(57)【要約】      （修正有）【課題】ＳＣＮ１Ａに乳幼児ミオクロニーてんかんに関連した新規な遺伝子変異と、この遺伝子変異を利用した診断方法を提供する。【解決手段】乳児由来の特定な塩基配列において、以下の群：第３０２位ｇがａ、第４２９−４３０位ｇｔが欠失、第５６８位ｔがｃ、第１３０３位ｇがｔ、第２７７２位ｇがｃ、第２７７２位ｇがａ、第２８０１位ｔがａ、第２８０６位ｃがｔ、第２８０７位ｇがａ、第２８２５位ｇがａ、第３４９４−３４９５位ｔｔが欠失、第４０３４位ｔがｃ、第４６４１−４６４３位ａａｔが欠失、第４９０３位ｃがｔ、第５０４５位ｔがｃ、第５０５１位ａがｇ、第５２６６−５２６８位ｔｔｔが欠失、第５３１２位ａがｇ、第５７０４位ｃがｔ、より許容選択される１以上の変異を有するポリヌクレオチドと、前記ヌクレオチド変異によって生じるアミン酸変異を有するポリペプチド。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳児重症ミオクロニーてんかんに関連する遺伝子由来のポリヌクレオチドであって、配列番号１の塩基配列において、以下の群：
（ａ）    第３０２位ｇがａに置換；
（ｂ）    第４２９−４３０位ｇｔが欠失；
（ｃ）    第５６８位ｔがｃに置換；
（ｄ）    第１３０３位ｇがｔに置換；
（ｅ）    第２７７２位ｇがｃに置換；
（ｆ）    第２７７２位ｇがａに置換；
（ｇ）    第２８０１位ｔがａに置換；
（ｈ）    第２８０６位ｃがｔに置換；
（ｉ）    第２８０７位ｇがａに置換；
（ｊ）    第２８２５位ｇがａに置換；
（ｋ）    第３４９４−３４９５位ｔｔが欠失；
（ｌ）    第４０３４位ｔがｃに置換；
（ｍ）    第４６４１−４６４３位ａａｔが欠失；
（ｎ）    第４９０３位ｃがｔに置換；
（ｏ）    第５０４５位ｔがｃに置換；
（ｐ）    第５０５１位ａがｇに置換；
（ｑ）    第５２６６−５２６８位ｔｔｔが欠失；
（ｒ）    第５３１２位ａがｇに置換；および
（ｓ）    第５７０４位ｃがｔに置換
より許容選択される１以上の変異を有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１のポリヌクレオチドの一部であって、その変異箇所を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１のポリヌクレオチドまたは請求項２のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヒト染色体ＤＮＡ由来のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１または請求項３のポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するためのプライマーセットであって、一方のプライマーが、変異箇所を含むオリゴヌクレオチドまたはその相補配列であるプライマーセット。
【請求項５】
請求項１のポリヌクレオチドまたは請求項２のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項６】
乳児重症ミオクロニーてんかんに関連する遺伝子由来の請求項１または３のポリヌクレオチドの発現産物であって、配列番号２のアミノ酸配列において、以下の群：
（Ａ）    第１０１位ＡｔｇがＧｌｎに置換；
（Ｂ）    第１４３位Ｖａｌ以下が配列番号３のアミノ酸配列に置換；
（Ｃ）    第１９０位ＴｒｐがＡｒｇに置換；
（Ｄ）    第４３５位Ｇｌｕ以下が欠失；
（Ｅ）    第９２４位ＭｅｔがＩｌｅに置換；
（Ｆ）    第９２４位ＭｅｔがＩｌｅに置換；
（Ｇ）    第９３４位ＶａｌがＡｌａに置換；
（Ｈ）    第９３６位ＡｒｇがＣｙｓに置換；
（Ｉ）    第９３６位ＡｒｇがＨｉｓに置換；
（Ｊ）    第９４２位Ｔｒｐ以下が欠失；
（Ｋ）    第１１６５位Ｌｅｕ以下が配列番号４のアミノ酸配列に置換；
（Ｌ）    第１３４５位ＬｅｕがＰｒｏに置換
（Ｍ）    第１５４９位Ｍｅｔが欠失；
（Ｎ）    第１６３５位Ａｒｇ以下が欠失；
（Ｏ）    第１６８２位ＰｈｅがＳｅｒに置換；
（Ｐ）    第１６８４位ＴｙｒがＣｙｓに置換；
（Ｑ）    第１７５６位Ｐｈｅが欠失；
（Ｒ）    第１７７１位ＴｙｒがＣｙｓに置換；および
（Ｓ）    第１９０２位Ａｒｇ以下が欠失
より許容選択される１以上の変異を有するポリペプチド。
【請求項７】
請求項６のポリペプチドの一部であって、変異箇所を含むオリゴペプチド。
【請求項８】
請求項７のオリゴペプチドを抗原として作製された抗体。
【請求項９】
乳児重症ミオクロニーてんかんの診断方法であって、被験者から単離した染色体ＤＮＡ中に請求項３のポリヌクレオチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
【請求項１０】
被験者から単離した染色体ＤＮＡまたはそのｍＲＮＡと、請求項１のポリヌクレオチドまたは請求項２のオリゴヌクレオチドがストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか否かを検出する請求項９の方法。
【請求項１１】
被験者から単離した染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを鋳型とし、請求項４のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った場合のＰＣＲ産物の有無を検出する請求項９の方法。
【請求項１２】
乳児重症ミオクロニーてんかんの診断方法であって、被験者から単離した生体試料中に請求項６のポリペプチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
【請求項１３】
被験者から単離した生体試料中に、請求項８の抗体と反応するポリペプチドが存在するか否かを検出する請求項１２の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、乳児重症ミオクロニーてんかんの関連遺伝子変異とその診断方法に関するものでる。さらに詳しくは、点突然変異および欠失変異によって特徴付けられる乳児重症ミオクロニーてんかん関連遺伝子由来のポリヌクレオチドと、その遺伝子産物であるポリペプチド、並びにこれらポリヌクレオチドまたはポリペプチドを対象とする乳児重症ミオクロニーてんかんの診断方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
乳児重症ミオクロニーてんかん（ｓｅｖｅｒｅ  ｍｙｏｃｌｏｎｉｃ  ｅｐｉｌｅｐｃｙ  ｉｎ  ｉｎｆａｎｃｙ：  ＳＭＥＩ）は、乳幼児期に多い熱性けいれんと同様に、発熱時のけいれんを初期症状として発症することが多い。しかしながら、熱性けいれんが予後良好であるのに対し、ＳＭＥＩは、その後もてんかん発作が頻発し、知能の退行などの重大な障害を生じさせる。このため、発熱性のけいれん発作を示した乳幼児に対しては、それが熱性けいれんによるものか、あるいはＳＭＥＩによるものであるかを速やかに診断し、後者である場合には早期の治療処理が必要とされる。その診断は現在、国際抗てんかん連盟の分類および用語委員会（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｅａｇｕｅ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｅｐｉｌｅｐｓｙ）により提出されたガイドラインに基づいて行なわれている（非特許文献１）。
