(57)【要約】【課題】本発明は、たとえばグルコースセンサなどに応用し得る２種類のＧＤＨを効率良く製造することを課題としている。【解決手段】本発明に係るグルコース脱水素酵素の製造方法では、グルコース脱水素活性を有するαサブユニットおよび電子伝達タンパク質であるβサブユニットをコードする配列を含むＤＮＡを、シュードモナス属に属する微生物に導入して形質転換体を形成し、この形質転換体を培養して、前記βサブユニットを含む第１のグルコース脱水素酵素と、前記βサブユニットを含まない第２のグルコース脱水素酵素とを産生させる。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載するグルコース脱水素活性を有するαサブユニットおよび電子伝達タンパク質であるβサブユニットをコードする配列を含むＤＮＡを、シュードモナス属に属する微生物に導入して形質転換体を形成し、この形質転換体を培養して、前記βサブユニットを含む第１のグルコース脱水素酵素と、前記βサブユニットを含まない第２のグルコース脱水素酵素とを産生させることを特徴とする、グルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項２】
前記αサブユニットは、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約６０ｋＤａであり、
前記βサブユニットは、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約４３ｋＤａである、請求項１に記載のグルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡは、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約１４ｋＤａであるγサブユニットをコードする塩基配列を含んでおり、
前記第１および第２グルコース脱水素酵素は、前記γサブユニットを含むものとして産生される、請求項１または２に記載のグルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項４】
前記シュードモナス属に属する微生物は、シュードモナス・プチダである、請求項１ないし３のいずれかに記載のグルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡは、ブルクホルデリア属に属する微生物であって、グルコース脱水素酵素を産生する能力を有する微生物から取得したものである、請求項１ないし４のいずれかに記載のグルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項６】
前記ブルクホルデリア属に属する微生物は、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７３０６）である、請求項５に記載のグルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項７】
前記αサブユニットは、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有している、請求項１ないし６のいずれかに記載のグルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡは、配列番号１の塩基配列のうち、塩基番号７６４〜２３８０からなるαサブユニットをコードする塩基配列を含んでいる、請求項７に記載のグルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項９】
前記βサブユニットは、配列番号５のアミノ酸配列、または配列番号５のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有している、請求項１ないし８のいずれかに記載のグルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡは、配列番号１のうち、塩基番号２３８６〜３６６０からなるβサブユニットをコードする塩基配列を含んでいる、請求項９に記載のグルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項１１】
前記γサブユニットは、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有している、請求項２ないし１０のいずれかに記載のグルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡは、配列番号１の塩基配列のうち、塩基番号２５８〜７６１からなるγサブユニットをコードする塩基配列を含んでいる、請求項１１に記載のグルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項１３】
前記ＤＮＡは、前記βサブユニットのシグナルペプチドをコードする塩基配列を含んでいる、請求項１ないし１２のいずれかに記載のグルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項１４】
前記シグナルペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１〜２２のアミノ酸配列を有している、請求項１３に記載のグルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項１５】
