(57)【要約】【課題】安全で優れた細胞死抑制剤の提供。【解決手段】マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質を含有してなる本発明の細胞死抑制剤は、例えば、心疾患、神経変性疾患、脳血管疾患、中枢神経感染症、外傷性疾患、脱髄疾患、骨・関節疾患、腎疾患、肝疾患、骨髄異形成疾患、動脈硬化症、糖尿病、肺高血圧症、敗血症、炎症性腸疾患、自己免疫性疾患、移植臓器の拒絶時の障害、エイズ、癌などの予防・治療剤などとして有用である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質を含有してなる細胞死抑制剤。
【請求項２】
マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質が、マクロファージ遊走阻止因子に対する抗体である請求項１記載の細胞死抑制剤。
【請求項３】
抗体がモノクローナル抗体である請求項２記載の細胞死抑制剤。
【請求項４】
マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質が、式
【化１】
2004002404.tif 000015
〔式中、Ｒは置換基を有していてもよい炭化水素基、置換基を有していてもよい芳香族複素環基または置換基を有していてもよいアミノを示す。〕で表される化合物またはその塩である請求項１記載の細胞死抑制剤。
【請求項５】
マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質が、メタロポルフィリン類である請求項１記載の細胞死抑制剤。
【請求項６】
マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質が、Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ制御下にある遺伝子の発現を促進する物質である請求項１記載の細胞死抑制剤。
【請求項７】
マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質が、Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ制御下にある遺伝子タンパク質の産生を亢進する物質である請求項１記載の細胞死抑制剤。
【請求項８】
マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質が、Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ制御下にある遺伝子タンパク質の活性を促進する物質である請求項１記載の細胞死抑制剤。
【請求項９】
マクロファージ遊走阻止因子を用いることを特徴とする細胞死抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
細胞死抑制剤が、Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ制御下にある遺伝子の発現を促進する物質である請求項９記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
（ｉ）　マクロファージ遊走阻止因子および標識されたマクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する化合物を混合した場合、および（ｉｉ）試験化合物、マクロファージ遊走阻止因子および標識されたマクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する化合物を混合した場合における、マクロファージ遊走阻止因子に結合した標識化合物の結合量をそれぞれ測定し、比較することを特徴とする請求項９記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
マクロファージ遊走阻止因子を含有することを特徴とする細胞死抑制剤のスクリーニング用キット。
【請求項１３】
マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質を用いることを特徴とするマクロファージ遊走阻止因子の定量方法。
【請求項１４】
請求項１３記載の定量方法を用いるマクロファージ遊走阻止因子が関与する疾患の診断方法。
【請求項１５】
心疾患、神経変性疾患、脳血管疾患、中枢神経感染症、外傷性疾患、脱髄疾患、骨・関節疾患、腎疾患、肝疾患、骨髄異形成疾患、動脈硬化症、糖尿病、肺高血圧症、敗血症、炎症性腸疾患、自己免疫性疾患、移植臓器の拒絶時の障害、エイズもしくは癌の予防・治療剤または移植用臓器の保護剤である請求項１記載の細胞死抑制剤。
【請求項１６】
炎症性腸疾患の予防・治療剤である請求項１記載の細胞死抑制剤。
【請求項１７】
さらにＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、フィブラート系高脂血症薬および（または）抗癌剤を組み合わせてなる請求項１記載の細胞死抑制剤。
【請求項１８】
哺乳動物に対して、マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質の有効量を投与することを特徴とする細胞死抑制方法。
【請求項１９】
細胞死抑制剤を製造するための、マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞死抑制剤、細胞死抑制剤のスクリーニングなどに関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞死は死に至る過程の特徴からネクローシスとアポトーシスの二種類に分けられる。ネクローシスは、物理的・化学的要因などで不慮に起こる細胞死である。それに対してアポトーシスは、発生過程での形態、組織の形成、ホメオスタシスの維持、生体の防御などに深く関わり、個体の生命維持に重要な役割を持つ細胞の死で、その過程は遺伝子によって制御されている。これら細胞死の過程が先天的または後天的に障害されると、細胞死が過剰に誘発または抑制され、様々な臓器の機能障害を引き起こして病気に至る（最新医学　第５４巻、８２５頁、１９９９年）。
近年、種々の疾患の発症または進展に、これら細胞死が深く関わっていることが明らかとなってきた（Ｒ．Ｓａｎｄｅｒｓ　Ｗｉｌｌｉａｍｓ，　Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　第３４１巻、７５９頁、１９９９年）。例えば、細胞死の増加に起因する疾患としては、神経変性疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性など）、虚血性疾患（例、心筋梗塞、心不全、脳卒中、脳梗塞、虚血性急性腎不全など）、骨・関節疾患（例、骨粗鬆症、変形性関節症、リウマチなど）、骨髄異形成疾患（例、再生不良性貧血など）、肝疾患（例、アルコール性肝炎、ウイルス性肝炎など）、糖尿病、エイズなどが挙げられる〔日本臨床、第５４巻、１９９６年；別冊・医学のあゆみ、８頁、１９９７年など〕。マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、免疫担当細胞や脳下垂体などから生体侵襲に即応して産生される炎症性サイトカインであり、炎症性サイトカインカスケードの上流に位置して炎症反応を制御することが知られている（Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３３巻、２４頁、１９９８年；Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６６巻、１９７頁、１９９７年）。さらにＭＩＦは脂肪細胞、癌細胞などの増殖、分化に関与し、免疫応答だけでなく様々な生体反応に重要な役割を果たしていることが明らかになりつつある（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２巻、１７頁、１９９８年）。ＭＩＦを発現する細胞・組織としては、Ｔ細胞、単球・マクロファージ、メサンギウム細胞、尿細管上皮細胞、角膜上皮細胞、肝細胞、卵細胞、セルトリ細胞、ケラチノサイト、骨芽細胞、滑膜細胞、脂肪細胞、アストロサイト、癌細胞、粘膜、脳下垂体などが知られている。ＭＩＦがヒトの疾患に関与する例として、リウマチ患者の滑膜液や血清、急性呼吸促迫症候群患者の肺胞洗浄液、腎臓移植を受けた患者の拒絶反応時における尿、および急性心筋梗塞、糖尿病、全身性エリテマトーデス、クローン病、アトピー性皮膚炎患者で血清中のＭＩＦ濃度が健常人と比べて顕著に上昇していることを示した報告などが挙げられ、また、ＭＩＦの機能を抑制することが症状の改善につながることを示した例として、抗ＭＩＦ中和抗体を用いた実験例を挙げることができる。即ち、腎炎、肝炎、肺炎、関節炎、エンドドキシンショックなどの動物病態モデルでは、抗ＭＩＦ中和抗体の投与群で明らかな改善効果が認められているＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２巻、１７頁、１９９８年）。
このＭＩＦと細胞死の関係に関しては、マウスＢ細胞株で抗ＩｇＭ抗体によって引き起こされるアポトーシスが、ＭＩＦの産生低下によって抑制されることが報告されている（非特許文献１　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４３巻、６１頁、１９９９年）。しかしながら、マウスＢ細胞株以外には、ＭＩＦと細胞死の関係は知られておらず、さらにＭＩＦが関与する細胞死のメカニズムについての報告はない。
【非特許文献１】
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４３巻、６１頁、１９９９年
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
最近、細胞死の研究、特にアポトーシス研究の発展につれてその誘導を制御する因子が次々と明らかにされてきている。その結果、それら制御因子を標的として探索した低分子化合物などを用いて、直接アポトーシスを抑制する試みが数多く行われるようなってきた。中でもアポトーシスの最終段階で働くカスパーゼを標的にしたカスパーゼ阻害剤の研究が盛んに行われているが、臨床応用されたものはない〔実験医学、第１９巻、１７２６頁、２００１年〕。またネクローシスに関してもＨＳＰ７０などのシャペロンを対象にした研究が行われているが、やはり臨床応用されたものはない（Ｅｓｓａｙｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３２巻、１７頁、１９９７年）。そのため安全で強力な細胞死抑制剤、およびこの細胞死抑制剤を探索するためのスクリーニング系の開発が切望されている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
以上のような状況を鑑み、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）に対するモノクローナル抗体およびＭＩＦに結合する低分子化合物などが、血清除去によるラット初代心筋細胞の細胞死を抑制することを見出した。さらにこのＭＩＦに結合する低分子化合物が、ドキソルビシンやＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬による心筋細胞死、ＮＯによる軟骨細胞死などをも抑制することを、およびＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ（ＡＲＥ）制御下にある遺伝子の発現を上昇させることも見出した。　これらの知見に基づいてさらに検討を重ね、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、
（１）　マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質を含有してなる細胞死抑制剤、
（２）　マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質が、マクロファージ遊走阻止因子に対する抗体である上記（１）記載の細胞死抑制剤、
（３）　抗体がモノクローナル抗体である上記（２）記載の細胞死抑制剤、
（３ａ）　モノクローナル抗体が、ＢＷＳ４８−１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９９１）で標示されるハイブリドーマ細胞から産生され得るＢＷＳ４８−１ａで標示されるモノクローナル抗体である上記（３）記載の細胞死抑制剤、
