(57)【要約】【課題】自己以外の動物由来成分を含まない無血清培地でヒト細胞を培養する方法等を提供し、培養細胞を安全に利用できるようにすること。【解決手段】自己以外の動物由来成分を含まない無血清培地に自己組織抽出液を添加してヒト細胞の培養を開始する手順と、細胞培養の過程で前記ヒト細胞から分泌された物質を含む培養上清を利用して細胞培養を継続する手順と、を含むヒト細胞培養方法、該方法によって培養された細胞を自己以外の動物由来成分を含まない無血清培地で分離継代する方法及びこれらの方法で培養された細胞を凍結保存する方法を提供する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己以外の動物由来成分を含まない無血清培地に自己組織抽出液を添加してヒト細胞の培養を開始する手順と、
細胞培養の過程で前記ヒト細胞から分泌された物質を含む培養上清を利用して細胞培養を継続する手順と、を含むことを特徴とするヒト細胞培養方法。
【請求項２】
請求項１記載のヒト細胞培養方法において、前記ヒト細胞を多孔膜又は粒状担体と接触させながら培養した後、培養されたヒト細胞が付着した前記多孔膜又は前記粒状担体の一部を他の培養器具に移し、該培養器具内で細胞塊を形成する手順を含むことを特徴とするヒト細胞分離継代方法。
【請求項３】
前記培養器具は、遠沈管であることを特徴とする請求項２記載のヒト細胞分離継代方法。
【請求項４】
請求項１記載のヒト細胞培養法によって得られる増殖細胞を分離し、該分離細胞の培養液に、カルシウム（Ｃａ）及びマグネシウム（Ｍｇ）を添加することを特徴とするヒト細胞分離培養方法。
【請求項５】
請求項１記載のヒト細胞培養方法において、前記ヒト細胞を多孔膜と接触させながら培養し、ヒト細胞が付着した状態の前記多孔膜を凍結保存することを特徴とする培養ヒト細胞の凍結保存方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト細胞培養に係わる技術に関する。詳しくは、自己以外の動物由来成分を含まない無血清培地でヒト細胞を培養する方法、この方法によって得られた培養細胞を分離継代する方法、並びに前記養細胞を凍結保存する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術（背景技術）及び発明が解決しようとする課題】
現在、再生医療や細胞医療の技術分野や美容技術分野等において、ヒト細胞を利用する技術に関する研究・開発が進展しているが、ヒト細胞の利用において最も安全で且つ有用な素材は、自分自身の細胞である。これは、異種動物由来の成分が添加又は使用されていないヒト細胞は、ウイルスやプリオン等への感染の心配がなく、更にこれを自分自身に利用する場合には、アレルギー反応や拒絶反応が発生しないからである。
【０００３】
しかし、従来一般の細胞培養技術（例えば、特許文献１参照）を採用した場合には、細胞へのダメージや異種動物由来である蛋白質等の外来成分の混入が生じてしまうという問題点がある。細胞のダメージは、継代に用いるトリプシン等の分解酵素による細胞表面蛋白質の分解や、培地に添加する血清に含まれる抗体及び補体による細胞への付着が原因で起こる。また、前記特許文献１に開示された方法のように、牛肉由来のペプトンを添加した培地で細胞培養を行うと、プリオンによる感染の可能性を排除できない。
【０００４】
【特許文献１】特開平４−２３４９８２号報
【０００５】
これらの問題点は、従来の細胞培養においても現実に生じていたが、大量生産に用いる細胞が従来は癌細胞や不死化細胞株に限られていたので、増殖が早く、分解酵素への抵抗性もあり、更に蛋白質生産用の工場として利用されていたため、それほど大きな問題とはならなかった。
【０００６】
しかし、今後、培養としたヒト細胞又はその抽出物を、医薬として体内に戻したり、人口皮膚等の医用材料や化粧品等に利用したりする場合には、自己成分以外の異物による拒絶（アレルギー）惹起と異種動物（例えば、ウシ）由来の外来成分に混在している可能性のあるウイルスやプリオンの感染を確実に防止できることが非常に重要となる。特に近年、ＢＳＥ（狂牛病）問題が深刻化しており、その危険性が明白となっているため、再生医療や細胞医療等の分野での安全性の確保は、極めて重要課題となっている。
