(57)【要約】【課題】  ローソニア・イントラセルラリスタンパク質、および関連の方法および材料を提供すること。【解決手段】  単離されたポリペプチド分子は、Ｌ．イントラセルラリスのＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００タンパク質をコードしているヌクレオチド配列、その配列の実質的な部分または相同配列を含む。関連ポリペプチド、免疫原性組成物および検定法を記載する。【選択図】  図１
2004229667.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリヌクレオチド分子であって、
（ａ）Ｌ．イントラセルラリスのＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００タンパク質をコードしているヌクレオチド配列；
（ｂ）該Ｌ．イントラセルラリスのＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００タンパク質をコードしている該ヌクレオチド配列の実質的な部分であるヌクレオチド配列；および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列に相同であるヌクレオチド配列
から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む上記単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項２】
前記Ｌ．イントラセルラリスのＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００タンパク質をコードしている前記ヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項３】
約ｎｔ１６５〜約ｎｔ１７４５の配列番号：１の読み取り枠、約ｎｔ３０３１〜約ｎｔ３７３８の配列番号：１の読み取り枠、約ｎｔ３６９５〜約ｎｔ６３８５の配列番号：１の読み取り枠、約ｎｔ２５２〜約ｎｔ２６９０の配列番号：２の読み取り枠、約ｎｔ２８９１〜約ｎｔ４３１５の配列番号：２の読み取り枠、および約ｎｔ４５８１〜約ｎｔ４８２９の配列番号：２の読み取り枠から成る群より選択される読み取り枠から成るヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項４】
プロモーター活性を有する且つ約ｎｔ２６９１〜約ｎｔ２８９０の配列番号：２内で見出される２０ヌクレオチドを越えるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子またはその補体。
【請求項５】
請求項１に記載のポリヌクレオチド分子を含む組換え体ベクター。
【請求項６】
ｐｏｎＡ遺伝子を含有するプラスミドｐＥＲ４３２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３５）、ｈｔｒＡ遺伝子を含有するプラスミドｐＥＲ４３４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３６）、ｈｙｐＣ遺伝子を含有するプラスミドｐＥＲ４３６（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３７）、ｌｙｓＳおよびｙｃｆＷ遺伝子を含有するプラスミドｐＴ０６８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−２２３２）、ｙｃｆＷおよびａｂｃ１遺伝子を含有するプラスミドｐＥＲ４３８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３８）、およびＯｍｐ１００遺伝子を含有するプラスミドｐＥＲ４４０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３９）から成る群より選択されるプラスミドから成る請求項５に記載の組換え体ベクター。
【請求項７】
請求項５に記載の組換え体ベクターを含む形質転換された宿主細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の形質転換された宿主細胞によって生産されるポリペプチド。
【請求項９】
ローソニア遺伝子を変化させるのに用いることができるポリヌクレオチド分子を含む遺伝子構築物であって、
（ａ）ｈｔｒＡ、ｐｏｎＡ、ｈｙｐＣ、ｌｙｓＳ、ｙｃｆＷ、ａｂｃ１またはｏｍｐ１００遺伝子のヌクレオチド配列と他の点では同様である、またはそれに相同のヌクレオチド配列と他の点では同様であるヌクレオチド配列、または該ヌクレオチド配列の実質的な部分を含むが、そのヌクレオチド配列が、該ｈｔｒＡ、ｐｏｎＡ、ｈｙｐＣ、ｌｙｓＳ、ｙｃｆＷ、ａｂｃ１またはｏｍｐ１００遺伝子を変化させうる一つまたはそれ以上の突然変異を更に含むポリヌクレオチド分子；または
（ｂ）該ｈｔｒＡ、ｐｏｎＡ、ｈｙｐＣ、ｌｙｓＳ、ｙｃｆＷ、ａｂｃ１またはｏｍｐ１００遺伝子のＯＲＦにその場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で自然に隣接しているヌクレオチド配列、または該隣接する配列に相同のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含み；
（ａ）または（ｂ）の遺伝子構築物を用いたローソニア細胞の形質転換が、該ｈｔｒＡ、ｐｏｎＡ、ｈｙｐＣ、ｌｙｓＳ、ｙｃｆＷ、ａｂｃ１またはｏｍｐ１００遺伝子を変化させるようにある上記遺伝子構築物。
【請求項１０】
請求項９に記載の遺伝子構築物を含む形質転換された細胞。
【請求項１１】
単離されたポリペプチドであって、
（ａ）Ｌ．イントラセルラリスのＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００タンパク質；
（ｂ）該Ｌ．イントラセルラリスのＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００タンパク質のアミノ酸配列と相同のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｃ）該Ｌ．イントラセルラリスのＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００タンパク質の実質的な部分、または該Ｌ．イントラセルラリスのＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００タンパク質のアミノ酸配列と相同のアミノ酸配列を有する該ポリペプチドの実質的な部分から成るポリペプチド；
（ｄ）別のタンパク質またはポリペプチドに融合した（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のタンパク質またはポリペプチドを含む融合タンパク質；および
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のタンパク質またはポリペプチドの類似体または誘導体
から成る群より選択される該ポリペプチド。
【請求項１２】
前記Ｌ．イントラセルラリスタンパク質が、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８および配列番号：１０２から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する請求項１１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
挿入された、欠失したまたは置換された１〜１０個のアミノ酸を有する、それらの組合せを含めた前記Ｌ．イントラセルラリスのＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００タンパク質から成るポリペプチドを含む請求項１１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
抗ローソニア抗体と特異的に反応性であるＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００タンパク質のエピトープを含む実質的に純粋なポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１に記載のポリヌクレオチド分子によってコードされるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項１６】
Ｌ．イントラセルラリスのＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００タンパク質と特異的に反応する単離された抗体。
【請求項１７】
請求項１０に記載の形質転換された細胞を含む弱毒化生ワクチン。
【請求項１８】
請求項１０に記載の形質転換された細胞を死滅した形で含む死菌ワクチン。
【請求項１９】
請求項１１に記載のポリペプチドの免疫学的有効量を薬学的に許容しうる担体との組合せで含む免疫原性組成物。
【請求項２０】
請求項１１に記載のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子の免疫学的有効量を薬学的に許容しうる担体との組合せで含む免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ローソニア・イントラセルラリス（Lawsonia intracellularis）に由来するタンパク質に関し、関連のタンパク質、核酸および免疫原性組成物を包含する。それら免疫原性組成物は、ブタなどの感受性動物のＬ．イントラセルラリス感染の予防において特に有用である。それらタンパク質、フラグメントおよび核酸も、診断薬として用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
商業的に飼育されているブタは、ブタ繁殖性腸症（ＰＰＥ）と集合的に称される広範囲の腸疾患または症候群に感受性である。これら疾患には、腸腺腫症複合症（Barker I.K. ら，1985, “Pathology of Domestic Animals,”第３版，２巻，1-237頁中，K.V.F.Jubb ら監修（Academic Press: オーランド））、ブタ腸腺腫症（ＰＩＡ）、壊死性腸炎（Rowland A.C. ら，1976, Veterinary Record 97:178-180）、繁殖性出血性腸症（Love,R.J. ら，1977, Veterinary Record 100:473）、限局性回腸炎（Jonsson,L. ら，1976, Acta Veterinaria Scandinavica 17:223-232）、出血性腸症候群（O'Neil,I.P.A., 1970, Veterinary Record 87:742-747）、ブタ繁殖性腸炎およびカンピロバクター（Campylobacter）種によって起こる腸炎（Straw,B.E., 1990, Journal of American Veterinary Medical Association 197:355-357）が含まれる。
【０００３】
ＰＰＥの一つの主な種類は、非出血性であり、ブタ腸腺腫症（ＰＩＡ）によって現れる。この型のＰＰＥは、しばしば、成長遅滞および軽い下痢を引き起こす。もう一つ重要な種類のＰＰＥは、出血性である。それは、致死的であることが多く、繁殖性出血性腸症（ＰＨＥ）によって現れ、その場合、遠位小腸内腔は、充血した状態になる。
【０００４】
ブタのＰＰＥは、商業的に最も重要であるが、ＰＰＥは、ハムスター（Stills,H.F., 1991, Infection and Immunology 59:3227-3236）、フェレット（Fox ら，1989, Veterinary Pathology 26:515-517）、モルモット（Elwell ら，1981, Veterinary Pathology 18:136-139）、ウサギ（Schodeb ら，1990, Veterinary Pathology 27:73-80）および若干の鳥類（Mason ら，1998）の飼育においても問題である。
【０００５】
ＰＰＥを引き起こす微生物は、カンピロバクター様細菌“Ｌ．イントラセルラリス”である（McOrist S ら，1995, International Journal Of Systematic Bacteriology 45:820-825）。この微生物は、回腸共生生物イントラセルラリスとしても知られている（Stills, 1991, 上記）。ブタのＰＰＥ様疾患は、カンピロバクターの他の種によって引き起こされることもありうる（Gebhart ら，1983, American Journal of Veterinary Research 44:361-367）。
【０００６】
Ｌ．イントラセルラリスは、感染した動物の絨毛の細胞質中および腸陰窩細胞中で認められ、そこで、構造的不規則および腸細胞増殖を引き起こす。絨毛および腸陰窩のような膿瘍形態は、分岐した状態になり且つ炎症性細胞で満たされる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現行のＰＰＥ制御は、抗細菌化合物の使用に頼っている。しかしながら、Ｌ．イントラセルラリス感染を制御するそれに代わる手段が要求される。
国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ９６／００７６７号には、ワクチンとして有用であるＬ．イントラセルラリスのポリペプチドおよび免疫原性組成物が記載されている。しかしながら、Ｌ．イントラセルラリス感染への抵抗性を与える更に別の組成物が要求される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、単離されたポリヌクレオチド分子であって、
（ａ）Ｌ．イントラセルラリスのＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００タンパク質をコードしているヌクレオチド配列；
（ｂ）そのＬ．イントラセルラリスＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００タンパク質をコードしているヌクレオチド配列の実質的な部分であるヌクレオチド配列；および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列に相同であるヌクレオチド配列
から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む上記単離されたポリヌクレオチド分子に関する。
【０００９】
もう一つの態様において、本発明は、これらポリヌクレオチド分子を含む組換え体ベクターに関し、その組換え体ベクターの発現が、上記のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質またはポリペプチドに融合した担体または融合パートナーを含む融合タンパク質を生じるような担体または融合パートナーをコードしているものが含まれる。本発明は、これら組換え体ベクターを含む形質転換された宿主細胞およびこのような形質転換された宿主細胞によって生産されるポリペプチドも包含する。
【００１０】
もう一つの態様において、本発明は、単離されたポリペプチドであって、
（ａ）Ｌ．イントラセルラリスのＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００タンパク質；
（ｂ）そのＬ．イントラセルラリスのＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００タンパク質のアミノ酸配列と相同のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｃ）そのＬ．イントラセルラリスのＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００タンパク質の実質的な部分、またはそのＬ．イントラセルラリスのＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００タンパク質のアミノ酸配列と相同のアミノ酸配列を有するポリペプチドの実質的な部分から成るポリペプチド；
（ｄ）別のタンパク質またはポリペプチドに融合した（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のタンパク質またはポリペプチドを含む融合タンパク質；および
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のタンパク質またはポリペプチドの類似体または誘導体
から成る群より選択される上記単離されたポリペプチドに関する。
【００１１】
本発明は、更に、プロモーター活性を有する且つ約ｎｔ２６９１〜約ｎｔ２８９０の配列番号：２内で見出される２０ヌクレオチドを越えるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１２】
本発明は、更に、これらポリペプチドのいずれかを製造する方法であって、組換え体発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞を培養し、その細胞培養から発現されたポリペプチドを回収することを含む上記方法に関する。そのベクターは、ポリペプチドのいずれかをコードしているヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含み、そのヌクレオチド配列は、一つまたはそれ以上の調節因子と機能的に結合している。培養は、ポリペプチドの発現を導きうる条件下で行われる。
【００１３】
なおもう一つの態様において、本発明は、上記のＬ．イントラセルラリスのＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００タンパク質またはポリペプチドのいずれかと特異的に反応する単離された抗体に関する。
【００１４】
本発明はまた、本発明のタンパク質、ポリペプチド、抗体またはポリヌクレオチドの免疫学的有効量を薬学的に許容しうる担体との組合せで含む免疫感作用組成物に関する。本発明は、Ｌ．イントラセルラリス感染に対してＰＰＥ感受性動物を免疫感作する方法であって、その動物に免疫感作用組成物を投与することを含む上記方法を包含する。
【００１５】
本発明はまた、Ｌ．イントラセルラリスによって引き起こされるまたは悪化する疾患状態に対してＰＰＥ感受性動物を免疫感作するためのキットであって、上記のタンパク質、ポリペプチド、抗体またはポリヌクレオチドの内１種類の免疫学的有効量が中に入っている容器を含む上記キットに関する。本発明はまた、Ｌ．イントラセルラリス、Ｌ．イントラセルラリス特異的アミノ酸またはヌクレオチド配列、または抗Ｌ．イントラセルラリス抗体の存在を検出するためのキットであって、本発明のタンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体が中に入っている容器を含む上記キットに関する。
【００１６】
発明の詳細な記述
本明細書中に引用される特許、特許出願および公報は全て、本明細書中にそのまま援用される。
【００１７】
ポリヌクレオチド分子
本発明の単離されたポリヌクレオチド分子は、ローソニアのいずれの種または菌株にも由来するヌクレオチド配列を有することができるが、好ましくは、イントラセルラリス種に由来する。本発明を実施するのに用いるための病原性ローソニア菌株または種は、下記の単離技術を用いて、感染した動物の器官、組織または体液から単離することができる。
【００１８】
本明細書中で用いられるように、“ポリヌクレオチド分子”、“ポリヌクレオチド配列”、“コーディング配列” 、“読み取り枠（ＯＲＦ）”等の用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子双方を示すためのものであり、それは一本鎖かまたは二本鎖でありうるし、しかも、１種類またはそれ以上の原核性配列、ｃＤＮＡ配列、エクソンおよびイントロンを含めたゲノムＤＮＡ配列、および化学合成されたＤＮＡおよびＲＮＡ配列、並びにセンス鎖および対応するアンチセンス鎖双方を含むことがありうる。本明細書中で用いられるように、“ＯＲＦ”という用語は、終止コドンを全く介在させることなく、ローソニアＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００タンパク質をコードするのに必要な最小限のヌクレオチド配列を意味する。
【００１９】
本明細書中に開示されるポリヌクレオチド分子およびオリゴヌクレオチド分子の製造および操作は、当該技術の範囲内であり、特に、Maniatis ら，1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, コールド・スプリング・ハーバー，ＮＹ；Ausubel ら，1989, Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, ＮＹ；Sambrook ら，1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, コールド・スリング・ハーバー，ＮＹ；Innis ら（監修），1995, PCR Strategies, Academic Press,Inc., サン・ディエゴ；および Erlich（監修），1992, PCR Technology, Oxford University Press, ニューヨーク並びにこれら文献の全改訂版に記載の組換え技術によって行うことができる。
【００２０】
配列番号：１および２に示されるヌクレオチド配列並びにそれらの実施的な部分の本明細書中での意味は、Central Research, イースタン・ポイント・ロード，グロートン，ＣＴの Pfizer Inc. によって、American Type Culture Collection, １２３０１  パークローン・ドライブ，ロックビル，ＭＤ，２０８５２に寄託された大腸菌（E.coli）Ｔｏｐ１０細胞中に含有される次のプラスミド中に存在するような該当するヌクレオチド配列およびそれらの実質的な部分をそれぞれ示すためのものでもある。
【００２１】
ｐｏｎＡ遺伝子を含有する、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３５として１９９９年９月９日に寄託されたｐＥＲ４３２；
ｈｔｒＡ遺伝子を含有する、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３６として１９９９年９月９日に寄託されたｐＥＲ４３４；
ｈｙｐＣ遺伝子を含有する、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３７として１９９９年９月９日に寄託されたｐＥＲ４３６；
ｙｃｆＷおよびａｂｃ１遺伝子を含有する、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３８として１９９９年９月９日に寄託されたｐＥＲ４３８；
Ｏｍｐ１００遺伝子を含有する、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３９として１９９９年９月９日に寄託されたｐＥＲ４４０；および
ｌｙｓＳおよびｙｃｆＷ遺伝子を含有する、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−２２３２として２０００年７月１４日に寄託されたｐＴ０６８。
【００２２】
更に、配列番号：３〜９および配列番号：１０２に示されるアミノ酸配列並びにそれらの実施的な部分およびペプチドフラグメントの本明細書中での意味は、特に断らない限り、上に挙げたプラスミド中に存在するヌクレオチド配列をコードしている該当するタンパク質によってコードされている該当するアミノ酸配列並びにそれらの実施的な部分およびペプチドフラグメントをそれぞれ示すためのものでもある。
【００２３】
ＨｔｒＡ関連ポリヌクレオチド分子
本発明は、Ｌ．イントラセルラリス由来のＨｔｒＡタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい実施態様において、そのＨｔｒＡタンパク質は、配列番号：７のアミノ酸配列を有する。更に好ましい実施態様において、本発明のＨｔｒＡをコードしている単離されたポリヌクレオチド分子は、ｈｔｒＡ遺伝子の読み取り枠（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列である約ｎｔ２８９１〜約ｎｔ４３１５の配列番号：２のヌクレオチド配列、およびプラスミドｐＥＲ４３４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３６）のＨｔｒＡをコードしているＯＲＦのヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００２４】
本発明は、更に、本発明のＨｔｒＡをコードしているポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に相同であるヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。ＨｔｒＡ関連ポリヌクレオチド分子を論及するのに用いられる場合の“相同”という用語は、（ａ）本発明の前述のＨｔｒＡをコードしているポリヌクレオチド分子の一つと同様のタンパク質をコードしている；または（ｂ）Ｌ．イントラセルラリスＨｔｒＡタンパク質のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の補体に、少なくとも中程度のストリンジェントな条件下において、すなわち、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中において６５℃でフィルターに結合したＤＮＡへのハイブリダイゼーションおよび０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中において４２℃で洗浄すること（Ausubel ら（監修），1989, Current Protocols In Molecular Biology, １巻，Green Publishing Associates,Inc., and John Wiley & Sons,Inc. ニューヨーク，2.10.3頁を参照されたい）においてハイブリッド形成する、しかも本発明の実施において有用であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を意味する。好ましい実施態様において、その相同ポリヌクレオチド分子は、Ｌ．イントラセルラリスＨｔｒＡタンパク質のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の補体に、高ストリンジェントな条件下において、すなわち、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中において６５℃でフィルターに結合したＤＮＡへのハイブリダイゼーションおよび０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中において６８℃で洗浄すること（Ausubel ら，1989, 上記）においてハイブリッド形成し、しかも本発明の実施において有用である。より好ましい実施態様において、その相同ポリヌクレオチド分子は、高ストリンジェントな条件下において、約ｎｔ２８９１〜約ｎｔ４３１５である配列番号：２のＨｔｒＡをコードしているＯＲＦから成る群より選択されるヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子の補体にハイブリッド形成する。上記のように、本明細書中の相同ポリヌクレオチド分子の意味は、このような分子の補体を示すためのものでもある。
