(57)【要約】【課題】牛白血病ウイルスに共通して存在する構造糖蛋白に特異的に結合するモノクローナル抗体を開発すること。これにより、従来のモノクローナル抗体では検出不能であったウエスタンブロット法により牛白血病ウイルスを検出可能とすること。さらに迅速簡便かつ正確に牛血清中の抗牛白血病抗体を検出する方法を提供すること。【解決手段】牛白血病ウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｓ）のエンベロープ主　要糖タンパクであって、還元性条件下、ＳＤＳで変性され、且つ電気泳動で測定された分子量が５１ｋＤａである抗原（ｇｐ５１）に特異的に結合するモノクローナル抗体によって、課題が解決できた。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
牛白血病ウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｓ）のエンベロープ主要糖タンパクであって、還元性条件下、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で変性され、且つ電気泳動で測定された分子量が５１ｋＤａである抗原（ｇｐ５１）に特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項２】
寄託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０１０の細胞の結合特異性の特徴を持つハイブリドーマ細胞系によって産生され得る、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
牛白血病ウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｓ）のエンベロープ主要糖タンパクであって、還元性条件下、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で変性され、且つ電気泳動で測定された分子量が５１ｋＤａである抗原（ｇｐ５１）を、ウエスタンブロット法により転写した抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
寄託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０１０の細胞の結合特異性の特徴を持つハイブリドーマ細胞系によって産生することを特徴とする、請求項１記載のモノクローナル抗体の産生方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載されるモノクローナル抗体を用いて、牛白血病ウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｓ）抗原をウエスタンブロット法により検出する方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載されるモノクローナル抗体で酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を行うことによって、血清中の抗牛白血病抗体を特異的に検出する方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかに記載されるモノクローナル抗体を含む、血清中の抗牛白血病抗体を特異的に検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、牛白血病ウイルス抗原の検出あるいは牛白血病ウイルスに対する抗体量を免疫学的に測定するための方法及び該方法に用いる抗体に関する。特に本発明は、新規なハイブリドーマ細胞系（寄託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０１０）が産生するモノクローナル抗体、及び該モノクローナル抗体を用いる牛白血病ウイルスの検出に関する。
【０００２】
【従来技術】
牛白血病（ｂｏｖｉｎｅ　ｌｅｕｋｏｓｉｓ）はリンパ細網組織由来のリンパ系細胞が全身性に悪性腫瘍性増殖したもので、同意の病名としてｂｏｖｉｎｅ　ｌｅｕｋｅｍｉａやｌｙｍｐｈｏｓａｒｃｏｍａが用いられる。現在、本病は疫学的、臨床病理学的所見から、▲１▼地方病型（地方病性牛白血病ｅｎｚｏｏｔｉｃ　ｂｏｖｉｎｅｌｅｕｋｏｓｉｓ）と散発型（散発性牛白血病ｓｐｏｒａｄｉｃ　ｂｏｖｉｎｅ　ｌｅｕｋｏｓｉｓ）に大別される。
牛白血病という名は総称であるが、一般には、牛白血病といえば地方病型を指すほど、牛に最も多発する型の腫瘍で、罹患することによる経済的損失も大きい。本病は１９７８年、ドイツの牛において初めて報告された。１９６９年、Ｍｉｌｌｅｒらによって地方病型発症牛からＣ型ウイルス粒子が発見された。このウイルスはＢｏｖｉｎｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｓ（ＢＬＶ）と呼ばれ、地方病型を発生させる。散発型の病原微生物は不明である。地方病型の発症は散発型よりはるかに多く、感染牛のうちおよそ１％が発症すると言われている。感染は水平・垂直ともに起こる。これまで発症率が低いことから軽視されることが多く、ほとんど摘発淘汰の措置は行われていなかった。近年感染牛の発見が増加し、日本国内における感染牛は全体の５０％以上を占めるといわれ、比例して発症牛の数も急増傾向である。このため、近年定期的な抗体検査によって感染牛の摘発を行い、感染牛を繁殖に用いない措置が講じられている。しかし、全国で統一された措置を講ずることはなく、また対策も不十分であることも多く、依然として感染牛の増加が認められ、このまま放置すればいずれはほとんどが感染牛となる恐れもある。感染あるいは発症した牛は有効な治療法がなく、また予防措置としてのワクチンもない。毎年国内で５００頭程度の成牛が発症している。発症牛は市場価値がまったくないため、それまでに要した飼養コストがすべて無駄となり、甚大な損害をもたらす。
【０００３】
かかる病気の予防措置は、現在ではあくまでも早期発見と蔓延防止である。そのため、感染牛であるか否かの適切な摘発と淘汰が必要であるが、従来汎用されている病理学的診断法として抹消血リンパ球からのウイルス分離やゲル内沈降反応による抗体の検出が行われている。ウイルスの分離には検体の抹消血リンパ球を感受性細胞たとえば羊胎児腎臓細胞に感染させ、シンチウム形成を判定する。またはシンチウム形成細胞を既知抗ウイルス抗体を用いた蛍光抗体法などで証明する。一方、抗体の検出にはゲル内沈降反応による方法が一般的である。しかし検出感度に課題があり、感染牛を発見できない場合もある。一方、中和法は感度は高いものの、操作に熟練を要する。また、活性のある牛白血病ウイルスを用いなければならないため、農場に出入りする獣医師等が検査にあたることは好ましくない。
【０００４】
ウイルス検出に用いられる蛍光抗体法は、検体の抹消リンパ球を分離後、７〜１０時間液体培地中で培養し、蛍光物質（ＦＩＴＣ）で標識したポリクローナル抗体を反応させ、蛍光顕微鏡下で観察する。
蛍光発色が認められればウイルスの存在が証明される。しかし、用いるポリクローナル抗体はヒツジやヤギなどの感受性動物にＢＬＶを頻回接種して得られた血清から精製されたもので、非特異的な反応が起こることがある。他に、ＢＬＶ感受性細胞（ヒツジ胎児腎臓細胞など）にＢＬＶを感染させ、感染細胞を乾燥固定したのち蛍光抗体法でウイルスの確認をする場合がある。この場合でも同様に非特異的な反応のほか、乾燥固定によって一部の抗原エピトープが破壊されている。
【０００５】
抗体検出の方法として、ゲル内沈降反応は世界的に汎用されている方法である。一般にＡｇａｒ　ｇｅｌ　ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ（略してＡＧＩＤ）と呼ばれる。方法の詳細は国際獣疫機構（ＯＩＥ）のマニュアル３．２．４章に記載されている。簡単に記すと、０．８〜１．２％の寒天平板に直径６．５ｍｍの穴を１つ、その周辺に５個の同径の穴をあける。中心の穴に不活化した牛白血病ウイルスを含む抗原液を加え、周辺の穴に被検血清を加え、室温で７２時間まで静置する。検体が牛白血病抗体陽性であれば、中心の穴と被検血清の穴との間に沈降線が現れる。陰性であれば沈降線が現れない。
