(57)【要約】【課題】紫外線暴露により引き起こされる各種疾病、例えば、白内障、皮膚癌、皮膚におけるしわやしみなどを予防又は改善する組成物を提供すること。【解決手段】大豆由来のサポニン、ケール及び／又はその抽出物からなるプロテアソーム活性促進作用を有する成分を有効成分として含む紫外線傷害予防又は改善用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆由来のサポニンを含むことを特徴とする紫外線傷害予防又は改善用組成物。
【請求項２】
ケール及び／又はその抽出物を含むことを特徴とする紫外線傷害予防又は改善用組成物。
【請求項３】
プロテアソーム活性促進作用を有する成分を含むことを特徴とする紫外線傷害予防又は改善用組成物。
【請求項４】
プロテアソーム活性促進作用を有する成分が大豆由来のサポニンである請求項３記載の組成物。
【請求項５】
プロテアソーム活性促進作用を有する成分がケール及び／又はその抽出物である請求項３記載の組成物。
【請求項６】
プロテアソーム活性促進作用を有する成分を含むことを特徴とする紫外線による皮膚老化防止用組成物。
【請求項７】
経口用又は非経口用である、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
食品の形態である請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
化粧料の形態である請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
医薬の形態である請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、紫外線に暴露されるあるいは暴露された生体組織、特に皮膚に対して、紫外線による傷害を予防又は改善することのできる紫外線傷害予防又は改善用組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、活性酸素による生体内の細胞や組織で見られる様々な酸化傷害が問題になっている。活性酸素は非常に反応性が高く、生体の様々な成分を破壊し、脳卒中、心筋梗塞、白内障、リウマチ、癌、胃潰瘍、皮膚におけるしわやしみなどの様々な疾患に関与することが明らかになっている（非特許文献１）。活性酸素を増加させる要因として、加齢、過度の運動、紫外線暴露、精神的ストレスなどが知られている。活性酸素が増加すると、生体内に酸化タンパク質、いわゆる異常タンパク質が蓄積し、前述したような様々な疾患を引き起こす（非特許文献２）。皮膚においては、特に紫外線暴露による酸化障害の影響が大きく、紫外線暴露により、表皮角化細胞や皮膚線維芽細胞のＤＮＡ損傷、皮膚の弾性成分であるエラスチンやコラーゲンの分解などが起こり、しわやしみの形成を促進することが知られている（非特許文献３）。
【０００３】
これまで、活性酸素による酸化障害を防ぐために、抗酸化物質の摂取、適用により生体内の活性酸素を消去し、タンパク質の酸化を抑制するという試みがなされてきた。代表的な抗酸化物質として、トコフェロール類、カロテノイド類及びフラボノイド類などが知られており、これらのいくつかは食品や化粧品に配合されて利用されている。
しかしながら、抗酸化物質の摂取、適用は、生体内で発生する活性酸素の消去には関与するが、既に蓄積している異常タンパク質の除去には全く関与しない。したがって、生体内に蓄積した異常タンパク質が関与する種々の疾病の改善をするには蓄積している異常タンパク質の除去が必須となる。
【０００４】
生体内の異常タンパク質を除去する酵素として、プロテアソームが知られている。プロテアソームは複雑な分子構成をした巨大な多成分複合体であり、近年その生体内における生理機能の研究が注目されている。プロテアソームは、タンパク質が立体構造を形成する過程で正常な折り畳みや分子集合に支障をきたした異常タンパク質の除去を行い、タンパク質の品質管理の役割を担うとともに、紫外線や酸化ストレスなどにより、変性や傷害を受けたタンパク質を除去することにより、ストレス応答にも密接に関係している（非特許文献４）。このように、プロテアソームは異常タンパク質を除去することにより、細胞の恒常性を維持、監視する中心的役割を担う物質である。
【０００５】
以上のようなことから、生体内のプロテアソーム活性を促進し、種々の疾病を予防及び改善する組成物が開発されている。例えば、マンネンタケの抽出物を含むプロテアソーム活性促進剤（特許文献１）、特定のペプチド化合物を含むプロテアソーム作用増強剤（特許文献２）、プロテアソーム活性促進作用をもつ大豆由来サポニンを含む異常タンパク質除去用組成物（特許文献３）、及びケール及び／又はその抽出物を含むプロテアソーム活性促進用組成物（特願２００２−２５５４４９）が開発されている。
【０００６】
【特許文献１】
特開２００２−２９９９６号公報
【特許文献２】
国際公開００／０４０４２号パンフレット
【特許文献３】
特開２００２−１７９５９２号公報
【非特許文献１】
老化のメカニズムと制御、藤本大三郎編著、株式会社アイピーシー、平成５年６月３０日
【非特許文献２】
ＢＩＯ　Ｃｌｉｎｉｃａ、１１巻、第５号、１９９６年