前記シグナルペプチドは、配列番号１の塩基配列のうち、塩基番号２３８６〜２４５１の塩基配列によりコードされる、請求項１４に記載のグルコース脱水素酵素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グルコース脱水素酵素の製造方法に関する。この製造方法により得られるグルコース脱水素酵素は、たとえばグルコースセンサなどに使用できるものである。
【０００２】
【背景の技術】
特定の基質に対して特異的に反応する酵素を用いたバイオセンサの開発は、産業の分野を問わず盛んに行われている。その代表的なものとして、主に医療分野で使用されるグルコースセンサが挙げられる。
【０００３】
グルコースセンサは、酵素と電子伝達物質を含む反応系を構築するためのものであり、このグルコースセンサを利用する場合には、たとえばアンペロメトリックな手法を用いてグルコースが定量される。酵素としては、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）やグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）が使用されている。
【０００４】
ＧＯＤは、グルコースに対する基質特異性が高くて熱安定性に優れており、酵素の量産化が可能であるために生産コストが他の酵素と比べて安価であるといった利点がある。その反面、ＧＯＤを使用した系は、測定サンプル中の溶存酸素の影響を受けやすいため、溶存酸素が測定結果に影響を及ぼすといった問題がある。
【０００５】
一方、ＧＤＨを使用した系は、測定サンプル中の溶存酸素の影響を受けにくい。このため、ＧＤＨを使用した系は、酸素分圧が低い環境下で測定を行ったり、酸素量が多く要求される高濃度サンプルを測定する場合であっても、精度よくグルコース濃度を測定することができる。その反面、ＧＤＨは、熱安定性が悪く、基質特異性がＧＯＤよりも劣るといった問題点がある。
【０００６】
このような事情から、ＧＯＤとＧＤＨの双方の欠点を補う酵素が模索されていた。本発明者の一人である早出は、国際公開ＷＯ０２／３６７７９号公報に開示したように、温泉付近の土壌から新規菌株（ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株）を分離し、この菌株から新しいＧＤＨを取得した。このＧＤＨは、α、β、γサブユニットからなるものであり（以下「ＣｙＧＤＨ」という）、電子伝達物質との反応速度が高く、耐熱性の面でも問題がないものであり、グルコースセンサ用としては好適なものであった。
【０００７】
しかしながら、ＫＳ１株では、ＣｙＧＤＨの生産性が悪いため、工業的な応用を考えた場合にはＫＳ１株によるＣｙＧＤＨの量産化は困難である。そこで、本発明者らは、α、β、γサブユニットをコードするＤＮＡを大腸菌に導入して発現させたところ、効率良くＧＤＨが産生された。ところが、このＧＤＨは、α、γサブユニットからなるものであり、βサブユニットが欠落したものであった（以下「αＧＤＨ」という）。このように、大腸菌を形質転換する方法では、α、β、γサブユニットの全てを発現させることができなかった。
【０００８】
本発明者らはさらに、αＧＤＨの特性について調べたところ、αＧＤＨは、ＣｙＧＤＨに比べて電子伝達物質との反応速度が小さいものの、ＣｙＧＤＨよりも耐熱性が高く、グルコースに対するＫｍが小さいものであった。つまり、αＧＤＨは、ＣｙＧＤＨと同様に、グルコースセンサ用の酵素として有用なものであることが確認された。
【０００９】
従来、このように有用な酵素２種を製造する際には、発現菌株の取得、培養および精製を、それぞれ別個に行う必要があり、製造コスト、効率の面で不利であった。
【００１０】
【発明の開示】
本発明は、たとえばグルコースセンサなどに応用し得る２種類のＧＤＨを効率良く製造することを目的としている。
【００１１】
本発明に係るグルコース脱水素酵素の製造方法は、配列番号１に記載するグルコース脱水素活性を有するαサブユニットおよび電子伝達タンパク質であるβサブユニットをコードする配列を含むＤＮＡを、シュードモナス属に属する微生物に導入して形質転換体を形成し、この形質転換体を培養して、前記βサブユニットを含む第１のグルコース脱水素酵素と、前記βサブユニットを含まない第２のグルコース脱水素酵素とを産生させることを特徴としている。
【００１２】
前記αサブユニットは、たとえば還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約６０ｋＤａである。一方、前記βサブユニットは、たとえば還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約４３ｋＤａである。
【００１３】
前記ＤＮＡは、たとえば還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約１４ｋＤａであるγサブユニットをコードする塩基配列を含んでいる。この場合、前記第１および第２グルコース脱水素酵素は、前記γサブユニットを含んだものとして産生される。
【００１４】
前記シュードモナス属に属する微生物としては、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・アエルギノーサなどが挙げられるが、組み換え体の安全性の面からシュードモナス・プチダを使用するのが好ましい。
