(57)【要約】【課題】本発明は、ＨＧＦ／ＳＦのＭｅｔとの結合を阻害することがらなる腫瘍細胞の転移を防止する方法ならびにぞのための医薬組成物を提供する。【解決手段】腫瘍を有する哺乳動物における腫瘍細胞の転移を防止するための医薬組成物であって、ＨＧＦ／ＳＦとＭｅｔとの結合を防止する有効量の物質を含む医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍を有する哺乳動物における腫瘍細胞の転移を防止するための医薬組成物であって、ＨＧＦ／ＳＦとＭｅｔとの結合を防止する有効量の物質を含む医薬組成物。
【請求項２】
該物質がＨＧＦ／ＳＦ変種、ＨＧＦ／ＳＦ模擬体およびＨＧＦ／ＳＦに対する抗体または抗体フラグメントからなる群より選択されるものである請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
該物質がＭｅｔ変種、Ｍｅｔ模擬体およびＭｅｔに対する抗体または抗体フラグメントからなる群より選択されるものである請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
該抗体がポリクローナル抗体１２４２である請求項３記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、腫瘍転移防止法およびそのための医薬組成物、詳細には、腫瘍を有する哺乳動物における腫瘍細胞の転移を防止するための医薬組成物であって、ＨＧＦ／ＳＦとＭｅｔとの結合を防止する有効量の物質を含む医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、ラット・肝細胞の有糸分裂生起を刺激する能力に基づいて、ヒトおよびウサギの血漿ならびにラットの血小板から最初に精製された（イー・ゴーダ（Ｅ．Ｇｏｈｄａ）ら，ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲイション（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ）第８１巻：４１４頁（１９８８年）；アール・ザーネガー（Ｒ．Ｚａｒｎｅｇａｒ）およびジー・ミカロプーロス（Ｇ．Ｍｉｃｈａｌｏｐｏｕｌｏｓ），キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．）第１９巻：３３１４頁（１９８９年）；ティー・ナカムラ（Ｔ．Ｎａｋａｍｕｒａ）ら，ＦＥＢＳ・レターズ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．）第２２４巻：３１１頁（１９８７年））。よって、ＨＧＦは、部分的肝切除または肝傷害後の肝臓の再生を促進する体液性因子として作用しうる（イー・エイチ・ゴーダ（Ｅ．Ｈ．Ｇｏｈｄａ）ら，ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲイション第８１巻：４１４頁（１９８８年）；ジー・ケイ・ミカロプーロス（Ｇ．Ｋ．Ｍｉｃｈａｌｏｐｏｕｌｏｓ），ＦＡＳＥＢ・ジャーナル（ＦＡＳＥＢ　Ｊ．）第４巻：１７６頁（１９９０年））。同じ因子が、ヒト・繊維芽細胞培養液から精製され、メラノサイトならびに種々の上皮および皮内細胞に作用することが示された（ティー・イガワ（Ｔ．Ｉｇａｗａ）ら，ＢＢＲＣ第１７４巻：８３１〜８３８頁（１９９１年）；エム・カン（Ｍ．Ｋａｎ）ら，ＢＢＲＣ第１７４巻：３３１〜３３７頁（１９９１年）およびジェイ・エス・ルビン（Ｊ．Ｓ．Ｌｕｂｉｎ）ら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）第８８巻：４１５頁（１９９０年））。いくつかの器官におけるＨＧＦ発現に関する証拠（ジェイ・エス・ルビン，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第８８巻：４１５頁（１９９０年）；ケイ・タシロ（Ｋ．Ｔａｓｈｉｒｏ）ら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第８７巻：３２００頁（１９９０年）；アール・ザーネガーら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第８７巻：１２５２頁（１９９０年）；ティー・キノシタ（Ｔ．Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ）ら，バイオケミ・バイオフィジ・リサーチ・コミュニ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．）第１６５巻：１２２９頁（１９８９年））とともに、ＨＧＦが、細胞形態に対する広いスペクトルを有する増殖についてのパラクリン伝達体として作用しうるということを、これらの知見は示している。ＨＧＦの分子クローニングにより、プラスミノーゲンおよび関連セリンプロテアーゼに対する著しい構造上の相同性が明らかとなった（ジェイ・エス・ルビンら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第８８巻：４１５頁（１９９０年）；ティー・ナカムラ（Ｔ．Ｎａｋａｍｕｒａ）ら，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第３４２巻：４４０頁（１９８９年）；ケイ・ミヤザワ（Ｋ．Ｍｉｙａｚａｗａ）ら，バイオフィジ・リサーチ・コミュニ（Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．）第１６３巻：９６７頁（１９８９年））。ＨＧＦが、無処理の標的細胞において蛋白のチロシンのすみやかなリン酸化を誘導するという最近の証拠は、チロシンキナーゼ受容体がその分裂シグナルを伝達するということを示唆するものである（ジェイ・エス・ルビンら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第８８巻：４１５頁（１９９０年））。
【０００３】
ＨＧＦは、プラスミノーゲン、プロトロンビン、ウロキナーゼ、および組織プラスミノーゲンアクチベータを包含するセリンプロテアーゼの族と構造的に関連している（ジェイ・エス・ルビンら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第８８巻：４１５頁（１９９０年）；ティー・ナカムラら，ネイチャー第３４２巻：４４０頁（１９８９年））。例えば、ＨＧＦは、特徴的なクリングルドメイン（ｋｒｉｎｇｌｅ　ｄｏｍａｉｎ）（パシー（Ｐａｔｔｈｙ）ら，ＦＥＢＳ・レターズ第１７１巻：１３１〜１３６頁（１９８４年））およびセリンプロテアーゼドメイン（ミヤザワら，バイオケミ・バイオフィジ・リサーチ・コミュニ第１６３巻：６９７〜９７３頁（１９８９年）；ナカムラら，ネイチャー第３４２巻：４４０〜４４３頁（１９８９年））を有するということにおいて構造的にプラスミノーゲンに類似している。本発明において定義するように、ＨＧＦは、プラスミノーゲン様増殖因子（ＰＬＧＦ）と呼ばれる広スペクトルのマイトジェン（米国特許出願第０７／５８２，０６３号の主題物質である）として以前特徴付けられた増殖因子を包含する。セリンプロテアーゼ族をはじめとするいくつかのプロテアーゼは、おそらく、インスリン受容体のトリプシン活性化と同様の蛋白分解機構により、ＤＮＡ合成を刺激するであろう（エス・イー・シェールソン（Ｓ．Ｅ．Ｓｈｏｅｌｓｏｎ）ら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）第２６３巻：４８５２頁（１９８８年））。ウロキナーゼのみが、それ自体いかなる既知チロシンキナーゼ受容体とも相同性を有しない特異的な細胞表面受容体と関連があることが見いだされている（エイ・エル・ロルダン（Ａ．Ｌ．Ｒｏｌｄａｎ）ら，ジ・ＥＭＢＯ・ジャーナル第９巻：４６７頁（１９９０年）。
【０００４】
散在因子（ｓｃａｔｔｅｒ　ｆａｃｔｏｒ）（ＳＦ）は、もともと、ＨＧＦと関連があるが、異なるものであると考えられていた。ＳＦは、運動原性（運動性）と関連しており、さらにＨＧＦは、細胞有糸分裂生起（増殖）に関連していると考えられいた。しかしながら、最近の研究により、実際には、ＳＦおよびＨＧＦは、同じアミノ酸配列、ｃ−ｍｅｔ腫瘍原遺伝子によりコードされる蛋白である同じ受容体、および同じ生物学的作用を有する同一蛋白であることが示された（イー・ジェラルディー（Ｅ．Ｇｈｅｒａｒｄｉ）およびエム・ストーカー（Ｍ．Ｓｔｏｋｅｒ），ネイチャー第３４６巻：２２８頁（１９９０年）；ケイ・エム・ワイドナー（Ｋ．Ｍ．Ｗｅｉｄｎｅｒ）ら，ＰＮＡＳ第８８巻：７００１〜７００５頁（１９９１年）；エム・バルガヴァ（Ｍ．Ｂｈａｒｇａｖａ）ら，セル・グロウス・アンド・ディファレンシエイション（Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　＆　Ｄｉｆｆ．）第３巻（１）：１１〜２０頁（１９９２年）；ナルディーニ（Ｎａｌｄｉｎｉ）ら，ＥＭＢＯ・ジャーナル第１０巻（１０）：２８６７〜２８７８頁（１９９１年）；イー・ジェラルディーおよびエム・ストーク（Ｍ．Ｓｔｏｋｅ），キャンサー・セルズ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｌｌｓ）第３巻（６）：２２７〜２３２頁（１９９１年）およびグラジアーニ（Ｇｒａｚｉａｎｉ）ら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ＵＳＡ）第２６巻）。
