(57)【要約】【課題】取り扱い性がよく、口腔内の欠損部に移植した場合に、移植部位の安静状態を長期間維持することが可能であり、また、外部からの刺激による痛みを緩和することを提供する。【解決手段】口腔用移植片１０は、線維芽細胞及び／又は担体を含む真皮層１２と、シート材からなる支持体１６と、上皮細胞を含む上皮層２０とを積層している。このとき、支持体１６には、真皮層１２から全周にわたって突出した延長部１４が設けられている。口腔用移植片１０を口腔内の欠損部に移植する際は、延長部１４の貫通孔に縫合糸を通して、欠損部周囲の正常部位に固定する。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維芽細胞及び／又は担体を含む真皮層と、該真皮層の周縁部よりも外方へ延長した延長部を有する支持体と、上皮細胞を含む上皮層と、を積層したことを特徴とする口腔用移植片。
【請求項２】
前記上皮層は、前記真皮層と前記支持体との接触面と少なくとも同等の面積を有することを特徴する請求項１に記載の口腔用移植片。
【請求項３】
前記延長部は、少なくとも１つの貫通孔を有することを特徴とする請求項１に記載の口腔用移植片。
【請求項４】
前記貫通孔は、縫合糸が通過可能な大きさを有していることを特徴とする請求項３に記載の口腔用移植片。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、口腔用移植片に関し、特に、口腔内に形成された口腔粘膜欠損部への移植に適した口腔用移植片に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、培養技術の発展にともなって、培養皮膚、培養軟骨などの移植物が開発され、臨床にも利用されている。殊に、培養皮膚の歴史は古く、１９７０年代後半にGreen 及び Rheinwaldによって表皮細胞（Keratinocyte）を培養してシート化する技術が確立された。そのような培養シートは、O'Connorらによって火傷患者に、Leighらによって潰瘍患者に対して適用された。また、Bellらによって水和コラーゲン格子に線維芽細胞を保持及び培養した培養真皮と、この培養真皮上で表皮細胞を培養した複合型の培養皮膚が案出された（特許文献１及び非特許文献１参照）。その後、特許文献２などの種々の培養皮膚が案出されている。
【０００３】
しかしながら、これらの培養皮膚は、患者外部に露出している皮膚を治療対象としたものであって、口腔内の欠損部に対してまで配慮されたものではない。外部皮膚を対象とした治療では、培養皮膚を適用した後、ドレッシング材などにより被覆することで施術部位を比較的安静にすることができるが、口腔欠損部の治療においては、食事の際の食べ物や舌などが治療部位に接触するなど、治療後においても長時間安静な状態で維持することが困難である。特許文献３には、口腔内の組織由来の培養上皮シートが開示されているが、上皮細胞のみで構成されているので脆弱であり、取り扱いが困難であるとともに、深部に至る欠損には適していない。
【０００４】
【特許文献１】
特公平２−２３１９１号公報
【特許文献２】
特許第２６５５２６９号公報
【特許文献３】
特許第３０４３７２７号公報
【非特許文献１】
Bell E. Ehrlich H P. Buttle D J. Nakatsuji T., "Science", (United States of America), 1981, 211, 4486, p.1052-1054
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、取り扱い性がよく、口腔欠損部に移植した場合に、移植部位の安静状態を長期間維持することが可能な口腔用移植片を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、線維芽細胞及び／又は担体を含む真皮層と、該真皮層の周縁部よりも外方へ延長した延長部を有する支持体と、上皮細胞を含む上皮層と、を積層したことを特徴とする口腔用移植片を提供するものである。
本発明の前記上皮層は、前記真皮層と前記支持体との接触面と少なくとも同等の面積を有することを特徴としている。
本発明の前記延長部は、少なくとも１つの貫通孔を有することを特徴としている。
本発明の前記貫通孔は、縫合糸が通過可能な大きさを有していることを特徴としている。
【０００７】
【発明の実施の形態】
図１には、本発明の実施の形態に係る口腔用移植片１０の断面が示されている。この口腔用移植片１０は、移植物として口腔欠損部へ移植されるものである。
