(57)【要約】【課題】キチン・キトサン様物質を、微生物を用いて効率よく製造すること。【解決手段】有機酸を炭素源としてキチン・キトサン様物質を生産する能力を有する微生物を担体に固定化し、固定化微生物を得る工程、および該固定化微生物を培養する工程を含む方法で、キチン・キトサン様物質を製造する。担体としては、ポリビニルアルコールの多孔質体、ポリプロピレンの多孔質体あるいはセラミックスの多孔質体が好ましい。微生物としては、シトロバクター属に属する微生物が好ましく用いられる。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機酸を炭素源としてキチン・キトサン様物質を生産する能力を有する微生物を担体に固定化し、固定化微生物を得る工程、および該固定化微生物を培養する工程を含む、キチン・キトサン様物質の製造方法。
【請求項２】
前記担体が、ポリビニルアルコールの多孔質体、ポリプロピレンの多孔質体およびセラミックスの多孔質体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物がシトロバクター属に属する微生物である、請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、固定化微生物を用いてキチン・キトサン様物質を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
キチン・キトサン類は、カニ、エビなどの甲殻類の殻に多く含まれる物質であり、その用途は多岐にわたる。例えば、水処理分野における凝集剤；医療分野における人工皮膚、縫合糸、免疫強化剤（例えば、生薬）もしくは薬効調整剤；工業分野における分離精製用の担体；あるいは、農業分野における病害防除剤などに使用されている。さらに、キチン・キトサン類は、上記分野の他に、健康食品、食品添加物、化粧品、整髪料、抗菌剤、生分解性プラスチックなどにも使用されている。
【０００３】
キチン・キトサン類は、一般に、カニ、エビなどを加工する過程で廃棄される甲殻部分を原料として製造されている。すなわち、カニ、エビなどの甲殻に、脱灰処理、脱タンパク処理等の処理を施して、粗キチンを抽出し、精製することによってキチンが製造される。さらにこのキチンを脱アセチル化することによりキトサンが製造される。そのため、原料供給の季節変動性およびキチンからキトサンへの化学変換に伴う処理コストが高いという問題がある。
【０００４】
これらの問題を解決するために、Ｍｕｃｏｒ　ｒｏｕｘｉｉ、Ａｂｓｉｄｉａ　ｂｕｔｌｅｒｉ、Ａｂｓｉｄｉａ　ｃｏｅｒｕｌｅａなどのカビ類を用いてキチン・キトサン様物質を生産する研究がなされている。しかし、この方法においても、培地コストが高いこと、生産性が低いことなどの問題が残されている。
【０００５】
他方、酢酸などの有機酸を炭素源として、キチン・キトサン様物質を生産する微生物（細菌）を培養することによって、キチン・キトサン様物質が得られることが開示されている（特開２００２−３４５８８号公報、および特開平１１−２７６１６０号公報参照）。この特開２００２−３４５８８号公報に記載された方法は、有機酸（廃有機酸）などの安価な原料を用いてキチン・キトサン様物質が生産できる点ではすぐれているが、キチン・キトサン様物質の生産量は、せいぜい５００ｍｇ／Ｌ培養上清程度であり、依然として生産性が低いという問題が残る。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、有機酸を原料としてキチン・キトサン様物質を生産し得る微生物を用いて、キチン・キトサン様物質を効率よく製造する方法が望まれている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、有機酸を炭素源としてキチン・キトサン様物質を生産する能力を有する微生物を担体に固定化し、固定化微生物を得る工程、および該固定化微生物を培養する工程を含む、キチン・キトサン様物質の製造方法に関する。
【０００８】
好ましい実施態様においては、前記担体は、ポリビニルアルコールの多孔質体、ポリプロピレンの多孔質体およびセラミックスの多孔質体からなる群から選択される。
【０００９】
より好ましい実施態様においては、前記微生物はシトロバクター属に属する微生物である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
（微生物）
本発明に用いられる微生物は、有機酸を炭素源としてキチン・キトサン様物質を生産する能力を有する微生物である。このような能力を有する微生物であれば、特に制限なく、本発明に用いられる。有機酸としては、酢酸、プロピオン酸、乳酸、オレイン酸などが挙げられる。中でも、酢酸および／またはプロピオン酸、あるいはこれらの塩を資化し、キチン・キトサン様物質を生産し得る微生物が好ましく用いられる。
