(57)【要約】【課題】Ｒｈマイナスの判定に用いる核酸プローブおよびプライマーの提供。【解決手段】ヒトＲＨＤ遺伝子における、第９エクソン中の３’末端に存在するグアニン残基（Ｇ）の他のヌクレオチドへの変異を検出しうる核酸分子であって、ヒトＲＨＤ遺伝子のヌクレオチド配列において前記変異を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＲＨＤ遺伝子における、第９エクソン中の３’末端に存在するグアニン残基（Ｇ）の他のヌクレオチドへの変異を検出しうる核酸分子であって、
ヒトＲＨＤ遺伝子のヌクレオチド配列において前記変異を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列において、第１２２７番目のグアニン残基（Ｇ）が他のヌクレオチドに置換された配列を含んでなるポリヌクレオチドである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記他のヌクレオチドがアデニン残基（Ａ）である、請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチド、またはこれに相補的なポリヌクレオチドの、第９エクソン中の３’末端のヌクレオチドを含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドの、第９エクソン中の３’末端のヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６】
Ｒｈマイナスの判定に用いるための、請求項１〜５に記載の核酸分子。
【請求項７】
ヒトＲＨＤ遺伝子における、第９エクソン中の３’末端に存在するグアニン残基（Ｇ）の他のヌクレオチドへの変異を検出しうるプライマーペアであって、
ヒトＲＨＤ遺伝子のヌクレオチド配列において前記変異を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの、第９エクソン中の３’末端のヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、プライマーペア。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列において、第１２２７番目のグアニン残基（Ｇ）が他のヌクレオチドに置換された配列を含んでなるポリヌクレオチドである、請求項７に記載のプライマーペア。
【請求項９】
前記他のヌクレオチドがアデニン残基（Ａ）である、請求項７または８に記載のプライマーペア。
【請求項１０】
Ｒｈマイナスの判定に用いるための、請求項７〜９に記載のプライマーペア。
【請求項１１】
ヒトＲＨＤ遺伝子の変異を検出することによりＲｈマイナスを判定する方法であって、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項７〜１０のいずれか一項に記載のプライマーペアを用いて、ヒトＲＨＤ遺伝子における、第９エクソン中の３’末端に存在するグアニン残基（Ｇ）の他のヌクレオチドへの変異を検出する工程を含んでなる、方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項７〜１０のいずれか一項に記載のプライマーペアを含んでなる、Ｒｈマイナスの判定用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、Ｒｈマイナスの判定法に関するものである。更に詳細には、ヒトＲＨＤ遺伝子のエクソン９の変異を検出することを特徴とするＲｈマイナスの判定法に関するものである。
【０００２】
背景技術
Ｒｈ抗原は、ｔａｉｌ　ｔｏ　ｔａｉｌでつながったヒトＲＨＤ遺伝子とＲＨＣＥ遺伝子とによりコードされ、ヒトＲＨＤ遺伝子からはＲｈＤまたはＲｈｄ抗原が、ＲＨＣＥ遺伝子からはＲｈＣｅ、Ｒｈｃｅ、ＲｈｃＥ、またはＲｈＣＥ抗原がそれぞれ発現する。
【０００３】
これらのうち、Ｒｈｄは、ＲｈＤ抗原陰性を意味し、一般にＲｈマイナスと呼ばれている。Ｒｈマイナスは欧米の白人に高頻度に存在するが、日本人ではわずか０．６％といわれている。
【０００４】
ＲｈＤ抗原は免疫原性が非常に強く、ＲｈプラスのヒトからＲｈマイナスのヒトへの不適合輸血を行なうと、約８割のヒトにおいて抗体が産生するといわれており、これにより溶血性副作用が生じる。従って、このような不適合輸血は避けなければならない。また、Ｒｈマイナスの母親がＲｈプラスの子を妊娠した後に再度Ｒｈプラスの子を妊娠した場合（母児間不適合）、母親の体内において生産されている抗Ｄ抗体により、第二の子において胎児溶血性疾患が生ずることが知られている。この胎児溶血性疾患は、第一の子を出産した後に、母親にＲｈγグロブリンを注射することによって防止することができる。従って、医学の分野においては、Ｒｈマイナスを判定することは重要な意義を有する。
【０００５】
Ｒｈマイナスを判定する方法としては、血清学的検査法が知られている。しかし、血清学的検査法では、反応が弱い、あるいは用いる抗体により反応特性が異なるなどの理由から、必ずしも正確にＲｈマイナスを判定できるとは限らない。すなわち、ＲｈＤ抗原性は、互いに独立した幾つかのアミノ酸またはそのつながりにより生じているが、これらのアミノ酸またはその周辺に変異がある場合には、ポリクローナル抗体を用いた検査では反応が弱くなることがあり、モノクローナル抗体を用いた検査ではＲｈプラスと判定されるべき検体がＲｈマイナスと判定されることがある。
