(57)【要約】      （修正有）【課題】  アユの腫瘍壊死因子を単離・同定し、腫瘍壊死因子活性を有する新規タンパク質を提供するとともに、該タンパク質の腫瘍壊死因子を利用したアユの感染症予防・治療剤及び予防・治療方法、該タンパク質の発現レベルを指標としたアユの感染症診断方法及び診断用キット、並びに、該タンパク質の発現レベル亢進効果を指標とした、アユの感染症に対して予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法及びスクリーニング用キットを提供する。【解決手段】  腫瘍壊死因子活性を有する新規タンパク質として、（ａ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｂ）特定ののアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍壊死因子活性を有するタンパク質を利用する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列のうち７３〜２３５番目のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列のうち７３〜２３５番目のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍壊死因子活性を有するタンパク質
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡを含む請求項２記載の遺伝子。
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列、又は配列番号１記載の塩基配列のうち１７１〜８７８番目の塩基配列若しくは３８７〜８７８番目の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１記載の塩基配列、又は配列番号１記載の塩基配列のうち１７１〜８７８番目の塩基配列若しくは３８７〜８７８番目の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ腫瘍壊死因子活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
請求項２又は３記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
請求項１記載のタンパク質に反応し得る抗体又はその断片。
【請求項７】
請求項１記載のタンパク質を含有するアユの感染症予防・治療剤。
【請求項８】
アユに請求項１記載のタンパク質を投与する工程を含むアユの感染症予防・治療方法。
【請求項９】
アユにおける請求項１記載のタンパク質の発現レベルを指標として、前記アユが感染症に罹患しているか否かを診断する工程を含むアユの感染症診断方法。
【請求項１０】
前記発現レベルを、前記アユから採取した検体における請求項１記載のタンパク質をコードするｍＲＮＡの存在量に基づいて測定する請求項９記載の感染症診断方法。
【請求項１１】
前記発現レベルを、前記アユから採取した検体における請求項１記載のタンパク質の存在量に基づいて測定する請求項９記載の感染症診断方法。
【請求項１２】
被験アユにおける請求項１記載のタンパク質の発現レベルが、健常アユにおける請求項１記載のタンパク質の発現レベルよりも亢進しているときに、前記被験アユが感染症に罹患していると診断する請求項９〜１１のいずれかに記載の感染症診断方法。
【請求項１３】
請求項１記載のタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むアユの感染症診断用キット。
【請求項１４】
請求項１記載のタンパク質に反応し得る抗体又はその断片を含むアユの感染症診断用キット。
【請求項１５】
アユに候補物質を投与した後、前記アユにおける請求項１記載のタンパク質の発現レベル亢進効果を指標として、アユの感染症に対する前記候補物質の予防・治療効果を判定する工程を含む、アユの感染症に対して予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項１６】
請求項１記載のタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む、アユの感染症に対して予防・治療効果を有する物質のスクリーニング用キット。
【請求項１７】
請求項１記載のタンパク質に反応し得る抗体又はその断片を含む、アユの感染症に対して予防・治療効果を有する物質のスクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍壊死因子活性を有する新規タンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、上記タンパク質に対する抗体、上記タンパク質の腫瘍壊死因子活性を利用したアユの感染症の予防・治療剤及び予防・治療方法、上記タンパク質の発現レベルを指標としたアユの感染症の診断方法及び診断用キット、並びに、上記タンパク質の発現レベル亢進効果を指標としたアユの感染症に対して予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法及びスクリーニング用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
アユは、サケ目アユ科に属する淡水魚で、サケの仲間の特徴であるアブラビレを有しており、本州以南の川に生息する他、世界的には朝鮮半島の中国国境、台湾等に生息する。アユは、秋に川で産卵・孵化し、冬・仔魚期には海でくらし、春には稚魚になって河川に上って成魚に成長する一年魚である。成長すると２００〜４００ｇ程度の大きさになる。アユは、水苔を主食とし、スイカのような香りがあり、香魚の別名を有する。アユの独特の香りや、季節感が高いことから、日本におけるアユの食材価値は高く、アユの養殖は徳島県等で重要な産業となっている。
【０００３】
冷水病は、グラム陰性菌Flavobacterium psychrophilumを病原菌とするサケの仲間に感染する病気であり、低水温期に発病することから冷水病と名付けられた。冷水病に感染すると皮膚やえらに潰瘍が発生し、死に至る。日本では１９８７年に徳島県でアユから冷水病菌が確認され、現在では、アユの養殖現場において全国的に流行している。冷水病に感染したアユが成魚になるまでに死亡する割合は７０％に達することもあり、冷水病による養殖場の被害は甚大である。アユの魚病別死亡率を見てみると、４０％を冷水病が占める。現在のところ、冷水病に対する抜本的な治療法はなく、その対策が急がれている。
【０００４】
また、シュードモナス症はPseudomonas plecoglossicidaを病原菌とする感染症であり、眼球内出血、腹腔内出血、肛門の拡張発赤を特徴とする症状を示す。平成１０年度のシュードモナス症の発生状況は魚病別で２０％になる。Pseudomonas plecoglossicidaは薬剤に対する感受性が低く、現在のところ対処法が無いため、シュードモナス症に対する治療法の早期確立が求められている。
【０００５】
アユは、細菌の侵入に対して免疫防御機構を働かせて、細菌の感染を防御している。したがって、アユにおける免疫防御機構の亢進は細菌の感染防御を可能とすると考えられる。哺乳類のサイトカインの研究から、腫瘍壊死因子（以下「ＴＮＦ」という場合がある。）が免疫防御機構の制御に重要な分子であることが明らかとなってきた。細菌、ウイルス、カビ等が体内に侵入すると、侵入した病原体をマクロファージが異物として識別・貪食し、活性化したマクロファージからＴＮＦが産生される。産生されたＴＮＦは、炎症性細胞を遊走して活性酸素産生増強等の活性化を誘導し、その結果、細菌は除去される。また、ＴＮＦは、ウイルス感染細胞のアポトーシス誘導を起こすとともに、繊維芽細胞の増殖促進等による創傷治癒を促す。
【０００６】
このように、ＴＮＦは病原体の感染に伴って誘導されることから、ＴＮＦは感染症の指標となる。また、体内ＴＮＦ量の増強は、感染症の予防・治療に有用であるとともに、創傷治癒の促進に有用である。
したがって、アユの感染症の診断や予防・治療に際し、アユのＴＮＦを用いることは有用であると考えられるが、アユのＴＮＦ及びそれをコードする遺伝子については未だ単離・同定されていない。
【０００７】
魚類のＴＮＦ遺伝子は、ヒラメからランダムシークエンスにより発見されたのが始まりで（非特許文献１）、その後、ニジマス（非特許文献２）、川マス（非特許文献３）、タイ（非特許文献４）及びナマズ（DNA data base: accession No. AJ417565）から、ヒラメのＴＮＦ遺伝子とホモロジーのある遺伝子が発見されている。魚類のＴＮＦ遺伝子より推定されるアミノ酸配列は、哺乳類のＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βに対して約３０％のホモロジーを有している。魚類のＴＮＦには哺乳類のＴＮＦと構造的なホモロジーは認められているが、その機能については未だ報告がない。ヒラメとニジマスについては、グラム陰性菌の菌体成分であるリポ多糖（LPS）刺激でマクロファージからＴＮＦ遺伝子の発現誘導が認められており、ＴＮＦが魚類の細菌感染防御に関連することが示唆される。
【０００８】
【非特許文献１】ヒロノ(Hirono), Ｉ.ら, ジャーナル オブ イムノロジー(Journal of Immnology), ２０００年, 第１６５巻, ｐ.４４２３−４４２７
【非特許文献２】レイン(Laing), ＫＪ.ら, ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケミストリー(European Journal of Biochemistry), ２００１年, 第２６８巻, ｐ.１３１５−１３２２
【非特許文献３】ボウブ(Bobe), Ｊ.ら, コンパラティブ バイオケミストリー アンド フィジオロジー Ｂ： バイオケミストリー アンド モレキュラー バイオロジー(Comparative Biochemistry and Physiology B： Biochemistry and Molecular Biology), ２００２年, 第１２９巻, ｐ.４７５−４８１
【非特許文献４】ガルシア-カスティロ(Garcia-Castillo), Ｊ.ら, イムノジェネティクス(Immunogenetics), ２００２年, 第５４巻, ｐ.２００−２０７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、第一に、腫瘍壊死因子活性を有する新規タンパク質（アユの腫瘍壊死因子を含む）、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体及び上記タンパク質に対する抗体を提供することを目的とする。
また、本発明は、第二に、上記タンパク質の腫瘍壊死因子活性を利用したアユの感染症の予防・治療剤及び予防・治療方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、第三に、上記タンパク質の発現レベルを指標としたアユの感染症の診断方法及び診断用キットを提供することを目的とする。
