(57)【要約】【課題】生殖組織に特異的であり、視床下部−下垂体−生殖腺軸中で重要な役割を有していると考えられる新規な転写因子ＧＣＸ−１を提供する。【解決手段】卵巣中に卓越して発現している新規遺伝子ＧＣＸ−１（配列番号２）をラットの卵巣顆粒細胞のｃＤＮＡライブラリーから単離した。この遺伝子及び遺伝子産物（配列番号１）の異常あるいは産生異常を調べたり、この転写活性化領域に作用する薬剤を開発すれば、不妊症、多のう胞性卵胞症候群、子宮内膜症、思春期早発症、骨粗しょう症等の生殖系器官の異常に起因する疾患の原因究明と治療が可能である。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）から成る転写活性化因子。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列から成るタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、転写活性化能を有するタンパク質
【請求項２】
請求項１に記載の転写活性化因子を有効成分とする、転写活性化を目的とする薬剤。
【請求項３】
請求項１に記載の転写活性化因子を特異的に認識し結合することができる抗体又はアンタゴニスト。
【請求項４】
被検者から生殖系器官の細胞を採取する段階、及び採取した細胞に対する請求項３に記載の抗体又はアンタゴニストの反応性を調べる段階から成る、生殖系器官の異常に起因する疾患の検査方法。
【請求項５】
請求項３に記載の抗体又はアンタゴニストを有効成分とする、転写活性化を目的とする薬剤のスクリーニング剤。
【請求項６】
以下の（ａ）又は（ｂ）から成る転写活性化因子の遺伝子。
（ａ）配列番号２の塩基配列から成るＤＮＡ
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列から成るタンパク質、又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り転写活性化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項７】
被検者から請求項６に記載の遺伝子に相当する部分を含むＤＮＡを採取する段階、及び採取したＤＮＡを請求項６に記載の遺伝子の塩基配列と比較する段階から成る、生殖系器官の異常に起因する疾患の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、転写活性化因子に関し、より詳細には、生殖系器官に特異的に発現する転写活性化因子ＧＣＸ−１に関する。
【０００２】
【従来の技術】
卵巣における特定の現象、即ち卵胞形成、排卵、又はステロイド産生のような現象はその組織における遺伝子発現に完全に依存している。卵巣における機能と遺伝子の関係を解明するために多くの研究が行われてきた（Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ  １５  ：  ７２５−７５１  （１９９４）；  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １６３：  ６１−６６  （２０００）；  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４２：  ２１８４−２１９３  （２００１）；  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  １３：  １  ６９−１７３  （２００２）；  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ６７：  ９００−９１０  （２００２））。
発明者らは、卵胞発育の分子的メカニズムに焦点を当てて、ゴナドトロピンにより誘導される多くの卵巣の遺伝子を同定した（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２３０：  ５１８−５２３  （１９９７）；  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：  ２２５１２−２２５１９  （２０００）；  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ６４：１３１５−１３１９  （２００１）；  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ６６：  １８１３−１８１９  （２００２）；  Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ  Ｔ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｏｖａｒｙ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ．  ）。ゴナドトロピン処置によりラットの卵巣中に強く誘導される新規の転写抑制因子を最近報告し、ＧＩＯＴ−１（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｏｖａｒｉａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−１）と命名した（非特許文献１）。