(57)【要約】【課題】本発明は、生体刺激存在下で蛋白質を発現する方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明の方法は、生体刺激の存在下においてそのｍＲＮＡがフレームシフトする遺伝子（刺激応答遺伝子）、並びに標的蛋白質をコードする遺伝子の融合遺伝子発現ベクターを、細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体に導入することを含み、ここにおいて、前記刺激応答遺伝子と標的蛋白質遺伝子はベクター内において、生体刺激の存在する場合にのみ、当該刺激応答遺伝子のｍＲＮＡがフレームシフトして両遺伝子の読み枠が一致するように配置されている。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体刺激の存在下においてそのｍＲＮＡがフレームシフトする遺伝子（刺激応答遺伝子）、並びに標的蛋白質をコードする遺伝子の融合遺伝子発現ベクターを、細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体に導入することを含む、生体刺激存在下で融合蛋白質を発現する方法であって、ここにおいて、前記刺激応答遺伝子と標的蛋白質遺伝子はベクター内において、生体刺激の存在する場合にのみ、当該刺激応答遺伝子のｍＲＮＡがフレームシフトして両遺伝子の読み枠が一致するように配置されている、前記方法。
【請求項２】
前記標的蛋白質が蛍光蛋白質であり、前記細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体において蛍光を測定して生体刺激を検出する、ことを含む前記方法。
【請求項３】
前記生体内刺激が小胞体ストレスである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記刺激応答遺伝子がＸＢＰ１遺伝子である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
蛍光蛋白質が、緑色蛍光蛋白質若しくはその変異体である、請求項２ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法に使用するための、生体刺激の存在下においてそのｍＲＮＡがフレームシフトする遺伝子（刺激応答遺伝子）、並びに標的蛋白質をコードする遺伝子を含むベクター。
【請求項７】
請求項６のベクターを適当なアジュバントとともに含む、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法に使用するための試薬。
【請求項８】
生体刺激の存在下においてそのｍＲＮＡがフレームシフトする遺伝子（刺激応答遺伝子）、並びに標的蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターを、導入された細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体刺激存在下でのｍＲＮＡのフレームシフトを利用した蛋白質の発現方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
真核細胞において、小胞体ストレス状態（小胞体内の折り畳み異常蛋白質（ｕｎｆｏｌｄｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の蓄積を含む）はいくつかの適応応答を誘導する。これらの内の一つは折り畳み異常蛋白質応答（ＵＰＲ）であり、それは蛋白質折り畳み活性を増加させるため、および、小胞体内の折り畳み異常蛋白質の凝集を防ぐため、小胞体−局在シャペロンおよび折り畳み触媒をコード化している遺伝子の転写活性化を導いている１。ＵＰＲシグナリング経路は酵母でよく調べられている。
【０００３】
ＩＲＥ１およびＨＡＣ１は出芽酵母におけるＵＰＲのための必須分子である。ＩＲＥ１は小胞体に位置しているＩ型膜貫通蛋白質であり、セリン／スレオニン蛋白質キナーゼおよびＲＮａｓｅ　Ｌの相同域をカルボキシル末端に持っている。ＩＲＥ１のアミノ末端領域は小胞体内腔中の折り畳み異常蛋白質の蓄積を感知し、ＩＲＥ１のオリゴマー化およびトランス−自己リン酸化を導いている。最終的に、この分子はＨＡＣ１　ｍＲＮＡの非通常スプライシングを誘導する。スプライスされたＨＡＣ１　ｍＲＮＡは効率よく翻訳され、ＨＡＣ１蛋白質（転写因子）はＵＰＲの種々の標的遺伝子プロモーターを活性化する２。
【０００４】
哺乳動物ゲノムにおいては、酵母ＩＲＥ１の２つのホモログ、ＩＲＥ１α３およびＩＲＥ１β４が存在するが、ＨＡＣ１ホモログはいまだ同定されていない。しかしながら、哺乳動物ＩＲＥ１のリボヌクレアーゼドメインの切断標的としていくつかのＲＮＡ分子が同定されている。小胞体ストレス時に、各々のＩＲＥ１ｍＲＮＡはそれ自身のＩＲＥ１により切断され、および２８Ｓ　ｒＲＮＡはＩＲＥ１βにより切断される５，６。最近、Ｙｏｓｈｉｄａらは、小胞体ストレス条件下で、ＸＢＰ１　前駆体ｍＲＮＡがＩＲＥ１による非通常スプライシングの標的になることを報告している。ヒト細胞においては、ＸＢＰ１　ｍＲＮＡ領域５３１から５５６（２６ヌクレオチドのイントロン）が小胞体ストレス時にスプライスされ、ＸＢＰ１　ｍＲＮＡの“フレームシフト”を導いている。スプライスされたＸＢＰ１　ｍＲＮＡは成熟ＸＢＰ１蛋白質へ翻訳され、シス配列ＥＲＳＥ（小胞体ストレス応答エレメント）及びＵＰＲＥ（折り畳み異常蛋白質応答エレメント）を介して標的遺伝子の転写を誘導する。ＥＲＳＥ又はＵＰＲＥを介した転写は、ＢｉＰ、ＰＤＩ、ＧＲＰ９４等の小胞体シャペロン遺伝子群などの誘導に帰結する。
【０００５】
過度な小胞体ストレスは細胞死を誘導することが知られている。もし、小胞体ストレスに対する適応応答が十分でないならば、アポトーシス応答が開始され、哺乳動物細胞においてはＪＮＫおよびカスパーゼ７および１２の活性化を導く８−１０。神経変性疾患の研究において、小胞体ストレスおよびＵＰＲはアルツハイマー病およびパーキンソン病により起こる神経細胞死と密接に関係していることが報告されている１１，１２。小胞体ストレス応答のシグナリング分子は発生に必要であることも示されている１３。よって、小胞体ストレスおよび小胞体ストレス応答についての研究から、病理学および発生生物学ならびに細胞生物学に有用な情報が得られると期待される。ｉｎ　ｖｉｖｏでの小胞体ストレスを研究する第一段階として、小胞体ストレスを受けている細胞を可視化する方法を開発が重要である。
【０００６】
従来、小胞体ストレスの検出は、ある種の小胞体分子シャペロンの発現量を測定することによって行われている。具体的には、ＢｉＰやカルレティキュリンのｍＲＮＡの発現レベルをノザンブロット解析により放射活性で測定すること、あるいは、これらの分子をコードする遺伝子のプロモーター活性をルシフェラーゼ等のレポーター分子を測定することによって、小胞体ストレスの検出が行われている。しかしながら、これらの手法では細胞を溶解する工程を伴うため、固体レベルで小胞体ストレスを受けている組織学的領域を正確に特定できない。また、生細胞での小胞体ストレスの検出は不可能である。よって、これらの方法はｉｎｖｉｖｏで、リアルタイムでの小胞体ストレスの空間的および時間的変化についての十分な情報を提供しない。
【０００７】
また、ＢｉＰやカルレティキュリン遺伝子のプロモーター制御下に蛍光蛋白質のコード遺伝子をつなげた遺伝子発現コンストラクトを使用する方法も考えられる。この方法は培養細胞レベルで生細胞のまま小胞体ストレルを検出できるという利点を有するが、低感度であるため有用性が低いと考えられている。
【０００８】
一般に、小胞体ストレス以外の生体刺激についても、細胞を破壊することなく高感度に検出できる方法が希求される。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、生体刺激存在下で蛋白質を発現する方法を提供することを目的とする。本発明の方法は、生体刺激の存在下においてそのｍＲＮＡがフレームシフトする遺伝子（刺激応答遺伝子）、並びに標的蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターを、細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体に導入することを含み、ここにおいて、前記刺激応答遺伝子と標的蛋白質遺伝子はベクター内において、生体刺激の存在する場合にのみ、当該刺激応答遺伝子のｍＲＮＡがフレームシフトして両遺伝子の読み枠が一致するように配置されている。
