(57)【要約】【課題】プローブ分子と検体分子とのハイブリダイゼーション結合を検出するには、結合を認識するための蛍光ラベル分子等を新たに付加する必要があった。このための手間とコストが余分にかかり、しかも、結合を認識するための分子の付加により、検体あるいはプローブが変質し、検出精度が阻害されることがあった。【解決手段】プローブ分子と検体分子との結合を、該分子を構成する糖又はアミノ酸の有する光学活性に由来する旋光能の変化により直接認識することにより、検体あるいはプローブの変質による検出精度の低下のない検出法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブ分子と検体分子の結合を、該分子を構成する糖又はアミノ酸の有する光学活性に由来する旋光能の変化により検出することを特徴とする反応検出セル。
【請求項２】
プローブＤＮＡと検体ＤＮＡのハイブリダイゼーションを、該ＤＮＡを構成する糖の有する光学活性に由来する旋光能の変化により検出することを特徴とする請求項１に記載の反応検出セル。
【請求項３】
前記分子は蛋白質であることを特徴とする請求項１に記載の反応検出セル。
【請求項４】
前記プローブ分子は抗体であり、前記検体分子は抗原であることを特徴とする請求項１に記載の反応検出セル。
【請求項５】
前記分子は糖蛋白質であることを特徴とする請求項１に記載の反応検出セル。
【請求項６】
前記旋光能の変化を調べるための光の経路が光ファイバーにより形成されることを特徴とする請求項１に記載の反応検出セル。
【請求項７】
プローブ分子を表面に固定した粒子をバッファー液に分散させた分散液がセルに満たされることを特徴とする請求項６に記載の反応検出セル。
【請求項８】
前記セルはキャピラリーと該キャピラリーの出入口を塞ぐ半透膜から構成され、該半透膜は前記検体分子を通し前記粒子を通さないことを特徴とする請求項７に記載の反応検出セル。
【請求項９】
前記セルはガラス製のキャピラリーであり、該キャピラリーの外径の側面にはメタル膜が付着してあることを特徴とする請求項８に記載の反応検出セル。
【請求項１０】
請求項９に記載の反応検出セルを用いる分析システム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の技術分野】
本発明は、遺伝子診断及び生理機能診断等に使用される多数の機能分子の認識を可能にする反応検出セル及び同反応検出セルを用いる検出システムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
本明細書では、本発明に関する装置及び関連技術を「チップ」あるいは「セル」と呼称する。
【０００３】
昨今のバイオテクノロジーの著しい進展に伴い、機能分子の認識を可能にする反応検出チップは、ますます重要な役割を担いつつある。反応検出チップの中でも最近注目度の高いＤＮＡチップを例に説明する。
【０００４】
遺伝子の変異、特に一塩基多型（塩基配列における一塩基の変異）の検出は、突然変異等に起因する疾患、例えば、ガンの診断等に有効なだけでなく、多因子疾患の病因関連遺伝子の解析や予測医療にも貢献し、個々人の薬剤応答性や副作用の程度を調べる上にも必要である。また、遺伝子の発現状況、すなわち、遺伝子情報がｍＲＮＡに読み取られ対応するタンパク質がつくられる状況を調べることは、遺伝子レベルで生命現象や病気を理解し、新薬を開発する上に非常に重要である。この遺伝子変異、あるいは、遺伝子の発現状況を速やかに検出する手段として、ＤＮＡチップが有効であることが知られている。
【０００５】
ＤＮＡチップとは、検体である各種ＤＮＡとそれぞれ特異的に結合する性質を有する分子をプローブとし、それぞれのプローブごとに、担体の表面上に、それぞれの区画に対応させて配列し固定したものである。このプローブは、一本鎖にした検体ＤＮＡに対し相補的な塩基配列を有する一本鎖のＤＮＡあるいはオリゴヌクレオチドであることが一般的である。
【０００６】
ＤＮＡチップのプローブが固定された面に検体ＤＮＡを含む試料を接触させ、検体ＤＮＡと対応するプローブ間で結合を起こさせる。この結合は、通常、プローブと検体ＤＮＡとの対合する塩基間で水素結合する性質、すなわち、ハイブリダイゼーションを利用したものである。そして、このハイブリダイゼーションによる結合を何らかの手段で検出することにより、プローブと結合した検体ＤＮＡを同定し、かつ、定量することができる。
