(57)【要約】【課題】γ−プロテオバクテリアを用いて発酵法により、Ｌ−アミノ酸等の有用物質を生産するに際し、生産効率を向上させる。【解決手段】γ−プロテオバクテリアを培地に培養し、該培地又は菌体中に目的物質を生成蓄積させ、該目的物質を採取する、微生物を利用した目的物質の製造法において、前記γ−プロテオバクテリアとして、例えば、染色体上のａｒｃＡ遺伝子が破壊されたことにより、細胞内でＡｒｃＡタンパク質が正常に機能しない株を用いる。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的物質の生産能を有し、かつ、ＡｒｃＡタンパク質が正常に機能しないように改変されたγ−プロテオバクテリア。
【請求項２】
正常に機能するＡｒｃＡタンパク質が、下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のタンパク質である請求項１に記載のγ−プロテオバクテリア。
（Ａ）配列番号３２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号３２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、γ−プロテオバクテリアにおいて、そのタンパク質が正常に機能する場合に比べて、同タンパク質が正常に機能しないときに目的物質の生産能を向上させるタンパク質。
【請求項３】
正常に機能するＡｒｃＡタンパク質が、配列番号３２に示すアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ、そのタンパク質が正常に機能する場合に比べて、同タンパク質が正常に機能しないときに目的物質の生産能を向上させるタンパク質である請求項１に記載のγ−プロテオバクテリア。
【請求項４】
正常に機能するＡｒｃＡタンパク質が、配列番号３２に示すアミノ酸配列において、２以上、かつ、２０以下のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、γ−プロテオバクテリアにおいて、そのタンパク質が正常に機能する場合に比べて、同タンパク質が正常に機能しないときに目的物質の生産能を向上させるタンパク質である請求項１に記載のγ−プロテオバクテリア。
【請求項５】
染色体上のａｒｃＡ遺伝子が破壊されたことによりＡｒｃＡタンパク質が正常に機能しないことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のγ−プロテオバクテリア。
【請求項６】
前記ａｒｃＡ遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡである請求項５に記載のγ−プロテオバクテリア。
（ａ）配列番号３１の塩基番号１０１〜８１７からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号３１の塩基番号１０１〜８１７からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、そのタンパク質が正常に機能する場合に比べて、同タンパク質が正常に機能しないときに目的物質の生産能を向上させるタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
前記γ−プロテオバクテリアは、エシェリヒア属細菌である請求項１〜６のいずれか一項に記載のγ−プロテオバクテリア。
【請求項８】
前記目的物質がＬ−アミノ酸である請求項１〜７のいずれか一項に記載のγ−プロテオバクテリア。
【請求項９】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、又はＬ−アルギニンである請求項８に記載のγ−プロテオバクテリア。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のγ−プロテオバクテリアを培地で培養し、目的物質を該培地又は菌体中に生成蓄積させ、該培地又は菌体より目的物質を採取することを特徴とする目的物質の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、発酵工業に関し、詳しくは微生物を利用した発酵法によりＬ−アミノ酸などの目的物質を効率よく製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細菌の細胞は、様々な環境に適応するために、代謝経路や呼吸経路などを改変させてきた。エネルギー代謝において、大きな役割を果たす制御システムとして、Ａｒｃ（ａｅｒｏｂｉｃ　ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ）、Ｆｎｒ（ｆｕｍａｒａｔｅ　ｎｉｔｒａｔｅ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）が知られている。これらは、エシェリヒア・コリとその近縁種に普遍的に存在するグローバルレギュレータータンパク質であり、前者はエシェリヒア・コリ染色体の０分の位置に存在するａｒｃＡ遺伝子によりコードされ、後者は２９分の位置に存在するｆｎｒ遺伝子によりコードされ、両者はともに、嫌気的条件下において数多くの因子を制御することにより、細胞をその環境に適応させる。また、ＡｒｃＡタンパク質、Ｆｎｒタンパク質は転写因子であり、嫌気的条件において、エシェリヒア・コリ染色体上のターゲット遺伝子のプロモーター領域に直接結合することにより、そのターゲット遺伝子の発現を正または負に制御することが明らかとなっている（非特許文献１）。
【０００３】
最近では、ＤＮＡマイクロアレイ技術を用いて、エシェリヒア・コリ由来ＡｒｃＡタンパク質、Ｆｎｒタンパク質のようなグローバルなレギュレーターをコードする遺伝子の破壊株の発現プロファイルがデータベース化され、公開されている（非特許文献２）。
【０００４】
これまでに、ＡｒｃＡタンパク質は、ＴＣＡサイクル上の遺伝子の発現を負に制御することが知られており（非特許文献１）、このデータベース上のａｒｃＡ破壊株においてはＴＣＡサイクル上の遺伝子の発現が上昇していることが明らかになっている。一方、Ｆｎｒタンパク質は嫌気的条件で機能する呼吸経路の遺伝子発現を正に調節することが知られている。
【０００５】
グローバルな因子の破壊株における発現プロファイルで、ａｒｃＡ破壊株と同様にＴＣＡサイクル上の遺伝子発現が上昇する株にとしてｄａｍ破壊株が挙げられる（非特許文献３）。
【０００６】
Ｄａｍタンパク質は、細胞内の制限修飾系に関与する修飾因子のメチラーゼであり、エシェリヒア・コリ染色体の７６分の位置に存在するｄａｍ遺伝子によりコードされる（非特許文献４）。
【０００７】
これまでのところ、ａｒｃＡ遺伝子、ｆｎｒ遺伝子、ｄａｍ遺伝子などのグローバルな因子の発現調節を行うことによる物質生産の向上に関する報告はなされていない。
【０００８】
【非特許文献１】Ｓ．　Ｉｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ，　６６，　５−７　（１９９１）
【非特許文献２】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／ｄｂｇｅｔ−ｂｉｎ／ｇｅｔ＿ｈｔｅｘｔ？Ｅｘｐ＿ＤＢ＋−ｎ＋Ｂｇｅｔ−ｂｉｎ／ｇｅｔ＿ｈｔｅｘｔ？Ｅｘｐ＿ＤＢ＋−ｎ＋Ｂ
【非特許文献３】２００１年　日本バイオインダストリー協会資源生物変換研究会主催　シンポジウム「ゲノム時代のグリーンバイオテクノロジー」にて、奈良先端大　森浩禎　口頭発表
【非特許文献４】Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　８７　（２３），　９４５４−９４５８　（１９９０）
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、エシェリヒア属細菌等のγ−プロテオバクテリアを用いて発酵法により有用物質を生産するに際し、生産効率を向上させることを課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行い、γ−プロテオバクテリアに普遍的に存在するレギュレータータンパク質をコードする遺伝子を改変することで、γ−プロテオバクテリアによる物質生産を改善させ得ることを見出した。すなわち、γ−プロテオバクテリアにおいてａｒｃＡ遺伝子を破壊することにより、目的物質の生産能が改善されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、以下のとおりである
（１）目的物質の生産能を有し、かつ、ＡｒｃＡタンパク質が正常に機能しないように改変されたγ−プロテオバクテリア。
（２）正常に機能するＡｒｃＡタンパク質が、下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のタンパク質である（１）のγ−プロテオバクテリア。
（Ａ）配列番号３２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号３２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、γ−プロテオバクテリアにおいて、そのタンパク質が正常に機能する場合に比べて、同タンパク質が正常に機能しないときに目的物質の生産能を向上させるタンパク質。
（３）正常に機能するＡｒｃＡタンパク質が、配列番号３２に示すアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ、そのタンパク質が正常に機能する場合に比べて、同タンパク質が正常に機能しないときに目的物質の生産能を向上させるタンパク質である（１）のγ−プロテオバクテリア。
（４）正常に機能するＡｒｃＡタンパク質が、配列番号３２に示すアミノ酸配列において、２以上、かつ、２０以下のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、γ−プロテオバクテリアにおいて、そのタンパク質が正常に機能する場合に比べて、同タンパク質が正常に機能しないときに目的物質の生産能を向上させるタンパク質である（１）のγ−プロテオバクテリア。
（５）染色体上のａｒｃＡ遺伝子が破壊されたことによりＡｒｃＡタンパク質が正常に機能しないことを特徴とする（１）〜（４）のいずれかのγ−プロテオバクテリア。
（６）前記ａｒｃＡ遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡである（５）のγ−プロテオバクテリア。
