(57)【要約】【課題】高いメチオニン枯渇活性、延長された半減期および低い免疫原性を有する化学的に改変されたメチオニナーゼの提供。【解決手段】天然の材料から、および組換え宿主から調製された高度に純粋な、エンドトキシンを含まないメチオニナーゼをポリエチレングリコール等のポリマーと結合させた改変メチオニナーゼ。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素学的に活性な凍結乾燥された改変メチオニナーゼ（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ）。
【請求項２】
メチオニナーゼがエンドトキシンを実質的に含まない、請求項１に記載の改変メチオニナーゼ。
【請求項３】
メチオニナーゼが組換えにより製造された請求項１または２に記載の改変メチオニナーゼ。
【請求項４】
以下のヌクレオチド配列によりコードされる請求項１−３のいずれか１つに記載の改変メチオニナーゼ。
2004081209.tif 000033
2004081209.tif 000034
【請求項５】
請求項１−４のいずれか１つに記載の改変メチオニナーゼの治療上有効量を含む治療組成物。
【請求項６】
治療のための医薬製造のための請求項１−５のいずれか１つに記載の改変メチオニナーゼの使用。
【請求項７】
診断薬製造のための請求項１−５のいずれか１つに記載の改変メチオニナーゼの使用。
【請求項８】
該医薬が腫瘍、心臓血管疾患の治療のため、またはホモシステインレベルを低下させるためである請求項６の使用。
【請求項９】
メチオニナーゼをコードする高レベル発現モジュールであって、該モジュールはプロモーター配列に機能しうる形で連結された、メチオニナーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、該プロモーター配列は宿主細胞中でメチオニナーゼの発現が該宿主細胞によって産生される全タンパク質の約５から７５％であるメチオニナーゼの発現を引き出すことができる、該モジュール。
【請求項１０】
プロモーターがＴ７　　ＲＮＡポリメラーゼプロモーターである、請求項９記載の発現モジュール。
【請求項１１】
メチオニナーゼをコードするヌクレオチド配列がシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）、膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ　ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ニッポストロンジラス・ブラジリエンシス（Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）およびフゾバクテリウム属種（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ．）からなる群より選択された生物より単離される、請求項１０記載の発現モジュール。
【請求項１２】
該メチオニナーゼが下記ヌクレオチド配列によりコードされる、請求項１１記載の発現モジュール。
2004081209.tif 000035
2004081209.tif 000036
【請求項１３】
請求項９−１２のいずれか１つに記載の発現モジュールによって形質転換された宿主細胞。
【請求項１４】
大腸菌である、請求項１３記載の宿主。
【請求項１５】
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）である、請求項１４記載の宿主。
【請求項１６】
高レベルのメチオニナーゼを製造するための方法であって、請求項１３−１５のいずれか１つに記載の細胞を培養し、そして場合によっては該細胞からメチオニナーゼを回収することを含む該方法。
【請求項１７】
高レベルのメチオニナーゼを発現する請求項１３−１５のいずれか１つに記載の宿主細胞を同定する方法であって、以下の工程を含んでなる該方法：
形質転換宿主細胞をメチオニナーゼが発現される条件下で培養し；そして色がピンク色である形質転換宿主細胞を高レベルのメチオニナーゼを産生するものとして選択する。
【請求項１８】
該細胞が固体培地上で培養される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
腫瘍細胞または免疫細胞である、請求項１３記載の細胞。
【請求項２０】
発現モジュールが腫瘍特異的プロモータによって制御される請求項１９記載の腫瘍細胞または免疫細胞。
【請求項２１】
以下の工程を含んでなるメチオニナーゼの精製方法：
ａ）メチオニナーゼを発現する宿主をメチオニナーゼが発現される条件下で培養し；
ｂ）水性緩衝液中にメチオニナーゼを含む、形質転換細胞の抽出物を約４０〜６０℃で約１〜１０分間加熱し；
ｃ）加熱した抽出物を約１０ｋから２０ｋ　ｒｐｍで約１５分から１時間遠心し；
ｄ）細孔径が約５０Ｋから１００Ｋのフィルターを用いて上清を限外濾過し；
ｅ）低イオン強度（約１０〜５０　ｍＭ）のＫＣｌ中ｐＨ約７．０〜７．６で上清をＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーにかけ、そして約４０〜２００　ｍＭのＫＣｌ勾配を用いて溶出した、メチオニナーゼを含む画分を回収し；
ｆ）中程度イオン強度（１００〜２００　ｍＭ）のＫＣｌ中ｐＨ約８．０〜８．６で該画分を第２のＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーにかけ、そしてリン酸で緩衝化した約０．１から　．２　ＭのＫＣｌを用いて溶出した、メチオニナーゼを含む画分を回収し；
ｇ）上記工程ｅ）で回収した画分を、エンドトキシンを吸収することのできるクロマトグラフィー媒体と接触させ；そして
ｈ）メチオニナーゼを含む溶出液を回収する。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、メチオニナーゼ（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ）組成物、メチオニナーゼの精製方法、メチオニナーゼとＰＥＧ等のポリマーとの結合方法、並びに抗メチオニンおよび抗ホモシステイン化学療法におけるメチオニナーゼの使用方法に関する。より具体的には、本発明の方法は癌療法、心臓血管療法、並びに腫瘍イメージングおよび診断におけるメチオニナーゼの使用を含む。本発明はさらに組換えＤＮＡ技術に関する。本発明は特にメチオニナーゼをコードする発現モジュール（ｍｏｄｕｌｅ）を提供する。
【０００２】
【従来の技術】
治療剤に基づく癌の治療は、許容量を超えて正常な組織機能を損なわないようにしながら、癌細胞を選択的に阻害する、または殺す医薬の使用に向けられている。従来の化学療法における困難は、正常な組織に対する治療剤の毒性であった。
【０００３】
多くの腫瘍が、結腸、乳房前立腺、卵巣、腎臓、喉頭黒色腫、肉腫、肺、脳、胃および膀胱の腫瘍、並びに白血病およびリンパ腫を含む種々の細胞タイプおよび評価された癌組織において、メチオニンを絶対に必要とすることを示した。メチオニン依存性は、増殖培地中でメチオニンをホモシステインに置換した場合の腫瘍の増殖不能として規定された。例えば、Ｃｈｅｌｌｏら，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　３３：１８９８−１９０４，　１９７３；およびＨｏｆｆｍａｎ，　Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　５：１−３０，　１９８５参照。メチオニン枯渇は、メチオニン依存性腫瘍細胞を選択的に細胞周期のＳ／Ｇ２期末期に同調させる。Ｈｏｆｆｍａｎら，Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　７７：７３０６−７３１０，　１９８０。抗メチオニン化学療法と呼ばれる、メチオニンを剥奪し、その後、抗有糸分裂剤への暴露と組み合わせてメチオニンを充満させる方法を用いると、腫瘍細胞は正常細胞および腫瘍細胞の混合培養物から選択的に排除され、旺盛に増殖する正常細胞の培養物をもたらした。Ｓｔｅｒｎら，Ｊ．　Ｎａｔｌ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．，　７６：６２９−６３９，　１９８６。
しかし、メチオニン依存性化学療法をｉｎ　ｖｉｖｏで実施するためには、循環メチオニンを血清から効果的に枯渇させる手段を持たなければならない。抗癌療法において効果を発揮するのに十分なだけ循環メチオニンのレベルをｉｎ　ｖｉｖｏで低下させるメチオニン枯渇法は、これまで記述されていない。
メチオニンを分解する酵素であるメチオニナーゼが種々の細菌性の源から精製され、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞増殖速度を遅くすることが報告されている。Ｋｒｅｉｓ
ら，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　３３：１８６２−１８６５　および１８６６−１８６９，　１９７３；　Ｔａｎａｋａら，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，　６６：３０７−３１１，　１９７６；　Ｉｔｏら，Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　７９：１２６３−１２７２，　１９７６；　およびＮａｋａｙａｍａら，Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　４８：２３６７−２３６９，　１９８４。
Ｋｒｅｉｓら，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　３３：１８６６−１８６９，　１９７３は、マウスモデルに移植した癌肉腫細胞の増殖を阻止するための、スポロゲネス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐｏｒｇｅｎｅｓ）から単離した高度に不純なメチオニナーゼの用量１１５０単位／ｋｇ／日での使用を記述している。上記酵素は明らかに一次腫瘍細胞増殖を減少させたが、腫瘍直径のＴ／Ｃ（処理細胞ｖｓ対照細胞）比を５０％　以下に下げたとも、転移について何らかの効果を有したとも報告されていない。著者らは、他の不特定の介在物の不在下でのメチオニナーゼの腫瘍特異性は期待できないとも指摘した。そして、不純な調製物中のエンドトキシンまたは他の成分が、観察された効果に関与しているかもしれない可能性については何らコメントしなかった。報告された唯一の毒性研究は、治療期間後に動物の体重減少がなかったこと、および毒性に関する消極的な肉眼検査であった。さらに、著者らは該酵素が４時間という血清半減期を有したと報告している。該酵素調製物は半精製の状態でしかなく、また重大な量のエンドトキシンを含んでいた。これらのことが結果の解釈を複雑にしている。
さらに、Ｋｒｅｉｓは血清メチオニンレベルを対照の約８％以下に低下させることができなかった。これは、上記クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）　酵素の高いＫｍ値（約　９０　ｍＭ）　によるものと思われる。該メチオニナーゼ調製物は不安定で、精製の際、２％の回収（収率）しか達成できなかったと報告されている。
Ｋｒｅｉｓら，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　３３：１８６６−１８６９，　１９７３はさらに、抗癌療法としてメチオニンを枯渇させる手段としてメチオニンを含まない食餌の使用を報告した。しかし、著者らは、該食餌の使用はメチオニナーゼの不純な調製物の使用ほど効果的に腫瘍増殖を遅らせなかったこと、そして実験動物の継続的な体重減少という望ましくない副作用をもたらしたこと、を報告している。著者らは、メチオニナーゼ治療と組み合わせたメチオニン欠乏食餌の使用を報告していない。また、細胞同調化（ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ）を研究していない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の優先権出願は、有害な損傷を与えることなく有益な抗腫瘍効果をもたらすように効果的にメチオニンの量を減らすことに向けられた、メチオニナーゼを用いた腫瘍の効果的化学療法を開示する。本発明は、商業的に成立する量の高度に純粋な組換えメチオニナーゼを産生する供給源を提供することによって、開示した治療および診断法ならびに組成物を改良する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
メチオニナーゼは、ＰＥＧと結合した形態であれ、または高度に純粋な、エンドトキシンを含まない組み換え体として産生され精製されたものであれ、害を与えずに哺乳動物のメチオニンレベルを枯渇させることができ、腫瘍増殖を選択的に阻止するために効果的に使用することができ、さらにまた腫瘍細胞を選択的に阻止し、それによって該細胞を抗有糸分裂化学療法のために同調させることができる、ことが見いだされた。
また、幾つかの異なる方法を共働的に用いて有効メチオニンレベルを実質的に低下させる場合、メチオニン枯渇が最も効果的であることが見いだされた。これらの方法には、メチオニンを含まない食餌を用いるメチオニン飢餓、メチオニンを利用する酵素に対してメチオニンと競合するインヒビターの使用によるメチオニンの競合阻害、メチオニン枯渇により誘導される特異的腫瘍選択性細胞周期ブロックの利点を利用する化学治療剤、およびそれらの組み合わせが含まれる。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明は、腫瘍細胞の集団を本明細書に規定する治療上有効量のメチオニナーゼに、該集団の細胞において細胞周期静止を誘導し、静的（ｓｔａｔｉｃ）腫瘍細胞を形成させるに十分な期間接触させることを含んでなる、腫瘍細胞の増殖を阻止する方法を記述する。「接触させる」という用語は、腫瘍阻止効果が観察されるように、本発明の治療組成物を標的腫瘍に十分近い所に配置すること、または、培地中のメチオニンレベルが培地中の腫瘍細胞増殖が阻止されるレベルまで低下するように、該治療組成物を培地（栄養培地または血液、等）中に配置すること、を意味する。「静的（ｓｔａｔｉｃ）」腫瘍細胞という用語は、増殖を阻止された腫瘍細胞を意味する。この方法はｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏで実施することができる。腫瘍細胞の接触は直接的である必要はなく、腫瘍細胞を含む栄養培地を接触させることによってｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏで行なうことができる。接触は循環血をメチオニナーゼと接触させることによっても達成できる。腫瘍は循環しない固形腫瘍である場合があるので、このような循環血は腫瘍を含むことも、含まないこともある。「腫瘍細胞増殖を阻止する」という表現は、本発明の化合物の投与が例えば大きさを測定した場合に、該化合物で処理されなかった腫瘍に較べ、腫瘍の増殖を１０％　から１００％、より好ましくは３４％　から７９％、そしてより好ましくは５５％　から６８％　減少させることを意味する。
メチオニナーゼは、メチオニンを枯渇させて細胞分裂を遅くする、または停止させるための抗腫瘍試薬として使用される。この効果は、メチオニンの競合的インヒビターを用いて増強することができる。さらに、メチオニナーゼを抗有糸分裂剤および他の細胞周期特異的細胞毒性剤と組み合わせて用いて、細胞周期同調化を誘導することにより抗有糸分裂剤および他の細胞周期特異的細胞毒性剤の治療的効果を増大させることができる。
メチオニナーゼはまた、心臓血管性疾患の危険を減少させ、かつこの疾患を治療するためのホモシステイン枯渇化学療法にも使用される。メチオニナーゼはまた、［１１Ｃ］　メチオニンを充満させる前に、血液および腫瘍の［１２Ｃ］　メチオニンを枯渇させ、超高度分解能で身体内の腫瘍を検出し診断するためにも使用される。
１つの実施態様においては、腫瘍細胞はまずメチオニンレベルを低下させるためメチオニン飢餓工程にかけられる。場合により、正常細胞への毒性を減少させ、それによって療法の特異性を増大させるため、メチオニン飢餓はホモシステインを伴ってもよい。
本発明のもう１つの関連する局面は、腫瘍細胞を細胞周期のＳ／Ｇ２期末期に引き止めるためのメチオニン枯渇法の使用と、それに続く同調的に細胞周期を開始させるための処理、および選択的かつ効果的に腫瘍細胞を殺すための抗有糸分裂剤等の細胞周期特異的細胞毒性剤の投与、を特徴とする。当業者は細胞周期の特定期にある細胞にたいして毒性な細胞周期特異的細胞毒性剤に精通している。この方法は以下の工程を含んでなる：
（ａ）上記のメチオニン枯渇工程によって生成した静的腫瘍細胞を、細胞周期誘導量のメチオニンと接触させて該静的腫瘍細胞の細胞周期を開始させ、細胞周期を進行する細胞（ｃｙｃｌｉｎｇ　ｃｅｌｌ）を形成し、そして
（ｂ）該細胞周期を進行する細胞を、有糸分裂細胞の有糸分裂を阻止するに十分な量の細胞周期特異的細胞毒性剤と接触させ、これによって腫瘍細胞の増殖を阻止する。
１つの実施態様においては、この方法は以下の工程：
（ａ）上記のメチオニン枯渇工程によって生成した静的腫瘍細胞を、細胞周期誘導量のメチオニンと接触させて該静的腫瘍細胞の有糸分裂を開始させ、有糸分裂細胞を形成し、そして
（ｂ）該有糸分裂細胞を、有糸分裂細胞の有糸分裂を阻止するに十分な量の抗有糸分裂剤と接触させ、これによって腫瘍細胞の増殖を阻止する、
を含んでなる。
本発明はまた、患者のホモシステインレベルを低下させて心臓血管性疾患の危険を減少させ、かつ該疾患を治療するためのメチオニナーゼの使用を特徴とする。本発明は、腫瘍診断およびイメージングのための、メチオニナーゼの投与によるメチオニンの枯渇方法を提供する。
治療上有効量の、タンパク質１ミリグラムあたり少なくとも約１０から約５０単位メチオニナーゼ活性という比活性を有する実質的に単離されたメチオニナーゼ、およびタンパク質１ミリグラムあたり約１未満から約１００　ｎｇのエンドトキシンを含む、メチオニン枯渇療法のための治療組成物もまた特徴である。好ましい実施態様においては、該治療組成物はタンパク質１ミリグラムあたり１０ナノグラム未満のエンドトキシンを、製薬上許容される担体と共に含む。
本発明の治療組成物は、エンドトキシンを含まないメチオニナーゼをも包含する。１つに実施態様においては、メチオニナーゼは改良された発酵条件下で増殖させたシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）　から新規で効率的な方法を用いて調製される。この目的のため、本発明はＰ．プチダの改良された、高メチオニン産生株の単離方法をも提供する。別の実施態様においては、メチオニナーゼはメチオニナーゼをコードする発現モジュールを含む組換え宿主から産生される。
本発明のメチオニナーゼ組成物は、メチオニナーゼをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリマーと結合させることにより、化学的に改変された形でも提供される。本発明のＰＥＧ改変メチオニナーゼは高いメチオニン枯渇活性、延長された半減期、および低い免疫原性を示す。
本発明のメチオニナーゼ組成物は、本明細書中に規定される高発現ベクター等の発現ベクターを用いて産生された組換えタンパク質としても提供される。高発現系を用いて産生されたメチオニナーゼを、本明細書に記述する方法を用いて容易に精製して、エンドトキシンを含まず、かつ高度に純粋な、メチオニナーゼ１ミリグラムあたり約１０から約５０単位の比活性を有するメチオニナーゼ組成物を得ることができる。
本発明はさらに、予想されない高レベルのメチオニナーゼを発現する、核酸分子を含むベクターを提供する。このようなベクター、例えばＴ７　ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを利用したベクターは、１リットルあたり約１〜約４グラムの割合で、粗ホモジネートの形で約２．６　〜５の比活性を有する、適切なインキュベーション条件下で全細胞性タンパク質の約１０〜２０％　に相当するメチオニナーゼを産生するために使用された。
本発明はさらに、本明細書に開示する方法においてメチオニナーゼを含む組成物に代わりに用いることができるクローン化メチオニナーゼ遺伝子を利用する遺伝子治療の方法を提供する。治療的量のメチオニナーゼを患者の血清に供給する手段として、患者の体内でメチオニナーゼを発現するように細胞を変更することが可能である。
本発明の他の特徴、利点および関連する実施態様は、本明細書に含まれる開示に基づいて明らかであろう。
Ａ．定義
「アミノ酸残基」とは、ポリペプチドの化学的消化（加水分解）の結果、そのペプチド結合に形成されたアミノ酸をいう。本明細書に記載するアミノ酸残基は、好ましくは「Ｌ」異性体形である。しかし、所望の機能特性がポリペプチドによって保持される限り、任意のＬ−アミノ酸残基に換えて「Ｄ」異性体形の残基を用いることができる。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離のアミノ基をいう。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離のカルボキシ基をいう。標準的ポリペプチド命名法（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２４３：３５５２−５９，　１９６９に記述され、３７　Ｃ．Ｆ．Ｒ．　１．８２２（Ｂ）（２）に採用された）（本明細書中に参考として組み入れる）に従う。
本明細書中に式として表される全てのアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシ末端へという通常の方向を、左から右へ向けて示すことに注意すべきである。さらに、「アミノ酸残基」という句は、Ｔａｂｌｅ　ｏｆ　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ　に記載されたアミノ酸、並びに本明細書中に参考として組み入れる３７　Ｃ．Ｆ．Ｒ．　１．８２２（Ｂ）（４）　に記載されたもの等の修飾された及び通常のアミノ酸を包含して、広く定義される。さらに、アミノ酸残基配列の初めまたは終わりにあるダッシュ（−）は、１以上のアミノ酸残基からなる別の配列へのペプチド結合、またはＮＨ２、アセチル等のアミノ末端基への、またはＣＯＯＨ等のカルボキシ末端基への共有結合を示す。
「組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）分子」とは、２個のＤＮＡセグメントを機能しうる形で連結することにより作製されたＤＮＡ分子をいう。したがって、組換えＤＮＡ分子とは、天然においては通常共に見いだされることのない少なくとも２つのヌクレオチド配列を含むハイブリッドＤＮＡ分子である。共通の生物的起源を持たない（すなわち、進化論的に異なる）ｒＤＮＡは、「異種」（”ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ”）　であると言われる。
「ベクター」とは、細胞中で自律複製が可能なｒＤＮＡ分子をいい、結合させたセグメントの複製をもたらすようにＤＮＡセグメント（例えば遺伝子またはポリヌクレオチド）を機能しうる形でそこに連結することができる。１個以上のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を引き出すことが可能なベクターは、本明細書中で「発現ベクター」と呼ばれる。特に重要なベクターは、本発明のメチオニナーゼタンパク質の好都合な発現を可能とする。
Ｂ．抗腫瘍剤としてのメチオニナーゼの使用方法
Ｉ．メチオニン枯渇
本明細書中では、メチオニナーゼは腫瘍細胞、腫瘍組織または癌を有する哺乳動物の循環からメチオニンを実質的に枯渇させるために、またはメチオニンの枯渇が望ましいと考えられる場合にメチオニンを枯渇させるために、本明細書に記述する種々の様式で抗腫瘍剤として用いられる。
先行技術の方法はｉｎ　ｖｉｖｏメチオニンレベルを約３５マイクロモル（μＭ）まで低下させることができるが、安全に、容易に、かつ迅速にメチオニンレベルを実質的に約１０μＭ　以下に下げることのできる方法は知られていない。「実質的に」とは、通常のメチオニン検出法を用いて、少なくとも検出可能な１０μＭ　以下、好ましくは１　μＭ　未満、より好ましくは０．１　μＭ　未満、そして最も好ましくは検出不能レベルまで下げることを意味する。メチオニンは、血液、血漿および血清等の体液を含む溶液中で種々の方法により測定することができる。典型的な方法は、メチオニン標準品を用いた逆相ＦＰＬＣである。
枯渇は、哺乳動物の循環中でｉｎ　ｖｉｖｏで、または組織培養物または他の生物学的培地のメチオニン枯渇が望ましい場合はｉｎ　ｖｉｔｒｏで、そして生物学的流体、細胞または組織が哺乳動物患者の身体外で操作され、後にその体内に戻される場合はｅｘ　ｖｉｖｏ（生体外）手順を用いて実施することができる。
循環、培養培地、生物学的流体、または細胞からのメチオニンの枯渇は、処理すべき物質に到達しうるメチオニンの量を減少させるために行なわれる。したがってメチオニン枯渇は、メチオニンを枯渇させるべき物質をメチオニンを枯渇させる量の本発明のメチオニナーゼと、接触させるべき物質の周囲のメチオニンを分解するようにメチオニン枯渇条件下で接触させることを含む。
腫瘍細胞はメチオニンについて栄養培地に依存するため、メチオニン枯渇を細胞の栄養源に向けて実施してもよく、必ずしも細胞そのものに向けなくてよい。したがって、本発明のｉｎ　ｖｉｖｏ適用においては、メチオニナーゼを腫瘍細胞集団の栄養培地と接触させることができる。この実施態様では、該培地はメチオニン枯渇が望まれる血液、リンパ液、脊髄液、等の体液でありうる。
メチオニンを枯渇させる量は、その使用法によって広範に変わりうる。そして、典型的には、上記物質中に存在するメチオニンの量、所望の枯渇率、およびメチオニナーゼへの暴露に対する該物質の耐性に依存する。物質中のメチオニンレベル、そして該物質からのメチオニンの枯渇率は、当分野で周知の種々の化学的および生化学的方法によって容易にモニターすることができる。典型的なメチオニン枯渇量を本明細書中に記述する。それらは、処理すべき物質１ミリリットル（ｍｌ）あたり、メチオニナーゼの０．００１　から１００　単位（Ｕ）、好ましくは約０．０１から１０　Ｕ、そしてより好ましくは約０．１　から５　Ｕ　メチオニナーゼの範囲でありうる。
メチオニン枯渇条件とは、メチオニナーゼ酵素の生物活性と適合する緩衝液および温度の条件で、該酵素に適合する穏やかな温度、塩およびｐＨ条件を含む。典型的条件は、生理的条件が好ましいが、約４　〜４０℃、約０．０５から０．２　Ｍ　ＮａＣｌに等価なイオン強度、および約５から９のｐＨを含む。
好ましい実施態様において、本発明はメチオニナーゼを抗腫瘍剤として使用する方法を意図し、それゆえ、腫瘍細胞の集団を治療上有効量のメチオニナーゼと、該集団の細胞において細胞周期静止を誘導し、静的腫瘍細胞を形成させるに十分な期間接触させることを含む。
本明細書に記述するように、腫瘍細胞を細胞周期静止状態に置くことは種々の理由から好ましい。これらの理由には、選択的に腫瘍増殖を遅くする、静止している細胞を細胞死をもたらすほどの長期間維持することにより腫瘍細胞を殺す、後で行なう化学療法的治療に先立って腫瘍細胞の集団を細胞周期同調化のために準備する、等がふくまれるが、それだけに限定されない。
メチオニナーゼとの接触によって細胞周期静止を誘導するのに必要な期間は、幾つかの因子に依存する。例えば、細胞または細胞を含む培地と接触させるメチオニナーゼの量、メチオニンの量、酵素の比活性、温度および反応速度に影響をおよぼす他の反応条件、等の実践者によって容易に制御可能なパラメーターである。典型的な期間は、１０分から約３０日、好ましくは約１時間から２０日、そしてより好ましくは約１日から１０日である。
細胞周期静止とは、細胞が分裂せず、それぞれＧ０、Ｇ１、Ｇ２およびＳ期と呼ばれる各期からなる完全な細胞周期を細胞が進行していかない状態である。メチオニン枯渇後、細胞は正常な休止細胞に較べＤＮＡが蓄積していることから明らかなように、Ｓ／Ｇ２期末期で進行を停止するものと思われる。細胞周期静止を同定する方法は、種々の組織学的方法によって決定することができ、また細胞培養物によって評価することができる。そして上記の方法は、細胞集団のＤＮＡ含有量を実施例に記載のように測定することを伴う。
本発明の治療法が有用な腫瘍は、固形腫瘍または血液学的腫瘍に見いだされるような任意の悪性細胞型を含む。典型的固形腫瘍は、以下のものを含みうるがそれらだけに限定されない。すなわち、膵臓、結腸、盲腸、胃、脳、首、卵巣、腎臓、喉頭、肉腫、肺、膀胱、前立腺および乳房からなる群から選択される器官の腫瘍である。典型的な血液学的腫瘍は、骨髄の腫瘍、ＴまたはＢ細胞悪性疾患、白血病、リンパ腫、芽腫、骨髄腫、等である。
１つの実施態様においては、ｉｎ　ｖｉｖｏにおける接触は、静脈内または腹腔内注入により、治療上有効量の、本発明のメチオニナーゼを含む生理的に許容される組成物を患者に投与することにより達成され、それによって患者に存在する腫瘍細胞の循環性メチオニン供給源を枯渇させる。メチオニナーゼの接触は、腫瘍細胞を含む組織にメチオニナーゼを投与することによっても達成することができる。治療上有効量のメチオニナーゼとは、所望の効果を達成し（すなわち、腫瘍組織または患者の循環からメチオニンを枯渇させ）、それによって腫瘍細胞に分裂を停止させるために計算された、あらかじめ定められた量をいう。
【０００７】
したがって、本発明のメチオニナーゼ投与の用量範囲は、腫瘍細胞の分裂および細胞周期の進行という症状が減じる所望の効果を奏するのに十分な範囲である。用量は、好ましくない副作用、例えば高粘稠度、肺水腫、うっ血性心不全、等を引き起こすほど大きくてはならない。一般に、用量は患者の年齢、状態、性別および疾患の程度によって変わり、当業者によって決定され得る。
【０００８】
何らかの合併症が生じた場合は、それぞれの医師が用量を調整することができる。
本発明のメチオニナーゼの治療上有効量は、典型的には、生理的に許容される組成物として投与した時に、１　ｍｌあたり約０．００１から約１００単位（Ｕ）　、好ましくは約０．１　Ｕ以上、そしてより好ましくは１　Ｕメチオニナーゼという血管内（血漿）または局所的濃度を達成するのに十分な量である。典型的用量は体重に基づいて投与することができ、約１〜１０００　Ｕ／ｋｇ／日、好ましくは約５〜１００　Ｕ／ｋｇ／日、より好ましくは約１０〜５０　Ｕ／ｋｇ／日の範囲である。
好ましい方法においては、用いられるメチオニナーゼは本明細書中でさらに論じるように実質的にエンドトキシンを含まない。特に好ましいのは、実質的にエンドトキシンを含まない、組換えによって産生されたメチオニナーゼに使用である。
メチオニナーゼは、注射または時間をかけた徐々の注入によって、非経口的に投与することができる。メチオニナーゼは、静脈内、動脈内、腹腔内、経口、筋肉内、皮下、体腔内、経皮、皮膚に投与して、ぜん動性の手段によって送達するか、または腫瘍細胞を含む組織に直接注射するか、または潜在的バイオセンサーまたはメチオニンを含みうるカテーテルに連結したポンプによって投与することができる。
メチオニナーゼを含む治療組成物は、例えば単位用量の注射として静脈内に好都合に投与することができる。本発明の治療組成物に言及して使用する「単位用量」という用語は、患者への単位投薬として適する物理的に別個の単位を指し、各単位は所望の治療効果を奏するように計算された、あらかじめ定められた量の活性物質を希釈剤（すなわち、担体またはビヒクル）と共に含む。
これらの組成物は、投与剤形に適合する様式で、かつ治療上有効量を投与される。投与すべき量は、治療すべき患者、患者の系の活性成分を利用する能力、および望まれる治療効果の程度に依存する。投与を必要とされる活性成分の正確な量は医師の判断に依存し、各患者に特有のものである。しかし、全身的使用のための適切な用量範囲を本明細書に開示してあり、これは投与経路に依存する。最初の投与およびブースター投与の適切な方法もまた意図されており、これらは最初の投与とそれに続く、注射または他の手段によって行なわれる、１時間以上の間隔を置いた反復投与によって代表される。典型的な多重投与が本明細書中に記述され、それらはメチオニナーゼの高い血清および組織レベルおよび逆にメチオニンの低い血清および組織レベルを継続的に維持するのに特に好ましい。または、ｉｎ　ｖｉｖｏ療法について特定した範囲の血中濃度を維持するに十分な継続的静脈内注入もまた意図される。
ＩＩ．　メチオニン枯渇方法
本発明を実施する際、先に記述したようにメチオニン含有物質をメチオニナーゼに接触させることによるメチオニン枯渇は、１つ以上の補足的メチオニン枯渇工程を伴うことができる。さらに、本発明は本明細書にさらに記述するように、メチオニンの枯渇が望ましい場合の種々の治療方法を意図する。
ａ．メチオニン飢餓
例えば、メチオニンの周辺レベルを先ず低下させるために、メチオニン飢餓工程を用いてもよい。飢餓工程は、メチオニナーゼ接触工程に先立って、または該工程の間に実施される、腫瘍細胞をメチオニン飢餓期間の間メチオニンを含まない栄養分に接触させることを含む。メチオニン飢餓工程は、メチオニンを欠く培地（すなわち、低レベルのメチオニンを含む、またはメチオニンを全く含まない培地）のｉｎ　ｖｉｔｒｏ使用を含んでもよく、またはメチオニンを含まない食餌のｉｎ　ｖｉｖｏ使用を含んでもよい。メチオニンを含まない培地は組織培養技術において周知である。典型的な培地は、ＧＩＢＣＯ等から入手可能な、非必須アミノ酸を含むイーグルの最少必須培地（メチオニンおよび塩化コリンを欠く）である。メチオニン欠乏アミノ酸ダイエット食品もまた市販されており、Ｔｅｋｌａｄ，　Ｉｎｃ．から入手可能なダイエットＴＤ　９２０７７を含む。
メチオニン飢餓工程のための期間は、具体的な使用方法によって大幅に変わりうる。この期間は、メチオニンの細胞培養物、組織または血管濃度がより低いレベルに低下し、そしてそれ以上の実質的なレベル低下を停止するのに十分な期間である。典型的な期間は約６時間から約２か月でありうるが、好ましくは約１日から２週間である。
メチオニンは必須アミノ酸なので、本方法の多数の使用が正常細胞にとって幾らか毒性でありうることが理解されねばならない。しかし、本明細書に記述するように、正常細胞と腫瘍細胞はメチオニン前駆体ホモシステインを違った風に代謝するので、ホモシステインは腫瘍細胞のメチオニン依存性を救助しないが、正常細胞のメチオニン欠乏を補うことができる。
したがって、関連する実施態様において、本発明は、正常細胞によって必要な栄養補充をもたらすために使用されるホモシステインまたはその類似体等のメチオニン前駆体によって補充されうるメチオニン欠乏栄養物（培地または食餌）を用いる方法を意図する。ホモシステインを約５から約２００μＭ、好ましくは約１０から約１００μＭの濃度で栄養培地に添加することができる。
この実施態様において有用な好ましいメチオニン前駆体は、Ｌ−ホモシステイン−チオラクトン、ホモシステイン、および４−メチルチオ−２−オキソブタン酸を含む。
したがって、１つの実施態様においては、本発明はメチオニンの血管内濃度を枯渇させる期間にわたって哺乳動物にメチオニン欠乏食餌を与える工程を含む。該食餌は場合により、メチオニン補充物としてメチオニン前駆体を含んでもよい。または、メチオニン前駆体を注射または周知の他の経路により投与してもよい。食餌補充物としてのホモシステインの好ましい日用量は、１日につき哺乳動物体重１ｋｇあたり約５から約１０００　ｍｇのホモシステインである。
ホモシステインの投与経路は、典型的には添加すべきメチオニナーゼのそれと同じであり、該補充物を送達する標的組織に依存する。
ｂ．メチオニンを利用する酵素の競合的インヒビター
実施例に記述する観察の後に、メチオニンを利用する酵素の競合的インヒビターが、本明細書に記載のメチオニン枯渇法の効果を相乗的に増大させるのに有用であることがさらに判明した。したがって、本発明は腫瘍細胞をある量のメチオニンのインヒビターに、メチオニンを利用する酵素によってメチオニン代謝を阻害するのに十分な期間接触させることをさらに含むメチオニン飢餓工程の使用を意図する。競合的インヒビターを引き出すのに有用なメチオニンを利用する酵素は、Ｓ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ、メチオニンｔ−ＲＮＡシンターゼおよびメチオニンアデノシルトランスフェラーゼを含む。
好ましくは、メチオニンを阻止するのに必要とされる期間は、メチオニン飢餓期間自体の継続期間である。
メチオニンの競合的インヒビターは、メチオニンを利用する酵素の基質としてメチオニンと競合し、それゆえ直接競合によって、内因性メチオニンが奏するかもしれない任意の正常な代謝効果を阻害するように作用する。すなわち、メチオニン代謝を阻害する。細胞がメチオニンおよび付随するメチオニン代謝を必要とする場合、競合的インヒビターはメチオニンの代謝を低下させるように作用し、これは高いメチオニン濃度をもたらし、インヒビターが存在しない場合に観察されるのと同じ効果を生じる。
メチオニンの競合的インヒビターは、古典的な競合的インヒビターとして機能する任意のメチオニン誘導体でありうる。典型的な競合的インヒビターは、メチオニンのアルキル誘導体（すなわち、アルキルチオニン類）を含み、これらの誘導体ではメチオニンのメチル基がエチル基（エチオニン）、プロピル基（プロチオニン）、ブチル基（ブチオニン）、またはペンチル基（ペンチオニン）によって置換されている。
シクロロイシンおよびハロゲン化メチオニンもまた有用なメチオニンの競合的インヒビターとして考えられる。典型的なハロゲン化メチオニンは、フルオロメチオニン、クロロメチオニン、ブロモメチオニンおよびヨードメチオニンからなる群より選択される。したがって、意図されるメチオニンの競合的インヒビターは、アルキルチオニン、シクロロイシン、およびハロゲン化メチオニンからなる群より選択され、ここでアルキルチオニンはメチオニンではない。
競合的にメチオニンを阻止するのに有効な、メチオニンの競合的インヒビターの量とは、メチオニンの有効濃度を低下させる量である。この量は、典型的には、実施例に示すように、存在するメチオニンに対してモル過剰である。典型的には、インヒビターのこの量はメチオニンが競合させられる培地中のメチオニン濃度に対して１０から１０００倍モル過剰であり、好ましくは少なくとも２０倍モル過剰、そしてより好ましくは少なくとも５０倍モル過剰である。インヒビターがｉｎ　ｖｉｖｏで用いられる場合は、その用量は本明細書に示すように典型的には動物の体重１ｋｇあたり約５〜３０　ｍｇ、好ましくは約２５　ｍｇ／ｋｇである。
効果的であるために必要とされるインヒビターの量は、インヒビターが投与される時に存在する内在性メチオニンの量によって変わりうる。メチオニン濃度とインヒビターの有効濃度との関係は、実施例に示す用量滴定結果によって示される。そしてこの関係は、競合的インヒビターの古典的な反応速度論によって規定される。インヒビターの典型的な量は、約１０μＭから約１　ｍＭである。
さらに、効果的インヒビターの量は、本明細書に記述するｉｎ　ｖｉｔｒｏ組織培養法によってあらかじめ定めて、まず特定の腫瘍組織における本明細書に記載の任意の方法によるメチオニン枯渇の効果的条件を確立し、次にインヒビターの有効濃度を決定することができる。
メチオニンの競合的インヒビターを用いることによるメチオニン代謝の阻害は、実施例に記載のインジケーター（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）を含む種々のインジケーターによりモニターすることができる。これらのインジケーターは、組織を培養して細胞周期阻止のインジケーターとしてＤＮＡ含有量を測定すること、およびメチオニンを含まない食餌を与えたマウスにおける腫瘍組織増殖の阻止の増大、を含む。当業者には他のインジケーターも明らかであろう。
ｃ．多重メチオニン枯渇法を用いた相乗効果　−　抗メチオニン化学療法
１つの実施態様において、本発明は、２つ以上の異なるメチオニン枯渇法を用いた場合に起こる相乗作用を利用するために、一般に抗メチオニン化学療法と呼ばれるメチオニン枯渇のための多重法の使用を意図する。
本明細書に記述するメチオニン枯渇方法は、以下のものを含む。すなわち、（１）メチオニンを含まない培地（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）または食餌（ｉｎ　ｖｉｖｏ）を用いたメチオニン飢餓、（２）酵素的に内在性メチオニンレベルを枯渇させるためのメチオニナーゼへの暴露、（３）メチオニンレベルがすでに低下している場合は、特に（１）および（２）と組み合わせて、内在性メチオニンの有効レベルを低下させるメチオニンの競合的インヒビター、および（４）他の３つのメチオニン枯渇法の任意のものの腫瘍細胞に対する選択性を増大させる、本明細書に記載のホモシステイン等のメチオニン前駆体の使用である。
したがって、メチオニン枯渇のための本明細書に記載の抗メチオニン化学療法は、上記の方法の種々の組み合わせのいずれによっても実施することができる。これらの組み合わせは、（１）＋（２）、（１）＋（３）、（２）＋（３）、（１）＋（２）＋（３）、およびこれら４つの組み合わせのいずれかプラス（４）を含む。
【０００９】
メチオニンの最大限枯渇および生じる代謝生成物の点から特に好ましいのは、メチオニンを含まないがメチオニン前駆体を含む食餌の使用、およびこれに加えて、メチオニンの競合的インヒビターおよびメチオニナーゼの使用である。
ＩＩＩ．　抗有糸分裂腫瘍療法の増強
別の実施態様において、本発明は本明細書に記載のメチオニン枯渇法を、従来の化学療法の効力および選択性、好ましくは癌療法に使用される抗有糸分裂剤の選択性を増大させる（増強する）ための方法に使用することを意図する。
従来の抗有糸分裂療法と組み合わせてメチオニン枯渇工程を使用する重要な目的は、以下の事実を利用することである。すなわち、メチオニン枯渇は選択的かつ特異的に腫瘍細胞増殖を有糸分裂の前で停止させるので、細胞、組織、培地または血管系にメチオニンを充満させると、静的細胞は同調的に細胞周期を開始して有糸分裂に入り、細胞集団が一様に増殖するようになり、細胞周期特異的化学療法の効果を受けやすくなる、という事実である。腫瘍細胞に細胞周期静止を引き起こすために、任意の細胞周期毒性剤を使用することができる。そのような作用物質は当業者には周知である。好ましい実施態様においては、細胞周期毒性剤は抗有糸分裂剤である。
したがって、好ましい実施態様において、本発明は、静的腫瘍細胞を形成するための本明細書に記載のメチオニン枯渇法、およびそれに続く以下の付加的工程を含む抗腫瘍化学療法の方法を意図する：
