(57)【要約】【課題】有効かつ副作用の少ない星細胞活性化抑制剤、及び、肝臓、腎臓等の臓器線維症の予防又は治療剤を提供すること。【解決手段】Ｌ−メチオニン、Ｌ−システイン又はそれらの誘導体を有効成分とする星細胞活性化抑制剤並びに臓器線維症の予防又は治療剤。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−メチオニン、Ｌ−システイン又はそれらの誘導体を有効成分とする星細胞活性化抑制剤。
【請求項２】
Ｌ−メチオニン、Ｌ−システイン又はそれらの誘導体を有効成分とする臓器線維症の予防又は治療剤。
【請求項３】
前記臓器線維症が、肝臓、腎臓、膵臓、肺臓、脾臓及び大腸の線維症のいずれかである請求項２記載の臓器線維症の予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、肝臓や腎臓などの臓器に存在する星細胞の活性化を抑制する星細胞活性化抑制剤、及び、星細胞の活性化に伴う臓器線維症の予防又は治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
臓器線維症は、臓器内の細胞が、ウイルス、アルコール、薬剤等の種々の原因により壊死した後、十分に再生せず、結合組織が増加して線維化することにより生じる疾患であり、肝硬変、腎硬化症、肺線維症等が知られている。線維化が進行した場合、現在、その予後を改善する治療法は皆無といっても過言ではない。
【０００３】
臓器線維症のうち、肝硬変は、慢性肝炎から高率で進行し、さらに、肝不全ないし肝癌に移行する確率が高いことが知られており、この慢性肝炎→肝硬変→肝癌という病態連鎖の進行を抑制することは重要である。
肝硬変の予防に関しては、インターフェロンやグリチルリチン製剤を用いる治療法が存在する。しかしながら、インターフェロン製剤は高価である上、有効性は３割程度しかなく、また、ウイルス性の肝障害にしか適応がない。また、グリチルリチン製剤は静脈内投与が必要であり、患者への頻回投与は困難である。
一方、腎硬化症に対する有効な薬剤についての報告はほとんどないのが現状である。
【０００４】
ところで、近年、肝構成細胞の分離および初代培養技術は著しい進歩を遂げている。ラットやマウスなどの小動物やヒトから、肝（実質）細胞のみならず、非実質細胞であるＫｕｐｆｆｅｒ細胞、内皮細胞、星細胞、ｐｉｔ細胞、胆管上皮細胞が分離可能となっており、これらの非実質細胞について数多くの研究がなされている。その結果、肝細胞代謝の恒常性維持と肝局所炎症反応における肝非実質細胞の重要性が認識されるようになり、特に、星細胞の機能が注目を集めている。
【０００５】
星細胞は、ＧＦＡＰ（グリア細胞線維性酸性蛋白質）、ネスチン、Ｎ−ＣＡＭ（神経細胞接着分子）、プリオンなどを発現することから、ｎｅｕｒａｌ　ｃｒｅｓｔ由来の細胞であると考えられている。肝臓の星細胞は、通常、ビタミンＡ代謝において中心的な役割を果たすことが知られている。
【０００６】
星細胞は、肝炎等において惹起された炎症が持続すると、いわゆる「活性化」とよばれる機能変化をとげて、筋線維芽細胞へと形質転換する。
この活性化された星細胞においては、以下の１）〜４）などの現象が生じることが明らかになっている。
１）コラーゲンやプロテオグリカンなどの細胞外マトリックスの代謝が活性化する。
２）ＴＧＦβ　（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　β）等の、臓器線維化を促進する各種成長因子の産生が著明に増加する。
３）マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の阻害物質であるｔｉｓｓｕｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ＭＭＰ（ＴＩＭＰ）の産生が増加する。
４）星細胞膜上に、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）に対する受容体（ＰＤＧＦＲβ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ）に対する受容体（ＩＧＦ−ＩＲβ）が発現誘導され、星細胞の増殖促進や遊走能の獲得がみられる。
【０００７】
