(57)【要約】【課題】本発明は、夥しい数の遺伝子の機能を、動物個体レベルで、最小限の労力および時間を使って、解明することができるシステムおよび方法を開発すること【解決手段】ノックアウト動物を作製する方法であって、以下の工程：１）胚性幹細胞およびジーントラップベクターを用いて、ジーントラップを行う工程；２）トラップされた遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドを、それぞれの該胚性幹細胞から調製する工程；３）調製した該オリゴヌクレオチドを用いてマイクロアレイを作製する工程；４）該マイクロアレイを用いて、該オリゴヌクレオチドの遺伝学的情報を提供する工程；５）提供された該遺伝学的情報から、所望の性質を有する該遺伝子を選択する工程；および６）該所望の性質を有する遺伝子が破壊された該胚性幹細胞を用いてノックアウト動物を作製する工程、を包含する、方法【選択図】　図４
2004141074.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ノックアウト動物を作製する方法であって、以下の工程：
１）胚性幹細胞およびジーントラップベクターを用いて、ジーントラップを行い、改変胚性幹細胞の集団を生成する工程；
２）該改変胚性幹細胞中のトラップされた遺伝子の配列に基づいて該遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドを調製する工程；
３）調製した該オリゴヌクレオチドまたはその誘導体をプローブとして用いて該トラップされた遺伝子の遺伝学的情報を得る工程；
４）該遺伝学的情報に基づいて、所望の性質を有する遺伝子を選択する工程；および
５）工程１）で調製された改変胚性幹細胞から、該所望の性質を有する遺伝子が破壊された胚性幹細胞を選択し、該遺伝子が破壊された胚性幹細胞を用いてノックアウト動物を作製する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
ノックアウト動物を作製する方法であって、以下の工程：
１）胚性幹細胞およびジーントラップベクターを用いて、ジーントラップを行い、改変胚性幹細胞の集団を生成する工程；
２）工程１）で調製された改変胚性幹細胞からノックアウト動物を作製する工程；
３）該改変胚性幹細胞中のトラップされた遺伝子の配列に基づいて該遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドを調製する工程；
４）調製した該オリゴヌクレオチドまたはその誘導体をプローブとして用いて該トラップされた遺伝子の遺伝学的情報を得る工程；および
５）該遺伝学的情報に基づいて選択した所望の性質を有する遺伝子と、該ノックアウト動物とを相関付ける工程、
を包含する、方法。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドまたはその誘導体は他から識別可能に標識されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝学的情報は、マイクロアレイを用いて解析される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記マイクロアレイは、ナイロンメンブレン型である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ジーントラップベクターは、レトロウイルスベクター形態または改良ポリＡトラップ形態である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝学的情報は、ｍＲＮＡの発現量、ｍＲＮＡが発現する細胞もしくは組織、ｍＲＮＡの発現パターンまたはｍＲＮＡの発現調節である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記所望の性質は、抗生物質刺激に対して応答性を有すること、または細胞もしくは組織において有意な発現パターンを示すことである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記所望の性質は、細胞の癌化に伴い発現量が有意に増加または減少すること、細胞死の誘導に伴い発現量が有意に増加すること、および脳内で長期記憶を司る海馬領域において特異的に発現することからなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
前記ノックアウト動物の作製は、胚盤胞への胚性幹細胞の微量注入より行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドは、ｃＤＮＡである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
ノックアウト動物を作製するためのキットであって、
１）遺伝子がジーントラップされた胚性幹細胞の集団；および
２）該胚性幹細胞の集団中の各胚性幹細胞においてトラップされた該遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドまたはその誘導体、
を備える、キット。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドまたはその誘導体は、マイクロアレイに配置される、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記胚性幹細胞は、凍結状態で提供される、請求項１２に記載のキット。
【請求項１５】
前記遺伝子は、ラット、マウスまたはハムスター由来である、請求項１２に記載のキット。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドまたはその誘導体は、約１５０から約３００のヌクレオチド長である、請求項１２に記載のキット。
【請求項１７】
前記マイクロアレイは、少なくとも約１０００個のオリゴヌクレオチドまたはその誘導体を含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１８】
前記マイクロアレイは、約１０００〜２０００個のオリゴヌクレオチドまたはその誘導体を含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１９】
前記オリゴヌクレオチドまたはその誘導体は、ｃＤＮＡである、請求項１３に記載のキット。
【請求項２０】
ノックアウト動物を作製するためのキットであって、
１）ジーントラップベクター；
２）胚性幹細胞の集団；および
３）該胚性幹細胞の集団中の各胚性幹細胞においてトラップされるべき遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドまたはその誘導体、
を備える、キット。
【請求項２１】
前記オリゴヌクレオチドまたはその誘導体は、マイクロアレイに配置される、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
オリゴヌクレオチドまたはその誘導体が配置されたマイクロアレイであって、該オリゴヌクレオチドまたはその誘導体は、ノックアウト動物を作製するためのキットにおいて使用される、ジーントラップされた胚性幹細胞においてトラップされた遺伝子に由来する、マイクロアレイ。
【請求項２３】
ジーントラップされた胚性幹細胞であって、該胚性幹細胞においてジーントラップされた遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドまたはその誘導体は、ノックアウト動物を作製するためのキットにおいて使用されるマイクロアレイに配置される、胚性幹細胞。
【請求項２４】
ノックアウト動物を作製するためのシステムであって、
１）ジーントラップベクター；
２）胚性幹細胞の集団；
３）該胚性幹細胞の集団中の各胚性幹細胞においてトラップされるべき遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドまたはその誘導体；および
４）該オリゴヌクレオチドまたはその誘導体を解析するための手段、
を備える、システム。
【請求項２５】
前記オリゴヌクレオチドまたはその誘導体は、マイクロアレイに配置され、前記解析するための手段は、マイクロアレイを解析するための手段である、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
さらに、以下の手順：
１）胚性幹細胞およびジーントラップベクターを用いて、ジーントラップを行い、改変胚性幹細胞の集団を生成する工程；
２）該改変胚性幹細胞中のトラップされた遺伝子の配列に基づいて該遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドを調製する工程；
３）調製した該オリゴヌクレオチドまたはその誘導体をプローブとして用いて該トラップされた遺伝子の遺伝学的情報を得る工程；
４）該遺伝学的情報に基づいて、所望の性質を有する遺伝子を選択する工程；および
５）工程１）で調製された改変胚性幹細胞から、該所望の性質を有する遺伝子が破壊された胚性幹細胞を選択し、該遺伝子が破壊された胚性幹細胞を用いてノックアウト動物を作製する工程、
を示した指示書を備える、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２７】
さらに、以下の手順：
１）胚性幹細胞およびジーントラップベクターを用いて、ジーントラップを行い、改変胚性幹細胞の集団を生成する工程；
２）工程１）で調製された改変胚性幹細胞からノックアウト動物を作製する工程；
３）該改変胚性幹細胞中のトラップされた遺伝子の配列に基づいて該遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドを調製する工程；
４）調製した該オリゴヌクレオチドまたはその誘導体をプローブとして用いて該トラップされた遺伝子の遺伝学的情報を得る工程；および
５）該遺伝学的情報に基づいて選択した所望の性質を有する遺伝子と、該ノックアウト動物とを相関付ける工程、
を示した指示書を備える、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２８】
ノックアウト動物を作製するためのシステムであって、
１）ジーントラップされた胚性幹細胞の集団；
２）該胚性幹細胞の集団中の各胚性幹細胞においてトラップされた遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドまたはその誘導体；および
３）該オリゴヌクレオチドまたはその誘導体を解析するための手段；
を備える、システム。
【請求項２９】
前記オリゴヌクレオチドまたはその誘導体は、マイクロアレイに配置され、前記解析するための手段は、マイクロアレイを解析するための手段である、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３０】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって作製されたノックアウト動物。
【請求項３１】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって同定された、所望の性質を有する遺伝子の核酸分子。
【請求項３２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって同定された、所望の性質を有する遺伝子のポリペプチド。
【請求項３３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって得られた、遺伝子の遺伝学的情報を記録した記録媒体。
【請求項３４】
請求項４に記載の方法において、ノックアウト動物を作製するための胚性幹細胞を選択する方法をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムであって、該方法は、
１）前記マイクロアレイにおいて配置された前記オリゴヌクレオチドまたはその誘導体のアドレス情報と、該マイクロアレイを用いて前記遺伝学的情報を提供するためのアッセイを行ったときの該マイクロアレイにおける該アドレス上における該遺伝学的情報を示す信号とを相関付ける工程、および
２）該アドレス情報と、前記トラップされた遺伝子が由来する胚性幹細胞のＩＤとを相関させる工程、
を包含し、ここで、所望の性質を示す遺伝学的情報を選択すると、それに対応する胚性幹細胞のＩＤが示される、
コンピュータプログラム。
【請求項３５】
請求項４に記載の方法において、前記マイクロアレイ上で選択される所望の性質を反映するスポットが前記集団のどのクローンまたは遺伝子に該当するかを判別する方法をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムであって、該方法は、
１）入力された該所望の性質のデータに基づいて該当するスポットを選択する工程；
２）該選択されたスポットのアドレスに相関付けられたクローンまたは遺伝子を選択する工程；
３）選択されたクローンまたは遺伝子を表示する工程、
を包含する、
コンピュータプログラム。
【請求項３６】
請求項３４または３５に記載のコンピュータプログラムが格納される、コンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【請求項３７】
請求項４に記載の方法において、ノックアウト動物を作製するための胚性幹細胞を選択する方法を実行するシステムであって、該システムは、
Ａ）コンピュータ；および
Ｂ）請求項３４に記載のコンピュータプログラム、
を備える、
システム。
【請求項３８】
請求項４に記載の方法において、前記マイクロアレイ上で選択される所望の性質を反映するスポットが前記集団のどのクローンまたは遺伝子に該当するかを判別するシステムであって、
Ａ）コンピュータ；および
Ｂ）請求項３５に記載のコンピュータプログラム、
を備える、
システム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、所望の性質を有するノックアウト動物を簡便に作製する方法ならびにそのためのキット、システム、胚性幹細胞およびマイクロアレイに関する。より詳細には、本発明は、マイクロアレイを利用してノックアウト動物を作製する方法ならびにそのためのキット、システム、胚性幹細胞およびマイクロアレイに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトゲノムが解析されたのに続き、イネなどでもゲノム解読が一応終了し、近年ではますます、遺伝子の機能の解析が重要な課題となっている。従来の遺伝子機能解析は、個々の遺伝子に注目して行われていたことが多く、今後は、大量に遺伝子機能を簡便に開発することが求められている。
【０００３】
そのような中、最近１０年間ほどで、遺伝子機能の解析を目的として、胚性幹（ＥＳ）細胞の相同組換えを介したノックアウト動物の解析が重要な手段となってきている。ノックアウト哺乳動物は、例えば相同組換えを応用したポジティブネガティブセレクション法を用いて作製することができる（特許文献１〜３、非特許文献４、非特許文献５など）。ノックアウト動物作出（ジーンターゲティングとも呼ばれる）の概説に関しては、例えば、非特許文献６〜７に記載され、ますます汎用されている。
【０００４】
高等生物では、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を用いる陽性選択とＨＳＶのチミジンキナーゼ遺伝子やジフテリア毒素遺伝子を用いる陰性選択により組換え体の効率的な選別が行われている。ノックアウトＰＣＲまたはサザンブロット法により相同組換え体の選択が行われる。すなわち、標的遺伝子の一部を陽性選択用のネオマイシン耐性遺伝子等で置換し、その末端に陰性選択用のＨＳＶＴＫ遺伝子等を連結したターゲティングベクターを作成し、エレクトロポレーションによりＥＳ細胞に導入し、Ｇ４１８およびガンシクロビルの存在下で選択して、生じたコロニーを単離し、さらにＰＣＲまたはサザンブロットにより相同組換え体を選択する。
【０００５】
このように、内在する標的遺伝子を破壊して、機能が喪失したかまたは減少した変異を有するノックアウト（標的遺伝子組換え、遺伝子破壊）マウスを作製すると方法は、標的とした遺伝子だけに変異が導入されるので、その遺伝子機能の解析に有用である。
【０００６】
所望の相同組換え体を選択した後、得られた組換えＥＳ細胞を胚盤注入法または集合キメラ法により正常な胚と混合してＥＳ細胞と宿主胚とのキメラマウスを作製する。胚盤注入法では、ＥＳ細胞を胚盤胞にガラスピペットで注入する。集合キメラ法では、ＥＳ細胞の塊と透明帯を除去した８細胞期の胚とを接着させる。ＥＳ細胞を導入した胚盤胞を偽妊娠させた代理母の子宮に移植してキメラマウスを得る。ＥＳ細胞は、全能性を有するので、生体内では、生殖細胞を含め、あらゆる種類の細胞に分化することができる。ＥＳ細胞由来の生殖細胞を有するキメラマウスと正常マウスを交配させるとＥＳ細胞の染色体をヘテロに有するマウスが得られ、このマウス同士を交配するとＥＳ細胞の改変染色体をホモに有するノックアウトマウスが得られる。得られたキメラマウスから改変染色体をホモに有するノックアウトマウスを得るには、雄性キメラマウスと雌性野生型マウスとを交配して、Ｆ１世代のヘテロ接合体マウスを産出させ、生まれた雄性および雌性のヘテロ接合体マウスを交配して、Ｆ２世代のホモ接合体マウスを選択する。Ｆ１およびＦ２の各世代において所望の遺伝子変異が導入されているか否かは、組換えＥＳ細胞のアッセイと同様に、サザンブロッティング、ＰＣＲ、塩基配列の解読など当該分野において慣用される方法を用いて分析され得る。
【０００７】
しかし、現在行われているノックアウト動物の作製技術では、個体を構成する全細胞で同時に遺伝子破壊が起こるため、多様な遺伝子機能を選択的に解析することができないという欠点を有する。
【０００８】
