(57)【要約】【課題】スギ花粉症患者の減感作療法や診断などに有用なスギ花粉アレルゲンをコードする遺伝子をクローニングすることを課題とする。【解決手段】スギ花粉ＲＮＡを鋳型に、ランダムヘキサマーあるいはオリゴ（ｄＴ）１７プライマーを用いた逆転写でｃＤＮＡを合成した。マウンテンシダー花粉アレルゲンＪｕｎ　ａ　３と相同性の高い数種の植物の保存領域に基づき合成したプライマーを用いてランダムｃＤＮＡからクレノウ酵素で２本鎖ＤＮＡを合成した。このＤＮＡを鋳型に上記保存領域に基づき合成したプライマーを用いたＰＣＲでスギ花粉Ｃｒｙ　ｊ　３の部分ＤＮＡ断片を得た。５’側は縮重プライマーを用いたＰＣＲで得た。そして３’側は３’−ＲＡＣＥ法で得た。これらから全Ｃｒｙ　ｊ　３ａの遺伝子配列を決定した。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたスギ花粉アレルゲンタンパクＣｒｙ　ｊ　３ａ。
【請求項２】
配列番号：４で表されるアミノ酸配列を有する、請求項１記載のＣｒｙ　ｊ　３ａ（前駆体タンパク）。
【請求項３】
配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有する、請求項１記載のＣｒｙ　ｊ　３ａ（成熟タンパク）。
【請求項４】
単離されたスギ花粉アレルゲンタンパクＣｒｙ　ｊ　３ｂ。
【請求項５】
配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有する、請求項４記載のＣｒｙ　ｊ　３ｂ（前駆体タンパク）。
【請求項６】
配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を有する、請求項４記載のＣｒｙ　ｊ　３ｂ（成熟タンパク）。
【請求項７】
単離されたスギ花粉アレルゲンタンパクＣｒｙ　ｊ　３ｃ。
【請求項８】
配列番号：１４で表されるアミノ酸配列を有する、請求項７記載のＣｒｙ　ｊ　３ｃ（前駆体タンパク）。
【請求項９】
配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を有する、請求項７記載のＣｒｙ　ｊ　３ｃ（成熟タンパク）。
【請求項１０】
請求項２記載のタンパクＣｒｙ　ｊ　３ａをコードする配列番号：２で示される核酸分子。
【請求項１１】
請求項３記載のタンパクＣｒｙ　ｊ　３ａをコードする配列番号：３核酸分子。
【請求項１２】
請求項５記載のタンパクＣｒｙ　ｊ　３ｂをコードする配列番号：７の核酸分子。
【請求項１３】
請求項６記載のタンパクＣｒｙ　ｊ　３ｂをコードする配列番号：８の核酸分子。
【請求項１４】
請求項８記載のタンパクＣｒｙ　ｊ　３ｃをコードする配列番号：１２の核酸分子。
【請求項１５】
請求項９記載のタンパクＣｒｙ　ｊ　３ｃをコードする配列番号：１３の核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、Ｃｒｙ　ｊ　３ａ、Ｃｒｙ　ｊ　３ｂおよびＣｒｙ　ｊ　３ｃをコードする核酸分子ならびに組換えＣｒｙ　ｊ　３ａ、Ｃｒｙ　ｊ　３ｂおよびＣｒｙ　ｊ　３ｃタンパク質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
スギ花粉症は、我が国で最も罹患人口の多い疾患のひとつで、その有病率は１５％にも及ぶといわれている。代表的なＩ型アレルギー疾患であり、その主因となるのは花粉中に含まれるスギ花粉アレルゲンである。
【０００３】
スギ花粉からは２種類のメジャーなアレルゲンが同定されている。Ｙａｓｕｅｄａら（Ｊ．　Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｃｌｉｎ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　４５：　７７−８６，　１９８３）により精製されたＣｒｙ　ｊ　１（旧名ＳＢＰ）と、Ｓａｋａｇｕｃｈｉら（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．：　Ａｌｌｅｒｇｙ，　４５：　３０９−３１２，　１９９０）により精製されたＣｒｙ　ｊ　２である。Ｃｒｙ　ｊ　１とＣｒｙ　ｊ　２はともに分子量が約４０，０００の塩基性糖タンパク質であるが、両者の抗原性は独立しており、交差反応性はない。
【０００４】
この２つの主要メジャーなアレルゲンに対するＩｇＥ抗体をほぼすべての患者が保有しており、他のマイナーなアレルゲンに対するＩｇＥ抗体の関与は少ないと考えられている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．：　Ｃｌｉｎ．　Ｅｘｐ．　Ａｌｌｅｒｇｙ．　２５：　８４８−８５２，　１９９５　）。
【０００５】
しかし、スギ花粉症患者血清中には、Ｃｒｙ　ｊ　１とＣｒｙ　ｊ　２以外へもＩｇＥ抗体の結合がみられており（井手　武：医学のあゆみ，　２００（５）：　３６３−３６８，　２００２　）、スギ花粉症の減感作療法に使用するアレルゲンエキスには、これらのマイナーなアレルゲンを含むことが必要となる。
【０００６】
Ｃｒｙ　ｊ　１およびＣｒｙ　ｊ　２のｃＤＮＡはクローニングされている（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，　Ｉ．Ｊ．ｅｔ　ａｌ．：　Ｊ．　Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　９１：　３３９，　１９９３．（Ａｂｓｔｒａｃｔ）；　Ｓｏｎｅ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．：　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　１９９：　６１９−６２５，　１９９４；　Ｋｏｍｉｙａｍａ，　Ｎ．　ｅｔａｌ．：　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　２０１：　１０２１−１０２８，　１９９４；　Ｎａｍｂａ，　Ｍ．　ｅｔａｌ．：　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．，　３５３：　１２４−１２８，　１９９４　）。
【０００７】
小埜らは、スギ花粉ｃＤＮＡライブラリーからＣＪＰ−６と称するｃＤＮＡをクローニングし、組換えタンパクｒＣＪＰ−６を作製した。そして、ｒＣＪＰ−６に対するスギ花粉症患者血清中ＩｇＥ抗体結合を調べた結果、２５名中１９名の患者血清中のＩｇＥが結合したと報告している（特開２００２−５８４８７）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、スギ花粉中の新規なアレルゲン遺伝子をクローニングすることを課題とする。本発明は、スギ花粉症患者の減感作療法やペプチド免疫療法などに有用な、新規なアレルゲンタンパクを提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
スギ花粉ＲＮＡを鋳型に、ランダムプライマー（ヘキサマー）を用いた逆転写反応でｃＤＮＡ（以下「ランダムｃＤＮＡ」という）を合成した。また、アダプター付きオリゴ（ｄＴ）１７プライマーＰＮＸＣＴを用いた逆転写反応でｃＤＮＡ（以下「アダプターｃＤＮＡ」という）を合成した。
【００１０】
マウンテンシダー花粉アレルゲンＪｕｎ　ａ　３と相同性の高い数種の植物タンパクのアミノ酸配列で保存されている領域に基づき、プライマーＶＳＬＶＳ、ＮＱＣＧＳ、ＣＰＱＡＡを合成し、５’プライマー（ＶＳＬＶＳあるいはＮＱＣＧＳ）をランダムｃＤＮＡにアニールしてから、クレノウ酵素を作用させて二本鎖ｃＤＮＡを合成した。
【００１１】
この二本鎖ｃＤＮＡを鋳型に、ＶＳＬＶＳ−ＣＰＱＡＡあるはＮＱＣＧＳ−ＣＰＱＡＡのＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物の微量成分としてＪｕｎ　ａ　３のｃＤＮＡと相同性の高い２５５　ｂｐと５０７　ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
【００１２】
これらＤＮＡ断片の５’側領域は、縮重プライマー（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｒｉｍｅｒ：ＤＯＰ１あるいはＤＯＰ２）を用いたＰＣＲにより得た。すなわち、ランダムｃＤＮＡにＤＯＰ１をアニールさせ、クレノウ酵素で２本鎖ＤＮＡを合成した。この２本鎖ＤＮＡを鋳型に、プライマーＰＮＸＣとＱＱＬＤＡによるＰＣＲ、さらに、このＰＣＲ産物を鋳型に、プライマーＰＮＸＣとＡＧＬＰＡによるｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行い、開始コドンの約２０　ｂｐ下流から始まるＤＮＡ断片を得た。また、このＤＮＡ断片の配列に基づきプライマー（ＱＥＡＧＡとＮＱＣＧＡ）を合成し、同様の操作を繰り返して、さらに上流の非翻訳領域に及ぶＤＮＡ断片を得た。