（ａ）静止腫瘍細胞を細胞周期誘導量のメチオニンと接触させて静的腫瘍細胞の有糸分裂を開始させ、それによって有糸分裂細胞を形成し、そして
（ｂ）該有糸分裂細胞を、該有糸分裂細胞の有糸分裂を阻止するに十分な量の抗有糸分裂剤に接触させ、それによって腫瘍細胞の増殖を阻止する。
メチオニン、メチオニン塩、および静的細胞の細胞周期を開始させるように機能するそれらの機能性等価物は、細胞周期誘導剤と呼ばれ、これらは組み合わせてまたは単独で、メチオニンを枯渇させた腫瘍細胞集団の１以上の静的細胞において細胞周期および有糸分裂を開始させるための試薬として用いることができる。細胞周期誘導剤の細胞周期誘導量とは、メチオニンを枯渇させた腫瘍細胞集団の静的細胞の少なくとも少数（１０％）、好ましくは大多数、そしてより好ましくは少なくとも９０％　において細胞周期を開始させる量である。細胞周期の開始および程度は、組織学的マーカーまたは代謝マーカーの使用により容易に測定することができる。メチオニンについては、細胞周期誘導量は典型的には約１　μＭから約２．５ｍＭ、好ましくは約１０〜２５０μＭである。Ｓ期特異的薬剤を同様に用いて、メチオニンを充満させた時にまだＳ期に留まっている腫瘍細胞を攻撃することができる。
細胞周期誘導剤の静的腫瘍細胞への接触（投与）経路はさまざまであるが、典型的にはメチオニナーゼまたは競合的インヒビターを投与するのに用いる本明細書に記載の経路と同じである。
静的腫瘍細胞を細胞周期誘導剤に接触させる時機および期間は、腫瘍および経験的（例えば、本明細書に記載の組織培養法によって）に決定することができる他の要件によって変わりうる。細胞周期誘導剤は、抗有糸分裂剤の前に、または実質的にこれと同時に添加することができる。特定の抗有糸分裂剤が迅速に作用し、また細胞周期の誘導が遅いことが分かっている場合は、誘導剤を抗有糸分裂剤の前に添加することが有利であろう。これらのパラメーターは、特定の腫瘍タイプ、組織の位置、抗有糸分裂剤の選択、等に依存しうる。さらに、時機、用量および薬剤選択等の変数の最適化を、治療組成物のｉｎ　ｖｉｖｏ投与に先立って、種々の方法により容易に実施することができる。好ましい最適化手順は、本明細書に記載の典型的組織培養アッセイ系の使用である。
抗有糸分裂剤を接触させる時機は、静的腫瘍細胞の細胞周期の誘導に依存する。典型的には、抗有糸分裂剤は、細胞周期進行中の任意の時期、および細胞が有糸分裂を始めて直ぐに、有糸分裂細胞と接触させることができる。幾つかの腫瘍細胞集団においては、誘導剤の添加後にこの現象が迅速に起こり、静的腫瘍細胞への誘導剤および抗有糸分裂剤の同時またはほぼ同時の添加を可能とする。または、抗有糸分裂剤を誘導剤の約１時間から３０日後に添加してもよいが、好ましくは誘導の１または２日以内に添加する。
本明細書に使用する抗有糸分裂剤または他の細胞周期特異的作用物質は、細胞増殖、有糸分裂または細胞周期に向けられた、細胞毒性に基づく作用機構を示す任意の作用物質でありうる。したがって、抗有糸分裂剤は代謝拮抗物質、または分裂中の（有糸分裂）細胞に異なった様式で毒性を示す種々の化合物の任意のもの含みうる。本発明の方法に用いる抗有糸分裂剤の好ましい臨床薬理学は、細胞有糸分裂活性の阻害、核酸合成の阻害、アルキル化剤、抗生物質、アルカロイド、およびそれらに類似した抗腫瘍剤である。薬理学の分野が絶え間なく進歩するかぎりにおいて、本発明は現在公知の抗有糸分裂剤および他の細胞周期特異的作用物質に限定されるものではなく、むしろ公知化合物、新規に発見された化合物、または開発された化合物の等価物、並びに必要な活性を示す類似の作用物質の使用を含むものであることが理解されねばならない。
典型的なアルキル化剤は、シクロホスファミド（ＣＴＸ；　ｃｙｔｏｘａｎ）、クロラムブシル（ＣＨＬ；　ｌｅｕｋｅｒａｎ）、シスプラチン（ＣｉｓＰ；　ｐｌａｔｉｎｏｌ）、ブスルファン（ｍｙｌｅｒａｎ）　、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、マイトマイシンＣ、および類似のアルキル化剤である。
典型的な代謝拮抗物質は、メトトレキセート（ＭＴＸ）、エトポシド（ＶＰ１６；　ｖｅｐｅｓｉｄ）、６−メルカプトプリン（６ＭＰ）、チオグアニン（６ＴＧ）、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、および類似の代謝拮抗物質を含む。典型的な抗生物質は、アクチノマイチンＤ、ドキソルビシン（ＤＸＲ；アドリアマイシン）、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよび類似の抗生物質を含む。
典型的なアルカロイドは、ビンクリスチン（ＶＣＲ）、ビンブラスチン等のビンカアルカロイド等を含む。
他の抗腫瘍剤は、タキソールおよびタキソール誘導体、デキサメタゾン（ＤＥＸ；ｄｅｃａｄｒｏｎ）等の細胞増殖抑制剤グルココルチコイド、プレドニゾン等のコルチコステロイド、ヒドキシ尿素等のヌクレオシド酵素インヒビター、アスパラギナーゼ等のアミノ酸枯渇酵素、および類似の多様な抗腫瘍剤を含む。
上記の抗有糸分裂（細胞毒性）剤の合成および製剤は周知であり、種々の文献に記述されているので、本明細書では繰り返し記述しない。上記作用物質の合成および製剤のための典型的文献は、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ　Ｄｅｓｋ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，　Ｂａｒｎｈａｒｔ編、Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ，　Ｉｎｃ．，　Ｏｒａｄｅｌｌ，　Ｎ．Ｊ．，　１９９２；　およびＭｅｒｃｋ　Ｉｎｄｅｘ，　　第１１版、Ｍｅｒｃｋ　＆　Ｃｏ．，　１９８９を含む。
化学療法における上記の細胞毒性剤の使用は、癌治療技術において一般に良く特徴付けられており、本明細書におけるそれらの使用は、若干の調整を加えれば、耐性および効果をモニターし、また投与経路および用量をコントロールするために考慮すべき事柄は癌治療のそれらと同一である。例えば、細胞毒性剤の実際の用量は、本発明の組織培養法を用いて測定された、患者の培養細胞の応答によって変わりうる。一般に、本明細書の開示に示すように、同調化細胞周期の不在下で使用される量に較べ、用量は減らされる。
効果的細胞毒性剤の典型的な用量は、製造業者によって推奨される範囲内にありうる。そしてｉｎ　ｖｉｔｒｏ応答または動物モデルにおける応答によって表示される場合には、マグニチュード濃度または量の約１桁分まで用量を減らすことができる。したがって、実際の用量は医師の判断；患者の状態；および一次培養した悪性細胞または組織培養した組織サンプルのｉｎ　ｖｉｔｒｏ応答性、または適切な動物モデルにおいて観察された応答に基づく治療法の効果に依存する。
ＩＶ．　遺伝子療法
別の実施態様においては、本発明は、本発明のメチオニナーゼ接触法によって処理すべき組織または該組織周辺のリンパ球内でメチオニナーゼを発現させるために、ｒＤＮＡの使用を意図する。この目的のため、調節可能なメチオニナーゼ発現遺伝子を発現させ、それによってメチオニナーゼ遺伝子産物を産生させることにより、メチオニナーゼを接触工程のために提示することが考えられる。
先に記述したように、使用することのできる、現在公知の非常に様々な、メチオニナーゼの発現に適切な発現ベクターが存在する。１つの実施態様においては、メチオニナーゼ遺伝子の発現は調節可能である。したがって、発現ベクターは、第１のメチオニナーゼをコードする配列に機能しうる形で連結された第２のヌクレオチド配列を有し、これはメチオニナーゼ遺伝子の発現を調節するための手段を規定する。典型的な手段は誘導性プロモーターで、好ましくは腫瘍特異的プロモーターである。その中でメチオニナーゼ遺伝子の発現が腫瘍特異的プロモーターによって制御される発現モジュールは、本明細書に記載の遺伝子療法に特に有用である。
誘導性プロモーターの１クラスは、培養培地に添加することができる、またはメチオニナーゼ遺伝子を発現するための該遺伝子を含む宿主細胞に容易に浸透できる成分に対し、応答性である。別のクラスは、上記の腫瘍特異的プロモーター、例えば癌胎児性抗原（ＣＥＡ）である。
したがって、本発明はメチオニナーゼと腫瘍細胞集団との接触が以下の工程を含む、メチオニン枯渇法をも意図する：
（ｉ）　発現ベクターを腫瘍細胞、もしくは腫瘍に浸潤しているリンパ細胞またはそれらの骨髄前駆体にｉｎ　ｖｉｖｏまたはｅｘ　ｖｉｖｏで導入し（ここで該発現ベクターはメチオニナーゼをコードし、メチオニナーゼの調節された発現が可能であるヌクレオチド配列を有し、かつメチオニナーゼの発現を調節する手段を提供するヌクレオチド配列を有する）、メチオニナーゼ遺伝子でトランスフェクトされた細胞を形成し；
（ｉｉ）　腫瘍細胞をｉｎ　ｖｉｖｏで上記メチオニナーゼ遺伝子でトランスフェクトされた細胞に接触させ；そして
（ｉｉｉ）　メチオニナーゼをコードするヌクレオチド配列を該トランスフェクトされた細胞中で発現させ、それによって該トランスフェクトされた細胞中でメチオニナーゼを産生させ、そしてそれによって腫瘍細胞を産生されたメチオニナーゼと接触させる。「導入する」とは、発現ベクターに含まれる遺伝子が標的細胞によって発現されるような様式で発現ベクターを標的細胞に挿入する、当業者に公知の任意の方法を意味する。この導入は、ｅｘ　ｖｉｖｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏで実施することができる。このような「導入」は、例えばトランスフェクション、形質転換、またはウイルス感染によって実施することができる。
腫瘍細胞のトランスフェクションは、付着細胞であれ、浮遊細胞であれ、またはｉｎ　ｖｉｖｏの細胞であれ、種々の公知のトランスフェクション法によって達成することができる。その後、トランスフェクトされた細胞（ｅｘ　ｖｉｖｏトランスフェクションを用いた場合）を宿主中に再導入し、処置すべき組織の天然の、適切な近辺に位置させ、それによってトランスフェクトされた細胞を処置すべき腫瘍細胞と接触させる。トランスフェクトされる細胞へのメチオニナーゼの導入は種々の手段によって達成可能であるが、一般には選択マーカーの存在を必要とする。
１つの実施態様においては、遺伝子の発現を調節する手段は、培地に添加することのできる試薬に対して応答性の誘導性プロモーターである。この例はメタロチオネインプロモーターである。または、誘導性プロモーターは腫瘍特異的プロモーターでありうる。このようなプロモーターは、メチオニナーゼの発現を腫瘍細胞に向けるように作用する。
トランスフェクトされるべき細胞は、腫瘍細胞のサンプル、または腫瘍に浸潤している細胞等の正常な免疫細胞（例えば、腫瘍に浸潤しているリンパ球または、造血幹細胞、前駆細胞等の骨髄の骨髄前駆体）でありうる。上記細胞はｉｎ　ｖｉｖｏまたはｅｘ　ｖｉｖｏでありうる。
実施例９は、メチオニナーゼをコードする核酸分子の単離を記述する。この実施例はさらにメチオニナーゼを産生するためのバッチ発酵に用いる発現ベクターの作製を記述する。当業者は、例えばｐＡＣ−１　中に提供されるようなクローン化メチオニナーゼ遺伝子を容易に使用して、上記の遺伝子療法における使用に適した発現カセットを作製することができる。
Ｃ．治療組成物
別の実施態様においては、本発明は、治療上有効量の実質的に単離された、好ましくは遺伝子組換えにより産生されたメチオニナーゼを、製薬上許容される担体と共に含む治療組成物を意図する。
Ｌ−メチオニナーゼ（Ｌ−メチオニン−α−デアミノ−γ−メルカプトメタン−リアーゼまたはメチオニナーゼ）は、脱アミノ反応および脱チオメチル反応によりメチオニンを分解する酵素である。メチオニナーゼ活性は、少なくともメチオニンの開裂後に形成されるα−ケト酪酸の量を測定することにより測定することができる。メチオニナーゼの１単位（Ｕ）は、Ｉｔｏら，Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　７９：１２６３−１２７２，　１９７６；およびＳｏｄａ，　Ａｎａｌｙｔ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２５：２２８−２３５，　１９６８に記述される標準的アッセイ条件下で、メチオニンから１分あたり１マイクロモルのα−ケト酪酸を生成する酵素の量と定義される。
メチオニナーゼは、実施例９および１２に記述するような細菌培養物からの直接単離、またはメチオニナーゼタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子からの発現を含めて、種々の源から調製することができる。
メチオニナーゼの細菌性供給源は、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・オバリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｖａｌｉｓ）およびアエロモナス種（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）、並びに他の任意の潜在的メチオニナーゼ供給源を含む。Ｐ．プチダ株はＡＴＣＣから商業的に入手可能であり、それぞれ受託番号ＡＴＣＣ　８２０９およびＡＴＣＣ　７９５５を有する。他の細菌は、一般に学究的な研究機関から入手可能である。メチオニナーゼの精製は、種々の方法によって記述されている。例えば、Ｋｒｅｉｓら，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　３３：１８６２−１８６５，　１９７３；　Ｔａｎａｋａら，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　６６：３０７−３１１，　１９７６；　Ｉｔｏら，Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　７９：１２６３−１２７２，　１９７６；　Ｎａｋａｙａｍａら，Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　４８：２３６７−２３６９，　１９８４；およびＳｏｄａ，　Ａｎａｌｙｔ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２５：２２８−２３５，　１９６８　参照。しかし、これらの方法はいずれも高度に純粋な、エンドトキシンを含まないメチオニナーゼをもたらしていない。本発明は、メチオニナーゼが実質的にエンドトキシンを含まなくなるように精製するために用いた２つの方法を提供する。
好ましいメチオニナーゼは、タンパク質１　ｍｇあたり約１０〜約５０単位（Ｕ）の比活性を有する。精製メチオニナーゼの典型的調製物は、約１０〜約５０　Ｕ／ｍｇの比活性を有すると本明細書に記述されている。実施例１２において、発現ベクターｐＡＣ−１
を用いて調製したメチオニナーゼは、約２０．１　Ｕ／ｍｇの比活性を有していた。
好ましいメチオニナーゼは、好ましくは実質的に単離されている。実質的に単離されているとは、該酵素が重量を基準として少なくとも５０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９９％純粋であるか、または本質的にホモジニアスであることを意味する。好ましいタンパク質は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）等の電気泳動媒体を用いて分析すると、本質的にホモジニアスである。ＰＡＧＥにかけるとホモジニアスであるとは、検出可能なバンドが一本のみであることを意味する。
好ましいメチオニナーゼは、静脈内または腹腔内投与等によってエンドトキシンが生理的に哺乳動物体内で接触した場合のエンドトキシンに伴う望ましくない副作用ゆえに、細菌性リポ多糖等のエンドトキシンを実質的に含まない。実質的に含まないとは、メチオニナーゼタンパク質　１　ｍｇ　あたり約１０　ｎｇ未満のエンドトキシン、好ましくはメチオニナーゼ　１　ｍｇ　あたり　１　ｎｇ未満のエンドトキシン、そしてより好ましくはメチオニナーゼ　１　ｍｇ　あたり　０．１　ｎｇ未満のエンドトキシンを意味する。エンドトキシンのアッセイは治療技術の分野で周知であり、種々の方法のうち任意のものにより実施することができる。好ましい方法は実施例に記述されている。
好ましいメチオニナーゼは、その保存性および高温条件下で使用された場合（例えば動物の体内におけるｉｎ　ｖｉｖｏ使用）の効果を増大させるように、熱安定性である。熱安定性とは、酵素が６０℃に１０分間暴露されて、その比活性の８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％を保持できることを意味する。
好ましいメチオニナーゼは、少なくとも５時間、好ましくは６時間、より好ましくは少なくとも７時間の血清半減期を有する。
特に好ましいのは、Ｐ．プチダから調製されたメチオニナーゼ、またはＰ．プチダから単離されたメチオニナーゼをコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターを用いて調製したメチオニナーゼである。Ｐ．プチダメチオニナーゼは、ＰＡＧＥ−ＳＤＳで分析した場合、約４３キロダルトンの見かけ分子量を有する。好ましいメチオニナーゼ精製法を実施例に記述する。
したがって、治療組成物は、生理的に許容される担体を、活性成分としてそこに溶解または懸濁させた実質的に単離されたメチオニナーゼと共に含む。好ましい実施態様においては、該治療組成物は治療上の目的でヒト患者に投与した場合、免疫原性でない。
本発明の１実施態様は、ポリマーに結合させたメチオニナーゼからなる、化学的に改変されたメチオニナーゼを特徴とする。好ましくは、上記メチオニナーゼは実質的に単離されており、かつ実質的にエンドトキシンを含まない。「化学的に改変された」とは、天然から精製されたメチオニナーゼと異なった形に変化させた、任意の形のメチオニナーゼを意味する。好ましくは、メチオニナーゼをポ
リエチレングリコール等のポリマーと結合させることにより化学的に改変する。
【００１０】
本明細書中に用いる「製薬上許容される」、「生理的に許容される」という用語およびそれらの文法的変形は、それらが組成物、担体、希釈剤および試薬に言及している場合、相互交換可能に使用され、そして該物質が望ましくない生理的効果（例えば、吐き気、めまい、胃のむかつき等）を生じることなく哺乳動物またはヒトの内部または上に投与可能であることを表す。
溶解または懸濁させた活性成分を含む医薬組成物の調製は、当分野でよく理解されている。典型的には、そのような組成物は、水性または非水性の液体溶液または懸濁物の形で無菌の注射剤として調製されるが、使用前に液体中に溶解または懸濁するのに適した固形製剤としても調製することができる。該調製物を乳化することもできる。特に好ましいのは、本明細書に記載のリン脂質およびリポソーム組成物である。さらに、治療量のメチオニナーゼを軟膏または拡散性パッチ（包帯等）中に存在させ、該作用物質の局所的送達をもたらすこともできる。
活性成分を、製薬上許容され、かつ該活性成分と適合し、本明細書に記載の治療法に使用するのに適切な量の賦形剤と混合することができる。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセリン等およびそれらの組み合わせである。さらに、所望であれば、該組成物は少量の湿潤化剤、乳化剤、ｐＨ緩衝化剤、等の活性成分の効果を増強する補助的物質を含むことができる。
本発明の治療組成物は、活性成分の製薬上許容される塩を含むことができる。製薬上許容される塩は、無機酸（塩酸またはリン酸、等）または有機酸（酢酸、酒石酸、マンデル酸、等）によって形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離のアミノ基によって形成される）を含む。遊離のカルボキシル基によって形成される塩もまた、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄等の無機塩基およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基から誘導することができる。
生理的に許容される担体は、当分野で周知である。典型的な液体担体は、活性成分および水以外は何も含まない、またはそれら以外に生理的ｐＨ値のリン酸ナトリウム等の緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩水等の生理食塩水、またはその両方を含む、無菌の水性溶液である。さらに、水性担体は２以上の緩衝塩、並びに塩化ナトリウムおよび塩化カリウム等の塩、デキストロース、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および他の溶質を含むことができる。
液体組成物は、水の他に、および水を除外して、本明細書に記載するように液相をも含むことができる。そのような付加的液相の典型的例は、グリセリン、綿実油等の植物油、オレイン酸エチル等の有機エステル、および水−油エマルジョン、特に先に記述したリポソーム組成物である。
治療組成物は有効量のメチオニナーゼを、典型的には治療組成物の全重量に対して少なくとも０．１　重量パーセントの活性タンパク質を、そして好ましくは少なくとも２５重量パーセントの活性タンパク質を含む。重量パーセントとは、全組成物に対するメチオニナーゼタンパク質の重量比である。したがって、例えば、０．１　重量パーセントは全組成物１００　ｇあたり０．１　ｇ　のメチオニナーゼである。
メチオニナーゼ組成物がｉｎ　ｖｉｖｏで静脈内に用いることができる限り、１つの実施態様においてメチオニナーゼの制御された送達のための治療組成物を製剤し、そして場合により、メチオニナーゼタンパク質を分解、および投与されたメチオニナーゼの血清半減期を減少させるであろう他の現象から保護することが意図される。
したがって、１つの実施態様においては、本発明は送達ビヒクル、例えばポリマー、ポリマー性ビヒクル、粒子、ラテックス、コアセルベート、イオン交換樹脂、リポソーム、腸溶剤皮（ｅｎｔｅｒｉｃ　ｃｏａｔｉｎｇ）、媒介物、バイオ接着剤、マイクロカプセル、ヒドロゲル等および類似のビヒクルを含む治療組成物を意図する。リポソームを含む典型的な薬物送達ビヒクルは、少なくともＴａｒｃｈａによって”Ｐｏｌｙｍｅｒｓ　Ｆｏｒ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，　ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，　１９９０に記述されている。
本発明はさらに、他の公知の方法に較べてより優れた収率および純度をもたらすメチオニナーゼの詳細な精製方法を提供する。組換えメチオニナーゼ、特にメチオニナーゼをコードする高発現モジュールを含む形質転換宿主を用いて産生したメチオニナーゼの好ましい精製法は、以下の工程を含む：
ａ）水性緩衝液中にメチオニナーゼを含む、形質転換細胞の抽出物を約４０〜６０℃で約１〜１０分間、好ましくは５０℃で１　分間加熱し；
ｂ）加熱した抽出物をＧＳ−３ローター（Ｓｏｒｖａｌ　Ｄｕ　Ｐｏｎｔ）を用いて約１０ｋから２０ｋ
ｒｐｍで約１５分から１時間、好ましくは約１３ｋ　ｒｐｍ　で約３０分４　℃で遠心し；
ｃ）細孔径が約５０Ｋから１００Ｋのフィルター、好ましくはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｐｒｅ／Ｓｃａｌｅ：ＴＴＦＰＬＨＫ　１００　Ｋ　２．５　ｆｔ２カートリッジを用いて、１０　ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ　８．３）を用いて上清を限外濾過し；
ｄ）低イオン強度（約１０〜５０　ｍＭ）のＫＣｌをｐＨ約７．０〜７．６の１０−２０　ｍＭのリン酸カリウム緩衝液中で用いて、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーを実施し（好ましくはＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ　カラムを用いる）、そして約４０〜２００　ｍＭのＫＣｌ勾配を用いて溶出した、メチオニナーゼを含む画分を回収し；
ｅ）中程度イオン強度（５０〜１００　ｍＭ）のＫＣｌをｐＨ約８．０〜８．６の１０−２０　ｍＭのリン酸カリウム緩衝液中で用いて第２のＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーを実施し（好ましくはＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ　カラムを用いる）、そしてリン酸緩衝液（ｐＨ８．３）で緩衝化した１００〜２００　ｍＭ　ＫＣｌを用いて溶出した、メチオニナーゼを含む画分を回収し；そして
ｆ）上記工程ｅ）で回収した画分を、エンドトキシンを吸収することのできるクロマトグラフィー媒体と接触させ（好ましくは　ＡｃｔｉｃｌｅａｎＴＭ　Ｅｔｏｘカラムを使用する）、そして溶出液を回収し、これによって該溶出液からエンドトキシンを除去して、タンパク質　１　ｍｇあたり少なくとも２０単位の活性を有し、かつタンパク質　１　ｍｇあたり約１〜１００　ｎｇのエンドトキシンを含む、実質的にエンドトキシンを含まないメチオニナーゼを形成する。
好ましくは、細胞抽出物は高レベル（全細胞性タンパク質の５〜７５％）の組換えメチオニナーゼを発現するように変更された宿主細胞から調製される。または、本来メチオニナーゼを発現する生物を出発材料として用いることができる。細菌の細胞抽出物については、抽出物は一般にまず集菌し、そして細菌細胞培養物を洗浄して、集菌が遠心でなされたか又は中空糸濾過によってなされたかによって細胞ペースト／ペレットを形成することにより調製される。これらの方法は一般に周知である。
次に、通常の手段を用いて細胞を破砕する。好ましくは、キャビテーター（ｃａｖｉｔａｔｏｒ）型ホモジナイザー、例えばＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ　Ｃｏｒｐ．モデル　＃ＨＣ８０００等のホモジナイザーを用いて細胞を破砕する。
得られた懸濁物を加熱して、選択タンパク質および他の不溶性物質を沈殿させる。典型的加熱条件は、約４５−６０　℃で１−１０分間である。５０℃１分間の加熱工程が好ましい。
加熱した抽出物を遠心にかけて破砕物を除去し、上清を濾過して、上記のように２工程にしてＤＥＡＥイオン交換媒体に適用する。このましい吸着および溶出条件を実施例に記述する。これらの工程では、種々のＤＥＡＥイオン交換カラムクロマトグラフィー媒体の任意のものが使用でき、媒体の選択は限定的なものと解釈されるべきではない。商業的供給源は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＢｉｏｒａｄおよびＳｉｇｍａを含む。
その後、エンドトキシンを除去して、先に記述した許容されるレベルのエンドトキシンを含むタンパク質を調製する。エンドトキシン除去工程は、周知の種々の手段のうち任意のものを用いて実施でき、そして典型的には溶液中のタンパク質をエンドトキシンを吸着することのできるクロマトグラフィー媒体に接触させて、エンドトキシンを含まないタンパク質を含有するクロマトグラフィー媒体溶出液を得ることを包含する。エンドトキシンの除去に用いる好ましい市販の試薬は、Ａｃｔｉｃｌｅａｎ　ＴＭ　Ｅｔｏｘである。
Ｄ．化学的に改変されたメチオニナーゼ
メチオニナーゼの半減期を延長し、かつその免疫原性または抗原性を減少させるため、メチオニナーゼをポリマーと結合させることができる。
【００１１】
過敏な患者においてはアレルギー性応答の可能性がある。他方、抗メチオニナーゼ抗体はメチオニナーゼの半減期を短くする可能性がある。
ポリペプチドおよびタンパク質の抗原性の問題を解決しようと試みて、種々のアプローチが採用されてきた。ポリエチレングリコール等のポリマーをタンパク質と結合させることは、タンパク質の抗原性を減少させるアプローチの１つである。本発明は、新規でかつ効果的な方法によって産生されるメチオニナーゼの化学的改変に関する。この改変においては、精製メチオニナーゼはこの酵素の活性が維持される条件下でポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合される。本発明のＰＥＧ−メチオニナーゼは延長された半減期を有し、また明白な免疫原性を何ら有さない。
ポリエチレングリコールに結合した新規なメチオニナーゼ（「ＰＥＧ−メチオニナーゼ」または「ＰＥＧ化　（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）メチオニナーゼ」）は、高いメチオニン枯渇活性、延長された半減期、および低い免疫原性を示す。したがって、ＰＥＧ化メチオニナーゼは、安定性を維持し、該酵素の血清半減期を延長し、免疫原性を低下させ、そして毒性を低下させる一方で、腫瘍増殖を阻止する新規な手段を提供する。
安定で、長い半減期を有してメチオニン枯渇に有効であり、そして非免疫原性であるＰＥＧ化メチオニナーゼの発明は、安全で効果的な多数回投与用の抗腫瘍剤として利用可能である。ＰＥＧ−メチオニナーゼは、１０　ｍＭ　のリン酸ナトリウム（ｐＨ　７．２）に溶解した０．１２　Ｍ塩化ナトリウム液体製剤中に　−７０℃、４　℃および室温で活性を喪失することなく保存することができる。
重要なことに、本発明のＰＥＧ−メチオニナーゼは、メチオニナーゼに感受性であって反復投与を必要とする癌患者を治療するのに該メチオニナーゼを特に望ましいものとする非免疫原性である。当業者は、メチオニナーゼとして該ＰＥＧ−メチオニナーゼが種々の剤形で提供され得ることを認識するであろう。
精製された、エンドトキシンを含まないメチオニナーゼの好ましい剤形は、０．０６Ｍから０．２　Ｍ　の濃度で、１０　ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ　７．２）に溶解した０．１２　Ｍ塩化ナトリウム中にあることである。この活性は約１０単位／ｍｇ　である。
ＰＥＧ化メチオニナーゼは、当業者に周知の手段によって試験することができる。例えば、ｉｎ　ｖｉｖｏ試験を用いて、本発明の方法により作製したＰＥＧ−メチオニナーゼの薬理学、安全性および機能的特徴を確認することができる。
このような試験は、急性毒性の測定、ＰＥＧ−メチオニナーゼの薬物動態、血清中のメチオニンの枯渇、およびＰＥＧ−メチオニナーゼの免疫原性の評価を含む。
精製された、エンドトキシンを含まないＰＥＧ−メチオニナーゼを、マウスの尾静脈に注射し、そして血液サンプルを２　時間ごとに採取する。メチオニナーゼのレベルを活性アッセイにより測定する。メチオニンのレベルを、メチオニン誘導体化後ＨＰＬＣによって測定する。
急性毒性試験は、実施例５および１５に記載するような任意の適切な実験動物を用いて実施することができる。マウスにおいては、１　〜１０　ｍｇあたり１０〜１００単位のＰＥＧ−メチオニナーゼを尾静脈に注射する。生死に関わる兆候および視覚的観察を記録する。血液サンプルは、注射前および注射後２　時間毎に採取する。メチオニナーゼ活性およびメチオニンレベルの両方を測定する。腎および肝機能の両方もまた測定する。肺、腎臓、肝臓および脳等の組織に及ぼす毒性効果の存在または不在を標準的技法により確認する。血液および骨髄も分析する。
別の実施態様においては、メチオニナーゼをポリマーに結合させて実質的に非免疫原性な組成物をもたらし、またｉｎ　ｖｉｖｏにおけるメチオニナーゼ活性の半減期の増大をもたらす。
１つの実施態様においては、ポリマーに結合させることによりメチオニナーゼを化学的に改変する。
別の実施態様においては、ポリアルキレンオキシドに結合させることによりメチオニナーゼを化学的に改変する。ポリアルキレンオキシドの例は、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、エチレンオキシドのコポリマー、およびプロピレンオキシドのコポリマーを含むが、これらだけに限定されない。
好ましい実施態様においては、ポリエチレングリコールと結合させることによりメチオニナーゼを化学的に改変する。
別の好ましい実施態様においては、ポリエチレングリコールに結合させたメチオニナーゼはエンドトキシンを実質的に含まない。
本発明はまた、ポリマーと結合した治療上有効量のメチオニナーゼを含む医薬組成物を提供する。該ポリマーは例えばポリアルキレンオキシドであってよいが、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、エチレンオキシドのコポリマー、およびプロピレンオキシドのコポリマーに限定されない。
好ましい実施態様においては、ポリエチレングリコールと結合した治療上有効量のメチオニナーゼを含む医薬組成物が提供される。別の好ましい実施態様においては、該医薬組成物は、実質的にエンドトキシンを含まず、かつポリエチレングリコールと結合した治療上有効量のメチオニナーゼを含む。このような組成物は、本来メチオニナーゼを産生する生物、または好ましくはメチオニナーゼを発現するように変更された宿主から単離した物質から調製することができる。
ポリマーと結合したエンドトキシンを含まないメチオニナーゼの作製方法もまた提供される。この方法は、エンドトキシンを含まないメチオニナーゼをポリマーと結合させ、実質的に非免疫原性の、化学的に改変された、エンドトキシンを含まないメチオニナーゼを形成することによる。
好ましい実施態様においては、該方法はメチオニナーゼをポリエチレングリコールと結合することを含む。
さらに好ましい実施態様においては、該結合はエンドトキシンを含まないメチオニナーゼをメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルカルボネートと反応させることにより実施される。
治療上有効量のメチオニナーゼを投与することを含む、腫瘍を有する患者の治療方法もまた提供される。
好ましい実施態様においては、該メチオニナーゼはエンドトキシンを実質的に含まない。
さらに好ましい実施態様においては、該メチオニナーゼはポリマーと結合している。
別の実施態様においては、該ポリマーはポリアルキレンオキシドである。
Ｅ．組換えメチオニナーゼの製剤
本発明はさらに、凍結乾燥形態または結晶形態のメチオニナーゼを提供する。詳細には、メチオニナーゼは当分野で公知の方法を用いて容易に凍結乾燥または結晶化できることが観察された。得られるメチオニナーゼ調製物（凍結乾燥形態または結晶形態）は、高度に安定で、容易に水和することができ、そして再水和の後でも高い活性を維持することが判明した。
当分野で公知の種々の方法を用いて、結晶化または凍結乾燥形態のメチオニナーゼを得ることができる。実施例においては、メチオニナーゼの凍結乾燥および結晶化はＶｅｒｄｉｓ，　Ｆｒｅｅｚｅ　ｍｏｂｉｌｅ　２４を　１００ミリバールで　−８０℃で７２時間用いて実施した。当業者は、凍結乾燥形態または結晶形態のメチオニナーゼを作製するのに用いるため、当分野で公知の他の手段を容易に適合させることができよう。
Ｆ．ＤＮＡセグメントおよびベクター
Ｉ．メチオニナーゼをコードするＤＮＡ分子
メチオニナーゼをコードする単離されたＤＮＡ分子をプロモーター、特にＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター等のＲＮＡポリメラーゼプロモーターに機能しうる形で連結することにより、適切な宿主細胞に導入した場合、組換えメチオニナーゼが全細胞性タンパク質の約５〜７５％　のレベルで発現されうることが判明した。したがって、本発明は適切な条件下で宿主に導入すると高レベルの組換えメチオニナーゼを発現する高レベル発現モジュールを提供する。
本明細書に用いる「高レベル発現モジュール」または「本発明の発現モジュール」とは、メチオニナーゼをコードする機能しうる形で連結されたヌクレオチド配列の転写および翻訳を引き出す１つ以上の発現制御要素を含む核酸分子をいう。この発現モジュールは、単離された核酸分子でありうる。またはベクター（下に記述する）中に存在することができる。
本発明の発現モジュールは、産生される組換えメチオニナーゼが全細胞性タンパク質の約５〜７５％　、好ましくは全細胞性タンパク質の１０％　以上に相当するようにメチオニナーゼの発現を引き出す制御要素を含んでいる。好ましい発現制御要素は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターであり、最も好ましいのはＴ７　　ＲＮＡポリメラーゼプロモーターである。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの他の例は、ＴａｃおよびＴｒｃプロモーターを含むが、これらだけに限定されない。
プロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼの結合を可能にし、転写を起こさせるＤＮＡ配列によって形成される発現制御要素である。特定の宿主系に適合性のプロモーター配列が当分野で公知であり、そして典型的には、１以上の好都合な制限部位を含むプラスミドベクター中に提供される。このようなプラスミドベクターの典型は、商業的供給者およびＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ等の種々の供給源から入手可能なＴ７　　ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ｐＴ７　およびｐＥＴ
を含むベクターである。
本発明の発現モジュールは、メチオニナーゼをコードする核酸配列をさらに含む。本明細書中では、ある核酸配列は、該配列を含む核酸分子の転写および翻訳がメチオニナーゼ活性を有するタンパク質の産生をもたらす場合、メチオニナーゼをコードするという。
Ｌ−メチオニナーゼ（Ｌ−メチオニン−α−デアミノ−γ−メルカプトメタン−リアーゼまたはメチオニナーゼ）は、脱アミノ反応および脱チオメチル反応によりメチオニンを分解する酵素である。メチオニナーゼ活性は、少なくともメチオニンの開裂後に形成されるα−ケト酪酸の量を測定することにより測定することができる。メチオニナーゼの１単位（Ｕ）は、Ｉｔｏら，Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　７９：１２６３−１２７２，　１９７６；およびＳｏｄａ，　Ａｎａｌｙｔ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２５：２２８−２３５，　１９６８に記述される標準的アッセイ条件下で、メチオニンから１分あたり１マイクロモルのα−ケト酪酸を生成する酵素の量と定義される。
メチオニナーゼをコードする核酸配列は、本来メチオニナーゼを産生する生物から得た変更されていない配列からなることができる。または、本来メチオニナーゼを産生する生物から得た配列で、１つ以上の核酸またはアミノ酸置換、欠失または付加を含むように変更された配列からなることができる。
変更されたものであれ変更されていないものであれ、メチオニナーゼをコードする核酸分子はメチオニナーゼを本来産生する任意の生物から引き出すことができる。メチオニナーゼをコードする核酸分子の好ましい供給源は、シュードモナス・プチダである。実施例９は、Ｐ．プチダ由来のメチオニナーゼをコードする核酸分子の単離および配列決定を開示する。メチオニナーゼをコードする核酸分子の他の好ましい供給源は、膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ　ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ニッポストロンジラス・ブラジリエンシス（Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）およびフゾバクテリウム属種（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ．）を含むが、これらだけに限定されない。
メチオニナーゼの完全なコード配列は、種々の供給源、特に上記の供給源から種々の方法を用いて得ることができる。Ｐ．プチダ以外の生物からのメチオニナーゼをコードする核酸分子の単離は、図８に示すアミノ酸および核酸配列によって非常に容易となる。
特に、当業者は図８に示す核酸配列を用いて、メチオニナーゼ発現生物由来のメチオニナーゼをコード　る核酸を選択的に増幅するポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）に用　るオリゴヌクレオチドプライマーの対を容易に作製できる。図８に示す配列に　づく好ましいＰＣＲプライマー対は：
2004081209.tif 000002
である。
上記ＰＣＲプライマーを使用するための好ましいＰＣＲ変性／アニーリング／伸長サイクルは、以下の通りである。すなわち、９５℃で１０分間最初の変性；次に９４℃で３０秒間変性、６０℃で３０秒間アニーリング、そして７２℃で２　分間伸長からなるサイクルを５回；次に９４℃で３０秒間変性、６０℃で３０秒間、そして７２℃で１．５分間伸長からなるサイクルを２５回；次に７２℃で１０分間最終伸長である。ＰＣＲ増幅産物は２本のバンドで、このうち１３６５　ｂｐのバンドを採取し、挿入ＯＮＣａｓｅ−１　ＤＮＡとして精製した。
または、図８のヌクレオチド配列の断片をプローブとして用いて、シュードモナス・プチダ以外の生物からメチオニナーゼをコードするＤＮＡを公知の方法で単離することができる。約１８〜２０個のヌクレオチドを含むオリゴマー（約６〜７個のアミノ酸の１続きをコードする）を調製し、これをプローブとして十分なストリンジェンシー条件下でゲノムＤＮＡとハイブリダイズさせ、周知の手順を用いて誤った陽性物を除去する。（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ　１９８９参照）。
プローブまたはポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）の特異的プライマーとして使用されるＤＮＡ配列（すなわち、合成オリゴヌクレオチド）、およびメチオニナーゼをコードする遺伝子配列は化学的技法、例えばＭａｔｔｅｕｃｃｉら（Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　１０３：３１８５−３１９１，　１９８１）のホスホトリエステル法によって、または自動合成法を用いて容易に合成することができる。さらに、周知の方法（例えば、ＤＮＡセグメントを規定する１群のオリゴヌクレオチドを合成し、次にオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションと連結を行い、完全なセグメントを構築する）によってより大きいＤＮＡセグメントを容易に調製することができる。