【０００６】
また、正確かつ迅速な診断法としては、遺伝子診断が考えられる。かつては、Ｒｈマイナスの多くはヒトＲＨＤ遺伝子欠損によると考えられていた。白人に関してはこのことがほぼ当てはまるため、ヒトＲＨＤ遺伝子の有無によってＲｈマイナスを判定することが可能であるかもしれない。しかし、Ｒｈマイナスの日本人のうち、約３０％（ＲｈＣプラス−Ｒｈマイナスのうち約７０％）がヒトＲＨＤ遺伝子を持っていることが報告されている（Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　１００，　３７３−３７９，１９９７）。このため、日本人に関しては、ヒトＲＨＤ遺伝子の有無を調べるだけではＲｈプラス／マイナスを確定できない。
【０００７】
一方で、Ｒｈ抗原に関する遺伝子診断法はいくつか開発されているが（Ｐ．Ａ．　Ｍａａｓｋａｎｔ−ｖａｎ　Ｗｉｊｋ，　Ｂ．Ｈ．Ｗ．　Ｆａａｓ，　Ｊ．Ａ．Ｍ．　ｄｅ　Ｒｕｉｊｔｅｒ，　Ｍ．Ａ．Ｍ．　Ｏｖｅｒｂｅｅｋｅ，　Ａ．Ｅ．Ｇ．Ｋｒ．　ｖｏｎ　ｄｅｍ　Ｂｏｒｎｅ，　Ｄ．Ｊ．　ｖａｎ　Ｒｈｅｎｅｎ，　ａｎｄ　Ｃ．Ｅ．　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｓｃｈｏｏｔ　（１９９８）　Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　ｏｆ　ＲＨＤ　ｂｙ　ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｓｉｘ　ＲＨＤ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｘｏｎｓ，　Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ　３８，　１０２１−１０５１；　Ｔ．Ｊ．　Ｌｅｇｌｅｒ，　Ｊ．Ｈ．　Ｍａａｓ，　Ｖ．　Ｂｌａｓｃｈｋｅ，　Ｍ．　Ｍａｌｅｋａｎ，　Ｈ．　Ｏｈｔｏ，　Ｒ．　Ｌｙｎｅｎ，　Ｎ．　Ｂｕｓｔａｍｉ，　Ｄ．Ｗ．Ｍ．　Ｓｃｈｗａｒｔｚ，　Ｗ．Ｒ．　Ｍａｙｒ，　Ｍ．　Ｋｏｈｌｅｒ，　ａｎｄ　Ｓ．　Ｐａｎｚｅｒ　（１９９８）　ＲＨＤ　ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　ｉｎ　ｗｅａｋ　Ｄ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｂｙ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，　Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ　３８，　４３４−４４０）、Ｒｈマイナスの判定を可能とする技術は報告されていない。
【０００８】
従って、遺伝子レベルでＲｈマイナスを正確に判定するための方法の開発が望まれている。
【０００９】
【発明の概要】
本発明者らは、ヒトＲＨＤ遺伝子上の、第９エクソン中の３’末端に存在するグアニン残基（Ｇ）の他のヌクレオチドへの変異が、Ｒｈマイナスの遺伝子診断に利用可能であることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【００１０】
従って、本発明は、Ｒｈマイナスの判定に用いるための核酸分子およびプライマーペア、診断用キット、ならびにＲｈマイナスの判定方法の提供を目的とする。
【００１１】
そして、本発明による核酸分子は、ヒトＲＨＤ遺伝子における、第９エクソン中の３’末端に存在するグアニン残基（Ｇ）の他のヌクレオチドへの変異を検出しうる核酸分子であって、ヒトＲＨＤ遺伝子のヌクレオチド配列において前記変異を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる核酸分子である。
【００１２】
さらに、本発明によるプライマーペアは、ヒトＲＨＤ遺伝子における、第９エクソン中の３’末端に存在するグアニン残基（Ｇ）の他のヌクレオチドへの変異を検出しうるプライマーペアであって、ヒトＲＨＤ遺伝子のヌクレオチド配列において前記変異を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの、第９エクソン中の３’末端のヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅することができるプライマーペアである。
【００１３】
さらに、本発明によるＲｈマイナスの判定方法は、ヒトＲＨＤ遺伝子の変異を検出することによりＲｈマイナスを判定する方法であって、本発明による核酸分子および／または本発明によるプライマーペアを用いて、ヒトＲＨＤ遺伝子における、第９エクソン中の３’末端に存在するグアニン残基（Ｇ）の他のヌクレオチドへの変異を検出する工程を含んでなる方法である。
【００１４】
さらに、本発明によるキットは、本発明による核酸分子および／または本発明によるプライマーペアを含んでなる、Ｒｈマイナスの判定用キットである。
【００１５】
【発明の具体的説明】