【００１０】
本発明の方法は、好ましくは、例えば、前記標的蛋白質として蛍光蛋白質を適用することにより、前記細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体において蛍光を測定して、生体刺激の存在を検出するために使用可能である。生体内刺激としては、例えば小胞体ストレスが含まれる。
【００１１】
本発明はまた、前記蛋白質の発現方法に使用するための、生体刺激の存在下においてそのｍＲＮＡがフレームシフトする遺伝子（刺激応答遺伝子）、並びに標的蛋白質をコードする遺伝子の融合遺伝子発現ベクターを提供することを目的とする。
【００１２】
本発明はさらに、前記ベクターを適当なアジュバントとともに含む、前記方法に使用するための試薬を提供することを目的とする。
本発明はさらにまた、前記ベクターを、が導入された細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
上記問題の解決を目的として、本発明者らは鋭意研究に努めた結果、生体刺激の存在下においてそのｍＲＮＡがフレームシフトする遺伝子を利用して、生体刺激存在下のみ蛋白質を発現させる方法を構築し、本発明を想到した。
【００１４】
生体刺激存在下で蛋白質を発現する方法
よって、本発明は、生体刺激存在下で蛋白質を発現する方法を提供する。本発明の方法は、生体刺激の存在下においてそのｍＲＮＡがフレームシフトする遺伝子（刺激応答遺伝子）、並びに標的蛋白質をコードする遺伝子の融合遺伝子発現ベクターを、細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体に導入することを含み、ここにおいて、前記刺激応答遺伝子と標的蛋白質遺伝子はベクター内において、生体刺激の存在する場合にのみ、当該刺激応答遺伝子のｍＲＮＡがフレームシフトして両遺伝子の読み枠が一致するように配置されている、ことを特徴とする。
【００１５】
本発明の原理としては、以下の通りである。ベクターは、生体刺激の存在下においてそのｍＲＮＡがフレームシフトする遺伝子（刺激応答遺伝子）、並びに標的蛋白質をコードする遺伝子を含んでいる。刺激応答遺伝子のｍＲＮＡは、生体刺激の存在に応じたリボヌクレアーゼのスプライシングの標的である。スプライシングによって当該ｍＲＮＡにフレームシフトが生じると、標的蛋白質をコードする遺伝子との読み枠が一致し、刺激応答遺伝子のコードする蛋白質（刺激応答蛋白質）と、標的蛋白質との融合蛋白質が発現される。所期の生体刺激が存在しない場合にはフレームシフトが生ぜず、標的蛋白質との融合蛋白質は、刺激応答遺伝子との読み枠が一致しないため発現しない。よって、本願発明は、生体刺激の存在に応じて刺激応答遺伝子のｍＲＮＡのフレームシフトが生じることを利用して、刺激の存在下でのみ標的蛋白質を発現させることを特徴とする。
【００１６】
本明細書において、「生体刺激」とは特に限定されない。当該刺激に応じて、１ないしまたは複数のリボヌクレアーゼが発現し又は活性化し、特定のｍＲＮＡのスプライシングによって当該ｍＲＮＡにフレームシフトを生じさせるようなものが好ましい。限定されるわけではないが、小胞体ストレス等が挙げられる。特定の癌細胞では、ある遺伝子のｍＲＮＡにフレームシフトが生ずるが、正常組織では生じない、という場合には、このような癌の状態も本明細書における「生体刺激」に含まれる。
【００１７】
「生体刺激の存在下においてそのｍＲＮＡがフレームシフトする遺伝子」とは、生体刺激の存在下と非存在下でスプライシングの態様が異なり、結果、フレームシフトが生ずる遺伝子を言う。即ち、生体刺激の存在下と非存在下で、ｍＲＮＡの長さが異なり、塩基配列の長さの差が３の倍数でないため、読み枠がずれるような遺伝子である。本明細書において、簡略のため場合により「刺激応答遺伝子」と呼称する。生体刺激存在下又は非存在下のいずれか片方の条件下でのみスプライシングが生じてもよいし、あるいは、生体刺激存在下及び非存在下の双方でスプライシングが起こるがその態様が異なる、選択的スプライシングが生じても良い。
【００１８】
刺激応答遺伝子の例としては、小胞体ストレスに応じて２６ヌクレオチドのイントロンがスプライシングされる、ＸＢＰ１遺伝子が含まれる。ＸＢＰ１遺伝子は、例えば、ヒト、ウシ、マウス、アフリカツメガエル、ゼブラダニオ（ｚｅｂｒａ　ｆｉｓｈ）において知られており、そのｃＤＮＡ配列がＥＳＴデータベース上に、各々ＢＥ１７０１１９、ＡＶ６０４６６７、ＢＦ１４３０１９、ＡＦ３５８１３３、ＡＦ３９９９１８として登録されている。本明細書の後述の配列表において、ヒトＸＢＰ１のｃＤＮＡ配列を配列番号１として記載した（ＧｅｎＢａｎｋ　登録番号ＡＢ０７６３８３）。
【００１９】
標的蛋白質は、生体刺激の存在下においてのみ発現させることを目的とする蛋白質であり、特に限定されない。前記刺激応答遺伝子と標的蛋白質遺伝子はベクター内において、生体刺激の存在する場合にのみ、当該刺激応答遺伝子のｍＲＮＡがフレームシフトして両遺伝子の読み枠が一致するように配置されている。よって、生体刺激が存在する場合にのみ、標的蛋白質が発現する。
【００２０】
前記標的蛋白質として、蛍光蛋白質を用いた場合、ベクターを導入した細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体において蛍光を測定して生体刺激の有無を検出することが可能である。蛍光蛋白質の例としては、好ましくは緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）若しくはその変異体である。ＧＦＰは発光クラゲ類の有する緑色蛍光蛋白質の総称である。オワンクラゲのＧＦＰは、約５００ｎｍの紫外線により励起され緑色蛍光を発する。この蛍光には酸素以外に特別の因子を必要としない。外来遺伝子としてＧＦＰ遺伝子を導入すると、蛍光を有する培養細胞、植物、線虫、ハエ、魚、マウスなどが得られるため、生きてる細胞中で、発現を直接観察できる。さらに、ＧＦＰの変異体でより強い蛍光を発するＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｏ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＹＦＰ（ｙｅｌｌｏｗｆｌｕｏｒｏ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＢＦＰ（ｂｌｕｅ　ｆｌｕｏｒｏ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＲＦＰ（ｒｅｄ　ｆｌｕｏｒｏ　ｐｒｏｔｅｉｎ）等が開発されており、市販されている（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社より入手可能）。本発明の方法では、導入される発現ベクター内において、生体刺激の存在する場合にのみ、刺激応答遺伝子と蛍光蛋白質遺伝子の読み枠が一致し、両者の融合蛋白質が発現する。蛍光の測定により、生体刺激の、細胞内局在、組織局在、又は時間的局在に関する情報を得ることが可能である。
【００２１】
あるいは、生体刺激として、特定の癌細胞では、ある遺伝子のｍＲＮＡにフレームシフトが生ずるが、正常組織では生じない、という場合には、本発明の方法を利用することにより、標的蛋白質を癌細胞でのみ発現させることができる。標的蛋白質として毒性蛋白質、例えば、カスパーゼ、ｐ５３等を発現させることにより、癌細胞を特異的に攻撃することが可能である。
【００２２】
その他、本発明の方法において発現させうる標的蛋白質の例としては、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシラーゼが含まれる。
本発明のベクター、細胞等、及びベクターの導入方法
本発明の方法において、刺激応答遺伝子及び標的蛋白質を含むベクター、ベクターが導入される細胞等、並びにベクターの導入方法等は特に限定されず、公知のベクター等を利用可能である。
【００２３】