ＰＣＲおよびＤＮＡプローブに基づく方法に加えて、メチオニナーゼをコードするＤＮＡ分子は、ポリクローナル抗血清、または免疫原性であることが予測される図８のペプチド断片に対して産生させたモノクローナル抗体を用いて単離することができる。このような抗体は、特定の生物から作製された発現ライブラリー（λ　ｇｔ１１　ライブラリー等）を釣り上げて、Ｐ．プチダ以外の生物由来のメチオニナーゼをコードするＤＮＡ分子を得ることができる。
天然に存在する、メチオニナーゼをコードする核酸分子がいったん得られたならば、当業者はランダムまたは部位特異的突然変異誘発手順を採用して、メチオニナーゼをコードする配列を発現レベルを増大させるように、またはコードされたメチオニナーゼから１個以上のアミノ酸を置換、付加または削除するように変更することができる。
１つの実施態様においては、メチオニナーゼをコードする配列は、コードされたメチオニナーゼのアミノ酸配列を変えずに、特定の宿主細胞における組換えメチオニナーゼの発現レベルを増大させるように変更される。特定の宿主における組換えメチオニナーゼの発現増加は、核酸分子中に存在する１個以上のコドンを、得られるコドンが特定アミノ酸をコードするのに宿主生物によってより頻繁に使用されるものであるように変更することによって達成できる。好ましいコドンを含むように核酸配列を変更することは、部位特異的突然変異誘発等の公知の手順を用いて、または該好ましいコドンを含む核酸分子を合成することによって、達成できる。
発現に影響を及ぼす変更の他に、得られるタンパク質の精製を容易とするように、メチオニナーゼをコードする核酸を変更することができる。例えば、実施例に開示するように、組換えメチオニナーゼのアミノまたはカルボキシ末端にポリヒスチジンの１続きを加えるように変更することによって、Ｎｉ＋＋　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて得られた融合タンパク質を精製することができる。
メチオニナーゼをコードする配列を変更して、コードされたメチオニナーゼのアミノ酸配列に１個以上のアミノ酸残基を付加、置換または削除するように変化を導入することも可能である。得られる組換えメチオニナーゼは、好ましくは、より良い生物学的および生理学的特性（例えば、増大した活性、低下したＫｍ、低下した免疫原性、または増大した血清半減期、等）をもつ組換えメチオニナーゼをもたらす変更を含む。このような変更された形は、合理的に設計するか、またはランダムに生成される。
変更が最初のおよび最終的なタンパク質のアミノ酸配列並びに所望の生理学的特性に基づいて特異的に選択されている場合、その変更は合理的に設計されたと表現される。例えば、合理的に設計された変更の１タイプは、疎水性アミノ酸をより疎水性の低い残基と置換して溶解性を増大させるものである。合理的に設計された変更を創出する好ましい方法は、不適正（ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ）ＰＣＲプライマー伸長法を用いた部位特異的突然変異誘発である。
変更が合理的に選択されない場合、その変更はランダムに生成されたと表現される。化学的突然変異誘発、ＰＣＲシャフリング（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）およびリンカースキャニング突然変異誘発、等のランダム突然変異誘発技法は、特定のタンパク質コード配列において非常に多様なランダムで非特異的な変更を発生させる。このような方法は、メチオニナーゼをコードする核酸分子を徹底的に変更するのに用いることができる。
次に、この様式で創出された組換えメチオニナーゼの変更された形を、種々の公知方法を用いて所望の特性に関してスクリーニングする。用いる選択法の選択は、宿主、ベクターおよび採用された突然変異誘発法、並びに選択される特性に依存する。
本発明はさらに、本発明の発現モジュールを１以上含むベクターを提供する。ベクターとは、宿主内で自律複製が可能なＤＮＡ分子である。ベクターは天然に存在するプラスミド由来のエピソーム性複製起源、ゲノム性複製機転を含むことができる。または、ベクターはウイルスゲノムから引き出すことができる。本発明の発現モジュールを挿入すべきベクターの選択は、当分野で周知のように、所望の機能特性（例えば、タンパク質の発現）および形質転換すべき宿主細胞に直接依存する。
１つの実施態様においては、ベクターは原核生物のレプリコンを含む。Ｃｏ１Ｅ１レプリコン等の原核生物のレプリコンは当分野で周知であり、本発明の発現モジュールと組み合わせて容易に採用することができる。さらに、ベクターは薬剤耐性等の選択マーカーをコードする遺伝子を含むことができる。
真核生物発現ベクターもまた本発明の発現ベクターと組み合わせて用いることができる。真核細胞発現ベクターは当分野で周知であり、幾つかの商業的供給源から入手可能である。そのようなベクターの典型的なものは、ＰＳＶＬ、ｐＫＳＶ−１０　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ　（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｉｎｃ．）、ｐＴＤＴ１　（ＡＴＣＣ，　＃３１２５５）、本明細書に記述するベクターｐＣＤＭ８、および類似の真核生物発現ベクターである。さらに、バキュロウイルスに基づくベクター系等の昆虫細胞発現系を用いて、高レベル発現ベクターを創出することができる。
【００１２】
一般には、メチオニナーゼをコードする高発現モジュールの創出は典型的に以下の工程を包含する：
第１に、メチオニナーゼをコードするＤＮＡを得る。もしその配列がイントロンによって中断されていないならば（細菌由来のものに期待されるように）、それは任意の宿主における発現に適している。メチオニナーゼをコードする配列を挟む両側の領域に１以上の制限エンドヌクレアーゼ部位を挿入することにより、この配列を容易に切り出して回収できる形に変更することができる。
次に、切り出した、または回収したコード領域を、好ましくは複製可能な発現ベクター中で、高発現制御要素に機能しうる形で連結する。次に、発現モジュールまたはベクターを用いて適切な宿主を形質転換し、そして形質転換した宿主を組換えメチオニナーゼの産生をもたらす条件下で培養する。場合により、組換えメチオニナーゼを培地または細胞から単離する。若干の不純物が許容される幾つかの場合には、タンパク質の回収および精製は必要ないことがある。
上記の各工程は、種々の方法で実施することができる。例えば、所望のコード配列をゲノム断片から得て、適切な宿主中で直接使用することができる。種々の宿主中で機能できる発現ベクターの構築は、２つ以上の適切なレプリコンおよび制御要素を用いて行なうことができる。通常は利用可能でないにしても、適切な制限酵素部位をコード領域の両端に付加して、上記のベクターに挿入すべき切り出し可能な遺伝子を提供することができる。
ＩＩ．　高レベルの組換えメチオニナーゼを発現する形質転換宿主細胞
本発明はさらに、全細胞性タンパク質の約５〜７５％　を、好ましくは約１０％　以上を組換えメチオニナーゼとして産生するように、本発明の発現モジュールまたはベクターを用いて形質転換した宿主細胞を提供する。宿主細胞は原核生物または真核生物宿主でありうる。
任意の原核生物宿主を用いて、本発明の高レベルメチオニナーゼ発現モジュールを発現させることができる。好ましい原核生物宿主は大腸菌である。以下の実施例においては、大腸菌のＤＨ５αおよびＢＬ２１（ＤＥ３）株を使用した。
好ましい真核宿主細胞は、昆虫細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞を含み、好ましくはＳＰ６等の昆虫細胞およびマウス、ラット、サル、またはヒト繊維芽細胞細胞系由来のもの等の脊椎動物細胞を含む。他の好ましい真核宿主細胞は、ＡＴＣＣよりＣＣＬ６１として入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＡＴＣＣよりＣＲＬ　１６５８として入手可能なＮＩＨスイスマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、および類似の真核生物組織培養細胞系である。
本発明の高レベル発現組換えモジュールを用いた適切な宿主の形質転換は、典型的には使用する宿主およびベクターのタイプに依存する周知の方法によって達成することができる。原核宿主細胞の形質転換に関しては、宿主細胞のエレクトロポレーションまたは塩処理が好ましい。例えば、Ｃｏｈｅｎら，Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　６９：２１１０，　１９７２；　およびＭａｎｉａｔｉｓら，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　ＮＹ　（１９８２）参照。
真核宿主細胞の形質転換に関しては、エレクトロポレーションまたはカチオン性脂質の使用が好ましい。例えば、Ｇｒａｈａｍら，Ｖｉｒｏｌ．　５２：４５６，　１９７３；およびＷｉｇｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　７６：１３７３−７６，　１９７９　参照。上首尾に形質転換された細胞、すなわち本発明の発現モジュールを含む細胞は、周知の技法により同定することができる。例えば、本発明の発現モジュールの導入によって得られた細胞をクローン化して単一コロニーを生成させることができる。これらのコロニー由来の細胞を集め、溶解し、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　９８：５０３，　１９７５　またはＢｅｒｅｎｔら，　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　３：２０８，　１９８５に記述されているような方法を用いて、それらのＤＮＡ含有量をｒＤＮＡの存在について検査することができる。しかし、以下に記述するように、本発明はさらに、高レベルの組換えメチオニナーゼを発現する形質転換体を同定するための迅速なスクリーニング方法をも提供する。
ＩＩＩ．　高レベルの組換えメチオニナーゼを発現する宿主の同定
本発明はさらに、組換えメチオニナーゼを全細胞性タンパク質の約５〜７５％　のレベルで産生する形質転換宿主細胞を同定する方法を提供する。具体的には、全細胞性タンパク質の約５〜７５％　を組換えメチオニナーゼとして発現する形質転換宿主細胞は、明瞭で観察可能なピンク色を有することが観察された。これは大腸菌を宿主として使用した場合、特に顕著である。
高レベルの組換えメチオニナーゼを発現する形質転換体を同定するため、組換えメチオニナーゼが発現される条件下で、そして増殖細胞の視覚による検査が可能な条件下で、形質転換細胞を培地上または培地中で増殖させる。増殖細胞またはコロニーを検査し、ピンク色の表示に基づいて選択する。
本方法を用いた選択のため、種々の培養／増殖条件を採用して形質転換宿主細胞を増殖させることができる。増殖培地の成分は使用される宿主／ベクター系の栄養要求、および高レベルの組換えメチオニナーゼの発現に伴うピンク色を同定し、それによって高レベル発現クローンの単離を可能とするために用いられる検査系に依存する。好ましい培地は、その上に形質転換細胞を播いて、それぞれが単一の宿主に由来する単離された複数のコロニーとして増殖させることができる固体培地である。高レベル発現クローンを同定する好ましい方法は、増殖するコロニーの視覚による検査である。
ＩＶ．　高レベル発現モジュールを用いた組換えメチオニナーゼの産生
本発明はさらに組換えメチオニナーゼを産生する方法を提供する。具体的には、本発明の高レベル発現モジュールを１つ以上用いて形質転換した宿主を用いて、商業的に有意義なレベルで組換えメチオニナーゼを産生することが可能である。そのような形質転換宿主は、全細胞性タンパク質の約５〜７５％　のレベルで組換えメチオニナーゼを発現するであろう。本発明の宿主を用いれば、当業者は公知の方法を用いた種々の診断および治療法に使用する組換えメチオニナーゼを容易に産生することができる。
メチオニナーゼをコードする高発現モジュールを含む形質転換宿主を用いて産生した組換えメチオニナーゼ、または本来メチオニナーゼを産生する宿主から産生されたメチオニナーゼの好ましい精製法は、以下の工程を含む：
ａ）水性緩衝液中にメチオニナーゼを含む、形質転換細胞の抽出物を約４０〜６０℃で約１〜１０分間、好ましくは５０℃で１　分間加熱し；
ｂ）加熱した抽出物をＧＳ−３ローター（Ｓｏｒｖａｌ　Ｄｕ　Ｐｏｎｔ）を用いて約１０ｋから２０ｋｒｐｍで約１５分から１時間、好ましくは約１３ｋ　ｒｐｍ　で約３０分４　℃で遠心し；
ｃ）細孔径が約５０Ｋから１００Ｋのフィルター、好ましくはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｐｒｅ／Ｓｃａｌｅ：ＴＴＦＰＬＨＫ　１００　Ｋ　２．５　ｆｔ２カートリッジを用いて、１０　ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ　８．３）を用いて上清を限外濾過し；
ｄ）低イオン強度（約１０〜５０　ｍＭ）のＫＣｌをｐＨ約７．０〜７．６の１０−２０　ｍＭのリン酸カリウム緩衝液中で用いて、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーを実施し（好ましくはＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ　カラムを用いる）、そして約４０〜２００　ｍＭのＫＣｌ勾配を用いて溶出した、メチオニナーゼを含む画分を回収し；
ｅ）中程度イオン強度（５０〜１００　ｍＭ）のＫＣｌをｐＨ約８．０〜８．６の１０−２０　ｍＭのリン酸カリウム緩衝液中で用いて第２のＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーを実施し（好ましくはＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ　カラムを用いる）、そしてリン酸緩衝液（ｐＨ８．３）で緩衝化した１００〜２００　ｍＭ　ＫＣｌを用いて溶出した、メチオニナーゼを含む画分を回収し；そして
ｆ）上記工程ｅ）で回収した画分を、エンドトキシンを吸収することのできるクロマトグラフィー媒体と接触させ（好ましくは　ＡｃｔｉｃｌｅａｎＴＭ　Ｅｔｏｘカラムを使用する）、そして溶出液を回収し、これによって該溶出液からエンドトキシンを除去して、タンパク質　１　ｍｇあたり少なくとも２０単位のメチオニナーゼ活性を有し、かつタンパク質　１　ｍｇあたり約１〜１００　ｎｇのエンドトキシンを含む、実質的にエンドトキシンを含まないメチオニナーゼを形成する。
好ましくは、細胞抽出物は高レベル（全細胞性タンパク質の５〜７５％）の組換えメチオニナーゼを発現するように変更された宿主細胞から調製される。細菌の細胞抽出物については、抽出物は一般にまず集菌し、そして細菌細胞培養物を洗浄して、集菌が遠心でなされたか又は中空糸濾過によってなされたかによって細胞ペースト／ペレットを形成することにより調製される。これらの方法は一般に周知である。
次に、通常の手段を用いて細胞を破砕する。好ましくは、キャビテーター（ｃａｖｉｔａｔｏｒ）型ホモジナイザー、例えばＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ　Ｃｏｒｐ．モデル　＃ＨＣ８０００等のホモジナイザーを用いて細胞を破砕する。
得られた懸濁物を加熱して、選択タンパク質および他の不溶性物質を沈殿させる。典型的加熱条件は、約４５−６０　℃で１−１０分間である。５０℃１分間の加熱工程が好ましい。
加熱した抽出物を遠心にかけて破砕物を除去し、上清を濾過して、上記のように２工程にしてＤＥＡＥイオン交換媒体に適用する。好ましい吸着および溶出条件を実施例に記述する。これらの工程では、種々のＤＥＡＥイオン交換カラムクロマトグラフィー媒体の任意のものが使用でき、媒体の選択は限定的なものと解釈されるべきではない。商業的供給源は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＢｉｏｒａｄおよびＳｉｇｍａを含む。
その後、エンドトキシンを除去して、先に記述した許容されるレベルのエンドトキシンを含むタンパク質を調製する。エンドトキシン除去工程は、周知の種々の手段のうち任意のものを用いて実施でき、そして典型的には溶液中のタンパク質をエンドトキシンを吸着することのできるクロマトグラフィー媒体に接触させて、エンドトキシンを含まないタンパク質を含有するクロマトグラフィー媒体溶出液を得ることを包含する。エンドトキシンの除去に用いる好ましい市販の試薬は、Ａｃｔｉｃｌｅａｎ　ＴＭ　Ｅｔｏｘである。
Ｇ．高ホモシステイン血症に関連する心臓血管性疾患の予防のためのメチオニナーゼの使用
本発明の別な側面は、ホモシステイン枯渇療法のためのメチオニナーゼの使用である。高ホモシステイン血症は種々のタイプの心臓血管性疾患と関連してきた。これらの疾患と高ホモシステイン血症との最初の関連付けは　ＭｃＣｕｌｌｙによって１９６９年になされた（ＭｃＣｕｌｌｙ，　ＫＳ，　Ａｍ．　Ｊ．　Ｐａｔｈｏｌ．　５６：１１１−２８，　１９６９）。ＭｃＣｕｌｌｙ　は、上昇した血漿ホモシステイン濃度と動脈硬化性疾患の間に連結（ｌｉｎｋ）を見いだした。最近結論が出されたＦｒａｍｉｎｇｈａｍ　Ｈｅａｒｔ　Ｓｔｕｄｙによる１，０４１人の研究は、血漿ホモシステイン濃度の上昇は、動脈硬化の危険の増大をもたらすことを見いだした（Ｓｅｌｈｕｂ，　Ｊ．ら，Ｎ．　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．　３２：２８６−９１，　１９９５）。他の研究は、穏やかな高ホモシステイン血症までも末梢血管性、脳血管性および冠状動脈性心臓疾患と結び付けた（Ｋａｎｇ，　Ｓ．ら，Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｎｕｔｒ．　１２：２７９−９８，　１９９２）。例えば、血管性疾患を有する患者における絶食（ｆａｓｔｉｎｇ）ホモシステイン濃度は、正常な被験者における濃度よりも３１％　高い。正常の上限よりも１２％　高い血漿ホモシステイン濃度は、心筋梗塞の危険における３．４　倍の増加と連結している（Ｓｔａｍｐｆｅｒ，　Ｍ．ら，ＪＡＭＡ　２６８：８７７−８１，　１９９２）。ホモシステイン代謝の研究は、２０００人以上の被験者に関する２０件の対照および横断的研究において、発作および他の心臓血管性疾患を有する患者は、心臓血管性疾患をもたはい被験者に較べ、ホモシステインのより高い血中レベルを示すことが見いだされた。これは、心筋梗塞を有する殆どの患者が正常なコレステロール値を示す事実と対照的である。Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｔｕｄｙ　において驚くべき結果が判明した。すなわち、心臓血管性疾患が診断される前に血液を採取したとところ、後に心筋梗塞を起こした２７１　人の男性は心筋梗塞を起こさなかった対照に較べ、有意に高いホモシステインの平均基線レベルを有したことが示された（Ｕｅｌａｎｄ，　Ｐ．ら，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｓ　ａｎｄＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｌｅｒ；　１８３−２３６，　１９９２）。種々の条件がホモシステインレベルの上昇をもたらしうるが、根本にある代謝上の原因に関わりなく、高レベルのホモシステインと血管性疾患の関係は存在する。直接試験において、ヒヒに血管性病巣を誘導し、３ケ月間ホモシステインを注入した（Ｕｅｌａｎｄ，　Ｐ．ら，前出）。メチオニンを経口投与し、その後患者のホモシステインレベルを測定すると、高ホモシステイン血症が診断されるであろう。この経口メチオニンチャレンジ後の異常なホモシステイン血漿濃度は、動脈硬化性疾患を有する患者においては正常な被験者に較べて１２倍である（Ｕｅｌａｎｄ，　Ｐ．ら，前出）。血漿ホモシステインレベルはＨＰＬＣアッセイにより容易にかつ迅速に測定することができる。複数の研究が、人口の４０％　が上昇したホモシステインレベルを有する可能性があり、心臓血管性疾患の危険があることを示唆している（Ｓｔａｍｐｆｅｒ，　Ｍ．　およびＭａｌｉｎｏｗ，　Ｍ．，　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．　３３２：３２６−３２９　１９９５）。高ホモシステイン血症は、動脈硬化性疾患を誘導して患者を心筋梗塞および脳血管性疾患の危険に陥れる急性作用をもつ場合がある。したがって、心臓血管性疾患の危険がある患者の多くの部分に対し、緊急の医学的介入が指示された。本発明のメチオニナーゼは、危険な患者のホモシステインレベルを直ちに低下させるための緊急介入の優れた療法として用いることができる。メチオニナーゼは２つの反応を触媒する。すなわち、メチオニンにおけるばかりでなく、ホモシステインにおいても、窒素−炭素結合およびγ−炭素−硫黄結合の両方の開裂である（Ｈｏｆｆｍａｎ，　Ｂｉｏｃｈ．　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｏｎ　Ｃａｎｃｅｒ，　７３８：４９−８７，　１９８４）。図７は、ホモシステインおよびメチオニン代謝の代謝サイクルを示す。ビタミンＢ−１２、Ｂ−６　および葉酸は図に示すサイクルの「左側」に影響を及ぼし、そしてメチオニナーゼ治療後のある患者における正常なホモシステインレベルの維持を助ける。しかし、サイクルの「右側」は、これらビタミンのレベルに依存しない。サイクルの右側では、メチオニンの存在がトランスメチル化反応の増大を介して過剰なホモシステインレベルをもたらしうる。これは、癌および動脈硬化性疾患をもたらしうる。サイクルの右側に異常を有する患者は、ホモシステインの正常レベルを維持するためにメチオニナーゼの持続的使用および緊急使用が必要であろう。心臓血管性疾患にとっては、メチオニナーゼのメチオニナーゼおよびホモシステインの両方に対する基質特異性が重要である。メチオニナーゼはホモシステインの前駆体であるメチオニンのレベルを低下させ、またホモシステインレベルを直接低下させる。この領域における以前の研究は、高ホモシステイン血を低下させる療法としてビタミンＢ−１２、Ｂ−６　および葉酸の使用を示唆するのみであった。図７に示すように、単にこれらのビタミンを供給することは、サイクルの右側に存在する異常をなんら矯正せず、またサイクルの右側に異常を有する患者のホモシステインレベルを低下させないであろう。本発明は、メチオニナーゼを用いてこのような心臓血管性疾患を有する患者を治療する方法を含む。
１つの側面において、治療上有効量のメチオニナーゼを患者に投与することを含む、心臓血管性疾患を有する患者の治療方法が提供される。
ホモシステイン枯渇のための治療上有効量のメチオニナーゼとは、例えば動脈硬化の危険を減少させるために、所望のホモシステインレベルを達成すべく計算された、あらかじめ定められた量をいう。
したがって、本発明のメチオニナーゼを投与するための用量範囲は、例えば動脈硬化の危険またはレベルが低下するという、所望の効果を奏するに十分大きい用量である。用量は、好ましくない副作用、例えば高粘稠度症候群、肺水腫、うっ血性心不全、等を引き起こすほど大きくてはならない。一般に、用量は患者の年齢、状態、性別および疾患の程度によって変わり、当業者によって決定され得る。
何らかの合併症が生じた場合は、それぞれの医師が用量を調整することができる。
本発明のメチオニナーゼの治療上有効量は、典型的には、生理的に許容される組成物として投与した時に、１　ｍｌあたり約０．００１から約１００単位（Ｕ）　、好ましくは約０．１　Ｕ以上、そしてより好ましくは１　Ｕメチオニナーゼという血管内（血漿）または局所的濃度を達成するのに十分な量である。典型的用量は体重に基づいて投与することができ、約５〜１０００　Ｕ／ｋｇ／日、好ましくは約１０〜５０　Ｕ／ｋｇ／日、より好ましくは約２０〜４０　Ｕ／ｋｇ／日の範囲である。
好ましい方法においては、用いられるメチオニナーゼは本明細書中で詳述したように実質的にエンドトキシンを含まない。特に好ましいのは、組換えによって産生された実質的にエンドトキシンを含まないメチオニナーゼに使用である。
当業者に公知の投与方法を使用することができ、それらは本明細書に記述されている。
本発明の別な側面においては、エンドトキシンを実質的に含まない、そしてポリマーに結合したメチオニナーゼの治療上有効量を投与することにより、心臓血管性疾患を有する患者を治療する。好ましい側面においては、該ポリマーはポリエチレングリコールである。別の好ましい側面においては、該心臓血管性疾患は動脈硬化である。本発明の別の側面において、メチオニナーゼは頭蓋外頸動脈狭窄、末梢血管性、脳血管性、冠状動脈性疾患および閉塞性血管疾患を有する患者に投与される。
本発明の別な側面においては、治療上有効量のメチオニナーゼを投与することによる、高ホモシステイン血症を有する患者の治療方法が提供される。該メチオニナーゼは実質的にエンドトキシンを含まないことが可能で、またポリエチレングリコール等のポリマーと結合していることが可能である。
本発明はまた、患者に治療上有効量のメチオニナーゼを投与する工程を含む、患者のホモシステインレベルを低下させる方法を提供し、該方法においてメチオニナーゼは実質的にエンドトキシンを含まない。本発明の別な側面においては、患者に治療上有効量のメチオニナーゼを投与する工程を含む、患者における心臓血管性疾患を予防する方法が提供される。好ましい側面においては、患者に投与されるメチオニナーゼは実質的にエンドトキシンを含まない。別の好ましい側面においては、該メチオニナーゼはポリマーと結合している。さらに別の好ましい側面においては、患者に治療上有効量の、エンドトキシンを実質的に含まない、そしてポリエチレングリコールと結合しているメチオニナーゼを投与する工程を含む、患者における心臓血管性疾患を予防する方法が提供される。実施例７はｉｎ　ｖｉｖｏホモシステイン枯渇の１例を示す。
Ｈ．腫瘍イメージングのためのメチオニナーゼの使用
本発明の別な側面においては、以下の工程を含んでなる、患者の腫瘍を診断する方法が提供される。すなわち、患者にメチオニナーゼを投与することにより該患者の１２Ｃメチオニンを枯渇させ、次に１１Ｃメチオニンを該患者に投与することにより該患者にメチオニンを充満させ、そして最終的に該患者の腫瘍細胞における１１Ｃメチオニンの存在を検出する。１１Ｃメチル化は、例えば、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）走査を手段として検出することができる。ただし、手段はこれだけに限定されない。当業者は癌細胞による１１Ｃ取り込みを検出する他の方法に精通している。そのような方法は、例えば、全て参考のために本明細書に組み入れている　Ｌａｐｅｌａら，　Ｊ．　Ｎｕｃｌ．　Ｍｅｄ．　３５：１６１８−２３，　１９９４；　Ｍｉｙａｚａｗａら，Ｊ．　Ｎｕｃｌ．　Ｍｅｄ．　３４：１８８６−９１，　１９９３；　Ｌｅｓｋｉｎｅｎ−Ｋａｌｌｉｏら，Ｊ．　Ｎｕｃｌ．　Ｍｅｄ．　３３：６９１−９５，　１９９２；　Ｓｈｉｅｌｄｓら，Ｊ．　Ｎｕｃｌ．　Ｍｅｄ．　３３：５８１−８４，　１９９２；　Ｈｕｏｖｉｎｅｎら，Ｂｒｉｔ　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ　６７：７８７−９１，　１９９３；　Ｄｅｔｈｙら，Ｊ．　Ｎｕｃｌ．　Ｍｅｄ．　３５：１１６２−６６，　１９９４；　Ｌｉｎｄｈｏｌｍら，Ｊ．　Ｎｕｃｌ．　Ｍｅｄ．　３４：１７１１−１６，　１９９３；　Ｌｅｓｋｉｎｅｎ−Ｋａｌｌｉｏｒら，Ｊ．　Ｎｕｃｌ．　Ｍｅｄ．　３２：１２１１−１８，　１９９１；　およびＭｉｎｅｕｒａら，Ｊ．　Ｎｕｃｌ．　Ｍｅｄ．　３２：７２６−２８，　１９９１　を参照されたい。
本発明の好ましい側面においては、投与されるメチオニナーゼは実質的にエンドトキシンを含まない。
本発明の別の好ましい側面においては、該メチオニナーゼをポリエチレングリコール等のポリマーに結合させていた。
【００１３】
【実施例】
本発明に関する以下の実施例は説明的なものであって、言うまでもなく本発明を具体的に限定するものと解釈されるべきではない。さらに、現在公知であるかまたは後になって開発される、当業者の理解範囲内にある本発明の変法は、本明細書に後に記述する請求の範囲に含まれると考えるべきである。
実施例１
メチオニナーゼの拡大生産
シュードモナス　プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）の一株を修飾し、カナマイシン耐性及び下記のような高レベルのメチオニナーゼ発現に対して選別した。
シュードモナス　プチダ　ＡＴＣＣ　８２０９及びエシェリキア　　コリ（Ｅ．　ｃｏｌｉ）　ＡＴＣＣ　７７１００を１９９３年１０月にＡＴＣＣから購入した。ＡＴＣＣ　７７１００を５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ら，　分子クローニング：実験の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ）　Ａ．１，　１９８９）　中で増殖させた。シュードモナス　　プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）及びエシェリキア　　コリのいずれにおいても複製可能なカナマイシン耐性遺伝子を含有するシャトルベクター、プラスミド　ｐＣＮ　５１　（Ｎｉｅｃｏら，　Ｇｅｎｅ　８７：　１４５−１４９，　１９９０。これは、ここで参照することにより本明細書に含まれるものである。）をＡＴＣＣ　７７１００から単離し、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−リゾチーム法を用いて精製した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ら，　分子クローニング：実験の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ）　１．２９−１．３０，　１９８９）　。ＡＴＣＣ　８２０９　をＬＢ培地中で増殖させ、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，　分子クローニング：実験の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ）　１．７４−１．８４，　１９８９に記載された手順と同様の標準的な形質転換の手順を用いてｐＣＮ　５１で形質転換した。カナマイシン耐性株をＬＢ培地中でカナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）　を用いて選別し、　１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢプレート（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ら，　分子クローニング：実験の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ）　Ａ．１−Ａ．４，　１９８９）　中でさらに増殖させた。単独のコロニーを　１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ中で一晩増殖させ、次いで高メチオニナーゼ発現条件下（５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む、１０％ＬＢ、　０．１％リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）　、　０．１％尿素、　０．０２５％酵母抽出物、０．０１％硫酸マグネシウム及び０．２５％メチオニン中）に、２４時間置いた。メチオニナーゼの発現を本明細書中に記載したような標準的なメチオニナーゼアッセイを用いて測定した。シュードモナス
プチダのメチオニナーゼ過剰産生株を選別し、ＡＣ−１と名付けた。
次いで、シュードモナス　　プチダ　ＡＣ−１　の拡大発酵方法を用いた。単独のコロニー　ＡＣ−１　を５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢプレート中で増殖させた。選別したコロニーを５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ５ｍｌ中で、２６℃にて　２５０ｒｐｍ／分で振盪しながら１８時間インキュベートした。細菌２ｍｌを５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ　６００ｍｌ中で、２６℃にて　２００ｒｐｍ／分で振盪しながら６時間増幅させた。次に、細菌５０ｍｌを５０μＭ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ２リットル中で、２６℃にて　１００ｒｐｍ／分で振盪しながら一晩（１８時間）インキュベートした。続いて、細菌２リットル（ＯＤ６００　　１．２〜１．６）を、４０リットルタンク中の１０％ＬＢ、　０．１％リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）　、０．１　％グリセロール、　０．１％尿素、　０．０２５％酵母抽出物、０．０１％硫酸マグネシウム及び０．２５％メチオニンを含む特別な培地中で、高好気性条件下、２６℃にて２４時間増殖させた。ＯＤ６００　は　１．２〜１．８　に達し、活性は２０〜３０単位／リットルに達した。採収に最適な細胞密度は、ＯＤ６００　　１．５〜１．８　である（２〜３ｍｇ／ｌのメチオニナーゼを含有）。これは、１ｋｇ湿細胞／４００リットルに等しい。好ましくは、おおよその収量が約１ｋｇ湿細胞／１０〜２０リットルである完全装備の発酵槽が用いられる。細胞をＡＧＴカラム（モデル　ＵＦＰ−５００−Ｅ−５５　カートリッジ、Ａ／Ｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いて温度を４℃に保持しながら採収し、次いで自動低温遠心分離機（Ｓｏｒｖａｌｌ超高速ＲＣ２−Ｂ）を用いて４℃、９ｋｒｐｍにて１０分間遠心分離した。続いて細胞ペレットを採取した。
次に、細胞を抽出溶液（２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ９．０）中に　５００ｇ湿細胞／リットルの密度で懸濁し、キャビテーターホモジナイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社モデル＃ＨＣ　８０００）　による三つの通路（ｐａｓｓａｇｅ）　を用いて粉砕した。細胞を破壊した後、ただちにホモジネートを−８０℃で保存した。ホモジネート中のメチオニナーゼの比活性は０．０８〜０．１　単位／ｍｇ（タンパク質）であった。
ＡＣ−１ホモジネートを抽出緩衝液（１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．２）　、１０μＭ　リン酸ピリドキサール、０．０１％β−メルカプトエタノール、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　及び２０％エタノール）中に懸濁し、５０℃で２分間加熱した。加熱工程は、メチオニナーゼ活性を維持する一方で感熱性の混入タンパク質を沈殿させるのに十分な時間をかけて行われ得る。懸濁液を１２ｋｒｐｍで４℃にて３０分間遠心分離した。上清を採取してミリポアＰｒｅｐ／Ｓｃａｌｅ−ＴＦＦ　ＰＬＨＫ　１００Ｋ　２．５ｆｔ２　カートリッジを用いて限外濾過した。次いでｐＨを　７．２に調節した。
タンパク質を合計約２５〜３５ｇ含む抽出緩衝液（１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）　、１０μＭ　リン酸ピリドキサール及び０．０１％Ｊ−メルカプトエタノール）１０Ｌからなる試料を、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）で予備平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ　ＤＥＡＥ−６５０Ｍ　カラム１０ｃｍ×５０ｃｍ（Ｔｏｓｏ　Ｈａａｓ　Ｊａｐａｎ）　に加えた。このカラムを、１０μＭ　リン酸ピリドキサール及び０．０１％β−メルカプトエタノールを含有し、４０ｍＭ塩化カリウムを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）　２０〜３０Ｌを用いてＯＤ２８０　が　０．１以下に低下するまで予備洗浄した。次に、抽出緩衝液中の塩化カリウムの濃度が４０ｍＭから出発して　３００ｍＭまで増大する、塩化カリウムの直線グラジェントによってこのカラムからの溶離を行った。　４００ｍｌの溶出画分を集めた。メチオニナーゼを含む画分を本明細書中に記載したようなメチオニナーゼ活性アッセイによって定量し、プールした。プールされた画分を同一濃度のリン酸ピリドキサール及びβ−メルカプトエタノール並びに　１５０ｍＭ塩化カリウムを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．３）　を用いて予備平衡化した。
ＤＥＡＥ−６５０Ｍ　（５ｃｍ×２０ｃｍ）　カラムのメチオニナーゼピークから得られたタンパク質を合計約１〜２ｇ含む、１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．３）　、　１５０ｍＭ塩化カリウム、１０μＭｒｉｎｎｓａｎピリドキサール及び０．０１％Ｊ−メルカプトエタノールを含有する緩衝液からなる試料をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ａ５０−カラムに加えた。１０μＭ　リン酸ピリドキサール及び０．０１％β−メルカプトエタノールを含有する１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．３）　中の　１５０〜５００ｍＭ　ＫＣｌ　直線グラジェントを用いて前記カラムからの溶離を行った。　１５０ｍｌの溶出画分を集めた。本明細書中に記載したような活性アッセイによって定量したメチオニナーゼを含む画分をプールした。次いで、プールされたメチオニナーゼをさらに精製してエンドトキシンを除去した。この試料を０．１２Ｍ塩化ナトリウム及び１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１）　中で透析することによって予備平衡化した。この試料を５ｃｍ×１５ｃｍ　Ａｃｔｉｃｌｅａｎ　Ｅｔｏｘ　樹脂カラム（Ｓｔｅｒｏｇｅｎ　Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、アルカディア（Ａｒｃａｄｉａ）　、カリフォルニア（ＣＡ））　に加えた。次に、同様の緩衝液を用いてカラムからその酵素を溶離させ、メチオニナーゼ活性を有する溶出画分を集めて、続いてエンドトキシンの量を溶出した画分について定量した。表１にこの精製方法の結果を示す。
【００１４】
【表１】
2004081209.tif 000003
【００１５】
７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける精製メチオニナーゼの分析では１本の４３ｋｄのタンパク質のバンドが現れた。これは、第２のカラムから得られた活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析したときに観察された　１７２ｋｄのタンパク質の一つのサブユニットを示すものである。この方法によって単離されたメチオニナーゼの純度をＨＰＬＣ分析（これはただ一つのタンパク質のピークを示した。）を用いて調べたところ９８．７％であった。
本明細書に記載した抽出方法によれば、実質的にエンドトキシンを含まない実質的に単離されたメチオニナーゼを調製することができる。当業者には、ここで記載された抽出方法に修正がなされ得、それらが本発明の範囲に含まれるということは理解されるであろう。
実施例２
ヒト腫瘍の高レベルメチオニン依存性
ヒト癌においてメチオニン依存性はしばしば生ずる。全主要器官系由来の２０のＮＣＩヒト腫瘍細胞系についてメチオニン依存性を試験した。２０の全ての細胞系がメチオニン依存性であることがわかった。さらに、新鮮なヒト腫瘍標本を試験したところ、メチオニン依存性であることがわかった。正常なヒト細胞系はメチオニン依存性ではなかった。
図１には一つのそのような試験の結果を示す。図１では、正常細胞株及び腫瘍細胞系を、メチオニン含有、ホモシステインフリー（ＭＥＴ＋　ＨＣＹ　−　）　；メチオニンフリー、ホモシステイン含有（ＭＥＴ−　ＨＣＹ　＋　）　；又はメチオニンフリー、ホモシステインフリー（ＭＥＴ−　ＨＣＹ　−　）　のいずれかである１０％透析血清を含むイーグルのＭＥＭ中で増殖させた。腎臓、結腸、肺及び前立腺癌細胞系、黒色腫、並びに正常線維芽細胞株を、メチオニン（ＭＥＴ）含有培地、ＭＥＴフリー培地、ホモシステイン（ＨＣＹ）含有培地及びＭＥＴフリー培地、ホモシステイン（ＨＣＹ）含有培地及びＭＥＴフリー、ＨＣＹフリー培地中でスクリーニングした。１０％透析ウシ胎児血清、１０μＭ　ヒドロキソコバラミン及び　１００μＭ　葉酸を補給したイーグルの最小必須培地（ＭＥＭ培地）中で細胞を増殖させた。培地には、下記の方法でメチオニンを補給するか、又はメチオニンを補給しなかった：ＭＥＭ＋ＨＣＹ：培地にホモシステインを含まない　１００μＭ　Ｌ−メチオニンを補給した。ＭＥＴＨＣＹ＋：培地にメチオニンを含まない　２００μＭ　Ｄ，Ｌ−ホモシステインを補給した。ＭＥＴＨＣＹ：培地はメチオニンフリーであり、ホモシステインフリーであった。ウシ胎児血清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１０回透析した（血清：ＰＢＳ＝１：１２）。
