(57)【要約】【課題】  サイレージ原料、特に暖地型イネ科牧草を処理して家畜による消化性を向上させたサイレージを製造するために有用なリグニン分解酵素含有サイレージ調製剤と、該調製剤の使用により家畜による消化性を向上させたサイレージの製造方法を提供する。【解決手段】  リグニン分解酵素、特に白色腐朽菌が生産するリグニン分解酵素を含有するサイレージ調製剤と、該サイレージ調製剤及び／又は白色腐朽菌でサイレージ原料、特に暖地型イネ科牧草を処理することからなる家畜による消化性を向上させたサイレージの調製方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグニン分解酵素を含有するサイレージ調製剤。
【請求項２】
前記リグニン分解酵素が白色腐朽菌が生産するリグニン分解酵素であることを特徴とする請求項１記載のサイレージ調製剤。
【請求項３】
前記リグニン分解酵素がアラゲカワラタケが生産するラッカーゼ、マンガンペルオキシダーゼ及びリグニンペルオキシダーゼからなる少なくとも１種を含有することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のサイレージ調製剤。
【請求項４】
セルラーゼを配合してなる請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のサイレージ調製剤。
【請求項５】
請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のサイレージ調製剤を用いてサイレージ原料を処理することを特徴とするサイレージの調製方法。
【請求項６】
サイレージ原料を白色腐朽菌で処理することを特徴とするサイレージの調製方法。
【請求項７】
白色腐朽菌がアラゲカワラタケであることを特徴とする請求項６記載のサイレージの調製方法。
【請求項８】
前記サイレージ原料の処理が乳酸菌との複合処理であることを特徴とする請求項５〜７のいずれか１項に記載のサイレージの調製方法。
【請求項９】
前記サイレージ原料が暖地型イネ科牧草であることを特徴とする請求項５〜８のいずれか１項に記載のサイレージの調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リグニン分解酵素を含有するサイレージ調製剤と、それを用いたサイレージの調製方法に関する。詳しくは、白色腐朽菌、特にアラゲカワラタケが生産するリグニン分解酵素を含むサイレージ調製用リグニン分解酵素剤と、このサイレージ調製用リグニン分解酵素剤又は白色腐朽菌、特にアラゲカワラタケを用いて、サイレージ原料、特に暖地型イネ科牧草を処理して乳酸菌の資化源を溶出させ、且つ家畜による消化性を向上させたサイレージを製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
牧草をサイレージとして貯蔵する場合、その貯蔵性の良否を決定する重要な要因のひとつに単少糖（単糖類及び少糖類）含量がある（非特許文献１〜３参照）。即ち、サイレージとは、牧草を収穫した後、密封して酸素を遮断し、嫌気性微生物である乳酸菌に単少糖を発酵基質として乳酸を生成させる。生成した乳酸が牧草のｐＨを低下させ、乳酸菌自身を含むすべての微生物の活動を停止させ、牧草を安定状態にすることで貯蔵を可能にするものである。したがって、牧草には乳酸菌が乳酸を生成するための一定量以上の単少糖が含まれていることが必要である。
【０００３】
近年、ロールベールサイレージ体系が普及し、ロールベール体系に適した夏作草種の選定や栽培技術の検討が行われ、ギニアグラスやスーダングラスの利用が検討されている。しかし、暖地型イネ科牧草は糖含量が低く、十分な乳酸発酵が行われないために、サイレージ品質が劣ることが大きな問題となっている（非特許文献４、５参照）。これを解決するために、牧草に糖を添加することで発酵品質を改善する試みがある（非特許文献６〜８参照）。即ち、糖蜜を添加することでサイレージの発酵品質を改善することが報告されている（非特許文献９〜１１参照）。しかし、糖蜜の添加はその取り扱いが不便なことや添加量が比較的多いために、利用は減少している。
【０００４】
