(57)【要約】【課題】固相担体を利用した核酸検出方法において、その検出感度をより向上させるための簡便かつ低廉な手段の提供。【解決手段】標的核酸の一部又は全部に相補的な配列と、互いに相補的な２つの配列とを含むタンデム構造を、１回又は２回以上反復して有する核酸プローブを支持体上に固定した核酸検出用担体、及び該担体を利用した核酸の検出。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸の一部又は全部に相補的な配列と、互いに相補的な２つの配列とを含むタンデム構造を、１回又は２回以上反復して有する核酸プローブを支持体上に固定した、核酸検出用担体。
【請求項２】
核酸プローブが、同一鎖上の互いに相補的な２つの配列間の少なくとも一部においてアニールすることによりループ形成していることを特徴とする、請求項１記載の担体。
【請求項３】
標的核酸の一部又は全部に相補的な配列と、互いに相補的な２つの配列とが、少なくとも一部において重複していることを特徴とする、請求項１又は２記載の担体。
【請求項４】
標的核酸の一部又は全部に相補的な配列と、互いに相補的な２つの配列とが、重複していないことを特徴とする、請求項１又は２記載の担体。
【請求項５】
核酸プローブが、以下のプライマー（ａ）及び／又は（ｂ）を用いた増幅法によって提供されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の担体。
（ａ）　鋳型核酸上の増幅すべき配列の３’側から該鋳型核酸上の３’末端方向に向かって、順に第１の任意配列Ｆ１ｃ及び第２の任意配列Ｆ２ｃを選択したとき、該Ｆ１ｃと同一の配列及び該Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２を５’側から３’側にこの順で含むプライマー
（ｂ）　鋳型核酸上の増幅すべき配列の５’側から該鋳型核酸上の５’末端方向に向かって、順に第３の任意配列Ｒ１及び第４の任意配列Ｒ２を選択したとき、該Ｒ１に相補的配列Ｒ１ｃ及び該Ｒ２と同一の配列Ｒ２を５’側から３’側にこの順で含むプライマー
【請求項６】
増幅法がＬＡＭＰ法である、請求項５記載の担体。
【請求項７】
支持体が、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、ラテックス、マイクロビーズ、シリコンチップ、及びキャピラリーから選ばれるいずれか一つである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の担体。
【請求項８】
核酸プローブ中に、タンデム構造が１〜２０回反復して含まれていることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の担体。
【請求項９】
核酸プローブが、１００〜１００００塩基長である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の担体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の担体を用いた核酸の検出方法。
【請求項１１】
以下の工程を含む、核酸の検出方法。
１）試料中の核酸を標識物質で標識する工程；
２）標識された核酸を請求項１〜９のいずれか１項に記載の担体にハイブリダイズさせる工程；
３）ハイブリダイズした標識核酸量を標識物質のシグナル強度により検出する工程：
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標的核酸の一部又は全部に相補的な配列と、互いに相補的な２つの配列とを含むタンデム構造を有する核酸プローブを固定した核酸検出用担体、及び該担体を利用した高感度な核酸検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸の検出は、サザンブロッティングやノーザンブロッティングにはじまり、ＲＴ−ＰＣＲ法、ディファレンシャルディスプレイ法など様々な方法が開発されている。最近では、数千あるいは数万の異なった遺伝子を簡便かつ高感度に検出できるという利点からＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップ等の固相担体が幅広く利用されている。
【０００３】
こうした固相担体は、標的核酸に相補的な複数のプローブをガラス基板等の固相担体上に高密度に固定して作製される。プローブの固定は、予め合成した核酸プローブを基板上にスポット（固定）する方法（Ｓｃｈｅｂａ　Ｍ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７０：　４６７−４７０，　１９９５）と、光リソグラフィー技術を応用して、基板上で複数の核酸プローブを合成していく方法（Ｆｏｄｏｒ　ＳＰ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　３６４：　５５５−５５６，　１９９３）の２つに大別される。ちなみに、ＤＮＡマイクロアレイとＤＮＡチップは同義に用いられる場合もあるが、狭義には、前者の方法で作製した担体をＤＮＡマイクロアレイ、後者の方法で作製した担体をＤＮＡチップという。
【０００４】
ＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップ等の固相担体を利用した検出方法では、通常蛍光色素で標識した試料（ターゲット）を担体上のプローブにハイブリダイズさせ、このハイブリダイズした標識ターゲットのシグナルを検出する。特に、細胞から抽出した全ｍＲＮＡ中に存在する微量な標的遺伝子を検出するためには、より感度の高い検出が望まれる。そのために、試料中のｃＤＮＡはＴ７ＲＮＡポリメラーゼでｃＲＮＡとして増幅し、さらにビオチン−アビジン系で増幅して用いられることもある。また、標識物質を使わず、電気化学的活性を有するインターカレーター（例えば、フォエロセン化ナフタレンジイミド）と走査型電気化学顕微鏡を用いて高感度の検出を可能にする方法（Ｓ．　Ｔａｋｅｎａｋａ，　Ｂｕｌｌ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　Ｊｐｎ．，　７４　（２），　２１７−２２４　（２００１），　Ｔ．　Ｎｏｊｉｍａ，　ｅｔ　ａｌ，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，　１，　１０５−１０６　（２００１））も開発されている。しかしながら、いずれの方法も、時間とコストがかかるという問題がある。
【０００５】