（ａ）配列番号３１の塩基番号１０１〜８１７からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号３１の塩基番号１０１〜８１７からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、そのタンパク質が正常に機能する場合に比べて、同タンパク質が正常に機能しないときに目的物質の生産能を向上させるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（７）前記γ−プロテオバクテリアは、エシェリヒア属細菌である（１）〜（６）のいずれかのγ−プロテオバクテリア。
（８）前記目的物質がＬ−アミノ酸である（１）〜（７）のいずれかのγ−プロテオバクテリア。
（９）前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、又はＬ−アルギニンである（８）のγ−プロテオバクテリア。
（１０）（１）〜（９）のいずれかのγ−プロテオバクテリアを培地で培養し、目的物質を該培地又は菌体中に生成蓄積させ、該培地又は菌体より目的物質を採取することを特徴とする目的物質の製造法。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明のγ−プロテオバクテリア
本発明に用いるγ−プロテオバクテリアとしては、エシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、サルモネラ属、モルガネラ属など、γ−プロテオバクテリアに属する微生物であって、目的物質を生産する能力を有するものであれば、特に限定されない。具体的にはＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）データベースに記載されている分類によりγ−プロテオバクテリアに属するものが利用できる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｈｔｂｉｎ−ｐｏｓｔ／Ｔａｘｏｎｏｍｙ／ｗｇｅｔｏｒｇ？ｍｏｄｅ＝Ｔｒｅｅ＆ｉｄ＝１２３６＆ｌｖｌ＝３＆ｋｅｅｐ＝１＆ｓｒｃｈｍｏｄｅ＝１＆ｕｎｌｏｃｋ）。
【００１３】
エシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリ等が挙げられる。また。エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス、エンテロバクター・アエロゲネス等が挙げられる。
【００１４】
尚、近年、エンテロバクター・アグロメランスは、１６Ｓ　ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ　ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）又はパントエア・アナナティス（Ｐ．　ａｎａｎａｔｉｓ）、パントエア・スチューアルティ（Ｐ．　ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）アグロメランス等に再分類されているものがある。本発明においては、γ−プロテオバクテリアに分類され、かつ、ａｒｃＡ遺伝子を有するものであれば、エンテロバクター属又はパントエア属のいずれに属するものであってもよい。
【００１５】
エシェリヒア・コリを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、Ｅ．　ｃｏｌｉ　Ｋ１２株及びその誘導体を用いることができる。また、パントエア・アナナティスを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６６１４）、ＡＪ１３３５６株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６６１５）、ＡＪ１３６０１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７２０７）及びそれらの誘導体を用いることができる。これらの株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、上記のとおり、１６Ｓ　ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
【００１６】
本発明のγ−プロテオバクテリアは、上記細菌であって、目的物質の生産能を有する細菌である。「目的物質の生産能」とは、本発明の細菌を培地に培養したときに、目的物質を細胞又は培地から回収できる程度に、細胞又は培地中に生産、蓄積する能力をいう。
【００１７】
本発明により製造される目的物質としては、γ−プロテオバクテリアによって生産され得るもので、かつ、ＴＣＡサイクルを経由して合成される物質、又はそれらの物質を基質として合成される物質であれば特に限定されない。たとえば、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、などの種々のアミノ酸、Ｌ−ホモセリン、コハク酸などの有機酸など、従来よりγ−プロテオバクテリアにより生産されてきたものが挙げられる。また、従来γ−プロテオバクテリアにより工業的に生産されていない物質であっても、ＴＣＡサイクルを経由して合成される物質を基質として合成される得る限り、本発明を適用することができる。
【００１８】
Ｌ−リジン生産性のγ−プロテオバクテリアとしては、Ｌ−リジンアナログに耐性を有する変異株が例示できる。このＬ−リジンアナログは、Ｌ−アミノ酸生産菌の増殖を阻害するようなものであるが、その抑制はＬ−リジンが培地中に共存すれば、全体的または部分的に解除されるようなものである。たとえば、オキサリジン、リジンハイドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどがある。これらのリジンアナログに耐性を有する変異株は、通常の人工変異操作をγ−プロテオバクテリアに施すことにより得られる。Ｌ−リジン製造に用いる菌株として、具体的にはエシェリヒア・コリＡＪ１１４４２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１５４３、ＮＲＲＬ　Ｂ−１２１８５；特開昭５６−１８５９６号及び米国特許第４３４６１７０号参照）、エシェリヒア・コリＶＬ６１１が挙げられる。これらの微生物のアスパルトキナーゼは、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されている。
【００１９】
その他にも、たとえば後述のＬ−スレオニン生産菌が挙げられる。Ｌ−スレオニン生産菌も、一般的にはそのアスパルトキナーゼのＬ−リジンによる阻害が解除されているからである。
【００２０】
後記実施例においては、エシェリヒア・コリのＬ−リジン生産菌として、ＷＣ１９６株を用いた。本菌株は、エシェリヒア・コリＫ−１２由来のＷ３１１０株にＡＥＣ耐性を付与することによって育種されたものである。同株は、エシェリヒア・コリＡＪ１３０６９株と命名され、平成６年１２月６日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（現　独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター、〒３０５−８５６６　日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１４６９０として寄託され、平成７年９月２９日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−５２５２が付与されている（ＷＯ９６／１７９３０号国際公開パンフレット参照）。
【００２１】
Ｌ−スレオニン生産性のγ−プロテオバクテリアとしては、エシェリヒア・コリＶＫＰＭ　Ｂ−３９９６（ＲＩＡ　１８６７）（米国特許第５，１７５，１０７号参照）、ＭＧ４４２株（Ｇｕｓｙａｔｉｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅｔｉｋａ　（ｉｎ　Ｒｕｓｓｉａ），　１４，　９４７−９５６　（１９７８）参照）などが挙げられる。
【００２２】
γ−プロテオバクテリアに属し、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物としては、たとえば、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損もしくは、低下した微生物が挙げられる。α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下したエシェリヒア属細菌およびその取得方法は、特開平５−２４４９７０号公報及び特開平７−２０３９８０号公報に記載されている。具体的には次のような株が挙げられる。
【００２３】
エシェリヒア・コリＷ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍｒ
エシェリヒア・コリＡＪ１２６２４（ＦＥＲＭ　ＢＰ−３８５３）
エシェリヒア・コリＡＪ１２６２８（ＦＥＲＭ　ＢＰ−３８５４）
エシェリヒア・コリＡＪ１２９４９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４８８１）
エシェリヒア・コリＷ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍｒは、エシェリヒア・コリＷ３１１０のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（以下、「ｓｕｃＡ遺伝子」）と略す）が破壊されて得られた株であり、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ完全欠損株である。
【００２４】
γ−プロテオバクテリア属に属し、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下した微生物およびその取得方法は、特開平５−２４４９７０号公報及び特開平７−２０３９８０号公報に記載されている。
【００２５】
Ｌ−アルギニン生産性のγ−プロテオバクテリアとしては、ａｒｇＡ遺伝子を導入されたエシェリヒア・コリ（特開昭５７−５６９３号参照）、及び、エシェリヒア・コリ２３７株（ロシア特許出願第２０００１１７６７７号）等が挙げられる。
【００２６】
Ｌ−イソロイシン生産性のγ−プロテオバクテリアとしては、エシェリヒア・コリＫＸ１４１（ＶＫＰＭ　Ｂ−４７８１）（欧州特許出願公開第５１９，１１３号参照）が挙げられる。
Ｌ−ホモセリン生産性のγ−プロテオバクテリアとしては、Ｃ６００株（Ａｐｐｌｅｙａｒｄ　Ｒ．　Ｋ．，　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　３９，　４４０−４５２　（１９５４）　参照）のＬｅｕ＋復帰変異株であるＮＺ１０株が挙げられる。
【００２７】