そこで、近年、牧草繊維中のセルロースを活性の強いセルラーゼによって分解し、乳酸菌の資化源にする技術が開発された（非特許文献１２〜１４参照）。しかし、セルロースは反芻家畜にとって易利用性の構造性炭水化物である。したがって、それを発酵に用いることは、家畜にとっての栄養価の減少につながり、特に、もともと栄養価が高くない暖地型牧草では大きな問題である。また、キシラン分解酵素をサイレージ調製時に添加することで消化性を改善できることが報告されている（特許文献２参照）。この特許によれば、動物飼料の消化性増大に関しては、キシラン分解及びセルロース分解酵素の混合物が最適性能を有すると言われてきたが（非特許文献１５参照）、組換えＤＮＡ技術によって製造された単一成分のキシラナーゼを利用することにより、さらに消化性が改善されることが示されている。しかしながら、キシランも反芻家畜にとって易利用性の構造性炭水化物である。したがって、それを発酵に用いることは、家畜にとっての栄養価の減少につながり、特に、もともと栄養価が高くない暖地型牧草では大きな問題である。
【０００５】
一方、暖地型イネ科の植物は概してリグニン含量が高いため、反芻家畜の消化性が低いことが問題である（非特許文献１６、１７参照）。即ち、リグニン含量と乾物消化率の間には負の相関が認められている（非特許文献１８、１９参照）。これはリグニン自身が難消化性であること、及びリグニンがセルロースやヘミセルロースといった易消化性繊維の消化に対して阻害作用をもつことに起因するものである（非特許文献２０〜２２参照）。そのため、リグニンをアルカリを用いて除去するアルカリ処理が行われ、消化性の向上が認められている（非特許文献２３〜２５参照）。しかし、アルカリ処理は取り扱いが危険であるという理由により普及していない。
【特許文献１】特許第１９４５４５４号公報
【特許文献２】特許第３３０７９４７号公報
【非特許文献１】P. McDonald et al The Biochemistry of silage 2nd Edition, P19-23,1991
【非特許文献２】D.S. Fisher and J.C. Burns Agronomy Journal 1987 79, 242-248.
【非特許文献３】大山嘉信・柾木茂彦  日本畜産学会報 1988 39, 61-67
【非特許文献４】小林民憲ら  日本草地学会誌1980 26,81-88
【非特許文献５】山野大偉治ら  九大農学芸誌1987 41,9-13
【非特許文献６】D. R. Seal, Grass and Forage Science, 1986 41, 61-70
【非特許文献７】服部育男ら, 日本草地学会誌 1993 39, 326−333
【非特許文献８】Y.Ohyama et.al Jap. J. Zootech.Sci.Tech. 1973 44,59-67
【非特許文献９】J. W. Thomas, J. Anim. Sci. 1978 47, 721-735
【非特許文献１０】P.McDonald and D. Purves J.Sci.Food Agric. 1956 7,189-196
【非特許文献１１】G.W.Lanigan Aust.J. Agric.Res. 1961 12,1023-1038
【非特許文献１２】友田裕代ら, 日本草地学会誌 1996 42, 159-162
【非特許文献１３】J.L.Jacobs et.al. Grass and Forage Sci. 1992 47, 103-113
【非特許文献１４】張建国ら日本草地学会誌1997 43, 88-94
【非特許文献１５】M. Alam, I. Gomes, G. Mohiuddin, and MM. Hoq, Enzyme Microb. Technol. 1994 16 298-302
【非特許文献１６】川村  修  畜産の研究  1995  49, 905-912
【非特許文献１７】H.G.Jung et.al. J.Anim.Sci. 1986 62 1703-1712
【非特許文献１８】D.J. Minson, Nutrition Abstracts and Reviews. Series B. 1982 5, 2.591-615
【非特許文献１９】J.H. Cheney et.al. Proc.ＸＶ Int. Grassl.Sci.Cong. 1984 953-954
【非特許文献２０】川村  修  ルーメン研究会報1995 6 7-18
【非特許文献２１】H.G.Jung Agronomy J. 1989 81 33-38
