(57)【要約】      （修正有）【課題】結腸直腸癌と診断されているか又はその癌について処置された患者における結腸直腸癌の再発傾向を評価するための方法の提供。【解決手段】結腸サンプル又は手術境界部から採取される上皮細胞を含むサンプルの少なくとも３種の単離された核酸配列、および、同遺伝子グループの分別的変調を例えばマイクロアレイ等で分析することによって遺伝子発現プロフィールを解析して結腸直腸癌状態を評価する。特定の核酸配列、マイクロアレイ分析試薬を含むキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４から成る群から選択された遺伝子の組み合わせにおける個々の遺伝子の分別的変調（正常集団における同じ遺伝子発現に対して）を同定することを含んで成る結腸直腸癌状態の評価方法。
【請求項２】
前記遺伝子の組み合わせが、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子の組み合わせが、配列番号２、配列番号３及び配列番号４である請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記変調された遺伝子の発現において少なくとも２倍の差異が存在する請求項１記載の方法。
【請求項５】
分別的変調を示すp−値が0.05末満である請求項１記載の方法。
【請求項６】
遺伝的に基づかれない結腸直腸診断をさらに含んで成る請求項１記載の方法。
【請求項７】
配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４から成る群から選択された遺伝子の組み合わせにおける単離された核酸配列、それらの補体又はそれらの一部を含んで成る診断ポートフォリオ。
【請求項８】
前記遺伝子の組み合わせが、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４である請求項７記載の診断ポートフォリオ。
【請求項９】
前記遺伝子の組み合わせが、配列番号２、配列番号３及び配列番号４である請求項７記載の診断ポートフォリオ。
【請求項１０】
そこに含まれる遺伝子の分別的発現を同定するために適切なマトリックスにおける請求項７記載の診断ポートフォリオ。
【請求項１１】
前記マトリックスが、マイクロアレイに使用される請求項10記載の診断ポートフォリオ。
【請求項１２】
前記マイクロアレイが、cDNAマイクロアレイである請求項11記載の診断ポートフォリオ。
【請求項１３】
前記マイクロアレイが、オリゴヌクレオチドマイクロアレイである請求項11記載の診断ポートフォリオ。
【請求項１４】
配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４から成る群から選択された遺伝子の組み合わせにおける単離された核酸配列、それらの補体、又はそれらの一部を検出するための材料を含んで成る、結腸直腸癌患者の予後を決定するためのキット。
【請求項１５】
前記遺伝子の組み合わせが、配列番号２、配列番号３及び配列番号４である請求項14記載のキット。
【請求項１６】
前記遺伝子の組み合わせが、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４である請求項14記載のキット。
【請求項１７】
マイクロアレイ分析を行うための試薬をさらに含んで成る請求項14記載のキット。
【請求項１８】
媒体をさらに含んで成り、それを通して、前記核酸配列、そらの補体又はそれらの一部がアッセイされる請求項14記載のキット。
【請求項１９】
配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４から成る群から選択された遺伝子の組み合わせにおける個々の遺伝子の分別的変調（正常集団における同じ遺伝子発現に対して）を同定することを含んで成る結腸直腸癌についての処理に対する応答を評価するための方法。
【請求項２０】
配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４から成る群から選択された遺伝子の組み合わせにおける核酸配列、それらの補体又はそれらの一部を同定するための材料を含んで成る結腸直腸癌状態の評価のための製品。
【請求項２１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４から成る群から選択された遺伝子の組み合わせにおける単離された核酸配列、それらの補体又はそれらの一部の代表を含んで成る結腸直腸癌状態の評価のための製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景：
本発明は、生物学的サンプルの遺伝子発現プロフィールに基づいての結腸直腸癌についての予後に関する。
結腸直腸癌は、複雑な起源を有する異種疾患である。患者が結腸直腸癌について処理されると、再発の傾向は、腸壁を通しての腫瘍侵入の程度及び結節関与の存在又は不在に関連する。それらの特徴は、デュウク（Duke）の分類により定義される現病期分類システムに基づかれる。デュウクのA疾患は、結腸又は直腸の粘膜下組織層に限定される。デュウクのB腫瘍は、筋層を通して侵入し、そして結腸又は直腸の壁を侵入する。デュウクのC疾患は、局部リンパ節転移を伴ってのいずれかの程度の腸壁侵入を包含する。
【０００２】
手術切除は初期段階の結腸直腸がんに関しては非常に効果的であり、デュウクのA患者において95％の治癒率及びデュウクのB患者において75％の治癒率を提供する。デュウクのC疾患における陽性リンパ節の存在は、５年以内での再発の60％の傾向を予測する。手術後コースの化学治療法によるデュウクのC患者の処理は、再発率を40％〜50％に低め、そして現在、デュウクのC患者についての医療の標準である。比較的低い再発率のために、デュウクのB患者における手術後の化学療法の有益性は、検出するには困難であり、そして論争のままである。しかしながら、デュウクのB分類は、それらの患者の約20〜30％がデュウクのC患者のように挙動し、そして５年以内に再発するので、不完全である。デュウクのB分類の選択を導くための結節関与によりも良好な、再発する傾向があり、そして生存するであろう予後因子を同定する必要が明らかに存在する。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、結腸直腸癌と診断されているか又はその癌について処理された患者における結腸直腸癌の再発の傾向を評価するための方法である。前記方法は、遺伝子発現プロフィールの分析を包含する。
本発明の１つの観点においては、遺伝子発現プロフィールは、少なくとも３種の遺伝子を含む。
本発明のもう１つの観点においては、遺伝子発現プロフィールは、少なくとも４種の遺伝子を含む。
【０００４】
本発明の実施に使用される製品はまた、本発明の観点である。そのような製品は、遺伝子発現プロフィール、又は機械−読み取り可能媒体、例えばコンピューター読み取り可能媒体に固定されるそれらの代表を包含する。