コハク酸生産性のγ−プロテオバクテリアとしては、エシェリヒア・コリを用いた例が知られている（Ｗａｎｇ，　Ｘ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｐｐｌ．　ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｔｅｃｈ．，　７０−７２，　９１９−９２８　（１９９８））。
【００２８】
また、Ｌ−アミノ酸生産能を有するγ−プロテオバクテリアは、Ｌ−アミノ酸の生合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡを遺伝子組換え技術により導入、増強することによっても、育種することができる。例えば、Ｌ−リジン生産菌においては、導入される遺伝子は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパルトキナーゼ、ジヒドロジピコリン酸合成酵素、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、スクシニルジアミノピメリン酸トランスアミアミナーゼ、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ等、Ｌ−リジンの生合成経路上の酵素をコードする遺伝子である。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、又はアスパルトキナーゼ及びジヒドロピコリン酸合成酵素のようにＬ−アスパラギン酸、又はＬ−リジンによるフィードバック阻害を受ける酵素遺伝子の場合には、かかる阻害が解除された酵素をコードする変異型遺伝子を用いることが望ましい。
【００２９】
また、Ｌ−グルタミン酸生産菌においては、導入される遺伝子として、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミンシンテターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、エノラーゼ、ホスホグリセルムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼなどがある。
【００３０】
さらに、目的とするＬ−アミノ酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損していてもよい。たとえば、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼがある（ＷＯ９５／２３８６４号国際公開パンフレット参照）。また、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、αケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼなどがある。
【００３１】
上記のような目的物質産生能を有するγ−プロテオバクテリアの育種において、γ−プロテオバクテリアに遺伝子を導入、増強するには、γ−プロテオバクテリア細胞内で自律複製可能なベクターに遺伝子を連結して組換えＤＮＡを作製し、それでγ−プロテオバクテリアを形質転換する方法がある。その他にトランスダクション、トランスポゾン（Ｂｅｒｇ，　Ｄ．　Ｅ．　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ，　Ｃ．　Ｍ．，　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．　１，　４１７　（１９８３））、Ｍｕファージ（特開平２−１０９９８５号）または相同組換え（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　（１９７２））を用いた方法で宿主染色体に目的遺伝子を組み込むこともできる。また、ＰＣＲ反応により生成した直鎖上ＤＮＡを用いて遺伝子を破壊する方法によっても目的遺伝子を導入することができる（Ｋｉｒｉｌｌ　Ａ．　Ｄａｔｓｅｎｋｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．，　９７　（１２），　６６４０−６６４５　（２０００）　）。
【００３２】
上記のように組換えＤＮＡ技術により育種されたγ−プロテオバクテリアとしては、例えば、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するジヒドロジピコリン酸合成酵素、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ等の活性が増強され、Ｌ−リジン生産能を有するエシェリヒア属細菌（米国特許第６，０４０，１６０号）、あるいは、クエン酸シンターゼ、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ、又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼの活性が高められ、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するエンテロバクター属（パントエア属）細菌が挙げられる（ＥＰ　０　９５２　２２１　Ａ２、ＥＰ　０　９９９　２８２　Ａ２、ＥＰ　１　０７８　９８９　Ａ２）。
【００３３】
本発明に用いるγ−プロテオバクテリアは、上記のような目的物質を産生する能力を有し、かつ、細胞内でＡｒｃＡタンパク質が正常に機能しないように改変された細菌である。「ＡｒｃＡタンパク質が正常に機能しないように改変された」とは、ＡｒｃＡタンパク質の機能が全く消失するか、あるいは、エシェリヒア属細菌の非改変株、例えば野生株に比べて該機能が低下するように改変されたことを意味する。ＡｒｃＡタンパク質が正常に機能しない状態としては、例えば、ａｒｃＡ遺伝子の転写又は翻訳が妨げられ、同遺伝子産物であるＡｒｃＡタンパク質が産生されないか、あるいは産生が低下した状態であってもよいし、産生されるＡｒｃＡタンパク質に変異が起こり、ＡｒｃＡタンパク質の本来の機能が低下又は消失した状態であってもよい。ＡｒｃＡタンパク質が正常に機能しないγ−プロテオバクテリアとして、典型的には、染色体上のａｒｃＡ遺伝子が遺伝子組換え技術により破壊された遺伝子破壊株、及び、染色体上のａｒｃＡ遺伝子の発現調節配列又はコード領域に変異が生じたことにより、機能を有するＡｒｃＡタンパク質が産生されないようになった変異株が挙げられる。
【００３４】
本発明の細菌の育種に用いられる野生株又は非改変株が保持するＡｒｃＡタンパク質としては、例えば、配列番号３２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。また、ａｒｃＡ遺伝子としては、例えば、配列番号３１に示す塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。また、同塩基配列において、各々のコドンを他の等価のコドンに置換した配列であってもよい。なお、本発明において「タンパク質をコードするＤＮＡ」とは、ＤＮＡが二本鎖の場合にはそのいずれか一方の鎖がタンパク質をコードすることを意味する。
【００３５】
また、野生株又は非改変株が保持するＡｒｃＡタンパク質は、野生型タンパク質には限られず、ＡｒｃＡタンパク質の活性を有している限り、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含んでいてもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２から３０個、好ましくは、２から２０個、より好ましくは２から１０個である。
【００３６】
前記「ＡｒｃＡタンパク質の活性」とは、同タンパク質が正常に機能している場合に比べて、正常に機能しないときに目的物質の生産能を向上させる活性である。言い換えれば、ＡｒｃＡタンパク質の活性とは、同タンパク質が正常に機能しないように改変されたγ−プロテオバクテリアが、γ−プロテオバクテリアの非改変株、例えば野生株よりも多量に目的物質を培地中に生産蓄積することを意味する。エシェリヒア・コリの野生株としては、例えばＫ１２株又はその誘導体、例えばＥ．　ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．４７０７６）、及びＷ３１１０株（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．２７３２５）が挙げられる。また、パントエア・アナナティス（エンテロバクター・アグロメランス）の非改変株としては、ＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６６１４）、ＡＪ１３３５６株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６６１５）株、ＡＪ１３６０１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７２０７）が挙げられる。
【００３７】
上記のようなアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、ＡｒｃＡタンパク質を保持する微生物の個体差、種や株の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ｍｕｔａｔｉｏｎまたはｖａｒｉａｔｉｏｎ）も含まれる。
【００３８】
上記のようなａｒｃＡ遺伝子の変異体又はバリアントとしては、配列番号３１の塩基番号１０１〜８１７からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡｒｃＡと同様の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００３９】
プローブとして、配列番号３１の塩基配列の一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、配列番号３１の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、配列番号３１の塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。
【００４０】
以下、ａｒｃＡ遺伝子又はＡｒｃＡタンパク質というときは、配列番号３１又は配列番号３２に示す塩基配列又はアミノ酸配列を有するものに限られず、これらの変異体又はホモログも含まれる。このようなホモログの一例として、パントエア・アナナティスのａｒｃＡ遺伝子の塩基配列及びＡｒｃＡタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号１９及び配列番号２０に示す。
【００４１】