【非特許文献３】
化粧品の有用性・評価技術の進歩と将来展望、日本化粧品技術者会編、薬事日報社、２００１年３月３１日
【非特許文献４】
蛋白質　核酸　酵素、第４４巻、第６号、７６６〜７７５頁、１９９９年、共立出版社
【非特許文献５】
薬用天然物化学・第２版、奥田拓男編、廣川書店、平成１３年２月２５日
【非特許文献６】
Ｈａｙａｓｈｉ，ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ａｇｅｉｎｇａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１０２，ｐ５５−６６，１９９８
【非特許文献７】
治療学，第３２巻，第４号，５８〜６１頁，１９９８年
【非特許文献８】
Ｎａｋａｍｕｒａ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１９９，ｐ７６８−７７４，１９９６
【非特許文献９】
Ｎａｋａｍｕｒａ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１９９，ｐ７６８−７７４，１９９６
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は生体組織、特に皮膚に生じる又は生じた紫外線による傷害を効率的に予防又は改善できる紫外線傷害予防又は改善用組成物を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、プロテアソーム活性促進成分に関して、紫外線傷害を予防又は改善する作用を検討した結果、プロテアソーム活性促進成分が紫外線による傷害を有意に予防又は改善することを見出し、本発明を完成した。前記のとおり、プロテアソーム活性促進成分が生体内の異常タンパク質を除去することは知られていたが、プロテアソーム活性促進成分が、紫外線傷害を予防又は改善する作用をもつことはこれまで知られていなかった。本発明は、プロテアソーム活性促進成分、例えば大豆由来サポニンやケール及び／又はその抽出物を紫外線障害予防又は改善用組成物の有効成分として用いることを特徴とする。さらに本発明は、それらのプロテアソーム活性促進成分が紫外線障害による皮膚の老化も防止しうることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、
１．大豆由来のサポニンを含むことを特徴とする紫外線傷害予防又は改善用組成物、
２．ケール及び／又はその抽出物を含むことを特徴とする紫外線傷害予防又は改善用組成物、
３．プロテアソーム活性促進作用を有する成分を含むことを特徴とする紫外線傷害予防又は改善用組成物、
４．プロテアソーム活性促進作用を有する成分が大豆由来のサポニンである３記載の組成物、
５．プロテアソーム活性促進作用を有する成分がケール及び／又はその抽出物である３記載の組成物、
６．プロテアソーム活性促進作用を有する成分を含むことを特徴とする紫外線による皮膚の老化防止用組成物、
７．経口用又は非経口用である、１〜６のいずれかに記載の組成物、
８．食品の形態である１〜６のいずれかに記載の組成物、
９．化粧料の形態である１〜６のいずれかに記載の組成物、及び
１０．医薬の形態である１〜６のいずれかに記載の組成物、
に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の組成物は、プロテアソーム活性促進作用を有し、かつ、紫外線傷害予防又は改善作用を有する成分を有効成分とする。プロテアソーム活性促進作用は、種々の方法で測定できることが報告されており、例えば、蛍光標識したペプチド基質を用いて、細胞抽出物中のプロテアソーム活性を蛍光強度の測定により、評価できる。また、紫外線傷害抑制作用は種々の方法で測定できることが報告されており、例えば、皮膚由来の線維芽細胞に一定量の紫外線を照射し、薬剤処理の有無の場合で、生存細胞数や乳酸脱水素酵素活性を比較することにより測定できる。このような成分は、特に限定されないが、好適なものとして大豆由来のサポニン及びケール及び／又はその抽出物が挙げられる。
【００１１】
本発明で使用される大豆由来のサポニンは、大豆種子中の種皮、子葉、胚軸又は大豆植物体の葉、茎、根などに広く分布する。大豆由来のサポニンはグリチルリチンと類似の構造のものであり、トリテルペノイドサポニンに分類される。大豆サポゲノールＢをアグリコンとするサポニンで、大豆サポニンＩ、ＩＩ及びＩＩＩなどが知られている。抗脂質酸化作用が認められている（非特許文献５）。本発明に用いる大豆由来のサポニンは、大豆サポゲノールＢ、大豆サポニンＩ、ＩＩ及びＩＩＩなど、すべての大豆由来のサポニンを含み、さらに、大豆由来のサポニンのある特定の種類を高含有したようなものでも良い。本発明に用いる大豆由来のサポニンは、乾燥粉末及びエタノール、ジメチルスルホキシドなどの有機溶媒を用いて溶解した溶解物などの形状で用いることができる。一般に、サポニンは溶血性を示すものが多いが、本発明者が大豆由来のサポニンの家兎２％血液浮遊液に対する溶血指数を測定したところ、人参サポニンと同様に１００以下であり、溶血性を示さなかった。
【００１２】