（４）　マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質が、式
【化２】
2004002404.tif 000002
〔式中、Ｒは置換基を有していてもよい炭化水素基、置換基を有していてもよい芳香族複素環基または置換基を有していてもよいアミノを示す。〕で表される化合物またはその塩である上記（１）記載の細胞死抑制剤、
（５）　マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質が、メタロポルフィリン類である上記（１）記載の細胞死抑制剤、
（５ａ）　メタロポルフィリン類が、ヘミンまたはヘマチンである上記（５）記載の細胞死抑制剤、
（６）　マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質が、Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ制御下にある遺伝子の発現を促進する物質である上記（１）記載の細胞死抑制剤、
（６ａ）Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ制御下にある遺伝子が、ヘムオキシゲナーゼ−１、Ｌｉｖｅｒ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　Ｙａ　ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｌｉｖｅｒ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　Ｙｃ　ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　Ｙｂ　ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　Ｙｃ１　ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｇａｍｍｍａ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：ｑｕｉｎｏｎｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ＵＤＰ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，　ｅｘｏｎ　１、Ｂｉｌｉｒｕｎｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＵＤＰ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−ｍｅｎａｄｉｏｎｅ　ｏｘｉｄｅｒｅｄｕｃｔａｓｅである上記（６）記載の細胞死抑制剤、
（６ｂ）Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ制御下にある遺伝子が、ヘムオキシゲナーゼ−１である上記（６）記載の細胞死抑制剤、
（７）　マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質が、Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ制御下にある遺伝子タンパク質の産生を亢進する物質である上記（１）記載の細胞死抑制剤、
（７ａ）Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ制御下にある遺伝子が、ヘムオキシゲナーゼ−１（Ｈｅｍｅ　ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１）、Ｌｉｖｅｒ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　Ｙａ　ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｌｉｖｅｒ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　Ｙｃ　ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　Ｙｂ　ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　Ｙｃ１　ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｇａｍｍｍａ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：ｑｕｉｎｏｎｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ＵＤＰ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，　ｅｘｏｎ　１、Ｂｉｌｉｒｕｎｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＵＤＰ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−ｍｅｎａｄｉｏｎｅ　ｏｘｉｄｅｒｅｄｕｃｔａｓｅである上記（７）記載の細胞死抑制剤、（７ｂ）Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ制御下にある遺伝子が、ヘムオキシゲナーゼ−１である上記（７）記載の細胞死抑制剤、
（８）　マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質が、Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ制御下にある遺伝子タンパク質の活性を促進する物質である上記（１）記載の細胞死抑制剤、
（８ａ）Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ制御下にある遺伝子が、ヘムオキシゲナーゼ−１（Ｈｅｍｅ　ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１）、Ｌｉｖｅｒ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　Ｙａ　ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｌｉｖｅｒ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　Ｙｃ　ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　Ｙｂ　ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　Ｙｃ１　ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｇａｍｍｍａ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：ｑｕｉｎｏｎｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ＵＤＰ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，　ｅｘｏｎ　１、Ｂｉｌｉｒｕｎｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＵＤＰ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−ｍｅｎａｄｉｏｎｅ　ｏｘｉｄｅｒｅｄｕｃｔａｓｅである上記（８）記載の細胞死抑制剤、（８ｂ）Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ制御下にある遺伝子が、ヘムオキシゲナーゼ−１である上記（８）記載の細胞死抑制剤、
（９）　マクロファージ遊走阻止因子を用いることを特徴とする細胞死抑制剤のスクリーニング方法、
（１０）　細胞死抑制剤が、Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ制御下にある遺伝子の発現を促進する物質である上記（９）記載のスクリーニング方法、
（１１）　（ｉ）　マクロファージ遊走阻止因子および標識されたマクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する化合物を混合した場合、および（ｉｉ）試験化合物、マクロファージ遊走阻止因子および標識されたマクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する化合物を混合した場合における、マクロファージ遊走阻止因子に結合した標識化合物の結合量をそれぞれ測定し、比較することを特徴とする上記（９）記載のスクリーニング方法、
（１２）　マクロファージ遊走阻止因子を含有することを特徴とする細胞死抑制剤のスクリーニング用キット、
（１３）　マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質を用いることを特徴とするマクロファージ遊走阻止因子の定量方法、
（１４）　上記（１３）記載の定量方法を用いるマクロファージ遊走阻止因子が関与する疾患の診断方法、
（１４ａ）　疾患が、心疾患、神経変性疾患、脳血管疾患、中枢神経感染症、外傷性疾患、脱髄疾患、骨・関節疾患、腎疾患、肝疾患、骨髄異形成疾患、動脈硬化症、糖尿病、肺高血圧症、敗血症、炎症性腸疾患、自己免疫性疾患、エイズまたは癌である上記（１４）記載の診断方法、
（１５）　心疾患、神経変性疾患、脳血管疾患、中枢神経感染症、外傷性疾患、脱髄疾患、骨・関節疾患、腎疾患、肝疾患、骨髄異形成疾患、動脈硬化症、糖尿病、肺高血圧症、敗血症、炎症性腸疾患、自己免疫性疾患、移植臓器の拒絶時の障害、エイズもしくは癌の予防・治療剤または移植用臓器の保護剤である上記（１）記載の細胞死抑制剤、
（１６）　炎症性腸疾患の予防・治療剤である上記（１）記載の細胞死抑制剤、（１７）　さらにＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、フィブラート系高脂血症薬および（または）抗癌剤を組み合わせてなる上記（１）記載の細胞死抑制剤、
（１８）　哺乳動物に対して、マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質の有効量を投与することを特徴とする細胞死抑制方法、
（１８ａ）　哺乳動物に対して、マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質の有効量を投与することを特徴とする炎症性腸疾患の予防・治療方法、
（１９）　細胞死抑制剤を製造するための、マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質の使用、
（１９ａ）　炎症性腸疾患の予防・治療剤を製造するための、マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質の使用などに関する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）に結合する能力を有する物質としては、ＭＩＦに結合する能力を有する物質であればいずれでもよい。ＭＩＦの機能を調節する物質であってもよい。
ＭＩＦに結合する能力を有する物質としては、例えば、（ａ）ＭＩＦに対する抗体、（ｂ）式
【化３】
2004002404.tif 000003
〔式中、Ｒは置換基を有していてもよい炭化水素基、置換基を有していてもよい芳香族複素環基または置換基を有していてもよいアミノを示す。〕で表される化合物またはその塩、（ｃ）メタロポルフィリン類、（ｄ）ＷＯ　０３／０２０７１９号公報に記載されている化合物またはその塩、（ｅ）ＷＯ　０２／０９４２０３号公報に記載されている化合物またはその塩などが挙げられる。
上記（ａ）のＭＩＦに対する抗体としては、ＭＩＦに特異的に反応するものであればよく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、好ましくはモノクローナル抗体が挙げられる。好ましい具体例としては、ＢＷＳ４８−１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９９１）で標示されるハイブリドーマ細胞から産生され得る、ＢＷＳ４８−１ａで標示されるモノクローナル抗体などが挙げられる。
【０００６】
