(57)【要約】【課題】本発明の目的は従来方法によるアルデヒドからの生成物の存在をより短時間で、且つ容易に確認できる方法を提供することにある。【解決手段】培地をｐＨ３．０〜５．０の酸性培地とし、該培地を密封状態にして培養温度を３５〜５５℃、好ましくは４０℃以上に維持しつつ培養を行い、培養生成物より好酸性芽胞形成細菌によるアルデヒドからの生成物の存在を確認することを特徴とする酸性保存食品中の好酸性芽胞形成細菌の検出方法。【選択図】　　　図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸性保存食品を培地に添加し、アルデヒドの共存下で培養を行う該酸性保存食品中の好酸性芽胞形成細菌の検出方法において、
培地をｐＨ３．０〜５．０の酸性培地とし、該培地を密封状態にして培養温度を３５〜５５℃に維持しつつ培養を行い、培養生成物より好酸性芽胞形成細菌によるアルデヒドからの生成物の存在を確認することを特徴とする酸性保存食品中の好酸性芽胞形成細菌の検出方法。
【請求項２】
培地は、予めアルデヒドが添加され、滅菌処理されているものであることを特徴とする請求項１に記載の好酸性芽胞形成細菌の検出方法。
【請求項３】
培養温度が４０〜５５℃であることを特徴とする請求項１又は２記載の酸性保存食品中の好酸性芽胞形成細菌の検出方法。
【請求項４】
培養容器は実質的に密封容器であり、且つ培地に対し１０％以上のヘッドスペースを有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の酸性保存食品中の好酸性芽胞形成細菌の検出方法。
【請求項５】
アルデヒドがバニリンであり、アルデヒドからの生成物であるグアヤコールを検出することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の酸性保存食品中の好酸性芽胞形成細菌の検出方法。
【請求項６】
密封可能な培養容器と、
該培養容器中に入れられた、アルデヒドを含む好酸性芽胞形成細菌用培地と、
を有し、前記容器には、培地容積に対し１０％以上のヘッドスペースが存在することを特徴とする好酸性芽胞形成細菌の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は酸性保存食品中の好酸性芽胞形成細菌の検出方法及び検出キット、特に好酸性芽胞形成細菌の代謝物より該好酸性芽胞形成細菌の存在を確認する方法の改良に関する。
【０００２】
【従来の技術】
果汁飲料などの比較的酸性度の高い食品には、通常の微生物は生育しにくいと考えられており、従来、パスツール殺菌（８５〜９５℃程度の範囲の加熱殺菌）で十分とされてきた。
しかしながら、これらの果汁飲料を充填した缶飲料などから変敗缶が発見されており、特に充填後しばらくしてから変敗現象が発見される場合が多いため、その検出方法の確立が望まれている。
【０００３】
近年、このような酸性飲料の変敗の原因が耐熱性の好酸性菌にあることが報告されている（例えば、「缶詰時報」７２巻１０号第２８頁　平成５年１０月１日社団法人　日本缶詰協会発行あるいは「缶詰時報」７３巻１０号第４４頁　平成６年１０月１日　社団法人　日本缶詰協会発行）。
好酸性菌の検出方法は、従来は一般的な菌培養に基づくコロニー確認に依存していたため、検査担当者にある程度の熟練を要し、しかも平板培地上のコロニーを確認した後、さらに芽胞形成を顕微鏡で確認するには４〜５日の日数を要していた。そのため、酸性保存食品を出荷する前に長期にわたって保存し、その間に当該ロット中の好酸性菌の存否を判断していた。
【０００４】
その後、本発明者等の研究により、好酸性菌はその培養中にバニリン等のアルデヒド類を特異的に変化させることが見出され、それを基にして、本発明者等から、酸性保存食品中の好酸性菌の検査日数を従来方法よりも短縮する方法が提案された（特許第３１７７３６７号）。すなわち、酸性保存食品を培地に添加し、培養を行うことで該酸性保存食品中の菌を検出する方法において、酸性培地にアルデヒドを添加し、培養生成物より好酸性芽胞形成細菌によるアルデヒドからの生成物の存在を確認することにより、酸性保存食品中の好酸性芽胞形成細菌の存否を検出する方法である。
【０００５】
【特許文献１】
特許第３１７７３６７号公報
【非特許文献１】
「缶詰時報」７２巻１０号第２８頁　平成５年１０月１日　社団法人　日本缶詰協会発行
【非特許文献２】
「缶詰時報」７３巻１０号第４４頁　平成６年１０月１日　社団法人　日本缶詰協会発行