【００１３】
一方、３’側の終止コドンを含む非翻訳領域を含むＤＮＡ断片は、通常の３’−ＲＡＣＥ法により得ることができた。
【００１４】
以上のようにして、Ｃｒｙ　ｊ　３と仮称するＪｕｎ　ａ　３と相同性の高いスギ花粉タンパクをコードするｃＤＮＡ配列の概略が得られた。Ｃｒｙ　ｊ　３には多型性が認められるたので、最初に得られたＶＳＬＶＳ−ＣＰＱＡＡあるいはＮＱＣＧＳ−ＣＰＱＡＡの断片の配列で特徴づけられるアイソタイプをＣｒｙ　ｊ　３ａと称した。Ｃｒｙ　ｊ　３ａに特異的なプライマーと、Ｃｒｙ　ｊ　３ａとは異なるアイソタイプに特異的なプライマーを数種合成し、それらを組み合わせてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をクローン化して塩基配列を決定し、ＰＣＲの過程で生じたと考えられる変異が除去されたＣｒｙ　ｊ　３ａのｃＤＮＡの全塩基配列を決定した。また、Ｃｒｙ　ｊ　３とは異なるアイソタイプのｃＤＮＡとしては２種類の塩基配列を得て、それらのアイソタイプをＣｒｙｊ　３ｂ、Ｃｒｙｊ　３ｃと称した。
【００１５】
すなわち、本発明は
（１）　単離されたスギ花粉アレルゲンタンパクＣｒｙ　ｊ　３ａ、
（２）　配列番号：４で表されるアミノ酸配列を有する、（１）のＣｒｙ　ｊ　３ａ（前駆体タンパク）、
（３）　配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有する、（１）のＣｒｙ　ｊ　３ａ（成熟タンパク）、
（４）　単離されたスギ花粉アレルゲンタンパクＣｒｙ　ｊ　３ｂ、
（５）　配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有する、（４）のＣｒｙ　ｊ　３ｂ（前駆体タンパク）、
（６）　配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を有する、（４）のＣｒｙ　ｊ　３ｂ（成熟タンパク）、
（７）　単離されたスギ花粉アレルゲンタンパクＣｒｙ　ｊ　３ｃ、
（８）　配列番号：１４で表されるアミノ酸配列を有する、（７）のＣｒｙ　ｊ　３ｃ（前駆体タンパク）、
（９）　配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を有する、（７）のＣｒｙ　ｊ　３ｃ（成熟タンパク）、
（１０）　（２）のタンパクＣｒｙ　ｊ　３ａをコードする配列番号：２で示される核酸分子、
（１１）　（３）のタンパクＣｒｙ　ｊ　３ａをコードする配列番号：３核酸分子、
（１２）　（５）のタンパクＣｒｙ　ｊ　３ｂをコードする配列番号：７の核酸分子、
（１３）　（６）のタンパクＣｒｙ　ｊ　３ｂをコードする配列番号：８の核酸分子、
（１４）　（８）のタンパクＣｒｙ　ｊ　３ｃをコードする配列番号：１２の核酸分子、
（１５）　（９）のタンパクＣｒｙ　ｊ　３ｃをコードする配列番号：１３の核酸分子、
からなる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明により、Ｃｒｙ　ｊ　３ａ、Ｃｒｙ　ｊ　３ｂおよびＣｒｙ　ｊ　３ｃのｃＤＮＡが単離され、全塩基配列およびリーディングフレームが決定された。一方、スギ花粉からのＲＮＡの単離はＳｏｎｅらの報告（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　１９９：　６１９−６２５，　１９９４　）がある。これらの情報に基づき、ＰＣＲ技術を駆使して、スギ花粉から、Ｃｒｙ　ｊ　３ａ、Ｃｒｙ　ｊ　３ｂあるいはＣｒｙ　ｊ　３ｃのｃＤＮＡを単離することが容易となった。
例えばＣｒｙ　ｊ　３ａのｃＤＮＡを得るための一つの実施形態は、Ｃｒｙ　ｊ　３ａのｃＤＮＡの塩基配列に基づいて、いくつかのセンスおよびアンチセンスＰＣＲプライマーを作製し、スギ花粉ＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲを行う。このようなヌクレオチド配列は、少なくとも約１５ヌクレオチドの断片であり、さらに好ましくは、少なくとも２０ヌクレオチドである。もちろん、それより長い２５〜６００ヌクレオチドからなる断片も有用である。このようなプライマー配列は、Ｃｒｙ　ｊ　３ａのｃＤＮＡ塩基配列と相同性の高いＣｒｙ　ｊ　３ｂあるいはＣｒｙ　ｊ　３ｃのＤＮＡからもデザインすることができる。
【００１７】
ＰＣＲ産物中、期待の長さのＤＮＡをプラスミドｐＵＣ１８／ｐＵＣ１９あるいはｐＵＣ１１８／ｐＵＣ１１９などにクローニングし、常法により塩基配列を決定する。これらのｃＤＮＡクローンの塩基配列を結合することによって、クローンに対するコンセンサス配列を得る。Ｃｒｙ　ｊ　３ａのｃＤＮＡの３’　−領域は３’−ＲＡＣＥ法で得ることができる。５’　−領域のクローニング法としては、通常、５’−ＲＡＣＥ法あるいはＩＰＣＲ（Ｉｎｖｅｒｓｅｄ　ＰＣＲ）法などが用いられるが、分解が少なく純度の高いＲＮＡが得られない場合は困難である。この場合は、縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−Ｐｒｉｍｅｄ　ＰＣＲ）で５’　−領域をクローニングすることができる。
【００１８】
本発明で用いた縮重オリゴヌクレオチドプライマー（ＤＯＰ１、ＤＯＰ２およびＤＯＰ３）は、３’末端の配列をＮＮＮＮＫＫＫＫＫ（ＮはＡ、Ｔ、ＧおよびＣ；ＫはＧまたはＴ）とした。これにより、Ｇ−Ｔの塩基対が許容されるとした場合、この配列が偶然ＤＮＡ上に存在する頻度は３２塩基対（２２＝３２）に１カ所の割合で、一方、Ｇ−Ｔの塩基対が許容されないとした場合、１０２４塩基対（４４＝１０２４）に１カ所の割合で、任意の配列とハイブリダイズする。したがって、ハイブリダイゼーション（アニーリング）の温度条件を調節することにより、任意の配列の数カ所に、ＤＯＰを比較的高い特異性でハイブリダイズさせることが可能となる。下流に２つのプライマーを用いて、２段階のｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを実施することにより、２つのＤＮＡ特異的プライマーを用いた通常のＰＣＲと同程度の特異性増幅が可能である。
【００１９】
Ｔａｑ　ＤＮＡ　ポリメラーゼは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性がない。そのため４４０塩基に１回程度読み誤りが生じ伸長反応が停止する。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性のある（ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ）耐熱性ポリメラーゼ（例えばＫＯＤ　Ｄａｓｈ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ）を用いるとロングＰＣＲが可能である。各配列データをアラインメントし、結合することによって、Ｃｒｙ　ｊ　３ａのｃＤＮＡの全塩基配列が決定される（配列番号：１）。
【００２０】
Ｃｒｙ　ｊ　３ａのｃＤＮＡは、開始コドンＡＴＧ（ヌクレオチド１〜３番目）から終止コドンＴＡＧ（ヌクレオチド６９４〜６９６番目）に至るコーディング領域（配列番号：２）に、２３１アミノ酸残基からなるＣｒｙ　ｊ　３ａタンパク（配列番号：４）をコードしている。開始コドンＡＴＧ〜ＧＣＡ（ヌクレオチド１〜８１番目）のコードする２７アミノ酸残基からなる領域は疎水性アミノ酸に富むことから、シグナルペプチドの可能性が高い。したがって、成熟Ｃｒｙ　ｊ　３ａタンパク（配列番号：５）は２０４アミノ酸残基からなる。
【００２１】
Ｃｒｙ　ｊ　３ｂのｃＤＮＡは、開始コドンＡＴＧ（ヌクレオチド１〜３番目）から終止コドンＴＡＧ（ヌクレオチド６７６〜６７８番目）に至るコーディング領域（配列番号：７）に、２２５アミノ酸残基からなるＣｒｙ　ｊ　３ｂタンパク（配列番号：９）をコードしている。開始コドンＡＴＧ〜ＧＣＡ（ヌクレオチド１〜７８番目）のコードする２６アミノ酸残基からなる領域は疎水性アミノ酸に富むことから、シグナルペプチドの可能性が高い。したがって、成熟Ｃｒｙ　ｊ　３ｂタンパク（配列番号：１０）は１９９アミノ酸残基からなる。
【００２２】