細胞増殖を、　４５０ｎｍにおける吸収によって測定されるような色素ＸＴＴの代謝的還元によって定量した。細胞を、４８ウェル皿上で、１ウェル当たり５×１０３　乃至２×１０４　細胞を接種することによって増殖させた。ＸＴＴ（２，３−　ビス（２−　メトキシ−４−　ニトロ−５−　スルホフェニル）−５−［（フェニルアミノ）　カルボニル］−２Ｈ−　テトラゾリウムヒドロキシド（これは生細胞中で水可溶性ホルマザン生成物に代謝的に還元される）を用いて細胞増殖を定量した。　４５０ｎｍにおける還元生成物の吸光度を測定した。ＸＴＴを予め温めた（３７℃）ＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍｌに調製し、フェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）をＰＢＳ中で５ｍＭに調製した。新鮮なＸＴＴ溶液をＰＭＳ保存溶液と、１ｍｌのＸＴＴ当たり５　ｍｌのＰＭＳの割合で混合した。各ウェルを培地１ｍｌで満たした。混合したＸＴＴ　０．２５ｍｌ　を各ウェルに添加した。　４５０ｎｍにおける還元ＸＴＴの吸光度を、３時間のインキュベーション後に日立Ｕ−２０００分光光度計を用いて読んだ。ＸＴＴのＯＤを、細胞を２４時間初期培養した後、３日毎に測定した。包皮線維芽細胞株ＦＳ−３及びＨＳ−６８は、　ＭＥＴ＋ＨＣＹ　−　又は　ＭＥＴ−　ＨＣＹ　−　中で本質的に同等に増殖した。しかしながら、両方の線維芽細胞株はある程度まで増殖し、次いで少なくとも１６日間ＭＥＴ　ＨＣＹ培地中にそれ自体を維持することができるという新たな所見をここに報告する。表２に２０の腫瘍細胞系の細胞増殖アッセイの結果を示す。このアッセイにおいて、細胞懸濁液中の５×１０３　〜２×１０４　細胞／ウェルを４８−ウェルプレートにて、１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ中で２４時間培養した。細胞をハンクス塩基性塩類溶液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄し、次いで３群に分けた。Ｉ群：　ＭＥＴ＋　ＨＣＹ　−　培地で培養した細胞；ＩＩ群：　ＭＥＴ−　ＨＣＹ　＋　培地中で培養した細胞；ＩＩＩ　群：　ＭＥＴ−ＨＣＹ　−　培地中で培養した細胞。細胞を９５％空気／５％ＣＯ２　を供給したインキュベーター中で培養した。培地は２〜３日毎に交換した。表２には、細胞系の激しい増殖を＋＋＋で示し、少しの増殖を＋＋で示し、わずかな増殖を＋で示し、増殖無しを−で示した。腫瘍細胞系の約２分の１はＭＥＴフリーＨＣＹ含有培地中で増殖することができず、残りはいろいろな程度まで増殖する一方で、それと同じ培地中で正常細胞はＭＥＴ含有培地における増殖と同じくらい十分に増殖することができる。ＭＥＴフリー、ＨＣＹフリー培地中では、正常細胞株はある程度まで増殖し、次いで２週間以上それを維持することができるが、試験された２０の全腫瘍細胞系はかかる培地中で死滅し、これは潜在的に全ての癌をＭＥＴ欠乏によって選択的に殺すことができるということを示唆するものである。本実施例は、メチオニン依存性が、特に治療薬としてのメチオニナーゼとともに癌の治療に対して万能で選択的なターゲットであり得るという証拠を提供するものである。
【００１６】
【表２】
2004081209.tif 000004
【００１７】
実施例３
マウス異種移植片モデルにおけるメチオニナーゼによるヒト腫瘍増殖の阻害
腫瘍増殖の低減におけるメチオニナーゼの効力を試験するために、マウス異種移植片モデルを用いた。ヒト肺癌腫瘍（Ｈ４６０）をヌードマウスの皮下組織に移植した。マウスを４匹ずつの４群に分けた。移植の４日後、Ａ群には４時間毎に緩衝液（０．１２Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．１））　０．４ｍｌ　を腹腔内注射によって投与し；Ｂ群には４時間毎にメチオニナーゼ（１単位／ｇ）を腹腔内注射によって投与し；Ｃ群には４日毎に５−ＦＵ（６０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射によって投与し；そしてＤ群には４日毎にビンクリスチン（ＶＣＲ）（０．９ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射によって投与した。腫瘍のサイズ及び体重を２日毎に測定した。その結果を図２及び３に示す。それらの結果は、メチオニナーゼによる治療がヌードマウスにおけるＨ４６０ヒト非小細胞肺癌の増殖を大いに遅延させるということを示している。これらの実験において、マウスには通常のメチオニンが枯渇していない食餌を与えた。Ｈ４６０に対するメチオニナーゼの効力は、５−フルオロウラシル及びビンクリスチン治療（これらはかかる腫瘍に対しては不活性である）とは全く対照的であった。投与されたメチオニナーゼの活性は、４０〜１２０
単位／日での１０日間までの治療では体重減少を引き起こさず、これは低毒性の可能性を示すものである。それとは対照的に、ビンクリスチンは体重減少を引き起し、これは毒性を示すものである。このように、メチオニナーゼは最小毒性の新規腫瘍選択的作用機構を有する非常に有効な抗腫瘍剤であり、ヒト固形腫瘍に対する潜在的な臨床的有効性を示すものである。
実施例４
ＰＥＧ−メチオニナーゼの調製
分子量５０００のメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルカーボネート（Ｍ−ＳＣ　５０００　ＰＥＧ）を２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）に２ｍＭ乃至２０ｍＭの濃度で溶かした。Ｍ−ＳＣ　５０００　ＰＥＧとメチオニナーゼの比率は６：１と　２４０：１の間で変化させた。ＰＥＧ化反応は反応緩衝液（２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．３）中で４℃又は２０℃にて３０分から６０分間行った。０℃にて停止緩衝液（０．１４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５）を用いて反応を停止させた。次いで、未反応のＭ−ＳＣ　５０００　ＰＥＧを本明細書中に記載したようなゲル濾過クロマトグラフィーによって除去した。得られたＰＥＧ−メチオニナーゼを０．１２Ｍ塩化ナトリウム及び１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）溶液中に３０ｋ　Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ
濃縮器を用いて配合した。次に、ＰＥＧ−メチオニナーゼを　０．２μＭ　ミクロン膜フィルターを用いて濾過することによって滅菌した。ＰＥＧ−メチオニナーゼは−７０℃にて６カ月まで活性を損失することなく保存し得る。
メチオニナーゼ活性を測定した。ＰＥＧ−メチオニナーゼの活性は、非ＰＥＧ化メチオニナーゼの活性の少なくとも６０％に維持されていた。ＰＥＧ−メチオニナーゼを、Ｌａｅｍｍｌｉ　及びＳａｍｂｒｏｏｋ（Ｌａｅｍｍｌｉ，　Ｎａｔｕｒｅ　２２７−６８０，１９７０；　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ら，　分子クローニング：実験の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ）　１８．４７−１８．５９，　１９８９）　に記載されたような未変性及びＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。この電気泳動は下記のようにして修正を加えた：ＰＥＧ−メチオニナーゼの電気泳動はＳＤＳを含むか又はＳＤＳを含まない　０．２Ｍトリス−グリシン緩衝液（ｐＨ８．３）中の　７．５％ポリアクリルアミドプレキャストゲル中で行った。ゲルをクーマシーブルーで染色し、４０％メタノール１０％酢酸を用いて脱色した。ＰＥＧ−メチオニナーゼを未変性ゲルに加えた場合、非修飾メチオニナーゼのバンドは観察されなかったが、ＳＤＳゲル中では非常に小さいバンドが観察された。
次に、ＰＥＧ−メチオニナーゼをＨＰＬＣゲル濾過カラムによって下記のようにして分析した：ＰＥＧ−メチオニナーゼ（１〜２ｍｇ／ｍｌで２０　ｍｌ）を２０μｍ　ループを用いて　０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中のＰｒｏｇｅｌ−ＴＳＫ　Ｇ３０００　ＳＷ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）カラムに加えて、　０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）にて流量　１．０ｍｌ／分で溶離させた。タンパク質のピークはＰＥＧ−メチオニナーゼのピークが一つだけ検出され（未反応のＰＥＧは含まれない）；非ＰＥＧ化メチオニナーゼのピークは検出されなかった。ＰＥＧ−メチオニナーゼの純度は約　１００％であった。
ａ）ＰＥＧ化反応の経時進行研究
メチオニナーゼに対するポリエチレングリコールの結合の経時進行を下記のようにして測定した：メチオニナーゼ０．０７ｍＭを、Ｍ−ＳＣ　５０００　ＰＥＧ　０．４ｍＭを含む０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）と、４℃にて２時間までの様々な時間にわたって反応させた。　０．２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）を用いて種々の時点で反応を停止させた。未反応ＰＥＧを３０ｋ　Ａｍｉｃｏｎ　ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ　濃縮器を用いて除去した。その結果を表３に示す。
ＰＥＧ−メチオニナーゼを本明細書中に記載したようにして未変性及びＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。高分子量のバンドの出現を観察し、表３に−、＋−、＋、又は＋＋の記号で示す。−はＰＥＧ−メチオニナーゼ又はメチオニナーゼがないことを示し、＋−は少量のＰＥＧ−メチオニナーゼ又はメチオニナーゼが存在することを示し、そして＋＋は多量のＰＥＧ−メチオニナーゼ又はメチオニナーゼが存在することを示す。また、表３にＰＥＧ−メチオニナーゼ又はメチオニナーゼの活性も示す。
【００１８】
【表３】
2004081209.tif 000005
＊Ｍ　＝メチオニナーゼ、＊＊Ｐ＝Ｍ−ＳＣ　５０００　ＰＥＧ
ｂ）Ｍ−ＳＣ　５０００　ＰＥＧ　　を用いたメチオニナーゼＰＥＧ化の濃度依存性
０．０７ｍＭのメチオニナーゼを、種々の濃度（０．４ｍＭから４．０ｍＭ）のＭ−ＳＣ　５０００　ＰＥＧを含む　０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）と反応させた。モル比は１：６〜１：６０であった。反応を実施例ａと同様の条件で４℃にて６０分間行った。
その結果を表４に示す。
【００１９】
【表４】
2004081209.tif 000006
ｃ）ＰＥＧ−メチオニナーゼの薬物速度論（Ｐｈａｒｍｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）
Ｍ−ＳＣ　５０００　ＰＥＧを有するメチオニナーゼとメチオニナーゼのＰＥＧ化のモル比は、それぞれ１：６（Ｐ１）及び１：１２（Ｐ２）であった。反応は上記（ｂ）　と同じ条件で行った。精製されたＰ１及びＰ２並びに非修飾メチオニナーゼを、３つの異なる群のマウスの尾静脈にそれぞれ注射した。血液試料を０、１、２、３、４及び２０時間後に集めた。メチオニナーゼ及びＰＥＧ−メチオニナーゼの活性アッセイ、並びにメチオニンの枯渇のレベルを測定した。その結果を表５に示す。
【００２０】
【表５】
2004081209.tif 000007
実施例５
モルモットにおけるＰＥＧ−メチオニナーゼを用いた抗原性実験
メチオニナーゼをＭ−ＳＣ　５０００　ＰＥＧとそれぞれ１：６０、１：１２０　及び１：２４０　のモル比で２０℃にて３０分間反応させた。その他の条件は上記（ａ）　と同様である。ＰＥＧ−メチオニナーゼをメチオニナーゼ活性アッセイ、電気泳動及びＨＰＬＣによって分析した。非修飾メチオニナーゼのバンド又はピークは検出不能であった。したがって、ＰＥＧ−メチオニナーゼが唯一の酵素源であった。
２ｍｇのメチオニナーゼ又はＰＥＧ−メチオニナーゼをモルモットに２日毎に合計３回腹腔内投与した。２週間後、４ｍｇのメチオニナーゼ又はＰＥＧ−メチオニナーゼを静脈内投与した。この実験において、　０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液及びＢＳＡを、それぞれ陰性の対照及び陽性の対照として用いた。その結果を表６の基準にしたがって評価した。その結果を表７に示す。モルモットで試験されたように、メチオニナーゼのＰＥＧ化によって極端に低い抗原性の組成物が得られた。モルモットはヒトよりも抗原に対して感受性が強いということが知られている。
【００２１】
【表６】
2004081209.tif 000008
【００２２】
2004081209.tif 000009
2004081209.tif 000010
【００２３】
【表７】
2004081209.tif 000011
【００２４】
それらの結果は、ＰＥＧ−メチオニナーゼは、ウシ血清アルブミン（Ｂ．Ｓ．Ａ．）及びメチオニナーゼとは対照的にモルモットにおいて抗原性を有さないということを示しており、このことは、ＰＥＧ−メチオニナーゼを哺乳類に投与した場合、ＰＥＧ−メチオニナーゼは非免疫原性であるということを示唆するものである。
実施例６
ヒト癌治療のためのメチオニナーゼの投与
メチオニナーゼの毒性、薬物速度論及び最大許容用量を測定するために、メチオニナーゼのＩ期用量漸増研究を開始した。　５，０００単位（０．５ｇ）　及び１０，０００単位（１．０ｇ）　のメチオニナーゼを含む注入液を進行した乳癌を有する患者２人に静脈内輸液によって２時間投与した。０〜２４時間の間にたびたび血液試料及び尿試料を採取した。ＷＨＯ格付け方式（ｇｒａｄｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ）にしたがって毒性評価を行った。血清中のメチオニナーゼレベル及びメチオニンレベルから薬物速度論データが得られた。
あらゆる毒性基準を用いて測定しても最小グレード０を有しており急性の臨床的毒性は全く観察されなかった。患者１及び患者２におけるメチオニナーゼの半減期は、それぞれ２時間及び　３．２時間であった。血清メチオニンの枯渇は輸液開始後３０分以内に始まり、輸液終了後４時間持続された。患者１及び患者２における血清メチオニンの最低レベルは、それぞれ治療前のレベルの３５％及び１９％であった。それらの結果を表８〜１０及び図４〜６に示す。患者は下記のようにして治療した。
患者１：日付：１９９４年１２月４日。診断：腋窩リンパ節及び肺転移を有する乳癌。女性、４６歳。抽出法（実施例１）にしたがって精製したメチオニナーゼ　５，０００単位（０．４ｇ）を静脈内注入液　２００ｍｌに加えて２時間投与した。治療前と、治療後２０時間までの２時間毎に血液試料を採取した。メチオニン及びメチオニナーゼのレベルを測定し、相対レベルを計算した（図４）。
患者２：日付：１９９５年２月２日。診断：腋窩リンパ節転移を有する乳癌。女性、５４歳。抽出法（実施例１）にしたがって精製したメチオニナーゼ１０，０００単位（０．８ｇ）を静脈内注入液　４００ｍｌに加えて２時間投与した。治療前と、治療後２０時間までの２時間毎に血液試料を採取した。メチオニン及びメチオニナーゼのレベルを測定し、相対レベルを計算した（図５）。
患者３：日付：１９９５年１０月１５日。診断：腋窩リンパ節転移を有する乳癌。女性、４５歳。抽出法（実施例１）にしたがって精製したメチオニナーゼ２０，０００単位（１．６ｇ）を静脈内注入液１０００ｍｌに加えて１０時間投与した。治療前と、治療後２０時間までの２時間毎に血液試料を採取した。メチオニン及びメチオニナーゼのレベルを測定し、相対レベルを計算した（図６）。
患者３は、輸液直後の６時間の間、最高レベルの５０％の血清メチオニナーゼレベルを維持していた。メチオニンは輸液１０時間後に２３．１μＭ　から　０．１μＭ　と、　２００倍以上激減した。あらゆる毒性基準で測定しても臨床的毒性は全く観察されなかった。
４分野：ａ．　病歴及び診断データ；ｂ．　理学的検査；ｃ．　検査室評価（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）　；及びｄ．　薬物速度論的評価（血清中のメチオニナーゼレベル及びメチオニンレベル）において、ＷＨＯ毒性基準にしたがって毒性評価を行った。それらの結果を表８〜１１及び図４〜６に示すが、本発明のメチオニナーゼは毒性がなく、ヒトにおけるメチオニンレベルの低減に使用し得ることが証明されている。
【００２５】
【表８】
2004081209.tif 000012
【００２６】
【表９】
2004081209.tif 000013
【００２７】
【表１０】
2004081209.tif 000014
【００２８】
【表１１】
2004081209.tif 000015
【００２９】
実施例７
ホモシステインのｉｎ　ｖｉｖｏ　枯渇
本発明によるホモシステインの枯渇における使用のためのメチオニナーゼのｉｎ　ｖｉｖｏ　の効果を下記のようにマウスに該酵素を投与することによって立証した：実施例１の方法にしたがって精製したメチオニナーゼ４単位をマウスに腹腔内注射した。注射の約１時間後、メチオニン、ホモシステイン及びシステインの血中濃度を、マウス血清５０μｌ　をＰＩＴＣによる誘導体化後、逆相ＦＰＬＣによる分析にかけることによって定量した。そのクロマトグラフィー図をＰＩＴＣ誘導体化内標準メチオニン、ホモシステイン及びシステインのものと比較した。このアッセイの感度は約　０．５μＭ　メチオニンであった。
表１２に示したように、対照の未治療マウスにおけるホモシステイン及びシステインのレベルと比較すると、メチオニナーゼは、システインのｉｎ　ｖｉｖｏ　レベルの有意な枯渇なしに有意なｉｎ　ｖｉｖｏ　ホモシステイン枯渇活性を有していた。
【００３０】
【表１２】
2004081209.tif 000016
【００３１】
実施例８
腫瘍イメージングのためのメチオニナーゼの使用
患者に本明細書中に記載したような精製メチオニナーゼを投与することによって［１２Ｃ］　メチオニンを枯渇させる。そのメチオニナーゼはエンドトキシンを含まないことが好ましい。メチオニナーゼ（　１０，０００〜２０，０００単位）を４〜８時間にわたって静脈内輸液によって投与した。次いで、約５〜５０ｍＣｉ　の［１１Ｃ］　メチオニナーゼを投与した。次に、陽電子射出断層撮影（ＰＥＴ）イメージングを用いて、患者の細胞による［１１Ｃ］　トレーサーの取込みを検出する。トレーサー取込みは、当業者に知られた方法によって標準取込み値（Ｓ．Ｕ．Ｖ．）及び速度論的流出定数（ｋｉｎｅｔｉｃ　ｉｎｆｌｕｘ　ｃｏｎｓｔａｎｔ，　Ｋｉ）　値を計算することによって定量化される。細胞中の［１１Ｃ］　メチオニンのレベルの上昇は、かかる細胞が腫瘍細胞である可能性があることを示すものである。腫瘍細胞による［１１Ｃ］　メチオニンの優先的な取込みは、正常細胞の中の腫瘍細胞を選択的に検出する方法を与える。
上述の明細書は、特定の態様及び実施例を含むが、本発明を説明するものであり、限定的なものとして受け取られるものではない。多数のその他の変形及び修正が本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなくもたらされ得る。
実施例９
メチオニナーゼをコードする核酸分子の単離
メチオニナーゼ遺伝子クローンの挿入断片のＰＣＲ反応：
ＡＴＣＣ８２０９由来の、シュードモナス　　プチダＡＣ−１のゲノムＤＮＡを鋳型として用いた：使用したプライマーは下記のとおりである：
2004081209.tif 000017
【００３２】
ＰＣＲ反応条件は下記のとおりである：まず、９５℃で１０分間変性させ、次いで９４℃、３０秒間の変性を５サイクル行い、６０℃で３０秒間アニーリングし、そして７２℃で２分間伸長させる；次に、９４℃にて３０秒間、６０℃にて３０秒間、続いて７２℃にての　１．５分間の変性を２５サイクル行い；次いで最終的に７２℃で１０分間伸長させる。ＰＣＲ増幅産物のバンドが二つあり、その中の１３６５ｂｐのバンドを採取して挿入断片ＯＮＣａｓｅ−１　ＤＮＡとして精製した。
クローニング及び形質転換
ＯＮＣａｓｅ−１　ＤＮＡをｐＴ７Ｂｌｕｅ　Ｔ−ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）　とＥｃｏＲ　Ｖ　Ｔ−　クローニング部位で連結した。標準的な手順によってｐＯＮＣａｓｅ−１　ＤＮＡでＤＨ５−α細菌細胞を形質転換した。
ＤＮＡ配列決定
Ｔ７　　ＤＮＡポリメラーゼ及びジデオキシヌクレオチド停止反応を用いてＤＮＡ配列決定を行った。プライマー歩行法（ｐｒｉｍｅｒ　ｗａｌｋｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ）　を用いた。標識には　［３５Ｓ］ｄＡＴＰを用いた。６％ポリアクリルアミドウェッジ又は８Ｍ尿素を含む非ウェッジゲル上で配列決定反応を分析した。ＤＮＡ試料をＡＣＧＴの順に加えた。ＤＮＡ配列をＭａｃＶｅｃｔｏｒ　によって分析した。ＤＮＡ配列及びそれに対応するアミノ酸配列を図８に示す。
実施例１０
組換えメチオニナーゼの高発現クローン
メチオニナーゼ発現クローンの挿入断片のＰＣＲ反応：
鋳型として　ｐＯＮＣａｓｅ−１　クローンを用いた。使用したプライマーは下記のとおりである：
2004081209.tif 000018
【００３３】
ＰＣＲ反応条件は下記のとおりである：まず、９５℃で１０分間変性させ、次いで９４℃、１分間の変性を５サイクル行い、５６℃で　１．５分間アニーリングし、そして７２℃で２分間伸長させる；次に、９４℃にて３０秒間の変性、５６℃にて３０秒間の変性、続いて７２℃にての　１．５分間の伸長を２０サイクル行い；次いで最終的に７２℃で１０分間伸長させる。二つのＰＣＲ増幅産物、ＯＮＣａｓｅ−２（１２３８ｂｐ）、ＯＮＣａｓｅ−３（１２２０ｂｐ）のバンドを採取して精製した。
クローニング及び形質転換
ＯＮＣａｓｅ−２　ＤＮＡ及び　ＯＮＣａｓｅ−３　ＤＮＡをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ　で消化してｐＴ７．７　ベクターとＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ　クローニング部位で連結した。次いで、標準的な手順によってｐＯＮＣａｓｅ−２　及びｐＯＮＣａｓｅ−３　ＤＮＡ配列でＢＬ２１（ＤＥ３）　細菌細胞を形質転換した。
ｐＡＣ−１　及びｐＡＣ−２　クローンの選択
アンピシリン含有プレートから陽性クローンを選別した。４℃で２４時間保存したところ、高レベルの組換えメチオニナーゼを発現した陽性クローンは、その同定及び選別を可能にするようなはっきりした桃色になっていた。陽性クローンのメチオニナーゼ発現レベルを活性アッセイによって定量した。二つの高発現クローンを、ＯＮＣａｓｅ−３を含むｐＡＣ−１　クローン及びＯＮＣａｓｅ−２を含むｐＡＣ−２　クローンとして選別した。
ｐＡＣ−３　クローン及びｐＡＣ−４　クローンの構築
ｐＢＲ３２２のＡｖａ　Ｉ　及びＣｌａ　Ｉ　部位からテトラサイクリン耐性遺伝子を得た。Ａｖａ
Ｉ　末端を平滑末端でふさいで、ＢａｍＨ　Ｉ及びＣｌａ　Ｉ　制限酵素で消化したｐＡＣ−１　（このＢａｍＨ　Ｉ末端は平滑末端でふさいだ。）と連結した。４℃で２４時間保存した後に桃色になった陽性クローンをテトラサイクリン含有プレートから選別した。高発現組換えメチオニナーゼクローンを活性アッセイによって測定し、ｐＡＣ−３　クローンと名付けた。
また、ｐＢＲ３２２のＡｖａ　Ｉ　及びＨｉｎｄ　ＩＩＩ部位からもテトラサイクリン耐性遺伝子を得た。Ａｖａ　Ｉ　末端を平滑末端でふさいで、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ及びＣｌａ　Ｉ　制限酵素で消化したｐＡＣ−１　（このＣｌａ　Ｉ　末端は平滑末端でふさいだ。）と連結した。４℃で２４時間保存した後に桃色になった陽性クローンをテトラサイクリン含有プレートから選別した。高発現組換えメチオニナーゼクローンを活性アッセイによって測定し、ｐＡＣ−４　クローンと名付けた。種々の高レベルの発現クローンを表１３及び図９に示す。
【００３４】
【表１３】
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【００３５】
実施例１１
組換えメチオニナーゼ発現クローンの発酵
組換えメチオニナーゼの発現クローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）　又はテトラサイクリン　（１０μｇ）を含むＴｅｒｒｉｆｉｃ　Ｂｒｏｔｈ培地中で、２８℃又は３７℃にて、６−Ｌフラスコ又は発酵槽中で４００ｒｐｍで振盪させながら増殖させた。
実施例１２
組換えメチオニナーゼの精製
精製法の概要を図１０及び１１に示す。
（１）　試料の前カラム処理
４℃、　８００×ｇで１０分間遠心分離することによって細菌を採収した。次いで、細菌ペレットを抽出溶液（２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ９．０）、１０μＭ　リン酸ピリドキサール及び０．０１％β−メルカプトエタノール）中に懸濁して、キャビテーター型ホモジナイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社、モデル♯ＨＣ　８０００）を用いて破砕した。次に、ホモジネートの加熱処理を５０℃で１分間行った。この懸濁液を自動低温遠心分離機（ＳＯＲＶＡＬＬ　Ｓｕｐｅｒｓｐｅｅｄ　ＲＣ　２−Ｂ）　を用いて４℃、１３ｋ　ｒｐｍ　にて３０分間遠心分離した。続いて上清を採取した。この工程の後、ミリポアＰｒｅｐ／Ｓｃａｌｅ−ＴＦＦ　ＰＬＨＫ　１００ｋ　２．５　ｆｔ２カートリッジで緩衝液（１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８．３）とともに限外濾過した。限外濾過によってｐＨを　７．２に調節した。
（２）　クロマトグラフィーの条件
第１のカラム：ＤＥＡＥ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ　
カラム：ＸＫ　１００／６０　、高さ：３２ｃｍ、容積：　２．５Ｌ
溶液：
［Ａ］　４０ｍＭ塩化カリウム、１０μＭ　リン酸ピリドキサールを含む１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．２）　及び０．０１％β−メルカプトエタノール。
［Ｂ］　　２００ｍＭ塩化カリウム、１０μＭ　リン酸ピリドキサールを含む１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．２）　及び０．０１％β−メルカプトエタノール。
流量：５ｍｌ／分
試料：合計約　１００〜２００　ｇ（１０〜２０ｍｇ／ｍｌ）のタンパク質を第１のカラムに加える。
グラジエント：
［１］　ＯＤ２８０　が　０．１以下に下がるまで溶液Ａ約１０容で予備洗浄。
［２］　グラジエント：溶液Ｂを２０％〜１００　％。
分画：溶出画分　２００ｍｌを回収する。ｒＭＥＴａｓｅ　を含む画分を活性アッセイによって確認し、プールする。
第２のカラム：ＤＥＡＥ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ　
カラム：ＸＫ　５０／３０、高さ：２５ｃｍ、容積：　５００ｍｌ
溶液：［Ａ］　　１００ｍＭ塩化カリウム、１０μＭ　リン酸ピリドキサールを含む１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．３）　及び０．０１％β−メルカプトエタノール。
【００３６】
［Ｂ］　　２００ｍＭ塩化カリウム、１０μＭ　リン酸ピリドキサールを含む１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．３）　及び０．０１％β−メルカプトエタノール。
流量：５ｍｌ／分
試料：合計約１０〜２０ｇ（２〜４ｍｇ／ｍｌ）のタンパク質を、　１００ｍＭ塩化カリウム、１０μＭ　リン酸ピリドキサールを含む１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．３）　中で２４時間透析した後、第２のカラムに加える。
グラジエント：
［１］　ＯＤ２８０　が０．０５以下に下がるまで溶液Ａ約５容で予備洗浄。
［２］　グラジエント：溶液Ｂを０％〜６０％。
分画：溶出画分　２００ｍｌを回収する。ｒＭＥＴａｓｅ　を含む画分を活性アッセイによって確認し、プールする。
第３のカラム：Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００　ＨＲ
カラム：ＨｉＰｒｅｐ　２６／６０、容積：　３２０ｍｌ。
溶液：０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）
流量：　１．２ｍｌ／分
試料：約１０ｍｌの濃縮試料（０．１５Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）中での１２時間の透析後）、第３のカラムに加える。
分画：ｒＭＥＴａｓｅ　を含む２０ｍｌの溶出画分（黄色及び活性アッセイで確認する）を回収する。
第４のカラム：Ａｃｔｉｃｌｅａｎ　Ｒ　Ｅｔｏｘ　　
容量　１００〜２００ｍｌ　の精製ｒＭＥＴａｓｅ（１０〜２０ｍｇタンパク質／ｍｌ）を　５００ｍｌの　ＡｃｔｉｃｌｅａｎＲ　Ｅｔｏｘ　カラムに加えて、エンドトキシンを排除するために溶離緩衝液（０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）で溶出する。　ＡｃｔｉｃｌｅａｎＲ　Ｅｔｏｘ　は再生可能であり、１Ｍ水酸化ナトリウムで清浄にしてオートクレーブで処理することができる。
最終溶離剤の濃度
最終溶離剤は３０Ｋ　Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ　濃縮器で濃縮する。精製ｒＭＥＴａｓｅ　用の処方は、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２　である。
ｒＭＥＴａｓｅ．ヒスチジンの精製：Ｎｉ＋＋Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　カラム上のクロマトグラフィー
前カラム処理後、細胞ホモジネートを結合緩衝液（５ｍＭイミダゾール、　０．５Ｍ　ＮａＣｌ　、２０ｍＭトリス．ＨＣｌ、ｐＨ７．９）に懸濁する。次に、カラムを結合緩衝液１０容で洗浄した後、洗浄緩衝液（６０ｍＭイミダゾール、　０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭトリス．ＨＣｌ、ｐＨ７．９）を用いて洗浄する。溶離緩衝液（１Ｍイミダゾール、　０．５Ｍ　ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス．ＨＣｌ、ｐＨ７．９）６容がカラムを通過した後、溶離が起こる。ｒＭＥＴａｓｅ　を含有する画分を黄色の着色によって確認し、回収する。
実施例１３
ＨＰＬＣによるｒＭＥＴａｓｅ　の純度分析
カラム：ＳＵＰＥＬＣＯ　、８−０８５４１　、Ｐｒｏｇｅｌ　ＴＭ−ＴＳＫ　、Ｇ　３０００−ＳＷＸＬ　、３０ｃｍ×７．８ｍｍ　。
溶離溶液：０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）　。
流量：　０．１ｍｌ／分。
試料：２０μｌ　（０．１〜１ｍｇ／ｍｌ）。
ｒＭＥＴａｓｅ　の製造例を図１０及び１１に示す。純度は図１２に示す。
実施例１４
組換えメチオニナーゼ、結晶化体及び凍結乾燥体を含む製剤
溶液製剤：
ｒＭＥＴａｓｅ　を０．１５Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）の溶液に１０〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で配合した。ｒＭＥＴａｓｅ　の安定性を図１３に示す。
結晶化体：
ｒＭＥＴａｓｅ（１０〜２０ｍｇ／ｍｌ）　を０．１５Ｍ塩化ナトリウム及び１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）　に加えた溶液をＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５（ＤＮＡグレード、超微細（ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）　、Ｓｉｇｍａ）カラムを用いて脱塩した。この溶液をドライアイス及びアセトン浴にて凍結させ、次にＶｅｒｄｉｓ　Ｆｒｅｅｚｅ　Ｍｏｂｉｌ　２４を用いて　１００ｍｉｌｉｆａｒ　の真空度で、−８０℃にて７２時間結晶化を行った。
凍結乾燥体：
ｒＭＥＴａｓｅ（１０〜２０ｍｇ／ｍｌ）を０．１５Ｍ塩化ナトリウム及び１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）　に加えた溶液を、ドライアイス及びアセトン浴にて凍結させ、ＶｅｒｄｉｓＦｒｅｅｚｅ　Ｍｏｂｉｌ　２４を用いて　１００ｍｉｌｉｆａｒ　の真空度で、−８０℃にて７２時間凍結乾燥を行った。
活性アッセイ：
このアッセイは１０μＭ　リン酸ピリドキサール及び１０ｍＭメチオニンを含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）　１ｍｌ容中で酵素の量を変えながら３７℃で１０分間行った。　４．５％ＴＣＡ　０．５ｍｌを添加することによって反応を停止させた。懸濁液を１５Ｋ　ｒｐｍ　で２分間遠心分離した。上清　０．５ｍｌを０．０５％３−メチル−２−　ベンゾチアゾリノンヒドラゾン　０．５ｍｌとともに１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）　１ｍｌに加えた溶液を５０℃で３０分間インキュベートした。そして、次にＯＤ３３５　での分光光度測定によってα−ケトブチレートを測定した。Ｌｏｗｒｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）の手順にしたがってタンパク質の量を測定した。比活性を単位／ｍｇタンパク質として計算した。
ｒＭＥＴａｓｅ　の活性を比較したところ、それらの結果は異なる剤形間で大きな相違はなかった。
【００３７】
実施例１５
組換えメチオニナーゼの化学修飾
精製ｒＭＥＴａｓｅ　を０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）　に　０．１Ｍ〜０．２　Ｍの濃度で配合した。その活性は約２０単位／ｍｇであった。
分子量５０００のＭ−ＳＣ　５０００　ＰＥＧ（　メトキシ−ＳＣ−ＰＥＧ　、ＭＷ　５０００　、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒｐｏｌｙｍｅｒｓ　社）を２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）　に２ｍＭ〜２０ｍＭの濃度で溶解した。Ｍ−ＳＣ　５０００　ＰＥＧとｒＭＥＴａｓｅ　のモル比は１０：１〜　１２０：１で間で変動する。
反応緩衝液（２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．３）中、２０℃で６０分間ＰＥＧ化反応を行った。停止緩衝液（０．１４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５）を用いて０℃で反応を停止させた。次いで、未反応のＭ−ＳＣ　５０００　ＰＥＧを３０　Ｋ　ＡｍｉｃｏｎＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ濃縮器を用いて除去した。得られたＰＥＧ−メチオニナーゼを、３０　ＫＡｍｉｃｏｎ　Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ濃縮器を用いて遠心分離しながら０．１５Ｍ塩化ナトリウム及び１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）　に配合した。
ＰＥＧ−ｒＭＥＴａｓｅ　のｉｎ　ｖｉｔｒｏ分析
ＰＥＧ−ｒＭＥＴａｓｅ　を活性アッセイ、電気泳動及びＨＰＬＣによって分析した（図１４〜１６）。
活性アッセイ
ＰＥＧ−ｒＭＥＴａｓｅ　の活性は非修飾ｒＭＥＴａｓｅ　の８０％〜２０％の間であった。
電気泳動
ＰＥＧ−ｒＭＥＴａｓｅ　を未変性及びＳＤＳ−ＰＡＧＥの両方に加えた。
ＨＰＬＣ分析：
ＰＥＧ−ｒＭＥＴａｓｅ　をゲル濾過カラムに加えた。原料のｒＭＥＴａｓｅ　のピークは検出されず、ＰＥＧ−ｒＭＥＴａｓｅ　のピークのみが観察された。保持時間（ＲＴ）はＰＥＧとｒＭＥＴａｓｅ　のモル比が上昇するにつれて短くなった。
ＰＥＧ−ｒＭＥＴａｓｅ　の薬物速度論：
精製したエンドドキシンフリーのＰＥＧ−ｒＭＥＴａｓｅ　をマウスの尾静脈に注射した。血液試料を２時間毎に採取した。ｒＭＥＴａｓｅ　のレベルを活性アッセイによって測定した（図１６）。
実施例１６
組換えメチオニナーゼの効力及び毒性
ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるｒＭＥＴａｓｅ　による細胞増殖阻害
ＫＢ３−１　細胞（ヒト扁平上皮癌）を１０％ＦＢＳを補給したＲＰＭＩ　１６４０　培地中で増殖させた。種々の濃度のｒＭＥＴａｓｅ　を該培地に加えて、３７℃、５％ＣＯ２　中でインキュベートした。相対細胞数をＯＤ５７０　で測定した。その結果は、ｒＭＥＴａｓｅ　が効果的に細胞増殖を阻害するといことを証明している（図１７）。
ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるｒＭＥＴａｓｅ　によるＨ４６０及びＨＴ２９の増殖阻害
ヒト肺癌細胞Ｈ４６０及びヒト結腸癌細胞ＨＴ２９を、種々の濃度（０〜４単位／ｍｌ）のｒＭＥＴａｓｅ　とともに４日間増殖させ、次に生細胞を計数した。この実験を３回繰り返した。これらの結果は、ｒＭＥＴａｓｅ　が効果的にＨ４６０と及びＨＴ２９の細胞増殖を阻害するということを証明している（図２５）。
ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける正常細胞とヒト癌細胞とのｒＭＥＴａｓｅ　に対する感受性の比較
正常ヒト包皮線維芽細胞ＨＳ−６８及びヒトケラチノサイトを対照として用いて、ヒト結腸癌ＳＷ−６２０及びヒト肺ガン細胞Ｈ３２２ｍと比較した。それらの細胞を種々の濃度（０〜４単位／ｍｌ）のｒＭＥＴａｓｅ　とともに３日間増殖させ、次いで生細胞を計数した。この実験を３回繰り返した。これらの結果は、ＳＷ−６２０とＨ３２２ｍ細胞の両方が１単位／ｍｌの濃度のｒＭＥＴａｓｅ　で死滅し、正常ヒトＨＳ−６８細胞はその増殖率は減少したが依然として生存しているということを示すものである。また、正常ヒトケラチノサイトも癌細胞と比較してｒＭＥＴａｓｅ　に対する感受性がかなり低かった（図２６）。
ヌードマウスにおけるｒＭＥＴａｓｅ　による細胞の増殖阻害
８群のマウス（Ｂａｌｂ／ｃ　ｎｕ／ｎｕ　、雌）　に２×１０５　細胞を注射した。対照：通常生理食塩水。Ｉ群：ｒＭＥＴａｓｅ　３０単位、ＩＩ群：ｒＭＥＴａｓｅ　１００　単位；５日目〜１４日目の間、１日２回腹腔内注射。腫瘍サイズ及び体重を測定した。血液を１８日目に採取した。それらの結果から、ｒＭＥＴａｓｅ　が体重減少及び血液細胞産生における作用なしに効果的に腫瘍増殖を阻害するということが証明された（図１８〜２２）　。
ヌードマウスにおけるｒＭＥＴａｓｅ　によるＨ４６０及びＨＴ２９細胞の増殖阻害
１０６　Ｈ４６０細胞及びＨＴ２９細胞をそれぞれ皮下移植し、２日目〜１６日目の間、１日２回、ｒＭＥＴａｓｅ　４０単位又は　１００単位を腹腔内注射によって投与した。対照群には通常生理食塩水　０．２ｍｌを１日２回腹腔内注射した。１６日目にマウスを殺した。それらの結果から、ｒＭＥＴａｓｅ　が体重減少及び血液細胞産生における作用なしに効果的に腫瘍増殖を阻害するということが証明された。
精製組換えＭＥＴａｓｅｒ　のパイロットＩ期臨床試験
女性、５０歳、リンパ節転移を伴った段階ＩＶの乳癌を有する患者１に１０，０００単位（０．５ｇ）のｒＭＥＴａｓｅ　を１０時間静脈内輸液した。
女性、４８歳、リンパ節転移を伴った段階ＩＶの乳癌を有する患者２に　５，０００単位（０．２５ｇ）　のｒＭＥＴａｓｅ　を２４時間静脈内輸液した。
女性、５６歳、段階ＩＩＩ　の腎臓癌を有する患者３に１０，０００単位（０．５ｇ）のｒＭＥＴａｓｅを２４時間静脈内輸液した。表１４。
理学的検査を記録し、治療前、治療中の２時間毎、及び輸液終了後４８時間（示したとおりである）までの２時間毎において血液試料を採取した。ＷＨＯ基準にしたがって、検査室測定を行った。
それらの結果は、全ての患者において輸液の開始直後にｒＭＥＴａｓｅ　レベルが増大し、輸液中高レベルで維持されるということを示している。一人の患者においては、４８時間後、メチオニナーゼレベルがベースラインまで下がっている。これらの結果は、輸液開始直後にｒＭＥＴａｓｅ　レベルが増大し、１０時間後に頂点に達したということを示している。輸液の終了後８時間で、そのレベルはピークの５０％になり、輸液終了後１６時間においても依然としてピークの２０％を維持していた。検査室検査の結果を、ＷＨＯ基準にしたがって評価したところ、患者１、２又は３において急性毒性は見られなかった。表１５及び１６並びに図２３及び２４。この結果は、ｒＭＥＴａｓｅ　が毒性を何ら引き起こさないということを示唆するものであった。
【００３８】
【表１４】
2004081209.tif 000020
【００３９】
【表１５】
2004081209.tif 000021
【００４０】
【表１６】
2004081209.tif 000022
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、メチオニンを含まない、ホモシステインを含まない、またはメチオニンおよびホモシステインを含まない培地における癌細胞系の増殖を示す６つのグラフを集めたものである。
【図２】図２は、マウス異種移植片におけるヒト肺癌（Ｈ４６０）の増殖レベルを低下させるメチオニナーゼの効力を示すグラフである。５−ＦＵおよびビンクリスチン処理の結果を合わせて示す。
【図３】図３は、ヒト肺癌（Ｈ４６０）を移植したマウスの体重に及ぼすメチオニナーゼ、５−ＦＵおよびビンクリスチンの効果を示すグラフである。
【図４】図４は、メチオニナーゼを３人のヒト患者に投与した後のメチオニナーゼおよびメチオニンの薬物動態のグラフである。メチオニナーゼ活性の百分率は、実験開始時のメチオニナーゼ調製物の活性の相対百分率として測定されている。メチオニンの百分率は、メチオニナーゼ投与前のメチオニンに濃度の相対百分率として測定されている。
【図５】図５は、メチオニナーゼを３人のヒト患者に投与した後のメチオニナーゼおよびメチオニンの薬物動態のグラフである。メチオニナーゼ活性の百分率は、実験開始時のメチオニナーゼ調製物の活性の相対百分率として測定されている。メチオニンの百分率は、メチオニナーゼ投与前のメチオニンに濃度の相対百分率として測定されている。
【図６】図６は、メチオニナーゼを３人のヒト患者に投与した後のメチオニナーゼおよびメチオニンの薬物動態のグラフである。メチオニナーゼ活性の百分率は、実験開始時のメチオニナーゼ調製物の活性の相対百分率として測定されている。メチオニンの百分率は、メチオニナーゼ投与前のメチオニンに濃度の相対百分率として測定されている。
