(57)【要約】【課題】健康食品に用いた場合、酵母ＲＮＡとキトサンの双方の性能特性を満足に発揮し、これらの混合物を用いた場合よりも、より経済的で高品質に製造されうるところのＲＮＡ−キトサン複合体を提供する。【解決手段】塩化ナトリウムで抽出した酵母ＲＮＡの酸性懸濁液とキトサンの酸性水溶液とをｐＨ３〜４の酸性条件下で混合することによるＲＮＡ−キトサン複合体の製造方法であって、該複合体に対するＲＮＡの含量は６０重量％以上であり、かつ、該複合体は元素分析において塩素をほとんど検出しないことを特徴とする方法。得られたＲＮＡ−キトサン複合体は水難溶性のため、ろ過等により容易に分離でき、しかも塩分をほとんど含まないので、製造後特別な加工をせずに健康食品の材料としてそのまま、利用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母菌体を含有する懸濁液を破砕処理して得られたスラリーに塩類を添加し、さらに酸性にした後、キトサンの酸性水溶液とｐＨ３〜４の酸性条件下で混合することによるＲＮＡ−キトサン複合体の製造方法であって、該複合体に対するＲＮＡの含量は６０重量％以上であり、かつ、該複合体は元素分析において塩素を有意に検出しないことを特徴とする方法。
【請求項２】
塩化ナトリウムで抽出した酵母ＲＮＡの酸性水溶液とキトサンの酸性水溶液とをｐＨ３〜４の酸性条件下で混合することによるＲＮＡ−キトサン複合体の製造方法であって、該複合体に対するＲＮＡの含量は６０重量％以上であり、かつ、該複合体は元素分析において塩素を有意に検出しないことを特徴とする方法。
【請求項３】
酵母がビール酵母、パン酵母、乳酵母由来のものである請求項１または２記載のＲＮＡ−キトサン複合体の製造方法。
【請求項４】
請求項１ないし３記載の製造方法により得られる、これら両者の活性が消失することなく複合形成されてなるＲＮＡ−キトサン複合体。
【請求項５】
請求項４記載のＲＮＡ−キトサン複合体を含む健康食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵母由来のＲＮＡとキトサンとからなるＲＮＡ−キトサン複合体の製造方法、該方法から得られたそのＲＮＡ−キトサン複合体、ならびに該ＲＮＡ−キトサン複合体を含む健康食品に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、酵母より抽出された核酸、特にＲＮＡは、細胞の新陳代謝を補助する栄養素として知られ、一方、カニやエビの甲殻などから抽出される高分子多糖類であるキトサンは、血圧やコレステロールの調整作用、免疫力の向上作用、食物繊維としての働きで腸内有用菌を増殖する作用、および自律神経の調節作用などの様々な作用を有することが知られており、近年注目を浴びている。そしてこれらは、健康食品の他、化粧品や医薬品等の材料として、様々な分野で使用されている。その場合、これらはそれぞれ単独で用いられる場合もあるが、より効能を高める観点から、これら両者の併用も試みられている。酵母ＲＮＡと、キトサンとを含む健康食品等は、一般に原料となる精製酵母ＲＮＡと精製キトサンとを別々に製造し、製造されたそれらを所定の配合比で混合することにより製造されている。即ち、上記の健康食品等の製造にあっては、酵母由来のＲＮＡとキトサンの各々独立した製造及び精製過程を経る必要があり、製造工程数が多く、生産費を上げる要因の一つとなっていた。
また、従来酵母からＲＮＡを単離し、それを最終用途となる健康食品等に材料として提供するため、酵母から抽出されるＲＮＡはできるだけ精製されていることが必要であった。
【０００３】
