，０.２，１.０および５μＭと連続的段階で）濃度を増加させていく場合の増殖による増幅に関して選択する。形質転換体をクローン化し、生物学的に活性のあるＢＭＰ−９発現を、上記実施例III記載のローゼン改変サムパス−レディのラット・骨形成試験によりモニターする。ＢＭＰ−９発現はＭＸＴ耐性レベルの上昇にともない増加するはずである。［３５Ｓ］メチオニンまたはシステインによるパルスラベリングおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動のごとき当業者に知られた標準的手法を用いてＢＭＰ−９ポリペプチドを特徴づける。同様の方法に従い、他の関連ＢＭＰ−９蛋白生産を行うことができる。
【００２７】
Ａ.ＢＭＰ−９ベクターの構築
　本発明のヒト・ＢＭＰ−９蛋白を生産するために、ヒト・ＢＭＰ−９蛋白の成熟領域をコードしているＤＮＡ配列を、ネズミ・ＢＭＰ−９蛋白のプロペプチド領域をコードしているＤＮＡ配列に連結してもよい。このネズミ／ヒト・ハイブリッドＤＮＡ配列を適当な発現ベクター中に挿入し、慣用的遺伝子工学的手法により、動物細胞または他の好ましい真核または原核宿主中に導入する。このネズミ／ヒト・ＢＭＰ−９を含む発現プラスミドの構築を以下に記載する。
　１０５〜４７０番目のヌクレオチド配列からなるヒト・ＢＭＰ−９配列誘導体（配列番号：８）を特異的に増幅する。以下に示したオリゴヌクレオチド
　　　　　　　#3 ATCGGGCCCCTTTTAGCCAGGCGGAAAAGGAG
　　　　　　　#4 AGCGAATTCCCCGCAGGCAGATACTACCTG
をプライマーとして用いて上記クローンｐＧＥＭ−１１１由来のヒト・ＢＭＰ−９（配列番号：８）の１０５〜４７０番目のヌクレオチドを増幅する。この方法は、１０５番目のヌクレオチドのすぐ前のヌクレオチド配列ＡＴＣＧＧＧＣＣＣＣＴの挿入および４７０番目のヌクレオチドのすぐ後のヌクレオチド配列ＧＡＡＴＴＣＧＣＴの挿入を生じさせる。これらの配列の付加は、特異的に増幅されるＤＮＡ断片の個々の末端にＡｐａＩおよびＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を生じさせる。得られた３７４ｂｐのＡｐａＩ／ＥｃｏＲＩ断片を、ＡｐａＩおよびＥｃｏＲＩで消化したプラスミドベクターｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）（プロゲマ(Progema)社製，カタログ番号ｐ２２５１）中にサブクローニングする。得られたクローンをｐｈＢＭＰ９ｍｅｘ−１と命名する。
　ネズミ・ＢＭＰ−９配列（配列番号：１）に基づいて以下に示したオリゴヌクレオチド配列
＃５
GATTCCGTCGACCACCATGTCCCCTGGGGCCTGGTCTAGATGGATACACAGCTGTGGGGCC
＃６
CCACAGCTGTGTATCCATCTAGACCAGGCCCCAGGGGACATGGTGGTCGACG
を設計し、修飾して上述ネズミ／ヒト・発現プラスミドの構築を容易にする。これらのオリゴヌクレオチドは、互いに付加すると該２つの個々の配列のアニーリングを容易にする相補的配列を含んでおり、下記のような合成二本鎖ＤＮＡリンカー（ＬＩＮＫ−１と命名）
1   5   10        20         30        40        50        60
|   |    |         |          |         |         |         |
#5 GATTCCGTCGACCACCATGTCCCCTGGGGCCTGGTCTAGATGGATACACAGCTGTGGGGCC
GCAGCTGGTGGTACAGGGGACCCCGGACCAGATCTACCTATGTGTCGACACC   #6
