(57)【要約】      （修正有）【課題】肝芽細胞を含む肝臓機能不全治療剤および前記肝芽細胞を利用した人工肝臓の製造方法を提供する。【解決手段】  成人の肝臓の単細胞懸濁液を調整し、成熟肝細胞、成熟胆管細胞、内皮細胞及び肝葉細胞に対し特異的な抗体を利用し懸濁液をパンニングし、上記抗体を利用した蛍光励起細胞分離捕集を利用して単離した肝芽細胞を血管を介して肝臓内に注入する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝芽細胞を包含する肝臓機能不全治療剤。
【請求項２】
血管を介して肝臓内に前記肝芽細胞を注入するための請求項１記載の肝臓機能不全治療剤。
【請求項３】
肝臓外の部位に前記肝芽細胞を注入するための請求項１に記載の肝臓機能不全治療剤。
【請求項４】
肝臓外の部位である脾臓に前記肝芽細胞を注入するための請求項１に記載の肝臓機能不全治療剤。
【請求項５】
前記肝芽細胞が、
（ａ）胚または新生児の肝細胞の単細胞懸濁液を調製する工程、
（ｂ）赤血球、内皮細胞および他の肝葉細胞を含む造血細胞が上記懸濁液から除去されるように、赤血球、内皮細胞または他の肝葉細胞を含む造血細胞に対して特異的な抗体を利用して上記懸濁液をパンニングする工程、および 
（ｃ）赤血球、内皮細胞および他の肝葉細胞を含む造血細胞が上記懸濁液から除去されるように、上記抗体を利用した蛍光励起細胞分離捕集を行い、そしてこの懸濁液に対し、肝細胞マーカーに対する抗体の少なくとも１種類、側面散乱、正面散乱および／または自己蛍光を利用した多変数の蛍光励起細胞分離捕集を行うことにより、上記懸濁液中に残る細胞を単離された肝芽細胞とする工程を包含する、胚または新生児の肝臓から肝芽細胞を単離する方法によって単離された肝芽細胞である請求項１記載の肝臓機能不全治療剤。
【請求項６】
前記肝芽細胞が、
（ａ）成人の肝臓の単細胞懸濁液を調製する工程、
（ｂ）成熟肝細胞、成熟胆管細胞、内皮細胞および肝葉細胞が上記懸濁液から除去されるように、成熟肝細胞、成熟胆管細胞、内皮細胞および肝葉細胞に対して特異的な抗体を利用して上記懸濁液をパンニングする工程、および
（ｃ）成熟肝細胞、成熟胆管細胞、内皮細胞および肝葉細胞が上記懸濁液から除去されるように上記抗体を利用した蛍光励起細胞分離捕集を行い、そしてこの懸濁液に対し、肝細胞マーカーに対する抗体、側面散乱、正面散乱および／または自己蛍光を利用した多変数の蛍光励起細胞分離捕集を行うことにより、上記懸濁液中に残る細胞を単離された肝芽細胞とする工程を包含する、成人の肝臓から肝芽細胞を単離する方法によって単離された肝芽細胞である請求項１記載の肝臓機能不全治療剤。
【請求項７】
バイオリアクターを備える肝芽細胞の利用を包含する、人工肝臓を製造する方法。
【請求項８】
前記肝芽細胞が
（ａ）胚または新生児の肝細胞の単細胞懸濁液を調製する工程、
（ｂ）赤血球、内皮細胞および他の肝葉細胞を含む造血細胞が上記懸濁液から除去されるように、赤血球、内皮細胞または他の肝葉細胞を含む造血細胞に対して特異的な抗体を利用して上記懸濁液をパンニングする工程、および 
（ｃ）赤血球、内皮細胞および他の肝葉細胞を含む造血細胞が上記懸濁液から除去されるように、上記抗体を利用した蛍光励起細胞分離捕集を行い、そしてこの懸濁液に対し、肝細胞マーカーに対する抗体の少なくとも１種類、側面散乱、正面散乱および／または自己蛍光を利用した多変数の蛍光励起細胞分離捕集を行うことにより、上記懸濁液中に残る細胞を単離された肝芽細胞とする工程を包含する、胚または新生児の肝臓から肝芽細胞を単離する方法によって単離された肝芽細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記肝芽細胞が
（ａ）成人の肝臓の単細胞懸濁液を調製する工程、
（ｂ）成熟肝細胞、成熟胆管細胞、内皮細胞および肝葉細胞が上記懸濁液から除去されるように、成熟肝細胞、成熟胆管細胞、内皮細胞および肝葉細胞に対して特異的な抗体を利用して上記懸濁液をパンニングする工程、および
（ｃ）成熟肝細胞、成熟胆管細胞、内皮細胞および肝葉細胞が上記懸濁液から除去されるように上記抗体を利用した蛍光励起細胞分離捕集を行い、そしてこの懸濁液に対し、肝細胞マーカーに対する抗体、側面散乱、正面散乱および／または自己蛍光を利用した多変数の蛍光励起細胞分離捕集を行うことにより、上記懸濁液中に残る細胞を単離された肝芽細胞とする工程を包含する、成人の肝臓から肝芽細胞を単離する方法によって単離された肝芽細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
培養設備内の肝芽細胞の利用を包含する人工肝臓を製造する方法。
【請求項１１】
前記肝芽細胞が
（ａ）胚または新生児の肝細胞の単細胞懸濁液を調製する工程、
（ｂ）赤血球、内皮細胞および他の肝葉細胞を含む造血細胞が上記懸濁液から除去されるように、赤血球、内皮細胞または他の肝葉細胞を含む造血細胞に対して特異的な抗体を利用して上記懸濁液をパンニングする工程、および 
（ｃ）赤血球、内皮細胞および他の肝葉細胞を含む造血細胞が上記懸濁液から除去されるように、上記抗体を利用した蛍光励起細胞分離捕集を行い、そしてこの懸濁液に対し、肝細胞マーカーに対する抗体の少なくとも１種類、側面散乱、正面散乱および／または自己蛍光を利用した多変数の蛍光励起細胞分離捕集を行うことにより、上記懸濁液中に残る細胞を単離された肝芽細胞とする工程を包含する、胚または新生児の肝臓から肝芽細胞を単離する方法によって単離された肝芽細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記肝芽細胞が
（ａ）成人の肝臓の単細胞懸濁液を調製する工程、
（ｂ）成熟肝細胞、成熟胆管細胞、内皮細胞および肝葉細胞が上記懸濁液から除去されるように、成熟肝細胞、成熟胆管細胞、内皮細胞および肝葉細胞に対して特異的な抗体を利用して上記懸濁液をパンニングする工程、および
（ｃ）成熟肝細胞、成熟胆管細胞、内皮細胞および肝葉細胞が上記懸濁液から除去されるように上記抗体を利用した蛍光励起細胞分離捕集を行い、そしてこの懸濁液に対し、肝細胞マーカーに対する抗体、側面散乱、正面散乱および／または自己蛍光を利用した多変数の蛍光励起細胞分離捕集を行うことにより、上記懸濁液中に残る細胞を単離された肝芽細胞とする工程を包含する、成人の肝臓から肝芽細胞を単離する方法によって単離された肝芽細胞である、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、１９９１年８月７日に「肝細胞前駆細胞の増殖」と題して出願された米国特許出願第０７/７４１,１２８号の一部継続出願である。
【０００２】
本発明は肝芽細胞を単離するための方法および単離肝芽細胞に関する。本発明の単離肝芽細胞は、肝幹細胞（多分化能性前駆細胞）および、肝細胞または胆管細胞のいずれか一方に分化が決定付けられている始原細胞（committed progenitors；１つの分化可能性（fate）のみを有する前駆細胞）を包含する。本発明の単離肝芽細胞は、肝機能不全の治療、人工肝臓、遺伝子治療、薬剤検定およびワクチン製造に使用されることができる。さらに、本発明の単離肝芽細胞は、機能性肝臓細胞集団の使用を必要とする、研究、治療および商業目的のために使用されることができる。
【０００３】
成熟肝細胞と異なり、本発明の肝芽細胞は、肝臓系列（liver lineage）全てに成熟可能である娘細胞を産生し、かつ多くが系列上の位置（lineage-position）に特異的である全ての範囲の肝機能を提供する。さらに、本発明の肝芽細胞は成熟肝細胞よりも優れた増殖能および長期生存能力を有している。その結果として、本発明の肝芽細胞は、成熟肝細胞よりも研究、治療および商業に適している。
【背景技術】
【０００４】
幹細胞および初期始原細胞が、骨髄、腸および表皮等の急速に増殖する成人組織中に存在することは古くから知られていたが、近年になって、長期の細胞寿命によって特徴付けられる器官である成人肝臓のような静止組織中にも存在すると考えられるようになった。自己複製し、かつ種々の分化可能性を有する娘細胞を産生する幹細胞の能力は、分化の決定付けられた始原細胞から幹細胞を明瞭に区別する。対照的に、分化の決定付けられた始原細胞は、細胞タイプに関しては単一の分化可能性を有する娘細胞を産生し、それらの娘細胞は緩やかな成熟過程をたどるが、その過程において、系列上の位置に依存した過程中に、分化した機能が出現する。
【０００５】
成人器官において、体組織中の幹細胞は、単一の方向性を有する最終分化過程をたどる娘細胞系列を産生する。造血、腸および表皮等の良く特徴付けられた系列系において、幹細胞は経験的なアッセイ法により同定されてきたが、そのようなアッセイ法において幹細胞が全ての範囲の子孫を産生し得ることが示されている。現在までのところ、細胞の一般的な分類として幹細胞を択一的に同定する分子マーカーは知られておらず、そして、自己増殖および多分化する能力を有する細胞を、単一の分化可能性および分化が決定付けられた細胞へと変換する結果をもたらす分子メカニズムも知られていない。
【０００６】
肝実質の構造および機能上の単位は、２つに分かれた血管ベッドの周りの車輪のように組織された細葉である。それぞれが門細静脈、肝細動脈および胆管を有する６組の門脈三連構造が周辺部を形成し、そして中央血管が中枢（ハブ）を形成している。車輪の「スポーク」を含む実質は、有窓洞様内皮（fenestrated sinusidal endothelium）の両側に列をなす細胞のプレートからなる。血液は、門脈三連構造の門細静脈および肝細動脈から、実質のプレートを並べた洞様毛細血管を通り、最後の肝臓血管である中央血管へと流れる。肝細胞は、それらの細葉上の位置によって、著しい、形態学的、生化学的および機能的不均質性を示す(Gebhardt，Pharmac．Ther.，Vol．53，pp．275-354（1990）参照)。