本発明の細菌は、ＡｒｃＡタンパク質が正常に機能しないように改変された細菌であり、具体的には、例えば、ａｒｃＡ遺伝子が破壊されたγ−プロテオバクテリアである。このような細菌は、例えば、遺伝子組換え法を用いた相同組換え法（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｐｒｅｓｓ　（１９７２）；　Ｍａｔｓｕｙａｍａ，　Ｓ．　ａｎｄ　Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，　Ｓ．，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１６２，　１１９６（１９８５））により、染色体上のａｒｃＡ遺伝子を、正常に機能しないａｒｃＡ遺伝子（以下、「破壊型ａｒｃＡ遺伝子」ということがある）で置換することによって行うことができる。
【００４２】
相同組換えの機構は以下のとおりである。染色体上の配列と相同性を有する配列を持つプラスミド等が菌体内に導入されると、ある頻度で相同性を有する配列の箇所で組換えを起こし、導入されたプラスミド全体が染色体上に組み込まれる。この後さらに染色体上の相同性を有する配列の箇所で組換えを起こすと、再びプラスミドが染色体上から抜け落ちるが、この時組換えを起こす位置により破壊された遺伝子の方が染色体上に固定され、元の正常な遺伝子がプラスミドと一緒に染色体上から抜け落ちることもある。このような菌株を選択することにより、破壊型ａｒｃＡ遺伝子が、染色体上の正常なａｒｃＡ遺伝子と置換された菌株を取得することができる。
【００４３】
このような相同組換えによる遺伝子破壊技術は既に確立しており、直鎖ＤＮＡを用いる方法、温度感受性プラスミドを用いる方法等が利用できる。また、薬剤耐性等のマーカー遺伝子が内部に挿入されたａｒｃＡ遺伝子を含み、かつ、目的とする微生物細胞内で複製できないプラスミドを用いることによっても、ａｒｃＡ遺伝子の破壊を行うことができる。すなわち、前記プラスミドで形質転換され、薬剤耐性を獲得した形質転換体は、染色体ＤＮＡ中にマーカー遺伝子が組み込まれている。このマーカー遺伝子は、その両端のａｒｃＡ遺伝子配列と染色体上のこれらの遺伝子との相同組換えによって組み込まれる可能性が高いため、効率よく遺伝子破壊株を選択することができる。
【００４４】
エシェリヒア属細菌で機能する温度感受性プラスミドとしては、ｐＭＡＮ９９７（ＷＯ　９９／０３９８８号国際公開パンフレット）、ｐＨＳＧ４１５、ｐＨＳＧ４２２（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ，　Ｇｅｎｅ，　１６，　２２７−２３５　（１９８１））等が挙げられる。
【００４５】
遺伝子破壊に用いる破壊型ａｒｃＡ遺伝子は、具体的には、制限酵素消化及び再結合によるこれらの遺伝子の一定領域の欠失、これらの遺伝子への他のＤＮＡ断片（マーカー遺伝子等）の挿入、または部位特異的変異法（Ｋｒａｍｅｒ，　Ｗ．　ａｎｄ　Ｆｒｉｔｓ，　Ｈ．　Ｊ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，　１５４，　３５０　（１９８７））や次亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン等の化学薬剤による処理（Ｓｈｏｒｔｌｅ，　Ｄ．　ａｎｄ　Ｎａｔｈａｎｓ，　Ｄ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　７５，　２７０（１９７８））によって、ａｒｃＡ遺伝子のコーディング領域またはプロモーター領域等の塩基配列の中に１つまたは複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせることにより、コードされるリプレッサーの活性を低下又は消失させるか、又はａｒｃＡ遺伝子の転写を低下または消失させることにより、取得することができる。これらの態様の中では、制限酵素消化及び再結合によりａｒｃＡ遺伝子の一定領域を欠失させる方法、又はこれらの遺伝子へ他のＤＮＡ断片を挿入する方法が、確実性及び安定性の点から好ましい。
【００４６】
ａｒｃＡ遺伝子は、配列自体が公知であり、それらの配列に基づいて、ＰＣＲ法又はハイブリダイゼーション法等によって容易に取得することができる。尚、遺伝子破壊に用いるａｒｃＡ遺伝子は、目的とする細菌が保持するａｒｃＡ遺伝子と相同組換えが生じる程度の相同性を有していればよく、具体的には、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有していればよい。
【００４７】
目的とする遺伝子が破壊されたことは、サザンブロッティングやＰＣＲ法により、染色体上の遺伝子を解析することによって、確認することができる。
本発明に用いる各種遺伝子の取得、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換等の方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．，　Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｅ．　Ｆ．，　Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１．２１　（１９８９）に記載されている。
【００４８】
また、機能を有するＡｒｃＡタンパク質が産生されないようになった変異株は、γ−プロテオバクテリアを紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸などの通常変異処理に用いられる変異剤によって処理することによって、取得することができる。
【００４９】
上記のようにして得られる、目的物質生産能を有し、かつ、細胞内でＡｒｃＡタンパク質が正常に機能しないように改変されたγ−プロテオバクテリアを培地に培養し、該培地又は菌体中に目的物質を生成蓄積させ、該培地又は菌体より目的物質を採取することにより、目的物質を製造することができる。本発明において、上記の性質を有するγ−プロテオバクテリアを用いることにより、目的物質の生産効率を向上させることができる。これは、ａｒｃＡ遺伝子に関するγ−プロテオバクテリア野生株は、培養のａｒｃＡ遺伝子が発現し、ＴＣＡサイクル上の遺伝子の発現を抑制するのに対し、ＡｒｃＡタンパク質が正常に機能しない株では、ＴＣＡサイクル上の遺伝子の発現抑制が解除されるためであると推測される。
【００５０】
本発明に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地でよい。炭素源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボースや澱粉の加水分解物などの糖類、グリセロール、マンニトールやソルビトールなどのアルコール類、グルコン酸、フマール酸、クエン酸やコハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養素としては、ビタミンＢ１等のビタミン類、アデニンやＲＮＡ等の核酸類などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カルシウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００５１】
培養は、使用する菌株に応じて従来より用いられてきた周知の条件で行ってかまわない。たとえば、好気的条件下で１６〜７２時間程度実施するのがよく、培養温度は３０℃〜４５℃に、培養中ｐＨは４．５〜８に制御する。なお、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、さらにアンモニアガス等を使用することができる。
【００５２】
培地又は菌体からの目的物質の採取は、本願発明において特別な方法が必要とされることはない。すなわち、目的物質の採取は、従来より周知となっているイオン交換樹脂法、沈殿法その他の方法を、目的物質の種類に応じて組み合わせることにより実施できる。また、菌体中に蓄積した目的物質の採取は、菌体を物理的又は酵素的に破壊し、目的物質に応じて菌体抽出液又は膜画分から採取することができる。尚、目的物質によっては、目的物質を菌体中に存在したままの状態で、微生物触媒等として利用することもできる。
【００５３】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００５４】
【実施例１】エシェリヒア・コリのａｒｃＡ，　ｄａｍ，　ｆｎｒ遺伝子の破壊
エシェリヒア・コリ（Ｅ．　ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株のゲノムＤＮＡの全塩基配列は既に明らかにされている（Ｂｌａｔｔｎｅｒ　Ｆ．Ｒ．，　Ｐｌｕｎｋｅｔｔ　Ｇ．，　Ｂｌｏｃｈ　Ｃ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２２７，　１４５３−１４７４　（１９９７）；　ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｗｉｓｃ．ｅｄｕ／ｐｕｂ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ／ｅｃｏｌｉｍ５２．ｓｅｑ．ｇｚ）。既知のａｒｃＡ、ｄａｍ、ｆｎｒ遺伝子の塩基配列に基づいて、ａｒｃＡ、ｄａｍ、ｆｎｒの各遺伝子破壊株を作製した。以下の操作において、ゲノムＤＮＡの抽出は、ＱＩＡＧＥＮ−Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（キアゲン社製）を用いた。
【００５５】
（１）エシェリヒア・コリのａｒｃＡ遺伝子の破壊
報告されているａｒｃＡの塩基配列に基づいてプライマーを合成し、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ａｒｃＡ遺伝子のＮ末およびＣ末断片をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲは、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用い、添付説明書にしたがって行った。Ｎ末端断片増幅用ＰＣＲ用プライマーにはプライマー１、２を、Ｃ末端断片増幅用ＰＣＲ用プライマーにはプライマー３、４を用いた。プライマー１にはＨｉｎｄＩＩＩサイトが、プライマー４にはＸｂａＩサイトがそれぞれデザインされている。
【００５６】
プライマー１：ｃｃｃａａｇｃｔｔａａａｇｃｃｃｔｔｔａｃｔｔａｇｃｔｔａ（ＧｅｎＢａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＥ０００５１０の塩基配列の塩基番号５４８２−５５０１に相補的な配列の５’末にｃｃｃおよびＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加した配列：配列番号１）
