(57)【要約】【課題】従来、そのほとんどが廃棄処理されていたアセロラ種子の有効利用が可能となり、安全性に優れ、皮膚外用剤、化粧料や食料品等に利用して優れた抗酸化作用、コラゲナーゼ阻害活性やヒアルロニダーゼ阻害活性を示す抗酸化剤、コラゲナーゼ活性阻害剤、ヒアルロニダーゼ活性阻害剤、並びにこれらを含む皮膚外用剤、化粧料又は食料品を提供すること。【解決手段】本発明の抗酸化剤、コラゲナーゼ活性阻害剤、ヒアルロニダーゼ活性阻害剤は、アセロラ種子の抽出物を有効成分として含み、本発明の化粧料はこれらの少なくとも１種を、本発明の食料品は、本発明の抗酸化剤を含むことを特徴とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセロラ種子の抽出物を有効成分として含む抗酸化剤。
【請求項２】
アセロラ種子の抽出物が、クェルシトリンを含む請求項１記載の抗酸化剤。
【請求項３】
アセロラ種子の抽出物を有効成分として含むコラゲナーゼ活性阻害剤。
【請求項４】
アセロラ種子の抽出物を有効成分として含むヒアルロニダーゼ活性阻害剤。
【請求項５】
請求項１又は２記載の抗酸化剤、請求項３記載のコラゲナーゼ活性阻害剤、請求項４記載のヒアルロニダーゼ活性阻害剤の少なくとも１種を含むことを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項６】
請求項１又は２記載の抗酸化剤、請求項３記載のコラゲナーゼ活性阻害剤、請求項４記載のヒアルロニダーゼ活性阻害剤の少なくとも１種を含むことを特徴とする化粧料。
【請求項７】
請求項１又は２記載の抗酸化剤を含むことを特徴とする食料品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アセロラ種子の抽出物を有効成分とする抗酸化剤、コラゲナーゼ活性阻害剤、ヒアルロニダーゼ活性阻害剤、並びにこれらのいずれかを用いた皮膚外用剤、化粧料及び食料品に関する。
【０００２】
【従来の技術】
食品、化粧品、医薬品等の物品において油脂類を含む場合、その貯蔵、保存、加工の過程において最も問題になるのは、空気中の酸素による油脂成分等の酸化や過酸化である。とりわけ、油脂中に含まれるリノール酸、リノレン酸等の不飽和脂肪酸は、酸素により容易に過酸化されて過酸化脂質やフリーラジカルを生成し、更には発癌性物質をも生成することが知られている。このような酸化や過酸化が起こると、着色、変色、変性、異臭あるいは栄養価の有効性の低下ばかりか、毒物の生成等が生じ、製品の品質の劣化を招く。
そこで、前述の不飽和脂肪酸の酸化及び過酸化を抑制し、製品の品質の劣化を防ぐために従来から種々の抗酸化剤が用いられている。抗酸化剤は、酸化の際に生ずるペルオキシドラジカルに作用し、酸化の連鎖反応を停止させるか、あるいはフリーラジカルに作用して酸化反応を停止させる。抗酸化剤としては、従来から、例えば、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）やブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）等の合成抗酸化剤が一般に用いられている。ところが、近年、合成抗酸化剤の使用が増えるにつれその安全性が問題にされ、消費者の拒否反応が強くなってきていると共にその使用量も減っている。また、これら合成抗酸化剤は、油溶性であるため水溶液への使用が困難である。
一方、安全性の高い天然物由来の抗酸化剤としては、例えば、天然ビタミンＥ（α−トコフェロール）、ビタミンＣ等が知られている。しかし、これら天然物由来の抗酸化剤は、極端な脂溶性又は水溶性という性質を有しているため、その利用には限度が生じる。また、その活性が長時間安定に持続しない等の欠点もある。
従って、抗酸化活性が強く、水への溶解性に富み、しかも抗酸化活性が長時間安定である天然物由来の抗酸化剤が強く求められている。
また、皮膚の水分保持、柔軟性、弾力性に作用する物質として、コラーゲンやヒアルロン酸などが知られている。コラーゲンは、皮膚では真皮の９０％を占め、真皮全体に分布しており、皮膚に適度な弾性及び強度を保持させる。また、ヒアルロン酸は、皮膚、関節液、硝子体、靭帯など生体に広く分布しており、皮膚において、細胞の接着、細胞の保護、皮膚組織の形成、組織の水分保持、柔軟性の維持などを担っている。生体内でコラーゲンを分解する酵素としてコラゲナーゼ、ヒアルロン酸を分解する酵素としてヒアルロニダーゼが知られているが、これらによってコラーゲンやヒアルロン酸が分解されその量が減少すると、皮膚の潤い、ハリがなくなり、皮膚の老化現象であるシワやたるみが起こるといわれている。
そこで、皮膚外用剤や各種化粧料に、皮膚の老化防止やしわ防止作用等を期待してこれら酵素の活性を阻害する物質等を配合することが提案され、従来、様々なコラゲナーゼ活性阻害剤やヒアルロニダーゼ活性阻害剤が開発されている。
【０００３】
ところで、アセロラの果実は、豊富なビタミンＣを含む植物として近年知られるようになり、現在では世界各国で飲料や健康食品として用いられている。また、豊富なビタミンＣを含むアセロラの果実は、その抽出物に含まれるビタミンＣによる抗酸化作用等を期待して化粧料等に用いられるようになっている（例えば、特許文献１〜４参照）。
しかし、アセロラの果実において化粧品や食料品に利用されているのは、ビタミンＣを多く含む果肉のみであり、その種子は、有効利用の途がほとんど見出されておらず、大部分が廃棄されているのが現状である。最近、アセロラ種子を含む植物の種子を水蒸気蒸留法により処理して得られる水蒸気蒸留水を、皮膚感触改善効果を期待して化粧料に配合した組成物が提案されている（例えば、特許文献５参照）が、更なる有効利用の途が望まれている。
また、このようなアセロラの種子は、その含有成分、及びその作用等についてもほとんど知られていない。
【０００４】
【特許文献１】
特許第２８１４０９４号明細書
【特許文献２】
特開２０００−２１２０２６号公報
【特許文献３】
特開２０００−２１２０２７号公報
【特許文献４】
特開２０００−２１２０３２号公報
【特許文献５】
特開２００１−２２６２１８号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明の目的は、従来、そのほとんどが廃棄処理されていたアセロラ種子の有効利用が可能となり、安全性に優れ、化粧料や食料品等に利用して優れた抗酸化作用を示す抗酸化剤を提供することにある。