【００１５】
前記ＤＮＡは、たとえばブルクホルデリア属に属する微生物であって、グルコース脱水素活性を有する酵素を産生する能力を有する微生物から取得することができる。本発明で採用されるブルクホルデリア属に属する微生物は、本酵素の生産能を有するブルクホルデリア属に属する微生物であれば特に制限されないが、ブルクホルデリア・セパシア、特にブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株（以下、単に「ＫＳ１株」という）が好ましい。
【００１６】
このＫＳ１株は、本発明者らが　温泉付近の土壌から分離した新規菌株であり、その菌学的性質からブルクホルデリア・セパシアと同定され、ＫＳ１株と命名された。このＫＳ１株は、平成１２年９月２５日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６　日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６）に微生物受託番号第ＦＥＲＭ　ＢＰ−７３０６として寄託されている。
【００１７】
なお、本発明者らはＫＳ１株以外の株について、財団法人発酵研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，　Ｏｓａｋａ，　ＩＦＯ）又は理化学研究所微生物系統保存施設（Ｊａｐａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，　ＪＣＭ）に寄託されている同ブルクホルデリア・セパシアのいくつかの菌株を取り寄せてグルコース脱水素酵素活性を測定したところ、いずれの菌株にも活性があることを確認している。したがって、本発明で使用されるＤＮＡを取得するための微生物としては、ＫＳ１株以外のブルクホルデリア・セパシア、たとえばＪＣＭ５５０６、ＪＣＭ５５０７、ＪＣＭ２８００、ＪＣＭ２８０１、ＩＦＯ１５１２４、ＩＦＯ１４５９５を採用できる。
【００１８】
前記ＤＮＡは、ブルクホルデリア・セパシア染色体のＤＮＡから単離されるが、その塩基配列及び同塩基配列によってコードされるアミノ酸配列が明らかとされているので、これらの配列に基づいて化学合成することによっても取得することができる。
【００１９】
前記αサブユニットとしては、たとえば配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有しているものが採用される。このαサブユニットは、たとえば配列番号１の塩基配列のうち、塩基番号７６４〜２３８０からなる塩基配列によりコードされる。したがって、本発明で使用するＤＮＡとしては、上記塩基配列を有するものを使用するのが好ましい。
【００２０】
前記βサブユニットとしては、たとえば配列番号５のアミノ酸配列、または配列番号５のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有しているものが採用される。このβサブユニットは、たとえば配列番号１のうち、塩基番号２３８６〜３６６０の塩基配列によりコードされる。したがって、本発明で使用するＤＮＡとしては、上記塩基配列を有するものを使用するのが好ましい。
【００２１】
前記γサブユニットをαサブユニットとともに発現させると、αサブユニットのみを発現させた場合に比べて高い酵素活性が得られることが早出によって確認されている。したがって、酵素活性の観点からは、γサブユニットを発現させるのが好ましく、前記ＤＮＡにおいては、γサブユニットの構造遺伝子は、αサブユニットの上流域に含ませておくのが好ましい。そうすれば、αサブユニットを産生する際に、先ずγサブユニットが発現されてタンパク質として存在することにより微生物体内で効率良くαサブユニットを産生することができると考えられる。
【００２２】
前記γサブユニットとしては、たとえば配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有しているものが採用される。このγサブユニットは、たとえば配列番号１の塩基配列のうち、塩基番号２５８〜７６１からなる塩基配列によりコードされる。したがって、本発明で使用するＤＮＡとしては、上記塩基配列を有するものを使用するのが好ましい。
【００２３】
配列番号１の塩基配列のうち、塩基番号２３８６以降の塩基配列は、β−サブユニットをコードしていると推定されるが、塩基番号２３８６〜２４５１の塩基配列は、β−サブユニットのシグナルペプチドをコードしていると推測される。同シグナルペプチドの推定されるアミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸番号１〜２２のアミノ酸配列である。
【００２４】
シグナルペプチドは、リボソームで合成されたタンパク質が内膜を通ってペリプラズム空間に分泌される際に必要なペプチドであるため、シグナルペプチドが存在すれば、菌体のぺリプラズムもしくは培養上清中に含有するタンパク質量が増加する。したがって、前記ＤＮＡとしては、前記βサブユニットのシグナルペプチドの発現をコードする塩基配列を含んでいるものを使用するのが好ましい。
【００２５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に係るグルコース脱水素酵素の製造方法について、具体的に説明する。
【００２６】