【非特許文献２２】D.E.Akin Anim.Feed Sci.Technol. 1988 21 295-310
【非特許文献２３】F. McHan J. Dairy Sci. 1986 69 1837-1846
【非特許文献２４】永西ら  日本草地学会誌1995, 41 160-163
【非特許文献２５】B.G. Cottyn et.al. Anim.Feed Sci.Technol. 1988 21 287-294
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、牧草、中でも難消化性である暖地型イネ科植物の家畜による消化性を向上させたサイレージ製造法の提供を目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために、リグニン分解酵素又は白色腐朽菌により牧草、特に暖地型イネ科植物を処理するサイレージ製造法を検討した。その結果、リグニン分解酵素により処理することにより、乳酸菌の資化源を溶出させ、且つ家畜による消化性を向上させたサイレージ製造法を見出し、本発明を完成するに至った。リグニン分解酵素の添加により乳酸菌の資化源が溶出される理由は定かではないが、セルロースやヘミセルロースに結合しているリグニンが分解されることにより、セルロースやヘミセルロースがそれらを分解する菌により一部分解され易くなり、単少糖類が発生するためと推定される。本発明は、以下の各発明を包含する。
【０００８】
（１）リグニン分解酵素を含有するサイレージ調製剤。
（２）前記リグニン分解酵素が白色腐朽菌が生産するリグニン分解酵素であることを特徴とする（１）項記載のサイレージ調製剤。
【０００９】
（３）前記リグニン分解酵素がアラゲカワラタケが生産するラッカーゼ、マンガンペルオキシダーゼ及びリグニンペルオキシダーゼからなる少なくとも１種を含有することを特徴とする（１）項又は（２）項に記載のサイレージ調製剤。
（４）セルラーゼを配合してなる（１）項〜（３）項のいずれか１項に記載のサイレージ調製剤。
【００１０】
（５）前記（１）項〜（４）項のいずれか１項に記載のサイレージ調製剤を用いてサイレージ原料を処理することを特徴とするサイレージの調製方法。
（６）サイレージ原料を白色腐朽菌で処理することを特徴とするサイレージの調製方法。
（７）白色腐朽菌がアラゲカワラタケであることを特徴とする（６）項記載のサイレージの調製方法。
【００１１】
（８）前記サイレージ原料の処理が乳酸菌との複合処理であることを特徴とする前記（５）項〜（７）項のいずれか１項にサイレージの調製方法。
（９）前記サイレージ原料が暖地型イネ科牧草であることを特徴とする（５）項〜（８）項のいずれか１項に記載のサイレージの調製方法
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、リグニン含量が高いために難消化性の暖地性牧草からサイレージを製造するにあたって、消化性を向上させ、牧草の栄養価の改善を図ることができる。家畜の生産性向上に役立つものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のサイレージ調製剤は、リグニン分解酵素を含むものであり、例えば、白色腐朽菌が生産するラッカーゼ、マンガンペルオキシダーゼ及びリグニンペルオキシダーゼから選ばれる少なくとも１種を含有するものである。白色腐朽菌に属する菌としては、リグニン分解酵素の生産菌であれば特に限定されるものではないが、例えば、アラゲカワラタケを好適なものとして挙げることができる。
【００１４】
このような白色腐朽菌が生産するリグニン分解酵素は、例えば、白色腐朽菌を培養後、遠心分離等により除菌して得られた上澄み液を、更に限外濾過法により濃縮し、スプレードライ法により水分を除去すれば、粉末製剤として得ることができる（特許文献１参照）。なお、スプレードライの際、上澄み液に更に乳糖、澱粉、澱粉の部分分解物又はグルコースなどを添加することにより、プロセス収率の改善や、得られた粉末製剤の物性、例えば、溶解性や安定性の改善が期待される。
【００１５】
また、本発明のリグニン分解酵素を含有するサイレージ調製剤は、上記のようなリグニン分解酵素の粉末製剤の他、この粉末製剤を必要量水に溶解した液剤や、リグニン分解酵素製造時に粉末化することなく、限外濾過法による濃縮液より調製した液剤及び該液剤を適宜希釈した液剤であってもよい。