【００２５】
本明細書中で用いられるように、ポリヌクレオチド分子は、そのポリヌクレオチド分子を、ポリメラーゼ連鎖反応のような標準的な増幅技術を用いてローソニア特異的ポリヌクレオチド分子を増幅させるのに用いることができる、またはローソニアに感染した動物由来の体液若しくは組織試料中のローソニア特異的ポリヌクレオチドの存在を検出する診断薬として用いることができる場合、またはそのポリヌクレオチド分子が、下記のように本発明の実施において有用であるポリペプチドをコードしている場合、“本発明の実施において有用” である。
【００２６】
本発明のＨｔｒＡをコードしているポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に相同であるヌクレオチド配列を有する本発明のポリヌクレオチド分子には、大腸菌、ネズミチフス菌（S.typhimurium）、Ｃ．ジジュニ（jejuni）、インフルエンザ菌（H.influenzae）、マルタ熱菌（B.melitensis）、ウシ流産菌（B.abortus）、トラコーマクラミジア（C.trachomatis）、エルジニア・エンテロコリティカ（Y.enterocolitia）、リケッチア属（Rickettsia）、Ｂ．ブルグドルフェリ（burgdorferi）および枯草菌（B.subtilis）などの細菌から記載されてきたポリヌクレオチド分子が含まれない。配列番号：２によってコードされるＬ．イントラセルラリスＨｔｒＡタンパク質は、Ｂ．アボルタスＨｔｒＡタンパク質と３９．６％のアミノ酸配列同一性を有する。そのＬ．イントラセルラリスタンパク質は４７４残基長さであるが、Ｂ．アボルタスタンパク質は５１３残基長さである。Ｌ．イントラセルラリスタンパク質は、インフルエンザ菌のそれと３５．４％一致する。
【００２７】
本発明の分子の相同ヌクレオチド配列は、好ましくは、約ｎｔ２８９１〜約ｎｔ４３１５である配列番号：２の分子との５０％を越える、より好ましくは、約９０％を越える、なおより好ましくは、約９５％を越える、そして最も好ましくは、約９９％を越える配列同一性を有する配列を含み、その配列同一性は、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム（GenBank, National Center for Biotechnology Information）の使用によって決定される。
【００２８】
もう一つの実施態様において、ポリヌクレオチドは、Ｌ．イントラセルラリスＨｔｒＡタンパク質をコードしているヌクレオチド配列の長さの約５０％を越える相同配列を有する。もう一つの実施態様において、その配列は、Ｌ．イントラセルラリスタンパク質をコードしているヌクレオチド配列の長さの７０％を越え、もう一つの実施態様において、その配列は９０％を越え、そしてもう一つの実施態様においては、約９８％を越える。なおもう一つの実施態様において、相同配列を有する単離されたポリヌクレオチドは、Ｌ．イントラセルラリスＨｔｒＡタンパク質をコードしている配列と長さが等しい。
【００２９】
なおもう一つの実施態様において、Ｌ．イントラセルラリスＨｔｒＡタンパク質をコードしている配列と相同であるヌクレオチド配列は、約ｎｔ２８９１〜約ｎｔ４３１５である配列番号：２の配列に関して、挿入された、欠失したまたは置換された１〜５０個、より好ましくは、１〜２５個、そして最も好ましくは、１〜５個のヌクレオチドを有する。
【００３０】
本発明は、更に、Ｌ．イントラセルラリスＨｔｒＡタンパク質と相同であるポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。Ｌ．イントラセルラリスＨｔｒＡタンパク質と相同であるポリペプチドを論及するのに本明細書中で用いられるように、“相同”という用語は、他の点ではＬ．イントラセルラリスＨｔｒＡタンパク質のアミノ酸配列を有するポリペプチドであるが、得られたポリペプチドが本発明の実施において有用である限りにおいて、その１個またはそれ以上のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置換されているポリペプチドを意味する。保存的アミノ酸置換は、当該技術分野において周知である。このような置換を行う規則には、特に、Dayhof,M.D., 1978, Nat.Biomed.Res.Found., ワシントン，Ｄ．Ｃ．，５巻，補遺３によって記載されたものが含まれる。より具体的には、保存的アミノ酸置換は、側鎖の酸性度、極性または嵩高性に関するアミノ酸ファミリー内で一般的に起こるものである。遺伝子にコードされるアミノ酸は、概して、（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニンおよびチロシンの４群に分けられる。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは一緒に、芳香族アミノ酸としても分類される。いずれか特定の基内の１個またはそれ以上の置換、例えば、ロイシンをイソロイシンまたはバリンで、またはアスパラギン酸をグルタミン酸で、またはトレオニンをセリンで、または任意の他のアミノ酸残基を構造的に関連したアミノ酸残基、例えば、側鎖の同様の酸性度、極性、嵩高性またはそれらのいくつかの組合せの類似性を有するアミノ酸残基での置換は、概して、そのポリペプチドの機能または免疫原性に有意の作用を有するであろう。好ましい実施態様において、相同ポリペプチドは、配列番号：７と少なくとも約５０％、より好ましくは、少なくとも約７０％、そしてなおより好ましくは、少なくとも約９０％の配列同一性、そして最も好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【００３１】
もう一つの実施態様において、ポリヌクレオチドは、挿入された、欠失したまたは置換された、それらの組合せを含めた１〜１０個、より好ましくは、１〜５個のアミノ酸を有するＬ．イントラセルラリスＨｔｒＡタンパク質から成る単離されたポリペプチドをコードしている。この実施態様のより具体的な例において、そのポリヌクレオチドは、配列番号：７のＨｔｒＡ配列の代わりに保存的に置換された１〜５個のアミノ酸を有する単離されたポリペプチドをコードしている。
【００３２】
本明細書中で用いられるように、ポリペプチドは、ローソニアに免疫応答を示した動物からの血液、血清または他の体液試料中のローソニア特異的抗体の存在を検出する診断試薬としてそのポリペプチドを用いることができる場合、“本発明の実施において有用” である。そのポリペプチドはまた、それを用いてローソニアに対する動物の免疫応答を引き起こすことができるならば有用である。
【００３３】
本発明は、更に、本発明の前述のローソニアＨｔｒＡ関連ポリヌクレオチド分子のいずれかの実質的な部分から成るポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書中で用いられるように、ＨｔｒＡ関連ポリヌクレオチド分子の“実質的な部分”とは、ＨｔｒＡ関連ポリヌクレオチド分子の完全なヌクレオチド配列より少ないものから成るが、ＨｔｒＡ関連ポリヌクレオチド分子の少なくとも５％、より好ましくは、少なくとも約１０％、そしてなおより好ましくは、少なくとも約２０％、そして最も好ましくは、少なくとも約５０％のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を意味し、それは本発明の実施において有用である。このようなポリヌクレオチド分子には、例えば、ＨｔｒＡタンパクのペプチドフラグメントをコードしているポリヌクレオチド分子が含まれる。
【００３４】
前述のＨｔｒＡ関連ポリヌクレオチド分子のいずれかのヌクレオチド配列に加えて、本発明のポリヌクレオチド分子は、自然にＨｔｒＡ  ＯＲＦに隣接するものまたはＬ．イントラセルラリスのその場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）の遺伝子より選択されるヌクレオチド配列を更に含むことができる、或いは、から成ることができ、約ｎｔ２６９１〜約ｎｔ２８９０および約ｎｔ４３１６〜約ｎｔ４５８０の配列番号：２に示されるヌクレオチド配列またはそれらの実質的な部分を含む。
【００３５】
ＰｏｎＡ関連ポリヌクレオチド分子
本発明は、Ｌ．イントラセルラリス由来のＰｏｎＡタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい実施態様において、そのＰｏｎＡタンパク質は、配列番号：６のアミノ酸配列を有する。更に好ましい実施態様において、本発明のＰｏｎＡをコードしている単離されたポリヌクレオチド分子は、約ｎｔ２５２〜約ｎｔ２６９０の配列番号：２のヌクレオチド配列（ＰｏｎＡ遺伝子の読み取り枠（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列）、およびプラスミドｐＥＲ４３２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３５）のＰｏｎＡをコードしているＯＲＦのヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００３６】
本発明は、相同という用語がＨｔｒＡ関連ポリヌクレオチド分子に関して上に相応して定義されているように、本発明のＰｏｎＡをコードしているポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に“相同”であるヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド分子を更に提供する。好ましい実施態様において、その相同ポリヌクレオチド分子は、Ｌ．イントラセルラリスＰｏｎＡタンパク質のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の補体に、高ストリンジェントな条件下においてハイブリッド形成する。より好ましい実施態様において、その相同ポリヌクレオチド分子は、高ストリンジェントな条件下において、約ｎｔ２５２〜約ｎｔ２６９０の配列番号：２のヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子の補体にハイブリッド形成する。
【００３７】
本発明のＰｏｎＡをコードしているポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に相同であるヌクレオチド配列を有する本発明のポリヌクレオチド分子には、ナイセリア・フラベセンス（Neisseria flavescens）、淋菌（N.gonorrhoeae）および髄膜炎菌（N.meningitidis）のＰｏｎＡタンパク質をコードしている既知のポリヌクレオチド分子が含まれない。
【００３８】
本発明の分子の相同ヌクレオチド配列は、好ましくは、約ｎｔ２５２〜約ｎｔ２６９０である配列番号：２の分子との５０％を越える、より好ましくは、約９０％を越える、なおより好ましくは、約９５％を越える、そして最も好ましくは、約９９％を越える配列同一性を有する配列を含み、その配列同一性は、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム（GenBank, National Center for Biotechnology Information）の使用によって決定される。
【００３９】
もう一つの実施態様において、ポリヌクレオチドは、Ｌ．イントラセルラリスＰｏｎＡタンパク質をコードしているヌクレオチド配列の長さの約５０％を越える相同配列を有する。もう一つの実施態様において、その配列は、Ｌ．イントラセルラリスタンパク質をコードしているヌクレオチド配列の長さの９０％を越え、もう一つの実施態様においては約９８％を越える。なおもう一つの実施態様において、相同配列を有する単離されたポリヌクレオチドは、Ｌ．イントラセルラリスＰｏｎＡタンパク質をコードしている配列と長さが等しい。
【００４０】
なおもう一つの実施態様において、Ｌ．イントラセルラリスＰｏｎＡタンパク質をコードしている配列と相同であるヌクレオチド配列は、配列番号：２の配列に関して、挿入された、欠失したまたは置換された１〜５０個、より好ましくは、１〜２５個、そして最も好ましくは、１〜５個のヌクレオチドを有する。
【００４１】
本発明は、更に、相同という用語がＨｔｒＡタンパクに関して上に相応して記載されているように、Ｌ．イントラセルラリスＰｏｎＡタンパク質と“相同”であるポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい実施態様において、相同ポリペプチドは、配列番号：６と少なくとも約５０％、より好ましくは、少なくとも約７０％、そしてなおより好ましくは、少なくとも約９０％の配列同一性、そして最も好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【００４２】
もう一つの実施態様において、ポリヌクレオチドは、挿入された、欠失したまたは置換された、それらの組合せを含めた１〜１０個、より好ましくは、１〜５個のアミノ酸を有するＬ．イントラセルラリスＰｏｎＡタンパク質から成る単離されたポリペプチドをコードしている。この実施態様のより具体的な例において、そのポリヌクレオチドは、配列番号：６のＰｏｎＡ配列の代わりに保存的に置換された１〜５個のアミノ酸を有する単離されたポリペプチドをコードしている。
【００４３】
本発明は、更に、実質的な部分という用語がＨｔｒＡタンパクに関して上に相応して記載されているように、本発明の前述のローソニアＰｏｎＡ関連ポリヌクレオチド分子のいずれかの“実質的な部分” から成るポリヌクレオチド分子を提供する。
【００４４】
前述のＰｏｎＡ関連ポリヌクレオチド分子のいずれかのヌクレオチド配列に加えて、本発明のポリヌクレオチド分子は、自然にｐｏｎＡ  ＯＲＦに隣接するものまたはＬ．イントラセルラリスのその場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）の遺伝子より選択されるヌクレオチド配列を更に含むことができる、或いは、から成ることができ、約ｎｔ１２６〜約ｎｔ２５１および約ｎｔ２６９１〜約ｎｔ２８９０の配列番号：２に示されるヌクレオチド配列またはそれらの実質的な部分を含む。
【００４５】
ＨｙｐＣ関連ポリヌクレオチド分子
本発明は、Ｌ．イントラセルラリス由来のＨｙｐＣタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい実施態様において、そのＨｙｐＣタンパク質は、配列番号：８のアミノ酸配列を有する。更に好ましい実施態様において、本発明のＨｙｐＣをコードしている単離されたポリヌクレオチド分子は、約ｎｔ４５８１〜約ｎｔ４８２９の配列番号：２のヌクレオチド配列、およびプラスミドｐＥＲ４３６（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３７）のＨｙｐＣをコードしているＯＲＦのヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００４６】
本発明は、相同という用語がＨｔｒＡ関連ポリヌクレオチド分子に関して上に相応して定義されているように、本発明のＨｙｐＣをコードしているポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に“相同”であるヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド分子を更に提供する。好ましい実施態様において、その相同ポリヌクレオチド分子は、Ｌ．イントラセルラリスＨｙｐＣタンパク質のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の補体に、高ストリンジェントな条件下においてハイブリッド形成する。より好ましい実施態様において、その相同ポリヌクレオチド分子は、高ストリンジェントな条件下において、約ｎｔ４５８１〜約ｎｔ４８２９の配列番号：２のＯＲＦから成る群より選択されるヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子の補体にハイブリッド形成する。
【００４７】
本発明のＨｙｐＣをコードしているポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に相同であるヌクレオチド配列を有する本発明のポリヌクレオチド分子には、デスルフォビブリオ・ギガス（Desulfovibrio gigas）およびリゾビウム・レグミノサルム（Rizobium leguminosarum）のＨｙｐＣまたはＨｙｐＤタンパク質をコードしているポリヌクレオチド分子が含まれない。
【００４８】
本発明の分子の相同ヌクレオチド配列は、好ましくは、約ｎｔ４５８１〜約ｎｔ４８２９である配列番号：２の分子との５０％を越える、より好ましくは、約９０％を越える、なおより好ましくは、約９５％を越える、そして最も好ましくは、約９９％を越える配列同一性を有する配列を含み、その配列同一性は、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム（GenBank, National Center for Biotechnology Information）の使用によって決定される。
【００４９】
もう一つの実施態様において、ポリヌクレオチドは、Ｌ．イントラセルラリスＨｙｐＣタンパク質をコードしているヌクレオチド配列の長さの約５０％を越える相同配列を有する。もう一つの実施態様において、その配列は、Ｌ．イントラセルラリスＨｙｐＣタンパク質をコードしているヌクレオチド配列の長さの９０％を越え、もう一つの実施態様においては約９８％を越える。なおもう一つの実施態様において、相同配列を有する単離されたポリヌクレオチドは、Ｌ．イントラセルラリスＨｙｐＣタンパク質をコードしている配列と長さが等しい。
【００５０】
なおもう一つの実施態様において、Ｌ．イントラセルラリスＨｙｐＣタンパク質をコードしている配列と相同であるヌクレオチド配列は、配列番号：２の配列に関して、挿入された、欠失したまたは置換された１〜５０個、より好ましくは、１〜２５個、そして最も好ましくは、１〜５個のヌクレオチドを有する。
【００５１】
本発明は、更に、相同という用語がＨｔｒＡタンパクに関して上に相応して記載されているように、Ｌ．イントラセルラリスＨｙｐＣタンパク質と“相同”であるポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい実施態様において、相同ポリペプチドは、配列番号：８と少なくとも約５０％、より好ましくは、少なくとも約７０％、そしてなおより好ましくは、少なくとも約９０％の配列同一性、そして最も好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【００５２】
もう一つの実施態様において、ポリヌクレオチドは、挿入された、欠失したまたは置換された、それらの組合せを含めた１〜１０個、より好ましくは、１〜５個のアミノ酸を有するＬ．イントラセルラリスＨｙｐＣタンパク質から成る単離されたポリペプチドをコードしている。この実施態様のより具体的な例において、そのポリヌクレオチドは、配列番号：８のＨｙｐＣ配列の代わりに保存的に置換された１〜５個のアミノ酸を有する単離されたポリペプチドをコードしている。
【００５３】
本発明は、更に、実質的な部分という用語がＨｔｒＡタンパクに関して上に相応して記載されているように、本発明の前述のローソニアＨｙｐＣ関連ポリヌクレオチド分子のいずれかの“実質的な部分” から成るポリヌクレオチド分子を提供する。
【００５４】
前述のＨｙｐＣ関連ポリヌクレオチド分子のいずれかのヌクレオチド配列に加えて、本発明のポリヌクレオチド分子は、自然にｈｙｐＣ  ＯＲＦに隣接するものまたはＬ．イントラセルラリスのその場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）の遺伝子より選択されるヌクレオチド配列を更に含むことができる、或いは、から成ることができ、約ｎｔ４３１６〜約ｎｔ４５８０および約ｎｔ４３８０〜約ｎｔ４９１１の配列番号：２に示されるヌクレオチド配列またはそれらの実質的な部分を含む。
【００５５】
ＬｙｓＳ関連ポリヌクレオチド分子
本発明は、Ｌ．イントラセルラリス由来のＬｙｓＳタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい実施態様において、そのＬｙｓＳタンパク質は、配列番号：１０２のアミノ酸配列を有する。更に好ましい実施態様において、本発明のＬｙｓＳをコードしている単離されたポリヌクレオチド分子は、ｌｙｓＳ遺伝子のヌクレオチド配列の約ｎｔ１６５〜約ｎｔ１７４５の配列番号：１のヌクレオチド配列、およびプラスミドｐＴ０６８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−２２３２）のＬｙｓＳをコードしているＯＲＦのヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００５６】
本発明は、相同という用語がＨｔｒＡ関連ポリヌクレオチド分子に関して上に相応して定義されているように、本発明のＬｙｓＳをコードしているポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に“相同”であるヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド分子を更に提供する。好ましい実施態様において、その相同ポリヌクレオチド分子は、Ｌ．イントラセルラリスＬｙｓＳタンパク質のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の補体に、高ストリンジェントな条件下においてハイブリッド形成する。より好ましい実施態様において、その相同ポリヌクレオチド分子は、高ストリンジェントな条件下において、約ｎｔ１６５〜約ｎｔ１７４５の配列番号：１のヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子の補体にハイブリッド形成する。
【００５７】
本発明の分子の相同ヌクレオチド配列は、好ましくは、約ｎｔ１６５〜約ｎｔ１７４５の配列番号：１の分子との５０％を越える、より好ましくは、約９０％を越える、なおより好ましくは、約９５％を越える、そして最も好ましくは、約９９％を越える配列同一性を有する配列を含み、その配列同一性は、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム（GenBank, National Center for Biotechnology Information）の使用によって決定される。
【００５８】
もう一つの実施態様において、ポリヌクレオチドは、Ｌ．イントラセルラリスＬｙｓＳタンパク質をコードしているヌクレオチド配列の長さの約５０％を越える相同配列を有する。もう一つの実施態様において、その配列は、Ｌ．イントラセルラリスＬｙｓＳタンパク質をコードしているヌクレオチド配列の長さの９０％を越え、もう一つの実施態様においては約９８％を越える。なおもう一つの実施態様において、相同配列を有する単離されたポリヌクレオチドは、Ｌ．イントラセルラリスＬｙｓＳタンパク質をコードしている配列と長さが等しい。
【００５９】
なおもう一つの実施態様において、Ｌ．イントラセルラリスＬｙｓＳタンパク質をコードしている配列と相同であるヌクレオチド配列は、配列番号：１の配列に関して、挿入された、欠失したまたは置換された１〜５０個、より好ましくは、１〜２５個、そして最も好ましくは、１〜５個のヌクレオチドを有する。
【００６０】
本発明は、更に、相同という用語がＨｔｒＡタンパクに関して上に相応して記載されているように、Ｌ．イントラセルラリスＬｙｓＳタンパク質と“相同”であるポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい実施態様において、相同ポリペプチドは、配列番号：１０２と少なくとも約５０％、より好ましくは、少なくとも約７０％、そしてなおより好ましくは、少なくとも約９０％の配列同一性、そして最も好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【００６１】
もう一つの実施態様において、ポリヌクレオチドは、挿入された、欠失したまたは置換された、それらの組合せを含めた１〜１０個、より好ましくは、１〜５個のアミノ酸を有するＬ．イントラセルラリスＬｙｓＳタンパク質から成る単離されたポリペプチドをコードしている。この実施態様のより具体的な例において、そのポリヌクレオチドは、配列番号：１０２のＬｙｓＳ配列の代わりに保存的に置換された１〜５個のアミノ酸を有する単離されたポリペプチドをコードしている。
【００６２】
本発明は、更に、実質的な部分という用語がＨｔｒＡタンパクに関して上に相応して記載されているように、本発明の前述のローソニアｌｙｓＳ関連ポリヌクレオチド分子のいずれかの“実質的な部分” から成るポリヌクレオチド分子を提供する。
【００６３】
前述のｌｙｓＳ関連ポリヌクレオチド分子のいずれかのヌクレオチド配列に加えて、本発明のポリヌクレオチド分子は、自然にｌｙｓＳ  ＯＲＦに隣接するものまたはＬ．イントラセルラリスの現場の遺伝子より選択されるヌクレオチド配列を更に含むことができる、或いは、から成ることができる。
【００６４】
ＹｃｆＷ関連ポリヌクレオチド分子
本発明は、Ｌ．イントラセルラリス由来のＹｃｆＷタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい実施態様において、そのＹｃｆＷタンパク質は、配列番号：３のアミノ酸配列を有する。更に好ましい実施態様において、本発明のＹｃｆＷをコードしている単離されたポリヌクレオチド分子は、ＹｃｆＷ遺伝子のヌクレオチド配列の約ｎｔ１７４５〜約ｎｔ３０２８の配列番号：１のヌクレオチド配列、およびプラスミドｐＥＲ４３８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３８）とｐＴ０６８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−２２３２）のＹｃｆＷをコードしているＯＲＦのヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００６５】
本発明は、相同という用語がＨｔｒＡ関連ポリヌクレオチド分子に関して上に相応して定義されているように、本発明のＹｃｆＷをコードしているポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に“相同”であるヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド分子を更に提供する。好ましい実施態様において、その相同ポリヌクレオチド分子は、Ｌ．イントラセルラリスＹｃｆＷタンパク質のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の補体に、高ストリンジェントな条件下においてハイブリッド形成する。より好ましい実施態様において、その相同ポリヌクレオチド分子は、高ストリンジェントな条件下において、約ｎｔ１７４５〜約ｎｔ３０２８の配列番号：１のヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子の補体にハイブリッド形成する。