上記検出手段として従来は、検体ＤＮＡに標識として予め蛍光分子を付加し、プローブと結合した検体ＤＮＡの蛍光分子からの蛍光の強度を測定している。標識に蛍光分子ではなく、放射性分子を用いていた時期もあった。最近では、電気化学的に活性な分子をハイブリダイゼーションの塩基対間に挿入させることにより、プローブでの電気の流れ易さの変化からハイブリダイゼーション結合を検出する方法も開発されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
このように、検体分子とプローブとのハイブリダイゼーション結合を検出するには、結合を認識するための分子等を新たに付加する必要があった。したがって、このための手間とコストが余分にかかり、しかも、結合を認識するための分子の付加により、検体あるいはプローブが変質し、検出精度が阻害されることがあった。
【０００８】
このような問題は、ＤＮＡチップに限らず、反応検出チップ一般に当てはまる。プローブ分子と検体分子の結合を認識するためには、結合を認識するための分子（例えば、蛍光ラベルを付着させた反応性分子）等を新たに付加することが一般的だからである。
【０００９】
上記の問題点を解決すべく、ハイブリダイゼーション結合等、プローブ分子と検体分子との結合を検出する際、結合を認識するための分子等を新たに付加することなく、これらの結合をそのまま直接認識する手法を提供し、手間とコストが余計にかからず、検体あるいはプローブの変質による検出精度の低下のない検出法を確立することが本発明の課題である。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、下記の手段により前記の課題を解決した。
（１）プローブ分子と検体分子との結合を、該分子を構成する糖又はアミノ酸の有する光学活性に由来する旋光能の変化により検出することを特徴とする反応検出セル。
（２）プローブＤＮＡと検体ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを、該ＤＮＡを構成する糖の有する光学活性に由来する旋光能の変化により検出することを特徴とする上記第１項に記載の反応検出セル。
（３）前記分子は蛋白質であることを特徴とする第１項に記載の反応検出セル。
（４）前記プローブ分子は抗体であり、前記検体分子は抗原であることを特徴とする第１項に記載の反応検出セル。
（５）前記分子は糖蛋白質であることを特徴とする第１項に記載の反応検出セル。
（６）前記旋光能の変化を調べるための光の経路が光ファイバーにより形成されることを特徴とする第１項に記載の反応検出セル。
（７）プローブ分子を表面に固定した粒子をバッファー液に分散させた分散液がセルに満たされることを特徴とする第６項に記載の反応検出セル。
（８）前記セルはキャピラリーと該キャピラリーの出入口を塞ぐ半透膜から構成され、該半透膜は前記検体分子を通し前記粒子を通さないことを特徴とする第７項に記載の反応検出セル。
（９）前記セルはガラス製のキャピラリーであり、該キャピラリーの外径の側面にはメタル膜が付着してあることを特徴とする第８項に記載の反応検出セル。
（１０）第９項に記載の反応検出セルを用いる分析システム。
【００１１】
すなわち、ＤＮＡチップの場合を例にとるならば、ハイブリダイゼーション反応の前後における物性量の変化として、プローブＤＮＡと検体ＤＮＡの構成要素である、デオキシリボースに帰属する光学活性に由来する、旋光能に着目する。これらの糖は、不斉炭素を有するため、光学活性、すなわち直線偏光の偏光面を回転させる作用を持つ。この回転作用の強さは、一般的に知られているように、糖の濃度に比例する。よって、ハイブリダイゼーション結合し、糖の総量が結合前の約２倍になり、糖の濃度が約２倍になることにより、旋光能が約２倍、すなわち、偏光面の回転角度（旋光角）が約２倍になる。この旋光角の違いを定量的に調べることにより、ハイブリダイゼーションの有無およびハイブリダイゼーションした検体の量を検出することが可能になる。
【００１２】
また、糖に限らず、旋光能を有するアミノ酸から構成される蛋白質（抗原、抗体、酵素等）においても、これらの検出に対し、本手段を適用できる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
この旋光角測定を行うのに相応しい系は、プローブ分子を浮遊させた液相であり、そこに検体分子を混ぜてハイブリダイゼーション反応を起こさせるのが好適である。ただし、ハイブリダイゼーション反応後、ハイブリダイゼーションの対象外である、プローブと結合しない検体分子を洗い流す必要があるため、プローブ分子をそのままの状態で単に浮遊させていたのでは、ハイブリダイゼーションした検体分子およびプローブ分子までも洗い流されてしまい不都合である。
【００１４】