本発明で使用されるケール（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｏｌｅｒａｃｅａ　ｖａｒ．ａｃｅｐｈａｌａ　ＤＣ．）は、アブラナ科の植物でもともと南ヨーロッパ原産の野菜であり、キャベツの原種といわれている。本発明においては、キッチンケール、マローケール、ブッシュケール、ツリーケール、コラード及び緑葉カンランなどの種々のケールを用いることができる。本発明におけるケールは、通常食用として供されている葉又は茎、花、根などのすべての部位が適用できる。栽培方法や栽培地も特に限定されない。
【００１３】
本発明に用いるケール及びその抽出物としては、ケール乾燥粉末、ケールの細片化物及びその乾燥粉末、ケールの搾汁及びその乾燥粉末、ケールの抽出物及びその乾燥粉末などが挙げられる。ケールの抽出物には、水又はアルコール、エーテル、アセトンなどの有機溶媒により抽出した粗抽出物、及び粗抽出物を分配、カラムクロマトなどの各種クロマトグラフィーなどで段階的に精製して得られた抽出物画分などが含まれる。これらは単独で用いても良く、２種以上混合して用いても良い。本発明に用いるケール及びその抽出物は、天然物であるためその毒性は低く、有害な副作用などは報告されていない。
【００１４】
本発明の組成物は、紫外線暴露により発生した活性酸素により産生された細胞内の変性タンパク質（異常タンパク質）を効率良く分解し、紫外線暴露による細胞傷害を抑制することにより、白内障、皮膚癌、皮膚におけるしわやしみなどの様々な疾患を予防及び改善することができる。
本発明の紫外線傷害予防又は改善用組成物は、食品、化粧料、経口用あるいは非経口用の医薬の形態として製造することができる。
【００１５】
食品としては、大豆由来サポニン、ケール又はその抽出物などを直接、又は種々の栄養成分を添加して使用できる。例えば、澱粉、乳糖、麦芽糖、植物油脂粉末、カカオ脂末、ステアリン酸などの適当な助剤を添加した後、慣用の手段を用いて、食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペーストなどに成形して健康補助食品、保健機能食品などとして、食用に供してもよく、また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージなどの食肉加工食品、かまぼこ、ちくわなどの水産加工食品、パン、菓子、バター、粉乳、発酵乳製品に添加して使用してもよく、水、果汁、牛乳、清涼飲料などの飲料に添加して使用してもよい。
【００１６】
化粧料としては、大豆由来サポニン、ケール又はその抽出物を直接又は小麦胚芽油あるいはオリーブ油などに添加して、化粧料成分として使用し、これらを用いて化粧料を製造することができる。
【００１７】
医薬としての適用方法は、経口投与又は非経口投与のいずれも採用することができる。投与に際しては、有効成分を経口投与、直腸内投与、注射などの投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与することができる。
【００１８】
非経口適用の組成物は、例えば水溶液、油剤、乳液、懸濁液等の液剤、ゲル、クリーム等の半固形剤、粉末、顆粒、カプセル、マイクロカプセル、固形等の固形剤の形態で適用可能である。従来から公知の方法でこれらの形態に調製し、ローション剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏、硬膏、ハップ剤、エアゾール剤、坐剤、注射剤、粉末剤等の種々の剤型とすることができる。これらを身体に塗布、貼付、噴霧等により適用することができる。特にこれら剤型の中で、ローション剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、ハップ剤、エアゾール剤等が皮膚外用剤に適している。化粧料としては、化粧水、乳液、クリーム、パック等の皮膚化粧料、メイクアップベースローション、メイクアップクリーム、乳液状又はクリーム状あるいは軟膏型のファンデーション、口紅、アイカラー、チークカラーといったメイクアップ化粧料、ハンドクリーム、レッグクリーム、ボディローション等の身体用化粧料等とすることができる。
【００１９】
本発明における紫外線傷害予防又は改善作用を有する成分の有効投与量は、被投与者の年齢、体重、症状の程度、投与経路、投与スケジュール、製剤形態などにより、適宜決定することができる。例えば、大豆由来サポニンを経口投与する場合は、通常成人換算で乾燥重量として０．０１〜９ｇ／体重ｋｇの範囲で、ケール又はその抽出物を経口投与する場合は、通常成人換算で乾燥重量として０．１ｇ／体重ｋｇ以上の範囲で、適宜調節して、１日１回又は数回に分けて投与することができる。
【００２０】
本発明における紫外線傷害予防又は改善用組成物への有効配合量は、成分の調製法、製剤の形態などにより、適宜選択、決定され、特に限定されないが、例えば、大豆由来のサポニンを用いる場合は、乾燥重量として０．０１〜６０重量％、ケール又はその抽出物を用いる場合は、乾燥重量として０．１〜６０重量％が適当である。
【００２１】
