(57)【要約】【課題】　本発明は天然ＧＬＰ−１分子に伴う血清の不安定性および血清の短い半減期の問題を解決する。【解決手段】　本発明は、ＧＬＰ−１分子と共沈澱できる２価の金属陽イオンと結合したＧＬＰ−１分子からなる新規複合体を提供する。更に、本発明は、哺乳動物、特にヒトにおける成人発症真性糖尿病の治療法として、ランゲルハンス島Ｂ型細胞におけるインスリン発現を増強させるための該複合体の使用法および医薬組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　Val8−ＧＬＰ−１(７−３７)ＯＨおよび１個の更なるアミノ酸置換を含む、ＧＬＰ−１化合物。
【請求項２】
　α−メチル−Ala８−ＧＬＰ−１(７−３６)ＮＨ２および１個の更なるアミノ酸置換を含む、ＧＬＰ−１化合物。
【請求項３】
　Gly8−Gln21−ＧＬＰ−１(７−３７)ＯＨおよび１個の更なるアミノ酸置換を含む、ＧＬＰ−１化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は薬化学および有機化学の分野に関しており、そして哺乳動物の膵臓ランゲルハンス島Ｂ型細胞からのインスリン発現を増強し、哺乳動物の成人発症真性糖尿病を治療するのに有用である新規化合物およびその医薬組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
　膵臓ランゲルハンス島の内分泌は血液輸送代謝物質（グルコース、アミノ酸、カテコールアミン等）だけでなく、局所的傍分泌の作用にもよる、複合制御下にある。主な膵臓ランゲルハンス島のホルモン（グルカゴン、インスリン、およびソマトスタチン）はそれらの特定の細胞型（各々Ａ、Ｂ、およびＤ細胞）間で相互作用して、前述の代謝物質が介在する分泌反応を調節する。インスリン分泌は主に血糖値によって調節されるが、ソマトスタチンはグルコース介在インスリン分泌反応を抑制する。インスリン分泌のランゲルハンス島間傍分泌調節を提示するのに加えて、腸内にインスリン分泌刺激因子が存在することを支持する証拠がある。この概念は、経口摂取されたグルコースは同等量の静脈内投与されたグルコースよりもインスリン分泌のより強力な刺激であるという観察から生じる。
【０００３】
　ヒトホルモンのグルカゴンは、膵臓のＡ細胞において産生される２９アミノ酸ペプチドホルモンである。このホルモンは構造的に関連したペプチド（例えば、セクレチン、ガストリック・インヒビトリー・ペプチド、バソアクティブ・インテスティナル・ペプチド、およびグリセンチン）の多重遺伝子族に属する。これらペプチドは糖質の代謝、消化管流動性、および分泌作用を様々に調節する。しかし、膵臓グルカゴンの主な認識された作用は、肝グリコーゲン分解および糖新生を促進し、結果血糖値が上昇することである。これに関して、グルカゴンの作用はインスリンの作用に拮抗する調節であり、真性糖尿病に伴う高血糖の一因となり得る［Lund, P. K.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79: 345-349 (1982)］。
【０００４】
　グルカゴンはインスリン産生細胞の表面上に在る特定のリセプターに結合できることが発見されている。これらリセプターに結合する際、グルカゴンはこれら細胞によるｃＡＭＰの速やかな合成を刺激する。次いで、cＡＭＰはインスリン発現を刺激することが発見されている［Korman, L. Y.ら、Diabetes, 34: 717-722 (1985)］。インスリンはグルカゴン合成を抑制するよう作用する［Ganong, W. F.、Review of Medical Physiology, Lange Publications, Los Altos, California, 273頁 (1979)］。従って、グルカゴン発現はインスリンによって綿密に、そして最終的に血清グルコース濃度によって調節されている。
【０００５】
　最初に、グルカゴン遺伝子は３６０塩基対の前駆体から翻訳されて、ポリペプチドのプレプログルカゴンを形成する［Lundら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79: 345-349 (1982)］。次いで、このポリペプチドはプロセシングされて、プログルカゴンを形成する。次に、プログルカゴンはグルカゴンとセカンド・ポリペプチドに切断されることが証明された［Patzelt, C.ら、Nature, 282: 260-266 (1979)］。続く研究によって、プログルカゴン分子はLys−Argジペプチド残基のすぐ後で切断されることが証明された［Lund, P. K.ら、Lopez, L. C.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 5485-5489 (1983)、およびBell, G. I.ら、Nature, 302: 716-718 (1983)］。チャンネルナマズ（Ictalurus punctata）によって産生されたプログルカゴンの研究は、該動物由来のグルカゴンもまた隣接したLys−Argジペプチド残基の後ろでタンパク質分解的に切断されることを示した［Andrews, P. C.ら、J. Biol. Chem., 260: 3910-3914 (1985)、Lopez, L. C.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 5485-5489 (1983)］。哺乳動物プログルカゴンはLys−ArgまたはArg−Argジペプチドで切断されることが発見され、プログルカゴン分子はグルカゴン、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、およびグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）と称される、３つの個別的かつ高い相同性をもつペプチド分子を含有することが証明された［Bell, G. I.ら、同上］。Lopezらは、グルカゴン様ペプチド１は３７アミノ酸残基長であり、グルカゴン様ペプチド２は３４アミノ酸残基長であると結論した。ラットのプレプログルカゴンの構造の類似した研究は、隣接したLys−ArgまたはArg−Argジペプチド残基間でのタンパク質分解的切断の結果、グルカゴン、ＧＬＰ−１、およびＧＬＰ−２を形成するという同様のパターンを示した［Heinrich, G.ら、Endocrinol., 115: 2176-2181 (1984)］。ヒト、ラット、ウシ、およびハムスターのＧＬＰ−１配列は同一であることが発見されている［Ghiglione, M.ら、Diabetologia, 27: 599-600 (1984)］。
