(57)【要約】　　　（修正有）【課題】ヒトサイトケラチン（ヒトＣＫ）を検出するための遺伝子増幅反応に用いる新規プライマーを提供する。【解決手段】特定の塩基配列の２７０〜１３７５番目の領域及びその相補鎖の領域から選択され、例えば３４０種類のいずれかで表される特定の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーを構築する。また、特定の塩基配列の２７０〜９３０番目の領域及びその相補鎖の領域から選択され、例えば９２種類のいずれかで表される特定の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーを構築する。さらに特定の塩基配列の３４０〜４９０番目若しくは４９５〜１０５０番目の領域及びそれらの相補鎖の領域から選択され、例えば３９種類のいずれかで表される特定の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーを構築することによる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＡＭＰ法によりサイトケラチンを検出するための核酸増幅用プライマー。
【請求項２】
サイトケラチンが、サイトケラチン１８、サイトケラチン１９及びサイトケラチン２０からなる群より選択される請求項１に記載の核酸増幅用プライマー。
【請求項３】
以下の群より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含むヒトサイトケラチン１８検出のための核酸増幅用プライマー；
１）配列番号１で表される塩基配列の２７０〜１３７５番目の領域及びその相補鎖の領域から選択され、配列番号１及び／又はその相補鎖の連続する塩基を少なくとも５以上含むオリゴヌクレオチド。
２）配列番号２〜３４１のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
３）前記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号６６〜８８又は１７９〜３４１で表される塩基配列のいずれかより選択されるオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン１８検出のための核酸増幅用プライマー。
【請求項５】
核酸増幅の手段がＬＡＭＰ法である請求項３又は４に記載の核酸増幅用プライマー。
【請求項６】
以下の群より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用プライマーから少なくとも２種を選択することを特徴とするヒトサイトケラチン１８検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号１で表される塩基配列の２７０〜１３７５番目の領域及びその相補鎖の領域から選択され、配列番号１及び／又はその相補鎖の連続する塩基を少なくとも５以上含むオリゴヌクレオチド。
２）配列番号２〜３４１のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
３）前記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
核酸増幅の手段がＬＡＭＰ法である請求項６に記載のヒトサイトケラチン１８検出のための核酸増幅用プライマーセット。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用プライマーから少なくとも４種を選択することを特徴とする請求項７に記載のヒトサイトケラチン１８検出のためのプライマーセット。
【請求項９】
前記プライマーセットに含まれるプライマーのうち少なくとも２種が、配列番号１で表される塩基配列及び／又はその相補鎖の各々２箇所の領域を認識することを特徴とする請求項６〜８のいずれか１に記載のヒトサイトケラチン１８検出のためのプライマーセット。
【請求項１０】
前記プライマーセットに含まれるプライマーが、配列番号１で表される塩基配列及び／又はその相補鎖の少なくとも６箇所の領域を認識することを特徴とする請求項７〜９のいずれか１に記載のプライマーセット。
【請求項１１】
配列番号２３４〜３４１で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン１８検出のための核酸増幅用プライマーであって、
（ａ）配列番号２３４〜２８６、及び（ｂ）配列番号２８７〜３４１、
に分類した場合の、（ａ）及び（ｂ）から各１のプライマーを選択した組合せを含むことを特徴とするプライマーセット。
【請求項１２】
請求項１１のプライマーセットに、配列番号６６〜８８又は配列番号１７９〜２０１で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン１８検出のための核酸増幅用プライマーであって、
（ｃ）配列番号６６〜８８、及び（ｄ）配列番号１７９〜２０１、
に分類した場合の、（ｃ）及び（ｄ）から各１のプライマーを選択した組合せのプライマーをさらに含むことを特徴とするプライマーセット。
【請求項１３】
請求項１１又は１２のプライマーセットに、配列番号２０２〜２３３で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン１８検出のための核酸増幅用プライマーであって、
（ｅ）配列番号２０２〜２１９、及び（ｆ）配列番号２２０〜２３３、
に分類した場合の、（ｅ）及び（ｆ）から各１のプライマーを選択した組合せのプライマーをさらに含むことを特徴とするプライマーセット。
【請求項１４】
次に示す１）〜４）のいずれかからなるサイトケラチン１８検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号２３４、２８７、６６及び１７９で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２）配列番号２５２、２９７、６８及び１８２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
３）配列番号２５９、３０７、７２及び１８４で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
４）配列番号２７８、３３１、７９及び１９３で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
【請求項１５】
次に示す１）〜４）のいずれかからなるヒトサイトケラチン１８検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号２３４、２８７、６６、１７９、２０３及び２２０で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２）配列番号２５２、２９７、６８、１８２、２１１及び２２３で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
３）配列番号２５９、３０７、７２、１８４、２１２及び２２６で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
４）配列番号２７８、３３１、７９、１９３、２１４及び２２８で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
【請求項１６】
次に示す１）〜８）のいずれかからなるヒトサイトケラチン１８検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号２８０、３３４、８２及び１９５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２）配列番号２８１、３３５、８３及び１９６で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
３）配列番号２８２、３３６、８４及び１９７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
４）配列番号２８２、３３７、８４及び１９７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
５）配列番号２８３、３３８、８５及び１９８で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
６）配列番号２８４、３３９、８６及び１９９で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
７）配列番号２８５、３４０、８７及び２００で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
８）配列番号２８６、３４１、８８及び２０１で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
【請求項１７】
次に示す１）〜６）のいずれかからなるヒトサイトケラチン１８検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号２８２、３３６、８４、１９７、２１６及び２２９で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２）配列番号２８２、３３７、８４、１９７、２１６及び２３０で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
３）配列番号２８２、３３７、８４、１９７、２１６及び２３１で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
４）配列番号２８３、３３８、８５、１９８、２１７及び２３２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
５）配列番号２８６、３４１、８８、２０１、２１８及び２３３で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
６）配列番号２８６、３４１、８８、２０１、２１９及び２３３で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
【請求項１８】
請求項３若しくは４に記載のプライマーから必要なプライマーを選択し、又は請求項５〜１７のいずれか１に記載のプライマーセットを選択して使用することによるヒトサイトケラチン１８の核酸検出方法。
【請求項１９】
以下の群より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含むヒトサイトケラチン１９検出のための核酸増幅用プライマー；
１）配列番号３４２で表される塩基配列の２７０〜９３０番目の領域及びその相補鎖の領域から選択され、配列番号３４２及び／又はその相補鎖の連続する塩基を少なくとも５以上含むオリゴヌクレオチド。
２）配列番号３４３〜４３２のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
３）前記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
配列番号３５７〜３６１又は３７８〜４３４の配列番号に表される塩基配列のいずれかより選択されるオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン１９検出のための核酸増幅用プライマー。
【請求項２１】
核酸増幅の手段がＬＡＭＰ法である請求項１９又は２０に記載のヒトサイトケラチン１９検出のための核酸増幅用プライマー。
【請求項２２】
以下の群より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用プライマーから少なくとも２種を選択することを特徴とするヒトサイトケラチン１９検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号３４２で表される塩基配列の２７０〜９３０番目の領域及びその相補鎖の領域から選択され、配列番号３４２又はその相補鎖の連続する塩基を少なくとも５以上含むオリゴヌクレオチド。
２）配列番号３４３〜４３４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
３）前記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
核酸増幅の手段がＬＡＭＰ法である請求項２２に記載のヒトサイトケラチン１９検出のためのプライマーセット。
【請求項２４】
オリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用プライマーから少なくとも４種を選択することを特徴とする請求項２２又は２３に記載のヒトサイトケラチン１９検出のためのプライマーセット。
【請求項２５】
前記プライマーセットに含まれるプライマーのうち少なくとも２種が、配列番号３４２で表される塩基配列及び／又はその相補鎖の各々２箇所の領域を認識することを特徴とする請求項２２〜２４のいずれか１に記載のヒトサイトケラチン１９検出のためのプライマーセット。
【請求項２６】
前記プライマーセットに含まれるプライマーが、配列番号３４２で表される塩基配列及び／又はその相補鎖の少なくとも６箇所の領域を認識することを特徴とする請求項２２〜２５のいずれか１に記載のヒトサイトケラチン１９検出のための核酸増幅用プライマーセット。
【請求項２７】
配列番号４１３〜４３４に表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン１９検出のための核酸増幅用プライマーであって、
（ａ）配列番号４１３〜４１７、４１９、４２２若しくは４２４〜４２７、及び
（ｂ）配列番号４１８、４２０、４２１、４２３若しくは４２８〜４３４、
に分類した場合の、（ａ）及び（ｂ）から各１のプライマーを選択した組合せを含むことを特徴とするプライマーセット。
【請求項２８】
請求項２７で選択された各プライマーの組合せに、
配列番号３５７〜３６１又は３７８〜３８４に表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン１９検出のための核酸増幅用プライマーであって、
（ｃ）配列番号３５７〜３６１、及び（ｄ）配列番号３７８〜３８４、
に分類した場合の、（ｃ）及び（ｄ）から各１のプライマーを選択した組合せのプライマーをさらに含むことを特徴とするプライマーセット。
【請求項２９】
請求項２７又は２８で選択された各プライマーの組合せに、
配列番号３８５〜４１２に表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン１９検出のための核酸増幅用プライマーであって、
（ｅ）配列番号３８５〜３９８、及び（ｆ）配列番号３９９〜４１２、
に分類した場合の、（ｅ）及び（ｆ）から各１のプライマーを選択した組合せを含むことを特徴とするプライマーセット。
【請求項３０】
各配列番号に表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン１９検出のための核酸増幅用プライマーであって、１）〜４）のいずれかの組合せを含むプライマーセット；
１）（ａ）配列番号４１３〜４１７、（ｂ）配列番号４１８、（ｃ）配列番号３５７、（ｄ）配列番号３７８に分類した場合の、各分類から１のプライマーを選択した組合せ。２）（ａ）配列番号４１９、（ｂ）配列番号４２０〜４２１、（ｃ）配列番号３５８、（ｄ）配列番号３７９に分類した場合の、各分類から１のプライマーを選択した組合せ。３）（ａ）配列番号４２２、（ｂ）配列番号４２３、（ｃ）配列番号３５９、（ｄ）配列番号３８０に分類した場合の、各プライマーを選択した組合せ。