本発明の組成物には、適用形態に応じて、適宜、植物油のような油脂類、高級脂肪酸、高級アルコール、シリコーン、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤、防腐剤、糖類、金属イオン封鎖剤、水溶性高分子のような高分子、増粘剤、粉体成分、紫外線吸収剤、紫外線遮断剤、保湿剤、香料、ｐＨ調整剤等を含有させることができる。ビタミン類、皮膚賦活剤、血行促進剤、活性酸素消去剤、抗炎症剤、美白剤、殺菌剤等の他の薬効成分、生理活性成分を含有させることもできる。
【００２２】
油脂類としては、例えば、ツバキ油、月見草油、マカデミアナッツ油、オリーブ油、ナタネ油、トウモロコシ油、ゴマ油、ホホバ油、胚芽油、小麦胚芽油、トリオクタン酸グリセリン、等の液体油脂、カカオ脂、ヤシ油、硬化ヤシ油、パーム油、パーム核油、モクロウ、モクロウ核油、硬化油、硬化ヒマシ油等の固体油脂、ミツロウ、キャンデリラロウ、綿ロウ、ヌカロウ、ラノリン、酢酸ラノリン、液状ラノリン、サトウキビロウ等のロウ類が挙げられる。
【００２３】
炭化水素類としては、例えば、流動パラフィン、スクワレン、スクワラン、マイクロクリスタリンワックス等が挙げられる。
【００２４】
高級脂肪酸として、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）等が挙げられる。
【００２５】
高級アルコールとして、例えば、ラウリルアルコール、ステアリルアルコール、セチルアルコール、セトステアリルアルコール等の直鎖アルコール、モノステアリルグリセリンエーテル、ラノリンアルコール、コレステロール、フィトステロール、オクチルドデカノール等の分枝鎖アルコール等が挙げられる。
【００２６】
シリコーンとして、例えば、鎖状ポリシロキサンのジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン等、環状ポリシロキサンのデカメチルシクロペンタシロキサン等が挙げられる。
【００２７】
アニオン界面活性剤として、例えば、ラウリン酸ナトリウム等の脂肪酸塩、ラウリル硫酸ナトリウム等の高級アルキル硫酸エステル塩、ＰＯＥラウリル硫酸トリエタノールアミン等のアルキルエーテル硫酸エステル塩、Ｎ−アシルサルコシン酸、スルホコハク酸塩、Ｎ−アシルアミノ酸塩等が挙げられる。
【００２８】
カチオン界面活性剤として、例えば、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム等のアルキルトリメチルアンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム等が挙げられる。
【００２９】
両性界面活性剤として、例えば、アルキルベタイン、アミドベタイン等のベタイン系界面活性剤等が挙げられる。
【００３０】
非イオン界面活性剤として、例えば、ソルビタンモノオレエート等のソルビタン脂肪酸エステル類、硬化ヒマシ油誘導体が挙げられる。
【００３１】
防腐剤として、例えば、メチルパラベン、エチルパラベン等を挙げることができる。
金属イオン封鎖剤として、例えばエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、エデト酸、エデト酸ナトリウム塩等のエデト酸塩を挙げることができる。
【００３２】
高分子として、例えば、アラビアゴム、トラガカントガム、ガラクタン、グアーガム、カラギーナン、ペクチン、寒天、クインスシード、デキストラン、プルラン、カルボキシメチルデンプン、コラーゲン、カゼイン、ゼラチン、メチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）、アルギン酸ナトリウム、カルボキシビニルポリマー（ＣＡＲＢＯＰＯＬ等）等のビニル系高分子、等を挙げることができる。
【００３３】
増粘剤として、例えば、カラギーナン、トラガカントガム、クインスシード、カゼイン、デキストリン、ゼラチン、ＣＭＣ、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシビニルポリマー、グアーガム、キサンタンガム、ベントナイト等を挙げることができる。
【００３４】
粉末成分としては、例えば、タルク、カオリン、雲母、シリカ、ゼオライト、ポリエチレン粉末、ポリスチレン粉末、セルロース粉末、無機白色顔料、無機赤色系顔料、酸化チタンコーテッドマイカ、酸化チタンコーテッドタルク、着色酸化チタンコーテッドマイカ等のパール顔料、赤色２０１号、赤色２０２号等の有機顔料を挙げることができる。
【００３５】
紫外線吸収剤としては、例えば、パラアミノ安息香酸、サリチル酸フェニル、パラメトキシケイ皮酸イソプロピル、パラメトキシケイ皮酸オクチル、２，４−ジヒドロキシベンゾフェノン、等を挙げることができる。
【００３６】
紫外線遮断剤として、例えば、酸化チタン、タルク、カルミン、ベントナイト、カオリン、酸化亜鉛等を挙げることができる。
【００３７】
保湿剤として、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、１，２−ペンタンジオール、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、キシリトール、マルチトール、マルトース、ソルビトール、ブドウ糖、果糖、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、ピロリドンカルボン酸、シクロデキストリン等が挙げられる。