そこで、プローブ分子を担体粒子に固定し、このプローブ分子付き担体粒子を液相に浮遊させる方法が考えられる。この担体粒子は、検体分子より十分大きい。よって、セルの両端が、検体分子は通すが担体粒子を通さない半透膜によって密閉されている円筒セル等に閉じ込め、その両側からこの半透膜を介してシリンジ等により送液するシステムにすれば、この問題は解決する。つまり、検体分子はセルの内外を自由に行き交うが、プローブ分子はセル内にとどまるような工夫を施せば良い。
【００１５】
本発明の好ましい態様である反応検出セル及びこれを使用した検出システムを図１〜図３を参照して更に、詳しく説明する。
本発明で使用できるプローブは反応検出チップに通常使用されているものを使用できる。これらの例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの断片、任意の塩基配列をもったオリゴヌクレオチド、抗原、抗体およびエピトープ、酵素、タンパク質およびその機能部位ポリペプチド鎖、あるいは糖蛋白質等を挙げることができる。
【００１６】
このようなプローブの担体として好適な粒子を選ぶ。図１に示すように、担体粒子１としては、直径１０μｍから２ｍｍ、好ましくは５０μｍ〜０．５ｍｍの球体、もしくは球体類似構造、あるいはタイル状の多孔質担体を用いることができる。担体の材料は、物理的に十分な強度を有し、かつ化学的に安定なものであれば使用できる。通常、ガラス、シリカ、各種の合成樹脂、天然高分子物質等が使用でき、多孔質であることが好ましい。
【００１７】
この粒子上にプローブ分子を固定する。例えば、ＤＮＡを固定する場合の固定法としては、ｃＤＮＡ法、In-situ合成法いずれも選択し得る。
このようにして作製したプローブ分子（例えば、ＤＮＡ）付き粒子を分散媒中に分散させ、その分散液を、キャピラリーを一定長に切断した円筒型セルの内部に封入する。キャピラリーの材質は、ガラス、シリカ、各種の合成樹脂、天然高分子物質が使用できる。このうち、加工性、安定性の点でガラスが好ましい。また、分散媒２は、ハイブリダイゼーション反応において通常用いられるバッファー液であることが好ましい。この分散液におけるプローブ分子付き粒子の濃度は２０〜４０ｗｔ％程度が良い。
【００１８】
図１に示す、セル３の両端は、検体分子は通すが担体粒子を通さない半透膜になっている。
セルは、中央がキャピラリー５から構成される。キャピラリーの内径は０．１〜０．８ｍｍ、好ましくは０．３〜０．７ｍｍ、更に好ましくは０．５ｍｍ程度である。キャピラリーの長さは１０〜２００ｍｍ、好ましくは５０〜１２０ｍｍ、更に好ましくは１００ｍｍ程度である。外径の側面には、金等の金属を、めっき、あるいは蒸着等の手段によりコーティングする。このメタルは、キャピラリー内部を進行する光を反射させることによりキャピラリー内部に光を閉じ込めるはたらきを有する。
【００１９】
半透膜４は、厚さ０．３〜０．８ｍｍ、好ましくは０．４〜０．６ｍｍ、更に好ましくは０．５ｍｍ程度であり、直径０．５〜３ｍｍ、好ましくは０．５〜２ｍｍ、更に好ましくは１ｍｍ程度である。１ｍｍ程度の円柱形で、材質は透明な多孔質であり、細孔径は1μm程度であることが望まれる。多孔質ガラス、多孔質プラスチック、多孔質樹脂、イオン交換膜等が使用できる。
【００２０】
通常、１つのセルは、１種類のプローブ分子に対応する。ＤＮＡチップでは、必要とされるプローブＤＮＡの種類の数は用途により異なるが、一般的には、数百〜千程度である。よって、図２に示すように、セル３の数は、数百〜千程度にもなるので、セルをセル集合部６としてコンパクトに束ねる工夫が必要になる。セル集合部は、セルとセルとの間を適当な樹脂等によって埋め固めることにより構成できる。セル集合部は必要最小限に小さくし、そこに光ファイバー７が集まるかたちに構成することがポイントである。セルは二次元的に束ねることもできるが、セルを三次元的に集合させることにより集積度をさらに上げることも可能である。
【００２１】
このように集合させたセルのそれぞれについて、ハイブリダイゼーション反応前の旋光角の測定を行う。セル集合部における個々のセルの前後に，セルの直径に相当する直径を持つ（例えば、１ｍｍ程度）光ファイバー７を接続する。片側の光ファイバーには、光源８が接続されており、途中に円偏光を直線偏光に変える偏光子９が介在する。この偏光子により直線偏向に変換された光は、セル内を通過する。この際、光の進行とともに偏光面が回転していく。この回転角、すなわち旋光角を光の出口側にある光ファイバーに接続された旋光角検出部１０により検出する。
【００２２】