遺伝子発現プロフィールを同定するために使用される製品はまた、遺伝子発現を捕獲し、そしてその存在、不在又は程度を示すために、支持体又は表面を包含することができる。
本発明のさらにもう1つの観点においては、キットは、結腸直腸再発の予後の遺伝子発現分析を行うための試薬を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
組織サンプルにおける特定の核酸配列の単なる存在又は不在が、診断又は予後値を有することがまれに見出されて来た。他方では、種々のタンパク質、ペプチド又はmRNAの発現についての情報は、ますます重要なものに見えてきた。ゲノム内のタンパク質、ペプチド又はmRNA（そのような配列は、“遺伝子”として言及される）を単独で発現する可能性を有する核酸配列の単なる存在は、タンパク質、ペプチド又はmRNAが所定の細胞において発現されるかどうかの決定因子ではない。
【０００６】
タンパク質、ペプチド又はmRNAを発現できる所定の遺伝子が発現されるか又は否か、及びそのような発現がどれくらいの程度、存在するかは、種々の複雑な因子により決定される。それらの因子の理解及び評価における困難性とは関係なく、遺伝子発現のアッセイは、重要な現象、例えば腫瘍形成、転移、アポプトシス及び他の臨床的に適切な現象の発生についての有用な情報を提供する。遺伝子が活性的であるか又は不活性である程度の相対的表示は、遺伝子発現プロフィールにおいて見出され得る。本発明の遺伝子発現プロフィールは、結腸直腸癌について患者を診断し、そして処理するために使用される。
【０００７】
サンプル調製は、患者サンプルの収集を必要とする。本発明の方法に使用される患者サンプルは、疾病細胞、例えば結腸サンプル又は手術境界部から採取される上皮細胞を含むと思われるそれらのサンプルである。疑わしいサンプルを得るための１つの有用な技法は、Laser Capture Microdisection (LCM) である。LCM技法は、細胞型異種性により引き起こされる変動性を最小にする、研究されるべき細胞を選択する手段を提供する。
【０００８】
従って、正常細胞と癌性細胞との間での遺伝子発現の適度な又は小さな変化は、容易に検出され得る。好ましい方法においては、サンプルは、末梢血液から抽出される循環性上皮細胞を含んで成る。それらは、多くの方法に従って得られるが、しかし最も好ましい方法は、引用により本明細書に組み込まれるアメリカ特許第6,136,182号（Immunivest Corp.）に記載される磁気分離方法である。興味ある細胞を含むサンプルが得られると、RNAが抽出され、そして増幅され、そして遺伝子発現プロフィールが、好ましくは適切なポートフォリオにおける遺伝子について、マイクロアレイを通して得られる。
【０００９】
遺伝子発現プロフィールを確立するための好ましい方法は、タンパク質又はペプチドをコードすることができる遺伝子により生成されるRNAの量を決定することを包含する。これは、逆転写酵素PCR（RT−PCR）、競争RT−PCR、同時RT−PCR、示差表示RT−PCR、ノザンブロット分析及び他の関連する試験により達成される。個々のPCR反応を用いて、それらの技法を行うことが可能であるが、mRNAから生成されるコピーDNA（cRNA）を増幅し、そしてマイクロアレイを通してそれを分析することが最良である。
【００１０】
多くの異なったアレイ配置及びそれらの生成方法は、当業者に知られており、そして次のアメリカ特許（それらは、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている：アメリカ特許第5,445,934号；第5,532,128号；第5,556,752号；第5,242,974号；第5,384,261号；第5,405,783号；第5,412,087号；第5,424,186号；第5,429,807号；第5,436,327号；第5,472,672号；第5,527,681号；第5,529,756号；第5,545,531号；第5,554,501号；第5,561,071号；第5,571,639号；第5,593,839号；第5,599,695号；第5,624,711号；第5,658,734号及び第5,700,637号。
【００１１】
マイクロアレイ技法は、数千の遺伝子の定常状態mRNAレベルの同時測定を可能にし、それにより、制御されていない細胞増殖の開始、阻止又は調節のような効果を同定するための強力な手段を提供する。２種のマイクロアレイ技法が現在、広く使用されている。第１の技法はcDNAアレイであり、そして第２の技法はオリゴヌクレオチドアレイである。それらのチップの構成には、差異が存在するが、実質的にすべての下流のデータ分析及び出力は同じである。
【００１２】
それらの分析の結果は、典型的には、マイクロアレイに基づいて既知の位置での核酸配列に対してハイブリダイズする、サンプルからのcDNA配列を検出するために使用されるラベルされたプローブから受動するシグナルの強度の測定である。典型的には、シグナルの強度は、サンプル細胞において発現されるcDNA及び従って、mRNAの量に比例する。多数のそのような技法は入手でき且つ有用である。遺伝子発現を決定するための好ましい方法は、アメリカ特許第6,271,002号（Linsleyなど.）; 第6,218,122号（Friendなど.）;第6,218,114号（Peckなど.）及び第6,004,755号（Wandなど.）（それらの開示は引用により本明細書に組み込まれる）に見出され得る。
【００１３】
発現レベルの分析は、そのような強度の比較によって行われる。これは、試験サンプルにおける遺伝子の発現強度−対−対照サンプルにおけるそれらの強度の比率マトリックスを生成することによって最良に行われる。例えば、疾病組織からの遺伝子発現強度が、同じタイプの正常組織から生成される発現強度と比較され得る（例えば、疾病結腸組織サンプル−対−正常結腸組織サンプル）。それらの発現強度の比は、試験サンプルと対照サンプルとの間の遺伝子発現における倍率−変化を示す。
【００１４】
遺伝子発現プロフィールはまた、多くの手段で示され得る。最も通常の方法は、縦列が試験サンプルを示し、そして横列が遺伝子を示すグラフ樹状図中に、原蛍光強度を配置することである。データは、類似する発現プロフィールを有する遺伝子がお互い、隣接するよう配置される。個々の遺伝子についての発現比率は、色として可視化される。例えば、１未満の比率（ダウン−レギュレーションを示す）は、スペクトルの青色部分において出現し、そして１以上の比率（アップ−レギュレーションを示す）は、スペクトルの赤色部分における色として出現する。市販のコンピューターソフトウェアプログラム、例えばSilicon Genetics, Inc. からの“GENESPRINT”及びPartek, Inc. からの“DISCOVERY”及び“INFER”ソフトウェアが、そのようなデータを示すために利用できる。
【００１５】