Ｃｒｙ　ｊ　３ｃのｃＤＮＡは、開始コドンＡＴＧ（ヌクレオチド１〜３番目）から終止コドンＴＡＧ（ヌクレオチド６７６〜６７８番目）に至るコーディング領域（配列番号：１２）に、２２５アミノ酸残基からなるＣｒｙ　ｊ　３ｃタンパク（配列番号：１４）をコードしている。開始コドンＡＴＧ〜ＧＣＡ（ヌクレオチド１〜７８番目）のコードする２６アミノ酸残基からなる領域は疎水性アミノ酸に富むことから、シグナルペプチドの可能性が高い。したがって、成熟Ｃｒｙ　ｊ　３ｃタンパク（配列番号：１５）は１９９アミノ酸残基からなる。
【００２３】
Ｊｕｎ　ａ　３と、Ｃｒｙ　ｊ　３ａ、Ｃｒｙ　ｊ　３ｂおよびＣｒｙ　ｊ　３ｃ（以後一括して「Ｃｒｙ　ｊ　３」と称する場合もある）のアミノ酸配列の相同性を比較すると、Ｃｒｙ　ｊ　３ｂおよびＣｒｙ　ｊ　３ｃの前駆体のアミノ酸残基数は２２５残基と、Ｊｕｎ　ａ　３のそれと全く同じ残基数であり、Ｃｒｙ　ｊ　３ｂはＪｕｎ　ａ　３と８５％相同、Ｃｒｙ　ｊ　３ｃもほぼ同じく８４％相同である。
【００２４】
一方、Ｃｒｙ　ｊ　３ａ　の前駆体は２３１残基と、Ｊｕｎ　ａ　３のそれより６残基多く、この６残基を除いたＣｒｙ　ｊ　３ａ　の前駆体のアミノ酸配列との比較でも、相同性はＣｒｙｊ　３ｂおよびＣｒｙ　ｊ　３ｃよりも低く、７６％であった。
【００２５】
また、Ｃｒｙ　ｊ　３ａ、Ｃｒｙ　ｊ　３ｂおよびＣｒｙ　ｊ　３ｃのアミノ酸配列を相互比較すると、Ｃｒｙ　ｊ　３ａはＣｒｙ　ｊ　３ｂと８０％相同、Ｃｒｙ　ｊ　３ｃとはほぼ同じ７８％相同である。そしてＣｒｙ　ｊ　３ｂとＣｒｙ　ｊ　３ｃとは９６％と相同性が極めて高い。
Ｊｕｎ　ａ　３、Ｃｒｙ　ｊ　３ａ、Ｃｒｙ　ｊ　３ｂおよびＣｒｙ　ｊ　３ｃのタンパク間の相同性の高いことから、これらの間には共通の抗原性が存在することが示唆される。多くのスギ花粉症患者は、スギ花粉のみならず、ヒノキをはじめヒノキ科花粉によっても症状を呈する。紀らは、花粉症患者から、ヒノキ花粉特異的Ｔ細胞クローンを樹立し、ヒノキ花粉症の存在を証明した（日本免疫学総会・学術集会記録　１９９８；　２８：３３９　）。
【００２６】
マウンテンシダー花粉症患者１３例中６例（４６％）がＪｕｎ　ａ　３　と反応するＩｇＥ　抗体陽性であり、スギ花粉症患者３６例中１２例（３３％）がＪｕｎ　ａ　３と反応するＩｇＥ抗体陽性であるという報告（Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　１６４：　２１８８−２１９２，　２０００　）から、スギ花粉症患者においても、Ｃｒｙ　ｊ　３ａ、Ｃｒｙ　ｊ　３ｂ、あるいはＣｒｙ　ｊ　３ｃ（以後これら３者を一括して「Ｃｒｙ　ｊ　３」と称する場合もある）　に対する　ＩｇＥ　抗体をもっている可能性がある。
【００２７】
以上のことから、マイナーなアレルゲンであるＣｒｙ　ｊ　３に対する感作効果も含めた症状の増悪も考えられる。したがって、スギ花粉症あるいはマウンテンシダー花粉症の予防あるいは治療（減感作やペプチド免疫療法）に向けて、メジャーなアレルゲンＣｒｙ　ｊ　１およびＣｒｙｊ　２に加えてＣｒｙ　ｊ　３を用いる技術的意義が存在する。
また、スギ花粉症の診断方法のひとつである皮膚反応などにも有用性が期待される。
【００２８】
Ｃｒｙ　ｊ　３　に反応するＩｇＥ　の検出／定量にはスギ花粉からＣｒｙ　ｊ　３タンパクを精製する必要がある。精製にはＣｒｙ　ｊ　３　に対する特異的抗体が有用である。Ｃｒｙ　ｊ　３　に対する抗体は精製工程の検討、抗体アフィニティーカラムクロマトによる精製に利用することができる。
【００２９】
本発明のＣｒｙ　ｊ　３をコードする核酸分子は、タンパクの部分、アナログ又は誘導体をコードする核酸分子の変異体を含む。変異は、例えば、自然のアレル変異のように自然に発生する。人為的に生じる変異は、当該技術分野で公知の部位特異的突然変異誘発技術を用いて作製できる。
【００３０】
このような変異は、一つ又は二つ以上のヌクレオチドを含むヌクレオチドの置換、欠失、又は付加によって作製される変異を含む。該変異は、コーディング領域、又は非コーディング領域、又はその両方を変異させ得る。コーディング領域の変更は、保存的、又は非保存的アミノ酸置換、欠失、又は付加を生じ得る。精製、又は発現したＣｒｙ　ｊ　３タンパクの機能的特性は、例えば、該花粉症患者の血液中のＩｇＥ結合活性を調べることにより可能である。
【００３１】
Ｃｒｙ　ｊ　３　タンパクの一次構造に基づき、当業者であるならば、該タンパク分子上のＴ細胞エピトープを容易に同定することができる。同定方法は当業者に公知である（例えば、ＷＯ９７／３２６００公開公報参照）。概説すれば、該一次構造をカバーする１２〜２０残基からなるオーバーラップペプチドを合成する。スギ花粉症患者の末梢血リンパ球、樹立されたＴ細胞ライン、或いはＴ細胞クローンと該ペプチドを培養し、Ｔ細胞増殖応答（例えば、３Ｈ−チミジンの取り込み）を測定することによって、Ｔ細胞エピトープ部位を同定する。
【００３２】
したがって、本発明は、このようにして同定された少なくとも１つのＣｒｙ　ｊ　３タンパクのＴ細胞エピトープ活性を有する最小の領域または該領域を含むペプチド（一括して「Ｔ細胞エピトープペプチド」という）も包含する。
【００３３】
上記Ｔ細胞エピトープペプチドは、スギ花粉又は該花粉と交差反応性のアレルゲンにアレルギー反応を引き起こす患者に対する花粉症の予防または治療剤として有用である（Ｗａｌｌｎｅｒ，　Ｂ．Ｐ．　＆　Ｇｅｆｔｅｒ，Ｍ．Ｌ．：　Ａｌｌｅｒｇｙ，　４９：　３０）。
【００３４】
また、組換えＣｒｙ　ｊ　３タンパク質は、花粉症の減感作剤として有用である。
一般に、Ｃｒｙ　ｊ　３の断片をコードする核酸配列は、成熟タンパク質をコードするポリヌクレオチドから選ばれるが、ある場合には、断片の全て又は一部を本発明の核酸配列のプレ配列から選ぶのが望ましい。本発明の核酸配列は、リンカー配列、修飾制限エンドヌクレアーゼ部位及びＣｒｙ　ｊ　３またはその断片のクローニング、発現、或いは精製に有用な他の配列も含むことができる。
【００３５】
本発明のＤＮＡに代表される核酸分子は、ＲＮＡの形態、例えば、ｍＲＮＡ、あるいは、ＤＮＡの形態、例えば、クローニング又は合成で作製されるｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを含む。該ＤＮＡは２本鎖（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ）、又は１本鎖（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ）であってもよい。１本鎖ＤＮＡ、又はＲＮＡは、コーディング鎖（センス鎖）であってもよく、また、ノンコーディング鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
【００３６】
「単離された核酸分子」とは、スギ花粉アレルゲンから単離されたＣｒｙ　ｊ　３核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。例えば、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のために単離されたと考えられる。さらに、単離されたＤＮＡ分子の例は、異種の宿主細胞中に保持される組換えＤＮＡ分子を含むか、又は、溶液中の精製された（部分的に又は実質的に）ＤＮＡ分子を含む。
【００３７】
本発明は、単離されたＣｒｙ　ｊ　３核酸分子を発現するための発現プラスミド及び該プラスミドで形質転換された宿主細胞を提供する。Ｃｒｙ　ｊ　３をコードする核酸分子又はそれらの１断片を発現ベクターに挿入し、適切な宿主でポリペプチドを発現させることによって、Ｃｒｙ　ｊ　３タンパク質又はそのペプチド断片を組換え的に産生させることができる。さまざまな発現系が当業者に公知である。特に、大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ）を宿主とするタンパク質の大量発現系は試みてみるべきである。
【００３８】
大腸菌発現系としては、１）他のタンパク質（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼやマルトース結合タンパク質等のキャリアータンパク質）や、短いアミノ酸配列と核酸レベルで融合させて発現する系と、２）そのまま単独で発現させる系とがある。本発明はその何れをも用いることができる。現在、さまざまな大腸菌発現系が市販されており、例えば、ｐＧＥＸ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＲＳＥＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＥＴ　ＴＲＸ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＴｒｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＰｐｒｏＥＸ　ＨＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等が挙げられる。これらの中で、転写能力が強いＴ７ファージＲＮＡポリメラーゼを利用するｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が今日最も汎用されており、本発明においても好ましい発現系と考えられるが、当業者であれば、本発明の実施のために、それぞれ個々に試みてみて最もふさわしい発現系を選択することができる。
