(57)【要約】　　　（修正有）【課題】ウイルス因子を対象とする場合に比べてエスケープミュータントの出現効率が極めて低くなるような、宿主因子を標的とし宿主因子とウイルス因子の相互作用を阻害することができる、胞毒性の低い特異的抗ウイルス剤を開発し提供する。【解決手段】宿主細胞由来のトポイソメラーゼＩの一部のアミノ酸、特に、第２３６番目のグルタミン酸及び第２３７番目のアスパラギンの少なくとも一つ、好ましくは、これら２つのアミノ酸の双方に結合する化合物を選択することからなる、レトロウイルスに対する治療薬のスクリーニング方法、及び、宿主細胞由来のトポイソメラーゼＩの一部のアミノ酸に結合し、レトロウイルスの複製過程を阻害する化合物。【選択図】　　　　図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞由来のトポイソメラーゼＩの一部のアミノ酸に結合する化合物を選択することからなる、レトロウイルスに対する治療薬のスクリーニング方法。
【請求項２】
宿主細胞由来のトポイソメラーゼＩの第２３６番目のグルタミン酸及び第２３７番目のアスパラギンの少なくとも一つに結合する化合物を選択することからなる、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
宿主細胞由来のトポイソメラーゼＩの第２３６番目のグルタミン酸及び第２３７番目のアスパラギンの双方に結合する化合物を選択することからなる、請求項２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
宿主細胞がヒト由来である、請求項１ないし３のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
レトロウイルスがレンチウイルスである、請求項１ないし４のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
レンチウイルスが免疫不全ウイルスである、請求項５記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
免疫不全ウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）である、請求項６記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
レトロウイルスのプロウイルスＤＮＡを含むベクターを培養細胞に導入するステップを含むことを特徴とする、請求項１ないし７のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
培養細胞がヒト由来細胞株である、請求項項１ないし８のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
培養細胞から得られた上清で感染させた細胞が発現するベータガラクトシダーゼを定量することにより、ウイルス感染価を測定するステップを含む、請求項１ないし９のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
ベータガラクトシダーゼを発現する細胞が、ＭＡＧＩＣ５細胞である、請求項１０に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
宿主細胞由来のトポイソメラーゼＩの一部のアミノ酸に結合し、レトロウイルスの複製過程を阻害する化合物。
【請求項１３】
レトロウイルスの複製過程において、逆転写反応を阻害することを特徴とする、請求項１２記載の化合物。
【請求項１４】
レトロウイルスがレンチウイルスである、請求項１２又は１３記載の化合物。
【請求項１５】
レトロウイルスが免疫不全ウイルスである、請求項１４記載の化合物。
【請求項１６】
免疫不全ウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）である、請求項１５記載の化合物。
【請求項１７】
請求項１２ないし１６のいずれか一項に記載の化合物を活性成分として含有する医薬組成物。
【請求項１８】
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）治療薬であることを特徴とする、請求項１７記載の医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１７又は１８記載の医薬組成物を患者に投与することからなる、レトロウイルスが病因となる疾患の処置方法。
【請求項２０】
請求項１７又は１８記載の医薬組成物を患者に投与することからなる、後天性免疫不全症の処置方法。