【０００６】
　Lopezらが達したＧＬＰ−１のサイズに関する結論は、Uttenthal, L. O.らの研究［J. Clin. Endocrinol. Metabol., 61: 472-479 (1985)］によって確証された。Uttenthalらはヒト膵臓に存在するＧＬＰ−１の分子形態を調べた。彼等の調査によって、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２が各々３７アミノ酸および３４アミノ酸ペプチドとして膵臓に存在することが示されている。
【０００７】
　ＧＬＰ−１およびグルカゴン間の類似性は、初期の研究者に、ＧＬＰ−１が生物学的活性を有するかもしれないということを示唆した。何人かの研究者は、ＧＬＰ−１がラットの脳細胞を誘発してｃＡＭＰを合成できることを発見したが［Hoosein, N. M.ら、Febs Lett., 178: 83-86 (1984)］、他の研究者は、ＧＬＰ−１についての生理学的役割を同定することに失敗した［Lopez, L. C.ら］。ＧＬＰ−１の生理学的役割の同定の失敗によって、何人かの研究者は、ＧＬＰ−１は実際にホルモンであるか否か、グルカゴンおよびＧＬＰ−１間の関連は人工的であるか否かという疑問を抱いた。
【０００８】
　また、ＧＬＰ−１(７−３７)の変異体およびその類似体が開示されている。これら変異体および類似体には、例えば、Gln９−ＧＬＰ−１(７−３７)、Ｄ−Gln９−ＧＬＰ−１(７−３７)、アセチル−Lys９−ＧＬＰ−１(７−３７)、Thr１６−Lys１８−ＧＬＰ−１(７−３７)、Lys１８−ＧＬＰ−１(７−３７)等が含まれ、その誘導体には、例えば、酸付加塩、カルボン酸塩、低級アルキルエステル、およびアミドが含まれる［例えば、国際公開 91／11457号を参照］。一般に、種々の開示された形態のＧＬＰ−１はインスリンの分泌を刺激し（インスリン分泌刺激作用）、ｃＡＭＰの形成を刺激することが知られている［例えば、Mojsov, S.、Int. J. Peptide Protein Research, 40: 333-343 (1992)を参照］。
【０００９】
　より重要なことには、多数の著者が、外因的投与のＧＬＰ−１［特に、ＧＬＰ−１(７−３６)ＮＨ２およびＧＬＰ−１(７−３７)］に対する哺乳動物（特に、ヒト）のインスリン分泌刺激反応と研究室の実験間の関係を証明した［例えば、Nauck, M. A.ら、Diabetologia, 36: 741-744 (1993)；Gutniak, M.,ら、New England J. of Medicine, 326 (20): 1316-1322 (1992)；Nauck, M. A.ら、J. Clin. Invest., 91: 301-307 (1993)；および Thorens, B.ら、Diabetes, 42: 1219-1225 (1993)を参照］。
【００１０】
　特に、成人発症糖尿病における高血糖の原因であると同定された基本的欠陥は、内因性インスリン分泌の低減ならびに筋肉および肝臓によるインスリン作用への抵抗である［Galloway, J. S.、Diabetes Care, 13: 1209-1239 (1990)］。後者の欠陥の結果、肝臓からグルコースが過剰に産生される。従って、正常な個体は約２mg／kg／分の速度でグルコースを放出するのに対し、成人発症糖尿病の患者においては、この量が通常２.５mg／kg／分を超過し、その結果少なくとも７０g／２４時間のグルコースの正味の過剰となる。グリコヘモグロビン測定によって示されるように、肝グルコース産生、空腹時血糖値、および全代謝制御間の非常に高い相互関係が存在するという事実［Galloway, J. A.、同上；および Galloway, J. A.ら、Clin. Therap., 12: 460-472 (1990)］によって、空腹時血糖値の調節が、高血糖の余病を予防するのに十分な代謝の全面的正常化を達成するのに不可欠であるということが容易に明白となる。有意な高インスリン血症および低血糖を生じることなしに、インスリンの現形態が肝グルコース産生を正常化することはめったにないという事実［Galloway, J. A.、および Galloway, J. A.ら、同上］の観点から、別のアプローチが必要である。
【００１１】
　２倍の正常血清濃度を生じさせるためのＧＬＰ−１(７−３６)ＮＨ２の静脈内注入によって、以下の表に示した作用が生じることが証明されている。
【００１２】
（表１）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　正常対象　　　成人発症糖尿病患者
食事時血糖(1)　　　　　　　　　　　　　　変化なし　　　　　　減少
空腹時血糖(2)　　　　　　　　　　　　　　　−　　　　　　　　減少
空腹時グルカゴン(2)　　　　　　　　　　　　−　　　　　　　　減少
食事後グルカゴン(1)　　　　　　　　　　　　−　　　　　　　　減少
食事に応答した内因性インスリン分泌(1)　　変化なし　　　　　　増加
遊離脂肪酸　　　　　　　　　　　　　　　 減少(3)　　　　　　 減少(2)　   