【０００５】
上記文献により取り込まれた米国特許出願第０７／６４２，９７１号の主題物質は、ＨＧＦ／ＳＦおよびｍｅｔ腫瘍原遺伝子蛋白（「Ｍｅｔ］）よりなる複合体であることが記載されており、ＨＧＦ／ＳＦの受容体としてＭｅｔが同定されている。ｍｅｔ腫瘍原遺伝子蛋白はチロシンキナーゼ増殖因子受容体族の１つである。この受容体／リガンドの関係に関する知識により、これらの分子の発現がが重要な役割を果している可能性のある増殖性疾患および腫瘍原性についての研究が容易になる。さらに、ｍｅｔ腫瘍原遺伝子受容体ＨＧＦ／ＳＦ複合体の同定により、因子の結合により影響を受ける肝臓組織以外の組織を同定するための手段が提供される。
【０００６】
細胞増殖に対する正の影響は、細胞内（モーゼス（Ｍｏｓｅｓ）ら，セル（Ｃｅｌｌ）第６３巻：２４５〜２４７頁（１９９０年））および細胞表面（ハナム（Ｈａｎｎｕｍ）ら，ネイチャー第３４３巻：３３６〜３４０頁（１９９０年）；アイゼンベルク（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）ら，ネイチャー第３４３巻：３４１〜３４６頁（１９９０年）；カーター（Ｃａｒｔｅｒ）ら，ネイチャー第３４４巻：６３３〜６３７頁（１９９０年））の両方で、種々の濃度において妨げられることが、証拠によって示唆されている。
【０００７】
ヒト・ＨＧＦの種々の源が同定されており（ナカムラ，ティー，プログレス・イン・グロウス・ファクター・リサーチ（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）第３巻：６７〜８６頁（１９９２年））、Ｃｏｓ細胞中またはバキュロウイルス宿主系中にトランスフェクションされた場合、遺伝子産物が過剰産生されることが示されている（ナカムラら，ネイチャー第３４２巻：４４０〜４４３頁（１９８９年）；クーパー（Ｃｏｏｐｅｒ）ら，ジ・ＥＭＢＯ・ジャーナル（Ｔｈｅ　ＥＭＢＯ　Ｊ．）第５巻（１０）：２６２３〜２６２８頁（１９８６年））。大量のヒト・ＨＧＦ／ＳＦを連続的に産生する哺乳動物細胞系は、まだ同定されていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】
したがって、本発明は、ＨＧＦおよびＳＦが同じ蛋白であって、その受容体へのＨＧＦ／ＳＦの結合を阻害することにより腫瘍細胞転移を防止することができるという認識を基礎とした転移を阻害する方法を包含する。
より詳細には、ＨＧＦ／ＳＦがＭｅｔと結合するのを妨げるＨＧＦ／ＳＦ変種、ＨＧＦ／ＳＦ模擬体、またはＨＧＦ／ＳＦに対する抗体または抗体フラグメントである物質により、結合が阻害される。同様にＨＧＦ／ＳＦ−Ｍｅｔ結合を妨げるＭｅｔ変種、Ｍｅｔ模擬体およびＭｅｔに対する抗体または抗体フラグメントによっても結合が阻害されうる。
そのうえ、大量のＨＧＦ／ＳＦ源を連続的に産生する必要性の観点において、出願人らは、意外にも、組み換え法により、高レベルのＨＧＦ／ＳＦを発現しうるマウス・ＮＩＨ／３Ｔ３細胞系を見いだし、本明細書に記載した。よって、本発明の１の具体例は、以下のステップ：
（ａ）　ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、ＨＧＦ／ＳＦｈｕ（ｈｕはヒト由来）およびＭｅｔｈｕをコードしているＤＮＡでトランスフェクションし；
（ｂ）　ステップ（ａ）によりトランスフェクションされた細胞を哺乳動物内に導入し、それにより、１次腫瘍を生じさせ；
（ｃ）　１次腫瘍細胞を外移植し、インビトロで増殖させ；
（ｄ）　ステップ（ｃ）により増殖した高レベルのＨＧＦ／ＳＦｈｕおよび高レベルのＭｅｔｈｕを発現する細胞を選択し；
（ｅ）　ステップ（ｄ）により選択した細胞を哺乳動物内に導入し、それにより、２次腫瘍を生じさせ；
（ｆ）　２次腫瘍細胞を外移植し、インビトロで増殖させ；ついで
（ｇ）　ステップ（ｆ）の細胞により産生されたＨＧＦ／ＳＦｈｕを得る
からなるＨＧＦ／ＳＦの製造法を提供する：
さらにもう１つの本発明の具体例は、作動可能に連結されたレトロウイルスの末端反復配列由来のプロモーター、ヒト・Ｍｅｔの全コーディングドメインをコードしているＤＮＡおよびポリアデニレーションシグナルからなる第１のＤＮＡベクター、および作動可能に連結されたレトロウイルスの末端反復配列由来のプロモーター、ヒト・ＨＧＦ／ＳＦをコードしているＤＮＡおよびポリアデニレーションシグナルからなる第２のＤＮＡベクターで同時トランスフェクションされた細胞系に関する。
【０００９】
さらに本発明は、
腫瘍を有する哺乳動物における腫瘍細胞の転移を防止するための医薬組成物であって、ＨＧＦ／ＳＦとＭｅｔとの結合を防止する有効量の物質を含む医薬組成物；
該物質がＨＧＦ／ＳＦ変種、ＨＧＦ／ＳＦ模擬体およびＨＧＦ／ＳＦに対する抗体または抗体フラグメントからなる群より選択されるものである上記医薬組成物；
該物質がＭｅｔ変種、Ｍｅｔ模擬体およびＭｅｔに対する抗体または抗体フラグメントからなる群より選択されるものである上記医薬組成物；および
該抗体がポリクローナル抗体１２４２である上記医薬組成物
にも関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
１の具体例において、本発明は、ＨＧＦ／ＳＦのＭｅｔとの結合を阻害することがらなる腫瘍細胞の転移を防止する方法を包含する。「防止」なる語は、腫瘍の転移を減少または阻止することを意味する。
【００１１】
「転移性」となる腫瘍細胞に関しては、多くの相関のある事柄が起こらなくてはならない。例えば、転移は、癌細胞が血管およびリンパ循環系の壁を透過し、循環系に侵入し、下流毛細血管床またはリンパ節に定着（「付着」）し、循環系を去り（「移動／運動性」）正常な支質組織中に透過していくプロセスを包含する。起こるべきこれらのプロセスのためには、腫瘍細胞が侵略的特性を獲得しなければならない。侵略的特性としては、（１）外部マトリックスに付着する細胞の能力（インテグリンのごとき細胞表面上の受容体による）；（２）コラゲナーゼ類およびプラスミノゲナーゼ類のごとき外部マトリックスを突き破る破壊酵素（「メタロプロテアーゼ類」）の誘導；および（３）酵素による破壊によってできた「穴」を通る細胞の移動が挙げられる。細胞により分泌されるメタロプロテアーゼ類のレベルの上昇、細胞の運動原性の増加、および受容体（付着体（インテグリン）に包含される）発現のパターンの変化は、すべて記載されており、いくつかの場合、ヒト・癌腫細胞の転移能と関連がある（エル・エイ・リオッタ（Ｌ．Ａ．Ｌｉｏｔｔａ），サイエンティフィック・アメリカン（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ）５４〜６３頁（１９９２年２月））。
【００１２】
ＨＧＦ／ＳＦが、これらの事柄のうちの最後の２つ（すなわち、コラゲナーゼ類およびプラスミノゲナーゼ類の分泌ならびに運動原性）における活性レベルを増加させることが知られている。さらに、ＨＧＦ／ＳＦは、脈管形成性であることが知られており、血管形成は腫瘍細胞の生存にとり重要である（ジェイ・ベーレンス（Ｊ．Ｂｅｈｒｅｎｓ）ら，ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．）第１０８巻：２４３５〜２４４７頁（１９８９年）；ケイ・エム・ウェイドナー（Ｋ．Ｍ．Ｗｅｉｄｎｅｒ）ら，ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー第１１１巻：２０９７〜２１０８頁（１９９０年））。
【００１３】
「運動原性」なる語は、連続した細胞のシートが凝集せず、形態を変化させ、運動性となるプロセスをいう（イー・ジェラルディおよびエム・ストーカー，キャンサー・セルズ第３巻：２２７〜２３２頁（１９９１年））。この現象は「散在化」とも呼ばれる。出願人は、ＨＧＦ／ＳＦが運動原性を２通りの様式で誘導することを示した。下記実施例１参照。まず、表１に示すように、ＨＧＦ／ＳＦに対して古典的な散在化応答を示す細胞は、内在性ｍｅｔ受容体のチロシンのすみやかなリン酸化を示し、このことは、ｍｅｔ受容体を通して散在化が活性化されることを示唆する。
【００１４】
【表１】
2004002440.tif 000002
１運動原性インデックス＝ＨＧＦ存在下における３Ｈ−チミジン取り込み／ＨＧＦ不存在下における３Ｈ−チミジン取り込み
【００１５】