本発明に使用可能なモデル系としての細胞等は、特に限定されず、細菌（例えば、大腸菌、乳酸菌）、酵母（例えば、発芽酵母、分裂酵母）等の単細胞であってもよい。または、ヒト（例えば、ＨｅＬａ、２９３Ｔ、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）、マウス（例えば、Ｎｅｕｒｏ２ａ、ＮＩＨ３Ｔ３）等由来の培養細胞で使用可能である。これらはいずれも公知であり、市販されているか（例えば、大日本製薬社）、あるいは公共の研究機関（例えば、理研セルバンク）より入手可能である。あるいは、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体も使用可能である。
【００２４】
限定されるわけではないが、プラスミドなどの組換え発現ベクターに本発明の遺伝子のＤＮＡ断片を組み込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．５３（１９８９）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えベクター（例えば、組換えプラスミド）は、上述した細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体等に導入される。
【００２５】
プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．７４（１９８９）に記載のリン酸カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
【００２６】
べクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用べクター（例えば、プラスミドＤＮＡなど）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。発現べクターの種類は、原核細胞および／または真核細胞の各種の細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望の蛋白質を過剰発現しうる機能を有するものであれば特に限定されない
哺乳動物細胞内に核酸を導入するための確立された方法が、Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，　Ｌａｒｇｅ　Ｓｃａｌｅ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ，　１９９０，　ｐｐ．１５−６９に記載されている。商業的に入手可能な試薬、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ脂質試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−Ｐｌｕｓ脂質試薬を用いた、さらなるプロトコルを用いて、細胞をトランスフェクションすることが可能である（Ｆｅｌｇｎｅｒら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８４：７４１３−７４１７，　１９８７）。さらに、エレクトロポレーションを用いて、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　第２版．　Ｖｏｌ．１−３，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）におけるもののような、慣用法を用いて、哺乳動物細胞をトランスフェクションすることが可能である。安定形質転換体の選択は、例えば細胞毒性薬剤に対する耐性など、当該技術分野に知られる方法を用いて、行うことが可能である。
【００２７】
哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写および翻訳調節配列は、ウイルスゲノムより切り出すことが可能である。通常用いられるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、又はヒト・サイトメガロウイルス由来である。好ましくは、ヒト・サイトメガロウイルス由来のエンハンサーを使用可能である。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０起点、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライシング、およびポリアデニル化部位を用いて、哺乳動物宿主細胞における構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝要素を提供することが可能である。２種類以上の種由来の細胞中での発現を可能にするために、プロモーターとエンハンサーが各々異なる種に由来するものであってもよい。
【００２８】
あるいは、酵母などのより低次の真核生物において、または細菌などの原核生物に、ベクターを導入することも可能である。潜在的に適切な酵母株には、サッカロミセス・セレビシエ等、異種性ポリペプチドを発現することが可能ないかなる酵母株も含まれる。潜在的に適切な細菌株には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等、異種性ポリペプチドを発現することが可能ないかなる細菌株も含まれる。昆虫発現系も利用可能である。
【００２９】
本発明はまた、前記ベクターを適当なアジュバントとともに含む、本発明の蛋白質を発現する方法に使用するための試薬を提供する。本発明の試薬に含まれる適当なアジュバントは、ベクターが導入される細胞等の種類、導入方法等に応じて適宜当事者が選択可能である。
【００３０】
【好ましい発明の実施の形態】
病理学的および発生研究において、ｉｎ　ｖｉｖｏで小胞体ストレスをモニターできる方法が希求されている。本発明の方法は、生きている細胞中の小胞体ストレスを非破壊的におよび連続的に可視化するために利用可能である。本発明者らは、「ＥＲＡＩ」（小胞体ストレス活性化指標）と名付けた、生きている細胞における小胞体ストレスのための指標を開発した。
【００３１】
本態様の原理を図３に模式図として示した。本態様は、小胞体ストレス条件下に起こる、ＩＲＥ１によるＸＢＰ１　ｍＲＮＡスプライシングに基づいている。小胞体ストレス指標遺伝子は、ＸＢＰ１および蛍光蛋白質、例えば、ＧＦＰ変異体、ｖｅｎｕｓを融合することにより構築される。融合ｍＲＮＡはＩＲＥ１αによる非通常スプライシングの標的であり、小胞体ストレス時に２６ヌクレオチドのイントロン（ヒトでは、配列番号１の塩基５０２−５２７に相当）がスプライスされ、指標ｍＲＮＡのフレームシフトが導かれる。ＸＢＰ１は小胞体ストレス条件下でスプライスされるが、このスプライシングは正常条件下ではほとんど観察されない７。最終的に、スプライスされたｍＲＮＡの翻訳は蛍光蛋白質の終結コドンで終結する。結果として、小胞体ストレス条件下ではＸＢＰ１のｍＲＮＡのスプライシングにより、配列番号１中の塩基９−５０１及び５２８−１１６５がコード領域となり、３７６アミノ酸残基（配列番号２）からなるＸＢＰ１蛋白質に翻訳される。スプライシングされたＸＢＰ１のｍＲＮＡに対し、蛍光蛋白質をコードする遺伝子がインフレームに結合しているため、この場合、ＸＢＰ１および蛍光蛋白質の融合蛋白質が産生される。一方、正常条件下、即ち、非スプライシング時には、配列番号中の塩基９−７９４がコード領域となり（配列番号３）、２６１アミノ酸残基（配列番号４）からなるＸＢＰ１蛋白質（短縮型）に翻訳される。
【００３２】
このように、小胞体ストレス下では、ＸＢＰ１および蛍光蛋白質の融合蛋白質が産生され、蛍光蛋白質の蛍光活性により小胞体ストレスへ暴露された細胞を検出できる。一方、小胞体ストレスの非存在下ではスプライシングによるフレームシフトは生ぜず、翻訳はＸＢＰ１および蛍光蛋白質の遺伝子間の連結部位近くの終結コドンで終了する。よって、標的蛋白質である蛍光蛋白質の翻訳は誘導されない。
【００３３】
本態様において小胞体ストレスは、天然に生じた生体刺激でも人為的に生じさせた生体刺激でもよい。後述の実施例３において、ある条件を人為的に細胞に与えると小胞体ストレスが生じ、細胞中でＵＰＲを誘導することが確認された。具体的には、ツニカマイシン、タプシガーギンおよびＤＴＴは強力な小胞体侵襲因子と考えられ、熱（４２℃）およびＭＧ１３２は弱い小胞体侵襲因子と考えられる。よって、本発明の方法を利用して、上記のような処理を人為的に施すことによって、標的蛋白質（蛍光蛋白質を含む）を発現させることも可能である。または、ＵＰＲの必須分子であるＩＲＥ１αを細胞内で過剰発現させることによっても、標的蛋白質の発現が可能である（実施例５、図８）。