また、現行のノックアウト動物の作製は、目的の遺伝子を同定した後に、上述のようにその目的の遺伝子を一から破壊し、ノックアウトすることが必要であり、非常に労力および時間がかかる上、熟練した研究者でも必ずうまくいくとは限らない。従って、未だに労働集約的な作業を要する仕事である。
【０００９】
そのため、多様な遺伝子機能を選択的に解析することができないという問題を克服する次世代技術として、Ｃｒｅレコンビナーゼの細胞種特異的発現とＣｒｅ−ｌｏｘＰの部位特異的組み換えを併用するコンディショナルノックアウト技術が注目されている。Ｃｒｅ−ｌｏｘＰを用いるコンディショナルノックアウトマウスは、標的遺伝子の発現を阻害しない位置にネオマイシン耐性遺伝子を導入し、後に削除するエキソンをはさむようにしてｌｏｘＰ配列を挿入したターゲティングベクターをＥＳ細胞に導入し、その後相同組換え体を単離する。この単離したクローンからキメラマウスを得、遺伝子改変マウスが作製される。　次に、大腸菌のＰ１ファージ由来の部位特異的組換え酵素Ｃｒｅを組織特異的に発現するトランスジェニックマウスとこのマウスを交配させると、Ｃｒｅを発現する組織中でのみ遺伝子が破壊される（ここでは、Ｃｒｅは、ｌｏｘＰ配列（３４ｂｐ）を特異的に認識して、２つのｌｏｘＰ配列にはさまれた配列で組換えを起こさせ、これが破壊される）。臓器特異的なプロモータに連結したＣｒｅ遺伝子を有するトランスジェニックマウスと交配させるか、またはＣｒｅ遺伝子を有するウイルスベクターを使用して、成体でＣｒｅを発現させることができる。
【００１０】
この方法でもなお、目的の遺伝子を同定した後に、その目的の遺伝子を一から破壊し、ノックアウトすることが必要であり、非常に労力および時間がかかる上、熟練した研究者でも必ずうまくいくとは限らない。
【００１１】
特定の遺伝子を解析する方法としてジーントラップ（遺伝子トラップ）法が注目されている。ジーントラップ法では、プロモータを有しないレポーター遺伝子が細胞に導入され、その遺伝子が偶発的にゲノム上に挿入されると、レポーター遺伝子が発現することを利用して、新規な遺伝子を単離（トラップ）される。ジーントラップ法は、マウス初期胚操作法，胚性幹細胞培養法，相同組換えによる遺伝子ターゲティング法に基づく、効率的な挿入変異と未知遺伝子同定のための方法である（非特許文献８）。ジーントラップ法では、遺伝子の導入ならびに挿入変異体の選択およびその表現型解析が比較的に容易である。
【００１２】
ジーントラップ法では、例えば、スプライシング／アクセプター配列とポリＡ付加シグナルとの間にｌａｃＺとｎｅｏとの融合遺伝子であるβ−ｇｅｏを連結したジーントラップベクターをＥＳ細胞に導入し、Ｇ４１８で選択すると、ＥＳ細胞で発現している遺伝子を偶然にトラップしたクローンだけが選択される。
【００１３】
このようにして得られたクローンからキメラ胚を作製すると、トラップした遺伝子の発現パターンにより、さまざまなＸ−ｇａｌの染色パターンを示す。このようにして、ジーントラップ法では、未知の遺伝子が単離され、その遺伝子発現パターンが解析され、またその遺伝子が破壊される。
【００１４】
しかし、従来のジーントラップ法では、偶然にトラップされたクローンをその都度解析する必要があったことから、ある目的で遺伝子を探索するというプロジェクトではあまり有用ではなかった（特許文献４）。従って、系統的な研究をするためのツールとしてはジーントラップはあまり適していないという問題点があった。
【００１５】
【特許文献１】
米国特許第５，４６４，７６４号公報
【特許文献２】
米国特許第５，４８７，９９２号公報
【特許文献３】
米国特許第５，６２７，０５９号公報
【特許文献４】
特開２００１−５４３３７号公報
【００１６】
【非特許文献１】
Ｇｏｓｓｌｅｒ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．（１９８９），Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４，４６３−４６５
【非特許文献２】
Ｗｕｒｓｔ，Ｗ．ｅｔ　ａｌ．（１９９５），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１３９，８８９−８９９
【非特許文献３】
Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ、Ｂ．Ｐ．ｅｔ　ａｌ．（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ　３９２，６０８−６１１
【非特許文献４】
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８６，８９３２−８９３５，１９８９
【非特許文献５】
Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４２，４３５−４３８，１９８９
【非特許文献６】
村松正實、山本雅編集、『実験医学別冊　新訂　遺伝子工学ハンドブック　改訂第３版』（１９９９年、羊土社発行）中特に２３９から２５６頁
【非特許文献７】
相沢慎一（１９９５）実験医学別冊「ジーンターゲティング−ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」
【非特許文献８】
Ｓｔａｎｆｏｒｄ　ＷＬ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
２：７５６−７６８（２００１）
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、夥しい数の遺伝子の機能を、動物個体レベルで、最小限の労力および時間を使って、組織的に解明することができるシステムおよび方法を開発することを課題とした。
【００１８】
【課題を解決する手段】
上記課題は、本発明者らが鋭意検討の結果、ジーントラップ法にマイクロアレイを用いた解析を組み合わせることによって、夥しい数の遺伝子の機能を、動物個体レベルで、最小限の労力および時間を使って、予想外に解明することができたということを発見したことにより解決された。従って、本発明は、以下を提供する。
【００１９】
（１）　ノックアウト動物を作製する方法であって、以下の工程：
１）胚性幹細胞およびジーントラップベクターを用いて、ジーントラップを行い、改変胚性幹細胞の集団を生成する工程；
２）上記改変胚性幹細胞中のトラップされた遺伝子の配列に基づいて上記遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドを調製する工程；
３）調製した上記オリゴヌクレオチドまたはその誘導体をプローブとして用いて上記トラップされた遺伝子の遺伝学的情報を得る工程；
４）上記遺伝学的情報に基づいて、所望の性質を有する遺伝子を選択する工程；および
５）工程１）で調製された改変胚性幹細胞から、上記所望の性質を有する遺伝子が破壊された胚性幹細胞を選択し、上記遺伝子が破壊された胚性幹細胞を用いてノックアウト動物を作製する工程、
を包含する、方法。
【００２０】
（２）　ノックアウト動物を作製する方法であって、以下の工程：
１）胚性幹細胞およびジーントラップベクターを用いて、ジーントラップを行い、改変胚性幹細胞の集団を生成する工程；
２）工程１）で調製された改変胚性幹細胞からノックアウト動物を作製する工程；
３）上記改変胚性幹細胞中のトラップされた遺伝子の配列に基づいて上記遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドを調製する工程；
４）調製した上記オリゴヌクレオチドまたはその誘導体をプローブとして用いて上記トラップされた遺伝子の遺伝学的情報を得る工程；および
５）上記遺伝学的情報に基づいて選択した所望の性質を有する遺伝子と、上記ノックアウト動物とを相関付ける工程、
を包含する、方法。
【００２１】
（３）　上記オリゴヌクレオチドまたはその誘導体は他から識別可能に標識されている、項目１または２に記載の方法。
【００２２】
（４）　上記遺伝学的情報は、マイクロアレイを用いて解析される、項目１または２に記載の方法。
【００２３】
（５）　上記マイクロアレイは、ナイロンメンブレン型である、項目４に記載の方法。
【００２４】
（６）　上記ジーントラップベクターは、レトロウイルスベクター形態または改良ポリＡトラップ形態である、項目１または２に記載の方法。
【００２５】
（７）　上記遺伝学的情報は、ｍＲＮＡの発現量、ｍＲＮＡが発現する細胞もしくは組織、ｍＲＮＡの発現パターンまたはｍＲＮＡの発現調節である、項目１または２に記載の方法。
【００２６】
（８）　上記所望の性質は、抗生物質刺激に対して応答性を有すること、または細胞もしくは組織において有意な発現パターンを示すことである、項目１または２に記載の方法。
【００２７】
（９）　上記所望の性質は、細胞の癌化に伴い発現量が有意に増加または減少すること、細胞死の誘導に伴い発現量が有意に増加すること、および脳内で長期記憶を司る海馬領域において特異的に発現することからなる群より選択される、項目１または２に記載の方法。
【００２８】
（１０）　上記ノックアウト動物の作製は、胚盤胞への胚性幹細胞の微量注入より行われる、項目１に記載の方法。
【００２９】
（１１）　上記オリゴヌクレオチドは、ｃＤＮＡである、項目１または２に記載の方法。
【００３０】
（１２）　ノックアウト動物を作製するためのキットであって、
１）遺伝子がジーントラップされた胚性幹細胞の集団；および
２）上記胚性幹細胞の集団中の各胚性幹細胞においてトラップされた上記遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドまたはその誘導体、
を備える、キット。
【００３１】
（１３）　上記オリゴヌクレオチドまたはその誘導体は、マイクロアレイに配置される、項目１２に記載のキット。
【００３２】
（１４）　上記胚性幹細胞は、凍結状態で提供される、項目１２に記載のキット。
【００３３】
（１５）　上記遺伝子は、ラット、マウスまたはハムスター由来である、項目１２に記載のキット。
【００３４】
（１６）　上記オリゴヌクレオチドまたはその誘導体は、約１５０から約３００のヌクレオチド長である、項目１２に記載のキット。
【００３５】
（１７）　上記マイクロアレイは、少なくとも約１０００個のオリゴヌクレオチドまたはその誘導体を含む、項目１３に記載のキット。
【００３６】
（１８）　上記マイクロアレイは、約１０００〜２０００個のオリゴヌクレオチドまたはその誘導体を含む、項目１３に記載のキット。
【００３７】
（１９）　上記オリゴヌクレオチドまたはその誘導体は、ｃＤＮＡである、項目１３に記載のキット。
【００３８】
（２０）　ノックアウト動物を作製するためのキットであって、
１）ジーントラップベクター；
２）胚性幹細胞の集団；および
３）上記胚性幹細胞の集団中の各胚性幹細胞においてトラップされるべき遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドまたはその誘導体、
を備える、キット。
【００３９】
（２１）　上記オリゴヌクレオチドまたはその誘導体は、マイクロアレイに配置される、項目２０に記載のキット。
【００４０】
（２２）　オリゴヌクレオチドまたはその誘導体が配置されたマイクロアレイであって、上記オリゴヌクレオチドまたはその誘導体は、ノックアウト動物を作製するためのキットにおいて使用される、ジーントラップされた胚性幹細胞においてトラップされた遺伝子に由来する、マイクロアレイ。
【００４１】
（２３）　ジーントラップされた胚性幹細胞であって、上記胚性幹細胞においてジーントラップされた遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドまたはその誘導体は、ノックアウト動物を作製するためのキットにおいて使用されるマイクロアレイに配置される、胚性幹細胞。
【００４２】
（２４）　ノックアウト動物を作製するためのシステムであって、
１）ジーントラップベクター；
２）胚性幹細胞の集団；
３）上記胚性幹細胞の集団中の各胚性幹細胞においてトラップされるべき遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドまたはその誘導体；および
４）上記オリゴヌクレオチドまたはその誘導体を解析するための手段、
を備える、システム。
【００４３】
（２５）　上記オリゴヌクレオチドまたはその誘導体は、マイクロアレイに配置され、上記解析するための手段は、マイクロアレイを解析するための手段である、項目２４に記載のシステム。
【００４４】
（２６）　さらに、以下の手順：
１）胚性幹細胞およびジーントラップベクターを用いて、ジーントラップを行い、改変胚性幹細胞の集団を生成する工程；
２）上記改変胚性幹細胞中のトラップされた遺伝子の配列に基づいて上記遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドを調製する工程；
３）調製した上記オリゴヌクレオチドまたはその誘導体をプローブとして用いて上記トラップされた遺伝子の遺伝学的情報を得る工程；
４）上記遺伝学的情報に基づいて、所望の性質を有する遺伝子を選択する工程；および
５）工程１）で調製された改変胚性幹細胞から、上記所望の性質を有する遺伝子が破壊された胚性幹細胞を選択し、上記遺伝子が破壊された胚性幹細胞を用いてノックアウト動物を作製する工程、
を示した指示書を備える、項目２４に記載のシステム。
【００４５】
（２７）　さらに、以下の手順：
１）胚性幹細胞およびジーントラップベクターを用いて、ジーントラップを行い、改変胚性幹細胞の集団を生成する工程；
２）工程１）で調製された改変胚性幹細胞からノックアウト動物を作製する工程；
３）上記改変胚性幹細胞中のトラップされた遺伝子の配列に基づいて上記遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドを調製する工程；
４）調製した上記オリゴヌクレオチドまたはその誘導体をプローブとして用いて上記トラップされた遺伝子の遺伝学的情報を得る工程；および
５）上記遺伝学的情報に基づいて選択した所望の性質を有する遺伝子と、上記ノックアウト動物とを相関付ける工程、
を示した指示書を備える、項目２４に記載のシステム。
【００４６】
（２８）　ノックアウト動物を作製するためのシステムであって、
１）ジーントラップされた胚性幹細胞の集団；
２）上記胚性幹細胞の集団中の各胚性幹細胞においてトラップされた遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドまたはその誘導体；および
３）上記オリゴヌクレオチドまたはその誘導体を解析するための手段；
を備える、システム。
【００４７】
（２９）　上記オリゴヌクレオチドまたはその誘導体は、マイクロアレイに配置され、上記解析するための手段は、マイクロアレイを解析するための手段である、項目２８に記載のシステム。
【００４８】
（３０）　項目１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって作製されたノックアウト動物。
【００４９】
（３１）　項目１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって同定された、所望の性質を有する遺伝子の核酸分子。
【００５０】
（３２）　項目１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって同定された、所望の性質を有する遺伝子のポリペプチド。
【００５１】
（３３）　項目１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって得られた、遺伝子の遺伝学的情報を記録した記録媒体。
【００５２】
（３４）　項目４に記載の方法において、ノックアウト動物を作製するための胚性幹細胞を選択する方法をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムであって、上記方法は、
１）上記マイクロアレイにおいて配置された上記オリゴヌクレオチドまたはその誘導体のアドレス情報と、上記マイクロアレイを用いて上記遺伝学的情報を提供するためのアッセイを行ったときの上記マイクロアレイにおける上記アドレス上における上記遺伝学的情報を示す信号とを相関付ける工程、および
２）上記アドレス情報と、上記トラップされた遺伝子が由来する胚性幹細胞のＩＤとを相関させる工程、
を包含し、ここで、所望の性質を示す遺伝学的情報を選択すると、それに対応する胚性幹細胞のＩＤが示される、
コンピュータプログラム。
【００５３】
（３５）　項目４に記載の方法において、上記マイクロアレイ上で選択される所望の性質を反映するスポットが上記集団のどのクローンまたは遺伝子に上記当するかを判別する方法をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムであって、上記方法は、
１）入力された上記所望の性質のデータに基づいて上記当するスポットを選択する工程；
２）上記選択されたスポットのアドレスに相関付けられたクローンまたは遺伝子を選択する工程；
３）選択されたクローンまたは遺伝子を表示する工程、
を包含する、
コンピュータプログラム。
【００５４】
（３６）　項目３４または３５に記載のコンピュータプログラムが格納される、コンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【００５５】
（３７）　項目４に記載の方法において、ノックアウト動物を作製するための胚性幹細胞を選択する方法を実行するシステムであって、上記システムは、
Ａ）コンピュータ；および
Ｂ）項目３４に記載のコンピュータプログラム、
を備える、
システム。
【００５６】
（３８）　項目４に記載の方法において、上記マイクロアレイ上で選択される所望の性質を反映するスポットが上記集団のどのクローンまたは遺伝子に上記当するかを判別するシステムであって、
Ａ）コンピュータ；および
Ｂ）項目３５に記載のコンピュータプログラム、