(1) Gutniak, M.ら、同上。
(2) Nauck, M. A.ら、Diabetologia，同上。
(3) Orskov, C.ら、Diabetes, 42: 658-661 (1993)。
【００１３】
　しかし、ＧＬＰ−１、特に哺乳動物に投与するための医薬組成物の成分としてのＧＬＰ−１の長期安定性は疑わしい。実際、４℃という低温度で保存する際、試料調製後１１カ月という早期にＧＬＰ−１(７−３７)の副産物が見いだされている［Mojsov, S.、同上］。従って、そのような治療を必要とする哺乳動物に安全に投与し得る、より安定なＧＬＰ−１化合物の必要性が存在する。
【００１４】
　さらに、ＧＬＰ−１分子、特にジペプチジル−ペプチダーゼIV（ＤＰＰIV）活性の影響を受けるＧＬＰ−１分子の生物学的半減期はかなり短い。例えば、ＧＬＰ−１(７−３７)の生物学的半減期は、ほんの３〜５分であり、さらに哺乳動物への非経口投与につづく迅速な吸収の影響を受ける。従って、非経口投与につづく吸収を遅延させるＧＬＰ−１化合物の必要性もまた存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
　従って、本発明は天然ＧＬＰ−１分子に伴う血清の不安定性および血清の短い半減期の問題を解決する。さらに、本発明の化合物は非経口投与につづく遅延吸収を提供し、その結果、延長された生物学的半減期を有するだろう。また、本発明の化合物の医薬組成物、ならびに該化合物の使用方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
　本発明は、構造式：
【００１７】
　Ｒ１−Ｘ−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Val−Ser−Ser−Tyr−
　Leu−Ｙ−Gly−Gln−Ala−Ala−Lys−Ｚ−Phe−Ile−Ala−Trp−Leu−
　Val−Lys−Gly−Arg−Ｒ２
［式中、Ｒ１はＬ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、脱アミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、およびα−メチル−ヒスチジンからなる群から選択され；
　ＸはAla、Gly、Val、Thr、Ile、およびα−メチル−Alaからなる群から選択され；
　ＹはGlu、Gln、Ala、Thr、Ser、およびGlyからなる群から選択され；
　ＺはGlu、Gln、Ala、Thr、Ser、およびGlyからなる群から選択され；
　Ｒ２はＮＨ２、およびGly−ＯＨからなる群から選択される］
【００１８】
　で示される化合物と結合し、かつ該化合物と共沈澱することができる、２価の金属陽イオンを含む複合体を提供する（但し、該化合物は約６.０〜９.０の範囲内の等電点を有し、さらにＲ１がHis、ＸがAla、ＹがGlu、およびＺがGluである時、Ｒ２はＮＨ２でなければならない）。
【００１９】
　また本発明は、１またはそれ以上の薬学的に許容し得る担体、希釈剤、または賦形剤と共に、本発明の化合物を含有する医薬組成物を提供する。
　さらに本発明は、哺乳動物の膵臓ランゲルハンス島Ｂ型細胞に有効量の本発明の化合物を供給することからなる、インスリンの発現を増強するための方法、ならびに治療を必要とする哺乳動物に有効量の本発明の化合物を投与することからなる、成人発症真性糖尿病の治療法を提供する。
【００２０】
　本発明の態様の１つは、約６.０〜９.０の範囲内の等電点を有し、２価の金属陽イオンと複合したＧＬＰ−１分子からなる複合体を提供する。
　本明細書中に用いるように、用語「ＧＬＰ−１分子」は天然型ＧＬＰ−１(７−３６)ＮＨ２、ＧＬＰ−１(７−３７)、天然および非天然の機能的類似体ならびにその誘導体、そしてその塩を指す。ＧＬＰ−１(７−３６)ＮＨ２のアミノ酸配列は当分野において周知であるが、読者に好都合なように以下に示す：
【００２１】
　His７−Ala−Glu−Gly１０−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp１５−Val−Ser−Ser−
　Tyr−Leu２０−Glu−Gly−Gln−Ala−Ala２５−Lys−Glu−Phe−Ile−Ala３０−
　Trp−Leu−Val−Lys−Gly３５−Arg−ＮＨ２
【００２２】
　ＧＬＰ−１(７−３７)の場合、Arg３６のカルボキシ末端アミド官能基はＧＬＰ−１(７−３６)ＮＨ２分子の第３７位でGlyと置換される。
【００２３】
　さらに、ＧＬＰ−１(７−３６)ＮＨ２およびＧＬＰ−１(７−３７)分子の多数の保護、非保護、および部分的保護された天然および非天然官能類似体および誘導体の存在と調製は、当分野で開示されている［例えば、米国特許第5,120,712号および第5,118,666号（これらは本明細書の一部を構成する）、および Orskov, C.ら、J. Biol. Chem., 264 (22): 12826-12829 (1989)、および国際公開 91／11457号（Buckley, D. I.ら、1991年8月8日公開）を参照］。
【００２４】
　当分野で既知のように、アミノ酸残基は、アミノ基およびカルボキシ基の両方が適当な保護基を有している保護された形態、アミノ基もしくはカルボキシ基のいずれかが適当な保護基を有している部分的に保護された形態、またはアミノ基もしくはカルボキシ基のいずれも適当な保護基を有していない非保護形態であってよい。このような保護基の形成および除去についての数多くの反応は多くの標準的著作に記載されている［例えば、「プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・ケミストリー(Protective Groups in Organic Chemistry)」Plenum Press(LondonおよびNew York, 1973)；Green, T. H.「プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス(Protective Groups in Organic Synthesis)」Wiley(New York, 1981)；および「ザ・ペプチド(The Peptides)」第１巻、SchroederおよびLuebke、Academic Press(LondonおよびNew York, 1965)］。