次いで、発明者らはＧＩＯＴ−１の生理学的機能を明らかにするために、卵巣においてＧＩＯＴ−１と相互作用を示す蛋白を同定する試みを行い、転写性の調節補助因子ＴＩＦ１β（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  １β、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：  １４２２−１４２６  （２００１）；  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １８：  ５８８０−５８８７  （１９９８）；  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １５：  ３０２３−３０３８  （２００１））と転写調節因子ＲＩＣ（ｒａｔ  ｈｏｍｏｌｏｇｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｉ−ｍｆａ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：  ４８４８−４８５７  （２０００））がＧＩＯＴ−１と相互作用を示すことを報告した（非特許文献１）。
【０００３】
生殖組織中に発現することが知られている転写因子としてＡｄ４ＢＰ／ＳＦ−１とＤＡＸ−１がある（非特許文献２〜４）。Ａｄ４ＢＰ／ＳＦ−１は、ステロイド産生酵素、ＳｔＡＲ又はＧＩＯＴ−１などを含むステロイド産生と関連する多くの遺伝子を調節してる。また胚形成中の生殖システムの発育において、Ａｄ４ＢＰ／ＳＦ−１は重要な役割を演じている。ＤＡＸ−１もＡｄ４ＢＰ／ＳＦ−１の機能と拮抗することによりその組織の発育に関与している。しかし、これらの因子は副腎腺中にも発現しており、副腎腺の発育にも関与しているため、生殖系器官特異的ではない。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １５：  １６９３−１７０５  （２００１）
【非特許文献２】
Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ  １８：  ３６１−３７７  （１９９７）
【非特許文献３】
Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇ  Ｈｏｒｍ  Ｒｅｓ  ５１：  ２４１−２６０  （１９９６）
【非特許文献４】
Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １０：  １２６１−１２７２  （１９９６）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、生殖組織中に発現する転写因子であるＡｄ４ＢＰ／ＳＦ−１やＤＡＸ−１（非特許文献２〜４）とは異なり、生殖組織に特異的であり、視床下部−下垂体−生殖腺軸中で重要な役割を有していると考えられる新規な転写因子ＧＣＸ−１を提供する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、生殖組織における転写因子の研究（非特許文献１）の過程において、ラットの卵巣顆粒膜細胞ｃＤＮＡライブラリーから、ＨＭＧ−ｂｏｘドメインを含有する転写因子様蛋白をコード化する新規のクローンを単離した。発明者らは、この新規遺伝子ＧＣＸ−１（ａｇｒａｎｕｌｏｓａ  ｃｅｌｌ  ＨＭＧ−ｂｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１、配列番号２）を単離し、ＧＣＸ−１の構造と分布を決定し、ＧＣＸ−１の生殖系、特に卵巣における役割を解明するために、その遺伝子の機能を解析した。またＧＣＸ−１の発現パターンについて実験し、ＧＣＸ−１蛋白は生殖と関連する組織、即ち、視床下部、下垂体、生殖腺、子宮においてのみ発現していることを見出し、更にＧＣＸ−１蛋白が核内に局在していることを見出した。更に発明者らはＧＡＬ４を基本とする非相同性検定法を用いて、ＧＣＸ−１が遺伝子転写を活性化することを確認した。
【０００７】
即ち、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）から成る転写活性化因子である。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列から成るタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、転写活性化能を有するタンパク質
この転写活性化能は視床下部、下垂体、生殖腺、子宮などの生殖に関連する組織における転写活性化能をいい、レポーター遺伝子を用いた公知の方法により知ることができる。
また、遺伝子治療の目的で、この因子を生殖系細胞に導入し、細胞内での転写を活性化することができる。従って、本発明は、この転写活性化因子を有効成分とする、転写活性化を目的とする薬剤である。
【０００８】
更に、本発明は、この転写活性化因子を特異的に認識し結合することができる抗体又はアンタゴニストである。
この抗体は、本発明の転写活性化因子又はその活性部分をマウスなどの適当な動物に投与して、免疫反応を起こさせ、脾臓などの抗体産生組織から採取することができる。
また、このアンタゴニストは、例えば、本発明の転写活性化因子又はその活性部分から予想される立体構造から、結合可能な化合物をスクリーニングすること、又は、本発明の転写活性化因子又はその活性部分と結合するペプチドライブラリーを２ハイブリッドシステムを用いてスクリーニングすることにより、取得することができる。
【０００９】