【００１１】
このようなキチン・キトサン様物質を生産する能力を有する微生物は、例えば、以下のようにして得られる。まず、台所の排水溝、汚泥処理場、活性スラッジ、森林の土壌などのサンプルから、酢酸とプロピオン酸とを含む培地で生育する微生物を選択する。本発明に用いられる微生物の選択に用いられる培地としては、１Ｌ中に、酢酸ナトリウム　７．０ｇ、プロピオン酸ナトリウム　３．０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４　１．０ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４　１．０ｇ、ＮａＣｌ　０．０５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．２ｇ、ＣａＣｌ２　１．０ｇ、ＦｅＣｌ３　０．０１ｇ、およびイーストエキス　０．１ｇを含む培地（ｐＨ７．２）（以下、選択培地という）が挙げられる。次いで、選択した微生物の中から、後述するカオリン凝集効果を有する物質を培養液中に生産する微生物をさらに選択する。そして、そのカオリン凝集効果を有する物質がキチン・キトサン様物質であることを確認することにより、有機酸を炭素源としてキチン・キトサン様物質を生産する能力を有する微生物（以下、キチン・キトサン生産微生物という）が選択される。
【００１２】
このような方法で得られたキチン・キトサン生産微生物として、シトロバクター属に属する微生物が挙げられる。中でも、シトロバクターＴＫＦ０４株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１６７２２）が好ましく用いられる。シトロバクターＴＫＦ０４株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１６７２２）の詳しい菌学的性質は、特開平１１−２７６１６０号公報に記載されている。
【００１３】
（固定化方法）
微生物の固定化方法としては、一般的には、不溶性の担体に菌体を物理的あるいは化学的に付着させる担体結合法、高分子ゲルマトリクス格子中にあるいは半透膜マイクロカプセル中に微生物菌体を包括する包括法などが挙げられる。確実に微生物を固定化するためには包括法が好ましい。しかし、本発明の場合、生産されるキチン・キトサン様物質の分子サイズが比較的大きいことを考慮すると、多孔質担体を用いる担体結合法が好ましく用いられる。
【００１４】
（多孔質担体）
多孔質担体としては、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、ポリウレタンフォーム、セラミックスなどの多孔質体が挙げられる。これらの多孔質体は必要に応じて、荷電物質や化学物質による表面処理を行ってもよい。中でも、多孔質のポリビニルアルコール、多孔質のポリプロピレン、あるいは多孔質のセラミックスが好ましく用いられる。これらの担体の大きさならびに形状は、特に限定されない。使用状態に合わせて、球状、棒状、板状、角柱状、円柱状、円筒状、シート状などの形状で、適切な大きさとすればよい。担体の強度などを考慮すると、球状、あるいは角柱状（立方体）が好ましく、直径あるいは一片が約２〜５０ｍｍ程度であることが好ましい。
【００１５】
これらの多孔質担体の孔の大きさは、用いる微生物が侵入できる程度の大きさであれば特に制限はない。一般的には、孔径が約１０〜５００μｍであることが好ましい。
【００１６】
多孔質のポリビニルアルコール（以下、ＰＶＡということがある）としては、ＰＶＡゲル、ＰＶＡスポンジなどが例示される。多孔質のポリプロピレンとしては、発泡ポリプロピレンが好ましく用いられる。また、多孔質のセラミックスとしては、セラミックス多孔球が好ましく用いられる。
【００１７】
（微生物の多孔質担体への固定化）
微生物の多孔質担体への固定化には、特別な方法は必要ない。担体、あるいは必要に応じて荷電物質や化学物質による表面処理を行った担体と、微生物とを接触させることにより行われる。具体的には、液体培地（例えば、上記選択培地と同じ組成の培地）に多孔質担体を投入し、この培地に目的の微生物を植菌して、適当な時間振盪培養することにより、生育した微生物が多孔質担体に固定化される。培養終了後、多孔質体を回収することにより、固定化微生物が得られる。
【００１８】
（固定化微生物によるキチン・キトサン様物質の生産）
上記で得られた固定化微生物を、キチン・キトサン生産培地に添加し、所定時間培養することにより、キチン・キトサン様物質が生産される。
【００１９】