　代表的アミノ保護基には、例えば、ホルミル、アセチル、イソプロピル、ブトキシカルボニル、フルオレニルメトキシカルボニル、カルボベンジルオキシ等が含まれる。
　代表的カルボキシ保護基には、例えば、ベンジルエステル、メチルエステル、エチルエステル、t−ブチルエステル、p−ニトロフェニルエステル等が含まれる。
【００２５】
　アミノ基およびカルボキシ基の両方が適当な保護基を有している保護形態に加えて、用語「保護された」はまたジペプチジル−ペプチダーゼIV活性に耐性であるかまたはこの活性を阻害するＧＬＰ−１分子を指す［例えば、Mentlein, R.ら、Eur. J. Biochem., 214: 829-835 (1993)を参照］。ＧＬＰ−１(７−３６)ＮＨ２に加えて、ＤＰＰIV活性から保護されている分子が好ましく、Gly８−ＧＬＰ−１(７−３６)ＮＨ２、Val８−ＧＬＰ−１(７−３７)ＯＨ、α−メチル−Ala８−ＧＬＰ−１(７−３６)ＮＨ２、およびGly８−Gln２１−ＧＬＰ−１(７−３７)ＯＨがより好ましい。
【００２６】
　天然型ＧＬＰ−１分子の誘導体は、天然型配列を断片化することによって得られる、または天然型アミノ酸配列をコードする遺伝物質（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の天然型アミノ酸配列の配列についての知識を基に合成されるペプチドである。用語「誘導体」は天然または非天然ＧＬＰ−１分子の化学的修飾物をも含む。これら誘導体の調製法は当分野の有機およびペプチド化学者に周知である［例えば、国際公開 91／11457号（同上）を参照］。
【００２７】
　本発明のＧＬＰ−１分子には、原配列には存在しない１またはそれ以上のアミノ酸が追加または削除されているＧＬＰ−１(７−３６)ＮＨ２およびＧＬＰ−１(７−３７)の類似体、ならびにその誘導体をも含む。特に、分子の全体の等電点が約６〜９の範囲内である限り、Hisおよび脱アミノ−HisがＲ１に好ましい。分子の全体の等電点が約６〜９の範囲内である限り、Ala、Gly、およびValが「Ｘ」位にあるのが好ましい。同様に、分子の全体の等電点が約６〜９の範囲内である限り、GluおよびGlnが「Ｙ」位にあるのが好ましい。また、分子の全体の等電点が約６〜９の範囲内である限り、GluおよびGlnが「Ｚ」位にあるのが好ましい。最後に、分子の全体の等電点が約６〜９の範囲内である限り、Gly−ＯＨがＲ２に好ましい。
【００２８】
　さらに、本発明はＧＬＰ−１分子の塩形態を包含する。本発明のＧＬＰ−１は十分に酸性の、十分に塩基性の、または両方の官能基を有することができ、従って多くの無機塩基、ならびに無機および有機酸のいずれとも反応して塩を形成し得る。酸付加塩を形成するのに一般に用いられる酸は、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸などであり、および有機酸、例えば、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、p−ブロモフェニル−スルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸などである。このような塩の例には以下に挙げる塩が含まれる：硫酸塩、ピロ硫酸塩、硫酸水素塩、亜硫酸塩、次亜硫酸塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオール酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１,４−二酸塩、ヘキシン−１,６−二酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、γ−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、マンデル酸塩など。好ましい酸付加塩は、塩酸および臭化水素酸のような鉱酸、および特に塩酸と形成した酸付加塩である。
【００２９】
　塩基付加塩には、無機塩基、例えば、水酸化アンモニウムまたはアルカリもしくはアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩などから誘導された塩基付加塩が含まれる。従って、本発明の塩の調製に有用な塩基には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウム等が含まれる。この塩形態は特に好ましい。
　勿論、本発明の化合物が薬物治療目的のために使用される際に、これら化合物は塩の形態であってもよいが、この塩は薬学的に許容されねばならない。
【００３０】
　こうして、本発明のＧＬＰ−１分子は、中でも、インスリン分泌刺激活性を機能的に示すＧＬＰ−１を包含する。用語「インスリン分泌刺激活性」は、ホルモンインスリンの合成または発現を刺激する、またはその刺激を引き起こす、物質の能力を指す。
　化合物のインスリン分泌刺激特性は、該化合物を動物細胞に供給する、または該化合物を動物に注射し、各々、動物の媒質または循環系への免疫反応性インスリン（ＩＲＩ）放出をモニターすることによって決定される。ＩＲＩの存在は、特異的にインスリンを検出できるラジオイムノアッセイの使用によって検出される。
【００３１】
