(57)【要約】　　　（修正有）【課題】新規核酸、当該核酸を有する微生物の同定又は検出方法、及び石炭系油分で、石油系油分で又は鉱油等で汚染された土壌の当該微生物による浄化又はモニタリング方法の提供。【解決手段】以下の：（ａ）ブルクホルデリア属細菌由来の特定な塩基配列；又は（ｂ）上記（ａ）の塩基配列の全体又は一部とストリンジェント条件下でハイブリダイズする塩基配列；を有し、かつ、油分除去に好適なブルクホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｒｄｅｒｉａ）属細菌又はブルクホルデリア属近縁細菌の１６Ｓ　リボソームＲＮＡ　遺伝子配列に含まれる核酸、及び上記核酸を含むブルクホルデリア属細菌又はブルクホルデリア属近縁細菌を用いて、油分に汚染された土壌から油分を【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の：
（ａ）配列番号１〜８のいずれかに示す塩基配列；又は
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列の全体又は一部とストリンジェント条件下でハイブリダイズする塩基配列；
を有し、かつ、油分除去に好適なブルクホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｒｄｅｒｉａ）属細菌又はブルクホルデリア属近縁細菌の１６Ｓ　リボソームＲＮＡ　遺伝子配列に含まれる核酸。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸の全体又は一部に基づき微生物を同定又は検出する方法。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸の存在又は不存在に基づいて、ブルクホルデリア属細菌又はブルクホルデリア属近縁細菌が土壌、土壌スラリー又は培養液中に存在するか否かを確認する方法。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸の存在又は不存在に基づいて、ブルクホルデリア属細菌又はブルクホルデリア属近縁細菌が土壌、土壌スラリー又は培養液中に存在するか否かを確認し、それにより、原位置でのバイオレメディエーションによる油分除去の適用可能性を判定する方法。
【請求項５】
請求項１に記載の核酸を含むブルクホルデリア属細菌又はブルクホルデリア属近縁細菌を用いて、油分に汚染された土壌から油分を除去する方法。
【請求項６】
請求項１に記載の核酸を含むブルクホルデリア属細菌又はブルクホルデリア属近縁細菌を含有する土壌を用いて、油分に汚染された土壌から油分を除去する方法。
【請求項７】
請求項１に記載の核酸を含むブルクホルデリア属細菌又はブルクホルデリア属近縁細菌を含有する土壌スラリーを用いて、油分に汚染された土壌から油分を除去する方法。
【請求項８】
前記土壌又は土壌スラリーが、油分汚染土壌と、海水、淡水若しくは製鉄所安水活性汚泥処理水のいずれか又はこれらの混合水とにより形成されるスラリーである、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載の核酸の塩基配列に基づいて、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法において、油分除去に関連する微生物をモニタリングする方法。
【請求項１０】
前記油分の汚染が、コールタール、コークスを含む石炭系油分の汚染である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記油分の汚染が、原油、ガソリンを含む石油系油分の汚染である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規核酸に、当該核酸を有する微生物の同定又は検出方法に、及びコールタール、アスファルト、コークスなどに起因する石炭系油分で、原油、ガソリンなどに起因する石油系油分で又は鉱油等で汚染された土壌の当該微生物による浄化又はモニタリングに関する。
【０００２】
【従来の技術】
コールタール、アスファルトやコークスなど石炭系の油分で汚染された土壌又は原油、ガソリンなど石油系の油分や鉱油で汚染された土壌には、環境上好ましくないベンゼン、トルエン、キシレンなどの単環芳香族炭化水素（Ｍｏｎｏ　Ａｒｏｍａｔｉｃ　Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ）やナフタレン、フェナンスレン、アントラセン、ピレンなどの多環芳香族系炭化水素（Ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ　Ａｒｏｍａｔｉｃ　Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ、略称ＰＡＨｓ）が含まれる。これらの油分で汚染された土壌はさらに地下水汚染の原因となることも心配される。そこで、我が国でも２００３年１月から「土壌汚染対策法」が施行されることになっている。工場の廃止や宅地転用にともない、上記石炭系又は石油系などの油分によって汚染された土壌サイト、例えば、石炭製品製造工場、ガス製造工場、石油精製工場の跡地やガソリンスタンド跡地などが、多数顕在化することが懸念される。油分汚染土壌の浄化は産業政策又は環境保全上、解決されるべき重要な課題となっている。