【０００７】
この状況下、自己成分以外の成分、即ち異種動物由来成分（蛋白質等）を全く添加しない条件下で、自己細胞の培養を確実に行うことができたならば、再生医療や細胞医療等の分野において大きな利点となる。
【０００８】
そこで、本発明は、ヒト細胞の培養において、該ヒト細胞自体から分泌される物質を積極的に有効利用する方法を検討し、従来一般に用いられているウシ胎児血清（ＦＢＳ）やトリプシン等の分解酵素を使わない条件下でも、ヒト細胞の増殖能力の向上を確実に達成できるヒト細胞培養方法と、それに不随するヒト細胞分離継代方法並びにヒト細胞凍結保存方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本願では、まず、自己以外の動物由来成分を含まない無血清培地に自己組織抽出液を添加してヒト細胞の培養を開始する手順と、細胞培養の過程で前記ヒト細胞から分泌された物質を含む培養上清を利用して細胞培養を継続する手順と、を含むヒト細胞培養方法を提供する。即ち、このヒト細胞培養方法では、自己以外の動物由来成分を一切含まない条件で、自己の細胞を培養することが可能となる。
【００１０】
次に、前記ヒト細胞培養方法において、前記ヒト細胞を多孔膜又は粒状担体と接触させながら培養した後、培養されたヒト細胞が付着した前記多孔膜又は前記粒状担体の一部を他の培養器具に移し、該培養器具内で細胞塊を形成する手順を含むヒト細胞分離継代方法を提供する。特に、前記培養器具として遠沈管を用いる方法も提供する。この方法では、多孔膜や粒状担体において細胞増殖の足場を確保することによって、細胞の遊走が促進されやすい培養環境を確保でき、また、遠沈管を用いることにより、強固に結合した細胞塊を形成することができる。
【００１１】
また、本願では、上記ヒト細胞培養法によって得られる増殖細胞を分離し、該分離細胞の培養液に、カルシウム（Ｃａ）及びマグネシウム（Ｍｇ）を添加することを特徴とするヒト細胞分離培養方法を提供する。この方法では、カルシウムとマグナシウムの添加によって、無血清であっても、ヒト細胞の一部が樹状に伸び、互いに結合して、神経様ネットワークを形成することができる。
【００１２】
更に、本願では、上記ヒト細胞培養方法において、前記ヒト細胞を多孔膜と接触させながら培養し、ヒト細胞が付着した状態の前記多孔膜を凍結保存する培養ヒト細胞の凍結保存方法を提供する。この方法によれば、確実にヒト細胞を凍結保存し、利用することができる。
【００１３】
以上の本発明は、自己細胞を体外で培養して増殖または組織化させる際に異種動物由来の成分を全く使用しない自己細胞由来成分のみでの培養、細胞の分離継代並びに細胞の凍結保存を可能とするので、より培養されたヒト細胞の安全性が高まり、再生医療や細胞医療の発展に寄与するという技術的意義を有している。
【００１４】
【実施例】
以下、本発明に係る方法を構成する手順の実施例について説明する。
【００１５】
実施例１：細胞培養の開始手順。
同意の上、採取した皮膚組織の小片（美容整形のフェイスリフト手術の際に生じた皮膚組織片）や吸引脂肪組織を、抗生物質（ペニシリン１００単位／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、アンホテリンＢ０．２５μｇ／ｍｌ）を含むリン酸バッファー（以下、「ＰＢＳ」）の入った滅菌済み５０ｍｌ遠沈管（室温）に保存して輸送した。
【００１６】
組織片はできるだけ早く、遅くとも２日以内には安全キャビネット内で以下の操作を行った。組織片は、上記した抗生剤入りのＰＢＳで、少なくとも３回洗浄し、２分割した。
【００１７】
１つは、組織片重量の５倍量の無血清培地を加えてホモジネナイズ（細切、破砕）した。そのホモジネートをメッシュまたはファルコン製セルストレーナーで組織残渣を除去し、更に０．２２μｍのフィルターを通して滅菌したものを、「自己組織抽出液」として血清の代わりに用いた。
【００１８】
もう１つは、１ｍｍ四方程度に細切して、滅菌済みの直径１３ｍｍの多孔膜であるメンブレンフィルター（以下、「ＭＦ」と略称。）（例えば、日本ミリポア製アイソポア・メンブレンフィルター）上に載せて数十秒間放置し、組織片を固定した。組織片を固定したＭＦを６−ウエルプレートに入れて、組織片が浸る最小量（０５〜１ｍｌ）の１０〜２０％前記自己組織抽出液を添加したＤＭＥＭ培地で培養した。
