(57)【要約】【課題】接種豚に過度のストレスを誘導せず、注射局所における接種物質の残留及び接種反応が極めて軽度で、高い安全性と有効性を保持するワクチン製剤を提供することを目的とするものである。【解決手段】Ｂｂおよび／またはＰｍ由来抗原ならびにマイクロエマルジョンを含有するワクチンを作製し、豚のＡＲ予防用製剤とする。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボルデテラ・ブロンキセプチカ由来抗原および／またはパスツレラ・ムルトシダ由来抗原と、キレート化剤を有するマイクロエマルジョンを免疫賦活剤として含有することを特徴とする豚の萎縮性鼻炎用ワクチン製剤。
【請求項２】
前記ボルデテラ・ブロンキセプチカ由来抗原が、ボルデテラ・ブロンキセプチカ不活化菌体である請求項１に記載の豚の萎縮性鼻炎用ワクチン製剤。
【請求項３】
前記パスツレラ・ムルトシダ由来抗原が、分子量約１４０　ｋＤａの皮膚壊死毒素タンパク質である請求項１に記載の豚の萎縮性鼻炎用ワクチン製剤。
【請求項４】
ボルデテラ・ブロンキセプチカ由来抗原および／またはパスツレラ・ムルトシダ由来抗原の他に、さらに豚に由来する細菌性またはウイルス性の病原体由来抗原の１種または２種以上を含む混合ワクチンである、請求項１から３のいずれかに記載の豚の萎縮性鼻炎用ワクチン製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、豚の萎縮性鼻炎（ａｔｒｏｐｈｉｃ　ｒｈｉｎｉｔｉｓ，以下ＡＲと略記）の予防用ワクチン製剤に関し、詳しくは、高い安全性と優れた有効性を発現する豚用ワクチン製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＡＲはボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ，以下Ｂｂと略記）および毒素産生性パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ，以下Ｐｍと略記）の単独あるいは混合感染により起こる。豚の萎縮性鼻炎はわが国を含めた世界の養豚地帯で発生し、養豚経営上多大な経済的被害をもたらしている。
【０００３】
本病の予防のため、両病原体の不活化菌体あるいは不活化毒素を成分とするワクチンが開発され広く利用されている。この不活化ワクチンには、免疫効果の誘導のため免疫賦活剤（アジュバント）が含まれるが、これは油性アジュバントと水酸化アルミニウムゲルアジュバントの二つに区別される。油性アジュバントを含むワクチンは高い免疫応答を誘導する反面、接種豚に強いストレスを誘発することおよび接種部位に重度な接種反応を惹起して接種物や接種痕を遺残させるという問題がある。一方、水酸化アルミニウムゲルアジュバントを含むワクチンは上記ストレスおよび遺残に関する問題はないが、そのアジュバント効果は油性アジュバントに較べると一般に弱い。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように豚用ＡＲ不活化ワクチンにおいては、高い安全性を保持しつつ優れた有効性を発現することが可能なアジュバントを含む製剤が要望されている。
【０００５】
そこで、本発明が解決しようとする課題は、接種豚に過度のストレスを誘導せず、注射局所における接種物質の残留および接種反応が極めて軽度で、高い安全性を保持する豚の萎縮性鼻炎用ワクチン製剤を提供することである。
【０００６】
さらに、本発明の他の課題は、妊娠豚への注射によってＢｂおよびＰｍ毒素に対して高値の抗体を誘導し、それが初乳を介して産子に伝達され、育成および肥育期間中におけるＡＲに対する高度な防御能を賦与する優れた有効性を保持するワクチン製剤を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するするために、本発明者らはマイクロエマルジョンをＡＲワクチンのアジュバントに応用することを試み、鋭意研究を進め、上記のような問題を解決できることを見いだし、本発明を完成させた。すなわち、本発明は次の通りである。
（１）ボルデテラ・ブロンキセプチカ由来抗原および／またはパスツレラ・ムルトシダ由来抗原と、キレート化剤を有するマイクロエマルジョンを免疫賦活剤として含有することを特徴とする豚の萎縮性鼻炎用ワクチン製剤。
（２）前記ボルデテラ・ブロンキセプチカ由来抗原が、ボルデテラ・ブロンキセプチカ不活化菌体である前記（１）に記載の豚の萎縮性鼻炎用ワクチン製剤。