を形成する。このＤＮＡリンカー（ＬＩＮＫ−１）は、哺乳動物細胞発現系における異種配列の最大発現のみならずネズミ／ヒト・発現プラスミドの構築に必要なそれ以降の操作を容易にするのに必要な制限エンドヌクレアーゼの認識配列を有している。より詳細には（ヌクレオチド＃５／ＬＩＮＫ−１の番号づけした配列を参照）、１〜１１番目のヌクレオチドは制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ認識部位からなっており、１１〜１５番目のヌクレオチドは哺乳動物細胞発現系において異種配列を最大発現させるものであり、１６〜３１番目のヌクレオチドは、ネズミ・ＢＭＰ−９配列（配列番号：１）の６１０〜６２５番目のヌクレオチドに対応しており、３２〜３３番目のヌクレオチドが２つの隣接制限エンドヌクレアーゼ部位（ＥｃｏＯ１０９およびＸｂａＩ）の有効な制限的消化を容易ならしめるために挿入されている。３４〜６０番目のヌクレオチドは、合成ヌクレオチド＃５の５８番目のヌクレオチドが配列番号１の１５３９番目にあるＡよりもむしろＧであることを除いては、ネズミ・ＢＭＰ−９配列（配列番号：１）の１５１５〜１５４１番目のヌクレオチドに対応している。このヌクレオチド変換は、コードすることが予期されるアミノ酸配列を変更することなく、ＡｐａＩ制限エンドヌクレアーゼ認識配列を生ぜしめ、さらなるネズミ／ヒト・ハイブリッド発現プラスミドの操作を容易ならしめる。ＬＩＮＫ−１（オリゴヌクレオチド＃５および＃６をアニーリングした二本鎖産物）を、制限エンドヌクレアーゼＡｐａＩおよびＢａｍＨＩで消化したプラスミドベクターｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）中にサブクローニングする。これにより、通常はｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）プラスミドポリリンカーのＡｐａＩおよびＢａｍＨＩ部位の間に存在している配列が、上記ＬＩＮＫ−１配列に置き換わったプラスミドを得る。得られたプラスミドクローンをｐＢＭＰ−９ｌｉｎｋと命名する。
　ｐＢＭＰ−９ｌｉｎｋを、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、ＬＩＮＫ−１の１〜３４番目のヌクレオチド（オリゴヌクレオチド＃５の番号づけを参照）を除去する。クローンＭＬ１４ａは、配列番号：１に示した配列からなる挿入断片からなり、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化すると、配列番号：１（ネズミ・ＢＭＰ−９）の１〜１５１５番目の配列が除去される。ネズミ・ＢＭＰ−９のこのＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ断片をＭＬ１４ａプラスミドクローンの残りの部分から単離し、上記のごとく合成リンカー配列を除去することにより生じたＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ部位中にサブクローニングする。得られたクローンをｐ３０２と命名する。
　ｐ３０２クローンを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＯ１０９Ｉで消化し、ネズミ・ＢＭＰ−９配列（配列番号：１）の６２１〜１５１５番目のヌクレオチドおよびＬＩＮＫ−１の３５〜５９番目のヌクレオチド（オリゴヌクレオチド＃５の番号づけ参照）に対応するヌクレオチド配列を切形する。上記のごとくＡからＧへの変換により作られたＡｐａＩ制限部位がＥｃｏＯ１０９Ｉ認識配列のサブセットであることに注意すべきである。それゆえ、ＥｃｏＯ１０９Ｉによるｐ３０２の消化は、もともと存在するネズミのＥｃｏＯ１０９Ｉ部位（配列番号：１の６１９〜６２５番目に位置）のみならずＡｐａＩ部位をも開裂させ、上記配列からなる９２０ｂｐのＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＥｃｏＯ１０９Ｉ(ＡｐａＩ)断片を切形する。この９２０ｂｐのＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＥｃｏＯ１０９Ｉ(ＡｐａＩ)断片を、ｐ３０２プラスミドクローンの残りの部分から単離し、同様にＥｃｏＯ１０９Ｉで消化したｐＢＭＰ−９ｌｉｎｋ中にサブクローニングする。ＬＩＮＫ−１の２つの隣接するＥｃｏＯ１０９ＩおよびＸｂａＩ制限部位の消化をより完全なものにするために、ヌクレオチドＧＧ（オリゴヌクレオチド＃５の３２〜３３番目）をはじめに作っておき、今度はこれをｐＢＭＰ−９ｌｉｎｋの一部とし、Ｄｃｍメチレーション認識部位を生じさせることに注意すべきである。