(57)【要約】【課題】マルトースやガラクトースなどに対する反応性が低い改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を提供する。【解決手段】対応する野生型酵素のアミノ酸配列を基準として、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）由来のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素における第３２６番アミノ酸〜第３５４番アミノ酸からなる第１領域に相当する領域、及び第２７８番アミノ酸〜第３２０番アミノ酸からなる第２領域に相当する領域においてそれぞれ一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されてなるアミノ酸配列を有する、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対応する野生型酵素のアミノ酸配列を基準として、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）由来のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素における第３２６番アミノ酸〜第３５４番アミノ酸からなる第１領域に相当する領域において一つ以上のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列を有する、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
【請求項２】
前記第１領域に相当する領域において二つ以上のアミノ酸が置換されている、請求項１に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
【請求項３】
前記第１領域内の第３４２番アミノ酸及び第３５１番アミノ酸に相当するアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されている、請求項１に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
【請求項４】
アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）由来のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素における第２７８番アミノ酸〜第３２０番アミノ酸からなる第２領域に相当する領域において一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、請求項１〜３のいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
【請求項５】
前記第２領域内の第２９５番アミノ酸に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、請求項４に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
【請求項６】
アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）由来のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素における第１６２番アミノ酸〜第１９７番アミノ酸からなる第３領域に相当する領域において一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、請求項１〜５のいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
【請求項７】
アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）由来のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素における第７５番アミノ酸、第１６８番アミノ酸、及び第３４７番アミノ酸にそれぞれ相当するアミノ酸からなるグループより選択される一以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、請求項１〜６のいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
【請求項８】
アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）由来である、請求項１〜７のいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
【請求項９】
配列番号１のアミノ酸配列において、第３２６番アミノ酸〜第３５４番アミノ酸からなる第１領域において一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されてなるアミノ酸配列を有する、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
【請求項１０】
前記第１領域において二つ以上のアミノ酸が置換されている、請求項９に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
【請求項１１】
前記第１領域内の第３４２番アミノ酸及び第３５１番アミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されている、請求項９に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
【請求項１２】
配列番号１のアミノ酸配列の第２７８番アミノ酸〜第３２０番アミノ酸からなる第２領域において一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、請求項９〜１１のいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
【請求項１３】
前記第２領域内の第２９５番アミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、請求項１２に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
【請求項１４】
配列番号１のアミノ酸配列の第１６２番アミノ酸〜第１９７番アミノ酸からなる第３領域において一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、請求項９〜１３のいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
【請求項１５】
配列番号１のアミノ酸配列の第７５番アミノ酸、第１６８番アミノ酸、及び第３４７番アミノ酸からなるグループより選択される一以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、請求項９〜１４のいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
【請求項１６】
グルコースに対する反応性を基準として、マルトースに対する反応性が４０％以下、ガラクトースに対する反応性が１０％以下である、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかの改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１７に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項１９】
請求項１７に記載のポリヌクレオチドを保有する形質転換体。
【請求項２０】
請求項１９に記載の形質転換体を、前記ポリヌクレオチドが発現可能な状態で培養する工程、及び
前記ポリヌクレオチドの発現産物を分離する工程、を含む改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項２１】
請求項１〜１６のいずれかの改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を含んでなるグルコース測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明はピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素に関する。詳しくは、野生型の酵素と比較して特定の領域のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素に関する。本発明の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素は、例えば臨床検査などにおけるグルコース量の測定に利用される。
【０００２】
【従来の技術】
ピロロキノリンキノン依存性β−Ｄグルコース脱水素酵素（ＥＣ１．１．１９９、ＰＱＱＧＤＨ）は補酵素ピロロキノリン（ＰＱＱ）と共役してβ−Ｄグルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒する。この性質を利用してＰＱＱＧＤＨは臨床検査や食品分析、培養プロセスのモニタリング等におけるグルコースの定量に利用されている。
過去に報告されたＰＱＱＧＤＨとしては、アシネトバクター・スピーシーズ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）Ｌ．Ｍ．Ｄ  ７９．４１株が産生するＰＱＱＧＤＨ及びその改変型ＰＱＱＧＤＨが知られている（例えば、特許文献１〜５、非特許文献１参照。）このＬ．Ｍ．Ｄ  ７９．４１株が産生するＰＱＱＧＤＨの基質特異性は低く、例えばグルコースに対する反応性の約９０％に相当する反応性をマルトースに対しても有するものであった。
【０００３】
【特許文献１】
特開２０００−３１２５８８号公報
【特許文献２】
特開２０００−３５０５８８号公報
【特許文献３】
特開２００１−１９７８８８号公報
【特許文献４】
特開２００１−３４６５８７号公報
【特許文献５】
ＷＯ  ０２／３４９１９  Ａ１公報
【非特許文献１】
Ａ−Ｍ  Ｃｌｅｔｏｎ−ＪａｎｓｅｎらＭｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２１７，  ４３０（１９８９）
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