該抗体は、ＭＩＦを抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ｉ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にＭＩＦ自体、またはＭＩＦおよび担体または希釈剤などとともに投与する。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられる。マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、標識化ＭＩＦと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻、４９５頁　（１９７５年）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
【０００７】
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ　１６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
（ｉｉ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【０００８】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
ポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）自体、あるいは免疫抗原（タンパク質抗原）とキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から目的とする抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どのようなものをどのような比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【０００９】
上記（ｂ）の式（Ｉ）中、Ｒで示される「置換基を有していてもよい炭化水素基」の「炭化水素基」としては、例えばアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキルなどが挙げられる。
該「アルキル」としては、例えばＣ１−６アルキル（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなど）などが挙げられる。
該「シクロアルキル」としては、例えばＣ３−６シクロアルキル（例、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなど）などが挙げられる。
該「シクロアルキルアルキル」としては、例えばＣ４−７シクロアルキルアルキル基（例、シクロプロピルメチル、シクロイブチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチルなど）などが挙げられる。
該「アルケニル」としては、例えばＣ２−６アルケニル（例えば、ビニル、アリル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、２−メチル−２−プロペニル、１−メチル−２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニルなど）などが挙げられる。
該「アルキニル」としては、例えばＣ２−６アルキニル（例えば、エチニル、プロパルギル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ヘキシニルなど）などが挙げられる。
該「アリール」としては、例えばＣ６−１４アリール（例、フェニル、ナフチル、ビフェニル、インダニル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチルなど）などが挙げられる。
該「アラルキル」としては、例えばＣ７−１６アラルキル（例、ベンジル、フェネチル、フェニルプロピル、ナフチルメチル、インダニルメチルなど）などが挙げられる。
【００１０】
Ｒで示される「置換基を有していてもよい炭化水素基」の「置換基」としては、例えば、ハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）、芳香族複素環基、オキソ、ヒドロキシ、Ｃ１−４アルコキシ（例、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシなど）、カルボキシ、Ｃ１−４アルキル−カルボニル（例、アセチル、プロピオニルなど）、Ｃ６−１４アリール−カルボニル（例、ベンゾイルなど）、Ｃ１−４アルコキシ−カルボニル（例、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、ブトキシカルボニルなど）、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル（例、フェノキシカルボニルなど）、Ｃ７−１６アラルキルオキシ−カルボニル（例、ベンジルオキシカルボニルなど）、カルバモイル、モノ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル（例、メチルカルバモイル、エチルカルバモイルなど）、ジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル（例、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、エチルメチルカルバモイルなど）、ハロゲン化されていてもよいＣ６−１４アリール−カルバモイル、５ないし６員複素環カルバモイル（例、２−ピリジルカルバモイル、３−ピリジルカルバモイル、４−ピリジルカルバモイル、２−チエニルカルバモイル、３−チエニルカルバモイルなど）、置換基を有していてもよい５ないし７員飽和環状アミノ−カルボニルなどが挙げられる。このうち、Ｃ６−１４アリール−カルボニル、Ｃ１−４アルコキシ−カルボニル、５ないし６員複素環カルバモイル、５ないし７員飽和環状アミノ−カルボニルなどが好ましい。
【００１１】
該「芳香族複素環基」としては、例えば、炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１または２種、１ないし４個のヘテロ原子を含む５ないし１４員（好ましくは５ないし１０員）芳香族複素環から任意の１個の水素原子を除いてできる１価基などが挙げられる。該「５ないし１４員（好ましくは５ないし１０員）の芳香族複素環」としては、例えば、チオフェン、ベンゾ［ｂ］チオフェン、ベンゾ［ｂ］フラン、ベンズイミダゾール、ベンズオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンズイソチアゾール、ナフト［２，３−ｂ］チオフェン、フラン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドール、イソインドール、１Ｈ−インダゾール、プリン、４Ｈ−キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、カルバゾール、β−カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナジン、チアゾール、イソチアゾール、フェノチアジン、イソオキサゾール、フラザン、フェノキサジンなどの芳香族複素環、またはこれらの環（好ましくは単環）が１ないし複数個（好ましくは１または２個）の芳香環（例、ベンゼン環等）と縮合して形成された環などが挙げられる。
該「芳香族複素環基」としては、例えばチエニル（例、２−チエニル、３−チエニル）、フリル（例、２−フリル、３−フリル）、ピリジル（例、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル）、キノリル（例、２−キノリル、３−キノリル、４−キノリル、５−キノリル、８−キノリル）、イソキノリル（例、１−イソキノリル、３−イソキノリル、４−イソキノリル、５−イソキノリル）、ピラジニル、ピリミジニル（例、２−ピリミジニル、４−ピリミジニル）、ピロリル（例、３−ピロリル）、イミダゾリル（例、２−イミダゾリル）、ピリダジニル（例、３−ピリダジニル）、イソチアゾリル（例、３−イソチアゾリル）、イソオキサゾリル（例、３−イソオキサゾリル）、インドリル（例、１−インドリル、２−インドリル、３−インドリル）、ベンゾチアゾリル（例、２−ベンゾチアゾリル）、ベンゾチエニル（例、２−ベンゾ［ｂ］チエニル、３−ベンゾ［ｂ］チエニル）、ベンゾフラニル（例、２−ベンゾ［ｂ］フラニル、３−ベンゾ［ｂ］フラニル）などが挙げられる。このうち、例えば炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１ないし３個のヘテロ原子を含む５ないし６員の複素環基（例、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジルなどのピリジル）が好ましい。
【００１２】
該「ハロゲン化されていてもよいＣ６−１４アリール−カルバモイル」としては、例えば、１ないし３個のハロゲン原子（例、フッ素、塩素など）を有していてもよいＣ６−１４アリール−カルバモイル（例、フェニルカルバモイル、１−ナフチルカルバモイル、２−ナフチルカルバモイルなど）などが挙げられる。
該「置換基を有していてもよい５ないし７員飽和環状アミノ−カルボニル」の「５ないし７員飽和環状アミノ−カルボニル」としては、例えば、ピロリジン−１−イルカルボニル、ピペリジノカルボニル、ピペラジン−１−イルカルボニル、モルホリノカルボニルなどが挙げられる。該「置換基を有していてもよい５ないし７員飽和環状アミノ−カルボニル」の「置換基」としては、Ｃ１−３アルキル（例、メチルなど）、フェニル、ベンジルなどが１ないし２個挙げられる。
該「炭化水素基」は、例えば上記置換基を、置換可能な位置に１ないし５個、好ましくは１ないし３個有していてもよく、置換基数が２個以上の場合、各置換基は同一または異なっていてもよい。
【００１３】
Ｒで示される「置換基を有していてもよい芳香族複素環基」の「芳香族複素環基」としては、例えば、炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１または２種、１ないし４個のヘテロ原子を含む５ないし１４員（好ましくは５ないし１０員）芳香族複素環から任意の１個の水素原子を除いてできる１価基などが挙げられる。該「５ないし１４員（好ましくは５ないし１０員）の芳香族複素環」としては、例えば、チオフェン、ベンゾ［ｂ］チオフェン、ベンゾ［ｂ］フラン、ベンズイミダゾール、ベンズオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンズイソチアゾール、ナフト［２，３−ｂ］チオフェン、フラン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドール、イソインドール、１Ｈ−インダゾール、プリン、４Ｈ−キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、カルバゾール、β−カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナジン、チアゾール、イソチアゾール、フェノチアジン、イソオキサゾール、フラザン、フェノキサジンなどの芳香族複素環、またはこれらの環（好ましくは単環）が１ないし複数個（好ましくは１または２個）の芳香環（例、ベンゼン環等）と縮合して形成された環などが挙げられる。
該「芳香族複素環基」としては、例えばチエニル（例、２−チエニル、３−チエニル）、フリル（例、２−フリル、３−フリル）、ピリジル（例、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル）、キノリル（例、２−キノリル、３−キノリル、４−キノリル、５−キノリル、８−キノリル）、イソキノリル（例、１−イソキノリル、３−イソキノリル、４−イソキノリル、５−イソキノリル）、ピラジニル、ピリミジニル（例、２−ピリミジニル、４−ピリミジニル）、ピロリル（例、３−ピロリル）、イミダゾリル（例、２−イミダゾリル）、ピリダジニル（例、３−ピリダジニル）、イソチアゾリル（例、３−イソチアゾリル）、イソオキサゾリル（例、３−イソオキサゾリル）、インドリル（例、１−インドリル、２−インドリル、３−インドリル）、ベンゾチアゾリル（例、２−ベンゾチアゾリル）、ベンゾチエニル（例、２−ベンゾ［ｂ］チエニル、３−ベンゾ［ｂ］チエニル）、ベンゾフラニル（例、２−ベンゾ［ｂ］フラニル、３−ベンゾ［ｂ］フラニル）などが挙げられる。このうち、例えば炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１ないし３個のヘテロ原子を含む５ないし６員の複素環基（例、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジルなどのピリジル）が好ましい。