【０００７】
比較してみると、門脈周囲の実質細胞は大きさが小さく、細葉内の細胞は大きさが中位であり、そして中央血管周囲の細胞は大きさが最も大きい。ミトコンドリア、小胞体およびグリコーゲン顆粒の形態には、細葉上の位置に依存する変異が存在する。極めて重要なことは、二倍体実質細胞および最も高い生長能力を有するものが門脈の周囲に配置されていることである。同様にして、組織特異的遺伝子発現も細葉上の位置に依存しているということは、遺伝子の発現は成熟に依存するという仮説を導く(Sigal et al.，Amer．J．Physiol.，Vol．263，pp.G139-G148（1993）参照)。
【０００８】
肝臓は、種々の点で腸系、皮膚系および造血系と類似した系列系と幹細胞を有していると、現時点では信じられている(Sigal et al.，Amer．J．Physiol.，Vol．263，pp．G139-G148（1993）; Sigal et al．In Extracellular Matrix，Zern and Reed，eds，Marcel Dekker，NY.，pp．507-537(1993); およびBrill et al.，Liver Biology and Pathobiology，Arias et al.，3d eds，Raven Press，NY（1994年、印刷中）参照)。従って、動物の全てまたは多くの年齢の肝臓内に始原細胞集団が存在することが期待される。肝臓の系列モデルは次のことを明らかにし得る。それは、培養において僅かな分裂回数以上に亘って成人の成熟肝臓細胞を生長させることが研究者に不可能であるのはなぜか、肝臓または肝臓外の部位（ectopic site）の生体内に注入した場合にも成熟した成人肝臓細胞の分裂は僅かしか研究者に観察されないのはなぜか、および成人肝臓細胞を用いた人工肝臓の確立において研究者が限られた成功しか納めていないのはなぜか、ということである。これらの行詰りは、肝臓移植、人工肝臓、遺伝子治療ならびにその他の治療および商業利用のための単離肝臓細胞と非常に関係がある。
【０００９】
上記した行為の成功は、初期胚肝臓中の肝細胞に高い割合で見出され、かつ成人肝臓中に門脈周辺で少数見出される肝始原細胞（肝芽細胞）の使用を必要とする。そのような肝芽細胞を単離することが望ましいので、該肝芽細胞を成功裏に単離する方法を開発する必要性が生じていた。本発明者らは、マーカーを同定し、そして全ての年齢の動物の肝臓から肝芽細胞を単離するための方法を開発した。本発明の方法はラット由来の胚肝臓および新生児肝臓を用いて開発されたが、本発明の方法は全ての年齢の全ての動物種から肝芽細胞を単離するための体系的なアプローチを提供する。
【００１０】
本発明の方法は、充分な数の多分化能肝臓細胞（肝幹細胞）および分化の決定付けられた始原細胞（肝細胞または胆管のいずれか一方となる１つだけの分化可能性を有する細胞）が存在する胚性肝臓を用いて開発された。ラットの肝実質細胞の分化の開始は、妊娠１０日目までに生じる。この段階まで、実質細胞（上皮細胞または類上皮細胞）は形態学的に均質であり、小さな細胞からなるが、そのような細胞は細胞質に乏しいので細胞質に対する核の割合が高く、そして未分化の淡い（pale）核と僅かな細胞間接着を有している。この段階における肝実質細胞の多くは胆管細胞と肝細胞の２種類の分化の可能性があると考えられている。
【００１１】
これらの細胞は、アルブミンおよびα−フェト蛋白質（ＡＦＰ）等の発達の極初期に活性化されることが知られている幾つかの肝臓に特異的な機能を、通常は僅かに発現するが、グリコーゲン、尿素回路酵素または主要尿蛋白質（ＭＵＰ）等の成人に特異的なマーカーは発現しない。胎児細胞の僅かな島だけが、胆管細胞に特異的なマーカーであるＢＤＳ7に対して陽性であり、そして肝細胞に特異的なマーカーであるＨＥＳ6に対して陽性なものはない(Germain et al.，Cancer Research，Vol．48，pp．4909-4918（1988）参照)。乏しい細胞質を有し、しばしば卵形の核を有する肝芽細胞は、それぞれ単肝細胞または肝細胞のいずれか一方への単一の分化可能性を有する、分化の決定付けられた始原細胞および多分化能性肝幹細胞を含む数種類の細胞集団を包含する。
【００１２】
妊娠１５日目までに、肝芽細胞は、胆管または肝細胞系列のどちらか一方に沿って分化してゆく、分化の決定付けられた始原細胞を漸増して含むようになる。それらの細胞の成熟は形態学的変化（大きさの増大、細胞質小器官および小胞の数の増加、不均質な核の形態および色素顆粒の増加）により示されるが、そのような変化は流動細胞測定法の変数により容易に区別され得る。「正面散乱」が細胞の大きさを測定する。「側面散乱」が、細胞器官の数に影響される細胞の複雑さまたは顆粒度（granularity）を測定する。自己蛍光はリポフスチン類および成熟に伴い増加するその他の色素に依存している。
【００１３】
形態学的変化に伴うのは、サイトケラチン（cytokeratins）のタイプ、種々の表面抗原および組織特異遺伝子の発現の、段階的または連続的な変化である。肝幹細胞を含む初期肝芽細胞はＡＦＰを強く発現しアルブミンを弱く発現するが、肝細胞になると決まった分化の決定付けられた始原細胞はＡＦＰ発現をやめた細胞の索を形成し、高レベルのアルブミンを漸増して発現し、そしてグリコーゲンおよび尿素回路酵素等の肝細胞に特異的なマーカーを徐々に獲得する。胆管細胞になると決まった細胞は、表面上は同一の肝芽細胞から生じ、ＡＦＰの発現を保持し、アルブミン発現をやめ、そしてサイトケラチン１９（ＣＫ１９）を獲得する。最初、真珠様細胞のストリングが肝臓の門に近接した大きな血管分枝の周りに存在する。それに続く日々をかけて同様の構造が肝臓中に出現する。ＢＤＳ7−陽性の細胞が急速に大きくなり、そして発達齢の増加に伴いより多くなる。徐々に構造内に管腔を形成し、妊娠１８日目までに、胆管状の構造が形態学的に同定可能となる。
【００１４】
肝臓の発達および成熟に伴う肝臓に特異的な遺伝子の発現を理解するためには、直接肝芽細胞を研究する必要がある。しかし、肝芽細胞の研究は、肝芽細胞が胚、新生児および成人の肝臓の細胞タイプの内で小さな割合（１０％以下）しか構成しておらず、且つその単離が困難であるために妨げられている。胚においては、肝臓は造肝細胞（肝細胞の形成）および造血（血液細胞の形成）の両方のための部位である。造血細胞は妊娠の１２日目の間に卵黄嚢から肝臓内に移住する。続いて、造血、特に造赤血球が急速に、肝臓重量の５０％あるいはそれ以上の造血細胞を含む胎児肝臓の、最も顕著な機能の一つとなる。新生児においては、肝細胞の過半数は造血細胞または成熟肝細胞（肝細胞または胆管細胞）のどちらか一方である。その結果、無傷肝臓中の実質の機能における連続的な変化を明らかにすることは困難であるが、それは変化する造血の影響によりデータが混乱させられるからである。例えば、妊娠１８日目における実質の機能の移行的減少は、肝細胞における減少またはそれらの遺伝子の発現の減少に起因するものではないが、そのときに肝臓の多くが赤血球細胞からなり、造赤血球のピークであるために生じるものである。肝臓における造血は、誕生後にこの機能が成人における造血の場である骨髄に移行されるに連れて急速に減衰する。しかし、成人肝臓における肝芽細胞の単離には依然として問題があるが、それは成人肝臓が非常に小さな割合でしか肝細胞を含んでいないからである。
【００１５】
肝芽細胞は肝臓細胞の全ての発達段階を生じることができ、従って、肝芽細胞は分化の初期から後期の段階までにおいて活性化および発現される遺伝子によりコードされた肝臓に特異的な機能を全ての範囲に亘って提供し、成熟肝細胞よりも優れた生長能力を有し、より優れた増殖能を有し、そして適当な遺伝子による形質移入に際してのより優れた能力（即ちより優れた遺伝子治療受入れ能力）を提供するので、（成熟肝臓細胞ではなく）肝芽細胞を単離することが望ましい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
肝芽細胞の単離のために現在適用可能な方法は、造肝細胞前駆細胞から造血細胞を分離するには適さない、細胞の大きさおよび細胞の密度による分画法の使用を必要とするか、（肝細胞小集団も殺すことが証明されている）プロナーゼ分解等の特定の酵素による処理を生き抜く細胞の使用を必要とするか、あるいは対象細胞の濃縮が基層に対する接触性の違いまたは特定の培養培地における生長の違いに依存する培養における選択プロトコルの使用を必要とする。従って、現在適用可能な単離方法は非常に非効率的であると証明されている。さらに、実質細胞前駆細胞の同定は、実質細胞に特異的な機能によるアッセイに依存している。そして、肝芽細胞は多くの培養条件下に脱分化し、それにより、検出不可能となるか、あるいは混入細胞集団の機能により対象細胞の機能が侵されてしまう程に非有効細胞（例えば間葉細胞）の割合が高くなる。加えて、解離した肝細胞はカルシウムおよび温度に依存し、糖蛋白質に仲介される過程により、急速に大きな凝集体を形成する。肝細胞を脱凝集させるためには、乱暴なピペッティングおよびシリンジによる吸い上げを含む機械的方法を利用することが必要であるが、これらの方法は単細胞懸濁液を得るには通常不十分であり、かつ劇的に減少した細胞生存度という結果をもたらす。従って、胎児肝芽細胞を単離する方法であって、肝芽細胞を単細胞懸濁液として維持し、細胞凝集の結果をもたらさず、そして全ての年齢に対して適用可能な方法を開発することが望ましい。
