(57)【要約】【課題】多種多様な細胞に分化誘導する体性幹細胞株（ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ）、及び体性幹細胞クローン（ｃｅｌｌ　ｃｌｏｎｅ）、並びにこれらの幹細胞を利用した分化誘導方法、さらに、該分化誘導方法により得られた生物材料、並びに動物個体を提供する。【解決手段】骨、軟骨、筋肉、筋様、胸腺上皮、神経膠、脂肪、造血系、及び神経系細胞に分化誘導可能なラットの胸腺由来の体性幹細胞株は、例えば、細胞分化や組織（臓器）再生の研究、再生医療等の基礎研究等に利用可能である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨、軟骨、筋肉、筋様、胸腺上皮、神経膠、脂肪、造血系、及び神経系細胞に分化誘導可能なラットの胸腺由来の体性幹細胞株。
【請求項２】
請求項１に記載の体性幹細胞株からクローニングされた体性幹細胞クローンであって、骨、軟骨、筋肉、筋様、胸腺上皮、神経膠、脂肪、造血系、及び神経系細胞に分化誘導可能な体性幹細胞クローン。
【請求項３】
請求項１に記載の体性幹細胞株を用いた、骨、軟骨、筋肉、筋様、胸腺上皮、神経膠、脂肪、造血系、及び神経系細胞のいずれかの細胞に分化誘導する分化誘導方法。
【請求項４】
請求項２に記載の体性幹細胞クローンを用いた、骨、軟骨、筋肉、筋様、胸腺上皮、神経膠、脂肪、造血系、及び神経系細胞のいずれかの細胞に分化誘導する分化誘導方法。
【請求項５】
請求項３または４に記載の分化誘導方法により、得られる生物材料。
【請求項６】
請求項１に記載の体性幹細胞株または請求項２に記載の体性幹細胞クローンを用いて、再構成した動物個体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、多種多様な細胞に分化する体性幹細胞株、該体性幹細胞株からクローニングされた体性幹細胞クローン、分化誘導方法、及び生物材料、並びに動物個体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
幹細胞は未分化の細胞であり、理論的には、全ての細胞に分化する能力を有していると考えられている。その中でも、特に、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、全ての組織に分化する能力を有する細胞として、細胞分化の研究や、臓器再生、再生医療等の基礎研究等に用いられている。
【０００３】
しかし、このＥＳ細胞は生殖細胞由来であるため、ＥＳ細胞を用いた研究には、生命倫理の問題や政策的な問題等が多く存在する。
【０００４】
そこで、上記研究のために、新たな幹細胞として、体性幹細胞が用いられるようになってきている。
【０００５】
従来、体性幹細胞は、ＥＳ細胞に比べて分化能がより限られていると考えられていた。しかし、近年、造血系、間葉系、神経系の幹細胞が、それぞれ血液、間葉系、神経系の組織だけでなく、肝臓（Ｌａｇａｓｓｅ　Ｅ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．　６：　１２２９−１２３４　（２０００）　）、腸（Ｃｌａｒｋｅ　Ｄ．Ｌ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８８，　１６６０−１６６３）、心臓及び骨格筋（Ｆｅｒｒａｒｉ　Ｇ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７９，１５２８−１５３０　（１９９８）　、Ｇｕｓｓｏｎｉ　Ｅ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ　４０１，　３９０−３９４　（１９９９）　）の組織に分化する報告がなされている。これらの報告は、いわゆる移植を通して、体性幹細胞を新しい環境にさらすことにより、体性幹細胞の制限された分化能を解放できることを示唆している。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
このように、体性幹細胞は、ＥＳ細胞を用いる場合のような倫理的、政策的な障害が全くないだけでなく、例えば、再生医療の際に、自己組織由来の体性幹細胞を用いて組織を再生し、その再生組織を移植する場合、免疫拒絶の問題が生じないという利点もある。
【０００７】
従って、体性幹細胞は、細胞分化や組織再生の研究、再生医療等の基礎研究、応用研究等を行う上で、さらに、分化条件の解析、分化誘導因子の検索決定、分化に関連する遺伝子の同定、マーカー検索、組織再生のメカニズムの解析等を研究する上で、非常に有用である。
【０００８】
そのため、より多くの新規な体性幹細胞を見出すとともに、これを利用した分化誘導方法等の開発が強く望まれていた。
【０００９】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、多種多様な細胞に分化誘導する体性幹細胞株（ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ）、及び体性幹細胞クローン（ｃｅｌｌ　ｃｌｏｎｅ）、並びにこれらの幹細胞を利用した分化誘導方法、さらに、該分化誘導方法により得られた生物材料、並びに動物個体を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、ラットの胸腺由来の細胞とＨＴＬＶ−Ｉ（Ｈｕｍａｎ　Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　ｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　Ｉ）の感染により生じたヒトＴ細胞株由来であって、Ｘ線を照射されている細胞とを共培養することにより、樹立された胸腺由来細胞株が、多種多様な細胞に分化することを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
即ち、本発明に係る体性幹細胞株は、骨、軟骨、筋肉、筋様、胸腺上皮、神経膠、脂肪、造血系、及び神経系細胞に分化誘導可能なラットの胸腺由来の体性幹細胞株である。
【００１２】