したがって、星細胞の活性化が臓器線維化に関与していると考えられ、実際、ヒトの慢性肝炎や肝硬変組織の線維性隔壁部には、細胞外マトリックスとともに、活性化された星細胞が多数存在していることが確認されている。
それゆえに、星細胞の活性化を抑制することができれば、肝硬変等における臓器線維化を抑制することが可能になるだけでなく、軽減することも可能となると考えられる。
【０００８】
これまで、星細胞の活性化を抑制するいくつかの試みがなされてきた。例えば、ＴＧＦβの可溶型受容体を投与することによって内因性のＴＧＦβの作用を中和して線維化を抑制しようとする試み、ドミナントネガティブ型ＴＧＦβ受容体を発現させる遺伝子治療、ＰＤＧＦ受容体特異的チロシンキナーゼ阻害剤の開発などである。しかしながら、未だ、臨床使用の結果が公表されているものはない。
また、モルフォゲンとしての作用を有する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を用いた遺伝子治療も提案されている。しかしながら、ＨＧＦを長期投与した場合、種々の臓器での発癌が促進される可能性を否定できないことから、臨床応用できるかどうかははっきりしていない。
【０００９】
一方、上述ように、肝臓の線維化の分子機構とその制御戦略についての研究はなされているものの、腎臓や肺、膵臓、脾臓及び消化管等の臓器に関してはまだ解析が少ない。
しかし、これらの臓器にも星細胞が存在することはすでに確認されており、腎硬化症等の臓器線維症にも星細胞が関与していることが推察される。
【００１０】
それゆえに、星細胞の活性化を抑制することができれば、肝臓のみならず、腎臓や肺などの、星細胞が存在する多様な臓器の線維化についても抑制することができると考えられる。したがって、本発明は、有効かつ副作用の少ない星細胞活性化抑制剤、及び、肝臓、腎臓等の臓器線維症の予防又は治療剤を提供することを課題とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究をおこなった結果、Ｌ−メチオニン、Ｌ−システイン又はそれらの誘導体が星細胞の活性化及び増殖を抑制し、それらの細胞の増殖因子に対する反応性を減弱させることに極めて有効であることを見いだし、本発明に至った。
【００１２】
前記課題を解決する本発明の第一の発明は、Ｌ−メチオニン、Ｌ−システイン又はそれらの誘導体を有効成分とする星細胞活性化抑制剤である。
前記課題を解決する本発明の第二の発明は、Ｌ−メチオニン、Ｌ−システイン又はそれらの誘導体を有効成分とする臓器線維症の予防又は治療剤である。
前記臓器線維症は、肝臓、腎臓、膵臓、肺臓、脾臓及び大腸の線維症のいずれかであることが好ましい。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の星細胞活性化抑制剤の有効成分であるＬ−メチオニン及びＬ−システインは必須アミノ酸として知られている。Ｌ−メチオニン及びＬ−システインはともに含硫アミノ酸であり、それぞれ以下の構造を有している。
【００１４】
【化１】
2004018418.tif 000002
【００１５】
これらのアミノ酸の薬理作用に関し、様々な報告がなされているが、星細胞の活性化や、肝臓、腎臓等の臓器の炎症に伴う臓器線維化に関連する報告はない。
【００１６】
本発明において用いられるＬ−メチオニン及びＬ−システインは、通常遊離アミノ酸の形態で用いられるが、特に遊離形態である必要はなく、誘導体、すなわち、薬理学的に許容される塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩等の金属塩、塩酸塩、硫酸塩等の鉱酸塩、酢酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩等の有機酸塩等の形態、又は生体内で加水分解されて遊離アミノ酸に変換されるエステルの形態で用いることもできる。
これらの誘導体の形態での利用は、遊離アミノ酸形態では溶解度が低く、沈殿が生じる危険がある場合に特に有効である。また、必要に応じて還元糖を配合する場合に生じるおそれのある、メイラード反応による褐変現象を有利に抑制できる。
【００１７】