次に、マウスおよびヒトのｍｅｔ　ｃＤＮＡがコードしているｍｅｔ腫瘍原遺伝子産物でトランスフェクションしたマウス・乳癌「上皮」細胞系（Ｃ１２７細胞）について活発性の試験が行われ、外部から導入されたｍｅｔ　ｃＤＮＡ由来のｍｅｔ産物を発現する細胞においてのみ（トランスフェクションしていない細胞においてではない）、ＨＧＦ／ＳＦに応答した散在化を示した。これらの結果を表２に示す。
【００１６】
【表２】
2004002440.tif 000003
ａ３Ｈ−チミジン取り込みに対する刺激は、Ｃ１２７細胞における外来性ｃ−ｍｅｔ産物のレベルの低さによるものと推測される。
【００１７】
ＨＧＦ／ＳＦ−Ｍｅｔ経路の不活性化により、本発明の治療的方法論に関する基礎が提供される。これらの方法論は、ＨＧＦ／ＳＦとＭｅｔとの結合を妨げる物質の製造を包含する。かかる物質としては、ＨＧＦ／ＳＦまたはＭｅｔの変種、ＨＧＦ／ＳＦまたはＭｅｔの模擬体、およびＨＧＦ／ＳＦとＭｅｔとの結合を妨げるＨＧＦ／ＳＦまたはＭｅｔに対する抗体または抗体フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
「変種」としては、例えば、ｍｅｔ結合ドメインを欠いているかまたは損傷を受けたｍｅｔ結合ドメインを有するか、もしくは活性化ドメインを欠いているかまたは損傷を受けた活性化ドメインを有するＨＧＦ／ＳＦ種（しかしＨＧＦ／ＳＦの構造的および生物学的特徴を保持している）が挙げられる（ロッカー（Ｌｏｋｋｅｒ）ら，ジ・ＥＭＢＯ・ジャーナル第１１巻（７）：２５０３〜２５１０頁（１９９２年）。
【００１９】
本発明の変種とされるＨＧＦ／ＳＦ種を、慣用的な遺伝子工学的方法により、本発明にしたがって製造することができる。例えば、部位特異的変位を含む方法により、変種を製造することができる。カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ），８．０．３中「ミュータジェネシス・オブ・クローンド・ディーエヌエイ（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｃｌｏｎｅｄ　ＤＮＡ）」およびその続きの部分；上記ロッカーらの文献参照。
【００２０】
本発明の変種としては、例えば、ＨＧＦ／ＳＦと結合する正常なＭｅｔに対するアンタゴニストとして作用する細胞外ＨＧＦ／ＳＦ結合ドメインからなる可溶性系形態のＭｅｔも挙げられる。かかる変種を、本発明の分野においてよく知られた分子設計法により製造することができる。例えば、フー（Ｆｕｈ）ら，サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第２５６巻：１６７７〜１６８０頁（１９８２年）参照。
【００２１】
本発明の転移阻害性変種は、米国同時係属出願第０７／６５５，５０２号に開示されたＨＧＦ／ＮＫ２またはＨＧＦ／ＮＫ１のごとき天然の変種であってもよい。該出願は文献により取り込まれる。ＨＧ／ＮＫ２は、Ｎ−末端および最初の２個のクリングルドメイン（ｋｒｉｎｇｌｅ　ｄｏｍａｉｎ）を含む配列により特徴づけられる別のＨＧＦ転写物によりコードされるＨＧＦ／ＳＦの切形形態である。ＨＧＦ／ＮＫ１は、Ｎ−末端および最初の２個のクリングルドメイン（ｋｒｉｎｇｌｅ　ｄｏｍａｉｎ）を含む配列により特徴づけられるＨＧＦ／ＳＦ転写物によりコードされるＨＧＦ／ＳＦのもう１つの切形形態である。
【００２２】
本発明の転移阻害性物質は、ＨＧＦ／ＳＦまたはＭｅｔのためには模擬体であってもよい。模擬体の一例は、抗−イディオタイプ抗体、すなわち、抗原上のエピトープに特異的に結合する抗体で動物を免疫することにより産生される抗体である。抗−イディオタイプ抗体は、第１の抗体の結合部位を認識し、確認する。それゆえ、その結合部位の形態は、第１の抗体の結合部位中に適合するエピトープに非常によく似ている。抗−イディオタイプ抗体が、もとの抗原に似た結合部位を有しているので、それを、もとの抗原に対する受容体との結合のためのリガンドとして用いることができる。ファインバーグ（Ｆｉｎｅｂｅｒｇ）およびアートル（Ｅｒｔｌ），ＣＲＣ・クリティカル・レビューズ・イン・イミュノロジー（ＣＲＣ　Ｃｒｉｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）第７巻：２６９〜２８４頁参照。ＨＧＦ／ＳＦの適当な模擬体を、ＨＧＦ／ＳＦ抗体でスクリーニングしていずれの化合物がそれに結合するのか、あるいはいずれの化合物が分子設計により製造できるのかを調べることができる。モーガン（Ｍｏｒｇａｎ）ら，アニュアル・リポーツ・イン・メディシナル・ケミストリー（Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ），１９８９年）中「アプローチズ・トゥ・ザ・ディスカバリー・オブ・ザ・ノン−ペプチド・リガンズ・フォー・ペプチド・リセプターズ・アンド・ペプチダーゼス（Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅＮｏｎ−Ｐｅｐｔｉｄｅ　ＬＬｉｇａｎｄｓ　ｆｏｒ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ）」参照。
【００２３】
本発明の転移阻害性物質は、ＨＧＦ／ＳＦのＭｅｔとの結合を阻害するＨＧＦ／ＳＦまたはＭｅｔに対する抗体または抗体フラグメントであってもよい。本発明にいう「抗体」は、抗体全体およびその一部、あるいはそれのみまたは他の部分を伴うものを包含する。抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および単鎖抗体が挙げられる。抗体フラグメントは、ＨＧＦ／ＳＦまたはＭｅｔと結合するもの、とりわけ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２フラグメントが挙げられる。本発明の抗体を、動物中で生産することができ、また、当業者によく知られた組換えＤＮＡ法により生産することができる。
【００２４】
本発明の１の具体例において、出願人らは、リガンド結合またはリガンド結合の調節に用いるＭｅｔ細胞外ドメインに対応する合成ペプチドに対するポリクローナル抗体を製造する。図６および図９およびその説明参照。
【００２５】
出願人らは、腫瘍の侵略または転移をブロックする能力を測定するＭｅｔに対して指向されたリガンド結合阻害剤についてのインビトロ試験に関するプロトコールを開発した。例えば、出願人らは、ｍｅｔｍｕ（内因的にネズミ・ＨＧＦ／ＳＦを産生する）およびｍｅｔの腫瘍形態であるｔｐｒ−ｍｅｔでトランスフェクションした細胞が侵略的であるのと同様に、ＨＧＦ／ＳＦおよびｍｅｔｈｕでトランスフェクションしたＮＩＨ／３Ｔ３細胞が、ボイデン−チェンバーアッセイにおいて侵略的であることを見いだした。同様に、「ならし培地」、すなわちＨＧＦ／ＳＦｈｕを含有する培地中にある場合には、ｍｅｔｈｕトランスフェクション体は侵略的である。さらに出願人らは、Ｍｅｔの細胞外ドメイン中のペプチド配列に対して産生された「１２４２」抗体が、腫瘍細胞の侵略能をブロックすることを見いだした。
【００２６】
実際に、実施例２に開示され、図５を参照して議論されるようなキメラなマウス／ヒトに関する実験により、リガンド／受容体結合に包含されるＭｅｔ受容体およびＨＧＦ／ＳＦに関するドメインを明らかにすることが可能になる。図６に示され記載された数学的かつコンピューターによる計算により、マウスおよびヒトにおいて異なっているドメイン中の領域を明らかにすることが可能である。これらの「相違」により、ＨＧＦ／ＳＦに対する応答における種特異性が調節されている可能性があり、かかる領域に対する抗体を、そのＨＧＦ／ＳＦ結合を阻害する能力に関して試験することができる。よって、出願人らは、インビボ用途の組成物の開発に適用可能な、腫瘍転移阻害についてのインビトロ試験法を提供した。
【００２７】
作用すべき選択部位への本発明腫瘍転移阻害物質の送達を、ドラッグデリバリー、遺伝子導入、またはそれらのすべての組み合わせといった慣用的方法を用いて行うことができる。ケイ・ジェー・バン・ゼー（Ｋ．Ｊ．Ｖａｎ　Ｚｅｅ）ら，ＰＮＡＳ第８９巻：４８４５〜４８４９頁（１９９２年）参照。送達手段としては、炭水化物またはキャリア蛋白との抱合体化；当該分野で認められているいかなる徐放複合体とともに行う投与；微小球またはリポソームのごとき他の送達システムとの組み合わせ；または発現ベクター系に導入しての投与が挙げられる。本発明に適用可能な送達方法の１つとしては、デイビス（Ｄａｖｉｓ）ら，米国特許第４，４７９，３３７号の方法により、本発明の腫瘍転移阻害物質をポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールとカップリングさせて生理学的に活性な免疫原性のない水溶性組成物を製造することが挙げられる。
【００２８】
かかる組成物の投与を、当業者に知られたいかなる方法によっても行うことができる。例えば、組成物を水溶液中に入れ、哺乳動物の循環系内または筋肉内系に注射することができる。適正な用量の決定は、哺乳動物の年令および体重をはじめとするそれぞれのケースに特異的な変数の数に依存し、当業者の技術・知識範囲内の通常の実験を必要とする。