上記の体性幹細胞株（ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ）は、ＥＳ細胞のように、生殖細胞由来ではないため、利用に際して生命倫理の問題や政策的な問題等を考慮する必要はない。
【００１３】
また、ラットは実験動物・病態モデル動物として広く用いられていることから、ラットの胸腺由来の体性幹細胞等を用いることにより、細胞分化や組織再生の研究、再生医療等の基礎研究等だけでなく、さらに、分化条件の解析、分化誘導因子の検索決定、分化に関連する遺伝子の同定、マーカー検索、組織再生のメカニズムの解析等といった種々の研究に、容易に利用することができる。
【００１４】
なお、ここでいう「体性幹細胞」とは、胚以外の組織由来の幹細胞のことをいい、「幹細胞」とは、自己複製能と多分化能とを併せ持つ細胞をいう。また、「細胞株」（ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ）とは、試験管内で無限に増殖する能力を獲得した、単一でない細胞の集合体のことである。
【００１５】
また、本発明に係る体性幹細胞クローンは、上記の体性幹細胞株からクローニングされた体性幹細胞クローンであって、骨、軟骨、筋肉、筋様、胸腺上皮、神経膠、脂肪、造血系、及び神経系細胞に分化誘導可能な体性幹細胞クローン（ｃｅｌｌ　ｃｌｏｎｅ）である。
【００１６】
なお、「細胞クローン」とは、シングルセルクローニング等の従来公知の方法により、細胞株から単離された単一の細胞クローン（ｃｅｌｌ　ｃｌｏｎｅ）のことである。
【００１７】
また、本発明に係る分化誘導方法は、上記体性幹細胞株を用いた、骨、軟骨、筋肉、筋様、胸腺上皮、神経膠、脂肪、造血系、及び神経系細胞のいずれかの細胞に分化誘導する分化誘導方法である。
【００１８】
また、本発明に係る分化誘導方法は、上記体性幹細胞クローンを用いた、骨、軟骨、筋肉、筋様、胸腺上皮、神経膠、脂肪、造血系、及び神経系細胞のいずれかの細胞に分化誘導する分化誘導方法である。
【００１９】
また、本発明に係る生物材料は、上記の分化誘導方法により、得られた生物材料である。なお、ここでいう、「生物材料」とは、細胞、細胞塊、組織、器官等の他、これら細胞等から取得されるＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、多糖を含むものをいう。
【００２０】
また、本発明に係る動物個体は、上記体性幹細胞株または体性幹細胞クローンを用いて、再構成した動物個体である。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２２】
本発明は、多種多様な細胞、組織に分化することができる体性幹細胞を取得するとともに、これらの体性幹細胞を用いた分化誘導方法を提案するものである。そこで以下に、本発明に係る体性幹細胞株及び体性幹細胞クローン、並びにこれらの体性幹細胞を用いた分化誘導方法、生物材料について説明し、次いでこれらの利用方法について説明することとする。
【００２３】
（１）本発明に係る体性幹細胞株
本発明に係る体性幹細胞株は、骨、軟骨、筋肉、筋様、胸腺上皮、神経膠、脂肪、造血系、及び神経系細胞に分化誘導する、ラットの胸腺由来の体性幹細胞を含んだ細胞集合体であればよい。
【００２４】
本発明の体性幹細胞を取得、樹立する方法は、従来公知の方法を利用でき、特に限定されるものではない。例えば、本実施の形態では、後述する実施例に示すように、ラットの胸腺を取り出し、ホモジナイザーで緩やかに分散させた後、濾過して得た細胞と、ＨＴＬＶ−Ｉに感染させて作製したヒトＴ細胞であって、１０，０００ＲのＸ線を照射されたＭＴ２細胞とを共培養することにより、体性幹細胞株を樹立した。
【００２５】
上記ＨＴＬＶ−Ｉに感染させて作製したヒトＴ細胞は、ＩＬ−２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２）、ＧＭ−ＣＳＦ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ）、ＩＮＦ−γ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ）等の多種のサイトカインを生産すると報告されている。
【００２６】
このため、ＨＴＬＶ−Ｉに感染させて作製したヒトＴ細胞により生産されるＩＬ−２、ＩＮＦ−γ、ＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ−α）等のサイトカインや、他の因子が、ラット胸腺より得た細胞中に含まれる体性幹細胞を増殖させ、あるいは不死化させた結果、体性幹細胞株を取得、樹立できたのではいかと考察される。また、ＨＴＬＶ−Ｉが、これらの体性幹細胞に感染していないことは実験的に確認されており、体性幹細胞の不死化等の原因は、ＨＴＬＶ−Ｉの体性幹細胞への直接感染ではないと考えられる。
【００２７】
なお、体性幹細胞株を取得、樹立するために用いる機器や器具、保存・培養するための溶液（塩濃度、ｐＨ、温度等）、用いる細胞の濃度等の実験条件については、従来公知の方法を用いることができ、特に限定されるものではない。
【００２８】
また、分離したり、ｅｘ　ｖｉｖｏにて増殖させたりするのが困難である、神経系の組織由来の体性幹細胞を用いる場合に比べて、体性幹細胞の分離や培養がより容易な他の組織、例えば、後述する実施例に示すように胸腺や、その他の間葉系組織、造血系組織、皮膚等から細胞を取得し、体性幹細胞を樹立することによって、取り扱いしやすい体性幹細胞を容易に得ることができる。
【００２９】
本発明の体性幹細胞株について、具体的な一例を挙げて以下に説明する。
【００３０】
（１−１）ラット胸腺由来体性幹細胞株ＳＴ１
