(57)【要約】【課題】Ｘ型ホスホリパーゼＡ２遺伝子の機能が欠損したマウスを提供する。【解決手段】Ｘ型ホスホリパーゼＡ２遺伝子に他の遺伝子を挿入することによりＸ型ホスホリパーゼＡ２遺伝子の機能を欠損させる。【効果】本発明動物は、Ｘ型ホスホリパーゼＡ２の関与する循環器系、呼吸器系、免疫系疾患の病態生理、原因の解明および治療法の開発等のために有用である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｘ型ホスホリパーゼＡ２のノックアウトマウス。
【請求項２】
Ｘ型ホスホリパーゼＡ２遺伝子のいずれかの部位に他の遺伝子が挿入されることによりＸ型ホスホリパーゼＡ２遺伝子が発現していない請求項１に記載のマウス。
【請求項３】
他の遺伝子が選択マーカー遺伝子である請求項２に記載のマウス。
【請求項４】
他の遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子である、請求項３に記載のマウス。
【請求項５】
Ｘ型ホスホリパーゼＡ２遺伝子の第１エキソンにネオマイシン耐性遺伝子が挿入されている、請求項４に記載のマウス。
【請求項６】
以下の工程：
（１）マウスＸ型ホスホリパーゼＡ２遺伝子ＤＮＡの相同組換え用コンストラクトを作製する工程、
（２）ＥＳ細胞のＸ型ホスホリパーゼＡ２遺伝子に変異を導入する工程、
（３）偽妊娠マウスの子宮角に移植してキメラマウスを作製する工程、
（４）ヘテロ変異マウス同士を交配し、サザンブロットによりＸ型ホスホリパーゼＡ２遺伝子のホモ変異マウスを選択する工程、を含む請求項１から５のいずれかに記載のＸ型ホスホリパーゼＡ２のノックアウトマウスの作製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な系統の動物自体およびその作出方法に関する。さらに詳しくは、Ｘ型ホスホリパーゼＡ２構造遺伝子の一部に１個以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失等の変異を有し、Ｘ型ホスホリパーゼＡ２蛋白質の合成が抑制されているマウスおよびその作出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ホスホリパ−ゼＡ２（ＰＬＡ２；  ＥＣ  ３．１．１．４）は、３−ｓｎ−ホスホグリセリドの２−アシルエステル結合を加水分解するリン脂質分解酵素の総称である。その中で１つのファミリーを形成している分泌型ＰＬＡ２（ｓＰＬＡ２）は、細胞外に分泌される低分子量（１３−１８  ｋＤａ）のＰＬＡ２分子群であり、ヒトでは、ＩＢ型、ＩＩＡ型、ＩＩＤ型、ＩＩＥ型、ＩＩＦ型、Ｖ型、Ｘ型、ＸＩＩ型の８種類が知られている。いずれの分子種も、その構造中に１２〜１６個のＣｙｓ残基を持ち分子内ジスルフィド結合を形成しており、またＨｉｓ−Ａｓｐ残基からなる活性中心部位が保存されている。さらに、共通のＣａ２＋結合領域を持ち、酵素活性の発現にはｍＭオーダーのＣａ２＋が必要である（非特許文献１〜４）。
【０００３】
この中で、ヒトＸ型ｓＰＬＡ２は、ＤＮＡデータベースよりｓＰＬＡ２関連配列に基づき、１９９７年に胎児肺組織よりクローニングされた（非特許文献５）。ヒトＸ型ｓＰＬＡ２の遺伝子は、他のｓＰＬＡ２と異なり第１６番染色体上に位置する。本ｓＰＬＡ２は、分子内に１６システイン残基を有し、ＩＢ型ｓＰＬＡ２とＩＩ型（ＩＩＡ／ＩＩＤ／ＩＩＥ／ＩＩＦ型）ｓＰＬＡ２のそれぞれに存在する特徴的な分子内ジスルフィド架橋をすべて含んでいる。さらに、ＩＩ型ｓＰＬＡ２に特有のカルボキシル基末端延長構造を有する。Ｘ型ｓＰＬＡ２には、１１アミノ酸残基から成るプロペプチド配列をＮ−末端に有する非活性型のプロ型と、そのプロペプチド部分がＴｒｙｐｓｉｎなどのプロテアーゼによって切断されて生じる活性型の２つの分子種が存在する（非特許文献６）。
【０００４】