正確なグルコース量を測定するためにＰＱＱＧＤＨには高い基質特異性が要求される。例えば輸血による点滴を受けている患者を対象とした糖尿病の診断を行う場合などにおいて基質特異性の低いＰＱＱＧＤＨが用いられれば、測定値として得られるものはグルコース量のほかに輸液中のマルトース量を測り込んだものであり正確な血中グルコース量が求められない。同様に例えば肝機能障害のある患者を対象とした測定を行う場合においてはガラクトースの影響を受けて信頼性の高い測定が行えないおそれがある。このように基質特異性の低いＰＱＱＧＤＨではマルトースなどの他の糖質の影響を大きく受け、正確なグルコース量を測定できない。
【０００５】
過去に報告された上記改変型ＰＱＱＧＤＨでは野生型ＰＱＱＧＤＨの一部のアミノ酸を置換することによって基質特異性の改善が行われている。しかしながら、依然としてマルトースやガラクトースに対する反応性がかなり残存しており、より正確なグルコース量の測定を可能とすべく更なる基質特異性の向上が望まれている。特に、ガラクトースに対する反応性が十分に低いＰＱＱＧＤＨは未だ見出されておらず、その提供が切望されている。
本発明は以上の背景の下、グルコースに対する基質特異性の高い改変型ＰＱＱＧＤＨを提供することを目的とする。特に、マルトースに対する反応性の低さに加えてガラクトースに対する反応性が極めて低い改変型ＰＱＱＧＤＨを提供することを目的とする。併せて、このような改変型ＰＱＱＧＤＨの作製に利用することができるポリヌクレオチド、発現ベクター、及び形質転換体、更にはこれらを利用した改変型ＰＱＱＧＤＨの作製方法、グルコース測定キットを提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記目的を達成するためにアシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）が産生するＰＱＱＧＤＨにおいて特定の領域のアミノ酸の置換と基質特異性の変化との関係を詳細に検討した。その結果、基質特異性に深く関与する複数の領域を見出すことに成功した。即ち、後述の実施例で示されるように本発明者らはアシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）の野生型ＰＱＱＧＤＨにおいて３５１番目のアミノ酸が置換されることによってマルトース及びガラクトースに対する反応性が顕著に低下することを見出した。また３４２番目のアミノ酸も同様に基質特異性に深く関与していることを見出した。ここで、これらのアミノ酸は第３２６番アミノ酸残基〜第３５４番アミノ酸残基からなる二次構造内に位置することから、当該構造部分の改変によってグルコースに対する基質特異性を効果的に改善できると考えられた。
また、２７８番アミノ酸残基〜３２０アミノ酸残基からなる二次構造内に位置する第２９５番アミノ酸残基も同様にマルトース及びガラクトースに対する反応性に大きく関与することが示され、このことから当該構造部分の改変もグルコースに対する基質特異性の改善に極めて有効であると考えられた。同様に、１６９番アミノ酸残基の置換によって基質特異性の向上が見られたことから、これが位置する１６２番アミノ酸残基〜１９７番アミノ酸残基からなる２次構造部分の改変も基質特異性の改善に有効であると考えられた。
さらに、その他のいくつかのアミノ酸残基が基質特異性に関与することが示唆された。
ここで、同一の機能を有するタンパク質は一般にその活性部位や基質特異性に関与する領域の構造が類似していることが多い。従って、アシネトバクター・カルコアセティカス由来のＰＱＱＧＤＨにおける特定のアミノ酸の置換と基質特異性の関係に関して得られた上記情報は他の微生物由来のＰＱＱＧＤＨについても適用できると予想された。
本発明は以上の知見に基づき完成されたものであって、以下の構成を提供する。
［１］  対応する野生型酵素のアミノ酸配列を基準として、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）由来のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素における第３２６番アミノ酸〜第３５４番アミノ酸からなる第１領域に相当する領域において一つ以上のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列を有する、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
［２］  前記第１領域に相当する領域において二つ以上のアミノ酸が置換されている、［１］に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
［３］  前記第１領域内の第３４２番アミノ酸及び第３５１番アミノ酸に相当するアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されている、［１］に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
［４］  アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）由来のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素における第２７８番アミノ酸〜第３２０番アミノ酸からなる第２領域に相当する領域において一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、［１］〜［３］のいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
［５］  前記第２領域内の第２９５番アミノ酸に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、［４］に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
［６］  アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）由来のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素における第１６２番アミノ酸〜第１９７番アミノ酸からなる第３領域に相当する領域において一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、［１］〜［５］のいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
［７］  アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）由来のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素における第７５番アミノ酸、第１６８番アミノ酸、及び第３４７番アミノ酸にそれぞれ相当するアミノ酸からなるグループより選択される一以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、［１］〜［６］のいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
［８］  アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）由来である、［１］〜［７］のいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
［９］  配列番号１のアミノ酸配列において、第３２６番アミノ酸〜第３５４番アミノ酸からなる第１領域において一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されてなるアミノ酸配列を有する、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
［１０］  前記第１領域において二つ以上のアミノ酸が置換されている、［９］に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
［１１］  前記第１領域内の第３４２番アミノ酸及び第３５１番アミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されている、［９］に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
［１２］  配列番号１のアミノ酸配列の第２７８番アミノ酸〜第３２０番アミノ酸からなる第２領域において一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、［９］〜［１１］のいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
［１３］  前記第２領域内の第２９５番アミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、［１２］に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
［１４］  配列番号１のアミノ酸配列の第１６２番アミノ酸〜第１９７番アミノ酸からなる第３領域において一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、［９］〜［１３］のいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
［１５］  配列番号１のアミノ酸配列の第７５番アミノ酸、第１６８番アミノ酸、及び第３４７番アミノ酸からなるグループより選択される一以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、［９］〜［１４］のいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
［１６］  グルコースに対する反応性を基準として、マルトースに対する反応性が４０％以下、ガラクトースに対する反応性が１０％以下である、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
［１７］  ［１］〜［１６］のいずれかの改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
［１８］  ［１７］に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
［１９］  ［１７］に記載のポリヌクレオチドを保有する形質転換体。
［２０］  ［１９］に記載の形質転換体を、前記ポリヌクレオチドが発現可能な状態で培養する工程、及び
前記ポリヌクレオチドの発現産物を分離する工程、を含む改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素の製造方法。