【００１４】
Ｒで示される「置換基を有していてもよい芳香族複素環基」の「置換基」としては、例えば、前記「置換基を有していてもよい炭化水素基」の「置換基」と同様のものが同個数挙げられる。このうち、ヒドロキシなどが好ましい。
【００１５】
Ｒで示される「置換基を有していてもよいアミノ」としては、例えばアミノ、グアニジノ、置換基を有しているアミノ、置換基を有しているグアニジノなどが挙げられる。
該「置換基を有しているアミノ」および「置換基を有しているグアニジノ」の「置換基」としては、例えば、前記Ｒで示される「置換基を有していてもよい炭化水素基」などが挙げられる。
Ｒの好ましい例としては、ベンジル、ベンゾイルメチル、３−ピリジルアミノカルボニルメチル、４−クロロフェニルアミノカルボニルメチル、エトキシカルボニルメチル、ピペリジノカルボニルメチル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、３−ヒドロキシ−２−ベンゾ［ｂ］フラニル、グアニジノなどが挙げられる。
【００１６】
また、式（Ｉ）で表される化合物には、式
【化４】
2004002404.tif 000004
〔式中、ＸはＣＨまたは窒素原子、Ｒ’はＲからＸ−Ｈを除いた基を示す。〕で表される互変異性体およびその塩が存在しうる。式（Ｉ）で表される化合物またはその塩〔以下、化合物（Ｉ）と略記することもある〕は、該互変異性体ならびにその塩、およびこれらと化合物（Ｉ）との混合物も含む。
【００１７】
式（Ｉ）で表される化合物および互変異性体の「塩」としては、薬学的に許容される塩が好ましく、例えば無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
化合物（Ｉ）として具体的には、後述の参考例１〜５の化合物などが挙げられる。
化合物（Ｉ）は、市販品を購入してもよく、あるいは自体公知の方法またはそれに準じた方法により製造できる。
【００１８】
上記（ｃ）のメタロポルフィリン類としては、例えば、ヘミン、ヘマチン、Ｓｎ（ＩＶ）　ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ　ＩＸ、Ｚｎ（ＩＩ）　ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ　ＩＸ、Ｃｏ（ＩＩＩ）　ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ　ＩＸなどがあげられる。
【００１９】
ＭＩＦに結合する能力を有する物質は、優れた細胞死抑制作用を有する。例えば、酸化ストレスによる細胞死、血清除去による細胞死、増殖因子の欠乏による細胞死、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬による細胞死、抗癌剤による細胞死、ＮＯによる細胞死、アミロイドβタンパク質による細胞死などを抑制する。
さらに、ＭＩＦに結合する能力を有する物質は、Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ（ＡＲＥ）制御下にある遺伝子（例、種々のストレスから細胞を防御する因子の遺伝子等）発現促進作用、ＡＲＥ制御下にある遺伝子タンパク質（遺伝子産物）の産生亢進（促進）作用または活性促進用などを有する。
ＡＲＥ制御下にある遺伝子としては、ヘムオキシゲナーゼ−１（Ｈｅｍｅ　ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１）、Ｌｉｖｅｒ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　Ｙａ　ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｌｉｖｅｒ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　Ｙｃ　ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　Ｙｂ　ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　Ｙｃ１　ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｇａｍｍｍａ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：ｑｕｉｎｏｎｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ＵＤＰ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，　ｅｘｏｎ　１、Ｂｉｌｉｒｕｎｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＵＤＰ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−ｍｅｎａｄｉｏｎｅ　ｏｘｉｄｅｒｅｄｕｃｔａｓｅなどが挙げられる。
このようにＭＩＦに結合する能力を有する化合物は、ストレスから細胞を防御する因子を増加させることによって様々な原因による細胞死を強力に抑制する。ＭＩＦに結合する能力を有する物質は低毒性であり、細胞死抑制剤として、例えば、心疾患（例、心筋症、心不全、狭心症、心筋梗塞など）、神経変性疾患（例、パーキンソン病、アルツハイマー病、トリプレットリピート病、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症、小脳変性、色素性網膜炎など）、脳血管疾患（例、脳梗塞など）、中枢神経感染症（例、ＨＩＶ脳炎、細菌性髄膜炎など）、外傷性疾患（例、脊髄損傷、脳損傷など）、脱髄疾患（例、多発性硬化症など）、骨・関節疾患（例、骨粗鬆症、変形性関節症、リウマチなど）、腎疾患（例、虚血性急性腎不全、溶血性尿毒症症候群、急性尿細管壊死、水腎症、糸球体腎炎、糖尿病性腎症など）、肝疾患（例、ウィルス性肝炎、アルコール性肝炎など）、骨髄異形成疾患（例、再生不良性貧血など）、動脈硬化症、糖尿病、肺高血圧症、敗血症、炎症性腸疾患、自己免疫性疾患（例、全身性エリテマトーデス、アトピー性皮膚炎など）、移植臓器の拒絶時の障害、エイズ、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤、移植用臓器の保護剤などとして有用である。
ＭＩＦに結合する能力を有する物質は、自体公知の方法に従って医薬組成物とし、種々の剤形で哺乳動物（例、ヒト、サル等）に経口的または非経口的に安全に投与しうる。
具体的には、ＭＩＦに結合する能力を有する物質を、薬学的に許容される担体と混合し、錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などとして経口投与、または、注射剤、坐剤または舌下錠などとして、静脈内、皮下および筋肉内などに非経口投与する。また、舌下錠、マイクロカプセル等の徐放製剤として、舌下、皮下および筋肉内などに投与してもよい。
【００２０】
上記薬学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合される。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。
上記賦形剤の好適な例としては、例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸などが挙げられる。上記滑沢剤の好適な例としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。上記結合剤の好適な例としては、例えば結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。上記崩壊剤の好適な例としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウムなどが挙げられる。上記溶剤の好適な例としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などが挙げられる。上記溶解補助剤の好適な例としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。上記懸濁化剤の好適な例としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子などが挙げられる。上記等張化剤の好適な例としては、例えば塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなどが挙げられる。上記緩衝剤の好適な例としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。無痛化剤の好適な例としては、例えばベンジルアルコールなどが挙げられる。上記防腐剤の好適な例としては、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。上記抗酸化剤の好適な例としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。
【００２１】
ＭＩＦに結合する能力を有する物質の投与量は、症状の程度；投与対象の年齢、性別、体重；投与の時期、間隔、医薬製剤の性質、調剤、種類；有効成分の種類などによって異なり、特に限定されないが、心疾患の治療に用いる場合は、通常、成人に対して一日につき、約１０μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１００μｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ体重である。通常１日１〜４回に分けて投与する。
ＭＩＦに結合する能力を有する物質の、細胞死抑制剤中の含有量は、剤全体の約０．０１ないし１００重量％である。
【００２２】
本発明の細胞死抑制剤は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬（例、　シンバスタチン（Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）、アトロバスタチン（Ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ）など）、フィブラート系高脂血症薬（例、ゲムフィブロジル（Ｇｅｍｆｉｂｒｏｚｉｌ）など）、抗癌剤（例、イホスファミド（Ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ＵＦＴ、アドリアマイシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ペプロマイシン（Ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、シクロフォスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、５−ＦＵ、メトレキセート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、マイトマイシンＣ（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ　Ｃ）、マイトキサントロン（Ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）など）などと併用して用いると、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、フィブラート系高脂血症薬、抗癌剤などの、正常細胞に障害を及ぼす副作用が軽減される。
【００２３】
ＭＩＦを用いて細胞死抑制剤をスクリーニングすることができる。
ＭＩＦに結合する化合物が種々の細胞の細胞死を抑制することから、ＭＩＦに結合する物質を選択することにより、細胞死抑制作用を有する物質を得ることができる。細胞死抑制作用を有する物質として、好ましくはＡＲＥ制御下にある遺伝子の発現を促進する物質などである。
本発明のスクリーニング方法の具体例としては、表面プラズモンセンサー技術を利用し、ＭＩＦに結合する物質をスクリーニングする方法などが挙げられる。　具体的には、ビアコア３０００のセンサーチップ表面にＭＩＦを固定化後、チップ表面にリン酸緩衝液（ＰＢＳ）などに溶解した試験物質を流したときの表面プラズモンの変化を測定することにより、ＭＩＦに結合する物質をスクリーニングする。例えば、表面プラズモンの変化の測定値が５レゾナンスユニット以上与える試験物質を、細胞死抑制剤として選択する。
