(57)【要約】【課題】昆虫における混合機能オキシダーゼの活性の上昇を、昆虫１個体を用いて、手早く簡単に、しかも容易に判断できるように検査する方法および試験キットを提供する。【解決手段】酸性の緩衝液中で昆虫１個体を好ましくはエッペンドルフチューブのような小型のチューブ内で粉砕用乳棒を用いて粉砕することによりホモジナイズする工程と、酸性の緩衝液で緩衝されたテトラメチルベンジジン溶液を基質として追加する工程と、過酸化水素を酸化剤として追加する工程と、青色の呈色強度を評価して混合機能オキシダーゼ活性の上昇を判定する工程とを含む。上記の方法で使用される試験キットは、酸性の緩衝液（好ましくはｐＨ４緩衝液）、テトラメチルベンジジン、テトラメチルベンジジンの溶媒（好ましくはメタノール）、および過酸化水素、をそれぞれ別個に収容する複数の容器を含む。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫における混合機能オキシダーゼ活性の上昇を検査する方法であって、酸性の緩衝液中で昆虫１個体をホモジナイズする工程と、酸性の緩衝液で緩衝されたテトラメチルベンジジン溶液を基質として追加する工程と、過酸化水素を酸化剤として追加する工程と、青色の呈色強度を評価して混合機能オキシダーゼ活性の上昇を判定する工程とを含む、検査方法。
【請求項２】
試験キットを用いて行う請求項１に記載の方法であって、当該試験キットは、
酸性の緩衝液、
テトラメチルベンジジン、
テトラメチルベンジジンの溶媒、および
過酸化水素、
をそれぞれ別個に収容する複数の容器を含む、検査方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記緩衝液はｐＨ４〜６である、検査方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記緩衝液はｐＨ５である、検査方法。
【請求項５】
請求項１または２に記載の方法であって、前記緩衝液は酢酸ナトリウムである、検査方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の方法であって、前記溶媒はアセトンである、検査方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の方法であって、前記過酸化水素は３％の水溶液である、検査方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の方法に使用される試験キットであって、
酸性の緩衝液、
テトラメチルベンジジン、
テトラメチルベンジジンの溶媒、および
過酸化水素、
をそれぞれ別個に収容する複数の容器を含む、試験キット。
【請求項９】
請求項８に記載の試験キットであって、前記緩衝液はｐＨ４〜６である、試験キット。
【請求項１０】
請求項９に記載の試験キットであって、前記緩衝液はｐＨ５である、試験キット。
【請求項１１】
請求項８に記載の試験キットであって、前記緩衝液は酢酸ナトリウムである、試験キット。
【請求項１２】
請求項８から１１のいずれかに記載の試験キットであって、前記溶媒はメタノールである、試験キット。
【請求項１３】
請求項８から１２のいずれかに記載の試験キットであって、前記過酸化水素は３％の水溶液である、試験キット。
【請求項１４】
請求項８から１３のいずれかに記載の試験キットであって、前記試験を実施するための器具をさらに含む、試験キット。
【請求項１５】
請求項１４に記載の試験キットであって、試験管と、ピペットと、マイクロアッセイプレートとを含む、試験キット。
【請求項１６】
請求項１４に記載の試験キットであって、カラーチャートをさらに含む、試験キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、昆虫の殺虫剤耐性の検査方法および試験キットに関し、より特定的には、昆虫の、ピレスロイド系殺虫剤に対する耐性の、現場で使用可能な検査方法および試験キットを提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】
マラリア、デング熱、フィラリア症など昆虫を媒介とする疾病においては、殺虫剤が最も重要な予防手段となっている。１９４０年代に初めて合成殺虫剤ＤＤＴが登場して以来、数え切れないほどの人命が救われている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、殺虫剤の長期使用は媒介昆虫、特に上記のような疾病を媒介する昆虫に耐性を獲得させることとなり、媒介昆虫の駆除効果、ひいてはそれらが媒介する疾病の予防効果が上がらないということになっている。耐性検査は主に世界保健機構（ＷＨＯ）の標準試験手順に基づいているが、この標準手順は使い勝手が良いとは到底言い難く、試験キットの貯蔵寿命も短く、試験の実施および判定には熟練を要する。その結果、多くの媒介昆虫について、感受性についての情報がほとんど何も得られないということが非常にしばしばであり、これが伝染病対策の成果に影響しがちであった。