さらに、本発明は、第四に、上記タンパク質の発現レベル亢進効果を指標とした、アユの感染症に対して予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法及びスクリーニング用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明は、以下のタンパク質、遺伝子、組換えベクター、形質転換体、抗体、アユの感染症の予防・治療剤及び予防・治療方法、アユの感染症の診断方法及び診断用キット、並びに、アユの感染症に対して予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法及びスクリーニング用キットを提供する。
【００１１】
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列のうち７３〜２３５番目のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列のうち７３〜２３５番目のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍壊死因子活性を有するタンパク質
（２）前記（１）記載のタンパク質をコードする遺伝子。
（３）以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡを含む前記（２）記載の遺伝子。
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列、又は配列番号１記載の塩基配列のうち１７１〜８７８番目の塩基配列若しくは３８７〜８７８番目の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１記載の塩基配列、又は配列番号１記載の塩基配列のうち１７１〜８７８番目の塩基配列若しくは３８７〜８７８番目の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ腫瘍壊死因子活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（４）前記（２）又は（３）記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
（５）前記（４）記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（６）前記（１）記載のタンパク質に反応し得る抗体又はその断片。
（７）前記（１）記載のタンパク質を含有するアユの感染症予防・治療剤。
（８）アユに前記（１）記載のタンパク質を投与する工程を含むアユの感染症予防・治療方法。
（９）アユにおける前記（１）記載のタンパク質の発現レベルを指標として、前記アユが感染症に罹患しているか否かを診断する工程を含むアユの感染症診断方法。
（１０）前記発現レベルを、前記アユから採取した検体における前記（１）記載のタンパク質をコードするｍＲＮＡの存在量に基づいて測定する前記（９）記載の感染症診断方法。
（１１）前記発現レベルを、前記アユから採取した検体における前記（１）記載のタンパク質の存在量に基づいて測定する前記（９）記載の感染症診断方法。
（１２）被験アユにおける前記（１）記載のタンパク質の発現レベルが、健常アユにおける前記（１）記載のタンパク質の発現レベルよりも亢進しているときに、前記被験アユが感染症に罹患していると診断する前記（９）〜（１１）のいずれかに記載の感染症診断方法。
（１３）前記（１）記載のタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むアユの感染症診断用キット。
（１４）前記（１）記載のタンパク質に反応し得る抗体又はその断片を含むアユの感染症診断用キット。
（１５）アユに候補物質を投与した後、前記アユにおける前記（１）記載のタンパク質の発現レベル亢進効果を指標として、アユの感染症に対する前記候補物質の予防・治療効果を判定する工程を含む、アユの感染症に対して予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法。
（１６）前記（１）記載のタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む、アユの感染症に対して予防・治療効果を有する物質のスクリーニング用キット。
（１７）前記（１）記載のタンパク質に反応し得る抗体又はその断片を含む、アユの感染症に対して予防・治療効果を有する物質のスクリーニング用キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によって、腫瘍壊死因子活性を有する新規タンパク質（アユの腫瘍壊死因子を含む）、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体及び上記タンパク質に対する抗体が提供される。また、本発明によって、上記タンパク質の腫瘍壊死因子活性を利用したアユの感染症の予防・治療剤及び予防・治療方法が提供される。さらに、本発明によって、上記タンパク質の発現レベルを指標としたアユの感染症の診断方法及び診断用キットが提供される。さらに、本発明によって、上記タンパク質の発現レベル亢進効果を指標とした、アユの感染症に対して予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法及びスクリーニング用キットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質は、腫瘍壊死因子活性を有する。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列のうち７３〜２３５番目のアミノ酸配列からなるタンパク質（以下「タンパク質（ａ）」という。）
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列のうち７３〜２３５番目のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍壊死因子活性を有するタンパク質（以下「タンパク質（ｂ）」という。）
ここで、「腫瘍壊死因子活性」には、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）としての作用、例えば、腫瘍細胞傷害作用、創傷治癒促進作用、再生促進作用、感染防御作用、細胞分化誘導作用、胎発生制御作用等が含まれる。なお、これらの生物活性はＴＮＦ分子がＴＮＦ受容体に結合し、細胞質内に種々のシグナルを伝達することに始まる。そして、細胞内シグナルがカスパーゼを活性化することで細胞のアポトーシスを誘導し、腫瘍細胞が傷害を受ける。また、細胞内シグナルが、ＮＦκＢやＡＰ−１等の転写制御タンパクを活性化することで、種々のサイトカインや一酸化窒素の産生を誘導し、ファイブロブラストの増殖促進（創傷治癒、再生促進）、一酸化窒素産生増強・活性化酸素誘導・好中球の活性化（感染防御作用）、細胞分化誘導、胎発生制御が起こる。
【００１４】
哺乳類のＴＮＦはＩＩ型の膜結合タンパクとして産生される。この膜結合タンパク質は膜結合型ＴＮＦ又はプロＴＮＦと呼ばれる。膜結合型ＴＮＦは、メタロプロテアーゼの一種であるＴＡＣＥ（TNF alpha converting enzyme）により加水分解され分泌型ＴＮＦになる。哺乳類では多くの生物活性が分泌型ＴＮＦについて報告されているが、膜結合型ＴＮＦも生物活性（殺腫瘍細胞活性、細菌感染防御作用等）を有することが報告されている。多くの哺乳類（マウス、ウシ、ウサギ、マーモット等）のＴＮＦは、Ｔｈｒ−Ｌｅｕの部位でＴＡＣＥにより開裂することが知られている。魚類のＴＮＦでもこの配列が保存されているので、魚類でも哺乳類と同様にＴｈｒ−Ｌｅｕの部位で開裂し、分泌型になると推定される。
ＴＡＣＥにより開裂すると推定されるＴｈｒ−Ｌｅｕの部位は、配列番号２記載のアミノ酸配列のうち７２〜７３番目のアミノ酸配列に相当し、配列番号２記載のアミノ酸配列のうち７３〜２３５番目のアミノ酸配列からなるタンパク質は分泌型タンパク質に相当する。
【００１５】
配列番号２記載のアミノ酸配列において欠失、置換又は付加されるアミノ酸の個数は、タンパク質（ｂ）が腫瘍壊死因子活性を有する限り特に限定されるものではなく、その個数は１又は複数個、好ましくは１又は数個であり、その具体的な範囲は通常１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個である。このとき、タンパク質（ｂ）のアミノ酸配列は、タンパク質（ａ）のアミノ酸配列と通常９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の相同性を有する。
【００１６】
配列番号２記載のアミノ酸配列において欠失、置換又は付加されるアミノ酸の位置は、タンパク質（ｂ）が腫瘍壊死因子活性を有する限り特に限定されるものではない。
ヒト分泌型ＴＮＦにおいては、Ｎ末端側の１２番目のアミノ酸に変異が存在しても生物活性が保持されることが報告されている（ソマ(Soma), G-I.ら, バイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コミニュケイション(Biochemical and Biophysical Research Communications), １９８７年, 第１４８巻, ｐ６２９−６３５）。したがって、ヒト分泌型ＴＮＦとのホモロジーから、配列番号２記載のアミノ酸配列のうち、７３〜８１番目のアミノ酸配列に変異が加わっても腫瘍壊死因子活性が保持されると考えられえる。
【００１７】
タンパク質（ｂ）には、タンパク質（ａ）に対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入したタンパク質の他、欠失、置換又は付加された状態で天然に存在するタンパク質（例えば、アユにおいて多型等によって生じ得るタンパク質）や、それに対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入したタンパク質も含まれる。
【００１８】
タンパク質（ａ）及び（ｂ）には、糖鎖が付加されたタンパク質及び糖鎖が付加されていないタンパク質のいずれもが含まれる。タンパク質に付加される糖鎖の種類、位置等は、タンパク質の製造の際に使用される宿主細胞の種類によって異なるが、糖鎖が付加されたタンパク質には、いずれの宿主細胞を用いて得られるタンパク質も含まれる。また、タンパク質（ａ）及び（ｂ）には、その医薬的に許容される塩も含まれる。
【００１９】
タンパク質（ａ）及び（ｂ）は、それぞれのタンパク質をコードする遺伝子を用いて常法に従って製造できる。タンパク質（ａ）をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡを使用できる。
配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡは、例えば、アユの頭腎、肝臓、脾臓等の組織から抽出したｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製し、配列番号１記載の塩基配列に基づいて合成したプローブを用いて、ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを含むクローンをスクリーニングすることにより得られる。以下、ｃＤＮＡライブラリーの作製、及び目的のＤＮＡを含むクローンのスクリーニングの各工程について説明する。
【００２０】
〔ｃＤＮＡライブラリーの作製〕