４）（ａ）配列番号４２４〜４２７、（ｂ）配列番号４２８〜４３４、（ｃ）配列番号３６０〜３６１、（ｄ）配列番号３８１〜３８４に分類した場合の、各分類から１のプライマーを選択した組合せ。
【請求項３１】
各配列番号に表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン１９検出のための核酸増幅用プライマーであって、１）〜４）のいずれかの組合せを含むプライマーセット；
１）（ａ）配列番号４１３〜４１７、（ｂ）配列番号４１８、（ｃ）配列番号３５７、（ｄ）配列番号３７８、（ｅ）配列番号３８５〜３９１、（ｆ）配列番号３９９〜４０２に分類した場合の、各分類から１のプライマーを選択した組合せ。
２）（ａ）配列番号４１９、（ｂ）配列番号４２０〜４２１、（ｃ）配列番号３５８、（ｄ）配列番号３７９、（ｅ）配列番号３９２〜３９３、（ｆ）配列番号４０３〜４０６に分類した場合の、各分類から１のプライマーを選択した組合せ。
３）（ａ）配列番号４２２、（ｂ）配列番号４２３、（ｃ）配列番号３５９、（ｄ）配列番号３８０、（ｅ）配列番号３９４〜３９６、（ｆ）配列番号４０７〜４０９に分類した場合の、各分類から１のプライマーを選択した組合せ。
４）（ａ）配列番号４２４〜４２７、（ｂ）配列番号４２８〜４３４、（ｃ）配列番号３６０〜３６１、（ｄ）配列番号３８１〜３８４、（ｅ）配列番号３９７〜３９８、（ｆ）配列番号４１１〜４１２に分類した場合の、各分類から１のプライマーを選択した組合せ。
【請求項３２】
１）〜３）のいずれかからなるヒトサイトケラチン１９検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号４１３、４１８、３５７及び３７８で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２）配列番号４１９、４２１、３５８及び３７９で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
３）配列番号４２４、４３１、３６０及び３８１で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
【請求項３３】
１）〜４）のいずれかからなるヒトサイトケラチン１９検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号４１３、４１８、３５７、３７８、３８５及び４０２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２）配列番号４１９、４２１、３５８、３７９、３９２及び４０４で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
３）配列番号４２２、４２３、３５９、３８０、３９４及び４０７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
４）配列番号４２４、４３１、３６０、３８１、３９７及び４１１で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
【請求項３４】
請求項１９若しくは２０に記載のプライマーから必要なプライマーを選択し、又は請求項２１〜３３のいずれかから選択されるプライマーセットを使用することによる核酸検出方法。
【請求項３５】
以下の群より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含むヒトサイトケラチン２０検出のための核酸増幅用プライマー；
１）配列番号４３５で表される塩基配列の３４０〜４９０番目若しくは４９５〜１０５０番目の領域及びそれらの相補鎖の領域から選択され、配列番号４３５及び／又はその相補鎖の連続する塩基を少なくとも５以上含むオリゴヌクレオチド。
２）配列番号４３６〜４６０のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
３）前記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
配列番号４４３、４４４又は４５４〜４７４の配列番号に表される塩基配列のいずれかより選択されるオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン２０検出のための核酸増幅用プライマー。
【請求項３７】
核酸増幅の手段がＬＡＭＰ法である請求項３５又は３６に記載のヒトサイトケラチン２０検出のための核酸増幅用プライマー。
【請求項３８】
以下の群より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用プライマーから少なくとも２種を選択することを特徴とするヒトサイトケラチン２０検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号４３５で表される塩基配列の３４０〜１０５０番目及びその相補鎖の領域から選択され、配列番号４３５及び／又はその相補鎖の連続する塩基を少なくとも５以上含むオリゴヌクレオチド。
２）配列番号４３６から４６０のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
３）前記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
核酸増幅の手段がＬＡＭＰ法である請求項３８に記載のヒトサイトケラチン２０検出のための核酸増幅用プライマーセット。
【請求項４０】
オリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用プライマーから少なくとも４種を選択することを特徴とする請求項３９に記載のヒトサイトケラチン２０検出のためのプライマーセット。
【請求項４１】
前記プライマーセットに含まれるプライマーのうち少なくとも２種が、配列番号４３５で表される塩基配列及び／又はその相補鎖の各々２箇所の領域を認識することを特徴とする請求項３８〜４０のいずれか１に記載のヒトサイトケラチン２０検出のためのプライマーセット。
【請求項４２】
前記プライマーセットに含まれるプライマーが、配列番号４３５で表される塩基配列及び／又はその相補鎖の少なくとも６箇所の領域を認識することを特徴とする請求項３８〜４１のいずれか１に記載のヒトサイトケラチン２０検出のためのプライマーセット。
【請求項４３】
配列番号４６１〜４６６及び４６８〜４７３に表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン２０検出のための核酸増幅用プライマーであって、　（ａ）配列番号４６１〜４６６、（ｂ）配列番号４６８〜４７３に分類した場合の、各分類から１のプライマーを選択した組合せを含むことを特徴とするプライマーセット。
【請求項４４】
請求項４３で選択された各プライマーの組合せに、さらに配列番号４４４及び配列番号４５５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むヒトサイトケラチン２０検出のためのプライマーセット。
【請求項４５】
請求項４３又は４４に記載のプライマーセットにさらに配列番号４５７及び／又は４５９若しくは４６０で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むヒトサイトケラチン２０検出のためのプライマーセット。
【請求項４６】
配列番号４４３、４５４、４６７及び４７４で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むヒトサイトケラチン２０検出のためのプライマーセット。
【請求項４７】
配列番号４４３、４５４、４６７及び４７４で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドの他にさらに配列番号４５６及び／又は４５８で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用するヒトサイトケラチン２０検出のためのプライマーセット。
【請求項４８】
請求項３５若しくは３６に記載のプライマーから必要なプライマーを選択し、又は請求項３７〜４７のいずれかから選択されるプライマーセット使用して行う核酸検出方法。
【請求項４９】
核酸検出方法がＬＡＭＰ法である請求項１８、３４又は４８に記載の核酸検出方法。
【請求項５０】
請求項１８、３４、４８又は４９に記載の核酸検出方法に使用する試薬。
【請求項５１】
請求項１８、３４、４８又は４９に記載の核酸検出方法に使用する試薬キット。
【請求項５２】
請求項１８、３４、４８又は４９に記載の核酸検出方法を用いた核酸検出システム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、ヒトサイトケラチンを検出するための核酸増幅用プライマーに関する。
【０００２】
【従来の技術】
サイトケラチン（以下、本明細書中では「ＣＫ」と記載する）は、細胞の繊維性骨格を形成するタンパク質の一つで、少なくとも２０個の遺伝子群からなるファミリーを形成し、ヒトＣＫ１８、ヒトＣＫ１９及びヒトＣＫ２０等が公知である。ＣＫは上皮細胞で発現される。
例えばヒトＣＫ１８は、乳腺、肺、大腸、胃などの正常組織だけでなくそれぞれの癌組織においても発現されることが報告されているが、ヒトＣＫ１８は上皮系組織ではないリンパ節では発現されないことが知られている。また、ヒトＣＫ１９は肺癌、胃癌、乳癌、膵癌、前立腺癌等で発現されることが報告されており、正常組織と癌組織でのヒトＣＫ１９の発現量に差が認められる。ヒトＣＫ２０は大腸癌、胃癌、メルケル細胞癌、婦人科粘液癌、移行上皮癌、膵癌・胆管癌で発現されることが報告されており、やはり正常組織と癌組織でのヒトＣＫ２０の発現量に差が認められる。そこで、リンパ節等の組織においてヒトＣＫ１８、ヒトＣＫ１９及び／又はヒトＣＫ２０の発現の有無を調べることで癌の転移の有無を確認することができる、さらに上記正常組織と癌組織で発現量の差が認められるものを調べることでも癌の転移を確認することができる。
【０００３】
癌細胞は、原病巣部位を離れ、血流やリンパ系を経由して全身に転移する。癌の手術では、できるだけ確実に病巣を取り除くことが必要であるため、転移を正確に検出し、転移の度合に応じて適切な処置をすることが要求される。このため、術中のリンパ節への癌転移診断は極めて重要な意義を有している。例えば乳癌の場合には、ＱＯＬ向上のために郭清範囲を縮小化する傾向であるが、術中のリンパ節癌転移診断は、最小限のリンパ節郭清範囲を決定するための重要な指針となりうる。食道癌においては、リンパ節転移の部位を検出することにより、開腹、閉胸、頚部切開のうち、いずれの術式を選択するかの決定するための指針となりうる。前立腺癌においては、リンパ節転移があれば摘出手術は中止し、ホルモン療法を行う等の意思決定の指標となり、さらに胃癌においても、術式及び術後の治療方針の選択の指針となりうる。又、患者への負担を考えると、術中の癌転移診断は、迅速に行うことが必要である。
【０００４】
リンパ節への癌転移診断の１手法として、癌マーカーとしてＣＫタンパク質を検出する方法がある。例えば、切除したリンパ節を凍結し、凍結した組織の切断面を染色する等により行われているが、このような手法では切断面の情報のみであるから微小癌転移を見落とす危険性がある。
【０００５】
近年の遺伝子解析技術の発展により、癌マーカー遺伝子の発現を検出することで、効果的に癌診断が行われるようになった。例えばＰＣＲ法は、ＤＮＡ鎖の１本鎖への解離、ＤＮＡ鎖の中の特定の領域をはさんだプライマーの結合、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を繰り返すことによって、目的のＤＮＡ断片を数十万倍にも増幅できる方法であり（特開昭６１−２７４６９７号公報）、種々の試料中の核酸の高感度分析法として使用可能である。例えば、動物体液や組織由来の試料中の核酸の分析が可能であるため、感染症や遺伝病や癌の診断などに有用である。
【０００６】
ＲＮＡの検出には、ＲＴ−ＰＣＲ法が利用できる。ＲＴ−ＰＣＲ法とは、例えば腫瘍組織からＲＮＡを抽出し、オリゴ（ｄＴ）又はランダムヘキサマーをプライマーにして逆転写酵素（ＲＴ）によりｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡをＰＣＲ法で増幅し、検出する方法である。この方法を用いた線維芽細胞腫の診断の例が報告されている（北海道医学雑誌、ｐ．１３５−１４１，　Ｖｏｌ．　６６（２），（１９９１））。ＲＴ−ＰＣＲにより、切除した組織からＣＫのｍＲＮＡ発現の検出が可能となり、癌転移の見落としの間題はある程度回避されるようになった。腫瘍や癌の診断分野では、このような核酸増幅方法が実用化されている（臨床検査法提要、第３１版１３１４頁、金原出版株式会杜、１９９８年９月２０日発行）。
しかし、ＰＣＲ法では、鋳型ＤＮＡの２本鎖から１本鎖への変性の操作を必要とし、増幅反応は複数の温度条件で繰り返し行う必要があった。また、一般に検出可能な増幅産物を得るのに２時間程度かかり、迅速性を要求される術中に行う検査としては好ましいものではない。
【０００７】
ＰＣＲ法以外のＤＮＡ増幅方法として、ＬＡＭＰ法が報告されている（特許文献１）。ＬＡＭＰ法は、鎖置換反応が進行すると増幅産物の末端にヘアピン構造を形成するプライマーを含む複数のプライマーによる遺伝子増幅法である。まず、初期反応において、２種類のインナープライマー（ＦＩＰ、ＲＩＰ）と２種類のアウタープライマー（Ｆ３プライマー、Ｒ３プライマー）及び鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼにより鋳型ＤＮＡから両端に一本鎖ループ部分をもつダンベル状の構造が合成される。この構造が増幅サイクルの起点構造となって、この構造の３’末端側から自己を鋳型としてＤＮＡの伸長・合成反応が進む。増幅産物は多数の繰り返し構造からなり、繰り返し構造の単位はプライマーに挟まれた被増幅領域を構成する２本の核酸の塩基配列が逆向きになった同一鎖内の相補性領域からなる。　ＬＡＭＰ法は、鋳型ＤＮＡの２本鎖から１本鎖への熱変性の操作を必要とせず、増幅反応はすべて等温で連続的に進行することが特徴である（非特許文献１、２）。鋳型がＲＮＡの場合には、鋳型がＤＮＡの場合の反応液組成にさらに逆転写酵素を添加することで同様に起点構造を合成することができ、増幅を進めることができる（ＲＴ−ＬＡＭＰ法）。ＬＡＭＰ法では、３０分程度で検出に十分な増幅産物が得られる。したがって、核酸検出に要する時間が短縮されるため、例えば迅速に治療方針を決定することを目的としたリンパ節への癌転移の診断に適用できる。又、迅速に結果が得られることから、術中診断への適用も期待できる。
ＬＡＭＰ法に適用されるプライマーの基本的な考え方は、特許文献１及び特許文献２に記載されている。
【０００８】
ヒトＣＫ１８検出用のＰＣＲ用プライマー又はプローブについては既に報告されている（非特許文献３）。同様に、ヒトＣＫ１９検出用のＰＣＲ用プライマー又はプローブについても既に報告されている（特許文献３、非特許文献４）。また、同様にヒトＣＫ２０検出用のＰＣＲ用プライマー又はプローブについても既に報告されている（非特許文献５、６）。
しかしながら、ヒトＣＫ検出用であって、ＬＡＭＰ法に適用されるプライマーの報告はなく、その開発が望まれている。また、その他の核酸増幅手段に適用されるプライマーでも、公知のプライマーのほかに新たなプライマー又は測定に有用なプライマーセットの構築が望まれている。
【０００９】
【先行文献】
【特許文献１】
国際公開ＷＯ　００／２８０８２号公報
【特許文献２】
国際公開ＷＯ　０２／２４９０２号公報
【特許文献３】
米国ＵＳ　６２０３９９２特許公報
【非特許文献１】
Ｂｉｏベンチャー、Ｖｏｌ．１，　Ｎｏ．１，　ｐ．１０９−１１５（２００１）
【非特許文献２】
ＢＩＯ　ＩＮＤＵＳＴＲＹ、Ｖｏｌ．１８，　Ｎｏ．２，　ｐ．１５−２９（２００１）