【００３８】
薬効成分としては、例えば、ビタミンＡ油、レチノール等のビタミンＡ類、リボフラビン等のビタミンＢ２類、ピリドキシン塩酸塩等のＢ６類、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸モノパルミチン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸ジパルミチン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド等のビタミンＣ類、パントテン酸カルシウム等のパントテン酸類、ビタミンＤ２、コレカルシフェロール等のビタミンＤ類；α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、ニコチン酸ＤＬ−α−トコフェロール等のビタミンＥ類等のビタミン類を挙げることができる。
【００３９】
プラセンタエキス、グルタチオン、ユキノシタ抽出物等の美白剤、ローヤルゼリー、ブナノキエキス等の皮膚賦活剤、カプサイシン、ジンゲロン、カンタリスチンキ、イクタモール、カフェイン、タンニン酸、γ−オリザノール等の血行促進剤、グリチルリチン酸誘導体、グリチルレチン酸誘導体、アズレン等の消炎剤、アルギニン、セリン、ロイシン、トリプトファン等のアミノ酸類、常在菌コントロール剤のマルトースショ糖縮合物、塩化リゾチーム等を挙げることができる。
【００４０】
さらに、本発明組成物に配合するものとして、カミツレエキス、パセリエキス、ブナノキエキス、ワイン酵母エキス、グレープフルーツエキス、スイカズラエキス、コメエキス、ブドウエキス、ホップエキス、コメヌカエキス、ビワエキス、オウバクエキス、ヨクイニンエキス、センブリエキス、メリロートエキス、バーチエキス、カンゾウエキス、シャクヤクエキス、サボンソウエキス、ヘチマエキス、トウガラシエキス、レモンエキス、ゲンチアナエキス、シソエキス、アロエエキス、ローズマリーエキス、セージエキス、タイムエキス、茶エキス、海藻エキス、キューカンバーエキス、チョウジエキス、ニンジンエキス、マロニエエキス、ハマメリスエキス、クワエキス等の各種抽出物を挙げることができる。
【００４１】
次に、実施例と参考例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
［大豆由来サポニン含有液の調製］
トキワ漢方製薬社製の大豆由来サポニンを５０％エタノールにより、１０ｍｇ／ｍｌに調製した。使用時に、５０％エタノールにより適当な濃度に希釈して各試験に用いた。
【００４２】
［正常ヒト皮膚線維芽細胞の培養］
新生児由来正常ヒト皮膚線維芽細胞；ＮＨＦＢ（三光純薬）を線維芽細胞用培地；ＦＢＭ（三光純薬）で３７℃−５％ＣＯ２インキュベーターにて培養した。ＦＢＭは、線維芽細胞基礎培地にヒト線維芽細胞増殖因子（１μｇ／ｍｌ）、インシュリン（５ｍｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、アンフォテリシンＢ（５０μｇ／ｍｌ）を添加したものである。本実験には継代数が３〜７代の細胞を使用した。
【００４３】
［大豆由来サポニン含有液の紫外線傷害抑制作用の測定］
細胞を２４ウェルプレートに５×１０４個／ウェルで播種し、２４時間培養した。大豆由来サポニン含有液を最終濃度が１、３、５及び１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、２４時間培養した。培養液を廃棄し、細胞をＰＢＳ（−）で洗浄後、再度ＰＢＳ（−）を添加し、プレートに蓋をしない状態でＵＶＢを５０ｍＪ／ｃｍ２で照射した。対照として、ＵＶＢを照射しない群の細胞も作製した。さらに２４時間培養後、顕微鏡下で細胞形態の変化を観察し、写真撮影した。
【００４４】
写真撮影後、各ウェルの培養上清液を回収し、１，２００ｒｐｍ、５分間遠心して浮遊細胞を除去した後、１５，０００ｒｐｍ、３０分間遠心して細胞片を除去した。この培養上清液を用いて、細胞膜に傷害を受けた細胞から遊離される乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性を測定することにより、細胞毒性を測定した。ＬＤＨ活性の測定は、ＬＤＨ−細胞毒性テストキット（和光純薬）を用いてプロトコールに従って行った。具体的には、ＰＢＳ（−）を用いて適当に希釈した培養上清液を９６ウェルの反応プレートに分注後、発色液を処理し、室温で２０分間反応させた。反応停止液を添加後、マイクロプレートリーダーにより５６０ｎｍの吸光度を測定し、細胞毒性を評価した。結果は大豆由来サポニン含有液を各濃度で処理した３試料の測定値から、平均±標準誤差を計算し、グラフ化した。
【００４５】
大豆由来サポニン含有液を１０μｇ／ｍｌで処理した場合の細胞の形態変化を写真撮影した結果を図１に示す。ＵＶＢ非照射の場合は、無処理に比べて大豆由来サポニン含有液を処理すると、紡錘形の細胞が多くみられた。ＵＶＢ照射の場合は、無処理では細胞が偏平化し、分裂、凝集化した核が見られたのに対して、大豆由来サポニン含有液を処理した場合は、細胞の偏平化、核の分裂、凝集化が抑制された。