【０００６】
中和法は牛白血病ウイルス感染細胞に被検血清を加えた後、あらかじめイーグルＭＥＭ培地中で培養したＦＬＫ細胞を加えて培養する。抗牛白血病抗体が検体中に存在しなければウイルスがＦＬＫ細胞に感染し、顕微鏡下、細胞は巨核細胞に変化する。抗体があればウイルスの感染が阻止され巨核細胞への変化は見られない。判定までにおよそ１週間程度の時間を要する。
【０００７】
かかる現状を打破すべく、各方面でＢＬＶに対するモノクローナル抗体が開発されている。　これまでＢＬＶ遺伝子の全配列が判明している。ウイルス表面構造タンパクもいくつか定義されており、ｇｐ５１，ｐ２４，ｐ１２，ｇｐ３０などが知られている。これらの遺伝子配列も既知である（非特許文献１参照）。これらのうち、特にｇｐ５１がＢＬＶの宿主細胞への感染に関与する主要な構造糖タンパクであることが知られ、ｇｐ５１に対するモノクローナル抗体の研究が行われた。中でも、ＤＡＮＩＥＬ　ＰＯＲＴＥＴＥＬＬＥらがｇｐ５１に対するモノクローナル抗体８種を開発した（非特許文献２参照）。これらはＡ〜Ｈまで８種のエピトープを認識し、内、３種が中和エピトープを認識するものであった。
【０００８】
しかしながら、これら８種のモノクローナル抗体はタンパクの可溶化に用いられる界面活性剤であるＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）及び、たんぱく質構造中のＳ−Ｓ結合を還元して切断する作用のある２Ｍｅ（２−メルカプトエタノール）で処理されたｇｐ５１とは反応しない。一般に、モノクローナル抗体が開発された場合、評価手段の一つにウエスタンブロット法がある。これは標的抗原を含むウイルス、細胞、菌体など、不純物を多く含む物質でも、電気泳動で分離し、これをニトロセルロース膜などに転写し、該膜を免疫染色してモノクローナル抗体が抗原のどの分子量の位置と特異的に反応するかを観察する手法で、現在広く用いられている。しかしながら、標的抗原を電気泳動により純粋に分子量的に分割するためには、タンパクを可溶化し、立体構造を破壊して直鎖状することが必要である。そこで賞用されている手法は２Ｍｅを含むＳＤＳで抗原を処理したのち、ＳＤＳを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動である。さらに泳動後、脆弱なゲルでは免疫染色が困難なため、ニトロセルロース膜などに電気的に転写する。膜に転写された抗原にモノクローナル抗体を接触、反応させると、結合部位にモノクローナル抗体は結合する。さらに市販の酵素標識抗マウス抗体を反応させ、酵素と反応して発色する基質を加えて特異的なバンドの有無を観察する。
ここで前提となるのは、ＳＤＳや２Ｍｅの処理により、変性や分解が起こるが、こうして変化させてもなおかつ認識するエピトープのみが本方法で検出されていることである。すなわち、上述の８種のモノクローナル抗体はいずれも２Ｍｅ及びＳＤＳ処理によって変性したＢＬＶ抗原のいずれのエピトープも認識できないことを意味する。
【０００９】
そこでＰＯＲＴＯＴＥＬＬＥらは、ラジオイムノプレシピテーション法により、該モノクローナル抗体群がＢＬＶのｇｐ５１を認識していることを確認した。すなわち、放射線標識したＢＬＶを極温和な界面活性剤で可溶化し、これにモノクローナル抗体を加えると、抗原抗体反応により生じた抗原抗体複合体の沈殿が生じる。この沈殿を集め、通常の電気泳動を行う。抗体と抗原は同時に電気泳動に供されることになるが、抗体に認識された放射線標識抗原がＸ線写真により分子量５１ｋＤａの位置に明確にバンドとして示されていた。この方法では放射性物質を取り扱うための特殊な施設と資格が必要で、一般的な研究者が簡単にできるものではなく、危険性も高い。
【００１０】
一方、ウエスタンブロット法において、モノクローナル抗体を用いず、ポリクローナル抗体であれば、特異的なバンドを確認することは可能である。ポリクローナル抗体はＢＬＶに感受性の動物（ヒツジ、ヤギ，ウシなど）にＢＬＶを感染させることにより得られる。ポリクローナル抗体の場合はウエスタンブロットに先立つＳＤＳや２Ｍｅ処理による変性によっても認識可能な抗体を含んでいればバンドとして検出可能である。しかし、ポリクローナル抗体は再現性が乏しいため、抗血清のロットごとに抗原への反応性が異なることがある。また、非特異的な吸着によるバンドの出現は珍しくない。このことは特異的な抗原の検出の妨げになることがある。
そこで、ウエスタンブロットに供した検体中のｇｐ５１が明確にバンドとして確認しうるモノクローナル抗体の開発が必要となる。還元性条件でＳＤＳ変性の影響を受けないエピトープを認識するモノクローナル抗体は、ｇｐ５１の一次構造を認識するものであることが必要である。そのためには、免疫原として天然の牛白血病ウイルスと大部分一次構造が一致していると考えられる遺伝子組み換えｇｐ５１を組み合わせることが必要と考えられた。
【００１１】
【非特許文献１】
Ｓａｇａｔａら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｓｅ　ＵＳＡ　８２巻　ｐ６７７−ｐ６８１（１９８５）
【非特許文献２】
ＤＡＮＩＥＬ　ＰＯＲＴＥＴＥＬＬＥら　ＶＩＲＯＬＯＧＹ　１２２，ｐ３５３−３６２（１９８２）
【非特許文献３】
Ｙｅａｓｔ　４巻、ｐ４７−５９（１９８８）
【非特許文献４】
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　７３巻　ｐ２４５７−ｐ２４６１（１９９２）
【非特許文献５】
安藤民衛ら　単クローン抗体実験操作入門　ｐ１９５〜ｐ１９７（１９９１年）
【非特許文献６】
Ｐ．Ｎａｋａｎｅ　ａｎｄ　Ａ．Ｋａｗａｏｉ　Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２２，ｐ１０８４−１０９１（１９７４）
【非特許文献７】
石川栄治ら、酵素免疫測定法　第二版　ｐ７５−１００　医学書院（１９８２年）
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記の従来技術の問題点を解決しようとするものである。すなわち、本発明は牛白血病ウイルスを検出するために用いることが出来るモノクローナル抗体を開発することを第１の課題とする。さらに、本発明は、そのようなモノクローナル抗体を用いて牛白血病ウイルスを特異的に短時間で再現性よく検出するシステムを構築することを課題とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはまず、牛白血病ウイルスに共通して存在し、かつ他の類縁ウイルスに存在しないウイルス表面構造糖蛋白ｇｐ５１に注目した。天然の牛白血病ウイルスを抗原としてマウスに免疫し、さらに遺伝子組み換えによって得られた、ｇｐ５１を構成するペプチドを最終免疫に用いた。これにより、天然のＢＬＶに存在するｇｐ５１のうち、立体構造よりも一次構造配列を特異的に認識する抗体も多く産生され、ウエスタンブロット法に使用できるモノクローナル抗体が得られる可能性が高まると仮定した。つまり、該抗原に対するモノクローナル抗体を開発することを第一の課題とて鋭意研究した。さらに迅速簡便かつ正確に抹消リンパ球中のウイルス抗原ｇｐ５１や感受性細胞に接種増殖させたウイルス抗原ｇｐ５１を、一般に用いられるウエスタンブロット法により、非特異的反応を抑え、正確迅速にスクリーニングし、もって牛白血病の蔓延を効果的に防御するための抗原検査システムあるいは安定な抗原エピトープを用いた酵素免疫測定法により抗体検査システムを構築することをさらなる課題として鋭意研究した。その結果、本発明者らは、牛白血病ウイルスのウエスタンブロットによる抗原検出あるいはＥＬＩＳＡによる抗体の迅速、正確な測定に寄与しうるモノクローナル抗体を発明し、本発明を完成させた。
【００１４】
すなわち、本発明は下記の構成を有する。