【０００３】
しかしながら、熱性けいれんとＳＭＥＩとは、けいれん発作の状態が極めて類似しているため、初発時の身体症状の観察によって両者を診断することは極めて困難である。そこで、ＳＭＥＩの診断には、遺伝子レベルでの診断に大きな期待が寄せされている。すなわち、ＳＭＥＩの発症には家族性の因果関係が存在するためである（非特許文献２−４）。
【０００４】
ＳＭＥＩに関連した遺伝子変異としては、ニューロンの電位依存性Ｎａ＋チャンネルαサブユニット遺伝子（ＳＣＮＡ１Ａ）の異常が幾つか報告されている（非特許文献５−７）。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＬＡＥ  （１９８９）  Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ，  ３０，  ３８９−３９９．
【非特許文献２】
Ｋａｎｅｋｏ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｒｅｓ．，  ４４（１），  １１−３０．
【非特許文献３】
Ｏｇｕｎｉ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｂｒａｉｎ  Ｄｅｖ．，  ２３（７），  ７３６−７４８．
【非特許文献４】
Ｄｒａｖｅｔ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊｏｈｎ  Ｌｉｂｂｅｙ  Ｃｏ  Ｌｔｄ．，  Ｅａｓｔｌｅｉｇｈ，  ＵＫ，  ８１−１０３．
【非特許文献５】
Ｃｌａｅｓ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．，６８（６），１３２７−１３３２．
【非特許文献６】
Ｏｈｍｏｒｉ，  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２９５（１），  １７−２３．
【非特許文献７】
Ｓｕａｇａｗａｒａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，  ５８（７），  １１２２−１１２４．
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
遺伝子の突然変異が同定されたことによって、ＳＭＥＩの診断や、あるいは予防・治療法の開発に新たな可能性がもたらされている。例えば、熱性けいれんを発症した乳幼児を対象として、変異遺伝子の存在や、変異遺伝子が発現する変異タンパク質の存在を調べることによって、そのけいれん発作がＳＭＥＩによるものであるか否かを事前に高い確率で診断することが可能となる。また、そのような事前診断によって、予防や治療のための処置を早い段階から処方することも可能となる。
【０００７】
しかしながら、ＳＭＥＩの表現型は浸透度が不完全であり、また家族内変異も頻繁にみられるため、遺伝子変異をできる限り多く同定し、複数の変異の総合判断によって診断を行うことが必要である。
【０００８】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、ＳＣＮＡ１Ａ遺伝子に存在するＳＭＥＩに関連した新規の遺伝子変異と、この遺伝子変異を利用したＳＭＥＩ診断方法を提供することを課題としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するものとして、以下の（１）〜（１４）の発明を提供する。
（１）    乳児重症ミオクロニーてんかんに関連する遺伝子由来のポリヌクレオチドであって、配列番号１の塩基配列において、以下の群：
（ａ）    第３０２位ｇがａに置換；
（ｂ）    第４２９−４３０位ｇｔが欠失；
（ｃ）    第５６８位ｔがｃに置換；
（ｄ）    第１３０３位ｇがｔに置換；
（ｅ）    第２７７２位ｇがｃに置換；
（ｆ）    第２７７２位ｇがａに置換；
（ｇ）    第２８０１位ｔがａに置換；
（ｈ）    第２８０６位ｃがｔに置換；
（ｉ）    第２８０７位ｇがａに置換；
（ｊ）    第２８２５位ｇがａに置換；
（ｋ）    第３４９４−３４９５位ｔｔが欠失；
（ｌ）    第４０３４位ｔがｃに置換；
（ｍ）    第４６４１−４６４３位ａａｔが欠失；
（ｎ）    第４９０３位ｃがｔに置換；
（ｏ）    第５０４５位ｔがｃに置換；
（ｐ）    第５０５１位ａがｇに置換；
（ｑ）    第５２６６−５２６８位ｔｔｔが欠失；
（ｒ）    第５３１２位ａがｇに置換；および
（ｓ）    第５７０４位ｃがｔに置換
より許容選択される１以上の変異を有するポリヌクレオチド。
（２）    前記発明（１）のポリヌクレオチドの一部であって、その変異箇所を含むオリゴヌクレオチド。
（３）    前記発明（１）のポリヌクレオチドまたは前記発明（２）のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヒト染色体ＤＮＡ由来のポリヌクレオチド。
（４）    前記発明（１）または（３）のポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するためのプライマーセットであって、一方のプライマーが、変異箇所を含むオリゴヌクレオチドまたはその相補配列であるプライマーセット。
（５）    前記発明（１）のポリヌクレオチドまたは前記発明（２）のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするマイクロアレイ。
（６）    乳児重症ミオクロニーてんかんに関連する遺伝子由来の前記発明（１）または（３）のポリヌクレオチドの発現産物であって、配列番号２のアミノ酸配列において、以下の群：
（Ａ）    第１０１位ＡｔｇがＧｌｎに置換；
（Ｂ）    第１４３位Ｖａｌ以下が配列番号３のアミノ酸配列に置換；
（Ｃ）    第１９０位ＴｒｐがＡｒｇに置換；
（Ｄ）    第４３５位Ｇｌｕ以下が欠失；
（Ｅ）    第９２４位ＭｅｔがＩｌｅに置換；
（Ｆ）    第９２４位ＭｅｔがＩｌｅに置換；
（Ｇ）    第９３４位ＶａｌがＡｌａに置換；
（Ｈ）    第９３６位ＡｒｇがＣｙｓに置換；
（Ｉ）    第９３６位ＡｒｇがＨｉｓに置換；
（Ｊ）    第９４２位Ｔｒｐ以下が欠失；
（Ｋ）    第１１６５位Ｌｅｕ以下が配列番号４のアミノ酸配列に置換；
（Ｌ）    第１３４５位ＬｅｕがＰｒｏに置換
（Ｍ）    第１５４９位Ｍｅｔが欠失；
（Ｎ）    第１６３５位Ａｒｇ以下が欠失；
（Ｏ）    第１６８２位ＰｈｅがＳｅｒに置換；
（Ｐ）    第１６８４位ＴｙｒがＣｙｓに置換；
（Ｑ）    第１７５６位Ｐｈｅが欠失；
（Ｒ）    第１７７１位ＴｙｒがＣｙｓに置換；および
（Ｓ）    第１９０２位Ａｒｇ以下が欠失
より許容選択される１以上の変異を有するポリペプチド。
（７）    前記発明（６）のポリペプチドの一部であって、変異箇所を含むオリゴペプチド。
（８）    前記発明（７）のオリゴペプチドを抗原として作製された抗体。
（９）    乳児重症ミオクロニーてんかんの診断方法であって、被験者から単離した染色体ＤＮＡ中に前記発明（３）のポリヌクレオチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
（１０）  被験者から単離した染色体ＤＮＡまたはそのｍＲＮＡと、前記発明（１）のポリヌクレオチドまたは前記発明（２）のオリゴヌクレオチドがストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか否かを検出する前記発明（９）の方法。