口腔用移植片１０は、線維芽細胞を含む真皮層１２と、延長部１４を有する支持体１６と、上皮細胞を含む上皮層２０とをこの順で備えている。これらの真皮層１２、支持体１６及び上皮層２０は、それぞれがほぼ相似形であることが好ましく、同心状に積層されている。これにより、真皮層１２から突出した支持体１６の周縁部に一様な幅（長さ）の延長部１４を設けることができる。
【０００８】
真皮層１２は、線維芽細胞とこれを保持する担体（Scaffold）とから構成されている。
真皮層１２は、口腔欠損部の形状に応じた大きさ及び形状をとり、欠損部内をほぼ埋めるように配置可能となっている。厚みは、欠損部の深さに応じて変更可能であるが、良好な取り扱い性が得られるためには、１〜３ｍｍ程度であることが好ましい。
【０００９】
線維芽細胞は、適当な生体組織、例えば、粘膜下組織、皮膚真皮組織などから既知の採取方法によって採取された細胞を使用することができる。採取された細胞をそのまま使用することもできるが、適当な培地で所定期間培養して増殖させた後に使用することもできる。このような線維芽細胞は、担体中にほぼ均一な密度で配置されていることが好ましい。
【００１０】
担体は、スポンジ状、ゲル状、フェルト状、不織布、織物など種々の形態のものが利用できる。担体の材料は、生体に移植するために適した組成のものであれば使用することができるが、生体吸収性材料であることが好ましい。例えば、コラーゲン、ヒアルロン酸、フィブリン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ乳酸グリコール重合体、絹フィブロイン、及びポリロタキサンなどから選択的に決定することができ、単独で使用するだけでなく、複数の材料を混合したり、積層させたりしてもよい。
【００１１】
真皮層１２上には、支持体１６が配置されている。支持体１６は、真皮層１２の周縁部よりも外方へ延長し、口腔用移植片１０を欠損部周辺に固定する際の縫合部として使用される延長部１４を有している。延長部１４は、真皮層１２の周縁部よりも突出しており、口腔用移植片１０を欠損部に移植した際に、欠損部周辺の正常部位上に位置する。このように延長部１４が正常部位上にあることによって、口腔用移植片１０に食物や舌があたって荷重が掛かったとしても、そのほとんどが正常部位で受け止められることになるので、欠損部（移植部位）に直接荷重が掛かることが抑制され、患者への痛みを軽減することができる。
【００１２】
支持体１６は、多数の貫通孔を有するシート材であって、適用する欠損部周辺の形状に応じた形に形成されている。この支持体１６は、変化可能に柔軟性を有しているものであることが好ましい。
支持体１６の材料は、生体に移植するために適した組成のものであれば使用することができるが、生体吸収性材料であることが好ましい。例えば、ポリ乳酸グリコール重合体、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、及びポリロタキサンなどから選択的に決定することができる。また、支持体１６の生体への吸収時間と、真皮層１２が適用される欠損部の治癒時間とがほぼ等しいものがなお好ましい。
【００１３】
このような支持体１６としては、支持体１６のうち延長部１４に相当する部分は、少なくとも１つの貫通孔を有し、例えば、図２に示されるような適度な強度を有するメッシュ状シート材が挙げられる。支持体１６には、全面に略矩形状の貫通孔１８が設けられている。この貫通孔１８は、口腔用移植片１０を口腔内で固定する際の固定部材を通す孔として機能することができる。貫通孔１８の大きさは、支持体１６としての強度を保つと共に、固定部材を通すことが可能であれば如何なる大きさであってもよいが、好ましくは孔径１００〜４００μｍである。また、貫通孔１８の形状は、円孔などであってもよい。口腔用移植片１０を欠損部に固定する際には、貫通孔１８のうち延長部１４に相当する部分の貫通孔１８に、固定部材を通して縫合すればよい。
固定部材としては、通常の口腔用の、縫合糸、縫合針などが挙げられるが、例えば３−０、４−０のサイズの縫合糸が好ましい。
このように支持体１６は、適度な強度を有しており且つ貫通孔１８を縫合糸を通す孔として利用することができるので、口腔用移植片１０を固定する際、延長部１４を容易且つ確実に固定することができると共に、固定後であっても口腔用移植片１０が破れたりすることがない。
【００１４】