［２１］  ［１］〜［１６］のいずれかの改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を含んでなるグルコース測定用キット。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明では、対応する野生型酵素と比較して特定の領域のアミノ酸配列が置換されている改変型のＰＱＱＧＤＨが提供される。本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは典型的には、天然に存在するＰＱＱＧＤＨ、即ち野生型のＰＱＱＧＤＨにおいて一部のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することによって作製或いは設計される。このように本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨの基礎となる（由来する）野生型のＰＱＱＧＤＨのことを本明細書では「対応する野生型の酵素」と表現する。本発明における野生型酵素としては、アシネトバクター・カルコアセティカス、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、アセトバクター・アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ）等の酸化細菌やアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリヒア・コリ、クレブシーラ・エーロジーンズ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等が産生するＰＱＱＧＤＨを例示することができる。
【０００８】
本明細書においてアミノ酸残基または領域について使用する場合における「相当する」とは、比較されるタンパク質（酵素）間において、構造に起因する機能が同等であることを意味し、特にマルトースやガラクトースなど、グルコース以外の糖質に対する反応性についての機能が同等であることを意味する。例えばアシネトバクター・カルコアセティカス以外の微生物に由来するＰＱＱＧＤＨにおいて、一次構造を比較し、且つ二次構造の相同性を考慮した上でアシネトバクター・カルコアセティカス由来のＰＱＱＧＤＨのある二次構造領域と同じ機能を有していると合理的に考えられる領域は「アシネトバクター・カルコアセティカス由来のＰＱＱＧＤＨの当該二次構造領域に相当する」と言うことができる。
本明細書においてアミノ酸の位置はＮ末端のアスパラギン酸を１としてＮ末端側からＣ末端側に向かって順番に番号付けを行った場合の番号によって特定される。
【０００９】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨでは対応する野生型酵素のアミノ酸配列を基準として、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）由来のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素（以下、「Ａ．Ｃ．ＰＱＱＧＤＨ」という）における第３２６番アミノ酸〜第３５４番アミノ酸からなる第１領域に相当する領域において一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている。本明細書におけるＡ．Ｃ．ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列は配列番号１によって特定される配列である。この配列は後述の実施例で示されるようにアシネトバクター・カルコアセティカスＩＦＯ  １２５５２株が産生するＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列である。
【００１０】
以上のアミノ酸の置換に加えて、Ａ．Ｃ．ＰＱＱＧＤＨにおける第２７８番アミノ酸〜第３２０番アミノ酸からなる第２領域に相当する領域において一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されていることが好ましい。
更には、Ａ．Ｃ．ＰＱＱＧＤＨにおける第１６２番アミノ酸〜第１９７番アミノ酸からなる第３領域に相当する領域において一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されていることが好ましい。
加えて、Ａ．Ｃ．ＰＱＱＧＤＨにおける第７５番アミノ酸、第１６８番アミノ酸、及び第３４７番アミノ酸にそれぞれ相当するアミノ酸からなるグループより選択される一以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されていることが好ましい。
【００１１】
各領域において置換されるアミノ酸の数は特に限定されない。但し、上記第１領域に相当する領域では二つ以上のアミノ酸が置換されていることが好ましい。
また、各領域において置換されているアミノ酸の位置は特に限定されないが、例えば上記の第１領域に相当する領域においては当該第１領域内の第３４２番アミノ酸及び／又は第３５１番アミノ酸に相当する位置のアミノ酸が置換されていることが好ましい。同様に、第２領域に相当する領域においては当該第２領域内の第２９５番アミノ酸に相当する位置のアミノ酸が置換されていることが好ましく、第３領域に相当する領域においては当該第３領域内の第１６９番アミノ酸に相当する位置のアミノ酸が置換されていることが好ましい。
【００１２】
ここで、置換後のアミノ酸の種類は特に限定されないが、例えば第７５番アミノ酸位置ではトリプトファン、第１６８番アミノ酸位置ではヒスチジン、第１６９番アミノ酸位置ではフェニルアラニン、第２９５番アミノ酸位置ではグルタミン酸やアスパラギン酸、チロシン、フェニルアラニンなど、第３４２番アミノ酸位置ではプロリン、第３４７番アミノ酸位置ではアルギニン、第３５１番アミノ酸位置ではスレオニンである。
【００１３】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型の酵素に比してグルコースに対する選択性が向上していることを特徴とする。即ち本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは野生型の酵素に比較してマルトースやラクトースなどに対する反応性が低く、特にガラクトースに対する反応性が顕著に低いという特徴を有する。グルコースに対する反応性を１００％とした相対値で表せば、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはマルトースに対する反応性が好ましくは４０％以下であり、より好ましくは３０％以下であり、さらに好ましくは２０％以下である。同様にラクトースに対する反応については好ましくは５０％以下であり、より好ましくは４０％以下である。ガラクトースに対する反応性については好ましくは２０％以下であり、より好ましくは１０％以下であり、さらに好ましくは実質的に０％である。尚、本明細書において単に「基質特異性」という場合には、このグルコースに対する選択性を意味する。
【００１４】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨでは上記のアミノ酸置換に加えて、さらに一部のアミノ酸の改変が行われていてもよい。ここでの「一部のアミノ酸の改変」とは、アミノ酸配列を構成する１〜数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは１〜数個のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列に変化が生ずることをいうが、このような改変は原則としてＰＱＱＧＤＨとしての活性（即ちグルコースに対する反応性）が維持される限りにおいて行うことができる。但し、ＰＱＱＧＤＨ活性が多少低下する場合であっても、他の基質（例えばマルトースやガラクトース）に対する反応性も低下して却ってグルコースに対する基質特異性が向上する場合や、基質特異性が多少低下したとしてもグルコース量の測定に利用するのに支障のない場合などであれば上記のごとき改変が許容される。
以上のような一部のアミノ酸の改変は、マルトースやガラクトースなどに対する反応性が低い状態に維持される範囲内で行われることが好ましい。
ここでの改変に供されるアミノ酸の位置は特に限定されず、また複数の位置で改変が行われてもよい。ここでの複数とは例えば全アミノ酸の１０％以内に相当する数であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内に相当する数である。さらに好ましくは全アミノ酸の１パーセント以内に相当する数である。
【００１５】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、まず野生型のＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を取得し、次いでそれを改変して改変型ＰＱＱＧＤＨをコードするポリヌクレオチドを構築し、最後に当該ポリヌクレオチドを適当な発現系において発現させることによっても作製され得る。以下に当該作製方法について説明する。尚、一旦その配列が設計された後は配列情報に基づきデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）を材料とした化学合成によって本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードするポリヌクレオチド（遺伝子）を調製することができる。
【００１６】
＜野生型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子の取得＞
まず、ＰＱＱＧＤＨ生産菌からＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を取得する。ＰＱＱＧＤＨ生産菌としては、例えばアシネトバクター・カルコアセティカス、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、アセトバクター・アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ）等の酸化細菌やアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリヒア・コリ、クレブシーラ・エーロジーンズ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等の腸内細菌を挙げることができる。中でもアシネトバクター・カルコアセティカスをＰＱＱＧＤＨ生産菌として用いることが好ましい。
