(57)【要約】【課題】酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌を迅速かつ精度よく検出できるＰＣＲ用のプライマー及び酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌を迅速かつ精度よく検出できる方法を提供する。【解決手段】所定条件のＰＣＲに供されることにより酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出可能に増幅するが、同じ条件のＰＣＲに供されることにより、実質的にラクトバチルス属細菌以外の生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出可能に増幅しないプライマーセット。【選択図】  図２
2004329161.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定条件のＰＣＲに供されることにより酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出可能に増幅するが、同じ条件のＰＣＲに供されることにより、実質的にラクトバチルス属細菌以外の生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出可能に増幅しないプライマーセット。
【請求項２】
細菌のＤＮＡ分子中に配列番号３の塩基配列及び配列番号４の塩基配列を含むＤＮＡを特異的に検出可能に増幅するプライマーセット。
【請求項３】
所定条件のＰＣＲに供されることにより、実質的に、細菌のＤＮＡ分子中に配列番号３の塩基配列及び配列番号４の塩基配列を含むＤＮＡを検出可能に増幅するが、同じ条件のＰＣＲに供されることにより、実質的に、分子中に配列番号３の塩基配列及び配列番号４の塩基配列を含まないＤＮＡを検出可能に増幅しないプライマーセット。
【請求項４】
以下の（１）又は（２）のプライマーと（３）又は（４）のプライマーとからなるプライマーセット。
（１）    配列番号１における塩基番号１０〜１９の塩基配列、塩基番号９〜１９の塩基配列、塩基番号８〜１９の塩基配列、塩基番号７〜１９の塩基配列、塩基番号６〜１９の塩基配列、塩基番号５〜１９の塩基配列、塩基番号４〜１９の塩基配列、塩基番号３〜１９の塩基配列、塩基番号２〜１９の塩基配列、又は、塩基番号１〜１９の塩基配列からなるプライマー。
（２）    配列番号１における塩基番号１０〜１９の塩基配列、塩基番号９〜１９の塩基配列、塩基番号８〜１９の塩基配列、塩基番号７〜１９の塩基配列、塩基番号６〜１９の塩基配列、塩基番号５〜１９の塩基配列、塩基番号４〜１９の塩基配列、塩基番号３〜１９の塩基配列、塩基番号２〜１９の塩基配列、又は、塩基番号１〜１９の塩基配列を３’末端側に含む最大３０塩基のＤＮＡからなるプライマー。
（３）    配列番号２における塩基番号９〜１８の塩基配列、塩基番号８〜１８の塩基配列、塩基番号７〜１８の塩基配列、塩基番号６〜１８の塩基配列、塩基番号５〜１８の塩基配列、塩基番号４〜１８の塩基配列、塩基番号３〜１８の塩基配列、塩基番号２〜１８の塩基配列、又は、塩基番号１〜１８の塩基配列からなるプライマー。
（４）    配列番号２における塩基番号９〜１８の塩基配列、塩基番号８〜１８の塩基配列、塩基番号７〜１８の塩基配列、塩基番号６〜１８の塩基配列、塩基番号５〜１８の塩基配列、塩基番号４〜１８の塩基配列、塩基番号３〜１８の塩基配列、塩基番号２〜１８の塩基配列、又は、塩基番号１〜１８の塩基配列を３’末端側に含む最大３０塩基のＤＮＡからなるプライマー。
【請求項５】
以下の（１）又は（２）のプライマー。
（１）    配列番号１における塩基番号１０〜１９の塩基配列、塩基番号９〜１９の塩基配列、塩基番号８〜１９の塩基配列、塩基番号７〜１９の塩基配列、塩基番号６〜１９の塩基配列、塩基番号５〜１９の塩基配列、塩基番号４〜１９の塩基配列、塩基番号３〜１９の塩基配列、塩基番号２〜１９の塩基配列、又は、塩基番号１〜１９の塩基配列からなるプライマー。
（２）    配列番号１における塩基番号１０〜１９の塩基配列、塩基番号９〜１９の塩基配列、塩基番号８〜１９の塩基配列、塩基番号７〜１９の塩基配列、塩基番号６〜１９の塩基配列、塩基番号５〜１９の塩基配列、塩基番号４〜１９の塩基配列、塩基番号３〜１９の塩基配列、塩基番号２〜１９の塩基配列、又は、塩基番号１〜１９の塩基配列を３’末端側に含む最大３０塩基のＤＮＡからなるプライマー。
【請求項６】
以下の（３）又は（４）のプライマー。
（３）  配列番号２における塩基番号９〜１８の塩基配列、塩基番号８〜１８の塩基配列、塩基番号７〜１８の塩基配列、塩基番号６〜１８の塩基配列、塩基番号５〜１８の塩基配列、塩基番号４〜１８の塩基配列、塩基番号３〜１８の塩基配列、塩基番号２〜１８の塩基配列、又は、塩基番号１〜１８の塩基配列からなるプライマー。
（４）    配列番号２における塩基番号９〜１８の塩基配列、塩基番号８〜１８の塩基配列、塩基番号７〜１８の塩基配列、塩基番号６〜１８の塩基配列、塩基番号５〜１８の塩基配列、塩基番号４〜１８の塩基配列、塩基番号３〜１８の塩基配列、塩基番号２〜１８の塩基配列、又は、塩基番号１〜１８の塩基配列を３’末端側に含む最大３０塩基のＤＮＡからなるプライマー。
【請求項７】
（ｉ）被験食品に含まれるＤＮＡを抽出する工程と、（ｉｉ）このＤＮＡを鋳型として請求項１から４のいずれかに記載のプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程と、
（ｉｉｉ）    ＤＮＡ増幅の有無を検出する工程と
を含む細菌の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、主に酸性食品の細菌汚染検査に用いられるＰＣＲプライマーセット及びそのプライマーセットを用いた細菌の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
乳酸菌は乳糖やブドウ糖を分解して乳酸をつくる細菌の総称であり、ヨーグルトや発酵乳等の食品の製造に活用されている。その乳酸菌の中で、自然界のあらゆるところに生息するグラム陽性通性嫌気性細菌の一部の細菌群は、加工食品等に汚染し、風味の劣化や食品収納密閉容器の膨化等を引き起こす原因菌として知られている（Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ３４：５４１−５４５（１９７１），  Ｄａｋｉｎ  Ｊ．  Ｃ．  ａｎｄ  Ｊ．  Ｙ．  Ｒａｄｗｅｌｌ；  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ｃａｕｓｉｎｇ  ｓｐｏｉｌａｇｅ  ｏｆ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｅｓｅｒｖｅｓ．；  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６４：３５５−３６０（２００１），  Ｌｙｈｓ  Ｕ．，  Ｈ．  Ｋｏｒｋｅａｌａ  Ｈ．，  Ｐ．  Ｖａｎｄａｍｍｅ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｂｊｏｒｋｒｏｔｈ；  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ：  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｐｏｉｌａｇｅ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｉｎ  ｍａｒｉｎａｔｅｄ  ｈｅｒｒｉｎｇ．）。