また、このアミノ酸配列を認識する抗体を作成し、患者の卵巣顆粒膜細胞（これは体外受精の治療の際に卵とともに採取されてくるので利用可能）での量を調べることにより、ＧＣＸ−１の産生異常を知ることができる。
即ち、本発明は、被検者から生殖系器官の組織を採取する段階、及び採取した細胞に対する上記抗体又はアンタゴニストの反応性を調べる段階から成る、生殖系器官の異常に起因する疾患の検査方法である。
ここで生殖系器官とは視床下部、下垂体、生殖腺、子宮などをいい、生殖系器官の異常に起因する疾患とは、不妊症、多のう胞性卵胞症候群、子宮内膜症、思春期早発症、骨粗しょう症等をいう。
また、本発明は上記抗体又はアンタゴニストを有効成分とする、転写活性化を目的とする薬剤のスクリーニング剤である。
【００１０】
更に、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）から成る転写活性化因子（ＧＣＸ−１）の遺伝子である。
（ａ）配列番号２の塩基配列から成るＤＮＡ
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列から成るタンパク質、又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り転写活性化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
この転写活性化能は、例えば、実施例５に記載した方法により、この遺伝子と共に適当なレポーター遺伝子を適当な細胞に導入して該レポーター遺伝子の発現を調べることにより知ることができる。
【００１１】
また、患者の白血球からゲノムＤＮＡを分離し、ＧＣＸ−１の塩基配列に異常があるかどうかを調べることができる。
即ち、本発明は、被検者から上記遺伝子に相当する部分を含むＤＮＡを採取する段階、及び採取したＤＮＡをこの遺伝子の塩基配列と比較する段階から成る、生殖系器官の異常に起因する疾患の検査方法である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、卵巣中に卓越して発現している新規遺伝子ＧＣＸ−１をラットの卵巣顆粒細胞のｃＤＮＡライブラリーから単離した（実施例１）。ＧＣＸ−１遺伝子は、既によく研究されているＤＮＡ結合モチーフの一種であり、酵母から哺乳類まで全ての真核生物に広く分布しているＨＭＧ−ｂｏｘモチーフを含む蛋白をコードしている。
ＨＭＧ−ｂｏｘは酵母から哺乳類まで真核生物に広く分布しているＤＮＡ結合モチーフの一つであり（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  １０：  ９４−１００  （１９９４）；  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ２６：  １６３−１７４  （２００１））、多くのＨＭＧ−ｂｏｘ含有蛋白は、各種の生理学的現象、例えばｒＲＮＡ転写調節因子としてのＵＢＦ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：  １１９２−１１９７  （１９８８）；  Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：  ８３０−８３６  （１９９０））、性決定に必須の蛋白としてのＳＲＹ（Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：  ２４０−２４４  （１９９０）；  Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：  ２４５−２５０  （１９９０））、Ｔ細胞分化調節因子としてのＴＣＦ（Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：  ７０−７４  （１９９５））とＴＯＸ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｎｍｏｌ  ３：  ２７２−２８０  （２００２））などの重要な役割を演じていることが知られている。更に、ある種のＨＭＧ−ｂｏｘ含有蛋白が転写調節物質としてではなく、細胞内の信号伝達物質として機能していることが最近報告された（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９  ２８５：  ２４８−２５１  （１９９９）；  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １  ９２：  ５６５−５７０  （２０００）；  Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：  １９１−１９５  （２００２））。加えて、ＨＭＧ−ｂｏｘ蛋白が核のステロイドホルモン受容体と反応し、転写補助因子として作用することが報告されてきた（Ｍｏｌ  ＣｅｌｌＢｉｏｌ  １８：  ４４７１−４４８７  （１９９８）；  Ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ６４：  ５７６−５８６  （１９９９））。そのために、ＨＭＧ−ｂｏｘ蛋白は生殖−内分泌系の生物学的機能に強く関与していると考えられる。
【００１３】