を備える、
システム。
【００５７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００５８】
（用語）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００５９】
本明細書において使用される用語「基板」および「支持体」は、本明細書において、同じ意味で使用され、本発明のアレイが構築される材料（好ましくは固体）をいう。基板の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される生体分子に結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。
【００６０】
基板として使用するためのそのような材料としては、固体表面を形成し得る任意の材料が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）以下が挙げられるがそれらに限定されない。基板は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。本発明においてはまた、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜など、ブロッティングに使用される膜を用いることもできる。ナイロン膜が好ましい。ナイロン膜を用いた場合は、簡便な解析システムを用いて結果を分析することができるからである。しかし、高密度のものを解析する場合は、ガラスなど硬度のあるものを材料として使用することが好ましい。
【００６１】
本明細書において「チップ」または「マイクロチップ」とは、多様の機能をもち、システムの一部となる超小型集積回路をいう。本明細書において、「ＤＮＡチップ」とは、基板と、ＤＮＡとを含み、その基板にはＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ断片）が少なくとも１つ配置されている。「ＤＮＡチップ」は、本明細書では、「マイクロチップ」または単に「チップ」に含まれる。「マイクロアレイ」とは、そのようなチップ上に１以上の生体分子（例えば、ｃＤＮＡ断片のようなオリゴヌクレオチド）が整列されて配置されたものをいう。
【００６２】
本発明において使用される生体分子（たとえば、ＤＮＡのようなオリゴヌクレオチド）は、生体から採取されたものを利用し得るほか、当業者に公知の方法によっ化学的に合成され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどにより市販されるＤＮＡ合成機の何れかを用いて、自動化学合成により調製され得る。自動オリゴヌクレオチドの合成のための組成物および方法は、例えば、米国特許第４，４１５，７３２号，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓｅｔ　ａｌ．（１９８３）；米国特許第４，５００，７０７号およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ　（１９８５）；米国特許第４，６６８，７７７号，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８７）に開示される。
【００６３】
基板には、任意の数の生体分子（例えば、ＤＮＡ）が配置され得るが、通常、基板１つあたり、１０８個の生体分子まで、他の実施形態において１０７個の生体分子まで、１０６個の生体分子まで、１０５個の生体分子まで、１０４個の生体分子まで、１０３個の生体分子まで、または１０２個の生体分子までの個の生体分子が配置され得る。これらの場合において、基板の大きさはより小さいことが好ましい。特に、生体分子（例えば、ＤＮＡ）のスポットの大きさは、単一の生体分子のサイズと同じ小さくあり得る（これは、１−２ｎｍの桁であり得る）。最小限の基板の面積は、いくつかの場合において基板上の生体分子の数によって決定される。　本明細書において使用される用語「生体分子」とは、生体に関連する分子をいう。本明細書において「生体」とは、生物学的な有機体をいい、動物、植物、菌類、ウイルスなどを含むがそれらに限定されない。生体分子は、生体から抽出される分子を包含するが、それに限定されず、生体に影響を与え得る分子であれば生体分子の定義に入る。そのような生体分子には、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子など）、これらの複合分子などが包含されるがそれらに限定されない。本明細書では、生体分子は、好ましくは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
【００６４】
本明細書において使用される用語「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされ得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。
【００６５】
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。オリゴヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは一本鎖が使用されるが、本発明では一本鎖に限定されるわけではない。従って、本明細書においてオリゴヌクレオチドの「誘導体」とは、上述のようなヌクレオチドの誘導体を含むオリゴヌクレオチドをいう。
【００６６】
本明細書において用いられる用語「アレイ」とは、基板または膜上の固定物体の固定されたパターンまたはパターン化された基板そのものをいう。アレイの中で、小さな基板（例えば、１０×１０　ｍｍ上など）上にパターン化されているものはマイクロアレイというが、本明細書では、マイクロアレイとアレイとは互換可能に使用される。従って、上述の基板より大きなものにパターン化されたものでもマイクロアレイと呼ぶことがある。例えば、アレイはそれ自身固相表面または膜に固定されている所望のオリゴヌクレオチドのセットで構成される。アレイは好ましくは異なるオリゴヌクレオチドを少なくとも１０２個、より好ましくは少なくとも１０３個、およびさらに好ましくは少なくとも１０４個、さらにより好ましくは少なくとも１０５個を含む。これらのオリゴヌクレオチドは、好ましくは表面が１２５×８０　ｍｍ、より好ましくは１０×１０　ｍｍ上に配置される。形式としては、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートなどのプレートの大きさのものから、スライドグラス程度の大きさのものが企図される。
【００６７】
典型的に、アレイはそれ自身固相表面または膜に固定されている核酸配列を捕獲するように結合した生体分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質−ＲＮＡ融合分子、タンパク質、有機低分子など）で構成される。ここで、アレイ上には、生体分子の「スポット」が配置され得る。本明細書において「スポット」とは、生体分子の一定の集合をいう。本明細書において「スポッティング」とは、ある生体分子のスポットをある支持体に作製することをいう。スポッティングはどのような方法でも行うことができ、そのような方法は当該分野において周知である。
【００６８】
本明細書において使用される用語「アドレス」とは、基板上のユニークな位置をいい、他のユニークな位置から弁別可能であり得るものをいう。アドレスは、そのアドレスを伴うスポットとの関連づけに適切であり、そしてすべての各々のアドレスにおける存在物が他のアドレスにおける存在物から識別され得る（例えば、光学的）、任意の形状を採り得る。アドレスを定める形は、例えば、円状、楕円状、正方形、長方形であり得るか、または不規則な形であり得る。したがって、「アドレス」は、抽象的な概念を示し、「スポット」は具体的な概念を示すために使用され得るが、両者を区別する必要がない場合、本明細書においては、「アドレス」と「スポット」とは互換的に使用され得る。
【００６９】
各々のアドレスを定めるサイズは、とりわけ、その基板の大きさ、特定の基板上のアドレスの数、分析物の量および／または利用可能な試薬、微粒子のサイズおよびそのアレイが使用される任意の方法のために必要な解像度の程度に依存する。大きさは、例えば、１−２ｎｍから数ｃｍの範囲であり得るが、そのアレイの適用に一致した任意の大きさが可能である。
【００７０】
アドレスを定める空間配置および形状は、そのマイクロアレイが使用される特定の適用に適合するように設計される。アドレスは、密に配置され得、広汎に分散され得るか、または特定の型の分析物に適切な所望のパターンへとサブグループ化され得る。
【００７１】
マイクロアレイ（ＤＮＡが配置されている場合、ＤＮＡマイクロアレイとも呼ばれる）については、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。以下、ＤＮＡアレイおよびそれを使用する遺伝子分析方法を簡単に説明する。
【００７２】
「ＤＮＡアレイ」または「ＤＮＡマイクロアレイ」とは、ＤＮＡを基板上に整列（ａｒｒａｙ）させて、固定させたデバイスをいう。ＤＮＡアレイは、基盤の大きさまたは載せるＤＮＡの密度によって、ＤＮＡマクロアレイおよびＤＮＡマイクロアレイなどに分けられるが、本明細書では、特に断らない限り、ＤＮＡアレイは、ＤＮＡマイクロアレイと互換的に使用される。マクロとマイクロとの境界は厳密に決まっているわけではないが、一般に、「ＤＮＡマクロアレイ」とは、メンブレン上にＤＮＡをスポットした高密度フィルター（ｈｉｇｈ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｆｉｌｔｅｒ）をいい、「ＤＮＡマイクロアレイ」とは、ガラス、シリコンなどの基板表面にＤＮＡを載せたものをいう。載せる種類によって、ｃＤＮＡアレイ、オリゴＤＮＡアレイなどがある。
【００７３】
高密度オリゴＤＮＡマイクロアレイのうち、半導体集積回路製造のためのフォトリソグラフィー技術を応用し、基板上で一度に複数種のオリゴＤＮＡを合成することで作製されたものを、半導体チップになぞらえて、特に「ＤＮＡチップ（ｃｈｉｐ）」という。この方法を用いて作製されたものとしては、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ、ＣＡ、米国）などが挙げられる（Ｍａｒｓｈａｌｌ　Ａら、（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２７−３１およびＲａｍｓａｙ　Ｇら、（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６　４０−４４を参照のこと）。好ましくは、本発明におけるマイクロアレイを用いた遺伝子解析においては、このＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）が用いられ得る。ＤＮＡチップは、狭義には上記のように定義されるが、ＤＮＡアレイまたはＤＮＡマイクロアレイ全体をいうこともあり、従って、ｃＤＮＡのような既成のＤＮＡが高密度で配置されたチップもまた、ＤＮＡチップと呼ばれ得る。
【００７４】
ＤＮＡマイクロアレイは、このように、ガラス基板上に数千〜数万またはそれを超える遺伝子ＤＮＡを高密度に配列したデバイスであることから、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとのハイブリダイゼーションによって、遺伝子発現のプロファイルまたは遺伝子多型をゲノムスケールで解析することが可能となっている。この手法により、シグナル伝達系および／または転写制御経路の解析（Ｆａｍｂｒｏｕｇｈ　Ｄら（１９９９），Ｃｅｌｌ　９７，７２７−７４１）、組織修復の機構の解析（Ｉｙｅｒ　ＶＲら、（１９９９），Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８３：８３−８７）、医薬品の作用機構（Ｍａｒｔｏｎ　ＭＪ、（１９９９），Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：１２９３−１３０１）、発生・分化の過程における遺伝子発現変動の広汎な解析、病態に伴って発現変動する遺伝子群の同定、またはシグナル伝達系もしくは転写制御に関与する新たな遺伝子の発見などが可能となってきた。また、遺伝子多型についても、多数のＳＮＰを１つのＤＮＡマイクロアレイで解析することが可能となっている（Ｃａｒｇｉｌｌ　Ｍら、（１９９９），Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２２：２３１−２３８）。
【００７５】
合成型ＤＮＡマイクロアレイにおける標識方法としては、例えば、二蛍光標識法が挙げられる。この方法では、２つの異なるｍＲＮＡサンプルをそれぞれ異なる蛍光で標識し、同一マイクロアレイ上で競合的ハイブリダイゼーションを行って、両方の蛍光を測定し、それを比較することで遺伝子発現の相違を検出する。蛍光色素としては、例えば、Ｃｙ５およびＣｙ３などが最も用いられているが、それらに限定されない。Ｃｙ３およびＣｙ５の利点は、蛍光波長の重なりが殆どないという点である。二蛍光標識法は、遺伝子発現の相違のみならず、変異または多型性を検出するためにも使用され得る。
【００７６】
ＤＮＡマイクロアレイを用いたアッセイにおいては、ＤＮＡマイクロアレイ上でハイブリダイズした蛍光シグナルを蛍光検出器等で検出する。このような検出器は、現在までに種々の検出器が利用可能である。例えば、Ｓｔａｎｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙのグループは、オリジナルスキャナを開発しており、このスキャナは、蛍光顕微鏡と稼動ステージとを組み合わせたものである（ｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｂｒｏｗｎを参照のこと）。従来型のゲル用蛍光イメージアナライザであるＦＭＢＩＯ（日立ソフトウェアエンジニアリング）、Ｓｔｏｒｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ）などでも、スポットがそれほど高密度でなければ、ＤＮＡマイクロアレイの読み取りを行い得る。その他に利用可能な検出器としては、ＳｃａｎＡｒｒａｙ　４０００、同５０００（ＧｅｎｅｒａｌＳｃａｎｎｉｎｇ；スキャン型（共焦点型））、ＧＭＳ４１８　Ａｒｒａｙ　Ｓｃａｎｎｅｒ（宝酒造；スキャン型（共焦点型））、Ｇｅｎｅ　Ｔｉｐ　Ｓｃａｎｎｅｒ（日本レーザ電子；スキャン型（非共焦点型））、Ｇｅｎｅ　Ｔａｃ　２０００（Ｇｅｎｏｍｉｃ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ；ＣＣＤカメラ型））などが挙げられる。
【００７７】
マイクロアレイから得られるデータは膨大であることから、クローンとスポットとの対応の管理、データ解析などを行うためのデータ解析ソフトウェアが重要である。そのようなソフトウェアとしては、各種検出システムに付属のソフトウェアが利用可能である（Ｅｒｍｏｌａｅｖａ　Ｏら（１９９８）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０：１９−２３）。また、データベースのフォーマットとしては、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘが提唱しているＧＡＴＣ（ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）と呼ばれる形式が挙げられる。
【００７８】
別の実施形態では、ナイロン膜にｃＤＮＡをスポットしたものをマイクロアレイとして使用することができる。このｃＤＮＡは、放射性標識などの標識体で標識され得る。このような標識体を目印にスクリーニングすることができる。
【００７９】
本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子という。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／あるいは「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」をさすことがある。
【００８０】
本明細書において、ある遺伝子に「対応する」オリゴヌクレオチドとは、その遺伝子の配列と実質的に同一または相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドをいう。ここの配列が実質的に同一であるとは、遺伝子とそのオリゴヌクレオチドの対応関係が１：１であることを意味する。従って、好ましくは、ある遺伝子に「対応する」オリゴヌクレオチドは、その遺伝子が有する配列と完全に同一のまたは完全に相補的な配列を有する。そのような「対応する」オリゴヌクレオチドのヌクレオチド長は、本発明の目的に合致する限り、どのような長さでもよい。好ましくは、そのようなオリゴヌクレオチドは、対応する遺伝子の全長であり得るがそれに限定されない。ここで、その遺伝子の全長とは、構造遺伝子にあたる部分の全長であってもよく、ｍＲＮＡ配列の全長であってもよく、ゲノム上の全長であってもよい。
【００８１】
本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
【００８２】
本明細書ではアミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。
【００８３】
