(57)【要約】　　　（修正有）【課題】投与が容易な殺虫性タンパク質とともに異種系における毒素の発現を提供すること、また、多くの昆虫目に対して機能する活性をもちさらに効果的な殺虫性毒素の薬剤送達方法を提供すること。【解決手段】ホトルハブダス属由来の特定のアミノ酸配列を有するタンパク質毒素及びその変異体、該タンパク質をコードする核酸分子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種プロモーターに機能可能に接続されたポリヌクレオチドであって、昆虫に対して経口的毒性を有するタンパク質をコードし、かつ、配列番号１１および配列番号４６からなる群より選ばれる配列を有するポリヌクレオチドの変異体であり、配列番号１１および配列番号４６からなる群より選ばれる配列の相補配列とハイブリダイゼーションおよび洗滌後にハイブリダイゼーションを維持することが可能であり、前記ハイブリダイゼーションが２５℃、３ｘ　ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ下において行われる、前記ポリヌクレオチド。
【請求項２】
ハイブリダイゼーションにおける洗浄が６８℃にて０．２５ｘ　ＳＳＣ、０．２％　ＳＤＳで行われる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物細胞。
【請求項４】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドを発現させるトランスジェニック植物細胞。
【請求項５】
昆虫に対して経口的毒性を有する組換えタンパク質であって、前記タンパク質が配列番号１２および配列番号４７からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質の変異体であり、前記変異体をコードするヌクレオチドが配列番号１１および配列番号４６からなる群より選ばれる配列の相補配列とハイブリダーゼーションおよび洗滌後にハイブリダイゼーションを維持することが可能であり、前記ハイブリダイゼーションが２５℃、３ｘ　ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ下において行われる、前記タンパク質。
【請求項６】
ハイブリダイゼーションにおける洗浄が６８℃にて０．２５ｘＳＳＣ、０．２％　ＳＤＳで行われる、請求項５に記載のタンパク質。
【請求項７】
請求項５に記載のタンパク質を与えることを含む、昆虫を防除する方法。
【請求項８】
タンパク質が昆虫の接近が可能なトランスジェニック植物によって産生され、前記トランスジェニック植物中に存在する、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細菌から分離された毒素および殺虫剤としての当該毒素の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
自家所有者、ピクニックにでかける人々、庭師、農業従事者、および作物への昆虫被害の結果によりその農作物における投資がしばしば壊滅または減少させられるその他の人々にとって、多くの昆虫は広く害虫と見做される。特に成育期間が短い地域では、栽培者にとって顕著な昆虫被害は全ての利益の喪失と作物収量の劇的な減少を意味する。特定の農産物の供給不足は、食品加工業者、続いて食用植物およびこれらの植物に由来する製品の最終消費者にとって常に高コストをもたらす。
作物および花舟への昆虫の被害の防止および厄介な害虫の排除は、典型的には強力な有機害虫駆除剤および広範な毒性を有する殺虫剤に依存する。これらの合成生成物は環境に対して、さらにそのような薬剤に曝される者に対してあまりに過酷であるということで公衆の攻撃を受けることとなった。非農業的状況においても同様に、自家所有者は、昆虫を自宅に寄せつけないことに、また戸外での食事に昆虫を殺す必要がないことに満足を覚えるであろう。
【０００３】
化学殺虫剤の広範囲な使用は、農業従事者、当該殺虫剤を製造する企業、政府機関、関心公衆団体および一般大衆に環境と健康上の懸念を惹起した。より侵襲性の少ない害虫制御方法は、社会の環境に対する懸念と、昆虫制御機構を解明する生物学的手段の進歩の両方によって促進された。生物学的制御剤は化学殺虫剤に対して有望な選択肢を提供する。
それぞれの進化発達段階で生物は、自分自身の存続と生存を強化する多様な手段を獲得する。防御と攻撃の手段として生物学的分子を使用することは動物界および植物界を通して知られている。さらに、遺伝子工学の比較的新しい手段によって生物学的殺虫剤の改変が可能になり、特定の問題に対して特定の解決が得られる。
【０００４】
そのような薬剤の１つ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）は効果的な殺虫性薬剤であり、広く産業的に用いられている。実際、Ｂｔ細菌殺虫剤は限定された毒性を有するタンパク質であり、収穫した日に人間の食用作物として用いることができる。目標とされていない生物に対しては；このＢｔ毒素は消化可能な非毒性タンパク質である。
また別の既に知られている生物学的昆虫制御剤の類は、殺虫性細菌共生者の媒介動物として知られているある種の線虫類である。殺虫性細菌を含む線虫は昆虫の幼虫に侵入する。続いて細菌は幼虫を殺し線虫は幼虫の死体の中で増殖する。続いて線虫の子どもは体内から死体を食べる。このようにして生産された細菌含有線虫の子どもは続いて新たな別の幼虫に侵入することができる。
【０００５】
これまでにＳｔｅｉｎｅｒｎｅｍａおよびＨｅｔｅｒｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ属の殺虫性線虫が昆虫制御剤として用いられた。明らかに、線虫の各属は特定の細菌の宿主となる。Ｈｅｔｅｒｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ属の線虫では、共生細菌はＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓである。
これらの線虫は効果的な昆虫制御剤であるが、それは現時点では高価でさらに製造し、維持し、昆虫制御のために線虫を散布させることが困難である。
当技術分野では、ホトルハブダス　ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）から殺虫性毒素を分離できることが知られている。この毒素は、鱗翅目および鞘翅目昆虫の幼虫に注入されたときにのみ活性を有する。このことが、線虫またはその共生細菌の殺虫性特性の効果的な開発を不可能にしている。大切なことは、散布後もその生物学的特性を保持する殺虫性毒素のより実際的で、非労働集約型の薬剤送達方法であろう。経口活性を有するＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ属が産生する毒素を見つけることが強く所望される。これらの毒素の分離と使用は有効であるという理由から所望される。出願人らが発見するまで、これらの毒素は分離されたことがなく、また性状を調べられたこともなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
天然の毒素は、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ属の増殖細菌細胞が産生し分泌するタンパク複合体で、特に興味のあるものはＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ種が産生するタンパク質である。約１０００ｋＤａの分子量サイズをもつタンパク複合体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析で多数の成分タンパク質に分離させることができる。この毒素はヘモリジン、リパーゼ、Ｃ型ホスホリパーゼまたはヌクレアーゼ活性を含まない。この毒素は、多数の昆虫に曝露投与したとき顕著な毒性を示す。
本発明は、投与が容易な殺虫性タンパク質とともに異種系における毒素の発現を提供する。
本発明はまた、多くの昆虫目に対して機能する活性をもちさらに効果的な殺虫性毒素の薬剤送達方法を提供する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、異種プロモーターに機能可能に接続されたポリヌクレオチドであって、昆虫に対して経口的毒性を有するタンパク質をコードし、かつ、配列番号１１および配列番号４６からなる群より選ばれる配列を有するポリヌクレオチドの変異体であり、配列番号１１および配列番号４６からなる群より選ばれる配列の相補配列とハイブリダイゼーションおよび洗滌後にハイブリダイゼーションを維持することが可能であり、前記ハイブリダイゼーションが２５℃、３ｘ　ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ下において行われる、前記ポリヌクレオチド。本発明は、このようなポリヌクレオチドを含む、または発現させ得るトランスジェニック植物細胞でもある。
また、本発明は、昆虫に対して経口的毒性を有する組換えタンパク質であって、前記タンパク質が配列番号１２および配列番号４７からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質の変異体であり、前記変異体をコードするヌクレオチドが配列番号１１および配列番号４６からなる群より選ばれる配列の相補配列とハイブリダーゼーションおよび洗滌後にハイブリダイゼーションを維持することが可能であり、前記ハイブリダイゼーションが２５℃、３ｘ　ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ下において行われる、前記タンパク質である。また、本発明は、このようなタンパク質を含む、または発現させ得るトランスジェニック植物細胞でもある。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の目的、利点および特徴は以下の明細書から明らかになるであろう。
本発明は、昆虫に対して経口毒性を有するＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ属由来の極めて稀な殺虫性毒素類の発見を目的とする。Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓの固有の特性はその生物発光である。Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓは種々の起源から分離することができる。そのような起源の１つは線虫、より具体的にはＨｅｔｅｒｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ属の線虫である。また別の起源は人間の創傷から得られる臨床サンプル由来である（Ｆａｒｍｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：１５９４−１６００（１９９８）を例えば参照）。これらの死物寄生株はアメリカ菌培養収集所（ロックビル、メリーランド）に、ＡＴＣＣ＃４３９４８、４３９４９、４３９５０、４３９５２として寄託されており、この文献は参照により本明細書に含まれる。他のものも殺虫性毒素を産生するＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ細菌を含む可能性があるだろう。環境中のそのような起源は陸性または水性由来のいずれでも可能であろう。
Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ属は、分類学的には腸内細菌科の菌と定義されるが、この科に関しては非定型的なある種の特徴を有する。例えば、この属の株は硝酸塩還元陰性、黄色および赤色色素産生性、並びに生物発光性である。この後者の特徴は腸内細菌科では知られてない。Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓは最近になってＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓとは別の属として記載された（Ｂｏｅｍａｒｅら。、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４３：２４９−２５５（１９９３））。この相違は、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション実験、表現型の相違（例えばカタラーゼおよび生物学的発光の有無（有（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）無（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ））、線虫宿主の種類（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ；（Ｓｔｅｉｎｅｒｎｅｍａｔｉｄａｅ）、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ；（Ｈｅｔｅｒｏｒｈａｂｄｉｔｉｄａｅ））を基にしている。細胞脂肪酸の比較分析（Ｊａｎｓｅら、Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：１３１−１３５（１９９０）；Ｓｕｚｕｋｉら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：３９３−４０１（１９９０））は、ＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓのＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓからの分離を支持する。
【０００９】
本明細書で開示する株収集がＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓを含むことを確認するために、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓと特定し、さらに他の腸内細菌科およびＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種と区別するために認知されている特徴に基づいてこれらの株の性状を調べた（Ｆａｒｍｅｒ，Ｂｅｒｇｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１巻、５１０−５１１；Ａｋｈｕｒｓｔ　＆　Ｂｏｅｍａｒｅ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３４：１８３５−１８４５（１９８８）；Ｂｏｅｍａｒｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４３：２４９−２５５（１９９３）、これらの文献は参照により本明細書に含まれる）。調べた特徴は以下のとおりであった：グラム染色陰性桿菌、微生物のサイズ、コロニー色素沈着、封入体、カタラーゼの存在、硝酸塩還元能、生物学的発光、色素取り込み、ゼラチン水解、選択培地ので増殖、増殖温度、嫌気性条件下での生存および運動性。脂肪酸分析は、本明細書の株は全て単一のＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ属に属することを確認するために用いた。
【００１０】
現在のところ、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ属細菌は単一の限定された種、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＡＴＣＣ標準株＃２９９９９、Ｐｏｉｎａｒら、Ｎｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ　２３：９７−１０２（１９７７））を含む。種々の関連株が文献に記載された（Ａｋｈｕｒｓｔら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３４：１８３５−１８４５（１９８８）；Ｂｏｅｒａｒｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４３：２４９−２５５（１９９３）；Ｐｕｔｚら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６：１８１−１８６（１９９０））。本明細書では多数の株の性状を調べた。そのような株は実施例の表１８に挙げた。現在のところＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ属に規定されるのはただ１つの種（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）のみであるので、ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ種の特徴を本明細書の株の特徴として用いた。図５で分かるように、これらの株は極めて多様である。ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ種の特徴の幾つかを有し、しかも現在のところＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅの特徴として認識されていないいくつかの異なる特質を有する他のＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ種が将来出現することは予期せぬことではない。しかしながら、本発明の範囲は、それらの特徴および性状にもかかわらず、昆虫制御剤としての機能的活性を有するタンパク質を産生する一切のＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ種または株を含む。
【００１１】
さらにまた、本明細書で具現するように、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ属の細菌は、本明細書で規定するように機能的な活性を有するタンパク質を産生する。特に興味深いものは、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ種によって産生されるタンパク質である。本明細書の発明はここに開示する株に全く限定されるべきではない。これらの株は、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓの多様な分離株によって産生されるタンパク質は昆虫をこれに曝したとき有毒であることを初めて例証する。したがって、本発明に含まれるものは、本明細書で明らかにする特徴をもつ株およびその全ての変異株とともに、本明細書で開示する機能的活性を有するＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ属の一切の株または種である。
【００１２】
特定の意味を有し本明細書で用いられるいくつかの用語があるが、それらは以下のとおりである。
本明細書では”機能的な活性”とは、該タンパク毒素が、経口的に活性であるか、または毒性効果を有しているか、または摂食を妨害させるか停止させて（昆虫の死を引き起こすか否かにかかわらない）、昆虫制御剤として機能することを意味する。昆虫が遺伝子導入植物の発現、製剤化タンパク組成物、噴霧可能タンパク組成物、毒餌マトリックスまたは他の薬剤送達系によってもたらされた有効量の毒素と接触するとき、典型的にはそめ結果は昆虫の死であるか、または昆虫は毒素を昆虫に利用させる元となる餌を食べることができない。
【００１３】
”Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ毒素”という用語を用いるとき、当該用語はＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ微生物株によって産生される、昆虫に対して機能的な活性を有する一切のタンパク質を指すが、この場合、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ毒素は噴霧可能な組成物として製剤化されるか、遺伝子導入植物によって発現されるか、毒餌マトリックスとして製剤化されるか、バキュロウイルスを介して分布させられるか、または他の利用可能な一切の宿主もしくは薬剤送達系を用いて分布させられる。
本明細書で考察されるタンパク毒素は典型的には”殺虫剤”と呼はれる。本明細書では”殺虫剤”とは、本明細書でさらに定義するように、タンパク質が”機能的な活性”を有し、昆虫制御剤として用いられることを意味する。
【００１４】
”オリゴヌクレオチド”という用語は、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの短い鎖から成る巨大分子を意味する。そのような鎖の長さは少なくとも１個のヌクレオチドであるが、典型的には約１０から１２ヌクレオチドの範囲である。オリゴヌクレオチドの長さの決定は当技術分野で周知で、本明細書で限定すべきものではない。したがって、オリゴヌクレオチドは１０未満でもよく、１２より大きくてもよい。
本明細書で用いられるように、”有毒”または”毒性”という用語は、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓによって産生される毒素が、本明細書で定義するように”機能的な活性”を有することを意味する。
本明細書で用いられるように、”遺伝物質”とは全ての遺伝子、核酸、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むことを意味する。
【００１５】
表１８で報告する選択株の醗酵ブロスを用いて、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ属による殺虫性毒素産生の幅、これら毒素の殺虫スペクトルを決定し、さらに毒素複合体の精製のための出発材料が提供される。本明細書で性状を調べた株は昆虫の多様な目に対して経口毒性を有することが示された。そのような昆虫目には、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ、Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、Ｄｉｐｔｅｒａ、Ａｃａｒｉｎａ、ＨｙｍｅｎｏｐｔｅｒａおよびＤｉｃｔｙｏｐｔｅｒａが含まれるが、これらに限定されるものではない。
他の細菌毒素に関しては、この細菌の集団内の変異率は、現存の配列と僅かに異なる多くの関連毒素を生じる。本明細書で興味のある毒素は、本明細書で開示するように暴露に際して多様な昆虫に毒性を有するタンパク複合体を産生するものである。好ましくは、この毒素はＣｏｌｅｏｐｔｅｒａ、Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、Ｄｉｐｔｅｒａ、Ａｃａｒｉｎａ，ＨｙｍｅｎｏｐｔｅｒａおよびＤｉｃｔｙｏｐｔｅｒａに対して活性を有する。本発明は、本明細書の株およびその一切の誘導株によって産生されるタンパク毒素とともに、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓによって産生される全てのタンパク毒素と同種のタンパク毒素を包含することを意図する。これらの同種タンパク質は配列が異なるかもしれないが、本明細書で述べるこれらの毒素とは機能が異なることはない。同種毒素は３００ｋＤａから２０００ｋＤａの間のタンパク複合体を含み、さらに少なくとも２つのサブユニットを含むことが意図される。この場合、１つのサブユニットはペプチドで、他のサブユニットと同じでも異なっていてもよい。種々のタンパクサブユニットが同定され、本明細書の実施例で開示される。典型的には、該タンパクサブユニットは約１８ｋＤａから約２３０ｋＤａ、約１６０ｋＤａから約２３０ｋＤａ、約１００ｋＤａから１６０ｋＤａ、約８０ｋＤａから約１００ｋＤａ、および約５０ｋＤａから約８０ｋＤａである。
【００１６】
上記で考察したように、いくつかのＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株が線虫から分離された。幾つかの線虫（線虫門の細長い筒状の寄生虫）は、好ましい増殖環境として昆虫の幼虫を利用する能力を進化させた。昆虫の幼虫は、成長する線虫のために摂食源および増殖のための環境を提供する。ある種の線虫による幼虫の侵入に続く劇的な作用の１つは幼虫の死である。幼虫の死は、ある種の線虫では殺虫性毒素を産生する細菌の存在によって生じる。この毒素は幼虫の増殖を拘束し、摂食能力を抑制する。
興味深いことには、昆虫寄生線虫は、当該線虫との共生増殖のために固有の適応を示す特定の細菌種の宿主であるらしい。この研究を開始して暫くの間、細菌のＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓの呼称はＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓおよびＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓに再分類された。
【００１７】
Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ属の細菌はＨｅｔｅｒｏｒｈａｂｄｉｔｕｓ線虫の共生細菌であるという性状を有し、一方、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種はＳｔｅｉｎｅｒｎｅｍａ種の共生細菌である。命名法に於けるこの変化は本明細書にも反映されているが、命名法におけるこの変化は、本明細書に開示する本発明の範囲に全く影響を与えない。
本明細書に開示するペプチドおよび遺伝子は、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ誌の”著者への指示（Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ　ｔｏ　Ａｕｔｈｏｒｓ）”（ｉ−ｘｉｉページ、１９９６年、１月）（この文献は参照により本明細書に含まれる）に最近発表されたガイドラインにしたがって名称を付与した。以下のペプチドおよび遺伝子がＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株Ｗ−１４から分離された。
【００１８】
【表１】
2004089189.tif 000002
（括弧内の配列はトリプシン消化で得られた内部アミノ酸配列を示す）
【００１９】
上記に挙げた配列はゲノム領域でグループ分けされている。ｔｃｂＡ遺伝子は、実施例で説明するように２つのタンパクフラグメントＴｃｂＡおよびＴｃｂＡｉｉｉとして大腸菌で発現された。いくつかの配列をタンパク質分解によって切り取って、遺伝子導入用市販品のためにより高い活性をもつ毒素を得ることは有益であろう。
【００２０】
本明細書で開示する毒素は、当該毒素が機能的な活性（これが昆虫制御戦略の開発の鍵であるが）を有するという点において極めて特異的である。昆虫制御略の開発では、生物の消化管を避けて当該生物に直接タンパク質を注射してタンパク分解過程を遅らせまたは妨害することが可能である。そのような場合には、該生物に投与されるタンパク質は、変性、非特異的分解または高等生物の免疫系による排除までその機能を保持するであろう。殺虫性毒素の昆虫への注射は実験室でのみ応用が可能で、さらに容易に注射できる大型の昆虫について可能である。本明細書で開示する殺虫性タンパク毒素は、経口消化または毒素との接触後にその毒性活性を表すという観察は、該タンパク毒素を昆虫の餌に取り込ませることの可能性を専らあてにする昆虫制御計画の開発を可能にする。そのような計画の結果は昆虫の毒餌であろう。
【００２１】
Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓの毒素は昆虫に精製形で投与してもよい。この毒素はまた約１から約１００ｍｇ／リットルブロスの量で薬剤分布させてもよい。これは、製剤の条件、接種源の条件、毒素分離技術などにしたがって変動するであろう。この毒素は異種原核細胞または真核細胞宿主で初めに発現された滲出分泌物または細胞タンパク質として投与してもよい。細菌は、典型的には当該タンパク質が発現される宿主である。真核細胞宿主には植物、昆虫および酵母が含まれるが、これらに限られるものではない。また別にはこの毒素は、細菌により、または野外で遺伝子導入植物により、またはバキュロウイルスベクターにより昆虫で産生させてもよい。典型的にはこの毒素は、昆虫の餌に１種または２種以上の毒素を混ぜることによって昆虫に導入されるであろう。
【００２２】
摂食昆虫に対する完全致死率は有用であるが、有意義な毒性を達成するためには要求されない。もし昆虫が毒素を避けるかまたは摂食を中止するならば、たとえ毒素の効果が致死量以下であったとしてもこの回避行動は幾つかの応用例で有用であろう。例えば、昆虫耐性遺伝子導入作物植物を所望する場合、昆虫が当該植物を接触するのをためらうことは該昆虫に対する致死的毒性と同様に有用である。なぜならば、究極の目的は該植物の保護であって当該昆虫を死滅させることではないからである。
毒素を昆虫の餌に混ぜるために他の多くの方法がある。一例として、本明細書に開示したようにタンパク質溶液を噴霧して当該毒素タンパク質を幼虫の摂食源に混ぜることが可能である。また別には、精製タンパク質を無害な細菌に遺伝子工学によって導入し、続いてこれを培養して増殖させ、さらに摂食源に用いるかまたは該昆虫を撲滅しようとする地域の土壌に定着させる。また、該タンパク質を昆虫の摂食源に遺伝子工学的に直接導入することもできる。例えば、多くの昆虫の幼虫の主要な摂食源は植物成分である。
【００２３】
Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ毒素の殺虫特性をコードする遺伝成分を、特定の害虫が摂食する植物のゲノムに組み込むことによって、該摂食用植物を食べた後で成虫または幼虫は死滅するであろう。単子葉および双子葉に属する多くの植物が形質転換された。遺伝子導入農作物は果物および野菜とともに商業的に重要である。そのような作物にはトウモロコシ、コメ、ダイズ、カノラ（ｃａｎｏｌａ）、ヒマワリ、アルファルファ、モロコシ、コムギ、綿花、ピーナツ、トマト、ジャガイモなどが含まれるが、これらに限られるものではない。外来遺伝成分を植物細胞に導入し、さらに該導入遺伝子を安定的に維持し発現させるためにはいくつかの技術がある。そのような技術には、微粒子上に被覆された遺伝物質の直接細胞導入の促進が含まれる（米国特許４９４５０５０号（Ｃｏｒｎｅｌｌ）および同５１４１１３１号（ＤｏｗＥｌａｎｃｏ））。植物はアグロバクテリウム関連技術を用いて形質転換できる（米国特許５１７７０１０号（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｐｌｅｄｏ）、同５１０４３１０号（Ｔｅｘａｓ　Ａ＆Ｍ）、欧州特許出願公開公報第０１３１６２４Ｂ１号、欧州特許出願公開公報第１２０５１６号、同１５９４１８Ｂ１号および同１７６１１２号（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔ）、米国特許５１４９６４５号、同５４６９９７６号、同５４６４７６３号および同４９４０８３８号、並びに同４６９３９７６号（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔ）、欧州特許出願公開公報第１１６７１８号１２９０７９９号、３２０５００号（全てＭａｘＰｌａｎｃｋ）、欧州特許出願公開公報第６０４６６２号および６２７７５２号（Ｊａａｐａｎ　Ｔｏｂａｃｃｏ）、欧州特許出願公開公報第０２６７１５９号および０２９２４３５号並びに米国特許５２３１０１９号（全てＣｉｂａ　Ｇｅｉｇｙ）、米国特許５４６３１７４号および４７６２７８５号（ともにＣａｉｇｅｎｅ）、米国特許５００４８６３号および５１５９１３５号（ともにＡｇｒａｃｅｔｕｓ）を参照のこと）。他の形質転換技術にはウィスカー（Ｗｈｉｓｋｅｒｓ）の技術（米国特許５３０２５２３号および５４６４７６５号（ともにＺｅｎｅｃａ）を参照のこと）が含まれる。電気穿孔術（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）もまた植物の形質転換に用いられた（ＷＯ８７／０６６１４号（Ｂｏｙｃｅ　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、同５４７２８６９号および５３８４２５３号（ともにＤｅｋａｌｂ）、ＷＯ９２０９６９５号およびＷＯ９３２１３３５号（ともにＰＧＳ）を参照のこと）。
【００２４】
これらの形質転換に関する特許および刊行物は参照により本明細書に含まれる。植物を形質転換させる多くの技術だけでなく、外来遺伝子と接触する組織の種類も同様に変化をもたせることができる。そのような組織には胎児性組織、カルス組織Ｉ型およびＩＩ型、ヒポコチル、メリステムなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。ほとんど全ての植物組織は、当技術分野の適切な技術を用いて分化中に形質転換させることができる。
また別の変動因子は、選別マーカーの選択てある。具体的マーカーとして何を選択するかは当業者の自由裁量であるが、以下の選別マーカーのいずれも使用することができ、さらに、本明細書に挙げられていない選別マーカーとして機能しえる他の何れの遺伝子も用いることができる。そのような選別マーカーには、トランスポゾンＴｎ５（ＡｐｈＩＩ）のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（これは、抗生物質（カナマイシン、ネオマイシンおよびＧ４１８）に対する耐性をコードする）とともに、グリホセート；ヒグロマイシン；メトトレキセート；ホスフィノスリシン（ビアロホス）；イミダゾリノン、スルホニルウレアおよびトリアゾロピリミジン除草剤（例えばクロロスルフロン）；ブロモキシニル、ダラポンなどに対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
選別マーカーの他に、レポーター遺伝子を用いることが望ましい。いくつかの例では、選別マーカーを使用しないでレポーター遺伝子を用いることができる。レポーター遺伝子は、受容生物または組織には典型的には存在しないかまたは発現されない遺伝子である。レポーター遺伝子は典型的には、何らかの表現型の変化または酵素特性を提供するタンパク質をコードする。そのような遺伝子の例は文献に記載されている（Ｋ．Ｗｅｉｓｉｎｇら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　２２：４２１（１９８８）、この文献は参照により本明細書に含まれる）。好ましいルポーター遺伝子はグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子である。
形質転換技術に関係なく、植物プロモーターをベクターに包含させることによって植物細胞でＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ毒素を発現できるように適応させた遺伝子伝達ベクターに好ましくは当該遺伝子を取り込ませる。植物プロモーターの他に、種々の起源のプロモーターが、外来遺伝子を発現させるために植物細胞で有効に用いられる。例えば、細菌由来のプロモーター（例えばオクトピンシンセターゼプロモーター、ノパリンシンセターゼプロモーター、マンノピンシンセターゼプロモーター）、ウイルス由来プロモーター（例えばカリフラワーモザイクウイルス（３５Ｓおよび１９Ｓ））などを用いることができる。植物プロモーターには、リブロース−１，６−ビスホスフェート（ＲＵＢＰ）カルボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓｕ）、ベータ−コングリシニンプロモーター、ファセオリンプロモーター、ＡＤＨプロモーター、熱ショックプロモーターおよび組織特異的プロモーターが含まれるが、これらに限られるものではない。プロモーターはまた、転写効率を改良することができるある種のエンハンサー配列成分を含むことができる。典型的なエンハンサーにはＡｄｈ−イントロン１およびＡｄｈ−イントロン６が含まれるが、これらに限定されない。構成的プロモーターも用いることができる。構成的プロモーターは、全ての細胞型で常に連続的な遺伝子発現を誘導する（例えばアクチン、ユビキチン、ＣａＭＶ３５Ｓ）。組織特異的プロモーターも例えば葉または種子のような特定の細胞または組織型での遺伝子発現をもたらし（例えばゼイン、オレオシン、ナピン、ＡＣＰ）、これらのプロモーターもまた使用できる。プロモーターは、植物組織および器官で活性を有するのと同様に植物の発育時の一定段階でもまた活性を有する。そのようなプロモーターの例には花粉特異的、胎児特異的、トウモロコシの穂の毛特異的、綿花繊維特異的、根特異的、種子エンドスパーム（ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ）特異的プロモーターなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
