(57)【要約】【課題】ＤＮＡの一塩基多型（ＳＮＰｓ）を含め、各種の生理機能診断に利用される酵素、抗原、ＤＮＡ断片、抗体等を用いてＤＮＡチップに担当する各種診断検査に用いることの出来る高感度アフィニティー反応検出チップを提供する。【解決手段】他の物質と結合した状況を作り得る反応性物質が、その反応性を立体障害により妨害されない程度に充分な反応の場を与えられて担持体に結合させられることにより、被検出物の物質認識機能性を高めることを特徴とする高感度アフィニティー反応検出チップ。特定の分子構造物との特異反応性を持つ物質分子と反応性を持たない分子を、一定の比率で担持体に結合させることにより、特異反応性を持つ物質分子の物質認識機能性を高めた高感度アフィニティー反応検出チップ。及びその作製方法並びにその装置。【選択図】　　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
他の物質と結合した状況を作り得る反応性物質が、その反応性を立体障害により妨害されない程度に充分な反応の場を与えられて担持体に結合させられることにより、被検出物の物質認識機能性を高めることを特徴とする高感度アフィニティー反応検出チップ。
【請求項２】
特定の分子構造物との特異反応性を持つ物質分子と特異反応性を持たない分子を、一定の比率で担持体に結合させることにより、特異反応性を持つ物質分子の物質認識機能性を高めることを特徴とする高感度アフィニティー反応検出チップ。
【請求項３】
前記担持体がアミノ基、エポキシ基等の反応性基を付与した石英ガラス、ホウ珪酸ガラス、ソーダライムガラスなどのガラス類、シリコーンウエハーなどの無機基板、ポリエステルフイルム、ポリエチレンフイルムなどの有機基板であることを特徴とする請求項１又は請求項２記載の高感度アフィニティー反応検出チップ。
【請求項４】
前記担持体がアミノ基、エポキシ基等の反応性基を付与した多孔質ガラス、シリカゲル、イオン交換樹脂などの無機もしくは有機多孔質担体であることを特徴とする請求項２記載の高感度アフィニティー反応検出チップ。
【請求項５】
特異反応性を持つ物質分子がオリゴヌクレヲチド、相補型ＤＮＡ、酵素、抗原、抗体、エピトープ又はタンパク質であることを特徴とする請求項２〜４のいずれか１項記載の高感度アフィニティー反応検出チップ。
【請求項６】
１つもしくは１つ以上の異なった区分を持ち、それぞれに異なった特定の分子構造物との特異反応性を持つ物質分子と反応性を持たない分子を、一定の比率で担持させたことを特徴とする請求項３または請求項４記載の高感度アフィニティー反応検出チップ。
【請求項７】
特定の分子構造物との特異反応性を持つ物質分子を結合させることの出来る反応性基を持つカップリング剤と、同反応性のない物質、もしくは目的の反応に寄与しない反応基を持つカップリング剤を、一定比率で担持体に反応させることにより、最終的に特定の分子構造物との特異反応性を持つ物質分子と反応性を持たない分子を、一定の比率で担持体に結合させることを特徴とする高感度アフィニティー反応検出チップの作製方法。
【請求項８】
特定の分子構造物との特異反応性を持つ物質分子と反応性を持たない分子を一定の比率で担持体に結合させることにより、特異反応性を持つ物質分子の物質認識機能性を高めることを特徴とする高感度アフィニティー反応検出チップを用い、蛍光ラベル法もしくは放射化検出により高感度に特定物質を検出することを特徴とする、高感度アフィニティー反応検出システム。
【請求項９】
特異反応性を持つ物質分子の物質認識機能性を高められた高感度アフィニティー反応検出チップと、蛍光ラベル法もしくは放射化検出用の測定機器を有することを特徴とする、高感度アフィニティー反応検出システム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子診断及び生理機能診断等に使用される、特定機能物質分子の認識を可能にするアフィニティー反応検出チップ及びその作製方法、並びに高感度アフィニティー反応検出システムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子の変異、特に一塩基（配列）の変異による多型の検出は、突然変異等に起因する疾患、例えば、ガンの診断等に有効なだけでなく、薬剤応答性や副作用の指針に必要であり、多因子疾患の病因関連遺伝子の解析や測医療にも貢献する。この検出にいわゆるＤＮＡチップの使用が有効であることが知られている。従来利用されてきた、短いＤＮＡ鎖を固定化したＤＮＡチップ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のいわゆるＧｅｎｅ　Ｃｈｉｐは、図３に示すように、通常約１ｃｍ角のシリコンもしくはガラス基板１上にフォトリソグラフィー技術を用いて１万以上のオリゴＤＮＡ断片（ＤＮＡプローブ）２を作り込んだものである。
