(57)【要約】【課題】移植用眼球を生体に移植し、正常発生の眼球と同様な視覚機能を有する眼球の再生方法や、脊椎動物の未分化細胞からインビトロで誘導した移植用眼球を提供すること。【解決手段】アフリカツメガエル後期胞胚から未分化細胞であるアニマルキャップを切り出し、高濃度のアクチビン溶液で１時間処理した後、５時間前培養する。これを、後期胞胚から切り出した２枚の無処理のアニマルキャップでサンドイッチし、２日間培養することにより、眼球を含む外植体を作製することができ、この外植体から眼球を摘出する。このインビトロで作製した眼球を、外科的手法により左目を除去した後期尾芽胚に移植する。移植した眼球は、正常発生と同様に、移植された場に於いて発生が進み、レンズや網膜に分化し、移植をうけた胚の中脳領域向けて視神経を伸ばし、視覚機能を有することを確認する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎動物の未分化細胞からインビトロで誘導した移植用眼球であって、移植された場に於いて発生が進み、レンズや網膜に分化し、移植された脊椎動物の中脳領域に向けて視神経を伸ばすことができる移植用眼球を、生体に移植することを特徴とする眼球の再生方法。
【請求項２】
移植用眼球が、初期胚から未分化細胞であるアニマルキャップを切り出し、アクチビンで処理した後、前培養してサンドイッチ培養を行い、インビトロで誘導した眼球であることを特徴とする請求項１記載の眼球の再生方法。
【請求項３】
後期胞胚のアニマルキャップを切り出すことを特徴とする請求項２記載の眼球の再生方法。
【請求項４】
２００〜４００ｎｇ／ｍｌのアクチビンで０．５〜２時間処理することを特徴とする請求項２又は３記載の眼球の再生方法。
【請求項５】
生理食塩水中で４〜６時間前培養することを特徴とする請求項２〜４のいずれか記載の眼球の再生方法。
【請求項６】
後期胞胚から切り出した２枚のアニマルキャップでサンドイッチ培養を１〜４日間行うことを特徴とする請求項２〜５のいずれか記載の眼球の再生方法。
【請求項７】
初期胚から未分化細胞である背唇とＬＭＺ細胞を切り出し、アニマルキャップを用いたサンドイッチ培養を３〜５日間行うことにより、インビトロで移植用眼球を誘導することを特徴とする請求項１記載の眼球の再生方法。
【請求項８】
移植用眼球が、レンズ、神経節細胞層、内部核層、外部核層、及び網膜色素上皮層を備えた眼球であることを特徴とする請求項１記載の眼球の再生方法。
【請求項９】
脊椎動物の未分化細胞からインビトロで誘導した移植用眼球であって、移植された場に於いて発生が進み、レンズや網膜に分化し、移植された脊椎動物の中脳領域に向けて視神経を伸ばすことができることを特徴とする移植用眼球。
【請求項１０】
初期胚から未分化細胞であるアニマルキャップを切り出し、アクチビンで処理した後、前培養してサンドイッチ培養を行い、インビトロで誘導されたことを特徴とする請求項９記載の移植用眼球。
【請求項１１】
後期胞胚のアニマルキャップを切り出すことを特徴とする請求項１０記載の移植用眼球。
【請求項１２】
２００〜４００ｎｇ／ｍｌのアクチビンで０．５〜２時間処理することを特徴とする請求項１０又は１１記載の移植用眼球。
【請求項１３】
生理食塩水中で４〜６時間前培養することを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか記載の移植用眼球。
【請求項１４】
後期胞胚から切り出した２枚のアニマルキャップでサンドイッチ培養を１〜４日間行うことを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか記載の移植用眼球。
【請求項１５】
初期胚から未分化細胞である背唇とＬＭＺ細胞を切り出し、アニマルキャップを用いたサンドイッチ培養を３〜５日間行うことにより、インビトロで誘導することを特徴とする請求項９記載の移植用眼球。
【請求項１６】
レンズ、神経節細胞層、内部核層、外部核層、及び網膜色素上皮層を備えていることを特徴とする請求項９記載の移植用眼球。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、発生工学又は臓器工学に関し、より詳しくは、生体内に移植した際に生体内で機能することができる、インビトロで未分化細胞から誘導した移植用眼球や、該移植用眼球を生体へ移植する眼球の再生方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
発生段階において、眼球の誘導過程は脊椎動物間でよく保存されており、アフリカツメガエルの初期胚は、眼球の誘導やレンズや網膜のような高度に特殊化した組織の形成の過程を研究するのに優れたモデルとして使用されている。神経胚のステージで、水晶体（レンズ）、角膜は外胚葉のうち表皮から、網膜は神経管から生じる。まず神経管の前端に膨らみができ、脳胞ができあがり、３つにくびれ、前脳胞の両側から袋状の眼胞がせり出し、やがて前端がややくぼんだ杯状の構造の眼杯が形成される。その後眼杯が表皮にはたらきかけ表皮外胚葉が水晶体板になり、やがて水晶体胞となる。眼胞の内側の層は神経網膜へと発達し、外側の層は網膜色素上皮層（ＲＰＥ）へと発達する。水晶体板は水晶体胞となり、神経網膜形成に必須となる。このように、眼の組織が予定神経網膜とレンズの間の相互作用によって誘導されることは、発生学上の実験により示されている（例えば、非特許文献１、２、３参照。）。しかしながら、網膜細胞の分化や残存はレンズの分化とは無関係のように見える（例えば、非特許文献４〜７参照。）。近年、眼の形成の初期段階に関係しているＰａｘ６、Ｏｔｘ２、Ｓｉｘ３やＲｘ１などの多くの転写因子が同定されている（例えば、非特許文献８、９参照。）。
【０００３】
