(57)【要約】      （修正有）【課題】白血球粘着分子−１（ＬＡＭ−１、Ｌ−セレクチン）の放出形と細胞表面結合形を識別する。【解決手段】ＬＡＭ−１の放出形はヒト血漿中に高レベルで存在する。ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡ分析によって放出ＬＡＭ−１（ｓＬＡＭ−１）を検出する定量方法が開示される。放出ＬＡＭ−１の存在下で細胞表面結合ＬＡＭ−１の特異的検出方法、および細胞表面結合ＬＡＭ−１と反応するが放出ＬＡＭ−１とは反応しない単クローン性抗体を用いる免疫治療の方法もまた開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表面結合性ＬＡＭ−１のＥＧＦ様領域中に存在し放出ＬＡＭ−１中には存在しない抗原決定基へ結合する単クローン性抗体であって、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＨＢ１０８４４のハイブリドーマ細胞株により産生される抗ＬＡＭ１−１単クローン性抗体以外の前記単クローン性抗体。
【請求項２】
単クローン性抗体を産生する請求項１項記載のハイブリドーマ細胞株。
【請求項３】
（ａ）細胞表面結合性ＬＡＭ−１と反応性の単クローン性抗体集団を分離する工程、（ｂ）前記集団をスクリーニングして放出ＬＡＭ−１に非反応性な単クローン性抗体を得る工程、及び（ｃ）細胞表面結合性ＬＡＭ−１には反応性であるが放出ＬＡＭ−１には非反応性である前記単クローン性抗体を採集する工程、から構成される細胞表面結合性ＬＡＭ−１と反応性であるが放出ＬＡＭ−１とは非反応性である単クローン性抗体の分離方法。
【請求項４】
請求項３項記載の方法によって分離された、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＨＢ１０８４４のハイブリドーマ細胞株により産生される抗ＬＡＭ１−１単クローン性抗体以外の単クローン性抗体。
【請求項５】
（ａ）放出ＬＡＭ−１を含有すると見られる媒質中の細胞集団を細胞表面結合性ＬＡＭ−１には反応性であるが放出ＬＡＭ−１には非反応性である単クローン性抗体と接触させる工程、及び
（ｂ）前記抗体が結合する細胞を可視化させる工程、から構成される放出ＬＡＭ−１を含有すると見られる媒質中においてＬＡＭ−１を発現させる細胞の識別方法。
【請求項６】
前記媒質が生物学的液体であることを特徴とする請求項５項記載の方法。
【請求項７】
（ａ）放出ＬＡＭ−１を含有すると見られる媒質中の細胞集団を細胞表面結合性ＬＡＭ−１には反応性であるが放出ＬＡＭ−１には非反応性である単クローン性抗体と接触させる工程、及び
（ｂ）前記抗体が結合する細胞を分離する工程、から構成される放出ＬＡＭ−１を含有すると見られる媒質からＬＡＭ−１を発現させる細胞の分離方法。
【請求項８】
前記媒質が生物学的液体であることを特徴とする請求項７項記載の方法。
【請求項９】
（ａ）画像化剤を細胞表面結合性ＬＡＭ−１には反応性であるが放出ＬＡＭ−１には非反応性である単クローン性抗体へカプラー結合させる工程、
（ｂ）放出ＬＡＭ−１を含有すると見られる媒質中の細胞集団を前記画像化剤と結合した抗体と接触させる工程、及び
（ｃ）前記画像化剤を検出する工程、から構成される放出ＬＡＭ−１を含有すると見られる媒質中においてＬＡＭ−１を発現させる細胞の識別方法。
【請求項１０】
前記媒質が生物学的液体であることを特徴とする請求項９項記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）サンプルを細胞表面結合性ＬＡＭ−１には結合するが放出ＬＡＭ−１には結合しない単クローン性抗体と接触させる工程、及び
（ｂ）結合した前記抗体量を測定する工程、から構成されるサンプル中の細胞表面結合性ＬＡＭ−１量の測定方法。
【請求項１２】
（ａ）サンプルを細胞表面結合性ＬＡＭ−１には結合するが放出ＬＡＭ−１には結合しない第一の単クローン性抗体と接触させる工程、
（ｂ）前記サンプルを放出ＬＡＭ−１と結合する第二の単クローン性抗体と接触させる工程、及び
（ｃ）結合した前記第二の抗体量を測定する工程、から構成されるサンプル中の放出ＬＡＭ−１量の測定方法。
【請求項１３】
前記サンプルが生物学的液体であることを特徴とする請求項１１項または１２項記載の方法。
【請求項１４】
細胞表面結合性ＬＡＭ−１には結合するが放出ＬＡＭ−１には結合しない抗体を含有するサンプル中に存在する細胞表面結合性ＬＡＭ−１量あるいは放出ＬＡＭ−１量の測定に用いられるキット。
【請求項１５】
放出ＬＡＭ−１の存在下でＬＡＭ−１依存性細胞の付着を阻害する薬物製剤への細胞表面結合性ＬＡＭ−１と反応性で放出ＬＡＭ−１と非反応性な単クローン性抗体の利用。
【請求項１６】
放出ＬＡＭ−１の存在下においてリンパ球の組織への移入を阻害する薬物製剤への、細胞表面結合性ＬＡＭ−１とは反応性であるが放出ＬＡＭ−１とは非反応性である単クローン性抗体の利用。
【請求項１７】
細胞表面結合性ＬＡＭ−１のＥＧＦ様領域中に存在するが放出ＬＡＭ−１中には存在せず、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＨＢ１０８４４のハイブリドーマ細胞株により産生される抗ＬＡＭ１−１単クローン性抗体と反応性であることを特徴とする抗原決定基。
【請求項１８】
抗体産生細胞を請求項１７項記載の抗原決定基と接触させ次いで抗体を採集する工程を含むことを特徴とする、細胞表面結合性ＬＡＭ−１と反応性で放出ＬＡＭ−１と非反応性な抗体の生成方法。
【請求項１９】
前記抗体が単クローン性抗体であることを特徴とする請求項１８項記載の方法。
【請求項２０】
細胞表面結合性ＬＡＭ−１と反応性で放出ＬＡＭ−１と非反応性な抗体の生産への請求項１７項記載の抗原決定基の利用。
【請求項２１】
前記抗体が単クローン性抗体であることを特徴とする請求項２０項記載の利用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許出願第０７／７３０５０３号（Tedder, 1991年7月８日出願）（これは、米国特許出願０７／３１３１０９号（1989年２月21日出願、現在出願放棄))の３７ＣＦＲ１．６２に基づく継続出願である）、米国特許出願第０７／７００７７３号（Tedder, 1991年５月15日出願) 、米国特許出願第０７／７３７０９２号（Tedder, 1991年７月29日出願) および米国特許出願第０７／７７０６０８号（Tedder, 1991年10月３日出願) の部分継続出願である。これら全ては参照により本明細書に含まれる。
【０００２】
発明の分野
【０００３】
本発明は、ヒト白血球関連細胞表面蛋白、特に白血球粘着分子−１（ＬＡＭ−１）とその検出方法に関する。
【０００４】
本発明の基となった研究の一部は合衆国政府の基金で行われた。したがって、合衆国政府は本発明について一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００５】
循環系を離れ、組織中に移動する白血球の能力は、免疫反応の重要な特色である。通常、浸潤白血球は、侵入有機体または死細胞もしくは損傷細胞を貪食する。しかし、病的炎症では、浸潤白血球は重篤で、時には致死的な障害を引き起こす可能性がある。白血球仲介性炎症は、成人呼吸窮迫症候群、多臓器不全および再潅流性障害を含むヒトの臨床的徴候の多くに関与している。
【０００６】
幾つかの異なる受容体（レセプター）粘着分子が、白血球が炎症部位の血管内皮を通って移動し、粘着する過程に関与している（Springer, Nature 346:425-434 (1990))。最初の白血球の内皮への粘着に関与する幾つかの分子の１つは、白血球粘着分子−１（ＬＡＭ−１，Ｌ−セレクチン）（Kishimoto ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2244-2248 (1990); Leyら、Blood 77:2553-2555(1991); Spertiniら、J. Immunol. 147:2565-2573 (1991)） である。ＬＡＭ−１は、粘着分子のセレクチン系の１種である（Brownら、J. Cell Biol. 109:421-427 (1989); Siegelmanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:5562-5566 (1989); Tedderら、J. Exp. Med., 170:123-133 (1989)） 。セレクチン系は、マウスＬ−セレクチン、ＭＥＬ−１４（Gallatinら、Nature, 304:30-34 (1983); Laskeyら、Cell, 56:1045-1055 (1989); Siegelmanら、Science 243:1165-1172 (1989)）、内皮−白血球粘着分子−１（ＥＬＡＭ−１、Ｅ−セレクチン）（Bevilacquaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:9238-9243 (1987); Bevilacqua ら、Science 243:1160-1164 (1989); Luscinskasら、J. Immunol. 142:2257 (1989);Luscinskasら、J. Immunol. 146:1617-1625 (1991)） およびＣＤ６２（ＰＡＤＧＥＭ、ＧＭＰ−１４０）(Geng ら、Nature, 343:757-760 (1990); Johnstonら、Cell, 56:1033-1044 (1989); Larsen ら、Cell, 59:305-312 (1989); Larsen ら、Cell, 63:467-474 (1990))を含む。全てのセレクチンは、進化において