【０００３】
石炭系又は石油系の油分によって汚染された土壌からの油分除去には、加熱による油分の揮発・脱離や、熱分解などの熱エネルギーを加える方法の他、酸化剤などを用いて化学的に油分を分解する方法などが知られている。一方、生物作用を利用して油分を土壌から除去することも試みられている。生物作用による土壌浄化には大きく分けてバイオスティミュレーション（ｂｉｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）とバイオオーグメンテーション（ｂｉｏ−ａｕｇｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）がある。バイオスティミュレーションでは汚染土壌に自生する微生物に対して、必要とする炭素源、塩類、酸素などを与えて、微生物の生息環境を制御して、汚染現場の土壌に自生する微生物を活性化させて、土壌から有害物質を取り除く方法である。一方、バイオオーグメンテーションでは、単離されている浄化作用のある有用微生物を大量に培養して、汚染現場の土壌中に微生物を注入・添加することにより汚染の浄化が企てられる。このような生物作用を利用した土壌浄化は、微生物の機能を利用して常温、常圧で行うことが可能であり、２次汚染の可能性が小さいこと、省エネルギーであること、低コストであることなどに因り土壌浄化への応用が期待されている。バイオスティミュレーションもバイオオーグメンテーションも原位置で汚染土壌を移動させることなく浄化を行う方法であるが、一方、汚染土壌を掘り出して、浄化処理を施してから原位置に戻す方法もある。例えば洗浄処理では、土壌に含有・吸着している油分を水中に分散又は溶解させることができ、油分除去への応用も試みられている。さらに土壌をスラリーとして処理する方法では、洗浄処理と微生物処理の両者の長所を組み合わせて利用することができる。土壌スラリーは、土壌に水を添加し土壌スラリーとして、汚染物の微生物分解を図る方法であり、米国等で適用事例がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記の生物による油分汚染土壌の浄化処理には、以下のような問題点・課題がある。
【０００５】
１）バイオスティミュレーションでは汚染サイトに自生する微生物の働きを促進させる方法であるものの、油分に汚染された土壌に対してどのような微生物が浄化作用をもたらすか、微生物の正体がわからないまま実行されているのが現状である。
【０００６】
２）バイオオーグメンテーションでは外部から汚染土壌に投入した外来微生物による浄化作用を期待するが、効率が必ずしも高くない。これは大量培養した微生物を土壌中に注入・添加しても、土壌中に微生物が効果的に拡散・浸透できないことや、土壌中の環境条件を制御できないことから、添加した微生物を土壌環境中安定に棲息させて定着させることが容易でないことに起因する。また、培養が困難なＶＮＣ（Ｖｉｓｉｂｌｅ　ｂｕｔ　Ｎｏｎ　Ｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ）である微生物が数多く存在するため、土壌から浄化作用のある微生物を単離して大量培養すること自体が容易なことではない。したがって、一般的に培養される大腸菌、シュードモナス、枯草菌など培養が容易な外来微生物を油分汚染土壌中に常在させることは極めて難しい。したがって、油分に汚染された土壌にバイオオーグメンテーションのために外来微生物を用いることは容易でない。また十分量の外来微生物を培養により準備して、土壌修復処理のために用いることはコスト的にも不利である。
【０００７】
３）特に、コールタールやコークスなどの石炭系の油分で汚染された土壌の生物作用による浄化処理は一般に難しいとされている。石炭系の油分は石油系の油分と比較して微生物による分解を受け易い鎖状の分子構造をもつ炭化水素の割合が非常に少なく、微生物による分解を受けにくい多環系芳香族の割合が高いため、石炭系の油分に汚染された土壌の微生物作用による修復は難しいと考えられている。このような油分に汚染された土壌であっても、浄化作用を発揮できる微生物を用いることが望まれるが、そのような微生物がどのようなものであるのか、その正体も定かではない。
【０００８】
そこで、本発明は、これらの問題点・課題を解決して、上記石炭系あるいは石油系油分に汚染された土壌に対して油分を効率的に除去することができる生物を利用した新規土壌浄化方法を提供するものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、今般、上記の課題を解決すべく検討を重ねた結果、以下の方法により、汚染土壌、特に石炭系又は石油系油分に汚染された土壌から油分を効率的に除去する生物を利用した新規土壌浄化方法を確立することに成功した。本発明は、以下の（１）〜（１１）の態様をもつ：