キチン・キトサン生産培地には、炭素源として有機酸の他に、微生物の生育に必要な窒素源と、必要に応じて、無機塩などが含まれる。有機酸は、特に制限はないが、微生物（菌）が資化し易いという点では、分子量の小さい有機酸の方が効率的である。例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸などの低級脂肪酸またはそれらの塩、もしくはそれらの混合物が好ましい。酢酸およびプロピオン酸がより好ましく用いられる。特に、下廃水汚泥などの有機性廃棄物を処理する際に生成される廃酢酸および廃プロピオン酸を炭素源として使用すると、低コストで生産することができ、環境保全および廃棄物の有効利用に貢献し得る。培地に含まれる炭素源の量は、キチン・キトサン生産微生物が増殖阻害を受けない程度の量であればよく、有機酸の種類によっても異なるが、培地中に約５〜１５ｇ／Ｌの割合で含有されることが好ましい。
【００２０】
窒素源としては、硝酸塩、アンモニウム塩（例えば、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウムなど）、尿素、イーストエキス、ペプトン、肉エキスなどの有機性窒素が挙げられる。窒素源の量は、生産培地中に約０．６〜１．８ｇ／Ｌの割合で含有されることが好ましい。無機塩としては、ＮａＣｌ、ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２、Ｋ２ＨＰＯ４、ＦｅＣｌ３などが挙げられる。ｐＨは、７〜１１であることが好ましく、７．２〜９．０であることが好ましく、ｐＨ８．０〜８．５であることがさらに好ましい。培養温度は用いる微生物によって異なるが、一般的には、１０〜５０℃である。例えば、シトロバクターＴＫＦ０４株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１６７２２）の場合、約２５〜４０℃、好ましくは２８〜３３℃である。
【００２１】
培養時間は、培養液の組成、温度、ｐＨなどにより影響を受けるので、特に制限はない。キチン・キトサン様物質の生産をモニターして、培養時間を適宜決定すればよい。一般的には、培養時間は３〜１０日である。
【００２２】
培養方法には特に制限はなく、振盪培養、バッチ培養、フェドバッチ培養、連続培養、多段式連続培養などの方法が用いられる。カラムに固定化微生物を充填し、連続的に培地を供給・回収してもよい。カラムを複数、接続してもよい。
【００２３】
フェドバッチ培養を行う場合、あるいは連続培養を行う場合、キチン・キトサン生産培地の炭素源と窒素源の比率は、Ｃ／Ｎ比（Ｃ原子数／Ｎ原子数）が、５〜１２であることが好ましく、７〜１０であることがさらに好ましい。
【００２４】
さらに、培養液中の溶存酸素量を、例えば、攪拌羽根の回転速度、通気量、通気するガスの酸素濃度の増加などで調節することにより、キチン・キトサン様物質の生産量を向上させることも可能である。
【００２５】
キチン・キトサン様物質が生産されたか否かの確認は、例えば、カオリン凝集活性を以下のように測定して行われる。まず、カオリン粒子（３００メッシュ、Ｋｉｓｈｉｄａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、大阪）をイオン交換水に濃度５ｇ／Ｌとなるように懸濁し、この懸濁液１０ｍＬに微生物の培養液１ｍＬを投入し、ミキサーで３０秒間攪拌混合して５分間静置する。その後、カオリン懸濁液の５５０ｎｍにおける吸光度を測定する（この値をＡとする）。他方、培養液の代りにイオン交換水を用いて同様の処理をしたカオリン懸濁液の５５０ｎｍにおける吸光度を測定する（この値をＢとする）。そして、凝集活性値Ｇを、Ｇ＝｛（Ｂ−Ａ）／Ｂ｝×１００（％）の式で求め、この凝集活性値Ｇから、キチン・キトサン様物質の生産（量）が推定できる。
【００２６】
（キチン・キトサン様物質の回収および精製）
生産されたキチン・キトサン様物質は、培養液から回収される。まず、培養液から固定化微生物を、例えば、目の粗い濾布を用いた濾過により、取り除く。得られた濾液を、硫安沈殿、ヘキサンなどによる溶媒抽出、酸またはアルカリによる沈殿、アルコール沈殿などの方法により処理する。なお、菌体が担体から剥離あるいは脱落する場合を考慮して、濾液を遠心分離処理してから、上記処理を行ってもよい。得られた抽出物または沈殿物を濾過、遠心分離などの方法で回収するか、限外濾過膜（例えば、限界分子量５０，０００）などによる濃縮・分離することによって、キチン・キトサン様物質が回収される。中でも、濾液のｐＨを１２〜１３のアルカリ側に調整し、沸騰浴中で処理する（例えば、約１０分間加熱する）アルカリ沈殿法；培養上清の等倍〜３倍量の冷エタノールを添加し、−２０℃で静置するエタノール沈殿法；および限外濾過膜による分離が好ましい。限外濾過膜による分離法は、収率よくキチン・キトサン様物質を回収できるため好ましい。また、これらの方法は、単独で用いてもよく、あるいは組合せて用いてもよい。特に、限外濾過膜による分離濃縮とエタノール沈殿とを組合せることにより、キチン・キトサン様物質を効率よく回収できる。例えば、限外濾過濃縮液に冷エタノールを等倍〜２倍容量添加し、１０分間〜一晩放置し、その後、濾過あるいは遠心分離することにより、ほぼ、定量的にキチン・キトサン様物質が回収され得る。