【００１７】
ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子はＰＱＱＧＤＨ生産菌の菌体から常法によって抽出することができる。ＰＱＱＧＤＨのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法等を利用してＰＱＱＧＤＨ遺伝子を調製することもできる。一方、抽出した遺伝子をＰＣＲ法等の増幅方法を利用して一旦増幅し、そして増幅産物を以降の操作に供してもよい。尚、ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子の塩基配列が同定された後は、化学的手法によっても目的とするＰＱＱＧＤＨ遺伝子を調製することができる。以下、ＰＱＱＧＤＨ遺伝子を調製する方法の一例としてアシネトバクター・カルコアセティカスＩＦＯ  １２５５２株を出発材料とした場合について具体的に説明する。
【００１８】
まず、アシネトバクター・カルコアセティカスＩＦＯ  １２５５２  の染色体を分離、精製した後、超音波処理や制限酵素処理等を施して得られるＤＮＡ断片と、リニアーな状態に調製した発現ベクターとをＤＮＡリガーゼなどを利用して両者の平滑末端又は付着末端において結合閉鎖させ、組換えベクターを構築する。公知のアシネトバクター・スピーシーズＬ．Ｍ．Ｄ  ７９．４１株由来のＰＱＱＧＤＨ遺伝子の塩基配列を基に設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＰＱＱＧＤＨ遺伝子を増幅し、ＤＮＡリガーゼにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築することもできる。次に、以上のいずれかの方法により構築した組換えベクターをそれが自律複製可能な宿主微生物に移入する。そして、発現ベクターに固有のマーカーとＰＱＱＧＤＨ酵素活性を指標としてスクリーニングし、ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を含有する組換えベクターで形質転換された宿主微生物を得る。
【００１９】
次いで、必要に応じて選択された形質転換体を培養した後、菌体を回収する。回収した菌体から常法に従って組換えベクターを分離、精製する。このようにして目的のＰＱＱＧＤＨ遺伝子を含有する組換えベクターが取得される。かかる組換えベクターからのＰＱＱＧＤＨ遺伝子の分離は制限酵素処理等によって行うことができる。
【００２０】
ここで、アシネトバクター・カルコアセティカスＩＦＯ  １２５５２からのＰＱＱＧＤＨ遺伝子の取得方法の一例についてその詳細を以下に示す。まず、アシネトバクター・カルコアセティカスＩＦＯ  １２５５２を例えば１〜３日間攪拌培養して得られた培養液を遠心処理して集菌し、次いで菌体を溶菌させることによりＰＱＱＧＤＨ遺伝子を含有する溶菌物を調製する。溶菌の方法としては、例えばリゾチーム等の溶菌酵素により処理を採用することができる。また、必要に応じてプロテアーゼ等の酵素処理やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤による処理を併用してもよい。さらに、凍結融解やフレンチプレス処理のような物理的破砕方法と組み合わせてもよい。
【００２１】
上記のようにして得られた溶菌物からのＤＮＡの分離、精製は常法に従って行うことができる。例えばフェノール処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理などの方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。
【００２２】
微生物から分離、精製されたＤＮＡからＰＱＱＧＤＨ遺伝子を取得するために、既に明らかにされているアシネトバクター・スピーシーズＬ．Ｍ．Ｄ．  ７９．４１株の塩基配列を基にしたプライマーを用いた遺伝子増幅反応を行う。
【００２３】
増幅されたＰＱＱＧＤＨ遺伝子を適当なベクターにクローニングすることも可能である。クローニングする際のベクター（クローニングベクター）としては、宿主微生物内で自律的に複製し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。このようなファージの例としては大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を宿主微生物とするＬａｍｂｄａ  ｇｔ１０  、Ｌａｍｂｄａ  ｇｔ１１  などが挙げられる。同様にプラスミドの例としては大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を宿主微生物とするｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＴｒｃ９９，  ｐＧＥＭ−Ｔ  ｖｅｃｔｏｒなどが挙げられる。
【００２４】
ベクターへのクローニングは、上述の方法で取得したＰＱＱＧＤＨ遺伝子をベクターのクローニングサイトに挿入することにより行われる。かかる操作は制限酵素及びＤＮＡリガーゼを利用した周知の方法によって行うことができる。
【００２５】
クローニングに使用する宿主微生物としては、その中で組換えベクターが安定かつ自律増殖可能であって、さらに外来性遺伝子を形質発現できるものであれば特に限定されない。一般的には大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０  、大腸菌Ｃ６００、大腸菌ＨＢ１０１  、大腸菌ＪＭ１０９  、大腸菌ＤＨ５  αなどを用いることができる。
【００２６】
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリの場合を例に採れば、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いることができる。
目的の組換えベクターが適切に導入された宿主微生物を選択するには、ベクターが有するマーカー（例えば薬剤耐性遺伝子）の発現と、ＰＱＱの添加によるＧＤＨ活性の発現が同時に認められる微生物を検索すればよい。例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつＰＱＱＧＤＨを産生する微生物を選択すればよい。このような方法によって選択された形質転換体は、栄養培地で培養されることにより、多量のＰＱＱＧＤＨを安定に生産し得る。
【００２７】
以上の方法により得られた野生型ＰＱＱＧＤＨ遺伝子の塩基配列をＳｃｉｅｎｃｅ  ，第２１４巻，１２０５（１９８１）に記載されたジデオキシ法により解読した（図１、配列番号２）。また、ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列は上記のように決定された塩基配列より推定した（図１、配列番号１）。尚、シグナル領域を含む、遺伝子配列（配列番号４）及びアミノ酸配列（配列番号３）は図２に示される。
【００２８】
ＰＱＱＧＤＨ遺伝子を保有する組換えベクターから回収したＰＱＱＧＤＨ遺伝子を遺伝子工学的手法を用いて容易に改変することができる。具体的には例えば部位特異的変異法を用いて、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように遺伝子の改変を行う。
【００２９】
＜改変型ＰＱＱＧＤＨをコードするポリヌクレオチドの構築＞
以上のようにして取得されたＰＱＱＧＤＨ遺伝子に対して、発現産物であるタンパク質において特定のアミノ酸が置換されるように変異を加えることにより、目的とする改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を作製することができる。このような部位特異的塩基配列置換のための方法は当該技術分野において数多く知られており（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）、その中から適切な方法を選択して用いることができる。尚、ＰＱＱＧＤＨ遺伝子にランダムな変異を挿入し、各変異体（改変体）の発現産物の基質特異性を比較して好ましい基質特異性を有する遺伝子を選択することによっても、改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を作製することができる。このようなランダム変異を導入する場合は、まず例えばエラープローンＰＣＲを利用して標的とする遺伝子領域にランダムに変異を導入し、改変型ＰＱＱＧＤＨ遺伝子ライブラリーを構築する。ランダム変異によって得られた有用な変異の組合せを有する多重置換体はノバルティスファーマ社によりバイオサイエンスとインダストリー誌  ｖｏｌ．５９，  Ｎｏ．３（２００１），  Ｐ３５−３８に報告されているミューテーションスクランブリング法にて得ることが出来る。この方法では、得られたコロニーの培養、リゾチームなど溶菌酵素を用いた菌体の溶菌、そして酵素活性の測定といった手順により、簡便かつ容易に改変型酵素の評価が行える。
【００３０】
改変型ＰＱＱＧＤＨ遺伝子ライブラリーを効率良くスクリーニングするため、予めＰＱＱＧＤＨ遺伝子にヒスチジンタグをコードする塩基配列を付加しておくことができる。このようにすることによって、生育状態、発現効率などに起因して産生酵素量が変動するとしても、一定量を用いた酵素活性の評価などを行うことができる。具体的には、例えばマイクロプレートのようなタンパク質吸着性の基材表面に一定量の抗ヒスチジンタグモノクローナル抗体を吸着させ、非特異的なタンパク質の吸着防止処理を施した後、上記溶菌液と反応させることで、上記溶菌液に含まれる内の一定量のＰＱＱＧＤＨを基材上に固相化し酵素活性を評価することができる。上記操作を９６穴マイクロプレートで行うことにより一度に多数の改変体の単位量あたりの酵素活性を効率良く評価することが出来る。
目的とする改変型遺伝子を保有するクローンの選択は例えば次のように行われる。溶菌液に１−ｍｅｔｈｏｘｙ−ＰＭＳとＸＴＴを加えて一定時間経過した後の４１０ｎｍの吸光度をもとにＰＱＱＧＤＨの活性を測定し、そしてマルトースに対する反応性が野生型ＰＱＱＧＤＨに比べ約８０％以下に低下している検体をまず選択し、次にグルコースに対する反応性が野生型ＰＱＱＧＤＨに比べ約９０％以上保持されているクローンを選択する。ここで得られたクローンの塩基配列を解析してその変異を確認する。
【００３１】
＜改変型ＰＱＱＧＤＨ遺伝子の発現＞
改変型ＰＱＱＧＤＨ遺伝子の発現には、大腸菌を宿主とする発現系などを利用することができる。例えば、まず上述の方法によって調製された改変型ＰＱＱＧＤＨ遺伝子を大腸菌を宿主とするベクター（例えばｐＵＣベクター、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター）に挿入して発現ベクターを構築する。当該発現ベクターには宿主内での改変型ＰＱＱＧＤＨの発現に必要なプロモーター配列、複製開始点、ターミネータ配列などが含まれる。
