(57)【要約】　　　（修正有）【課題】アルツハイマー病に対する可能な治療をテストするためのアルツハイマー病を引き起こす天然に存在する条件に非常に類似するトランスジェニク動物、および治療に有用な化合物を試験方法する方法の提供。【解決手段】βアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の全ての３つの型、ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、およびＡＰＰ７７０の発現、そして、ロンドンおよびインディアナ家系性アルツハイマー病（ＦＡＤ）のようなアミノ酸７１７位での変異およびＡＰＰ遺伝子中で予測された変異のような天然に生じる変異に基づく特徴を有するトランスジェニック動物を提供し、該トランスジェニク動物はアルツハイマー病の病理学的経過を変える化合物についてのスクリーニングに使用できる。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み合わせｃＤＮＡ／ゲノム発現クローンに対して作動可能に連結したプロモーターを含む遺伝子構築物を含有するトランスジェニックげっ歯動物であって、
前記発現クローンはＡＰＰ７７０をコードするｃＤＮＡ配列または天然に存在する変異を有するＡＰＰ７７０をコードするｃＤＮＡ配列を含有し、
エキソン６およびスプライシングのために十分な領域を有する隣接する下流イントロン、ＫＩコード領域およびＯＸ−２コード領域およびスプライシングのために十分な領域を有するそれぞれのそれらの上流および下流イントロン、そしてエキソン９およびスプライシングのために十分な領域を有する隣接する上流イントロンからなるゲノムＡＰＰ　ＤＮＡ配列を、ＡＰＰ７７０をコードするｃＤＮＡ配列または天然に存在する変異を有するＡＰＰ７７０をコードするｃＤＮＡの対応する領域に置換し、そして
前記構築物は、トランスジェニックげっ歯動物中で、転写され、そして選択的にスプライシングされて、ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１およびＡＰＰ７７０をコードしそしてＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１およびＡＰＰ７７０に翻訳されるｍＲＮＡ分子を形成する、
前記トランスジェニックげっ歯動物。
【請求項２】
プロモーターが、ヒトＡＰＰプロモーター、マウスＡＰＰプロモーター、ラットＡＰＰプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ラットニューロン特異的エノラーゼプロモーター、ヒトβアクチン遺伝子プロモーター、ヒト血小板由来成長因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）鎖遺伝子プロモーター、ラットナトリウムチャンネル遺伝子プロモーター、マウスミエリン塩基性タンパク質遺伝子プロモーター、ヒト銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子プロモーター、および哺乳類ＰＯＵ−ドメイン調節遺伝子プロモーターからなる群から選択される、請求項１に記載のトランスジェニックげっ歯動物。
【請求項３】
構築物が、げっ歯動物の染色体中に組み込まれる、請求項１に記載のトランスジェニックげっ歯動物。
【請求項４】
請求項３に記載のトランスジェニックげっ歯動物から培養された細胞。
【請求項５】
野生型ＡＰＰ７７０タンパク質の７１７位でバリン残基をコードするコドンが、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、およびＧ１ｎからなる群から選択されるアミノ酸をコードするように変異している、請求項１に記載のトランスジェニックげっ歯動物。
【請求項６】
請求項１に記載のトランスジェニックげっ歯動物であって、前記プロモーターが、そのトランスジェニックげっ歯動物の起源であるげっ歯動物と同一種のＡＰＰプロモーターである、請求項１に記載のトランスジェニックげっ歯動物。
【請求項７】
組み合わせｃＤＮＡ／ゲノム発現クローンに対して作動可能に連結したプロモーターを含む遺伝子構築物を、げっ歯動物細胞またはげっ歯動物胚に導入することを含む、アルツハイマー病のトランスジェニックモデルを形成するための方法であって；
前記発現クローンはＡＰＰ７７０をコードするｃＤＮＡ配列または天然に存在する変異を有するＡＰＰ７７０をコードするｃＤＮＡ配列を含有し、
エキソン６およびスプライシングのために十分な領域を有する隣接する下流イントロン、ＫＩコード領域およびＯＸ−２コード領域およびスプライシングのために十分な領域を有するそれぞれのそれらの上流および下流イントロン、そしてエキソン９およびスプライシングのために十分な領域を有する隣接する上流イントロンからなるゲノムＡＰＰ　ＤＮＡ配列を、ＡＰＰ７７０をコードするｃＤＮＡ配列または天然に存在する変異を有するＡＰＰ７７０をコードするｃＤＮＡの対応する領域に置換し、
前記構築物は、哺乳類細胞中で、転写され、そして選択的にスプライシングされて、ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１およびＡＰＰ７７０をコードしそしてＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１およびＡＰＰ７７０に翻訳されるｍＲＮＡ分子を形成する、
前記方法。
【請求項８】
トランスジェニックモデルが、行動の変化を示すげっ歯動物である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
化合物がアルツハイマー病の治療に有用であるかどうかを試験する方法であって、以下の工程；
試験すべき化合物を、遺伝子構築物をその染色体中に組み込んだトランスジェニックげっ歯動物に対してさらす工程、
ここで、前記構築物は、組み合わせｃＤＮＡ／ゲノム発現クローンに対して作動可能に連結したプロモーターを含み、前記発現クローンは、ＡＰＰ７７０をコードするｃＤＮＡ配列または天然に存在する変異を有するＡＰＰ７７０をコードするｃＤＮＡを含有し、
エキソン６およびスプライシングのために十分な領域を有する隣接する下流イントロン、ＫＩコード領域およびＯＸ−２コード領域およびスプライシングのために十分な領域を有するそれぞれのそれらの上流および下流イントロン、そしてエキソン９およびスプライシングのために十分な領域を有する隣接する上流イントロンからなるゲノムＡＰＰ　ＤＮＡ配列を、ＡＰＰ７７０をコードするｃＤＮＡ配列または天然に存在する変異を有するＡＰＰ７７０をコードするｃＤＮＡ配列中に置換し、そして
前記構築物は、トランスジェニックげっ歯動物中で、転写され、そして選択的にスプライシングされて、ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１およびＡＰＰ７７０に翻訳されるｍＲＮＡを形成する、
そして、化合物のアルツハイマー病に対する効果の指標となる、ＡＰＰの発現またはプロセッシングの変化が、存在するかどうかを決定する工程、
を含む、前記試験する方法。
【請求項１０】
化合物を投与した後、トランスジェニックげっ歯動物の組織病理学または行動が変化したかどうかを決定する工程、をさらに含む、トランスジェニックげっ歯動物を使用する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
組み合わせｃＤＮＡ／ゲノム発現クローンに対して作動可能に連結したプロモーターを含む遺伝子構築物を含有するトランスジェニック哺乳類細胞であって、
前記発現クローンは、ＡＰＰ７７０をコードするｃＤＮＡ配列または天然に存在する変異を有するＡＰＰ７７０をコードするｃＤＮＡ配列を含有し、
エキソン６およびスプライシングのために十分な領域を有する隣接する下流イントロン、ＫＩコード領域およびＯＸ−２コード領域およびスプライシングのために十分な領域を有するそれぞれのそれらの上流および下流イントロン、そしてエキソン９およびスプライシングのために十分な領域を有する隣接する上流イントロンからなるゲノムＡＰＰ　ＤＮＡ配列を、ＡＰＰ７７０をコードするｃＤＮＡ配列または天然に存在する変異を有するＡＰＰ７７０をコードするｃＤＮＡの対応する領域に置換し、そして
前記構築物は、哺乳類細胞中で、転写され、そして選択的にスプライシングされて、ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１およびＡＰＰ７７０をコードし、そしてＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１およびＡＰＰ７７０に翻訳されるｍＲＮＡ分子を形成する、
前記トランスジェニック哺乳類細胞。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
トランスジェニック技術が、アルツハイマー前駆体タンパク質あるいはその改変型の発現を介して、ヒトアルツハイマー病の徴候を示す動物の生産について、記載されている。
アルツハイマー病（ＡＤ）は、アリオスアルツハイマー（Ａｌｉｏｓ　Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）が１９０７年に、認識能力が激烈に減退し、普遍的な痴呆を有する彼の患者の１人を診察後に、初めて記載された（Ｂｉｃｋ　Ｋ．、Ａｍａｄｕｃｃｉ　Ｌ．およびＰｅｐｅｕ　Ｇ．編の「Ｔｈｅ　ｅａｒｌｙｓｔｏｒｙ　ｏｆ　Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ」（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８７））脳の萎縮異常である。これは、初老のヒトに痴呆を引き起こす。ＡＤ患者は、記憶の喪失および健常個人として機能し得ないほどに進行する知性機能の喪失の増大された問題を有する。知性技能を喪失した患者は、性格変化、社会不適合行動、および精神分裂を示す（Ｊｏｒｍ　ＡＦ．編の「Ａ　ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ　ｏｆ　Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８７））。ＡＤは、不可避な神経萎縮を一時的にやわらげ、予防する有効な治療がないため、罹病者および家族を破滅させる。アルツハイマー患者の最も一般的な問題は、自力での衣服の着用能力がないこと、日中の落ち着きのなさ、尿失禁、および睡眠障害である。家族は、困惑、不安、憂うつ、および社会生活の減退を報告している。
ＡＤの社会および国家経済に対する衝撃は莫大である。合衆国における痴呆症の初老の人口は、２０００年までに４１％に増加する。制度上および補助介護を患者に対して提供すべき、健康管理機構には、年間見積４００億ドルの経費がかかる（Ｊｏｒｍ、１９８７；Ｆｉｓｈｅｒ、ＬＭ：Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ｔｉｍｅｓ，１９８９年８月２３日、Ｄ１，Ｒｅｉｓｂｅｒｇ，Ｂ．編の「Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ」（Ｔｈｅ　Ｆｒｅｅ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　ａｎｄ　Ｌｏｎｄｏｎ　１９８３））。これらの要素は、ＡＤ研究に財源を割り当てることによる、ＡＤ発生を減少させるために取られるべき予防行動を暗示する。