活性型のＸ型ｓＰＬＡ２は、哺乳動物由来の他のｓＰＬＡ２、特にＩＢ、ＩＩＡ型ｓＰＬＡ２と比較して、基質であるリン脂質の種類や性状に関わりなく高い酵素活性を有し、さらに細胞に作用させた際の細胞膜からのアラキドン酸遊離、ならびにエイコサノイドやリゾリン脂質などの脂質性メディエーターの産生能がＩＢ、ＩＩＡ型ｓＰＬＡ２よりも非常に高いことが明らかにされている（非特許文献７および８）。特異抗体を用いた免疫組織化学的解析により、Ｘ型ｓＰＬＡ２の発現は、ＩＩ型肺胞上皮細胞や脾臓マクロファージで認められるほか、ヒト大腸ガン組織のガン細胞（特許文献１）およびアルツハイマー病患者脳（特許文献２）で発現が亢進していることが明らかにされている。
【０００５】
また、Ｘ型ホスホリパーゼＡ２がホスファチジルコリンを表面にもつリポ蛋白質からも脂肪酸を遊離すること、そうした変性を受けた低密度リポ蛋白質はマクロファージに取り込まれ、動脈硬化病変部位で観察されるコレステロールエステルの蓄積を引き起こすこと、動脈硬化モデル動物の病変部位でＸ型ホスホリパーゼＡ２の発現が上昇していることが明らかとなった（特許文献３）。これらのことから本酵素が炎症、免疫応答、大腸ガン、アルツハイマー病、動脈硬化症の発症・進展に関与することが示唆されるが、その本質に迫るまでにはいたっていない。また、このような生理機能の解明に必要な、Ｘ型ホスホリパーゼＡ２遺伝子の機能が欠損したマウスは知られていない。
【０００６】
【特許文献１】
ＷＯ０２／０００２５５、実施例３
【特許文献２】
ＷＯ０２／０００２５７、実施例３
【特許文献３】
ＷＯ０２／０７４３４２、実施例７
【非特許文献１】
イシザキ（Ｉｓｈｉｚａｋｉ）ら、ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー“Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．”、１９９９年  第２７４巻，２４９７３−２４９７９頁、図２
【非特許文献２】
スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）ら、ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー“Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．”、２０００年、第２７５巻，５７８５−５７９３頁、図３
【非特許文献３】
シックス（Ｓｉｘ）ら、バイオシム  バイオフィズ  アクタ“Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ”、２０００年、第１４８８巻，  １−１９頁、図１
【非特許文献４】
ゲルブ（Ｇｅｌｂ）ら、ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー“Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．”、  ２０００年、第２７５巻，  ３９８２３−３９８２６頁、図３
【非特許文献５】
カピラード（Ｃｕｐｉｌｌａｒｄ）ら、ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー“Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．”、１９９７年、第２７２巻，１５７４５−１５７５２頁、図６
【非特許文献６】
モリオカ“Ｍｏｒｉｏｋａ”ら、アーカイブス  オブ  バイオケミストリー  アンド  バイオフィジックス“Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．”、２０００年、第３８１巻，３１−４２頁、図１
【非特許文献７】
ハナサキ“Ｈａｎａｓａｋｉ”ら、ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー“Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．”、１９９９年、第２７４巻、３４２０３−３４２１１頁、図５および６
【非特許文献８】
サイガ“Ｓａｉｇａ”ら、バイオシム  バイオフィズ  アクタ“Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ”、２００１年、第１５３０巻，６７−７６頁、図１および図３