【請求項２１】
請求項１７又は１８記載の医薬組成物を患者に投与することからなる、ヒト後天性免疫不全症の処置方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、宿主細胞由来のトポイソメラーゼＩの一部のアミノ酸に結合する化合物を選択することからなる、レトロウイルスに対する治療薬のスクリーニング方法、該スクリーニング方法によって確認された化合物、該化合物を活性成分として含有する医薬組成物、及び、該医薬組成物を投与することからなる後天性免疫不全症の治療方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＡＩＤＳ（Ａｃｑｕｉｒｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）はレトロウイルス属に属する１本領ＲＮＡウイルスであるＨＩＶ−１（Ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　１）の感染によって惹起される致死的疾患である。ＨＩＶ‐１は主に、宿主ＣＤ４陽性細胞に感染し宿主免疫不全状態を招く。
【０００３】
ＨＩＶ−１感染者は世界で３千万人を教え、アフリカ、南アジア、中国において爆発的な感染者増加を認める。ＨＩＶ−１感染後、治療を行わなければＡＩＤＳの発症が必発である。感染者が増加している環境においては感染予防に対するワクチンが必要であるが、ＨＩＶ−１のゲノムはウイルス遺伝子の組換えや突然変異（ミューテーション）が容易に生じてしまうことから、現在有効なワクチンは開発されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ＨＩＶ‐１感染者に対して逆転写酵素阻害剤とプロテアーゼ阻害剤治療が行われているが、長期加療におけるＨＩＶ−１の中和抵抗性変異株（エスケープミュータント）の出現が問題となっており、新たな抗ウイルス剤の開発が切に望まれている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
発明者らの研究室では１９９０年初頭より一貫してＨＩＶ−１の研究を継続しており、平成１０年からは科学技術振興事業団のＣＲＥＳＴ「脳を守る」プロジェクトの一員として、ウイルス脳症の治療法の確立を目指して研究を遂行している。
最近、発明者らはＨＩＶ‐１の宿主域は、ＨＩＶ‐１粒子内に取り込まれる宿主由来のトポイソメラーゼＩによって調節されていること、さらにトポイソメラーゼＩ構成アミノ酸のうち２３６番目のグルタミン酸、及び２３７番目のアスパラギンがこの調節の責任アミノ酸であることを見出した。
【０００６】
即ち、本発明は、第一の態様として、宿主細胞由来のトポイソメラーゼＩの一部のアミノ酸、特に、第２３６番目のグルタミン酸及び第２３７番目のアスパラギンの少なくとも一つ、好ましくは、これら２つのアミノ酸の双方に結合する化合物を選択することからなる、レトロウイルスに対する治療薬のスクリーニング方法に係る。
レトロウイルスには、ＲＮＡ腫瘍ウイルス、レンチウイルス、スプマウイルスの３つの亜科がある。レンチウイルスの代表的な例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２）等の免疫不全ウイルスを挙げることができる。
本発明のスクリーニング方法の一例において、ＲＮＡウイルス粒子は当業者に公知の適当な培養細胞にプロウイルスＤＮＡを含むベクターを導入するステップを含む。かかる培養細胞の例として、当業者に公知の任意のヒト由来細胞株、及びその他の哺乳動物細胞由来の細胞株を挙げることが出来る。
【０００７】
阻害効果を測定する方法自体は当業者に公知の任意の手段で行うことが出来る。このような手段の例として、例えば、上記の培養細胞から得られた上清で感染させた細胞が発現するベータガラクトシダーゼを定量することにより、ウイルス感染価を測定する方法を挙げることができる。このようなベータガラクトシダーゼを発現し得る細胞の例として、ＭＡＧＩＣ５細胞（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ　Ｎ，　Ｏｔｓｕｋａ　Ｎ，　Ｍａｔｓｕｏ　Ｋ，　Ｓｈｉｉｎｏ　Ｔ，　Ｋｏｊｉｍａ　Ａ，　Ｋｕｒａｔａ　Ｔ，　Ｓａｋａｉ　Ｋ，　Ｙａｍａｍｏｔｏ　Ｎ，　Ｉｓｏｍｕｒａ　Ｓ，　Ｄｈｏｌｅ　ＴＮ，　Ｔａｋｅｂｅ　Ｙ，　Ｍａｔｓｕｄａ　Ｍ，　Ｔａｔｓｕｍｉ　Ｍ．　Ａｎ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ＤＮＡ　ｃｌｏｎｅ　ｏｆ　ＨＩＶ　ｔｙｐｅ　１　ｓｕｂｔｙｐｅ　Ｃ．ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ　Ｈｕｍ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　１９９９　Ｓｅｐ　２０；１５（１４）：１３２１−４）がある。