【００１６】
本発明のサイレージ調製方法は、前記のリグニン分解酵素を含有するサイレージ調製剤及び／又は白色腐朽菌でサイレージ原料を処理することからなる方法である。
サイレージ調製剤として、白色腐朽菌が生産するリグニン分解酵素を含有するサイレージ調製剤を使用する場合は、それぞれの白色腐朽菌に適した培地で培養した菌体を、培養液そのまま、もしくは遠心分離等により集菌して得た菌体を凍結、凍結後粉砕、凍結乾燥、水もしくは適度な栄養源を含む培地に懸濁する等の方法により、増殖能力を持つ菌体として調製し、これをサイレージ調製剤として用いることができる。
【００１７】
本発明のサイレージ調製方法において、サイレージ調製剤又は白色腐朽菌、好ましくはアラゲカワラタケをサイレージ原料に添加する時期としては、牧草や飼料作物等の場合は、刈り取りから、適当な長さに切断した原料草をサイロに詰め込み鎮圧までの作業の任意の段階で添加することができる。また、その他の材料の場合は、これをサイロに詰め込み鎮圧までの作業時に添加することができる。添加方法としては、粉剤を散布、混合しても良いし、液剤を噴霧しても良い。
【００１８】
サイレージ原料に対するサイレージ調製剤、即ち、ラッカーゼ又はリグニンペルオキシダーゼ等のリグニン分解酵素剤の添加量は、それぞれの原料新鮮物質量１ｋｇ当り、０．００１〜３０００単位（Ｕ）、好ましくは０．１〜１０単位（Ｕ）である。
【００１９】
白色腐朽菌体を添加する場合には、原料表面積１平方ｃｍ当り０．０１〜１，０００，０００個程度、特に好ましくは０．１〜１０００個のコロニーを生ずるように菌体を噴霧、あるいは滴下し、該菌株の増殖に適した条件、即ち適当な温度とｐＨに保つことが好ましい。アラゲカワラタケの場合、０℃〜４０℃、ｐＨ４〜ｐＨ８の範囲が好ましい。
【００２０】
本発明で用いるアラゲカワラタケは、国内、海外に広く分布し、これらの子実体から純粋分離して用いることが適当である。また例えば独立行政法人製品評価技術基盤機構生物資源遺伝部門（ＮＢＲＣ）からＩＦＯ４９１７として分譲されている株を用いることができる。さらに好ましくはアラゲカワラタケ由来のリグニン分解酵素高生産株を用いることが好ましい。この様な菌としてアラゲカワラタケのリグニン分解酵素高生産株ＮＴＧＩＩＩ−５５株はＦＥＲＭ Ｐ−１４０４６として、生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託されている。
【００２１】
また、本発明のサイレージ調製剤は、必要に応じて、ラクトバチルス、ストレプトコッカス、ラクトコッカス、ペディオコッカス属の乳酸菌等からなる製剤及び／又はプロピオニバクテリウム属等の酸生成菌からなる製剤と併用することができる。この場合には、相乗作用による一層の品質改善効果がある。
【００２２】
サイレージ原料としては、通常のサイレージに用いられる牧草、飼料作物、製造副産物、農業副産物、飼料等の全てが対象となる。まず、牧草としては、例えば、イネ科牧草としては、ギニアグラス、スーダングラスが好ましいが、チモシー、オーチャードグラス、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、メドウフェスク等も用いることができ、マメ科牧草としては、アルファルファ、クローバ等を用いることができる。
【００２３】
飼料作物としては、トウモロコシ、ソルガム、大麦、ライムギ、ライコムギ等を用いることができ、また、製造副産物としては廃糖蜜、酢粕、ビール粕、トウフ粕、ミカン粕、焼酎粕等を用いることができる。更に、農業副産物としては、麦藁、ビートトップ、ビートパルプ等を用いることができる。また、サイレージ原料としての飼料は、通常、発酵飼料に使用される単味飼料及び配合飼料や濃厚飼料、これら飼料と粗飼料とを混合した混合飼料等を用いることができる。
【００２４】
サイレージ原料として、牧草、飼料作物を用いる場合は、原料草を刈り取り、そのまま用いるか、或いは、刈り取った後、１〜２日間放置して部分的に乾燥させて用いる。この場合、原料草中の水分は５０〜８５％、好ましくは６０〜８０％に調整する。その後、これらの原料草は、カッターなどで数センチメートル程度ないしサイレージの方式に合わせた長さに切断してから用いることもできる。次に、製造副産物、農業副産物、原料飼料等の場合も、水分を上記の範囲に調整した後、用いることができる。