本発明者は、後述する実施例に示すように、ラットの胸腺由来の細胞と、ＨＴＬＶ−Ｉ（Ｈｕｍａｎ　Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　ｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　Ｉ）の感染により生じたヒトＴ細胞株であって、Ｘ線を照射されたＭＴ２細胞とを共培養した結果、筋様細胞に分化する細胞株ＳＴ１（以下ＳＴ１細胞と称する）を樹立できることを見出した（Ｏｋａ　ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｅｌｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｒｅｓ　３００，　１１９−１２７　（２０００））。そして、さらに、上記ＳＴ１細胞の性質を詳細に検討した結果、ＳＴ１細胞は、多種多様な細胞に分化する体性幹細胞株であることが実験的に示された。
【００３１】
より詳細には、ＳＴ１細胞は、後述する実施例（図１参照）に示すように、分化前には、上皮細胞のような形態をしており、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて分化誘導を行うに従い、多核化した巨大細胞の形態へと変化し、最終的には筋管（筋様細胞）へと変化する。また、ＳＴ１細胞は、筋様細胞へと分化するに従い、筋肉に特異的なタンパク質である、ＭｙｏＤ１、デスミン、アセチルコリン受容体、骨格筋ミオシン、α−骨格筋アクチン、α−平滑筋アクチン、ミオグロビン、Ｓ１００α、ラットＴｈｙ１、サイトケラチンを発現する（図２参照）。
【００３２】
また、ＳＴ１細胞は、後述する実施例に示すように（図３参照）、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、神経細胞、グリア細胞（神経膠）、骨芽細胞、骨格筋細胞へと分化することが実験的に示されている。さらに、分化したＳＴ１細胞は、神経細胞に特異的なタンパク質である、神経細胞特異的エノラーゼ（ＮＳＥ：ｎｅｕｒｏｎ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｎｏｌａｓｅ）、微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２：ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２）、シナプトフィジン（ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）を発現する。また、分化したＳＴ１細胞は、グリア細胞に特異的なタンパク質、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ：ｇｌｉａｌ　ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ　ａｃｉｄｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｓ１００を発現する。さらに、分化したＳＴ１細胞は、骨マトリックス、最終分化した骨格筋を形成する（図３（ｃ）、（ｋ）参照）。
【００３３】
さらに、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、ＳＴ１細胞に対する分化誘導の検討を行ったところ、大部分のＳＴ１細胞は上述した筋管へと分化するが、一方、同一条件で、脂肪細胞や軟骨細胞へと分化するＳＴ１細胞が存在することも実験的に示されている（図４参照）。
【００３４】
また、異なる条件でｉｎ　ｖｉｔｒｏ分化誘導を行ったところ、ＳＴ１細胞は、緩やかに、筋管、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞へと分化することも示された。このとき、分化したＳＴ１細胞は、それぞれ、筋管、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞に特異的に発現するタンパク質を発現していることも実験的に確認された（図５参照）。
【００３５】
また、上述したように、分化したＳＴ１細胞は、単に形態的変化やマーカーの発現といった現象だけでなく、機能的にも中胚葉及び外胚葉由来の細胞、組織等へと分化できることが実験的に示されている。さらに、後述するように、ＳＴ１細胞よりクローニングされたＳＴ１Ｂ細胞が、内胚葉由来の細胞、組織等へ分化する能力を有していることから、ＳＴ１細胞も同様の能力を有していると推定される。
【００３６】
（２）本発明に係る体性幹細胞クローン
また、本発明に係る体性幹細胞クローンは、上記ラットの胸腺由来の体性幹細胞株からクローニングされた体性幹細胞クローンであって、骨、軟骨、筋肉、筋様、胸腺上皮、神経膠、脂肪、造血系、及び神経系細胞に分化する体性幹細胞クローンであればよい。
【００３７】
即ち、上述した本発明の体性幹細胞株から、シングルセルクローニングすることにより分離した、分化能を有する単一の体性幹細胞クローンであればよい。なお、シングルセルクローニングの方法は、従来公知の方法を用いることができ、特に限られるものではない。本発明の体性幹細胞クローンについて、具体的な一例を挙げて以下に説明する。
【００３８】
（２−１）細胞クローンＳＴ１Ｂ
本発明者は、上述したラット胸腺由来のＳＴ１細胞は種々雑多な状態の細胞の集合体であるため、より詳細な検討ができないと考え、上記胸腺由来体性幹細胞株ＳＴ１からシングルセルクローニングを行い、単離培養して得た細胞クローンＳＴ１Ｂ（以下ＳＴ１Ｂ細胞と称する）を作製した。
【００３９】
ＳＴ１Ｂ細胞は、多分化能を有していることが実験的に示された。具体的には、後述する実施例に示すように、ＳＴ１Ｂ細胞は、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、造血系細胞や、間葉系細胞である、骨格筋、骨芽細胞、軟骨芽細胞へと分化する（図４参照）。また、ＳＴ１Ｂ細胞は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、骨格筋、脂肪細胞へと分化する（図５参照）。このことから、ＳＴ１Ｂ細胞は、中胚葉由来の細胞、組織へと分化する能力を有していると考えられる。
【００４０】
さらに、ＳＴ１Ｂ細胞は、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、典型的なＨａｓｓａｌｌ’ｓ小体を含んでいる胸腺上皮細胞へと分化する。また、ＳＴ１Ｂ細胞は、サイトケラチンやＴｈｙ１を発現していることが実験的に示されたため、内胚葉由来の細胞、組織へと分化する能力をも有していることが示された（図４、５参照）。