試験物質としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、醗酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【００２４】
本発明のスクリーニング方法の具体例として、（ｉ）ＭＩＦおよび標識されたＭＩＦに結合する能力を有する化合物（標識化合物）を混合した場合、および（ｉｉ）試験化合物、ＭＩＦおよび標識されたＭＩＦに結合する能力を有する化合物（標識化合物）を混合した場合における、ＭＩＦに結合した標識化合物の結合量をそれぞれ測定、比較することにより、ＭＩＦに結合する物質をスクリーニングする方法も挙げられる。
標識化合物の化合物としては、化合物（Ｉ）、メタロポルフィリン類、ＷＯ　０３／０２０７１９号公報に記載されている化合物またはその塩、ＷＯ　０２／０９４２０３号公報に記載されている化合物またはその塩などが用いられる。
標識に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、ランタニド元素、スピン試薬などが挙げられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕、〔３２Ｐ〕、〔３３Ｐ〕、〔３５Ｓ〕、〔５９Ｆｅ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、シアニン蛍光色素（例、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（アマシャムバイオサイエンス社製）など）、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。
例えば、上記（ｉｉ）において、上記（ｉ）の場合におけるＭＩＦに結合した標識化合物の結合量を、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を、ＭＩＦに結合する物質（細胞死抑制剤）として選択する。
試験物質としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、醗酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【００２５】
本発明のスクリーニング用キットは、ＭＩＦ、必要に応じて上記標識化合物を含有するものである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、細胞死抑制作用を有する化合物またはその塩であり、上記と同様な細胞死抑制剤として用いられる。
【００２６】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ　　　　　：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ　　　　：相補的デオキシリボ核酸
Ａ　　　　　　：アデニン
Ｔ　　　　　　：チミン
Ｇ　　　　　　：グアニン
Ｃ　　　　　　：シトシン
ＲＮＡ　　　　　：リボ核酸
ｍＲＮＡ　　　　：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ　　　　：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ　　　　：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ　　　　：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ　　　　：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ　　　　　：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ　　　　：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ　　　　　：ドデシル硫酸ナトリウム
ＮＯ　　　　　　　　　　　　：一酸化窒素
【００２７】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｍｅ　　　　　　：メチル基
Ｅｔ　　　　　　：エチル基
Ｂｕ　　　　　　：ブチル基
Ｐｈ　　　　　　：フェニル基
ＴＣ　　　　　　：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｔｏｓ　　　　　：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ　　　　　：ホルミル
Ｂｚｌ　　　　　：ベンジル
Ｃｌ２−Ｂｚｌ　　　　　：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ　　　　　：ベンジルオキシメチル
Ｚ　　　　　　　：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ　　　　：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ　　　　：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ　　　　　：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ　　　　　：ジニトロフェニル
Ｔｒｔ　　　　　：トリチル
Ｂｕｍ　　　　　：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ　　　　：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ　　　　：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ　　　：３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−
１，２，３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ　　　　：１−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド
ＤＣＣ　　　　　：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
【００２８】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
実施例１で使用した５’末端側にＮｄｅＩ切断部位を含むラットＭＩＦのＮ末端と一致するセンス鎖の塩基配列を示す。
〔配列番号：２〕
実施例１で使用した５’末端側にＳａｐＩ切断部位を含むラットＭＩＦのＣ末端と一致する抗−センス鎖の塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
実施例１で使用した５’末端側にＮｄｅＩ切断部位を含むマウスＭＩＦのＮ末端と一致するセンス鎖の塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
実施例１で使用した５’末端側にＳａｐＩ切断部位を含むマウスＭＩＦのＣ末端と一致する抗−センス鎖の塩基配列を示す。
【００２９】
後述の参考例７で得られたハイブリドーマ細胞ＢＷＳ４８−１は、平成１４（２００２）年３月２８日から、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９９１として寄託されている。
【００３０】
以下に、参考例、実験例および実施例を示し、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
以下の参考例中の「％」は特記しない限り重量パーセントを意味する。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは内部基準としてテトラメチルシランを用いてバリアンＧＥＭＩＮＩ　２００（２００ＭＨｚ）型スペクトルメーターで測定した。全δ値をｐｐｍで示す。
その他の本文中で用いられている略号は下記の意味を示す。
ｓ　　　　　：シングレット（ｓｉｎｇｌｅｔ）
ｄ　　　　　：ダブレット（ｄｏｕｂｌｅｔ）
ｄｄ　　　　：ダブルダブレット（ｄｏｕｂｌｅ　ｄｏｕｂｌｅｔ）
ｔ　　　　　：トリプレット（ｔｒｉｐｌｅｔ）
ｑ　　　　　：クァルテット（ｑｕａｒｔｅｔ）
ｍ　　　　　：マルチプレット（ｍｕｌｔｉｐｌｅｔ）
Ｊ　　　　　：カップリング定数（ｃｏｕｐｌｉｎｇ　ｃｏｎｓｔａｎｔ）
Ｈｚ　　　　：ヘルツ（Ｈｅｒｔｚ）
ＣＤＣｌ３　　：重クロロホルム
１Ｈ−ＮＭＲ　：プロトン核磁気共鳴
ＩＲ　　　　　：赤外吸収スペクトル
【実施例】
【００３１】
参考例１
２−（２−ピリジル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン（化合物１）
【化５】
2004002404.tif 000005
チオサリチル酸メチル（１．６ｇ，　９．５１ｍＭ）と２−シアノピリジン（１．０ｇ，９．６０ｍＭ）とをトルエン（２ｍｌ）に溶解し、これにトリエチルアミン（２ｍｌ，１４．４ｍＭ）を加え、８時間加熱還流後、トルエンを留去した。残留物にエタノールを加え、析出物を濾取して粗結晶（１．７ｇ）を得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：クロロホルム＝５：１→クロロホルム）で精製し、表題化合物を結晶として得た（１．０ｇ，４３．４％）。
元素分析値　Ｃ１３Ｈ８Ｎ２ＯＳとして
計算値（％）　Ｃ：６４．９８，　Ｈ：３．３６，　Ｎ：１１．６６
実測値（％）　Ｃ：６４．９３，　Ｈ：３．３１，　Ｎ：１１．５９
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：７．５０−７．７５（ｍ，４Ｈ），７．８５−８．００（ｍ，１Ｈ），８．５０−８．６０（ｍ，２Ｈ），８．７０−８．８０（ｍ，１Ｈ）．
ＩＲ（ＫＢｒ）：１６６０ｃｍ−１
【００３２】
参考例２
２−（３−ピリジル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン
【化６】
2004002404.tif 000006
チオサリチル酸メチル（１．８ｇ，１０．７ｍＭ）と３−シアノピリジン（１．１ｇ，１０．５６ｍＭ）とをトルエン（５ｍｌ）に溶解し、これにトリエチルアミン（２ｍｌ，１４．４ｍＭ）を加え、４８時間加熱還流後、参考例１と同様の操作を行い、表題化合物を結晶として得た（１．１ｇ，４３．４％）。
元素分析値　Ｃ１３Ｈ８Ｎ２ＯＳとして
計算値（％）　Ｃ：６４．９８，　Ｈ：３．３６，　Ｎ：１１．６６
実測値（％）　Ｃ：６４．９７，　Ｈ：３．３３，　Ｎ：１１．６３
【００３３】
参考例３
２−（４−ピリジル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン
【化７】
2004002404.tif 000007
チオサリチル酸メチル（２．０ｇ，１１．９ｍＭ）と４−シアノピリジン（１．２ｇ，１１．５ｍＭ）とをトルエン（５ｍｌ）に溶解し、これにトリエチルアミン（２ｍｌ）を加え、２２時間加熱還流後、参考例１と同様の操作を行い、表題化合物を結晶として得た（８５０ｍｇ，３０．７％）。
元素分析値　Ｃ１３Ｈ８Ｎ２ＯＳとして
計算値（％）　Ｃ：６４．９８，　Ｈ：３．３６，　Ｎ：１１．６６
実測値（％）　Ｃ：６５．０７，Ｈ：３．１５，　Ｎ：１１．６２
【００３４】
参考例４
２−（４−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−２−イリデン）酢酸エチル
【化８】
2004002404.tif 000008
チオサリチル酸メチル（６ｇ，３５．７ｍＭ）とシアノ酢酸エチル（４ｇ，３５．４ｍＭ）とをトルエン（１０ｍｌ）に溶解し、これにトリエチルアミン（５ｍｌ，３５．８ｍＭ）を加えて、７時間加熱還流した。反応液を濃縮し、残留物にエタノールを加えて放置し、析出した結晶を濾取して粗結晶を得た。これをエタノールから再結晶し、表題化合物を針状晶として得た（５．４ｇ，６０．７％）。
元素分析値　Ｃ１２Ｈ１１ＮＯ３Ｓとして
計算値（％）　Ｃ：５７．８２，Ｈ：４．４５，　Ｎ：５．６２
実測値（％）　Ｃ：５７．８６，Ｈ：４．３６，　Ｎ：５．５１