（１）以下の：
（ａ）配列番号１〜８のいずれかに示す塩基配列；又は
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列の全体又は一部とストリンジェント条件下でハイブリダイズする塩基配列；
を有し、かつ、油分除去に好適なブルクホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｒｄｅｒｉａ）属細菌又はブルクホルデリア属近縁細菌の１６Ｓ　リボソームＲＮＡ　遺伝子配列に含まれる核酸。
【００１０】
（２）上記（１）に記載の核酸の全体又は一部に基づき微生物を同定又は検出する方法。
【００１１】
（３）上記（１）に記載の核酸の存在又は不存在に基づいて、ブルクホルデリア属細菌又はブルクホルデリア属近縁細菌が土壌、土壌スラリー又は培養液中に存在するか否かを確認する方法。
【００１２】
（４）上記（１）に記載の核酸の存在又は不存在に基づいて、ブルクホルデリア属細菌又はブルクホルデリア属近縁細菌が土壌、土壌スラリー又は培養液中に存在するか否かを確認し、それにより、原位置でのバイオレメディエーションによる油分除去の適用可能性を判定する方法。
【００１３】
（５）上記（１）に記載の核酸を含むブルクホルデリア属細菌又はブルクホルデリア属近縁細菌を用いて、油分に汚染された土壌から油分を除去する方法。
【００１４】
（６）上記（１）に記載の核酸を含むブルクホルデリア属細菌又はブルクホルデリア属近縁細菌を含有する土壌を用いて、油分に汚染された土壌から油分を除去する方法。
【００１５】
（７）上記（１）に記載の核酸を含むブルクホルデリア属細菌又はブルクホルデリア属近縁細菌を含有する土壌スラリーを用いて、油分に汚染された土壌から油分を除去する方法。
【００１６】
（８）前記土壌スラリーが、油分汚染土壌と、海水、淡水若しくは製鉄所安水活性汚泥処理水のいずれか又はこれらの混合水とにより形成されるスラリーである、上記（７）に記載の方法。
【００１７】
（９）上記（１）に記載の核酸の塩基配列に基づいて、上記（５）〜（８）のいずれかに記載の方法において、油分除去に関連する微生物をモニタリングする方法。
【００１８】
（１０）前記油分の汚染が、コールタール、コークスを含む石炭系油分の汚染である、上記（５）〜（８）のいずれかに記載の方法。
【００１９】
（１１）前記油分の汚染が、原油、ガソリンを含む石油系油分の汚染である、上記（５）〜（８）のいずれかに記載の方法。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、油分に汚染された土壌を生物学的に浄化するため、以下の方法を発明した。
【００２１】
まず、油分に汚染された土壌中に自生する一連の微生物群が存在することをつきとめた。油分に汚染された土壌に馴化した微生物群は、一般的な土壌から検出される微生物群とは明らかに異なる菌相を構成していた。そこでこれら油分汚染土壌に自生している、言い換えれば、既に油分汚染環境に馴化している微生物群を積極的に利用することによって、油分に汚染された土壌の微生物作用による修復が可能であると考えた。そこで、土壌からの油分除去に関連する、油分に汚染された土壌に馴化した微生物群を鋭意解析した。その結果、これら微生物の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の一部が、配列番号１〜８に示す新規な塩基配列をもつことを発見した。ＤＮＡは二重らせん構造であるため、配列番号１〜８の新規な塩基配列をもつ核酸と、これら核酸の全体又は一部とストリンジェントな条件下で、相補的にハイブリダイズする塩基配列をもつ核酸がまた、定まる。したがって、配列番号１〜８の塩基配列をもつ核酸と共に、この核酸の全体又は一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列をもつ核酸が、本発明の１の態様となる。
【００２２】
配列番号１〜８に示す新規な塩基配列を用いることにより当該塩基配列を同定又は検出することができる。ある微生物が特異的に有するゲノムＤＮＡの塩基配列に基づいてその微生物を同定又は検出することは最も確実な同定又は検出方法である。
【００２３】
以下の表１に示すように、配列番号１〜８に示す塩基配列についてＤＮＡ塩基配列のデータベースを検索したところ、全てグラム陰性桿菌であるブルクホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｒｄｅｒｉａ）属の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列とホモロジーが高いことから、ブルクホルデリア属又はその近縁細菌であることが判明した。
【００２４】
【表１】
2004089024.tif 000002
【００２５】