【００３９】
機能的特性に翻訳後修飾が必要な場合は、酵母発現系（Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．：　Ｇｅｎｅ，　１９０：　５５−６２，　１９９７；　Ｋｏｎｄｏ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．：　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　１５：　４５３−４５７，　１９９７）、昆虫細胞発現系［Ｐｉｗｎｉｃａ−Ｗｏｒｍｓ，Ｈ．：　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄ．　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．）：　１６．１５．１−１６．１９．９，　１９８７］、ウイルス／哺乳動物細胞発現系（Ｍｏｓｓ，Ｂ．　ｅｔ　ａｌ．：　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ｅｄ．　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．）：　１６．１５．１−１６．１９．９，１９８７）、哺乳動物細胞発現系［Ｋａｕｆｍａｎ，　Ｒ．Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．：　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．）：　１６．１２．１−１６．１４．１３，　１９８７；　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．：　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ／２ｎｄ　ｅｄ．：　１６．１−１６．８１，　１９８９］について試みてみる。
【００４０】
Ｃｒｙ　ｊ　３タンパクは適切な形、例えば、融合タンパク質として発現することができ、また、分泌シグナルのみならず、付加的な異種の機能領域を含むことができる。例えば、付加的なアミノ酸領域、特に、荷電したアミノ酸が、精製の間、あるいは引き続くハンドリング及び貯蔵のあいだ、宿主細胞中での安定性及び持続性を改善するために、該タンパク質のＮ末端に付加することができる。また、ペプチドの一部分を精製を容易にするために付加することができる。このような領域は、該タンパク質の最終調製に先だって除くことができる。安定性を改善し、精製を容易にすべく、分泌を生じさせるために、ポリペプチドに対して、ペプチドの一部の付加は、当業者によく知られた慣用技術である。
【００４１】
本発明は、Ｃｒｙ　ｊ　３タンパクに対する特異的抗体、及び該抗体と特異的に反応するタンパク質（或いはポリペプチド）を包含する。該抗体は、ポリクローナル、またはモノクローナル抗体、ヒト化抗体、さらには、ヒト抗体を包含する。Ｃｒｙ　ｊ　３タンパク、若しくはそれらの変種、又はそれらを発現する細胞を抗原として、好ましくは、非ヒト動物にアジュバントとともに投与することにより、該抗原に対して該抗体を生じさせることができる。モノクローナル抗体は、当業者によく知られた技術を用いて調製することができる（Ｋｏｈｌｅｒ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　２５６：　４９５，　１９７５；　Ｃｕｒｒｅｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ａｕｓｕｂｅｌ，　ｅｔ　ａｌ．，　ｅｄ．，　１９８９）。Ｃｒｙ　ｊ　３タンパクに対するポリクローナル抗体も、当業者に公知の方法を用いて調製できる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　ｅｄ．　ｂｙ　Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ：　１９８８））。
【００４２】
モノクローナル抗体の調製のために、連続的セルライン培養によって産生される抗体を提供する技術は、いずれも用いることができる。このような技術は、例えば、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　２５６　：　４９５，　１９７５）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ，　ｅｔ　ａｌ．，　１９８３，　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　４　：　７２）、及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ，　ｅｔ　ａｌ．，　１９８５，　ｉｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ，　Ａｌａｎ　Ｒ．　Ｌｉｓｓ，　Ｉｎｃ．，　ｐｐ．　７７−９６）、等が挙げられる。
【００４３】
本発明のＣｒｙ　ｊ　３タンパク、その機能的断片、又は抗体をスギ花粉症を検出し及び診断に使用することもできる。例えば、検査対象のヒトから得た血液中のＩｇＥ抗体をＥＬＩＳＡ法で測定することができる。
【００４４】
【実施例】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでない。
［実施例１］　ＲＮＡの調製
スギ花粉からのＲＮＡの調製は、曽根ら（Ｓｏｎｅ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　２０１：　１０２１−１０２８，　１９９４）の方法に準じ、以下のように行った。１ｇ　のスギ花粉に　５　ｍＬ　の抽出緩衝液（０．１　Ｍ　ＬｉＣｌ，　１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ，１　％　ＳＤＳ，　２０％　２−メルカプトエタノール、０．１　Ｍ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，　ｐＨ　９．５）と　５　ｍＬ　のフェノール／クロロフォルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加え、ポッター型のホモゲナイザーでホモジナイズ後、１０，０００　ｒｐｍで１０　分間遠心した。遠心上清について、フェノール抽出とクロロフォルム／イソアミルアルコール抽出をそれぞれ一回ずつ行ってから、１／１０　容量の　３　Ｍ　酢酸ナトリウム（ｐＨ　５．６）および等容の４　Ｍ　塩化リチウムを加え−２０　゜Ｃ　で一晩置いた。１０，０００　ｒｐｍ　で　１０　分間遠心し、その沈澱をフォルムアミドに溶解し凍結保存した。一部を希釈してからエタノール沈澱を行い、ＴＥ　緩衝液に溶解し紫外の吸光度を測定した。収量は６μｇと著しく少なかった。また　２８０　ｎｍ　の吸光度が高く（Ａ２６０／Ａ２８０　＝　１．６９）、精製度も低かった。
【００４５】
［実施例２］　プライマーの合成
Ｊｕｎ　ａ　３　の　ｃＤＮＡ　塩基配列に基づき合成したＰＣＲプライマーの塩基配列を表１に示す。ＧＳＣＱＳ、ＮＱＣＧＳおよびＶＳＬＶＳ　は順方向（センス）プライマー、ＣＰＱＡＡ、ＣＱＴＧＡおよびＤＧＦＮＡ　は逆方向（アンチセンス）プライマーである。
【００４６】
【表１】
2004089103.tif 000002
【００４７】
Ｃｒｙ　ｊ　３のｃＤＮＡのクローニングに用いたＰＣＲプライマーの塩基配列を表２に示す。ＰＮＸＣＴ　は　３´　−ＲＡＣＥ　のためのオリゴ（ｄＴ）１７アダプタープライマー（オリゴ（ｄＴ）１７に、ＰｓｔＩ／ＮｏｔＩ／ＸｈｏＩ／ＣｌａＩの認識配列を付加したもの）で、その　５´側（下線部分）は　ＰＮＸＣ　の３´　側（下線部分）と同じ配列となっている。また、縮重オリゴヌクレチドプライマー　ＤＯＰ１、ＤＯＰ２およびＤＯＰ３　の　５´−側も　ＰＮＸＣの　３´　側と同じ配列となっている。