（３）前記パスツレラ・ムルトシダ由来抗原が、分子量約１４０　ｋＤａの皮膚壊死毒素タンパク質である前記（１）に記載の豚の萎縮性鼻炎用ワクチン製剤。
（４）ボルデテラ・ブロンキセプチカ由来抗原および／またはパスツレラ・ムルトシダ由来抗原の他に、さらに豚に由来する細菌性またはウイルス性の病原体由来抗原の１種または２種以上を含む混合ワクチンである、前記（１）から（３）のいずれかに記載の豚の萎縮性鼻炎用ワクチン製剤。
【０００８】
【発明の実施の形態】
上記課題を解決するために本発明より提供される動物用ワクチン製剤の特徴は、Ｂｂおよび／またはＰｍ由来抗原ならびにマイクロエマルジョンを含有するワクチンであり、特に、このワクチンが豚のＡＲ予防用のものであるところにある。
【０００９】
本発明におけるマイクロエマルジョンは免疫賦活剤として機能するものであり、本発明におけるマイクロエマルジョンとは、水中に分散された微小油性粒子からなるものである。微小油性粒子とは、軽鉱物油と界面活性剤を混合し、水中で乳化することにより５ｎｍから５００ｎｍの粒子を形成させたものである。軽鉱物油としては、たとえばエ−テル化流動パラフィン、マコール５２（商品名、セピック（株）製）、ドラケオール６ＶＲ（商品名、ペンレコ（株）製）、軽質流動化パラフィン（日局）等を挙げることができる。界面活性剤としては、たとえばマンナイドモノオレイン酸、オレイン酸マンニタンエステルのエトキシル化誘導体、モノステアリン酸グリセリル、モノラウリン酸デカグリセリル、ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート等が使用できるが、軽鉱物油からマイクロエマルジョンを調製できればこれらのものに限定されない。
【００１０】
本発明のマイクロエマルジョンは、これらの軽鉱物油をマイクロエマルジョン当り、０．００１〜１０．０ｗｔ％、好ましくは、０．０１〜０．１ｗｔ％含むものである。０．００１ｗｔ％未満では粒子が不安定となり、１０ｗｔ％を超えて添加すると接種動物に対して接種物の遺残をもたらすことになる。
【００１１】
また、界面活性剤は、上記軽鉱物油を乳化してマイクロエマルジョンとすることができれば、その添加量は特に限定されない。
【００１２】
本発明のマイクロエマルジョンに含まれるキレ−ト化剤は、微小油性微粒子に結合した抗原の安定化と、微小油性粒子の免疫担当細胞への結合を介助する作用があり、例として、グルコン酸カルシウム、グルコン酸マンガン、サリチル酸アルミニウムまたは可溶性酢酸アルミニウム等の多イオン性酸複合体等が使用できる。これらのキレート化剤の添加量は、マイクロエマルジョン当り０．００２〜３０ｗｔ％、好ましくは０．０１〜１５ｗｔ％である。０．００２ｗｔ％未満では免疫増幅効果が期待されず、３０ｗｔ％を超えて添加すると接種動物に対して副作用がもたらされる。
【００１３】
本発明のキレート化剤を有するマイクロエマルジョンを調製する方法は、例えば、水に、上記軽鉱物油、界面活性剤およびキレート化剤を加えて、公知の乳化手段により乳化して、マイクロエマルジョンとすればよい。
【００１４】
キレート化剤を有するマイクロエマルジョンの最終ワクチン製剤液量に対する添加量は、好ましくは２０〜５０％（Ｖ／Ｖ）の範囲であり、特に好ましくは５０％（Ｖ／Ｖ）とする。
【００１５】
本発明の対象となるＢｂ由来抗原としては、Ｂｂ菌体に由来し、抗原として作用するものを用いることができ、具体的にはＢｂの不活化菌体またはその菌体由来成分が含まれる。菌体由来成分は、Ｂｂより抽出・精製したもの、あるいはＢｂの遺伝子をもとに大腸菌等の他の生物または細胞で発現させた組換えタンパク質であってもよい。
【００１６】
本発明の対象となるＰｍ由来抗原としては、好ましくは不活化Ｐｍ毒素であり、毒素産生性Ｐｍより抽出・精製し化学的処理によって毒素活性を消失させたもの、あるいはＰｍの遺伝子をもとに一部改変し、大腸菌等の他の生物または細胞で発現させた無毒型の組換えタンパク質であってもよい。また、毒素以外のＰｍ菌体成分を抽出したもの、あるいはＰｍの遺伝子をもとに大腸菌等の他の生物または細胞で発現させた組換えタンパク質であってもよい。
【００１７】