【０００３】
このＤＮＡチップ３上に、たとえば蛍光標識した、調べたいＤＮＡ試料４を流すと、上記ＤＮＡチップ３上のプローブ２と相補的な配列を有するＤＮＡ断片４はプローブ２と結合し、その部分だけが蛍光により識別でき、ＤＮＡ試料中のＤＮＡ断片４の特定配列を認識、定量することができる。この方法により、既に、ガン遺伝子の突然変異の検出や、遺伝子多型の検出が可能であることが示されている。
【０００４】
また、相補型ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をスライドガラス上に配列したマイクロアレーも用いられるが、分子が固定化されていないこともあり、自由に利用するにはほど遠かった。
また、各種の生理機能診断に利用される酵素、抗原、ＤＮＡ断片、抗体、エピトープまたはタンパク質は、積極的に反応検出チップとして構成されてはいなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
反応性物質をその表面に結合担持させた反応検出チップ、いわゆる「ＤＮＡチップ」３の作製は、集積した半導体産業で使用されているフォトリソグラフィーを用いるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のいわゆるＧｅｎｅ　Ｃｈｉｐの合成法や、アジレントテクノロジー社のインクジェット法などのようなその場合成法と、あらかじめ合成してあったオリゴヌクレオチドやｍＲＮＡから転写されたｃＤＮＡを張り付けるマイクロアレー法が知られている。
【０００６】
これに対し、本発明者は、あらかじめ反応性物質を多孔質担体に作り込んだものを基材に配列する方法などを提案している。
これらの方法により一定の成果が得られている。
【０００７】
しかしながら、従来のＤＮＡチップを実際の臨床応用に使用しようとすると、感度が十分に高くないという欠点があり、例えば癌患者の遺伝子を検出しようとすると、一回の測定に１０ｇ程度の筋肉組織を必要としており、生体検査で通常採取しても差しつかえがないとして、実際に採取している組織量（１ｇ以下）から見ても、感度の面に於いて充分なレベルに到達していないという問題があった。
【０００８】
本発明は、ＤＮＡの一塩基多型（ＳＮＰｓ）を含め、各種の生理機能診断に利用される酵素、抗原、ＤＮＡ断片、抗体、エピトープ又はタンパク質を用いてＤＮＡチップに担当する各種診断検査に用いることの出来る高感度アフィニティー反応検出チップの提供を目的とする。さらには、その反応検出チップの作製方法及び高感度アフィニティー反応検出装置あるいはシステムの提供を目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者は、高感度のアフィニティー反応検出チップを得るように種々検討したところ、通常は高感度とするためには、その作用する基を高密度にする手段が取られるので、高密度にするべく努力するうちに、むしろ低密度のものの中に感度の高いものがある場合があることが分かった。
その原因を研究したところ、高密度でありながら感度が低くなるのは、プローブ分子（オリコヌクレオチド）が過密にガラス基板上に作り込まれているため、立体障害により認識対象分子がプローブ分子と効率的に結合できず、そのために分子認識効果が低いという欠点を生じているのではないかという問題があることが分かってきた。
【００１０】
本発明は、上記の課題を解決するために、特定の分子構造物との特異反応性を持つ物質分子と特異反応性を持たない物質分子を、一定の比率で担持体に結合させることにより、特異反応性を持つ物質分子の物質認織機能性を高めることができることを見出し、かかる知見に基づいて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明者が鋭意研究した結果、後で詳しく説明するように、感度が低い原因の一つが、ハイブリダイズが立体的な反応であり、立体障害を考えると充分な反応場が与えられていないことに起因することを見いだした。従って、プローブ分子密度を高密度にするのではなく、むしろ一つ一つのプローブ分子の周囲に充分な反応場を積極的に与え、すなわちプローブ分子密度を一定レベルまで低く押さえながら、かつ最適な密度に保つこと、それと共に周囲に立体認織を妨害しない構造を積極的に構成することにより、高感度なアフィニティー反応検出チップを作製することに成功した。