【００２５】
なお、サイレージの方式は、タワーサイロ、バンカサイロ、スタックサイロ、ロールベール方式、スチールやプラスチック容器を用いる方法など様々な方式を適用できるが、気密性の高いものが好ましい。
【００２６】
サイレージの発酵品質に大きく影響を与える因子としては、水分を挙げることができる。水分は、通常、５０〜８５％、好ましくは６０〜８０％に調整する。また、発酵温度もサイレージ品質に大きな影響を与える。発酵品質保持、排汁（ドレイン）防止の観点から、貯蔵温度は３０゜Ｃ以下、好ましくは２５゜Ｃ以下にすることが好ましい。さらに、貯蔵中の好気性菌による変敗を抑制するため、容器を密閉し、嫌気度を高めるのが基本である。サイレージ品質の安定や開封後の好気的変敗を抑制する上で、原料草を詰め込んで密封したサイレージは、通常、少なくとも２４時間以上、好ましくは４５日間以上貯蔵・熟成させることが望ましい。
【００２７】
なお、発酵品質、即ち、得られたサイレージの品質としては、ｐＨが低く、乳酸産生量は高く、酪酸産生量は少なく、揮発性塩基態窒素分の全窒素に対する比率が低い方が良いとされている。ここで、低いｐH及び乳酸産生量の増加は乳酸菌の増殖の、酪酸産生量の増加は酪酸菌の増殖の、揮発性塩基態窒素分の全窒素に対する比率の増加は蛋白質分解菌の増殖の、それぞれ指標と考えられる。
【００２８】
実施にあたっては、発酵品質としてｐＨ、有機酸組成を高速液体クロマトグラフを用いたＢＴＢポストラベル法（自給飼料品質評価研究会編  粗飼料の品質評価ガイドブック２００１ ３６−４２,ＶＢＮ（揮発性塩基態窒素）／Ｔ-Ｎ（全窒素）（ＶＢＮを微量拡散法（自給飼料品質評価研究会編  粗飼料の品質評価ガイドブック２００１ ３６−４２、全窒素をＲａｐｉｄ Ｎ法）にて測定した。家畜の消化性からみた繊維分画を有機細胞壁（Ｏｒｇａｎｉｃ ＣｅｌｌＷａｌｌ；ＯＣＷ）、細胞内容物（Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｔｅｎｔｓ；ＯＣＣ）、有機細胞壁の高消化性繊維（Ｏａ）及び低消化性繊維（Ｏｂ）をいずれも酵素分析法（自給飼料品質評価研究会編  粗飼料の品質評価ガイドブック２００１ １４−１５）により測定し、推定可消化養分総量（Ｔｏｔａｌ Ｄｉｇｅｓｔｉｂｌｅ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ；ＴＤＮ）を推定ＴＤＮ＝−５．４５＋０．８９×（ＯＣＣ＋Ｏａ）＋０．４５×ＯＣＷ（自給飼料品質評価研究会編  粗飼料の品質評価ガイドブック２００１ ７７−７９）により推定した。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例等によって限定されるものではない。
【００３０】
実施例1
ギニアグラス（ナツコマキ  開花期）をカッターで２〜３ｃｍに細切後、生草４００ｇに対して、マンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）１．５Ｕ／ＤＭｇとなるよう純水２０ｍｌに溶解して添加し、良く混合した後、約２４時間室内にて好気条件下で静置した。２４時間後、純水１０ｍｌを加えた。添加後、材料草をパウチサイロに１００ｇ詰め込み、吸引、密封した。約１５０日間処理後、発酵品質を評価した。結果は表１に示すとおりであって、ＭｎＰの単独添加はｐＨが低下し、比較例１にくらべて乳酸含量が増加する傾向があり、ＶＦＡ（揮発性有機酸）は顕著に減少した。その結果Ｖ−ｓｃｏｒｅも有意に向上した。
【００３１】
なお、「ＤＭ」は、Ｄｒｙ  Ｍａｔｔｅｒの略であり、「／ＤＭｇ」は乾物重量１ｇあたりを意味する。また、「Ｖ−ｓｃｏｒｅ」は、サイレージ品質のうち、発酵品質を表わす指標であって、ＶＢＮ／Ｔ-Ｎやプロピオン酸、酪酸などの量を勘案してスコアを決めるものであり、スコアが８０点以上が良、６０〜８０点が可、６０点未満が不良と評価する。
【００３２】
実施例２
ギニアグラス（ナツコマキ  開花期）をカッターで２〜３ｃｍに細切後、生草４００ｇに対して、マンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）の代わりにラッカーゼを１．５Ｕ／ＤＭｇとなるように酵素を混合し、実施例１と同様に処理した。結果は表１に示すとおりであって、比較例１に比べてｐＨが有意に低下し、ＶＦＡが減少傾向にありＶ−ｓｃｏｒｅが高まる傾向があった。