本発明の別の目的は、従来、そのほとんどが廃棄処理されていたアセロラ種子の有効利用が可能となり、安全性に優れ、皮膚外用剤や各種化粧料等に利用して優れたコラゲナーゼ活性阻害作用やヒアルロニダーゼ活性阻害作用を示すコラゲナーゼ活性阻害剤又はヒアルロニダーゼ活性阻害剤を提供することにある。
本発明の他の目的は、安定した抗酸化作用、コラゲナーゼ活性阻害作用やヒアルロニダーゼ活性阻害作用を期待しうる安全性に優れ、皮膚の老化防止やしわ防止作用が期待しうる皮膚外用剤及び化粧料を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、安定した抗酸化作用を期待しうる安全性に優れた食料品を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、まず、従来、果汁の圧搾後、廃棄されていたアセロラ種子の有用性について鋭意検討した。その結果、アセロラ種子から得られる抽出物が、強力な抗酸化能、コラゲナーゼ活性阻害能及びヒアルロニダーゼ活性阻害能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明によれば、アセロラ種子の抽出物を有効成分として含む抗酸化剤、コラゲナーゼ活性阻害剤又はヒアルロニダーゼ活性阻害剤が提供される。
また本発明によれば、前記抗酸化剤、前記コラゲナーゼ活性阻害剤、前記ヒアルロニダーゼ活性阻害剤の少なくとも１種を含むことを特徴とする皮膚外用剤又は化粧料が提供される。
更に本発明によれば、前記抗酸化剤を含むことを特徴とする食料品が提供される。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の抗酸化剤、コラゲナーゼ活性阻害剤及びヒアルロニダーゼ活性阻害剤は、アセロラ種子の抽出物を有効成分として含む。
アセロラ種子は、大西洋のカリブ海西インド諸島を原産とするアセロラ（Ａｃｅｒｏｌａ、学名：Ｍａｌｐｉｇｈｉａ  ｅｍａｒｇｉｎａｔａ  ＤＣ）の種子である。
アセロラの果肉はビタミンＣが豊富であることが知られ、食料品、化粧品等に利用されているが、その種子は、その有効利用の途がほとんど見出されていない。
【０００８】
アセロラ種子の抽出物は、例えば、抽出溶媒を用いて抽出したものであれば特に限定されず、リノール酸自動酸化抑制能やＤＰＰＨラジカル消去作用等の抗酸化機能を有しておれば、その抽出方法や条件は特に限定されない。また、アセロラ種子の生産地及び品種についても何ら制限されず、例えば、生産地としては、沖縄、ブラジルが挙げられる。
【０００９】
アセロラ種子の抽出物とは、例えば、生のアセロラ種子、その乾燥物、或いは凍結物を、粉砕等して加工し、水及び／又は有機溶媒を加えて抽出した抽出物、得られた抽出物を濃縮した濃縮物、また、前記抽出物や濃縮物を更に液液抽出やカラムクロマトグラフィー等で分画精製した分画精製物、これらの乾固物の総称を意味し、その形態は液状、ペースト状、固体のいずれも含む意である。
【００１０】
前記抽出物を得るために用いる有機溶媒は、親水性有機溶媒、疎水性有機溶媒のいずれでもよい。親水性有機溶媒としては、例えば、メチルアルコール、エチルアルコール、グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等のアルコール；アセトン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、１，４−ジオキサン、ピリジン、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、酢酸等の公知の有機溶媒が挙げられる。疎水性有機溶媒としては、例えば、ヘキサン、シクロヘキサン、四塩化炭素、クロロホルム、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン等の公知の有機溶媒が挙げられる。これらの有機溶媒は使用に際しては１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。中でも、水及び／又は親水性有機溶媒、特に、メタノール、エタノール、１，３−ブチレングリコール、水又はこれらの混合物や組合せが好ましい。
【００１１】
抽出条件は特に限定されないが、例えば、温度は５〜９５℃、好ましくは１０〜９０℃、更に好ましくは１５〜８５℃で、常温でも好適に抽出できる。温度が高い方が、抽出効率が高くなる傾向がある。抽出時間は、数時間〜数日間であり、また、抽出に使用する溶媒量は、原料に対して質量比で通常１〜２０倍量、好ましくは２〜１０倍量である。
抽出操作も特に限定的ではなく、常法に従って行えばよい。抽出効率を向上させるため、振とう抽出や、撹拌機等を備えた抽出機を用いても抽出することができる。例えば、アセロラ種子を抽出溶媒に浸漬するか、若しくは浸漬せずに、抽出溶媒と共に撹拌、振とうする抽出処理を行い、処理液を、濾過、遠心分離又はデカンテーション等によって抽出液と抽出残渣に分離することにより抽出処理を行うことができ、抽出残渣は更に同様な抽出処理に付しても良い。得られる抽出液はそのまま用いても良いが、必要により、更に濃縮処理及び／又は分画・精製処理することもできる。
【００１２】
前記濃縮処理は特に限定されず、例えば、溶媒除去、水及び／又は有機溶媒に対する溶解性を利用した可溶分回収処理、不溶分回収処理、水−疎水性有機溶媒での液液分配処理、再結晶処理、再沈澱処理、冷却により生じた析出物を回収する処理等、若しくはこれらから選択される２種以上の処理を組合せる方法等が挙げられる。
前記分画・精製処理も特に限定されず、例えば、順相及び／又は逆相クロマトグラフィーによる処理等が挙げられる。
【００１３】
本発明の抗酸化剤の有効成分としてのアセロラ種子の抽出物は、クェルシトリンを含むことが好ましい。また、本発明のコラゲナーゼ活性阻害剤及びヒアルロニダーゼ活性阻害剤の有効成分としてのアセロラ種子の抽出物が、クェルシトリンを含んでいても良い。
本発明の抗酸化剤、コラゲナーゼ活性阻害剤又はヒアルロニダーゼ活性阻害剤において、有効成分であるアセロラ種子の抽出物の使用量は、使用形態等により適宜選択することができる。
【００１４】
本発明の皮膚外用剤及び化粧料は、前記本発明の抗酸化剤、コラゲナーゼ活性阻害剤、ヒアルロニダーゼ活性阻害剤の少なくとも１種を含んでおれば良い。また、前記化粧料の種類は特に限定されず、例えば、化粧水、乳液、クリーム、パック、洗浄料等のスキンケア化粧料；口紅、ファンデーション等のメーキャップ化粧料；頭髪用化粧料等が挙げられ、その剤型は特に制限されず任意である。また、皮膚外用剤としては、軟膏、各種皮膚用薬剤等が挙げられる。