【００１７】
従って、本発明の目的は、肝芽細胞を単離する方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、単離肝芽細胞の提供である。本発明の別の目的は、単離肝芽細胞を肝臓機能不全を治療するために利用する方法を提供することである。本発明のさらに別の目的は、単離肝芽細胞を利用した人工肝臓を形成する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、単離肝芽細胞、および肝細胞の細胞懸濁液に対するパンニング技法（panning techniques）および細胞光度測定（蛍光励起細胞分離捕集）を利用して肝芽細胞を単離する方法に関する。解離肝細胞がパンニングされ、そして蛍光励起細胞が抗体を利用して分離捕集されて、混入細胞タイプの数を大幅に減少させる。混入細胞タイプは、例えば、胚肝臓では造血細胞であり、そして成人では成熟肝細胞である。パンニング皿に接着しない細胞が混入細胞タイプに対する複数の抗体を用いて陰性に（negatively）分離捕集されるが、これにより未成熟肝細胞タイプに非常に富んだ細胞集団となる。次に、多変数蛍光励起細胞分離捕集により、細胞は未成熟肝細胞タイプの別々の亜分類に分けられる。さらに本発明は、肝臓機能不全の治療および人工肝臓の製造のための単離肝芽細胞の使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、単離肝芽細胞、およびパンニング技法および蛍光励起細胞分離捕集を利用して解離した肝細胞から肝芽細胞を単離する方法に関する。本発明の単離肝芽細胞は、肝臓機能不全を治療すること、人工肝臓を製造すること、肝機能の研究、遺伝子治療、薬剤検定およびワクチン製造に使用されることができる。
【００２０】
肝臓は酵素的分解により解離させられ、肝芽細胞に不利益に影響するプロナーゼのような酵素を破棄し、次いで、ＥＧＴＡのようなキレート剤を含有し、冷却されている溶液中に維持され、この結果、単細胞として維持され得る細胞となる。解離された肝細胞は、次に、混入細胞タイプ（胚肝臓および新生児肝臓では、赤血球、内皮細胞およびその他の肝葉細胞であり、成人肝臓では、成熟肝細胞、胆管細胞内皮細胞およびその他の肝葉細胞である）の数を大幅に減少させるために抗体と共にパンニングされる。パンニングだけであると素早くはあるが十分ではなく、高度に純粋な細胞集団を産しない。しかし、これは非肝芽細胞の数を素早く減少させるために用いられることができる。パンニング皿に接着しない細胞は、次いで、蛍光励起細胞分離捕集により分別されるが、この技法は非常に高い正確性および効率を備えている。素早いパンニング方法論と蛍光励起細胞分離捕集の正確さは、良好な生存度を有する高度に純化された細胞集団という結果をもたらす。
【００２１】
胚肝臓および新生児肝臓において、パンニングプロトコルにより減少する混入細胞タイプは、赤血球系細胞、骨髄系細胞および他の造血細胞タイプおよび内皮細胞（肝葉細胞タイプ）である。パンニング工程により細胞集団は未成熟細胞タイプに富むものとなる。成人肝臓においては、混入細胞タイプは成熟肝細胞、胆管細胞、内皮細胞および幾つかの造血細胞集団である。
【００２２】
パンニングされた細胞は、また、肝前駆細胞集団の別々のさらに細かい分類を区別する種々のマーカーにより分離捕集される。同定されたマーカーは、（ａ）蛍光励起細胞分離捕集における側面散乱により測定される顆粒化度の程度(より未成熟な細胞集団はより無顆粒状であり、顆粒化度の上昇は成熟度の上昇と相関する)、（ｂ）自己蛍光の程度(自己蛍光の上昇は成熟度の上昇と相関する)、および／または（ｃ）肝細胞マーカーの発現（例えば、モノクローナル抗体３７４.３により検出される、門脈域介在部の細胞のマーカーＯＣ.３）等である。（骨髄系細胞および内皮細胞を認識する）モノクローナル抗体ＯＸ−４３および／またはＯＸ−４４により認識される造血細胞または内皮細胞の抗原を発現せず、かつ赤血球抗原に対するモノクローナル抗体により認識される抗原を発現しない肝臓細胞は、本発明の肝芽細胞を包含している。本発明の肝芽細胞は未成熟肝細胞の下記の３つの分類を包含している。
【００２３】
（１）より顆粒状の細胞、ＯＣ.３+であり、胆管前駆細胞に分化が決定 付けられている。また、これらの細胞は、ＡＦＰ+、アルブミン+ かつＣＫ１９+である。
（２）より顆粒状の細胞、ＯＣ.３-であり、肝細胞前駆細胞に分化が決 定付けられている。また、これらの細胞は、ＡＦＰ+、アルブミ ン+++かつＣＫ１９-である。
（３）無顆粒状の細胞、ＯＣ.３-であり、非常に未成熟な肝肝臓の前駆 細胞である。また、これらの細胞は、ＡＦＰ+++、アルブミン+かつＣＫ１９-である。
【００２４】
本発明はさらに、本発明の方法により単離された肝芽細胞の使用をも意図している。本発明の単離肝芽細胞は、肝臓機能不全を治療するために使用されることができる。例えば、肝芽細胞は、肝臓または肝臓以外の部位等の体内に注入されることができる。非常に費用が掛かりかつ危険な大手術である全肝移植は、門脈を介して肝臓内に入れるか、あるいは脾臓等の肝臓以外の部位内に入れるか、それらのどちらかにより肝芽細胞を生体内に導入する小手術に取って代わられることができる。また、肝芽細胞は人工肝臓を製造するためのバイオリアクターまたは培養装置において使用されることができる。さらに、肝芽細胞は、遺伝子治療、薬剤検定、ワクチン製造ならびに、種々の成熟度の肝細胞を必要とする全ての研究、商業および治療目的において使用されることができる。
【実施例】
【００２５】
実施例 Ｉ 妊娠の持続期間が既知のフィッシャー３４４ラットをハーラン（Harlan Sprague Dawley，Inc.，Indianapolis，IN.）から取得し、そして標準ラット食餌および１２時間昼サイクルで、本学（Albert Einstein College of Medicine,Bronx，Ny）の飼育施設にて維持した。慣習通り、妊娠の最初の日を妊娠０日目とした。動物の使用は実験動物の飼育と使用に関するＮＩＨの指針に従って行い、本学の動物の飼育および使用に関する委員会により承認された。
【００２６】
胎児肝細胞を単離するために、妊娠１４日目のラットをエーテルにて安楽死させ、胚を無傷で除去し、ＣＡ+2を含有せず、０.０４％デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮＡｓｅ）、０.８ｍＭ ＭｇＣｌ2および２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有した氷冷ハンクス溶液（Hank's Balanced Salt Solution，pH 7.3；ＨＢＳＳ）内に入れた。次いで、肝臓を胎児から切り出して新鮮な氷冷ＨＢＳＳ内に入れた。全ての組織を収集し、非肝臓組織を除去した後、ＨＢＳＳ−５ｍＭ ＥＧＴＡを添加して最終ＥＧＴＡ濃度を１ｍＭとした。肝臓をピペットにより５０ｍｌ容円錐形遠心管に移し、穏やかに６〜８回磨砕して組織を部分的に脱凝集させ、その後、４℃、４００ｇにて５分間の遠心に供した。今後の遠心も全てこの条件にて行った。上澄みおよび細胞のペレットを除去し、そして組織を５０ｍｌの１ｍＭＣａＣｌ2含有ＨＢＳＳ内の０.６％コラゲナーゼＤに再懸濁させた。穏やかに磨砕した後、エーレンマイヤーフラスコ内で３７℃にて１５分間攪拌した。分散した細胞をプールし、１ｍＭ ＥＧＴＡ含有ＨＢＳＳに懸濁し、そして４６μｍ組織収集器（Bellco Glass，Inc.，Vineland，NY）を通して濾過した。細胞懸濁液を遠心し、そして、ＭＥＭアミノ酸、ＭＥＭビタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸、インシュリン(１０μｌ/ｍｌ)、鉄飽和トランスフェリン(１０μｌ/ｍｌ)、遊離脂肪酸（７.６ｍＥｑ/ｌ、チェスベフら（Chessbeuf et al.，1984）に記載の通り、Nu-Chek-Prep，Elvsian，MN）を添加し、さらに微量成分として、アルブミン(０.１％画分Ｖ、脂肪酸含有せず、Miles Inc.，Kankakee，IL)、ミオイノシトール（０.５ｍＭ）およびゲンタマイシン（１０μｇ/ｍｌ、Gibco BRL，Grand Island，NY）を補給したＨＢＳＳ（ＨＢＳＳ−ＭＥＭ）に、細胞を再懸濁した。細胞の数および生存度を血球計算板およびトリパンブルーの排出により測定した。
【００２７】
赤血球を除去するために、ウサギ抗ラットＲＢＣＩｇＧ（Rockland Inc.，Gilbertsville，PA）を用いるウイソキとサト（Wysocki and Sato，1978）の方法に従いパンニング皿を調製した。９ｍＭの０.０５Ｍトリス（ｐＨ９.５）で希釈した抗体（０.５ｍｇ/皿）を１００ｍｍ2微生物学用ポリスチレンペトリ皿（Falcon，Lincoln Park，NJ）上に注いだ。皿をぐるぐる回して表面を均一に被覆し、室温で４０分間インキュベーションした。使用に先立って、被覆した皿をＰＢＳで４回、および０.１％ＢＳＡ含有ＨＢＳＳで１回、洗浄した。
【００２８】
３ｘ１０7までの細胞を含有する細胞懸濁液を３ｍｌに分け、これをウサギの抗ラットＲＢＣＩｇＧで被覆した皿に入れて４℃で１０分間インキュベーションした。接着しなかった細胞を吸い取って除去し、そしてＨＢＳＳ−０.１％ＢＳＡ−０.２ｍＭ ＥＧＴＡで３回、皿を洗浄した後、遠心に供した。細胞のペレットをＨＢＳＳ−ＭＥＭに再懸濁し、ＲＢＣパンニングを繰り返した。２回目のＲＢＣパンニングの後、細胞の数および生存度を再度測定した。
【００２９】