ブルクホルデリア属については、汚染土壌との関連を示す報告がある。例えば、ブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｒｄｅｒｉａ　ｃｅｐａｃｉａ）は、アミノ安息香酸で汚染された土壌（Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１７６：　４０３４−４０４２，　１９９４）やポリ塩化ビフェニルに汚染された土壌から見つかっているほか、ｐ−ニトロフェノールの分解菌として（Ａｎｔｏｎｉｅ　Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ　４４：　１７１−１７４，　１９７８）、さらにフタル酸分解菌や有機塩素化合物の分解菌として報告されている。しかしながら、本発明に係る配列番号１〜８に示す新規塩基配列を有するブルクホルデリア属又はその近縁細菌についてはこれまで全く報告されていない。
【００２６】
上記石炭系又は石油系油分に汚染された土壌を浄化しようとする場合、油分汚染土壌に馴化しており、かつ、油分除去作用を有する配列番号１〜８に示す塩基配列を有するブルクホルデリア属又はその近縁細菌のいずれかが、油分汚染された土壌中に存在するか否かを、本発明に係る配列番号１〜８に示す塩基配列の情報を用いてＦＩＳＨ用ＤＮＡプローブやＰＣＲプライマーを作製して、ＦＩＳＨ、ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ、ＤＮＡマイクロアレイなどにより確認することができる。
【００２７】
バイオレメディエーション（ｂｉｏ−ｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ）の実施に際しては、油分除去のバイオレメディエーションが実施可能か否かを判定できることが望ましい。例えば、汚染土壌に自生する微生物の機能を促進して浄化を行おうとする場合、汚染浄化に関わる微生物が存在しない状態でバイオスティミュレーションを行っても効果が期待できない。本願発明によれば、配列番号１〜８の新規塩基配列を用いて油分除去に関わる微生物の存在又は不存在を確認して、バイオレメディエーションが可能であるか否かを予め判定することが可能である。すなわち、油分に汚染された土壌中に自生する配列番号１〜８に示す新規塩基配列を有するブルクホルデリア属又はその近縁細菌のいずれかが存在する場合、当該細菌を用いて油分除去を行うことが可能と判定できる。しかしながら、汚染サイトの土壌に配列番号１〜８に示す新規塩基配列を有するブルクホルデリア属又はその近縁細菌の存在が認められない場合であっても、当該細菌を含む土壌、土壌スラリー、培養液等をそのような汚染土壌に添加して混合することにより、油分汚染土壌からの油分除去効果を高めることができる。
【００２８】
次に、本願発明に係る配列番号１〜８に示す新規塩基配列を有するブルクホルデリア属又はその近縁細菌による油分に汚染された土壌からの油分除去について説明する。本発明に係る油分除去方法は、コールタール、アスファルトやコークスなど石炭系の油分で汚染された土壌又は原油、ガソリンなど石油系の油分、鉱油等で汚染された土壌のいずれにも適用可能である。一般的に石炭系の油分に汚染された土壌の微生物による浄化処理は石油系油分に汚染された土壌に比較して、難しいと考えられている。しかしながら、本発明に係る新規塩基配列を有する微生物は、もともと石炭系の油分に汚染された土壌に馴化したものであることから、特に一般的には困難とされる石炭系の油分に対しても油分汚染土壌からの高い油分除去効果を発揮することができる。
【００２９】
汚染サイトで原位置において油分除去を行う場合、配列番号１〜８に示す新規な塩基配列を有するブルクホルデリア属又はその近縁細菌のいずれかが油分汚染土壌に自生するときは、通常、栄養塩添加、通気等によって微生物の浄化作用を高めるランドファーミング法（ｌａｎｄ　ｆａｒｍｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ）を適用できる。この場合、土壌の撹拌を随時実施して微生物への栄養塩補給と通気を強制的に行うことが望ましい。当該細菌が自生していない場合には、培養した配列番号１〜８に示す新規な塩基配列を有するブルクホルデリア属又はその近縁細菌の培養液を、油分で汚染された土壌中に注入・添加することによって、当該細菌を、油分で汚染された土壌からの油分除去に用いることができる。培養液の土壌への添加方法としては、専用孔により一定位置の土中へ注入しても構わないが、微生物が拡散できにくい問題がある。酸素を供給するために、土壌撹拌と組み合わせて、培養液を添加することで、当該細菌を汚染土壌中にまんべんなく分布させることがより、好ましい。さらに、配列番号１〜８に示す新規塩基配列を有するブルクホルデリア属又はその近縁細菌の培養液に替えて、当該細菌を含む土壌又は土壌スラリーを汚染土壌に添加して、油分除去効果を発揮させることもできる。また、温度としては１５℃以上４０℃以下が好ましいが、効率を高めるために。２０℃以上３７℃以下がより好ましい。しかしながら、この場合、浄化作用の微生物を十分に増殖させて油分除去を行うにはコスト的にもエネルギー効率的に問題がある。ランドファーミング法を適用する際、汚染土壌に海水又は人工海水を用いることにより、本発明に係るブルクホルデリア属細菌又はブルクホルデリア属近縁細菌の増殖を促進できた。
