(57)【要約】【課題】　アルツハイマー病、アルツハイマー型老人性痴呆症又は脳血管性痴呆症を始とする細胞生存延長作用及び／又はアセチルコリントランスフェラーゼ賦活作用が有効な各種の脳機能障害による疾患の予防と治療に有用な予防・治療薬を提供する。【解決手段】　顆粒球コロニー刺激因子を有効成分として含有する脳機能障害による疾患の予防・治療薬である。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　顆粒球コロニー刺激因子を有効成分として含有する脳機能障害による疾患の予防・治療薬。
【請求項２】
　脳機能障害による疾患が、細胞生存延長作用及び／又はアセチルコリントランスフェラーゼ賦活作用が有効な疾患である請求項１記載の脳機能障害による痴呆症の予防・治療薬。
【請求項３】
　脳機能障害による疾患が、アルツハイマー病、アルツハイマー型老人性痴呆症又は脳血管性痴呆症である請求項１記載の脳機能障害による疾患の予防・治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　この発明は、脳機能障害による疾患を予防し、また、治療するために使用される治療薬に係り、更に詳しくは、エリスロポイエチン、顆粒球コロニー刺激因子又はマクロファージコロニー刺激因子を有効成分とする脳機能障害による疾患の予防・治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
　脳機能障害による疾患には、遺伝性で進行が早いアルツハイマー病や、老人になって発病し、非遺伝性で進行が遅いアルツハイマー型老人性痴呆症や、脳梗塞、脳出血等の脳虚血障害、脳循環障害に伴うと考えられている記憶障害、知能障害、意欲低下、注意力低下等の脳血管性痴呆症が知られている。そして、これらの疾患では、その大きな特徴として発病初期に記憶障害という症状が顕著に現れるが、これは、疾患の進行の初期に大脳基底核のコリン作動性の神経細胞が比較的選択的に変性脱落することに起因するものと考えられている。
【０００３】
　この様な脳機能障害による疾患は、特に近年における老年人口が急増する中で社会問題化しつつあり、医薬業界においてもこれらの疾患を根本的に予防し、治療するための治療薬の開発が急務とされている。
【０００４】
　そこで、従来においても、この様な疾患の発病のメカニズムと共にその治療薬の開発も種々の方面から検討され、幾つかの治療薬の開発の試みがされている。例えば、アルツハイマー型老人性痴呆症が脳内のコリン作動性神経系の機能低下、すなわち脳内のアセチルコリン量の低下を伴うことから、この脳内のアセチルコリン量を増加させる目的で、アセチルコリン前駆体物質やアセチルコリン分解酵素であるアセチルコリンエステラーゼの活性を阻害するアセチルコリンエステラーゼ阻害剤の使用が提案され、実際にもアセチルコリンエステラーゼ阻害剤としてフィゾスチグミン、テトラヒドロアミノアクリジン等の使用が提案されている。しかしながら、これらの薬剤は、アルツハイマー型老人性痴呆症を始めとする脳機能障害による疾患に対する治療効果が十分でなく、しかも、好ましくない副作用がある等の問題がある。
【０００５】
　また、最近では、上記と同様に脳内のアセチルコリン量を増加させる目的ではあるが、上記のアセチルコリンエステラーゼ阻害作用を利用するものではなく、アセチルコリン合成酵素であるアセチルコリントランスフェラーゼ（ChAT）の活性を賦活するアセチルコリントランスフェラーゼ賦活作用（ChAT賦活作用）を有する物質の使用が提案され、実際に、インターロイキン３（IL-3）を有効成分とする老人性痴呆症の治療・予防薬〔特開平3-93,728号公報、Kamegai et al., Neuron, 4, 429〜436 (March 1990)、Kamegai et al., Brain Research, 532, 323〜325 (1990)〕や、神経成長因子（nerve growth factor: NGF）が交感神経、感覚神経、前脳コリン作動性神経細胞等に作用してその分化や成熟を促進し、生存、機能維持に有効であること〔Dev. Brain Res. 9, 45〜52 (1983)〕、Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor（GM-CSF）がin vitroで神経の栄養因子としての作用を有すること〔Kamegai et al., Brain Research，532, 323〜325 (1990)〕等が報告されている。