ある種の環境下では、誘導可能なプロモーターを用いることが望ましいであろう。誘導可能なプロモーターは、特異的シグナル（例えば生理的シグナル（熱ショック遺伝子）、光（ＲＵＢＰカルボキシラーゼ）、ホルモン（Ｅｍ）、代謝物およびストレス）に反応して遺伝子の発現をもたらす。植物で機能する他の望ましい転写および翻訳成分も用いることができる。植物特異的な多くの遺伝子伝達ベクターが当技術分野で知られている。
さらに、植物で細菌遺伝子の高い発現を得るためには、細菌遺伝子が植物の細胞質でより効果的に発現するようにそれらを再操作することが好ましいことが知られている。トウモロコシは、形質転換の前に細菌遺伝子を再操作して植物での毒素の発現レベルを高めることが好ましい植物の１つである。再操作の理由の１つは、天然の細菌遺伝子のＧ＋Ｃ含有量が極めて低い（Ａ＋Ｔ含有量が高いという結果になる）ということである。この結果は、Ａ＋Ｔが極めて豊富であることが知られている植物遺伝子制御配列を模倣するまたは複製する配列の作製であろう。植物内に導入される遺伝子のＤＮＡ内にＡ＋Ｔに富むいくつかの配列（例えば遺伝子プロモーターに通常見出されるＴＡＴＡボックス領域）が存在するということは、遺伝子の異常な転写をもたらす可能性がある。他方、転写ｍＲＮＡに存在する他の調節配列（例えばポリアデニル化シグナル配列（ＡＡＵＡＡＡ）または前駆体ｍＲＮＡのスプライシングに必要な小型の核ＲＮＡ）の存在は、ＲＮＡの不安定性につながるかもしれない。したがって、再操作した細菌遺伝子デザイン（より好ましくは植物最適化遺伝子と称される）の目標の１つは、より高いＧ＋Ｃ含有量をもつＤＮＡ配列、および好ましくは代謝酵素をコードする植物遺伝子のそれに近いものを作製することである。植物最適化遺伝子のデザインのまた別の目標は、Ｇ＋Ｃ含有量が高いというだけでなく、その配列変化を修飾（変更）することによって翻訳を妨げないＤＮＡ配列を作製することである。
【００２７】
高Ｇ＋Ｃ含有量を有する植物の例はトウモロコシである。下記の表は、Ｇ＋Ｃ含有量がトウモロコシでどのように高いかを示している。トウモロコシの場合のように、他の植物のＧ＋Ｃ含有量もまた高いと考えられる。
【００２８】
【表２】
表１．
2004089189.tif 000003
ａ　遺伝子類の数は括弧内に示す。
ｂ　標準偏差は括弧内に示す。
ｃ　統合群の平均は全体の平均の計算では無視した。
【００２９】
表１のデータについては、遺伝子のコード領域はＧｅｎＢａｎｋ（レリース７１）の登録から抽出し、塩基組成はマックベクター（登録商標）プログラム（ＭａｃＶｅｃｔｏｒＴＭ，ＩＢＩ，Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ，コネチカット）を用いて計算した。イントロン配列は計算では無視した。Ｉ群およびＩＩ群の貯蔵タンパク遺伝子配列はそれらの塩基組成における顕著な相違で区別した。
遺伝暗号の余剰性（すなわちいくつかのアミノ酸は１つ以上のコドンによって特定される）によって許容される柔軟性のゆえに、異なる生物または異なる種類のゲノムの進化は余剰コドンの異なる用い方をもたらした。この”コドンの偏り”はタンパクコード領域の平均塩基組成に現れる。例えば、比較的低いＧ＋Ｃ含有量をもつ生物は余剰コドンの第三位にＡまたはＴを有するコドンを利用し、一方、高いＧ＋Ｃ含有量をもつものは第三位にＧまたはＣを有するコドンを利用する。遺伝子のｍＲＮＡ内に”マイナー”コドンが存在することによって、特に該マイナーコドンに対応する稼働ｔＲＮＡの相対的なゆとりが低い場合は当該ｍＲＮＡの絶対翻訳率が低下すると考えられる。これを拡大すれば、個々のマイナーコドンによる翻訳率の低下は、多数のマイナーコドンについて少なくとも累積的であるということである。したがって、マイナーコドンの含有量が比較的高いｍＲＮＡはそれに対応して翻訳率が低いであろう。この翻訳率は、該当コードタンパク質の低レベルの合成によって体現される。
【００３０】
細菌遺伝子の再操作のために植物のコドンの偏りを決定する。コドンの偏りは、植物がそのタンパク質をコードするために用いる統計的コドン分布である。この偏りを求めた後で対象遺伝子のコドンの％頻度を求める。植物が好んで用いる主要コドンが、第二および第三の好ましいコドンとともに求められるべきであろう。対象タンパク質のアミノ酸配列を逆に翻訳し、その結果、生じた核酸配列が天然の細菌遺伝子と同じタンパク質をコードするが、生じた核酸配列は所望の植物の第一の好ましいコドンに対応するようにした。新規な配列は、変更によってつくり出された制限酵素部位に関して分析される。さらに第二または第三の好ましい選択コドンで当該コドンを置換することによって、この特定した部位を変更する。対象遺伝子の転写または翻訳に影響を与える配列内のその他の部位は、エクソン：イントロン５’または３’結合部、ポリＡ付加シグナル、またはＲＮＡポリメラーゼ終結シグナルである。さらにこの配列を分析し、ＴＡまたはＧＣ対の頻度を減少させるために修飾する。これらの対の他に、約４つ以上の同じ残基を有するＧまたはＣ配列ブロックも当該配列の転写に影響を与える。したがって、これらのブロックもまた第一または第二の選択コドンなどをその次に好ましい選択コドンで置換することによって変更される。好ましくは、この植物最適化遺伝子は、約６３％の第一の選択コドンを、約２２％から約３７％の第二の選択コドンを、さらに１５％から０％の第三の選択コドンを含み、ここで百分率の合計は１００％である。最も好ましくは、植物最適化遺伝子は、約６３％の第一の選択コドンを、少なくとも約２２％の選択コドンを、約７．５％の第三の選択コドンを、さらに約７．５％の第四の選択コドンを含み、ここで百分率の合計は１００％である。上記に述べた方法は、当業者が、特定の植物にとって外来性である遺伝子を修飾し、その結果該遺伝子を植物内で最適に発現させることを可能にする。本方法は、現在審査中の条件付き米国特許出願６０／００５４０５号（１９９５年１０月１３日出願、この文献は参照により本明細書に含まれる）でさらに詳述されている。
【００３１】
したがって、植物最適化遺伝子をデザインするために、形質転換される特定の植物についての遺伝子ＤＮＡ配列に関して編集したコドンの偏り表から確定した非余剰性遺伝暗号を用いて、該毒素のアミノ酸配列をＤＮＡに逆翻訳する。得られたＤＮＡ配列（これはコドンの用い方においては完全に均質である）をさらに修飾して、より高いコドンの多様性を有するという他に、計画的な制限酵素部位の配置、所望の塩基組成、および遺伝子の転写または生成ｍＲＮＡの翻訳に干渉するおそれのある配列の除去を図る。
細菌遺伝子がプラスチドで発現される場合には、該細菌遺伝子はもっと容易に植物で発現されるであろうという学説がある。したがって、遺伝子を植物発現に最適にすることなく細菌遺伝子を植物で発現させ、タンパク質の高発現を得ることは可能かもしれない（例えば米国特許４７６２７８５号、５４５１５１３号および５５４５８１７号を参照のこと、これらの文献は参照により本明細書に含まれる）。
【００３２】
商品として遺伝子導入植物を開発するための課題の１つは耐性の管理である。
これはＢａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素に関して特にいえる。商業的にＢａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを開発している企業は多く、耐性Ｂｔ毒素に関してはこれまで懸念が多かった。昆虫の耐性に関する管理についてのこれまでの戦略はＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓによって産生される毒素を例えばＢｔのような草食性昆虫タンパク毒素（Ｃｉｂａ　Ｇｅｉｇｙ）または他の毒素と混ぜることであろう。噴霧可能なようにこの組み合わせを製剤化するか、または分子として組み合わせることができるであろう。植物は、昆虫毒素を産生するＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ遺伝子および他の昆虫毒素遺伝子（例えばＢｔ）で形質転換できるであろう。
欧州特許出願公開公報第０４００２４６Ａ１は、２種のＢｔ（この２種の遺伝子は何でもよい）による１つの植物の形質転換を開示する。１種以上の昆虫耐性遺伝子を含む遺伝子導入植物を製造するまた別の方法は、各植物が１つの昆虫耐性遺伝子を含む２種の植物を製造することである。これらの植物を慣習的な交配技術を用いて戻し交配し、１種以上の昆虫耐性遺伝子を含む植物を製造する。
【００３３】
植物最適化遺伝子を含む形質転換植物の製造に加えて、細菌遺伝子の再操作にとって望ましいと思われる他の薬剤送達系が存在する。同じように摂食源として昆虫誘因性をもつ分子と毒素の殺虫活性とを融合させた、遺伝学的に操作して容易に分離可能なタンパク毒素を作出し、標準的で周知の技術を用いて細菌または真核細胞で発現させることができる。研究室で精製した後、”はめ込み式”毒餌を含むそのような毒素薬剤は標準的な昆虫補足用ハウジングに梱包できる。
別の薬剤送達系はバキュロウイルスベクターに毒素の遺伝物質を取り込ませることである。バキュロウイルスは、特定の昆虫宿主（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ毒素の好ましい標的である昆虫を含む）に感染する。Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ毒素の発現構築物を含む感染性バキュロウイルスを昆虫被害地域に導入し、それによって感染昆虫を毒で汚染させる。
【００３４】
殺虫特性の伝達には、タンパク発現ベクターに組み込まれたＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ毒素のアミノ酸配列をコードする核酸配列が必要である。当該ベクターはそれが生存する宿主にとって適切なものでなければならない。殺虫特性を有するタンパク質をコードする核酸配列を得る方法の１つは、毒素のアミノ酸配列（その大部分は下記で詳述する）から推定される情報を用いて、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓから該毒素を産生する天然の遺伝物質を分離することである。下記で説明するように、毒素活性をもたらすタンパク質を精製する方法もまた開示する。
下記に述べるようにＮ−末端アミノ酸情報を用いて、当該毒素の最初のアミノ酸をコードするＤＮＡ塩基の全て（または部分）に対して相補的なオリゴヌクレオチドを構築することができる。これらのオリゴヌクレオチドを放射能標識して、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株から分離した遺伝物質から構築したゲノム遺伝子ライブラリーから当該遺伝物質を分離するために分子プローブとして用いることができる。この遺伝子ライブラリーは、プラスミド、コスミド、ファージまたはファージミドベクターでクローニングできる。このライブラリーで大腸菌を形質転換し、毒素に対して作製した抗体または昆虫毒素のための直接アッセイを用いて、形質転換細胞による毒素産生についてスクリーニングすることができるであろう。
【００３５】
このアプローチはオリゴヌクレオチド一式の産生を必要とする。なぜならば、縮退遺伝暗号のために、１つのアミノ酸は数個の３ヌクレオチドの組み合わせによってコードされえるからである。例えば、アミノ酸のアルギニンは核酸トリプレット、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ、ＡＧＡおよびＧＧによってコードされえる。どのトリプレットが毒素遺伝子のその位置で用いられるかを予想することはできないので、可能性のあるトリプレットの各々を用いてオリゴヌクレオチドを調製する必要がある。経口毒素を完成させるために必要なタンパクサブュニットの全てを回収するためには、１つのタンパクサブユニットに対応する１つ以上のＤＮＡ分子が、充分な数のオリゴヌクレオチドプローブを構築するために必要であろう。
【００３６】
精製タンパク質のアミノ酸配列から、毒素の生産に必要な遺伝物質は容易に分離することができ、さらに分子生物学の技術分野で習熟した者にとって周知のいくつかの技術の何れかを用いて発現ベクターに全体または部分をクローニングすることができる。典型的な発現ベクターはＤＮＡプラスミドであるが、コスミド、ファージミドおよびファージを含む（ただしこれらに限定されない）他の伝達手段もまた用いることができる。ブラスミドの複製のために必要なまたは望ましい特性（例えは複製起点および抗生物質耐性または他の形態の選別マーカー（例えばＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓまたはＶｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓのｂａｒ遺伝子））に加えて、タンパク発現ベクターは通常発現カセットを必要とする。これは、対象の遺伝子の転写および翻訳に必要なｃｉｓ−作動性配列を含んでいる。原核細胞での発現に必要なｃｉｓ−作動性配列は、真核細胞および植物で必要とされるものとは異なっている。
【００３７】
真核細胞発現カセットは、対象の遺伝子に対して上流（５’）に転写プロモーター、転写終結領域（例えばポリＡ付加部位）および対象の遺伝子の最初のコドンの上流にリボソーム結合部位を必要とする。細菌細胞の場合にベクターに含むことができる有用な転写プロモーターは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ結合プロモーターである。本明細書で先に述べたように、プロモーターはｍＲＮＡの転写を効果的に促進することが知られている。また対象の遺伝子から上流に、該ベクターはシグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含むことができるが、これは、宿主細胞の特定の部分（例えば細胞表面）に共有結合によって連結されたタンパク質を誘導することが分かっている。
昆虫ウイルスまたはバキュロウイルスは、ある種の昆虫に感染または悪い影響を与えることが知られている。昆虫に対するウイルスのこの影響は緩徐で、ウイルスは昆虫の摂食を停止させない。したがって、ウイルスは害虫制御剤として有用なようには見えない。Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ毒素遺伝子をバキュロウイルスベクターに結合させることによって、ウイルスの致死性を高めながら当該毒素を伝達する有効な方法が提供される。さらに、異なるバキュロウイルスは異なる昆虫に対して特異性を有するので、特定の毒素を用いて特定の害虫を選択的に標的とすることが可能である。該毒素遺伝子に対して特に有用なベクターは核多角体病ウイルスである。このウイルスを用いる伝達ベクターは既に記載され、外来遺伝子を昆虫に伝達するために選択されるベクターとなっている。ウイルス−毒素遺伝子リコンビナントは、経口的に伝達可能な形態として構築できる。通常、バキュロウイルスは中腸の腸管粘液を介して昆虫に感染する。強力なウイルスのコートタンパクプロモーターの後ろに挿入された毒素遺伝子は発現されて迅速に感染昆虫を殺すであろう。
【００３８】
昆虫ウイルスもしくはバキュロウイルスまたは本発明のタンパク毒素のための遺伝子導入植物による薬剤送達系の他に、このタンパク質は、例えば米国特許４６９５４５５号、４６９５４６２号、４８６１５９５号（ただしこれらに限定されない）（これらの文献は参照により本明細書に含まれる）のＢａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ被包化技術を用いて被包化できる。本発明のタンパク毒素のまた別の薬剤送達系は毒餌マトリックスへの該タンパク質の製剤化である。この製剤は続いて地上または地下昆虫毒餌ステーションで用いることができる。そのような技術の例にはＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／２３９８９号（この文献は参照により本明細書に含まれる）が含まれるが、ただしこれに限定されない。
上記で述べたように、当該タンパク質を本来の宿主ではない宿主で発現させる場合は、該タンパク質をコードする配列を変更することが必要となるかもしれない。なぜならば、他の宿主で好んで使用されるコドンはＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓの場合と異なる可能性があるからである。そのような場合には、該コード配列に対して埋め合わせとなる変更が行われないかぎり、新しい宿主での翻訳は極めて効率が悪いであろう。さらに、新しい宿主のタンパク質との抑制性交差反応を避けるために、または新しい宿主での該タンパク質の殺虫特性を高めるために、アミノ酸配列に対する変更が望ましいであろう。遺伝子的に修飾された毒素遺伝子は、例えば毒性強化もしくは低下、昆虫の耐性発達の変化、安定性の変化または標的種特異性の変化を示す毒素をコードするかもしれない。
【００３９】
該毒素をコードするＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ遺伝子の他に、本発明は、該毒素タンパク質と相同なアミノ酸バイオポリマーをコードし、さらに経口消化の後で昆虫種においてＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓタンパク質の毒性効果を保持する関連核酸配列を含むことを意図する。
例えば、本発明で用いられる毒素は、結果として死がもたらされる前に先ず幼虫の摂食を抑制するように思える。Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ毒素の核酸配列またはその制御配列を操作することによって、毒素遺伝子を植物に配置した遺伝子工学技術者は、例えば摂食抑制活性を保ち、その一方で幼虫に対する絶対的な毒性を取り除くために当該タンパク質の能力またはその作用態様を調節することができるであろう。この変化によって、全ての標的昆虫を根絶させるという環境系に対する不必要で劇的な影響を与えることなく、形質転換植物が収穫まで残存することが可能となろう。該毒素をコードする遺伝子のそのような変更の全て、または該遺伝子によってコードされるタンパク質のそのような変更の全てか本発明の範囲内に包含される。
【００４０】
包含される他の核酸の変更には、該毒素の有効性を改善するために昆虫の幼虫の特定の部分に毒素を誘導するために照準用配列を付加することが含まれる。
ＡＴＣＣ５５３９７、４３９４８、４３９４９、４３９５０、４３９５１、４３９５２株はアメリカ菌培養収集所（１２３０１，Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ　２０８５２　ＵＳＡ）に寄託された。Ｗ−１４天然毒素（ＡＴＣＣ５５３９７）のアミノ酸および核酸配列データは下記に提示する。毒素のゲノムＤＮＡの細菌宿主からの分離は本明細書で例証する。
標準的技術および分子生物的技術を用い、さらにそれらは本明細書で開示される。更なる情報は、分子クローニング：実験室マニュアル（コールドスプリングハーバー研究所出版部（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ　＆　Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９））で見出される（この文献は参照により本明細書に含まれる）。
以下の略語は実施例を通して用いられる：Ｔｒｉｓ＝トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン；ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム；ＥＤＴＡ＝エチレンジアミンテトラ酢酸；ＩＰＴＧ＝イソプロピルチオ−β−ガラクトシド；Ｘ−ｇａｌ＝５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトシド；ＣＴＡＢ＝臭化セチルトリメチルアンモニウム；ｋｂｐ＝キロ塩基対；ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、Ｉ＝それぞれアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびイノシンの２’−デオキシヌクレオシド５’−三燐酸塩；ＡＴＰ＝アデノシン５’三燐酸塩。
【００４１】
【実施例】
実施例１　Ｐ．ｌｕｍｌｎｅｓｃｅｎｓ由来毒素の精製と精製毒素の経口的薬剤送達後の毒性の証明
本発明の殺虫性タンパク毒素は、Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓＷ−１４株（ＡＴＣＣ　Ａｃｃｅｓｓ　＃５５３９７）から精製された。Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓのストック培養を１．５％寒天に２％プロテオースペプトン＃３（すなわちＰＰ３、Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，デトロイト、ミシガン）を含むペトリ皿で２５℃で保温し毎週継代して維持した。細菌の一次形態コロニーを１リットルフラスコ中の０．５％のポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（トゥイーン６０、Ｓｉｇｎｌａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ，セントルイス、ミズーリ）補充２００ｍｌのＰＰ３ブロスに摂取した。回転シェーカーで３０℃で７２時間ブロス培養を増殖させた。毒素タンパク質をトゥイーンの非存在下または存在下で増殖させた培養から回収することかできる。しかしながらトゥイーンの非存在下では増殖細菌の形態および該細菌によって産生されるタンパクプロフィールは影響を受ける。トゥイーンの非存在下では、種々のシフトが生じ、少なくとも特定された１つの毒素サブユニットの分子量に関するかぎり約２００ｋＤａから約１８５ｋＤａへとシフトする。
【００４２】
この７２時間培養を１００００×ｇで３０分遠心して細胞と残屑を除去した。殺虫活性を含む上清分画を傾けて流し出し、適切な容量の１．０ＭのＫ２ＨＰＯ４を添加して５０ｍＭ　Ｋ２ＨＰＯ４とする。水酸化カリウムを添加してｐＨを８．６に調整した。続いてこの上清分画を、５０ｍＭ　Ｋ２ＨＰＯ４で平衡化したＤＥＡＥ−セファセル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と混合した。この毒性活性をＤＥＡＥ樹脂に吸着させた。続いてこの混合物を２．６×４０ｃｍカラムに注入し、５０ｍＭ　Ｋ２ＨＰＯ４で室温で流速３０ｍｌ／時間で洗浄して、溶出液を安定した２８０ｎｍＵＶ吸収基準ラインに到達させた。続いて溶出液が再び安定した２８０ｎｍ基準ラインに達するまでカラムを１５０ｍＭ　ＫＣｌで洗浄した。最後にカラムを３００ｍＭ　ＫＣｌで洗浄し、分画を採集した。
【００４３】
毒素を含む分画を集め、０．２ミクロン孔の膜フィルターを用いて濾過滅菌した。続いて毒素を濃縮し、さらに分子量カットオフが１００ｋＤａの限外濾過膜（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ　１００，Ａｍｉｃｏｎ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ−Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて４℃で１００ｍＭ　ＫＰＯ４（ｐＨ６．９）に平衡化した。毒素濃縮物の３ｍｌを２．６×９５ｃｍのセファシルＳ−４００ＨＲゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の上部に積載した。溶離液は１００ｍＭＫＰＯ４（ｐＨ６．９）で、これを１７ｍｌ／時間の流速で４℃で流した。溶出液を２８０ｎｍでモニターした。
分画を集め毒素活性について調べた。クロマトグラフィーの分画の毒性をＭａｎｄｕｃａ　ｓｅｘｔａの幼虫を用いて生物学的アッセイで調べた。分画を直接昆虫の食餌（マイマイガ用コムギ麦芽餌、ＩＣＮ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ−ＩＣＮ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）に適用するか、または第４もしくは第５齢幼虫の第一前肢から５μｌのサンプルを３０ゲージ注射針を用いて血体腔注射によって投与した。処置群の各幼虫の体重は２４時間間隔で記録した。昆虫が摂食を停止し、処置した昆虫餌を消費し数日以内に死んだ場合、または分画を注射して２４時間以内に死んだ場合に毒性があったと推定した。
【００４４】
毒性分画を集め、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１００を用いて濃縮し、続いて７．５ｍｍ×６０ｃｍのＴＳＫ−ＧＥＬＧ−４０００ＳＷゲル透過カラムを用い１００ｍＭ燐酸カリウム（ｐＨ６．９）溶離液を０．４ｍｌ／分で流しながらＨＰＬＣで分析した。この分析によって、毒素タンパク質は約３３．６分の保持時間でカラムから溶出する単一のシャープなピークに含まれることが明らかにされた。この保持時間は概算分子量１０００ｋＤａに相当する。ピーク分画を更なる精製のために集め、一方このタンパク質を含まない分画は廃棄した。ＨＰＬＣから溶出したピークは２１８および２８０ｎｍでＵＶ光を吸収したが４０５ｎｍでは吸収しなかった。４０５ｎｍの吸収は、ゼノラブジン（ｘｅｎｏｒｈａｂｄｉｎ）抗生物質化合物の属性であることが示された。
集めたピーク分画の非変性アガロースゲル（Ｍｅｔａｐｈｏｒ　Ａｇａｒｏｓｅ，ＦＭＣ　ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）での電気泳動によって、２つのタンパク複合体が当該ピークに存在することが示された。このピーク材料（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で緩衝）を、１．５％アガロースの積載用ゲル（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で緩衝）および１．９％アガロースの解析用ゲル（２００ｍＭトリスーホウ酸塩（ｐＨ８．３）で緩衝）で標準的緩衝液条件（陽極緩衝液１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）；陰極緩衝液０．０２５Ｍトリス、０．１９２Ｍグリシン）下で分離した。フェノールレッドの追跡用色素がゲル端に達するまで、ゲルに１３ｍＡの定常電流を１５℃で流した。クマシーブリリアントブルー染色を用いて２本のタンパクバンドをアガロースゲルで可視化させた。
【００４５】
より遅く移動するバンドを”タンパクバンド１”と呼び、より速く移動するバンドを”タンパクバンド２”と呼んだ。２本のタンパクバンドはほぼ等量で存在した。クマシー染色アガロースゲルは、ゲルの未染色部分から２本のタンパクバンドを正確に切り出すためのガイドとして用いた。タンパクバンドを含む切り出した細片をふやかし、少量の滅菌水を加えた。コントロールとして、タンパク質を含まないゲルの一部分もまた切り出し、タンパク質を含むゲルと同じ態様で処理した。１００ｍＭトリス−ホウ酸塩（ｐＨ８．３）に１００ボルト（定常電圧）で２時間電気泳動してゲル片からタンパク質を回収した。また別に、タンパク質は、等容量の５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）をゲル片に加え、続いて３０℃で１６時間保温することによってゲル片から受動的に溶出させた。これによってタンパク質は緩衝液中に拡散させられ続いてこのタンパク質を採集した。
【００４６】
ＨＰＬＣ精製毒素（３３．６分ピーク）およびアガロースゲル精製毒素を用いた昆虫毒素テストの結果は抽出物の毒性を明示した。１．５μｇのＨＰＬＣ精製タンパク質の注射は２４時間以内の死亡をもたらした。アガロースから受動的溶出または電気泳動溶出で回収したタンパクバンド１および２は両方とも注射では致死的であった。これらのサンプルについての概算タンパク質濃度は５０ｎｇ／幼虫未満であった。タンパクバンド１または２を注射された幼虫群間での体重増加と死亡率の比較によって、タンパクバンド１は注射による送達ではより毒性が強いことが示された。
ＨＰＬＣ精製毒素を幼虫の餌に７．５μｇ／幼虫の濃度で適用したとき、幼虫の体重増加の停止をもたらした（調べた２４匹の幼虫で）。幼虫は摂食を始めたが、毒素処理餌の極めて少しの部分を消費した後、幼虫は毒素によって誘発された病理兆候を示し始め、摂食を停止した。昆虫の糞粒は変色し、大半の幼虫は下痢の症状を示した。７−１０日間にわたって餌にそれぞれ５μｇ毒素を適用したとき有意の死亡率が得られた。
【００４７】
アガロース分離タンパクバンド１は、２００ｎｇ／幼虫の投与量で顕著に幼虫の体重増加を抑制した。同様な濃度のタンパクバンド２を与えた幼虫では抑制されず、コントロールの幼虫と同じ率で体重は増加した。１２匹の幼虫には溶出タンパク質を与え、４５匹の幼虫にはタンパク質含有アガロース片を与えた。これら２組のデータは、タンパクバンド１はＭａｎｄｕｃａ　ｓｅｘｔａに対して経口的に毒性を有することを示した。この実験では、タンパクバンド２はＭａｎｄｕｃａ　ｓｅｘｔａには毒性をもたないようであった。
変性条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパクバンド１および２の更なる分析によって、各バンドはいくつかのより小さなタンパクサブユニットを含むことが示された。タンパク質をクマシーブリリアントブルー染色で可視化し、その後最大の感度を達成するために銀染色を施した。
【００４８】
２本のバンドのタンパクサブユニットは非常に類似していた。タンパクバンド１は８個のタンパクサブユニット（２５．１、５６．２、６０．８、６５．６、１６６、１７１、１８４および２０８ｋＤａ）を含む。タンパクバンド２は、２５．１、６０．８および６５．６ｋＤａタンパク質が存在しないという点を除いて同一のプロフィールを有していた。５６．２、６０．８、６５．６および１８４ｋＤａタンパク質がタンパクバンド１の複合体中にほぼ等しい濃度で存在し、当該複合体の全タンパク質含有量の８０％またはそれ以上を占めていた。
天然のＨＰＬＣ精製毒素をさらに以下のように性状を調べた。毒素は易熱性で、６０℃（２５０゜Ｆ）で１５分加熱した後、Ｍ．ｓｅｘｔａの幼虫に注射または餌として与えたとき死亡させまたは体重増加を抑制させるその能力を失った。リパーゼ、Ｃ型ホスホリパーゼ、ヌクレアーゼ、または赤血球細胞溶血活性を検出するためにアッセイをデザインし、精製毒素を用いて実施した。これらの活性のいずれも存在しなかった。抗生物質ゾーン抑制アッセイもまた実施した。精製毒素はグラム陰性もしくは陽性細菌、酵母または糸状菌の増殖を抑制することができなかった。このことはこの毒性はゼノラブジン抗生物質ではないことを示唆している。
天然のＨＰＬＣ精製毒素を、Ｍ．ｓｅｘｔａ以外の昆虫を殺す能力について調べた。表２では、この実験でＨＰＬＣ精製Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ毒素によって殺される昆虫が列挙されている。
【００４９】
【表３】
表２．Ｐ．　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ毒素により死亡する昆虫
2004089189.tif 000004
【００５０】
実施例２殺虫剤の効用
Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓの効用及び毒性を、更に特徴づけた。Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ（菌株Ｗ−１４）培養ブロスは、下記に従って調製した。生産培地は、ミリ−Ｑ（登録商標）脱イオン水を溶媒とする、２％バクト・プロテオース・ペプトン（登録商標）＃３（ＰＰ３、ディフコラボラトリー社、デトロイト、ミシガン）であった。播種培養フラスコは、デロング（Ｄｅｌｏｎｇ）首を備えた５００ｍｌの３枚板（ｔｒｉｂａｆｆｉｅ）フラスコ中の培地１７５ｍｌからなり、カプット（Ｋａｐｕｔ）で覆い、温度１２１℃（２５０゜Ｆ）で、２０分間高圧滅菌した。生産フラスコは、デロング首を備えた５００ｍｌの３枚仕切り板フラスコ中の２．８リットル中５０ｍｌからなり、シンエツ（Ｓｈｉｎｅｔｓｕ）シリコーンフォームクロージャーで覆った。これらは、温度１２１℃（２５０゜Ｆ）で、４５分間高圧滅菌した。播種培養は、振幅５．０８ｃｍ（２インチ）で旋回振盪しているインキュベーターにおいて、２８℃、１５０ｒｐｍでインキュベートした。１６時間増殖した後、この播種培地の１％を、該生産フラスコ中に入れ、収穫前に２４時間増殖した。毒素の産生は、対数増殖期に明らかであった。この微生物のブロスを、１リットルの遠心管に移し、かつ細胞バイオマスをペレットとした（４℃、２５００ｒｐｍで、３０分間［Ｒ．Ｃ．Ｆ．＝〜１６００］、ＨＧ−４ＬローターＲＣ３、ソルバル（Ｓｏｒｖａｌ）遠心機、ヂュポン社、ウィルミントン、デラウェア）。最初のブロスを、４℃で、８〜１６時間冷却し、少なくとも２時間再度遠心分離し（前述の条件）、放置時に沈殿したムコ多糖類と推定されるものを除去することによって、更にブロスを透明にした。（別の加工法は、両方の工程を組合わせ、かつ前述と同じ条件で、１６時間の透明化遠心分離を使用した。）。その後、このブロスを、バイオアッセイ又はろ過の前に、４℃で貯蔵した。
【００５１】
このブロスから精製されたＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロス及びタンパク質の毒素（複数）は、多くの昆虫に対して活性（死亡及び／又は成長阻害、羽化の低下）を示した。更に詳細に述べると、昆虫目のコレオプテラ（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）の一員である、ハムシモドキ（幼虫及び成虫）、コロラドジャガイモハムシ、及び芝の地虫（ｔｕｒｆ　ｇｒｕｂｓ）に対する活性が認められた。コレオプテラ目の他の一員は、コメツキムシ、花粉の甲虫（ｐｏｌｌｅｎ　ｂｅｅｔｌｅ）、トビハムシ、種子の甲虫（ｓｅｅｄ　ｂｅｅｔｌｅ）、及びゾウムシを含んだ。同様にホモプテラ（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ）目の一員である、アスターヨコバイに対する活性も認められた。ホモプテラ目の他の一員は、多くの宿主に特異的なアブラムシ種に加え、プラントヨコバイ（ｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ）、ヨーロッパナシキジラミ、リンゴサッカ（ａｐｐｌｅ　ｓｕｃｋｅｒ）、カイガラムシ、コナジラミ及びアワフキを含んだ。前述のブロス及び精製された分画も、同じくシロイチモンジヨウトウガ、イラクサキンウワバ、黒色ネキリムシ、タバコの芽食虫（ｂｕｄｗｏｒｍ）、ヨーロッパアワノメイガ、オオタバコガ及びヒメハマキに対して活性を示した。
【００５２】
この目の他の典型的一員は、イガ、インディアンミールモス（Ｉｎｄｉａｎ　ｍｅａｌｍｏｔｈ）、ハマキムシ、アオムシ、ワタキロバガ、ミノムシ、束部テンマクケムシ、芝のガ（ｓｏｄ　ｗｅｂｗｏｒｍ）、及びシロナガヤであった。活性は、ディプテラ（Ｄｉｐｔｅｒａ）目の一員であるミバエ及び力の幼虫に対しても認められた。ディプテラ目の他の一員は、エンドウのユスリカ、ニンジンのハエ、キャベツ根のハエ、キスジノハムシ、タマネギのハエ、ガガンボ、イエバエ及び各種の力種である。同じくフシアリ、オデロウスイエアリ（ｏｄｅｒｏｕｓ　ｈｏｕｓｅ　ａｎｔ）、及び小クロアリ（ｌｉｔｔｌｅ　ｂｌａｃｋａｎｔ）を含む目の一員である、オオアリ及びアルゼンチンアリ（Ａｒｇｅｎｔｉｎｅ　ａｎｔ）に対する活性も認められた。
【００５３】
前述のブロス／分画は、昆虫の個体数を減少するために有用であり、かつ昆虫の個体数を阻害する方法において使用した。この方法は、前述の活性物を、昆虫を不活性化するのに十分な量、昆虫の場所（ｌｏｃｕｓ）に塗布することを含むことができる。結果を表３に示した。