（１１）  被験者から単離した染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを鋳型とし、前記発明（４）のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った場合のＰＣＲ産物の有無を検出する前記発明（９）の方法。
（１２）  乳児重症ミオクロニーてんかんの診断方法であって、被験者から単離した生体試料中に前記発明（６）のポリペプチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
（１３）  被験者から単離した生体試料中に、前記発明（８）の抗体と反応するポリペプチドが存在するか否かを検出する前記発明（１２）の方法。
【００１０】
すなわち、この出願の発明者らは、日本人のＳＭＥＩ患者６１例についてＳＣＮＡ１Ａ遺伝子ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ＿００６９２０：配列番号１：６０４６ｎｔ）の変異を直接シークエンス方により検索した。なお、ＳＭＥＩ患者６１例中、診断ガイドラインの基準を全て満たす患者（２２例）と、症状はＳＭＥＩ患者と同一であるがガイドラインの診断基準とは完全に一致しない患者（以下「ＳＭＥＢ：ｂｏｒｄｅｒｌｉｎｅ  ＳＳＭＥＩ」と記載する）３９例である。
【００１１】
その結果、２６例の患者からそれぞれ１個ずつの変異が見出されたが、既に報告されている変異を除いて、表１に示した（ａ）〜（ｓ）の１９種の新規ヌクレオチド変異を見出した。また、ＳＣＮＡ１Ａ遺伝子におけるこれらのヌクレオチド変異に伴って、その発現産物であるタンパク質（ポリペプチド：配列番号２：１９９９ａａ）には、表１に示した（Ａ）〜（Ｓ）のアミノ酸変異が生じることを見出した。
【００１２】
【表１】
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【００１３】
前記の発明（１）〜（１３）は、以上のとおりの新規な知見に基づいて完成されたものである。
【００１４】
なお、この発明において「許容選択」とは、前記のヌクレオチド変異群（ａ）〜（ｓ）、またはアミノ酸変異群（Ａ）〜（Ｓ）の２以上の変異が存在する場合、その組み合わせの選択が可能であることを意味する。例えば、ヌクレオチド変異（ｅ）および（ｆ）は同一ヌクレオチドに対する異なる置換変異であるため、これらが一つのポリヌクレオチド配列内で同時に存在することはない。従って、変異（ｅ）および（ｆ）の選択が許容されることはない。また、アミノ酸置換（Ｂ）を有するポリペプチドは配列番号２の第１４８位からＣ端側が存在しない短鎖ペプチドであるため、共存しうる変異はアミノ酸変異（Ａ）のみである。同様に、フレームシフトおよび停止コドンを生じさせるアミノ酸変異（Ｄ）、（Ｊ）、（Ｋ）、（Ｎ）は、それらよりＣ端側の変異を共存することはない。
【００１５】
また「ポリヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジンが糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ヌクレオチドＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ；またはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）が１００個以上結合した分子を言い、「オリゴヌクレオチド」とは２−９９個連結した分子を言う。なお、この発明におけるポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは１本鎖または２本鎖であり、１本鎖の場合はセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれか一方である。
【００１６】
「ポリペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）によって互いに結合した３４個以上のアミノ酸残基から構成された分子を意味し、「オリゴヌクレオチド」は２−３３個のアミノ酸残基からなる分子を意味する。
【００１７】
この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９；  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ，  １９９５等に記載されている。
【００１８】
【発明の実施の形態】
この出願の発明（１）は、ヒトＳＣＮＡ１Ａ遺伝子に由来する変異ポリヌクレオチドであって、配列番号１のＤＮＡ配列において、表１に示したヌクレオチド変異（ａ）〜（ｓ）のいずれか１以上を有するポリヌクレオチドである。
【００１９】
この発明（１）のポリヌクレオチドは、例えば、後記の発明（２）のオリゴヌクレオチドをプローブとして、ＳＭＥＩ患者の全ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。また後記の発明（４）のプライマーセットを用い、ＳＭＥＩ患者のｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲによって単離することもできる。あるいは、野生型ＳＣＮＡ１ＡのｃＤＮＡに、市販のミューテーションキット等を用いて前記の塩基置換を導入することによって取得することもできる。得られたｃＤＮＡは、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＮ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法およびＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。
【００２０】
この発明（１）のポリヌクレオチドは、後記発明（１０）のＳＭＥＩ診断方法に使用することができる。また、後記発明（６）のポリペプチドを遺伝子工学的に作成する場合の材料としても使用することができる。
【００２１】
この出願の発明（２）は、前記発明（１）のポリヌクレオチドの一部であって、各々の変異箇所を含む２０〜１００の連続したＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドである。この発明（２）のオリゴヌクレオチドは、公知の方法（例えば、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ（１９８２）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．  Ｑｕａｎｔ．  Ｂｉｏｌ．  ４７：４１１−４１８；  Ａｄａｍｓ（１９８３）Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １０５：６６１；  Ｂｅｌｏｕｓｏｖ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２５：３４４０−３４４４；  Ｆｒｅｎｋｅｌ（１９９５）Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．  １９：３７３−３８０；  Ｂｌｏｍｍｅｒｓ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：７８８６−７８９６；  Ｎａｒａｎｇ（１９７９）Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ６８：９０；  Ｂｒｏｗｎ（１９７９）Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ６８：１０９；  Ｂｅａｕｃａｇｅ（１９８１）Ｔｅｔｒａ．  Ｌｅｔｔ．  ２２：１８５９；  米国特許第４，４５８，０６６号）に記載されているような周知の化学合成技術により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて合成することができる。また、発明（１）のポリヌクレオチドを適当な制限酵素で切断するなどの方法によって作製することもできる。