【００３３】
実施例３
ギニアグラスの代わりに飼料イネ（スプライス  黄熟期）を用いた他は実施例１と同様に処理した。結果は表２に示したように比較例２に比べてＯｂ含量が有意に減少し、推定ＴＤＮ含量が有意に高まった。
【００３４】
実施例４
ギニアグラスの代わりに飼料イネ（スプライス  黄熟期）を用いた他は実施例２と同様に処理した。結果は表２に示したように、比較例２に比べてＯＣＷとＯｂが減少傾向にあり、ＯＣＣとＯａが増加する傾向にあったため、推定ＴＤＮ含量は有意に高まった。
【００３５】
実施例５
ギニアグラス（ナツコマキ  開花期）をカッターで２〜３ｃｍに細切後、生草４００ｇに対して、マンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）１．５Ｕ／ＤＭｇとラッカーゼ１．５Ｕ／ＤＭｇとなるよう各酵素を混合後、純水で２０ｍｌに希釈して添加し、約２４時間室内にて好気条件下で静置した。２４時間後、乳酸菌を該ギニアグラスの新鮮物１ｇ当り１０8／ＦＭｇとなるように純水１０ｍｌに溶解して添加した。添加後、材料草をパウチサイロに１００ｇ詰め込み、吸引、密封した。１５０日間処理後、発酵品質を評価した。結果は表１に示したように、比較例１や比較例３と比べてｐＨは有意に低下し、Ｖ−ｓｃｏｒｅも高まった。
なお、「ＦＭ」は、Ｆｒｅｓｈ  Ｍａｔｔｅｒ（新鮮物即ち乾燥していない植物）の略で、「／ＦＭｇ」は新鮮物１ｇあたりを意味する。
【００３６】
実施例６
飼料イネ（スプライス  黄熟期）をカッターで２〜３ｃｍに細切後、生草４００ｇに対して、マンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）１．５Ｕ／ＤＭｇとなるよう純水で２０ｍｌに希釈して添加し、約２４時間室内にて好気条件下で静置した。２４時間後、乳酸菌を該飼料イネの乾物１ｇ当り１０8／ＦＭｇとなるように純水１０ｍｌに溶解して添加した。添加後、材料草をパウチサイロに１００ｇ詰め込み、吸引、密封した。１５０日間処理後、発行品質を評価した。結果は表２に示したように、比較例２と比べてＯＣＣが増加し、Ｏｂが減少した結果、推定ＴＤＮ含量が有意に高まった。
【００３７】
実施例７
飼料イネ（スプライス  黄熟期）をカッターで２〜３ｃｍに細切後、生草４００ｇに対して、マンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）の代わりにラッカーゼを１．５Ｕ／ＤＭｇとなるように酵素を混合し、実施例６と同様に処理した。結果は表２に示したように、比較例２と比べてＯＣＣ、Ｏａがやや増加し、Ｏｂが減少した結果、推定ＴＤＮ含量が有意に高まった。
【００３８】
実施例８
ギニアグラスの代わりに飼料イネ（スプライス  黄熟期）を用いた他は実施例５と同様に処理した。結果は表２に示したように、比較例２と比べてＯＣＣがやや増加し、Ｏａが増加、Ｏｂが減少した結果、推定ＴＤＮ含量が有意に高まった。
【００３９】
実施例９
ギニアグラス（ナツコマキ  開花期）をカッターで２〜３ｃｍに細切後、生草４００ｇに対して、マンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）１．５Ｕ／ＤＭｇとなるよう純水で２０ｍｌに希釈して添加し、約２４時間室内にて好気条件下で静置した。２４時間後、セルラーゼをＣＭＣアーゼ（カルボキシメチルセルロース分解酵素、セルラーゼの１種）として該ギニアグラスの乾物１ｇ当り０．１Ｕとなるよう、所定量を純水１０ｍｌに溶解して添加した。添加後、材料草をパウチサイロに１００ｇ詰め込み、吸引、密封した。１５０日間処理後、発酵品質を評価した。結果は表１に示したように、比較例１や比較例３と比べてｐＨが低下し、ＶＦＡ含量がやや減少した結果、Ｖ−ｓｃｏｒｅがやや高まった。
【００４０】
実施例１０
ギニアグラス（ナツコマキ  開花期）をカッターで２〜３ｃｍに細切後、生草４００ｇに対して、マンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）の代わりにラッカーゼを１．５Ｕ／ＤＭｇとなるように酵素を混合し、実施例９と同様に処理した。結果は表１に示したように、比較例１や比較例３と比べてｐＨが低下し、ＶＦＡ含量が減少傾向にあり、Ｖ−ｓｃｏｒｅがやや高まった。