眼胞の基部は、網膜を脳に結ぶ眼柄を形成する。終末芽ステージからオタマジャクシ段階に至るまでの間に、網膜の軸索は目的地（網膜視蓋の突起）まで移動する。終末芽ステージでは、網膜神経節細胞（ＲＣＧ）はレンズ上皮細胞から放出された因子によって導かれ、軸索を網膜の中央まで伸ばす。その後、網膜の軸索は方向を変え、眼球から出る。これらの網膜の軸索は眼柄に沿って間脳の腹側に伸びる。ステージ３３／３４までには、網膜の軸索は間脳に到達する。網膜の軸索はステージ３５／３６では間脳の腹側の視交叉に移動し、最終的にステージ３９までに視索を経由して蓋まで伸びる（例えば、非特許文献１０〜１３参照。）。この網膜の軸索の伸長は連続した誘導シグナルによって調節されている（例えば、非特許文献１４〜１６参照。）。近年、例えば、筋肉、表皮、内臓などさまざまな種類の細胞をインビトロで誘導する研究が未分化細胞を利用していくつも行われている（例えば、非特許文献１７、１８参照。）。しかしながら、初期発達段階において順次誘導処理することにより形成される感覚器官を、高い頻度でインビトロで形成することは非常に困難であった。
【０００４】
本発明者らは、アフリカツメガエルの胚の外胚葉片（多分化能を備えた細胞集団）をアクチビンとレチノイン酸で処理し、個体発生で最初に作られる最も基本的な排出器官である前腎の分化誘導を行い、続いて前腎へ分化の方向性が決まった外胚葉片を、あらかじめ前腎原基（本来、前腎を形成する領域）を除去した胚に、該前腎原基の発生ステージに応じた所定の発生ステージまで培養した後移植すると、インビトロで作った前腎が生体内で機能することを世界で初めて見い出し、インビトロで作った臓器を生体に移植することができることを確認している（例えば、特許文献１参照。）。
【０００５】
また本発明者らは、本来インビトロで培養すると脊索や筋肉、あるいは咽頭などを形成し、膵臓を形成しない初期原腸胚の原口上唇部、すなわち、背側中胚葉組織や前端部内胚葉組織となる部域を、アフリカツメガエル初期原腸胚から切り出しレチノイン酸で処理した後、ＢＳＡを含むスタインバーグ溶液中でこれらの外植体を培養することにより、その発生運命を膵臓へと変化させ、形態的かつ機能的な膵臓をインビトロで高率で形成しうることを見い出した。また、高率で膵臓を分化形成させるには、レチノイン酸を一時的に作用させることが有効であり、継続的なレチノイン酸の処理は膵臓分化を高率に誘導せず、また、原口上唇部を切り出してから０〜１５時間前培養し、レチノイン酸処理を行うことが有効であり、膵臓を高率に分化誘導しうることを見い出している（例えば、特許文献２参照。）。
【０００６】
さらに本発明者らは、本来インビトロで培養すると不整表皮を形成し、膵臓を形成しない後期胞胚の未分化細胞の予定外胚葉域を、アフリカツメガエルの後期胞胚から切り出しアクチビンで処理し、３〜５時間後にレチノイン酸で処理した後、ＢＳＡを含むスタインバーグ溶液中でこれらの外植体を静置培養することにより、その発生運命を膵臓へと変化させ、形態的かつ機能的な膵臓をインビトロで高率に形成しうることを見い出している（例えば、特許文献３参照。）。
【０００７】
眼球の誘導の過程が脊椎動物の中で保存されたものであることはよく知られていた。しかしながら、インビトロで眼球を誘導する方法はなかった。そこで本発明者らは、アフリカツメガエルの初期原腸胚を利用したインビトロの眼球の発達を調節する研究をし、胞胚期のアニマルキャップ（未分化細胞塊）をインビトロでアクチビンやコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ．Ａ）及びレチノイン酸で処理することで、眼球を形成している（例えば、非特許文献１９参照。）。しかしながら、Ｃｏｎ．Ａを使用した場合など、前記報告における眼球は、未分化細胞からの形成率が低く、網膜やレンズの形成、視神経の形成が不充分であり、眼球そのものも不完全であった。
【０００８】
【特許文献１】
特開２０００−２１７５７１号公報
【特許文献２】
特開２００１−２９９３３５号公報
【特許文献３】
特開２００１−３３３７７０号公報
【非特許文献１】
Ｓｐｅｍａｎｎ，　Ｈ．　Ｙａｌｅ　Ｕｎｉｖ　Ｐｒｅｓｓ，　（１９３８）
【非特許文献２】
Ｊａｃｏｂｓｏｎ，　Ａ．Ｇ．　Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｚｏｏｌ．　１３９，　５２５−５５７　（１９５８）
【非特許文献３】
Ｇｒａｉｎｇｅｒ，　Ｒ．Ｍ．　Ｃｅｌｌ　Ｄｅｖ．　Ｂｉｏ．　７，　１４９−１５５　（１９９６）
【非特許文献４】
Ａｓｈｅｒｙ−ｐａｄａｎ　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｎｅｎ．　Ｄｗｖ．　１４，　２７０１−２７１１　（２０００）
【非特許文献５】
Ｂｒｅｉｔｍａｎ，　Ｍ．Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ．　２３８，　１５６３−１５６５　（１９８７）
【非特許文献６】
Ｋａｕｌ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１０５，　６１３−６１９　（１９８９）
【非特許文献７】
Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ，　Ｌ．　Ｄｅｖ．　Ｂｉｏｌ．　１４８，　５０８−５１６　（１９９１）
【非特許文献８】
Ｃｈｏｗ，　Ｒ．Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１２６，　４２１３−４２２２　（１９９９）
【非特許文献９】
Ａｓｈｅｒｙ−ｐａｄａｎ　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１３，　７０６−７１４　（２００１）
【非特許文献１０】
Ｇｒａｎｔ，　Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．　Ｃｏｍｐ．　Ｎｅｕｒｏｎ．　１８９，　５９３−６１３　（１９８０）
【非特許文献１１】
Ｇｒａｎｔ，　Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．　Ｃｏｍｐ．　Ｎｅｕｒｏｎ．　１８９，　６７１−６９８　（１９８０）
【非特許文献１２】
Ｃｉｍａ，　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｄｅｖ．　Ｂｉｏｌ．７６，　２２９−２３７　（１９８０）
【非特許文献１３】