ＨＭＧ−ｂｏｘモチーフを有する蛋白は、ＤＮＡ結合様式により大まかに２群に分けられる。ＳＲＹ又はＴＣＦのような１群の蛋白はそれらの標的遺伝子上の特定のＤＮＡ配列を認識する。ＨＭＧＢ１、ＵＢＦなどの他の群に所属する蛋白は、非特異的ＤＮＡ結合能を示す。前者の蛋白は１個のＨＭＧ−ｂｏｘモチーフのみを有するが、後者の蛋白は２個又はそれ以上のＨＭＧ−ｂｏｘモチーフを有している（Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １０：  １２６１−１２７２  （１９９６）；  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  １０：  ９４−１００  （１９９４））。
ＧＣＸ−１は特定のタイプのＨＭＧ−ｂｏｘ蛋白のように１個のＨＭＧ−ｂｏｘモチーフしか持たないが（実施例１）、ＧＣＸ−１のＨＭＧ−ｂｏｘ内のアミノ酸配列は、非特異的タイプのＨＭＧ−ｂｏｘ蛋白（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  １０：  ９４−  １００  （１９９４）；  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ２６：  １６３−１７４（２００１））の配列と低いが有意な類似性を示しており、特異的タイプの蛋白とは明らかに類似性がない。それ故に、ＧＣＸ−１は新規タイプのＨＭＧ−ｂｏｘ蛋白に属すると考えられる。
【００１４】
ＧＣＸ−１の遺伝子発現は、卵巣、睾丸、下垂体、視床下部に限定されていることから、ＧＣＸ−１は視床下部−下垂体−生殖腺軸で作用していると考えられる（実施例２）。同様に転写因子であるＡｄ４ＢＰ／ＳＦ−１とＤＡＸ−１はステロイド産生と内分泌組織の胚発育に必須であり、ＧＣＸ−１と類似した遺伝子発現パターンを示す（Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ  １８：  ３６１−３７７  （１９９７）；  Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇ  Ｈｏｒｍ  Ｒｅｓ  ５１  ：  ２４１−２６０  （１９９６）；  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １０：  １２６１−１２７２  （１９９６））。しかし、これらの遺伝子は、ＧＣＸ−１が全く発現していない副腎腺でも発現しており、生殖組織中でのみ発現している転写因子は今までに知られていない。一方、Ｐ４５０アロマターゼ（Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ  １５：  ３４２−３５５（１９９４））とＩ型１７β−ヒドロキシステロイド脱水素酵素をコード化する遺伝子（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １７１：  ７１−７６  （２００１）；  Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ  １８：  ２８１−３０５  （１９９７））は生殖組織中にのみ発現していることが知られているが、これらは下垂体中では発現していない。それ故に、ＧＣＸ−１は視床下部−下垂体−生殖腺システムにおいて重要な役割を演じていると考えられる。
【００１５】
ｉｎ  ｓｉｔｕ融合研究によりＧＣＸ−１の遺伝子発現はステロイド産生活性が未だ非常に低い、早期段階の卵胞の顆粒細胞に限定していることが明らかになった（実施例３）。そして、ＧＣＸ−１の遺伝子発現が他のステロイド産生組織である副腎腺又は胎盤では見られなかったという所見は、ＧＣＸ−１がステロイドホルモンの生合成において重要な役割をしていないことを示唆している。むしろ、それは生殖組織の胚発育又は早期段階の卵胞の成長と発育においてある役割を演じていると考えられる。早期段階の卵胞における現象はゴナドトロピン刺激に依存していないと思われている。顆粒膜細胞中においてゴナドトロピンによりＧＣＸ−１の誘導がないという所見は、上の推測と一致していると考えられる。
【００１６】
ＧＣＸ−１のウエスターンブロッティング解析により、ＧＣＸ−１遺伝子産物は卵巣の顆粒細胞の核内に実際に存在していることが明らかになり、ＧＦＰ融合蛋白解析により、推定上のＮＬＳモチーフはＧＣＸ−１の核内転座に必須であることが明らかとなった（結果は省略する。）。加えて、ＧＡＬ４融合蛋白を基本とする非相同性レポーター検定法により、ＧＣＸ−１は強力な転写活性化因子であることが明らかとなった。これらのデータはＧＣＸ−１は生殖組織中で転写活性化因子として作用することを示唆している。ＧＣＸ−１の活性化ドメインをＮ末端から２５−６３個の残基間の部位であることを示した。ＧＣＸ−１は夫々セリン、プロリン、リジン残基が豊富な部位も有しているが、これらの部位は転写活性には不要であった。活性化ドメインはＬＸＸＬＬのような典型的な転写活性化モチーフ（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １２：  ３３５７−３３６８  （１９９８）；  Ｃｅｌｌ１０８：  ４６５−４７４  （２００２）；  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４３：  ２４６１−２４６５  （２００２））を有していないが、その部位は疎水性アミノ酸残基が豊富で且つＬＸＸＬＬ様の配列を有している。ＬＸＸＬＬモチーフは核のステロイドホルモン受容体又は核内の相互活性化因子との相互作用に必要であることが知られている。しかし、発明者らはＧＣＸ−１活性化ドメインと数種の既知の相互活性化因子間での相互作用を確認できなかった（データは示さない。）。位置特定変異解析の結果から、発明者らは、完全な活性を示すためにはＧＣＸ−１活性化ドメインの全体構造が必要であるに違いないと結論した。ＧＣＸ−１活性化ドメインの二次又は三次構造に関する情報はほとんどないが、上記の所見はＧＣＸ−１活性化ドメインは新規タイプの相互活性化ドメインであることを示している。
