(57)【要約】【課題】インフルエンザ等のウイルスによる感染症によって引き起こされる組織傷害や炎症等の重症合併症の原因と考えられる過剰の白血球遊走を抑制する効果を有する白血球遊走能調節剤を提供する。【解決手段】ラクトフェリンを有効成分として含有することを特徴とする白血球遊走能調節剤であって、該白血球がインフルエンザウイルス感染呼吸器に遊走される白血球であること、並びに組織傷害、気管支炎、中耳炎、肺炎の予防及び／又は治療に効果を有すること、を望ましい態様としている。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトフェリンを有効成分として含有することを特徴とする白血球遊走能調節剤。
【請求項２】
白血球が、インフルエンザウイルス感染呼吸器に遊走される白血球である請求項１に記載の白血球遊走能調節剤。
【請求項３】
組織傷害、気管支炎、中耳炎、肺炎の予防及び／又は治療に効果を有する請求項１又は請求項２に記載の白血球遊走能調節剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラクトフェリンを有効成分として含有することを特徴とする白血球遊走能調節剤に関する。さらに詳しくは、本発明は、インフルエンザウイルスに感染した宿主の気管や肺等の呼吸器において誘導される白血球の遊走能を抑制する調節剤であって、インフルエンザウイルス感染症を発症した宿主の症状緩和効果、及びインフルエンザウイルス感染症によって引き起こされる合併症とされる組織傷害、気管支炎、中耳炎、肺炎などの予防及び／又は治療に効果を有する白血球遊走能調節剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ウイルス感染の宿主免疫機構に及ぼす影響が、ウイルス感染症における症状の重篤化と密接に関係していることが明らかにされてきた。例えば、インフルエンザウイルスを感染させたマウスでは、好中球、マクロファージ、リンパ球などの白血球が気管や肺等の呼吸器に過剰に遊走して組織傷害を引き起こし、重篤化の大きな要因となることが明らかにされている（例えば、非特許文献１）。ウイルス感染症には、アシクロビル、アジドチミジン、リバビリン、インターフェロンをはじめとする抗ウイルス剤が使用されているが、これらの薬剤はその副作用と耐性ウイルス出現が臨床上の問題となっている。これらの抗ウイルス剤による根本治療に加えて、ウイルス感染防御能が無い薬剤も症状緩和の目的で対症療法的に使用されている。例えば、Ｃ型慢性肝炎ウイルス感染患者には、抗ウイルス作用の無いグリチルリチンが肝炎の症状緩和の目的で投与されている。
【０００３】
インフルエンザ感染症は、感染した呼吸器へ白血球等の遊走が活発となって組織傷害を引き起こし、中耳炎、気管支炎、インフルエンザ肺炎、インフルエンザ脳炎、インフルエンザ心筋炎、インフルエンザ筋炎等の合併症を併発することがあり、重篤化した場合は死に至ることがある。特に小児や高齢者などのハイリスク群では、それらの合併症による重篤化を防ぐための対策が重要な課題であると考えられている（例えば、非特許文献２）。インフルエンザウイルスを感染させたマウスでは、漢方の有効成分であるイソフェルラ酸の投与によって、抗ウイルス効果は観察されないものの、肺胞および気管内腔への白血球の遊走が抑制され、組織傷害の抑制などの症状緩和作用が認められている（例えば、非特許文献１又は３）。さらに、生体における抗酸化酵素であるヘムオキシゲナーゼを遺伝子導入により呼吸器で発現させたマウスでは、普通のマウスと比較して、肺に検出されるウイルス量に変化は観察されないものの、肺胞および気管内腔への白血球の遊走が抑制され、組織傷害が抑制されるなどの症状緩和作用が認められている（例えば、非特許文献４）。
【０００４】
ラクトフェリンは、哺乳類の乳汁、唾液、涙液、気道粘液等の分泌液に含有される鉄結合性糖タンパク質であり（例えば、非特許文献５）、工業的には牛乳から大量スケールで精製される（例えば、特許文献１）。ラクトフェリンには、抗菌性、抗ウイルス活性、腸管からの鉄吸収調節作用、細胞増殖作用、免疫調節作用等の多様な生物機能が報告されており（例えば、非特許文献５）、すでにインフルエンザウイルス感染防御剤（例えば、特許文献２）、病原性細菌及びウイルス感染防御剤（例えば、特許文献３）、大腸菌付着防止剤（例えば、特許文献４）等に関する技術が開示されている。しかしながら、ラクトフェリンがウイルス感染に伴う組織傷害や炎症を引き起こす可能性がある白血球の遊走を調節する効果は一切報告されていなかった。
【０００５】
【特許文献１】
特公平６−１３５６０号公報
【特許文献２】
特許第３０６１３７６号公報
【特許文献３】