【００４１】
なお、データは示さないが、胸腺上皮細胞へと分化したＳＴ１Ｂ細胞は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、抗原提示能があること、またはＩＦＮ−γ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ）の添加により抗原提示能が著しく増強されることがわかった。
【００４２】
（３）本発明に係る分化誘導方法
本発明の分化誘導方法は、上記のラットの胸腺由来の体性幹細胞株、または、上記のラットの胸腺由来の体性幹細胞株からクローニングされた体性幹細胞クローンを用いた、骨、軟骨、筋肉、筋様、胸腺上皮、神経膠、脂肪、造血系、及び神経系細胞のいずれかの細胞に分化誘導する方法であればよい。従って、本発明の分化誘導方法は、ｉｎ　ｖｉｖｏ、ｉｎ　ｖｉｔｒｏいずれの条件でも行うことができる。
【００４３】
即ち、上記ラットの胸腺由来の体性幹細胞株、または体性幹細胞クローン（以下、まとめて体性幹細胞株等と称する）を分化誘導し、多種多様な細胞、組織、器官等に分化させる方法であればよく、特に限定されるものではない。
【００４４】
具体的には、例えば、ＴＧＦβ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　β）やＢＭＰ（ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）等の従来公知の分化誘導因子（タンパク質、ポリペプチド、遺伝子等を含む）を体性幹細胞株等へ付与することにより前記体性幹細胞株等を分化誘導させることができる。
【００４５】
ここで、ＴＧＦβ等の分化誘導因子を体性幹細胞株等へ付与する方法としては、例えば、直接培地中に添加する方法や、ＴＧＦβ遺伝子等の分化誘導因子をコードする遺伝子を有する発現ベクターを組み込んだ組換えベクター（例えば、アデノウイルスベクターやレトロウイルスベクター等）を体性幹細胞株等に感染させる方法等が挙げられるが、これに限られるものではない。
【００４６】
また、体性幹細胞株等を、従来公知の方法を用いて、生体組織に移植することにより、前記体性幹細胞株等を分化誘導させることもできる。
【００４７】
即ち、後述する実施例に示すように、体性幹細胞株等を例えば、胸腺や脳といった組織に移植することにより、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、体性幹細胞株等は新たな環境にさらされることになる。このため、体性幹細胞株等は何らかの要因により分化誘導を受けることになり、多種多様な細胞へと分化できることが実験的に示されている。
【００４８】
また、従来公知の分化を誘導する培地にて体性幹細胞株等を培養することにより、分化誘導させてもよい。なお、本実施の形態では、後述する実施例に示すように、分化誘導培地１または２を用いて、分化誘導を行っている。
【００４９】
なお、本発明の体性幹細胞株等を分化誘導させるために用いる機器や器具、保存・培養するための溶液（塩濃度、ｐＨ、温度等）、用いる細胞の濃度等の実験条件については、従来公知の方法を用いることができ、特に限定されるものではない。
【００５０】
（４）本発明に係る生物材料
本発明に係る生物材料は、上述した本発明に係る分化誘導方法により、得られた生物材料であればよい。即ち、本発明に係る体性幹細胞株、または体性幹細胞クローンを骨、軟骨、筋肉、筋様、胸腺上皮、神経膠、脂肪、造血系、及び神経系の細胞のいずれかの細胞に分化誘導した結果、得られた細胞、細胞塊、組織、器官等、さらに、これら細胞等から取得されるＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、多糖であればよく、特に限定されるものではない。なお、これらの生物材料は、ｉｎ　ｖｉｖｏ、ｉｎ　ｖｉｔｒｏいずれの条件で得られたものであってもよい。
【００５１】
（５）本発明に係る動物個体
本発明に係る動物個体は、上記体性幹細胞株、または体性幹細胞クローンを用いて、再構成された動物個体であればよく、特に限定されるものではない。
【００５２】
上記「再構成された動物個体」とは、例えば、核を取り除いた受精卵にマイクロインジェクション等の従来公知の方法により、上記体性幹細胞株、または体性幹細胞クローンを注入することによって得られるものである。
【００５３】
（６）本発明に係る体性幹細胞株、体性幹細胞クローン、分化誘導方法、及び生物材料、並びに動物個体の利用方法
上記のように、本発明に係る体性幹細胞株、及び体性幹細胞クローンは、本発明者によって初めて明らかにされたように、骨、軟骨、筋肉、筋様、胸腺上皮、神経膠、脂肪、造血系、及び神経系細胞に分化する能力を有する、新規な体性幹細胞である。従って、本発明に係る体性幹細胞株、及び体性幹細胞クローン、並びに、該体性幹細胞株または体性幹細胞クローンを用いた分化誘導方法は以下の有用性を有する。
【００５４】
本発明に係る体性幹細胞株、及び体性幹細胞クローンは、細胞分化や組織（臓器）再生の研究、再生医療等の基礎研究等を行う上で、さらに、分化条件の解析、分化誘導因子の検索決定、分化に関連する遺伝子の同定、マーカー検索、組織再生のメカニズムの解析等を研究する上で、非常に有用である。より具体的には、例えば、細胞分化、臓器再生、再生医療等の基礎研究や研究開発に材料として用いることができる。
【００５５】
なお、本発明に係る体性幹細胞株、または体性幹細胞クローンは生殖細胞由来ではないため、本発明に係る体性幹細胞株、または体性幹細胞クローンを上記の研究等に用いる場合、特に生命倫理的、政策的な問題は生じない。
【００５６】
また、上述したように、胸腺上皮細胞へと分化したＳＴ１Ｂ細胞は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、抗原提示活性を著しく増強させることができることから、本発明に係る体性幹細胞クローンは、免疫システムのメカニズム解析や、免疫疾患の治療、診断等に利用できる可能性がある。
【００５７】