関連する遺伝子に由来する(Collinsら、J. Biol. Chem., 266:2466-2478 (1991); Johnstonら、J. Biol. Chem., 34:21381-21385 (1990); Ordら、J. Biol. Chem., 265:7760-7767 (1990); Watsonら、J. Exp. Med., 172:263-272 (1990))、ＮＨ２−末端、Ｃａ＋−依存レクチンドメイン、多数の短コンセンサスリピート（ＳＣＲ）ドメインを伴う表皮性成長因子（ＥＧＦ）様ドメイン、トランスメンブレン領域および細胞質性尾部という特徴を有する。
【０００７】
ＬＡＭ−１は、リンパ球、好中球、単球、好酸球、原始造血細胞および未成熟胸腺細胞を含む殆どのリンパ球表面に発現されている（Griffin ら、J. Immunol. 145:576-584 (1990); Tedderら、J. Immunol. 144:532-540 (1990)）。ＬＡＭ−１は、高度に糖付加された好中球では９５−１０５０００Ｍｒ 、リンパ球では７４０００Ｍｒの蛋白である（Griffin ら、J. Immunol. 145:576-584(1990); Tedderら、Eur. J. Immunol., 20:1351-1355 (1990))。ヒトＬＡＭ−１およびマウスＭＥＬ−１４は、構造的に発現されたリガンドとの反応を介して、抹消リンパ節の高内皮性小静脈（ＨＥＶ）へのリンパ球の結合を仲介し（Imaiら、J. Cell Biol. 113:1213-1221 (1991); Kishimoto ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA87:2244-2248 (1990); Spertiniら、Leukemia, 5:300-308(1991);Stamper Jr.ら、J. Exp. Med., 144:828-833 (1976); Tedderら、J.Immunol. 144:532-540(1990))、さらに炎症部位へのリンパ球、好中球および単球の付着に必要である（Hallmannら、Biochem. Biophys. Res. Commun., 174:236-243 (1991); Jutilaら、J. Immunol. 143:3318-3324 (1989); Lewinsohn ら、J. Immunol. 138:4313-4321 (1987); Smith ら、J. Clin. Invest., 87:609-618 (1991); Spertini ら、J.Immunol., 147:2565-2573 (1991); Watsonら、Nature, 349:164-167 (1991)) 。インビトロでは、ＬＡＭ−１リガンドの内皮細胞表面発現は、炎症性サイトカインに細胞を曝した後でのみ誘発され、内皮性リガンドは、ＨＥＶによって発現されるＬＡＭ−１リガンドと多くの共通の特徴を有する（Smith ら、J. Clin. unvest., 87:609-618 (1991); Spertiniら、J. Immunol. 147:2565-2573(1991)) 。炭水化物硫酸塩およびＬＡＭ−１のレクチンドメインに結合するｍＡｂは、ＬＡＭ−１特異的粘着を抑制する(Imai ら、J. Cell Biol. 113:1213-1221 (1991); Kansasら、J. Cell Biol. 114:351-358 (1991); Spertiniら、J. Immunol. 147:2565-2573 (1991); Stoolmanら、Blood 70:1842-1850 (1987); Yednockら、J. Cell Biol. 104:725-731 (1987); Yednock ら、J. Cell Biol. 104:713-723 (1987)）。ＬＡＭ−１のレクチンドメインは、特異性を決定するためのリガンド結合単位として作用するようであり、一方、ＥＧＦ様ドメインおよびＳＣＲドメインはこの反応の親和性を調節しているらしい(Kansas ら、J. Cell Biol. 114:351-358 (1991); Siegelman ら、Cell, 61:611-622 (1990); Spertini ら、J. Immunol. 147:942-949(1991); Watson ら、J. Cell Biol. 115:235 (1991)）。
【０００８】
病的炎症を起こしている患者を粘着レセプター機能に対する拮抗剤で処置すると、標的内皮細胞が処理できる程度にまで白血球の移動を減少させ、その後の患者の劇的な回復をもたらすことができるということが提唱された。治療剤の局所投与は、白血球と炎症領域に近い内皮との間の粘着反応を競合的に阻害することができる。また治療剤は、播種性炎症をおこしている患者の治療に全身レベルで投与することもできる（Harlan & Liu編、粘着: 炎症性疾患におけるその役割(Adhesion: Its Role in Inflammatory Disease)、W. H. Freeman(印刷中））。
【０００９】
Ｌ−セレクチン固有の特徴は、ヒトＬＡＭ−１およびマウスＭＥＬ−１４は、インビトロで細胞を活性化させた後、細胞表面から放出されるということである(Griffinら、J. Immunol. 145:576-584 (1990); Jungら、J. Immunol.144:3130-3136 (1990); Kishimoto ら、Science 245:1238-1241 (1989); KIshimoto ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2244-2248 (1990); Spertini ら、Leukemia, 5:300-308 (1991)) 。マウスについては、白血球からのＭＥＬ−１４の放出は、インビボで白血球が内皮を通り抜けて炎症部位へ移動することを可能にするために必要かもしれないと言われている（Jutilaら、J. Immunol. 143:3318-3324 (1989); Kishimoto ら、Science 245:1238-1241 (1989)）。これは、白血球粘着調節および内皮の脱粘着のための迅速な手段を提供するであろう。放出されたＬＡＭ−１（ｓ−ＬＡＭ−１）分子のその後の運命と可能性のある機能は不明であるが、ラットの胸部リンパ管に存在する、ＨＥＶへのリンパ球結合を抑制することができる可溶性因子の存在が明らかにされた（Chinら、J. Immunol. 125:1764-1769 (1980))。さらに、この因子は、リンパ球上に存在する構造物と抗原的に関連することが示された（Chinら、J. Immunol. 125:1764-1769 (1980)； Chin ら、J. Immunol. 131:1368-1374 (1983)）。
【００１０】
種々の細胞上に存在する多数の表面分子が放出され、それによって細胞外環境に遊離されることが知られている(Tedder ら、Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 5:305-306 (1991)) 。これらには、成長因子レセプター、並びにインターロイキン−１、インターロイキン−２（ＣＤ２５）、トランスフェリン（ＣＤ７２）、インシュリン、成長ホルモン、腫瘍壊死因子（Porteuら、J. Exp. Med., 172:599-607 (1990)) 、コロニー刺激因子−１(Downingら、Mol. Cell. Biol.9:2890-2896 (1989)) および神経成長因子(DiStefanoら、Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 85:270-274 (1988))のためのレセプターが、ＣＤ８およびＣＤ１４同様含まれる。これらの蛋白は、構造およびアミノ酸配列が極めて多様で、現在理解されている機能的特徴について統一性をもたない。殆どの場合、プロテアーゼは膜の近くでレセプターを切断し、ほぼ無傷の細胞外ドメインを遊離させる（DiStefano ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:270-274 (1988); Downingら、Mol.Cell Biol., 9:2890-2896 (1989); Kishimoto ら、Science 245:1238-1241(1989); Spertini ら、Leukemia, 5:300-308 (1991))。