特開平１１−２８６４５２号公報
【特許文献４】
特許第２８３２５１７号公報
【０００６】
【非特許文献１】
ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、アメリカ、第７４巻、２０００年、ｐ．２４７２−２４７６
【非特許文献２】
日本臨床、第５８巻、２０００年、ｐ．２２４９−２２８１
【非特許文献３】
メディエーター・オブ・インフラメーション（Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）、イギリス、第１０巻、２００１年、ｐ．９３−９６
【非特許文献４】
ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、イギリス、第８巻、２００１年、ｐ．１４９９−１５０７
【非特許文献５】
アニュアル・レビュー・オブ・ニュートリション（Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）、アメリカ、第１５巻、１９９５年、ｐ．９３−１１０
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように、前記特許文献２又は特許文献３には、ラクトフェリンによるインフルエンザウイルスの感染防御及び感染症の治療効果が開示されていたが、感染症を発症した宿主の呼吸器等において誘導される白血球遊走を調節する効果は示されていなかった。また、感染症に伴って白血球が遊走された呼吸器における炎症反応や組織傷害を予防又は改善する効果についても開示されていなかった。
【０００８】
白血球は本来、外から侵入した異物から体を守るという免疫機能の主役を担い、空気中の細菌やウイルス等の異物が体内に侵入すると、これを認識し、すばやく攻撃して、抗体（異物をキャッチするもの）を作り、体の外に排除しようとする機能を有しており、その際に放出されたメディエーターによって炎症が起こる。本発明者らは、感染症などの際に、白血球が活性化して異常に反応したり、過剰な炎症反応が起きると重篤化して合併症を併発することに注目し、その原因の一つとして考えられる過剰な白血球遊走をコントロールすることが可能な手段を鋭意検討してきた結果、乳中に含まれる蛋白質であるラクトフェリンに白血球遊走能を抑制する効果が存在することを発見し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明は、インフルエンザ等のウイルスによる感染症によって引き起こされる組織傷害や炎症等の重症合併症の原因と考えられる過剰の白血球遊走を抑制する効果を有する白血球遊走能調節剤を提供することを目的としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決する本発明の態様は、ラクトフェリンを有効成分として含有することを特徴とする白血球遊走能調節剤であって、該白血球がインフルエンザウイルス感染呼吸器に遊走される白血球であること、並びに組織傷害、気管支炎、中耳炎、肺炎の予防及び／又は治療に効果を有すること、を望ましい態様としている。
【００１１】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の好ましい実施態様について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施態様に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
【００１２】
本発明に使用されるラクトフェリンは、ウシ、ヒト、ヤギ、ヒツジ、ウマ等の哺乳類の初乳、移行乳、常乳、末期乳、またはこれらの乳の処理物である脱脂乳、ホエー等から常法（例えば、イオンクロマトグラフィー等）によって分離されたラクトフェリンである。より簡便には、市販のラクトフェリン（例えば森永乳業社製等）を使用することができる。また、遺伝子操作によって微生物、動物細胞、トランスジェニック動物等で生産した各種ラクトフェリンを使用してもよい。
【００１３】
本発明における白血球遊走能調節効果とは、白血球の遊走能を抑制あるいは促進することで、宿主の生理機能を正常に維持する効果を意味する。本発明のラクトフェリンにおいては、特に白血球の遊走能を抑制する効果を有し、これに伴って、インフルエンザウイルス感染症を発症した宿主の症状緩和効果、及びインフルエンザウイルス感染症によって引き起こされる合併症とされる組織傷害、気管支炎、中耳炎、肺炎などの予防及び／又は治療において極めて有効であると考えられる。
【００１４】