プライマー２：ｔｃｃｇｃｇｃｃａｔｃｔｇｔｃｇｃｔｔｃ（ＧｅｎＢａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＥ０００５１０の塩基配列の塩基番号４８５１−４８７０の配列：配列番号２）
プライマー３：ｇａａｇｃｇａｃａｇａｔｇｇｃｇｃｇｇａａａａｇｃｔａｃａａｇｔｔｃａａｔｇｇｔ（ＧｅｎＢａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＥ０００５１０の塩基配列の４５４１−４５６０に相補的な配列の５’末にＧｅｎＢａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＥ０００５１０の塩基配列の塩基番号４８５１−４８７０に相補的な配列を付加した配列：配列番号３）
プライマー４：ｇｇｇｔｃｔａｇａｇｇｔｔｇａａａａａｔａａａａａｃｇｇｃ（ＧｅｎＢａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＥ０００５１０の塩基配列の塩基番号４１８８−４２０７の配列に５’末にｇｇｇおよびＸｂａＩサイトを付加した配列：配列番号４）
【００５７】
ＰＣＲ後の増幅ＤＮＡ断片は、それぞれ、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）にて精製し、精製したＮ末端ＤＮＡ断片およびＣ末端ＤＮＡ断片、プライマー１、４を用いて、クロスオーバーＰＣＲ法（Ａ．　Ｊ．　Ｌｉｎｋ，　Ｄ．　Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，　Ｇ．　Ｍ．　Ｃｈｕｒｃｈ，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，　１７９，　６２２８−６２３７　（１９９７））により、破壊型ａｒｃＡ断片を得た。精製したＤＮＡ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ（宝酒造社製）にて切断した後、フェノール／クロロホルム処理、及びエタノール沈殿を行った。同様にＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで切断した温度感受性プラスミドｐＭＡＮ９９７（ＷＯ　９９／０３９８８号国際公開パンフレット）と前記ＤＮＡ断片とをＤＮＡ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて連結した。この連結反応液にて、ＪＭ１０９コンピテント細胞（宝酒造社製）を形質転換し、アンピシリン（シグマ社製）を２５μｇ／ｍＬ含むＬＢ寒天プレート（ＬＢ＋アンピシリンプレート）に塗布した。３０℃で１日培養後、生育したコロニーを２５μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地で３０℃にて試験管培養し、自動プラスミド抽出機ＰＩ−５０（クラボウ社製）を用いてプラスミド抽出を行った。得られたプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで切断し、アガロースゲル電気泳動を行って、目的断片が挿入されているプラスミドをａｒｃＡ破壊用プラスミドｐＭＡＮ＿ΔａｒｃＡとした。尚、前記ｐＭＡＮ９９７は、ｐＭＡＮ０３１（Ｓ．Ｍａｔｓｕｙａｍａ　ａｎｄ　Ｓ．　Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１６２，　１１９６　（１９８５））とｐＵＣ１９（宝酒造社製）のそれぞれのＶｓｐＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を繋ぎ換えたものである。
【００５８】
プラスミドｐＭＡＮ＿ΔａｒｃＡでエシェリヒア・コリＷＣ１９６株をＣ．　Ｔ．　Ｃｈｕｎｇらの方法により形質転換し、ＬＢ＋アンピシリンプレートで３０℃でコロニーを選択した。選択したクローンを３０℃で一晩液体培養した後、培養液を１０−３希釈してＬＢ＋アンピシリンプレートにまき、４２℃でコロニーを選択した。選択したクローンをＬＢ＋アンピシリンプレートに塗り広げて３０℃で培養した後、プレートの１／８の菌体をＬＢ培地　２　ｍＬに懸濁し、４２℃で４〜５時間振とう培養した。１０−５希釈した培養液をＬＢプレートにまき、得られたコロニーのうち数百コロニーをＬＢプレートとＬＢ＋アンピシリンプレートに植菌し、生育を確認することで、アンピシリン感受性株を選択した。アンピシリン感受性株の数株についてコロニーＰＣＲを行い、ａｒｃＡ遺伝子の欠失を確認した。こうしてＥ．　ｃｏｌｉＷＣ１９６由来のａｒｃＡ破壊株ＷＣ１９６ΔａｒｃＡを得た。
【００５９】
（２）エシェリヒア・コリのｄａｍ遺伝子の破壊
（１）と同様の方法を用い、ＷＣ１９６よりｄａｍ遺伝子破壊株を作製した。
報告されているｄａｍ遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ｄａｍ遺伝子のＮ末およびＣ末断片をＰＣＲ法により増幅した。Ｎ末端断片増幅用ＰＣＲ用プライマーにはプライマー５、６を、Ｃ末端断片増幅用ＰＣＲ用プライマーにはプライマー７、８を用いた。プライマー５にはＨｉｎｄＩＩＩサイトが、プライマー８にはＸｂａＩサイトがそれぞれデザインされている。
【００６０】
プライマー５：ｃｃｃａａｇｃｔｔｃｃｇｔｇｇｔａｔｇｔｃｃｔｇｇｔｔｔｃ（ＧｅｎＢａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＥ０００４１４の塩基配列の塩基番号５１５０−５１６９に相補的な配列の５’末にｃｃｃおよびＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加した配列：配列番号５）
プライマー６：ａｇａｃｔｇａｔｃａｇｇｔｃｇｃｔａｔｔ（ＧｅｎＢａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＥ０００４１４の塩基配列の塩基番号４７４１−４７６０の配列：配列番号６）
プライマー７：ａａｔａｇｃｇａｃｃｔｇａｔｃａｇｔｃｔｇｃｃｔｔａｔｇｃａｃｃｇｃｔｇｔｃｔｇ（ＧｅｎＢａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＥ０００４１４の塩基配列の４３６１−４３８０に相補的な配列の５’末にＧｅｎＢａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＥ０００４１４の塩基配列の塩基番号４７４１−４７６０に相補的な配列を付加した配列：配列番号７）
プライマー８：ｇｇｇｔｃｔａｇａｃｇｔｃａｇａｔｔｇｇｇａａｃａｔａｇｔ（ＧｅｎＢａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＥ０００４１４の塩基配列の塩基番号３９３１−３９５０の配列に５’末にｇｇｇおよびＸｂａＩサイトを付加した配列：配列番号８）
【００６１】
ＰＣＲ後の増幅ＤＮＡ断片は、それぞれ、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）にて精製し、精製したＮ末端ＤＮＡ断片およびＣ末端ＤＮＡ断片、プライマー５、８を用いて、クロスオーバーＰＣＲ法により、欠損型ｄａｍ断片を得た。後の操作は（１）と同様に行い、ｄａｍ破壊型ＷＣ１９６Δｄａｍを得た。
【００６２】
（３）エシェリヒア・コリのｆｎｒ遺伝子の破壊
（１）と同様の方法を用い、ＷＣ１９６よりｆｎｒ遺伝子破壊株を作製した。
報告されているｆｎｒ遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ｆｎｒ遺伝子のＮ末およびＣ末断片をＰＣＲ法により増幅した。
【００６３】
Ｎ末端断片増幅用ＰＣＲ用プライマーにはプライマー９、１０を、Ｃ末端断片増幅用ＰＣＲ用プライマーにはプライマー１１、１２を用いた。プライマー９にはＨｉｎｄＩＩＩサイトが、プライマー１２にはＸｂａＩサイトがそれぞれデザインされている。（１）と同様の方法を用い、ＷＣ１９６よりｆｎｒ破壊株を得た。
【００６４】
プライマー９：ｃｃｃａａｇｃｔｔｇｃａａｔｔｇｇｇｃｃｇｔｃｃｔｇｇｃｇ（ＧｅｎＢａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＥ０００２３１の塩基配列の塩基番号７９８１−８０００に相補的な配列の５’末にｃｃｃおよびＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加した配列：配列番号９）
プライマー１０：ｔｃａａｇｃｔｇａｔｃａａｇｃｔｃａｔｇ（ＧｅｎＢａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＥ０００２３１の塩基配列の塩基番号７５０１−７５２０の配列：配列番号１０）
プライマー１１：ｃａｇｇａｇｔｔｇａｔｃａｇｃｔｔｇａｇａａａａａｔｇｃｃｇａｇｇａａｃｇｔｃ
（ＧｅｎＢａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＥ０００２３１の塩基配列の７１２１−７１４０に相補的な配列の５’末にＧｅｎＢａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＥ０００２３１の塩基配列の塩基番号７５０１−７５２０に相補的な配列を付加した配列：配列番号１１）
プライマー１２：ｇｇｇｔｃｔａｇａｔｔｇｇｔｃｇｔｃｃｔｇｇｔｔａｇｇａｔ（ＧｅｎＢａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＥ０００２３１の塩基配列の塩基番号６６７１−６６９０の配列に５’末にｇｇｇおよびＸｂａＩサイトを付加した配列：配列番号１２）
【００６５】
ＰＣＲ後の増幅ＤＮＡ断片は、それぞれ、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）にて精製し、精製したＮ末端ＤＮＡ断片およびＣ末端ＤＮＡ断片、プライマー９、１２を用いて、クロスオーバーＰＣＲ法により、破壊型ｆｎｒ断片を得た。後の操作は（１）と同様に行い、ｆｎｒ破壊株ＷＣ１９６Δｆｎｒを得た。
【００６６】
【実施例２】エシェリヒア・コリａｒｃＡ破壊株のＬ−リジン生産への効果
ａｒｃＡ遺伝子破壊株ＷＣ１９６ΔａｒｃＡ株、ｄａｍ遺伝子破壊株ＷＣ１９６Δｄａｍ株およびｆｎｒ遺伝子破壊株ＷＣ１９６Δｆｎｒ株、ならびにそれらの親株であるＷＣ１９６を培養し、Ｌ−リジン生産量を測定した。以下に、そのための培地および培養方法ならびに分析方法を示す。
【００６７】
〔基本培地Ｅ−１００培地〕
2004089188.tif 000003
【００６８】
〔培養方法〕
リフレッシュ（ｒｅｆｒｅｓｈ）培養；保存状態の菌を接種
ＬＢ寒天培地（必要に応じて薬剤添加）、３７℃、２４時間