通常、酵母には、ＲＮＡが２〜４重量％含まれており、これを利用するためのＲＮＡの抽出精製作業は一般に、食塩水溶液を用いて行い（例えば、特許文献１）、その後、抽出溶液の食塩分を除く工程を経て行われている。しかし、この食塩分の除去には複雑な工程が必要であり、多大なコストがかかるため、従来の酵母ＲＮＡ製品には、完全に塩分除去されない１０重量％以上のかなりの塩分を含む製品として製造されているものも知られている。このような製品を健康食品等の原料として使用する場合には、脱塩等の前処理を要することもある。
また、他にも酵母からのＲＮＡ抽出法として、酸やアルカリ、ドデシル硫酸ソーダ（ＳＤＳ）等の界面活性剤や、フェノール等の抽出剤を使用する方法、その他リゾチームを使用する生化学的方法、超音波、ガラスビーズ、ボールミル、高圧噴射衝撃、等を使用する方法が知られている。例えば特許文献２には、酵母菌体を含有する懸濁液を破壊処理することにより得られた酵母スラリーに塩類を添加し、さらにアルカリ性（ｐＨ９〜９．５）で９０℃〜１１０℃で１５ないし６０分加熱抽出し、それをｐＨ２以下の硫酸酸性下で沈殿させ分離することによる高純度のリボ核酸を製造する方法が開示されている。
上述のような酵母からのＲＮＡ抽出方法では、脱塩や抽出後、さらなるＲＮＡ精製が必要となる。また、使用する抽出剤には食品製造に適しない抽出剤も多い。
【０００４】
一方、特許文献３には、子牛胸腺由来のＤＮＡ水溶液とキトサン水溶液とをｐＨ５前後に、即ち好ましくはｐＨ４．８〜５．２の範囲に調整して混合することにより得られた、核酸・キトサン複合体であって、該複合体中の核酸濃度が約３０〜５０％である複合体を示す。しかしこの文献には、原料として慣用の食塩水により抽出された塩分濃度の高い酵母ＲＮＡを使用することや、それにより元素分析によって塩素を検出できない複合体が得られる旨の記載はない。
【０００５】
【特許文献１】
特開昭５０−１３５２７４号公報（第１〜２頁）
【特許文献２】
特開平１０−１１７７９４号公報（第２〜４頁）
【特許文献３】
特開平１０−７７２３５号公報（第２〜４頁）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はかかる事情の下なされたもので、従来の食塩水により抽出された酵母ＲＮＡをそのまま使用したり、酵母ＲＮＡの製造過程にあるものを使用するにもかかわらず、元素分析による塩素がほとんど検出されない、即ち食塩含量が極めて低く、そのまま最終用途である健康食品等に使用できる、ＲＮＡ−キトサン複合体であって、ＲＮＡとキトサンの双方の性能特性を満足に発揮できかつ、これらの各精製成分の混合物を用いた場合と比較してより経済的に、しかも高品質に製造されうるところのＲＮＡ−キトサン複合体を提供することを課題とするものである。また、本発明はかかる新規ＲＮＡ−キトサン複合体を利用した従来に無い健康食品の提供をも課題とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは酵母ＲＮＡとキトサンに関し、様々な研究を重ねていたところ、食塩水により抽出された１０重量％程度の食塩含量をもつ酵母ＲＮＡ懸濁液とキトサンの酸性水溶液の所定の酸性条件下における混合により得られる、水難溶性の酵母ＲＮＡ−キトサン複合体においては、元素分析による塩素の検出がほとんどなく、塩分含量が極めて低いことを見出した。そこで本発明者らはこの知見に基づいて鋭意検討し、酵母ＲＮＡとキトサンの作用を併せ持つことが期待できる、ＲＮＡ−キトサン複合体であって、健康食品等のための材料として利用可能な本発明を完成させた。
従って、本発明は、酵母菌体を含有する懸濁液を破砕処理して得られたスラリーに塩類を添加し、さらに酸性にした後、キトサンの酸性水溶液とｐＨ３〜４の酸性条件下で混合することによるＲＮＡ−キトサン複合体の製造方法であって、該複合体に対するＲＮＡの含量は６０重量％以上であり、かつ、該複合体は元素分析において塩素を有意に検出しないことを特徴とする方法に関する。