【００１１】
放出レセプターの多くはリガンド結合能を保持しているが、放出レセプターの明確な機能は解明されていない。したがって、レセプター機能は、細胞表面からレセプターの蛋白分解切断によるだけでなく、細胞外環境中の放出レセプターによってもまた調節されえる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、ＬＡＭ−１の放出形がリガンド結合能を保持している場合、それが存在する結果、ＬＡＭ−１機能の拮抗剤の診断または治療的投与が干渉される可能性がある。レセプターの放出形は、大量に存在する場合、いずれの投与ＬＡＭ−１拮抗剤とも競合的に結合する可能性があり、したがって、診断の成果または治療的養生プログラムの妨げとなる。
【００１３】
発明の要旨
【００１４】
リンパ球および好中球の両方から放出される白血球粘着分子−１（ｓＬＡＭ−１）は、ヒトの血漿中に高水準で存在することが明らかにされたことを報告する。ウェスタンブロット分析および特別に開発した定量的酵素結合免疫吸着検定またはＥＬＩＳＡの２種の方法を用いた。血漿由来の準精製ｓＬＡＭ−１は、サイトカイン活性化内皮へのリンパ球のＬＡＭ−１特異的結合を用量依存態様で抑制した。ＬＡＭ−１依存リンパ球結合の完全な抑制は、８から１５μｇ／ｍｌのｓＬＡＭ−１濃度で達成され、一方生理的濃度のｓＬＡＭ−１は、弱いがしかし一定したリンパ球結合抑制を生じた。血漿中のｓＬＡＭ−１はまた、殆どの抗ＬＡＭ−１ｍＡｂ（２から５μｇ／ｍｌ）の白血球表面への結合を抑制した。しかしながら、ＬＡＭ−１のＥＧＦ様ドメイン内に存在する１つのエピトープはｓＬＡＭ−１では消失し、放出後のレセプターの構造に形態的な変化が生じることを示唆した。
【００１５】
ｓＬＡＭ−１の生理的濃度でさえもレセプターの放出形によってＬＡＭ−１依存リンパ球結合が抑制されるということ、さらに殆どの抗ＬＡＭ−１ｍＡｂの結合が抑制されるということは、ＬＡＭ−１機能に対する拮抗剤の全身投与を必要とする治療計画、または診断技術について相当な問題を提起するであろう。ｓＬＡＭ−１の存在によって、そのような薬剤は有効であるためには過剰量を投与されなければならないであろう。しかしながら、ＬＡＭ−１分子のＥＧＦ様ドメインとその放出形との間でエピトープに相違があるという出願人らの発見は、当該分子の放出形と結合することなく、細胞表面結合レセプターＬＡＭ−１と反応する診断および治療薬剤の開発を可能にした。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の１つの特徴は、一般に、ＬＡＭ−１と反応するが放出形ＬＡＭ−１とは反応しない単クローン性抗体、および該抗体を分離する方法である。
好ましくは、該抗体は、単クローン性抗体、抗ＬＡＭ−１としてＬＡＭ−１に対して同じ反応パターンを有し、最も好ましくは、該抗体は、抗ＬＡＭ−１単クローン性抗体である。本発明はまた、該選択的抗体を診断および治療に応用するために使用する方法を特徴とする。
【００１７】
本発明のまた別の特徴は、サンプル中のＬＡＭ−１またはそのフラグメント量を定量する方法であり、該方法は、結合検定において結合剤またはＬＡＭ−１もしくはそのフラグメントに対するリガンドと該サンプルとを反応させ、さらに標準曲線と該結合検定の結果を比較することを含む。好ましくは、検出されるべきＬＡＭ−１のフラグメントは放出ＬＡＭ−１であり；検定されるべきサンプルは生物学的サンプルで、最も好ましくは該サンプルは患者由来で、結合検定で決定されるＬＡＭ−１またはフラグメントの量は、診断用数値として用いることができ、該結合検定はＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットのいずれかで、該結合剤はＬＡＭ−１抗体である。
【００１８】
本発明のまた別の特徴は、サンプル中のＬＡＭ−１またはそのフラグメントの量を定量するために使用するキットである。該キットは、サンプルの抽出に必要な成分、結合検定に使用するために必要な成分を含む。後者はＬＡＭ−１もしくはそのフラグメントに対する結合剤またはリガンドを含む。
【００１９】
本発明の他の特徴および利点は、以下の好ましい具体例および請求の範囲から明白となろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
まず第一に、ｓＬＡＭ−１−ＥＬＩＳＡの開発は容易で、有効でかつ鋭敏なｓＬＡＭ−１の定量方法を可能にした。血漿中並びに活性化好中球およびリンパ球上清液のｓＬＡＭ−１の直接検出によって、インビボおよびインビトロにおけるＬＡＭ−１白血球表面発現の損失は放出によるものであることが確認された。放出の程度は強く、正常で健常な血液供与者集団では、ｓＬＡＭ−１の平均血清レベルは、１．６±０．８μｇ／ｍｌと決定された。
【００２１】
ＬＡＭ−１の放出形は、細胞結合形とは主要な事項において異なることが分かった。ｓＬＡＭ−１は、抗ＬＡＭ−１ｍＡｂによって識別されるＬＡＭ−１のＥＧＦ様ドメイン内にエピトープを含まないが、一方、このエピトープは容易に細胞表面ＬＡＭ−１で認められる（Kansasら、J. Cell Biol. 114:351-358 (1991); Spertiniら、J. Immunol. 147:942-949 (1991); Tedderら、J. Immunol. 144:532-540 (1990)) 。これは、ＥＬＩＳＡ分析および白血球の免疫蛍光染色における競合抑制の欠如の両方で明らかにされた。ＥＧＦ様ドメインはｓＬＡＭ−１に保持されているので、抗ＬＡＭ−１ｍＡｂ結合の欠如をもたらす、ＬＡＭ−１の三次元構造における変化は放出に続いて生じるということはありそうなことである。ＬＡＭ−１エピトープは、可溶性ＬＡＭ−１−ＩｇＧ融合蛋白上に存在することが容易に示されたので、この反応性の消失は、技術的な問題とは思えない。
【００２２】
ｓＬＡＭ−１の検出と性状決定
【００２３】
血清中のｓＬＡＭ−１は、リンパ球および好中球の両方に由来するようである。なぜならば、好中球から分離されたｓＬＡＭ−１（９５−１０５０００Ｍｒ）の分析およびリンパ球から分離されたｓＬＡＭ−１（７４０００Ｍｒ）の分析によって、対応するＭｒのバンドが得られたからである。ＬＡＭ−１ｍＲＮＡの単一種が同定されているだけであるので（Ord ら、J. Biol. Chem., 265:7760-7767 (1990)）、リンパ球ｓＬＡＭ−１と好中球ｓＬＡＭ−１との間のＭｒの相違は、単一蛋白種の糖付加における相違に起因するということが最も可能性が高い。ｓＬＡＭ−１を生じるＬＡＭ−１の切断は、おそらくエクソンＶＩＩＩでコードされるトランスメンブレン領域の基部であろう（Ordら、上掲書）。この領域における切断は、無傷の細胞性ＬＡＭ−１分子とその放出形との間のＭｒの相違が小さいことの説明となるだろう(Kishimotoら、Proc. Natl. Acad. Sci.USA., 87:2244-2248 (1990); Laskey ら、Cell, 56:1045-1055 (1989); Spertini ら、Leukemia, 5:300-308 (1991))。ｓＬＡＭ−１の濃度は、２種類の別個の手段によって標準化した、０．８５から１．９μｇ／ｍｌの間の範囲にある参考血漿サンプルと比較して決定した。値が１．３μｇ／ｍｌの範囲の平均値は、血漿中に存在するｓＬＡＭ−１の実際の値より控えめな概数を表しているはずで、したがって、今後の全ての計算の基礎として選ばれた。Ｋ５６２−ＬＡＭ−１核酸感染体（トランスフェクタント）での放出実験から得られた実験データに基づく理論的考察によって、この概算の有効性はさらに確証される。各Ｋ５６２−ＬＡＭ細胞に３０から４００００ＬＡＭ−１分子が存在し、さらに、全ての分子（ＭＷ７１０００）がＰＭＡ活性化に続いて放出されると仮定して、ｓＬＡＭの血漿中の濃度は、Ｋ５６２トランスフェクタント（１×１０７細胞／ｍｌ）から放出されるｓＬＡＭ−１の濃度（標準血漿濃度の１．７％）を標準血漿の定量曲線と比較することによって算出できる。この計算にしたがえば、血漿濃度は、２．１から２．８μｇ／ｍｌの範囲に存在するであろう。同様な考えから、血清または血漿で見出されるｓＬＡＭ−１量は、
サンプル調製中に存在する血液白血球によって細胞表面ＬＡＭ−１が放出されて出現したということは殆ど有り得ない。