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記の実情に基づき、本発明者らはＸ型ホスホリパーゼＡ２の遺伝子を欠損したマウスを作成して、その生理機能の変化を解析することによって、Ｘ型ホスホリパーゼＡ２の生理的な役割を直接明らかにすることを可能にするとともに、同時に、Ｘ型ホスホリパーゼＡ２の関与する種々の病態の解明あるいは治療法の研究のために、遺伝的背景の明確な動物モデルを提供しようとするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明は、遺伝子工学的方法でＸ型ホスホリパーゼＡ２遺伝子（ＰＬＡ２−Ｘ）の機能を人為的に欠損させたマウスを提供する。
【０００９】
【具体的な説明】
Ｘ型ホスホリパーゼＡ２の遺伝子の機能を人為的に欠損させたマウスを得るためには、Ｘ型ホスホリパーゼＡ２遺伝子をクロ−ニングし、Ｘ型ホスホリパーゼＡ２の遺伝子に１個以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失等の変異を起して失活させた後にマウスにもどす方法が用いられる。Ｘ型ホスホリパーゼＡ２遺伝子のクロ−ニングは、たとえばマウスの肝臓のジェノミックＤＮＡライブラリ−をすでにクロ−ニングされているＸ型ホスホリパーゼＡ２をコードするＤＮＡ、たとえばｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋＴＭ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＦ１６６０９７）を用いてスクリーニングすればよい。
【００１０】
Ｘ型ホスホリパーゼＡ２の遺伝子の第１エクソンは、開始コドンならびにＮ末端領域のアミノ酸をコードしている（図１）。Ｘ型ホスホリパーゼＡ２遺伝子の機能を欠損するためには、この第１エクソンを欠失させるか、あるいは他の遺伝子を挿入すればよい。Ｘ型ホスホリパーゼＡ２遺伝子の欠損を検出するための遺伝子マーカーとしても機能する他の遺伝子を挿入することが好ましく、この様な遺伝子としてはネオマイシン耐性遺伝子（Ｇ４１８耐性により選択）、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（ハイグロマイシンＢにより選択）、ブラスチシジンＳ耐性遺伝子（ブラスチシジンＳにより選択）、チミジンキナーゼ  （フルオロヨードアデノシルウラシンもしくはガンサイクロビアにより選択）、ジフテリア毒素Ａフラグメント遺伝子等が用いられる。これらの遺伝子の挿入は試験管内で常用のＤＮＡ組換技法により行うことができる。
【００１１】
次に、こうして得られた相同組み換え用ＤＮＡをマウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に導入し、ＥＳ細胞中のＸ型ホスホリパーゼＡ２遺伝子と相同組み換えを行う。相同組み換え用ＤＮＡの挿入は、たとえば常用のエレクトロポレ−ションにより行うことができる。この相同組み換えにおいては、ＥＳ細胞中のＸ型ホスホリパーゼＡ２遺伝子のＤＮＡと相同組み換え用ＤＮＡの対応する領域との間で組み換えが生じ、相同組み換え用ＤＮＡ中に挿入されていたマ−カ−遺伝子がＥＳ細胞のジェノミックＸ型ホスホリパーゼＡ２遺伝子に挿入される。この結果、ＥＳ細胞はＸ型ホスホリパーゼＡ２遺伝子を欠失し、同時にマ−カ−遺伝子を得る。このマ−カ−遺伝子に基づいてＸ型ホスホリパーゼＡ２遺伝子の機能が欠損したＥＳ細胞を得ることができる。
【００１２】
次に、このＥＳ細胞をマウスの胚盤胞に注入し、さらに偽妊娠マウスの子宮角に移植して産仔を得る。次に、こうして得たキメラマウスを適当な系統のマウスと交配することにより産仔を得る。キメラマウスの生殖細胞が相同組み換え体（Ｘ型ホスホリパーゼＡ２遺伝子が破壊されている）に由来すればＸ型ホスホリパーゼＡ２遺伝子の機能が欠損されたマウスを得ることができる。
【００１３】
