(57)【要約】【課題】バクミドを用いたバキュロウイルス外来遺伝子発現システムは、部位特異的転位の原理に基づき、大腸菌内で組み換えウイルスのＤＮＡを作るシステムである。このシステムは、昆虫細胞内で相同組み換えによって作る方法に比べ、迅速かつ効率よく組み換えウイルスのＤＮＡを作製することができる。しかし、現在のバクミドはＡｃＮＰＶをバックボーンとしているため、蚕幼虫や蚕の培養細胞に感染させるための組換えウイルス作製に対しては利用できなかった。【解決手段】ｍｉｎｉＦレプリコン、ＢｍＮＰＶ  ＤＮＡ、およびトランスポゾンの付着部位を含むマーカー遺伝子からなるＢｍＮＰＶシャトルベクター。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ｍｉｎｉＦレプリコン、（２）ＢｍＮＰＶ  ＤＮＡおよび（３）トランスポゾンの付着部位を含むマーカー遺伝子からなるＢｍＮＰＶシャトルベクター。
【請求項２】
請求項１のＢｍＮＰＶシャトルベクターを含有する大腸菌株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蚕に組換え遺伝子を発現させるためのＢｍＮＰＶシャトルベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
組み換えバキュロウイルスは、昆虫の培養細胞や幼虫固体において外来遺伝子を発現させるためのベクターとして広く利用されるようになった。組み換えバキュロウイルスにおいて、ポリヘドリンプロモーターの下流に置かれた外来遺伝子は、ウイルスの感染後期に多量に発現する。ほとんどの場合、発現した組み換えタンパク質に対し、そのプロセシング、修飾、局在化などが本来のタンパク質と機能的に近い状態で行なわれる。
【０００３】
組み換えバキュロウイルスは、従来法では２つのステップで作られる。まず、トランスファーベクター内のバキュロウイルスプロモーターの下流に、外来遺伝子をクローニングする。つぎに、外来遺伝子を含有するトランスファーベクターを野生株のバキュロウイルスＤＮＡと共に昆虫細胞にコトランフフェクションし、トランスファーベクターとバキュロウイルスＤＮＡとの相同組み換えを行なうことによって、外来遺伝子を含有する組換えバキュロウイルスが得られる。しかしながらこの方法では、目的とする組み換えウイルスは０．１〜１％しか得られず、大量の野生株のウイルスが含まれる。そこで、ＤＮＡを直鎖状にしたり、さらにはウイルスの生育に必要な遺伝子の一部を欠損させたウイルスＤＮＡと相同組み換えを行なうことによって、目的外の組み換えウイルスの出現率を著しく減らし、目的ウイルスの割合を飛躍的に向上させたが（非特許文献１および非特許文献２）、目的ウイルスの出現数は変わらない。さらに、得られたプラーク中には野生株のウイルスも多少含まれているため、組み換えウイルスのみを得るためには純化の作業が必要となる。また、タンパク質発現に必要なウイルス量を得るためには、ウイルスの増幅が必要となり、プラークアッセイによるウイルスの純化やウイルスの増幅が欠かせない。
【０００４】
近年、組み換えバキュロウイルス作製のための、速くて効率のよい方法が開発された（非特許文献３）。これは、Ｅ．ｃｏｌｉ内で増幅するバキュロウイルスのシャトルベクター（バクミド（ｂａｃｍｉｄ））へ発現カセットを部位特異的に転位させることが基礎となっている。バクミドは、コピー数の少ないｍｉｎｉ−Ｆレプリコン、バクテリアトランスポゾンＴｎ７の付着部位、カナマイシン耐性マーカー遺伝子、ｐＵＣ由来のｌａｃＺαを含有する。Ｔｎ７の付着部位は、ｌａｃＺαのコドンのフレームが本来のフレームからずれないよう、ＬａｃＺα遺伝子内に挿入されている。
【０００５】