続いて、ハイブリダイゼーション反応を行う。図３に示すように、適当なシリンジ１１に、検体サンプル（例えば、検体ＤＮＡ）を分散媒に分散させた検体液１２を充填し、適当なコネクターを介して、セル集合部における個々のセルの両側に接続させる。そして、適当なポンプにより検体液を各セルに送液する。１回の送液量は、セルのキャピラリーの容量程度である。一方向だけから送液すると、セル内のプローブ固定粒子がセル内において偏って配置してしまうので、両方向から順次送液するようにすると良い。
【００２３】
こうしてセル内に検体サンプルが十分に行き渡った後、検体サンプルとプローブ分子との間でのハイブリダイゼーション反応を促進させるため、インキュベーションを行う。具体的には、セル集合部を、検体の種類によって異なるが、検体ＤＮＡの場合には、４０〜８０℃程度に加熱し、１〜１０時間程度この温度で保持する。加熱方法としては、恒温槽による温浴、ヒーター加熱等を利用できる。
【００２４】
インキュベーション後、ハイブリダイゼーションしなかった検体サンプルをセル内から除去する目的で、セル内に洗浄液を送液する。検体液を送液する時と同様、シリンジを用いて行う。洗浄液は、ＤＮＡチップにおけるハイブリダイゼーション反応後の洗浄に通常用いられるＳＳＣ、あるいはＳＤＳ添加ＳＳＣで良い。
【００２５】
洗浄が終了したら最後に、ハイブリダイゼーション反応後の状態における旋光角を、ハイブリダイゼーション反応前と同様に測定する。旋光角は、検体がＤＮＡの場合、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの濃度に比例する。ヌクレオチドの濃度は、ハイブリダイゼーション反応前に比べると反応後は約２倍になる。よって旋光角は、ハイブリダイゼーション反応前に比べると反応後は約２倍になる。この旋光角の変化を検出することにより、ハイブリダイゼーションの有無を調べ、また、ハイブリダイゼーションの結合量を定量化することができる。
【００２６】
検出感度を上げるためには、この旋光角をなるべく大きくする必要がある。そのためには、プローブＤＮＡを用いる場合、ヌクレオチドの濃度を上げることが必要になる。担体に多孔質微粒子を選択して表面積を大きくし、プローブＤＮＡの付着総量を多くすることは非常に有効である。分散性の劣化を招かない範囲で、担体の分散濃度を上げることも効果的である。また、１プローブＤＮＡ当たりのヌクレオチド数が多い方が同様の理由で検出に有利であることがわかる。このヌクレオチド数は、プローブの種類、すなわち、どのような検体を検出するためのプローブかという、言わば“コンテンツ”に関わる問題である。よって、本発明にふさわしいコンテンツは、ヌクレオチド数が多い、すなわち、塩基数の多いプローブＤＮＡを用いるもの、ということになる。好ましいヌクレオチド数（塩基数）は１００以上である。
【００２７】
また、検出感度を上げるために、セルの長さを長くすることも有効である。検出装置のサイズが必要以上に大きくならない範囲で、セルの長さを長くすれば良い。
【００２８】
以上、本発明の反応検出セルとして、ＤＮＡチップを例にとって説明した。プローブＤＮＡを光学活性を持つプローブ分子、検体ＤＮＡを光学活性を持つ検体分子に置き換えれば、本発明は、反応検出チップ全般に拡張できることは容易に類推できる。プローブ分子の種類に応じて相応しい担体粒子等を選択することは言うまでもない。
【００２９】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。この実施例では、ＤＮＡを固定したセルの場合を例にとって説明する。ただし、この実施例によって本発明は限定されるものではない。
［実施例］
プローブＤＮＡの担体として平均直径約１００μｍの多孔質ガラス粒子を選んだ。そして、この粒子上にプローブＤＮＡを固定する。プローブＤＮＡの作製と固定法としては、ｃＤＮＡ法を選択し、プローブＤＮＡの長さ、すなわち、ヌクレオチド数（塩基数）は２００以上のＤＮＡを用いた。
【００３０】
このようにして作製したプローブＤＮＡ付き粒子１を分散液２に分散させ、図１に示すセル３の内部に封入する。分散液２は、ハイブリダイゼーション反応において通常用いられるバッファー液である。セル３の両側は、検体分子は通すが担体粒子を通さない半透膜４になっている。この分散液２におけるプローブＤＮＡ付き粒子１の濃度は約０．３ｇ／ｍｌであった。
【００３１】
セル３は、中央がガラス製のキャピラリー５から構成される。キャピラリー５の内径は０．５ｍｍ程度、長さは１００ｍｍ程度であり、外径の側面には、金を蒸着によりコーティングした。この金のコーティングは、キャピラリー内部を進行する光を反射させることによりキャピラリー内部に光を閉じ込めるはたらきを有する。