（１）牛白血病ウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｓ）のエンベロープ主要糖タンパクであって、還元性条件下、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で変性され、且つ電気泳動で測定された分子量が５１ｋＤａである抗原（ｇｐ５１）に特異的に結合するモノクローナル抗体。
（２）寄託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０１０の細胞の結合特異性の特徴を持つハイブリドーマ細胞系によって産生される、上記（１）記載のモノクローナル抗体。
（３）牛白血病ウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｓ）のエンベロープ主要糖タンパクであって、還元性条件下、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で変性され、且つ電気泳動で測定された分子量が５１ｋＤａである抗原（ｇｐ５１）を、ウエスタンブロット法により転写した抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体であることを特徴とする上記（１）または（２）に記載のモノクローナル抗体。
（４）寄託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０１０の細胞の結合特異性の特徴を持つハイブリドーマ細胞系によって産生することを特徴とする、上記（１）記載のモノクローナル抗体産生方法。
（５）上記（１）〜（３）のいずれかに記載されるモノクローナル抗体を用いて、牛白血病ウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｓ）抗原をウエスタンブロット法により検出する方法。
（６）上記（１）〜（３）のいずれかに記載されるモノクローナル抗体で酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を行うことによって、血清中の抗牛白血病抗体を特異的に検出する方法。
（７）上記（１）〜（３）のいずれかに記載されるモノクローナル抗体を含む、血清中の抗牛白血病抗体を特異的に検出するためのキット。
【００１５】
モノクローナル抗体の作成法はＭｉｌｓｔｅｉｎらによって１９７５年頃に開発され、その後急速に発展し、生物学、医学、農学等の幅広い分野で利用されている。特にマウス由来の骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とマウスの抗体産生細胞たとえばＢリンパ球との融合によって単一のエピトープを認識する抗体を永続的に産生しうる融合細胞（ハイブリドーマ）の作成が今日最も一般的になっている。
【００１６】
マウスモノクローナル抗体作製法の概略は以下の通りである。
遺伝的に単一なＢＡＬＢ／ｃマウスに抗原物質を免疫注射し、抗体を産生させる。抗体産生の有無は酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）やウエスタンブロット、オクタロニー法、免疫拡散法等種々の方法で確認できる。抗体価の上昇が認められたら、マウスから無菌的に脾臓を摘出する。脾臓には抗体産生細胞が約１〜２×１０８個程度存在しているが、これらの細胞のマウス体内での半減期は数週間から数ヶ月であり、増殖分化しない。また、各細胞はそれぞれ１つのエピトープを認識する抗体のみを産生しており、全体で種々のエピトープを認識するポリクローナルな抗体を産生している。
【００１７】
脾臓から細胞を取り出した後、マウスのミエローマ細胞と融合させる。ミエローマ細胞は抗体産生細胞と異なり、増殖を繰り返す。ミエローマ細胞には現在ＮＳ−１、Ｐ３、Ｐ３Ｕ１、ＭＰＣ−１１、ＳＰ２等がよく用いられている。細胞融合により、得られたハイブリドーマは、抗体を産生し、かつ永続的に増殖しうるため、大量の抗体を得ることができまた、後述のクローニングによって単一のエピトープのみを認識するモノクローナルな抗体を永続的に産生しうる。
細胞融合は、２０重量％〜８０重量％のポリエチレングリコール溶液を脾細胞とミエローマの混合物に加えることにより、脾細胞とミエローマ細胞の細胞膜が溶けて、当初は二つ以上の核と共に通常の細胞質を取り囲む。細胞膜を融合した後、数日で核が溶け、同調的有糸分裂が可能となる。これらの融合した細胞が分裂すると、両方の融合したパートナーの多くの種類の染色体は、ハイブリッド細胞系が安定するまでに消失する。
融合直後は、脾細胞同士およびミエローマ同士の融合細胞が存在する。また、未融合の脾細胞、ミエローマ細胞も存在する。脾細胞とミエローマの融合細胞すなわちハイブリドーマ以外はヒポキサンチンアミノプテリンチミジン（ＨＡＴ）選択培地により、増殖を防止あるいは死滅させることができる。このようにしてハイブリドーマだけが培養液中で増殖する。
【００１８】
ハイブリドーマが生成すると７日〜１４日のうちに増殖したハイブリドーマの細胞塊が肉眼で確認できるようになる。このときの培養上清には産生された抗体が放出されている。この時点では数種のハイブリドーマが混在している状態であり、培養上清中の抗体も種々のエピトープを認識する抗体の混合物であったり、あるいは不必要な抗体を含んでいる場合が多い。この段階でまず、培養上清中の抗体の中に、必要とする抗体が含まれているか否かをＥＬＩＳＡ等でスクリーニングする。スクリーニングによって陽性のクローンを選択する。
【００１９】
次にクローニングによって、陽性クローンをさらに単一なものに仕上げる。一般的なクローニング法は限界希釈法及び軟寒天法であるが前者の方が一般的である。限界希釈法では、ハイブリドーマ細胞を１個／ウェル程度となるように９６ウェル培養プレートにまき込んで７日〜１４日間培養し、生じたコロニーが単一でありかつ陽性クローンであることを条件として選択する。一般にクローニングは２回以上繰り返す方が単一なクローンを得られやすくなる。
得られたクローンは、２４ウェルプレートへ移して拡大培養し、最終的には１００ｍＬ前後のスケールまで増殖させる。増殖して得られたハイブリドーマは、通常、−８０℃以下、望ましくは液体窒素中で凍結保存することが望ましい。
適当な方法で凍結保存されたハイブリドーマは必要に応じて融解し、増殖させることができる。充分に増殖したハイブリドーマの培養上清にはモノクローナル抗体が約１０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ程度含まれている。またハイブリドーマをＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に接種し、マウス体内で無ウイルス的にハイブリドーマを増殖させることができる。十分な増殖が達成されれば、マウスの腹水および血液から１０ｍｇ／ｍＬ前後のモノクローナル抗体が得られる。
得られたモノクローナル抗体は様々な視点からスクリーニングされ、１個〜数個のクローンに絞られるのが普通である
【００２０】
モノクローナル抗体の利用分野は広範囲にわたるが、例えば、本研究の成果では、モノクローナル抗体を用いた牛白血病の主要表面構造糖タンパクｇｐ５１の特異的な検出がある。
材料としてはＢＬＶ感染細胞例えば感染動物から得られた抹消リンパ球や、感染動物のリンパ球を感受性細胞例えばＦＬＫ（ヒツジ胎児腎臓細胞）に接種して数日培養後、ウイルスを増殖させたものを用いる。ブランクとしてウイルス感染のない上記細胞を用いる。これらの細胞を温和な非イオン系界面活性剤、例えばノニデットＰ−４０（商標）やＴｒｉｔｏｎＸ（商標）などを０．１Ｗ／Ｖ％〜１０Ｗ／Ｖ％の濃度で加えて細胞膜を溶解する。これを一般にセルライセートと呼ぶ。セルライセートの上清を遠心分離（１００００ｒｐｍ程度）により得て、一般に用いられるＳＤＳ電気泳動に供する。すなわち、上清１００μＬに対して０．６２５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１２．５μＬ、β−メルカプトエタノール５μＬ、２ｍｇＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）０．０５Ｗ／Ｖ％を加えて５６℃で３０分間あるいは２５℃で１８〜２４時間処理する。これをスラブ電気泳動のウェルに各１０μＬずつチャージする。同時に分子量マーカー（第一化学薬品製）を５μＬチャージする。