【００６６】
本発明の分子の相同ヌクレオチド配列は、好ましくは、約ｎｔ１７４５〜約ｎｔ３０２８の配列番号：１の分子との５０％を越える、より好ましくは、約９０％を越える、なおより好ましくは、約９５％を越える、そして最も好ましくは、約９９％を越える配列同一性を有する配列を含み、その配列同一性は、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム（GenBank, National Center for Biotechnology Information）の使用によって決定される。
【００６７】
もう一つの実施態様において、ポリヌクレオチドは、Ｌ．イントラセルラリスＹｃｆＷタンパク質をコードしているヌクレオチド配列の長さの約５０％を越える相同配列を有する。もう一つの実施態様において、その配列は、Ｌ．イントラセルラリスＹｃｆＷタンパク質をコードしているヌクレオチド配列の長さの９０％を越え、もう一つの実施態様においては約９８％を越える。なおもう一つの実施態様において、相同配列を有する単離されたポリヌクレオチドは、Ｌ．イントラセルラリスＹｃｆＷタンパク質をコードしている配列と長さが等しい。
【００６８】
なおもう一つの実施態様において、Ｌ．イントラセルラリスＹｃｆＷタンパク質をコードしている配列と相同であるヌクレオチド配列は、配列番号：１の配列に関して、挿入された、欠失したまたは置換された１〜５０個、より好ましくは、１〜２５個、そして最も好ましくは、１〜５個のヌクレオチドを有する。
【００６９】
本発明は、更に、相同という用語がＨｔｒＡタンパクに関して上に相応して記載されているように、Ｌ．イントラセルラリスＹｃｆＷタンパク質と“相同”であるポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい実施態様において、相同ポリペプチドは、配列番号：３と少なくとも約５０％、より好ましくは、少なくとも約７０％、そしてなおより好ましくは、少なくとも約９０％の配列同一性、そして最も好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【００７０】
もう一つの実施態様において、ポリヌクレオチドは、挿入された、欠失したまたは置換された、それらの組合せを含めた１〜１０個、より好ましくは、１〜５個のアミノ酸を有するＬ．イントラセルラリスＹｃｆＷタンパク質から成る単離されたポリペプチドをコードしている。この実施態様のより具体的な例において、そのポリヌクレオチドは、配列番号：３のＹｃｆＷ配列の代わりに保存的に置換された１〜５個のアミノ酸を有する単離されたポリペプチドをコードしている。
【００７１】
本発明は、更に、実質的な部分という用語がＨｔｒＡタンパクに関して上に相応して記載されているように、本発明の前述のローソニアＹｃｆＷ関連ポリヌクレオチド分子のいずれかの“実質的な部分” から成るポリヌクレオチド分子を提供する。
【００７２】
前述のＹｃｆＷ関連ポリヌクレオチド分子のいずれかのヌクレオチド配列に加えて、本発明のポリヌクレオチド分子は、自然にｙｃｆＷ  ＯＲＦに隣接するものまたはＬ．イントラセルラリスのその場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）の遺伝子より選択されるヌクレオチド配列を更に含むことができる、或いは、から成ることができる。
【００７３】
ＡＢＣ１関連ポリヌクレオチド分子
本発明は、Ｌ．イントラセルラリス由来のＡＢＣ１タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい実施態様において、そのＡＢＣ１タンパク質は、配列番号：４のアミノ酸配列を有する。更に好ましい実施態様において、本発明のＡＢＣ１をコードしている単離されたポリヌクレオチド分子は、約ｎｔ３０３１〜約ｎｔ３７３８の配列番号：１のヌクレオチド配列（ＡＢＣ１遺伝子の読み取り枠（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列）、およびプラスミドｐＥＲ４３８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３８）のＡＢＣ１をコードしているＯＲＦのヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００７４】
本発明は、相同という用語がＨｔｒＡ関連ポリヌクレオチド分子に関して上に相応して定義されているように、本発明のＡＢＣ１をコードしているポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に“相同”であるヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド分子を更に提供する。好ましい実施態様において、その相同ポリヌクレオチド分子は、Ｌ．イントラセルラリスＡＢＣ１タンパク質のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の補体に、高ストリンジェントな条件下においてハイブリッド形成する。より好ましい実施態様において、その相同ポリヌクレオチド分子は、高ストリンジェントな条件下において、約ｎｔ３０３１〜約ｎｔ３７３８である配列番号：１のＯＲＦから成る群より選択されるヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子の補体にハイブリッド形成する。
【００７５】
本発明のＡＢＣ１をコードしているポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に相同であるヌクレオチド配列を有する本発明のポリヌクレオチド分子には、ナイセリア・フラベセンス、淋菌および髄膜炎菌のＡＢＣ１タンパク質をコードしているポリヌクレオチド分子が含まれない。
【００７６】
本発明の分子のヌクレオチド配列は、好ましくは、約ｎｔ３０３１〜約ｎｔ３７３８の配列番号：１の分子との５０％を越える、より好ましくは、約９０％を越える、なおより好ましくは、約９５％を越える、そして最も好ましくは、約９９％を越える配列同一性を有する配列を含み、その配列同一性は、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム（GenBank, National Center for Biotechnology Information）の使用によって決定される。
【００７７】
もう一つの実施態様において、ポリヌクレオチドは、Ｌ．イントラセルラリスＡＢＣ１タンパク質をコードしているヌクレオチド配列の長さの約５０％を越える相同配列を有する。もう一つの実施態様において、その配列は、Ｌ．イントラセルラリスＡＢＣ１タンパク質をコードしているヌクレオチド配列の長さの９０％を越え、もう一つの実施態様においては約９８％を越える。なおもう一つの実施態様において、相同配列を有する単離されたポリヌクレオチドは、Ｌ．イントラセルラリスＡＢＣ１タンパク質をコードしている配列と長さが等しい。
【００７８】
なおもう一つの実施態様において、Ｌ．イントラセルラリスＡＢＣ１タンパク質をコードしている配列と相同であるヌクレオチド配列は、配列番号：１の配列に関して、挿入された、欠失したまたは置換された１〜５０個、より好ましくは、１〜２５個、そして最も好ましくは、１〜５個のヌクレオチドを有する。
【００７９】
本発明は、更に、相同という用語がＨｔｒＡタンパクに関して上に相応して記載されているように、Ｌ．イントラセルラリスＡＢＣ１タンパク質と“相同”であるポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい実施態様において、相同ポリペプチドは、配列番号：１と少なくとも約５０％、より好ましくは、少なくとも約７０％、そしてなおより好ましくは、少なくとも約９０％の配列同一性、そして最も好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【００８０】
もう一つの実施態様において、ポリヌクレオチドは、挿入された、欠失したまたは置換された、それらの組合せを含めた１〜１０個、より好ましくは、１〜５個のアミノ酸を有するＬ．イントラセルラリスＡＢＣ１タンパク質から成る単離されたポリペプチドをコードしている。この実施態様のより具体的な例において、そのポリヌクレオチドは、配列番号：４のＡＢＣ１配列の代わりに保存的に置換された１〜５個のアミノ酸を有する単離されたポリペプチドをコードしている。
【００８１】
本発明は、更に、実質的な部分という用語がＨｔｒＡタンパクに関して上に相応して記載されているように、本発明の前述のローソニアＡＢＣ１関連ポリヌクレオチド分子のいずれかの“実質的な部分” から成るポリヌクレオチド分子を提供する。
【００８２】
前述のＡＢＣ１関連ポリヌクレオチド分子のいずれかのヌクレオチド配列に加えて、本発明のポリヌクレオチド分子は、自然にａｂｃ１  ＯＲＦに隣接するものまたはＬ．イントラセルラリスのその場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）の遺伝子より選択されるヌクレオチド配列を更に含むことができる、或いは、から成ることができ、配列番号：１に示される隣接するヌクレオチド配列を含む。
【００８３】
Ｏｍｐ１００関連ポリヌクレオチド分子
本発明は、Ｌ．イントラセルラリス由来のＯｍｐ１００タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい実施態様において、そのＯｍｐ１００タンパク質は、配列番号：５のアミノ酸配列を有する。更に好ましい実施態様において、本発明のＯｍｐ１００をコードしている単離されたポリヌクレオチド分子は、約ｎｔ３６９５〜約ｎｔ６３８５の配列番号：１のヌクレオチド配列（Ｏｍｐ１００遺伝子の読み取り枠（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列）、およびプラスミドｐＥＲ４４０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３９）のＯｍｐ１００をコードしているＯＲＦのヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００８４】
本発明は、相同という用語がＨｔｒＡ関連ポリヌクレオチド分子に関して上に相応して定義されているように、本発明のＯｍｐ１００をコードしているポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に“相同”であるヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド分子を更に提供する。好ましい実施態様において、その相同ポリヌクレオチド分子は、Ｌ．イントラセルラリスＯｍｐ１００タンパク質のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の補体に、高ストリンジェントな条件下においてハイブリッド形成する。より好ましい実施態様において、その相同ポリヌクレオチド分子は、高ストリンジェントな条件下において、約ｎｔ３６９５〜約ｎｔ６３８５である配列番号：１のＯＲＦから成る群より選択されるヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子の補体にハイブリッド形成する。
【００８５】
本発明のＯｍｐ１００をコードしているポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に相同であるヌクレオチド配列を有する本発明のポリヌクレオチド分子には、GenBank データベースに挙げられる次のタンパク質、大腸菌のＹａｅＴ（Ａｃｃｎ．Ｕ７０２１４またはＡＥ０００１２７）；フレクスナー赤痢菌（Shigella flexneri）のＯｍａ９０（Ａｃｃｎ．ＡＦ１２０９２７）；髄膜炎菌のＯｍｐ８５（Ａｃｃｎ．ＡＦ０２１２４５）；インフルエンザ菌（Ｄ１５）のＤ１５（Ａｃｃｎ．Ｕ６０８３４）；パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）のＯｍａ８７（Ａｃｃｎ．Ｕ６０４３９）のいずれかをコードしているポリヌクレオチド分子が含まれない。
【００８６】
本発明の分子のヌクレオチド配列は、好ましくは、約ｎｔ３６９５〜約ｎｔ６３８５の配列番号：１の分子との５０％を越える、より好ましくは、約９０％を越える、なおより好ましくは、約９５％を越える、そして最も好ましくは、約９９％を越える配列同一性を有する相同配列を含み、その配列同一性は、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム（GenBank, National Center for Biotechnology Information）の使用によって決定される。
【００８７】
もう一つの実施態様において、ポリヌクレオチドは、Ｌ．イントラセルラリスＯｍｐ１００タンパク質をコードしているヌクレオチド配列の長さの約５０％を越える相同配列を有する。もう一つの実施態様において、その配列は、Ｌ．イントラセルラリスＯｍｐ１００タンパク質をコードしているヌクレオチド配列の長さの９０％を越え、もう一つの実施態様においては約９８％を越える。なおもう一つの実施態様において、相同配列を有する単離されたポリヌクレオチドは、Ｌ．イントラセルラリスＯｍｐ１００タンパク質をコードしている配列と長さが等しい。
【００８８】
なおもう一つの実施態様において、Ｌ．イントラセルラリスＯｍｐ１００タンパク質をコードしている配列と相同であるヌクレオチド配列は、配列番号：５の配列に関して、挿入された、欠失したまたは置換された１〜５０個、より好ましくは、１〜２５個、そして最も好ましくは、１〜５個のヌクレオチドを有する。
【００８９】
本発明は、更に、相同という用語がＨｔｒＡタンパクに関して上に相応して記載されているように、Ｌ．イントラセルラリスＯｍｐ１００タンパク質と“相同”であるポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい実施態様において、相同ポリペプチドは、配列番号：５と少なくとも約５０％、より好ましくは、少なくとも約７０％、そしてなおより好ましくは、少なくとも約９０％の配列同一性、そして最も好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【００９０】
もう一つの実施態様において、ポリヌクレオチドは、挿入された、欠失したまたは置換された、それらの組合せを含めた１〜１０個、より好ましくは、１〜５個のアミノ酸を有するＬ．イントラセルラリスＯｍｐ１００タンパク質から成る単離されたポリペプチドをコードしている。この実施態様のより具体的な例において、そのポリヌクレオチドは、配列番号：５のＯｍｐ１００配列の代わりに保存的に置換された１〜５個のアミノ酸を有する単離されたポリペプチドをコードしている。
【００９１】
本発明は、更に、実質的な部分という用語がＨｔｒＡタンパクに関して上に相応して記載されているように、本発明の前述のローソニアＯｍｐ１００関連ポリヌクレオチド分子のいずれかの“実質的な部分” から成るポリヌクレオチド分子を提供する。
【００９２】
前述のＯｍｐ１００関連ポリヌクレオチド分子のいずれかのヌクレオチド配列に加えて、本発明のポリヌクレオチド分子は、自然にｏｍｐ１００  ＯＲＦに隣接するものまたはＬ．イントラセルラリスの現場の遺伝子より選択されるヌクレオチド配列を更に含むことができる、或いは、から成ることができ、配列番号：１に示される隣接するヌクレオチド配列を含む。
【００９３】
プロモーター配列
本発明は、プロモーター活性を有する且つ約ｎｔ２６９１〜約ｎｔ２８９０の配列番号：２内で見出される２０ヌクレオチドを越えるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子またはその補体にも関する。下記の実施例で更に論じられるように、ローソニア配列のこの領域は、ｈｔｒＡ遺伝子の温度反応性プロモーターを含有することが確認されている。好ましい実施態様において、そのポリヌクレオチドは、約ｎｔ２７９７〜ｎｔ２８２９の配列を含む。
【００９４】
本発明は、約ｎｔ２６９１〜約ｎｔ２８９０の配列番号：２内で見出される２０ヌクレオチドを越えるヌクレオチド配列の補体に、中程度のストリンジェントな条件下および、より好ましくは、高ストリンジェントな条件下においてハイブリッド形成する、プロモーター活性を有するオリゴヌクレオチドにも関する。好ましくは、プロモーター活性を有するそのオリゴヌクレオチドは、中程度のストリンジェントな条件下または高ストリンジェントな条件下において、約ｎｔ２７９７〜ｎｔ２８２９の配列を含むポリヌクレオチドの補体にハイブリッド形成する。もう一つの実施態様において、本発明は、約ｎｔ２６９１〜約ｎｔ２８９０である配列番号：２の配列に関して、挿入された、欠失したまたは置換された１〜２５個、最も好ましくは、１〜５個のヌクレオチドを有する、プロモーター活性を有するオリゴヌクレオチドを包含する。
【００９５】
本発明のプロモーター活性を有する機能的配列は、Ｌ．イントラセルラリスの宿主細胞中若しくは任意の他のローソニア種の宿主細胞中におけるまたは任意の他の適当な宿主細胞中における本発明の遺伝子のいずれかまたは他の遺伝子若しくはコーディング配列の組換え体発現の制御を含めた種々の目的に有用である。このような他の遺伝子またはコーディング配列は、天然でありうるかまたは組換え体宿主細胞に異種でありうる。そのプロモーター配列は、当該技術分野において知られているような標準的な組換え技術を用いて特定の遺伝子またはコーディング配列に融合させることができるので、そのプロモーター配列は、“機能的結合”が下記に定義されているように、それらと機能的に結合している。プロモーターを用いることにより、組換え体発現系は、例えば、ローソニアまたは他の細菌の遺伝子の発現を調節することができる化合物および転写因子についてスクリーニングするように構築し且つ用いることができる。更に、このようなプロモーター構築物は、ローソニア、大腸菌または他の適当な宿主細胞において異種ポリペプチドを発現させるのに用いることができる。
【００９６】
オリゴヌクレオチド分子
本発明は、更に、本発明の前述のポリヌクレオチド分子のいずれか一つにハイブリッド形成する、または本発明の前述のポリヌクレオチド分子のいずれか一つの補体であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチド分子を提供する。このようなオリゴヌクレオチド分子は、好ましくは、少なくとも約１０ヌクレオチド長さ、より好ましくは、約１５〜約３０ヌクレオチド長さであり、そして高ストリンジェントな条件下において、すなわち、６ｘＳＳＣ／０．５％ピロリン酸ナトリウム中において、約１４塩基オリゴについては約３７℃で、約１７塩基オリゴについては約４８℃で、約２０塩基オリゴについては約５５℃で、そして約２３塩基オリゴについては約６０℃で洗浄することにおいて前述のポリヌクレオチド分子の一つまたはそれ以上にハイブリッド形成する。本発明のより長いオリゴヌクレオチド分子のための他のハイブリダイゼーション条件は、標準的な技法を用いて当業者が決定することができる。好ましい実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチド分子は、本発明の前述のポリヌクレオチド分子の少なくとも一つの一部分に相補的である。
【００９７】
本発明のオリゴヌクレオチド分子は、例えば、鑑別疾病診断において用いるためのローソニア特異的ポリヌクレオチド分子の増幅におけるプライマーとして、または遺伝子調節において有用なアンチセンス分子として作用させることを含めた種々の目的に有用である。適当に設計されたプライマーは、脳組織、肺組織、腸組織、胎盤組織、血液、脳脊髄液、糞便、粘液、尿、羊水等を含めた動物の組織または体液の試料中のローソニア特異的ポリヌクレオチド分子の存在を検出するのに用いることもできる。オリゴヌクレオチド分子は、ローソニア微生物と特異的に反応するが、これは、概して、充分な長さの配列を用いることによって達成される。特異的増幅産物の生産は、ローソニア感染の診断を支持しうるが、増幅産物の欠如は、感染していないことを示すことができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅を行う方法は、特に、Innis ら（監修），1995，上記；および Erlich（監修），1992，上記に記載されている。当該技術分野において知られている他の増幅技術、例えば、リガーゼ連鎖反応は、代わりに用いることができる。本明細書中に開示されているポリヌクレオチド分子の配列は、ローソニアの他の種若しくは菌株または他の細菌細胞から相同遺伝子を単離する場合に用いるためのプライマーを設計するのに用いることもできる。
【００９８】
具体的ではあるが、本発明を実施するのに有用なオリゴヌクレオチド分子の非制限実施態様には、配列番号：１０〜１０１から成る群より選択されるオリゴヌクレオチド分子およびそれらの補体が含まれる。
【００９９】
組換え体発現系
クローニングベクターおよび発現ベクター
本発明は、更に、クローニングベクター、発現ベクター、それらベクターのいずれかを含む形質転換された宿主細胞、および新規菌株またはそれらに由来する細胞系を含めた、本発明のポリヌクレオチド分子のいずれかをクローニングするおよび発現させる方法および組成物を包含する。好ましい実施態様において、本発明は、Ｌ．イントラセルラリスのＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を含む組換え体ベクターを提供する。具体的な実施態様において、本発明は、ｐｏｎＡ遺伝子を含有するプラスミドｐＥＲ４３２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３５）、ｈｔｒＡ遺伝子を含有するプラスミドｐＥＲ４３４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３６）、ｈｙｐＣ遺伝子を含有するプラスミドｐＥＲ４３６（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３７）、ｌｙｓＳおよびｙｃｆＷ遺伝子を含有するプラスミドｐＴ０６８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−２２３２）、ｙｃｆＷおよびａｂｃ１遺伝子を含有するプラスミドｐＥＲ４３８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３８）、およびＯｍｐ１００遺伝子を含有するプラスミドｐＥＲ４４０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３９）を提供する。本発明は、本発明のポリペプチドを得るのに用いられる組換え体ベクターおよび形質転換された細胞も包含する。
【０１００】
本発明の組換え体ベクター、特に、発現ベクターは、好ましくは、本発明のポリヌクレオチド分子のコーディング配列が、ポリペプチドを生産するためのそのコーディング配列の転写および翻訳に必要な一つまたはそれ以上の調節因子と機能的に結合しているように構築される。本明細書中で用いられるように、“調節因子”という用語には、誘導性および非誘導性プロモーター、エンハンサー、オペレーター、リボソーム結合部位、およびポリヌクレオチドコーディング配列の発現を誘導するおよび／または調節するのに役立つ当該技術分野において知られている他の因子をコードするヌクレオチド配列が含まれるが、それらに制限されるわけではない。更に、本明細書中で用いられるように、そのコーディング配列は、一つまたはそれ以上の調節因子と“機能的に結合”していて、その場合、それら調節因子は、コーディング配列の転写またはそのｍＲＮＡの翻訳を効果的に調節し且つ可能にする。
【０１０１】
適当な調節因子と機能的に結合している特定のコーディング配列を含有する組換え体ベクターを構築する方法は当該技術分野において周知であり、これらを用いて本発明を実施することができる。これら方法には、in vitro 組換え技術、合成技術および in vivo 遺伝子組換えが含まれる。例えば、Maniatis ら，1989, 上記；Ausubel ら，1989, 上記；Sambrook ら，1989, 上記；Innis ら，1995, 上記；および Erlich，1992, 上記に記載された技術を参照されたい。
【０１０２】
特定のコーディング配列を含有する組換え体バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡおよびコスミドＤＮＡ発現ベクターを含めた、本発明のＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００コーディング配列を発現するのに用いることができる種々の発現ベクターは、当該技術分野において知られている。本発明のポリヌクレオチド分子を含有するように遺伝子操作することができる典型的な原核性発現ベクタープラスミドには、特に、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９（Biorad Laboratories, リッチモンド，ＣＡ）、ｐＰＬおよびｐＫＫ２２３（Pharmacia, ピスカタウェイ，ＮＪ）、ｐＱＥ５０（Qiagen, チャツワース，ＣＡ）、およびｐＧＥＭ−Ｔ  ＥＡＳＹ（Promega, マディソン，ＷＩ）が含まれる。本発明のポリヌクレオチド分子を含有するように遺伝子操作することができる典型的な真核性発現ベクターには、特に、エクジソン誘導性哺乳動物発現系（Invitrogen, カールズバット，ＣＡ）、サイトメガロウイルスプロモーター−エンハンサーに基づく系（Promega, マディソン，ＷＩ；Stratagene, ラ・ホヤ，ＣＡ；Invitrogen）およびバキュロウイルスに基づく発現系（Promega）が含まれる。
【０１０３】
これらおよび他のベクターの調節因子は、強度および特異性が異なることがありうる。用いられる宿主／ベクター系に依存して、多数の適当な転写因子および翻訳因子のいずれかを用いることができる。例えば、哺乳動物細胞系においてクローニングする場合、哺乳動物細胞のゲノムから単離されるプロモーター、例えば、マウスメタロチオネインプロモーター、またはこれら細胞中で成長するウイルスからの、例えば、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーターまたはモロニーマウス肉腫ウイルス長末端反復配列を用いることができる。組換えＤＮＡ技術または合成技術によって得られるプロモーターは、挿入される配列を転写させるのに用いることもできる。更に、ある種のプロモーターからの発現は、メタロチオネインプロモーターの特定の誘導物質、例えば、亜鉛イオンおよびカドミウムイオンの存在下において増加することがありうる。転写調節領域すなわちプロモーターの非制限例には、特に、細菌については、β−ｇａｌプロモーター、Ｔ７プロモーター、ＴＡＣプロモーター、λ左右プロモーター、ｔｒｐおよびｌａｃプロモーター、ｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーター等；酵母については、ＡＤＨ−Ｉおよび−IIプロモーター、ＧＰＫプロモーター、ＰＧＩプロモーター、ＴＲＰプロモーター等のような解糖酵素プロモーター；そして哺乳動物細胞については、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーターが含まれる。本発明は、更に、ローソニア、大腸菌または他の適当な宿主において本発明のコーディング配列のいずれかを発現させるのに用いることができる、Ｌ．イントラセルラリスのｈｔｒＡ遺伝子のプロモーターのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を提供する。