【００２９】
本発明のもう１つの具体例において、ＨＧＦ／ＳＦ経路の人工的な活性化により、本来の生物学的活性を回復、置換、または増強するための治療的方法論に関する根拠が提供される。これらの方法論としては、ＭｅｔとＨＧＦ／ＳＦとの間の結合相互作用を増強するＨＧＦ／ＳＦまたはＭｅｔ変種あるいは模擬体を活性化すべき部位へ送達し、そのことにより、人工的に支持されたＨＧＦ／ＳＦ相互作用を作り出すことが挙げられる。例えば、ＭｅｔのＨＧＦ／ＳＦ結合ドメイン、またはＨＧＦ／ＳＦのＭｅｔ結合ドメイン（あるいはその両方）の部位特異的変異を用いて、他のペアーのメンバーに対するより高い親和性を有するＨＧＦ／ＳＦ−Ｍｅｔペアーのメンバーを作り出すことができ、よって、損傷組織の成長または再生の加速に影響が及ぶ。同様に、構成的に活性化されたチロシンキナーゼを有するＭｅｔの変異をはじめとする慣用的な組換えＤＮＡ法を用いて、通常はＨＧＦ／ＳＦ結合により調節されるＭｅｔ蛋白のキナーゼ活性を増強または支援することができる。外部から投与されたＨＧＦ／ＳＦと組み合わせた組換えＤＮＡ法によりＭｅｔの自然発現を補う手段によってＨＧＦ／ＳＦ−Ｍｅｔ経路を活性化することも、本発明の範囲内に包含される。
【００３０】
作用すべき選択部位への遺伝子操作されたＨＧＦ／ＳＦまたはＭｅｔ種の送達を、腫瘍転移を阻害する物質の送達に関して上で議論されたような、ドラッグデリバリー、遺伝子導入、またはそれらのすべての組み合わせといった慣用的方法を用いて行うことができる。
【００３１】
本発明の別の具体例において、出願人らは、ヒト・ＨＧＦ／ＳＦの製造法を提供する。詳細には、出願人らは、驚くべきことに、マウス・繊維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３細胞が、ヒト・ＨＧＦ　ｃＤＮＡを含むトランスフェクションされた末端反復配列（ＬＴＲ）ベクター組み換え体から高レベルのＨＧＦ／ＳＦを発現することを見いだした。出願人らは、ＬＴＲヒト・ｃ−ｍｅｔ腫瘍原遺伝子（ｃＤＮＡベクター）がヒト・ＬＴＲ／ＨＧＦ構築物とともに同時トランスフェクションされ、かつ細胞が２次腫瘍から由来する場合に、最高レベルのＨＧＦがＮＩＨ／３Ｔ３中に検出されることを見いだした。下記実施例２参照。この細胞系の１の利点は、形質転換細胞が高密度にまで増殖することである。したがって、この細胞系は、非常に高レベルのＨＧＦ／ＳＦ、すなわちリットルあたりＨＧＦ／ＳＦ約１ｍｇ（ｍｌあたり１２５０ユニット）を産生する。これに対し、ヒト・表皮ケラチン細胞由来の別の細胞系であるｎｄｋ細胞は、４８時間でリットルあたり約１０μｇを産生する。ジェイ・シーアダムス（Ｊ．Ｃ．Ａｄａｍｓ）ら，サイエンス第９８巻：３８５〜３９４頁（１９９１年）；イー・エム・ローゼン（Ｅ．Ｍ．Ｒｏｓｅｎ）ら，ＢＢＲＣ第１６８巻（３）：１０８２〜１０８８頁（１９９０頁）参照。それゆえ、本発明の組換えベクター構築物で同時トランスフェクションしたＮＩＨ／３Ｔ３細胞から、１ｍｇ／ｍｌの収量でＨＧＦ／ＳＦを得ることは予期されないことである。
【００３２】
よって、本発明の１の具体例は、以下のステップ：
（ａ）　ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、ＨＧＦ／ＳＦｈｕおよびＭｅｔｈｕをコードしているＤＮＡでトランスフェクションし；
（ｂ）　ステップ（ａ）によりトランスフェクションされた細胞を哺乳動物内に導入し、それにより、１次腫瘍を生じさせ；
（ｃ）　１次腫瘍細胞を外移植し、インビトロで増殖させ；
（ｄ）　ステップ（ｃ）により増殖した高レベルのＨＧＦ／ＳＦｈｕおよび高レベルのＭｅｔｈｕを発現する細胞を選択し；
（ｅ）　ステップ（ｄ）により選択した細胞を哺乳動物内に導入し、それにより、２次腫瘍を生じさせ；
（ｆ）　２次腫瘍細胞を外移植し、インビトロで増殖させ；ついで
（ｇ）　ステップ（ｆ）の細胞により産生されたＨＧＦ／ＳＦｈｕを得る
からなるＨＧＦ／ＳＦの製造法に関する。
【００３３】
本発明ＤＮＡは、作動可能に連結されたレトロウイルスの末端反復配列由来のプロモーター、ヒト・Ｍｅｔの全コーディングドメインをコードしているＤＮＡおよびポリアデニレーションシグナルからなる第１のＤＮＡベクター、および作動可能に連結されたレトロウイルスの末端反復配列由来のプロモーター、ヒト・ＨＧＦ／ＳＦをコードしているＤＮＡおよびポリアデニレーションシグナルからなる第２のＤＮＡベクターよりなる。
【００３４】
本発明ＤＮＡベクターの製造を、当業者に知られた種々の方法により行うことができるが、方法を実施例２のｃＤＮＡプラスミド構築物および細胞系の議論において例示する。本発明の好ましいＤＮＡプラスミド構築物を図１１に示す。
【００３５】
ＨＧＦ／ＳＦｈｕおよびＭｅｔｈｕＬＴＲ−ｃＤＮＡでトランスフェクションされた細胞を、当該分野でよく知られた方法により、好ましくは、注射により哺乳動物中に導入する。ブレイアー，ディー・ジー（Ｂｒａｉｒ，Ｄ．Ｇ．）ら，サイエンス第２１８巻：１１２２〜１１２５頁（１９８２年）参照。本発明の好ましい哺乳動物はヌードマウスである。これらの動物中で５〜１０週間増殖した後の１次腫瘍を外移植し、実施例２のヌードマウスアッセイ記載のごとくインビトロ培養で増殖させる。ついで、インビトロ増殖した１次腫瘍細胞を、免疫沈降分析に付してどの細胞が高レベルのＨＧＦ／ＳＦｈｕおよび高レベルのＭｅｔｈｕを発現しているのかを確認する。図３およびその説明参照。例えば、外移植された細胞を代謝的にラベルし、ついで、Ｍｅｔｈｕモノクローナル抗体（モノクローナル１９Ｓ）とともに免疫沈降させ、濃縮し、ついで、ＨＧＦ／ＳＦｈｕモノクローナル抗体Ａ３．１．２．とともに免疫沈降させる。高レベルのＨＧＦ／ＳＦｈｕおよびＭｅｔｈｕを、出発物質における発現レベルと比較して測定する。したがって、出発物質において観察されるよりも高い発現レベルのものすべてを、この方法の目的に照らし合わせて、「高い」とみなす。ついで、高レベルのＨＧＦ／ＳＦｈｕおよびＭｅｔｈｕを発現する細胞を哺乳動物中に導入し、増殖する２次腫瘍を外移植し、当該分野でよく知られた方法によりインビトロ増殖させる。ブレイアー・ディー・ジーら，サイエンス第２１８巻：１１２２〜１１２５頁（１９８２年）参照。
【００３６】
ついで、外移植された２次腫瘍細胞により発現されるＨＧＦ／ＳＦｈｕを、ウェイドナーら，ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー第１１１巻：２０９７〜２１０８（１９９０年）記載のごとく精製する（本発明の適用可能な他の方法は当業者によく知られている）。
【００３７】
さらにもう１つの具体例において、本発明は、ｍｅｔ　ｃＤＮＡでトランスフェクションされたＮＩＨ／３Ｔ３細胞由来のマウスおよびヒトのＭｅｔのＣ−末端イソ体（ｉｓｏｆｏｒｍ）に関する。これらのイソ体は翻訳後のプロセッシングにより生じる可能性がもっと高いが、出願人らは、トランスフェクションされたＤＮＡの可能な再配列を排除することはできない。Ｃ−末端において切形されたいくつかのｍｅｔ産物が報告されている（プラト，エム（Ｐｒａｔ，Ｍ．）ら，モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）第１１巻：５９５４〜５９６２頁（１９９１年））が、これらの産物は本発明イソ体（ｉｓｏｆｏｒｍ）とは異なる。その理由は、それらがＣ−末端抗体と反応しないからである。そのうえ、これらのイソ体は、高レベルのｍｅｔを発現している細胞においてのみ検出され、そのことは、それらの存在量が少ないことを示すものである。
【００３８】
【実施例】
つぎに実施例を挙げて本発明を説明するが、実施例は何ら本発明を限定するものではない。
【００３９】
実施例１．ｃ−ｍｅｔ腫瘍原遺伝子は運動原性に関連した受容体である
ｃ−ｍｅｔ受容体を発現する多くのヒト・癌細胞系において転移および／または散在化（運動原性）を誘導するＨＧＦ／ＳＦの能力を調べた。上記表１に示す細胞系を、１Ｘ１０４〜５Ｘ１０４個／ｍｌとなるよう９６ウェル組織培養プレートに撒き、集密的に近くなるまで増殖させた。ウェルを洗浄して血清を除去し、無血清培地にて２日間細胞を飢餓状態とした。その翌日、細胞を、無血清、血清、またはＨＧＦ／ＳＦ１０ｎｇ／ｍｌで１６〜１８時間処理し、ついで、ウェルあたり３Ｈ−チミジン１μＣｉ（５μＣｉ／ｍｌ）を添加して、さらに６時間置いた。氷冷ＰＢＳでウェルから標識を洗い落とすことによりアッセイを終了し、細胞を５％ＴＣＡ中で固定し、ついで、０．２５Ｍ　ＮａＯＨでＤＮＡを可溶化した。運動原性インデックスは、血清不存在下におけるチミジンの取り込みとＨＧＦによるチミジンの取り込みとの比である。運動原性アッセイ用に、細胞を、２Ｘ１０３個／ｍｌとなるように１６−ウェルチェンバースライド（ラブテック（ＬａｂＴｅｋ）社製）に撒き、６０％集密的になるまで増殖させた。ついで、細胞を洗浄して血清を除去し、ＨＧＦ／ＳＦ添加／無添加無血清培地にて一晩インキュベーションした。スライドを氷冷アセトンで１０分間固定し、クリスタルバイオレット染色した（５分間）。「散在化した表現形」における質的な変化が記録された。