【非特許文献３】
Ｇｅｎｅ，　１５９（１），　ｐ．４３−４７（１９９５）
【非特許文献４】
Ｂｒｅａｓｔ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　６０，　ｐ．１４３−１５１（２０００）
【非特許文献５】
Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊ．　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ，　７７（８），　ｐ．１３２７−１３３２（１９９８）
【非特許文献６】
Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊ．　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ，　８２（１），　ｐ１５７−１６０　（２０００）
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ヒトＣＫを検出するための核酸増幅反応に用いる新規プライマーを提供することを目的とする。より具体的には、ＬＡＭＰ法による核酸増幅用のプライマーを提供することに関する。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ＬＡＭＰ法に効果的に適用されるヒトＣＫを検出するための核酸増幅用プライマーを構築することができた。
【００１２】
即ち本発明は、
１．ＬＡＭＰ法によりサイトケラチンを検出するための核酸増幅用プライマー、
２．サイトケラチンが、サイトケラチン１８、サイトケラチン１９及びサイトケラチン２０からなる群より選択される前項１に記載の核酸増幅用プライマー、
３．以下の群より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含むヒトサイトケラチン１８検出のための核酸増幅用プライマー；
１）配列番号１で表される塩基配列の２７０〜１３７５番目の領域及びその相補鎖の領域から選択され、配列番号１及び／又はその相補鎖の連続する塩基を少なくとも５以上含むオリゴヌクレオチド、
２）配列番号２〜３４１のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
３）前記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、
４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド、
４．配列番号６６〜８８又は１７９〜３４１で表される塩基配列のいずれかより選択されるオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン１８検出のための核酸増幅用プライマー、
５．核酸増幅の手段がＬＡＭＰ法である前項３又は４に記載の核酸増幅用プライマー、
６．以下の群より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用プライマーから少なくとも２種を選択することを特徴とするヒトサイトケラチン１８検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号１で表される塩基配列の２７０〜１３７５番目の領域及びその相補鎖の領域から選択され、配列番号１及び／又はその相補鎖の連続する塩基を少なくとも５以上含むオリゴヌクレオチド、
２）配列番号２〜３４１のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
３）前記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、
４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド、
７．核酸増幅の手段がＬＡＭＰ法である前項６に記載のヒトサイトケラチン１８検出のための核酸増幅用プライマーセット、
８．オリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用プライマーから少なくとも４種を選択することを特徴とする前項７に記載のヒトサイトケラチン１８検出のためのプライマーセット、
９．前記プライマーセットに含まれるプライマーのうち少なくとも２種が、配列番号１で表される塩基配列及び／又はその相補鎖の各々２箇所の領域を認識することを特徴とする前項６〜８のいずれか１に記載のヒトサイトケラチン１８検出のためのプライマーセット、
１０．前記プライマーセットに含まれるプライマーが、配列番号１で表される塩基配列及び／又はその相補鎖の少なくとも６箇所の領域を認識することを特徴とする前項７〜９のいずれか１に記載のプライマーセット、
１１．配列番号２３４〜３４１で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン１８検出のための核酸増幅用プライマーであって、
（ａ）配列番号２３４〜２８６、及び（ｂ）配列番号２８７〜３４１、
に分類した場合の、（ａ）及び（ｂ）から各１のプライマーを選択した組合せを含むことを特徴とするプライマーセット、
１２．前項１１のプライマーセットに、配列番号６６〜８８又は配列番号１７９〜２０１で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン１８検出のための核酸増幅用プライマーであって、
（ｃ）配列番号６６〜８８、及び（ｄ）配列番号１７９〜２０１、
に分類した場合の、（ｃ）及び（ｄ）から各１のプライマーを選択した組合せのプライマーをさらに含むことを特徴とするプライマーセット、
１３．前項１１又は１２のプライマーセットに、配列番号２０２〜２３３で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン１８検出のための核酸増幅用プライマーであって、
（ｅ）配列番号２０２〜２１９、及び（ｆ）配列番号２２０〜２３３、
に分類した場合の、（ｅ）及び（ｆ）から各１のプライマーを選択した組合せのプライマーをさらに含むことを特徴とするプライマーセット、
１４．次に示す１）〜４）のいずれかからなるサイトケラチン１８検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号２３４、２８７、６６及び１７９で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
２）配列番号２５２、２９７、６８及び１８２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
３）配列番号２５９、３０７、７２及び１８４で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
４）配列番号２７８、３３１、７９及び１９３で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
１５．次に示す１）〜４）のいずれかからなるヒトサイトケラチン１８検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号２３４、２８７、６６、１７９、２０３及び２２０で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
２）配列番号２５２、２９７、６８、１８２、２１１及び２２３で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
３）配列番号２５９、３０７、７２、１８４、２１２及び２２６で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
４）配列番号２７８、３３１、７９、１９３、２１４及び２２８で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
１６．次に示す１）〜８）のいずれかからなるヒトサイトケラチン１８検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号２８０、３３４、８２及び１９５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
２）配列番号２８１、３３５、８３及び１９６で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
３）配列番号２８２、３３６、８４及び１９７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
４）配列番号２８２、３３７、８４及び１９７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
５）配列番号２８３、３３８、８５及び１９８で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
６）配列番号２８４、３３９、８６及び１９９で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
７）配列番号２８５、３４０、８７及び２００で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
８）配列番号２８６、３４１、８８及び２０１で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
１７．次に示す１）〜６）のいずれかからなるヒトサイトケラチン１８検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号２８２、３３６、８４、１９７、２１６及び２２９で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
２）配列番号２８２、３３７、８４、１９７、２１６及び２３０で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
３）配列番号２８２、３３７、８４、１９７、２１６及び２３１で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
４）配列番号２８３、３３８、８５、１９８、２１７及び２３２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
５）配列番号２８６、３４１、８８、２０１、２１８及び２３３で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
６）配列番号２８６、３４１、８８、２０１、２１９及び２３３で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
１８．前項３若しくは４に記載のプライマーから必要なプライマーを選択し、又は請求項５〜１７のいずれか１に記載のプライマーセットを選択して使用することによるヒトサイトケラチン１８の核酸検出方法、
１９．以下の群より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含むヒトサイトケラチン１９検出のための核酸増幅用プライマー；
１）配列番号３４２で表される塩基配列の２７０〜９３０番目の領域及びその相補鎖の領域から選択され、配列番号３４２及び／又はその相補鎖の連続する塩基を少なくとも５以上含むオリゴヌクレオチド、
２）配列番号３４３〜４３２のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
３）前記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、
４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド、
２０．配列番号３５７〜３６１又は３７８〜４３４の配列番号に表される塩基配列のいずれかより選択されるオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン１９検出のための核酸増幅用プライマー、
２１．核酸増幅の手段がＬＡＭＰ法である前項１９又は２０に記載のヒトサイトケラチン１９検出のための核酸増幅用プライマー、
２２．以下の群より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用プライマーから少なくとも２種を選択することを特徴とするヒトサイトケラチン１９検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号３４２で表される塩基配列の２７０〜９３０番目の領域及びその相補鎖の領域から選択され、配列番号３４２又はその相補鎖の連続する塩基を少なくとも５以上含むオリゴヌクレオチド、
２）配列番号３４３〜４３４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
３）前記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、
４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド、
２３．核酸増幅の手段がＬＡＭＰ法である前項２２に記載のヒトサイトケラチン１９検出のためのプライマーセット、
２４．オリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用プライマーから少なくとも４種を選択することを特徴とする前項２２又は２３に記載のヒトサイトケラチン１９検出のためのプライマーセット、
２５．前記プライマーセットに含まれるプライマーのうち少なくとも２種が、配列番号３４２で表される塩基配列及び／又はその相補鎖の各々２箇所の領域を認識することを特徴とする前項２２〜２４のいずれか１に記載のヒトサイトケラチン１９検出のためのプライマーセット、
２６．前記プライマーセットに含まれるプライマーが、配列番号３４２で表される塩基配列及び／又はその相補鎖の少なくとも６箇所の領域を認識することを特徴とする前項２２〜２５のいずれか１に記載のヒトサイトケラチン１９検出のための核酸増幅用プライマーセット、
２７．配列番号４１３〜４３４に表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン１９検出のための核酸増幅用プライマーであって、
（ａ）配列番号４１３〜４１７、４１９、４２２若しくは４２４〜４２７、及び
（ｂ）配列番号４１８、４２０、４２１、４２３若しくは４２８〜４３４、
に分類した場合の、（ａ）及び（ｂ）から各１のプライマーを選択した組合せを含むことを特徴とするプライマーセット、
２８．前項２７で選択された各プライマーの組合せに、
配列番号３５７〜３６１又は３７８〜３８４に表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン１９検出のための核酸増幅用プライマーであって、
（ｃ）配列番号３５７〜３６１、及び（ｄ）配列番号３７８〜３８４、
に分類した場合の、（ｃ）及び（ｄ）から各１のプライマーを選択した組合せのプライマーをさらに含むことを特徴とするプライマーセット、
２９．前項２７又は２８で選択された各プライマーの組合せに、
配列番号３８５〜４１２に表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン１９検出のための核酸増幅用プライマーであって、
（ｅ）配列番号３８５〜３９８、及び（ｆ）配列番号３９９〜４１２、
に分類した場合の、（ｅ）及び（ｆ）から各１のプライマーを選択した組合せを含むことを特徴とするプライマーセット、
３０．各配列番号に表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン１９検出のための核酸増幅用プライマーであって、１）〜４）のいずれかの組合せを含むプライマーセット；