【特許文献１】特開平3-93,728号公報
【非特許文献１】Kamegai et al., Neuron, 4, 429〜436 (March 1990)
【非特許文献２】Kamegai et al., Brain Research, 532, 323〜325 (1990)
【非特許文献３】Dev. Brain Res. 9, 45〜52 (1983)
【非特許文献４】Kamegai et al., Brain Research，532, 323〜325 (1990)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
　そこで、本発明者らは、脳機能障害による疾患がその特徴として発病初期に記憶障害という症状を伴い、大脳基底核のコリン作動性の神経細胞が比較的選択的に変性脱落することに着目し、このコリン作動性の神経細胞の変性脱落を予防し、また、治療できる治療薬の開発について鋭意研究を重ねた結果、造血因子であるエリスロポイエチン（EPO）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）及びマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）が優れた細胞生存延長作用とアセチルコリントランスフェラーゼ賦活作用とを有し、脳機能障害による疾患の予防と治療に有効であることを見出し、本発明に到達した。
【０００７】
　従って、本発明の目的は、脳機能障害による各種の疾患の予防と治療に有効である予防・治療薬を提供することにある。
　また、本発明の目的は、細胞生存延長作用及び／又はアセチルコリントランスフェラーゼ賦活作用が有効な疾患の予防と治療に有効である予防・治療薬を提供することにある。更に、本発明の目的は、アルツハイマー病、アルツハイマー型老人性痴呆症又は脳血管性痴呆症の予防と治療に有効である予防・治療薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
　本発明は、エリスロポイエチン、顆粒球コロニー刺激因子及びマクロファージコロニー刺激因子から選ばれた１種又は２種以上の造血因子を有効成分として含有する脳機能障害による疾患の予防・治療薬である。
【０００９】
　本発明で有効成分として使用する造血因子のエリスロポイエチン、顆粒球コロニー刺激因子及びマクロファージコロニー刺激因子については、造血因子としての本質的作用を奏する限り、それが如何なる方法で製造されたものでもよいと考えられる。すなわち、天然から抽出したものでもよいし、遺伝子組換技術により製造したものでもよい。また、この際、その形質転換細胞は原核細胞又は真核細胞の何れであってもよい。
【００１０】
　すなわち、エリスロポイエチン（EPO）については、例えば、ヒト再生不良性貧血患者の尿から抽出して得られた天然のヒトＥＰＯ（特公平1-38,800号公報）や、ヒトＥＰＯのアミノ酸配列に対応するメッセンジャーＲＮＡ（mRNA）を採取し、そのｍＲＮＡを利用して組換ＤＮＡ体を作成し、次いで適当な宿主（例えば、大腸菌の如き菌類や、酵母類や、植物の細胞株や、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）、マウスＣ-１２７細胞等の動物の細胞株等）で生産させる遺伝子組換技術により製造されたもの〔例えば、特公平1-44,317号公報、Kenneth Jacobs等，Nature, 313, 806〜810 (1985)〕等を挙げることができる。そして、具体的には、例えば、天然ヒト尿ＥＰＯ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）を宿主として産生させた遺伝子組換ヒトＥＰＯであるrhＥＰＯ／ＣＨＯ等のＥＰＯが挙げられる。
【００１１】
　また、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）については、例えば、ヒトＧ-ＣＳＦ産生細胞を培養し、その培養上澄から抽出、分離、精製して得られた天然のヒトＧ-ＣＳＦ（特公平1-44,200号公報）や、遺伝子組換によって大腸菌や動物細胞等の宿主を形質転換して得た形質転換体から産生せしめこれを単離精製したもの又はそれを化学修飾したもの等を挙げることができる（例えば、特公平2-5,395号、特開昭62-129,298号、特開昭62-132,899号、特開昭62-236,488号、特開昭64-85,098号の各公報）。そして、具体的には、例えば、天然ヒトＧ-ＣＳＦ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）を宿主として産生させた遺伝子組換ヒトＧ-ＣＳＦであるrhＧ-ＣＳＦ／ＣＨＯ、大腸菌（E.coli.）を宿主として産生させた遺伝子組換ヒトＧ-ＣＳＦであるrhＧ-ＣＳＦ／E.coli.等のＧ-ＣＳＦが挙げられる。