また、本発明は塩化ナトリウムで抽出した酵母ＲＮＡの酸性水溶液とキトサンの酸性水溶液とをｐＨ３〜４の酸性条件下で混合することによるＲＮＡ−キトサン複合体の製造方法であって、該複合体に対するＲＮＡの含量は６０重量％以上であり、かつ、該複合体は元素分析において塩素を有意に検出しないことを特徴とする方法に関する。
さらに本発明はこれらの製造方法により得られる、ＲＮＡおよびキトサンこれら両者の活性が消失することなく複合形成されてなるＲＮＡ−キトサン複合体にも関する。
前述のように健康食品の材料として、酵母ＲＮＡとキトサンとを配合したものは既に知られているが、本発明のようなＲＮＡ−キトサン複合体を含む健康食品は知られていない。
【０００８】
本発明で使用する酵母は食品として利用できる種類のものであれば、特に制限されることはないが、代表的にはビール酵母、パン酵母、乳酵母として知られるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  属やＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属の他、場合によってＰｉｃｈｉａ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属およびＣａｎｄｉｄａ属等の酵母等も挙げられる。特にビール酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）が好ましい。
本発明における複合体の製造方法におけるＲＮＡ源としては、酵母菌体を直接破砕処理して得られたスラリーに塩類を添加することにより得た懸濁液やそれから菌体を除去したＲＮＡ抽出物や市販の酵母ＲＮＡエキスを使用できる。例えば、酵母菌体を破砕処理して得られたスラリーに塩化ナトリウムを約１０〜１５重量％で使用することによって得られた高濃度の塩分を含む懸濁液を使用できる。それにも関わらず、得られた本発明の複合体においては元素分析によるＣｌの検出はほとんどみられず、塩分濃度は非常に低い。従って、本発明は一般的に使用されている塩化ナトリウムによるＲＮＡ抽出法により得られた、塩分濃度は高いが、核酸ＲＮＡの含有率の高い抽出物を材料に使用することができる。なお、本明細書におけるＣｌの元素分析はフラスコ燃焼法で行うものである。
なお、酵母菌体を含有する懸濁液を破砕処理して得られたスラリー等に添加する塩類は、上述のような塩化ナトリウムの他、塩化カリウム、塩化リチウム、過塩素酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等がある。
【０００９】
また、本発明で使用するキトサンは、カニやエビ、昆虫などの甲殻類の硬い殻や、イカの甲に含まれるキチンを加水分解により脱アセチル化したポリグルコサミンであり、特にカニ殻由来のものが商業的に入手できる。キトサンは水に不溶のため、ＲＮＡ水溶液との反応に用いるキトサンは、例えば酢酸、塩酸、蟻酸等を添加した酸性水溶液に溶解する。
【００１０】
なお、本発明のＲＮＡ−キトサン複合体はポリアニオン性天然高分子であるＲＮＡやＤＮＡに対し、ポリカチオン性高分子であるキトサンを加えることにより形成されるものと考えられる。
従って、本発明のＲＮＡと複合体を形成するキトサンはポリカチオン性高分子であるが、本発明に関連して、ＲＮＡとの複合体はキトサン以外にも他のポリカチオン性の天然高分子または合成高分子が使用できる。これらの例としては、キトサン以外の天然多糖及びその誘導体、リシンやアルギニンなどの塩基性アミノ酸を多く含むタンパク質、例えばプロタミン、コラーゲンやその誘導タンパク質即ち、ゼラチン等また、ポリエチレンアミンなどの合成高分子も使用できる。