ＲＢＣパンニングの後再収集した細胞を、次に、マウスのモノクローナル抗体ＯＸ−４３（１/２００=１５μｇ/ｍｌ、MCA276、Bioproducts for Science，Indianapolis，IN）およびモノクローナル抗体３７４.３（１/５００〜１/７５０、ファリスおよびヒクソン（R．Faris and D．Hixon，Brown University，Providence，In）からの贈り物）と共に、同時に４℃で４０分間インキュベーションすることにより懸濁液内で標識した。ＯＸ−４３は、マクロファージおよび赤血球細胞の亜集団である内皮細胞上の抗原を認識し(Barclay，Immunology，Vol．42，pp．593-600（1981）およびRobinson et al.，Immunology,Vol．57,pp．231-237（1986）参照)、そして３７４.３は胆管細胞および造血細胞である、門脈域介在部の卵形細胞を認識する(Hixon et al.，Pathology：Liver Carcinogenesis，pp．65-77（1990）参照)。第二の抗体は、長鎖（heavy chain）に特異的なＰＥ結合抗マウスＩｇＧ（Southern Biotechnology Inc.，AL）および長鎖に特異的なＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＭ（Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO）であった。陰性対照は、標識を有しない細胞およびマウスイソタイプ対照の標識を有する細胞を包含していた。
【００３０】
分離捕集前後の細胞は、４℃でＨＢＳＳ内に維持した。抗体標識の完了後、最終濃度１０μｇ/ｍｌのプロピオジウムイオジドをそれぞれの試料の管に添加した。出力６０ｍＷおよび１００μｍのノズルを備え、４Ｗアルゴンレーザーを用いた機械（Becton Dickinson FACSTARPLUS，San Jose，CA）にて蛍光励起細胞分離捕集を行った。４８８ｎｍ励起での蛍光放出は、ＦＩＴＣに関しては５３０/３０ｎｍバンド通過フィルターを通過した後、そしてＰＥに関しては５８３/４２ｎｍバンド通過フィルターを通過した後に収集した。蛍光測定は、ＦＬ１（ＦＩＴＣ）対ＦＬ２（ＰＥ）の２変数プロットに対する対数増幅を用いて行った。蛍光が陰性対照細胞の９５％を越えた場合に、細胞が陽性であるとした。
【００３１】
細胞の物理的性質の測定のために、ＦＡＣＳＴＡＲplus変数をＦＳＣゲイン８（FSC gain 8）およびＳＳＣゲイン８とした。これらの設定は、この尺度で全ての細胞を視覚化させることを可能にした。ＨＢＳＳをシース（sheath）液として利用した。分析のために、少なくとも１０,０００の事象を測定した。リスト形式のデータを獲得し、そしてライシスＩＩ（LysisII）ソフトウエアを用いて分析した。死んだ細胞は、未標識細胞に対するプロピジウムイオジド蛍光ヒストグラムを用いて排除した。
【００３２】
１つの抗体に対する陽性さ（positivility）の測定のために、蛍光対側面散乱のドットプロットを使用した。ＦＬ１対ＦＬ２の密度プロットを、両方の抗体の発現に関して選択集団に対して使用した。非方形排除（non-rectangular gating）および対象の選択集団に対する他変数排除の使用のために、分離捕集濃縮モジュールを利用した。
【００３３】
全ての集団の妊娠１４日目のものに由来するショーテッド細胞(shorted cells)を、αＭＥＭを添加した、血清を含有せずホルモン既知の培地内に入れたが、この培地には次の成分が添加されていた。即ち、インシュリン(１０μｌ/ｍｌ)、ＥＧＦ(０.０１μｇ/ｍｌ、Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY)、成長ホルモン(１０μＵ/ｍｌ)、プロラクチン(２０ｍＵ/ｍｌ)、トリイオドチロニン(１０-7Ｍ)、デキサメタソン(１０-7Ｍ)、鉄飽和トランスフェリン(１０μｇ/ｍｌ)、フォリニン酸(１０-8Ｍ、Gibco BRL，Grand Island，NY)、遊離脂肪酸混合物(７.６ｍＥｑ/Ｌ、チェスベフら（Chessbeuf et al.，1984）に記載の通り、Nu-Chek-Prep，Elvsian，MN)、プトレッシン(０.０２μｇ/ｍｌ)、ヒポキサンチン(０.２４μｇ/ｍｌ)、チミジン(０.０７μｌ／ｍｌ)、ウシアルブミン（０.１％画分Ｖ、脂肪酸含有せず、Miles Inc.，Kankakee，IL）であり、これに微量成分として、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ（０.０００００２５ｍｇ/ｌ）、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ(０.８ｍｇ/ｌ)、ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ(０.０００００２４ｍｇ/ｌ)、（ＮＨ4）6Ｍｏ24・Ｈ2Ｏ(０.００１２ｍｇ/ｌ)、ＮｉＣｌ2・６Ｈ2Ｏ(０.００００１２ｍｇ/ｌ)、ＮＨ4ＶＯ3(０.００００５８ｍｇ/ｌ)、Ｈ2ＳｅＯ3(０.０００３９ｍｇ/ｌ)を添加し、さらにヘペス（Hepes、３１ｍＭ）およびゲンタマイシン（１０μｇ/ｍｌ、Gibco BRL，Grand Island，NY）を添加した。試薬は特に断らない限り、シグマ（Sigma Chemical Company，St．Louis,Mo）から供給された。微量成分混合物は、レミスカ博士（Dr．I．Lemishka，Princeton University，NJ）からの贈り物であった。
【００３４】
培養皿および種々の細胞懸濁液のサイトスピン（cytospins）を氷冷エタノールまたはアセトンで固定した。室温下に３０分間かけて１％ＢＳＡ含有ＰＢＳでブロックした後、固定細胞を下記の第一の抗体を用いた間接免疫蛍光により研究した。使用した抗体は、ポリクローナルウサギ抗ラットアルブミン(United States Biochemical Corporation，Cleveland，OH)、ウサギ抗マウスＡＦＰ抗血清(ICN Biomedical，In.，Costa Mesa，CA)、モノクローナルマウス抗ヒトサイトケラチン１９(Amersham Life Science，Arlington Heights，IL)、ポリクローナルウサギ抗ヒトＩＧＦＩＩ受容体(ゼチ博士（Dr．Micheal Czech，University of Worchester，MA）の贈り物)、マウスモノクローナル抗ラット−Ｔｈｙ−１(ＯＸ−７、Bioproducts for Science，Indianapolis，IN)、モノクローナルマウス抗デスマイン(desmin)(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）および生後の肝細胞および幾つかの胎児肝実質細胞を同定するモノクローナルマウス抗ラット抗体である２５８.２６（ファリスおよびヒクソン両博士（Drs.R．Faris and D．Hixon，Brown Univeersity，Providence，In）からの贈り物）であった。第二の抗体は、第一の抗体に対応する、種特異的ローダミン結合抗体を包含していた。陰性対照は、マウスまたはラットのＩｇＧで染色した細胞もしくはマウスのイソタイプ対照からなっていた。単離直後の成人肝細胞をアルブミン染色の対照として使用した。ルテンバーグらの文献（Rutenberg et al.，J．Hist．Cyt.，Vol．17，pp．517-526，1969）に記載の方法を用いたエタノール固定細胞に対する免疫化学により、ガンマ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）をアッセイした。
【００３５】
特定のｍＲＮＡの存在に関してノーザンブロット分析を行うために、コンチェンスキらの文献（Chomcznyski et al.，Anal．Biochem.，Vol．162，pp．156-159，1987）に記載の方法通り、グアニジウムイソチオシアネート法を用いて分離捕集細胞から全てのＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ試料を、１％アガロースホルムアルデヒドゲルを通した電気泳動法により３−(Ｎ−モルホリノ)プロパンスルフォン酸緩衝液中に再度溶解させた。次いで、ＲＮＡをジーンスクリーン（Gene Screen，New England Nuclear，Boston，MA）に移し、フィルターを予備ハイブリダイゼーションさせ、そして適切なプローブとハイブリダイゼーションさせた。特定のｍＲＮＡと相補的なｃＤＮＡクローンを、フェインバーグらの文献（Feinberg et al.，Anal．Biochem.，Vol．137，pp．266-267，1984）に記載の通り、32Ｐ ｄＣＴＰを用いたプライマー伸長により放射標識した。ハイブリダイゼーションに用いたｃＤＮＡは、ラットアルブミン(ゼーン博士（Dr．Zern，Jefferson University，Philadelphia，PA）の贈り物)、およびマウスα−フェト蛋白質(Dr．Tighlman，Princeton，NJ)、ＧＧＴ（マンソン博士（Dr．Manson，MRC Medical Research Council，Surrey，UK）から得た）ならびにＰＧ１９であった。オートラジオグラムは線密度測定器（Model 920: Manufacturer's Cambridge Instrument）を用いてスキャンした。それぞれの遺伝子に関するデータは慣用の遺伝子１８Ｓのデータ（J．Darnell，Rockefeller University，New York，NY）に対して正規化した。