支持体１６の厚さは、適度な強度が保たれる厚さであればよく、好ましくは移植後の口腔内において、違和感が生じない又は少ない程度の厚さであることが望まれる。
【００１５】
支持体１６上には、真皮層１２と支持体１６との接触面と少なくとも同等の面積及び形状の上皮層２０が配置されている。なお、上皮層２０は支持体１６の延長部１４上にまで形成されていることが好ましい。この方が、移植後の口腔内における違和感が少ない。上皮層２０は、上皮細胞の層で構成されている。
上皮細胞は、適当な生体組織、例えば、粘膜上皮組織などから既知の採取方法によって採取された細胞を使用することができる。採取された細胞をそのまま使用することもできるが、適当な培地で所定期間培養して増殖させた後に使用することもできる。
【００１６】
また、上皮層２０は、担体と、その担体に保持された状態の上皮細胞層と、で構成されていてもよい。この場合には、担体上に形成された上皮細胞層が好ましい。担体は、上述の真皮層１２を構成する担体と同様の形態のものであってよい。例えば、スポンジ状、ゲル状、フェルト状、不織布、織物など種々の形態のものが利用できる。また、担体の材料は、上述の真皮層１２を構成する担体と同様の材料のものであってよく、生体吸収性材料であることが好ましい。例えば、コラーゲン、ヒアルロン酸、フィブリン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ乳酸グリコール重合体、絹フィブロイン、及びポリロタキサンなどから選択的に決定することができる。
【００１７】
上皮層２０の厚さは、移植後の口腔内において、違和感が生じない又は少ない程度の厚さであることが好ましい。また、上皮層２０を構成する上皮細胞層は、単層であってもよいし、重層化させて複数層としてもよい。これにより、上皮層２０は、上皮細胞層によるバリア効果を得ることができると共に、上皮細胞層から産生されるサイトカイン（産生基質）による組織再生の促進が期待される。
【００１８】
次に、口腔用移植片１０の作製方法について説明する（図４参照）。
口腔用移植片１０は、真皮層１２を形成する真皮層形成工程と、上皮層２０を形成する上皮層形成工程と、真皮層１２、支持体１６及び上皮層２０を積層状態に結合させる結合工程と、を含む工程により作製される。
なお、結合工程は、真皮層形成工程及び上皮層形成工程において真皮層１２及び上皮層２０を形成した後に、各層を支持体１６と共に積層して結合してもよいが、真皮層１２及び／又は上皮層２０を細胞及び担体で構成させる場合には、真皮層形成工程及び／又は上皮層形成工程の一部として、支持体１６と、真皮層１２及び／又は上皮層２０とを結合させてもよい。
本実施の形態では、担体としてゲル化可能なコラーゲンを使用し、結合工程を上皮層形成工程の一部として口腔用移植片１０を製造する方法について説明する。
【００１９】
真皮層形成工程では、担体に線維芽細胞を播種し、線維芽細胞を担体に保持させた状態で培養して真皮層１２を形成する。これにより、線維芽細胞が増殖すると共に、線維芽細胞が産生するサイトカインが担体に確実に保持され、移植後における組織再生の促進が期待できる。
【００２０】
播種する線維芽細胞の細胞数は、採取した細胞数、予定される培養期間、担体の種類や大きさ、培地組成等によって異なるが、１×１０３個／ｍｌ〜１×１０８個／ｍｌ程度であることが好ましい。
また、線維芽細胞の培養に使用される培地は、当業界で既知の如何なる培地からも選択することができる。例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）などが挙げられる。培養容器は、組織培養に通常用いられるものをそのまま使用することができる。
【００２１】
線維芽細胞が播種された担体を培養容器に入れ、線維芽細胞の通常の培養に用いられる条件下で所定時間培養することにより、真皮層１２を形成する。ここで所定時間は、培養条件及び細胞の状態等によって異なるが、一般に数日から数週間である。培養は、所望する構成の真皮層１２が形成されるまで行い、必要に応じて適宜培地交換を行う。真皮層形成工程の終了は、例えば、細胞数、サイトカイン量、強度、大きさ等に基づいて判断することが好ましい。
例えば、コラーゲンゲル内に線維芽細胞を包埋する場合には、培養することによってコラーゲンゲルが収縮するので、ゲル体積を溶液の１／２０〜１／２００程度まで収縮させると、真皮層１２に適度な強度が寄与され、良好な取り扱い性を得ることができる。
【００２２】