【００４８】
【表２】
2004089103.tif 000003
【００４９】
Ｃｒｙ　ｊ　３　の　ｃＤＮＡ　のクローニングに用いたＣｒｙ　ｊ　３のｃＤＮＡ塩基配列由来ＰＣＲプライマーの塩基配列を表３に示す。小文字で示した配列は　Ｃｒｙ　ｊ　３　の　ｃＤＮＡ　とは相同性のない制限酵素認識部位導入等を目的とする人為的な配列である。Ｃｒｙ　ｊ　３ａ、Ｃｒｙ　ｊ　３ｂおよびＣｒｙ　ｊ　３ｃに対する特異性は、配列が完全に一致する場合＋＋、１塩基の不一致の場合　＋　、そして２塩基以上の不一致の場合を−とした。なおＣＪ３ＣＳとＣｒｙ　ｊ　３ｂのｃＤＮＡの一致の程度は不明であるが、ＣＪ３ＣＳはＣｒｙ　ｊ　３ｂのｃＤＮＡのＰＣＲによる増幅に使用することができる。
【００５０】
【表３】
2004089103.tif 000004
【００５１】
［実施例３］　ｃＤＮＡの合成
１μｇ　のスギ花粉ＲＮＡ溶液を二分し、５０　ｐｍｏｌｅ　のアダプター付きオリゴ（ｄＴ）１７プライマー　ＰＮＸＣＴ（配列番号：２８）、あるいは約　３０　ｐｍｏｌｅ　のランダムプライマー（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ８１９０）を加え、６５゜Ｃ　で　３　分間インキュベートした。急冷後、ＲＮａｓｅ　Ｈ活性を除去した逆転写酵素〔ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＲＮａｓｅ　Ｈ（−）〕を用いて逆転写反応を行った。反応産物はフェノール／クロロフォルム抽出後、エタノール沈澱させた。沈澱は０．１　Ｎ　ＮａＯＨ　に溶解し、６５　゜Ｃ　で　３０　分間加熱処理し、ＲＮＡを加水分解した。１　Ｎ　塩酸を１／１０　容量加えて中和し、エタノール沈澱させた。沈殿物は７０　％　エタノールで洗浄後乾燥し、１００μＬ　の緩衝液〔２　ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ　８．０）、０．２　ｍＭ　ＥＤＴＡ〕に溶解した。ランダムプライマー（ヘキサマー）を用いて合成したｃＤＮＡを以後「ランダムｃＤＮＡ」と称し、アダプター付きオリゴ（ｄＴ）１７プライマー　ＰＮＸＣＴを用いて合成したｃＤＮＡを以後「アダプターｃＤＮＡ」と称する。
【００５２】
［実施例４］　二本鎖ＤＮＡの合成
Ｊｕｎ　ａ　３のｃＤＮＡ塩基配列に基づき合成したプライマーによるＰＣＲを行う前に、クレノウ酵素によりｃＤＮＡの相補鎖ＤＮＡを合成した。
５’側プライマー（１　ｐｍｏｌｅ）とランダムｃＤＮＡ溶液（３μＬ）を含む反応液２０μＬ〔２０　ｍＭ　ＫＣｌ、７　ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、および５０μＭ　ｄＮＴＰｓ　〕を　９６　゜Ｃ　で　５　分間インキュベートした。その後、３０　分かけて　６５　゜Ｃ　から　３５　゜Ｃ　に冷却した。１　ｕｎｉｔのクレノウ酵素を加え、２０　゜Ｃで１０分間、次いで３７　゜Ｃ　で１０　分間インキュベートし、二本鎖ＤＮＡを合成した。
【００５３】
［実施例５］　ＤＮＡ塩基配列の決定
プラスミドに挿入されたＤＮＡは、ユニバーサルプライマー（表　２　の　Ｍ１３Ｆ　および　Ｍ１３Ｒ；Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　の　Ａｍｐｌｉ−Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ　に含まれる）を用いたＰＣＲで増幅した。この増幅産物からセファアクリル　Ｓ−３００　のスピンカラムでＤＮＡを精製し、このＤＮＡを鋳型に、Ｍ１３Ｆ　あるいは　Ｍ１３Ｒ　をプライマーとして、Ｔｈｅｒｍｏ　ＳｅｑｕｅｎａｓｅＩＩＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）あるいは　ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用したサイクルシークエンシングの反応を行った。反応産物をセファデックス　Ｇ−５０　のスピンカラムで精製後、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ　３７７　あるいは　３１００）で塩基配列を決定した。
【００５４】
［実施例６］　　Ｃｒｙ　ｊ　３　ｃＤＮＡのクローニング
（１）　ＰＣＲ条件
Ｔａｑ　ポリメラーゼによるＰＣＲは、サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）を用いて、９６゜Ｃ　１５　秒、５５゜Ｃ　３０　秒、７２゜Ｃ　９０　秒の反応を　３０　回サイクル行った。反応液（１００μＬ）組成は、鋳型ＤＮＡ５μＬ、ＰＣＲプライマー２０　ｐｍｏｌｅ、２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ　（ｐＨ　８．３）、１．５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２５　ｍＭ　ＫＣｌ、０．０５　％　Ｔｗｅｅｎ　８０、１００μｇ／ｍＬ　ゼラチン、５０　μＭ　ｄＮＴＰｓ、および１０−２０　ｕ／ｍＬ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、であった。　非特異的プライミングを回避するため、Ｔａｑ　ＤＮＡ　ポリメラーゼは、鋳型　ＤＮＡ　を　９６゜Ｃ　で　５　分間加熱変性し、６０　分かけて５５゜Ｃ　から　３０゜Ｃ　に徐冷後、加えた。３０゜Ｃ、５５゜Ｃ、７２゜Ｃ　で各５　分間インキュベートした後、ＰＣＲを開始した。ＰＣＲ産物は直接、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、あるいはアガロースゲル電気泳動し、目的のバンドを切り出した。ＫＯＤ　Ｄａｓｈ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたＰＣＲは、サーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９６００）を用いて、９６゜Ｃ　２０　秒、６８゜Ｃ　１分の反応を　３０　回サイクル行った。反応液（２５−５０μＬ）は、酵素に付属の　１０　倍濃度緩衝液に、ｄＮＴＰｓおよびＰＣＲプライマーをそれぞれ２００μＭ、０．４μＭの濃度となるように加えた。ＧＣ含量が多い部分を含み増幅が困難な場合は、上記反応液にＤＭＳＯ　を２　％の濃度となるように添加し、９８゜Ｃ　２０　秒、６８゜Ｃ　１分の反応を　３０　回サイクル行った。
（２）　ＤＮＡ　断片の精製
ポリアクリルアミドゲル中のＤＮＡは、抽出液（０．５　Ｍ　酢酸アンモニウム、１０ｍＭ　酢酸マグネシウム、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、および０．１　％　ＳＤＳ）を用いて、３７　゜Ｃ　で４−１６時間抽出した。抽出液はブタノールで脱水濃縮し、２．５　容のエタノールを加えて　ＤＮＡを沈澱させた。アガロースゲル中のＤＮＡは、ＱＩＡＥＸＩＩ　ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ　社）で抽出／精製した。
（３）　ＤＮＡ断片のクローニング
ＤＮＡ断片は、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、あるいはｐＵＣ１１９に組み込み、大腸菌Ｋ１２株（ＭＣ１０６１）を形質転換してクローン化した。
【００５５】
（４）　Ｃｒｙ　ｊ　３のｃＤＮＡのクローニング
４−１　　Ｃｒｙ　ｊ　３のｃＤＮＡの部分クローニング
Ｊｕｎ　ａ　３と相同性の高い３種類の植物由来の５種類のタンパクのアミノ酸配列をアラインメントさせ、保存されている４ケ所を選び、６種類のＰＣＲプライマーを合成した。これらのプライマーを組み合わせ、ランダムｃＤＮＡ由来の二本鎖ＤＮＡを鋳型に、ＴａｑポリメラーゼによるＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動したが、主要バンドは期待する移動度を示さず、Ｊｕｎ　ａ３に相同なタンパクのｃＤＮＡ由来ではないと判断された。
そこで、プライマー　ＶＳＬＶＳ（配列番号：２１），　ＣＰＱＡＡ（配列番号：１６）を用いたＰＣＲで得られた、微量成分ではあるが期待する長さ（２５０　ｂｐ）のＤＮＡ断片（ＶＳ−ＣＰ）をｐＵＣ１１８にクローン化（ｐＵＣ１１８ＶＳ−ＣＰ＃５）し、その塩基配列を決定した。ｐＵＣ１１８ＶＳ−ＣＰ＃５の挿入塩基配列は、Ｊｕｎ　ａ　３　のｃＤＮＡの一部〔ヌクレオチドＣ（３８１番目）〜Ｇ（５８８番目）〕と相同性が高かった。
４−２　３’側ＤＮＡのクローニング