本発明によれば、ヒトＲＨＤ遺伝子における、エクソン９の３’末端に存在するグアニン残基（Ｇ）の他のヌクレオチドへの変異（本明細書において「Ｇ１２２７Ｈ変異」という）を検出することができる。前記他のヌクレオチドは、グアニン残基（Ｇ）以外のヌクレオチド（本明細書において「Ｈ」ということがある）であり、例えば、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）またはシトシン（Ｃ）であり、好ましくはアデニン（Ａ）である。
【００１６】
ヒトＲＨＤ遺伝子はヒトの第１染色体上に位置し、１０個のエクソンを含んでいる。さらに、ヒトＲＨＤ遺伝子のヌクレオチド配列も決定されており、特に、そのエクソン１〜１０を含むｃＤＮＡ配列を配列番号１に示す（Ａｒｃｅ，　Ｍ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９３）　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ＲｈＤ　ｃＤＮＡ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ａ　ｇｅｎｅ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ｉｎ　ＲｈＤ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ，　ｂｕｔ　ｎｏｔ　ＲｈＤ−ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ，　Ｂｌｏｏｄ　８２（２），　６５１−６５５；ＮＣＢＩデータベースアクセス番号：Ｌ０８４２９）。配列番号１で表されるヌクレオチド配列において、エクソン１は第１〜１４８番残基、エクソン２は第１４９〜３３５番残基、エクソン３は第３３６〜４８６番残基、エクソン４は第４８７〜６３５番残基、エクソン５は第６３６〜８０１番残基、エクソン６は第８０２〜９３９番残基、エクソン７は第９４０〜１０７３番残基、エクソン８は第１０７４〜１１５３番残基、エクソン９は第１１５４〜１２２７番残基、エクソン１０は第１２２８〜１２５４番残基に位置する。ここで、本発明により検出されるＧ１２２７Ｈ変異は、配列番号１中では第１２２７塩基に位置する。参考までに、この変異部位の周辺のヌクレオチド配列を図１に示す。図１において、実線で囲まれた部分がエクソン９の配列である。Ｇ１２２７Ｈ変異は、このエクソン９の３’末端に存在するグアニン残基（Ｇ）（図１Ａ）が、他のヌクレオチド、好ましくはアデニン残基（Ａ）（図１Ｂ）に変異するものである。
【００１７】
本発明に従ってＧ１２２７Ｈ変異が検出された場合には、ＲｈＤ抗原が生産されず、従って、その被検者のＲｈ式血液型がＲｈマイナスであると判定することができる。これは、この変異により、ヒトＲＨＤ遺伝子が発現する際にエクソン９が欠失するためと考えられる。
【００１８】
また、被検者がヒトＲＨＤ遺伝子を有していない場合にも、ＲｈＤ抗原が生産されず、よって、その被検者のＲｈ式血液型がＲｈマイナスであると判定することができる。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、本発明に従ってＧ１２２７Ｈ変異の検出を行なう前に、または同時に、ヒトＲＨＤ遺伝子欠損の検出が行なわれる。これにより、ヒトＲＨＤ遺伝子欠損が検出された場合には被検者のＲｈ式血液型がＲｈマイナスであると判定することができ、ヒトＲＨＤ遺伝子欠損が検出されない場合であっても、Ｇ１２２７Ｈ変異が検出された場合には、同様に、被検者のＲｈ式血液型がＲｈマイナスであると判定することができる。ヒトＲＨＤ遺伝子欠損の検出は、例えば、ヒトＲＨＤ遺伝子に特異的なヌクレオチド配列を有するプローブまたはプライマーを用いて、当業者に公知の方法、例えば、サザンハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法等によって行なうことができる。ヒトＲＨＤ遺伝子欠損の検出に関しては、例えば、Ｃｏｌｉｎ　Ｙ．，　Ｃｈｅｒｉｆ−ＺａｈａｒＢ．，　Ｌｅ　Ｖａｎ　Ｋｉｍ　Ｃ．，　Ｒａｙｎａｌ　Ｖ．，　Ｖａｎ　Ｈｕｆｆｅｌ　Ｖ．，　Ｃａｒｔｒｏｎ　Ｊ−Ｐ　（１９９１）　Ｇｅｎｅｔｉｃｂａｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＲｈＤ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ａｎｄ　ＲｈＤ−ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｂｌｏｏｄ　ｇｒｏｕｐ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ，　Ｂｌｏｏｄ　７８，　２７４７−２７５２を参照されたい。また、本発明の別の好ましい実施態様によれば、本発明によるＧ１２２７Ｈ変異の検出は、ＲＨＤ遺伝子を有することが判明したヒト被検者に対して行なわれる。
【００１９】
本発明による核酸分子は、ヒトＲＨＤ遺伝子のヌクレオチド配列において前記変異を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。本発明の別の態様によれば、ヒトＲＨＤ遺伝子のヌクレオチド配列において前記変異を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。