【００３４】
蛍光蛋白質は、蛍光蛋白質の種類に応じた蛍光極大波長において、公知の方法によって蛍光を観察することにより、検出可能である。限定されるわけではないが、ＧＦＰは、約５００ｎｍの紫外線により励起され緑色蛍光を発する。ＥＧＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ、ＲＦＰは各々、４８８ｎｍ、５１３ｎｍ、３８０ｎｍ及び５５８ｎｍの波長により励起され、５０７ｎｍ、５２７ｎｍ、４４０ｎｍ及び５８３ｎｍの波長を観察する。
【００３５】
なお、図３に記載のベクターｐＣＡＸは、サイトメガロウイルスエンハンサーおよびニワトリβ−アクチンプロモーターを有する。ゆえにこのベクターは、ヒト及びニワトリのいずれの細胞中でも下流遺伝子の発現が可能である。
【００３６】
さらに、図３に記載のベクターは、発現させた融合蛋白質の同定を容易にするためにＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド、Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓをコードする塩基配列を含んでいる。該ペプチドは非常に抗原性であり、そして特異的なモノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供し、発現された組換え蛋白質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。４Ｅ１１と称されるネズミハイブリドーマは、本明細書に援用される米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるように、特定の二価金属陽イオンの存在下で、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞株は、寄託番号ＨＢ　９２５９下に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されている。または、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体は、例えばＳｉｇｍａ社、Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ社等より入手可能である。
【００３７】
本発明の方法は、折り畳み異常蛋白質応答（ＵＰＲ）の標的遺伝子のプロモーターにより調節されるレポーターよりも（参考例１）、広い測定範囲において特異的および高感度の小胞体ストレス指標として機能する。さらに、本指標の基礎レベルは非常に低い。よって、本発明の方法は生きている細胞で小胞体ストレスを可視化するために応用可能である。後述の実施例ではヒトの培養細胞を使用した例を記載したが、本発明の方法は、ヒトのみならずマウス培養細胞においてもうまく機能した（データは示されていない）。よって、ＥＲＡＩを発現しているトランスジェニック動物（トランスジェニックマウスを含む）の特異的組織および器官の非破壊的および連続的モニタリングを実施することが可能である。これらのトランスジェニック動物は発生過程に起こる生理学的小胞体ストレスおよび小胞体ストレスといくつかの疾病との間の関係についての情報を提供する。加えて、細胞選別システムの使用により、これらのトランスジェニック動物から、ｉｎ　ｖｉｖｏで小胞体ストレスに暴露された細胞を単離することも可能である。
【００３８】
ＥＲＡＩは、低い基礎活性および広い測定範囲という二つの都合のよい特性を持っている。従って、この指標は、小胞体ストレスを誘導するまたは減少させる物質のハイスループットスクリーニングにより有用である。
【００３９】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。以下の実施例及び参考例においては、特に言及しない限り、以下の方法に従って行った。
【００４０】
細胞培養、トランスフェクションおよび処理
ヒーラー細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ヒト胎児腎細胞由来）を、６０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび１０％ウシ胎児血清を補給したαＭＥＭ中、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃にて培養した。ＭＥＭ培地の組成は下記の表１の通りである。
【００４１】
【表１】
2004081143.tif 000002
2004081143.tif 000003
各プラスミドをリン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿法により細胞内へトランスフェクトした。トランスフェクション後、小胞体ストレスを起こすグルコース飢餓を避けるため、６時間毎に培地を交換した。各々の薬剤に対する細胞応答を試験するため、細胞は種々の時間、５μｇ／ｍｌのツニカマイシン、５μｇ／ｍｌのタプシガーギン、１ｍＭのジチオスレイトール、１０μＭのＭＧ１３２、１００μＭのエトポシド、または１００μｇ／ｍｌのテオニルトリフルオロ　アセトンで処理された。
【００４２】
蛍光強度の測定
細胞はジギトニン緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７．５、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　ＥＧＴＡおよび１０μＭジギトニン）中、３７℃で３０分間溶解し、次に溶解物を１６，５００ｇでの遠心分離により清澄化した。上清の蛍光（４８５ｎｍで励起した５２０ｎｍでの発光）は分光蛍光計（Ｂｉｏｌｕｍｉｎ　９６０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ）で測定した。各々の試料の蛍光強度はβ−ガラクトシダーゼ活性に対して規格化した。値は３回の実験から得られたデータの平均±ＳＥＭとして示されている。
【００４３】
ウェスタンブロット分析
細胞はＳＤＳ試料緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、５０ｍＭ　ＤＴＴ、１０％グリセロール、および１μｇ／ｍｌブロモフェノール　ブルー）中で溶解し、次に溶解物を９８℃で１０分間煮沸した。溶解物中の蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％ゲル）により分離した。電気泳動後、蛋白質はポリビニリデン　フルオリド微小孔性メンブラン上へ電気的に移行させ、標準法を使用して抗−Ｆｌａｇモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）により免疫検出を実施した。
【００４４】
ノーザンブロット分析
全ＲＮＡはＩｓｏｇｅｎ試薬（Ｎｉｐｐｏｎ　ｇｅｎｅ）を使用して調製した。全ＲＮＡの２０マイクログラムを１％変性アガロースゲルの各々のレーンへ加え、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎメンブラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上へ移した。ハイブリダイゼーションは標準溶液中、４２℃で実施した。メンブランを２ｘＳＳＣ中、６５℃で洗浄した。
【００４５】
ＢｉＰおよびＧＡＰＤＨの検出に、以下のプローブを使用した：ＢｉＰ、コード領域の＋１から＋１９５９；ＧＡＰＤＨ、＋７５から＋１０１９。なお、ＢｉＰ及びＧＡＰＤＨの塩基配列は、各々、ＧｅｎＢａｎｋのＡＦ２１６２９２（配列番号６）及びＢＣ００４１０９（配列番号７）に開示されている。
【００４６】
参考例１　ＵＰＲ標的遺伝子のプロモーターにより調節されているｖｅｎｕｓ発現ベクターによる、生きている細胞中での小胞体ストレス検出
小胞体ストレス条件下、ＢｉＰおよびカルレティキュリンのようなＵＰＲ標的遺伝子の転写が、プロモーター上のシスエレメントである折り畳み異常蛋白質エレメント（ＵＰＲＥ）および小胞体ストレス応答エレメント（ＥＲＳＥ）を経て活性化される１４，１５。これらのエレメントはＵＰＲ誘導に必須および十分であることが知られており、そのためＵＰＲＥおよびＥＲＳＥ由来レポーター遺伝子はしばしば小胞体ストレスをモニターするために使用されてきた。緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）およびその変異体は生きている細胞中の指標またはマーカーとして、広く利用されてきた。