【００２４】
実際に血清中に見出されるｓＬＡＭ−１の量は、サンプル中に存在する白血球（〜４×１０６／ｍｌ）の細胞表面から最大限に放出されるＬＡＭ−１量（その密度が５０から１０００００レセプター／細胞と仮定して）より１０から２５倍多い。したがって、ｓＬＡＭ−１は、インビボで白血球から細胞表面ＬＡＭ−１の放出が進行することによって生じたにちがいない。
【００２５】
血漿から準精製されたｓＬＡＭ−１は、用量依存態様で、ＴＮＦ活性化内皮へのＬＡＭ−１仲介性リンパ球結合を抑制し、〜８から１５μｇ／ｍｌで完全に抑制した。正常な血液供与者の血漿中で見出されるものと同じようなｓＬＡＭ−１の濃度では、低いが、しかし明瞭な白血球内皮結合の抑制が認められた。循環ｓＬＡＭ−１は、おそらくインビボで機能するであろう。なぜならば、抗ＬＡＭ−１ｍＡｂによる組織免疫化学染色によって、内皮細胞（ＨＥＶ内皮上および炎症部位の両方に）の管腔表面に特異的に結合したｓＬＡＭ−１が明らかにされたからである。
【００２６】
ウェスタンブロット分析による検出
【００２７】
インビトロでは、白血球およびＬＡＭ−１ｃＤＮＡ核酸感染（トランスフェクト）細胞は、細胞表面から培養上清液で検出できるＬＡＭ−１を放出する。この過程がインビボでも起こるか否かを決定するために、抗ＬＡＭ１−３ｍＡｂ（これはレクチンドメイン内のエピトープを識別する）を用いて、正常ヒト血漿から反応性物質を免疫沈降させた。沈澱した物質を続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ニトロセルロースに移し、ＳＣＲ領域内に位置するＬＡＭ−１エピトープと結合する抗ＬＡＭ１−１４ｍＡｂを用いたウェスタンブロット分析によって、ＬＡＭ−１の可溶形の存在を可視化した。ｓＬＡＭ−１の２種の主なｓＬＡＭ−１の同位形（アイソフォーム）が認められたが、それらは〜６２０００Ｍｒアイソフォームと７５−１０００００Ｍｒアイソフォームである。ＰＭＡ刺激リンパ球、好中球およびＬＡＭ−１ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＫ５６２細胞（Ｋ５６２−ＬＡＭ）の培養上清液の分析によって、ｓＬＡＭ−１の異なる、細胞特異的アイソフォームが明らかになった。好中球はｓＬＡＭ−１の７５−１０００００Ｍｒアイソフォームを放出し、これは、おそらく顕著な糖付加によるものと思われるが、上部境界が不明瞭な幅の広いバンドとして移動する（Ord ら、J. Biol. Chem., 265:7760-7767 (1990)）。リンパ球は６２０００Ｍｒアイソフォームを産生し、Ｋ５６２−ＬＡＭ細胞はｓＬＡＭ−１の７１０００１ｍＡｂＭｒ アイソフォームを放出する。上記の分析を用いたとき、非トランスフェクトＫ５６２細胞の上清液からは特異的蛋白は分離されなかった。さらに、血漿または上清液の抗ＬＡＭ１−３ｍＡｂによる予備除去によって、その後のウェスタンブロットの結果の可能性は排除された。したがって、血漿で確認された２種の主要なｓＬＡＭ−１同位形は、リンパ球および好中球の両方におそらく由来するであろう。さらに、レクチン（抗ＬＡＭ１−３）およびＳＣＲ（抗ＬＡＭ１−１４）ドメインと反応するｍＡｂを用いた実験で可視化されたように、血清中のｓＬＡＭ−１はレクチン、ＥＧＦおよびＳＣＲドメインを含んでいた。しかし、先に記載されたように、ｓＬＡＭ−１のＭr は、洗剤可溶化細胞から分離したＬＡＭ−１のそれより小さい（Lasky ら、Cell, 56:1045-1055 (1989); Spertini ら、Leukemia, 5:300-308 (1991)）。
【００２８】
ＥＬＩＳＡによる血漿と血清中のｓＬＡＭ−１の定量
【００２９】
ヒト血漿中に見出されるｓＬＡＭ−１の量を、捕捉抗体として抗ＬＡＭ１−５ｍＡｂを、検出抗体としてビオチン化抗ＬＡＭ１−３ｍＡｂを用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡで定量した。このｍＡｂの特別な組み合わせは最高水準の感度を提供し、それによって〜５ｎｇのｓＬＡＭ−１が容易に検出できた。健常で正常な血液供与者集団の血清中のＥＬＩＳＡ測定ｓＬＡＭ−１レベルは、１．６±０．８１．０μｇ／ｍｌ（ｎ＝６３）であることが分かった。幾人かの供与者では、血漿中のｓＬＡＭ−１レベルも同時に定量され、同様な結果が得られた（１．９±１．０μｇ／ｍｌ、ｎ＝１８）。超遠心の前後で血清または血漿中で同じレベルのｓＬＡＭが見出されるので、血漿中または血清中のｓＬＡＭ−１がなお膜に結合するという可能性は排除された。ｓＬＡＭ−１は、血清または血漿の分離前に少なくとも２４時間まで２０℃で放置された全血中で安定であった。４℃でアザイドの存在下で血清もしくは血漿の３か月までの保存、または凍結融解の繰り返し（１０回まで）では、血清中のｓＬＡＭ−１の検出能に影響は無かった。したがって、ｓＬＡＭ−１はヒト血漿および血清中に比較的高いレベルで存在するようである。
【００３０】
活性化白血球上清中のｓＬＡＭ−１の定量
【００３１】
白血球の刺激または培養は細胞表面からのＬＡＭ−１の放出と関係があった。ｓＬＡＭ−１が蓄積するか否かを決定するために実施した実験では、ｐＬＡＭ−１ｃＤＮＡをトランスフェクトした赤白血病細胞株（Ｋ５６２−ＬＡＭ）から得た培養上清液は、同じ密度に培養したトランスフェクトされていない細胞から得た上清液とは対照的に、検出可能なｓＬＡＭ−１を含むことが分かった。同様に、新しく分離して３７℃で６０分培養した好中球の培養液も検出可能なｓＬＡＭ−１を含んでいた。細胞表面のＬＡＭ−１発現に影響を与えない刺激、顆粒球コロニー刺激因子、インターロイキン１、単球コロニー刺激因子、インターロイキン６、インターフェロンγ、およびインターロイキン４はｓＬＡＭ−１の増加を誘発しなかった。しかしながら、ホルミル化メチオニン−ロイシン−フェニルアラニン、リポポリサッカライド、顆粒球／単球コロニー刺激因子、インターロイキン８およびＴＮＦは、それらの細胞表面発現刺激能に対応してＬＡＭ−１放出を誘発した。３７℃で６０分培養したリンパ球は、ある程度のＬＡＭ−１の放出を引き起こしたが、これはＰＭＡ処理によって強力に増強された。好中球およびリンパ球の（１×１０７細胞／ｍｌ）の活性化に続いて上清液に見出されるｓＬＡＭ−１量の定量では、約１０から３０ｎｇ／ｍｌの間を変動した。しかしながら、２５分以上のリンパ球のＰＭＡ活性化および１０分以上の活性化は、ｓＬＡＭ−１を徐々に分解した。分解はＫ５６２−ＬＡＭ細胞の上清では認められなかったが、ここではｓＬＡＭは２２±６ｎｇ／ｍｌ（１．７±標準血漿の０．５％、ｎ＝１４）の濃度で定常的に見出された。また、フィトヘマグルチニン、コンカナバリンＡ、およびアメリカヤマゴボウ由来有糸分裂促進剤で３から６日３７℃で培養したリンパ球の培養上清では、増加レベルのｓＬＡＭ−１が検出された。これらの有糸分裂促進剤は細胞表面のＬＡＭ−１低下を引き起こすことが知られている（Tedderら、J. Immunol. 144:532-540(1990))。したがって、細胞表面からのＬＡＭ−１の低下は、培養液中のｓＬＡＭ−１の増加に正比例する。
【００３２】
ｓＬＡＭ−１による活性化内皮へのリンパ球結合の抑制
【００３３】
ｓＬＡＭ−１を、塩分画の後抗ＬＡＭ１−３ｍＡｂで記載したように血漿から準精製した。カラム溶出液を濃縮し、存在するｓＬＡＭ−１レベルをＥＬＩＳＡで定量し、〜１５μｇ／ｍｌ（全溶出蛋白の６から１０％）に調整した。ＬＡＭ−１を介した内皮へのリンパ球結合を調べる前に、ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳ中で種々の濃度でｓＬＡＭ−１をサイトカイン活性化内皮細胞とともに保温（１５分、４℃）した。生理的濃度のｓＬＡＭ−１はリンパ球結合の部分的抑制（３２．１±１５．９％、ｎ＝１０）を示しただけで、一方、８μｇ／ｍｌの濃度では殆どのＬＡＭ−１依存リンパ球結合を抑制（５２から１００％）し、１２から１５μｇ／ｍｌではＬＡＭ−１仲介結合はほぼ完全に抑制（９３から１００％）することが分かった。ＬＡＭ−１仲介リンパ球結合は、与えられたｓＬＡＭ−１の濃度における完全な結合と、ＬＡＭ−１仲介粘着を完全に阻害する抗ＬＡＭ１−３ｍＡｂの存在化で見出されるリンパ球結合との間の相違として算出した（Spertiniら、J. Immunol. 147:2565-2573 (1991))。重要なことには、１５μｇ／ｍｌのｓＬＡＭ−１は、抗ＬＡＭ１−３ｍＡｂ単独で得られたものを越えるリンパ球結合抑制は引き起こさなかった。ｓＬＡＭ−１サンプルを検定前に抗ＬＡＭ１−１５ｍＡｂ（これはＬＡＭ−１機能を阻害しない）で予備除去を行ったとき、この調製物は、ｓＬＡＭ−１が該抑制を仲介することを示すリンパ球結合を抑制することはできなかった。したがって、ｓＬＡＭ−１は、その仮説内皮リガンドと結合することによって、内皮へのＬＡＭ−１特異的リンパ球結合を抑制することができるように思える。