本発明の皮膚外用剤及び化粧料において、本発明の抗酸化剤、コラゲナーゼ活性阻害剤又はヒアルロニダーゼ活性阻害剤の配合割合は、その種類及び配合される他の成分の種類や量、形態等に応じて適宜選択できるが、通常、皮膚外用剤又は化粧料全量に対して、アセロラ種子抽出物の乾燥物換算で０．００１〜２０質量％、好ましくは０．０１〜１０質量％である。
【００１５】
本発明の皮膚外用剤又は化粧料には、本発明の所望の効果を損なわない範囲で、通常、皮膚外用剤原料や化粧料原料として用いられる種々の他の成分を配合することができる。他の成分としては、例えば、水、油剤、界面活性剤、潤滑剤、アルコール類、水溶性高分子剤、ゲル化剤、保湿剤、緩衝剤、防腐剤、抗炎症剤、増粘剤、香料、ビタミン類、本発明の抗酸化剤以外の抗酸化剤等が挙げられ、使用に際しては、これらから１種又は２種以上を適宜選択して配合することができる。
【００１６】
本発明の食料品は、前記本発明の抗酸化剤を含んでおれば良く、食料品の種類は特に限定されず、例えば、飴、飲料、ジャム、チューインガム等が挙げられる。また、その剤型は特に制限されず任意である。
本発明の食料品において、本発明の抗酸化剤の配合割合は、食料品の種類及び該食料品に配合される他の成分の種類や量、形態等に応じて適宜選択できるが、通常、食料品全量に対して、アセロラ種子抽出物の乾燥物換算で０．００１〜２０質量％、好ましくは０．０１〜１０質量％である。
【００１７】
本発明の食料品には、本発明の所望の効果を損なわない範囲で、通常、食料品原料として用いられる種々の他の成分を配合することができる。他の成分としては、例えば、水、アルコール類、甘味料、酸味料、着色料、保存料、香料、賦形剤等が挙げられ、使用に際しては、これらから適宜選択して１種又は２種以上を配合することができる。
【００１８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
実施例１
洗浄したアセロラ種子を乾燥後、破砕して得られた粉砕物６１４０ｇに７倍質量のメタノールを加え、室温で一晩撹拌した。全量を遠心後、ろ過し、ろ液を濃縮乾固して抽出物（Ａ）を２２５．８９ｇ得た。
この抽出物（Ａ）に水２０００ｍｌを加え、更にヘキサン１２００ｍｌを加えて振とうした後、分液された水層を回収した。この水層に対し、ヘキサンを用いた同様の振とうを更に２回繰り返した。ヘキサン層を除いて得られた水層に、酢酸エチル１２００  ｍｌを加えて振とうすることを１０回繰り返し、分液された酢酸エチル層を集めて濃縮乾固し、濃縮物（Ａ）を１１．４８ｇ得た。次に、濃縮物（Ａ）を、シリカゲル（ワコーシルＣ−３００：和光純薬社製）を充填したカラムを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分画した。クロロホルム、クロロホルム：メタノール（９７：３、９：１、８：２、６：４、４：６、２：８）、メタノールで順次溶出させた。クロロホルム溶出部を１５の画分に分け（画分１〜１５）、その後のクロロホルム：メタノール溶出部をそれぞれ、画分１６（９７：３）、１７（９：１）、１８（８：２）、１９（６：４）、２０（４：６）とした。
【００１９】
各画分の抗酸化活性を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いた評価法により確認した。すなわち、各画分の試料をシリカゲル薄層プレートに塗付し、展開溶媒により展開した。この際、蛍光指示薬を含有するプレートを用い（Ｋ５Ｆ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  １５０Å：Ｗｈａｔｍａｎ社製）、展開後、乾燥したプレートに紫外線を照射することで、ＵＶ吸収をもつ試料のスポットを検出した。その後、プレートに安定なラジカルであるＤｉｐｈｅｎｙｌ−ｐ−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｄｉｌ（ＤＰＰＨ）の６×１０−４Ｍメタノール溶液を噴霧した。ＤＰＰＨ溶液は紫色を呈しているが、ラジカルが消去されるとその色を失う。このため、ラジカル消去活性をもつ物質のスポット部分では、ＤＰＰＨラジカルが消去されることでスポット部分が白く抜けて見える。
画分１〜２０をシリカゲルプレートに塗付し、クロロホルム：メタノール＝９：１の溶媒でプレート先端まで展開した後、ＤＰＰＨ溶液を噴霧した。結果を図１に示す。図１より、アセロラ種子抽出物には、抗酸化活性を有する多数の物質が含まれていることがわかる。
【００２０】
このうち、画分１９を、逆相系高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により更に精製した。まず下記溶出条件で粗精製し、更に以下の条件を行うことで精製した。ＨＰＬＣ条件を以下に示す。
カラム：Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｃ−１８［２０×２５０ｍｍ］（ＹＭＣ）、流速：５ｍｌ／分、温度：３５℃
検出：ＵＶ  ａｔ  ２５４ｎｍ、Ｅｌｕｅｎｔ：３０％メタノール（０−２ｍｉｎ）、３０−１００％メタノール（２−３２ｍｉｎ、ｌｉｎｅａｒ）、１００％メタノール（３２−４０ｍｉｎ）、３０％メタノール（４０−５０ｍｉｎ）の条件で粗精製した後、アセトニトリル／水（３０／７０）で最終精製を行って、分画精製物７２ｍｇを得た。
得られた分画精製物に対し、各種スペクトル測定を行った。得られたデータを以下に示す。
マススペクトル：［Ｍ−Ｈ］−  ４４７
紫外線吸収スペクトル：（ＥｔＯＨ）  ２５６．５ｎｍ、３５２．００ｎｍ、Ｈ−ＮＭＲケミカルシフト：５００ＭＨｚ  溶媒ＣＤ３ＯＤ、０．９４ｐｐｍ（ｄ：Ｊ＝６．１Ｈｚ）、６．９１ｐｐｍ（ｄ：Ｊ＝８．２Ｈｚ）、７．３１ｐｐｍ（ｄ，  ｄ：Ｊ＝８．２，２．１Ｈｚ）、７．３４  ｐｐｍ（ｄ：Ｊ＝２．１Ｈｚ）、６．２０ｐｐｍ（ｄ：Ｊ＝２．１Ｈｚ）、６．３７ｐｐｍ（ｄ：Ｊ＝２．１  Ｈｚ）、３．３３ｐｐｍ（ｍ：Ｊ＝  ９．５，９．３Ｈｚ）、３．４１ｐｐｍ（ｍ：Ｊ＝  ９．５Ｈｚ）、３．７４ｐｐｍ（ｄ，ｄ：Ｊ＝９．３，３．３  Ｈｚ）、４．２１ｐｐｍ（ｄ，ｄ：Ｊ＝  ３．３Ｈｚ）、５．３５ｐｐｍ（ｄ：Ｊ＝１．７Ｈｚ）、Ｃ−ＮＭＲ  ケミカルシフト：１２５．８ＭＨｚ  溶媒ＣＤ３ＯＤ、１７．７ｐｐｍ、７２．０ｐｐｍ、７２．１ｐｐｍ、７２．２ｐｐｍ、７３．３ｐｐｍ、９４．８ｐｐｍ、９９．９ｐｐｍ、１０３．６ｐｐｍ、１０６．０ｐｐｍ、１１６．４ｐｐｍ、１１７．０ｐｐｍ、１２２．９ｐｐｍ、１２３．１ｐｐｍ、１３６．３ｐｐｍ、１４６．５ｐｐｍ、１４９．９ｐｐｍ、１５８．６ｐｐｍ、１５９．４ｐｐｍ、１６３．３ｐｐｍ、１６６．０ｐｐｍ、１７９．７ｐｐｍ。