ハムシモドキ幼虫に対する活性を、下記の方法で試験した。Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓル培養ブロス（ろ過滅菌し、細胞を含まない）又は精製したＨＰＬＣ分画を、それぞれ、対照培地又は１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０に希釈した後の３０μｌアリコートを、人工飼料０．２５ｍｌの表面（〜１．５ｃｍ２）に、直接塗布した。この飼料プレートを、滅菌フローフード中で風乾し、かつこれらのウェルには、不稔卵からふ化した一匹の新生虫ディアブロティカ・ウンデシムプンクタタ・ホワルディ（ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ　ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎ　ｈｏｗａｒｄｉ）（南部ハムシモドキ、ＳＣＲ）、人工飼料で成長した第２齢のＳＣＲ、又はメトロミックス（登録商標）中で生育したトウモロコシ苗木で飼育した第２齢のディアブロティカ・ビルジフェラ・ビルジフェラ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ　ｖｉｒｇｉｆｅｒａ　ｖｉｒｕｇｉｆｅｒａ）（西部ハムシモドキ、ＷＣＲ）を群らがらせた。第２齢の幼虫は、飼料投与前に秤量した。これらのプレートに封をし、湿らせた生育用チャンバーに置き、適当な期間２７℃に保った（ＳＣＲ新生虫及び成虫については４日間、ＷＣＲ幼虫については２〜５日間、第２齢のＳＣＲについては７〜１４日間）。死亡率及び測定体重は、指示されたようにスコア化した。一般に、全ての試験において、１処置について１６匹の虫を使用した。対照の死亡率は、下記のものである：新生幼虫については＜５％、甲虫成虫については５％。
【００５４】
コロラドジャガイモハムシに対する活性を、下記の方法で試験した。Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロス又は対照培地を、２４ウェルの組織培養プレートのウェル中に保持された、標準人工飼料１．５ｍｌの表面（〜２．０ｃｍ２）に塗布した。各ウェルに、５０μｌの処置を行い、風乾した。次に、個々の第２齢のコロラドジャガイモハムシ（レプチノタルサ・デセムリネアタ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ　ｄｅｃｅｌｉｍｅａｔａ）、ＣＰＢ）幼虫を、この飼料の上に置き、かつ４日後の死亡率をスコア化した。全ての試験について、１処置につき１０匹の幼虫を用いた。対照の死亡率は３．３％であった。
マメコガネの地虫（Ｊａｐａｎｅｓｅ　ｂｅｅｔｌｅ　ｇｒｕｂ）及び甲虫に対する活性は、下記の方法で試験した。芝の地虫（ポピィア・ジャポニカ（Ｐｏｐｉｌｌｉａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）、第２〜３齢）を、群生した芝から採取し、実験室内で、土壌／ピート混合物で、追加食餌としてニンジンのスライスを与え、養った。芝の甲虫は、局所的なフェロモンで捕獲し（ｐｈｅｒｏｍｏｎｅ−ｔｒａｐｐｅｄ）、かつ実験室内では、プラスティックの容器で、食餌としてカエデの葉を与えて養った。未希釈のＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロス又は対照培地を、ハムシモドキの人工飼料（３０μｌ／１．５４ｃｍ２、甲虫）又はニンジンのスライス（幼虫）に塗布した後、両ステージを飼料ウェル中に単独で配置し、死亡率及び摂食を観察した。両方とも、摂食（及び糞排泄）量の明らかな減少が認められた。
【００５５】
カの幼虫に対する活性は、下記の方法で試験した。このアッセイは、９６個のウェルの微量滴定プレートで行った。各ウェルは、水溶液（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロス、対照培地又は水）２００μｌ、及び約２０匹の、１日齢の幼虫（アエデス・アエギプチ（Ａｅｄｅｓ　ａｅｇｙｐｔｉ））を含んだ。１処置につき６個のウェルを実施した。結果を、群生の２時間後に調べ、かつ３日間の観察期間にわたり変化しなかった。対照の死亡率は、調べなかった。
ミバエに対する活性を、下記の方法で調べた。購入したドロソフィア・メラノガステル（Ｄｒｏｓｏｐｈｉａ　ｍｅｇａｎｏｇａｓｔｅｒ）培地を、乾燥培地５０％、及び水、対照培地又はＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロスのいずれかの液体５０％を用いて調製した。これは、１処置につき３個の飼育バイアルの各々の中に、乾燥培地８．０ｍｌを入れ、及び適当な液体８．０ｍｌを加えることによって達成した。その後、１０日後期（ｌａｔｅ）齢のドロソフィア・メラノガステルのうじを、各バイアルに加えた。これらのバイアルは、室温で、天井に蛍光灯のついた実験用ベンチの中に置いた。さなぎ又は成虫の数を、暴露の３，７及び１０日後に測定した。ミバエさなぎ用飼料へのＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロスの混合物では、１０日目の羽化が、水又は対照培地（３％減少）と比べ、わずか（１７％）であるが有意の減少を示した。
【００５６】
アスターヨコバイに対する活性を、下記の方法で試験した。アスターヨコバイ（マクロステレス・セベリニ（Ｍａｃｒｏｓｔｅｌｅｓ　ｓｅｖｅｒｉｎｉ））に関する摂取アッセイは、外部と接触せずに、この活性物を摂取することができるようにデザインした。この活性物／”食品”溶液の容器は、３５×１０ｍｍのペトリ皿の底面の中央に２個の穴があるように製造した。５ｃｍ（２インチ）四方のパラフィルムＭ（登録商標）を、この皿の表面を覆うように置き、かつ”Ｏ”型リングでしっかり締めた。次に、２８．３ｇ（ｌｏｚ．）のプラスティックカップに、約７匹のヨコバイを群がらせ、このカップの頂上に前述の容器を配置し、パラフィルムをはずした。その後試験溶液を、穴を通じてこの容器に入れた。未希釈のＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロスを使用する試験においては、このブロス及び対照培地を、水に対して透析し、対照の死亡率を低下した。死亡率は、対照死亡率が２６．５％であった２日目について報告した。精製した分画（２００ｍｇタンパク質／ｍｌ）を使用する試験において、ショ糖の５％の最終濃度を、全ての処置において用い、アスターヨコバイの生存率を高めた。このアッセイは、照射間隔が１６／８である、２８℃で、相対湿度が７０％のふ化器において行った。このアッセイは、７２時間後の死亡率について等級付けした。対照の死亡率は、５．５％であった。
【００５７】
アルゼンチンアリに対する活性を、下記の方法で試験した。１００％Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロス、対照培地又は水の１．５ｍｌアリコートを、２．０ｍｌの透明なガラスバイアルにピペットで移した。これらのバイアルを、適当な処置で湿らせた歯科用綿芯で栓をした。各バイアルを、８〜１２匹のアルゼンチンアリ（リネピセマ・フミレ（ＬｉｎｅＰｉｔｈｅｆｍａ　ｈｕｍｉｌｅ））の成虫を入れた、個別の６０×１６ｍｍのペトリ皿に置いた。１処置にっいて３個を試験した。バイオアッセイプレートを、室温で、天井に蛍光灯がついた実験用ベンチに置いた。死亡率は、暴露の５日後に読み取った。対照の死亡率は、２４％であった。
【００５８】
オオアリに対する活性は、下記の方法で試験した。黒色オオアリの働きアリ（カンポノタス・ペンシルバニカス（Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ　ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓ））を、インディアナポリス（ＩＮ）のダウエランコ（ＤｏｗＥｌａｎｃｏ）農場の木から採取した。Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロスによる試験は、下記の方法で実施した。プラスティックのバイオアッセイ容器（１８．１ｃｍ×７．６ｃｍ（７１／８”×３”））の各々に、１５匹の働きアリ、紙製隠れ家、及びプラスティックの一口用グラスに入れたブロス又は対照１０ｍｌを置いた。一口用グラスのふたに開けた穴を通して、綿芯を伝って、アリに処置が届くようにした。全ての処置は、５％ショ糖を含んだ。バイオアッセイは、暗所、室温で行い、かつ１９日目に等級付けした。対照の死亡率は、９％であった。アリの人工飼料に利用したアッセイ用に送達する精製した分画は、前述の処置（精製した分画又は対照溶液）と、プラスティック試験管の中で、処置０．２ｍｌ／飼料２．０ｇの割合で混合した。精製された分画の最終的なタンパク質濃度は、１０１μｇ／飼料ｇ未満であった。１処置につきアリ１０匹、水、隠れ家及び処理した飼料を、封をしたプラスティック容器に入れ、かつ加湿したふ化器の中で、暗所、２７℃で養った。１０日目に、死亡率をスコア化した。対照の死亡率は調べなかった。
【００５９】
様々な鱗翅類の幼虫に対する活性を、下記の方法で試験した。Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロス又は精製した分画は、標準の人工飼料０．２５ｍｌの表面（〜１．５ｃｍ２）に、それぞれ対照培地又は１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．０のいずれかに希釈した後の３０μｌアリコートで、直接塗布した。これらの飼料プレートは、滅菌したフローフード中で風乾し、かつこれらのウェルに、１匹の新生幼虫を群がらせた。ヨーロッパアワノメイガ（オストリニア・ヌビラリス（Ｏｓｔｒｉｎｉａ　ｎｕｂｉｌａｌｉｓ））及びオオタバコガ（ヘリコベルパ・ゼア（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ　ｚｅａ））の卵は、商業的供給源から入手し、かつ社内でふ化したが、シロイチモンジョウトウガ（スポドプテラ・エキシグア（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｅｘｉｇｕａ））、イラクサキンウワバ（トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ））、タバコの芽食虫（ヘリオチス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓｖｉｒｅｓｃｅｎｓ））、ヒメハマキ（ラスペイレシア・ポモネラ（Ｌａｓｐｅｙｒｅｓｉａ　ｐｏｍｏｎｅｌｌａ））及び黒色ネキリムシ（アグロチス・イプシロン（Ａｇｒｏｔｉｓ　ｉｐｓｉｌｏｎ））の幼虫は、社内で調達した。幼虫を群がらせた後、飼料プレートに封をし、加湿した生育用チャンバーの中に置き、暗所、２７℃で、適当な期間養った。死亡率及び体重測定は、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロスについては５〜７日目に、及び精製した分画については４〜７日目に、スコア化した。一般に、全実験において、１処置につき昆虫１６匹を使用した。対照培地に関する対照死亡率は、４〜１２．５％の範囲であり、かつＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓバッファーに関しては１０％未満であった。
【００６０】
【表４】
表３．様々な昆虫目／種の死亡率及び成長阻害に対するＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ（菌株Ｗ−１４）培養ブロス及び精製した毒素分画の作用
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Ｍｏｒｔ＝　死亡率、Ｇ．Ｉ．＝成長阻害、ｎａ＝適用できず、ｎｔ＝試験せず、ａ．ｆ．＝抗摂食
【００６１】
実施例３　土壌への適用に関する殺虫剤の効用
Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ（菌株Ｗ−１４）培養ブロスを、土壌又は土壌混合物（メトロミックス（登録商標））に直接適用した場合の、ハムシモドキに対する活性を示した。メトロミックス（登録商標）中の新生ＳＣＲ及ＷＣＲに対する活性を、下記の方法で試験した（表４）。試験は、６日間、光をあてた、湿ったフィルターペーパー上で発芽した、トウモロコシの苗木（ユナイティッドアグリシード銘柄のＣＬ６１４）を用いて行った。根が約３〜６ｃｍに伸びた後、１個の穀粒／苗木を、乾燥メトロミックス（登録商標）５０ｇを入れた、５９１ｍｌの透明なプラスティックカップに、植えた。その後、２０匹の新生ＳＣＲ又はＷＣＲを、この苗木の根に直接置き、かつメトロミックス（登録商標）で覆った。群生する間に、この苗木に、希釈したブロス溶液全量５０ｍｌを散布（ｄｒｅｎｃｈ）した。散布した後、このカップに封をして、かつ明所、室温で、７日間放置した。その後、この苗木を洗浄し、メトロミックス（登録商標）を完全に除去し、根を切断して、秤量した。対照の根に対するトウモロコシ根の残存率、及び摂食によって引き起こされた葉の損傷について、活性を等級付けした。葉の損傷は、目で見てスコア化し、かつ−、＋、＋＋、又は＋＋＋のいずれかに等級付けし、損傷のないものを−、及び重度の損傷を＋＋＋で表した。
【００６２】
土壌中の新生ＳＣＲに対する活性を、下記の方法て試験した（表５）。この試験は、６日間、光をあてた、湿ったフィルターペーパー上で発芽した、トウモロコシの苗木（ユナイティッドアグリシード銘柄のＣＬ６１４）を用いて行った。根が約３〜６ｃｍに伸びた後、１個の穀粒／苗木を、レバノン（ＩＮ）の前年トウモロコシを栽培した畑から採取した土壌１５０ｇを入れた、５９１ｍｌの透明なプラスティックカップに、植えた。この土壌は、それまで殺虫剤処理を行っていない。２０匹の新生ＳＣＲを、この苗木の根に直接置き、かつ土壌で覆った。群生後に、この苗木に、希釈したブロス溶液全量５０ｍｌを散布した。散布した後、封をしないカップを、相対湿度が高い（８０％）チャンバーで、２５℃（７８゜Ｆ）でインキュベートした。その後、この苗木を洗浄し、土壌を完全に除去し、根を切断して、秤量した。対照の根に対するトウモロコシ根の残存率、及び摂食によって引き起こされた葉の損傷について、活性を等級付けした。葉の損傷は、目で見てスコア化し、かつ−、＋、＋＋、又は＋＋＋に等級付けし、損傷のないものを−、及び重度の損傷を＋＋＋で表した。
【００６３】
【表５】
表４．群生後に散布した後のハムシモドキに対するＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ（菌株Ｗ−１４）培養ブロスの作用（メトロミックス（登録商標））
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【００６４】
【表６】
表５．群生後に散布した後のハムシモドキに対するＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ（菌株Ｗ−１４）培養ブロスの作用（土壌）
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【００６５】
Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ（菌株Ｗ−１４）培養ブロスの、メトロミックス（登録商標）中の第２齢の芝の地虫に対する活性を、下記の方法で行った試験で観察した（表６）。５９１ｍｌの透明なプラスティックカップに、乾燥メトロミックス（登録商標）約５０ｇを入れた。その後このメトロミックス（登録商標）を、５０容量％希釈したＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓブロス溶液全量５０ｍｌを散布した。粗ブロスの希釈は、水で行い、５０％ブロスは、粗ブロス２５ｍｌに、水２５ｍｌを加えて、総量５０ｍｌとした。
通常の培地濃度を５０％希釈したものである、プロテオースペプトン＃３（ＰＰ３）の１重量／容量％溶液を、ブロス対照として使用した。散布した後、５匹の第２齢の芝地虫を、湿らせたメトロミックス（登録商標）の表面に置いた。元気な芝地虫の幼虫は、メトロミックス（登録商標）の中に、即座に穴を掘って潜り込んだ。
１時間以内に穴を掘って潜らなかった幼虫は、除外し、新たな幼虫と交換した。
このカップに封をして、かつ暗所、２８℃のふ化器に入れた。７日後、メトロミックス（登録商標）から幼虫を取り出し、死亡率をスコア化した。活性は、対照に対する死亡率の割合で示した。
【００６６】
【表７】
表６．群生前に散布した後の芝の地虫に対するＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ（菌株Ｗ−１　４）培養ブロスの作用（メトロミックス（登録商標））
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＊は、幼虫の死亡／生存の比を示す。
【００６７】
実施例４　葉への適用に関する殺虫剤の効用
Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓブロスのヨーロッパアワノメイガに対する活性を、ブロスをトウモロコシの葉の表面に直接塗布した場合について調べた（表７）。このアッセイにおいて、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓブロスを、培養培地で１００倍希釈し、かつ切り採ったトウモロコシの葉の表面に、葉表面の〜６．０μｌ／ｃｍ２の割合で、手で塗布した。これらの葉を、風乾し、等しい大きさの細片（約５×５ｃｍ（約２×２インチ））に切断した。これらの葉を丸め、ペーパークリップで固定し、底面に２％寒天を０．６３ｃｍ（０．２５インチ）入れた、２８ｇ（ｌｏｚ）の一口用プラスチックグラスの中に置き、湿らせた。その後、新生ヨーロッパアワノメイガ１２匹を、前述の丸めた葉の上に置き、カップに封をした。５日間、暗所、２７℃でインキュベートした後、これらの試料を、摂食による損傷及び回収された幼虫について、スコア化した。
【００６８】
【表８】
表７．切り採ったトウモロコシ葉に群生前に塗布した後のヨーロッパアワノメイガに対するＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ（菌株Ｗ−１４）培養ブロスの作用
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【００６９】
新生タバコの芽食虫（ヘリオチス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ））に対する前述の培養ブロスの活性を、葉の浸漬法を用いて明らかにした。新鮮な綿の葉を、植物から切り採り、かつ葉のディスクを、１８．５ｍｍのコルクの穴あけ器で切断した。このディスクを、対照培地（ＰＰ３）、又は１０ｋＤａフィルターを備えたアミコン社（ビバリー、ＭＡ）のプロフラックスＭ１２接線方向のろ過システムを用いて、約１０倍に濃縮したＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ（菌株Ｗ−１４）培養ブロスに、個々に浸漬した。過剰な液体を取り除き、かつ真っ直ぐにしたペーパークリップで、該ディスクの中心を貫通させた。その後、このペーパークリップを、１％寒天を２．０ｍｌ含む２８ｇ（ｌｏｚ）の一口用プラスチックグラスの中に、打ち込んだ。これは、葉が寒天の上方に吊り下げられた状態にした。この葉ディスクを乾燥した後、１匹の新生タバコのハマキガの幼虫を、該ディスクの上に置き、カップに蓋をした。その後このカップを、ポリ袋内に入れ封をし、かつ暗所、２７℃のふ化器に、５日間放置した。この時点で、残っている幼虫及び葉材料を秤量し、葉の損傷を測定した（表８）。
【００７０】
【表９】
表８．綿葉の浸漬アッセイにおけるタバコの芽食虫に対するＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ（菌株Ｗ−１４）培養ブロスの作用
2004089189.tif 000010
【００７１】
実施例５　パートＡ
毒素ペプチド成分の特徴
引き続き行われた分析において、実施例１で単離されたバンドの毒素タンパク質のサブユニットを、３０：０．８の比（アクリルアミド：ＢＩＳ−アクリルアミド）の７％ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動ゲル上で分解した。このゲルマトリックスは、比較的大きいタンパク質の分解をより容易にする。実施例１において、バンド１及びバンド２のサブユニットの分子量を推定するのに用いたゲルシステムは、３８：０．１８の比（アクリルアミド：ＢＩＳ−アクリルアミド）の１８％ゲルであり、これは、広範な領域で大きさによる分離ができるが、高分子量成分については、分解能が低い。
【００７２】
この分析においては、８個ではなく１０個のタンパク質バンドに分解された。表９は、１０個の分解されたバンドの計算上の分子量を示し、かつこれらの条件下で推定された分子量を、先の実施例の分子量と直接比較している。追加のバンドが、本実施例で使用された異なる分離条件下で検出されたことは、驚くべきことではない。前述の分子量推定値及び新たな推定値の間の変動も、分解条件の差異によってもたらされたと予想される。本実施例の分析において、改善された分解能の結果、比較的大きい分子量の推定値は、実施例１よりもより正確であると考えられる。しかしながら、これらは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を基に推定され、この方法は典型的には分析としては正確ではなく、かつペプチドの推定値をもたらし、かつこれは、翻訳後修飾又は翻訳時修飾のために、更に代わり得る。
【００７３】
アミノ酸配列は、１０個の分解されたペプチド中の５個のＮ−末端について決定した。表９は、これらのタンパク質の分子量及び同定された配列を、相互に関連付けている。配列番号２において、ある分析は、５位のプロリン残基は、アスパラギン（ａｓｎ）でありうることを示した。配列番号３において、ある分析は、１３及び１４位のアミノ酸残基は、いずれもアルギニン（ａｒｇ）であることを示した。配列番号４において、ある分析は、６位のアミノ酸残基は、アラニン（ａｌａ）又はセリン（ｓｅｒ）のいずれかであることを示した。配列番号５において、ある分析は、３位のアミノ酸残基は、アスパラギン酸（ａｓｐ）であることを示した。
【００７４】
【表１０】
表９．
2004089189.tif 000011
＊新たな推定値は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを基にしたもので、遺伝子配列を基にしたものではない。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、分析としては正確ではない。
【００７５】
実施例５、パートＢ
毒素ペプチド成分の特徴
新たなＮ−末端配列である配列番号１５、Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｔｈｒは、前記実施例５パートＡにおいて説明された天然のＨＰＬＣで精製された毒素から単離されたペプチドを更にＮ−末端配列決定することによって得られた。ＴｃａＡｉｉと称されるこのペプチドは、２５４位に始まり、かつ４９１位に至り、ここでＴｃａＡｉｉペプチドは、配列番号４を開始する。遺伝子配列を基にして推定されたこのペプチドの大きさは、２５，２４０Ｄａである。
【００７６】
実施例６　毒素ペプチド成分の特徴
更に別の分析において、この毒素タンパク質複合体は、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓの増殖培地（ツイーンを含まずに培養した後）から、１０〜８０％の硫酸アンモニウムにより沈殿させ、その後のイオン交換クロマトグラフィー工程（モノＱ）及び２種の分子サイジングクロマトグラフィー工程により、再び単離した。これらの条件は、実施例１で使用したものと類似していた。最初の分子サイジング工程において、第二の生物学的活性のピークは、約１００±１０ｋＤａに認められた。タンパク質測定を基に、この分画は、約８６０±１００ｋＤａ（天然）のより大きい、又は第一の活性ピークよりも、２０〜５０倍活性が低かった。この単離実験の間に、出発時の生物学的活性のかなりの部分を保持した約３２５±５０ｋＤａのより小さい活性ピークも、分解された。この３２５ｋＤａのピークは、前述の８６０ｋＤａのピークに、関連、もしくは由来したと考えられた。
【００７７】
この分析においては、５６ｋＤａタンパク質が分解された。このタンパク質のＮ−末端配列を、配列番号６に示した。注目すべきは、このタンパク質が、配列番号５のＮ−末端と、著しい同一性及び保存性を共有することであり、これは、これら２種が、ある遺伝子ファミリーの別個の一員によってコードされ得ること、及び各遺伝子によって産生されたタンパク質が、この殺虫性毒素複合体において両方を操作することができるように十分類似していることを示唆している。
二番目に顕著な１８５ｋＤａタンパク質は、表９のタンパク質３と同等の量、一貫して存在するので、これは同じタンパク質又はタンパク質断片であろう。この１８５ｋＤａタンパク質のＮ−末端は、配列番号７に示した。
【００７８】
追加のＮ−末端アミノ酸配列のデータが、同じく単離されたタンパク質から得られた。決定されたＮ−末端配列はいずれも、表９で同定されたタンパク質とは一致しなかった。他のタンパク質が、単離された調製物中に存在した。このようなタンパク質の１種は、推定分子量が１０８ｋＤａであり、かつ配列番号８に示したＮ−末端配列を有した。二番目のこのようなタンパク質は、推定分子量が８０ｋＤａであり、かつ配列番号９に示したＮ−末端配列を有した。
ほぼ３２５ｋＤａに活性ピークを伴うこのタンパク質物質を、大きさで分析すると、ほぼ５１、３１、２８及び２２ｋＤａのバンドが認められた。いずれも分子量を電気泳動の移動度で決定したので、これらの分子量は、バッファーのイオン強度の差、電気泳動の電位差などに起因した誤差作用を受けた。当業者は、明確な分子量値は、これらの標準的方法を用いては決定することができないこと、及び各々が変動をうけやすいことを、理解するであろう。このような大きさのタンパク質は、より大きい最初の毒素複合体において認められた、より大きいタンパク質種（約２００ｋＤａの大きさ）の分解産物であると仮定された。
【００７９】
最後に、いくつかの調製物は、配列番号１０に示されたＮ−末端配列を有するタンパク質を含んでいた。この配列は、巨大なタンパク質複合体の構造形成機能が知られている補助（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ）タンパク質である、公知のシャペロニンタンパク質との相同性が強かった。本出願人は、このような構造形成機能か、配列番号１０に同定されたタンパク質に起因するとはみなさないが、これは、その構造形成にシャペロンタンパク質が関連しているような、説明された毒素タンパク質複合体の存在と矛盾しない。更に、このようなタンパク質は、毒性を有することが直接示唆されることはないが、このタンパク質にとって、タンパク質毒素全体の構造的性質を決定することは重要であり、その結果、経口的デリバリー後のｉｎ　ｖｉｖｏにおける、該複合体の毒性又は耐用度に貢献するであろう。
引き続きプロテイナーゼＫに対する該タンパク質毒素複合体の安定性の分析を行った。該複合体を、プロテイナーゼＫが１０倍モル過剰量存在する条件で、２４時間インキュベートした後、活性はほとんど失活した（経口投与の死亡率は、約５％に低下した。）ことが結論づけられた。これらのデータは、前述の毒素がタンパク質性であることを裏付けている。
この毒性は、更に透析膜によっても保持され、天然の毒素複合体の大きさが大きいことが再度裏付けられた。
【００８０】
実施例７　Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ毒素の単離、特徴及び部分的アミノ酸配列決定単離及びＮ−末端アミノ酸配列決定：
実施例５及び６に平行して行われた１組の実験において、典型的には２〜３リットルのＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓブロスに、最終濃度が１０又は２０％のいずれかになるように結晶硫酸アンモニウムをゆっくり添加し調節することによって、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓタンパク質の硫酸アンモニウム沈殿を行った。４℃で１時間攪拌した後、この材料を１２，０００×ｇで、３０分間遠心分離した。上清を８０％硫酸アンモニウムで調節し、４℃で１時間攪拌し、かつ１２，０００×ｇで、６０分間遠心分離した。このペレットを、その容量の１／１０量の１０ｍＭ　Ｎａ２ＰＯ４、ｐＨ７．０中で再懸濁し、同じリン酸バッファーで、４℃で一晩透析した。透析された材料を、１２，０００×ｇで、１時間遠心分離し、イオン交換クロマトグラフィーにかけた。
【００８１】
ＨＲ　１６／５０　Ｑセファロース（ファルマシア社）陰イオン交換カラムを、１０ｍＭ　Ｎａ２ＰＯ４、ｐＨ７．０で平衡にした。遠心分離し、透析した硫酸アンモニウムペレットを、このＱセファロースカラムに、１．５ｍｌ／分の速度で加え、かつ光学濃度（Ｏ．Ｄ．２８０）が０．１００未満に達するまで、平衡化バッファーを、３．０ｍｌ／分で大量に流し洗浄した。次に、６０分間かけて、０から０．５ＭまでのＮａＣｌ勾配を３ｍｌ／分で、もしくは６０分間にわたり、０．１Ｍ、０．４Ｍ及び最後は１．０ＭのＮａＣｌを用いる一連の溶出工程のいずれかを、各々該カラムに流した。分画を収集し、セントリプレップ（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ）１００を用いて濃縮した。あるいは、タンパク質を、０．１Ｍ　ＮａＣｌで溶出せずに、単一の０．４Ｍ　ＮａＣｌ洗浄液で溶出することができる。
【００８２】
濃縮したＱセファロースの２ｍｌアリコート試料を、１０ｍＭ　Ｎａ２ＰＯ４、ｐＨ７．０で平衡にしたＨＲ　１６／５０スペロース１２（ファルマシア社）ゲルろ過カラム上に、０．５ｍｌ／分で加えた。このカラムを、同じバッファーで、２４０分間、０．５ｍｌ／分で洗浄し、かつ２分間ずつ試料を収集した。間隙容量の物質を収集し、かつセントリプレップ１００を用いて濃縮した。濃縮したスペロース１２の試料の２ｍｌのアリコートを、１０ｍＭ　Ｎａ２ＰＯ４、ｐＨ７．０で平衡にしたＨＲ　１６／５０セファロース４Ｂ−ＣＬ（ファルマシア社）ゲルろ過カラム上に、０．５ｍｌ／分で加えた。このカラムを、同じバッファーで、０．５ｍｌ／分で、２４０分間洗浄し、２分間ずつ試料を収集した。
【００８３】
溶出されたタンパク質のピークを、セファロースＣＬ−４Ｂ樹脂を使用したゲルろ過カラムに適用することによって、２回目の分画を施し、〜３０ｋＤａから１０００ｋＤａの範囲のタンパク質を分離した。この分画を、２種のピークについて分解し；小さいピークが間隙容量（＞１０００ｋＤａ）で、及び大きいピークが、見かけの分子量約８６０ｋＤａで溶出した。１週間以上、連続的に試料をゲルろ過に晒したところ、前述の大きいピークから生じるように見え、おそらく限定的タンパク質分解によると思われる、第三のピーク（約３２５ｋＤａ）の段階的出現が認められた。これらの３種のピークに関して行ったバイオッセイは、この間隙ピークは活性を持たないが、８６０ｋＤａの毒素複合体が高い活性を有し、かつ３２５ｋＤａのピークは、かなり可能性はあるが、より活性が少ないことを示した。異なる発酵生成物に由来するセファロースＣＬ−４Ｂの毒素複合体のピークのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、”Ｐ”及び”Ｓ”と称される、２種の異なるペプチドパターンを明らかにした。これら２種のパターンは、分子量、及びそれらの分画中のペプチド成分濃度の差が際立っていた。”Ｓ”パターンは、最も頻繁に産生され、４個の高分子量ペプチド（＞１５０ｋＤａ）を有する一方で、”Ｐ”パターンは、３個の高分子量ペプチドを有した。これに加え、”Ｓ”ペプチド分画は、ヨーロッパアワノメイガに対して、２〜３倍より強い活性が認められた。この偏りは、接種の虫齢及び／又は年数を経た培養（ａｇｅｄｃｕｌｔｕｒｅ）の増殖因子を基にした他の因子に起因した、タンパク質発現の変動に関連するであろう。
【００８４】
”Ｐ”及び”Ｓ”ペプチドパターンと定義されたピーク毒素複合体分画のミリグラム量に、分取的ＳＤＳ−ＰＡＧＥを施し、かつトリスーグリシン（セプラバフ（登録商標））で、ＰＶＤＦ膜（プロブロット（登録商標）、アプライドバイオシステム社）に、３〜４時間かけて、ブロットを写し取った。ブロットは、アミノ酸分析及びＮ−末端アミノ酸配列決定のために、それぞれ、ハーバードマイクロケム社及びケンブリッジプロケム社に送った。”Ｓ”パターン中の３種のペプチドは、前述の例において同定された配列と比較して、独特のＮ−末端アミノ酸配列を有した。下記配列番号１３で説明された２０１ＫＤａ（ＴｃｄＡｉｉ）ペプチドは、配列番号１（ＴｃｂＡｉｉ）と、３３％のアミノ酸同一性及び５０％の類似性を共有した（表１０、表１０において縦の線は、アミノ酸の同一性を示し、かつ点線はアミノ酸の同類置換を意味した。）。
【００８５】
配列番号１４の１９７ｋＤａの第二のペプチド（ＴｃｄＢ）は、配列番２（ＴｃａＣ）と、４２％の同一性及び５８％の相同性を有した。更に、第三のペプチド２０５ｋＤａは、ＴｃｄＡｉｉを意味した。これに加え、限定されたＮ−末端アミノ酸配列である配列番号１６（ＴｃｂＡ）は、少なくとも２３５ｋＤａのペプチドであるが、これはクローン化された配列番号１１の遺伝子（ｔｃｂＡ）から推定された、配列番号１２のアミノ酸配列と、相同性が同じであり、配列番号１（ＴｃｂＡｉｉ）に相当する推定されたアミノ酸配列を有した。これは、より大きい２３５＋ｋＤａペプチドが、発酵時に、タンパク質分解的に、２０１ｋＤａペプチド（ＴｃｂＡｉｉ）（配列番号１）へと処理され、おそらく該分子の活性化を生じることを示している。更に別の配列において、前述の実施例５で報告された配列番号５（ＴｃａＢｉｉ）として最初に報告された配列は、３位に、グリシン（Ｇｌｙ）ではなくアスパラギン酸残基（Ａｓｐ）を、並びに８及び９位に、それぞれ、２個の追加のアミノ酸Ｇｌｙ及びＡｓｐを含むことがわかった。更に別の２種の配列、配列番号２（ＴｃａＣ）及び配列番号３（ＴｃａＢｉ）においては、追加のアミノ酸配列が得られた。Ｎ−末端分析に送られた”Ｓ”調製物と同一である試料を用いて、デンシトメーターによる定量を行った。この分析は、２０１ｋＤａ及び１９７ｋＤａペプチドが、それぞれ、”Ｓ”パターン中のクマーシーブリリアントブルーで染色されたタンパク質全体の７．０％及び７．２％であり、かつ他の豊富なペプチドに匹敵する量で存在することを示した。これらのペプチドが、他の細菌性毒素、例えば様々なＣｒｙｌ　Ｂｔ毒素などで認められた状況に対し、タンパク質相同体、類似体を表すことが推測された。これらのタンパク質は、そのＮ−末端アミノ酸配列で、４０〜９０％相同性が変動し、これは毒性断片を包含している。
【００８６】
内部アミノ酸配列決定：毒素ペプチド遺伝子のクローニングを促進するために、選択されたペプチドの内部アミノ酸配列を、下記の方法で得た。”Ｐ”又は”Ｓ”ペプチドパターンであると決定されたピーク２Ａ分画のミリグラム量に、分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥを施し、かつトリス−グリシン（セプラバフ（登録商標））で、ＰＶＤＦ膜（プロブロット（登録商標）、アプライドバイオシステム社）に、３〜４時間かけて、ブロットを写しとった。ブロットは、アミノ酸分析及びＮ−末端アミノ酸配列決定のために、それぞれ、ハーバードマイクロケム社及びケンブリッジプロケム社に送った。ＴｃｂＡｉｉ（配列番号１を含む）、ＴｃｄＡｉｉ及びＴｃａＢｉ（配列番号３を含む）と称される３種のペプチドに、ハーバードマイクロケム社でトリプシン消化を施し、その後ＨＰＣＬクロマトグラフィーで、個々のペプチドを分離した。Ｎ−末端アミノ酸分析は、選択されたトリプシンペプチド断片について行った。ペプチドＴｃａＢｉ（２０５ｋＤａペプチド）について配列決定された、２個の内部ペプチドは、ＴｃａＢｉ−ＰＴ１１１（配列番号１７）及びＴｃａＢｉ−ＰＴ７９（配列番号１８）と称される。ペプチドＴｃａＢｉ（６８ｋＤａペプチド）について配列決定された、２種の内部ペプチドは、ＴｃａＢｉ−ＰＴ１５８（配列番号１９）及びＴｃａＢｉ−ＰＴ１０８（配列番号２０）と称される。ペプチドＴｃｂＡｉｉ（２０１ｋＤａペプチド）について配列決定された、４種の内部ペプチドは、ＴｃｂＡｉｉ−ＰＴ１０３（配列番号２１）、ＴｃｂＡｉｉ−ＰＴ５６（配列番号２２）、ＴｃｂＡｉｉ−ＰＴ８１（ａ）（配列番号２３）、及びＴｃｂＡｉｉ−ＰＴ８１（ｂ）（配列番号２４）と称される。
【００８７】
【表１１】
表１０．
2004089189.tif 000012
【００８８】
実施例８Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓＷ−１４ゲノムＤＮＡのコスミドライブラリーの作製、及び毒性タンパク質調製物を含むペプチドをコードしている遺伝子を単離するためのスクリーニング
異種宿主における、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓの昆虫毒性タンパク質の生成、及び他の使用のための必須条件として、これらのペプチドをコードしている遺伝子を、単離し、かつ特徴づけることが必要である。この目的は、平行して詳細に調べられる。ひとつの方法では、後述するように、その後発現ライブラリーからのクローンの単離に使用されるような、精製された毒素に対して生じた、モノクローナル及びポリクローナル抗体の使用を基にしている。別の方法は、本実施例において説明したように、ＰＣＲ増幅に使用するための縮重オリゴヌクレオチドを設計するための、Ｎ−末端及び内部のアミノ酸配列データの使用を基にしている。いずれの方法も、各遺伝子の単離、及びそれらのＤＮＡ塩基配列の決定を可能にするために、該ペプチドをコードしている遺伝子を含むＤＮＡクローンの同定に使用することができる。