【００１２】
　更に、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）についても、例えば、人の尿等の生体試料から抽出、分離、精製して得られた天然のヒトＭ-ＣＳＦ（例えば、特開昭64-22,899号、特開平3-17,021号の各公報）や、遺伝子組換技術により製造されたもの（例えば、特表昭62-501,607号、特表平1-502,397号の各公報）等を挙げることができる。そして、具体的には、例えば、天然ヒトＭ-ＣＳＦ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）を宿主として産生させた遺伝子組換ヒトＭ-ＣＳＦであるrhＭ-ＣＳＦ／ＣＨＯ、大腸菌（E.coli．）を宿主として産生させた遺伝子組換ヒトＭ-ＣＳＦであるrhＭ-ＣＳＦ／E.coli.等のＭ-ＣＳＦが挙げられる。
【００１３】
　この様なＥＰＯ、Ｇ-ＣＳＦ又はＭ-ＣＳＦの投与経路としては、外科的に脳内に直接薬剤を投与する脳内投与や、脳脊髄液内に直接薬剤を注射する脳脊髄液内投与が考えられ、また、静脈内注射等も可能性が期待される。
【００１４】
　そして、これらＥＰＯ、Ｇ-ＣＳＦ又はＭ-ＣＳＦの投与量については、対象となる疾患やその病状等を配慮して適宜決定できるものであるが、投与量については、ＥＰＯの場合が通常成人１人当たり０．１〜５００μg、好ましくは５〜１００μgであり、また、Ｇ-ＣＳＦの場合が通常成人１人当たり０．１〜１，０００μg、好ましくは１〜７００μgであり、更に、Ｍ-ＣＳＦの場合が通常成人１人当たり０．１〜１，０００μg、好ましくは１〜７００μgである。
【００１５】
　更に、本発明のＥＰＯ、Ｇ-ＣＳＦ又はＭ-ＣＳＦを有効成分とする製剤については、その投与方法や剤型に応じて必要により、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤等を添加することができる。ここで、懸濁化剤の例としては例えばメチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等を挙げることができ、溶解補助剤としては例えばポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マグロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステル等を挙げることができ、安定化剤としては例えばヒト血清アルブミン、デキストラン４０、メチルセルロース、ゼラチン、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム等を挙げることができ、等張化剤としては例えばＤ-マンニトール、ソルビトール等を挙げることができ、また、保存剤としては例えばパラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等を挙げることができ、更に、吸着防止剤としては例えばヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキサイド・プロピレンオキサイド共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。
【００１６】
　次に、以下に本発明の効果を確認するための実験例を示す。
〔１〕初代培養細胞の調製
　胎児期１５日のＢＡＬＢ／マウス（三共実験サービス、東京）から前脳基底を含んだ中隔野を得た。ハンクスの平衡塩類溶液（HBSS溶液、pH7.4）中で組織を摘出して細断し、これを３７℃で３分間０．０３%のトリプシンを含んだＨＢＳＳ溶液（pH6.5）で処理した。６３μmのナイロンメッシュで濾過した後、無血清培地に再度懸濁した。培養は、細胞６×１０５個/mlで開始した。細胞の培養開始時にマウスβＮＧＦ（ｍβＮＧＦ、シグマ社、ミズリー州）１００ng/ml、リコンビナントヒトマクロファージコロニー刺激因子（rhM-CSF）（ゲンザイム社製、米国マサチューセッツ州）１０CFU/ml、５０CFU/ml又は１００CFU/ml、リコンビナントヒト顆粒球コロニー刺激因子（rhＧ-ＣＳＦ）（中外製薬株式会社製）１０CFU/ml、５０CFU/ml又は１００CFU/ml、若しくはリコンビナントヒトエリスロポイエチン（rhEPO）（中外製薬株式会社製）１IU/ml、５IU/ml又は１０IU/mlをそれぞれ加え、３日後に培養液交換を行い、５日目に細胞をラバーポリスマン（ガラス管の先にゴムを嵌め込んだ器具）で回収し、下記の方法でコリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）活性を測定した。