ラクトフェリンは、白血球遊走能を調節する作用を有しているので、白血球遊走能調節剤（以下、「本発明の調節剤」という場合がある。）の有効成分として使用することができる。ここで、「有効成分」とは、白血球遊走能を調節する作用を有する成分を意味し、ラクトフェリンが本発明の調節剤の主成分である必要はなく、また、本発明の調節剤にはラクトフェリン以外に白血球遊走能を調節する作用を有する成分が含まれていてもよい。
【００１５】
本発明において、白血球遊走能調節剤とは、インフルエンザ等のウイルスによる感染症によって引き起こされる気管や肺等の呼吸器における組織傷害や炎症等の重症合併症の原因と考えられる過剰の白血球遊走を抑制する効果を有し、白血球の遊走能を調節することによって、インフルエンザウイルス感染症などによって併発される各種重症合併症や炎症性疾患、組織傷害等の症状緩和作用を有する効果も包含するが、過剰の白血球遊走に起因する疾患に対する予防及び／又は治療の使用に限定されるものではない。本発明の白血球遊走能調節剤は、その有効成分が乳タンパク質等の食品素材に含まれるものであるので、ヒトに対する安全性が高く、飲食品に含有させた組成物として日常的に経口摂取することによってインフルエンザウイルスなどの感染症によって引き起こされる重症合併症等に対する予防及び／又は治療に効果が発揮される特徴を併せ持つ。
【００１６】
本発明の白血球遊走能調節剤の形態は特に限定されるものではなく、本発明の形態としては、例えば、医薬組成物が挙げられる。本発明の白血球遊走能調節剤を摂取する形態としては、調製粉乳、経腸栄養食、機能性食品等の各種飲食品組成物に配合して摂取する形態が挙げられる。
【００１７】
本発明の調節剤は、ラクトフェリンそれ自体であってもよいし、ラクトフェリン以外の成分を含有していてもよい。ラクトフェリン以外の成分は、摂取の形態に応じて適宜選択できる。例えば、ラクトフェリン粉末やラクトフェリン水溶液（シロップ等）等を本発明の白血球遊走能調節剤として配合して各種飲食品を調製してもよい。
【００１８】
医薬組成物は、例えば、ラクトフェリンを、薬学的に許容され得る賦形剤その他任意の添加剤を用いて製剤化することにより製造でき、製剤化したラクトフェリンは、インフルエンザウイルスなどの感染症によって引き起こされる重症合併症等に対する予防及び／又は治療剤として使用できる。製剤化する場合、製剤中のラクトフェリンの含有量は、通常０．００１〜２０質量％、好ましくは０．１〜１５質量％である。製剤化にあたっては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、注射剤用溶剤等の添加剤を使用できる。
【００１９】
賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、α−デンプン、デキストリン、カルボキシメチルデンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等のセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルラン；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム等の珪酸塩誘導体；リン酸カルシウム等のリン酸塩誘導体；炭酸カルシウム等の炭酸塩誘導体；硫酸カルシウム等の硫酸塩誘導体等が挙げられ、結合剤としては、例えば、上記賦形剤の他、ゼラチン；ポリビニルピロリドン；マグロゴール等が挙げられ、崩壊剤としては、例えば、上記賦形剤の他、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン又はセルロース誘導体等が挙げられ、滑沢剤としては、例えば、タルク；ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；コロイドシリカ；ビーガム、ゲイロウ等のワックス類；硼酸；グリコール；フマル酸、アジピン酸等のカルボン酸類；安息香酸ナトリウム等のカルボン酸ナトリウム塩；硫酸ナトリウム等の硫酸類塩；ロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム等のラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物等の珪酸類；デンプン誘導体等が挙げられ、安定剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；無水酢酸；ソルビン酸等が挙げられ、矯味矯臭剤としては、例えば、甘味料、酸味料、香料等が挙げられ、注射剤用溶剤としては、例えば、水、エタノール、グリセリン等が挙げられる。
【００２０】