一方、発明者らは、ＰＣＲ法で不可欠とされる複雑な温度制御を必要としない新しい核酸増幅法：ＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の開発に成功している（Ｎｏｔｏｍｉ，　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２８（１２）：ｅ６３（２０００）；ＷＯ　００／２８０８２）。ＬＡＭＰ法では、特有のプライマーを用いることで、同一鎖上末端に互いに相補的な配列を有する増幅産物が生成する。そして、この相補的配列間のアニールによって形成されるループを起点とした伸長反応と、このループにアニールする別なプライマー（ループプライマー）による伸長反応によって、従来にない増幅効率で核酸の増幅が可能になる。発明者らは、このＬＡＭＰ法の高い増幅効率を利用して、目視による遺伝子の検出方法等（Ｍｏｒｉ　Ｙ．　Ｎａｇａｍｉｎｅ　Ｋ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，　Ｖｏｌ．２８９，Ｎｏ．１，　１５０−１５４，　２００１）を報告している。しかしながら、これまでＬＡＭＰ法をマイクロアレイ等の固相担体を用いた核酸検出法に応用したことはない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、固相担体を利用した核酸検出方法において、その検出感度をより向上させるための簡便かつ低廉な手段の提供を目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討した結果、ＬＡＭＰ産物に特有な、互いに相補的な配列を有する核酸プローブを固定化した担体では、従来の核酸プローブを固定化した担体よりもシグナル強度が２倍以上増強されることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１１）を提供する。
（１）　標的核酸の一部又は全部に相補的な配列と、互いに相補的な２つの配列とを含むタンデム構造を、１回又は２回以上反復して有する核酸プローブを支持体上に固定した、核酸検出用担体。
（２）　核酸プローブが、同一鎖上の互いに相補的な２つの配列間の少なくとも一部においてアニールすることによりループ形成していることを特徴とする、上記（１）記載の担体。
【０００９】
（３）　標的核酸の一部又は全部に相補的な配列と、互いに相補的な２つの配列とが、少なくとも一部において重複していることを特徴とする、上記（１）又は（２）記載の担体。
（４）　標的核酸の一部又は全部に相補的な配列と、互いに相補的な２つの配列とが、重複していないことを特徴とする、上記（１）又は（２）記載の担体。
【００１０】
（５）　核酸プローブが、以下のプライマー（ａ）及び／又は（ｂ）を用いた増幅法によって提供されることを特徴とする、上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の担体。
（ａ）　鋳型核酸上の増幅すべき配列の３’側から該鋳型核酸上の３’末端方向に向かって、順に第１の任意配列Ｆ１ｃ及び第２の任意配列Ｆ２ｃを選択したとき、該Ｆ１ｃと同一の配列及び該Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２を５’側から３’側にこの順で含むプライマー
（ｂ）　鋳型核酸上の増幅すべき配列の５’側から該鋳型核酸上の５’末端方向に向かって、順に第３の任意配列Ｒ１及び第４の任意配列Ｒ２を選択したとき、該Ｒ１に相補的配列Ｒ１ｃ及び該Ｒ２と同一の配列Ｒ２を５’側から３’側にこの順で含むプライマー
【００１１】
（６）　増幅法がＬＡＭＰ法である、上記（５）記載の担体。
（７）　支持体が、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、ラテックス、マイクロビーズ、シリコンチップ、及びキャピラリーから選ばれるいずれか一つである、上記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の担体。
（８）　核酸プローブ中に、タンデム構造が１〜２０回反復して含まれていることを特徴とする、上記（１）〜（７）のいずれか１項に記載の担体。
（９）　核酸プローブが、１００〜１００００塩基長である、上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載の担体。
（１０）　上記（１）〜（９）のいずれか１項に記載の担体を用いた核酸の検出方法。
【００１２】
（１１）　以下の工程を含む、核酸の検出方法。
１）試料中の核酸を標識物質で標識する工程；
２）標識された核酸を上記（１）〜（９）のいずれか１項に記載の担体にハイブリダイズさせる工程；
３）ハイブリダイズした標識核酸量を標識物質のシグナル強度により検出する工程：
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．用語の定義
核酸：本明細書中における「核酸」は天然のものであっても、人工的に合成されたものであってもよい。該核酸には、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、及びＰＮＡ等の全てを含むものとする。また１本鎖核酸及び２本鎖核酸の双方を含むものとする。さらに、部分的に修飾された、あるいは全体が完全に人工的構造からなるヌクレオチド誘導体であっても、それが塩基対結合を形成しうるものであるかぎり、本発明の核酸に含まれる。また、遺伝子（生命に関わる特定の機能や情報を担う核酸）という用語も、核酸に含まれる。なお、本発明における核酸の構成塩基数は制限されない。
標的核酸：本明細書中における「標的核酸」とは、検出すべき核酸分子を意味する。
【００１４】
プローブとターゲット：本明細書中における「プローブ（核酸プローブ）」とは、標的核酸を検出するためにの固相担体上に固定化される核酸断片を意味する。これに対し、「ターゲット」とは、担体上に固定されたプローブにハイブリダイズさせる試料中の核酸断片を意味する。（文献によっては、プローブとターゲットの呼称を逆に用いる例もあるが、本明細書中では　［Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．，　２１（１）　ｓｕｐｌ．　：１，　１９９９］に従い、上記のように定義する。）
タンデム構造：本明細書中における「タンデム（縦列）構造」とは、２以上の配列が縦列した構造、すなわち該配列が同一鎖上に存在する構造を意味する。このタンデム構造については、次項で詳述する。
【００１５】
鋳型と相補鎖：本明細書中における「鋳型」とは、相補鎖合成の鋳型となる側の核酸を意味する。鋳型に相補的な塩基配列を持つ「相補鎖」は、鋳型に対応する鎖としての意味を持つが、両者の関係はあくまでも相対的なものに過ぎない。
【００１６】
アニール：「アニール」と「ハイブリダイズ」は、核酸がワトソン−クリックのモデルに基づく相補的塩基対結合によって２本鎖を形成することを意味する。したがって、塩基対結合を構成する核酸鎖が同一鎖上にあっても、分子内の相補的な塩基配列が塩基対結合を形成すれば、アニール、あるいはハイブリダイズである。本発明において、アニールとハイブリダイズは、核酸が塩基対結合による２本鎖構造を構成する点で同義である。
【００１７】
２．　核酸検出用担体
本発明の核酸検出用担体は、標的核酸の一部又は全部に相補的な配列と、互いに相補的な２つの配列とを含むタンデム構造を、１回又は２回以上反復して有する核酸プローブを支持体上に固定した固相担体である。
【００１８】
２．１　核酸プローブ
（１）核酸プローブの構造
本発明の核酸検出用担体で用いられる核酸プローブ（以下、「本発明のプローブ」という）は、標的核酸の一部又は全部に相補的な配列と、互いに相補的な２つの配列とを含むタンデム構造を、１回又は２回以上反復して有する。ここで、タンデム構造とは、前述したように「標的核酸の一部又は全部に相補的な配列」と「互いに相補的な２つの配列」が同一鎖上に存在する構造を意味する。
【００１９】
該タンデム構造において、「標的核酸の一部又は全部に相補的な配列」と「互いに相補的な２つの配列」は、少なくとも一部において重複していてもよい。すなわち、両配列のそれぞれ一部が他方に含まれていてもよいし、一方が他方に完全に包含されていてもよい。例えば、後記する本発明の実施態様のように、標的核酸上の特定の配列を選択し、これを「互いに相補的な２つの配列」として含むプローブを合成することもできる。
