(57)【要約】【課題】乳製品の製造に適した乳酸菌である、ラクトコッカス属乳酸菌の中から、腸内生残性に優れ、しかも効果が生体レベルで見られるような抗アレルギー剤を提供すること。【解決手段】ラクトコッカス　ラクティス　サブスピーシーズ　ラクティスＧ５０株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８４１５）を有効成分として含有することを特徴とする抗アレルギー剤並びに当該抗アレルギー剤を含むことを特徴とする発酵食品。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトコッカス　ラクティス　サブスピーシーズ　ラクティスＧ５０株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８４１５）を有効成分として含有することを特徴とする抗アレルギー剤。
【請求項２】
抗アレルギー剤がＩｇＥ抗体産生抑制作用によるものである請求項１記載の抗アレルギー剤。
【請求項３】
ラクトコッカス　ラクティス　サブスピーシーズ　ラクティスＧ５０株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８４１５）が生菌である請求項１記載の抗アレルギー剤。
【請求項４】
ラクトコッカス　ラクティス　サブスピーシーズ　ラクティスＧ５０株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８４１５）を有効成分として含有する抗アレルギー剤を含むことを特徴とする発酵食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗アレルギー剤に関し、詳しくは特定のラクトコッカス属乳酸菌を有効成分として含有する抗アレルギー剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、食生活や生活習慣などの変化により、アレルギー患者が増大している。アレルギー疾患は、その作用機序によりＩ型からＩＶ型まで分類されており、このうちＩ型アレルギーには、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー等が含まれ、子供から成人まで幅広い年代の人々がアレルギー症状に苦しんでいる。
これまで、食物アレルギーの予防、治療には、食物から原因となる物質を除去する方法が主として行われてきた。しかし、原因物質の除去には、本人の負担だけでなく、調理をする側の負担も伴い、問題点も多い。
【０００３】
Ｉ型アレルギー反応では、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体産生が重要な役割を果たすとされている。したがって、Ｉ型アレルギー反応を抑制するには、ＩｇＥ抗体産生の抑制が重要であり、これまでエンテロコッカス属乳酸菌、ラクトバチルス属乳酸菌、ビフィズス菌によるＩｇＥ抗体産生抑制効果のような免疫系の調節作用が報告されている。
ところで、乳酸菌やビフィズス菌ならば、医薬品としてだけでなく、食品としても摂取が可能であるため、アレルギーの予防のために毎日摂取することにも、抵抗が少ないと考えられる。
【０００４】
しかし、エンテロコッカス属乳酸菌については、このグループに属する菌株のすべてが安全であるとは限らず、病原性を有する菌株も存在するため、使用する菌株を慎重に選択する必要がある。
また、ラクトバチルス属乳酸菌は、乳酸菌の中でも安全性が高いグループであることが知られているが、この菌株は一般に牛乳中での生育が劣るものが多く、発酵乳の製造の際に、本菌株を十分に生育させるためには、乳由来の乳酸菌と混合したり、グルコースや酵母エキスなどを添加しなければならない。
一方、ビフィズス菌は安全性が高い菌であるが、ビフィズス菌は酸素の存在するところでは全く生育できない偏性嫌気性細菌であるため、その取扱いには嫌気性グローブボックス等の設備が必要とされる。
【０００５】