【００８９】
ゲノムＤＮＡの単離：Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓの菌株Ｗ−１４（ＡＴＣＣ寄託番号５５３９７）を、２％プロテオースペプトン＃３寒天（ディフコラボラトリー社、デトロイト、ＭＩ）上で増殖し、かつ殺虫性毒素の受容能（ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ）を、前記実施例１の方法を用いて、通過後に反復されたバイオアッセイにより維持した。振盪培養物５０ｍｌを、２％プロテオースペプトン＃３培地を含む、１７５ｍｌの仕切り付きフラスコ中で作製し、２８℃かつ１５０ｒｐｍで、約２４時間増殖した。この培養物１５ｍｌをペレット化し、かつＤＮＡ単離のために解凍するまで、その培地中で、−２０℃で凍結した。この解凍した培養物を、遠心分離し（７００×ｇ、３０分間）、かつ浮遊しているオレンジ色のムコ多糖物質を除去した。残りの細胞物質を、遠心分離し（２５，０００×ｇ、１５分間）、細菌細胞をペレット化し、かつこの培地を取り除いた。
【００９０】
分子生物学における最近のプロトコール（Ａｕｓｂｅｌらの編集、ジョン・ウィリー・ソン社（１９９４））の２．４．１節に記載されたＣＴＡＢ法を適用して、ゲノムＤＮＡを単離した（塩ショック（ｓａｌｔ　ｓｈｏｃｋ）を含み、及び全ての容量を１０倍に増量した点を変更した。）。ペレット化した細菌細胞を、ＴＦバッファー（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中で再懸濁し、最終容量を１０ｍｌにし、その後５Ｍ　ＮａＣｌを１２ｍｌ添加し；この混合物を、１５，０００×ｇで、２０分間遠心分離した。得られたペレットを、ＴＥ　５．７ｍｌ中で再懸濁し、かつこの懸濁液に、１０％ＳＤＳ　３００ｍｌ及び２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ　６０ｍｌ（ギブコＢＲＴプロダクツ社、グランド・アイランド、；滅菌蒸留水を溶媒とする）を添加した。この混合物を、３７℃で１時間インキュベートし；その後、リゾチーム１０ｍｇ（ウォーシングトン・バイオケミカル社、フリーホールド、ＮＪ）を添加した。添加の４５分後に、５Ｍ　ＮａＣｌ　１ｍｌ及びＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液８００ｍｌ（１０重量／容量％ＣＡＴＢ及び０．７Ｍ　ＮａＣｌ）を添加した。この調製物を、６５℃で１０分間インキュベートし、次に緩やかに攪拌し、更にインキュベートし、かつ約２０分間攪拌し、細胞物質が透明化するのを補助した。クロロホルム／イソアミルアルコール溶液（２４：１、容量／容量）を等量添加し、緩徐に混合し、かつ遠心分離した。等量のＰＣＩ（フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール、５０：４９：１、容量／容量／容量、１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で平衡にした；インターマウンティンサイエンティフィック社、カイスビル、ＵＴ）で２回抽出した後、このＤＮＡを、イソプロパノール０．６容量で沈殿した。
【００９１】
このＤＮＡ沈殿物を、ガラス棒でゆっくり取り出し、７０％エタノールで２回洗浄し、乾燥し、かつ２ｍｌ　ＳＴＥ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に溶解した。この調製物は、２６０ｎｍで光学濃度を測定したところ（すなわちＯＤ２６０）、ＤＮＡを２．５ｍｇ／ｍｌ含有していた。
この単離されたゲノムＤＮＡの分子の大きさの範囲は、ライブラリーの作製に適すると評価した。ＣＨＥＦゲル分析を、パルスウェーブ７６０変換器を備えたバイラドＣＨＥＦ−ＤＲ　ＩＩ装置（バイオラドラボラトリー社、リッチモンド、ＣＡ）上で、０．５×ＴＢＥバッファー（４４．５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、４４．５ｍＭ　Ｈ３ＢＯ３、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）を用い、１．５％アガロース（シーケム（登録商標）ＬＥ、ＦＭＣバイオプロダクツ社、ロックランド、ＭＥ）ゲル中で行った。この操作パラメーターは：初期Ａ時間、３秒；最終Ａ時間、１２秒；２００ボルト；操作温度、４〜１８℃；操作時間、１６．５時間であった。臭化エチジウムで染色し、紫外線下でこのゲルを検査し、このＤＮＡの大きさが３０〜２５０ｋｂｐの範囲であることが示された。
【００９２】
ライブラリーの作製：このＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓゲノムＤＮＡ調製物を、部分的Ｓａｕ３Ａ　１で消化した。この方法は、Ａｕｓｂｅｌ（前掲）の３．１．３節に基づいた。ほとんど最適の結果が得られるまで、様々な条件下で、より小さい規模で反応を実行することで適合させた。様々な条件で、規模拡大したいくつかの大量反応を行い、結果を、ＣＨＥＦゲル上で分析し、かつ最良の大規模調製物のみについて、先に進めた。最適な場合、ＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓゲノムＤＮＡ２００μｌを、Ｓａｕ３Ａ　１（ニューイングランド・バイオラボ社、”ＮＥＢ”、ビバリー、ＭＡ）１．５ユニットと共に、全量２ｍｌの１Ｘ　ＮＥＢ４バッファー（該製造業者から１０×で供給）中で、３７℃で、１５分間、インキュベートした。この反応を、ＰＣＩ　２ｍｌを添加することによって停止し、かつ８０００×ｇで１０分間、遠心分離した。上清に、５Ｍ　ＮａＣｌを２００μｌと、氷冷したエタノール６ｍｌを添加した。この調製物を、−２０℃で３０分間冷却し、その後１２，０００×ｇで１５分間、遠心分離した。上清を除去し、かつ沈殿を４０℃の真空炉で乾燥し、その後ＳＴＥ　４００μｌに再懸濁した。
【００９３】
分光光度学的アッセイは、投入したＤＮＡの約４０％を回収したことを示した。消化されたＤＮＡは、ＣＰＭＢの５．３．２節（前掲）に従い、ショ糖密度勾配上で大きさで分画した。１０％から４０％（重量／容量）の直線状のショ糖密度勾配を、ウルトラ−クリアー（登録商標）チューブ（ベックマンインスツルメンツ社、パロアルト、ＣＡ）中で、勾配作製器を用いて調製し、かつ該ＤＮＡ試料を、最上部に乗せた。遠心分離（２６，０００ｒｐｍ、１７時間、ベックマンＳＷ４１ローター、２０℃）後、分画（約７５０μｌ）を、この勾配の最上部から採取し、かつＣＨＥＦゲル電気泳動（前述）で分析した。大きさが２０〜４０ｋｂｐのＳａｕ３Ａ　１断片を含有する分画を選択し、かつＡｕｓｂｅｌ（前掲）の５．３．３節の方法を変更して（全ての溶液の量を、約６．３倍に増量）、ＤＮＡを沈殿した。一晩沈殿した後、ＤＮＡを、遠心分離（１７，０００×ｇ、１５分間）により収集し、乾燥し、ＴＥに再度溶解し、最終容積８０μｌとし、かつ３Ｍ酢酸ナトリウム８μｌ及びエタノール２２０μｌを添加して、再沈殿した。前述の遠心分離により収集されたペレットを、ＴＥ　１２μｌ中で再懸濁した。ＤＮＡ濃度を、ホウファ−ＴＫ０１００蛍光光度計（ホウファーサイエンティフィックインスツルメンツ社、サンフランシスコ、ＣＡ）を用いて、ヘキスト３３２５８染料（ポリサイエンス社、ワーリントン、ＰＡ）蛍光定量法で測定した。大きさで分画されたＤＮＡの約２．５μｌが、回収された。
【００９４】
コスミドｐＷＥ１５　ＤＮＡ（ストラータジーン社、ラホラ、ＣＡ）３０μｇを、制限酵素ＢａｍＨ　１（ＮＥＢ）１００ユニットで、製造業者のバッファー（最終容量が２００μｌ、３７℃、１時間）を溶媒として、完全に消化した。この反応物を、ＰＣＩ　１００μｌで抽出し、かつＤＮＡを、３Ｍ酢酸ナトリウム及び−２０℃の無水エタノール５５０μｌを添加することによって、水相から沈殿した。−７０℃で２０分間放置した後、このＤＮＡを、遠心分離（１７，０００×ｇ、１５分間）により収集し、真空で乾燥し、かつ１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１８０μｌに溶解した。これに、１０×ＣＩＰバッファー（１００ｍｌトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３；１０ｍＭ　ＺｎＣｌ２；１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２）２０μｌを添加し、かつ１：４に希釈した仔ウシの腸のアルカリホスファターゼ（ベーリンガーマンハイム社、インディアナポリス、ＩＮ）１μｌ（０．２５ユニット）を添加した。３７℃で３０分放置後、下記を添加し：０．５Ｍ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８．０を２μｌ；１０％ＳＤＳを１０μｌ；２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（前述）を０．５μｌであり、引き続き５５℃で３０分間インキュベートした。ＰＣＩ　１００μｌ及びフェノール（インターマウンティンサイエンティフィック社、１Ｍトリス−ＨＣｌで平衡化、ｐＨ８．０）１００μｌで連続抽出した後、脱リン酸化したＤＮＡを、７．５Ｍ酢酸アンモニウム７２μｌ及び−２０℃のエタノール５５０μｌの添加により沈殿し、氷上で３０分間インキュベートし、前述のように遠心分離した。沈殿したＤＮＡを、−２０℃の７０％エタノール５００μｌで１回洗浄し、真空で乾燥し、かつＴＥバッファ−２０μｌに溶解した。
【００９５】
大きさで分画したＳａｕ３Ａ　１断片の、ＢａｍＨ　１で消化しかつリン酸化したｐＷＥ１５ベクターへのライゲーションを、Ａｕｓｂｅｌの３．３節のプロトコールを変更（すなわち、製造業者によって供給された、予備混合した１０×ライゲーションバッファーを使用）して、Ｔ４リガーゼ（ＮＥＢ）を用いて達成した。ライゲーションは、総量２０μｌについて、１５℃で一晩行い、引き続き−２０℃で貯蔵した。
ＤＮＡ約１μｇを含有する、コスミドＤＮＡライゲーション反応物４μｌを、市販のパッケージングエクストラクト（ギガパック（登録商標）ＩＩＩゴールドパッケージングエクストラクト、ストラータジーン社）を用いて、製造業者の指示に従って、λバクテリオファージにパッケージした。パッケージした調製物は、使用時まで４℃で貯蔵した。下記のギガパック（登録商標）ＩＩＩゴールドプロトコール（コスミドライブラリーのタイタリング（ｔｉｔｅｒｉｎｇ））に従い、このパッケージしたコスミド調製物を、エシェリキア・コリＸＬ１ブルーＭＲ細胞（ストラータジーン社）への導入に使用した。ＸＬ１ブルーＭＲ細胞を、０．２重量／容量％マルトースと１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４を含有する、ＬＢ培地（ｇ／Ｌ：バクト−トリプトンが１０；バクト酵母抽出物が５；バクト寒天が１５；ＮａＣｌが５（ディフコラボラトリー社、デトロイト、Ｍ　Ｉ））中で、３７℃で増殖した。
【００９６】
５時間増殖した後、細胞を、７００×ｇ（１５分間）でペレット化し、１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４　６ｍｌ中に再懸濁した。培養物の濃度を、１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４で、ＯＤ６００＝０．５に調節した。パッケージしたコスミドライブラリーを、滅菌したＳＭ培地（０．１Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．０１重量／容量％ゼラチン）で１：１０又は１：２０に希釈し、かつ希釈した調製物２５μｌを、希釈したＸＬ１ブルーＭＲ細胞２５μｌと混合した。この混合物を、２５℃で３０分間インキュベートし（振盪せず）、その後ＬＢブロス２００μｌを添加し、かつインキュベーションを、時々緩く攪拌しながら、約１時間継続した。この培養物のアリコート（２０〜４０μｌ）を、アンピシリンを１００ｍｇ／ｌ含む、ＬＢ寒天プレート（すなわちＬＢ−Ａｍｐ１００）上に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。増幅せずにこのライブラリーを保存するために、単一のクローンを採取し、かつ滅菌した９６ウェルのマイクロウェルプレートの個々のウェルに接種し；各ウェルには、テリフィックブロス（ＴＢ培地：バクトトリプトンが１２ｇ／ｌ、バクト酵母抽出物が２４ｇ／ｌ、０．４容量％グリセロール、１７ｍＭ　Ｈ２ＰＯ４、７２ｍＭ　Ｋ２ＨＰＯ４）７５μｌと、アンピシリン１００ｍｇ／ｌ（すなわちＴＢ−Ａｍｐ１００）を入れ、かつ一晩、３７℃でインキュベートした（振盪せず）。
【００９７】
９６ウェルプレートを、コピープレートに複写した後、フィルター滅菌したＴＢ：グリセロール（１：１、容量／容量、アンピシリン１００ｍｇ／ｌは有又は無）を７５μｌ／ウェルずつ、このプレートに添加し、これを手短に１００ｒｐｍ、３７℃で振盪し、その後パラフィルム（登録商標）（アメリカンナショナル社、グリニッジ、ＣＴ）で封をし、−７０℃のフリーザーに静置貯蔵した。コピープレートを、マスタープレートと同じように増殖処理した。全部で４０個のこのようなマスタープレート（及びそれらのコピー）を調製した。
【００９８】
放射標識したＤＮＡプローブによるライブラリースクリーニング：放射性標識したプローブでプロービングするためのコロニーフィルターを調製するために、前述のライブラリーの９６ウェルプレート１０個を、２５℃で解凍した（ベンチ表面は室温）。９６の先が尖った部分を備えたレプリカプレーティング器具を用いて、ＴＢ−Ａｍｐ１００を７５μｌ／ウェル含む、新たな９６ウェルコピープレートに接種した。このコピープレートを、３７℃で一晩増殖し（静置）、その後１００ｒｐｍ、３７℃で、約３０分間振盪した。増殖しなかったものを分離するために、全部で８００のコロニーを、このコピープレート上に出現させた。前記レプリカ器具を用いて、バイオアッセイプラスチックディッシュ（Ｎｕｎｃ、２４３×２４３×１８ｍｍ；カーティンマティソンサイエンティフィック社、ウッドデールＩＬ）中の、固形ＬＢ−Ａｍｐ１００（１００ｍｌ／ディッシュ）上に配置した、マグナＮＴ；（ＭＳＩ社、ウェストボロ、ＭＡ）ナイロン膜（０．４５μｍ、２２０×２５０ｍｍ）の上に、この９６ウェルアレーのデュプリケートの痕跡（ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）を接種した。これらのコロニーを、前述の膜の上で、３７℃で、約３時間増殖した。
【００９９】
陽性対照コロニー（ＧＺ４配列インサートを含む細菌クローン、下記参照）を、クロラムフェニコール３５ｍｇ／ｌを補充したＬＢ培地（すなわちＬＢ−Ｃａｍ３５）について、セパレートのマグナＮＴ膜（Ｎｕｎｃ．、０．４５μｍ、８２ｍｍの円形）上で増殖し、かつこのライブラリーコロニー膜に沿って処理した。膜上の細菌コロニーを溶菌し、かつゲニウス（登録商標）システムユーザーガイド２．０版（ベーリンガーマンハイム、インディアナポリス、ＩＮ）のプロトコールに従って、ＤＮＡを、変性かつ中和した。０．５Ｎ　ＮａＯＨと１．５Ｍ　ＮａＣｌに１５分間浸漬したフィルターペーパー上に、膜をコロニー側が上になるように置いて、変性し、かつ１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１．５Ｍ　ＮａＣｌに１５分間浸漬したフィルターペーパー上で中和した。ストラータジーン社のＵＶストラタリンカーを自動架橋（ａｕｔｏ　ｃｒｏｓｓｌｉｎｋ）に設定して用いて、ＵＶ架橋した後、この膜を、乾燥状態２５℃で、使用時まで保存した。膜を、単一の９６ウェルプレートのデュプリケートの痕跡を含む細片に切り揃え、その後ＣＰＭＢ（前掲）６．４．１節の方法で、広く洗浄した：３×ＳＳＣ、０．１重量／容量％ＳＤＳ中で、２５℃で３時間洗浄した後、同じ溶液で、６５℃で１時間洗浄し、次にハイブリダイゼーション工程（２０×ＳＳＣ＝３Ｍ　ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）のための調製物中の、２×ＳＳＣで洗い流した。
【０１００】
ｔｃａＣ遺伝子の特異的ゲノム断片の増幅：精製したＴａｃＣペブチド分画に関して決定されたＮ−末端アミノ酸配列（ここでは配列番号２として示す）を基に、縮重オリゴヌクレオチドのプール（プールＳ４Ｐｓｈ）を、アプライドバイオシステムＡＢＩ３９４　ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（パーキンエルマー社、フォスターシティー、ＣＡ）で、標準的βシアノエチル化学により合成した。これらのオリゴヌクレオチドを、８時間、５５℃で脱保護し、水に溶解し、分光光度計による測定で定量し、かつ使用するために希釈した。このプールは、ＴａｃＣペプチドのＮ−末端の決定されたアミノ酸配列と一致した。決定されたアミノ酸配列及び対応する縮重したＤＮＡ配列を、下記に示し、ここでＡ、Ｃ、Ｇ及びＴは、標準のＤＮＡ塩基であり、Ｉはイノシンを表す：
2004089189.tif 000013
縮重オリゴヌクレオチドの別のセットを、合成し（プールＰ２．３．５Ｒ）、配列番号１７の決定されたアミノ酸配列に関するコード鎖の完全性を示した：
2004089189.tif 000014
【０１０１】
これらのオリゴヌクレオチドは、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ菌株Ｗ−１４（前記参照）から調製されたゲノムＤＮＡ由来の特異的ＤＮＡ断片を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ（登録商標）、ロッシュモレキュラーシステム社、ブランチュバーグ、ＮＪ）のプライマーとして使用した。
【０１０２】
典型的な反応物（５０μｌ）は、各プライマープールＰ２Ｐｓｈ及びＰ２．３．５Ｒを１２５ｐｍｏｌ、ゲノム鋳型ＤＮＡを２５３ｎｇ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを各々１０ｎｍｏｌ、１×ゲネアンプ（登録商標）ＰＣＲバフッファー、並びにアムプリタック（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを２．５ユニット（両方ともロシュモレキュラーシステム社から入手；１０×ゲネアンプ（登録商標）バッファーは、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５００ｍＭ　ＫＣｌ、０．０１重量／容量％ゼラチン）を含有した。増幅は、９４℃（１．０分間）、５５℃（２．０分間）、７２℃（３．０分間）、その後７．０分間７２℃の伸長期間の３５サイクルを用い、パーキンエルマーセタスＤＮＡサーマルサイクラー（パーキンエルマー社、フォスターシティー、ＣＡ）中で行った。増幅生成物は、ＴＥＡバッファー（４０ｍＭトリス−酢酸、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中で、２重量／容量％ヌシーヴ（登録商標）３：１アガロース（ＦＭＣバイオプロダクツ社）を通す電気泳動で分析した。このゲルを臭化エチジウム（０．５μｇ／ｍｌ）で染色し、紫外線下て検出することにより、大きさが２５０ｂｐと推定される特異的生成物が多くの他の増幅生成物中に認められた。
【０１０３】
およそ２５０ｂｐ生成物を含有しているゲルの部分を切り、小さいプラグ（直径０．５ｍｍ）を取り出し、ＰＣＲ増幅（４０サイクル）用の鋳型の供給に使用した。この反応物（５０μｌ）は、ゲノム鋳型ＤＮＡを除いて、前述と同じ内容物を含有した。増幅後、この断片の末端を平滑にし、かつ１ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、１ｎｍｏｌ　ＡＴＰ、及び２．１５ユニットのＴ４キナトゼ（ファルマシアバイオテク社、ピスケートウェイ、ＮＪ）と共に、２５℃で２０分間、インキュベートすることによって、リン酸化した。
ＤＮＡ断片は、ＴＥＡを溶媒とする１重量／容量％ＧＴＧ（登録商標）アガロース（ＦＭＣ）を通す電気泳動により、残留するプライマーから分離した。見かけの大きさ２５０ｂｐの断片を有するゲル切片を切り取り、かつそのＤＮＡを、キアエックスキット（キアゲン社、チャストウォース、ＣＡ）を用いて抽出した。
【０１０４】
この抽出されたＤＮＡ断片を、制限酵素Ｓｍａ　１で完全に消化したプラスミドベクターｐＢＣ　ＫＳ（＋）（ストラータジーン社）にライゲートし、かつ前述のｐＷＥ１５　ＤＮＡプローブに関して説明したのと同様の方法で抽出した。典型的なライゲーション反応物（１６．３μｌ）は、１×ライゲーションバッファー（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２；１０ｍＭジチオスレイトール；１ｍＭスペルミジン；１ｍＭ　ＡＴＰ；１００ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）を溶媒として、消化されたｐＢＣＫＳ（＋）ＤＮＡを１００ｎｇ、２５０ｂｐ　ＤＮＡ断片を７０ｎｇ、１ｎｍｏｌ［Ｃｏ（ＮＨ３）６］Ｃｌ、及びＴ４　ＤＮＡリガーゼを３．９　Ｗｅｉｓｓユニット（コラボラチブバイオメディカルプロダクト社、ベッドフォード、ＭＡ）を含有した。
【０１０５】
１４℃で一晩インキュベートした後、供給者の指示に従って、ライゲーションした生成物を、凍結したコンピテントエシェリキア・コリＤＨ５α（ギブコＢＲＬ）に形質転換し、ＩＰＴＳ（１１９μｇ／ｍｌ）及びＸ−ガル（５０μｇ／ｍｌ）を含有する、ＬＢ−Ｃａｍ３５プレート上に配置した。独立した白色コロニーを採取し、かつプラスミドＤＮＡを、変更されたアルカリ溶解／ＰＥＧ沈殿法（ＰＲＩＳＭ（登録商標）簡易反応ダイデオキシ（登録商標）ターミネーターサイクル配列決定キットのプロトコール；ＡＢＩ／パーキンエルマー社）により、調製した。このインサートＤＮＡの両方の鎖のヌクレオチド配列を、Ｔ７プライマー［ｐＢＣ　ＫＳ（＋）塩基６０１−６２３：ＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＧ］及びＬａｃＺプライマー［ｐＢＣ　ＫＳ（＋）塩基７９２−８１６：ＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＧＣＧＣｌ、及びＰＲＩＳＭ（登録商標）配列決定キット（ＡＢＩ／パーキンエルマー社）のプロトコールを用いて決定された。組込まれていない染色したターミネーターであるジデオキシリボヌクレオチドは、セントリーセップ１００カラム（プリンストンセパレーション社、アデルフィア、ＮＪ）を、製造業者の指示に従って通すことによって、除去した。このＤＮＡ配列は、ＡＢＩモデル３７３Ａ　ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ／パーキネルマー社）を用いて、これらの試料を分析することによって得られた。２種の単離体ＧＺ４及びＨＢ１４のＤＮＡ配列は、図１に詳細に説明したものが認められた。
【０１０６】
この配列は、下記の特徴を持つ：ｉ）塩基１−２０は、Ｓ４Ｐｓｈ縮重オリゴヌクレオチドの６４の可能性のある配列のひとつを表す、ｉｉ）アミノ酸１−３及び６−１２の配列は、ＴａｃＣのＮ−末端について決定されたもの（配列番号２）と正確に一致する、ｉｉｉ）コードされた４番目のアミノ酸は、セリン残基ではなく、システイン残基であり、この差異は、セリンコドンの縮重内でコードされている（前記参照）、ｉｖ）コードされた５番目のアミノ酸は、プロリンであり、配列番号２で示されたＴｃａＣ　Ｎ−末端配列に対応している、Ｖ）塩基２５７−２７６は、縮重プールにデザインされた１９２の可能性のある配列のひとつをコードしている、Ｖｉ）塩基２６８−２７０に導入されたＴＧＡ終結コドンは、対応する位置で該オリゴヌクレオチドプールに組込まれた縮重に対する相補性の結果であり、かつ対応する遺伝子の短い読み枠を示すものではない。
【０１０７】
ＴｃａＣペプチド遺伝子特異性プローブの標識
夫々１００ｐモルのＰ２Ｐｓｈプライマー及びＰ２．３．５Ｒプライマー、鋳型としてのプラスミドＧＺ４またはＨＥ１４　１０ｎｇ、夫々２０ｎモルのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、Ａｍｐｌｉｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ５単位、１ｘ濃度のＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）緩衝液を上記と同じ温度レジメのもとに使用して、上記２７６塩基に相当するＤＮＡフラグメントを１００μｌの反応容積でＰＣＲ（登録商標）により増幅した（３５サイクル）。増幅産物をＱｉａｅｘキットにより１％ＧＴＧ（登録商標）アガロースゲルから抽出し、フルオロメトリーにより定量した。
プラスミドＨＢ１４鋳型から抽出された増幅産物（約４００ｎｇ）を５つのアリコートに分け、製造業者の指示に従ってハイ・プライム・ラベリング・ミックス（ベーリンガー・マンハイム）を使用して３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識した。とり込まれなかった放射性同位元素を供給業者の指示に従ってＮｕｃＴｒａｐプローブ精製カラム（ストラタゲン）中の通過により除去した。標識されたＤＮＡ産物の比活性をシンチレーションカウントにより測定したところ、３．１１×１０８ｄｐｍ／μｇであった。この標識されたＤＮＡを使用してゲノムライブラリーの８００の員から調製された膜を探査した。
【０１０８】
ＴｃａＣペプチド遺伝子特異性プローブによるスクリーニング
放射能標識されたＨＢ１４プローブを約１０分間沸騰させ、次いで”最小ｈｙｂ”溶液に添加した［注：”最小ｈｙｂ”方法をＣＥＲＥＳプロトコル；”制限酵素断片長多型研究マニュアルバージョン４．０”，節４−４０及び４−４７；ＣＥＲＥＳ／ＮＰＩ，Ｓａｌｔ　Ｌａｋｅ　Ｃｉｔｙ，ＵＴから採用する。ＮＰＩは現存していないが、その継承者がＬｉｎｋａｇｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓとして運用している］。”最小ｈｙｂ”溶液は１０％ｗ／ｖのＰＥＧ（ポリエチレングリコール、Ｍ．Ｗ．約８０００）、７％ｗ／ｖのＳＤＳ、０．６ＸのＳＳＣ、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（９５ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４・１Ｈ２Ｏ及び８４．５ｇ／ｌのＮａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏを含む１Ｍの原液から）、５ｍＭのＥＤＴＡ、及び１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む。膜を素早く乾燥ブロットし、次いで、プレハイブリダイゼーションを用いないで、膜の５ストリップを、”最小ｈｙｂ”７５ｍｌ及び２．６ｎｇ／ｍｌの放射能標識されたＨＢ１４プローブを含む二つのプラスチックボックスの夫々に入れた。これらを６０℃で徐々に振とうしながら一夜インキュベートした。フィルターを夫々約１０分間にわたって２５℃で”最小ｈｙｂ洗浄液”（０．２５ＸのＳＳＣ、０．２％のＳＤＳ）中で３回洗浄し、続いて同溶液中で６０℃で徐々に振とうしながら２回の３０分間の洗浄を行った。
【０１０９】
フィルターをライト−タイト・オートラジオグラフィーカセット中でサランラップＲ（ダウ・ブランド、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で覆われた紙の上に置き、４時間にわたって−７０℃で２種のデュポン・クロネックス・ライトニング・エンハンサー＋Ｃ１エンハンサー（シグマ・ケミカル社，Ｓｔ．Ｌｏｉｓ，ＭＯ）を用いてＸ−Ｏｍａｔ　Ｘ線フィルム（コダック，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に露出した。現像（通常の写真操作）後に、有意なシグナルが更に弱く、更に不規則なシグナルのハイバックグラウンドの間で両方の反復試験で明らかであった。再度、フィルターを約４時間にわたって６８℃で”最小ｈｙｂ洗浄液”中で洗浄し、次いで再度カセットに入れ、フィルムを−７０℃で一夜露出した。１２の可能な陽性を二重の９６ウェル・コロニー陥凹の両方について強いシグナルにより同定した。シグナルは陰性の対照膜（ｐＷＥ１５を含むＸＬ１ブルーＭＲ細胞のコロニー）では見られず、非常に強いシグナルが実験サンプルで同時に処理された陽性の対照膜（ＰＣＲ産物のＧＺ４分離物を含むＤＨ５α細胞）で見られた。
【０１１０】
１２の推定ハイブリダイゼーション−陽性コロニーを凍結された９６ウェルライブラリープレートから回収し、固体ＬＢ−Ａｍｐ１００培地で３７℃で一夜増殖させた。次いでそれらを固体ＬＢ−Ａｍｐ１００にパッチした（３／プレート、＋３種の陰性対照：ｐＷＥ１５ベクターを含むＸＬ１ブルーＭＲ細胞）。膜（マグナＮＴナイロン、０．４５ミクロン）の二つの組をハイブリダイゼーションのために調製した。フィルターをパッチプレートのコロニーの上に直接置き、次いでそれを付着バクテリア細胞とともに除去し、以下のようにして処理することにより第一組を調製した。第二組のフィルターをＬＢ−Ａｍｐ１００培地を含むプレートに入れ、次いで細胞をパッチプレートからフィルターに移すことにより接種した。３７℃で一夜増殖後に、フィルターをプレートから除去し、処理した。
【０１１１】
フィルターのバクテリア細胞を溶解し、夫々のフィルターをプラスチックプレート中の０．５ＮのＮａＯＨのプール（１．０ｍｌ）に３分間にわたってコロニー面を上にして置くことによりＤＮＡを変性した。フィルターをペーパータオルで乾燥ブロットし、次いでそのプロセスを新しい０．５ＮのＮａＯＨで繰り返した。乾燥ブロッティング後に、フィルターを夫々１Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５の１．０ｍｌのプールに３分間入れることにより中和し、乾燥ブロットし、新しい緩衝液で再度中和した。これに続いて０．５Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５＋１．５ＭのＮａＣｌのプールで２回の同様のソーキング（夫々５分間）を行った。乾燥ブロッティング後に、そのＤＮＡをフィルター（上記のとおり）にＵＶ架橋し、フィルターを３Ｘ　ＳＳＣ約１００ｍｌ＋０．１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ中で洗浄した（２５℃、１００ｒｐｍ）（４回、夫々の洗浄について夫々新しい溶液で３０分間）。次いでそれらを２時間にわたって６５℃、５０ｒｐｍで最小容積のプレハイブリダイゼーション溶液［６Ｘ　ＳＳＣ＋夫々１％ｗ／ｖのフィコール４００（ファーマシア）、ポリビニルピロリドン（平均Ｍ．Ｗ．３６０，０００；シグマ）及びウシ血清アルブミンフラクションＶ；（シグマ）］に入れた。プレハイブリダイゼーション溶液を除去し、ライブラリー膜の先のハイブリダイゼーションから保存されており、９５℃で５分間変性されたＨＢ１４　３２Ｐ標識プローブで置換した。５０ｒｐｍで振とうしなからハイブリダイゼーションを６０℃で１６時間行った。
【０１１２】
標識プローブ溶液の除去後に、膜を２５℃（５０ｒｐｍ、１５分間）で３Ｘ　ＳＳＣ（夫々約１５０ｍｌの洗浄液）中て３回洗浄した。次いてそれらを０．２５Ｘ　ＳＳＣ＋０．２％のＳＤＳ（最小ｈｙｂ洗浄液）中で６８℃で３時間洗浄し（５０ｒｐｍ）、１．５時間にわたって２５℃で上記のＸ線フィルムに露出した（無エンハンサースクリーン）。この露出はコスミド分離物２２Ｇ１２、２５Ａ１０、２６Ａ５、及び２６Ｂ１０について非常に強いハイブリダイゼーションシグナルを明らかにし、またコスミド分離物８Ｂ１０では非常に弱いシグナルを明らかにした。シグナルは陰性対照（ｐＷＥ１５）コロニーでは見られず、非常に強いシグナルが実験サンプルで同時に処理された陽性対照膜（ＰＣＲ産物のＧＺ４分離物を含むＤＨ５α細胞）で見られた。
【０１１３】
ｔｃａＢ遺伝子の特定のゲノムフラグメントの増幅
精製されたＴｃａＢｉペプチドフラクションについて決定されたＮ末端アミノ酸配列（本明細書中配列番号３として開示される）に基いて、縮重オリゴヌクレオチドのプール（プールＰ８Ｆ）をペプチドＴｃａＣについて記載されたようにして合成した。決定されたアミノ酸配列及び相当する縮重ＤＮＡ配列を以下に示し、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴは通常のＤＮＡ塩基であり、Ｉはイノシンを表す。
2004089189.tif 000015
縮重オリゴヌクレオチドの別の組を合成し（プールＰ８．１０８．３Ｒ）、ＴｃａＢｉ−ＰＴ１０８内部ペプチドの決定されたアミノ酸配列（本明細書中配列番号２０として開示される）についてコードストランドの相補物に相当した。
2004089189.tif 000016
【０１１４】
ホットスタート５０チューブＴＭ（モレキュラー・パイオープロダクツ社，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用してこれらのオリゴヌクレオチドをＰＣＲのプライマーとして使用してフォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）株Ｗ−１４（上記を参照のこと）から調製されたゲノムＤＮＡから特定のＤＮＡフラグメントを増幅した。典型的な反応液（５０μｌ）は、１ｘＧｅｎｅＡｍｐＲ緩衝液中にそれぞれ２ｎモルのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰとともに夫々２５ｐモルのプライマープールＰ８Ｆ及びＰ８．１０８．３Ｒ（下層）、並びに１ｘＧｅｎｅｍＡＭｐＲ緩衝液中にゲノム鋳型ＤＮＡ２３０ｎｇ、それぞれ８ｎモルのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、および２．５単位のＡｍｐｌｉＴａｑＲポリメラーゼ（上層）を含んでいた。増幅をＴｃａＣペプチドについて記載されたようにして３５サイクルにより行った。増幅産物をＴＥＡ緩衝液中で０．７％ｗ／ｖのシーケムＲＬＥアガロース（ＦＭＣ）による電気泳動により分析した。推定サイズ１６００ｂｐの特定産物を観察した。
４種のこのような反応液をプールし、増幅されたＤＮＡをＴｃａＣペプチドについて記載されたようにしてＱｉａｅｘキットにより１．０％のシーケムＲＬＥゲルから抽出した。Ｐ８Ｆプライマープール及びＰ８．１０８．３Ｒプライマープールを使用して、抽出されたＤＮＡを配列決定（ＰＲＩＳＭＴＭ配列決定キット）の鋳型として直接使用した。
【０１１５】
夫々の反応液は鋳型ＤＮＡ約１００ｎｇ及び２５ｐモルの一種のプライマープールを含み、ＴｃａＣペプチドについて記載されたようにして通常のプロトコルに従って処理した。Ｐ８Ｆプライマーの延長から誘導された配列の分析は短いＤＮＡ配列（及びコードされたアミノ酸配列）を明らかにした。
2004089189.tif 000017
これは配列番号３（ＴｃａＢｉ）として開示されたＮ末端ペプチド配列の一部に相当する。
【０１１６】
ＴｃａＢｉペプチド遺伝子特異性プローブの標識
ゲル精製されたＴｃａＢｉ　ＤＮＡフラグメント約５０ｎｇを上記のようにして３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識し、取り込まれなかった放射性同位元素をＮＩＣＫカラムＲ（ファルマシア）中の通過により除去した。標識されたＤＮＡの比活性を測定したところ、６ｘ１０９ｄｐｍ／μｇであった。この標識されたＤＮＡを使用してＴｃａＣ−ペプチド特異性プローブにハイブリッドを形成したゲノムライブラリーの員から調製されたコロニー膜を探査した。
ＴｃａＣ−プローブライブラリースクリーン（上記を参照のこと）で同定された１２のコロニーを含む膜を毎回約３０分間で１リットルの０．１Ｘ　ＳＳＣ＋０．１％のＳＤＳ中で２回沸騰することにより放射性ＴｃａＣ−特異性標識からストリッピングした。放射性標識の除去を６時間のフィルム露出でチェックした。次いでストリッピングされた膜を先に調製したＴｃａＢｉペプチド特異性プローブとともにインキュベートした。標識ＤＮＡを１０分間の沸騰により変性し、次いで６０℃で”最小ｈｙｂ”溶液１００ｍｌ中で１時間インキュベートされたフィルターに添加した。この温度で一夜のハイブリダイゼーション後に、プローブ溶液を除去し、フィルターを以下のようにして洗浄した（全て、０．３Ｘ　ＳＳＣ＋０．１％のＳＤＳ中）。２５℃で５分間にわたって１回、新しい溶液中で６０℃で１時間にわたって１回、そして新しい溶液中で６３℃で１時間にわたって１回。通常の操作によるＸ線フィルムへの１．５時間の露出後に、４つの強くハイブリッドを形成するコロニーを観察した。これらは、ＴｃａＣ−特異性プローブによれば、分離物２２Ｇ１２、２５Ａ１０、２６Ａ５、及び２６Ｂ１０であった。