医薬組成物の投与経路としては、例えば、経口投与、経腸投与等の非経口投与が挙げられ、医薬組成物の投与剤形としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等が挙げられる。また、医薬組成物は、飲食品、飼料等に配合して投与することもできる。投与投与量及び投与回数は、目的とする作用効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、投与量は、成人１日当たり通常１０ｍｇ〜１０ｇの範囲から適宜選択でき、投与回数は、１日１回から数回の範囲から適宜選択できる。
【００２１】
飲食品組成物に配合して摂取する形態としては、例えば、ラクトフェリン粉末やラクトフェリン水溶液（シロップ等）等を本発明の白血球遊走能調節剤として配合した清涼飲料、乳飲料等又はこれらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末；加工乳、発酵乳等の乳製品；経腸栄養食；機能性食品等が挙げられる。
【００２２】
飲食品組成物の形状としては、タブレット状のサプリメントを例示することができる。これによって、一日当りの食事量及び摂取カロリーを他の食品の摂取量を加味した上でコントロールする必要が無く、また、有効成分の摂取量を正確に把握できる。
【００２３】
本発明において、ラクトフェリンによる白血球遊走能調節作用を評価するために、以下の報告、『ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、アメリカ、第７４巻、２０００年、ｐ．２４７２−２４７６』、及び『ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、イギリス、第８巻、２００１年、ｐ．１４９９−１５０７』に基づき、インフルエンザ感染モデルマウスによる、炎症細胞数抑制作用、及び肺コンソリデーション（肺炎症の重症度）として検討した。詳細は、後記する試験例の方法に従った。
【００２４】
次に試験例を示して本発明を詳細に説明する。
［試験例１］
本試験は、インフルエンザウイルス感染症を発症した宿主の呼吸器における白血球遊走、及び組織傷害に対するラクトフェリンの抑制作用を調べるために行った。
【００２５】
（１）試料の調製
ラクトフェリン（森永乳業社製）を、精製水に１２．５％の濃度に溶解して試験試料とした。供試ウイルスとして、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）株を用いた。
【００２６】
（２）試験方法
７週齢のＢＡＬＢ／Ｃ雌性マウス（日本エス・エル・シー社から購入）１２匹を、糞食防止ネットを設置したケージに入れ、標準固形飼料（日本クレア社製）と飲水で一週間馴化飼育した。次に、マウスを６匹ずつ２群に分け、そのうち試験群としては前記試験試料０．５ｍｌをゾンデで経口投与した。またもう１群には対照群として精製水０．５ｍｌをゾンデで経口投与した。これらの経口投与は、感染１日前から開始し、感染５日後まで一日一回ずつ７日間行った。感染日には、すべてのマウスに麻酔下でインフルエンザウイルス６６０ＰＦＵ（プラーク形成単位）を含むリン酸緩衝液１０μｌを経鼻的に接種した。感染６日後に解剖を行い、気道に注射針を差し込み、１ｍｌの血清無添加イーグルＭＥＭ培地（日水製薬社製）を注射器で注入した後、同じ注射器内に液を回収した。同様の注入と回収を、さらに２回、合計３回繰り返した。このようにして採取した気管支肺胞洗浄液を１０００回転で遠心分離した。この気管支肺胞洗浄液の上清中のウイルス量を定法〔ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、イギリス、第７１巻、１９９０年、ｐ．２１４９−２１５５〕によって測定した。さらに、気管支肺胞洗浄液の遠心分離の残さに回収された白血球数を細胞数測定装置（日本光電社製）を用いて測定した。さらに、気管支肺胞洗浄液を回収した後のマウスから肺を摘出し、インフルエンザウイルス感染症による組織傷害の指標であるコンソリデーションを観察した。肺コンソリデーションの重症度は、〔ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、アメリカ、第９５巻、１９５２年、ｐ．１３５−１４５〕を参考にして、０（コンソリデーションなし）から１０（重篤なコンソリデーション）にスコア化した。これらの測定値は、一群６匹の平均値として表示した。
【００２７】
（３）試験結果