　ＩＲＩの存在を検出できる任意のラジオイムノアッセイを使用できるが、Albano, J. D. M.らの改良検定法［Acta Endocrinol., 70: 487-509 (1972)］を使用するのが好ましい。この改良法において、ｐＨ７.４のリン酸／アルブミン緩衝液を使用する。インキュベート物を、リン酸緩衝液（５００μL）、灌流試料または灌流液中の標準ラット・インスリン（５０μL）、抗インスリン抗血清（１００μL、Wellcome Laboratories；１：４０,０００希釈）、および[１２５Ｉ]インスリン（１００μL）を連続的に加えて調製し、１０×７５mmの使い捨てガラス試験管中に総量７５０μLを得る。４℃で２〜３日間のインキュベーション後、遊離インスリンを抗体結合インスリンから活性炭分離によって分離する。この検定感受性は１〜２μU／mLである。組織培養物中で増殖した細胞の細胞培養培地中へのＩＲＩ放出を測定するために、プロインスリン中に放射活性ラベルを組み込むのが好ましい。ポリペプチドをラベルできる任意の放射活性ラベルを使用できるが、ラベルされたプロインスリンを得るためには３Ｈロイシンを使用するのが好ましい。検出可能なラベルされたプロインスリン分子プールを形成させるのに十分な任意の期間でラベルすることができるが、６０分間放射活性ラベルの存在下で細胞をインキュベートするのが好ましい。
【００３２】
　インスリンを発現できる多くのセルラインを、化合物がインスリン分泌刺激作用を有するか否か決定するために使用できるが、ラット・インスリノーマ細胞、および特にＲＩＮ−３８ラット・インスリノーマ細胞を使用するのが好ましい。このような細胞を任意の適当な培地中で増殖し得るが、０.１％ＢＳＡおよび２５mＭグルコースを含有するＤＭＥ培地を使用するのが好ましい。
【００３３】
　また、化合物のインスリン分泌刺激特性を膵注入によって測定できる。インサイトゥで単離；灌流したラット膵臓の調製を、Penhos, J. C.らの改良法［Diabetes, 18: 733-738 (1969)］によって行なう。絶食させた雄性Charles River種アルビノラット（体重３５０〜６００g）を、Amytal Sodium（Eli Lilly and Co.：１６０ng／kg）の腹腔内注射でもって麻酔する。腎、副腎、胃、および下部結腸血管を結紮する。全腸を約４cmの十二指腸ならびに下行結腸および直腸を除いて切除する。故に、腸の小部分のみを灌流し、グルカゴン様免疫反応性をもつ腸物質によって起こり得る妨害を最小限にする。この灌流液は、４％デキストランＴ７０および０.２％ウシ血清アルブミンを含有する改良クレブス−リンゲル重炭酸塩緩衝液（分画Ｖ）であり、９５％Ｏ２および５％ＣＯ２を吹き込む。脈動流には４チャンネルのローラーベアリングポンプ（Buchler polystatic, Buchler Instruments Division, Nuclear-Chhicago Corp.）を用い、そして一灌流源から別の灌流源への切り替えを３点調節弁を切り替えることによって行なう。灌流を実施し、モニターし、そして分析する方法は、Ｗeir, Ｇ. Ｃ.らの方法［J. Clin. Inestigat., 54: 1403-1412 (1974)］（これは本明細書の一部を構成する）に従う。
【００３４】
　本発明のＧＬＰ−１分子は、アミノ末端にヒスチジン官能性を有することが必要とされる。また、本発明のＧＬＰ−１分子は、必要とされたヒスチジン官能性の代わりに修飾ヒスチジン官能性を有してもよい。
　用語「修飾ヒスチジン」は、化学的もしくは生物学的に変えられているヒスチジン官能性、または新たに合成されたが、その金属結合特性を保持している変えられたヒスチジン官能性を指す。
　数多くの修飾ヒスチジン官能性およびそれらの調製は当分野において既知であり、例えば、Ｄ−ヒスチジン［国際公開 91/11457号］、脱アミノ−ヒスチジン［国際公開 92/18531号］、２−アミノ−ヒスチジン［Levine-Pinto, H.ら、Biochem. Biophys. Res. Commun., 103 (4): 1121-1130 (1981)］、β−ヒドロキシ−Ｌ−ヒスチジン［Owa, Tら、Chemistry Letters, 1873-1874頁 (1988)］、Ｌ−ホモヒスチジン［Altman, J.ら、Synthetic Commun., 19 (11および12): 2069-2076(1989)］、α−フルオロメチル−ヒスチジン［米国特許第4,347,374号］、およびα−メチルヒスチジン［O'Donnell, M. J.、Synthetic Commun., 19 (7および8): 1157-1165 (1989)］が含まれる。
【００３５】
　さらに、本発明のＧＬＰ−１分子は、約６.０〜９.０の範囲内の等電点を有することが必要とされる。この範囲内の等電点を有する数多くのＧＬＰ−１分子が開示されており、例えば以下に挙げるものが含まれる：
【００３６】
　ＧＬＰ−１(７−３６)ＮＨ２
　Gly８−ＧＬＰ−１(７−３６)ＮＨ２
　Gln９−ＧＬＰ−１(７−３７)
　Ｄ−Gln９−ＧＬＰ−１(７−３７)
　アセチル−Lys９−ＧＬＰ−１(７−３７)
　Thr９−ＧＬＰ−１(７−３７)
　Ｄ−Thr９−ＧＬＰ−１(７−３７)
　Asn９−ＧＬＰ−１(７−３７)
　Ｄ−Asn９−ＧＬＰ−１(７−３７)
　Ser２２−Arg２３−Arg２４−Gln２６−ＧＬＰ−１(７−３７)
　Thr１６−Lys１８−ＧＬＰ−１(７−３７)
　Lys１８−ＧＬＰ−１(７−３７)
　Arg２３−ＧＬＰ−１(７−３７)
　Arg２４−ＧＬＰ−１(７−３７)など
　［例えば、国際公開 91／11457号（同上）を参照］。
【００３７】
　さらに、本発明のＧＬＰ−１分子は、ヒスチジン官能性の代わりに各々の上述した修飾ヒスチジン官能性を有する際に、上記定義した範囲内におさまる等電点を有する。他のＧＬＰ−１分子の等電点の計算方法または実験的測定法は当業者に知られている。
【００３８】
　また、本発明のＧＬＰ−１分子の調製法は当分野のペプチド化学者に周知である。