本発明の方法に使用される変調された遺伝子は例に示される。分別的に発現される遺伝子は、再発を有するそれらの患者に対して結腸癌の再発を有する患者においては、アップレギュレートされるか又はダウンレギュレートされるかのいずれかである。アップレギュレーション及びダウンレギュレーションとは、検出できる差異（ノイズを測定するための使用されるシステムにおけるノイズの寄与を越えて）が、基線に対する遺伝子の発現の量として見出されることを意味する相対的用語である。この場合、基線は非再発性患者の測定された遺伝子発現である。次に、疾病細胞（再発性患者からの）における興味ある遺伝子が、同じ測定方法を用いて、基線レベルに対してアップレギュレートされるか又はダウンレギュレートされる。
【００１６】
この情況下で、疾病とは、細胞の制御されていない増殖により生じるような、身体の機能の適切な性能を中断するか、又は妨げるか、又は妨げる可能性を有する身体の状態の変更を言及する。個人の遺伝子型又は表現型のいくらかの観点が疾病の存在と一致する場合、疾病の個人は診断される。しかしながら、診断又は予後を行う行為は、疾病/状態論争の決定、例えば再発の傾向及び治療モニターリングの決定を包含する。治療モニターにおいては、臨床学的判断は、遺伝子発現プロフィールが変化したか又は正常組織とより一致するパターンに変化するかどうかを決定するために、一定時間にわたって遺伝子の発現を比較することによって、所定の治療経路の効果に関して行われる。
【００１７】
好ましくは、アップ及びダウンレギュレーションのレベルは、ハイブリダイズされたマイクロアレイプローブの強度測定値の倍率変化に基づいて区別される。2.0倍の差異が、そのような識別を行うために、又は0.05未満のｐ−値のために好ましい。すなわち、遺伝子が疾病/再発性細胞−対−正常/非再発性細胞において分別的に発現されるといわれる前、疾病細胞は、正常細胞よりも、少なくとも２倍以上、又は２倍以下の強度を生成することが見出される。倍率差異が大きいほど、診断又は予後としての遺伝子の使用が、より好ましい。本発明の遺伝子発現プロフィールのために選択された遺伝子は、臨床学的実験室計測を用いて、バックグラウンドを越える量により正常又は変調されていない遺伝子の発現レベルと区別できるシグナルの生成をもたらす発現レベルを有する。
【００１８】
統計学的値は、変調された遺伝子及びノイズと変調されていないそれらとを信頼をもって区別するために使用され得る。統計学的試験は、種々のグループ間で最も有意に異なった遺伝子を見出す。スチューデントのｔ−試験は、２種のグループ間での有意な差異を見出すために使用され得る強い統計学的試験の例である。p-値が低いほど、遺伝子が異なったグループ間での差異を示す証拠をより一層、強制する。
【００１９】
それもかかわらず、マイクロアレイは１つよりも多くの遺伝子を同時に測定するので、10,000の統計学的試験が１度に行われ得る。このために、偶然、低いp−値を見出す傾向はなく、そしてSidak補正及びランダム化/過突然変異誘発実験を用いて、このための調製が行われ得る。ｔ−試験による0.05以下のp−値は、遺伝子が有意に異なる証拠である。より強制証拠は、Sidak補正が計算に入れられた後の0.05以下のｐ−値である。個々のグループにおける多数のサンプルに関しては、ランダム化/過突然変異誘発試験の後の0.05以下のｐ−値は、有意な差異の最も強制証拠である。
【００２０】
変調されていない遺伝子又はノイズのシグナルよりも高いシグナルを生成する遺伝子を選択するために使用され得るもう１つのパラメーターは、絶対シグナル差異の測定の使用である。好ましくは、変調された遺伝子発現により生成されるシグナルは、正常又は変調されていない遺伝子のシグナルよりも少なくとも20％異なる（絶対基礎に基づいて）。そのような遺伝子は、正常又は変調されていない遺伝子の発現パターンよりも少なくとも30％異なる発現パターンを生成することが、さらにより好ましい。
【００２１】
グループにおける遺伝子組について得られる情報が臨床学的に適切な判断、例えば診断、予後又は処理選択を行うための正常な基礎を提供するよう遺伝子がグループ分けされ得る。それらの組の遺伝子が本発明のポートフォリオを構成する。この場合、ポートフォリオにより支持される判断は結腸直腸癌を包含する。ほとんどの診断マーカーに関しては、正しい医学的判断を行うために十分な最少のマーカーを用いることがしばしば、所望される。これは、さらなる分析を継続する処理の遅延、及び時間及び供給源の不適切な使用を妨げる。
【００２２】
好ましくは、ポートフォリオは、そのポートフォリオにおける遺伝子の組合せが、個々の遺伝子又は遺伝子のランダムに選択された組み合わせに対して、改良された感受性及び特異性を示すよう確立される。本発明の情況下で、ポートフォリオの感受性は、正常状態に対する疾病状態における遺伝子の発現により示される倍率差異において影響され得る。特異性は、遺伝子発現のシグナル化と興味ある条件との相互関係の統計学的測定において影響され得る。例えば、標準偏差がそのような測定として使用され得る。ポートフォリオに包含されるグループを考慮する場合、発現測定値における小さな標準偏差は、より高い特異性と相互関係する。変動の他の測定値、例えば相関係数がまた、この能力において使用され得る。
【００２３】
遺伝子発現ポートフォリオを確立するための好ましい方法は、最適化アルゴリズム、例えば株式ポートフォリオの確立において広く使用される平均偏差アルゴリズムの使用を通してである。この方法は、2003年、３月21日に出願された、Tim Jatkoe, などによる、“ポートフォリオ選択”と称する名称の特許出願に詳細に記載されている。実質的に、この方法は、リターンの変動性を最少にしながら、リターン（例えば、生成されるシグナル）を最適化するであろう１組の入力（財政適用における株式、本明細書における強度により測定されるような発現）の確立を必要とする。多くの市販のソフトウェアプログラムが、そのような操作を行うために入手できる。本明細書を通して“Wagnerソフトウェア”として言及される“Wagner Associates Mean-Variance Optimization Application”が好ましい。このソフトウェアは、効果的境界を決定するために、“Wagner Associates Mean-Variance Optimization Library”からの機能を使用し、そしてMarkowitzセンスにおける最適ポートフォリオが好ましい。
【００２４】
このタイプのソフトウェアの使用は、マイクロアレイデータが、株式リターンの場合、入力として処理され、そしてソフトウェアがその意図された財政分析目的のために使用される場合、リスク測定値が、使用されるよう、変換され得ることを必要とする。たとえば、Wagnerソフトウェアが、マイクロアレイ強度測定値を共に使用される場合、次のデータ変換方法が使用される。
【００２５】
遺伝子はまず、その発現が少なくともいくらかの最少レベルの分化を示すそれらの遺伝子を同定することによって予備選択される。好ましい予備選択方法は、次に通りにして行われる。基線種類が選択される。典型的には、これは、興味ある条件を有さない集団からの遺伝子を含んで成るであろう。例えば、乳癌についての診断である遺伝子のポートフォリオを選択することに興味がある場合、再発を有さない患者からのサンプルが基線種類を製造するために使用され得る。
