(57)【要約】　　　（修正有）【課題】新規のＣＤ３３様タンパク質、該ＣＤ３３様タンパク質をコードする単離された核酸分子、該核酸分子を含んでなる組換えベクターおよび該組換えベクターにより遺伝的に処理を施された宿主細胞の提供。【解決手段】ＣＤ３３様タンパク質またはそのポリペプチドの断片をコードする特定の配列の核酸分子を含んでなる単離された核酸分子、該核酸分子を含んでなる組換えベクター、該組換えベクターにより遺伝的に処理を施された宿主細胞、および組換え技術により該宿主細胞において製造されるＣＤ３３様タンパク質またはそのポリペプチド断片。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　本願明細書または図面に記載されたいずれかの発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、新規のＣＤ３３様タンパク質に関する。特に、ＣＤ３３様タンパク質をコードする単離された核酸分子を提供する。さらに、組換えＣＤ３３様ポリペプチド並びに組換えベクターおよび宿主細胞も提供する。本発明はさらに、腫瘍性または炎症性の疾患の診断または予後に有用な方法およびＣＤ３３様ポリペプチドを発現している細胞を標的とする治療的処置を提供する。
【背景技術】
【０００２】
　ＣＤ３３は、造血系の細胞にその発現が限定される６７ｋＤの糖タンパク質を認識する一連のモノクローナル抗体（ＭｏＡｂｓ）により、ヒトの骨髄細胞上ではじめて同定された（非特許文献１〜４）。ＣＤ３３は、造血幹細胞には存在しないが、混成コロニー形成細胞の部分集団において、はじめて検出される（非特許文献４および５）。その後、発現が顆粒球で下方調節されるが単球と組織マクロファージによって維持されるまで、骨髄単球経路にしたがって発現が続く（非特許文献２および６）。造血系内のＣＤ３３の発現パターンは、骨髄細胞分化の調節における潜在的役割を示している。しかし、その同定が１０年前であるにもかかわらず（非特許文献３）、ＣＤ３３の機能とび結合特性はいまだに分かっていない。
【０００３】
　ＣＤ３３ＭoＡbは、骨髄性白血病細胞（急性骨髄性白血病［ＡＭＬ］仏米英分類（French-American-British classification）ＭＩ−７）とリンパ系由来の通常のＣＤ３３陰性細胞との区別が可能な急性白血病の免疫診断において非常に重要である。（非特許文献４および７〜９)。これは、正確な分類が予後の予測および治療法の選択に必須であるにもかかわらず形態学的な判断基準が不充分ある、ＡＭＬのより幼若な形態にとって特に価値がある。ＣＤ３３ＭoＡbはまた、特に移植前かまたは化学療法に耐性である疾患の場合、主としてＡＭＬ患者の骨髄を除くために、予備的な試験的治療にいて用いられてきた。（非特許文献１０〜１２）。
【０００４】
【非特許文献１】Peiper S.C.ら, in Knapp W, Dorken B, Gilks WR, Rieber EP, Schmidt RE, Stein H, von dem Borne AEG (編): Leucocyte Typing IV. White Cell Differentiation Antigens. Oxford, UK, Oxford University 1989, p814
【非特許文献２】Pierelli L.ら, Br J Haematol 84: 24 (1993)
【非特許文献３】Andrews R.G.ら, Blood 62: 124,(1983)
【非特許文献４】Griffin J.D.ら, Leuk Res 8: 521 (1984)
【非特許文献５】Pierelli L.ら, Br J Haematol 84: 24 (1993)
【非特許文献６】Bernstein I.D.ら, J. Clin. Invest 79： 1153 (1987)
【非特許文献７】Matutes E.ら, Haematol Oncol 3: 179 (1985)
【非特許文献８】Bain B.J., Immunological cytogenetic and other markers, in Bain BJ (編)
【非特許文献９】Lulaemia Diagnosis: A Guide to FAB Classification. London, UK, Gower Medical, 1990, p61
【非特許文献１０】Robertson M.J.ら, Blood 79: 2229 (1992)
【非特許文献１１】Applibaum F.R.ら, Transplantation 54: 829 (1992)
【非特許文献１２】Caron P.C.ら, Cancer 73: 1049 (1994)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
　ＣＤ３３の重要性ゆえに、ＣＤ３３様タンパク質活性を有するさらなるポリペプチドをコードする核酸分子を同定し、単離することが明らかに必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
　本発明は、そのアミノ酸配列が図１（配列番号２）に示されるＣＤ３３様タンパク質またはそのポリペプチドの断片をコードする核酸配列を含んでなる単離された核酸分子を提供する。ＣＤ３３様タンパク質遺伝子は、その開始コドンが図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列の３７〜３９番に存在し、約１５アミノ酸残基のリーダー配列を有し、推定分子量が約６０ｋＤａである、約５５１アミノ酸残基のタンパク質をコードする読み取り枠を含んでいる。
【０００７】
　別の態様では、本発明は、１９９６年４月２５日にＡＴＣＣ受託番号９７５２１として寄託されたクローンのｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有するＣＤ３３様ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。好ましくは、該核酸分子は、上記の寄託されたｃＤＮＡによってコードされる成熟ポリペプチドをコードする。
【０００８】
　本発明の好ましい核酸断片には、以下のものをコードする単離された核酸分子が含まれる：ＣＤ３３様タンパク質細胞外領域（図１（配列番号２）の約１６〜約４２２番のアミノ酸残基）を含んでなるポリペプチド；ＣＤ３３様タンパク質膜貫通領域（図１（配列番号２）の約４２３〜約４６４番のアミノ酸残基）を含んでなるポリペプチド；ＣＤ３３様タンパク質細胞内領域（図１（配列番号２）の約４６５〜約５５１番のアミノ酸残基）を含んでなるポリペプチド；および膜貫通領域のすべてまたは一部が削除されている、細胞外および細胞内領域を含んでなるポリペプチド。
【０００９】
　本発明の更なる態様には、本明細書に記載のいずれかの核酸分子と少なくとも９０％同一、およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子が含まれる。
【００１０】
　本発明はさらに、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含んでなるベクター、その組換えベクターにより遺伝的に処理を施された宿主細胞、および組換え技術によるＣＤ３３様ポリペプチドまたはその断片の製造を提供する。
【００１１】
　本発明のポリペプチドには、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド、配列番号２のポリペプチド（特に成熟ポリペプチド）、並びに寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドまたは配列番号２のポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも９０％類似、より好ましくは少なくとも９５％類似するアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。さらに、本発明のポリペプチドには、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドまたは配列番号２のポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％または９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。
【００１２】
　本発明の好ましいポリペプチド断片には、以下のものを含んでなるポリペプチドが含まれる：ＣＤ３３様タンパク質細胞外領域；ＣＤ３３様タンパク質膜貫通領域；ＣＤ３３様タンパク質細胞内領域；または膜貫通領域が削除されている、ＣＤ３３様タンパク質細胞外領域および細胞内領域。
【００１３】
　本発明はさらに、腫瘍性または炎症性疾患の診断において有用な方法を提供し、その方法はＣＤ３３様タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルまたは哺乳類細胞または体液における遺伝子コピー数を分析すること、およびその遺伝子発現レベルまたはコピー数を、標準のＣＤ３３様タンパク質遺伝子発現レベルまたは遺伝子コピー数と比較することを含み、それにより、標準に対する遺伝子発現レベルまたは遺伝子コピー数の増加が、ある種の腫瘍性または炎症性疾患の指標となる。本発明によれば、上記の方法は予後の指標としても有用である。
【００１４】
　別の態様では、白血病患者の移植片に由来する白血病性の造血系細胞を除くための in vitro 法が提供される。この方法は、抗ＣＤ３３様タンパク質モノクローナル抗体（ＭoＡb）と補体によって、ＣＤ３３様抗原を含む造血系細胞を患者から得られた骨髄から除去することを含んでなる。
【００１５】
　更なる態様では、本発明は、本発明のＣＤ３３様抗原を発現している腫瘍細胞を選択的に死滅させるか、または増殖を阻止するための in vivo 法であって、ＣＤ３３様タンパク質レセプターシグナル伝達経路を阻止するに有効な量のアンタゴニストを患者に投与することを含んでなる方法を提供する。本発明によれば、ＣＤ３３様タンパク質のこのようなアンタゴニストの患者への投与は、炎症性疾患の処置にも有用である。
【００１６】
　更なる態様では、ＣＤ３３様タンパク質を発現している細胞に特異的なイムノトキシンを、腫瘍細胞を選択的に死滅させるために提供する。本発明のイムノトキシンはさらに、上記の方法に従えば、 in vitro での白血病造血系ＣＤ３３+細胞の除去に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
　本発明は、クローニングされたｃＤＮＡの配列決定によって決定された図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を有するＣＤ３３様タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなる単離された核酸分子を提供する。本発明のＣＤ３３様タンパク質は、ヒトの分化抗原（ＣＤ３３）（図２）に関して配列の相同性を共有する。図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション,12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852において１９９６年４月２５日に受託され、受託番号９７５２１を付与された、ＨＭＱＣＤ１４クローンを配列決定することにより得られる。
【００１８】
（核酸分子）
　特記しない限り、本明細書中のＤＮＡ分子を配列決定することによって決定されたヌクレオチド配列はすべて、自動化されたＤＮＡシクエンサー（Applied Biosystems, Inc.のモデル３７３のような）を用いて決定し、本明細書中の決定されたＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列はすべて、上記のように決定されたＤＮＡ配列の翻訳によって推定した。したがって、この自動化された方法によって決定されたＤＮＡ配列に関して当分野で知られているように、本明細書中のいずれかのヌクレオチド配列がいくつかのエラーを含んでいるかもしれない。オートメーションによって決定されたヌクレオチド配列は、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列と、典型的には少なくとも約９０％同一、より典型的には少なくとも約９５％〜少なくとも９９．９％同一である。実際の配列は、当分野によく知られている手動のＤＮＡ配列決定法を含む他の方法によって、より精密に決定し得る。当分野において知られているように、実際の配列と比較して、決定されたヌクレオチド配列における１個の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳におけるフレームシフトを引き起こし、そのような挿入または欠失を起点として、決定されたヌクレオチド配列によってコードされる推定アミノ酸配列は、配列決定されたＤＮＡ分子によって実際にコードされたアミノ酸配列と完全に異なるであろう。
【００１９】
　特記しない限り、本明細書に記載の「ヌクレオチド配列」はそれぞれ、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと略す）の配列として表する。しかし、核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡ分子またはポリヌクレオチドについてはデオキシリボヌクレオチドの配列を意図し、ＲＮＡ分子またはポリヌクレオチドについては特定のデオキシヌクレオチド配列のそれぞれのチミジンデオキシヌクレオチド（Ｔ）がリボヌクレオチドウリジン（Ｕ）で置換されている、リボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＵ）の対応する配列を意図する。例えば、デオキシリボヌクレオチドの略号を用いて記載された配列番号１を有するＲＮＡ分子への言及は、配列番号１のそれぞれのデオキシヌクレオチドＡ、ＧまたはＣが、対応するリボヌクレオチドＡ、ＧまたはＣで置換されており、それぞれのデオキシヌクレオチドＴがリボヌクレオチドＵで置換されている配列を有するＲＮＡ分子を示すことを意図している。
【００２０】
　このように、１つの態様では、ＣＤ３３様タンパク質をコードする単離された核酸分子が提供される。「単離された」核酸分子とは、その天然の環境から除去された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図する。例えば、ベクター中に含まれている組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的からすると単離されていると考えられる。単離されたＤＮＡ分子の更なる例には、ヘテロローガスな宿主細胞中で維持される組換えＤＮＡ分子または（部分的にまたは実質的に）精製された溶液中のＤＮＡ分子が含まれる。単離されたＲＮＡ分子には、本発明のＤＮＡ分子の in vitro ＲＮＡ転写物が含まれる。本発明の単離された核酸分子にはさらに、合成によって製造されたそのような分子が含まれる。
【００２１】
　図１に示されるようなヌクレオチド配列などのような、本明細書に記載された情報を用いて、ＣＤ３３様タンパク質をコードする本発明の核酸分子を、ｍＲＮＡを出発物質として使用するｃＤＮＡのクローニングするための方法のような標準的なクローニングおよびスクリーニング法を用いて得ることができる。本発明の実例として、図１に記載の核酸分子は、ヒトの活性化された単球に由来するｃＤＮＡライブラリーにおいて発見された。さらに、該遺伝子は、以下のタイプのヒトの細胞に由来するｃＤＮＡライブラリーにおいてもみられた：ヒト好酸球、脾臓、慢性リンパ球白血病、ヒト活性化好中性細胞およびヒト扁桃。
【００２２】
　ＣＤ３３様タンパク質遺伝子は、その開始コドンが図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列の３７〜３９番であり、推定されるリーダー配列が約１５アミノ酸残基であり、その推定分子量が約６０ｋＤである、約５５１アミノ酸残基の完全長タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含んでいる。推定の成熟ＣＤ３３様タンパク質のアミノ酸配列は、図１（配列番号２）のアミノ酸残基１６番〜５５１番に示されている。成熟ＣＤ３３様タンパク質は、３つの主要な構造領域を有している。これらには、リガンド結合領域を含み、図１（配列番号１）のアミノ酸残基約１６番〜約４２２番に対応すると推定される細胞外領域が含まれている。成熟細胞外領域は、分子量が約４５ｋＤで、長さ約４０７アミノ酸であると推定される。もうひとつの領域は、図１（配列番号２）の約４２３番〜約４６４番の残基に対応すると推定される膜貫通領域である。さらにもうひとつの領域は、図１（配列番号２）の約４６５番〜約５５１番のアミノ酸残基に対応すると推定される細胞内領域である。図１（配列番号２）に示されるＣＤ３３様タンパク質は、受託番号Ｍ２３１９７でＧｅｎＢａｎｋにアクセスできるヒトの分化抗原ＣＤ３３と約５３％同一であり、約６４％類似している。当業者が認識し得るように、上に記載した配列決定のエラーの可能性、並びに異なる既知のタンパク質においてリーダーの開裂部位に可変性があるために、寄託されたｃＤＮＡによってコードされる実際の完全長のＣＤ３３様タンパク質（リーダーを含む）は約５５１アミノ酸を含むが、５４５〜５６０アミノ酸の範囲のいずれかであり得るし、このタンパク質の実際のリーダー配列は約１５アミノ酸であるけれども約１２〜約１８アミノ酸の範囲のいずれかであり得る。当業者は、使用した判断基準によっては、上記のＣＤ３３様タンパク質領域の正確な「位置（address）」に関して意見が異なるかもしれない。したがって、例えば、図１（配列番号２）のＣＤ３３様タンパク質の細胞外、細胞内および膜貫通領域の正確な所在は、その領域を定義づける為に使用した判断基準によってわずかに変化するかもしれない（例えば、正確な「位置」は、図１に示される位置と比較して約１〜５残基異なることもある）。
【００２３】
　示したように、本発明の核酸分子はｍＲＮＡのようなＲＮＡ、または例えばクローニングによって得られたかまたは合成によって製造されたｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含むＤＮＡの形態であってよい。ＤＮＡは二本鎖または一本鎖であってよい。一本鎖ＤＮＡは、センス鎖としても知られているコード鎖であってよく、またはアンチセンス鎖としても知られている非コード鎖であってもよい。
【００２４】