【００３０】
本発明者らは、土壌中の微生物が空間的に不均一に分布するため浄化作用が非効率であるものと考えた。微生物による浄化作用を土壌全体に均一に行き届けさせる必要性を考慮した。そこで、土壌の洗浄処理と生物処理を組み合わせた土壌スラリーを形成させることによって空間的に微生物を均一に分布させることにより、土壌スラリー中に棲息する微生物の制御も容易にするとともに、土壌粒子同士の接触による油分除去効果をも期待できるのではないかと考えた。
【００３１】
本発明において土壌スラリーの調製のために用いる土壌は、上記油分等に汚染された土壌である。配列番号１〜８に示す塩基配列を有する核酸及びそれに等価な核酸をもつ微生物のいずれかが土壌中に存在しない場合、これら微生物の少なくとも１種類を含む土壌、土壌スラリー又は培養液をさらに加えることで油分除去効果が期待できる。汚染土壌を、海水、淡水又は製鉄所安水の活性汚泥処理水のいずれかあるいはこれらの混合水を汚染土壌と混合することにより、土壌スラリーを調製する。調製したスラリーの含水率は１０質量％以上５０質量％未満の範囲が望ましい。５０質量％以上の場合は、攪拌動力が過大となり攪拌を維持することが難しく、一方、１０質量％未満では水使用量が増大してしまい経済的でないからである。
【００３２】
本発明において、スラリーを調製する際に使用する水は海水、淡水又は製鉄所安水の活性汚泥処理水のいずれかあるいはこれらを混合したものが好ましい。これは本発明では汚染土壌に自生する微生物を賦活化して油分除去などの浄化を行うものであるが、土壌には臨海埋立地のように海水由来の塩分を多く含む土壌や内陸の塩分を殆ど含まない土壌が存在するからである。汚染土壌中に自生する微生物はそれぞれ汚染土壌のおかれた環境によって、塩分濃度に対しても海水のように高い塩濃度に適応しているものやしていないものが存在するものと考えられる。したがって、臨海埋立地などの汚染土壌では、海水のような塩分濃度の高い水を用いて土壌スラリーを調製することが好ましく、一方、内陸地の汚染土壌では淡水を用いて土壌スラリーを調製することが好ましいが、勿論、これに制限されるものではない。
【００３３】
尚、土壌スラリー調製のため、汚染土壌に添加する水としては、海水が容易に得られる場合は海水を用いることが望ましい。人工海水を用いてもかまわない。また、海水に淡水を混合して用いてもかまわない。海水が流入している汽水域の河川水を用いてもかまわない。海水は、微生物処理に必要な微量栄養源を含有しており、沿岸域、汽水域であれば窒素やリンの濃度も高い場合がある。海水を用いることにより、本発明に係るブルクホルデリア属細菌又はブルクホルデリア属近縁細菌の増殖を促進できる。また、ｐＨが８．１程度であってｐＨ緩衝能があり、安価で大量入手可能であり、水温がほぼ一定であるとういう特長がある。また、汚染土壌中の間隙水は河川等の淡水に比べ、イオン濃度、言い換えれば電気伝導度が高い場合が多く、この状況に応じた微生物が生息しており、海水と河川水、工業用水などの淡水の混合によってこの状況を作り出せる。また、製鉄所のコークス工場から発生する安水の活性汚泥処理水を汚染土壌に添加する水として用いてもかまわない。これは、製鉄所のコークス工場から発生する安水の活性汚泥処理水は、廃水と海水を混合させて活性汚泥処理しており、海水を廃水に対して１５０容積％から３００容積％添加しているためである。安水の活性汚泥処理水もｐＨ緩衝能があり、通常海水希釈した安水の活性汚泥処理水はｐＨ６以上９未満で安定している。また、安水の活性汚泥処理水は水温も約３０℃から３８℃で一定しているため、冬場の微生物活性の低下する時期には最適である。さらに、微生物の栄養源である窒素やリンなども大量に含有しているため、汚染土壌をスラリー化して用いる水として望ましい。
【００３４】
土壌スラリーによる汚染物質の分解を促進するためには、スラリーの酸化還元電位（ＯＲＰ）が０ｍＶ（銀／塩化銀複合電極基準、以下同じ）以上に維持されるように、ブロアー及び／又は攪拌機の回転数を制御し、空気を供給することが望ましい。汚染物質の分解反応は、好気的雰囲気で促進されるため、溶存酸素の維持は反応促進に必要である。ＯＲＰ値としては、０ｍＶ以上が好ましい。ＯＲＰ値の上限値は特に限定はないが、４００ｍＶ未満が好ましい。
【００３５】
土壌スラリーのｐＨは、微生物の生育に適した６以上９未満に維持されることが望ましい。油分の土壌粒子からの洗浄効果のみを考えると、ｐＨは高い方が望ましいことは知られているが、ｐＨが９以上では油分の洗浄効果は増大しても、微生物の活性が急激に低下するので、ｐＨは９未満であることが必要である。また、ｐＨが６未満では洗浄効果が小さく、また微生物の活性も衰えるため、ｐＨは６以上であることが望ましい。このように、スラリー反応槽又はスラリーラグーンのｐＨは、洗浄促進効果と微生物による分解促進効果の両面から決定すべきであり、より好ましくは、ｐＨは７以上９未満である。ｐＨ調整剤としては、希硫酸や水酸化ナトリウムの水溶液を用いればよい。海水を用いたスラリーであれば、ｐＨ緩衝作用があるため、薬品費も削減できるという利点がある。
【００３６】