３’末端側のＤＮＡ領域は、３’−ＲＡＣＥ法でクローニングした。
ｐＵＣ１１８ＶＳ−ＣＰ＃５の配列に基づいて、３’−ＲＡＣＥ法のプライマーＹＳＭＩＳ（配列番号：４２）を合成した。また、アダプターｃＤＮＡを鋳型に、プライマーのＹＳＭＩＳおよびＰＮＸＣ（配列番号：２７）によるＰＣＲ（ＫＯＤ　Ｄａｓｈ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ）を行った。ＰＣＲ産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動し、約４００ｂｐのバンドを切り出し、ＤＮＡを精製し、ｐＵＣ１９上にクローン化し、挿入塩基配列を決定した。４−３　５’側ＤＮＡのクローニング
ＶＳ−ＣＰ　断片の　上流のＤＮＡ断片をプライマーＮＱＣＧＳ（配列番号：３６）およびＣＰＱＡＡ（配列番号：１６）によるＰＣＲで増幅することを試みたが、期待する長さのＤＮＡ断片は得られなかった。Ｊｕｎ　ａ　３の上流部分のＤＮＡ配列中にはＧＣ含量がやや高い部分が存在する。そこで、ランダムｃＤＮＡを鋳型に、プライマーＮＱＣＧＳ（配列番号：２０）およびＣＰＱＡＡ（配列番号：１６）によるＰＣＲを２　％　ＤＭＳＯ　を添加した反応液でＫＯＤ　Ｄａｓｈ　ＤＮＡポリメラーゼを使用して行った。このとき、３´側のプライマーのハイブリダイゼーションを促進するために、ＶＳ−ＣＰ　断片をＰｓｔＩで消化して得られた３´側の断片を添加した。ＰＣＲ産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動したところ期待する易動度（約４８０ｂｐ）のバンドが観察され、そこでこのバンドを切り出し、ＤＮＡを抽出・精製した。このＤＮＡの約４００　ｂｐのＳａｌＩ断片をｐＵＣ１９上にクローン化して、ｐＵＣ１９ＮＱ−ＣＰ＃６を得、その塩基配列を決定した。ｐＵＣ１９ＮＱ−ＣＰ＃６は、Ｊｕｎ　ａ　３のｃＤＮＡの一部〔Ｇ（１２１番目）〜Ａ（５４５番目）〕と相同性の高い塩基配列をクローン化していることが判明した。
さらに、ｐＵＣ１９ＮＱ−ＣＰ＃６の上流ＤＮＡをクローニングするために、縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｐｒｉｍｅｄ　ＰＣＲ：ＤＯＰ−ＰＣＲ）を行った。
ランダムｃＤＮＡ溶液（実施例３）４μＬと縮重オリゴヌクレオチドプライマー（ＤＯＰ１，ＤＯＰ２，ＤＯＰ３のうちいずれか１つ）２０　ｐｍｏｌｅを含む１０μＬの反応液〔２０　ｍＭ　ＫＣｌ、７　ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０μＭ　ｄＮＴＰｓ〕を９５゜Ｃで５分間加熱した。３５゜Ｃで１０　分間インキュベート後、３μＬを採り氷冷した。残りの溶液を３０゜Ｃで１０　分間インキュベート後、３μＬ　を採り氷冷した。残りの　４μＬ　は２５゜Ｃで　１０　分間インキュベートした。
プライマーＤＯＰ１（配列番号：２２）を３０゜Ｃで１０　分間アニールし、クレノウ酵素で二本鎖ＤＮＡとしたＤＮＡを鋳型に、プライマーＰＮＸＣ（配列番号：２７）およびＱＱＬＤＡ（配列番号：３８）によるＰＣＲ（Ｔａｑ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ）を行った。ＰＣＲ産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動したところ、約４５０　ｂｐのスメアなバンドが得られた。このバンドからＤＮＡを抽出・精製し、これを鋳型に、プライマーＰＮＸＣおよびＡＧＬＰＡによるｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ（ＫＯＤ　Ｄａｓｈ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ）を行った。ＰＣＲ産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動し、２５０−３００　ｂｐのバンドを切り出し、ＤＮＡを抽出・精製し、ｐＵＣ１９のＳｍａＩ−ＡａｔＩＩ断片（４８０　ｂｐ）と結合させた。この結合断片を鋳型に、プライマーＭ１３ＦおよびＰＮＸＣによるＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ、あるいは　ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ　で消化し、ｐＵＣ１９　のＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩ，　ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ、あるいは　ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ部位にクローン化し、７つのクローンｐＵＣ１９ＤＯ−ＡＧ＃ＥＳ３、ｐＵＣ１９ＤＯ−ＡＧ＃ＥＸ７、ｐＵＣ１９ＤＯ−ＡＧ＃ＥＰ５、ＥＰ６、ＥＰ７、ＥＰ８、およびＥＰ２２を得た。
これらのクローンの挿入断片の塩基配列を決定した。これらのクローンはＣｒｙ　ｊ　３の開始コドンの１２−３４塩基下流から始まると思われる約１５０　ｂｐのＤＮＡ断片をクローン化していた。これらのクローンの塩基配列を比較した結果、２　つのアイソタイプが認められた。
一方のアイソタイプでは開始コドンの約３０塩基対の後に、ＴＧＴＧＧというＤＯＰ１と相同性の高い配列が存在し、３クローン（ＤＯ−ＡＧ（ＥＳ）＃３、ＤＯ−ＡＧ（ＥＰ）＃５およびＤＯ−ＡＧ（ＥＰ）＃７）はそれ以降をクローン化していた。残りの４クローン（ＤＯ−ＡＧ（ＥＸ）＃７、ＤＯ−ＡＧ（ＥＰ）＃６、ＤＯ−ＡＧ（ＥＰ）＃８およびＤＯ−ＡＧ（ＥＰ）＃２２）のうち３クローン（ＤＯ−ＡＧ（ＥＰ）＃６、ＤＯ−ＡＧ（ＥＰ）＃８およびＤＯ−ＡＧ（ＥＰ）＃２２）はＴＧＴＧＧという配列が欠落しており、プライマーＰＮＸＣが直接ｃＤＮＡにハイブリダイズして伸長し、増幅されていた。これらの配列に基づいて、２種類のプライマーＱＥＡＧＡ（配列番号：３７）およびＮＱＣＧＡ（配列番号：３６）を合成し、上記の工程を繰り返し、いわゆるウォーキングにより、さらに上流のＤＮＡを以下のようにしてクローニングした。
一本鎖ｃＤＮＡとプライマー　ＤＯＰ２（配列番号：２３）を　２５゜Ｃ　でアニール後、クレノウ酵素により二本鎖ＤＮＡとしたＤＮＡを鋳型に、プライマーＰＮＸＣおよびＮＱＣＧＡによるＰＣＲ（Ｔａｑポリメラーゼ）を行った。ＰＣＲ産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動し、約１５０　ｂｐのバンドを切り出し、ＤＮＡを抽出・精製した。このＤＮＡを鋳型に、プライマーＱＥＡＧＡおよびＰＮＸＣによるｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動し、約１４０　ｂｐのバンドを切り出し、ＤＮＡを抽出・精製した。このＤＮＡ断片をｐＵＣ１９にクローン化し、ｐＵＣ１９ＤＯ−ＱＥ＃ＨＰ２および＃ＨＰ５を得た。挿入断片の塩基配列を決定した結果。これらのクローンは、Ｃｒｙ　ｊ　３の開始コドンの上流３０塩基から始まる配列を含んでおり、開始コドンの約３０塩基対後にＴＧＴＧＧがないアイソタイプ（Ｃｒｙ　ｊ　３ａ）のｃＤＮＡをクローン化していた。
また、プライマーＭ１３ＲおよびＰＮＸＣ増幅産物をＰｓｔＩで消化し、ｐＵＣ１１８のＰｓｔＩ部位にクローン化したｐＵＣ１１８ＤＯ−ＱＥ＃Ｐ２、＃Ｐ３、および＃Ｐ４もＣｒｙ　ｊ　３ａのｃＤＮＡの開始コドンの２５−３０塩基対上流から始まる塩基配列を含んでいた。
４−４　Ｃｒｙ　ｊ　３　ａの全長塩基配列決定
以上の実験で　Ｃｒｙ　ｊ　３ａ　をコードする　ｃＤＮＡ　塩基配列の全容がほぼ明らかとなった。ＰＣＲによる変異が起きている可能性があり、少なくとも　２　種類のアイソタイプが存在することから、それぞれのＰＣＲで増幅した複数のクローンの塩基配列をアラインメントして比較し、ＰＣＲ　の過程で生じたと思われる変異と多型性について検討した。
成熟型　Ｃｒｙ　ｊ　３　の全アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するために、Ｃｒｙ　ｊ　３ａに対応する５´側のプライマーＣＪ３ＢＳ（配列番号：３４）およびＣｒｙ　ｊ　３ａ　とは異なるアイソタイプに対応するプライマーＣＪ３ＡＳ（配列番号：３１）を合成した。また、３´側のプライマーとして、塩基配列が判明している一方のアイソタイプに対応するプライマーＣＪ３Ａ（配列番号：３０）を合成した。