また、本発明に係る分化誘導方法を用いることにより、骨、軟骨、筋肉、筋様、胸腺上皮、神経膠、脂肪、造血系、及び神経系細胞等のいずれかの生物材料を得ることができる。従って、本発明に係る分化誘導方法によって得られた種々の生物材料は、細胞分化や組織（臓器）再生の研究、再生医療等の基礎研究等や、分化条件の解析、分化誘導因子の検索決定、分化に関連する遺伝子の同定、マーカー検索、組織再生のメカニズムの解析研究等に利用可能である。
【００５８】
また、本発明に係る分化誘導方法によって得られた種々の生物材料は、さらに、骨、軟骨、筋肉、筋様、胸腺上皮、神経膠、脂肪、造血系、及び神経系の組織や器官等の生産、または再生に利用することができる。
【００５９】
ここでいう、組織や器官等の生産とは、生体の内外において、新たに組織または器官等を作製することをいう。また、組織や器官等の再生とは、疾患や事故等の種々の原因で生じた組織や臓器の損傷等を、生体の内外において回復させ、組織等を再生させることをいう。
【００６０】
上記生産または再生された組織等は体性幹細胞を利用していることから、上記生産または再生された組織等を細胞分化や組織（臓器）再生の研究、再生医療等の基礎研究等に用いる場合であっても、生殖細胞由来であるＥＳ細胞を用いる場合のような、倫理的、政策的な障害はない。
【００６１】
即ち、本発明に係る生物材料を用いて、疾患や事故等の種々の原因で生じた組織や臓器等の損傷を回復させることができる。換言すれば、本発明に係る生物材料は、いわゆる再生医療に利用可能である。また、この体性幹細胞技術を応用し、自己の組織由来の体性幹細胞を用いて得た細胞、組織、または器官等を利用することにより、免疫拒絶の問題を回避することができる。
【００６２】
また、本発明に係る体性幹細胞株、または体性幹細胞クローンは、いわゆる細胞治療等にも利用可能である。例えば、上記体性幹細胞等をカプセル等に内包させて生物の体内に導入し、カプセル内において、これら体性幹細胞等にサイトカイン等の可溶性の物質を産生させることにより、種々の疾患の治療や病態機序の研究等に利用することができる。
【００６３】
また、上記再構成された動物個体は、基礎研究、細胞治療、再生医療等の様々な研究に利用可能である。例えば、上記動物個体を利用して、特定の遺伝子を欠損させたノックアウトマウス等を作製することもできる。このノックアウトマウスは、特定の遺伝子の機能解析、同遺伝子が関係する病気の病態解析やその病気の診断法、診断薬、治療法、治療薬の開発などに有用である。
【００６４】
以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。
【００６５】
【実施例】
〔実施例１〕　胸腺由来体性幹細胞株ＳＴ１の樹立
胸腺由来体性幹細胞株ＳＴ１の樹立は、基本的には、論文（Ｏｋａ　Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｅｌｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｒｅｓ　３００，　１１９−１２７　（２０００））に従い、以下のように行った。
【００６６】
４週齢のメスのフィッシャーラット（Ｆ３４４／ＤｕＣｒｊ；　Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｊａｐａｎ，　Ｙｏｋｏｈａｍａ，　Ｊａｐａｎ）をエチルエーテルで麻酔した後、１組の胸腺葉を注意深く隣接する組織と分離し、採取した。その後、Ｄａｕｎｃｅホモジナイザーで緩やかに分散させ、ＲＰＭ１１６４０培地にサスペンドした。そして、この溶液を３Ｇ３−ガラスフィルターにて濾過した後、２回ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒ　ｓａｌｉｎｅ）溶液で洗浄し、共培養用の細胞群溶液とした。
【００６７】
胸腺由来細胞（５×１０６個）と、ＨＴＬＶ−Ｉに感染させて作製したヒトＴ細胞であって、１０，０００ＲのＸ線を照射されたＭＴ２細胞（５×１０５個）とを共培養した。共培養溶液は、１０％の熱不活性化ＦＣＳ（ｆｅｔａｌ　ｃａｌｆ　ｓｅｒｕｍ）、４ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン含有ＲＰＭ１１６４０培地、５％ＣＯ２存在下、３７℃で維持し、胸腺由来体性幹細胞株ＳＴ１（以下ＳＴ１細胞と称する）を樹立した。ＳＴ１細胞は、５％熱不活性化ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地、５％ＣＯ２存在下、３７℃で維持した。
【００６８】
〔実施例２〕　ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるＳＴ１細胞の分化誘導
上記ＳＴ１細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、分化誘導培地１（１％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地）を用いて分化誘導した。具体的には、以下のように行った。
【００６９】
上記ＳＴ１細胞は、図１（ａ）に示すように、分化誘導前には上皮細胞様形態をしており、急速に増殖分裂をしていた。そして、ＳＴ１細胞を分化誘導培地１（１％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地）に移し、分化誘導したところ、図１（ｂ）に示すように、２週間後に多核巨細胞となり、最終的には筋管（筋様細胞）を形成し、周期的に収縮した。この筋管は、筋節の構造を形成し、太い線維と細い線維およびＺバンドの構成が観察された。なお、バーは５０μｍを示す。
【００７０】
次に、ＳＴ１細胞を筋様細胞に分化させたときのタンパク質発現を調べた。具体的には、以下のように行った。
【００７１】