【００１９】
培養１週間で、前記組織片からは細胞がアウトグロース（ｏｕｔｇｒｏｔｈ）してきた。その様子を添付した図（図面代用写真）１（Ａ）に示した。更に、本実験では、前記ＤＭＥＭ培地に、海洋深層水、ビタミンや鉄キレート剤等を添加することにより、細胞の培養効率を上げることができることがわかった。
【００２０】
なお、細胞の遊走や増殖状態は、ＭＦに１ｍｍ径以下の穴を開けておくと、細胞が穴を覆うように増殖するので、通常の倒立顕微鏡で観察することができる。更に培養を続けると、２〜３週間後にはＭＦからプレートの底面に細胞がアウトグロースしてくる。その間、自己組織抽出液を含む前記培地を５日間隔で交換した。
【００２１】
なお、図（図面代用写真）１（Ｂ）は、自己組織抽出液を全く添加しないＤＭＥＭ培地で同組織片を培養した比較例の１週間後の様子を示している。自己組織抽出液を添加した上記実施例１の場合と異なり、細胞からのアウトグロースは観察できなかった。このことから、上記自己組織抽出液を添加して培養を開始すると、細胞の遊走が促進されることがわかる。
【００２２】
実施例２：継続（拡大）培養手順（Ｉ）。
６−ウエルプレートのＭＦ上で培養している組織片から細胞が増殖し、ＭＦからウエルの底面にまで細胞が増えてきたら、組織片の載ったＭＦを新しいフラスコやディシュ等の培養器具に移して、無血清培地（市販培地、例えば、ＥＸ−ＣＥＬＬ５０５：ニチレイ（株）社製、又は自己組織抽出液を添加した培地）で培養する。
【００２３】
この際、ＭＦはフラスコ等の培養器具の底面には、必ずしも固定する必要はなく、数日でＭＦから細胞が底面に細胞が移り、２週間後には細胞の増殖速度が大きくなるので、更に組織片の載ったＭＦを別の新しいフラスコ等に移すことで細胞の継代を行うことができた。この結果、ＭＦを用いた継代方法によって、６ヶ月以上細胞の継代を続けることができた。
【００２４】
実施例３：継続（拡大）培養手順（ＩＩ）。
予め、６ｃｍデッシュの底面にＭＦをワセリンで付着させておき、組織片の載ったＭＦ（細胞が増殖し付着しているＭＦ）を入れて培養する。ＭＦ上の細胞が新しいＭＦに移って増殖した。この際、組織片の載ったＭＦをディシュ底面に付着させても浮遊させても細胞の移動速度に差がないことがわかった。
【００２５】
実施例４：細胞の継続（拡大）培養手順（ＩＩＩ）。
６−ウエルプレートのウエル中に、組織片や細胞の載ったＭＦと共に、粒状担体（マイクロキャリアー、例えば、Ｂｉｏｓｉｌｏｎ：ファルコン等）を入れて培養すると数日〜１週間で、粒状担体に細胞が増殖して付着することがわかったので、培地ごと前記粒状担体を別の新しいフラスコ等の培養器具へ移して培養を行った。その結果、細胞が粒状担体からフラスコの底面へ移動して増殖することが確認できた。
【００２６】
実施例２と同様に、フラスコの底面で細胞が増殖してきたら、また、細胞の付着した粒状担体を回収し、更に新しいフラスコ等の培養器具に移し、細胞の継代を行うことによって、６ヶ月以上細胞の継代を続けることができた。このことから、多孔膜（ＭＦ）同様に、粒状担体を用いた細胞継代は、有効であることが確認できた。
【００２７】
実施例５：細胞の継続培養手順（ＩＶ）。
当初の１３ｍｍのＭＦから大きなＭＦに継代して、その大きなＭＦをより大きなサイズのフラスコ等の培養器具へと拡大培養することも可能であることがわかったが、これには時間がかかるという欠点があることがわかった。
【００２８】
そこで、時間をかけないで拡大培養する方法として、実施例２の細胞の付着したＭＦ、または実施例４の細胞の付着した粒状担体を、ポリプロピレン、またはポリメチルペンテン製の遠沈管（遠心用チューブ）に培地２０ｍｌと共に入れて無血清培養を行った。遠沈管は、上方に開口する円筒状の胴体を備え、その下端部が窄んで尖塔形状になっている容器で、遠心分離に利用される容器である。
【００２９】
ＭＦから細胞が増殖して遠沈管の壁面に移って増殖する際には、細胞は、細胞塊を作って神経細胞のように網目構造を形成した。この様子を図（図面代用写真）２に示した。なお、図２（Ａ）は、遠沈菅の上端部における細胞の図面代用写真、図２（Ｂ）は、遠沈菅下端部の緩く傾斜する側面部における細胞の図面代用写真、図２（Ｃ）は、遠沈菅の底面部における細胞の図面代用写真をそれぞれ示している。特に、遠沈菅下端部の緩く傾斜する側面部において細胞塊が形成し易いこともわかった。