【００４７】
生きている哺乳動物細胞における小胞体ストレスをモニターするため、ＧＦＰ変異体“ｖｅｎｕｓ”のｃＤＮＡがヒトＢｉＰまたはマウスカルレティキュリンのプロモーターにより調節されている二つの発現ベクターを設計した（図１）。
【００４８】
具体的には、ｐＢｉＰ（−３０４）／ｖｅｎｕｓは、ヒトＢｉＰプロモーター（−３０４）１４，１５およびＳＶ４０イントロン／ポリＡ配列間のＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ部位にｖｅｎｕｓ　ｃＤＮＡを挿入することにより作製した。ｐＣＲＴ（−２．３ｋ）／ｖｅｎｕｓは、マウス　カルレティキュリンプロモーター（−２．３ｋ）１８およびＳＶ４０イントロン／ポリＡ配列間のＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ部位にｖｅｎｕｓ　ｃＤＮＡを挿入することにより作製した。
【００４９】
ｖｅｎｕｓは、ＧＦＰの変異体であるＥＹＦＰを修飾したものである。ＥＹＦＰは公知の蛍光蛋白質であり、そのアミノ酸配列は登録番号ＡＡＦ６５４５５としてＮＣＢＩに寄託されており、本明細書の配列表に配列番号５として記載されている。ｖｅｎｕｓは、ＥＹＦＰの配列において以下の５箇所のアミノ酸残基が修飾されており、非常に強い蛍光活性を示す：Ｆ４７Ｌ／Ｆ６５Ｌ／Ｍ１５４Ｔ／Ｖ１６４Ａ／Ｓ１７６Ｇ。マーカーとしてｖｅｎｕｓを選んだのは、それが高い折り畳み活性を示し、およびアシドーシスおよびＣｌ−への暴露に対する耐性を示したからである１６。これらの特色はストレス誘導条件下で細胞を研究するために都合がよい。
【００５０】
図１及び２は、ＵＰＲ標的遺伝子のプロモーターにより調節されているｖｅｎｕｓ発現ベクターによる、生きている細胞中での小胞体ストレス検出の結果を示す。各々の指標プラスミドはｐＣＡＧ−βｇａｌとヒーラー細胞内へ同時にトランスフェクトした。図１では、ヒストグラムはトランスフェクトされた細胞の相対的蛍光強度を示している。細胞はトランスフェクション３６時間後に採取し、溶解した。溶解物が蛍光強度の測定に使用された。ツニカマイシン（Ｔｍ）処理は細胞採取６時間前に開始された。図２は、細胞採取直前にトランスフェクトされた細胞における蛍光活性（緑）を示している顕微鏡写真である。これらの蛍光像は位相差像と重ね合わされた。
【００５１】
各々のｖｅｎｕｓ発現ベクターが一時的にヒーラー細胞内へトランスフェクトされた場合、ｖｅｎｕｓの蛍光強度はツニカマイシン（小胞体ストレス剤）で処理した細胞中で増加した。しかしながら、小胞体ストレス条件下での蛍光レベルは正常条件下より２．５から３倍高いのみであった（図１）。このことは、正常条件下で細胞中の基礎蛍光強度がかなり高かったためである（図２）。正常条件下、細胞中でＢｉＰおよびマウスカルレティキュリンはある程度のレベルで発現しているため、このレポーターの高い基礎活性は予想されなかった訳ではない。
【００５２】
実施例１　ベクターの構築
本実施例では、小胞体ストレス特異的イントロン（２６ヌクレオチド）を含んでいるヒトＸＢＰ１の部分配列の下流にｖｅｎｕｓコード領域を融合したベクターを作成した。
【００５３】
二つのＤＮＡ断片（Ｆ−ＸＢＰ１およびＦ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ）はＰＣＲにより作製した；前者はコザック配列、Ｆｌａｇタグ配列およびヒトＸＢＰ１　ｃＤＮＡの一部（配列番号１の１２−６０４ヌクレオチド）を含んでおり、および後者はコザック配列、Ｆｌａｇタグ配列およびヒトＸＢＰ１　ｃＤＮＡのより小さな一部（配列番号１の３８１−６０４ヌクレオチド）を含んでおり、それはＤＮＡ結合ドメインが欠けている。Ｆ−ＸＢＰ１−ｖｅｎｕｓおよびＦ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ−ｖｅｎｕｓはＦ−ＸＢＰ１およびＦ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ各々の下流のＢｇｌＩＩ部位にｖｅｎｕｓ　ｃＤＮＡを結合させることにより作製した。
【００５４】
Ｆ−ＸＢＰ１−ｖｅｎｕｓおよびＦ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ−ｖｅｎｕｓは哺乳動物発現ベクター、ｐＣＡＸ（サイトメガロウイルスエンハンサーおよびニワトリβ−アクチンプロモーターにより下流の遺伝子の発現を活性化する）のＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ部位内へ挿入した。プラスミドｐＣＡＸは、例えば、理化学研究所脳科学総合研究センター　修復機構研究グループの三浦研究室より分与可能である。ｐＣＡＸ−Ｆ−ＸＢＰ１−ｖｅｎｕｓおよびｐＣＡＸ−Ｆ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ−ｖｅｎｕｓはヒトおよびマウス培養細胞の両方で指標プラスミドとして働く。サイトメガロウイルスエンハンサーおよびニワトリβ−アクチンプロモーターに連結されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含んでいるプラスミド（ｐＣＡＧ−βｇａｌ）はトランスフェクション効率の内部標準として使用した。
【００５５】
小胞体ストレス活性化指標（ＥＲＡＩ）のスキームを図３に示す。。ｐＣＡＸ−Ｆ−ＸＢＰ１−ｖｅｎｕｓまたはｐＣＡＸ−Ｆ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ−ｖｅｎｕｓからの転写産物は正常条件下ではスプライスされない。スプライスされていないｍＲＮＡはＮ−末端にＦｌａｇタグを持つ端切断ＸＢＰ１へ翻訳される。小胞体ストレス条件下、これらの転写体はスプライスされ、フレームシフトを導く。スプライスされたｍＲＮＡはＮ−末端にＦｌａｇタグを持つＸＢＰ１−ｖｅｎｕｓ融合蛋白質へ翻訳される。それ故、小胞体ストレスへ暴露されている細胞のみで蛍光が検出される。
【００５６】
実施例２　小胞体ストレスによるＸＢＰ１−ｖｅｎｕｓ融合蛋白質の検出
融合遺伝子が哺乳動物細胞において小胞体ストレスの指標として、実際にうまく働くかどうかを試験するため、融合遺伝子の発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞内へトランスフェクトした。
【００５７】
これらの実験における融合遺伝子として、実施例１で作成したＦ−ＸＢＰ１−ｖｅｎｕｓおよびＦ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ−ｖｅｎｕｓ（ＸＢＰ１のＤＮＡ結合ドメインを欠いている）を含むベクターを用いた。各々の融合遺伝子はＮ末端にＦＬＡＧタグを持つ蛋白質をコード化している。各指標プラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞内へ、トランスフェクトした。
【００５８】
図４は、トランスフェクション３６時間後の細胞における蛍光活性（緑）を示している顕微鏡像である。ツニカマイシン（Ｔｍ）処理は画像を撮る１２時間前に開始された。これらの蛍光像を位相差像と重ね合わせた。Ｆ−ＸＢＰ１−ｖｅｎｕｓ発現ベクターをトランスフェクトされた細胞において、ツニカマイシン処理処理により核内に検出可能な蛍光を生じ、一方、正常条件下ではどの区画でもほとんど検出されなかった（図４）。
【００５９】
図４の観察は、ウェスタンブロット分析の結果と一致した。具体的には、細胞をトランスフェクション３６時間後に採取および溶解した。Ｔｍ処理は細胞採取１２時間前に開始した。外因性Ｆｌａｇ融合蛋白質を、抗−Ｆｌａｇモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いたウェスタンブロット分析により免疫検出した。結果を図５に示す。
【００６０】
ＸＢＰ１−ｖｅｎｕｓ融合蛋白質（４５ｋＤａ）のシグナルは小胞体ストレス条件下では非常に強かったが、正常条件下ではわずかであった。スプライスされていないｍＲＮＡから翻訳される短縮型ＸＢＰ１（３０ｋＤａ）は両方の条件下で検出された（図５Ａ）。短縮型ＸＢＰ１（３０ｋＤａ）が、正常条件下のみならず、ＥＲストレス条件下でも発現したのは、ストレス条件下でも必ずしも全てのｍＲＮＡがスプライスされるわけではないからである。