【００２０】
また、「標的核酸の一部又は全部に相補的な配列」と「互いに相補的な２つの配列」は、本発明のプローブ上で全く重複していなくてもよい。すなわち、標的核酸の一部又は全部に相補的な配列とは無関係の配列を、「互いに相補的な２つの配列」として含むプローブであってもよい。
【００２１】
本発明のプローブ中には、前記タンデム構造が１回、又は２回以上繰り返し含まれる。プローブ中に含まれるタンデム構造の数は特に限定されないが、通常１〜５０回程度、好ましくは１〜２０回程度である。また、プローブの塩基長も特に限定されないが、好ましくは１００〜１００００塩基長、より好ましくは２００〜４０００塩基長である。
【００２２】
本発明のプローブ中に含まれる標的核酸の配列は、標的核酸の一部であっても、全部であってもよい。含まれる領域は、標的核酸に特異的な配列を選択して用いることが好ましく、例えば、構造遺伝子ならば繰り返し配列を含まない、ｍＲＮＡ３’非翻訳領域に存在する配列特異性が高い部分等を好適に用いることができる。
【００２３】
また「互いに相補的な２つの配列」とは、例えば、５’−ａｇｔｔｃａｔｃ−３’とその相補的配列３’−ｔｃａａｇｔａｇ−５’を意味するが、これらは同一鎖上に含まれるため、後者は５’−ｇａｔｇａａｃｔ−３’として逆方向に配置される。この互いに相補的な２つの配列は少なくとも一部において、鎖内アニール（同一鎖内でアニール）することによってループ構造を形成しうる。そして、このループ形成は本発明のプローブに特異な２次（あるいは３次）構造を与える。例えば、同一鎖上の両端にループが形成されると、本発明のプローブはダンベル型構造となり、同一鎖上に多数のループが形成されれば、該プローブはカリフラワー型構造となる。後述するように、本発明のプローブを固定した固相担体が従来のプローブを固定した固相担体よりも強いシグナル強度を示すメカニズムは明らかではないが、前記した特異な構造も一部では寄与していることが考えられる。例えば、標的核酸以外の領域によるリンカー効果、ターゲットとの結合点の増加が挙げられる。リンカー効果とは、プローブ末端に付加したリンカー配列により、プローブがターゲットとハイブリダイズしやすくなる効果をいう。これは、プローブをリンカー配列部分で固相に結合させると、標的配列が固相から浮き上がった状態になり、ターゲットとのハイブリダイズが容易になるためである。すなわち、本発明のプローブには、標的核酸以外の領域が繰り返し現れるが、この領域がリンカー配列として標的配列を浮き上がらせ、ターゲットとのハイブリダイズをより容易にしている可能性がある。また、通常ＰＣＲ産物をプローブとして固定した固相担体（特にＵＶ架橋で固定した場合）では、洗浄工程でプローブが支持体から剥がれることがある。しかし、本発明のプローブは比較的長鎖であるため、洗浄工程で支持体からはがれ難く、そのために従来の固相担体よりも高い検出感度を示すことも考えられる。
【００２４】
本発明で用いられるプローブは、当該技術分野で公知の適当な修飾を施されていてもよい。そのような修飾は、支持体上での固定性の向上、安定性の向上、標的核酸への結合性の向上（例えば、ペプチドＤＮＡ）等を目的として行われる。
【００２５】
（２）核酸プローブの合成
本発明のプローブは、光リソグラフィー等の公知の技術を用いて支持体上で合成するもの（Ｆｏｄｏｒ　ＳＰ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　３６４：　５５５−５５６，　１９９３）、ラテックス等の支持体に固定したプライマーからの増幅（合成）反応によって合成するもの（特願２００１−１６１４８６号）、予め合成したものを支持体上に固定するもの（Ｓｃｈｅｂａ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７０：　４６７−４７０，　１９９５）のいずれであってもよい。特に、本発明においてはプローブの長さと構造上の特徴から、後の２つの方法が好ましい。これらの方法において、プローブは化学的合成等の公知の核酸合成法や、ＰＣＲ法、ＳＤＡ法等の核酸増幅法を用いて調製できるが、特に、後述するＸ１ｃ＋Ｘ２構造を有するプライマーを用いた増幅法（例えば、ＬＡＭＰ法等）を利用すれば、効率的に合成することができる。
【００２６】
（３）Ｘ１ｃ＋Ｘ２構造を有するプライマーを用いた増幅法
本発明のプローブは、Ｘ１ｃ＋Ｘ２構造を有するプライマーを用いた増幅法によって効率的に合成することができる。
Ｘ１ｃ＋Ｘ２構造を有するプライマーは、具体的には以下のようにして設計する。
（ａ）　鋳型核酸鎖上の増幅すべき配列の３’側から当該鋳型核酸鎖上の３’末端方向に向かって、順に第１の任意配列Ｆ１ｃ及び第２の任意配列Ｆ２ｃを選択したとき、該Ｆ１ｃと同一の配列及び該Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２を５’側から３’側にこの順で含むプライマー
（ｂ）　鋳型核酸鎖上の増幅すべき配列の５’側から当該鋳型核酸鎖上の５’末端方向に向かって、順に第３の任意配列Ｒ１及び第４の任意配列Ｒ２を選択したとき、該Ｒ１に相補的配列Ｒ１ｃ及び該Ｒ２と同一の配列Ｒ２を５’側から３’側にこの順で含むプライマー
なお、上記プライマーは（ａ）（ｂ）をペアとして用いてもよいし、（ａ）（ｂ）どちらか一方と通常のプライマーをペアにして用いてもよい。
【００２７】
鋳型核酸としては、標的核酸の一部又は全部を構成する配列を用いる。該鋳型核酸において、Ｆ１ｃ　Ｆ２ｃ　Ｒ１　Ｒ２をすべて標的核酸上に選択すると、増幅産物はその末端に生成する「互いに相補的な２つの配列」も含めてすべて標的核酸由来のものとなる。
増幅反応は、例えば上記プライマー、鋳型核酸、ヌクレオチド基質及びＤＮＡ（ＲＮＡ）ポリメラーゼを用いて、通常のＰＣＲ法により達成できる。
【００２８】
さらに、前記増幅反応はポリメラーゼとして鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを用いれば、等温条件下で行うこともできる。これは、プライマーがＸ１ｃ＋Ｘ２の構造を有するため、該プライマーからの伸長生成物はＸ１ｃ＋（Ｘ２＋）Ｘ１の相補的配列（下線部）を含み、これが鎖内アニールして、合成された２本鎖核酸上に１本鎖部分を生成するためである。すなわち、２本鎖を高温で解離させなくとも、伸長生成物上には鎖内アニールによる新たな鎖置換反応の開始点が与えられる。この反応の概略は後述するＬＡＭＰ法を参照されたい。
【００２９】
なお、前記鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えばＢｓｔ　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　ポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｖｅｎｔ　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ　ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ　ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ＤｅｅｐＶｅｎｔ　ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ−２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ−Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製）、ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）等が挙げられる。