【００３０】
２週間で網目構造の細胞塊が多数形成されたので、振動等の物理的衝撃を加えると、遠沈管の壁面から細胞塊が容易に剥離させることができた。それを培地（細胞塊と多数の細胞）ごと、大きな培養面積のフラスコに容易に移すことができた。
【００３１】
トリプシン等の酵素処理を行わない細胞塊でも、フラスコ等に付着して増殖した。この様子を図（図面代用写真）３（Ａ）〜（Ｃ）に示した。これらの図面代用写真を見ればわかるように、個々の細胞が分散せずに、まとまった細胞塊を形成して増殖していることがわかる。
【００３２】
ここで、細胞の増殖は、無血清培養では特に細胞密度が重要である。その理由は、細胞が増殖に必要な生理活性物質を血清から供給を受けることができず、細胞自身の産生した生理活性物質が唯一の供給源となるため、細胞密度が低い場合は増殖できるまでの生理活性物質濃度に達するまでに時間がかかるからである。しかし、上記実施例５で得られたような高密度状態の細胞塊であれば、細胞の増殖に必要な生理活性物質が早期に高濃度で産生されるので、無血清培養条件下であっても、細胞の増殖を容易に行うことができる。
【００３３】
次に、細胞の足場への付着に必要な接着蛋白質の供給が無血清培養では十分でないため、細胞が剥がれ易く、死滅し易いという問題がある。
【００３４】
実施例６：細胞の継続培養手順（Ｖ）。
前記問題を解決するため、本発明では、細胞塊（と細胞）を新しい大型フラスコに加え、０．２Ｍカルシウム（Ｃａ）と０．２Ｍマグネシウム（Ｍｇ）を培地に添加するように工夫した。
【００３５】
この結果、細胞の一部が突起様に伸び、その突起同士が結合して網目状に発達することわかった。細胞塊を用いない場合でも、無血清状態で０．２Ｍカルシウム及び０．２Ｍマグネシウムが存在すると、図（図面代用写真）４の各写真に示されているように網目状に増殖することがわかった。なお、図５の各写真は、カルシウム及びマグネシウムを添加しなかった（図中（−）で示す）、比較例の細胞培養の様子を示している。比較例では、培養細胞には網目状の発達が見られない。
【００３６】
このように、遠沈管を用いて、細胞を網目状に発達させて細胞同士の結合を強めたり、更には、無血清培地へのカルシウムやマグネシウムの添加効果によって、ヒト細胞の一部が樹状に伸び、互いに結合して、神経様ネットワークを形成させたりすることによって、無血清培養下でも早期に拡大培養が可能となった。
【００３７】
実施例７：自己細胞の無血清培養上清（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）の調製手順。
実施例２又は実施例４に準じて、細胞を１００％コンフルエントになるまで無血清培養した。培地は、自己組織抽出液を添加したＤＭＥＭ培地、または市販の無血清培地（ＥＸ−ＣＥＬＬ５０５）を用いることにした。
【００３８】
１００％コンフルエント後、更に１週間培養を続け、過増殖になるまで行う。その後、前記ＤＭＥＭ培地に交換して、５日間隔で培地の７０％を新しい培地に交換した。培地の細胞産生蛋白質濃度をモニターリングし、該濃度が低下したら、自己組織抽出液を添加したＤＭＥＭ培地、または市販の無血清培地（ＥＸ−ＣＥＬＬ５０５）で培養し、細胞の蛋白質産生能力を回復させた。
【００３９】
回収した培養上清は、５Ｋのフィルターを用いた限外濾過にて、低分子の老廃物を除去して２５〜５０倍に濃縮した。濃縮液は、０．２２μｍのフィルターを通して滅菌したものを、血清の代わりの添加剤として用いた。５０倍濃縮した培養上清を１０％添加したＤＭＥＭ培地で、２種類の初代培養ヒト線維芽細胞（Ａ細胞、Ｂ細胞）を培養した。
【００４０】
表１の比較例は、ＤＭＥＭ培地のみで培養したもの（比較例Ｘ）、ＤＭＥＭ培地にＦＢＳを添加したもの（比較例Ｙ）、市販・無血清培地ＥＸ−ＣＥＬＬ５０５を用いたもの（比較例Ｚ）を準備した。なお、細胞の増殖性は、ＭＴＴアッセイ（ＷＳＴ−１：ＴａＫａＲａ）にて測定した。その結果を表１に示した。なお、細胞の増殖性は、４５０ｎｍの吸光度の大きさで表せるので、増殖が促進されたものほど、吸光度も大きな値となる。