マススペクトルにおいて、脱プロトン化分子と考えられるイオンがｍ／ｚ４４７に観測され、分子量は４４８と考えられた。Ｈ−ＮＭＲでは、０．９４ｐｐｍはＣＨ３、６．９１ｐｐｍ、７．３１ｐｐｍ、７．３４ｐｐｍは１，２，４−置換ベンゼン、６．２０ｐｐｍ、６．３７ｐｐｍは１，２，３，５−置換ベンゼンの１Ｈに帰属された。３．３３〜５．３５ｐｐｍには５種類のピークが観測された。また、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルでは２１本のピークが観測され、７０−７４ｐｐｍの４本のピークは＞ＣＨ−Ｏ−と考えられ、１７９．７ｐｐｍには共役カルボニルに帰属できるピークが観測された。これらデータよりケルセチン配糖体の可能性が示唆されたため、更に高分解能マススペクトルの測定及び、ケルセチン配糖体で分子量４４８であるクェルシトリン標品のＮＭＲスペクトルとの比較を行った。高分解能マススペクトル測定を行った結果、精密質量４４７．０９１７が得られ、Ｃ、Ｈ、Ｏを元素種として組成計算を行った。その結果、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルで観測された炭素数２１を満足する組成式Ｃ２１Ｈ１９Ｏ１１が算出され、分子式はＣ２１Ｈ１９Ｏ１１と決定された。更にＮＭＲスペクトルを、クェルシトリン（ケルセチン−３−ラムノシド）標品のスペクトルと比較した結果、一致したため、アセロラ種子の抽出物より分離精製された物質はクェルシトリンであると同定した。
【００２１】
クェルシトリンは、フラボノイドの一つで自然界に広く分布しており、特にドクダミに豊富に含まれることが知られている。以上の結果から、アセロラ種子にクェルシトリンが含まれ、該クェルシトリンが抽出物中の抗酸化活性に関与する物質の１つであることが判った。
【００２２】
実施例２
洗浄したアセロラ種子１００ｇを破砕し、３倍体積の水を加え、室温で一晩振とうした。全量をガラスフィルター、０．６５μｍフィルター及び０．２２μｍフィルターでろ過後、ろ液を濃縮乾固して抽出物１ｇを得た。
次に、リノール酸を用いた抗酸化活性測定（ロダン鉄法）により得られた抽出物の抗酸化活性を測定した。
即ち、２．５％（ｗ／ｖ）リノール酸（９９．５％エタノール溶液）２ｍｌ及び０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４ｍｌの反応液に、アセロラ種子の抽出物０．４ｍｇ、９９．５％エタノール２ｍｌ及び蒸留水２ｍｌからなる混液を混合し、褐色ネジ口瓶に入れ１０ｍｌの試験液を調製した。また、アセロラ種子抽出物の代わりにα−トコフェロール又はＢＨＡを用い、反応液中にアセロラ種子の抽出物と同量含まれるように同様の操作を行い、各々試験液を調製し、これらを正の対照とした。コントロールにはアセロラ種子抽出物を添加せず、９９．５％エタノール２ｍｌ及び蒸留水２ｍｌのみを反応液に添加した試験液を用いた。得られた各試験液を暗所にて４０℃で保存したものを本検、４℃で保存したものを盲検として、経時的に被検物を取り出し以下の方法により測定を行った。試験は１４日間行った。
【００２３】
まず、被検物０．１ｍｌ、７５％エタノール９．７ｍｌ、３０％ロダンアンモニウム水溶液０．１ｍｌの混液に、２×１０−２Ｍの塩化第一鉄（３．５％塩酸溶液）０．１ｍｌを加えてから正確に３分後５００ｎｍにおける吸光度を測定した。盲検についても同様に測定し、Δ吸光度＝（本検の吸光度）−（盲検の吸光度）とした。試料の酸化が始まると吸光度は上昇し、最高点に達した後、酸化されるべき試料が少なくなるにつれて吸光度は減少する。従って、吸光度のピークが早くできはじめるほど抗酸化活性は弱いといえる。また、酸化率を用いて各試験液の抗酸化活性を比較した。酸化率は、コントロールの酸化（吸光度）を１００％として、以下の式で求めた。酸化率が高いほど抗酸化活性が低いことを意味する。
酸化率（％）＝（［試料のΔ吸光度］／［コントロールのΔ吸光度］）×１００
吸光度の経時的変化の結果を図２に、試験開始後１４日目の各試料溶液の酸化率を図３に示す。
【００２４】
実施例３
洗浄したアセロラ種子１００ｇを破砕し、３倍体積の、エタノール含量が２５体積％の含水エタノール水溶液を加え、室温で一晩振とうした。全量を実施例２と同様なフィルターでろ過後、ろ液を濃縮乾固して抽出物を１．６９ｇ得た。
得られた抽出物を用いて実施例２と同様に抗酸化活性を測定した。吸光度の経時的変化の結果を図２に、試験開始後１４日目の各試料溶液の酸化率を図３に示す。
【００２５】
実施例４
洗浄したアセロラ種子１００ｇを破砕し、３倍体積の、エタノール含量が５０体積％の含水エタノール水溶液を加え、室温で一晩振とうした。全量を実施例２と同様なフィルターでろ過後、ろ液を濃縮乾固して抽出物２．２７ｇを得た。
得られた抽出物を用いて実施例２と同様に抗酸化活性を測定した。吸光度の経時的変化の結果を図２に、試験開始後１４日目の各試料溶液の酸化率を図３に示す。
【００２６】
実施例５
洗浄したアセロラ種子１００ｇを破砕し、３倍体積の、エタノール含量が７５体積％の含水エタノール水溶液を加え、室温で一晩振とうした。全量を実施例２と同様なフィルターでろ過後、ろ液を濃縮乾固して抽出物２．５０ｇを得た。
得られた抽出物を用いて実施例２と同様に抗酸化活性を測定した。吸光度の経時的変化の結果を図２に、試験開始後１４日目の各試料溶液の酸化率を図３に示す。
図２及び３より、アセロラ種子の抽出物には明らかにリノール酸の酸化抑制効果があり、またその強さは代表的抗酸化剤であるα−トコフェロール、ＢＨＡと比較して、同等又は同等以上であることが判った。更に、実施例２〜５の結果より、抽出溶媒として用いる含水エタノール中のエタノールの割合を変化させることで、抗酸化活性の強さをコントロールできることが判る。
【００２７】
実施例６