Ｅａｓｔｅｒ，　Ｊｒ．　Ｓ．Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１０７，　５５３−５７３　（１９８９）
【非特許文献１４】
Ｈｏｌｔ，　Ｃ．Ｅ．　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．　２４，　１４００−１４２２　（１９９３）
【非特許文献１５】
Ｄｉｎｇｗｅｌｌ，　Ｋ．Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．　４４，　２４６−２５９　（２０００）
【非特許文献１６】
Ｓｔｕｅｒｍｅｒ，　Ｃ．Ａ．Ｏ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｒｏｇ．　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．　６２，　１９７−２１４　（２０００）
【非特許文献１７】
Ａｓａｓｈｉｍａ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｏｍｐ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　１９８，　３３０−３３５　（２０００）
【非特許文献１８】
Ｍｏｒｉｙａ，　Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｄｅｖｅｌｏｐ．　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｄｉｆｆｅｒ．　４２，　５９３−６０２　（２０００）
【非特許文献１９】
Ｍｏｒｉｙａ，　Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｚｏｏｌ．Ｓｃｉ．　１５，　８７９−８８６　（１９９８）
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
これまでに、他の脊椎動物においては、眼の構成要素である網膜、角膜、水晶体などの移植が成功しているが、眼球全体の形成をインビトロにおいて制御し、これを移植するという試みが成功したとの報告はない。本発明の課題は、移植用眼球を生体に移植し、正常発生の眼球と同様な視覚機能を有する眼球の再生方法や、脊椎動物の未分化細胞からインビトロで誘導した移植用眼球を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
アフリカツメガエル初期胚から未分化細胞であるアニマルキャップを切り出し、高濃度のアクチビン溶液で１時間処理した後、５時間前培養してサンドイッチ培養を行い、インビトロで眼を作製した。このようにしてインビトロで作製した眼が実際に機能しうるかどうかを検証するため、インビトロで作製した眼を外科的手法により左目を除去した無標識の後期尾芽胚に移植した。移植を受けた胚と移植した眼の手術後の経過を、１週間に渡って蛍光実体顕微鏡を用いて観察した。その結果、インビトロでツメガエルの未分化細胞から作製した眼は、正常発生と同様に、移植された場に於いて発生が進み、レンズや網膜に分化することがわかった。さらに、移植された眼は、正常発生と同様、移植をうけた胚の中脳領域に向けて視神経を伸ばすことが観察され、移植した眼球によって胚が視覚を取り戻した。この幼生は更に３ヶ月余り変態を乗り越え若ガエルになったが、移植した眼球は生着し、免疫反応も起きず、正常カエルと同様に視覚をもち機能することを初めて見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、脊椎動物の未分化細胞からインビトロで誘導した移植用眼球であって、移植された場に於いて発生が進み、レンズや網膜に分化し、移植された脊椎動物の中脳領域に向けて視神経を伸ばすことができる移植用眼球を、生体に移植することを特徴とする眼球の再生方法（請求項１）や、移植用眼球が、初期胚から未分化細胞であるアニマルキャップを切り出し、アクチビンで処理した後、前培養してサンドイッチ培養を行い、インビトロで誘導した眼球であることを特徴とする請求項１記載の眼球の再生方法（請求項２）や、後期胞胚のアニマルキャップを切り出すことを特徴とする請求項２記載の眼球の再生方法（請求項３）や、２００〜４００ｎｇ／ｍｌのアクチビンで０．５〜２時間処理することを特徴とする請求項２又は３記載の眼球の再生方法（請求項４）や、生理食塩水中で４〜６時間前培養することを特徴とする請求項２〜４のいずれか記載の眼球の再生方法（請求項５）や、後期胞胚から切り出した２枚のアニマルキャップでサンドイッチ培養を１〜４日間行うことを特徴とする請求項２〜５のいずれか記載の眼球の再生方法（請求項６）や、初期胚から未分化細胞である背唇とＬＭＺ細胞を切り出し、アニマルキャップを用いたサンドイッチ培養を３〜５日間行うことにより、インビトロで移植用眼球を誘導することを特徴とする請求項１記載の眼球の再生方法（請求項７）や、移植用眼球が、レンズ、神経節細胞層、内部核層、外部核層、及び網膜色素上皮層を備えた眼球であることを特徴とする請求項１記載の眼球の再生方法（請求項８）に関する。
【００１２】
また本発明は、脊椎動物の未分化細胞からインビトロで誘導した移植用眼球であって、移植された場に於いて発生が進み、レンズや網膜に分化し、移植された脊椎動物の中脳領域に向けて視神経を伸ばすことができることを特徴とする移植用眼球（請求項９）や、初期胚から未分化細胞であるアニマルキャップを切り出し、アクチビンで処理した後、前培養してサンドイッチ培養を行い、インビトロで誘導されたことを特徴とする請求項９記載の移植用眼球（請求項１０）や、後期胞胚のアニマルキャップを切り出すことを特徴とする請求項１０記載の移植用眼球（請求項１１）や、２００〜４００ｎｇ／ｍｌのアクチビンで０．