制限ヌクレアーゼＥｃｏＯ１０９ＩはＤｃｍメチレーションに感受性があり、それゆえ、制限ヌクレアーゼＥｃｏＯ１０９Ｉによるこの配列(オリゴヌクレオチド＃５/ＬＩＮＫ−１の２５〜３１番目のヌクレオチド）の開裂がこの部位において防止される。よって、プラスミドクローンｐＢＭＰ−９ｌｉｎｋを、ＥｃｏＯ１０９Ｉ部位ではなくＡｐａＩ部位において、上記のごとく制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＯ１０９Ｉで消化することにより開裂させ、ＬＩＮＫ−１のＥｃｏＯ１０９ＩとＸｂａＩ部位との間の配列（オリゴヌクレオチド＃５の番号づけにより定義された３２〜５５番目）の予期された除去を防止する。これにより、ｐＢＭＰ−９ｌｉｎｋのＥｃｏＯ１０９Ｉ（ＡｐａＩ）部位において、９２０ｂｐのＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＡｐａＩ断片の挿入が起こる。得られたクローンをｐ３１８と命名する。
　クローンｐ３１８を制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩおよびＡｐａＩで消化し、ＬＩＮＫ−１の６〜５６番目のヌクレオチド（位置についてはオリゴヌクレオチド＃５参照）、ネズミ・ＢＭＰ−９（配列番号：１）の６２１〜１５１５番目のヌクレオチドおよびＬＩＮＫ−１（位置についてはオリゴヌクレオチド＃５参照）の３５〜６０番目のヌクレオチドからなる配列を切形する。得られた上記９７２ｂｐのＳａｌＩ／ＡｐａＩ断片を、ｐ３１８プラスミドクローンの残りの部分から単離し、引き続いての操作に用いる。
　ヒト・ＢＭＰ−９蛋白の全成熟領域およびそのプロペプチドをコードしているＤＮＡ配列を含むクローンｐｈＢＭＰ−９ｍｅｘ−１（上記）を、制限エンドヌクレアーゼＡｐａＩおよびＥｃｏＲＩで消化する。これにより、ヒト・ＢＭＰ−９配列(配列番号：８)の１０５〜４７０番目のヌクレオチドからなる３７４ｂｐの断片と、制限エンドヌクレアーゼＡｐａＩならびにＥｃｏＲＩ認識配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー＃３および＃４のヌクレオチドとが切形される。この３７４ｂｐのＡｐａＩ／ＥｃｏＲＩ断片を、ｐ３１８由来の９７２ｂｐのＳａｌＩ／ＡｐａＩ断片（上記のごとく単離）に結合し、ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで消化された哺乳動物細胞発現プラスミドｐＥＤ６（ｐＥＭＣ２β１誘導体）に連結する。得られたクローンをｐ３２４と命名する。
　クローンＭＬ１４ａ(ネズミ・ＢＭＰ−９)をＥｃｏＯ１０９ＩおよびＸｂａＩで消化して、配列番号：１の６２１〜１５１５番目のヌクレオチドからなる断片を得る。
　以下のオリゴヌクレオチドを自動ＤＮＡ合成装置にて合成して結合し、その相補的配列を互いに塩基ペアーとし（アニーリングし）、ＬＩＮＫ−２と命名される合成二本鎖ＤＮＡリンカー
ＬＩＮＫ−２：
#7 TCGACCACCATGTCCCCTGG
#8 GCCCCAGGGGACATGGTGG
を得る。この合成二本鎖ＤＮＡリンカー（ＬＩＮＫ−２）を、下記のようにしてＳａｌＩ（一方の末端）またはＥｃｏＯ１０９Ｉ（もう一方の末端）のどちらにも対応する一重鎖末端
#7 TCGACCACCATGTCCCCTGG
GGTGGTACAGGGGACCCCG #8
を生じるようなやり方でアリーリングする。
　このＬＩＮＫ−２合成ＤＮＡリンカーを、上記ネズミ・ＢＭＰ−９(配列番号:１）の６２１〜１５１５番目のヌクレオチドからなる上記８９５ｂｐのＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＸｂａＩ断片にライゲーションする。これにより、９１５ｂｐのＳａｌＩ／ＸｂａＩ断片を得る。