　方法の１つでは、ＧＬＰ−１分子を周知の固相ペプチド合成系によって調製する［Merrifield, J. M.、Chem. Soc., 85: 2149(1962)、およびStewartとYoung, Solid Phase Peptide Synthesis, 24-66頁, Freeman(San Francisco, 1969)］。しかし、例えば、タンパク質分解酵素を用いて天然型アミノ酸配列を断片化することによって、プログルカゴンポリペプチドのまたはＧＬＰ−１(１−３７)のフラグメントを得ることもまた可能である。さらに、Maniatis、 T.らによって開示されているように［Molecular Biology：A Laboratory Manual, CHS(Cold Spring Harbor, 1982)］、組換えＤＮＡ技術の使用によりプログルカゴンペプチドまたはＧＬＰ−１(１−３７)の所望のフラグメントを得ることが可能である。
【００３９】
　さらに、現時点の水準の分子生物学において、本発明の化合物を得ることのできる別の方法が当業者に提供されている。該化合物を固相ペプチド合成法または組換え法によって産生することができるが、高収率が可能であることから組換え法がより好ましい。組換え体産生の基本工程を以下に示す：
ａ）ＧＬＰ−１分子をコードする天然ＤＮＡ配列を単離するか、ＧＬＰ−１分子についての合成または半合成ＤＮＡコード配列を構築し、
ｂ）単独でか融合タンパク質としてのいずれかでタンパク質を発現するのに適当な方法で、コード配列を発現ベクター中に組み込み、
ｃ）発現ベクターでもって適当な真核または原核宿主細胞を形質転換し、
ｄ）ＧＬＰ−１分子を発現させるであろう条件下で形質転換宿主細胞を培養し、そして
ｅ）組換え産生ＧＬＰ−１分子を回収し精製する。
【００４０】
　前述のように、このコード配列は全くの合成物であるか、または大きい天然のグルカゴンをコードするＤＮＡの修飾の産物であってもよい。プレプログルカゴンをコードするＤＮＡ配列は、Lundらによって示されており［Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79: 345-349 (1982)］、所望の結果を得るために天然配列を変えることによる本発明の化合物の半合成産生において、出発物質として用いてもよい。
【００４１】
　インビトロまたはインビボでの転写および翻訳がＧＬＰ−１分子産生という結果になる合成遺伝子を、当分野で周知の技術によって構築し得る。遺伝コードの自然縮重のために、全部がＧＬＰ−１分子をコードする、かなり多数だが限定数のＤＮＡ配列が構築され得ることを、当業者は認識するであろう。
　合成遺伝子構築の方法は当分野において周知である［Brownら(1979)、Methods in Enzymology, Academic Press, N. Y., 第68巻, 109-151頁を参照］。ＧＬＰ−１分子をコードするＤＮＡ配列を、本明細書に開示したアミノ酸配列を基に設計することができる。一度設計すると、Ｍodel３８０Ａまたは３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザー（PE-Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404）のような通常のＤＮＡ合成装置を用いて配列自身を生成することができる。
【００４２】
　ＧＬＰ−１分子を発現させるために、適当な制限エンドヌクレアーゼの使用によって、操作した合成ＤＮＡ配列を多くの適当な組換えＤＮＡ発現ベクターのいずれかに挿入する［Maniatisら(1989)、Molecular Cloning；A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, N. Y., 第1-3巻を一般に参照］。制限エンドヌクレアーゼ切断部位を、ＧＬＰ−１分子をコードするＤＮＡのどちらの末端にも作成して、既知の増幅および発現ベクターからの単離、および該ベクター中への組み込みを容易にする。使用する特定のエンドヌクレアーゼは、使用すべき親発現ベクターの制限エンドヌクレアーゼ切断パターンによって用を決定されるであろう。制限部位の選択は、制御配列と共にコード配列を適切に方向づけて、適切な枠内を読み、そして標的のタンパク質を発現させるように選択する。コード配列は発現ベクターのプロモーター部位およびリボソーム結合部位（両部位はタンパク質を発現させる宿主細胞において機能的である）と共に適切な読み枠内に在るように位置しなければならない。
　合成遺伝子を効率よく転写させるために、該合成遺伝子をプロモーター−オペレーター領域に機能的に結合しなければならない。故に、合成遺伝子のプロモーター−オペレーター領域を合成遺伝子のＡＴＧ開始コドンに関して同じ配列方向に置く。
【００４３】
　原核および真核細胞を形質転換するのに有用な種々の発現ベクターは当分野において周知である［The Promega Biological Research Products Catalogue (1992)(Promega Corp., 2800 Woods Hollow Road, Madison, WI, 53711-5399)；およびThe Stratagene Cloning Systems Catalogue (1992)(Stratagene Corp., 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA, 92037)を参照］。また、高レベルでＥ.coliにおいて外因性遺伝子を発現させるのに有用な、環状ＤＮＡプラスミド形質転換ベクターが開示されている［米国特許第4,710,473号］。これらプラスミドは組換えＤＮＡ法における形質転換ベクターとして有用であり、そして
（ａ）プラスミドに宿主細胞における自律複製能力を与え；
（ｂ）宿主細胞培養物を維持する温度に関して、自律プラスミド複製を制御し；
（ｃ）宿主細胞集団中のプラスミドの維持を安定させ；
（ｄ）宿主細胞集団中のプラスミド維持を表すタンパク質産物の合成を命令し；