５〜２時間処理することを特徴とする請求項１０又は１１記載の移植用眼球（請求項１２）や、生理食塩水中で４〜６時間前培養することを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか記載の移植用眼球（請求項１３）や、後期胞胚から切り出した２枚のアニマルキャップでサンドイッチ培養を１〜４日間行うことを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか記載の移植用眼球（請求項１４）や、初期胚から未分化細胞である背唇とＬＭＺ細胞を切り出し、アニマルキャップを用いたサンドイッチ培養を３〜５日間行うことにより、インビトロで誘導することを特徴とする請求項９記載の移植用眼球（請求項１５）や、レンズ、神経節細胞層、内部核層、外部核層、及び網膜色素上皮層を備えていることを特徴とする請求項９記載の移植用眼球（請求項１６）に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の眼球の再生方法としては、脊椎動物の未分化細胞からインビトロで誘導した移植用眼球であって、移植された場に於いて発生が進み、レンズや網膜に分化し、移植された脊椎動物の中脳領域に向けて視神経を伸ばすことができる移植用眼球を、生体に移植する方法であれば特に制限されるものではなく、また、本発明の移植用眼球とは、脊椎動物の未分化細胞からインビトロで誘導した移植用眼球であって、移植された場に於いて発生が進み、レンズや網膜に分化し、移植された脊椎動物の中脳領域に向けて視神経を伸ばすことができる眼球であればどのようなものでもよく、上記脊椎動物の未分化細胞としては、カエル、ニワトリ、マウス、ヒト、ネコ、イヌ、ヒツジ、サル、ウマ、ウシ等のアニマルキャップやＥＳ細胞を挙げることができる。また、移植を受ける生体は、インビトロで誘導した移植用眼球と同種、すなわち分類学上同じ“種（ｓｐｅｃｉｅｓ）”の脊椎動物を挙げることができる。
【００１４】
上記移植用眼球は、例えば、初期胚、好ましくは後期胞胚から未分化細胞であるアニマルキャップ（外胚葉域の未分化の細胞群）を切り出し、アクチビンやコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ．Ａ）及びレチノイン酸で処理した後、前培養してサンドイッチ培養を行うことにより、インビトロで誘導（形成）することができる。アクチビンで処理する場合は、２００〜４００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは３００ｎｇ／ｍｌの高濃度アクチビン溶液で０．５〜２時間、好ましくは１時間程度処理するアクチビン処理を好適に例示することができる。アクチビンやコンカナバリンＡ等で処理されたアニマルキャップは、生理食塩水中で４〜６時間、好ましくは５時間程度２０℃で前培養され、この前培養物は後期胞胚から切り出した２枚の無処理のアニマルキャップでサンドイッチし、１〜４日間、好ましくは２日間程度培養を行うことにより、眼球を含む外植体を作製することができ、この外植体から眼球を摘出することにより移植用眼球を得ることができる。
【００１５】
また、上記移植用眼球は、例えば、初期胚から未分化細胞である背唇（ｄｏｒｓａｌｌｉｐ）とＬＭＺ（ｌａｔｅｒａｌ　ｍａｒｇｉｎａｌ　ｚｏｎｅ）細胞を切り出し、これら背唇とＬＭＺ細胞を後期胞胚から切り出した２枚のアニマルキャップでサンドイッチし、３〜５日間、好ましくは４日間程度、０．１％ウシ血清アルブミンと４．５％システイン塩酸塩を含むＳｔｅｉｎｂｅｒｇ溶液中２０℃で培養を行うことにより、眼球を含む外植体を作製することができ、この外植体から眼球を摘出することにより移植用眼球を得ることができる。
【００１６】
そして、上記移植用眼球としては、レンズ、神経節細胞層、内部核層、外部核層、及び網膜色素上皮層を備えているものが好ましく、かかる移植用眼球を移植することにより、生体に眼球を再生することができる。インビトロで誘導した移植用眼球を同種の被移植動物の生体内に移植した際に生体内で機能することができるかどうかは移植時期に大きく依存することから、インビトロで誘導した移植用眼球は、同種の被移植動物の発生ステージに応じた所定の発生ステージ、すなわち生体内に移植した際に生体内で機能することができる発生ステージまで培養することが好ましい。多くの場合、被移植動物と同じ発生ステージまで培養し、該培養後の移植用眼球を被移植動物の生体内に移植すると、生体内に移植した際に生体内で機能する可能性が大きくなる。ここで、発生ステージとは、受精卵又は単為発生卵などを出発点として一つの生物が成体に到達する個体発生の進行を、一定の段階（ステージ）に区切って番号をつけた各段階（ステージ）のことであり、例えば両生類では変態に至るまでが約６０期の発生ステージに分けられている。
【００１７】
細胞分化及び発生ステージの検定には、組織の観察や抗体を用いる方法によっても行うことができるが、インビトロで誘導した移植用眼球の発生ステージに応じて発現するゲノムＤＮＡを分子マーカーとすることにより一層精確な検定を実施することができる。例えば、両生類胚の正常発生においては、卵割が１２回行われた中期胞胚期からゲノムＤＮＡの発現が急激に増加し、その後は胚の発生ステージに応じて発現する遺伝子の量と種類が厳密な階層を示しながら変化していくことが明らかになっており、アフリカツメガエルの眼球分化に関連するマーカー遺伝子としては、βクリスタリン遺伝子を例示することができる。
【００１８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１（方法）
［アフリカツメガエルの胚と系統標識（ｌｉｎｅａｇｅ　ｌａｂｅｌｉｎｇ）］