本発明においてマイクロアレイに配置されるオリゴヌクレオチド（例えば、ｃＤＮＡ）は、生体からのｍＲＮＡを用いて分子生物学的手法で作製されるほか、当業者に公知の方法によって化学的に合成され得る。例えば、自動固相ペプチド合成機を用いた合成方法は、以下により記載される：Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．（１９８４）．Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．；Ｇｒａｎｔ，Ｇ．Ａ．（１９９２）．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ　Ｕｓｅｒ’ｓ　Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．（１９９３）．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．（１９９４）．Ｔｈｅ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；Ｆｉｅｌｄｓ，Ｇ．Ｂ．（１９９７）．Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ　ａｌ．（Ｉ　９９４）．Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ；Ｆｉｅｌｄｓ，Ｇ．Ｂ．（１９９７）．Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ　ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。オリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどにより市販されるＤＮＡ合成機の何れかを用いて、自動化学合成により調製され得る。自動オリゴヌクレオチドの合成のための組成物および方法は、例えば、米国特許第４，４１５，７３２号，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）；米国特許第４，５００，７０７号およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８５）；米国特許第４，６６８，７７７号，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８７）に開示される。
【００８４】
本明細書において、遺伝子の「発現」とは、目的の細胞、生物などにおいてその遺伝子の転写物であるｍＲＮＡまたは翻訳産物であるポリペプチドが生成されることをいう。本明細書において、好ましい実施形態では、遺伝子の発現は、ｍＲＮＡレベルの発現をいう。
【００８５】
「発現量」とは、目的の細胞、生物などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡが発現される量をいう。ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量の測定方法としては、特異的抗体を用いたＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法などが挙げられる。ｍＲＮＡレベルでの発現の測定方法としては、ノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法が挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、好ましい実施形態では、遺伝子の発現量または発現レベルは、ｍＲＮＡレベルの発現の量またはレベルをいう。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価されるポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。本明細書において、好ましい実施形態では、遺伝子の発現量または発現レベルの変化は、ｍＲＮＡレベルの発現の量またはレベルでの変化をいう。
【００８６】
本明細書において、遺伝子が「特異的に発現する」とは、その遺伝子が、生物の特定の部位または時期において他の部位または時期とは異なる（好ましくは高い）レベルで発現されることをいう。
【００８７】
本明細書において、遺伝子の発現量の測定は、種々のストリンジェンシー条件下で行われ得る。そのようなストリンジェンシー条件としては、ストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件、低い程度にストリンジェントな条件などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００８８】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、その条件下でプローブがその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件であり、当該分野で慣用される周知の条件である。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる環境において異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。代表的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、少なくとも約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）の塩濃度を含み、そして温度は、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）について少なくとも約３０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化試薬の添加で達成される。例えば、５×ＳＳＰＥ（７５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）の条件および２５〜３０℃の温度は、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーションに適切である。
【００８９】
本発明の実施する際に、このような条件は、好ましくは、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ　塩化ナトリウム、１５ｍＭ　クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することが挙げられる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１−３８、ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１：Ｃｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９５）などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００９０】
特異的ハイブリダイゼーションは、配列が複合混合物中のＤＮＡまたはＲＮＡに存在する場合、ストリンジェントな条件下で特定のヌクレオチド配列のみへの、ハイブリダイゼーションをいう。ここで、Ｔｍは、（規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度の下で）標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。（標的配列は一般的に、過剰に存在するので、Ｔｍで、プローブの５０％が、平衡状態で占有される）。完全に適合したプローブは、特定の標的配列に完全に相補的な配列を有する。
【００９１】
アレイでの発現解析のために使用されるような試験プローブは、代表的には、標的配列の部分（配列）に完全に相補的である。用語「ミスマッチプローブ」とは、その配列が特定の標的配列に完全に相補的でないように故意に選択されるプローブをいう。ミスマッチは、ミスマッチプローブ中どこにでも位置し得るが、末端のミスマッチはあまり望ましくない。なぜなら、末端のミスマッチは、ほとんど、標的配列のハイブリダイゼーションを防止しないようであるからである。従って、プローブは、しばしば、ミスマッチが試験ハイブリダイゼーション条件下で標的配列との二重鎖を不安定化する可能性が最も高いように、プローブの中心または中心付近に位置するミスマッチを有するように設計される。
【００９２】
転写レベルは、絶対的または相対的に定量され得る。絶対的な定量は、１つ以上の既知濃度の標的核酸の包含によって、または既知量の標的核酸自体を用いて、そして公知の標的核酸との未知のハイブリダイゼーション強度を参照して（例えば、標準曲線の作成によって）、行うことができる。あるいは、相対定量は、転写物の２つ以上の多型性形態の間でのハイブリダイゼーションシグナルの比較によって達成され得る。このような解析は、コンピュータシステムを用いて行うことができる。そのような解析を行うソフトウェアとしては、例えば、ＡｒｒａｙＧａｕｇｅ　Ｖｅｒ．１．２，ＩｍａｇｅＧａｕｇｅ　Ｖｅｒ．　３．４５（ともに富士フィルム株式会社）が挙げられるがそれらに限定されない。
【００９３】
本明細書において使用される技術は、そうではないと具体的に指示しない限り、当該分野の技術範囲内にある、マイクロフルイディクス、微細加工、有機化学、生化学、遺伝子工学、分子生物学、微生物学、遺伝学および関連する分野における周知慣用技術を使用する。そのような技術は、例えば、以下に列挙した文献および本明細書において他の場所おいて引用した文献においても十分に説明されている。
【００９４】
微細加工については、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｓ．Ａ．（１９９６）．Ｔｈｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ；Ｚａｕｔ，Ｐ．Ｖ．（１９９６）．Ｍｉｃｒｏｍｉｃｒｏａｒｒａｙ　Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ；Ｍａｄｏｕ，Ｍ．Ｊ．（１９９７）．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ１　５　Ｐｒｅｓｓ；Ｒａｉ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，Ｐ．（１９９７）．Ｈａｎｄｂｏｏｋｏｆ　Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ，＆　Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【００９５】
分子生物学および組換えＤＮＡ技術は、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔａｌ．（１９８２）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆＭｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ　ａｎｎｕａｌ　ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ　ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【００９６】
ＤＮＡ合成技術などの核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃ　，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ　ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ　＆　Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ　ａｌ．（１９９４）．ＡｄｖａｎｃｅｄＯｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ　９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【００９７】
フォトリソグラフィー技術は、Ｆｏｒｄｏｒ　ｅｔ　ａｌ．によって開発された技術であり、光反応性保護基を利用する（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１、７６７（１９９１）を参照のこと）。この保護基は、各塩基モノマーと同種、あるいは別種の塩基モノマーとの結合を阻害する働きがあり、この保護基が結合している塩基末端には、新たな塩基の結合反応は生じない。また、この保護基は、光照射によって容易に除去することができる。まず、基板全面にこの保護基を有するアミノ基を固定化させておく。次に、所望の塩基を結合させたいスポットにのみ、通常の半導体プロセスで使用されるフォトリソグラフィー技術と同様の方法を使って、選択的に光照射を行う。これにより、光が照射された部分の塩基のみ、後続の結合によって次の塩基を導入できる。ここに、同じ保護基を末端に有する所望の塩基を結合させる。そして、フォトマスクの形状を変更して、別のスポットに選択的に光照射を行う。このあと、同様にして、保護基を有する塩基を結合させる。この工程をスポット毎に所望の塩基配列が得られるまで繰返すことによってＤＮＡアレイが作製される。本明細書において、フォトリソグラフィー技術が使用され得る。
【００９８】
本明細書において、「ノックアウト」とは、遺伝子について言及されるとき、その遺伝子を破壊（欠損）または機能不全にさせることをいう。
【００９９】
本明細書において、「ノックアウト動物」とは、ある遺伝子がノックアウトされた動物（例えば、マウス）をいう。
【０１００】
本明細書において、「動物」は、ノックアウトすることができるものであればどのような動物であってもよい。従って、動物には、脊椎動物および無脊椎動物が包含される。動物としては、哺乳動物（例えば、マウス、イヌ、ネコ、ラット、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、イルカ、クジラ、ヤギ、ウマなど）、鳥類（例えば、ニワトリ、ウズラなど）、両生類（例えば、カエルなど）、爬虫類、昆虫（例えば、ショウジョウバエなど）などが挙げられる。好ましくは、動物は、哺乳動物であり得、より好ましくは、ノックアウトを作製することが容易な動物（例えば、マウス）であり得る。別の好ましい形態では、動物は、ヒトのモデル動物として適切であることが判明している動物（例えば、サル）であり得る。ある実施形態では、動物は、非ヒト動物であり得るが、それに限定されない。
【０１０１】
本明細書において、「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多分化能を有し、組織が傷害を受けたときに再生することができる細胞をいい、胚性幹（ＥＳ）細胞、組織幹細胞（組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）などがある。本発明において使用される幹細胞は、通常胚性幹細胞であるがそれに限定されない。「胚性幹細胞」とは、初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。従って、本発明の１つの好ましい実施形態では、ノックアウト動物を作る材料として胚性幹細胞が使用され得るが、胚性幹細胞でない細胞であっても、ノックアウト動物を作製することができる限り、本発明において利用することができる。
【０１０２】
本明細書において「レトロウイルス」とは、ＲＮＡの形で遺伝情報を有し、逆転写酵素によってＲＮＡの情報からＤＮＡを合成するウイルスをいう。したがって、「レトロウイルスベクター」とは、レトロウイルスを遺伝子の担い手（ベクター）として使用した形態をいう。本発明において使用される「レトロウイルスベクター」としては、例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙ　Ｍｕｒｉｎｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｓ（ＭＭＬＶ）、Ｍｕｒｉｎｅ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉｒｕｓ（ＭＳＣＶ）にもとづいたレトロウイルス型発現ベクターなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１０３】
好ましくは、レトロウイルスベクターとしては、ｐＧｅｎ−、ｐＭＳＣＶなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１０４】
本明細書において、「ジーントラップ（法）」とは、目的の細胞に、例えば、プロモーターを欠いたレポーター遺伝子を導入し、染色体上で活性化されているプロモーターの下流に挿入された場合にのみレポーター活性が検出できること利用した遺伝子の同定方法をいう。このようなジーントラップは、「ジーントラップベクター」を、真核生物の宿主染色体中に導入して、宿主遺伝子を破壊することにより達成される。レポーター遺伝子が挿入された遺伝子は、レポーターとの複合タンパク質を発現するため、そのタンパク質をモニターすることによって遺伝子を同定することが可能である。したがって、相同組換えと同様に本来の遺伝子座にレポーター遺伝子が組み込まれるため、転写調節が完全なレポーター系を作ることができる。この手法を用いることによって、遺伝子破壊によって変異体を単離する手法では、得られなかった遺伝子の同定を行うことができる。
【０１０５】