【０００３】
マヨネーズや食酢のような低ｐＨ食品では、含有される酢酸の静菌作用により、一般的な汚染菌の増殖による食品腐敗は制御されている。しかし、このような酢酸等による低ｐＨ環境下においても増殖可能で、食品の腐敗、汚染原因となる乳酸菌（酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌）が存在する。低ｐＨ食品製造事業所等で危機管理の対象菌となっている代表的な酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌としては、具体的にはラクトバチルスフラクチボランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ）、ラクトバチルスブレビス（Ｌ．  ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルスブチェネリ（Ｌ．  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルスプランタラム（Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルスパラカゼイ（Ｌ．  ｐａｒａｃａｓｅｉ）の５菌種が挙げられる（「食品の腐敗変敗防止対策ハンドブック」、株式会社サイエンスフォーラム発行）。これらの酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌は、いずれもラクトバチラレス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）目；  ラクトバチラセ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）科に属する。
【０００４】
これら酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌群を迅速かつ精度よく検出することは、低ｐＨ食品の製品や製造工程における品質管理手法を開発する上で非常に重要である。
【０００５】
従来主に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ＭＲＡ  Ｂｒｏｔｈ［Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．  （ＢＤ  Ｄｉｆｃｏ）］寒天培地のようなラクトバチルス属細菌を選択的に培養できる培地を用いることにより低ｐＨ食品の乳酸菌汚染の有無が判定されている。しかし、酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌はいずれも増殖速度が遅いため、この方法では、細菌が視覚的に確認可能なコロニーにまで増殖するのに通常３〜５日間の培養時間を要し、即ち汚染状況の把握に長時間を要するという問題がある。
【０００６】
そこで、迅速な細菌検出方法としてＰＣＲを行うことが考えられる。乳酸菌をＰＣＲ法で検出するためのプライマーとしては、特許文献１、２又は３に記載のプライマーが知られている。しかし、これらは特定の乳酸菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に由来するＤＮＡを認識できるプライマーであり、低ｐＨ食品の汚染菌として問題となる酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌の有無を一度に検出できるものではない。
【０００７】
一方、広範囲な細菌を一度に検出できるプライマーとして非特許文献１又は２に記載されたプライマーが知られている。しかし、これらはいずれも細菌一般、グラム陽性菌又はグラム陰性菌のように極めて広範囲の細菌種を対象としているため、酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌に汚染されているか否かの判断には用い難い。しかもこれらのプライマーは植物のクロロプラストのＤＮＡも認識するため、食品の検査には使用し難い（本明細書の表１参照）。
【０００８】
【特許文献１】
特開平０７−２８９２９５号公報（段落００２９、００３１等）
【０００９】
【特許文献２】
特開平１１−１５１０９７号公報（段落００６０、配列１〜２１等）
【００１０】
【特許文献３】
特開２００３−２５５号公報（請求項１、請求項２、段落００５５等）
【００１１】
【非特許文献１】
Ｊ．  Ｄｅｎｔ．  Ｒｅｓ．  ７８：８５０−８５６（１９９９）Ｒｕｐｆ，  Ｓ．，  Ｋ．  Ｍｅｒｔｅ，  ａｎｄ  Ｋ．  Ｅｓｃｈｒｉｃｈ；Ｑｕ    ａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ    ｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｎ  ｏｒａｌ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｂｙ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ      ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．  （第８５１頁等）
【００１２】
【非特許文献２】
Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３７：４６４−４６６（１９９９），Ｋｌａｕｓｅｇｇｅｒ，  Ａ．，  Ｍ．  Ｈｅｌｌ，  Ａ．  Ｂｅｒｇｅｒ，  Ｋ．  Ｚｉｎｏｂｅｒ，  Ｓ．  Ｂａｉｅｒ，  Ｎ．  Ｊｏｎｅｓ，  Ｗ．  Ｓｐｅｒｌ，  ａｎｄ  Ｂ．  Ｋｏｆｌｅｒ；  Ｇｒａｍ  ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｒｏａｄ−ｒａｎｇｅ  ＰＣＲ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ６２  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ．  （第４６４〜４６５頁等）
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌を迅速かつ精度よく検出できるＰＣＲ用プライマーセット及び酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌を迅速かつ精度よく検出できる方法を提供することを主目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために本発明者は研究を重ね、酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を確認し、また公共のＤＮＡデータベースに収録されているその他の細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子、細菌以外の原生生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子、食品中に含まれる植物又は動物のミトコンドリアの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子、植物のクロロプラストの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を確認し、さらにこれらの遺伝子のアラインメント解析を行うことにより、以下の知見を得た。