なお、播種時に充分な細胞数が得られている場合には、上述の培養工程を省略し、播種した線維芽細胞が担体に確実に保持（接着）された時点で真皮層形成工程の終了としてもよい。
【００２３】
次の上皮層形成工程には、ゲル化可能なコラーゲンを上皮層２０の担体として使用する場合、真皮層１２の上に支持体１６を配置した後、上皮層２０を構成する担体を用いて、真皮層１２、支持体１６及び上皮層２０を結合することが含まれる。
このとき支持体１６は、延長部１４が真皮層１２の外側に同様の幅（長さ）で形成されるように、真皮層１２上に載置する。その後、ゲル化可能なコラーゲン溶液を支持体１６の上から流し入れる。その際、液面が支持体１６よりも高くなる量のコラーゲン溶液を流し入れると、ゲル化したコラーゲンによって支持体１６が覆われた状態で、真皮層１２と支持体１６とを結合させることができる。
【００２４】
コラーゲン溶液を結合に使用する場合には、その範囲を画定する囲み部材を使用することが好ましい。囲み部材には、例えばガラスリングなどを挙げることができ、コラーゲン溶液がその中に流し込まれる。
【００２５】
このように、真皮層１２と支持体１６とを確実に結合することによって、真皮層１２のみの場合よりも、口腔用移植片１０の強度を確保することができるので、口腔用移植片１０の取り扱い性を高めることができる。また、真皮層１２及び支持体１６の上方からの投影形状を相似形とし、同心状に配置して結合することにより、支持体１６の全周にわたり均等な幅の延長部１４が形成される。
【００２６】
また、この上皮層形成工程には、支持体１６上または支持体１６上に配置した担体上に上皮細胞を播種して培養することによって、上皮層２０を形成することが含まれる。
上皮細胞は、１×１０３個／ｃｍ２〜１×１０８個／ｃｍ２の播種密度であることが好ましい。
また、上皮細胞の培養に使用される培地は、通常、上皮細胞を成育させるために用いられる既知の如何なるものでもよいが、例えば、ケラチノサイト増殖用培地（ＫＧＭ）やＦＢＳ含有ＤＭＥＭなどが好ましい。
【００２７】
培養は、最初に上皮細胞の懸濁液を支持体１６上または支持体１６上に配置した担体上に播種することにより行なわれる。その後、所定の培養条件で培養することにより、上皮細胞が支持体１６上または担体上で増殖し、上皮細胞層が形成される。上皮細胞の培養は、通常の培養条件下で行うことができ、上皮細胞が重層化するまで行うことが好ましい。
この培養工程では、上皮細胞懸濁液の播種前に、予めフィーダ細胞を支持体１６上または担体上に敷設しておいてもよい。フィーダ細胞としては、当分野で既知のもの、例えば、不活化したマウス線維芽細胞等を利用することができる。
【００２８】
また、上述のフィーダ細胞を使用せず、ＫＧＭ等の無血清培地で培養工程を行う際には、カルシウム（Ｃａ）濃度を高濃度で含む培地に切り換えた後、気相リフト（気液界面培養）を行うことで上皮細胞を充分に重層化することができる。
なお、上皮細胞は単層であってもよいが、重層化させることが好ましい。重層化によって生体の上皮組織に近い上皮細胞層が形成される。さらには、細胞数が多くなるので、産生されるサイトカインが増加し、創傷治癒を促進することが期待される。
【００２９】
これにより、真皮層１２、支持体１６及び上皮層２０がこの順に積層され、延長部１４が全周にわたり突出して設けられた口腔用移植片１０が作製される。
【００３０】
なお、真皮層１２を構成する担体を用いて支持体１６と真皮層１２とを結合させる場合には、予め担体に線維芽細胞を包埋させて真皮層１２の一部を形成した後に、支持体１６を載置し、その後、線維芽細胞を包埋する担体を支持体１６の上から流し込んで、支持体１６と真皮層１２とを結合させる。この場合には、真皮層１２と支持体１６とを一体化させることができる。
また、真皮層１２上への担体の流し込みの量（厚み）を調整することによって、上皮層２０の担体としての作用も兼ねることができる。この場合には、その後に支持体１６上の担体に上皮細胞を配置して培養することにより、上皮層２０も構成することができる。上述のように担体を連続させて設けてもよく、連続させずに分離させた状態で形成させてもよい。
このように担体を各層で利用することにより、工程を省略して短期間で口腔用移植片１０を作製することができる。
【００３１】
また、真皮層１２、支持体１６及び上皮層２０の結合を、各種の接着部材を用いて行ってもよい。後述の担体のみで形成した真皮層１２を支持体１６に結合する場合も同様に、接着部材を用いて担体と支持体１６とを結合させてもよい。このような用途に用いられる接着部材としては、ゼラチンやフィブリンのり等が挙げられる。この場合には、各層をそれぞれ作製後に結合することができ、上皮層２０及び真皮層１２を形成するための細胞培養を同時に行うことができるので、口腔用移植片１０の作製期間を短縮することができる。