【００２６】
基線種類が選択されると、算術平均及び標準偏差が基線種類サンプルのための個々の遺伝子の遺伝子発現のインジケーターのために計算される。次に、コンピューター処理された統計学的データが、個々の遺伝子についての（X*標準偏差＋平均）の基線値を計算するために使用される。これは、すべての他のサンプルが比較される遺伝子についての基線読み取りである。Xはポートフォリオを処方する個人により選択される緊縮変数である。Xの値が高いほど、より緊縮性になる。好ましくは、Xは0.5〜３の範囲であり、２〜３がより好ましく、そして３が最も好ましい。
【００２７】
個々の実験サンプル（興味ある状態を表示するそれら）−対−基線読み取りの間の比率が計算される。次に、その比率が、ソフトウェアによるデータ取り扱いの容易さのために底10の対数値に変換される。これは、Wagnerソフトウェアを用いて、Markman平均−分散アルゴリズムに従って最適化のために必要な負の値へのダウンレギュレートされた遺伝子の表示を可能にする。
それらの変換された比率を含んで成る予備処理されたデータは、それが財政分析目的のために使用される場合、Wagnerソフトウェアに通常使用されるリターン値の代わりに入力として使用される。
【００２８】
効果的境界が処方されると、最適化されたポートフォリオが、前記境界上の点に対応する所定の入力レベル（リターン）又は分散のために選択される。それらの入力又は分散は、ポートフォリオを処方する個人により設定される予定された標準である。換言すれば、最適なポートフォリオを探究する個人は、許容できる入力レベル（感染性の表示）又は所定レベルの分散（特異性の表示）を決定し、そしてその入力レベル又は分散に対応する効果的な境界にそって存在する遺伝子を選択する。Wagnerソフトウェアは、入力レベル又は分散が選択される場合、そのような遺伝子選択することができる。それはまた、それが株式ポートフォリオにおける株に関してであるように、ポートフォリオにおける個々の遺伝子に重量を割り当てることができる。
【００２９】
サンプルが、ポートフォリオが診断である条件を有するかどうかの決定は、患者サンプルについてのポートフォリオにおける遺伝子の発現と、ポートフォリオを確立するために使用される、分別的に発現された遺伝子の計算された値とを比較することによって行われ得る。好ましくは、ポートフォリオ値が、ポートフォリオにおける個々の遺伝子の、強度値のポートフォリオ選択工程におけるその遺伝子に割り当てられる重量による積を要約することによって、最初に生成される。次に、境界値が、（Y*標準偏差＋基線グループについてのポートフォリオ値の平均）により計算され、ここでYは上記Xと同じ意味を有する緊縮値である。次に、基線種類の境界値よりも高いポートフォリオ値を有するサンプルが、その条件を有するものとして分類される。所望には、この工程は、信頼レベルを改良するための良く知られている統計学的方法に従って、反復して行われ得る。
【００３０】
任意には、最良の予測正確度が得られるまで、この工程を反復することができる。未知のもののポートフォリオ選択及び特徴づけの工程は次の通りである：
１．基線種類を選択し：
２．基線種類のサンプルンついての個々の遺伝子の平均及び標準偏差を計算し；
３．個々の遺伝子について（X*標準偏差＋平均）を計算する。これは、すべての他のサンプルが比較される基線読み取りである。Xは緊縮変数であり、高いX値は、低いX値よりも緊縮性である。
４．個々の実験サンプル−対−段階３で計算された基線読み取り間の比率を計算し；
５．１以下の比率が負であるように比率を変換し（例えば、対数底10を用いて）。（ダウンレギュレートされた遺伝子が現在、MV最適化のために必要な負の値を正確に有する）；
【００３１】
６．それらの変換された比率が、ソフトフェアアプリケーションに通常使用される有用なリターンの変わりに入力として使用され；
７．前記ソフトウェアは、効果的な境界をプロットし、そしてその効果的な境界にそってのいずれかの点での最適化されたポートフォリオを戻し；
８．前記効果的な境界上の所望するリターン又は分散を選択し；
９．ポートフォリオ選択アルゴリズムにより生成される重量による、個々の遺伝子の強度値の積を要約することにより、個々のサンプルについてのポートフォリオ値を計算し；
10．（Y×基線のポートフォリオ値の標準差）＋平均ポートフォリオ値により境界値を計算する。この境界値よりも大きな値は、実験種類として分類されるであろう；
11．任意には、最良の予測正確度が得られるまで、この工程を反復することができる。
【００３２】
他方では、遺伝子がまず、発現がいくらかの最少レベルの分化を示すそれらの遺伝子を同定することによって予備選択され得る。このもう１つの方法における予備選択は、好ましくは下記式：
【００３３】
【数１】
2004329211.tif 000002
【００３４】
により与えられる限界に基づかれており、ここでμiは疾病又は病状を有することが知られているサブセットの平均であり、μnは正常サンプルのサブセットの平均であり、そしてσi＋σnは組合わされた標準偏差を表す。シグナル：ノイズ  カットオフはまた、１つの関係、例えば下記式：
【００３５】
【数２】
2004329211.tif 000003
【００３６】
に従って、データを予備選択することによって使用され得る。これは、それらの分別的変調に基づいて予備選択される遺伝子が臨床学的に有意な手段で識別されることを確実にする。それは、診断パラメーターを測定する仕事に適切な計測のノイズレベル以上である。それらの基準に従っての予備選択された個々のマーカーに関しては、縦列がサンプルを表し、横列がマーカーを表し、そして個々の要素が、下記関係：
【００３７】
【数３】
2004329211.tif 000004
【００３８】
（ここでIは強度測定値である）に従ってのマーカーの発現についての標準化された強度測定値であるマトリックスが確立される。
最適なポートフォリオを定義するために追加の境界条件を設定することがまた可能である。例えば、ポートフォリオサイズは、固定された範囲又は多くのマーカーに制限され得る。これは、データ予備選択基準をより厳重にすることにより（例えば、下記式：
【００３９】
【数４】
2004329211.tif 000005
の代わりに、下記式：
【数５】
2004329211.tif 000006
【００４０】
を用いて）、又は特徴のプログラミング、例えばポートフォリオサイズの制限を用いることにより行われ得る。例えば、効果的境界が最適な10の遺伝子のみから選択されるべき境界条件を定めることができる。また、効果的境界を決定するために予備選択されたすべての遺伝子を使用し、そして次に、選択された遺伝子の数を制限することができる（例えば、10以下）。
【００４１】