【００３２】
半透膜４は、厚さ０．５ｍｍ程度、直径１ｍｍ程度の円柱形で、材質は透明な多孔質であり、細孔径は１μｍ程度である多孔質ガラスを使用した。
１つのセル３は、１種類のプローブＤＮＡに対応する。ＤＮＡチップでは、必要とされるプローブＤＮＡの種類の数は用途により異なるが、一般的には、数百〜千程度である。よって、セル３の数は、数百〜千程度にもなるので、図２に示すように、セル３をセル集合部６のようにコンパクトに束ねる工夫が必要になる。セル集合部６は、セル３とセル３の間を適当な樹脂等によって埋め固めることにより構成される。セル集合部６は必要最小限に小さくし、そこに光ファイバー７が集まるかたちに構成することがポイントである。図２では二次元的に表現してあるが、セルを三次元的に集合させることにより集積度をさらに上げることも可能である。
【００３３】
最初に、ハイブリダイゼーション反応前の旋光角の測定を行う。セル集合部６における個々のセル３の前後に直径１ｍｍ程度の光ファイバー７を接続する。片側の光ファイバー７には、光源８がつながっており、途中に円偏光を直線偏光に変える偏光子９が介在する。この偏光子９により直線偏向に変換された光は、セル３内を通過する。この際、光の進行とともに偏光面が回転していく。この回転角、すなわち旋光角を旋光角検出部１０により検出する。
【００３４】
続いて、ハイブリダイゼーション反応を行う。図３に示すように、シリンジ１１に、検体ＤＮＡを分散液２に分散させた検体液１２を封入し、適当なコネクター（図示せず）を介して、セル集合部６における個々のセル３の両側に接続させる。そして、適当なポンプ（図示せず）により検体液１２をセル３に送液する。１回の送液量は、セル３のキャピラリー５の容量程度である。一方向だけから送液すると、セル３内のプローブＤＮＡ付き粒子１がセル３内において偏って配置してしまうので、両方向から交代で送液した。
【００３５】
こうしてセル３内に検体ＤＮＡが十分に行き渡った後、検体ＤＮＡとプローブＤＮＡの間でのハイブリダイゼーション反応を促進させるため、恒温槽による温浴により、インキュベーションを行う。セル集合部６を６０℃程度に加熱し、６時間程度この温度で保持した。
【００３６】
インキュベーション後、ハイブリダイゼーションしなかった検体ＤＮＡをセル３内から除去する目的で、セル３内に洗浄液を送液した。検体液を送液する時と同様、シリンジを用いて行った。洗浄液は、ＳＤＳ添加ＳＳＣを用いた。洗浄が終了したら最後に、ハイブリダイゼーション反応後の状態における旋光角を、ハイブリダイゼーション反応前と同様に測定した。この結果、旋光角はハイブリダイゼーション反応前において、３°、ハイブリダイゼーション反応後において、６°であった。この旋光角の変化を検出することにより、ハイブリダイゼーションの有無を調べ、また、ハイブリダイゼーションの結合量を定量化することができる。
【００３７】
本実施例では、反応検出セルとして、ＤＮＡチップを例に説明した。プローブＤＮＡをプローブ分子、検体ＤＮＡを検体分子に置き換えれば、本実施例は反応検出チップ全般に拡張できることは容易に類推できる。プローブ分子の種類に応じて相応しい担体粒子等を選択することは言うまでもない。
【００３８】
【発明の効果】
従来の技術との関連において、本発明が有する有利な効果を記載する。
本発明によれば、ハイブリダイゼーション結合等、プローブ分子と検体分子の結合を検出する際、結合を認識するための分子等を新たに付加する必要がないため、余分にかかっていた手間とコストが省略できる。すなわち、ＤＮＡチップ等、反応検出チップによる検出操作を従来に比し短時間かつ低コストで行うことが可能になる。また、結合を認識するための分子等を新たに付加する必要がないため、検体あるいはプローブが変質することがなくなり、このプローブ変質に因る検出精度の劣化が解消される。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例におけるセルを説明する説明図。
【図２】実施例のセルを使用し、セル中の分散液の旋光角を測定するシステムを示す説明図。
【図３】検体液をセルへ送液するシステムを示す説明図。
１ プローブＤＮＡ付き粒子
２ 分散液
３ セル
４ 半透膜
５ キャピラリー
６ セル集合部
７ 光ファイバー
８ 光源
９ 偏光子
１０ 旋光角検出部
１１ シリンジ
１２ 検体液
【図１】
2004212108.tif 000002
【図２】
2004212108.tif 000003
【図３】
2004212108.tif 000004