【００３６】
ウエスターンブロット分析を行うために、種々の分離捕集細胞からの全ての蛋白質試料を１０％ポリアクリルアミドミニゲルに供した。スロット当たり１００,０００細胞の等しい細胞数とすることで負荷を標準化した。電気泳動およびそれに引き続くニトロセルロース膜（Scheicher and Schuell，Keene，NH）への電気的ブロッティングを行った。４℃にて２％ドライミルク溶液内でブロットを一晩でブロックし、ブロック溶液内で１：５０に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ（Amersham Life Science，Arlington Heights，IL）と共に１時間インキュベーションした後、ブロック溶液内で１：８００に希釈したウサギ抗ラットアルブミン抗血清を用い、室温下に１時間かけてアルブミンに関するアッセイを行った。検出は、ブロットをＥＣＬ−ケミルミネッセンスキット試薬（ECL-chemiluminescence kit reagents，Amersham Life Science，Arlington Heights，IL）と共に１分間インキュベーションし、続いてオートラジオグラフを撮影して行った。
【００３７】
レイドの文献(Reid，Methods in Molecular Biology，The human Press，Inc.，Vol．5，pp．237-276，1990)に記載の通り、ラット尾部の鍵から抽出したタイプＩコラーゲンを用いて４８ウエルプレートを被覆した。５０,０００〜１００,０００細胞/ｃｍ2の間の密度の分離捕集細胞をウエル毎に入れた。接着させるために一晩おいた後、接着していない細胞を有する培地を穏やかに除去し、新鮮な培地で置換した。２４時間毎に完全に培地を交換した。細胞を、３７℃で、５％二酸化炭素を含有する、完全に飽和した湿度を有する空気中で培養し、毎日観察した。４日間の培養後、細胞を氷冷エタノールで固定し、そして後述の通り、アルブミン、ＡＦＰ、ＣＫ１９およびＩＧＦＩＩ受容体に対しては免疫蛍光により、かつＧＧＴに対しては免疫化学により、その場で染色した。
【００３８】
妊娠１４日目の胚由来肝臓をＥＧＴＡ−コラーゲナーゼ分解により単離し、単細胞懸濁液と無視できる数の細胞凝集を得た。細胞の生存度は、トリパンブルーの排出により測定して９５％より大きかった。細胞収量は、肝臓当たり２.６２±０.３１ｘ１０6細胞であった。取得した細胞懸濁液を、ウサギの抗ラットＲＢＣＩｇＧ被覆したポリスチレン皿を用いた免疫接着（「パンニング」）の２つの工程に供した。２つのパンニング工程の完了後の細胞の回収は、５１％（±８％）であったが、異なる抗体ロットにより変化した。
【００３９】
ＲＢＣ−パンニング後に回収された細胞を、２つの抗体の混合物を用いて懸濁液中で染色した。用いた抗体は、「門脈域介在部の卵形細胞」に対して生起された抗体（モノクローナル抗体３７４.３）およびラットにおいて上皮細胞ならびに幾つかの赤血球細胞および骨髄細細胞を認識することが知られている商業的に入手可能な抗体（モノクローナル抗体ＯＸ−４３）であった適切なＦＩＴＣおよびＰＥ標識抗体と共にインキュベーションした後、細胞をその蛍光パターンに関して分析した。図１、パネルＡに示す如く、両方の抗体に関する蛍光強度を互いに対してプロットしたときに、Ｒ１〜Ｒ５として示した５つの異なる集団が観察された。それぞれの集団毎にその割合に若干の差はあるが、５つの集団を形成する細胞の分布は極めて再現性が高かった。この小さな差異は、ＲＢＣパンニング後の細胞の回収割合の変動により説明することができる。
【００４０】
免疫蛍光による分離捕集細胞の最初の分析は、ＯＸ−４３陽性細胞集団の１つ（Ｒ２）においてアルブミンおよびＡＦＰに対して陽性な細胞の存在を明らかにした。より大きくかつより複雑なこれらの細胞は、このゲート(gate：分別基準)内に細胞の約５〜１０％を含んでいた。しかし、分離捕集直後の細胞をエピ蛍光顕微鏡下で見ると、より大きなこれらの細胞はＯＸ−４３に対して陰性であるように思われた(ＰＥ未標識)。肝臓内の実質細胞は有意な程度の自己蛍光を有しており、この自己蛍光は、肝臓の成熟に連れて、ＦＡＣＳでの側面散乱により測定された細胞の複雑性と平行して増大した。従って、幾つかの実質細胞がＯＸ−４３陽性細胞の領域に出現するが抗原を発現しないという現象によるものであると仮定することができる。この仮説を確かめるために、ＯＸ−４３に対する陽性さを、ＦＬ２スケールで測定した（図１、パネルＢ）如く、側面散乱（細胞の顆粒度）対ＰＥ蛍光について正確に測定し、そしてＯＸ−４３陽性細胞および陰性細胞を分離捕集して特性付けた。分離捕集の正確性を測定するために、同様の現在の設定を用いて、分離捕集細胞から再度分離捕集後獲得物を得た。典型的な分離捕集後の純度（即ち、再度の分離捕集後に分析したときに、同一の領域に出現した少数化した集団（shorted population）からの細胞の割合）は＞９０％であった。
【００４１】
ＯＸ−４３陽性および陰性の両方のゲートからの分離捕集細胞を、ウエスターンブロットおよび間接免疫蛍光による肝臓に特異的な遺伝子の発現に関してアッセイした。図２のパネルＢに示したとおり、ＯＸ−４３陰性細胞と比較して、ウエスターンブロットによる検出で、ＯＸ−４３陽性細胞画分内に最小限の量のアルブミンが存在した。分離捕集されたＯＸ−４３陽性細胞のサイトスピンに対する間接免疫蛍光ではＡＦＰ陽性細胞は示されなかったが、これは３０％のＯＸ−４３陰性細胞が胎児肝臓マーカーを発現していたのと対照的である。妊娠１４日目においては全ての胎児肝実質細胞がＯＸ−４３陰性であると結論された。従って、「より明確な」ゲートを達成するために、ＯＸ−４３陽性および陰性細胞がＳＳＣ対ＦＬ２プロットにより分けられ、そして別々に染色された。
【００４２】
ＯＸ−４３陽性細胞を電気的に閉め出して、残りの細胞をＦＬ１対ＦＬ２プロット上で見てみると、閉め出されていない細胞懸濁液におけるＲ３〜Ｒ５に相当する３つの別々の集団を容易が検出された。Ｒ３内の細胞は全て３７４.３陽性であり、Ｒ４内の細胞の３０％がそのマーカーに対して陽性であった。Ｒ５細胞はＯＣ.３を発現しなかった。種々の肝臓に特異的な遺伝子およびその他の遺伝子の発現をＲ３〜５から分離捕集された細胞について研究した。その結果を下記表１にまとめて示す。
【００４３】
【表１】
2004339227.tif 000002
【００４４】
Ｒ３細胞の約２〜３％（未分別細胞全体の０.２％未満）が、アルブミンおよびＡＦＰに関して強く染色された。また、これらは胆管系列のマーカーであるＧＧＴおよびＣＫ１９も発現した。しかし細胞の過半数は小さい芽細胞様細胞に見え、肝臓に特異的な遺伝子を発現していなかったが、Ｔｈｙ−１およびセログリシン等の古典的造血細胞マーカーを発現していた（表１および図の３と４参照）。肝実質細胞の多くは、Ｒ４ゲート内に認められた（表１および図３参照）。かなり多くの細胞が、全て胎児肝実質細胞のマーカーであるアルブミン、ＡＦＰおよびＧＧＴを発現していた。このゲート内には造血細胞および脂肪貯蔵細胞のマーカーは検出されなかった。Ｒ５として表された細胞集団は、主として２つ細胞タイプを含む不均質な集団である（図４参照）が、その細胞タイプは（１）形態学的に正赤芽球のように思われる細胞と（２）実質細胞肝臓遺伝子（parenchymal liver genes）を発現しない簡素で小さな細胞である。これらの２つの細胞タイプ間の比率は幾らか変動し、ＲＢＣパンニングの効率に依存していた。
【００４５】
全てのＯＸ−４３陰性細胞を閉め出した場合には、ＦＬ１/ＦＬ２プロット上に２つの別々の集団が観察される。期待通り、これらの細胞内には実質細胞肝臓マーカーは検出されなかった。僅かなＲ２細胞が、脂肪貯蔵細胞内に通常発現される中位のフィラメントであるデスミンに対する抗体により染色された。形態学的にはＲ２細胞の多くは初期赤血球前駆体であるように思われた（図４参照）が、それらの細胞の１０％がＴｈｙ−１を発現した。過半数の細胞は小さく芽細胞様であり、そして試験したどのマーカーも発現していなかった。その他の、このゲート内の細胞の２０％は、薄い細胞質を有するより大きな細胞であり、ＩＧＦ−ＩＩに対する受容体を発現していた。Ｒ１からの非常に僅かな細胞がＴｈｙ−１に関して染色された。
【００４６】
５つの集団全てから分離捕集した細胞を４日間培養して生体外での分化可能性を測定した。既述のような条件下に高密度で蒔いたときに、Ｒ４細胞は非常に僅かの分散した間質細胞に取り囲まれた上皮細胞の集塊を作った(図５Ａおよび下記表２参照)。
【００４７】
【表２】
2004339227.tif 000003
【００４８】
細胞分裂は、培養体の上皮および間質成分の双方において明白に起こった。培養２日目、ブロモーデオキシーウリジン（ＢｒｄＵ）を含有する培地と共に１時間インキュベーションした後に、上皮細胞の２５％はＢｒｄＵの取り込みを示した。ＲＢＣパンニングを行ったが分離捕集は行わなかった妊娠１４日目の細胞を同様の条件下に置いたところ、これらの細胞は少なくとも１０日間生存した(データ示さず)。しかし、分離捕集したＲ４細胞の集塊は急速に変敗した。上皮細胞は、血清の存在下に成人肝細胞の初期培養中に見られると同様に、古典的な多角形状を失って伸展した。さらに、アルブミン、ＡＦＰおよびＧＧＴに関してその場で染色したときに、集塊したＲ４細胞はこれらの肝臓に特異的な遺伝子の緩やかな減衰を示したが、ＲＢＣパンニングした妊娠１４日目の細胞は同様の条件下に遺伝子発現を維持した(データ示さず)。ＩＧＦ−ＩＩ受容体は残り、そして集塊した上皮細胞および間質細胞のゴルジ体内に検出された。集塊したＲ４細胞の約３０％が、胆管細胞内に存在し成人肝細胞内には存在しないサイトケラチンであるＣＫ１９に関して染色されることを示した。