ｃＤＮＡライブラリーを作製する際には、アユの頭腎、肝臓、脾臓等の組織から全ＲＮＡを得た後、オリゴｄＴ−セルロースやポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法、バッチ法等によりポリ（Ａ＋）ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得る。この際、ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ（Ａ＋）ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分画してもよい。次いで、得られたｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、該一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成する。このようにして得られた二本鎖ｃＤＮＡを適当なクローニングベクターに組み込んで組換えベクターを作製し、該組換えベクターを用いて大腸菌等の宿主細胞を形質転換し、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性を指標として形質転換体を選択することにより、ｃＤＮＡのライブラリーが得られる。ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターは、宿主細胞中で自立複製できるものであればよく、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター等を使用できる。宿主細胞としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）等を使用できる。
【００２１】
大腸菌等の宿主細胞の形質転換は、塩化カルシウム、塩化マグネシウム又は塩化ルビジウムを共存させて調製したコンピテント細胞に、組換えベクターを加える方法等により行うことができる。なお、ベクターとしてプラスミドを用いる場合は、テトラサイクリン、アンピシリン等の薬剤耐性遺伝子を含有させておく。
【００２２】
ｃＤＮＡライブラリーの作製にあたっては、市販のキット、例えば、SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning（Gibco BRL社製）、ZAP-cDNA Synthesis Kit（ストラタジーン社製）等を使用できる。
【００２３】
〔目的のＤＮＡを含むクローンのスクリーニング〕
ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを含むクローンをスクリーニングする際には、配列番号１記載の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、これを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、ＰＣＲ増幅断片を得る。ＰＣＲ増幅断片は、適当なプラスミドベクターを用いてサブクローニングしてもよい。ＰＣＲに使用するプライマーセットは特に限定されるものではなく、配列番号１記載の塩基配列に基づいて設計できる。
【００２４】
ｃＤＮＡライブラリーに対して、ＰＣＲ増幅断片をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーション又はプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、目的のＤＮＡが得られる。プローブとしては、ＰＣＲ増幅断片をアイソトープ（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ）、ビオチン、ジゴキシゲニン、アルカリフォスファターゼ等で標識したものを使用できる。目的のＤＮＡを含むクローンは、抗体を用いたイムノスクリーニング等の発現スクリーニングによっても得られる。
【００２５】
取得されたＤＮＡの塩基配列は、該ＤＮＡ断片をそのまま、又は適当な制限酵素等で切断した後、常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、マキサム−ギルバートの化学修飾法、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法を用いて決定できる。塩基配列解析の際には、通常、３７３Ａ ＤＮＡシークエンサー（Perkin Elmer社製）等の塩基配列分析装置が用いられる。
【００２６】
以上のようにして、タンパク質（ａ）をコードする遺伝子として、配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡが得られる。
配列番号１記載の塩基配列のうち、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は１７１〜８７８番目の塩基配列によってコードされており、翻訳開始コドンＡＴＧは１７１〜１７３番目の塩基配列によってコードされており、終止コドンＴＡＧは、８７６〜８７８番目の塩基配列によってコードされており、膜貫通ドメインは２８５〜３３５番目の塩基配列によってコードされており、ＴＡＣＥ（TNF alpha converting enzyme）により解裂するアミノ酸配列（Ｔｈｒ−Ｌｅｕ）は３８４〜３８９番目の塩基配列によってコードされている。また、配列番号２記載のアミノ酸配列のうち７３〜２３５番目のアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号１記載の塩基配列のうち３８７〜８７８番目の塩基配列によってコードされている。
【００２７】
タンパク質（ａ）をコードする遺伝子は、配列番号１記載の塩基配列、又は配列番号１記載の塩基配列のうち１７１〜８７８番目の塩基配列若しくは３８７〜８７８番目の塩基配列からなるＤＮＡに限定されるものではなく、タンパク質（ａ）をコードする限り、その他の塩基配列からなるＤＮＡも含まれる。そのようなＤＮＡは、その塩基配列に従って化学合成により得られる。ＤＮＡの化学合成は、市販のＤＮＡ合成機、例えば、チオホスファイト法を利用したＤＮＡ合成機（島津製作所社製）、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機（パーキン・エルマー社製）を用いて行うことができる。
【００２８】
タンパク質（ｂ）をコードする遺伝子には、配列番号１記載の塩基配列、又は配列番号１記載の塩基配列のうち１７１〜８７８番目の塩基配列若しくは３８７〜８７８番目の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ腫瘍壊死因子活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが含まれる。
【００２９】
「ストリンジェントな条件」としては、例えば、３７〜８０℃、０．０５〜５×ＳＳＣ及び０．１〜１０％ＳＤＳの条件、好ましくは５０〜７２℃、０．１〜２×ＳＳＣ及び０．２〜５％ＳＤＳの条件が挙げられる。
【００３０】
標的ＤＮＡ（すなわち、配列番号１記載の塩基配列、又は配列番号１記載の塩基配列のうち１７１〜８７８番目の塩基配列若しくは３８７〜８７８番目の塩基配列からなるＤＮＡ）と相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの具体例としては、標的ＤＮＡと少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００３１】
タンパク質（ｂ）をコードする遺伝子は、例えば、配列番号１記載の塩基配列、又は配列番号１記載の塩基配列のうち１７１〜８７８番目の塩基配列若しくは３８７〜８７８番目の塩基配列からなるＤＮＡに、部位特異的変異誘発法等の公知の方法を用いて人為的に変異を導入することにより得られる。変異の導入は、例えば、変異導入用キット、例えば、Mutant-K（TAKARA社製）、Mutant-G（TAKARA社製）、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて行うことができる。また、塩基配列が既に決定されているＤＮＡについては化学合成によっても得られる。
【００３２】
タンパク質（ａ）及び（ｂ）は、例えば、以下の工程に従って、それぞれのタンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞中で発現させることにより製造できる。
【００３３】
〔組換えベクター及び形質転換体の作製〕
組換えベクターを作製する際には、目的とするタンパク質のコード領域を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、目的とするタンパク質のコード領域の塩基配列を、宿主細胞における発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換したＤＮＡを調製する。
【００３４】
このＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより組換えベクターを作製し、該組換えベクターを適当な宿主細胞に導入することにより、目的とするタンパク質を生産し得る形質転換体が得られる。上記ＤＮＡ断片は、その機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要であり、ベクターは、プロモーターの他、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子）、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を含有できる。
【００３５】
発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用できる。プラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えば、pRSET、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、pUB110、pTP5）、酵母由来のプラスミド（例えば、YEp13、YEp24、YCp50）が挙げられ、ファージベクターとしては、例えば、λファージ（例えば、Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP）が挙げられ、ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスが挙げられる。
【００３６】
宿主細胞としては、目的とする遺伝子を発現し得る限り、原核細胞、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等のいずれを使用してもよい。また、動物個体、植物個体、カイコ虫体等を使用してもよい。
【００３７】