【００１７】
【発明の効果】
本発明の遺伝子（配列番号２）及び遺伝子産物（配列番号１）は生殖系のみに発現しており、特に卵巣で強く発現するため、排卵障害やステロイドホルモン産生異常の原因ともなりうることから、この遺伝子の異常あるいは産生異常を調べることにより、不妊症、多のう胞性卵胞症候群、子宮内膜症、思春期早発症、骨粗しょう症等の生殖系器官の異常に起因する疾患の原因究明と治療に利用できる。
またアミノ酸配列（配列番号１）中の転写活性化領域に作用する薬剤を開発すれば、それは上記疾患の治療薬となる。
【００１８】
【実施例】
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
実施例１
まず、ラット顆粒膜細胞を培養した。未成熟のＷｉｓｔａｒラット（２１日齢）を使用した。ごま油０．１ｍｌ中にジエチルスチルベストロール（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）２ｍｇを加え、１日１回、４日間処置することにより卵巣顆粒膜細胞の増殖を刺激した。常時、国立衛生研究所のガイドラインに従って動物を処置した。卵巣を切開し、２６ゲージの針を用いて卵胞を穿刺することにより顆粒膜細胞を分離し、分離した顆粒細胞を集めた。細胞を洗浄し、室温、５分間５００ｇ×５の簡単な遠心により細胞を採取し、トリパンブルー染色により生存性を調べた。細胞生存率は９０％以上であった。その後、顆粒膜細胞をコラーゲン処理したプレート上に抗生物質と０．１％ＢＳＡを添加したＨａｍ  Ｆ−１２：Ｄｕｌｂｅｃｃｏの修正Ｅａｇｌｅ培地（１：１，Ｖ：Ｖ）中に入れ、炭酸ガス５％と空気９５％を含む加湿混合ガス内で３７℃下で培養した。
【００１９】
次に、酵母２種融合スクリーニングを行った。酵母２種融合システムにはＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）から購入したキットを用いた。全ての実験手順は、特記した以外は製造元の指示書に従って実施した。酵母２種融合システムのための親ベクターであるｐＧＢＫＴ７ベクターは酵母内でＧＡＬ４  ＤＢＤ融合蛋白を発現する。誘導プラスミドであるｐＧＢＫＴ７−ＧＩＯＴ−１ベクターは以前記述した方法（非特許文献１）により作製した。ＴＥ／ＬｉＯＡｃを基本とした高効率形質転換法（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４：  ５９６−６００  （１９９８）  参照）を用いて、この誘導プラスミドによりＡＨ１０９細胞を形質転換させた。酵母２種融合スクリーニングのためにラット顆粒膜細胞からプラスミドｃＤＮＡライブラリーを、既報（Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ６４：  １３１５−１３１９  （２００１）参照）に従って、作製した。ｐＧＢＫＴ７−ＧＩＯＴ−１を有する酵母をライブラリーにより形質転換し、約７×１０６個の最初の形質転換した細胞を得た。次いで全てのクローンをスクリーニングし、７種のＨＩＳ３＋／ＡＤＥ２＋／ＭＥＬ１＋陽性クローンを得た。Ｂｉｇ  ＤｙｅターミネーターＦＳサイクル配列化キットと３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊａｐａｎ）を用いてヌクレオチド配列解析を行い、次いでＧｅｎＢａｎｋ  ＤＮＡデータベースを用いて同一性検索を行うことにより全てのクローンの特徴を調べた。データベースを用いた検索により、４種のクローンのヌクレオチド配列は既知の蛋白をコード化する遺伝子（非特許文献１）と高い類似性を有し、他の３種クローンは新規の蛋白をコード化することが判明した。この３種の新規クローンから、ｐＡＣＴ２−ＧＣＸ−１と名付けられ、ＨＭＧ−ｂｏｘモチーフを有する１２１９−ｂｐを含むプラスミドを単離した。更に解析を行うために、７５８−ｂｐ  ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片（ｎｔ−１６０／５９７）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ部位へサブクローニングし、得られたプラスミドをｐＢＳ−ＧＣＸ−１と命名した。
【００２０】