１）（ａ）配列番号４１３〜４１７、（ｂ）配列番号４１８、（ｃ）配列番号３５７、（ｄ）配列番号３７８に分類した場合の、各分類から１のプライマーを選択した組合せ。
２）（ａ）配列番号４１９、（ｂ）配列番号４２０〜４２１、（ｃ）配列番号３５８、（ｄ）配列番号３７９に分類した場合の、各分類から１のプライマーを選択した組合せ。
３）（ａ）配列番号４２２、（ｂ）配列番号４２３、（ｃ）配列番号３５９、（ｄ）配列番号３８０に分類した場合の、各プライマーを選択した組合せ。
４）（ａ）配列番号４２４〜４２７、（ｂ）配列番号４２８〜４３４、（ｃ）配列番号３６０〜３６１、（ｄ）配列番号３８１〜３８４に分類した場合の、各分類から１のプライマーを選択した組合せ、
３１．各配列番号に表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン１９検出のための核酸増幅用プライマーであって、１）〜４）のいずれかの組合せを含むプライマーセット；
１）（ａ）配列番号４１３〜４１７、（ｂ）配列番号４１８、（ｃ）配列番号３５７、（ｄ）配列番号３７８、（ｅ）配列番号３８５〜３９１、（ｆ）配列番号３９９〜４０２に分類した場合の、各分類から１のプライマーを選択した組合せ。
２）（ａ）配列番号４１９、（ｂ）配列番号４２０〜４２１、（ｃ）配列番号３５８、（ｄ）配列番号３７９、（ｅ）配列番号３９２〜３９３、（ｆ）配列番号４０３〜４０６に分類した場合の、各分類から１のプライマーを選択した組合せ。
３）（ａ）配列番号４２２、（ｂ）配列番号４２３、（ｃ）配列番号３５９、（ｄ）配列番号３８０、（ｅ）配列番号３９４〜３９６、（ｆ）配列番号４０７〜４０９に分類した場合の、各分類から１のプライマーを選択した組合せ。
４）（ａ）配列番号４２４〜４２７、（ｂ）配列番号４２８〜４３４、（ｃ）配列番号３６０〜３６１、（ｄ）配列番号３８１〜３８４、（ｅ）配列番号３９７〜３９８、（ｆ）配列番号４１１〜４１２に分類した場合の、各分類から１のプライマーを選択した組合せ、
３２．１）〜３）のいずれかからなるヒトサイトケラチン１９検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号４１３、４１８、３５７及び３７８で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２）配列番号４１９、４２１、３５８及び３７９で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
３）配列番号４２４、４３１、３６０及び３８１で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
３３．１）〜４）のいずれかからなるヒトサイトケラチン１９検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号４１３、４１８、３５７、３７８、３８５及び４０２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
２）配列番号４１９、４２１、３５８、３７９、３９２及び４０４で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
３）配列番号４２２、４２３、３５９、３８０、３９４及び４０７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
４）配列番号４２４、４３１、３６０、３８１、３９７及び４１１で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
３４．前項１９若しくは２０に記載のプライマーから必要なプライマーを選択し、又は前項２１〜３３のいずれかから選択されるプライマーセットを使用することによる核酸検出方法、
３５．以下の群より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含むヒトサイトケラチン２０検出のための核酸増幅用プライマー；
１）配列番号４３５で表される塩基配列の３４０〜４９０番目若しくは４９５〜１０５０番目の領域及びそれらの相補鎖の領域から選択され、配列番号４３５及び／又はその相補鎖の連続する塩基を少なくとも５以上含むオリゴヌクレオチド、
２）配列番号４３６〜４６０のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
３）前記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、
４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド、
３６．配列番号４４３、４４４又は４５４〜４７４の配列番号に表される塩基配列のいずれかより選択されるオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン２０検出のための核酸増幅用プライマー、
３７．核酸増幅の手段がＬＡＭＰ法である前項３５又は３６に記載のヒトサイトケラチン２０検出のための核酸増幅用プライマー、
３８．以下の群より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用プライマーから少なくとも２種を選択することを特徴とするヒトサイトケラチン２０検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号４３５で表される塩基配列の３４０〜１０５０番目及びその相補鎖の領域から選択され、配列番号４３５及び／又はその相補鎖の連続する塩基を少なくとも５以上含むオリゴヌクレオチド、
２）配列番号４３６から４６０のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
３）前記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、
４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド、
３９．核酸増幅の手段がＬＡＭＰ法である前項３８に記載のヒトサイトケラチン２０検出のための核酸増幅用プライマーセット、
４０．オリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用プライマーから少なくとも４種を選択することを特徴とする前項３９に記載のヒトサイトケラチン２０検出のためのプライマーセット、
４１．前記プライマーセットに含まれるプライマーのうち少なくとも２種が、配列番号４３５で表される塩基配列及び／又はその相補鎖の各々２箇所の領域を認識することを特徴とする前項３８〜４０のいずれか１に記載のヒトサイトケラチン２０検出のためのプライマーセット、
４２．前記プライマーセットに含まれるプライマーが、配列番号４３５で表される塩基配列及び／又はその相補鎖の少なくとも６箇所の領域を認識することを特徴とする請求項３８〜４１のいずれか１に記載のヒトサイトケラチン２０検出のためのプライマーセット。
４３．配列番号４６１〜４６６及び４６８〜４７３に表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン２０検出のための核酸増幅用プライマーであって、（ａ）配列番号４６１〜４６６、（ｂ）配列番号４６８〜４７３に分類した場合の、各分類から１のプライマーを選択した組合せを含むことを特徴とするプライマーセット、
４４．前項４３で選択された各プライマーの組合せに、さらに配列番号４４４及び配列番号４５５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むヒトサイトケラチン２０検出のためのプライマーセット。
４５．前項４３又は４４に記載のプライマーセットにさらに配列番号４５７及び／又は４５９若しくは４６０で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むヒトサイトケラチン２０検出のためのプライマーセット、
４６．配列番号４４３、４５４、４６７及び４７４で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むヒトサイトケラチン２０検出のためのプライマーセット、
４７．配列番号４４３、４５４、４６７及び４７４で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドの他にさらに配列番号４５６及び／又は４５８で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用するヒトサイトケラチン２０検出のためのプライマーセット、
４８．前項３５若しくは３６に記載のプライマーから必要なプライマーを選択し、又は前項３７〜４７のいずれかから選択されるプライマーセット使用して行う核酸検出方法、
４９．核酸検出方法がＬＡＭＰ法である前項１８、３４又は４８に記載の核酸検出方法、
５０．前項１８、３４、４８又は４９に記載の核酸検出方法に使用する試薬、
５１．前項１８、３４、４８又は４９に記載の核酸検出方法に使用する試薬キット、
５２．前項１８、３４、４８又は４９に記載の核酸検出方法を用いた核酸検出システム、からなる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
（プライマーの設計）
本発明は、ヒトＣＫの核酸増幅法、好ましくはＬＡＭＰ法に適用可能な核酸増幅用のプライマーを提供するものである。該プライマーは、例えば、公知の配列番号１，３４２，　４３５等に表されるＣＫの塩基配列及び／又はその相補的な配列から連続する塩基を少なくとも５以上含む適当なオリゴヌクレオチドを選択して設計することができる。
【００１４】
ＬＡＭＰ法で用いるプライマーの基本的な考え方は、特許文献１に記載の通りである。具体的には、増幅すべき標的ＤＮＡの、３’末端側から順にＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという領域を、５’末端側から順にＲ３、Ｒ２、Ｒ１という領域を規定し、少なくともこの６つの領域に対し、実質的に同一な塩基配列、又は実質的に相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド鎖を選択し、少なくとも４種のプライマーを設計する。
【００１５】
実質的に同じ塩基配列とは、次のように定義される。すなわち、ある塩基配列を鋳型として合成された相補鎖が、目的の塩基配列に対してハイブリダイズし、相補鎖合成の起点を与えるとき、この配列は目的の塩基配列に対して実質的に同一である。例えば、Ｆ２に対して実質的に同一な塩基配列とは、Ｆ２と全く同一な塩基配列に加えて、Ｆ２にハイブリダイズして相補鎖合成の起点となりうる塩基配列を与える鋳型として機能する塩基配列を含む。
【００１６】
本発明に基づくオリゴヌクレオチドを構成する塩基配列の特徴付けのために用いられる同一、あるいは相補的という用語はいずれも完全に同一、あるいは完全に相補的であることを要しない。すなわち、ある配列と同一とは、ある配列に対してハイブリダイズすることができる塩基配列に対して相補的な配列をも含むことができる。他方、相補的とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、相補鎖合成の起点となる３’末端を提供することができる配列を意味する。
【００１７】
本発明のプライマーは、以下に述べる各種の核酸合成反応において与えられた環境のもとで必要な特異性を維持しながら相補鎖との塩基対結合を行うことができる程度の鎖長をもつ。具体的には５〜２００塩基、より望ましくは１０〜５０塩基対とする。配列依存的な核酸合成反応を触媒する公知のポリメラーゼが認識するプライマーの鎖長は最低５塩基前後であることから、ハイブリダイズする部分の鎖長はそれ以上である必要がある。加えて、塩基配列としての特異性を維持するためには、１０塩基以上の長さを維持するのが望ましい。一方、あまりにも長い塩基配列は化学合成によって調製することが困難となることから、前記のような鎖長が望ましい範囲として例示される。
【００１８】
本発明において用いられる鋳型という用語は、相補鎖合成の鋳型となる側の核酸を意味する。鋳型に相補的な塩基配列を持つ相補鎖は、鋳型にハイブリダイズしうる鎖としての意味を持つが、両者の関係はあくまでも相対的なものに過ぎない。すなわち、相補鎖として合成された鎖は、再び鋳型として機能することができる。つまり、相補鎖は鋳型になることができる。
【００１９】
本発明において、標的ＤＮＡの塩基配列から選択されるプライマーは、各々ＦＩＰ（ｆｏｒｗａｒｄ　ｉｎｎｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ）、Ｆ３プライマー（ｆｏｒｗａｒｄ　ｏｕｔｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ）、ＲＩＰ（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｉｎｎｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ）及びＲ３プライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｏｕｔｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ）のいずれかを構成する。
ＦＩＰは、標的ＤＮＡのＦ２ｃ領域と実質的に相補的なＦ２領域の塩基配列を３’末端にもち、５’末端に標的ＤＮＡのＦ１ｃ領域と実質的に同じ塩基配列をもつように設計する。この場合において、Ｆ２及びＦ１ｃの配列間に標的ＤＮＡに依存しない配列が介在していても良い。この標的ＤＮＡに依存しない配列の長さは０〜５０塩基、好ましくは０〜４０塩基であれば許容しうる。
Ｆ３プライマーは、標的ＤＮＡのＦ３ｃ領域と実質的に相補的なＦ３領域と実質的に同じ塩基配列をもつように設計する。
ＲＩＰは、標的ＤＮＡのＲ２ｃ領域と実質的に相補的なＲ２領域の塩基配列を３’末端にもち、５’末端に標的ＤＮＡのＲ１ｃ領域と実質的に同じ塩基配列をもつように設計する。ＲＩＰもＦＩＰと同様に、Ｒ２及びＲ１ｃの配列の間に標的ＤＮＡに依存しない配列が介在していても良い。
Ｒ３プライマーは、標的ＤＮＡのＲ３ｃ領域と実質的に相補的なＲ３領域と実質的に同じ塩基配列をもつように設計する。
【００２０】
また、ＬＡＭＰ法では、少なくとも１種以上のループプライマーを併用することで増幅時間を短縮することができる（特許文献２）。ループプライマーとは、ダンベル構造の５’末端側のループの１本鎖部分、具体的には例えばＲ１領域とＲ２領域の間、あるいはＦ１領域とＦ２領域の間に相補的な配列をもつプライマーをいう。ループプライマーを用いることによりＤＮＡ合成の起点を増やすことが可能となる。このループプライマーは、ＤＮＡ合成過程でできたＦＩＰ又はＲＩＰがハイブリダイズしないループ領域にハイブリダイズするように設計する。
【００２１】
（ヒトＣＫ１８検出用のプライマーの設計）
ヒトＣＫ１８検出用のプライマーは、既知の配列番号１に表される１４１２塩基よりなる塩基配列及び／又はその相補的な配列から、連続する塩基を少なくとも５以上含む適当なオリゴヌクレオチドを選択して設計される。尚、配列番号１に示す塩基配列はＧｅｎｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　４５５７８８７に基づく。
ヒトＣＫ１８検出用のプライマーも、上記プライマーの原理に従った領域を選択して設計する。
【００２２】