▲１▼  酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌は、特徴的な塩基配列として、１６ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡ（１６ＳｒＤＮＡ）分子中に配列番号３の塩基配列（５’−ＣＴＴＧＡＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＣ−３’）及び配列番号４の塩基配列（５’−ＧＡＧＧＧＴＴＴＣＣＧＣＣＣＴＴＣＡ−３’）を有する。この配列は、酢酸耐性乳酸菌群及びこれに類縁のラクトバチルス属に属する一部細菌の１６ＳｒＲＮＡに特異的な塩基配列であり、ラクトバチルス属細菌以外の細菌、その他の原生生物、植物、動物等には実質的に存在しない。従って、配列番号３の塩基配列及び配列番号４の塩基配列を有するＤＮＡの２本鎖を認識して増幅できるＰＣＲプライマーセットを用いることにより、酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌を検出でき、さらにラクトバチルス属細菌中の酢酸耐性乳酸菌群の類縁細菌を特異的に検出できる。
▲２▼  配列番号３の塩基配列及び配列番号４の塩基配列を有するＤＮＡを認識して増幅できるプライマーセットとしては、配列番号１の塩基配列（５’−  ＣＴＴＧＡＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＣ−３’）からなるプライマーと他のプライマーとのセット、配列番号２の塩基配列（５’−ＴＧＡＡＧＴＧＣＧＧＡＡＡＣＣＣＴＣ−３’）からなるプライマーと他のプライマーとのセット、好ましくは、配列番号１の塩基配列からなるプライマーと配列番号２の塩基配列からなるプライマーとのセットが挙げられる。
【００１５】
配列番号１の塩基配列からなるプライマーは、配列番号３に相補的な配列部分にハイブリダイズでき、配列番号２の塩基配列からなるプライマーは、配列番号４の配列部分にハイブリダイズできるものである。
【００１６】
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下のプライマーセット、プライマー及び細菌の検出方法を提供する。
【００１７】
項１．  所定条件のＰＣＲに供されることにより酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出可能に増幅するが、同じ条件のＰＣＲに供されることにより、実質的にラクトバチルス属細菌以外の生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出可能に増幅しないプライマーセット。
【００１８】
項２．  細菌のＤＮＡ分子中に配列番号３の塩基配列及び配列番号４の塩基配列を含むＤＮＡを特異的に検出可能に増幅するプライマーセット。
【００１９】
項３．  所定条件のＰＣＲに供されることにより、実質的に、細菌のＤＮＡ分子中に配列番号３の塩基配列及び配列番号４の塩基配列を含むＤＮＡを検出可能に増幅するが、同じ条件のＰＣＲに供されることにより、実質的に、分子中に配列番号３の塩基配列及び配列番号４の塩基配列を含まないＤＮＡを検出可能に増幅しないプライマーセット。
【００２０】
項４．  以下の（１）又は（２）のプライマーと（３）又は（４）のプライマーとからなるプライマーセット。
（１）    配列番号１における塩基番号１０〜１９の塩基配列、塩基番号９〜１９の塩基配列、塩基番号８〜１９の塩基配列、塩基番号７〜１９の塩基配列、塩基番号６〜１９の塩基配列、塩基番号５〜１９の塩基配列、塩基番号４〜１９の塩基配列、塩基番号３〜１９の塩基配列、塩基番号２〜１９の塩基配列、又は、塩基番号１〜１９の塩基配列からなるプライマー。
（２）    配列番号１における塩基番号１０〜１９の塩基配列、塩基番号９〜１９の塩基配列、塩基番号８〜１９の塩基配列、塩基番号７〜１９の塩基配列、塩基番号６〜１９の塩基配列、塩基番号５〜１９の塩基配列、塩基番号４〜１９の塩基配列、塩基番号３〜１９の塩基配列、塩基番号２〜１９の塩基配列、又は、塩基番号１〜１９の塩基配列を３’末端側に含む最大３０塩基のＤＮＡからなるプライマー。
（３）    配列番号２における塩基番号９〜１８の塩基配列、塩基番号８〜１８の塩基配列、塩基番号７〜１８の塩基配列、塩基番号６〜１８の塩基配列、塩基番号５〜１８の塩基配列、塩基番号４〜１８の塩基配列、塩基番号３〜１８の塩基配列、塩基番号２〜１８の塩基配列、又は、塩基番号１〜１８の塩基配列からなるプライマー。
（４）    配列番号２における塩基番号９〜１８の塩基配列、塩基番号８〜１８の塩基配列、塩基番号７〜１８の塩基配列、塩基番号６〜１８の塩基配列、塩基番号５〜１８の塩基配列、塩基番号４〜１８の塩基配列、塩基番号３〜１８の塩基配列、塩基番号２〜１８の塩基配列、又は、塩基番号１〜１８の塩基配列を３’末端側に含む最大３０塩基のＤＮＡからなるプライマー。
【００２１】
項５．  以下の（１）又は（２）のプライマー。
（１）    配列番号１における塩基番号１０〜１９の塩基配列、塩基番号９〜１９の塩基配列、塩基番号８〜１９の塩基配列、塩基番号７〜１９の塩基配列、塩基番号６〜１９の塩基配列、塩基番号５〜１９の塩基配列、塩基番号４〜１９の塩基配列、塩基番号３〜１９の塩基配列、塩基番号２〜１９の塩基配列、又は、塩基番号１〜１９の塩基配列からなるプライマー。
（２）    配列番号１における塩基番号１０〜１９の塩基配列、塩基番号９〜１９の塩基配列、塩基番号８〜１９の塩基配列、塩基番号７〜１９の塩基配列、塩基番号６〜１９の塩基配列、塩基番号５〜１９の塩基配列、塩基番号４〜１９の塩基配列、塩基番号３〜１９の塩基配列、塩基番号２〜１９の塩基配列、又は、塩基番号１〜１９の塩基配列を３’末端側に含む最大３０塩基のＤＮＡからなるプライマー。
【００２２】
項６．  以下の（３）又は（４）のプライマー。
【００２３】
（３）  配列番号２における塩基番号９〜１８の塩基配列、塩基番号８〜１８の塩基配列、塩基番号７〜１８の塩基配列、塩基番号６〜１８の塩基配列、塩基番号５〜１８の塩基配列、塩基番号４〜１８の塩基配列、塩基番号３〜１８の塩基配列、塩基番号２〜１８の塩基配列、又は、塩基番号１〜１８の塩基配列からなるプライマー。
（４）    配列番号２における塩基番号９〜１８の塩基配列、塩基番号８〜１８の塩基配列、塩基番号７〜１８の塩基配列、塩基番号６〜１８の塩基配列、塩基番号５〜１８の塩基配列、塩基番号４〜１８の塩基配列、塩基番号３〜１８の塩基配列、塩基番号２〜１８の塩基配列、又は、塩基番号１〜１８の塩基配列を３’末端側に含む最大３０塩基のＤＮＡからなるプライマー。
【００２４】
項７．  （ｉ）被験食品に含まれるＤＮＡを抽出する工程と、（ｉｉ）このＤＮＡを鋳型として項１から４のいずれかに記載のプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程と、
（ｉｉｉ）    ＤＮＡ増幅の有無を検出する工程と
を含む細菌の検出方法。
【００２５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）プライマー・プライマーセット