【０１０４】
特異的開始シグナルは、挿入されるコーディング配列の充分な翻訳にも必要である。これらシグナルには、典型的に、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接した配列が含まれる。それ自体の開始コドンおよび隣接した配列を含めた本発明のポリヌクレオチド分子を適当な発現ベクター中に挿入する場合、追加の翻訳調節シグナルは必要でないことがありうる。しかしながら、コーディング配列の一部分だけを挿入する場合、ＡＴＧ開始コドンを含めた外因性翻訳調節シグナルを必要とすることがありうる。これら外因性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然および合成両方の様々な源から入手することができる。更に、開始コドンは、インサート全体のインフレーム翻訳を確実にするために、コーディング領域の読み枠と同相でなければならない。
【０１０５】
本発明のタンパク質またはポリペプチドを含む融合タンパク質を発現するであろう発現ベクターも構築することができる。このような融合タンパク質は、例えば、ローソニアタンパク質に対する抗血清を生じさせるために、ローソニアタンパク質の生化学的性状を研究するために、異なった免疫学的または機能的性状を示すローソニアタンパク質を遺伝子操作するために、または組換えによって発現されるローソニアタンパク質の識別若しくは精製を助けるためにまたは安定性を向上させために用いることができる。可能な融合タンパク質発現ベクターには、β−ガラクトシダーゼおよびｔｒｐＥ融合、マルトース結合タンパク質融合（ｐＭａｌ系列；New England Biolabs）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合（ｐＧＥＸ系列；Pharmacia）、ポリヒスチジン融合（ｐＥＴ系列；Novagen Inc., マディソン，ＷＩ）、およびチオレドキシン融合（ｐＴｒｘＦｕｓ；Invitrogen, カールズバット，ＣＡ）をコードする配列を包含するベクターが含まれるが、それらに制限されるわけではない。これらおよび他の融合タンパク質をコードしている発現ベクターを構築する方法は、当該技術分野において周知である。
【０１０６】
融合タンパク質は、発現されるタンパク質の精製を助けるのに有用でありうる。非制限実施態様において、例えば、ＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００−マルトース結合融合タンパク質は、アミロース樹脂を用いて精製することができ；ＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質は、グルタチオン−アガロースビーズを用いて精製することができ；そしてＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００−ポリヒスチジン融合タンパク質は、二価のニッケル樹脂を用いて精製することができる。或いは、担体タンパク質またはペプチドに対する抗体を、融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製に用いることができる。例えば、単クローン性抗体の標的エピトープをコードするヌクレオチド配列は、発現されるエピトープが本発明のローソニアタンパク質に融合されるように、調節因子と機能的に結合している発現ベクター中に遺伝子操作し且つ配置することができる。非制限実施態様において、親水性マーカーペプチドであるＦＬＡＧＴＭエピトープ標識（International Biotechnologies Inc.）をコードするヌクレオチド配列は、ＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００タンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端に相当する地点の発現ベクター中に、標準的な技法によって挿入することができる。次に、発現されるＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００タンパク質−ＦＬＡＧＴＭエピトープ融合産物を、商業的に入手可能な抗ＦＬＡＧＴＭ抗体を用いて検出し且つアフィニティー精製することができる。
【０１０７】
発現ベクターは、特異的プロテアーゼ切断部位をコードするポリリンカー配列を含有するように遺伝子操作することもできるので、発現されるローソニアタンパク質は、特異的プロテアーゼを用いた処理によって担体領域または融合パートナーから解放されうる。例えば、融合タンパク質ベクターは、特に、トロンビンすなわちＸａ因子切断部位をコードしているヌクレオチド配列を含むことができる。
【０１０８】
ローソニアコーディング配列と同じ読み枠から上流のおよび中のシグナル配列は、発現されるタンパク質の輸送および分泌を支配するように、既知の方法によって発現ベクター中に遺伝子操作することができる。シグナル配列の非制限例には、特に、α因子、免疫グロブリン、外膜タンパク質、ペニシリナーゼおよびＴ細胞受容体からのものが含まれる。
【０１０９】
本発明の組換え体ベクターを用いて形質転換されるまたはトランスフェクションされる宿主細胞の選択を助けるために、そのベクターは、受容体遺伝子産物または他の選択可能マーカーのコーディング配列を更に含むように遺伝子操作することができる。このようなコーディング配列は、好ましくは、上記のように調節因子と機能的に結合している。本発明を実施する場合に有用である受容体遺伝子は、当該技術分野において周知であり、特に、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、グリーン蛍光タンパク質、ホタルルシフェラーゼおよびヒト成長ホルモンをコードしているものを含む。選択可能マーカーをコードしているヌクレオチド配列は、当該技術分野において周知であり、抗生物質または抗代謝産物への耐性を与える遺伝子産物をコードするもの、または栄養要求性を与えるものが含まれる。このような配列の例には、特に、チミジンキナーゼ活性、またはメトトレキセート、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン（zeocin）、ピリメタミン、アミノグリコシドまたはハイグロマイシンへの耐性をコードするものが含まれる。
【０１１０】
宿主細胞の形質転換
本発明は、更に、本発明のポリヌクレオチド分子または組換え体ベクターを含む形質転換された宿主細胞、およびそれらに由来する細胞株を提供する。本発明の実施において有用な宿主細胞は、真核性細胞または原核性細胞でありうる。このような形質転換された宿主細胞には、特に、組換え体バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡベクターを用いて形質転換された細菌、または組換え体ベクターを用いて形質転換された酵母のような微生物、または組換え体ウイルスベクター、例えば、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞のような動物細胞、または組換え体ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスまたはワクシニアウイルスに感染した哺乳動物細胞が含まれるが、それらに制限されるわけではない。例えば、大腸菌の菌株、例えば、ＡＴＣＣ，ロックビル，ＭＤ，米国から（受託番号３１３４３）またはＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，ゲイサーズバーグ，ＭＤから入手可能なＤＨ５α菌株などを用いることができる。真核性宿主細胞には、酵母細胞が含まれるが、哺乳動物、例えば、特に、マウス、ハムスター、乳牛、サルまたはヒトの細胞株からの細胞も有効に用いることができる。本発明の組換え体タンパク質を発現させるのに用いることができる真核性宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−６１）、ＮＩＨスイスマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３（例えば、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１６５８）および Madin-Darby ウシ腎（ＭＤＢＫ）細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−２２）が含まれる。トランスフェクションされた細胞は、染色体組込みによってまたはエピソームによって本発明のポリヌクレオチドを発現することができる。
【０１１１】
本発明の組換え体ベクターは、好ましくは、細胞の実質的に均一な培養の１種類またはそれ以上の宿主細胞中に形質転換されるまたはトランスフェクションされる。そのベクターは、概して、既知の技法によって、例えば、特に、プロトプラスト形質転換、リン酸カルシウム沈降、塩化カルシウム処理、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、組換えられたウイルスとの接触によるトランスフェクション、リポソームに媒介されるトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、形質導入、接合または微量発射衝撃（microprojectile bombardment）などによって宿主細胞中に導入される。形質転換細胞の選択は、組換え体発現ベクターと結合した選択可能マーカー、例えば、抗生物質耐性を発現する細胞について選択することによるなどの標準法によって行うことができる。
【０１１２】
発現ベクターが宿主細胞中に導入されたら、宿主細胞ゲノム中かまたはエピソームによる本発明のポリヌクレオチド分子の組込みおよび保持は、標準的な技法によって、例えば、サザンハイブリダイゼーション分析、制限酵素分析、逆転写酵素ＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含めたＰＣＲ分析、または予想されるタンパク質産物を検出する免疫学的検定によって確認することができる。本発明のポリヌクレオチド分子を含有するおよび／または発現する宿主細胞は、（ｉ）ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−アンチセンスＲＮＡハイブリダイゼーション；（ii）“マーカー”遺伝子機能の存在を検出すること；（iii）宿主細胞中の特異的ｍＲＮＡ転写物の発現によって測定される転写レベルを評価すること；または（iv）当該技術分野において知られているように、例えば、免疫検定によって成熟ポリペプチド産物の存在を検出することを含めた当該技術分野において周知である少なくとも四つの一般的なアプローチのいずれかによって識別することができる。
【０１１３】
組換え体ポリペプチドの発現および精製
本発明のポリヌクレオチド分子が適当な宿主細胞中に安定して導入されたら、その形質転換された宿主細胞をクローン増殖させ、そして得られた細胞を、コードされているポリペプチドの最大生産をもたらす条件下で成長させる。このような条件には、典型的に、形質転換された細胞を高密度まで成長させることが含まれる。発現ベクターが誘導性プロモーターを含む場合、適当な誘導条件、例えば、温度シフト、栄養素の消耗、無償性誘導物質（例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）などの炭水化物の類似体）の添加、過剰の代謝副産物の蓄積等のような条件を必要に応じて用いて発現を誘導する。
【０１１４】
ポリペプチドが宿主細胞内に保持されている場合、それら細胞を採取し、溶解させ、そしてその産物を、タンパク質分解を最小限にする当該技術分野において知られている抽出条件下において、例えば、４℃でまたはプロテアーゼインヒビターの存在下でまたはその両方などにおいてその溶解物から実質的に精製するまたは単離する。ポリペプチドが宿主細胞から分泌される場合、消耗した栄養培地を簡単に集め、そこからポリペプチドを実質的に精製するまたは単離することができる。
【０１１５】
ポリペプチドは、細胞溶解物または培地から、必要に応じて次の方法、すなわち、硫酸アンモニウム沈降、サイズ分画、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、密度遠心分離およびアフィニティークロマトグラフィーの一つまたはそれ以上が含まれるがそれらに制限されるわけではない標準法を用いて実質的に精製するまたは単離することができる。そのポリペプチドが生物学的活性を欠いている場合、それは、例えば、サイズ、またはポリペプチド特異的抗体との反応性に基づいて、または融合標識の存在によって検出することができる。本発明の実施において用いるためには、そのポリペプチドは、培養液中に分泌されているようにまたは細胞溶解物中に存在するように未精製の状態でありうるが、好ましくは、そこから実質的に精製されまたは単離される。本明細書中で用いられるように、ポリペプチドは、そのポリペプチドが特定の標品中の少なくとも約２０ｗｔ％のタンパク質を構成している場合、“実質的に精製”されている。更に、本明細書中で用いられるように、ポリペプチドは、そのポリペプチドが特定の標品中の少なくとも約８０ｗｔ％のタンパク質を構成している場合、“単離”されている。本発明のもう一つの実施態様において、そのタンパク質は、その天然の対応物がＬ．イントラセルラリス細胞溶解物の標品中で通常見出されるよりも少なくとも約１０００ｘ高い濃度で標品中に存在する。
【０１１６】
ポリペプチド
したがって、本発明は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる実質的に精製されたまたは単離されたポリペプチドを包含する。非制限実施態様において、そのポリペプチドは、ＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００のＬ．イントラセルラリスタンパク質である。好ましい実施態様において、Ｌ．イントラセルラリスＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００タンパク質は、配列番号：３〜８または配列番号：１０２のアミノ酸配列を有する。もう一つの実施態様において、それらポリペプチドは、他のローソニアタンパク質を実質的に含まない。
【０１１７】
本発明は、更に、“相同”という用語がポリペプチドに関して上に定義されているように、前述のＬ．イントラセルラリスタンパク質のいずれかに相同であるポリペプチドを提供する。本発明のタンパク質に相同である本発明のポリペプチドには、本明細書中に記載の非ローソニアタンパク質のアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれない。本発明のポリペプチドは、一つの実施態様において、ローソニアタンパク質との７０％を越える、より好ましくは、約９０％を越える、そして最も好ましくは、約９５％を越えるアミノ酸配列同一性を有し、その配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム（GenBank, ＮＣＢＩ）の使用によって決定される。
【０１１８】
もう一つの実施態様において、そのポリペプチドは、挿入された、欠失したまたは置換された、それらの組合せを含めた１〜１０個、より好ましくは、１〜５個のアミノ酸を有するＬ．イントラセルラリスＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００タンパク質から成る。この実施態様のより具体的な例において、単離されたポリペプチドは、ＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００タンパク質のアミノ酸配列中に保存的に置換された１〜５個のアミノ酸を有する。
【０１１９】
本発明は、更に、本発明の前述のポリペプチドのいずれか一つの実質的な部分から成るポリペプチドを提供する。本明細書中で用いられるように、本発明のポリペプチドの“実質的な部分”または“ペプチドフラグメント”とは、対応する完全長さポリペプチドの完全なアミノ酸配列より少ないアミノ酸配列から成るが、そのアミノ酸配列の少なくとも約５％、より好ましくは、少なくとも約２０％、なおより好ましくは、少なくとも約５０％、そして最も好ましくは、少なくとも約９５％を含むポリペプチドを意味し、それは本発明の実施において有用である。特に好ましいのは、免疫原性である、すなわち、対応する完全長のローソニアポリペプチドに対して特異的に反応する抗体の生産をもたらす免疫応答を引き起こすことができるペプチドフラグメントである。
【０１２０】
もう一つの実施態様において、本発明のポリペプチドは、抗ローソニア抗体と特異的に反応性であるＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００タンパク質のエピトープを含む。そのエピトープは、好ましくは、そのタンパク配列の８個を越える、より好ましくは、１２個を越える、そして最も好ましくは、２０個を越えるアミノ酸である。
【０１２１】
本発明は、更に、当該技術分野において知られている担体または融合パートナーに融合した本発明のポリペプチドのいずれかを含む融合タンパク質を提供する。
本発明は、更に、上記のポリペプチドのいずれかを製造する方法であって、組換え体発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞を培養し、その組換え体発現ベクターは、特定のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含み、そのポリヌクレオチド分子は、ポリペプチドの発現をもたらす条件下において一つまたはそれ以上の調節因子と機能的に結合していて、そして発現されたポリペプチドを細胞培養物から回収することを含む上記方法を提供する。
【０１２２】
ポリペプチドの使用
充分な純度の本発明のポリペプチドが得られたら、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー、アミノ酸配列分析、免疫学的活性、生物学的活性等を含めた標準法によってそれを特性決定することができる。そのポリペプチドを、親水性分析（例えば、Hopp および Woods, 1981, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:3824 を参照されたい）または類似のソフトウェアアルゴリズムを用いて更に特性決定して、疎水性および親水性領域を決定することができる。構造分析は、特異的二次構造をとるポリペプチドの領域を決定するように行うことができる。Ｘ線結晶学（Engstrom, 1974, Biochem.Exp.Biol. 11:7-13）、計算機モデル化（Fletterick および Zoller（監修），1986，Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, コールド・スプリング・ハーバー，ＮＹ中）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）などの生物物理学的方法は、ポリペプチドと他の推定上の相互作用性タンパク質／受容体／分子との可能な相互作用部位を地図に示し且つ研究するのに用いることができる。これら研究から得られる情報を用いて、欠失突然変異体およびワクチン組成物を設計することができるし、そしてそのポリペプチドの生物学的機能を in vivo で特異的に阻止しうる治療的または薬理学的化合物を設計するまたは選択することができる。
【０１２３】
本発明のポリペプチドは、ＰＰＥ感受性動物をＰＰＥから保護するワクチン組成物の成分として；または例えば、ＥＬＩＳＡ検定などの標準的な技法を用いて、動物からの血液または血清試料中のローソニア特異的抗体についてスクリーニングするための診断用試薬として；または例えば、ウェスタンブロット検定のような標準的な技法を用いて、動物からの細胞、組織または体液試料中のローソニア特異的タンパク質についてスクリーニングするための診断用試薬として有用である多クローン性または単クローン性抗体を下記のように生じさせる抗原としてを含めた種々目的に有用である。
【０１２４】
ポリペプチドの類似体および誘導体
本発明のポリペプチドは、その生物学的または免疫学的特性を向上させるようにまたは他の点では変化させるようにタンパク質レベルで修飾することができる。ポリペプチドの一つまたはそれ以上の化学修飾は、次のいずれか、すなわち、ポリペプチドの１個またはそれ以上のアミノ酸を、例えば、カルバゼートまたは第三中心を生じるように、該当するＤ−アミノ酸、アミノ酸類似体またはアミノ酸模擬体で置換すること；または、例えば、トリプシン、キモトリプシン、パパインまたはＶ８プロテアーゼを用いたタンパク質分解切断、またはＮａＢＨ４または臭化シアンを用いた処理、またはアセチル化、ホルミル化、酸化または還元等のような特異的化学修飾が含まれるがそれらに制限されるわけではない既知の技法を用いて行って、そこから類似体を製造することができる。或いは、または更に、本発明のポリペプチドは、遺伝子組換え技術によって修飾することができる。
【０１２５】
本発明のポリペプチドは、アセチル基、硫黄橋架け基、グリコシル基、脂質およびリン酸塩が含まれるがそれらに制限されるわけではない１個またはそれ以上の化学基のそれへの結合によって、および／または本発明の別のポリペプチド、または別のタンパク質、例えば、血清アルブミン、スカシガイのヘモシアニンまたは商業的に活性化されたＢＳＡなど、またはポリアミノ酸（例えば、ポリリシン）、または多糖（例えば、セファロース、アガロース、または修飾または非修飾セルロース）への結合によって誘導体化することができる。このような結合は、好ましくは、そのポリペプチドのアミノ酸側鎖および／またはＮ末端若しくはＣ末端における共有結合による。このような結合反応を行う方法は、当該タンパク質化学分野において周知である。
【０１２６】
請求の範囲に記載の発明を実施する場合に有用な誘導体には、例えば、ポリエチレングリコールのような水溶性ポリマーが本発明のポリペプチドまたはその類似体若しくは誘導体に結合することによって、そのポリペプチドの免疫原性を少なくとも一部分は維持しながら、追加の望ましい性状を与えているものも含まれる。これら追加の望ましい性状には、例えば、水溶液中での増加した溶解性、増加した貯蔵安定性、タンパク質分解脱水への増加した耐性および増加した in vivo 半減期が含まれる。本発明のポリペプチドへの結合に適した水溶性ポリマーには、ポリエチレングリコールホモポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマーが含まれるがそれらに制限されるわけではなく、ここにおいて、それらホモポリマーおよびコポリマーは、非置換であるかまたは、アルキル基、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖、ポリビニルエチルエーテルおよびα，β−ポリ［２−ヒドロキシエチル］−ＤＬ−アスパルトアミドで一方の末端に置換されている。ポリエチレングリコールが特に好ましい。ポリペプチドの水溶性ポリマー結合体を製造する方法は、当該技術分野において周知であり、特に、米国特許第３，７８８，９４８号；米国特許第３，９６０，８３０号；米国特許第４，００２，５３１号；米国特許第４，０５５，６３５号；米国特許第４，１７９，３３７号；米国特許第４，２６１，９７３号；米国特許第４，４１２，９８９号；米国特許第４，４１４，１４７号；米国特許第４，４１５，６６５号；米国特許第４，６０９，５４６号；米国特許第４，７３２，８６３号；米国特許第４，７４５，１８０号；欧州特許（ＥＰ）第１５２，８４７号；ＥＰ９８，１１０号；および日本国特許第５，７９２，４３５号に記載されており、それら特許は本明細書中に援用される。
【０１２７】
抗体
本発明は、更に、本発明のポリペプチドに対して向けられる単離された抗体を提供する。好ましい実施態様において、抗体は、既知の方法を用いて、Ｌ．イントラセルラリスからのＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００タンパク質に対して生じさせることができる。ブタ、乳牛、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジまたはマウスより選択される種々の宿主動物は、部分的に若しくは実質的に精製されたまたは単離されたＬ．イントラセルラリスタンパク質を用いて、または上に記載されているようなその同族体、融合タンパク質、実質的な部分、類似体または誘導体を用いて免疫感作することができる。下記のようなアジュバントは、抗体産生を促進するのに用いることができる。
【０１２８】
多クローン性抗体は、免疫感作された動物の血清から得られ且つ単離され、抗原に対する特異性について標準的な技法を用いて調べることができる。或いは、単クローン性抗体は、培養中の連続的継代細胞系によって抗体分子を産生させる任意の技法を用いて製造し且つ単離することができる。これらには、Kohler および Milstein（Nature, 1975,256:495-497）によって最初に記載されたハイブリドーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor ら，1983, Immunology Today 4:72；Cote ら，1983, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2026-2030）；およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole ら，1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss,Inc., 77-96頁）が含まれるがそれらに制限されるわけではない。或いは、単鎖抗体の産生について記載された技法（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照されたい）を、Ｌ．イントラセルラリス抗原特異的単鎖抗体を生じるように適応することができる。これら公報は、本明細書中に援用される。
【０１２９】
本発明のポリペプチドに特異的な結合部位を含有する抗体フラグメントは、本発明の範囲内にも包含され、既知の技法によって生じさせることができる。このようなフラグメントには、自然のままの抗体分子のペプシン消化によって生じることができるＦ（ａｂ’）２フラグメント、およびそのＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生じることができるＦａｂフラグメントが含まれるがそれらに制限されるわけではない。或いは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して（Huse ら，1989, Science 246:1275-1281）、Ｌ．イントラセルラリスタンパク質への所望の特異性を有するＦａｂフラグメントの迅速な識別を可能にすることができる。
【０１３０】