細菌を宿主細胞とする場合、例えば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属する細菌を宿主細胞として使用できる。具体的には、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli K12、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101等の大腸菌や、Bacillus subtilis MI 114、Bacillus subtilis 207-21等の枯草菌を宿主細胞として使用できる。この場合のプロモーターは、大腸菌等の細菌中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、trpプロモーター、lacプロモーター、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーターを使用できる。また、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターも使用できる。
【００３８】
細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等を使用できる。
【００３９】
酵母を宿主細胞とする場合、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomycescerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）等を宿主細胞として使用できる。この場合のプロモーターは、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等を使用できる。
【００４０】
酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を使用できる。
【００４１】
動物細胞を宿主細胞とする場合、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞等を宿主細胞として使用できる。この場合のプロモーターは、動物細胞中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTR(Long Terminal Repeat)プロモーター、CMVプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を使用できる。
【００４２】
動物細胞への組換えベクターの導入方法は、動物細胞にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を使用できる。
【００４３】
昆虫細胞を宿主とする場合には、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞、Trichoplusia niの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を宿主細胞として使用できる。Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞としてはSf9、Sf21等、Trichoplusia niの卵巣細胞としてはHigh 5、BTI-TN-5B1-4（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはBombyx mori N4等が挙げられる。
【００４４】
昆虫細胞への組換えベクターの導入方法は、昆虫細胞にＤＮＡを導入し得る限り特に限定されず、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等を使用できる。
【００４５】
〔形質転換体の培養〕
目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを導入した形質転換体を通常の培養方法に従って培養する。形質転換体の培養は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【００４６】
大腸菌や酵母等の微生物を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを使用してもよい。
【００４７】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を使用できる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物等を使用できる。無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を使用できる。
【００４８】
大腸菌や酵母等の微生物を宿主細胞として得られた形質転換体の培養は、振盪培養又は通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は通常２０〜３７℃、培養時間は通常６時間〜６日間であり、培養期間中はｐＨを５．０〜８．０に保持する。ｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行うことができる。また、培養の際、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４９】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００５０】
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地、EagleのMEM培地、DMEM培地、Ham F12培地、Ham F12K培地又はこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を使用できる。形質転換体の培養は、通常５％ＣＯ２存在下、２０〜４２℃で２４時間〜６日間行う。また、培養の際、必要に応じてカナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００５１】
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているTNM-FH培地（ファーミンジェン社製）、Sf-900 II SFM培地（Gibco BRL社製）、ExCell400、ExCell405（JRHバイオサイエンシーズ社製）等を使用できる形質転換体の培養は、通常２５〜３０℃で２〜４日間行う。また、培養の際、必要に応じてゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００５２】
目的とするタンパク質は、分泌タンパク質又は融合タンパク質として発現させることもできる。融合させるタンパク質としては、例えば、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（His-tag）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン等が挙げられる。
【００５３】
〔タンパク質の単離・精製〕
形質転換体の培養物より目的とするタンパク質を採取することにより、目的とするタンパク質が得られる。ここで、「培養物」には、培養上清、培養細胞、培養菌体、細胞又は菌体の破砕物のいずれもが含まれる。
目的とするタンパク質が形質転換体の細胞内に蓄積される場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に細胞を破砕して、目的とするタンパク質を抽出する。目的とするタンパク質が形質転換体の細胞外に分泌される場合には、培養上清をそのまま使用するか、遠心分離等により培養上清から細胞又は菌体を除去する。
【００５４】
こうして得られるタンパク質（ａ）又は（ｂ）は、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、ゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法等により精製できる。
【００５５】
タンパク質（ａ）又は（ｂ）は、そのアミノ酸配列に基づいて、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造できる。この際、市販のペプチド合成機を使用できる。
【００５６】
タンパク質（ａ）又は（ｂ）を免疫用抗原として利用することより、タンパク質（ａ）又は（ｂ）に反応し得る抗体又はその断片を作製できる。ここで、「抗体」には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれもが含まれ、「抗体の断片」には、Fab断片、F(ab)'2断片、単鎖抗体(scFv)等が含まれる。
【００５７】
免疫用抗原としては、例えば、(i) タンパク質（ａ）又は（ｂ）を発現している細胞又は組織の破砕物又はその精製物、(ii) ＤＮＡ組換え技術を用いて、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードするＤＮＡ（例えば、タンパク質（ａ）については配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ）を大腸菌、昆虫細胞又は動物細胞等の宿主に導入して発現させた組換えタンパク質、(iii) 化学合成したペプチド等を使用できる。
【００５８】
ポリクローナル抗体の作製にあたっては、免疫用抗原を用いて、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等の哺乳動物を免疫する。免疫動物は、抗体を容易に作製できることからマウスを利用することが好ましい。免疫の際には、抗体産生誘導する為に、フロイント完全アジュバント等の免疫助剤を用いてエマルジョン化した後、複数回の免疫することが好ましい。免疫助剤としては、フロイント完全アジュバント(FCA)の他、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムゲル等を利用できる。哺乳動物１匹当たりの抗原の投与量は、哺乳動物の種類に応じて適宜設定できるが、マウスの場合には通常１〜１００μｇである。投与部位は、例えば、静脈内、皮下、腹腔内等である。免疫の間隔は、通常、数日から数週間間隔、好ましくは７日〜５週間間隔で、合計１〜１０回、好ましくは３〜６回免疫を行う。そして、最終免疫日から５〜１０日後に、タンパク質（ａ）又は（ｂ）に対する抗体力価を測定し、抗体力価が上昇した後に採血し、抗血清を得る。抗体力価の測定は、酵素免疫測定法(ELISA)、放射性免疫測定法(RIA)等により行うことができる。
【００５９】
抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して又はこれらを組み合わせて利用できる。
【００６０】
モノクローナル抗体の作製にあたっては、ポリクローナル抗体の場合と同様に免疫用抗原を用いて哺乳動物を免疫し、最終免疫日から２〜４日後に抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、胸腺細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞が一般的に利用される。
【００６１】
次いで、ハイブリドーマを得るために、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、ヒト、マウス等の哺乳動物由来の細胞であって一般に入手可能な株化細胞を利用できる。利用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態では選択培地(例えばHAT培地)で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞の具体例としては、P3X63-Ag.8.U1（P3U1）、P3/NSI/1-Ag4-1、Sp2/0-Ag14等のマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