【００６１】
Ｆ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ−ｖｅｎｕｓも、生きている細胞において小胞体ストレスのための指標としてＦ−ＸＢＰ１−ｖｅｎｕｓ同様に働いた。ただし融合蛋白質は細胞質に局在化し、短縮型ＸＢＰ１は検出されなかった（図４Ｂおよび図５Ｂ）。理論に拘束されるわけではないが、正常条件下でも短縮型ＸＢＰ１が検出されなかったのは、おそらく、ＤＮＡ結合ドメインを欠いたＸＢＰ１は構造的に不安定であるため、合成されても、直後に分解されてしまったからではないか、と考えられる。
【００６２】
以下に記載したすべてのデータはＦ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ−ｖｅｎｕｓ発現ベクターでトランスフェクトされた細胞を使用して得られた。
実施例３　種々の条件下における細胞中のＢｉＰ発現レベルのノーザンブロット分析による測定
小胞体は細胞内器官であり、その機能は分泌性および膜蛋白質を正しく折り畳みおよび組み立てること、およびこれらの蛋白質を他の細胞内器官へ輸送することである。細胞がある種の条件下で培養された場合、これらの小胞体機能は弱められ、細胞中でＵＰＲの誘導が生じる。種々の培養条件下でのＵＰＲ活性を決定するため、ノーザンブロット分析により細胞中のＢｉＰ発現レベルを測定した（図７）。
【００６３】
以下の条件を用いた：４２℃熱ショックまたはツニカマイシン（Ｎ−連結グリコシル化の阻害剤）、タプシガーギン（小胞体からのＣａ２＋放出剤）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ、小胞体におけるジスルフィド結合形成を破壊する還元剤）、ＭＧ１３２（ユビキチン−プロテアソーム系による蛋白質分解の阻害剤）、エトポシド（アポトーシス誘導剤）、またはテオニルトリフルオロ　アセトン（化学的低酸素の誘導剤）による処理。種々の処理に暴露されたヒーラー細胞におけるＢｉＰ発現レベルをノーザンブロット分析により試験した。処理後の時間は、図７の各々のレーンの上に示されている。内部標準としてＧＡＰＤＨ発現レベルを使用した。
【００６４】
図７に示したように、ツニカマイシン、タプシガーギンおよびＤＴＴによる処理後、ＢｉＰ刺激の放射活性は６時間の時点で１５倍増加した。加えて、細胞を４２℃で培養するかまたはＭＧ１３２で処理した６時間後、ＢｉＰレベルは各々２または４倍に増加した。ＢｉＰ遺伝子発現はエトポシド、テオニルトリフルオロ　アセトンまたは偽処理によっては活性化されなかった。これらのデータから、ツニカマイシン、タプシガーギンおよびＤＴＴは強力な小胞体ストレス剤と考えられ、熱（４２℃）およびＭＧ１３２は弱い小胞体ストレス剤と考えられ、およびエトポシドおよびテオニルトリフルオロ　アセトンは小胞体ストレス剤ではない。
【００６５】
実施例４　小胞体ストレスを検出するためのＥＲＡＩに基づいた本願発明の方法の特性の検討
Ｆ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ−ｖｅｎｕｓトランスフェクト細胞を使用して、実施例４の図７で調べた条件を分析した。具体的には、ｐＣＡＸ−Ｆ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ−ｖｅｎｕｓを、ｐＣＡＧ−βｇａｌと同時にヒーラー細胞内へトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を種々のストレス誘導剤に暴露した；熱（４２℃の培養温度）またはツニカマイシン（Ｔｍ）、タプシガーギン（Ｔｇ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ＭＧ１３２、エトポシド（Ｅｔｐ）、またはテオニルトリフルオロ　アセトン（ＴＴＦＡ）による処理。図４のグラフは、トランスフェクトされた細胞における蛍光強度を示している。細胞はトランスフェクション３６時間後に採取および溶解された。溶解物が蛍光強度の測定に使用された。各々の処理は細胞採取６または１２時間前に開始した。
【００６６】
Ｆ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ−ｖｅｎｕｓトランスフェクト細胞においては、図７のノザンブロット分析によれば、ＢｉＰ遺伝子誘導は６時間で飽和したが、蛍光強度は１２時間の間、時間と伴に増加し、強力な小胞体ストレス剤で処理した後は基礎レベルの３０−７０倍に達した。弱い小胞体ストレス剤に暴露された細胞においては、蛍光レベルは基礎レベルの５倍に増加した。エトポシドまたはテオニルトリフルオロ　アセトンで処理された細胞または対照細胞において、蛍光はほとんど検出されなかった（図６）。
【００６７】
従って、蛍光強度に基づいたこれらの図６のデータは、図７のノーザンブロット分析の結果と相関していた。これらの結果は、広い測定範囲で、小胞体ストレスのための特異的および高感度の指標として、本発明の方法が働くことを示している。加えて、この指標の基礎レベルは、ＵＰＲ標的遺伝子のプロモーターを使用するレポータープラスミドの基礎レベルよりも低い。本実施例の結果は、本発明の方法が生きている細胞における小胞体ストレスの可視化に応用可能であることを示している。
【００６８】
実施例５　ＩＲＥ１α−過剰発現細胞における蛍光強度を測定
ＸＢＰ１　ｍＲＮＡは、細胞中でＩＲＥ１αが過剰発現されている場合、ならびに細胞が小胞体ストレスに暴露されている場合にスプライスされる７。ＩＲＥ１α過剰発現はそれ自身のオリゴマー化および自己リン酸化を起こし、それはＵＰＲを誘導する３。本実施例では、ＩＲＥ１α−過剰発現細胞において蛍光強度を測定した。
【００６９】
本実施例では、ｐＣＡＧ−ｈＩＲＥ１αおよびｐＣＡＧ−ｈＩＲＥ１α　Ｋ５９９Ａを、各々ヒトＩＲＥ１αおよびヒトＩＲＥ１α　Ｋ５９９Ａの発現ベクターとして使用した。ＩＲＥの配列は、ヒトＩＲＥ１α　Ｋ５９９Ａでは、５９９位のリジンがアラニンに突然変異している。５９９位のリジンは、ＩＲＥのキナーゼサブドメイン内の種間で広く保存されていることが知られている残基である６。
【００７０】
ｐＣＡＸ−Ｆ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ−ｖｅｎｕｓを、ｐＣＡＧ−βｇａｌおよびＩＲＥ１発現ベクターと同時にヒーラー細胞内へトランスフェクトした。図８は、本指標ｍＲＮＡのＩＲＥ１α−依存性スプライシングの結果を示したものであり、ヒストグラムはトランスフェクトされた細胞中の蛍光強度を示している。細胞はトランスフェクション３６時間後に採取および溶解された。溶解物が蛍光強度の測定に使用された。
【００７１】
図８に示したように、蛍光はＩＲＥ１α−過剰発現細胞において高レベルで検出されたが、キナーゼ変異体ＩＲＥ１α、ＩＲＥ１α　Ｋ５９９Ａを過剰発現している細胞ではほとんど観察されなかった。加えて、指標ｍＲＮＡのスプライシング部位が内在性ＸＢＰ１　ｍＲＮＡと同一であることを確認するため、ＲＴ−ＰＣＲ生成物の配列分析を行った（データは示されていない）。これらのデータから、指標ｍＲＮＡのスプライシングは内在性ＸＢＰ１　ｍＲＮＡと同様の様式で、小胞体ストレス条件下でＩＲＥ１αに依存していることが確認された。
参考文献
以下の文献は、参考文献としてその内容が本明細書中に援用される。
【００７２】
１．　　Ｍｏｒｉ，　Ｋ．　　Ｔｒｉｐａｔｉｔｅ　ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｕｎｆｏｌｄｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．　　Ｃｅｌｌ　１０１，　４５１−４５４　（２０００）．
２．　　Ｃｈａｐｍａｎ，　Ｒ．，　Ｓｉｄｒａｕｓｋｉ，　Ｃ．　＆　Ｗａｌｔｅｒ，　Ｐ．　　Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅｕｓ．　　Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｃｅｌｌ　Ｄｅｖ．　Ｂｉｏｌ．　１４，　４５９−４８５　（１９９８）．