【００１１】
本発明は、下記の手段により前記の課題を解決することができた。
（１）他の物質と結合した状況を作り得る反応性物質が、その反応性を立体障害により妨害されない程度に充分な反応の場を与えられて担持体に結合させられることにより、被検出物の物質認識機能性を高めることを特徴とする高感度アフィニティー反応検出チップ。
（２）特定の分子構造物との特異反応性を持つ物質分子と特異反応性を持たない物質分子を、一定の比率で担持体に結合させることにより、特異反応性を持つ物質分子の物質認識機能性を高めることを特徴とする高感度アフィニティー反応検出チップ。
（３）前記担持体がアミノ基、エポキシ基等の反応性基を付与した石英ガラス、ホウ珪酸ガラス、ソーダライムガラスなどのガラス類、シリコーンウエハーなどの無機基板、ポリエステルフイルム、ポリエチレンフイルムなどの有機基板であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の高感度アフィニティー反応検出チップ。
【００１２】
（４）前記担持体がアミノ基、エポキシ基等の反応性基を付与した多孔質ガラス、シリカゲル、イオン交換樹脂などの無機もしくは有機多孔質担体であることを特徴とする前記（２）記載の高感度アフィニティー反応検出チップ。
（５）特異反応性を持つ物質分子がオリゴヌクレヲチド、相補型ＤＮＡ、酵素、抗原、抗体、エピトープ又はタンパク質であることを特徴とする前記請求項２〜４のいずれか１項記載の高感度アフィニティー反応検出チップ。
（６）１つもしくは１つ以上の異なった区分を持ち、それぞれに異なった特定の分子構造物との特異反応性を持つ物質分子と反応性を持たない分子を、一定の比率で担持させたことを特徴とする前記（３）又は（４）記載の高感度アフィニティー反応検出チップ。
【００１３】
（７）特定の分子構造物との特異反応性を持つ物質分子を結合させることの出来る反応性基を持つカップリング剤と、同反応性のない物質、もしくは目的の反応に寄与しない反応基を持つカップリング剤を、一定比率で担持体に反応させることにより、最終的に特定の分子構造物との特異反応性を持つ物質分子と反応性を持たない分子を、一定の比率で担持体に結合させることを特徴とする高感度アフィニティー反応検出チップの作製方法。
【００１４】
（８）特定の分子構造物との特異反応性を持つ物質分子と反応性を持たない分子を一定の比率で担持体に結合させることにより、特異反応性を持つ物質分子の物質認識機能性を高めることを特徴とする高感度アフィニティー反応検出チップを用い、蛍光ラベル法もしくは放射化検出により高感度に特定物質を検出することを特徴とする、高感度アフィニティー反応検出システム。
（９）特異反応性を持つ物質分子の物質認識機能性を高められた高感度アフィニティー反応検出チップと、蛍光ラベル法もしくは放射化検出用の測定機器を有することを特徴とする、高感度アフィニティー反応検出システム。
【００１５】
本発明は、特定の分子構造物と特異反応牲を持つ物質分子によるいわゆるアフィニティー法による分子認識反応を利用する、物質検出における感度向上技術に関する発明であり、この技術はこれまでに発表されている分子認識技術一般に使用しうるが、特にＤＮＡ、タンパク質等の高分子量物質の特定認識反応においてその効果は大きい。
【００１６】
アフィニティー法による分子認識反応は、例えばＤＮＡプローブを用いたハイブリダイズ検出においては、液中などで反応させる場合は自由な反応場が与えられるが、いわゆるＤＮＡチップの場合、一端が固定されたＤＮＡプローブとの反応は必ずしも充分に反応しない。そのため、充分な反応プローブが存在していても、実際にハイブリダイズしうるプローブ分子の数は制約されるために、充分な感度が得られない。これらの制約は、各種ＤＮＡチップに共通の問題であり、特にフォトリソグラフ法、インクジェット法に顕著に現れることは充分予測される。（図３参照）
この感度の問題を解決するために、プローブ分子密度を高密度にすることによって反応性を向上させることが提案されている（特開２００２−１９５９９６、ダイヤモンドチップなど）。
【００１７】
しかしながら、本発明者が鋭意研究した結果、感度が低い原因の一つが、ハイブリダイズが立体的な反応であり、立体障害を考えると充分な反応場が与えられていないことに起因することを見いだした。従って、プローブ分子密度を高密度にするのではなく、むしろ一つ一つのプローブ分子の周囲に充分な反応場を積極的に与え、すなわちプローブ分子密度を一定レベルまで低く押さえながら、かつ最適な密度に保つこと、それと共に周囲に立体認織を妨害しない構造を積極的に構成することにより、高感度なアフィニティー反応検出チップを作製することに成功した。