本試験の結果は表１に示すとおりである。表１は、気管支肺胞洗浄液１ｍｌ当りの白血球数及び肺コンソリデーションを表す。表１から明らかなとおり、気管支肺胞洗浄液１ｍｌ当りの白血球数は、対照群で９．６×１０５であるのに対し、ラクトフェリンを投与した試験群では４．８×１０５に抑制されたことから、ラクトフェリンによるインフルエンザウイルス感染症に対する白血球遊走調節作用が確認された。また、肺コンソリデーションのスコアは、対照群で５．０であるのに対し、ラクトフェリンを投与した試験群では３．８に抑制されたことから、ラクトフェリンによって、インフルエンザウイルス感染症に対する組織傷害抑制作用が確認された。一方、これとは別に気管支肺胞洗浄液の上清中のウイルス量を計測したところ、対照群と試験群の間でウイルス量の差は観察されなかった。これらの結果から、ラクトフェリンは、インフルエンザウイルス感染症に対して抗ウイルス効果を示さないものの、白血球遊走調節作用および組織傷害抑制作用を示すことが明らかになった。
【００２８】
【表１】
2004256395.tif 000002
【００２９】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３０】
【実施例】
実施例１
次の組成の白血球遊走能調節効果を有する注射剤を常法により製造した。
ラクトフェリン（森永乳業社製）                        ２．０（％）
アクチノマイシンＤ（シグマ社製）                      ０．００５
塩化ナトリウム（和光純薬社製）                        ０．９
マンニトール（関東化学社製）                          １．０
注射用蒸留水（大塚製薬社製）                        ９６．０９５
【００３１】
実施例２
乳糖（メグレ社製）６００ｇ、トウモロコシデンプン（日清製粉社製）４００ｇ、結晶セルロース（和光純薬工業社製）４００ｇ及びラクトフェリン（森永乳業社製）６００ｇを５０メッシュのふるい（ヤマト科学社製）により篩い分けし、厚さ０．５ｍｍのポリエチレン製の袋にとり、転倒混合し、全自動カプセル充填機（セセレ・ペディーニ社製。プレス式）を用い、前記粉末をカプセル（日本エランコ社製。１号ゼラチンカプセル、Ｏｐ．  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｎｏ．６  Ｂｏｄｙ、空重量７５ｍｇ）に内容量２７５ｍｇで充填し、白血球遊走調節効果を有するカプセル剤７０００個を得た。
【００３２】
実施例３
ホエー蛋白酵素分解物（森永乳業社製）１０．８ｋｇ、デキストリン（昭和産業社製）３６ｋｇ、および少量の水溶性ビタミンとミネラルを水２００ｋｇに溶解し、水相をタンク内に調製した。これとは別に、大豆サラダ油（太陽油脂社製）３ｋｇ、パーム油（太陽油脂社製）８．５ｋｇ、サフラワー油（太陽油脂社製）２．５ｋｇ、レシチン（味の素社製）０．２ｋｇ、脂肪酸モノグリセリド（花王社製）０．２ｋｇ、及び少量の脂溶性ビタミンを混合溶解し、油相を調製した。タンク内の水相に油相を添加し、攪拌して混合した後、７０℃に加温し、更に、ホモゲナイザーにより１４．７ＭＰａの圧力で均質化した。次いで、９０℃で１０分間殺菌した後、濃縮し、噴霧乾燥して、中間製品粉末約５９ｋｇを調製した。この中間製品粉末５０ｋｇに、蔗糖（ホクレン社製）６．８ｋｇ、アミノ酸混合粉末（味の素社製）１６７ｇ、およびラクトフェリン（森永乳業社製）６０ｇを添加し、均一に混合して、白血球遊走能調節剤であるラクトフェリンを含有する経腸栄養食粉末約５６ｋｇを製造した。
【００３３】
実施例４
ラクトフェリン（森永乳業社製）１５０ｇ、ラクチュロース粉末（森永乳業社製）１００ｇ、マルツデキストリン（松谷化学工業社製）６３５ｇ、脱脂粉乳（森永乳業社製）８５ｇ、ステビア甘味料（三栄源エフ・エフ・アイ社製）１ｇ、ヨーグルト・フレーバー（三栄源エフ・エフ・アイ社製）５ｇ、グリセリン脂肪酸エステル製剤（理研ビタミン社製）２４ｇの各粉末を添加して均一に混合し、打錠機（畑鉄鋼所社製）を使用して、錠剤１錠当り０．５ｇとし、１２錠／分の打錠速度、９．８ＫＰａの圧力で前記混合粉末を連続的に打錠し、白血球遊走能調節剤であるラクトフェリンを含有するタブレット１８００錠（約９００ｇ）を製造した。
【００３４】
【発明の効果】
以上詳記したとおり、本発明はラクトフェリンを有効成分として含有することを特徴とする白血球遊走能調節剤に関するものであり、本発明により奏される効果は次のとおりである。
（１）インフルエンザウイルス感染症を発症した宿主の呼吸器において誘導される白血球遊走を抑制することができる。
（２）インフルエンザウイルス感染症によって引き起こされる組織傷害、気管支炎、中耳炎、肺炎等の合併症の予防及び／又は治療に効果を有する。
（３）乳等の原料から安価で大量に製造することができる。
（４）ヒトに対する安全性が高く、日常的に摂取することが可能である。