本発明のプライマーセットは、所定条件のＰＣＲに供されることにより酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（１６ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡ）を検出可能に増幅するが、同じ条件のＰＣＲに供されることにより、実質的にラクトバチルス属細菌以外の生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出可能に増幅しないプライマーセットである。
【００２６】
本発明において、「１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出可能に増幅する」とは、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の全配列又はその部分配列を、何らかの手段で検出可能な程度までＰＣＲにより増幅することを意味する。
【００２７】
本発明において、「酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌」とは、ラクトバチルスフラクチボランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ）、ラクトバチルスブレビス（Ｌ．  ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルスブチェネリ（Ｌ．  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルスプランタラム（Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）及びラクトバチルスパラカゼイ（Ｌ．  ｐａｒａｃａｓｅｉ）をいう。
【００２８】
本発明のプライマーセットは、酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌の他に、酢酸耐性乳酸菌群に類縁のラクトバチルス属細菌の全て又は一部を検出可能に増幅するものであってもよい。
【００２９】
「酢酸耐性乳酸菌群に類縁の細菌」とは、酢酸耐性乳酸菌群と同様にラクトバチルス属に属し、酢酸耐性乳酸菌群に分子系統樹上極めて近く、酢酸耐性乳酸菌群と同様に低ｐＨ下での増殖が可能で、場合によっては低ｐＨの食品において、酢酸耐性乳酸菌群と同様に食品の腐敗、汚染の原因となる可能性を有する菌である。
【００３０】
また、実質的にラクトバチルス属細菌以外の生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出可能に増幅しないことには、ラクトバチルス属細菌以外の全ての生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出可能に増幅しない場合だけでなく、例外的にラクトバチルス属細菌以外の数種の生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出可能に増幅する場合も含まれる。
【００３１】
前記の所定条件は通常ＰＣＲにおいて採用される条件であればよいが、例えば、変性を８５〜９９℃程度で３０秒間〜１５分間程度まで、アニーリングを５０〜６８℃程度で５秒間〜１分間程度行い、ＤＮＡ伸長を６８〜７５℃程度で１０秒間〜１分間程度行い、反応液中のＭｇイオン濃度を１〜４ｍＭ程度とする条件が挙げられる。
【００３２】
ラクトバチルス属細菌の中の酢酸耐性乳酸菌及びその類縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子には、そのＤＮＡ分子中に配列番号３の塩基配列（５’−ＣＴＴＧＡＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＣ−３’）及び配列番号４の塩基配列（５’−ＧＡＧＧＧＴＴＴＣＣＧＣＣＣＴＴＣＡ−３’）が特異的に含まれている。特に酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子には、そのＤＮＡ分子中に上記２配列が含まれている。従って、本発明のプライマーセットは、換言すれば、配列番号３の塩基配列及び配列番号４の塩基配列を含むＤＮＡを特異的に検出可能に増幅するものといえる。
【００３３】
また上記２配列は、ラクトバチルス属細菌以外の生物種には、実質的に見出されない。従って、本発明のプライマーセットは、所定条件のＰＣＲに供されることにより、実質的に、１分子中に配列番号３の塩基配列及び配列番号４の塩基配列を含むＤＮＡを検出可能に増幅するが、同じ条件のＰＣＲに供されることにより、実質的に、１分子中に配列番号３の塩基配列及び配列番号４の塩基配列を含まないＤＮＡを検出可能に増幅しないプライマーセットと表現することもできる。
【００３４】
前述したように、酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌は、主に低ｐＨ食品を汚染して風味の低下や食品の密閉包装容器の膨張等を引き起こす点で問題になっている危機管理の対象細菌群である。従って、これらの酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌を一度に必ず検出でき、しかも、ラクトバチルス属細菌以外の細菌、細菌以外の原生生物、食品に含まれる植物及び動物の各１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を実質的に検出しない本発明のプライマーセットは、上記の危機管理対象菌群を精度よく検出できる、優れたプライマーセットである。
プライマーセットの具体例
本発明におけるプライマーの塩基配列には、その塩基配列及びその塩基配列において１〜３個程度の塩基が欠失、挿入又は置換された塩基配列が含まれる。
【００３５】
本発明のプライマーとしては、代表的には、以下の（１）若しくは（２）のプライマー、又は、（３）若しくは（４）のプライマーが挙げられる。（１）及び（２）のプライマーは、前述した配列番号３の塩基配列に相補的な塩基配列を認識できるプライマーであり、（３）及び（４）のプライマーは、前述した配列番号４の塩基配列を認識できるプライマーである。
（１）    配列番号１（５’−  ＣＴＴＧＡＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＣ−３’）における塩基番号１０〜１９の塩基配列、塩基番号９〜１９の塩基配列、塩基番号８〜１９の塩基配列、塩基番号７〜１９の塩基配列、塩基番号６〜１９の塩基配列、塩基番号５〜１９の塩基配列、塩基番号４〜１９の塩基配列、塩基番号３〜１９の塩基配列、塩基番号２〜１９の塩基配列、又は、塩基番号１〜１９の塩基配列からなるプライマー。
（２）    配列番号１における塩基番号１０〜１９の塩基配列、塩基番号９〜１９の塩基配列、塩基番号８〜１９の塩基配列、塩基番号７〜１９の塩基配列、塩基番号６〜１９の塩基配列、塩基番号５〜１９の塩基配列、塩基番号４〜１９の塩基配列、塩基番号３〜１９の塩基配列、塩基番号２〜１９の塩基配列、又は、塩基番号１〜１９の塩基配列を３’末端側に含む最大３０塩基のＤＮＡからなるプライマー。
【００３６】
（２）のプライマーは、前記列記したいずれかの塩基配列の５’末端側に任意の塩基配列を有し、全体として最大３０塩基までの長さのＤＮＡからなるものである。（２）のプライマーにおいて、５’末端側に付加されて存在することがある前記任意の塩基配列は、１〜６個程度の塩基からなることが好ましい。この任意の塩基配列は付加されていないのが最も好ましい。
【００３７】
（１）又は（２）のプライマーの中では、塩基番号３〜１９の塩基配列からなるプライマー、塩基番号２〜１９の塩基配列からなるプライマー、若しくは、塩基番号１〜１９の塩基配列からなるプライマー、又は、これらの塩基配列を３’末端側に含む最大３０塩基のＤＮＡからなるプライマーが好ましく、塩基番号１〜１９の塩基配列からなるプライマーがより好ましい。