スラブ電気泳動用のポリアクリルアミドゲルは濃縮ゲル３．５〜５．０Ｖ／Ｖ％、分離ゲル７．５〜１２Ｖ／Ｖ％とし、２０ｍＡで時間通電し、ＢＰＢのラインがゲルの下端から５ｍｍ程度まで泳動したら通電をとめる。
泳動後、ゲルをニトロセルロースメンブランに電気通電によって転写し、１重量％スキムミルクを含む生理食塩液に浸して４℃で１８〜２４時間あるいは３７℃で１時間ブロッキングを行う。次にメンブランを０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩液で洗浄し、分子量マーカーが泳動されたレーンのみを切り取ってクマジーブリリアントブルー染色液（ＣＢＢ）で染色する。モノクローナル抗体を０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩液で１０倍希釈し、上記メンブランを浸し、振盪しながら２５℃で１時間反応させる。次にメンブランを０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩液で充分洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（ザイメッド社製）を０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩液で２００倍に希釈してメンブランを浸し、振盪しながら２５℃で３０分間反応させる。次にメンブランを０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩液で充分洗浄した。次に５０ｍＭ４−クロロ−１−ナフトール（シグマ社製）および０．００３容量％過酸化水素水を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）にメンブランを浸して室温で発色させる。
ＣＢＢで染色された分子量マーカーの位置と比較して、上記ウエスタンブロットにより、ウイルス感染細胞にはモノクローナル抗体と特異的に結合した分子量は５１ｋＤａの位置に抗原のバンドが認められ、一方、非感染細胞には全くバンドが認められない。ポリクローナル抗体を用いた場合、非感染細胞にもバンドが出現することがしばしば起こる。これは用いた細胞に対する抗体を含んでいる場合があるためで、５１ｋＤａ付近に出現する場合は特に紛らわしい。従って、モノクローナル抗体を用いることはきわめて有意義である。
【００２１】
また、本発明の効果として牛白血病抗体の検出がある。抗原を固相に固相化し、モノクローナル抗体が認識する抗原エピトープと全く同一の部位を認識する抗体だけを検出する競合的ＥＬＩＳＡによって、モノクローナル抗体の認識エピトープの機能が明らかであれば、検出された抗体の持つ機能的意義が明確となる。具体的には、牛白血病ウイルス由来の抗原を固相、例えば９６穴式ポリスチレン製マイクロタイタープレートに固相化する。抗原はウイルスの超遠心ショ糖密度勾配法による分画精製画分、ウイルスを含む培養上清等があげられる。しかし、得られるｇｐ５１の量は極めて少ないため、実用的ではない。牛白血病のような持続型感染の経過をとるウイルスは一般的に得られるウイルス粒子量が極めて少なく、ある程度大量に必要な場合は遺伝子組み換えによって発現された必要な抗原エピトープを含んだ画分が有効である。この方法では標的とする牛白血病ウイルスの特定エピトープたとえばｇｐ５１，ｐ２４，ｐ１２，ｇｐ３０などの遺伝子配列が上述の通り既知である（非特許文献１参照）。
既知配列を適当なベクターに組み込み、標的蛋白を発現させる試みもすでになされている（非特許文献３，４参照）。いずれにせよエピトープが保存されており、かつ液状物質となっていれば固相への固相化は達成可能である。抗原溶液は、陰イオンクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の分離精製用担体を用いてさらに精製することが望ましい。陰イオンクロマトグラフィーは例えばＤＥＡＥ−セファロースがある。アフィニティークロマトグラフィーでは、モノクローナル抗体の抗原結合部位を損なうことなく固定化できるものであれば何でも良い。例えばアフィゲル１０（バイオラッド社製）がある。
一方、組み換え蛋白の末端にヒスチジン６残基が付加されるようにあらかじめ塩基配列の設計を施してあれば、得られた組み換え蛋白はニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製可能である。
精製された抗原をタンパク量で０．０１μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬの濃度範囲で中性〜アルカリ性の緩衝液で希釈する。希釈した抗原液は５０μＬ〜１００μＬずつマイクロタイタープレートに加えて４℃〜１０℃で１５時間〜２４時間静置する。
０．０５重量％〜０．１重量％のＴｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩水で該プレートを洗浄する。洗浄回数は５回程度が望ましい。
次にブロッキング操作を行う。ブロッキング剤としては牛血清アルブミン、オブアルブミン、スキムミルク、ゼラチンまたはカゼインなどの０．１重量％〜１０重量％の生理食塩溶液を用いることが出来る。該プレートに３００μＬずつブロッキング剤を含む溶液を分注し、該プレートを４℃〜１０℃で１５時間〜１８時間静置する。
該プレートを０．０５重量％〜０．１％重量％のＴｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩水で洗浄する。
洗浄が終了したプレートを水気を良く切った後、室温中で自然乾燥又は減圧乾燥させる。以上のように抗原を固定化して得られたプレートを乾燥剤が同封されたビニール袋に入れれば、４℃にて長期保存が可能である。
【００２２】
次に、酵素標識モノクローナル抗体の作製法について述べる。酵素標識に先立って、モノクローナル抗体を精製しなければならない。モノクローナル抗体はマウス腹水由来あるいは培養上清由来のいずれでも良い。一般には３３Ｖ／Ｖ％飽和〜５０Ｖ／Ｖ％飽和相当の硫酸アンモニウム粉末を加えて、抗体画分を沈殿させて得た後、プロテインＡあるいはプロテインＧ固定化担体を用いて精製する。プロテインＡ固定化担体あるいはプロテインＧ固定化担体には例えばプロテインＡセファロース（ファルマシア社製）あるいはプロテインＧセファロース（ファルマシア社製）がある。これら用いた抗体の精製法は既存の方法例えば非特許文献５等が参考にできる。精製されたモノクローナル抗体は、各種の酵素、例えばペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、で標識することができる。これらのうち、ペルオキシダーゼによる標識は、バックグラウンドが低く、高感度であることから、近年多く使われている。方法は、ペルオキシダーゼ糖鎖を過ヨウ素酸酸化して生じたアルデヒド基と抗体の一級アミンとを反応させる方法（非特許文献６参照）、抗体をペプシン消化、２−メルカプトエタノールによる還元で生じたＳＨ基とペルオキシダーゼの一級アミンとをマレイミド架橋試薬を用いて結合させる方法（非特許文献７参照）などがある。いずれの方法でも抗体とペルオキシダーゼの結合モル比は１：１〜１：３程度が望ましい。
【００２３】
次にＥＬＩＳＡの術式について述べる。
被検血清を２〜２００倍に希釈する。血清を希釈するための溶液は０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０（登録商標）および１重量％から１０重量％のブロッキング剤を含む生理食塩水が望ましい。同様に、陰性コントロール血清および陽性コントロール血清も希釈する。希釈した被検血清ならびに陰性コントロール血清および陽性コントロール血清を上記作成したプレートのウェルに５０〜１００μＬずつ加える。測定は２連以上で行うことが望ましい。プレート上に蒸発を防ぐためにビニール製のフィルムを張り、該プレートを２０℃〜３７℃で一定時間望ましくは３０分以上静置する。