土壌スラリーの土壌と上澄み液は沈降分離、遠心分離、フィルタ分離、脱水機などにより分離することができる。処理された土壌は、通常、油分が除去されたことを確認した上で、元の位置に埋め戻して再利用することができる。
【００３７】
また、発生した廃水については、未分解の油分や細かく砕かれた土壌粒子が含まれ、ＣＯＤ（化学的酸素要求量）も高いため、水処理操作によって廃水基準を満たすまで処理する必要がある。このような水処理操作として、活性汚泥のような微生物処理が適用できる。汚染土壌中に存在する微生物は、汚染物質、例えば、油分や芳香族系炭化水素で既に馴養されており、固液分離した廃水にも馴養された微生物が含まれていることから、汚染物質である油分や芳香族系炭化水素で馴養された微生物を有する活性汚泥で処理することが好ましい。油分や芳香族系炭化水素で馴養された微生物であれば特に種類は問わないが、製鉄所のコークス工場から発生する安水を処理している活性汚泥が望ましい。安水の活性汚泥は、安水に含まれる油分や多種類の芳香族系炭化水素で十分に馴養されており、また、海水でも馴養されているため、油分や芳香族系炭化水素の分解を加速することができるからである。
【００３８】
【実施例】
実施例１：配列番号１に示す塩基配列を有するブルクホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｒｄｅｒｉａ）属細菌、ブルクホルデリア・クルリエンシス（Ｂｕｒｋｈｏｒｄｅｒｉａ　ｋｕｒｕｒｉｅｎｓｉｓ）又はブルクホルデリア・ブラシレンシス（Ｂｕｒｋｈｏｒｄｅｒｉａ　ｂｒａｓｉｌｅｎｓｉｓ）の存在確認
土壌スラリーを採取して、８０００ｒｐｍで３０分間遠心後、沈殿物を回収した。この沈殿物３ｇを緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、４０ｍＭ　ＥＤＴＡ）に懸濁してホモジナイザーにより分散した。次いで、塩化ベンジル法によりＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡはエタノール沈澱で濃縮回収した。回収したＤＮＡについて　ＧＦＸＴＭ　ＰＣＲ　ＤＮＡ及びＧｅｌ　Ｂａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてＤＮＡを精製して土壌からの夾雑物を除いた。
【００３９】
精製したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により配列番号１に示す塩基配列を有するブルクホルデリア属細菌ブルクホルデリア・クルリエンシス（Ｂｕｒｋｈｏｒｄｅｒｉａ　ｋｕｒｕｒｉｅｎｓｉｓ）又はブルクホルデリア・ブラシレンシス（Ｂｕｒｋｈｏｒｄｅｒｉａ　ｂｒａｓｉｌｅｎｓｉｓ）の検出を行った。使用したプライマーを以下の表２：
【００４０】
【表２】
2004089024.tif 000003
【００４１】
に示す。ＤＮＡポリメラーゼはＡｍｐｌｉＴａｑ　ＧｏｌｄＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、サーマルサイクラーにはＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲＳｙｓｔｅｍｓ　９６００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。ＰＣＲの条件は、９４℃、７分＋（９４℃、３０秒、６５〜５５℃、６０秒、７２℃、９０秒）×２０サイクル（ここで２サイクル毎にアニーリング温度を１℃下げた（６５〜５５℃）＋（９４℃、３０秒、５５℃、６０秒、７２℃、９０秒）×１５サイクル＋７２℃、１０分として実施した。ＰＣＲ産物はＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。このＰＣＲ産物の確認には２質量％アガロースゲルを用いて電気泳動した。泳動後、ゲルをエチジウムブロマイド染色して紫外線照射下で、マーカーＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ（ＴＡＫＡＲＡ）と比較して、目的の長さのＤＮＡ断片が増幅されていることを確認した。単一のＤＮＡバンドが検出され、配列番号１に示す塩基配列を有するホルデリア属細菌ブルクホルデリア・クルリエンシス（Ｂｕｒｋｈｏｒｄｅｒｉａ　ｋｕｒｕｒｉｅｎｓｉｓ）又はブルクホルデリア・ブラシレンシス（Ｂｕｒｋｈｏｒｄｅｒｉａ　ｂｒａｓｉｌｅｎｓｉｓ）の存在が確認できた（図１参照）。
【００４２】
実施例２：油分汚染土壌に自生する微生物による油分汚染除去の可能性を判定する方法