（ｅ）プラスミドに独特の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を連続して与え；
（ｆ）mＲＮＡ転写を終結させる。
　これら環状ＤＮＡプラスミドは、外因性遺伝子の高レベルの発現を保証するための組換えＤＮＡ法におけるベクターとして有用である。
【００４４】
　ＧＬＰ−１分子のための発現ベクターを構築したら、次の工程はベクターを適当な細胞に組み入れ、それによってポリペプチド発現に有用な組換え宿主細胞を構築することである。組換えＤＮＡベクターにより細胞を形質転換する技術は、当分野において周知であり、Maniatisら記載［同上］のような一般文献に見い出される。作成される宿主細胞は真核または原核細胞のいずれかから構築される。
　普通、原核宿主細胞はタンパク質を高速度で産生し、かつ培養するのが容易である。高レベルの細菌発現系において発現するタンパク質は、高レベルの過発現タンパク質を含む顆粒または封入体に凝集する特徴をもつ。普通、このようなタンパク質凝集物を、当分野に周知の技術を用いて可溶化し、変性させ、そして再編成しなければならない［Kreugerら(1990)、Protein Folding, GieraschとKing編, 136-142頁, American Association for the Advancement of Science Publication No. 89-18S, Washington, D. C.；および米国特許第4,923,967号を参照］。
【００４５】
　一度所望のＧＬＰ−１分子を調製したら（但し、約６.０〜９.０の範囲内の等電点をもつ）、当分野で周知の方法により所望のＧＬＰ−１分子を２価の金属陽イオンと複合させることによって、本発明の複合体を調製する。このような金属陽イオンには、例えば、Ｚn＋＋、Ｍn＋＋、Ｆe＋＋、Ｃo＋＋、Ｃd＋＋、Ｎi＋＋等が含まれる。この金属陽イオンのうち、Ｚn＋＋が好ましい。
　普通、所望のＧＬＰ−１分子（所望の等電点を有する）を、適当な緩衝液および適当な形態の金属陽イオンの混合物と一緒にする。
　適当な緩衝液は、混合物を約ｐＨ６.０〜９.０の範囲で維持するが、反応を妨害しないであろう緩衝液である。好ましい緩衝液には、グッドの緩衝液、特にＨＥＰＥＳ、ならびにトリスおよび酢酸トリスが含まれる。
　適当な形態の金属陽イオンは、本発明のＧＬＰ−１分子と複合体を形成するのに利用できる、任意の形態の２価の金属陽イオンである。好ましくは、ＧＬＰ−１基質の各分子につき２価の金属陽イオン約５０分子までのモル比を得るように、塩化亜鉛のような２価の金属陽イオン塩を過剰に加える。
　本工程で使用する温度は、反応を完成させるのに十分な温度である。普通、反応は周囲温度で行なう。
　本反応の産物は、結晶または非結晶懸濁液であり、標準技術を用いて単離精製される。
【００４６】
　また本発明は、薬学的に許容し得る担体、希釈剤、または賦形剤と共に本発明の化合物を含んでなる医薬組成物を提供する。該医薬組成物は、医薬分野において周知の方法で調製され、個別にまたは他の治療物質と共に、好ましくは非経口経路によって投与される。特に好ましい経路には、筋肉内投与および皮下投与が含まれる。
　非経口１日投与量（好ましくは１回の１日投与量）は約１pg／kg体重〜１,０００μg／kg体重の範囲内であるが、それより少ないまたは多い投与量が投与され得る。必要とされる投与量は患者の症状の重度に依存し、そして患者の身長、体重、性別、年令、および治療歴のような評価基準に依存するであろう。
【００４７】
　本発明の組成物の調製において、活性成分は、少なくとも本発明の化合物の１つを含み、通常、賦形剤と混合するか、または賦形剤によって希釈される。賦形剤を希釈剤として用いる際、賦形剤はビークル、担体、または媒質として活性成分に作用する、固体、半固体、または液体物質であってもよい。
　製剤の調製において、他の成分と混合する前に、適当な粒子サイズを得るよう活性化合物を粉砕することが必要であるかも知れない。もし活性化合物が事実上不溶性であるなら、通常、約２００メッシュ未満の粒子サイズに粉砕する。もし活性化合物が事実上水溶性であるなら、通常、製剤中において事実上均一な分布が得られるよう粉砕することによって粒子サイズを調節する（例えば、約４０メッシュ）。
　適当な賦形剤のいくつかの例として、ラクトース、デキストロース、スクロース、トレハロース、ソルビトール、およびマンニトールが含まれる。本発明の組成物は、当分野において周知の方法を使用することによって、患者に投与された後、活性成分が迅速に、持続して、または遅延して放出されるよう製剤化することができる。
【００４８】
　本組成物は、各投与量が通常約５０μg〜１００mg、より普通には約１〜１０mgの活性成分を含有する、単位投与量形態に製剤化するのが好ましい。用語「単位投与量形態」は、各単位が、適当な医薬賦形剤と共に、所望の治療効果を産むよう計算して予め決められた量の活性物質を含有する、ヒト対象者および他の哺乳動物にとって１回の投与量として適当な、物理的に分離した単位を指す。
　非経口投与の目的のために、好ましくは、本発明の化合物を含有する組成物を蒸留水と混合し、約ｐＨ６.０〜９.０に調節する。
【００４９】
　作用の持続期間を調節するために、さらなる医薬方法を使用してもよい。放出制御調製を、本発明の化合物を複合または吸収するために重合体を用いることによって行ってもよい。放出を調節するために、適当な高分子（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレン−ビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、およびプロタミンサルフェート）、および高分子の濃度、ならびに取り込み方法を選択することによって輸送制御を行ってもよい。