前記グルコース脱水素酵素の製造方法では、たとえばαサブユニットおよびβサブユニットの発現をコードするＤＮＡを取得する第１工程と、このＤＮＡを含む組み換えベクターを、シュードモナス属に属する微生物に導入して形質転換体を形成する第２工程と、この形質転換体を培地にて培養し、βサブユニットを含むグルコース脱水素酵素（たとえばＣｙＧＤＨ）と、βサブユニットを含まないグルコース脱水素酵素（たとえばαＧＤＨ）と産生させる第３工程と、培地または微生物からグルコース脱水素酵素を採取する第４工程と、を含んでいる。
【００２７】
第１工程（ＤＮＡの取得）：
ＤＮＡの取得にあたっては、まず組み換えベクターを構築する。組み換えベクターは、ブルクホルデリア属に属する微生物（たとえばブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株）から染色体ＤＮＡを分離・精製した後、この染色体ＤＮＡを切断した染色体ＤＮＡ断片またはＰＣＲなどにより増幅させたＤＮＡ断片と、リニアーな発現ベクターとを結合閉鎖させることにより構築される。
【００２８】
染色体ＤＮＡの分離・精製は、微生物を溶菌して得られる溶菌物に基づいて行われる。溶菌の方法としては、たとえばリゾチームなどの溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤が併用される。さらに、凍結融解やフレンチプレス処理のような物理的破砕方法とを組み合わせてもよい。一方、溶菌物からのＤＮＡの分離・精製は、たとえばフェノール処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理などの方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。
【００２９】
染色体ＤＮＡの切断は、常法にしたがい、たとえば超音波処理や制限酵素処理を用いて行うことができる。制限酵素としては、たとえば特定のヌクレオチド配列に作用するＩＩ型制限酵素を用いられる。染色体ＤＮＡ断片と発現ベクターとの結合は、たとえばＤＮＡリガーゼを用いて行われる。
【００３０】
発現ベクターとしては、宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組み換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、たとえば後述するエシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、Ｌａｍｂｄａ　ｇｔ１０、Ｌａｍｂｄａ　ｇｔ１１などが例示される。一方、プラスミドとしては、たとえば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、　ｐＵＣ１１８、　ｐＵＣ１９、　ｐＵＣ１１９、　ｐＴｒｃ９９Ａ、　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔあるいはコスミドであるＳｕｐｅｒＣｏｓＩなどが例示される。また、シュードモナスを用いる場合には、グラム陰性菌用広宿主域ベクターであるＲＳＦ１０１０、ｐＢＢＲ１２２、ｐＣＮ５１などが例示される。
【００３１】
次いで、組み換えベクターにマーカーを施して、この組み換えベクターを宿主微生物に移入して形質転換体を形成する。この形質転換体から、ベクターのマーカーと酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、ＧＤＨをコードする遺伝子を含有する組み換えベクターを保持する遺伝子供与微生物を得る。
【００３２】
宿主微生物としては、組み換えベクターが安定であり、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質を発現できるのであれば特に制限されない。一般的には、エシェリヒア・コリＤＨ５α、ＸＬ−１ＢｌｕｅＭＲなどを用いることができる。宿主微生物に組み換えベクターを移入する方法としては、たとえば宿主微生物がエシェリヒア・コリの場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いることができる。
【００３３】
さらに、遺伝子供与微生物を培養して、この微生物から組み換えベクターを分離・精製した後、組み換えベクターからＧＤＨをコードする遺伝子（クローン化断片）を採取する。クローン化断片の採取は、染色体ＤＮＡを採取するのと同様な手法により行うことができる。
【００３４】
このクローン化断片は、グルコース脱水素活性を有するαサブユニットと、電子伝達タンパク質であるβサブユニットをコードする塩基配列を有している。ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株から目的ＤＮＡを得る場合には、クローン化断片は、αサブユニットやβサブユニット（βサブユニットのシグナルペプチドを含む）をコードする塩基配列に加えて、γサブユニットをコードする塩基配列を含むものとして得られる。なお、クローン化断片がαサブユニットやβサブユニットをコードしていることは、あるいはγサブユニットをコードしていることは、このクローン化断片の塩基配列を常法により解読することによって確認することができる。
【００３５】
第２工程（形質転換体の形成）：