（３）    配列番号２（５’−ＴＧＡＡＧＴＧＣＧＧＡＡＡＣＣＣＴＣ−３’）における塩基番号９〜１８の塩基配列、塩基番号８〜１８の塩基配列、塩基番号７〜１８の塩基配列、塩基番号６〜１８の塩基配列、塩基番号５〜１８の塩基配列、塩基番号４〜１８の塩基配列、塩基番号３〜１８の塩基配列、塩基番号２〜１８の塩基配列、又は、塩基番号１〜１８の塩基配列からなるプライマー。
（４）    配列番号２における塩基番号９〜１８の塩基配列、塩基番号８〜１８の塩基配列、塩基番号７〜１８の塩基配列、塩基番号６〜１８の塩基配列、塩基番号５〜１８の塩基配列、塩基番号４〜１８の塩基配列、塩基番号３〜１８の塩基配列、塩基番号２〜１８の塩基配列、又は、塩基番号１〜１８の塩基配列を３’末端側に含む最大３０塩基のＤＮＡからなるプライマー。
【００３８】
（４）のプライマーは、前記列記したいずれかの塩基配列の５’末端側に任意の塩基配列を有し、全体として最大３０塩基までの長さのＤＮＡからなるものである。（４）のプライマーにおいて、５’末端側に付加されて存在することがある前記任意の塩基配列は、１〜６個程度が好ましい。この任意の塩基配列は付加されていないのが最も好ましい。
【００３９】
（３）又は（４）のプライマーの中では、塩基番号３〜１８の塩基配列からなるプライマー、塩基番号２〜１８の塩基配列からなるプライマー、若しくは、塩基番号１〜１８の塩基配列からなるプライマー、又は、これらの塩基配列を３’末端側に含む最大３０塩基のＤＮＡからなるプライマーが好ましく、塩基番号１〜１８の塩基配列からなるプライマーがより好ましい。
【００４０】
本発明のプライマーセットとしては、代表的には（１）又は（２）のプライマーと（３）又は（４）のプライマーとの組み合わせが挙げられる。
【００４１】
（１）又は（２）のプライマーと（３）又は（４）のプライマーとの組み合わせは、特に限定されずどのような組み合わせであってもよいが、配列番号１の塩基番号１〜１９の塩基配列からなるプライマーと配列番号２の塩基番号１〜１８の塩基配列からなるプライマーとの組み合わせが最も好ましい。
製造方法
本発明のプライマーセットの各プライマーは、その塩基配列に基づき常法に従って合成することができる。また、プライマー合成メーカー（例えばサワディーテクノロジー社）から購入することもできる。
（ＩＩ）細菌の検出方法
基本的構成
本発明の細菌の検出方法は、（ｉ）被験食品に含まれるＤＮＡを抽出する工程と、（ｉｉ）このＤＮＡを鋳型として上記説明した本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程と、（ｉｉｉ）    ＤＮＡ増幅の有無を検出する工程と
を含む方法である。
対象食品
本発明方法の対象となる被験食品は、酢酸耐性乳酸菌に汚染し得る食品である限り特に限定されない。被験食品には加工食品の他にその原材料も含まれる。特に、酢酸耐性乳酸菌の増殖が問題となる食品が対象として好適である。このような食品として、例えば、マヨネーズ、ケチャップ、ドレッシング、醤油、つゆ、ウスターソース、中濃ソース、みりん、ウインナーソーセージ、ロングライフ牛乳等及びこれらの原材料が挙げられる。
【００４２】
ＤＮＡ抽出工程
本発明においては、食品から分離培養した細菌からＤＮＡを抽出してもよいが、食品から直接ＤＮＡを抽出することもできる。
【００４３】
被験食品からのＤＮＡの調製方法は公知の方法を採用すればよい。例えば、被験食品に市販の界面活性剤を加え、８０〜１００℃程度で１〜１５分間程度加熱した後、冷却し、次いで遠心分離して上清を採取することによりＤＮＡを含有する試料を調製することができる。被験食品から調製されたＤＮＡ含有試料には、食品に細菌が含まれている場合には細菌１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が含まれており、その他各種ＲＮＡ、ＤＮＡ及びタンパク質等が含まれる。従って、この試料を常法に従って精製してＤＮＡを含む画分を得てもよい。
【００４４】
死菌がＰＣＲの結果に影響を与えると考えられる場合や、得られる菌数が少なすぎるために十分量のＤＮＡを得ることができないが酢酸耐性乳酸菌の検出感度を高めたい場合には、例えば以下の方法でＤＮＡを抽出すればよい。先ず、ＭＲＡ培養液（日水製薬）のようなラクトバチルス属細菌の選択培地を塩酸等でｐＨ６．０程度に調整し、この選択培地で被験食品を２０〜３０℃程度で培養する。培養時間は、被験食品中に存在する細菌数によっても異なるが、通常１２〜３６時間程度とすればよい。培養液を５０〜３００×ｇ程度で遠心分離し、得られる上清をさらに、２０００〜１４０００×ｇ程度で遠心分離する。被験食品に細菌が含まれていれば、得られる沈殿には通常細菌が含まれる。この沈殿を１０％キレックス液［１０％（Ｗ／Ｖ）キレックス（バイオラッド社）、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ８．０］２００μＬ中に懸濁後、ヒートブロックを用いて１００℃前後で５分間程度加熱することにより溶解し、細菌溶解物を２０００〜１４０００×ｇ程度で遠心分離した上清を採取することによりＤＮＡ含有試料を調製することができる。
【００４５】
食品の種類によっても異なるが、食品１ｇ当たり１０〜２０ｃｆｕ程度の酢酸耐性乳酸菌が含まれていれば、被験食品を上記のようにして２４時間程度培養することにより、ＰＣＲにより酢酸耐性乳酸菌由来のＤＮＡを検出できる。
【００４６】
食品１ｇ当たりに含まれる酢酸耐性乳酸菌の数が１０ｃｆｕ未満の場合の検査等で、さらに、検出感度を高くしたい場合は、被験食品量を増やしたり、培養時間を延長させたりすればよい。
【００４７】
ＰＣＲ工程
ＰＣＲを行うにあたっては、上記説明した本発明のプライマーセットを用いる。具体的には、（１）又は（２）のプライマーと（３）又は（４）のプライマーとのセット、特に、配列番号１のプライマーと配列番号２のプライマーとのセットを用いることが好ましい。
【００４８】
ＰＣＲ条件は特に限定されず、ＰＣＲ装置毎に最適条件を定めればよいが、例えば、リアルタイムＰＣＲ装置の場合、以下の条件が挙げられる。
反応液：例えば、ＰＣＲ反応用のキットであるＴａｋａｒａ  Ｅｘ  ＴａｑＴＭ  Ｒ−ＰＣＲ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  （Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社、Ｏｔｓｕ、Ｊａｐａｎ）のようなリアルタイムＰＣＲ専用のＰＣＲ反応液を用いる。
ＰＣＲサイクル条件：
・２本鎖ＤＮＡの熱変性：９５℃で５秒間
・プライマーの一本鎖ＤＮＡへのアニーリング：６６℃で１０秒間
・ＤＮＡ伸長：７２℃で２０秒間
この反応を通常３０〜３５サイクル程度行うことにより、目的ＤＮＡを検出可能な程度に増幅することができる。
【００４９】
ＰＣＲ装置としては、ブロックタイプ、リアルタイムＰＣＲタイプ等の市販の装置を使用できる。迅速にＤＮＡを増幅するためにはキャピラリータイプのリアルタイムＰＣＲ装置を用いることが好ましい。
【００５０】
ＤＮＡ増幅の確認工程
ＤＮＡ増幅の有無の確認は、通常、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド、サイバーグリーンＩなどで核酸染色することにより行える。また、リアルタイムＰＣＲ装置を用いてＰＣＲを行う場合は、その装置の検出システムにより自動的に短時間でＤＮＡ増幅の有無が確認される。例えば、ＰＣＲ反応液中にサイバーグリーンＩを添加した場合では、サイバーグリーンＩが二本鎖ＤＮＡに結合したときに発する蛍光値から増幅産物量をサイクル毎にモニター可能であり、さらに、ＰＣＲ後に融解曲線分析を行うことによりＰＣＲ増幅産物が目的の増幅産物であるかどうかを確認できる。判断が困難な場合は、増幅産物の大きさをアガロースゲル電気泳動により確認すればよい。