現在知られているバクミドは、オートグラファ・カルフォルニカ多角体ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ）をバックボーンとする大きなプラスミドとして大腸菌細胞内で増幅し、カナマイシン耐性を有する。また、バクミドがｌａｃＺ遺伝子を有しているため、大腸菌のコロニーは５−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシドおよびＩＰＴＧの存在下で青色を呈する。組み換えバクミドは、ヘルパープラスミドから供給されるトランスポゼースにより、外来遺伝子を供給するためのドナープラスミド上のｍｉｎｉ−Ｔｎ７が、バクミド上のＴｎ７付着部位に転位することによって作製される。現在市販されているドナープラスミド上のｍｉｎｉ−Ｔｎ７は、ゲンタマイシン耐性遺伝子、ＡｃＮＰＶからのポリヘドリンプロモーター、クローニング部位、ＳＶ４０ｐｏｌｙ（Ａ）からなる発現カセットをＴｎ７の左右のアームのあいだにもっている。発現させる遺伝子は、ドナープラスミド上のポリヘドリンプロモーターの下流のクローニング部位に挿入される。
【０００６】
ｍｉｎｉ−Ｔｎ７がバクミド上のｍｉｎｉ−ａｔｔＴｎ７付着部位に挿入されるとｌａｃＺαペプチドの発現を崩壊させる。したがって、組み換えバクミドを含むコロニーは白色である。
【０００７】
組み換えバクミドＤＮＡは、スモールスケールでの宿主細胞の培養から短時間に分離され、昆虫細胞へのトランスフェクションに使用し得る。トランスフェクションした昆虫細胞から集めたウイルスのストックは、その後のタンパク質発現、精製、解析に使われる。
【０００８】
外来の組換えタンパク質の大量発現を念頭に置いた場合、昆虫の幼虫固体を使うことが非常に有効である。とくに蚕幼虫は体が大きいため、他の昆虫と比べて極めて多量のタンパク質を得ることができる。また、蚕幼虫を飼育するためのノウハウも確立されており、扱い易い昆虫である。しかしながら前術したように、バクミドはＡｃＮＰＶをバックボーンとしているため、ＡｃＮＰＶが感染することのできない蚕幼虫に対しては、前記バクミドを適用することができなかった。
【０００９】
【非特許文献１】
キッツ（Ｋｉｔｔｓ）ら１９９０年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第１８巻、ｐ．５６６７
【非特許文献２】
ハーティグ（Ｈａｒｔｉｇ）ら、１９９２年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、第３８巻、ｐ．６１
【特許文献３】
ルクノウ（Ｌｕｃｋｏｗ）ら、１９９３年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、第６７巻、ｐ．４５６６
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、蚕用の組換えバキュロウイルスを容易に作製するために使用する、ＢｍＮＰＶシャトルベクターを提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決するため、本発明は、（１）ｍｉｎｉＦレプリコン、（２）ＢｍＮＰＶ  ＤＮＡおよび（３）トランスポゾン（Ｔｎ）の付着部位を含むｌａｃＺα遺伝子からなる、ＢｍＮＰＶシャトルベクターを提供する。
【００１２】
本発明はまた、ＢｍＮＰＶシャトルベクターを含有する大腸菌株を提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明のＢｍＮＰＶシャトルベクターは、ｍｉｎｉＦレプリコン、ＢｍＮＰＶＤＮＡおよびトランスポゾン（Ｔｎ）の付着部位を含むｌａｃＺα遺伝子からなる。
【００１４】
本発明においてｍｉｎｉＦレプリコン（配列番号１）は、大腸菌ＤＨ５αＦ′ＩＱより分離したプラスミド由来の、複製に必要な領域を意味する。本発明のＢｍＮＰＶシャトルベクターにおいて、ｍｉｎｉＦレプリコンは、ｃｃｄＡ、ｃｃｄＢ、ｒｅｓＤおよびｒｅｐＥの各遺伝子ならびに４ヶ所のリピートユニットを含有する。
【００１５】
本明細書において、ＢｍＮＰＶは、蚕の幼虫、蚕の蛹および蚕の培養細胞に感染して、感染細胞の核内に多角体をつくるカイコガ核多角体病ウイルス（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）を意味し、ＢｍＮＰＶ  ＤＮＡは、ＢｍＮＰＶのＤＮＡ配列を意味する。