ｃ−ｍｅｔの上皮細胞系への導入により「散在化」活性が該細胞に付与されることを示すために、ヒト・ｍｅｔ　ｃＤＮＡまたはネズミ・ｍｅｔ　ｃＤＮＡのいずれかでリポフェクション（ＢＲＬ）することにより、Ｃ１２７細胞をトランスフェクションした。表１のように分裂原性および／または運動原性を測定した。この研究結果を上記表２に示す。
【００４０】
実施例２．ＮＩＨ／３Ｔ３細胞系におけるＨＧＦ／ＳＦ産生
ｃＤＮＡプラスミド構築物および細胞系　　ｍｅｔ　ｃＤＮＡプラスミドを、ｐＭＥＸ（オスカム，アール（Ｐｓｋａｍ，Ｒ．）ら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第８５巻：２９６４〜２９６８頁（１９８８年））の誘導体（ポリリンカー配列なし）であるｐＭＢ１中で構築した。該プラスミドは、モロニー・ミュリン・サルコーマ・ウイルス（Ｍｏｌｏｎｙ　ｍｕｒｉｎｅ　ｓａｒｃｏｍａ　ｖｉｒｕｓ）（ＭＳＶ）由来のＬＴＲプロモーターおよびシミアン・ウイルス４０（ｓｉｍｉａｎ　ｖｉｒｕｓ　４０）のポリアデニレーションシグナルを含んでいる。オーオプンリーディングフレームを含む４．６ｋｂのｍｅｔｈｕ配列中において、内部の３００ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントをｐＯＫの２５０ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントと置換することによりｍｅｔｈｕプラスミドを構築した。パーク，エム（Ｐａｒｋ，Ｍ．）ら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第８４巻：６３７９〜６３８３頁（１９８７年）；ロドリゲス（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ）ら，モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー第１１巻：２９６２〜２９７０頁（１９９１年）参照。ｍｅｔｍｕプラスミドは、４．６Ｋｂのマウス・ｍｅｔオープンリーディングフレーム全体を含んでいる。アイヤー，エイら，セル・グロウス・アンド・ディファレンシエイション第１巻：８７〜９５頁（１９９０年）参照。キメラなヒト／マウスｍｅｔ構築物を、保存的なＰｖｕＩＩ部位（アミノ酸８０７）を用いて構築した。ｐＭＥＸのＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ部位中にヒト・ＨＧＦ配列の２．３ＫｂのＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩフラグメントを挿入することによりＨＧＦｈｕプラスミドを構築した。ナカムラ，ティーら，ネイチャー第３４２巻：４４０〜４４３頁（１９８９年）；オスカム，アールら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第８５巻：２９６４〜２９６８頁（１９８８年）参照。ＮＩＨ／３Ｔ３　４９０細胞を、８％子ウシ血清（ギブコ社製）含有ＤＭＥＭ培地（ギブコ社製）中で増殖させた。
【００４１】
ＤＮＡトランスフェクション　　プラスミドＤＮＡ（子ウシ胸腺キャリアＤＮＡ８μｇを含む水７５μｌ中２μｇ）を０．６７Ｍ　ＣａＣｌ２７５μｌと混合することにより、ＤＮＡトランスフェクションに関するリン酸カルシウム法（クーパー，シー・エス（Ｃｏｏｐｅｒ，Ｃ．Ｓ．）ら，ネイチャー第３１１巻：２９〜３３頁（１９８４年））を行った。連続的に撹拌しながらこの混合物を、０．１５ｍｌの溶液Ｈ（０．２７Ｍ　ＮａＣｌ、０．０１Ｍ　ＫＣｌ、０．００１４Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１２Ｍ　デキストロース）に滴下した。室温に３０分間置いた後、０．０１Ｍ　Ｈｅｐｅｓバッファーを含む培地１ｍｌを入れた３５ｍｍディッシュ上で約７０％の集密性を有する細胞に、該混合物を添加した。細胞を３７℃で４時間インキュベーションし、ついで、溶液Ｈ中の１５％グリセロール（ｖ／ｖ）で２分間処理した。Ｇ４１８により選択のために、細胞を再度ＤＭＥＭおよび８％子ウシ血清中に一晩フィードし、ついで、３個の６０ｍｍディッシュに移した。２４時間インキュベーションした後、細胞を、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ギブコ社製）を含有する培地に、１週間に２度フィードした。
【００４２】
ノーザン分析　　ＲＮＡｓｏｌ（ＣＩＮＮＡ／ＢＩＯＴＥＣＸ社製）を用いてＲＮＡを単離した。ＲＮＡ２０μｇを、１％変性的ホルムアミドアガロースゲル上の電気泳動に供し、ついで、ニトロセルロースフィルター（シュライヒャー・アンド・シュール（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　Ｓｃｈｕｅｌｌ）社製）に移した。３０％ホルムアミド、６ｘセイラインクエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、５ｘデンハート溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）および超音波処理したサケ・精子ＤＮＡ（２５０μｇ／ｍｌ）中で、ブロットを、３２Ｐ−標識ランダムプライマーＤＮＡプローブと４２℃で１５時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダーゼーション後、フィルターを、１ｘＳＳＣ（０．１％ＳＤＳ含有）中、室温で２回洗浄し、ついで、１ｘＳＳＣ（０．１％ＳＤＳ含有）中、５０℃で洗浄した。フィルターを乾燥させて−７０℃で１〜３日間、Ｘ線フィルムに暴露した。
【００４３】
免疫沈降　　集密的に近い細胞を、メチオニンおよびシステイン不含ＤＭＥＭ中で、０．２５ｍＣｉのトランスラベル（Ｔｒａｎｓｌａｂｅｌ（ＩＣＮ社製））（１ｍｌ／３５ｍｍディッシュ）で４ないし６時間ラベルした。ラベルした細胞を、０．５ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液［１％トリトンＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ），０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０２Ｍ　ＮａＰＯ４，ｐＨ７．２、１ｍＭ　フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ），２ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０ｍＭ　ＮａＦ、３０ｍＭ　ピロリン酸ナトリウム］中で溶解させた。等量の放射線カウントを有する清澄化した溶解物を、１９Ｓモノクローナル抗−メチオニン抗体（ファテット，ディー・エル（Ｆａｌｅｔｔｏ，Ｄ．Ｌ．）ら，オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）第７巻：１１４９〜１１５７頁（１９９１年））と４℃で一晩免疫沈降させた。免疫沈降物を、プロテインＧ−セファロース（ギブコ社製）に複合体化させ、ついで、ＲＩＰＡ緩衝液で２回洗浄し、ハイサルト緩衝液（ｈｉｇｈ−ｓａｌｔ　ｂｕｆｆｅｒ）（１Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．２、０．５％トリトン）で洗浄した。５％β−メルカプトエタノール含有ＳＤＳ試料用緩衝液中で煮沸することにより、免疫沈降物を可溶化させた。試料をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、ついで、フルオログラフィックエンハンサー（ｆｌｕｏｒｏｇｒａｐｈｉｃ　ｅｎｈａｎｃｅｒ）（アンプリファイ（Ａｍｐｌｉｆｙ）ＴＭ，アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製）で処理し、−７０℃において増強スクリーンでフルオログラフィーを得た。
ＳＰ２６０は、ウサギ・抗血清から作られたペプチド抗体であり、ｍｅｔｍｕのＣ−末端の２１個のアミノ酸に対して指向されている（アイヤー，エイら，セル・グロウス・アンド・ディファレンシエイション第１巻：８７〜９５頁（１９９０年））。Ａ．３．１．２は、抗−ヒト組み替え型ＨＧＦモノクローナル抗体（ＩｇＧ，サブクラスＧ２ａ）である。
【００４４】
パルスチェイス分析　　集密的に近い細胞を、メチオニンおよびシステイン不含ＤＭＥＭ１ｍｌ中（各３５ｍｍディッシュ）、０．２５ｍＣｉのトランスラベルで４５分間ラベルした。細胞を２回洗浄し、完全培地で３時間チェイスし、ついで、溶解し、免疫沈降分析に供した。
【００４５】