これらのプライマーを組み合わせて、ランダムｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動した結果、期待する長さのバンドが得られた。このバンドからＤＮＡを抽出・精製し、ｐＵＣ１１９　上にクローン化し、塩基配列を決定した。その結果、Ｃｒｙ　ｊ　３ａプライマー　ＣＪ３ＢＳ　を用いた４　クローン（ｐＵＣ１１９ＣＪ３Ｂ＃１、＃２、＃３および＃４）はすべて　５´側プライマーの部分に様々な欠失ないしは変異が起きていたが、その他の部分はいずれもＣｒｙ　ｊ　ａの塩基配列であった。一方、プライマーＣＪ３ＡＳおよびＣＪ３Ａ　を用いたＰＣＲで得られた２クローン（ｐＵＣ１１９ＣＪ３Ａ＃１および＃２）はいずれも、５´側プライマーの部分のみがＣＪ３ＡＳ　の配列であり、その他の部分の塩基配列はすべてＣｒｙ　ｊ　３ａの塩基配列であった。
アダプタープライマーＰＮＸＣＴ　によるＰＣＲで合成したｃＤＮＡを鋳型に、プライマーＣＪ３ＡＳ（配列番号：３１）あるいはＣＪ３ＢＳ（配列番号：３４）と、プライマーＰＮＸＣを組み合わせてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した結果、約１　ｋｂのバンドが得られた。このバンドからＤＮＡを抽出し、プライマーＶＤＮＣＳとＰＮＸＣ　の組み合わせでｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動した結果、期待する長さ（約４００　ｂｐ）のバンドが得られた。このバンドからＤＮＡ　を抽出・精製・増幅し、ＳａｌＩ／ＰｓｔＩで消化後、ｐＵＣ１９　の　ＳａｌＩ−ＰｓｔＩ部位にクローン化し、３クローン〔ｐＵＣ１９ＶＤｐＡ（Ａ）＃１，ｐＵＣ１９ＶＤｐＡ（Ｂ）＃４，ｐＵＣ１９ＶＤｐＡ（Ｂ）＃６〕の挿入断片の塩基配列を決定した。先に得られたクローンの塩基配列も参考にしながら、開始コドンからポリＡ　に至るまでのＣｒｙ　ｊ　３ａ　の（主要成分の）ｃＤＮＡの全塩基配列を決定した（配列番号：１）。
４−５　Ｃｒｙ　ｊ　３　の　ｃＤＮＡ　塩基配列の多型性
プライマーＣＪ３ＡＳ（配列番号：３１）およびＰＮＸＣによるＰＣＲで得たＤＮＡ断片（約１　ｋｂ）を鋳型として、プライマーＣＪ３ＡＳおよびＣＪ３Ａ（配列番号：３０）によるＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物をクローン化した結果、Ｃｒｙ　ｊ　３ａ　とは異なるアイソタイプのｃＤＮＡクローン（ｐＵＣ１１９ＣＪ３Ａ＃１４，　＃１５，　＃１６）が得られた。これら３　クローンの塩基配列をアラインメントし、比較した結果、ｐＵＣ１１９ＣＪ３Ａ＃１４　とｐＵＣ１１９ＣＪ３Ａ＃１６　は３塩基のみが異なっていたが、ｐＵＣ１１９ＣＪ３Ａ＃１４とｐＵＣ１１９ＣＪ３Ａ＃１５とは３６塩基が異なっていた。すなわち、Ｃｒｙ　ｊ　３ａとは異なる、少なくとも２つのアイソタイプが存在することが判明した。
そこで、ｐＵＣ１１９ＣＪ３Ａ＃１４およびｐＵＣ１１９ＣＪ３Ａ＃１６にクローン化されているＤＮＡを「Ｃｒｙ　ｊ　３ｂ」と称し、ｐＵＣ１１９ＣＪ３Ａ＃１５にクローン化されているｃＤＮＡを「Ｃｒｙ　ｊ　３ｃ」と称した。
４−６　Ｃｒｙ　ｊ　３ｃ　ｃＤＮＡ塩基配列決定
Ｃｒｙ　ｊ　３ｃのｃＤＮＡに特異性が高いプライマーＹＴＱＳＳ（配列番号：４３）を用いた３´−ＲＡＣＥ　法により、３´側の未知領域をクローン化した〔ｐＵＣ１９ＹＴｐＡ（２）＃１および＃１１，　ｐＵＣ１９ＹＴｐＡ（３）＃２〕。一方、５´側領域について、プライマー　ＤＯＰ３とプライマーＮＱＣＧＡ（配列番号：３６）およびＹＩＱＥＡ（配列番号：４１）によるＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物をクローン化した（ｐＵＣ１９ＤＯ−ＹＩ＃ＨＰ１およびｐＵＣ１９ＤＯ−ＹＩ＃ＨＨ２）。
得られた５´および３´側非翻訳領域の塩基配列をもとに合成したプライマーＣＪ３ＣＳ（配列番号：３５）およびＣＪ３ＢＡ２（配列番号：３３）を用い、ランダムｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行った。このＰＣＲで得られた断片をＸｂａｌで切断したｐＵＣ１９に結合させ、Ｍ１３Ｆ−ＣＪ３ＢＡ１のＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片をｐＵＣ１９上にクローン化しｐＵＣ１９ＣＪ３ＣＳ−ＢＡ１＃１を得た。またＣＪ３ＣＳ−Ｍ１３ＲのＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片の一部（Ｂｇ１ＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ）をｐＵＣ１１９上にクローン化し、ｐＵＣ１１９ＢｇｌＢＡ２＃３を得た。
これらのクローンの塩基配列をアラインメントさせて、Ｃｒｙ　ｊ　３ｃのｃＤＮＡの全塩基配列を決定した（配列番号：１１）。
４−７　Ｃｒｙ　ｊ　３ｂ　の　ｃＤＮＡ　塩基配列決定
Ｃｒｙ　ｊ　３ｂとＣｒｙ　ｊ　３ｃのＤＮＡ塩基配列の異なる部分に基づいてＣｒｙ　ｊ　３ｂ　に特異性の高いプライマーＹＹＤＶＡ（配列番号：４４）を合成した。ランダムｃＤＮＡを鋳型に、プライマーＹＹＤＶＡおよびＣＪ３ＣＳ（配列番号：３５）によるＰＣＲで、Ｃｒｙ　ｊ　３ｂ　の　５´側領域を増幅した。増幅産物をクローン化し（ｐＵＣ１９ＣＪ３ＣＳ−ＹＹ＃１、＃２および＃３）、塩基配列を決定した。
一方、３′側領域は、Ｃｒｙ　ｊ　３ｂ　に特異性が高いプライマー　ＴＹＡＮＳを用いた単純な一段階の　３´−ＲＡＣＥ　法では得ることは出来なかった。そこで、Ｃｒｙ　ｊ　３ｂおよびＣｒｙ　ｊ　３ｃに共通なプライマーＣＪ３ＡＳ（配列番号：３１）とアダプタープライマーＰＮＸＣを用いて、アダプターｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物を鋳型に、プライマーＴＹＡＮＳおよびアダプタープライマーＰＮＸＣ　によるｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動し、約　４４０　ｂｐのバンドからＤＮＡを抽出・精製し、断片ＴＹ−ＰＮ（３）を得た。このＤＮＡ断片の塩基配列を決定したところ、Ｃｒｙ　ｊ　３ｂの３´側領域を含んでいた。
また、このＤＮＡ断片をｐＵＣ１９にクローン化し、（ｐＵＣ１９ＴＹｐＡ＃ＥＰ１および＃ＥＰ３）、挿入断片の塩基配列を決定した。これらのクローンの塩基配列をアラインメントさせた結果、Ｃｒｙ　ｊ　３ｂの全ＤＮＡ塩基配列が決定した（配列番号：６）。
４−８　Ｃｒｙ　ｊ　３ａ、Ｃｒｙ　ｊ　３ｂおよびＣｒｙ　ｊ　３ｃとＪｕｎ　ａ　３の相同性
マウンテンシダー由来のアレルゲンタンパクＪｕｎ　ａ　３のアミノ酸配列と、スギ花粉由来のＣｒｙ　ｊ　３ａ、Ｃｒｙ　ｊ　３ｂおよびＣｒｙ　ｊ　３ｃタンパクのアミノ酸配列のアラインメントを図１にまとめて示した。図１にはまた、Ｊｕｎ　ａ　３と相同性の高いｅａｓｔｅｒｎ　ｒｅｄ　ｃｅｄａｒの抗原Ｊｕｎ　ｖ　３とＣｕｐｒｅｓｓｕｓ　ａｒｉｚｏｎｉｃａの抗原Ｃｕｐ　ａ　３のアミノ酸配列のアラインメントも示した。また、Ｃｒｙ　ｊ　３ａ、Ｃｒｙ　ｊ　３ｂおよびＣｒｙ　ｊ　３ｃタンパクのアミノ酸配列の相同性の関連を図２に示した。
Ｊｕｎ　ａ　３と、Ｃｒｙ　ｊ　３ａ、Ｃｒｙ　ｊ　３ｂおよびＣｒｙ　ｊ　３ｃのアミノ酸配列の相同性を比較すると、Ｃｒｙ　ｊ　３ｂおよびＣｒｙ　ｊ　３ｃの前駆体のアミノ酸残基数は２２５残基と、Ｊｕｎ　ａ　３のそれと全く同じ残基数であり、Ｃｒｙ　ｊ　３ｂはＪｕｎ　ａ　３と８５％相同、Ｃｒｙ　ｊ　３ｃもほぼ同じく８４％相同で、相同性が高いといえる。
一方、Ｃｒｙ　ｊ　３ａ　の前駆体のアミノ酸残基数は２３１残基と、Ｊｕｎ　ａ　３のそれより６残基多く、この６残基を除いたＣｒｙ　ｊ　３ａ　の前駆体のアミノ酸配列との比較でも、相同性はＣｒｙ　ｊ　３ｂおよびＣｒｙ　ｊ　３ｃよりも低く、７６％であった。
また、Ｃｒｙ　ｊ　３ａ、Ｃｒｙ　ｊ　３ｂおよびＣｒｙ　ｊ　３ｃのアミノ酸配列を相互比較すると、Ｃｒｙ　ｊ　３ａはＣｒｙ　ｊ　３ｂと８０％相同、Ｃｒｙ　ｊ　３ｃとはほぼ同じ７８％相同である。そしてＣｒｙ　ｊ　３ｂとＣｒｙ　ｊ　３ｃとは９６％と相同性が極めて高い。
【００５６】
［実施例７］　　Ｃｒｙ　ｊ　３タンパク質の発現
５−１　ヒスチジンタグ融合タンパク（Ｃｒｙ　ｊ　３ａ）
Ｃｒｙ　ｊ　３ａ　のＤＮＡを　ＣＪ３ＢＳ−ＣＪ３Ａ　のＰＣＲで増幅し、大腸菌発現ベクターに組み込むことを何度か試みたが、５´　側プライマーの周辺に様々な欠失あるいは変異が起きた（実施例６、４−４参照）。そこで　１５　ｂｐ　程上流の　ＮｄｅＩ　認識部位を利用して組換えた。この場合、Ｎ末端にポリヒスチジン（６　ヒスチジン残基）が付加したヒスチジンタグ融合タンパクとして発現される。