本発明において、星細胞の活性化抑制効果を発揮するために必要なＬ−メチオニンの有効投与量は、１日あたり、好ましくは１．５ｍｇ／体重１ｋｇ以上、特に好ましくは１５〜１５００ｍｇ／体重１ｋｇである。また、Ｌ−システインの有効投与量は、１日あたり、好ましくは２ｍｇ／体重１ｋｇ以上、特に好ましくは２０〜１２００ｍｇ／体重１ｋｇである。
【００１８】
本発明の星細胞活性化抑制剤は、上記有効成分の他に、本発明の効果を損なわない範囲で、生理的に受容可能な液体又は固体の製剤担体を配合した薬剤組成物として使用することができる。
製剤担体としては、通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、被覆剤、溶解補助剤、乳化剤、懸濁化剤、安定化剤、溶剤等を添加することができる。前記薬剤組成物は、投与方法に応じて、様々な製剤形態をとることができる。該製剤形態としては、水剤、シロップ剤、懸濁剤、乳濁剤、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、カプセル剤等の経口摂取可能な形態が好ましいが、注射剤、輸液等の形態であってもよい。
投与方法としては、経口、経静脈、経中心静脈、経直腸投与等の任意の投与方法が可能であるが、特に、経口投与が好ましい。
前記薬剤組成物中におけるＬ−メチオニン、Ｌ−システイン又はそれらの誘導体の配合量は、特に制限はなく、剤形に合わせて適宜決定すればよい。
【００１９】
また、本発明の星細胞活性化抑制剤は、食品に添加して用いてもよく、その場合、上記の他に、通常、食品に添加可能な物質（酸化防止剤、着色料等）を添加することができる。
【００２０】
また、本発明の星細胞活性化抑制剤は、１日に１回又は数回に分けて投与することができる。
【００２１】
本発明の星細胞活性化抑制剤は、肝臓や腎臓などの臓器において、慢性炎症後などに惹起される臓器線維症の進行を抑制するための臓器線維症の予防又は治療剤としても使用可能である。
本発明の臓器線維症の予防又は治療剤が用いられる臓器線維症としては、肝硬変、腎硬化症、肺線維症、慢性膵炎、胃潰瘍、炎症性腸疾患等を挙げることができ、好ましくは肝硬変、腎硬化症である。
【００２２】
本発明において、臓器繊維化抑制効果を発揮するために必要なＬ−メチオニンの有効投与量は、１日あたり、好ましくは１．５ｍｇ／体重１ｋｇ以上、特に好ましくは１５〜１５００ｍｇ／体重１ｋｇである。また、Ｌ−システインの有効投与量は、１日あたり、好ましくは２ｍｇ／体重１ｋｇ以上、特に好ましくは２０〜１２００ｍｇ／体重１ｋｇである。
【００２３】
本発明の臓器繊維化抑制剤は、上記有効成分の他に、本発明の効果を損なわない範囲で、上述したような、生理的に受容可能な液体又は固体の製剤担体を配合した薬剤組成物として使用することができる。
【００２４】
本発明において、Ｌ−メチオニン及びＬ−システインはともに必須アミノ酸であるので、本発明の星細胞活性化抑制剤及び臓器線維化抑制剤は、安全で、副作用が生じるおそれがない。また、経口摂取することが可能であり、各種医薬品、食品、栄養剤等に添加して用いることができる。
星細胞は、肝炎等において惹起された炎症が持続すると、いわゆる「活性化」とよばれる機能変化をとげて、筋線維芽細胞へと形質転換する。本発明の星細胞活性化抑制剤及び臓器線維化抑制剤は、星細胞の活性化を抑制することができるので、肝硬変等における臓器線維化を抑制することが可能であるだけでなく、軽減することも可能であると考えられる。
【００２５】
【実施例】
以下の試験例により、本発明およびその効果を具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
なお、下記試験例では、Ｌ−システインとＬ−メチオニンとして、シグマ社製の生化学研究用（純度９９％以上）のものを使用した。
【００２６】
＜試験対象＞
ラットの肝臓と腎臓から分離・培養した星細胞。
＜星細胞の分離・培養方法＞