【００３２】
作製された口腔用移植片１０は、口腔内、殊に口腔歯肉に形成された欠損部に、当分野において既知の方法により移植される。また、口腔用移植片１０は、複数の細胞からなる組織構造を再構築した三次元再構成培養物であるので、そのまま移植片として直接的に欠損部に移植することができる。さらに、口腔用移植片１０は、適度な強度を有しているので、取り扱い性に優れている。
【００３３】
口腔用移植片１０を欠損部に移植する際には、真皮層１２を欠損部の内部に配置させ接触させる。このとき延長部１４は、欠損部周辺の正常部位上に配置される。このため、口腔用移植片１０を移植する際には、延長部１４に設けられた貫通孔に例えば縫合糸を通せばよく、容易かつ確実に取り付けることができる。またこのとき口腔用移植片１０は適度な強度を有しているので、移植部位を保護することができる。
【００３４】
また、口腔用移植片１０全体が延長部１４で正常部位に固定されるため、長期間にわたって移植部位の安静状態を維持することができると共に、口腔用移植片１０全体の荷重を正常部位で受けることができる。これにより、口腔用移植片１０全体の荷重を分散させて欠損部への負担を軽くし、外部刺激による欠損部の痛みを緩和させることができる。
さらに、口腔用移植片１０を移植した際に、配置した真皮層１２と正常部位との間に形成される隙間を延長部１４が覆うことになるので、欠損部への異物の混入を防止することができると共に、長期間にわたって移植部位の安静状態を維持することができる。
【００３５】
本発明の実施の形態では、移植の際に延長部１４を縫合糸などで固定する構成となっているが、これに限定されない。例えば、口腔用移植片１０の延長部１４には、固定部材、例えば縫合糸を予め設けていてもよい。この場合には、延長部１４の少なくとも１カ所に固定部材を取り付け可能であればよく、欠損部及び口腔用移植片１０の形状に応じて、固定部材の数及び固定場所を適宜選択することができる。固定部材は、延長部１４の貫通孔に貫通させて固定させたものであってもよく、或いは支持体１６の一部として形成されたものであってもよい。
この場合の固定部材は、通常、固定に用いられる手術用の固定部材であればよく、例えば縫合糸、縫合針、接着剤などを挙げることができる。
このように延長部１４に予め固定部材を設けた場合には、口腔用移植片１０を欠損部に移植する際、固定部材を別途取り付ける必要性を排除することができる。
【００３６】
なお、延長部１４は全周にわたって均一な幅（長さ）で設けなくてもよく、欠損部の周囲の形状、大きさに応じて延長部１４の幅を変更してもよい。また、厚さについても同様である。
【００３７】
一方、支持体１６の貫通孔１８は、均一な大きさ及び密度で配置される必要はなく、適用条件に応じて種々の形態のものを利用することができる。例えば、不定形の孔が設けられたスポンジ状のシート材であってもよい。
【００３８】
例えば、図３には、支持体１６の変形例として、貫通孔の大きさ及びパターンが異なる複数の領域を有する支持体３６が示されている。支持体３６は、真皮層１２上に位置する中央の領域３６ａと、延長部１４の内周側に相当する領域３６ｂと、延長部１４の外周側に相当する領域３６ｃとで構成されている。
【００３９】
領域３６ａには、格子状の比較的大きな貫通孔３８が均一に設けられている。この貫通孔３８の大きさは、真皮層１２と上皮層２０を構成する担体を用いて結合させるのに必要な連続する面積があればよく、好ましくは約孔径１００μｍ〜１ｍｍの範囲である。これにより、前述のコラーゲン溶液による結合方法を適用した場合に、支持体３６と、真皮層１２及び／又は上皮層２０との接触面積が増加するので、各層間の結合を充分に確保することができる。なお、接着因子等で真皮層１２と支持体３６とを接着させる場合には、貫通孔３８を設けなくともよい。
【００４０】
領域３６ｂには、全面に多数の小孔（ピンホール）４０が設けられている。この小孔４０の大きさは、異物が侵入しない程度の大きさであればよく、好ましくは約孔径１０〜５００μｍの範囲である。この領域３６ｂは、欠損部と正常部位との間に配置されるため、欠損部の隙間に異物が侵入することを防止できる。また、口腔内の唾液が小孔４０を通過するので、移植部位の湿潤環境が維持され、理想的な治癒環境を持続することができる。
【００４１】