【００１１】
ＲＮＡ−キトサン複合体形成は、酵母菌体を含有する懸濁液を破砕処理して得られたスラリーに塩類を添加したもの、または市販等の酵母ＲＮＡ抽出物を水性媒体に溶解し酸を添加して酸性溶液にし、キトサンを酸性水性媒体に溶解した懸濁溶解した水溶液と、最終的にｐＨ３〜４の条件下で混合することにより行う。ｐＨが３よりもより低い強酸場合には、ＲＮＡの加水分解が起こりやすくなり好ましくなく、ｐＨ４以上ではＲＮＡ−キトサン複合体におけるキトサンに対するＲＮＡの含有量に影響を及ぼす。また、これらのｐＨ調整のための酸は塩酸、硫酸、酢酸、クエン酸、酒石酸などが適当である。
また、反応温度は１０〜９０℃か適当であり、室温でも十分進行可能である。
上記条件下で、反応を２０〜３０分ないし４〜５時間おこなうことにより目的の複合体が得られる。
【００１２】
本発明の製造方法で得られたＲＮＡ−キトサン複合体は、塩分含量が極めて低いため作成後は水洗のみでさらなる脱塩等の工程を必要とすることなく、健康食品等にそのまま利用できる。本発明のＲＮＡ−キトサン複合体は水難溶性で、水溶液中で沈殿するのでろ過、遠心分離等により、容易に溶液から分離できる。分離後、乾燥し、粉末状、顆粒状、固形状または懸濁溶液状の健康食品や他の可能な用途、例えば化粧品等の材料として使用することができ、ＲＮＡとキトサンの両方の効力が期待できる健康食品用の材料とすることができる。
従って、本発明はさらに上記ＲＮＡ−キトサン複合体を含む健康食品にも関する。これらは例えば、錠剤、タブレット、機能性食品、各種飲料等の原料として使用できる。
【００１３】
【実施例】
以下、本発明を限定することを目的としない実施例によって、本発明をより詳細に説明する。
実施例１
固形分１５％ビール酵母懸濁水溶液を高圧噴射衝撃式ホモジナイザーを用いて、１０００ｋｇｆ／ｃｍ２の圧力で１回破砕処理した。この酵母懸濁液１５０ｍｌに水５０〜２００ｍｌおよび食塩５〜２０ｇ加え十分に混合した後、１００℃のオートクレーブに１時間かけ、室温まで水冷して懸濁スラリーを得た。これとは別にキトサンは、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  社製・カニ由来のキトサンをさらに５０重量％水酸化ナトリウム水溶液を用いて１２０℃で脱アセチル化反応させ、ＮＭＲにて脱アセチル化度が９９％以上であることを確認したものを使用し、その１ｇを１００ｍｌの２体積％酢酸水溶液に溶解し、１重量％のキトサン酢酸（２体積％）水溶液を調製した。次いで、室温下、前記懸濁スラリー２０ｍｌに、酢酸（和光純薬製）を滴下してｐＨを約３に調整した後、前記１重量％のキトサン酢酸（２体積％）水溶液６ｍｌを滴下した。得られた混合液（約ｐＨ３）を室温で４時間振とうさせた。得られたサンプルを３０００ｒｐｍで３０分遠心分離した後、沈殿物を１０ｍｌの蒸留水で３回洗浄し、４０℃で真空乾燥させた。
約０．１１ｇ（例えば食塩２０ｇ使用の場合）の黄白色固体が得られたが、この複合体にはそのまま実際の食品に使用しても支障のない程度の塩分が含まれるにすぎなかった。
また、この複合体の赤外分光分析（装置：ＨＯＲＩＢＡ  ＦＴ−２１０、（株）堀場製作所製、条件：ＫＢｒ法）を行ったところ、下記、図１のビール酵母由来のＲＮＡが示した波数１５３５ｃｍ−１、１４７３ｃｍ−１、１２３５ｃｍ−１、１０５０ｃｍ−１の位置とほぼ同じ位置にピークがみられることから、この沈殿物はビール酵母由来のＲＮＡの特徴を示すことが判る。
【００１４】
実施例２