これに対して、ラクトコッカス属乳酸菌は、上記のラクトバチルス属乳酸菌と並んで安全性が高い上に、牛乳中での生育が良く、乳製品製造に適した乳酸菌のグループである。また、本菌は通性嫌気性菌であるため、取扱いも容易である。したがって、ラクトコッカス属乳酸菌において、付加価値の高い乳製品の開発に向け、新規な菌株、とりわけＩｇＥ抗体産生抑制効果を有する菌株が求められていた。しかし、これまでラクトコッカス属乳酸菌を用いた免疫調節作用についての研究は、試験管レベルでの報告がなされているにすぎない。試験管レベルで得られた結果から生体での効果を推定することは危険であり、慎重、かつ十分な配慮が必要な上、信頼性が低いという問題がある。そのため、実用化には生体レベルでの解析が不可欠である。
【０００６】
ラクトコッカス属乳酸菌は、免疫調節作用を含め、そのプロバイオティック機能については、これまで殆ど評価がなされていなかった。「プロバイオティクス」とは、もともと「宿主の腸内フローラのバランスを改善することにより、宿主動物に有益に働く微生物添加物」と定義されており、乳酸菌がプロバイオティクスとしての機能を十分に発揮するためには、腸管まで生きたまま到達することが望ましいとされてきた。
このため、プロバイオティクス研究は、動物の腸由来のラクトバチルス属乳酸菌やビフィズス菌を用いた研究が主流であった。一方、ラクトコッカス属乳酸菌の多くは、乳由来であり、これまで腸内生残性が低いとされてきたため、プロバイオティクスとしての研究は進展しなかった。
【０００７】
最近では、プロバイオティクスなる用語は「宿主の健康維持に有益な働きをする微生物」として広い意味で用いられることが多く、そのため死菌体でもプロバイオティクスに含めることができるという考えも見られる。しかし、生菌のまま消化管に到達する方が、抗菌作用等の機能を発揮する上で有利であり、他の生理作用との複合的な効果が期待できる。
また、生菌として腸内に存在する期間が長ければ、効果の持続という点で、効果が一過性である死菌体よりも有利であると考えられる。
試験管レベルでの免疫調節作用が報告されている上記のラクトコッカス属乳酸菌、特にラクトコッカス　ラクティス　サブスピーシーズ　クレモリス　ＡＴＣＣ１９２５７株やラクトコッカス　プランタラム　ＡＴＣＣ４３１９９株、ラクトコッカス　ラフィノラクティス　ＡＴＣＣ４３９２０株は、いずれも腸内生残性が低いため、経口摂取しても、死菌体としての作用、すなわち一過性の作用しか期待できないものと予想される。
【０００８】
乳酸菌の性質は、腸内生残性を含め、殆どが菌株特異的であり、同じ種に属する乳酸菌であっても、腸内生残性が異なることがある。そのため、乳製品製造において重要な役割を果たしているラクトコッカス属乳酸菌に属し、腸内生残性に優れ、かつ抗アレルギー作用、特にＩｇＥ抗体産生抑制効果が生体レベルで見出されるような乳酸菌株が求められている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、乳製品製造に適した乳酸菌である、ラクトコッカス属乳酸菌の中から、腸内生残性に優れ、しかも効果が生体レベルで見られるような抗アレルギー剤を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく検討を重ねた結果、ラクトコッカス属乳酸菌のうち、ラクトコッカス　ラクティス　サブスピーシーズ　ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　ｌａｃｔｉｓ）　Ｇ５０株は、生菌のままで腸まで到達することができ、経口投与によってマウスのＩｇＥ抗体産生を抑制する作用を有していることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
請求項１記載の本発明は、ラクトコッカス　ラクティス　サブスピーシーズ　ラクティスＧ５０株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８４１５）を有効成分として含有することを特徴とする抗アレルギー剤である。
請求項２記載の本発明は、抗アレルギー剤がＩｇＥ抗体産生抑制作用によるものである請求項１記載の抗アレルギー剤である。
請求項３記載の本発明は、ラクトコッカス　ラクティス　サブスピーシーズ　ラクティスＧ５０株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８４１５）が生菌である請求項１記載の抗アレルギー剤である。