【００６２】
細胞融合は、血清を含まないDMEM、RPMI-1640培地等の動物細胞培養用培地中に、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを所定の割合（例えば１：３〜１：１０）で混合し、ポリエチレングリコール等の細胞融合促進剤の存在下で、又は電気パルス処理(例えばエレクトロポレーション)により融合反応を行う。
【００６３】
細胞融合処理後、選択培地を用いて培養し、目的とするハイブリドーマを選別する。次いで、増殖したハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法 (ELISA)、放射性免疫測定法(RIA)等によってスクリーニングできる。
【００６４】
ハイブリドーマのクローニングは、例えば、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法等により行うことができ、最終的にモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得する。
【００６５】
取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法等を利用することができる。細胞培養法においては、例えばハイブリドーマを10〜20％牛胎児血清含有RPMI-1640培地、MEM培地等の動物細胞培養培地中、通常の培養条件(例えば37℃，5％CO2濃度)で２〜７日間培養することにより、その培養上清からモノクローナル抗体を取得することができる。また、ハイブリドーマをマウス等の腹腔内に移植し、１０〜２０日後に腹水を採取し、当該腹水からモノクローナル抗体を取得することもできる。
【００６６】
モノクローナル抗体の精製が必要とされる場合は、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して又はこれらを組み合わせて利用できる。
【００６７】
タンパク質（ａ）又は（ｂ）は腫瘍壊死因子活性を有するので、アユの感染症予防・治療剤の有効成分として利用できる。アユに投与されたタンパク質（ａ）又は（ｂ）は、アユの免疫防御機構を亢進させて、アユの感染症を予防・治療できる。
【００６８】
タンパク質（ａ）又は（ｂ）が予防・治療効果を発揮し得る感染症は特に限定されるものではないが、例えば、冷水病（病原菌：Flavobacterium psychrophilum）、シュードモナス症（病原菌：Pseudomonas plecoglossicida）、細菌性鰓病（病原菌：Flexibacter species, Cytophaga species）、ビブリオ病（病原菌：Vibrio anguillarum）等が挙げられる。
【００６９】
タンパク質（ａ）又は（ｂ）がアユ以外の動物の感染症予防・治療効果を発揮し得る場合には、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をアユ以外の動物の感染症予防・治療剤の有効成分として利用することもできる。タンパク質（ａ）又は（ｂ）が感染症予防・治療効果を発揮し得るアユ以外の動物としては、例えば、サケ目の魚類であるシロザケ、カラフトマス、ベニザケマスノスケ、ギンザケ、ビワマス、ニジマス、アメマス、オショロコマ、カワマス、ワカサギ、シシャモ、シラウオ等が挙げられる。
【００７０】
アユの感染症予防・治療剤は、タンパク質（ａ）又は（ｂ）のみから構成されていてもよいが、通常は、医薬上許容される１種以上の担体及び／又は添加剤とともに常法に従って製剤化される。製剤中のタンパク質含有量は、目的とする効果、投与方法、投与対象動物の年齢や体重等に応じて適宜調節できる。アユの感染症予防・治療剤の有効成分として、タンパク質（ａ）又は（ｂ）を発現し得る組換えベクターを利用することもできる。
【００７１】
医薬上許容される担体としては、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等が挙げられる。
【００７２】
製剤化に際して使用される添加剤としては、例えば、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、賦形剤、安定化剤、抗菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤等が挙げられ、これらの添加剤は製剤の投与単位形態等に応じて適宜選択される。これらのうち、通常の蛋白製剤等に使用される成分、例えば、安定化剤、抗菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤等が好ましく選択される。
【００７３】
タンパク質（ａ）又は（ｂ）は、医薬上許容される塩であってもよく、その具体例としては、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウム等の無毒性アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等が挙げられる。また、上記塩には、タンパク質又はアミノ酸と適当な有機酸又は無機酸との反応による無毒性酸付加塩も含まれる。代表的無毒性酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、硼酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩（トシレート）、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、スルホン酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、アスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩等が挙げられる。
【００７４】
アユの感染症予防・治療剤の投与経路としては、例えば、経口投与、非経口投与（例えば、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与等）が挙げられ、投与剤形としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、液剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤、挿入剤等が挙げられる。また、アユの感染症予防・治療剤は、飼料等に配合して投与することもできる。
【００７５】
アユの感染症予防・治療剤の投与量及び投与回数は、目的とする効果、投与対象動物の年齢や体重等により異なるが、１回あたり投与量は、アユ一匹あたり通常０．０００１〜１０μｇ、好ましくは０．００１〜１μｇ、さらに好ましくは０．００５〜０．１μｇとなるように適宜調節される。また、投与回数は、１日１回から数回の範囲から適宜選択される。
【００７６】
アユが感染症に罹患すると、免疫防御機構の働きによって腫瘍壊死因子活性を有するタンパク質（ａ）又は（ｂ）の発現レベルが亢進する。したがって、アユにおけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）の発現レベルを指標とすることにより、アユが感染症に罹患しているか否かを診断できる。
【００７７】
感染症の診断に際しては、例えば、アユから検体を採取し、当該検体におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）の発現レベルを測定する。アユから採取して検体として用いる組織や器官は特に限定されず、例えば、血液、皮膚、肝臓、筋肉、脾臓、鰓、鰭、腎臓、腸、胃等が挙げられる。
【００７８】
「タンパク質（ａ）又は（ｂ）の発現レベル」には、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子のｍＲＮＡへの転写レベル及びタンパク質（ａ）又は（ｂ）への翻訳レベルが含まれる。したがって、検体におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）の発現レベルは、検体におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードするｍＲＮＡの存在量、あるいは、検体におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）の存在量に基づいて測定できる。
【００７９】
検体におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードするｍＲＮＡの存在量の測定にあたっては、公知の遺伝子解析技術、例えば、ハイブリダイゼーション技術（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法等）、遺伝子増幅技術（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ等）等を利用できる。
【００８０】
ハイブリダイゼーション技術を利用する際には、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをプローブとして利用でき、遺伝子増幅技術を利用する際には、当該オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをプライマーとして利用できる。
【００８１】
「タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする核酸」にはＤＮＡ及びＲＮＡの両者が含まれ、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ等が含まれる。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドのいずれであってもよい。オリゴヌクレオチドの塩基長は特に限定されないが、通常１５〜３０塩基、好ましくは１８〜２５塩基である。また、ポリヌクレオチドの塩基長は特に限定されないが、通常５０〜１５００塩基、好ましくは２００〜８００塩基である。
【００８２】
タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする核酸に特異的にハイブリダイズし得ることが好ましい。「特異的にハイブリダイズし得る」とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得ることを意味し、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、３７〜８０℃、０．０５〜５×ＳＳＣ及び０．１〜１０％ＳＤＳの条件、好ましくは５０〜７２℃、０．１〜２×ＳＳＣ及び０．２〜５％ＳＤＳの条件が挙げられる。
【００８３】
タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの塩基配列は、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする核酸の塩基配列に基づいて設計できる。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、例えば、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする核酸のＣＤＳ領域にハイブリダイズし得るように、ＣＤＳ領域の５'末端側又は３'末端側の領域にハイブリダイズし得るように、あるいは、ＣＤＳ領域からその５'末端側又は３'末端側の領域にわたる領域にハイブリダイズし得るように設計される。プライマーの５'末端側には制限酵素認識配列、タグ等を付加でき、プライマー及びプローブには、蛍光色素、ラジオアイソトープ等の標識を付加できる。
【００８４】
検体におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードするｍＲＮＡの存在量の具体的測定方法について、ＲＴ−ＰＣＲを利用する場合を例にして説明する。アユから採取した検体から全ＲＮＡを抽出し、抽出した全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した後、合成したｃＤＮＡを鋳型とし、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードするｃＤＮＡにハイブリダイズし得るプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅断片を定量することによって、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードするｍＲＮＡの存在量を測定できる。この際、ＰＣＲは、ＰＣＲ増幅断片生成量が初期鋳型ｃＤＮＡ量を反映するような条件（例えば、ＰＣＲ増幅断片が指数関数的に増加するＰＣＲサイクル数）で行う。
【００８５】
ＰＣＲ増幅断片の定量方法は特に限定されるものではなく、ＰＣＲ増幅断片の定量には、例えば、ラジオアイソトープ（ＲＩ）を用いた定量方法、蛍光色素を用いた定量方法等を利用できる。
【００８６】
ＲＩを用いた定量方法としては、例えば、(i) 反応液にＲＩ標識したヌクレオチド（例えば32Ｐ標識されたｄＣＴＰ等）を基質として加えておき、ＰＣＲ増幅断片に取り込ませてＰＣＲ増幅断片をＲＩ標識し、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動等で分離した後、放射活性を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法、(ii) ＲＩ標識したプライマーを用いることによりＰＣＲ増幅断片をＲＩ標識し、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動等で分離した後、放射活性を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法、(iii) ＰＣＲ増幅断片を電気泳動した後、メンブランにブロッティングし、ＲＩ標識したプローブをハイブリダイズさせ、放射活性を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法等が挙げられる。放射活性は、例えば、液体シンチレーションカウンター、Ｘ線フィルム、イメージングプレート等を用いて測定できる。
【００８７】
蛍光色素を用いた定量方法としては、(i) 二本鎖ＤＮＡにインターカレートする蛍光色素（例えば、エチジウムブロマイド（EtBr）、SYBR GreenI、PicoGreen等）を用いてＰＣＲ増幅断片を染色し、励起光の照射によって発せられる蛍光強度を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法、(ii) 蛍光色素で標識したプライマーを用いることによりＰＣＲ増幅断片を蛍光色素で標識し、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動等で分離した後、蛍光強度を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法等が挙げられる。蛍光強度は、例えば、ＣＣＤカメラ、蛍光スキャナー、分光蛍光光度計等を用いて測定できる。
【００８８】
検体におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）の存在量の測定にあたっては、公知のタンパク質解析技術、例えば、タンパク質（ａ）又は（ｂ）に反応し得る抗体又はその断片を利用したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ、組織免疫染色法等を利用できる。
【００８９】
タンパク質（ａ）又は（ｂ）に反応し得る抗体又はその断片を用いて、検体におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）の存在量を測定する際には、例えば、放射能免疫測定法(RIA)、酵素免疫測定法(EIA)、化学発光測定法（CLIA）、蛍光免疫測定法(FIA)、組織免疫染色法等を利用できる。具体的には、物理吸着や化学結合等により抗体を結合させた固相担体（例えば、イムノプレート、ラテックス粒子等）を用いて、検体中のタンパク質（ａ）又は（ｂ）を捕捉した後、捕捉されたタンパク質（ａ）又は（ｂ）を、固相担体に固定化した抗体とはタンパク質（ａ）又は（ｂ）に対する抗原認識部位が異なる標識化抗体（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、フロレッセンス、ウンベリフェロン等の蛍光物質等で標識した抗体）を用いて定量できる。
【００９０】
また、検体におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）の存在量の測定は、検体におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）の活性を測定することによって行うこともできる。タンパク質（ａ）又は（ｂ）の活性は、例えば、タンパク質（ａ）又は（ｂ）に反応し得る抗体又はその断片を利用したウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法等の公知の方法によって測定できる。
【００９１】
タンパク質（ａ）又は（ｂ）の発現レベルの測定値は、発現レベルが大きく変動しないタンパク質（例えば、β−アクチン、ＧＡＰＤＨ）の発現レベルの測定値に基づいて補正することが好ましい。
【００９２】
アユの感染症診断方法においては、例えば、被験アユから採取した検体におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）の発現レベルが、健常アユから採取した検体におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）の発現レベルよりも高いとき、被験アユが感染症に罹患していると診断できる。
【００９３】
被験アユと健常アユとの間で、タンパク質（ａ）又は（ｂ）の発現レベルを比較する際には、検体として同一の組織又は器官を使用することが好ましい。また、タンパク質（ａ）又は（ｂ）の発現レベルを比較する際には、複数の健常アユ（健常動物群）におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）の発現レベルを定量し、その値の分布から正常範囲を設定して、被験アユにおけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）の発現レベルが正常範囲以上になるか正常範囲以下になるかを判別することが好ましい。このとき、被験アユの検体におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）の発現レベルが正常範囲以上であるときに、被験アユが感染症に罹患していると診断できる。
【００９４】
タンパク質（ａ）又は（ｂ）の発現レベルを指標としたアユの感染症診断方法は、アユの感染症について広く一般に利用でき、診断可能な感染症は特に限定されるものではない。診断可能な感染症としては、例えば、冷水病、シュードモナス症、細菌性鰓病（病原菌：Flexibacter species, Cytophaga species）、ビブリオ病（病原菌：Vibrio anguillarum）等が挙げられる。
【００９５】
タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、あるいは、タンパク質（ａ）又は（ｂ）に反応し得る抗体又はその断片は、アユの感染症診断用キットの構成要素として利用できる。これらのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドあるいは抗体又はその断片は、被験アユから採取した検体におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）の発現レベルを測定するための試薬としてアユの感染症診断用キットに含まれる。
【００９６】
アユの感染症診断用キットは、上記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドあるいは上記抗体又はその断片を含む限り、いかなる形態であってもよく、任意の試薬、器具等を含むことができる。
【００９７】
アユの感染症診断用キットが、上記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む場合には、ＰＣＲに必要な試薬（例えばＨ２Ｏ、バッファー、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰミックス、Ｔａｑポリメラーゼ等）、ＰＣＲ増幅断片の定量に必要な試薬（例えばＲＩ、蛍光色素等）、ＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ等の１種類又は２種類以上を含むことができる。
【００９８】
また、アユの感染症診断用キットが、上記抗体又はその断片を含む場合には、上記抗体又はその断片を固定化するための固相担体（例えば、イムノプレート、ラテックス粒子等）、抗γ−グログリン抗体（二次抗体）、抗体（二次抗体を含む）又はその断片の標識（例えば、酵素、蛍光物質等）、各種試薬（例えば、酵素基質、緩衝液、希釈液等）等の１種類又は２種類以上を含むことができる。
【００９９】
アユ体内において腫瘍壊死因子活性を有するタンパク質（ａ）又は（ｂ）の発現レベルが増強されると、アユの免防御機構が亢進され、アユの感染症を予防・治療できる。したがって、アユに候補物質を投与した後、アユにおけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）の発現レベル亢進効果を指標とすることにより、アユの感染症に対する候補物質の予防・治療効果を判定でき、タンパク質（ａ）又は（ｂ）の発現レベル亢進効果を有する物質（ＴＮＦ誘導物質）を選択することにより、アユの感染症に対して予防・治療効果を有する物質をスクリーニングできる。
【０１００】
「タンパク質（ａ）又は（ｂ）の発現レベル亢進効果」には、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子の転写・翻訳、タンパク質（ａ）又は（ｂ）の活性発現等のいずれのステップに対する効果も含まれる。
【０１０１】
タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、あるいは、タンパク質（ａ）又は（ｂ）に反応する抗体又はその断片は、アユの感染症に対して予防・治療効果を有する物質のスクリーニング用キットの構成要素として利用できる。これらのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドあるいは抗体又はその断片は、検体におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）の発現レベルを測定するための試薬として、アユの感染症に対して予防・治療効果を有する物質のスクリーニング用キットに含まれる。
【０１０２】
アユの感染症に対して予防・治療効果を有する物質のスクリーニング用キットは、上記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドあるいは上記抗体又はその断片を含む限り、いかなる形態であってもよく、上記アユの感染症診断用キットにおいて例示した各種試薬、器具等の他、候補物質、候補物質合成キット、アユの飼育キット等を含むことができる。
【実施例】
【０１０３】
〔実施例１〕  アユのＴＮＦ遺伝子のクローニング
アユのＴＮＦ遺伝子のクローニングは、ディジェネレイティブＰＣＲ法によって行った。アユはサケ目に属するので、すでにＴＮＦ遺伝子がクローニングされている近縁のサケ目のニジマスＴＮＦ遺伝子（レイン(Laing), ＫＪ.ら, ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケミストリー(European Journal of Biochemistry), ２００１年, 第２６８巻, ｐ.１３１５−１３２２）に基づき、スクリーニングＰＣＲ用プライマーを設計した（図１参照）。さらに、サケ目とは遠縁の魚類としてＴＮＦ遺伝子がクローニングされているカレイ類のヒラメＴＮＦ（ヒロノ(Hirono), Ｉ.ら, ジャーナル オブ イムノロジー(Journal of Immnology), ２０００年, 第１６５巻, ｐ.４４２３−４４２７）とニジマスＴＮＦとの保存領域から、ディジェネレイティブＰＣＲ用プライマーを設計した（図２参照）。なお、図１は、ヒラメＴＮＦ遺伝子とニジマスＴＮＦ遺伝子のアライメント、及びニジマスＴＮＦ遺伝子に基づいて設計したスクリーニングＰＣＲ用プライマーのハイブリダイズ位置を示す。また、図２は、アユＴＮＦとヒラメＴＮＦとニジマスＴＮＦのアライメント、及びヒラメＴＮＦとニジマスＴＮＦとの保存領域から設計したディジェネレイティブＰＣＲ用プライマーのハイブリダイズ位置を示す。
【０１０４】
上記のように設計したスクリーニングＰＣＲ用プライマー及びディジェネレイティブＰＣＲ用プライマーの塩基配列は、次の通りである。
SP1：5'- AAAGCAGCCATCCATTTAGA -3'
SP2：5'- GAACCAAATCCTCATCCCAC -3’
SP3：5'- TTCTTCGTTTACAGCCAGGC -3’
AP4：5'- TCATTCAGCTTAAACACTGC -3'
AP5：5'- TCAGTCCACAGTTTGTCCCC -3'
AP6：5'- AGTGCAAACACACCAAAGAA -3'
SP9：5'- CTGGAGATATTCATTGGTGC -3'
SP11：5'- GCAGTGTTCCAGCTGAACGAAGGGG -3'
AP12：5'- TCATAGTGCAAACACACCAAAGAA -3'
SP13：5'- GGGGACAAACTGTGGACTGAGACCA -3'
AP14：5'- TTGTCCCCTTCGTTCAGCTGGAACACT -3'
SP15：5'- TTCTTTGGTGTGTTTGCACTATGA -3'
SP17：5'- GCAAAAGCAGCCATCCATTTAGA -3'
SP21：5'- GGGCGAARGC(Inosine)GC(Inosine)ATHCAYYT -3'
AP22：5'- GGCAGGTA(Inosine)AY(Inosine)GCRTTRTACCA -3'
AP24：5'- GGGTCTC(Inosine)GT(Inosine)CD(Inosine)ARYTTRTC -3'
SP25：5'- GGTTCTTCGT(Inosine)TAYWS(Inosine)CARG -3'
AP26：5'- GCGAG(Inosine)GCRAA(Inosine)ACNCCRAARAA -3'
【０１０５】
なお、SPはセンスプライマーを、APはアンチセンスプライマーを示す。また、混合型プライマーにおいて、MはAとC、RはAとG、WはAとT、SはCとG、YはCとT、KはGとT、VはAとCとG、HはAとCとT、DはAとGとT、BはCとGとT、NはAとCとGとTとの混合型配列を示す。
【０１０６】
目的遺伝子をＰＣＲで増幅を容易にするためには、より多くの遺伝子の存在が有効である。ニジマスではＬＰＳ投与によりＴＮＦ遺伝子が数十倍に増幅することがわかっているので、アユのＴＮＦ遺伝子もＬＰＳによって増幅するであろうと予想し、アユにＬＰＳ(LIST社製、E. coli LPS)を１．５ｍｇ／ｋｇ体重を腹腔内に投与した。３時間後に、アユの頭腎、肝臓、脾臓を単離し、直ちに液体窒素で凍結した。凍結組織からのＲＮＡの抽出は、市販のキット(セパゾールRNAI, 半井)を用い添付のマニュアルに従って行った。
【０１０７】
ＰＣＲのテンプレートとしてアユの各組織より抽出したＲＮＡ(５μｇ)からｃＤＮＡを合成するために、Oligo dT (アマシャムファルマシア)をプライマーとし、逆転写酵素(Rever Tra Ace, 東洋紡)を用いて常法に従ってｃＤＮＡを合成した。アユの肝臓より常法に従いゲノムＤＮＡを精製した。
【０１０８】
各種プライマーの組み合わせで、アユの各組織由来のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡをテンプレートにしてＰＣＲを行い、アガロースゲル電気泳動でＰＣＲの産物を解析した。ＰＣＲはサーマルサイクラーPC-700（アステック）を用いて行い、反応条件は、(i) ステップ１：９４℃で２分間、(ii) ステップ２：９４℃で１分間、(iii) ステップ３：６０℃で１分間、(iv) ステップ４：７２℃で１分間、(v) ステップ２〜４を４０回繰り返す、(vi) ステップ５：７０℃で１０分間とした。
【０１０９】
各組み合わせで得られたＰＣＲ産物をTA-cloning vector (pGEM-T easy vector system プロメガ)を用いてサブクローニングし、クローニングされたＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。得られた塩基配列をＢＬＡＳＴでアミノ酸データーベースを対象としてホモロジー検索し、アユ以外の動物のＴＮＦとのホモロジー検索を行った。その結果、センスプライマーが SP11：5'- GCAGTGTTCCAGCTGAACGAAGGGG -3'、アンチセンスプライマーが AP26：5'- GCGAG(Inosine)GCRAA(Inosine)ACNCCRAARAA-3'であるプライマーの組み合わせで得られたＰＣＲ産物に、魚類・哺乳類のＴＮＦとホモロジーを有する配列を含むものが見いだされた。
【０１１０】
このＰＣＲ産物の部分的配列情報から、上述の頭腎のｍＲＮＡを用いて3’RACE, 5’RACE (Rapid amplification of cDNA end)を行い、一つの完全なオープンリーディングフレームを含むｃＤＮＡ（1731塩基）を得た（配列番号１）。この塩基配列から推定されるアミノ酸配列（配列番号２）は２３５個のアミノ酸からなる。配列番号２記載のアミノ酸配列からなるアユＴＮＦは、アミノ酸レベルで、ニジマスＴＮＦと４３．９％、川マスＴＮＦと４３．３％、タイＴＮＦと３６．９％、ナマズＴＮＦと３６．６％、ヒラメＴＮＦと３６．５％、ヒトＴＮＦと２７．５％のホモロジーを有していた。なお、ホモロジー検索は、成熟型と予想される領域を比較してＦＡＳＴＡを用いて調べた。
【０１１１】
〔実施例２〕  シュードモナス感染症に対するＴＮＦ遺伝子発現誘導の効果
アユにＬＰＳを投与し、ＴＮＦ遺伝子を誘導することで、シュードモナス感染症に対する防御効果が得られるか調べた。ＬＰＳはグラム陰性菌のパントエア アグロメランス(Pantoea agglomerans)より常法に従い精製した。ＬＰＳは配合飼料に、アユの摂取飼料重量を推定した上で、体重１ｋｇあたりに摂取するＬＰＳが４, ２０, １００μｇ／ｋｇになるように調製した。
【０１１２】
アユは徳島県種苗センターより入手した。アユ(平均体重２０ｇ)を２５匹ずつ４区に分け、１区をＬＰＳ非投与区（対照区）、２区をＬＰＳ ４μｇ／ｋｇ投与区、３区をＬＰＳ ２０μｇ／ｋｇ投与区、４区をＬＰＳ １００μｇ／ｋｇ投与区として、水槽内で飼育した。７日間連続でＬＰＳ入り飼料を摂取させた後、シュードモナスをアユの腹腔内に４．１×１０２個投与した。アユに菌体を摂取させた後、飼料は与えずに生存を経時的に２週間観察した。各区の生存数を対照区と比較した（表１）。ＬＰＳ ２０μｇ／ｋｇ投与区（３区）のアユで統計的(Logrank検定)に有意な差(Ｐ＜０．０５)が認められた。
【０１１３】
［表１］
ＬＰＳ投与量(μg/kg)    死亡数(匹)    生存数(匹)    生存率(％)
１区            0                  14            11            44
２区            4                  11            14            56
３区           20                   7            18            72
４区          100                  15            10            40
【０１１４】
次に、ＬＰＳ投与によってＴＮＦが誘導されるか否かを、競合的ＰＣＲ法によって解析した。ＬＰＳを投与した後、６時間後にアユの頭腎(魚類の腎臓は免疫組織と糸球体組織を含む、特に頭部に近い部分は免疫組織が多い)を単離し、液体窒素で直ちに凍結した。凍結組織からのＲＮＡの抽出は、市販のキット(セパゾールRNAI, 半井)を用い添付のマニュアルに従って行った。
【０１１５】
ＰＣＲのテンプレートとしてアユの脾臓より抽出したＲＮＡ (５μg)からｃＤＮＡを合成するために、Oligo dTをプライマーとし、逆転写酵素(Rever Tra Ace, 東洋紡)を用いて、常法に従いｃＤＮＡを合成した。
【０１１６】
競合的ＰＣＲに用いたプライマーは次のとおりである。
［競合ＰＣＲ用プライマー］
センス P4: 5'- TGTGCGGCACCTGCAGGATG -3'
アンチセンス P12: 5'- GTAGTACAGCAGAAGGTACTA -3'
［Competitor合成用プライマー］
センス P4: 5'- TGTGCGGCACCTGCAGGATGGTACGGTCATCATCTGACAC -3'
アンチセンス P12: 5'- GTAGTACAGCAGAAGGTACTAGCGCCATCCTGGGAAGACTCC -3'
【０１１７】
ＰＣＲはサーマルサイクラーPC-700（アステック）を用いて行い、反応条件は、(i) ステップ１：９４℃で２分間、(ii) ステップ２：９４℃で１分間、(iii) ステップ３：６０℃で１分間、(iv) ステップ４：７２℃で１分間、(v) ステップ２〜４を３０回繰り返す、(vi) ステップ５：７２℃で１０分間とした。