【００１６】
ＬａｃＺ遺伝子は、本明細書において、外来遺伝子がシャトルベクター上に挿入されたことを確認するために用いられる。
【００１７】
本明細書において、トランスポゾン（Ｔｎ）の付着部位とは、ドナーベクター内のトランスポゼース認識配列に挟まれた外来遺伝子を、転位酵素トランスポゼースによりシャトルベクター内の標的部位に挿入させるための配列である。トランスポゾンの付着部位としては、Ｔｎ７の付着部位ｍｉｎｉ−ａｔｔＴｎ７（ＣＣＣＣＧ：配列番号２）、Ｔｎ３の付着部位およびＴｎ４の付着部位などが挙げられる。
【００１８】
本発明のＢｍＮＰＶシャトルベクターはさらに、薬剤耐性遺伝子を含有してもよい。薬剤耐性遺伝子としては、カナマイシン耐性遺伝子やアンピシリン耐性遺伝子など、当業者により適宜選択することができる。
【００１９】
本発明のＢｍＮＰＶシャトルベクターは、たとえば、以下のようにして得ることができる。
（ｉ）ｐＵＣ−４ＫをＰｓｔ  Ｉで消化しカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎ：１２４０ｂｐ）を取り、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）のＰｓｔ  Ｉサイトに入れ、カナマイシン耐性遺伝子をもつプラスミドを構築する。
（ｉｉ）Ｆ−レプリコンをＦ′プラスミドから取り出し、（ｉ）で構築したカナマイシン耐性遺伝子に連結し、Ｋａｎ−ｍｉｎｉＦレプリコン配列を得る。
（ｉｉｉ）ｍｉｎｉ−ａｔｔＴｎ７を得る。すなわち、ｐＭＯＮ７１３４からＰＣＲによりｍｉｎｉ−ａｔｔＴｎ７を増幅した。増幅した断片をｐＢＣＳＫＰのＬａｃＺα遺伝子のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ部位に挿入し、ＬａｃＺα−ｍｉｎｉ−ａｔｔＴｎ７−ＬａｃＺα配列を得る。
（ｉｖ）前記（ｉｉｉ）で構築したＬａｃＺα−ｍｉｎｉ−ａｔｔＴｎ７−ＬａｃＺα遺伝子を、前記（ｉｉ）で構築したＫａｎ−ｍｉｎｉＦレプリコンに連結させ、Ｋａｎ−ｍｉｎｉＦレプリコン−ＬａｃＺα−ｍｉｎｉ−ａｔｔＴｎ７−ＬａｃＺαの配列を得る。
（ｖ）前記（ｉｖ）で構築した配列をＢｍＮＰＶ用トランスファーベクター（ｐＢＫ２８３、ポリヘドリンプロモーターを欠損しているベクター）に挿入し、ｍｉｎｉＦレプリコン−ＬａｃＺα−ｍｉｎｉ−ａｔｔＴｎ７−ＬａｃＺαが含まれるＢｍＮＰＶ用トランスファーベクターを得ることができる。
【００２０】
このようにして得られたＢｍＮＰＶ用トランスファーベクターを、通常の方法でＢｍＮＰＶ  ＤＮＡに組込むことによって、本発明のＢｍＮＰＶシャトルベクターを得ることができる。さらに、通常の方法によって、得られたＢｍＮＰＶシャトルベクターで大腸菌を形質転換させることにより、ＢｍＮＰＶシャトルベクターを含有する大腸菌株を得ることができる。
【００２１】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。
【００２２】
【実施例】
実施例１
（ｍｉｎｉＦレプリコン、カナマイシン耐性遺伝子、およびＴｎ７の付着部位を含むｌａｃＺα遺伝子を含有するトランスファーベクターの作製）
ｍｉｎｉＦレプリコン、カナマイシン耐性遺伝子、およびＴｎ７の付着部位を含むｌａｃＺα遺伝子を含有するＤＮＡ領域（約８．４Ｋｂｐ。以下、「ｍｉｎｉＦ−ｋａｎ．」と称する）を得るために、以下の操作を実施した。すなわち、ＡｃＮＰＶバクミドを含有するＤＨ１０Ｂａｃ（インビトロジェン製）をＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．２）において２７℃で培養し、アルカリ−ＳＤＳ法によりＡｃＮＰＶバクミドを抽出した。得られたＡｃＮＰＶバクミド２００ｐｇを鋳型とし、ＤＮＡポリメラーゼ（タカラ製）２．５Ｕ、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ（タカラ製）、下記フォワードプライマー１およびリバースプライマー１を各０．５ｐｍｏｌならびに蒸留水を混合し、全量５０μｌのＰＣＲ用反応液を調製した。ついで、ＰＣＲ用反応溶液を、ＰＣＲ用反応溶液を、９５℃で２分間インキュベーションしたのち、９５℃で３０秒間、５８℃で３０秒間および７２℃で８．５分間を１サイクルとしてこれを２５サイクル行ない、ついで７２℃で８．５分間インキュベーションすることによりＰＣＲを実施し、ＰＣＲ産物としてｍｉｎｉＦ−ｋａｎ．を得た。