配列番号１〜８に示す塩基配列に基づいて、５つの異なる油分汚染サイトＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅにおいて、汚染土壌中に配列番号１〜８に示す塩基配列を有するブルクホルデリア属細菌又はブルクホルデリア属近縁細菌が自生しているか否かを、調査して、油分汚染土壌に自生する微生物による油分汚染除去の可能性を判定した。上記５つの異なる油分汚染サイトから、それぞれ、土壌を採取して、土壌１０ｇを緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、４０ｍＭ　ＥＤＴＡ）に懸濁してホモジナイザーにより分散させた。次いで、塩化ベンジル法によりＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡをエタノール沈澱で濃縮回収した。回収したＤＮＡについて、ＧＦＸＴＭ　ＰＣＲ　ＤＮＡ及びＧｅｌ　Ｂａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてＤＮＡを精製して土壌からの夾雑物を除いた。
【００４３】
精製したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により配列番号１〜８に示す塩基配列を有するブルクホルデリア属細菌又はブルクホルデリア属近縁細菌の検出を行った。使用したプライマーは実施例１で使用したものと同一であった。ＤＮＡポリメラーゼはＡｍｐｌｉＴａｑ　ＧｏｌｄＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、サーマルサイクラーにはＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　９６００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。ＰＣＲの条件は、９４℃、７分＋（９４℃、３０秒、６５〜５５℃、６０秒、７２℃、９０秒）×２０サイクル（ここで２サイクル毎にアニーリング温度を１℃下げた（６５〜５５℃）＋（９４℃、３０秒、５５℃、６０秒、７２℃、９０秒）×１５サイクル＋７２℃、１０分として実施した。ＰＣＲ産物はＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。このＰＣＲ産物の確認には２質量％アガロースゲルを用いて電気泳動した。泳動後、ゲルを塩化エチジウム染色して紫外線照射下で、マーカーＤＮＡ（ＴＡＫＡＲＡ）と比較して、目的の長さのＤＮＡ断片が増幅されていることを確認した。精製されたＤＮＡはＤｃｏｄｅ　ＤＧＧＥ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）を用いてＤＧＧＥ解析した。変性剤として尿素を使用した。変性剤濃度勾配は電気泳動方向に３０質量％から６０質量％までとし、ポリアクリルアミドゲル濃度は５質量％から１０質量％までとした。泳動条件は電圧１３０Ｖで７時間とした。泳動後、ゲルをＣｙｂｅｒ　Ｇｒｅｅｎ（ＴＡＫＡＲＡ）で染色して、ＵＶ３１０ｎｍ照射下でＤＧＧＥ後のＤＮＡバンド像をＣＣＤカメラで撮影した。Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ各汚染サイトの油分汚染土壌についてＰＣＲ−ＤＧＧＥにより、配列番号１〜８に示す塩基配列を有するブルクホルデリ属細菌又はブルクホルデリ属近縁細菌のいずれかが自生しているか否かが判り、油分汚染土壌に自生する微生物による油分汚染除去の可能性を判定することができた。結果を以下の表３：
【００４４】
【表３】
2004089024.tif 000004
【００４５】
に示す。
【００４６】
表中、○は、配列番号１〜８に示す塩基配列を有するブルクホルデリ属細菌又はブルクホルデリ属近縁細菌のいずれかが自生しており、油分汚染土壌に自生する微生物による油分汚染除去が可能と判定されたことを意味する。一方、×は、配列番号１〜８に示す塩基配列を有するブルクホルデリ属細菌又はブルクホルデリ属近縁細菌のいずれも存在しておらず、油分汚染土壌に自生する微生物による油分汚染除去は困難と判定されたことを意味する。
【００４７】
実施例３：土壌スラリー状態における微生物作用による油分汚染された土壌からの油分除去
配列番号１〜８に示す塩基配列を有するブルクホルデリ属細菌又はブルクホルデリ属近縁細菌の一連の微生物群が存在することを確認した油分汚染土壌に対して、等体積の人工海水（アクアマリン）を加えた。ステンレス製羽根を有する撹拌機によって強化ガラス容器中で土壌と海水を混合することにより、土壌スラリーを形成させた。強制的に空気を通気することで、土壌スラリーのＯＲＰを５０ｍＶ以上に制御した。また、酸性化するため、ｐＨを７に保つようにアルカリを加えて維持した。温度は２０℃で一定に保った。経時的に土壌スラリーを採取して、ＧＦＢろ紙にて吸引ろ過して残留土壌とろ液に分けた。この土壌中の油分をノルマルヘキサン抽出物質として、ＪＩＳ　Ｋ０１０２　２４に基づいて定量した。
【００４８】
図２に土壌スラリーにおける微生物処理による油分除去の結果を示す。４０日間にわたる土壌スラリー処理により、汚染土壌の９０％以上の油分除去を達成できた。
【００４９】
実施例４：土壌スラリーにおける微生物作用による油分汚染された土壌からの油分除去を行う際の、微生物モニタリング