【００３２】
宿主微生物に発現ベクターを導入（移入）する方法としては、例えば宿主微生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いることができる。宿主微生物への発現ベクターが適切に導入された宿主微生物の選択は、発現ベクターが有する薬剤耐性マーカーの有無、及びＰＱＱを添加した際のＧＤＨ活性の発現の有無を指標に行うことができる。例えば、発現ベクターの導入操作後の微生物を薬剤耐性マーカーを保有している場合のみに生育が可能な選択培地で培養し、続いて生育が認められた形質転換体の中から改変型ＰＱＱＧＤＨを産生するものを選択すればよい。
【００３３】
以上の操作によって選択された形質転換体を、それが良好に生育・増殖し且つ発現ベクターに挿入された改変型ＰＱＱＧＤＨ遺伝子が発現可能な条件で培養することにより、多量の改変型ＰＱＱＧＤＨを安定的に産生させることができる。
【００３４】
培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００３５】
形質転換体が生育可能であって且つ改変型ＰＱＱＧＤＨが産生される温度条件で形質転換体の培養が行われる。例えば、２０℃〜３０℃の範囲内に培養温度を設定することができる。培養時間は、培養対象の形質転換体の生育特性や改変型ＰＱＱＧＤＨ産生特性、或いは必要とする改変型ＰＱＱＧＤＨ生産量などを考慮して設定することができ、例えば改変型ＰＱＱＧＤＨの収量が最大に達する時期に培養を完了させる。培養時間の目安としては１２〜７２時間程度である。培地のｐＨは、形質転換体が生育し且つＰＱＱＧＤＨが産生される範囲内に調製される。好ましくは培地のｐＨを６．０〜９．０程度とする。
【００３６】
改変型ＰＱＱＧＤＨを生産する菌体を含む培養液をそのまま、或いは濃縮、不純物の除去などを経た後に酵素溶液として利用することもできるが、一般的には培養液又は菌体より改変型ＰＱＱＧＤＨを一旦回収する。産生される改変型ＰＱＱＧＤＨが分泌型タンパク質であれば培養液より、それ以外であれば菌体内より回収することができる。培養液から回収する場合には、例えば培養上清をろ過、遠心処理して不溶物を除去した後、減圧濃縮、膜濃縮、硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムを利用した塩析、メタノールやエタノール又はアセトンなどによる分別沈殿法、透析、加熱処理、等電点処理、ゲルろ過や吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー（例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ファルマシアバイオテク）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ  （ファルマシアバイオテク）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ  （ファルマシアバイオテク）、ＣＭセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシアバイオテク））などを組み合わせて分離、精製を行ことにより改変型ＰＱＱＧＤＨの精製品を取得することができる。他方、菌体内から回収する場合には、培養液をろ過、遠心処理等することによって菌体を採取し、次いで菌体を加圧処理、超音波処理などの機械的方法またはリゾチームなどによる酵素的方法で破壊した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより改変型ＰＱＱＧＤＨの精製品を取得することができる。尚、必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加してＰＱＱＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取することができる。
精製酵素は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００３７】
上記のようにして得られた精製酵素を、例えば凍結乾燥や真空乾燥或いはスプレードライなどにより粉末化して流通させることが可能である。その際、精製酵素を予めリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液やＧＯＯＤの緩衝液に溶解させておいてもよい。ここで使用される緩衝液として好適なものはＧＯＯＤの緩衝液であり、中でもＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ又はＭＯＰＳ緩衝液が特に好ましい。
【００３８】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、ＰＱＱを補酵素として、グルコースを酸化してδ−グルコノラクトンを生成する反応を触媒する作用を有する。かかる酵素活性は、ＰＱＱＧＤＨによるグルコースの酸化に伴って還元されるＰＱＱの量を酸化還元試薬の呈色反応により定量することが出来る。呈色試薬としては例えば、ＰＭＳ−ＤＣＩＰ、１−ｍｅｔｈｏｘｙ−ＰＭＳ−ＸＴＴ、フェリシアン化カリウムなどを用いることが出来る。
本発明においてはＰＱＱＧＤＨ活性の測定を、原則として、以下の試薬を用い、以下の条件において行うこととする。
＜試薬＞
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）
１ｍＭ  １−ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）
０．２５ｍＭ  ＸＴＴ
５ｍＭ  グルコース
＜測定条件＞
上記試薬混液１４０μｌを２５℃で約５分予備加温した後に０．１ｍｌの酵素溶液を加え、緩やかに混和する。その後、水を対照とし、２５℃に制御された分光光度計で１５分間記録し、その直線部分から１分間あたりの４１０ｎｍの吸光度変化を測定する。盲検は酵素溶液の代わりに蒸留水を試薬混液に加えて、以下同様に吸光度変化を測定する。上記条件で１分間に生成するホルマザン１／２  μｍｏｌの酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【００３９】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨのグルコースに対する選択性は、基質としてラクトース、マルトース、ガラクトース、シュークロース及びキシロース等の各種の糖を用いて上述と同様に酵素活性を測定し、グルコースを基質としたときの活性に対する相対活性を調べることにより評価することが出来る。
【００４０】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを用いて、グルコース測定用キットを構築することができる。即ち、本発明の他の局面は改変型ＰＱＱＧＤＨを含有するグルコース測定用キットを提供する。かかるキットには改変型ＰＱＱＧＤＨの他に、測定する際に必要とされる緩衝液などの溶液や標準としてのグルコース溶液等を含有させることができる。
【００４１】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］  染色体ＤＮＡの分離
アシネトバクター・カルコアセティカスＩＦＯ  １２５５２株の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した。同菌株を１０ｍＬのＬＢ培地で３０℃、一晩振とう培養した後、遠心処理（１５０００ｒｐｍ、１０分間）により集菌した。得られた菌体からＤｎｅａｓｙ  ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて染色体ＤＮＡを抽出、精製し、そしてＴＥバッファーに溶解した。
【００４２】
［実施例２］  ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片の調製、及び当該ＤＮＡ断片を含有する組換えベクターの構築
実施例１で得られた染色体ＤＮＡを鋳型とし、次のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、目的とするＰＱＱＧＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ領域を増幅させた。尚、ここで使用されるプライマーは、アシネトバクター・スピーシーズ  Ｌ．Ｍ．Ｄ  ７９．４１株由来の可溶性ＰＱＱＧＤＨの塩基配列（Ａ−Ｍ  Ｃｌｅｔｏｎ−ＪａｎｓｅｎらＭｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２１７，  ４３０（１９８９））を基に設計した。
フォワードプライマー：５’−ＡＣＡＡＡＴＣＡＴＡＴＡＧＡＧＡＡＣＴＣＧ−３’（配列番号５）
リバースプライマー：５’−ＴＴＡＣＴＴＡＧＣＣＴＴＡＴＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＡＡＴＧＡＧＡＧＡＴＣＣＴＧＧＧ−３’（配列番号６）
ＰＣＲは以下の表１に示す組成の溶液中で行い、９４℃２分間の反応、次に９４℃３０秒間、４８℃３０秒間、及び７２℃２分間の反応を３０サイクル、最後に７２℃１０分間の反応を行う条件とした。
【００４３】
【表１】
ＴＡＫＡＲＡ  ＬＡ−ｔａｑ  ０．５  μＬ
１０−ｆｏｌｄ  ｂｕｆｆｅｒ  ５  μＬ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ５  μＬ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ  （２．５ｍＭ）  ８  μＬ
フォワードプライマー  （１０ｐｍｏｌ／μＬ）  １  μＬ
リバースプライマー  （１０ｐｍｏｌ／μＬ）  １  μＬ
ｔｅｍｐｌａｔｅ
Ｈ２Ｏで５０  μＬに調整
【００４４】
得られた増幅遺伝子断片をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（キアゲン社）に連結し、このプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。尚、得られたプラスミドをｐＴＧＥＭ−ＧＤＨＢとした。
【００４５】
［実施例３］  アシネトバクター・カルコアセティカスＩＦＯ  １２５５２の可溶性ＰＱＱＧＤＨの塩基配列の決定