アフリカツメガエルの初期胚は、オスとメスのアフリカツメガエルにそれぞれ６００ＩＵのｈＣＧ（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン；Ｇｅｓｔｒｏｎ；デンカ製薬社製）を注入し、これらアフリカツメガエルを交配させて卵を得た。受精卵は４．５％システイン塩酸塩（ｐＨ７．６、和光純薬工業社製）を含むＳｔｅｉｎｂｅｒｇ溶液（ＳＳ溶液；５８．００ｍＭのＮａＣＬ、０．６７ｍＭのＫＣＬ、０．３４ｍＭのＣａ（ＮＯ３）２、０．８３ｍＭのＭｇＳＯ４、３．００ｍＭのヒドロキシエチルピペラジニルエタンスルホン酸及び１００ｍｇ／Ｌカナマイシン硫酸塩、ｐＨ７．４）で処理してゼリーを除去し、無菌ＳＳ溶液（ｐＨ７．４）で洗浄した。胚の発生段階は文献（Ｎｉｅｕｗｋｏｏｐ，　Ｐ．Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｎｏｒｍａｌ　ｔａｂｌｅ　ｏｆ　Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ　（Ｄａｕｄｉｎ）．　Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ　ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　ｃｏｍｐａｎｙ，　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ　（１９５６））に従った。微量注入は５％フィコールを含むＳＳ溶液で行った。２細胞期胚は０．５％の赤色の蛍光色素ＴＲＤＡ（Ｔｅｘａｓ　ｒｅｄ−ｄｅｘｔｒａｎ−ａｍｉｎｅ；Ｄ−１８６３；　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，　Ｅｕｇｅｎｅ，　ＯＲ，　ＵＳＡ）を８ｎＬ注入した。卵黄膜は実体顕微鏡を用いて細いピンセットで除去した。全ての工程は無菌状態で行われた。
【００１９】
［ＲＴ−ＰＣＲ分析］
全ＲＮＡの摘出とＲＴ−ＰＣＲは文献（Ｓｅｄｏｈａｒａ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｚｏｏｌｏｇ．　Ｓｃｉ．　１９，　６７−８０　（２００２））記載の方法に準じて行った。また、ＲＴ−ＰＣＲに使用するプライマーセットとしては、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）については文献（Ｏｓｂｏｍｅ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２０２，　５７５−５８１　（１９９１））記載のものを、ｏｔｘ−２、ＨｏｘＢ９については文献（Ｆｕｋｕｉ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｄｅｖｅｌｏｐ．　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｄｉｆｆｅｒ．　４２，　４８９−４９８　（２０００））記載のものを、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）については文献（Ｋｉｎｔｎｅｒ，　Ｃ．Ｒ．　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　９９，　３１１−３２５　（１９８７））記載のものを、及びβクリスタリンについては文献（Ｏｎｕｍａ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９９，　２０２０−２０２５　（２００２））記載のものを、それぞれ用いた。ＯＤＣの検出により各サンプルにおける全ＲＮＡの総量が同程度であることがわかった。
【００２０】
［組織学と免疫染色法］
ヘマトキシリンとエオシン染色のために、外植体をＢｏｕｉｎ’ｓ溶液（７５ｍＬの飽和ピクリン酸、２５ｍＬのホルマリンと５ｍＬの氷酢酸）で３時間室温で固定した。免疫染色のために、外植体は４％パラホルムアルデヒドで一晩４℃で固定した。次にサンプルは段階別のエタノール（７０％、９０％、９９．５％もしくは１００％）でそれぞれ１５分間脱水され、パラフィン（Ｈｉｓｔｐｒｅｐ　５４８，　Ｗａｋｏ　Ｉｎｃ．社製）で包埋する前にキシレン（Ｗａｋｏ社製）を２０分間染み込ませた。サンプルをヘマトキシリンとエオシンの染色では６μｍ、蛍光染色には４μｍの連続切片とした。蛍光染色は確立した手順にしたがって行われた。抗体は次の希釈度（ウサギ抗ウシ・ロドプシン（ＬＳＬ）抗体１：５００、マウス抗グルタミンシンテターゼモノクローナル抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＮＡＬ　ＩＮＣ．社製）１：５００、ウサギ抗ヒトαβクリスタリン抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＮＡＬ　ＩＮＣ．社製）１：５００）で使用した。また、使用した二次抗体は、Ａｌｅｘａ　４８８−結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｈ＋Ｌ）及びＡｌｅｘａ　４８８−結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｈ＋Ｌ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社製）を１：１００に希釈したものである。
【００２１】
［電子顕微鏡］
外植体はｐＨ７．４で３％のパラホルムアルデヒド、２．５％のグルタルアルデヒド及び０．１Ｍのカコジル塩酸緩衝液で１日、前固定した。前固定された外植体は緩衝液で洗浄され、１％のＯｓＯ４と０．１Ｍのカコジル塩酸緩衝液でｐＨ７．４で２時間後固定された。洗浄後、後固定されたサンプルは段階別のエタノールとアセトンで脱水された。これらのサンプルはエポキシ樹脂で包埋される。超薄切片を切りだし、酢酸ウラニルとクエン酸鉛で二重染色した。これらの切片は透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ−２００ＣＸ；Ｊｏｅｌ　Ｃｏ．　Ｌｔｄ．社製）で観察された。
【００２２】
実施例１（結果）
［インビトロで形成された眼球は、正常な眼球と同等の形態であった］
背唇の外植体（０．４×０．４ｍｍ）はステージ１０．２５の胚より切除することにより、また、外側周辺部（ＬＭＺ）細胞の集合体（０．３×０．３ｍｍ）はステージ１０．２５の胚から切除することにより得た。眼球を誘導するため、背唇とＬＭＺ外植体の両方を外胚葉域からの２枚の外植体（０．７×０．７ｍｍ）、すなわちステージ９の胚より切除されたアニマルキャップと結合した（図１Ａ）。これらの外植体は０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．社製）を含むＳＳ溶液で、同胞胚がステージ４２に到達するまで２０℃で４日間培養した。図１Ｂ、Ｄは通常の胚（Ｂ）と外植体（Ｄ）の外観であるが、結果として、眼球はインビトロで高い頻度での誘導が確認できた。また外観では、レンズとＲＰＥ（網膜色素上皮）を外植体で観察することができる（図１Ｄ）。ヘマトキシリンとエオシンで染色された切片では、眼の構造の配列が正常な眼球と等しいことが確認された（図１Ｃ、Ｅ）。レンズ、神経節細胞層、内部核層、外部核層、及び色素ＲＰＥ上皮層がインビトロで誘導された眼球の全ての外植体ではっきりと観察された（図１Ｅ、２３／２３、１００％）。このデータはインビトロで形成された眼球が正常な眼球と似通った形態であることを示している。