同ＴｃａＢｉプローブ溶液を等容積（約１００ｍｌ）の”最小ｈｙｂ”溶液で希釈し、次いでゲノムライブラリーの８００の員を含む膜をスクリーニングするのに使用した。
上記のようなハイブリダイゼーション、洗浄、そしてＸ線フィルムへの露出後に、４種のコスミドクローン２２Ｇ１２、２５Ａ１０、２６Ａ５、及び２６Ｂ１０のみがこのプローブに強くハイブリッドを形成することがわかった。
【０１１７】
ＴｃａＣペプチド及びＴｃａＢｉペプチドをコードする遺伝子を含むサブクローンの単離、及びそのＤＮＡ塩基配列の決定
株ＸＬ１ブルーＭＲ中の３種のハイブリダイゼーション陽性コスミドを３０℃でＴＢ−Ａｍｐ１００中で一夜振とう（２００ｒｐｍ）しながら増殖させた。細胞を遠心分離により回収した後、製造業者のプロトコルに従って市販のキット（ＢＩＧｐｒｅｐＴＭ、５プライム３プライム社，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）を使用してコスミドＤＮＡを調製した。一種のコスミド、２６Ａ５のみをこの操作により成功裏に単離した。制限酵素ＥｃｏＲ　１（ＮＥＢ）で消化し、ゲル電気泳動により分析した時、およそのサイズ１４、１０、８（ベクター）、５、３．３、２．９、及び１．５ｋｂｐのフラグメントを検出した。３種の同株からコスミドＤＮＡを単離しようとする第二の試み（８ｍｌの培養；ＴＢ−Ａｍｐ１００、３０℃）は沸騰ミニプレプ方法（ＥｖａｎｓＧ．及びＧ．Ｗａｈｌ．，１９８７，”Ｃｏｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ｗａｌｋｉｎｇ　ａｎｄ　ｒａｐｉｄｒｅｓｔｒｉ−ｃｔｉｏｎ　ｍａｐｐｉｎｇ”，Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５２巻，Ｓ．Ｂｅｒｇｅｒ及びＡ．Ｋｉｍｍｅｌ編集，６０４−６１０頁）を利用した。
【０１１８】
一種のコスミド、２５Ａ　１０のみをこの方法により成功裏に単離した。制限酵素ＥｃｏＲ　１（ＮＥＢ）で消化し、ゲル電気泳動により分析した時、このコスミドはコスミド２６Ａ５で先に見られたのと同じ断片化パターンを示した。
２６Ａ５コスミドＤＮＡ０．１５μｇのサンプルを供給業者のプロトコルによりＥ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α細胞（ギブコＢＲＬ）５０ｍｌを形質転換するのに使用した。その株の単一コロニー分離物をＴＢ−Ａｍｐ１００　４ｍｌに接種し、３７℃で８時間増殖させた。クロラムフェニコールを２２５μｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、インキュベーションを更に２４時間続け、次いで細胞を遠心分離により回収し、−２０℃で凍結した。２６Ａ５コスミドＤＮＡの単離は全ての容積を５０％増加し、夫々の工程でボルテックスではなく攪拌または軽い混合を用いることにより改良された通常のアルカリ溶解ミニプレプ（Ｍａｎｉａｔｉｓらの上記引用文献、３８２頁）によるものであった。ＤＮＡペレットを７０％のエタノール中で洗浄した後、それを２５μｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡ（ベーリンガー・マンハイム）を含むＴＥに溶解した。
【０１１９】
ＧＺ４誘導プローブ及びＴｃａＢｉブローブにハイブリッドを形成するＥｃｏＲ　１フラグメントの同定
コスミド２５Ａ１０（ＸＬ１ブルーＭＲ細胞から）約０．４μｇ及びコスミド２６Ａ５（クロラムフェニコール増幅されたＤＨ５α細胞から）約０．５μｇを約１５単位のＥｃｏＲ　１（ＮＥＢ）で８５分間にわたって夫々消化し、一夜凍結し、次いで６５℃で５分間加熱し、０．７％のアガロースゲル中で電気泳動にかけた（シーケムＲＬＥ、１ｘＴＥＡ、８０ボルト、９０分間）。そのＤＮＡを上記のようにして臭化エチジウムで染色し、紫外線のもとに写真撮影した。コスミド２５Ａ１０のＥｃｏＲ　１消化産物は完全消化であったが、コスミド２６Ａ５のサンプルはこれらの条件下で部分消化されたにすぎなかった。ＤＮＡフラグメントを含むアガロースゲルをデプリネーション（ｄｅｐｕｒｉｎａｔｉｏｎ）、変性及び中和にかけ、続いて全てＡｕｓｕｂｅｌら（ＣＰＭＢ）上記引用文献）の節２．９に記載されたようにして高塩（２０Ｘ　ＳＳＣ）プロトコルを使用してマグナＮＴナイロン膜にサザンブロッティングした。次いで移入されたＤＮＡを前記のようにしてナイロン膜にＵＶ架橋した。
【０１２０】
プラスミド分離物ＧＺ４のインサートに相当するＴｃａＣペプチド特異性ＤＮＡフラグメントを上記のようにして１００ｍｌの反応容積でＰＣＲにより増幅した。３種のこのような反応からの増幅産物をプールし、上記のようにしてＱｉａｅｘキットにより１％のＧＴＧＲアガロースゲルから抽出し、フルオロメトリーにより定量した。上記のようにしてハイ・プライム・ラベリング・ミックス（ベーリンガー・マンハイム）を使用して、ゲル精製されたＤＮＡ（１００ｎｇ）を６．３４ｘ１０８ｄｐｍ／μｇの比活性に３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識した。
３２Ｐ標識されたＧＺ４プローブを１０分間沸騰し、次いで”最小ｈｙｂ”緩衝液に添加し（１ｎｇ／ｍｌで）、消化されたコスミドＤＮＡフラグメントを含むサザンブロット膜を添加し、５０ｒｐｍで穏やかに振とうしながら６０℃で４時間インキュベートした。次いで膜を夫々約５分間で２５℃で３回洗浄し（最小ｈｙｂ洗浄液）、続いて夫々３０分間にわたって６０℃で２回洗浄した。ブロットを約３０分間にわたって−７０℃でフィルム（エンハンサースクリーンを使用）に露出した。ＧＺ４プローブはこれらの２種のコスミド、２６Ａ５及び２５Ａ１０の両方の５．０ｋｂｐ（見掛サイズ）ＥｃｏＲ　１フラグメントに強くハイブリッドを形成した。
【０１２１】
膜を０．１Ｘ　ＳＳＣ＋０．１％のＳＤＳ中て約３０分間沸騰することにより放射能をストリッピングし、放射性標識の不在をフィルムへの露出によりチェックした。次いでそれをコロニー膜（上記）をスクリーニングするのに先に使用された”最小ｈｙｂ”緩衝液中で６０℃で３．５時間にわたって（変性）ＴｃａＢｉプローブとハィブリッドを形成し、前記のようにして洗浄し、二つのエンハンサースクリーンを使用して−７０℃で４０分間にわたってフィルムに露出した。両方のコスミドでは、ＴｃａＢｉプローブが約５．０ｋｂｐのＥｃｏＲ　１フラグメントと軽くハイブリッドを形成し、約２．９ｋｂｐのフラグメントと強くハイブリッドを形成した。
前記のコスミド２６Ａ５　ＤＮＡ（ＤＨ５α細胞から）のサンプルをＤＮＡの起源（これから関係するバンドをサブクローン化する）として使用した。このＤＮＡ（２．５μｇ）を３０μｌの合計容積で１．５時間にわたって約３単位のＥｃｏＲＩ　１（ＮＥＢ）で消化して、ゲル電気泳動により確認して部分消化産物を得た。ｐＢＣ　ＫＳ（＋）ＤＮＡ（ストラタゲン）１０μｇを２０μｌの合計容積で１．５時間にわたって２０単位のＥｃｏＲＩ　１で消化して、電気泳動により確認して完全消化をもたらした。両方のＥｃｏＲＩ　１切断ＤＮＡ製剤を水で５０μｌに希釈し、夫々に等容積のＰＣＩを添加し、その懸濁液を穏やかに混合し、小型遠心分離機中で回転させ、水性上澄みを回収した。ＤＮＡをエタノール１５０μｌにより沈殿させ、その混合物を−２０℃で一夜置いた。遠心分離及び乾燥後に、ＥｃｏＲ１消化したｐＢＣ　ＫＳ（＋）をＴＥ１００μｌに溶解した。部分消化された２６Ａ５をＴＥ２０μｌに溶解した。ＤＮＡ回収をフルオロメトリーによりチェックした。
【０１２２】
別々の反応において、ＥｃｏＲ　１消化したｐＢＣ　ＫＳ（＋）ＤＮＡ約６０ｎｇを部分消化されたコスミド２６Ａ５　ＤＮＡ約１８０ｎｇまたは２７０ｎｇとつないだ。Ｔ４リガーゼ及びニュー・イングランド・バイオラブズからの緩衝液を使用して、結合を２０μｌの容積で１５℃で５時間行った。無菌ＴＥで１００μｌに希釈された結合混合物を供給業者の指示に従って凍結したコンピテントＤＨ５α細胞（ギブコＢＲＬ）を形質転換するのに使用した。種々の量（２５〜２００μｌ）の形質転換された細胞を、１ｍＭのＩＰＴＧ及び５０ｍｇ／ｌのＸ−ｇａｌを含む新たに調製した固体ＬＢ−Ｃａｍ３５培地に塗布した。プレートを３７℃で約２０時間インキュベートし、次いで約３時間にわたって暗所で冷却して挿入選択のために着色を強化し。白色のコロニーを同組成のパッチプレートに取り、３７℃で一夜インキュベートした。
選択されたパッチプレートの夫々の２種のコロニーリフトを以下のようにして調製した。白色のコロニーを新しいプレートに取った後、円形のマグナＮＴナイロン膜をパッチプレートに押しつけ、膜を持ち上げ、ライブラリーコロニー膜について上記されたようにして変性、中和及びＵＶ架橋にかけた。過剰の細胞デブリをティッシュで軽くふき取ることを含み、架橋されたコロニーリフトを激しく洗浄した。”最小ｈｙｂ”プロトコルに従って、一つの組を前記ＧＺ４（ＴｃａＣ）プローブ溶液とハイブリッドを形成し、他の組を前記ＴｃａＢｉプローブ溶液とハイブリッドを形成し、続いてライブラリーコロニー膜について記載されたようにして洗浄し、フィルムに露出した。ＧＺ４プローブのみ、ＧＺ４プローブ及びＴｃａＢｉプローブの両方、またはＴｃａＢｉプローブのみとハイブリダイゼーションシグナルを示すコロニーを更なる研究のために選択し、細胞を前記のＩＰＴＧ及びＸ−ｇａｌを含むＬＢ−Ｃａｍ３５培地に単一コロニー単離のためにストリーキングした。
【０１２３】
１６種の異なる分離物からの約３５の単一コロニーを液体ＬＢ−Ｃａｍ３５培地に取り、３７℃で一夜増殖させた。細胞を遠心分離により回収し、プラスミドＤＮＡをＭａｎｉａｔｉｓら（上記引用文献、３６８頁）に従って通常のアルカリ溶解ミニプレプにより単離した。ＤＮＡペレットをＴＥ＋２５μｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡに溶解し、ＤＮＡ濃度をフルオロメトリーにより測定した。ＥｃｏＲ　１消化パターンをゲル電気泳動により分析した。下記の分離物を有益なものとして採取した。分離物Ａ１７．２は再度つながれたｐＢＣ　ＫＳ（＋）のみを含み、（陰性）対照に使用した。分離物Ｄ３８．３及びＣ４４．１は夫々ｐＢＣ　ＫＳ（＋）に挿入された２．９ｋｂｐのＴｃａＢｉとハイブリッドを形成するＥｃｏＲ　１フラグメントのみを含む。ｐＤＡＢ２０００及びｐＤＡＢ２００１と称されるこれらのプラスミドが夫々図２に示される。
分離物Ａ３５．３はｐＢＣ　ＫＳ（＋）に挿入された約５ｋｂｐのＧＺ４とハイブリッドを形成するＥｃｏＲ　１フラグメントのみを含む。このプラスミドをｐＤＡＢ２００２と称した（また、図２に示される）。これらの分離物はＤＮＡ配列決定の鋳型を与えた。
前記ＢＩＧｐｒｅｐＴＭキットを使用して、プラスミドｐＤＡＢ２０００及びｐＤＡＢ２００１を調製した。培養物（３０ｍｌ）をＴＢ−Ｃａｍ３５中で２のＯＤ６００まで一夜増殖し、次いでプラスミドを製造業者の指示に従って単離した。ＤＮＡペレットを夫々１００μｌのＴＥに再度溶解し、サンプル保全性をＥｃｏＲ　１消化及びゲル電気泳動分析によりチェックした。
【０１２４】
配列決定反応を二重反復試験で実験し、一つの反復試験は鋳型としてｐＤＡＢ２０００ＤＮＡを使用し、他の反復試験は鋳型としてｐＤＡＢ２００１　ＤＮＡを使用した。ＧＺ４／ＨＢ１４　ＤＮＡの配列決定について上記されたように、ジデオキシ色素ターミネーターサイクル配列決定方法を使用して、反応を行った。初期配列決定実験はプライマーとして上記ＬａｃＺプライマー及びＴ７プライマー、＋ＴｃａＢｉ　ＰＣＲ増幅産物の決定された配列をベースとするプライマー（ＴＨ１＝ＡＴＴＧＣＡＧＡＣＴＧＣＣＡＡＴＣＧＣＴＴＣＧＧ、ＴＨ１２＝ＧＡＧＡＧＴＡＴＣＣＡＧＡＣＣＧＣＧＧＡＴＧＡＴＣＴＧ）を使用した。　夫々の配列決定アウトプットの整列及び編集後に、夫々をパーキン・エルマー・アプライド・バイオシステムズ部門ＳｅｑＥｄ　６７５ソフトウェアにより解読されるようなクロマトグラフィーデータの積分に応じて２５０〜３５０塩基にトランケートした。新規プライマーに適した配列を選択することにより、その後の配列決定”工程”を行った。二三の例外があるが、プライマー（上記のようにして合成した）は５０％　Ｇ＋Ｃ組成を有し、長さが２４塩基であった。この方法による配列決定を約２．９ｋｂｐのＥｃｏＲ　１フラグメントの両方のストランドについて行った。
【０１２５】
ＤＮＡ配列決定の鋳型として更に利用するために、分離物ｐＤＡＢ２００２からのプラスミドＤＮＡをＢＩＧｐｒｅｐＴＭキットにより調製した。上記のようにして配列決定反応を行い、分析した。初期に、Ｔ３プライマー（ｐＢＳ　ＳＫ（＋）塩基７７４−７９６：ＣＧＣＧＣＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧ）及びＴ７プライマー（ｐＢＳ　ＳＫ（＋）塩基６２１−６４３：ＧＣＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ）を使用して隣接ベクター配列からインサートＤＮＡまて読み取る配列決定反応を開始した。プライマーの別の組（ＧＺ４Ｆ：ＧＴＡＴＣＧＡＴＴＡＣＡＡＣＧＣＴＧＴＣＡＣＴＴＣＣＣ；ＴＨ１３：ＧＧＧＡＡＧＴＧＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＡＡＴＣＧＡＴＡＣ；ＴＨ１４：ＡＴＧＴＴＧＧＧＴＧＣＧＴＣＧＧＣＴＡＡＴＧＧＡＣＡＴＡＡＣ；及びＬＷ−１−２０４：ＧＧＧＡＡＧＴＧＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＡＡＴＣＧＡＴＡＣ）をつくって内部配列から開始し、これらをサブクローン化ＴｃａＣ−ペプチドＰＣＲ産物の縮重オリゴヌクレオチド媒介配列決定により前もって決定した。配列決定の初期ラウンド中に生じたデータから、プライマーの新規な組を設計し、約５ｋｂｐのフラグメントの完全長をウォーク（ｗａｌｋ）するのに使用した。合計５５オリゴプライマーを使用して、連続配列の合計４８３２ｂｐの同定を可能にした。
【０１２６】
ｐＤＡＢ２００２のＥｃｏＲ　１フラグメントインサートのＤＮＡ配列をｐＤＡＢ２０００／ｐＤＡＢ２００１分離物の決定された配列の一部と組み合わせる場合、合計６００５ｂｐの連続配列を生じた（本明細書中、配列番号２５として開示される）。長い読み取り枠を相当するアミノ酸に翻訳した場合、その配列はメチオニン残基（翻訳の開始）の直後に塩基１９−７５によりコードされたＴｃａＢｉ　Ｎ末端ペプチド（配列番号３として開示される）を明らかに示す。上流に潜在的リボソーム結合部位（塩基１−９）があり、下流に、ＴｃａＢｉ−ＰＴ１５８内部ペプチド（本明細書中、配列番号１９として開示される）が塩基１６６−２２８でコードされる。更に下流に、同読み取り枠中に、塩基１７３８−１７７３で、ＴｃａＢｉ−ＰＴ１０８内部ペプチドをコードする配列（本明細書中、配列番号２０として開示される）が存在する。また、同読み取り枠中に、塩基１８９７−１９２３で、ＴｃａＢｉｉＮ末端ペプチド（本明細書中、配列番号５として開示される）がコードされ、読み取り枠がヌクレオチド３５８６−３５８８にある翻訳終止コドンまで中断されないで存続する。
【０１２７】
ＴｃａＢｉ−ＰＴ１０８をコードする配列の末端とＴｃａＢｉｉコード領域の開始の間のイン−フレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）終止コドンの欠如、及びＴｃａＢｉｉコード領域の直ぐ上流の認識できるリボソーム結合部位の欠如は、ペプチドＴｃａＢｉｉ及びＴｃａＢｉが配列番号２５中の塩基対１６で開始する３５６７ｂｐの単一読み取り枠によりコードされ、おそらく後翻訳開裂により１１８９アミノ酸（１３１，５８６ダルトン；本明細書中、配列番号２６として開示される）の単一の一次遺伝子産物から誘導されることを示す。ＴｃａＢｉｉＮ末端ペプチドに直ぐに先行するアミノ酸がペプチドＴｃａＢｉのＣ末端アミノ酸に相当する場合、ＴｃａＢｉｉ（６２７アミノ酸）の予想質量はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより観察されたサイズ（６８ｋＤａ）より若干高く、７０，８１４ダルトンである（本明細書中、配列番号２８として開示される）。このペプチドは１８８１塩基対の連続ストレッチ（本明細書中、配列番号２７として開示される）によりコードされるであろう。ＴｃａＢｉの天然Ｃ末端はＴｃａＢｉ−ＰＴ１０８のＣ末端に若干近くにあるものと考えられる。ＰＴ１０８の分子量［３．４３８ｋＤａにのペプチドのＮ末端アミノ酸配列分析中に測定］は３０アミノ酸のサィズを予測する。ＴｃａＢｉコード領域のＣ末端［配列番号２８の位置６０４にあるＧｌｕ］を指示するのにこのペプチドのサイズを使用して、ＴｃａＢｉの誘導サイズは、更に実験上の観察と一致して、６０４アミノ酸または６８，４６３ダルトンであることが測定される。
【０１２８】
１６８６塩基対のＴｃａＢｉｉペプチドコード領域（本明細書中、配列番号２９として開示される）の翻訳は６０，７８９ダルトンの予想質量を有する５６２アミノ酸（本明細書中、配列番号３０として開示される）のタンパク質を生じ、これは観察された６１ｋＤａと良く一致する。
潜在的リボソーム結合部位（塩基３６３３−３６３８）はｔｃａＢ読み取り枠の終止コドンの４８ｂｐ下流に見られる。塩基３６４５−３６７７に、ペプチドＴｃａＣのＮ末端をコードする配列（配列番号２として開示される）が見られる。このＮ末端ペプチドにより開始される読み取り枠は塩基６００５まで中断されないで存続する（２３６１塩基対、本明細書中、配列番号３１の最初の２３６１塩基対として開示される）。完全ＴｃａＣペプチド（見掛サイズ約１６５ｋＤａ；約１５００アミノ酸）をコードする遺伝子（ｔｃａＣ）は約４５００ｂｐを含むであろう。
また、コスミド２６Ａ５のクローン化ＥｃｏＲ　１フラグメントを含む別の分離物、Ｅ２０．６を前記ＧＺ４プローブ及びＴｃａＢｉプローブに対するその相同性により同定した。この株により宿されたプラスミド（ｐＤＡＢ２００４、図２）のＤＮＡのＥｃｏＲ　１消化産物のアガロースゲル分析は推定サイズ２．９、５、及び３．３ｋｂｐのインサートフラグメントを明らかにした。プラスミドｐＤＡＢ２００２の配列から指示されたプライマーから開始されたＤＮＡ配列分析は、ｐＤＡＢ２００４の３．３ｋｂｐのＥｃｏＲ　１フラグメントがｐＤＡＢ２００２に代表された５ｋｂｐのＥｃｏＲ　１フラグメントに隣接して存在することを明らかにした。
【０１２９】
ｐＤＡＢ２００２中に発見された２３６１塩基対読み取り枠はｐＤＡＢ２００４中の別の２０９４塩基［本明細書中、配列番号３１の塩基対２３６２〜４４５８として開示される）について中断されないで存続する。親コスミド２６Ａ５　ＤＮＡを鋳型として使用するＤＮＡ配列分析がその読み取り枠の連続性を確認した。要するに、その読み取り枠（ＴｃａＣ配列番号３１）は４４５５塩基対を含み、かつ１４８５アミノ酸［本明細書中、配列番号３２として開示される］のタンパク質（ＴｃａＣ）をコードする。１６６，２１４ダルトンの計算分子サイズはＴｃａＣペプチドの推定サイズ（１６５ｋＤａ）と一致し、誘導アミノ酸配列はＴｃａＣ　Ｎ末端配列［配列番号２］について開示されたものと正確に適合する。
発見された配列中の縮重オリゴヌクレオチドプライマープールを設計するのに使用された配列番号１７に相当するアミノ酸配列の欠如は、分離物ＧＺ４及びＨＢ１４（これらは初期ライブラリースクリーンにおいてプローブとして使用された）中に見られるＰＣＲ産物の発生がその縮重プール中のプライマーの一つによる逆ストランドプライミングにより偶発的に生じたことを示す。更に、誘導タンパク質配列は本明細書中配列番号１８として開示された内部フラグメントを含まない。これらの配列は、プラスミドｐＤＡＢ２００４がＴｃａＣペプチドの完全コード領域を含むことを明らかにする。
【０１３０】
実施例９　ＴｃｂＡｉｉペプチドをコードする遺伝子のフォトラブダス　ゲノムライブラリーのスクリーニング
この実施例はＴｃｂＡｉｉペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡクローンを同定するのに使用した方法、その遺伝子の単離、及びその部分ＤＮＡ塩基配列の決定を記載する。
プライマー及びＰＣＲ反応　昆虫活性製剤のＴｃｂＡｉｉポリペプチドは約２０６ｋＤａである。このペプチドのＮ末端のアミノ酸配列が配列番号１として開示される。このアミノ酸配列の一部をコードするために、縮重オリゴヌクレオチドプライマーの４種のプール（”フォワード（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー”：ＴＨ−４、ＴＨ−５、ＴＨ−６、及びＴＨ−７）を実施例８に記載されたようにして合成し、以下に示す。
【０１３１】
【表１２】
表１１．
2004089189.tif 000018
【０１３２】
加えて、内部ペプチド製剤（ＴｃｂＡｉｉ−ＰＴ８１）の一次配列（”ａ”）及び二次配列（”ｂ”）を決定し、夫々、本明細書中、配列番号２３及び配列番号２４として開示する。以下に示されるように、配列番号２３のペプチドの−部をコードする配列の逆補体をコードするために、縮重オリゴヌクレオチドの４種のプール（”リバース（Ｒｅ−ｖｅｒｓｅ）プライマー”：ＴＨ−８、ＴＨ−９、ＴＨ−１０及びＴＨ−１１）を同様に設計し、合成した。
【０１３３】
【表１３】
表１２．
2004089189.tif 000019
【０１３４】
これらのプライマーの組をＰＣＲ反応に使用して、実施例６で調製されたゲノム　フォトラブダス・ルミネセンスＷ−１４　ＤＮＡからＴｃｂＡｉｉをコードする遺伝子フラグメントを増幅した。ＡｍｐｌｉＷａｘＴＭゲム（ｇｅｍｓ）並びにその他のパーキン・エルマー試薬及びプロトコルを使用して、全てのＰＣＲ反応を”ホット・スタート”技術を用いて行った。典型的には、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ、１０ｘＧｅｎｅＡｍｐＲ　ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、及び、プライマーの混合物（全容積１１μｌ）を、単一ワックスビードを含む管に添加した［１０　ｘＧｅｎｅＡｍｐＲ　ＰＣＲ緩衝液ＩＩは１００ｍＭは１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、および５００ｍＭのＫＣｌを含む。管を２分間にわたって８０℃に加熱し、冷却した。ワックスシールの上に１０　ｘ　ＧｅｎｅＡｍｐＲ　ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、ＤＮＡ鋳型、及びＡｍｐｌｉＴａｑＲ　ＤＮＡポリメラーを含む溶液を添加した。ワックスシールの融解及び熱サイクルによる成分の混合後に、最終反応条件は、５０μｌの容積、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、夫々２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、１．２５ｍＭの単一フォワードプライマープール、１．２５μＭの単一リバースプライマープール、１．２５単位のＡｍｐｌｉＴＡｑ　ＤＮＡポリメラーゼ、及び１７０ｎｇの鋳型ＤＮＡであった。
反応液をサーモサイクラー（実施例８と同様）に入れ、下記のプログラムで実験した。
【０１３５】
【表１４】
表１３．
2004089189.tif 000020
【０１３６】
縮重プライマープールを使用して、一連の増幅を三つの異なるアニーリング温度（５５℃、６０℃、６５℃）で行った。６５℃におけるアニーリングによる反応はアガロース電気泳動後に目視できる増幅産物を有していなかった。６０℃のアニーリングレジメを有し、プライマーＴＨ−５＋ＴＨ−１０を含む反応は、２．９ｋｂｐに相当する移動度を有する増幅産物を生じた。更に少ない量の２．９ｋｂｐの産物をプライマーＴＨ−７＋ＴＨ−１０を用いるこれらの条件下で生じた。反応を５５℃でアニールした場合、これらのプライマー対は更に多くの２．９ｋｂｐの産物を生じ、またこの産物をプライマー対ＴＨ−５＋ＴＨ−８及びＴＨ−５＋ＴＨ−１１により生じた。付加的な非常に不鮮明な２．９Ｋｂｐのバンドがプライマー対ＴＨ−７＋ＴＨ−８、ＴＨ−９、ＴＨ−１０、またはＴＨ−１１からの増幅産物を含むレーン中で見られた。
クローニング及びＤＮＡ配列決定に充分なＰＣＲ増幅産物を得るために、プライマーＴＨ−５＋ＴＨ−１０を使用して１０の別々のＰＣＲ反応を設定し、５５℃のアニーリング温度で上記条件を使用して行った。全ての反応液をプールし、２．９ｋｂｐの産物を上記のようにしてアガロースゲルからＱｉａｅｘ抽出により精製した。
ＴｃｂＡｉｉ内部ペプチドについて決定された付加的な配列が本明細書中配列番号２１及び配列番号２２として開示される。前記のように、これらのペプチドのアミノ酸配列の一部をコードする配列の逆補体に相当する縮重オリゴヌクレオチド（リバースプライマーＴＨ−１７及びＴＨ−１８）をつくった。
【０１３７】
【表１５】
表１４．
2004089189.tif 000021
【０１３８】
【表１６】
表１５
2004089189.tif 000022
【０１３９】
縮重オリゴヌクレオチドＴＨ−１８及びＴＨ−１７を、鋳型としてのフォトラブダス・ルミネセンスＷ−１４　ＤＮＡ及び５−（フォワード）プライマーとしてのＴＨ−４、ＴＨ−５、ＴＨ−６、またはＴＨ−７を用いる増幅実験に使用した。これらの反応は夫々約４ｋｂｐ及び４．５ｋｂｐの産物を増幅した。これらのＤＮＡをアガロースゲルからナイロン膜に移し、ＴＨ−５＋ＴＨ−１０プライマー対により増幅された２．９ｋｂｐの産物から調製された３２Ｐ−標識プローブ（上記のとおり）とハイブリッドを形成した。４ｋｂｐ及び４．５ｋｂｐの増幅産物の両方が２．９ｋｂｐのプローブに強くハイブリッドを形成した。これらの結果を使用して図３に示されたようなＴｃｂＡｉｉ内部ペプチド配列を規制する地図をつくった。プライマー間のおよその距離を図３にヌクレオチド数で示す。
【０１４０】
２．９ｋｂｐのＴｃｂＡｉｉをコードするフラグンントのＤＮＡ配列
精製した２．９ｋｂｐのフラグメント（先に調製した）約２００ｎｇをエタノールで沈殿させ、水１７ｍｌに溶解した。２５ｐモルのＴＨ−５プールをプライマーとして用いて、この半分を配列決定鋳型として使用し、別の半分をＴＨ−１０プライミングの鋳型として使用した。配列決定反応は実施例８に示されたとおりであった。ＴＨ−１０プライマープールを使用して、信頼できる配列を生じなかった。しかしながら、ＴＨ−５プライマープールとの反応は、以下に開示された配列を生じた。
2004089189.tif 000023
この配列に基いて、配列決定プライマー（ＴＨ−２１、５’−ＣＣＧＧＧＣＧＡＣＧＴＴＴＡＴＣＴＡＧＧ−３’）を設計し、補体塩基１２０−１３９を反転し、ゲル精製した２．９ｋｂｐのＴｃｂＡｉｉをコードするＰＣＲフラグメントの５’末端（即ち、ＴＨ−５末端）に向かって重合を開始した。決定された配列を以下に示し、ＴｃｂＡｉｉ配列番号１の生化学的に決定されたＮ末端ペプチド配列と比較する。
【０１４１】
ＴｃｂＡｉｉ２．９ｋｂｐ　ＰＣＲフラグメント配列確認
［下線を施したアミノ酸＝縮重オリゴヌクレオチドによりコードされる］
2004089189.tif 000024
生化学的に決定されたアミノ酸配列に対する誘導アミノ酸配列の相同性から、２．９ｋｂｐ　ＰＣＲフラグメントがＴｃｂＡコード領域に相当することが明らかである。次いでこの２．９ｋｂｐフラグメントをハイブリダイゼーションプローブとして使用してＴｃｂＡｉｉをコードする遺伝子を含むコスミドについて実施例８で調製されたフォトラブダスＷ−１４ゲノムライブラリーをスクリーニングした。
【０１４２】
Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓコスミドライブラリーのスクリーニング
実施例８に記載されたようなベーリンガー・マンハイムのハイ・プライム標識キットを使用して、２．９ｋｂｐのゲル精製したＰＣＲフラグメントを３２Ｐで標識した。コスミドライブラリーからの約８００のコロニーのレムナント（ｒｅｍｎａｎｔ）を含むフィルターを前記（実施例８）のようにしてスクリーニングし、陽性クローンを単離コロニーについてストリーキングし、再度スクリーニングした。３種のクローン（８Ａ１１、２５Ｇ８、及び２６Ｄ１）は幾つかのスクリーニング工程及び結合工程により陽性結果を生じた。ＴｃｂＡｉｉ特異性プローブのハイブリダイゼーションが実施例８で同定された４種のコスミド（これらはｔｃａＢ遺伝子及びｔｃａＣ遺伝子を含む）のいずれでも観察されなかった。コスミド８Ａ１１、２５Ｇ８、及び２６Ｄ１からのＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ（単独または互いの組み合わせ）で消化し、フラグメントをアガロースゲルで分離し、実施例８に記載されたようにしてナイロン膜に移した。
【０１４３】
膜を４．５ｋｂｐフラグメント（プライマーＴＨ−５＋ＴＨ−１７によるＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓゲノムＤＮＡの増幅により生成した）から調製された３２Ｐ標識プローブとハイブリッドを形成した。コスミドＤＮＡ８Ａ１１及び２６Ｄ１から生じたパターンは同膜について同様に切断されたゲノムＤＮＡで生じたパターンと同一であった。コスミド８Ａ１１及び２６Ｄ１はゲノムＴｃｂＡｉｉをコードする遺伝子座の正確な代表であることが結論される。しかしながら、コスミド２５Ｇ８はゲノムＤＮＡよりわずかに大きい単一ＢｇｌＩＩフラグメントを有する。これはベクター内のインサートの位置決めに由来し得る。
【０１４４】
ｔｃｂＡをコードする遺伝子のＤＮＡ配列
コスミド２６Ｄ１の膜ハイブリダイゼーション分析は、４．５ｋｂｐプローブが単一の大きいＥｃｏＲ　１フラグメント（９ｋｂｐより大きい）にハイブリッドを形成することを明らかにした。このフラグメントをゲル精製し、実施例８に記載されたようにしてｐＢＣ　ＫＳ（＋）のＥｃｏＲ　１部位につないでプラスミドｐＢＣ−Ｓ１／Ｒ１を生成した。実施例８に記載された操作を使用して、このプラスミドのインサートＤＮＡの部分ＤＮＡ配列を隣接ベクター配列からの”プライマーウォーキング”により決定した。更に別の配列を先に決定された配列から設計された新規なオリゴヌクレオチドからの延長により生じた。別法により同定されたｔｃｂＡ遺伝子について決定されたＤＮＡ配列（下記の実施例１２に記載されたように本明細書中配列番号１１として開示される）と比較した時に、完全相同性がヌクレオチド１−２７２、３１９−８２６、２５７８−３０３６、及び３０６８−３５４０（合計塩基＝１７１２）について見られた。両方のアプローチがＴｃｂＡｉｉペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを同定するのに使用し得ることが結論された。
【０１４５】
ｔｃｂＡ遺伝子の誘導アミノ酸配列の分析
配列番号１１として同定されたＤＮＡフラグメントの配列は、誘導アミノ酸配列が本明細書中配列番号１２として開示されるタンパク質をコードする。幾つかの特徴がＴｃｂＡｉｉタンパク質をコードする配列としてのその遺伝子の同定を証明する。ＴｃｂＡｉｉＮ末端ペプチド（配列番号１：Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ａｌａ）はアミノ酸８８−１００としてコードされる。ＴｃｂＡｉｉ内部ペプチドＴｃｂＡｉｉ−ＰＴ８１（ａ）（配列番号２３）はアミノ酸１０６５−１０７７としてコードされ、ＴｃｂＡｉｉ−ＰＴ８１（ｂ）（配列番号２４）はアミノ酸１５７１−１５９２としてコードされる。更に、内部ペプチドＴｃｂＡｉｉ−ＰＴ５６（配列番号２２）はアミノ酸１４７４−１４８８としてコードされ、内部ペプチドＴｃｂＡｉｉ−ＰＴ１０３（配列番号２４）はアミノ酸１６１４−１６３９としてコードされる。この遺伝子はＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ・ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ株Ｗ−１４の殺虫剤タンパク質製剤から単離されるようなＴｃｂＡｉｉペプチドをコードする真正クローンであることが自明である。
【０１４６】
ペプチドＴｃｂＡｉｉとして単離されたタンパク質は、更に長いペプチドの開裂から誘導される。この証拠は、ＴｃｂＡｉｉＮ末端ペプチド配列番号１をコードするヌクレオチドが更に長い読み取り枠の２６１塩基（配列番号１１）（８７Ｎ末端近位アミノ酸をコードする）により先行されるという事実により与えられる。この読み取り枠は大きいペプチドＴｃｂＡのＮ末端配列に相当し、かつ本明細書中配列番号１６として開示されるアミノ酸配列Ｍｅｔ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕをコードするヌクレオチドで開始する。ＴｃｂＡはＴｃｂＡｉｉの前駆体タンパク質であると考えられる。
【０１４７】
ｔｃｂＡ遺伝子、ｔｃａＢ遺伝子及びｔｃａＣ遺伝子の関係
ｔｃａＢ遺伝子及びｔｃａＣ遺伝子は密接に関連し、単一ｍＲＮＡとして転写し得る（実施例８）。ｔｃｂＡ遺伝子は、ｔｃａＢクラスター及びｔｃａＣクラスターを宿しているコスミドと明らかに重ならないコスミドで産生される。何となれば、夫々のゲノムライブラリースクリーンが異なるコスミドを同定したからである。しかしながら、ｔｃｂＡ遺伝子とのｔｃａＢ遺伝子及びｔｃａＣ遺伝子によりコードされたアミノ酸配列の比較は相同性の実質的な程度を明らかにする。アミノ酸保存（マックベクターＴＭ配列分析ソフトウェアのタンパク質アラインメントモード、スコアリングマトリックスｐａｍ２５０、ハッシュ値＝２；コダック・サイエンティフィック・イメージング・システムズ，Ｒ−ｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）が図４に示される。図４中の夫々のパネルのスコアラインについて、上カラット（＾）は相同性または保存アミノ酸変化を示し、また下カラット（ｖ）は非相同性を示す。
【０１４８】
この分析は、残基１７３９から１８９４までのＴｃｂＡペプチドのアミノ酸配列がＴｃａＢｉペプチドのアミノ酸４４１−６０３（Ｐ８の全６２７アミノ酸の１６２；配列番号２８）に高度に相同であることを示す。加えて、ＴｃｂＡアミノ酸１９３２−２４５９の配列はペプチドＴｃａＢｉｉのアミノ酸１２−５３１（全５６２アミノ酸の５２０；配列番号３０）に高度に相同である。ＴｃｂＡペプチド（配列番号１２）が２５０５アミノ酸を含むことを考慮すると、それのＣ近位末端にある合計６８４アミノ酸（２７％）はＴｃａＢｉペプチドまたはＴｃａＢｉｉペプチドに相同であり、その相同性が推定ＴｃａＢプレプロテイン（配列番号２６）の配置に共直線状に配置される。ＴｃｂＡ相同性中のサイザブル（ｓｉｚｅａｂｌｅ）ギャップはＴｃａＢプレプロテインのＴｃａＢｉ部分とＴｃａＢｉｉ部分の間の結合と一致する。明らかに、ＴｃｂＡ遺伝子産物及びＴｃａＢ遺伝子産物は進化的に関連し、それらがＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ中で或る種の共通の機能を共有することが提案される。
【０１４９】
実施例１０　Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓブロース中の亜鉛−メタロプロテアーゼの特性決定：プロテアーゼ抑制、分類、及び精製
プロテアーゼ抑制アッセイ及び分類アッセイ：基質として水に溶解したＦＩＴＣ−カゼイン（０．０８％最終アッセイ濃度）を使用して、プロテアーゼアッセイを行った。タンパク質分解反応をＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓブロース２５μｌを含む適当な緩衝液中で２５℃で１時間行った（合計反応容積１５０μｌ）。また、サンプルをジチオスレイトールの存在下及び不在下で分析した。インキュベーション後、等容積の１２％のトリクロロ酢酸を添加して未消化のタンパク質を沈殿させた。０．５時間の沈殿及びその後の遠心分離後に、上澄み１００μｌを９６ウェル・ミクロタイタプレートに入れ、その溶液のｐＨを等容積の４ＮのＮａＯＨの添加により調節した。次いで夫々４８５ｎｍ及び５３８ｎｍの励起波長及び発光波長でフルオロスキャンＩＩフルオロメトリー・プレートリーダーを使用してタンパク質分解を定量した。プロテアーゼ活性をｐＨ５．０−１０．０の範囲で０．５単位の増分で試験した。下記の緩衝液を５０ｍＭの最終濃度で使用した：酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０−６．５）；トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０−８．０）；及びビス−トリスプロパン（ｐＨ８．５−１０．０）。観察された一種以上のプロテアーゼのクラスを同定するために、粗ブロースを種々のプロテアーゼインヒビター（最終濃度０．５μｇ／μｌ）で処理し、次いで上記基質を使用してｐＨ８．０でプロテアーゼ活性について試験した。使用したプロテアーゼインヒビターはＥ−６４（Ｌ−トランス−エポキシサクシニルロイシルアミノ［４−，−グアニジノ］−ブタン）、３，４−ジクロロイソクマリン、ロイペプチン、ペプスタチン、アマスタチン、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）及び１，１０フェナントロリンを含んでいた。
