(57)【要約】【課題】ＭＫタンパク質の分泌を特異的に強く抑制する、あるいは分泌されたＭＫに特異的に結合して受容体とＭＫの結合を阻害する。【解決手段】ＭＫ受容体であるＬＲＰ（ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のアミノ酸配列の中に特にＭＫに親和性の高い部分を見出し、このペプチドを細胞外に分泌させる、あるいは小胞体停留シグナルをつけて小胞体内で発現させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトミッドカインと結合するＬＲＰ部分ペプチド。
【請求項２】
請求項１の細胞内、細胞外供給システム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトミッドカインと結合するＬＲＰ部分ペプチドおよびその細胞内、細胞外供給システムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ミッドカイン（ｍｉｄｋｉｎｅ：ＭＫ）は、胚性腫瘍細胞（ＥＣ）のレチノイン酸による分化誘導の過程で一過性に発現する遺伝子の産物として発見された増殖・分化因子で、塩基性アミノ酸とシステインに富む分子量１３ｋＤａのポリペプチドであり、細胞外に分泌される（Ｋａｄｏｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５１：１３１２−１３１８；Ｔｏｍｏｍｕｒａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１０７６５−１０７７０，１９９０）。ＭＫはヒトからショウジョウバエまで見出されているが、種間でのタンパク質の保存度は高く、ヒトとマウスのＭＫでは、アミノ酸配列において、８７％の相同性がある。ＭＫは、様々な生物活性を有する。すなわち、神経突起の伸長、神経細胞の生存を促進し、神経系の構築に関与すると考えられる。損傷時の組織、多くのヒト癌、そしてアルツハイマー病の老人斑にも発見され、組織の修復、線溶系活性化能、そして病態の関連でも注目される。ことにＭＫは多くのヒト癌で発現が上昇し（Ａｒｉｄｏｍｅ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊａｐ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，８６：６５５−６６１，１９９５），またＭＫ  ｃＤＮＡの導入と発現により細胞が癌化する（Ｋａｄｏｍａｔｓｕ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７５：３５４−３５９，１９９７）ことからヒト癌の発生と進展に深く関与すると想定される。またＭＫ遺伝子を欠くノックアウトマウスではバルーン障害モデルにおいて新生内膜の形成が著しく低下することから、ＭＫは血管病変の生起にも関与すると考えられる（Ｈｏｒｉｂａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０５：４８９−４９５，２０００）。さらにＭＫ遺伝子を欠くノックアウトマウスでは血液再還流による間質性腎炎の障害の程度も著しく低下する（Ｓａｔｏ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：３４６３−３４６９，２００１）。したがってＭＫの生産を抑えるか作用を阻害することによって、いくつかの疾病、ことに癌の治療に寄与することが可能と考えられる。
【０００３】
ＭＫ特異的高親和性ペプチドが得られれば細胞外でＭＫをトラップしてＭＫと受容体との結合を阻害し、ＭＫの生物活性を抑制することが期待される。一方、このペプチドを細胞内小胞体で発現させることが可能ならばＭＫを小胞体内でトラップすることによりＭＫの分泌が抑制され、ＭＫの生物活性の抑制に繋がることが期待される。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ヒトＭＫの生物活性を抑えることを大目的として、ＭＫタンパク質の分泌を特異的に強く抑制すること、あるいは分泌されたＭＫに特異的に結合して受容体とＭＫの結合を阻害することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