【００３０】
（４）ＬＡＭＰ法
１）ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法の概要
前記増幅法の好適な態様として、ＬＡＭＰ法による増幅法を用いることができる。「ＬＡＭＰ法」とは本発明者らが開発した核酸の増幅方法で、インナープライマーペア或いはこれにアウタープライマーペア、さらにループプライマーペアを加えた、２種、４種或いは６種の特異的プライマーと、鎖置換型ポリメラーゼ及び基質であるヌクレオチドを用いて、等温条件下（６５℃前後）でＤＮＡ又はＲＮＡを迅速かつ安価に増幅する方法である。ＬＡＭＰ法の概要については、文献：Ｎｏｔｏｍｉ，　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２８（１２）：ｅ６３（２０００）、特許：国際公開ＷＯ　００／２８０８２号、あるいは栄研化学（株）ホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｉｋｅｎ．ｃｏ．ｊｐ／）を参照されたい。
【００３１】
ＬＡＭＰ法では、増幅生成物の同一鎖上末端に互いに相補的な配列が生成し、これらがアニールしてヘアピン状のループが形成され、そのループを起点としたポリメラーゼによる伸長反応が起きる。同時に、ループ内にアニールしたプライマーからは鎖置換型伸長反応が起こり、先の伸長生成物を１本鎖に解離させていく。解離した１本鎖もまた、末端に相補的配列を有するため、この反応は繰り返し起きる。こうして、ＬＡＭＰ法では増幅生成物の同一鎖上の複数の位置で、伸長反応と増幅反応が同時進行するため、ＤＮＡの増幅が超指数関数的にしかも等温条件下で達成され、本発明のタンデム構造を有するプローブ核酸を効率的に合成できる。
【００３２】
２）ＬＡＭＰ法用プライマー
ＬＡＭＰ法ではインナープライマー、アウタープライマー、ループプライマーと呼ばれる、特異的プライマーが用いられる。
【００３３】
インナープライマーとはＬＡＭＰ法に必須のプライマーであって、鋳型ＤＮＡのそれぞれの鎖において、３’側に存在する任意配列Ｘ２ｃ、これより５’側の任意配列Ｘ１ｃを選択したとき、該Ｘ２ｃに相補的配列Ｘ２と該Ｘ１ｃと同一の配列Ｘ１ｃを３’側から５’側にこの順で含む（Ｘ１ｃ＋Ｘ２の構造をもつ）プライマーをいう。機能的にいえば、インナープライマー上のＸ２は鋳型に特異的にアニールして相補鎖合成の起点を与える部分であり、Ｘ１ｃは増幅（伸長）生成物がループを形成するための相補的配列を与える。そして、このループが新たな相補鎖合成の起点となる。
【００３４】
アウタープライマーとは、インナープライマーよりも外側（鋳型の３’側）の任意配列Ｘ３ｃに相補的配列を有し、これにアニールしうるプライマー２種（２本鎖に相補的な各々について１つずつ）をいう。
なお、プライマーの鋳型核酸へのアニールを容易にするため、上記Ｘ１（Ｘ１ｃ）、Ｘ２（Ｘ２ｃ）、Ｘ３（Ｘ３ｃ）の長さは５〜１００塩基が好ましく、１０〜５０塩基がさらに好ましい。
【００３５】
上記インナープライマー及びアウタープライマーは、２本鎖（Ｆ及びＲ）のそれぞれについて必要であり、インナープライマー（Ｆ１ｃ＋Ｆ２、Ｒ１ｃ＋Ｒ２）、アウタープライマー（Ｆ３、Ｒ３）の各々２種が設計される。
【００３６】
各任意配列は、ＬＡＭＰ法により得られる増幅産物が分子間アニールではなく、分子内アニールを優先的に生じ、末端ヘアピン構造を形成するように選択することが好ましい。例えば、分子内アニールを優先的に生じさせるためには、任意配列の選択に当たって、Ｆ１ｃ配列とＦ２ｃ配列との間の距離及びＲ１配列とＲ１ｃ配列との間の距離を考慮することが重要である。具体的には、両者各配列が、０〜５００塩基、好ましくは０〜１００塩基、最も好ましくは１０〜７０塩基の距離を介して存在するように選択することが好ましい。ここで、数値はそれぞれ、Ｆ１ｃ配列及びＦ２ｃ配列自身並びにＲ１配列及びＲ２配列自身を含まない塩基数を示している。
【００３７】
また、ループプライマーとは、ＬＡＭＰ法による増幅生成物の同一鎖上に生じる相補的配列が互いにアニールしてループを形成するとき、該ループ内の配列に相補的な塩基配列をその３’末端に含むプライマー２種（２本鎖に相補的な各々について１つずつ）をいう。前記アウタープライマーとループプライマーはＬＡＭＰ法に必須のプライマーではないが、これらがあれば増幅（伸長）反応はより効率的に進行する。
【００３８】
３）増幅用鋳型核酸
ＬＡＭＰ法で用いられる増幅用鋳型核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、組織又は細胞等の生物学的試料から公知方法により、あるいは化学合成法により調製することができる。この場合、増幅すべき領域（標的領域という）の両側には、適当な長さの配列（両側配列という）が存在するように鋳型ポリヌクレオチドを調製する。両側配列とは、当該標的領域の５’末端からポリヌクレオチド鎖の５’末端までの領域の配列、及び当該標的領域の３’末端からポリヌクレオチド鎖の３’末端までの領域の配列を意味する。両側配列の長さは、標的領域の５’側及び３’側のいずれの領域も、１０〜１０００塩基、好ましくは３０〜５００塩基である。
【００３９】
４）反応条件
一連の反応は、酵素反応に好適なｐＨを与える緩衝剤、酵素の触媒活性の維持やアニールのために必要な塩類、酵素の保護剤、更には必要に応じて融解温度（Ｔｍ）の調整剤等の共存下で行うことが好ましい。緩衝剤としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の中性から弱アルカリ性に緩衝作用を持つものが用いられる。ｐＨは使用するＤＮＡポリメラーゼに応じて調整すればよい。塩類としては、例えばＫＣｌ、ＮａＣｌ、あるいは（ＮＨ４）２ＳＯ４等が、酵素の活性維持とＤＮＡの融解温度（Ｔｍ）調整のために適宜添加される。酵素の保護剤としては、ウシ血清アルブミンや糖類が利用される。また、融解温度（Ｔｍ）調整剤としては、ベタイン、プロリン、ジメチルスルホキシド、あるいはホルムアミドを一般的に利用することができる。
【００４０】
５）ＬＡＭＰ反応
ＬＡＭＰ法における反応は、鋳型核酸に対して、以下の成分（ｉ）（ｉｉ）（ｉｉｉ）を加え、インナープライマーが鋳型核酸上の相補的配列に対して安定な塩基対結合を形成することができ、かつ鎖置換型ポリメラーゼが酵素活性を維持しうる温度でインキュベートすることにより進行する。インキュベート温度は５０〜７５℃、好ましくは５５〜７０℃であり、インキュベート時間は１分〜１０時間、好ましくは５分〜４時間である。
（ｉ）　インナープライマー２種、或いはさらにアウタープライマー２種、或いはさらにループプライマー２種
（ｉｉ）　鎖置換型ポリメラーゼ
（ｉｉｉ）基質ヌクレオチド
【００４１】
２．２　支持体
本発明の核酸検出用担体に用いられる支持体は、核酸プローブを固定可能な固相であれば特に限定されず、例えば、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、ラテックス、マイクロビーズ、シリコンチップ、及びキャピラリー等を用いることができる。