単クローン性抗体および抗体フラグメントの産生および単離の技術は、当該技術分野において周知であり、特に、Harlow および Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory に、および J.W.Goding, 1986, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, ロンドンに更に記載されており、それらは本明細書中に援用される。
【０１３１】
ローソニア遺伝子の標的突然変異
本発明のポリヌクレオチド分子の開示に基づいて、ローソニアｈｔｒＡ、ｐｏｎＡ、ｌｙｓＳ、ｙｃｆＷ、ｈｙｐＣ、ａｂｃ１またはｏｍｐ１００遺伝子（その遺伝子を、以下、“ローソニア遺伝子”と称する）を無能力にするまたはそれ以外の場合は突然変異させる場合に用いるための遺伝子構築物を製造することができる。そのローソニア遺伝子は、適当に設計される遺伝子構築物を用いて突然変異させることができる。例えば、ローソニア遺伝子は、（ａ）ローソニア遺伝子のコーディング配列または調節配列の全部または一部分を欠失する；または（ｂ）ローソニア遺伝子のコーディング配列または調節配列の全部または一部分を別のヌクレオチド配列で置き換える；または（ｃ）ローソニア遺伝子のコーディング配列または調節配列中に、ローソニアからのまたは異種源からのヌクレオチド配列を含むことができる１個またはそれ以上のヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド分子、またはポリヌクレオチド分子を挿入する；または（ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいくつかの組合せを行うように機能する本発明の遺伝子構築物を用いて突然変異させることができる。或いは、構築物を用いて、ローソニア遺伝子の発現またはそのコードされているタンパク質の安定性を変化させることができる。
【０１３２】
ローソニア遺伝子が突然変異しているローソニア細胞は、例えば、その遺伝子の突然変異が、突然変異した遺伝子を有するローソニア細胞の病原性を、そのように遺伝子が突然変異していない同じローソニア菌株の細胞と比較して減少させる場合、および無能力にされた遺伝子を有するこのようなローソニア細胞をワクチン組成物中で、特に、修飾生ワクチン中で用いて、ＰＰＥに対する動物の防御応答を誘導するまたはその誘導に寄与することができる場合、本発明の実施において有用である。好ましい実施態様において、その突然変異は、ローソニア遺伝子を部分的にまたは完全に無能力にする、またはローソニア遺伝子によってコードされるタンパク質を部分的にまたは完全に無能力にするのに役立つ。この場合、ローソニア遺伝子またはタンパク質は、タンパク質産物が生産されていない（例えば、遺伝子が欠失している）かまたは、その通常の生物学的機能をもはや有することができない若しくはその通常の細胞の場所にもはや輸送され得ないタンパク質産物が生産される、またはその通常の生物学的機能は有するが、有意に低下した速度で生産物が生産される場合、部分的にまたは完全に無能力にされていると考えられる。ローソニア遺伝子が突然変異しているローソニア細胞は、その遺伝子の発現またはそのコードされるタンパク質の安定性を増加させるのにも有用である。病原性ローソニア菌株の細胞の病原性を検出可能に減少させる突然変異は、特に有用である。本発明は、本発明のタンパク質およびポリペプチドを発現する細胞が構成的突然変異体である場合、このような細胞も包含する。
【０１３３】
非制限実施態様において、本発明の遺伝子構築物は、野生型遺伝子のコーディング配列またはそのプロモーター若しくは他の調節領域、またはその一部分を、例えば、突然変異したコーディング配列若しくは突然変異した調節領域またはその一部分のような別のヌクレオチド配列で置き換えることによって、野生型ローソニア遺伝子を突然変異させるのに用いられる。このような遺伝子構築物中で用いるための突然変異したローソニア遺伝子配列は、誤りがちの（error-prone）ＰＣＲの使用またはカセット突然変異誘発を含めた種々の既知の方法のいずれかによって生じることができる。例えば、オリゴヌクレオチドに支配された突然変異誘発は、野生型ローソニア遺伝子のコーディング配列またはプロモーター配列を一定方法で変化させるのに、例えば、その配列内の特定の地点にフレームシフトまたは終止コドンを導入するのに用いることができる。或いは、または更に、本発明の遺伝子構築物中で用いるための突然変異したヌクレオチド配列は、そのコーディング配列またはプロモーター配列の１個またはそれ以上のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド分子またはポリヌクレオチド分子の挿入または欠失によって、またはそのコーディング配列またはプロモーター配列の一部分の、１個またはそれ以上の別のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド分子またはポリヌクレオチド分子を用いた置換によって製造することができる。このようなオリゴヌクレオチド分子またはポリヌクレオチド分子は、任意の天然に存在する源から得ることができるしまたは合成でありうる。挿入されるまたは欠失する配列は、ローソニア遺伝子の読み枠を簡単に破壊するのに役立ちうるし、または選択可能マーカーのような異種遺伝子産物を更にコードすることができる。
【０１３４】
或いは、または更に、ランダム突然変異誘発を用いて、本発明の遺伝子構築物中で用いるための突然変異したローソニア遺伝子配列を生じることができる。ランダム突然変異誘発は、任意の適当な技法によって、例えば、ローソニア遺伝子を有する細胞を紫外線またはｘ線に、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン、スルホン酸エチルメタン、亜硝酸またはナイトロジェンマスタードのような化学的突然変異誘発物質に暴露した後、特定の遺伝子に突然変異を有する細胞について選択することなどによって行うことができる。突然変異誘発技術の概説については、例えば、Ausubel, 1989, 上記を参照されたい。
【０１３５】
本発明の実施において有用である修飾されたローソニア細胞を生じる突然変異は、ＯＲＦ中、プロモーター配列または他の調節領域中、または遺伝子若しくはＯＲＦを天然に含むまたは遺伝子の発現若しくはそのコードされるタンパク質の安定性を変化させる任意の他の配列中を含めたローソニア遺伝子中のどこでも起こりうる。このようなローソニア細胞には、ローソニア遺伝子によって通常コードされるタンパク質の修飾型が生産される、またはローソニア遺伝子によって通常コードされるタンパク質が生産されない突然変異体が含まれ、ヌル（ｎｕｌｌ）、条件的、構成的または漏出性の突然変異体でありうる。
【０１３６】
或いは、本発明の遺伝子構築物は、ローソニア遺伝子またはＯＲＦにその場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で自然に隣接するヌクレオチド配列を含むことができ、遺伝子それ自体のコーディング領域からのヌクレオチド配列を一部分だけ含むまたは全く含まない。このような遺伝子構築物は、例えば、ローソニア遺伝子全体またはＯＲＦを欠失するのに有用であると考えられる。
【０１３７】
一つの実施態様において、本発明の遺伝子構築物は、ローソニア遺伝子を無能力にするのに用いることができるポリヌクレオチド分子であって、（ａ）Ｌ．イントラセルラリスからのＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００タンパク質をコードしているヌクレオチド配列と他の点では同様であるヌクレオチド配列を有するが、そのヌクレオチド配列が、一つまたはそれ以上の無能力にする突然変異を更に含むポリヌクレオチド分子；または（ｂ）ローソニア遺伝子のＯＲＦに現場で自然に隣接するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含むものを含む。ローソニア菌株の細胞中にいったん形質転換されたら、その遺伝子構築物のポリヌクレオチド分子は、相同的組換えによって特定のローソニア遺伝子に特異的に集中し、それによって、その遺伝子若しくはその一部分を置換するかまたはその遺伝子中に挿入される。この組換え現象の結果として、その特定のローソニア菌株にとって他の点では本来のローソニア遺伝子が無能力にされる。
【０１３８】
もう一つの実施態様において、遺伝子構築物は、例えば、ＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００タンパク質を構成的に発現することまたは過発現することによって発現を変化させる突然変異に用いられる。このような突然変異は、例えば、宿主細胞を衰弱させるのに有用でありうる。その構築物は、タンパク質の安定性を増加させる突然変異を用いて、例えば、宿主細胞を弱毒化することもできる。
【０１３９】
相同的組換えによる標的遺伝子突然変異に関して、その遺伝子構築物は、好ましくは、上記のような突然変異したヌクレオチド配列を含む環状かまたは線状のプラスミドである。非制限実施態様において、突然変異した配列の少なくとも約２００ヌクレオチドを用いて、相同的組換えのための特定の標的ローソニア遺伝子に本発明の遺伝子構築物を特異的に向けるが、より短いヌクレオチド長さも有効でありうる。更に、そのプラスミドは、好ましくは、破壊される天然のローソニア遺伝子の調節因子配列と機能的に結合しているローソニアゲノム中に挿入されるように構築される、リポーター遺伝子産物または他の選択可能マーカーをコードしている追加のヌクレオチド配列を含む。本発明の実施において用いることができるリポーター遺伝子は、当該技術分野において周知であり、特に、ＣＡＴ、グリーン蛍光タンパク質およびβ−ガラクトシダーゼをコードしているものが含まれる。選択可能マーカーをコードしているヌクレオチド配列も、当該技術分野において周知であり、抗生物質または抗代謝産物への耐性を与える遺伝子産物をコードするもの、または栄養要求性を与えるものが含まれる。このような配列の例には、ピリメタミン耐性、またはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（アミノグリコシドへの耐性を与える）、またはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ハイグロマイシンへの耐性を与える）をコードするものが含まれる。
【０１４０】
本発明の遺伝子構築物を生じるのに用いることができる方法は、当該技術分野において周知であり、特に、Maniatis ら，1989, 上記；Ausubel ら，1989, 上記；Sambrook ら，1989, 上記；Innis ら，1995, 上記；および Erlich，1992, 上記に記載のような、in vitro 組換え技術、合成技術および in vivo 遺伝子組換えが含まれる。
【０１４１】
ローソニア細胞は、既知の技法にしたがって、例えば、エレクトロポレーションなどによって本発明の遺伝子構築物を用いて形質転換することができるしまたはトランスフェクションすることができる。形質転換細胞の選択は、その構築物と結合した選択可能マーカーを発現する細胞について選択することなどによる標準的な技法を用いて行うことができる。満足すべき組換え現象が起こっているおよび特定の標的遺伝子が変更されている形質転換細胞の識別は、サザンブロット分析、または特定のタンパク質をコードしているｍＲＮＡ転写物が無いことを検出するノーザンブロット分析などによる遺伝分析によって、または例えば、免疫学的分析、減少した病原性のような新規表現型の出現、ＰＣＲ検定またはそれらのいくつかの組合せで確認されるような特定のタンパク質を欠いている細胞によって行うことができる。
【０１４２】
更に別の非制限実施態様において、本発明の遺伝子構築物は、ローソニアからのまたは動物に感染する別の病原体からの別の遺伝子またはコーディング領域を更に含むことができ、その遺伝子またはコーディング領域は、本発明の修飾されたローソニア生細胞を用いたワクチン接種によって動物において別々の且つ異なった防御免疫応答を誘導するまたはその誘導に寄与するのに有用な抗原をコードしている。この追加の遺伝子またはコーディング領域は、修飾されたローソニア生細胞からのコードされる抗原の分泌をもたらし、それによって、ワクチン接種された動物の免疫系に抗原を提示させるシグナル配列を含有するように更に遺伝子操作することができる。
【０１４３】
本発明は、したがって、ｈｔｒＡ、ｐｏｎＡ、ｈｙｐＣ、ｌｙｓＳ、ｙｃｆＷ、ａｂｃ１またはｏｍｐ１００遺伝子が突然変異している修飾されたローソニア生細胞を提供する。更に、本発明は、修飾されたローソニア生細胞を製造する方法であって、（ａ）本発明の遺伝子構築物を用いてローソニア細胞を形質転換し；（ｂ）その遺伝子構築物によってｈｔｒＡ、ｐｏｎＡ、ｈｙｐＣ、ｌｙｓＳ、ｙｃｆＷ、ａｂｃ１またはｏｍｐ１００遺伝子が突然変異している形質転換された細胞を選択し；そして（ｃ）工程（ｂ）の細胞の中から、ＰＰＥ感受性動物をＰＰＥから防御するワクチン中で用いることができる細胞を選択することを含む上記方法を提供する。本発明は、このような修飾されたローソニア細胞から製造される死滅細胞組成物も包含する。
【０１４４】
ローソニア細菌の培養
本発明において用いるためのローソニア細菌は、例えば、Joens ら，1997, Am.J.Vet.Res. 58:1125-1131; Lawson ら，1993, Journal of Clinical Microbiology 31:1136-1142; および McOrist ら，1995, 上記に記載の方法を用いて、in vitro で培養し且つ維持することができる。
【０１４５】
抗ローソニアワクチン
本発明は、更に、本発明のタンパク質またはポリペプチドの免疫学的有効量および薬学的に許容しうる担体を含む、ＰＰＥに対するワクチンを提供する。好ましい実施態様において、そのワクチンは、ＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００のＬ．イントラセルラリスタンパク質を含む。
【０１４６】
本発明は、更に、本発明の１種類またはそれ以上のポリヌクレオチド分子の免疫学的有効量および薬学的に許容しうる担体を含む、ＰＰＥに対するワクチンを提供する。好ましい実施態様において、そのワクチンは、Ｌ．イントラセルラリスＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００をコードしているヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を含む。
【０１４７】
本発明は、更に、本発明の修飾されたローソニア細菌の免疫学的有効量および薬学的に許容しうる担体を含む、ＰＰＥに対するワクチンを提供する。一つの実施態様において、本発明のワクチン中で用いるための修飾されたローソニア細胞は、ＨｔｒＡ−、ＰｏｎＡ−、ＨｙｐＣ−、ＬｙｓＳ−、ＹｃｆＷ−、ＡＢＣ１−またはＯｍｐ１００−表現型を発現するＬ．イントラセルラリス生細菌である。或いは、本発明のワクチンは、失活している本発明のこのような修飾されたローソニア細胞のいずれかを含むことができる。修飾されたローソニア細胞の失活は、二元エチレンイミン（ＢＥＩ）またはβ−プロピオラクトンまたはホルムアルデヒドなどを用いた化学的処理による、凍結融解または熱処理による、または細胞のホモジナイゼーションによる、或いはこれら種類の技法の組合せによることを含めた当該技術分野において知られているいずれの技法を用いても行うことができる。均一化され修飾されたローソニア細胞から製造されるワクチンは、未分画の細胞ホモジネートそのままかまたはその免疫学的に有効な部分画分から成りうる。
【０１４８】
本明細書中で用いられるように、“免疫学的有効量”という用語は、ＰＰＥ感受性動物種のメンバーに投与された場合、１回投与後かまたは多数投与後に、ＰＰＥに対する防御応答を誘導することができる抗原、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド分子または修飾された細胞の量を意味する。
【０１４９】
“防御応答を誘導することができる”という句は、ワクチン接種された動物をＰＰＥから防御するのに役立つ抗体かまたは細胞または両方に媒介される免疫応答を含めたワクチン接種に応答した動物の任意の免疫に基づく応答の誘導または促進を含むように本明細書中において広義に用いられる。本明細書中で用いられる“防御応答”および “防御する”という用語は、ＰＰＥの完全な予防またはローソニアによる感染の完全な予防のみならず、このような病原体による感染度または率の任意の検出可能な減少、または例えば、ワクチン接種された動物において同種のワクチン接種されていない感染動物と比較される、１種類またはそれ以上の組織で形成される病変の形成速度若しくは絶対数または他の動物への伝染の任意の検出可能な減少を含めた、その病原体による感染によって生じる疾患または任意の症状若しくは状態の重症度の任意の検出可能な減少も意味する。
【０１５０】
更に好ましい実施態様において、本発明のワクチンは、ＰＰＥ感受性動物をＰＰＥおよび場合により、その動物を苦しめることがありうる１種類またはそれ以上の他の疾患または病理学的状態から防御する組合せワクチンであり、その組合せワクチンは、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド分子または修飾されたローソニア細胞を含む第一成分の免疫学的有効量；その第一成分とは異なり、しかもＰＰＥ感受性動物を苦しめることがありうる疾患または病理学的状態に対する防御応答を誘導することができるまたはその誘導に寄与することができる第二成分の免疫学的有効量；および薬学的に許容しうる担体を含む。
【０１５１】
組合せワクチンの第二成分は、当該技術分野において知られているように、ＰＰＥかまたは適切な種のメンバーを苦しめることがありうる疾患または病理学的状態に対する防御応答を誘導するまたはその誘導に寄与する能力に基づいて選択される。特定の種におけるワクチン組成物中で有用である抗原性成分は、組合せワクチンの第二成分として用いることができる。このような抗原性成分には、レプトスピラ属（Leptospira）種、カンピロバクター属（Campylobacter）種、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis）、マイコプラズマ属（Mycoplasma）種、クレブシエラ属（Klebsiella）種、サルモネラ属（Salmonella）種、ロタウイルス、コロナウイルス、狂犬病、パスツレラ・ヘモリティカ（Pasteurella hemolytica）、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）、クロストリジウム属（Clostridia）種、破傷風トキソイド、大腸菌、クリプトスポリジウム属（Cryptosporidium）種、アイメリア属（Eimeria）種、トリコモナス属（Trichomonas）種、セルプリナ（ブラキスピラ）・ヒオディセンテリエ（Serpulina (Brachyspira) hyodysenteriae）、アクチノバチルス・プレウロニューモニエ（Actinobacillus pleuropneumoniae）、アクチノバチルス・スイス（Actinobacillus suis）、ブタコレラ菌（Salmonella cholerasuis）、ブタ丹毒菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）、レプトスピラ属（Leptospira）種、スタフィロコッカス・ヒイクス（Staphylococcus hyicus）、ヘモフィルス・パラスイス（Haemophilus parasuis）、気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）、マイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Mycoplasma hyopneumoniae）、ブタの生殖および呼吸症候群ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタ免疫欠損ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタのパルボウイルス、脳心筋炎ウイルス、コロナウイルス、仮性狂犬病ウイルス、シルコウイルスおよび他の真核性寄生生物から成る群より選択される病原体に対する防御を与えるものが含まれるがそれらに制限されるわけではない。
【０１５２】
一つの実施態様において、本発明の組合せワクチンは、本発明のタンパク質またはポリペプチドの免疫学的有効量、本発明のポリヌクレオチド分子の免疫学的有効量、および本発明の修飾されたローソニア細胞の免疫学的有効量から成る群より選択される２種類またはそれ以上の成分の組合せを含む。
【０１５３】
本発明のワクチンは、例えば、下記のようなアジュバントまたはサイトカインを含めた１種類またはそれ以上の追加の免疫調節性成分を更に含むことができる。
本発明は、更に、ＰＰＥに対するワクチンを製造する方法であって、免疫学的有効量の本発明のＬ．イントラセルラリスタンパク質またはポリペプチド、またはポリヌクレオチド分子、または修飾されたローソニア細胞を、ＰＰＥ感受性動物への投与に適した形で薬学的に許容しうる担体と組み合わせることを含む上記方法を提供する。好ましい実施態様において、そのタンパク質は、Ｌ．イントラセルラリスのＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００であり、ポリヌクレオチド分子は、好ましくは、Ｌ．イントラセルラリスのＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含み、そして修飾されたローソニア細胞は、ＨｔｒＡ−、ＰｏｎＡ−、ＨｙｐＣ−、ＬｙｓＳ−、ＹｃｆＷ−、ＡＢＣ１−またはＯｍｐ１００−表現型を有する。
【０１５４】
本発明の修飾されたローソニア生細胞を含むワクチンは、そのローソニア細胞を培地中に遊離した状態かまたは哺乳動物宿主細胞中に残した状態で含有する培養液のアリコートを用いて製造することができるし、ＰＰＥ感受性動物に直接的にまたは濃縮した形で投与することができる。或いは、修飾されたローソニア生細胞は、当該技術分野において知られているものより選択される且つ選択された投与経路に適当な免疫調節性物質を用いてまたは用いることなく、薬学的に許容しうる担体と組み合わせることができ、好ましくは、そこで、ワクチン組成物中の修飾されたローソニア生細胞の少なくともある程度の生存度が維持される。
【０１５５】
本発明のワクチン組成物は、標準的な緩衝剤、安定化剤、希釈剤、保存剤および／または可溶化剤のような薬学的に許容しうる担体を含むように承認された慣例にしたがって製剤化することができるし、徐放を容易にするように製剤することもできる。希釈剤には、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール等が含まれる。等張性のための添加剤には、特に、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースが含まれる。安定化剤には、特に、アルブミンが含まれる。調整生ワクチンを製剤する場合に特に有用であるものを含めた適当な他のワクチン用ビヒクルおよび添加剤は、知られているしまたは当業者に明らかであろう。例えば、本明細書中に援用される Remington's Pharmaceutical Science, 第18巻，1990, Mack Publishing を参照されたい。
【０１５６】
本発明のワクチンは、更に、例えば、特にアジュバントまたはサイトカインのような１種類またはそれ以上の追加の免疫調節性成分を含むことができる。本発明のワクチン中で用いることができるアジュバントの非制限例には、ＲＩＢＩアジュバント系（Ribi Inc., ハミルトン，ＭＴ）、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲルのようなミネラルゲル、水中油エマルジョン、油中水エマルジョン、例えば、フロイントの完全および不完全アジュバントなど、Block コポリマー（CytRx，アトランタ，ＧＡ）、ＱＳ−２１（Cambridge Biotech Inc., ケンブリッジ，ＭＡ）、ＳＡＦ−Ｍ（Chiron, エメリービル，ＣＡ）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、Quil Ａまたは他のサポニン画分、モノホスホリルリピドＡ、Avridine リピド−アミンアジュバント、およびコレラ菌（Vibrio cholera）毒素および大腸菌不安定毒素などのタンパク質アジュバントが含まれる。本発明のワクチン中で有用な水中油エマルジョンの具体的な非制限例には、修飾されたＳＥＡＭ６２およびＳＥＡＭ１／２製剤が含まれる。修飾ＳＥＡＭ６２は、５％（ｖ／ｖ）スクアレン（Sigma）、１％（ｖ／ｖ）ＳＰＡＮ（登録商標）８５デタージェント（ＩＣＩ Surfactants）、０．７％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０デタージェント（ＩＣＩ Surfactants）、２．５％（ｖ／ｖ）エタノール、２００μｇ／ｍｌ  Quil Ａ、１００μｇ／ｍｌコレステロールおよび０．５％（ｖ／ｖ）レシチンを含有する水中油である。修飾ＳＥＡＭ１／２は、５％（ｖ／ｖ）スクアレン、１％（ｖ／ｖ）ＳＰＡＮ（登録商標）８５デタージェント、０．７％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ８０デタージェント、２．５％（ｖ／ｖ）エタノール、１００μｇ／ｍｌ  Quil Ａおよび５０μｇ／ｍｌコレステロールを含む水中油である。ワクチン中に含まれうる他の免疫調節性物質には、例えば、１種類またはそれ以上のインターロイキン、インターフェロンまたは他の既知のサイトカインが含まれる。ワクチンが修飾されたローソニア生細胞を含む場合、アジュバントは、好ましくは、得られたワクチン製剤がその修飾されたローソニア生細胞の生存率を少なくともある程度維持するその能力に基づいて選択される。
【０１５７】
ワクチン組成物がポリヌクレオチド分子を含む場合、そのポリヌクレオチド分子は、ＤＮＡかまたはＲＮＡでありうるが、ＤＮＡが好適であり、そして好ましくは、当該技術分野において知られているように、組換え体プラスミドまたはウイルスベクターのような発現ベクター構築物中で、ＰＰＥから防御されるＰＰＥ感受性動物に投与される。組換え体ウイルスベクターの例には、組換え体アデノウイルスベクターおよび組換え体レトロウイルスベクターが含まれる。ワクチン製剤は、ＤＮＡプラスミドに基づくベクターのような非ウイルスＤＮＡベクターも含むことができる。ポリヌクレオチド分子は、脂質と結合して、例えば、リポソームまたはコクレイト（cochleates）のようなＤＮＡ−脂質複合体を形成してよい。例えば、国際特許公開ＷＯ９３／２４６４０号を参照されたい。
【０１５８】
ＤＮＡワクチン中のワクチン物質として有用な発現ベクターは、好ましくは、当該技術分野において知られているように、例えば、プロモーター配列などの真核性細胞中でのローソニアコーディング配列の発現に必要な一つまたはそれ以上の転写調節因子と機能的に結合している１種類またはそれ以上の抗原性ローソニアタンパク質をコードしているヌクレオチド配列、またはそのようなヌクレオチド配列の実質的な部分を含む。好ましい実施態様において、その調節因子は、例えば、ＲＳＶまたはＣＭＶからのウイルスプロモーターのような強力なウイルスプロモーターである。このような発現ベクターには、好ましくは、クローニングのための細菌の複製起点および原核性選択可能マーカー遺伝子、および発現されるｍＲＮＡの適切な終結を確実にするポリアデニル化配列も含まれる。発現されるタンパク質の細胞分泌を支配するように、シグナル配列も含まれうる。