【００２０】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明による核酸分子がストリンジェントな条件下で標的ヌクレオチド分子にハイブリダイズし、標的ヌクレオチド分子以外のヌクレオチド分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明による核酸分子とその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｅ．　Ｆ．　Ｆｒｉｓｃｈ，　Ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉｓ；　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８９）等を参照することができる。例えば、使用する核酸分子の融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、核酸分子を標的ヌクレオチド分子に特異的にハイブリダイズさせることができる。本発明の好ましい実施態様によれば、あるポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子は、そのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの全部または一部の配列を含んでなるものとする。
【００２１】
本発明において「核酸分子」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）を含む意味で用いられる。本発明の好ましい実施態様によれば、核酸分子はＤＮＡである。
【００２２】
ヒトＲＨＤ遺伝子のヌクレオチド配列においてＧ１２２７Ｈ変異を有するヌクレオチド配列を含む上記ポリヌクレオチドは、前記変異を有するヒトＲＨＤ遺伝子のゲノムＤＮＡとすることができる。前記ゲノムＤＮＡは、前記変異を有するヒトＲＨＤ遺伝子の全エクソン（エクソン１〜１０）および全イントロン（イントロン１〜９）を含むものであることが好ましく、そのエクソン１〜１０のヌクレオチド配列としては、例えば、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列において、第１２２７番目のグアニン（Ｇ）残基が他のヌクレオチドに置換された配列が挙げられる。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、上記ポリヌクレオチドは、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列において、第１２２７番目のグアニン（Ｇ）残基が他のヌクレオチドに置換された配列を含んでなるポリヌクレオチドとされる。前記他のヌクレオチドは、例えば、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）またはシトシン（Ｃ）であり、好ましくはアデニン（Ａ）である。
【００２３】
本発明による核酸分子のヌクレオチド配列は、当業者により適宜設計されうる。例えば、本発明による核酸分子は、エクソンにハイブリダイズする部分だけでなく、イントロンにハイブリダイズする部分をも含むことができ、あるいは、これらのどちらか一方のみにより構成されていてもよい。
【００２４】
本発明による核酸分子は、ヒトＲＨＤ遺伝子におけるＧ１２２７Ｈ変異の検出において、核酸プローブとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、上記ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、第９エクソン中の３’末端のヌクレオチドを含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなることが好ましい。
【００２５】
本発明による核酸分子を核酸プローブとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１０〜１００ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜５０ヌクレオチドとする。
【００２６】
また、本発明による核酸分子は、ヒトＲＨＤ遺伝子におけるＧ１２２７Ｈ変異の検出において、核酸増幅用プライマーとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、上記ポリヌクレオチドの、第９エクソン中の３’末端のヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものであることが好ましい。
【００２７】
本発明による核酸分子を核酸増幅用プライマーとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１０〜５０ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜３０ヌクレオチドとする。
【００２８】