【０１１８】
競合するｃＤＮＡ(competitor)は市販のキット(Competitor DNA construction kit, 宝酒造)を用いて、添付マニュアルに従い合成した。プライマーによって合成されるＰＣＲ産物のサイズはアユのｃＤＮＡで４０８塩基、competitorで３４１塩基である。合成されたcompetitorは常法に従い、アガロースゲル電気泳動(1.5% アガロース(半井)、100V)で泳動した後、３４１塩基に相当するＰＣＲ産物を切り出し、市販のキット(東洋紡)を用いマニュアルに従い抽出精製した。精製competitorのＯＤ２６０ｎｍの吸収を測定し、１ＯＤ＝５０μｇＤＮＡとしてcompetitorのモル数を計算し、希釈して、１×１０１から１×１０５個/μＬになるように調製した。アユのｃＤＮＡ(全ＲＮＡとして５０ｎｇ／μＬ) １μＬとcompetitor １μＬをテンプレートに用いてＰＣＲを上記条件で行い、エチジウムブロマイド(０．５μｇ/ｍＬ)含有アガロースゲル電気泳動(１．５％ アガロース(半井)、１００Ｖ)で泳動した。紫外光でエチジウムブロマイドと結合したＤＮＡを検出し、異なるcompetitorの遺伝子数と未知のｃＤＮＡに含まれるＴＮＦ遺伝子数から増幅されるＰＣＲ産物の量を見積もることで、ＴＮＦのｍＲＮＡ量を比較定量できる。
【０１１９】
４０８塩基のバンドはアユのｃＤＮＡ由来の増幅産物であり、３４１塩基のバンドはcompetitor由来の増幅産物である。同等のバンドの濃さを与えるcomptitorのＤＮＡ個数から、全ＲＮＡ １００ｎｇあたりのｃＤＮＡに含まれるコピー数を計算した。結果を表２に示す。脾臓のＴＮＦ ｍＲＮＡの量はＬＰＳ投与３時間後にコントロールの３０倍に増加し、６時間後に１０倍に低下、２４時間後にはコントロールと同じ量に戻ることが示された。このことから、アユはＬＰＳ投与によりＴＮＦ量が増加することが確認された。
【０１２０】
［表２］
サンプルの種類      全RNA100ngあたりのmRNA数      相対倍率
コントロール                 1.2×103                 1
LPS投与3時間後               4.0×104                30
LPS投与6時間後               1.2×104                10
LPS投与24時間後              1.2×103                 1
【０１２１】
以上の結果から、ＴＮＦ遺伝子の発現を誘導することによって、シュードモナス感染症等のアユの感染症を予防・治療することができると考えられる。
【０１２２】
〔実施例３〕アユＴＮＦの発現及びウエスタンブロッティング解析
（１）発現プラスミドの構築
リポポリサッカライド（LPS）（Escherichia coli O111:B4由来、リスト社・201）を腹腔内投与（11.5mg/kg）3時間後のアユより頭腎を摘出し、この頭腎よりグアニジンチオシアネート法にてトータルRNAを抽出した。上記トータルRNAを鋳型とし、オリゴdTをプライマーとし、M-MLV逆転写酵素によって逆転写を行い、相補的DNA（cDNA）を得た。上記cDNAを鋳型とし、アユTNF塩基配列中、下記の2種類の配列を持つオリゴDNAをプライマーとし、TaqDNAポリメラーゼ酵素を用いて、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（PCR）反応を行い、発現させるタンパク部位に相当するDNA配列を増幅した。
センスプライマー：CGGGATCCATGTTAAGACACCTTTCCGGAATA
アンチセンスプライマー：CGGGATCCTCACAGTGCAAACACACCGAAAAA
【０１２３】
上記増幅DNA配列の末端を、BamHI制限酵素によって処理することにより、BamHI制限酵素末端を露出させた。大腸菌での発現ベクターであるpUC540K（アンピシリン及びカナマイシンに対する薬剤耐性遺伝子を持ち、外来タンパクを大腸菌にてイソプロピルチオガラクトピラノシド（IPTG）依存的に発現させるtacプロモーターを有する）もBamHI制限酵素によって処理することにより、同じくBamHI制限酵素末端を露出させ、さらに再度の自己接着をしないように、アルカリフォスファターゼを用いて、５’末端の脱リン酸化を行った。増幅DNAとベクターDNAをそれぞれポリアクリルアミドゲル及びアガロースゲルを担体として電気泳動し、ゲルから切り出すことによって精製した上で、両者をT4DNAリガーゼによって、ライゲーション（接着）させた。すなわち、pUC540Kのtacプロモーターの下流に位置するBamH1部位に増幅DNAのBamH1断片を挿入した。
【０１２４】
上記ライゲーション反応液を大腸菌JM109に導入し、目的の発現プラスミドを保持して形質転換された大腸菌をアンピシリン入りの寒天培地上でスクリーニングした。上記でスクリーニングした形質転換大腸菌クローンより発現プラスミドを回収し、そのプラスミドの塩基配列に変異がないことをDNAシークエンサーで解析し確認した上で、発現プラスミドとして使用した。
【０１２５】
（２）タンパクの発現
上記発現プラスミドを保持する大腸菌JM109を寒天培地上でシングルコロニーとしておき、このコロニーを2mlの液体培地に植菌し一晩培養して前培養液とした。液体培地5mlに前培養液を0.5%の割合で加え、さらにIPTGを最終濃度1mMとなるように添加し、37℃で14時間培養した。培養後の菌体を3000回転/分で10分間遠心して沈殿させた。沈殿した菌体を培養液の1/10の体積のバッファー（50mM Tris-HCl, 2mMEDTA, pH8.0）に再懸濁した。懸濁後の大腸菌にタンパク分解酵素阻害剤p-APMSF（（p-アミジノフェニル）メタンスルホニルフルオリド塩酸塩）を最終濃度2.5mMになるように加え、さらに細胞壁溶解酵素リゾチームを最終濃度5mg/mlになるように加え、室温で5分放置し、大腸菌をプロトプラスト化した。上記プロトプラスト化した大腸菌溶液を氷冷しつつ超音波破砕機にかけて破砕した。上記破砕溶液を12000回転/分にて10分間遠心し、上澄みを可溶性タンパク画分とし、沈殿を不溶性タンパク画分として分離した。不溶性タンパク画分は、上澄みと等量のバッファー（50mM Tris-HCl, 2mM EDTA, pH8.0）を加え、再懸濁した。
【０１２６】
（３）ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるタンパク発現の確認
上記可溶性及び不溶性タンパク画分の4μlを、15％SDSポリアクリルアミドゲルを担体として電気泳動し分離した。電気泳動後のゲルを染色液（0.25%クマシーブリリアントブルー, 50%メタノール, 10%酢酸）で染色し、続いて脱色液（25%メタノール, 10%酢酸）にてタンパク以外の部分を脱色した上で、大腸菌独自のタンパクのほかに、発現プラスミド由来のタンパクの染色帯が見られるかどうかを確認した。
【０１２７】
（４）ウエスタンブロッティング
上記と同様に可溶性及び不溶性タンパク画分の1.4μlを、15%SDSポリアクリルアミドゲルを担体として電気泳動し分離した。電気泳動後のゲルをウエスタンバッファー（25mMトリス, 192mMグリシン、20%メタノール、ｐH8.3）に30分間浸漬した。浸漬後のゲルと、あらかじめウエスタンバッファーに浸漬しておいた濾紙2枚及びニトロセルロースフィルターとをブロッティング装置のマイナス側から濾紙、ゲル、フィルター、濾紙の順になるように重ね、氷冷しておいたウエスタンバッファーを入れたブロッティング装置にセットし、装置を氷水中に置き、100Vで1時間通電しブロッティングした。この操作により、ゲル中のタンパクをフィルター上に電気的に移行吸着させた。ブロッティング終了後、フィルターのサイズマーカーがブロッティングされた部分だけを切り取り、アミドブラック染色をすることにより、ゲルからフィルターへのタンパクの移行（ブロッティング）ができていることを確認した。
【０１２８】
（５）非特異的抗体吸着反応の抑制（ブロッキング）
ブロッティング後のフィルターをハイゼックスフィルムバッグに入れ、ブロッキングバッファー（0.1Mトリス, 0.5M塩化ナトリウム,10%スキムミルク, pH7.5)を5ml加えて、バッグをシールし、4℃で一晩保存した。上記フィルターを洗浄バッファー（0.1Mトリス, 0.5M塩化ナトリウム, 0.05%ツイーン20, 2%トリトンX-100, pH7.5）中で5分間振とうすることを2回繰り返しさらに、TBSバッファー（0.1Mトリス, 0.5M塩化ナトリウム, pH7.5）溶液中で5分間振とうすることを2回くりかえして洗浄した。
【０１２９】
（６）マウス抗体によるタンパク検出反応（ウェスタン解析）
上記洗浄後のフィルターをハイゼックスフィルムバッグに入れ、一次抗体溶液（Anti mouse TNF rabbit pAb、ウサギで作らせた抗マウスTNFポリクローナル抗体をブロッキングバッファーにて500倍に希釈したもの）5mlを加え、バッグをシールして、室温で1時間反応させた。反応後、フィルターを洗浄バッファー（0.1Mトリス, 0.5M塩化ナトリウム, 0.05%ツイーン20, 2%トリトンX-100, pH7.5）中で5分間振とうすることを3回繰り返し、さらにTBSバッファー（0.1Mトリス, 0.5M塩化ナトリウム, pH7.5）溶液中で5分間振とうすることで、反応しなかった余分な抗体液を洗浄した。
上記一次抗体反応後のフィルターをハイゼックスフィルムバッグに入れ、二次抗体溶液（AP-Goat Anti-Rabbit IgG（Zymed社・65-6122）、ヤギで作らせたアルカリフォスファターゼ結合型抗ウサギIgG抗体をブロッキングバッファーにて2000倍に希釈したもの）5mlを加え、バッグをシールし、室温で1時間反応させた。反応後、同様に洗浄した。
【０１３０】
上記フィルターをAPバッファー（100mMトリス, 100mM塩化ナトリウム, 5mM塩化マグネシウム, pH9.5）に3分間浸漬した後、ハイゼックスフィルムバッグに入れ、発色バッファー（0.033%ニトロブルーテトラゾリウム（NBT）, 0.021% 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-リン酸二ナトリウム塩（BCIP）をAPバッファーに溶解させたもの）5mlを加え、バッグをシールし、37℃で2時間インキュベーションした後、蒸留水で洗浄した。フィルター上のタンパクの内、１次抗体が結合し、従ってさらにアルカリフォスファターゼ結合型2次抗体が結合した箇所は、アルカリフォスファターゼによるNBT及びBCIPの還元反応が起こり、青色に発色した。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】ヒラメＴＮＦ遺伝子とニジマスＴＮＦ遺伝子のアライメント、及びニジマスＴＮＦ遺伝子に基づいて設計したスクリーニングＰＣＲ用プライマーのハイブリダイズ位置を示す図である。
【図２】アユＴＮＦとヒラメＴＮＦとニジマスＴＮＦのアライメント、及びヒラメＴＮＦとニジマスＴＮＦとの保存領域から設計したディジェネレイティブＰＣＲ用プライマーのハイブリダイズ位置を示す図である。
【図１】
2004173693.tif 000002
【図２】
2004173693.tif 000003
【配列表】
2004173693000001.app