本明細書において「ジーントラップベクター」とは、真核生物遺伝子のｍＲＮＡが成熟ｍＲＮＡとなる過程においてスプライシングを受ける現象を利用して、遺伝子中へ挿入されたベクターを選択するためのベクターである。ジーントラップベクターとしては、（１）プロモーターを有さないレポーター遺伝子のコード領域、およびスプライスアクセプター部位を含むＤＮＡ配列を含むベクター、または（２）プロモーターを有するレポーター遺伝子のコード領域、およびスプライスドナー部位を含むＤＮＡ配列を含むベクター、ならびに（３）これら（１）および（２）の両方のＤＮＡ配列を含むベクターが挙げられるがこれらに限定されない。この（３）に示されたジーントラップベクターの例としては、ｐＲＥＴトラップベクター（Ｙａｓｕｍａｓａ　ＩｓｈｉｄａおよびＰｈｉｌｉｐ　Ｌａｄｅｒ、Ｎｕｃ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９９９、Ｖｏｌ．２７、Ｎｏ．２４、ｅ３５）が挙げられるが、これに限定されない。このｐＲＥＴベクターを図１Ａに示す。ｐＲＥＴベクターは、（１）標的細胞中でまったく発現していない遺伝子でも効率よくトラップできる、（２）トラップした遺伝子の機能を完全に破壊できる、（３）トラップした遺伝子の発現をＧＦＰでモニターできる、（４）いったんゲノムに挿入されたベクターを切り出すことができる、などの優れた効果を奏する。
【０１０６】
上述のようなスプライスアクセプター配列を含むジーントラップベクターは、必要に応じて、ポリＡ付加シグナルを含んでもよい。スプライスドナー配列を含むジーントラップベクターは、必要に応じて、エンハンサー領域、および／またはｍＲＮＡ不安定化領域を含んでもよい。ポリＡ付加シグナルとしては、「ＡＡＴＡＡＡ」が挙げられるが、これに限定されない。
【０１０７】
本発明において使用するプロモーターとしては、ＭＣ１プロモーター、ＲＮＡｐｏｌ　ＩＩプロモーターなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１０８】
本発明において使用されるエンハンサーとしては、ポリオーマウイルスエンハンサー（ＰＹＦ４４１）などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１０９】
本発明において使用されるスプライスドナー配列としては、マウスｈｐｒｔ遺伝子エキソン８スプライスドナーが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１１０】
本発明において使用されるスプライスアクセプター配列としては、ヒトｂｃｌ−２遺伝子エキソン３スプライスアクセプターが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１１１】
本明細書において、遺伝子の「遺伝学的情報」とは、その遺伝子の状態、性質などに関する情報をいう。そのような遺伝学的情報としては、発現量、発現時期、発現する細胞、ある刺激に対する特異性、ｍＲＮＡの発現量、ｍＲＮＡが発現する細胞もしくは組織、ｍＲＮＡの発現パターン、ｍＲＮＡの発現調節などが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、上記遺伝学的情報から所望の性質を有する遺伝子を選択する方法は、当該分野において周知の任意の方法を用いて選択することができる。そのような遺伝学的情報は、マイクロアレイを用いて分析することができる。
【０１１２】
本明細書において使用される「レポーター」分子または「レポーター」遺伝子とは、細胞内において遺伝子発現の指標として使用することのできる分子（例えば、ポリペプチド）または遺伝子をいう。そのような分子としては、公知のレポータータンパク質を用いることができ、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、またはエクオリンなどが挙げられる。
【０１１３】
（好ましい実施形態の説明）
１つの局面において、本発明は、ノックアウト動物を作製する方法を提供する。このノックアウト動物作製方法は、ジーントラップ法にＤＮＡアレイでの分析を組み合わせることによって達成される。したがって、代表的には、本発明のこの方法は、以下の工程：１）胚性幹細胞およびレトロウイルスベクターを用いて、ジーントラップを行い、改変胚性幹細胞を生成する工程；２）改変胚性幹細胞中の各胚性幹細胞中のトラップされた遺伝子の配列に基づいて、その遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドを調製する（および識別する）工程；３）調製した該オリゴヌクレオチドを用いてマイクロアレイを作製する工程；４）該マイクロアレイを用いて、該オリゴヌクレオチドの遺伝学的情報を提供する工程；５）提供された該遺伝学的情報から、所望の性質を有する遺伝子を選択する工程；および６）該所望の性質を有する遺伝子が破壊された該胚性幹細胞を用いてノックアウト動物を作製する工程、を包含する。
【０１１４】
ここで、胚性幹細胞およびレトロウイルスベクターを用いてジーントラップを行う方法は、当該分野において公知の技術をもちいて所望の材料を用いて行う。ジーントラップは、例えば、目的とする胚性幹細胞に、例えば、プロモーターを欠いたレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、アルカリホスファターゼ遺伝子、Ｃｒｅレコンビナーゼ遺伝子など）を導入し、染色体上で活性化されているプロモーターの下流に挿入された場合にのみレポーター活性が検出する。ジーントラップベクターはこのレポーター遺伝子のほか、選択マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピュールマイシン耐性遺伝子、レスキューマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子＋コリシンＥ１複製開始起点）などを含んでいてもよい。ここで、選択マーカー遺伝子は、ベクターが入った宿主を選択するために使用される。レスキューマーカー遺伝子は、ベクターをレスキューするために使用される　（Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．ｅｄ．”Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ”（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，２０００）を参照のこと）。ジーントラップを行うと、改変胚性幹細胞が生成される。この改変胚性幹細胞は、遺伝子がトラップされている。ここで、トラップされているとは、ゲノムへのトラップベクターの挿入により内在性遺伝子が破壊され、同時にそのベクターによって破壊された遺伝子がマーキングされた状態をいう。
【０１１５】
本発明の方法では、改変胚性幹細胞中の各胚性幹細胞中のトラップされた遺伝子の配列に基づいて、その遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドを調製する（および識別する）工程を行う。上述のレポーター遺伝子が挿入された遺伝子は、レポーターとの複合タンパク質を発現するため、そのタンパク質をモニターすることによって遺伝子を同定することが可能であり、そのようにして同定された遺伝子のオリゴヌクレオチドを作製する。特定の配列を有するオリゴヌクレオチドの調製は、当該分野において周知の技術を用いて行うことができ、例えば、Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．ｅｄ．”Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ”（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，２０００）に記載される方法で行うことができる。オリゴヌクレオチドは、必要に応じて、蛍光、放射能などで標識することができる。そのような標識方法は当該分野において周知であり、本明細書において引用される文献に記載されている。
【０１１６】
本発明の方法では、上述の工程において調製されたオリゴヌクレオチドを用いてマイクロアレイを作製する工程を行う。マイクロアレイを作製する技術は当該分野において周知であり、本明細書において引用される文献にも記載されている。マイクロアレイには、好ましくは、情報を格納するための部分が配置されていてもよい。マイクロアレイ上へのオリゴヌクレオチドの配置は、直接単離したものを配置することのほか、基板上にそのｃＤＮＡと同じ配列のオリゴヌクレオチドを直接合成（たとえば、フォトリソグラフィー技術を用いる）することによって達成され得る。
【０１１７】
マイクロアレイ用ＤＮＡの調製は種々の方法を用いて行うことができる。例えば、発現解析に用いるマクロアレイ作製のためのスポット用　ＤＮＡとしては、クローン、ＰＣＲによる増幅断片、合成オリゴヌクレオテチドなどを使用することができる。例えば、上述のｃＤＮＡ、クローニングしたクローンなどを鋳型として、ベクター内の共通配列プライマーを用いてＰＣＲ増幅した断片を、スポット用ＤＮＡとして使用してもよい。クローン化したＤＮＡが入手できない生物種の場合には、解析したい遺伝子に特異的なプライマーセットを準備し、ゲノムＤＮＡもしくは、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型として、同様の反応を行ってアレイ用サンプルとして使用してもよい。
【０１１８】
そのような調製方法としては、以下の工程を包含する方法が挙げられる：１）９６穴ＰＣＲ反応用プレートを用いて、１００μｌ反応系で２０−３０サイクルのＰＣＲを行う；２）サンプルの一部（１−５μｌ）をアガロースゲル電気泳動を行い、増幅の状態を確認する；３）イソプロパノール１３０μｌを加えて混合し、２０−３０分間室温放置する；４）３０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、溶液を除去後、沈殿を乾燥させる；５）適当な濃度（０．５−１μｇ／ｍｌ）になるように２×ＳＳＣ、もしくは、ＴＥに溶解させる。
【０１１９】
ＲＮＡ試料からのターゲット調製も利用され得る。例えば、ＲＮＡ抽出法としては、変性剤または酵素による細胞壁の破壊やガラスビーズによる破壊などがある。細胞内のＲＮＡ存在量を忠実に測定することができる方法としてホットフェノール法を使用してもよい。ホットフェノール法は、当該分野において周知である。例えば、１）ホットフェノール法によってＲＮＡを抽出することに加え、ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡを調製してもよい。この後に以下のような工程を行って圧政を行うことができる：２）逆転写酵素（ＳＳＩＩ，ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて標識してもよい。反応系は、２０μｌ（１０μｇ　ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ、１×反応バッファー（ＳＳＩＩに付属するもの）、２５ｎｇ／ｍｌ　オリゴ（ｄＴ）プライマー、０．５μＭ　ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ、０．２μＭ　ｄＴＴＰ、０．１μＭ　ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ　ｄＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｆａｒｍａｃｉａ）、１０μＭ　ＤＴＴ、１００Ｕ　ＲＮａｓｉｎ）とし、２種類の細胞からのＲＮＡをそれぞれ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ　Ｃｙ３−ｄＵＴＰ，ＦｌｕｏｒｏＬＩｎｋ　Ｃｙ５−ｄＵＴＰで標識する。３）６５℃、２分加熱後、４２℃に移し、２００Ｕ　ＳＳＩＩを加えて、４２℃、３０−４０分インキュベートする。４）２００Ｕ　ＳＳＩＩを加えて、さらに、４２℃、３０−４０分インキュベートする。５）２０μｌ　Ｄｗ、５μｌ　０．５Ｍ　ＥＤＴＡ、１０μｌ　１Ｍ　ＮａＯＨを加えて、６５℃、６０分インキュベートする。６）２５μｌ　１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を加えて、中和する。７）溶液を、ｍｉｃｒｏｃｏｎ３０を用いて、１０−２０μｌに濃縮する。８）２００−４００μｌＴＥを加えた後、ｍｉｃｒｏｃｏｎ３０を用いて、１０−２０μｌに濃縮する。この操作を２−３回繰り返して、未標識のｄＮＴＰを除去する。９）標識したサンプルのうち、１μｌをアガロースゲル電気泳動後、蛍光検出可能なゲルスキャナーを用いて標識を確認する。このようにして、細胞内のＲＮＡ存在量を正確に測定することができる。
【０１２０】
本発明において、上述のように作製したマイクロアレイを用いて、配置されたオリゴヌクレオチドからそのｃＤＮＡが由来する遺伝子の遺伝学的情報を提供する工程が行われ得る。そのような遺伝学的情報としては、発現量、発現時期、発現する細胞、ある刺激に対する特異性、ｍＲＮＡの発現量、ｍＲＮＡが発現する細胞もしくは組織、ｍＲＮＡの発現パターン、ｍＲＮＡの発現調節、ある刺激（例えば、抗生物質、薬剤、ホルモン、ビタミン、リガンドなど）に対するある遺伝子の応答などが挙げられるがそれらに限定されない。マイクロアレイ上の遺伝子のスポット位置はすでに確定されているので、所望する結果を持つスポットを選択するだけで、そのスポットに対応する遺伝子が破壊された胚性幹細胞を即座に（理論的には選んだ瞬間に）入手することができることになる。したがって、マイクロアレイ分析の結果から興味のある遺伝子を選択するだけで、トランスジェニック動物を作製するための材料は手に入ったことになる。
【０１２１】
そのようなマイクロアレイを用いた分析としては、全遺伝子をマイクロアレイ化し、遺伝子発現量を定量的に測定するアッセイ、外部刺激または遺伝子破壊・増幅操作株における全遺伝子の発現量変化の計測、得られたデータベースから、モデル生物の全遺伝子の発現制御回路図を作成する機械的学習アルゴリズムの開発、遺伝子発現制御を想定するシミュレーターなどを行うことも可能である。
【０１２２】
ここで、上記工程において提供された該遺伝学的情報から、所望の性質を有する該遺伝子を選択する工程を行う。このような選択工程は、例えば、単にマイクロアレイ上のスポットを選択するだけであるので、特に特別の技術を用いることなく行うことができる。
【０１２３】
このように、興味のあるスポットを選択した瞬間にそのような興味のあるスポットに対応した遺伝子のノックアウト動物の材料（胚性幹細胞）が手中にあることになるので、この胚性幹細胞を用いて、所望の性質を有する遺伝子が破壊されたノックアウト動物を作製する工程を行えば、本発明のノックアウト動物を作製する方法は達成される。胚性幹細胞からノックアウト動物を作製する技術は当該分野において周知であり、当業者であれば、その胚性幹細胞および破壊された遺伝子の種類などに応じて、適宜条件を設定してノックアウト動物を作製することができる。簡潔に述べると、得られた胚性幹細胞を用いて相同組換えを行い、一方の対立遺伝子を改変および破壊した胚性幹細胞を選別し、ノックアウト動物を作出する。ここで、受精卵の胚盤胞または８細胞期胚細胞に本発明で得られる胚性幹細胞を注入し、胚性幹細胞と胚由来の細胞とが混ざったキメラマウスを得る。このキメラ動物と正常動物とを交配すると、一方の対立遺伝子のすべてが改変および破壊されたヘテロ接合体動物が作製される。このヘテロ接合体動物同士を交配することによって、ホモ接合体マウスを作出することができる。
【０１２４】
好ましい実施形態において、本発明で用いられるジーントラップベクターは、レトロウイルスベクターであり得る。そのようなレトロウイルスベクターとしては、Ｍｏｌｏｎｅｙ　Ｍｕｒｉｎｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｓ（ＭＭＬＶ）、Ｍｕｒｉｎｅ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉｒｕｓ（ＭＳＣＶ）にもとづいたレトロウイルス型発現ベクター（ｐＧｅｎ−、ｐＭＳＣＶなど）が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１２５】
好ましい実施形態において、本発明で用いられるマイクロアレイは、ナイロン膜またはスライドグラスであり得る。
【０１２６】
好ましい実施形態において、本発明で用いられる遺伝学的情報は、ｍＲＮＡの発現量、発現パターンであり得る。
【０１２７】
好ましい実施形態において、本発明で用いられる所望の性質は、薬剤刺激における発現、抗生物質刺激における発現、情報伝達物質での刺激における発現、疾患状態における発現、特殊な機能を担うごく少数の細胞における発現であり得る。
【０１２８】
本発明で用いられるノックアウト動物の作製は、種々の方法を用いて行うことができ、例えば、そのような方法としては、遺伝子を改変した胚性幹細胞を正常マウス由来の胚盤胞へ注入したり、あるいは、正常マウス由来の初期胚と凝集させることによってキメラマウスを作製し、その子孫としてノックアウトマウスを作製する方法が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１２９】
別の局面において、本発明は、ノックアウト動物を作製するためのキットを提供する。このキットは、１）ジーントラップされた胚性幹細胞；および２）該胚性幹細胞においてトラップされた遺伝子に由来するオリゴヌクレオチドが配置されたマイクロアレイ、を備える。
【０１３０】
ジーントラップされた胚性幹細胞は、当該分野において周知の技術を用いて作製することができる（Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．ｅｄ．”Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ”（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，２０００））。ジーントラップの具体的な方法は、上述の説明に記載され、実施例において例示されるとおりである。
【０１３１】