【００２２】
このようなオリゴヌクレオチドは、特にプローブとして使用する場合には、標識物質によって標識化することができる。標識は、ラジオアイソトープ（ＲＩ）法または非ＲＩ法によって行うことができるが、非ＲＩ法を用いることが好ましい。非ＲＩ法としては、蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法を用いることが好ましい。蛍光物質としては、オリゴヌクレオチドの塩基部分と結合できるものを適宜に選択して用いることができるが、シアニン色素（例えば、Ｃｙ  Ｄｙｅ  ＴＭシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ２−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）などを使用することが好ましい。
【００２３】
発明（２）のオリゴヌクレオチドもまた、後記発明（１０）のＳＭＥＩ診断方法に使用することができる。あるいは、後記発明（７）のオリゴペプチドを遺伝子工学的に作成するための材料として使用することもできる。
【００２４】
この出願の発明（３）は、前記発明（１）ポリヌクレオチドまたは前記発明（２）のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヒト染色体ＤＮＡ由来のポリヌクレオチド（ゲノムＤＮＡ）である。ここで、ストリンジェント（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）な条件とは、前記のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと、染色体由来のゲノムＤＮＡとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、およびその他公知の条件によって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）は増加する。例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、ＮａＣｌ約７５０  ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約７５  ｍＭ以下、より好ましくはＮａＣｌ約５００  ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約５０  ｍＭ以下、最も好ましくはＮａＣｌ約２５０  ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約２５  ｍＭ以下である。ストリンジェントな有機溶媒濃度は、ホルムアミド約３５％以上、最も好ましくは約５０％以上である。ストリンジェントな温度条件は、約３０℃以上、より好ましくは約３７℃以上、最も好ましくは約４２℃以上である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）の濃度、およびキャリアーＤＮＡの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。１つの好まし態様としては、７５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、７５  ｍＭ  クエン酸三ナトリウムおよび１％  ＳＤＳの条件で、３０℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。より好ましい態様としては、５００  ｍＭ  ＮａＣｌ、５０  ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、１％  ＳＤＳ、３５％ホルムアミド、１００  μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡの条件で、３７℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。最も好ましい態様としては、２５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、２５  ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、１％  ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００  μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡの条件で、４２℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。また、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。例えば、洗浄のためのストリンジェントな塩条件は、好ましくはＮａＣｌ約３０  ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約３  ｍＭ以下、最も好ましくはＮａＣｌ約１５  ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約１．５  ｍＭ以下である。洗浄のためのストリンジェントな温度条件は、約２５℃以上、より好ましくは約４２℃以上、最も好ましくは約６８℃以上である。１つの好ましい態様としては、３０  ｍＭ  ＮａＣｌ、３  ｍＭ  クエン酸三ナトリウムおよび０．１％  ＳＤＳの条件で、２５℃の温度により洗浄を行う。より好ましい態様としては、１５  ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５  ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび０．１％  ＳＤＳの条件で、４２℃の温度により洗浄を行��。最も好ましい態様としては、１５  ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５  ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび０．１％  ＳＤＳの条件で、６８℃の温度により洗浄を行うことである。
【００２５】
発明（３）のポリヌクレオチドは、例えば、発明（２）のオリゴヌクレオチドをプローブとして、以上のとおりのストリンジェントはハイブリダイゼーションおよび洗浄処理により、ＳＭＥＩ患者の染色体ＤＮＡから調製したゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。
【００２６】
この発明（３）のポリヌクレオチドは、後記発明（９）の診断方法において検出対象等となる。
【００２７】
この出願の発明（４）は、前記発明（３）のポリヌクレオチドとその相補配列からなる二本鎖ポリヌクレオチド（ゲノムＤＮＡ）、または前記発明（３）ポリヌクレオチドから転写されるｍＲＮＡをＰＣＲ増幅するためのプライマーセットである。そしてこれらのプライマーセットは、一方のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号１（ＳＣＮＡ１Ａ）のそれぞれの変異（置換または欠失）箇所を含む１５〜３０ｎｔの連続したＤＮＡ配列またはその相補配列からなっている。他方のプライマーは、配列番号１の各変異箇所の５’側または３’側の任意の連続ＤＮＡ配列またはその相補配列とすることができる。
【００２８】
これらのプライマーセットは、それぞれの変異箇所含む配列番号１に基づいて公知のＤＮＡ合成法により作製することができる。また、プライマーの端部にはリンカー配列等を付加することもできる。さらに、配列の設計には、市販のソフトウェア、例えばＯｌｉｇｏＴＭ［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．（米国）製］、ＧＥＮＥＴＹＸ［ソフトウェア開発（株）（日本）製］等を用いることもできる。
【００２９】
この発明（４）のプライマーセットは、後記発明（１２）のＳＭＥＩ診断方法等に使用することができる。
【００３０】
この出願の発明（５）は、前記のポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドをキャプチャープローブとして備えているマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）である。マイクロアレイの作製方法としては、固相担体表面で直接オリゴヌクレオチドを合成する方法（オン・チップ法）と、予め調製したオリゴヌクレオチドを固相担体表面に固定する方法とが知られている。この発明のマイクロアレイは、このいずれの方法でも作成することができる。オン・チップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術および固相合成技術とを組み合わせて、微少なマトリックスの所定の領域での選択的合成を行う方法（マスキング技術：例えば、Ｆｏｄｏｒ，  Ｓ．Ｐ．Ａ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７，  １９９１）等によって行うことができる。一方、予め調製したオリゴヌクレオチドを固相担体表面に固定する場合には、官能基を導入したオリゴヌクレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面にオリゴヌクレオチドを点着し、共有結合させる（例えば、Ｌａｍｔｕｒｅ，  Ｊ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：２１２１−２１２５，  １９９４；  Ｇｕｏ，  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：５４５６−５４６５，  １９９４）。オリゴヌクレオチドは、一般的には、表面処理した固相担体にスペーサーやクロスリンカーを介して共有結合させる。ガラス表面にポリアクリルアミドゲルの微小片を整列させ、そこに合成オリゴヌクレオチドを共有結合させる方法も知られている（Ｙｅｒｓｈｏｖ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４：４９１３，  １９９６）。また、シリカマイクロアレイ上に微小電極のアレイを作製し、電極上にはストレプトアビジンを含むアガロースの浸透層を設けて反応部位とし、この部位をプラスに荷電させることでビオチン化オリゴヌクレオチドを固定し、部位の荷電を制御することで、高速で厳密なハイブリダイゼーションを可能にする方法も知られている（Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉ，  Ｒ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４：１１１９−１１２３，  １９９７）。この発明のいマイクロアレイは、以上のいずれの方法によっても作製することができる。
【００３１】
この出願の発明（６）は、発明（１）または発明（３）のポリヌクレオチドの発現産物であって、配列番号２のアミノ酸配列において、表１に示したアミノ酸変異（Ａ）〜（Ｓ）のいずれか１以上を有するポリペプチドである。
【００３２】
すなわち、これらのポリペプチドにおけるアミノ酸変異は、前記発明（１）のポリヌクレオチドにおけるミスセンス変異または欠失変異によって、正常（野生型）ポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸が変異するか、フレームシフトまたは停止コドンによって短鎖のポリペプチドとなっている。
【００３３】
これらのポリペプチドは、ＳＭＥＩ患者の生体試料から公知の方法に従って単離する方法、それぞれの変異アミノ酸残基を含む配列番号２のアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法、あるいは前記発明（１）のポリヌクレオチド（変異ｃＤＮＡ）を用いて組換えＤＮＡ技術で生産する方法などにより取得することができる。この発明（６）のポリペプチドは、例えば、後記発明（２３）のＳＭＥＩ診断方法の検査対象とすることができる。
【００３４】
この出願の発明（７）は、前記発明（６）のポリペプチドの一部であって、各々のアミノ酸変異を含む５−３０の連続したアミノ酸配列を有するオリゴペプチドである。これらのオリゴペプチドは、所定のアミノ酸配列に基づいて化学的に合成する方法、あるいは発明（６）のポリペプチドを適当なプロテアーゼによって消化する方法等によって作製することができる。これらのオリゴペプチドは、例えば、後記発明（８）の抗体作製のための抗原として使用することができる。
【００３５】
発明（８）の抗体は、前記発明（７）のオリゴペプチドを抗原として作製されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、発明（６）のポリペプチドのエピトープに結合することができる全体分子、およびＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片等が全て含まれる。このような抗体は、例えばポリクローナル抗体の場合には、前記のオリゴペプチドを免疫原として動物を免役した後、血清から得ることができる。あるいは、上記の真核細胞用発現ベクターを注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどが用いられる。また、モノクローナル抗体は、公知のモノクローナル抗体作成法（「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、１９９０年；  ”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ”  Ｊａｍｅｓ  Ｗ．  Ｇｏｄｉｎｇ，  ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９６）に従って作成することができる。これらの抗体は、発明（６）のポリペプチドを特異的に認識することができ、後記発明（１２）の診断方法等に使用することができる。
【００３６】
この出願の発明（９）は、被験者が後年、ＳＭＥＩを発症するか否かを診断する方法である。すなわち、被験者の生体試料から染色体ＤＮＡを単離し、このＤＮＡ中に、発明（３）のポリヌクレオチドが存在する場合に、この被験者をＳＭＥＩハイリスクと判定する。被験者は、熱性けいれん経験者やその家族とすることができるが、それらの者に限定されるものではない。ポリヌクレオチドの検出は、それを直接シークエンシングする方法によっても行うことができるが、発明（１０）または（１１）の方法が好ましい。
【００３７】
発明（１０）の方法では、被験者から単離した染色体ＤＮＡまたはそのｍＲＮＡと、前記発明（１）のポリヌクレオチドまたは発明（２）のオリゴヌクレオチドがストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか否かを検出する。被験者がＳＭＥＩに関連した遺伝子変異を有している場合には、染色体ＤＮＡまたはそのｍＲＮＡとポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下でもハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションは、例えば、前記の標識プローブやマイクロアレイを用いて簡便かつ高精度で行うことができる。標識ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション法としては、具体的には、例えばＡｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅ法、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法等の公知の方法を採用することができる。また、マイクロアレイでの診断は、例えば以下のとおりに行うことができる。すなわち、被験者の生体試料（例えば血液等）から単離したｍＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅する。その際に、標識ｄＮＴＰを取り込ませて標識ｃＤＮＡとする。この標識ｃＤＮＡをマクロアレイに接触させ、マイクロアレイのキャプチャープローブ（オリゴヌクレオチド）にハイブリダイズしたｃＤＮＡを検出する。ハイブリダイゼーションは、９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注して標識ｃＤＮＡ水性液を、マイクロアレイ上に点着することによって実施することができる。点着の量は、１〜１００ｎｌ程度とすることができる。ハイブリダイゼーションは、室温〜７０℃の温度範囲で、６〜２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の標識ｃＤＮＡを除去する。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが好ましい。
【００３８】
また発明（１１）の方法では、被験者から単離した染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを鋳型とし、前記発明（４）のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った場合のＰＣＲ産物の有無を検出する。被験者がＳＭＥＩに関連した遺伝子変異を有している場合には、プライマーセットによって規定されるポリヌクレオチドのＰＣＲ産物が得られる。ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲは公知の方法により行うことができる。ヌクレオチド変異の検出は、ＰＣＲ産物を直接シークエンシングする方法の他に、例えばＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法等を行ってもよい。また、Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｏｌｉｇｏ  Ｂａｓｅ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ法の公知の方法を採用することもできる。
【００３９】
この出願の発明（１２）もまた、被験者が後年、ＳＭＥＩを発症するか否かを診断する方法であり、被験者から単離した生体試料中に、前記発明（６）のポリペプチドが存在する場合に、その被験者をＳＭＥＩハイリスクと判定する。ポリペプチドの存在は様々な公知方法によって行うことができるが、発明（１３）の方法が好ましい。発明（１３）の方法は、発明（８）の抗体を用いる方法であって、特に標識化抗体を用いることによって、簡便かつ高精度の検出が可能となる。標識は、酵素、放射性同位体または蛍光色素を使用することができる。酵素は、ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ｎｕｍｂｅｒが大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常のＥＩＡに用いられる酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。放射性同位体としては、１２５Ｉや３Ｈ等の通常のＲＩＡで用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルオレッセンスイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。放射生同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。また、蛍光色素を用いる場合には、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。さらに、１次抗体と標識化２次抗体を用いたサンドイッチ法（標識として酵素を用いた場合には「ＥＬＩＳＡ法」）も好ましく用いることができる。
【００４０】
以下、前記発明の基礎となった遺伝子変異を確認したスクリーニングの手続と結果を示す。
１．方法
１−１．患者
ＳＭＥＩまたはＳＭＥＢの診断は、まず、小児神経科医により、国際抗てんかん連盟の分類および用語委員会のガイドライン（非特許文献１）等における以下の基準に従った。
（１）家族歴に、てんかんまたは熱性痙攣の高い罹患率があること。
（２）発症前の身体および神経の発育が正常であること。
（３）全身性または一側性の熱性および無熱性の間代性発作、ミオクロニー攣縮の二次的な出現、および頻発性部分発作が生後１年間に出現したこと。
（４）初期の段階における脳波（ＥＥＧ）に発作性波形は存在しないが、光感受性の初期の出現とともに、全身性の棘波、多棘波、および限局性の異常波形が出現したこと。
（５）初期には精神運動性の発育が正常であるが、生後２年目から、失調、錐体路徴候、発作性ミオクローヌスの出現とともに精神遅延が顕在化したこと。
（６）すべての発作型はあらゆる治療手段に対し抵抗性であること。
【００４１】
以上の６基準の全てが満たされた場合に、ＳＭＥＩと診断された。一方、上記の基準に合致している患者に、以下の排他基準がある場合にはＳＭＥＢと診断した。
（７）発作が生後１年以降に始まっている場合。
（８）ミオクロニー発作および／または異型性アブサンスがない場合。
（９）重大な精神運動性遅延の証拠がない場合。
【００４２】
最終的な調査対象は、ＳＭＥＩ２２例（男性９および女性１３）と、ＳＭＥＢ３９例（男性１３および女性２６）である。また健康なボランティア９６例を対照群とした。
１−２．遺伝子分析