フォワードプライマー１：５′−ＴＴＴＴＧＣＴＴＴＧＣＣＡＣＧＧＡＡＣＧＧＴＣＴＧＣ−３′（配列番号３）
リバースプライマー１：５′−ＴＴＧＣＣＧＧＧＴＣＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＡＴ−３′（配列番号４）
【００２３】
ＰＣＲによって得られたｍｉｎｉＦ−ｋａｎ．の両末端は、Ｔ４ポリメラーゼ（タカラ製）により平滑にし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡製）によりリン酸化した。
【００２４】
ＢｍＮＰＶ用トランスファーベクターｐＢＫ２８３（フナコシ製）を制限酵素ＫｐｎＩで切断したのち、Ｂａｌ３１で約１５０ｂｐ削りポリヘドリンプロモーターを取り除き、Ｔ４ポリメラーゼによって削り口を平滑にした。平滑末端にしたトランスファーベクターに前記ｍｉｎｉＦ−ｋａｎ．をライゲーションし、これを用いてＤＨ５αを形質転換した。ついで、形質転換体を培地（ＴＮＭ−ＦＨ（シグマ製）＋１０％ＦＢＳ（シグマ製）＋０．５％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｏｔｉｃ（ペニシリン、ストレプトマイシンおよびアンホテリシンを含有；インビトロジェン製）において２７℃で培養したのちにプラスミドＤＮＡを抽出することにより、ｍｉｎｉＦレプリコン、カナマイシン耐性遺伝子およびｌａｃＺα遺伝子を含有するトランスファーベクター（以下、「ｐＢＫ２８３／ｍｉｎｉＦ−ｋａｎ」と称する）を得た。
【００２５】
（ＢｍＮＰＶ  ＤＮＡとｐＢＫ２８３／ｍｉｎｉＦ−ｋａｎとの相同組み換え）
ＢｍＮＰＶ  ＤＮＡにｍｉｎｉＦ−ｋａｎ．を組み込むために、ＢｍＮＰＶ  ＤＮＡとｐＢＫ２８３／ｍｉｎｉＦ−ｋａｎとのあいだで相同組み換えを行なった。すなわち、ＢｍＮＰＶの直鎖ＤＮＡ（フナコシ製）１μｇ、ｐＢＫ２８３／ｍｉｎｉＦ−ｋａｎ．５μｇ、リポフェクチン（インビトロジェン製）２０μｌおよび蒸留水を混合することにより合計２７５μｌのリポフェクション用ＤＮＡ溶液を調製した。該ＤＮＡ溶液用いて蚕の培養細胞Ｂｍ５（韓国ソウル大学、Ｂ．Ｋ．  Ｋｉｍ教授より分譲）に共トランスフェクションした。ついで、形質転換したＢｍ５から、ｍｉｎｉＦ−ｋａｎ．が組み込まれた組み換えＢｍＮＰＶ（以下、「ＢｍＮＰＶ／ｍｉｎｉＦ−ｋａｎ．」と称する）と、組み換えの起こっていないＢｍＮＰＶとの混合物を得た。
【００２６】
ついで、得られた混合物をＰＥＧ沈殿法により精製したのち、ＤＮａｓｅＩ処理によって細胞外に混在しているトランスファーベクターを分解し、細胞内に存在したＢｍＮＰＶ／ｍｉｎｉＦ−ｋａｎ．、トランスファーベクターおよび組み換えの起こっていないＢｍＮＰＶ  ＤＮＡの混合物を得た。得られたウイルス混合物にＰＥＧ沈殿法を実施し、ウイルス混合物からＤＮａｓｅＩを除去した。ついで、プロテイナーゼＫ処理、フェノール／クロロフォルム処理、クロロフォルム抽出およびエタノール沈澱法による処理によって、ウイルス混合物をさらに精製した。
【００２７】
（組み換えＢｍＮＰＶ  ＤＮＡ（ＢｍＮＰＶシャトルベクター）の選択）