まず、細胞に分化誘導をかけた後、種々の日数経過後、細胞を回収しタンパク質を抽出した。そして、１２．５％のポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いて、７０μｇの培養細胞分のタンパク質抽出物を泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写した。そのタンパク質を転写した膜をＴｈｙ１、サイトケラチン（ｃｙｔｏｋｅｒｔｉｎ）、ＭｙｏＤ１、デスミン（Ｄｅｓｍｉｎ）、α−骨格筋アクチン（Ｓｒ−ａｃｔｉｎ）、ビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）のそれぞれに対する抗体を用いて反応させ、その後、２次抗体として、ペルオキシダーゼでラベルされたヤギ抗マウスＩｇＧと反応させ、ＥＣＬ−ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｉｅｒｃｅ，　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，　ＩＬ，　ＵＳＡ）を用いて発光させ、Ｘ線フィルムに感光させた。
【００７２】
その結果、図２に示すように、ＳＴ１細胞は、筋様細胞へと分化するに従い、筋肉に特異的なタンパク質である、ＭｙｏＤ１、デスミン（Ｄｅｓｍｉｎ）、アセチルコリン受容体、骨格筋ミオシン、α−骨格筋アクチン（Ｓｒ−ａｃｔｉｎ）、α−平滑筋アクチン、ミオグロビンを発現していることがわかった。さらに、分化したＳＴ１細胞は、Ｓ１００α、ラットＴｈｙ１、サイトケラチン（ｃｙｔｏｋｅｒｔｉｎ）等、グリア細胞（神経膠細胞）または胸腺上皮細胞のマーカーを発現していた。これらの結果から、ＳＴ１細胞は、多分化能を有しており、幹細胞として異なるタイプの細胞に分化することができることが示唆された。
【００７３】
〔実施例３〕　ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるＳＴ１細胞の分化誘導
上記ＳＴ１細胞に対して、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて分化誘導をかけた場合、どのようにＳＴ１細胞が分化するかを調べた。具体的には、以下のように行った。
【００７４】
まず、ｐＥＧＦＰプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂ　Ｊａｐａｎ，　Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）をＳＴ１細胞に遺伝子導入し、ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）で標識した５×１０６個のＳＴ１細胞を３回ＰＢＳ溶液で洗浄した後、新生仔Ｂａｌｂ／ｃマウスの脳に移植した。移植後４週間後にマウスを解剖し、移植したＳＴ１細胞の分化状態を調べた。
【００７５】
その結果を図３に示す。図３（ａ）、（ｄ）、（ｊ）は共焦点レーザ顕微鏡を用いてＥＧＦＰの蛍光を指標に、移植したＳＴ１細胞を観察した結果を示し、図３（ｂ）、（ｋ）は通常のヘマトキシリン・エオジン染色によりＳＴ１細胞移植部位を観察した結果を示す。図３（ｃ）、（ｅ）〜（ｉ）は免疫染色によりＳＴ１細胞移植部位を観察した結果を示す。なお、図３（ａ）〜（ｉ）のバーは５０μｍを示し、図３（ｊ）、（ｋ）のバーは、１０μｍを示す。
【００７６】
また、図３（ｃ）はオステオカルシン（骨芽細胞マーカー）に、（ｅ）は神経細胞特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）に、（ｆ）は微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）に、（ｇ）はシナプトフィジン（ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）に、（ｈ）はグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に、（ｉ）はＳ１００に対する抗体を、それぞれ用いて免疫染色を行った。
【００７７】
その結果、図３（ａ）〜（ｉ）に示すように、上記ＳＴ１細胞は、マウス脳に移植することにより、神経細胞、グリア細胞、骨芽細胞、骨格筋細胞へと分化することがわかった。さらに、神経細胞に分化したＳＴ１細胞は、神経細胞に特異的なタンパク質である、神経細胞特異的エノラーゼ（ＮＳＥ：ｎｅｕｒｏｎ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｎｏｌａｓｅ）、微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２：ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２）、シナプトフィジン（ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）を発現していることがわかった。また、グリア細胞に分化したＳＴ１細胞は、グリア細胞に特異的なタンパク質、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ：ｇｌｉａｌ　ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ　ａｃｉｄｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｓ１００を発現していることがわかった。さらに、図３（ｃ）（ｋ）に示すように、分化したＳＴ１細胞は、骨マトリックス、最終分化した骨格筋を形成することがわかった。
【００７８】
〔実施例４〕　ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるＳＴ１Ｂ細胞の分化誘導
ラット胸腺由来の体性幹細胞ＳＴ１細胞の分化能をより詳細に調べるために、上記ＳＴ１細胞からシングルセルクローニングにより単離したＳＴ１Ｂ細胞を用いて、ｉｎ　ｖｉｖｏにおける分化誘導を行った。具体的方法は、以下に示す。
【００７９】
まず、実施例３に示す方法と同様に、ＥＧＦＰ標識したＳＴ１Ｂ細胞をラットの胸腺に移植した後、４週間後に解剖を行い、移植部位におけるＳＴ１Ｂ細胞の分化の状態を調べた。
【００８０】
その結果を図４に示す。図４（ａ）、（ｃ）、（ｅ）は共焦点レーザ顕微鏡による観察の結果を示し、図４（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）は通常のヘマトキシリン・エオジン染色、図４（ｈ）は免疫染色により観察した結果を示す。なお、図４（ａ）（ｂ）（ｅ）（ｇ）（ｈ）のバーは５０μｍ、図４（ｃ）のバーは２０μｍ、図４（ｄ）のバーは１０μｍ、図４（ｆ）のバーは１００μｍを示す。