実施例２で得られたプラスミドｐＴＧＥＭ−ＧＤＨＢに挿入された遺伝子断片の塩基配列をＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライド・バイオシステムス社製）を用いて決定した。決定した塩基配列及びアミノ酸配列はそれぞれ配列番号２及び配列番号１に示す通りである。尚、シグナル領域を含めた塩基配列及びアミノ酸配列はそれぞれ配列番号４及び配列番号３に示される。アミノ酸配列から計算されたタンパク質の分子量は約５０，０００であり、アシネトバクター・カルコアセティカスの可溶性ＰＱＱＧＤＨの分子量とほぼ一致した。
【００４６】
［実施例４］  ＰＱＱＧＤＨ遺伝子を含有する発現ベクターの構築
実施例２で得られたプラスミドｐＴＧＥＭ−ＧＨＤＢを鋳型とし、次のプライマーを用いたＰＣＲを行った。
フォワードプライマー：５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＴＡＡＡＣＡＴＴＴＡＴＴＧＧＣＴＡＡＡＡＴＴＡＣＴＴＴＡＴ−３’（配列番号７）
リバースプライマー：５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＣＴＡＴＴＡＣＴＴＡＧＣＣＴＴＡＴＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＡＡＴＧＡＧＡＧＡＴＣＣＴＧＧＧ−３’  （配列番号８）
ＰＣＲは以下の表２に示す組成の溶液中で行い、９４℃２分間の反応、次に９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、及び７２℃２分間の反応を３０サイクル、最後に７２℃１０分間の反応を行う条件とした。
【００４７】
【表２】
Ｓｉｇｍａ  ＫｌｅｎＴａｑ  ０．５  μＬ
１０−ｆｏｌｄ  ｂｕｆｆｅｒ  ５  μＬ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ  （１０ｍＭ）  ２．５  μＬ
フォワードプライマー  （１０ｐｍｏｌ／μＬ）  ２  μＬ
リバースプライマー  （１０ｐｍｏｌ／μＬ）  ２  μＬ
ｔｅｍｐｌａｔｅ
Ｈ２Ｏで５０  μＬに調整
【００４８】
得られた増幅遺伝子を制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩにて切断した。切断した遺伝子断片を発現ベクターに連結し、このプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。尚、得られた発現プラスミドをｐＵＫ−ＧＤＨＢ（Ｓ）とした（図３）。形質転換体を３０℃、１００μｇ／ｍＬアンピシリンと６μＭ  ＰＱＱを含む１００ｍＬのＬＢ培地で一晩培養したところＰＱＱＧＤＨの産生が認められた。尚、このＰＱＱＧＤＨの分子量をアミノ酸配列から計算したところ約５０，０００であり、アシネトバクター・カルコアセティカスＩＦＯ  １２５５２の分子量とほぼ一致した。
【００４９】
［実施例５］  アシネトバクター・カルコアセティカスＰＱＱＧＤＨ遺伝子産物の製造
ＬＢ培地１Ｌを５００ｍＬ容フラスコに５０ｍＬずつ分注し、１２１℃，  ２０ｍｉｎオートクレーブを行った。放冷後、別途無菌濾過した１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン溶液とイソプロピルガラクトピラノシド５０μＬを添加し、ＰＱＱＧＤＨ発現ベクターｐＵＫ−ＧＤＨＢ（Ｓ）を有するコロニーを接種した。そして３０℃で１６時間振とう培養した。培養終了時のＰＱＱＧＤＨ活性は約１Ｕ／ｍＬであった。
【００５０】
培養終了後の培養液を遠心処理することにより回収した菌体を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．５）に懸濁した。次に、菌体懸濁液を超音波破砕後、再度遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。この粗酵素液をカチオン凝集剤で処理し、脱塩濃縮した後、ＤＥＡＥセファロース（ファルマシアバイオテク）、ＣＭセファロース（ファルマシアバイオテク）カラムクロマトグラフィーにて分離、精製して精製酵素を得た。
【００５１】
以上の方法によって得られたＰＱＱＧＤＨは電気泳動においてほぼ単一のバンドを示し、この際の比活性は約１６００Ｕ／ｍｇであった。以下に、得られたＰＱＱＧＤＨの性質を示す。
2004173538.tif 000002
【００５２】
［実施例６］  ＰＱＱＧＤＨのＣ末端ヒスチジンタグの付加
先ずＰＱＱＧＤＨ遺伝子の下流にヒスチジンタグを導入し、続いてその直後に終始コドンを付加するプライマーを用いてＰＣＲを行った。実施例４で得られたｐＵＫ−ＧＤＨＢ（Ｓ）を鋳型として、次のプライマーを用いたＰＣＲを行った。
フォワードプライマー：５’−ＴＣＡＣＡＴＧＴＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＧＴＴＡＴＣ−３’（配列番号９）
リバースプライマー：５’−ＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＣＴＴＡＧＣＣＴＴＡＴＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＡＡＴＧＡＧＡ−３’（配列番号１０、下線で示したのが６×ヒスチジンタグの配列）
ＰＣＲは実施例４と同様の組成及び条件にて行った。
続いて増幅遺伝子を鋳型としてヒスチジンタグの下流に翻訳終止コドンを導入するため次のプライマーを用いたＰＣＲを行った。
フォワードプライマー：５’−ＴＣＡＣＡＴＧＴＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＧＴＴＡＴＣ−３’（配列番号９）
リバースプライマー：５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＣＴＡＴＴＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＣＴＴＡＧＣＣＴＴＡ−３’（配列番号１１）
ＰＣＲは実施例４と同様の溶液組成及び条件にて行った。
【００５３】
ＰＱＱＧＤＨ遺伝子下流にヒスチジンタグ、終止コドンを付加して得られた増幅遺伝子をＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで切断した。切断した遺伝子断片を発現ベクターに連結し、このプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。尚、得られた発現プラスミドをｐＵＫ−ＧＤＨＢ（Ｓ）Ｃ−Ｈｉｓとした。形質転換体を３０℃、１００μｇ／ｍＬアンピシリンと６μＭ  ＰＱＱを含む１００ｍＬのＬＢ培地で一晩培養したところＰＱＱＧＤＨの産生が認められた。尚、このＰＱＱＧＤＨの分子量をアミノ酸配列から計算したところ約５０，０００であり、アシネトバクター・カルコアセティカスＩＦＯ  １２５５２の分子量とほぼ一致した。さらに対照として実施例５で得られた野生型のＰＱＱＧＤＨと一般的性質を比較したところ同等であることが認められた。
【００５４】
［実施例７］  変異ＰＱＱＧＤＨ遺伝子ライブラリーの構築
実施例６で得られたプラスミドｐＵＫ−ＧＤＨＢ（Ｓ）Ｃ−Ｈｉｓを鋳型とし、次のプライマーを用いてエラープローンＰＣＲ法を行い、変異の挿入を行った。
フォワードプライマー：５’−ＴＣＡＣＡＴＧＴＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＧＴＴＡＴＣ−３’（配列番号９）
リバースプライマー：５’−ＧＧＣＧＣＧＴＡＣＴＡＴＧＧＴＴＧＣＴＴＴＧＡ−３’（配列番号１２）
変異導入の条件は以下の通りである。ＰＣＲは以下の表３に示す組成の溶液中で行い、９４℃５分間の反応、次に９４℃１分間、５０℃１分間、７０℃２分間の反応を２５サイクル、最後に７２℃７分間の反応を行う条件とした。
【００５５】
【表３】
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）  ０．５  μＬ
５００ｍＭ  ＫＣｌ  ５  μＬ
１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ  ２．５  μＬ
（１５〜１００ｍＭ）ＭｇＣｌ２  ５  μＬ
１ｍＭ  ＭｎＣｌ２  １．２５〜３．７５  μＬ
１０ｍＭ  ＡＴＰ  ０．５〜１．５５  μＬ
１０ｍＭ  ＴＴＰ  ０．５〜５．０  μＬ
１０ｍＭ  ＧＴＰ  １．０〜５．０  μＬ
１０ｍＭ  ＣＴＰ  ０．５〜５．０  μＬ
フォワードプライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）  ２．５  μＬ
リバースプライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）  ２．５  μＬ
Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ  ０〜７．５  μＬ
０．２ｎｇ／μＬ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ５  μＬ
ｒＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ０．５  μＬ
Ｈ２Ｏで５０  μＬに調整
【００５６】
変異の導入された遺伝子増幅断片をＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで切断し、ｐＵＫ−ＧＤＨＢ（Ｓ）の野生型遺伝子と入れ換えた。このようにして得られたプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して変異遺伝子ライブラリーを構築した。
【００５７】
得られたコロニーを９６穴の培養用深溝マイクロプレート中の１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、５μＭのＰＱＱそして１ｍＭの塩化カルシウムを含む６００μＬのＣｉｒｃｌｅ  Ｇｒｏｗ  Ｍｅｄｉｕｍ（ストラタジーン社）に接種し、３７℃で一晩２００ｒｐｍの振とう条件で培養した。その後、菌体を遠心分離（３０００ｒｐｍ，  ４℃，  ３０ｍｉｎ）で回収し、３倍に希釈された溶菌液（５０ｍＭ  トリス緩衝液ｐＨ８．０，  ２ｍＭ  ＥＤＴＡ，  １ｍｇ／ｍＬリゾチーム，  １５μＭ  ＰＱＱ）６００μＬに再懸濁した。その後３７℃で１時間振とうし、３０μＬの２０ｍＭ塩化カルシウム溶液を添加した。ライセートをフィルタープレート（コーニング社製）に移し、遠心分離した（２０００ｒｐｍ，  ４℃，  ５ｍｉｎ）。得られた上清を以下のスクリーニングに用いた。
【００５８】