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者等が提案した上記検出方法によって、従来は４〜５日の日数を要していた好酸性菌の存否の確認が２〜３日に短縮できた。
しかしながら、果汁飲料の缶詰や瓶詰、ペットボトル詰などの生産速度は近年かなり高速化されているので、飲料缶詰などの製造ラインを半日稼動させただけでも大量の飲料缶詰などが製造されるようになったこと、及び、缶詰販売会社は、大量の缶詰、瓶詰やペットボトル詰等を製品倉庫に貯蔵しておいて（従って、大きな製品倉庫が必要となる）、少しずつスーパーマーケットやコンビニエンスストアなどに出荷する従来の方法から、製品倉庫に缶詰などを大量に貯蔵することなく、製造したものを短い日数で出荷する方法を採用しはじめた（大きな製品倉庫を必要とせず、流通コストの低減化が可能となる）ため、出荷の可否につながる酸性保存食品中の好酸性菌の存否もさらに短時間で検出できる方法が求められている。
【０００７】
尚、酸性保存食品中の好酸性菌の存在の有無を検出するのは、缶詰や瓶詰を製造したときだけでなく、例えば、外国から果汁を購入する場合に、購入予定の果汁中に好酸性菌が存在していないか否かを予め確認するために必要であり、また、外国からタンク等に入れて輸入した果汁から、缶詰や瓶詰等を製造する前に、輸送中に何らかの原因で好酸性菌が混入してはいないか否かを検出するために必要である。これらの場合にも、保存食品中の好酸性菌の存否は短時間で検出できることが望ましい。
【０００８】
本発明は前記従来技術の課題に鑑みなされたものであり、その目的は従来方法によるアルデヒドからの生成物の存在をより短時間で、且つ容易に確認できる方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明にかかる好酸性芽胞形成細菌の検出方法は、　酸性保存食品を培地に添加し、アルデヒドの共存下で培養を行う方法において、
培地をｐＨ３．０〜５．０の酸性培地とし、該培地を密封状態にして培養温度を３５〜５５℃に維持しつつ培養を行い、培養生成物より好酸性芽胞形成細菌によるアルデヒドからの生成物の存在を確認することを特徴とする。
すなわち、これらのｐＨ及び温度は好酸性芽胞形成細菌の増殖しやすい条件であるとともに、他の細菌の増殖を抑制することができ、好酸性芽胞形成細菌が短時間で増殖してアルデヒドの大部分を急速に特異的に変化させるので、その生成物の存在を確認することで好酸性芽胞形成細菌の有無を確認できる。
【００１０】
また、前記方法において、培地は、予めアルデヒドが添加され、滅菌処理されているものであることが好適であり、特別に技能を有さない者でもこの培地を使用すれば容易に検査を実施することができる。
また、前記方法において、培養温度が４０〜５５℃であることが好適であり、特に細菌の選択性を高めることができる。
【００１１】
また、前記方法において、培養容器は実質的に密封容器であり、且つ培地に対し１０％以上のヘッドスペースを有することが好適であり、ヘッドスペース中に酸素を確保することができるので、元々の培地の酸素濃度が低くても空間部分の酸素が培地中に溶出し、培地の酸素濃度が次第に高くなり、その結果、好酸性芽胞形成細菌の増殖が促進され、それだけ早く好酸性芽胞形成細菌の有無の検出が可能となる。
【００１２】
また、前記方法において、アルデヒドがバニリンであり、アルデヒドからの生成物であるグアヤコールを検出することが好適である。この結果、グアヤコールの特有な臭いにより、検出する者が特別の臭気に敏感になるような訓練を受けていなくても、極めて容易にその存否が検出できることとなる。
また、本発明にかかる検出キットは、密封可能な培養容器と、
該培養容器中に入れられた、アルデヒドを含む好酸性芽胞形成細菌用培地と、
を含み、前記容器には、培地容積に対し１０％以上のヘッドスペースが存在することを特徴とする。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照しつつ本発明の好適な実施形態を説明する。
本発明者らは、特許第３１７７３６７号の方法をさらに詳細に検討し、検査期間の短縮とともに、培養対象となる細菌の選択性の向上を図った。すなわち、パスツール殺菌が行われた缶飲料中には、変敗の原因菌である好酸性芽胞形成細菌（分離菌Ａ〜Ｄ）のほかにも、酸性保存食品中では事実上まったく生育、増殖しない細菌の生存も皆無とは言えず、これらの細菌が好酸性菌の培養中に発現し、検出精度に影響を与えないとも限らない。