表面ヨウ素化　　集密的に近い細胞を、ヨード−ジェン（Ｉｏｄｏ−Ｇｅｎ（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）社製）の存在下でＮａ１２５Ｉでラベルした。ヨードージェン試薬２０μｌ（クロロホルム中１０ｍｇ／ｍｌ）をＩ−ドラムバイアル（Ｉ−ｄｒａｍ　ｖｉａｌ）の底に入れ、窒素の流れにより乾燥させた。ついで、ヨード−ジェンを１０ｍＭＥＤＴＡを含有する１Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）に溶解し、細胞ペレットに添加した。Ｎａ１２５Ｉ（０．５ｍＣｉ）を添加した１０分間反応した。ラベルした細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ついで、ＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、免疫沈降分析に付した。
【００４６】
ウエスタン分析　　１００ｍｍディッシュ上の集密的に近い細胞を、冷ＴＢＳ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ）で２回洗浄し、１ｍｌの溶解用緩衝液（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ　ＮａＦ、１％トリトンＸ−１００、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１．２５ｍＭ　ＰＭＳＦ、１ｍＭバナジン酸塩）中で溶解させた。蛋白１ｍｇを、抗−Ｃ２８抗−Ｍｅｔｈｕポリクローナル抗体（ゴンザッティ−ヘイセス，エム（Ｇｏｎｚａｔｔｉ−Ｈａｃｅｓ，Ｍ．），プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第８５巻：２１〜２５頁（１９８８年））とともに免疫沈降させ、抗−ホスホチロシン（抗−Ｐ−Ｔｙｒ）抗体４Ｇ１０（モリソン、ディー・ケイ（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｄ．Ｋ．）ら，セル第５８巻：６４９〜６５７頁（１９８９年））、またはヒトもしくはマウスのｍｅｔ特異的抗体である１９Ｓモノクローナル（ファレット，ディー・エルら，オンコジーン第７巻：１１４９〜１１５７頁（１９９１年））あるいはＳＰ２６０（アイヤー，エイら，セル・グロウス・アンド・ディファレンシエイション第１巻：８７〜９５頁（１９９０年））のいずれかとウエスタン分析を行った。製造者の指示に従い、１２５Ｉ−プロテインＡ（アマシャム社製）を用いて陽性バンドを検出した。
【００４７】
ヌードマウス腫瘍アッセイ　　すでに記載されているようにして（ブレイアー，ディー・ジーら，サイエンス第２１８巻：１１２２〜１１２５頁（１９８２年））、アッセイを行った。トランスフェクションされＧ４１８で選択されたＮＩＨ／３Ｔ３細胞（１０６個）を２回洗浄し、無血清培地０．１ｍｌ中に再懸濁した。細胞を、離乳した胸腺除去ヌードマウス（ハーラン・スプラグ・ダウリー，インク（Ｈａｒｌａｎ　Ｓｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．））の背中に注射した。腫瘍形成を、毎週１０週目までモニターした。腫瘍が１５ｍｍのサイズになった時、腫瘍を外移植し、腫瘍細胞を免疫沈降分析に供した。
【００４８】
軟寒天アッセイ　　軟寒天増殖アッセイを、ブレイアら，ウイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）第９５巻：３０３〜３１６頁（１９７９年）の変法により行った。簡単に説明すると、トリプシン処理細胞を、１０％子ウシ血清および０．２４％精製寒天（ＤＩＦＣＯ社製）を含有する８ｍｌのＤＭＥＭ中、２ｘ１０５および２ｘ１０４個となるように懸濁し、１０％子ウシ血清および０．２７％寒天を含有するＤＭＥＭの硬化下層を入れた２系の６０ｍｍディッシュに移した。１週間間隔で、１０％子ウシ血清および０．２７％寒天を含有するＤＭＥＭ２ｍｌをプレートにフィードした。３７℃で３週間インキュベーションした後、顕微鏡でコロニーを数えた。
【００４９】
ＮＩＨ／３Ｔ３細胞におけるＭｅｔｈｕおよびＭｅｔｍｕの発現　　ｍｅｔｈｕ腫瘍原遺伝子ｃＤＮＡを含んでいるプラスミドを、ｐＳＶ２ｎｅｏとともにＮＩＨ／３Ｔ３細胞に同時トランスフェクションし、免疫沈降分析により、ヒトまたはマウスのＭｅｔ発現に関してＧ４１８耐性細胞をスクリーニングした。これらの分析により、トランスフェクションされたＮＩＨ／３Ｔ３細胞において、ヒトおよびマウスのｐ１７０ｍｅｔおよびｐ１４０ｍｅｔが発現されることが示されている（図１Ａのそれぞれレーン２および３）。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞における同等のレベルのｍｅｔｍｕ発現が報告されている（アイヤー，エイら，セル・グロウス・アンド・ディファレンシエイション第１巻：８７〜９５頁（１９９０年））。出願人らは、Ｍｅｔｈｕを発現するＧ４１８耐性細胞において、外来性のＭｅｔｍｕの発現が見られないかまたは殆ど起こらないことを見いだした。ＭｅｔｈｕおよびＭｅｔｍｕの適当なプロセッシングについて、パルスチェイスラベリング実験により試験し、これらの研究により、４５分のパルスの間に合成されるｐ１７０ｍｅｔ（図１Ｂ，レーン１および３）が、３時間後に、効果的に成熟ｐ４１０ｍｅｔへとプロセッシングされる（レーン２および４）ことが示された。そのうえ、ヒトおよびマウスのＭｅｔは、細胞表面に局在化していた。出願人らは、無処理の細胞をＮａ１２５Ｉでラベルし、その溶解物を免疫沈降して、ｐ１４０ｍｅｔおよびｐ１７０ｍｅｔ両形態ともがヨウ素化されたことを示した（図１Ｃ）。よって、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞において発現されるヒトまたはマウスのＭｅｔは、正確にプロセッシングされ、細胞表面に局在化するのである。これらの分析は、ｐ１７０ｍｅｔが細胞表面に到達することも示す。ｐ１７０ｍｅｔのヨウ素化物は、溶解細胞からは生じなかった。なぜならば、同じヨウ素化条件において、細胞質性ｔｐｒ−ｍｅｔ腫瘍蛋白が検出されなかったからである（ゴンザッティ−ヘイセス，エム（Ｇｏｎｚａｔｔｉ−Ｈａｃｅｓ，Ｍ．），プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第８５巻：２１〜２５頁（１９８８年））。さらに、ｍｅｔｈｕを過剰産生するヒト・胃癌細胞系であるオカジマ細胞（Ｏｋａｊｉｍａ　ｃｅｌｌｓ）において発現されるｐ１７０ｍｅｔもまた、表面ヨウ素化によりラベルされるが（データ示さず）、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞と比較した場合、ラベルされたｐ１４０ｍｅｔに対するｐ１７０ｍｅｔの割合は小さかった。
【００５０】
ＮＩＨ／３Ｔ３細胞におけるｍｅｔの構造的なチロシンのリン酸化　　ノーザンハイブリダイゼーション分析により、出願人らは、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞およびｍｅｔｈｕまたはｍｅｔｍｕのいずれかでトランスフェクションされた細胞におけるＨＧＦ／ＳＦ　ｍＲＮＡ発現を検出した。出願人らは、同レベルのＨＧＦ／ＳＦｍＲＮＡ発現を観察した。そのことは、Ｇ４１８選択細胞系におけるｍｅｔｈｕまたはｍｅｔｍｕの過剰産生は外来性ＨＧＦ／ＳＦ発現に影響しないことを示すものであった。これらの結果もまた、Ｍｅｔがオートクリン様式で活性化されうることを示すものであった。それゆえ、出願人らは、これらの細胞において発現したＭｅｔｈｕおよびＭｅｔｍｕが抗−Ｐ−Ｔｙｒ抗体と反応するかどうかを調べた。ＭｅｔｈｕおよびＭｅｔｍｕを発現する細胞系からの抽出物を、ヒトまたはマウスに特異的なペプチド抗体との免疫沈降に供し、ついで、抗−Ｐ−Ｔｙｒ抗体（図２Ａおよび２Ｂ）、またはヒト（図２Ｃ）あるいはマウス（図２Ｄ）に特異的なＭｅｔ抗体を用いたウエスタン分析を行った。これらの分析は、Ｍｅｔｈｕのｐ１７０ｍｅｔおよびｐ１４０ｍｅｔならびにＭｅｔｈｕが抗−Ｐ−Ｔｙｒ抗体と強く反応したことを示すものである。これは、ｐ１７０ｍｅｔのチロシンリン酸化物が抗−Ｐ−Ｔｙｒ抗体と反応することを示した最初の例である。１の細胞系はＭｅｔｈｕを非常に高レベルで発現した（図２ＡおよびＣのレーン１）。これは例外である。なぜならば、他のすべてのＭｅｔｈｕ細胞系が、図２ＡおよびＣのレーン２および３で分析された細胞系に匹敵するレベルの発現を示したからである。さらに、Ｃ−末端Ｍｅｔ蛋白産物（ｐ８５、ｐ７５、およびｐ６５）がマウスまたはヒトいずれかのｍｅｔを発現する細胞におけるＣ−末端抗体でもって検出された（図２Ａ〜Ｄのレーン１）。