請求項４記載の本発明は、ラクトコッカス　ラクティス　サブスピーシーズ　ラクティスＧ５０株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８４１５）を有効成分として含有する抗アレルギー剤を含むことを特徴とする発酵食品である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明に係るラクトコッカス　ラクティス　サブスピーシーズ　ラクティスＧ５０株は、ラクトコッカス属乳酸菌の中から、以下に示す方法によって選抜することができる。
すなわち、供試乳酸菌と免疫担当細胞の一つであるマクロファージ株とを共培養したときのマクロファージ株のサイトカイン産生量を指標として選抜することができる。このとき用いるマクロファージ株としては、ＢＡＬＢ／ｃ系マウス由来のＪ７７４．１株（ＡＴＣＣ　ＴＩＢ−６７）などがある。
選抜したラクトコッカス　ラクティス　サブスピーシーズ　ラクティスＧ５０株は、独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ　Ｐ−１８４１５である。
【００１３】
本菌株は、代表的な食物アレルゲンである卵白オボムコイドもしくは乳清β−ラクトグロブリンで免疫したマウスに経口投与した場合、血清中のＩｇＥ抗体量の上昇を抑制する作用を有している。しかも、マウスに経口投与した場合に、生菌として糞便から検出されたことから、腸まで生菌のまま到達していることが判明した。このことから、経口摂取の後に、本菌株は消化管内の特異的な環境条件（胃酸の低ｐＨ、小腸の胆汁酸の存在等）に打ち勝って、腸管まで到達し、持続的な効果を発揮できる可能性が高い。本菌株はプロバイオティクスとして重要な特性を有する微生物である。
【００１４】
本菌株は、乳酸菌の培養の常法に従って任意の条件で培養し、培養物から遠心分離等の固−液分離手段によって集菌したものを１〜２回、好ましくは２回、生理食塩水や滅菌水などで洗浄して、本発明の目的に使用することができる。製剤化の形態についても特に制限はなく、所望により凍結乾燥粉末、噴霧乾燥粉末、液体への懸濁など、使用目的に応じて適宜決定すればよい。その他、本菌をスターター等として使用して発酵食品を製造し、本菌を含む状態で用いることもできる。
【００１５】
本発明によるＩｇＥ抗体産生抑制には、本菌株の経口投与が望ましい。マウス（体重２０ｇ）での実験において、菌体重量で０．１７１〜０．２２ｍｇ／０．２ｍｌ／日投与で抑制効果が認められたことから、ヒトの場合、体重１ｋｇあたり菌体重量で８．５５〜１１ｍｇ／日程度の投与で十分な効果が奏されるが、これより多量に摂取しても良い。
上記の菌体量を１日１回もしくは数回に分けて摂取すれば良い。本菌株は、牛乳中でもよく生育するため、前記したように、本菌株を使用して製造した発酵乳などの乳製品の形態で摂取することもできる。
【００１６】
【実施例】
以下に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
実施例１
ＢＡＬＢ／ｃマウス（平均体重２０ｇ）は、搬入後、馴致のために１２日間、市販の飼料（ＭＭ−３、船橋農場製、千葉県）と水で飼育した。
ラクトコッカス　ラクティス　サブスピーシーズ　ラクティスＧ５０株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８４１５）またはラクトバチルス　アシドフィルスＪＣＭ１１３２株（理化学研究所）は、予め常法に従って一昼夜培養した。次に、上記の乳酸菌株を０．８５％食塩水で２回洗浄し、２００μｌ当たり０．１７１〜０．２２ｍｇとなるように１０％脱脂乳（雪印スキムミルク、雪印乳業製）に懸濁した。
【００１７】
当該乳酸菌生菌体の１０％脱脂乳懸濁液２００μｌを、前記ＢＡＬＢ／ｃマウス６匹に１日１回１９日間強制的に連続して経口投与した。なお、対照群には、１０％脱脂乳のみを同様に経口投与した。