【００５１】
ＰＣＲによりＰＣＲ産物が検出される場合は、酢酸耐性乳酸菌が被験食品に存在していたと判定できる。またＰＣＲ産物が検出されない場合は、酢酸耐性乳酸菌は被験食品に存在していなかったと判定できる。酢酸耐性乳酸菌が存在する場合は、アガロースゲル電気泳動により、２０３塩基対程度の大きさのバンドが検出される。
【００５２】
被験食品の酢酸耐性乳酸菌による汚染の有無をさらに精度よく判定する必要がある場合には、ＰＣＲ増幅断片が酢酸耐性乳酸菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に由来するものであることを確認することがより好ましい。
【００５３】
確認方法としては、例えばＰＣＲ増幅断片を制限酵素で処理して得られるＤＮＡ断片について制限断片長多型解析を行う方法が挙げられる。この際使用する制限酵素はＰＣＲ増幅断片を切断し制限断片長多型を示し得るものであれば特に限定されない。制限酵素は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できるが、２種以上を組み合わせて使用することが望ましい。制限断片長多型は、例えば、アガロース電気泳動やサザンブロット法により検出することができる。
【００５４】
また、ＰＣＲ増幅断片の塩基配列を常法により決定し、その塩基配列を公共のＤＮＡデータベースの塩基配列と比較することによっても、ＰＣＲ増幅断片が酢酸耐性乳酸菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に由来するものであることを確認することができる。
【００５５】
【実施例】
以下、本発明を実施例及び試験例を示して詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５６】
実施例１（酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌の標準菌株に対する検出感度の確認）
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ＪＣＭ  １１３４Ｔ株及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ  ＪＣＭ  １１１７Ｔ株をそれぞれＭＲＳ液体培地（ｐＨ６．０）を用いて培養した。各菌株の培養液からＰＵＲＥＧＥＮＥ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｇｅｎｔｒａ社、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）を用いて、ＤＮＡ溶液を調整した。各菌株のＤＮＡ量を測定し、各菌株のゲノムの分子量を３．０Ｍｂｐと概算してゲノムのコピー数を２コピー／μＬ程度、２０コピー／μＬ程度、２×１０２コピー／μＬ程度、２×１０３コピー／μＬ程度及び２×１０４コピー／μＬ程度にした被験ＤＮＡ溶液をそれぞれ調整した。
【００５７】
一方、配列番号１及び配列番号２の各ＤＮＡプライマーをＤＮＡ合成機を用いて合成した。上記各被験ＤＮＡ溶液１μＬをＰＣＲ反応用のキットであるＴａｋａｒａ  Ｅｘ  ＴａｑＴＭ  Ｒ−ＰＣＲ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  （Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社、Ｏｔｓｕ、Ｊａｐａｎ）の説明書に従って調整して総量２０μＬのＰＣＲ反応液を調整した。すなわち、２μＬの１０×Ｒ−ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋ｆｒｅｅ）、０．１６μＬの２５０ｍＭ  Ｍｇ２＋Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｒ−ＰＣＲ、０．４μＬのｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各１０ｍＭ）、０．２μＬ  のＴａＫａｒａ  ＥＸ  ＴａｑＴＭ  Ｒ−ＰＣＲ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ）、０．８μＬの０．１２５％  ＳＹＢＲＴＭ  ＧｒｅｅｎＩ  （Ｆｍｃ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＵＳＡ）、１．０μＬのＤＮＡプライマー液（配列番号１のＤＮＡプライマー及び配列番号２のＤＮＡプライマーを各々５μＭ含有）及び１６．４４μＬの蒸留水を含む１９μＬの調整液に、被験ＤＮＡ溶液１μＬを加えて２０μＬにしたＰＣＲ反応液を調整した。
【００５８】
ＰＣＲはロシュ・ダイアグノスティックス社のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒを用いて次のように行った。すなわち、初期変性を９５℃で１分間行った後、９５℃で５秒間、６６℃で１０秒間、及び７２℃で２０秒間、蛍光測定（ＰＣＲによる増幅産物の測定）を１サイクルとし、これを３５サイクル行い、続いて増幅産物の融解曲線分析のために、９７℃で０秒、６０℃で１０秒後、０．２℃／秒の速度で９７℃まで昇温させると同時に連続的に蛍光測定により各温度に対する増幅産物の二本鎖ＤＮＡ量を測定し、最後に４０℃まで降温させた。
【００５９】
ＰＣＲ終了後、融解曲線解析を同ＰＣＲ装置上のソフトウェアで行い、増幅産物のＴｍ値を求めることで特異的な増幅産物の有無を判定した。さらに、Ｍｕｐｉｄミニゲル泳動槽（ＡＤＶＡＮＣＥ社）を用いて１．８％アガロースゲルによる電気泳動を行い、エチジウムブロマイド溶液でゲルを染色して、目的バンドの増幅の有無を確認することにより、増幅産物の有無を確認した。
【００６０】
ＰＣＲ後の反応液を電気泳動した後のゲルを図１に示す。レーン１〜５はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ  ＪＣＭ  １１１７Ｔ株を示し、図１のレーン６〜１０はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ＪＣＭ  １１３４Ｔを示す。レーンＭはＤＮＡ分子量マーカーを、レーンＢはネガティブコントロールを示す。
【００６１】
図１の結果から、配列番号１のＤＮＡプライマーと配列番号２のＤＮＡプライマーとをセットで使用することにより、反応液中に２〜２０コピー程度のゲノムＤＮＡが存在すれば前記のＰＣＲ条件でＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ  ＪＣＭ  １１１７Ｔ株やＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ＪＣＭ  １１３４Ｔ株ＤＮＡを検出できることが確認された。