【図７】図７は、メチオニナーゼ−ホモシステイン代謝サイクルの説明図である。
【図８】図８は、Ｐ．プチダから単離されたメチオニナーゼをコードするＤＮＡ分子のヌクレオチド配列およびそれに対応するアミノ酸配列を示す。
【図９】図９は、ベクターに含まれる代表的な高発現モジュールの図を示す。
【図１０】図１０は、高度に純粋で、エンドトキシンを含まないメチオニナーゼを得るために用いられる精製工程の概要を示す。
【図１１】図１１は、本明細書に記述する精製法を用いたｒＭＥＴａｓｅの典型的純度および回収収率の概観を示す。
【図１２】図１２は、本発明の方法によって産生されたｒＭＥＴａｓｅの純度の例を示す。
【図１３】図１３は、異なるｒＭＥＴａｓｅ製剤の活性プロフィールを示す。
【図１４】図１４は、ＰＥＧ−ｒＭＥＴａｓｅのＨＰＬＣ分析データを示す。
【図１５】図１５は、ＰＥＧ−ｒＭＥＴａｓｅのＨＰＬＣ分析データを示す。
【図１６】図１６は、マウスにおけるＰＥＧ−ｒＭＥＴａｓｅの薬物動態を示す。
【図１７】図１７は、ｒＭＥＴａｓｅによってもたらされるＫＢ３−１細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏ増殖阻止を示す。
【図１８】図１８は、ヌードマウスにおけるｒＭＥＴａｓｅのＫＢ３−１細胞に対する効力を示す。
【図１９】図１９は、ヌードマウスの体重に及ぼすｒＭＥＴａｓｅの毒性を示す。
【図２０】図２０は、ＫＢ３−１細胞を有するヌードマウスの血液細胞に対するｒＭＥＴａｓｅの毒性を示す。
【図２１】図２１は、ＢＡＬＢ／ＣマウスにおけるｒＭＥＴａｓｅの毒性を示す。
【図２２】図２２は、ＢＡＬＢ／ＣマウスにおけるｒＭＥＴａｓｅの毒性を示す。
【図２３】図２３は、ヒト患者におけるメチオニナーゼの毒性評価を示す。
【図２４】図２４は、ヒト患者におけるｒＭＥＴａｓｅの薬物動態評価を示す。
【図２５】図２５は、ヌードマウスにおけるｒＭＥＴａｓｅのＨ４６０およびＨＴ２９に対する増殖阻止を示すデータを提供する。
【図２６】図２６は、正常細胞とヒト癌細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるｒＭＥＴａｓｅに対する感受性の比較を示す。
図面は必ずしも一定の比例に応じて描かれているわけではなく、明確と簡潔を期して本発明のある特徴が寸法の上で誇張されて図示されている場合がある。
【発明の効果】
本発明の化学的に改変されたメチオニナーゼは、高いメチオニン枯渇活性、延長された半減期および低い免疫原性を有する。
【配列表】
2004081209.tif 000023
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2004081209.tif 000047
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年9月5日(2003.9.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、メチオニナーゼ（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ）組成物、メチオニナーゼの精製方法、メチオニナーゼとＰＥＧ等のポリマーとの結合方法、並びに抗メチオニンおよび抗ホモシステイン化学療法におけるメチオニナーゼの使用方法に関する。より具体的には、本発明の方法は癌療法、心臓血管療法、並びに腫瘍イメージングおよび診断におけるメチオニナーゼの使用を含む。本発明はさらに組換えＤＮＡ技術に関する。本発明は特にメチオニナーゼをコードする発現モジュール（ｍｏｄｕｌｅ）を提供する。
【０００２】
【従来の技術】
治療剤に基づく癌の治療は、許容量を超えて正常な組織機能を損なわないようにしながら、癌細胞を選択的に阻害する、または殺す医薬の使用に向けられている。従来の化学療法における困難は、正常な組織に対する治療剤の毒性であった。
【０００３】
多くの腫瘍が、結腸、乳房前立腺、卵巣、腎臓、喉頭黒色腫、肉腫、肺、脳、胃および膀胱の腫瘍、並びに白血病およびリンパ腫を含む種々の細胞タイプおよび評価された癌組織において、メチオニンを絶対に必要とすることを示した。メチオニン依存性は、増殖培地中でメチオニンをホモシステインに置換した場合の腫瘍の増殖不能として規定された。例えば、Ｃｈｅｌｌｏら，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　３３：１８９８−１９０４，　１９７３；およびＨｏｆｆｍａｎ，　Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　５：１−３０，　１９８５参照。
メチオニン枯渇は、メチオニン依存性腫瘍細胞を選択的に細胞周期のＳ／Ｇ２期末期に同調させる。Ｈｏｆｆｍａｎら，Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　７７：７３０６−７３１０，　１９８０。抗メチオニン化学療法と呼ばれる、メチオニンを剥奪し、その後、抗有糸分裂剤への暴露と組み合わせてメチオニンを充満させる方法を用いると、腫瘍細胞は正常細胞および腫瘍細胞の混合培養物から選択的に排除され、旺盛に増殖する正常細胞の培養物をもたらした。Ｓｔｅｒｎら，Ｊ．　Ｎａｔｌ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．，　７６：６２９−６３９，　１９８６。
しかし、メチオニン依存性化学療法をｉｎ　ｖｉｖｏで実施するためには、循環メチオニンを血清から効果的に枯渇させる手段を持たなければならない。抗癌療法において効果を発揮するのに十分なだけ循環メチオニンのレベルをｉｎ　ｖｉｖｏで低下させるメチオニン枯渇法は、これまで記述されていない。
メチオニンを分解する酵素であるメチオニナーゼが種々の細菌性の源から精製され、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞増殖速度を遅くすることが報告されている。Ｋｒｅｉｓ
ら，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　３３：１８６２−１８６５　および１８６６−１８６９，　１９７３；　Ｔａｎａｋａら，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，　６６：３０７−３１１，　１９７６；　Ｉｔｏら，Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　７９：１２６３−１２７２，　１９７６；　およびＮａｋａｙａｍａら，Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　４８：２３６７−２３６９，　１９８４。
Ｋｒｅｉｓら，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　３３：１８６６−１８６９，　１９７３は、マウスモデルに移植した癌肉腫細胞の増殖を阻止するための、スポロゲネス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐｏｒｇｅｎｅｓ）から単離した高度に不純なメチオニナーゼの用量１１５０単位／ｋｇ／日での使用を記述している。上記酵素は明らかに一次腫瘍細胞増殖を減少させたが、腫瘍直径のＴ／Ｃ（処理細胞ｖｓ対照細胞）比を５０％　以下に下げたとも、転移について何らかの効果を有したとも報告されていない。著者らは、他の不特定の介在物の不在下でのメチオニナーゼの腫瘍特異性は期待できないとも指摘した。そして、不純な調製物中のエンドトキシンまたは他の成分が、観察された効果に関与しているかもしれない可能性については何らコメントしなかった。報告された唯一の毒性研究は、治療期間後に動物の体重減少がなかったこと、および毒性に関する消極的な肉眼検査であった。さらに、著者らは該酵素が４時間という血清半減期を有したと報告している。該酵素調製物は半精製の状態でしかなく、また重大な量のエンドトキシンを含んでいた。これらのことが結果の解釈を複雑にしている。
さらに、Ｋｒｅｉｓは血清メチオニンレベルを対照の約８％以下に低下させることができなかった。これは、上記クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）　酵素の高いＫｍ値（約　９０　ｍＭ）　によるものと思われる。該メチオニナーゼ調製物は不安定で、精製の際、２％の回収（収率）しか達成できなかったと報告されている。
Ｋｒｅｉｓら，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　３３：１８６６−１８６９，　１９７３はさらに、抗癌療法としてメチオニンを枯渇させる手段としてメチオニンを含まない食餌の使用を報告した。しかし、著者らは、該食餌の使用はメチオニナーゼの不純な調製物の使用ほど効果的に腫瘍増殖を遅らせなかったこと、そして実験動物の継続的な体重減少という望ましくない副作用をもたらしたこと、を報告している。著者らは、メチオニナーゼ治療と組み合わせたメチオニン欠乏食餌の使用を報告していない。また、細胞同調化（ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ）を研究していない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の優先権出願は、有害な損傷を与えることなく有益な抗腫瘍効果をもたらすように効果的にメチオニンの量を減らすことに向けられた、メチオニナーゼを用いた腫瘍の効果的化学療法を開示する。本発明は、商業的に成立する量の高度に純粋な組換えメチオニナーゼを産生する供給源を提供することによって、開示した治療および診断法ならびに組成物を改良する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
メチオニナーゼは、ＰＥＧと結合した形態であれ、または高度に純粋な、エンドトキシンを含まない組み換え体として産生され精製されたものであれ、害を与えずに哺乳動物のメチオニンレベルを枯渇させることができ、腫瘍増殖を選択的に阻止するために効果的に使用することができ、さらにまた腫瘍細胞を選択的に阻止し、それによって該細胞を抗有糸分裂化学療法のために同調させることができる、ことが見いだされた。
また、幾つかの異なる方法を共働的に用いて有効メチオニンレベルを実質的に低下させる場合、メチオニン枯渇が最も効果的であることが見いだされた。これらの方法には、メチオニンを含まない食餌を用いるメチオニン飢餓、メチオニンを利用する酵素に対してメチオニンと競合するインヒビターの使用によるメチオニンの競合阻害、メチオニン枯渇により誘導される特異的腫瘍選択性細胞周期ブロックの利点を利用する化学治療剤、およびそれらの組み合わせが含まれる。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明は、腫瘍細胞の集団を本明細書に規定する治療上有効量のメチオニナーゼに、該集団の細胞において細胞周期静止を誘導し、静的（ｓｔａｔｉｃ）腫瘍細胞を形成させるに十分な期間接触させることを含んでなる、腫瘍細胞の増殖を阻止する方法を記述する。「接触させる」という用語は、腫瘍阻止効果が観察されるように、本発明の治療組成物を標的腫瘍に十分近い所に配置すること、または、培地中のメチオニンレベルが培地中の腫瘍細胞増殖が阻止されるレベルまで低下するように、該治療組成物を培地（栄養培地または血液、等）中に配置すること、を意味する。「静的（ｓｔａｔｉｃ）」腫瘍細胞という用語は、増殖を阻止された腫瘍細胞を意味する。この方法はｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏで実施することができる。腫瘍細胞の接触は直接的である必要はなく、腫瘍細胞を含む栄養培地を接触させることによってｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏで行なうことができる。接触は循環血をメチオニナーゼと接触させることによっても達成できる。腫瘍は循環しない固形腫瘍である場合があるので、このような循環血は腫瘍を含むことも、含まないこともある。「腫瘍細胞増殖を阻止する」という表現は、本発明の化合物の投与が例えば大きさを測定した場合に、該化合物で処理されなかった腫瘍に較べ、腫瘍の増殖を１０％　から１００％、より好ましくは３４％　から７９％、そしてより好ましくは５５％　から６８％　減少させることを意味する。
メチオニナーゼは、メチオニンを枯渇させて細胞分裂を遅くする、または停止させるための抗腫瘍試薬として使用される。この効果は、メチオニンの競合的インヒビターを用いて増強することができる。さらに、メチオニナーゼを抗有糸分裂剤および他の細胞周期特異的細胞毒性剤と組み合わせて用いて、細胞周期同調化を誘導することにより抗有糸分裂剤および他の細胞周期特異的細胞毒性剤の治療的効果を増大させることができる。
メチオニナーゼはまた、心臓血管性疾患の危険を減少させ、かつこの疾患を治療するためのホモシステイン枯渇化学療法にも使用される。メチオニナーゼはまた、［１１Ｃ］　メチオニンを充満させる前に、血液および腫瘍の［１２Ｃ］　メチオニンを枯渇させ、超高度分解能で身体内の腫瘍を検出し診断するためにも使用される。
１つの実施態様においては、腫瘍細胞はまずメチオニンレベルを低下させるためメチオニン飢餓工程にかけられる。場合により、正常細胞への毒性を減少させ、それによって療法の特異性を増大させるため、メチオニン飢餓はホモシステインを伴ってもよい。
本発明のもう１つの関連する局面は、腫瘍細胞を細胞周期のＳ／Ｇ２期末期に引き止めるためのメチオニン枯渇法の使用と、それに続く同調的に細胞周期を開始させるための処理、および選択的かつ効果的に腫瘍細胞を殺すための抗有糸分裂剤等の細胞周期特異的細胞毒性剤の投与、を特徴とする。当業者は細胞周期の特定期にある細胞にたいして毒性な細胞周期特異的細胞毒性剤に精通している。この方法は以下の工程を含んでなる：
（ａ）上記のメチオニン枯渇工程によって生成した静的腫瘍細胞を、細胞周期誘導量のメチオニンと接触させて該静的腫瘍細胞の細胞周期を開始させ、細胞周期を進行する細胞（ｃｙｃｌｉｎｇ　ｃｅｌｌ）を形成し、そして
（ｂ）該細胞周期を進行する細胞を、有糸分裂細胞の有糸分裂を阻止するに十分な量の細胞周期特異的細胞毒性剤と接触させ、これによって腫瘍細胞の増殖を阻止する。
１つの実施態様においては、この方法は以下の工程：
（ａ）上記のメチオニン枯渇工程によって生成した静的腫瘍細胞を、細胞周期誘導量のメチオニンと接触させて該静的腫瘍細胞の有糸分裂を開始させ、有糸分裂細胞を形成し、そして
（ｂ）該有糸分裂細胞を、有糸分裂細胞の有糸分裂を阻止するに十分な量の抗有糸分裂剤と接触させ、これによって腫瘍細胞の増殖を阻止する、
を含んでなる。
本発明はまた、患者のホモシステインレベルを低下させて心臓血管性疾患の危険を減少させ、かつ該疾患を治療するためのメチオニナーゼの使用を特徴とする。本発明は、腫瘍診断およびイメージングのための、メチオニナーゼの投与によるメチオニンの枯渇方法を提供する。
治療上有効量の、タンパク質１ミリグラムあたり少なくとも約１０から約５０単位メチオニナーゼ活性という比活性を有する実質的に単離されたメチオニナーゼ、およびタンパク質１ミリグラムあたり約１未満から約１００　ｎｇのエンドトキシンを含む、メチオニン枯渇療法のための治療組成物もまた特徴である。好ましい実施態様においては、該治療組成物はタンパク質１ミリグラムあたり１０ナノグラム未満のエンドトキシンを、製薬上許容される担体と共に含む。
本発明の治療組成物は、エンドトキシンを含まないメチオニナーゼをも包含する。１つに実施態様においては、メチオニナーゼは改良された発酵条件下で増殖させたシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）　から新規で効率的な方法を用いて調製される。この目的のため、本発明はＰ．プチダの改良された、高メチオニン産生株の単離方法をも提供する。別の実施態様においては、メチオニナーゼはメチオニナーゼをコードする発現モジュールを含む組換え宿主から産生される。
本発明のメチオニナーゼ組成物は、メチオニナーゼをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリマーと結合させることにより、化学的に改変された形でも提供される。本発明のＰＥＧ改変メチオニナーゼは高いメチオニン枯渇活性、延長された半減期、および低い免疫原性を示す。
本発明のメチオニナーゼ組成物は、本明細書中に規定される高発現ベクター等の発現ベクターを用いて産生された組換えタンパク質としても提供される。高発現系を用いて産生されたメチオニナーゼを、本明細書に記述する方法を用いて容易に精製して、エンドトキシンを含まず、かつ高度に純粋な、メチオニナーゼ１ミリグラムあたり約１０から約５０単位の比活性を有するメチオニナーゼ組成物を得ることができる。
本発明はさらに、予想されない高レベルのメチオニナーゼを発現する、核酸分子を含むベクターを提供する。このようなベクター、例えばＴ７　ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを利用したベクターは、１リットルあたり約１〜約４グラムの割合で、粗ホモジネートの形で約２．６　〜５の比活性を有する、適切なインキュベーション条件下で全細胞性タンパク質の約１０〜２０％　に相当するメチオニナーゼを産生するために使用された。
本発明はさらに、本明細書に開示する方法においてメチオニナーゼを含む組成物に代わりに用いることができるクローン化メチオニナーゼ遺伝子を利用する遺伝子治療の方法を提供する。治療的量のメチオニナーゼを患者の血清に供給する手段として、患者の体内でメチオニナーゼを発現するように細胞を変更することが可能である。
本発明の他の特徴、利点および関連する実施態様は、本明細書に含まれる開示に基づいて明らかであろう。
Ａ．定義
「アミノ酸残基」とは、ポリペプチドの化学的消化（加水分解）の結果、そのペプチド結合に形成されたアミノ酸をいう。本明細書に記載するアミノ酸残基は、好ましくは「Ｌ」異性体形である。しかし、所望の機能特性がポリペプチドによって保持される限り、任意のＬ−アミノ酸残基に換えて「Ｄ」異性体形の残基を用いることができる。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離のアミノ基をいう。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離のカルボキシ基をいう。標準的ポリペプチド命名法（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２４３：３５５２−５９，　１９６９に記述され、３７　Ｃ．Ｆ．Ｒ．　１．８２２（Ｂ）（２）に採用された）（本明細書中に参考として組み入れる）に従う。
本明細書中に式として表される全てのアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシ末端へという通常の方向を、左から右へ向けて示すことに注意すべきである。さらに、「アミノ酸残基」という句は、Ｔａｂｌｅ　ｏｆ　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ　に記載されたアミノ酸、並びに本明細書中に参考として組み入れる３７　Ｃ．Ｆ．Ｒ．　１．８２２（Ｂ）（４）　に記載されたもの等の修飾された及び通常のアミノ酸を包含して、広く定義される。さらに、アミノ酸残基配列の初めまたは終わりにあるダッシュ（−）は、１以上のアミノ酸残基からなる別の配列へのペプチド結合、またはＮＨ２、アセチル等のアミノ末端基への、またはＣＯＯＨ等のカルボキシ末端基への共有結合を示す。
「組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）分子」とは、２個のＤＮＡセグメントを機能しうる形で連結することにより作製されたＤＮＡ分子をいう。したがって、組換えＤＮＡ分子とは、天然においては通常共に見いだされることのない少なくとも２つのヌクレオチド配列を含むハイブリッドＤＮＡ分子である。共通の生物的起源を持たない（すなわち、進化論的に異なる）ｒＤＮＡは、「異種」（¨ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ¨）　であると言われる。
「ベクター」とは、細胞中で自律複製が可能なｒＤＮＡ分子をいい、結合させたセグメントの複製をもたらすようにＤＮＡセグメント（例えば遺伝子またはポリヌクレオチド）を機能しうる形でそこに連結することができる。１個以上のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を引き出すことが可能なベクターは、本明細書中で「発現ベクター」と呼ばれる。特に重要なベクターは、本発明のメチオニナーゼタンパク質の好都合な発現を可能とする。
Ｂ．抗腫瘍剤としてのメチオニナーゼの使用方法
Ｉ．メチオニン枯渇
本明細書中では、メチオニナーゼは腫瘍細胞、腫瘍組織または癌を有する哺乳動物の循環からメチオニンを実質的に枯渇させるために、またはメチオニンの枯渇が望ましいと考えられる場合にメチオニンを枯渇させるために、本明細書に記述する種々の様式で抗腫瘍剤として用いられる。
先行技術の方法はｉｎ　ｖｉｖｏメチオニンレベルを約３５マイクロモル（μＭ）まで低下させることができるが、安全に、容易に、かつ迅速にメチオニンレベルを実質的に約１０μＭ　以下に下げることのできる方法は知られていない。「実質的に」とは、通常のメチオニン検出法を用いて、少なくとも検出可能な１０μＭ　以下、好ましくは１　μＭ　未満、より好ましくは０．１　μＭ　未満、そして最も好ましくは検出不能レベルまで下げることを意味する。メチオニンは、血液、血漿および血清等の体液を含む溶液中で種々の方法により測定することができる。典型的な方法は、メチオニン標準品を用いた逆相ＦＰＬＣである。
枯渇は、哺乳動物の循環中でｉｎ　ｖｉｖｏで、または組織培養物または他の生物学的培地のメチオニン枯渇が望ましい場合はｉｎ　ｖｉｔｒｏで、そして生物学的流体、細胞または組織が哺乳動物患者の身体外で操作され、後にその体内に戻される場合はｅｘ　ｖｉｖｏ（生体外）手順を用いて実施することができる。
循環、培養培地、生物学的流体、または細胞からのメチオニンの枯渇は、処理すべき物質に到達しうるメチオニンの量を減少させるために行なわれる。したがってメチオニン枯渇は、メチオニンを枯渇させるべき物質をメチオニンを枯渇させる量の本発明のメチオニナーゼと、接触させるべき物質の周囲のメチオニンを分解するようにメチオニン枯渇条件下で接触させることを含む。
腫瘍細胞はメチオニンについて栄養培地に依存するため、メチオニン枯渇を細胞の栄養源に向けて実施してもよく、必ずしも細胞そのものに向けなくてよい。したがって、本発明のｉｎ　ｖｉｖｏ適用においては、メチオニナーゼを腫瘍細胞集団の栄養培地と接触させることができる。この実施態様では、該培地はメチオニン枯渇が望まれる血液、リンパ液、脊髄液、等の体液でありうる。
メチオニンを枯渇させる量は、その使用法によって広範に変わりうる。そして、典型的には、上記物質中に存在するメチオニンの量、所望の枯渇率、およびメチオニナーゼへの暴露に対する該物質の耐性に依存する。物質中のメチオニンレベル、そして該物質からのメチオニンの枯渇率は、当分野で周知の種々の化学的および生化学的方法によって容易にモニターすることができる。典型的なメチオニン枯渇量を本明細書中に記述する。それらは、処理すべき物質１ミリリットル（ｍｌ）あたり、メチオニナーゼの０．００１　から１００　単位（Ｕ）、好ましくは約０．０１から１０　Ｕ、そしてより好ましくは約０．１　から５　Ｕ　メチオニナーゼの範囲でありうる。
メチオニン枯渇条件とは、メチオニナーゼ酵素の生物活性と適合する緩衝液および温度の条件で、該酵素に適合する穏やかな温度、塩およびｐＨ条件を含む。典型的条件は、生理的条件が好ましいが、約４　〜４０℃、約０．０５から０．２　Ｍ　ＮａＣｌに等価なイオン強度、および約５から９のｐＨを含む。
好ましい実施態様において、本発明はメチオニナーゼを抗腫瘍剤として使用する方法を意図し、それゆえ、腫瘍細胞の集団を治療上有効量のメチオニナーゼと、該集団の細胞において細胞周期静止を誘導し、静的腫瘍細胞を形成させるに十分な期間接触させることを含む。
本明細書に記述するように、腫瘍細胞を細胞周期静止状態に置くことは種々の理由から好ましい。これらの理由には、選択的に腫瘍増殖を遅くする、静止している細胞を細胞死をもたらすほどの長期間維持することにより腫瘍細胞を殺す、後で行なう化学療法的治療に先立って腫瘍細胞の集団を細胞周期同調化のために準備する、等がふくまれるが、それだけに限定されない。
メチオニナーゼとの接触によって細胞周期静止を誘導するのに必要な期間は、幾つかの因子に依存する。例えば、細胞または細胞を含む培地と接触させるメチオニナーゼの量、メチオニンの量、酵素の比活性、温度および反応速度に影響をおよぼす他の反応条件、等の実践者によって容易に制御可能なパラメーターである。典型的な期間は、１０分から約３０日、好ましくは約１時間から２０日、そしてより好ましくは約１日から１０日である。
細胞周期静止とは、細胞が分裂せず、それぞれＧ０、Ｇ１、Ｇ２およびＳ期と呼ばれる各期からなる完全な細胞周期を細胞が進行していかない状態である。メチオニン枯渇後、細胞は正常な休止細胞に較べＤＮＡが蓄積していることから明らかなように、Ｓ／Ｇ２期末期で進行を停止するものと思われる。細胞周期静止を同定する方法は、種々の組織学的方法によって決定することができ、また細胞培養物によって評価することができる。そして上記の方法は、細胞集団のＤＮＡ含有量を実施例に記載のように測定することを伴う。
本発明の治療法が有用な腫瘍は、固形腫瘍または血液学的腫瘍に見いだされるような任意の悪性細胞型を含む。典型的固形腫瘍は、以下のものを含みうるがそれらだけに限定されない。すなわち、膵臓、結腸、盲腸、胃、脳、首、卵巣、腎臓、喉頭、肉腫、肺、膀胱、前立腺および乳房からなる群から選択される器官の腫瘍である。典型的な血液学的腫瘍は、骨髄の腫瘍、ＴまたはＢ細胞悪性疾患、白血病、リンパ腫、芽腫、骨髄腫、等である。
１つの実施態様においては、ｉｎ　ｖｉｖｏにおける接触は、静脈内または腹腔内注入により、治療上有効量の、本発明のメチオニナーゼを含む生理的に許容される組成物を患者に投与することにより達成され、それによって患者に存在する腫瘍細胞の循環性メチオニン供給源を枯渇させる。メチオニナーゼの接触は、腫瘍細胞を含む組織にメチオニナーゼを投与することによっても達成することができる。治療上有効量のメチオニナーゼとは、所望の効果を達成し（すなわち、腫瘍組織または患者の循環からメチオニンを枯渇させ）、それによって腫瘍細胞に分裂を停止させるために計算された、あらかじめ定められた量をいう。
【０００７】
したがって、本発明のメチオニナーゼ投与の用量範囲は、腫瘍細胞の分裂および細胞周期の進行という症状が減じる所望の効果を奏するのに十分な範囲である。用量は、好ましくない副作用、例えば高粘稠度、肺水腫、うっ血性心不全、等を引き起こすほど大きくてはならない。一般に、用量は患者の年齢、状態、性別および疾患の程度によって変わり、当業者によって決定され得る。
【０００８】
何らかの合併症が生じた場合は、それぞれの医師が用量を調整することができる。
本発明のメチオニナーゼの治療上有効量は、典型的には、生理的に許容される組成物として投与した時に、１　ｍｌあたり約０．００１から約１００単位（Ｕ）　、好ましくは約０．１　Ｕ以上、そしてより好ましくは１　Ｕメチオニナーゼという血管内（血漿）または局所的濃度を達成するのに十分な量である。典型的用量は体重に基づいて投与することができ、約１〜１０００　Ｕ／ｋｇ／日、好ましくは約５〜１００　Ｕ／ｋｇ／日、より好ましくは約１０〜５０　Ｕ／ｋｇ／日の範囲である。
好ましい方法においては、用いられるメチオニナーゼは本明細書中でさらに論じるように実質的にエンドトキシンを含まない。特に好ましいのは、実質的にエンドトキシンを含まない、組換えによって産生されたメチオニナーゼに使用である。
メチオニナーゼは、注射または時間をかけた徐々の注入によって、非経口的に投与することができる。メチオニナーゼは、静脈内、動脈内、腹腔内、経口、筋肉内、皮下、体腔内、経皮、皮膚に投与して、ぜん動性の手段によって送達するか、または腫瘍細胞を含む組織に直接注射するか、または潜在的バイオセンサーまたはメチオニンを含みうるカテーテルに連結したポンプによって投与することができる。
メチオニナーゼを含む治療組成物は、例えば単位用量の注射として静脈内に好都合に投与することができる。本発明の治療組成物に言及して使用する「単位用量」という用語は、患者への単位投薬として適する物理的に別個の単位を指し、各単位は所望の治療効果を奏するように計算された、あらかじめ定められた量の活性物質を希釈剤（すなわち、担体またはビヒクル）と共に含む。
これらの組成物は、投与剤形に適合する様式で、かつ治療上有効量を投与される。投与すべき量は、治療すべき患者、患者の系の活性成分を利用する能力、および望まれる治療効果の程度に依存する。投与を必要とされる活性成分の正確な量は医師の判断に依存し、各患者に特有のものである。しかし、全身的使用のための適切な用量範囲を本明細書に開示してあり、これは投与経路に依存する。最初の投与およびブースター投与の適切な方法もまた意図されており、これらは最初の投与とそれに続く、注射または他の手段によって行なわれる、１時間以上の間隔を置いた反復投与によって代表される。典型的な多重投与が本明細書中に記述され、それらはメチオニナーゼの高い血清および組織レベルおよび逆にメチオニンの低い血清および組織レベルを継続的に維持するのに特に好ましい。または、ｉｎ　ｖｉｖｏ療法について特定した範囲の血中濃度を維持するに十分な継続的静脈内注入もまた意図される。
ＩＩ．　メチオニン枯渇方法
本発明を実施する際、先に記述したようにメチオニン含有物質をメチオニナーゼに接触させることによるメチオニン枯渇は、１つ以上の補足的メチオニン枯渇工程を伴うことができる。さらに、本発明は本明細書にさらに記述するように、メチオニンの枯渇が望ましい場合の種々の治療方法を意図する。
ａ．メチオニン飢餓
例えば、メチオニンの周辺レベルを先ず低下させるために、メチオニン飢餓工程を用いてもよい。飢餓工程は、メチオニナーゼ接触工程に先立って、または該工程の間に実施される、腫瘍細胞をメチオニン飢餓期間の間メチオニンを含まない栄養分に接触させることを含む。メチオニン飢餓工程は、メチオニンを欠く培地（すなわち、低レベルのメチオニンを含む、またはメチオニンを全く含まない培地）のｉｎ　ｖｉｔｒｏ使用を含んでもよく、またはメチオニンを含まない食餌のｉｎ　ｖｉｖｏ使用を含んでもよい。メチオニンを含まない培地は組織培養技術において周知である。典型的な培地は、ＧＩＢＣＯ等から入手可能な、非必須アミノ酸を含むイーグルの最少必須培地（メチオニンおよび塩化コリンを欠く）である。メチオニン欠乏アミノ酸ダイエット食品もまた市販されており、Ｔｅｋｌａｄ，　Ｉｎｃ．から入手可能なダイエットＴＤ　９２０７７を含む。
メチオニン飢餓工程のための期間は、具体的な使用方法によって大幅に変わりうる。この期間は、メチオニンの細胞培養物、組織または血管濃度がより低いレベルに低下し、そしてそれ以上の実質的なレベル低下を停止するのに十分な期間である。典型的な期間は約６時間から約２か月でありうるが、好ましくは約１日から２週間である。
メチオニンは必須アミノ酸なので、本方法の多数の使用が正常細胞にとって幾らか毒性でありうることが理解されねばならない。しかし、本明細書に記述するように、正常細胞と腫瘍細胞はメチオニン前駆体ホモシステインを違った風に代謝するので、ホモシステインは腫瘍細胞のメチオニン依存性を救助しないが、正常細胞のメチオニン欠乏を補うことができる。
したがって、関連する実施態様において、本発明は、正常細胞によって必要な栄養補充をもたらすために使用されるホモシステインまたはその類似体等のメチオニン前駆体によって補充されうるメチオニン欠乏栄養物（培地または食餌）を用いる方法を意図する。ホモシステインを約５から約２００μＭ、好ましくは約１０から約１００μＭの濃度で栄養培地に添加することができる。
この実施態様において有用な好ましいメチオニン前駆体は、Ｌ−ホモシステイン−チオラクトン、ホモシステイン、および４−メチルチオ−２−オキソブタン酸を含む。
したがって、１つの実施態様においては、本発明はメチオニンの血管内濃度を枯渇させる期間にわたって哺乳動物にメチオニン欠乏食餌を与える工程を含む。該食餌は場合により、メチオニン補充物としてメチオニン前駆体を含んでもよい。または、メチオニン前駆体を注射または周知の他の経路により投与してもよい。食餌補充物としてのホモシステインの好ましい日用量は、１日につき哺乳動物体重１ｋｇあたり約５から約１０００　ｍｇのホモシステインである。
ホモシステインの投与経路は、典型的には添加すべきメチオニナーゼのそれと同じであり、該補充物を送達する標的組織に依存する。
ｂ．メチオニンを利用する酵素の競合的インヒビター
実施例に記述する観察の後に、メチオニンを利用する酵素の競合的インヒビターが、本明細書に記載のメチオニン枯渇法の効果を相乗的に増大させるのに有用であることがさらに判明した。したがって、本発明は腫瘍細胞をある量のメチオニンのインヒビターに、メチオニンを利用する酵素によってメチオニン代謝を阻害するのに十分な期間接触させることをさらに含むメチオニン飢餓工程の使用を意図する。競合的インヒビターを引き出すのに有用なメチオニンを利用する酵素は、Ｓ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ、メチオニンｔ−ＲＮＡシンターゼおよびメチオニンアデノシルトランスフェラーゼを含む。
好ましくは、メチオニンを阻止するのに必要とされる期間は、メチオニン飢餓期間自体の継続期間である。
メチオニンの競合的インヒビターは、メチオニンを利用する酵素の基質としてメチオニンと競合し、それゆえ直接競合によって、内因性メチオニンが奏するかもしれない任意の正常な代謝効果を阻害するように作用する。すなわち、メチオニン代謝を阻害する。細胞がメチオニンおよび付随するメチオニン代謝を必要とする場合、競合的インヒビターはメチオニンの代謝を低下させるように作用し、これは高いメチオニン濃度をもたらし、インヒビターが存在しない場合に観察されるのと同じ効果を生じる。
メチオニンの競合的インヒビターは、古典的な競合的インヒビターとして機能する任意のメチオニン誘導体でありうる。典型的な競合的インヒビターは、メチオニンのアルキル誘導体（すなわち、アルキルチオニン類）を含み、これらの誘導体ではメチオニンのメチル基がエチル基（エチオニン）、プロピル基（プロチオニン）、ブチル基（ブチオニン）、またはペンチル基（ペンチオニン）によって置換されている。
シクロロイシンおよびハロゲン化メチオニンもまた有用なメチオニンの競合的インヒビターとして考えられる。典型的なハロゲン化メチオニンは、フルオロメチオニン、クロロメチオニン、ブロモメチオニンおよびヨードメチオニンからなる群より選択される。したがって、意図されるメチオニンの競合的インヒビターは、アルキルチオニン、シクロロイシン、およびハロゲン化メチオニンからなる群より選択され、ここでアルキルチオニンはメチオニンではない。
競合的にメチオニンを阻止するのに有効な、メチオニンの競合的インヒビターの量とは、メチオニンの有効濃度を低下させる量である。この量は、典型的には、実施例に示すように、存在するメチオニンに対してモル過剰である。典型的には、インヒビターのこの量はメチオニンが競合させられる培地中のメチオニン濃度に対して１０から１０００倍モル過剰であり、好ましくは少なくとも２０倍モル過剰、そしてより好ましくは少なくとも５０倍モル過剰である。インヒビターがｉｎ　ｖｉｖｏで用いられる場合は、その用量は本明細書に示すように典型的には動物の体重１ｋｇあたり約５〜３０　ｍｇ、好ましくは約２５　ｍｇ／ｋｇである。
効果的であるために必要とされるインヒビターの量は、インヒビターが投与される時に存在する内在性メチオニンの量によって変わりうる。メチオニン濃度とインヒビターの有効濃度との関係は、実施例に示す用量滴定結果によって示される。そしてこの関係は、競合的インヒビターの古典的な反応速度論によって規定される。インヒビターの典型的な量は、約１０μＭから約１　ｍＭである。
さらに、効果的インヒビターの量は、本明細書に記述するｉｎ　ｖｉｔｒｏ組織培養法によってあらかじめ定めて、まず特定の腫瘍組織における本明細書に記載の任意の方法によるメチオニン枯渇の効果的条件を確立し、次にインヒビターの有効濃度を決定することができる。
メチオニンの競合的インヒビターを用いることによるメチオニン代謝の阻害は、実施例に記載のインジケーター（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）を含む種々のインジケーターによりモニターすることができる。これらのインジケーターは、組織を培養して細胞周期阻止のインジケーターとしてＤＮＡ含有量を測定すること、およびメチオニンを含まない食餌を与えたマウスにおける腫瘍組織増殖の阻止の増大、を含む。当業者には他のインジケーターも明らかであろう。
ｃ．多重メチオニン枯渇法を用いた相乗効果　−　抗メチオニン化学療法
１つの実施態様において、本発明は、２つ以上の異なるメチオニン枯渇法を用いた場合に起こる相乗作用を利用するために、一般に抗メチオニン化学療法と呼ばれるメチオニン枯渇のための多重法の使用を意図する。
本明細書に記述するメチオニン枯渇方法は、以下のものを含む。すなわち、（１）メチオニンを含まない培地（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）または食餌（ｉｎ　ｖｉｖｏ）を用いたメチオニン飢餓、（２）酵素的に内在性メチオニンレベルを枯渇させるためのメチオニナーゼへの暴露、（３）メチオニンレベルがすでに低下している場合は、特に（１）および（２）と組み合わせて、内在性メチオニンの有効レベルを低下させるメチオニンの競合的インヒビター、および（４）他の３つのメチオニン枯渇法の任意のものの腫瘍細胞に対する選択性を増大させる、本明細書に記載のホモシステイン等のメチオニン前駆体の使用である。
したがって、メチオニン枯渇のための本明細書に記載の抗メチオニン化学療法は、上記の方法の種々の組み合わせのいずれによっても実施することができる。これらの組み合わせは、（１）＋（２）、（１）＋（３）、（２）＋（３）、（１）＋（２）＋（３）、およびこれら４つの組み合わせのいずれかプラス（４）を含む。
【０００９】
メチオニンの最大限枯渇および生じる代謝生成物の点から特に好ましいのは、メチオニンを含まないがメチオニン前駆体を含む食餌の使用、およびこれに加えて、メチオニンの競合的インヒビターおよびメチオニナーゼの使用である。
ＩＩＩ．　抗有糸分裂腫瘍療法の増強
別の実施態様において、本発明は本明細書に記載のメチオニン枯渇法を、従来の化学療法の効力および選択性、好ましくは癌療法に使用される抗有糸分裂剤の選択性を増大させる（増強する）ための方法に使用することを意図する。
従来の抗有糸分裂療法と組み合わせてメチオニン枯渇工程を使用する重要な目的は、以下の事実を利用することである。すなわち、メチオニン枯渇は選択的かつ特異的に腫瘍細胞増殖を有糸分裂の前で停止させるので、細胞、組織、培地または血管系にメチオニンを充満させると、静的細胞は同調的に細胞周期を開始して有糸分裂に入り、細胞集団が一様に増殖するようになり、細胞周期特異的化学療法の効果を受けやすくなる、という事実である。腫瘍細胞に細胞周期静止を引き起こすために、任意の細胞周期毒性剤を使用することができる。そのような作用物質は当業者には周知である。好ましい実施態様においては、細胞周期毒性剤は抗有糸分裂剤である。
したがって、好ましい実施態様において、本発明は、静的腫瘍細胞を形成するための本明細書に記載のメチオニン枯渇法、およびそれに続く以下の付加的工程を含む抗腫瘍化学療法の方法を意図する：
（ａ）静止腫瘍細胞を細胞周期誘導量のメチオニンと接触させて静的腫瘍細胞の有糸分裂を開始させ、それによって有糸分裂細胞を形成し、そして
（ｂ）該有糸分裂細胞を、該有糸分裂細胞の有糸分裂を阻止するに十分な量の抗有糸分裂剤に接触させ、それによって腫瘍細胞の増殖を阻止する。
メチオニン、メチオニン塩、および静的細胞の細胞周期を開始させるように機能するそれらの機能性等価物は、細胞周期誘導剤と呼ばれ、これらは組み合わせてまたは単独で、メチオニンを枯渇させた腫瘍細胞集団の１以上の静的細胞において細胞周期および有糸分裂を開始させるための試薬として用いることができる。細胞周期誘導剤の細胞周期誘導量とは、メチオニンを枯渇させた腫瘍細胞集団の静的細胞の少なくとも少数（１０％）、好ましくは大多数、そしてより好ましくは少なくとも９０％　において細胞周期を開始させる量である。細胞周期の開始および程度は、組織学的マーカーまたは代謝マーカーの使用により容易に測定することができる。メチオニンについては、細胞周期誘導量は典型的には約１　μＭから約２．５
ｍＭ、好ましくは約１０〜２５０μＭである。Ｓ期特異的薬剤を同様に用いて、メチオニンを充満させた時にまだＳ期に留まっている腫瘍細胞を攻撃することができる。
細胞周期誘導剤の静的腫瘍細胞への接触（投与）経路はさまざまであるが、典型的にはメチオニナーゼまたは競合的インヒビターを投与するのに用いる本明細書に記載の経路と同じである。
静的腫瘍細胞を細胞周期誘導剤に接触させる時機および期間は、腫瘍および経験的（例えば、本明細書に記載の組織培養法によって）に決定することができる他の要件によって変わりうる。細胞周期誘導剤は、抗有糸分裂剤の前に、または実質的にこれと同時に添加することができる。特定の抗有糸分裂剤が迅速に作用し、また細胞周期の誘導が遅いことが分かっている場合は、誘導剤を抗有糸分裂剤の前に添加することが有利であろう。これらのパラメーターは、特定の腫瘍タイプ、組織の位置、抗有糸分裂剤の選択、等に依存しうる。さらに、時機、用量および薬剤選択等の変数の最適化を、治療組成物のｉｎ　ｖｉｖｏ投与に先立って、種々の方法により容易に実施することができる。好ましい最適化手順は、本明細書に記載の典型的組織培養アッセイ系の使用である。
抗有糸分裂剤を接触させる時機は、静的腫瘍細胞の細胞周期の誘導に依存する。典型的には、抗有糸分裂剤は、細胞周期進行中の任意の時期、および細胞が有糸分裂を始めて直ぐに、有糸分裂細胞と接触させることができる。幾つかの腫瘍細胞集団においては、誘導剤の添加後にこの現象が迅速に起こり、静的腫瘍細胞への誘導剤および抗有糸分裂剤の同時またはほぼ同時の添加を可能とする。または、抗有糸分裂剤を誘導剤の約１時間から３０日後に添加してもよいが、好ましくは誘導の１または２日以内に添加する。