ＮＩＨ／３Ｔ３細胞におけるｍｅｔの腫瘍原性　　出願人らは、図５に示すように、Ｍｅｔｍｕを発現するがＭｅｔｈｕを発現しないＮＩＨ／３Ｔ３細胞培養物が形質転換されたこと（アイヤー，エイら，セル・グロウス・アンド・ディファレンシエイション第１巻：８７〜９５頁（１９９０年））を観察した。このことは、ヌードマウスにおける培養物の腫瘍原性について試験し、ついで、トランスフェクションし、Ｇ４１８選択を行うことによって確認された。ｍｅｔｍｕを発現するＮＩＨ／３Ｔ３細胞は、下表３に示すように非常に腫瘍原性があるが、ｍｅｔｈｕを発現する細胞は腫瘍原性が低く、試験した８系のうち１系のみが腫瘍を生成したにすぎなかった。
【００５１】
【表３】
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【００５２】
細胞（１０６個）を、無血清培地で２回洗浄し、離乳した胸腺除去ヌードマウスの背中に皮下注射した。腫瘍形成を、毎週、１０週間までモニターした。
注射する前は、これらの腫瘍原性細胞系（図２ＡおよびＣのレーン１）は、腫瘍原性でない細胞系（図２ＡおよびＣのレーン２および３）と比較すると、高レベルのＭｅｔｈｕを産生していた。この系の腫瘍外移植物も同様に高レベルのＭｅｔｈｕを示した。比較のため、注射する前のＭｅｔｍｕ系のレベルをに示す（図２ＢおよびＤのレーン１）。より低いレベルのＭｅｔｍｕを発現する細胞系もまた、このアッセイにおいて腫瘍原性であった。細胞系１２３−１により生じた２個の腫瘍（表３）は、外来性Ｍｅｔｍｕの発現レベルの増加およびＭｅｔｈｕレベルの減少を示すものであった。このことは、すでに記載されたように（クーパー，シー・エス（Ｃｏｏｐｅｒ，Ｃ．Ｓ．）ら，ジ・ＥＭＢＯ・ジャーナル第５巻：２６２３〜２６２８頁（１９８６年）；ヘルデン，シー・エイチ（Ｈｅｌｄｅｎ，Ｃ．Ｈ．）ら，ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）第１８４巻：４８７〜４９６頁（１９８９年））、マウス・ｍｅｔの増幅により２個の腫瘍が生じたことを示唆するものである。出願人らは、Ｍｅｔｈｕは、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞においては殆ど腫瘍原性がないと結論する。
【００５３】
ｍｅｔｈｕおよびＨＧＦ／ＳＦｈｕで同時トランスフェクションされたＮＩＨ／３Ｔ３細胞の腫瘍原性　　ｍｅｔｈｕでトランスフェクションされたＮＩＨ／３Ｔ３細胞の低い腫瘍原性に関する１の説明は、外来性のＨＧＦ／ＳＦｍｕによってはｍｅｔｈｕ受容体活性化により十分なシグナルを得ることができないということである。それゆえ、出願人らは、ｍｅｔｈｕおよびＨＧＦ／ＳＦｈｕ両方のｃＤＮＡでのトランスフェクションが、オートクリン機構を通して腫瘍原性を増加させるかどうかを調べた。これらの分析により、ｍｅｔｈｕおよびＨＧＦ／ＳＦｈｕで同時トランスフェクションされたＮＩＨ／３Ｔ３細胞が高い腫瘍原性となることが示されている（表４）。
【００５４】
【表４】
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【００５５】
そのうえ、腫瘍細胞は、ＭｅｔｈｕおよびＨＧＦ／ＳＦｈｕ両方のレベルの増加を示した（それぞれ図３ＡおよびＣのレーン２、４および５）。レーン４および５に示される腫瘍外移植物において、ＭｅｔｈｕおよびＨＧＦ／ＳＦｈｕが両方とも高レベルで発現された。外来性のｍｅｔｍｕの増幅を示した細胞系はなかった（図３Ｂ）。出願人らは、ＨＧＦ／ＳＦｈｕでトランスフェクションされたＮＩＨ／３Ｔ３細胞もまた、いくつかの腫瘍を生じさせたが、外移植物由来の腫瘍細胞において発現したＨＧＦ／ＳＦｈｕ産物のレベルは、ｍｅｔｈｕ−ＨＧＦ／ＳＦｈｕ同時トランスフェクション実験（図３Ｃ）による腫瘍において発現したレベルほど高くなかった。５個のＨＧＦ／ＳＦｈｕ腫瘍のうち１個において、外来性のｍｅｔｈｕのレベル上昇が検出された。
【００５６】
ＮＩＨ／３Ｔ３細胞におけるキメラなヒト／マウス・ｍｅｔの腫瘍原性　　リガンド結合ドメインが腫瘍原性に影響するかどうかを調べるために、出願人らは、キメラなヒト／マウス・ｍｅｔ受容体分子を得、ヌードマウスにおけるそれらの腫瘍原性を試験した（図５）。出願人らは、トランスメンブレンをコードしている部位に隣接した外部ドメイン中の保存されたＰｖｕＩＩ部位を用いてこれらの組換体を作った。マウス・外部リガンド結合ドメインをヒト・トランスメンブランおよびチロシンキナーゼドメインに連結した場合、該キメラな受容体は、Ｍｅｔｍｕと同等の腫瘍原活性を示した（図５）。これらの腫瘍の外移植物は、ヒト・チロシンキナーゼドメインに対して指向されたヒト・抗体でもって認識されるキメラなＭｅｔ蛋白のレベルの増加を示した（図４のレーン２および３）。これらの腫瘍において、ｍｅｔｍｕの増幅に関する証拠は得られず、キメラな産物は、抗−Ｐ−Ｔｙｒ抗体を用いたエウスタン分析によって認められた（図４のレーン５）。
マウス・Ｍｅｔ外部リガンド結合ドメインを伴ったキメラの高い腫瘍原性とは対照的に、ヒト・Ｎ−末端／マウス・Ｃ−末端キメラは殆ど腫瘍原性がなかった。しかしながら、Ｍｅｔｈｕの場合と同様に、ＨＧＦ／ＳＦｈｕｃＤＮＡでこのキメラを同時トランスフェクションした場合、効果的な腫瘍形成が観察された（図５）。さらに出願人らは、ｍｅｔｍｕ−ｍｅｔｈｕキメラを発現する細胞が、ヌードマウスに注射する前に、形質転換され、ｍｅｔｍｕでトランスフェクションされた細胞と同様に軟寒天中にコロニーを形成することを示す。ｍｅｔｈｕ−ｍｅｔｍｕ細胞は、ＨＧＦ／ＳＦで同時発現されないかぎり、形質転換された表現形を示さない。出願人らは、Ｍｅｔｍｕ外部リガンド結合ドメインが、腫瘍原性を調べる主要因子であると結論した。
【発明の効果】
腫瘍転移防止法およびそのための医薬組成物、詳細には、腫瘍を有する哺乳動物における腫瘍細胞の転移を防止することに有用な医薬組成物であって、ＨＧＦ／ＳＦとＭｅｔとの結合を防止する有効量の物質を含む医薬組成物が本発明により提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、トランスフェクションされたＮＩＨ／３Ｔ３細胞におけるｍｅｔ産物を示す。（Ａ）免疫沈降分析　　細胞を［３５Ｓ］メチオニンよび［３５Ｓ］システイン（ＩＣＮ社製、トランスラベル（Ｔｒａｎｓｌａｂｅｌ））で、５分間、メチオニンおよびシステインを欠くＤＭＥＭ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社製）中で代謝的にラベルし、細胞溶解物をＭｅｔｈｕ−特異的モノクローナル抗体１９Ｓ（ファレット，ディー・エル（Ｆａｌｅｔｔｏ，Ｄ．Ｌ．）ら，オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）第７巻：１４９〜１１５７頁（１９９１年））（レーン１および２）、またはＭｅｔｍｕ（ｍｕはネズミ由来）−特異的ペプチド抗体ＳＰ２６０（アイヤー，エイ（Ｉｙｅｒ，Ａ．）ら，セル・グロウス・アンド・ディファレンシエイション第１巻：８７〜９５頁（１９９０年））（レーン３）のいずれかと免疫沈降させた。プロテインＧ−セファロース（ギブコ社製）で免疫沈降を完了させ、複合体を、５％β−メルカプトエタノールを含有するＳＤＳ試料用緩衝液に可溶化し、７．５％アクリルアミドゲル上で分離した。レーン１は、細胞をｐＳＶ２ｎｅｏのみでトラスフェクションした場合；レーン２は、細胞をｍｅｔｈｕでトランスフェクションした場合；レーン３は、細胞をｍｅｔｍｕでトランスフェクションした場合である。（Ｂ）パルス−チェイス分析　　細胞を［３５Ｓ］メチオニンよび［３５Ｓ］システインで４５分間代謝的にラベルし（レーン１および３）、ついで、チェイス時間を３時間間とした（レーン２および４）。Ｍｅｔを、Ｍｅｔｈｕに対する１９Ｓモノクローナル抗体（レーン１および３）またはＭｅｔｍｕに対するモノクローナル抗体（レーン２および４）と免疫沈降させ、パネルＡに示す電気泳動を行った。レーン１および２は、細胞をＭｅｔｈｕでトランスフェクションした場合；レーン３および４は、細胞をＭｅｔｍｕでトランスフェクションした場合である。（Ｃ）細胞表面におけるｍｅｔのヨウ素化　　集密的に近い細胞をペレット化し、ヨードゲン（Ｉｏｄｏ−Ｇｅｎ（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）社製）の存在下においてＮａ１２５Ｉでラベルした。ラベルされた細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、１９Ｓモノクローナル抗体（レーン１および２）またはＳＰ２６０ペプチド抗体（レーン３および４）のいずれかと免疫沈降させた。Ｍｅｔｈｕを発現するＮＩＨ／３Ｔ３細胞はレーン１および３である。Ｍｅｔｍｕを発現するＮＩＨ／３Ｔ３細胞はレーン２および４である。矢印は、ｐ１７０ｍｅｔおよびｐ１４０ｍｅｔの位置を示す。