【００４６】
ＬＤＨ活性を測定した結果を図２に示す。大豆由来サポニン含有液を無処理で、ＵＶＢ非照射の場合を１００％として表した。ＵＶＢ非照射の場合は、大豆由来サポニン含有液処理の有無に関わらず、同程度のＬＤＨ活性で、細胞毒性はみられなかった。一方、ＵＶＢを５０ｍＪ／ｃｍ２で照射した場合は、無処理の時のＬＤＨ活性が約１６０％であったのに対して、大豆由来サポニン含有液を処理した場合は、濃度依存的に有意にＬＤＨ活性の低下がみられ、細胞毒性を抑制することが明らかになった。
【００４７】
［大豆由来サポニン含有液のプロテアソーム活性促進作用の測定］
細胞を２４ウェルプレートに５×１０４個／ウェルで播種し、２４時間培養した。大豆由来サポニン含有液を最終濃度が１、３、５及び１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、２４時間培養した。培養液を廃棄し、細胞をＰＢＳ（−）で洗浄後、再度ＰＢＳ（−）を添加し、プレートに蓋をしない状態でＵＶＢを５０ｍＪ／ｃｍ２で照射した。対照として、ＵＶＢを照射しない群の細胞も作製した。さらに２４時間培養後、公知の方法（非特許文献６）により細胞から抽出したプロテアソーム溶液を試料として用い、本試験を行った。
トリプシン様プロテアソーム活性を測定するための基質として、ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルギニル−４−メチル―クマリル―７−アミド（ペプチド研究所）を用い、キモトリプシン様プロテアソーム活性を測定するための基質として、サクシニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリル−Ｌ−チロシル−４−メチル―クマリル―７−アミド（ペプチド研究所）を用いた。０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で調製した１００μＭの基質溶液１０．５μｌに、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で調製したプロテアソーム溶液３９．５μｌを加えて、３７℃、１時間反応させた。遊離した７−アミノ−４−メチルクマリンの蛍光強度を励起波長（Ｅｘ）３８０ｎｍ、吸収波長（Ｅｍ）４４０ｎｍで測定した。結果は大豆由来サポニン含有液を各濃度で処理した３試料の測定値から、平均±標準誤差を計算し、グラフ化した。
【００４８】
トリプシン様プロテアソーム活性を測定した結果を図３に示す。大豆由来サポニン含有液は、ＵＶＢ照射の有無に関わらず、濃度依存的にトリプシン様プロテアソーム活性を促進した。ＵＶＢ照射の有無で、プロテアソームの活性化率を比較すると、ＵＶＢ非照射の場合は、大豆由来サポニン含有液を５及び１０μｇ／ｍｌで処理した時のプロテアソームの活性化率は、いずれも約１６５％であるが、ＵＶＢ照射の場合はそれぞれ約１７５％、約１８５％で、プロテアソームの活性化率がより高いことが明らかになった。
【００４９】
キモトリプシン様プロテアソーム活性を測定した結果を図４に示す。大豆由来サポニン含有液は、ＵＶＢ照射の有無に関わらず、濃度依存的にキモトリプシン様プロテアソーム活性を促進した。ＵＶＢ照射の有無で、プロテアソームの活性化率を比較すると、ＵＶＢ非照射の場合は、大豆由来サポニン含有液を１，３，５及び１０μｇ／ｍｌで処理した時のプロテアソームの活性化率は、それぞれ約１１５％、約２０５％、約２４０％及び約２６０％であるが、ＵＶＢ照射の場合は約１７５％、約２４５％、約３８０％及び約４２０％で、プロテアソームの活性化率がより高いことが明らかになった。
【００５０】
［大豆由来サポニン含有液のカルボニル化タンパク質産生抑制作用の測定］
カルボニル化タンパク質は酸化タンパク質の一種で、生体内における老化の指標の一つとして知られている。薬剤を処理した時の生体内のカルボニル化タンパク質を測定することにより、その薬剤の老化抑制の作用を試験することができる（非特許文献７）。例えば、薬剤を処理した皮膚線維芽細胞に紫外線を照射し、細胞内のカルボニル化タンパク質を公知の方法（非特許文献８）で測定することにより、その薬剤の老化抑制の作用を試験することができる。
【００５１】
本試験では下記のとおりの方法で試験を行った。細胞を２４ウェルプレートに５×１０４個／ウェルで播種し、２４時間培養した。大豆由来サポニン含有液を最終濃度が１、５及び１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、２４時間培養した。培養液を廃棄し、細胞をＰＢＳ（−）で洗浄後、再度ＰＢＳ（−）を添加し、プレートに蓋をしない状態でＵＶＢを５０ｍＪ／ｃｍ２で照射した。対照として、ＵＶＢを照射しない群の細胞も作製した。さらに２４時間培養後、細胞をＰＢＳ（−）で洗浄後、５００μｌの細胞抽出液｛５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．０５％　Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ｝を加えて溶解した。１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心後、その上清について解析を行った。
【００５２】
カルボニル化タンパク質は、酸化傷害により生じたタンパク質のカルボニル基に特異的に結合する２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）を用いてカルボニル化タンパク質を標識後、ＤＮＰＨに特異的に結合する抗ＤＮＰＨ抗体を用いて検出した。具体的な方法は以下のとおりである。サンプル中のタンパク質を公知の方法（非特許文献９）によりＤＮＰＨ化した。ＤＮＰＨ化したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、タンパク質転写装置を用いてニトロセルロース膜に転写した。転写後の膜をブロッキング溶液｛５％のスキムミルクを含むＰＢＳ（−）｝に浸し、室温で１時間ブロッキングした。洗浄液｛０．１％のＢＳＡ及び０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含むＰＢＳ｝で洗浄後、一次抗体溶液｛洗浄液で１μｇ／ｍｌに調製したＤＮＰＨに対する抗体（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）｝に浸し、室温で１８時間反応させた。洗浄後、二次抗体溶液｛洗浄液で１μｇ／ｍｌに調製したビオチン化抗ラビットイムノグロブリンＧ（ＶＥＣＴＯＲ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）｝に浸し、室温で１時間反応させた。洗浄後、酵素溶液｛洗浄液で１μｇ／ｍｌに調製したアルカリフォスファターゼアビジンＤ（ＶＥＣＴＯＲ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ））に浸し、室温で１時間反応させた。洗浄後、基質液｛ＢＣＩＰ／ＮＢＴｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｋｉｔ　（ＶＥＣＴＯＲ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）｝に浸し、室温で１５分間反応させた。
結果を図５に示す。大豆由来サポニン無処理の場合は、ＵＶＢ非照射に比べて、ＵＶＢを照射すると、図中に矢印で示したカルボニル化タンパク質の増加が見られたが、大豆由来サポニン含有液を５及び１０μｇ／ｍｌの濃度で処理した場合は、図中に矢印で示したカルボニル化タンパク質が有意に低下することが明らかになった。
【００５３】
【参考例】
［ケールのエタノール抽出物の調製］
ケールの葉を９０℃で乾燥させた後、粉砕した。その粉砕物４ｋｇを電熱式水浴機で加熱還流しながら、９９．５％エタノール（和光純薬工業）２０Ｌを用いて抽出を行った。その後、ロータリーエバポレーターで濃縮乾固することにより、ケール抽出物８０ｇを得た。９９．５％エタノールにより、１０ｍｇ／ｍｌに調製し、使用時に適当な濃度に希釈して各試験に用いた。
【００５４】
［肝細胞の培養］
本実験では株化したラット肝細胞（Ｃｌｏｎｅ　９）を用いた。細胞は、牛胎児血清を１０％（容量／容量）の濃度で含む培地｛Ｆ−１２Ｋ　Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｋａｉｇｈｎ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）｝を用いて、３７℃−５％ＣＯ２インキュベーターにて培養し、増殖させた。細胞に薬剤を処理する場合は、血清の影響を最小限に抑えるために血清を０．５％（容量／容量）の濃度で含む培地を使用した。
【００５５】
［ケール抽出物のプロテアソーム活性促進作用の測定］
細胞を２４穴プレートに５×１０４個／ウェルで播種し、２４時間培養した。ケール抽出物を最終濃度が０．１、１．０、１０．０、１００．０μｇ／ｍｌとなるように添加し、２４時間培養後、公知の方法（非特許文献６）により細胞から抽出したプロテアソーム溶液を試料として用いた。
トリプシン様プロテアソーム活性を測定するための基質として、ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルギニル−４−メチル―クマリル−７−アミド（ペプチド研究所）を用い、キモトリプシン様プロテアソーム活性を測定するための基質として、サクシニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリル−Ｌ−チロシル−４−メチル―クマリル―７−アミド（ペプチド研究所）を用いた。０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で調製した１００μＭの基質溶液１０．５μｌに、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で調製したプロテアソーム溶液３９．５μｌを加えて、３７℃、１時間反応させた。遊離した７−アミノ−４−メチルクマリンの蛍光強度を励起波長（Ｅｘ）３８０ｎｍ、吸収波長（Ｅｍ）４４０ｎｍで測定した。結果はケール抽出物を各濃度で処理した３試料の測定値から、平均±標準誤差を計算し、グラフ化した。