ＥＤＴＡ処理した全血標本より、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。ＳＣＮ１Ａ、ＳＣＮ２Ａ、ＳＣＮ１ＢおよびＳＣＮ２Ｂの遺伝子異常のスクリーニングは、自動シーケンサーによる直接的な配列決定法を用いて行った（Ｓｕｇａｗａｒａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，  ５７，  ７０３−７０５；  Ｓｕｇａｗａｒａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９８（１１），  ６３８４−６３８９）。遺伝子の全てのエクソンをＰＣＲ増幅するためのプライマーおよびＰＣＲ反応条件は文献（Ｓｕａｇａｗａｒａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，  ５８（７），  １１２２−１１２４；Ｓｕｇａｗａｒａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，  ５７，  ７０３−７０５）の記載されたものを使用した。各ｍＲＮＡの参考配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋ登録配列を使用した。ヒトＳＣＮ２Ａ：Ｍ９４０５５、ヒトＳＣＮ３Ａ：ＡＪ２５１５０７、ヒトＳＣＮ５Ａ：Ｍ７７２３５、ヒトＳＣＮ８Ａ：ＡＢ０２７５６７．１、ヒトＳＣＮ１０Ａ：ＡＦ１１７９０７．１、ラットｓｃｎ１ａ：Ｍ２２２５３、フグ：Ｄ３７９７７、デンキウナギ：Ｍ２２２５２、ショウジョウバエ：Ｍ３２０７８、イカ：Ｌ１９９７９、クラゲ：ＡＦ０４７３８０。
１−３．統計的分析
異常の発生率の差は、χ２検定を用いた統計的有意性に基づき判定した。Ｐ値が０．０５未満の場合に統計的有意差とした。
２．結果
ＳＭＥＩおよびＳＭＥＢ群の間には、性比、低−および高度の熱誘導性発作、精神の発育遅滞、光感受性、および治療抵抗性発作の頻度などの主要な兆候について何ら有意差がなかった。ＳＭＥＢ３９例では、３例は生後１年以後に初回の発作があり、４例には見かけ上の精神運動の遅延はなく（ＩＱ，ＤＱ＞８０）、また２６例にはミオクロニー攣縮がなかった。光感受性は１１例の患者に観察された［すなわち、ＳＭＥＩ２２例中８例（３６．４％）、ＳＭＥＢ３９例中３例（７．７％）］。従って、光感受性はＳＭＥＢよりもＳＭＥＩにおいて有意であった（ｐ＜０．０５）。
【００４３】
ＳＭＥＩ患者２２例のうち１４例（６３．６％）において、ＳＣＮ１Ａのミスセンス変異３例、ナンセンス変異８例、結果として未成熟の停止を生じるフレームシフト変異２例、インフレーム欠失変異１例が同定された（表２および図１）。またＳＭＥＢ患者３９例のうち１２例（３０．８％）においては、ＳＣＮ１Ａのミスセンス変異９例、ナンセンス変異２例、インフレーム欠失変異１例が検出された（表２および図１）。すなわち図１においてＳＭＥＩの変異は、ミスセンス変異（黒丸数字）、ナンセンス変異（黒四角数字）、結果として停止コドンを生じるフレームシフト（黒三角数字）、およびインフレーム欠失変異（黒ひし形数字）により示されている。またＳＭＥＢの変異はミスセンス変異（白丸数字）、ナンセンス変異（白四角数字）、およびインフレーム欠失変異（白ひし形数字）により示されている。具体的には、ＳＭＥＩにおける変異は以下のとおりである。なお、変異の記載方法は、文献（Ｄｕｎｎｅｎ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ａｎｔｏｎａｒａｋｉｓ，  Ｓ．  （２００１）  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １０９，  １２１−１２４）に従った。
ミスセンス変異（黒丸）：
１．  ｃ．２７７２Ｇ＞Ｃ：  Ｍ９２４Ｉ
２．  ｃ．２８０６Ｃ＞Ｔ：  Ｒ９３６Ｃ
３．ｃ．５０５１Ａ＞Ｇ：  Ｙ１６８４Ｃ
ナンセンス変異（黒四角）：
１．  ｃ．６６４Ｃ＞Ｔ：  Ｒ２２２Ｘ
２．  ｃ．１３０３Ｇ＞Ｔ：  Ｅ４３５Ｘ
３．  ｃ．２１０１Ｃ＞Ｔ：  Ｒ７０１Ｘ
４．  ｃ．２８２５Ｇ＞Ａ：  Ｗ９４２Ｘ
５．  ｃ．４１８９Ｃ＞Ｔ：  Ｒ１３９７Ｘ
６．  ｃ．４９０３Ｃ＞Ｔ：Ｒ１６３５Ｘ
７．  ｃ．５６４４Ｃ＞Ｔ：  Ｒ１８８２Ｘ
フレームシフト変異（黒三角）：
１．  ｃ．４９２−３０ｄｅｌＧＴ：Ｖ１４３ｆｓＸ１４８
２．  ｃ．３４９４−５ｄｅｌＴＴ：Ｌ１１６５ｆｓＸ１１７２
インフレーム変異（黒ひし形）：
ｃ．４６４１−３ｄｅｌＡＡＴ：  Ｍ１５４９ｄｅｌ
またＳＭＥＢにおける変異は以下のとおりである。
ミスセンス変異（白丸）：
１．  ｃ．３０２Ｇ＞Ａ：  Ｒ１０１Ｑ
２．  ｃ．５６８Ｔ＞Ｃ：  Ｗ１９０Ｒ
３．  ｃ．２７７２Ｇ＞Ａ：  Ｍ９２４Ｉ
４．  ｃ．２８０１Ｔ＞Ｃ：  Ｖ９３４Ａ
５．  ｃ．２８０６Ｃ＞Ｔ：  Ｒ９３６Ｃ
６．  ｃ．２８０７Ｇ＞Ａ：  Ｒ９３６Ｈ
７．  ｃ．４０３４Ｔ＞Ｃ：  Ｌ１３４５Ｐ
８．  ｃ．５０４５Ｔ＞Ｃ：  Ｆ１６８２Ｓ
９．  ｃ．５３１２Ａ＞Ｇ：  Ｙ１７７１Ｃ
ナンセンス変異（白四角）：
１．  ｃ．２１０１Ｃ＞Ｔ：  Ｒ７０１Ｘ
２．  ｃ．５７０４Ｃ＞Ｔ：  Ｒ１９０２Ｘ
インフレーム変異（白ひし形）：
ｃ．５２６６−８ｄｅｌＴＴＴ：Ｆ１７５６ｄｅｌ
一方、調べられた領域内では、ＳＣＮ２Ａ、ＳＣＮ３Ａ、およびＳＣＮ２Ｂの変異は検出されなかった。全調査集団６１例の患者のうち、２６例（４２．６％）に変異が見られ、残りのＳＭＥＩ８例とＳＭＥＢ２７例の患者には変異は見られなかった。従って、変異はＳＭＥＢよりもＳＭＥＩにおいて有意に多い（ｐ＜０．０５）。さらに、分子切端ナンセンスまたはフレームシフト変異もＳＭＥＢよりもＳＭＥＩにおいて有意に多く見られた（４５．５対５．１％：ｐ＜０．００１）が、一方ミスセンス変異の発生率では二つの群間に何ら差異がなかった（ＳＭＥＩで１８．２％対ＳＭＥＢで２５．６％、表２）。光感受性と突然変異の間には何ら関係がなかった。
【００４４】
【表２】
2004329153.tif 000004
【００４５】
興味深いことに、そのような変異の中で、一つのナンセンス変異および二つのミスセンス変異がＳＭＥＩおよびＳＭＥＢの双方において見られた（図１）。また、先にＳＭＥＩ患者２例について報告されているナンセンス変異ｃ．２１０１Ｃ＞Ｔ：Ｒ７０１Ｘ（Ｏｈｍｏｒｉ，  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２９５（１），  １７−２３；Ｓｕａｇａｗａｒａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，  ５８（７），  １１２２−１１２４）は、今回の調査でもＳＭＥＩ患者１例と、深度精神運動遅滞のないＳＭＥＢ患者１例において同定された。ミスセンス突然変異（ｃ．２８０６Ｃ＞Ｔ：  Ｒ９３６Ｃ）は、ＳＭＥＩ患者１例およびミオクロニー攣縮のない１例のＳＭＥＢにおいて検出された。また同じアミノ酸の置換をもたらす二つのミスセンス変異（ｃ．２７７２Ｇ＞Ｃ：  Ｍ９２４Ｉおよびｃ．２７７２Ｇ＞Ａ：  Ｍ９２４Ｉ）が、ＳＭＥＩ患者１例およびミオクロニー攣縮のないＳＭＥＢ患者１例において各々同定された。
【００４６】