【００２３】
眼球が前述の方法で誘導されたものかどうかを確認するために、ステージ４２の外植体についてさまざまな状況のもとでＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。次のマーカー遺伝子（成熟したレンズβクリスタリン、前脳ｏｔｘ−２、脊髄ＨｏｘＢ９、ｐａｎ−ｎｅｕｒａｌ　ＮＣＡＭ）を使用した。その結果、成熟したレンズマーカーであるβクリスタリンの出現は背唇とＬＭＺ細胞の両方が２枚のアニマルキャップに挟まれたとき、すなわち眼球の形成の状態であるとき（レーン５）にだけ確認できた。反対に、多くの前部組織（セメント腺と内胚葉細胞部分）へと分化したアニマルキャップと背唇が結合したときには、βクリスタリンの発現は認められなかった（レーン４）。しかしながら、ｏｔｘ−２（前脳マーカー）とＮＣＡＭ（ｐａｎ−ｎｅｕｒａｌマーカー）はこの非眼球状態で発現した（レーン４）。無処理アニマルキャップ、背唇及びアニマルキャップと結合したＬＭＺ細胞はレンズや周辺特定神経マーカーを発現しなかった（レーン１、２、３）。この結果により、背唇とＬＭＺ細胞の両方がアニマルキャップ外植体と結合したときにだけ、眼球がインビトロで誘導されることが証明された。
【００２４】
［成熟したレンズと異なった種類の網膜細胞で構成されたインビトロで形成された眼球］
次に、インビトロで形成された眼球にミュラーｇｒａｉｌ　細胞や桿体視細胞などのいくつかの分化細胞やレンズが存在するかどうかを調べるため、インビトロで形成された眼球の組織切片を特異的な分子マーカーを使用して、免疫染色を試みた。そこで、ロドプシンに対する細胞特異的抗体（桿体視細胞）、グルタミンシンテターゼ（ミュラーｇｒａｉｌ　細胞）やαβクリスタリン（レンズ）を使用して１０日間培養された眼球を含む外植体の組織切片の免疫蛍光検査を行った。結果的に、正常な眼球と同様、特異的な染色がインビトロで形成された眼球の全てのマーカーで観察された（図２Ａ〜Ｐ）。二次抗体にだけ反応したネガティブコントロールでは特異的な染色は観察されなかった（図２Ｍ〜Ｐ）。この結果は、インビトロで形成された眼球に成熟したレンズ、ミュラーｇｒａｉｌ　細胞や桿体視細胞が存在することを示した。加えて、これらの視細胞は正常な眼球と同じ配列で並んでいた（図２Ａ〜Ｐ）。例えば、αβクリスタリンの抗体で染色されたレンズはＲＰＥ層からもっとも遠くに位置していた（図２Ａ〜Ｄ）。反対に、桿体視細胞であった抗ロドプシン染色における陽性細胞はＲＰＥ層の近くで観察された（図２Ｉ〜Ｌ）。免疫染色により、インビトロで形成された眼球には分化細胞が存在し、インビトロで形成された眼球内でも正常な眼球と同様に適切な位置に配列されていることが明らかになった。
【００２５】
［宿主オタマジャクシに結合された移植眼球］
インビトロで形成された眼球が本来の眼球と同じ機能を持つかどうかを調べるため、インビトロで形成された眼球をオタマジャクシステージで移植した。移植の方法の説明図は図３−Ａに示されている。系統標識のために、２細胞期胚の動物極側の各分割球に０．５％のテキサスレッドデキストランアミン（ＴＲＤＡ）８ｎＬを注入した。これらの胚は、同胞胚がそれぞれ後期胞胚及び初期原腸胚に達するまで培養した。これらの標識胚を使用して、眼球は前述したようにインビトロで形成した（図１Ａ）。これらの外植体は同胞胚がオタマジャクシ（ステージ３３）（図３Ａａ）に到達するまで培養した。移植には無マーカーのステージ３３のオタマジャクシが移植片の被移植体として使用された。非マーカーのオタマジャクシは左側の眼球を外科的手法により摘出された。つぎに、インビトロで形成されたマーカー眼球は外植体から摘出され、他の細胞を完全に除去した。このマーカー眼球は被移植体に移植された（ｎ＝１５）。すべての処置は１００％ＳＳ溶液で１：３０００に希釈されたＦＡ１００溶液（田辺製薬株式会社製）で行われた（図３Ａｂ）。眼球を含んだ外植体と左側の眼球を摘出された被移植体の外観を図３Ｂに表す。倍率は図３Ｃに示してある。外植体の眼球ははっきりと観察できた（図３Ｂ、Ｃ、矢印）。左側の眼球は完全に摘出された（図３Ｃ）。ＴＲＤＡシグナル（赤い蛍光色）は外植体でのみ観察された（図３Ｄ、白い矢印）。移植されたオタマジャクシは図３Ｅ〜Ｇ（矢頭）に示した。移植された眼球は本来の眼球の位置である左のくぼみに移植され（図３Ｅ、Ｆ）、ＴＲＤＡシグナルを確認した（図３Ｇ）。
【００２６】
移植片が回復した後、移植されたオタマジャクシは１０％ＳＳ溶液に移された。これらの移植されたオタマジャクシを飼育し、移植した眼球を日々観察した（図３Ａｂ）。その結果、移植された眼球は宿主オタマジャクシに翌日定着した（１５／１５、１００％）。１５日後、移植されたオタマジャクシがステージ５０に到達したことを確認した（図４Ａ、Ｂ、Ｄ〜Ｆ）。移植された眼球は完全に被移植体に定着した（図４Ａ、背側図、白い矢頭）。レンズとＲＰＥは観察することができた（図４Ｂ、側面図）。両側の眼を摘出されたオタマジャクシの場合、眼の跡は確認できなかった（図４Ｃ）。これは、二次的な眼の構造が本来の眼を摘出した後に誘導されなかったことを示している。高倍率での観察により、眼神経のような繊維が移植された眼球から宿主の脳まで伸びたことが明らかになった（図４Ｄ、白い矢印）。ＴＲＤＡシグナルは移植された眼と視神経でのみ観察された（図４Ｅ）。ＴＲＤＡシグナルは完全に視神経と一致した（図４Ｆ）。この結果は移植された眼球から伸びた視神経が移植片から派生していることを示した。
【００２７】
［電子顕微鏡による観察による、視神経が宿主の脳まで伸びていることの証明］