胚性幹細胞においてトラップされた遺伝子に由来するオリゴヌクレオチドが配置されたマイクロアレイを作製する方法は、当該分野において周知である（ＤＮＡ　Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ−Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　Ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｍａｒｋ　Ｓｃｈｅｎａ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照）。マイクロアレイを作製する具体的な方法は、上述の説明に記載され、実施例において例示されるとおりである。
【０１３２】
キット中に含まれる胚性幹細胞の形態としては、凍結状態、粉末状態、保存液中に存在する形態、培養液を満たした培養容器の底面に付着するの形態が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１３３】
本発明においてトラップされる遺伝子は、マウス胚性幹細胞由来であるものが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１３４】
アレイ上に配置されるオリゴヌクレオチドは、５００塩基長以上のものが好ましいが、５００塩基未満のものでも使用可能である。したがって、好ましくは、このオリゴヌクレオチドの長さとしては、約１５０から約８００、より好ましくは約３００から約６００のヌクレオチド長のものが使用され得る。また、約１５０〜３００のヌクレオチド長のものも好ましくあり得る。
【０１３５】
本発明において使用されるマイクロアレイには、所望の数の遺伝子に数に対応するスポットが配置され得る。例えば、その基板には、任意の数のスポットが配置され得るが、通常、１０８スポットまで、他の実施形態において１０７スポットまで、１０６スポットまで、１０５スポットまで、１０４スポットまで、１０３スポットまで、または１０２スポットまでのスポットが配置され得る。したがって、１スポットにｃＤＮＡ１個が配置されているときは、基板には、１０８個のｃＤＮＡまで、他の実施形態において１０７個のｃＤＮＡまで、１０６個の生体分子まで、１０５個の生体分子まで、１０４個のｃＤＮＡまで、１０３個のｃＤＮＡまで、または１０２個の生体分子までの個数のｃＤＮＡが配置され得る。これらの場合において、より小さな基板の大きさおよびより小さな個数が適切である。特に、スポットの大きさは、単一のｃＤＮＡのサイズと同じ小さくてもよい（これは、１−２ｎｍの桁であり得る）。最小限の基板の面積は、ある場合において基板上のスポットの数によって決定される。
【０１３６】
別の局面において、本発明は、オリゴヌクレオチドが配置されたマイクロアレイを提供する。ここで、このオリゴヌクレオチドは、ノックアウト動物を作製するためのキットにおいて使用される、ジーントラップされた胚性幹細胞においてトラップされた遺伝子に由来するものである。そのようなオリゴヌクレオチドの製造方法は本明細書において記載されるとおりである。
【０１３７】
別の局面において、本発明は、ジーントラップされた胚性幹細胞を提供する。本発明において、このような胚性幹細胞においてジーントラップされた遺伝子のｃＤＮＡ配列は、ノックアウト動物を作製するためのキットにおいて使用されるマイクロアレイに配置されることが特徴である。そのような胚性幹細胞を作製する方法は当該分野において周知であり、本明細書において記載されている。
【０１３８】
本発明は、ノックアウト動物を作製するためのシステムを提供する。このシステムは、１）ジーントラップされた胚性幹細胞；２）該胚性幹細胞においてトラップされた遺伝子のオリゴヌクレオチドまたはその誘導体；３）該オリゴヌクレオチドまたはその誘導体を解析するための手段を備える。このオリゴヌクレオチドまたはその誘導体はマイクロアレイに配置され得る。解析手段は、マイクロアレイを解析する手段であり得る。
【０１３９】
このようなシステムにおいて使用される、ジーントラップされた胚性幹細胞の作製方法は、本明細書において記載したとおりである。このようなシステムにおいて使用されるマイクロアレイの作製方法もまた、本明細書において記載したとおりである。
【０１４０】
マイクロアレイを解析する手段としては、種々の公知の手段が使用され得る。そのような手段としては、コンピュータシステムが挙げられる。そのような解析手段の具体的な例としては、ＧＭＳ４１８，ＧＭＳ４２８（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、Ｓｃａｎａｒｒａｙ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＧＳＩ　Ｌｕｍｏｎｉｃｓ）、ＧｅｎｅＰｉｘ　４０００Ｂ（Ａｘｏｎ）などが挙げられるがそれらに限定されない。その際に使用される解析用のソフトウェアとしては、ＧＭＳ系についてはＩｍａｇｅｎｅ、Ｓｃａｎａｒｒａｙ　ＥｘｐｒｅｓｓについてはＱｕａｎｔａｒｒａｙ、ＧｅｎｅｐｉｘについてはＧｅｎｅＰｉｘ　Ｐｒｏが挙げられるがそのソフトウェアの改変版もまた使用され得る。ナイロン膜をマイクロアレイとして使用する際は、放射性同位体（３３Ｐなど）で標識した金剛ｃＤＮＡでスクリーニングすることができる。その場合、上述の専用解析装置は特に必要ではなく、汎用性の高いイメージアナライザーＢＡＳ２５００、あるいはＢＡＳ５０００（共に富士フィルム）および解析ソフトウェアＡｒｒａｙＧａｕｇｅ　Ｖｅｒ．１．２（富士フィルム）を用いてデータを解析することができる。そのような解析の原理は、周知であり、ＤＮＡ　Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ−Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　Ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｍａｒｋ　Ｓｃｈｅｎａ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９９）に詳述されている。
【０１４１】
本発明のシステムは、そのシステムを使用する方法を記載した指示書が付属していてもよい。この指示書は、必要に応じて、本発明が実施される国の監督官庁が規定した様式に従って作成され、必要に応じてその監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆるマニュアルであり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【０１４２】
ここで、このような指示書には、以下の手順：１）胚性幹細胞およびジーントラップベクターを用いて、ジーントラップを行い、改変胚性幹細胞の集団を生成する工程；２）該改変胚性幹細胞中のトラップされた遺伝子の配列に基づいて該遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドを調製する工程；３）調製した該オリゴヌクレオチドまたはその誘導体をプローブとして用いて該トラップされた遺伝子の遺伝学的情報を得る工程；４）該遺伝学的情報に基づいて、所望の性質を有する遺伝子を選択する工程；および５）工程１）で調製された改変胚性幹細胞から、該所望の性質を有する遺伝子が破壊された胚性幹細胞を選択し、該遺伝子が破壊された胚性幹細胞を用いてノックアウト動物を作製する工程が示されていてもよい。これらの具体的な工程はまた、１）胚性幹細胞およびジーントラップベクターを用いて、ジーントラップを行い、改変胚性幹細胞の集団を生成する工程；２）工程１）で調製された改変胚性幹細胞からノックアウト動物を作製する工程；３）該改変胚性幹細胞中のトラップされた遺伝子の配列に基づいて該遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドを調製する工程；４）調製した該オリゴヌクレオチドまたはその誘導体をプローブとして用いて該トラップされた遺伝子の遺伝学的情報を得る工程；および５）該遺伝学的情報に基づいて選択した所望の性質を有する遺伝子と、該ノックアウト動物とを相関付ける工程であってもよい。これらの工程は、当業者が読んで使用できる程度の記載であってもよいが、知識のない人が使用する可能性もあることから、この指示書には、具体的かつ詳細にプロトコルが記載されていてもよい。また、指示書には、上述のすべての工程が記載されている必要はなく、少なくとも１つの工程が含まれているだけでもよい。好ましくは、２つ以上、３つ以上、４つ以上、より好ましくは５つの工程すべてが記載されていてもよい。また、これらの５つの工程以外の事項がこの指示書に記載されていてもよい。
【０１４３】
これらの各々の工程は、指示書には具体的には、以下のようなプロトコル形式で記載されていてもよい。
１）胚性幹細胞およびジーントラップベクターを用いて、ジーントラップを行い、改変胚性幹細胞の集団を生成する工程：
胚性幹細胞へのジーントラップベクターの導入（レトロウイルス型の感染による）；例えばＧ４１８などの選択マーカーによる選択；Ｇ４１８などの選択マーカー耐性胚性幹細胞コロニーのピックアップ；およびＧ４１８などの選択マーカー耐性胚性幹細胞の凍結およびＧＦＰのＦＡＣＳ解析；
２）該改変胚性幹細胞中のトラップされた遺伝子の配列に基づいて該遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドを調製する工程：
Ｇ４１８耐性胚性幹細胞からのＲＮＡ抽出；抽出したＲＮＡを逆転写することによるｃＤＮＡの合成、ＰＣＲによるトラップされた遺伝子のＤＮＡ断片の増幅；
３）調製した該オリゴヌクレオチドまたはその誘導体をプローブとして用いて該トラップされた遺伝子の遺伝学的情報を得る工程（例えば、調製したオリゴヌクレオチドを用いてマイクロアレイを作製する工程およびそのマイクロアレイを用いてトラップされた遺伝子の遺伝学的情報を得る工程）：
遺伝子特異的プライマーを用いた、ＤＮＡ断片の精製およびさらなる増幅、および支持体（ナイロン膜、スライドグラスなど）へのＤＮＡのスポッティング；いくつかの異なるサンプル（細胞または組織）から調製したｍＲＮＡを逆転写することによって放射性同位体で標識したものと、作製したマイクロアレイ上のＤＮＡのハイブリダイゼーションを行い、マイクロアレイの洗浄およびオートラジオグラフィーを行い、結果をソフトウェアにより解析する；
４）該遺伝学的情報に基づいて、所望の性質を有する遺伝子を選択する工程：
研究対象とする所望の性質を選択する；
５）改変胚性幹細胞から、該所望の性質を有する遺伝子が破壊された胚性幹細胞を選択し、該遺伝子が破壊された胚性幹細胞を用いてノックアウト動物を作製する工程：
遺伝子が破壊された胚性幹細胞の、胚盤胞へのマイクロインジェクション；キメラマウスの作製；キメラマウスと野生型マウスの交配によるヘテロマウスの作製、ヘテロマウス同士の交配による、ホモマウス（父親由来および母親由来の両方の対立遺伝子が変異型となっている）の作製およびその表現型の解析により、所望のノックアウトマウスを選択する。
【０１４４】
１つの局面において、本発明は、本発明の方法によって作製されたノックアウト動物（例えば、マウス）を提供する。このようなノックアウト動物は、従来の技術では迅速に作ることができなかったものである。
【０１４５】
ある局面において、本発明は、本発明の方法によって同定された、所望の性質を有する遺伝子の核酸分子を提供する。本発明の方法によって、従来では行うことができなかった未知遺伝子の機能を解析することができる。このように解析された遺伝子情報は、従来の方法では得られることができない情報であり、そのような情報を有する遺伝子の配列を有する核酸分子は、従来技術では取得することができなかった核酸分子である。
【０１４６】
別の局面において、本発明は、本発明の方法によって同定された、所望の性質を有する遺伝子のポリペプチドを提供する。上述のように従来技術で得ることができなかった情報を有する遺伝子の配列を有するポリペプチドは、従来技術では取得することができなかったポリペプチドである。
【０１４７】
本発明は、本発明の方法によって得られた、遺伝子の遺伝学的情報を記録した記録媒体を提供する。記録媒体は、フレキシブルディスク、ＭＯ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＡＭ、ＤＶＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＷ、ＤＶＤ＋ＲＷ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、メモリーカードなどであり得るがそれらに限定されない。
【０１４８】
本発明は、本発明の方法において用いるための、ノックアウト動物を作製するための胚性幹細胞を選択する方法をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムを提供する。このプログラムによって実行される方法は、１）前記マイクロアレイにおいて配置された前記ｃＤＮＡのアドレス情報と、該マイクロアレイを用いて前記遺伝学的情報を提供するためのアッセイを行ったときの該マイクロアレイにおける該アドレス上における該遺伝学的情報を示す信号とを相関させる工程、および２）該アドレス情報と、前記トラップされた遺伝子が由来する胚性幹細胞のＩＤとを相関させる工程、を包含し、ここで、所望の性質を示す遺伝学的情報を選択すると、それに対応する胚性幹細胞のＩＤが示される。
【０１４９】
別の局面において、本発明は、本発明の方法において、ノックアウト動物を作製するための胚性幹細胞を選択する方法をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが格納されるコンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供する。ここで、その記録媒体に格納されるコンピュータプログラムが実行させる方法は、１）前記マイクロアレイにおいて配置された前記ｃＤＮＡのアドレス情報と、該マイクロアレイを用いて前記遺伝学的情報を提供するためのアッセイを行ったときの該マイクロアレイにおける該アドレス上における該遺伝学的情報を示す信号とを相関させる工程、および２）該アドレス情報と、前記トラップされた遺伝子が由来する胚性幹細胞のＩＤとを相関させる工程、を包含し、ここで、所望の性質を示す遺伝学的情報を選択すると、それに対応する胚性幹細胞のＩＤが示されるする。ここで、記録媒体は、フレキシブルディスク、ＭＯ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＡＭ、ＤＶＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＷ、ＤＶＤ＋ＲＷ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、メモリーカードなどであり得るがそれらに限定されない。また、記録媒体は、ハードディスクでもよい。したがって、アプリケーション・サーバー・プロバイダーがそのようなプログラムを提供してもよい。
【０１５０】
別の局面において、本発明は、本発明の方法において、ノックアウト動物を作製するための胚性幹細胞を選択する方法を実行するシステムを提供する。このようなシステムは、Ａ）コンピュータ；およびＢ）該コンピュータにノックアウト動物を作製するための胚性幹細胞を選択する方法を実行させるコンピュータプログラム、を備える。ここで、上記方法は、１）前記マイクロアレイにおいて配置された前記ｃＤＮＡのアドレス情報と、該マイクロアレイを用いて前記遺伝学的情報を提供するためのアッセイを行ったときの該マイクロアレイにおける該アドレス上における該遺伝学的情報を示す信号とを相関させる工程、および２）該アドレス情報と、前記トラップされた遺伝子が由来する胚性幹細胞のＩＤとを相関させる工程、を包含し、ここで、所望の性質を示す遺伝学的情報を選択すると、それに対応する胚性幹細胞のＩＤが示される。これらのシステムは、同一の場所にあっても良く、異なる場所にあってもよい。したがって、アプリケーション・サーバー・プロバイダーのような距離を隔てた場所にある媒体がそのようなプログラムを提供してもよい。
【０１５１】
別の局面において、本発明は、本発明のノックアウト動物作製方法において、マイクロアレイ上で選択される所望の性質を反映するスポットが前記集団のどのクローンまたは遺伝子に該当するかを判別する方法をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムを提供する。ここで、上記方法は、１）入力された該所望の性質のデータに基づいて該当するスポットを選択する工程；２）該選択されたスポットのアドレスに相関付けられたクローンまたは遺伝子を選択する工程；３）選択されたクローンまたは遺伝子を表示する工程、を包含する。これらのシステムは、同一の場所にあっても良く、異なる場所にあってもよい。したがって、アプリケーション・サーバー・プロバイダーのような距離を隔てた場所にある媒体がそのようなプログラムを提供してもよい。
【０１５２】
次に、図６を参照して本発明のコンピュータでの実行方法を示す。図６は、本発明のノックアウト動物を作製するための胚性幹細胞を選択する方法の処理を実行するコンピュータの５００の構成例を示す。
【０１５３】
コンピュータ５００は、入力部５０１と、ＣＰＵ５０２と、出力部５０３と、メモリ５０４と、バス５０５とを備える。入力部５０１と、ＣＰＵ５０２と、出力部５０３と、メモリ５０４とは、バス５０５によって相互に接続されている。入力部５０１と出力部５０３とは入出力装置５０６に接続されている。
【０１５４】
以下、コンピュータ５００によって実行されるノックアウト動物を作製するための胚性幹細胞を選択する方法の処理の概略を説明する。
【０１５５】