次に、λ−ファージｃＤＮＡライブラリーの作製と全配列ＧＣＸ−１  ｃＤＮＡのクローニングを行った。ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて、ヒツジＦＳＨ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｎｄ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ）３０ｎｇ／ｍｌを３時間処置して、顆粒膜細胞から全ＲＮＡを作製した。ｏｌｉｇｏｔｅｘ  ｄＴ−３０  ｓｕｐｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）を用いてｐｏｌｙ（Ａ）＋−ＲＮＡを単離した。ｏｌｉｇｏ−ｄＴをプライマーとし、ｃＤＮＡ合成システムとＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて１５μｇのｐｏｌｙ（Ａ）＋−ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩアダプターを二本鎖ｃＤＮＡに結合させ、両端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより燐酸化した。そのｃＤＮＡをλＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓファージアーム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に結合させ、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで包括することにより、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。そのｃＤＮＡライブラリーは１×１０７個の独立したクローンを含んでいた。
ＧＣＸ−１に対応する全配列ｃＤＮＡを単離するために、ライブラリーをＢｃａＢｅｓｔ  ＤＮＡ標識キット（宝バイオメディカルス）により標識されたｐＢＳ−ＧＴＸ−１の７５８−ｂｐ  α−３２ＰｄＣＴＰ標識ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片を用いてスクリーニングした。約６０，０００種のｃＤＮＡクローンから１１種の陽性のクローンを単離した。
【００２１】
この蛋白をコード化する完全なｃＤＮＡクローンを単離するために、単離クローンをプローブとして用いることによりそのｃＤＮＡライブラリーを再びスクリーニングし、４７３個のアミノ酸の蛋白をコード化する遺伝子の完全なｃＤＮＡクローンを得た（配列番号２）。この塩基配列からアミノ酸配列（配列番号１）を得た。
図１に示すように、この蛋白は蛋白中心部に１個のＨＭＧ−ｂｏｘモチーフ（配列番号１のアミノ酸配列の２０５−２７２位）を有している。そのために、発明者らはそれをＧＣＸ−１（ｇｒａｎｕｌｏｓａ  ｃｅｌｌ  ＨＭＧ−ｂｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）と呼ぶ。その蛋白はＨＭＧ−ｂｏｘのＮ末端に１個のＮＬＳ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ）様モチーフ（配列番号１のアミノ酸配列の１８０−１９９位）と夫々セリン高含有部位（配列番号１のアミノ酸配列の１２４−１６４位）、プロリン高含有部位（配列番号１のアミノ酸配列の３４８−４３１位）、リジン高含有部位（配列番号１のアミノ酸配列の１８０−１９９位）から成る３個のドメインも有している。これらの構造的特徴は転写調節因子に典型的なものである。
【００２２】
実施例２
ＧＣＸ−１の組織分存を調べるために、２１日齢のラットの各種の組織についてＲＴ−ＰＣＲを行い、ノーザンブロット解析を行った。
２１日齢の雌ラットをＰＭＳＧ（帝国臓器株式会社）３０ＩＵ又はｈＣＧ（三共株式会社）５０ＩＵで感作し、卵巣を記述した時間に採取した。未成熟雌ラットの各種組織（視床下部、下垂体、小脳、副腎腺、腎臓、脾臓、腸管、肝臓、子宮及び卵巣）と未成熟雄ラットの睾丸から、ＴＲＩｚｏｌ試薬を用いて全ＲＮＡを抽出した。ノーザンブロット解析のために、１０μｇの全ＲＮＡを１％変性アガロースゲル上で電気泳動により分離し、ナイロン膜（Ｂｉｏｄｙｎｅ，  ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｇｌｅｎ  Ｃｏｖｅ，  ＮＹ）に移し、ＵＶ照射により交差結合させた。前融合と融合を行うために、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂハイブリダイゼーション液（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いた。既に記述したｐＢＳ−ＧＣＸ−１の７５８−ｂｐ放射線標識ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片又はラットＵＳＦ−２（上流刺激因子）の１．４−ｋｂｐ  α−３２ＰｄＣＴＰ標識ＢａｍＨＩ断片をプローブとして使用した。前融合、融合及び洗浄法に関する条件は、提供者から得たプロトコールに従って実施した。ブロットをＦＵＪＩＸ映像板（富士写真フィルム）に曝露した。融合信号をＦＵＪＩＸ  ＢＡＳ−２０００画像解析装置を用いて検出した。ＲＴ−ＰＣＲを行うために、５μｇの全ＲＮＡを逆転写し、反応混合液の一部（１／１００）をＰＣＲ反応に使用した。プライマーとして５’−ＣＣＣＡＡＴＧＡＧＣＣＡＣＡＧＡＡＧＣＣＡ−３’（５’−プライマー：ｎｔ  ５８９／６０９、配列番号３）と５’−ＧＧＡＡＡＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＧＡＧ−３’（３’−プライマー：ｎｔ  ９３６／９５５、配列番号４）を用いた。反応条件として、ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて２０秒間９４℃で変性、３０秒間５５℃でアニールし、４５秒間７２℃で伸展する操作を３０回行った。１．５％アガロースゲル上でＰＣＲ産物１０μｌを電気泳動し、次いで臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）染色により可視化した。その結果を図２に示す。