【００４２】
支持体は、核酸プローブを固定化するために、適当な表面処理を施すことが好ましい。例えば、ポリＬ−リシンコーティング（Ｓｃｈｅｎａ　Ｍ，　ｅｔ　ａｌ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９３：１０６１４−１０６１９，　１９９６）、シランコーティング（ＤｅＲｉｓｉ　Ｊ，　ｅｔ　ａｌ，　Ｎａｔ．　Ｇｅｎｅｔ．　１４：４５７−４６０，　１９９６）等が当該技術分野で公知である。また、市販の表面処理済みガラス板（例えば、カルボステーションＴＭ（日清紡製）、アルミニウム＆アミノシランコーティンググラス（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ製）等）を用いてもよい。
【００４３】
３．　核酸検出用担体の作製
本発明の核酸検出用担体は、上記支持体に本発明の核酸プローブを固定して作製される。前記したように、プローブは光リソグラフィー技術等により支持体上で合成してもよいが、予め合成したプローブを支持体上に固定する方法、あるいは支持体（ラテックス粒子等）に固定したプライマーからＬＡＭＰ反応を行う方法（特願２００１−１６１４８６号）が、本発明の核酸検出用担体の作製には好ましい。以下、これらの方法について説明する。
【００４４】
（１）シランコーティング−ＵＶ架橋
シランコーティングを施した支持体上に核酸プローブをスポッティングし、ＵＶ照射してプローブを支持体上のシランコーティングに共有結合（架橋）させて固定する。ＵＶ架橋は、市販のＵＶクロスリンカー（例えば、ＳＰＥＣＴＲＯ　ＬＩＮＫＥＲ（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃｓ　ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）等）を用いて、５０ｍＪ〜１５０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶ照射を行って実施する。シランコーティングは公知の技術（ＤｅＲｉｓｉ　Ｊ，　ｅｔ　ａｌ，　Ｎａｔ．　Ｇｅｎｅｔ．１４：４５７−４６０，　１９９６）にしたがって実施してもよいし、市販のシランコーティンググラス（例えば、アルミニウム＆アミノシランコーティンググラス（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ製）等）を用いてもよい。支持体上への核酸プローブのスポッティングは、市販のスポッター（又はアレイヤーともいう）を用いて行うことができる。市販のスポッターとしては、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ製Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ　ｓｙｓｔｅｍ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ＩＩＩ、日本レーザー電子製　ＳＴＡＭＰ　ＭＡＮ、日立ソフトウェアエンジニアリング製　ＳＰＢＩＯ２０００等、任意のものを用いることができる。
【００４５】
（２）ポリＬ−リシンコーティング−ＵＶ架橋
ポリＬ−リシンコーティングを施した支持体上に核酸プローブをスポッティングし、ＵＶ照射してプローブを支持体上のポリＬ−リシンコーティングに共有結合（架橋）させて固定する。ＵＶ架橋は前項と同様に実施すればよいが、架橋前に１００〜１５０℃に支持体を加熱すると、プローブの固定率がより向上する。ポリＬ−リシンコーティングは、公知の技術（Ｓｃｈｅｎａ　Ｍ，　ｅｔ　ａｌ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９３：１０６１４−１０６１９，　１９９６）に従って実施してもよいし、市販の表面処理済みガラスを用いてもよい。支持体上への核酸プローブのスポッティングは前項と同様にして実施すればよい。架橋後の支持体は、後処理溶液（マイクロアレイキットの添付品等）に浸漬後、洗浄して乾燥する。
【００４６】
（３）ビオチン−アビジン結合
ビオチン−アビジン結合を利用した支持体上への核酸プローブの固定化方法である。例えば、支持体上にアビジンを固定し、このアビジンにビオチン化ヌクレオチドを導入した核酸プローブを、ビオチン−アビジン結合を介して結合させる方法等が公知である（Ｃａｒｌ　Ｆ．　Ｅｄｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．　２５：　４９０７−４９１４（１９９７））。
【００４７】
（４）ナイロンメンブレンへの固定（ドットブロット法）
ドットブロット法では核酸プローブを固定したメンブレンを核酸検出用担体として用いる。メンブレンの素材や大きさは特に限定されず、目的に応じて適宜選択されるが、特にナイロン製メンブレンが好適に用いられる。
【００４８】
メンブレンへのプローブの付着方法は特に限定されず、ピペットで一つずつ付着させても、市販の９６穴のドットブロット装置を用いてもよいが、ピンの先端にプローブを付着させて写し取る器具を用いるとより効率的である。ただし、検出の精度を高めるために、付着させるＤＮＡ量をそろえることが必要で、そのために、プローブ濃度やメンブレンに移す液量を一定にすることが重要となる。
【００４９】
（５）支持体に固定したプライマーからのＬＡＭＰ反応
前述のＬＡＭＰ法におけるインナープライマーあるいはループプライマーを支持体上に固定しておき、そこから増幅反応を行ることにより、プローブが固定された固相担体を作製する方法である（特願２００１−１６１４８６参照）。例えば、ラテックス粒子にループプライマーの５’末を結合させたものを用いてＬＡＭＰ反応を行う。これによりラテックス粒子に固定されたＬＡＭＰ産物が合成できる。
【００５０】
４．核酸検出用担体による核酸の検出
本発明の核酸検出用担体を用いた核酸検出の手順は、従来の核酸検出用担体を用いた場合の手順と基本的に変わらない。すなわち、標識したターゲットをプローブにハイブリダイズさせ、その標識物質のシグナル強度によりターゲット量を検出する方法等が挙げられる。
以下、本発明の核酸検出用担体を用いた核酸検出方法について具体的に説明する。
【００５１】
４．１　試料（ターゲット）の調製
まず、検出対象である試料を調製する。試料は標的核酸を含むものであれば特に限定されない。例えば、生物試料中の特定遺伝子の検出であれば、周知の方法に従って細胞より全ＲＮＡあるいはｍＲＮＡを調製し、このｍＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡとして増幅し、ターゲットとして用いることができる。解析対象とする核酸量が少ない場合には、さらに前記ｃＤＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼによってｃＲＮＡとして増幅して用いてもよい。
【００５２】
４．２　ターゲットの標識
調製したターゲットは、通常検出のために適当な試薬で標識する。標識物質としては、例えば、蛍光色素（Ｃｙ３、Ｃｙ５等）、酵素、タンパク、放射性同位体、化学発光物質（例えば、ＤＮＰ）、ビオチン、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）等を挙げることができる。
【００５３】