スクリーニングに用いる９６穴マイクロプレートには予め以下の方法で処理を施しておいた。即ち、まず９６穴マイクロプレート（コースター社製）に１５ｎｇ／μＬのＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ／Ｇ液を１００μＬ添加し３７℃で約２時間定置した。次にＰＢＳ溶液で３回洗浄しブロッキング溶液を１５０μＬ添加し、３７℃で約２時間定置し、スクリーニング用マイクロプイレートとした。予め用意した８０μＬの０．１ｎｇ／μＬのマウスＩｇＧ１抗５×ヒスチジンタグモノクローナル抗体の入った９６穴マイクロプレートに上記の遠心上清を添加、混和し１００μＬのブロッキング液をＰＢＳ溶液で洗浄除去したスクリーニング用マイクロプレートに添加し、２５℃で１時間定置した。その後ＰＢＳで３回洗浄し１４０μＬのＰＱＱＧＤＨアッセイ溶液（４ｍＭ  １−ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳ  ３．５ｍＬ，  １ｍＭ  ＸＴＴ溶液  ３．５ｍＬ，  ２０ｍＭ  マルトースもしくはグルコース溶液  ３．５ｍＬ，  ４０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ７．０  ３．５ｍＬの混合液）を添加し、４１０ｎｍ  の吸光度を１５分間室温で測定した。
【００５９】
第一段階のスクリーニングはランダム一塩基置換ライブラリーに対してマルトースを基質としたスクリーニングを実施し、酵素活性が野生型の約８０％以下に低下した変異体を発現するクローンを同定した。同定された変異株に対して次にグルコースを基質としたスクリーニングを実施し、グルコースへの反応性に比しマルトースへの反応性の低下が大きい変異体を発現するクローンを得た。これら変異ＰＱＱＧＤＨ遺伝子の塩基配列を決定したところ７５番目のグリシンがアルギニン、２９５番目のグリシンがグルタミン酸、３４２番目のメチオニンがバリン、３５１番目のアラニンがスレオニン、１６８番目のグルタミンがヒスチジン、１６９番目のロイシンがグルタミン、３４７番目のトリプトファンがアルギニンに変異していることが明らかとなった。以下の表４に示されるように、本発明で得られた改変型ＰＱＱＧＤＨはマルトースへの特異性が野生型に比し何れも低下していた。グルコースを基質としたときの野生型ＰＱＱＧＤＨの活性を１００とし、これに対する相対値としてマルトースに対する反応性を示した。尚、対照として実施例６で得られたヒスチジンタグを付加した野生型のＰＱＱＧＤＨを用いた。
表４のアミノ酸置換の欄における数字はアミノ酸番号を、数字の左側の記号は野生型におけるアミノ酸の種類を、数字の右側は変異後のアミノ酸の種類をそれぞれ表す。従って、例えばＧｌｙ７５Ａｒｇは第７５番アミノ酸のグリシンがアルギニンに置換された改変体を意味する。
【００６０】
【表４】
2004173538.tif 000003
【００６１】
［実施例８］  野生型ＰＱＱＧＤＨ遺伝子への部位特異的変異の導入と及び改変型ＰＱＱＧＤＨの基質特異性の検討
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（ストラタジーン社）を用いて、配列番号４で示されるアシネトバクター・カルコアセティカス由来ＰＱＱＧＤＨの構造遺伝子に部位特異的変異の導入を行った。実施例７で変異が導入された部位、即ち、７５番目のグリシン、２９５番目のグリシン、３４２番目のメチオニン、３５１番目のアラニン、１６８番目のグルタミン、１６９番目のロイシン、３４７番目のトリプトファンの各部位のアミノ酸をコードする塩基配列がランダムに２０種類のアミノ酸をコードするように置換される条件とした。各部位を２０種類のアミノ酸に置換するプライマーの配列を表５に示す。尚、表５において各配列名の語尾に記したＦ及びＲはそれぞれフォワード及びリバースを表す。
【００６２】
【表５】
配列名：配列
ＧＤＨＢ／Ｇ１００−Ｆ：５’−ＧＴＡＡＡＴＧＡＴＧＣＴＧＡＴＮＮＮＣＡＡＡＡＣＧＧＴＴＴＡＴＴＧＧＧ−３’（３５ｍｅｒ、配列番号１３）
ＧＤＨＢ／Ｇ１００−Ｒ：５’−ＣＣＣＡＡＴＡＡＡＣＣＧＴＴＴＴＧＮＮＮＡＴＣＡＧＣＡＴＣＡＴＴＴＡＣ−３’（３５ｍｅｒ、配列番号１４）
ＧＤＨＢ／Ｇ３２０−Ｆ：５’−ＣＡＡＡＴＴＡＡＡＧＡＴＴＴＡＮＮＮＣＡＡＡＡＴＧＧＴＴＴＡＡＡＡＧＴＧＧＣ−３’（３８ｍｅｒ、配列番号１５）
ＧＤＨＢ／Ｇ３２０−Ｒ：５’−ＧＣＣＡＣＴＴＴＴＡＡＡＣＣＡＴＴＴＴＧＮＮＮＴＡＡＡＴＣＴＴＴＡＡＴＴＴＧ−３’（３８ｍｅｒ、配列番号１６）
ＧＤＨＢ／Ｍ３６７−Ｆ：５’−ＣＣＡＡＣＣＴｇＴｇｇｇｇＡＴＮＮＮＡＣＣＴＡＣＡＴＴＴｇＣＴｇｇ−３’（３３ｍｅｒ、配列番号１７）
ＧＤＨＢ／Ｍ３６７−Ｒ：５’−ＣＣＡｇＣＡＡＡＴｇＴＡｇｇＴＮＮＮＡＴＣＣＣＣＡＣＡｇｇＴＴｇｇ−３’（３３ｍｅｒ、配列番号１８）
ＧＤＨＢ／Ａ３７６−Ｆ：５’−ｇＣＣＡＡＣｇｇＴＴＮＮＮＣＣｇＴＣＡＴＣＴｇＣＴＴＡＴｇＴＣＴＡ−３’（３３ｍｅｒ、配列番号１９）
ＧＤＨＢ／Ａ３７６−Ｒ：５’−ＴＡｇＡＣＡＴＡＡｇＣＡｇＡＴｇＡＣｇｇＮＮＮＡＡＣＣｇＴＴｇｇＣ−３’（３３ｍｅｒ、配列番号２０）
ＧＤＨＢ／Ｑ１９３−Ｆ：５’−ＧＡＴＣＡＧＧＧＧＣＧＴＡＡＣＮＮＮＣＴＧＧＣＴＴＡＴＴＴＡＴＴＣ−３’（３３ｍｅｒ、配列番号２１）
ＧＤＨＢ／Ｑ１９３−Ｒ：５’−ＧＡＡＴＡＡＡＴＡＡＧＣＣＡＧＮＮＮＧＴＴＡＣＧＣＣＣＣＴＧＡＴＣ−３’（３３ｍｅｒ、配列番号２２）
ＧＤＨＢ／Ｌ１９４−Ｆ：５’−ＧＧＧＧＣＧＴＡＡＣＣＡＧＮＮＮＧＣＴＴＡＴＴＴＡＴＴＣＴＴＡＣＣ−３’（３３ｍｅｒ、配列番号２３）
ＧＤＨＢ／Ｌ１９４−Ｒ：５’−ＧＧＴＡＡＧＡＡＴＡＡＡＴＡＡＧＣＮＮＮＣＴＧＧＴＴＡＣＧＣＣＣＣ−３’（３３ｍｅｒ、配列番号２４）
ＧＤＨＢ／Ｗ３７２−Ｆ：５’−ｇｇＡＴＡＴｇＡＣＣＴＡＣＡＴＴＴｇＣＮＮＮＣＣＡＡＣｇｇＴＴｇＣｇＣＣｇ−３’（３７ｍｅｒ、配列番号２５）
ＧＤＨＢ／Ｗ３７２−Ｒ：５’−ＣｇｇＣｇＣＡＡＣＣｇＴＴｇｇＮＮＮｇＣＡＡＡＴｇＴＡｇｇＴＣＡＴＡＴＣＣ−３’（３７ｍｅｒ、配列番号２６）
【００６３】
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔに付属する１μＬのＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μＬ）、１２５ｎｇのフォワードとリバースの各プライマー、ｄＮＴＰのミックス、１０ｎｇのｐＵＫ−ＧＤＨＢ（Ｓ）と１／１０量のＰＣＲバッファーとを混合した。反応条件は９５℃３０秒間、次に、９５℃３０秒間、５５℃１分間、及び６８℃１０分間を１６サイクルとした。反応終了後に鋳型ＤＮＡを除去するためにキットに付属の制限酵素ＤｐｎＩ（１０Ｕ／μＬ）を１μＬ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。反応産物の１μＬを用いて大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを形質転換しコロニーを得た。
【００６４】
次に、得られた形質転換体のコロニーを６００μＬのＣｉｒｃｌｅ  Ｇｒｏｗ  ｍｅｄｉｕｍ（ストラタジーン社）に接種し、実施例７と同様の方法でスクリーニングを行った。その結果選択された変異株の塩基配列を決定したところ、以下の表６に示されるようにアミノ酸置換が行われた各種の変異体が得られていることがわかった。一方、これらの各変異体をアンピシリン１００μｇ／ｍＬ、０．０１ｍＭのイソプロピルチオガラクトシド及び６μＭのＰＱＱを含む２ｍＬのＬＢ培地で３０℃、一晩培養した。培養後、菌体を遠心分離で回収し、６μＭのＰＱＱを含む１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）５００μＬに再懸濁した。続いて懸濁溶液に２５０ｍｇのガラスビーズ（安井器械社製）を加え、マルチビーズショッカー（安井器械社製）（２０００ｒｐｍ，  運転６０秒間，  インターバル３０秒間を７サイクル）によって菌体を破砕した。
【００６５】
菌体破砕後の溶液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ，  １０分間，  ４℃）し、上清をＨｉｓ  ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅ（アマシャム・ファルマシアバイオテク社製）を用いて精製した。その結果、２００μＬの精製酵素溶液が得られた。この精製酵素溶液にＰＱＱを５μＭとなるように添加し、そして１ｍＭ  塩化カルシウム存在下で１時間以上放置してホロ化を行った。
【００６６】
以上のようにして得られた各改変型ＰＱＱＧＤＨの基質特異性を次の方法で測定した。即ち、精製酵素溶液を５０μＬずつ分注した後、１３０μＬのアッセイ溶液（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．０に溶解された３．３ｍＭ  １−ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳを６０μＬ  ２０ｍＭ，  １７１μＭ  ＸＴＴを７０μＬ）及びＤ−グルコース溶液２０μＬを最終濃度５ｍＭになるように添加し、実施例５に示した方法に従いＰＱＱＧＤＨ活性を測定した。尚、対照として実施例６で得られたヒスチジンタグを付加した野生型のＰＱＱＧＤＨを用いた。測定結果を表６に示す。表６から明らかなように、野生型のＰＱＱＧＤＨに比較していずれの改変型ＰＱＱＧＤＨもマルトース及びガラクトースに対する反応性が低下しており、またラクトース及びガラクトースに対する反応性も同時に低下している改変体も得られた。尚、表６のアミノ酸置換の欄における数字はアミノ酸番号を、数字の左側の記号は野生型におけるアミノ酸の種類を、数字の右側は変異後のアミノ酸の種類をそれぞれ表す。従って、例えばＧｌｙ７５  Ｔｒｐは第７５番アミノ酸のグリシンがトリプシンに置換された改変体を意味する。
【００６７】
【表６】
2004173538.tif 000004
【００６８】
［実施例９］  ミューテーションスクランブリング法を利用した多重変異の導入及び多重置換体の基質特異性の検討