【００３４】
正常な生理的濃度（１．５μｇ／ｍｌ）でのｓＬＡＭ−１の抑制能をさらに調べ、リンパ球と内皮との相互反応を変化させることができるか否かを決定した。内皮をＴＮＦ（１００Ｕ／ｍｌ）で種々の時間活性化し、炎症反応の開始時に起こりえるものと同様な態様でＬＡＭ−１リガンドを誘発した。ＬＡＭ−１リガンドの誘発過程で、内皮のｓＬＡＭ−１処理は、一定であるがしかし弱いＬＡＭ−１依存リンパ球結合の抑制を引き起こした（２時間で３０％、３時間で４３％、４時間で４１％、５時間で１５％、および６時間で２２％）。繰り返せば、ｓＬＡＭ−１と抗ＬＡＭ１−３ｍＡｂとの組み合わせは、ｍＡｂ単独で認められたもの以上の抑制をもたらさなかった。したがって、炎症反応の進展時には、ｓＬＡＭ−１は白血球結合過程を変化させることができるが、その影響は、このインビトロ検定では小さいように思える。
【００３５】
血清ｓＬＡＭ−１は抗ＬＡＭ−１ｍＡｂの結合を阻害する
【００３６】
循環ｓＬＡＭ−１の存在は、さらに、抗ＬＡＭ−１ｍＡｂとＬＡＭ−１＋細胞との反応性が血漿によって抑制することができることを示すことによって実証された。リンパ球を未希釈ヒト血漿中で抗ＬＡＭ−１ｍＡｂを用いて染色したとき、ＲＰＭＩ／ＦＣＳ中で飽和状態のｍＡｂの濃度では顕著な染色は得られなかった。次に、リンパ球（１×１０６／１００μｌ）を、自家血漿または免疫沈降によって予備除去した自家血漿で希釈（１：１００）した種々の濃度のＬＡＭ−１に対するｍＡｂとともに保温した。間接免疫蛍光染色が完了した後、フローサイトメトリーで抗体結合を測定した。殆どの場合、血漿の存在によって、ｍＡｂを２から５μｇ／ｍｌで用いたとき、抗ＬＡＭ−１ｍＡｂ染色は抑制された。したがって、〜１３から３３ｐＭＩｇＧ1（ＭＷ１５００００）が、上記に該略したようにして求めた血漿中に存在するｓＬＡＭ濃度（１．６μｇ／ｍｌ）に基づき、〜２１ｐＭｓＬＡＭ−１（ＭＷ７５０００）に結合した。ｍＡｂ結合のｓＬＡＭ依存抑制は、レクチンドメイン（抗ＬＡＭ１−３、−４、および−１０）およびＥＧＦ様ドメイン（抗ＬＡＭ１−５、および−１５）を認識するｍＡｂについて血漿中で認められた。対照的に、抗ＬＡＭ１−１ｍＡｂ（これはＥＧＦ様ドメインのエピトープに結合する）の結合は、血漿の存在によって顕著には抑制されなかった。
【００３７】
ＬＡＭ１−１エピトープはヒト血漿のｓＬＡＭ−１で検出されなかった
【００３８】
リンパ球への抗ＬＡＭ−１ｍＡｂ結合が血漿によって抑制されなかったので、このｍＡｂによって認識されるエピトープはｓＬＡＭ−１には存在しないかもしれない。これをさらに調べるために、ＥＬＩＳＡを実施した。この場合、異なるＬＡＭ−１に対するｍＡｂが捕捉抗体として、検出抗体としての抗ＬＡＭ１−３ｍＡｂとともにＥＬＩＳＡプレートに結合させた。レクチンドメイン特異的抗体（抗ＬＡＭ１−６、−７、−１０および−１１）およびＥＦＧドメイン特異的ｍＡｂ（抗ＬＡＭ１−５および−１５）は、強力で容易に検出できる陽性シグナルを生じた。抗ＬＡＭ１−３ｍＡｂおよび−４ｍＡｂ（これらは互いに検出抗体（抗ＬＡＭ１−３ｍＡｂ）を阻害する）で被覆した凹み（ウェル）は、バックグラウンド反応のための内部コントロールとして供した。他の全てのｍＡｂと対照的に、抗ＬＡＭ１−１は、捕捉試薬としてＢＳＡを用いて明らかにしたように、バックグラウンドと顕著には異ならないシグナルを生じた。したがって、抗ＬＡＭ１−１ｍＡｂによって特異的に認識されるＥＧＦ領域内に位置するエピトープは、放出後ＬＡＭ−１から失われるように思われる。ＬＡＭ−１は、免疫蛍光染色で全てのＬＡＭ−１特異的ｍＡｂによって容易に認識され、さらに、３種の全ての細胞外ドメインが血漿中に見出されるｓＬＡＭ上に保存されているので、該ｓＬＡＭ−１蛋白の構造変化はＥＧＦドメイン関連ＬＡＭ１−１エピトープの損失をもたらすかもしれない。
【００３９】
ＬＡＭ−１のトランスメンブレン領域または細胞質領域がその細胞外ドメインの完全な三次元構造を支えるために必要であるか否かを決定するために、可溶性ＬＡＭ−１の第二の形態、ＬＡＭ−ＩｇＧ融合蛋白をつくり、ＥＬＩＳＡでエピトープの配列地図を作製した。融合蛋白を作製するために用いるキメラｃＤＮＡは、それが実質的に完全なＬＡＭ−１の細胞外領域を含むように構築した。一時的にキメラｃＤＮＡをトランスフェクトしたＣＯＳ細胞の培養上清液を、ＥＬＩＳＡによってＬＡＭ−ＩｇＧの産生について調べた。抗ＬＡＭ１−５、−７および−１５ｍＡｂ（これらは、血漿およびＰＭＡ刺激Ｋ６５２−ＬＡＭ細胞の上清液中のｓＬＡＭ−１を検出する）もまた同じ程度にＬＡＭ−ＩｇＧキメラに結合した。対照的に、抗ＬＡＭ１−１ｍＡｂは、血漿およびＫ５６２−ＬＡＭトランスフェクタントのｓＬＡＭ−１と顕著な反応を生じなかったが、一方、それは容易にＬＡＭ−ＩｇＧ融合蛋白と結合した。したがって、インビボまたはインビトロで産生されたｓＬＡＭ−１は、抗ＬＡＭ１−１ｍＡｂ結合に要求される構造決定基を失っているという可能性が高い。
【００４０】
ヒト炎症組織におけるＬＡＭ−１の発現
【００４１】
おそらくｓＬＡＭ−１は、白血球が活性化されおよび／または内皮を通過するときに、インビボで産生される。種々の組織から分離された白血球は殆どＬＡＭ−１を発現しないということが観察されたが（Tedderら、J. Immunol.144:532-540 (1990)） 、これは、該細胞が内皮を通過するときまたは組織に局在するときにＬＡＭ−１を放出すると考えられる。しかしながら、組織免疫化学的分析によって明らかにされたように、細胞表面ＬＡＭ−１の存在は、血管内の白血球に厳格には限定されなかった。ＬＡＭ−１陽性の血管外白血球が調べられた全ての組織において認められ、これらは（それが存在する場合は）、リンパ球、好中球および単球を含む。血管外遊出の過程は全細胞からの細胞表面ＬＡＭ−１の完全な喪失をもたらすわけではない。なぜならば内皮細胞を通り抜けるらしいリンパ球がＬＡＭ−１＋のままであり、さらに幾つかの遊走単球もまたＬＡＭ−１＋と思えるからである。一般に、組織内に局在する単球／大食細胞（マクロファージ）および顆粒球は主にＬＡＭ−１陰性であったが、幾つかの血管外遊出好中球およびマクロファージはＬＡＭ−１＋であった。非常に大切なことには、小静脈内皮細胞の病巣染色が、４例の過形成リンパ節のうち２例で、３例の類肉腫リンパ節のうち２例で、４例の類リューマチ滑液のうち１例で、３例の炎症皮膚標本のうち１例で、さらに４例の虫垂炎のうち２例で観察された。この内皮染色は、ｓＬＡＭ−１は内皮の先端表面にあるそのリガンドと結合することができるという考えと一致する。
【００４２】
実験手順
【００４３】
抗体
【００４４】
ＬＡＭ−１に対するｍＡｂは、レクチンドメイン内のエピトープに対する抗ＬＡＭ１−３、−４、−６、−７、−８、−１０、および−１２ｍＡｂ、ＥＧＦ様ドメイン内のエピトープと反応する抗ＬＡＭ１−１、−５および−１５、並びにＬＡＭ−１のＳＣＲ領域と反応する抗ＬＡＭ１−１４ｍＡｂで、すべてのＩｇＧ１アイソタイプである（Spertiniら、J.Immunol. 147:942-949 (1991))。抗ＬＡＭ−１ｍＡｂは、塩分画とそれに続く陰イオン交換クロマトグラフィーで精製され、ｍＡｂ濃度は光吸収で求めた。抗ＬＡＭ１−３ｍＡｂは、製造元の方法を用いて、ビーズ１ｍｌにつき２．５ｍｇのｍＡｂでＣＮＢｒ活性化セファローズ４Ｂ（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー、ピスカタウェー、ＮＹ）（抗ＬＡＭ−セファローズ）に結合させた。
【００４５】
血液単球の分離
【００４６】
ダナハーバー癌研究所（Dana-Farber Cancer Institute、ボストン、マサチューセッツ)の患者保護委員会(Human Protection Committee)によって承認されたプロトコルにしたがってヘパリン加血を得た。単核球をフィコールハイパーク（Ficoll Hypaque)密度勾配遠心で分離した。直ちに細胞を１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０（Gibco-BRL 、ゲーザースバーグ、メリーランド) に懸濁し、使用まで４℃で保存した。ほとんどの例で、これらの細胞は、形態（ライト染色）およびフローサイトメトリーで決定したとき、細胞集団の８５から９５％がリンパ球であったのでリンパ球と呼ぶ。好中球は、モノ−ポリ分離培地（Mono-poly Resolving Medium)(Flow Laboratories、マクリーン、バージニア)のクッションで遠心し、続いて赤血球を氷冷高張０．２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液で溶解して精製した。顆粒球は、最終的には５％ＦＣＳ含有ＨＢＳＳ（シグマ、セントルイス、ミズーリー）に懸濁した。ｓＬＡＭをウェスタンブロット分析のために調製したとき、単核球を先ず３７℃で３０分、ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中でプラスチック皿で保温し、粘着単球を除去した。非粘着性細胞は表面ＬＡＭ−１を有し、主にリンパ球であった（〜９９％）。