【００４９】
その他の４つの集団全てからの細胞を同様の条件下に置いたときには、光を散乱させる繊維芽細胞様細胞（しかし上皮細胞コロニーではない）が僅かだけ観察された。Ｒ３細胞の肝実質的な性質にも関わらず、類似の培養条件下ではこれらの細胞由来の上皮細胞コロニーを得ることができなかった。これは、このゲート内における上皮細胞の低い密度のためである可能性がある。これらの細胞は懸濁液中で凝集して約４８時間生存し、そして死んだ。タイプＩまたはタイプＩＩコラーゲン、フィブロネクチンあるいはラミニンを、単独で、または組合わせて用いて皿を被覆することは、これらの細胞の接着または生存を改善しなかった(データ示さず)。
【００５０】
実施例 ＩＩ 妊娠の持続期間が既知のフィッシャー３４４ラットをハーラン（Harlan Sprague Dawley，Inc.，Indianapolis，IN.）から取得し、そして標準ラット食餌および１２時間昼サイクルで、本学（Albert Einstein College of Medicine,Bronx，Ny）の飼育施設にて維持した。慣習通り、妊娠の最初の日を妊娠０日目とした。動物の使用は実験動物の飼育と使用に関するＮＩＨの指針に従って行い、本学の動物の飼育および使用に関する委員会により承認された。
【００５１】
妊娠１５日目の妊娠ラットをエーテルにて安楽死させ、胚を調達した。次いで、胎児から肝臓を切り出して計量し、ＣＡ+2を含有せず、０.８ｍＭ ＭｇＣｌ2および２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有した氷冷ハンクス溶液（Hank's Balanced Salt Solution，pH7.3；ＨＢＳＳ）内に入れ、そして室温下に１分間、穏やかに攪拌した。非肝臓組織を除去した後、肝臓を穏やかに磨砕し、次いで、１ｍＭ ＣａＣｌ2含有ＨＢＳＳ中の０.６％タイプＩＶコラゲナーゼ(Sigma Chemical Co.，Lot 11H6830，St．Louis，MO)、および０.０６％ＤＮＡｓｅ（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）と共に、エーレンマイヤーフラスコ内で３７℃にて１０〜１５分間攪拌した。５分間放置した後、組織断片を１ｇで沈殿させた。上澄みを回収し、新鮮なコラゲナーゼ溶液を添加した。分散した細胞をプールし、５ｍＭ ＥＧＴＡ含有ＨＢＳＳに懸濁し、そして４６μｍ組織収集器（Bellco Glass，Inc.，Vineland，NY）を通して濾過した。得られた細胞懸濁液を４℃で５分間、４５０ｇにて遠心した。細胞ペレットを、０.２ｍＭ ＥＧＴＡおよび０.５％ＢＳＡを含有したＨＢＳＳ（ＨＢＳＳ−ＥＧＴＡ−０.５％ＢＳＡ）に再懸濁し、そしてコールター計測器（Coulter Counter，Coulter Electronics，Inc.,Hialeah，FL）を用いて細胞数を評価した。０.０４％トリパンブルーの排出により細胞生存度をアッセイし、そして懸濁液の一定部分を風袋用マイクロ遠心管に入れ、４５０ｇにて５分間遠心した。
【００５２】
造血細胞および内皮細胞を抗体被覆したポリスチレン皿に免疫接着させるために、ウイソキとサト（Wysocki and Sato）の方法に従いパンニング皿を調製した。採用した抗体は、ウサギ抗ラットＲＢＣＩｇＧ(Inter-cell Technologies，Inc.，Hopewell，NJ)およびマウスの全ＩｇＧ分子に対するヤギＩｇＧ（M-3014,Sigma,St．Louis，MO）を包含していた。１０ｍｌの０.０５Ｍトリス（ｐＨ９.５で希釈した抗体（０.５ｍｇ/皿）を１００ｍｍ2微生物学用ポリスチレンペトリ皿に注ぎ入れてその表面を均等に被覆し、室温下に４０分間インキュベーションした。使用に先だって被覆した皿をＰＢＳで４回洗浄し、そして０.１％ＢＳＡ含有ＨＢＳＳで１回洗浄した。
【００５３】
３ｘ１０7までの細胞を含有する細胞懸濁液を３ｍｌに分け、これをウサギの抗ラットＲＢＣＩｇＧで被覆した皿に入れて４℃で１０分間インキュベーションした。接着しなかった細胞を含有する上澄みを穏やかに吸い取って除去し、そして皿を傾けたりぐるぐる回したりしながら７ｍｌのＨＢＳＳ−ＥＧＴＡ−０.１％ＢＳＡで３回洗浄した後、４℃で５分間、４５０ｇの遠心に供した。２つの皿からの細胞をプールし、そしてウサギ抗ラットＲＢＣＩｇＧで被覆した新鮮な皿を用いて再度パンニングした。上記と同様にして非接着細胞を除去して、１ｘ１０7/ｍｌの濃度となるようにＨＢＳＳ−ＥＧＴＡ−０.１％ＢＳＡを用いて再懸濁した。次いで、濃縮された肝芽細胞をマウスモノクローナル抗体ＯＸ−４３（１５μｇ/ｍｌ、MCA276，Serotec，Indianapolis，IN）およびモノクローナル抗体ＯＸ−４４（１８μｇ/ｍｌ、MCA371，Serotec，Indianapolis，IN）と共に、同時に４℃で４０分間インキュベーションした。ＯＸ−４３はマクロファージ、内皮細胞および赤血球細胞上の抗原を認識し、そしてＯＸ−４４は、全てのラット骨髄細胞および末梢リンパ細胞上に存在し且つヒト白血球抗原ＣＤ３７と関係がある膜−糖蛋白質であるＣＤ５３を認識する。洗浄して過剰な抗体を除去した後、ヤギ抗マウス全ＩｇＧ抗体で被覆した皿内で４℃にて１０分間、細胞をパンニングし、そして上記の通りにして非接着細胞を除去した。
【００５４】
種々の細胞懸濁液のサイトスピンを氷冷エタノールまたはアルコール、アセトンおよびカルボワックス１５４０（Fix-Rite，Richard-Allan Medical Industries，Richland，MI）を用いて固定した。反応をブロックした後、β−ガラクトシダーゼ（BioGenex，San Roman，CA）と共にウサギ抗のラットアルブミンＩｇＧ（USB Corp.，Cleveland，OH）またはウサギ抗マウスＡＦＰ抗血清（ICN ImmunoBiologicals，Lisle，IL）を第一の抗体として用いたビオチン/ストレプトアビジン法または間接免疫蛍光により、固定した細胞を免疫染色した。陰性対照は、第一の抗体を除いたものを用いて染色した細胞からなっていた。アルブミン染色のための陽性対照には単離直後の成人肝細胞を充てた。
【００５５】
ノーザンブロット分析を行うために、パンニング前後の細胞およびパンニング皿に接着した細胞からグアニジウムイソチオシアネート法を用いて全てのＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ試料を、１％アガロースホルムアルデヒドゲルを通した電気泳動法により、３−(Ｎ−モルホリノ)プロパンスルフォン酸緩衝液中に再度溶解させた。次いで、ＲＮＡを、予備ハイブリダイゼーションさせてあったジーンスクリーン（Gene Screen，New England Nuclear，Boston，MA）に移した後、適切なプローブとハイブリダイゼーションさせた。特定のｍＲＮＡと相補的なｃＤＮＡクローンを、32Ｐ ｄＣＴＰを用いたプライマー伸長により放射標識した。使用したｃＤＮＡは、ラットアルブミン、マウスＡＦＰおよびマウス１８Ｓ（J．Daenell，Rockfeller University，NY）であった。オートラジオグラムは線密度測定器（Model 920: Manufacturer's Cambridge Instrument）を用いてスキャンした。それぞれの遺伝子に関するデータは慣用の遺伝子１８Ｓのデータに対して正規化した。
【００５６】
妊娠１５日目における造血細胞および内皮細胞のマーカーに関する分離捕集およびＦＡＣＳ分析を行うために、種々の段階の濃縮物の細胞懸濁液を、本学（The Albert Einstein College of Medicine，Bronx，NY）のＦＡＣＳ設備内で流動細胞計測法により分析した。細胞を１ｘ１０7細胞/ｍｌとなるように再懸濁し、ＯＸ−４３およびＯＸ−４４と共に、またはＯＸ−４３のみと、４℃で４０分間インキュベーションした後、引き続き、ＦＩＴＣと結合した抗マウスＩｇＧと４℃で４０分間インキュベーションした。ＦＩＴＣと結合した抗マウスＩｇＧによってだけ染色された細胞を陰性対照として供した。
【００５７】
流動細胞計測法は１５ｍＷの空冷アルゴンレーザーを備えた機械（Becton-Dickinson FACScan，San Jose，CA）にて行った。細胞の分離捕集は出力６０ｍＷおよび１００μｍのノズルを備え、４Ｗアルゴンレーザーを用いた機械（Becton Dickinson FACSTARPLUS，San Jose，CA）にて行った。双方の測定において、４８８ｎｍ励起での蛍光放出を、ＦＩＴＣに関して、５３０/３０ｎｍバンド通過フィルターを通過した後収集した。蛍光測定は対数増幅を用いて行った。蛍光が陰性対照細胞の９５％を越えた場合に、細胞が陽性であるとした。
【００５８】
細胞の物理的性質の測定のために、正面散乱（ＦＳＣ）に関しては、検出器値（detector value）を中範囲増幅したＥ−１とした。側面散乱（ＳＳＣ）に関しては、検出器値は１の増幅を有する中範囲であった。ＦＡＣＳＴＡＲplus変数の等量（equivalent）はＦＳＣゲイン４およびＳＳＣゲイン８であった。これらの設定は、スケール上で全ての細胞を視覚化させることを可能にした。ＦＳＣおよびＳＳＣによる閉め出しは、線形増幅を用い、両変数を２５６の任意の単位（Ａ.Ｕ.）に分割して行った。分析のために、少なくとも１０,０００の事象を測定した。リスト形式のデータを獲得し、そしてライシスＩＩ（LysisII）ソフトウエアを用いて分析した。分離捕集前後の細胞は、ＨＤＭ添加補給物に関して詳述した通り、インシュリン、トランスフェリン、遊離脂肪酸、微量成分、アルブミンおよびゲンタマイシンを補給したＨＢＳＳ内にて、４℃で維持した。