本発明の別の好ましい実施態様によれば、本発明による核酸分子の鎖長は、１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド、さらに好ましくは１８〜５０ヌクレオチドとする。このような鎖長を有する本発明による核酸分子は、特に夾雑物を含む核酸試料において、上記Ｇ１２２７Ｈ変異を検出する上で好ましいものである。
【００２９】
核酸増幅法は、多くの場合、プライマーのペアを用いて実施される。従って、本発明によれば、ヒトＲＨＤ遺伝子におけるＧ１２２７Ｈ変異を検出しうるプライマーペアが提供され、前記プライマーペアは、ヒトＲＨＤ遺伝子のヌクレオチド配列において前記変異を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの、第９エクソン中の３’末端のヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものである。このようなプライマーペアを構成する２本のプライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができる。このようなプライマーは、増幅の対象となる領域のヌクレオチド配列に基づいて当業者が適宜設計することができる。例えば、プライマーペアの一方のプライマーを、増幅対象領域のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとし、他方のプライマーを、増幅対象領域の相補鎖のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとすることができる。
【００３０】
本発明によるプライマーペアのヌクレオチド配列は、当業者であれば適宜決定することが出来るため、特に限定されないが、例えば、以下に示す配列とすることができる：
Ｅ９ＤＦ：　５’−ＡＡＴ　ＡＴＧ　ＧＡＡ　ＡＧＣ　ＡＣＣ　ＴＣＡ　ＴＧＡ−３’（配列番号４）；
Ｉ９ＤＲ：　５’−ＴＡＣ　ＴＣＡ　ＴＡＡ　ＡＣＡ　ＧＣＡ　ＡＧＴ　ＣＡＡ　ＣＡ−３’（配列番号５）。
【００３１】
本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアを用いることにより、ヒトＲＨＤ遺伝子におけるＧ１２２７Ｈ変異を検出することができ、これにより、Ｒｈマイナスを判定することができる。上記の検出の結果、被検者からのＲＨＤ遺伝子がＧ１２２７Ｈ変異を有する場合には、その被検者のＲｈ式血液型がＲｈマイナス型であると判断することができる。
【００３２】
また、Ｇ１２２７Ｈ変異部位におけるＨアレルを有する場合の遺伝子型としてはＨ／ＧおよびＨ／Ｈが考えられるが、被検者がＨ／Ｇを有する場合よりもＨ／Ｈを有する場合の方が、より確実にＲｈマイナスを判定することができる。従って、本発明の好ましい態様によれば、本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアを用いて、ヒトＲＨＤ遺伝子におけるＧ１２２７Ｈ変異部位の遺伝子型を同定する工程を含んでなる、Ｒｈマイナスを判定する方法が提供される。
【００３３】
さらに、被検者のＲｈ式血液型がＲｈマイナス型であるということは、同時に、その被検者がＲｈＤ抗原を有さないということをも意味する。従って、Ｒｈマイナスの判定法は、ＲｈＤ抗原の不存在を判定する方法でもある。ここで、「ＲｈＤ抗原が存在しない」とは、ＲｈＤ抗原タンパク質が全く生産されないことのみならず、実質的なＲｈＤ抗原の機能を有さないタンパク質しか生産されないこと、例えば、ＲｈＤタンパク質の一部が欠失するか、またはＲｈＤタンパク質がＲｈＣＥタンパク質と部分的に組み変わること等により、生産されたタンパク質がＲｈＤ抗原性を失っていることをも意味するものとする。
【００３４】
具体的には、本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアは、ヒトＲＨＤ遺伝子におけるＧ１２２７Ｈ変異を検出するための核酸増幅法においてプライマーとして用いることができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて、被検者由来の核酸試料を鋳型とする核酸増幅法を行ない、得られた増幅産物中においてＧ１２２７Ｈ変異を検出する工程を含んでなる、Ｒｈマイナスの判定法が提供される。
【００３５】
この方法による診断に当たっては、例えば、被験者から血液等の試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡ等の核酸試料を抽出し、得られた核酸試料を鋳型として、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施し、得られた増幅産物のヌクレオチド配列を解析することにより、ヒトＲＨＤ遺伝子におけるＧ１２２７Ｈ変異を検出することができる。核酸増幅法およびこれによる前記変異の検出法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、核酸増幅法としてはＰＣＲ法等を用いることができる。
【００３６】
核酸増幅法により得られた増幅産物のヌクレオチド配列の解析は、例えば、シークエンス用プライマーを用いるダイレクトシークエンス法等により容易に行なうことができる。このような方法は当技術分野において周知であり、例えば、市販のキットを用いて実施することができる。