　クローンｐ３２４をＳａｌＩ／ＸｂａＩで消化して、ＬＩＮＫ−１の６〜５６番目のヌクレオチドからなる配列（位置についてはオリゴヌクレオチド＃５参照）およびネズミ・ＢＭＰ−９（配列番号：１）の６１２〜１５１５番目のヌクレオチドからなる配列を除去する。ＬＩＮＫ−１の３５〜６０番目のヌクレオチドからなる配列（位置についてはオリゴヌクレオチド＃５参照）およびｐｈＢＭＰ−９ｍｅｘ−１由来の３７４ｂｐのＡｐａＩ／ＥｃｏＲＩ断片（ヒト・ＢＭＰ−９配列）からなる配列はｐＥＤ６骨格に結合したままである。ＬＩＮＫ−２配列およびネズミ・ＢＭＰ−９（配列番号：１）の６２１〜１５１５番目のヌクレオチドからなる該９１５ｂｐのＳａｌＩ／ＸｂａＩ断片を、上記したＳａｌＩからＸｂａＩまでの配列を除去したｐ３２４クローン中にライゲーションする。
　得られたプラスミドをＢＭＰ９ｆｕｓｉｏｎと命名する。該プラスミドは、ＬＩＮＫ−２、ネズミ・ＢＭＰ−９（配列番号：１）の６１２〜１５５１番目のヌクレオチド、ＬＩＮＫ−１の３５〜５９番目のヌクレオチドよりなる配列（位置についてはオリゴヌクレオチド＃５参照）、および哺乳動物細胞発現ベクターｐＥＤ６のＳａｌＩならびにＥｃｏＲＩ部位の間に挿入されたクローンｐＢＭＰ９ｍｅｘ−１（上記）由来の３７４ｂｐのＡｐａＩ／ＥｃｏＲＩ断片からなる。
　ＢＭＰ９ｆｕｓｉｏｎを、当業者に知られた標準的手法を用いてＣＨＯ細胞中に形質導入し、ヒト・ＢＭＰ−９蛋白を発現できる安定な細胞系を造成する。該細胞系を適当な培養条件下で培養し、ＢＭＰ−９蛋白を培養基から単離、精製する。
【実施例５】
【００２８】
発現ＢＭＰ−９の生物学的活性
　上記実施例IVで得られた発現ＢＭＰ−９蛋白の生物学的活性を測定するために、該蛋白を細胞培養基から回収し、他の汚染物質と同様に同時生成される他の蛋白性物質からＢＭＰ−９蛋白を単離することにより精製する。該精製蛋白を、実施例III記載のラット・骨形成試験により分析してもよい。
　当業者に知られた標準的な手法を用いて精製を行う。精製が、他のＢＭＰ蛋白に関するのと同様に、ヘパリンセファロースの使用を包含していてもよいと考えられる。
　銀染色(アール・アール・オークリー(R.R.Oakley)ら，アナリティカル・バイオケミストリー(Anal.Biochem.)，第１０５巻，３６１頁(１９８０年))と組み合わせたＳＤＳ−ＰＡＧＥアクリルアミド（ユー・ケイ・ラエムリ(U.K.Laemmli)，ネイチャー(Nature)，第２２７巻，６８０頁（１９７０年））のごとき標準的手法およびイムノブロット（エイチ・トウビン(H.Towbin)ら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，第７６巻，４３５０頁（１９７９年））を用いて、蛋白の分析を行う。
【００２９】
　本発明により骨および軟骨の形成を誘導するな新規ＢＭＰ−９蛋白を含有する医薬組成物が提供される。本発明の組成物により、ヒトや他の動物における骨折および軟骨欠損の治療が可能となり、また、骨が正常に形成されない環境において使用することもできる。
　以上の記載は、本発明の好ましい具体例を詳説するものである。その実施において、当業者は、これらの記載を考慮して、多くの改変および変法を思い付くであろう。これらの改変および変法は、本明細書に付記した請求の範囲中に包含されると確信する。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
　本発明のＢＭＰ−９組成物は骨および軟骨の形成を誘導を要する医療分野において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、以下にさらに記載されるＭＬ１４ａクローン由来のネズミ・ＢＭＰ−９のＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、ラムダＵ２０Ｓ−３　ＡＴＣＣ　４０３４２由来のヒト・ＢＭＰ−４のＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、λＦＩＸ／Ｈ６１１１　ＡＴＣＣ　７５２５２由来のヒト・ＢＭＰ−９のＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【配列表】
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