むろん、培養操作中の細菌汚染の可能性もあり、これらに対する対策も必要である。
【００１４】
このため、培養は対象となる好酸性芽胞形成細菌に好適であるとともに、他の細菌には不適となる条件で行われることが好ましい。
本発明者らによる検討の結果、このような細菌選択性の向上は、ｐＨ、温度及び酸素量を適切に制御することで達成されることが明らかとなった。
【００１５】
至適ｐＨ
まず、本発明者等は分離菌を使用して、好酸性芽胞形成細菌がもっとも繁殖しやすい培地のｐＨを求めることにした。
すなわち、ｐＨを２．０，２．５，３．０，３．５，４．０，４．５，５．０，５．５，６．０，６．５と変化させた培地をそれぞれ用意し、これらの培地を１２１℃で約１５分間殺菌処理し、自然冷却させて室温付近になった時点で、クリーンベンチ内で培地を殺菌済みの２０ｍｌの試験管にそれぞれ１０ｍｌずつ入れる。その後、０．４５μｍのフィルターを通して無菌酸素を滅菌済みのチューブを介して各試験管内の培地に約２分間バブリングして、溶存酸素量を通常の酸素溶解量（８ｐｐｍ）から、過飽和な状態になるようにする。このような処理をした試験管内に、あらかじめ分離菌Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄをそれぞれ添加し、約４０℃に維持して３６時間の培養実験を行った。その結果を図１〜図４に示す。
【００１６】
図１〜図４の試験結果を見ると、いずれの菌でもｐＨ３．０〜５．５の範囲が比較的増殖率が高く、そのうちで特に、ｐＨ３．０〜５．０の範囲内が増殖率が高いことが判る。
すなわち、好酸性芽胞形成細菌がもっとも繁殖しやすいｐＨは、３．０〜５．０である。
【００１７】
至適培養温度
次に、本発明者等は、分離菌を使用して、好酸性芽胞形成細菌がもっとも繁殖しやすい温度を求めることとした。
表１に各種微生物と、それぞれの至適ｐＨでの温度と発育状況の関係を示し、表２に各種微生物とｐＨ３．０〜５．０での温度と発育状況の関係を示す。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
表１の結果より明らかなように、各至適ｐＨにある場合、一般細菌あるいはカビ酵母は４０℃程度となるとかなり生育、増殖が困難となるが、分離菌Ａ〜Ｄ及び好熱菌は４０℃以上にあっても生育、増殖ともに活発であり、単に培養温度を４０℃以上としたのみでは、分離菌Ａ〜Ｄと好熱菌との選択はできないことが理解される。なお、分離菌Ａ〜Ｄは芽胞形成細菌の一種であることは確認されているが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ＬｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓやＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏａｇｕｌａｎｓといった一般的な芽胞形成細菌と比較して高温域における発育性も確認された。
そこで、本発明者らはｐＨと温度の組み合わせにより分離菌Ａ〜Ｄの選択的生育、増殖を行うことを検討した。
【００２０】
【表２】
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【００２１】
前記表２より明らかなように、ｐＨ３．０〜５．０で、且つ培養温度を３５℃以上、特に好ましくは４０〜５５℃とすると、分離菌Ａ〜Ｄの生育、増殖は良好であるが、好熱菌の増殖はほぼ抑制され、高い選択性を得ることができる。
【００２２】
酸素と発育
図５に酸素と好酸性芽胞形成細菌の生育との関係を示す。
同図より明らかなように、脱酸素（酸素濃度０．５ｐｐｍ）の場合と比較し、培地中の酸素濃度を５ｐｐｍとした場合には生育が向上し、さらにヘッドスペースを形成することにより発育が促進される。これはヘッドスペース中の酸素が消費されるためと考えられる。
【００２３】
したがって、例えば、培地に酸性保存食品を添加した後、フィルターを通して無菌状態となった酸素ないし空気を該培地に供給し、該培地の酸素濃度を６．０ｐｐｍ以上の状態に維持しつつ培養を行うことが好適である。この結果、該培地の酸素濃度が高くなり、それだけ好酸性芽胞形成細菌の増殖が促進され、より短時間で増殖が起こり、アルデヒドの大部分をより短時間で特異的に変化させてその生成物を検出しやすくできる。
【００２４】