ポートフォリオの選択方法はまた、帰納的規則の適用を包含することができる。好ましくは、そのような規則は、生物学、及び臨床学的結果を生成するために使用される技術の理解に基づいて生成される。より好ましくは、それらは、最適化された方法からの出力に適用される。例えば、ポートフォリオ選択の平均分散方法は、乳癌を有する対象において分別的に発現される多くの遺伝子についてのマイクロアレイデータに適用され得る。前記方法からの出力は、末梢血液、及び疾病の乳房組織において発現されるいくつかの遺伝子を包含する最適化された遺伝子組である。
【００４２】
試験方法に使用されるサンプルが末梢血液から得られ、そして乳癌の場合に分別的に発現される一定の遺伝子がまた、末梢血液において分別的に発現される場合、ポートフォリオが、末梢血液において分別的に発現されるそれらの遺伝子を除いて、効果的に境界から選択される帰納的規則が適用され得る。勿論、前記規則は、データ予備選択の間、前記規則を適用することにより、効果的境界の形式の前、適用され得る。
【００４３】
問題の生物学に必ずしも関連しない他の帰納的規則が適用され得る。例えば、ポートフォリオの所定の百分率のみが特定の遺伝子により表され得る規則を適用することができる。市販のソフトウェア、例えばWagnerソフトウェアは、それらのタイプの帰納法を容易に適応する。これは、例えば、正確度及び精度以外の因子（例えば、予測される実施許諾料）が１又は複数の遺伝子の所望性に影響を及ぼす場合、有用であり得る。
【００４４】
本発明の１つの方法は、予後を行うために種々の遺伝子（又はポートフォリオ）について遺伝子発現プロフィールを比較することを包含する。ポートフォリオを含んで成る遺伝子の個々の遺伝子発現プロフィールが、媒体、例えばコンピューター読み取り媒体に固定される。これは、多くの形を取ることができる。例えば、疾病を示すシグナル（例えば、強度測定値）の範囲が入力である表が確立され得る。実際の患者のデータは、患者サンプルが正常であるか又は疾病であるかどうかを決定するために、表における値に比較され得る。より精巧な態様においては、発現シグナル（例えば、蛍光強度）のパターンがデジタル的に又はグラフ的に記録される。次に、患者サンプルと共に使用される遺伝子ポートフォリオからの遺伝子発現パターンが、前記発現パターンに比較される。
【００４５】
次に、パターン比較ソフトウェアが、患者サンプルが問題の疾病を示すパターンを有するかどうかを決定するために使用され得る。もちろん、それらの比較はまた、患者が疾病再発をたぶん経験しないかどうかを決定するために使用され得る。次に、サンプルの発現プロフィールが、対照細胞のポートフォリオに比較される。サンプル発現パターンが結腸直腸癌の再発ための発現パターンと一致する場合（対抗する医学的考慮の不在下で）、患者は、再発性患者として処置される。サンプル発現パターンが正常/対照細胞からの発現パターンと一致する場合、患者は結腸直腸癌について陰性として診断される。
【００４６】
多くの良く知られたパターン認識方法が利用できる。次の参照は、いくつかの例を提供する：
加重された投票（Weighted voting）:
Golub, TR., Slonim, DK., Tamaya, p., Huard, C., Gaasenbeek, M., Mesirov, JP., Coller, H., Loh, L., Downing, JR., Caligiuri, MA., Bloomfield, CD., Lander, ES. Molecular Classification of cancer class discovery and class Prendiction by gene ezpression monitoring. Science 286: 531-537, 1999；
【００４７】
支持ベクター機械（Support Vector Machines）：
Su, AI., Welsh, JB., Sapinoso, LM., Kern, SG., Dimitrov, P., Lapp, H., Schultz, PG., Powell, SM., Moskaluk, CA., Frierson, HF, Jr., Hampton, GM. Molecular classification of human carcinomas by use of gene expression signatures. Cancer Research 61: 7388-93, 2001;
Ramaswamy, S., Tamayo, P., Rifkin, R., Mukherjee, S., Yeang, CH., Angelo, M., Ladd, C., Reich, M., Latulippe, E., Mesirov, JP., Poggio, T., Gerald, W., Loda, M., Lander, ES., Gould, TR. Multiclass cancer diagnosis using tumor gene expression signatures Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 98: 15149-15154, 2001;
【００４８】
K−隣接体（K-nearest Neighbors）
Ramaswamy, S., Tamayo, P., Rifkin, R., Mukherjee, S., Yeang, CH., Angelo, M., Ladd, C., Reich, M., Latulippe, E., Mesirov, JP., Poggio, T., Gerald, W., Loda, M., Lander, ES., Gould, TR. Multiclass cancer diagnosis using tumor gene expression signatures Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 98: 15149-15154, 2001;
【００４９】
相関係数：
van’t Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ, He YD, Hart AA, Mao M, Peterse HL, van der Kooy K, Marton MJ, Witteveen AT, Schreiber GJ, Kerkhoven RM, Roberts C, Linsley PS, Bemards R, Friend SH. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 2002 Jan 31: 415 (6871):530-6。
【００５０】
本発明の遺伝子発現プロフィールはまた、癌診断、予後又は処理モニターリングにおいて有用な他の非遺伝的診断方法と共に使用され得る。例えば、いくつかの環境下では、上記の遺伝子発現に基づく方法の診断力と、従来のマーカー、例えば血清タンパク質マーカー（例えば、癌胚性抗原）からのデータとを組合すことは有益である。広範囲のそのようなマーカー、例えばCEAのような分析物が存在する。１つのそのような方法においては、血液が処理された患者から定期的に採血され、そして次に、上記血清マーカーの１つについて酵素イムノアッセイにゆだねられる。