また、本発明のワクチン製剤には、Ｂｂおよび／またはＰｍ由来抗原の他に、抗原性を有する物質を混合してもよい。例えば、豚由来病原性細菌または病原ウイルス由来抗原が好適であり、より具体的には、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ　ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、マイコプラズマ・ハイオニュ−モニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アクチノバシラス・プルロニュ−モニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｓｕｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、サルモネラ・コレレエスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｕｉｓ）、豚繁殖呼吸障害症候群ウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｖｉｒｕｓ）、日本脳炎ウイルス（Ｊａｐａｎｅｓｅ　ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ）、豚サ−コウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ　Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ）、豚インフルエンザウイルス（Ｓｗｉｎｅ　Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ｖｉｒｕｓ）、オーエスキー病ウイルス（Ａｕｊｅｓｋｙ’ｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ　ｖｉｒｕｓ）等を挙げることができる。病原体由来抗原とは、当該菌またはウイルスそのもの、あるいは当該菌またはウイルスより抽出・精製したもの、あるいはその遺伝子をもとに大腸菌等の他の生物で発現させた組換えタンパク質であってもよい。
【００１８】
さらに、本発明のワクチン製剤には、一般にワクチン製剤に混合することがある他の成分を配合してもよい。
【００１９】
本発明のワクチン製剤は、各成分を撹拌しながら混合することにより得られる。各成分の配合順序は限定されない。
【００２０】
本発明のワクチン製剤は、筋肉内接種しても接種豚に過度の局所および全身性の接種反応を惹起せず、接種物の残存も比較的短期間に消失し、これらの性状は豚用のワクチンとして重要である。
【００２１】
以下、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２２】
【実施例】
＜実施例１＞　マイクロエマルジョンワクチンの調製
（１）抗原液の調製
Ｂｂ　Ｎ−４０株（野外採取し、日生研株式会社が保有）を液体培地で３７℃、１５〜２４時間培養した。培養菌液に０．２５％（Ｖ／Ｖ）の割合で日局ホルマリンを加えて不活化後、遠心集菌して得られた菌体をリン酸緩衝食塩液（以下ＰＢＳと略す）に均一に浮遊して抗原液とした。なお、ワクチン調製時には所定の総菌数（４×１０９〜４×１０１０個／２　ｍＬ，ド−ス）となるようＰＢＳで調整した。Ｐｍ　Ｇ−７株（野外採取し、日生研株式会社が保有）を液体培地で３７℃、５〜８時間培養した。これを遠心集菌して得られた菌体をリン酸緩衝液に均一に浮遊した後、物理的処理により菌体を破砕した。これを陰イオン交換カラムクロマトグラフィ−により分画し、毒素活性の存在する分画を採取して濃縮後、０．４％（Ｖ／Ｖ）の割合で日局ホルマリンを加えて不活化した。なお、ワクチン調製時には所定の不活化前タンパク量（６０〜１００μｇ／２　ｍＬ，ド−ス）となるようＰＢＳで調整した。
【００２３】
（２）マイクロエマルジョンの調製
牛脂を４０気圧下にて２００℃で２０分間処理して水解した。得られた水解物よりグリセロール分画を除去し、１８０℃にて減圧下に蒸留した。蒸留により得られたオレイン酸にプリオレン６９３０（商品名、セピック（株）製）とマンニトールを加え、２３０℃で６時間加温してエステル化した。形成されたマンナイドモノオレイン酸７０ｇ、エーテル化流動パラフィン１０ｇ、およびキレート化剤であるグルコン酸マンガン１０ｇを、ＰＢＳ９００ｍｌに溶解し、エマルジョン形成用乳化機を用いて、室温で処理して乳化し、マイクロエマルジョンを調製した。
【００２４】
なお、得られたマイクロエマルジョンの物性値は以下の通りであった。
・粒子サイズ：２００ｎｍ
・比重：１．０