先ず、ｐＵＣ１１９ＣＪ３Ａ＃２の挿入塩基配列とｐＵＣ１９ＤＯ−ＡＧ＃ＥＰ６の挿入塩基配列を以下のようにしてつないだ。ｐＵＣ１９ＤＯ−ＡＧ＃ＥＰ６を鋳型に、プライマーＭ１３ＲおよびＡＧＬＰＡによるＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片と、ｐＵＣ１９ＣＪ３Ａ＃２を鋳型に、プライマーＣＪ３ＡＳおよびＣＪ３ＡによるＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片を混合してアニールし、プライマーＭ１３ＲおよびＣＪ３ＡによるＰＣＲで融合断片を増幅した。このＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩで消化後、ｐＵＣ１９ＤＯ−ＱＥ＃Ｐ３（単なるベクターとして使用した）の　ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩアームと結合させ、ｐＵＣ１９Ｃｊ３ａＮＨ＃４を得た。ｐＵＣ１９Ｃｊ３ａＮＨ＃４（ｐＵＣ１１９ＣＪ３Ａ＃２）の挿入塩基配列がコードするアミノ配列の３０番目のアミノ酸は微量成分に対応すると考えられたので、ｐＵＣ１９Ｃｊ３ａＮＨ＃４の約１９０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＡｖａＩＩ断片と、ｐＵＣ１１９ＣＪ３Ｂ＃２の約５４０　ｂｐのＡｖａＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ　断片を　ｐＵＣ１９　の　ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ　アーム上でつないで、ｐＵＣ１９Ｃｊ３ａＮＨ´＃１　を得た。
ｐＱＥ１１をＨｉｎｄＩＩＩ　で消化後、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰの存在下でクレノウ酵素処理したものと、ｐＵＣ１９Ｃｊ３ａＮＨ′＃１をＮｄｅＩで消化後、　ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびＴＴＰの存在下クレノウ処理したものを結合させた。プライマーＰＱＥＳＤＳ（配列番号：４５）およびＭ１３Ｒを用いたＰＣＲでＣｒｙ　ｊ　３ａ　のＤＮＡを増幅した。このＤＮＡ断片をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ｐＱＥ１０　の　ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩアームと結合させた。得られたクローンのうち　ｐＱＥＣｊ３ａ＃７　の挿入塩基配列を両方向で読んだ。結果、Ｃｒｙ　ｊ　３ａ　のシグナル部分のＡｌａがＴｈｒに変換されていたが、その他のアミノ酸配列を変えるような変異がないことを確認した。
５−２　ヒスチジンタグ融合タンパク（Ｃｒｙ　ｊ　３ｂ）
ｐＵＣ１１９ＣＪ３Ａ＃１４を鋳型に、ユニバーサルプライマーによるＰＣＲで挿入塩基配列を増幅した。ＤＮＡ断片をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ｐＱＥ９のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩアームと結合し、得られたクローンｐＱＥＣｊ３ｂ＃３／＃４　の挿入塩基配列が正しいことを確認した。
５−３　ヒスチジンタグ融合タンパク（Ｃｒｙ　ｊ　３ｃ）
Ｃｒｙ　ｊ　３ｃ　のＤＮＡは３つのクローン（ｐＵＣ１９ＹＴｐＡ（３）＃ＥＰ１、ｐＵＣ１９ＣＪ３ＣＳ−ＢＡ１＃１おいびｐＵＣ１９ＢｇｌＢＡ２＃３）のＤＮＡ断片を組み合わせて作製した。
ｐＵＣ１９ＹＴｐＡ（３）＃ＥＰ１　は、アダプターｃＤＮＡを鋳型に、４段階の　ＰＣＲ（１回目はプライマーＣＪ３ＡＳおよびＰＮＸＣ、２回目は、プライマーＹＴＱＳＳおよびＰＮＸＣ、３回目はプライマーＹＴＱＳＳおよびＭ１３Ｒ、そして４回目はプライマーＭ１３ＦおよびＰＮＸＣ）により得た、約　９００　ｂｐのＤＮＡ断片をｐＵＣ１９にクローン化して得た。３回目と４回目のＰＣＲの前に、ＰｓｔＩ／ＳｍａＩ、あるいは　ＸｂａＩで消化したｐＵＣ１９　への結合反応を行った。原因は不明であるが、本来クローン化されるはずのないプライマー　ＣＪ３ＡＳの認識部位に始まりポリＡに至るｃＤＮＡ　の断片がクローン化されていた。プライマーＣＪ３ＡＳ由来のＢａｍＨＩ認識部位からＨｉｎｆＩ　認識部位に至るまでの１３９　ｂｐに変異がないことを確認したので用いた。
ｐＵＣ１９ＣＪ３ＣＳ−ＢＡ１＃１　は　ＨｉｎｆＩ　認識部位から　ＳｐｈＩ　認識部位に至るまでの　２２６　ｂｐ　に変異がないことを確認したので用いたた。
ｐＵＣ１９ＢｇｌＢＡ２＃３　は　ＳｐｈＩ　認識部位以降、終止コドンに至るまでの　２５２　ｂｐ　に変異がないことを確認したので用いた。
ｐＵＣ１９ＹＴｐＡ（３）＃ＥＰ１をＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、約　８００　ｂｐ　の挿入塩基配列を切り出し、さらにＨｉｎｆＩで消化して、１６０　ｂｐのＤＮＡ断片を分離した。また、ｐＵＣ１９ＣＪ３ＣＳ−ＢＡ１＃１をＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、約　７００　ｂｐ　の挿入塩基配列を切り出し、さらにＨｉｎｆＩで消化して、４７０　ｂｐのＤＮＡ断片を分離した。これら２つのＤＮＡ断片をｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ　アームと結合させ、ｐＵＣ１９Ｃｊ３ｃ´＃１を得た。
ｐＵＣ１９Ｃｊ３ｃ´＃１　の挿入塩基配列は、変異クローンが　１／３　程度混入していたが、主要成分の塩基配列は正しかった。そこで、ｐＵＣ１９Ｃｊ３ｃ´＃１をＳｐｈＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＤＮＡ断片（ベクター側、　Ｃｒｙ　ｊ　３ｃ　の　Ｎ−末端側の　ｃＤＮＡ　塩基配列を含む）を分離した。
一方、ｐＵＣ１９ＢｇｌＢＡ２＃３を鋳型に、プライマーＭ１３ＦおよびＣＪ３ＢＡ１によるＰＣＲで挿入塩基配列の大部分を増幅し、終止コドンの直後に　ＨｉｎｄＩＩＩ　の認識部位を付加した。このＰＣＲ断片ＳｐｈＩとＰＣＲ断片をＳｐｈＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して得た約　４５０　ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＵＣ１９Ｃｊ３ｃ´＃１のＳｐｈＩ−ＨｉｎｄＩＩＩアームと結合させて、ｐＵＣ１９Ｃｊ３ｃ＃２　を得た。ｐＵＣ１９Ｃｊ３ｃ＃２をＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＱＥ９の　ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩアームと結合し、ｐＱＥＣｊ３ｃ＃４　の挿入塩基配列が正しいことを確認した。
【００５７】
【配列表】
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【発明の効果】
本発明により、マウンテンシダーＪｕｎ　ａ　３タンパクのアミノ酸配列に相同性の高いスギ花粉アレルゲンをコードする３種類のＤＮＡが提供された。これらのＤＮＡの発現タンパクであるＣｒｙ　ｊ　３ａ、Ｃｒｙ　ｊ　３ｂおよびＣｒｙ　ｊ　３ｃタンパクは、スギ花粉症の減感作治療や診断に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｃｒｙ　ｊ　３ａ、Ｃｒｙ　ｊ　３ｂおよびＣｒｙ　ｊ　３ｃと、Ｊｕｎ　ａ　３　の前駆体Ｊｕｎ　ｖ　３（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＡＦ１５１４３０）、Ｃｕｐ　ａ　３（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＡＪ２９４４１１）のアミノ酸配列のアラインメントを示す。Ｃｒｙ　ｊ　３ａ　の前駆体は　Ｊｕｎ　ａ　３，　Ｃｒｙ　ｊ　３ｂ，Ｃｒｙ　ｊ　３ｃ　の前駆体よりも　６　アミノ酸残基長く、斜体で示したアミノ酸残基が挿入されている。
【図２】Ｃｒｙ　ｊ　３ａ，　Ｃｒｙ　ｊ　３ｂ，　Ｃｒｙ　ｊ　３ｃ　と　Ｊｕｎ　ａ　３　の前駆体のアミノ酸配列の相同性を示す。
【図１】
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【図２】
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