尚、本発明のスクリーニング方法において使用する試薬類の種類、反応温度及び時間などの各種測定条件は当業者が適宜選択することが出来る。
【０００８】
本発明は第二の態様として、宿主細胞由来のトポイソメラーゼＩの一部のアミノ酸に結合し、レトロウイルスの複製過程、より具体的には、逆転写反応を阻害する化合物に係る。このような効果を有する化合物は本発明のスクリーニング方法によって確認し、同定することが可能である。
【０００９】
本発明は更に、第三の態様として、上記化合物を活性成分として含有する医薬組成物に係る。この医薬組成物はレトロウイルスが病因となる様々な疾患の予防及び治療に使用することが出来る。このような疾患の代表的な例として、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を挙げることが出来る。本発明の医薬組成物には、上記活性成分の他に、当業者に公知の任意の様々な補助剤等を、適宜含有させることが出来る。活性成分である本発明化合物及びこのような各種補助剤の種類及び含有量、並びに該医薬組成物の形態は、当該組成物の使用目的、患者の病状・性別・年齢・体重等に応じて、当業者が適宜選択することが出来る。医薬組成物の形態としては、例えば、錠剤、粉末剤等の各種固形剤、水溶液、懸濁液及び乳濁液等の液剤、更には、エアゾール等を挙げることが出来る。
本発明は更に、第四の態様として、上記医薬組成物をヒト及び哺乳動物などの患者に投与することからなる、上記各種疾患の予防及び治療等の各種処置方法に係る。投与方法は医薬組成物の種類、並びに患者の病状・性別・年齢・体重等に応じて、当業者に公知の任意の手段で行うことが出来る。例えば、経口投与、静注及びインハレーション等を挙げることが出来る。本発明医薬組成物の一回の投与量及び投与間隔等は、患者の病状・性別・年齢・体重等に応じて、当業者が適宜選択することが出来る。
【００１０】
以下、実施例に沿って本発明を説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に何等拘束されるものではない。
【００１１】
【実施例】
ＨＩＶ‐１感染価のモニターによるＨＩＶ‐１複製におけるトポイソメラーゼＩの役割の解析
１．サルトポイソメラーゼＩのクローニングとシークエンス、およびヒトトポイソメラーゼＩとの比較
以下の手順に従い、アフリカミドリザル腎臓細胞株Ｖｅｒｏ細胞からｃＤＮＡライブラリーを作成し、ＰＣＲによってサルトポイソメラーゼＩをクローニングし、シークエンスを行った。
１、ポリＡ　ＲＮＡをＶｅｒｏ細胞より抽出した。
２、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＲＮａｓｅＨ￣　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｃａｒｌｓｂａｄ，　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によりｃＤＮＡを合成した。
３、プライマーｔｏｐｏＦ　（５’￣ＡＴＧＡＧＴＧＧＧＧＡＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＡＡＣＧＡ￣３’）及び　ｔｏｐｏＲ　（５’￣ＣＴＡＡＡＡＣＴＣＡＴＡＧＴＣＴＴＣＡＴＣＡＧＣＣＡ￣３’）によりｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　（ＰＣＲ）にてサルｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ　Ｉ　ｃＤＮＡを合成した。
４、約２．３ｋｂの産物をｐＳＴｂｌｕｅ￣１　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒ　（Ｎｏｖａｇｅｎ，　Ｍａｄｉｓｏｎ，　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）へクローニングした。
５、ベクターのインサートをａ　ｍｏｄｅｌ　３７７Ａ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）を使用してシークエンスした。