【００５１】
マーカーの濃度が腫瘍の再発又は治療の失敗を示す場合、遺伝子発現分析に敏感に反応するサンプル源が採取される。疑いのある塊状物が存在する場合、細い針状吸入物が採取され、そして次に、前記塊状物から採取された細胞の遺伝子発現プロフィールが、上記のようにして分析される。他方では、組織サンプルが、腫瘍が以前に除去されている組織に隣接する領域から採取され得る。このアプロ−チは、他の試験が不明瞭な結果をもたらす場合、特に有用である。
【００５２】
本発明の製品は、疾病を処理し、診断し、予後し、そして他方では、評価するために有用なポートフォリオを製造する遺伝子発現プロフィールの表示を包含する。それらの表示は、機械、例えばコンピューター読み取り可能媒体（磁気、光学及び同様のもの）により自動的に読み取られ得る媒体に変換される。製品はまた、そのような媒体において遺伝子発現プロフィールを評価するための使用説明書を包含することができる。例えば、製品は、上記遺伝子のポートフォリオの遺伝子発現プロフィールを比較するためのコンピューター使用説明書を有するCD ROMを包含することができる。
【００５３】
製品はまた、そこにおいてデジタル記録される遺伝子発現プロフィールを有することができ、その結果、それらは患者サンプルからの遺伝子発現データと比較され得る。他方では、前記プロフィールは異なった表示フォーマットで記録され得る。グラフの記録が１つのそのようなフォーマットである。クラスターリングアルゴリズム、例えば上記に言及される、Partek, Inc.からの“DISCOVER”及び“INFER”ソフトウエアーに組み込まれるそれらは、そのようなデータの可視化において最良に助けることができる。
【００５４】
本発明の異なったタイプの製品は、遺伝子発現プロフィールを示すために使用され、媒体又はフォーマットされたアッセイである。それらは、例えば配列補体又はプローブが、興味ある遺伝子を示す配列が結合し、それらの存在を読み取ることができる決定因子を創造するマトリックスに付加されるマイクロアレイを包含することができる。他方では、本発明の製品は、結腸直腸癌を検出するための興味ある遺伝子の発現レベルを示す、ハイブリダイゼーション、増幅及びシグナル生成を実施するための試薬キットに形成され得る。
【００５５】
本発明に従って製造されるキットは、遺伝子発現プロフィールを決定するためのフォーマットされたアッセイを包含する。それらは、アッセイを行うために必要とされる材料、例えば試薬及び使用説明書のすべて又はいくつかを包含することができる。
本発明は、次の非制限的例によりさらに例示される。
【００５６】
例：本発明に従って分析される遺伝子は、典型的には、タンパク質又はペプチドの生成をコードする十分な長さの核酸配列に関係する。それらは典型的には、タンパク質又はペプチドの生成をコードする十分な長さの核酸配列に関連する。当業者は、十分な長さの配列の識別が分析観点から必要でないことを認識するであろう。すなわち、配列又はESTの一部は、プローブがその対応する遺伝子についての遺伝子発現を評価するために企画され得る、良く知られた原理に従って選択され得る。
【実施例】
【００５７】
例１：サンプル取り扱い及びLCM：
新鮮な凍結された組織サンプルを、結腸直腸癌に関する手術を行った患者から採取した。使用されたサンプルは、標準の臨床学的診断学及び病理学に従ってのデュウクのB分類の段階の63人の患者からであった。患者の臨床学的結果は知られている。前記患者の36人は３年以上の間、疾病を有さないまま存続し、そして27人の患者は３年以内に腫瘍再発を有した。
【００５８】
組織を、収穫の20〜30分以内に液体窒素において凍結し、そしてその後、−80℃で貯蔵した。レーザー捕獲のために、サンプルを切断し（６μm）、そして１つの切片をガラススライド上に固定し、そしてガラススライド上に固定されている第２切片をフィルム（P.A.L.M.）上に固定した（Micro Slides Colorfrost, VWR Scientific, Media, PA）。ガラススライド上に固定された切片を、その後、冷アセトンにおいて固定し、そしてMayer’s Haemotoxylin (Sigma, St. Louis, MO) により染色した。病理学者は、診断及び等級についてサンプルを分析した。臨床学的段階を、デュウク分類を確かめるために、付随する手術病理学及び臨床学的報告から評価した。
【００５９】
フィルム上に固定された切片を、その後、100％エタノールにおいて５分間、固定し、エオシン/100％エタノール（脱水されたエタノール100ml中、エオシン100μg）において、１分間、対比染色し、100％エタノールにより１度、すばやくソーキングし、遊離染色物を除去し、そして10分間、空気乾燥した。
LCMにおける使用の前、膜（LPC-MEMBRANE PEN FOIL, 1.35μm  No8100, P.A.L.M. GmbH Mikrolaser Technologies, Bernried, Germany) 及びスライドを、RNアーゼを破壊し、そしてフィルムへの組織サンプルの結合を増強するために前処理した。手短に言及すれば、スライドをDEP水により洗浄し、そしてフィルムを、RNase AWAY (Molecular Bioproducts, Inc., San Diego, CA) により洗浄し、そしてDEP水によりすすいだ。
【００６０】
ガラススライド上へのフィルムの結合の後、スライドを+120℃で８時間、焼き、TI−SAD（Diagnostic Products Corporation, Los Angleles, CA； DEP水中、1:50、綿羊毛を通して濾過されている）により処理し、そして＋37℃で30分間インキュベートした。使用の直前、10μlのアリコートのRNアーゼインヒビター溶液（Rnasin Inhibitor 2500U=33U/μl N211A, Promega GmbH, Mannheim, Germany, 0.15モルのNaCl, 10mモルのトリス（pH8.0）、0.25mモルのジチオトレイトールを含む凍結溶液400μl中、0.5μl）を、組織サンプルが固定されるべきであるフィルム上に広げた。
【００６１】
フィルム上に固定された組織の切片を、LCMのために使用した。約2000の上皮細胞/サンプルを、PALM Robot-Microbeam技法（P.A.L.M. Mikrolaser Technologies, Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY）を用いて捕獲し、vert 135顕微鏡（Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Germany）に結合した。正常粘膜における周囲の支質、及び癌サンプルにおける時折の介在性支質成分を包含した。捕獲された細胞を、100％エタノールを含む管に入れ、そして-80℃で保存した。