【００２４】
次に、洗浄液でプレートを洗浄するが、洗浄液は０．０５重量％〜１．０重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩水が適当である。洗浄回数は３回〜１０回が適当である。
次に、標識モノクローナル抗体を希釈液で５０００〜１００００倍に希釈し、上述のウェルに５０〜１００μＬずつ加える。
標識抗体を加えた後、蒸発を防ぐためにビニール製のフィルムをプレート上に張り、２０℃〜３７℃で一定時間望ましくは３０分以上静置する。
次に、洗浄液でプレートを洗浄する。洗浄液は０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩水が適当である。洗浄回数は３回〜１０回が適当である。
【００２５】
次に、発色操作を行う。標識抗体の標識酵素がペルオキシダーゼの場合、発色基質は２，２’−アジノジ−（３−エチルベンズチアゾリン）−６−スルホン酸、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン等が適当である。過酸化水素を含むこれらの発色基質溶液を５０〜１００μＬずつウェルに加えて発色をスタートさせる。
１５分〜４０分間、２０℃〜３７℃で静置後、反応停止液を５０μＬ〜１００μＬずつウェルに加えて発色反応を停止させる。反応停止液としては、１Ｍ〜２Ｍ　　硫酸水溶液、１Ｍ〜４Ｍ　塩酸水溶液、１Ｍ〜３Ｍ　　水酸化ナトリウム水溶液が挙げられる
直ちにプレートリーダーで発色反応を停止させたプレートの吸光度を測定する。酵素や用いた発色基質により極大吸収が異なるので、最適波長を選択する。例えば酵素がペルオキシダーゼで発色基質が２，２’−アジノジ−（３−エチルベンズチアゾリン）−６−スルホン酸の場合は４０５ｎｍ〜４１５ｎｍ、同じく酵素がペルオキシダーゼで発色基質が３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジンの場合は４５０ｎｍが適当である。
【００２６】
抗原固定化プレート、ならびにこれに付随する、陰性コントロール血清、陽性コントロール血清、洗浄液、標識抗体溶液、血清希釈用液、発色基質および反応停止液はあらかじめ調製して安定な条件下、例えば凍結乾燥あるいは安定剤を添加した溶液状態で４℃〜８℃で保存すれば長期保存および即時使用可能となる。測定用キットは上記の条件で調製した抗原固定化プレート及びこれに付随する標識抗体溶液、血清希釈用液、発色基質、反応停止液をセットしたものからなる。キットは上述と同様の方法で使用する。
得られた吸光度は被検血清中の抗牛白血病抗体の量に反比例対数的に増加する。この結果から抗体価の高低を比較する。
また、測定に必要な、抗原固定化済みのプレートやその他必要な試薬をセットにしたキットとして提供することも可能である。
【００２７】
抗原固定化プレート、ならびにこれに付随する、陰性コントロール血清、陽性コントロール血清、洗浄液、標識抗体溶液、血清希釈用液、発色基質および反応停止液はあらかじめ調製して安定な条件下、例えば凍結乾燥あるいは安定剤を添加した溶液状態で４℃〜８℃で保存すれば長期保存および即時使用可能となる。測定用キットは上記の条件で調製した抗原固定化プレート及びこれに付随する標識抗体溶液、血清希釈用液、発色基質、反応停止液をセットしたものからなる。キットは上述と同様の方法で使用する。
【００２８】
以下実施例をあげて本発明の具体的な説明をするが、本発明はこれに限定されるわけではない。
【実施例１】
（モノクローナル抗体評価用抗原固相化プレートの作製）
牛白血病ウイルスの構造蛋白のうち、表面糖蛋白のｇｐ５１に相当する全長０．９０２ｋｂのｇｐ５１遺伝子（理化学研究所　分子ウイルス学研究ユニット）をバキュロウイルストランスファーベクター：ｐＹＮＧｓｉｇＨｉｓ（カタクラ工業（株）製）に組み込んだ。該ベクターは発現蛋白のＮ末端側にヒスチジンＴａｇが付加されるよう設計されている。組み換えバキュロウイルスはカイコに感染、増殖させることによりカイコ体液に多量の組み換えｇｐ５１が発現した。組み換え及び組み換えバキュロウイルスによる大量発現はカタクラ工業（株）の特開平０７−３０３４８８に基づくベクター及び製造方法に従って行った。すなわち、バキュロウイルスベクターのＢに相当するＥｃｏＲＩ、ＸＢａＩサイト内にｇｐ５１遺伝子配列を組み込み、タンパク分解酵素遺伝子欠損カイコに感染させた。
カイコ体液１ｍＬを結合バッファー：２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ＋１０ｍＭイミダゾール（ｐＨ　７．４）１Ｌに対して２４時間４℃で透析した。ニッケルキレートセファロース（アマシャム社製）をバイオラッド製エコノカラム（１．０ｃｍφ×５ｃｍ）に充填し、ゲル体積を１ｍＬとし、結合バッファーで平衡化した。カラムはエコのシステム（バイオラッド社製）に接続し、カイコ体液を同カラムに０．１ｍＬ／分の流速で添加した。全量添加後、約１０培ゲル体積分の結合バッファーを流しつづけた。続いて溶出バッファー：結合バッファー＋４９０ｍＭイミダゾールを０．２ｍＬ／分で流し、組み換えｇｐ５１を溶出した。紫外線吸収検出器によって検出されたピーク位置の溶出画分を分取した（ｇｐ５１画分）。ｇｐ５１画分を０．０５Ｍ炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．６）で２０倍に希釈し、９６穴平底ポリスチレン製マイクロタイタープレート（ヌンク社製）に５０μＬ加え、４℃で２４時間静置した。内容物を廃棄後、１Ｗ／Ｖ％スキムミルクを含むＰＢＳで全ウェルを満たし、４℃で２４時間静置した。内容物を廃棄後、０．０５Ｗ／Ｖ％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））を含むＰＢＳで５回洗浄して直ちに使用した。
【００２９】
【実施例２】
（ポリクローナル血清の調製）
牛白血病ウイルス感染細胞である羊胎児腎臓由来株化細胞（理化学研究所　分子ウイルス学研究ユニット　ＦＬＫ：Ｖａｎ，ｄｅｒ　Ｍａａｔｅｎ　ａｎｄ　Ｍｉｌｌｅｒ、　１９７６）を抗原として用いた。ＦＬＫは牛白血病ウイルスに持続的に感染し、細胞の増殖に伴い、細胞内にウイルス粒子を蓄積し、一部は細胞外に放出されている。ＦＬＫを１０Ｖ／Ｖ％牛胎児血清（Ｔｒａｃｅ社製）加イーグルＭＥＭ培地（日水製薬製）中、２２０ｃｍ２フラスコ（住友ベークライト製）（培地量１０ｍＬ）中で７２時間培養後、培養液を除去し、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ−）で２回細胞を洗浄後、トリプシン−ＥＤＴＡ混液（ギブコ社製）を０．５ｍＬ加えて細胞をフラスコから剥離し、直ちに培地１０ｍＬを加えて消化を停止した。３００×ｇで遠心して細胞を集めた。培養液を捨て、細胞ペレットに１Ｗ／Ｖ％非イオン性界面活性剤トライトン−Ｘ（登録商標）生理食塩水溶液２０ｍＬ加えてウイルスの不活化ならびに可溶化を行った。ＰＢＳ−に対して２４時間４℃で透析し、１００００×ｇで４℃、１０分間遠心し、上清２５ｍＬを得た。使用時まで−８０℃で保存した。この上清をセルライセートと呼ぶ。
セルライセートを不完全フロイントアジュバントとし、これをＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に注射した。２週間ごとに同様に追加免疫を行った。マウスが牛白血病ウイルスに対して免疫状態になったことを確かめるため、ＥＬＩＳＡによって免疫前後の抗体価の変動を調べた。ＥＬＩＳＡは実施例１で作製したプレートを用いた。すなわち、マウスの尾静脈より採血して得られた被検血清を０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０（登録商標）および５重量％のスキムミルク（和光純薬製）を含むＰＢＳで１０００倍に希釈した。希釈した被検血清ならびプレートのウェルに１００μＬずつ加えた。プレート上に蒸発を防ぐためにビニール製のフィルムを張り、該プレートを３７℃で１時間静置した。
次に、プレートを０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含むＰＢＳで６回洗浄した。
次に、西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（和光純薬製）を上記洗浄液で５００倍希釈し、ウェルに１００μＬずつ加えた。蒸発を防ぐためにビニール製のフィルムをプレート上に張り、３７℃で３０分静置した。
次に、プレートを０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含むＰＢＳで６回洗浄した。
ジメチルホルムアミド（和光純薬製）に５５ｍＭ　３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジ（同仁化学製）相当の粉末を溶解し、０．０５Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）に１／１００容溶解し、さらに３０Ｖ／Ｖ％過酸化水素水（和光純薬製）を蒸留水で１００倍希釈したものを１／１００容加えたものを発色基質１００μＬずつウェルに加えて発色をスタートさせた。
１５分間、室温で静置後、１Ｍ　硫酸水溶液を５０μＬずつウェルに加えて発色反応を停止した。
直ちにプレートリーダー（バイオラッド社製　モデル３５５０）で発色反応を停止させたプレートの４５０ｎｍの吸光度を測定した。
これにより、抗牛白血病抗体だけが牛白血病ウイルスの最初の注射に先立ってマウスから得られた対照血清よりもそれらに結合するようになる。３度目の免疫注射により、免疫前より１００倍に抗体力価が上昇した。十分な抗体価があると判断した。最終免疫として実施例１で調製した組み換え精製ｇｐ５１画分を希釈せずにマウスの尾静脈に５０μＬ注射した。最終免疫から３日後、マウスは全採血を行うと同時に直ちに次の実施例３に供した。
【００３０】
【実施例３】
（ハイブリドーマの作成）
実施例２で全採血されて死亡したマウスからその脾臓を摘出した。骨髄腫細胞ＳＰ−０／Ａｇ１４（理化学研究所　　分子ウイルス学研究ユニット　Ｓｃｈｕｌｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２７６、２６９（１９７８））を１５Ｖ／Ｖ％牛胎児血清と１０−５Ｍβ−メルカプトエタノールとペニシリン１００Ｕ／ｍＬとストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬとアンホテリシンＢ２．５μｇ／ｍＬを含むイスコフ培地（ＧＩＢＣＯ社）中で増殖した。脾臓を１ｍＭグルタミンと５ｍＭＨＥＰＥＳを含むＭＥＭ培地（日水製薬）で２回洗浄し、先曲がりピンセットで脾細胞を押し出した。２００メッシュのステンレスメッシュ上で夾雑物を除去し、脾細胞を集めた。脾細胞（１×１０８個）は次に２×１０７の骨髄腫細胞と共に５０ｍＬの円錐チューブに入れ１０分間１０００ｒｐｍの回転速度で遠心した。上清を吸引し、その細胞に５０重量％のポリエチレングリコール１ｍＬを１分間以上かけて滴下し、骨髄腫細胞と脾細胞を融合した。次の５分間にわたって１０ｍＬの無血清イスコフ培地を滴下した。混合物を１０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を吸引除去した。細胞ペレットを軽くほぐし、ＨＡＴ培地すなわち０．０８８ｍｇ／ｍＬアミノプテリンと１．９４ｍｇ／ｍＬチミジンと６．８ｍｇ／ｍＬのヒポキサンチンと１５Ｖ／Ｖ％牛胎児血清と１０−５Ｍβ−メルカプトエタノールとペニシリン１００Ｕ／ｍＬとストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬとアンホテリシンＢ２．５μｇ／ｍＬを含むイスコフ培地を１００ｍＬに再懸濁した。再懸濁した細胞液は５枚の９６ウェル培養プレートに１００μ／ウェルとなるようにまき込みを行った。炭酸ガスインキュベーター内で、湿度９９％、３７℃、炭酸ガス濃度７．０Ｖ／Ｖ％の条件で培養した。培養後１日目にＨＡＴ培地を各ウェルに１５０μＬずつ滴下した。４日目に各ウェルの培地を半量吸引除去し、新たにＨＡＴ培地を１５０μＬずつ各ウェルに加えた。クローンは７日〜１０日目に現れた。各ウェルの上清のＥＬＩＳＡ測定によって牛白血病抗体陽性のクローン数は１６であることを確認した。確認培養のため、各陽性クローンを２４ウェルプレートに移し、ＨＴ培地すなわちＨＡＴ培地からアミノプテリンのみをのぞいた培地を０．５ｍＬ各ウェルに加え、２日〜３日間培養した。クローンが目視できるようになるまで増殖したら、再びＥＬＩＳＡで陽性クローンを確認した。この時点で１４クローンが陽性で、残るクローンは抗体生産能が消失していた。陽性クローンをさらにクローニングし、モノクローナルなハイブリドーマに仕上げた。すなわち各陽性ウェル中のハイブリドーマを５個／ｍＬとなるまでＨＴ培地で希釈し、９６ウェルプレート１枚に各ウェル２００μＬずつまき込んだ。７日〜１０日後に出現したクローンのうち、高い抗体価を示し、コロニーが単一であるクローンを選択した。選択したクローンをさらに２４ウェルプレートにまき込んで増殖させ、上述と同じクローニング操作をもう一度繰り返し、完全な単一クローンを得た。クローニングの過程で４個のクローンが増殖能を失い、最終的に１０個の単一なクローンが得られた。各クローンは２４ウェルプレートへ増殖培養後、１０ｍＬ培養フラスコへ増殖させ、最終的に１００ｍＬのスケールまで増殖させた。３００×ｇの遠心分離により培養上清と細胞と分け、各クローンは２×１０７個／ｍＬずつ１０％ジメチルスホルムアミド（和光純薬社製）を含む牛胎児血清に懸濁し、プラスチックバイアル（住友ベークラト）に０．５ｍＬずつ分注後、液体窒素内で保存した。保存した各クローンの細胞は１０Ｖ／Ｖ％牛胎児血清、０．１８Ｗ／Ｖ％炭酸水素ナトリウムおよび２ｍＭグルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬）で培養可能であった。必要に応じて凍結細胞を同培地で復帰させ、１０００ｍＬスケールまで培養した。培養上清はモノクローナル抗体を含むため、実施例３〜６に供した。なお、１０種の各クローンはそれぞれ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の番号を付した。このうちクローン７を独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０１０として寄託した。
【００３１】
【実施例４】
（ハイブリドーマのタイピング）
実施例２で得られた１０種のハイブリドーマが生産する抗体のサブクラスを決定するため、市販のタイピングキットを用いて検査した。各ハイブリドーマの培養上清をタイピングキット（ピアス社製）に供試した。その結果、すべてＩｇＧ１産生株で、Ｌ鎖はすべてカッパー鎖であった。
【００３２】
【実施例５】
（モノクローナル抗体の抗原との反応部位）
ウエスタンブロットにより、組み換えｇｐ５１との反応位置を牛白血病抗体陽性牛血清（北里研究所製）と比較した。
実施例１で得たｇｐ５１　１００μＬに対して０．６２５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１２．５μＬ、β−メルカプトエタノール５μＬ、２ｍｇＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を加えて１００℃で３分間加熱処理した。これをスラブ電気泳動の濃縮ゲル上に各１００μＬチャージした。同時に分子量マーカー（第一化学薬品製）を専用レーンに５μＬチャージした。
スラブ電気泳動用のポリアクリルアミドゲルは濃縮ゲル５．０Ｖ／Ｖ％、分離ゲル１０Ｖ／Ｖ％とし、３０ｍＡで１．５時間通電した。