６、得られたサルトポイソメラーゼＩのシークエンスを元にＳＭＡＲＴＴＭ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　ＣＡ　ＵＳＡ）を使用して５’及び３’のシークエンスを得た。
得られたサルトポイソメラーゼＩのｃＤＮＡおよびアミノ酸シークエンスは、それぞれ、配列番号１及び配列番号２で示した。尚、該配列は、ＧｅｎＢａｎｋ　ｔｈｅ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　ＡＢ０８９３２１　に登録されている（公開は平成１５年２月３日予定）。又、ヒトトポイソメラーゼＩの配列はＧｅｎＢａｎｋ　ｔｈｅ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　Ｊ０３２５０で登録されている。
その結果、サルトポイソメラーゼＩはヒトと比較して、核酸塩基配列で４７箇所異なっていた。その結果から予測したアミノ酸配列では８箇所異なっており、９８．４％の相似性を有していた（図１）。
【００１２】
２．発現ベクターの作製
サルｃＤＮＡをプライマー５’￣ＡＧＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＧＴＧＧＧＧＡＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣ￣３’　及び　５’￣ＡＣＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＡＡＡＣＴＣＡＴＡＧＴＣＴＴＣ￣３’（Ｅｃｏ　ＲＩ及びＮｏｔ　Ｉサイトを下線で示す。）でＰＣＲにて増幅し、産物をさらにＥｃｏ　ＲＩ及びＮｏｔ　Ｉにて消化し、ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ￣Ｃ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＥｃｏ　ＲＩ　およびＮｏｔ　Ｉサイトへ挿入した。
さらにヒトトポイソメラーゼＩのうちサルと異なるアミノ酸部分についてそれぞれサル型に変換した変異トポイソメラーゼＩを発現するべクターも作成した。具体的には、ヒトトポイソメラーゼＩの第２３６番目のグルタミン酸をアスパラギン酸に、第２３７番目のアスパラギンをセリンに変換したミュータントトポイソメラーゼＩ（ＨｕＥ２３６Ｄ／Ｎ２３７Ｓ）を作成した。
【００１３】
３．発現べクタ−による感染性ウイルス粒子の作製
ＨＩＶ‐１は１本鎖直鎖状ＲＮＡウイルスで染色体上のブロウイルスとしては９，７０９ｂｐの長さを有する。ＨＩＶ−１のブロウイルスＤＮＡを含むべクターｐＮＬ４３（１９８６年にＡｄａｃｈｉ等が発表）を哺乳類細胞へ導入するとＨＩＶ‐１蛋白群が転写、翻訳され、感染性を有する粒子を培養細胞上清に得ることが出来る。
上述のｐＮＬ４３２を１　マイクログラム、野生株ヒト、サル及び上記で作成したミュータントトポイソメラーゼＩ発現べクタ−を１マイクログラム、同時にサル由来のＣＯＳＩ細胞へ哺乳細胞遺伝子導入試薬Ｆｕｇｅｎｅ　６（Ｒｏｓｃｈｅ）を用いて導入し、２ｍ１の培養液で培養した。
【００１４】
４．ウイルス感染価の定量
Ｈａｃｈｉｙａ　Ａ，　Ａｉｚａｗａ￣Ｍａｔｓｕｏｋａ　Ｓ，　Ｔａｎａｋａ　Ｍ，　Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｙ，　Ｉｄａ　Ｓ，　Ｇａｔａｎａｇａ　Ｈ，　Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ　Ｙ，　Ｋｏｊｉｍａ　Ａ，　Ｔａｔｓｕｍｉ　Ｍ，　Ｏｋａ　Ｓ．Ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　ｓｉｍｐｌｅ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｄｒｕｇ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　１　ｕｓｉｎｇ　ＣＣＲ５￣ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ＨｅＬａ／ＣＤ４（＋）　ｃｅｌｌ　ｃｌｏｎｅ　１￣１０　（ＭＡＧＩＣ￣５）．　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ　Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ　２００１　Ｆｅｂ；４５（２）：４９５￣５０１に記載の方法に従い、遺伝子導入から４８時間後、上清のＨＩＶ‐１抗原（Ｐ２４）を定量した。