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１．３１（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），４．２２（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），５．５７（ｓ，１Ｈ），７．３５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．５０−７．６０（ｍ，１Ｈ），８．２８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），９．７３（ｓ，１Ｈ）．
ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：１６６０，　１５９０，　１５８０，　１５６０，　１４４０，　１２９５，　１１６５，　７３０．
【００３５】
参考例５
２−［２−オキソ−２−（１−ピペリジニル）エチリデン］−２，３−ジヒドロ−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン
【化９】
2004002404.tif 000009
チオサリチル酸メチル（１．７ｇ，１０．１ｍＭ）と１−シアノアセチルピペリジン（２．０ｇ，１３．１ｍＭ）とをトルエン（５ｍｌ）に溶解し、これにトリエチルアミン（２ｍｌ，１４．４ｍＭ）を加えて、３０時間加熱還流し、反応液を濃縮して粗結晶を得た。これをエタノールから再結晶し、表題化合物を針状晶として得た（７３０ｍｇ，２５％）。
元素分析値　　Ｃ１５Ｈ１６Ｎ２Ｏ２Ｓとして
計算値（％）　Ｃ：６２．４８，Ｈ：５．５９，　Ｎ：９．７１
実測値（％）　Ｃ：６２．２２，Ｈ：５．５８，　Ｎ：９．６５
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１．３０−１．８０（ｍ，６Ｈ），３．３０−３．７０（ｍ，４Ｈ），５．３０（ｓ，１Ｈ），６．９０−７．６０（ｍ，３Ｈ），８．２７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ，Ｊ＝２Ｈｚ）．
ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：１６６０，　１５９５，　１５６０．
【００３６】
参考例６
ラットＭＩＦタンパク質およびマウスＭＩＦタンパク質の調製
（１）ＭＩＦ発現ベクターの構築
Ｔ７プロモータ発現プラスミドｐＥＴ３２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ　社）をＳａｐＩとＴｔｈＩＩＩで切断後、切断面を平滑末端化して再び環状化することで、ｐＥＴ３２ｂ（＋）よりＳａｐＩ切断部位を除去したｐＥＴ３２ｂ−１を得た。次に、ｐＣＹＢ１（ＩＭＰＡＣＴ　Ｉ：　Ｏｎｅ−Ｓｒｅｐ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社）をＮｄｅＩとＢｇｌＩで切断して、マルチクローニング部位とインテイン−キチンバインディングドメイン融合タンパク質をコードする領域のＤＮＡ断片を回収し、このＢｇｌＩ切断部位を平滑末端化した後、ｐＥＴ３２ｂ−１のＮｄｅＩとＥｃｏＲＶ部位の間に挿入してｐＥＴ３２ｂ−Ｉｎｔ−ＣＢＤを得た。
次にラットおよびマウスの脳の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリー（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社）よりＭＩＦをコードする領域をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により増幅した。ラットＭＩＦのｃＤＮＡ増幅には、５’末端側にＮｄｅＩ切断部位を含むラットＭＩＦのＮ末端と一致するセンス鎖（配列番号：１）と５’末端側にＳａｐＩ切断部位を含むラットＭＩＦのＣ末端と一致する抗−センス鎖（配列番号：２）を使用した。マウスＭＩＦのｃＤＮＡ増幅には、５’末端側にＮｄｅＩ切断部位を含むマウスＭＩＦのＮ末端と一致するセンス鎖（配列番号：３）と５’末端側にＳａｐＩ切断部位を含むマウスＭＩＦのＣ末端と一致する抗−センス鎖（配列番号：４）を使用した。増幅したＭＩＦｃＤＮＡはＮｄｅＩとＳａｐＩで切断後、ｐＥＴ３２ｂ−Ｉｎｔ−ＣＢＤのＮｄｅＩ切断部位とＳａｐＩ切断部位の間に挿入して、それぞれＭＩＦ−インテイン−キチンバインディングドメイン融合タンパク質発現プラスミドｐＥＴ３２ｂ−ｒＭＩＦ−Ｉｎｔ−ＣＢＤとｐＥＴ３２ｂ−ｍＭＩＦ−Ｉｎｔ−ＣＢＤを得た。得られた発現プラスミド内のＭＩＦｃＤＮＡ配列は、ＤＮＡシーケンス・システム（アプライド・バイオシステム社）を用いて確認した。
【００３７】
（２）ラットＭＩＦタンパク質の調製
ｐＥＴ３２ｂ−ｒＭＩＦ−Ｉｎｔ−ＣＢＤを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した後、アンピシリンを添加したＬＢ培地（１　％トリプトン、０．５　％イーストイクストラクト、０．５　％　ＮａＣｌ）（ＬＢａｍｐ培地）に植菌し、３７℃で一晩振とう培養した。これをＬＢａｍｐ培地に１　％となるように移し、３７℃で約２時間振とう培養した後２２℃で約１時間培養し、０．４　ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して１５　℃でさらに２４　時間培養してラットＭＩＦ−インテイン−キチンバインディングドメイン融合タンパク質の発現を誘導した。培養終了後、大腸菌を回収し１／１０量の０．１　％トライトンＸ−１００を含むカラムバッファー（２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；　ｐＨ８．０，　５００　ｍＭ　ＮａＣｌ，　０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ）に懸濁して超音波破砕した。この菌体破砕液を４　℃、１２０００ｒｐｍで３０分間遠心分離してその上清を回収した。回収した上清は０．１　％トライトンＸ−１００を含むカラムバッファーで平衡化したキチンビーズカラム（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社）を通過させて、ＭＩＦ−インテイン−キチンバインディングドメイン融合タンパク質をカラムに結合させた後、カラムサイズの１０倍容量の０．１　％トライトンＸ−１００を含むカラムバッファーとカラムサイズの１０倍容量のカラムバッファーで洗浄して非特異的に結合したタンパク質および随伴する物質を除去した。次にカラム内のバッファーを５０　ｍＭのジチオスレイトールを含むカラムバッファーと置換して４　℃で１６　時間以上放置することで、インテインのタンパク質スプライシング活性を利用して融合タンパク質よりＭＩＦタンパク質を切り出した。切り出したＭＩＦタンパク質はカラムバッファーで溶出した後、２０　ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液で透析した。
（３）マウスＭＩＦタンパク質の調製
マウスＭＩＦタンパク質を、ラットＭＩＦタンパク質とほぼ同様の方法で取得した。ただし、タンパク質を発現させた大腸菌を破砕する際に懸濁するカラムバッファー（２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；　ｐＨ８．０，　５００　ｍＭ　ＮａＣｌ，　０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ）には０．１　％トライトンＸ−１００を加えなかった。
【００３８】
参考例７
モノクローナル抗マウスＭＩＦ抗体の作製
（１）抗マウスＭＩＦを産生するハイブリドーマ細胞の調製
（ｉ）免疫
６〜８週令のＢＡＬＢ／Ｃ雌マウスに、参考例６で得られたマウスＭＩＦを、それぞれ約５０μｇ／匹となるよう、完全フロイントアジュバントとともに皮下免疫した。以後２週間おきに同量の免疫原を不完全フロイントアジュバントとともに２〜３回追加免疫した。
（ｉｉ）マウスＭＩＦを免疫したマウスの抗血清中の抗体価測定
マウスＭＩＦを２週間間隔で２回免疫し、その１週間後に眼底採血を行い血液を採取した。さらに血液を４℃で１２，０００　ｒｐｍで１５分遠心した後、上清を回収し抗血清を得た。抗血清中の抗体価を下記の方法により測定した。マウスＭＩＦ結合マイクロプレートを作製するため、まず、マウスＭＩＦを２μｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を９６ウェルマイクロプレートに１００μｌずつ分注し、４℃で２４時間放置した。次に、プレートを０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで洗浄したのち、ウェルの余剰の結合部位をふさぐため２％　ＢＳＡ（シグマ社製）を含むＰＢＳを２００μｌずつ分注し、３７℃で１時間処理した。
得られた抗マウスＭＩＦ結合マイクロプレートの各ウェルにＰＢＳで希釈した抗血清１００μｌを加え、室温で２時間反応させた。次に、該プレートを０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで洗浄したのち、ＨＲＰ標識化抗マウスＩｇＧ−ｇａｍｍａ（ＰＢＳで５，０００倍希釈）１００μｌを加え、室温で１時間反応させた。次に、該プレートを０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで洗浄したのち、固相上の酵素活性をＴＭＢマイクロウェルパーオキシダーゼ基質システム（ＫＩＲＫＥＧＡＡＲＤ＆ＰＥＲＲＹ　ＬＡＢ，　ＩＮＣ、フナコシ薬品取り扱い）１００μｌを加え室温で１０分間放置した。反応を１Ｍリン酸１００μｌを加えて停止させたのち、４５０ｎｍの吸収をプレートリーダー（ＢＩＣＨＲＯＭＡＴＩＣ、大日本製薬社製）で測定した。
（ｉｉｉ）モノクローナル抗マウスＭＩＦ抗体の作製
比較的高い抗体価を示したマウスに対して１０〜１００μｇの免疫原を生理食塩水０．２ｍｌに溶解させたものを静脈内に接種することにより最終免疫を行なった。最終免疫４日後のマウスから脾臓を摘出し、スライドグラスで脾細胞を遊出させメッシュでろ過した。この細胞をイーグルズ・ミニマム・エッセンシャルメデイウム（ＭＥＭ）に浮遊させ、脾臓細胞浮遊液を得た。細胞融合に用いる細胞として、ＢＡＬＢ／Ｃマウス由来ミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３．Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を用いた（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｎｏｌｏｇｙ、８１巻、１頁、１９７８年）。
細胞融合は、原法（Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻、４９５頁、１９７５年）に準じて行なった。すなわち、脾臓細胞およびＰ３Ｕ１をそれぞれ、血清を含有しないＭＥＭで３度洗浄し、脾臓細胞とＰ３Ｕ１数の比率を５：１になるよう混合して、８００回転で１５分間遠心を行ない細胞を沈澱させた。上清を充分に除去した後、沈殿を軽くほぐし、４５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１５００（Ｓｉｇｍａ社製）を０．３ｍｌ加え、３７℃温水槽中で７分間静置して融合を行なった。融合後、細胞に毎分２ｍｌの割合でＭＥＭを添加し、合計１５ｍｌのＭＥＭを加えた後６００回転１５分間遠心して上清を除去した。この細胞沈殿物をＣＭ−Ｂメデイウム（三光純薬）に、Ｐ３Ｕ１が１ｍｌ当り２ｘ１０５個になるように浮遊し、２４穴マルチディッシュ（コースター社製）に１ウェル１ｍｌずつ１９２ウェルに播種した。播種後、細胞を３７℃で５％炭酸ガスインキュベーター中で培養した。２４時間後、ＨＡＴ（ヒポキサンチン　１ｘ１０−４Ｍ、アミノプテリン　４ｘ１０−７Ｍ、チミジン　１．６ｘ１０−３Ｍ）を含んだＣＭ−Ｂ培地（ＨＡＴ培地）を１ウェル当り１ｍｌずつ添加することにより、ＨＡＴ選択培養を開始した。ＨＡＴ選択培養は、培養開始３、５、７および９日後に旧液を１ｍｌ捨てた後、１ｍｌのＨＡＴ培地を添加することにより継続した。ハイブリドーマの増殖は、細胞融合後９〜１４日で認められ、培養液が黄変したとき（約１ｘ１０６セル／ｍｌ）、上清を採取し、（ｉｉ）に記載の方法に従って抗体価を測定後、細胞のクローニングを行い、ハイブリドーマ細胞ＢＷＳ４８−１を取得した。
このハイブリドーマを、あらかじめミネラルオイル０．５ｍｌを腹腔内投与されたマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）に１ｘ１０６セル／匹を腹腔内投与したのち、６〜２０日後に抗体含有腹水を採取した。