【００６２】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ＪＣＭ  １０５９Ｔ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ  ＪＣＭ  １１１５Ｔ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ    ＪＣＭ  １１４９Ｔ株及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  ＪＣＭ  ８１３０Ｔ株について同様にしてゲノムＤＮＡコピー数を変化させてＰＣＲを行ったところ、いずれの菌種のＤＮＡにおいても、２〜２０コピー程度のゲノムＤＮＡが存在すれば、同様に検出できることが確認された。
【００６３】
実施例２（酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌の標準菌株に対する反応性の確認）
実施例１と同様にしてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ  ＪＣＭ  １１１７Ｔ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ＪＣＭ  １１３４Ｔ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ＪＣＭ  １０５９Ｔ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ  ＪＣＭ  １１１５Ｔ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ    ＪＣＭ  １１４９Ｔ株及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  ＪＣＭ  ８１３０Ｔ株のＤＮＡ溶液を調整し、ゲノムのコピー数が２×１０４コピー／μＬ程度の被験ＤＮＡ溶液をそれぞれ調整した。
【００６４】
これらの各菌株のＤＮＡに対する配列番号１のＤＮＡプライマーと配列番号２のＤＮＡプライマーとのプライマーセットの反応性を調べるために、上記の各被験ＤＮＡ溶液１μＬに対する同ＤＮＡプライマーセットを用いたＰＣＲを実施例１と同様にして実施した。ＰＣＲ増幅産物の有無を、実施例１と同様にしてアガロースゲルによる電気泳動で確認した。
【００６５】
ＰＣＲ後の反応液を電気泳動した後のゲルを図２に示す。図２のレ−ン１〜６はそれぞれＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ＪＣＭ  １１３４Ｔ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ  ＪＣＭ  １１１７Ｔ株、  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ＪＣＭ  １０５９Ｔ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ  ＪＣＭ  １１１５Ｔ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ    ＪＣＭ  １１４９Ｔ株及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  ＪＣＭ  ８１３０Ｔ株を示す。図２から、配列番号１のＤＮＡプライマーと配列番号２のＤＮＡプライマーとをセットで使用することにより、上記乳酸菌（酢酸耐性乳酸菌とその類縁菌１種）６種を検出できることが確認された。
【００６６】
実施例３（酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌以外の細菌及びその他の生物由来ＤＮＡとの反応性の確認）
以下の表１に示す各細菌株及び各真菌株をそれぞれに適合する培地を用いて培養し、実施例１と同様にしてＤＮＡ溶液を調整した。各ＤＮＡ溶液のＤＮＡ量を測定し、各細菌株ＤＮＡは濃度５ｐｇ／μＬ程度にした被験ＤＮＡ溶液を調整し、各真菌株ＤＮＡは濃度１ｎｇ／μＬにした被験ＤＮＡ溶液を調整した。また、市販の小麦粉、トウモロコシ、ジャガイモ、ナタネ、及びダイズからＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてそれぞれの植物ＤＮＡを抽出した。各ＤＮＡ溶液のＤＮＡ量を測定し、小麦ＤＮＡは濃度８ｎｇ／μＬ程度にした被験ＤＮＡ溶液を調整し、トウモロコシ、ジャガイモ、ナタネ及びダイズのＤＮＡは濃度３ｎｇ／μＬ程度にした被験ＤＮＡ溶液をそれぞれ調整した。また、ヒトＭＣＦ−７細胞（大日本製薬社）からＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてヒトＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ溶液のＤＮＡ量を測定し、濃度３ｎｇ／μＬ程度にした被験ＤＮＡ溶液を調整した。ウシ及びニワトリの精製ＤＮＡはＣｅＭｉｎｅｓ社から購入し、サケの精製ＤＮＡはＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から購入した。各ＤＮＡ溶液のＤＮＡ量を測定し、ウシ及びニワトリＤＮＡは濃度３ｎｇ／μＬ程度にした被験ＤＮＡ溶液を調整し、サケＤＮＡは濃度１ｎｇ／μＬ程度にした被験ＤＮＡ溶液を調整した。
【００６７】
これらの各生物のＤＮＡに対する配列番号１のＤＮＡプライマーと配列番号２のＤＮＡプライマーとのプライマーセット（ＬＡ１−２０３）の反応性を調べるために、上記の各被験ＤＮＡ溶液１μＬに対する同ＤＮＡプライマーセットを用いたＰＣＲを実施例１と同様にして実施した。ＰＣＲ増幅産物の有無を、実施例１と同様にしてアガロースゲルによる電気泳動で確認した。
【００６８】
また、配列番号１及び２のプライマーセット（ＬＡ１−２０３）に代えて前述した非特許文献１に記載の細菌一般を検出できるプライマーセット（ｐｒｂａｃ）を用いて同様にしてＰＣＲを行った。但し、ＰＣＲは次の反応条件に置換して実施した。すなわち、初期変性を９５℃で１分間行った後、９５℃で５秒間、５９℃で１０秒間、及び７２℃で２０秒間、蛍光測定（ＰＣＲによる増幅産物の測定）を１サイクルとし、これを３０サイクル行った。
【００６９】
これらのＰＣＲの結果を次の表１及び表２に示す。表中＋は電気泳動によりバンドが検出されたことを示し、マイナスはバンドが検出されなかったことを示す。
【００７０】
【表１】
2004329161.tif 000003
【００７１】
【表２】
2004329161.tif 000004
【００７２】
表１及び表２に示す結果から、配列番号１のプライマーと配列番号２のプライマーとのセットを用いたＰＣＲにより、酢酸耐性乳酸菌５種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ  ＪＣＭ  １１１７Ｔ、  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ＪＣＭ  １０５９Ｔ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ  ＪＣＭ  １１１５Ｔ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ    ＪＣＭ  １１４９Ｔ及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  ＪＣＭ  ８１３０Ｔ株）及びその類縁のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する一部細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に由来するＤＮＡ断片を特異的に増幅できることが判明した。
【００７３】