ラット肝臓から、既報（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ　ＤＢ，　Ｋａｗａｄａ　Ｎ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．　２０００３２：２６８−７７）に準じて星細胞を分離した。その手順を簡単に述べると、ラット肝臓を門脈から灌流して脱血したのち、コラゲナーゼとプロナーゼを含む酵素溶液でさらに灌流して消化した。肝臓を取りだしたのち、さらに、前記と同じ酵素溶液中で消化した。この消化産物を遠心して未消化の細胞群を集めたのち、この細胞群を８．２％ナイコデンツ溶液と混合して３２００回転、１５分間遠心すると、溶液の最上層に星細胞が得られた。得られた星細胞を遠心洗浄したのち１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中に浮遊させ、滅菌したプラスチックシャーレに注入して培養した。星細胞はシャーレ上で接着して成長した。
ラット腎臓の星細胞も上記と同様の手順で分離した。
両臓器に由来する星細胞を数日間、１０％のウシ胎児血清を含む、あるいは含まない、ダルベッコＭＥＭ溶液（ＳＩＧＭＡ社製）中で、３５ｍｍプレート（Ｆａｌｃｏｎ３００３）に接着させ、３７℃、５％ＣＯ２存在下で、１プレートあたりの細胞数：７．５×１０５ｃｅｌｌｓにまで培養した。星細胞は、血清の存在下で培養すると細胞形態を変化させながら増殖した。
【００２７】
試験例１：肝臓由来の星細胞
（１−１）「星細胞の増殖に対するＬ−システインの効果」
星細胞の増殖に対するＬ−システイン及びＬ−メチオニンの影響を評価するために、星細胞の細胞核への５’−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取込みを、以下の手順により評価した。
上記と同じ培養液に、各種濃度（１、５、１０ｍＭ）となるようにＬ−システインを添加し、培養星細胞を２４時間培養した。２４時間後、一旦培養液を交換して、再度、上記と同じ濃度のＬ−システインを添加し、それと同時に、最終濃度１００μＭのＢｒｄＵを培養液に添加して、さらに２４時間培養した。コントロールとして、Ｌ−システインを添加しなかった以外は同様の手順で星細胞を培養した。
培養終了後、細胞を、９５％エタノールと５％酢酸の混合溶液で固定した。
細胞核へのＢｒｄＵの取込みは、ＢｒｄＵを免疫染色した細胞を顕微鏡下で撮影し、全細胞中の、染色されている細胞（ＢｒｄＵが取り込まれた細胞）の割り合いを計算して評価した。
【００２８】
＜結果＞
図１に、血清の存在下（Ｓｅｒｕｍ（＋））及び血清の非存在下（Ｓｅｒｕｍ（−））における結果を示す。
Ｓｅｒｕｍ（−）では、１ｍＭ以上のＬ−システインを添加した場合に、染色されている細胞（ＢｒｄＵ陽性細胞）が減少しており、有意にＢｒｄＵの取り込みが阻害されたことがわかる。
また、Ｓｅｒｕｍ（＋）では、５ｍＭ以上のＬ−システインを添加した場合（図示せず）に、有意にＢｒｄＵの取り込みが阻害された。
図２に、血清の存在下（Ｓｅｒｕｍ（＋））におけるＢｒｄＵ陽性細胞の割合を示す。血清の存在下（Ｓｅｒｕｍ（＋））において、コントロールでは８６．１％の星細胞がＢｒｄＵ陽性であった。これに対し、５ｍＭ以上のＬ−システインを添加した場合、有意にＢｒｄＵの取込みが阻害された。
【００２９】
（１−２）「星細胞の増殖に対するＬ−メチオニンの効果」
Ｌ−システインに換えてＬ−メチオニンを用いた以外は上記（１−１）と同様の手順で星細胞の増殖に対するＬ−メチオニンの影響を評価した。
【００３０】
＜結果＞
図３に、血清の存在下（Ｓｅｒｕｍ（＋））における結果を示す。１ｍＭ以上のＬ−メチオニンを添加した場合、ＢｒｄＵ陽性の星細胞が顕著に減少していた。
図４に、血清の非存在下（Ｓｅｒｕｍ（−））における結果を示す。コントロールでは２９％の星細胞がＢｒｄＵ陽性であったのに対し、１０ｍＭ以上のＬ−メチオニンを添加した場合に有意にＢｒｄＵの取込みが阻害され、その割合は８％であった。
【００３１】
（１−３）「ＰＤＧＦ−ＢＢ存在下における星細胞の増殖に対するＬ−システインの効果」
星細胞は増殖因子の一つであるＰＤＧＦ−ＢＢに反応して増殖することが知られている。血清を含まない（Ｓｅｒｕｍ（−））培養液中に、２０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢを添加し、２４時間培養することにより星細胞を刺激したところ、図５に示す結果が得られた。すなわち、ＰＤＧＦ−ＢＢを添加した場合、ＢｒｄＵを取込んだ細胞の割合は、コントロール（約５９％）よりも多かった（約８２％）が、ここに、５ｍＭのＬ−システインを添加しておくと、星細胞増殖は抑制された（約１６％）。