種（ｓｅｅｄ）培養；リフレッシュ培養した菌を２ｍｌ　ＬＢ培地に接種
ＬＢ培地（必要に応じて薬剤添加）、３７℃、一晩
主（ｍａｉｎ）培養；種培養菌体プレートの１／１６を接種
Ｅ−１００培地（必要に応じて、薬剤添加）、３７℃、２０ｍｌ／５００ｍｌ容坂口フラスコ
【００６９】
〔分析方法〕
培養液５００μｌを経時的にサンプリングし、培養液中のグルコース濃度、Ｌ−リジン蓄積を測定した。グルコース濃度、及びＬ−リジン濃度は、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心し、その上清液を適当倍率に水で希釈した培養液をバイオテックアナライザー（サクラ精器）により測定した。結果を図１に示す。
【００７０】
その結果、ｆｎｒ遺伝子破壊株は対照株と同等のＬ−リジン蓄積を示し、ｄａｍ遺伝子破壊株は対照株と比較して蓄積が減少することが観察された。一方、ａｒｃＡ遺伝子破壊株のＬ−リジン蓄積が対照株と比較して向上することが認められた。
【００７１】
【実施例３】エシェリヒア・コリａｒｃＡ破壊株のＬ−グルタミン酸生産への効果
実施例２において、ａｒｃＡ遺伝子破壊によりＬ−リジン蓄積向上効果が認められたため、ここでは、ａｒｃＡ遺伝子のＬ−グルタミン酸発酵への効果を検討した。
【００７２】
Ｌ−グルタミン酸生産に対するエシェリヒア・コリＭＧ１６５５におけるａｒｃＡ遺伝子の欠損効果を確認するため、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５由来のｓｕｃＡ欠損株（ＭＧ１６５５ΔｓｕｃＡ）及びエシェリヒア・コリＭＧ１６５５由来のｓｕｃＡ、ａｒｃＡ二重欠損株（ＭＧ１６５５ΔｓｕｃＡΔａｒｃＡ）を構築した。
【００７３】
（１）エシェリヒア・コリのｓｕｃＡ遺伝子の破壊
実施例１と同様の方法を用い、ＭＧ１６５５よりｓｕｃＡ遺伝子破壊株を作製した。
報告されているｓｕｃＡ遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ｓｕｃＡ遺伝子のＮ末およびＣ末断片をＰＣＲ法により増幅した。
【００７４】
Ｎ末端断片増幅用ＰＣＲ用プライマーにはプライマー１３、１４を、Ｃ末端断片増幅用ＰＣＲ用プライマーにはプライマー１５、１６を用いた。プライマー１３はＨｉｎｄＩＩＩサイトが、プライマー１６にはＸｂａＩサイトがそれぞれデザインされている。（１）と同様の方法を用い、ＭＧ１６５５よりｓｕｃＡ遺伝子破壊株を得た。
【００７５】
プライマー１３：ｃｃｃａａｇｃｔｔｃｔｇｃｃｃｃｔｇａｃａｃｔａａｇａｃａ（ＧｅｎＢａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＥ０００１７５の塩基配列の塩基番号１０７２１−１０７４０の配列の５’末にｃｃｃおよびＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加した配列：配列番号１３）
プライマー１４：ｃｇａｇｇｔａａｃｇｔｔｃａａｇａｃｃｔ（ＧｅｎＢａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＥ０００１７５の塩基配列の塩基番号１１５０１−１１５２０に相補的な配列：配列番号１４）
プライマー１５：ａｇｇｔｃｔｔｇａａｃｇｔｔａｃｃｔｃｇａｔｃｃａｔａａｃｇｇｇｃａｇｇｇｃｇｃ（ＧｅｎＢａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＥ０００１７５の塩基配列の１２８０１−１２８２０の配列の５’末にＧｅｎＢａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＥ０００１７５の塩基配列の塩基番号１０５０１−１１５２０の配列を付加した配列：配列番号１５）
プライマー１６：ｇｇｇｔｃｔａｇａｃｃａｃｔｔｔｇｔｃａｇｔｔｔｃｇａｔｔ（ＧｅｎＢａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＥ０００１７５の塩基配列の塩基番号１３８０１−１３８２０に相補的な配列に５’末にｇｇｇおよびＸｂａＩサイトを付加した配列：配列番号１６）
【００７６】
ＰＣＲ後の増幅ＤＮＡ断片は、それぞれ、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）にて精製し、精製したＮ末端ＤＮＡ断片およびＣ末端ＤＮＡ断片、プライマー１３、１６を用いて、クロスオーバーＰＣＲ法により、欠損型ｓｕｃＡ断片を得た。後の操作は（１）と同様に行い、ｓｕｃＡ破壊株ＭＧ１６５５ΔｓｕｃＡを得た。
【００７７】
（２）エシェリヒア・コリのｓｕｃＡ、ａｒｃＡ遺伝子二重欠損株の作製
実施例１と同様の方法を用い、ＭＧ１６５５ΔｓｕｃＡよりａｒｃＡ遺伝子を破壊し、ｓｕｃＡ、ａｒｃＡ二重欠損株を作製した（ＭＧ１６５５ΔｓｕｃＡΔａｒｃＡ）。
【００７８】
同様にして、ｓｕｃＡ、ｄａｍ二重欠損株（ＭＧ１６５５ΔｓｕｃＡΔｄａｍ）、及びｓｕｃＡ、ｆｎｒ二重欠損株を作製した（ＭＧ１６５５ΔｓｕｃＡΔｆｎｒ）。
ａｒｃＡ遺伝子破壊のＬ−グルタミン酸発酵への効果を検討するため、各遺伝子二重欠損株ＭＧ１６５５ΔｓｕｃＡΔａｒｃＡ株、ＭＧ１６５５ΔｓｕｃＡΔｄａｍ、及びＭＧ１６５５ΔｓｕｃＡΔｆｎｒを、ｓｕｃＡ遺伝子欠損株ＭＧ１６５５ΔｓｕｃＡを対照として培養し、Ｌ−グルタミン酸生産量を測定した。以下に、そのための培地および培養方法ならびに分析方法を示す。
【００７９】
〔基本培地ＭＳ培地〕
2004089188.tif 000004
【００８０】
〔培養方法〕
リフレッシュ（ｒｅｆｒｅｓｈ）培養；保存状態の菌を接種
ＬＢ寒天培地（必要に応じて薬剤添加）、３７℃、２４時間
種（ｓｅｅｄ）試験管培養；リフレッシュ培養した菌を接種
ＬＢ液体培地（必要に応じて薬剤添加）、３７℃、１６時間
主（ｍａｉｎ）培養；種培養液体培地から１０％接種
ＭＳ液体培地（必要に応じて薬剤添加）、３７℃
２０ｍｌ／５００ｍｌ容坂口フラスコ
【００８１】
〔分析方法〕
培養液５００μｌを経時的にサンプリングし、培養液中のグルコース濃度、Ｌ−グルタミン酸蓄積を測定した。グルコース濃度、及びＬ−グルタミン酸濃度は、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心し、その上清液を適当倍率に水で希釈した培養液をバイオテックアナライザー（サクラ精器）により測定した。残糖がなくなった時点でのＬ−グルタミン酸蓄積と収率を表１に示した。
【００８２】
【表１】
2004089188.tif 000005
【００８３】
その結果、ｓｕｃＡ，　ｄａｍ遺伝子破壊株のグルタミン酸蓄積、収率ともに対照株よりやや劣り、ｓｕｃＡ，　ｆｎｒ遺伝子破壊株においては対照株と同程度であった。一方、ｓｕｃＡ，　ａｒｃＡ遺伝子破壊株のＬ−グルタミン酸蓄積、収率はともに対照株と比較して向上することが認められた。
【００８４】
【実施例４】パントエア・アナナティスのａｒｃＡ遺伝子の破壊
＜１＞パントエア・アナナティスのａｒｃＡ遺伝子の取得
（１）低ｐＨ環境下でＬ−グルタミン酸を生産するパントエア・アナナティス菌株の構築
ＡｒｃＡはエシェリヒア・コリとその近縁種に普遍的に存在するグローバルレギュレータである。ここでは、既知のエシェリヒア・コリのａｒｃＡ遺伝子配列に基づき、エシェリヒア・コリの近縁種であるパントエア属細菌パントエア・アナナティスＡＪ１３６０１を用いて、パントエア・アナナティスのａｒｃＡ遺伝子を取得した。ＡＪ１３６０１は、以下のようにして取得された株である（ＥＰ　１　０７８　９８９　Ａ２参照）。静岡県磐田市の土壌から、低ｐＨでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として、ＡＪ１３３５５株が分離された。ＡＪ１３３５５株から、粘液低生産性の変異株であり、かつ、生育良好な株としてＳＣ１７株が選択され、このＳＣ１７株から、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（αＫＧＤＨ）遺伝子破壊株として、ＳＣ１７ｓｕｃＡが構築された。ＳＣ１７ｓｕｃＡに、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（ｇｌｔＡ）を含むプラスミド（ｐＳＴＶＣＢ）、及びエシェリヒア・コリ由来のｇｌｔＡ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ｐｐｃ）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｄｈＡ）の各遺伝子を含むプラスミド（ＲＳＦＣＰＧ）が導入された形質転換株から、低ｐＨ環境下で高濃度のＬ−グルタミン酸に対する耐性が向上した菌株として、ＡＪ１３６０１株が選択された。ＡＪ１３６０１株は、平成１１年８月１８日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（現　独立法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター、〒３０５−８５６６　日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６）に受託番号ＲＥＲＭ　Ｐ−１７５１６として寄託され、平成１２年６月６日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７２０７が付与されている（ＥＰ　１　０７８　９８９　Ａ２参照）。
【００８５】
（２）パントエア・アナナティスＡＪ１３６０１株のａｒｃＡ遺伝子の取得
前記パントエア・アナナティスＡＪ１３６０１のゲノムＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ−Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（キアゲン社製）を用いて抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記オリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲにより、ａｒｃＡ遺伝子のＯＲＦを含む７５９ｂｐのＤＮＡ断片を取得した。ＰＣＲはＰｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造製）を用い、添付説明書にしたがって行った。増幅用ＰＣＲプライマーはプライマー１７、１８を用いた。プライマー１７にはＥｃｏＲＩサイトが、プライマー１８にはＳｐｈＩサイトがそれぞれデザインされている。
【００８６】
プライマー１７：ｃｃｃｇａａｔｔｃｃｃｔｇｔｔｔｃｇａｔｔｔａｇｔｔｇｇｃ（ＧｅｎＢａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＥ０００５１０の塩基配列の４９８０−４９９９に相補的な配列の５’末にＥｃｏＲＩ配列を付加した配列：配列番号１７）
プライマー１８：ｃｃｃｇｃａｔｇｃｇａｔｔａａｔｃｔｔｃｃａｇａｔｃａｃｃ（ＧｅｎＢａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＥ０００５１０の塩基配列の４２４５−４２６４の配列の５’末にＳｐｈＩ配列を付加した配列：配列番号１８）
【００８７】
取得したＤＮＡ断片を、両プライマーに設計しておいたＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩサイトを利用してクローニングベクターｐＳＴＶ２９（宝酒造社製）のＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩサイトに、ｌａｃＺ遺伝子の転写方向に対して順方向となるように挿入し、ｐＳＴＶ２９＿ＥａａｒｃＡを作製した。配列番号１９にｐＳＴＶ２９にクローニングした配列を示す。また、配列番号２０にこのＯＲＦによってコードされる予想アミノ酸配列を示した。ここで取得したＯＲＦは、エシェリヒア・コリのａｒｃＡ遺伝子とＤＮＡ配列で約８１．２％、アミノ酸配列で約９２．１％の高い相同性を有することから、パントエア・アナナティスのａｒｃＡ遺伝子をコードしていると考えられる。
【００８８】
＜２＞パントエア・アナナティスのａｒｃＡ遺伝子の破壊
パントエア・アナナティスにおけるａｒｃＡ遺伝子の破壊株作製は、パントエア・アナナティスＧ１０６Ｓ株を使用した。本菌株は、前記のＡＪ１３６０１が保有している２つのプラスミドＲＳＦＣＰＧおよびｐＳＴＶＣＢのうち、ＲＳＦＣＰＧのみを保有し、ｐＳＴＶＣＢが脱落した株である。Ｇ１０６ＳよりａｒｃＡ遺伝子の破壊株を作製し、得られた破壊株にｐＳＴＶＣＢを導入することにより、ＡＪ１３６０１のａｒｃＡ遺伝子破壊株を作製した。以下に詳細を説明する。
【００８９】
（１）ａｒｃＡ遺伝子破壊のための接合伝達用プラスミドの構築
これまでに行われてきた温度感受性プラスミドを用いた染色体上組み換えによる育種は、４２℃ではほとんど生育できないパントエア・アナナティスの特徴から、組み換え手順上、その利用は簡便ではない。したがってここでは、接合伝達法を使用した染色体上組み換えによる手法を採用した。接合伝達法の場合、パントエア・アナナティスの複製開始起点（ｏｒｉ）を持たない、すなわちパントエア・アナナティスでは複製できないプラスミドを構築する必要がある。そこで、まずプライマー２１、２２を用い、Ｔｎ５転移用プラスミドであるｐＵＴ／ｍｉｎｉＴｎ５−Ｃｍ（Ｌｏｒｅｎｚｏ　Ｖ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，　１７２，　６５６８−　（１９９０）、およびＨｅｒｒｅｒｏ　Ｍ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，　１７２，　６５５７　（１９９０））を鋳型として、ｏｒｉＲ６ＫおよびｍｏｂＲＰ４部分をＰＣＲで増幅した。また、プライマー２３、２４を用いて、ｐＨＳＧ３９９を鋳型として、マルチクローニングサイトおよびクロラムフェニコール耐性遺伝子部分をＰＣＲで増幅した。得られた各々の増幅断片をＢｇｌＩＩ（宝酒造社製）処理し、ＤＮＡ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて、両断片を結合させた。
【００９０】
次に、この結合反応液にて、Ｅ．　ｃｏｌｉ　Ｓ１７−１　λｐｉｒ株（Ｒ．　Ｓｉｍｏｎ．，　ｅｔ　ａｌ．，　ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ　ＮＯＶＥＭＢＥＲ　１９８３，　７８４−７９１　（１９８３））を形質転換し、クロラムフェニコール３０μｇ／ｍｌ含むＬＢ寒天プレートに塗布した。３７℃で１日培養後、生育したコロニーを３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地で３７℃で試験管培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｍｉｎｉ　Ｓｐｉｎ　ｃｏｌｕｍｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドを取得した。取得したプラスミドをＢｇｌＩＩ処理し、１ヶ所消化されるプラスミドを取得し、接合伝達用のプラスミドｐＵＴ３９９Ｃｍとした。
【００９１】
プライマー２１：ｔｃａｔａｇａｔｃｔｔｔｔａｇａｔｔｇａｔｔｔａｔｇｇｔｇｃ（配列番号２１）
プライマー２２：ｃｃａｃａｇａｔｃｔａａｔｔｃｃｃａｔｇｔｃａｇｃｃｇｔｔａ（配列番号２２）
プライマー２３：ａｔａａａｇａｔｃｔｇｔｇｔｃｃｃｔｇｔｔｇａｔａｃｃｇｇｇ（配列番号２３）
プライマー２４：ｇｇｇｇａｇａｔｃｔｔｇｃａａｇｇｃｇａｔｔａａｇｔｔｇｇｇ（配列番号２４）
【００９２】
次に下記の手法によりｐＵＴ３９９にカナマイシン耐性遺伝子を導入し、クロラムフェニコール耐性遺伝子を除去した。ｐＭＷ２１９（ニッポンジーン社製）を鋳型とし、プライマー２５、プライマー２６を用いてＰＣＲ法によりカナマイシン耐性遺伝子を増幅した。ＰＣＲはＰｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用い、添付説明書にしたがって行った。プライマー２５およびプライマー２６の配列の５’末端にはＢｇｌＩＩサイトを付加している。得られたＤＮＡ断片およびｐＵＴ３９９を制限酵素ＢｇｌＩＩ（宝酒造社製）で消化し、ＤＮＡ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて結合した。この連結反応液にて、Ｅ．　ｃｏｌｉ　Ｓ１７−１　λｐｉｒ株（Ｒ．　Ｓｉｍｏｎ．，　ｅｔ　ａｌ．，　ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ　ＮＯＶＥＭＢＥＲ　１９８３，　７８４−７９１　（１９８３））を形質転換し、カナマイシン２５μｇ／ｍｌ含むＬＢ寒天プレート（ＬＢ＋カナマイシンプレート）に塗布した。３７℃で一日培養後、生育したコロニーをカナマイシン２５μｇ／ｍｌ含むＬＢ培地で３７℃にて試験管培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドを抽出した。得られたプラスミドをＢｇｌＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動を行って、目的断片が挿入されているプラスミドをｐＵＴ３９９ＣｍＫｍとした。
【００９３】
プライマー２５：ｃｃｃａｇａｔｃｔａｇｔｔｔｔｃｇｃｃｃｃｇａａｇａａｃｇ（配列番号２５）
プライマー２６：ｃｃｃａｇａｔｃｔｃｃａｇａｇｔｃｃｃｇｃｔｃａｇａａｇａ（配列番号２６）
【００９４】
次に下記の手法により、ｐＵＴ３９９ＣｍＫｍよりクロラムフェニコール耐性遺伝子を除去した。ｐＵＴ３９９ＣｍＫｍを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）で消化し、ＤＮＡ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて結合した。この連結反応液にて、Ｅ．　ｃｏｌｉ　Ｓ１７−１　λｐｉｒ株（Ｒ．　Ｓｉｍｏｎ．，　ｅｔ　ａｌ．，　ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ　ＮＯＶＥＭＢＥＲ　１９８３，　７８４−７９１　（１９８３））を形質転換し、カナマイシン２５μｇ／ｍｌ含むＬＢ寒天プレート（ＬＢ＋カナマイシンプレート）に塗布した。３７℃で一日培養後、生育したコロニーをカナマイシン２５μｇ／ｍｌ含むＬＢプレートおよびクロラムフェニコール（シグマ社製）３０μｇ／ｍｌ含むＬＢ寒天プレートで３７℃にて培養し、クロラムフェニコール感受性となった株を取得した。この株をカナマイシン２５μｇ／ｍｌ含むＬＢ　培地にて３７℃で１日培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドを抽出した。得られたプラスミドをｐＵＴ３９９Ｋｍとした。
【００９５】
＜１＞において取得したパントエア・アナナティスのａｒｃＡ遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、ｐＳＴＶ２９＿ＥａａｒｃＡを鋳型として、ａｒｃＡ遺伝子のＮ末端およびＣ末端断片を、各々ＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲはＰｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用い、添付説明書にしたがって行った。Ｎ末断片増幅用ＰＣＲ用プライマーにはプライマー２７、２８を、Ｃ末断片増幅用ＰＣＲ用プライマーには２９、３０を用いた。プライマー２７にはＥｃｏＲＩサイトが、プライマー３０にはＳｐｈＩサイトがそれぞれデザインされている。
【００９６】
プライマー２７：ｃｃｃｇａａｔｔｃｇｃｇａｃｃｇａｔｇｇｔｇｃａｇａｇａｔ（配列番号２７）
プライマー２８：ａａｇｇｃａａａｔｔｃａｔｇｇｔｇｃｇｃ（配列番号２８）
プライマー２９：ｇｃｇｃａｃｃａｔｇａａｔｔｔｇｃｃｔｔａｃｃｃａａｔｇａａｇａｇｃｇｔｃｇｃｃ（配列番号２９）
プライマー３０：ｃｃｃｇｃａｔｇｃａｃｃｔｔｃｇｃｃｇｔｇａａｔｇｇｔｇｇ（配列番号３０）
【００９７】
ＰＣＲ後の増幅ＤＮＡ断片は、それぞれ、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）にて精製し、精製したＮ末端ＤＮＡ断片およびＣ末端ＤＮＡ断片、プライマー２７、３０を用いて、クロスオーバーＰＣＲ法（Ａ．　Ｊ．　Ｌｉｎｋ，　Ｄ．　Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，　Ｇ．　Ｍ．　Ｃｈｕｒｃｈ，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，　１７９，　６２２８−６２３７　（１９９７））により、破壊型ａｒｃＡ断片を得た。精製したＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ及びＳｐｈＩ（宝酒造社製）にて切断した後、フェノール／クロロホルム処理、及びエタノール沈殿を行った。同様にＥｃｏＲＩ及びＳｐｈＩで切断したプラスミドｐＵＴ３９９Ｋｍと前記ＤＮＡ断片とをＤＮＡ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて連結した。この連結反応液にて、Ｅ．　ｃｏｌｉ　Ｓ１７−１　λｐｉｒ株（Ｒ．　Ｓｉｍｏｎ．，　ｅｔ　ａｌ．，　ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ　ＮＯＶＥＭＢＥＲ　１９８３，　７８４−７９１　（１９８３））を形質転換し、カナマイシン２５μｇ／ｍｌ含むＬＢ寒天プレートに塗布した。３７℃で１日培養後、生育したコロニーを２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で３７℃にて試験管培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドを抽出した。得られたプラスミドをＥｃｏＲＩ及びＳｐｈＩで切断し、アガロースゲル電気泳動を行って、目的断片が挿入されているプラスミドをａｒｃＡ破壊用プラスミドｐＵＴ３９９Ｋｍ＿ΔａｒｃＡとした。