実施例８で明らかにされた、基質特異性の向上に有効なアミノ酸置換の可能なすべての組み合わせを有する多重置換体ライブラリーをミューテーションスクランブリング法により作製することにより、各アミノ酸置換を単独で有する場合に比べてより高い基質特異性を有する改変体の取得を試みた。多重置換体ライブラリーの作製には既報のバイアスミューテーションスクランブリング法（第３９回日本生物物理学会年会、平成１３年１０月６日開催、演題番号１Ｐ０５７、ノバルティスファーマ社；Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ、６４号（２００２年）、Ｐ．９５−１０５）を利用した。バイアスミューテーションスクランブリング法はミューテーションスクランブリング法の改変法であり、組み合わせるアミノ酸置換の導入確率を自由に設定可能であるという特徴を有する。本実施例では、構造モデルからの推定によって基質結合部位の近傍に位置しており特に基質特異性への貢献度が高いと期待されるＧ７５，  Ｇ２９５，  Ｍ３４２，  Ａ３５１については８０％の高確率で、構造的に特徴が認められると考えられるＱ１６８，  Ｌ１６９，  Ｗ３４７については５０％の確率で変異が導入されるような条件に設定した。具体的には、ＰＱＱＧＤＨ遺伝子全長を、末端が重複し且つ実施例８で明らかにされたアミノ酸置換を１〜３個含むような図４に示した５つの断片に分割し、各アミノ酸置換が上記の確率で導入されるように図５に示した各断片の混合比率でミューテーションスクランブリング法を施行してＰＱＱＧＤＨ遺伝子の再構築を行った。
【００６９】
ミューテーションスプラングリング法では、まず野生型遺伝子を鋳型としたＰＣＲを行い部分増幅産物を得た（図４）。ＰＣＲに使用した反応液の組成を表７に示す。プライマーにはＧ７５を挟みＱ１６８とＬ１６９に対応する配列を含むものを用いた。
【００７０】
【表７】
１０×ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＡｃｃｕＴａｑ（シグマ社製）  ２  μＬ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  １  μＬ
フォワードプライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ）  １．２  μＬ
リバースプライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ）  １．２  μＬ
Ｔｅｍｐｌａｔｅ（１０ｎｇ／μＬ）  ０．５  μＬ
ｄＨ２Ｏ  １３．９  μＬ
ＡｃｃｕＴａｑ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ）  ０．２  μＬ
Ｔｏｔａｌで２０  μＬ
【００７１】
フォワードプライマー：５’−ＴＣＡＣＡＴＧＴＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＧＴＴＡＴＣ−３’（配列番号９）
Ｓ−ｐｒｉｍｅｒ（Ｇ）−１０−ＱＬ：５’−ＡＡｇＡＡＴＡＡＡＴＡＡｇＣＣＡｇＴＴＧｇＴＴＡＣｇＣＣＣＣＴｇＡＴＣ−３’（配列番号２７）
反応条件は９８℃３０秒間、次に９４℃５秒間、６０℃２０秒間、及び６８℃９０秒間を３０サイクル、最後に６８℃１０分間とした。次に同じ反応条件でＧ７５に変異を有する改変型遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行い、上記と同じ領域の部分増副産物を得た。ここで、表６からわかるようにＧ７５部位、Ｑ１６８部位、Ｌ１６９部位のアミノ酸置換の組み合わせは１６通り存在する。これらすべての組み合わせに対応する部分増副産物は、図４に示した８種類のプライマー（Ｓ−ｐｒｉｍｅｒ（Ｇ）−１０−ＱＬ〜Ｓ−ｐｒｉｍｅｒ（Ｇ）−１０−ＹＦ）を用い、野生型と改変型の２種の遺伝子を鋳型にした遺伝子増幅反応を行うことによって調製された。得られた部分増幅産物を図５の混合比で混合して断片１（断片１、図４を参照）を得た。断片２から断片５（断片２、断片３、断片４、断片５、図４を参照）は、断片１の場合と同様の要領で、図４に示したプライマーを利用して得られる遺伝子増幅産物を図５にそれぞれ示される比率で混合することにより調製された。
【００７２】
次に上述の各断片を等量ずつ混合し、以下の表８に示す溶液組成においてＰＣＲを行った。反応条件は９８℃３０秒間、次に９４℃５秒間、６０℃２０秒間、及び６８℃２分間を５サイクルとした。ＰＣＲ反応終了後、２．４μＬずつの上記プライマー（１０  ｐｍｏｌ／μＬ）（配列番号７及び８）を添加し、再度ＰＣＲを行った。このときの反応条件は９４℃５秒間、次に６０℃２０秒間、及び６８℃２分間を２５サイクル、最後に７２℃１０分間とした。
【００７３】
【表８】
混合された断片    Ｘ  μＬ
１０×ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＡｃｃｕＴａｑ（シグマ社製）  ２  μＬ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  １  μＬ
ｄＨ２Ｏ  （１４．４−Ｘ）  μＬ
ＡｃｃｕＴａｑ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ）  ０．２  μＬ
Ｔｏｔａｌで１７．６  μＬ
【００７４】
以上の操作によって得られた改変型遺伝子のライブラリーをＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで切断し、ｐＵＫ−ＧＤＨＢ（Ｓ）の野生型遺伝子と入れ替え、大腸菌を形質転換した。形質転換体のコロニーを実施例８に示した方法で培養した後、ＰＱＱＧＤＨ活性及び基質特異性を指標としてスクリーニングを行った。基質特異性の向上が見られたクローンについてはそれが保有する改変型ＰＱＱＧＤＨの塩基配列を決定した。その結果、図６の表に示すように、置換されるアミノ酸の組合わせが異なる複数の改変型ＰＱＱＧＤＨが得られたことが判明した。尚、図６の表においてＧ７５（ＧＧＡ）等の記号は、数字で特定されるアミノ酸位置が数字の左側のアルファベット一文字で特定されるアミノ酸であることを意味する。またカッコ内は当該アミノ酸をコードする塩基配列を表す。一方、Ｐｈｅ（ＴＴＴ）等はそれが位置する列の最上段に記載された記号（例えばＬ１９４（ＣＴＧ））で特定されるアミノ酸位置が当該アルファベット３文字で特定されるアミノ酸に置換されていることを意味する。またカッコ内は当該アミノ酸をコードする塩基配列を表す。
【００７５】
これらの改変型ＰＱＱＧＤＨを保有する各形質転換体を実施例７に示した方法と同様の方法で精製した後、各基質に対する反応性を測定した。測定結果を図６の表の右欄に示した。この表から明らかなように、取得された改変型ＰＱＱＧＤＨは野生型に比較していずれもマルトースに対する反応性が顕著に低下している。また、ラクトースに対する反応性についても同様の低下が認められる。さらにガラクトースに対する反応性についてはいずれの改変型ＰＱＱＧＤＨにおいても大きく低下し、一部のものではその反応性の低下は著しい。このように、マルトース、ラクトース、及びガラクトースに対する反応性が顕著に低下した、即ち基質特異性に極めて優れた改変型ＰＱＱＧＤＨを取得することができた。この結果から図６の表に示されるアミノ酸位置の変異を組み合わせることにより、単独の変異の場合に比較して更に基質特異性に優れた改変型ＰＱＱＧＤＨを作製することができることが分った。
【００７６】
ここで、特にＮＯ．１改変体ではマルトースに対する反応性が野生型に比べて１／９にまで低下しており、同様にラクトースに対する反応性では約１／２、ガラクトースに対する反応性では約１／９にまでそれぞれ低下している。また、Ｎｏ．６改変体においてもマルトースに対する反応性が野生型に比べて１／２以下に低下していると同時に、ラクトースに対する反応性も低下し、ガラクトースに対する反応性についても約１／４に低下している。同様に、Ｎｏ．７改変体においてもマルトースに対する反応性が野生型に比べて約１／５にまで低下していると同時に、ラクトースに対する反応性も約１／２にまで低下し、ガラクトースに対しては実質的に反応性がないことがわかる。以上のように基質特異性の向上が特に顕著であったＮｏ．１、Ｎｏ．６及びＮｏ．７改変体におけるアミノ酸置換部位を比較すれば、第３４２番アミノ酸及び第３５１番アミノ酸の置換が基質特異性の向上に特に重要であることが示唆される。次いで、第２９５番アミノ酸の置換が重要であり、また第１９４番アミノ酸の置換も基質特異性の向上に大きく関与することが予想される。
【００７７】
本発明は、上記発明の実施の形態の説明に何ら限定されるものではなく、特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【００７８】
【発明の効果】
本発明で提供される改変型のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素はグルコースに対する基質特異性が高い。従って、かかる改変型の酵素を利用すれば高い精度でグルコースの定量が行える。
【００７９】
【配列表】
2004173538.tif 000005
2004173538.tif 000006
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１はアシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）由来のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素をコードする遺伝子の配列（シグナル領域は含まない）及びアミノ酸配列（シグナル領域は含まない）を示した図である。
【図２】図２はアシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）由来のピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素をコードする遺伝子の配列（シグナル領域を含む）及びアミノ酸配列（シグナル領域を含む）を示した図である。
【図３】図３は実施例において使用される発現ベクターｐＵＫ−ＧＤＨＢ（Ｓ）の構造を示す図である。
【図４】図４は実施例におけるミューテションスクランブリングで用いたプライマー及び増幅部位を示した表である。
【図５】図５はミューテーションスプランブリングにおける各ＤＮＡ断片の混合比率を示した表である。設定バイアス率を０．８  ：  Ｇ７５，  Ｇ２９５，  Ｍ３４２，  Ａ３５１、０．５  ：Ｑ１６８，  Ｌ１６９，  Ｗ３４７とした。尚、バイアス率とは、あるアミノ酸置換がＭｕｔａｔｉｏｎ  Ｓｃｒａｍｂｌｉｎｇ法によって導入される確率である。
【図６】図６は実施例のミューテーションスクランブリングによって得られた各種の改変型ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸置換位置、及び基質特異性をまとめた表である。
【図１】
2004173538.tif 000024
【図２】
2004173538.tif 000025
【図３】
2004173538.tif 000026
【図４】
2004173538.tif 000027
【図５】
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【図６】
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