　本発明の単離された核酸分子は、その開始コドンが図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列の３７〜３９番にあるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでなるＤＮＡ分子、さらに、ＯＲＦの全部または一部が実質的に異なる配列を含んでなるが、遺伝コードの縮重のためＣＤ３３様タンパク質またはその断片を依然としてコードする、開始コドンが図１（配列番号１）に示したヌクレオチド配列の３７〜３９番にあるＤＮＡ分子を含んでいる。勿論、遺伝コードは当分野のおいてよく知られている。したがって、上記の縮重変異体を作成することは当業者には慣用的なことであろう。
【００２５】
　別の態様では、本発明は、１９９６年４月２５日にＡＴＣＣ受託番号９７５２１として寄託されたクローンのｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有するＣＤ３３様ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。好ましくは、核酸分子は、上記の寄託されたｃＤＮＡによってコードされる成熟ポリペプチドをコードする。
【００２６】
　本発明はさらに、図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列または上記の寄託されたｃＤＮＡに含まれるＣＤ３３様タンパク質遺伝子のヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子、または上記配列の１つに相補的な配列を有する核酸分子を提供する。このような単離された分子、特にＤＮＡ分子は、染色体との in situ ハイブリダイゼーションによる遺伝子マッピングやノーザンブロッティング解析によるＣＤ３３様タンパク質遺伝子のヒト組織における発現を検出するためのプローブとして有用である。以下詳細に記載するように、ある組織におけるＣＤ３３様タンパク質遺伝子発現の増大を検出することは新生物の指標である。
【００２７】
　本発明はさらに、本明細書中に記載した単離された核酸分子の断片に関する。寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または図１（配列番号１）に示したヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子の断片は、少なくとも約１５ｎｔ、およびより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、およびさらにより好ましくは少なくとも約４０ｎｔの長さであり、本明細書中で記述される診断用プローブおよびプライマーとして有用な断片を意図する。勿論、長さ５０〜１５００ｎｔのより大きな断片もまた、寄託されたｃＤＮＡまたは図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列の、全部でないとしても大部分に対応する断片と同様に本発明に有用である。例えば、少なくとも長さ約２０ｎｔの断片は、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列に由来する２０またはそれ以上の隣接した塩基を含む断片を意図する。該遺伝子は寄託されており、図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列が提供されているので、このようなＤＮＡ断片を作成することは当業者には常套的であろう。例えば、制限エンドヌクレアーゼ開裂または超音波処理によるせん断を容易に使用して様々なサイズの断片を作成することができよう。あるいは、そのような断片を合成によって作成することができよう。
【００２８】
　本発明の好ましい核酸断片には、以下のものをコードする核酸分子が含まれる：ＣＤ３３様タンパク質細胞外領域を含んでなるポリペプチド（図１（配列番号１）のアミノ酸残基約１６番〜約４２２番）；ＣＤ３３様タンパク質膜貫通領域を含んでなるポリペプチド（図１（配列番号２）のアミノ酸残基約４２３番〜約４６４番）；ＣＤ３３様タンパク質細胞内領域を含んでなるポリペプチド（図１（配列番号２）のアミノ酸残基約４６５番〜約５５１番）；膜貫通領域の全部または一部が削除されているＣＤ３３様タンパク質細胞外および細胞内領域を含んでなるポリペプチド。
【００２９】
　別の態様では、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、上記の本発明の核酸分子のポリヌクレオチドの一部、例えばＡＴＣＣ受託番号９７５２１に含まれるｃＤＮＡクローンとハイブリダイズするポリペプチドを含んでなる単離された核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮaＣl,１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Denhardt's溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μg／ｍL変性、せん断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の４２℃での一晩のインキュベーションの後、約６５℃の０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することを意図する。ポリヌクレオチドの「一部」とハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、言及するポリヌクレオチドの少なくとも１５ヌクレオチド（ｎｔ）、およびより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらに好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０〜７０ｎｔとハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を意図する。これらは、上記および以下により詳細に記載する診断用プローブおよびプライマーとして有用ある。
【００３０】
　勿論、言及するポリヌクレオチド（例えば寄託されたｃＤＮＡクローン）のより大きな部分、例えば言及するポリヌクレオチドの長さ５０〜７５０ｎｔの部分、またはさらに全長に匹敵する長さとハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または図１（配列番号１）に示されるのヌクレオチド配列の、全部でないとしても大部分に対応するポリヌクレオチドと同様、本発明のプローブとして有用である。「少なくとも２０ｎｔの長さ」のポリヌクレオチドの一部は、例えば、言及するポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（例えば、寄託されたｃＤＮＡまたは図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列）に由来する２０またはそれ以上の隣接したヌクレオチドを意図する。示すように、そのような部分は、例えば、参考のためその全開示が本明細書の一部を構成する Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第２版 , Sambrook, J., Fritsh, E. F.および Maniatis, T.編(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press に記載されているように、慣用のＤＮＡハイブリダイゼーション技術に従うプローブとしてかまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による標的配列の増幅のためのプライマーとして、診断上有用である。
【００３１】
　勿論、ポリＡ配列（図１（配列番号２）に示されるＣＤ３３様ｃＤＮＡの３'末端ポリＡ配列のような）またはＴ（またはＵ）残基の相補的な連続配列にのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、ポリＡ連続配列またはその相補鎖（例えば、実際上いずれかの二本鎖ｃＤＮＡクローン）を含むいかなる核酸分子ともハイブリダイズし得るので、本発明の核酸の一部とハイブリダイズさせるために使用される本発明のポリヌクレオチドには含まれない。
【００３２】
　示すように、ＣＤ３３様ポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は以下のものが含まれるがこれらに限られない：成熟ポリペプチドそれ自身のコード配列；成熟ポリペプチドのコード配列と約１５アミノ酸のリーダーまたは分泌配列をコードする配列などの更なる配列、例えばプレ−またはプロ−またはプレプロ−タンパク質配列；前述の更なるコード配列を有しまたは無さず、以下の更なる非コード配列を有する成熟ポリペプチドのコード配列、その配列は、イントロンおよび、例えば転写、ｍＲＮＡプロセシング（例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含む）、リボソーム結合およびｍＲＮＡの安定性において役割を担っている転写され翻訳されない配列などの非コード５'および３'配列を含むがそれに限られない；更なる機能をもたらす更なるアミノ酸をコードする更なるコード配列。このように、例えば、ポリペプチドをコードする配列は、あるペプチドをコードする配列などのマーカー配列に融合し、そのペプチドは、その融合したポリペプチドの精製を容易にすることができる。本発明のこの態様におけるある好ましい具体例では、マーカー配列は、なかでもｐＱＥベクター（Quigen,Inc）において与えられるｔａｇのようなヘキサヒスチジンペプチドであり、なかでも、その多くが商業的に入手可能である。Gentzら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 821-824 (1989)に記載されているように、例えば、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の便利な精製をもたらす。ＨＡ ｔａｇは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質から得られるエピト−プに対応する精製に有用なもうひとつのペプチドであり、例えば、Wilsonら, Cell 37: 767 (1984)に記載されている。
【００３３】
　本発明はさらに、ＣＤ３３様タンパク質の断片、同族体または誘導体をコードする本発明の核酸分子の変異体に関する。変異体は、アレル変異体のような天然に存在するものであってよい。「アレル変異体」は、生物の染色体上の所定の座を占有している遺伝子の、それに代わるいくつかの形態のうちの１つを意図する。非天然の変異体は、当分野に知られた突然変異誘発技術を用いて製造することができる。
【００３４】
　そのような変異体には、ヌクレオチド置換、欠失または付加によって生じるものが含まれる。置換、欠失または付加は、１またはそれ以上のヌクレオチドが関与し得る。変異体は、コードまたは非コード領域またはその両方において変化していてもよい。コード領域における変化により、保存的または非保存的なアミノ酸置換、欠失または付加を生じることができる。
【００３５】
　これらのうち特に好ましいのは、ＣＤ３３様タンパク質またはその一部の特性および活性を変えないサイレント置換、付加および欠失である。また、これに関して特に好ましいのは、保存的置換である。
【００３６】
　本発明の更なる態様には、以下のものに対して少なくとも９０％同一、およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含んでなる単離された核酸分子を含む：（a）図１（配列番号２）に示されるまたはＡＴＣＣ受託番号９７５２１に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるような完全なアミノ酸配列（推定のリーダー配列を含む）を有する完全長ＣＤ３３様ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（b）図１（配列番号２）に示されるまたはＡＴＣＣ受託番号９７５２１に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるようなアミノ酸配列を有する成熟ＣＤ３３ポリペプチド（リーダー配列が除去された完全長ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列；（c）図１（配列番号２）に示されるまたはＡＴＣＣ受託番号９７５２１に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるようなアミノ酸配列を有するＣＤ３３様タンパク質細胞外領域をコードするヌクレオチド配列；（d）図１（配列番号２）に示されるまたはＡＴＣＣ受託番号９７５２１に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるようなアミノ酸配列を有するＣＤ３３様タンパク質細胞内領域をコードするヌクレオチド配列；（e）図１（配列番号２）に示されるまたはＡＴＣＣ受託番号９７５２１に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるようなアミノ酸配列を有するＣＤ３３様タンパク質膜貫通領域をコードするヌクレオチド配列；（f）図１（配列番号２）に示されるまたはＡＴＣＣ受託番号９７５２１に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるようなアミノ酸配列を有するＣＤ３３様タンパク質細胞外領域および細胞内領域（膜貫通領域の全部または一部が除去されている）をコードするヌクレオチド配列；または（g）（ａ）〜（ｆ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【００３７】
　ＣＤ３３様ポリペプチドをコードする言及するヌクレオチド配列に例えば少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ＣＤ３３様ポリペプチドをコードする言及するヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドにつき５つまでの突然変異をそのポリヌクレオチド配列が含んでもよいということ以外は、その言及する配列と同一であることを意図する。言いかえれば、言及するヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、その言及する配列のヌクレオチドの５％までは、欠失または別のヌクレオチドで置換されていてもよいか、またはその言及する配列のヌクレオチドの総数の５％までの数のヌクレオチドをその言及する配列に挿入してもよい。言及する配列のこれらの突然変異は、その言及するヌクレオチド配列の５'または３'末端の位置またはこれら末端の位置の間のどこかにおいて、その言及する配列内で個別にかまたはその言及する配列内の１またはそれ以上の隣接した群として分散して存在し得る。
【００３８】
　実際的な問題として、いずれかの特定の核酸分子が、例えば図１に示したヌクレオチド配列または寄託されたｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列を有しているかどうかは、Bestfit プログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711）などの既知のコンピュータプログラムを使用して慣用的に決定することができる。Bestfitは、Smith と Waterman (Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981))の局所的相同性アルゴリズムを使用して２つの配列間の相同性が最良のセグメントを見つけ出す。特定の配列が、本発明の言及する配列と例えば少なくとも９５％同一であるかどうかを決定するために、Bestfitまたは他のいずれかの配列アラインメントプログラムを使用する場合、勿論、言及するヌクレオチド配列の全長にわたって同一性の百分率を計算し、言及する配列のヌクレオチドの総数の５％までの相同性の相違が許容されるようにパラメーターをセットする。
【００３９】
　本願は、ＣＤ３３様タンパク質活性を有するポリペプチドをコードするかどうかに関係なく上記の核酸配列に少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一である核酸分子に関する。これは、特定の核酸分子がＣＤ３３様タンパク質活性を有するポリペプチドをコードしない場合でさえも、当業者は、例えばハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとしてその核酸分子を如何にして使用するかを知っているであろうからである。ＣＤ３３様タンパク質活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用には、とりわけ、以下のものが含まれる：（１）ＣＤ３３様タンパク質またはｃＤＮＡライブラリー由来のそのアレル変異体をコードする遺伝子の単離；（２）Vermaら, Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988)に記載されているようなＣＤ３３様遺伝子の染色体上の正確な位置を得るための、分裂中期染色体スプレッド（spread）との in situ ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）；および（３）特定の組織におけるＣＤ３３様ｍＲＮＡの発現を検出するためのノーザンブロット解析が含まれる。
【００４０】
　しかし、ＣＤ３３様タンパク質活性を有するポリペプチドを実際にコードする上記核酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一である核酸分子が好ましい。「ＣＤ３３様タンパク質活性を有するポリペプチド」とは、ある特定の生物学的分析で測定したときに本発明のＣＤ３３様ポリペプチドの活性と同様であるが同一である必要はない活性を示すポリペプチドを意図する。
【００４１】
　例えば、固相結合アッセイでは、本発明のＣＤ３３様タンパク質は、ＣＤ３３およびシアロアドへジンと同様な方法で、赤血球（ＲＢＣ）へのシアル酸依存の粘着を媒介し得る。（このアッセイは、その内容が本明細書の一部を構成するFreeman, S.D.ら, Blood 85 (8): 2005-2012 (1995)に詳細に記載されている）。特に、ヒトの赤血球（ＲＢＣ）を酵素で修飾し、独特の結合によってシアル酸を持たせることができる（Paulson JC.ら, Methods Enzymol. 138: 162 (1987)）。これは、シアル酸依存の粘着分子の特異性を特徴付る有用な実験的方法を提供する。簡潔に言えば、このアッセイは、Ｆｃ−ＣＤ３３様タンパク質を、上記のＣＤ３３様タンパク質ｃＤＮＡの細胞外部分のポリメラーゼ連鎖反応増幅によって作成し、Ｆｃ発現ベクターｐＩＧへクローニングし（Simmons DL: Cloning cell surface molecules by transient expression in mammalian cells, in Hartley DA（編）: Cellular Interactions in Development-A Practical Approach. Oxford, UK, IRL, 1993, p93）、次いで Freeman, S.D.ら, 85 (8): 2005-2012 (1995)に記載されているようにＣＯＳ−１細胞において発現させることを含む。ＣＯＳ細胞上清をトランスフェクト後約６日目に集め、前掲の Simmons DLに記載のようにＦｃ−ＣＤ３３様タンパク質をプロテインＡセファロースで精製する。