　結果を表１に示す。
【００１７】
　なお、無血清培地は、４．５g/lのグルコースを含むダルベッコの修正したイーグル培地（ＤＭＥＭ）（ギブコ社製、米国ニューヨーク州）と下記の成分を補足したＨａｍのＦ１２（ギブコ社製）（pH7.4）との１：１の混合物であった。すなわち、１５mMのＨＥＰＥＳ緩衝液、３０nMのセレン酸ナトリウム、１%のペニシリン-ストレプトマイシン溶液（ギブコ社製）、１００μg/mlのヒトトランスフェリン、２５μ/mlのウシ結晶化インシュリン、２０nMのプロゲステロン、２０nMのヒドロコルチゾン-２１-燐酸塩、１０mMのＬ-カルニチン、３０nMの3,3',5-トリヨード-Ｌ-サイロニン、７ng/mlのトコフェロール、７ng/mlのレチノール、１μMのチオクト酸、及び、１μl/mlのミネラル混合物〔Hutchingsら，P.N.A.S., 75, 901〜904 (1978）〕である。化合物は、特別に記載がない限り、シグマ社（米国ルイジアナ州又はミズリー州）製を使用した。
【００１８】
〔２〕ＳＮ6.10.2.2の培養細胞の調製
　米国シカゴ大学に保管されており、この大学のWainer博士から提供されたＳＮ6.10.2.2細胞は、マウス中隔野神経細胞とマウス神経芽細胞腫Ｎ１８ＴＧ２との融合雑種細胞として樹立されたＳＮ６細胞〔Hanmondら、Science, 234, 1237〜1240 (1986)〕のサブクローンである。細胞は、１０%ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中に維持した。使用の前に、細胞２×１０５個/mlをＨＢＳＳ溶液（pH7.4）で２回、無血清培地で１回洗浄した。rhＭ-ＣＳＦ、rhＧ-ＣＳＦ又はrhＥＰＯを含んだ試験培地で３５mm皿（ベクトン ディッキンソン社製、米国ニュージャージー州）中で２日間培養した後、３日目に細胞をラバーポリスマンで回収し、下記の方法でＣｈＡＴ活性を測定した。
　結果を表２に示す。
【００１９】
〔３〕Fimbria（海馬采）-Fornix（脳弓）切断による脳内in vivoモデルの作製
　体重３００〜３５０gのWister系アルビノ雄ラット（日本クレア、東京）を３０〜５０mg/kgのペントバルビタールナトリウム（sodium pentobarbital）で麻酔し、頭部を脳定位装置（ナリシゲ器械社、東京）に固定した。次いで、以下に示す手順でFimbria-Fornix切断を行った。すなわち、左側頭蓋骨のBregmaより０．５mm後方の線及び正中線を直交二辺とする３mm角の部分を切除し、左背側のFimbriaとFornixを皮質と共に吸引除去した。右側頭蓋骨のBregmaから０．２mm前方及び正中線より１mm右側の位置に穿孔し、この孔に直径１mmのカニューレ（クニイ社、東京）を挿入した。
【００２０】
　このカニューレを通じて、１２５I.U.／１５μl／dayあるいは１２．５I.U.／１５μl／dayの２doseのrhＥＰＯを各々ラット３匹からなる実験群に４日間連続投与した。対照群として、５μg／１５μl／dayのβ-ＮＧＦあるいは１５μl／dayの生理食塩水を上記と同じ条件下で投与した。
【００２１】
　術後１４日目のラットに２mg/kgのジイソプロピルフルオロフォスフェート（diisopropyl fluorophosphate）を筋肉内投与し、４時間後に１００mlの生理食塩水並びに３００mlの４%パラホルムアルデヒド（paraformaldehyde）及び０．１%のグルタールアルデヒド（glutaraldehyde）を含む冷却した０．１Mリン酸緩衝液で灌流した。脳を摘出して、２%ザンボーニ（Zamboni）液で４日間固定した後、４℃の１０%蔗糖溶液中に一晩静置した。厚さ２０μmの脳冠状切片を作成し、ブッチャーらの方法〔Butcher et al. Neuron, 7, 197〜208 (1991)〕の改法で染色した。
【００２２】