領域３６ｃには、支持体３６の周縁に沿って略等間隔に貫通孔４２が設けられている。この貫通孔４２は、固定部材を通す孔として使用する。貫通孔４２の大きさは、固定部材を通すことが可能な大きさであればよく、好ましくは孔径１００〜４００μｍ程度である。この領域３６ｃは、正常部位上に配置されるため、貫通孔４２に固定部材を通すことにより、正常部位に固定することができる。このように、貫通孔４２が設けられているので、口腔用移植片１０を正常部位に容易かつ確実に固定することができる。
【００４２】
本発明の実施の形態では、真皮層１２を担体と線維芽細胞とによって構成させているが、担体のみで真皮層１２を構成してもよい。この場合に使用する担体は、好ましくは多孔質体（スポンジ）で形成されたもの、不織布や織物を積層して厚みを持たせたもの等である。このような担体のみの真皮層１２は、欠損部周辺組織と接触することにより、移植後にこの周辺組織からの細胞の遊走を促す。これにより、細胞が担体内に定着し、創傷治癒が行われる。
【００４３】
本発明の実施の形態の口腔用移植片１０では、延長部１４は、真皮層１２と上皮層２０の間に介在している支持体１６の一部として形成されているが、これに限定されない。例えば、上皮層２０を支持体１６と同一の面積及び形状として、支持体１６及び上皮層２０の２層によって延長部１４を形成してもよい。これにより、延長部１４上にも上皮層２０が設けられるので、上皮細胞層によるバリア効果が期待でき、真皮層１２と欠損部との隙間への異物混入を確実に防止できると共に、長期にわたって安静状態にすることができる。
また、支持体１６の延長部１４に予め貫通孔を設けることなく、上皮層２０を支持体１６の全面上で形成した後に、上皮層２０及び支持体１６の延長部１４の双方を貫通する貫通孔を設けてもよい。これによれば、支持体１６上で容易かつ安定的に上皮層２０を形成することができるとともに、移植部位の湿潤環境を維持するための貫通孔を容易に設けることができる。
【００４４】
【実施例】
以下に、本発明について一実施例を挙げて説明するが、これらに何ら限定されるものではない（図４参照）。
【００４５】
＜細胞の準備＞
患者又はドナーの口腔から正常な粘膜組織及び粘膜下組織（上皮細胞及び線維芽細胞が含まれる）を採取し、ディスパーゼ処理によって上皮組織と真皮組織とに分離した。具体的には、１０００ＰＵ／ｍｌのディスパーゼ（登録商標）（合同酒精株式会社製）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に４℃で１６時間浸漬することで分離した。
【００４６】
分離した上皮組織をトリプシン処理することによって細胞を分散し、上皮細胞を細胞懸濁液の状態で得た。具体的には、０．２５％トリプシン溶液に室温で３０分間浸漬した後、トリプシンインヒビターで洗浄することにより酵素活性を停止させた。その後、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで３０分間攪拌した後、５０μｍのナイロンガーゼでデブリスをろ過して、上皮細胞を単離した。単離した上皮細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、分離した細胞ペレットを０．０３ｍＭ Ｃａ２＋含有ケラチノサイト増殖用培地（ＫＧＭ）（クラボウ社製）に懸濁することで上皮細胞懸濁液を得た。
【００４７】
一方、分離した真皮組織をコラゲナーゼ処理することによって細胞を分散し、線維芽細胞を細胞懸濁液の状態で得た。具体的には、０．５％コラゲナーゼ溶液に室温で３時間浸漬することにより真皮組織を構成するコラーゲンを溶解し、線維芽細胞を単離した。単離した線維芽細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、分離した細胞ペレットを１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで懸濁することで線維芽細胞懸濁液を得た。
【００４８】
＜真皮層形成工程＞
０．３％コラーゲン溶液１０ｍｌと、線維芽細胞懸濁液 ５ｍｌ（線維芽細胞数：３×１０６個）とを混合し、混合液を調製した。この混合液１０ｍｌを径６０ｍｍディッシュに滴下した。このときのコラーゲン溶液の深さは約３．５ｍｍであった。
コラーゲン溶液を滴下した後、５％ＣＯ２、３７℃に設定されたインキュベータ内で２時間静置し、ゲル化させた。ゲル化後、ディッシュ底面よりゲルを剥離し、培地として１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ １０ｍｌをディッシュに加え、７日間培養した。培地交換は２日毎行った。