ＭＫの作用を阻害するか生産を抑える手段として、分泌されたＭＫが受容体に結合することを阻害する方法と、細胞からのＭＫの生産を抑える方法とが考えられる。前者については抗ＭＫ抗体が考えられ、実際、抗ＭＫ抗体は培養ウィルムス腫瘍細胞の増殖を部分的に阻害した（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．：Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ，１５９：３９２−４０２，１９９３）。また後者については、マウスＭＫの発現を抑制するアンチセンスオリゴＤＮＡ配列を見出し、これにより腫瘍形成の抑制に成功している（Ｔａｋｅｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：８４８６−８４９１，２００１）。申請者らは今回ＭＫ受容体であるＬＲＰ（ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のアミノ酸配列の中に特にＭＫに親和性の高い部分を見出した。このペプチドを細胞外に分泌させるとＭＫと強く結合した。また細胞内の小胞体に発現するように小胞体停留シグナルをつけて発現させると、このペプチドは小胞体内でＭＫと結合し、ＭＫの分泌を強力に抑制した。
【０００６】
すなわち、本発明は、（１）ヒトＭＫと結合するＬＲＰ部分ペプチドの決定と（２）そのペプチドの細胞内、細胞外供給システムの開発からなる。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下添付の図面に従ってこの発明を詳細に説明する。図１はＭＫとＬＲＰ部分ペプチドの結合を調べるリガンドブロットである。図２は小胞体停留型ＬＲＰ部分ペプチドの発現ベクターの概略図である。図３はＭＫ結合性ＬＲＰ部分ペプチドの小胞体内発現によるＭＫ分泌の抑制を調べるウエスタンブロットである。
【０００８】
１．分泌型ＬＲＰ部分ペプチドの発現ベクターについて説明する。様々な分泌型ＬＲＰ部分ペプチドの発現ベクターについては既にＯｂｅｒｍｏｅｌｌｅｒらによって報告されている（Ｏｂｅｒｍｏｅｌｌｅｒ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０７６１−１０７６８，１９９７）。以下に示す１２種類のＬＲＰ部分ペプチドについてＭＫとの結合性を調べる。ヒトＬＲＰは大きく４つのリガンド結合ドメインを有する。これらは各々２、８、１０、１１個のリガンド結合リピートから成り、さらに隣接して各々２、３、３、３個のＥＧＦ様リピートが存在する。これら４つのリガンド結合ドメインを分泌型ペプチドとして発現させるために、ＬＲＰ本来のシグナルシークエンスの直下にヘモアグルチニン（ＨＡ）タグのシークエンスを付け、さらにその直下に各々のｃＤＮＡをおいたＤＮＡフラグメントをｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン社）に組み込んだ発現ベクターを作成し、それらによって生産されるペプチドをＳＬＲＰ１、ＳＬＲＰ２、ＳＬＲＰ３、ＳＬＲＰ４と名づける（Ｏｂｅｒｍｏｅｌｌｅｒ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０７６１−１０７６８，１９９７）。ＳＬＲＰ２をさらにＮ末半分（１つのＥＧＦ様リピートと４つのリガンド結合リピートから成る）とＣ末半分（４つのリガンド結合リピートと２つのＥＧＦ様リピートから成る）に分け、ＳＬＲＰ２Ｎ、ＳＬＲＰ２Ｃと名づける。ＳＬＲＰ２Ｎ、ＳＬＲＰ２ＣからＥＧＦ様リピートを除いたＳＬＲＰ２Ｎ−ＥＧＦ、ＳＬＲＰ２Ｃ−ＥＧＦも作成する。ＳＬＲＰ３、ＳＬＲＰ４もＮ末半分とＣ末半分に分け、それぞれＳＬＲＰ３Ｎ、ＳＬＲＰ３Ｃ、ＳＬＲＰ４Ｎ、ＳＬＲＰ４Ｃと名づける（Ｏｂｅｒｍｏｅｌｌｅｒ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０７６１−１０７６８，１９９７）。以上、ＳＬＲＰ１、ＳＬＲＰ２、ＳＬＲＰ３、ＳＬＲＰ４、ＳＬＲＰ２Ｎ、ＳＬＲＰ２Ｃ、ＳＬＲＰ２Ｎ−ＥＧＦ、ＳＬＲＰ２Ｃ−ＥＧＦ、ＳＬＲＰ３Ｎ、ＳＬＲＰ３Ｃ、ＳＬＲＰ４Ｎ、ＳＬＲＰ４Ｃの１２種類のペプチドについてＭＫとの結合性を調べる。
【０００９】
２．分泌型ＬＲＰ部分ペプチドとヒトＭＫとの結合性の決定について説明する。分泌型ＬＲＰ部分ペプチドを得るために上記の１２種類の発現ベクターを各々動物細胞に投与して、培養液中に分泌されるペプチドとＭＫの結合をリガンドブロット法（Ｏｂｅｒｍｏｅｌｌｅｒ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：  １０７６１−１０７６８，１９９７）およびデンシトメーターで定量する。
【００１０】
３．細胞内小胞体停留型ＬＲＰ部分ペプチドの発現ベクターについて説明する。上記の分泌型ＬＲＰ部分ペプチドとＭＫの結合性の決定により、候補となるＬＲＰ部分ペプチドを絞り込む。候補のペプチドが小胞体内に停留するように４個のアミノ酸からなる小胞体停留シグナルをＣ末側に付加した発現ベクターを作成する。
【００１１】