乳酸菌体投与開始後、５日目、１９日目および４３日目に生理食塩水に懸濁したオボムコイド（ＯＶＭ）５０μｇおよび水酸化アルミニウム２〜３ｍｇ／匹を腹腔内投与し、５０日目にマウスより血液を採取し、血清中の総ＩｇＥ値およびＯＶＭ特異的ＩｇＥ値を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。総ＩｇＥ値は、ＯｐｔＥＩＡマウスＩｇＥ測定キット（ファーミンジェン社製）を用いて測定した。対照を１００％とした相対値で示す。
【００１８】
総ＩｇＥ値の測定結果を図１に、ＯＶＭ特異的ＩｇＥ値の測定結果を図２に示した。図１から明らかなように、ラクトコッカス　ラクティス　サブスピーシーズ　ラクティスＧ５０株を投与した群では、総ＩｇＥ値が対照群に比べて有意に低下していた。なお、図中の＊＊は有意水準１％未満（ｐ＜０．０１）であることを示す。また、ＯＶＭ特異的ＩｇＥ値は、当該Ｇ５０株の投与群では、対照群よりも減少する傾向が認められた（図２）。
一方、ラクトバチルス　アシドフィルスＪＣＭ１１３２株を投与した群では、総ＩｇＥ値が対照群に比べて減少していたが、有意ではなかった（図１）。また、図２に示したように、当該ＪＣＭ１１３２株を投与した群のＯＶＭ特異的ＩｇＥ値は、対照群よりも減少する傾向が認められなかった。
【００１９】
実施例２
実施例１と同様にして培養し、食塩水で２回洗浄して得たＧ５０株（ＦＥＲＭＰ−１８４１５）またはラクトバチルス　アシドフィルスＪＣＭ１１３２株（理化学研究所）を、実施例１と同様に予備飼育したＢＡＬＢ／ｃマウス（平均体重２０ｇ）に１５日間経口投与した。投与期間中に牛乳アレルゲンの１種であるβ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）の経口投与（１ｍｇ×５／匹）と免疫（ＢＬＧ５０μｇ＋水酸化アルミニウム２〜３ｍｇ／匹）を行い、ＢＬＧに対する抗体応答（カウント、×１０−３）　について調べた。結果を図３（Ａ）、（Ｂ）に示す。（Ａ）はＢＬＧ未投与群を、（Ｂ）はＢＬＧ投与群を示す。図中、生食は生理食塩水を、−は平均値を、＊は有意水準５％未満（ｐ＜０．０５）であることを示す。
図３（Ａ）、（Ｂ）から明らかなように、当該Ｇ５０株投与群では、ＢＬＧの投与、未投与に関わらず、当該ＪＣＭ１１３２株投与群や対照群と比較して強いＩｇＥ抗体抑制効果が認められた。
ここで、特筆すべきことは、ＢＬＧを予め経口投与しておくと、ＢＬＧに対する免疫応答が抑制され、すなわち、経口免疫寛容が誘導されるが、さらにＧ５０株を投与することにより、ＢＬＧ特異的ＩｇＥ抗体産生が対照（生理食塩水のみ投与）群よりも有意に減少することである。このことから、Ｇ５０株は、経口免疫寛容を効率的に誘導する働きを有していると考えられる。
【００２０】
実施例３
本実施例では、マウスに経口投与したＧ５０株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８４１５）の腸内生残性を検討した。まず、Ｇ５０株のリファンピシン耐性株を作製した。Ｇ５０株を常法に従って一昼夜培養し、リファンピシン（シグマ社製、１００μｇ／ｍｌ）含有ＧＭ１７寒天培地に塗布した。３０℃で培養後、生育したコロニーを釣菌することにより、リファンピシン耐性株を得た。この耐性株を一昼夜培養し、０．８５％食塩水で４回洗浄し、２００μｌあたり１０９ｃｅｌｌｓになるように１０％脱脂乳に懸濁した。
リファンピシン耐性Ｇ５０株生菌体の１０％脱脂乳懸濁液２００μｌを、実施例１と同様に予備飼育したＢＡＬＢ／ｃマウス３匹に強制的に経口投与した。投与後、経時的に糞便を採取し、滅菌した０．８５％食塩水に懸濁した後、その一部を段階希釈し、リファンピシン含有寒天培地に塗布した。これを３０℃のインキュベーター内で１−２日間培養後、生育したコロニー数を測定した。
乳酸菌投与前の糞便からは、リファンピシン含有培地で生育するコロニーは検出されなかった。Ｇ５０株投与後、糞便から検出されたラクトコッカス属菌の生菌数は、１２時間後で７．３０±０．３２９（対数値）、２４時間後で４．７５±０．４２６であり、Ｇ５０株は生きたままマウスの消化管を通過できることが明らかとなった。
【００２１】
試験例１
Ｇ５０株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８４１５）、ラクトコッカス　ラクティス　サブスピーシーズ　クレモリスＡＴＣＣ１９２５７株、ラクトコッカス　ラフィノラクティスＡＴＣＣ４３９２０株およびラクトコッカス　プランタラムＡＴＣＣ４３１９９株は予め常法に従って一昼夜培養した。