７日間培養後には、収縮した線維芽細胞含有コラーゲンゲルを得ることができた。この際の線維芽細胞含有コラーゲンゲルは、直径が約１５ｍｍ、厚さが約２ｍｍ程度であった。
【００４９】
＜結合工程＞
支持体としては、ポリ乳酸グリコール重合体（ＰＬＧＡ）で構成された柔軟性のあるメッシュ状のシート材（孔径２００μｍ）を用意した。シート材は径２５ｍｍの円形状のものを準備した。
上述で形成した線維芽細胞含有コラーゲンゲルを径３５ｍｍディッシュの底面に配置し、支持体であるシート材をコラーゲンゲル上に載置した。この際、コラーゲンゲルの中心位置とシート材の中心位置が略同じになるように同心円状に載置させた。これにより、シート材の周縁がコラーゲンゲル周縁からほぼ均等に突出し、延長部が形成される。
【００５０】
シート材を載置した後、内径１５ｍｍ（線維芽細胞含有コラーゲンゲルの外径と略同じ）のガラスリングをその内径とコラーゲンゲル周縁部とが略一致するようにシート材上に載置した。ガラスリング内に０．３％コラーゲン溶液を０．５ｍｌ注入し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下でインキュベートすることでコラーゲン溶液をゲル化させた。このゲル化により、メッシュ状のシート材と線維芽細胞含有コラーゲンゲルとを、結合して一体化した。このメッシュ状のシート材上には、コラーゲンゲル層が形成された。コラーゲンゲル層形成後は、ガラスリングは取り除かれた。
【００５１】
＜上皮層形成工程＞
得られたシート材結合コラーゲンゲルの外周に、内径２５ｍｍ（シート材の外径と略同じ）のガラスリングを載置した。この際、ガラスリングは、シート材外周とガラスリング内周とが略接触する状態にしてディッシュ上に設置した。
ガラスリング設置後、予め調製した上皮細胞懸濁液を１×１０５個／ｃｍ２の播種密度となるように、シート材上及びシート材上に形成されたコラーゲンゲル層の上に播種した。１時間静置することで上皮細胞をシート材上及びコラーゲンゲル層上に接着させた後、０．０３ｍＭ Ｃａ２＋含有ＫＧＭをガラスリング内に加え、３日間培養した。この間に上皮細胞は、シート材上及びコラーゲンゲル層上で増殖した。この時点で、単層の上皮細胞層を有する口腔用移植片が作製された。
重層化した上皮細胞層を有する口腔用移植片とするために、培地を１．８ｍＭＣａ２＋含有ＫＧＭに切り替え、引き続き３日間培養した後、気相リフト（気液界面培養）することで、上皮細胞に重層化を促した。気相リフトで約１週間培養することで、重層化させた上皮細胞層を有する口腔用移植片を得ることができた。なお、この間の培地交換は２日毎行った。
【００５２】
このように作製された口腔用移植片は取扱い性が良好で欠損部に容易に移植でき、簡単に縫合固定することができる。また、固定後においては荷重が欠損部にかからないので痛みをなくすことができ、欠損部への異物の侵入を防止すると共に湿潤状態を維持することができる。
【００５３】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、取り扱い性がよく、口腔内の欠損部に移植した場合に、移植部位の安静状態を長期間維持することが可能な口腔用移植片が提供される。また、欠損部が保護されることで、外部からの刺激による痛みを緩和することが可能な口腔用移植片が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態に係る口腔用移植片の断面図である。
【図２】本発明の実施の形態に係る支持体の平面図である。
【図３】本発明の実施の形態に係る支持体の変形例の平面図である。
【図４】本発明の実施例に係る口腔用移植片の作製手順を説明する図である。
【符号の説明】
１０    口腔用移植片
１２    真皮層
１４    延長部
１６    支持体
１８    貫通孔
２０    上皮層
３６    支持体
３８    貫通孔
４０    小孔
４２    貫通孔
【図１】
2004195103.tif 000003
【図２】
2004195103.tif 000004
【図３】
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【図４】
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