【００５９】
次に、造血細胞および内皮細胞のマーカーの多変数流動細胞計測法を、門脈域介在部位の卵形細胞抗原ＯＣ.３に関して行った。単離した細胞を、ＯＸ−４３およびＯＸ−４４(マウスＩｇＧ)、ならびにモノクローナル抗体３７４.３（マウスＩｇＧ、Hixson and Feris，Brown University，Providence，RI）の組合せを用い、引き続いてＦＩＴＣと結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（長鎖特異性、So Biotech，Birmingham，AL）およびＰＥと結合したヤギ抗マウスＩｇＭ（長鎖特異性、So Biotech，Birmingham，AL）を用いて標識した。ＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧおよびＰＥ結合抗マウスＩｇＭだけを用いて染色した細胞を陰性対照として供した。プローブの１つに対する蛍光の度合いおよび側面散乱による細胞の複雑性の測定（細胞質小器官の度合い）の両方について、細胞を評価した。
【００６０】
妊娠１５日目の肝臓からの細胞をラット赤血球細胞抗体に対してパンニングし、外皮細胞に富む細胞懸濁液を、基本培地としてαＭＥＭを含有し、血清を含有せずホルモン既知の培地に蒔いた。この培地には下記の成分、即ち、インシュリン(１０μｇ/ｍｌ)、ＥＧＦ(０.０１μｇ/ｍｌ、Upstate Biotechnology，Lake Plasid，NY)、生長ホルモン(１０μＵ/ｍｌ)、プロラクチン(２０ｍＵ/ｍｌ)、グルカゴン（１０μｌ/ｍｌ）、トリイオドチロニン(１０-7Ｍ)、デキサメタゾン(１０-7Ｍ)、鉄飽和トランスフェリン(１０μｇ/ｍｌ)、フォリン酸(１０-8Ｍ、Gibco BRL，Grand Island，NY)、遊離脂肪酸混合物(０.７６ｍＥｑ/ｌ、チェスベフら（Chessbeuf et al.，1984）に記載の方法の変形、Nu-Chek-Prep，Elvsian，MN)、プトレッシン(０.０２μｇ/ｍｌ)、ヒポキサンチン(０.２４μｇ/ｍｌ)、チミジン(０.０７μｇ/ｍｌ)、ウシアルブミン（０.１％画分Ｖ、脂肪酸含有せず、Miles Inc.，Kankakee，IL）と、微量成分としてＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ(０.０００００２５ｍｇ/ｌ)、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ(０.８ｍｇ/ｌ)、ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ(０.０００００２４ｍｇ/ｌ)、（ＮＨ4）6Ｍｏ24・Ｈ2Ｏ(０.００１２ｍｇ/ｌ)、ＮｉＣｌ2・６Ｈ2Ｏ(０.００００１２ｍｇ/ｌ)、ＮＨ4ＶＯ3(０.００００５８ｍｇ/ｌ)、Ｈ2ＳｅＯ3(０.０００３９ｍｇ/ｌ)を添加し、さらにヘペス（Hepes、３１ｍＭ）およびゲンタマイシン（１０μｇ/ｍｌ、Gibco BRL，Grand Island，NY）を添加した。試薬は、特に断らない限り、シグマ（Sigma Chemical Company，St．Louis，Mo）から供給された。微量成分混合物は、レミスカ博士（Dr．I．Lemishka，Princeton University，NJ）からの贈り物であった。
【００６１】
ＥＨＳ腫瘍から抽出したタイプＩＶコラーゲンを用いて２４ウエルプレートを被覆した。パンニングされた細胞を、１２,５００および２５,０００細胞/ｃｍ2の間の密度でウエル毎に蒔き、４〜５時間に亘って細胞がプレートに接着することを可能にした。その後、非接着細胞を含有する培地を穏やかに除去し、新鮮な培地で置き換えた。細胞を５％二酸化炭素を含有し、完全な飽和湿度を有する空地中で３７℃にて培養し、５〜１６日の間、毎日観察した。４８時間毎に完全に培地を交換した。
【００６２】
培養開始後、種々の時点で、細胞を氷冷エタノールにて固定し、免疫化学またはアルブミンおよびＡＦＰに関する免疫蛍光によりその場で染色した。
【００６３】
妊娠１５日目における肝臓の重量は９.１±１.３ｍｇであった。コラゲナーゼ処理は肝臓を完全に分解し、そして最小限の粒状のものだけが組織篩いによって排除された。この工程で得られた細胞の数は１.０７ｘ１０-7/肝臓であり、解離した細胞の重量は、この器官の全重量の９５％にあたる８.６±１.１ｍｇ/肝臓であった。懸濁液はほぼ完全に単離細胞からなり、僅かに小さな凝集体があったが、この凝集体は、ＥＧＴＡの不在および４℃以上の温度の下で、その大きさおよび数を増加させた。トリパンブルー排出による生存度は９０％を越えていた。
【００６４】
それぞれのパンニングの後、位相鎖顕微鏡観察は接着細胞が赤血球細胞形態を呈することを示した。極僅かの細胞だけが、免疫化学法による測定でアルブミンに関して陽性であった。赤血球を除去するためにウサギ抗ラット赤血球細胞抗体で被覆した皿を用いてパンニングした後、および次いでＯＸ４３/ＯＸ４４+細胞の数を減少させるためにヤギ抗マウス全分子ＩｇＧ抗体で被覆した皿を用いてパンニングした後、非接着細胞はそれぞれ、分散直後の胎児肝臓（最初の懸濁）の細胞数の２９±５％、および１６±４％であった。パンニングは肝臓組織に対して、全ての胎児および誕生直後の年齢において成功したことが証明されたが、発達齢に伴う造血成分の変動が濃縮の度合いを相違させるという結果をもたらした(データ示さず)。また、ＲＢＣパンニング手法の効率は抗体のロットにより変動した。しかし、直接パンニングには貧弱な効率の抗体を用いて、懸濁液中で細胞を標識し、その後に抗ウサギＩｇＧ被覆ペトリ皿を用いたパンニングが続く間接免疫接着は成功した。
【００６５】
肝臓分散に続く位相鎖顕微鏡観察では、優占細胞タイプは小さな赤色細胞であり、この細胞は初期赤血球細胞の形態と一致する形態を有していた。また、より大きな空胞化した細胞も存在した。免疫細胞化学は、この空胞化した細胞および数の少ないより小さな卵形細胞の大部分がアルブミンおよびＡＦＰに対して強い陽性であることを示した(図７参照)。濃縮物の種々の段階におけるアルブミンおよびＡＦＰ陽性細胞の割合を下記表３に示す（表３および図６参照）。
【００６６】
【表３】
2004339227.tif 000004
【００６７】
肝臓に特異的な遺伝子（アルブミンおよびＡＦＰ）に関するノーザンブロット分析を、パンニング前後の細胞に対して行った。それを図８に示す。パンニング後の細胞は、ＡＦＰｍＲＮＡに関しては５倍まで、およびアルブミンｍＲＮＡに関しては２倍まで濃縮されていた。この知見は、パンニング手法および（成熟肝細胞とは反対に）高濃度の肝芽細胞の成功の両方を示すものである。無視できるレベルのアルブミンおよびＡＦＰのｍＲＮＡが、パンニング皿に接着した細胞内に認められた。
【００６８】
造血細胞および内皮細胞を除去する効率を測定するために、種々の段階の濃縮物の細胞を、マクロファージ、内皮細胞および赤血球を認識するＯＸ−４３の存在ならびに骨髄細胞および末梢リンパ細胞を認識するＯＸ−４４の存在に関して、流動細胞計測法により分析した。その結果を図６および表３に示す。最初の細胞懸濁液におけるＯＸ−４３/ＯＸ−４４に対して陽性な細胞の割合は、８７.９±２.５％であった。抗ラットＲＢＣＩｇＧと抗マウス全ＩｇＧ抗体とを組み合わせたパンニング手法は細胞の８４％を除去した。非接着性細胞の６９±１０.０％が依然としてＯＸ−４３/４４マーカーに対して陽性であったが、肝芽細胞の割合は劇的に（５倍に）高められた。付加的なパンニングはＯＸ−４３/４４+細胞集団をさらに減少させ得るが、すでにパンニングにより、ＯＸ−４３/４４+細胞を排除する過程を完了させるためのＦＡＣ分離捕集を可能にするには充分な位に細胞の数が減少させられていることが判明した。
【００６９】
流動細胞計測法により測定したところ、胎児肝細胞は、細胞の大きさの測定であるＦＳＣに関して、そして細胞質の複雑さの測定であるＳＳＣに関して、不均質な集団から構成されていた。細胞学的には、細胞の大きさは広大な範囲に亘っている（コーター計測器による測定で５〜１５μ、データ示さず）が、細胞の大きさが肝細胞を実質細胞前駆細胞から分けることに有用であるとは認められなかった。むしろ、集団同士は、ＳＳＣを用いることにより最も良く分離された。顆粒状細胞対無顆粒状細胞の定義は、蛍光対側面散乱の２変数プロットを用いた側面散乱に関する線形尺度に基づき決定した。集団のプロフィールに基づいて、通常は、５０Ａ.Ｕ.を無顆粒状細胞として顆粒状細胞と区別した。
【００７０】
ＳＳＣ対蛍光を用いることで、胎児肝細胞を３つの集団に分けることができる。それは、内皮細胞および／または骨髄細胞のマーカーに対して陽性な無顆粒状細胞（Ｒ１集団）ならびにＯＸ４３/ＯＸ４４マーカーに対して陰性で無顆粒状の細胞（Ｒ２）および顆粒状の細胞（Ｒ３）である（図９参照）。陽性と陰性との間の分画は、顆粒状細胞のより強い自己蛍光のために、より顆粒状の集団においてはより無顆粒状の集団よりも高かった。分離捕集されたＦＡＣＳ集団の分析は、それぞれ、Ｒ１集団内の細胞の１％未満およびＲ２集団内の細胞の３.０±０.７％がＡＦＰに対して陽性であったことを明らかにした。しかし、上記マーカーに対して陰性な顆粒状細胞（Ｒ３）の７５.１±４.７％は、免疫細胞化学による測定で、ＡＦＰに対して陽性であった（下記表４参照）。