８例のナンセンス然変異のうち３例は、ＳＭＥＩ日本人患者における初期の報告と同様であった（Ｏｈｍｏｒｉ，  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２９５（１），  １７−２３；Ｓｕａｇａｗａｒａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，  ５８（７），  １１２２−１１２４）。一方、ＳＭＥＩ患者２例において同定された２つのフレームシフト変異は、これまで報告されていない新規変異であった。このようなナンセンス変異およびフレームシフト変異のすべてはヘテロ接合性であり、多くの親の標本が入手されるにつれてｄｅ  ｎｏｖｏであることが判明した。すなわち、１３の症例のうち９例について両親が遺伝的分析を受け、ｄｅ  ｎｏｖｏであることが確認された。１例については母親のみが突然変異をもたないことが確認された。
【００４７】
ＳＣＮ１Ａ内の二つのインフレーム欠失変異（ｃ．４６４１−３ｄｅｌＡＡＴ：  Ｍ１５４９ｄｅｌおよびｃ．５２６６−８ｄｅｌＴＴＴ：Ｆ１７５６ｄｅｌ）は、各々ＳＭＥＩおよびＳＭＥＢであり、それぞれの原因となる遺伝的異常についての新規なメカニズムを提案する（図２）。すなわち、ｃ．４６４１−３ｄｅｌＡＡＴ：  Ｍ１５４９ｄｅｌをもつ患者は１２歳の少女であり、その臨床的表現型はＳＭＥＩの診断基準を満たしている。このヌクレオチド欠失は、ドメインＩＶの第１のセグメント４の高度に保存されたメチオニンを消失させる（図１、図３Ａおよび３Ｂ）。彼女の両親および兄は見かけ上健康であり、２人の妹にはいくつかの熱性痙攣挿間があった。母親はこの変異について陰性であることがわかったが、父親および兄弟のＤＮＡは入手できなかった。ｃ．５２６６−８ｄｅｌＴＴＴ：Ｆ１７５６ｄｅｌをもつ患者は３７歳の女性であり、ミオクロニー攣縮がないことからＳＭＥＢと診断された。このヌクレオチド欠失は、任意のイオンチャンネルにおける保存された構造であるドメインＩＶのセグメント６からフェニルアラニン残基を消失させる（図１、図３Ｃおよび３Ｄ）。これらのインフレーム欠失変異はともに、対象健常者からの１９２個の染色体には見い出されなかった。従って、これらはＳＭＥＩまたはＳＭＥＢに密接に関連した突然変異であることが確認された。
【００４８】
１１個のミスセンス変異が１２例の患者において同定された。それらはすべて新規であり、かつヘテロ接合性であった。各々の突然変異は一つのアミノ酸残基に対して生じており、それらのアミン酸残基は、ヒトのＮａ＋チャンネルのサブユニットのサブタイプのみならず、他種のＮａ＋チャンネルでも高度に保存されている。４つのｄｅ  ｎｏｖｏのミスセンス変異は、ドメインＩＩのポアループ付近の３つの保存されたアミノ酸上に密集していた（図１および図３）。それらのうち、ｃ．２７７２Ｇ＞Ｃまたはｃ．２７７２Ｃ＞Ａのいずれかに起因するミスセンス変異Ｍ９２４Ｉは、各々ＳＭＥＩおよびＳＭＥＢの症例で検出された。ｃ．２８０１Ｔ＞Ｃ：  Ｖ９３４ＡはＳＭＥＩ患者で検出された。ｃ．２８０６Ｃ＞Ｔ：  Ｒ９３６ＣはＳＭＥＩ患者およびＳＭＥＢ患者の双方で同定された。ｃ．２８０７Ｇ＞Ａ：  Ｒ９３６Ｈは、ＳＭＥＢ患者に認められた（図３）。さらに、同定された１１個のミスセンス変異のいずれもが、対象健常者から得られた１９２染色体には見い出されなかった。従って、これらは疾患と密接に関連する変異であることが確認された。
【００４９】
同定されたミスセンス変異は、多くの家族の標本が入手されるにつれてｄｅ  ｎｏｖｏであることが判明した。すなわち、ＳＭＥＩ患者３例のうち２例と、ＳＭＥＢ患者９例のうち４例について分析した。このうち、ミスセンス変異（ｃ．５０４５Ｔ＞Ｃ：  Ｆ１６８２Ｓ）を持つＳＭＥＢ患者の父親は小児期を通じて熱性痙攣挿間があったと報告されている（図４Ａおよび４Ｂ）。この患者の母親および妹は、この変異について陰性であった。このＳＭＥＢ患者は、軽度の脳萎縮症（おそらく新生児仮死により引き起こされた）と、生後１年以降の最初の発作の出現を根拠としてＳＭＥＢと診断されたが、他の点ではＳＭＥＩの診断基準を満たしている。それにもかかわらず、この変異は、ＳＭＥＩ患者のミスセンス変異（ｃ．５０５１Ａ＞Ｇ：  Ｙ１６８７Ｃ、図４Ｃ）近傍の高度に保存された第１６８２位のフェニエルアラニンをセリンに置換しており、これは対象健常者の１９２染色体には全く検出されなかった。
【００５０】
なお、先の報告（Ｏｈｍｏｒｉ，  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２９５（１），  １７−２３）にあるＳＣＮ１Ａ多型（ｃ．３１６９Ａ＞Ｇ：  Ｔ１０５７Ａ）もまた、ＳＭＥＩおよびＳＭＥＢの患者１１例の１１染色体と、健常者２１例の２４染色体において同定された。
【００５１】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、ＳＣＮＡ１Ａに存在する乳児重症ミオクロニーてんかんに関連した新規な遺伝子変異と、この遺伝子変異を利用した乳児重症ミオクロニーてんかん診断方法が提供される。これらの発明によって、乳児重症ミオクロニーてんかんの事前診断を確実に行うことが可能となる。
【００５２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＭＥＩおよびＳＭＥＢにおけるＳＣＮ１Ａ遺伝子変異箇所を示した模式図である。正常な電位依存性Ｎａ＋チャンネルは、３つのサブユニット（１つのαサブユニットと２つの補助的なβサブユニットβ１およびβ２）からなっている。αサブユニットは大きな孔形成性の鐘型分子であり、その発現だけでＮａ＋チャンネルとして機能するには充分である。αサブユニットは相同な４つのドメイン（Ｉ〜ＩＶ）をもち、各々は膜にかかる６個のセグメントからなっている。各ドメインの４番目のセグメントは、電位センサーとして機能する。イオン孔は５番目と６番目のセグメントの間に形成されている（Ｈｉｒｏｓｅ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｂｒａｉｎ  Ｄｅｖ．，２４，  ２１１−２２２）。
【図２】ＳＭＥＩおよびＳＭＥＢの患者における新規なインフレーム欠失変異（ｃ．４６４１−３ｄｅｌＡＡＴ：  Ｍ１５４９ｄｅｌおよびｃ．５２６６−８ｄｅｌＴＴＴ：Ｆ１７５６ｄｅｌ）の解析結果である。Ａは、ｃ．４６４１−３ｄｅｌＡＡＴを検出するための、関連領域のエレクトロフェログラム（波形データ）。矢印はヌクレオチド４６４１〜４６４３を示しており、そこでは一方のアレルにおいてＡＡＴが欠失している。Ｂは、Ｎａ＋チャンネルファミリーにおけるアミノ酸配列の比較である。ヌクレオチドの欠失は、各イオンチャンネルにおける保存された構造であるメチオニン（Ｍ）残基を欠失させた。Ｃは、ｃ．５２６６−８ｄｅｌＴＴＴを検出するための関連領域のエレクロフェログラム。矢印はヌクレオチド５２６６〜５２６８を示しており、そこでは一方のアレルにおいてＴＴＴが欠失している。Ｄは、Ｎａ＋チャンネルファミリーにおけるアミノ酸配列の比較である。ヌクレオチドの欠失は、Ｎａ＋チャンネルに保存されたフェニルアラニン（Ｆ）残基を欠失させている。
【図３】ＳＭＥＩおよびＳＭＥＢ患者におけるＳＣＮ１Ａのミスセンス変異箇所を示す。この領域は各々のチャンネルのイオン孔の一部を形成する。
【図４】ＳＭＥＢ患者と、単純な熱性痙攣歴を有する父親で同定されたミスセンス変異（ｃ．５０４５Ｔ＞Ｃ：  Ｆ１６８２Ｓ）の解析結果である。Ａは、ＳＣＮ１Ａのエクソン２６の関連領域のエレクトロフェログラム。矢印は第５０４５位のヌクレオチドＴからＣへの置換を示す。Ｂは、Ｎａ＋チャンネルファミリーにおけるアミノ酸配列の比較である。変異を含む領域は、αサブユニットユニットのドメインＩＶにおけるセグメント５に局在する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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