目的とするＤＮＡ含有する形質転換体は、第１工程において得られたクローン化断片をベクターに組み込んだ後、シュードモナス属に属する微生物に導入することにより形成される。シュードモナス属に属する微生物としては、たとえばシュードモナス・プチダが好ましく使用される。宿主微生物への組み換えベクターの導入方法は、第１工程におけるスクリーニングの際の形質転換体の形成と同様な手法により行うことができる。
【００３６】
第３工程（形質転換体の培養およびＧＤＨの産生）：
第２工程において得られた形質転換体は、ＧＤＨを産生させるべく培養される。この形質転換体からは、βサブユニットを含むＧＤＨとβサブユニットを含まないＧＤＨが同時に産生される。たとえば、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株から目的とするＤＮＡを得た場合には、α、β、γサブユニットを有するＣｙＧＤＨと、α、γサブユニットを有するαＧＤＨとが同時に産生される。
【００３７】
形質転換体の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【００３８】
培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、たとえばグルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素源としては、資化可能な窒素化合物であればよく、たとえばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他に、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００３９】
培養温度は、菌が生育し、菌がＧＤＨを産生する範囲で適宜変更し得るが、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養は、ＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に完了すればよく、通常は培養時間が１２〜７２時間程度とされる。培地のｐＨは、菌が発育し、菌がＧＤＨを産生する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ５．０〜９．０程度の範囲である。
【００４０】
第４工程（ＧＤＨの採取）：
ＧＤＨの採取は、一般には、常法に従って、培養液や菌からＧＤＨ含有溶液を分離した後、このＧＤＨ含有溶液を精製することにより行われる。
【００４１】
ＧＤＨ含有溶液は、ＧＤＨが菌体内に存在する場合には、ろ過または遠心分離などの手段により培養液から菌体を採取した後、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、必要に応じてＥＤＴＡなどのキレート剤及び界面活性剤を添加してＧＤＨを可溶化することにより得ることができる。一方、ＧＤＨが菌体外（培養液中）に存在する場合には、ろ過または遠心分離などの手段により培養液と菌体とを分離することにより得ることができる。
【００４２】
ＧＤＨ含有溶液の精製は、この溶液から直ちに行うこともできるが、この溶液中のＧＤＨを濃縮した後に行うこともできる。濃縮は、たとえば減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理、あるいは親水性有機溶媒（たとえばメタノール、エタノール、アセトン）による分別沈殿法により行うことができる。ＧＤＨの濃縮には、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。濃縮液の精製は、たとえばゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを適宜組み合わせることによって行うことができる。これにより、βサブユニットを含むＧＤＨとβサブユニットを含まないＧＤＨとを個別に得ることができる。
【００４３】
このようにして得られた精製酵素は、たとえば凍結乾燥、真空乾燥、スプレードライにより粉末化して市場に流通させることができる。
【００４４】
【実施例】
以下においては、上述した製造方法の具体的な例について説明するとともに、この例により２種類のＧＤＨが得られることについて実証する。
【００４５】
ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株からの染色体ＤＮＡの調製：
ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株からの染色体ＤＮＡは、常法に従って調製した。すなわち、まず、ＫＳ１株をＴＬ液体倍地（ポリペプトン＝１０ｇ、酵母抽出液＝１ｇ、ＮａＣｌ＝５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４＝２ｇ、グルコース＝５ｇ；全量１Ｌ、ｐＨ　７．２）を用いて、３４℃で一晩振盪した。増殖した菌体は、遠心分離機により回収した。この菌体を１０ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫを含む溶液に懸濁し、５０℃で６時間処理した。この懸濁液に等量のフェノール−クロロホルムを加えて室温で１０分間撹拌した後、遠心分離機により上清を回収した。これに終濃度０．３Ｍになるように酢酸ナトリウムを加え、２倍量のエタノールを重層して中間層に染色体ＤＮＡを析出させた。析出物をガラス棒を用いてすくいとり、７０％エタノールで洗浄した後、適当量のＴＥバッファーに溶解させ、染色体ＤＮＡ溶液とした。