具体的には、以下の方法で実施した。
１．９６穴ディッシュにＭＡＧＩＣ５細胞を１穴あたり１万個でまく。
２．サンプルの希釈配列を作成し、それぞれ３７℃５％ＣＯ２の条件で４８時間培養する。
３．ウイルスを含む上精を除き１％ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ，０．２％ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅを含むＰＢＳにて常温で固定した。
４．Ｘ￣Ｇａｌ（５￣ｂｒｏｍｏ￣４￣ｃｈｌｏｒｏ￣３￣ｉｎｄｏｌｙｌ￣ｂ￣Ｄ￣ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅによって感染細胞を染色した。
５．顕微鏡下に数えた。
【００１５】
ヒトトポイソメラーゼＩ野生株（ＨｕＷＴ）、サルトポイソメラーゼＩ野生株（ＳｉｍＷＴ）、及び２３６、２３７番目のグルタミン酸、アスパラギン（２３６ＧＩｕ、２３７Ａｓｎ）をサル型にしたミュータントトポイソメラーゼＩ（ＨｕＥ２３６Ｄ／Ｎ２３７Ｓ）を発現したサル細胞から得られたウイルス感染価を比べた結果を図２に示す。
サルトポイソメラーゼＩとは対照的にヒトトポイソメラーゼＩを発現することにより、サル細胞由来ＨＩＶ‐１ウイルスの感染価は回復できた。さらにヒトトポイソメラーゼＩのうち２３６ＧＩｕ、２３７Ａｓｎをサル型にしたミュータントトポイソメラーゼＩ（ＨｕＥ２３６Ｄ／Ｎ２３７Ｓ）を発現した細胞由来のＨＩＶ‐１　ウイルスはサルトポイソメラーゼＩ野生株（ＳｉｍＷＴ）を発現した細胞またはべクタ−（ｐｃＤＮＡ）を導入した細胞由来のＨＮ−１と同様、ウイルス感染価を回復することはできなかった。
【００１６】
以上の結果が示すように、本発明者等はサル細胞由来のＨＩＶ‐１　ウイルス感染価がヒト細胞由来ＨＩＶ‐１の感染価に比べ約７から９倍減少していることから、ヒトウイルス産生細胞の細胞宿主因子の中にサル細胞の宿主因子では代償できない因子が含まれていると考えられる。
ヒトとサルのトポイソメラーゼＩをサル由来細胞に発現し、その細胞でウイルスを産生させた結果、サルトポイソメラーゼＩはサル細胞由来ＨＩＶ‐１の感染価を回復させることができないがヒトトポイソメラーゼＩを発現することにより、サル細胞由来ＨＩＶ‐１ウイルスの感染価は回復したこと、ヒトトポイソメラーゼＩのミュータントを用いて、ウイルス感染価の回復には２３６ＧＩｕ、２３７Ａｓｎが不可欠であることが明らかになった。
トポイソメラーゼＩはＨＩＶ‐１の複製過程においてｃＤＮＡの産生に関与していることも既に明らかにしており、合わせて考えると２３６ＧＩｕ、２３７Ａｓｎは逆転写においてウイルス因子と相互作用していると部位であると予想される。
【００１７】
【発明の効果】
上記の結果に基づき、発明によって、トポイソメラーゼＩの２３６ＧＩｕ、２３７Ａｓｎに結合する化合物（薬物）のスクリーニングをが提供される。見出された薬剤群はトポイソメラーゼＩとウイルス因子の関係を阻害することが予測され、培養細胞のＨＩＶ‐１複製系における作用と細胞毒性を調べ実用性を確認する。
宿主因子とウイルス因子との相互作用を標的としたＡＩＤＳ治療の場合、ウイルス因子を対象とする場合に比べエスケープミュータントの出現効率が極めて低く細胞毒性の低い特異的抗ウイルス剤開発につながることが期待できる。
宿主因子を標的としたＡＩＤＳ治療の場合、ウイルス因子を対象とする場合に比べエスケープミュータントの出現効率が極めて低いと予測できる。宿主因子自体ではなく、宿主因子とウイルス因子の相互作用を阻害する薬物が選択出来れば、さらに細胞毒性の低い特異的抗ウイルス剤開発につながると考えられる。
ゲノムＲＮＡの切断と再結合はＨＩＶ−１の高い変異効率の原因の一つでもあり、その原因を阻害する薬剤は宿主免疫によるウイルス排除機構を大幅に伸長させる効果も望まれる。
【００１８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】サルとヒトのトポイソメラーゼＩのアミノ酸配列を比較した結果を示す。
【図２】ヒトトポイソメラーゼＩ野生株（ＨｕＷＴ）、サルトポイソメラーゼＩ野生株（ＳｉｍＷＴ）、及び２３６、２３７番目のグルタミン酸、アスパラギン（２３６ＧＩｕ、２３７Ａｓｎ）をサル型にしたミュータントトポイソメラーゼＩ（ＨｕＥ２３６Ｄ／Ｎ２３７Ｓ）を発現したサル細胞から得られたウイルス感染価を比べた結果を示す。
【図１】
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【図２】
2004089053.tif 000018