　ゲイジらの方法〔Gage et al. Neuroscience, 19, 241〜255 (1986)〕に従い、アセチルコリンエステラーゼ（AchE）陽性細胞、すなわち内側中隔野の主軸沿いに存在する最小直径１２μmの神経細胞を画像解析ソフトウエア（オリンパス光学社、東京）を用いて調べた。
【００２３】
　個々の動物のFimbria-Fornix切断側及び反対側の両方の中隔野領域について、ＡｃｈＥ陽性細胞の数を計測し、切断側に存在するＡｃｈＥ陽性細胞数を反対側に存在する細胞数で割ったパーセンテージをアセチルコリン作動性神経細胞の生存率とした。
【００２４】
　結果を図１に示す。
　なお、図中のカラムはMean±1S.D.であり、**はｐ＜０．０１を示し、また、ＥＰＯ-Ｈは１２５I.U.／１５μl／day投与群を、ＥＰＯ-Ｌは１２．５I.U.／１５μl／day投与群をそれぞれ示す。
【００２５】
〔４〕コリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）活性の測定及び蛋白質の定量
　ＣｈＡＴ活性は、Fonnumの方法〔F. Fonnum, J. Neurochem., 24, 407〜409 (1975)〕に基づいて求めた。すなわち、上記の初代培養細胞あるいはＳＮ6.10.2.2培養細胞をラバーポリスマンで回収した後、３０μlの１０mM-ＥＤＴＡ液中でホモジナイズし、更に最終濃度０．５%（v/v）Triton-X100を加えたものを酵素源とした。酵素反応溶液は３００mM-ＮａＣｌ、５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ7.4）、２０mM-ＥＤＴＡに基質として０．２mM〔1-14C〕acetyl-CoA（アマシャム ジャパン社より購入）及び８mM-Choline bromide及びアセチルコリンエステラーゼ阻害剤として０．１mM-Physostigmineを加えたものである。この反応溶液５μｌを１．５mlのマイクロチューブ（エッペンドルフ社製、ドイツ）に入れ、酵素液サンプル２μｌを加えて軽く振とう攪拌し、３７℃で１５分間反応させた。氷冷することによって反応を停止させ、マイクロチューブを液体シンチレーション用バイアルの中に入れて中身の反応混液を５mlの１０mM-Phosphate bufferで洗いだした。このバイアルに１０mg/mlのカリグノスト（Sodium Tetraphenylborate）を含む２mlのアセトニトリルと１０mlのトルエン系シンチレーターを加え、１分間軽く振とうした。バイアルを１０分間静置した後、液体シンチレーションカウンターによって14Ｃで標識されたアセチルコリンの量を決定し、ＣｈＡＴ活性を求めた。
【００２６】
　また、蛋白質の定量は、ローリー法〔Lowryら, J. Biol. Chem., 193, 265〜275 (1951)〕に従って行った。この目的で上述の酵素液サンプルの１０μlを使用した。
　そして、これらの値を基に比活性、総蛋白量及び総ＣｈＡＴ活性をそれぞれ算出した。ＣｈＡＴ活性、タンパク質濃度及び生存率についてはt-testを行った。
【００２７】
【表１】
2004131507.tif 000002
【００２８】
【表２】
2004131507.tif 000003
【００２９】
　上記表１に示す結果から明らかなように、中隔野神経細胞の初代培養系に本発明のrhＭ-ＣＳＦ、rhＧ-ＣＳＦ又はrhＥＰＯを表中に示すDoseで添加したときの５日後のＣｈＡＴ比活性、総蛋白量及び総ＣｈＡＴ活性を調べた結果は、rhＭ-ＣＳＦの場合にはControlに対してDose：１０CFU/ml、５０CFU/ml及び１００CFU/mlで総蛋白量をそれぞれ２５%、４４%及び１５%増加させ、rhＧ-ＣＳＦの場合にはControlに対してDose：１０CFU/ml、５０CFU/ml及び１００CFU/mlで総蛋白量をそれぞれ１２%、２４%及び１８%増加させ、また、rhＥＰＯの場合にはControlに対してDose：１IU/ml、５IU/ml及び１０IU/mlで総蛋白量をそれぞれ３１%、２５%及び３８%増加させた。これらの値は、対照として実験したｍβＮＧＦ（１００ng/ml）の場合の効果２３%と同等あるいはそれ以上の結果を示すものであり、本発明で使用する造血因子類が神経栄養因子のｍβＮＧＦと類似の作用を発揮し、初代培養神経細胞の生存を促進することが判明した。
【００３０】