【００４１】
【表１】
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（＋）：添加    （−）：未添加
【００４２】
結果。無血清培養上清を添加した実施例は、５％ＦＢＳを添加した比較例Ｙに比較して、１４５％（０２７９／０．１６７）と８６％（０．４５５／０．５２２）の増殖性を示し、また、無血清培地ＥＸ−ＣＥＬＬ５０５を用いた比較例Ｚと比較しても、１６７％（０２７９／０．１６７）と９３％（０．４５５／０．４７４）の増殖性を示したことから、十分な増殖促進効果が存在することが分かる。
【００４３】
即ち、この培養上清中には、細胞自身が生産した蛋白性増殖因子や細胞外マトリクスが含まれていて、血清の代用培地となることがわかった。これを繰り返すことで、細胞の生産した因子を効率良く利用することができる。
【００４４】
実施例８：多孔膜（ＭＦ）上の細胞の凍結保存法。
多孔膜であるＭＦ上で培養した細胞をＭＦと一緒の状態（ＭＦに結合させた状態）で凍結保存できるかを検討した。
【００４５】
１３ｍｍのＭＦ上で十分に細胞を増殖させ、０．５ｍｌ用シーラムチューブ入れ、市販の無血清の凍結保存液（セルバンカー：十慈フィールド、バンバンカー：日本ジェネテックス）０．５ｍｌを加えて、バイセルで−８０℃の条件で保存した。
【００４６】
翌日、一部を液体窒素に移して保存した。それぞれ−８０℃及び液体窒素で１週間保存した後、解凍は通常の細胞と同じように凍結状態のシーラムチューブを４２℃で一気に解凍して、凍結保存液を除き、５０倍に濃縮した無血清培養上清を２０％添加したＤＭＥＭ培地で培養した。
【００４７】
結果。解凍したＭＦを６−ウエルプレートに入れて、自己培養上清濃縮液を添加したＤＭＥＭ培地で１週間培養したところ、−８０℃で保管したＭＦでは、そのフラスコに細胞が確認され、ＭＦからフラスコへ細胞が移動したことで、細胞の生存が確認できた。これを図（図面代用写真）６に示す。この結果から、ＭＦ上の細胞を凍結保存することができたことが確認できた。
【００４８】
【発明の効果】
再生医療や細胞治療において、自己細胞を体外で培養した後に体内に戻す際、自己成分以外の物質（ウイルスやプリオン）の混入を避ける必要があるが、通常の細胞培養では自己以外の成分が混入しているので、それを後で細胞と自己以外の成分（抗原物質、アレルギー惹起物質、病原菌、ウイルス、プリオン）とに精製・分離できない。このため、細胞培養時に自己成分以外、他の生物に由来する成分を使用しない細胞培養技術が、再生医療や細胞医療等の分野から求められているところ、本発明は、無血清培地のみでは採取した組織片から細胞を分離して大量培養することは困難であるため、自己細胞の分泌する蛋白性因子等の成分を積極的に利用するヒト細胞培養関連技術を実現し、提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】（Ａ）自己組織抽出液を全く添加しないＤＭＥＭ培地で、細胞がアウトグロースしてきた様子を示す図面代用写真。
（Ｂ）自己組織抽出液を全く添加しないＤＭＥＭ培地で同組織片を培養した比較例の１週間後の様子を示す図面代用写真
【図２】（Ａ）実施例５の結果を示す遠沈菅の上端部における細胞の図面代用写真
（Ｂ）同遠沈菅下端部の緩く傾斜する側面部における細胞の図面代用写真
（Ｃ）同遠沈菅の底面部における細胞の図面代用写真
【図３】遠沈菅からフラスコへ移した細胞の増殖の様子を示す図面代用写真（（Ａ）〜（Ｃ））
【図４】実施例６の結果を示す図面代用写真（０．２Ｍカルシウム（Ｃａ）と０．２Ｍマグネシウム（Ｍｇ）を培地に添加することで、細胞が突起様に伸び、その突起同士が結合して網目状に発達することを示す図）
【図５】実施例６の比較例の結果を示す図面代用写真（カルシウム及びマグネシウムを添加しなかったときの細胞培養の様子を示す図面代用写真）
【図６】実施例８の結果を示す図面代用写真（凍結保存後に、ＭＦ上の細胞の生存が確認できたことを示す図面代用写真）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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