【０００４】
現場で使用できる試験キットが開発されれば、昆虫を媒介とする疾病の防除において大きな前進となろう。
一般に、耐性は生化学的に以下の３つの機序に基づいている。
１）有機リンおよびカルバメートを対象とする非特異性エステラーゼのレベルが上昇する。
２）ピレスロイドに対する混合機能オキシダーゼの活性が上昇する。
３）有機リンおよびカルバメートに対するアセチルコリンエステラーゼの感受性喪失。
本発明は、昆虫における混合機能オキシダーゼの活性の上昇を、昆虫１個体を用いて、手早く簡単に、しかも容易に判断できるように検査する方法および試験キットを提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、試験キットは、酸性の緩衝液、テトラメチルベンジジン、テトラメチルベンジジンの溶媒、および過酸化水素、をそれぞれ別個に収容する複数の容器を収納する容器を含む。
フィールドでの使用のために、このキットは上記試験を実施するための器具、例えば混合用の容器やエッペンドルフチューブなどの試験管、ピペットやマイクロアッセイプレート、さらに通常はカラーチャートを含む。これらの器具はそれぞれ複数用いられてもよい。
【０００６】
好ましくは、緩衝液はｐＨ４〜６であり、より好ましくはｐＨ約５である。
好ましくは、緩衝液は酢酸ナトリウムである。
好ましくは、溶媒は無水メタノールである。
好ましくは、過酸化水素は３％の水溶液（３％  ｗ／ｗ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）である。
【０００７】
本発明の方法は、酸性の緩衝液中で昆虫１個体を好ましくはエッペンドルフチューブのような小型のチューブ内で粉砕用乳棒（ｐｅｓｔｌｅ）を用いて粉砕することによりホモジナイズする工程と、酸性の緩衝液で緩衝されたテトラメチルベンジジン溶液を基質として追加する工程と、過酸化水素を酸化剤として追加する工程と、青色の呈色強度を評価して混合機能オキシダーゼ活性の上昇すなわちピレスロイド系殺虫剤に対する耐性を判定する工程とを含む。
【０００８】
耐性のない昆虫では呈色はきわめてわずかであるが、耐性が強くなるにつれて濃青色となる。
色の判定はカラーチャートを使用して肉眼で行うことが可能である。より正確な結果を必要とする場合には免疫アッセイリーダー（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｒｅａｄｅｒ）による６３０ｎｍでのスキャニングにより判定することが可能である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
５つのボトルにそれぞれ、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）１０ｍｌ、無水メタノール２．５ｍｌ、テトラメチルベンジジン５ｍｇ、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）７．５ｍｌ、過酸化水素（３％）５ｍｌを用意した。
試験を行うにあたり、上記無水メタノールを上記テトラメチルベンジジンに加えて十分に振ってテトラメチルベンジジンを完全に溶解させ、これを上記酢酸ナトリウム緩衝液７．５  ｍｌで緩衝した。蚊一匹をエッペンドルフチューブに入れ、粉砕用乳棒で緩衝液一滴中にホモジナイズし、さらにエッペンドルフチューブの１ｍｌのマークまで緩衝液で希釈した。このホモジネート２滴をマイクロアッセイプレートのそれぞれのウェルに滴下し、さらにテトラメチルベンジジン溶液４滴と過酸化水素１滴を滴下した。
上記の結果として起こった色の変化を、標準カラーチャートによって肉眼、または免疫アッセイリーダーによる６３０ｎｍのスキャニングにより判定した。
【００１０】
【発明の効果】
本発明は、昆虫における混合機能オキシダーゼの活性上昇を、わずか１個体の昆虫を用いて手早く、事実上即座に、しかも装置を必要とせず肉眼による比色によって判断できる初めての試験キットを提供するものである。また、この試験キットと方法は使用に際して従来ほどの熟練も特殊な訓練も必要としない。さらに、この試験キットは長い貯蔵寿命を有しかつ室温で数週間保存できる安定性を有している。
また、このキットの使用により以下の効果が得られる。
耐性検査を大幅に簡略化することができる。
疾病予防や媒介昆虫の駆除に使用される殺虫剤の有効性を保証することが可能になり、したがって、生命を救い費用や人手を節約することができる。
対象昆虫の薬剤耐性について恒常的かつ定期的なモニタリングが可能となる。
新しい駆除剤の開発や対抗策の立案、さらには殺虫剤の作用態様の解明に役立つ。