洗浄したアセロラ種子７６０ｇを破砕し、５倍質量のメタノールを加え、室温で一晩撹拌した。全量を遠心後、ろ過し、ろ液を濃縮乾固して抽出物１２．３６ｇ得た。この抽出物に水３００ｍｌを加え、更にヘキサン１００ｍｌを加えて振とうした後、分液された水層を回収した。この水層に対し、ヘキサンを用いた同様の振とうを更に３回繰り返した。ヘキサン層を除いて得られた水層に、酢酸エチル１００ｍｌを加えて振とうすることを６回繰り返し、分液された酢酸エチル層を集めて濃縮乾固し、固形分０．４１ｇを得た。
得られたアセロラ種子の抽出物の抗酸化活性を実施例２と同様にロダン鉄法により測定した。この際、試験期間は２０日間とした。試験開始後２０日目の各試料溶液の酸化率を図４に示す。
図４より、アセロラ種子の抽出物の酢酸エチル画分には、抽出物そのものと同様に明らかにリノール酸の酸化抑制効果があり、またその強さは、α−トコフェロールよりも強いことが判った。
【００２８】
実施例７
洗浄したアセロラ種子７０ｇを破砕し、４倍質量の、１，３−ブチレングリコール含量が３０質量％の１，３−ブチレングリコール水溶液を加え、室温で一晩撹拌した。全量を遠心後、上清を０．２２μｍフィルターでろ過し、アセロラ種子の抽出物を溶液として１２４．１２ｇ得た。
得られたアセロラ種子の抽出物の抗酸化活性を以下のＤＰＰＨラジカル消去による方法により測定した。結果を表１に示す。
２５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ＝５．５）１６００μｌにエタノール１２００μｌ、検体４００μｌ（任意の濃度に調整）を混合し、３０℃、５分間プレインキュベートした。この液に５００μＭ  ＤＰＰＨ／エタノール溶液を８００μｌ添加混合し、３０℃、３０分間放置後、５１７ｎｍの吸光度を測定した。α−トコフェロールについても同様の操作を行い、これを正の対照とした。コントロールには、試料溶液の代わりにその溶媒を用いて同様の操作を行ったものを用いた。測定された吸光度から、次式によりラジカル消去率を算出した。
消去率（％）＝（１−［試料の吸光度］／［コントロールの吸光度］）×１００
試料溶液の試料濃度を段階的に変更して上記消去率の測定を行い、ＤＰＰＨラジカルの消去率が５０％になる試料溶液の濃度を求め、ＤＰＰＨラジカル５０％消去濃度とした。よって、この数値が低いほどラジカル消去能が高いことを意味する。
【００２９】
【表１】
2004175856.tif 000002
表１より、実施例７の抽出物はα−トコフェロールと同等のラジカル消去能を有することが判った。
【００３０】
実施例８
洗浄したアセロラ種子１５００ｇを破砕し、２倍質量の、１，３−ブチレングリコール含量が３０質量％の１，３−ブチレングリコール水溶液を加え、室温で一晩撹拌した。全量を遠心後、上清を０．２２μｍフィルターでろ過し、アセロラ種子抽出物を溶液として２３２７ｇ得た。
得られたアセロラ種子抽出物の抗酸化活性を、実施例２と同様にロダン鉄法により測定した。但し、アセロラ種子抽出物は溶液であることから、水とエタノールを用いて必要濃度に希釈して添加し、アセロラ種子抽出液のコントロールには、添加したアセロラ種子抽出液と同様の溶媒組成でアセロラ種子抽出物を含まないものを用いた。また、試験期間は７日とした。
吸光度の経時的変化の結果を図５に、試験開始後７日目の各試料溶液の酸化率を図６に示す。
図５及び６より、アセロラ種子抽出物には明らかにリノール酸の酸化抑制効果があり、またその強さは、α−トコフェロール、ＢＨＡと比較して、同等又は同等以上であることが判った。
【００３１】
ところで、従来よりビタミンＣが抗酸化作用を有することが知られているので、上記で調製したアセロラ種子抽出液中のビタミンＣ量を測定し、上記アセロラ種子抽出液における抗酸化作用が含有されるビタミンＣのみによるものか否かを検討した。
まず、上記で調製したアセロラ種子抽出液１００ｇ中に含有されるビタミンＣ量を測定したところ、５７ｍｇ／１００ｇ（酸化型ビタミンＣ：５６ｍｇ／１００ｇ＋還元型ビタミンＣ：１ｍｇ／１００ｇ）であった。そこで、上記で調製したアセロラ種子抽出液１００ｇを蒸発乾固したところ、固形分９７５ｍｇが得られた。次いで、実施例２と同様にロダン鉄法により抗酸化活性を測定した。この際、本実施例のアセロラ種子抽出物は溶液であることから、上記と同様、反応液中に固形分として０．４ｍｇ含まれるように希釈して添加した。またコントロールにも上記と同様、添加したアセロラ種子抽出液と同様の溶媒組成でアセロラ種子抽出物を含まないものを用いた。なお、測定は７日間で行った。対照として、該固形分０．４ｍｇ中に含まれるビタミンＣ  ０．０２３ｍｇ  （０．４ｍｇ×（５７ｍｇ／９７５ｍｇ））を用いて同様に抗酸化活性を測定した。
試験開始後７日目の酸化率は、アセロラ種子抽出物が１．９％であったのに対して、ビタミンＣ単独のものは１１５．８％であった。
以上の結果より、アセロラ種子抽出物中に含まれるビタミンＣは、該抽出物の抗酸化作用にはほとんど寄与していないことが判った。
【００３２】
更に、本発明におけるアセロラ種子抽出物において、実施例１で確認した抗酸化作用を示す物質の１つであるクェルシトリンについて、上記で調製したアセロラ種子抽出物中に含有されるか否かを実施例１と同様に測定した。その結果、クェルシトリンを含有していることが判った。
ところで、従来、例えば、特開平７−３００５８１号公報において、クェルシトリンが抗酸化作用を有することが提案されている。そこで、上記アセロラ種子抽出液における抗酸化作用が含有されるクェルシトリンのみによるものか否かを以下の方法で検討した。
まず、クェルシトリンはポリフェノールの１種であるので、上記で調製したアセロラ種子抽出液中のポリフェノール量をＦｏｌｉｎ−Ｄｅｎｉｓ法により測定したところ、抽出液１００ｇ中の固形分９７５ｍｇに占めるポリフェノールの割合は２５％であった。従って、上記で調製したアセロラ種子抽出液の固形分中に含まれるクェルシトリン量は、最大でも２５％である。この結果に基づいて、上記ビタミンＣとの比較試験と同様に、実施例２と同様にロダン鉄法により抗酸化活性を測定した。この際、測定は７日間で行った。対照として、該固形分０．４ｍｇ中にクェルシトリンが３２％（最大量でも２５％であるので、それ以上の量）含まれると仮定した場合のクェルシトリン０．１２８ｍｇを用いて同様に抗酸化活性を測定した。
その結果、試験開始後７日目の酸化率は、アセロラ種子抽出物が１．９％であったのに対して、クェルシトリン単独のものは６．９％であった。
以上の結果より、アセロラ種子抽出物中に含まれるクェルシトリンは、該抽出物の抗酸化作用の有効成分の１つではあるが、該抽出物の抗酸化作用はクェルシトリンのみの作用ではなく、しかも、アセロラ種子抽出物は、クェルシトリン単独による抗酸化作用よりも優れていることが判った。