ヒトＣＫ１８検出用プライマーの領域は、塩基組成、ＧＣ含量、二次構造、Ｔｍ値などに注意し、ＤＮＡ領域を認識する塩基配列の長さは、塩基数が少なくとも５塩基以上、好ましくは１０〜３０塩基、より好ましくは１７〜２５塩基のものを選択することができる。Ｔｍ値は、一般的にＮｅａｒｅｓｔ　Ｎｅｉｇｈｂｏｒ法で求めることができる。ＤＮＡ領域は、Ｔｍ値が５５〜６５℃、好ましくは５８〜６４℃のものを選択し、ＧＣ含量が４０〜７０％、好ましくは５０〜６５％のものを選択することができる。
【００２３】
このような条件により、本発明で選択されたプライマーの領域は、配列番号１で表される塩基配列の２７０〜１３７５番目の領域及びその相補鎖の領域、好ましくは塩基配列の２８０〜５８０番目の領域及びその相補鎖の領域に含まれる。
【００２４】
ヒトＣＫ１８検出用プライマーは、１）　配列番号１で表される塩基配列の２７０〜１３７５番目の領域及び／又はその相補鎖の領域に含まれ、塩基数が少なくとも５以上のオリゴヌクレオチド、２）　配列番号２〜４１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、３）　前記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、４）　前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、又は、５）　前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、から選択され、設計される。
【００２５】
オリゴヌクレオチドは、自体公知の方法により製造することができ、例えば化学的に合成することができる。あるいは、天然の核酸を制限酵素などによって切断し、上記のような塩基配列で構成されるように改変し、あるいは連結することも可能である。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置（アプライドバイオシステムズ社製　Ｅｘｐｅｄｉｔｅ　Ｍｏｄｅｌ　８９０９　ＤＮＡ合成機）等を用いて合成することができる。また、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異させたオリゴヌクレオチドの合成法も、自体公知の製法を使用することができる。例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法又はＰＣＲ法を単独又は適宜組合せて、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年；［ラボマニュアル遺伝子工学］、村松正實編、丸善株式会社、１９８８年；［ＰＣＲテクノロジー、ＤＮＡ増幅の原理と応用］、Ｅｈｒｌｉｃｈ，　ＨＥ．編、ストックトンプレス、１９８９年等に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、例えばＵｌｍｅｒの技術（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８３）２１９：６６６）を利用することができる。
【００２６】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は一般に知られたものを選択することができる。その一例としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１５ｍＭ　クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．６、５×デンハーツ溶液、１０％デキストラン硫酸、及び２０μｇ／ｍｌのＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、室温で２×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳ中で一次洗浄し、次いで、約６５℃において０．１×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳで二次洗浄といった条件があげられる。
【００２７】
ここで増幅されるべき核酸の鋳型はヒトＣＫ１８のｍＲＮＡであるから、使用するプライマーが、検体中に含まれるゲノムＤＮＡを増幅しないように設計することが必要とされる。具体的には、本発明のプライマーセットに含まれるプライマーの少なくとも１つは、ヒトＣＫ１８の遺伝子において複数のエクソンにまたがる領域を含むものであることが望ましい。このような工夫を行うことによって、ゲノムＤＮＡ由来の配列の増幅が排除され、ヒトＣＫ１８のｍＲＮＡ由来の配列を選択的に増幅することが可能となる。
【００２８】
（ヒトＣＫ１９検出用のプライマーの設計）
ヒトＣＫ１９検出用のプライマーも、ヒトＣＫ１８検出用プライマーと同様に、設計することができる。ヒトＣＫ１９検出用プライマーは、既知の配列番号３４２に表される１３６０塩基よりなる塩基配列及び／又はその相補的な配列から、連続する塩基を少なくとも５以上含む適当なオリゴヌクレオチドを選択して設計される。尚、配列番号３４２に示す塩基配列はＧｅｎｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　４５０４９１６に基づく。
ヒトＣＫ１９検出用プライマーも、上記の原理に従った領域を選択し、設計する。ヒトＣＫ１９検出用プライマーの領域は、配列番号３４２で表される塩基配列の２７０〜９３０番目の領域及びその相補鎖の領域、好ましくは２７０〜５６０番目、３７０〜５８５番目、６２５〜８５４番目の領域若しくは６５５〜９３０番目及びそれらの相補鎖の領域に含まれる。
【００２９】
ヒトＣＫ１９検出用プライマーは、１）　配列番号３４２で表される塩基配列の２７０〜９３０番目の領域及び／又はその相補鎖の領域に含まれ、好ましくは２７０〜５６０番目、３７０〜５８５番目、６２５〜８５４番目若しくは６５５〜９３０番目の領域及び／又はそれら相補鎖の領域に含まれ、塩基数が少なくとも５以上のオリゴヌクレオチド、２）　配列番号３４３〜３８２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、３）　前記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、４）　前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、又は、５）　前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含むオリゴヌクレオチドから選択され、設計される。
【００３０】
（ヒトＣＫ２０検出用のプライマーの設計）
ヒトＣＫ２０検出用のプライマーも、ヒトＣＫ１８検出用プライマーやヒトＣＫ１９検出用のプライマーと同様に、設計することができる。ヒトＣＫ２０検出用プライマーは、既知の配列番号４３５に表される１２７５塩基よりなる塩基配列及び／又はその相補的な配列から、連続する塩基を少なくとも５以上含む適当なオリゴヌクレオチドを選択して設計される。尚、配列番号４３５に示す塩基配列はＧｅｎｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．４０２６４４に基づく。
ヒトＣＫ２０検出用プライマーも、上記の原理に従った領域を選択し、設計する。ヒトＣＫ２０検出用プライマーの領域は、配列番号４３５で表される塩基配列の３４０〜１０５０番目の領域及びその相補鎖の領域、好ましくは３４０〜４９０番目若しくは４９５〜１０５０番目の領域及びそれらの相補鎖の領域、さらに好ましくは３４０〜４９０番目、４９５〜５７０番目若しくは７９０〜１０５０番目の領域及びそれらの相補鎖の領域に含まれる。
【００３１】
ヒトＣＫ２０検出用プライマーは、１）　配列番号４３５で表される塩基配列の３４０〜１０５０番目の領域及び／又はその相補鎖の領域に含まれ、好ましくは３４０〜４９０番目若しくは４９５〜１０５０番目の領域及び／又はそれらの相補鎖の領域、さらに好ましくは、３４０〜４９０番目、４９５〜５７０番目若しくは７９０〜１０５０番目の領域及び／又はそれらの相補鎖の領域に含まれ、塩基数が少なくとも５以上のオリゴヌクレオチド、２）　配列番号４３６〜４７４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、３）　前記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、４）　前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、又は、５）　前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含むオリゴヌクレオチドから選択され、設計される。
【００３２】
（プライマーセット）
本発明のプライマーを使用して核酸増幅を行う場合、少なくとも２種を組合せてプライマーセットとして使用する。ＬＡＭＰ法では、少なくとも４種のプライマー（ＦＩＰ、Ｆ３プライマー、ＲＩＰ、Ｒ３プライマー）を組合せてプライマーセットとして使用する。さらに、１種以上のループプライマーを組合せて、プライマーセットとして使用することもできる。
【００３３】
（ＲＴ−ＬＡＭＰ法）
ＲＴ−ＬＡＭＰ法は、ＲＮＡを鋳型とするＬＡＭＰ法であり、ＬＡＭＰ法の基本的な考え方は、特許文献１に記載の通りである。ＲＴ−ＬＡＭＰ法では一つの溶液中で、鋳型ＲＮＡからｃＤＮＡを合成しながら、ＬＡＭＰ法の起点構造が合成される。具体的には次の１）のステップを経た後、２）〜５）ステップの繰り返しにより、ＤＮＡの伸長が繰り返され、標的ＤＮＡの増幅が行われる。
【００３４】
１）　鋳型ＲＮＡ鎖にＦＩＰが結合し、鋳型ＲＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖が伸長する。この反応は逆転写酵素、例えばＡＭＶ由来の逆転写酵素等を用いる。
２）　上記１）で合成したＦＩＰからのＤＮＡ鎖を、Ｆ３プライマーが鋳型ＲＮＡから剥がしながら、鋳型ＲＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖が伸長する。以降ＤＮＡ鎖の伸長はＤＮＡポリメラーゼによる。
３）　上記２）で剥がされたＤＮＡ鎖に、ＲＩＰが結合してＤＮＡ鎖が伸長する。
４）　上記３）で伸長したＲＩＰからのＤＮＡ鎖をＲ３プライマーが剥がしながら、ＦＩＰからのＤＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖が伸長し、ＬＡＭＰ法の起点構造が合成される。
５）　上記４）で剥がされたＤＮＡ鎖の両端の配列は、同じＤＮＡ鎖の配列中に相補的な配列を有するので、各々ハイブリダイズし、両端にループ構造を持つ。
なお、例えばＢｃａＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅのように、逆転写酵素活性とＤＮＡポリメラーゼ活性の両活性を有する酵素があり、このような酵素を使用する場合は、上記の反応は１つの酵素で実施することができる。
【００３５】
（検出方法）
ＬＡＭＰ法では、合成されたＤＮＡ鎖は自己の配列に対して相補的な配列をもつので、その大部分が塩基対結合を形成している。この特徴を利用して、増幅生成物の検出が可能である。エチジウムブロマイド、ＳＹＢＥＲ　ＧＲＥＥＮ　Ｉ、あるいはＰｉｃｏ　Ｇｒｅｅｎのような２本鎖インターカーレーターである蛍光色素の存在下で本発明のプライマーを用いて核酸増幅を実施すれば、生成物の増加に伴って蛍光強度の増大が観察される。これをモニターすれば、閉鎖系でＤＮＡの増幅と蛍光の増加が同時に追跡可能である（臨床検査法提要、３１版１３１８頁；特開２００１−２４２１６９号公報参照。以下単に「リアルタイム法」という）。
また、ＬＡＭＰ法では、増幅反応の過程で、副産物として不溶性のピロリン酸マグネシウムが生成し、白濁する。そこで、反応液の濁りを目視により確認する、あるいは反応液の吸光度や散乱光強度を測定して濁度を検出する、または反応液を有色のフィルターでろ過し、フィルター上の残渣を確認することにより増幅生成物の有無を検出することができる（国際公開ＷＯ０１／８３８１７号参照）。
【００３６】
（試薬、試薬キット、その他）
本発明のプライマーを用いて核酸の検出を行う際に必要な各種の試薬類は、あらかじめパッケージングしてキット化することができる。具体的には、本発明の相補鎖合成のプライマーとして、あるいは置換用のプライマーとして必要な各種のオリゴヌクレオチド、逆転写活性を有する酵素、相補鎖合成の基質となるｄＮＴＰ、鎖置換型の相補鎖合成を行うＤＮＡポリメラーゼ、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、必要があればＲＮａｓｅインヒビターのように増幅反応を阻害する物質を除去するための薬剤、さらに必要に応じて反応生成物の検出のために必要な試薬類がキットとして提供される。
【００３７】
本発明は、核酸増幅用プライマー及びプライマーセット、ならびにこれらのプライマーを用いた核酸検出方法、核酸検出方法に使用される検出試薬、核酸検出キットならびに核酸検出システム全体に及ぶ。
【００３８】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３９】
（実施例１−１）ヒトＣＫ１８塩基配列からの領域の選択
配列番号１に記載するヒトＣＫ１８の塩基配列から、プローブ設計ソフトを用いてＬＡＭＰ法に適切な領域の位置を検討した。Ｆ１ｃ及びＲ１ｃはＴｍ値が５８．５〜６３．５℃、Ｆ２及びＲ２はＴｍ値が６１．５〜６２．５℃、Ｆ３及びＲ３はＴｍ値が５８．５〜６２．５℃の条件により領域を選択した結果、次に示すものが選択された。選択された領域は、配列番号１で表される塩基配列の３４０〜１０５０番目の領域及びその相補鎖の領域に含まれる。
【００４０】
2004089180.tif 000002
2004089180.tif 000003
【００４１】
2004089180.tif 000004
【００４２】
2004089180.tif 000005
【００４３】
2004089180.tif 000006
2004089180.tif 000007
【００４４】
2004089180.tif 000008
2004089180.tif 000009
【００４５】
2004089180.tif 000010
【００４６】
2004089180.tif 000011
【００４７】
2004089180.tif 000012
【００４８】
（実施例１−２）ＣＫ１８検出用プライマーの設計
実施例１−１で選択された領域の配列から、ＬＡＭＰ法に適用される次の核酸増幅用プライマーが得られた。
【００４９】
2004089180.tif 000013
2004089180.tif 000014
【００５０】
2004089180.tif 000015
2004089180.tif 000016
【００５１】
2004089180.tif 000017
【００５２】
2004089180.tif 000018
【００５３】
2004089180.tif 000019
【００５４】
（実施例２−１）ヒトＣＫ１９塩基配列からの領域の選択
配列番号３４２に記載するヒトＣＫ１９の遺伝子の塩基配列から、プローブ設計ソフトを用いてＬＡＭＰ法に適切な領域の位置を検討した。Ｆ１ｃ及びＲ１ｃはＴｍ値が５８．５〜６３．５℃、Ｆ２及びＲ２はＴｍ値が６１．５〜６２．５℃、Ｆ３及びＲ３はＴｍ値が５８．５〜６２．５℃の条件により領域を選択した結果、次に示すものが選択された。選択された領域は、配列番号３４２で表される塩基配列の２７０〜９３０番目の領域及びその相補鎖の領域に含まれる。
【００５５】
2004089180.tif 000020
【００５６】
2004089180.tif 000021
【００５７】
2004089180.tif 000022
【００５８】
2004089180.tif 000023
【００５９】
2004089180.tif 000024
【００６０】
2004089180.tif 000025
【００６１】
2004089180.tif 000026
【００６２】
2004089180.tif 000027
【００６３】
（実施例２−２）ＣＫ１９検出用プライマーの設計
実施例２−１で選択された領域の配列から、ＬＡＭＰ法に適用される次の核酸増幅用プライマーが得られた。
各プライマーを、本発明のＲＴ−ＬＡＭＰ法において使用するプライマーセットとして示し、領域ごとにＡ〜Ｄの４つのグループに分類した。Ａグループの各プライマーは、配列番号３４２で表される塩基配列の２７０〜５６０番目の領域及びその相補鎖の領域から選択され、Ｂグループの各プライマーは、同様に３７０〜５８５番目の領域及びその相補鎖の領域、Ｃグループの各プライマーは、同様に６２５〜８５４番目の領域及びその相補鎖の領域、Ｄグループの各プライマーは、同様に６５５〜９３０番目の領域及びその相補鎖の領域の各領域から選択される。
【００６４】
2004089180.tif 000028
2004089180.tif 000029
【００６５】
2004089180.tif 000030
【００６６】
2004089180.tif 000031
【００６７】
2004089180.tif 000032
2004089180.tif 000033
【００６８】
（実施例３−１）ヒトＣＫ２０塩基配列からの領域の選択
配列番号４３５に記載するヒトＣＫ２０の塩基配列から、プローブ設計ソフトを用いてＬＡＭＰ法に適切な領域の位置を検討した。Ｆ１ｃ及びＲ１ｃはＴｍ値が５８．５〜６３．５℃、Ｆ２及びＲ２はＴｍ値が６１．５〜６２．５℃、Ｆ３及びＲ３はＴｍ値が５８．５〜６２．５℃の条件により領域を選択した結果、次に示すものが選択された。選択された領域は、配列番号４３５で表される塩基配列の３４０〜１０５０番目の領域及びその相補鎖の領域に含まれる。
【００６９】
2004089180.tif 000034
【００７０】
2004089180.tif 000035
【００７１】
2004089180.tif 000036
【００７２】
（実施例３−２）ＣＫ２０検出用プライマーの設計
実施例３−１で選択された領域の配列から、ＬＡＭＰ法に適用される次の核酸増幅用プライマーが得られた。
【００７３】
2004089180.tif 000037
【００７４】
2004089180.tif 000038
【００７５】
2004089180.tif 000039
【００７６】
2004089180.tif 000040
【００７７】
2004089180.tif 000041
【００７８】
【実験例】
上記で取得したＣＫ１８、ＣＫ１９又はＣＫ２０検出用の各種プライマーを用いてＲＴ−ＬＡＭＰ法を実施した場合の効果を、実験例１〜３により測定し、確認した。
【００７９】
（実験例１−１）増幅の確認
ヒトＣＫ１８検出用の各種プライマーを次の組合せでＲＴ−ＬＡＭＰ法で測定した場合の、反応を開始してから増幅が確認できるまでに要する時間を各プライマーセットについて調べることを目的として実験を行った。
【００８０】
１）ヒトＣＫ１８ＲＮＡ試料の調製方法
ヒトＣＫ１８の塩基配列を基に設計したプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、ＫＡＴＯＩＩＩ（胃癌細胞）由来トータルＲＮＡから、ヒトＣＫ１８ｃＤＮＡを単離した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製プラスミド）にクローニングしたヒトＣＫ１８ｃＤＮＡから、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの転写システム（Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製））を用いて転写産物を合成した。得られた原液のＲＮＡ濃度を２６０ｎｍでの吸光度測定により算出し、その値をもとにヒトＣＫ１８のＲＮＡコピー数が６００００、６０００、６００、６０、６及び０（対照）となるように５０　ｎｇ／μＬ　ｙｅａｓｔ　ＲＮＡ（Ａｍｉｂｏｎ社製）で希釈調製し、鋳型とした。
【００８１】
２）ヒトＣＫ１８検出用プライマーセット
各種プライマーを（表１）の組合せで用いた。
（表１）プライマーセット
（各番号は配列番号を示し、プライマーは各配列番号で表される配列からなるプライマーを意味する）
2004089180.tif 000042
【００８２】
３）反応液組成
ｄＮＴＰｓ　（ＧＩＢＣＯ社製）　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．４　ｍＭ
ＭｇＳＯ４　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２　ｍＭ
ジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）　　　　　　　　　　　５　ｍＭ
ベタイン（ｂｅｔａｉｎｅ）（Ｓｉｇｍａ社製）　　　　　　　　　　　　　６４０　ｍＭ
Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ　ｂｕｆｆｅｒ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）
ＡＭＶ　逆転写酵素　（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）　　　　　　　　　　　　　１．２５Ｕ
Ｂｓｔ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製）　　　　　１６Ｕ
エチジウムブロマイド（ｅｔｈｉｄｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ）　　　　　　０．１２５　ｍｇ／ｍＬ
プライマー
ＦＩＰ　　　　　４０ｐｍｏｌ，　　ＲＩＰ　　　　　　４０ｐｍｏｌ，
Ｆ３プライマー　５ｐｍｏｌ，　　Ｒ３プライマー　５ｐｍｏｌ，
ループプライマー（ｌｏｏｐ　Ｆ，　ｌｏｏｐ　Ｒ）　各　２０ｐｍｏｌ
【００８３】
４）ＲＴ−ＬＡＭＰ法
上記６種のプライマーを含む反応液２３μｌに、ヒトＣＫ１８のＲＮＡ試料を２μｌ添加し、６５℃で１時間加温して行った。
【００８４】
５）増幅の確認
増幅産物は２本鎖構造をもつので、エチジウムブロマイドがインターカレートして蛍光を発する。その蛍光強度の増加　（Ｒｎ）　をＡＢＩ社製ＰＲＩＳＭ７７００を用いてリアルタイム法により測定した。
【００８５】
６）結果
Ｉ〜ＩＶの各プライマーセットを用いた場合の結果を各々図１〜４に示した。その結果、各セットについてヒトＣＫ１８の鋳型の量が多いほうが、増幅が確認できるまでに要する時間は短かかった。プライマーセットＩ及びＩＩＩでは、６００コピーの場合でも２０分以内に増幅が確認され、プライマーセットＩＩでは６０００コピーの場合に約２０分で増幅が確認され、プライマーセットＩＶの場合は６０００コピーの場合に約２０分で増幅が確認され、６００コピーの場合でも約３０分で増幅が確認された。
【００８６】
（実験例１−２）ループプライマーの効果
実験例１−１で検討したプライマーセットのうち、増幅の確認に要する時間が短かったプライマーセットＩを選択し、ループプライマーを用いた場合と用いない場合での感度を調べることを目的として実験を行った。
【００８７】
１）ヒトＣＫ１８ＲＮＡ試料の調製方法
実験例１−１と同様の操作を行い、コピー数が６００００、６０００、６００及び０（対照）となるよう試料を調製した。
【００８８】
２）プライマーセット
表１に示すプライマーセットＩ　及びプライマーセットＩ　から各ループプライマーを除いたプライマーセットを用いた。
【００８９】
３）反応液組成
実験例１−１と同様のものを使用し、ループプライマーのないセットについては、ループプライマーを添加しなかった。
【００９０】
４）ＲＴ−ＬＡＭＰ法
６種又は４種のプライマーを含む反応液２３μｌに、ヒトＣＫ１８のＲＮＡ試料を２μｌとなるよう添加し、６５℃で１時間加温して行った。
【００９１】
５）増幅の確認
実験例１−１と同様にリアルタイム法により測定した。
【００９２】
６）結果
測定結果を図５及び図６に示した。その結果、ループプライマーを用いたほうが、増幅が確認できるまでに要する時間は短かかった。しかし、ループプライマーを用いない場合でも、６００００コピーの場合で約５０分でヒトＣＫ１８の増幅が確認された。
【００９３】
（実験例１−３）ヒトＣＫ１８に対する増幅特異性
プライマーセットＩ　を用いて測定した場合のヒトＣＫ１８に対する増幅特異性を調べた。サイトケラチン（ＣＫ）には、ヒトＣＫ１８のほかにヒトＣＫ１９，２０等のアイソフォームが知られており、これらはヒトＣＫ１８と約６０％のホモロジーを有する塩基配列からなる。上記プライマーセットを用いて測定した場合に、ヒトＣＫ１９又は２０と識別して検査可能か否かを調べることを目的として実験を行った。
【００９４】
１）ＲＮＡ試料の調製方法
実験例１−１と同様の操作を行い、コピー数が６００００のヒトＣＫ１８のＲＮＡ試料を調製した。ヒトＣＫ１９及びヒトＣＫ２０のＲＮＡについても同様に試料を調製した。
【００９５】
２）プライマーセット
表１に示すプライマーセットＩ　を用いた。
【００９６】
３）反応液組成
組成は実験例１−１と同様のものを使用した。
【００９７】
４）ＲＴ−ＬＡＭＰ法
実験例１−１と同様の条件で行った。
【００９８】
５）増幅の確認
実験例１−１と同様にリアルタイム法により測定した。
【００９９】
６）結果
その結果を図７に示した。その結果、プライマーセットＩ　を用いると、ヒトＣＫ１８ＲＮＡは増幅するが、ヒトＣＫ１９ＲＮＡ及びヒトＣＫ２０ＲＮＡについては全く増幅せず、プライマーセットＩはヒトＣＫ１８ＲＮＡに特異性があることが確認された。
【０１００】
（実験例２−１）ヒトＣＫ１９検出用プライマーセット（Ａグループ）の効果
実施例２−２で示されたＡグループから選択されるプライマーセットを用いてヒトＣＫ１９のＲＮＡをＲＴ−ＬＡＭＰ法で測定した場合の増幅パターンを調べることを目的として実験を行った。
【０１０１】
１）プライマーセット（Ａグループ）
ＦＩＰ：　ＦＡ−４０１，　ＲＩＰ：　ＲＡ−４０１，　Ｆ３：　Ｆ３−４０１及び　Ｒ３：　Ｒ３−４０１の各プライマーからなるプライマーセット、並びにさらに各種ループプライマー：ＬＰＦ−４０１とＬＰＲ−４０１、ＬＰＦ−４０１とＬＰＲ−４０２、ＬＰＦ−４０１とＬＰＲ−４０３、又はＬＰＦ−４０１とＬＰＲ−４０４を組合せて用いたプライマーセットの場合について調べた。
【０１０２】
２）ヒトＣＫ１９ＲＮＡ試料の調製方法
ヒトＣＫ１９の塩基配列を基に設計したプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、ＫＡＴＯＩＩＩ（胃癌細胞）由来トータルＲＮＡから、ヒトＣＫ１９ｃＤＮＡを単離した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製プラスミド）にクローニングしたヒトＣＫ１９ｃＤＮＡから、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの転写システム（Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　（Ｐｒｏｍｅｇａ社製））を用いて転写産物を合成した。得られた原液のＲＮＡ濃度を２６０ｎｍでの吸光度測定により算出し、その値をもとにヒトＣＫ１９のＲＮＡコピー数が６００００、６０００、６００及び０　（対照）となるように５０　ｎｇ／μＬ　ｙｅａｓｔ　ＲＮＡ（Ａｍｉｂｏｎ社製）で希釈調製し、鋳型とした。
【０１０３】
３）反応液組成
実験例１−１と同様のものを使用した。ループプライマーのないセットについては、ループプライマーは添加しなかった。
【０１０４】
４）ＲＴ−ＬＡＭＰ法
上記のうちループプライマーを含まない４種、又はループプライマーを含む６種のプライマーを含む反応液２３μＬに、ヒトＣＫ１９のＲＮＡ試料を２μＬ添加し、６５℃で１時間加温して行った。
【０１０５】
５）増幅の確認
実験例１−１と同様にリアルタイム法により測定した。
【０１０６】
６）結果
ループプライマーを用いないプライマーセット、及び各種ループプライマーを用いたプライマーセットによる結果を図８〜１２に示した。その結果、ループプライマーを用いない場合には、核酸の増幅が確認できるまでに要する時間は試験開始後約４０分であった。一方、図９〜１２に示すように、ループプライマーを加えた系では、約１０分から２０分の間に増幅を確認することができた。
【０１０７】
（実験例２−２）ヒトＣＫ１９検出用プライマーセット（Ｃグループ）の効果
実施例２−２で示されたＣグループから選択されるプライマーセットを用いてヒトＣＫ１９のＲＮＡをＲＴ−ＬＡＭＰ法で測定した場合の増幅パターンを調べることを目的として実験を行った。
【０１０８】
１）プライマーセット（Ｃグループ）
ＦＩＰ：　ＦＡ−１１０１，　ＲＩＰ：　ＲＡ−１１０１，　Ｆ３：　Ｆ３−１１０１及びＲ３：　Ｒ３−１１０１の各プライマーからなるプライマーセット、並びにさらに各種ループプライマー：ＬＰＦ−１１０１とＬＰＲ−１１０１、ＬＰＦ−１１０１とＬＰＲ−１１０２、ＬＰＦ−１１０１とＬＰＲ−１１０３、ＬＰＦ−１１０１とＬＰＲ−１１０４、ＬＰＦ−１１０２とＬＰＲ−１１０１、又はＬＰＦ−１１０３とＬＰＲ−１１０１を組合せて用いたプライマーセットの場合について調べた。
【０１０９】
２）ヒトＣＫ１９ＲＮＡ試料の調製、
実験例２−１と同様の操作を行い、コピー数が、６００００、６０００、６００、６０及び０　（対照）となるように調製した。
【０１１０】
３）反応液組成、４）ＲＴ−ＬＡＭＰ法及び５）増幅の確認は実験例２−１と同様の手法により行った。
【０１１１】
６）結果
ループプライマーを用いないプライマーセット、及び各種ループプライマーを用いたプライマーセットによる結果を図１３〜１９に示した。その結果、ループプライマーを用いない場合には、核酸の増幅が確認できるまでに要する時間は試験開始後約３０分であった（図１３）。一方、ループプライマーを用いた系では、ＬＰＦ−１１０１とＬＰＲ−１１０１（図１４）、ＬＰＦ−１１０１とＬＰＲ−１１０２（図１５）、ＬＰＦ−１１０１とＬＰＲ−１１０４（図１７）、ＬＰＦ−１１０２とＬＰＲ−１１０１（図１８）又はＬＰＦ−１１０３とＬＰＲ−１１０１（図１９）を組合せた場合に約１０分から２０分の間に増幅を確認することができ、ＬＰＦ−１１０１とＬＰＲ−１１０３（図１６）を組合せた場合には約２０分で増幅を確認することができた。
【０１１２】
（実験例２−３）ヒトＣＫ１９検出用プライマーセット（Ｄグループ）の効果
実施例２−２で示されたＤグループから選択されるプライマーセットを用いてヒトＣＫ１９のＲＮＡをＲＴ−ＬＡＭＰ法で測定した場合の増幅パターンを調べることを目的として実験を行った。
【０１１３】
１）プライマーセット（Ｄグループ）
ＦＩＰ：　ＦＡ−６０１，　ＲＩＰ：　ＲＡ−６０４，　Ｆ３：　Ｆ３−６０１及びＲ３：　Ｒ３−６０１の各プライマーからなるプライマーセット、並びにさらにループプライマー：ＬＰＦ−６０１とＬＰＲ−６０１を組合せて用いたプライマーセットの場合について調べた。
【０１１４】
２）ヒトＣＫ１９ＲＮＡ試料の調製
実験例２−１と同様の操作を行い、コピー数が、６００００、６０００、６００、６０及び０　（対照）となるように調製した。
【０１１５】
３）反応液組成、４）ＲＴ−ＬＡＭＰ法及び５）増幅の確認は実験例２−１と同様の手法により行った。
【０１１６】
６）結果
ループプライマーを用いないプライマーセット及び用いたプライマーセットによる結果をそれぞれ図２０及び図２１に示した。その結果、ループプライマーを用いない場合は、核酸の増幅が確認できるまでに要する時間は約７０分であった。また、コピー数が０でも非特異的な増幅が起こり若干特異性が低かった。一方、ループプライマーを用いた場合は、約２０分程度で増幅が確認でき、かつコピー数が０で非特異増幅は起こらなかった。ループプライマーを用いることにより特異性は向上した。