【００４６】
形質転換体の形成：
先に得た染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法によりＧＤＨをコードする遺伝子全長を増幅した。プライマーは、ＧＤＨのγサブユニットのＮ末端部の配列、およびＧＤＨのβサブユニットのＣ末端部の配列を用いた。このＤＮＡ断片を各プライマーの端に位置する制限酵素認識部位で切断した断片、およびｔｒｃプロモータを含むＤＮＡ断片を調整し、広宿主域ベクターＲＳＦ１０１０と結合した後、大腸菌ＪＭ１０９に導入し、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地でコロニーを形成させた。生じたコロニーからプラスミドを調整し、これを鋳型として、前記ＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲによって、約３．４Ｋｂの断片が増幅されるクローンを選択し、これを、シュードモナス・プチダＡＴＣＣ４７０５４株に導入することにより、目的とする形質転換体（ＧＤＨ発現菌株）を得た。
【００４７】
形質転換体の培養およびＧＤＨの産生：
形質転換体の培養は、好気的培養条件で行った。より具体的には、形質転換体の培養は、培養液１Ｌ当たりの組成が表１となるように調整された培地７Ｌを用いて、３４℃で８時間行った。本培養液７Ｌを４℃、１０分間、９，０００×ｇで遠心分離することにより菌体を得た。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
ＧＤＨの精製：
得られた菌体を１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に分散させた状態で、フレンチプレス（大竹製作所　東京　日本）で１，５００Ｋｇ／ｃｍ２の圧力差を加えて破壊した。このときに得られた細胞抽出液を８，０００×ｇで１０分間、遠心分離し、細胞固形物を除いた。
【００５０】
得られた粗酵素溶液は、最終濃度が１％になるようにＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を添加した。そして、４℃で一晩ゆっくり攪拌した。次に超遠心（４℃、６９８００×ｇ、９０分間）した後に再遠心（４℃、１５０００×ｇ、１５分間）し、上清として可溶化フラクションを得た。
【００５１】
その可溶化フラクションを０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で透析した後、その溶液を、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で等量化されたＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦカラム（２２ｍｍＩＤ×２０ｃｍ　アマシャムバイオサイエンス）に供給した。タンパク質を、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中のＮａＣｌの濃度が０〜５００ｍＭになるように、直線的グラジエントで溶出した。その流速は５ｍＬ／ｍｉｎで行った。
【００５２】
溶出液については、各フラクション毎にＧＤＨ活性を測定した。その結果を、図１に模式的に表した。図１から分かるように、グラジエントをかけた範囲において２つの大きなピークが確認された。
【００５３】
ＧＤＨの活性測定は、グルコースの脱水素化に基づく、電子受容体の還元反応を追跡することにより行った。電子受容体としては、２，６−ジクロルフェノルインドフェノル（ＤＣＩＰ）及びフェナンジメトサルフェート（ＰＭＳ）を用いた。反応はポリエチレンチューブ内で所定の温度で実施した。
【００５４】
まず、０．７５ｍＭＰＭＳと０．７５ｍＭＤＣＩＰ含有２５ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）２０μＬに酵素溶液５μＬを添加して混合液を準備した。この混合液は、事前に１分間定温放置した。混合液に２Ｍグルコース１μＬ（最終濃度：７７ｍＭ）を添加して反応を開始させ、２分間定温放置した。次に、氷冷蒸留水１００μＬまたは７．５Ｍ尿素１２０μＬを添加して試料を冷却した。この試料について、超微量計測用セル（１００μＬ）及びこれを用いて計測できる分光光度計（ＵＶ１６０、島津製作所、京都、日本）を用いて、ＤＣＩＰ還元にもとづく退色を経時的に計測した。測定波長は、ＤＣＩＰの吸収波長である６００ｎｍとした。ＤＣＩＰのモル吸光係数は２２．２３ｍＭ×ｃｍ−１とした。酵素１単位（Ｕ）は標準検定条件下で１分ごとに１μＭグルコースを酸化する量と定義した。タンパク濃度はローリー法で測定した。
【００５５】
次いで、２つのＧＤＨ活性のピークについて、フラクションを別個に集め、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０、４℃）で一夜透析し、２種類のＧＤＨ溶液を調整した。
【００５６】