顕微鏡レベルでは、ＡＤ患者の脳は通常小さく、時には１，０００グラム未満の重さである。顕微鏡レベルでは、ＡＤの組織病理学的徴候には、神経細線維のもつれ（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ　ｔａｎｇｌｅｓ）（ＮＦＴ）、神経炎によるプラーク（ｎｅｕｒｉｔｉｃ　ｐｌａｑｕｅｓ）、およびニューロンの萎縮が含まれる。ＡＤ患者は、大脳皮質の前頭および側頭皮質の神経細胞、海馬三角骨ニューロン、内側のニューロン、へん桃の内側、中枢および皮質核、青斑（ｌｏｃｕｓ　ｃｏｅｒｕｌｅｕｓ）のノルアドレナリン作動性ニューロン、および基底前脳コリン作動性系のニューロンにおける、萎縮を示す。コリン作動性系のニューロンの喪失は、ＡＤにおけるコリン作動性前シナプス性マーカーの欠損に一致する（Ｒｅｉｓｂｅｒｇ、１９８３；「Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，ｒｅｓａｒｃｈ　ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」Ｋｅｌｌｙ　ＷＥ編；（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｃ．Ｔｈｏｍａｓ、　Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＩＬ．１９８４））。
ＡＤは、皮質、海馬、鉤状回、海馬回、およびへん桃の、直径２００μｍまでの大きさの神経炎によるプラークに関連する。神経炎プラークの本質的な成分はアミロイドであり、これは、コンゴーレッドに染色される（Ｒｅｉｓｂｅｒｇ、１９８３；Ｋｅｌｌｙ、１９８４）。アミロイドプラークは、紬胞外で、明視野でピンクあるいはさび色であり、偏光で複屈折する。プラークは、ポリペプチド原線維から構成され、しばしば血管周囲に存在し、脳中の種々のニューロンへの血液の供給を減少させる。
遺伝的素因、感染因子、トキシン、金属、および脳腫瘍のような種々の因子がすべて、ＡＤ神経病の可能な機構として挙げられる。しかし、明白な証拠が、ＡＤに対する２つの異なる型の遺伝的素因を強く示す。第一に、分子分析で、あるＡＤ罹病家族の、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子中の変異の証拠を明らかにした（Ｇｏａｔｅら、Ｎａｔｕｒｅ　３４９：７０４−７０６（１９９１）；Ｍｕｒｒｅｌｌ，Ｊら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５４；９７−９９。１９９１；Ｃｈａｒｔｉｅｒ−Ｈａｒｌｉｎ，Ｍ−Ｃら、Ｎａｔｕｒｅ　３５３，８４４−８４６（１９９１））。第二に、ＡＤに対して明白な遺伝子素因を有する他の家族では、染色体２１に変異が存在するが、ＡＰＰ遺伝子座とは異なる（Ｔａｎｚｉ，Ｒ．Ｅ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３３１；５２８−５３０（１９８８））。アミロイドプラークは、ＡＤ患者および４０才まで生存しているダウン症患者に多量に存在する。プラークはまた、少量であるが、健常な老化した脳にも存在する。これらのプラークは、アミロイドβペプチドからなり（βペプチド）（ＧｌｅｎｎｅｒおよびＷｏｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１２０：８８５−８９０（１９８４））、これもまた、脳血管沈着物および神経原繊維濃縮体中のタンパク質成分である。βペプチドは、βシート構造に配列されたフィラメント状物質であり、４．２−４．５ｋｄの分子量を有する。これは、３９−４２アミノ酸を有する疎水性ペプチドである。そのアミノ酸配列決定は、ＡＰＰ　ｃＤＮＡのクローニングを導いた（Ｋａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ　３２５：７３３−７３５（１９８７）；Ｇｏｌｄｇａｂｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３５：８７７−８８０（１９８７）；Ｒｏｂａｋｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：４１９０−４１９４（１９８７）；Ｔａｎｚｉら、Ｎａｔｕｒｅ　３３１：５２８−５３０（１９８８））および、ゲノムＡＰＰ　ＤＮＡ（Ｌｅｍａｉｒｅら、Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１７：５１７−５２２（１９８９）；Ｙｏｓｈｉｋａｉら、Ｇｅｎｅ　８７，２５７−２６３（１９９０））。ＡＰＰ　ｃＤＮＡの３つの型（ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１およびＡＰＰ７７０）が単離され、代替スプライシングにより１つの前駆体ＲＮＡからつくられる。遺伝子の全長は、１８エキソンを含み、１７５Ｋｂを超える（Ｙｏｓｈｉｋａｉら、１９９０）。ＡＰＰは、３つの細胞外ドメイン、トランスメンブレン領域、および細胞質ドメインを有する。βペプチドは、膜外の２８アミノ酸、および疎水性トランスメンブレンドメインの１４残基からなる。従って、βペプチドは、通常、脳、および、心臓、腎臓ならびに脾臓のようなその他の臓器中に認められるＡＰＰの切断産物である。Ｊｏａｃｈｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ３４１：２２６−２２８（１９８９）では、βペプチド沈着物は、ＡＤ患者の脳外で、皮膚、腸および皮下組織に認められることを報告してるが、しかし、βペプチド沈着物は、通常は脳のみに認められる。
ＡＰＰのより大きな代替型（ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ７７０）は、全ＡＰＰ６９５と１つあるいは２つのその他のドメインとからなる。ＡＰＰ７５１は、全ＡＰＰ６９５と、セリンプロテアーゼ阻害剤Ｋｕｎｉｔｚファミリー（ＫＰ１）に相同性を有するその他の５６アミノ酸とからなる（Ｔａｎｚｉら、１９８８；Ｗｅｉｄｅｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ　５７：１１５−１２６（１９８９）；Ｋｉｔａｇｕｃｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ　３３１：５３０−５３２（１９８８）；Ｔａｎｚｉら、Ｎａｔｕｒｅ　３２９，１５６（１９８７））。ＡＰＰ７７０は、ＡＰＰ７５１と、ニューロン細胞表面抗原ＯＸ−２と相同である他の１９アミノ酸ドメインとからなる（Ｗｅｉｄｅｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ　５７：１１５−１２６（１９８９）；Ｋｉｔａｇｕｃｈｉら、１９８８）。ＡＰＰは、リーダー配列の除去および硫酸基および糖鎖の付加により、翻訳後に改変される。
Ｖａｎ　Ｂｒｏｅｃｋｈａｖｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４８：１１２０−１１２２（１９９０）では、オランダ人の２家族において、ＡＰＰ遺伝子が、アミロイド−シス（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）をともなう遺伝性脳出血に強く結び付くことを実証した。このことは、オランダ人の２患者のＡＰＰコード領域中に重要な変異が認められたことにより確証された（Ｌｅｖｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４８：１１２４−１１２８（１９９０））。変異は、βペプチドの２２位で、グルタミンがグルタミン酸に置換されていた（ＡＰＰ６９５の６１８位）。さらに、ある家族は、全長タンパク質の７１７位でのアミノ酸置換による変異を介して、遺伝的にアルツハイマー病にかかりやすい、家系性アルツハイマー病（ＦＡＤ）と呼ばれる状態である（Ｇｏａｔｅら、（１９９１）；Ｍｕｒｒｅｌｌら、（１９９１）；Ｃｈａｒｔｉｅｒ−Ｈａｒｌｉｎら、（１９９１））。これらの変異は、家族内で疾患と同時分離し、遅延徴候ＡＤの家族には存在しない。
ヒト以外の老齢霊長動物は、脳実質ならびに、ある随膜および皮質血管壁に、βペプチドのアミロイドプラークを進展させるようであるが、ＡＤ研究のために実証された動物モデルは存在しない。老齢霊長動物およびイヌは動物モデルとして使用し得るが、それらは維持するのに費用がかかり、長期の研究期間を必要とする。実験モデルとして有用であるためにＡＤに十分な類似性を有する、自発的動物変異体は存在しない。ＡＤ様徴候が、電気分解、ＡＤ脳試料の移植、塩化アルミニウム、カイニン酸、あるいはコリン類似体により誘発され得る、種々のモデルが報告された（Ｋｉｓｎｅｒら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ　７；２８７−２９２（１９８６）；Ｍｉｓｔｒｙ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ２９；３３７−３４３（１９８６））。Ｆｌｏｏｄら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　８８：３３６３−３３６６（１９８６））には、βペプチドに相同な４つの合成ペプチドに、マウスにおける健忘症効果が報告されている。これらのどれもが、ＡＤの一般的徴候、生化学あるいは病原論のいずれにも貢献しないので、病因学あるいは治療に多大の有用な情報を与えないようである。Ｅ．ｃｏｌｉ　β−ガラクトシダーゼに結合されたヒトＡＰＰプロモーターによるトランスジェニックマウス（Ｗｉｒａｋ，Ｄ．Ｏ．ら、Ｔｈｅ　ＥＭＢＯ　Ｊ　１０；２８９−２９６（１９９１））および、ヒトＡＰＰ７５１　ｃＤＮＡ（Ｑｕｏｎ，Ｄら、Ｎａｔｕｒｅ　３５２，２３９−２４１（１９９１））あるいは、βペプチドを含むｃＤＮＡのサブフラグメント（Ｗｉｒａｋ，Ｄ．Ｏ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５３，３２３−３２５（１９９１）；Ｓａｎｄｈｕ，Ｆ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，２１３３１−２１３３４（１９９１）；Ｋａｗａｂａｔａ，Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ　３５４，４７６−４７８（１９９１））を発現するトランスジェニックマウスが、生産された。個々の研究で得られた結果は、プロモーターのソーおよび使用されたタンパク質コード配列に依存すると思われる。例えば、Ｗｉｒａｋらは（１９９１）、βペプチド型を発現するトランスジェニックマウスには、ＡＰＰに対して調製された抗体と反応する「ミエロイド様」物質の細胞内沈着物が観察されたが、その他の組織病理学的疾患徴候は認められなかったことを見い出した。抗体反応物質の紬胞内特性およびその他の徴候がないことは、この特定のトランスジェニック動物は、アルツハイマー病の正確なモデル系でないことを示唆する。Ｋａｗａｂａｔａらは（１９９１）、トランスジェニック動物でのアミロイドプラークの産生、神経細線維のもつれ、およびニューロン細胞壊死を報告している。これらの各研究では、同じペプチドフラグメント、すなわちβペプチドにＡＰＰのＣ末端５６アミノ酸を加えたものが発現された。Ｋａｗａｂａｔａらは（１９９１）ヒトｔｈｙ−１プロモーターを使用したが、Ｗｉｒａｋらは（１９９１）、ヒトＡＰＰプロモーターを使用した。Ｑｕｏｎ，Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ　３５２，２３９−２４１（１９９１）のニューロン特異的エノラーゼプロモーター由来のＡＰＰ７５１　ｃＤＮＡを発現するトランスジェニックマウスでは、ＡＰＰに対して調製された抗体に反応する物質の細胞外沈着物が観察された。沈着物が、ＡＰＰ７５１全長あるいはβペプチド、または両方を含むか否かは示さなかった。従って、このことは、アルツハイマー病でのこれらの存在と沈着物とのあらゆる相関性を除外する。Ｑｕｏｎら（１９９１）はまた、ニューロン特異的エノラーゼプロモーターから発現されたＡＰＰ６９５　ｃＤＮＡにコードされるタンパク質は、紬胞外免疫反応性沈着物を形成しないと述べている。これらの結果は、βペプチドはＡＰＰ６９５前駆体内に含まれるが、ＡＰＰ６９５　ｃＤＮＡとの結合でのニューロン特異的エノラーゼプロモーターの使用は、有効なアルツハイマー病モデルを提供し得ないことを示す。さらに、ＡＰＰ免疫反応性沈着物の存在は、年齢、あるいは特定のトランスジェニックモデルでの遺伝子使用量とは相関しない。
アルツハイマー病は、病理学的な面および行動面に関連する、複合症候群である。有用な疾患モデルは、これらの複合性を考慮に入れなければならない。提供された組織中で優勢なある型の遺伝子から多数のタンパク質が発現する。脳では、６９５型が優勢であるが、他の型のｍＲＮＡもまた存在する（Ｇｏｌｄｅら、Ｎｅｕｒｏｎ　４；２５３−２６７（１９９０））。異なる型の割合が、個人の年齢とともに変化するかどうかは知られていない。種々のタンパク質型は、ＫＩドメインおよび／またはＯＸ−２ドメインが成熟タンパク質に存在し得るかまたは存在し得ないような、代替スプライシングにより得られる。さらに、βペプチドは、前駆体タンパク質の翻訳後プロセシングにより得られる。このプロセスは、個人の年齢のような時間で変化し得、βペプチドの構造に直接影響しない変異により影響され得る：例えば、全長タンパク質中のアミノ酸７１７位での、家系性アルツハイマー病（ＦＡＤ）変異（Ｇｒｏａｔｅら、１９９１；Ｍｕｒｒｅｌｌら、１９９１；Ｃｈａｒｔｉｅｒ−Ｈａｒｌｉｎら、１９９１）。これらの考察を得て、アルツハイマー病の普遍的な動物モデルの生産が、これらの型の発現から得られる表現型の周知の変異効果、および、動物の生涯中の異なる型の割合の可能性を考慮する、動物モデルの構築を必要とする。
従って、本発明の目的は、トランスジェニック技術により構築される、アルツハイマー病用の動物モデルの提供である。
本発明のさらなる目的は、アミロイド前駆体タンパク質の異なる型の発現を正確に反映する、トランスジェニック動物の提供である。
さらに、本発明の目的は、アミロイド前駆体タンパク質の発現における、ある種の遺伝子異常に特徴付けられる、トランスジェニック動物の提供である。
発明の要旨
アルツハイマー病に対する可能な治療をテストするためのトランスジェニック動物モデルの構築が記載されている。このモデルは、アルツハイマー病を引き起こす天然に存在する条件に非常に類似することで特徴付けられる。すなわち、βアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の３つの型、ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、およびＡＰＰ７７０、あるいはそのサブフラグメントのうちの１つ以上の発現を制御する能力に加えて、アミノ酸７１７位でのＦＡＤ変異およびＡＰＰ遺伝子中で予測された変異のような天然に生じる変異に基づいた種々の位置での変異に基づく。ＡＰＰ遺伝子構築物は、ヒト、マウス、またはラット起源の天然に生じるＡＰＰプロモーターに加えて、マウスメタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーターのような誘導プロモーターを使用して調製され、動物の水あるいは食餌に亜鉛のような重金属を添加することにより調節され得る。構築物のニューロン特異的発現は、ラットニューロン特異的エノラーゼプロモーターを使用して調製される。
構築物は、マイクロインジェクションのような標準的な技術を用いて動物の胚に、または胚性幹細胞に導入される。モデルに基づく細胞培養物もまた、２つの方法により調製され得る。細胞培養物は、トランスジェニック動物から単離され得るか、あるいは、標準細胞トランスフェクション技術で、同様の構築物を用いて樹立細胞培養物から調製され得る。
上記の特異的な構築物は、以下のタンパク質コード配列を使用する：ＡＰＰ７７０　ｃＤＮＡ；アミノ酸７１７位での変異を有するＡＰＰ７７０　ｃＤＮＡ；構築物中にＯＸ２ドメインではなくＫＩプロテアーゼインヒビタードメインを有する、ＡＰＰ７５１　ｃＤＮＡ；アミノ酸７１７位での変異を有するＡＰＰ７５１　ｃＤＮＡ；ＡＰＰ６９５　ｃＤＮＡ；アミノ酸７１７位での変異を有するＡＰＰ６９５　ｃＤＮＡ；βペプチド領域がそれに続くＡＰＰリーダー配列およびＡＰＰのカルボキシ末端の残余の５６個のアミノ酸；βペプチド領域がそれに続くＡＰＰリーダー配列およびアミノ酸７１７位での変異が加えられたカルボキシ末端の残余の５６個のアミノ酸；βペプチド領域がそれに続くＡＰＰリーダー配列；βペプチド領域およびＡＰＰのカルボキシ末端の残余の５６個のアミノ酸；βペプチド領域、およびアミノ酸７１７位での変異が加えられたＡＰＰのカルボキシ末端の残余の５６個のアミノ酸；ゲノム−ｃＤＮＡ　ＡＰＰ遺伝子組合せ構築物；および、プロモーターに作動可能に連結し、アミノ酸７１７位での変異が加えられたゲノム−ｃＤＮＡ　ＡＰＰ遺伝子組合せ構築物であって、該プロモーターが、ヒトＡＰＰ遺伝子プロモーター、マウスＡＰＰ遺伝子プロモーター、ラットＡＰＰ遺伝子プロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、ラットニューロン特異的エノラーゼ遺伝子プロモーター、ヒトβアクチン遺伝子プロモーター、ヒト血小板由来成長因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）鎖遺伝子プロモーター、ラットナトリウムチャンネル遺伝子プロモーター、マウスミエリン塩基性タンパク質遺伝子プロモーター、ヒト銅−亜鉛スーパーオキサイドジスムターゼ遺伝子プロモーター、および哺乳類のＰＯＵドメイン調節遺伝子プロモーターから選択されるゲノム−ｃＤＮＡ　ＡＰＰ遺伝子組合せ構築物である。さらなる構築物には、ヒトＡＰＰプロモーターにより制御されるヒト酵母人工染色体構築物；アミノ酸７１７位での変異が加えられたヒトＡＰＰプロモーターにより制御されるヒト酵母人工染色体構築物；マウスまたはラット胚性幹（ＥＳ）細胞内のＡＰＰ遺伝子と野生型ヒトＡＰＰ　ｃＤＮＡを有するベクターとの間の相同組換えプロセスを介して、組換え位置（好ましい組換え部位は、ＡＰＰエキソン９内である）を越える常在性げっ歯動物の染色体ＡＰＰ遺伝子中のその配列が、類似のヒト配列で置換されるように改変された、内生マウスあるいはラットＡＰＰ遺伝子；マウスまたはラットＥＳ細胞内のＡＰＰ遺伝子とアミノ酸７１７位での変異を有するヒトＡＰＰ　ｃＤＮＡを有するベクターとの間の相同組換えプロセスを介して、組換え位置（好ましい組換え部位は、ＡＰＰエキソン９内である）を越える常在性げっ歯動物の染色体ＡＰＰ遺伝子中のその配列が、アミノ酸７１７位での変異を有する類似のヒト配列で置換されるように改変された、内生マウスあるいはラットＡＰＰ遺伝子。これらの構築物は、トランスジェニック動物に導入され得、次いで、別の構築物を発現する動物の交配により組み合わされる。
トランスジェニック動物または動物細胞は、アルツハイマー病の病理学的経過を変える化合物についてスクリーニングするために使用される。この変化は、動物中のＡＰＰおよびβペプチドの総量および組織病理学に対する影響、そして行動変化により測定される。
発明の詳細な説明
構築物ならびにトランスジェニック動物および動物細胞が、下記の方法および材料を用いて調製される。
材料のソース
制限エンドヌクレアーゼは、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ．）、Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ．）およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ　ＣＡ．）などの、従来の市販のソースから得られる。放射性材料は、Ｄｕｐｏｎｔ／ＮＥＮまたはＡｍｅｒｓｈａｍのような従来の市販のソースから得られる。部位特異的変異誘起用のために注文設計されたオリゴヌクレオチドは、ＢｉｏＳｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｉｎｃ．，Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ．のような、数社の材料販売業者から入手可能である。部位特異変異誘起を行うためのキットは、Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅなどの販売業者から入手可能である。ＡＰＰ　ｍＲＮＡのＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、およびＡＰＰ７７０型を含むｃＤＮＡクローンは、Ｄｒ．Ｄｍｉｔｒｙ　Ｇｏｌｄｇａｂｅｒ、ＮＩＨから直接得た。ＤＮＡライブラリーは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ．またはＣｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ．ような販売業者から入手可能である。ＰＣ１２および３Ｔ３細胞は、ＡＴＣＣから得た（それぞれ、＃ＣＲＬ１７２１および＃ＣＣＬ９２）。さらにＰＣ１２細胞系は、Ｈａｒｖａｒｄ　Ｍｅｄｉｃａｌ　ＳｃｈｏｏｌのＤｒ．Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｍａｒｏｔｔａ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ、およびＭｃＬｅａｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌから得た。細胞系に適した標準細胞培養培地は、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬのような従来の市販のソースから得られる。マウス幹細胞、株Ｄ３は、Ｄｒ．Ｒｏｌｆ　Ｋｅｍｌｅｒから得られた（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．８７，２７（１９８５））。ＤＮＡトランスフェクション用のリポフェクチン、および安定な形質転換体の選択試薬Ｇ４１８は、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬから入手可能である。
ヒトＡＰＰプロモーターの単離
ｐＷＥ１５コスミドベクターにヒト胎盤ＤＮＡから構築されたコスミドライブラリーは、ＡＰＰ７７０　ｃＤＮＡクローンのニックトランスレーション（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ　１９８９））により調製された３２Ｐ標識プローブとのハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。プローブとハイブリダイズされたクローンを、取り出して精製し、制限マッピング、ハイブリダイゼーション、およびＤＮＡ塩基配列決定により特徴付けた。長い５’フランキング領域を含むこのようなクローンの１つから、約２５ｋｂのＮｏｔｌからＮｒｕｌの制限ＤＮＡフラグメントを単離した。このフラグメントは、アルツハイマータンパク質コード領域の開始メチオニンコドンの２つ前のヌクレオチドで終わる。このフラグメントまたはそのサブフラグメントは、本明細書に記載の構築物のためのヒトＡＰＰプロモーターのソースである。マウスまたはラットゲノムライブラリーから同じ方法を用いて単離された類似のＤＮＡフラグメントは、マウスまたはラットプロモーターのソースである。
ＡＰＰ　ｃＤＮＡクローンの定義
ｃＤＮＡクローンＡＰＰ−６９５は、Ｋａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ　３２５：７３３−７３５（１９８７）に記載のｃＤＮＡの型であり、脳中のアルツハイマータンパク質の最も優勢な型を示す。ｃＤＮＡクローンＡＰＰ−７５１は、Ｐｏｎｔｅ，Ｐ，Ｎａｔｕｒｅ　３３１，５２５−５２７（１９８８）に記載された型である。ｃＤＮＡクローンＡＰＰ−７７０は、Ｋｉｔａｇｕｃｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ　３３１：５３０−５３２（１９８８）に記載された型である。この型には、６９５型に関連する２２５ヌクレチド挿入断片が含まれる。２２５ヌクレオチド挿入断片は、ＫＩドメインに加えて、ＯＸ−２ドメインもコードする。
ＡＰＰゲノム遺伝子座の定義
以下の表に示すように、ヒトゲノムＤＮＡクローンのファージおよびコスミドクローンにより、アルツハイマー遺伝子の最小の大きさが本来少なくとも１００ｋｂであることが特徴付けられた。ＡＰＰ遺伝子中には、合計１８個のエキソンが存在する（Ｌｅｍａｉｒｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ，１７；５１７−５２２，１９８９；Ｙｏｓｈｉｋａｉら、１９９０）。これらの結果を併せて、アルツハイマー遺伝子の最小の大きさは１７５ｋｂであることが示される。
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トランスジーンの構築
図１〜図５に示すヒトＡＰＰ遺伝子配列の種々の部分を有するクローンを、同様の方法で構築する。まず、２５３塩基対のＢｃｌｌからＢａｍＨＩのフラグメントとして、ＳＶ４０ウイルス由来のポリＡ付加シグナル（Ｒｅｄｄｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２００；４９４−５０２（１９７８））を、一連のｐＵＣからの改変されたベクター内にクローン化する。次に、ｃＤＮＡコード配列（７７０、７５１、または６９５）を挿入する。挿入されたフラグメントの正確な方向および構成を、制限エンドヌクレアーゼマッピングおよび限定的配列決定により、決定する。
図４および図５に示すヒトＡＰＰ遺伝子配列の種々のカルボキシ末端部分を有するクローンを、上記の工程に加えて数工程を経て構築する。まず、ＡＰＰ７７０　ｃＤＮＡクローンを、５６位（Ｋａｎｇら（１９８７）の番号付けシステム）の後で切断するＡｓｐ７１８で消化する。得られる５’延長部分をクレノウ酵素（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９）で満たし、次の配列のヘキサヌクレオチドに連結する：ＡＧＡＴＣＴ、ＢｇｌＩＩの認識部位。ＢｇｌＩＩ（これもまた１７６９位の後で切断する）による切断および再連結後に、タンパク質の翻訳読み取り枠は保存される。このコードした切形型タンパク質は、リーダー配列、その後に、βペプチドの前の約６個のアミノ酸、その後に、βペプチド、そして、ＡＰＰの５６個の末端アミノ酸を含む。図５のクローンは、図４ａのクローン中のヌクレオチド１９１３位の部位特異的変異誘起（Ｋａｎｇら（１９８７）の番号付けシステム）を介して、Ｔへ導入することにより造り出され、それによりβペプチドの最後のアミノ酸コドンのすぐ後に終止コドンが作り出される。図１〜図５に示す各ＡＰＰ　ｃＤＮＡ配列クローンは、各構築物を完成するために使用される異なるプロモーターの結合に用いられる、開始メチオニンコドンから２ヌクレオチド上流に１つのＮｒｕｌ部位を有する。
これらは同一であるが、全長タンパク質のアミノ酸７１７位での変異（ＦＡＤ変異部位）を有する発現クローンもまた、構築される。アミノ酸７１７位での変異は、部位特異的変異誘起（Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌ．　３，３３４−３４７（１９８９））により造られ、次のコドンの１つに対応する野生型ｖａｌコドンの変異を含む：ｉｌｅ、ｐｈｅ、ｇｌｙ、ｔｙｒ、ｌｅｕ、ａｌａ、ｐｒｏ、ｔｒｐ、ｍｅｔ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ａｓｎ、ｇｌｎ。
図６の組み合せｃＤＮＡ／ゲノム発現クローンの好ましい構築方法は、次の通りである。ＡＰＰ７７０　ｃＤＮＡクローンの８６０位のＴａｑＩ部位（Ｋａｎｇら（１９８７）の番号付けシステム）は、部位特異的変異誘起によりＸｈｏＩに変換される。ＸｈｏＩを有する得られるプラスミドの切断は、新規のＸｈｏＩ部位および９３０位の予め存在する部位でなされ、ＫＩおよびＯＸ−２コード配列を放出する。
この産生されたプラスミドは、ＫＩおよびＯＸ−２の代替スプライシングカセットの受容体として機能する。代替スプライシングカセットは、一連のクローニング工程を介して造られる。まず、エキソン６および隣接下流イントロンを含む、ゲノムクローン中の８６０位のＴａｑＩ部位（Ｋａｎｇら（１９８７）の番号付けシステム）は、部位特異的変異誘起によりＸｈｏＩに変換される。ＸｈｏＩを有する得られるプラスミドの切断は、新規のＸｈｏＩ部位および隣接イントロン内のＸｈｏＩ部位でなされる。このフラグメントは、プラスミドベクター中のＸｈｏＩ部位にクローン化される。第二に、エキソン９および隣接上流イントロンを含むゲノムクローンは、ＸｈｏＩ（９３０位）で切断され、プラスミドベクターのＸｈｏＩ部位にクローン化される。これらの２つの連結エキソン／イントロンフラグメントは、それらの個々のプラスミド骨格からＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩまたはＢｇｌＩＩのいずれかでの切断で放出され、プラスミドベクターのＸｈｏＩ部位にクローン化される。得られるＸｈｏＩフラグメントは、ＢａｍＨＩまたはＢｇｌＩＩのいずれかで切断され、フランキングイントロン配列を伴ったＫＩおよびＯＸ−２コード領域を含むゲノム６．６ｋｂ　ＢａｍＨＩセグメント（Ｋｉｔａｇｕｃｈｉら、１９８８）が、挿入される。ＸｈｏＩでの切断後に、このＤＮＡセグメントは、上記で構築された改変ＡＰＰ７７０　ｃＤＮＡのＸｈｏＩ部位に挿入される。これらのクローニング工程は、トランスジェンニック動物中の細胞が、天然の代替スプライシング機構によりＫＩおよびＯＸ−２ドメインの含有物を調節し得る、組み合せｃＤＮＡ／ゲノム発現クローンを産生する。アミノ酸７１７位での変異を有する類似の遺伝子は、上記のＡＰＰ７７０　ｃＤＮＡの変異型を使用して構築される。
遺伝子プロモーターの活性
種々のプロモーター配列は、ＡＰＰコード配列の発現を制御するために用いられる。トランスジェニック動物におけるＡＰＰ遺伝子の発現を調節する能力は、ＡＤにおいて種々のＡＰＰ遺伝子産物のはたらきを評価するのに有用であると考えられている。培養された細胞におけるＡＰＰ遺伝子の発現を調節する能力は、種々のＡＰＰ遺伝子産物の発現およびプロセシングを評価するのに有用であると考えられており、そして細胞培養された薬剤スクリーンの基準を提供し得る。
メタロチオネイン（ＭＴ）プロモーターは、よく特徴付られており、トランスジェニック動物において用いられた。そしてその発現は亜鉛およびグルココルチコイドホルモンレベルの調整によって調節され得る（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３００，６１１−６１５（１９８２））。
ヒトＡＰＰプロモーターはまた、ＣＮＳにおける発現に関して特徴付けられる（Ｗｉｒａｋら、１９９１）。このプロモーターは、トランスジェニックげっ歯動物のＣＮＳにおけるヒトＡＰＰ配列の時間的なおよび空間的な発現の正確な再生に有用であると考えられている。ヒトＡＰＰプロモーターに加えて、マウスおよびラット由来のＡＰＰプロモーターは、種々の野生型および変異ＡＰＰコード配列と共に用いられる。ヒトＡＰＰプロモーターは、トランスジェニックマウスの脳の適切な領域において活性を有することが示されている（Ｗｉｒａｋら、１９９１）が、トランスジェニックマウスにおけるマウスＡＰＰプロモーターまたはトランスジェニックラットにおけるラットＡＰＰプロモーターの使用は、トランスジェニック動物のＣＮＳにおける発現のより正確なパターンを提供すると考えられている。
ニューロンにおけるヒトＡＰＰ発現の制御の代替物として、ラットニューロン特異的エノラーゼ遺伝子プロモーターが用いられる。このプロモーターは、ニューロンにおけるコード配列を発現させることが知られている（Ｆｏｒｓｓ−Ｐｅｔｔｅｒら、Ｎｅｕｒｏｎ５；１９７−１９７（１９９０））。
ニューロンにおけるヒトＡＰＰ発現を制御するのに用いられる他の代替物には、ヒトβアクチン遺伝子プロモーター（Ｒａｙら、Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　５：２２６５−２２７３（１９９１））、ヒト血小板由来成長因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）鎖遺伝子プロモーター（Ｓａｓａｈａｒａら、Ｃｅｌｌ　６４：２１７−２２７（１９９１））、ラットナトリウムチャンネル遺伝子プロモーター（Ｍａｕｅら、Ｎｅｕｒｏｎ　４：２２３−２３１（１９９０））、ヒト銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子プロモーター（Ｃｅｂａｌｌｏｓ−Ｐｉｃｏｔら、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．　５５２：１９８−２１４（１９９１））、および哺乳類のＰＯＵドメイン調節遺伝子ファミリーのメンバーのプロモーター（Ｘｉら、Ｎａｔｕｒｅ　３４０：３５−４２（１９８９））が含まれる。ＰＯＵドメインは、４つの哺乳類転写因子Ｐｉｔ−１、Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−２、およびｕｎｃ−８６の間の類似の領域であり、そしてＤＮＡ結合ドメインの一部を表す。これらのプロモーターは、トランスジェニック動物のニューロン内で特異的な発現を生じさせることが知られているかまたは考えられている。非ニューロンの脳細胞におけるヒトＡＰＰの発現は、マウスミエリン塩基性タンパク質のプロモーターによってなされ得る（Ｒｅａｄｈｅａｄら、Ｃｅｌｌ　４８：７０３−７１２（１９８７））。
酵母人工染色体
図７に示される構築物は、以下のように構築されている。ヒトゲノムＤＮＡの大きなセグメントは、ある種のベクター内にクローン化される場合、酵母細胞内で自律複製単位として増殖され得る。このようなベクター産生（ｖｅｃｔｏｒ−ｂｏｒｎｅ）セグメントは、酵母人工染色体と呼ばれている（ＹＡＣ；Ｂｕｒｋｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３６，８０６（１９８７））。ヒトＹＡＣライブラリーは、市販され入手可能で（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）、平均挿入断片サイズ２５０，０００塩基対（１８０，０００塩基対〜５００，０００塩基対の範囲）を有している。アルツハイマーの遺伝子のＹＡＣクローンは、ヒトＡＰＰ７７０　ｃＤＮＡを有するライブラリーをスクリーニングすることによって直接単離され得る。クローンにおける本質的な遺伝子領域のすべての含有物は、ＰＣＲ解析によって確認され得る。
図７ａに示されるＹＡＣ−ＡＰＰクローンは、ＹＡＣベクターによってコードされるネオマイシン耐性に対して選択することによって、胚幹（ＥＳ）細胞において、確立される。ＹＡＣ−ＡＰＰクローンを有するＥＳ細胞は、以下に記載の確立された方法（「トランスジェニックマウス」および「胚幹細胞の方法」）によって、トランスジェニックマウスを産生するために用いられる。７１７位のアミノ酸での変異を有するＹＡＣ−ＡＰＰ遺伝子（図７ｂ）は、７１７位のアミノ酸での変異によって作用を及ぼされるヒト由来のゲノムＤＮＡを用いたＹＡＣライブラリーの生成によって産生される。クローンは、上記のようにして同定され、そしてＥＳ細胞内で確立される。
マウスＡＰＰ遺伝子の遺伝子改変
ヒトのアルツハイマータンパク質遺伝子とネズミのアルツハイマータンパク質遺伝子との間のヌクレオチド配列の相同性は、およそ８５％である。βペプチドのコード領域内には、この２つの配列の間に３つのアミノ酸の相違がある。７１７位のアミノ酸で変異しているｖａｌ残基は、マウス、ラット、およびヒトの間で保存される。野生型のげっ歯動物は、アルツハイマー病を起こさないか、またはヒトアルツハイマー患者において存在するものに類似のそれらのＣＮＳにおける堆積物またはプラークを生じない。従って、βペプチドのげっ歯動物形態ではなく、ヒトの形態は、疾患を引き起こし得る。相同組換え（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，ＭＲ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４．１２８８−１２９２（１９８９））は、インサイチューでマウスのアルツハイマー遺伝子をヒトβペプチドをコードする遺伝子に変換するのに用いられ得る。この組換えは、ＫＩおよびＯＸ−２ドメイン由来の下流部位、例えば、エキソン９内でなされる。その結果、トランスジェニック動物内の全ての細胞に適切な自然選択的なスプライシング機構は、最終遺伝子産物を発現するのに用いられ得る。
ヒトｃＤＮＡの野生型（図８の概略図「ａ」）および変異型（図８の概略図「ｂ」）の両方の形態は、ＡＰＰの野生型または変異型のいずれかの形態を発現するトランスジェニックモデルを産生するのに用いられる。組換えベクターは、ヒトＡＰＰ　ｃＤＮＡ（６９５または７７０型）から構築され、それは、７１７位のアミノ酸が野生型または変異型のいずれかである。組換えベクターの切断（例えば、エキソン９内のＸｈｏＩ部位において）は、直接的な隣接配列内において相同組換えを促進する（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８９）。このことから生じる内生ＡＰＰ遺伝子は、組換えの時点まで正常であり（この例におけるエキソン９内で）、そしてこの遺伝子は、その後、ヒトｃＤＮＡ配列からなる。
ＡＰＰタンパク質の変異型
ＦＡＤ変異部位である、タンパク質全長のアミノ酸７１７位での変異を有すること以外はこれらと同一の発現クローンもまた、構築される。アミノ酸７１７位での変異は、部位特異的変異誘発によってつくられ（Ｖｉｎｃｅｎｔら、１９８９）、野生型ｖａｌコドンの以下のコドンの１種への変異を包含する；ｉｌｅ、ｐｈｅ、ｇｌｙ、ｔｙｒ、ｌｅｕ、ａｌａ、ｐｒｏ、ｔｒｐ、ｍｅｔ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ａｓｎ、ｇｌｎ。ｖａｌ−７１７からｉｌｅ、ｐｈｅ、およびｇｌｙへの変異は、記載されている（Ｇｏａｔｅら、１９９１；Ｍｕｒｒｅｌｌら、１９９１；Ｃｈａｒｔｉｅｒ−ｈａｒｌｉｎら、１９９１）。これらの天然に生じる変異は、荷電されたアミノ酸でもバルキーアミノ酸でもない。従って、ｖａｌ−７１７と列挙された他のアミノ酸との置換はまた、ＦＡＤ症候群を促進し得、そして動物のＡＤモデルに有用な特性を有し得ると考えられている。
トランスフェクションおよびマイクロインジェクションのための構築物の調製
マイクロインジェクションのためのＤＮＡクローンを、適切な酵素（例えば、Ｓａｌ１、Ｎｏｔ１など）で切断し、そしてこのＤＮＡフラグメントをＴＢＥ緩衝液中の１％アガロースゲルで電気泳動する（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９）。ＤＮＡバンドを、エチジウムブロマイドで染色することにより可視化し、切り出し、そして０．３Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０を入れた透析バッグ中に入れる。ＤＮＡを透析バッグ中で電気溶離し、フェノール−クロロホルム（１：１）で抽出し、そして２容量のエタノールによって沈澱させる。このＤＮＡを低塩緩衝液（０．２Ｍ　ＮａＣｌ、２０ｍＭトリスＴＭ、ｐＨ７．４、および１ｍＭＥＤＴＡ）１ｍｌに再溶解し、そしてＥｌｕｔｉｐ−ＤＴＭカラムで精製する。このカラムを、まず、高塩緩衝液（１Ｍ　ＮａＣｌ、２０ｍＭトリスＴＭ、ｐＨ７．４、および１ｍＭ　ＥＤＴＡ）３ｍｌで満たし、次いで、低塩緩衝液５ｍｌで洗浄する。ＤＮＡ溶液をこのカラムに３回通し、ＤＮＡをカラムマトリックスに結合させる。低塩緩衝液３ｍｌで１回洗浄した後、このＤＮＡを高塩緩衝液０．４ｍｌで溶出し、そして２容量のエタノールによって沈澱させる。ＤＮＡの濃度をＵＶ分光光度計における２６０ｎｍでの吸光度によって測定する。マイクロインジェクションのために、ＤＮＡの濃度を、５ｍＭトリスＴＭ、ｐＨ７．４および０．１ｍＭ　ＥＤＴＡで３μｇ／ｍｌに調整する。マイクロインジェクションのためのＤＮＡの精製の他の方法はまた、Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｍｏｕｓｅ　ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８６）、Ｐａｌｍｉｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ３００，６１１（１９８２）、“Ｔｈｅ　Ｑｉａｇｅｎｏｌｏｇｉｓｔ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”、第３版（これはＱｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ．ＣＡにより出版された）、およびＭａｎｉａｔｉｓら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ　１９８９）に記載されている。
トランスジェニック動物の構築
動物のソース
トランスジェニック試験に適切な動物は、標準的な市販のソース、例えば、Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）、Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）、Ｈａｒｌａｎ　Ｓｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）などから得られ得る。Ｓｗｉｓｓ　Ｗｅｂｓｔｅｒ雌マウスは、胚の回収（ｅｍｂｒｙｏ　ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）および胚移植に好ましい。Ｂ６Ｄ２Ｆ１雄は、交配に用いられ得、そして精管切除されたＳｗｉｓｓ　Ｗｅｂｓｔｅｒ種ウマは、偽妊娠を刺激するのに用いられ得る。精管切除されたマウスおよびラットは、供給業者から得られ得る。
マイクロインジェクションの手順
げっ歯動物の胚のマニピュレーションのための手順およびＤＮＡのマイクロインジェクションのための手順は、Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｍｏｕｓｅ　ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８６）に詳細に記載されており、その教示は本明細書中に参考のために援用されている。
トランスジェニックマウス
６週齢の雌マウスに、過剰排卵を誘発するため、妊娠ウマ血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ；Ｓｉｇｍａ）５　ＩＵ（０．１ｃｃ，ｉｐ）を注入し、４８時間後にヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ；Ｓｉｇｍａ）５ＩＵ（０．１ｃｃ，ｉｐ）を注入する。雌は、ｈＣＧ注入後直ちに雄と共に置かれる。ｈＣＧ注入から２１時間後、交配した雌をＣＯ２で窒息させるか、または頸部を脱臼させて屠殺し、そして切り出した輸卵管から胚を回収し、さらにこれを０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ）が入ったダルベッコリン酸緩衝生理食塩水中に入れる。周辺の丘細胞をヒアルロニダーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）で取り除く。次いで、前核胚を洗浄し、そしてこれをＣＯ２　５％、空気９５％の加湿雰囲気下の３７．５℃のインキュイベーター中で、０．５％ＢＳＡ（ＥＢＳＳ）を含有するアール調節塩溶液（Ｅａｒｌｅ’ｓ　ｂａｌａｎｃｅｄ　ｓａｌｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に注入時間まで入れておく。
不定周期の成熟雌マウスを、精管切除した雄と対にする。Ｓｗｉｓｓ　Ｗｅｂｓｔｅｒまたは他の類似する系統がこの目的のために用いられ得る。同時に、受容雌をドナー雌として交配させる。胚移植の際に、この受容雌に、体重１グラムあたり２．５％のアベルチン０．０１５ｍｌを腹腔内注入して麻酔する。一本の正中背側切開により輸卵管を露出させる。そして体壁から直接輸卵管への切開を行う。次いで卵巣嚢を時計工鉗子（ｗａｔｃｈｍａｋｅｒｓ　ｆｏｒｃｅｐｓ）で引き裂く。移植する胚をＤＰＢＳに入れ、さらに移植ピペットのチップに（約１０〜１２の胚）入れる。ピペットのチップを卵管漏斗（ｉｎｆｕｎｄｉｂｕｌｕｍ）に挿入し、そして胚を移植する。移植後、２箇所縫合して切り口を閉じる。
トランスジェニックラット
トランスジェニックラットを生産するための手順は、マウスに対する手順と同様である（Ｈａｍｍｅｒら、Ｃｅｌｌ　６３；１０９９−１１２（１９９０））。３０日齢の雌ラットにＰＭＳＧ　２０　ＩＵ（０．１ｃｃ）を皮下注入し、そして４８時間後に、個々の雌を試験に供した雄と共にする。同時に、４０〜８０日齢の雌を精管切除した雄と共にケージの中に入れる。これらは胚移植の仮親（ｆｏｓｔｅｒ　ｍｏｔｈｅｒｓ）を提供する。翌朝、雌の膣栓をチェックする。精管切除した雄と交配した雌は、移植のときまで別に置いておく。交配した雌のドナーを屠殺し（ＣＯ２による窒息）、そしてそれらの輸卵管を取り出し、これを０．５％ＢＳＡが入ったＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）に入れ、そして胚を集める。胚周辺の丘細胞をヒアルロニダーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）で取り除く。次いで、胚を洗浄し、そしてこれを３７．５℃のインキュベーター中で、０．５％ＢＳＡを含有するＥＢＳＳ（アール調節塩溶液）にマイクロインジェクションの時間まで入れておく。
胚を一度注入し、生存胚を、仮親への移植のためにＤＰＢＳへ移す。ケタミン（４０ｍｇ／ｋｇ，ｉｐ）およびキシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）（５ｍｇ／ｋｇ，ｉｐ）で仮親を麻酔する。皮膚から背側正中切開を行い、そして、筋肉層から直接卵巣への切開を行い、卵巣および輸卵管を露出させる。卵巣嚢を引き裂き、胚を移植ピペットで吸引し、そして移植ピペットのチップを卵管漏斗に挿入する。次いで、切り口を縫合して閉じ、そして仮親を個々に収容する。
胚幹（ＥＳ）細胞方法
ｃＤＮＡのＥＳ細胞への導入
ＥＳ細胞の培養方法およびそれに続くトランスジェニック動物の生産、種々の方法によるＤＮＡのＥＳ細胞への導入（例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム／ＤＮＡ沈降、および直接注入（ｄｉｒｅｃｔ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ））が、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ　ａｎｄ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ，　ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　１９８７）に詳細に記載されており、その教示は本明細書中に援用される。トランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）含有ＥＳ細胞の望ましいクローンの選択は、いくつかの手法の１つにより達成される。ランダムな遺伝子組込みを含む場合には、ＡＰＰクローンは、ネオマイシン耐性をコードする遺伝子と共沈する。トランスフェクションは、Ｌｏｖｅｌｌ−Ｂａｄｇｅ、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ　ａｎｄ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ，ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　１９８７）またはＰｏｔｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８１，７１６１（１９８４）で詳細に記載されるいくつかの方法のいずれかにより達成される。リン酸カルシウム／ＤＮＡ沈降、直接注入、およびエレクトロポレーションは好ましい方法である。これらの手順においては、０．５×１０６個のＥＳ細胞を組織培養皿にプレートし、そして、最終的に１００μｌの体積になるようにして５０ｍｇのリポフェクチン（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）の存在下で沈澱させた、線状化したＡＰＰクローンと１ｍｇのｐＳＶ２ｎｅｏ　ＤＮＡとの混合物によりトランスフェクトした（ＳｏｕｔｈｅｒｎおよびＢｅｒｇ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：３２７−３４１（１９８２））。この細胞を、１０％胎仔ウシ血清のＧ４１８で補足した（２００と５００μｇ／ｍｌとの間）ＤＭＥＭ溶液を含有する選択培地で培養する。Ｇ４１８耐性の細胞のコロニーをクローニングリングを利用して単離し、そして増大させた。薬剤耐性のクローンからＤＮＡを抽出し、そしてＡＰＰ配列を有するこれらのクローンを同定するために用いられるＡＰＰ７７０　ｃＤＮＡプローブを用いて、サザーンブロッティング実験を行う。いくつかの実験では、重要なクローンを同定するのにＰＣＲ法を用いる。
ＥＳ細胞へ導入されたＤＮＡ分子はまた、Ｃａｐｅｃｃｈｉ（１９８９）に記載されるように、相同組換えのプロセスにより染色体へ組込まれ得る。直接注入は組込みの効果が高い。所望のクローンは、注入されたＥＳ細胞のプールから調製されるＤＮＡのＰＣＲにより同定される。プール内の陽性の細胞は、細胞クローニングに続くＰＣＲにより同定される（ＺｉｍｍｅｒおよびＧｒｕｓｓ、Ｎａｔｕｒｅ　３３８，１５０−１５３（１９８９））。エレクトロポレーションによるＤＮＡの導入はあまり効果的ではなく、そして選択工程を必要とする。組換え時の陽性物の選択の方法（つまり、ｎｅｏ耐性）および２重陽陰選択の方法（つまり、ｎｅｏ耐性およびガンシクロビル（ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）耐性）、およびそれに続く所望のクローンのＰＣＲによる同定についてが、Ｊｏｙｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３３８，１５３−１５６（１９８９）およびＣａｐｅｃｃｈｉ（１９８９）に記載されており、それらの教示は本明細書中に援用される。
胚の回収およびＥＳ細胞注入
雄と交配した自然周期または過剰排卵の雌マウスが、ＥＳ細胞移植のための胚を採取するのに用いられる。この目的にマウスを用いるときは、Ｃ５７株を用いることが望ましい。交配が成功して約３．５日後に適齢の胚を回収する。交配した雌をＣＯ２で窒息させるか、または頸部を脱臼させて屠殺し、そして切開した子宮角から胚を取り出して洗浄し、そしてＥＳ細胞注入のため、ダルベッコの１０％ウシ血清を加えた修正必須培地にこれを入れる。約２０μｍの内径を有するガラス製顕微針を用いて、約１０〜２０のＥＳ細胞を胚盤胞へ注入する。
偽妊娠した雌への胚の移植
不定周期の成熟雌マウスを精管切除した雄と対にする。Ｓｗｉｓｓ　Ｗｅｂｓｔｅｒ、ＩＣＲまたはその他のマウス系統がこの目的のために用いられ得る。ＥＳ細胞を含有する胚盤胞の移植に要求される、交配してから２．５〜３．５日となるように受容雌を交配させる。胚移植の際に、体重１グラムあたり２．５％アベルチンの０．０１５ｍｌを腹腔内注入して、受容雌を麻酔する。体壁から直接輸卵管への切開により卵巣を露出させ、そして卵巣および子宮を外にさらす。２５ゲージ針を用いて子宮角に穴をあけ、そこから胚盤胞を移植する。移植後、卵巣および子宮を体内へ押し戻し、そして２箇所縫合して切り口を閉じる。さらに移植をするときは、反対側でこの手順を繰り返す。
トランスジェニックマウスおよびラットの同定
３週齢の動物から尾のサンプル（１〜２ｃｍ）を取り出す。ＤＮＡを調製し、サザーンブロットおよびＰＣＲの両方法により分析し、トランスジェニック親（Ｆ０）動物およびそれらの子孫（Ｆ１およびＦ２）を検出する。
病理学的研究
マイクロインジェクションを行ったトランスジーンを有する種々のＦ０、Ｆ１およびＦ２動物をＣＯ２で窒息させて屠殺し、そして脳内の神経炎によるプラーク（ｎｅｕｒｉｔｉｃ　ｐｌａｑｕｅｓ）および神経細線維のもつれ（ＮＦＴ）を免疫組織学的に分析する。各トランスジェニックラインからのマウスおよびラットの脳を４％パラフォルムアルデヒド中で固定し、そしてクリオスタット上で分割する。ＡＰＰおよび／またはβペプチドと反応性の抗体で切片を染色する。フルオレセイン、ローダミン、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼと結合した二次抗体が、一次抗体を検出するために用いられる。これらの実験は、アミロイドプラークの同定、および脳の特定の領域へそれらのプラークを局所化させることを可能にする。９〜５０μｍの範囲の大きさを有するプラークが、大脳皮質中においてＡＤ患者の脳内に特徴的に生じるだけでなく、へん桃核、線条体および間脳を含むさらに奥の灰白質にも観察され得る。切片は、アルツハイマープラーク診断用の他の抗体でもまた染色され、抗原（例えば、Ａｌｚ−５０、ｔａｕ、Ａ２Ｂ５、神経フィラメント、ニューロン特異的エノラーゼ、およびアルツハイマープラークに特有の他の抗原）を認識する（Ｗｏｌｏｚｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３２，６４８（１９８６）；ＨａｒｄｙおよびＡｌｌｓｏｐ、Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１２，３８３−３８８（１９９１）；Ｓｅｌｋｏｅ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２，４６３−４９０（１９８９）；Ａｒａｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７，２２４９−２２５３（１９９０）；Ｍａｊｏｃｈａら、Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ　Ａｂｓ；９９，２２（１９８８）；Ｍａｓｔｅｒｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２，４２４５−４２４９；Ｍａｊｏｃｈａら、Ｃａｎ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　６３；５７７−５８４（１９８５））。また、チオフラビン類およびコンゴ−レッドによる染色も、神経炎によるプラークおよびＮＦＴ内のβペプチド沈着物の位置を共に確認するのに行われる。
ＡＰＰペプチドおよびβペプチドの発現の分析：
ｍＲＮＡ：　酸グアニジニウムチオシアネート−フェノール／クロロホルム抽出法によりトランスジェニック動物の細胞系および細胞組織から、ｍＲＮＡを単離し（ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ，Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ１６２，１５６−１５９（１９８７））、ノーザンブロット法により発現レベルを決定する。
タンパク質：　細胞質外ドメイン、βペプチド領域、およびＣ末端に特異的なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を用いることによって、ＡＰＰペプチドおよびβペプチドを検出する。
ウェスタンブロット分析：　タンパク質画分を組織ホモジェネートおよび細胞溶解産物から単離し、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８８）；Ｂｒｏｗｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．４０；２９９−３０８（１９８３）；およびＴａｔｅ−Ｏｓｔｒｏｆｆら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　８６；７４５−７４９（１９８９）に記載のように、ウェスタンブロット分析にかける。以下にごく簡単な説明をする。
タンパク質画分をラエムリサンプル緩衝液中で変性し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動する。その後、エレクトロブロッティングによりタンパク質をニトロセルロースフィルターに移す。フィルターをブロックし、一次抗体と共にインキュベートし、最終的に酵素を結合した二次抗体と反応させる。続いて、適当な発色性基質を用いてインキュベートすることにより、ＡＰＰタンパク質の位置が示される。
病理学的・行動的研究
病理学的研究
免疫組織的手法（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｌｏｇｙ）およびチオフラビンＳ染色は、本明細書の別項に記載のように行われる。
インサイチューハイブリダイゼーション：　放射性プローブまたは酵素標識されたプローブを用いてｍＲＮＡをインサイチューで検出する。これらのプローブを、よりよく細胞透過させるために長さおよそ１００ヌクレオチドに分解する。固定され、パラフィン包埋されたサンプル用のＣｈｏｕら、Ｊ．Ｐｓｙｃｈ．Ｒｅｓ．２４，２７−５０（１９９０）に記載の手順を以下に簡潔に記載するが、同様の手順は凍結材料として切開されたサンプルに対しても用いることができる。インサイチューハイブリダイゼーション用のパラフィン切片をキシレンで脱脂し、エタノールで段階的・連続的に再水和し、最後にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。切開片を新鮮な４％パラフォルムアルデヒド中で後固定（ｐｏｓｔ−ｆｉｘｅｄ）する。切片をＰＢＳで５分間２回洗浄して、パラフォルムアルデヒドを除去する。その後、２０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ溶液による処理によって切開片を浸透性にする。切開片を４％パラフォルムアルデヒドで再固定し、バックグランドのプローブ結合を生じさせうる塩基性分子を０．１Ｍトリエタノールアミン、０．３Ｍ無水酢酸溶液中で１０分間アセチル化する。切片をＰＢＳで洗浄してから、エタノールで段階的・連続的に脱水し、空気乾燥する。センスプローブをコントロールとして用いて、アンチセンスプローブで切開片をハイブリダイズする。適切な洗浄後、結合した放射性プローブをオートラジオグラフィによって検出する。あるいは、適切な発色性基質との反応を通じて酵素的に標識されたプローブを検出する。
行動的研究
学習および記憶の欠損を評価するように考案された行動試験を用いる。このような試験には、例えばＭｏｒｒｉｓ　Ｗａｔｅｒ迷路（Ｍｏｒｒｉｓ、Ｌｅａｒｎ　Ｍｏｔｉｖａｔ．１２；２３９−２６０（１９８１））がある。この手順によれば、水で満たした円形のプールの中に動物が入れられ、水面のすぐ下にはエスケーププラットフォームが沈められている。その動物が近位の視覚的手がかりに向かって泳いでいくことによって見つけられるように、視覚的マーカーがプラットフォームの上に置かれている。あるいは、プラットフォームの位置を示す形式的手がかりがないより複雑な形式の試験をその動物に課すこともできる。その形式の場合、動物は遠位の視覚的手がかりに関連してプラットフォームの位置を学習しなければならない。
トランスジェニックマウスに適用される手順は、トランスジェニックラット用の手法と同様である。
アルツハイマー病治療用の化合物のスクリーニング
標準的な方法論によってアルツハイマー病の治療をする時に潜在的な効果をもたらす化合物をスクリーニングするために、トランスジェニック動物と動物細胞を用いる。この化合物を一定期間の間に投与量を変化させて動物に投与するか、培地に導入する。次いで、その動物あるいは動物細胞は、上記の手順を用いてＡＰＰ発現、組織病理学、および／または行動における変化を調べた。
実施例１：ＮＩＨ３Ｔ３およびＰＣ１２細胞におけるｐＭＴＡＰＰ−１の発現
クローンｐＭＴＡＰＰ−１は、図１ａに示される発現ベクターの一例である。ここで使用されているプロモーターは、メタロチオネインプロモーターである。ＮＩＨ３Ｔ３およびＰＣ１２細胞系（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ９２およびＣＲＬ１７２１）をトランスフェクトすることによって安定な細胞系を得た。０．５ｘ１０６個のＮＩＨ３Ｔ３またはＰＣ１２細胞を１００ｍｍ皿にプレートし、そして、５０ｍｇのリポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ）の存在下で沈澱させた５ｍｇのＳａｌｌフラグメントおよび１ｍｇのｐＳＶ２ｎｅｏ　ＤＮＡ（４６）の混合物を最終容積が１００μｌになるようにしてトランスフェクトした。ＰＣ１２細胞には、ポリリジンでコートしたプレートを用いた。この細胞は通常、組織培養皿にあまり付着しないためである。ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ中１０％のウシ胎児血清を含有し、Ｇ４１８を補給した選択培地を細胞に与えた。５００ｍｇ／ｍｌ（生物学的重量）および２５０ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を用いて、ＮＩＨ３Ｔ３およびＰＣ１２細胞由来のコロニーをそれぞれ選択した。トランスフェクションの１５日後、Ｇ４１８に対して耐性を有する細胞のコロニーをクローニングリングで単離し、Ｔフラスコ内で増した。細胞内のＡＰＰ　ｃＤＮＡの存在は、ＭｕｌｌｉｓおよびＦａｌｏｏｎａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５；３３５−３５０（１９８７）の手法を用いたＰＣＲで検出した。本明細書中に上記教示するところを援用する。
各細胞系からの２５個のコロニー内のＡＰＰの発現を、免疫染色（Ｍａｊｏｃｈａら、１９８８）によって分析した。細胞を集密培養し、４％のパラフォルムアルデヒド、０．１２ＭのＮａＣｌ、および２０ｍｍのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ７．０を含む溶液中で固定した。これらの増殖細胞を、Ｄｒ　Ｒｏｎａｌｄ　Ｍａｊｏｃｈａ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡによって提供される合成βペプチド配列（Ｍａｓｔｅｒｓら、１９８５）に対する初代モノクローナル抗体、次いでビオチンに結合した汎化抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ，ＰＡ）と一晩インキュベートした。次に、アビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）および色素体としてジアミノベンジジン（Ｍａｊｏｃｈａら、１９８５）を加えることにより免疫染色を行った。その結果、ｐＭＴＡＰＰ−１ベクターはＮＩＨ３Ｔ３およびＰＣ１２細胞の両方においてＡＰＰを発現していることが示された。
実施例２：ＰＣ１２細胞におけるｐＥＡＰＰ−１の発現
ｐＥＡＰＰ−１は、図１Ａの構築物と同様なヒトＡＰＰ７７０　ｃＤＮＡに結合し、その発現を制御する２５ｋｂヒトＡＰＰ遺伝子プロモーターの一例である。この構築物からのＤＮＡを上記のようにしてＰＣ１２細胞にトランスフェクトした。ｐＥＡＰＰ−１トランスフェクト細胞の特定のクローンは、神経成長因子（ＮＧＦ）で処理されたＰＣ１２細胞によって示されるのと形態的に同様な分化表現型を示した。ＰＣ１２細胞は通常、ほぼ円形および平坦な細胞である。ｐＥＡＰＰ−１でトランスフェクトされた細胞は、神経突起に類似した細胞質伸長部を有する。ＰＣ１２細胞をＮＧＦで処理すると、神経突起伸長が非常に長く伸長する。ｐＥＡＰＰ−１でトランスフェクトされた１３個のＰＣ１２細胞クローンを選択し、増殖させた。これらの細胞クローンのうち８個が自発分化表現型を示し、クローン１−８、１−１および１−４が最も強力な表現型を示した。上記のようにβペプチドに対する抗体でｐＥＡＰＰ−１トランスフェクトＰＣ１２細胞を染色したところ、分化を示す細胞もＡＰＰを発現していることが示された。ＡＰＰ７７０　ｃＤＮＡは発現されるが、ｐＭＴＡＰＰ１クローンでトランスフェクトされたＰＣ１２細胞はこの表現型を示さなかったので、これらの結果により、ヒトプロモーター由来のＡＰＰ７７０の発現が、細胞生理学に関する新規な特徴を有することが示唆される。
実施例３：ＰＣ１２細胞におけるｐＭＴＡ４の発現
ｐＭＴＡ４は、図４Ａに示される構築物のタイプの一例である。ここで使用されているプロモーターは、メタロチオネインプロモーターである。この構築物でコードされるタンパク質は、図４に示されるタンパク質とはわずかに異なる。ＡＰＰ７７０　ｃＤＮＡクローンを、５６位（Ｋａｎｇらの番号付けシステムによる、１９８７年）より後を切断するＡｓｐ７１８で消化した。その結果得られた５’エクステンションをクレノウ酵素（Ｍａｎｉａｔｉｓ）を用いてうめた。同一のＤＮＡ調製物もまた、１７９５位より後を切断するＥｃｏＲＩで切断し、その結果得られた５’エクステンションをクレノウ酵素（Ｍａｎｉａｔｉｓ）を用いてうめた。この分子が自己連結することにより発現クローンとなる。この発現クローンでは、このようにしてコードされた欠失タンパク質は、リーダー配列、βペプチドのｐｈｅ−ａｒｇ−ｖａｌ−ｇｌｙ−ｓｅｒ配列で開始する短縮βペプチド、そしてＡＰＰの５６末端アミノ酸をこの順で含んでいる。この構築部からのＤＮＡを上記のようにＰＣ１２細胞にトランスフェクトした。
実施例４：ＭＴ−１プロモーターのコントロール下でのＡＰＰ発現トランスジェニックマウスの発生。
トランスジェニックマウスを、前核胚にｐＭＴＡＰＰ１ベクターＤＮＡをマイクロインジェクションすることによりつくった。ｐＭＴＡＰＰ１は、図１ａに示した構築物の一例であり、それはメタロチオネインプロモーターに操作可能に連結する。マウスの胚へのマイクロインジェクションの手順は、Ｂ．Ｈｏｇａｎらによる「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｍｏｕｓｅ　ｅｍｂｒｙｏ」（１９８６）に記載されている。手順の簡単な説明のみを下に記載する。
マウスをＴａｃｏｎｉｃ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇｅｒｍａｎ　Ｔｏｗｎ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）から入手した。Ｓｗｉｓｓ　Ｗｅｂｓｔｅｒ雌マウスを、胚の回収および移植に用いた。Ｂ６Ｄ２Ｆ１雄を交配に用い、そして精管切除したＳｗｉｓｓ　Ｗｅｂｓｔｅｒ種ウマを、偽妊娠をシミュレートするのに用いた。
胚の回収：　４〜８週齢の雌マウスを、５ＩＵの妊娠ウマ血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ；Ｓｉｇｍａ）、続いて４８時間後５ＩＵのヒト繊毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ；Ｓｉｇｍａ）を用いて、過剰排卵を誘発した。ｈＣＧ注入後、ただちに雌を雄と一緒に置いた。ｈＣＧの２１時間後に、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ）の入ったダルベッコリン酸緩衝生理食塩水中で交配した雌から切除した輸卵管から胚を回収した。周囲の丘細胞を、ヒアルロニダーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて除去した。次いで前核胚を洗浄し、そして７％　ＣＯ２、５％　Ｏ２、および８８％　Ｎ２からなる加湿雰囲気下の３７．５℃のインキュベーター中の０．４％ＢＳＡ（ＥＢＳＳ）を含有するアール調節塩溶液中に注入時間まで入れておいた。
マイクロインジェクション：　Ｅｌｕｔｉｐ−ＤＴＭで精製したＳａｌ１ＤＮＡを、マイクロインジェクションのために５ｍＭトリス（ｐＨ７．４）および０．１ｍＭ　ＥＤＴＡに溶解して、３μｌ／ｍｌ濃度にした。微小針およびホールディングピペットを、ＤＫＩモデル７２０ｐｉｐｅｔｔｅ　ｐｕｌｌｅｒを用いてＦｉｓｈｅｒ凝集（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）チューブ（Ｆｉｓｈｅｒ）から曵いて作製した。次いで、ホールディングピペットを約７０μｍ（Ｏ．Ｄ．）で壊し、そしてナリシゲマイクロフォージ（モデルＭＦ−８３）で約３０μｍのＩ．Ｄ．にまで炎でなめらかにした。Ｎｉｋｏｎ　Ｄｉａｐｈｏｔ顕微鏡に取り付けたナリシゲマイクロマニピュレーターにピペットを備え付けた。空気の詰まったインジェクションピペットを、ホールディングピペットに対してチップを破壊した後、チップを通してＤＮＡ溶液で満たした。マイクロマニピュレーションのためにパラフィンオイル下で、３０〜４０の群の胚を、ＥＢＢＳの滴量１００μｌに入れた。胚を配向させ、そしてホールディングピペットで保持した。次いで、インジェクションピペットを、雄の前核（通常は、より大きい前核）に挿入した。ピペットが膜を突き破らなかった場合は、直ちに台を軽く叩いて貫通を助けた。次いで、細胞核を注入し、この注入を細胞核の膨張によってモニターした。注入後、胚群を受容雌に移すまで、ＥＢＳＳ中に入れて置いた。
移植：不定周期の成熟雌マウスを、精管切除したＳｗｉｓｓ　Ｗｅｂｓｔｅｒの雄と対にした。受容雌を、ドナー雌として同時に交配した。移植する時に、雌をアベルチンで麻酔した。一本の正中背側切開により、輸卵管を露出した。次いで、体壁から直接輸卵管への切開を行った。次いで、卵巣嚢を、時計工鉗子で引き裂いた。移植すべき胚を、ＤＰＢＳ中に入れ、そしてトランスファーピペットのチップに入れた（約１０〜１２個の胚）。ピペットのチップを、卵管漏斗に挿入し、そして胚を移植した。移植後、２箇所縫合して切り口を閉じた。
トランスジーン組込みのためのマウスの分析：　３週齢の１ｃｍの長さの尾のサンプルを、ＤＮＡ分析について実験した。０．７ｍｌの５ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳおよび３５０μｇプロテイナーゼＫの存在下、５５℃で一晩振とうしながらインキュベートすることにより、尾のサンプルを消化した。消化物を、等量のフェノールで一回、そして等量のフェノール：クロロホルム（１：１混合液）で一回抽出した。上清を、７０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）と混合し、そして等量の１００％エタノールを添加することによりＤＮＡを沈澱させた。ＤＮＡを微量遠心で沈澱させ、７０％エタノールで一回洗浄し、乾燥させ、そして１００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリスｐＨ８．０および１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に溶解した。
１０〜２０μｌのＤＮＡを、ＢａｍＨ１で制限切断し、１％アガロースゲル上で電気泳動し、ニトロセルロースペーパーにブロットし、そして３２Ｐで標識したＡＰＰ　ｃＤＮＡフラグメントでハイブリダイズした。トランスジェニック動物を、ハイブリダイズしたヒトロセルロースフィルターのオートラジオグラフィーにより同定した。ＤＮＡもまた、８００ｂｐフラグメントを生み出す合成プライマーによって実行されるＰＣＲにより分析した。
全部で６７１個の前核胚をマイクロインジェクションして、７３匹が生きて生まれ、そして６匹が死産であった。Ｆ１およびＦ２トランスジェニックを生み出した９匹のトランスジェニックマウス（雌５匹および雄４匹）を、ＤＮＡ分析により同定した。これらの動物は、ｍＲＮＡの発現および異なる組織におけるＡＰＰのタンパク質、および上記のような行動的および診断的異常の分析について解析され得る。
【図面の簡単な説明】
図面の簡単な説明
図の枠で囲んだ部分は、構築物のアミノ酸コード部分を示す。模様部分（ｆｉｌｌｅｄ　ｐｏｒｔｉｏｎ）は、図の註訳部分に示されているように、タンパク質の種々の領域を示す。線は、ゲノム配列に隣接する、５’あるいは３’非翻訳配列、フランキングゲノム配列またはイントロンである、クローン中の配列を示す。図７および８おいて、構築物の左側の線の省略部分は、長いＤＮＡ配列が存在することを示す。
図１ａは、ＡＰＰ　７７０　ｃＤＮＡコード配列の図である。
図１ｂは、７１７位での変異を有する、ＡＰＰ７７０　ｃＤＮＡコード配列の図である。
図２ａは、ＡＰＰ７５１　ｃＤＮＡコード配列の図である。
図２ｂは、７１７位での変異を有する、ＡＰＰ７５１　ｃＤＮＡコード配列の図である。
図３ａは、ＡＰＰ６９５コード配列の図である。
図３ｂは、７１７位での変異を有する、ＡＰＰ６９５　ｃＤＮＡコード配列の図である。
図４ａは、ＡＰＰのカルボキシ末端部分のコード配列の図である。
図４ｂは、７１７位での変異を有する、ＡＰＰのカルボキシ末端部分のコード配列の図である。
図５は、ＡＰＰのβペプチド部分のコード配列の図である。
図６ａは、ＫＩおよびＯＸ２エキソンの代替スプライシングを可能にする、組み合せゲノム／ｃＤＮＡコード配列の図である。
図６ｂは、７１７位での変異を有し、ＫＩおよびＯＸ２エキソンの代替スプライシングを可能にする、組み合せゲノム／ｃＤＮＡコード配列の図である。
図７ａは、ヒトＡＰＰ　ＹＡＣコード配列の図である。
図７ｂは、７１７位での変異を有する、ヒトＡＰＰ　ＹＡＣコード配列の図である。
図８は、マウスＥＳ細胞中のマウスＡＰＰ遺伝子と、遺伝子のエキソン９部分に対するヒトＡＰＰ　ｃＤＮＡ（野生型あるいはＦＡＤ変異型のいずれか）を有するベクターとの相同組換えによる、マウスＡＰＰ遺伝子の遺伝子改変の図である。この組換えの結果として、エキソン９中の組換え位置を越える、常在性マウス染色体ＡＰＰ遺伝子中の配列は、類似のヒト配列で置換される。
【図１】
2004089187.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年8月19日(2003.8.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
図面の簡単な説明
図の枠で囲んだ部分は、構築物のアミノ酸コード部分を示す。模様部分（ｆｉｌｌｅｄ　ｐｏｒｔｉｏｎ）は、図の註訳部分に示されているように、タンパク質の種々の領域を示す。線は、ゲノム配列に隣接する、５´あるいは３´非翻訳配列、フランキングゲノム配列またはイントロンである、クローン中の配列を示す。図７および８おいて、構築物の左側の先の省略部分は、長いＤＮＡ配列が存在することを示す。
【図１】図１ａは、ＡＰＰ　７７０　ｃＤＮＡコード配列の図である。
図１ｂは、７１７位での変異を有する、ＡＰＰ　７７０　ｃＤＮＡコード配列の図である。
【図２】図２ａは、ＡＰＰ　７５１　ｃＤＮＡコード配列の図である。
図２ｂは、７１７位での変異を有する、ＡＰＰ　７５１　ｃＤＮＡコード配列の図である。
【図３】図３ａは、ＡＰＰ　６９５コード配列の図である。
図３ｂは、７１７位での変異を有する、ＡＰＰ　６９５　ｃＤＮＡコード配列の図である。
【図４】図４ａは、ＡＰＰのカルボキシ末端部分のコード配列の図である。
図４ｂは、７１７位での変異を有する、ＡＰＰのカルボキシ末端部分のコード配列の図である。
【図５】図５は、ＡＰＰのβペプチド部分のコード配列の図である。
【図６】図６ａは、ＫＩおよびＯＸ２エキソンの代替スプライシングを可能にする、組み合せゲノム／ｃＤＮＡコード配列の図である。
図６ｂは、７１７位での変異を有し、ＫＩおよびＯＸ２エキソンの代替スプライシングを可能にする、組み合せゲノム／ｃＤＮＡコード配列の図である。
【図７】図７ａは、ヒトＡＰＰ　ＹＡＣコード配列の図である。
図７ｂは、７１７位での変異を有する、ヒトＡＰＰ　ＹＡＣコード配列の図である。
【図８】図８は、マウスＥＳ細胞中のマウスＡＰＰ遺伝子と、遺伝子のエキソン９部分に対するヒトＡＰＰ　ｃＤＮＡ（野生型あるいはＦＡＤ変異型のいずれか）を有するベクターとの相同組換えによる、マウスＡＰＰ遺伝子の遺伝子改変の図である。この組換えの結果として、エキソン９中の組換え位置を越える、常在性マウス染色体ＡＰＰ遺伝子中の配列は、類似のヒト配列で置換される。


【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
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