【００７１】
【表４】
2004339227.tif 000005
【００７２】
ＯＸ−４３/ＯＸ４４+細胞を有する集団の内で分析された唯一の集団であるＲ１細胞集団の複像分析（double image analysis）は、ＯＸ−４３/４４陽性とＯＣ.３との広範な重複を明らかにした。ＯＸ−４３/ＯＸ−４４に関するＦＡＣＳパターンは、肝臓における赤血球産生の増加に起因した、妊娠齢の加算に伴うＲ１での微妙な増加（およびＲ３集団での減少）を除けば、全ての妊娠齢において類似していた。ＯＸ−４３/４４に対して陽性である分離捕集細胞集団の分析は、ＯＣ.３または顆粒性の発現に関わりなく、形態学的に多いのは造血細胞前駆細胞であり、それらはＡＦＰに対して陰性であるということを明らかにした。顆粒状でＯＸ−４３/４４-である細胞（Ｒ３細胞集団）は多くがＡＦＰ+であり、集団の約３０％がＯＣ.３+であった。ＯＸ４３/４４-で無顆粒状かつＡＦＰ+である細胞の小集団（表４中のＲ２）は、ＯＣ.３発現に対しては評価しなかった。
【００７３】
肝芽細胞に関してパンニングにより濃縮された妊娠１５日目からの細胞調製物をタイプＩＶコラーゲンで被覆した皿上の、既述の如く血清を含有せずホルモン既知の培地中に蒔いた。その次の日、上皮細胞が再凝集して小細胞集塊となってマトリックスに接着した。６０％までのコロニー形成率が得られた(データ示さず)。細胞は、上皮細胞ではない繊維芽細胞様の細胞に取り囲まれ、細胞同士の密接な接触および胆細管を形成する、典型的な実質細胞の島に組織化された(図１０参照)。培養４〜５日後には、実質細胞成分は徐々に非実質細胞によって覆われ始めていた。しかし、肝芽細胞の残余集塊は、免疫化学または免疫蛍光によるその場でのアッセイで、培養１６日目までアルブミンおよびＡＦＰに対して陽性を保っていた（図１１参照）。培養培地からグルカゴンを排除した少数の実験において、目立たない形態学的な相違が観察され、そして免疫蛍光または免疫化学によりその場で染色したところ、細胞はアルブミンおよびＡＦＰを発現していた(データ示さず)。この観察は、胎児肝芽細胞の相対的なグルカゴン耐性によるものと考えられる。
【００７４】
本発明者らは、肝実質細胞前駆細胞に関して高度に濃縮された細胞集団を単離する、パンニング技法および多変数ＦＡＣ分離捕集を組み込んだ方法を開発した。本発明の方法は、妊娠齢１３日目から誕生直後までに亘る期間の肝臓から肝細胞前駆細胞の単離に適用し得るものとして本発明者らにより見出された。本明細書に記載された肝臓分散手法は、９０％を越える生存度を有する単細胞が優占的な集団をもたらし、そして妊娠１５日目では、器官全体の重量の９５％が回収される。パンニング技法は細胞総数の８４％までを除去し、同時に肝が細胞集団を５倍に濃縮する。実質細胞に特異的な遺伝子発現であるアルブミンおよびＡＦＰの増加はパンニング前後の細胞のノーザンブロット分析によって説明され、そしてこの手法の特異性はパンニング皿に対する細胞接着の分析により示された。同様にして、濃縮されていることは、最初の懸濁液と比較して、パンニング後にアルブミンおよびＡＦＰを発現するコロニーの細胞数の劇的な増加が存在することを示す生体外でのデータにより確認された。さらに、パンニング後のコロニー形成率は、従来報告されていた値である６〜１０％と比較して有意に高かった(６０％まで)。パンニング手法後にも肝芽細胞は依然として少数集団のままであるが、標準的なその場での肝細胞灌流プロトコールが平均して３７.７％の肝細胞を含有する集団をもたらすことを勘案することが重要である。
【００７５】
培養皿への分散肝細胞の付着、低速分画遠心分離およびアルギニン欠乏培地での培養を包含する従来の方法と比較した本プロトコールの利点は数点ある。孤立した肝細胞は、生体外で急速に組織に特異的な遺伝子の制御を失う。結果として、マトリックスへの細胞付着を必要とする手法において、蛋白質またはｍＲＮＡの含量等の実質細胞に特異的な機能の測定は生体内におけるレベルを反映することができない。解離した胎児肝芽細胞も、カルシウムおよび温度依存性で糖蛋白質に仲介される過程を経て、大きな凝集体を急速に形成する。妊娠１４日目と同じくらい早くに、ウボモルリン（Ｅ−カドヘリン）と考えられる細胞膜蛋白質の高いレベルが肝芽細胞に存在していた。凝集に関するこの傾向は、特にＣａ2+の存在下に４℃よりも高い温度で、比較的大きな（Ｅ１９）肝芽細胞を濃縮するための低速分画遠心分離の能力を説明する。肝芽細胞を解離させるために、乱暴なピペッティングおよびシリンジを通した吸い上げを包含する機械的方法が採用されてきたが、そのような方法は不十分であり、ＦＡＣＳのような単細胞懸濁液を必要とするさらなる分析を困難にすることが判明している。
【００７６】
細胞が凝集しようとする傾向は、細胞を４℃に保ち、ＥＧＴＡでカルシウムを除去し、ＣＡＭにより仲介される凝集を妨害することにより、防止される。細胞を単細胞懸濁液として維持することの利点は２つある。第一に、実質細胞に特異的な機能の測定が、造血細胞集団の生理学的に不等価な変化に邪魔されずに、細胞に基づいて測定されることが可能となる。第二に、単細胞懸濁液を要求するＦＡＣＳのような手法が容易に実施されることが可能となる。
【００７７】
妊娠１５日目に肝芽細胞は非実質細胞よりも大きく見えるが、ＦＡＣＳにおいて正面散乱よりもむしろ側面散乱が、種々の集団を分けることに関してより良い識別子であることを証明したが、恐らくは、それは、妊娠１２日目にさえ、肝芽細胞は液胞、ミトコンドリアおよび廃小胞体を含んでおり、比較的複雑であるからであろう。さらに、側面散乱は細胞成熟の合理的な指標であると証明した。一般的に、より顆粒度の高い肝芽細胞は形態学的および生化学的により成熟していた(データ示さず)。
【００７８】
そこで、肝幹細胞を同定するために提案されていた、門脈域介在部に存在する卵形細胞のマーカーであるＯＣ.３の発現を試験するために、ＦＡＣＳが採用された。顆粒度の特定レベルの細胞に関する閉め出しと組み合わせたＯＣ.３またはＯＸ−４３/４４の発現に関する多変数ＦＡＣＳ分析を用いて、本発明者らは、非実質細胞（造血細胞、内皮細胞および間質細胞）と、ＡＦＰ+であった実質細胞前駆細胞とに、集団をさらに細かく分けることを可能とした。さらに、本発明者らは種々の亜集団におけるＯＣ.３抗原の発現を評価することを可能とした。妊娠１５日目に無顆粒状であるＯＸ４３/４４+細胞が造血細胞であり、より大きな赤血球細胞集団であることを証明した。ＡＦＰ+細胞が優占的であった顆粒状のＯＸ４３/４４-細胞集団の細胞の約３０％はＯＣ.３+であった。そしてそれは恐らく胆管細胞前駆細胞に該当し、一方、ＯＣ.３-細胞は肝細胞前駆細胞であったのだろう。しかし、無顆粒状のＯＸ４３/４４-細胞の少ない割合はＡＦＰ+であった。
【００７９】
造血の分野と比較すると、肝幹細胞の分野はいまだその幼年期にある。しかし、これらの変数を用いたＦＡＣＳ分離捕集により特定集団を単離する能力およびそれに続く生体外および生体内での研究は、肝幹細胞を同定する上で大きな助けとなる。さらに、この技術は、胆管上皮細胞、発癌、再生、加齢および組織に特異的な遺伝子発現を包含する、肝幹細胞生物学の全ての範囲に亘る研究に適用されることができる。
【００８０】
ここまで、本発明を特定の実施態様に言及して記述してきたが、これらの実施態様は本発明の種々の主題を単に説明するためだけのものであることをご理解戴きたい。従って、本発明の精神および範囲から離れることなく、前記説明のための実施態様に種々の変更をなし得ること、およびその他の改変をなし得ることをご理解戴きたい。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
上記の簡単な記述ならびに本発明の目的および特徴は、添付図面と共に、本発明の現時点で好ましい単なる説明のための実施態様の下記の詳細な記載を参照することにより、よりよく理解されるであろう。
【図１−１】図１は、妊娠１４日目の肝臓からの細胞を示しているが、細胞はモノクローナル抗体３７４.３およびＯＸ−４３で染色され、次いでＦＩＴＣおよびＰＥ標識した第二の抗体で処理されている。パネルＡは２色密度プロットであり、閉め出されていない（ungated）試料中の、Ｒ１〜５として表した５集団を示している。Ｒ１およびＲ２はＯＸ−４３に対して陽性な細胞集団であり、一方、Ｒ３〜５は、このマーカーに対して陰性である。パネルＢはＦＬ２対ＳＳＣの２変数ドットプロットであり、ＯＸ−４３+細胞とＯＸ−４３-細胞とを分離するために使用した閉め出し変数（gating parameters）を示している。挿入してあるものは、陰性対照を示している。
【図１−２】パネルＣはＯＸ−４３-細胞のＦＬ１対ＦＬ２の３次元プロットであり、３つの別々の細胞集団であるＲ３〜５を示している。
【図２−１】図２において、パネルＡは分離捕集された細胞からの全ての蛋白質のウエスターンブロットであり、もっぱらＯＸ−４３-集団内にアルブミンを含有する細胞が存在することを示している。
【図２−２】パネルＢおよびＣは、ＯＸ−４３-（Ｂ）およびＯＸ−４３+（Ｃ）に対するＡＦＰのための間接免疫蛍光を示している。
【図３】図３は、全てのＯＸ−４３+細胞を閉め出した後で分離捕集された、Ｒ３〜５からの細胞、およびグアニジニアムイソチオシアネート法により調製された総ＲＮＡを表している。ノーザンブロットは、Ｒ４においてアルブミンの発現を示し、一方、セログリシン（serglycin）はＲ３細胞により発現された。
【図４−１】図４は、ＯＸ−４３に対して陽性の集団と陰性の集団に分けるために分別され、次いで蛍光およびＦＬ１対ＦