(57)【要約】【課題】悪性腫瘍抑制効果の優れ、かつ人体への毒性のない成分を用いた悪性腫瘍抑制剤を提供する。【解決手段】柑橘類の低極性溶剤可溶成分をリポソーム、特にリン脂質と低ＨＬＢの非イオン性界面活性剤とからなる混合物から製造されたハイブリッド型リポソームで分散させてなる悪性腫瘍抑制剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
柑橘類の低極性溶剤可溶成分をリポソームで分散させてなる悪性腫瘍抑制剤。
【請求項２】
リポソームが、リン脂質と低ＨＬＢの非イオン性界面活性剤とからなる混合物から製造されたハイブリッド型リポソームであることを特徴とする請求項１記載の悪性腫瘍抑制剤。
【請求項３】
リン脂質が高級脂肪酸ホスファチジルコリンであることを特徴とする請求項１〜２記載の悪性腫瘍抑制剤。
【請求項４】
高級脂肪酸ホスファチジルコリンがジミリストイルホスファチジルコリンであることを特徴とする請求項３記載の悪性腫瘍抑制剤。
【請求項５】
非イオン性界面活性剤が低ＨＬＢの非イオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項１〜４記載の悪性腫瘍抑制剤。
【請求項６】
低ＨＬＢの非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートであることを特徴とする請求項５記載の悪性腫瘍抑制剤。
【請求項７】
柑橘類が夏みかんであることを特徴とする請求項１〜６記載の悪性腫瘍抑制剤。
【請求項８】
低極性溶剤が石油エーテル、ジエチルエーテル、クロロホルムのうちから選ばれる１種以上の溶剤であることを特徴とする請求項１〜７記載の悪性腫瘍抑制剤。
【請求項９】
柑橘類の低極性溶剤可溶成分がオーラプテンであることを特徴とする請求項１〜８記載の悪性腫瘍抑制剤。
【請求項１０】
悪性腫瘍がヒト肺腺癌であることを特徴とする請求項１〜９記載の悪性腫瘍抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【発明が属する分野】
本発明は、悪性腫瘍抑制剤に関する。本発明は特に柑橘類から得られる悪性腫瘍抑制剤に関する。
【０００１】
【従来の技術】
夏みかんをはじめとする柑橘類の加工食品製造工程からは果皮を中心とした大量の産業廃棄物（バイオマス）が排出されるため、その処理が問題となっている。
【０００２】
柑橘類の果皮は、古くから漢方薬の原料として使用されているが、近年、温州みかんに多く含まれるカロテノイドのβ−クリプトキサンチン、夏ミカン、ハッサク、グレープフルーツに含まれるクマリン系化合物、オーラプテンが悪性腫瘍抑制効果のあることが動物実験等で明らかになり注目されている。
【０００３】
しかし、これらの柑橘類に由来する有効成分の多くは脂溶性であり、水への分散が困難であるため、医療工学的応用には不向きであった。
【０００４】
オーラプテンに関する特許出願としては、例えば特開２０００−３７１４５号にはカラタチを花粉親として高オーラプテン含有柑橘類を栽培する方法が、特開平１１−２９５６５号にはオーラプテンの精製方法が記載されているのみであり、水への分散性改良方法に関する提案は皆無である。
【０００５】
【本発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、悪性腫瘍抑制効果の優れた悪性腫瘍抑制剤を提供することを目的とする。本発明の他の目的は、果皮中の悪性腫瘍抑制成分の体内への吸収を促進し、悪性腫瘍抑制効果を有効に働かせてなる悪性腫瘍抑制剤を提供することを目的とする。本発明の更に他の目的は、果皮中の悪性腫瘍抑制成分の水への分散剤として人体への毒性の少ない成分を用いた悪性腫瘍抑制剤を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
すなわち本発明は、柑橘類の低極性溶剤可溶成分をリポソームで分散させてなる悪性腫瘍抑制剤である。
【０００７】
リポソームは、リン脂質と低ＨＬＢの非イオン性界面活性剤とからなる混合物から製造されたハイブリッド型リポソームであることが好ましい。
【０００８】
リン脂質は高級脂肪酸ホスファチジルコリンであることが好ましい。
【０００９】
高級脂肪酸ホスファチジルコリンはジミリストイルホスファチジルコリンであることが好ましい。
【００１０】
非イオン性界面活性剤は低ＨＬＢの非イオン性界面活性剤であることが好ましい。
【００１１】
低ＨＬＢの非イオン性界面活性剤はポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートであることが好ましい。
【００１２】
柑橘類は夏みかんであることが好ましい。
【００１３】
低極性溶剤は石油エーテル、ジエチルエーテル、クロロホルムのうちから選ばれる１種以上の溶剤であることが好ましい。
【００１４】
柑橘類の低極性溶剤可溶成分はオーラプテンであることが好ましい。
【００１５】
本発明の悪性腫瘍抑制剤は、ヒト肺腺癌の抑制に特に効果がある。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明につき詳しく説明する。本発明の悪性腫瘍抑制剤は、柑橘類を原料とする。
【００１７】
本発明における柑橘類とは、公知のように夏みかん、イヨカン、温州みかん、はっさく、夏ダイダイ、ネーブル、柚子、かぼす、グレープフルーツ、すだち、レモン、ポンカン等のミカン科植物の果実（果皮を含む）をいう。本発明ではこれらの柑橘類の中では夏みかんが悪性腫瘍抑制剤成分を多く含んでいるため、好ましい。
【００１８】
本発明においては、バイオマスの有効利用の観点から柑橘類の果皮を原料とすることが好ましい。柑橘類の果皮は好ましくは有効成分を取り出しやすいように粉砕して用いる。
【００１９】
柑橘類の果皮から有効成分を取り出すには、好ましくは果皮の粉砕物を圧搾または溶剤で抽出する。抽出は公知のごとく、溶剤と粉砕物とを容器に入れ、攪拌下にまたは攪拌せずに、好ましくは溶剤の沸点付近の温度で放置することにより溶剤中に有効成分が溶け出す。
【００２０】
本発明で用いる溶剤としては、低極性の溶剤であることが好まく、低極性の溶剤で抽出される成分中に悪性腫瘍抑制剤として有効な成分が多く含まれている。
【００２１】
本発明でいう低極性溶剤とは、例えば、クロロホルム、ジエチルエーテル、石油エーテル等の溶剤をいう。これらの中では、クロロホルムが好ましい。これらの低極性溶剤は混合して、あるいは順次抽出する溶剤として使用することが出来る。
【００２２】
柑橘類に含有されるオーラプテン、エポキシオーラプテン、ウンベリフェロン、イソインペラトリン、［（３，７−ジメチル−６−エポキシ−２−オクチニル）オキシ］プソラレン）等のクマリンが悪性腫瘍抑制効果を持っていることは知られている。柑橘類の果皮から低極性溶剤で抽出した成分は悪性腫瘍抑制効果を持っていることからこの低極性溶剤抽出分中にはこれらのクマリンが含まれていると考えられる。
【００２３】
この有効成分が溶解した溶液から溶剤を溶剤置換法、あるいは、溶剤蒸発法、減圧乾燥法等の公知の各種の方法により除去する。
【００２４】
上記方法で得た柑橘類の低極性溶剤可溶成分は脂溶性で、難水溶性であるので、そのままでは生体内に取り込まれ難く、悪性腫瘍抑制剤としての効果を発揮しにくい。本発明では、柑橘類の低極性溶剤可溶成分を水に分散しうるように、リポソームを用いる。
【００２５】
リポソームとは、リン脂質やグリセロ糖脂質を少なくとも５０％以上の水に、ゲル液晶転位温度以上の温度で懸濁することにより形成される脂質二重層からなる閉鎖小胞である。この小胞は超音波処理することにより１枚膜の小胞とすることができる。
【００２６】
本発明では、リポソームはリン脂質と非イオン性界面活性剤との混合物から形成されてなるハイブリッド型リポソームであることが好ましい。
【００２７】