本明細書に使用する抗有糸分裂剤または他の細胞周期特異的作用物質は、細胞増殖、有糸分裂または細胞周期に向けられた、細胞毒性に基づく作用機構を示す任意の作用物質でありうる。したがって、抗有糸分裂剤は代謝拮抗物質、または分裂中の（有糸分裂）細胞に異なった様式で毒性を示す種々の化合物の任意のもの含みうる。本発明の方法に用いる抗有糸分裂剤の好ましい臨床薬理学は、細胞有糸分裂活性の阻害、核酸合成の阻害、アルキル化剤、抗生物質、アルカロイド、およびそれらに類似した抗腫瘍剤である。薬理学の分野が絶え間なく進歩するかぎりにおいて、本発明は現在公知の抗有糸分裂剤および他の細胞周期特異的作用物質に限定されるものではなく、むしろ公知化合物、新規に発見された化合物、または開発された化合物の等価物、並びに必要な活性を示す類似の作用物質の使用を含むものであることが理解されねばならない。
典型的なアルキル化剤は、シクロホスファミド（ＣＴＸ；　ｃｙｔｏｘａｎ）、クロラムブシル（ＣＨＬ；　ｌｅｕｋｅｒａｎ）、シスプラチン（ＣｉｓＰ；　ｐｌａｔｉｎｏｌ）、ブスルファン（ｍｙｌｅｒａｎ）　、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、マイトマイシンＣ、および類似のアルキル化剤である。
典型的な代謝拮抗物質は、メトトレキセート（ＭＴＸ）、エトポシド（ＶＰ１６；　ｖｅｐｅｓｉｄ）、６−メルカプトプリン（６ＭＰ）、チオグアニン（６ＴＧ）、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、および類似の代謝拮抗物質を含む。典型的な抗生物質は、アクチノマイチンＤ、ドキソルビシン（ＤＸＲ；アドリアマイシン）、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよび類似の抗生物質を含む。
典型的なアルカロイドは、ビンクリスチン（ＶＣＲ）、ビンブラスチン等のビンカアルカロイド等を含む。
他の抗腫瘍剤は、タキソールおよびタキソール誘導体、デキサメタゾン（ＤＥＸ；ｄｅｃａｄｒｏｎ）等の細胞増殖抑制剤グルココルチコイド、プレドニゾン等のコルチコステロイド、ヒドキシ尿素等のヌクレオシド酵素インヒビター、アスパラギナーゼ等のアミノ酸枯渇酵素、および類似の多様な抗腫瘍剤を含む。
上記の抗有糸分裂（細胞毒性）剤の合成および製剤は周知であり、種々の文献に記述されているので、本明細書では繰り返し記述しない。上記作用物質の合成および製剤のための典型的文献は、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ´ｓ　Ｄｅｓｋ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，　Ｂａｒｎｈａｒｔ編、Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ，　Ｉｎｃ．，　Ｏｒａｄｅｌｌ，　Ｎ．Ｊ．，　１９９２；　およびＭｅｒｃｋ　Ｉｎｄｅｘ，　　第１１版、Ｍｅｒｃｋ　＆　Ｃｏ．，　１９８９を含む。
化学療法における上記の細胞毒性剤の使用は、癌治療技術において一般に良く特徴付けられており、本明細書におけるそれらの使用は、若干の調整を加えれば、耐性および効果をモニターし、また投与経路および用量をコントロールするために考慮すべき事柄は癌治療のそれらと同一である。例えば、細胞毒性剤の実際の用量は、本発明の組織培養法を用いて測定された、患者の培養細胞の応答によって変わりうる。一般に、本明細書の開示に示すように、同調化細胞周期の不在下で使用される量に較べ、用量は減らされる。
効果的細胞毒性剤の典型的な用量は、製造業者によって推奨される範囲内にありうる。そしてｉｎ　ｖｉｔｒｏ応答または動物モデルにおける応答によって表示される場合には、マグニチュード濃度または量の約１桁分まで用量を減らすことができる。したがって、実際の用量は医師の判断；患者の状態；および一次培養した悪性細胞または組織培養した組織サンプルのｉｎ　ｖｉｔｒｏ応答性、または適切な動物モデルにおいて観察された応答に基づく治療法の効果に依存する。
ＩＶ．　遺伝子療法
別の実施態様においては、本発明は、本発明のメチオニナーゼ接触法によって処理すべき組織または該組織周辺のリンパ球内でメチオニナーゼを発現させるために、ｒＤＮＡの使用を意図する。この目的のため、調節可能なメチオニナーゼ発現遺伝子を発現させ、それによってメチオニナーゼ遺伝子産物を産生させることにより、メチオニナーゼを接触工程のために提示することが考えられる。
先に記述したように、使用することのできる、現在公知の非常に様々な、メチオニナーゼの発現に適切な発現ベクターが存在する。１つの実施態様においては、メチオニナーゼ遺伝子の発現は調節可能である。したがって、発現ベクターは、第１のメチオニナーゼをコードする配列に機能しうる形で連結された第２のヌクレオチド配列を有し、これはメチオニナーゼ遺伝子の発現を調節するための手段を規定する。典型的な手段は誘導性プロモーターで、好ましくは腫瘍特異的プロモーターである。その中でメチオニナーゼ遺伝子の発現が腫瘍特異的プロモーターによって制御される発現モジュールは、本明細書に記載の遺伝子療法に特に有用である。
誘導性プロモーターの１クラスは、培養培地に添加することができる、またはメチオニナーゼ遺伝子を発現するための該遺伝子を含む宿主細胞に容易に浸透できる成分に対し、応答性である。別のクラスは、上記の腫瘍特異的プロモーター、例えば癌胎児性抗原（ＣＥＡ）である。
したがって、本発明はメチオニナーゼと腫瘍細胞集団との接触が以下の工程を含む、メチオニン枯渇法をも意図する：
（ｉ）　発現ベクターを腫瘍細胞、もしくは腫瘍に浸潤しているリンパ細胞またはそれらの骨髄前駆体にｉｎ　ｖｉｖｏまたはｅｘ　ｖｉｖｏで導入し（ここで該発現ベクターはメチオニナーゼをコードし、メチオニナーゼの調節された発現が可能であるヌクレオチド配列を有し、かつメチオニナーゼの発現を調節する手段を提供するヌクレオチド配列を有する）、メチオニナーゼ遺伝子でトランスフェクトされた細胞を形成し；
（ｉｉ）　腫瘍細胞をｉｎ　ｖｉｖｏで上記メチオニナーゼ遺伝子でトランスフェクトされた細胞に接触させ；そして
（ｉｉｉ）　メチオニナーゼをコードするヌクレオチド配列を該トランスフェクトされた細胞中で発現させ、それによって該トランスフェクトされた細胞中でメチオニナーゼを産生させ、そしてそれによって腫瘍細胞を産生されたメチオニナーゼと接触させる。「導入する」とは、発現ベクターに含まれる遺伝子が標的細胞によって発現されるような様式で発現ベクターを標的細胞に挿入する、当業者に公知の任意の方法を意味する。この導入は、ｅｘ　ｖｉｖｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏで実施することができる。このような「導入」は、例えばトランスフェクション、形質転換、またはウイルス感染によって実施することができる。
腫瘍細胞のトランスフェクションは、付着細胞であれ、浮遊細胞であれ、またはｉｎ　ｖｉｖｏの細胞であれ、種々の公知のトランスフェクション法によって達成することができる。その後、トランスフェクトされた細胞（ｅｘ　ｖｉｖｏトランスフェクションを用いた場合）を宿主中に再導入し、処置すべき組織の天然の、適切な近辺に位置させ、それによってトランスフェクトされた細胞を処置すべき腫瘍細胞と接触させる。トランスフェクトされる細胞へのメチオニナーゼの導入は種々の手段によって達成可能であるが、一般には選択マーカーの存在を必要とする。
１つの実施態様においては、遺伝子の発現を調節する手段は、培地に添加することのできる試薬に対して応答性の誘導性プロモーターである。この例はメタロチオネインプロモーターである。または、誘導性プロモーターは腫瘍特異的プロモーターでありうる。このようなプロモーターは、メチオニナーゼの発現を腫瘍細胞に向けるように作用する。
トランスフェクトされるべき細胞は、腫瘍細胞のサンプル、または腫瘍に浸潤している細胞等の正常な免疫細胞（例えば、腫瘍に浸潤しているリンパ球または、造血幹細胞、前駆細胞等の骨髄の骨髄前駆体）でありうる。上記細胞はｉｎ　ｖｉｖｏまたはｅｘ　ｖｉｖｏでありうる。
実施例９は、メチオニナーゼをコードする核酸分子の単離を記述する。この実施例はさらにメチオニナーゼを産生するためのバッチ発酵に用いる発現ベクターの作製を記述する。当業者は、例えばｐＡＣ−１　中に提供されるようなクローン化メチオニナーゼ遺伝子を容易に使用して、上記の遺伝子療法における使用に適した発現カセットを作製することができる。
Ｃ．治療組成物
別の実施態様においては、本発明は、治療上有効量の実質的に単離された、好ましくは遺伝子組換えにより産生されたメチオニナーゼを、製薬上許容される担体と共に含む治療組成物を意図する。
Ｌ−メチオニナーゼ（Ｌ−メチオニン−α−デアミノ−γ−メルカプトメタン−リアーゼまたはメチオニナーゼ）は、脱アミノ反応および脱チオメチル反応によりメチオニンを分解する酵素である。メチオニナーゼ活性は、少なくともメチオニンの開裂後に形成されるα−ケト酪酸の量を測定することにより測定することができる。メチオニナーゼの１単位（Ｕ）は、Ｉｔｏら，Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　７９：１２６３−１２７２，　１９７６；およびＳｏｄａ，　Ａｎａｌｙｔ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２５：２２８−２３５，　１９６８に記述される標準的アッセイ条件下で、メチオニンから１分あたり１マイクロモルのα−ケト酪酸を生成する酵素の量と定義される。
メチオニナーゼは、実施例９および１２に記述するような細菌培養物からの直接単離、またはメチオニナーゼタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子からの発現を含めて、種々の源から調製することができる。
メチオニナーゼの細菌性供給源は、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・オバリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｖａｌｉｓ）およびアエロモナス種（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）、並びに他の任意の潜在的メチオニナーゼ供給源を含む。Ｐ．プチダ株はＡＴＣＣから商業的に入手可能であり、それぞれ受託番号ＡＴＣＣ　８２０９およびＡＴＣＣ　７９５５を有する。他の細菌は、一般に学究的な研究機関から入手可能である。メチオニナーゼの精製は、種々の方法によって記述されている。例えば、Ｋｒｅｉｓら，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　３３：１８６２−１８６５，　１９７３；　Ｔａｎａｋａら，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　６６：３０７−３１１，　１９７６；　Ｉｔｏら，Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　７９：１２６３−１２７２，　１９７６；　Ｎａｋａｙａｍａら，Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　４８：２３６７−２３６９，　１９８４；およびＳｏｄａ，　Ａｎａｌｙｔ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２５：２２８−２３５，　１９６８　参照。しかし、これらの方法はいずれも高度に純粋な、エンドトキシンを含まないメチオニナーゼをもたらしていない。本発明は、メチオニナーゼが実質的にエンドトキシンを含まなくなるように精製するために用いた２つの方法を提供する。
好ましいメチオニナーゼは、タンパク質１　ｍｇあたり約１０〜約５０単位（Ｕ）の比活性を有する。精製メチオニナーゼの典型的調製物は、約１０〜約５０　Ｕ／ｍｇの比活性を有すると本明細書に記述されている。実施例１２において、発現ベクターｐＡＣ−１
を用いて調製したメチオニナーゼは、約２０．１　Ｕ／ｍｇの比活性を有していた。
好ましいメチオニナーゼは、好ましくは実質的に単離されている。実質的に単離されているとは、該酵素が重量を基準として少なくとも５０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９９％純粋であるか、または本質的にホモジニアスであることを意味する。好ましいタンパク質は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）等の電気泳動媒体を用いて分析すると、本質的にホモジニアスである。ＰＡＧＥにかけるとホモジニアスであるとは、検出可能なバンドが一本のみであることを意味する。
好ましいメチオニナーゼは、静脈内または腹腔内投与等によってエンドトキシンが生理的に哺乳動物体内で接触した場合のエンドトキシンに伴う望ましくない副作用ゆえに、細菌性リポ多糖等のエンドトキシンを実質的に含まない。実質的に含まないとは、メチオニナーゼタンパク質　１　ｍｇ　あたり約１０　ｎｇ未満のエンドトキシン、好ましくはメチオニナーゼ　１　ｍｇ　あたり　１　ｎｇ未満のエンドトキシン、そしてより好ましくはメチオニナーゼ　１　ｍｇ　あたり　０．１　ｎｇ未満のエンドトキシンを意味する。エンドトキシンのアッセイは治療技術の分野で周知であり、種々の方法のうち任意のものにより実施することができる。好ましい方法は実施例に記述されている。
好ましいメチオニナーゼは、その保存性および高温条件下で使用された場合（例えば動物の体内におけるｉｎ　ｖｉｖｏ使用）の効果を増大させるように、熱安定性である。熱安定性とは、酵素が６０℃に１０分間暴露されて、その比活性の８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％を保持できることを意味する。
好ましいメチオニナーゼは、少なくとも５時間、好ましくは６時間、より好ましくは少なくとも７時間の血清半減期を有する。
特に好ましいのは、Ｐ．プチダから調製されたメチオニナーゼ、またはＰ．プチダから単離されたメチオニナーゼをコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターを用いて調製したメチオニナーゼである。Ｐ．プチダメチオニナーゼは、ＰＡＧＥ−ＳＤＳで分析した場合、約４３キロダルトンの見かけ分子量を有する。好ましいメチオニナーゼ精製法を実施例に記述する。
したがって、治療組成物は、生理的に許容される担体を、活性成分としてそこに溶解または懸濁させた実質的に単離されたメチオニナーゼと共に含む。好ましい実施態様においては、該治療組成物は治療上の目的でヒト患者に投与した場合、免疫原性でない。
本発明の１実施態様は、ポリマーに結合させたメチオニナーゼからなる、化学的に改変されたメチオニナーゼを特徴とする。好ましくは、上記メチオニナーゼは実質的に単離されており、かつ実質的にエンドトキシンを含まない。「化学的に改変された」とは、天然から精製されたメチオニナーゼと異なった形に変化させた、任意の形のメチオニナーゼを意味する。好ましくは、メチオニナーゼをポ
リエチレングリコール等のポリマーと結合させることにより化学的に改変する。
【００１０】
本明細書中に用いる「製薬上許容される」、「生理的に許容される」という用語およびそれらの文法的変形は、それらが組成物、担体、希釈剤および試薬に言及している場合、相互交換可能に使用され、そして該物質が望ましくない生理的効果（例えば、吐き気、めまい、胃のむかつき等）を生じることなく哺乳動物またはヒトの内部または上に投与可能であることを表す。
溶解または懸濁させた活性成分を含む医薬組成物の調製は、当分野でよく理解されている。典型的には、そのような組成物は、水性または非水性の液体溶液または懸濁物の形で無菌の注射剤として調製されるが、使用前に液体中に溶解または懸濁するのに適した固形製剤としても調製することができる。該調製物を乳化することもできる。特に好ましいのは、本明細書に記載のリン脂質およびリポソーム組成物である。さらに、治療量のメチオニナーゼを軟膏または拡散性パッチ（包帯等）中に存在させ、該作用物質の局所的送達をもたらすこともできる。
活性成分を、製薬上許容され、かつ該活性成分と適合し、本明細書に記載の治療法に使用するのに適切な量の賦形剤と混合することができる。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセリン等およびそれらの組み合わせである。さらに、所望であれば、該組成物は少量の湿潤化剤、乳化剤、ｐＨ緩衝化剤、等の活性成分の効果を増強する補助的物質を含むことができる。
本発明の治療組成物は、活性成分の製薬上許容される塩を含むことができる。製薬上許容される塩は、無機酸（塩酸またはリン酸、等）または有機酸（酢酸、酒石酸、マンデル酸、等）によって形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離のアミノ基によって形成される）を含む。遊離のカルボキシル基によって形成される塩もまた、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄等の無機塩基およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基から誘導することができる。
生理的に許容される担体は、当分野で周知である。典型的な液体担体は、活性成分および水以外は何も含まない、またはそれら以外に生理的ｐＨ値のリン酸ナトリウム等の緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩水等の生理食塩水、またはその両方を含む、無菌の水性溶液である。さらに、水性担体は２以上の緩衝塩、並びに塩化ナトリウムおよび塩化カリウム等の塩、デキストロース、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および他の溶質を含むことができる。
液体組成物は、水の他に、および水を除外して、本明細書に記載するように液相をも含むことができる。そのような付加的液相の典型的例は、グリセリン、綿実油等の植物油、オレイン酸エチル等の有機エステル、および水−油エマルジョン、特に先に記述したリポソーム組成物である。
治療組成物は有効量のメチオニナーゼを、典型的には治療組成物の全重量に対して少なくとも０．１　重量パーセントの活性タンパク質を、そして好ましくは少なくとも２５重量パーセントの活性タンパク質を含む。重量パーセントとは、全組成物に対するメチオニナーゼタンパク質の重量比である。したがって、例えば、０．１　重量パーセントは全組成物１００　ｇあたり０．１　ｇ　のメチオニナーゼである。
メチオニナーゼ組成物がｉｎ　ｖｉｖｏで静脈内に用いることができる限り、１つの実施態様においてメチオニナーゼの制御された送達のための治療組成物を製剤し、そして場合により、メチオニナーゼタンパク質を分解、および投与されたメチオニナーゼの血清半減期を減少させるであろう他の現象から保護することが意図される。
したがって、１つの実施態様においては、本発明は送達ビヒクル、例えばポリマー、ポリマー性ビヒクル、粒子、ラテックス、コアセルベート、イオン交換樹脂、リポソーム、腸溶剤皮（ｅｎｔｅｒｉｃ　ｃｏａｔｉｎｇ）、媒介物、バイオ接着剤、マイクロカプセル、ヒドロゲル等および類似のビヒクルを含む治療組成物を意図する。リポソームを含む典型的な薬物送達ビヒクルは、少なくともＴａｒｃｈａによって¨Ｐｏｌｙｍｅｒｓ　Ｆｏｒ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ¨，　ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，　１９９０に記述されている。
本発明はさらに、他の公知の方法に較べてより優れた収率および純度をもたらすメチオニナーゼの詳細な精製方法を提供する。組換えメチオニナーゼ、特にメチオニナーゼをコードする高発現モジュールを含む形質転換宿主を用いて産生したメチオニナーゼの好ましい精製法は、以下の工程を含む：
ａ）水性緩衝液中にメチオニナーゼを含む、形質転換細胞の抽出物を約４０〜６０℃で約１〜１０分間、好ましくは５０℃で１　分間加熱し；
ｂ）加熱した抽出物をＧＳ−３ローター（Ｓｏｒｖａｌ　Ｄｕ　Ｐｏｎｔ）を用いて約１０ｋから２０ｋ
ｒｐｍで約１５分から１時間、好ましくは約１３ｋ　ｒｐｍ　で約３０分４　℃で遠心し；
ｃ）細孔径が約５０Ｋから１００Ｋのフィルター、好ましくはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｐｒｅ／Ｓｃａｌｅ：ＴＴＦ
ＰＬＨＫ　１００　Ｋ　２．５　ｆｔ２カートリッジを用いて、１０　ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ　８．３）を用いて上清を限外濾過し；
ｄ）低イオン強度（約１０〜５０　ｍＭ）のＫＣｌをｐＨ約７．０〜７．６の１０−２０　ｍＭのリン酸カリウム緩衝液中で用いて、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーを実施し（好ましくはＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ　カラムを用いる）、そして約４０〜２００　ｍＭのＫＣｌ勾配を用いて溶出した、メチオニナーゼを含む画分を回収し；
ｅ）中程度イオン強度（５０〜１００　ｍＭ）のＫＣｌをｐＨ約８．０〜８．６の１０−２０　ｍＭのリン酸カリウム緩衝液中で用いて第２のＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーを実施し（好ましくはＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ　カラムを用いる）、そしてリン酸緩衝液（ｐＨ８．３）で緩衝化した１００〜２００　ｍＭ　ＫＣｌを用いて溶出した、メチオニナーゼを含む画分を回収し；そして
ｆ）上記工程ｅ）で回収した画分を、エンドトキシンを吸収することのできるクロマトグラフィー媒体と接触させ（好ましくは　ＡｃｔｉｃｌｅａｎＴＭ　Ｅｔｏｘカラムを使用する）、そして溶出液を回収し、これによって該溶出液からエンドトキシンを除去して、タンパク質　１　ｍｇあたり少なくとも２０単位の活性を有し、かつタンパク質　１　ｍｇあたり約１〜１００　ｎｇのエンドトキシンを含む、実質的にエンドトキシンを含まないメチオニナーゼを形成する。
好ましくは、細胞抽出物は高レベル（全細胞性タンパク質の５〜７５％）の組換えメチオニナーゼを発現するように変更された宿主細胞から調製される。または、本来メチオニナーゼを発現する生物を出発材料として用いることができる。細菌の細胞抽出物については、抽出物は一般にまず集菌し、そして細菌細胞培養物を洗浄して、集菌が遠心でなされたか又は中空糸濾過によってなされたかによって細胞ペースト／ペレットを形成することにより調製される。これらの方法は一般に周知である。
次に、通常の手段を用いて細胞を破砕する。好ましくは、キャビテーター（ｃａｖｉｔａｔｏｒ）型ホモジナイザー、例えばＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ　Ｃｏｒｐ．モデル　＃ＨＣ８０００等のホモジナイザーを用いて細胞を破砕する。
得られた懸濁物を加熱して、選択タンパク質および他の不溶性物質を沈殿させる。典型的加熱条件は、約４５−６０　℃で１−１０分間である。５０℃１分間の加熱工程が好ましい。
加熱した抽出物を遠心にかけて破砕物を除去し、上清を濾過して、上記のように２工程にしてＤＥＡＥイオン交換媒体に適用する。このましい吸着および溶出条件を実施例に記述する。これらの工程では、種々のＤＥＡＥイオン交換カラムクロマトグラフィー媒体の任意のものが使用でき、媒体の選択は限定的なものと解釈されるべきではない。商業的供給源は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＢｉｏｒａｄおよびＳｉｇｍａを含む。
その後、エンドトキシンを除去して、先に記述した許容されるレベルのエンドトキシンを含むタンパク質を調製する。エンドトキシン除去工程は、周知の種々の手段のうち任意のものを用いて実施でき、そして典型的には溶液中のタンパク質をエンドトキシンを吸着することのできるクロマトグラフィー媒体に接触させて、エンドトキシンを含まないタンパク質を含有するクロマトグラフィー媒体溶出液を得ることを包含する。エンドトキシンの除去に用いる好ましい市販の試薬は、Ａｃｔｉｃｌｅａｎ　ＴＭ　Ｅｔｏｘである。
Ｄ．化学的に改変されたメチオニナーゼ
メチオニナーゼの半減期を延長し、かつその免疫原性または抗原性を減少させるため、メチオニナーゼをポリマーと結合させることができる。
【００１１】
過敏な患者においてはアレルギー性応答の可能性がある。他方、抗メチオニナーゼ抗体はメチオニナーゼの半減期を短くする可能性がある。
ポリペプチドおよびタンパク質の抗原性の問題を解決しようと試みて、種々のアプローチが採用されてきた。ポリエチレングリコール等のポリマーをタンパク質と結合させることは、タンパク質の抗原性を減少させるアプローチの１つである。本発明は、新規でかつ効果的な方法によって産生されるメチオニナーゼの化学的改変に関する。この改変においては、精製メチオニナーゼはこの酵素の活性が維持される条件下でポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合される。本発明のＰＥＧ−メチオニナーゼは延長された半減期を有し、また明白な免疫原性を何ら有さない。
ポリエチレングリコールに結合した新規なメチオニナーゼ（「ＰＥＧ−メチオニナーゼ」または「ＰＥＧ化　（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）メチオニナーゼ」）は、高いメチオニン枯渇活性、延長された半減期、および低い免疫原性を示す。したがって、ＰＥＧ化メチオニナーゼは、安定性を維持し、該酵素の血清半減期を延長し、免疫原性を低下させ、そして毒性を低下させる一方で、腫瘍増殖を阻止する新規な手段を提供する。
安定で、長い半減期を有してメチオニン枯渇に有効であり、そして非免疫原性であるＰＥＧ化メチオニナーゼの発明は、安全で効果的な多数回投与用の抗腫瘍剤として利用可能である。ＰＥＧ−メチオニナーゼは、１０　ｍＭ　のリン酸ナトリウム（ｐＨ　７．２）に溶解した０．１２　Ｍ塩化ナトリウム液体製剤中に　−７０℃、４　℃および室温で活性を喪失することなく保存することができる。
重要なことに、本発明のＰＥＧ−メチオニナーゼは、メチオニナーゼに感受性であって反復投与を必要とする癌患者を治療するのに該メチオニナーゼを特に望ましいものとする非免疫原性である。当業者は、メチオニナーゼとして該ＰＥＧ−メチオニナーゼが種々の剤形で提供され得ることを認識するであろう。
精製された、エンドトキシンを含まないメチオニナーゼの好ましい剤形は、０．０６
Ｍから０．２　Ｍ　の濃度で、１０　ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ　７．２）に溶解した０．１２　Ｍ塩化ナトリウム中にあることである。この活性は約１０単位／ｍｇ　である。
ＰＥＧ化メチオニナーゼは、当業者に周知の手段によって試験することができる。例えば、ｉｎ　ｖｉｖｏ試験を用いて、本発明の方法により作製したＰＥＧ−メチオニナーゼの薬理学、安全性および機能的特徴を確認することができる。
このような試験は、急性毒性の測定、ＰＥＧ−メチオニナーゼの薬物動態、血清中のメチオニンの枯渇、およびＰＥＧ−メチオニナーゼの免疫原性の評価を含む。
精製された、エンドトキシンを含まないＰＥＧ−メチオニナーゼを、マウスの尾静脈に注射し、そして血液サンプルを２　時間ごとに採取する。メチオニナーゼのレベルを活性アッセイにより測定する。メチオニンのレベルを、メチオニン誘導体化後ＨＰＬＣによって測定する。
急性毒性試験は、実施例５および１５に記載するような任意の適切な実験動物を用いて実施することができる。マウスにおいては、１　〜１０　ｍｇあたり１０〜１００単位のＰＥＧ−メチオニナーゼを尾静脈に注射する。生死に関わる兆候および視覚的観察を記録する。血液サンプルは、注射前および注射後２　時間毎に採取する。メチオニナーゼ活性およびメチオニンレベルの両方を測定する。腎および肝機能の両方もまた測定する。肺、腎臓、肝臓および脳等の組織に及ぼす毒性効果の存在または不在を標準的技法により確認する。血液および骨髄も分析する。
別の実施態様においては、メチオニナーゼをポリマーに結合させて実質的に非免疫原性な組成物をもたらし、またｉｎ　ｖｉｖｏにおけるメチオニナーゼ活性の半減期の増大をもたらす。
１つの実施態様においては、ポリマーに結合させることによりメチオニナーゼを化学的に改変する。
別の実施態様においては、ポリアルキレンオキシドに結合させることによりメチオニナーゼを化学的に改変する。ポリアルキレンオキシドの例は、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、エチレンオキシドのコポリマー、およびプロピレンオキシドのコポリマーを含むが、これらだけに限定されない。
好ましい実施態様においては、ポリエチレングリコールと結合させることによりメチオニナーゼを化学的に改変する。
別の好ましい実施態様においては、ポリエチレングリコールに結合させたメチオニナーゼはエンドトキシンを実質的に含まない。
本発明はまた、ポリマーと結合した治療上有効量のメチオニナーゼを含む医薬組成物を提供する。該ポリマーは例えばポリアルキレンオキシドであってよいが、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、エチレンオキシドのコポリマー、およびプロピレンオキシドのコポリマーに限定されない。
好ましい実施態様においては、ポリエチレングリコールと結合した治療上有効量のメチオニナーゼを含む医薬組成物が提供される。別の好ましい実施態様においては、該医薬組成物は、実質的にエンドトキシンを含まず、かつポリエチレングリコールと結合した治療上有効量のメチオニナーゼを含む。このような組成物は、本来メチオニナーゼを産生する生物、または好ましくはメチオニナーゼを発現するように変更された宿主から単離した物質から調製することができる。
ポリマーと結合したエンドトキシンを含まないメチオニナーゼの作製方法もまた提供される。この方法は、エンドトキシンを含まないメチオニナーゼをポリマーと結合させ、実質的に非免疫原性の、化学的に改変された、エンドトキシンを含まないメチオニナーゼを形成することによる。
好ましい実施態様においては、該方法はメチオニナーゼをポリエチレングリコールと結合することを含む。
さらに好ましい実施態様においては、該結合はエンドトキシンを含まないメチオニナーゼをメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルカルボネートと反応させることにより実施される。
治療上有効量のメチオニナーゼを投与することを含む、腫瘍を有する患者の治療方法もまた提供される。
好ましい実施態様においては、該メチオニナーゼはエンドトキシンを実質的に含まない。
さらに好ましい実施態様においては、該メチオニナーゼはポリマーと結合している。
別の実施態様においては、該ポリマーはポリアルキレンオキシドである。
Ｅ．組換えメチオニナーゼの製剤
本発明はさらに、凍結乾燥形態または結晶形態のメチオニナーゼを提供する。詳細には、メチオニナーゼは当分野で公知の方法を用いて容易に凍結乾燥または結晶化できることが観察された。得られるメチオニナーゼ調製物（凍結乾燥形態または結晶形態）は、高度に安定で、容易に水和することができ、そして再水和の後でも高い活性を維持することが判明した。
当分野で公知の種々の方法を用いて、結晶化または凍結乾燥形態のメチオニナーゼを得ることができる。実施例においては、メチオニナーゼの凍結乾燥および結晶化はＶｅｒｄｉｓ，　Ｆｒｅｅｚｅ　ｍｏｂｉｌｅ　２４を　１００ミリバールで　−８０℃で７２時間用いて実施した。当業者は、凍結乾燥形態または結晶形態のメチオニナーゼを作製するのに用いるため、当分野で公知の他の手段を容易に適合させることができよう。
Ｆ．ＤＮＡセグメントおよびベクター
Ｉ．メチオニナーゼをコードするＤＮＡ分子
メチオニナーゼをコードする単離されたＤＮＡ分子をプロモーター、特にＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター等のＲＮＡポリメラーゼプロモーターに機能しうる形で連結することにより、適切な宿主細胞に導入した場合、組換えメチオニナーゼが全細胞性タンパク質の約５〜７５％　のレベルで発現されうることが判明した。したがって、本発明は適切な条件下で宿主に導入すると高レベルの組換えメチオニナーゼを発現する高レベル発現モジュールを提供する。
本明細書に用いる「高レベル発現モジュール」または「本発明の発現モジュール」とは、メチオニナーゼをコードする機能しうる形で連結されたヌクレオチド配列の転写および翻訳を引き出す１つ以上の発現制御要素を含む核酸分子をいう。この発現モジュールは、単離された核酸分子でありうる。またはベクター（下に記述する）中に存在することができる。
本発明の発現モジュールは、産生される組換えメチオニナーゼが全細胞性タンパク質の約５〜７５％　、好ましくは全細胞性タンパク質の１０％　以上に相当するようにメチオニナーゼの発現を引き出す制御要素を含んでいる。好ましい発現制御要素は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターであり、最も好ましいのはＴ７　　ＲＮＡポリメラーゼプロモーターである。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの他の例は、ＴａｃおよびＴｒｃプロモーターを含むが、これらだけに限定されない。
プロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼの結合を可能にし、転写を起こさせるＤＮＡ配列によって形成される発現制御要素である。特定の宿主系に適合性のプロモーター配列が当分野で公知であり、そして典型的には、１以上の好都合な制限部位を含むプラスミドベクター中に提供される。このようなプラスミドベクターの典型は、商業的供給者およびＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ等の種々の供給源から入手可能なＴ７　　ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ｐＴ７　およびｐＥＴ
を含むベクターである。
本発明の発現モジュールは、メチオニナーゼをコードする核酸配列をさらに含む。本明細書中では、ある核酸配列は、該配列を含む核酸分子の転写および翻訳がメチオニナーゼ活性を有するタンパク質の産生をもたらす場合、メチオニナーゼをコードするという。
Ｌ−メチオニナーゼ（Ｌ−メチオニン−α−デアミノ−γ−メルカプトメタン−リアーゼまたはメチオニナーゼ）は、脱アミノ反応および脱チオメチル反応によりメチオニンを分解する酵素である。メチオニナーゼ活性は、少なくともメチオニンの開裂後に形成されるα−ケト酪酸の量を測定することにより測定することができる。メチオニナーゼの１単位（Ｕ）は、Ｉｔｏら，Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　７９：１２６３−１２７２，　１９７６；およびＳｏｄａ，　Ａｎａｌｙｔ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２５：２２８−２３５，　１９６８に記述される標準的アッセイ条件下で、メチオニンから１分あたり１マイクロモルのα−ケト酪酸を生成する酵素の量と定義される。
メチオニナーゼをコードする核酸配列は、本来メチオニナーゼを産生する生物から得た変更されていない配列からなることができる。または、本来メチオニナーゼを産生する生物から得た配列で、１つ以上の核酸またはアミノ酸置換、欠失または付加を含むように変更された配列からなることができる。
変更されたものであれ変更されていないものであれ、メチオニナーゼをコードする核酸分子はメチオニナーゼを本来産生する任意の生物から引き出すことができる。メチオニナーゼをコードする核酸分子の好ましい供給源は、シュードモナス・プチダである。実施例９は、Ｐ．プチダ由来のメチオニナーゼをコードする核酸分子の単離および配列決定を開示する。メチオニナーゼをコードする核酸分子の他の好ましい供給源は、膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ　ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ニッポストロンジラス・ブラジリエンシス（Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）およびフゾバクテリウム属種（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ．）を含むが、これらだけに限定されない。
メチオニナーゼの完全なコード配列は、種々の供給源、特に上記の供給源から種々の方法を用いて得ることができる。Ｐ．プチダ以外の生物からのメチオニナーゼをコードする核酸分子の単離は、図８に示すアミノ酸および核酸配列によって非常に容易となる。
特に、当業者は図８に示す核酸配列を用いて、メチオニナーゼ発現生物由来のメチオニナーゼをコード　る核酸を選択的に増幅するポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）に用　るオリゴヌクレオチドプライマーの対を容易に作製できる。図８に示す配列に　づく好ましいＰＣＲプライマー対は：
2004081209.tif 000063
である。
上記ＰＣＲプライマーを使用するための好ましいＰＣＲ変性／アニーリング／伸長サイクルは、以下の通りである。すなわち、９５℃で１０分間最初の変性；次に９４℃で３０秒間変性、６０℃で３０秒間アニーリング、そして７２℃で２　分間伸長からなるサイクルを５回；次に９４℃で３０秒間変性、６０℃で３０秒間、そして７２℃で１．５分間伸長からなるサイクルを２５回；次に７２℃で１０分間最終伸長である。ＰＣＲ増幅産物は２本のバンドで、このうち１３６５　ｂｐのバンドを採取し、挿入ＯＮＣａｓｅ−１　ＤＮＡとして精製した。
または、図８のヌクレオチド配列の断片をプローブとして用いて、シュードモナス・プチダ以外の生物からメチオニナーゼをコードするＤＮＡを公知の方法で単離することができる。約１８〜２０個のヌクレオチドを含むオリゴマー（約６〜７個のアミノ酸の１続きをコードする）を調製し、これをプローブとして十分なストリンジェンシー条件下でゲノムＤＮＡとハイブリダイズさせ、周知の手順を用いて誤った陽性物を除去する。（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ　１９８９参照）。
プローブまたはポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）の特異的プライマーとして使用されるＤＮＡ配列（すなわち、合成オリゴヌクレオチド）、およびメチオニナーゼをコードする遺伝子配列は化学的技法、例えばＭａｔｔｅｕｃｃｉら（Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　１０３：３１８５−３１９１，　１９８１）のホスホトリエステル法によって、または自動合成法を用いて容易に合成することができる。さらに、周知の方法（例えば、ＤＮＡセグメントを規定する１群のオリゴヌクレオチドを合成し、次にオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションと連結を行い、完全なセグメントを構築する）によってより大きいＤＮＡセグメントを容易に調製することができる。
ＰＣＲおよびＤＮＡプローブに基づく方法に加えて、メチオニナーゼをコードするＤＮＡ分子は、ポリクローナル抗血清、または免疫原性であることが予測される図８のペプチド断片に対して産生させたモノクローナル抗体を用いて単離することができる。このような抗体は、特定の生物から作製された発現ライブラリー（λ　ｇｔ１１　ライブラリー等）を釣り上げて、Ｐ．プチダ以外の生物由来のメチオニナーゼをコードするＤＮＡ分子を得ることができる。
天然に存在する、メチオニナーゼをコードする核酸分子がいったん得られたならば、当業者はランダムまたは部位特異的突然変異誘発手順を採用して、メチオニナーゼをコードする配列を発現レベルを増大させるように、またはコードされたメチオニナーゼから１個以上のアミノ酸を置換、付加または削除するように変更することができる。
１つの実施態様においては、メチオニナーゼをコードする配列は、コードされたメチオニナーゼのアミノ酸配列を変えずに、特定の宿主細胞における組換えメチオニナーゼの発現レベルを増大させるように変更される。特定の宿主における組換えメチオニナーゼの発現増加は、核酸分子中に存在する１個以上のコドンを、得られるコドンが特定アミノ酸をコードするのに宿主生物によってより頻繁に使用されるものであるように変更することによって達成できる。好ましいコドンを含むように核酸配列を変更することは、部位特異的突然変異誘発等の公知の手順を用いて、または該好ましいコドンを含む核酸分子を合成することによって、達成できる。
発現に影響を及ぼす変更の他に、得られるタンパク質の精製を容易とするように、メチオニナーゼをコードする核酸を変更することができる。例えば、実施例に開示するように、組換えメチオニナーゼのアミノまたはカルボキシ末端にポリヒスチジンの１続きを加えるように変更することによって、Ｎｉ＋＋　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて得られた融合タンパク質を精製することができる。
メチオニナーゼをコードする配列を変更して、コードされたメチオニナーゼのアミノ酸配列に１個以上のアミノ酸残基を付加、置換または削除するように変化を導入することも可能である。得られる組換えメチオニナーゼは、好ましくは、より良い生物学的および生理学的特性（例えば、増大した活性、低下したＫｍ、低下した免疫原性、または増大した血清半減期、等）をもつ組換えメチオニナーゼをもたらす変更を含む。このような変更された形は、合理的に設計するか、またはランダムに生成される。
変更が最初のおよび最終的なタンパク質のアミノ酸配列並びに所望の生理学的特性に基づいて特異的に選択されている場合、その変更は合理的に設計されたと表現される。例えば、合理的に設計された変更の１タイプは、疎水性アミノ酸をより疎水性の低い残基と置換して溶解性を増大させるものである。合理的に設計された変更を創出する好ましい方法は、不適正（ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ）ＰＣＲプライマー伸長法を用いた部位特異的突然変異誘発である。