【００１８】
【発明の実施の形態】
より具体的には、図１に示すように、特定の分子構造物との特異反応性を持つ物質分子を結合させることの出来る反応性基を持つカップリング剤５と、反応牲のない物質６、もしくは目的の反応に寄与しない反応基を持つカップリング剤を、一定比率で担持体１に反応させることにより、最終的に特定の分子構造物との特異反応性を持つ物質分子（反応性プローブ分子）２と反応性を持たない分子（スペーサ分子）６を一定の比率で担持体１に結合させることにより、最終的にプローブ分子の密度を制御することが、本発明の基本となる。
【００１９】
通常、プロ一ブ分子２を担持体１表面に結合もしくは担持体１表面から成長させる場合、まずカップリング剤５により担持体１表面に反応性を付与する。この際、例えばガラス１の表面にはシラノール基が有り、その上にカップリング剤５が結合する。カップリング剤５密度は、立体障害によりシラノール基密度として推定される８マイクロモル／ｍ２よりは少なく、通常４〜５マイクロモル／ｍ２程度である。これを基礎としてプローブ分子２が合成されるが、合成中の反応率の問題により最終的には０．５〜１マイクロモル／ｍ２程度になっている。
【００２０】
結果としてはプローブ分子２の密度はそれなりに低いことにはなるが、これはあくまでも、最終プローブ密度が低いだけで、プローブ分子２の反応場を充分保障した物にはなっていない。
【００２１】
そこで、本発明では、アルコールや反応に寄与しないカップリング剤、あるいはその他のプローブ分子２の担持に影響を与えないスペーサーになりうる分子６を導入することにより、充分な反応場を与えることを意図しており、反応基密度としては０．００１マイクロモル／ｍ２〜２．０マイクロモル／ｍ２、より好ましくは０．００５マイクロモル／ｍ２〜１．０マイクロモル／ｍ２、特に好ましくは０．１マイクロモル／ｍ２〜１．０マイクロモル／ｍ２であることを特徴とした高感度アフィニティー反応チップである。なお、０．００１マイクロモル／ｍ２以下の場合、プローブ分子２の密度が低くなりすぎて感度が落ちた。（図１および図２参照）。
なお、図４は図１のプローブ分子の結合を模式的に示す図である。
【００２２】
すなわち、本発明の方法では、反応性物質をその表面に結合担持させた反応検出チップ、いわゆる「ＤＮＡチップ」の作製は、集積した半導体産業で使用されているフォトリソグラフィーを用いるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ杜のいわゆるＧｅｎｅ　Ｃｈｉｐの合成法や、アジレントテクノロジー杜のインクジェット法などのようなその場合成法と、あらかじめ合成してあったオリゴヌクレオチドやｍＲＮＡから転写された相補型ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を張り付けるマイクロアレー法への適応も可能であり、本発明者らの提案になる、あらかじめ反応性物質を多孔質担体に作り込んだものを基材に配列する方法に特に適している。
【００２３】
本発明における「反応性物質」における「反応性」とは、化学反応によりイオン結合や共有結合による化学構造等が変化する場合のみではなく、ファンデルワールス力、水素結合、配位結合、化学吸着、物理吸着等のその他の様式により、他の物質と結合した状況を作り得る性質を意味する。そのような反応性物質としては、任意の構成を持つタンパク質もしくは任意の塩基配列を持ったオリゴヌクレオチドなどを担持する材料であるが、当然のことながらこれらに限定されるものではない。本発明の反応検出チップにおいて、微小区分、即ち反応性物質の区分の集積度には特に制限はない。反応検出チップの用途に応じて必要とされ、かつ便利な集積度は異なるので、用途に応じて適宜、集積度は変化させることができる。
【００２４】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００２５】
（実施例１）
γ−アミノプロピルシランとｎ−ブチルアルコールを、モル比１：９に混合した反応剤を１ｗｔ．％混合した脱水トルエンを用い、細孔径５０ｎｍ、直径５μｍの多孔質ガラス粉末をγ−アミノプロピルシリル化した。γ−アミノプロピルシラン１００％で反応した場合、アミノシラン処理すると平均５マイクロｍｏｌ／ｍ２になるが、ほぼこれは単層で細密に結合した構造である。これに対し、本発明の場合約１マイクロｍｏｌ／ｍ２となった。理論モル比と比べシラン密度は高くなったが、これはγ−アミノプロピルシランとｎ−ブチルアルコールの、多孔質ガラス表面との反応速度に起因するものと思われる。