　放出制御調製物によって作用の持続期間を調節する別の可能な方法は、本発明の化合物を重合物質、例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ(乳酸)またはエチレン−ビニルアセテート共重合体の粒子中に取り込むことである。
　別法として、化合物をこれら重合粒子に取り込む代わりに、例えば、コアセルベーション技術または界面重合（各々、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−ミクロカプセル）によって調製したミクロカプセル、またはコロイド・ドラッグ・デリバリー・システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョンに本発明の化合物を捕捉することが可能である。このような技術はＲemington's Ｐharmaceutical Ｓciences(1980)に開示されている。
【００５０】
　本発明の化合物はインスリン分泌刺激活性を有する。従って、本発明の別の態様は、哺乳動物膵臓ランゲルハンス島Ｂ型細胞に有効量の本発明の化合物を与えることからなる、インスリン発現を増強するための方法を提供する。
　同様に、本発明は、治療を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトに、有効量の本発明の化合物または組成物を投与することからなる、該哺乳動物における成人発症真性糖尿病を治療するための方法を提供する。
【００５１】
　（実施例）
　以下の実施例は本発明をさらに説明するためだけのものであり、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【実施例１】
【００５２】
　５つの異なるＧＬＰ−１分子の各々アリコートを、周知の固相ペプチド合成によって調製し、小バイアル中に凍結乾燥させた。種々の濃度の塩化亜鉛を含有する、ｐＨ７.４の０.１Ｍ ＨＥＰＥＳ（Ｎ−[２−ヒドロキシエチル]ピペラジン−Ｎ'−[２−エタンスルホン酸]）緩衝液をアリコートに滴下して、約０.１mg／mlのタンパク質濃度を得た。この試料を混合し、周囲温度（２２℃）で約１８時間保存した。次いで、この混合物を５分間遠心分離した（Fisher Model 235C ミクロ遠心機）。この透明な上清をチューブからピペットで吸い出した。この上清のタンパク質含量を分光光度計（Gilford 260）で２８０nmの吸光度を測定することにより算定した。１cmキュベットにおける２８０nmでの０.１mg／ml ＧＬＰ−１分子溶液の理論吸光度値は０.２０７である。この実験の結果を表２に示す。
【００５３】
（表２）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 
Ｚn／GLP-1分子　　　　　　　　　２８０nm 吸光度　　　　　　　　　　　　　
　モル比　 　GLP-1　　Gly８-GLP-1　Val８-GLP-1 α-メチル-　　Gly８-Gln２１-
　　　　 　(7-36)NH２　(7-36)NH２　(7-37)OH 　Ala８-GLP-1　GLP-1(7-37)OH
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　  　(7-36)NH２　　　　　　　　
　　0　　　　 0.172　　　0.136　　　 0.187　　　 0.163　　　　 0.167
　0.3　　　　0.099　　　0.079　　　 0.191　　　 0.134　　　　 0.113
　0.5　　　　0.057　　　0.070　　　 0.184　　　 0.098　　　　 0.082
　0.7　　　　0.035　　　0.058　　　 0.180　　　 0.079　　　　 0.069
　1.0　　　　0.039　　　0.057　　　 0.173　　　 0.076　　　　 0.065
　3.0　　　　0.048　　　0.044　　　 0.110　　　 0.055　　　　 0.055　　　 
【００５４】
　この実施例によって、これら希釈溶液から有意な部分のＧＬＰ−１分子と複合し、沈澱するために少量の亜鉛のみを必要とすることが示される。
【実施例２】
【００５５】
　ＧＬＰ−１(７−３６)ＮＨ２（５mg）を、亜鉛を含まない０.１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（pH７.４、２.５ml）に完全に溶解した。さらに、０.６mＭ 塩化亜鉛を含有する０.１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（pH７.４、２.５ml）を速やかに加えた。この試料中の亜鉛：ＧＬＰ−１(７−３６)ＮＨ２のモル比は約１：１である。この溶液は直ぐに白濁し、まもなく沈澱物を形成した。この混合物を周囲温度（２２℃）で１８時間保存した。
　この沈澱物はガラス・バイアルの底にしっかりと付着した。上清をピペットによって完全にデカンテーションした。次いで、沈澱物を０.０１Ｎ 塩酸（５.０ml）に完全に溶解した。２８０nmの吸光度を上清および再溶解沈澱物溶液の両方について測定した。これら溶液の亜鉛濃度を、原子吸光光度分析によって定量した。この実験の結果を表３に示す。
【００５６】
（表３）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　２８０nm吸光度　　亜鉛濃度(ppm)
上清（５mL）　　　　　　　　０.１１８　　　 ９.０２
再溶解沈澱物（５mL）　　　　１.９３２　　　 １３.３ 　　
【００５７】
　この実施例によって、亜鉛含有ＨＥＰＥＳ溶液を加えた際に、殆どのＧＬＰ−１(７−３６)ＮＨ２が溶液から沈澱することが示される。２８０nmの吸光度値１.９３２は、再溶解沈澱物のＧＬＰ−１(７−３６)ＮＨ２濃度が０.９３３mg／mL、または２８３μMであることを示す。この同じ溶液の亜鉛濃度（１３.３ppm）は亜鉛濃度２０３μＭに等しい。故に、沈澱物中の亜鉛：ＧＬＰ−１(７−３６)ＮＨ２のモル比は０.７１７：１であった。