【０１１７】
（実験例２−４）測定感度
実験例２−１〜２−３で示されたＡ、Ｃ、Ｄの各グループから選択された各プライマーセット及びＢグループから選択されたプライマーセットを用いて測定した場合の、ヒトＣＫ１９ＲＮＡの測定感度を調べることを目的として実験を行った。
【０１１８】
2004089180.tif 000043
【０１１９】
２）ヒトＣＫ１９ＲＮＡ試料の調製
実験例２−１と同様の操作を行い、コピー数が、６００００、２００００、６０００、２０００、６００、２００、６０、２０及び０　（対照）となるように調製した。
【０１２０】
３）反応液組成、４）ＲＴ−ＬＡＭＰ法及び５）増幅の確認は実験例２−１と同様の手法により行った。
【０１２１】
６）結果
結果を図２２〜２５に示した。その結果、各グループのプライマーセットについて、ヒトＣＫ１９ＲＮＡのコピー数が大きい方が核酸の増幅が確認できるまでに要する時間が短かく、コピー数が６００００の場合に１５〜２５分程度で増幅が認められた。また、Ａグループについてはコピー数が２００以上の場合に２０〜３０分（図２２）、Ｂグループについてはコピー数が２００以上の場合に１５〜２５分（図２３）、Ｃグループについてはコピー数が６００以上の場合に１５〜２５分（図２４）及びＤグループについてはコピー数が２００以上の場合に２５〜３５分（図２５）で増幅が認められた。
【０１２２】
（実験例２−５）ヒトＣＫ１９ＲＮＡに対する増幅特異性
実験例２−４で示された各プライマーセットを用いて測定した場合の、ヒトＣＫ１９ＲＮＡに対する増幅特異性を調べた。サイトケラチン（ＣＫ）には、ヒトＣＫ１９のほかにヒトＣＫ１８，２０等のアイソフォームが知られており、これらはヒトＣＫ１９と約６０％のホモロジーを有する塩基配列からなる。上記プライマーセットを用いて測定した場合に、ヒトＣＫ１８又は２０と識別して検査可能か否かを調べることを目的として実験を行った。
【０１２３】
１）プライマーセット
実験例２−４と同じプライマーセットについて調べた。
【０１２４】
２）ＲＮＡ試料の調製
実験例２−１と同様の操作を行い、コピー数が６００００、６０００、６００及び０　（対照）となるようにヒトＣＫ１９ＲＮＡ試料を調製した。ヒトＣＫ１８及びヒトＣＫ２０のＲＮＡについては同様に各々コピー数が６００００の試料を調製した。
【０１２５】
３）反応液組成、４）ＲＴ−ＬＡＭＰ法及び５）増幅の確認は実験例２−１の手法によりおこなった。
【０１２６】
６）結果
実験例２−４で示された各プライマーセットによる結果を図２６〜２９に示した。その結果、いずれのグループのプライマーセットも、ヒトＣＫ１９ＲＮＡに特異的に増幅が認められたが、ヒトＣＫ１８ＲＮＡ及びヒトＣＫ２０ＲＮＡについては増幅を認めなかった。
【０１２７】
（実験例２−６）ヒトＣＫ１９ＲＮＡに対する増幅の確認（濁度の測定）
１）プライマーセット（Ｃグループ）
ＦＩＰ：　ＦＡ−１１０１、ＲＩＰ：　ＲＡ−１１０１、Ｆ３：　Ｆ３−１１０１、Ｒ３：　Ｒ３−１１０１及び各ループプライマー：ＬＰＦ−１１０１とＬＰＲ−１１０１を組合せて用いたプライマーセットの場合について調べた。
【０１２８】
２）ヒトＣＫ１９ＲＮＡ試料の調製、
実験例２−１と同様の操作を行い、コピー数が、１０００００、１００００、１０００及び０　（対照）となるように調製した。
【０１２９】
2004089180.tif 000044
【０１３０】
４）ＲＴ−ＬＡＭＰ法は実験例２−１と同様の手法により行った。反応は０．２ｍｌのチューブ内で６５℃で１．５時間行った。
【０１３１】
５）増幅の確認
ＲＴ−ＬＡＭＰ反応物の濁度を、波長５００ｎｍにおける吸光度により経時的に測定した。測定装置はテラメックス社製のＬＡ−２００を使用した。
【０１３２】
６）結果
その結果を図３０に示した。鋳型コピー数に応じて、測定開始後１１〜１３分の間で、増幅開始が認められた。
【０１３３】
（実験例２−７）ヒトＣＫ１９ＲＮＡに対する増幅の確認（濁度の測定）
１）プライマーセット（Ｃグループ）
ＦＩＰ：　ＦＡ−１１０１、ＲＩＰ：　ＲＡ−１１０１、Ｆ３：　Ｆ３−１１０１、Ｒ３：　Ｒ３−１１０１及び各ループプライマー：ＬＰＦ−１１０１とＬＰＲ−１１０１を組合せて用いたプライマーセット及びＲＮａｓｅインヒビターを加えた場合について調べた。
【０１３４】
２）ヒトＣＫ１９ＲＮＡ試料の調製、
実験例２−１と同様の操作を行い、コピー数が、１０００００、１００００、１０００及び０　（対照）となるように調製した。
【０１３５】
３）反応液組成
さらに、ＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡社製）を２５Ｕ加える他は、実験例２−６と同様の反応組成液を使用した。
【０１３６】
４）ＲＴ−ＬＡＭＰ法及び５）増幅の確認は実験例２−６と同様に行った。
【０１３７】
６）結果
その結果を図３１に示した。鋳型コピー数に応じて、測定開始後１０〜１２分の間で、増幅開始が認められた。ＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを添加することによって、増幅反応を阻害する物質の影響が低減され、増幅の確認に要する時間を短くすることができた。
【０１３８】
（実験例３−１）
実施例３−２に示される各種プライマーから、次の組合せによりＲＴ−ＬＡＭＰ法で測定した場合の、反応を開始してから増幅が確認できるまでに要する時間を各プライマーセットについて調べることを目的として実験を行った。
【０１３９】
１）ヒトＣＫ２０ＲＮＡ試料の調製方法
ヒトＣＫ２０の塩基配列を基に設計したプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、ＫＡＴＯＩＩＩ（胃癌細胞）由来トータルＲＮＡから、ヒトＣＫ２０ｃＤＮＡを単離した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製プラスミド）にクローニングしたヒトＣＫ２０ｃＤＮＡから、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの転写システム（Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　（Ｐｒｏｍｅｇａ社製））を用いて転写産物を合成した。得られた原液のＲＮＡ濃度を２６０ｎｍでの吸光度測定により算出し、その値をもとにヒトＣＫ２０のＲＮＡコピー数が６０００００となるように　５０　ｎｇ／μＬ　ｙｅａｓｔ　ＲＮＡ（Ａｍｉｂｏｎ社製）で希釈調製し、鋳型とした。
【０１４０】
２）プライマーセット
各種プライマーを（表２）の組合せで用いた。
【０１４１】
（表２）プライマーセット及び増幅が確認できるまでに要する時間
2004089180.tif 000045
【０１４２】
３）反応液組成
実験例１−１と同様のものを使用し、ループプライマーは添加しなかった。
【０１４３】
４）ＲＴ−ＬＡＭＰ法
上記４種のプライマーを含む反応液２３μｌに、ヒトＣＫ２０のＲＮＡ試料を２μｌ添加し、６５℃で１時間加温して行った。
【０１４４】
５）増幅の確認
実験例１−１と同様にリアルタイム法により測定した。
【０１４５】
６）結果
各プライマーセットにより反応させた場合の増幅が確認できるまでに要する時間を表２に示した。その結果、最大で４０分であり、ほとんどのプライマーセットで、３０分以内で確認された。
【０１４６】
（実験例３−２）
実験例３−１で検討したプライマーセットのうち、増幅の確認に要する時間が短いプライマーセットを選択し、さらにループプライマーを用いた組合せのプライマーセットによりＲＴ−ＬＡＭＰ法で測定した場合の感度を調べることを目的として実験を行った。
【０１４７】
１）ヒトＣＫ２０ＲＮＡ試料の調製方法
実験例３−１と同様の操作を行い、コピー数が各々０、１９０、９６０、４８００、２４０００、１２００００、６０００００となるよう試料を調製した。
【０１４８】
２）プライマーセット
次の各組合せのプライマーセットについて検討を行った。
セット１：ＦＩＰ　（ＫＦＡ−５ｂ）、ＲＩＰ　（ＫＲＡ−５）　、Ｆ３プライマー　（ＫＦ３−５）、Ｒ３プライマー　（ＫＲ３−５）、ループプライマー　（Ｋ−ＬＰＦ２，　Ｋ−ＬＰＲ１）
セット２：ＦＩＰ　（ＫＦＡ−５ｂ）、ＲＩＰ　（ＫＲＡ−５）　、Ｆ３プライマー　（ＫＦ３−５）、Ｒ３プライマー　（ＫＲ３−５）、ループプライマー　（Ｋ−ＬＰＦ２，　Ｋ−ＬＰＲ２）
【０１４９】
３）反応液組成
実験例１−１と同様のものを使用した。
【０１５０】
４）ＲＴ−ＬＡＭＰ法及び５）増幅の確認は実験例３−１と同様の手法により行った。
【０１５１】
６）結果
プライマーセット１について検討した結果を図３２に示した。その結果、ヒトＣＫ２０のＲＮＡの鋳型の量が多い場合のほうが、増幅が確認できるまでに要する時間は短かかった。しかし鋳型の量が１９０コピーの場合でも３０分以内にＤＮＡの増幅が認められ、鋳型の量が６０００００コピーの場合でも１０分程度でＤＮＡの増幅が確認された。プライマーセット２を使用した場合にも同様の結果が得られた。
【０１５２】
（実験例３−３）ヒトＣＫ２０ＲＮＡに対する増幅特異性
実験例３−２で選択したプライマーセットを用いて測定した場合のヒトＣＫ２０のＲＮＡに対する増幅特異性を調べた。サイトケラチン（ＣＫ）には、ヒトＣＫ２０のほかにヒトＣＫ１８，１９等のアイソフォームが知られており、これらはヒトＣＫ２０と約６０％のホモロジーを有する塩基配列からなる。本発明のプライマーセットを用いて測定した場合に、ヒトＣＫ１８又は１９と識別して検査可能か否かを調べることを目的として実験を行った。
【０１５３】
１）ＲＮＡ試料の調製方法
実験例３−１と同様の操作を行い、コピー数６０００００のヒトＣＫ２０のＲＮＡ試料を調製した。ヒトＣＫ１８及びヒトＣＫ１９のＲＮＡについても同様試料を調製した。
【０１５４】
２）プライマーセット
実験例３−２で選択したプライマーセット１及びセット２を用いた。
【０１５５】
３）反応液組成、４）ＲＴ−ＬＡＭＰ法及び５）増幅の確認は、実験例３−２と同様の手法により行った。
【０１５６】
６）結果
プライマーセット１について検討した結果を図３３に示した。選択したプライマーセットではヒトＣＫ２０ＲＮＡは増幅するが、ヒトＣＫ１８ＲＮＡ及びヒトＣＫ１９ＲＮＡは全く増幅せず、ヒトＣＫ２０ＲＮＡに特異性があることが確認された。プライマーセット２についても同様の結果が得られた。
【０１５７】
（実験例３−４）
プライマーセットを用いて測定した場合の、ヒトＣＫ２０ＲＮＡの測定感度を調べることを目的として実験を行った。
【０１５８】
１）ヒトＣＫ２０ＲＮＡ試料の調製方法
実験例３−１と同様の操作を行い、コピー数が各々０、１９０、９６０、４８００、２４０００、１２００００及び６０００００となるように試料を調製した。
【０１５９】
２）プライマーセット
次の各組合せのプライマーセットについて検討を行った。
セット３：ＦＩＰ（ＡＦＡ）、ＲＩＰ（ＡＲＡｆ）、Ｆ３プライマー（ＡＦ３）、Ｒ３プライマー（ＡＲ３）、ループプライマー（ＬＰＦ２，　ＬＰＲ６）
【０１６０】
３）反応液組成、４）ＲＴ−ＬＡＭＰ法及び５）増幅の確認は、実験例３−２と同様の手法により行った。
【０１６１】
６）結果
その結果を図３４に示した。その結果、ヒトＣＫ２０のＲＮＡの鋳型の量が多い場合のほうが、増幅が確認できるまでに要する時間は短かかった。しかし鋳型の量が１９０コピーの場合でも３０分以内にＤＮＡの増幅が認められ、鋳型の量が６０００００コピーの場合でも１０分程度でＤＮＡの増幅が確認された。
【０１６２】
（実験例３−５）
実験例３−４で選択したプライマーセットを用いて測定した場合のヒトＣＫ２０ＲＮＡに対する増幅特異性を調べることを目的として実験を行った。
【０１６３】
１）ＲＮＡ試料の調製方法
実験例３−１と同様の操作を行い、コピー数が６０００００のヒトＣＫ２０のＲＮＡ試料を調製した。ヒトＣＫ１８及びヒトＣＫ１９のＲＮＡについても同様に試料を調製した。
【０１６４】
２）プライマーセット
実験例３−４で選択したプライマーセット（セット３）を選択した。
【０１６５】
３）反応液組成、４）ＲＴ−ＬＡＭＰ法及び５）増幅の確認は、実験例３−２と同様の手法により行った。
【０１６６】
６）結果
その結果を図３５に示した。選択したプライマーセットではヒトＣＫ２０ＲＮＡは増幅するが、ヒトＣＫ１８ＲＮＡ及びヒトＣＫ１９ＲＮＡについては全く増幅せず、ヒトＣＫ２０ＲＮＡに特異性があることが確認された。
【０１６７】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明のプライマー又はプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法を行うと、効果的にヒトＣＫ１８ＲＮＡ、ＣＫ１９ＲＮＡ及びＣＫ２０ＲＮＡを特異的に増幅させることができることがわかった。このことから、本発明のプライマーを用いると、短時間にヒトＣＫ１８ＲＮＡ、ＣＫ１９ＲＮＡ及びＣＫ２０ＲＮＡを検出することが可能となり、核酸増幅手段を用いたリンパ節への癌転移診断に要する時間の短縮化が可能となった。
【０１６８】
【配列表】
2004089180.tif 000046
2004089180.tif 000047
2004089180.tif 000048
2004089180.tif 000049
2004089180.tif 000050
2004089180.tif 000051
2004089180.tif 000052
2004089180.tif 000053
2004089180.tif 000054
2004089180.tif 000055
2004089180.tif 000056
2004089180.tif 000057
2004089180.tif 000058
2004089180.tif 000059
2004089180.tif 000060
2004089180.tif 000061
2004089180.tif 000062
2004089180.tif 000063
2004089180.tif 000064
2004089180.tif 000065
2004089180.tif 000066
2004089180.tif 000067
2004089180.tif 000068
2004089180.tif 000069
2004089180.tif 000070
2004089180.tif 000071
2004089180.tif 000072
2004089180.tif 000073
2004089180.tif 000074
2004089180.tif 000075
2004089180.tif 000076
2004089180.tif 000077
2004089180.tif 000078
2004089180.tif 000079
2004089180.tif 000080
2004089180.tif 000081
2004089180.tif 000082
2004089180.tif 000083
2004089180.tif 000084
2004089180.tif 000085
2004089180.tif 000086
2004089180.tif 000087
2004089180.tif 000088
2004089180.tif 000089
2004089180.tif 000090
2004089180.tif 000091
2004089180.tif 000092
2004089180.tif 000093
2004089180.tif 000094
2004089180.tif 000095
2004089180.tif 000096
2004089180.tif 000097
2004089180.tif 000098
2004089180.tif 000099
2004089180.tif 000100
2004089180.tif 000101