【図２】図２は、抗−Ｐ−Ｔｙｒ抗体との精製物の反応性を示す。１００ｍｍディッシュ上の集密的に近い細胞を冷ＴＢＳで２回洗浄し、溶解用緩衝液（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ　ＮａＦ、１％トリトンＸ−１００、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１．２５ｍＭ　ＰＭＳＦ、１ｍＭ　オルトバナジン酸ナトリウム）１ｍｌ中で溶解した。Ｍｅｔｈｕに対する抗−Ｃ２８ペプチド抗体（ゴンザッティ−ハセス，エム（Ｇｏｎｚａｔｔｉ−Ｈａｃｅｓ，Ｍ．）ら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第８５巻：２１〜２５頁（１９８８年））（パネルＡおよびＣ）またはＭｅｔｍｕに対するペプチド抗体ＳＰ２６０（アイヤーエイら，セル・グロウス・アンド・ディファレンシエイション第１巻：８７〜９５頁（１９９０年））（パネルＢおよびＤ）でもって蛋白１ミリグラムが免疫沈降した。ＳＤＳ緩衝液に溶解した後、試料を７．５％ゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、インモビロン−Ｐ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ）（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社製）に移し、ついで、抗−Ｐ−Ｔｙｒ抗体、４Ｇ１０（モリソン，ディー・ケイ（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｄ．Ｋ．）ら，セル第５８巻：６４９〜６５７頁（１９８９年））（パネルＡおよびＢ）、１９Ｓモノクローナル抗体（パネルＣ）、またはマウス・ｍｅｔペプチド抗体（パネルＤ）をプローブとして反応させた。ついで、インモビロンフィルターを１２５Ｉ−プロテインＡ（ＩＣＮ社製）とインキュベーションし、オートラジオグラフィーを行った。パナルＡおよびＣのレーン１〜３には、ｍｅｔｈｕでトランスフェクションした細胞の３本の異なる線があり；レーン４は対照細胞である。パネルＢおよびＤのレーン１は、ｍｅｔｍｕでトランスフェクションした細胞である。レーン２はＮＩＨ／３Ｔ３対照細胞である。
【図３】図３は、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞におけるＭｅｔｈｕおよびＨＧＦ／ＳＦｈｕの性質を示す。腫瘍細胞を外移植し、［３５Ｓ］メチオニンおよび［３５Ｓ］システインで６時間代謝的にラベルした。細胞溶解物を、１９Ｓモノクローナル抗体（パネルＡ）、またはペプチド抗体ＳＰ２６０（パネルＢ）のいずれかと免疫沈降させた。ついで、「６時間」上清０．２５ｍｌを、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）社製　１０Ｋカットオフ）で３倍に濃縮し、ＲＩＰＡ緩衝液で体積を０．３ｍｌに調節し、試料を、抗−ＨＧＦモノクローナル抗体Ａ３．１．２（パネルＣ）と免疫沈降させた。レーン１および３は、注入前に同時トランスフェクションされた２種の異なる細胞系からの試料である。レーン２は、レーン１で分析される細胞由来の腫瘍外移植物である。レーン４および５は、レーン３で分析される細胞由来の腫瘍外移植物である。レーン６は、対照ＮＩＨ／３Ｔ３細胞から調製した試料である。矢印は、ｐ１７０ｍｅｔおよびｐ１４０ｍｅｔの位置（パネルＡおよびＢ）ならびに８７ｋＤａ（前駆体）、６９ｋＤａ、および３４ｋＤａのＨＧＦポリペプチドの位置（パネルＣ）を示す。
【図４】図４は、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞腫瘍中のＭｅｔキメラ蛋白の性質を示す。細胞を、［３５Ｓ］メチオニンおよび［３５Ｓ］システインで６時間代謝的にラベルし、細胞溶解物を、１９Ｓモノクローナル抗体で免疫沈降させた（レーン１〜４）。レーン１は、マウス・Ｎ−末端／ヒト・Ｃ−末端キメラｍｅｔでトランスフェクションした注射していないＧ４１８（ギブコ社製）−耐性細胞であり、レーン２および３は、レーン１で分析される細胞由来の腫瘍であり、レーン４は、ＮＩＨ／３Ｔ３対照細胞であり、レーン５は、抗−Ｐ−Ｔｙｒ抗体（４Ｇ１０）で分析し、ついで、ヒト・抗−Ｃ２８ペプチド抗体とともに免疫沈降したレーン１〜４と同じ細胞のウエスタンブロットである。
【図５】図５は、Ｍｅｔｍｕの細胞外ドメインがＭｅｔｈｕに形質転換能を付与すること（第２行と第３行を比較）、およびＨＧＦｈｕとともに同時トランスフェクションした場合にＭｅｔｈｕ細胞外ドメインのみが形質転換能があること（第４行と第５行を比較）を示す。さらに、最後の２行は、Ｍｅｔｈｕに形質転換能を付与する領域としてのＮｄｅＩ−ＰｖｕＩＩ部位間のｍｅｔｍｕ領域を示す（第６行と第４行を比較）。
【図６】図６は、ヒト・Ｍｅｔのダイヤグラムを示す。
【図７】図７は、ヒト・Ｍｅｔの保存されたＮｄｅＩ−ＰｖｕＩＩ部位（上側）とマウス・Ｍｅｔ配列（下側）とのコンピューターによる予測構造での比較を示す。ヒトおよびマウスのＭｅｔ（ＮｄｅＩ−ＰｖｕＩＩ部位の間）のアミノ酸配列をボックス内に示す。アミノ酸配列がより保存的でない領域が強調されている（保存性を、ヒトとマウスの配列の間の線で示す）。Ｍｅｔに形質転換能を付与するｃＤＮＡのＮｄｅＩ−ＰｖｕＩＩセグメント内のより保存性の少ないドメインは、リガンド結合に直接用いられるドメインを反映しているか、あるいは構造的な特性によってリガンド結合またはリガンド結合後の受容体の活性化のいずれかを調節しているかである。それゆえ、出願人らは、これらの配列に対応する合成ペプチドに対するポリクローナル抗体を作った。第１のドメインに対する抗体は、ヒト・配列（α１２４０）およびマウス・配列（α１２４１）に対してウサギ中で産生された。第２のドメインに対する抗体は、ヒト・配列（α１２４２）およびマウス・配列（α１２４３）に対して産生された。１２４２および１２４３のみが、ヒトおよびネズミのｃ−ｍｅｔ蛋白それぞれに対して沈降を生じた。
【図８】図８は、マウス・Ｍｅｔ配列のダイヤグラムを示す。
【図９】図９は、ヒト（Ｃ２８、１９Ｓ、１２４２）およびマウス（２６０、１２４３）の特異的抗体に対するヒトおよびマウスのＭｅｔの反応性の対比を示す（パートＡ）。パートＢは、マウス・ｍｅｔ　ｃＤＮＡをＮＩＨ／３Ｔ３細胞中にトランスフェクションした場合（該細胞はＨＧＦ／ＳＦｍｕを発現する）、該細胞は、ボイデン・チェンバー・アッセイ（Ｂｏｙｄｅｎ　ｃｈａｍｂｅｒ　ａｓｓａｙ）において侵略的であることを示す（アルビーニ（Ａｌｂｉｎｉ）ら，キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．）第４７巻：３２３９〜３２４５頁（１９８７年））。すなわち、細胞は、マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）でコーティングしたフィルターを越えて移動するのである。ｍｅｔの腫瘍形態（ｔｐｒ−ｍｅｔ）でトランスフェクションした細胞もまた、このアッセイにおいて非常に侵略的である。フィルターを越えて移動する細胞に関しては、それらは、単に運動性があるだけでなく、基礎となる膜成分を分解しうるにちがいない（よって、コラゲナーゼまたはプラスミノゲナーゼのごとき酵素を分泌する）。Ｍｅｔｈｕトランスフェクション体（第２行）は、ヒト・リガンドであるＨＧＦ／ＳＦｈｕの不存在下では侵略的てはないが、ＨＧＦ産生細胞を培養したならし培地を添加した場合は侵略的である。一方、ｍｅｔｈｕおよびＨＧＦ／ＳＦｈｕの同時トランスフェクション体（第５行）は、このアッセイにおいて侵略的である。
この図の第２欄は、上記ドメイン中のヒト・Ｍｅｔに対する１２４２抗体が、ＨＧＦ／ＳＦｈｕを含有するならし培地で同時培養されたｍｅｔｈｕトランスフェクション体のフィルター侵入を阻害することを示す。最終欄は、この阻害が、競争的なペプチドの存在下でブロックされることを示す。一方、ＭｅｔｈｕおよびＨＧＦｈｕを産生する同時トランスフェクション体の侵略能（第４行）は、１２４２抗体によってはブロックされず、このことは、内部の、同時に産生されたＨＧＦ／ＳＦリガンドによる受容体の細胞内オートクリン活性化を示唆するものである。
結局、この図は、１２４３抗体は、ｍｅｔｍｕトランスフェクション体によるフィルターの侵略をブロックしなかったことを示す（第３行、第３欄）。
【図１０】図１０は、ｍｅｔｍｕおよびｔｐｒ−ｍｅｔトランスフェクション体が、インビボにおいて腫瘍原性であり（図５）、これらの細胞もまた、いくつかの形式のアッセイにおいては転移的であること（パネルＡおよびＢ）を示すインビボでの転移データを示す。さらに、Ｍｅｔｈｕ（パネルＡ）は、ＨＧＦｈｕ　ｃＤＮＡで同時トランスフェクションされないかぎり、インビボにおいて転移的でない。
【図１１】図１１は、実施例２において記載するように、ＨＧＦ／ＳＦの生産において、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞中に同時トランスフェクションされるプラスミドｐＲＳ２およびｐＲＳ２４の構築を示すダイアグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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