【０１５９】
ＤＮＡワクチン中のワクチン物質として有用な発現ベクターの必要条件は、特に、米国特許第５，７０３，０５５号、米国特許第５，５８０，８５９号、米国特許第５，５８９，４６６号、国際特許公開ＷＯ９８／３５５６２号、および Ramsay ら，1997, Immunol.Cell Biol. 75:360-363; Davis, 1997, Cur.Opinion Biotech. 8:635-640; Maniackan ら，1997, Critical Rev.Immunol. 17:139-154; Robinson, 1997, Vaccine 15(8):785-787; Lai および Bennett, 1998, Critical Rev.Immunol. 18:449-484; および Vogel および Sarver, 1995, Clin.Microbiol.Rev. 8(3):406-410 を含めた種々の科学公報に更に記載されている。
【０１６０】
ワクチン組成物が修飾されたローソニア生細胞を含む場合、そのワクチンは、冷却して、凍結させてまたは凍結乾燥させて貯蔵することができる。ワクチン組成物が、本発明のタンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド分子または失活した修飾されたローソニア細胞を代わりに含む場合、そのワクチンは、適当な希釈剤を用いて投与前に再水和される冷却した、凍結したまたは凍結乾燥した状態で貯蔵することができる。
【０１６１】
本発明のワクチンは、場合により、抗原の徐放のために製剤化することができる。このような徐放性製剤の例には、例えば、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−コグリコール酸）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲン等のような生体適合性ポリマーの組成物との組合せの抗原が含まれる。薬物デリバリービヒクル中の分解性ポリマーの構造、選択および使用は、本明細書中に援用される A.Domb ら，1992, Polymers for Advanced Technologies 3:279-292 を含めたいくつかの公報に概説されてきた。医薬製剤中のポリマーを選択し且つ使用する場合の更に別の指針は、本明細書中にも援用される M.Chasin および R.Langer（監修），1990, “Biodegtadable Polymers as Drug Delivery Systems”，Drugs and the Pharmaceutical Science, 45巻，M.Dekker, ＮＹの本文中で見出されうる。或いは、または更に、その抗原は、投与および効力を改善するようにマイクロカプセルに封入することができる。抗原をマイクロカプセルに封入する方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、いずれも本明細書中に援用される米国特許第３，１３７，６３１号；米国特許第３，９５９，４５７号；米国特許第４，２０５，０６０号；米国特許第４，６０６，９４０号；米国特許第４，７４４，９３３号；米国特許第５，１３２，１１７号；および国際特許公開ＷＯ９５／２８２２７号に記載された技法が含まれる。
【０１６２】
リポソームも、抗原を徐放させるのに用いることができる。リポソーム製剤を製造するおよび使用する方法に関する詳細は、特に、いずれも本明細書中に援用される米国特許第４，０１６，１００号；米国特許第４，４５２，７４７号；米国特許第４，９２１，７０６号；米国特許第４，９２７，６３７号；米国特許第４，９４４，９４８号；米国特許第５，００８，０５０号；および米国特許第５，００９，９５６号で見出されうる。
【０１６３】
本発明は、更に、ＰＰＥに対してＰＰＥ感受性動物にワクチン接種する方法であって、本発明のワクチンの免疫学的有効量を動物に投与することを含む上記方法を提供する。好ましくは、そのワクチンは、例えば、皮下かまたは筋肉内注射によって非経口投与される。しかしながら、ワクチンはまた、腹腔内または静脈内注射によって、または例えば、経口、鼻腔内、直腸、膣内、眼内を含めた他の経路によってまたは経路の組合せによっても、そして当該技術分野において知られている遅延放出装置によっても投与することができる。当業者は、最適のワクチン投与経路を決定し、その選択された投与経路にしたがってワクチン組成物に許容しうる製剤を確認することができる。
【０１６４】
有効な用量は、低用量の抗原を用いて開始した後、その作用を監視しながら用量を増加させる慣用的な手段によって決定することができる。動物当たりの最適用量を決定する場合、多数の因子が考慮されうる。これらの内の主なものは、動物の種、体格、齢および全身状態、その動物における他の薬物の存在、動物がワクチン接種される特定のローソニア菌株のビルレンス等である。実際用量は、好ましくは、他の動物の研究による結果の考察後に選択される。
【０１６５】
本発明のワクチン中の本発明のタンパク質またはポリペプチドの投与量は、好ましくは、約１μｇ〜約１０ｍｇ、より好ましくは、約５０μｇ〜約１ｍｇ、そして最も好ましくは、約１００μｇ〜約０．５ｍｇである。本発明のワクチン中の本発明のローソニアポリヌクレオチド分子の投与量は、好ましくは、約５０μｇ〜約１ｍｇである。本発明のワクチン中の本発明の修飾されたローソニア細胞の投与量は、好ましくは、細胞約１ｘ１０３〜約１ｘ１０８個／ｍｌ、より好ましくは、細胞約１ｘ１０５〜約１ｘ１０７個／ｍｌである。適当な用量寸法は、約０．１ｍｌ〜約１０ｍｌ、より好ましくは、約１ｍｌ〜約５ｍｌである。これら抗原の投与量は、本発明の組合せワクチンにも当てはまる。組合せワクチンの第二成分が、本発明のローソニアタンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは修飾された細胞以外の抗原である場合、組合せワクチン中で用いるための第二成分の投与量は、当該技術分野において知られているように、その第二成分の前のワクチン使用から決定することができる。
【０１６６】
本発明のワクチンは、動物、特に、ブタをＰＰＥから防御するのに有用である。そのワクチンは、ハムスター、フェレット、モルモット、シカおよびウシ、ウマおよび鳥類の種が含まれるがそれらに制限されるわけではないいずれか適当な動物に投与することができる。本発明のワクチンは、例えば、特にＰＰＥの発生のタイミング等を含めたいくつかの因子に依って、特定の動物の生存中のいずれかの時期に投与することができる。ワクチンは、離乳期の若しくはより若い動物に、またはより成熟した動物に投与することができる。有効なタンパク質は、一次ワクチン接種だけを必要とすることがありうるし、または１回またはそれ以上のブースターワクチン接種も必要であることがありうる。適切な免疫防御が得らているかどうかを検出する一つの方法は、ワクチン接種後の動物における血清交換および抗体力価を確認することである。ワクチン接種のタイミングおよびブースターを行うとすればその回数は、好ましくは、全ての適切な因子の分析に基づいて獣医によって決定され、そのいくつかは上に記載されている。
【０１６７】
一つの実施態様において、本発明のタンパク質またはポリペプチド、例えば、ＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００のＬ．イントラセルラリスタンパク質、またはそれらの組合せは、１ｍｌの緩衝溶液中に１００μｇのポリペプチド、およびアジュバントとして２５μｇの大腸菌不安定毒素を含有する製剤中で投与される。その製剤は、例えば、ブタの筋肉内に、５〜７日齢で投与され、１４日後に再投与される。
【０１６８】
本発明は、更に、ＰＰＥに対してＰＰＥ感受性動物にワクチン接種するためのキットであって、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド分子または修飾されたローソニア細胞、またはそれらの組合せの免疫学的有効量を有する容器を含む上記キットを提供する。そのキットは、場合により、薬学的に許容しうる担体または希釈剤を有する第二容器を含むことができる。好ましい実施態様において、そのポリペプチドは、ＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００のＬ．イントラセルラリスタンパク質であり；ポリヌクレオチド分子は、好ましくは、ＨｔｒＡ、ＰｏｎＡ、ＨｙｐＣ、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１またはＯｍｐ１００のＬ．イントラセルラリスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有し、そして修飾されたローソニア細胞は、好ましくは、ＨｔｒＡ−、ＰｏｎＡ−、ＨｙｐＣ−、ＬｙｓＳ−、ＹｃｆＷ−、ＡＢＣ１−またはＯｍｐ１００−表現型を発現する生細胞または不活化細胞である。
【０１６９】
本発明は、Ｌ．イントラセルラリス、Ｌ．イントラセルラリス特異的アミノ酸またはヌクレオチド配列、または抗Ｌ．イントラセルラリス抗体の存在を検出するキットであって、本発明のタンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体を含有するキットにも関する。そのキットは、例えば、本発明のタンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体に結合した、またはそのタンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体に結合する残基に結合した酵素、蛍光または放射性標識を含めた本発明のタンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体を検出する手段も含有しうる。
【０１７０】
次の実施例は、本発明を単に詳しく説明するものであり、発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【０１７１】
実施例１：Ｌ．イントラセルラリス染色体領域Ａの分子クローニング
ＤＮＡの単離およびＤＮＡライブラリーの構築
鋳型ＤＮＡを、実験的にＬ．イントラセルラリスに感染したブタの回腸から単離されたブタ腸粘膜から精製した。均一化された腸粘膜からのＤＮＡ精製は、（１）Nollau らの方法（Nollau ら，1996, Bio Techniques 20:784-788）または（２）ＤＮＡのフェノール抽出および酢酸ナトリウム−エタノール沈降によって行われた。Ｌ．イントラセルラリス遺伝子配列のクローニングを容易にするために、いくつかのゲノムライブラリーを構築した。これらライブラリーを、制限ＤＮＡフラグメントの５’および３’末端への既知の配列（Vectorette IIＴＭ，Genosys Biotechnologies,Inc., ザ・ウッドランズ，ＴＸ）の連結によって特異的に修飾した。VectoretteＴＭライブラリーは、Ｌ．イントラセルラリスに感染したブタ粘膜ＤＮＡ抽出物のアリコートを、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIII、ＥｃｏＲＩ、ＤｒａＩまたはＨｐａＩを用いて３７℃で一晩別々に消化することによって構築された。次に、その反応を、追加の新しい制限酵素を用いて止め、２ｍＭ  ＡＴＰ、２ｍＭ  ＤＴＴの最終濃度に調整した。VectoretteＴＭテーリング（tailing）を、３ピコモルの適当な適合した VectoretteＴＭリンカー（ＨｉｎｄIII  VectoretteＴＭ：ＨｉｎｄIIIで消化されたＤＮＡ；ＥｃｏＲＩ；ＥｃｏＲＩで消化されたＤＮＡ；Ｂｌｕｎｔ：ＤｒａＩ、ＨｐａＩで消化されたＤＮＡ）を加えたＴ４ＤＮＡリガーゼ（４００Ｕ）の添加によって行った。その混合物を２０℃、６０分間；および３７℃、３０分間で３サイクルインキュベートして、テーリング反応を完了させた後、水を用いて２００μｌに調整し、−２０℃で貯蔵した。
【０１７２】
ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１およびＯｍｐ１００タンパク質をコードしているゲノム領域Ａの分子クローニング
ゲノム領域Ａ（図１に示される）の識別は、ゲノムウォーキングおよびファージライブラリースクリーニング処理によって行われた。ＨｉｎｄIII、ＥｃｏＲＩ、ＤｒａＩおよびＨｐａＩの VectoretteＴＭライブラリーのスクリーニングは、細胞壁自己消化に関与する細菌Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼと相同のＬ．イントラセルラリスからの遺伝子（ａｍｉＢ）に隣接して位置するＤＮＡフラグメントを得るように行われた。オリゴヌクレオチドプライマーＥＲ１５９（配列番号：３７）、ＥＲ１６１（配列番号：３８）およびＥＲ１６２（配列番号：３９）は、ａｍｉＢのヌクレオチド配列に基づいて設計された。３種類全部のプライマーを、この領域内の（−）鎖を結合するように設計して、ＡｍｉＢをコードしている遺伝子の上流に位置するＤＮＡの増幅を可能にした。
【０１７３】
ｏｍｐ１００遺伝子のフラグメントのポリメラーゼ連鎖増幅には、オリゴヌクレオチドＥＲ１５９（配列番号：３７）、ＥＲ１６１（配列番号：３８）およびＥＲ１６２（配列番号：３９）を、VectoretteＴＭ特異的プライマー（ＥＲ７０）（配列番号：３３）と組み合わせて、１ｘＰＣＲ Buffer II（Perkin Elmer）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各２００μＭのデオキシＮＴＰ、各５０ピコモルのプライマーおよび２．５Ｕ  AmpliTaqＴＭGold（Perkin Elmer）熱安定性ポリメラーゼを含有する５０μｌの反応中において用いた。多数の単純反応を、ＤＮＡ鋳型として４μｌの VectoretteＴＭライブラリーを用いて行った。増幅は、次のように、すなわち、変性（９５゜９分間）；４０サイクルの変性（９５゜３０秒間）、アニーリング（６５゜３０秒間）および重合（７２゜２．５分間）；続いて７２゜で７分間の最終伸長で行った。
【０１７４】
増幅された産物を、１．２％アガロースゲル（Sigma）上での分離によって可視化した。ＥＲ１５９かまたはＥＲ１６２を VectoretteＴＭ特異的プライマーＥＲ７０と組み合わせて用いた場合、約２．５ｋｂの産物が、ＨｐａＩ VectoretteＴＭライブラリーの増幅によって生じた。このフラグメントは、ＡｍｉＢをコードしているＬ．イントラセルラリス遺伝子の直ぐ上流の１．９ｋｂ領域であった。そのＰＣＲ生産物を、ＪＥＴsorbＴＭキット（ＧＥＮＯＭＥＤ，Inc., Research Triangle Park, ＮＣ）を用いるアガロースゲル電気泳動にしたがって精製し、そしてｐＣＲ２．１ Topo（Invitrogen, カールズバット，ＣＡ）中にクローン化してプラスミドｐＥＲ３９３を生じた。そのインサートを、ベクター特異的プライマーを用いて部分的に配列決定した。得られた配列は、ＢＬＡＳＴｘアルゴリズム（Altschul ら，1990, J.Mol.Biol. 215:403-10）によって分析され、GenBank データベース中の約８５ｋＤａタンパク質に類似したタンパク質を部分的にコードすることが示された。髄膜炎菌、インフルエンザ菌およびパスツレラ・マルトシダからの報告されたタンパク質は、それぞれ、Ｏｍｐ８５、防御表面抗原Ｄ１５およびＯｍａ８７であった。
【０１７５】
この部分遺伝子フラグメントの新たに識別された配列（Ｏｍｐ１００タンパクのＣ末端の２／３をほぼコードしている）に基づいて、特異的プライマーＥＲ１７４（配列番号：４６）およびＥＲ１７５（配列番号：４７）を、ＰＣＲ増幅による VectoretteＴＭライブラリーの２回目のスクリーニングによって追加の５’フランキング配列を得るように設計した。オリゴヌクレオチドＥＲ１７４（配列番号：４６）およびＥＲ１７５（配列番号：４７）を、プライマーＥＲ７０（配列番号：３３）と組み合わせて、１ｘＰＣＲ Buffer II（Perkin Elmer）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各２００μＭのデオキシＮＴＰ、各５０ピコモルのプライマーおよび２．５Ｕ  AmpliTaqＴＭGold（Perkin Elmer）熱安定性ポリメラーゼを含有する５０μｌの反応中において用いた。多数の単純反応を、ＤＮＡ鋳型として２μｌの VectoretteＴＭＥｃｏＲＩおよびＤｒａＩライブラリーを用いて行った。増幅は、次のように、すなわち、変性（９５゜９分間）；３５サイクルの変性（９５゜３０秒間）、アニーリング（６２゜３０秒間）および重合（７２゜２．５分間）；続いて７２゜で７分間の最終伸長で行った。
【０１７６】
ＰＣＲによるＥｃｏＲＩおよびＤｒａＩの VectoretteＴＭライブラリーのスクリーニング（ＥＲ１７４かまたはＥＲ１７５をＥＲ７０と組み合わせて用いる）は、ＥｃｏＲＩ VectoretteＴＭライブラリーからの約１．４ｋｂフラグメントの満足すべき増幅を生じた。そのＰＣＲ産物を、ＪＥＴsorbＴＭキットを用いるアガロースゲル電気泳動にしたがって精製し、そしてｐＣＲ２．１ Topo 中にクローン化してプラスミドｐＥＲ３９４を生じた。ＥＲ１７５およびベクター特異的プライマーを用いるｐＥＲ３９４内のインサート両末端の配列分析は、このフラグメントが、ｐＥＲ３９４内のフラグメントインサートと隣接していた（例えば、オーバーラップしていた）ことを確証し、ｏｍｐ１００遺伝子の５’末端の決定を可能にした。この分析は、輸送体タンパク質のＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）スーパーファミリーと相同の追加の部分ＯＲＦの存在も示した。したがって、コードされる部分タンパク質をＡＢＣ１と称した。
【０１７７】
この部分遺伝子フラグメントの新たに識別された配列（ＡＢＣ１タンパクのＣ末端の１／２をほぼコードしている）に基づいて、特異的プライマーＥＲ１８８（配列番号：５５）を、ＰＣＲ増幅による VectoretteＴＭライブラリーの３回目のスクリーニングによって追加の５’フランキング配列を得るように設計した。オリゴヌクレオチドＥＲ１８８（配列番号：５５）を、プライマーＥＲ７０（配列番号：３３）と組み合わせて、１ｘＰＣＲ Buffer II、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各２００μＭのデオキシＮＴＰ、各５０ピコモルのプライマーおよび２．５Ｕ  AmpliTaqＴＭGold 熱安定性ポリメラーゼを含有する５０μｌの反応中において用いた。多数の単純反応を、ＤＮＡ鋳型として４μｌの VectoretteＴＭＨｉｎｄIII、ＤｒａＩおよびＨｐａＩライブラリーを用いて行った。増幅は、次のように、すなわち、変性（９５゜９分間）；３０サイクルの変性（９５゜３０秒間）、アニーリング（６０゜３０秒間）および重合（７２゜２．５分間）；続いて７２゜で７分間の最終伸長で行った。
【０１７８】
ＰＣＲによるＨｉｎｄIII、ＤｒａＩおよびＨｐａＩの VectoretteＴＭライブラリーのスクリーニング（ＥＲ１８８をＥＲ７０と組み合わせて用いる）は、ＨｉｎｄIII VectoretteＴＭライブラリーからの約０．８ｋｂフラグメントの満足すべき増幅を生じた。そのＰＣＲ産物を、ＪＥＴsorbＴＭキットを用いるアガロースゲル電気泳動にしたがって精製し、そしてｐＣＲ２．１ Topo 中にクローン化してプラスミドｐＥＲ３９５を生じた。ＥＲ１８８およびベクター特異的プライマーを用いるｐＥＲ３９５内のインサート両末端の配列分析は、このフラグメントが、ｐＥＲ３９４内のフラグメントインサートと隣接していた（例えば、オーバーラップしていた）ことを確証し、ａｂｃ１遺伝子の５’末端の決定を可能にした。追加の部分ＯＲＦは、そのａｂｃ１遺伝子の上流で確認された。そのコードされるタンパク質を、多数の細菌で見出される保存タンパク質であるＹｃｆＷとの相同性に基づいて、ＹｃｆＷと称した。
【０１７９】
ｙｃｆＷ  ＯＲＦの残りの部分をコードしている領域は、Ｌ．イントラセルラリスゲノムＤＮＡの部分Ｔｓｐ５０９１消化によって生じた Lambda ＺＡＰ ExpressＴＭファージライブラリーをスクリーニングすることによって得られた。そのファージライブラリーを、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、ＩＰＴＧおよびＸ−Ｇａｌの存在下においてＸＬ１−Blue ＭＲＦ’大腸菌細胞上にプレーティングした。透明なプラークを採取し、ファージインサートを、Expand Long Template ＰＣＲ SystemＴＭを供給者（Boehringer Mannheim, インディアナポリス，ＩＮ）によって提示のように用いて増幅させた。Ｔ３およびＴ７ファージ特異的プライマーを、変性（９４゜２分間）；２５サイクルの変性（９４゜１０秒間）、アニーリング（５０゜３０秒間）および重合（６８゜６分間）；続いて６８゜で７分間の最終伸長から成るＰＣＲ条件で用いた。得られたＰＣＲ産物を、Ｔ３およびＴ７プライマーを用いて最終配列決定し、ＢＬＡＳＴｘ分析によって GenBank データベース中の遺伝子と比較した。クローンＡ２１と称される一つのファージは、前に識別されたｙｃｆＷ、ＡＢＣ１およびｏｍｐ１００  ＤＮＡ配列にオーバーラップした２．８ｋｂを包含する約６．１ｋｂインサートを含有した。したがって、このクローンは、ＹｃｆＷタンパクのＮ末端をコードしているＤＮＡ配列を決定するのに用いられた。追加のＯＲＦは、ｙｃｆＷ遺伝子の上流で確認された。この遺伝子は、いくつかのリシル−ｔＲＮＡシンテターゼとの相同性を有し且つｌｙｓＳと称されるタンパクをコードしていた。
【０１８０】
ａｂｃ１遺伝子のＣ末端部分およびｏｍｐ１００の予備のヌクレオチド配列は、ｐＥＲ３９３およびｐＥＲ３９４内のインサートを配列決定することによって得られた。ＹｃｆＷのＣ末端の１４１アミノ酸部分およびＡＢＣ１のアミノ末端部分をコードしている予備ヌクレオチド配列は、ｐＥＲ３９５内のインサートを配列決定することによって得られた。ｙｃｆＷ遺伝子のＮ末端およびｌｙｓＳをコードしている予備ヌクレオチド配列は、ファージクローンＡ２１中に含有されたインサートであるＰＣＲ産物を配列決定することによって得られた。予備配列決定に用いられたプライマーには、ｐＥＲ３９３に関するＥＲ１５９（配列番号：３７）、ＥＲ１６９（配列番号：４１）、ＥＲ１７０（配列番号：４２）、ＥＲ１７６（配列番号：４８）およびＥＲ１７７（配列番号：４９）；ｐＥＲ３９４に関するＥＲ１７５（配列番号：４７）、ＥＲ１８５（配列番号：５２）、ＥＲ１８６（配列番号：５３）およびＥＲ１８７（配列番号：５４）；ｐＥＲ３９５に関するＥＲ１８８（配列番号：５５）；およびファージクローンＡ２１に関するＥＲ２４６（配列番号：９７）、ＥＲ２５４（配列番号：９８）、ＥＲ２５５（配列番号：９９）、ＥＲ２５６（配列番号：１００）およびＥＲ２５７（配列番号：１０１）の他に、ベクター特異的前進Ｍ１３、逆Ｍ１３、ファージＴ３およびＴ７のプライマーが含まれた。
【０１８１】
Ｌ．イントラセルラリス領域Ａを包含するサブゲノムＤＮＡフラグメントの特異的ＰＣＲ増幅
プラスミドｐＥＲ３９３、ｐＥＲ３９４、ｐＥＲ３９５およびファージクローンＡ２１中に含有されるゲノムフラグメントからのクローニングおよび予備配列決定の結果を用いて、オーバーラップサブゲノムフラグメントの特異的増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーを、Ｌ．イントラセルラリスに感染したブタ粘膜ＤＮＡ抽出物から直接的に設計した。ＤＮＡ抽出は、上記の方法にしたがって行った。このアプローチは、大腸菌中での遺伝子フラグメントのクローニング中に起こる可能性がある突然変異のために、配列決定用人工産物の導入を省略する要求に基づいて好適である。ｌｙｓＳと、ｙｃｆＷのＮ末端の３／４に隣接するオリゴヌクレオチドＥＲ２４６（配列番号：９７）およびＥＲ２５４（配列番号：９８）；ａｂｃ１遺伝子に隣接するオリゴヌクレオチドＥＲ２２９（配列番号：７３）およびＥＲ２０６（配列番号：６６）；およびｏｍｐ１００遺伝子に隣接するＥＲ２３１（配列番号：７５）およびＥＲ２３２（配列番号：７６）を用いて、この領域を粘膜ＤＮＡ抽出物から特異的に増幅させた。ｌｙｓＳ遺伝子は、５０μｌの最終試料容量中に鋳型としての２μｌの粘膜ＤＮＡ抽出物、１ｘＰＣ２緩衝液（Ab Peptide,Inc.）、各２００μＭのｄＮＴＰ、各５０ピコモルのプライマー、７．５Ｕ  Klen Taq１および０．１５Ｕクローン化Ｐｆｕ熱安定性ポリメラーゼを含有するＰＣＲ反応中で増幅した。増幅条件は、９４゜で５分間の変性後、３０サイクルの変性（９４゜１分間）、アニーリング（５５゜３０秒間）および重合（７２゜３分間）から成った。７２゜で７分間の最終伸長は、標的の２．６ｋｂ領域の増幅を完全にした。ａｂｃ１遺伝子は、５０μｌの最終試料容量中に鋳型としての１μｌの粘膜ＤＮＡ抽出物、１ｘＰＣ２緩衝液、各２００μＭのｄＮＴＰ、各５０ピコモルのプライマー、７．５Ｕ  Klen Taq１および０．１５Ｕクローン化Ｐｆｕ熱安定性ポリメラーゼを含有する３重ＰＣＲ反応中で増幅した。増幅条件は、９５゜で５分間の変性後、３３サイクルの変性（９４゜１分間）、アニーリング（５８゜３０秒間）および重合（７２゜８０秒間）から成った。７２゜で１０分間の最終伸長は、標的遺伝子領域の増幅を完全にした。ｏｍｐ１００遺伝子は、５０μｌの最終試料容量中に鋳型としての２μｌの粘膜ＤＮＡ抽出物、１ｘＰＣ２緩衝液、各２００μＭのｄＮＴＰ、各５０ピコモルのプライマー、７．５Ｕ  Klen Taq１および０．１５Ｕクローン化Ｐｆｕ熱安定性ポリメラーゼを含有する４重ＰＣＲ反応中で増幅した。増幅条件は、９４゜で５分間の変性後、３５サイクルの変性（９４゜３０秒間）、アニーリング（６０゜３０秒間）および重合（７２゜３分間）から成った。７２゜で７分間の最終伸長は、標的遺伝子領域の増幅を完全にした。増幅後、適宜、試料をそれぞれプールし、特定の産物をアガロースゲル電気泳動によって精製後、ＡＢＩ自動ＤＮＡシークエンサー（Lark Technologies,Inc., ヒューストン，ＴＸ）において DyeDeoxyＴＭ終結反応を用いる直接配列分析を行った。
【０１８２】
合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、Ｌ．イントラセルラリスからの増幅産物の両ＤＮＡ鎖を配列決定した。配列分析に用いられるプライマーには、ＡＰ５８．１（配列番号：２６）、ＡＰ５８．２（配列番号：２７）、ＡＰ５９．１（配列番号：２８）、ＡＰ５９．２（配列番号：２９）、ＡＰ５９．３（配列番号：３０）、ＡＰ５９．４（配列番号：３１）、ＡＰ５９．５（配列番号：３２）、ＥＲ１５９（配列番号：３７）、ＥＲ１６９（配列番号：４１）、ＥＲ１７０（配列番号：４２）、ＥＲ１７５（配列番号：４７）、ＥＲ１７６（配列番号：４８）、ＥＲ１７７（配列番号：４９）、ＥＲ１８５（配列番号：５２）、ＥＲ１８６（配列番号：５３）、ＥＲ１８７（配列番号：５４）、ＥＲ１８８（配列番号：５５）、ＥＲ２０５（配列番号：６５）、ＥＲ２０６（配列番号：６６）、ＥＲ２１７（配列番号：７１）、ＥＲ２２９（配列番号：７３）、ＥＲ２３０（配列番号：７４）、ＲＡ１３８（配列番号：７９）、ＲＡ１３９（配列番号：８０）、ＲＡ１４０（配列番号：８１）、ＡＰ１８２．１（配列番号：８３）、ＡＰ１８２．２（配列番号：８４）、ＡＰ１８２．３（配列番号：８５）、ＡＰ１８２．４（配列番号：８６）、ＡＰ１８２．５（配列番号：８７）、ＡＰ１８２．６（配列番号：８８）、ＡＰ１８２．７（配列番号：８９）、ＡＰ１８２．８（配列番号：９０）、ＡＰ１８２．９（配列番号：９１）、ＡＰ１８２．１０（配列番号：９２）、ＡＰ１８２．１１（配列番号：９３）、ＡＰ１８２．１２（配列番号：９４）、ＡＰ１８２．１３（配列番号：９５）、ＡＰ１８２．１４（配列番号：９６）、ＥＲ２４６（配列番号：９７）、ＥＲ２５４（配列番号：９８）、ＥＲ２５５（配列番号：９９）、ＥＲ２５６（配列番号：１００）およびＥＲ２５７（配列番号：１０１）が含まれた。