以下、上記の方法を工程に分けて簡単に説明した後、具体的な操作について説明する。
１）  マウスＸ型ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２−Ｘ）  遺伝子ＤＮＡの相同組換え用コンストラクトの作製
マウス肝臓のジェノミックライブラリ−に、マウスＰＬＡ２−Ｘ  ｃＤＮＡの部分配列をプロ−ブとしてハイブリダイズし、陽性クロ−ンを得た。これをベクターに挿入後、制限酵素で消化して第１エキソンを含むジェノミックＤＮＡをサブクロ−ニングした。次いで、ＰＬＡ２−Ｘ遺伝子の機能を欠損させ、ポジティブ／ネガティブセレクションを行うために、ネオマイシン耐性遺伝子およびジフテリア毒素Ａフラグメント遺伝子を挿入してコンストラクトを作製した。
【００１４】
２）  相同組換えによるＥＳ細胞でのＰＬＡ２−Ｘ遺伝子変異
相同組換え用コンストラクトＤＮＡをマウスＥＳ細胞Ｅ１４株（Ｈｏｏｐｅｒ，Ｍ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３２６：２９２，  １９８７）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁し、遺伝子導入を行った。次いで、Ｇ４１８で選択培養を行った。Ｇ４１８  耐性コロニ−については、サザンブロットにより相同組換え体の確認を行った。
【００１５】
３）  ＰＬＡ２−Ｘ遺伝子変異ＥＳ細胞によるキメラマウスの作製
サザンブロットで相同組換えを確認したＰＬＡ２−Ｘ遺伝子変異ＥＳ細胞については、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞に注入した後、偽妊娠マウスの子宮角に移植して産仔を得た。
【００１６】
４）  ホモ変異マウスの作製
移植によって得られたキメラマウスについては、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスと交配させ産仔を得た。キメラマウスの生殖細胞がＥＳ細胞に由来していれば、娩出される産仔の毛色は野性色を呈し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞に由来していれば黒色を呈する。野性色の毛色のマウスについては、サザンブロットによりＰＬＡ２−Ｘ遺伝子の変異を確認した。さらにＰＬＡ２−Ｘ遺伝子のヘテロ変異マウスについては、１度以上のＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスとの戻し交配によりＥＳ細胞由来の染色体の置換を行った後に、ＰＬＡ２−Ｘ遺伝子のヘテロ変異マウス同士を交配し、産仔のＰＬＡ２−Ｘ遺伝子をサザンブロットによって確認し、ＰＬＡ２−Ｘ遺伝子のホモ変異マウスを得た（図２）。
【００１７】
具体的な操作
１）  マウスＰＬＡ２−Ｘ遺伝子ＤＮＡの相同組換え用コンストラクトの作製
１２９ＳＶＪ系マウス肝臓のジェノミックライブラリ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から、マウスＰＬＡ２−Ｘの開始コドンを含む約３００ｂのｃＤＮＡの部分配列をプロ−ブとして用い、マウスＰＬＡ２−Ｘ遺伝子の第１エキソンを含む一部を単離した。次いで、ＰＬＡ２−Ｘ遺伝子の機能を欠損させ、ポジティブ、ネガティブセレクションを行うために、ネオマイシン耐性遺伝子を用いてコンストラクトを作製した。ジフテリア毒素Ａフラグメント遺伝子についても、同様に行った。ＸｂａＩ−ＡｃｃＩＩ  断片（２．８ｋｂ，  第１エキソンの５’側）とＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ（３．０ｋｂ，第１エキソンの３’側）を相同領域として用い、ネオマイシン耐性遺伝子をセレクションマーカーとしてターゲッティングベクターを構築した。ジフテリア毒素Ａフラグメント遺伝子についても、同様に行った。相同組み換えが起こった場合には、マウスＰＬＡ２−Ｘ第１エキソンを含むＡｃｃＩＩ−ＰｓｔＩ領域（１．３ｋｂ）がネオマイシン耐性遺伝子（１．８ｋｂ）に置き換わることになる。
【００１８】
２）ＥＳ細胞および培養方法
ＥＳ細胞として、１２９／ＳＶＪ系マウス胚盤胞由来のＥ１４株を用いた。ＥＳ細胞の培養には、ダルベッコ改変イ−グル培地（Ｄ−ＭＥＭ，１２８００−０６６  ＧＩＢＣＯ）  に１５％牛胎児血清（ＦＣＳ）、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノ−ル、核酸混合液、非必須アミノ酸溶液、Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、および１０３  ｕｎｉｔｓ／ｍｌのＬＩＦ（ＡＭＲＡＤ）を添加した培養液（ＥＳ培地）を用いた。ＥＳ細胞の継代は、３７℃で５分間、０．２５％トリプシンおよび０．０４％  ＥＤＴＡ  を含む溶液（ＴＥ溶液、Ｇｉｂｃｏ）で処理後、ピペッティングによって単一細胞にまで分散させ、フィーダー細胞層上に播種することにより行った。培養液は１２時間の間隔で交換した。
【００１９】
また、ＥＳ細胞のフィ−ダ−細胞として用いるマウス胎児線維芽細胞の培養には、Ｄ−ＭＥＭに２０％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを添加した培地（ＥＦ培地）を用いた。マウス胎児線維芽細胞の調製および培養は、以下の通りに行った。胎齢１０から１４日のＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胎児を無菌的に採取し、ＰＢＳで洗浄後、頭および内臓を除き、ハサミを用いて細切した。次いで、ＴＥ溶液で処理して細胞浮遊液を得た。細胞浮遊液はナイロンメッシュを通して細胞塊や組織片を除いた後に１５００ｒｐｍで５分間遠心後、上清を除去し、３０ｍｌのＥＦ培地に懸濁し、１７５ｍｌの培養用フラスコで培養を行った。３から４日間隔で継代を行い、継代が３代目の細胞を以下の様にマイトマイシンＣで処理し、フィーダー細胞として用いた。  コンフルエント状態に達したマウス胎児線維芽細胞を１０ｍｇ／ｍｌのマイトマイシンＣで２時間処理し、ＥＦ培地で３回洗浄した後にＴＥ溶液で処理して細胞を剥離した。次いで、遠心後、９０％ＦＣＳ、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で細胞数を６、０００、０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製し、液体窒素中で凍結保存した。フィーダー細胞はゼラチンでコ−トしたフラスコ、シャ−レあるいはマイクロプレート上に２０、０００から４０、０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種することによって用いた。
【００２０】
３）  相同組換えによるＥＳ細胞のＰＬＡ２−Ｘ遺伝子の変異
制限酵素ＮｏｔＩにより線状化した相同組換え用コンストラクトＤＮＡ  ３０ｍｇをＥ１４株２、３００、０００から  ２、５００、０００個を含むＰＢＳに懸濁し、８００Ｖ，  ３ｍＦの条件でエレクトロポレ−ション法により遺伝子導入を行った。導入後、１２５  ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｓｉｎ，  Ｓｉｇｍａ）で選択培養を行った。  Ｇ４１８  耐性コロニーについては、遺伝子導入約１５０時間後から、マイクロピペットを用いて２０ｍｌのＴＥ溶液を含む９６穴のマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ２５８５０）に移し換え、数分間処理し、さらにピペッティングにより細胞を分散させた後、２００ｍｌのＥＳ細胞用培地を含む９６穴マイクロプレ−トに移し換え、培養を継続した。
【００２１】
９６穴のマイクロプレート上の細胞がコンフルエントに達した段階で、ＴＥ処理後、順次、２４穴のマイクロプレート（ＩＷＡＫＩ  ３８２０−０２４）に移し換えて培養し、細胞の増殖を図った。なお、ＥＳ細胞の培養は、すべてフィ−ダ−細胞上で行った。相同組み換え体の確認は、サザンブロットによって以下の通りに行った。Ｇ４１８  耐性細胞からジェノミックＤＮＡ  を抽出し、２種類の制限酵素とプロ−ブを用いて、５’および３’側の組換えを確認した。５’側の確認は、ジェノミックＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩＩで消化後、５’側相同領域の上流側３６２ｂをＰＣＲ法により増幅し、プロ−ブとして行った。相同組換え体および野性型の確認はそれぞれ４．８ｋｂおよび１０ｋｂのバンドの検出により行った。この方法により相同組換え体として検出された細胞は、さらに３’側の組み換えについて確認した。３’側の確認はジェノミックＤＮＡを鋳型とし、ネオマイシン耐性遺伝子領域のセンスプライマーと、３’側相同領域の下流側のアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲ法により行った。相同組換え体のみで約５．４ｋｂのバンドが増幅される。相同組換え体のコロニ−数は、Ｇ４１８  耐性コロニ−４５０個のうち２９個であった。
【００２２】
４）ＰＬＡ２−Ｘ遺伝子変異ＥＳ細胞によるキメラマウスの作製
相同組換えを確認したＰＬＡ２−Ｘ遺伝子変異ＥＳ細胞株については、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞へ注入した後、偽妊娠マウスの子宮角に移植して産仔を得た。胚の採取は、自然交配３．５日目に、５％ＦＣＳを含むＰＢＳで子宮を灌流することによって行い、採取したＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞に１個あたり１５から２０個の相同組み換え体のＥＳ細胞を注入した。
【００２３】
注入に用いたＥＳ細胞は、２０時間前に凍結から融解させ培養を開始したものを用い、ＴＥ処理により分散させた後、ゼラチンコ−トした２４穴プレートに３０分間静置することによりフィ−ダ−細胞をディッシュの底に付着させ、ＥＳ細胞のみを回収した。ＥＳ細胞は顕微操作に供するまで、氷上に静置した。ＥＳ細胞の注入針は毛細管  （ＭＩＣＲＯＣＡＰＳ  ５０ｍｌ）を細く引き延ばし、先端を破砕し、鋭くカットされ、内径がＥＳ細胞よりやや小さめのものだけを用いた。胚の保持針は、上述の方法で引き延ばしたガラス管を切断した後に先端を溶融して用いた。
【００２４】
注入針と保持針は針先を約３０度屈曲し、マイクロマニピュレ−タ−  （ＮＡＲＩＳＩＧＥ）にセットした。顕微操作に用いたチャンバ−は５ｃｍのシャ−レのふたを用い、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ＥＳ  ｍｅｄｉｕｍのドロップを置き、上面をミネラルオイルで覆った。子宮より採取した胚盤胞は、３７℃、５％  ＣＯ２  条件下、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ＥＳ  ｍｅｄｉｕｍ中で１  時間培養して拡張させた。この胚盤胞とＥＳ細胞をガラス針を用いてドロップ中に入れ、倒立顕微鏡下でマイクロマニピュレ−トを行った。胚盤胞１個につき１５から２０個の相同組み換え体のＥＳ細胞を注入した。
【００２５】
操作胚は、１時間の培養後、偽妊娠２．５日目のＩＣＲ系受容雌の子宮角に移植した。分娩予定日を２日過ぎても産仔を娩出しなかった受容雌については、帝王切開を施し、里親に哺育させた。得られた１２匹の産仔のうち、毛色でキメラマウスと判定できたのは６匹で、これらはすべて形態的に雄を示していた。
【００２６】
４）  ホモ変異マウスの作製
ａ）  キメラマウスの交配
移植によって得られた６匹のキメラマウスのうち、ＥＳ細胞の寄与率の高い５匹をＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスと交配させた。キメラマウスの生殖細胞が相同組み換え体に由来していれば、娩出される産仔の毛色は野性色を呈し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞に由来していれば黒色を呈する。７例のキメラマウスのうち、４例についてＥＳ細胞の生殖系列への伝達が確認された。