変更が合理的に選択されない場合、その変更はランダムに生成されたと表現される。化学的突然変異誘発、ＰＣＲシャフリング（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）およびリンカースキャニング突然変異誘発、等のランダム突然変異誘発技法は、特定のタンパク質コード配列において非常に多様なランダムで非特異的な変更を発生させる。このような方法は、メチオニナーゼをコードする核酸分子を徹底的に変更するのに用いることができる。
次に、この様式で創出された組換えメチオニナーゼの変更された形を、種々の公知方法を用いて所望の特性に関してスクリーニングする。用いる選択法の選択は、宿主、ベクターおよび採用された突然変異誘発法、並びに選択される特性に依存する。
本発明はさらに、本発明の発現モジュールを１以上含むベクターを提供する。ベクターとは、宿主内で自律複製が可能なＤＮＡ分子である。ベクターは天然に存在するプラスミド由来のエピソーム性複製起源、ゲノム性複製機転を含むことができる。または、ベクターはウイルスゲノムから引き出すことができる。本発明の発現モジュールを挿入すべきベクターの選択は、当分野で周知のように、所望の機能特性（例えば、タンパク質の発現）および形質転換すべき宿主細胞に直接依存する。
１つの実施態様においては、ベクターは原核生物のレプリコンを含む。Ｃｏ１Ｅ１レプリコン等の原核生物のレプリコンは当分野で周知であり、本発明の発現モジュールと組み合わせて容易に採用することができる。さらに、ベクターは薬剤耐性等の選択マーカーをコードする遺伝子を含むことができる。
真核生物発現ベクターもまた本発明の発現ベクターと組み合わせて用いることができる。真核細胞発現ベクターは当分野で周知であり、幾つかの商業的供給源から入手可能である。そのようなベクターの典型的なものは、ＰＳＶＬ、ｐＫＳＶ−１０　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ　（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｉｎｃ．）、ｐＴＤＴ１　（ＡＴＣＣ，　＃３１２５５）、本明細書に記述するベクターｐＣＤＭ８、および類似の真核生物発現ベクターである。さらに、バキュロウイルスに基づくベクター系等の昆虫細胞発現系を用いて、高レベル発現ベクターを創出することができる。
【００１２】
一般には、メチオニナーゼをコードする高発現モジュールの創出は典型的に以下の工程を包含する：
第１に、メチオニナーゼをコードするＤＮＡを得る。もしその配列がイントロンによって中断されていないならば（細菌由来のものに期待されるように）、それは任意の宿主における発現に適している。メチオニナーゼをコードする配列を挟む両側の領域に１以上の制限エンドヌクレアーゼ部位を挿入することにより、この配列を容易に切り出して回収できる形に変更することができる。
次に、切り出した、または回収したコード領域を、好ましくは複製可能な発現ベクター中で、高発現制御要素に機能しうる形で連結する。次に、発現モジュールまたはベクターを用いて適切な宿主を形質転換し、そして形質転換した宿主を組換えメチオニナーゼの産生をもたらす条件下で培養する。場合により、組換えメチオニナーゼを培地または細胞から単離する。若干の不純物が許容される幾つかの場合には、タンパク質の回収および精製は必要ないことがある。
上記の各工程は、種々の方法で実施することができる。例えば、所望のコード配列をゲノム断片から得て、適切な宿主中で直接使用することができる。種々の宿主中で機能できる発現ベクターの構築は、２つ以上の適切なレプリコンおよび制御要素を用いて行なうことができる。通常は利用可能でないにしても、適切な制限酵素部位をコード領域の両端に付加して、上記のベクターに挿入すべき切り出し可能な遺伝子を提供することができる。
ＩＩ．　高レベルの組換えメチオニナーゼを発現する形質転換宿主細胞
本発明はさらに、全細胞性タンパク質の約５〜７５％　を、好ましくは約１０％　以上を組換えメチオニナーゼとして産生するように、本発明の発現モジュールまたはベクターを用いて形質転換した宿主細胞を提供する。宿主細胞は原核生物または真核生物宿主でありうる。
任意の原核生物宿主を用いて、本発明の高レベルメチオニナーゼ発現モジュールを発現させることができる。好ましい原核生物宿主は大腸菌である。以下の実施例においては、大腸菌のＤＨ５αおよびＢＬ２１（ＤＥ３）株を使用した。
好ましい真核宿主細胞は、昆虫細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞を含み、好ましくはＳＰ６等の昆虫細胞およびマウス、ラット、サル、またはヒト繊維芽細胞細胞系由来のもの等の脊椎動物細胞を含む。他の好ましい真核宿主細胞は、ＡＴＣＣよりＣＣＬ６１として入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＡＴＣＣよりＣＲＬ　１６５８として入手可能なＮＩＨスイスマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、および類似の真核生物組織培養細胞系である。
本発明の高レベル発現組換えモジュールを用いた適切な宿主の形質転換は、典型的には使用する宿主およびベクターのタイプに依存する周知の方法によって達成することができる。原核宿主細胞の形質転換に関しては、宿主細胞のエレクトロポレーションまたは塩処理が好ましい。例えば、Ｃｏｈｅｎら，Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　６９：２１１０，　１９７２；　およびＭａｎｉａｔｉｓら，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　ＮＹ　（１９８２）参照。
真核宿主細胞の形質転換に関しては、エレクトロポレーションまたはカチオン性脂質の使用が好ましい。例えば、Ｇｒａｈａｍら，Ｖｉｒｏｌ．　５２：４５６，　１９７３；およびＷｉｇｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　７６：１３７３−７６，　１９７９　参照。
上首尾に形質転換された細胞、すなわち本発明の発現モジュールを含む細胞は、周知の技法により同定することができる。例えば、本発明の発現モジュールの導入によって得られた細胞をクローン化して単一コロニーを生成させることができる。これらのコロニー由来の細胞を集め、溶解し、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　９８：５０３，　１９７５　またはＢｅｒｅｎｔら，　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　３：２０８，　１９８５に記述されているような方法を用いて、それらのＤＮＡ含有量をｒＤＮＡの存在について検査することができる。しかし、以下に記述するように、本発明はさらに、高レベルの組換えメチオニナーゼを発現する形質転換体を同定するための迅速なスクリーニング方法をも提供する。
ＩＩＩ．　高レベルの組換えメチオニナーゼを発現する宿主の同定
本発明はさらに、組換えメチオニナーゼを全細胞性タンパク質の約５〜７５％　のレベルで産生する形質転換宿主細胞を同定する方法を提供する。具体的には、全細胞性タンパク質の約５〜７５％　を組換えメチオニナーゼとして発現する形質転換宿主細胞は、明瞭で観察可能なピンク色を有することが観察された。これは大腸菌を宿主として使用した場合、特に顕著である。
高レベルの組換えメチオニナーゼを発現する形質転換体を同定するため、組換えメチオニナーゼが発現される条件下で、そして増殖細胞の視覚による検査が可能な条件下で、形質転換細胞を培地上または培地中で増殖させる。増殖細胞またはコロニーを検査し、ピンク色の表示に基づいて選択する。
本方法を用いた選択のため、種々の培養／増殖条件を採用して形質転換宿主細胞を増殖させることができる。増殖培地の成分は使用される宿主／ベクター系の栄養要求、および高レベルの組換えメチオニナーゼの発現に伴うピンク色を同定し、それによって高レベル発現クローンの単離を可能とするために用いられる検査系に依存する。好ましい培地は、その上に形質転換細胞を播いて、それぞれが単一の宿主に由来する単離された複数のコロニーとして増殖させることができる固体培地である。高レベル発現クローンを同定する好ましい方法は、増殖するコロニーの視覚による検査である。
ＩＶ．　高レベル発現モジュールを用いた組換えメチオニナーゼの産生
本発明はさらに組換えメチオニナーゼを産生する方法を提供する。具体的には、本発明の高レベル発現モジュールを１つ以上用いて形質転換した宿主を用いて、商業的に有意義なレベルで組換えメチオニナーゼを産生することが可能である。そのような形質転換宿主は、全細胞性タンパク質の約５〜７５％　のレベルで組換えメチオニナーゼを発現するであろう。本発明の宿主を用いれば、当業者は公知の方法を用いた種々の診断および治療法に使用する組換えメチオニナーゼを容易に産生することができる。
メチオニナーゼをコードする高発現モジュールを含む形質転換宿主を用いて産生した組換えメチオニナーゼ、または本来メチオニナーゼを産生する宿主から産生されたメチオニナーゼの好ましい精製法は、以下の工程を含む：
ａ）水性緩衝液中にメチオニナーゼを含む、形質転換細胞の抽出物を約４０〜６０℃で約１〜１０分間、好ましくは５０℃で１　分間加熱し；
ｂ）加熱した抽出物をＧＳ−３ローター（Ｓｏｒｖａｌ　Ｄｕ　Ｐｏｎｔ）を用いて約１０ｋから２０ｋ
ｒｐｍで約１５分から１時間、好ましくは約１３ｋ　ｒｐｍ　で約３０分４　℃で遠心し；
ｃ）細孔径が約５０Ｋから１００Ｋのフィルター、好ましくはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｐｒｅ／Ｓｃａｌｅ：ＴＴＦ
ＰＬＨＫ　１００　Ｋ　２．５　ｆｔ２カートリッジを用いて、１０　ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ　８．３）を用いて上清を限外濾過し；
ｄ）低イオン強度（約１０〜５０　ｍＭ）のＫＣｌをｐＨ約７．０〜７．６の１０−２０　ｍＭのリン酸カリウム緩衝液中で用いて、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーを実施し（好ましくはＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ　カラムを用いる）、そして約４０〜２００　ｍＭのＫＣｌ勾配を用いて溶出した、メチオニナーゼを含む画分を回収し；
ｅ）中程度イオン強度（５０〜１００　ｍＭ）のＫＣｌをｐＨ約８．０〜８．６の１０−２０　ｍＭのリン酸カリウム緩衝液中で用いて第２のＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーを実施し（好ましくはＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ　カラムを用いる）、そしてリン酸緩衝液（ｐＨ８．３）で緩衝化した１００〜２００　ｍＭ　ＫＣｌを用いて溶出した、メチオニナーゼを含む画分を回収し；そして
ｆ）上記工程ｅ）で回収した画分を、エンドトキシンを吸収することのできるクロマトグラフィー媒体と接触させ（好ましくは　ＡｃｔｉｃｌｅａｎＴＭ　Ｅｔｏｘカラムを使用する）、そして溶出液を回収し、これによって該溶出液からエンドトキシンを除去して、タンパク質　１　ｍｇあたり少なくとも２０単位のメチオニナーゼ活性を有し、かつタンパク質　１　ｍｇあたり約１〜１００　ｎｇのエンドトキシンを含む、実質的にエンドトキシンを含まないメチオニナーゼを形成する。
好ましくは、細胞抽出物は高レベル（全細胞性タンパク質の５〜７５％）の組換えメチオニナーゼを発現するように変更された宿主細胞から調製される。細菌の細胞抽出物については、抽出物は一般にまず集菌し、そして細菌細胞培養物を洗浄して、集菌が遠心でなされたか又は中空糸濾過によってなされたかによって細胞ペースト／ペレットを形成することにより調製される。これらの方法は一般に周知である。
次に、通常の手段を用いて細胞を破砕する。好ましくは、キャビテーター（ｃａｖｉｔａｔｏｒ）型ホモジナイザー、例えばＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ　Ｃｏｒｐ．モデル　＃ＨＣ８０００等のホモジナイザーを用いて細胞を破砕する。
得られた懸濁物を加熱して、選択タンパク質および他の不溶性物質を沈殿させる。典型的加熱条件は、約４５−６０　℃で１−１０分間である。５０℃１分間の加熱工程が好ましい。
加熱した抽出物を遠心にかけて破砕物を除去し、上清を濾過して、上記のように２工程にしてＤＥＡＥイオン交換媒体に適用する。好ましい吸着および溶出条件を実施例に記述する。これらの工程では、種々のＤＥＡＥイオン交換カラムクロマトグラフィー媒体の任意のものが使用でき、媒体の選択は限定的なものと解釈されるべきではない。商業的供給源は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＢｉｏｒａｄおよびＳｉｇｍａを含む。
その後、エンドトキシンを除去して、先に記述した許容されるレベルのエンドトキシンを含むタンパク質を調製する。エンドトキシン除去工程は、周知の種々の手段のうち任意のものを用いて実施でき、そして典型的には溶液中のタンパク質をエンドトキシンを吸着することのできるクロマトグラフィー媒体に接触させて、エンドトキシンを含まないタンパク質を含有するクロマトグラフィー媒体溶出液を得ることを包含する。エンドトキシンの除去に用いる好ましい市販の試薬は、Ａｃｔｉｃｌｅａｎ　ＴＭ　Ｅｔｏｘである。
Ｇ．高ホモシステイン血症に関連する心臓血管性疾患の予防のためのメチオニナーゼの使用
本発明の別な側面は、ホモシステイン枯渇療法のためのメチオニナーゼの使用である。高ホモシステイン血症は種々のタイプの心臓血管性疾患と関連してきた。これらの疾患と高ホモシステイン血症との最初の関連付けは　ＭｃＣｕｌｌｙによって１９６９年になされた（ＭｃＣｕｌｌｙ，　ＫＳ，　Ａｍ．　Ｊ．　Ｐａｔｈｏｌ．　５６：１１１−２８，　１９６９）。ＭｃＣｕｌｌｙ　は、上昇した血漿ホモシステイン濃度と動脈硬化性疾患の間に連結（ｌｉｎｋ）を見いだした。最近結論が出されたＦｒａｍｉｎｇｈａｍ　Ｈｅａｒｔ　Ｓｔｕｄｙによる１，０４１人の研究は、血漿ホモシステイン濃度の上昇は、動脈硬化の危険の増大をもたらすことを見いだした（Ｓｅｌｈｕｂ，　Ｊ．ら，Ｎ．　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．　３２：２８６−９１，　１９９５）。他の研究は、穏やかな高ホモシステイン血症までも末梢血管性、脳血管性および冠状動脈性心臓疾患と結び付けた（Ｋａｎｇ，　Ｓ．ら，Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｎｕｔｒ．　１２：２７９−９８，　１９９２）。例えば、血管性疾患を有する患者における絶食（ｆａｓｔｉｎｇ）ホモシステイン濃度は、正常な被験者における濃度よりも３１％　高い。正常の上限よりも１２％　高い血漿ホモシステイン濃度は、心筋梗塞の危険における３．４　倍の増加と連結している（Ｓｔａｍｐｆｅｒ，　Ｍ．ら，ＪＡＭＡ　２６８：８７７−８１，　１９９２）。ホモシステイン代謝の研究は、２０００人以上の被験者に関する２０件の対照および横断的研究において、発作および他の心臓血管性疾患を有する患者は、心臓血管性疾患をもたはい被験者に較べ、ホモシステインのより高い血中レベルを示すことが見いだされた。これは、心筋梗塞を有する殆どの患者が正常なコレステロール値を示す事実と対照的である。Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｔｕｄｙ　において驚くべき結果が判明した。すなわち、心臓血管性疾患が診断される前に血液を採取したとところ、後に心筋梗塞を起こした２７１　人の男性は心筋梗塞を起こさなかった対照に較べ、有意に高いホモシステインの平均基線レベルを有したことが示された（Ｕｅｌａｎｄ，　Ｐ．ら，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｓ　ａｎｄ
Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｌｅｒ；　１８３−２３６，　１９９２）。種々の条件がホモシステインレベルの上昇をもたらしうるが、根本にある代謝上の原因に関わりなく、高レベルのホモシステインと血管性疾患の関係は存在する。直接試験において、ヒヒに血管性病巣を誘導し、３ケ月間ホモシステインを注入した（Ｕｅｌａｎｄ，　Ｐ．ら，前出）。メチオニンを経口投与し、その後患者のホモシステインレベルを測定すると、高ホモシステイン血症が診断されるであろう。この経口メチオニンチャレンジ後の異常なホモシステイン血漿濃度は、動脈硬化性疾患を有する患者においては正常な被験者に較べて１２倍である（Ｕｅｌａｎｄ，　Ｐ．ら，前出）。血漿ホモシステインレベルはＨＰＬＣアッセイにより容易にかつ迅速に測定することができる。複数の研究が、人口の４０％　が上昇したホモシステインレベルを有する可能性があり、心臓血管性疾患の危険があることを示唆している（Ｓｔａｍｐｆｅｒ，　Ｍ．　およびＭａｌｉｎｏｗ，　Ｍ．，　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．　３３２：３２６−３２９　１９９５）。高ホモシステイン血症は、動脈硬化性疾患を誘導して患者を心筋梗塞および脳血管性疾患の危険に陥れる急性作用をもつ場合がある。したがって、心臓血管性疾患の危険がある患者の多くの部分に対し、緊急の医学的介入が指示された。本発明のメチオニナーゼは、危険な患者のホモシステインレベルを直ちに低下させるための緊急介入の優れた療法として用いることができる。メチオニナーゼは２つの反応を触媒する。すなわち、メチオニンにおけるばかりでなく、ホモシステインにおいても、窒素−炭素結合およびγ−炭素−硫黄結合の両方の開裂である（Ｈｏｆｆｍａｎ，　Ｂｉｏｃｈ．　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｏｎ　Ｃａｎｃｅｒ，　７３８：４９−８７，　１９８４）。図７は、ホモシステインおよびメチオニン代謝の代謝サイクルを示す。ビタミンＢ−１２、Ｂ−６　および葉酸は図に示すサイクルの「左側」に影響を及ぼし、そしてメチオニナーゼ治療後のある患者における正常なホモシステインレベルの維持を助ける。しかし、サイクルの「右側」は、これらビタミンのレベルに依存しない。サイクルの右側では、メチオニンの存在がトランスメチル化反応の増大を介して過剰なホモシステインレベルをもたらしうる。これは、癌および動脈硬化性疾患をもたらしうる。サイクルの右側に異常を有する患者は、ホモシステインの正常レベルを維持するためにメチオニナーゼの持続的使用および緊急使用が必要であろう。心臓血管性疾患にとっては、メチオニナーゼのメチオニナーゼおよびホモシステインの両方に対する基質特異性が重要である。メチオニナーゼはホモシステインの前駆体であるメチオニンのレベルを低下させ、またホモシステインレベルを直接低下させる。この領域における以前の研究は、高ホモシステイン血を低下させる療法としてビタミンＢ−１２、Ｂ−６　および葉酸の使用を示唆するのみであった。図７に示すように、単にこれらのビタミンを供給することは、サイクルの右側に存在する異常をなんら矯正せず、またサイクルの右側に異常を有���る患者のホモシステインレベルを低下させないであろう。本発明は、メチオニナーゼを用いてこのような心臓血管性疾患を有する患者を治療する方法を含む。
１つの側面において、治療上有効量のメチオニナーゼを患者に投与することを含む、心臓血管性疾患を有する患者の治療方法が提供される。
ホモシステイン枯渇のための治療上有効量のメチオニナーゼとは、例えば動脈硬化の危険を減少させるために、所望のホモシステインレベルを達成すべく計算された、あらかじめ定められた量をいう。
したがって、本発明のメチオニナーゼを投与するための用量範囲は、例えば動脈硬化の危険またはレベルが低下するという、所望の効果を奏するに十分大きい用量である。用量は、好ましくない副作用、例えば高粘稠度症候群、肺水腫、うっ血性心不全、等を引き起こすほど大きくてはならない。一般に、用量は患者の年齢、状態、性別および疾患の程度によって変わり、当業者によって決定され得る。
何らかの合併症が生じた場合は、それぞれの医師が用量を調整することができる。
本発明のメチオニナーゼの治療上有効量は、典型的には、生理的に許容される組成物として投与した時に、１　ｍｌあたり約０．００１から約１００単位（Ｕ）　、好ましくは約０．１　Ｕ以上、そしてより好ましくは１　Ｕメチオニナーゼという血管内（血漿）または局所的濃度を達成するのに十分な量である。典型的用量は体重に基づいて投与することができ、約５〜１０００　Ｕ／ｋｇ／日、好ましくは約１０〜５０　Ｕ／ｋｇ／日、より好ましくは約２０〜４０　Ｕ／ｋｇ／日の範囲である。
好ましい方法においては、用いられるメチオニナーゼは本明細書中で詳述したように実質的にエンドトキシンを含まない。特に好ましいのは、組換えによって産生された実質的にエンドトキシンを含まないメチオニナーゼに使用である。
当業者に公知の投与方法を使用することができ、それらは本明細書に記述されている。
本発明の別な側面においては、エンドトキシンを実質的に含まない、そしてポリマーに結合したメチオニナーゼの治療上有効量を投与することにより、心臓血管性疾患を有する患者を治療する。好ましい側面においては、該ポリマーはポリエチレングリコールである。別の好ましい側面においては、該心臓血管性疾患は動脈硬化である。本発明の別の側面において、メチオニナーゼは頭蓋外頸動脈狭窄、末梢血管性、脳血管性、冠状動脈性疾患および閉塞性血管疾患を有する患者に投与される。
本発明の別な側面においては、治療上有効量のメチオニナーゼを投与することによる、高ホモシステイン血症を有する患者の治療方法が提供される。該メチオニナーゼは実質的にエンドトキシンを含まないことが可能で、またポリエチレングリコール等のポリマーと結合していることが可能である。
本発明はまた、患者に治療上有効量のメチオニナーゼを投与する工程を含む、患者のホモシステインレベルを低下させる方法を提供し、該方法においてメチオニナーゼは実質的にエンドトキシンを含まない。本発明の別な側面においては、患者に治療上有効量のメチオニナーゼを投与する工程を含む、患者における心臓血管性疾患を予防する方法が提供される。好ましい側面においては、患者に投与されるメチオニナーゼは実質的にエンドトキシンを含まない。別の好ましい側面においては、該メチオニナーゼはポリマーと結合している。さらに別の好ましい側面においては、患者に治療上有効量の、エンドトキシンを実質的に含まない、そしてポリエチレングリコールと結合しているメチオニナーゼを投与する工程を含む、患者における心臓血管性疾患を予防する方法が提供される。実施例７はｉｎ　ｖｉｖｏホモシステイン枯渇の１例を示す。
Ｈ．腫瘍イメージングのためのメチオニナーゼの使用
本発明の別な側面においては、以下の工程を含んでなる、患者の腫瘍を診断する方法が提供される。すなわち、患者にメチオニナーゼを投与することにより該患者の１２Ｃメチオニンを枯渇させ、次に１１Ｃメチオニンを該患者に投与することにより該患者にメチオニンを充満させ、そして最終的に該患者の腫瘍細胞における１１Ｃメチオニンの存在を検出する。１１Ｃメチル化は、例えば、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）走査を手段として検出することができる。ただし、手段はこれだけに限定されない。当業者は癌細胞による１１Ｃ取り込みを検出する他の方法に精通している。そのような方法は、例えば、全て参考のために本明細書に組み入れている　Ｌａｐｅｌａら，　Ｊ．　Ｎｕｃｌ．　Ｍｅｄ．　３５：１６１８−２３，　１９９４；　Ｍｉｙａｚａｗａら，Ｊ．　Ｎｕｃｌ．　Ｍｅｄ．　３４：１８８６−９１，　１９９３；　Ｌｅｓｋｉｎｅｎ−Ｋａｌｌｉｏら，Ｊ．　Ｎｕｃｌ．　Ｍｅｄ．　３３：６９１−９５，　１９９２；　Ｓｈｉｅｌｄｓら，Ｊ．　Ｎｕｃｌ．　Ｍｅｄ．　３３：５８１−８４，　１９９２；　Ｈｕｏｖｉｎｅｎら，Ｂｒｉｔ　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ　６７：７８７−９１，　１９９３；　Ｄｅｔｈｙら，Ｊ．　Ｎｕｃｌ．　Ｍｅｄ．　３５：１１６２−６６，　１９９４；　Ｌｉｎｄｈｏｌｍら，Ｊ．　Ｎｕｃｌ．　Ｍｅｄ．　３４：１７１１−１６，　１９９３；　Ｌｅｓｋｉｎｅｎ−Ｋａｌｌｉｏｒら，Ｊ．　Ｎｕｃｌ．　Ｍｅｄ．　３２：１２１１−１８，　１９９１；　およびＭｉｎｅｕｒａら，Ｊ．　Ｎｕｃｌ．　Ｍｅｄ．　３２：７２６−２８，　１９９１　を参照されたい。
本発明の好ましい側面においては、投与されるメチオニナーゼは実質的にエンドトキシンを含まない。
本発明の別の好ましい側面においては、該メチオニナーゼをポリエチレングリコール等のポリマーに結合させていた。
【００１３】
【実施例】
本発明に関する以下の実施例は説明的なものであって、言うまでもなく本発明を具体的に限定するものと解釈されるべきではない。さらに、現在公知であるかまたは後になって開発される、当業者の理解範囲内にある本発明の変法は、本明細書に後に記述する請求の範囲に含まれると考えるべきである。
実施例１
メチオニナーゼの拡大生産
シュードモナス　プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）の一株を修飾し、カナマイシン耐性及び下記のような高レベルのメチオニナーゼ発現に対して選別した。
シュードモナス　プチダ　ＡＴＣＣ　８２０９及びエシェリキア　　コリ（Ｅ．　ｃｏｌｉ）　ＡＴＣＣ　７７１００を１９９３年１０月にＡＴＣＣから購入した。ＡＴＣＣ　７７１００を５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ら，　分子クローニング：実験の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ）　Ａ．１，　１９８９）　中で増殖させた。シュードモナス　　プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）及びエシェリキア　　コリのいずれにおいても複製可能なカナマイシン耐性遺伝子を含有するシャトルベクター、プラスミド　ｐＣＮ　５１　（Ｎｉｅｃｏら，　Ｇｅｎｅ　８７：　１４５−１４９，　１９９０。これは、ここで参照することにより本明細書に含まれるものである。）をＡＴＣＣ　７７１００から単離し、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−リゾチーム法を用いて精製した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ら，　分子クローニング：実験の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ）　１．２９−１．３０，　１９８９）　。ＡＴＣＣ　８２０９　をＬＢ培地中で増殖させ、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，　分子クローニング：実験の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ）　１．７４−１．８４，　１９８９に記載された手順と同様の標準的な形質転換の手順を用いてｐＣＮ　５１で形質転換した。カナマイシン耐性株をＬＢ培地中でカナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）　を用いて選別し、　１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢプレート（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ら，　分子クローニング：実験の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ）　Ａ．１−Ａ．４，　１９８９）　中でさらに増殖させた。単独のコロニーを　１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ中で一晩増殖させ、次いで高メチオニナーゼ発現条件下（５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む、１０％ＬＢ、　０．１％リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）　、　０．１％尿素、　０．０２５％酵母抽出物、０．０１％硫酸マグネシウム及び０．２５％メチオニン中）に、２４時間置いた。メチオニナーゼの発現を本明細書中に記載したような標準的なメチオニナーゼアッセイを用いて測定した。シュードモナス
プチダのメチオニナーゼ過剰産生株を選別し、ＡＣ−１と名付けた。
次いで、シュードモナス　　プチダ　ＡＣ−１　の拡大発酵方法を用いた。単独のコロニー　ＡＣ−１　を５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢプレート中で増殖させた。選別したコロニーを５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ５ｍｌ中で、２６℃にて　２５０ｒｐｍ／分で振盪しながら１８時間インキュベートした。細菌２ｍｌを５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ　６００ｍｌ中で、２６℃にて　２００ｒｐｍ／分で振盪しながら６時間増幅させた。次に、細菌５０ｍｌを５０μＭ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ２リットル中で、２６℃にて　１００ｒｐｍ／分で振盪しながら一晩（１８時間）インキュベートした。続いて、細菌２リットル（ＯＤ６００　　１．２〜１．６）を、４０リットルタンク中の１０％ＬＢ、　０．１％リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）　、０．１　％グリセロール、　０．１％尿素、　０．０２５％酵母抽出物、０．０１％硫酸マグネシウム及び０．２５％メチオニンを含む特別な培地中で、高好気性条件下、２６℃にて２４時間増殖させた。ＯＤ６００　は　１．２〜１．８　に達し、活性は２０〜３０単位／リットルに達した。採収に最適な細胞密度は、ＯＤ６００　　１．５〜１．８　である（２〜３ｍｇ／ｌのメチオニナーゼを含有）。これは、１ｋｇ湿細胞／４００リットルに等しい。好ましくは、おおよその収量が約１ｋｇ湿細胞／１０〜２０リットルである完全装備の発酵槽が用いられる。細胞をＡＧＴカラム（モデル　ＵＦＰ−５００−Ｅ−５５　カートリッジ、Ａ／Ｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いて温度を４℃に保持しながら採収し、次いで自動低温遠心分離機（Ｓｏｒｖａｌｌ超高速ＲＣ２−Ｂ）を用いて４℃、９ｋｒｐｍにて１０分間遠心分離した。続いて細胞ペレットを採取した。
次に、細胞を抽出溶液（２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ９．０）中に　５００ｇ湿細胞／リットルの密度で懸濁し、キャビテーターホモジナイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社モデル＃ＨＣ　８０００）　による三つの通路（ｐａｓｓａｇｅ）　を用いて粉砕した。細胞を破壊した後、ただちにホモジネートを−８０℃で保存した。ホモジネート中のメチオニナーゼの比活性は０．０８〜０．１　単位／ｍｇ（タンパク質）であった。
ＡＣ−１ホモジネートを抽出緩衝液（１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．２）　、１０μＭ　リン酸ピリドキサール、０．０１％β−メルカプトエタノール、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　及び２０％エタノール）中に懸濁し、５０℃で２分間加熱した。加熱工程は、メチオニナーゼ活性を維持する一方で感熱性の混入タンパク質を沈殿させるのに十分な時間をかけて行われ得る。懸濁液を１２ｋｒｐｍで４℃にて３０分間遠心分離した。上清を採取してミリポアＰｒｅｐ／Ｓｃａｌｅ−ＴＦＦ　ＰＬＨＫ　１００Ｋ　２．５ｆｔ２　カートリッジを用いて限外濾過した。次いでｐＨを　７．２に調節した。
タンパク質を合計約２５〜３５ｇ含む抽出緩衝液（１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）　、１０μＭ　リン酸ピリドキサール及び０．０１％Ｊ−メルカプトエタノール）１０Ｌからなる試料を、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）で予備平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ　ＤＥＡＥ−６５０Ｍ　カラム１０ｃｍ×５０ｃｍ（Ｔｏｓｏ　Ｈａａｓ　Ｊａｐａｎ）　に加えた。このカラムを、１０μＭ　リン酸ピリドキサール及び０．０１％β−メルカプトエタノールを含有し、４０ｍＭ塩化カリウムを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）　２０〜３０Ｌを用いてＯＤ２８０　が　０．１以下に低下するまで予備洗浄した。次に、抽出緩衝液中の塩化カリウムの濃度が４０ｍＭから出発して　３００ｍＭまで増大する、塩化カリウムの直線グラジェントによってこのカラムからの溶離を行った。　４００ｍｌの溶出画分を集めた。メチオニナーゼを含む画分を本明細書中に記載したようなメチオニナーゼ活性アッセイによって定量し、プールした。プールされた画分を同一濃度のリン酸ピリドキサール及びβ−メルカプトエタノール並びに　１５０ｍＭ塩化カリウムを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．３）　を用いて予備平衡化した。
ＤＥＡＥ−６５０Ｍ　（５ｃｍ×２０ｃｍ）　カラムのメチオニナーゼピークから得られたタンパク質を合計約１〜２ｇ含む、１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．３）　、　１５０ｍＭ塩化カリウム、１０μＭｒｉｎｎｓａｎピリドキサール及び０．０１％Ｊ−メルカプトエタノールを含有する緩衝液からなる試料をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ａ５０−カラムに加えた。１０μＭ　リン酸ピリドキサール及び０．０１％β−メルカプトエタノールを含有する１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．３）　中の　１５０〜５００ｍＭ　ＫＣｌ　直線グラジェントを用いて前記カラムからの溶離を行った。　１５０ｍｌの溶出画分を集めた。本明細書中に記載したような活性アッセイによって定量したメチオニナーゼを含む画分をプールした。次いで、プールされたメチオニナーゼをさらに精製してエンドトキシンを除去した。この試料を０．１２Ｍ塩化ナトリウム及び１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１）　中で透析することによって予備平衡化した。この試料を５ｃｍ×１５ｃｍ　Ａｃｔｉｃｌｅａｎ　Ｅｔｏｘ　樹脂カラム（Ｓｔｅｒｏｇｅｎ　Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、アルカディア（Ａｒｃａｄｉａ）　、カリフォルニア（ＣＡ））　に加えた。次に、同様の緩衝液を用いてカラムからその酵素を溶離させ、メチオニナーゼ活性を有する溶出画分を集めて、続いてエンドトキシンの量を溶出した画分について定量した。表１にこの精製方法の結果を示す。
【００１４】
【表１】
2004081209.tif 000064
【００１５】
７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける精製メチオニナーゼの分析では１本の４３ｋｄのタンパク質のバンドが現れた。これは、第２のカラムから得られた活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析したときに観察された　１７２ｋｄのタンパク質の一つのサブユニットを示すものである。この方法によって単離されたメチオニナーゼの純度をＨＰＬＣ分析（これはただ一つのタンパク質のピークを示した。）を用いて調べたところ９８．７％であった。
本明細書に記載した抽出方法によれば、実質的にエンドトキシンを含まない実質的に単離されたメチオニナーゼを調製することができる。当業者には、ここで記載された抽出方法に修正がなされ得、それらが本発明の範囲に含まれるということは理解されるであろう。
実施例２
ヒト腫瘍の高レベルメチオニン依存性
ヒト癌においてメチオニン依存性はしばしば生ずる。全主要器官系由来の２０のＮＣＩヒト腫瘍細胞系についてメチオニン依存性を試験した。２０の全ての細胞系がメチオニン依存性であることがわかった。さらに、新鮮なヒト腫瘍標本を試験したところ、メチオニン依存性であることがわかった。正常なヒト細胞系はメチオニン依存性ではなかった。
図１には一つのそのような試験の結果を示す。図１では、正常細胞株及び腫瘍細胞系を、メチオニン含有、ホモシステインフリー（ＭＥＴ＋　ＨＣＹ　−　）　；メチオニンフリー、ホモシステイン含有（ＭＥＴ−　ＨＣＹ　＋　）　；又はメチオニンフリー、ホモシステインフリー（ＭＥＴ−　ＨＣＹ　−　）　のいずれかである１０％透析血清を含むイーグルのＭＥＭ中で増殖させた。腎臓、結腸、肺及び前立腺癌細胞系、黒色腫、並びに正常線維芽細胞株を、メチオニン（ＭＥＴ）含有培地、ＭＥＴフリー培地、ホモシステイン（ＨＣＹ）含有培地及びＭＥＴフリー培地、ホモシステイン（ＨＣＹ）含有培地及びＭＥＴフリー、ＨＣＹフリー培地中でスクリーニングした。１０％透析ウシ胎児血清、１０μＭ　ヒドロキソコバラミン及び　１００μＭ　葉酸を補給したイーグルの最小必須培地（ＭＥＭ培地）中で細胞を増殖させた。培地には、下記の方法でメチオニンを補給するか、又はメチオニンを補給しなかった：ＭＥＭ＋ＨＣＹ：培地にホモシステインを含まない　１００μＭ　Ｌ−メチオニンを補給した。ＭＥＴＨＣＹ＋：培地にメチオニンを含まない　２００μＭ　Ｄ，Ｌ−ホモシステインを補給した。ＭＥＴＨＣＹ：培地はメチオニンフリーであり、ホモシステインフリーであった。ウシ胎児血清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１０回透析した（血清：ＰＢＳ＝１：１２）。
細胞増殖を、　４５０ｎｍにおける吸収によって測定されるような色素ＸＴＴの代謝的還元によって定量した。細胞を、４８ウェル皿上で、１ウェル当たり５×１０３　乃至２×１０４　細胞を接種することによって増殖させた。ＸＴＴ（２，３−　ビス（２−　メトキシ−４−　ニトロ−５−　スルホフェニル）−５−［（フェニルアミノ）　カルボニル］−２Ｈ−　テトラゾリウムヒドロキシド（これは生細胞中で水可溶性ホルマザン生成物に代謝的に還元される）を用いて細胞増殖を定量した。　４５０ｎｍにおける還元生成物の吸光度を測定した。ＸＴＴを予め温めた（３７℃）ＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍｌに調製し、フェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）をＰＢＳ中で５ｍＭに調製した。新鮮なＸＴＴ溶液をＰＭＳ保存溶液と、１ｍｌのＸＴＴ当たり５　ｍｌのＰＭＳの割合で混合した。各ウェルを培地１ｍｌで満たした。混合したＸＴＴ　０．２５ｍｌ　を各ウェルに添加した。　４５０ｎｍにおける還元ＸＴＴの吸光度を、３時間のインキュベーション後に日立Ｕ−２０００分光光度計を用いて読んだ。ＸＴＴのＯＤを、細胞を２４時間初期培養した後、３日毎に測定した。包皮線維芽細胞株ＦＳ−３及びＨＳ−６８は、　ＭＥＴ＋ＨＣＹ　−　又は　ＭＥＴ−　ＨＣＹ　−　中で本質的に同等に増殖した。しかしながら、両方の線維芽細胞株はある程度まで増殖し、次いで少なくとも１６日間ＭＥＴ　ＨＣＹ培地中にそれ自体を維持することができるという新たな所見をここに報告する。表２に２０の腫瘍細胞系の細胞増殖アッセイの結果を示す。このアッセイにおいて、細胞懸濁液中の５×１０３　〜２×１０４　細胞／ウェルを４８−ウェルプレートにて、１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ中で２４時間培養した。細胞をハンクス塩基性塩類溶液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄し、次いで３群に分けた。Ｉ群：　ＭＥＴ＋　ＨＣＹ　−　培地で培養した細胞；ＩＩ群：　ＭＥＴ−　ＨＣＹ　＋　培地中で培養した細胞；ＩＩＩ　群：　ＭＥＴ−ＨＣＹ　−　培地中で培養した細胞。細胞を９５％空気／５％ＣＯ２　を供給したインキュベーター中で培養した。培地は２〜３日毎に交換した。表２には、細胞系の激しい増殖を＋＋＋で示し、少しの増殖を＋＋で示し、わずかな増殖を＋で示し、増殖無しを−で示した。腫瘍細胞系の約２分の１はＭＥＴフリーＨＣＹ含有培地中で増殖することができず、残りはいろいろな程度まで増殖する一方で、それと同じ培地中で正常細胞はＭＥＴ含有培地における増殖と同じくらい十分に増殖することができる。ＭＥＴフリー、ＨＣＹフリー培地中では、正常細胞株はある程度まで増殖し、次いで２週間以上それを維持することができるが、試験された２０の全腫瘍細胞系はかかる培地中で死滅し、これは潜在的に全ての癌をＭＥＴ欠乏によって選択的に殺すことができるということを示唆するものである。本実施例は、メチオニン依存性が、特に治療薬としてのメチオニナーゼとともに癌の治療に対して万能で選択的なターゲットであり得るという証拠を提供するものである。
【００１６】
【表２】
2004081209.tif 000065
【００１７】
実施例３
マウス異種移植片モデルにおけるメチオニナーゼによるヒト腫瘍増殖の阻害