【００２７】
上記のように回収されたキチン・キトサン様物質は、さらに、精製され得る。例えば、得られたキチン・キトサン様物質をｐＨ約２〜３の酸性溶液（例えば、塩酸溶液）に溶解し、水（流水、イオン交換水など）に対して透析し、脱塩する。得られた透析物を凍結乾燥することによって、精製されたキチン・キトサン様物質が白色粉末として得られる。
【００２８】
得られた白色粉末は、酸加水分解による分解物の解析（例えば、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による構成糖（Ｄ−グルコサミン）の解析、１Ｈ−ＮＭＲによる分析、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ分析）、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ分析）など）、フーリエ変換赤外（ＦＴ−ＩＲ）分光分析による解析、キトサナーゼ、キチナーゼ、セルラーゼなどの酵素分解パターンによる解析などの方法によって、キチン・キトサン様物質であることが確認される。
【００２９】
なお、加水分解物のＴＬＣは、例えば、シリカゲルＧプレート（Ａｎａｌｔｅｃ　Ｉｎｃ．ＵＳＡ）を用いて、展開溶媒（ｎ−ブタノール：ギ酸：水＝２：３：１）で行われる。この溶媒系で、Ｄ−グルコサミンのＲｆ値は、０．４９である。
【００３０】
フーリエ変換赤外分光分析による解析では、ＦＴ−ＩＲ吸収スペクトルにより、キチン・キトサンに特有なＯＨ伸縮振動（３４４０〜３４８０ｃｍ−１）、ＣＨ伸縮振動（２８７８〜２９６０ｃｍ−１）、ＮＨ伸縮振動（３２６０〜３２７０ｃｍ−１）、アミド基に由来するアミド吸収帯（１６５０〜１５６０ｃｍ−１）、およびアミド吸収帯（１５５０〜１５６０ｃｍ−１）を有するか否かにより、確認される。
【００３１】
また、キトサナーゼ、キチナーゼ、セルラーゼなどの酵素分解パターンによる解析方法においては、キチナーゼおよびキトサナーゼ処理によってカオリン凝集活性が低下するが、セルラーゼ処理では、カオリン凝集活性が変化しないことにより、キチン・キトサン様物質であることが推定される。
【００３２】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明がこの実施例により制限されないことはいうまでもない。
【００３３】
（実施例１）
（キチン・キトサン生産微生物の担体への固定化）
以下の組成：
バクトトリプトン　　　　　１６．０ｇ
酵母エキス　　　　　　　　１０．０ｇ
ＮａＣｌ　　　　　　　　　　５．０ｇ
水　　　　　　　　　　　　　１Ｌ
の液体ＣＭ培地（ｐＨ７．２）１００ｍＬを含有する３００ｍＬ容三角フラスコを準備した。この培地に、多孔質担体としてＰＶＡゲル（商品名クラゲール：株式会社クラレ製）を用いた。このＰＶＡゲルは、直径４ｍｍの球状である。ＰＶＡゲルを見かけの体積で５０ｍＬ程度（約４００個）添加した後、オートクレーブにて１２１℃、２０分間滅菌した。培地を冷却後、シトロバクターＴＫＦ０４株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１６７２２）を一白金耳接種し、２８℃、１２０ｒｐｍで１１日間振盪培養した。培養終了後、無菌条件下で、培養液中からＰＶＡゲルのみを取り出した。得られたＰＶＡゲルを滅菌水で洗浄し、このＰＶＡゲルにシトロバクターＴＫＦ０４株が固定されていることを顕微鏡によって確認した。
【００３４】
（微生物固定化担体を用いた培養）
別に、以下の組成：
酢酸ナトリウム　　　　　　１０．０ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４　　　　　　　１．０ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４　　　　　　　　１．０ｇ
ＮａＣｌ　　　　　　　　　　０．０５ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　　　０．２ｇ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ　　　　０．０５ｇ