泳動後、ゲルをニトロセルロースメンブランに電気通電によって転写し、１重量％スキムミルクを含む生理食塩液に浸して３７℃で１時間振盪しながらブロッキングを行った。次にメンブランを０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩液で洗浄した。分子量マーカーが泳動されたレーンのみを切り取ってクマジーブリリアントブルー染色液（ＣＢＢ）で染色した。残りのメンブランは、幅約４ｍｍに切り、短冊状にした。実施例３で得たおのおののモノクローナル抗体の培養上清は０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩液で２倍希釈し、牛白血病陽性牛血清および陰性血清は同液で２０倍希釈した。それぞれに短冊状のメンブランを浸し、振盪しながら３７℃で１時間反応させた。次にメンブランを０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩液で充分洗浄した。モノクローナル抗体についてはペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（和光純薬製）を、牛陽性血清についてはペルオキシダーゼ標識抗ウシＩｇＧ（カペル社製）をそれぞれ０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩液で２００倍に希釈してメンブランを浸し、振盪しながら３７℃で３０分間反応させた。次にメンブランを０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩液で充分洗浄した。次に５０ｍＭ４−クロロ−１−ナフトール（シグマ社製）および０．００３容量％過酸化水素水を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）にメンブランを浸して室温で発色させた。結果を図１に示す。
ＣＢＢで染色された分子量マーカーの位置と比較して、上記ウエスタンブロットにより、糖鎖修飾が数段になされており牛白血病抗体陽性血清で複数のバンドが認められた。牛白血病抗体陽性血清がｇｐ５１と特異的に結合した抗原の分子量は３０ｋＤａ〜６６ｋＤａを有しており、これと共通のバンドが現れたモノクローナル抗体は１、２、７、８であった。これら以外のクローンは３５ｋＤａ付近に単一バンドが認められるが、牛陽性血清にはこの分子量位置にバンドは存在しなかった。
【００３３】
【実施例６】
（競合ＥＬＩＳＡによるクローンの絞込み）
実施例１で作製したプレートに牛白血病抗体陽性血清（北里研究所製）、ならびに牛白血病抗体陰性血清（ハイクローン社製）をそれぞれ０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩液で２倍希釈したものをウェルに５０μＬずつ加えてプレート上に蒸発を防ぐためにビニール製のフィルムを張り、該プレートを３７℃で１時間静置した。３７℃で１時間静置した。
次に、プレートを０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含むＰＢＳで４回洗浄した。
次に、実施例３で得た各クローンの培養上清を０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩液で１０倍希釈したものを牛白血病抗体陽性血清ならびに牛白血病抗体陰性血清を加えていたウェルにそれぞれ５０μＬずつ加えてプレート上に蒸発を防ぐためにビニール製のフィルムを張り、該プレートを３７℃で３０分間静置した。次に、プレートを０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含むＰＢＳで４回洗浄した。西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｑｕａｌｅｘ社製）を上記洗浄液で１０００倍希釈し、ウェルに１００μＬずつ加えた。蒸発を防ぐためにビニール製のフィルムをプレート上に張り、３７℃で３０分静置した。
次に、プレートを０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含むＰＢＳで４回洗浄した。
ジメチルホルムアミド（和光純薬製）に５５ｍＭ　３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジ（同仁化学製）相当の粉末を溶解し、０．０５Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）に１／１００容溶解し、さらに３０Ｖ／Ｖ％過酸化水素水（和光純薬製）を蒸留水で１００倍希釈したものを１／１００容加えたものを発色基質１００μＬずつウェルに加えて発色をスタートさせた。
１２分間、室温で静置後、１Ｍ　硫酸水溶液を５０μＬずつウェルに加えて発色反応を停止した。
直ちにプレートリーダー（バイオラッド社製　モデル３５５０）で発色反応を停止させたプレートの４５０ｎｍの吸光度を測定した。
牛陰性血清の吸光度に対する牛陽性血清の吸光度の割合を次式から求め、抑制率としたとき、１、２、７、８、は５０％以上の抑制率だったが、これら以外はすべて０％であった。
この結果は実施例４において牛陽性血清と共通のバンドが認められたクローン番号と一致していた。
このことから、今後の実施例では１、２、７、８のクローンについて絞り込んだ検討を行った。
抑制率（％）＝１００（１−牛陽性血清吸光度／牛陰性血清吸光度）
【表１】
2004107219.tif 000002
【００３４】
【実施例７】
（培養上清からのモノクローナル抗体の精製）
実施例６で絞り込んだ各クローン（１，２，７，８）の培養上清（約１０００ｍＬ）に硫酸アンモニウムを３００ｇ加えて溶解し、４℃で一晩静置して沈殿を生じさせた。沈殿を１００００×ｇで５分間遠心して沈殿部を得る。沈殿部にＰＢＳを１０ｍＬ加えて溶解する（粗抗体液）。あらかじめプロテインＧセファロースＦＦ（アマシャム社製）を１．５ｃｍφ×５ｃｍのエコノカラム（バイオラッド社製）にゲル体積５ｍＬとなるように充填し、ＰＢＳで平衡化した。これに粗抗体液を０．２ｍＬ／分の流速で加え、全量加えた後にＰＢＳを２０ｍＬ流しつづけて洗浄した。次に０．１Ｍグリシン塩酸酸バッファー（ｐＨ２．５）を０．４ｍＬ／分で流し、紫外線吸収検出器で２８０ｎｍの吸収をモニターし、現れたピークを分取した。得られた画分を精製水４Ｌに対して２４時間透析し、凍結乾燥した。それぞれ約５０ｍｇの精製モノクローナル抗体が得られた。
（モノクローナル抗体のペルオキシダーゼ標識）
０．３Ｍ炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ８．１）１ｍＬに西洋わさびペルオキシダーゼ（和光純薬社製）を１０ｍｇ溶解し、１ｍＬの２０ｍＭ−ＮａＩＯ４水溶液を加えた。２５℃で３０分静置し、精製モノクローナル抗体粉末４０ｍｇを０．１Ｍ炭酸ナトリウム１ｍＬに溶かし、先の溶液に加えた。グリセロールを２０μＬ加え、４℃℃で１８時間反応させた。５０％飽和となるように飽和硫安を加え、１００００×ｇで１０分遠心し、沈殿を得た。
沈殿にＰＢＳを１ｍＬ加えて溶解した。１ｍＬのグリセロールを加えて、使用時まで−２０℃で保存した。
得られた酵素標識モノクローナル抗体は後述の実施例にあるように適宜希釈してＥＬＩＳＡに供した。
【００３５】
【実施例８】
（エピトープ解析）
実施例７で標識した４種のモノクローナル抗体をそれぞれ１−ＨＲＰ、２−ＨＲＰ、７−ＨＲＰ
８−ＨＲＰとする。実施例３で得た各非標識モノクローナル抗体（培養上清）と標識モノクローナル抗体を用いて精製組み換えｇｐ５１に対する競合ＥＬＩＳＡを行った。競合ＥＬＩＳＡにあたっては実施例６で示した試薬を使用した。
実施例１で作製したプレートにそれぞれのモノクローナル抗体培養上清およびモノクローナル抗体産生細胞用の培養液を５０μＬ加え、３７℃で１時間静置した。４回洗浄後、１−ＨＲＰ、２−ＨＲＰ、７−ＨＲＰ、８−ＨＲＰをそれぞれ洗浄液で１０００倍希釈したものを５０μＬずつ各ウェルに加え、３７℃で３０分間静置した。洗浄後、発色基質で発色させて吸光度を測定した。モノクローナル抗体産生細胞用の培養液の発色強度を１００とした場合の各発色強度を下表に示す。
【表２】