【０１８３】
Ｌ．イントラセルラリスゲノム領域Ａのヌクレオチド配列を配列番号：１に挙げる。この領域内にコードされるＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１およびＯｍｐ１００タンパク質の推定上のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：１０２、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：５に示す。
【０１８４】
領域Ａによって規定されるＬ．イントラセルラリス遺伝子および遺伝子産物の分子分析
ａｍｉＢ遺伝子の上流で確認されたＬ．イントラセルラリス染色体領域Ａは、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１およびＯｍｐ１００と称されるタンパク質をコードしている（図１）。これら遺伝子は、同じＤＮＡ鎖によってコードされ、極めて接近して配列している。この体制は、これら遺伝子がオペロンの一部分でありうるし、ＬｙｓＳ／ＹｃｆＷおよびＡＢＣ１／Ｏｍｐ１００の場合に翻訳共役していると考えられることを示唆している。ｌｙｓＳ  ＯＲＦは、非定型ＴＴＧ開始コドンから開始すると考えられ、配列番号：１のヌクレオチド１６５〜１７４５から伸長すると考えられる。この遺伝子は、約６０，６２８ダルトンの理論分子量を有するＬｙｓＳ（配列番号：１０２）と称される推定上の５２６アミノ酸タンパク質をコードしている。ｙｃｆＷ  ＯＲＦは、報告された配列（配列番号：１）のヌクレオチド１７４５〜３０２８から伸長する。この遺伝子は、約４６，９５７ダルトンの理論分子量を有するＹｃｆＷ（配列番号：３）と称される推定上の４２７アミノ酸タンパク質をコードしている。ａｂｃ１  ＯＲＦは、配列番号：１のヌクレオチド３０３１〜３７３８から伸長し、約２５，６１８ダルトンの理論分子量を有する推定上の２３５アミノ酸タンパク質ＡＢＣ１（配列番号：４）をコードしている。更に下流であるが４４ヌクレオチドによってこのＯＲＦにオーバーラップしているのは、更に別の大きい読み取り枠である。このＯＲＦはｏｍｐ１００と称されたが、配列番号：１のヌクレオチド３６９５〜６３８８から伸長する。そのｏｍｐ１００遺伝子は、Ｏｍｐ１００（配列番号：５）と称された推定上の８９６アミノ酸タンパク質をコードしている。Ｏｍｐ１００タンパク質は、約１０１，１７８ダルトンの理論分子量を有する。
【０１８５】
Ｌ．イントラセルラリスＬｙｓＳタンパク質のリシル−ｔＲＮＡシンテターゼとの類似性
ＬｙｓＳタンパク質の推定上のアミノ酸配列（配列番号：１０２）を、ＢＬＡＳＴｐアルゴリズム（Altschul,S.F. ら，1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402）によって GenBank に報告された他のタンパク質と比較し、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズム（Thompson,J.D. ら，1994, Nucleic Acids Res. 22:4673-4680）によって整列させた。図９に示されるように、この分析は、ＬｙｓＳが、細胞質リシル−ｔＲＮＡシンテターゼファミリーのメンバーとの類似性を有するということを示した。Ｌ．イントラセルラリスＬｙｓＳタンパク質は、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）からのリシル−ｔＲＮＡシンテターゼタンパク質（Ａｃｃｎ．ＡＢ０１２１００）と４７％の同一性を有する。その細胞質の場所と一致して、このタンパク質の予想されるＮ末端付近には、分泌シグナル配列が確認されなかった。
【０１８６】
Ｌ．イントラセルラリスＹｃｆＷおよびＡＢＣ１タンパク質の他の仮定のタンパク質との類似性
ＹｃｆＷタンパク質は、約４０〜４５ｋＤａの寸法の保存される仮定のタンパク質のファミリーと一定の相同性を有する。このファミリーのメンバーは、膜貫通タンパク質または膜内在性タンパク質であることが報告されている。このファミリーからの典型的なタンパク質の構造予想比較は、ＴＭＰｒｅｄ（ＥＭＢｎｅｔ−European Molecular Biology Network; http://www.ch.embnet.org/index.html）を用いて行われた。そのＴＭＰｒｅｄプログラムは、膜に広がる領域およびそれらの配向の予測を行う。そのアルゴリズムは、天然に存在する膜貫通タンパク質のデータベースであるＴＭｂａｓｅの統計分析に基づく。（Hofmann & Stoffel, 1993, Biol.Chem. Hoppe-Seyler 347:166）。この分析は、このタンパク質ファミリー内の相同性が、そのタンパク質のＣ末端付近に集まった三つの強力な膜貫通ドメインを有することを示している。本発明者は、このファミリーを代表するものの極めてカルボキシル末端にある４個のアミノ酸（ＬＲＹＥ）のところに極めて充分に保存されたドメインに注目してきた。そのＣ末端領域は多数の膜貫通ドメインを含有するが、先端のＣ末端は高度に保存されるという知見は、相同タンパク質のＹｃｆＷファミリーのこの領域に関係した普遍の機能的必要条件を示唆している。配列番号：３に示されるＬ．イントラセルラリスＹｃｆＷタンパク質は、先端のＣ末端アミノ酸（ＬＲＹＥ）の他に、３個のＣ末端膜貫通ドメインも含有する。上の３個のカルボキシルドメインの他に、ＴＭＰｒｅｄ分析は、ＹｃｆＷタンパク質の残基１９〜４４が、膜貫通領域を形成していると考えられることを示している。ＹｃｆＷのアミノ末端は、既知の分泌シグナル配列上で操作される（trained）ネットワークを用いるＰＳＯＲＴ（６．４バージョン）計算機アルゴリズムによっても調べられる。この分析は、残基２９〜４５が、切断できないシグナル配列（D.J.McGeoch, Virus Research, 3:271,1985 および G.von Heijne, Nucl.Acids Res., 14:4683,1986）として作用すると考えられる膜貫通領域（P.Klein ら，1985, Biochim.Biophys.Acta, 815:468）を形成すると考えられることを示している。図２に示されるように、その４２７アミノ酸のＬ．イントラセルラリスＹｃｆＷタンパク質は、発疹チフスリケッチア（Rickettsia prowazekii）からの４１５残基の仮定のタンパク質（Ａｃｃｎ．ＡＪ２３５２７２）と３２％の同一性を有する。
【０１８７】
ＡＢＣ１タンパク質の推定上のアミノ酸配列（配列番号：４）を、ＢＬＡＳＴｐアルゴリズムによって GenBank に報告された他の既知のタンパク質と比較した。特に充分に保存される領域（ＧＡＳＧＳＧＫＳ）は、ＡＢＣ１のアミノ末端付近で確認された。この領域は、ＡＢＣ型輸送体中に存在するヌクレオチド結合モチーフＡ（Ｐループ）に相当する。それらＡＢＣ型タンパク質は、広範囲の細胞機能を有するタンパク質の極めて大きいスーパーファミリーから成る。これらタンパク質の大部分は、ヌクレオチド結合モチーフ内の局所相同性に基づいてＡＢＣ型タンパク質として分類され、概して、細胞輸送機能に関与していると考えられる。図３は、約４５％同一のアミノ酸残基を有する大腸菌からのＹｃｆＶ（Ａｃｃｎ．ＡＥ０００２１２）の列と一緒にＡＢＣ１の列を示す。大腸菌ＹｃｆＶタンパク質は、有望なＡＢＣ型輸送体タンパク質である。
【０１８８】
Ｌ．イントラセルラリスＯｍｐ１００タンパク質の８５ｋＤａタンパク質との類似性
Ｏｍｐ１００のアミノ末端の検討は、アミノ酸１〜２５が疎水性であり且つ正に荷電していることを示し、それはシグナル配列の特徴を示している（von Heijm, 1985, J.Mol.Biol. 184:99-105）。既知のシグナル配列上で操作されるネットワークを用いるＳｉｇｎａｌＰ（１．１バージョン）計算機アルゴリズム（Nielsen,H. ら，1997, Prot.Engineering, 10:1-6; http://www.cbs.dtv.dk/services/signalP/）は、アミノ酸２５と２６との間の最も可能性のある切断部位を予測した。したがって、アミノ酸１〜２５は、外膜局在化過程中にＯｍｐ１００から除去されると考えられる。Ｏｍｐ１００のＣ末端アミノ酸は、外膜タンパク質の正しい局在と一致する特徴であるフェニルアラニン残基であると考えられる（Struyve,M., 1991, J.Mol.Biol. 218:141-148）。
【０１８９】
Ｏｍｐ１００タンパク質の推定上のアミノ酸配列（配列番号：５）を、ＢＬＡＳＴｐアルゴリズム（Altschul,S.F. ら，1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402）によって GenBank に報告された他の既知のタンパク質と比較し、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズム（Thompson,J.D. ら，1994, Nucleic Acids Res. 22:4673-4680）によって整列させた。図４に示されるように、この分析は、Ｏｍｐ１００が、GenBank データベース中の約８５ｋＤａタンパク質（Ｕ７０２１４と称される）と一定の類似性を有することを示した。大腸菌からのＯｍｐ１００およびこの仮定のタンパク質（ＹａｅＴ，Ａｃｃｎ．Ｕ７０２１４またはＡＥ０００１２７）のＣ末端の列は、これらタンパク質が約２３％同一の残基を有することを示している。他の報告されたタンパク質には、特に、フレクスナー赤痢菌（Ｏｍｐ９０）、髄膜炎菌（Ｏｍｐ８５）、インフルエンザ菌（Ｄ１５）およびパスツレラ・マルトシダ（Ｏｍｐ８７）から識別されたものが含まれる。アミノ酸１〜１３９を含めたＮＨ２末端部分は、いずれの既知のタンパク質とも並列しない。コードされるＯｍｐ１００タンパク質のアミノ酸１〜２００を包含する領域だけを用いるＢＬＡＳＴｐアルゴリズムを用いた GenBank の追加の検索では、いずれの既知のＯｍｐ８５様タンパク質も検出できなかった。このデータは、Ｏｍｐ１００のアミノ末端部分がＬ．イントラセルラリスに全く特有であることを示している。
【０１９０】
実施例２：Ｌ．イントラセルラリス染色体領域Ｂの分子クローニング
ＰｏｎＡ、ＨｔｒＡ、ＨｙｐＣおよびＯＲＦ１タンパク質をコードしているゲノム領域Ｂの分子クローニング
ゲノム領域Ｂ（図１に示される）の識別は、ゲノムＡ領域の識別について記載されたのと同様のゲノムウォーキング処理によって行われた。ＨｉｎｄIII、ＥｃｏＲＩ、ＤｒａＩおよびＨｐａＩの VectoretteＴＭライブラリーのスクリーニングは、他の細菌の鞭毛フックタンパク質と相同のタンパク質をコードするＬ．イントラセルラリスからの遺伝子ｆｌｇＥに隣接して位置するＤＮＡフラグメントを得るように行われた。オリゴヌクレオチドプライマーＥＲ１４２（配列番号：３４）、ＥＲ１５３（配列番号：３５）およびＥＲ１５８（配列番号：３６）は、ｆｌｇＥの３’の既知のヌクレオチド配列に基づいて設計された。３種類全部のプライマーを、この領域内の（＋）鎖を結合するように設計して、ＦｌｇＥをコードしている遺伝子の下流に位置するＤＮＡの増幅を可能にした。
【０１９１】
ｐｏｎＡ遺伝子のフラグメントのポリメラーゼ連鎖増幅には、オリゴヌクレオチドＥＲ１４２（配列番号：３４）、ＥＲ１５３（配列番号：３５）およびＥＲ１５８（配列番号：３６）を、VectoretteＴＭ特異的プライマー（ＥＲ７０）（配列番号：３３）と組み合わせて、１ｘＰＣＲ Buffer II、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各２００μＭのデオキシＮＴＰ、各５０ピコモルのプライマーおよび２．５Ｕ  AmpliTaqＴＭGold 熱安定性ポリメラーゼを含有する５０μｌの反応中において用いた。多数の単純反応を、ＤＮＡ鋳型として４μｌの VectoretteＴＭライブラリーを用いて行った。増幅アニーリング温度、伸長時間およびサイクル数は、実験間で異なり、次の範囲にわたって行われた。変性（９５゜９分間）；３５〜４０サイクルの変性（９５゜３０秒間）、アニーリング（５０〜６０゜３０秒間）および重合（７２゜２．５〜３分間）；続いて７２゜で７分間の最終伸長。
【０１９２】
増幅された産物を、１．２％アガロースゲル上での分離によって可視化した。ＥＲ１５８（配列番号：３６）を VectoretteＴＭ特異的プライマーＥＲ７０と組み合わせて用いた場合、約１．２ｋｂの産物が、ＤｒａＩ VectoretteＴＭライブラリーの増幅によって生じた。この産物の特異的増幅をもたらす条件には、変性（９５゜９分間）；４０サイクルの変性（９５゜３０秒間）、アニーリング（６０゜３０秒間）および重合（７２゜２．５分間）；続いて７２゜で７分間の最終伸長が含まれた。このフラグメントは、ＦｌｇＥをコードしているＬ．イントラセルラリス遺伝子の直ぐ下流の１．４ｋｂ領域であった。そのＰＣＲ生産物を、ＪＥＴsorbＴＭキットを用いるアガロースゲル電気泳動にしたがって精製し、そしてｐＣＲ２．１ Topo 中にクローン化してプラスミドｐＥＲ３９０を生じた。そのインサートを、ＥＲ７０およびＥＲ１５８プライマーを用いて部分的に配列決定した。得られた配列は、ＢＬＡＳＴｘアルゴリズム（Altschul,S.F. ら，1990）によって分析され、GenBank データベース中のペニシリン結合タンパク質のアミノ末端半分に類似したポリペプチドをコードすることが示された。
【０１９３】
この部分遺伝子の新たに識別された配列に基づいて、プライマーＥＲ１６３（配列番号：４０）を、VectoretteＴＭライブラリーの２回目のスクリーニングによって追加の３’フランキング配列を得るように設計した。オリゴヌクレオチドＥＲ１６３（配列番号：４０）を、プライマーＥＲ７０（配列番号：３３）と組み合わせて、１ｘＰＣＲ Buffer II、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各２００μＭのデオキシＮＴＰ、各５０ピコモルのプライマーおよび２．５Ｕ  AmpliTaqＴＭGold 熱安定性ポリメラーゼを含有する５０μｌの反応中において用いた。多数の単純反応を、ＤＮＡ鋳型として２μｌの VectoretteＴＭＨｉｎｄIII、ＥｃｏＲＩおよびＨｐａＩライブラリーを用いて行った。増幅は、次のように、すなわち、変性（９５゜９分間）；３０サイクルの変性（９５゜３０秒間）、アニーリング（６２゜３０秒間）および重合（７２゜１．５分間）；続いて７２゜で７分間の最終伸長で行った。
【０１９４】
ＨｉｎｄIII  VectoretteＴＭライブラリーから２．７ｋｂフラグメントを増幅させた。そのＰＣＲ産物を、ＪＥＴsorbＴＭキットを用いるアガロースゲル電気泳動にしたがって精製し、そしてｐＣＲ２．１ Topo 中にクローン化してプラスミドｐＥＲ３９２を生じた。ベクター特異的プライマーを用いるクローン化されたインサート両末端の配列分析は、このフラグメントが、ｐＥＲ３９０内のフラグメントインサートと隣接していたことを確証した。この分析は、セリンプロテアーゼのＨｔｒＡタンパク質ファミリーのＮＨ２末端の４００残基にほぼ相当する追加の部分ＯＲＦの存在も示した。したがって、コードされる部分タンパク質をＨｔｒＡと称した。
【０１９５】
３回目のゲノムウォーキングを行って、ｈｔｒＡ  ＯＲＦ内の更に別の配列を決定した。特異的プライマーＥＲ１７３（配列番号：４５）を、ｐＥＲ３９２内のインサートの３’末端付近の既知の配列に基づいて設計した。オリゴヌクレオチドＥＲ１７３（配列番号：４５）を、プライマーＥＲ７０（配列番号：３３）と組み合わせて、上記のような５０μｌの反応中において用いた。多数の単純反応を、ＤＮＡ鋳型として２μｌの VectoretteＴＭＤｒａＩおよびＨｐａＩライブラリーを用いて行った。増幅（変性（９５゜９分間）；３５サイクルの変性（９５゜３０秒間）、アニーリング（６２゜３０秒間）および重合（７２゜２．５分間）；続いて７２゜で７分間の最終伸長）は、ＤｒａＩライブラリーから０．３ｋｂフラグメントを生じた。そのＰＣＲ産物を、ＪＥＴsorbＴＭキットを用いるアガロースゲル電気泳動にしたがって精製し、ｐＣＲ２．１ Topo 中にクローン化し、そしてそのインサートの両末端について、ベクター特異的プライマーを用いて配列決定した。配列およびＢＬＡＳＴｘの分析は、ｈｔｒＡ  ＯＲＦがそのクローン化されたフラグメントの３’末端によってオープンの状態のままであることおよび追加の１０アミノ酸が、コードされるＨｔｒＡタンパク質の末端の前に残っていると考えられることを示した。
【０１９６】
最終回のゲノムウォーキングを行って、ｈｔｒＡ  ＯＲＦおよび３’フランキング領域の残り部分を決定した。特異的プライマーＥＲ１８９（配列番号：５６）を、ｈｔｒＡ  ＯＲＦの３’末端付近の既知の配列に基づいて設計した。オリゴヌクレオチドＥＲ１８９（配列番号：５６）を、プライマーＥＲ７０（配列番号：３３）と組み合わせて、上記のような５０μｌの反応中において用いた。多数の単純反応を、ＤＮＡ鋳型として４μｌの VectoretteＴＭＨｉｎｄIII、ＥｃｏＲＩおよびＨｐａＩライブラリーを用いて行った。増幅は、次のように、すなわち、変性（９５゜９分間）；３０サイクルの変性（９５゜３０秒間）、アニーリング（６０゜３０秒間）および重合（７２゜２．５分間）；続いて７２゜で７分間の最終伸長で行った。増幅は、ＥｃｏＲＩライブラリーから約１ｋｂフラグメントを生じた。そのＰＣＲ産物を、ＪＥＴsorbＴＭキットを用いるアガロースゲル電気泳動にしたがって精製し、ｐＣＲ２．１ Topo 中にクローン化してｐＥＲ３９６を生じた。ベクター特異的プライマーを用いるｐＥＲ３９６内のインサート両末端の配列分析は、ｈｔｒＡ遺伝子の３’末端の決定を可能にした。追加の小さいＯＲＦは、ｈｔｒＡ遺伝子の下流で確認された。コードされるタンパク質は、他の細菌で見出されるＨｙｐＣタンパク質との相同性に基づいて、ＨｙｐＣと称された。ｈｙｐＣから更に下流は、ｏｒｆ１と称される更に別の部分ＯＲＦであり、それは反対のＤＮＡ鎖によってコードされる。この切断された１７７アミノ酸ポリペプチドをＯＲＦ１と称した。
【０１９７】
ｐｏｎＡ、ｈｔｒＡ、ｈｙｐＣ遺伝子、およびｏｒｆ１遺伝子のＣ末端部分の予備ヌクレオチド配列は、ｐＥＲ３９０、ｐＥＲ３９２およびｐＥＲ３９６内のインサートを配列決定することによって得られた。予備配列決定に用いられたプライマーには、ｐＥＲ３９０に関するＥＲ１９３（配列番号：５９）およびＥＲ１９４（配列番号：６０）；ｐＥＲ３９２に関するＥＲ１７１（配列番号：４３）、ＥＲ１７２（配列番号：４４）、ＥＲ１７８（配列番号：５０）、ＥＲ１７９（配列番号：５１）、ＥＲ１９０（配列番号：５７）およびＥＲ１９１（配列番号：５８）；およびｐＥＲ３９６に関するＥＲ１９５（配列番号：６１）およびＥＲ１９６（配列番号：６２）の他に、ベクター特異的前進Ｍ１３および逆Ｍ１３プライマーが含まれた。
【０１９８】
Ｌ．イントラセルラリス領域Ｂを包含するサブゲノムＤＮＡフラグメントの特異的ＰＣＲ増幅
プラスミドｐＥＲ３９０、ｐＥＲ３９２およびｐＥＲ３９６中に含有されるゲノムフラグメントからのクローニングおよび予備配列決定の結果を用いて、オーバーラップサブゲノムフラグメントの特異的増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーを、Ｌ．イントラセルラリスに感染したブタ粘膜ＤＮＡ抽出物から直接的に設計した（ＤＮＡ抽出については、上記の方法を用いた）。このアプローチは、大腸菌中での遺伝子フラグメントのクローニング中に起こる可能性がある突然変異のために、配列決定用人工産物の導入を省略する要求に基づいて好適である。ｐｏｎＡ遺伝子に隣接するオリゴヌクレオチドＥＲ２２８（配列番号：７２）およびＥＲ１９０（配列番号：５７）；ｈｔｒＡ遺伝子に隣接するオリゴヌクレオチドＥＲ２０７（配列番号：６７）およびＲＡ１３４（配列番号：７８）；およびｈｙｐＣ遺伝子に隣接するオリゴヌクレオチドＥＲ１８９（配列番号：５６）およびＥＲ１９６（配列番号：６２）を用いて、この領域を粘膜ＤＮＡ抽出物から特異的に増幅させた。これらフラグメントの端点はオーバーラップし、それによって、隣接しているサブゲノムＤＮＡフラグメントの特異的増幅後、独特のオーバーラップＤＮＡフラグメントそれぞれに存在する末端ヌクレオチド配列を比較することによる引き続きの確認を可能にした。したがって、最終配列は、完全なＬ．イントラセルラリスゲノム領域Ｂである。
【０１９９】
オーバーラップするｐｏｎＡ、ｈｔｒＡおよびｈｙｐＣ遺伝子領域を、５０μｌの最終試料容量中に鋳型としての１μｌの粘膜ＤＮＡ抽出物、１ｘＰＣ２緩衝液（Ab Peptide,Inc.）、各２００μＭのｄＮＴＰ、各５０ピコモルのプライマー、７．５Ｕ  Klen Taq１および０．１５Ｕクローン化Ｐｆｕ熱安定性ポリメラーゼをそれぞれ含有する３重ＰＣＲ反応中で増幅した。ｐｏｎＡの増幅条件は、９５゜で５分間の変性後、３３サイクルの変性（９５゜３０秒間）、アニーリング（６２゜３０秒間）および重合（７２゜３分間）から成った。ｈｔｒＡの増幅条件は、９４゜で５分間の変性後、３３サイクルの変性（９５゜３０秒間）、アニーリング（５８゜３０秒間）および重合（７２゜３分間）から成った。ｈｙｐＣの増幅条件は、９４゜で５分間の変性後、３３サイクルの変性（９５゜３０秒間）、アニーリング（６２゜３０秒間）および重合（７２゜８０秒間）から成った。７２゜で７分間の最終伸長は、標的の遺伝子領域それぞれの増幅を完全にした。増幅後、試料をそれぞれ別々にプールし、特定の産物をアガロースゲル電気泳動によって精製後、ＡＢＩ自動ＤＮＡシークエンサー（Lark Technologies,Inc., ヒューストン，ＴＸ）において DyeDeoxyＴＭ終結反応を用いる直接配列分析を行った。
【０２００】
合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、Ｌ．イントラセルラリスからの増幅産物の両ＤＮＡ鎖を配列決定した。配列分析に用いられるプライマーには、ＡＰ５５．１（配列番号：１０）、ＡＰ５５．２（配列番号：１１）、ＡＰ５５．３（配列番号：１２）、ＡＰ５５．４（配列番号：１３）、ＡＰ５５．５（配列番号：１４）、ＡＰ５５．６（配列番号：１５）、ＡＰ５５．７（配列番号：１６）、ＡＰ５５．８（配列番号：１７）、ＡＰ５５．９（配列番号：１８）、ＡＰ５５．１０（配列番号：１９）、ＡＰ５５．１１（配列番号：２０）、ＡＰ５６．１（配列番号：２１）、ＡＰ５６．２（配列番号：２２）、ＡＰ５６．３（配列番号：２３）、ＡＰ５７．１（配列番号：２４）、ＡＰ５７．２（配列番号：２５）、ＥＲ１５８（配列番号：３６）、ＥＲ１６３（配列番号：４０）、ＥＲ１７１（配列番号：４３）、ＥＲ１７２（配列番号：４４）、ＥＲ１７３（配列番号：４５）、ＥＲ１７８（配列番号：５０）、ＥＲ１７９（配列番号：５１）、ＥＲ１８９（配列番号：５６）、ＥＲ１９０（配列番号：５７）、ＥＲ１９１（配列番号：５８）、ＥＲ１９３（配列番号：５９）、ＥＲ１９４（配列番号：６０）、ＥＲ１９５（配列番号：６１）、ＥＲ１９６（配列番号：６２）、ＥＲ２０３（配列番号：６３）、ＥＲ２０４（配列番号：６４）、ＥＲ２０７（配列番号：６７）、ＥＲ２０８（配列番号：６８）、ＥＲ２１３（配列番号：６９）、ＥＲ２２８（配列番号：７２）、ＲＡ１３３（配列番号：７７）、ＲＡ１３４（配列番号：７８）およびＲＡ１７１（配列番号：８２）が含まれた。
【０２０１】
Ｌ．イントラセルラリスゲノム領域Ｂのヌクレオチド配列を配列番号：２に挙げる。この領域内にコードされるＰｏｎＡ、ＨｔｒＡ、ＨｙｐＣおよびＯＲＦ１タンパク質の推定上のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８および配列番号：９に示す。
【０２０２】
領域Ｂによって規定されるＬ．イントラセルラリス遺伝子および遺伝子産物の分子分析
ｆｌｇＥ遺伝子の下流で確認されたＬ．イントラセルラリス染色体領域Ｂは、ＰｏｎＡ、ＨｔｒＡ、ＨｙｐＣ、および部分“ＯＲＦ１”タンパク質と称されるタンパク質をコードしている（図１）。ｆｌｇＥ  ＯＲＦの一部分は、ここで与えられ、ヌクレオチド１〜１２５から伸長する（配列番号：２）。ｐｏｎＡ  ＯＲＦは、配列番号：２のヌクレオチド２５２〜２６９０から伸長し、約９０，２６３ダルトンの理論分子量を有する推定上の８１２アミノ酸タンパク質ＰｏｎＡ（配列番号：６）をコードしている。別のインフレーム翻訳開始コドンは、ヌクレオチド２７６に存在し、それは、用いられる場合、約８９，３１３ダルトンの理論分子量を有する僅かに小さい８０４アミノ酸タンパク質をコードすると考えられる。ｈｔｒＡ  ＯＲＦは、配列番号：２のヌクレオチド２９８１〜４３１５から伸長し、約５０，４７８ダルトンの理論分子量を有する推定上の４７４アミノ酸タンパク質ＨｔｒＡ（配列番号：７）をコードしている。小さいｈｙｐＣ  ＯＲＦは、配列番号：２のヌクレオチド４５８１〜４８２９から伸長し、約８，８８８ダルトンの理論分子量を有する推定上の８２アミノ酸タンパク質ＨｙｐＣ（配列番号：８）をコードしている。更に下流で且つ反対の配向で転写されるのは、更に別の読み取り枠である。このＯＲＦは“ｏｒｆ１”と称されたが、配列番号：２の３’末端のヌクレオチド４９１２〜５４４５から伸長する。このＯＲＦは、配列番号：２の３’末端によってオープンの状態のままであり、したがって、約２０，３４５ダルトンの理論分子量を有する切断されたタンパク質のＣ末端の１７７アミノ酸をコードしている。図８に示されるように、コードされるＯＲＦ１タンパク質（配列番号：９）は、メタノコッカス・ヤナシイ（Methanococcus jannaschii）ゲノムからの遺伝子“ＭＪ１１２３”（Ａｃｃｎ．Ｕ６７５５５）によってコードされる２０５アミノ酸の仮定のタンパク質と一定の相同性を有する。
【０２０３】
Ｌ．イントラセルラリスＨｙｐＣタンパク質のヒドロゲナーゼ成熟タンパク質との類似性
ＨｙｐＣタンパク質は、ヒドロゲナーゼ成熟タンパク質のｈｙｐ／ｈｕｐファミリーとの相同性を有する。ヒドロゲナーゼは、分子水素の可逆酸化を触媒し、水素が酸化されるまたは生じる多数の適切な嫌気性過程に関与している（Adams,M.W.W., ら，1990, Biochem.Biophys.Acta 594:105-176）。ＨｙｐＣタンパク質は、大腸菌における触媒活性なヒドロゲナーゼイソ酵素の成熟に必要である。この過程におけるＨｙｐＣの正確な役割はまだ知られていないが、ヒドロゲナーゼ成熟は、ニッケル挿入、タンパク質折りたたみ、Ｃ末端タンパク質分解プロセシング、膜組込みおよび還元的活性化を伴う（Lutz,S., ら，1991, Mol.Microbiol. 5:123-135; Przybyla,A.E., ら，1992, FEMS Microbiol.Rev. 88:109-136）。ＨｙｐＣタンパク質は、デスルフォビブリオ・ギガス８２アミノ酸ＨｙｎＤタンパク質（Ａｃｃｎ．ＡＪ２２３６６９，図７に示される）に４１％一致し、リゾビウム・レグミノサルムからの７５アミノ酸ＨｙｐＣタンパク質に３９％一致する。
【０２０４】