ＭＲＳ液体培地（ディフコ社製）に脱水胆汁（オキシガル、ディフコ社製）を０．３％になるように添加し、上記菌体を接種した。その後、腸内環境に合わせるために、３７℃で培養を行い、２４時間後に６２０ｎｍの吸光度を測定した。対照として、脱水胆汁無添加のＭＲＳ液体培地に上記菌体を接種し、同様に培養した。
その結果、脱水胆汁無添加培地で培養した場合、当該Ｇ５０株、ＡＴＣＣ１９２５７株、ＡＴＣＣ４３９２０株およびＡＴＣＣ４３１９９株は、それぞれ１．６９、０．６、０．９８および０．６２の濁度を示したが、脱水胆汁添加培地で培養した場合は、Ｇ５０株のみが対照と同程度の濁度を示し、ＡＴＣＣ１９２５７株、ＡＴＣＣ４３９２０株およびＡＴＣＣ４３１９９株は生育しなかった。
【００２２】
試験例２
Ｇ５０株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８４１５）、ラクトコッカス　ラクティス　サブスピーシーズ　クレモリスＡＴＣＣ１９２５７株およびラクトコッカス　ラフィノラクティスＡＴＣＣ４３９２０株は予め常法に従って一昼夜培養した。次に、これら乳酸菌株を０．８５％食塩水で２回洗浄し、ｐＨ７．０のリン酸緩衝液に懸濁した。この菌液に脱水胆汁を０．３％となるように添加し、３７℃で３時間保温した。
次いで、この菌液を段階希釈し、Ｍ１７（ディフコ社製）寒天培地に塗布し、３０℃のインキュベーター内で１−２日間培養後、寒天上で生育したコロニー数を数えた。その結果、胆汁酸で処理した後の生菌数は、Ｇ５０株が４．１×１０６　、ＡＴＣＣ１９２５７株が５．８×１０２　、ＡＴＣＣ４３９２０株が５．７×１０２　であった。このことから、Ｇ５０株は消化管内の特異的な環境条件下でも胆汁酸により破壊されることなく、腸管まで生菌として到達できることが分かった。
【００２３】
【発明の効果】
請求項１記載の本発明により、乳酸菌の中でもラクトバチルス属乳酸菌と並んで安全性が高く、しかも乳製品製造に適しているラクトコッカス属乳酸菌、ラクトコッカス　ラクティス　サブスピーシーズ　ラクティスＧ５０株を有効成分として含有する抗アレルギー剤が提供される。
【００２４】
さらには、請求項４記載の発明により、ラクトコッカス　ラクティス　サブスピーシーズ　ラクティスＧ５０株を有効成分として含有する抗アレルギー剤を含むことを特徴とする発酵食品が提供される。例えば、本菌株をスターターとして用いて乳製品を製造し、本菌株を含んだ発酵食品を摂取することによって、その機能を利用することができる。
【００２５】
本発明に係るＧ５０株は、腸管まで生きたまま到達できるため、生菌としての効果、すなわち抗菌物質の産生や栄養素の競合による有害菌の阻害などが期待でき、ＩｇＥ抗体抑制効果による抗アレルギー作用と併せた包括的な生理効果を期待することができる。
なお、今回は、食物アレルゲンのうち、卵白オボムコイド、乳清β−ラクトグロブリンを用いたが、小麦、落花生等のアレルギーを誘導するその他の食品に対しても、Ｇ５０株の経口投与による効果が期待される。また、食物アレルギーだけでなく、Ｉ型アレルギーに属する花粉症やアトピー性皮膚炎の症状の緩和にも、Ｇ５０株の投与効果が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】オボムコイドで免疫したマウスへのＧ５０株、ＪＣＭ１１３２株の経口投与が血清中のＩｇＥ抗体産生量に及ぼす影響を調べたものである。
【図２】オボムコイド特異的ＩｇＥ抗体産生に及ぼすＧ５０株、ＪＣＭ１１３２株の経口投与の影響を調べたものである。
【図３】β−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）特異的ＩｇＥ抗体産生に及ぼすＧ５０株、ＪＣＭ１１３２株の経口投与の影響を調べたものであり、（Ａ）はＢＬＧ未投与群を、（Ｂ）はＢＬＧ投与群を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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