【００３３】
実施例９
実施例２〜５で調製した各アセロラ種子抽出物について、以下の方法によりコラゲナーゼ活性阻害作用を測定した。
測定方法
〔試薬の調製〕
基質溶液：Ｐｚ−ペプチド（ＢＡＣＨＥＭ社製）０．３９ｍｇを、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．１、含２０ｍＭ塩化カルシウム）１ｍｌに溶解して使用した（０．５Ｍに相当）。
酵素溶液：コラゲナーゼ（ＴＹＰＥ  ＩＶ、シグマ社製）５ｍｇを蒸留水１ｍｌに溶解させ１００μｌずつ分注し、−２０℃で保管する。使用時に蒸留水で５０倍に希釈して反応に用いた。
【００３４】
〔コラゲナーゼ活性阻害作用測定法〕
実施例２の抽出物は１５ｍｇ／ｍｌ、実施例３、４、５の抽出物は０．５ｍｇ／ｍｌの濃度となるように、それぞれの抽出溶媒で溶解して調製を行い、これらを試料溶液とした。これらの試料溶液５０μｌ、コラゲナーゼ溶液５０μｌ及び基質溶液４００μｌを混合し、３７℃で３０分間インキュベーションした。次いで、２５ｍＭクエン酸溶液１ｍｌで反応を停止し、酢酸エチル５ｍｌで抽出した。遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）後、酢酸エチルを対照として、酢酸エチル層の波長３２０ｎｍにおける吸光度を測定した。対照には、試料溶液の代わりに各抽出溶媒を用い、また、それぞれのブランクとして、酵素溶液の代わりに蒸留水を加えて同様の操作を行った。
これらの値からコラゲナーゼ活性阻害率を次式により算出した。
阻害率（％）＝〔１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）〕×１００
但し、Ａ：試料溶液の３２０ｎｍにおける吸光度、Ｂ：試料溶液ブランクの３２０ｎｍにおける吸光度、Ｃ：対照溶液の３２０ｎｍにおける吸光度、Ｄ：対照溶液ブランクの３２０ｎｍにおける吸光度である。
上記方法で実施例２〜５の抽出物のコラゲナーゼ活性阻害率を求めた。結果を表２に示す。
【００３５】
【表２】
2004175856.tif 000003
【００３６】
実施例１０
実施例８で調製したアセロラ種子抽出物について、実施例９と同様の方法によりコラゲナーゼ活性阻害作用を測定した。但し、実施例８の抽出物は溶液であることから、アセロラ種子抽出物が固形物として０．５ｍｇ／ｍｌの濃度となるように抽出溶媒である３０質量％１，３−ブチレングリコール水溶液で希釈したものを試料溶液とした。このようにして実施例８の抽出物のコラゲナーゼ活性阻害率を求めた結果、７１．５％であった。
【００３７】
実施例１１
実施例８で調製した抽出物のヒアルロニダーゼ活性阻害作用を測定した。ヒアルロニダーゼ活性阻害測定は、Ｍｏｒｇａｎ−Ｅｌｓｏｎ法を応用した前田有美恵らの方法（食衛誌、３１巻、２３３−２３７、１９９０年）にて行った。
測定方法
〔試薬の調製〕
酵素溶液：牛精巣ヒアルロニダーゼ（和光純薬工業（株）製）を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ＝４．０）に溶解し最終酵素活性を４００ユニット／ｍｌに調整した。
酵素活性化溶液：ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０（シグマ社製）を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ＝４．０）に溶解し最終濃度を０．１ｍｇ／ｍｌに調整した。
基質溶液：ヒアルロン酸カリウム（和光純薬工業（株）製）を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ＝４．０）に溶解し最終濃度を０．４ｍｇ／ｍｌに調整した。
ホウ酸溶液：ホウ酸４．９５ｇに水５０ｍｌを加え、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ＝９．１にし、水を加えて１００ｍｌに調整した。
ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド（ｐ−ＤＡＢ）試薬：１０Ｎ塩酸１２．５ｍｌと酢酸８７．５ｍｌの混液にｐ−ＤＡＢ（和光純薬工業（株）製）を１０ｇ溶解し冷蔵保存する。使用直前に酢酸で１０倍希釈して用いた。
【００３８】
〔ヒアルロニダーゼ活性阻害作用測定法〕
実施例８の抽出物は溶液であることから、アセロラ種子抽出物が固形物として１ｍｇ／ｍｌの濃度となるように抽出溶媒である３０質量％１，３−ブチレングリコール水溶液で希釈したものを試料溶液とした。この試料溶液０．２ｍｌに酵素溶液０．１ｍｌを加えて、３７℃で２０分間放置した。次に、酵素活性化溶液０．２ｍｌを加えて３７℃で２０分間加温し、さらに基質溶液０．５ｍｌを加えて３７℃で４０分間反応させた後、０．４Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を０．２ｍｌ加えるとともに氷冷して反応を停止させた。ホウ酸溶液０．２ｍｌを加えてホットブロックバス（ＴＯＹＯ  ＳＥＩＳＡＫＵＳＨＯ、ＭＯＤＥＬ  ＴＰＢ−３２）により１００〜１２０℃で５分間加熱後氷冷し、ｐ−ＤＡＢ試薬６ｍｌを加えて３７℃で２０分間加温して発色させ、５８５ｎｍにおける吸光度を蒸留水を対照として測定した。対照には、試料溶液の代わりに抽出溶媒を用い、またそれぞれのブランクとして、酵素溶液の代わりに０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ＝４．０）を加えて同様の操作を行った。
これらの値からヒアルロニダーゼ活性阻害率を次式により算出した。
阻害率（％）＝〔１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）〕×１００
但し、Ａ：試料溶液の５８５ｎｍにおける吸光度、Ｂ：試料溶液ブランクの５８５ｎｍにおける吸光度、Ｃ：対照溶液の５８５ｎｍにおける吸光度、Ｄ：対照溶液ブランクの５８５ｎｍにおける吸光度である。
上記方法で実施例８の抽出物のヒアルロニダーゼ活性阻害率を求めた結果、９４．５％であった。
【００３９】
実施例１２
平成９年３月２６日付厚生省令第２１号「医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施の基準に関する省令」に従ってアセロラ種子抽出物の安全性試験を行なった。アセロラ種子抽出物としては、実施例８で調製したアセロラ種子抽出物を用いた。結果を表３に示す。