土壌スラリーにおける微生物作用で汚染土壌からの油分を除去している処理工程において、土壌スラリーを経時的に採取した。採取した土壌スラリーは、８０００ｒｐｍで３０分間遠心後、沈殿物を回収した。この沈殿物３ｇを緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、４０ｍＭ　ＥＤＴＡ）に懸濁してホモジナイザーにより分散した。次いで、塩化ベンジル法によりＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡはエタノール沈澱で濃縮回収した。回収したＤＮＡについてＧＦＸＴＭ　ＰＣＲ及びＤＮＡ　ａｎｄ　Ｇｅｌ　Ｂａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてＤＮＡを精製して土壌からの夾雑物を除いた。精製したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によりＤＮＡの検出感度を上げるとともに、ＤＧＧＥ法により僅かな塩基配列の違いでも検出できるようにした。使用したプライマーを以下の表４：
【００５０】
【表４】
2004089024.tif 000005
【００５１】
に示す。ＤＮＡポリメラーゼはＡｍｐｌｉＴａｑ　ＧｏｌｄＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、サーマルサイクラーにはＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲＳｙｓｔｅｍｓ　９６００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。ＰＣＲの条件は、９４℃、７分＋（９４℃、３０秒、６５〜５５℃、６０秒、７２℃、９０秒）×２０サイクル（ここで２サイクル毎にアニーリング温度を１℃下げた（６５〜５５℃）＋（９４℃、３０秒、５５℃、６０秒、７２℃、９０秒）×１５サイクル＋７２℃、１０分として実施した。ＰＣＲ産物はＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。このＰＣＲ産物の確認には２質量％アガロースゲルを用いて電気泳動した。泳動後、ゲルを臭化エチジウム染色して紫外線照射下で、マーカーＤＮＡ（ＴＡＫＡＲＡ）と比較して、目的の長さのＤＮＡ断片が増幅されていることを確認した。精製されたＤＮＡはＤｃｏｄｅ　ＤＧＧＥ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）を用いてＤＧＧＥ解析した。変性剤として尿素を使用した。変性剤濃度勾配は電気泳動方向に３０質量％から６０質量％までとし、ポリアクリルアミドゲル濃度は５質量％から１０質量％までとした。泳動条件は電圧１３０Ｖで７時間とした。泳動後、ゲルをＣｙｂｅｒ　Ｇｒｅｅｎ（ＴＡＫＡＲＡ）で染色して、ＵＶ１３０ｎｍ照射下でＤＧＧＥ後のＤＮＡバンド像をＣＣＤカメラで撮影した。結果を図３に示す。スラリー処理開始時と比較して、７日目から２１日目にかけて多種類の微生物が検出され、スラリー処理の進行にともない、微生物群集構造が大きく変化していることが明らかになった。４０日間の土壌スラリーでの微生物作用による処理で、経時的に微生物の菌相が変化する様子をモニタリングできた。
【００５２】
【発明の効果】
本発明により、新規塩基配列と、当該塩基配列を有する微生物の同定、検出方法、及びコールタール、アスファルトやコークスなどに起因する石炭系油分で汚染された土壌、あるいは原油、ガソリンなどに起因する石油系油分、鉱油等で汚染された土壌の微生物による浄化、およびモニタリングする技術を提供する。
【００５３】
本発明により、新規核酸を、当該核酸を有する微生物の同定又は検出方法を、そしてコールタール、アスファルト、コークスなどに起因する石炭系油分で、原油、ガソリンなどに起因する石油系油分で又は鉱油等で汚染された土壌の当該微生物による浄化又はモニタリングを、提供することができる。
【００５４】
【配列表】
2004089024.tif 000006
2004089024.tif 000007
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＣＲによる微生物の存在確認結果を示す図面に代わるゲル電気泳動写真である。
【図２】土壌スラリーにおける微生物作用による油分除去を示すグラフである。
【図３】汚染土壌処理中の微生物群衆構造の変化を示す図面に代わるゲル電気泳動写真である。
【図４】配列番号１及び配列番号２。配列番号１〜８中、ｒはａ又はｇ、ｓはｃ又はｇ、ｙはｃ又はｔ、ｋはｇ又はｔ、ｗはａ又はｔ、ｍはａ又はｃ、そしてｎはａ、ｃ、ｇ、ｔのいずれかを表す。
【図５】配列番号３及び配列番号４。
【図６】配列番号５及び配列番号６。
【図７】配列番号７及び配列番号８。
【図１】
2004089024.tif 000011
【図２】
2004089024.tif 000012
【図３】
2004089024.tif 000013
【図４】
2004089024.tif 000014
【図５】
2004089024.tif 000015
【図６】
2004089024.tif 000016
【図７】
2004089024.tif 000017