本発明でいうリン脂質とは、グリセリンエステルにおいて、グリセリンとエステルを形成する酸のうちの２つが、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸等の飽和高級脂肪酸、またはリノール酸、リノレイン酸、オレイン酸、アラキドン酸等の不飽和高級脂肪酸であり残りの１つがリン酸を介してコリン、エタノールアミン、セリン、イノシトール等のアルコールが結合されている化合物で、具体的にはホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン等をいう。これらの中ではジミリストイルホスファチジルコリンが最も分散性能が優れているため好ましい。
【００２８】
本発明では、好ましくはリポソームを形成する材料としてリン脂質とともに非イオン性界面活性剤を用いる。
【００２９】
非イオン性界面活性剤としては、公知の非イオン性界面活性剤、例えば高級脂肪酸高級アルコールエステル、ソルビタン高級脂肪酸部分エステル、グリセリン高級脂肪酸部分エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等を挙げることができる。これらの中では、ソルビタン高級脂肪酸部分エステル、なかでもポリオキシソルビタンジラウレート（ＴＷＥＥＮ２０）が好ましい。このＴＷＥＥＮ２０はポリオキシエチレンの重合度が低いためＨＬＢが低く、Ｗ／Ｏを形成する界面活性剤として知られている。
【００３０】
リポソームにおける（Ａ）リン脂質と（Ｂ）非イオン性界面活性剤との割合は、通常は（Ａ）が９９〜５０重量％：（Ｂ）が１〜５０重量％、好ましくは（Ａ）が９８〜７０重量％：（Ｂ）が２〜３０重量％、特に好ましくは（Ａ）が９５〜８０重量％：（Ｂ）が５〜２０重量％の範囲であることが望ましい。
【００３１】
（Ａ）リン脂質と（Ｂ）非イオン性界面活性剤との混合物からハイブリッド型リポソームを製造するには、（Ａ）リン脂質と（Ｂ）非イオン性界面活性剤を高速ミキサー等で撹拌混合後、超音波により分散処理することにより製造することができる。
【００３２】
柑橘類の低極性溶剤可溶成分をハイブリッド型リポソームで水分散させる方法としては、（Ａ）リン脂質湯、（Ｂ）非イオン性界面活性剤および（Ｃ）低極性溶剤可溶成分を高速ミキサー等で攪拌混合後、超音波により分散処理することにより製造する方法等を採用することが出来る。
【００３３】
（Ａ）柑橘類の低極性溶剤可溶成分と（Ｂ）ハイブリッド型リポソームとの配合量は、（Ａ）柑橘類の低極性溶剤可溶成分が、９９〜５０重量％：（Ｂ）が１〜５０重量％、好ましくは（Ａ）が９８〜７０重量％：（Ｂ）が２〜３０重量％、特に好ましくは（Ａ）が９５〜８０重量％：（Ｂ）が５〜２０重量％の範囲であることが望ましい。
【００３４】
以上のようにして製造された（Ａ）柑橘類の低極性溶剤可溶成分の（Ｂ）ハイブリッド型リポソーム分散体は、後述の実施例で示すように悪性腫瘍抑制剤としての効果を示す。
【００３５】
【本発明の効果】
本発明は上記のように（Ａ）柑橘類の低極性溶剤可溶成分の分散剤として（Ｂ）ハイブリッド型リポソームを用いたため、従来の柑橘類から得られる悪性腫瘍抑制剤としての働きと、ハイブリッド型リポソーム自体が有する悪性腫瘍抑制剤としての働きとが相乗効果として働く。また、ハイブリッド型リポソームにより（Ａ）柑橘類の低極性溶剤可溶成分が細かく分散されるため、体内への吸収が促進され、有効に働くことが出来る。本発明の悪性腫瘍抑制剤は特にＢ１６−メラノーマ細胞の増殖抑制に効果がある。本発明の悪性腫瘍抑制剤は（Ａ）柑橘類の低極性溶剤可溶成分と、（Ｂ）ハイブリッド型リポソームという殆どが天然物から抽出されたものであるため、人体への毒性のなく副作用が少ないという利点がある。
【００３６】
【実施例】
次ぎに実施例を挙げて本発明につき更に詳しく説明するが、本発明はその要旨を超えない限りこれらの実施例になんら限定されるものではない。
【００３７】
なお、実施例における試料の測定は次ぎの方法で行うことにした。
（ＩＲ吸収スペクトルの測定）
赤外分光光度計（日本分光（株）ＦＴ／ＩＲ−７０００型）を用いてＫＢｒ法により測定した。
（高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））
カラムとしてｍｉｇｈｔｙ　ｓｉｌ　ＲＰ−１８（４．６ｘ２５０ｍｍ）を用いた。移動相はメタノール／水＝８５／１５、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで行った。