移植された眼球から伸びた繊維が本当に視神経であるかどうかを確かめるために、この繊維を電子顕微鏡による観察で同定することを試みた。概略説明図でこの実験中の電子顕微鏡による観察の位置関係を表した（図５Ａ）。概略説明図の赤い線は視神経部分のおよその位置を示している。電子顕微鏡で観察された形態を、正常な視神経をもつ移植片から伸びた繊維と比較した。電子顕微鏡による観察は移植片から伸びた繊維（Ｃ〜Ｅ）が正常な視神経（Ｂ）と同じ構造をしていることを示した（図５Ｂ〜Ｅ）。さらに、同じ構造は、視神経の移植した側の別の観察場所（近位Ｃ、中間Ｄ、遠位Ｅ）からも観察された。この結果は視神経が移植された眼球から宿主の脳まで伸びていることを示している。継続して観察するために、眼球が移植されたオタマジャクシを飼育した。移植から１ヶ月後、移植した眼球は宿主で生存していた（９／１５、６０％）。しかしながら、残りの移植された眼球（６／１５、４０％）は消滅した。２ヶ月目には移植された眼球は変態の後、宿主のオタマジャクシと結合した（図６Ａ、Ｂ）。幼若カエルの左側の移植された眼球は本来のもの（右側）と区別できなかった（３／１５、２０％）。これらの結果はインビトロで形成された眼球は正常な眼球と同じ機能を持ち得ることを示している。
【００２８】
実施例２（方法）
実施例１と同様に、人工媒精によって得たツメガエルの２細胞期胚の両割球へ、１％の赤色の蛍光色素ＴＲＤＡを５ｎｌずつ動物局側へ微量注入し、発生段階が後期胞胚（ステージ９）に達するまで２０℃で培養した。この後期胞胚のアニマルキャップを切り出し、高濃度（３００ｎｇ／ｍｌ）のアクチビン（ヒト組換えアクチビンＡ）溶液で１時間処理した後、生理食塩水中で５時間前培養した。その後、アクチビン処理片を、同様にして赤色の蛍光色素を微量注入した後期胞胚から切り出した２枚の無処理のアニマルキャップでサンドイッチ培養を２日間行った（図７Ａ−ａ）。他方、同様にして得られたツメガエル胚を無処理のまま２日間幼生の発生段階がステージ３３に達するまで培養した（図７Ａ−ｂ）。このようにしてインビトロで誘導された眼をサンドイッチ外植体から摘出し、外科的手法を用いて眼球を除去した無標識の後期尾芽胚期幼生（ステージ３３）に移植を行った（図７Ｂ−ａ〜ｃ）。その結果、移植された眼球から移植を受けた幼生の中脳領域へ視神経を伸ばすことを確認した（図８〜１２）。このことは、未分化細胞からインビトロで作った眼が、実際に機能し得る可能性を示すものである。
【００２９】
【発明の効果】
本発明によると、インビトロで誘導された移植用眼球が実際に生体内で機能することを確認することができるので、移植用眼球の形成の仕組みを解明する上で多くの有用な知見を得ることができるばかりでなく、インビトロでの移植用眼球形成とその生体への移植という発生工学あるいは再生工学の新たな分野の確立にも貢献することができる。さらに、両生類での眼の形成機構は、両生類にとどまらずニワトリ、マウス及びヒトに代表される脊椎動物全般において共通するものであることから、本発明によると、免疫的に適合した移植用眼球の移植・再生が可能となり、ヒトを含めた高等動物の眼球疾患等の疾病に対して治療の道を拓くことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のインビトロで形成された移植用の眼球が、正常な眼と同様の形態を有することを示す図である。
Ａ：眼球の形成の説明図。背唇と初期原腸胚由来のＬＭＺの両方が後期胞胚由来の２枚のアニマルキャップに挟まれている。
Ｂ、Ｄ：通常の胚（Ｂ）と外植体（Ｄ）の外観。レンズとＲＰＥが観察できる（Ｄ、矢頭）。ＲＰＥ；網膜色素上皮を示し、スケールバーは１ｍｍを表す。
Ｃ、Ｅ：通常の胚（Ｃ）と外植体（Ｅ）の冠状切片のヘマトキシリンとエオシンによる染色。正常な眼と同じように、眼の構造物が正確に配置されているのが観察できる。ＮＲは神経網膜、ＲＰＥは網膜色素上皮を示し、スケールバーは５０ｎｍを表す。
Ｆ：外植体のＲＴ−ＰＣＲ分析はステージ４２で行われた。次の標識遺伝子としては、成熟したレンズβクリスタリン、前脳ｏｔｘ−２、脊髄ＨｏｘＢ９、ｐａｎ−ｎｅｕｒａｌ　ＮＣＡＭを使用した。成熟したレンズマーカー、βクリスタリンの発現は、完全な眼の構造が形成された状態、つまり、背唇とＬＭＺ細胞の両方が２枚のアニマルキャップに挟まれたときのみ認められる（レーン５）。対照的に、背唇がアニマルキャップと結合したとき、つまり、大部分の前部領域が誘導されている状態のときは、成熟したレンズマーカーは確認できない（レーン４）。無処理のアニマルキャップ、背唇、アニマルキャップと結合したＬＭＺ細胞はいくらかマーカーを発現した（レーン１、２、３）。ＯＤＣの検出は内部統制の働きをする。ＯＤＣ　ＲＴ−は逆転写酵素なしの実験を表す。ａｃ；アニマルキャップ、ＤＬ；背唇、ｅｃｔ；外胚葉外植体、ＰＥ；後部外植体、ＷＥ；全胚を示す。
【図２】本発明のインビトロで誘導した移植用の眼において、成熟した網膜細胞型とレンズが分化していることを示す図である。
正常な眼（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｊ、Ｍ、Ｎ）とインビトロで誘導された移植用の眼（Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｏ、Ｐ）の切片。ＤＩＣ照明（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｏ）と蛍光照明（緑色のマーカー）（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｌ、Ｎ、Ｐ）。αβクリスタリンの抗体での蛍光染色（Ａ〜Ｄ）は正常な眼と同様にインビトロで誘導した異所性の眼の中に、レンズが存在することを示した（Ｂ、Ｄ）。グルタミンシンテターゼの抗体に対する免疫反応（Ｅ〜Ｈ）は、インビトロで形成された眼と正常な眼の中にミュラーｇｒａｉｌ細胞が存在することを示した（Ｆ、Ｈ）。インビトロで形成された眼と正常な眼における桿体視細胞の存在（Ｊ、Ｌ）がロドプシンの抗体による免疫染色により証明された（Ｉ〜Ｊ）。二次抗体にのみ反応したネガティブコントロールでは特異的染色を観測できなかった（Ｍ〜Ｐ）。Ａ、Ｃ、Ｇにおけるスケールバーは５０ｎｍを表す。