・粘度：５ｍＰａｓ（２５℃）
・屈折率：１．３６７
・固形物含量：２２．３％
・外観：白色不透明液体
・過酸化物値：２ｍｍｏｌｅ以下
・ヨウ素値：３．６ｇ　Ｉ２／１００ｇ
・ケン化値：２２ｍｇ　ＫＯＨ／ｇ
・ｐＨ：５．６
・総灰分：０．５％
・異常毒性：なし
【００２５】
（３）ワクチン製剤の調製
調製したそれぞれの抗原液とマイクロエマルジョンとを、等量に混合し、室温で５分間以上撹拌した。
【００２６】
＜実施例２＞　マイクロエマルジョンワクチンの豚に対する安全性
実施例１で試作したワクチン２　ｍＬずつを、約３か月齢の豚４頭の頚部筋肉内に１か月間隔で２回注射した。各回注射後１０日間、臨床上の異常（振顫、嘔吐、横臥、食欲消失等）の有無を観察した。さらに第２回注射後３か月に剖検して注射局所の肉眼的観察を行い、異常（投与物質の残存、肉芽腫の形成、筋肉の変色等）の有無を調べた。結果は表１及び表２に示した。
【００２７】
【表１】
2004131417.tif 000002
【００２８】
表１中、臨床的に異常のないものは−で示した。
表１に示す通り、本試作ワクチンを注射した豚はいずれも臨床的異常を示さなかった。
【００２９】
【表２】
2004131417.tif 000003
【００３０】
表２中、異常のないものは−で示した。
表２に示す通り、初回（剖検時接種後４か月）及び第２回（剖検時接種後３か月）注射局所のいずれにも異常は見られなかった。
【００３１】
このように、マイクロエマルジョンを用いたＡＲワクチンは、接種豚に対して極めて安全であることが示された。
【００３２】
＜実施例３＞マイクロエマルジョンワクチンの豚における有効性
妊娠豚２頭を供試した。実施例１で作製したワクチン２　ｍＬずつを、１産目には１または２か月間隔で２回、２産目には１回を、それぞれ筋肉内注射した。１産目の第２回注射および２産目の注射は、分娩予定前２週〜４週に実施した。比較のため、実施例１と同じ抗原を用い、マイクロエマルジョンのかわりに水酸化アルミニウムゲルをアジュバントとしたワクチン（従来品）を調製し、同じ方法で妊娠豚に注射した。
【００３３】
マイクロエマルジョンワクチンおよび従来ワクチンを注射した母豚から初乳および分娩後約３週の血清を採取して、Ｂｂ凝集抗体価およびＰｍ毒素ＥＬＩＳＡ抗体価を測定した。それぞれの母豚の産子から経時的に４週齢から最終１２週齢まで採血し、同様に抗体価を測定した。
【００３４】
さらに、マイクロエマルジョンワクチンについてはＰｍ毒素に対する防御能の持続を確認するため、母豚Ｎｏ．１の　２産目の約６か月齢産子３頭および非注射対照母豚由来産子２頭に対し、Ｐｍ毒素を約４μｇ／体重ｋｇとなるよう筋肉内に注射して攻撃した。攻撃後２週に剖検し、鼻甲介部を肉眼的に観察してＡＲ病変の形成の有無を判定した。
【００３５】
抗体応答の成績を表３および表４に示した。
【００３６】
【表３】
2004131417.tif 000004
【００３７】
表３中、Ｂｂ抗体は凝集価で、Ｐｍ毒素抗体はＥＬＩＳＡ（Ｅ）値で示した。以降の表についても同様である。なお、表３中、「・」は、注射・採血を実施していないことを示した。
表３に示すように、試験に用いた４頭の母豚の初回注射時のＢｂ凝集価はすべて２０倍と低値であった。マイクロエマルジョンワクチンを注射した２頭の母豚の１産目の分娩後の血清のＢｂ凝集価は１２８０あるいは２５６０倍に上昇し、水酸化アルミニウムゲルワクチン注射豚の抗体価（３２０及び１６０倍）に比べて４〜１６倍高値であった。初乳においても、マイクロエマルジョンワクチン注射豚の凝集価は１０２４０および２０４８０倍で、水酸化アルミニウムゲルワクチン注射豚の抗体価に比べて４〜１６倍高値であった。マイクロエマルジョンワクチン注射豚の２産目の分娩後血清および初乳の凝集価は１産目と同値から２倍を示し、２産目においても高い抗体価を維持できることが示された。
【００３８】
試験に用いた４頭の母豚の初回注射時のＰｍ毒素Ｅ値は０〜０．０５と低値であった。マイクロエマルジョンワクチンを注射した２頭の母豚の１産目の分娩後の血清のＥ値は０．４１及び０．９６に上昇し、水酸化アルミニウムゲルワクチン注射豚の抗体価（０．１２および０．２５）に比べて約２〜８倍高値であった。初乳においても、マイクロエマルジョンワクチン注射豚のＥ値はいずれも２．０以上で、水酸化アルミニウムゲルワクチン注射豚の抗体価（２．０以上）と同様に高値であった。マイクロエマルジョンワクチン注射豚の２産目の分娩後血清および初乳のＥ値はすべて　２．０以上を示し、２産目においても高い抗体価を維持することが示された。