【００４１】
実施例１１
ギニアグラス（ナツコマキ  開花期）をカッターで２〜３ｃｍに細切後、生草４００ｇに対して、マンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）１．５Ｕ／ＤＭｇとラッカーゼ１．５Ｕ／ＤＭｇとなるよう各酵素を混合後、純水で２０ｍｌに希釈して、添加し、実施例９と同様に処理した。結果は表１に示したように、比較例１や比較例３と比べてｐＨの低下、ＶＦＡ含量の減少が認められ、Ｖ−ｓｃｏｒｅは有意に高まった。
【００４２】
実施例１２
ギニアグラスの代わりに飼料イネ（スプライス  黄熟期）を用いた他は実施例９と同様に処理した。結果は表２に示したように、比較例２と比べてＯａが増加し、Ｏｂが減少する傾向にあり、推定ＴＤＮ含量は有意に高まった。
【００４３】
実施例１３
ギニアグラスの代わりに飼料イネ（スプライス  黄熟期）を用いた他は実施例１０と同様に処理した。結果は表２に示したように、比較例２と比べてＯＣＣがやや増加し、Ｏｂがやや減少した結果、推定ＴＤＮ含量は高まる傾向があった。
【００４４】
実施例１４
ギニアグラスの代わりに飼料イネ（スプライス  黄熟期）を用いた他は実施例１１と同様に処理した。結果は表２に示したように、比較例２と比べてＯＣＣ、Ｏａが増加する傾向にあり、Ｏｂが減少した結果、推定ＴＤＮ含量は有意に高まった。
【００４５】
比較例１
ギニアグラス（ナツコマキ  開花期）をカッターで２〜３ｃｍに細切後、生草４００ｇに対して、マンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）の代わりに純水１０ｍｌを添加し、実施例１と同様に処理した。結果は表１に示すとおりであって、ｐＨがやや高く、ＶＦＡが認められた結果、Ｖ−ｓｃｏｒｅによる判定は不良であった。
【００４６】
比較例２
ギニアグラスの代わりに飼料イネ（スプライス  黄熟期）を用いた他は比較例１と同様に処理した。結果は表２に示すとおりであって、Ｏａ含量が低く、Ｏｂ含量が高かったため、推定ＴＤＮ含量は低い値となった。
【００４７】
比較例３
ギニアグラス（ナツコマキ  開花期）をカッターで２〜３ｃｍに細切後、生草４００ｇに対して、マンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）の代わりに純水１０ｍｌを混合し、実施例５と同様に処理した。結果は表１に示すとおりであって、ｐＨ、乳酸含量（ＬＡＣＴ）およびＶＦＡ含量は比較例１とほとんど変わらなかった。
【００４８】
比較例４
ギニアグラスの代わりに飼料イネ（スプライス  黄熟期）を用いた他は比較例３と同様に処理した。結果は表２に示したとおりで、サイレージの効果によりＯＣＣ、Ｏａがやや増加し、Ｏｂがやや減少した結果、比較例２に比べて推定ＴＤＮ含量は高まった。
【００４９】
【表１】
2004173688.tif 000002
【００５０】
【表２】
2004173688.tif 000003
【００５１】
実施例１５
ギニアグラス（ナツコマキ  開花期）を歩行式ロータリモア等で刈り取った後、生草１００ｋｇに対して、マンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）１．５Ｕ／ＤＭｇ材料草となるよう純水２０００ｍｌに溶解して添加し、良く混合した後、約２４時間屋外にて静置した。２４時間後、処理草をロールベーラーにてミニロールを調製し、ミニラップマシーンにて密封した。約９０日間処理後、発酵品質を評価した。結果は表３に示すとおりであって、ＭｎＰの単独添加はｐＨが低下し、比較例５にくらべて乳酸含量が増加する傾向があり、ＶＢＮ／Ｔ-Ｎは顕著に減少した。その結果Ｖ−ｓｃｏｒｅも有意に向上した。
【００５２】
実施例１６
ギニアグラス（ナツコマキ  開花期）を歩行式ロータリモア等で刈り取った後、生草１００ｋｇに対して、マンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）の代わりにラッカーゼを１．５Ｕ／ＤＭｇ材料草となるように酵素を混合し、実施例１５と同様に処理した。結果は表３に示すとおりであって、比較例５に比べてｐＨが有意に低下し、ＶＢＮ／Ｔ-Ｎが減少傾向にありＶ−ｓｃｏｒｅが高まる傾向があった。
【００５３】
実施例１７