【図３】本発明のインビトロで形成された系統標識された眼の移植の概要と結果を示す図である。
Ａ：系統マーカー（ａ）と移植（ｂ）の概略図。２細胞期胚の動物極に０．５％のテキサスレッドデキスドランアミン（ＴＲＤＡ）８ｎＬを注入し、これらの胚を使用して外植体を形成して眼球を誘導し、初期オタマジャクシ（ステージ３３）に達するまで培養した（ａ）。初期オタマジャクシは左側の眼球を摘出され、外植体から取り出した異所性の眼球を移植された（ｂ）。
Ｂ、Ｃ：被移植体となるステージ３３のオタマジャクシ（上）と移植される外植体の外観（下）（Ｂ）とＢの拡大図（Ｃ）。黒の矢印はインビトロで誘導された眼を指す。被移植体オタマジャクシは左側の眼球を摘出された。スケールバーは１ｍｍを表す。
Ｄ：Ｃを蛍光照明したもの。ＴＲＤＡシグナル（赤い蛍光）は外植体でのみ観察される。白い矢印は眼の位置を指している。
Ｅ、Ｆ：移植後のオタマジャクシ（Ｅ）とＥの拡大図（Ｆ）。移植片は摘出された眼の位置に移植した。スケールバーは１ｍｍを表す。
Ｇ：赤い蛍光は移植された眼で観察できた。白い矢頭は移植された眼を指している。
【図４】本発明の移植された眼球が移植された位置に定着し、視神経によって被移植体の脳とつながったことを示す図である。
Ａ：移植から１５日後の被移植体の背側からの図。移植された眼は被移植体の左側に観察される（白い矢頭）。スケールバーは１ｍｍを表す。
Ｂ：被移植体の側面図。ＲＰＥとレンズが観察できる。スケールバーは１ｍｍを表す。
Ｃ：両側の眼を摘出されたオタマジャクシ。摘出後、眼の構造は全く誘導されていない。スケールバーは１ｍｍを表す。
Ｄ：Ａの拡大図。移植された眼球から伸び、宿主の脳とつながった視神経（白い矢印）。スケールバーは１ｍｍを表す。
Ｅ：ＴＲＤＡシグナル（赤い蛍光）は移植された眼と視神経で観察できた。
Ｆ：ＴＲＤＡシグナルは伸びた視神経に対応する。
【図５】本発明の移植された眼からの視神経が被移植体の脳に到達したことを示す図である。
Ａ：正常な眼と移植された眼の視神経を電子顕微鏡で観察した部位を示す概略図で、赤い線は切片のおよその位置を示している。
Ｂ〜Ｅ：電子顕微鏡による写真。宿主の脳まで視神経が伸びていることが明らかである。
【図６】宿主のオタマジャクシの変態後に結合している本発明の移植された眼球を示す図である。
Ａ、Ｂ：幼若カエルの外観図（Ａ）とＡの拡大図（Ｂ）。矢頭は移植された眼球を指している（カエルの左側）。変態後、移植された眼球は宿主カエルと結合し、移植された眼球が本来のものと区別できないことを示す。
【図７】本発明のインビトロで形成した眼の移植方法の概要を示す図である。
Ａ：蛍光色素標識とインビトロでの眼の形成方法を示す。
Ｂ：ステージ３３胚の左目を外科的手法によって除去した後、眼を形成したサンドイッチ外植体から眼を摘出し、あらかじめ左目を除去しておいた後期尾芽胚へ移植する方法を示す。
【図８】本発明の赤色に蛍光色素標識された後期胞胚とサンドイッチ外植体を示す図である。
Ａ、Ｂ：Ａ（スケールバーは１ｍｍ）はステージ９（後期胞胚）の明視野像、ＢはＡの暗視野像を示す。
Ｃ、Ｄ：Ｃ（スケールバーは１ｍｍ）は２日間培養したサンドイッチ外植体の明視野像、ＤはＣの暗視野像を示す。Ｃではサンドイッチ外植体の中に眼が誘導されているのが観察される（黒い矢印）。Ｄではサンドイッチ外植体全体が赤い蛍光色素で標識されているのが分かる（白い矢印）。
【図９】本発明の左目を除去したステージ３３胚とサンドイッチ外植体及び移植直後の胚を示す図である。黒い矢印及び白い矢印は、外植体の眼を指し示す。
Ａ：移植を受ける左目を除去したステージ３３胚と眼を形成したサンドイッチ外植体の明視野像を示す。黒矢印は、外植体の眼を示し、スケールバーは１ｍｍを表す。
Ｂ、Ｃ：Ａの拡大図であり、ＣはＢの暗視野像を示す。眼を形成したサンドイッチ外植体でのみ赤い蛍光色素が観察される。黒矢印及び白矢印は、外植体の眼を示し、スケールバーは１ｍｍを表す。
Ｄ：移植を受けたステージ３３胚を示す。
Ｅ、Ｆ：ＥはＤの拡大図であり、ＦはＥの暗視野像を示し、スケールバーは１ｍｍを表す。また、移植された眼のみで赤い蛍光色素が観察され、移植が適正に行われたことを示す。
【図１０】本発明の発生段階ステージ４１における眼移植胚の観察結果（Ａ、Ｃ、Ｅは明視野像、Ｂ、Ｄ、Ｆは暗視野像）を示す図である。黒い矢頭及び白い矢頭は、移植された眼を示す。
Ａ、Ｂ：側面から見た図である。スケールバーは１ｍｍを表す。
Ｃ、Ｄ：Ａ、Ｂの拡大図である。スケールバーは１ｍｍを表す。
Ｅ、Ｆ：背側から見た図である。移植された眼でのみ、赤い蛍光色素が観察される。このとき、まだ移植された眼から中脳領域への視神経の伸張はごくわずかである。
【図１１】本発明の発生段階ステージ４３における眼移植胚の観察結果（Ａ、Ｃ、Ｅは明視野像、Ｂ、Ｄ、Ｆは暗視野像）を示す図である。ステージ４１と同様、移植された眼でのみ赤い蛍光色素が観察される。また、黒い矢頭及び白い矢頭は、移植された眼を示す。
Ａ、Ｂ：側面から見た図である。スケールバーは１ｍｍを表す。
Ｃ、Ｄ：Ａ、Ｂの拡大図である。通常の発生と同様、移植された眼の発生が進み、レンズが明瞭に観察されるようになる（白い矢印）。スケールバーは１ｍｍを表す。
Ｅ、Ｆ：背側から見た図である。移植された眼から中脳領域への視神経の伸長が観察できる。
【図１２】本発明の７日胚における眼移植胚の観察結果（Ａ、Ｃは明視野像、Ｂ、Ｄは暗視野像）を示す図である。移植された眼でのみ赤い蛍光色素が観察される。
Ａ、Ｂ：側面から見た図である。通常の発生と同様、移植された眼の発生がさらに進んでいる（Ａ、白い矢印）。スケールバーは１ｍｍを表す。
Ｃ、Ｄ：背側から見た図である。移植された眼（Ｃ、黒い矢頭）から中脳領域への視神経の伸張が観察できる（Ｃ、白い矢頭）。蛍光色素の標識が眼から伸びた視神経と位置的に重なることから、伸びた視神経は移植された眼由来であることが分かる（Ｄ、白い矢頭）。スケールバーは１ｍｍを表す。
Ｅ：両目を除去し、移植を受けなかった７日胚を示す。
Ｆ：無処理の７日胚を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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