【００３７】
本発明によるＲｈマイナス判定法においては、アレル特異的ＰＣＲ法を実施できるようにプライマーを設計することもできる。具体的には、一方のプライマーを変異部位に対合できるように設計し、他方のプライマーを変異部位を含まない領域に対合できるように設計することができる。このように設計されたプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施すると、核酸試料中に前記変異部位にかかるいずれかのアレルが存在する場合には増幅産物が得られ、これが存在しない場合には増幅産物が得られない。従って、この場合には、増幅産物の有無を検出することにより特定のアレルの有無を判定することができる。
【００３８】
本発明による核酸分子は、ハイブリダイゼーション法等によるヒトＲＨＤ遺伝子におけるＧ１２２７Ｈ変異の検出にプローブとして用いることができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子と被検者由来の核酸試料とのハイブリダイゼーションを行ない、次いでハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する工程を含んでなる、Ｒｈマイナスの判定法が提供される。ハイブリダイゼーション複合体の存在は、ヒトＲＨＤ遺伝子におけるＧ１２２７Ｈ変異部位にかかるいずれかのアレルの存在を示す。このハイブリダイゼーション法を用いる方法は、上述の核酸増幅法を用いる方法により得られる増幅産物に対して適用することもできる。
【００３９】
この方法による診断に当たっては、例えば、被検者から血液等の試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡ等の核酸試料を抽出し、ストリンジェントな条件下、本発明による核酸分子とのハイブリダイゼーションの有無を検出することにより、ヒトＲＨＤ遺伝子におけるＧ１２２７Ｈ変異を検出することができる。核酸試料は、必要であれば制限酵素処理等を施し、ハイブリダイゼーションに適切な長さとすることもできる。ハイブリダイゼーション法とこれによる前記変異の検出法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の技術を用いることができ、これらの方法については、例えば、Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｅ．　Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，　Ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉｓ；　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８９）を参照することができる。
【００４０】
ヒトＲＨＤ遺伝子におけるＧ１２２７Ｈ変異を検出する場合には、また、本発明による核酸分子をプライマーとして使用するプライマーエクステンション法を用いることもできる。プライマーエクステンション法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記のプライマーエクステンション法としては、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法またはＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法として知られる方法が用いられる。
【００４１】
ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法においては、一塩基変異の部位に隣接するプライマーであって、伸長反応によりその３’末端に付加するヌクレオチドが前記一塩基変異の部位に相補的なものとなるプライマーが用いられる。このようなプライマーを使用し、被検者からの核酸試料を鋳型としてプライマーの伸長反応が行なわれるが、その際にｄｄＮＴＰ（ジデオキシＮＴＰ）を用いることにより、伸長反応は、上記の変異部位に対応する一個のヌクレオチドを取り込んだ時点で終了する。取り込まれたヌクレオチドは、蛍光標識等で予め標識しておくことにより容易に同定され、従って、変異部位のヌクレオチドが同定される。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００４２】
Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法においては、被検者からの核酸試料を鋳型とするプライマーの伸長反応の際に、４種のｄＮＴＰを１種ずつ反応させる。ｄＮＴＰのいずれかが取り込まれると、等量のピロリン酸塩（ＰＰｉ）が遊離し、遊離したＰＰｉはスルフリラーゼと反応してＡＴＰを生成させ、このＡＴＰによりルシフェラーゼの反応が起こり、発光が起こる。従って、ある特定のｄＮＴＰを加えたときに発光が起こった場合には、そのｄＮＴＰに対応するヌクレオチドが取り込まれたことが明らかとなり、これにより核酸試料中の対象部位のヌクレオチドが同定される。この方法においては、ｄＮＴＰが用いられるため、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法で用いられるような変異部位に隣接するプライマーを用いる必要はなく、数塩基はなれたプライマーを用いてもよい。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００４３】