ノックアウト動物を作製するための胚性幹細胞を選択する方法を実行させるプログラム（以下、選択プログラム）は、例えば、メモリ５０２に格納されている。あるいは、選択プログラムは、フレキシブルディスク、ＭＯ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭのような任意のタイプの記録媒体に記録され得る。あるいは、アプリケーションサーバに格納されていてもよい。そのような記録媒体に記録された選択プログラムは、出入力装置５０６（例えば、ディスクドライブ、ネットワーク（例えば、インターネット））を介してコンピュータ５００のメモリ５０４にロードされる。ＣＰＵ５０２が選択プログラムを実行することによって、コンピュータ５００は、本発明のノックアウト動物を作製するための胚性幹細胞を選択する方法の処理を実行する装置として機能する。
【０１５６】
入力部５０１を介して、アドレス情報、信号情報、所望の性質に関する情報、胚性幹細胞のＩＤ情報、必要に応じ配列情報などを入力する。
【０１５７】
ＣＰＵ５０２は、入力部５０１で入力された情報をもとに、アドレス情報と信号強度データとを相関付け、メモリ５０４に相関データを格納する。次いで、ＣＰＵ５０２は、アドレス情報と胚性幹細胞のＩＤとを相関付ける。その後、ＣＰＵ５０２は、これらの情報をメモリ５０４に格納し得る。ＣＰＵ５０２は、所望の性質に関する情報に基づき、適切な信号強度を選択する。選択された信号強度データを有するアドレス情報に基づいて、対応する胚性幹細胞のＩＤを算出する。この情報をメモリ５０４に格納することもできる。
【０１５８】
その後、出力部５０３は、ＣＰＵ５０２が選択した胚性幹細胞のＩＤデータなどを出力する。出力されたデータは、入出力装置５０６から出力され得る。
【０１５９】
マイクロアレイ上で選択される所望の性質を反映するスポットが前記集団のどのクローンまたは遺伝子に該当するかを判別する方法もまた、図６のシステムを用いて、上記と同様に実行することができる。
【０１６０】
本発明の方法、キット、プログラム、システムなどは、例えば、診断、法医学、新規遺伝子の同定、薬物探索（医薬品のスクリーニング）および開発、分子生物学的分析（例えば、アレイベースのヌクレオチド配列分析およびアレイベースの遺伝子配列分析）、タンパク質特性および機能の分析、薬理ゲノム学、プロテオミクス、環境調査ならびにさらなる生物学的、医学的、薬学的、農学的、物理学的および化学的な分析において使用され得る。
【０１６１】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１６２】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【０１６３】
【実施例】
以下に示す実施例では、特に断らない限り、ナカライテスク（株）（京都）、和光純薬工業（株）（大阪）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）からの試薬、機器を用いた。
【０１６４】
（実施例１：Ｐｌａｔ−Ｅウイルスパッケージング細胞株のトランスフェクションによるウイルスの調製）
１）Ｐｌａｔ−Ｅ細胞の培養
Ｐｌａｔ−Ｅ細胞（Ｍｏｒｉｔａ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　７，１０６３−１０６６を参照）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ改変必須培地（ＤＭＥＭ）に、１０μｇ／ｍｌのブラスチシジン（ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎｅ）、１μｇ／ｍｌのピューロマイシン、１×ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、１×ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）中で、加湿した、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養する。３日毎に、１／４〜１／１０量を継代培養する。
【０１６５】
２）Ｐｌａｔ−Ｅ細胞のトランスフェクション
１０ｃｍのプレートに３×１０６個のＰｌａｔ−Ｅ細胞を播種する。播種の２４時間後、ＦｕＧＥＮＥ６試薬（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、製造業者の指示に従って、以下のようにトランスフェクションに使用する。
【０１６６】
１００μｌのＤＭＥＭを１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに分取する。９μｌのＦｕＧＥＮＥ６試薬を直接培地に添加する。この混合液に対して、３μｇのＤＮＡ溶液（ｐＲＥＴトラップベクター（Ｙａｓｕｍａｓａ　ＩｓｈｉｄａおよびＰｈｉｌｉｐ　Ｌａｄｅｒ、Ｎｕｃ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９９９、Ｖｏｌ．２７、Ｎｏ．２４、ｅ３５）図１Ａ）を添加し、穏やかに混合し、室温で１５分間インキュベートする。この混合液を細胞培養培地に添加する。ウイルス産生細胞を、加湿した、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養する。
【０１６７】
トランスフェクションの４８時間後、１０ｍｌのシリンジを使用して、上清を回収（１０ｃｍのプレートあたり１０ｍｌ）し、０．４５μｍのメンブレン（ＨＴｕｆｆｒｙｎ、Ｐａｌｌ　Ｇｅｌｍａｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）を通して濾過し、ウイルス産生細胞および細胞の砕片を除去する。濾過したウイルス調製物を、直接感染に使用するか、または−８０℃で保存する。
【０１６８】
（実施例２：調製したウイルスを用いたＥＳ細胞の感染）
ＳＴＯ培地（７％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ改変必須培地（ＤＭＥＭ）（高グルコース、４．５ｇ／Ｌ）に、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加した培地）、およびＥＳ培地（１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ改変必須培地（ＤＭＥＭ）（高グルコース、４．５ｇ／Ｌ）に、１００μＭの非必須アミノ酸、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００μＭの２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加した培地）を使用する。
【０１６９】
１）０日目；マイトマイシンＣ処理−ＳＴＯプレート（Ｍ−ＳＴＯプレート）の調製
Ｍ−ＳＴＯフィーダー細胞（ＭｃＭａｈｏｎ，Ａ．Ｐ．ａｎｄ　Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．（１９９０）Ｃｅｌｌ　６２、１０７３−１０８５）を融解するまえに、１０ｃｍプレートの内部表面を、０．１％のゼラチンでコートする。Ｍ−ＳＴＯ細胞（有糸分裂を不活化したマウス胚性線維芽細胞株（Ｍ−ＳＴＯフィーダー細胞）のバイアルを速やかに融解し、そして１５ｍｌチューブに移す。このチューブに約１０ｍｌのＳＴＯ培地を添加し、そして細胞懸濁液を非常に穏やかに混合する。細胞を、５分間、８００ｒｐｍ、４℃で遠心分離することによって回収する。上清を除去した後、細胞を、ＳＴＯ培地に穏やかに懸濁し、そしてゼラチン処理したプレートに穏やかにプレーティングする。細胞を、５％ＣＯ２存在下で、３７℃でインキュベートする。
【０１７０】
２）１日目；ＥＳ細胞の溶解
プレーティングの翌日、ＥＳ細胞（ＲＦ８株、Ｍｅｌｎｅｒ，Ｖ．Ｌ．ｅｔ　ａｌ．（１９９６）ＰＮＡＳ　９３，１４０４１−１４０４６）を３７℃で速やかに溶解する。バイアル中の細胞懸濁液を、ＥＳ培地に直ちに添加する。８００ｒｐｍで５分遠心分離し、上清を取り除いた後、ＥＳ培地に再懸濁する。Ｍ−ＳＴＯ細胞のプレートからＳＴＯ培地を取り除き、そしてＥＳ培地を添加する。ＥＳ細胞懸濁液をそのプレートに添加する。
【０１７１】
３）２〜４日目；ＥＳ細胞の分割
ＥＳ細胞のプレートから培地を取り除き、そして付着さいた細胞をＰＢＳを用いて洗浄する。ＰＢＳを除去した後、１ｍｌの０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を添加して、プレートを３７℃で１０〜１５分間インキュベートする。ＥＳ培地を添加して、トリプシンを中和した後、遊離したＥＳ細胞を単一の細胞に分散させるために、ピッペッティングする。ＥＳ細胞懸濁液を、Ｍ−ＳＴＯプレートに添加する。細胞がコンフルエントに達する前に、細胞を分割する。この際、細胞をコンフルエントに達するまでに過剰に増殖させないこと、および分割した際に、密度を低くしすぎないことが重要である。
【０１７２】
４）５日目；感染
プレートを５ｍｌのＰＢＳで洗浄する。１ｍｌのの０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を添加して、プレートを、３７℃で１５分間ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートする。９ｍｌのＥＳ培地を添加して、細胞を単一細胞懸濁液にまでバラバラにするためにピペッティングする。ＥＳ細胞の細胞数を決定する。８００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心分離して、細胞を回収する。５〜１０μｇ／ｍｌのポリブレンを含む１５ｍｌのレトロウイルス上清中に、２×１０６個のＥＳ細胞を懸濁する。ＣＯ２インキュベーター中で、３５〜３７℃で２時間インキュベートする。８００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心分離して、細胞を回収する。上清を除去し、そして細胞を２０ｍｌのＥＳ細胞中に懸濁する。Ｍ−ＳＴＯフィーダー細胞を含む１０ｃｍのプレートに対して、５ｍｌの細胞懸濁液を添加する。
【０１７３】
５）６〜１３（または１６）日目；Ｇ４１８での選択
３２〜４８時間のインキュベーションの後、全プレートに対して、２５０μｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ；Ｇ４１８）を含むＥＳ細胞培地を添加する。良好なコロニーを単離することができるまで、７〜１０日間の薬剤選択の間に、毎日培地を交換する。
【０１７４】
（実施例３；ＥＳ細胞のコロニーの単離）
１）０日目
コロニーを単離する１〜２日前に、Ｍ−ＳＴＯフィーダー細胞の２４ウェルプレートを調製する。この場合、Ｍ−ＳＴＯフィーダー細胞をプレーティングする濃度は、４×１０４細胞／ウェルである。
【０１７５】
２）１日目
２０μｌの０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を各ウェルに添加して、９６ウェルぽｕレートを調製する。ＥＳ培地を、ＥＳコロニーを含むプレートから除去する。プレートをＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳを除去した後に、５ｍｌのＰＢＳを添加して、プレートの表面を覆う。洗浄したプレートからコロニーを単離し、そして９６ウェル中のトリプシン／ＥＤＴＡ溶液に移す。９６ウェルプレートを約１５分間、３７℃で、ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートする。１ウェルあたり１８０μｌのＥＳ培地を添加する。細胞をバラバラにするために、２０回ピペッティングする。各ＥＳ細胞のクローンを、Ｍ−ＳＴＯフィーダー細胞を含む、番号を付けた２４ウェルプレートに移す。毎日ＥＳ培地を交換する。
【０１７６】
（実施例４；２４ウェルプレート中でのＥＳ細胞の凍結）
培地をウェルから取り除き、ＰＢＳで洗浄する。各ウェルに対して、１００μｌの０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を添加する。３７℃で５〜１０分間インキュベートする。各ウェルに対して、７００μｌのＥＳ培地を添加する。Ｐ−１０００ピペット（Ｇｉｌｓｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ））を用いて、各ウェル中の培地を１５〜２０回混合し、単一細胞懸濁液を調製する。
【０１７７】
１）保存用凍結細胞の調製
５００μｌの各細胞懸濁液を、５００μｌの２×凍結培地（ＤＭＥＭ　６０％；ＦＣＳ　２０％；ＤＭＳＯ　２０％）を含む凍結用バイアル（ｃｙｔｏ−ｖｉａｌ；ＩＷＡＫＩ　Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ　Ｖｉａｌ，旭テクノグラス、東京）に移す。凍結用バイアルを、液体窒素中または−８０℃のフリーザー中に移す。
【０１７８】
２）ＦＡＣＳ分析用凍結細胞の調製
各ウェル中に残っているＥＳ細胞に対して、９００μｌの新鮮なＥＳ培地を添加して、穏やかに混合する。３００μｌの細胞懸濁液を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上清を取り除き、５００μｌＰＢＳ中に懸濁する。
【０１７９】
３）総ＲＮＡ調製用凍結細胞の調製
残りの細胞懸濁液（およそ８００〜９００μｌ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、そして３０００ｒｐｍで５分間遠心する。培地を取り除き、そして５００μｌのＳｅｐａｓｏｌ試薬（ナカライテスク株式会社、京都）を添加する。直ちにボルテックスにより混合して、−８０℃で保存する。
【０１８０】
（実施例５；ＲＮＡの抽出）
各ウェルのＥＳ細胞に対応する総ＲＮＡを、Ｓｅｐａｓｏｌ試薬（ナカライテスク株式会社、京都）を用いて、製造業者の指示に従って抽出する。
【０１８１】
（実施例６；ｃＤＮＡ合成）
１）逆転写
モロニーＭＬＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、以下のとおりにｃＤＮＡを合成する：
2004141074.tif 000003
の反応溶液を調製して、６５℃で、５分間インキュベートして、次に氷上に３分以上放置する。次に、
2004141074.tif 000004
の反応液を調製して、３７℃で５０分間、次に７２℃で１５分間インキュベートする。１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を８０μｌ添加し、そして−２０℃で保存する。
【０１８２】
（実施例７；３’ＲＡＣＥ）
各ウェルに対応する総ＲＮＡから調製したｃＤＮＡを用いて、その３’末端を３’ＲＡＣＥ法によって調製する（Ｏｈａｒａ，Ｏ．ｅｔ　ａｌ．（１９８９）ＰＮＡＳ　８６，５６７３−５６７７）。
【０１８３】
３’ＲＡＣＥ法に使用するポリメラーゼとして、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ２ポリメラーゼミックス（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、以下の反応を行う。
【０１８４】
１）１回目のＲＡＣＥ反応
2004141074.tif 000005
の反応溶液を調製して、以下のサイクル：
2004141074.tif 000006
を行い、反応液を４℃で保存する。
【０１８５】
２）２回目のＲＡＣＥ反応
2004141074.tif 000007
の反応溶液を調製して、以下のサイクル：
2004141074.tif 000008
を行い、反応液を４℃で保存する。
【０１８６】
（実施例８；マイクロアレイの調製）
実施例７において３’ＲＡＣＥ法で調製したＤＮＡフラグメントの塩基配列を直接配列決定法（Ｋｕｓｕｋａｗａ，Ｎ．ｅｔ　ａｌ．１９９０，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　９：６６−７２）によって決定した。直接配列決定には、ＮＥＯ３．５プライマーを用いた。この配列情報に基づいて各遺伝子に特異的なプライマー（上流向き、つまりアンチセンス）を合成する。そしてそれぞれの遺伝子断片を、ＮＥＯ３．５プライマーおよび新たに合成した遺伝子特異的なプライマーを用いて、ＰＣＲによって増幅しなおした。マイクロアレイへの固定は、この増幅しなおしたＤＮＡフラグメントを用いた。
【０１８７】
増幅しなおしたＤＮＡフラグメントの吸光度（ＯＤ２６０）を測定し、それぞれのフラグメントの長さを考慮した上で、各フラグメントの濃度を０．５−１．５ｐｍｏｌ／μｌに合わせた。その上で各ＤＮＡフラグメントを９６ウェルプレートに移した。
【０１８８】
マイクロアレイの作製には、マルチピンプロッター９６（ＡＢ−６６９０ＮＭ型、アトー株式会社、東京）およびバイオダインＢナイロン膜（Ｐａｌｌ　Ｇｅｌｍａｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）を用いた。１１．０×７．５ｃｍのメンブレンに８６４種類のＤＮＡフラグメントをプロットすることができる。
【０１８９】
ＤＮＡフラグメントをプロットした後のメンブレンには、（１）アルカリ変性、（２）中和および（３）架橋（クロスリンク）の操作を加えた。
【０１９０】
（１）アルカリ変性：０．５Ｍ　ＮａＯＨ，１．５Ｍ　ＮａＣｌという溶液で飽和した濾紙の上にメンブレンを２分間置いた。
【０１９１】
（２）中和：まず、０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．５，１．５Ｍ　ＮａＣｌという溶液で飽和した濾紙の上にメンブレンを５分間置き、続いて２×ＳＳＣで飽和した紙の上にメンブレンを１分間置いた。そしてメンブレンを乾いたペーパータオルの上に置き、約３０分間風乾した。
【０１９２】
（３）架橋：ＵＶクロスリンカー（フナコシ株式会社、東京）を用いて、７０ｎＪ／ｃｍ２の強さの紫外線による架橋を行った。
【０１９３】