【００８１】
その結果、図４（ａ）〜（ｄ）より、移植部位におけるＥＧＦＰ標識のＳＴ１Ｂ細胞は、骨芽細胞へと分化しており、骨及び骨髄が形成されていることがわかった。また、図４（ｅ）（ｆ）より、移植部位におけるＥＧＦＰ標識のＳＴ１Ｂ細胞は、軟骨細胞へと分化しており、軟骨を形成していることがわかった。また、移植部位におけるＳＴ１Ｂ細胞は、図４（ｇ）より、骨格筋に分化していることが（図４（ｇ）の白矢印に示す位置）、図４（ｈ）より、サイトケラチン陽性上皮細胞に分化していることが、また、図４（ｇ）、（ｈ）より、ＳＴ１Ｂ細胞の移植部位において、典型的なＨａｓｓａｌｌ’ｓ小体が形成されていることがわかった（図４（ｇ）の黒矢印に示す位置）。このＨａｓｓａｌｌ’ｓ小体は、胸腺筋様細胞の由来と同じＳＴ１Ｂ細胞由来と考えられる。
【００８２】
これらの結果から、ＳＴ１Ｂ細胞は、体性幹細胞として機能するとともに、ｉｎｖｉｖｏにおいて、種々の細胞に分化することができることが示された。
【００８３】
〔実施例５〕　ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるＳＴ１細胞及びＳＴ１Ｂ細胞の分化誘導
ＳＴ１細胞とＳＴ１Ｂ細胞との分化能を、さらに詳細に検討するために、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける分化誘導実験を行った。具体的には、以下のように行った。
【００８４】
分化誘導培地１または分化誘導培地２（Ｈａｍ’ｓ　Ｆ−１２（１：１）、１０μｇ／ｍｌトランスフェリン、３×１０−８Ｍ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓｅｌｅｎｉｔｅ、５％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地）を用いて、ＳＴ１細胞及びＳＴ１Ｂ細胞の分化誘導を行った。
【００８５】
また、ＴＧＦβ遺伝子の発現ベクター（ＡｘＴＧＦ）を組み込んだ組換えアデノウイルスをＳＴ１細胞に感染させ、骨芽細胞への分化誘導の実験に用いた。組換えウイルスの感染は細胞の培地をウイルス液に移し替え、３７℃、６０分間培養により行った。その後、培養上清を新しい維持培地（５％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地）に入れ替え培養を継続した。
【００８６】
分化誘導を行った後のＳＴ１細胞及びＳＴ１Ｂ細胞の表現型の解析は、アセトン固定した細胞のスメアを用い、間接蛍光抗体法により行った。その結果を図５（ａ）、（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｈ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）に示す。１次抗体として、図５（ａ）ではα−骨格筋アクチンを、（ｂ）ではアセチルコリン受容体を、（ｅ）ではコラーゲンｔｙｐｅ　ＩＩ（軟骨芽細胞のマーカー）を、（ｆ）ではコラーゲンｔｙｐｅ　Ｘ（骨化軟骨芽細胞のマーカー）を、（ｈ）ではオステオカルシン（骨芽細胞のマーカー）を、（ｊ）ではＧＦＡＰ（グリア細胞のマーカー）を、（ｋ）ではサイトケラチン（上皮細胞マーカー）を、（ｌ）では胸腺細胞及び神経細胞のマーカーであるＴｈｙ１を、それぞれ認識する抗体を用いた。
【００８７】
２次抗体としては、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）２（Ｃａｐｐｅｌ；　ＩＣＮＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ；　Ａｕｒｏｒａ，　Ｏｈｉｏ，　ＵＳＡ）とＣｙ３−標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂ；　Ｗｅｓｔ　Ｇｒｏｖｅ，　ＰＡ，　ＵＳＡ）とを用いた。細胞の核は、４０μｇ／ｍｌのｂｉｓ−ｂｅｎｚｉｍｉｄｅ（Ｈｏｅｓｈｓｔ　＃３３２５８：　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ．　Ｃｏｍ．　Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，　ＵＳＡ）を用いて染色した。
【００８８】
また、図５（ｃ）には、分化誘導をかけたＳＴ１細胞に対して、軟骨ムコポリサッカライドに対するＡｌｃｉａｎ　ｂｌｕｅ染色を行った結果を示す。図５（ｄ）には、分化誘導をかけたＳＴ１細胞を位相差顕微鏡により観察した結果を示す。図５（ｇ）には、分化誘導をかけたＳＴ１細胞をＡｌｉｚａｒｉｎ　Ｒｅｄ染色した結果を示す。図５（ｉ）には、分化誘導をかけたＳＴ１細胞をｏｉｌ　ｒｅｄ　Ｏ法により染色した結果を示す。
【００８９】
なお、Ａｌｉｚａｒｉｎ　Ｒｅｄ染色は、細胞をＰＢＳ溶液で３回洗い、９５％エタノールで固定し、１％Ａｌｉｚａｒｉｎ　Ｒｅｄ溶液で５〜１０分間染色した。培養細胞のＡｌｃｉａｎ　ｂｌｕｅ染色は、細胞をＰＢＳ溶液で３回洗い、９５％エタノールで固定し、０．５％Ａｌｃｉａｎ　ｂｌｕｅ溶液で５〜１０分間染色した。
【００９０】
なお、図５（ａ）、（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｈ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）のバーは、２５μｍを示し、図５（ｃ）、（ｄ）、（ｇ）、（ｌ）のバーは、５０μｍを示し、図５（ｈ）のバーは、１００μｍを示す。
【００９１】
また、図５（ａ）〜（ｉ）まではＳＴ１細胞の分化誘導の結果を示し、図５（ｊ）〜（ｌ）まではＳＴ１Ｂ細胞の分化誘導の結果を示す。
【００９２】
その結果、ＳＴ１細胞は、図５（ａ）（ｂ）に示すように骨格筋に分化し、図５（ｃ）〜（ｆ）に示すように軟骨細胞に分化し、図５（ｇ）（ｈ）に示すように骨芽細胞に分化し、図５（ｉ）に示すように脂肪細胞に分化することがわかった。また、ＳＴ１Ｂ細胞は、図５（ｊ）に示すようにグリア様細胞に分化し、図５（ｋ）（ｌ）に示すように上皮細胞に分化することがわかった。
【００９３】
より詳細に説明すると、分化誘導培地１により分化誘導を行った場合、図５（ａ）（ｂ）に示すように、ＳＴ１細胞は大部分が筋様細胞（筋管）に分化した。また、その他のＳＴ１細胞は、同一条件で脂肪細胞、軟骨細胞へと分化した。
【００９４】
また、分化誘導培地２により分化誘導を行った場合、図５に示すように、ＳＴ１細胞は緩やかに筋管、脂肪細胞、軟骨細胞、あるいは骨芽細胞の表現型へと分化した。
【００９５】
分化したＳＴ１細胞はＡｌｃｉａｎ　ｂｌｕｅ染色陽性であり、これらの細胞またはコロニーは、軟骨細胞へ分化していると考えられた。分化誘導培地２におけるＳＴ１細胞の軟骨細胞への分化の頻度は、分化誘導培地１に比べて高かった。また、図５（ｅ）に示すように、抗コラーゲンｔｙｐｅ　ＩＩ抗体による免疫染色の結果から、Ａｌｃｉａｎ　ｂｌｕｅ染色陽性の細胞またはコロニーは、コラーゲンｔｙｐｅ　ＩＩを発現していることがわかった。また、図５（ｆ）に示すように、分化したＳＴ１細胞は、コラーゲンｔｙｐｅ　Ｘが発現していることから、後期段階の骨化した軟骨細胞にまで分化していることがわかった。
【００９６】
また、組換えアデノウイルスを感染させ、ＴＧＦβが発現しているＳＴ１細胞は、大部分がコロニー形態を示し、これらのコロニーのいくつかはＡｌｉｚａｒｉｎ　Ｒｅｄ染色により染色された。このことから、骨芽細胞に分化していると考えられた。なお、コントロールとして、外来遺伝子（Ａｘｌｗ）を有しないアデノウイルスを感染させたＳＴ１細胞は、Ａｌｉｚａｒｉｎ　Ｒｅｄ染色により染色されなかった。さらに、分化したＳＴ１細胞は、図５（ｈ）に示すように、抗オステオカルシン抗体により免疫染色されているため、骨芽細胞に分化していることが確認された。
【００９７】
また、分化誘導培地２において、図５（ｉ）に示すように、ｏｉｌ　ｒｅｄ　Ｏ法染色に陽性の細胞が存在していることから、ＳＴ１細胞は脂肪細胞へ分化することが明らかとなった。
【００９８】
クローニングされたＳＴ１Ｂ細胞もまた、ＳＴ１細胞と同様に、分化誘導培地１及び２において分化した。これは、図５（ｊ）〜（ｌ）に示すように、骨格筋アクチン、アセチルコリン受容体、ＧＦＡＰ、サイトケラチンまたはＴｈｙ１に対する免疫染色により確認された。このことから、ＳＴ１Ｂ細胞は筋管、グリア様細胞、上皮細胞へと分化することがわかった。また、ｏｉｌ　ｒｅｄ　Ｏ法染色に陽性の細胞が存在し、ＳＴ１Ｂ細胞もまた脂肪細胞へ分化することが明らかとなった。
【００９９】
上記結果から、ＳＴ１細胞及びＳＴ１Ｂ細胞はともに、ｉｎ　ｖｉｖｏ、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの両方において、形態学的な変化や、マーカーの発現のみでなく、機能的にも分化する体性幹細胞として働くことが示された。
【０１００】
【発明の効果】
本発明に係る体性幹細胞株、体性幹細胞クローン、及び分化誘導方法は、細胞分化や組織（臓器）再生の研究、再生医療等の基礎研究等を行う上で、さらに、分化条件の解析、分化誘導因子の検索決定、分化に関連する遺伝子の同定、マーカー検索、組織再生のメカニズムの解析等を研究する上で、非常に有用であるという効果を奏する。
【０１０１】
また、本発明に係る体性幹細胞株、体性幹細胞クローンをマイクロカプセル等に内包させて利用すれば、実際の治療に応用できる可能性がある。
【０１０２】
また、本発明に係る体性幹細胞株、体性幹細胞クローン、及び分化誘導方法は、体性幹細胞を利用していることから、生殖細胞由来のＥＳ細胞を用いる場合のような倫理的、政策的な障害が全くない。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１（ａ）は、ＳＴ１細胞が通常の培地で培養されている状態を位相差顕微鏡により観察した結果を示す図であり、図１（ｂ）は、ＳＴ１細胞の筋様細胞への分化に伴う形態学的変化を位相差顕微鏡により観察した結果を示す図である。
【図２】図２は、筋様細胞に分化したＳＴ１細胞におけるタンパク質発現をウエスタンブロッティングにより解析した結果を示す図である。
【図３】図３（ａ）〜（ｋ）は、ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるＳＴ１細胞の分化を調べた結果を示す図であり、より詳細には図３（ａ）、（ｄ）、（ｊ）は、共焦点レーザ顕微鏡により観察した結果を示し、図３（ｂ）、（ｋ）は、ヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す図であり、図３（ｃ）、（ｅ）〜（ｉ）は、免疫染色の結果を示す図である。
【図４】図４（ａ）〜（ｈ）は、ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるＳＴ１Ｂ細胞の分化を調べた結果を示す図であり、より詳細には、図４（ａ）（ｃ）（ｅ）は、共焦点レーザ顕微鏡により観察した結果を示し、図４（ｂ）（ｄ）（ｆ）（ｇ）は、ヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す図であり、図４（ｈ）は、免疫染色の結果を示す図である。
【図５】図５（ａ）〜（ｌ）は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるＳＴ１細胞及びＳＴ１Ｂ細胞の分化を調べた結果を示す図であり、より詳細には、図５（ａ）（ｂ）（ｅ）（ｆ）（ｈ）（ｊ）（ｋ）（ｌ）は、免疫染色の結果を示す図であり、図５（ｃ）は、Ａｌｃｉａｎ　ｂｌｕｅ染色の結果を示す図であり、図５（ｄ）は、位相差顕微鏡により観察した結果を示す図であり、図５（ｇ）は、Ａｒｉｚａｒｉｎ　Ｒｅｄ染色の結果を示す図であり、図５（ｉ）は、ｏｉｌ　ｒｅｄ　Ｏ法により染色した結果を示す図である。
【図１】
2004089093.tif 000002
【図２】
2004089093.tif 000003
【図３】
2004089093.tif 000004
【図４】
2004089093.tif 000005
【図５】
2004089093.tif 000006