標識は、前項に記載した増幅と同時に行うこともできる。例えば、ｍＲＮＡからｃＤＮＡ増幅時に　標識ヌクレオチド（例えば、Ｃｙ３／Ｃｙ５−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ製等）、ＤＮＰ−ｄＣＴＰ、ＤＩＧ−ｄＣＴＰ等）を加えて増幅すれば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＤＮＰ又はＤＩＧ標識されたｃＤＮＡターゲットを得ることができる。
【００５４】
ビオチン標識の場合は、ヌクレオチドのビオチン誘導体を酵素反応でターゲット鎖内に取り込ませる方法や、光活性型ビオチン誘導体や市販のビオチン標識試薬（カルボビオチンＴＭ（日清紡製）等）をターゲットに添加し反応させる方法により、ビオチン標識ターゲットを得ることができる。
【００５５】
４．３　ハイブリダイゼーション
次に標識したターゲットを核酸検出用担体にハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの条件（温度や時間等）やウォッシングの条件は、用いる核酸検出用担体やターゲットの種類に応じて、適宜決定される。ハイブリダイゼーションは市販の自動機器（例えば、ＡＳＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　ｐｈａｒｍａｃｉａ　ｂｉｏｔｅｃｈ製）を用いて行っても良い。
【００５６】
ビオチン標識ターゲットの場合は、ハイブリダイズの後に、例えばアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジンやアルカリフォスファターゼ抗ビオチン抗体を反応させ、さらに発光基質を反応させて化学発光させる。同様に、ＤＩＧ標識の場合も、例えば、アルカリフォスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体を結合後、さらに発光基質を反応させて化学発光させる。
【００５７】
４．４　検出と解析
最後に、核酸検出用担体にハイブリダイズした標識ターゲットによる蛍光や化学発光をシグナル強度として検出する。シグナルはスキャナー（例えば、ＧＴＭＡＳ　Ｓｃａｎ　ＩＩ　（日本レーザー電子製）等）で読み取り、解析ソフト（例えば、Ａｒｒａｙ−Ｐｒｏ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（日本レーザー電子製）等）を用いて画像化し、数値化する。スキャナーで読み取ったシグナルは必要に応じて、誤差の調整や各試料毎のばらつきの正規化を行ってもよい。正規化は、ハウスキーピング遺伝子等各サンプルで共通に発現している遺伝子を基準に行うことができる。さらに、信頼性限界ラインを特定して、相関性の低いデータを除いてもよい。
【００５８】
４．５　二蛍光標識法
２つの試料における核酸の発現量を比較したい場合には、比較したい２つの試料を蛍光波長の異なる２つの蛍光物質で標識する二蛍光標識法が簡便で好ましい。この際、２つの蛍光物質には蛍光波長の重なりがないことが必要で、例えば、Ｃｙ３とＣｙ５を好適に用いることができる。Ｃｙ３とＣｙ５を用いる場合、一方の試料をＣｙ３標識し、他方の試料をＣｙ５標識して、同時に核酸検出用担体にハイブリダイズさせてＣｙ３とＣｙ５の蛍光強度をスキャナーで読み取る。Ｃｙ３とＣｙ５の蛍光を重ね合わせた擬似色調を解析すれば、２つの試料間における核酸発現量差を簡便に検出することができる。
【００５９】
４．６　本発明の核酸検出用担体の効果
後述する実施例に示すように、互いに相補的な２つの配列を含むタンデム構造を有するプローブを固定した本発明の核酸検出用担体は、従来のプローブを固定した担体に比較して、同一試料について２倍以上高いシグナル強度を検出できる。
すなわち、本発明の核酸検出用担体を用いることにより、従来の方法よりも高感度に標的核酸を検出することが可能になる。
【００６０】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕　ＤＮＡマイクロアレイの調製
マウスのＧＡＰＤＨ、Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ、γ−ａｃｔｉｎの３種の遺伝子を鋳型とするＬＡＭＰ産物、及びＰＣＲ産物をそれぞれプローブとするＤＮＡマイクロアレイを作製した。
【００６１】
１．プローブの調製
マウスＧＡＰＤＨ　ｃＤＮＡ（配列番号１）、マウスＨａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ　ｃＤＮＡ（配列番号２）、マウスγ−ａｃｔｉｎ　ｃＤＮＡ（配列番号３）の配列をもとに、ＬＡＭＰ用プライマーを設計し、ＬＡＭＰ反応を行った。ＬＡＭＰ反応は、鋳型核酸の熱変性を行わず、表１に示す反応液組成にて、６５℃、２時間反応させた。Ｂｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　は　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　社製の８　Ｕ／μｌ　のものを用いた。
同様に、ＰＣＲ用プライマーを設計し、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９５℃，　１分に引き続き、９４℃，　３０秒、６５℃，　３０秒、６８℃，　３０秒を３０サイクル行った。得られる産物量が少ないため、この操作を３回繰り返した。
【００６２】
【表１】
2004081033.tif 000002
【００６３】
【表２】
2004081033.tif 000003
【００６４】
ＧＡＰＤＨ　　ＬＡＭＰ用プライマー：
Ｉｎｎｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ）：ＴＧＣＡＴＴＧＣＴＧＡＣＡＡＴＣＴＴＧＡＧＴＧＡＴＧＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＴＧＴＧＡＴ（配列番号４）
Ｉｎｎｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｒ）：ＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣＣＣＴＴＣＣＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＡＧＴ（配列番号５）
Ｏｕｔｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ）：ＡＡＡＣＧＧＧＴＣＡＴＣＡＴＣＴＣＣＧ（配列番号６）
Ｏｕｔｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｒ）：ＡＧＴＧＡＴＧＧＣＡＴＧＧＡＣＴＧＴＧ（配列番号７）
Ｌｏｏｐ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ）：ＧＴＴＧＴＣＡＴＡＴＴＴＣＴＣＧＴＧＧＴＴＣ（配列番号８）
Ｌｏｏｐ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｒ）：ＣＴＧＧＣＣＡＡＧＧＴＣＡＴＣＣＡＴ（配列番号９）
ＧＡＰＤＨ　　ＰＣＲ用プライマー：
Ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ）：ＧＡＴＧＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＴＧＴＧＡＴ（配列番号１０）