トリプシン様プロテアソーム活性を測定した結果を図６に、キモトリプシン様プロテアソーム活性を測定した結果を図７に示す。ケール抽出物は、トリプシン様プロテアソーム活性及びキモトリプシン様プロテアソーム活性のいずれにおいても濃度依存的にプロテアソーム活性を促進した。
【００５６】
以下に処方例を示す。
［処方例１］クリーム
下記の処方（単位は質量％）により、クリームを製造した。
（１）ステアリルアルコール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６．０％
（２）ステアリン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．０％
（３）水添ラノリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４．０％
（４）スクワラン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９．０％
（５）オクチルドデカノール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０％
（６）ＰＯＥ（２５）セチルアルコールエーテル　　　　　　　　　　　　３．０％
（７）モノステアリン酸グリセリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．０％
（８）大豆由来サポニン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０％
（９）防腐剤　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
（１０）香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
（１１）１，３ブチレングリコール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６．０％
（１２）ＰＥＧ　１５００　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４．０％
（１３）精製水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残余
上記成分（１）〜（１０）を８０℃に加熱溶解し油相とする。成分（１１）〜（１３）を７０℃に加熱溶解し水相とする。油相に水相を徐々に加え乳化し、攪拌しながら４０℃まで冷却し、さらに３０℃まで攪拌冷却してクリームを得た。
【００５７】
［処方例２］カプセル剤
下記の処方（単位は質量％）により、錠剤を製造した。
（１）大豆由来サポニン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０．０％
（２）乳糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６５．０％
（３）コーンスターチ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１４．０％
（４）グアーガム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０％
上記成分（１）〜（４）を混合し、ゼラチン及びグリセリンを混合したカプセル基剤中に充填し、軟カプセルを得た。
【００５８】
【発明の効果】
以上に説明したように、紫外線傷害予防又は改善作用を有する成分を含有する本発明の組成物は、紫外線暴露により生体内に生じた活性酸素が産生する異常タンパク質を効率良く分解することにより、これらの異常タンパク質が蓄積することにより生じる白内障、皮膚癌、皮膚におけるしわやしみなどを予防又は改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】紫外線暴露により皮膚線維芽細胞に生じる傷害を大豆由来のサポニンが抑制する作用を細胞の写真撮影により示す図である。
【図２】大豆由来のサポニンが紫外線暴露により生じる皮膚線維芽細胞の乳酸脱水素酵素活性を抑制する作用を示す図である。
【図３】大豆由来のサポニンが皮膚線維芽細胞のトリプシン様プロテアソーム活性を促進する作用を示す図である。
【図４】大豆由来のサポニンが皮膚線維芽細胞のキモトリプシン様プロテアソーム活性を促進する作用を示す図である。
【図５】大豆由来のサポニンが紫外線暴露により生ずる皮膚線維芽細胞のカルボニル化タンパク質の蓄積を抑制する作用を示す図である。
【図６】ケール抽出物がラット線維芽細胞のトリプシン様プロテアソーム活性を促進する作用を示す図である。
【図７】ケール抽出物がラット線維芽細胞のキモトリプシン様プロテアソーム活性を促進する作用を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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