【００４７】
細胞培養
【００４８】
２４ウェルの培養皿（プレート）（CostarCorp.、ケンブリッジ、メリーランド）で、１０％ＦＣＳ、２％Ｌ−グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培養液で１０６／ｍｌでリンパ球を培養した。培養液を採集する前に、細胞をＰＭＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）で６０分培養し、ＥＬＩＳＡでｓＬＡＭ−１について検査した。好中球は、ＨＢＳＳ／５％ＦＣＳ培養液単独、または顆粒球／単球コロニー刺激因子（２５ｎｇ／ｍｌ；スティーブン・クラーク博士およびゴードン・ワン博士（Genetics Institute、ケンブリッジ、マサチューセッツ）により提供）、単球コロニー刺激因子（１００ｎｇ／ｍｌ；genetics Institute） 、腫瘍壊死因子−ａ（ＴＮＦ−α；１００Ｕ／ｍｌ；Genzyme Corp.、ケンブリッジ、マサチューセッツ）、リポポリサッカライド（１μｇ／ｍｌ；大腸菌０１１：Ｂ４；シグマ）、ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（１０−８Ｍ；シグマ）、インターフェロン−γ（１０００Ｕ／ｍｌ；Genzyme Corp. 、ケンブリッジ、マサチューセッツ）またはインターロイキン−１β（１０Ｕ／ｍｌ；Genzyme Corp. 、ケンブリッジ、マサチューセッツ） を含有するＨＢＳＳ／５％ＦＣＳ培養液のいずれかで培養した。培養後、上清をＥＬＩＳＡでｓＬＡＭ−１の存在について調べた。ヒト赤白血球症細胞株Ｋ５６２を、先に報告されたようにｐＬＡＭ−１ｃＤＮＡでトランスフェクトし（Twdderら、J. Immunol. 144:532-540 (1990)）、一貫してＫ５６２−ＬＡＭと呼んだ。これらの細胞をＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳで培養し、細胞数を０．２から１×１０６細胞／ｍｌの間で維持した。全ての細胞は５％ＣＯ2、湿度１００％、３７℃で培養した。
【００４９】
間接免疫蛍光分析
【００５０】
間接免疫蛍光分析は、細胞を３回洗浄した後実施した。細胞（１×１０６細胞）を、種々の濃度の表示ｍＡｂを含む１００μｌの培養液に浮遊させ、４℃で６０分保温した。洗浄後、細胞をＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇ抗体（Southern Biotechnology Associates 、バーミンガム、アラバマ）で２０分４℃で処理した。細胞を洗浄して固定（ＰＢＳ中の１％パラホルムアルデヒド）し、フローサイトメトリー（PROFILEＴＭ、Coulter Immunology、ハイアレー、フロリダ）で単一の蛍光色を決定した。各サンプルにつき１万個の細胞を調べ、陽性染色細胞のピークチャンネル数を直線スケールを用いて求めた。
【００５１】
幾つかの実験では、ヒト血漿の存在下で染色した。ｓＬＡＭは、同じ血漿の部分標本から抗ＬＡＭ−セファローズ（血漿４ｍｌにつき１ｍｌのビーズ）による免疫沈降によって予備除去した。免疫沈降の効率はＥＬＩＳＡで調べた（＜２０ｎｇ／ｍｌ）。リンパ球（１×１０６）を１００μｌの血漿または表示したような種々の濃度の精製ｍＡｂを含む（１：１００で添加）予備除去血漿のいずれかに浮遊させた。細胞を２回洗浄し、染色して上記のように分析した。
【００５２】
内皮白血球結合分析
【００５３】
非休止条件下でサイトカイン活性化内皮へのリンパ球粘着を、凍結組織切片についてのスタンパー／ウッドラフ（Stamper/Woodruff） 検定を記載された通り正確に応用した検査系で調べた（Stamper Jr. ら、J. Exp. Med., 144:828-833 (1976)） 。該略すれば、記載のように（Spertiniら、J. Immunol. 147:2565-2573 (1991)） 、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を臍帯静脈から分離し、１０％ＦＣＳ、内皮細胞増殖因子（５０μｇ／ｍｌ、Biomedical Tchnologies, Inc.、ストートン、マサチューセツ） およびブタ腸由来ヘパリン（５０ｍｇ／ｍｌ；シグマ）補充Ｍ１９９培養液で増殖させた。内皮細胞をゼラチン（０．１％）被覆ガラススライド上に隙間無く増殖させ、ＴＮＦ−α（１００Ｕ／ｍｌ）で表示された時間３７℃で刺激した。一層の細胞を注意深く洗浄し、７５μｌのＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ単独または準精製ｓＬＡＭ−１含有ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳで１５分４℃で保温した。コントロールとして、幾つかの事例においては、準精製ｓＬＡＭ−１含有培養液を抗ＬＡＭ−セファローズで免疫沈降によって予備除去した。さらに洗浄することなく、７５μｌのそれぞれの培養液中の５×１０6リンパ球を添加した。６４ｒｐｍで回転させながら、４℃で２０分保温した後、スライドを洗浄し、続いてグルタールアルデヒド（ＰＢＳ中で１％（ｖ／ｖ）；ポリサイエンシーズ、ウォーリントン、ペンシルバニア）で一晩固定し、ヘマトキシリンで染色した。粘着リンパ球の数を顕微鏡の６視野を（０．０９ｍｍ２／視野）計測することによって求め、結果は平均値±ＳＤとして表した。
【００５４】
組織免疫化学
【００５５】
新鮮ヒト組織塊を急速凍結した。標本は抹消リンパ節（非特異的過形成、４例）、類肉腫リンパ節（３例）、急性虫垂炎（４例）、類リューマチ滑液（４例）および炎症皮膚（昆虫咬傷、ツベルクリンに対する遅延性過敏反応、慢性苔癬状ひこう疹；各１例）であった。抗ＬＡＭ１−３ｍＡｂおよびジアミノベンジジンによるアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ法を用いて、凍結切片で組織免疫化学的に調べた（Riceら、Am. J. Pathol., 138:385-393 (1991)）。コントロールとして、特異性のないネズミＩｇＧ１（Coulter Immunology,ハイアレー、フロリダ) を被験ｍＡｂよりも３倍高い濃度で用いた。コントロールＩｇＧは検出できる染色を示さず、したがって、全ての結果は被験ｍＡｂで得られる特異的染色にのみ当てはまる。
【００５６】
ＬＡＭ−１とＩｇＧキメラｃＤＮＡおよび蛋白の製造
【００５７】
ヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨ１からＣＨ３ドメインをコードするｃＤＮＡから１４００ｂｐのＢａｎＩＩフラグメントを、ｐＬＡＭ−１ｃＤＮＡ（Chinら、J. Immunol. 125:1770-1774 (1980)）に導入したＢａｎＩＩ部位にオリグヌクレオチド誘導変異によって挿入した。ｐＬＡＭ−１ｃＤＮＡにおけるヌクレオチドのＧＡＧＧＧＴ１０７８からＧＡＧＣＣＣへの交換は、成熟蛋白の膜近接領域のアミノ酸番号３７０に対応するＢａｎＩＩ部位を創出した。新規な制限部位を創出するために用いた反方向（アンチセンス）オリゴヌクレオチドとｐＬＡＭ−１ｃＤＮＡのプラスミド５’末端由来の正方向（センス）オリゴヌクレオチドアンカーを、ｐＬＡＭ−１ｃＤＮＡの５’末端を増幅するために用いた。ＰＣＲ産物をＴ４キナーゼで処理し、ゲル精製を行い、ｐＳＰ６５（Prpmega Biotech、マジソン、ウィスコンシン）でサブクローニングし、ＢａｎＩＩおよびＫｐｎｌで消化した。並行して、ｐＳＰ６５にサブクローニングしたＬＡＭ−１ｃＤＮＡをＫｐｎｌおよびＰｖｕｌで消化し、さらにヒト重鎖ＩｇＧ１をコードするｃＤＮＡをＢａｎＩＩおよびＰｖｕｌで消化した。ゲル精製の後、このようにして得たＤＮＡフラグメントを、先にＫｐｎｌおよびＢａｎＩＩで消化しておいたＰＣＲ産物と混合し共に結合させた。このＰＣＲ産物の配列を調べ、ＬＡＭ−１およびＩｇＧ１制限部位がｐＬＡＭ−ＩｇＧ１ＤＮＡに保存されていることを制限地図で確認した。ＬＡＭ−ＩｇＧ１ＤＮＡをＡｐｒＭ８発現ベクター（ロイド・リックステイン博士により提供（Dr. Lloyd Klickstein, Center for Blood Research、ボストン、メリーランド） ）でサブクローニングし、ＤＥＡＥデキストラン法によってＣＯＳ細胞を一過性にトランスフェクトした。このトランスフェクトしたＣＯＳ細胞を血清非含有ＡＩＭ−Ｖ培養液（Gibco-BRL0） で培養し、キメラＬＡＭ−１／ＩｇＧ１融合蛋白を含む上清液を３日後に採集した。
【００５８】
可溶性ＬＡＭ−１の精製
【００５９】
ヘパリン加ヒト血液から得た血漿からｓＬＡＭ−１を準精製した。Ｎａ２ＳＯ4（１８％（ｗ／ｖ））で血漿を塩分画した後、ｓＬＡＭ−１含有上清分画を０．０２Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、０．５ＭＮａＣｌで透析した。このｓＬＡＭ−１調製物をさらに抗ＬＡＭ−セファローズを用いて親和性カラムクロマトグラフィーで精製した。ｓＬＡＭ−１は０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）、０．１５ＭＮａＣｌでカラムから溶出し、該溶出物の低ｐＨは、２．０Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ９．０）を添加して直ちに上昇させた。溶出ピークを集めた分画を限外濾過し、ＰＢＳに懸濁させた。ｓＬＡＭ−１の濃度はＥＬＩＳＡで決定し、続いてＰＢＳで約１５μｇ／ｍｌに調整した。このｓＬＡＭ−１濃度では、サンプルの総蛋白量は、光吸収で決定したとき１３０から２２０μｇ／ｍｌの間で変動し、ｓＬＡＭ−１は総蛋白の〜６から１０％を占めた。一般に、この工程はｓＬＡＭ−１を２２０００から３７０００倍豊富にした。リンパ球−内皮粘着分析で使用するために、さらに限外濾過することによってＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳに準精製ｓＬＡＭ−１を移した。
【００６０】
ウェスタンブロット分析
【００６１】
上記のように血漿からｓＬＡＭ−１を準精製し、さらに、交互に高塩（０．５ＭＮａＣｌ、０．２％Ｎａ−デオキシコレート）と低塩（０．１２５ＭＮａＣｌ、０．０５％Ｎａ−デオキシコレート）ＲＩＰＡ緩衝液（１００ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、１０ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＥＧＴＡ、１０ｍＭＮａＦ、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）中でビーズを繰り返し洗浄しながら、抗ＬＡＭ−セファローズを用いて免疫沈降を行うことによって精製した。蛋白を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）、０．１５ＭＮａＣｌでビーズから溶出させた。ＰＭＡ刺激細胞の上清液をまた分析した。好中球（ＲＰＭＩ１６４０中の１０ｎｇ／ｍｌＰＭＡ、３７℃で１０分）、リンパ球（ＲＰＭＩ１６４０中の１０ｎｇ／ｍｌＰＭＡ、３７℃で２５分）およびＫ５６２−ＬＡＭトランスフェクタント（ＰＢＳ中の１００ｎｇ／ｍｌＰＭＡ、３７℃で１２０分）を含む細胞（１×１０7 ／ｍｌ）を実質的に全ての検出可能な細胞表面ＬＡＭ−１を放出するように誘発し、その後遠心（４℃、４００×ｇ、１０分）して沈澱させた。上清液を残し、限外濾過（Amicon Corp.、デンバー、メリーランド）によって１０倍に濃縮した。蛋白サンプル（１００μｌ）７．５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに添加し、電気泳動を行い、ニトロセルロースにブロットを転写した。ウェスタンブロット分析は、抗原検出抗体として抗ＬＡＭ１−１４ｍＡｂ（腹水、１：２０００）を用いて実施した。アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ1 抗体（Southern Biotechnology Associates)および基質としてＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Promega 、マジソン、ウィスコンシン）を用いて、このブロットを処理した。予備実験では、抗ＬＡＭ１−１４ｍＡｂが検査した１２種の抗ＬＡＭ−１ｍＡｂのうち最も感度が高く、それらのうち、抗ＬＡＭ１−３、−４、−８、−１０、−１４および−１５ｍＡｂは陽性染色を生じることが分かった。
【００６２】
可溶性ＬＡＭ−１のＥＬＩＳＡ
【００６３】
微量定量プレート（９６ウェル、平底、E.I.A./R.I.A.プレート、コースター、ケンブリッジ、メリーランド）のウェルを、０．１Ｍ硼酸緩衝液（ｐＨ８．４）中で４℃で１８時間、抗ＬＡＭ−１ｍＡｂ（１００μｇ／ｍｌ）で被覆した。トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ；２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、０．５ＭＮａＣｌ）でウェルを２度洗浄した後、ＴＢＳ中の１００μｌの２％ウシ血清アルブミンおよび１％ゲラチンで３７℃１時間、このウェルを阻止処理した。ウェルを０．０５％トゥイーン２０含有ＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で３度洗浄し、ＴＢＳＴ（５０μｌ）で希釈した被験サンプルを３組のウェルに２０℃で９０分加えた。各検定には、標準希釈曲線を作製するために用いた、先に定量済みの標準血漿サンプルの定量が含まれていた。ウシ胎児血清またはブタ血清での希釈は、結果に顕著な影響を与えなかった。ＴＢＳＴで４度洗浄した後、プレートをＴＢＳＴ中のビオチン化抗ＬＡＭ１−３ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌ）の１００μｌとともに２０℃、６０分保温した。さらに４度洗浄した後、１００μｌのアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（０．１μｇ／ｍｌ、ピアース、ロックフォード、イリノイ）を２０℃で３０分加えた。ＴＢＳＴでさらに４度洗浄した後、最後に基質として０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）中の１００μｌのｏ−フェニレンジアミン（０．１２５％（ｗ／ｖ）、シグマケミカルカンパニー）を用いて０．０１５％のＨ2 Ｏ2 の存在下でプレートを処理した。反応混合物のＯＤをＥＬＩＳＡ読み取り器（v-max、キネッティックマイクロプレートリーダー、Molecular Devices 、メンローパーク、カリフォルニア） を用いて定量した。標準血漿の最高濃度を含むウェルのＯＤが４９５ｎＭで〜０．８のときの結果を用いた。ＯＤのバックグラウンド値はアルブミンのみで被覆したウェルを用いて得た。ＥＬＩＳＡは標準血漿を用いて定量的にし、各検定について定量曲線を作製した。個々のサンプル中のｓＬＡＭ−１の相対濃度は、３組のウェルで得た平均ＯＤを直線回帰曲線を用いた定量標準血漿のセミログ標準曲線と比較することによって算出した。サンプル濃度は標準曲線にそれらの吸収を書き入れることによって得られた。標準血漿に存在するｓＬＡＭ−１の量は２種の方法で定量した。第一に、Ｋ５６２−ＬＡＭ−１細胞（培養細胞〜１１Ｌ（〜１．１×１０１０細胞））をＰＢＳに懸濁し（１×１０７細胞／ｍｌ）、ＰＭＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）で２時間３７℃で刺激した。上清液を採集し、限外濾過で濃縮し、抗ＬＡＭ−セファローズを用いてカラムクロマトグラフィーでアフィニティー精製した。準精製サンプルを１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行い、ゲルを続いてクーマシーブルーで染色して、主要バンド（７１０００Ｍｒ）および付加的バンド（〜１８０−、５７−、および２２０００Ｍｒ）を明らかにした。脱色したゲルをヒューレットパッカードデスクスキャナーで調べ、７１０００Ｍr のバンドの濃度を、アップルマッキントッシュＩＩｃｘコンピューターでエンハンスプログラム（（EnhanceＴＭprogram ）マイクロシステム社、デスモイン、アイオワ）を用いてＢＳＡで作製した標準曲線で定量した。標準血漿中のｓＬＡＭ−１の濃度は、準精製ｓＬＡＭ−１のシグナルを標準血漿のＬＡＭ−ＥＬＩＳＡ定量曲線と直線回帰曲線を用いて比較することによって〜１．３μｇ／ｍｌと算出された。ＬＡＭ−ＥＬＩＳＡの検出限界は≧５ｎｇ／ｍｌと決定された。第二の実験様式では、ＣＯＳ細胞をＬＡＭ−ＩｇＧキメラｃＤＮＡで一過性にトランスフェクトした後、血清非含有培養液で増殖させた。上清液を細胞から集め、蛋白−Ａセファロース（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー）親和性クロマトグラフィーカラムで処理し、融合蛋白を高塩−低ｐＨ緩衝液でカラムから溶出させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の後、染色蛋白バンドをＢＳＡの標準曲線と比較して精製融合蛋白を定量した。この分析から、標準血漿のＯＤ値はＬＡＭ−ＩｇＧ融合蛋白の〜１．９μｇ／ｍｌに匹敵するらしいということが分かった。融合蛋白の二量体特性によって、このサンドイッチＥＬＩＳＡでは密度が二倍になる可能性があるので、標準血漿中のｓＬＡＭ−１の量は〜１．９ｎｇ／ｍｌの半分の値であるかもしれない。
【００６４】
ヒト血漿、ブタ血清並びにＫ５６２−ＬＡＭ細胞、ＬＡＭ−ＩｇＧｃＤＮＡトランスフェクトＣＯＳ細胞および擬似トランスフェクトＣＯＳ細胞の培養上清液の被験サンプルを、ｓＬＡＭ−１の存在についてＥＬＩＳＡで調べた。顕著な反応性はヒト血漿並びにＫ５６２−ＬＡＭ細胞およびＬＡＭ−ＩｇＧｃＤＮＡトランスフェクト細胞の上清液においてのみ認められた。１０回の検定で、５−１３３ｎｇ／ｍｌの範囲の標準血漿定量曲線を用いたとき、ＬＡＭ−ＥＬＩＳＡは直線相関係数≧０．９７を示した。３種の異なる日の血漿中のｓＬＡＭ−１レベルの測定のための変数の検定間係数は４．５％であった。凍結後または１０回までの凍結融解後のサンプル間にｓＬＡＭ−１レベルの顕著な相違は認められず、さらに数時間室温に放置された全血中のｓＬＡＭ−１量の定量能にも明白な低下は存在しなかった。したがって、ｓＬＡＭ−１は全血中で極めて安定である。
【００６５】
正常人集団で認められるｓＬＡＭ−１量は血清について決定された（１．９２±０．９６ｎｇ／ｍｌ、ｎ＝１８）。同一人から血漿が同時に分離し、ＬＡＭ−ＥＬＩＳＡで定量したが、平均ｓＬＡＭ−１レベルは１．９１±０．９８μｇ／ｍｌであった。ｓＬＡＭ−１はまた組織培養上清中でも検出できた。有糸分裂促進剤でリンパ球を活性化した後、上清液ｓＬＡＭ−１のレベル上昇が１日後に検出され、６日の培養期間に亙ってこのレベルは上昇した。
【００６６】
用途
【００６７】
放出レセプターＬＡＭ−１を識別しないが細胞表面レセプターを識別する単クローン性抗体は、患者への直接投与用治療剤として用いることができる。本発明の抗体の使用は、抗体投与による二次的な副作用の多くを予防するであろう。このような副作用は、レセプターの可溶形に対する抗体の免疫複合体形成および交差反応または結合により生じる。また、レセプターの放出形は高レベルで存在する天然に生じる分子であるので、ｓＬＡＭ−１と構造が同じである組換え体蛋白生成物をデザインすることが可能である。すなわち、膜にかかる領域を含まない組換え体蛋白および細胞質尾部は天然の血清蛋白を模倣するものであろう。このような特性は、そのような組換え体の本来の種に対する免疫原性を減少させ、同様に治療用生成物として該レセプターを使用することを可能にする。リガンド結合領域におけるレセプターのアミノ酸一次配列に対する小さな変化は、リガンドに対するより高い結合定数または親和性を誘導するために導入することができる。続いて、この修飾され切り縮められた組換え体蛋白は、免疫原性は低いが、結合能および細胞表面レセプター蛋白のリガンド結合阻止能はより高い治療剤として、可溶形で用いることができる。
【００６８】
本発明の抗体は診断薬としてもまた有用である。例えば、細胞表面ｓＬＡＭ−１を発現する白血球を同定する能力は、与えられた細胞集団の遊走能並びに細胞分化の状態および活性化を知るために重要である。ｓＬＡＭ−１の高いレベルのために、細胞表面分子の同定に生物学的液体の存在下で抗体を使用することは困難である。しかしながら、抗ＬＡＭ１−１のような抗体は、血中または生物学的液体サンプル中に放出されたレセプターと反応しないので、細胞表面にのみ存在するレセプターを同定するために有用であろう。例えば、全血の間接免疫蛍光分析は促進され、レセプター分布のインビボ画像化または分析が、極めて少量の抗体を用いて可能になるであろう。
【００６９】
また、ｓＬＡＭ−１レベルのモニタリングによって、炎症性疾患、白血球集合、悪性疾患または感染に関する診断的、予防的情報が提供されえる。例えば、正常人の血清においてｓＬＡＭのレベルは容易にかつ正確に定量できるので、患者のｓＬＡＭ−１の血清レベルは全身性炎症または感染の種々の状態について測定できた。重篤な火傷をもつ患者は正常集団で見出されるｓＬＡＭ−１レベルと同じｓＬＡＭ−１レベルを有するが、一方、川崎症候群の患者は正常人のそれより一般に低いｓＬＡＭレベルを有していた。対照的に、敗血症またはＨＩＶ感染を罹患している患者は、正常な血液供与者集団のｓＬＡＭ−１レベルと顕著に異なる（ｐ＜０．００５）、極めて高い血清ｓＬＡＭ−１レベルを示した。ｓＬＡＭ−１はまた、脳脊髄液でも検出されたが、そのレベルは正常血清で見出されるものの０．６から６％であった。したがって、ｓＬＡＭ−１レベルの変化は、白血球集合または活性化によって示されるように、炎症性または感染性疾患についての診断的または予防的価値を有する。
【００７０】
本明細書で開示した分析は、溶液中のｓＬＡＭ−１レベルの検出が容易に達成できることを明らかにした。さらに、非常に正確な態様でのｓＬＡＭ−１レベルの定量もまた、ｓＬＡＭ−１が生物学的液体中に含まれる場合ですら達成できる。また、患者由来の生物学的液体中のｓＬＡＭ−１レベルの定量は診断的価値を有することも明らかにされた。
【００７１】
前出の開示により、通常の技術でｓＬＡＭ−１だけでなく、その元の蛋白ＬＡＭ−１またはＬＡＭ−１フラグメントを検出する種々の手段に影響を与えることができるであろう。２種の結合分析、ウェスタンブロット分析および抗体を基にしたＥＬＩＳＡの詳細な記載が提供された。しかしながら、選択的にＬＡＭ−１に結合する他の薬剤も、ＬＡＭ−１またはそのフラグメントの存在を明らかにし、またそれを捕捉するために用いることができる。これらは、例えばＰＰＭＥ、フコイジンまたは他のＬＡＭ−１リガンドを含む炭水化物成分である。細胞を基材とする捕捉機序、ＬＡＭ−１リガンドを含む例えばサイトカイン活性化内皮または組織標本もまた結合剤として利用することができる。
【００７２】
さらに、ＬＡＭ−１またはそのフラグメントの捕捉は、当業者にとって明白な種々の手段によって算定できる。例えば、構造の変化、捕捉試薬または検出試薬の共鳴もしくは光学特性をＬＡＭ−１結合を示すために測定することができる。捕捉試薬は、ＬＡＭ−１またはそのフラグメントに特異的な多クローン性抗体でもよい。検出試薬はまた、放射能性、免疫反応性、または酵素活性剤または化合物を用いて標識し、結合を可視化することができる。さらに、捕捉試薬はＬＡＭ−１またはそのフラグメントに特異的でなくてもよいが、ＬＡＭ−１特異性はＬＡＭ−１特異的検出試薬の使用によって得ることができる。また検出試薬は特異的でなく、捕捉試薬が特異的であってもよい。
【００７３】
サンプル中に存在するＬＡＭ−１またはそのフラグメントの量の定量もまた種々の手段を用いて達成できる。例えば、血清または血漿中の天然に生じるｓＬＡＭ−１についての分析で示したように、組換え体ＬＡＭ−１蛋白またはフラグメントを標準物として用いることができる。哺乳類、細菌または昆虫細胞の組織培養上清中に産生されたＬＡＭ−１またはそのフラグメントもまた用いることができる。捕捉試薬に結合する小さなペプチドフラグメントでさえ競合検定でＬＡＭ−１結合を算定し、定量するために用いることができる。また、ＬＡＭ−１による捕捉試薬からの小分子の置換は存在するＬＡＭ−１量を定量するために用いることができる。
【００７４】
本発明を好ましい具体例と合わせて詳述したので、前出の明細書を読むことによって通常の技術を有する者は、ここに述べた構成と方法に対する種々の変更、同等物の置き換え、およびその他の変更を実施することができる。したがって、特許権によって与えられる保護は、添付の請求の範囲およびそれと同等のものに含まれる範囲によってのみ制限される。
【００７５】
寄託
【００７６】
ハイブリドーマＬＡＭ−１はＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ１０８４４としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に１９９１年７月２８日に寄託された。出願人の譲受け人、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｉｎｃ．，はＡＴＣＣが該寄託の永久に保存できる寄託所であり、特許が付与された場合、公衆がそれを容易に入手できることを明言する。このように寄託した物質の公衆の入手に関する全ての制限は、特許付与の際に完全に取り除かれる。特許出願中に、３７ＣＦＲ１．１４および３５ＵＳＣ１２２の下にそれに対して権利を有すると長官が認めた者は、該物質を入手することができる。該寄託物質は、そのサンプルの最も最近の供給の要請後少なくとも５年間、さらにいずれの場合においても寄託の日から少なくとも３０年間または特許の有効期間の間（いずれか期間の長い方）は、活力を保持し、かつ汚染されないよう必要な全ての注意をもって維持されるであろう。出願人の譲り受け人は、該寄託所が、要請時に該寄託物の条件のためにサンプルを供給できない場合は、該寄託物を置き換える義務を負うことを承認する。