Ｐｒｉｍｅｒ（Ｒ）：ＣＣＣＴＴＣＣＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＡＧＴ（配列番号１１）
Ｈａｐｔｏｇｒｏｂｉｎ　　ＬＡＭＰ用プライマー：
Ｉｎｎｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ）：ＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＣＡＣＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＴ（配列番号１２）
Ｉｎｎｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｒ）：ＧＣＡＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＧＡＧＴＴＧＡＡＡＧＴＧＧＴＣＴＣＡＴＧＧ（配列番号１３）
Ｏｕｔｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ）：ＡＴＧＴＴＧＣＣＣＴＧＧＡＴＴＴＴＧＡＧ（配列番号１４）
Ｏｕｔｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｒ）：ＧＣＧＧＡＴＡＴＣＣＡＣＡＴＣＡＣＡＣＴ（配列番号１５）
Ｌｏｏｐ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ）：ＴＣＧＧＧＣＡＧＣＴＣＧＴＡＡＣＴＣＴ（配列番号１６）
Ｌｏｏｐ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｒ）：ＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＴＧ（配列番号１７）
Ｈａｐｔｏｇｒｏｂｉｎ　　ＰＣＲ用プライマー：
Ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ）：ＴＧＣＴＧＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＴ（配列番号１８）
Ｐｒｉｍｅｒ（Ｒ）：ＧＧＡＧＴＴＧＡＡＡＧＴＧＧＴＣＴＣＡＴＧＧ（配列番号１９）
γ−ａｃｔｉｎ　　ＬＡＭＰ用プライマー
Ｉｎｎｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ）：ＴＴＣＣＴＧＧＴＡＣＴＴＧＧＴＧＡＧＧＣＧＧＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＡＴＣＴＴＧＡＡ（配列番号２０）
Ｉｎｎｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｒ）：ＧＣＡＧＴＧＣＣＴＴＴＧＣＣＡＴＴＣＡＴＴＧＴＣＡＡＡＧＣＴＣＡＧＧＡＴＣＣＣＡ（配列番号２１）
Ｏｕｔｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ）：ＴＧＣＣＣＧＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＣＴＴＧ（配列番号２２）
Ｏｕｔｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｒ）：ＣＡＣＡＣＣＡＴＡＣＴＣＡＧＣＧＡＣＡＧ（配列番号２３）
Ｌｏｏｐ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ）：ＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＡＡＧＧＴＧＴＧ（配列番号２４）
Ｌｏｏｐ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｒ）：ＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＣＣＴＧＧＴＡＣＧＣ（配列番号２５）
γ−ａｃｔｉｎ　　ＬＡＭＰ用プライマー
Ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ）：ＧＧＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＡＴＣＴＴＧＡＡ（配列番号２６）
Ｐｒｉｍｅｒ（Ｒ）：ＴＧＴＣＡＡＡＧＣＴＣＡＧＧＡＴＣＣＣＡ（配列番号２７）
反応終了後、アルコール沈澱によってＡ１溶液に溶解した。
【００６５】
２．プローブの固定化
（株）日本レーザー電子に委託し、調製したプローブをガラス板上に固定して、ＤＮＡマイクロアレイを作製した。
（１）装置及び試薬
ＤＮＡスタンピング装置：ＳＴＡＭＰ　ＭＡＮ　（日本レーザー電子製）、マイクロプレート用遠心分離機（久保田製作所製）、ホットプレート（井内盛栄堂製）、ＵＶクロスリンカー（コスモバイオ製）、インキュベーター：Ｈｙｂｒｉ　Ｃａｎｍｂｅｒ　（日本レーザー電子製）
ＤＮＡ　Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ　Ｋｉｔ：ＤＮＡ　Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ　専用スライドグラス、ＤＮＡ　Ｐｒｉｎｔｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ、Ｐｏｓｔ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｗａｓｈ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、カバーガラス専用ゴムのり等含む（日本レーザー電子製）、カバーガラス：１８ｍｍ×１８ｍｍ（松浪ガラス製）、精製水：Ｍｉｌｌｉ　Ｑ
【００６６】
（２）作製方法（全工程をクリーンルーム内で実施）
まず、以下の条件でＤＮＡのスタンピングをおこなった。
パターン：１　ブロック
スポットサイズ：２００　μｍ
スポットエリア：約　０．５　ｃｍ２　
ドット：　４８ト゛ット／スライト゛カ゛ラス
【００６７】
次に、スタンピングしたスライドガラスを約　６０　℃の温水の上にスポット面が下になるようにかざし、約３〜５秒間蒸気にあてた後、８０　℃のホットプレートにのせて約　１時間インキュベートした。その後、スライドガラスに６０　ｍＪ　のＵＶ　照射を行い、ＤＮＡにＵＶ架橋を施した。
【００６８】
最後に、以下のようにしてブロッキングを行った。まず表３の組成でブロッキング溶液を調整し、スライドガラスをこのブロッキング溶液中で４〜５回上下させた後、約１５分間インキュベートした。次いで、９５℃の蒸留水で洗浄後、キットに添付されたＡ５溶液で洗浄し、乾燥のため　５００ｒｐｍ、１分間遠心分離を行った。
【００６９】
【表３】
2004081033.tif 000004
【００７０】
〔実施例２〕　ハイブリダイゼーションアッセイ
実施例１で作製した３種の遺伝子（ＧＡＰＤＨ、Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ、γ−ａｃｔｉｎ）検出用ＤＮＡマイクロアレイに、ＧＡＰＤＨ（配列番号１）、Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ（配列番号２）、γ−ａｃｔｉｎ（配列番号３）の配列をもとに作製した試料（ターゲット）をハイブリダイズさせ、蛍光強度を測定した。なお、この検出及び解析は（株）日本レーザー電子に委託した。