【００２７】
ＥＳ細胞の生殖系列への伝達が確認された４例のキメラマウスとＣ５７ＢＬ／６Ｊ系との交配では、２９回の分娩で１５９匹の野性色の毛色を示す産仔が得られた。これらの野性色の毛色のマウスについて遺伝子型の解析を行った結果、６０例でＰＬＡ２−Ｘ遺伝子のヘテロ変異を確認した。マウスの遺伝子型については、２から３週令のマウスの尾先端からＤＮＡを調製し、５’−プロ−ブを用いてサザンブロットを行って決定した。
【００２８】
ｂ）  ヘテロ変異マウスの交配
雄のＰＬＡ２−Ｘ遺伝子のヘテロ変異マウスはＥＳ細胞由来の染色体を置き換える目的で  雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスと１度以上戻し交配を行った。戻し交配によって得られた産仔はサザンブロットによってＰＬＡ２−Ｘ遺伝子の変異を確認した。こうして得られたＰＬＡ２−Ｘ遺伝子のヘテロ変異マウス同士を交配させ、サザンブロットにより産仔のＰＬＡ２−Ｘ遺伝子の変異を確認し、ＰＬＡ２−Ｘ遺伝子のホモ変異マウスを得た。
【００２９】
タンパク質分析
雄の野性型ならびにＰＬＡ２−Ｘ遺伝子ホモ変異マウス（１０週令）より胃、小腸、大腸を単離後、界面活性剤  ＮＰ−４０（１％）を含む緩衝液中でＰＨＹＳＣＯＴＲＯＮを用いてホモジナイズし、遠心分離により組織可溶性画分を調製した。この可溶性画分（２１．５ｍｇ  蛋白）に、ウサギ抗ヒトＸ型ホスホリパーゼＡ２抗体（５μｇ  ＩｇＧ）を添加し、４℃、１時間インキュベ−トした後、５０μｌ  プロテインＧセファロ−スゲル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を添加しさらに４℃、１時間インキュベ−トした。ゲルを５回洗浄後、結合している免疫複合体をＬａｅｍｍｌｉ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒで溶出した。これを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１５から２５％）で電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に電気的に転写し、ウサギ抗ヒトＸ型ホスホリパーゼＡ２抗体を用いてウエスタンブロッティングを行い、ＥＣＬ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてシグナルを検出した（図４）。
【００３０】
【発明の効果】以上の通り、本発明は、Ｘ型ホスホリパーゼＡ２遺伝子へのネオマイシン耐性遺伝子の挿入によってＸ型ホスホリパーゼＡ２遺伝子が破壊されているマウスを提出する。このマウスは、Ｘ型ホスホリパーゼＡ２の関与する循環器系、呼吸器系、免疫系疾患ならびに生殖系の病態生理、原因の解明および治療法の開発等の研究のための実験動物として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】マウスＰＬＡ２−Ｘ遺伝子、標的挿入用構築物およびＰＬＡ２−Ｘ遺伝子の相同組換え体を示す図。
【図２】マウスＤＮＡのサザンブロット分析の結果を示す。右端には、野性型（１０Ｋｂ）および変異型（４．８Ｋｂ）の位置を示す図。
【図３】野性型ならびにＰＬＡ２−Ｘホモ変異マウスの各組織におけるＸ型ホスホリパーゼＡ２  ｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲ法を用いて検出した結果を示す図。
【図４】野性型ならびにＰＬＡ２−Ｘホモ変異マウスの各組織可溶性画分におけるＰＬＡ２−Ｘタンパクの発現を示す図。
【図１】
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【図２】
2004329162.tif 000003
【図３】
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【図４】
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