【００３８】
（動的光散乱法）
サブミクロンサイザー（ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ　ＢＩ−９０）を用いた。光源としてＨｅ−Ｎｅレーザーの６３２．８ｎｍの発振線を出力３５ｍＷで行い、散乱角９０°で測定し、得られた拡散係数（Ｄ）からＳｔｏｋｅｓ−Ｅｉｎｓｔｅｉｎの式（１）に従い、膜の直径を求めた。
ｄｈｙ＝κＴ／３πηＤ　　　　　　　　　（１）
（但し、κはＢｏｌｔｚｍａｎｎ定数、Ｔは絶対温度、ηは溶剤の粘度）
【００３９】
【実施例１】
《試料及び試薬》
熊本県産の夏ミカン（甘夏柑）を洗浄し、採取した果皮を凍結乾燥した後、ミキサーで粉末化したものを抽出用試料とした。石油エーテル、ジエチルエーテル、クロロホルム、アセトン及びエタノールは、市販品（ナカライテスク（株）製）の特級試薬を使用した。また、オーラプテンは水俣環境技術センター（株）において合成されたものを使用した。さらにリン脂質Ｌ−α−ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ，日本油脂（株）製）と非イオン性界面活性剤ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０、ナカライテスク（株）製）をそのまま用いた。
【００４０】
《夏ミカン果皮成分の溶剤抽出》
夏ミカン果皮試料からの成分の抽出は、図１のスキームに従い、ソックスレー抽出器を用いて、▲１▼石油エーテル、▲２▼ジエチルエーテル、▲３▼クロロホルムで段階的に抽出し、次ぎに▲４▼アセトン、▲５▼エタノール、▲６▼水の順に温浸抽出を行った。
【００４１】
また、この一連の抽出操作と別にクロロホルムのみを用いて抽出を行った。得られた抽出液を減圧乾燥し、抽出溶剤の留去をガスクロマトグラフィーで確認した。各抽出工程でえられた抽出物の性状と収量を表１に示す。
【００４２】
【表１】
2004131432.tif 000002
【００４３】
乾燥試料からの抽出物総量は約３３％であった。全体的に極性の低い溶剤による抽出物１〜３は少なく、高極性の溶剤による抽出物４〜６が多く得られた。
【００４４】
《溶剤抽出成分の同定》
上記各工程で得られた抽出物とオーラプテンの赤外線吸収スペクトルの測定結果を図２、図３に示す。
【００４５】
低極性溶剤抽出物１〜３および７の赤外線吸収スペクトルについて見ると、２９００ｃｍ−１付近にＣ−Ｈの伸縮振動、１７５０ｃｍ−１および１６４０ｃｍ−１付近にＣ＝Ｏの伸縮振動、１４５０ｃｍ−１付近にＣ−Ｈの変角振動のピークが認められた。また、抽出物２と３では、３４００ｃｍ−１付近にＯ−Ｈの伸縮振動および１０７７ｃｍ−１付近にＣ−Ｏ−Ｃの伸縮振動のピークが観察されており、低極性溶剤抽出物の成分として高級脂肪酸化合物、カロテノイド、フラボノイドの存在が示唆された。
【００４６】
一方、高極性溶剤抽出物４〜６の赤外線吸収スペクトルの特徴として、３４００ｃｍ−１付近にＯ−Ｈあるいは、Ｎ−Ｈの伸縮振動、１６３８ｃｍ−１付近にＣ＝Ｏの伸縮振動、１０８０ｃｍ−１付近にＣ−Ｏ−Ｃの伸縮振動がみられ、高極性溶剤抽出物中には多糖類やアミノ酸が含まれていることが示唆される。
【００４７】
オーラプテンの赤外線吸光スペクトルの特性としては、図３に示したように２９００ｃｍ−１にＣ−Ｈの伸縮振動、１７３１ｃｍ−１にＣ＝Ｏの伸縮振動、１６１３ｃｍ−１に環状δラクトンのＣ＝Ｃの伸縮振動、１１２９ｃｍ−１にＣ−Ｏ−Ｃの伸縮振動が観察される。このスペクトルに類似のパターンは、低極性溶剤抽出物、特に抽出物１と７に見られた。
【００４８】
《抽出物中のオーラプテン含有量の測定》
上記各抽出物をアセトン／メタノール＝５０／５０の混合溶液に溶解し、不純物を濾別したのち、濾液を減圧乾燥したのち、メタノール／水＝８５／１５に溶解し、高速クロマトグラフィーにより抽出物中のオーラプテン含有量を測定した。なお注入量２０μｇ、オーラプテンの量の測定は、ＵＶ３２５ｎｍで行った。結果を表２に示す。
【００４９】
【表２】