ラットを用いる単回経口投与毒性試験
ラット２群（対照群、投与群）に対して、雌雄各５匹／群にて試験を行い、投与群には体重あたり２ｇ／ｋｇ投与した。
モルモットを用いる皮膚一次刺激性試験
モルモット３匹の健常皮膚に２４時間閉塞貼付を行い、除去後２４時間、４８時間及び７２時間に、それぞれ皮膚の状態を観察して判定を行った。
モルモットを用いる１４日間皮膚累積刺激性試験
モルモット３匹の健常皮膚に、１４日間連続の開放系で１日１回塗布を行い、試験期間中の毎日、塗布前及び塗布後２４時間に、それぞれ皮膚の状態を観察して判定を行った。
モルモットを用いる皮膚感作性試験
モルモット３群（対照群、塗布群、ＤＮＣＢ群）に対して、５匹／群にてＡｄｊｕｖａｎｔ  ａｎｄＰａｔｃｈ  Ｔｅｓｔ法に準じて試験を行い、塗布後２４時間及び４８時間に、それぞれ皮膚の状態を観察して判定を行った。
モルモットを用いる皮膚光毒性試験
モルモット１０匹の背部皮膚に森川藤凰らの方法に準じて試験を行い、紫外線照射後２４時間、４８時間及び７２時間にそれぞれ皮膚の状態を観察して判定を行った。
【００４０】
モルモットを用いる皮膚光感作性試験
モルモット３群（対照群、投与群、ＴＣＳＡ群）に対して、５匹／群にてＡｊｕｖａｎｔ  ａｎｄ  Ｓｔｒｉｐ法に準じて試験を行い、紫外線照射後２４時間及び４８時間に、それぞれ皮膚の状態を観察して判定を行った。
ウサギを用いる眼粘膜刺激性試験
ウサギ２群（非洗眼群、洗眼群）に対して、３匹／群にて試験を行った。点眼後、非洗眼群はそのままにし、洗眼群は微温の生理食塩水で約１分間洗浄し、その後１時間、２４時間、４８時間及び７２時間後に、角膜、虹彩及び結膜の状態について観察し、ＡＦＮＯＲの区分から判定を行った。
細菌を用いる復帰突然変異試験
プレインキュベーション法により、Ｓ９ｍｉｘ無添加とＳ９ｍｉｘ添加の場合について測定を行った。
・使用菌株：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＴＡ１００、ＴＡ９８、ＴＡ１５３５、ＴＡ１５３７
・使用菌株：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＷＰ２ｕｖｒＡ
哺乳類の培養細胞を用いる染色体異常試験
哺乳類の培養細胞（ＣＨＬ／ＩＵ細胞）を用いて３群（陰性対照群、被検物質群、陽性対照群）に対して、短時間処理法（６時間処理：Ｓ９ｍｉｘ無添加及びＳ９ｍｉｘ添加）及び連続処理法（２４時間及び４８時間処理）で検討を行った。
【００４１】
【表３】
2004175856.tif 000004
【００４２】
処方例１
グリチルリチン酸ジカリウム０．２０質量部、クエン酸０．１０質量部、クエン酸ナトリウム０．３０質量部、実施例７で調製したアセロラ種子の抽出物５．００質量部及び１，３−ブチレングリコール５．００質量部を混合して、精製水を加えて全体量を８０．０質量部にして５０℃で撹拌しながら溶解して抽出物含有水溶液を調製した。
次いで、テトラオレイン酸ＰＯＥ（６０）ソルビトール０．９０質量部、モノオレイン酸ソルビタン０．１０質量部、適量の防腐剤及びエタノール１０．００質量部を混合して、５０℃で撹拌しながら溶解した。続いて、得られた溶液を、最初に調製した抽出物含有水溶液に少量ずつ加えて、５０℃で混和撹拌した。均一に混和したら、更に撹拌しながら５０℃から３０℃に液温を下げ、３０℃になったらところで撹拌を止め、適量の香料及び精製水を加えて全体量を１００．００質量部にした。再度、混和撹拌し、均一に混和させて化粧水を調製した。
【００４３】
処方例２
スクワレン１０．００質量部及び適量の防腐剤を混合し、精製水を加えて全体量を７０．００質量部に調整し、８０℃に加温して溶液（１）を調製した。また、カルボキシビニルポリマー０．１０質量部及びキサンタンガム０．２０質量部を適量の精製水に常温で撹拌溶解し溶液（２）を調製した。更に、トリエタノールアミン０．１０質量部及び１，３−ブチレングリコール５．００質量部を適量の精製水に常温で撹拌溶解し溶液（３）を調製した。更にまた、ヒアルロン酸ナトリウム２．００質量部及び実施例８で調製したアセロラ種子の抽出物５．００質量部を適量の精製水に常温で撹拌溶解し溶液（４）を調製した。
次いで、適量の精製水に溶液（１）を少量ずつ加え、８０℃で混和撹拌し、更に撹拌しながら、溶液（２）を加え、続いて溶液（３）を加えた。均一に混和したら、撹拌しながら溶液を５０℃に下げて、５０℃になったところで、溶液（４）を加え、更に精製水を加えて全体量を１００質量部に調整した。溶液が３０℃になるまで再度撹拌し、３０℃になったところで撹拌を止め、均一に混和された乳液を調製した。
【００４４】
処方例３
ＰＯＥ（２０）ソルビタンモノステアレート２．００質量部、ＰＯＥソルビタンテトラオレエート０．５０質量部、モノステアリン酸グリセリル０．５０質量部、ステアリン酸７．００質量部、セチルアルコール３．００質量部、パルミチン酸セチル３．００質量部、ホホバ油７．００質量部、パラフィン３．００質量部及び適量の防腐剤を混合して、８０℃で撹拌しながら溶解し溶液（１）を調製した。一方、実施例８で調製したアセロラ種子の抽出物５．００質量部、１，３−ブチレングリコール７．００質量部及び精製水６２質量部を混合して、８０℃で撹拌しながら溶解し溶液（２）を調製した。
次いで、溶液（２）に溶液（１）を少量ずつ加え、乳化し、撹拌しながら冷却して４０℃に降温したところで撹拌を止め、均一に混和されたクリームを調製した。
【００４５】
処方例４
濃縮グレープフルーツジュース１００ｇ、糖類１５０ｇ、はちみつ１５ｇ、実施例２と同様の条件で調製したアセロラ種子の抽出物（Ａ）１．５ｇ及び適量の香料に、全体量が１０００ｇとなるように精製水を混合した。次いで、９５℃で２０分間殺菌し、１００ｍｌずつ無菌的にビンに充填してグレープフルーツジュースを製造した。
【００４６】
【発明の効果】
本発明の抗酸化剤、ヒアルロニダーゼ活性阻害剤及びコラゲナーゼ活性阻害剤は、アセロラ種子の抽出物を有効成分とし、安全性に優れ、且つ強力な抗酸化活性、ヒアルロニダーゼ阻害活性又はコラゲナーゼ阻害活性を有する。本発明の皮膚外用剤、化粧料及び食料品は、本発明の抗酸化剤、ヒアルロニダーゼ活性阻害剤又はコラゲナーゼ活性阻害剤を含むので、抗老化作用、しわ防止作用、活性酸素に起因する食料品の品質保持や酸化防止作用が得られる。加えて、産業廃棄物であったアセロラ種子の有効な利用も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で調製したアセロラ種子抽出物をカラムクロマトグラフィーで分画した各画分の抗酸化活性を薄層クロマトグラフィーを用いて測定した結果を示す写真の写しである。