【００７１】
１．ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション用試料（ターゲット）として、実施例２で設計したＰＣＲプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ）：すなわち、ＧＡＰＤＨは配列番号１０、Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎは配列番号１８、γ−ａｃｔｉｎは配列番号２６の塩基配列を有するＤＮＡ）の５’末端をＣｙ５で標識したものを作製した。実施例１と同様に、このプライマーを用いてＰＣＲ増幅したものをハイブリダイゼーション用試料とした。各ターゲット核酸は５０ｎｇ／μｌとなるようにＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒに溶解した。
【００７２】
スライドグラス（ＤＮＡマイクロアレイ）のスポット上に、調製したハイブリダイゼーション溶液　１０μｌ　を滴下し、空気が入らないようにカバーガラスをかぶせた。次いで、カバーガラスの淵をゴムのりで密閉し、温度６５　℃，湿度８０　％に設定したＨｙｂｒｉ　Ｃｈａｍｂｅｒ　にスライドグラスを入れ、１６　時間インキュベートした。
【００７３】
次に、ポストハイブリダイゼーションを行った。スライドグラスは、密閉用ゴムのり除去後、４２℃に温めたＢ４　溶液に浸してカバーガラスを外した。次いで、Ｂ５　溶液（４２℃）中で数回上下した後１分間インキュベートし洗浄、Ｂ６　溶液（４２℃）中で数回上下した後１分間インキュベートし洗浄し、Ｂ７　溶液（４２℃）中で数回上下した後１分間インキュベートし洗浄した。最後に乾燥のため　５００ｒｐｍ、１分間遠心分離をおこなった。
【００７４】
２．スキャニング及び解析
スキャナー：ＧＴＭＡＳ　Ｓｃａｎ　ＩＩ　（日本レーザー電子製）を用いてスライドガラス上の蛍光強度をスキャンし、解析ソフト：Ａｒｒａｙ−Ｐｒｏ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（日本レーザー電子製）を用いてＣｙ５　発色量の解析をおこなった。測定は各々２サンプルについて行い、その結果を図１〜図３に示した。
【００７５】
３．結果
いずれの試料においても、ＬＡＭＰ産物をプローブとして固定したＤＮＡマイクロアレイはＰＣＲ産物をプローブとして固定したＤＮＡマイクロアレイに比較して、２〜３倍程度高い蛍光強度を示した。
【００７６】
〔実施例３〕　ドットブロット法による検出感度の検討
１．ドットブロット
実施例１と同様の方法で調製したマウスＧＡＰＤＨ　ｃＤＮＡのＰＣＲ産物及びＬＡＭＰ産物、それぞれ１００　ｎｇ　をナイロンメンブレン上にスポットとした。試料（ターゲット）として、ＤＩＧラベルしたＧＡＰＤＨ　ｃＤＮＡ断片（配列番号１０）の１０倍、及び　１００倍希釈液を、ハイブリダイゼーション溶液１　ｍｌに１μｌ添加したものを調製　（各々１０　ｐｌ　ｔａｒｇｅｔ／１　ｍｌ，　１　ｐｌ　ｔａｒｇｅｔ／１　ｍｌ）し、前記ナイロンメンブレン上にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、６０℃、ｏｖｅｒ　ｎｉｇｈｔで行い、反応後、０．１　ｘ　ＳＳＣ，　０．５％　ＳＤＳ溶液を用いて６０℃で、４５分洗浄した。検出は、ＤＩＧ　ｌａｂｅｌ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（Ｒｏｃｈｅ社製）　を用いて行った。結果を図４に示す。
【００７７】
２．結果
図４から明らかなように、ＬＡＭＰ産物を固定した担体では、１０倍希釈試料（１０　ｐｌｔａｒｇｅｔ／１　ｍｌ）、１００倍希釈試料　（１　ｐｌ　ｔａｒｇｅｔ／１　ｍｌ）　のいずれをも検出することができたが、ＰＣＲ産物を固定した担体では１００倍希釈試料を検出することはできなかった。
【００７８】
以上の結果より、ＬＡＭＰ産物をスポットした担体は、従来のＰＣＲ産物をスポットした単体に比較して、少量の試料を感度よく検出できることが確認された。すなわち、本発明の核酸検出用担体は、発現量の少ない遺伝子の検出に極めて有効であることが確認できた。
【００７９】
【発明の効果】
本発明によれば、少量の核酸を感度よく検出することができる。しかも、本発明の核酸検出用担体は、ＬＡＭＰ法を利用することにより、容易かつ低廉に作製することができる。
【００８０】
【配列表】
2004081033.tif 000005
2004081033.tif 000006
2004081033.tif 000007
2004081033.tif 000008
2004081033.tif 000009
2004081033.tif 000010
2004081033.tif 000011
2004081033.tif 000012
2004081033.tif 000013
2004081033.tif 000014
2004081033.tif 000015
2004081033.tif 000016
【００８１】
【配列表フリーテキスト】
配列番号４−人工配列の説明：プライマー
配列番号５−人工配列の説明：プライマー
配列番号６−人工配列の説明：プライマー
配列番号７−人工配列の説明：プライマー
配列番号８−人工配列の説明：プライマー
配列番号９−人工配列の説明：プライマー
配列番号１０−人工配列の説明：プライマー
配列番号１１−人工配列の説明：プライマー
配列番号１２−人工配列の説明：プライマー
配列番号１３−人工配列の説明：プライマー
配列番号１４−人工配列の説明：プライマー
配列番号１５−人工配列の説明：プライマー
配列番号１６−人工配列の説明：プライマー
配列番号１７−人工配列の説明：プライマー
配列番号１８−人工配列の説明：プライマー
配列番号１９−人工配列の説明：プライマー
配列番号２０−人工配列の説明：プライマー
配列番号２１−人工配列の説明：プライマー
配列番号２２−人工配列の説明：プライマー
配列番号２３−人工配列の説明：プライマー
配列番号２４−人工配列の説明：プライマー
配列番号２５−人工配列の説明：プライマー
配列番号２６−人工配列の説明：プライマー
配列番号２７−人工配列の説明：プライマー
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＬＡＭＰ産物を固定したＤＮＡマイクロアレイとＰＣＲ産物を固定したＤＮＡマイクロアレイによる、ＧＡＰＤＨ　ｃＤＮＡ断片の検出結果を示すグラフである。
【図２】図２は、ＬＡＭＰ産物を固定したＤＮＡマイクロアレイとＰＣＲ産物を固定したＤＮＡマイクロアレイによる、Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ　ｃＤＮＡ断片の検出結果を示すグラフである。
【図３】図３は、ＬＡＭＰ産物を固定したＤＮＡマイクロアレイとＰＣＲ産物を固定したＤＮＡマイクロアレイによる、γ−ａｃｔｉｎの断片の検出結果を示すグラフである。
【図４】図４は、ＬＡＭＰ産物とＰＣＲ産物による、ＤＩＧ標識ＧＡＰＤＨ　ｃＤＮＡ断片のドットブロットの結果を示す。
【図１】
2004081033.tif 000017
【図２】
2004081033.tif 000018
【図３】
2004081033.tif 000019
【図４】
2004081033.tif 000020