【０１５０】
ｐＨ範囲にわたって行われたプロテアーゼアッセイは、実際に約８．０のｐＨで最大活性を示す一種以上のプロテアーゼが存在することを明らかにした（表１６）。ＤＴＴの添加はプロテアーゼ活性に影響しなかった。次いで粗ブロースを種々のプロテアーゼインヒビターで処理した（表１７）。上記インヒビターによる粗ブロースの処理は１，１０フェナントロリンが５０μｇの最終濃度で添加された時に全プロテアーゼ活性の完全な抑制を生じることを明らかにした。ＩＣ５０は２ｍｇ／ｍｌの粗ブロース溶液１００μｌ中５μｇであった。これらのデータは、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓブロース中に見られる最も多い一種以上のプロテアーゼが酵素の亜鉛−メタロプロテアーゼクラスからのものであることを示す。
【０１５１】
【表１７】
表１６．Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ　（株Ｗ−１４）　の１日目の産生に見られるプロテアーゼ活性に関するｐＨの効果
2004089189.tif 000025
ａ．Ｆｌｕ．単位＝蛍光単位（最大＝約２８，０００；　バックグラウンド＝約２２００）
ｂ．％はｐＨ８．０　における最大に対する活性である。
【０１５２】
【表１８】
表１７．Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ　（株Ｗ−１４）　の１日目の産生に見られるｐＨ８におけるプロテアーゼ活性に関する異なるプロテアーゼインヒビターの効果
2004089189.tif 000026
ａ．修正Ｆｌｕ．単位＝蛍光単位−バックグラウンド（２２００　ｆｌｕ．単位）
ｂ．抑制％はｐＨ８．０　におけるプロテアーゼ活性に対するものである
ｃ．インヒビターをメタノールに溶解した。
ｄ．インヒビターをＤＭＳＯに溶解した。
【０１５３】
Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ毒素について実施例５に記載されたようにして透析された１０−８０％の硫酸アンモニウムを５０ｍＭのＮａ２ＰＯ４、ｐＨ７．０で平衡にされたＱセファロースカラムに適用することにより、亜鉛−メタロプロテアーゼの単離を行った。徹底的な洗浄後に、０−０．５ＭのＮａＣｌ勾配を使用して毒素タンパク質を溶離した。生物活性及びタンパク質の大半を０．１５〜０．４５ＭのＮａＣｌで溶離した。しかしながら、タンパク質分解活性の大半が０．２５−０．３５ＭのＮａＣｌフラクション中に存在し、若干の活性が０．１５−０．３５ＭのＮａＣｌフラクション中に存在することが観察された。０．２５−０．３５ＭのＮａＣｌフラクションのＳＤＳ　ＰＡＧＥ分析は約６０ｋＤａの主要ペプチドバンドを示した。０．１５−０．２５ＭのＮａＣｌフラクションは同様の６０ｋＤａのバンドを含んでいたが、低い相対タンパク質濃度であった。スペロース１２ＨＲ　１６／５０カラムを使用するこのフラクションのその後のゲル濾過はＳＤＳ　ＰＡＧＥ分析により主として（合計の染色タンパク質の９０％より大）５８．５ｋＤａバンドを含む５７．５ｋＤａで移動する主要ピークを生じた。上記の種々のプロテアーゼインヒビターを使用するこのフラクションの付加的な分析は、プロテアーゼが亜鉛−メタロプロテアーゼであることを測定した。醗酵１日目のＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓブロース中に存在するプロテアーゼ活性の殆ど全てが約５８ｋＤａの亜鉛−メタロプロテアーゼに相当した。
【０１５４】
一種以上の亜鉛−メタロプロテアーゼの第二の単離において、３日間にわたって増殖されたＷ−１４Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓブロースを採取し、Ｓｃｈｒｒｌｉｄｔ，Ｔ．Ｍ．，Ｂｌｅａｋｌｅｙ，Ｂ．及びＮｅａｌｓｏｎ，Ｋ．Ｍ．１９８８に記載されたようにしてゼラチンと組み合わされたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用してプロテアーゼ活性を視覚化した。ＳＤＳランニングゲル（５．５ｘ８ｃｍ）を、０．１％のゼラチン最終濃度（バイオラドＥＩＡ銘柄試薬；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ　ＣＡ）を水に溶解後に混入した１２．５％のポリアクリルアミド（アクリルアミド／ビス−アクリルアミドの４０％原液；シグマ・ケミカル社，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）でつくった。ＳＤＳ−スタッキングゲル（１．０ｘ８ｃｍ）を０．１％のゼラチンとまた組み合わされた５％のポリアクリルアミドでつくった。典型的には、試験すべきタンパク質２．５μｇをジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含まないＳＤＳ−ＰＡＧＥ装填緩衝液０．０３ｍｌ中で希釈し、ゲルに装填した。タンパク質をＳＤＳ運転緩衝液（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．１９７０，Ｎａｔｕｒｅ　２２７，６８０）中で０℃で８ｍＡで電気泳動にかけた。
【０１５５】
電気泳動が完結した後、ゲルを２時間にわたって２．５％（ｖ／ｖ）のトリトンＸ−１００中で洗浄した。次いでゲルを１時間にわたって３７℃で０．１Ｍのグリシン（ｐＨ８．０）中でインキュベートした。インキュベーション後、ゲルを固定し、メタノール−酢酸−水（３０：１０：６０、ｖｏｌ．／ｖｏｌ．／ｖｏｌ．；シグマ・ケミカル社）中０．１％のアミドブラックで一夜にわたって染色した。プロテアーゼ活性をタンパク質分解及びその後のとり込まれたゼラチンの拡散のために暗色のアミドブラック染色されたバックグラウンドに対する明るい領域として視覚化した。５８ｋＤａ、４１ｋＤａ、及び３８ｋＤａのタンパク質分解活性により生じた少なくとも三つの異なるバンドが観察された。
【０１５６】
Ｗ−１４の３日培養ブロース中の異なるプロテアーゼの活性アッセイを、基質としての水に溶解されたＦＩＴＣ−カゼイン（０．０２％の最終アッセイ濃度）を使用して行った。タンパク質分解実験を３７℃で０−０．５時間にわたって０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で０．１５ｍｌの全容積中の異なるタンパク質フラクションで行った。反応を水に溶解された１２％のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）の等容積の添加により停止した。室温で０．２５時間のインキュベーション後に、サンプルを１０，０００ｘｇで０．２５時間にわたって遠心分離し、アリコート０．１０ｍｌを除去し、９６ウェル・ミクロタイタプレートに入れた。次いでその溶液を等容積の２Ｎの水酸化ナトリウムの添加により中和し、続いて夫々４８５ｎｍ及び５３８ｎｍの励起波長及び発光波長でフルオロスキャンＩＩフルオロメトリープレートリーダーを使用して定量した。ＦＩＴＣ−カゼインを異なるプロテアーゼ濃度で３７℃で０〜１０分間使用して、活性測定を行った。活性の単位を１０００の蛍光単位／分を生じるのに必要とされる酵素の量と任意に定義し、また比活性をプロテアーゼ１ｍｇ当たりの単位と定義した。
【０１５７】
２種の亜鉛−メタロプロテアーゼインヒビター；１，１０フェナントロリン及びＮ−（ａ−ラムノピラノシルオキシヒドロキシホスフィニル）−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（ホスホルアミドン）を使用して抑制研究を行い、夫々１００％のエタノール及び水に溶解したインヒビターの原液を使用した。原液濃度は典型的には１，１０フェナントロリン及びホスホルアミドンの夫々について１０ｍｇ／ｍｌ及び５ｍｇ／ｍｌであり、インヒビターの最終濃度は反応当たり０．５−１．０ｍｇ／ｍｌであった。全ての亜鉛メタロプロテアーゼのインヒビターである１，１０フェナントロリンによる３日目のＷ−１４粗ブロースの処理は全てのプロテアーゼ活性の完全な排除をもたらし、一方、サーモリシン様プロテアーゼ（Ｗｅａｖｅｒ，Ｌ．Ｈ．，Ｋｅｓｔｅｒ，Ｗ．Ｒ．，及びＭａｔｔｈｅｗｓ，Ｂ．Ｗ．１９７７．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１４，１１９−１３２）のインヒビターであるホスホルアミドンによる処理はプロテアーゼ活性の約５６％低下をもたらした。残留タンパク質分解活性を追加のホスホルアミドンで更に低下することができなかった。
【０１５８】
３日目のＷ−１４Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓブロースのプロテアーゼを以下のようにして精製した。アミコンＭ−１２濾過装置に取り付けられたアミコンらせん形限外濾過カートリッジ型ＳＩＹ１００を使用して、ブロース４．０リットルを濃縮した。アミコンＭ−１２濾過装置に取り付けられたアミコンらせん形限外濾過カートリッジ型ＳＩＹ１００を使用して、サイズ１００ｋＤａ未満の天然タンパク質を有するフロースルー物質（３．８Ｌ）を０．３７５Ｌに濃縮した。レテンテート（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）物質は１０−１００ＫＤａのサイズの範囲のタンパク質を含んでいた。この物質を、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で平衡化されたパーセプチブ・バイオシステム（Ｆｒａｍｉｇｔｏｎ、ＭＡ）ボロスＲ５０ＨＱ強陰イオン交換パッキングを詰め込まれたファーマシアＨＲ１６／１０カラムに装填した。タンパク質を５ｍｌ／分の流量でカラムに装填し、続いてＡ２８０＝０．００まで未結合タンパク質を洗浄した。その後、４０分で０−１．０ＭのＮａＣｌのＮａＣｌ勾配を使用して７．５ｍｌ／分の流量でタンパク質を溶離した。フラクションを上記のようにしてプロテアーゼ活性について分析し、活性フラクションをプールした。タンパク質分解活性フラクションを５０％（ｖ／ｖ）の１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、１０ｍＭのリン酸ナトリウムで平衡にされたファーマシアＨＲ１０／１０モノＱカラムに装填した。カラムをＡ２８０＝０．００まで緩衝液で洗浄した後、１時間にわたって０−０．５ＭのＮａＣｌのＮａＣｌ勾配を使用して２．０ｍｌ／分の流量でタンパク質を溶離した。
【０１５９】
フラクションをプロテアーゼ活性について分析した。最大量のホスホルアミドン感受性プロテアーゼ活性を有するフラクションをプールした（ホスホルアミドン感受性活性は下記のように４１／３８ｋＤａのプロテアーゼのためである）。これらのフラクションは０．１５−０．２５ＭのＮａＣｌの範囲で溶離することがわかった。また、優性のホスホルアミドン非感受性プロテアーゼ活性を含むフラクション、５８ｋＤａのプロテアーゼをプールした。これらのフラクションは０．２５−０．３５ＭのＮａＣｌの範囲で溶離することがわかった。次いでホスホルアミドン感受性プロテアーゼフラクションをミリポア・ウルトラフリーＲ−１５遠心分離フィルター装置バイオマックス−５Ｋ　ＮＭＷＬ膜を使用して０．７５ｍｌの最終容積に濃縮した。この物質を、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）／０．１ＭのＮａＣｌ中で平衡にされたファーマシア・セファデックスＧ−５０で詰め込まれたファーマシアＨＲ１０／３０カラムに０．５ｍｌ／分の流量で適用した。次いで最高のホスホルアミドン感受性プロテアーゼ活性を有するフラクションをプールし、ミリポア・ウルトラフリーＲ−１５遠心分離フィルター装置バイオマックス−５０Ｋ　ＮＭＷＬ膜で遠心分離した。上記のタンパク質分解活性分析は、この物質がホスホルアミドン感受性プロテアーゼ活性のみを有することを示した。ホスホルアミドン非感受性プロテアーゼ、５８ｋＤａのタンパク質をプールし、続いて、ミリポア・ウルトラフリーＲ−１５遠心分離フィルター装置バイオマックス−５０Ｋ　ＮＭＷＬ膜中で濃縮し、ファーマシア・スーパーデックス−７５カラムで更に分離した。プロテアーゼを含むフラクションをプールした。
【０１６０】
精製された５８ｋＤａ及び４１／３８ｋＤａの精製されたプロテアーゼの分析は、両方の型のプロテアーゼが１，１０フェナントロリンで完全に抑制されるが、４１／３８ｋＤａのプロテアーゼのみがホスホルアミドンで抑制されることを明らかにした。粗ブロースの更なる分析は、１日目のＷ−１４ブロースのプロテアーゼ活性が４１／３８ｋＤａのプロテアーゼのために全プロテアーゼ活性の２３％を有し、３日目のＷ−１４ブロースで４４％に増大することを示した。
タンパク質純度を試験し、アミノ末端配列を得るための通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、インテグレーテッド・セパレーション・システムズ（Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）から購入した４−２０％の勾配ミニプラス・セプラゲルズを使用して行った。アミノ末端配列決定すべきタンパク質を下記の精製後にＰＶＤＦ膜にブロットし（プロブロットＴＭ膜；アプラィド・バイオシステムズ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、０．１％のアミドブラックで視覚化し、切除し、配列決定のためにケンブリッジ・プロケム（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）に送った。
【０１６１】
３日経過したＷ−１４ブロースからの５８ｋＤａ（配列番号４５）及び４１／３８ｋＤａ（配列番号４４）のプロテアーゼの演繹アミノ末端配列は夫々ＤＶ−ＧＳＥＫＡＮＥＫＬＫ（配列番号４５）及びＤＳＧＤＤＤＫＶＴＮＴＤＩＨＲ（配列番号４４）であった。
４１／３８ｋＤａのプロテアーゼの配列決定は幾つかのアミノ末端を明らかにし、夫々の末端がタンパク質分解により除去される付加的なアミノ酸を有する。３８ｋＤａ及び４１ｋＤａのポリペプチドに関する一次配列、二次配列、三次配列及び四次配列の試験は先に示された配列の演繹を可能にし、これらの２種のプロテアーゼが相同であることを明らかにした。
【０１６２】
実施例１１、パートＡ
ＴｃｂＡペプチドをコードする遺伝子に関する抗体の使用によるＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓゲノムライブラリーのスクリーニング
上記配列決定と平行して、好適な探査及び配列決定をＴｃｂＡｉｉペプチド（配列番号１）に基いて行った。上記実施例１及び２に記載されたようにしてバクテリア培養ブロースを調製し、その毒素を精製することにより、この配列決定を行った。
ゲノムＤＮＡをグレースの昆虫組織培地中で増殖したＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ・ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ株Ｗ−１４から単離した。バクテリアを２５０ｍｌの三角フラスコ中で２８℃で２５０ｒｐｍで約２４時間にわたって培地５ｍｌ中で増殖した。培地１００ｍｌからのバクテリア細胞を５０００ｘｇで１０分間にわたってペレットにした。上澄みを捨て、次いで細胞ペレットをゲノムＤＮＡ単離に使用した。
Ａｕｓｕｂｅｌ（上記文献）の節２．４．３に記載陛れたＣＴＡＢ方法の改良を使用して、ゲノムＤＮＡを単離した。工程６中に”バクテリアゲノムＤＮＡの大規模ＣｓＣｌ　ｐｒｅｐ”と題する節に従った。この時点で、付加的なクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）抽出を行い、続いてフェノール／クロロホルム／イソアミル（２５：２４：１）抽出工程及び最後のクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）抽出を行った。
【０１６３】
ＤＮＡを０．６容積のイソプロパノールの添加により沈殿させた。沈殿したＤＮＡをフッキングし、曲げたガラス棒の端部のわまりに巻付け、最終洗浄液としての７０％のエタノールに素早く浸漬し、ＴＥ緩衝液３ｍｌに溶解した。
２８０／２６０ｎｍにおける光学密度により推定したＤＮＡ濃度は約２ｍｇ／ｍｌであった。
このゲノムＤＮＡを使用して、ライブラリーを調製した。
ゲノムＤＮＡ約５０μｇをＳａｕ３Ａ１で部分消化した。次いでＮａＣｌ密度勾配遠心分離を使用して部分消化されたＤＮＡフラグメントをサイズ分別した。アガロースゲル電気泳動により測定して１２ｋｂ以上の平均サイズを有するＤＮＡフラグメントを含むフラクションをプラスミドＢｌｕＳｃｒｉｐｔ（ストラタゲン，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）につなぎ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５αまたはＤＨＢ１０株に形質転換した。
別に、そのタンパク質の精製アリコートをタンパク質に対するモノクローナル抗体の産生についてウィスコンシン大学（Ｍａｄｉｓｏｎ）にあるバイオテクノロジーハイブリドーマセンターに送った。送られた物質は６５℃で変性された天然バンド１及び２を含むＨＬＰＣ精製フラクションであり、その２０μｇを４匹のマウスの夫々に注射した。未免疫マウスからの脾臓細胞を安定なミエローマ細胞系と融合した後、安定なモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系を回収した。モノクローナル抗体をハイブリドーマから回収した。
【０１６４】
別に、天然アガロースゲル精製バンド１（実施例１を参照のこと）を採取することによりポリクローナル抗体を生じ、次いでそのタンパク質を使用してニュージーランド白ウサギを免疫した。バンドを天然アガロースゲルから切除し、ゲル片を６５℃に素早く加熱してアガロースを融解し、アジュバントで直ちに乳化することによりタンパク質を調製した。フロイント完全アジュバントを一次免疫化に使用し、フロイント不完全を１ケ月間隔で３回の追加の注射に使用した。夫々の注射について、タンパク質５０〜１００マイクログラムを含む乳化バンド１約０．２ｍｌを多皮下注射によりウサギの背中に送出した。最初の注射の１０日後に血清を得、追加の採血を３週間にわたって毎週行った。血清補体を５６℃で１５分間加熱することにより不活化し、次いで−２０℃で貯蔵した。
次いでモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を使用して、エピトープにより検出し得る抗原の発現についてゲノムライブラリーをスクリーニングした。陽性クローンをニトロセルロースフィルターコロニーリフトで検出した。陽性クローンのイムノブロット分析を試みた。
【０１６５】
イムノブロット及びサザン分析の両方により特定されたクローンの分析はクローンの５種のクラスの暫定的な分析をもたらした。
クローンの第一クラス中に、ここでＴｃｂＡｉｉと称されるペプチドをコードする遺伝子があった。この遺伝子の完全ＤＮＡ配列（ＴｃｂＡ）を得た。それが配列番号１１として示される。その配列が配列番号１の内部配列をコードするという確認は、配列番号１１の読み取り枠により生じた演繹アミノ酸配列からアミノ酸番号８８にある配列番号１の存在により実証される。これは配列番号１２を参照することにより確認でき、これは配列番号１１により生じた演繹アミノ酸配列である。
毒素ペプチドの第二クラスはＴｃａＢｉ、ＴｃａＢｉｉ及びＴｃａＣと上記されたセグメントを含む。ポリクローナル抗血清によるライブラリーのスクリーニング後に、毒素遺伝子のこの第二クラスを異なるサイズのタンパク質を産生する幾つかのクローンにより同定し、これらの全てがイムノブロットでポリクローナル抗体と交差反応し、またサザンブロットでＤＮＡ相同性を共有することがわかった。配列比較は、それらが上記ＴｃａＢ及びＴｃａＣと称される遺伝子複合体に属することを明らかにした。
【０１６６】
また、抗体毒素クローンの三つのその他のクラスをポリクローナルスクリーンで単離した。これらのクラスはポリクローナル抗体と交差反応するタンパク質を産生し、またサザンブロッティングにより測定されるようにこれらのウラスとＤＮＡ相同性を共有した。これらのクラスがクラスＩＩＩ、クラスＩＶ及びクラスＶと称された。また、クラスＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶと交差反応したモノクローナルを同定することが可能であった。これは、全てが高いタンパク質相同性の領域を有することを示唆する。こうして、Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ細胞外タンパク質遺伝子は進化的に関連している遺伝子のファミリーに相当する。
この生物中に含まれる毒素ペプチドに進化的に関連する変化があり得るという概念を更に押し進めるために、二つのアプローチを試みて関連タンパク質の存在についてＰ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓのその他の株を試験した。これをゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅並びにポリクローナル抗体及び及びモノクローナル抗体を使用するイムノブロット分析の両方により行った。
結果は、関連タンパク質がＰ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ株ＷＸ−２、ＷＸ−３、ＷＸ−４、ＷＸ−５、ＷＸ−６、ＷＸ−７、ＷＸ−８、ＷＸ−１１、ＷＸ−１２、ＷＸ−１５及びＷ−１４により産生されることを示す。
【０１６７】
実施例１１、パートＢ
クラスＩＩＩ毒素クローン−ｔｃｃの配列及び分析
更なるＤＮＡ配列決定を実施例１１、パートＡに記載されたクラスＩＩＩ　Ｅ．ｃｏｌｉクローンから単離されたプラスミドについて行った。ヌクレオチド配列はこのゲノム遺伝子座で三つの近くに結合された読み取り枠であることが示された。この遺伝子座をｔｃｃと称し、三つの読み取り枠をｔｃｃＡ配列番号５６、ｔｃｃＢ配列番号５８及びｔｃｃＣ配列番号６０と称する（図６Ｂ）。
ｔｃｃＡ読み取り枠からの演繹アミノ酸は、その遺伝子が１０５，４５９Ｄａのタンパク質をコードすることを示す。このタンパク質をＴｃｃＡと称した。このタンパク質の最初の１２アミノ酸は、毒素複合体の一部として先に同定された、１０８ｋＤａのタンパク質、配列番号７から得られたＮ末端配列と適合する。
ｔｃｃＢ読み取り枠からの演繹アミノ酸は、この遺伝子が１７５，７１６Ｄａのタンパク質をコードすることを示す。このタンパク質をＴｃｃＢと称した。このタンパク質の最初の１１アミノ酸は、１８５ｋＤａの推定分子量を有するタンパク質、配列番号８から得られたＮ末端配列と適合する。
ｔｃｃＣの演繹アミノ酸配列は、この読み取り枠が１１１，６９４Ｄａのタンパク質をコードすることを示し、そのタンパク質産物をＴｃｃＣと称した。
【０１６８】
実施例１２
Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株の特性決定
本明細書に記載されたコレクションがｒｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株を含むことを証明するために、これらの株をＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓの特徴であり、かつそれをその他の腸内細菌科及びキセノラブダスｓｐｐ．（Ｆａｒｍｅｒ，Ｊ．Ｊ．１９８４．Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍｌｃ　Ｂａｃｔｅ−ｒｉｏｌｏｇｙ，１巻，５１０−５１１頁（ＫｒｅｉｇＮ．Ｒ．及びＨｏｌｔ，Ｊ．Ｇ．編集）．Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ．；Ａｋｈｕｒｓｔ及びＢｏｅｍａｒｅ，１９８８，Ｂｏｅｆｒｌａｒｅら，１９９３）から区別する認識された微生物学的形質に関して評価した。これらの特徴的な形質は以下のとおりである。グラム染色陰性ロッド、幅０．５−２μｍ及び長さ２−１０μｍの生物サイズ、赤色／黄色のコロニー着色、結晶性封入体の存在、カタラーゼの存在、硝酸塩を還元できないこと、生物発光の存在、成長培地から色素を吸収できること、プロテアーゼ産生について陽性、３７℃未満の成長温度範囲、嫌気性条件下の生存及び積極的な運動（表１８）。基準のエシェリキア・コリ株、キセノラブダス株及びＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株を比較のために全ての試験に入れた。総合の結果は、全ての株が腸内細菌科及びＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ属の一部であることと合致する。
【０１６９】
ルミノメーターを使用して夫々の株の生物発光を証明し、発色の定量的かつ相対的測定を得た。相対的な発光単位の測定について、夫々の株からのブロース（細胞及び培地）を培養液中の接種後の三つの時間間隔（６、１２、及び２４時間）で測定し、バックグラウンド明度（未接種の培地及び水）と比較した。種々のブロースからの発光の測定の前に、シパー（ｓｉｐｐｅｒ）セルを使用するギルフォード・システムズ（Ｏｂ−ｅｒｌｉｎ，ＯＨ）スペクトロメーター中で吸光度（５６０ｎＭ）を測定することにより細胞密度を確かめた。次いで明度を測定する前に適当な希釈を行った（光学密度を１．０単位に基準化するため）。次いで希釈したブロースのアリコートをキュベット（夫々３００μｌ）に入れ、バイオーオービット１２５１ルミノメーター（Ｂｉｏ−Ｏｒｂｉｔ　Ｏｙ，Ｔｗｉｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）中で読み取った。夫々のサンプルに関する組込み時間は４５秒であった。サンプルを連続的に混合（じゃま板付きキュベット中で回転させた）し、その間に読み取って酸素利用能を得た。陽性試験をバックグラウンドルミネセンスの５倍以上（約５−１０単位）であると決めた。加えて、コロニー明度を写真フィルムオーバーレイで検出し、暗室中の適合後に目視で検出した。夫々の株のグラム染色特性を、グラム染色コントロールスライド（フィッシャー・サイエンティフィック，Ｐｉｔｔｓ−ｂｕｒｇｈ，ＰＡ）と一緒に使用した市販のグラム染色キット（ＢＢＬ，Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で確かめた。
【０１７０】
次いでツァイス顕微鏡（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）１００Ｘオイル浸漬対物レンズ（１０Ｘ接眼倍率及び２Ｘ本体倍率）を使用して顕微鏡評価を行った。生物サイズ、細胞の記載及び封入体（対数期増殖後の封入体）に関する個々の株の顕微鏡試験を、オイル浸漬による湿潤取付けスライド（１０Ｘ接眼倍率、２Ｘ本体倍率及び４０Ｘ対物倍率）及びマイクロメーターを含む位相差顕微鏡（Ａｋｈｕｒｓｔ，Ｒ．Ｊ．及びＢｏｅｍａｒｅ，Ｎ．Ｅ．１９９０．Ｅｎｔｏｍｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　Ｎｅｍａｔｏｄｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｇａｕｇｌｅｒ，Ｒ．及びＫａｙａ，Ｈ．編集）．７５−９０頁．ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，ＵＳＡ．；Ｂａｇｈｄｉ−ｇｕｉａｎ　Ｓ．，Ｂｏｙｅｒ−Ｇｉｇ１ｉｏＭ．Ｈ．，Ｔｈａｌｅｒ，Ｊ．Ｏ．，Ｂｏｎｎｏｔ　Ｇ．，Ｂｏｅｍａｒｅ，Ｎ．１９９３．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ　７９，１７７−１８５）を使用して行った。コロニー着色をラベル指示により調製されたバクト栄養寒天（ジフコ・ラボラトリーズ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）に接種後に観察した。インキュベーションが２８℃で起こり、５−７日後に記載を生じた。酵素カタラーゼの存在について試験するために、試験生物のコロニーを栄養寒天プレートから小さいプラグで除去し、ガラス試験管の底部に入れた。家庭用過酸化水素溶液１ｍｌを管の側面を下に穏やかに添加した。気泡（推定上、酸素）が直ちにまたは５秒以内に現れた時に陽性反応を記録した。
【０１７１】
また、未接種栄養寒天及び過酸化水素溶液の対照を試験した。硝酸塩還元について試験するために、夫々の培養物をバクトニトレートブロース［ジフコ・ラボラトリーズ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ］１０ｍｌに接種した。２８℃で２４時間のインキュベーション後に、亜硝酸塩生成を２滴のスルファニル酸試薬及び２滴のα−ナフチルアミン試薬の添加により試験した（ジフコ・マニアル、第１０編、ジフコ・ラボラトリーズ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，１９８４を参照のこと）。明瞭なピンク色または赤色の発生が硝酸塩からの亜硝酸塩の生成を示す。成長培地から色素を吸収する夫々の株の能力を色素ニュートラル・レッドを含むバクト・マッコンキィ寒天；色素ブロモチモール・ブルーを含むバクト・タージトール−７寒天及び色素エオシン−Ｙを含むバクトＥＭＢ寒天（ジフコ・ラボラトリーズ，Ｄｅｔｒｏｌｔ，ＭＩからの寒天、全てをラベル指示に従って調製した）で試験した。これらの培地への接種後に、色素吸収を２８℃で５日のインキュベーション後に記録した。これらの後者の培地における成長が腸内細菌科の員に特徴的である。夫々の株の運動性を、ラベル指示に従って調製されたバクト運動性試験培地（ジフコ・ラボラトリーズ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）の溶液を使用して試験した。バット−スタブ（ｂｕｔｔ−Ｓｔａｂ）接種を夫々の株を用いて行い、運動性を接種物のラインから広がる成長の拡散ゾーンにより巨視的に判断した。多くの場合、運動性をまた湿潤取付けスライドのもとに培養液から顕微鏡で観察した。
【０１７２】
夫々の株に関する生化学的栄養評価を、ＢＢＬエンテロチューブＩＩ（ベントン、ディキンソン、ドイツ）を使用して行った。インキュベーションを２８℃で５日おこなった以外は製品指示に従った。結果はＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓに関する先の引用論文と一致した。プロテアーゼの産生を、ラベル指示に従ってつくられたバクトゼラチン（ジフコ・ラボラトリーズ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）プレートを使用してゼラチンの加水分解を観察することにより試験した。培養物を接種し、プレートを２８℃で５日間インキュベートした。異なる温度における成長を評価するために、寒天プレート［脱イオン水中２％のバクト寒天（ジフコ、Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）を含む２％のプロテオースペブトン＃３］を接種物の共通の源からストリーキングした。プレートをネスコＲフィルムでシールし、３週間までにわたって２０℃、２８℃及び３７℃でインキュベートした。３７℃で成長を示さないプレートは２８℃のインキュベーターに１週間移した後に細胞生存度を示さなかった。Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株に関する酸素要求を下記の方法で試験した。液体チオグリコレートブロース培地（ジフコ、Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）へのバット−スタブ接種を行った。管を室温で１週間インキュベートし、次いで培養物を成長の型及び程度について試験した。指示薬レサズリンは培地酸化のレベルまたは好気生活ゾーンを示す（ジフコ・マニュアル、第１０編、ジフコ・ラボラトリーズ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）。試験したＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株について得られた成長ゾーン結果は条件的嫌気性微生物の結果と一致した。
【０１７３】
【表１９】
表１８ホトルハブダス株の分類学的形質
評価した形質＊
2004089189.tif 000027
【０１７４】
【表２０】
表１８．つづき
2004089189.tif 000028
＊　−　Ａ＝グラム染色、Ｂ＝結晶性封入体、Ｃ＝生物発光性、Ｄ＝細胞形態、Ｅ＝運動性、Ｆ＝硝酸塩還元、Ｇ＝カタラーゼの存在、Ｈ＝ゼラチン加水分解、Ｉ＝色素吸収、Ｊ＝着色、Ｋ＝ＥＭＢ寒天における成長、Ｌ＝マッコンキィ寒天における成長、Ｍ＝タージトール−７寒天における成長、Ｎ＝条件的嫌気性、Ｏ＝２０℃における成長、Ｐ＝２８℃における成長、Ｑ＝３７度における成長、ａ：＋　＝形質について陽性、−　＝形質について陰性，ｒｄ＝棒状、Ｓ＝属ディスクリプター内のサイズ、ＲＯ＝赤色−オレンジ、ＬＲ＝明るい赤色、Ｒ＝赤色、Ｏ＝オレンジ、Ｙ＝黄色、Ｔ＝褐色、ＬＹ＝明るい黄色、ＹＴ＝黄褐色およびＬＯ＝明るいオレンジについて陽性または陰性
【０１７５】
細胞脂肪酸分析は属レベル及び種レベルでバクテリア特性決定について認められた手段であり（Ｔｏｒｎａｂｅｎｅ，Ｔ．Ｇ．１９８５．Ｌｉｐｉｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｔｏ　Ｃｈｅｍｏｔａｘｏｎｏｍｙ　ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１８巻，２０９−２１４．；Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，Ｍ．及びＯ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ａ．Ｇ．１９９３．Ｒｏｏｔｓ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ　ｉｎ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆＮｅｗ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，Ｍ．及びＯ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ａ．Ｇ．編集）３−５４頁Ｌｏｎｄｏｎ：Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｔｄ．）（これらの文献が参考として本明細書に含まれる）、これらを使用して本発明者らのコレクションが属レベルで関連することを確かめた。培養物を、微生物ＩＤ（ＭＩＤＩ，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ，ＵＳＡ）微生物同定系（ＭＩＳ）を使用する脂肪酸メチルエステル分析（ＦＡＭＥ）のために外部の契約研究所に輸送した。ＭＩＳ系は２５ｍｍｘ０．２ｍｍの５％のメチルフェニルシリコーン石英シリカキャピラリーカラムを備えたヒューレット・パッカードＨＰ５８９０Ａガスクロマトグラフからなる。水素をキャリヤーガスとして使用し、炎イオン化検出器が自動サンプラー、インテグレーター及びコンピューターと協力して機能する。コンピューターはサンプル脂肪酸メチルエステルを微生物脂肪酸ライブラリー及び既知脂肪酸の較正混合物と比較する。契約研究所により選択されたように、株を分析の前にトリプチカーゼ大豆寒天で２８℃で２４時間増殖した。サンプルの抽出を通常のＦＡＭＥ方法に従って契約研究所により行った。Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ以外のｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓバクテリアグループについて株の直接の同定がなかった。クラスター分析（これは分離物のグループの脂肪酸プロフィールを比較する）を行った時、株脂肪酸プロフィールが属レベルで関連していた。
【０１７６】