３．　　Ｔｉｒａｓｏｐｈｏｎ，　Ｗ．，　Ｗｅｌｉｈｉｎｄａ，　Ａ．　Ａ．　＆　Ｋａｕｆｍａｎ，　Ｒ．　Ｊ．　　Ａ　ｓｔｒｅｓｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｐａｔｈｗａｙ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅｕｓ　ｒｅｑｕｉｒｅｓ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ／ｅｎｄｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　（Ｉｒｅ１ｐ）　ｉｎ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ．　　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　１２，　１８１２−１８２４　（１９９８）．
４．　　Ｗａｎｇ，　Ｘ．　Ｚ．　ｅｔ　ａｌ．　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｉｒｅ１．　ｒｅｖｅａｌｓ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎ　ｔｈｅ　ＥＲ　ｓｔｒｅｓｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．　　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１７，　５７０８−５７１７　（１９９８）．
５．　　Ｔｉｒａｓｏｐｈｏｎ，　Ｗ．，　Ｌｅｅ，　Ｋ．，　Ｃａｌｌａｇｈａｎ，　Ｂ．，　Ｗｅｌｉｈｉｎｄａ，　Ａ．　Ａ．　＆　Ｋａｕｆｍａｎ，　Ｒ．　Ｊ．　　Ｔｈｅ　ｅｎｄｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ＩＲＥ１　ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｅｓｉｔｓ　ｍＲＮＡ　ａｎｄ　ｉｓ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｕｎｆｏｌｄｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ．　　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．１４，　２７２５−２７３６　（２０００）．
６．　　Ｉｗａｗａｋｉ，　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．　　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｂｙ　ｔｈｅ　ＥＲ　ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｋｉｎａｓｅｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ＩＲＥ１　ｕｎｄｅｒ　ｅｒ　ｓｔｒｅｓｓ．　　Ｎａｔ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　３，　１５８−１６４　（２００１）．
７．　　Ｙｏｓｈｉｄａ，　Ｈ．，　Ｍａｔｓｕｉ，　Ｔ．，　Ｙａｍａｍｏｔｏ，　Ａ．，　Ｏｋａｄａ，　Ｔ．　＆　Ｍｏｒｉ，　Ｋ．　　ＸＢＰ１　ｍＲＮＡ　ｉｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＡＴＦ６　ａｎｄ　ｓｐｌｉｃｅｄ　ｂｙ　ＩＲＥ１　ｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ＥＲ　ｓｔｒｅｓｓ　ｔｏ　ｐｒｏｄｕｃｅ　ａ　ｈｉｇｈｌｙ　ａｃｔｉｖｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ．　Ｃｅｌｌ　１０７，　８８１−８９１　（２００１）．
８．　　Ｕｒａｎｏ，　Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．　　Ｃｏｕｐｌｉｎｇ　ｏｆ　ｓｔｒｅｓｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＥＲ　ｔｏ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＪＮＫ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅｓ　ｂｙ　ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　ＩＲＥ１．　　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８７，　６６４−６６６　（２０００）．
９．　　Ｎａｋａｇａｗａ　ｅｔ　ａｌ．　　Ｃａｓｐａｓｅ−１２　ｍｅｄｉａｔｅｓ　ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ−ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｂｙ　ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ．　　Ｎａｔｕｒｅ　４０３，　９８−１０３　（２０００）．
１０．　　　　Ｒａｏ，　Ｒ．　Ｖ．　ｅｔ　ａｌ．　　Ｃｏｕｐｌｉｎｇ　ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ　ｓｔｒｅｓｓ　ｔｏ　ｔｈｅｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈ　ｐｒｏｇｒａｍ．　　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７６，　３３８６９−３３８７４　（２００１）．
１１．　　　　Ｋａｔａｙａｍａ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　　Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ−１　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅ　ｔｈｅ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｕｎｆｏｌｄｅｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ．　　Ｎａｔ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１，　４７９−４８５　（１９９９）．
１２．　　　　Ｉｍａｉ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　　Ａｎ　ｕｎｆｏｌｄｅｄ　ｐｕｔａｔｉｖｅ　ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，　ｗｈｉｃｈ　ｃａｎ　ｌｅａｄ　ｔｏ　ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ　ｓｔｒｅｓｓ，　ｉｓ　ａ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｏｆ　Ｐａｒｋｉｎ．　　Ｃｅｌｌ　１０５，　８９１−９０２　（２００１）．
１３．　　　　Ｓｈｅｎ，　Ｘ．　ｅｔ　ａｌ．　　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙｓ　ｒｅｇｕｌａｔｅ　ｔｈｅ　ｕｎｆｏｌｄｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ａｎｄ　ａｒｅ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　Ｃ．　ｅｌｅｇａｎｓ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．　　Ｃｅｌｌ　１０７，　８９３−９０３　（２００１）．