各々のＧＤＨ調整溶液について、ＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（８．０ｍｍＩＤ×７．５ｃｍ　東ソー、東京、日本）を用いて別個に精製した。カラムは、予め、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されている。タンパク質は、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中のＮａＣｌの濃度が０〜４００ｍＭになるようし、直線的グラジエントで、流速１ｍＬ／ｍｉｎで溶出させた。各々のクロマトグラフィーにおけるＧＤＨ活性が最も高いフラクションを集め、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で、一夜脱塩し、２種類の精製酵素（以下、便宜上、「第１精製酵素」および「第２精製酵素」という）を得た。
【００５７】
精製酵素のサブユニットの特定：
各精製酵素液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、サブユニットの分子量を特定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＴｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液を用いて８−２５％ポリアクリルアミドの勾配ゲル中で実施した。そのゲルのタンパク質はクマシー染色を行った。Ｐｈａｓｔ　　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により、分離と展開を自動的に行った。標準タンパクの相対移動度により分子質量を測定した。
【００５８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果を図２に示した。図２においては、レーン１は分子量標準マーカータンパク質のクマシー染色を、レーン２は第１精製酵素のクマシー染色を、レーン３は第２精製酵素のクマシー染色をそれぞれ示している。同図から分かるように、第１精製酵素は、分子量が約６０ｋＤａ、約４３ｋＤａ、および約１４ｋＤａのタンパク質に分離した。したがって、第１精製酵素は、分子量が約６０ｋＤａのαサブユニットと、分子量が約４３ｋＤａのβサブユニットと、分子量が約１４ｋＤａのγサブユニットとが結合していることが示唆された。第２精製酵素は、分子量が約６０ｋＤａ、および約１４ｋＤａのタンパク質に分離した。したがって、第２精製酵素は、分子量が約６０ｋＤａのαサブユニットと、分子量が約１４ｋＤａのγサブユニットとが結合していることが示唆された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果は、第１精製酵素と第２精製酵素とが異なるＧＤＨであり、２種類のＧＤＨが同時に生成されたことを示している。
【００５９】
電気泳動によって得られたαサブユニット、βサブユニットを含むバンドをそれぞれ切り取り、ポリビニリデンフルオリド膜に転写した後、アミノ酸シークエンサー（島津製作所製、ＰＰＳＱ−１０）によりアミノ酸配列を解析した。
【００６０】
αサブユニットについては、配列番号３のアミノ酸配列においてアミノ酸番号２〜１２からなる１１残基から構成されるペプチド配列を含むことが確認された。一方、βサブユニットについては、配列番号５に示すＮ末端の１６残基のアミノ酸配列を確認することができた。
【００６１】
組み換えベクターの分析：
ＧＤＨ活性を有するシュードモナス・プチダの形質転換体から、目的組み換えベクターを抽出した。この組み換えベクターの挿入ＤＮＡ断片について、常法により塩基配列を決定した。その結果、配列番号２５８〜３６６０の塩基配列を含んでいた。
【００６２】
国際公開ＷＯ０２／３６７７９号公報などに開示されているように、αサブユニットをコードする塩基配列は、配列番号１の塩基配列のうち、塩基番号７６４〜２３８０、βサブユニットをコードする塩基配列は、配列番号１のうち、塩基番号２３８６〜３６６０、γサブユニットをコードする塩基配列は、配列番号１の塩基配列のうち、塩基番号２５８〜７６１、βサブユニットのシグナルペプチドをコードする塩基配列は、配列番号１の塩基配列のうち、塩基番号２３８６〜２４５１の塩基配列である。
【００６３】
したがって、目的組み換えベクターは、αサブユニット、βサブユニット（βサブユニットのシグナルペプチドを含む）、γサブユニットをコードする塩基配列を含んでいることが確認された。なお、各塩基配列に対応するアミノ酸配列は、αサブユニットについては配列番号３、βサブユニットについては配列番号５、γサブユニットについては配列番号２、βサブユニットのシグナルペプチドについては配列番号４のアミノ酸配列のうちアミノ酸番号１〜２２に示してある。
【００６４】
【発明の効果】
本発明では、たとえばαＧＤＨとＣｙＧＤＨといったように、２種類のＧＤＨを同時に、しかも効率よく製造することができる。
【００６５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】形質転換体から取得した可溶化フラクションのＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦクロマトグラフィーの結果を示すものである。
【図２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を模式的に表したものである。
【図１】
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【図２】
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