　また、ＣｈＡＴ比活性に関しては、Controlに対して、rhＭ-ＣＳＦがDose：５０CFU/ml及び１００CFU/mlでそれぞれ１７%増加させ、rhＧ-ＣＳＦがDose：１０CFU/ml、５０CFU/ml及び１００CFU/mlでそれぞれ１%、２５%及び１４%増加させ、また、rhＥＰＯがDose：５IU/ml及び１０IU/mlでそれぞれ２０%及び１８%増加させた。更に、総ＣｈＡＴ活性については、Controlに対して、rhＭ-ＣＳＦがDose：１０CFU/ml、５０CFU/ml及び１００CFU/mlでそれぞれ２０%、７０%及び３７%増加させ、rhＧ-ＣＳＦがDose：１０CFU/ml、５０CFU/ml及び１００CFU/mlでそれぞれ１４%、５５%及び３３%増加させ、また、rhＥＰＯがDose：１IU/ml、５IU/ml及び１０IU/mlでそれぞれ１９%、４９%及び６２%増加させた。これらの結果から、本発明で使用する造血因子、rhＭ-ＣＳＦ、rhＧ-ＣＳＦ又はrhＥＰＯは、ＣｈＡＴ賦活作用においても優れた効果を発揮することが判明した。
【００３１】
　更に、表２は、ＳＮ6.10.2.2細胞のＣｈＡＴ比活性、総蛋白量及び総ＣｈＡＴ活性に対する本発明のrhＭ-ＣＳＦ、rhＧ-ＣＳＦ及びrhＥＰＯの影響を示すもので、この系では、総蛋白量がControlの場合と造血因子を添加した場合とでほとんど変化していないことからも分かるように、造血因子類の分化形質に対してのみの影響を単独で観察することができる。この実験の結果から明らかなように、rhＭ-ＣＳＦ（５０CFU/ml）、rhＧ-ＣＳＦ（５０CFU/ml）及びrhＥＰＯ（１０IU/ml）は、ＣｈＡＴ比活性をそれぞれ６１%、６８%及び８０%上昇させ、また、総ＣｈＡＴ活性をそれぞれ８０%、５８%及び７４%上昇させた。
【００３２】
　また、図１に示したように、rhＥＰＯ投与群では、対照群（生理食塩水、０．１%ＢＳＡ）に比べて片側性にFimbria-Fornix切断したラットの中隔野におけるＡｃｈＥ陽性細胞の生存率が有意に改善された。
　片側性にFimbria-Fornix切断したラットの中隔野で、rhＥＰＯのアセチルコリン作動性神経細胞に対するin vivoの効果が確認されたことは、実際の臨床的展開を考える上で意義深い。
　以上の実験から明らかなように、本発明のrhＭ-ＣＳＦ、rhＧ-ＣＳＦ及びrhＥＰＯは、元々血液細胞系に対して作用を有するものとして発見された造血因子であるが、中枢神経細胞系に対してもｍβＮＧＦと同様の活性を有することが判明した。すなわち、マウス中隔野神経細胞のin vitro初代培養において総蛋白量を顕著に増加させると共にＣｈＡＴ比活性や総ＣｈＡＴ活性を増加させ、また、マウス中隔野由来コリン作動性神経細胞株ＳＮ6.10.2.2細胞においてもＣｈＡＴ比活性や総ＣｈＡＴ活性を増加させ、従って、これらの造血因子、rhＭ-ＣＳＦ、rhＧ-ＣＳＦ及びrhＥＰＯは、優れた細胞生存延長作用を発揮すると共にＣｈＡＴ賦活作用を発揮するという二通りの作用を発揮する。
【００３３】
　更に、in vivoの実験、すなわちFimbria-Fornixの神経経路切断系においてもアセチルコリン作動性神経細胞の生存を支持する効果が認められた。この系では、海馬で産生され軸索を逆行性に運ばれてくるＮＧＦの供給が切断によって途絶えるために、中隔野のアセチルコリン作動性神経細胞はその供給を受けることができなくなり死滅する。従って、in vivoにおいてrhＥＰＯがＮＧＦ様のNeurotrophic Factor活性を持つことが明らかとなった。
【００３４】
　このため、本発明のrhＭ-ＣＳＦ、rhＧ-ＣＳＦ及びrhＥＰＯは、コリン作動性の神経細胞が変性脱落して記憶障害をもたらすような疾患、例えばアルツハイマー病やアルツハイマー型老人性痴呆症等に対して有効であるほか、脳梗塞、脳出血等の脳虚血障害、脳循環障害に伴うと考えられている記憶障害、知能障害、意欲低下、注意力低下等の脳血管性痴呆症等に対しても有効である。
【００３５】
　しかるに、本発明の造血因子、rhＭ-ＣＳＦ、rhＧ-ＣＳＦ及びrhＥＰＯの適応疾患は、上記の如きコリン作動性神経細胞が関与する疾患に限られるものではない。すなわち、中枢神経細胞系に対するｍβＮＧＦはその作用が末梢交感神経あるいは感覚神経や脳のコリン作動性神経に限られて比較的狭い細胞特異性を有するのに対し、本発明のrhＭ-ＣＳＦ、rhＧ-ＣＳＦ及びrhＥＰＯは元来血球系の細胞に対する因子であり、脳のより広範な種類の神経細胞に対して生存促進因子として作用する可能性を有するものと考えられ、これが優れた細胞生存延長作用を発揮する要因であると考えられる。このため、本発明のrhＭ-ＣＳＦ、rhＧ-ＣＳＦ及びrhＥＰＯは、単にコリン作動性神経細胞が関与する疾患に限られるものではなく、例えば、大脳基底核黒質のドパミン作動性神経細胞が変性脱落して生じるパーキンソン病や、大脳基底核の線条体（尾状核、被殻）のＧＡＢＡ作動性神経細胞が変性脱落して生じるハンチントン舞踏病等、広く脳機能障害による疾患の予防薬として、又は、治療薬として有望である。