【００２３】
ＧＣＸ−１遺伝子の発現は、視床下部（ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ）、下垂体（ｐｉｔｕｉｔａｒｙ）、睾丸（ｔｅｓｔｉｓ）、子宮（ｕｔｅｒｕｓ）及び卵巣（ｏｖａｒｙ）などの、の限定された組織中において検出された。ＧＣＸ−１の発現は卵巣中で最も高かったが、副腎腺（ａｄｒｅｎａｌ）と胎盤（データは示していない）中では発現が見られなかった。このことは、ＧＣＸ−１は視床下部−下垂体−生殖腺軸上で作用していることを強く示唆している。
【００２４】
実施例３
ｉｎ  ｓｉｔｕ融合法により卵胞発育の各段階でのＧＣＸ−１の発現について調べた。
アンチセンスプローブ作製のために、ＥｃｏＲＩにより直線化されたｐＢＳ−ＧＣＸ−１をｉｎｖｉｔｒｏでＴ３  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）とα−３５Ｓ  ＣＴＰにより転写した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）とα−３５Ｓ  ＣＴＰを用いてＢａｍＨＩ分解ｐＢＳ−ＧＣＸ−１からセンスプローブを転写した。次に、ラット卵巣を鋳型にはめ込み、ドライアイス中で凍結した。１２〜１４μｍの厚さの切片をクリオスタットで作製し、ｉｎ  ｓｉｔｕ融合のためにＡＰＳをコートしたスライドグラス上に包埋した。融合前に切片をプロティナーゼＫを処置し、アセチル化した。３５Ｓ標識ｃＲＮＡプローブとの融合は６０℃で６時間行い、切片を高ストリンジェンシーで洗浄し、ＮＴＢ３乳化剤（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．，  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，  ＮＹ）を用いてオートラジオグラフ解析を行った。
【００２５】
その結果を図３に示す。Ａは８日齢、Ｂは２１日齢、Ｃは成熟（発情間期）のラットの卵巣を摘出し、ＧＣＸ−１の３５Ｓ標識アンチセンス鎖ｃＲＮＡプローブと融合させたものを示す。Ｄは、２１日齢ラットの卵巣の切片をセンス鎖ｃＲＮＡプローブと融合させたものを示す。
図３のＡに示すように、非常に早期の前胞状段階の卵胞において強い信号が検出され、その発現は顆粒膜細胞層に限定していた。同様レベルの発現は２又はそれ以上の顆粒膜細胞層を有する僅かに進行した段階の卵胞でも観察された。図３のＢに示すように、大型前胞状と小型胞状段階の卵胞においてもその信号が検出されたが、更に進行した段階の大型胞状卵胞では非常に低レベルの発現が観察された。更に、図３のＣに示すように、その信号は黄体中では僅かしか検出されなかった。これらの所見は、ＧＣＸ−１遺伝子発現は早期の発育段階の卵胞中の未分化顆粒膜細胞に限定されていることを示している。
【００２６】
実施例４
ＧＣＸ−１に対する抗体を作製して、細胞中の内因性ＧＣＸ−１蛋白を確認した。
ＮＨ２−ＳＬＬＨＬＧＤＨＥＡＧＹＨＳＬＣ−ＣＯ２Ｈペプチド配列（配列番号１のアミノ酸配列の３９−５４位）を用い、ＩｇＧ精製によりＧＣＸ−１特異的ウサギポリクローナル抗血清を作製した。顆粒膜細胞を培養液５ｍｌ中に５×１０６生細胞を含む６０ｍｍシャーレ中で無ホルモン条件下で２４時間培養し、細胞をスクレーパーを用いて集め、燐酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）１０ｍｌで洗浄した。得られた細胞を１ｍｌのＰＢＳ中に懸濁し、エッペンドルフ管内へ移し、４℃下で１５００×ｇ、１０分間の遠心により、固形化した。既報（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １７：  ６４１９  （１９８９））に従って、顆粒膜細胞の細胞抽出物を作製した。細胞固型物を６００μｌの冷却緩衝液Ａ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，  ｐＨ７．９；１０ｍＭ  ＫＣｌ；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ；１ｍＭ  ＤＴＴ；及び０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ）中で静かにピペット処理することにより再懸濁した。細胞を１５分間氷の上で膨張させ、その後、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０  １０％液  ３７．５μｌを加え、１０秒間強く撹拌した。得られたホモジネートを４℃下で５分間、１７０００×ｇで遠心した。上清を蛋白分析のための細胞質分画として用い、核固型物を４０μｌの氷冷緩衝液Ｃ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．９；０．４Ｍ  ＮａＣｌ；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；１ｍＭ  ＥＧＴＡ；１ｍＭ  ＤＴＴ；及び１ｍＭ  ＰＭＳＦ）中に再懸濁し、試験管を振盪台上で４℃１５分間強く振盪した。その混合液を４℃下で１５分間１７０００×ｇで遠心し、得られた上清を核分画として蛋白分析に使用した。ＧＦＰ−ＧＣＸ−１融合蛋白を発現しているＨｅｐＧ２細胞から採取した核抽出物を同じプロトコールに従って作製した。