(57)【要約】【解決手段】グルコキナーゼ又はグルコキナーゼ活性化剤を有効成分とする膵β細胞形成促進剤。【効果】近年日本人の２型糖尿病が激増しているが、インスリン分泌低下の遺伝素因に高脂肪食による肥満・インスリン抵抗性が加わった病態の動物モデルとして、高脂肪食負荷グルコキナーゼヘテロ欠損マウスは有用である。グルコキナーゼはインスリン分泌のみならず、高脂肪食下でのインスリン抵抗性に対する代償性膵β細胞過形成にも重要であることより、日本人のように、インスリン分泌低下の遺伝素因がもともとあるところに高脂肪食による肥満・インスリン抵抗性が加わった病態では、グルコキナーゼ又はグルコキナーゼ活性化剤は、膵β細胞からのインスリン分泌を促進させるとともに、膵β細胞量をも増加させることによって、インスリン分泌能を改善させるので、日本人の２型糖尿病の有効な治療方法である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコキナーゼ又はグルコキナーゼ活性化剤を有効成分とする膵β細胞形成促進剤。
【請求項２】
グルコキナーゼ又はグルコキナーゼ活性化剤を投与することを特徴とする膵β細胞形成促進方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インスリン分泌細胞である膵β細胞形成を促進する薬剤に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
ヒト２型糖尿病は、インスリン分泌不全、インスリン抵抗性などの遺伝因子と、肥満、高脂肪食、過食、運動不足などの環境因子が重なって発症する多因子病である。その成因や病態には不明な点が多く、その解明が望まれている。
【０００３】
近年、日本人の２型糖尿病が激増しているが、インスリン分泌低下の遺伝素因に高脂肪食による肥満、インスリン抵抗性が加わったことが大きな原因と想定される。かように、インスリン分泌不全状態において高脂肪食を負荷した際の膵β細胞の機能や量を調整できれば、２型糖尿病の有効な治療が可能になると考えられる。
従って、本発明の目的は２型糖尿病の治療に有効な、インスリン分泌細胞である膵β細胞の機能又は量を増加させることのできる薬剤を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者はグルコキナーゼに着目した。グルコキナーゼは解糖系の一番最初に位置する酵素で、解糖系の律速段階を担っていると考えられている。グルコキナーゼ遺伝子異常が若年発症成人型糖尿病の原因遺伝子であることが１９９２年報告され、ヒトグルコキナーゼ遺伝子異常症ではインスリン分泌低下と軽度の耐糖能異常が認められている。本発明者は、グルコキナーゼヘテロ欠損型マウスに高脂肪食を負荷したところ、膵β細胞量が低下しており、グルコキナーゼ又はグルコキナーゼ活性化剤を用いればインスリン抵抗性を代償する膵β細胞の形成が促進され、２型糖尿病の治療に有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、グルコキナーゼ又はグルコキナーゼ活性化剤を有効成分とする膵β細胞形成促進剤を提供するものである。
また、本発明は、グルコキナーゼ又はグルコキナーゼ活性化剤を投与することを特徴とする膵β細胞形成促進方法を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明に用いられるグルコキナーゼとしては、ヒト由来又はマウス由来のグルコキナーゼが挙げられる。また、当該グルコキナーゼは、遺伝子組み換え技術により生産されたものも使用できる。
【０００７】
グルコキナーゼ活性化剤としては、グルコキナーゼをコードする遺伝子、グルコース、ｃＡＭＰ、レチノイン酸等が挙げられる。
【０００８】
グルコキナーゼヘテロ欠損マウスは野生型マウスと比較して血糖値が有意に高値で、インスリン分泌反応が悪い。また、グルコキナーゼヘテロ欠損マウス由来の膵ランゲルハンス島（以下、膵島という）からのインスリン分泌の用量反応曲線は右側にシフトしている。日本人糖尿病の特徴として、欧米人と比較しインスリン分泌能が半分程度に低下していることが知られているが、インスリン分泌不全とそれによる耐糖能異常を呈するグルコキナーゼヘテロ欠損マウスは日本人糖尿病のよい病態モデルになる。
【０００９】
このグルコキナーゼヘテロ欠損マウスに高脂肪食を負荷すると、膵島からのインスリン分泌は低下したが、高脂肪食を負荷されたマウスはむしろ高インスリン血症を呈することが判明した。そこで、膵β細胞量の変化を検討したところ、高脂肪食負荷野生型マウスは高炭水化物食負荷マウスと比較して４０週でβ細胞量が１０倍に増加したが、高脂肪食負荷グルコキナーゼヘテロ欠損マウスはβ細胞量の増加が２倍にとどまった。従って、グルコキナーゼ又はグルコキナーゼ活性化剤を投与すれば、膵β細胞形成を促進させることができる。
【００１０】