【００４２】
　固相結合アッセイは、Kelm, S.ら, Curr Biol 4: 965 (1994)に記載されているように、酵素を結合した免疫吸収剤アッセイプレートをＦｃ−ＣＤ３３様タンパク質でコーティングすること、および Freemn, S.D.ら, Blood 85 (8): 2005-2012 (1995)に記載されているようにシアル酸残基を１またはそれ以上の構造において有している放射能標識したＲＢＣを適当な濃度で加えること（例えば、４×１０６細胞／ｍL）を含む。３０分後、付着しなかったおよび弱く付着した細胞を洗浄により除く。それぞれのウェルにおいて結合した細胞の百分率を以下のように計算する：（ｃｐｍ 結合／ｃｐｍ 添加量）×１００。本発明のＣＤ３３様ポリペプチドはシアル酸依存的にＲＢＣに結合するであろう。
【００４３】
　このように、本発明により、「ＣＤ３３様タンパク質活性を有するポリペプチド」は、上記アッセイにおいてＲＢＣに結合もするポリペプチドを含む。言いかえれば、サイドバイサイドの比較において、ＣＤ３３様タンパク質を用いる上記のＲＢＣ結合の百分率は、「ＣＤ３３様タンパク質活性を有するポリペプチド」の候補を使用して得られる百分率と同様（即ち５０％以上は違わない、好ましくは２５％以上違わない）であろう。
【００４４】
　別の態様では、上記の結合アッセイは、ＣＤ３３様タンパク質活性の可能性のあるアンタゴニストおよびアゴニストをスクリーニングするのに有用である。この方法は、アゴニストとまたはアンタゴニスト候補（抗ＣＤ３３様タンパク質抗体のような）が、ＣＤ３３様タンパク質のＲＢＣに対するシアル酸依存の結合を、標準的な結合レベル、即ちアゴニストまたはアンタゴニスト候補不在でのＲＢＣに対するＣＤ３３様タンパク質結合の程度、と比較して増強するかまたは阻害するかを決定することを含む。
【００４５】
　勿論、遺伝コードの縮重のために、当業者は、上記の核酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列を有する数多くの核酸分子が「ＣＤ３３様タンパク質活性を有する」ポリペプチドをコードし得るということを即座に認識するであろう。実際には、すべての縮重変異体は同じポリペプチドをコードするので、上記の比較アッセイを行わなくてもこのことは当業者には明らかであろう。縮重変異体ではない核酸分子に関して、かなりの数のものも、ＣＤ３３様タンパク質活性を有するポリペプチドをコードするであろうことは、当分野においてさらに認識される。なぜならば、当業者は、それほどまたは全くタンパク質の機能に有意に影響しないようなアミノ酸置換（例えば、ある脂肪族アミノ酸を別の脂肪族アミノ酸に置換すること）について熟知しているからである。
【００４６】
　例えば、表現型に関してサイレントなアミノ酸置換を如何にして行うかについての手引きが Bowie, J.U.ら,“Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions,”Science 247: 1306-1310 (1990)に記載されており、その中で著者は、変化に対するアミノ酸配列の許容を調べる２つの主要な方法があることを示している。第１の方法は、進化の過程に依存しているもので、そこでは突然変異体が自然選択によって許容されるかまたは排除される。第２の方法は、遺伝子工学を用いてクローニングされた遺伝子の特定の位置にアミノ酸変化を導入し、選択またはスクリーニングにより機能を維持する配列を同定する。著者が述べているように、これらの研究により、タンパク質はアミノ酸置換に関して意外にも耐性であることが分かった。著者はさらに、どのようなアミノ酸変化が、そのタンパク質のある特定の位置で寛容でありそうかについて示している。例えば、たいていの内部に埋め込まれたアミノ酸残基は無極性の側鎖を必要とするが、表面の側鎖の２、３の特徴は一般的に保存される。他のそのような表現型的にサイレントな置換は、参考のために引用する前掲の Bowie, J.U.らに記載されている。
【００４７】
（ベクターおよび宿主細胞）
　本発明はまた、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含むベクター、その組換えベクターにより遺伝的に処理を施された宿主細胞、および組換え技術によるＣＤ３３様ポリペプチドまたはその断片の製造に関する。
【００４８】
　感染、形質導入、トランスフェクション、トランスベクションおよび形質転換などのよく知られた技術を用いて組換え構築物を宿主細胞に導入することができる。ベクターは、例えばプラスミド、プラスミド、ウイルスまたはレトロウイルスベクターであってよい。レトロウイルスベクターは、複製能を有していても複製欠陥であってもよい。後者の場合、レトロウイルスの増殖は、一般に相補的（complementing）宿主細胞においてのみ起こる。
【００４９】
　ポリペプチドは、宿主における増殖のための選択可能なマーカーを含むベクターに連結することができる。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿などの沈殿において導入するかまたは荷電した脂質との複合体において導入する。ベクターがウイルスである場合、適当なパッケージング細胞系を使用して in vitro でパッケージングした後、宿主細胞にトランスフェクトすることができる。
【００５０】
　好ましくは、目的のポリヌクレオチドにシス作用制御領域を含むベクターである。適当なトランス作用因子は、宿主によって供給されるか、相補的ベクターによって供給されるかまたは宿主細胞に導入されるとそのベクター自身から供給される。
【００５１】
　これに関してある特定の好ましい態様では、ベクターは、導入可能および／または細胞のタイプに特異的である特異的発現をもたらす。中でも特に好ましい導入可能なベクターは、扱いやすい環境因子、例えば温度や付加的栄養素などによる発現を誘導することができるベクターである。
【００５２】
　本発明に有用な発現ベクターには、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント、ウイルス例えばバキュロウイルス、パポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、偽性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスから得られるベクター、およびそれらの組合せに由来するベクター例えばコスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージ遺伝エレメントから得られるベクターが含まれる。
【００５３】
　ＤＮＡ挿入は、適当なプロモーター、いくつか挙げると、例えばファージラムダＰＬプロモーター、E. coli lac、trpおよびtacプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーターおよびレトロウイルスＬＴＲのプロモーターのようなプロモーターに作動可能なように連結する。他の適当なプロモータは当業者によく知られている。発現構築物は、転写開始、終止のための部位、および転写領域には翻訳のためのリボソーム結合領域を含む。構築物によって発現する成熟転写物のコード部分は、翻訳開始のＡＵＧを先頭に含み、適切に位置する終止コドンを翻訳されるポリペプチドの最後に位置する。
【００５４】
　示されるように、発現ベクターは好ましくは選択可能なマーカーを含む。そのようなマーカーには、真核細胞カルチャーのためのジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性および E. coli または他の細菌において培養するためのテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性を含む。適当な宿主の代表的な例には、E. coli、ストレプトミセス、ネズミチフス菌のような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；ショウジョウバエＳ２および Spodoptera Sf9のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳおよびボーズメラノーマのような動物細胞；および植物細胞が含まれる。上記の宿主細胞のための適当な培地と条件は当分野で知られている。
【００５５】
　Quiagenから入手可能であるｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９；ｐＢＳベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクター、Stratageneから入手可能なｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；および Pharmaciaから入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２３３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５は細菌において使用するのに好ましいベクターである。なかでも好ましい真核ベクターは、Stratageneから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；および Pharmaciaから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬである。他の適当なベクターは当業者に明らかである。
【００５６】
　なかでも本発明において使用するための既知の細菌プロモーターには、E. coli lacＩおよびlacＺプロモーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ラムダＰＲ、ＰＬプロモーターおよびｔｒｐプロモーターが含まれる。適当な真核プロモーターには、ＣＭＶ 即初期（immediate early）プロモーター、ＨＳＶチミジンキナ−ゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーターなどのレトロウイルスＬＴＲのプロモーター、およびマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターなどのメタロチオネインプロモーターが含まれる。
【００５７】
　構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウム沈殿トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン介在のトランスフェクション、カチオン脂質介在のトランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、感染または他の方法によって行うことができる。そのような方法は、例えば、Davisら, Basic Methods in Molecular Biology (1986)などの多くの標準的な実験マニュアルに記載されている。
【００５８】
　本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベクター内に挿入することによって増強することができる。エンハンサーは、通常約１０〜３００ｂｐの、所定の宿主細胞タイプにおけるプロモーターの転写活性を増加するように作用するＤＮＡのシス作用エレメントである。エンハンサーの例には、ｂｐ１００〜２７０の複製起点の後側に位置するＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。
【００５９】
　小胞体の管、細胞周辺腔、または細胞外環境への翻訳されたタンパク質の分泌のため、発現したポリペプチドに適当な分泌シグナルを組み込むことができる。シグナルは、ポリペプチドに対して内因性であってよく、またはヘテロローガスなシグナルであってもよい。
【００６０】
　ポリペプチドは、融合タンパク質などの修飾された形態で発現させることができ、分泌シグナルだけでなくさらなるヘテロローガスな機能性領域を含むことができる。即ち、例えば更なるアミノ酸、特に荷電したアミノ酸の領域をポリペプチドのＮ末端に付加して、精製の間のまたはその後の処理と保存の間の、宿主細胞における安定性と持続性を改善することができる。また、ペプチド部分をポリペプチドに付加して精製を容易にすることができる。
【００６１】
　ＣＤ３３様タンパク質を、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含むよく知られた方法によって、組換え培養細胞から回収し精製することができる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を精製に使用する。
【００６２】
　本発明のポリペプチドには、天然の精製された産物、化学的合成法の産物および、例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳類細胞を含む原核または真核宿主から組換え技術により製造された産物が含まれる。組換え製造法に使用される宿主によって、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されていることもあるし、グリコシル化されていないこともある。さらに、本発明のポリペプチドは、ある場合には宿主が関与する過程の結果として、最初の修飾されたメチオニン残基を含んでいてもよい。
【００６３】
（ＣＤ３３様ポリペプチドおよび断片）
　本発明はさらに、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列または図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を有する単離されたＣＤ３３様ポリペプチド、または上記ポリペプチドの一部を含んでなるペプチドまたはポリペプチドを提供する。「ペプチド」および「オリゴペプチド」なる語は、（通常認識されているように）同義語と考えられ、それぞれの語は文脈の前後関係から必要に応じて互換的に使用して、ペプチジル結合によって結合した少なくとも２つのアミノ酸の鎖を示すことができる。本明細書中の「ポリペプチド」なる語は、１０アミノ酸残基以上を含む鎖について用いられる。本明細書中のすべてのオリゴペプチドおよびポリペプチドの式または配列は、左から右へ、アミノ末端からカルボキシ末端の方向で記載する。
【００６４】
　「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、天然の環境から除去されたポリペプチドまたはタンパク質を意図する。例えば、宿主において発現した組換えにより製造されるポリペプチドおよびタンパク質は、いずれかの適当な技術、例えば Smith および Johnson, Gene 67: 31-40 (1988)に記載された１段階精製法によって実質的に精製された天然または組換えポリペプチドと同様、本発明の目的からすると単離されていると考えられる。
【００６５】
　当業者は、ＣＤ３３様ポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列は、タンパク質の構造または機能に対する有意な影響なしに変化させることができることを認識するであろう。配列のそのような違いを考えるならば、タンパク質の活性を決定している決定的な領域が存在するであろうということを忘れてはならない。そのような領域は、細胞外領域を構成する残基を含んでいてもよい。三次構造を形成する残基を置換することは一般的に可能ではあるが、但し、同様の機能を発揮する残基を使用する。他の例では、その変化がタンパク質の決定的でない領域で起こる場合、残基の種類は全く重要でないであろう。
【００６６】
　したがって、本発明はさらに、実質的にＣＤ３３様ポリペプチド活性を示すか、または以下に記載のタンパク質断片のようなＣＤ３３様タンパク質の領域を含むＣＤ３３様ポリペプチドの変異体を含む。このような突然変異体には、欠失、挿入、逆位、反復、および種類の置換（例えば、ある親水性残基を別の種類のものに置換することであるが、概して、強い疎水性残基は強い親水性残基と置換しない）が含まれる。わずかな変化または「中性の」アミノ酸置換は、一般には、活性にはほとんど影響しないであろう。
【００６７】
　保存的置換として典型的にみられるのは、脂肪族アミノ酸Ａla、Ｖal、ＬeuおよびＩleのなかでのあるものを別のものに置換すること；ヒドロキシル残基ＳerおよびＴhr間の相互交換、酸性残基ＡspとＧluの交換、アミド残基ＡsnとＧlnの置換、塩基性残基ＬeuとＡrgの交換および芳香族残基Ｐhe、Ｔyrのなかでの置換である。
【００６８】
　上で示したように、どのアミノ酸変化が表現型的にサイレント（即ち、機能に対して有意の有害な影響を及ぼしそうでない）でありそうかについての更なる手引きは、Bowie, J.U.ら,“Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions,”Science 247: 1306-1310 (1990)にみられる。
【００６９】
　本発明のポリペプチドはリーダーを含む寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるリーダーが削除された成熟ポリペプチド（即ち、成熟タンパク質）、リーダーを含む図１（配列番号２）のポリペプチド、リーダーを含まない図１（配列番号２）のポリペプチド、並びに本明細書に記載のポリペプチドと少なくとも９０％類似、より好ましくは少なくとも９５％類似、さらにより好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％類似であるポリペプチドを含む。本発明のさらなるポリペプチドには、本明細書に記載のポリペプチドど少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％または９５％同一、さらにより好ましくは少なくとも９７％、９８％または９８％同一であるポリペプチドを含み、さらに、少なくとも３０アミノ酸より好ましくは少なくとも５０アミノ酸を有する、そのようなポリペプチドの一部を含む。
【００７０】
　２つのポリペプチドに関する「％類似」とは、Bestfit プログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711）および類似性を決定するためのデフォールトセッティング（default setting）を用いて、２つのポリペプチドのアミノ酸配列を比較することによって求められる類似性のスコアを意図する。Bestfitは、Smith と Waterman (Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981))の局所的相同性アルゴリズムを使用して２つの配列間の相同性が最良のセグメントを見つけ出す。
【００７１】
　ＣＤ３３様ポリペプチドの言及するアミノ酸配列に対して少なくとも、例えば９５％「同一」なアミノ酸配列を有するポリペプチドは、そのポリペプチド配列が、ＣＤ３３様ポリペプチドの言及するアミノ酸の１００アミノ酸それぞれにつき５つまでのアミノ酸変化を有し得ることを除いては、そのポリペプチドのアミノ酸配列がその言及する配列と同一であることを意図する。言いかえれば、言及するアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るには、その言及する配列の５％までのアミノ酸残基が、欠失または別のヌクレオチドで置換されていてもよいか、またはその言及する配列のアミノ酸残基の総数の５％までの数のアミノ酸をその言及する配列に挿入してもよい。言及する配列のこれらの変化は、その言及するアミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端の位置でかまたはこれらの末端の位置の間のどこかで、その言及する配列の残基のなかで個別的にか、またはその言及する配列内の１またはそれ以上の隣接した群として分散して存在し得る。
【００７２】
　実際的な問題として、いずれかの特定のポリペプチドは、例えば図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列または寄託されたｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列またはその一部と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるかどうかは、Bestfit プログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711）のような既知のコンピュータプログラムを使用して常套的に決定することができる。Bestfitまたは他のいずれかの配列アラインメントプログラムを使用して、ある特定の配列が本発明の言及する配列と例えば少なくとも９５％同一であるかどうかを決定する場合は、勿論、言及するアミノ酸配列の全長にわたって同一性の百分率を計算し、言及する配列のアミノ酸の総数の５％までの相同性の相違が許容されるようパラメーターをセットする。
【００７３】
　別の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープを有する部分を含むペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエピトープは、本発明のポリペプチドの免疫原性または抗原性エピトープである。「免疫原性エピトープ」とは、タンパク質全体が免疫原である場合、抗体応答を引き起こすタンパク質の一部分であると定義される。これらの免疫原性エピトープは、その分子上での２，３の位置に限られると考えられている。他方、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域は「抗原性エピトープ」と定義される。タンパク質の免疫原性エピトープは、一般に抗原性エピトープの数よりも少ない。例えば、Geysen, H.M.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002 (1984)参照。
【００７４】
　抗原性エピトープを有する（即ち、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域を含む）ペプチドまたはポリペプチドの選択に関して、タンパク質配列の一部を模倣した比較的短い合成ペプチドが、その部分的に模倣されたタンパク質と反応する抗血清を誘導することが常套的に可能であるということは当分野においてよく知られている。例えば、Sutcliffe, J.G.ら, Science 219: 660-666(1984)参照。タンパク質反応性血清を誘導することが可能なペプチドは、タンパク質のプライマリーな配列にしばしば表示され、一組の単純な化学的規則によって特徴付ることができ、そして完全なタンパク質の免疫優性領域（即ち、免疫原性エピトープ）にもアミノまたはカルボキシ末端にも限られない。著しく疎水性であるペプチドおよび６またはそれ以下の残基のペプチドは、通常、模倣タンパク質に結合する抗体の誘導には効果的でない；より長い、可溶性のペプチド、特にプロリン残基を含むペプチドは一般的に効果的である。Sutcliffeら,前掲 661。例えば、インフルエンザウイルスヘマグルチニンＨＡ１ポリペプチド鎖の配列の７５％をカバーしている８〜３９残基を含む、これらガイドラインにしたがって設計された２０のペプチドのうち１８のペプチドは、ＨＡ１タンパク質または完全なウイルスと反応する抗体を誘導し；ＭｕＬＶポリメラーゼ由来のペプチドの１２のうち１２と、狂犬病ウイルス糖タンパク由来の１８のうち１８が、それぞれのタンパク質を沈殿させる抗体を誘導した。
【００７５】
　したがって、本発明の抗原性エピトープを有するペプチドおよびポリペプチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む抗体を惹起するのに有用である。例えば、抗原エピトープを有するペプチドで免疫されたドナー由来の脾臓細胞の融合によって得られたハイブリドーマは、一般に天然のタンパク質と反応する抗体を分泌する。Sutcliffeら,前掲 663。抗原性エピトープを有するペプチドまたはポリペプチドによって惹起される抗体は、模倣タンパク質を検出するのに有用であり、異なるペプチドに対する抗体は、翻訳後プロセシングを受けるタンパク質前駆体の様々な領域の運命を追跡するために使用することができる。該ペプチドおよび抗ペプチド抗体は、模倣タンパク質に関する様々な定性的または定量的分析、例えば競合アッセイにおいて使用することができる。なぜなら短いペプチド（即ち約９アミノ酸）でさえも、免疫沈降分析において、結合してより大きなペプチドにとって代わり得ることが示されているからである。例えば Wilson, I.A.ら, Cell 37: 767-778 p777 (1984)参照。本発明の抗ペプチド抗体もまた模擬タンパク質の精製、例えば、当分野においてよく知られている方法を用いる吸着クロマトグラフィーによる精製に有用である。
【００７６】
　上記の指針にしたがって設計された抗原性エピトープを有する本発明のペプチドおよびポリペプチドは、好ましくは少なくとも７の、より好ましくは少なくとも９の、および最も好ましくは約１５〜約３０アミノ酸の配列を、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含んでいた。しかしながら、約３０〜約５０アミノ酸または本発明のポリペプチドの全アミノ酸配列までのいずれかの長さおよび全アミノ酸配列を含む本発明のポリペプチドのアミノ酸配列のより大きい部分を含むペプチドまたはポリペプチドもまた、模倣タンパク質と反応する抗体を誘導するのに有用である。好ましくは、エピトープを有するペプチドのアミノ酸配列を選択して水性溶媒中での実質的な溶解性を得ることがでる（即ち、配列が比較的親水性の残基を含み、疎水性の高い配列は好ましくは避ける）；プロリン残基を含む配列が特に好ましい。
【００７７】
　本発明のエピトープを有するペプチドおよびポリペプチドは、本発明の核酸分子を用いる組換え法を含む、ペプチドまたはポリペプチドを製造するためのいずれかの慣用的な方法によって製造することができる。例えば、エピトープを有する短いアミノ酸配列は、組換え生産および精製の間並びに免疫して抗ペプチド抗体を製造する間、キャリヤーとして働くより大きなポリペプチドに融合させることができる。
【００７８】
　エピトープを有するペプチドはまた、化学合成の既知の方法を使用して合成することもできる。例えば、Houghten は、数多くのペプチドを合成するための簡単な方法を記載している。例えば、これらは４週間以内に調製され特徴付けられた（ＥＬＩＳＡ型結合分析により）ＨＡ１ポリペプチドのセグメントの１個のアミノ酸変異体である、１０〜２０ｍgの、異なった１３残基の２４８個のペプチド。Houghten, R.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131-5135 (1985)。この“Simultaneous Multiple Peptide Synthesis (SMPS)”法は、Houghtenら（1986）米国特許第４,６３１,２１１号にさらに記載されている。この方法では、様々なペプチドの固相合成のための個々の樹脂が別の溶媒透過性のパケットに入れられており、固相法に含まれる多くの同一の繰り返し工程の最適な使用を可能にしている。完全なマニュアル法は、５００〜１０００またはそれ以上の合成を同時に行うことが可能である。Houghtenら,前掲 5134。
【００７９】
　本発明のエピト−プを有するペプチドおよびポリペプチドは,当業者によく知られた方法にしたがって抗体を誘導するために使用する。例えば Sutcliffeら, 前掲、 Wilsonら, 前掲、Chow, M.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 910-914;および Bittle, F.J.ら, J. Gen. Virol. 66: 2347-2354 (1985)参照。一般に、動物を遊離のペプチドで免疫する；但し、抗ペプチド抗体力価は、ペプチドをキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイドのような巨大分子担体にカップリングすることによりブーストすることができる。例えば、ペプチドが含んでいるシステインをｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを用いて担体にカップリングすることができるが、他のペプチドをグルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を用いて担体にカップリングすることができる。ウサギ、ラットおよびマウスなどの動物は、遊離または担体とカップリングしたペプチド、例えば約１００μgのペプチドまたは担体タンパク質およびフロイントアジュバントを含むエマルジョンの腹腔内および／または皮内注射によって免疫する。例えば固体表面に吸着させた遊離のペプチドを用いるＥＬＩＳＡ分析によって検出し得る抗ペプチド抗体の有効な力価を得るために、例えば約２週間おきで、数回のブースター注射をすることが必要かもしれない。免疫された動物に由来する血清中の抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択、例えば、当分野でよく知られた方法に従う固体の担持体への吸着と選択された抗体の溶出によって、増加させることができる。
【００８０】
　本発明の免疫原エピト−プを有するペプチド、即ちタンパク質全体が免疫原である場合に抗体応答を引き起こすタンパク質の一部は、当分野で知られた方法にしたがって同定する。例えば、前掲の Geysenら, 1984は、酵素結合免疫吸着アッセイにおいて反応するに十分な純度の数百個のペプチドの、固体担持体上での迅速な同時合成（rapid concurrent synthesis）のための方法を開示している。次いで、抗体と合成されたペプチドの相互作用を、担持体から脱離することなく容易に検出する。この方法では、所望のタンパク質の免疫原エピト−プを有するペプチドは、当業者によって常套的に同定することができる。例えば、口蹄疫ウイルスのコートタンパク質における免疫学的に重要なエピトープは、Geysenらによって所在が決定され、そのタンパク質の２１３アミノ酸の全アミノ酸配列をカバーしている全部で２０８個の可能性のあるヘキサペプチドのオーバーラップしている組を合成することによって、７つのアミノ酸であると結論づけられた。次いで、２０のアミノ酸すべてがそのエピトープ内のすべての位置で代わる代わる置換されている、ペプチドの完全な置換のセットを合成し、抗体との反応の特異性を与えている特定のアミノ酸を決定した。このように、本発明のエピト−プを有するペプチドのペプチドアナログをこの方法により常套的に作ることができる。Geysen（1987）の米国特許第４,７０８,７８１号は、さらに所望のタンパク質の免疫原エピト−プを有するペプチドを同定する方法を記載している。
【００８１】
　さらに、Geysen（1990）の米国特許第５,１９４,３９２号にも、目的の抗体の特定のパラト−プ（抗原結合部位）に相補的なエピト−プ（即ち「ミモトープ」）のトポロジー的な等価物であるモノマー（アミノ酸または他の化合物）の配列を検出または決定する一般的な方法が開示されている。より一般的には、Geysen（1989）の米国特許第４,４３３,０９２号は、目的の特定のレセプターのリガンド結合部位に相補的なリガンドのトポロジー的な等価物であるモノマーの配列を検出または決定する方法を記載している。同様に、プレアルキル化オリゴペプチド混合物に関する Hougthen, R.A.ら（1996）の米国特許第５,４８０,９７１号は、直鎖状Ｃ１−Ｃ７アルキルのプレアルキル化されたオリゴペプチドおよびそのようなペプチドのセットおよびライブラリー、並びに目的のアクセプター分子に優先的に結合するプレアルキル化されたオリゴペプチドの配列を決定するためのそのようなオリゴペプチドセットおよびライブラリーを用いる方法を開示している。このように、本発明のエピトープを有しているペプチドの非ペプチドアナログもまた、これらの方法によって常套的に製造することができる。
【００８２】
　本願発明者は、ＣＤ３３様タンパク質が３つの主要な構造領域を示している５５１残基のタンパク質であることを発見した。第１に、細胞外領域（リガンド結合領域を含む）は、図１（配列番号２）の約１６〜４２２番の残基において同定された。成熟細胞外領域は、発明者によって長さが約４０７アミノ酸で分子量が約４５ｋＤａであると推定された。第２に、膜貫通領域は、図１（配列番号２）の約４２３〜４６４番の残基において同定された。第３に、細胞内領域は、図１（配列番号２）の約４６５〜５５１番の残基において同定された。このように、本発明はさらに、以下から選択されるポリペプチドを含む好ましいＣＤ３３様タンパク質断片を提供する：成熟ＣＤ３３様タンパク質；ＣＤ３３様タンパク質細胞外領域；ＣＤ３３様タンパク質膜貫通領域；ＣＤ３３様タンパク質細胞内領域；または膜貫通領域の一部または全部が削除されているＣＤ３３様タンパク質細胞外領域と細胞内領域。このようなＣＤ３３様タンパク質断片を製造するための方法は上に記載されている。
【００８３】
　レセプターの細胞外領域を、免疫グロブリン（ＩgＧ）の定常領域の一部と合し、キメラポリペプチドを得ることができる。これらの融合タンパク質はしばしば in vivo で半減期の増加を示す。このことは、例えば、ヒトのＣＤ４ポリペプチドの最初の２つの領域と哺乳類の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の様々な領域とからなるキメラタンパク質について証明されている（欧州特許出願公開第３９４,８２７号；Trauneckerら, Nature 331: 84-86 (1988)）。ＩgＧ部分のために、ジスルフィド結合した二量体構造を有する融合タンパク質は、モノマーの細胞外領域単独と比較して、リガンドの結合と中和においてより効果的であり得る（Fountoulakisら, J. Biochem. 270: 3958-3964 (1995))。
【００８４】
　以下に詳細に記載するように、本発明のポリペプチドおよびその断片は、以下に記載するようなＣＤ３３様タンパク質発現を検出するための診断的分析において、またはＣＤ３３様タンパク質の機能を増強または阻害することができるアゴニストおよびアンタゴニストとして有用であるポリクローナルおよびモノクローナル抗体を惹起するために使用し得る。さらに、このようなポリペプチドを酵母２ハイブリッド系において使用し、本発明のアゴニストおよびアンタゴニスト候補でもあるＣＤ３３様タンパク質結合タンパクを「捕捉」することができる。酵母２ハイブリッド系は、Fields および Song, Nature 340: 245-246 (1989)に記載されている。
【００８５】
　この「ＣＤ３３様ポリペプチドおよび断片」の節において引用した各文献の開示全体は、参考のため本明細書の一部を構成する。
【００８６】
（腫瘍性および炎症性疾患の診断と予後）
　腫瘍性または炎症性疾患に冒された哺乳類のある種の組織は、対応する「標準の」哺乳類、即ち腫瘍性または炎症性疾患に冒されていない同じ種の哺乳類と比較して、有意に増加したＣＤ３３様タンパク質遺伝子のコピー数を含み、有意に増加したレベルのＣＤ３３様タンパク質とＣＤ３３様タンパク質をコードするｍＲＮＡを発現すると考えられている。ＣＤ３３様タンパク質の増加したレベルは、腫瘍性または炎症性疾患に冒されていない同じ種の哺乳類から得られた血清と比較したとき、腫瘍性または炎症性疾患に冒された哺乳類から得られたある種の体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液および髄液）において検出されるであろう。このように、本発明は、腫瘍性または炎症性疾患の診断において有用な方法を提供し、その方法は、哺乳類細胞または体液におけるＣＤ３３様タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルまたは遺伝子コピー数を分析すること、およびその遺伝子発現レベルまたは遺伝子コピー数を標準のＣＤ３３様タンパク質遺伝子発現レベルまたは遺伝子コピー数と比較することを含み、それによって標準に対する遺伝子発現レベルまたは遺伝子コピー数の増加が、ある種の腫瘍性または炎症性疾患の指標になる。
【００８７】
　腫瘍性または炎症性疾患の診断が慣用的な方法にしたがって既に行われている場合、本発明は予後の指標として有用である。例えば、骨髄または末梢血の試料を、あらかじめ白血病と診断された患者から採取し、抗ＣＤ３３様タンパク質モノクローナル抗体を用いてＣＤ３３様タンパク質発現に関する試験のための白血病芽球を得ることができる。正常な骨髄細胞の分化のレベルを、発現したＣＤ３３様タンパク質抗原の濃度が反映すると考えられるので、試料をＣＤ３３−ブライト（未成熟）対ＣＤ３３−ダル（成熟）として分類し得る。その白血病芽球が、未成熟の骨髄細胞に関連した量でＣＤ３３様タンパク質抗原を示している患者は、より成熟した細胞に関連した表現型（即ち、比較的低いＣＤ３３様タンパク質発現レベル）を発現している白血病芽球を有する患者よりも悪い臨床的結果を経験するであろう。
【００８８】
　「ＣＤ３３様タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを分析すること」とは、第１の生物学的試料におけるＣＤ３３様タンパク質のレベルまたはＣＤ３３様タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを、直接的（例えば、絶対的なタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを決定または推定すること）または相対的（例えば、第２の生物学的試料におけるＣＤ３３様タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルと比較すること）に、質的または量的に測定または推定することを意図する。「ＣＤ３３様タンパク質をコードする遺伝子のコピー数を分析すること」とは、第１の生物学的試料における遺伝子コピー数を、直接的（例えば、絶対的な遺伝子コピー数を決定または推定すること）または相対的（第２の生物学的試料におけるＣＤ３３様タンパク質遺伝子コピー数と比較すること）に、質的または量的に測定または推定することを意図する。
【００８９】
　好ましくは、ＣＤ３３様タンパク質レベル、ｍＲＮＡレベル、または第１の生物学的試料における遺伝子コピー数を測定または推定し、標準のＣＤ３３様タンパク質レベル、ｍＲＮＡレベル、または遺伝子コピー数と比較する。標準は、腫瘍性または炎症性疾患でない人から得られた第２の生物学的試料から採取されたものである。あるいは、予後の指標としてその方法を使用する場合は、第１および第２の生物学的試料は両方とも、腫瘍性または炎症性疾患を有する人から採取することができ、相対的な発現レベルまたはコピー数を予後を決定するために測定する。当分野において認識されるように、標準のＣＤ３３様タンパク質レベル、ｍＲＮＡレベル、または遺伝子コピー数が分かれば、それを比較のための標準として反復的に使用することができる。
【００９０】
　「生物学的な試料」とは、個人、細胞系、培養組織、またはＣＤ３３様タンパク質またはｍＲＮＡを含む他の供給源から得られるいずれかの生物学的試料を意図する。生物学的試料には、選択された成熟ＣＤ３３様タンパク質またはその可溶性細胞外領域を含む哺乳類の体液（血清、血漿、尿、滑液および髄液など）、好酸球、脾臓組織、単球、好中球、扁桃および骨髄が含まれる。哺乳類から組織生検および体液を得るための方法は当分野においてよく知られている。生物学的試料がｍＲＮＡを含む場合、組織生検は好ましい供給源である。
【００９１】
　本発明は、哺乳類における腫瘍性または炎症性疾患を検出するのに有用である。特に本発明は、哺乳類における以下のタイプの腫瘍性または炎症性疾患の診断または予後において有用である：転移性腫瘍、白血病、リンパ腫、関節炎、およびアレルギー性疾患。好ましい哺乳類には、モンキー、エープ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギおよびヒトが含まれる。好ましいのはヒトである。
【００９２】
　細胞の総ＲＮＡは、Chomoczynski および Sacchi, Anal. Biochem. 162: 156-159 (1987)に記載されている１段階のグアニジウム−チオシアネート−フェノールクロロホルム法などのいずれかの適当な技術を用いて生物学的な試料から単離し得る。次いで、ＣＤ３３様タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを、いずれかの適当な方法を用いて分析する。これらには、ノーザンブッロティング分析、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応と組合わせた逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応と組合わせた逆転写（ＲＴ−ＬＣＲ）が含まれる。
【００９３】
　ノーザンブロッティング分析は、Haradaら, Cell 63: 303-312 (1990)に記載されているように行うことができる。簡潔に言えば、上記のように全ＲＮＡを生物学的試料から調製する。ノーザンブロッティングに関しては、適当な緩衝液（グリオキサル／ジメチルスルホキシド／リン酸ナトリウム緩衝液）中でＲＮＡを変性させて、アガロースゲル電気泳動にかけ、ニトロセルロースフィルター上に移す。ＵＶリンカーによりＲＮＡがフィルターに結合した後、フィルターをホルムアミド、ＳＳＣ、Denhardt's溶液、変性サケ精子、ＳＤＳ、およびリン酸ナトリウム緩衝液を含む溶液中でプレハイブリッド形成させる。いずれかの適当な方法（３２Ｐ−多重プライム（multiprimed）ＤＮＡ標識システム（Amersham））にしたがって標識したＣＤ３３様タンパク質ｃＤＮＡをプローブとして使用する。一晩ハイブリッド形成させた後、フィルターを洗浄してＸ線フィルムに感光させる。本発明にしたがってプローブとして使用するためのｃＤＮＡは、上の節に記載されており、好ましくは少なくとも１５ｂｐの長さであろう。
【００９４】
　Ｓ１マッピングは、Fujitaら, Cell 49: 357-367 (1987)に記載されているように行うことができる。Ｓ１マッピングに使用するためのプローブＤＮＡを調製するために、上記ｃＤＮＡのセンス鎖をテンプレートとして使用して標識されたアンチセンスＤＮＡを合成する。次いで、アンチセンスＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼを用いて消化し、所望の長さの更なるＤＮＡプローブを作成する。このようなアンチセンスプローブは、標的ｍＲＮＡ（即ち、ＣＤ３３様タンパク質をコードするｍＲＮＡ）に対応する保護されたバンドを視覚化するのに有用である。ノーザンブロッティング分析は上記のとおりに行う。
【００９５】
　好ましくは、ＣＤ３３様タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを、Makinoら, Technique 2: 295-301 (1990)に記載されているＲＴ−ＰＣＲ法を用いて分析する。この方法によれば、ポリアクリルアミドゲルバンド中の「アンプリコン」の放射能は、標的ｍＲＮＡの始めの濃度と直線的に相関する。簡潔に言えば、この方法は、生物学的試料から単離された全ＲＮＡを、ＲＴプライマーと適当な緩衝液を含む反応混合物に加えることを含む。プライマーのアニ−リングのためにインキュベーションした後、混合物にＲＴ緩衝液、ｄＮＴＰ、ＤＴＴ、ＲＮase阻害剤および逆転写酵素を加える。インキュベーションしてＲＮＡの逆転写を達成させた後、ＲＴ生成物を標識プライマーを用いるＰＣＲに付す。あるいは、プライマーを標識するよりはむしろ、標識したｄＮＴＰをＰＣＲ反応混合物に入れる。ＰＣＲ増幅は、慣用の技術にしたがってＤＮＡサーマルサイクラーで行うことができる。適当な回数を行って増幅した後、ＰＣＲ反応混合物をポリアクリルアミドゲルで電気泳動する。ゲルを乾燥させた後、適当なバンド（ＣＤ３３様タンパク質をコードするｍＲＮＡに対応する）の放射能をイメージングアナライザーを用いて定量する。ＲＴおよびＰＣＲ反応成分と条件、試薬およびゲル濃度、および標識法は当分野でよく知られている。ＲＴ−ＰＣＲ法に対する変更は、当業者には明らかであろう。
【００９６】
　逆転写された標的ｍＲＮＡを増幅し得るオリゴヌクレオチドプライマーのいずれかの組は、上の節で記載したように使用し設計することができる。
【００９７】
　ＣＤ３３様タンパク質遺伝子コピー数の分析は、例えば、組織試料と上記のｃＤＮＡプローブとの in situ ハイブリット形成のようないずれかの既知の技術にしたがって行うことができる。
【００９８】
　生物学的試料におけるＣＤ３３様タンパク質レベルの分析は、当分野で知られたいずれかの方法を用いて行うことができる。生物学的試料中のＣＤ３３様タンパク質レベルの分析に好ましいのは、抗体に基づいた技術である。例えば、組織におけるＣＤ３３様タンパク質発現を古典的な免疫組織学的方法で調べることができる。これら方法では、特異的な認識は一次抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）によってもたらされ、二次的な検出系は、蛍光、酵素または他のコンジュゲート二次抗体を使用し得る。結果として、病理学的試験のための組織片の免疫組織学的な染色が得られる。ウェスタンブロットまたはドット／スロットアッセイのためのＣＤ３３様タンパク質の遊離のために、例えば尿素や中性洗剤で組織を抽出することもできる（Jalkanen, M.ら, J. Cell. Biol. 101: 976-985 (1985)）；Jalkanen, M.ら, J. Cell. Biol. 105: 3087-3096 (1987)。陽イオン性の固相の使用に基づくこの技術では、単離されたＣＤ３３様タンパク質を標準として用い、ＣＤ３３様タンパク質の定量を行うことができる。この技術はまた、体液にも使用することができる。これらの試料に関して、ＣＤ３３様タンパク質のモル濃度が、血清、血漿、尿、滑液などの異なる体液についてのＣＤ３３様タンパク質含量の標準値を設定する手助けとなるであろう。次いで、ＣＤ３３様タンパク質量の正常な様相は、健康な人から得られる数値を使用して設定することができ、それを被検者から得られた値と比較することができる。
【００９９】
　ＣＤ３３様タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な抗体に基づく他の方法には、酵素を結合した免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）のようなイムノアッセイが含まれる。例えば、ＣＤ３３様タンパク質特異的モノクローナル抗体は、免疫吸着剤および酵素標識されたプローブの両方として使用し、ＣＤ３３様タンパク質を検出および定量することができる。試料中に存在するＣＤ３３様タンパク質の量は、回帰直線コンピュータアルゴリズムを用いて標準の調製物に存在する量を参照して計算することができる。腫瘍抗原を検出するためのこのようなＥＬＩＳＡは、Iacobelliら, Breast Cancer Research and Treatment 11: 19-30 (1988)に記載されている。別のＥＬＩＳＡ分析では、２つの別個の特定のモノクローナル抗体を使用して、体液中のＣＤ３３様タンパク質を検出することができる。この分析では、１つの抗体を免疫吸着剤として使用し、他方の抗体を酵素標識プローブとして使用する。
【０１００】
　上記技術は、本質的に「一段階」または「二段階」の分析として行うことができる。「一段階」の分析は、ＣＤ３３様タンパク質を固定化された抗体に接触させ、洗浄することなくその混合物を標識抗体と接触させることを含む。「二段階」の分析は、混合物を標識抗体と接触させる前に洗浄することを含む。他の慣用的な方法も適当に使用することができる。分析系の１つの成分を担持体に固定化することが通常望ましく、それによって分析系の他の成分がその成分と接触して試料から容易に脱離することが可能になる。
【０１０１】
　適当な酵素標識には、例えば、基質と反応することによって過酸化水素の生成を触媒するオキシダーゼ群の酵素が含まれる。グルコースオキシダーゼは、安定性に優れ、その基質（グルコース）が容易に入手できるため特に好ましい。オキシダーゼの活性のレベルは、酵素標識された抗体と基質の反応によって形成した過酸化水素の濃度を測定することによって分析することができる。酵素以外のほかに、他の適当な標識には、ヨウ素（125Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ）、イオウ（35Ｓ）、重水素（3Ｈ）、インジウム（112Ｉｎ）およびテクネチウム（99ｍＴｃ）などの放射性同位体、フルオレセインおよびローダミンなどの蛍光標識およびビオチンが含まれる。
【０１０２】
　人から得られた生物学的試料中のＣＤ３３様タンパク質レベルの分析に加えて、ＣＤ３３様タンパク質は、造影によって in vivo で検出することもできる。ＣＤ３３様タンパク質の in vivo 造影のための抗体標識またはマーカーには、Ｘ線ラジオグラフィー、ＮＭＲまたはＥＳＲによって検出可能なものが含まれる。例えば、Ｘ線ラジオグラフィーについては、適当な標識には、検出可能な放射線を放射するが患者に対しては際立って有害ではない、バリウムまたはセシウムのような放射性同位元素が含まれる。ＮＭＲおよびＥＳＲのための適当なマーカーには、重水素のような検出可能な特徴的なスピンを有するものが含まれ、それらは、関連するハイブリドーマのための栄養素を標識することによって抗体中に組み込むことができる。
【０１０３】
　適当な検出可能な造影用部分、例えば放射性同位元素（例えば、131Ｉ、112Ｉｎ、99mＴｃ）、放射能不伝導性（radio-opaque）の物質、または核磁気共鳴によって検出可能な物質などで標識されたＣＤ３３様タンパク質特異的な抗体または抗体断片を、腫瘍を検査する哺乳類に投与する（例えば、非経口、皮下または腹腔内投与）。患者の大きさおよび使用する造影系によって診断用画像を作成するに必要な造影用部分の量が決まるであろうということは当分野において理解されよう。放射性同位元素部分の場合、ヒトの患者に関し、注射される放射能の量は普通約５〜２０マイクロキュリーの範囲の99mＴｃである。標識された抗体または抗体断片は、ＣＤ３３様タンパク質を含む細胞の場所に選択的に蓄積されるであろう。in vivo 腫瘍造影は、S.W. Burchielら,“Immunopharmacokinetics of Radiolabelled Antibodies and Their Fragments”（Tumor imaging の第１３章：The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel および B.A. Rhodes 編, Masson Publising Inc. (1982)）に記載されている。
【０１０４】
　本発明において使用するためのＣＤ３３様タンパク質に特異的な抗体は完全なＣＤ３３様タンパク質またはその抗原性ポリペプチド断片に対して惹起し得る。それらは、アルブミンなどの担体タンパク質と一緒に動物系（ウサギまたはマウスなど）に提示してもよく、または十分に長い（少なくとも約２５アミノ酸）場合は担体なしで提示してもよい。
【０１０５】
　本明細書に使用される「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」（Ｍaｂ）は、ＣＤ３３様タンパク質に特異的に結合することができる完全な分子並びに抗体断片（例えばＦａｂおよびＦ(ａｂ')２断片）を意味し包含する。ＦａｂおよびＦ(ａｂ')２断片は、完全な抗体のＦｃ断片を欠いており、循環からより迅速に除去され、完全な抗体の非特異的な組織の結合がより少ないであろう（Wahlら, J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)）。このように、これらの断片は好ましい。
【０１０６】
　本発明の抗体は、様々な方法のいずれかによって製造することができる。例えば、ＣＤ３３様タンパク質またはその抗原性断片を発現している細胞を、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導するために動物に投与することができる。好ましい方法では、ＣＤ３３様タンパク質の調製物を調製し、精製してその調製物が実質的に天然の不純物を含まないようにする。次いで、そのような調製物をより高い比活性のポリクローナル抗血清を産生させるために動物に投与する。
【０１０７】
　最も好ましい方法では、本発明の抗体はモノクローナル抗体である（またはそのＣＤ３３様タンパク質結合断片）。そのようなモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を用いて製造することができる（Kohlerら, Nature 256: 495 (1975)；Kohlerら, Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976); Kohlerら, Eur. J. Immunol. 6: 292 (1976); Hammerlingら, In: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybriomas, Elsevier, N.Y., pp. 563-681 (1981)）。一般に、そのような方法は、動物（好ましくはマウス）をＣＤ３３様タンパク質抗原、またはより好ましくはＣＤ３３様タンパク質発現細胞で免疫する。適当な細胞は、抗ＣＤ３３様タンパク質抗体に結合するそれらの能力によって認識され得る。そのような細胞は、いずれかの適当な組織培地で培養できる。しかし、１０％ウシ胎児血清（約５６℃で不活性化した）、および約１０μg／Lの非必須アミノ酸、約１０００U／mLのペニシリン、および約１００μg／mLのストレプトマイシンを添加した Eagle の改変 Eagle 培地で細胞を培養するのが好ましい。そのようなマウスの脾細胞を抽出し、適当な骨髄腫細胞系と融合する。いずれかの骨髄腫細胞系が本発明に従って使用できる。しかし、アメリカンタイプカルチャーコレクション、ロックビル、メリーランドから入手可能なペアレント骨髄腫細胞系（ＳＰ２Ｏ）を使用することが好ましい。融合した後、得られたハイブリドーマ細胞はＨＡＴ培地で選択的に維持され、次いで Wandsら, (Gastroenterology 80: 225-232 (1981))に記載されているように限界希釈によりクローニングする。そのような選択によって得られたハイブリドーマ細胞を分析してＣＤ３３様タンパク質抗原に結合することができる抗体を分泌するクローンを同定する。
【０１０８】
　あるいは、ＣＤ３３様タンパク質抗原に結合することが可能な更なる抗体を、抗イディオタイプの抗体を使用する２段階の方法で製造することができる。そのような方法は、抗体がそれ自身抗原であるという事実を用いるものであり、従って第２の抗体に結合する抗体を得ることが可能である。この方法によれば、ＣＤ３３様タンパク質特異的抗体を使用して動物、好ましくはマウスを免疫する。次いで、そのような動物の脾細胞を使用してハイブリドーマ細胞を調製し、そのハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、ＣＤ３３様タンパク質特異的抗体と結合するその抗体の能力が、ＣＤ３３様タンパク質抗原によってブロックされ得る抗体を産生しているクローンを同定する。そのような抗体は、ＣＤ３３様タンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプの抗体を含み、動物の免疫に使用して更なるＣＤ３３様タンパク質特異的抗体の形成を誘導することができる。
【０１０９】
　ＦａｂおよびＦ(ａｂ’)２および本発明の抗体の他の断片は、本明細書に記載の方法に従って使用することができる。そのような断片は、パパイン（Ｆａｂ断片を生成する）またはペプシン（Ｆ(ａｂ’)２断片を生成する）のような酵素を用いてタンパク質加水分解的開裂によって典型的に製造する。あるいは、ＣＤ３３様タンパク質結合断片を、組換えＤＮＡ技術を適用することによりまたは化学的に合成することにより製造することができる。
【０１１０】
　in vivo 造影を、ヒトにおける腫瘍診断のため、ＣＤ３３様タンパク質の増加したレベルを検出するために使用する場合は、「ヒト化した」キメラモノクローナル抗体を使用するのが好ましいであろう。このような抗体は、上記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞から得られる遺伝的構築物を使用して製造し得る。キメラ抗体を製造する方法は、当分野で知られている。例えば、Morrison, Science 229: 1202 (1985); Oiら, BioTechniques 4: 214 (1986); Cabillyら, 米国特許第４,８１６,５６７号; Tanigutiら, ＥＰ１７１４９６；Morrisonら，ＥＰ１７３４９４；Neubergerら, ＷＯ８６０１５３３；Robinsonら,ＷＯ８７０２６７１; Boulianneら, Nature 312: 643 (1984); Neubergerら, Nature 314: 268 (1985)を参照。
【０１１１】
　本発明のＣＤ３３様タンパク質特異的抗体のための更なる適当な標識を以下に記載する。適当な酵素標識の例には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、Δ５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナ―ゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼ。
【０１１２】
　適当な放射性同位元素標識の例には、3Ｈ、111Ｉｎ、125Ｉ、131Ｉ、32Ｐ、35Ｓ、14Ｃ、51Ｃｒ、57Ｔｏ、58Ｃｏ、59Ｆｅ、75Ｓｅ、152Ｅｕ、90Ｙ、67Ｃｕ、217Ｃｉ、211Ａｔ、212Ｐｂ、47Ｓｃ、109Ｐｄなどが含まれる。111Ｉｎは、肝臓による125Ｉまたは131Ｉ標識されたモノクローナル抗体の脱ハロゲン化の問題を回避するので、in vivo 造影を使用する場合、好ましい放射性同位体である。さらに、この放射性ヌクレオチドは、造影にとってより好ましいガンマ線放射エネルギーを有する（Perkinsら, Eur. J. Nucl. Med. 10: 296-301 (1085); Carasquilloら, J. Nucl. Med. 28: 281-287 (1987)）。例えば、１−（Ｐ−イソチオシアナトベンジル）−ＤＰＴＡによってモノクローナル抗体にカップリングした111Ｉｎは、非腫瘍性組織、特に肝臓にはほとんど取り込まれないことが示されており、従って腫瘍の所在に対する特異性が高まる（Estebanら,J. Nucl. Med. 28: 861-870 (1987)）。
【０１１３】
　適当な非放射性同元素標識の例には、157Ｇｄ、55Ｍｎ、162Ｄｙ、52Ｔｒ、および56Ｆｅが含まれる。
【０１１４】
　適当な蛍光標識の例には、152Ｅｕ標識、フルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、ο−フタルアルデヒド標識、およびフルオレサミン標識が含まれる。
【０１１５】
　適当なトキシン標識の例には、ジフテリアトキシン、リシン、およびコレラトキシンが含まれる。
【０１１６】
　化学発光標識の例には、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、エクオリン標識が含まれる。
【０１１７】
　核磁気共鳴造影剤の例には、Ｇｄ、Ｍｎおよび鉄などの重金属核が含まれる。
【０１１８】
　上記の標識を抗体に結合するための典型的な技術は、Kennedyら, (Clin. Chim. Acta 70: 1-31 (1976)）、および Schursら, (Clin. Chim. Acta 81: 1-40 (1977)）に記載されている。後者で述べられているカップリング技術は、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸塩法、ジマレイミド法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシ−サクシンイミドエステル法であり、それら方法はすべて参考のために本明細書の一部を構成する。
【０１１９】
（治療法）
　ＣＤ３３は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の約９０％に由来するクローン産生性の白血病細胞により発現する。ＡＭＬを患っている成人の約６０〜７０％は、化学療法後に完全寛解を経験するがとはいえ、これら患者の大多数は白血病の再発により結局死亡する（Robertsonら, Blood 79: 2229-2236 (1992)）。ＣＤ３３と同様、本発明のＣＤ３３様タンパク質も、ＡＭＬの患者の大多数に由来するクローン産生性の白血病細胞により発現すると考えられる。
【０１２０】
　患者が同種骨髄移植により処置される場合は、寛解後の治療がよりうまくいく。しかし、この治療様式はしばしば、患者の年齢のために、または適当なドナーがいないために、人によってはできない。それに代わる処置は、患者が寛解にある間に採取した自己の骨髄を使用するものである。しかし、白血病細胞が残存していると、そのような同種移植はその患者に再発を招着得るであろう。従って、進行したＡＭＬ患者の自己移植組織から白血病細胞を除去する方法に対する必要性がある。そのような方法は、腫瘍細胞を選択的に除きまたは除去するが生着に必要な造血幹細胞は許容することが可能な細胞毒性物質の使用を理想的には含む。研究により、白血球細胞の大部分は持続的な複製ができないことが証明されている。しかし、これらの細胞は、他の細胞とは異なった表面抗原表現型を有すると思われる、即ち、本発明のＣＤ３３様タンパク質抗原を欠損していると考えられる、少数の白血病性の「幹細胞」によって生じる。
【０１２１】
　本発明によって、白血病性の造血細胞をＡＭＬ患者の自己移植組織から除去するための方法が提供される。この方法は、ＡＭＬ患者から、例えば後部腸骨骨稜からの経皮吸引によって骨髄（ＢＭ）を得、Ficollhypaque 密度勾配遠心法によりＢＭ単核細胞を単離し、抗ＣＤ３３様タンパク質モノクローナル抗体（ＭｏＡＢ）と、例えば３〜５回、１５〜３０分間、４〜６℃でインキュベーションした後、ウサギ補体と約３７℃で３０分間インキュベーションすることを含む（至適の特異的な細胞毒性について試験したウサギ補体は、Royら, Leuk. Res 14: 407 (1990)に記載されているように得ることができる）。次いで患者を、Robertsonら, Blood 79 (9): 2229 (1992)に記載されているように骨髄除去化学療法（myeloablative chemotherapy）に付した後、処置した自己のＢＭを標準的な技術に従って再輸液する。本発明によれば、生着に必要な造血細胞が許容されると同時にクローン産生性の腫瘍細胞が骨髄から除かれる。
【０１２２】
　更なる態様では、本発明は、本発明のＣＤ３３様タンパク質抗原を発現している腫瘍細胞を選択的に殺傷またはその増殖を阻害するための in vivo の方法を提供する。そのような腫瘍細胞には、転移性の腫瘍、白血病およびリンパ腫が含まれる。その方法は、ＣＤ３３様タンパク質レセプターのシグナル伝達経路を阻害する有効量のアンタゴニストを患者に投与することを含む。本発明によれば、患者へのそのようなＣＤ３３様タンパク質のアンタゴニストの投与はまた、関節炎および大腸炎を含む炎症性の疾患を処置するのに有用である。
【０１２３】
　本発明において使用するアンタゴニストには、ＣＤ３３様ポリペプチドまたはその断片に対して惹起されたポリクローナルおよびモノクローナル抗体が含まれる。ＣＤ３３様ポリペプチドに対して惹起されるそのようなアンタゴニスト抗体は、Caronら, Cancer Research 52: 6761 (1992); Juricら, Cancer Research (Suppl.) 55: 5908s-5910s (1995); Robertsonら, Blood 79: 2229-2236 (1992)に記載されているように製造することができる。
【０１２４】
　その他の可能性のあるアンタゴニストには、アンチセンス分子が含まれる。アンチセンス技術を使用して、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡによってまたは三重らせんの形成によって遺伝子発現を制御することができる。アンチセンス技術は、例えば、Okano, J., Neurochem. 56: 560 (1990); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)に記載されている。三重らせん形成は、例えば、Leeら, Nucleic Acids Reserch 6: 3073 (1979); Conneyら, Science 241: 456 (1988); Dervanら, Science 251: 1360 (1991)に記載されている。その方法は、ポリヌクレオチドの相補的ＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づいている。例えば、本発明の成熟タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５'コード部分を使用して、約１０〜４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計することができる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的になるように設計し、それにより転写とレセプターの産生を阻止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、 in vivo でｍＲＮＡとハイブリダイズし、ｍＲＮＡ分子のレセプターポリペプチドへの翻訳をブロックする。上記のオリゴヌクレオチドはまた、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡが in vivo で発現してレセプターの産生を阻害し得るように細胞へ送達することができる。
【０１２５】
　本発明の更なるアンタゴニストには、ＣＤ３３様タンパク質の可溶性の形態、即ち、完全長のレセプターの細胞外領域を含むＣＤ３３様タンパク質断片が含まれる。レセプターのそのような可溶性の形態は、天然のものでも合成されたものでもよく、ＣＤ３３レセプターリガンドに対する結合に関して細胞表面のＣＤ３３様タンパク質と競合することにより、シグナル伝達を媒介するＣＤ３３様タンパク質を拮抗する。
【０１２６】
　示すとおり、本発明のポリクローナルおよびモノクローナル抗体アンタゴニストは、ＷＯ９３／２０８４８および米国特許第５,２３９,０６２号に記載されている方法に従って惹起することができる。本明細書中で使用される「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）なる語は、抗原と結合することができる完全な分子並びにその断片（例えば、ＦａｂおよびＦ(ａｂ')２断片など）を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ(ａｂ')２断片は、完全な抗体のＦｃ断片を欠いており、より迅速に循環から除かれ、完全な抗体の非特異的な組織結合を少なくできる（Wahlら, J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)）。
【０１２７】
　本発明の抗体は、本発明のＣＤ３３様タンパク質免疫原を使用して様々な方法のいずれかによって製造することができる。示すように、そのようなＣＤ３３様タンパク質免疫原には、完全長のＣＤ３３様タンパク質ポリペプチド（リーダー配列を含んでいてもいなくてもよい）および細胞外領域、膜貫通領域、および細胞内領域などのＣＤ３３様タンパク質ポリペプチド断片が含まれる。
【０１２８】
　好ましい方法では、本発明の抗体はＭｏＡｂである。そのようなＭｏＡｂは、上記のハイブリドーマ技術を用いて製造することができる（Kohler および Milstein, Nature 256: 495-497 (1975)および米国特許第４,３７６,１１０号；Harlowら, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988; Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, New York, NY, 1980; Campbell,“Monoclonal Antibody Technology,”In: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13 (Burdonら編), Elsevier, Amsterdam (1984)）。
【０１２９】
　さらに本発明の範囲内であると意図されるのは、上記のｍＡｂを産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝的構築物を使用して製造されるヒト化されたキメラ抗体である。キメラ抗体の製造方法は当分野において知られている。Morrisonら, Science 229: 1202-1207 (1985); Oiら, BioTechniques 4: 214 (1986)を参照；さらに Cabillyら,米国特許第４,８１６,５６７号（3/28/89）; Taniguchiら, ＥＰＯ特許公開ＥＰ１７１４９６号(2/19/86); Morrisonら,ＥＰＯ特許公開ＥＰ１７３４９４号(3/5/86); Neubergerら,ＰＣＴ公開ＷＯ８６０１５３３号(3/13/86); Robinsonら,ＰＣＴ公開ＷＯ８７０２６７１号 (5/7/87); Boulianneら, Nature 312: 643-646 (1984); Neubergerら, Nature 314: 268-270 (1985)を参照。
【０１３０】
　抗ＣＤ３３様タンパク質ヒト化ＭｏＡｂを製造するための特に好ましい方法は、Caronら, Cancer Res 52: 6761 (1992)に記載されている。
【０１３１】
　ＣＤ３３様タンパク質領域に結合するタンパク質およびその他の化合物も、本発明のアンタゴニスト候補である。そのような結合化合物は、酵母２ハイブリッドシステムを使用して「捕捉」することができる（Fields および Song, Nature 340: 245-246 (1989)）。酵母２ハイブリッドシステムの改良法は、Roger Brentおよび彼の同僚(Gyuris, J.ら, Cell 75: 791-803 (1993); Zervos, A.S.ら, Cell 72: 223-232 (1993))によって記載されている。簡潔に言えば、ＣＤ３３様ポリペプチドの領域を、結合化合物のおとり（bait）として使用する。次いで、陽性のものを、過去に非常に詳細に記載されたとおりに（Gyuris,J.ら, Cell 75: 791-803 (1993)）、ロイシンを欠くプレート上で生育する能力により選択した後、Ｘ−galを添加したプレート上で青く変色する能力についてさらに試験する。好ましくは、酵母２ハイブリッドシステムを本発明に従って使用し、ＣＤ３３様細胞外リガンド結合領域またはＣＤ３３様タンパク質細胞内領域のいずれかに結合する化合物を捕捉する。そのような化合物は、本発明のアンタゴニストの優秀な候補である。このシステムは、ｐ５５およびｐ７５ＴＮＦレセプターの細胞内領域に結合するタンパク質を単離するために以前使用された（９５／３１５４４）。
【０１３２】
　本発明はさらに、腫瘍細胞の選択的な殺傷のためのビークルとして上記のＣＤ３３様タンパク質結合化合物を使用する方法を提供する。
【０１３３】
　ＣＤ３３様タンパク質に対する結合化合物の特異性は、それらの親和性によって決定し得る。その部分の解離定数（ＫＤ＝１／Ｋ、ここでＫは親和性定数）が＜１μＭ、好ましくは＜１００ｎＭ、最も好ましくは＜１ｎＭであれば、そのような特異性が存在する。抗体分子は、典型的に低い範囲のＫＤを有するであろう。ＫＤ＝［Ｒ−Ｌ］／［Ｒ][Ｌ］（ここで[Ｒ]、[Ｌ]および[Ｒ−Ｌ]は、各々、レセプターまたはＣＤ３３様タンパク質（Ｒ）、リガンド、抗体またはペプチド（Ｌ）、およびレセプター−リガンド複合体（Ｒ−Ｌ）の、平衡における濃度である）。典型的には、リガンドまたはペプチドとレセプターまたは抗体との間の結合の相互作用には、静電気相互作用、ファンデルワールス力、および水素結合などの可逆性の非共有結合が含まれる。
【０１３４】
　その他の分析形式には、Receptor-Effector Coupring - A Practical Approach, Hulme編, IRL Press, Oxford (1990)に記載されているような、下方調節(down modulation)、インターナリゼーション(internalization)、またはリン酸化の増加などの相互作用から生じる様々な生理学的または化学的変化の存在または不在の検出を含み得る。
【０１３５】
　ゲロニンは、Gelonium multiforum の種子から精製された糖タンパク質である（分子量約２９〜３０,０００Ｋｄ）。ゲロニンは、強力なリボソーム不活性化植物毒素のクラスに属する。リボーム不活性化植物毒素のこのクラスのその他の構成員はアブリン、リシンおよびモデクシン（modeccin）の鎖である。ゲロニンは、アブリンおよびリシンと同様、哺乳類リボソームの６０Ｓサブユニットに損傷を与えることにより、タンパク質合成を阻害する。ゲロニンは、化学的および物理的な処理に対して安定であるようである。さらに、ゲロニン自身は細胞に結合しないために非毒性であり（高濃度である場合を除いて）、実験室で扱うには安全である。リボソームの不活性化は、不可逆で、コファクターは関与していないようであり、ゲロニンが酵素的に作用していることを示唆する効率で生じる。
【０１３６】
　タンパク質の重量に基づけば、ゲロニンおよびリシンは、タンパク質合成を阻害する最も活性な毒素の１つである。ゲロニンは、タンパク質合成の阻害において、リシンＡ鎖に比べて１０〜１０００倍も活性である。ペプチド様のリシンおよびアブリンは２つの鎖から構成されており、Ａ鎖は毒性単位であり、Ｂ鎖は細胞へ結合することによって作用する。リシンおよびアブリンと異なり、ゲロニンは、１つの鎖から構成されており、細胞へ結合するためのＢ鎖を欠いているために、それ自身は無傷の細胞に対しては比較的毒性がない。
【０１３７】
　哺乳類細胞は、明らかに天然のゲロニン分子に結合および／またはインターナライズする能力を欠いている。本発明のＣＤ３３様タンパク質結合化合物とゲロニンの複合体は、ゲロニンを細胞へ結合するための特定の方法とゲロニン−結合化合物複合体のインターナリゼーションのための経路の両方を提供する。
【０１３８】
　ＣＤ３３様タンパク質結合化合物がＭｏＡｂである場合、イムノトキシンの細胞傷害性部分は、細胞傷害剤、または細菌または植物由来の酵素的に活性な毒素、またはそのような毒素の酵素的に活性な断片（「Ａ鎖」）であってよい。酵素的に活性な毒素およびその断片が好ましく、以下のものが例示される：ゲロニン、ジフテリアＡ鎖、ジフテリアトキシンの非結合性の活性断片、エキソトキシンＡ鎖（Pseudomonas aeruginosa 由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、αサルシン、Aleurites fordii タンパク質、ジアンチンタンパク質、Phytoiacca americana タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、momordica charantia インヒビター、クルシン、クロチン、サポナリア、officinalis インヒビター、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、およびエノマイシン。最も好ましいのはゲロニンとの複合体である。
【０１３９】
　抗ＣＤ３３様タンパク質ＭｏＡｂとカップリングしてイムノトキシンを形成し得る生物学的応答修飾因子には、ＩＬ−１、ＩＬ−２、インターフェロン（α、βまたはγ）、ＴＮＦ、ＬＴ、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−６などのリンホカインおよびサイトカインが含まれるがこれらに限られない。これらの生物学的応答修飾因子は、腫瘍細胞に対して様々な作用を有する。それらの作用には、直接的作用による腫瘍細胞殺傷の増大、並びに増大した宿主防御媒介過程による腫瘍細胞殺傷の増大がある。これら生物学的応答修飾因子へのＭｏＡｂの複合体形成は、腫瘍内での選択的な局在を可能にし、よって改良された抗増殖作用を可能にし、一方非標的細胞に対する毒性に導く非特異的作用を抑制する。
【０１４０】
　本発明において有用な細胞傷害剤（およびその誘導体）には、アドリアマイシン、cis-プラチニン複合体、ブレオマイシン、およびメトトレキセートが含まれるがこれらに限られない。これらの細胞傷害剤は、再発性の腫瘍の臨床的管理に有用であるが、その使用は重い副作用と非標的細胞に起こる損傷を伴う。ＭｏＡｂは、腫瘍への送達と腫瘍細胞自身への侵入の増強両方の効果的手段をもたらす、そのような薬剤の有用な担体として働く。さらに、腫瘍への細胞傷害剤の抗体送達は、化学療法剤の有害な作用からの、ＣＤ３３様タンパク質を発現しない肝臓や骨髄幹細胞などのような感受性の部位の保護をもたらすであろう。すべての薬剤部分が、腫瘍または白血病内部に集中する抗体にコンジュゲートされるので、送達システムとしての担体抗体にコンジュゲートした薬剤の使用は、その薬剤自身の用量を少なくすることができる。
【０１４１】
　モノクローナル抗体の複合体は、様々な二機能タンパク質カップリング剤を使用して製造することができる。そのような試薬の例は、ＳＰＤＰ、イミノチオランテ（ＩＴ）、ジメチルアジピミデートなどのイミドエステルの二機能誘導体、ＨＣl、スベリン酸ジサクシンイミジルなどの活性エステル、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド、bib（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなどの bis-アジド化合物、bi-（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミンなどの bis-ジアゾニウム誘導体、トリエン２，６−ジイソシアネートなどのジイソシアネート、および１，５−ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼンなどのbis−活性フッ素化合物である。
【０１４２】
　治療のために in vivo で使用する場合、イムノトキシンをヒトまたは動物の患者に治療上有効な量、即ち腫瘍部分を除去または減少させる量で、または化学療法または放射線治療による早期の処置の後に残存した疾患を取り除く量で投与する。通常、非経口、好ましくは静脈投与する。用量、用法は、その白血病の性質およびその規模、個々のイムノトキシンの特性、例えば、その治療上の指標、患者、および患者の既往歴に依存するであろう。投与するイムノトキシンの量は、典型的には約０．０１〜約１．０mg／kg（患者の体重）の範囲であろう。
【０１４３】
　非経口投与については、イムノトキシンを薬学的に許容し得る非経口用ビークルと一緒に注射可能な（溶液、懸濁液、エマルジョン）単位投与剤型に製剤化する。そのようなビークルは、本質的には非毒性で非治療的なものである。そのようなビークルの例には、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストラン溶液、および５％ヒト血清アルブミンである。固形油脂およびオレイン酸エチルなどの非水性のビークルも使用できる。リポソームは担体として使用できる。ビークルは、同種毒性と化学的安定性を高める物質、例えば緩衝剤や保存剤などのような少量の添加剤を含むことができる。イムノトキシンは、このようなビークル中約０．１mg／ｍL〜１０ｍg／ｍLの濃度で典型的に製剤化する。
【０１４４】
　本発明のイムノトキシンは、骨髄中の腫瘍細胞を殺傷する方法において使用することもできる。この方法では、最初に、白血病などの腫瘍性疾患を有する人から骨髄を取り出す。次いで、その骨髄を細胞破壊に効果的な用量の本発明のイムノトキシンで処理する。
【０１４５】
　本発明を一般的に記載したが、本発明は、説明として記載されるものであって限定を意図するものではない以下の実施例を参照することにより、さらに容易に理解されるであろう。
【実施例】
【０１４６】
実施例１：E. coli における発現
　寄託されたポリヌクレオチドにおけるＣＤ３３様タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ＣＤ３３様タンパク質のアミノ酸のカルボキシ末端の配列およびその遺伝子に対する３'のベクター配列に特異的なＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する。クローニングを助長するための制限部位を含む更なるヌクレオチドを５'および３'配列にそれぞれ加える。
【０１４７】
　５'オリゴヌクレオチドプライマーは、以下の配列
５'ＣＧＣＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＣＣＡＧＴＧＴＡＣＧＡＧ ３'
（配列番号４）を有し、ＮcoＩ部位内で開始点のＡＵＧをコードしている下線部のＮcoＩ制限部位、その後に、図１（配列番号１）のヌクレオチド第８５〜１０２番で示されるヌクレオチド配列を有するＣＤ３３様タンパク質ｃＤＮＡの１８ヌクレオチドを含んでいる。
【０１４８】
　３'プライマーは、以下の配列
５'ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＡＧＡＧＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＡＣＣＣ ３'
（配列番号５）の配列を有し、下線部のＢamＨＩ制限部位、図１（配列番号１）のヌクレオチド第１２８５〜１３０２番で示されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するＣＤ３３様タンパク質ｃＤＮＡの１８ヌクレオチドを含んでいる。
【０１４９】
　制限部位は、これら実施例において細菌での発現に使用する細菌発現ベクターｐＱＥ−６０における制限酵素部位に便利である。（Quiagen, Inc. 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311）ｐＱＥ６０は、アンピシリン抗生物質耐性（「Ａｍｐｒ」）をコードし、細菌複製起点（「ｏｒｉ」）、ＩＰＴＧ誘導可能なプロモーター、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、６−Ｈｉｓタグおよび制限酵素部位を含んでいる。
【０１５０】
　増幅されたＤＮＡおよびベクターｐＱＥ６０を、いずれもＮcoＩおよびＨindIIIで消化した後、互いをライゲーションする。ＣＤ３３様タンパク質をコードする増幅したｃＤＮＡをｐＱＥ６０へ挿入して、そのコード領域を、ベクターのＩＰＴＧ誘導可能プロモーターの下流に、作動可能なように連結されるように、そしてＣＤ３３様タンパク質の翻訳のために適当に位置した開始ＡＵＧとインフレームに配置する。
【０１５１】
　ライゲーション混合物を、標準的な方法を用いてコンピテント E. coli 細胞へ形質転換した。そのような方法は、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, 第２版; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載されている。ｌａｃリプレッサーを発現しカナマイシン耐性（「ｋａｎｒ」）を付与する、プラスミドｐＲＥＰ４の多重コピーを含む E. coli Ｍ１５/rep４株を、ここに記載する実施例の実施において使用する。この株は、ＣＤ３３様タンパク質を発現するのに適当な多くの株うちの単なる１つに過ぎないが、Qiagenから商業的に入手し得る。
【０１５２】
　形質転換体は、アンピシリンの存在下でＬＢプレートで生育する能力によって同定する。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、クローニングしたＤＮＡのアイデンティティーを制限分析によって確認する。
【０１５３】
　所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍL）とカナマイシン（２５μg／ｍL）の両方を添加したＬＢ培地の液体培地中で一晩（「Ｏ／Ｎ」）培養する。
【０１５４】
　Ｏ／Ｎ培養細胞を、約１：１００〜１：２５０に希釈して大規模培養の接種に使用する。６００ｎｍでの光学密度（「ＯＤ６００」）が０．４〜０．６になるまで細胞を培養する。次いで、イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を最終濃度１ｍＭになるように加え、ｌａｃＩリプレッサーを不活性化することにより、ｌａｃリプレッサー感受性プロモーターから転写を誘導する。次いで、細胞をさらに３〜４時間インキュベーションする。標準的な方法により、細胞を遠心によって集め、破砕する。インクルージョンボディーを、常套的な収集技術を用いて破砕した細胞から精製し、８Ｍ尿素中でインクルージョンボディーからタンパク質を可溶化する。可溶化したタンパク質を含む８Ｍ尿素溶液を、２×リン酸緩衝化生理食塩水（「ＰＢＳ」）中、ＰＤ−１０カラムに通し、それにより尿素を除き、緩衝液を交換してタンパク質をリフォールディングする。発現したタンパク質を更なるクロマトグラフィー工程によって精製し、外毒素を除く。次いで、これを滅菌ろ過する。滅菌ろ過されたタンパク質調製物は、２×ＰＢＳ中９５ｍg／ｍLの濃度で保存する。
【０１５５】
実施例２：哺乳類細胞（ＣＨＯ、ＣＯＳおよびその他）における発現
　哺乳類細胞におけるＣＤ３３様タンパク質をコードするｃＤＮＡの一過性発現に用いるベクターの大部分は、ＳＶ４０複製起点を有する。このことにより、ウイルスのＤＮＡ合成の開始に必要なＴ抗原を発現する細胞（例えばＣＯＳ細胞）において高いコピー数でベクターの複製が可能になる。他のいずれの哺乳類細胞系もこの目的に使用できる。
【０１５６】
　典型的な哺乳類の発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始に関与するプロモーターエレメント、タンパク質のコード配列、および転写の終止およびその転写物のポリアデニル化に必要なシグナルを含んでいる。更なるエレメントには、エンハンサー、コザック配列、およびＲＮＡスプライシングのための供与および受容部位が両端にある介在配列を含んでいる。効率性の高い転写は、ＳＶ４０由来の初期および後期プロモーター、例えばＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩなどのレトロウイルス由来の長い末端反復（ＬＴＲ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターにより達成できる。しかし、細胞のシグナル（例えば、ヒトアクチン、プロモーター）も使用できる。本発明の実践において使用するための適当な発現ベクターには、例えば、ｐＳＶＬおよびｐＭＳＧ（Pharmacia, Uppsala, Sweden）、ｐＲＳＶcat（ＡＴＣＣ３７１５２）、ｐＳＶ２dhfr（ＡＴＣＣ３７１４６）およびｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ６７１０９）が含まれる。使用できる哺乳類宿主細胞には、ヒトＨｅｌａ、２８３、Ｈ９、および Jurkart細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７およびＣＶ１アフリカミドリザル細胞、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞が含まれる。
【０１５７】
　別法として、その遺伝子が染色体に組み込まれた安定な細胞系において遺伝子を発現させることができる。dhfr、ｇｐｔ、ネオマイシン、ハイグロマイシン、などの選択可能なマーカーとの共トランスフェクションは、トランスフェクトされた細胞の同定と単離を可能にする。
【０１５８】
　トランスフェクトされた遺伝子を増幅して大量のコードされたタンパク質を発現させることもできる。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）は、目的の遺伝子の数百さらには数千ものコピーを有する細胞系を開発するための有用なマーカーである。他の有用な選択マーカーは、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）酵素である（Murphyら, Biochem J. 227: 277-275 (1991), Bebbingtonら, Bio/Technology 10: 163-175 (1992)）。これらのマーカーを使用して、哺乳類細胞を選択培地で培養し、最も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞系は、染色体に組み込まれた増幅された遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞はタンパク質の製造にしばしば使用される。
【０１５９】
　発現ベクターｐＣ１およびｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター（ＬＴＲ）（Cullenら, Molecular and Cellular Biology, 438-4470 (１９８５年３月)とＣＭＶ−エンハンサーの断片（Boshartら, Cell 41: 521-530 (1985)）を含んでいる。例えば制限酵素開裂部位ＢａｍＨＩ、ＸbalおよびＡsp７１８の多重クローニング部位は、目的の遺伝子のクローニングを助長する。ベクターはさらに、３'イントロン、ラットプレプロインスリン遺伝子のポリアデニル化および終止シグナルを含む。
【０１６０】
実施例２Ａ：ＣＯＳ細胞におけるＣＤ３３様タンパク質の細胞外可溶性領域の発現
　ＣＤ３３様タンパク質をコードするｃＤＮＡを発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Invitrogen, Inc.より入手できる）へクローニングすることにより発現プラスミドを製造する。
【０１６１】
　発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐは、以下のものを含んでいる：（１）E. coli および他の原核細胞における増殖に有効な E. coli 複製起点；（２）プラスミドを含む原核細胞の選択のためのアンピシリン耐性遺伝子；（３）真核細胞における増殖のためのＳＶ４０複製起点；（４）ポリリンカーにおける制限部位によって、ｃＤＮＡが、ＣＭＶプロモーターの発現調節下に便利なように置かれ、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されるように配置された、ＣＭＶプロモーター、ポリリンカー、ＳＶ４０イントロン、およびポリアデニル化シグナル。
【０１６２】
　ＣＤ３３様タンパク質細胞外可溶性領域をコードするＤＮＡ断片とその３'末端へインフレームで融合されたＨＡタグを、ベクターのポリリンカー領域に、組換えタンパク質発現がＣＭＶプロモーターによって指揮されるようにクローニングする。ＨＡタグは、Wilsonら, Cell 37: 767 (1984)に記載されたインフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピト−プに対応する。ＨＡタグの標的タンパク質への融合は、ＨＡエピト−プを認識する抗体による組換えタンパク質の容易な検出を可能にする。
【０１６３】
　プラスミド構築法は、以下のとおりである。多くは、E. coli におけるＣＤ３３様タンパク質の発現に関して上に記載したように、寄託されたクローンのＣＤ３３様タンパク質ｃＤＮＡを便利な制限部位を含むプライマーを用いて増幅する。発現したＣＤ３３様タンパク質の検出、精製および特徴付けを助長するため、プライマーのうち１つは、上記のヘマグルチニンタグ（「ＨＡタグ」）を含んでいる。
【０１６４】
　適当なプライマーには以下のものが含まれ、この実施例において使用される：５'プライマーＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＧＣＴＧＣＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧ３'（配列番号６）は、下線部のＢａｍＨＩ部位と、図１（配列番号１）のヌクレオチド第３７〜５４番に示されるヌクレオチド配列を有するＣＤ３３様タンパク質ｃＤＮＡのコード領域の最初の１８個のヌクレオチドを含む。
【０１６５】
　３'プライマーは、下線部のＸbaＩ部位、終止コドン、ヘマグルチニンタグを含んでおり、図１（配列番号１）に示される膜貫通領域（bps １２８５〜１３０２）の前の、最後の１８bpのヌクレオチド配列に相補的であり、以下の配列を有している：５'ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡＡＧＡＧＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＡＣＣＣ３'（配列番号７）。
【０１６６】
　ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片およびベクター、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐをＢamＨＩおよびＸbaＩで消化した後、ライゲーションする。ライゲーション混合物を E. coli ＳＵＲＥ株（Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037より入手可能）へ形質転換した後、形質転換した培養細胞をアンピシリン培地プレート上に蒔き、それをインキュベーションしてアンピシリン耐性コロニーを生育させる。耐性コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、制限分析とゲル分画によってＣＤ３３様タンパク質をコードする断片の存在について試験する。
【０１６７】
　組換えＣＤ３３様タンパク質の発現のために、例えば Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)に記載されているＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮを用いて上記のようにＣＯＳ細胞を発現ベクターでトランスフェクトする。ベクターによるＣＤ３３様タンパク質の発現条件下で細胞をインキュベーションする。ＣＤ３３様タンパク質／ＨＡ融合タンパク質の発現は、例えば Harlowら, Antibodies： A Laboratory Manual，第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988)に記載されている方法を用いて放射能標識および免疫沈降によって検出する。この目的のため、トランスフェクションの２日後に、細胞を、３５Ｓ−システインを含む培地中で８時間インキュベーションすることによって標識する。細胞および培地を集め、細胞を洗浄し、上で引用したWilsonらに記載されているように、界面活性剤を含むＰＩＰＡ緩衝液：１５０ｍＭ ＮaＣl、１％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、０．５％ＤＯＣ、５０ｍＭ ＴＲＩＳ（ｐＨ７．５）により溶解する。ＨＡ特異的モノクローナル抗体を使用して細胞リゼートおよび培地からタンパク質を沈殿させる。次いで、沈殿したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびオートラジオグラフィーにより分析する。期待されるサイズの発現生成物は細胞リゼートにおいてみられ、陰性対照にはみられなかった。
【０１６８】
実施例２Ｂ：ＣＨＯ発現系を使用するヒトＣＤ３３様タンパク質の発現と精製
　寄託されたヌクレオチドにおけるＣＤ３３様タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ＣＤ３３様タンパク質のカルボキシ末端配列およびその遺伝子に対する３'のベクター配列に特異的なＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する。クローニングを助長するための制限部位を含む更なるヌクレオチドを５'および３'配列にそれぞれ加える。
【０１６９】
　完全長の遺伝子および細胞外可溶性領域をコードするヌクレオチド配列の両方のための５'プライマーは、５'ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＧＣＴＧＣＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧ ３'（配列番号０９）の配列を有し、下線部のＢａｍＨＩ制限部位および図１（配列番号１）のヌクレオチド第３７〜５４番で示されるヌクレオチド配列を有する、ＣＤ３３様タンパク質ｃＤＮＡのコード領域の最初の１８個のヌクレオチドを含んでいる。完全長の遺伝子のための３'プライマーは、ＣＧＣＧＧＴＡＣＣＴＣＡＧＴＧＧＣＴＣＣＴＣＣＡＧＣＣＡＧＧ３'（配列番号８）の配列を有し、下線部のＡsp７１８制限部位および図１（配列番号１）のヌクレオチド第１７１３〜１７３０番で示されるヌクレオチド配列に相補的な配列を有するＣＤ３３様タンパク質ｃＤＮＡのヌクレオチドを含んでいる。細胞外領域のための３'プライマーは、５'ＣＧＣＧＧＴＡＣＣＴＣＡＡＧＡＧＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＡＣＣＣ３'（配列番号１０）の配列を有し、下線部のＡsp７１８制限部位および図１（配列番号１）のヌクレオチド第１２８５〜１３０２番で示されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するＣＤ３３様タンパク質ｃＤＮＡの１８個のヌクレオチドを含んでいる。制限部位は、ＣＨＯ発現ベクターＰＣ４における制限酵素部位に便利である。
【０１７０】
　増幅したＣＤ３３様タンパク質ＤＮＡおよびベクターＰＣ４を両方ともＢamＨＩで消化し、消化されたＤＮＡを互いにライゲーションする。ＣＤ３３様タンパク質ＤＮＡをＢamＨＩ制限したベクターに挿入して、そのＣＤ３３様タンパク質コード領域を、ベクターのプロモーターの下流で作動可能なように連結されるように配置する。ライゲーション混合物を、標準的な方法を用いてコンピテント E. coli 細胞へ形質転換した。そのような方法は、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載されている。
【０１７１】
実施例３：バキュロウイルス発現系におけるＣＤ３３様タンパク質のクローニングおよび発現
　寄託されたクローンにおける、可溶性細胞外領域または完全長ＣＤ３３様タンパク質レセプターのいずれかをコードするｃＤＮＡ配列を、その遺伝子の５'および３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する。
【０１７２】
　細胞外領域または完全長タンパク質のいずれかの発現ための５'プライマーは、５'ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＧＣＴＧＣＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧ ３'（配列番号０９）であり、下線部のＢamＨＩ制限部位および図１（配列番号１）のヌクレオチド第３７〜５４番で示されるヌクレオチド配列を有する、ＣＤ３３様タンパク質ｃＤＮＡのコード領域の最初の１８個のヌクレオチドを含んでいる。以下に記載するように、発現ベクターに挿入すると、ＣＤ３３様タンパク質をコードする増幅された断片の５'末端は有効なシグナルペプチドを与える。真核細胞における翻訳の開始のための有効なシグナルは、Kozak, M., J. Mol. Biol. 196: 947-950 (1987)に記載されているようにその構築物のベクター部分に適切に配置されている。
【０１７３】
　完全長の遺伝子のための３'プライマーは、完全長配列ＣＧＣＧＧＴＡＣＣＴＣＡＧＴＧＧＣＴＣＣＴＣＣＡＧＣＣＡＧＧ（配列番号８）を有し、下線部のＡsp７１８制限部位および図１（配列番号１）のヌクレオチド第１７１３〜１７３０番で示されるヌクレオチド配列に相補的な配列を有するＣＤ３３様タンパク質ｃＤＮＡのヌクレオチドを含んでいる。細胞外領域のための３'プライマーは、５'ＣＧＣＧＧＴＡＣＣＴＣＡＡＧＡＧＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＡＣＣＣ３'（配列番号１０）であり、下線部のＡsp７１８制限部位および図１（配列番号１）のヌクレオチド第１２８５〜１３０２番で示されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するＣＤ３３様タンパク質ｃＤＮＡの１８個のヌクレオチドを含んでいる。
【０１７４】
　増幅した断片を商業的に入手可能なキット（「Geneclean」ＢＩＯ １０１Inc., La Jolla, Ca）を用いて１％アガロースゲルから単離する。次いで、断片をＢamＨＩおよびＡsp７１８で消化し、再び１％アガロースゲルで精製する。この断片をここではＦ２と称する。
【０１７５】
　Summersら, A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555 (1987) に記載されている方法のような標準的な方法を用いて、ベクターｐＡ２を使用し、バキュロウイルス発現系においてＣＤ３３様タンパク質を発現させる。発現ベクターは、Autographa californica 核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリへドリンプロモーターそしてその後に便利な制限部位を含んでいる。組換えウイルスの容易な選択のために、E. coli 由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をポリへドリンプロモーターと同じ方向で挿入し、その後にポリへドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを挿入する。細胞が媒介する、野生型ウイルスＤＮＡとの相同的組換えのために、ポリヘドリン配列をウイルスの配列の両側につなぎ、クローニングされたポリヌクレオチドを発現する生育可能なウイルスを製造する。
【０１７６】
　他の多くのバキュロウイルスベクター、例えばｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１およびｐＡｃＩＭＩがｐＡ２の代わりに使用できる。但し、当業者が容易に認識するように、構築物はインフレームＡＵＧおよびシグナルペプチドなどの、転写、翻訳、転送などのための適切に配置されたシグナルを必要に応じて提供する。そのようなベクターは、特にLuckowら, Virology 170: 31-39に記載されている。
【０１７７】
　当分野で知られている常套的な方法を用いて、プラスミドをＢamＨＩおよびＡsp７１８制限酵素で消化した後、仔ウシ腸内ホスファターゼを用いて脱リン酸化する。次いで、商業的に入手可能なキット（「Geneclean」ＢＩＯ １０１Inc., La Jolla, Ca）を用いて、ＤＮＡを１％アガロースゲルから単離する。このＤＮＡをここではＶ２と称する。
【０１７８】
　Ｆ２断片と脱リン酸化したＶ２断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより、お互いにライゲーションする。E. coli ＨＢ１０１細胞をライゲーションミックスで形質転換し、培養プレート上に広げる。ＢａｍＨＩおよびＡsp７１８を用いて個々のコロニー由来のＤＮＡを消化した後、その消化産物をゲル電気泳動により分析することによって、ヒトＣＤ３３様タンパク質遺伝子を有するプラスミドを含む細菌を同定する。クローニングされた断片の配列を、ＤＮＡ配列決定により確認する。このプラスミドをここではｐＢａｃ／ＣＤ３３様タンパク質と称する。
　５μgのｐＢac／ＣＤ３３様タンパク質と１．０μgの商業的に入手可能な線状化されたバキュロウイルスＤＮＡ（「BaculoGoldＴＭ バキュロウイルスＤＮＡ」，Pharminigen，San Diego, CA）を、Felgnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417 (1987)に記載されたリポフェクション法を用いて共トランスフェクトする。１μｇのBaculoGoldＴＭウイルスＤＮＡと５μｇのプラスミドｐＢac／ＣＤ３３様タンパク質を、５０μＬの血清不含Ｇｒａｃｅ'ｓ培地（Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD）を含むマイクロタイタープレートの滅菌ウェル中で混合する。その後、リポフェクチン１０μＬおよびＧｒａｃｅ'ｓ培地９０μＬを加え、混合し、１５分間室温でインキュベーションする。次いで、トランスフェクション混合物を、１ｍLの血清不含Ｇｒａｃｅ'ｓ培地を含む３５mm組織培養プレートに蒔いたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）に滴加する。プレートを前後に振盪させて新たに加えた溶液を混合させる。次いで、プレートを２７℃で５時間インキュベーションする。５時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除き、１０％ウシ胎児血清を添加した１ｍLのＧｒａｃｅ'ｓ昆虫培地を加える。プレートをインキュベーターに戻し、２７℃で４日間培養を続ける。
【０１７９】
　４日後、上で引用したSummersおよび Smithに記載されたように、上清を集め、プラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Life Technologies Inc., Gaithersburg）を添加したアガロースゲルを使用して、ｇａｌを発現しているクローンの同定と単離を容易にする。そのクローンは青く染色されたプラークを形成する。（この種の「プラークアッセイ」の詳細な記載は、Life Technologies Inc., Gaithersburg, p9-10によって配布される昆虫培養細胞およびバキュロウイルス学についての使用説明書においてもみることもできる）。
【０１８０】
　連続希釈の４日後、ウイルスを細胞に加える。適当なインキュベーションの後、青く染色されたプラークをエッペンドルフピペットのチップで取る。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、２００μLのＧｒａｃｅ'ｓ培地を入れたエッペンドルフチューブ内で再懸濁する。寒天を手短かな遠心により除き、組換えバキュロウイルスを含む上清を用いて、３５ｍｍディッシュに蒔いたＳｆ９細胞を感染させる。４日後、これら培養細胞ディッシュの上清を集め、次いでそれを４℃で保存する。適切に挿入されたＣＤ３３様タンパク質レセプターを含むクローンを、制限マッピングおよび配列決定を含むＤＮＡ解析によって同定する。これをここではＶ−ＣＤ３３様タンパク質と称する。
【０１８１】
　Ｓｆ９細胞を、１０％熱不活性化ＦＢＳを添加したＧｒａｃｅ'ｓ培地で培養する。細胞を、約２（約１〜３）の多重感染度（「ＭＯＩ」）にて組換えバキュロウイルスＶ−ＣＤ３３様タンパク質により感染させる。６時間後に培地を除き、メチオニンおよびシステインを欠くＳＦ９００ＩＩ培地（Life Technologies Inc., Gaithersburg）と交換する。４２時間後、５μＣiの35Ｓ−メチオニンと35Ｓ−システイン（Amershamより入手可能）を加える。細胞をさらに１６時間インキュベーションした後、遠心によりそれらを集め、溶菌し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより、標識したタンパク質を視覚化する。
【０１８２】
実施例４：ＣＤ３３様タンパク質ｍＲＮＡ発現の組織分布
　特に、上で引用した Sambrookらに記載された方法を用いて、ノーザンブロット解析を行い、ヒトの組織におけるＣＤ３３様タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを調べた。本発明のＣＤ３３様タンパク質の全長ヌクレオチド配列（配列番号１）を含むｃＤＮＡプローブを、rediprimeＴＭＤＮＡ標識システム（Amersham Life Science）を用いて製造者の使用説明書に従い３２Ｐで標識した。標識した後、プローブを、ＣＨＡＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００ＴＭカラム（Clontech Laboratories, Inc.）を用い、製造者のプロトコル番号ＰＴ１２００−１にしたがって精製した。次いで、精製された標識プローブを使用して、ＣＤ３３様タンパク質をコードする遺伝子の発現について様々なヒト組織を調べた。
【０１８３】
　様々なヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含む多重組織ノーザン（ＭＴＮ）ブロットを Clontechから得、製造者のプロトコルＰＴ１１９０−１にしたがって ExpressHybＴＭハイブリダイゼーション溶液（Clontech）を使用して標識プローブにより調べた。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の後、ブロットを固定し、−７０℃で一晩フィルムに感光させ、標準的な方法にしたがってフィルムを現像した。
【０１８４】
　図３に示すように、本発明のＣＤ３３様タンパク質をコードする遺伝子の発現は、骨髄、末梢血白血球、および脾臓を含む造血組織において最も高かった（図３、各々レーン１０，１１，１５）が、リンパ節、虫垂、肺および胎盤（図３、各々レーン１４、１２、５および６）などの他の組織においても検出できる。
【０１８５】
　上の説明および実施例で特別に記載した以外にも本発明を実施し得ることは明らかである。
【０１８６】
　上記の教示に照らして、本発明の非常に多くの修飾と変更が可能であり、よってそれらは添付した請求の範囲の範囲内である。
【０１８７】
　本明細書において引用した特許、特許出願、および刊行物の開示はすべて、本明細書の一部を構成する。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】ＣＤ３３様タンパク質のヌクレオチド（配列番号１）および推定アミノ酸（配列番号２）配列を示す。約１〜１５番のアミノ酸は、シグナルペプチドを示し（最初の下線の配列）、約１６〜約４２２番のアミノ酸は細胞外領域を示し（最初と２番目の下線の間の配列）、約４２３〜約４６４番のアミノ酸配列は膜貫通領域を示し（２番目の下線の配列）、そして約４６５〜約５５１番のアミノ酸配列は細胞内領域を示す（残りの配列）。
【図２】本発明のＣＤ３３様タンパク質（配列番号２）とヒト分化抗原ＣＤ３３（配列番号３）との間のアミノ酸配列の類似の領域を示すアミノ酸配列の比較である。
【図３】ヒトＣＤ３３様タンパク質ｍＲＮＡ発現の組織分布を示すノーザンブロットである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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