ＢＷＳ４８−１ａで標示されるモノクローナル抗体は、得られた腹水よりプロテイン−Ｇカラムにより精製した。即ち、腹水６〜２０ｍｌを２倍量の結合緩衝液〔２０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）〕で希釈したのち、あらかじめ結合緩衝液で平衡化したリコンビナントプロテイン−Ｇ−セファロース（ファルマシア社製）カラムに供し、特異抗体を溶離緩衝液〔０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ２．７）〕で溶出した。溶出液をＰＢＳに対して４℃、２日間透析したのち、０．２２μｍのフィルター（ミリポア社製）により除菌濾過し、４℃あるいは−８０℃で保存した。
【００３９】
実験例１
ＭＩＦと化合物１との結合
参考例６で得られたラットＭＩＦと参考例１で得られた化合物１の結合をＢＩＡＣＯＲＥ３０００（ビアコア株式会社製）を用いて解析した。
ラットＭＩＦをセンサーチップＣＭ５（ビアコア株式会社製）に固定化後、１０μＭの化合物１を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）をチップ上に流し、表面プラズモン共鳴シグナルの変化をラットＭＩＦに対する化合物の結合として測定した。
結果を図１に示す。
これより化合物１がＭＩＦに結合することがわかる。
【００４０】
実験例２
（１）モノクローナル抗体ＢＷＳ４８−１ａおよび化合物１の心筋細胞死抑制作用
日本チャールスリバー社より購入した妊娠ウイスター・ラットより新生仔（生後１日以内のもの）を得、これをエーテル麻酔し、７０％エタノールで消毒後、ピンセットで心臓を摘出した。摘出した心臓を、リン酸緩衝生理食塩水（タカラ社製、Ｔ９００）で洗浄後、手術用のハサミで細片化した。この組織片を、リン酸緩衝生理食塩水で４〜５回洗浄し、大部分の血液由来の非心筋細胞を除去した。この新生仔１０匹分の組織片に対し、５ｍｌの酵素液〔リン酸緩衝液（１ｍｌ）に、トリプシン（１．２５ｍｇ）（ディフコ社製）およびコラゲナーゼ（０．２５ｍｇ）（シグマ社製）を溶解したもの〕を加え、３７℃に保ちながらスターラーで１５分間攪拌した。これに、２．５ｍｌの酵素液を追加し、さらに１５分間攪拌し、この操作を２回繰り返した。続いて、１０％牛胎仔血清（バイオウィカー社製）を含むＭｅｄｉｕｍ　１９９（ギブコ社製）を、酵素液の１／２量添加して酵素反応を停止させ、これをセルストレイナー（ファルコン社製）で濾過後、４００ｘｇで５分間遠心分離して細胞を集めた。
このように集めた新生仔１０匹分の細胞を、５０ｍｌの１０％牛胎仔血清を含むＭｅｄｉｕｍ１９９に懸濁し、１００ｍｍシャーレ（イワキ社製）に１０ｍｌずつ播種し、５％　ＣＯ２、３７℃に設定したＣＯ２インキュベーター中で１時間培養した。その後、細胞を回収してセルストレイナーで濾過後、４００ｘｇで５分間遠心分離し、ラット新生仔由来の初代心筋細胞を集めた。
次に、ラット新生仔（１０匹分）由来の初代心筋細胞を、２ｍｌの低張液〔水（１Ｌ）に、ＮＨ４Ｃｌ（８．２９ｇ）、ＫＨＣＯ３（１．０ｇ）およびＥＤＴＡ／２Ｎａ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｄｉｓｏｄｉｕｍ；同仁化学研究所製）（３７ｍｇ）を溶かしたもの〕に懸濁し、３分間放置して赤血球を破砕した。これに１０ｍｌの１０％牛胎仔血清を含むＭｅｄｉｕｍ　１９９を加え、４００ｘｇで５分間遠心分離し、ラット新生仔由来初代心筋細胞を集めた。これを１０％牛胎仔血清を含むＭｅｄｉｕｍ　１９９に懸濁してセルストレイナーで濾過した。得られた心筋細胞懸濁液の一部を取り、これに０．３％のトリパンブルーを添加し、軽く混合して心筋細胞数を血球計算板を用いて計数した。
このようにして調製したラット新生仔由来初代心筋細胞を３×１０５個／ｍｌとなるように、１０％牛胎仔血清を含むＭｅｄｉｕｍ　１９９に懸濁し、９６穴プレートに０．１ｍｌ／ｗｅｌｌずつ播種し、５％　ＣＯ２、３７℃に設定したＣＯ２インキュベーター中で１日培養した。これをマイクロミキサー（大洋化学工業社製）で攪拌後、血清を含まないＭｅｄｉｕｍ１９９と３回交換して血清を除去し、被検検体を加え、さらに４日間培養して細胞死を誘導した。被検検体としては、参考例７で得られたモノクローナル抗体ＢＷＳ４８−１ａまたは参考例１で得られた化合物１を使用した。
その後、これに牛胎仔血清を１０％となるように添加し、５％　ＣＯ２、３７℃に設定したＣＯ２インキュベーター中でさらに約１７時間培養した後、ＷＳＴ−８〔２−（２−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（２，４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，　ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ〕を発色基質とする細胞数計測キット（同仁化学研究所社製）を用いて生細胞数を測定することにより、心筋細胞死抑制作用を調べた。
上記実験を独立して３回行った。
抗体無添加群の生細胞数を１としたときの対照抗体（マウスＩｇＧ）およびモノクローナル抗体ＢＷＳ４８−１ａの各濃度添加群の生細胞数の平均値（±ＳＤ）を図２に示す。
化合物１の細胞死抑制に必要な最小有効濃度の平均値（±ＳＤ）は、０．０１５　±　０．０１１μＭであった。これは、化合物１を添加しなかったときの平均細胞数に比べて３０％増加させるために要求される化合物１の濃度を最小有効濃度とした。
以上の結果より、モノクローナル抗体ＢＷＳ４８−１ａおよび化合物１は、心筋細胞死抑制活性を有することがわかる。
（２）ヘミンおよびヘマチンの心筋細胞死抑制作用
上記（１）と同様に調製したラット新生仔由来初代心筋細胞を３×１０５個／ｍｌとなるように、１０％牛胎仔血清を含むＭｅｄｉｕｍ　１９９に懸濁し、９６穴プレートに０．１ｍｌ／ｗｅｌｌずつ播種し、５％　ＣＯ２、３７℃に設定したＣＯ２インキュベーター中で１日培養した。これをマイクロミキサー（大洋化学工業社製）で攪拌後、血清を含まないＭｅｄｉｕｍ　１９９と３回交換して血清を除去し、被検検体を加え、さらに４日間培養して細胞死を誘導した。被検検体としては、ヘミンまたはヘマチンを使用した。
その後、これに牛胎仔血清を１０％となるように添加し、５％　ＣＯ２、３７℃に設定したＣＯ２インキュベーター中でさらに約１７時間培養した後、ＷＳＴ−８を発色基質とする細胞数計測キット（同仁化学研究所社製）を用いて生細胞数を測定することにより、心筋細胞死抑制作用を調べた。
上記実験を独立して３回行った。
被検体無添加群の生細胞数を１としたときのヘミンおよびヘマチンの各濃度添加群の生細胞数の平均値（±ＳＤ）を図７に示す。
以上の結果より、ヘミンおよびヘマチンは、心筋細胞死抑制活性を有することがわかる。
【００４１】
実験例３
ドキソルビシンで誘導した心筋細胞死に対する抑制作用
実験例２で得られたラット新生仔由来初代心筋細胞を６×１０５個／ｍｌとなるように、１０％牛胎仔血清を含むＭｅｄｉｕｍ　１９９に懸濁し、９６穴プレートに０．１ｍｌ／ｗｅｌｌずつ播種し、５％　ＣＯ２、３７℃に設定したＣＯ２インキュベーター中で１日培養した。これをマイクロミキサー（大洋化学工業社製）で攪拌後、血清を含まないＭｅｄｉｕｍ　１９９で３回洗浄して血清を除去し、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９と被検検体を加え、３時間培養した。　培養後、ドキソルビシン（ＤＯＸ：終濃度２００μＭ）を添加し、さらに１８時間培養して細胞死を誘導した。その後、牛胎仔血清を１０％となるように添加し、５％　ＣＯ２、３７℃に設定したＣＯ２インキュベーター中でさらに約１７時間培養した後、ＷＳＴ−８を発色基質とする細胞数計測キット（同仁化学研究所社製）を用いて生細胞数を測定することにより、心筋細胞死抑制作用を調べた。上記実験は独立して３回行った。なお各実験群の生細胞数は、ドキソルビシン無添加群の生細胞数を１としたときの各実験群の生細胞数の平均値（±ＳＤ）で示した。
結果を図３に示す。
これより、化合物１がドキソルビシンで誘導した心筋細胞死に対する抑制活性を有することがわかる。
【００４２】
実験例４
スタチンで誘導した心筋細胞死に対する抑制作用
実験例２で得られたラット新生仔由来初代心筋細胞を６×１０５個／ｍｌとなるように、１０％牛胎仔血清を含むＭｅｄｉｕｍ　１９９に懸濁し、９６穴プレートに０．１ｍｌ／ｗｅｌｌずつ播種し、５％　ＣＯ２、３７℃に設定したＣＯ２インキュベーター中で１日培養した。これをマイクロミキサー（大洋化学工業社製）で攪拌後、血清を含まないＭｅｄｉｕｍ　１９９と３回交換して血清を除去し、シンバスタチン（０．３μＭ）またはアトロバスタチン（１μＭ）と化合物１とを加え、さらに３日間培養した。その後、これに牛胎仔血清を１０％となるように添加し、５％　ＣＯ２、３７℃に設定したＣＯ２インキュベーター中でさらに約１７時間培養した後、ＷＳＴ−８を発色基質とする細胞数計測キット（同仁化学研究所社製）を用いて生細胞数を測定することにより、スタチンで誘導した心筋細胞死に対する抑制作用を調べた。上記実験は独立して３回行った。なお各実験群の生細胞数は、スタチン無添加群の生細胞数を１としたときの各実験群の生細胞数の平均値（±ＳＤ）で示した。
結果を図４および図５に示す。
これより、シンバスタチン（０．３μＭ）およびアトロバスタチン（１μＭ）は心筋細胞死を誘導すること、さらに化合物１は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬で誘導した心筋細胞死に対する抑制活性を有することがわかる。
【００４３】
実験例５
血清除去で誘導した血管平滑筋細胞死に対する抑制作用
正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（大日本製薬社）を４×１０４個／ｍｌとなるように、１０％牛胎仔血清を含むＭＣＤＢ１３１培地（大日本製薬社）に懸濁後、９６穴プレートに０．１ｍｌ／ｗｅｌｌずつ播種し、５％　ＣＯ２、３７℃に設定したＣＯ２インキュベーター中で１日培養した。これをマイクロミキサー（大洋化学工業社製）で攪拌後、培地を除去し、血清を含まないＭＣＤＢ１３１培地および参考例１で得られた化合物１を加え、３日間培養した。培養後、ＷＳＴ−８を発色基質とする細胞数計測キット（同仁化学研究所社製）を用いて生細胞数を測定することにより、心筋細胞死抑制作用を調べた。上記実験は独立して３回行った。なお生細胞数は、化合物１無添加群の生細胞数を１としたときの、各濃度添加群の生細胞数の平均値（±ＳＤ）で示した。
結果を図６に示す。
これより化合物１は、血清除去で誘導した血管平滑筋細胞死に対する抑制活性を有することがわかる。
【００４４】
実験例６
ＮＯで誘導したヒト関節軟骨細胞死に対する抑制作用
ヒト正常関節軟骨細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社）を関節軟骨細胞用増殖培地（ＣＧＭ、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社）中で単層培養により増殖させた後に、１．２％　アルギン酸を含む　１５５　ｍＭＮａＣｌ溶液に　２．０×１０６個／ｍｌの密度で細胞を懸濁し、２２ゲージの注射針を付けた注射筒を用いて直径　２　ｍｍのビーズを作製した。このビーズを関節軟骨細胞用分化培地（ＣＤＭ、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社）を添加した　９６穴丸底プレート（１　ビーズ／ウェル、ファルコン社製）中でさらに７日間培養後、化合物１（０．１μＭまたは１μＭ）および　１０％　牛胎仔血清を含むα−ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｍｉｎｉｍｕｍ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍに換えて４８時間培養し、さらに１．５　ｍＭのニトロプルシッドナトリウム（ＮＯ発生剤、シグマ社製）を共存させて５時間培養した。対照薬としてカスパーゼ３インヒビター（Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ、１００　μＭ、Ｒ＆Ｄシステムズ社製）およびカスパーゼ９インヒビター（Ｚ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫ、１００　μＭ、Ｒ＆Ｄシステムズ社製）の作用についても同様に調べた。実験終了後に、アルギン酸を除去し、３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｔｈｉａｚｏｌｅ−２−ｙｌ）−　２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ　を用いた　ＭＴＴ法により細胞生存率を測定した。結果を表１に示す。