細胞質と核抽出物（各１００μｇ）を還元条件下で１０％アクリルアミドゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動を行った。蛋白をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏ．，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）の方へ電気泳動により移動させ、ミルク緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ［０．０００１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ］中に５％のスキムミルク添加）と、室温中で１時間、ミルク緩衝液中のＩｇＧ純化ＧＣＸ−１抗体（０．０１９μｇ／ｍｌ）とインキュベートすることによりブロッキングを行った。膜をＰＢＳ−Ｔを用いて洗浄し、ＥＣＬ−Ｐｌｕｓキット（Ａｍｅｒｃｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏ．，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）を用いて、製造元の提示書に従って免疫反応性のＧＣＸ−１蛋白を検出した。
【００２７】
その結果を図４に示す。図中、ＡはＧＣＸ−１特異的抗血清の解析を示す。ｐＥＧＦＰ−Ｃ１Ｅ１−移入（ｌａｎｅ  １）又はｐＥＧＦＰ−ＧＣＸ−１（−６１−４７３）移入（ｌａｎｅ  ２）ＨｅｐＧ２細胞の核抽出物を抗ＧＣＸ−１血清（ＩｇＧ精製を行った）によるウエスターンブロット解析に供した。１本のＧＦＰ−ＧＣＸ−１融合蛋白に対する特異的バンドが示されている。Ｂは、ラット卵巣の顆粒膜細胞における内因性ＧＣＸ−１蛋白の検出を示す。培養顆粒膜細胞から細胞質（ｌａｎｅ  １）と核（ｌａｎｅ  ２）抽出物を作製し、同じ抗血清を用いてウエスターンブロット解析を行った。１本のＧＣＸ−１特異的バンドが示されている。
図４のＡに示すようにポリクローナル抗体は効果的にＧＦＰ−ＧＣＸ−１蛋白（ｌａｎｅ  ２）を認識した。免疫反応性のＧＣＸ−１はラットの顆粒膜細胞の核抽出物中（図４のＢ、ｌａｎｅ  ２）でのみ検出されるが、細胞質分画中（図４のＢ、ｌａｎｅ  １）では検出されない。
【００２８】
実施例５
ＧＣＸ−１は核内蛋白であり、転写因子に典型的なモチーフの１種であるＨＭＧ−ｂｏｘを有していることから、ＧＣＸ−１の転写活性について調べた。
ＧＣＸ−１蛋白の標的遺伝子が未だ不明であることから、ＧＣＸ−１の転写能を確認するためにＧＡＬ４を基本とする非相同性ルシフェラーゼレポーターシステムを用いた。ｐＲＬ−ＣＭＶ  １ｎｇと５×ＧＡＬ４−Ｅ１ｂ／Ｌｕｃホタルルシフェラーゼレポータープラスミド又はｐＧＬ３−基本レポータープラスミド１００ｎｇをＨｅｐＧ２細胞に同時移入した。図５に記述した量のｐＳＧ−ＧＣＸ−１（−６１−４７３）を同様に細胞内へ移入した。各試料中に等量のＤＮＡを含むようにＧＡＬ４  ＤＢＤのみを発現するｐＳＧ４２４をある試料中へ添加した。
その結果を図５に示す。ＧＡＬ４  ＤＢＤ−ＧＣＸ−１融合蛋白の発現はレポータールシフェラーゼ活性を大きく増強させた。ＧＣＸ−１プラスミド０．１ｎｇを添加すると、約２５倍のルシフェラーゼ活性の誘導を起こし、１ｎｇのプラスミドは約１００倍の誘導を起こした。一方、ＧＡＬ４結合配列を有しないレポータープラスミドを５×ＧＡＬ４−Ｅ１ｂ／Ｌｕｃの代わりに用いると、ＧＣＸ−１プラスミドの同時移入によっても誘導は見られなかった。これらの所見はＧＣＸ−１は非常に強力な転写活性化因子であることを明確に示している。
【００２９】
実施例６
次いでＧＣＸ−１の相互活性化ドメインについて調べた。ＧＡＬ４  ＤＢＤ−ＧＣＸ−１欠損変異を有する各種のプラスミド構成物を作製し、ｐＲＬ−ＣＭＶ  １ｎｇ、５×ＧＡＬ４−Ｅ１ｂ／Ｌｕｃレポータープラスミド１００ｎｇ及びｐＳＧ−ＧＣＸ−１欠損各種変異体１ｎｇをＨｅｐＧ２細胞に同時移入した。その結果を図６に示す。
図６に示すように、Ｎ末端から２５−６３個のアミノ酸残基間の部位はＧＣＸ−１の転写活性に必須であることが証明された。この部位は今までに報告されている典型的な転写活性化モチーフを含有していない。
【００３０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＧＣＸ−１の推定アミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。下線は推定上の核局在信号（ＮＬＳ）部位を示し、太線は推定上のＨＭＧ−ｂｏｘドメインを示す。
【図２】ラットにおけるＧＣＸ−１の遺伝子発現を示す図である。
【図３】ラット卵巣中のＧＣＸ−１のｉｎ  ｓｉｔｕ融合化を示す図である。左図は明視野観察、右図は暗視野を示し、目盛り線は０．２ｍｍを示す。
【図４】内因性ＧＣＸ−１蛋白の同定を示す図である。
【図５】ＧＣＸ−１は転写活性化因子であることを示す図である。各測定値は、４回の独立した移入実験における平均値とＳＤで示す。
【図６】ＧＣＸ−１の相互活性化ドメインの決定を示す図である。各測定値は４回の独立した移入実験における平均値とそのＳＤで示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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