2004089180.tif 000102
2004089180.tif 000103
2004089180.tif 000104
2004089180.tif 000105
2004089180.tif 000106
2004089180.tif 000107
2004089180.tif 000108
2004089180.tif 000109
2004089180.tif 000110
2004089180.tif 000111
2004089180.tif 000112
2004089180.tif 000113
2004089180.tif 000114
2004089180.tif 000115
2004089180.tif 000116
2004089180.tif 000117
2004089180.tif 000118
2004089180.tif 000119
2004089180.tif 000120
2004089180.tif 000121
2004089180.tif 000122
2004089180.tif 000123
2004089180.tif 000124
2004089180.tif 000125
2004089180.tif 000126
2004089180.tif 000127
2004089180.tif 000128
2004089180.tif 000129
2004089180.tif 000130
2004089180.tif 000131
2004089180.tif 000132
2004089180.tif 000133
2004089180.tif 000134
2004089180.tif 000135
2004089180.tif 000136
2004089180.tif 000137
2004089180.tif 000138
2004089180.tif 000139
2004089180.tif 000140
2004089180.tif 000141
2004089180.tif 000142
2004089180.tif 000143
2004089180.tif 000144
2004089180.tif 000145
2004089180.tif 000146
2004089180.tif 000147
2004089180.tif 000148
2004089180.tif 000149
2004089180.tif 000150
2004089180.tif 000151
2004089180.tif 000152
2004089180.tif 000153
2004089180.tif 000154
2004089180.tif 000155
2004089180.tif 000156
2004089180.tif 000157
2004089180.tif 000158
2004089180.tif 000159
2004089180.tif 000160
2004089180.tif 000161
2004089180.tif 000162
2004089180.tif 000163
2004089180.tif 000164
2004089180.tif 000165
2004089180.tif 000166
2004089180.tif 000167
2004089180.tif 000168
2004089180.tif 000169
2004089180.tif 000170
2004089180.tif 000171
2004089180.tif 000172
2004089180.tif 000173
2004089180.tif 000174
2004089180.tif 000175
2004089180.tif 000176
2004089180.tif 000177
2004089180.tif 000178
2004089180.tif 000179
2004089180.tif 000180
2004089180.tif 000181
2004089180.tif 000182
2004089180.tif 000183
2004089180.tif 000184
2004089180.tif 000185
2004089180.tif 000186
2004089180.tif 000187
2004089180.tif 000188
2004089180.tif 000189
2004089180.tif 000190
2004089180.tif 000191
2004089180.tif 000192
2004089180.tif 000193
2004089180.tif 000194
2004089180.tif 000195
2004089180.tif 000196
2004089180.tif 000197
2004089180.tif 000198
2004089180.tif 000199
2004089180.tif 000200
2004089180.tif 000201
2004089180.tif 000202
2004089180.tif 000203
2004089180.tif 000204
2004089180.tif 000205
2004089180.tif 000206
2004089180.tif 000207
2004089180.tif 000208
2004089180.tif 000209
2004089180.tif 000210
2004089180.tif 000211
2004089180.tif 000212
2004089180.tif 000213
2004089180.tif 000214
2004089180.tif 000215
2004089180.tif 000216
2004089180.tif 000217
2004089180.tif 000218
2004089180.tif 000219
2004089180.tif 000220
2004089180.tif 000221
2004089180.tif 000222
2004089180.tif 000223
2004089180.tif 000224
2004089180.tif 000225
2004089180.tif 000226
2004089180.tif 000227
2004089180.tif 000228
2004089180.tif 000229
2004089180.tif 000230
2004089180.tif 000231
2004089180.tif 000232
2004089180.tif 000233
2004089180.tif 000234
2004089180.tif 000235
2004089180.tif 000236
2004089180.tif 000237
2004089180.tif 000238
2004089180.tif 000239
2004089180.tif 000240
2004089180.tif 000241
2004089180.tif 000242
2004089180.tif 000243
2004089180.tif 000244
2004089180.tif 000245
2004089180.tif 000246
2004089180.tif 000247
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトＣＫ１８のプライマーセットＩを用いてＬＡＭＰ法を行った場合の結果を示す図である。（実験例１−１）
【図２】ヒトＣＫ１８のプライマーセットＩＩを用いてＬＡＭＰ法を行った場合の結果を示す図である。（実験例１−１）
【図３】ヒトＣＫ１８のプライマーセットＩＩＩを用いてＬＡＭＰ法を行った場合の結果を示す図である。（実験例１−１）
【図４】ヒトＣＫ１８のプライマーセットＩＶを用いてＬＡＭＰ法を行った場合の結果を示す図である。（実験例１−１）
【図５】ヒトＣＫ１８のプライマーセットＩ（ループプライマーあり）を用いてＬＡＭＰ法を行った場合の結果を示す図である。（実験例１−２）
【図６】ヒトＣＫ１８のプライマーセットＩ（ループプライマーなし）を用いてＬＡＭＰ法を行った場合の結果を示す図である。（実験例１−２）
【図７】ヒトＣＫ１８のプライマーセットＩを用いてＬＡＭＰ法を行った場合の増幅特異性を示す図である。（実験例１−３）
【図８】ヒトＣＫ１９のプライマーセットＡ（ループプライマーなし）を用いてＬＡＭＰ法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−１）
【図９】ヒトＣＫ１９のプライマーセットＡ（ループプライマーなし）を用いてＬＡＭＰ法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−１）
【図１０】ヒトＣＫ１９のプライマーセットＡ（ループプライマーあり）を用いてＬＡＭＰ法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−１）
【図１１】ヒトＣＫ１９のプライマーセットＡ（ループプライマーあり）を用いてＬＡＭＰ法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−１）
【図１２】ヒトＣＫ１９のプライマーセットＡ（ループプライマーあり）を用いてＬＡＭＰ法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−１）
【図１３】ヒトＣＫ１９のプライマーセットＣ（ループプライマーなし）を用いてＬＡＭＰ法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−２）
【図１４】ヒトＣＫ１９のプライマーセットＣ（ループプライマーあり）を用いてＬＡＭＰ法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−２）
【図１５】ヒトＣＫ１９のプライマーセットＣ（ループプライマーあり）を用いてＬＡＭＰ法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−２）
【図１６】ヒトＣＫ１９のプライマーセットＣ（ループプライマーあり）を用いてＬＡＭＰ法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−２）
【図１７】ヒトＣＫ１９のプライマーセットＣ（ループプライマーあり）を用いてＬＡＭＰ法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−２）
【図１８】ヒトＣＫ１９のプライマーセットＣ（ループプライマーあり）を用いてＬＡＭＰ法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−２）
【図１９】ヒトＣＫ１９のプライマーセットＣ（ループプライマーあり）を用いてＬＡＭＰ法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−２）
【図２０】ヒトＣＫ１９のプライマーセットＤ（ループプライマーなし）を用いてＬＡＭＰ法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−３）
【図２１】ヒトＣＫ１９のプライマーセットＤ（ループプライマーあり）を用いてＬＡＭＰ法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−３）
【図２２】ヒトＣＫ１９のプライマーセットＡを用いてＬＡＭＰ法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−４）
【図２３】ヒトＣＫ１９のプライマーセットＢを用いてＬＡＭＰ法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−４）
【図２４】ヒトＣＫ１９のプライマーセットＣを用いてＬＡＭＰ法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−４）
【図２５】ヒトＣＫ１９のプライマーセットＤを用いてＬＡＭＰ法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−４）
【図２６】ヒトＣＫ１９のプライマーセットＡを用いてＬＡＭＰ法を行った場合の増幅特異性を示す図である。（実験例２−５）
【図２７】ヒトＣＫ１９のプライマーセットＢを用いてＬＡＭＰ法を行った場合の増幅特異性を示す図である。（実験例２−５）
【図２８】ヒトＣＫ１９のプライマーセットＣを用いてＬＡＭＰ法を行った場合の増幅特異性を示す図である。（実験例２−５）
【図２９】ヒトＣＫ１９のプライマーセットＤを用いてＬＡＭＰ法を行った場合の増幅特異性を示す図である。（実験例２−５）
【図３０】ヒトＣＫ１９のプライマーセットＣを用いてＬＡＭＰ法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−６）
【図３１】ヒトＣＫ１９のプライマーセットＣを用いてＬＡＭＰ法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−７）
【図３２】ヒトＣＫ２０のプライマーセット１を用いてＬＡＭＰ法を行った場合の結果を示す図である。（実験例３−２）
【図３３】ヒトＣＫ２０のプライマーセット１を用いてＬＡＭＰ法を行った場合の増幅特異性を示す図である。（実験例３−３）
【図３４】ヒトＣＫ２０のプライマーセット３を用いてＬＡＭＰ法を行った場合の結果を示す図である。（実験例３−４）
【図３５】ヒトＣＫ２０のプライマーセット３を用いてＬＡＭＰ法を行った場合の増幅特異性を示す図である。（実験例３−５）
【図１】
2004089180.tif 000248
【図２】
2004089180.tif 000249
【図３】
2004089180.tif 000250
【図４】
2004089180.tif 000251
【図５】
2004089180.tif 000252
【図６】
2004089180.tif 000253
【図７】
2004089180.tif 000254
【図８】
2004089180.tif 000255
【図９】
2004089180.tif 000256
【図１０】
2004089180.tif 000257
【図１１】
2004089180.tif 000258
【図１２】
2004089180.tif 000259
【図１３】
2004089180.tif 000260
【図１４】
2004089180.tif 000261
【図１５】
2004089180.tif 000262
【図１６】
2004089180.tif 000263
【図１７】
2004089180.tif 000264
【図１８】
2004089180.tif 000265
【図１９】
2004089180.tif 000266
【図２０】
2004089180.tif 000267
【図２１】
2004089180.tif 000268
【図２２】
2004089180.tif 000269
【図２３】
2004089180.tif 000270
【図２４】
2004089180.tif 000271
【図２５】
2004089180.tif 000272
【図２６】
2004089180.tif 000273
【図２７】
2004089180.tif 000274
【図２８】
2004089180.tif 000275
【図２９】
2004089180.tif 000276
【図３０】
2004089180.tif 000277
【図３１】
2004089180.tif 000278
【図３２】
2004089180.tif 000279
【図３３】
2004089180.tif 000280
【図３４】
2004089180.tif 000281
【図３５】
2004089180.tif 000282