【００３９】
図１に、マイクロエマルジョンワクチン注射母豚由来産子（第１産目および第２産目）ならびに水酸化アルミニウムゲルワクチン注射母豚由来産子（第１産目）において、４週齢から１２週齢まで経時的に採血し、Ｂｂ凝集価およびＰｍ毒素Ｅ値の推移を調査した成績を示した。Ｂｂ凝集価は、マイクロエマルジョンワクチン注射母豚由来第１産目産子では、４週齢時で８２５倍と初乳を介する高い移行抗体の伝達が認められ、以降週齢とともに抗体価は低下し、１２週齢でも４３倍を保持した。マイクロエマルジョンワクチン注射母豚の第２産目産子ではさらに高い移行抗体の伝達がみられ、４週齢では１０００倍以上で、１２週齢においても６９倍の抗体価が保持された。一方、従来品である水酸化アルミニウムゲルワクチン注射母豚由来産子の凝集価は、４週齢で１６６倍で、１０週齢以降は検出されなかった。
【００４０】
Ｐｍ毒素に対するＥ値は、マイクロエマルジョンワクチン注射母豚の第１産目産子では、４週齢時で０．４４と初乳を介する高い移行抗体の伝達が認められ、以降週齢とともに低下し、１０週齢時以降は０．１以下となり陰転した。マイクロエマルジョンワクチン注射母豚の第２産目産子ではさらに高い移行抗体の伝達がみられ、４週齢では２．０以上で、１２週の時点でも０．１４と陽性を保持した。一方、従来品である水酸化アルミニウムゲルワクチン注射母豚の第１産目産子のＥ値は、４週齢で０．４１で、８週齢以降０．１以下となり陰転した。
【００４１】
このように、Ｂｂ凝集抗体およびＰｍ毒素ＥＬＩＳＡ抗体は、従来品である水酸化アルミニウムゲルワクチンに比べて発明品であるマイクロエマルジョンワクチンで注射母豚に高く誘導され、それが初乳を介して産子に伝達され、高度な移行抗体が長期にわたって産子に保持されることが判明した。
【００４２】
マイクロエマルジョンワクチン注射母豚由来産子において、高週齢においてＰｍ毒素ＥＬＩＳＡ抗体消失後も防御能を保持していることを確認するため、ワクチン注射母豚由来産子が２５週齢に達した時点で、ワクチン非注射対照母豚由来産子とともにＰｍ毒素を筋肉内に注射して攻撃した。攻撃後２週に剖検し、鼻甲介を肉眼的に観察して形成されたＡＲ病変をスコアリングした。
【００４３】
【表４】
2004131417.tif 000005
【００４４】
表４中、ＡＲ病変スコアは、肉眼的観察により　−：正常、１＋：軽度、２＋：中等度、３＋：重度の４段階で示した。
【００４５】
表４に示すように、攻撃時のＰｍ毒素抗体価はすべての豚で０．１以下であり、陰性であった。攻撃後に形成されたＡＲ病変は非注射対照母豚由来産子では中等度（２＋）及び重度（３＋）であったが、マイクロエマルジョンワクチン注射母豚由来産子では３頭すべてで陰性（−）であった。このことより、マイクロエマルジョンワクチン注射母豚由来産子においては、高週齢になり抗体が陰転しても、Ｐｍ毒素攻撃に対する防御能は保持されることが確認された。
【００４６】
マイクロエマルジョンワクチンを母豚に注射することにより、従来の水酸化アルミニウムゲルアジュバントワクチンより高値の抗体が産生され、産子への移行抗体もより高値となり長期間持続することが確認された。また、Ｐｍ毒素に対する防御能は、通常の出荷月齢に相当する約６か月齢までの長期にわたって持続することがあわせて確認された。
【００４７】
以上の成績により、本マイクロエマルジョンワクチンは、ＡＲの制御にあたって従来品以上に重要な道具になるものと考えられる。
【００４８】
【発明の効果】
本発明の、豚の萎縮性鼻炎用ワクチン製剤は、接種豚に過度のストレスを誘導せず、注射局所における接種物質の残留および接種反応が極めて軽度で、高い安全性を保持するものである。
【００４９】
また本発明の、豚の萎縮性鼻炎用ワクチン製剤は、妊娠豚への注射によってＢｂおよびＰｍ毒素に対して高値の抗体を誘導し、それが初乳を介して産子に伝達され、育成および肥育期間中におけるＡＲに対する高度な防御能を賦与する優れた有効性を保持するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例３におけるマイクロエマルジョンワクチンあるいは水酸化アルミニウムゲルアジュバントワクチン（従来品）を注射した母豚由来産子における移行抗体の消長を示すグラフである。それぞれ母豚２頭ずつに由来する産子の平均抗体価を示す。
【図１】
2004131417.tif 000006