本発明者らのコレクション中のＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株の進化上の多様性を、夫々の株からのゲノムＤＮＡを使用してＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）媒介ゲノムフィンガープリンティングの分析により測定した。この技術は種々のバクテリア種のゲノム中に存在する反復ＤＮＡ配列のファミリーに基いている（Ｖｅｒｓａｌｏｖｉｃ，Ｊ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｍ．，ＤＥＢｒｕｉｊｎ，Ｆ．Ｊ．及びＬｕｐｓｋｉ，Ｊ．Ｒ．１９９４．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５，２５−４０に概説されている）。これらの三つ、反復遺伝子外パリンドーム配列（ＲＥＰ）、腸内細菌の反復遺伝子内コンセンサス（ＥＲＩＣ）及びＢＯＸ要素がバクテリアゲノムの編成に重要な役割を果たすものと考えられる。ゲノム編成は選択により成形されるものと考えられ、密接に関連するバクテリア株のゲノム内のこれらの要素の差別的な分散がこれらの株を区別するのに使用し得る（例えば、Ｌｏｕｗｓ，Ｆ．Ｊ．，Ｆｕｌｂｒｉｇｈｔ，Ｄ．Ｗ．，Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｃ．Ｔ．及びＤＥＢｒｕｉｊｎ，Ｆ．Ｊ．１９９４．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ．６０，２２８６−２２９５．）。Ｒｅｐ−ＰＣＲはこれらの反復配列に相補性のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してそれらの間にある可変サイズのＤＮＡフラグメントを増幅する。得られた産物を電気泳動により分離して夫々の株についてＤＮＡ”フィンガープリント”を確立する。
【０１７７】
本発明者らの株からゲノムＤＮＡを単離するために、細胞ペレットをＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中で最終容積１０ｍｌに再度懸濁させ、次いで５ＭのＮａＣｌ　１２ｍｌを添加した。この混合物を１５，０００ｘｇで２０分間遠心分離した。得られるペレットをＴＥ５．７ｍｌ中で再度懸濁させ、１０％のＳＤＳ３００μ１及び２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（ギブコＢＲＬプロダクツ，Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）６０μｌを添加した。この混合物を３７℃で１時間インキュベートし、次いでリゾチーム約１０ｍｇを添加し、その混合物を更に４５分間インキュベートした。次いで５ＭのＮａＣｌ　１ｍｌ及びＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液（１０％ｗ／ｖのＣＴＡＢ、０．７ＭのＮａＣｌ）８００μｌを添加し、その混合物を６５℃で１０分間にわたって穏やかに攪拌してインキュベートし、次いで更に２０分間にわたってインキュベートし、攪拌して細胞物質の透明化を助けた。等容積のクロロホルム／イソアミルアルコール溶液（２４：１、ｖ／ｖ）を添加し、穏やかに混合し、次いで遠心分離した。次いで２回の抽出を等容積のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（５０：４９：１）を用いて行った。ゲノムＤＮＡを０．６容積のイソプロパノールで沈殿させた。沈殿したＤＮＡをガラス棒で除去し、７０％のエタノールで２回洗浄し、乾燥させ、ＳＴＥ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）２ｍｌに溶解した。
【０１７８】
次いでＤＮＡを２６０ｎｍにおける光学密度により定量した。ＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓゲノムＤＮＡのｒｅｐ−ＰＣＲ分析を行うために、下記のプライマーを使用した。ＲＥＰ１Ｒ−Ｉ；５’−ＩＩＩＩＣＧＩＣＧＩＣＡＴＣＩＧＧＣ−３’及びＲＥＰ２−Ｉ；５’−ＩＣＧＩＣＴＴＡＴＣＩＧＧＣＣＴＡＣ−３’。下記の２５μｌの反応液を使用してＰＣＲを行った。７．７５μｌのＨ２Ｏ、２．５μｌの１０Ｘ　ＬＡ緩衝液（パンベラ・コーポレーション，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、１６μｌのｄＮＴＰ混合物（夫々２．５ｍＭ）、１μｌの夫々のプライマー（５０ｐＭ／μｌ）、１μｌのＤＭＳＯ、１．５μｌのゲノムＤＮＡ（０．０７５−０．４８０μｇ／μｌの範囲の濃度）及び０．２５μｌのタカラＥＸ　Ｔａｑ（パンベラ・コーポレーション，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。
【０１７９】
下記の条件を使用してＰＣＲ増幅をパーキン・エルマーＤＮＡサーマル・サイクラー（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）中で行った。９５℃／７分、次いて９４℃／１分、４４℃／１分、６５℃／８分、続いて６５℃で１５分の３５サイクル。サイクル後に、反応液２５μｌを６Ｘゲル装填緩衝液（Ｈ２Ｏ中０．２５％のブロモフェノールブルー、４０％ｗ／ｖの蔗糖）５μｌに添加した。次いで１５ｘ２０ｃｍの１％アガロースゲルを、夫々の反応液８μｌを使用してＴＢＥ緩衝液（０．０９Ｍのトリス−ボレート、０．００２ＭのＥＤＴＡ）中で実験した。ゲルを４５ｖで約１６時間実験した。次いでゲルを２０μｇ／ｍｌの臭化エチジウム中で１時間にわたって染色し、ＴＢＥ緩衝液中で約３時間にわたって脱色した。次いでゲルのポラロイド（登録商標）写真をＵＶ照明下で撮影した。夫々の株に関する特定サイズのバンドの存在または不在を写真からスコアに付け、数値分類学ソフトウェアプログラム、ＮＴＳＹＳ−ｐｃ（エクセター・ソフトウェア、Ｓｅｔａｕｋｅｔ，ＮＹ）に類似性マトリックスとして入力した。
【０１８０】
同時に評価したＥ．ｃｏｌｉ株ＨＢ１０１及びキサントモナス・オリザエｐｖ．オリザエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｏｒｙｚａｅ　ｐｖ．ｏｒｙｚａｅ）の対照は公表された論文（Ｖｅｒｓａｌｏｖｉｃ，Ｊ．，Ｋｏｅｕｔｈ，Ｔ．及びＬｕｐｓｋｉ，Ｊ．Ｒ．１９９１．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９，６８２３−６８３１；Ｖｅｒａ　Ｃｒｕｚ，Ｃ．Ｍ．，Ｈａｌｄａ−Ａｌｉｊａ，Ｌ．，Ｌｏｕｗｓ，Ｆ．，Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｄ．Ｚ．，Ｇｅｏｒｇｅ，Ｍ．Ｌ．，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．，ＤＥ　Ｂｒｕｉｊｎ，Ｆ．Ｊ．，Ｒｉｃｅ，Ｃ．及びＬｅａｃｈ，Ｊ．Ｅ．１９９５．Ｉｎｔ．Ｒｉｃｅ　Ｒｅｓ．Ｎｏｔｅｓ，２０，２３−２４；Ｖｅｒａ　Ｃｒｕｚ，Ｃ．Ｍ．，Ａｒｄａｌｅｓ，Ｅ．Ｙ．，Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｄ．Ｚ．，Ｔａｌａｇ，Ｊ．，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｌｏｕｗｓ，Ｆ．Ｊ．，Ｌｅｕｎｇ，Ｈ．，Ｍｅｗ，Ｔ．Ｗ．及びＬｅａｃｈ，Ｊ．Ｅ．１９９６．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ（夫々、印刷中））に一致するＰＣＲ”フィンガープリント”を生じた。次いでＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株からのデータをＮＴＳＹＳ−ｐｃ内の一連のプログラム；ＳＩＭＱＵＡＬ（定性データに関する類似性）で分析して類似性係数（ジャカード係数を使用する）及びＳＡＨＮ（連続の凝集性のヘアアーチカル（Ｈｅｉｒａｒｃｈｉｃａｌ）かつ巣状（Ｎｅｓｔｅｄ））クラスタリング［ＵＰＧＭＡ（算術平均による未計量のペアーグループ方法）方法を使用する］のマトリックス（これは関連株をグルーピングし、フェノグラム（図５）として表し得る）を生じた。ＣＯＰＨ（コフェネチック（ｃｏｐｈｅｎｅｔｉｃ）値）プログラム及びＭＸＣＯＭＰ（マトリックス比較）プログラムを使用してコフェネチック値マトリックスを生じ、これとクラスタリングが基いている初期のマトリックスの間の相関関係を比較した。得られる基準化マンテル統計値（ｒ）を生じ、これはクラスター分析の適合度の目安である（ｒ＝０．８−０．９は非常に良好な適合を表す）。本発明者らの場合、ｒは０．９１９である。それ故、本発明者らのコレクションはＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ属の代表的な容易に区別できる株の多様なグループを含む。
【０１８１】
実施例１３　　種々のＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株により産生された一種以上の毒素の殺虫剤実用性
種々のＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株の初期の”種子”培養物を、２％のプロテオースペプトン＃３（ＰＰＳ）（ジフコラボラトリーズ、Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）液体培地１７５ｍｌにカプット（Ｋａｐｕｔ）で覆われたデロング（Ｄｅｌｏｎｇ）口を有する三つのじゃま板付きフラスコ５００ｍｌ中で一次変異体サブクローンを接種することにより生じた。夫々の種子培養の接種物はオイル−オーバーレイ寒天スラント培養物またはプレート培養物に由来した。接種後に、これらのフラスコをロータリー・シェーカーで１６時間にわたって２８℃で１５０ｒｐｍでインキュベートした。次いでこれらの種子培養物を夫々の株の所定の醗酵のための一様な接種源として使用した。更に、後対数期の種子培養物を無菌鉱油でオーバーレイし、将来の再懸濁のために無菌マグネチック攪拌棒を加え、培養物を暗所で室温で貯蔵して、毒素応答状態で接種物の長期保存を得た。
【０１８２】
生産ブロースを、新しい２％のＰＰ３培地に１％の活発に成長している種子培養物（例えば、新しい培地１７５ｍｌ当たり１．７５ｍｌ）を添加することにより接種した。ブロースの生産は５００ｍｌの三つのじゃま板付きフラスコ（上記を参照のこと）、またはシリコンフォームクロージャーで覆われた２８００ｍｌのじゃま板付き凸形底部のフラスコ（体積５００ｍｌ）中で起こった。生産フラスコを上記条件下で２４〜４８時間インキュベートした。インキュベーション後に、ブロースを無菌の１Ｌのポリエチレンびんに分配し、１０℃で１時間にわたって２６００ｘｇで回転させ、細胞及びデブリペレットからデカントした。次いで液体ブロースをワッマンＧＦ／Ｄ（２．７μＭ保持）及びＧＦ／Ｂ（１．０ｐＭ保持）ガラスフィルターにより真空濾過してデブリを除去した。更なるブロース浄化を、０．５μＭのオープンーチャンネルフィルターを使用して接線方向の流れの微量濾過装置（ポール・フィルトロン、Ｎｏｒｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）で得た。必要な場合、付加的な浄化を、ブロースを（４℃に）冷却し、数時間にわたって２６００ｘｇで遠心分離することにより得ることができた。これらの操作後に、０．２μＭのニトロセルロース膜フィルターを使用してブロースをフィルター滅菌した。次いで無菌ブロースを生物学的アッセイ、生化学的分析に直接使用し、または１０，０００ＭＷカット−オフのＭ１２限外濾過装置（アミコン，Ｂｅｖｅｒｌｙ　ＭＡ）または１０，０００ＭＷ孔サイズを有する遠心分離濃縮機（ミリポア，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ及びポール・フィルトロン、Ｎｏｒｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を使用して濃縮した。遠心分離濃縮機の場合、ブロースを約２時間にわたって２０００ｘｇで回転させた。１０，０００ＭＷの透過物を相当する保持物に添加して１０，０００ＭＷより大きい成分の所望の濃縮を得た。処理されたブロースサンプルの熱不活化を、サンプルを１０分間にわたって砂充填加熱ブロック中で１００℃で加熱することにより得た。
【０１８３】
異なるＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株からの一種以上のブロース及び一種以上の毒素複合体は昆虫の集団を減少するのに有益であり、昆虫の遺伝子座に有効な昆虫不活化量の活性な記載された物質を適用することを含む昆虫集団の抑制方法に使用された。上記のようにして醗酵されたＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株の選択されたグループのブロースから観察された殺虫活性の幅の実証が表１９に示される。付加的な殺虫活性はブロースの増大された濃度により、または異なる醗酵方法を使用することによりこれらの株で検出し得ることが可能である。タンパク質と関連する活性と一致して、試験した全ての株の殺虫活性は熱不安定であった（上記を参照のこと）。
【０１８４】
種々のＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株からの一種以上の培養ブロースは幾つかの昆虫に対し異なる殺虫活性（死亡率及び／または成長抑制、減少された成体発生）を示す。更に詳しくは、その活性はコーン・ルートワーム（ｃｏｒｎ　ｒｏｏｔｗｏｒｍ）幼虫及びボール・ウィービル（ｂｏｌｌ　ｗｅｅｖｉｌ）幼虫（これらは昆虫目コレオプテラ（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）の員である）に対して見られる。コレオプテラのその他の員として、コメツキムシ幼虫、花粉カブトムシ、ノミハムシ、種子カブトムシ及びコロラド・ジャガイモカブトムシが挙げられる。また、活性がアスター・リーフホッパー（ａｓｔｅｒ　ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ）及びコーン・プラント・ホッパー（ｃｏｒｎ　ｐｌａｎｔ　ｈｏｐｐｅｒ）に対し観察され、これらはホモプテラ（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ）目の員である。ホモプテラのその他の員として、プラントホッパー（ｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ）、ピア・プシラ（ｐｅａｒ　ｐｓｙｌｌａ）、アップル・サッカー（ａｐｐｌｅ　ｓｕｃｋｅｒ）、カイガラムシ、コナジラミ、スピトル・バッグ（ｓｐｉｔｔｌｅ　ｂｕｇｓ）並びに多数の宿主特異性アリマキ種が挙げられる。また、ブロース及び一種以上の精製毒素複合体はタバコ・バッドワーム（ｂｕｄｗｏｒｍ）、タバコ・ホーンワーム（ｈｏｒｎｗｏｒｍ）及びヨーロピアン・コーン・ボラー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　ｃｏｒｎ　ｂｏｒｅｒ）（これらはレピドプテラ（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）目の員である）に対し活性である。この目のその他の典型的な員はビート・アーミィワーム（ｂｅｅｔ　ａｒｍｙｗｏｒｍ）、キャベツルーパー（ｃａｂｂａｇｅ　ｌｏｏｐｅｒ）、ブラック・カットワーム（ｂｌａｃｋ　ｃｕｔｗｏｒｍ）、コーンイアーワーム（ｃｏｒｎ　ｅａｒｗｏｒｍ）、コドリング・モス（ｃｏｄｌｉｎｇ　ｍｏｔｈ）、イガ、インディアン・ミールモス（Ｉｎｄｉａｎ　ｍｅａｌｍｏｔｈ）、ハマキムシ、アオムシ、コットン・ボールワーム（ｃｏｔｔｏｎ　ｂｏｌｌｗｏｒｍ）、ミノムシ、イースタン・テント・キャタピラー（Ｅａｓｔｅｒｎ　ｔｅｎｔ　ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ）、ソッド・ウェブワーム（ｓｏｄ　ｗｅｂｗｏｒｍ）及びフォール・アーミィワーム（ｆａｌｌ　ａｒｍｙｗｏｒｍ）である。また、活性がミバエ幼虫及び蚊幼虫（これらはジプテラ（Ｄｉｐｔｅｒａ）目の員である）に対して見られる。ジブテラ目のその他の員はピー・ミッジ（ｐｅａ　ｍｉｄｇｅ）、カラット・フライ（ｃａｒｒｏｔ　ｆｌｙ）、キャベツ・ルート・フライ（ｃａｂｂａｇｅ　ｒｏｏｔ　ｆｌｙ）、カブ・ルート・フライ（ｔｕｒｎｉｐｒ−ｏｏｔ　ｆｌｙ）、タマネギ・フライ（ｏｎｉｏｎ　ｆｌｙ）、ガガンボ及びイエバエ並びに種々の蚊種である。また、一種以上のブロース及び一種以上の毒素複合体による活性が２斑点クモダニに対して見られ、これはアカリナ（Ａｃａｒｉｎａ）目の一員であり、これはストロベリークモダニ、ブロードマイト（ｂｒｏａｄ　ｍｉｔｅｓ）、シトラス・レッド・マイト（Ｃｉｔｒｕｓｒｅｄ　ｍｉｔｅ）、ヨーロピアン・レッド・マイト（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　ｒｅｄｍｉｔｅ）、ピアー・ラストマイト（ｐｅａｒ　ｒｕｓｔ　ｍｉｔｅ）及びトマト・ラセット・マイト（ｔｏｍａｔｏ　ｒｕｓｓｅｔ　ｍｉｔｅ）を含む。
【０１８５】
コーン・ルートワーム幼虫に対する活性を以下のようにして試験した。一種以上のＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロース（０−１５倍に濃縮、フィルター滅菌）、２％のプロテオースペプトン＃３、一種以上の精製毒素複合体［０．２３ｍｇ／ｍｌ］または１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０を４０μｌのアリコート中の人工食（Ｒｏｓｅ，Ｒ．Ｉ．及びＭｃＣａｂｅ，Ｊ．Ｍ．（１９７３）．Ｊ．Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．６６，（３９８−４００））の表面（約１．５ｃｍ２）に直接適用した。毒素複合体を１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０中で希釈した。食事プレートを無菌フロー−フード中で空気乾燥させ、ウェルに表面滅菌卵から研化された単一の新生子ジアブロチカ・ウンデシムプンクタタ・ホワルジ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ　ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ　ｈｏｗａｒｄｉ）（サザン・コーン・ルートワーム（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｃｏｒｎ　ｒｏｏｔｗｏｒｍ，ＳＣＲ））を発生させた。プレートをシールし、保湿成長チャンバーに入れ、適当な期間（３〜５日）にわたって２７℃に保った。次いで死亡率及び幼虫重量測定をスコアにつけた。一般に、処理当たり１６匹の昆虫を全ての研究に使用した。対照死亡率は一般に５％未満であった。
【０１８６】
ボール・ウィービル（アントモナス・グランジス（Ａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｇｒａｎｄｉｓ）に対する活性を以下のようにして試験した。濃縮（１〜１０倍）Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓブロース、対照培地（２％のプロテオースペプトン＃３）、一種以上の精製毒素複合体［０．２３ｍｇ／ｍｌ］または１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０を６０μｌのアリコート中で人工食（ストーンビル・イエロー・レピドプテラン（Ｓｔｏｎｅｖｉｌｌｅ　Ｙｅｌｌｏｗ　ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）食）０．３５ｇの表面に適用し、乾燥させた。単一の１２〜２４時間のボール・ウィービル幼虫を食事に入れ、ウェルをシールし、２５℃で５０％ＲＨで５日間保った。次いで死亡率及び幼虫重量を評価した。対照死亡率は０〜１３％の範囲であった。
【０１８７】
蚊幼虫に対する活性を以下のようにして試験した。そのアッセイを９６ウェル・ミクロタイタプレート中で行った。夫々のウェルは２００μｌの水溶液（１０倍濃縮した一種以上のＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロース、対照培地（２％のプロテオースペプトン＃３）、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、一種以上の毒素複合体０．２３ｍｇ／ｍｌまたはＨ２Ｏ）及び約２０匹の生後１日の幼虫（アエデス・アエギプチ（Ａｅｄｅｓ　ａｅｇｙｐｔｉ））を含んでいた。処理当たり６のウェルがあった。結果を発生後３〜４日に読み取った。対照死亡率は０〜２０％であった。
【０１８８】
ミバエに対する活性を以下のようにして試験した。５０％の乾燥培地及び５０％の水、対照培地（２％のプロテオースペプトン＃３）、１０倍に濃縮した一種以上のＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロース、一種以上の精製毒素複合体［０．２３ｍｇ／ｍｌ］または１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０を使用して、購入したドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）培地を調製した。乾燥培地４．０ｍｌを処理当たり３個の育成バイアルの夫々に入れ、適当な液体４．０ｍｌを添加することによりこれを行った。次いで１０匹の後期虫齢のドロソフィラ・メラノガスターうじを夫々２５ｍｌのバイアルに加えた。バイアルを蛍光天井ライトのもとに室温で実験ベンチで保持した。さなぎまたは成体カウントを露出の１５日後に行った。成体発生を水及び対照培地と比較した（０〜１６％の減少）。
【０１８９】
アスター・リーフホッパー成体（マクロステルス・セベリニ（Ｍａｃｒｏｓｔｅｌｅｓ　ｓｅｖｅｒｉｎｉ））及びコーン・プラントホッパー若虫（ペレグリヌス・マイジス（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｓ　ｍａｉｄｉｓ））に対する活性を、その他の外部接触なしに活性物質の摂取を可能にするように設計した摂取アッセイで試験した。活性物質／”食物”溶液の溜を３５Ｘ１０ｍｍのペトリ皿の底部の中央に２つの孔をつくることによりつくる。２インチのパラフィルムＭＲ正方形を皿の上部を横切って置き、“Ｑ”リングで固定する。次いで１オンスのプラスチックカップに約７匹のホッパーを発生させ、溜をカップの上にパラフィルムを下にして置く。次いで試験液を孔を通って溜に添加する。１０倍濃縮した一種以上のＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロースを使用する試験において、ブロース及び対照培地（２％のプロテオースペプトン＃３）を１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０に対して透析し、蔗糖（５％まで）を得られる溶液に添加して対照死亡率を低下した。また、一種以上の精製毒素複合体［０．２３ｍｇ／ｍｌ］または１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０を試験した。死亡率を３日目に報告する。アッセイを１６／８光期間で２８℃、７０％ＲＨでインキュベーター中に保った。アッセイを７２時間で死亡率について等級付けした。対照死亡率は６％未満であった。
【０１９０】
レピドプテラン幼虫に対する活性を以下のようにして試験した。一種以上の濃縮（１０倍）Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロース、対照培地（２％のプロテオースペプトン＃３）、一種以上の精製毒素複合体［０．２３ｍｇ／ｍｌ］または１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０を４０μｌのアリコート中で通常の人工レピドプテラン食（ストーンビル・イエロー食）の表面（約１．５ｃｍ２）に直接適用した。食物プレートを無菌フロー−フード中で空気乾燥させ、単一の新生子幼虫を発生させた。ヨーロピアン・コーン・ボラー（オストリニア・ヌビラリス（Ｏｓｔｒｉｎｉａ　ｎｕｂｉｌａｌｉｓ））及びタバコ・ホーンワーム（マンジュカ・セクスタ（Ｍａｎｄｕｃａ　ｓｅｘｔａ））を市販源から入手し、ハウス内で孵化し、一方、タバコ・バッドワーム（ヘリオジス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ））幼虫を内部で供給した。幼虫を発生させた後、食物プレートをシールし、保湿成長チャンバーに入れ、適当な期間にわたって２７℃で暗所に保った。死亡率及び体重測定を５日目にスコアにつけた。一般に、処理当たり１６匹の昆虫を全ての研究に使用した。対照死亡率は対照培地について一般に４〜１２．５％の範囲であり、リン酸緩衝液について１０％未満であった。
【０１９１】
２斑点クモダニ（テトラニカス・ウルチカエ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ　ｕｒｔｉｃａｅ））に対する活性を以下のようにして試験した。若いカボチャ植物を単一子葉にトリミングし、一種以上の１０倍濃縮ブロース、対照培地（２％のプロテオースペプトン＃３）、一種以上の精製毒素複合体［０．２３ｍｇ／ｍｌ］または１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０で噴霧して流下させた。乾燥後、植物にクモダニの混合集団を発生させ、７２時間にわたって実験温度及び湿度に保った。次いで生存ダニをカウントして防除のレベルを測定した。
【０１９２】
【表２１】
表１９　異なるＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株からのブロースの観察された殺虫スペクトル
2004089189.tif 000029
【０１９３】
【表２２】
表１９　つづき
2004089189.tif 000030
＊　＝対照に対し２５％以上の死亡率及び／または成長抑制
＊＊＝１；タバコ・バッドワーム、２；ヨーロピアン・コーン・ボラー、３；タバコ・ホーンワーム、４；サザン・コーン・ルートワーム、５；ボール・ウィービル、６；蚊、７；ミバエ、８；アスター・リーフホッパー、９；コーン・プラントホッパー、１０；２斑点クモダニ
【０１９４】
実施例１４　非Ｗ−１４Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株：　精製、特性決定及び活性スペクトル精製
以下のプロトコルはＷ−１４の精製について開発されたものと同様であり、バイオアッセイ（実施例１３を参照のこと）で測定してサザン・コーン・ルートワーム（ＳＣＲ）に対し最も活性を有するフラクションを精製することに基いて確立された。典型的には、実施例１３に記載されたようにして濾過されたブロース４〜２０Ｌを受け取り、アミコンＭ−１２濾過装置に取り付けられたアミコンらせん形限外濾過カートリッジ型ＳＩＹ１００を使用して濃縮した。保持物は１００ｋＤａより大きい分子サイズからなる天然タンパク質を含み、一方、フロースルー物質は１００ｋＤａ未満のサイズの天然タンパク質を含んでいた。ＳＣＲに対する活性の大半が１００ｋＤａ保持物中に含まれていた。次いで保持物を、濾液がＡ２８０＜０．１００に達するまで１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．０）で連続的に透析濾過した。特にことわらない限り、この時点からの全ての操作を１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で特定されるような緩衝液中で行った。
【０１９５】
次いで保持物を約０．２０Ｌの最終容積まで濃縮し、０．４５ｍｍのナルゲンＴＭフィルムウェア無菌濾過ユニットを使用して濾過した。濾過された物質をパーセプチブ・バイオシステム・スプリントＲＨＰＬＣ系を使用して緩衝液中で平衡化されたパーセプチブ・バイオシステム・ポロスＲ５０ＨＱ強イオン交換マトリックスで詰め込まれたファーマシアＨＲ１６／１０カラムに７．５ｍｌ／分で装填した。装填後、Ａ２８０＜０．１００に達するまでカラムを緩衝液で洗浄した。次いでタンパク質を５０ｍｌの全容積について２０分間にわたって０．４ＭのＮａＣｌを含む緩衝液を使用して２．５ｍｌ／分でカラムから溶離した。１．０ＭのＮａＣｌを含む緩衝液を使用してカラムを同流量で更に２０分間にわたって洗浄した（最終容積＝５０ｍｌ）。０．４Ｍ及び１．０ＭのＮａＣｌで溶離したタンパク質を別々の透析バッグ（スペクロタ／ポーＲ膜ＭＷＣＯ：２０００）に入れ、１２Ｌの緩衝液中で４℃で一夜透析した。ＳＣＲに対する活性の大半が０．４Ｍのフラクション中に含まれていた。０．４Ｍのフラクションを、０．７５ｍｌ／分の流量を使用してセファロースＣＬ４Ｂ（ファーマシア）で予め詰め込まれたファーマシアＸＫ　２６／１００カラムへの２０ｍｌの適用により更に精製した。フラクションをＡ２８０ピークプロフィールに基づいてプールし、ミリポア・ウルトラフリーＲ１５遠心分離フィルター装置バイオマックス−５０Ｋ　ＮＭＷＬ膜を使用して０．７５ｍｌの最終容積まで濃縮した。標準物質としてウシγグロブリンを用いるバイオラド・タンパク質アッセイキットを使用してタンパク質濃度を測定した。
【０１９６】
特性決定
ＳＣＲ毒素複合体の天然分子量を、緩衝液中でセファロースＣＬ４Ｂで予め詰め込まれたファーマシアＨＲ　１６／５０を使用して測定した。次いで既知分子サイズのタンパク質を使用してカラムを較正し、それにより毒素のおよその天然分子サイズの計算を可能にした。表２０に示されるように、毒素複合体の分子サイズは株Ｈｂで７７７ｋＤａから株ＷＸ−１４で１，９００ｋＤａまでの範囲であった。また、毒素複合体の収率は０．８ｍｇ／Ｌを産生する株ＷＸ−１２から７．０ｍｇ／Ｌを産生する株則まで変化した。
毒素複合体に見られるタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を使用して個々のポリペプチドサイズについて試験した。典型的には、夫々の株からの毒素複合体のタンパク質２０ｍｇを２〜１５％のポリアクリルアミドゲル（インテグレーテッド・セパレーション・システムズ）に装填し、バイオラドＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液中で２０ｍＡで電気泳動にかけた。電気泳動の完結後に、ゲルをバイオラド・クーマシーブルーＲ−２５０（メタノール：酢酸：水；４０：１０：４０ｖ／ｖ／ｖ）中０．２％）中で一夜染色した。続いて、ゲルをメタノール：酢酸：水；４０：１０：４０（ｖ／ｖ／ｖ）中で脱色した。次いでゲルを１５分間にわたって水ですすぎ、モレキュラー・ダイナミクス・パーソナル・レーザー・デンシトメーターＲを使用してスキャンした。レーンを定量し、分子サイズをバイオラド高分子量標準物質と比較して計算し、これは２００−４５ｋＤａの範囲であった。
【０１９７】
夫々の株からのＳＣＲ毒素複合体を含む個々のポリペプチドのサイズを表２１にリストする。個々のポリペプチドのサイズは株ＷＸ−１で２３０ｋＤａから株ＷＸ−７で見られるような１６ｋＤａのサイズまでの範囲であった。株Ｈｂを除く夫々の株は１６０−２３０ｋＤａ範囲、１００−１６０ｋＤａ範囲、及び５０−８０ｋＤａ範囲である毒素複合体を含むポリペプチドを有していた。これらのデータは、毒素複合体が株によりペプチド組成及び成分を変化し得るが、全ての場合に毒素特性が大きいオリゴマータンパク質複合体からなることが明らかであることを示す。
【０１９８】
【表２３】
表２０．
2004089189.tif 000031
ａ　セファロースＣＬ４Ｂを詰め込んだファーマシアＨＲ　１６／５０カラムを使用して測定された天然分子量
ｂ　培養ブロースから回収された毒素複合体の量
【０１９９】
活性スペクトル
表２１に示されるように、株Ｈｍ及びＨ９から精製された毒素複合体を種々の昆虫に対する活性について試験した。株Ｗ−１４からの毒素複合体は比較のためであった。アッセイを実施例１３に記載されたようにして行った。全ての３種の株からの毒素複合体はタバコ・バッドワーム、ヨーロピアン・コーン・ボラー、サザン・コーン・ルートワーム、及びアスター・リーフホッパーに対し活性を示した。更に、株Ｈｍ及びＷ−１４からの毒素複合体がまた２斑点クモダニに対し活性を示した。加えて、Ｗ−１４からの毒素複合体が蚊幼虫に対し活性を示した。これらのデータは、毒素複合体が、昆虫の或る種の目の間に活性の類似性を有するとともに、昆虫のその他の目に対し異なる活性を示し得ることを示す。
【０２００】
【表２４】
表２１　Ｗ−１４　Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓからの精製毒素複合体中のペプチドの推定サイズ（ｋＤａ）
2004089189.tif 000032
【０２０１】
【表２５】
表２２．
2004089189.tif 000033
＊　＝２５％より大きい死亡率または成長抑制
＊＊＝１；タバコ・バッドワーム、２；ヨーロピアン・コーン・ボラー、３；サザン・コーン・ルートワーム、４；蚊、５；２斑点クモダニ、６；アスター・リーフホッパー、７；ミバエ、８；ボール・ウィービル
【０２０２】
実施例１５　Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓタンパク質毒素複合体のサブ−フラクション
Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓタンパク質毒素複合体を実施例１４に記載されたようにして単離した。次に、毒素約１０ｍｇを１ｍｌ／分の流量で２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０で平衡にされたモノＱ５／５カラムに適用した。２８０ｎｍにおける光学密度が基準線吸光度に戻るまで、カラムを２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０で洗浄した。カラムに結合したタンパク質を１ｍｌ／分で３０分間にわたって２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０中０〜１．０ＭのＮａＣｌの線形勾配で溶離した。フラクション１ｍｌを集め、サザン・コーン・ルートワーム（ＳＣＲ）バイオアッセイ（実施例１３を参照のこと）にかけた。活性のピークをＳＣＲバイオアッセイで夫々のフラクションの一連の希釈液により測定した。ＳＣＲに対する二つの活性ピークを観察し、Ａ（約０．２〜０．３ＭのＮａＣｌで溶離した）及びＢ（０．３〜０．４ＭのＮａＣｌで溶離した）と称した。活性ピークＡ及びＢを別々にプールし、下記の３工程操作を使用して両方のピークを更に精製した。
【０２０３】
固体（ＮＨ４）２ＳＯ４を上記タンパク質フラクションに１．７Ｍの最終濃度まで添加した。次いでタンパク質を１ｍｌ／分で５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７中１．７Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４で平衡にされたフェニル−スペロース５／５カラムに適用した。カラムに結合したタンパク質を０．５ｍｌ／分で１．７Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０％のエチレングリコール、５０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．０〜２５％のエチレングリコール、２５ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．０（（ＮＨ４）２ＳＯ４なし）の線形勾配で溶離した。フラクションを１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０に対し一夜透析した。ＳＣＲに対する夫々のフラクション中の活性をバイオアッセイにより測定した。
最高の活性を有するフラクションをプールし、１ｍｌ／分で２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０で平衡にされたモノＱ５／５カラムに適用した。カラムに結合したタンパク質を２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０中０〜１ＭのＮａＣｌの線形勾配により１ｍｌ／分で溶離した。
【０２０４】
精製の最終工程について、上記の最も活性なフラクション（ＳＣＲバイオアッセイにより測定した）をプールし、第二のフェニルースペロース５／５カラムにかけた。固体（ＮＨ４）２ＳＯ４を１．７Ｍの最終濃度まで添加した。次いでその溶液を１ｍｌ／分で５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７中１．７Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４で平衡にされたそのカラムに装填した。カラムに結合したタンパク質を１．７Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．０〜１０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．０の線形勾配で０．５ｍｌ／分で溶離した。フラクションを１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０に対し一夜透析した。ＳＣＲに対する夫々のフラクション中の活性をバイオアッセイにより測定した。