2004131432.tif 000003
【００５０】
段階抽出では抽出物１中に２６．６ｍｇ／ｇと最も多く含まれ、以下抽出物２、抽出物３、抽出物４の順に含有量が減少した。クロロホルムで直接抽出した抽出物７は４１．１ｍｇ／ｇのオーラプテンを含んでいた。これは、夏みかんの果皮１ｋｇからおよそ０．１１ｇのオーラプテンが得られることになる。
【００５１】
《抽出物含有ハイブリッド型リポソームの調整》
抽出物含有ハイブリッド型リポソームは、リン酸緩衝水溶液（−ＰＢＳ）中でＤＭＰＣとＴｗｅｅｎ２０および抽出物を９０Ｗで超音波照射（超音波発振装置：やまとＢＲＡＮＳＯＮＩＣ　ＭＯＤＥＬ　Ｂ２２１０）して調製し、孔径０．４５μｍのフイルターで濾過したものを実験に用いた。
【００５２】
《がん細胞増殖抑制試験》
（１）　使用がん細胞
臓器由来の異なるがん細胞として、マウス由来悪性黒色腫（Ｂ１６−メラノーマ）細胞、ヒト肺腺がん（ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＯＫ）細胞、ヒト胃がん（ＧＴ３ＴＫＢ）細胞およびヒト肝臓がん（Ｈｅｐ−Ｇ２）細胞の４種類の培養がん細胞を用いた。
【００５３】
（２）　増殖抑制試験（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）
酵素活性測定法の一つであるＷＳＴ−１法により行った。すなわち、初期細胞数を約１．０ｘ１０４ｃｅｌｌ／ｍｌに調製したがん細胞懸濁液１００μｌ／ｗｅｌｌを滅菌済み９６ｗｅｌｌマルチプレートに分注し、２４時間プレインキュベーション後、試験溶液１０μｌ／ｗｅｌｌを添加し、さらに３時間培養後、分光光度計を用いて４５０ｎｍの吸光度（ＡＭ）を測定した。コントロール（試験溶液無添加）の場合の吸光度（ＡＣ）を求め、吸光度比（ＡＭ／ＡＣ）を算出し、増殖抑制効果を評価した。
【００５４】
各溶剤での抽出物含有ハイブリッド型リポソームの増殖抑制効果の評価結果を図４にＥｘｔｒａｃｔ１、２、３、７として示す。
【００５５】
がん細胞増殖抑制効果が認められた。特にマウス由来悪性黒色腫（Ｂ１６−メラノーマ）細胞に対しては、８０％以上の高い増殖抑制効果が得られた。
【００５６】
【比較例１】
実施例１において、低極性溶剤抽出物含有ハイブリッド型リポソームの代わりに低極性溶剤抽出物のみを用いる以外は実施例１と同様にして、がん細胞増殖抑制試験を行った。
【００５７】
低極性溶剤での抽出物の増殖抑制効果の評価結果を図５に、Ｅｘｔｒａｃｔ１、２、３、７として示す。
【００５８】
【比較例２】
実施例１において、低極性溶剤抽出物含有ハイブリッド型リポソームの代わりに高極性溶剤抽出物含有ハイブリッド型リポソーム抽出物を用いる以外は実施例１と同様にして、がん細胞増殖抑制試験を行った。結果を図５にＥｘｔｒａｃｔ４、５、６として示す。がん細胞に対する増殖抑制効果は低いものであった。
【００５９】
【比較例３】
実施例１において、低極性溶剤抽出物含有ハイブリッド型リポソームの代わりに高極性溶剤抽出物を用いる以外は実施例１と同様にして、がん細胞増殖抑制試験を行った。結果を図４にＥｘｔｒａｃｔ４、５、６として示す。がん細胞に対する増殖抑制効果は殆ど認められなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は本発明の実施例において、夏みかんの果皮から有用成分を溶剤で抽出した際の手順を示した工程図である。
【図２】図２はＥｘｔｒａｃｔ１〜６の赤外線吸光分析結果を示したチャートである。
【図３】図３はＥｘｔｒａｃｔ７とブランクであるオーラプテンそのものの赤外線吸光分析結果を示したチャートである。
【図４】図４はがん細胞増殖抑制試験を行った結果を示したグラフである。
【図５】図５はがん細胞増殖抑制試験を行った結果を示したグラフである。
【図１】
2004131432.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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