ヒトＲＨＤ遺伝子におけるＧ１２２７Ｈ変異部位における遺伝子型を決定する場合には、さらに、本発明による核酸分子をプローブおよび／またはプライマーとして使用する遺伝子型決定法（タイピング法）を用いることもできる。遺伝子型決定法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプローブおよび／またはプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記の遺伝子型決定法としては、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法として知られる方法が用いられる。
【００４４】
ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法においては、Ｇ１２２７Ｈ変異部位のヌクレオチドを含む領域に対して、ＧアレルおよびＨアレル（例えば、Ａアレル、Ｃアレル、Ｔアレルなど）のそれぞれに特異的にハイブリダイズする２種のプローブであって、それぞれ別の蛍光標識物質が５’末端に付され、その蛍光標識に対するクエンチャー（消光物質）が３’末端に付され、さらに３’末端がリン酸化されてなるプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）が用いられ、これらをＰＣＲ反応液中に添加して、被検者由来の核酸試料を鋳型とするＰＣＲ反応を行なう。ＴａｑＭａｎプローブおよびＰＣＲ用のプライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができ、それらの具体的なヌクレオチド配列は、当業者であれば適宜決定することができるため、特に制限されない。
【００４５】
また、２種の蛍光標識物質は、互いに識別可能な組合せであればよく、そのような蛍光標識物質の組合せはそれぞれのクエンチャーとともに当業者に公知のものを用いることができるが、好ましくはＦＡＭとＶＩＣの組合せを用いる。このＰＣＲ反応においては、まず、各アレルにＴａｑＭａｎプローブがハイブリダイズし、プライマーからの伸長反応がそのハイブリダイゼーション領域に到達した際にＴａｑＤＮＡポリメラーゼの作用によって蛍光標識物質が遊離する。遊離した蛍光標識物質はクエンチャーの作用を受けないため、蛍光を発する。従って、この方法によれば、各アレルの存在量に対応する強度の各蛍光を観察することができ、これにより、被検者の遺伝子型（Ｇ／Ｇ、Ｇ／Ｈ、またはＨ／Ｈ）が容易に決定される。
【００４６】
本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアを用いることによりＧ１２２７Ｈ変異を検出するためには、上述の方法のみならず、遺伝子変異の検出法として一般に知られている種々の方法を利用できる。このような方法としては、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＯ法（Ｓａｉｋｉ，　Ｒ．　Ｋ．，　（１９８６）：　Ｎａｔｕｒｅ，　３２４，ｐ１６３−１６６．）、　ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法（Ｏｋａ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９４）：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，ｐ１５４１−１５４７．）、　ＰＣＲ−ＳＢＴ法（Ｉｎｎｉｓ，　Ｍ．　Ａ．，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９８８）：　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　，　８５，　ｐ９４３６−９４４０．）、　ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Ｏｒｉｔａ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９８９）：　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　５，　ｐ８７４−８７９．）、ＰＣＲ−ＯＬＡ法（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ，Ｄ．　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９０）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，８７，　ｐ８９２３−８９２７．）のように、ＰＣＲを利用して目的核酸を増幅した後検出する方法、ＰＣＲで目的核酸が増幅されるかどうかで検出する方法（Ｓａｉｋｉ，　Ｒ．　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９８５）：　Ａｍ．　Ｊ．　Ｈｕｍ．　Ｇｅｎｅｔ．　３７，　ｐ１７２．）、ＰＣＲ以外の方法で目的核酸を増幅した後にこれを検出する方法（　ＬＡＲ（Ｌｉｇａｓｅ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）；Ｗｕ，　Ｄ．　Ｙ．　ａｎｄ　Ｗａｌｌａｃｅ，　Ｒ．　Ｂ．（１９８９）：　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　４，　ｐ５６０−５６９．）等が挙げられる。