【図２】実施例２〜５で調製したアセロラ種子抽出物の酸化率測定のための吸光度の経時的変化を示すグラフである。
【図３】実施例２〜５で調製したアセロラ種子抽出物の１４日目の酸化率を示すグラフである。
【図４】実施例６で調製したアセロラ種子抽出物の２０日目の酸化率を示すグラフである。
【図５】実施例８で調製したアセロラ種子抽出物の酸化率測定のための吸光度の経時的変化を示すグラフである。
【図６】実施例８で調製したアセロラ種子抽出物の７日目の酸化率を示すグラフである。
【図１】
2004175856.tif 000005
【図２】
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【図３】
2004175856.tif 000007
【図４】
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【図５】
2004175856.tif 000009
【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年11月20日(2003.11.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
まず、被検物０．１ｍｌ、７５％エタノール９．７ｍｌ、３０％ロダンアンモニウム水溶液０．１ｍｌの混液に、２×１０−２Ｍの塩化第一鉄（３．５％塩酸溶液）０．１ｍｌを加えてから正確に３分後５００ｎｍにおける吸光度を測定した。盲検についても同様に測定し、Δ吸光度＝（本検の吸光度）−（盲検の吸光度）とした。試料の酸化が始まると吸光度は上昇し、最高点に達した後、酸化されるべき試料が少なくなるにつれて吸光度は減少する。従って、吸光度のピークが早くできはじめるほど抗酸化活性は弱いといえる。また、酸化率を用いて各試験液の抗酸化活性を比較した。酸化率は、コントロールの酸化（Δ吸光度）を１００％として、以下の式で求めた。酸化率が高いほど抗酸化活性が低いことを意味する。
酸化率（％）＝（［試料のΔ吸光度］／［コントロールのΔ吸光度］）×１００
吸光度の経時的変化の結果を図２に、試験開始後１４日目の各試料溶液の酸化率を図３に示す。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
実施例７
洗浄したアセロラ種子７０ｇを破砕し、４倍質量の、１，３−ブチレングリコール含量が３０質量％の１，３−ブチレングリコール水溶液を加え、室温で一晩撹拌した。全量を遠心後、上清を０．２２μｍフィルターでろ過し、アセロラ種子の抽出物を溶液として１２４．１２ｇ得た。
得られたアセロラ種子の抽出物の抗酸化活性を以下のＤＰＰＨラジカル消去による方法により測定した。結果を表１に示す。
２５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ＝５．５）１６００μｌにエタノール１２００μｌ、検体４００μｌ（任意の濃度に調製）を混合し、３０℃、５分間プレインキュベートした。この液に５００μＭ  ＤＰＰＨ／エタノール溶液を８００μｌ添加混合し、３０℃、３０分間放置後、５１７ｎｍの吸光度を測定した。α−トコフェロールについても同様の操作を行い、これを正の対照とした。コントロールには、試料溶液の代わりにその溶媒を用いて同様の操作を行ったものを用いた。測定された吸光度から、次式によりラジカル消去率を算出した。
消去率（％）＝（１−［試料の吸光度］／［コントロールの吸光度］）×１００
試料溶液の試料濃度を段階的に変更して上記消去率の測定を行い、ＤＰＰＨラジカルの消去率が５０％になる試料溶液の濃度を求め、ＤＰＰＨラジカル５０％消去濃度とした。よって、この数値が低いほどラジカル消去能が高いことを意味する。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
実施例９
実施例２〜５で調製した各アセロラ種子抽出物について、以下の方法によりコラゲナーゼ活性阻害作用を測定した。
測定方法
〔試薬の調製〕
基質溶液：Ｐｚ−ペプチド（ＢＡＣＨＥＭ社製）０．３９ｍｇを、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．１、含２０ｍＭ塩化カルシウム）１ｍｌに溶解して使用した（０．５ｍＭに相当）。
酵素溶液：コラゲナーゼ（ＴＹＰＥ  ＩＶ、シグマ社製）５ｍｇを蒸留水１ｍｌに溶解させ１００μｌずつ分注し、−２０℃で保管する。使用時に蒸留水で５０倍に希釈して反応に用いた。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
実施例１２
平成９年３月２６日付厚生省令第２１号「医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施の基準に関する省令」に従ってアセロラ種子抽出物の安全性試験を行なった。アセロラ種子抽出物としては、実施例８で調製したアセロラ種子抽出物を用いた。結果を表３に示す。
ラットを用いる単回経口投与毒性試験
ラット２群（対照群、投与群）に対して、雌雄各５匹／群にて試験を行い、投与群には体重あたり２ｇ／ｋｇ投与した。
モルモットを用いる皮膚一次刺激性試験
モルモット３匹の健常皮膚に２４時間閉塞貼付を行い、投与後２４時間、４８時間及び７２時間に、それぞれ皮膚の状態を観察して判定を行った。
モルモットを用いる１４日間皮膚累積刺激性試験
モルモット３匹の健常皮膚に、１４日間連続の開放系で１日１回塗布を行い、試験期間中の毎日、塗布前及び塗布後２４時間に、それぞれ皮膚の状態を観察して判定を行った。
モルモットを用いる皮膚感作性試験
モルモット３群（対照群、塗布群、ＤＮＣＢ群）に対して、５匹／群にてＡｄｊｕｖａｎｔ  ａｎｄ  Ｐａｔｃｈ  Ｔｅｓｔ法に準じて試験を行い、塗布後２４時間及び４８時間に、それぞれ皮膚の状態を観察して判定を行った。
モルモットを用いる皮膚光毒性試験
モルモット１０匹の背部皮膚に森川藤凰らの方法に準じて試験を行い、紫外線照射後２４時間、４８時間及び７２時間にそれぞれ皮膚の状態を観察して判定を行った。