本発明の膵β細胞形成促進剤を、ヒトを含む哺乳類に投与するには、前記有効成分に薬学的に許容される担体を加えて、種々の投与形態の医薬組成物とすることができる。当該医薬組成物としては、例えば散剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、アンプル剤等の経口投与剤；皮下、筋肉若しくは静脈注射剤；坐剤等が挙げられる。これらの医薬組成物は、前記有効成分と賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、矯味剤、香料、被覆剤等を適宜組み合わせて処方することにより製造することができる。
【００１１】
斯くして得られた本発明の膵β細胞形成促進剤の投与量は、症状、投与ルート等によっても異なるが、一般的に成人において、グルコキナーゼ又はグルコキナーゼ活性化剤として０．１〜１０００ｍｇ／日程度である。
【００１２】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれにより何ら限定されるものではない。
【００１３】
Ａ．方法
（１）野生型マウス、グルコキナーゼヘテロ欠損マウス（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，３０２５３−３０２５６（１９９５）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９，８６１−８６６（１９９７））に４０週間ＨＦまたはエネルギー価はほぼ同じでも脂肪分が少なく、相対的に炭水化物を多く含んだ高炭水化物食（ＨＣ）を投与し、耐糖能やインスリン感受性を経時的に追跡した（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，４，５９７−６０９（１９９９））。
（２）膵島を単離し、グルコース応答性インスリン分泌能（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８３，９８１−９８５（１９９９））や、膵島グルコキナーゼ活性・グルコース酸化能など膵島の糖代謝を検討した。
（３）膵島を単離し、膵島内中性脂肪含量を測定した。脂肪酸合成に関与するＳＲＥＢＰ１ａ／ｃ，ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＦＡＳ）の発現をＴａｑｍａｎ　ＰＣＲ法にて検討した。糖よりの脂質合成を検討した。
（４）免疫組織学的手法により膵β細胞量、非β細胞量を測定した（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９，８６１−８６６（１９９７））。さらに、Ｐｄｘ１分子の発現検討も行った。
（５）膵島を単離し、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法にてＩＲＳ−１／２，ｐ８５
ＰＩ３−ｋｉｎａｓｅ，Ａｋｔ、Ｐｄｘ１の発現を検討した。
（６）免疫組織学的手法を用いてＢｒｄＵ取り込み解析やＰＣＮＡ染色を行い、膵島の細胞増殖能を検討した。さらにＴｕｎｅｌ法によるアポトーシス反応を検討した。
【００１４】
Ｂ．結果
（１）図１にＨＦ２０週間負荷後の野生型マウス及びグルコキナーゼヘテロ欠損マウスの体重、脂肪組織重量、脂肪細胞サイズ、血清遊離脂肪酸値を示す。ＨＦ負荷グルコキナーゼヘテロ欠損マウスはＨＦ負荷野生型マウスと同程度に肥満が増悪した。
【００１５】
図２に４週間負荷した時点でのブドウ糖負荷試験の結果を示す。ＨＦ負荷野生型マウスは高インスリン血症によりインスリン抵抗性を代償し、正常耐糖能を維持していたが、グルコキナーゼヘテロ欠損マウスはＨＣ群と比較して高インスリン血症を呈さず、糖負荷試験にて高血糖を呈した。
その後、ＨＦ負荷後２０週時点で野生型マウスはＨＣ負荷グルコキナーゼヘテロ欠損マウスと同程度の耐糖能障害を呈するようになった（図３左）。図３右にインスリン負荷試験の結果を示す。ＨＣ負荷群と比較してＨＦ負荷野生型マウス、グルコキナーゼヘテロ欠損マウスはインスリンが効きにくい、抵抗性状態となっているのがわかる。このようにＨＦ負荷下でグルコキナーゼヘテロ欠損マウスは野生型マウスと同様に肥満・インスリン抵抗性となるにも関わらず、糖尿病を早期から発症した。
【００１６】
（２）図４左に膵島のグルコース応答性インスリン分泌の結果を示す。負荷後２０週時点でＨＦ負荷マウス群の膵島はＨＣ負荷マウス群の膵島と比較して高濃度グルコースに対するインスリン分泌の低下が目だつようになった。図４右に膵島内での糖代謝を反映するグルコース酸化能の結果を示すが、左のインスリン分泌とほとんど同じプロフィールを描いている。このように、長期間ＨＦ負荷をすると膵島の糖代謝の低下とパラレルに膵島からのインスリン分泌が低下していくことがわかる。
【００１７】
（３）ＨＦ負荷により膵島からのインスリン分泌は低下したが、ＨＦを負荷されたマウスはむしろ高インスリン血症を呈している。そこで、免疫組織学的手法によりβ細胞量の変化を検討した。図５左にＨＦ負荷後の経時的なβ細胞量の変化を示す。ＨＦ負荷野生型マウス膵島はＨＣ負荷群と比較し４０週で１０倍にβ細胞量が増加したが、ＨＦ負荷野生型マウス、グルコキナーゼヘテロ欠損マウスは２倍にとどまった。β細胞量の増加が細胞数の増加によるものか、細胞自体の肥大化の影響なのか区別するために膵島の細胞数を計測したところ、ＨＦ負荷野生型マウスでは他の３群に比較して細胞数の増加を認めた（図５右）。したがってβ細胞量の増加は主として細胞数増加、すなわち過形成によるものと考えられた。