【００６２】
例２：RNA抽出及び増幅：
Zymo-Spinカラム（Zymo Research, Orange, CA 92867）を用いて、LCM捕獲されたサンプルから全RNAを抽出した。約2ngの全RNAを、10μlの水に再懸濁し、そして２回のT7 RNAポリメラーゼに基づく増幅を行い、約50μgの増幅されたRNAを生成した。
【００６３】
例３．cDNAマイクロアレイハイブリダイゼーション及び定量化：
約23,000のヒトcDNAクローンから成る１組のcDNAマイクロアレイを用いて、Affymetrix, Inc. から得られ、そして市販されているhumanU133aチップの使用によりサンプルを試験した。上記に概略されているように得られ、そして調製された全RNAを、チップに適用し、そして製造業者のプロトコールに従ってAgilent BioAmlyzerに分析した。すべての63のサンプルは品質対照標準を通過し、そしてデータがマーカー選択のために使用された。
【００６４】
チップ強度データを、Affymetrix, Inc.から市販されているMAS Version5.0ソフトウェア（”MAS5.0）を用いて分析した。管理されていない分析を用いて、次の通りでないそれらの患者から再発する患者を区別する２種の遺伝子を同定した。記載のようにして得られたチップ強度データは、PARTEKバージョン5.1ソフトウェアとして市販されている管理されていないクラスターリングソフトウェアのための入力であった。この管理されていないクラスターリングアルゴリズムは、高い再発頻度を有する20人の患者グループを同定した（13人の再発者及び７人の生存者)。
【００６５】
オリジナルの23,000の遺伝子から、ｔ−試験分析は、それらの患者において優位に分別的に発現された276の遺伝子を選択した。このグループから、再発しないそれらの患者から再発する患者を最良に区別する次の２種の遺伝子を選択した：ヒト腸ペプチド関連トランスポーター（配列番号３）及びホモサピエンス脂肪酸結合タンパク質１（配列番号１）。それらの２種の遺伝子を、この患者グループからの再発性患者においてダウンレギュレートする（実際、それらは停止されるか又は発現されない）。これは図１及び２に示されており、ここでシグナル強度（ｙ軸）が患者サンプル数（x軸）に対してプロットされている。
【００６６】
次に、管理された分析が、残る43人の患者において再発しなかったそれらの患者から再発する患者をさらに区別するために行われた。次に、患者データのグループを、次のグループに分割した：27人の患者は訓練組として割り当てられ、そして16人の患者は試験組として割り当てられた。これは、同じデータがマーカーを同定し、そして次に、それらの利用能を確認するためには使用されなかったことを確かにした。
不平等分散ｔ−試験を、訓練組に対して行った。有意な補正されたｐ値を有する一連の28の遺伝子から、MHC II−DR−Bを選択した。それらの遺伝子を、再発者においてダウンレギュレートした。MHC II−DR−B（配列番号２）はまた、最小のp−値を有した（図３a）。
【００６７】
追加の回の管理された分析において、線状識別分析について種々の選択方法を、訓練組における生存者から再発者を分離するために、上記Partek Version 5.0ソフトウェアを用いて実行した。調査方法は前進性選択であった。最低の後方誤差を伴って選択された変数は、免疫グロブリン−様転写体５タンパク質（配列番号４）であった（図３b）。次に、Cox比例ハザードモデル（Insightful, Inc. 過らの“S Plus”ソフトウェアを用いる）を、生存時間の間、上記で同定された遺伝子選択を確保するために遺伝子選択のために使用した。
【００６８】
合計27のサイクルの個々のサイクルにおいては、訓練組における27人の個々の患者が保持され、残りの26人の患者は、患者の生存時間と遺伝子発現との関連性の強さを評価するために単一変量Coxモデル回帰において使用された。そのような関連性の強さは、その対応する、評価され、標準化されたパラメーター評価、及びCoxモデル回帰から戻されたP値により評価された。0.01のP値は、リーブ−ワン−アウト遺伝子選択（leave-one-out gene selection）の個々のサイクルから上部遺伝子を選択するための限界値として使用された。次に、個々のサイクルから選択された上部遺伝子を、合計27のリーブ−ワン−アウト遺伝子選択サイクルにおいて少なくとも26倍、暴露されたそれらの遺伝子を選択するために比較した。合計70の遺伝子を選択し、そしてMHC II−CR−B及び免疫グロブリン−様転写体５タンパク質の両者がそれらの間に存在した（再び、ダウンレギュレーションを示す）。
【００６９】
多重−遺伝子予測体の構成：２種の遺伝子、すなわちMHC II−DR−B及び免疫グロブリン−様転写体５タンパク質を、線状識別分析を用いて予測体を生成するために使用した。投票評点を、再発の後方確立として定義した。患者評点が0.5以上である場合、患者は再発者として分類された。患者評点が0.5以下である場合、患者は生存者として分類された。予測体を、訓練組に対して試験した（表１）。Kaplan-Meier曲線を、予測される再発者及び生存者に基づいて構成した（図４）。
【００７０】
予測体のクロス−確認及び評価：予測体の性能が独立したデータ組に基づいて決定されるべきである。なぜならば、ほとんどの分類方法は、それらの確立において使用される例に基づいて十分に作動するからである。16人の試験組を用いて、予測体精度を評価した。分類のためのカットオフを、ROC曲線を用いることによって決定した（図５）。選択されたカットオフにより、試験組における再発及び生存患者についての正しい予測の数を決定し、そして表２に要約する。Kaplan−Meier曲線を、予測される再発者及び生存者に基づいて構成した（図６）。
【００７１】
全体的な予測：63人のデュークB結腸癌患者の遺伝子発現プロフィールは、それらの患者における分別的発現（ダウンレギュレーション又は停止される）を有する４種の遺伝子の同定を導いた。それらの遺伝子は、配列番号１，２，３及び４である。患者の36人は３年以上、疾病を有さないまま存続し、そして27人の患者は３年以内に腫瘍再発を有した。配列番号２，３及び４の３種の遺伝子マーカーポートフォリオを用いて、27人の再発患者のうち22人及び36人の疾病を有さない患者のうち27人は正しく同定される。この結果は、82％の感受性及び75％の特異性を表す。正の予測値は71％であり、そして負の予測値は84％である（表３）。Kaplan-Meier曲線を、予測される再発者及び生存者に基づいて構成した（図６）。本発明のプロフィルを含んで成る遺伝子は下記に記載される。
【００７２】