Ｌ．イントラセルラリスＰｏｎＡタンパク質のペニシリン結合タンパク質との類似性
ｐｏｎＡ  ＯＲＦは、約９０，２６３ダルトンの理論分子量を有する推定上の８１２アミノ酸タンパク質をコードしている。別のインフレームメチオニンコドンが存在し、それは、約８９，３１３ダルトンの理論分子量を有する僅かに小さい８０４アミノ酸タンパク質をコードしている。類似のインフレームメチオニンコドンは、他の特性決定されたｐｏｎＡ  ＯＲＦ中で確認されている。例えば、ナイセリア・フラベセンス（Ａｃｃｎ．ＡＦ０８７６７７）、淋菌（Ａｃｃｎ．Ｕ７２８７６）および髄膜炎菌（Ａｃｃｎ．Ｕ８０９３３）からのＰｏｎＡ同族体は、それぞれ８個、６個および６個のコドンによって隔てられたアミノ末端インフレームメチオニンコドンを含有する。Ｌ．イントラセルラリスと同様、ナイセリア類のｐｏｎＡ遺伝子は、認識できないリボソーム結合部位が先行するので、真の開始メチオニンの予測は更に複雑である。淋菌ＦＡ１９  ＰｏｎＡタンパク質のＮ末端配列決定は、次のメチオニンが、この菌株における好ましい出発部位であることを示した（Ropp ら，1997, J.Bacteriol. 179:2783-2787）。上流のメチオニンコドンは、Ｌ．イントラセルラリスからのコードされるＰｏｎＡタンパク質の推定上の開始部位として用いられた。
【０２０５】
ＰｏｎＡタンパク質の構造予測は、ＴＭＰｒｅｄを用いて行われた。そのＴＭＰｒｅｄプログラムは、膜に広がる領域およびそれらの配向の予測を行う（K.Hofmann & W.Stoffel, 1993. TMbase- A database of membrane spanning proteins segments. Biol.Chem. Hoppe-Seyler 347:166）。この分析は、ＰｏｎＡが、そのタンパク質のＮＨ２末端に強力な膜貫通ドメインを有することを示す。ＰｏｎＡのアミノ末端は、既知のシグナル配列上で操作されるネットワークを用いるＰＳＯＲＴ（６．４バージョン）計算機アルゴリズムによっても調べられた。この分析は、残基１６〜３２が、切断できないシグナル配列（D.J.McGeoch, Virus Research, 3:271,1985 および G.von Heijne, Nucl.Acids Res., 14:4683,1986）として作用すると考えられる膜貫通領域（P.Klein ら，1985, Biochim.Biophys.Acta, 815:468）を形成すると考えられることを示している。したがって、ＰｏｎＡのアミノ末端は、細菌の内膜にタンパク質を固定すると考えられ、それは、他のペニシリン結合タンパク質の局在化の方法と似ている。
【０２０６】
ＰｏｎＡタンパク質は、他の細菌で識別されるクラスＡ高分子質量ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）との相同性を有する。ペニシリン結合タンパク質は、ペプチドグリカン合成の最終段階に関与する細菌の細胞質膜タンパク質である。それらクラスＡタンパク質は、概して、グリカン鎖を重合するグリコシルトランスフェラーゼおよびこれら鎖をそれらのペプチド側鎖によって架橋するトランスペプチダーゼの２種類の酵素活性を示す。これらの反応は、細胞質膜の外表面でかまたは更に外側で触媒されるので、ペプチドグリカン合成に関与するタンパク質の主要部分は、ペリプラズム中に局在している。ＰｏｎＡタンパク質の推定上のアミノ酸配列（配列番号：６）を、ＢＬＡＳＴｐアルゴリズム（Altschul,S.F. ら，1997, 上記）によって GenBank に報告された他のタンパク質と比較し、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズム（Thompson ら，1994, 上記）によって整列させた。図５に示されるように、この分析は、ＰｏｎＡが、ナイセリア・フラベセンス（Ａｃｃｎ．ＡＦ０８７６７７）からのペニシリン結合タンパク質に最も似ていることを示した。ＰｏｎＡは、クラスＡ高分子質量ＰＢＰに特有の特徴を有する。アミノ酸１２４〜１３４（ＲＱＧＧＳＴＩＴＱＱＶ）を含めた配列は、全てのクラスＡ高分子質量ＰＢＰ中で見出されるＱＧＡＳＴボックス（Popham ら，1994, J.Bacteriol. 176:7197-7205）として知られる高度に保存される共通アミノ酸配列に相当する。ＰｏｎＡのＣ末端側の半分内に、ペニシロイルセリントランスフェラーゼスーパーファミリーの全メンバー中に高度に保存される三つの領域が見出されうる。これら領域には、残基５０７〜５１０の活性部位セリンを含有するＳＸＸＫ四分子（ＳＡＦＫ）、残基５６５〜５６７のＳＸＮ三分子（ＳＲＮ）および残基６８８〜６９１のＫＴ（Ｓ）Ｇ四分子（ＫＴＧ）が含まれる。これらモチーフは、折りたたまれたタンパク質中で互いに近づけられて、β−ラクタム抗生物質と相互作用するトランスペプチダーゼドメイン活性部位ポケットを形成すると考えられる。
【０２０７】
Ｌ．イントラセルラリスＨｔｒＡタンパク質のペリプラズムセリンプロテアーゼタンパク質との類似性
ＨｔｒＡのアミノ末端の検討は、アミノ酸１〜２６が疎水性であり且つ正に荷電していることを示し、それはシグナル配列の特徴を示している（von Heijm, 1985, J.Mol.Biol. 184:99-105）。既知のシグナル配列上で操作されるネットワークを用いるＰＳＯＲＴ計算機アルゴリズム（Nakai,K., 1991, PROTEINS: Structure,Function,and Genetics 11:95-110）は、残基１〜２６が典型的なシグナル配列として機能すると考えられることを示し、アミノ酸２６と２７との間の最も可能性のある切断部位を予測する。したがって、アミノ酸１〜２６は、成熟過程中にＨｔｒＡから除去されると考えられる。
【０２０８】
ＨｔｒＡタンパク質の推定上のアミノ酸配列（配列番号：７）を、ＢＬＡＳＴｐアルゴリズム（Altschul,S.F. ら，1997, 上記）によって GenBank に報告された他の既知のタンパク質と比較し、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズム（Thompson,J.D. ら，1994, 上記）によって整列させた。この分析は、ペリプラズムセリンプロテアーゼの大きいＨｒｔＡ／ＤｅｇＰファミリーに属するＨｔｒＡを示した。報告されるタンパク質には、特に、大腸菌、ネズミチフス菌、カンピロバクター・ジジュニ（Camplylbacter jejuni）、インフルエンザ菌、マルタ熱菌（Brucella melitensis）、ウシ流産菌（Brucella abortus）、トラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis）、エルジニア・エンテロコリティカ（Yersinia enterocolitia）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）および枯草菌（Bacillus subtilis）から識別されるものが含まれる。ある場合には、ＨｔｒＡ同族体は、熱ショックタンパク質と称され、高温での細菌の生存または細胞内病原体の生存に必要であることが欠失分析によって示されてきた。他の場合には、ＨｔｒＡ同族体は温度によって生じないが、他の生理学的ストレスに応答して発現される。いくつかのＨｔｒＡ同族体は、セリンプロテアーゼ活性を有することが示されており、多くの場合、細菌ビルレンスおよび／または細胞内生存に、例えば、高温、過酸化水素、酸化および浸透圧ストレスへの耐性に重要である。
【０２０９】
Ｌ．イントラセルラリスＨｔｒＡタンパク質と緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）（Ａｃｃｎ．＃Ｕ３２８５３）からの最も類似した相対物との整列は、それら二つのタンパク質が、４０％一致するアミノ酸残基を有することを示す（図６に示される）。Ｌ．イントラセルラリスＨｔｒＡタンパク質と他のセリンプロテアーゼとの整列に基づき、ヒスチジン−１０９、アスパラギン酸−１４３および活性部位セリン−２１７を含めた特に充分に保存される残基は、細菌および哺乳動物のセリンプロテアーゼ中に高度に保存される残基の触媒性三分子を形成すると考えられる。多数のＨｔｒＡ同族体は、カルボキシル末端ＲＧＤモチーフを含有するが、他はＲＧＮモチーフを含有することが示されている。Ｌ．イントラセルラリスＨｔｒＡタンパク質は、残基４５８〜４６０に類似のモチーフを含有する（ＲＮＧ）。ＲＧＤモチーフは、哺乳動物接着性タンパク質の細胞結合部位として識別されている（Ruoslahti,E. ら，1986, Cell 44:517-518）。セリンプロテアーゼのＨｔｒＡ／ＤｅｇＰファミリーは、一定範囲のストレス応答中におよびＬ．イントラセルラリスによる感染中に生じ、ＨｔｒＡの表面発現は、ストレス応答機序の一部分として起こりうる。他の細胞内熱ショックタンパク質は、生理学的ストレス条件下で表面に発現された状態になることが示されており、接着性因子として関係している（Ensgraber,M. ら，1992, Infect.Immun. 60:3072-3078 および Hartmann,E. ら，Infect.Immun. 65:1729-1733）。
【０２１０】
ｈｔｒＡプロモーター領域の分析および温度に応じた誘導
Ｌ．イントラセルラリス領域Ａおよび領域Ｂの遺伝子配置は、それらのコードされるタンパク質の間の遺伝子間スペーシングの程度に関して異なる。領域Ａとは異なり、領域Ｂ内のＯＲＦは、より遠く離れている。例えば、ｆｌｇＥ、ｐｏｎＡ、ｈｔｒＡおよびｈｙｐＣ遺伝子は、それぞれの読み取り枠の間が約１２５、２００および２６５ヌクレオチドによって隔てられている。ｈｔｒＡの直ぐ上流の２００ｂｐ領域は、特に、いくつかのＨｔｒＡタンパク質同族体が、温度、酸化および浸透圧ストレスを含めた多数の異なった環境シグナルに応じて生じることが分かって以来、プロモーター領域を見つけるためにより詳細に検討された。ｈｔｒＡの上流の配列番号：２のヌクレオチド配列の検討は、ヌクレオチド２７９７〜２８０２（ＴＴＧＡＴＡ；−３５領域）およびヌクレオチド２８２４〜２８２９（ＴＡＴＡＡＴ；−１０領域）にほぼ位置するプロモーターを示した。これら二つの六量体は、２１ヌクレオチドスペースによって隔てられ、共通のσ７０型プロモーターにほぼ完全な相同性を有する。他のプロモーター因子はこの領域中に存在することができ、種々の環境シグナルに応じてｈｔｒＡ発現を調節する。プラスミドｐＥＲ４３４は、ｈｔｒＡ  ＯＲＦおよびｈｔｒＡプロモーター領域を含有し、３０℃かまたは３７℃で成長する大腸菌宿主細胞に温度依存性表現型を与える。したがって、ｈｔｒＡの上流の領域は、温度に応じた可能性のある機能的プロモーターとして認識されうる。したがって、ｈｔｒＡプロモーターを用いて、温度に応じて大腸菌および他の微生物における異種タンパクの発現を機能的に調節することは可能なはずである。他の環境因子に応じて発現を調節する他のプロモーター因子の存在は、それら他のシグナルを用いて発現を調節することを可能にすると考えられる。
【０２１１】
実施例３：プラスミドの製造および寄託材料
Ｌ．イントラセルラリス領域Ａを包含するＤＮＡフラグメント含有プラスミド
ｌｙｓＳ、ｙｃｆＷ、ａｂｃ１およびｏｍｐ１００遺伝子を示すＬ．イントラセルラリスゲノム領域を含有するプラスミドを製造した。ｌｙｓＳ遺伝子とｙｃｆＷ遺伝子の一部分とを包含する２．６ｋｂフラグメントを、プライマーＥＲ２４６（配列番号：９７）およびＥＲ２５４（配列番号：９８）を用いて増幅させ、ｙｃｆＷ遺伝子の一部分および完全なａｂｃ１遺伝子フラグメントを包含する０．８７ｋｂフラグメントを、プライマーＥＲ２２９（配列番号：７３）およびＥＲ２０６（配列番号：６６）を用いて増幅させた。これらフラグメントは、実施例１に記載のように、“Ｌ．イントラセルラリス領域Ａを包含するサブゲノムＤＮＡフラグメントの特異的ＰＣＲ増幅”の下で増幅した。それら２．６ｋｂおよび０．８７ｋｂ  ＤＮＡフラグメントを、スピンクロマトグラフィー（ＱＩＡｑｕｉｃｋＴＭ）を用いた抽出によって単離し、ｐＣＲ２．１ Topo のＴＡクローニング部位中に挿入した。ベクター特異的配列決定用プライマーを用いた単純配列伸長反応は、クローン化されたフラグメントの端点を確認し、そしてプラスミドｐＴ０６８中のＬｙｓＳおよびＹｃｆＷ並びにプラスミドｐＥＲ４３８中のＹｃｆＷおよびＡＢＣ１をコードしている遺伝子が、ラクトースプロモーターに相対して反対の配向にあることを示した。
【０２１２】
ｏｍｐ１００遺伝子を含有する２．９７ｋｂ  ＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲによって特異的５’および３’プライマーＥＲ１８７（配列番号：５４）およびＥＲ１７０（配列番号：４２）を用いて増幅させた。ＰＣＲ反応は、三重に行われ、５０μｌの最終試料容量中に鋳型としての１μｌ  ＤＮＡ抽出物、１ｘＰＣＲ Buffer II、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各２００μＭのデオキシＮＴＰ、各５０ピコモルのプライマーおよび２．５Ｕ  AmpliTaq Gold 熱安定性ポリメラーゼを含有した。増幅条件は、９５゜で９分間の変性後、３３サイクルの変性（９５゜３０秒間）、アニーリング（６２゜３０秒間）および重合（７２゜３分間）から成った。７２゜で７分間の最終伸長は、標的遺伝子領域の増幅を完全にした。増幅後、三重の試料をそれぞれプールし、その特定の生産物を、スピンクロマトグラフィー（ＱＩＡｑｕｉｃｋＴＭ）を用いた抽出によって単離し、ｐＣＲ２．１ Topo のＴＡクローニング部位中に、ラクトースプロモーターに相対して反対の配向で挿入した。このプラスミド構築物をｐＥＲ４４０と称した。
【０２１３】
プラスミドｐＥＲ４３８およびｐＥＲ４４０を、大腸菌ＴＯＰ１０細胞（Invitrogen, カールズバット，ＣＡ）中に導入した。得られたＰｚ４３８およびＰｚ４４０と称される菌株を、１９９９年９月９日にＡＴＣＣ（１０８０１  University Blvd, マナッサス，ＶＡ，２０１１０，米国）に寄託し、受託番号ＰＴＡ−６３８およびＰＴＡ−６４０をそれぞれ付与された。プラスミドｐＴ０６８を大腸菌ＴＯＰ１０細胞中に導入し、得られた菌株を２０００年７月１４日にＡＴＣＣに寄託し、受託番号ＰＴＡ−２２３２を付与された。
【０２１４】
Ｌ．イントラセルラリス領域Ｂを包含するＤＮＡフラグメント含有プラスミド
ｐｏｎＡ、ｈｔｒＡおよびｈｙｐＣ遺伝子を示すＬ．イントラセルラリスゲノム領域を含有するプラスミドを製造した。それらｐｏｎＡ、ｈｔｒＡおよびｈｙｐＣ遺伝子フラグメントを、上の実施例２の“Ｌ．イントラセルラリス領域Ｂを包含するサブゲノムＤＮＡフラグメントの特異的ＰＣＲ増幅”と題する項目に記載のように、ｐｏｎＡ遺伝子に隣接するプライマーＥＲ２２８（配列番号：７２）およびＥＲ１９０（配列番号：５７）；ｈｔｒＡ遺伝子に隣接するプライマーＥＲ２０７（配列番号：６７）およびＲＡ１３４（配列番号：７８）；およびｈｙｐＣ遺伝子に隣接するプライマーＥＲ１８９（配列番号：５６）およびＥＲ１９６（配列番号：６２）を用いて増幅させた。得られたｐｏｎＡ含有２．９８ｋｂフラグメントを、ＪＥＴsorbＴＭキットを用いるアガロースゲル電気泳動にしたがって精製し、そしてｐＣＲ２．１ Topo 中にクローン化してプラスミドｐＥＲ４３２を生じた。得られたｈｔｒＡ含有１．７２ｋｂフラグメントを、スピンクロマトグラフィー（ＱＩＡｑｕｉｃｋＴＭ）を用いた抽出によって単離し、ｐＣＲ２．１ Topo のＴＡクローニング部位中に挿入してプラスミドｐＥＲ４３４を生じた。ｈｙｐＣと、ＯＲＦ１のＣ末端の９４アミノ酸をコードしている追加の隣接するヌクレオチドを含有する得られた０．９８ｋｂフラグメントを、スピンクロマトグラフィー（ＱＩＡｑｕｉｃｋＴＭ）を用いた抽出によって単離し、ｐＣＲ２．１ Topo のＴＡクローニング部位中に挿入してプラスミドｐＥＲ４３６を生じた。ベクター特異的配列決定用プライマーを用いた単純配列伸長反応は、クローン化されたフラグメントの端点を確認し、そしてＰｏｎＡおよびＨｙｐＣをコードしている遺伝子が、ラクトースプロモーターに相対して反対の配向にあることを示した。ＨｔｒＡ遺伝子を、ラクトースプロモーターに相対して同じ配向でクローン化したが、このようなプラスミドを含有する細胞は、３７℃で不安定な表現型を示し、それは、３０℃で成長を維持した場合に軽減された。
【０２１５】
プラスミドｐＥＲ４３２、ｐＥＲ４３４およびｐＥＲ４３６を、大腸菌ＴＯＰ１０細胞（Invitrogen, カールズバット，ＣＡ）中に導入した。得られたＰｚ４３２、Ｐｚ４３４およびＰｚ４３６と称される菌株を、１９９９年９月９日にＡＴＣＣ（１０８０１  University Blvd, マナッサス，ＶＡ，２０１１０，米国）に寄託し、受託番号ＰＴＡ−６３５、ＰＴＡ−６３６およびＰＴＡ−６３７をそれぞれ付与された。
【０２１６】
実施例４：組換え体ＨｔｒＡおよびＯｍｐ１００タンパク質の大腸菌での発現
プラスミド発現ベクター
組換え体ＨｔｒＡおよびＯｍｐ１００の製造に用いられる発現ベクターは、ｐＥＴ−２８ｂ（＋）（Novagen,Inc., マディソン，ＷＩ）であった。ＨｔｒＡおよびＯｍｐ１００タンパク質のコーディング配列を、Ｌ．イントラセルラリスに感染したブタ粘膜ＤＮＡ抽出物から増幅させた。それらＰＣＲ産物を、ＪＥＴsorbＴＭキットを用いるアガロースゲル電気泳動にしたがって精製し、そしてｐＣＲ２．１ Topo 中にクローン化して、プラスミドｐＲＬ００１（ＨｔｒＡ）およびｐＥＲ４１５（Ｏｍｐ１００）を生じた。ＨｔｒＡ  ＯＲＦを増幅させるのに用いられた特異的ＰＣＲプライマーには、ＥＲ２０８（配列番号：６８）およびＲＡ１３３（配列番号：７７）が含まれた。プライマーＥＲ２０８は、ＮｄｅＩ部位（ＣＡＴＡＴＧ）を導入するように設計されたが、ＨｔｒＡシグナル配列を欠失していた。ｐＲＬ００１中に存在するＨｔｒＡインサートを、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩを用いた消化後、ｐＥＴ−２８ｂ（＋）中にサブクローン化した。得られたｐＥＲ４０５と称される発現プラスミドを、挿入されるフラグメントの５’および３’両末端において配列決定し、ベクターにコードされる６ｘＨｉｓリーダーとのインフレーム融合をコードすることを確認した。したがって、コードされるタンパク質の推定のアミノ末端配列は、ベクターによってコードされる配列ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭ、その直後の、ＨｔｒＡ読み取り枠のアラニン−２７で開始する配列ＡＬＰＮＦＶＰから成った。
【０２１７】
Ｏｍｐ１００  ＯＲＦを増幅させるのに用いられた特異的ＰＣＲプライマーには、ＥＲ２１６（配列番号：７０）およびＲＡ１３８（配列番号：７９）が含まれた。プライマーＥＲ２１６は、ＮｃｏＩ部位（ＣＣＡＴＧＧ）を導入するように設計されたが、Ｏｍｐ１００シグナル配列を欠失していた。更に、ＥＲ２１６は、本明細書中に援用される Sung ら，1986, Proc.Natll.Acad.Sci. USA 83:561-565; Sung ら，1987, Meth.Enzymol. 153:385-389; および米国特許第５，４６０，９５４号からの情報に基づいて、組換え体タンパク質をタンパク質分解から保護する“保護ペプチド”と称されるリーダーペプチドを規定した。アミノ酸配列ＭＧＴＴＴＴＴＴＳＬから成る保護ペプチドは、ＥＲ２１６の５’近位ヌクレオチド配列によってコードされた。ｐＥＲ４１５中に存在するＯｍｐ１００インサートを、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩを用いた消化後、ｐＥＴ−２８ｂ（＋）中にサブクローン化した。得られたｐＲＬ０２９と称される発現プラスミドを、挿入されるフラグメントの５’および３’両末端において配列決定し、保護ペプチドリーダーとのインフレーム融合をコードすることを確認した。したがって、コードされるタンパク質の推定のアミノ末端配列は、ＥＲ２１６の５’近位ヌクレオチド配列によって規定される配列ＭＧＴＴＴＴＴＴＳＬ、その直後の、Ｏｍｐ１００読み取り枠のアラニン−２６で開始する配列ＡＳＫＤＤＰＳＩＶから成った。
【０２１８】
組換え体タンパク質の発現
組換え体ＨｔｒＡおよびＯｍｐ１００をそれぞれコードしている、ｐＥＴ−２８ｂ（＋）に基づく発現ベクターｐＥＲ４０５およびｐＲＬ０２９を、発現宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中に導入した。この発現宿主は、ＩＰＴＧ誘導ファージＴ７プロモーターによって推進されるクローン化遺伝子の高レベル転写を可能にする遺伝子型Ｆ−，ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌ  ｄｃｍ（ＤＥ３）（Novagen,Inc.）を有する。それら大腸菌の形質転換細胞を、５Ｌ  BioFlowＴＭ３０００発酵槽（New Brunswick Scientific, エディソン，ＮＪ）中の５０μｇ／ｍｌ硫酸カナマイシンを含有するＳＢ＃２培地（２．４％酵母エキス，１．２％トリプトン，０．５％  Ｋ２ＨＰＯ４，０．２５％  ＫＨ２ＰＯ４，０．１４％  ＭｇＳＯ４）中において３０〜３７℃で、Ａ６２５が２．５〜３０．１になるまで増殖させた。組換え体タンパク質発現は、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いた１〜４．５時間の誘導後に得られた。
【０２１９】
組換え体ＨｔｒＡを発現する大腸菌の湿潤細胞を、１０，０００ｐｓｉ（２工程）でのホモジナイゼーションによって溶解させた後、遠心分離した。そのペレットはＨｔｒＡを含有し、それを、５：４比である２ｘＲＩＰＡ／ＴＥＴを用いて洗浄した。２ｘＲＩＰＡは、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２．０％デオキシコール酸ナトリウムおよび２％（ｖ／ｖ）Igepal ＣＡ−６３０ＴＭ（Sigma）である。ＴＥＴは、０．１Ｍトリス（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび２％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００である。次に、洗浄したペレットを、８Ｍ尿素、１０ｍＭトリス、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０中に溶解させた。溶解したタンパク質を、８Ｍ尿素、１０ｍＭトリス、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０中で２倍に希釈し、Ｎｉ  ＮＴＡカラム（ＱＩＡＧＥＮ，サンタ・クラリタ，ＣＡ）上に加えた。所望のタンパク質を、このカラムから、８Ｍ尿素、１０ｍＭトリス、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ４．５へのｐＨの減少によって溶出させた。最後にプールされた画分を、４ＭグアニジンＨＣｌ、５０ｍＭトリス、ｐＨ６．５に対して透析し、次の工程では、２ＭグアニジンＨＣｌ、２５ｍＭトリス、ｐＨ６．５に透析した。最終生成物を、０．２２μＭ濾過によって濾過した。タンパク質濃度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる７０％の推定目視純度で０．５６ｍｇ／ｍｌであった。
【０２２０】
組換え体Ｏｍｐ１００を発現する大腸菌の湿潤細胞を、ＤＮＡ分解を容易にするために、リゾチーム、および BenzonaseＴＭ（BenzonaseＴＭ（ＥＭ Industries,Inc., ホーソーン，ニューヨーク））の存在下の音波処理を用いて溶解させた後、遠心分離した。そのペレットはＯｍｐ１００を含有し、それを、２Ｍ尿素、５０ｍＭトリス、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５ｍＭ  ＤＴＴ、１％ Zwittergent ３−１４を用いて２回洗浄した。そのペレットを、６Ｍ尿素、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）を用いて再懸濁させた後、遠心分離した。そのペレットを、５：４比である２ｘＲＩＰＡ／ＴＥＴを用いて洗浄し、次に、その洗浄されたペレットを、８Ｍ尿素、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中に溶解させた。２５ｍＭ  ＤＴＴをその溶解したタンパク質に加え、８Ｍ尿素、２５ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）を用いて２：１に更に希釈した。希釈された溶解タンパク質を、８Ｍ尿素、２５ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）を用いて平衡されたＱ−セファロースカラム上に加えた。組換え体Ｏｍｐ１００は、８Ｍ尿素、２５ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中の０〜１Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配で溶離した。プールされた画分を、６ＭグアニジンＨＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）に対して透析し、次の工程では、４ＭグアニジンＨＣｌ、６．７ｍＭ  ＤＴＴ、３３．３ｍＭトリス（ｐＨ８．０）に透析した。最終生成物を、０．２２μＭ濾過によって濾過し、−７０℃で凍結させた。次に、精製されたＯｍｐ１００タンパク質を融解させ、遠心分離し（１６，０００ｒｐｍ，６０分間）、そしてその上澄みに再度０．２２μＭ濾過を施して、不溶性粒子および凝集物を除去した。タンパク質濃度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる８０％の推定目視純度で１．０８ｍｇ／ｍｌであった。
【図面の簡単な説明】
【０２２１】
【図１】図１は、ＬｙｓＳ、ＹｃｆＷ、ＡＢＣ１およびＯｍｐ１００タンパク質をコードしている遺伝子を含有する遺伝子クラスターＡの配列、およびＰｏｎＡ、ＨｔｒＡおよびＨｙｐＣタンパク質をコードしている遺伝子クラスターＢの配列を示す。
【図２】図２は、ＹｃｆＷアミノ酸配列の列を、GenBank データベースの検索で見出される最も類似した配列と一緒に示す。
【図３】図３は、ＡＢＣ１アミノ酸配列の列を、GenBank データベースの検索で見出される最も類似した配列と一緒に示す。
【図４】図４は、Ｏｍｐ１００アミノ酸配列の列を、GenBank データベースの検索で見出される最も類似した配列と一緒に示す。
【図５】図５は、ＰｏｎＡアミノ酸配列の列を、GenBank データベースの検索で見出される最も類似した配列と一緒に示す。
【図６】図６は、ＨｔｒＡアミノ酸配列の列を、GenBank データベースの検索で見出される最も類似した配列と一緒に示す。
【図７】図７は、ＨｙｐＣアミノ酸配列の列を、GenBank データベースの検索で見出される最も類似した配列と一緒に示す。
【図８】図８は、Ｏｒｆ１アミノ酸配列の列を、GenBank データベースの検索で見出される最も類似した配列と一緒に示す。
【図９】図９は、ＬｙｓＳアミノ酸配列の列を、GenBank データベースの検索で見出される最も類似した配列と一緒に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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