ＢｍＮＰＶ／ｍｉｎｉＦ−ｋａｎ．はカナマイシン耐性遺伝子を含有するため、前記ウイルス混合物を大腸菌内に導入し、カナマイシンを含有する培地において大腸菌を培養することにより、ＢｍＮＰＶ／ｍｉｎｉＦ−ｋａｎ．を含有する形質転換体を選択した。すなわち、精製したウイルス混合物のＤＮＡ０．０５μｇとＥＬＥＣＴＲＯ  ＭＡＸ  ＤＨ１０Ｂ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ（インビトロジェン製）２５μｌとを混合し、エレクトロポレーションを実施した。ついで、カナマイシン（Ｗａｋｏ製）を５０μｇ／μｌ含有するＬＢ培地において形成されたコロニーを選択することによって、ＢｍＮＰＶ／ｍｉｎｉＦ−ｋａｎ．を含有する形質転換体を得た。さらに、アンピシリン耐性遺伝子を含有するトランスベクターの混入がないことを確認するために、アンピシリン（Ｗａｋｏ製）を５０μｇ／μｌ含有するＬＢ培地において、選択した形質転換体のコロニーを３７℃で培養することによって、アンピシリン耐性でないもの形質転換体を選択した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（アプライド  バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製）を用いて、選択された形質転換体よりＢｍＮＰＶ／ｍｉｎｉＦ−ｋａｎ．を抽出した。
【００２８】
（ＢｍＮＰＶシャトルベクターのトランスフォーメーション）
ＢｍＮＰＶシャトルベクターを有する大腸菌を作製するため、以下のようにしてＢｍＮＰＶ／ｍｉｎｉＦ−ｋａｎ．によるトランスフォーメーションを実施した。
【００２９】
ＤＨ１０Ｂａｃをカナマイシンを含有しないテトラサイクリン（ＷＡＫＯ製）１０μｇ／ｍｌのみのＬＢ培地において３７℃で培養することによりＡｃＮＰＶバクミドを落とし、その大腸菌（ＤＨ１０Ｂ＋ヘルパープラスミド）に、ＢｍＮＰＶ／ｍｉｎｉＦ−ｋａｎ．をエレクトロポレーションした。ついで、得られた大腸菌からなるコンピテントセルを作製した。
【００３０】
試験例１
（トランスポジション）
ＢｍＮＰＶシャトルベクターのシステムが完成したことを確認するため、以下のようにしてトランスポジションを行なった。
【００３１】
クローニングベクターｐＥＮＴＲ  ＴＯＰＯ（インビトロジェン製）にＧＦＰ遺伝子をクローニングし、得られたベクターで実施例１で作製したコンピテントセルを形質転換した。ついで、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン（インビトロジェン製）７μｇ／ｍｌ、Ｂｌｕｏ−ｇａｌ（ＷＡＫＯ製）１００μｇ／ｍｌおよびＩＰＴＧ（ＷＡＫＯ製）４０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ培地において３７℃で形質転換体を培養した。トランスポジションの行なわれた組み換えＢｍＮＰＶシャトルベクターを含有するコロニーは、青白選択によって選択された。
【００３２】
トランスポジションの行なわれた組み換えＢｍＮＰＶシャトルベクターＤＮＡを、アルカリ−ＳＤＳ法およびイソプロプロパノール沈殿法によって分離した。
【００３３】
試験例２
（組み換えウイルスの作製）
試験例１で得られたＢｍＮＰＶシャトルベクターＤＮＡを用いて組み換えウイルスの作製が可能であるか否かを、以下のようにして確認した。
【００３４】
ＢｍＮＰＶシャトルベクターＤＮＡをＢｍ５細胞にトランスフェクションした。ついで、培地（ＴＮＭ−ＦＨ＋１０％ＦＢＳ＋０．５％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｏｔｉｃ）において２７℃でＢｍ５細胞を培養し、蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰの蛍光を観察することにより、組換えウイルスが作製されたことを確認した。
【００３５】
【発明の効果】
本発明により、ＢｍＮＰＶシャトルベクターが提供された。
【００３６】
このシステムによって、ＢｍＮＰＶの組み換えウイルスも迅速かつ効率よく作製することができる。したがって、組み換えＢｍＮＰＶを用いた蚕によるタンパク質の大量発現が、今まで以上に簡便になった。
【００３７】
【配列表】
2004173507.tif 000002
2004173507.tif 000003
2004173507.tif 000004
2004173507.tif 000005
2004173507.tif 000006
2004173507.tif 000007