ＦｅＣｌ３　　　　　　　　　　０．０１ｇ
イーストエキス　　　　　　　０．１ｇ
水　　　　　　　　　　　　　１Ｌ
のキチン・キトサン生産培地（ｐＨ８．２）１００ｍＬを含有する３００ｍＬ容三角フラスコを準備した。得られた固定化微生物をこの培地に添加し、２８℃、１２０ｒｐｍで４日間振盪培養した。培養終了後、固定化微生物を除去した培養液１５ｍＬに２倍容量の冷エタノールを加えて、−２０℃で一晩静置し、沈殿物を遠心分離により回収し、さらに凍結乾燥することにより白色粉末を得た。この粉末のＦＴ−ＩＲスペクトルを図１に示す。この結果、得られた白色粉末は、キチン・キトサン様物質であることが確認できた。キチン・キトサン様物質の収量は、培養液１Ｌあたり、２．６７ｇであった。
【００３５】
（実施例２）
多孔質体として、ＰＶＡゲルの代わりに、一辺が２〜３ｍｍの角柱状で、孔径が７００μｍであるＰＶＡスポンジ（商品名マイクロブレス；アイオン株式会社製）を２０個用いた以外は、実施例１と同様にして、シトロバクターＴＫＦ０４株をＰＶＡスポンジに固定化した。得られた固定化微生物を、実施例１と同じキチン・キトサン生産培地に投入して培養した。固定化微生物を除去した培養液から得られたエタノール沈殿物を遠心分離して回収し、凍結乾燥をおこない、白色粉末を得た。この白色粉末のＦＴ−ＩＲスペクトルを図２に示す。その結果、この白色粉末がキチン・キトサン様物質であることが確認できた。キチン・キトサンの収量は、培養液１Ｌあたり３．３４ｇであった。
【００３６】
（実施例３）
液体ＣＭ培地１００ｍＬを含有する３００ｍＬ容メチルペンテン製三角フラスコを準備した。この培地に、多孔質担体として、ポリプロピレン発泡樹脂（以下ＰＰ発泡樹脂という；商品名　バイオステージ１０φ；筒中シート防水株式会社製）を２０個添加した以外は、実施例１と同様にして、シトロバクターＴＫＦ０４株をＰＰ発泡樹脂に固定化した。なお、このＰＰ発泡樹脂は、外径および長さが１０ｍｍの円筒状である。得られた固定化微生物を、実施例１と同じキチン・キトサン生産培地に投入して培養した。培養液から得られたエタノール沈殿物を遠心分離して回収し、凍結乾燥をおこない、白色粉末を得た。この白色粉末のＦＴ−ＩＲスペクトルを図３に示す。その結果、この白色粉末がキチン・キトサン様物質であることが確認できた。キチン・キトサンの収量は、培養液１Ｌあたり４．８５ｇであった。
【００３７】
（実施例４）
ＰＰ発泡樹脂の代わりに、直径が８ｍｍの球状の高強度セラミックス多孔質体（商品名、ポーラスビーズＲ型；日本車輌製造株式会社製）を２０個用いた以外は、実施例３と同様にして、シトロバクターＴＫＦ０４株を高強度セラミックスに固定化した。得られた固定化微生物を、実施例１と同じキチン・キトサン生産培地に投入して培養した。培養液から得られたエタノール沈殿物を遠心分離して回収し、凍結乾燥をおこない、白色粉末を得た。この白色粉末のＦＴ−ＩＲスペクトルを図４に示す。その結果、この白色粉末がキチン・キトサン様物質であることが確認できたが、不純物も含まれていることが確認された。この不純物は、セラミックス多孔球が磨耗により生じたものと考えられる。キチン・キトサンの収量は、培養液１Ｌあたり４．７７ｇ／Ｌであった。
【００３８】
【発明の効果】
担体（好ましくは多孔質担体）に固定化されたキチン・キトサン生産微生物を用いることにより、キチン・キトサン様物質の収量は、固定化しない場合の５００ｍｇ／Ｌ培養液よりもはるかに大きく、２．５ｇ／Ｌ培養液以上であり、３ｇ／Ｌ培養液以上、あるいは４．５ｇ／Ｌ培養液以上にも達する。菌体外に物質を分泌する微生物を固定化した場合、一般には、表面積の関係などから、その生産量が低下すると考えられるが、逆に向上するという、予測できない結果が得られた。さらに、固定化することにより、培養液からキチン・キトサン生産微生物を除去する工程が不要となる、繰り返し使用することができるなどの利点がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】多孔質ＰＶＡゲルに固定化された微生物の培養によって得られた粉末のＦＴ−ＩＲスペクトルである。
【図２】多孔質ＰＶＡスポンジに固定化された微生物の培養によって得られた粉末のＦＴ−ＩＲスペクトルである。
【図３】多孔質ポリプロピレン発泡樹脂に固定化された微生物の培養によって得られた粉末のＦＴ−ＩＲスペクトルである。
【図４】多孔質セラミックスに固定化された微生物の培養によって得られた粉末のＦＴ−ＩＲスペクトルである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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