【００９８】
（２）接合伝達法を用いたパントエア・アナナティスａｒｃＡ遺伝子の破壊
続いて、上記ｐＵＴ３９９Ｋｍ＿ΔａｒｃＡを用いて、相同組み換えを利用した遺伝子破壊を行った。プラスミド受容菌はＧ１０６Ｓ株を用い、スクリーニングはグルコース５ｇ／Ｌ（純正化学製）、酵母エキス５ｇ／Ｌ（Ｄｉｆｃｏ社製）、トリプトンペプトン１０ｇ／Ｌ（Ｄｉｆｃｏ社製）、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ（純正化学社製）、リン酸水素二ナトリウム６ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム３ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム１ｇ／Ｌ、塩化カルシウム２水塩１．５ｇ／Ｌを含む培地（以下、「ＬＢＧ−Ｍ９培地」と記載）にテトラサイクリン２５μｇ／ｍｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍｌ、及び寒天を添加した寒天培地（以下、「ＬＢＧ−Ｍ９＋Ｔｅｔ＋Ｋｍプレート」と記載）で行った。ｐＵＴ３９９由来のプラスミドは前述のとおりパントエア・アナナティス中では複製できないため、この寒天培地上ではｐＵＴ３９９Ｋｍ＿ΔａｒｃＡが染色体に組み込まれたＧ１０６Ｓ株のみ１回組み換え体、すなわち、ａｒｃＡ遺伝子の破壊株として選抜できる。ｐＵＴ３９９Ｋｍ＿ΔａｒｃＡでＥ．　ｃｏｌｉ　Ｓ１７−１　λｐｉｒ株（Ｒ．　Ｓｉｍｏｎ．，　ｅｔ　ａｌ．，　ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ　ＮＯＶＥＭＢＥＲ　１９８３，　７８４−７９１　（１９８３））を形質転換し、カナマイシン２５μｇ／ｍｌ含むＬＢ寒天プレートに塗布した。培養後、得られた形質転換体Ｅ．　ｃｏｌｉ　Ｓ１７−１　λｐｉｒ／ｐＵＴ３９９Ｋｍ＿ΔａｒｃＡ　をカナマイシン２５μｇ／ｍｌ含むＬＢ培地を用い３７℃で１晩培養した。また、Ｇ１０６Ｓ株を、テトラサイクリン２５μｇ／ｍｌ含むＬＢＧ−Ｍ９培地で３４℃で１晩培養した。それぞれの培養液を遠心して集菌し、ＬＢ培地５０μｌで懸濁した。それぞれ２５μｌを混合し、ＬＢＧ−Ｍ９寒天培地上で室温にて１時間培養し、その後３４℃で３時間培養することで接合伝達を行った。１０−１、１０−２、１０−３希釈した菌体を、ＬＢＧ−Ｍ９＋Ｔｅｔ＋Ｋｍプレートに塗布し、テトラサイクリン、カナマイシン耐性株を選択した。得られた株の数株についてコロニーＰＣＲを行い、ａｒｃＡ遺伝子の欠失を確認した。こうしてＧ１０６Ｓ由来のａｒｃＡ破壊株Ｇ１０６ＳΔａｒｃＡを得た。
【００９９】
（３）１０６ＳΔａｒｃＡへのｐＳＴＶＣＢの導入およびＬ−グルタミン酸の製造
ｐＳＴＶＣＢを用いてＧ１０６ＳΔａｒｃＡを形質転換した。得られた形質転換体Ｇ１０６ＳΔａｒｃＡ／ｐＳＴＶＣＢは、前記ＡＪ１３６０１のａｒｃＡ遺伝子欠損株（ＡＪ１３６０１ΔａｒｃＡ）と同等である。同菌株、及び対照としてＡＪ１３６０１をそれぞれ培養し、Ｌ−グルタミン酸生産量を測定した。以下に、そのための培地および培養方法ならびに分析方法を示す。
【０１００】
〔グルタミン酸評価培地〕
2004089188.tif 000006
【０１０１】
〔培養方法〕
種（ｓｅｅｄ）試験管培養；保存状態の菌を接種
ＬＢＧ−Ｍ９寒天培地（必要に応じて薬剤添加）、３４℃、２４時間
主（ｍａｉｎ）培養；種培養菌体を３白金耳接種
基本培地（必要に応じて薬剤添加）、３４℃、２４時間
５ｍｌ／試験管
【０１０２】
〔分析方法〕
培養液４００μｌを経時的にサンプリングし、培養液中のスクロース濃度、Ｌ−グルタミン酸蓄積を測定した。スクロース濃度、及びＬ−グルタミン酸濃度は、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心し、その上清液を適当倍率に水で希釈した培養液をバイオテックアナライザー（サクラ精器）により測定した。残糖がなくなった時点でのＬ−グルタミン酸蓄積と収率を表２に示した。
【０１０３】
【表２】
2004089188.tif 000007
【０１０４】
その結果、パントエア・アナナティスのａｒｃＡ遺伝子破壊株のＬ−グルタミン酸蓄積、収率は、ともに対照と比較して向上することが認められた。
【０１０５】
【実施例５】エシェリヒア・コリａｒｃＡ破壊株のＬ−アルギニン生産への効果
実施例２においてｓｕｃＡ，　ａｒｃＡ遺伝子破壊株のＬ−グルタミン酸蓄積、収率はともに対照株であるｓｕｃＡ遺伝子破壊株と比較して向上することが認められた。ここで、グルタミン酸を基質として生成されるアルギニン生産への効果について検討した。エシェリヒア・コリ　アルギニン生産菌２３７株を使用した。２３７株は、２０００年４月１０日にＲｕｓｓｉａｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　（ＶＫＰＭ）にＶＫＰＭ　Ｂ−７９２５の番号で寄託され、２００１年５月１８日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管されている。
【０１０６】
（１）エシェリヒア・コリ２３７株のａｒｃＡ遺伝子破壊株の作製
実施例１と同様の方法を用い、２３７株よりａｒｃＡ遺伝子を破壊し、ａｒｃＡ破壊株２３７ΔａｒｃＡを作製した。
【０１０７】
（２）Ｌ−アルギニンの製造
ａｒｃＡ遺伝子破壊のＬ−アルギニン発酵への効果を検討するため、２３７ａｒｃＡ欠損株２３７ΔａｒｃＡを、２３７を対照として培養し、Ｌ−アルギニン生産量を測定した。以下に、そのための培地および培養方法ならびに分析方法を示す。
【０１０８】
〔アルギニン評価培地〕
2004089188.tif 000008
【０１０９】
〔培養方法〕
種（ｓｅｅｄ）試験管培養；保存状態の菌を接種
ＬＢ寒天培地（必要に応じて薬剤添加）、３２℃、２４時間
主（ｍａｉｎ）培養；種（ｓｅｅｄ）試験管培養から１白金耳接種
アルギニン評価培地（必要に応じて薬剤添加）、３２℃、３日間
２ｍｌ／試験管
【０１１０】
〔分析方法〕
培養液５００μｌを経時的にサンプリングし、培養液中のグルコース濃度、Ｌ−アルギニン蓄積を測定した。グルコース濃度、及びＬ−アルギニン濃度は、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心し、その上清液を適当倍率に水で希釈した培養液をバイオテックアナライザー（サクラ精器）およびアミノ酸アナライザーＬ−８５００（日立計測器サービス社製）により測定した。残糖がなくなった時点でのＬ−アルギニン蓄積と収率を表３に示した。
【０１１１】
【表３】
2004089188.tif 000009
【０１１２】
ａｒｃＡ遺伝子破壊株のＬ−アルギニン蓄積、収率はともに対照株と比較して向上することが認められた。
【０１１３】
【発明の効果】
本発明により、γ−プロテオバクテリアを用いて、Ｌ−アミノ酸などの有用物質を生産する際に、生産効率を向上させることができる。
【０１１４】
【配列表】
2004089188.tif 000010
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＷＣ１９６、ＷＣ１９６ΔａｒｃＡ、ＷＣ１９６Δｄａｍ、ＷＣ１９６Δｆｎｒの蓄積パターンを示す図。
【図１】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年7月14日(2003.7.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
【実施例４】パントエア・アナナティスのａｒｃＡ遺伝子の破壊
＜１＞パントエア・アナナティスのａｒｃＡ遺伝子の取得
（１）低ｐＨ環境下でＬ−グルタミン酸を生産するパントエア・アナナティス菌株の構築
ＡｒｃＡはエシェリヒア・コリとその近縁種に普遍的に存在するグローバルレギュレータである。ここでは、既知のエシェリヒア・コリのａｒｃＡ遺伝子配列に基づき、エシェリヒア・コリの近縁種であるパントエア属細菌パントエア・アナナティスＡＪ１３６０１を用いて、パントエア・アナナティスのａｒｃＡ遺伝子を取得した。ＡＪ１３６０１は、以下のようにして取得された株である（ＥＰ　１　０７８　９８９　Ａ２参照）。静岡県磐田市の土壌から、低ｐＨでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として、ＡＪ１３３５５株が分離された。ＡＪ１３３５５株から、粘液低生産性の変異株であり、かつ、生育良好な株としてＳＣ１７株が選択され、このＳＣ１７株から、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（αＫＧＤＨ）遺伝子破壊株として、ＳＣ１７ｓｕｃＡが構築された。ＳＣ１７ｓｕｃＡに、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（ｇｌｔＡ）を含むプラスミド（ｐＳＴＶＣＢ）、及びエシェリヒア・コリ由来のｇｌｔＡ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ｐｐｃ）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｄｈＡ）の各遺伝子を含むプラスミド（ＲＳＦＣＰＧ）が導入された形質転換株から、低ｐＨ環境下で高濃度のＬ−グルタミン酸に対する耐性が向上した菌株として、ＡＪ１３６０１株が選択された。ＡＪ１３６０１株は、平成１１年８月１８日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（現　独立法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター、〒３０５−８５６６　日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６）に受託番号ＲＥＲＭ　Ｐ−１７５１６として寄託され、平成１２年７月６日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７２０７が付与されている（ＥＰ　１　０７８　９８９　Ａ２参照）。