これに対して、公知のプライマーセットであるｐｒｂａｃを用いた場合は、広く細菌が検出され、さらに植物から抽出されたＤＮＡが検出された。なお、塩基配列解析の結果、植物由来のＤＮＡからｐｒｂａｃによって増幅されたＰＣＲ増幅産物はクロロプラストの１６ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡ断片であることが確認された。
【００７４】
図３は各種細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づいて作成された分子系統樹であり、配列番号１及び配列番号２の各ＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲにおいて検出された各菌株を＋で示している。
【００７５】
図３から、配列番号１及び配列番号２のＤＮＡプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことで、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づいて作成された分子系統分類上においても一群の菌群に分類可能な主要５種の酢酸耐性乳酸菌群とこれに類縁の菌群とを特異的に検出できたことがわかる。
【００７６】
実施例４（食品中の酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の検出）
一般生菌に汚染されていないことを予め確認済みの市販のマヨネーズ及び食酢に、代表的な酢酸耐性乳酸菌であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ  ＪＣＭ  １１１７Ｔ株を指標菌として、それぞれの食品１ｇあたり１０〜２０ｃｆｕ程度となるように添加したもの及び、無添加のものを調整した。それぞれ食品重量の９倍量のＭＲＳ液体培地（ｐＨ６．０）を加え、ストマッカーを用いて無菌的に攪拌混合した。
【００７７】
これらの食品希釈混合液１０ｍＬを１５ｍＬ容の培養管に移して密栓後、３０℃で２０時間〜２８時間、静置培養した。ＰＣＲで使用するＤＮＡ溶液の調整のために、０時間、２０時間、２４時間及び２８時間後の培養液を１．３ｍＬづつ採取した。
【００７８】
採取した培養液を１００×ｇで１分間遠心した後の上清をさらに１３，０００×ｇで５分間遠心して沈殿を得た。この沈殿を洗浄するために０．５ｍＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ８．０）に懸濁後、１３，０００×ｇで５分間遠心して沈殿を得た。この沈殿に１０％キレックス液［１０％（Ｗ／Ｖ）キレックス（バイオラッド社）、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ８．０］２００μＬを加えて沈殿を懸濁後、ヒートブロックを用いて９９℃で５分間加熱し、１３，０００×ｇで３分間遠心した上清を採取した。上清中にはＤＮＡが含まれており、ＰＣＲに使用するＤＮＡ溶液とした。
【００７９】
得られたＤＮＡ溶液１μＬを試料とし、実施例１に記載されたと同様の方法でＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅産物の有無を確認した。アガロースゲルによる電気泳動パターンを図４に示す。
【００８０】
図４の（Ａ）は市販マヨネーズの場合の電気泳動パターンであり、図４の（Ｂ）は市販食酢である場合の電気泳動パターンである。また、図（Ａ）、（Ｂ）ともに、レーン１、２、３及び４は、細菌を添加せずに食品の培養時間を０、２０、２４及び２８時間にしたサンプルである。またレーン５、６、７及び８は、食品に細菌を添加した後ＤＮＡを抽出する前の培養時間を０、２０、２４及び２８時間にしたサンプルである。
【００８１】
図４の（Ａ）に示すように、市販マヨネーズ１ｇあたり１０〜２０ｃｆｕ程度のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ  ＪＣＭ  １１１７Ｔ株の指標菌が存在する場合、ＤＮＡ抽出前の食品培養時間を２４時間以上にすれば、前記ＰＣＲによってその細菌ＤＮＡを検出できることがわかる。また、図４の（Ｂ）に示すように、市販食酢１ｇあたり１０〜２０ｃｆｕ程度のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ  ＪＣＭ  １１１７Ｔ株の指標菌が存在する場合、ＤＮＡ抽出前の食品培養時間を２４時間以上にすれば、前記ＰＣＲによってその細菌ＤＮＡを検出できることがわかる。
【００８２】
【発明の効果】
本発明により、酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌を迅速かつ精度よく検出できるＰＣＲ用のプライマー及び酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌を迅速かつ精度よく検出できる方法が提供された。
【００８３】
さらにいえば、本発明のプライマーセットを用いたＰＣＲを行うことにより、酢酸耐性乳酸菌を一括して検出できる。具体的には、酸性食品の腐敗において問題となるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉの食品等への混入の有無を従来の寒天培養法よりもより迅速に検査することができる。
【００８４】
従って、本発明のプライマーセットは、汚染頻度が比較的低い食品を対象にした細菌検査の一次スクリーニングに好適に使用できる。すなわち、本発明のプライマーセットを用いた一次スクリーニングにより細菌が検出された場合には、食品の製造工程や製品に対する適切な措置をより迅速に執ることが出来る。また、必要に応じて、ＰＣＲ増幅産物の塩基配列解析の実施や二次スクリーニングとして特定乳酸菌に特異的なプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより、菌種を同定することもできる。
【００８５】
また、従来の細菌一般を広く検出できるプライマーを使用する場合は、目的細菌以外の混入生物のＤＮＡや食品由来のＤＮＡまで検出されるが、本発明のプライマーを用いることにより、酢酸耐性乳酸菌を検出できるとともに、ラクトバチルス属細菌以外の混入生物由来のＤＮＡや食品由来のＤＮＡを実質的に検出せず、即ち高精度の検出が行える。
【００８６】
特に、本発明のプライマーは食品である植物や動物のＤＮＡを検出しないため、食品から細菌を分離培養した上でそのＤＮＡを抽出する必要がなく、食品から直接ＤＮＡを抽出するだけで、又は食品をおよそ２４時間培養した培養液からＤＮＡを抽出するだけで、そのＤＮＡをＰＣＲに供することができる。それにより、検査時間を大幅に短縮することができる。
【００８７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】酢酸耐性乳酸菌の検出感度を示す図である。
【図２】配列番号１及び２のプライマーセットにより乳酸菌６種を検出できたことを示す図である。
【図３】細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ  遺伝子配列に基づいた分子系統樹及び、配列番号１及び２のプライマーセットにより検出可能な細菌群を示す図である。
【図４】被験食品の培養時間と酢酸耐性乳酸菌の検出の有無との関係を示す図である。（Ａ）は市販マヨネーズ、（Ｂ）は市販食酢の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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