2004107219.tif 000003
数値が低いほど競合していることを示す。たとえば同一クローンの非標識、標識モノクローナル抗体は競合して数値が低くなるのが普通である。１と２のクローンおよび７と８のクローンの競合性は高く、数値が低い。したがってモノクローナル抗体１と２が似通ったエピトープ、７と８が似通ったエピトープを認識していると考えられた。逆に１や２は明らかに７や８とは異なるエピトープを認識していると考えられた。
【００３６】
【実施例９】
（ウエスタンブロットによる抗原検出）
ＢＬＶ感染ＦＬＫ細胞ならびに非感染ＦＬＫ細胞（理化学研究所　　分子ウイルス学研究ユニット）を１０％ウシ胎児血清を含むイーグルＭＥＭ培地中、２４穴細胞培養プレート（コースター社製）で５％炭酸ガス雰囲気下、３７℃４日間培養した。培養液を廃棄し、１Ｗ／Ｖ％ノニデットＰ−４０（商標）を含む生理食塩水を０．５ｍＬ加えて細胞膜を溶解した。このセルライセートの上清を遠心分離１００００ｒｐｍの遠心分離により得て、ＳＤＳ電気泳動に供した。すなわち、上清１００μＬに対して０．６２５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１２．５μＬ、β−メルカプトエタノール５μＬ、２ｍｇＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）０．０５Ｗ／Ｖ％を加えて５６℃で３０分間処理した。これをスラブ電気泳動のウェルに各１０μＬずつチャージした。同時に分子量マーカー（第一化学薬品製）を５μＬチャージした。
スラブ電気泳動用のポリアクリルアミドゲルは濃縮ゲル３．５Ｖ／Ｖ％、分離ゲル１０Ｖ／Ｖ％とし、２０ｍＡで通電し、ＢＰＢのラインがゲルの下端から５ｍｍ程度まで泳動したら通電をとめた。
泳動後、ゲルをニトロセルロースメンブラン（ワットマン製）に電気通電によって転写し、１重量％スキムミルクを含む生理食塩液に浸して４℃で１８〜２４時間あるいは３７℃で１時間ブロッキングを行った。次にメンブランを０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩液で洗浄し、分子量マーカーが泳動されたレーンのみを切り取ってクマジーブリリアントブルー染色液（ＣＢＢ）で染色した。実施例５のごとく、感染細胞及び非感染細胞を泳動して得たメンブランは４ｍｍ幅の短冊状に切り分けた。
４種（Ｎｏ．１，２，４，７）の精製モノクローナル抗体溶液ならびに市販の抗ｇｐ５１モノクローナル抗体２種（ＶＭＲＤ社製　ＢＬＶ１とＢＬＶ２）を０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩液でそれぞれ希釈し、ＩｇＧ濃度として１μｇ／ｍＬとなるように調製した。ＩｇＧ濃度は希釈前の溶液の２８０ｎｍの紫外吸収値から求めた。それぞれに上記短冊状のメンブランを浸し、振盪しながら２５℃で１時間反応させた。次にメンブランを０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩液で充分洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（ザイメッド社製）を０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩液で２００倍に希釈してメンブランを浸し、振盪しながら２５℃で３０分間反応させる。次にメンブランを０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩液で充分洗浄した。次に５０ｍＭ４−クロロ−１−ナフトール（シグマ社製）および０．００３容量％過酸化水素水を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）にメンブランを浸して室温で発色させた。結果を図２に示す。
ＣＢＢで染色された分子量マーカーの位置と比較して、上記ウエスタンブロットにより、ウイルス感染細胞にはモノクローナル抗体Ｎｏ．１と２　はきわめて薄いバンドが認められたが明瞭とは言いがたかった。Ｎｏ．８は全くバンドが認められなかった。本発明のＮｏ．７は最も強く５１ｋＤａの位置に明瞭な抗原のバンドが認められ、一方、非感染細胞には全くバンドが認められなかった。市販の２種のモノクローナル抗体はいずれもｇｐ５１相当の位置に特異バンドはほとんど認められなかった。
【００３７】
【実施例１０】
（牛血清中の抗牛白血病抗体価の測定）
実施例１で作製したプレートおよび実施例６で得たＭａｂ７−ＨＲＰを用いた。
ゲル内沈降反応（北里研究所製）により判別された牛白血病抗体陽性群の牛１０頭及び牛白血病抗体陰性牛１０頭の血清を被検血清とし、２倍に希釈した。血清を希釈するための溶液は０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０（登録商標）を含むＰＢＳを用いた。同様に、陰性コントロール血清（ハイクローン社製）および陽性コントロール血清（北里研究所製）も２倍希釈した。希釈した被検血清ならびに陰性コントロール血清および陽性コントロール血清を上記作成したプレートのウェルに５０μＬずつ４連で加えた。プレート上に蒸発を防ぐためにビニール製のフィルムを張り、該プレートを３７℃で１時間静置した。洗浄液でプレートを５回洗浄した。
次に、Ｍａｂ７を西洋わさびペルオキシダーゼ（和光純薬社製）で標識した標識モノクローナル抗体を希釈液で１００００倍に希釈したものを各ウェルに５０μＬずつ加えた。希釈用の液は上記血清希釈用の液を用いた。蒸発を防ぐためにビニール製のフィルムをプレート上に張り、３７℃で３０分静置した。次に、洗浄液でプレートを５回洗浄した。
５５ｍＭ　３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン−ジメチルホルムアミド溶液（同仁化学社製）および０．３容量％過酸化水素水を０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に１／１００容加え、発色基質溶液とした。発色基質溶液を１００μＬずつウェルに加えて発色をスタートさせた。
室温で３０分間静置後、反応停止液１Ｍ硫酸水溶液を５０μＬずつウェルに加えて発色反応を停止させた。
直ちにプレートリーダー（バイオラッド社製　モデル３５５０）で発色反応を停止させたプレートの吸収波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。実施例５で示したように抑制率を求めると以下の表のようになり、ゲル内沈降反応で陽性となった検体は４つの標識モノクローナルのいずれでも５０％以上の抑制率を示し、ゲル内沈降反応で陰性となった検体は４つの標識モノクローナルのいずれでも５０％未満の抑制率を示した。このことから、抑制率５０％以上を陽性、５０％未満を陰性とすれば陽性と陰性の区分が容易に可能であることが示された。
【表３】
2004107219.tif 000004
【００３８】
【発明の効果】
本発明は牛白血病ウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｓ）のエンベロープ主要糖タンパクであって、還元性条件下でＳＤＳで変性され、且つ電気泳動的に定められた５１ｋＤａの分子量を有する抗原（ｇｐ５１）に特異的に結合するモノクローナル抗体を提供することにより、牛白血病特異抗原ｇｐ５１をウエスタンブロット法により検出可能とし、さらに感染牛の血清抗体価測定を迅速、正確に行うことができる方法の開発に寄与しうるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】牛陽性血清、各クローンについて、組み換えｇｐ５１に対するウエスタンブロット像（実施例５）を示す。
【図２】ＢＬＶ感染ＦＬＫ細胞（ＦＬＫ＋）とＢＬＶ非感染細胞（ＦＬＫ−）に対する牛陽性血清、各クローン、市販抗ｇｐ５１モノクローナル抗体のウエスタンブロットにおける反応性（実施例９）を示す。
【図１】
2004107219.tif 000005
【図２】
2004107219.tif 000006