４．細胞内小胞体停留型ＬＲＰ部分ペプチドのＭＫの分泌に対する効果の評価について説明する。ＭＫを合成分泌している細胞に細胞内小胞体停留型ＬＲＰ部分ペプチドの発現ベクターを投与し、培養液中に分泌されるＭＫを免疫生化学的に定量する。ＭＫの免疫生化学的定量法としては酵素免疫法（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１９：１１７１−１１７５，１９９６）あるいはＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後のウェスタンブロッティング（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．：Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５９：３９２−４０２，１９９３）そしてデンシトメーターによる定量が考えられる。
【００１２】
【実施例】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１３】
（実施例１）分泌型ＬＲＰ部分ペプチドとヒトＭＫとの結合性の決定を行った。ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）を３５ｍｍディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ，３００１）に２×１０５個／ディッシュ［ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）１０％／ＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ）］の細胞密度で正確にまき、３７℃、５％ＣＯ２存在下で１晩前培養した。あらかじめ、１μｇ／μｌに濃度調整した発現ベクター（ＳＬＲＰ１、ＳＬＲＰ２、ＳＬＲＰ３、ＳＬＲＰ４、ＳＬＲＰ２Ｎ、ＳＬＲＰ２Ｃ、ＳＬＲＰ２Ｎ−ＥＧＦ、ＳＬＲＰ２Ｃ−ＥＧＦ、ＳＬＲＰ３Ｎ、ＳＬＲＰ３Ｃ、ＳＬＲＰ４Ｎ、ＳＬＲＰ４Ｃの１２種類のペプチドの発現ベクター）を各々１μｌとり、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  １００μｌと混合し、プラス試薬（インビトロジェン社）６μｌを加え、よく混合し、室温で１５分反応させた。さらに、リポフェクトアミン試薬（インビトロジェン社）４μｌとＯｐｔｉ−ＭＥＭ  １００μｌとの混合液を加え、室温で１５分反応させ、発現ベクター・リポソーム処理液の調製を完了した。なお、上記調製量は３５ｍｍディッシュで１枚に投与可能な量である。続いてＣＨＯ細胞に新鮮なＯｐｔｉ−ＭＥＭ  ０．８ｍｌを満たし、前述の発現ベクター・リポソーム処理液を０．２ｍｌを加えた後、３７℃、３時間トランスフェクションを行った。培養液をＤＭＥＭ  １ｍｌに置き換え、２４時間培養し、上清を回収した。回収した培養上清についてＳＤＳゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（１２．５％ゲル）の後、ＭＫ蛋白をリガンドとするリガンドブロットをＯｂｅｒｍｏｅｌｌｅｒらの方法によって行った（Ｏｂｅｒｍｏｅｌｌｅｒ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０７６１−１０７６８，１９９７）。結合したヒトＭＫの同定は抗ＭＫ抗体を用いたウエスタンブロットに準じて村松らの方法（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．：Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５９：３９２−４０２，１９９３）によって行った。その結果を図（図１）に示す。レーン５のＳＬＲＰ２Ｎ−ＥＧＦが最も強いＭＫとの結合性を示した。各バンドの濃度をデンシトメータで測定したところ、レーン１０のＳＬＲＰ４［ヒトＬＲＰアミノ酸残基３２７４−３８４３（Ｈｅｒｚ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．：ＥＭＢＯ  Ｊ．７：４１１９−４１２７，１９８８）］を１００％とするとレーン３（ＳＬＲＰ２Ｎ：  ヒトＬＲＰアミノ酸残基７８７−９９４）、５（ＳＬＲＰ２Ｎ−ＥＧＦ：  ヒトＬＲＰアミノ酸残基８２６−９９４）、１１（ＳＬＲＰ４Ｎ：  ヒトＬＲＰアミノ酸残基３２７４−３５５３）のみが１００％以上の値を示し、とくにレーン５のＳＬＲＰ２Ｎ−ＥＧＦは１９０％を示した。
【００１４】
（実施例２）細胞内小胞体停留型ＬＲＰ部分ペプチドの発現ベクターを作成した。（実施例１）により、ＳＬＲＰ２Ｎ、ＳＬＲＰ２Ｎ−ＥＦＧ、ＳＬＲＰ４、ＳＬＲＰ４Ｎが強いＭＫ結合能を有することを決定できた。したがってこれらのいずれも小胞体停留型ＬＲＰ部分ペプチドの候補となりうる。その中でもＳＬＲＰ２Ｎ−ＥＧＦが最も強いＭＫ結合能を有することが判明したので、このペプチドのＣ末に小胞体停留シグナルの一つであるＨＮＥＬ（ヒスチジン・アスパラギン・グルタミン酸・ロイシン）を付加するようにＰＣＲによりｃＤＮＡをつくり、ＳＬＲＰ２Ｎ−ＥＧＦの発現ベクターのｃＤＮＡと入れ替えた。完成した発現ベクターの概略図を図２に示す。これによって得られるＳＬＲＰ２Ｎ−ＥＧＦの小胞体停留型ペプチドを２ＮＥＥＲと名づけた。なお、ＳＬＲＰ２Ｎ−ＥＧＦとＳＬＲＰ２Ｎ、ＳＬＲＰ４、ＳＬＲＰ４Ｎを置き換えることができる。また、プロモーターとしては他の強力なプロモーターあるいは組織、細胞選択性の強いプロモーターを使うことができる。これらは本請求の範囲に含まれる。
【００１５】
（実施例３）細胞内小胞体停留型ＬＲＰ部分ペプチドのＭＫの分泌に対する効果の評価を行った。ＭＫを分泌しているラット骨肉種細胞（ＵＭＲ１０６，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＣＣ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＣＲＬ−１６６１）を３５ｍｍディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ，３００１）に２×１０５個／ディッシュ［ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）１０％／ＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ）］の細胞密度で正確にまき、３７℃、５％ＣＯ２存在下で１晩前培養した。あらかじめ、１μｇ／μｌに濃度調整した２ＮＥＥＲの発現ベクターあるいはコントロールとしてｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン社）を各々１μｌとり、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ１００μｌと混合し、プラス試薬（インビトロジェン社）６μｌを加え、よく混合し、室温で１５分反応させた。さらに、リポフェクトアミン試薬（インビトロジェン社）４μｌとＯｐｔｉ−ＭＥＭ１００μｌとの混合液を加え、室温で１５分反応させ、発現ベクター・リポソーム処理液の調製を完了した。なお、上記調製量は３５ｍｍディッシュで１枚に投与可能な量である。続いてＵＭＲ１０６細胞に新鮮なＯｐｔｉ−ＭＥＭ  ０．８ｍｌを満たし、前述の発現ベクター・リポソーム処理液を０．２ｍｌを加えた後、３７℃、３時間トランスフェクションを行った。培養液を１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ  １ｍｌに置き換え、２４時間培養し、上清を回収した。回収した培養上清についてＳＤＳゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（１２．５％ゲル）の後、抗ＭＫ抗体を用いたウエスタンブロットを村松らの方法（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．：  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５９：３９２−４０２，１９９３）によって行った。その結果を図（図３）に示す。レーン２の２ＮＥＥＲはレーン１のコントロールに比べて著明にＭＫの分泌を抑えた。各バンドの濃度をデンシトメータで測定したところ、レーン１を１００％とするとレーン２の２ＮＥＥＲは４２％を示した。
【００１６】
【発明の効果】
以上図示し説明したように本発明の分泌型ＬＲＰ部分ペプチドはＭＫと強く結合し、小胞体停留型ＬＲＰ部分ペプチドはＭＫの分泌を抑制することが出来る。
【００１７】
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の一実施例に関わる、ＣＨＯ細胞でつくらせた分泌型ＬＲＰ部分ペプチドとヒトＭＫとの結合を示すリガンドブロットの図である。
【図２】この発明の一実施例に関わる、小胞体停留型ＬＲＰ部分ペプチド発現ベクターの概略を示す図である。
【図３】この発明の一実施例に関わる、２ＮＥＥＲ発現ベクターなどを投与したＵＭＲ１０６細胞のＭＫ分泌抑制を示すウエスタンブロットの図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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