ビール酵母より抽出したＲＮＡ〔商品名：酵母ＲＮＡ、北京燕京中科生物技術有限公司製、中国、北京、塩化ナトリウム１２重量％含有、赤外分光スペクトル（装置：ＨＯＲＩＢＡ  ＦＴ−２１０、（株）堀場製作所製、条件：ＫＢｒ法）を図１に示す。）〕０．５ｇを９９．５ｍｌの水に溶かし２４時間振とうさせて（ラボシェーカー、井内盛栄堂（株）製を使用）、０．５重量％ＲＮＡ水溶液を調製した。キトサンは、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  社製・カニ由来のキトサンをさらに５０重量％水酸化ナトリウム水溶液を用いて１２０℃で脱アセチル化反応させ、ＮＭＲにて脱アセチル化度が９９％以上であることを確認したものを使用し、その１ｇを１００ｍｌの２体積％酢酸水溶液に溶解し、１重量％のキトサン酢酸（２体積％）水溶液を調製した。次いで、室温下、前記０．５重量％ＲＮＡ水溶液１０ｍｌに酢酸（和光純薬製）０．５ｍｌを滴下した後、前記１重量％のキトサン酢酸（２体積％）水溶液６ｍｌを滴下した。得られた混合液（約ｐＨ３）を室温で４時間振とうさせた。得られたサンプルを３０００ｒｐｍで３０分遠心分離した後、沈殿物を２ｍｌの蒸留水で洗浄し、４０℃で真空乾燥させた。
０．１０６５ｇの白色固体が得られ、塩素の元素分析（フラスコ燃焼法）では塩素は検出されなかった。従って、この複合体には実質的に塩化ナトリウムが含まれないと考えることができる。
さらに、この複合体の赤外分光分析（装置：ＨＯＲＩＢＡ  ＦＴ−２１０、（株）堀場製作所製、条件：ＫＢｒ法）を行ったところ、図２に示すスペクトルが得られ、図１のビール酵母由来のＲＮＡが示した波数１５３５ｃｍ−１、１４７３ｃｍ−１、１２３５ｃｍ−１、１０５０ｃｍ−１の位置と同じ位置にピークがみられることから、この沈殿物はビール酵母由来のＲＮＡの特徴を示すことが判る。
【００１５】
得られたキトサン−ＲＮＡ複合体中のＲＮＡの量を次の方法で測定した。
実施例１で得たキトサン−ＲＮＡ複合体１ｍｇに０．１Ｎ  ＨＣｌ  １ｍｌを加え、沸騰水浴中で１０分間時々振り混ぜながら、加熱する。この溶液５０μｌを０．９５ｍｌのＨＣｌで希釈して、分光光度計で波長２６０ｎｍにおける吸光度を測定した。同様に測定した標準ＲＮＡによる検量線から複合体中のＲＮＡ含量を算出したところ、６２重量％であった。
【００１６】
【発明の効果】
本発明によれば、従来、健康食品等において精製酵母ＲＮＡと精製キトサンをそれぞれ加える場合に比べ、２つの機能を併せ持つＲＮＡ−キトサン複合体を精製酵母ＲＮＡの製造過程で高純度で製造することができるので健康食品等の製造工程数をより少なくすることができる。また、本発明のＲＮＡ−キトサン複合体は、ｐＨ３〜４の酸性条件下に、酵母から塩化ナトリウムにより抽出されたかなりの塩分を含むＲＮＡ酸性懸濁液または酸性抽出液とキトサン酸性水溶液とを直接混合するという簡素な方法で形成でき、かつ水難溶性のため分離が容易である。しかも、本発明の方法により得られたＲＮＡ−キトサン複合体は殆ど塩分を含まないので、そのまま脱塩処理を要せずに、健康食品用の材料として利用できる。さらにいえば該複合体に対するＲＮＡの含量は６０重量％以上と高いので健康食品に対する核酸原料としても優れている。
従って本発明により、健康食品をより経済的に、効率良く提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２で使用した酵母由来のＲＮＡの赤外分光スペクトルを示す。
【図２】実施例２で得られた酵母由来のＲＮＡ−キトサン複合体の赤外分光スペクトルを示す。
【図１】
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【図２】
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