１４．　　　　Ｋｏｈｎｏ，　Ｋ．，　Ｎｏｒｍｉｎｇｔｏｎ，　Ｋ．，　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．，　Ｇｅｔｈｉｎｇ，　Ｍ．　Ｊ．　＆　Ｍｏｒｉ，Ｋ．　　Ｔｈｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｙｅａｓｔ　ＫＡＲ２　（ＢｉＰ）　ｇｅｎｅ　ｃｏｎｔａｉｎｓ　ａ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｄｏｍａｉｎ　ｔｈａｔ　ｒｅｓｐｏｎｄｓ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｃｅ　ｏｆ　ｕｎｆｏｌｄｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．　　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１３，　８７７−８９０　（１９９３）．
１５．　　　　Ｙｏｓｈｉｄａ，　Ｈ．，　Ｈａｚｅ，　Ｋ．，　Ｙａｎａｇｉ，　Ｈ．，　Ｙｕｒａ，　Ｔ．　＆　Ｍｏｒｉ，　Ｋ．　　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ　ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ　ｓｔｒｅｓｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ　ｆｏｒ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓ．　　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７３，　３３７４１−３３７４９　（１９９８）．
１６．　　　　Ｎａｇａｉ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　　Ａ　ｖａｒｉａｎｔ　ｏｆ　ｙｅｌｌｏｗ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗｉｔｈ　ｆａｓｔ　ａｎｄ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｃｅｌｌ−ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．　　Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　２０，　８７−９０　（２００２）．
１７．　　　　Ｃａｌｆｏｎ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　ＩＲＥ１　ｃｏｕｐｌｅｓ　ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ　ｌｏａｄ　ｔｏ　ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｂｙ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ＸＢＰ−１　ｍＲＮＡ．　　Ｎａｔｕｒｅ　４１５，　９２−９６　（２００２）．
１８．　　　　Ｗａｓｅｒ，　Ｍ．，　Ｍｅｓａｅｌｉ，　Ｎ．，　Ｓｐｅｎｃｅｒ，　Ｃ．　＆　Ｍｉｃｈａｌａｋ，　Ｍ．　　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｙ　ｃａｌｃｉｕｍ．　　Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１３８，　５４７−５５７　（１９９７）．
【００７３】
【配列表】
2004081143.tif 000004
2004081143.tif 000005
2004081143.tif 000006
2004081143.tif 000007
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＵＰＲ標的遺伝子（ＢｉＰおよびカルレティキュリン）のプロモーターにより調節されているｖｅｎｕｓ発現ベクターによる、生きている細胞中での小胞体ストレス検出の結果を示す。各々の指標プラスミドはｐＣＡＧ−βｇａｌとヒーラー細胞内へ同時にトランスフェクトした。ヒストグラムはトランスフェクトされた細胞の相対的蛍光強度を示している。細胞はトランスフェクション３６時間後に採取し、溶解した。溶解物が蛍光強度の測定に使用された。ツニカマイシン（Ｔｍ）処理は細胞採取６時間前に開始された。
【図２】図２は、ＵＰＲ標的遺伝子のプロモーターにより調節されているｖｅｎｕｓ発現ベクターによる、生きている細胞中での小胞体ストレス検出の結果を示す。各々の指標プラスミドはｐＣＡＧ−βｇａｌとヒーラー細胞内へ同時にトランスフェクトした。ツニカマイシン（Ｔｍ）処理は細胞採取６時間前に開始された。図２は、細胞採取直前にトランスフェクトされた細胞における蛍光活性（緑）を示している顕微鏡写真である。これらの蛍光像は位相差像と重ね合わされた。
【図３】図３は、小胞体ストレス活性化指標（ＥＲＡＩ）のスキームである。ｐＣＡＸ−Ｆ−ＸＢＰ１−ｖｅｎｕｓまたはｐＣＡＸ−Ｆ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ−ｖｅｎｕｓからの転写産物は正常条件下ではスプライスされない。スプライスされていないｍＲＮＡはＮ−末端にＦｌａｇタグを持つ短縮型ＸＢＰ１へ翻訳される。小胞体ストレス条件下では、これらの転写産物はスプライスされ、フレームシフトを導く。スプライスされたｍＲＮＡはＮ−末端にＦｌａｇタグを持つＸＢＰ１−ｖｅｎｕｓ融合蛋白質へ翻訳される。それ故、小胞体ストレスへ暴露されている細胞のみで蛍光が検出される。
【図４】小胞体ストレス時のＸＢＰ１−ｖｅｎｕｓ融合蛋白質の検出を示す。各々の指標プラスミドはＨＥＫ２９３Ｔ細胞内へトランスフェクトされた。図４は、トランスフェクション３６時間後の細胞における蛍光活性（緑）を示している顕微鏡像である。ツニカマイシン（Ｔｍ）処理は画像を撮る１２時間前に開始された。これらの蛍光像は位相差像と重ね合わされた。
【図５】図５は、小胞体ストレス時のＸＢＰ１−ｖｅｎｕｓ融合蛋白質の検出を示す。各々の指標プラスミドはＨＥＫ２９３Ｔ細胞内へトランスフェクトされた。図５は、外因性Ｆｌａｇ融合蛋白質がウェスタンブロット分析により免疫検出されたことを示す。細胞はトランスフェクション３６時間後に採取および溶解された。Ｔｍ処理は細胞採取１２時間前に開始された。
【図６】図６は、小胞体ストレスを検出するためのＥＲＡＩに基づいた方法の特異性を調べた結果を示す。
ｐＣＡＸ−Ｆ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ−ｖｅｎｕｓは、ｐＣＡＧ−βｇａｌと同時にヒーラー細胞内へトランスフェクトされた。トランスフェクトされた細胞は種々のストレス誘導剤に暴露された；熱（４２℃の培養温度）またはツニカマイシン（Ｔｍ）、タプシガーギン（Ｔｇ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ＭＧ１３２、エトポシド（Ｅｔｐ）、またはテオニルトリフルオロ　アセトン（ＴＴＦＡ）による処理。グラフはトランスフェクトされた細胞における蛍光強度を示している。細胞はトランスフェクション３６時間後に採取および溶解された。溶解物が蛍光強度の測定に使用された。各々の処理は細胞採取６または１２時間前に開始された。
【図７】図７は、図６と同様に種々の処理に暴露されたヒーラー細胞におけるＢｉＰ発現レベルを、ノーザンブロット分析により試験した結果を示す。処理後の時間は各々のレーンの上に示されている。ＧＡＰＤＨ発現レベルが内部標準として使用された。
【図８】図８は、ＸＢＰ１　ｍＲＮＡのＩＲＥ１α−依存性スプライシングを示す。ｐＣＡＸ−Ｆ−ＸＢＰ１ΔＤＢＤ−ｖｅｎｕｓはｐＣＡＧ−βｇａｌおよびＩＲＥ１発現ベクターと同時にヒーラー細胞内へトランスフェクトされた。ヒストグラムはトランスフェクトされた細胞中の蛍光強度を示している。細胞はトランスフェクション３６時間後に採取および溶解された。溶解物が蛍光強度の測定に使用された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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