ホモサピエンス脂肪酸結合タンパク質１（FABP１）：ヒト肝臓脂肪酸結合タンパク質（L−FABP）遺伝子をまず、Smith LCなど., J. Biol. Chem. 260 (5), 2629-2632 (1985) により、肝臓cDNAライブラリーにおいて同定した。L−FABPは、127個のアミノ酸残基を含む。脂肪酸結合タンパク質は、長鎖の脂肪酸及び他の疎水性リガンドを結合する、小さな、高く保存される細胞質のファミリーである。FABP役割が脂肪酸摂取、輸送及び代謝を包含すると思われる。それらはまた、細胞成長及び増殖の変調において応答することができる。L−FABPは、結腸組織において有意に発現されるI−FABPと有意な相同性を共有する。
【００７３】
ヒト腸ペプチド−関連のトランスポーターHPT−１ mRNA：この遺伝子は、El：Lilly会社からの化学者のグループ員により同定された。文献は、Science 1994 Apr. 15; 264 (5157): 430-3において公開されている。この遺伝子は、約92kダルトンの膜タンパク質をコードし、そしてそのアミノ酸配列は、この輸送−関連のタンパク質が、カルシウム依存性、細胞−細胞付着タンパク質のカドヘリンスーパーファミリーと、いくつかの保存された構造要素を共有することを示す。
【００７４】
ホモサピエンスMHCクラスII抗原（HLA−DRB1）mRNA：この遺伝子は、まず1997年、スペインの幼児から発現され、そしてTissue Antigens 1997 June; 49 (6): 648-61において公開された。その名称は、それがMHCクラスII抗原のスーパーファミリーに属することを示した。この遺伝子は、267個のアミノ酸のタンパク質生成物をコードする。
【００７５】
ホモサピエンスクローン６免疫グロブリン−様転写体５タンパク質mRNA：この遺伝子は、NK及びT細胞のサブセットによってのみならず、またB細胞、単球、マイクロファージ及び樹状細胞により発現される、免疫グロブリン−スーパーファミリーの阻害性MHCクラスI受容体であるタンパク質生成物である。この分子は、194個のアミノ酸を含む。この配列は、J. Exp. Med. 1997 Dec. 1; 186 (11): 1809-18において公開された。この受容体は、MHCクラスI分子を結合し、そしてNK及びT細胞による殺害を阻害し、そしてそれぞれB細胞抗原受容体及びヒト組織適合白血球抗原（HLA）−DRを通して誘発されるB細胞及び骨髄性単球細胞におけるCa2+代謝を阻害する負のシグナルを供給する。
【００７６】
ホモサピエンスヒドロキシメチルビランシンターゼ（また、ポリホビリノーゲンデアミナーゼ−PBGDとも呼ばれる）：この遺伝子は、対照遺伝子として使用された。それは、固形腫瘍と正常組織との間の最少変動遺伝子の１つである。配列は最初に、Nucleic Acids Res. 14 (15), 5955-5968 (1986) において公開された。
【００７７】
【表１】
2004329211.tif 000007
【００７８】
【表２】
2004329211.tif 000008
【００７９】
【表３】
2004329211.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図１は、患者サンプル（x軸）におけるホモサピエンス脂肪酸結合タンパク質遺伝子１の測定の強度（ｙ軸）のプロットである。より高い強度は、それらの遺伝子が再発患者においてダウンレギュレートされることを示す、より高い遺伝子発現を示す。
【図２】図２は、患者サンプル（x軸）におけるヒト腸ペプチド関連トランスポーター遺伝子の測定の強度（ｙ軸）のプロットである。より高い強度は、それらの遺伝子が再発患者においてダウンレギュレートされることを示す、より高い遺伝子発現を示す。
【図３】図３a及びbは、それぞれ、患者サンプル（x軸）におけるMHCクラスII抗原（HLA-DRB1）遺伝子及び免疫グロブリン−様転写体５タンパク質遺伝子の測定の強度（ｙ軸）のプロットである。より高い強度は、それらの遺伝子が再発患者においてダウンレギュレートされることを示す、より高い遺伝子発現を示す。
【図４】図４は、例に記載されるような訓練組として患者データから構成される標準のKaplan-Meierプロットである。
【図５】図５は、例に記載されるような試験組として患者データから構成された標準のKaplan-Meierプロットである。
【図６】図６は、例に記載されるようなすべての患者データから構成された標準のKaplan−Meierプロットである。
【図７】図７は、標準のROC曲線である。
【図１】
2004329211.tif 000010
【図２】
2004329211.tif 000011
【図３Ａ】
2004329211.tif 000012
【図３Ｂ】
2004329211.tif 000013
【図４】
2004329211.tif 000014
【図５】
2004329211.tif 000015
【図６】
2004329211.tif 000016
【図７】
2004329211.tif 000017
【配列表】
2004329211000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年6月24日(2004.6.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
【図１】図１は、患者サンプル（x軸）におけるホモサピエンス脂肪酸結合タンパク質遺伝子１の測定の強度（ｙ軸）のプロットである。より高い強度は、それらの遺伝子が再発患者においてダウンレギュレートされることを示す、より高い遺伝子発現を示す。
【図２】図２は、患者サンプル（x軸）におけるヒト腸ペプチド関連トランスポーター遺伝子の測定の強度（ｙ軸）のプロットである。より高い強度は、それらの遺伝子が再発患者においてダウンレギュレートされることを示す、より高い遺伝子発現を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、患者サンプル（x軸）におけるMHCクラスII抗原（HLA-DRB1）遺伝子の測定の強度（ｙ軸）のプロットである。より高い強度は、それらの遺伝子が再発患者においてダウンレギュレートされることを示す、より高い遺伝子発現を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、患者サンプル（x軸）における免疫グロブリン−様転写体５タンパク質遺伝子の測定の強度（ｙ軸）のプロットである。より高い強度は、それらの遺伝子が再発患者においてダウンレギュレートされることを示す、より高い遺伝子発現を示す。
【図４】図４は、例に記載されるような訓練組として患者データから構成される標準のKaplan-Meierプロットである。
【図５】図５は、例に記載されるような試験組として患者データから構成された標準のKaplan-Meierプロットである。
【図６】図６は、例に記載されるようなすべての患者データから構成された標準のKaplan−Meierプロットである。
【図７】図７は、標準のROC曲線である。
【外国語明細書】
2004329211000001.pdf