腫瘍増殖の低減におけるメチオニナーゼの効力を試験するために、マウス異種移植片モデルを用いた。ヒト肺癌腫瘍（Ｈ４６０）をヌードマウスの皮下組織に移植した。マウスを４匹ずつの４群に分けた。移植の４日後、Ａ群には４時間毎に緩衝液（０．１２Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．１））　０．４ｍｌ　を腹腔内注射によって投与し；Ｂ群には４時間毎にメチオニナーゼ（１単位／ｇ）を腹腔内注射によって投与し；Ｃ群には４日毎に５−ＦＵ（６０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射によって投与し；そしてＤ群には４日毎にビンクリスチン（ＶＣＲ）（０．９ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射によって投与した。腫瘍のサイズ及び体重を２日毎に測定した。その結果を図２及び３に示す。それらの結果は、メチオニナーゼによる治療がヌードマウスにおけるＨ４６０ヒト非小細胞肺癌の増殖を大いに遅延させるということを示している。これらの実験において、マウスには通常のメチオニンが枯渇していない食餌を与えた。Ｈ４６０に対するメチオニナーゼの効力は、５−フルオロウラシル及びビンクリスチン治療（これらはかかる腫瘍に対しては不活性である）とは全く対照的であった。投与されたメチオニナーゼの活性は、４０〜１２０
単位／日での１０日間までの治療では体重減少を引き起こさず、これは低毒性の可能性を示すものである。それとは対照的に、ビンクリスチンは体重減少を引き起し、これは毒性を示すものである。このように、メチオニナーゼは最小毒性の新規腫瘍選択的作用機構を有する非常に有効な抗腫瘍剤であり、ヒト固形腫瘍に対する潜在的な臨床的有効性を示すものである。
実施例４
ＰＥＧ−メチオニナーゼの調製
分子量５０００のメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルカーボネート（Ｍ−ＳＣ　５０００　ＰＥＧ）を２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）に２ｍＭ乃至２０ｍＭの濃度で溶かした。Ｍ−ＳＣ　５０００　ＰＥＧとメチオニナーゼの比率は６：１と　２４０：１の間で変化させた。ＰＥＧ化反応は反応緩衝液（２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．３）中で４℃又は２０℃にて３０分から６０分間行った。０℃にて停止緩衝液（０．１４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５）を用いて反応を停止させた。次いで、未反応のＭ−ＳＣ　５０００　ＰＥＧを本明細書中に記載したようなゲル濾過クロマトグラフィーによって除去した。得られたＰＥＧ−メチオニナーゼを０．１２Ｍ塩化ナトリウム及び１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）溶液中に３０ｋ　Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ
濃縮器を用いて配合した。次に、ＰＥＧ−メチオニナーゼを　０．２μＭ　ミクロン膜フィルターを用いて濾過することによって滅菌した。ＰＥＧ−メチオニナーゼは−７０℃にて６カ月まで活性を損失することなく保存し得る。
メチオニナーゼ活性を測定した。ＰＥＧ−メチオニナーゼの活性は、非ＰＥＧ化メチオニナーゼの活性の少なくとも６０％に維持されていた。ＰＥＧ−メチオニナーゼを、Ｌａｅｍｍｌｉ　及びＳａｍｂｒｏｏｋ（Ｌａｅｍｍｌｉ，　Ｎａｔｕｒｅ　２２７−６８０，１９７０；　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ら，　分子クローニング：実験の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ）　１８．４７−１８．５９，　１９８９）　に記載されたような未変性及びＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。この電気泳動は下記のようにして修正を加えた：ＰＥＧ−メチオニナーゼの電気泳動はＳＤＳを含むか又はＳＤＳを含まない　０．２Ｍトリス−グリシン緩衝液（ｐＨ８．３）中の　７．５％ポリアクリルアミドプレキャストゲル中で行った。ゲルをクーマシーブルーで染色し、４０％メタノール１０％酢酸を用いて脱色した。ＰＥＧ−メチオニナーゼを未変性ゲルに加えた場合、非修飾メチオニナーゼのバンドは観察されなかったが、ＳＤＳゲル中では非常に小さいバンドが観察された。
次に、ＰＥＧ−メチオニナーゼをＨＰＬＣゲル濾過カラムによって下記のようにして分析した：ＰＥＧ−メチオニナーゼ（１〜２ｍｇ／ｍｌで２０　ｍｌ）を２０μｍ　ループを用いて　０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中のＰｒｏｇｅｌ−ＴＳＫ　Ｇ３０００　ＳＷ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）カラムに加えて、　０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）にて流量　１．０ｍｌ／分で溶離させた。タンパク質のピークはＰＥＧ−メチオニナーゼのピークが一つだけ検出され（未反応のＰＥＧは含まれない）；非ＰＥＧ化メチオニナーゼのピークは検出されなかった。ＰＥＧ−メチオニナーゼの純度は約　１００％であった。ａ）ＰＥＧ化反応の経時進行研究
メチオニナーゼに対するポリエチレングリコールの結合の経時進行を下記のようにして測定した：メチオニナーゼ０．０７ｍＭを、Ｍ−ＳＣ　５０００　ＰＥＧ　０．４ｍＭを含む
０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）と、４℃にて２時間までの様々な時間にわたって反応させた。　０．２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）を用いて種々の時点で反応を停止させた。未反応ＰＥＧを３０ｋ　Ａｍｉｃｏｎ　ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ　濃縮器を用いて除去した。その結果を表３に示す。
ＰＥＧ−メチオニナーゼを本明細書中に記載したようにして未変性及びＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。高分子量のバンドの出現を観察し、表３に−、＋−、＋、又は＋＋の記号で示す。−はＰＥＧ−メチオニナーゼ又はメチオニナーゼがないことを示し、＋−は少量のＰＥＧ−メチオニナーゼ又はメチオニナーゼが存在することを示し、そして＋＋は多量のＰＥＧ−メチオニナーゼ又はメチオニナーゼが存在することを示す。また、表３にＰＥＧ−メチオニナーゼ又はメチオニナーゼの活性も示す。
【００１８】
【表３】
2004081209.tif 000066
＊Ｍ　＝メチオニナーゼ、＊＊Ｐ＝Ｍ−ＳＣ　５０００　ＰＥＧ
ｂ）Ｍ−ＳＣ　５０００　ＰＥＧ　　を用いたメチオニナーゼＰＥＧ化の濃度依存性
０．０７ｍＭのメチオニナーゼを、種々の濃度（０．４ｍＭから４．０ｍＭ）のＭ−ＳＣ　５０００　ＰＥＧを含む　０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）と反応させた。モル比は１：６〜１：６０であった。反応を実施例ａと同様の条件で４℃にて６０分間行った。
その結果を表４に示す。
【００１９】
【表４】
2004081209.tif 000067
ｃ）ＰＥＧ−メチオニナーゼの薬物速度論（Ｐｈａｒｍｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）
Ｍ−ＳＣ　５０００　ＰＥＧを有するメチオニナーゼとメチオニナーゼのＰＥＧ化のモル比は、それぞれ１：６（Ｐ１）及び１：１２（Ｐ２）であった。反応は上記（ｂ）　と同じ条件で行った。精製されたＰ１及びＰ２並びに非修飾メチオニナーゼを、３つの異なる群のマウスの尾静脈にそれぞれ注射した。血液試料を０、１、２、３、４及び２０時間後に集めた。メチオニナーゼ及びＰＥＧ−メチオニナーゼの活性アッセイ、並びにメチオニンの枯渇のレベルを測定した。その結果を表５に示す。
【００２０】
【表５】
2004081209.tif 000068
実施例５
モルモットにおけるＰＥＧ−メチオニナーゼを用いた抗原性実験
メチオニナーゼをＭ−ＳＣ　５０００　ＰＥＧとそれぞれ１：６０、１：１２０　及び１：２４０　のモル比で２０℃にて３０分間反応させた。その他の条件は上記（ａ）　と同様である。ＰＥＧ−メチオニナーゼをメチオニナーゼ活性アッセイ、電気泳動及びＨＰＬＣによって分析した。非修飾メチオニナーゼのバンド又はピークは検出不能であった。したがって、ＰＥＧ−メチオニナーゼが唯一の酵素源であった。
２ｍｇのメチオニナーゼ又はＰＥＧ−メチオニナーゼをモルモットに２日毎に合計３回腹腔内投与した。２週間後、４ｍｇのメチオニナーゼ又はＰＥＧ−メチオニナーゼを静脈内投与した。この実験において、　０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液及びＢＳＡを、それぞれ陰性の対照及び陽性の対照として用いた。その結果を表６の基準にしたがって評価した。その結果を表７に示す。モルモットで試験されたように、メチオニナーゼのＰＥＧ化によって極端に低い抗原性の組成物が得られた。モルモットはヒトよりも抗原に対して感受性が強いということが知られている。
【００２１】
【表６】
2004081209.tif 000069
【００２２】
2004081209.tif 000070
【００２３】
【表７】
2004081209.tif 000071
【００２４】
それらの結果は、ＰＥＧ−メチオニナーゼは、ウシ血清アルブミン（Ｂ．Ｓ．Ａ．）
及びメチオニナーゼとは対照的にモルモットにおいて抗原性を有さないということを示しており、このことは、ＰＥＧ−メチオニナーゼを哺乳類に投与した場合、ＰＥＧ−メチオニナーゼは非免疫原性であるということを示唆するものである。
実施例６
ヒト癌治療のためのメチオニナーゼの投与
メチオニナーゼの毒性、薬物速度論及び最大許容用量を測定するために、メチオニナーゼのＩ期用量漸増研究を開始した。　５，０００単位（０．５ｇ）　及び１０，０００単位（１．０ｇ）　のメチオニナーゼを含む注入液を進行した乳癌を有する患者２人に静脈内輸液によって２時間投与した。０〜２４時間の間にたびたび血液試料及び尿試料を採取した。ＷＨＯ格付け方式（ｇｒａｄｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ）にしたがって毒性評価を行った。血清中のメチオニナーゼレベル及びメチオニンレベルから薬物速度論データが得られた。
あらゆる毒性基準を用いて測定しても最小グレード０を有しており急性の臨床的毒性は全く観察されなかった。患者１及び患者２におけるメチオニナーゼの半減期は、それぞれ２時間及び　３．２時間であった。血清メチオニンの枯渇は輸液開始後３０分以内に始まり、輸液終了後４時間持続された。患者１及び患者２における血清メチオニンの最低レベルは、それぞれ治療前のレベルの３５％及び１９％であった。それらの結果を表８〜１０及び図４〜６に示す。患者は下記のようにして治療した。
患者１：日付：１９９４年１２月４日。診断：腋窩リンパ節及び肺転移を有する乳癌。女性、４６歳。抽出法（実施例１）にしたがって精製したメチオニナーゼ　５，０００単位（０．４ｇ）を静脈内注入液　２００ｍｌに加えて２時間投与した。治療前と、治療後２０時間までの２時間毎に血液試料を採取した。メチオニン及びメチオニナーゼのレベルを測定し、相対レベルを計算した（図４）。
患者２：日付：１９９５年２月２日。診断：腋窩リンパ節転移を有する乳癌。女性、５４歳。抽出法（実施例１）にしたがって精製したメチオニナーゼ１０，０００単位（０．８ｇ）を静脈内注入液　４００ｍｌに加えて２時間投与した。治療前と、治療後２０時間までの２時間毎に血液試料を採取した。メチオニン及びメチオニナーゼのレベルを測定し、相対レベルを計算した（図５）。
患者３：日付：１９９５年１０月１５日。診断：腋窩リンパ節転移を有する乳癌。女性、４５歳。抽出法（実施例１）にしたがって精製したメチオニナーゼ２０，０００単位（１．６ｇ）を静脈内注入液１０００ｍｌに加えて１０時間投与した。治療前と、治療後２０時間までの２時間毎に血液試料を採取した。メチオニン及びメチオニナーゼのレベルを測定し、相対レベルを計算した（図６）。
患者３は、輸液直後の６時間の間、最高レベルの５０％の血清メチオニナーゼレベルを維持していた。メチオニンは輸液１０時間後に２３．１μＭ　から　０．１μＭ　と、　２００倍以上激減した。あらゆる毒性基準で測定しても臨床的毒性は全く観察されなかった。
４分野：ａ．　病歴及び診断データ；ｂ．　理学的検査；ｃ．　検査室評価（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）　；及びｄ．　薬物速度論的評価（血清中のメチオニナーゼレベル及びメチオニンレベル）において、ＷＨＯ毒性基準にしたがって毒性評価を行った。それらの結果を表８〜１１及び図４〜６に示すが、本発明のメチオニナーゼは毒性がなく、ヒトにおけるメチオニンレベルの低減に使用し得ることが証明されている。
【００２５】
【表８】
2004081209.tif 000072
【００２６】
【表９】
2004081209.tif 000073
【００２７】
【表１０】
2004081209.tif 000074
【００２８】
【表１１】
2004081209.tif 000075
【００２９】
実施例７
ホモシステインのｉｎ　ｖｉｖｏ　枯渇
本発明によるホモシステインの枯渇における使用のためのメチオニナーゼのｉｎ　ｖｉｖｏ　の効果を下記のようにマウスに該酵素を投与することによって立証した：実施例１の方法にしたがって精製したメチオニナーゼ４単位をマウスに腹腔内注射した。注射の約１時間後、メチオニン、ホモシステイン及びシステインの血中濃度を、マウス血清５０μｌ　をＰＩＴＣによる誘導体化後、逆相ＦＰＬＣによる分析にかけることによって定量した。そのクロマトグラフィー図をＰＩＴＣ誘導体化内標準メチオニン、ホモシステイン及びシステインのものと比較した。このアッセイの感度は約　０．５μＭ　メチオニンであった。
表１２に示したように、対照の未治療マウスにおけるホモシステイン及びシステインのレベルと比較すると、メチオニナーゼは、システインのｉｎ　ｖｉｖｏ　レベルの有意な枯渇なしに有意なｉｎ　ｖｉｖｏ　ホモシステイン枯渇活性を有していた。
【００３０】
【表１２】
2004081209.tif 000076
【００３１】
実施例８
腫瘍イメージングのためのメチオニナーゼの使用
患者に本明細書中に記載したような精製メチオニナーゼを投与することによって［１２Ｃ］　メチオニンを枯渇させる。そのメチオニナーゼはエンドトキシンを含まないことが好ましい。メチオニナーゼ（　１０，０００〜２０，０００単位）を４〜８時間にわたって静脈内輸液によって投与した。次いで、約５〜５０ｍＣｉ　の［１１Ｃ］　メチオニナーゼを投与した。次に、陽電子射出断層撮影（ＰＥＴ）イメージングを用いて、患者の細胞による［１１Ｃ］　トレーサーの取込みを検出する。トレーサー取込みは、当業者に知られた方法によって標準取込み値（Ｓ．Ｕ．Ｖ．）及び速度論的流出定数（ｋｉｎｅｔｉｃ　ｉｎｆｌｕｘ　ｃｏｎｓｔａｎｔ，　Ｋｉ）　値を計算することによって定量化される。細胞中の［１１Ｃ］　メチオニンのレベルの上昇は、かかる細胞が腫瘍細胞である可能性があることを示すものである。腫瘍細胞による［１１Ｃ］　メチオニンの優先的な取込みは、正常細胞の中の腫瘍細胞を選択的に検出する方法を与える。
上述の明細書は、特定の態様及び実施例を含むが、本発明を説明するものであり、限定的なものとして受け取られるものではない。多数のその他の変形及び修正が本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなくもたらされ得る。
実施例９
メチオニナーゼをコードする核酸分子の単離
メチオニナーゼ遺伝子クローンの挿入断片のＰＣＲ反応：
ＡＴＣＣ８２０９由来の、シュードモナス　　プチダＡＣ−１のゲノムＤＮＡを鋳型として用いた：使用したプライマーは下記のとおりである：
2004081209.tif 000077
【００３２】
ＰＣＲ反応条件は下記のとおりである：まず、９５℃で１０分間変性させ、次いで９４℃、３０秒間の変性を５サイクル行い、６０℃で３０秒間アニーリングし、そして７２℃で２分間伸長させる；次に、９４℃にて３０秒間、６０℃にて３０秒間、続いて７２℃にての　１．５分間の変性を２５サイクル行い；次いで最終的に７２℃で１０分間伸長させる。ＰＣＲ増幅産物のバンドが二つあり、その中の１３６５ｂｐのバンドを採取して挿入断片ＯＮＣａｓｅ−１　ＤＮＡとして精製した。
クローニング及び形質転換
ＯＮＣａｓｅ−１　ＤＮＡをｐＴ７Ｂｌｕｅ　Ｔ−ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）　とＥｃｏＲ　Ｖ　Ｔ−　クローニング部位で連結した。標準的な手順によってｐＯＮＣａｓｅ−１　ＤＮＡでＤＨ５−α細菌細胞を形質転換した。
ＤＮＡ配列決定
Ｔ７　　ＤＮＡポリメラーゼ及びジデオキシヌクレオチド停止反応を用いてＤＮＡ配列決定を行った。プライマー歩行法（ｐｒｉｍｅｒ　ｗａｌｋｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ）　を用いた。標識には　［３５Ｓ］ｄＡＴＰを用いた。６％ポリアクリルアミドウェッジ又は８Ｍ尿素を含む非ウェッジゲル上で配列決定反応を分析した。ＤＮＡ試料をＡＣＧＴの順に加えた。ＤＮＡ配列をＭａｃＶｅｃｔｏｒ　によって分析した。ＤＮＡ配列及びそれに対応するアミノ酸配列を図８に示す。
実施例１０
組換えメチオニナーゼの高発現クローン
メチオニナーゼ発現クローンの挿入断片のＰＣＲ反応：
鋳型として　ｐＯＮＣａｓｅ−１　クローンを用いた。使用したプライマーは下記のとおりである：
2004081209.tif 000078
【００３３】
ＰＣＲ反応条件は下記のとおりである：まず、９５℃で１０分間変性させ、次いで９４℃、１分間の変性を５サイクル行い、５６℃で　１．５分間アニーリングし、そして７２℃で２分間伸長させる；次に、９４℃にて３０秒間の変性、５６℃にて３０秒間の変性、続いて７２℃にての　１．５分間の伸長を２０サイクル行い；次いで最終的に７２℃で１０分間伸長させる。二つのＰＣＲ増幅産物、ＯＮＣａｓｅ−２（１２３８ｂｐ）、ＯＮＣａｓｅ−３（１２２０ｂｐ）のバンドを採取して精製した。
クローニング及び形質転換
ＯＮＣａｓｅ−２　ＤＮＡ及び　ＯＮＣａｓｅ−３　ＤＮＡをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ　で消化してｐＴ７．７　ベクターとＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ　クローニング部位で連結した。次いで、標準的な手順によってｐＯＮＣａｓｅ−２　及びｐＯＮＣａｓｅ−３　ＤＮＡ配列でＢＬ２１（ＤＥ３）　細菌細胞を形質転換した。
ｐＡＣ−１　及びｐＡＣ−２　クローンの選択
アンピシリン含有プレートから陽性クローンを選別した。４℃で２４時間保存したところ、高レベルの組換えメチオニナーゼを発現した陽性クローンは、その同定及び選別を可能にするようなはっきりした桃色になっていた。陽性クローンのメチオニナーゼ発現レベルを活性アッセイによって定量した。二つの高発現クローンを、ＯＮＣａｓｅ−３を含むｐＡＣ−１　クローン及びＯＮＣａｓｅ−２を含むｐＡＣ−２　クローンとして選別した。
ｐＡＣ−３　クローン及びｐＡＣ−４　クローンの構築
ｐＢＲ３２２のＡｖａ　Ｉ　及びＣｌａ　Ｉ　部位からテトラサイクリン耐性遺伝子を得た。Ａｖａ
Ｉ　末端を平滑末端でふさいで、ＢａｍＨ　Ｉ及びＣｌａ　Ｉ　制限酵素で消化したｐＡＣ−１　（このＢａｍＨ　Ｉ末端は平滑末端でふさいだ。）と連結した。４℃で２４時間保存した後に桃色になった陽性クローンをテトラサイクリン含有プレートから選別した。高発現組換えメチオニナーゼクローンを活性アッセイによって測定し、ｐＡＣ−３　クローンと名付けた。
また、ｐＢＲ３２２のＡｖａ　Ｉ　及びＨｉｎｄ　ＩＩＩ部位からもテトラサイクリン耐性遺伝子を得た。Ａｖａ　Ｉ　末端を平滑末端でふさいで、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ及びＣｌａ　Ｉ　制限酵素で消化したｐＡＣ−１　（このＣｌａ　Ｉ　末端は平滑末端でふさいだ。）と連結した。４℃で２４時間保存した後に桃色になった陽性クローンをテトラサイクリン含有プレートから選別した。高発現組換えメチオニナーゼクローンを活性アッセイによって測定し、ｐＡＣ−４　クローンと名付けた。種々の高レベルの発現クローンを表１３及び図９に示す。
【００３４】
【表１３】
2004081209.tif 000079
【００３５】
実施例１１
組換えメチオニナーゼ発現クローンの発酵
組換えメチオニナーゼの発現クローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）　又はテトラサイクリン　（１０μｇ）を含むＴｅｒｒｉｆｉｃ　Ｂｒｏｔｈ培地中で、２８℃又は３７℃にて、６−Ｌフラスコ又は発酵槽中で４００ｒｐｍで振盪させながら増殖させた。
実施例１２
組換えメチオニナーゼの精製
精製法の概要を図１０及び１１に示す。
（１）　試料の前カラム処理
４℃、　８００×ｇで１０分間遠心分離することによって細菌を採収した。次いで、細菌ペレットを抽出溶液（２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ９．０）、１０μＭ　リン酸ピリドキサール及び０．０１％β−メルカプトエタノール）中に懸濁して、キャビテーター型ホモジナイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社、モデル♯ＨＣ　８０００）を用いて破砕した。次に、ホモジネートの加熱処理を５０℃で１分間行った。この懸濁液を自動低温遠心分離機（ＳＯＲＶＡＬＬ　Ｓｕｐｅｒｓｐｅｅｄ　ＲＣ　２−Ｂ）　を用いて４℃、１３ｋ　ｒｐｍ　にて３０分間遠心分離した。続いて上清を採取した。この工程の後、ミリポアＰｒｅｐ／Ｓｃａｌｅ−ＴＦＦ　ＰＬＨＫ　１００ｋ　２．５　ｆｔ２カートリッジで緩衝液（１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８．３）とともに限外濾過した。限外濾過によってｐＨを　７．２に調節した。
（２）　クロマトグラフィーの条件
第１のカラム：ＤＥＡＥ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ　
カラム：ＸＫ　１００／６０　、高さ：３２ｃｍ、容積：　２．５Ｌ
溶液：
［Ａ］　４０ｍＭ塩化カリウム、１０μＭ　リン酸ピリドキサールを含む１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．２）　及び０．０１％β−メルカプトエタノール。
［Ｂ］　　２００ｍＭ塩化カリウム、１０μＭ　リン酸ピリドキサールを含む１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．２）　及び０．０１％β−メルカプトエタノール。
流量：５ｍｌ／分
試料：合計約　１００〜２００　ｇ（１０〜２０ｍｇ／ｍｌ）のタンパク質を第１のカラムに加える。
グラジエント：
［１］　ＯＤ２８０　が　０．１以下に下がるまで溶液Ａ約１０容で予備洗浄。
［２］　グラジエント：溶液Ｂを２０％〜１００　％。
分画：溶出画分　２００ｍｌを回収する。ｒＭＥＴａｓｅ　を含む画分を活性アッセイによって確認し、プールする。
第２のカラム：ＤＥＡＥ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ　
カラム：ＸＫ　５０／３０、高さ：２５ｃｍ、容積：　５００ｍｌ
溶液：［Ａ］　　１００ｍＭ塩化カリウム、１０μＭ　リン酸ピリドキサールを含む１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．３）　及び０．０１％β−メルカプトエタノール。
【００３６】
［Ｂ］　　２００ｍＭ塩化カリウム、１０μＭ　リン酸ピリドキサールを含む１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．３）　及び０．０１％β−メルカプトエタノール。
流量：５ｍｌ／分
試料：合計約１０〜２０ｇ（２〜４ｍｇ／ｍｌ）のタンパク質を、　１００ｍＭ塩化カリウム、１０μＭ　リン酸ピリドキサールを含む１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．３）　中で２４時間透析した後、第２のカラムに加える。
グラジエント：
［１］　ＯＤ２８０　が０．０５以下に下がるまで溶液Ａ約５容で予備洗浄。
［２］　グラジエント：溶液Ｂを０％〜６０％。
分画：溶出画分　２００ｍｌを回収する。ｒＭＥＴａｓｅ　を含む画分を活性アッセイによって確認し、プールする。
第３のカラム：Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００　ＨＲ
カラム：ＨｉＰｒｅｐ　２６／６０、容積：　３２０ｍｌ。
溶液：０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）
流量：　１．２ｍｌ／分
試料：約１０ｍｌの濃縮試料（０．１５Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）中での１２時間の透析後）、第３のカラムに加える。
分画：ｒＭＥＴａｓｅ　を含む２０ｍｌの溶出画分（黄色及び活性アッセイで確認する）を回収する。
第４のカラム：Ａｃｔｉｃｌｅａｎ　Ｒ　Ｅｔｏｘ　　
容量　１００〜２００ｍｌ　の精製ｒＭＥＴａｓｅ（１０〜２０ｍｇタンパク質／ｍｌ）を　５００ｍｌの　ＡｃｔｉｃｌｅａｎＲ　Ｅｔｏｘ　カラムに加えて、エンドトキシンを排除するために溶離緩衝液（０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）で溶出する。　ＡｃｔｉｃｌｅａｎＲ　Ｅｔｏｘ　は再生可能であり、１Ｍ水酸化ナトリウムで清浄にしてオートクレーブで処理することができる。
最終溶離剤の濃度
最終溶離剤は３０Ｋ　Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ　濃縮器で濃縮する。精製ｒＭＥＴａｓｅ　用の処方は、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２　である。
ｒＭＥＴａｓｅ．ヒスチジンの精製：Ｎｉ＋＋Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　カラム上のクロマトグラフィー
前カラム処理後、細胞ホモジネートを結合緩衝液（５ｍＭイミダゾール、　０．５Ｍ　ＮａＣｌ　、２０ｍＭトリス．ＨＣｌ、ｐＨ７．９）に懸濁する。次に、カラムを結合緩衝液１０容で洗浄した後、洗浄緩衝液（６０ｍＭイミダゾール、　０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭトリス．ＨＣｌ、ｐＨ７．９）を用いて洗浄する。溶離緩衝液（１Ｍイミダゾール、　０．５Ｍ　ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス．ＨＣｌ、ｐＨ７．９）６容がカラムを通過した後、溶離が起こる。ｒＭＥＴａｓｅ　を含有する画分を黄色の着色によって確認し、回収する。
実施例１３
ＨＰＬＣによるｒＭＥＴａｓｅ　の純度分析
カラム：ＳＵＰＥＬＣＯ　、８−０８５４１　、Ｐｒｏｇｅｌ　ＴＭ−ＴＳＫ　、Ｇ　３０００−ＳＷＸＬ　、３０ｃｍ×７．８ｍｍ　。溶離溶液：０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）　。流量：　０．１ｍｌ／分。
試料：２０μｌ　（０．１〜１ｍｇ／ｍｌ）。
ｒＭＥＴａｓｅ　の製造例を図１０及び１１に示す。純度は図１２に示す。
実施例１４
組換えメチオニナーゼ、結晶化体及び凍結乾燥体を含む製剤
溶液製剤：
ｒＭＥＴａｓｅ　を０．１５Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）の溶液に１０〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で配合した。ｒＭＥＴａｓｅ　の安定性を図１３に示す。
結晶化体：
ｒＭＥＴａｓｅ（１０〜２０ｍｇ／ｍｌ）　を０．１５Ｍ塩化ナトリウム及び１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）　に加えた溶液をＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５（ＤＮＡグレード、超微細（ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）　、Ｓｉｇｍａ）カラムを用いて脱塩した。この溶液をドライアイス及びアセトン浴にて凍結させ、次にＶｅｒｄｉｓ　Ｆｒｅｅｚｅ　Ｍｏｂｉｌ　２４を用いて　１００ｍｉｌｉｆａｒ　の真空度で、−８０℃にて７２時間結晶化を行った。
凍結乾燥体：
ｒＭＥＴａｓｅ（１０〜２０ｍｇ／ｍｌ）を０．１５Ｍ塩化ナトリウム及び１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）　に加えた溶液を、ドライアイス及びアセトン浴にて凍結させ、Ｖｅｒｄｉｓ
Ｆｒｅｅｚｅ　Ｍｏｂｉｌ　２４を用いて　１００ｍｉｌｉｆａｒ　の真空度で、−８０℃にて７２時間凍結乾燥を行った。
活性アッセイ：
このアッセイは１０μＭ　リン酸ピリドキサール及び１０ｍＭメチオニンを含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）　１ｍｌ容中で酵素の量を変えながら３７℃で１０分間行った。　４．５％ＴＣＡ　０．５ｍｌを添加することによって反応を停止させた。懸濁液を１５Ｋ　ｒｐｍ　で２分間遠心分離した。上清　０．５ｍｌを０．０５％３−メチル−２−　ベンゾチアゾリノンヒドラゾン　０．５ｍｌとともに１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）　１ｍｌに加えた溶液を５０℃で３０分間インキュベートした。そして、次にＯＤ３３５　での分光光度測定によってα−ケトブチレートを測定した。Ｌｏｗｒｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）の手順にしたがってタンパク質の量を測定した。比活性を単位／ｍｇタンパク質として計算した。
ｒＭＥＴａｓｅ　の活性を比較したところ、それらの結果は異なる剤形間で大きな相違はなかった。
【００３７】
実施例１５
組換えメチオニナーゼの化学修飾
精製ｒＭＥＴａｓｅ　を０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）　に　０．１Ｍ〜０．２　Ｍの濃度で配合した。その活性は約２０単位／ｍｇであった。
分子量５０００のＭ−ＳＣ　５０００　ＰＥＧ（　メトキシ−ＳＣ−ＰＥＧ　、ＭＷ　５０００　、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ
ｐｏｌｙｍｅｒｓ　社）を２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）　に２ｍＭ〜２０ｍＭの濃度で溶解した。Ｍ−ＳＣ　５０００　ＰＥＧとｒＭＥＴａｓｅ　のモル比は１０：１〜　１２０：１で間で変動する。
反応緩衝液（２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．３）中、２０℃で６０分間ＰＥＧ化反応を行った。停止緩衝液（０．１４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５）を用いて０℃で反応を停止させた。次いで、未反応のＭ−ＳＣ　５０００　ＰＥＧを３０　Ｋ　Ａｍｉｃｏｎ
Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ濃縮器を用いて除去した。得られたＰＥＧ−メチオニナーゼを、３０　Ｋ
Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ濃縮器を用いて遠心分離しながら０．１５Ｍ塩化ナトリウム及び１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）　に配合した。
ＰＥＧ−ｒＭＥＴａｓｅ　のｉｎ　ｖｉｔｒｏ分析
ＰＥＧ−ｒＭＥＴａｓｅ　を活性アッセイ、電気泳動及びＨＰＬＣによって分析した（図１４〜１６）。
活性アッセイ
ＰＥＧ−ｒＭＥＴａｓｅ　の活性は非修飾ｒＭＥＴａｓｅ　の８０％〜２０％の間であった。
電気泳動
ＰＥＧ−ｒＭＥＴａｓｅ　を未変性及びＳＤＳ−ＰＡＧＥの両方に加えた。
ＨＰＬＣ分析：
ＰＥＧ−ｒＭＥＴａｓｅ　をゲル濾過カラムに加えた。原料のｒＭＥＴａｓｅ　のピークは検出されず、ＰＥＧ−ｒＭＥＴａｓｅ　のピークのみが観察された。保持時間（ＲＴ）はＰＥＧとｒＭＥＴａｓｅ　のモル比が上昇するにつれて短くなった。
ＰＥＧ−ｒＭＥＴａｓｅ　の薬物速度論：
精製したエンドドキシンフリーのＰＥＧ−ｒＭＥＴａｓｅ　をマウスの尾静脈に注射した。血液試料を２時間毎に採取した。ｒＭＥＴａｓｅ　のレベルを活性アッセイによって測定した（図１６）。
実施例１６
組換えメチオニナーゼの効力及び毒性
ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるｒＭＥＴａｓｅ　による細胞増殖阻害
ＫＢ３−１　細胞（ヒト扁平上皮癌）を１０％ＦＢＳを補給したＲＰＭＩ　１６４０　培地中で増殖させた。種々の濃度のｒＭＥＴａｓｅ　を該培地に加えて、３７℃、５％ＣＯ２　中でインキュベートした。相対細胞数をＯＤ５７０　で測定した。その結果は、ｒＭＥＴａｓｅ　が効果的に細胞増殖を阻害するといことを証明している（図１７）。
ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるｒＭＥＴａｓｅ　によるＨ４６０及びＨＴ２９の増殖阻害
ヒト肺癌細胞Ｈ４６０及びヒト結腸癌細胞ＨＴ２９を、種々の濃度（０〜４単位／ｍｌ）のｒＭＥＴａｓｅ　とともに４日間増殖させ、次に生細胞を計数した。この実験を３回繰り返した。これらの結果は、ｒＭＥＴａｓｅ　が効果的にＨ４６０と及びＨＴ２９の細胞増殖を阻害するということを証明している（図２５）。
ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける正常細胞とヒト癌細胞とのｒＭＥＴａｓｅ　に対する感受性の比較
正常ヒト包皮線維芽細胞ＨＳ−６８及びヒトケラチノサイトを対照として用いて、ヒト結腸癌ＳＷ−６２０及びヒト肺ガン細胞Ｈ３２２ｍと比較した。それらの細胞を種々の濃度（０〜４単位／ｍｌ）のｒＭＥＴａｓｅ　とともに３日間増殖させ、次いで生細胞を計数した。この実験を３回繰り返した。これらの結果は、ＳＷ−６２０とＨ３２２ｍ細胞の両方が１単位／ｍｌの濃度のｒＭＥＴａｓｅ　で死滅し、正常ヒトＨＳ−６８細胞はその増殖率は減少したが依然として生存しているということを示すものである。また、正常ヒトケラチノサイトも癌細胞と比較してｒＭＥＴａｓｅ　に対する感受性がかなり低かった（図２６）。
ヌードマウスにおけるｒＭＥＴａｓｅ　による細胞の増殖阻害
８群のマウス（Ｂａｌｂ／ｃ　ｎｕ／ｎｕ　、雌）　に２×１０５　細胞を注射した。対照：通常生理食塩水。Ｉ群：ｒＭＥＴａｓｅ　３０単位、ＩＩ群：ｒＭＥＴａｓｅ　１００　単位；５日目〜１４日目の間、１日２回腹腔内注射。腫瘍サイズ及び体重を測定した。血液を１８日目に採取した。それらの結果から、ｒＭＥＴａｓｅ　が体重減少及び血液細胞産生における作用なしに効果的に腫瘍増殖を阻害するということが証明された（図１８〜２２）　。
ヌードマウスにおけるｒＭＥＴａｓｅ　によるＨ４６０及びＨＴ２９細胞の増殖阻害
１０６　Ｈ４６０細胞及びＨＴ２９細胞をそれぞれ皮下移植し、２日目〜１６日目の間、１日２回、ｒＭＥＴａｓｅ　４０単位又は　１００単位を腹腔内注射によって投与した。対照群には通常生理食塩水　０．２ｍｌを１日２回腹腔内注射した。１６日目にマウスを殺した。それらの結果から、ｒＭＥＴａｓｅ　が体重減少及び血液細胞産生における作用なしに効果的に腫瘍増殖を阻害するということが証明された。
精製組換えＭＥＴａｓｅｒ　のパイロットＩ期臨床試験
女性、５０歳、リンパ節転移を伴った段階ＩＶの乳癌を有する患者１に１０，０００単位（０．５ｇ）のｒＭＥＴａｓｅ　を１０時間静脈内輸液した。
女性、４８歳、リンパ節転移を伴った段階ＩＶの乳癌を有する患者２に　５，０００単位（０．２５ｇ）　のｒＭＥＴａｓｅ　を２４時間静脈内輸液した。
女性、５６歳、段階ＩＩＩ　の腎臓癌を有する患者３に１０，０００単位（０．５ｇ）のｒＭＥＴａｓｅ
を２４時間静脈内輸液した。表１４。
理学的検査を記録し、治療前、治療中の２時間毎、及び輸液終了後４８時間（示したとおりである）までの２時間毎において血液試料を採取した。ＷＨＯ基準にしたがって、検査室測定を行った。
それらの結果は、全ての患者において輸液の開始直後にｒＭＥＴａｓｅ　レベルが増大し、輸液中高レベルで維持されるということを示している。一人の患者においては、４８時間後、メチオニナーゼレベルがベースラインまで下がっている。これらの結果は、輸液開始直後にｒＭＥＴａｓｅ　レベルが増大し、１０時間後に頂点に達したということを示している。輸液の終了後８時間で、そのレベルはピークの５０％になり、輸液終了後１６時間においても依然としてピークの２０％を維持していた。検査室検査の結果を、ＷＨＯ基準にしたがって評価したところ、患者１、２又は３において急性毒性は見られなかった。表１５及び１６並びに図２３及び２４。この結果は、ｒＭＥＴａｓｅ　が毒性を何ら引き起こさないということを示唆するものであった。
【００３８】
【表１４】
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【００３９】
【表１５】
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【００４０】
【表１６】
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【００４１】
【発明の効果】
本発明の化学的に改変されたメチオニナーゼは、高いメチオニン枯渇活性、延長された半減期および低い免疫原性を有する。
【００４２】
【配列表】
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【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、メチオニンを含まない、ホモシステインを含まない、またはメチオニンおよびホモシステインを含まない培地における癌細胞系の増殖を示す６つのグラフを集めたものである。
【図２】図２は、マウス異種移植片におけるヒト肺癌（Ｈ４６０）の増殖レベルを低下させるメチオニナーゼの効力を示すグラフである。５−ＦＵおよびビンクリスチン処理の結果を合わせて示す。
【図３】図３は、ヒト肺癌（Ｈ４６０）を移植したマウスの体重に及ぼすメチオニナーゼ、５−ＦＵおよびビンクリスチンの効果を示すグラフである。
【図４】図４は、メチオニナーゼを３人のヒト患者に投与した後のメチオニナーゼおよびメチオニンの薬物動態のグラフである。メチオニナーゼ活性の百分率は、実験開始時のメチオニナーゼ調製物の活性の相対百分率として測定されている。メチオニンの百分率は、メチオニナーゼ投与前のメチオニンに濃度の相対百分率として測定されている。
【図５】図５は、メチオニナーゼを３人のヒト患者に投与した後のメチオニナーゼおよびメチオニンの薬物動態のグラフである。メチオニナーゼ活性の百分率は、実験開始時のメチオニナーゼ調製物の活性の相対百分率として測定されている。メチオニンの百分率は、メチオニナーゼ投与前のメチオニンに濃度の相対百分率として測定されている。
【図６】図６は、メチオニナーゼを３人のヒト患者に投与した後のメチオニナーゼおよびメチオニンの薬物動態のグラフである。メチオニナーゼ活性の百分率は、実験開始時のメチオニナーゼ調製物の活性の相対百分率として測定されている。メチオニンの百分率は、メチオニナーゼ投与前のメチオニンに濃度の相対百分率として測定されている。
【図７】図７は、メチオニナーゼ−ホモシステイン代謝サイクルの説明図である。
【図８】図８は、Ｐ．プチダから単離されたメチオニナーゼをコードするＤＮＡ分子のヌクレオチド配列およびそれに対応するアミノ酸配列を示す。
【図９】図９は、ベクターに含まれる代表的な高発現モジュールの図を示す。
【図１０】図１０は、高度に純粋で、エンドトキシンを含まないメチオニナーゼを得るために用いられる精製工程の概要を示す。
【図１１】図１１は、本明細書に記述する精製法を用いたｒＭＥＴａｓｅの典型的純度および回収収率の概観を示す。
【図１２】図１２は、本発明の方法によって産生されたｒＭＥＴａｓｅの純度の例を示す。
【図１３】図１３は、異なるｒＭＥＴａｓｅ製剤の活性プロフィールを示す。
【図１４】図１４は、ＰＥＧ−ｒＭＥＴａｓｅのＨＰＬＣ分析データを示す。
【図１５】図１５は、ＰＥＧ−ｒＭＥＴａｓｅのＨＰＬＣ分析データを示す。
【図１６】図１６は、マウスにおけるＰＥＧ−ｒＭＥＴａｓｅの薬物動態を示す。
【図１７】図１７は、ｒＭＥＴａｓｅによってもたらされるＫＢ３−１細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏ増殖阻止を示す。
【図１８】図１８は、ヌードマウスにおけるｒＭＥＴａｓｅのＫＢ３−１細胞に対する効力を示す。
【図１９】図１９は、ヌードマウスの体重に及ぼすｒＭＥＴａｓｅの毒性を示す。
【図２０】図２０は、ＫＢ３−１細胞を有するヌードマウスの血液細胞に対するｒＭＥＴａｓｅの毒性を示す。
【図２１】図２１は、ＢＡＬＢ／ＣマウスにおけるｒＭＥＴａｓｅの毒性を示す。
【図２２】図２２は、ＢＡＬＢ／ＣマウスにおけるｒＭＥＴａｓｅの毒性を示す。
【図２３】図２３は、ヒト患者におけるメチオニナーゼの毒性評価を示す。
【図２４】図２４は、ヒト患者におけるｒＭＥＴａｓｅの薬物動態評価を示す。
【図２５】図２５は、ヌードマウスにおけるｒＭＥＴａｓｅのＨ４６０およびＨＴ２９に対する増殖阻止を示すデータを提供する。
【図２６】図２６は、正常細胞とヒト癌細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるｒＭＥＴａｓｅに対する感受性の比較を示す。
図面は必ずしも一定の比例に応じて描かれているわけではなく、明確と簡潔を期して本発明のある特徴が寸法の上で誇張されて図示されている場合がある。