ピークＡからの上記の３工程操作による最終精製タンパク質を毒素Ａと称し、ピークＢからの最終精製タンパク質を毒素Ｂと称した。
【０２０５】
毒素Ａ及び毒素Ｂの特性決定及びアミノ酸配列決定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中に、毒素Ａ及び毒素Ｂの両方は２種の主要（全クーマシー染色タンパク質の９０％より大）ペプチド：１９２ｋＤａ（夫々Ａ１及びＢ１と称する）及び５８ｋＤａ（夫々Ａ２及びＢ２と称する）を含んでいた。毒素Ａ及び毒素Ｂの両方は天然ＰＡＧＥ中に唯一の主要バンドを明らかにし、Ａ１及びＡ２が一種のタンパク質複合体のサブユニットであり、かつＢ１及びＢ２が一種のタンパク質複合体のサブユニットであることを示した。更に、毒素Ａ及び毒素Ｂの両方の天然分子量はゲル濾過クロマトグラフィーにより８６０ｋＤａであることが測定された。Ａ１対Ａ２の相対モル濃度はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのデンシトメトリー分析により測定して１対１の当量であると判断された。同様に、Ｂ１ペプチド及びＢ２ペプチドは同じモル濃度で存在した。
【０２０６】
毒素Ａ及び毒素Ｂを１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で電気泳動にかけ、ＰＶＤＦ膜にトランスブロットした。ブロットを夫々ハーバード・ミクロケム及びケンブリッジ・プロケムにアミノ酸分析及びＮ末端アミノ酸配列決定のために送った。Ｂ１のＮ末端アミノ酸配列は配列番号１、ｔｃｂＡ遺伝子のＴｃｂＡｉｉ領域（配列番号１２、位置８７−９９）と同一であることが決定された。特異なＮ末端配列をペプチドＢ２について得た（配列番号４０）。ペプチドＢ２のＮ末端アミノ酸配列はｔｃｂＡ遺伝子の誘導アミノ酸配列のＴｃｂＡｉｉｉ領域（配列番号１２、位置１９３５−１９４５）と同一であった。それ故、Ｂ毒素は主として２種のペプチド、ＴｃｂＡｉｉ及びＴｃｂＡｉｉｉを含み、これらが同じ遺伝子産物、ＴｃｂＡから誘導されることが観察された。
Ａ２のＮ末端配列（配列番号４１）はＴｃｂＡｉｉｉペプチド及びその他のペプチドと比較して特異であった。Ａ２ペプチドをＴｃｄＡｉｉｉと称した（実施例１７を参照のこと）。配列番号６はアミノ酸配列配列番号４０及び配列番号４１の混合物であることが決定された。
【０２０７】
更に、ペプチドＡ１及びＡ２を内部アミノ酸配列決定にかけた。内部アミノ酸配列決定について、毒素Ａ１０μｇを１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で電気泳動にかけ、ＰＶＤＦ膜にトランスブロットした。ブロットをアミドブラックで染色した後、夫々ＴｃｄＡｉｉ及びＴｃｄＡｉｉｉと称されるペプチドＡ１及びＡ２をブロットから切除し、ハーバード・ミクロケム及びケンブリッジ・プロケムに送った。ペプチドをトリプシン消化、続いてＨＰＬＣクロマトグラフィーにかけて個々のペプチドを分離した。Ｎ末端アミノ酸分析を選択されたトリプシンペプチドフラグメントについて行った。ペプチドＡ１の二つの内部アミノ酸配列（ＴｃｄＡｉｉ−ＰＫ７１、配列番号３８及びＴｃｄＡｉｉ−ＰＫ４４、配列番号３９）はｔｃｂＡ遺伝子のＴｃｂＡｉｉ領域の演繹アミノ酸配列（配列番号１２）と有意な相同性を有することがわかった。同様に、ペプチドＡ２のＮ末端配列（配列番号４１）及び二つの内部配列（ＴｃｄＡｉｉｉ−ＰＫ５７、配列番号４２及びＴｃｄＡｉｉｉ−ＰＫ２０、配列番号４３）はまたｔｃｂＡ遺伝子のＴｃｂＡｉｉｉ領域の演繹アミノ酸配列（配列番号１２）と有意な相同性を示した。
【０２０８】
上記結果を要約すると、毒素複合体はＳＣＲに対し少なくとも二つの活性タンパク質毒素複合体、毒素Ａ及び毒素Ｂを有する。毒素Ａ及び毒素Ｂはそれらの天然分子量及びサブユニット分子量が同様であるが、それらのペプチド組成が異なる。毒素Ａは主要ペプチドとしてＴｃｄＡｉｉ及びＴｃｄＡｉｉｉを含み、また毒素Ｂは主要ペプチドとしてＴｃｂＡｉｉ及びＴｃｂＡｉｉｉを含む。
【０２０９】
実施例１６　ＴｃｂＡペプチドの開裂及び活性化
毒素Ｂ複合体において、ペプチドＴｃｂＡｉｉ及びＴｃｂＡｉｉｉは単一遺伝子産物ＴｃｂＡに由来する（実施例１５）。ＴｃｂＡペプチドからＴｃｂＡｉｉ及びＴｃｂＡｉｉｉへのプロセシングはおそらく一種以上のＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓプロテアーゼ、そしておそらく実施例１０に記載されたメタロプロテアーゼの作用によるものである。或る場合には、ＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓＷ−１４ブロースをプロセシングした時、ＴｃｂＡペプチドが、ペプチドＴｃｂＡｉｉ及びＴｃｂＡｉｉｉに加えて主要成分として毒素Ｂ複合体中に存在することが注目された。毒素Ｂ複合体の精製について記載された（実施例１５）のと同じ操作を使用してＷ−１４ブロースの毒素複合体フラクションからペプチドＴｃｂＡを濃縮した。最終精製物質を４−２０％の勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分析し、主要ペプチドをデンシトメトリーにより定量した。ＴｃｂＡ、ＴｃｂＡｉｉ及びＴｃｂＡｉｉｉは全タンパク質の夫々５８％、３６％、及び６％を構成することが測定された。これらのペプチドの同定をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びモノ特異性抗体を使用するウェスタンブロット分析でそれらの夫々の分子サイズにより確認した。このフラクションの天然分子量を測定したところ、８６０ｋＤａであった。
【０２１０】
上記精製物質を精製された３８ｋＤａ及び５８ｋＤａのＷ−１４Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓメタロプロテアーゼ（実施例１０）、及び対照酵素としてのトリプシン（シグマ，ＭＯ）で処理することにより、ＴｃｂＡの開裂を評価した。標準反応液は１００μｌの合計容積中に上記精製フラクション１７．５μｇ、１．５単位のプロテアーゼ、及び０．１Ｍのトリス緩衝液、ｐＨ８．０からなっていた。対照反応について、プロテアーゼを省いた。その反応混合物を３７℃で９０分間インキュベートした。反応の終了時に、２０μｌを採取し、４−２０％の勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中の電気泳動分析のために直ちにＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液とともに沸騰させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥから、３８ｋＤａ及び５８ｋＤａのプロテアーゼ処理の両方において、ペプチドＴｃｂＡｉｉ及びＴｃｂＡｉｉｉの量が約３倍増加し、一方、ＴｃｂＡペプチドの量が比例して減少したことが測定された（表２３）。選択されたペプチドの相対減少及び増強をウェスタンブロット分析により確かめた。更に、開裂された物質のゲル濾過は、複合体の天然分子量が同じままであったことを明らかにした。トリプシン処理後に、ペプチドＴｃｂＡ及びＴｃｂＡｉｉを小さいペプチドに非特異的に消化した。これは、３８ｋＤａ及び５８ｋＤａのＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓプロテアーゼがペプチドＴｃｂＡをペプチドＴｃｂＡｉｉ及びＴｃｂＡｉｉｉに特異的にプロセシングし得ることを示した。
【０２１１】
残りの８０μｌの反応混合物のプロテアーゼ処理対照及び未処理対照を１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０で連続希釈し、ＳＣＲバイオアッセイにより分析した。幾つかの希釈液中の活性を比較することにより、３８ｋＤａのプロテアーゼ処理はＳＣＲ殺虫活性を約３〜４倍に増加することが測定された。プロテアーゼ処理における残存昆虫の成長抑制はまた対照よりも苛酷であった（表２３）。
【０２１２】
【表２６】
表２３．プロテアーゼ処理によるペプチドＴｃｂＡからペプチドＴｃｂＡｉｉ及びＴｃｂＡｉｉｉ　への変換及び活性化
2004089189.tif 000034
＊　：　アッセイ中の給餌の５日後に生存昆虫の平均体重を測定することによる成長抑制の指標
【０２１３】
実施例１７　ＴｃｄＡｉｉペプチドをコードする遺伝子のライブラリーのスクリーニング
配列番号１７（内部ペプチドＴｃｄＡｉｉ−ＰＴ１１１Ｎ末端配列）及び配列番号１８（内部ペプチドＴｃｄＡｉｉ−ＰＴ７９Ｎ末端配列）として記載されたＴｃｄＡｉｉペプチドをコードする遺伝子のクローニング及び特性決定を完結した。配列番号１７（表２４）及び配列番号１８（表２５）のアミノ酸配列並びにこれらの配列の逆補体をコードするするように設計された縮重オリゴヌクレオチドの２種のプールを実施例８に記載されたようにして合成した。オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列を以下に示す。
【０２１４】
【表２７】
表２４．配列番号１７のための縮重オリゴヌクレオチド
2004089189.tif 000035
【０２１５】
【表２８】
表２４　続き
2004089189.tif 000036
【０２１６】
【表２９】
表２５．配列番号１８のための縮重オリゴヌクレオチド
2004089189.tif 000037
【０２１７】
【表３０】
表２５．つづき
2004089189.tif 000038
＊　ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢに従い、ヌクレオチドに対するコードは、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｈ＝Ａ、Ｃ、またはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｒ＝ＡまたはＧ、およびＭ＝ＡまたはＣ。
【０２１８】
全てのフォワード／リバース組み合わせにおいて、フォワードプライマーとしてＰ２．３．６．ＣＢまたはＰ２．３．５．を使用し、リバースプライマーとしてＰ２．７９．Ｒ．１またはＰ２．７９Ｒ．ＣＢを使用し、鋳型としてＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓＷ−１４ゲノムＤＮＡを使用して、実質的に実施例８に記載されたようにしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。反応の別の組において、全てのフォワード／リバース組み合わせにおいて、プライマーＰ２．７９．２またはＰ２．７９．３をフォワードプライマーとして使用し、またＰ２．３．５Ｒ、Ｐ２．３．５ＲＩ、及びＰ２．３Ｒ．ＣＢをリバースプライマーとして使用した。リバースプライマーとしてのＰ２．７９．Ｒ．１またはＰ２．７９Ｒ．ＣＢと組み合わせたフォワードプライマーとしてのＰ２．３．６．ＣＢを含む反応のみにおいて、２５００塩基対の推定サイズ（アガロースゲルにおける移動度）の非人工増幅産物が見られた。この増幅産物を得るのに使用したプライマーの順序は、ペプチドフラグメントＴｃｄＡｉｉ−ＰＴ１１１がペプチドフラグメントＴｃｄＡｉｉ−ＰＴ７９にアミノ近位にあることを示す。
【０２１９】
２５００ｂｐ　ＰＣＲ産物を供給業者の指示に従ってプラスミドベクターｐＣＲＴＭＩＩ（インビトロゲン，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）につなぎ、２種の分離物（ＨＳ２４及びＨＳ２７）のインサートフラグメントの末端を横切るＤＮＡ配列を、供給業者の推奨したプライマー及び前記配列決定方法を使用して測定した。両方の単離物の配列は同じであった。新規プライマーを決定された配列に基いて合成し、付加的な配列決定反応を開始するのに使用してインサート［配列番号３６］の合計２５５７塩基を得た。配列番号３６によりコードされた部分ペプチドの翻訳が配列番号３７として開示された８４５アミノ酸配列を生じる。ＴｃｄＡｉｉペプチドフラグメントのこの部分のタンパク質相同性分析はタンパク質ＴｃｂＡ［配列番号１２］の残基５４２−１３９０に対する実質的なアミノ酸相同性（６８％の類似性；５３％の同一性）を明らかにする。それ故、配列番号３６により一部表される遺伝子が同様のタンパク質を産生するが、ＴｃｂＡと同一のアミノ酸配列を産生しないことが明らかであり、それはおそらくＴｃｂＡタンパク質と同様であるが、同一ではない生物活性を有する。
【０２２０】
更に別の場合、配列番号９（内部ペプチドＴｃｄＡｉｉ−ＰＫ４４配列）、及び配列番号４１（ＴｃｄＡｉｉｉ５８ｋＤａＮ末端ペプチド配列）として記載されたペプチドＴｃｄＡｉｉ−ＰＫ４４及びＴｃｄＡｉｉｉ５８ｋＤａＮ末端ペプチドをコードする遺伝子を単離した。配列番号３９（表２７）及び配列番号４１（表２６）、並びにこれらの配列の逆補体をコードするように設計された縮重オリゴヌクレオチドの２種のプールを実施例８、及びそれらのＤＮＡ配列に記載されたようにして合成した。
【０２２１】
【表３１】
表２６．配列番号４１のための縮重オリゴヌクレオチド
2004089189.tif 000039
【０２２２】
【表３２】
表２６．つづき
2004089189.tif 000040
【０２２３】
【表３３】
表２７．配列番号３９のための縮重オリゴヌクレオチド
2004089189.tif 000041
【０２２４】
【表３４】
表２７．つづき
2004089189.tif 000042
【０２２５】
全てのフォワード／リバース組み合わせにおいて、フォワードプライマーとしてＡ１．４４．１またはＡ１．４４．２を使用し、リバースプライマーＡ２．３ＲまたはＡ２．４Ｒを使用し、鋳型としてＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓＷ−１４ゲノムＤＮＡを使用して、実質的に実施例８に記載されたようにしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。反応の別の組において、全てのフォワード／リバース組み合わせにおいて、プライマーＡ２．１またはＡ２．２をフォワードプライマーとして使用し、またＡ１．４４．１Ｒ及びＡ１．４４．２Ｒをリバースプライマーとして使用した。リバースプライマーとしてのＡ２．３Ｒと組み合わせたフォワードプライマーとしてのＡ１．４４．１またはＡ１．４４．２を含む反応のみにおいて、１４００塩基対の推定サイズ（アガロースゲルにおける移動度）の非人工増幅産物が見られた。この増幅産物を得るのに使用したプライマーの順序は、ペプチドフラグメントＴｃｄＡｉｉ−ＰＫ４４がＴｃｄＡｉｉｉの５８ｋＤａペプチドフラグメントにアミノ近位にあることを示す。
【０２２６】
１４００ｂｐ　ＰＣＲ産物を供給業者の指示に従ってプラスミドベクターｐＣＲＴＭＩＩにつないだ。４種の分離物のインサートフラグメントの末端を横切るＤＮＡ配列を、供給業者の推奨したプライマーと配列の似ているプライマーを使用し、また前記配列決定方法を使用して測定した。全ての分離物の核酸配列は縮重プライマー配列に相当する領域において予想されたように異なっていたが、これらのデータから演繹されたアミノ酸配列は先に決定されたペプチドに関する実際のアミノ酸配列（配列番号４１及び配列番号３９）と同じであった。
先に調製したＤＮＡ（配列番号３６）を含む放射能標識プローブによる実施例８に記載されたＷ−１４ゲノムコスミドライブラリーのスクリーニングは５種のハイブリッド形成性コスミド分離物、即ち、１７Ｄ９、２０Ｂ１０、２１Ｄ２、２７Ｂ１０、及び２６Ｄ１を同定した。これらのコスミドは配列番号１１または配列番号２５として記載された遺伝子に相当するプローブで先に同定されたものとは異なった。制限酵素分析及びＤＮＡブロットハイブリダイゼーションは、配列番号３６のＤＮＡを含む領域をスパンするおよそのサイズ３．７、３．７、及び１．１ｋｂｐの３種のＥｃｏＲ　Ｉフラグメントを同定した。この実施例で調製された放射能標識された１．４ｋｂｐのＤＮＡフラグメントをプローブとして使用するＷ−１４ゲノムコスミドライブラリーのスクリーニングは同じ５種のコスミド（１７Ｄ９、２０Ｂ１０、２１Ｄ２、２７Ｂ１０、及び２６Ｄ１）を同定した。また、ＥｃｏＲ　Ｉ消化コスミドＤＮＡに関するＤＮＡブロットハイブリダイゼーションは２．５ｋｂｐのＴｃｄＡｉｉ遺伝子プローブで見られたのと同じＥｃｏＲ　Ｉフラグメントのサブセットに関するハイブリダイゼーションを示し、両方のフラグメントがゲノムＤＮＡでコードされることを示した。
【０２２７】
クローン化ＥｃｏＲ　ＩフラグメントのＤＮＡ配列決定は２５１６アミノ酸（配列番号４７）の２８２．９ｋＤａをコードする７５５１塩基対（配列番号４６）の中断されない読み取り枠を明らかにした。このタンパク質のアミノ酸配列の分析はペプチドＴｃｄＡｉｉの全ての予想された内部フラグメント（配列番号１７、１８、３７、３８及び３９）及びＴｃｄＡｉｉｉペプチドＮ末端（配列番号４１）並びに全てのＴｃｄＡｉｉｉ内部ペプチド（配列番号４２及び４３）を明らかにした。ＴｃｄＡｉｉ及びＴｃｄＡｉｉｉとして単離され、同定されたペプチドは、配列番号４６として開示されたｔｃｄＡと称される読み取り枠の夫々の産物である。更に、配列番号４７は位置８９で開始することを示し、配列番号１３として開示された配列（これは約２０１ｋＤａのサイズのペプチドのＮ末端配列である）は配列番号４６から生じた初期タンパク質が配列番号１２について先に開示されたタンパク質と同様の方法でプロセシングされることを示す。加えて、そのタンパク質は更に開裂されて、配列番号４８によりコードされ、配列番号４９（ＴｃｄＡｉｉペプチド）として開示されたサイズ２０９．２ｋＤａの産物、及び配列番号５０によりコードされ、配列番号５１（ＴｃｄＡｉｉｉペプチド）として開示されたサイズ６３．６ｋＤａの産物を生じる。
【０２２８】
こうして、配列番号４６の産物から誘導された毒素Ａ（実施例１５）として同定された殺虫活性は、配列番号４７として開示された２８２．９ｋＤａの完全長タンパク質により例示されるように、プロセシングされて配列番号４９及び５１として開示されたペプチドを生じるものと考えられる。毒素Ｂ（実施例１５）として同定された殺虫活性は、配列番号１２として開示された２８０．６ｋＤａのタンパク質により例示されるように、配列番号１１の産物に由来するものと考えられる。このタンパク質はタンパク質分解処理されて配列番号５３として開示された２０７．６ｋＤａのタンパク質（これは配列番号５２によりコードされる）、及び配列番号４０として開示され、更に配列番号５５として開示されたＮ末端配列を有する６２．９ｋＤａのペプチド（これは配列番号５４によりコードされる）を生じる。
配列番号１２及び配列番号４７として開示されたタンパク質のアミノ酸配列比較は、それらが６９％の類似性及び５４％の同一性を有することを明らかにする。進化的関係のこの高い程度はこれらのペプチドの全アミノ酸配列中で一様ではないが、タンパク質のカルボキシ末端に向かって高い。何となれば、配列番号５１（配列番号４７から誘導された）及び配列番号５５（配列番号１２から誘導された）として開示されたペプチドは７６％の類似性及び６４％の同一性を有するからである。
【０２２９】
実施例１８　　Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ（株Ｗ−１４）ブロースの噴霧適用によるトウモロコシ植物に関するヨーロピアン・コーンボラー誘発葉損傷の防除
昆虫幼虫により生じる植物損傷を軽減する一種以上のＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ毒素の能力を、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓブロースで処理されたトウモロコシ植物に発生されるヨーロピアン・コーンボラー（オストリニア・ヌビラリス（Ｏｓｔｒｉｎｉａ　ｎｕｂｉｌａｌｉｓ））により生じる葉損傷を測定することにより実証した。Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株Ｗ−１４からの醗酵ブロースを生産し、実施例１３に記載されたようにして限外濾過（１０，０００ＭＷ細孔サイズ）を使用して約１０倍に濃縮した。次いで得られる濃縮ブロースを、０．２ミクロンのニトロセルロース膜フィルターを使用してフィルター滅菌した。未接種の２％プロテオースペプトン＃３の同様に調製したサンプルを対照目的で使用した。トウモロコシ植物（ダウエランコ（ＤｏｗＥｌａｎｃｏ）所有の同系繁殖系）を温室（日中２７℃；夜間２２℃、約５０％ＲＨ、１４時間の日の長さ、必要により散水／施肥）中で無土壌混合物を含むポット中で種子から栄養成長期７または８まで育成した。
【０２３０】
試験植物を日中約２２℃；夜間１８℃の温度で、人工光を使用しないて、部分遮蔽し、約５０％のＲＨで必要により散水／施肥して温室中でランダム化完全ブロック設計（３レプ／処理、６植物／処理）で配置した。処理（未接種培地及び濃縮Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓブロース）をシリンジスプレーで適用し、２．０ｍｌを渦巻きで直接（約６インチ）適用し、追加の２．０ｍｌを渦巻きの上約１フィートから円形運動で適用した。加えて、植物の１グループは処理を受けなかった。処理が乾燥した後（約３０分間）、１２の新生子のヨーロピアン・コーン・ボラー幼虫（市販源から卵を入手し、室内で誘化させた）を渦巻きに直接適用した。１週間後、改良グスリースケール（Ｇｕｔｈｒｉｅ　Ｓｃａｌｅ）（Ｋｏｚｉｅｌ，Ｍ．Ｇ．，Ｂｅｌａｎｄ，Ｇ．Ｌ．，Ｂｏｗｍａｎ，Ｃ．，Ｃａｒｏｚｚｉ，Ｎ．Ｂ．，Ｃｒｅｎｓｈａｗ．Ｒ．，Ｃｒｏｓｓｌａｎｄ，Ｌ．，Ｄａｗｓｏｎ，Ｊ．，Ｄｅｓａｉ，Ｎ．，Ｈｉｌｌ．，Ｍ．，Ｋａｄｗｅｌｌ，Ｓ．，Ｌａｕｎｉｓ，Ｋ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｋ．，Ｍａｄｄｏｘ，Ｄ．，ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｋ．，Ｍｅｇｈｊｉ，Ｍ．Ｚ．，Ｍｅｒｌｉｎ，Ｅ．，Ｒｈｏｄｅｓ，Ｒ．，Ｗａｒｒｅｎ，Ｇ．Ｗ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｍ．及びＥｖｏｌａ，Ｓ．Ｖ．１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１，１９４−１９５）を使用して、植物を葉への損傷についてスコアをつけ、スコアを統計上比較した［Ｔテスト（ＬＳＤ）ｐ＜０．０５及びタキィスチューデント化レンジ（ＨＳＤ）テストｐ＜０．１］。結果を表２８に示す。参考として、１のスコアは損傷なしを表し、２のスコアはピンホール侵入のない巻かれていない葉に対する”ウィンドーパン”損傷を表し、また５のスコアは三つより多い葉について明らかな細長い病変及び／または中ろくフィーディング（ｆｅｅｄｉｎｇ）を有する葉侵入（病変＜１インチ（２．５４ｃｍ））を表す。これらのデータは、フラクションを含むブロースまたはその他のタンパク質が噴霧可能な配合で送出された時またはタンパク質もしくはその部分をコードする遺伝子またはその誘導体がトランスジェニック植物または微生物を介して送出される時に特定の昆虫ペストに対する保護を与え得ることを示す。
【０２３１】
【表３５】
表２８．トウモロコシに対するヨーロピアン・コーン・ボラー誘発葉損傷に関するＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロースの効果
2004089189.tif 000043
異なる文字を有する平均は統計上異なる（ｐ＜０．０５またはｐ＜０．１）
【０２３２】
実施例１９　Ｅ．ｃｏｌｉ中の発現のための遺伝子の遺伝子操作
構築の要約
一連のプラスミドを構築してエシェリキア・コリ中でＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓＷ−１４のｔｃｂＡ遺伝子を発現した。プラスミドのリストを表２９に示す。夫々の構築並びに得られたＥ．ｃｏｌｉ発現データの要約を以下に簡単に記載する。
【０２３３】
【表３６】
表２９．ｔｃｂＡ遺伝子の発現プラスミド
2004089189.tif 000044
略号：Ｋａｎ＝カナマイシン、Ｃｈｌ＝クロラムフェニコール、Ａｍｐ＝アンピシリン
【０２３４】
ｐＤＡＢ６３４の構築
実施例９に、ＴｃｂＡｉｉプローブにハイブリッドを形成する大きいＥｃｏＲ　Ｉフラグメントが記載される。このフラグメントをｐＢＣ（ストラタゲン，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ　ＣＡ）にサブクローン化した。配列分折は、このフラグメントが８８１６塩基対であることを示す。そのフラグメントは位置５７１に開始ＡＴＧを有し、位置８０８６に終止ＴＡＡを有するｔｃｂＡ遺伝子をコードする。それ故、そのフラグメントはＡＴＧの上流にＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓＤＮＡの５７０塩基対を有し、ＴＡＡの下流に７３０塩基対を有する。
【０２３５】
プラスミドｐＡｃＧＰ６７Ｂ／ｔｃｂＡの構築
下記のプライマーを使用してｔｃｂＡ遺伝子をＰＣＲ増幅した。５’プライマー（Ｓ１Ａｃ５１）５’ＴＴＴ　ＡＡＡ　ＣＣＡ　ＴＧＧ　ＧＡＡ　ＡＣＴ　ＣＡＴ　ＴＡＴ　ＣＡＡ　ＧＣＡ　ＣＴＡ　ＴＣ３’及び３’プライマー（Ｓ１Ａｃ３１）５’ＴＴＴ　ＡＡＡ　ＧＣＧ　ＧＣＣ　ＧＣＴ　ＴＡＡ　ＣＧＧ　ＡＴＧ　ＧＴＡ　ＴＡＡ　ＣＧＡ　ＡＴＡ　ＴＧ　３’。下記の反応でパンベラ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）からのタカラＬＡ　ＰＣＲキットを使用して、ＰＣＲを行った。５７．５ｍｌの水、１０ｍｌの１０Ｘ　ＬＡ緩衝液、１６ｍｌのｄＮＴＰ（夫々２．５ｍＭの原液）、２０ｍｌの夫々のプライマー（１０ｐモル／ｍｌ）、３００ｎｇのＷ−１４　ｔｃｂＡ遺伝子を含むプラスミドｐＤＡＢ６３４及び１ｍｌのタカラＬＡ　Ｔａｑポリメラーゼ。サイクル条件は３０サイクルについて９８℃／２０秒、６８℃／５分、７２℃／１０分であった。予想される約７５２６ｂｐのＰＣＲ産物をＴＢＥ（１００ｍＭのトリス、９０ｍＭのホウ酸、１ｍＭのＥＤＴＡ）緩衝液中０．８％のアガロースゲル中で単離し、キアゲン（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）からのＱｌａｅｘ　ＩＩキットを使用して精製した。精製ｔｃｂＡ遺伝子をＮｃｏ　Ｉ及びＮｏｔ　Ｉで消化し、バキュロウイルス移入ベクターｐＡｃＧＰ６７Ｂ（ファーミンゲン（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））につなぎ、ＤＨ５　αＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。次いでｔｃｂＡ遺伝子をｐＡｃＧＰ６７Ｂから切断し、ｐＥＴ２７ｂに移入してプラスミドｐＤＡＢ６３５をつくった。ｔｃｂＡ遺伝子中のミスセンス突然変異をｐＤＡＢ６３５中で修復した。
【０２３６】
修復されたｔｃｂＡ遺伝子は配列番号１１に示された配列からの二つの変化；アスパラギン７１をセリン７１に変化する２１２におけるＡ＞Ｇ及びアラニン７７をスレオニン７７に変化する２２９におけるＧ＞Ａを含む。これらの変化は両方とも提案されたＴｃｂＡｉｉＮ末端の上流である。
ｐＥＴ１５−ｔｃｂＡの構築
ｐＤＡＢ６３５のｔｃｂＡコード領域をベクターｐＥＴ１５ｂに移入した。ショットガン結合を使用してこれを行い、ＤＮＡを制限酵素Ｎｃｏ　Ｉ及びＸｈｏ　Ｉで切断した。得られた組換え体をｐＥＴ１５−ｔｃｂＡと称する。
【０２３７】
プラスミドｐＥＴ１５−ｔｃｂＡからＥ．ｃｏｌｉ中のＴｃｂＡの発現
Ｅ．ｃｏｌｉ中のｔｃｂＡの発現を、Ｓｔｕｄｉｅｒら（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．，Ｄｕｎｎ，Ｊ．，及びＤｕｂｅｎ−ｄｏｒｆｆ，Ｊ．，（１９９０）クローン化遺伝子の発現を誘導するためのＴ７ＲＮＡポリメラーゼの使用Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８５：６０−８９）により既に記載された方法の改良により得た。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞株ＢＬ２１（ＤＥ３）をプラスミドｐＥＴ１５−ｔｃｂＡで形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び４０ｍＭのグルコースを含むＬＢ寒天に塗布した。形質転換細胞を数百の単離コロニー／プレートの密度まで塗布した。３７℃一夜のインキュベーション後に、細胞をプレートからこすり落とし、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢブロース中で懸濁させた。典型的な培養容積は２００−５００ｍｌであった。０時に、培養密度（ＯＤ６００）は実験に応じて０．０５−０．１５であった。０．１５−０．５の密度が得られるまで、培養物を三つの温度（２２℃、３０℃または３７℃）の一つで振とうし、その時点でそれらを１ｍＭのイソプロピルチオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。培養物を指定温度で４〜５時間インキュベートし、次いで処理するまで４℃に移した（１７〜７２時間）。
【０２３８】
プラスミドｐＥＴ１５−ｔｃｂＡからＥ．ｃｏｌｉ中で発現されたＴｃｂＡの精製及び特性決定
ＴｃｂＡペプチドを発現するＥ．ｃｏｌｉ培養物を以下のようにして処理した。細胞を１７，０００ｘＧで遠心分離により回収し、培地をデカントし、別の容器中で保存した。Ｍ１２（アミコン，Ｂｅｖｅｒｌｙ　ＭＡ）濾過系及び１００ｋＤ分子量カット−オフフィルターを使用して、培地を約８倍に濃縮した。濃縮培地を陰イオン交換カラムに装填し、結合したタンパク質を１．０ＭのＮａＣｌで溶離した。１．０ＭのＮａＣｌ溶離ピークはサザン・コーン・ルートワーム（ＳＣＲ）幼虫に対し死亡を生じることがわかった（表３０）。１．０ＭのＮａＣｌフラクションを１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０に対し透析し、濃縮し、セファロースＣＬ−４Ｂ（ファーマシア，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）によるゲル濾過にかけた。天然Ｗ−１４毒素複合体としての計算分子量（約９００ｋＤａ）に相当するＣＬ−４Ｂ溶離プロフィールの領域を回収し、濃縮し、幼虫に対しバイオアッセイを行った。
【０２３９】
回収した９００ｋＤａのフラクションは殺虫活性を有することがわかり（表３０を参照のこと）、症候解滅（ｓｙｍｐｔｏｍｏｌｏｇｙ）が天然Ｗ−１４毒素複合体により生じた症候解滅と同様であった。このフラクションをプロテイナーゼＫ及び熱処理にかけ、両方の場合の活性を排除または低下し、その活性が性質上タンパク様であるという証拠を得た。加えて、試験した活性フラクションは抗ＴｃｂＡｉｉモノクローナル抗体で試験した時にイムノブロットアッセイでＴｃｂＡペプチド及びＴｃｂＡｉｉｉペプチドについて免疫学的に陽性であった。
【０２４０】
【表３７】
表３０．イムノブロットアッセイ及びＳＣＲバイオアッセイの結果
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ＰＫ＝　プロテイナーゼＫ処理２時間；熱処理＝１００　℃で１０分間；　ＮＤ＝　検出されず；ＮＴ＝　試験せず。対照サンプルと比較した死亡率及び成長抑制に関するスコアリング系；　５−２４％＝“＋”、２５−４９　％＝“＋＋”　、５０−１００％＝“＋＋＋”
【０２４１】
細胞ペレットを１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ＝７．０に再度懸濁させ、バイオーネブＴＭ細胞ネブライザー（グラスーコル社，Ｔｅｒｒａ　Ｈａｕｔｅ，ＩＮ）中の通過により溶解した。ペレットをＤＮａｓｅで処理してＤＮＡを除去し、１７，０００ｘｇで遠心分離して細胞ペレットを細胞上澄みから分離した。上澄みフラクションをデカントし、０．２ミクロンのフィルターで濾過して大きい粒子を除去し、陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。結合したタンパク質を１．０ＭのＮａＣｌで溶離し、透析し、５０，０００ダルトンの分子量カット−オフでバイオマックスＴＭ（ミリポア・コーポレーション，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）濃縮装置を使用して濃縮した。濃縮フラクションを、セファロースＣＬ−４Ｂビードマトリックスを使用してゲル濾過クロマトグラフィーにかけた。このようにして調製した物質に関するバイオアッセイを表３０に示し、”ＴｃｂＡ細胞Ｓｕｐ”と称する。
【０２４２】
多量の物質を取り扱う別法において、細胞ペレットを１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ＝７．０に再度懸濁させ、コンテス・グラス社（Ｖｉｎｅｌａｎｄ，ＮＪ）の４０ｍｌの組織粉砕機を使用することにより充分に均一にした。細胞デブリを２５，０００ｘｇで遠心分離によりペレット化し、細胞上澄みをデカントし、０．２ミクロンのフィルターに通し、ポロスＨＱ５０ビーズを詰め込んだファーマシア１０／１０カラムを使用して陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。０．０〜１．０ＭのＮａＣｌ勾配を行うことにより結合したタンパク質を溶離した。ＴｃｂＡタンパク質を含むフラクションを合わせ、５０ｋＤａ濃縮装置を使用して濃縮し、ファーマシアＣＬ−４Ｂビードマトリックスを使用してゲル濾過クロマトグラフィーにかけた。約９００ｋＤａの分子量のＴｃｂＡオリゴマーを含むフラクションを回収し、２０ｍＭのトリス緩衝液ｐＨ＝７．３で平衡にしたファーマシアモノＱ１０／１０カラムを使用して陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。
【０２４３】
０．０〜１．０ＭのＮａＣｌの勾配を使用して組換えＴｃｂＡタンパク質を溶離した。組換えＴｃｂＡは約０．３−０．４ＭのＮａＣｌの塩濃度でカラムから溶離し、同じモル濃度で天然ＴｃｂＡオリゴマーがモノＱ１０／１０カラムから溶離される。組換えＴｃｂＡオリゴマーは表３０中の実験と同様のバイオアッセイ実験でＳＣＲ死亡率を生じることがわかった。
【０２４４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の毒素の配列遺伝子の一部として用いたクローン化ＤＮＡ分離物の対合を示す。
【図２】配列決定工程で用いた３つのプラスミドのマップである。
【図３】幾つかの部分ＤＮＡフラグメント間の関係を示すマップである。
【図４Ａ】ＴｃｂＡｉｉおよびＴｃａＢｉｉタンパク質のタンパク配列間の相同性分析を示す。
【図４Ｂ】ＴｃｂＡｉｉおよびＴｃａＢｉｉタンパク質のタンパク配列間の相同性分析を示す。
【図５】Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株の樹状図である。Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株の関係はｒｅｐ−ＰＣＲで規定された。図５の上部の軸は、ｒｅｐ−ＰＣＲの得点に基づく株間の％類似性を示す（すなわち、０．０（類似性なし）から１．０（１００％類似性））。右軸の数字と文字は調べた種々の株を示す。すなわち、１４＝Ｗ−１４、Ｈｍ＝Ｈｍ、Ｈ９＝Ｈ９、７＝ＷＸ−７、１＝ＷＸ−１、２＝ＷＸ−２、８８＝ＨＰ８８、ＮＣ−１＝ＮＣ−１、４＝ＷＸ−４、９＝ＷＸ−９、８＝ＷＸ−８、１０＝ＷＸ−１０、ＷＩＲ＝ＷＩＲ、３＝ＷＸ−３、１１＝ＷＸ−１１、５＝ＷＸ−５、６＝ＷＸ−６、１２＝ＷＸ−１２、ｘ１４＝ＷＸ−１４、１５＝ＷＸ−１５、Ｈｂ＝Ｈｂ、Ｂ２＝Ｂ２、４８から５２＝ＡＴＣＣ４３９４８からＡＴＣＣ４３９５２。水平線を分けている垂直の線は水平線ベースにある株または株群の間の関係の度合い（例えば株Ｗ−１４は株Ｈ９およびＨｍと約６０％類似である）を示している（これは上部の軸と垂直線との外挿交点から読む）。
【図６Ａ】Ｗ−１４株のゲノムマップである。
【図６Ｂ】Ｗ−１４株のゲノムマップである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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