【発明の効果】
【００３６】
　本発明のエリスロポイエチン、顆粒球コロニー刺激因子又はマクロファージコロニー刺激因子を有効成分として含有する予防・治療薬は、優れた細胞生存延長作用及びＣｈＡＴ賦活作用を有し、しかも、副作用が低いことから、アルツハイマー病、アルツハイマー型老人性痴呆症又は脳血管性痴呆症を始とする脳機能障害による各種の疾患に適用する医薬として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
　以下、製剤に関する実施例に基づいて、本発明の好適な実施の形態を具体的に説明する。
　実施例１
　　エリスロポイエチン　　　　８μg
　　注射用蒸留水にて全量　　　２ml
　上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、密封した。
【００３８】
　実施例２
　　エリスロポイエチン　　　　８μg
　　注射用蒸留水にて全量　　　２ml
　上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、凍結乾燥して密封した。
【００３９】
　実施例３
　　エリスロポイエチン　　　１６μg
　　注射用蒸留水にて全量　　　２ml
　上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、密封した。
【００４０】
　実施例４
　　エリスロポイエチン　　　１６μg
　　注射用蒸留水にて全量　　　２ml
　上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、凍結乾燥して密封した。
【００４１】
　実施例５
　　エリスロポイエチン　　　　８μg
　　ヒト血清アルブミン　　　　５mg
　　注射用蒸留水にて全量　　　２ml
　上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、密封した。
【００４２】
　実施例６
　　エリスロポイエチン　　　　８μg
　　ヒト血清アルブミン　　　　５mg
　　注射用蒸留水にて全量　　　２ml
　上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、凍結乾燥して密封した。
【００４３】
　実施例７
　　エリスロポイエチン　　　１６μg
　　ヒト血清アルブミン　　　　５mg
　　注射用蒸留水にて全量　　　２ml
　上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、密封した。
【００４４】
　実施例８
　　エリスロポイエチン　　　１６μg
　　ヒト血清アルブミン　　　　５mg
　　注射用蒸留水にて全量　　　２ml
　上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注し、凍結乾燥して密封した。
【００４５】
　実施例９〜１２
　実施例５〜８におけるヒト血清アルブミンに代えて５mgのデキストラン４０を用い、これら実施例５〜８と同様にして注射剤を調製した。
【００４６】
　実施例１３
　注射用蒸留水１００ml中にＤ-マンニトール５g、エリスロポイエチン１mg、ヒト血清アルブミン１００mgを無菌的に溶解して水溶液を調製し、１mlずつバイアル瓶に分注し、凍結乾燥して密封した。
【００４７】
　実施例１４
　ｐＨ７．０の０．０５M-リン酸緩衝液５０ml中にエリスロポイエチン０．５mgとソルビトール１gとを無菌的に溶解して水溶液を調製し、０．５mlずつバイアル瓶に分注し、凍結乾燥して密封した。別に０．１%-メチルセルロース水溶液を無菌的に調製し、１mlずつアンプルに分注し、溶解用溶液とした。
【００４８】
　実施例１５
　精製されたヒトＧ-ＣＳＦ（10mM-リン酸緩衝液 pH7.0）の７５μg/ml及びＤ-マンニトールの１５mg/mlを注射用蒸留水に溶解して０．３mlとした後、０．２２μmのポアサイズを有するメンブランフィルターで濾過滅菌した。得られた溶液を滅菌処理したバイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴム栓を半打栓し、続いてアルミニウムキャップに巻き締めて注射用溶液製剤を得た。この注射用溶液製剤の保存は１０℃以下の冷暗所で行う。