【表１】
2004002404.tif 000010
表中の数値は、ＭＴＴ　法測定値から換算した細胞死抑制率の平均値（±ＳＤ）を示す。なお、１．５　ｍＭ　のニトロプルシッドナトリウム添加後の細胞生存率（化合物１または対照薬なし）は　３１．９％であった。
化合物１は、ＮＯで誘導したヒト関節軟骨細胞死に対する抑制活性を有することがわかる。
【００４５】
実験例７
ＤＮＡチップによる遺伝子発現解析
実験例２で得られたラット新生仔由来初代心筋細胞を１．５ｘ１０５個／ｍｌとなるように１０％牛胎仔血清を含むＭｅｄｉｕｍ　１９９に懸濁し、１２穴プレート　（旭テクノグラス社製）に２ｍｌ／ｗｅｌｌずつ播種して５　％　ＣＯ２、３７℃で１日培養した。これを軽く攪拌後、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地で３回洗浄して血清を除去し、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地と化合物１を添加して５％　ＣＯ２、３７℃で２１時間培養した。次に培養液を除去し、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを回収し、これを用いてＧｅｎｅＣｈｉｐ発現解析用アレイ（Ｒａｔ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｕ３４Ａ　アレイ：ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ社製）で網羅的な遺伝子の発現解析を行った。各遺伝子の発現上昇率は、化合物無添加時の発現量を１としたときの化合物添加時の発現量で表した。
結果を表２に示す。
【表２】
2004002404.tif 000011
これより化合物１は、Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ（ＡＲＥ）制御下にある遺伝子の発現を増強することがわかる。
【００４６】
実験例８
化合物１のヘムオキシゲナーゼ−１産生増加作用
実験例２で得られたラット新生仔由来初代心筋細胞を１．５×１０５個／ｍｌとなるように１０％牛胎仔血清を含むＭｅｄｉｕｍ１９９に懸濁し、１２穴プレート（旭テクノグラス社製）に２ｍｌ／ｗｅｌｌずつ播種し、５％　ＣＯ２、３７℃で１日培養した。これをＭｅｄｉｕｍ１９９培地で３回洗浄して血清を除去し、化合物１を添加して、５％　ＣＯ２、３７℃で２４時間培養した。培養終了後、心筋細胞をＰＢＳ（−）で１回洗浄し、１００μｌの細胞溶解用緩衝液〔１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ，　ｐＨ７．４，　１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ，１　ｍＭ　ＥＤＴＡ・２Ｎａ，１　ｍＭ　ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−ｂｉｓ−（β−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ〕Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ、０．５　ｍＭ　（ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，２００μＭ　ｓｏｄｉｕｍβ−Ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｎ−ｈｙｄｒａｔｅ，　２０　ｍＭ　ＮａＦ，　２　ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｃａｈｙｄｒａｔｅ，　１０　μｇ／ｍｌ　ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，　１０　μｇ／ｍｌ　ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，１　％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，　０．５　％　Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ４０，０．１　％　ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｓｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ〕を添加した後、セルスクレーパーを用いて細胞残渣をプレートより乖離させてから、細胞溶解用緩衝液を回収した。回収した細胞溶解用緩衝液はサンプル用緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＳＤＳ−ＭＥ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ；第一化学薬品製）と等量ずつ混合して、９５℃で５分間熱処理した後、マルチゲル（第一化学薬品社製）を用いて、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行った。次に、ブロッティング緩衝液〔０．１　Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ，　０．１９２　Ｍグリシン，　２０％　エタノール〕に１０分以上浸しておいたニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ−ＥＣＬ；アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製）、ブロッティング用ろ紙、透析膜およびゲルをホライズブロット（ＡＴＴＯ社製）にセットし、１００　ｍＡ／ゲル（６４　ｃｍ２）で１時間処理してゲル内のタンパク質をニトロセルロース膜に吸着させた。その後、ニトロセルロース膜をブロッキング緩衝液〔５　％　スキムミルク粉末を含有するＴＴＢＳ緩衝液（２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ７．６，　０．１３７　Ｍ　ＮａＣｌ，　０．１　％　Ｔｗｅｅｎ−２０）〕に浸し、室温で１時間攪拌してブロッキングを行った。次に、ブロッキング緩衝液で１０００〜２０００倍希釈した抗ＨＯ−１抗体溶液（ＳｔｒｅｓｓＧｅｎ社製）に上記のニトロセルロース膜を浸し、４℃で１２〜１８時間反応させた。反応終了後、このニトロセルロース膜をＴＴＢＳ緩衝液で３回洗浄し、さらにブロッキング緩衝液で２０００倍に希釈したｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識抗ウサギＩｇＧ抗体溶液（ＮＥＷ　ＥＮＧＬＡＮＤ　ＢｉｏＬａｂｓ社製）に浸し、室温で１時間反応させた。反応終了後、ＴＴＢＳ緩衝液を用いて３回洗���し、ウェスタンブロッティング検出試薬（ＥＣＬ＋Ｐｌｕｓ；アマシャム社製）と、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ　ＥＣＬ（アマシャム社製）を用いてタンパク質量を測定した。ヘムオキシゲナーゼ−１タンパク質の産生増加率は、化合物無添加時の産生量を１としたときの化合物添加時の産生量で表した。
結果を表３に示す。
【表３】
2004002404.tif 000012
これより化合物１はＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ　（ＡＲＥ）制御下にある遺伝子の産物の１つであるヘムオキシゲナーゼ−１の産生量を増加させることがわかる。
【００４７】
実施例１
化合物１（１００ｍｇ）、ラクトース（１６５ｍｇ）、コーンスターチ（２５ｍｇ）、ポリビニールアルコール（４ｍｇ）およびステアリン酸マグネシウム（１ｍｇ）を用いて、常法により錠剤を製造する。
実施例２
ＭＩＦに結合する化合物のスクリーニング
参考例６で得られたラットＭＩＦをセンサーチップＣＭ５（ビアコア株式会社製）に固定化後、１０μＭの３−［２−（４−オキソ−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−２−イル）−４−ピリジル］プロピオン酸（ＷＯ　０３／０２０７１９記載の実施例３０８の化合物）を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）をチップ上に流し、表面プラズモン共鳴シグナルの変化をラットＭＩＦに対する化合物の結合として測定した。
結果を図８に示す。
これより、ＭＩＦに結合する物質として、３−［２−（４−オキソ−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−２−イル）−４−ピリジル］プロピオン酸が選択できた。
【００４８】
【発明の効果】
マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質は、低毒性であり、優れた細胞死抑制作用を有する。例えば、酸化ストレスによる細胞死、血清除去による細胞死、増殖因子の欠乏による細胞死、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬による細胞死、抗癌剤による細胞死、ＮＯによる細胞死、アミロイドβタンパク質による細胞死などを抑制する。さらに、ＡＲＥ制御下にある遺伝子（例、種々のストレスから細胞を防御する因子の遺伝子等）発現を促進、ＡＲＥ制御下にある遺伝子タンパク質（遺伝子産物）の産生を亢進または活性を促進する。よって、本発明の細胞死抑制剤は、例えば、心疾患（例、心筋症、心不全、狭心症、心筋梗塞など）、神経変性疾患（例、パーキンソン病、アルツハイマー病、トリプレットリピート病、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症、小脳変性、色素性網膜炎など）、脳血管疾患（例、脳梗塞など）、中枢神経感染症（例、ＨＩＶ脳炎、細菌性髄膜炎など）、外傷性疾患（例、脊髄損傷、脳損傷など）、脱髄疾患（例、多発性硬化症など）、骨・関節疾患（例、骨粗鬆症、変形性関節症、リウマチなど）、腎疾患（例、虚血性急性腎不全、溶血性尿毒症症候群、急性尿細管壊死、水腎症、糸球体腎炎、糖尿病性腎症など）、肝疾患（例、ウィルス性肝炎、アルコール性肝炎など）、骨髄異形成疾患（例、再生不良性貧血など）、動脈硬化症、糖尿病、肺高血圧症、敗血症、炎症性腸疾患、自己免疫性疾患（例、全身性エリテマトーデス、アトピー性皮膚炎など）、移植臓器の拒絶時の障害、エイズ、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）などの予防・治療剤、移植用臓器の保護剤などとして有用である。
さらに、本発明の細胞死抑制剤は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、フィブラート系高脂血症薬、抗癌剤などと併用して用いると、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、フィブラート系高脂血症薬、抗癌剤などの、正常細胞に障害を及ぼす副作用が軽減される。
また、本発明のスクリーニングにより、効率よくＭＩＦに結合する物質を選択することができ、低毒性で優れた細胞死抑制剤を提供することができる。
【００４９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＭＩＦと化合物１の結合結果を示す。図中、縦軸は表面プラズモン共鳴シグナル（レゾナンスユニット）を、横軸は時間（秒）を示す。
【図２】モノクローナル抗体ＢＷＳ４８−１ａの心筋細胞死抑制作用結果を示す。図中、□はＢＷＳ４８−１ａを、■は対照抗体を示す。
【図３】ドキソルビシン（ＤＯＸ）で誘導した心筋細胞死に対する化合物１の抑制作用の結果を示す。
【図４】シンバスタチンで誘導した心筋細胞死に対する化合物１の抑制作用の結果を示す。
【図５】アトロバスタチンで誘導した心筋細胞死に対する化合物１の抑制作用の結果を示す。
【図６】血清除去で誘導した血管平滑筋細胞死に対する化合物１の抑制作用の結果を示す。
【図７】ヘミンおよびヘマチンの心筋細胞死抑制作用結果を示す。図中、□はヘミンを、■はヘマチンを示す。
【図８】ＭＩＦに結合する化合物のスクリーニング結果を示す。　図中、縦軸は表面プラズモン共鳴シグナル（レゾナンスユニット）を、横軸は時間（秒）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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