【００３２】
試験例２：腎臓由来の星細胞の増殖に対するＬ−システイン及びＬ−メチオニンの効果
肝臓由来の星細胞に換えて腎臓由来の星細胞を用いた以外は上記（１−１）と同様の手順で星細胞の増殖に対するＬ−システイン及びＬ−メチオニンの影響を評価した。
【００３３】
＜結果＞
図６にその結果を示す。血清存在下において、コントロールでは約２７．５％の星細胞がＢｒｄＵ陽性であった。これに対して、５ｍＭのＬ−システインを培養液中に添加すると、約１５．５％に減少した。また、５ｍＭのＬ−メチオニンを培養液中に添加すると、ＢｒｄＵ陽性細胞はほとんどみられなかった。
【００３４】
試験例３：星細胞の活性化とともに発現する蛋白質に対するＬ−システインの効果
星細胞が活性化すると、上述したＰＤＧＦＲβ及びＩＧＦ−ＩＲβや、平滑筋αアクチン（ＳＭα−ａｃｔｉｎ）、ＳＴＡＰ（Ｓｔｅｌｌａｔｅ　ｃｅｌｌ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ）などの蛋白質、いわゆる活性化マーカーが誘導されてくることが知られている。したがって、肝臓由来の星細胞における上記蛋白質の発現をウエスタン・ブロットを用いて測定し、星細胞活性化抑制効果を評価した。すなわち、培養星細胞に各種濃度（０、０．１、１、５、１０ｍＭ）のＬ−システインを添加して２４時間培養した。いったん培養液を交換して再度同じ濃度のＬ−システインを添加し、さらに２４時間培養した。培養後、細胞をＰＢＳで洗浄した後、細胞溶解液を加えて、細胞の蛋白質を可溶化した。９５℃、５分間の熱変性後、１０μｇずつの蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動した。これを電気的にナイロン膜に転写した後、膜上の各種蛋白質を、それらに対する市販の特異抗体（抗ＰＤＧＦＲβ抗体（サンタクルズ社）、抗ＩＧＦ−ＩＲβ抗体（サンタクルズ社）、抗平滑筋αアクチン抗体（Ｓｉｇｍａ社））を用いて検出した。なお、抗ＳＴＡＰ抗体は、以下の方法により作製した。リコンビナントＳＴＡＰを作製し、これをＮｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ白ウサギに３回免役して、得られた血清からＩｇＧ分画を精製して使用した。
【００３５】
＜実験結果＞
図７に示すように、培養星細胞において上記の各種蛋白質が発現している事が確認できた。培養液中のＬ−システイン濃度を０ｍＭから上昇させるにつれて、ＰＤＧＦＲ−β、ＩＧＦ−ＩＲβ及びＳＴＡＰのバンドの濃さが徐々に薄くなった。この結果は、Ｌ−システインにより、これらの蛋白発現が減弱したことを示す。
【００３６】
一方、腎星細胞のＳＭα−ａｃｔｉｎについて、血清を加えずに、上記と同じ操作を行った結果、図８に示すように、培養液中のＬ−システイン濃度を上昇させると、ＳＭα−ａｃｔｉｎについても発現量が減弱したことが確認できた。
【００３７】
【発明の効果】
本発明の星細胞活性化抑制剤は、Ｌ−メチオニン、Ｌ−システイン又はそれらの誘導体を有効成分とするものであり、肝臓や腎臓などに存在する星細胞の活性化を抑制することが可能である、臓器線維症の一因である星細胞の活性化を抑制することができるので、肝臓や腎臓などの臓器において、慢性炎症後などに惹起される臓器線維症の予防又は治療剤としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】試験例１−１の結果を示す図である。
【図２】試験例１−１の血清存在下における結果を示すグラフである。
【図３】試験例１−２の血清存在下における結果を示すグラフである。
【図４】試験例１−２の血清非存在下における結果を示すグラフである。
【図５】試験例１−３の結果を示すグラフでである。
【図６】試験例２の結果を示すグラフでである。
【図７】試験例３において、肝臓星細胞の結果を示す図である。
【図８】試験例３において、腎臓星細胞の結果を示す図である。
【図１】
2004018418.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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