【００４９】
　実施例１６
　精製されたヒトＧ-ＣＳＦ（10mM-リン酸緩衝液 pH7.0）の５０μg/mlをＮａＣｌで浸透圧比を１に調整した後、０．２２μmのポアサイズを有するメンブランフィルターで濾過滅菌した。得られた溶液を滅菌処理したバイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴム栓を打栓し、続いてアルミニウムキャップに巻き締めて注射用溶液製剤を得た。この注射用溶液製剤の保存は１０℃以下の冷暗所で行う。
【００５０】
　実施例１７
　精製されたヒトＧ-ＣＳＦ（10mM-リン酸緩衝液 pH7.0）の１００μg/mlをＮａＣｌで浸透圧比を１に調整した後、０．２２μmのポアサイズを有するメンブランフィルターで濾過滅菌した。得られた溶液を滅菌処理したバイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴム栓を打栓し、続いてアルミニウムキャップに巻き締めて注射用溶液製剤を得た。この注射用溶液製剤の保存は１０℃以下の冷暗所で行う。
【００５１】
　実施例１８
　精製されたヒトＧ-ＣＳＦ（10mM-リン酸緩衝液 pH7.0）の５０μg/mlにＨＳＡ濃度１０mg/ml及びＤ-マンニトール濃度５０mg/mlとなるように加えて溶解した後、０．２２μmのポアサイズを有するメンブランフィルターで濾過滅菌した。得られた溶液を滅菌処理したバイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴム栓を半打栓し、続いてアルミニウムキャップに巻き締めて注射用溶液製剤を得た。この注射用溶液製剤は室温以下の温度条件で保存し、使用時に注射用蒸留水で希釈して使用する。
【００５２】
　実施例１９
　精製されたヒトＧ-ＣＳＦ（10mM-リン酸緩衝液 pH7.0）の１００μg/mlにゼラチン濃度１０mg/ml及びＤ-マンニトール濃度５０mg/mlとなるように加えて溶解した後、０．２２μmのポアサイズを有するメンブランフィルターで濾過滅菌した。得られた溶液を滅菌処理したバイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴム栓を半打栓し、続いてアルミニウムキャップに巻き締めて注射用溶液製剤を得た。この注射用溶液製剤は室温以下の温度条件で保存し、使用時に注射用蒸留水で希釈して使用する。
【００５３】
　実施例２０
　精製されたヒトＭ-ＣＳＦ（10mM-リン酸緩衝液 pH7.0）の７５μg/ml及びＤ-マンニトールの１５mg/mlを注射用蒸留水に溶解して０．３mlとした後、０．２２μmのポアサイズを有するメンブランフィルターで濾過滅菌した。得られた溶液を滅菌処理したバイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴム栓を半打栓し、続いてアルミニウムキャップに巻き締めて注射用溶液製剤を得た。この注射用溶液製剤の保存は１０℃以下の冷暗所で行う。
【００５４】
　実施例２１
　精製されたヒトＭ-ＣＳＦ（10mM-リン酸緩衝液 pH7.0）の５０μg/mlをＮａＣｌで浸透圧比を１に調整した後、０．２２μmのポアサイズを有するメンブランフィルターで濾過滅菌した。得られた溶液を滅菌処理したバイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴム栓を打栓し、続いてアルミニウムキャップに巻き締めて注射用溶液製剤を得た。この注射用溶液製剤の保存は１０℃以下の冷暗所で行う。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
　本発明のエリスロポイエチン、顆粒球コロニー刺激因子又はマクロファージコロニー刺激因子を有効成分として含有する予防・治療薬は、優れた細胞生存延長作用及びＣｈＡＴ賦活作用を有し、しかも、副作用が低いことから、アルツハイマー病、アルツハイマー型老人性痴呆症又は脳血管性痴呆症を始とする脳機能障害による各種の疾患に適用する医薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は実験例〔３〕で得られた脳内in vivoモデルにおけるrhＥＰＯの細胞生存延長効果を示すグラフ図であり、図中、縦軸は細胞の相対的な生存率を、また、横軸は実験群をそれぞれ示す。
【図１】
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