【００１８】
（４）図６左に細胞増殖能を反映するＢｒｄＵ取り込み試験の結果を示す。ＨＦ負荷野生型マウス膵島はＨＣ負荷群と比較し有意なＢｒｄＵ取り込み能増加を認めたが、ＨＦ負荷グルコキナーゼヘテロ欠損マウス膵島では欠如していた。細胞増殖能を反映するＰＣＮＡ　ｓｔａｉｎｉｎｇ解析にても同様な結果を得た（図６右）。なお、Ｔｕｎｅｌ法による膵島のアポトーシス反応の検討では４群間で差を認めなかった。したがって、ＨＦ負荷グルコキナーゼヘテロ欠損マウスで認められた過形成障害はβ細胞増殖障害によるものであると考えられた。
【００１９】
（５）膵島におけるＩＲＳを介したシグナル、即ちＩＲＳ−２，ＰＩ３−ｋｉｎａｓｅ　ｐ８５，Ａｋｔが膵β細胞量の調節や膵β細胞肥大化に関与するという成績が得られている（Ｎａｔｕｒｅ　３９１，９００−９０４（１９９８）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　４９，１８８０−１８８９（２０００）、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７，１１３３−１１３７（２００１）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８，１６３１−１６３８（２００１））。また膵β細胞分化の調節転写因子であるＰｄｘ１が、ＩＲＳ−２欠損マウスやＦｏｘｏ１欠損マウスの解析を通して、ＩＲＳを介した膵β細胞量の調節のエフェクター分子であると考えられるようになってきている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９，１１９３−１２０１（２００２））。そこでこれら分子の膵島における発現を検討した。ＨＦ負荷野生型マウスとグルコキナーゼヘテロ欠損マウスの間でＩＲＳ−１／２，ＰＩ３−ｋｉｎａｓｅ　ｐ８５，Ａｋｔの発現に明かな差は認めらなかった（図７左）。しかし、興味深いことにＰｄｘ１の発現がＨＦ負荷グルコキナーゼヘテロ欠損マウスで低下していた（図７右）。
【００２０】
（６）膵β細胞内の中性脂肪蓄積がβ細胞の機能低下を引き起こすことが知られている。膵島の中性脂肪を検討したところ、グルコキナーゼヘテロ欠損マウス膵島の中性脂肪含量はＨＣ、ＨＦ負荷時ともに野生型マウス膵島より有意に低下していた（図８）。したがって膵β細胞内の中性脂肪蓄積がβ細胞機能低下の直接的な原因でないと考えられた。脂肪酸、中性脂肪合成の調節転写因子であるＳＲＥＢＰ１の発現は１ａ，１ｃともにグルコキナーゼヘテロ欠損マウス膵島で有意に低下しており、脂肪酸合成にかかわるＦＡＳの発現もまた低下していた（図９）。糖よりの脂肪合成を検討したところ、グルコキナーゼヘテロ欠損マウス膵島では有意に低下しており、膵島内でのｄｅ　ｎｏｖｏ　ｌｉｐｉｄ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓの低下が中性脂肪含量低下の原因と考えられた（図１０）。
【００２１】
【発明の効果】
近年日本人の２型糖尿病が激増しているが、インスリン分泌低下の遺伝素因に高脂肪食による肥満・インスリン抵抗性が加わった病態の動物モデルとして、高脂肪食負荷グルコキナーゼヘテロ欠損マウスは有用である。
グルコキナーゼはインスリン分泌のみならず、高脂肪食下でのインスリン抵抗性に対する代償性膵β細胞過形成にも重要であることより、日本人のように、インスリン分泌低下の遺伝素因がもともとあるところに高脂肪食による肥満・インスリン抵抗性が加わった病態では、グルコキナーゼ又はグルコキナーゼ活性化剤は、膵β細胞からのインスリン分泌を促進させるとともに、膵β細胞量をも増加させることによって、インスリン分泌能を改善させるので、日本人の２型糖尿病の有効な治療方法である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＦ又はＨＣ２０週間負荷後の体重、脂肪細胞サイズ及び血清遊離脂肪酸値を示す図である。
【図２】ＨＦ又はＨＣ２０週間負荷後のブドウ糖負荷試験結果を示す図である。
【図３】ＨＦ又はＨＣ２０週間負荷後のブドウ糖負荷及びインスリン負荷試験の結果を示す図である。
【図４】ＨＦ又はＨＣ２０週間負荷後の膵島のグルコース応答性インスリン分泌及びグルコース酸化能の結果を示す図である。
【図５】ＨＦ負荷後のβ細胞量の変化を示す図である。
【図６】ＨＦ又はＨＣ負荷後のβ細胞増殖能の結果を示す図である。
【図７】
膵島におけるＩＲＳ−１／２、ＰＩ３−Ｋｉｎａｓｅ　ｐ８５、Ａｋｔの発現の結果を示す図である。
【図８】膵島中の中性脂肪含量を示す図である。
【図９】ＳＲＥＢＰ１ａ、ＳＲＥＢＰ１ｃ及びＦＡＳの発現レベルを示す図である。
【図１０】糖よりの脂肪合成を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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