【００２６】
この基材を用い、定法により各種のオリゴヌクレオチドを合成した。このオリゴヌクレオチド担持多孔質ガラス粉体にアクリル系ポリマーを添加したスラリーを、図５に示す反応性物質担持用ピン７先に保持し、酸化膜被覆シリコン製チップ１２（約１ｃｍ×１ｃｍ）の表面に、０．５ｍｍピッチで配列し本発明の反応チップを得た。
このチップの感度は、従来の方法でγ−アミノプロピルシリル化した基材を用いた物と比べ約１０倍の感度を示した。
【００２７】
（実施例２）
ｐ−アミノフェニルトリメトキシシランとグリシドキシトリエトキシシランを、モル比１：２０に混合した反応剤を１ｗｔ．％混合した脱水トルエンを用い、直径１ミクロン、細孔径１０ｎｍの液体クロマトグラフィー充填剤用のシリカゲルをアミノシリル化した。アミン化率は０．２マイクロｍｏｌ／ｍ２であった。これをアミノ基をべースとして、定法により各種のオリゴヌクレオチドを合成した。この時、グリシドキシトリエトキシランのエポキシ基は結合反応には寄与していない。
【００２８】
このオリゴヌクレオチド固定シリカゲルにポリビニルアルコール水溶液を添加したスラリーを、図６に示す反応性物質担持用ピン７の先に保持し、リボン状シリカゲルコーティングポリエステルフィルム１６（約０．５ｃｍ×２０ｃｍ）の表面に、０．５ｍｍピッチで配列し本発明の反応チップを得た。このチップの感度は、従来の基材を用いた物と比べ約２０倍の感度を示した。
【００２９】
（実施例３）
グリシドキシトリエトキシシランとｎ−ヘキシルアルコールを、モル比１：１５に混合した反応剤を１ｗｔ．％混合した脱水トルエンを用い、表面エポキシ化した石英ガラス製スライドガラス上に、マスク法を用いてｎ−ヘキシルジオールをリンカーとして各種のオリゴヌクレオチドを合成した。石英ガラス製スライドガラス上のエポキシ化率の定量は困難であったが、検出感度は５倍以上になった。
【００３０】
（実施例４）
ｎ（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシランとグリシドキシトリエトキシシランを、モル比１：２０に混合した反応剤を１ｗｔ．％混合した脱水トルエンを用い、表面をアミノ化した表面酸化シリコンウェハー上に、グルタルアルデヒドを用い各種構成を持つ抗体プローブを固定した。このチップにより各種タンパク質を検出した。
【００３１】
なお、本実施例は本発明の本質である、プローブ分子密度をコントロールした例を示した物であり、分子認識のためのチップ形状はこれらの実施例には制約されないことは明らかである。
【００３２】
【発明の効果】
本発明によれば、従来のＤＮＡチップでは難しかった高感度検出が可能となることから、より少ないサンプル量で迅速に分子認識が可能になる。従って、臨床検査のような、より広く具体的な領域でのアフィニティー反応検出が可能になり、定量性、低コスト、かつ安定性の高い反応性検出チップを提供することができる。従って、必要に対応したＤＮＡなどの反応性検出チップの作製が可能となり、オーダーメイドの医療や環境領域などの広い領域での物質認識による分析に貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の高感度アフィニティー反応検出チップの製造工程の概略説明図である。
【図２】本発明の高感度アフィニティー反応検出チップの効果を説明する図である。
【図３】従来のアフィニティー反応検出チップの構成と欠点の概略説明図である。
【図４】本発明の検出チップ用のプローブ分子の結合法の一例の概略説明図である。
【図５】実施例１における担体粒子固定用ピンを用いる反応検出チップの作製過程を表す説明図を示す。
【図６】実施例２における担体粒子固定用ピンを用いる反応検出チップの作製過程を表す説明図を示す。
【符号の説明】
１　担持体
２　プローブ分子
３　ＤＮＡチップ
４　認識対象分子
５　シランカップリング剤
６　スペーサー分子
７　担体粒子固定用ピン
８　アミノ化多孔質ガラス粒子
９　オリゴヌクレオチド担持多孔質ガラス粒子
１０　アミノシリル化シリカゲル粒子
１１　オリゴヌクレオチド担持シリカゲル粒子
１２　酸化膜被覆シリコン製チップ
１３　シリカゲルコーティングポリエチレンフィルム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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