（実施例９：マイクロアレイを用いる、ＥＳ細胞ｍＲＮＡ発現パターンの解析）
ＥＳ細胞におけるｍＲＮＡ発現パターンを解析するために、ＥＳ細胞ｍＲＮＡからプローブを調製して、マイクロアレイ上に固定化した核酸とハイブリダイズさせる。
【０１９４】
（マイクロアレイの調製）
メンブレンフィルターを使用して、以下のとおりマイクロアレイを調製する。
【０１９５】
マクロアレイを、以前に記載のように、市販のグリッディングロボット（ＢｉｏＧｒｉｄ；ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を使用して、Ｈｙｂｏｎｄ　Ｎ＋メンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ　Ｎ＋、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）上にＩＭＡＧＥｃＤＮＡクローン（Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ＝Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅとはコンソーシアムの名称。Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｅｎｅｒｇｙが後援しているＥＳＴプロジェクトにおいて見出されたｃＤＮＡをデータベース化する団体）由来のＰＣＲ産物の溶液を、スポットすることによって調製した（１０ｎｇ　ＤＮＡ／スポットの量）（Ｎｇｕｙｅｎ，ｃ．ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２９，２０７−２１５、およびＢｅｒｔｕｃｃｉ，Ｆ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８，３９０５−３９１２）。同じ支持体でのマイクロアレイを、Ａｃａｄｅｍｉａ　Ｓｉｎｉｃａの研究者によって開発された固体ピンマイクロスポッティングデバイスを使用して調製した（Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｊ．Ｗ．ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，５１−３１３−３２４）。これらの実験に使用したクローンのセットは、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｔａｇｃ．ｕｎｉｖ−ｍｒｓ．ｆｒ／ｐｕｂ／Ｃａｎｃｅｒ／に示されるセットである。
【０１９６】
上記で調製した５×４ｍｍ２のナイロンメンブレン上には、２００個のｃＤＮＡクローンがスポットされる。このように調製したメンブレンに、０．１μｇの総ＲＮＡから作製した３３Ｐ標識したプローブをハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション容量は、１００μｌである。ハイブリダイゼーション後、ホスホロスクリーン（高解像度スキャナ）で画像化する。検出限界（ｍＲＮＡ量）は、１／１０，０００であり、検出のための最小サンプル量、０．２×１０６分子である。
【０１９７】
（ＥＳ細胞ｍＲＮＡからのプローブの調製）
常法を用いて、ＥＳ細胞からｍＲＮＡを調製した後、プローブを調製する。この方法は以下のとおりである。
【０１９８】
１μｌのｄＴ２５（４．１μｇ／μｌ）、０．３μｌのｄＴ１２−１８（０．５μｇ／μｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびポリＡ　ＲＮＡ（２００ｎｇ）を、ＤＥＰＣ処理したＨ２Ｏ中に最終容量２．３μｌにまで溶解する。
【０１９９】
この溶液を、７０℃で１０分間インキュベートする。次いで、２．５μｌの５×第１鎖緩衝液（２５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３７５ｍＭ　ＫＣｌ、１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２）、１．２５μｌの０．１Ｍ　ＤＴＴ、１μｌの１０ｍＭ　ｄＡ／ｄＴ／ｄＧおよび０．１μｌの０．１ｍＭ　ｄＣを添加する。得られた混合溶液に、５μｌの［３３Ｐ］ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を添加し、４３℃で２分間インキュベートする。次いで、０．５μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、４３℃（または３７℃）で１時間インキュベートする。次いで、０．５μｌの０．５Ｍ　ＥＤＴＡ、０．５μｌの１％　ＳＤＳおよび１．５μｌの３Ｍ　ＮａＯＨを添加し、６８℃で３０分間インキュベートする。インキュベーション後、室温で１５分間放置する。次いで、５μｌの１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１．５μｌの２ＮＨＣｌ、２．５μｌの３Ｍ　ＮａＯＡｃおよび５０μｌの１００％　冷ＥｔＯＨを添加し、−２０℃で３０分以上放置する。次いで、４℃で１０分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を廃棄する。ペレットに、３００μｌの７０％　冷ＥｔＯＨを添加し、４℃で５分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離する。上清を廃棄し、ペレットを風乾する。次いで、２５．５μｌの滅菌したｍｉｌｉＱを加えて、ボルテックスする。この溶液の０．５μｌ（１／５０容量）を、液体シンチレーションカウンティングによって放射活性を測定する。次いで、１／２０００ｃｐｍの標識したｔｅｔ−１を添加する。次いで、５μｌのｃｏｔ−１（１０．０μｇ／μｌ）および０．２μｌのポリＡ（１０．０μｇ／μｌ）を添加し、１００℃で５分間インキュベートする。
【０２００】
（ＥＳ細胞ｍＲＮＡプローブとマイクロアレイ上の核酸とのハイブリダイゼーション）
以下のとおり、上述のように調製したマイクロアレイ上に固定化した核酸に対して、上述のように調製したプローブをハイブリダイズさせる。
【０２０１】
メンブレンを、５００μｌのＰｅｒｆｅｃｔ　Ｈｙｂ（東洋紡）中で、６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションに供する。次いで、２５０μｌの新しいＰｅｒｆｅｃｔ　Ｈｙｂ中で、６８℃で３０分間インキュベートする。上記で調製したプローブを添加し、６８℃で一晩インキュベートする。次いで、２×ＳＳＣ＋１％　ＳＤＳ中で１５分間、２回洗浄し、０．１×ＳＳＣ＋１％　ＳＤＳ中で３０分間、２回洗浄する。メンブレンを乾燥し、高解像度ＩＰに直接露光する。
【０２０２】
（実施例１０；マイクロアレイを用いた解析）
マイクロアレイでの、解析を以下のように行った。
【０２０３】
１）標識ｃＤＮＡの調製
試験対象の動物を、屠殺し、組織を、液体窒素中で凍結する。凍結した組織から、以下の方法を用いて、総ＲＮＡを抽出する。
【０２０４】
総ＲＮＡの抽出方法：グアニジン（ＧＴＣ）溶解／セシウム（ＣｓＣｌ）超遠心分離法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ　ａｌ．１９７９、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１８，５２９４）に従って、凍結された動物組織より総トータルＲＮＡを抽出した。
【０２０５】
調製したＲＮＡとスーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を製造業者のマニュアルに準じて使用して、以下のとおりにｃＤＮＡを合成した：
2004141074.tif 000009
の反応溶液を調製して、６５℃で、５分間インキュベートして、次に氷上に２〜３分以上放置した。次に、
2004141074.tif 000010
の反応液を調製して、上記液に加え、４２℃で１時間インキュベートした。次に以下のものを加えた。
【０２０６】
１．０μｌ　　１０％　ＳＤＳ
１．０μｌ　　０．５Ｍ　ＥＤＴＡ
３．０μｌ　　３Ｍ　ＮａＯＨ
これを、６８℃、３０分間インキュベートすることによって、ＲＮＡを分解した。次いでチューブを室温に戻した。
【０２０７】
次に、室温にて以下のものを加えて反応を中和した。
【０２０８】
１０μｌ　１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．５
３μｌ　２Ｎ　ＨＣｌ。
【０２０９】
ｃＤＮＡに取り込まれなかったフリーのヌクレオチド（放射性のものを含む）は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）　Ｇ５０（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｃｏｒｐ．　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）カラムにより取り除いた。
【０２１０】
２）マイクロアレイ上でのハイブリダイゼーション
マイクロアレイでのハイブリダイゼーションを以下のように行った。
【０２１１】
ハイブリダイゼーションをハイブリダイゼーションオーブン（ＵＶＰ　ＨＢ−１０００，ＵＶＰ，Ｉｎｃ．Ｕｐｌａｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を利用して行った。１１．０×７．５ｃｍのナイロン膜に対して、２．０ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液（７５０ｍＭ　ＮａＣｌ；５０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４；５ｍＭ　ＥＤＴＡ；０．１％Ｆｉｃｏｌｌ；０．１％ＰＶＰ；０．１％　ＢＳＡ；１２０μｇ／ｍｌ　サケ精子ＤＮＡ；１０％デキストランサルフェート；１．０％　ＳＤＳ）と上述プロトコルにより作製したｃＤＮＡプローブを用いて行った。
【０２１２】
ハイブリダイゼーションは、６８℃で２４時間行った。
【０２１３】
ナイロン膜（フィルター）の洗浄は、以下の手順を用いた。
【０２１４】
（１）２×ＳＳＣ、５５℃、３０分間
（２）０．１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、６５℃、３０分間。
【０２１５】
検出されたハイブリダイゼーションシグナルを、標識したｃＤＮＡの供給源間で比較し、特異的発現パターンを示すｃＤＮＡを同定した。
【０２１６】
（コンピュータによる解析）
オートラジオグラフィーは、ＢＡＳ５０００（富士フィルム、東京）を利用して行い、ドットパターンの解析は、解析ソフトウェア「ＡｒｒａｙＧａｕｇｅ　Ｖｅｒ．１．２」（富士フィルム、東京）を用いて行った。
【０２１７】
（実施例１１；ノックアウト動物の作製）
実施例１０で、脳由来のｃＤＮＡスクリーンで発現し、肝臓由来のｃＤＮＡスクリーンで有意な発現が認められなかったスポットを特異的発現パターンを示すとして選択した。その模式図を図３に示す。特異的発現パターンを示すことが同定されたこのスポットに対応するＥＳ細胞を選択し、常法に従って、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｔｅ）にマイクロインジェクションした。そのように処理した胚盤胞を、偽妊娠させたマウスの子宮内に戻した。その結果、キメラ率が非常に高いマウス（微量注入したＥＳ細胞クローン由来の細胞を非常に高い割合（９０％以上）で有する）が６匹（雄性４匹、雌性２匹）生まれた。そのうちの雄性２匹を用いて、正常マウスとの交配を行った。
【０２１８】
染色体中に挿入されたジーントラップベクターを有するＦ１マウスを選択し、交配させ、ホモ接合型でジーントラップベクターを有するＦ２マウスを調製する。
【０２１９】
（実施例１２；ノックアウト動物を用いた遺伝子解析）
キメラ率が９０％以上の雄２匹と正常Ｃ５７／ＢＬ６雌マウスを交配したところ、遺伝子（ＧＡＢＡ　Ｃレセプターｒｈｏ３サブユニット遺伝子）がＲＥＴベクターによってトラップ（破壊）された対立遺伝子（アレル）をヘテロに持つマウスが多数生まれた。外部から観察する限り、これらのヘテロマウスには神経学的な異常所見は認められなかった。そこで、これらのヘテロマウス同士を交配することにより、ＧＡＢＡ　Ｃレセプターｒｈｏサブユニット遺伝子がＲＥＴベクターによって破壊された対立遺伝子をホモに持つノックアウト動物を作製した。
【０２２０】
（実施例１３：既知配列を利用したノックアウト動物の作製）
実施例８において配列決定された配列情報を元に、３’ＲＡＣＥ法でＤＮＡフラグメントを合成する代わりに、そのような配列情報を用いてマイクロアレイを作製した。そのような場合、既知の配列情報に基づいてＤＮＡフラグメントを合成する。合成は、核酸自動化合成機を使用する。あるいは、マイクロアレイ上で直接オリゴヌクレオチドを合成することも可能である。
【０２２１】
２）マイクロアレイ上でのハイブリダイゼーション
マイクロアレイでのハイブリダイゼーションを以下のように行った。
【０２２２】
ハイブリダイゼーションをハイブリダイゼーションオーブン（ＵＶＰ　ＨＢ−１０００，ＵＶＰ，Ｉｎｃ．Ｕｐｌａｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を利用して行った。１１．０×７．５ｃｍのナイロン膜に対して、２．０ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液（７５０ｍＭ　ＮａＣｌ；５０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４；５ｍＭ　ＥＤＴＡ；０．１％Ｆｉｃｏｌｌ；０．１％ＰＶＰ；０．１％　ＢＳＡ；１２０μｇ／ｍｌ　サケ精子ＤＮＡ；１０％デキストランサルフェート；１．０％　ＳＤＳ）と上述プロトコルにより作製したｃＤＮＡプローブを用いて行った。
【０２２３】
ハイブリダイゼーションは、６８℃で２４時間行った。
【０２２４】
ナイロン膜（フィルター）の洗浄は、以下の手順を用いた。
【０２２５】
（１）２×ＳＳＣ、５５℃、３０分間
（２）０．１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、６５℃、３０分間。
【０２２６】
検出されたハイブリダイゼーションシグナルを、標識したｃＤＮＡの供給源間で比較し、特異的発現パターンを示すｃＤＮＡを同定した。
【０２２７】
（コンピュータによる解析）
オートラジオグラフィーは、ＢＡＳ５０００（富士フィルム、東京）を利用して行い、ドットパターンの解析は、解析ソフトウェア「ＡｒｒａｙＧａｕｇｅ　Ｖｅｒ．１．２」（富士フィルム、東京）を用いて行った。
【０２２８】
検出されたハイブリダイゼーションシグナルを、標識したｃＤＮＡの供給源間で比較し、特異的発現パターンを示すｃＤＮＡを同定した。
【０２２９】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【０２３０】
【発明の効果】
本発明により、従来に比してはるかに簡便に所望の性質をもつノックアウトマウスを作製することができるようになった。また、従来の方法では同定不可能であった所望の性質をもつ新規遺伝子を同定することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明で用いたレトロウイルスベクター（ｐＲＥＴジーントラップベクター）の構造を示す。
図１Ａは、パッケージング細胞株中でのｐＲＥＴベクターの構造を示す。ｐＲＥＴベクターの５’ＬＴＲは、野生型配列を有するが、３’ＬＴＲは、Ｕ３部分の転写エンハンサーエレメントを有さない（このベクターは、「自己不活化」レトロウイルスベクターである）。その代わりに、３’ＬＴＲのＵ３部分は、ｌｏｘＰシグナルを有する。
図１Ｂは、感染細胞中でのｐＲＥＴの構造を示す。３’ＬＴＲのヌクレオチド配列は、逆転写および染色体への挿入の過程で、５’ＬＴＲに正確にコピーされる。従って、感染細胞内での５’ＬＴＲもまた、エンハンサーを欠き、そして３’ＬＴＲ内のｌｏｘＰシグナルと同一の配向のｌｏｘＰシグナルを有する。ｐＲＥＴウイルスは、ウイルス転写と逆方向において、以下の３つのエレメントを保有する：（ｉ）強力なスプライスアクセプター（ＳＡ）からなる遺伝子ターミネーターカセット、複数の終止コドン、ＩＲＥＳ配列、ＧＦＰのｃＤＮＡ、および効率的なポリＡシグナル；（ｉｉ）ウイルスの力価決定および陰性選択のための、完全かつ構成性のＨＳＶ　ｔｋカセット；ならびに（ｉｉｉ）スプライスドナー（ＳＤ）およびｍＲＮＡ不安定化シグナルを含むが、ポリＡシグナルを欠く増強したポリＡトラップのための独特のＮＥＯカセット。
図１Ｃは、Ｃｒｅ媒介性切り出し後に染色体に残るエレメントの構造を示す。斜線を引いた長方形は、ジーントラップベクターによって破壊された遺伝子のエクソンを示す。
Ｅｎ（−）：エンハンサー欠失；Ｐ１：ＭＣ１プロモーター；Ｐ２：ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター（短縮形態）；Ｘ−ＧＦＰ　ｍＲＮＡ：ジーントラップベクターによって破壊された遺伝子Ｘの５’半分と、ＧＦＰ　ｃＤＮＡとの融合転写物。
【図２】図２は、本発明で用いたＤＮＡマイクロアレイのチップの概略図を示す。
【図３】図３は、本発明で用いたＤＮＡマイクロアレイでの解析の例示を示す。
【図４】図４は、本発明のジーントラップ法で得られたｃＤＮＡを用いたマイクロアレイでの解析のフローの例示を示す図である。
【図５】図５は、本発明で利用されるノックアウト動物の作製方法の例示を示す。
【図６】図６は、本発明の解析において使用されるコンピュータシステムの一例を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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