【００４７】
上記の方法において、ヒトＲＨＤ遺伝子におけるＧ１２２７Ｈ変異を有すると評価されたサンプル、特にこの変異部位における遺伝子型がＨ／Ｈであると評価されたサンプルは、そのＲｈ式血液型がＲｈマイナスであると判定することができ、同時にＲｈＤ抗原が存在しないと判定することができる。また、本発明によれば、出生前および出生直後の判定も可能である。
【００４８】
以上のようなＲｈマイナス判定（ＲｈＤ抗原不存在の判定）のために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、本発明によるキットは、本発明による核酸分子および／または本発明によるプライマーペアを含んでなる。本発明によるキットはさらに、ヒトＲＨＤ遺伝子におけるＧ１２２７Ｈ変異を検出するための具体的方法に応じて、試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。
【００４９】
【実施例】
例１：Ｒｈマイナス検体における遺伝子解析
Ｒｈマイナス型血液からのバフィーコートから網状赤血球を分離し、これから抽出したｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。このｃＤＮＡ試料を鋳型として用い、ヒトＲＨＤ遺伝子とＲＨＣＥ遺伝子に共通な５’及び３’非翻訳領域に設定したプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行うと、選択的スプライシングに起因すると思われる数本のバンドが得られた（図２）。
【００５０】
完全なＲＨ遺伝子の増幅産物のサイズは約１．３ｋｂであることから、２検体についてこのサイズのフラグメントをクローニングして塩基配列を解析したところ、１．３ｋｂのフラグメントからはＲＨＣＥ遺伝子由来の配列のみが得られ、ヒトＲＨＤ遺伝子由来の配列は得られなかった。
【００５１】
次いで、更に短いフラグメントを解析したところ、ヒトＲＨＤ遺伝子由来の配列は得られたが、いずれもエクソン９、エクソン７＋９またはエクソン８＋９が欠失していた。
【００５２】
このように、ｃＤＮＡ試料からの増幅産物においてヒトＲＨＤ遺伝子のエクソン９の欠失が共通して見られたことから、エクソン９のスプライシングシグナルの変異の可能性に着目し、ＲＨＤ遺伝子のエクソン９からイントロン９までを特異的に増幅するプライマー：
Ｅ９ＤＦ：　５’−ＡＡＴ　ＡＴＧ　ＧＡＡ　ＡＧＣ　ＡＣＣ　ＴＣＡ　ＴＧＡ−３’（配列番号４）；
Ｉ９ＤＲ：　５’−ＴＡＣ　ＴＣＡ　ＴＡＡ　ＡＣＡ　ＧＣＡ　ＡＧＴ　ＣＡＡ　ＣＡ−３’（配列番号５）
を用い、Ｒｈマイナス検体から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、得られた増幅産物の塩基配列をダイレクトシークエンス法により解析した（図３）。
【００５３】
その結果、ヒトＲＨＤ遺伝子を有するがＲｈマイナスを示す（ＲｈＤ−ＲＨＤ＋）３２検体のうち、２８検体において、エクソン９の３’末端のグアニン残基（Ｇ）がアデニン残基（Ａ）に変異していることが明らかとなった。また、ｃＤＮＡ試料においてエクソン９の欠失が見られた上記２検体についても、同様の変異が確認された。
【００５４】
以上のことより、ヒトＲＨＤ遺伝子のエクソン９における３’末端の変異を検出すれば、Ｒｈマイナスを判定できることが明らかとなった。
【００５５】
エクソンの３’末端の変異については、赤血球膜に存在するグリコホリン上の抗原（ＭＮ型抗原系）をコードする遺伝子に、上記と同様にＧ→Ａ変異が見つかっており、この変異によりスプライシング効率が下がり、エクソン欠失が起きることが報告されている（Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２６８，　２５９０２−２５９０８，　１９９３）。上記の場合も同様に、エクソン９の欠失が起こっているものと推察される。
【００５６】
【配列表】
2004089057.tif 000002
2004089057.tif 000003
2004089057.tif 000004
2004089057.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】ＲｈＤプラス遺伝子（Ａ）およびＲｈＤマイナス遺伝子（Ｂ）のイントロン８、エクソン９、及びイントロン９の配列を示す図である。
【図２】ＲＨ−ｃＤＮＡ全長をＲＨ特異的プライマーでＰＣＲ増幅して得られたフラグメントのアクリルアミドゲル電気泳動パターンを示す図である。
【図３】エクソン９の３’末端のＧ→Ａ変異を示すシークエンスデータを表す図である。
【図１】
2004089057.tif 000006
【図２】
2004089057.tif 000007
【図３】
2004089057.tif 000008