また、培地の上方に空間部分が存在する状態で該培地を容器内に収容し、その後、無菌酸素ないし空気を培地内だけでなく該空間部分にも供給してから、該容器を密閉状態にし、該培地の酸素濃度を８．０ｐｐｍ以上の過飽和に維持した状態で培養を行うことが好適である。この結果、培地の上方に存在する空間部分も酸素濃度が高いので、元々の培地の酸素濃度が低くても、空間部分の酸素が培地中に溶出するので、培地の酸素濃度が次第に高くなり、好酸性芽胞形成細菌の増殖が促進され、それだけ早く好酸性芽胞形成細菌の有無の検出が可能となる。
本発明者等がさらに検討したところ、ヘッドスペース量は培地に対して５％以上、特に好ましくは１０％以上であることが好適である。
【００２５】
【実施例】
以下、本発明のより具体的な実施例について説明する。
図６には、本発明の一実施例にかかる検出キットが示されている。
同図に示す検出キット１０は、深底円筒状のガラス製培養容器１２と、該培養容器１２内に入れられた培地１４と、臭いの吸着性が少なくて（または臭いの吸着性が無くて）、それ自体にも臭いが少なく（または臭いが無く）、しかも培養容器１２に対して密封性の良いプラスチック製等の蓋１６とを含み、培地１４は容器１２内に半分ほど入れられており、十分なヘッドスペース１８を確保している。
【００２６】
本実施例において用いられた培地は以下の組成のものである。
ポテトデキストロースブロス（ＤＩＦＣＯ社製）　　２４ｇ
バニリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｍｇ
精製水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１Ｌ
上記培地を３Ｎ−ＨＣｌでｐＨ４．０に調整した。
そして、検出キット１０を用い、分離菌Ａを添加した果汁を加え、培養温度４５℃で振とう培養を行った場合、おおよそ３６時間で官能評価可能なグアヤコール量が生成された。
【００２７】
尚、検出キットを使用しない場合には、以下の様にする。水で希釈した際にｐＨ４．０程度になる量のクエン酸（他の酸でも良い）を予め加えてある適当な培地（粉末）を必要な量だけ滅菌済みの耐熱性容器内に収容し、更にバニリンを耐熱性容器内に所定量収容してから、両者を滅菌済みの水で希釈して混合した後、耐熱性容器を耐熱性の蓋で密封した後、オートクレーブで加熱殺菌（１２１℃×１５分間）し、冷却した後、蓋を取り除いて、耐熱性容器内に滅菌済みのピペットを挿入し、酸性培地を所定量だけ（培養容器のヘッドスペースを少なくとも１０％以上、好ましくは３０％以上残す量だけ）吸引して培養容器に入れた後、被検査食品である果汁を添加してから、フィルターを通した無菌空気により培地をバブリングした後、滅菌済みの蓋で培養容器を密封する。その後、この培養容器を良く振とうさせてから、４５℃で３６時間の培養を行う。尚、培地をバブリングする代わりに、培養容器に収容した培地の上方空間（ヘッドスペース）を大きく取り、この空間に存在する酸素を、培養液を十分に振とうさせることにより、培地に酸素を溶け込ませて、十分な量の酸素を培地に含有させる様にしても良い。
【００２８】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、ｐＨ３．０〜５．０、培養温度を３５〜５５℃、特に４０℃以上とすることにより、好酸性芽胞形成細菌を選択的に、且つ良好に生育させることができる。
また、ヘッドスペース量を培地に対して１０％以上にすることにより、好酸性芽胞形成細菌の生育をさらに向上させるとともに、該ヘッドスペース中にアルデヒドからの生成物を集積させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】酸性保存食品中の分離菌Ａの増殖に対するｐＨの影響の説明図である。
【図２】酸性保存食品中の分離菌Ｂの増殖に対するｐＨの影響の説明図である。
【図３】酸性保存食品中の分離菌Ｃの増殖に対するｐＨの影響の説明図である。
【図４】酸性保存食品中の分離菌Ｄの増殖に対するｐＨの影響の説明図である。
【図５】酸素と好酸性芽胞形成細菌の生育との関係を示す説明図である。
【図６】本発明にかかる検出キットの一例を示す説明図である。
【符号の説明】
１０　　検出キット
１２　　培養容器
１４　　培地
１６　　蓋
１８　　ヘッドスペース
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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