ギニアグラス（ナツコマキ  開花期）を歩行式ロータリモア等で刈り取った後、生草１００ｋｇに対して、白色腐朽菌アラゲカワラタケＮＴＧＩＩＩ−５５株を１０ｍｇＢＤ／ＤＭｇ材料草となるように添加し、実施例１５と同様に処理した。結果は表３に示したように、比較例５に比べてｐＨが有意に低下し、ＶＢＮ／Ｔ-Ｎが大きく低下し、その結果Ｖ−ｓｃｏｒｅは大きく向上した。
【００５４】
実施例１８
実施例１５で得られた飼料に対し、山羊を用いて消化試験を実施し、全糞採取法によりＴＤＮ（可消化養分総量）含量を測定した。その結果、表４に示すように比較例６に比べてＴＤＮにおいて有意な向上が認められた。
【００５５】
実施例１９
実施例１６で得られた飼料に対し、山羊を用いて消化試験を実施し、全糞採取法によりＴＤＮ含量を測定した。その結果、表４に示すように比較例６に比べＴＤＮにおいて有意な向上が認められた。
【００５６】
実施例２０
実施例１７で得られた飼料に対し、山羊を用いて消化試験を実施し、全糞採取法によりＴＤＮ含量を測定した。その結果、表４に示すように比較例６に比べＴＤＮにおいて有意な向上が認められた。
【００５７】
実施例２１
飼料イネ（スプライス  黄熟期）を歩行式ロータリモア等で刈り取った後、生草１００ｋｇに対して、ラッカーゼ（Ｌａｃｃａｓｅ）１．５Ｕ／ＤＭｇ材料草となるよう純水２０００ｍｌに溶解して添加し、良く混合した後、約２４時間屋外にて静置した。２４時間後、処理草をロールベーラーにてミニロールを調製し、ミニラップマシーンにて密封した。約９０日間処理後、発酵品質を評価した。結果は表５に示すとおりであって、比較例７に比べ、Ｌａｃｃａｓｅの単独添加は乾物重量（ＤＭ）において有意な向上が認められた。
【００５８】
実施例２２
飼料イネ（スプライス  黄熟期）を歩行式ロータリモア等で刈り取った後、生草100kgに対して、白色腐朽菌アラゲカワラタケＮＴＧＩＩＩ−５５株を１０ｍｇＢＤ／ＤＭｇ材料草となるよう純水２０００ｍｌに溶解して添加し、良く混合した後、約２４時間屋外にて静置した。２４時間後、処理草をロールベーラーにてミニロールを調製し、ミニラップマシーンにて密封した。約９０日間処理後、発酵品質を評価した。結果は表５に示すとおりであって、比較例７に比べ、白色腐朽菌の単独添加は乾物重量（ＤＭ）において有意な向上が認められた。
【００５９】
比較例５
ギニアグラス（ナツコマキ  開花期）を歩行式ロータリモア等で刈り取った後、生草１００ｋｇに対して、純水２０００ｍｌを添加し、良く混合した後、約２４時間屋外にて静置した。２４時間後、処理草をロールベーラーにてミニロールを調製し、ミニラップマシーンにて密封した。約９０日間処理後、発酵品質を評価した。結果は表３に示すとおりであって、ｐＨがやや高く、ＶＦＡが認められた結果、Ｖ−ｓｃｏｒｅによる判定は不良であった。
【００６０】
比較例６
比較例５で調製した飼料に対し、山羊を用いて消化試験を実施し、全糞採取法によりＴＤＮ（可消化養分総量）含量を測定した。その結果、表４に示すようにＴＤＮにおいて他の実施例と比べると高い数値を示すことはなかった。
【００６１】
比較例７
飼料イネ（スプライス  黄熟期）を歩行式ロータリモア等で刈り取った後、生草１００ｋｇに対して、純水２０００ｍｌを添加し、良く混合した後、約２４時間屋外にて静置した。２４時間後、処理草をロールベーラーにてミニロールを調製し、ミニラップマシーンにて密封した。約９０日間処理後、発酵品質を評価した。結果は表５に示すとおりであって、乾物重量の低下が認められた。
【００６２】
【表３】
2004173688.tif 000004
【００６３】
Ｃ２＋Ｃ３：酢酸＋プロピオン酸、Ｃ４〜：酪酸及びそれ以上の炭素数の揮発性脂肪酸、ＶＢＮ：揮発性塩基態窒素、Ｔ-Ｎ：全窒素
【００６４】
【表４】
2004173688.tif 000005
【００６５】
CF:粗繊維、NDF:中性デタージェント繊維、ADF:酸性デタージェント繊維、OCW:総繊維、Ob:低消化性繊維、TDN:可消化養分総量
【００６６】
【表５】
2004173688.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明のリグニン分解酵素によるサイレージ調製方法は、糖含有量の低い暖地型イネ科牧草から、その易利用性の構造性炭水化物であるセルロースの損失を伴うことなく、家畜による消化性が向上されたサイレージ調製に有効に利用される。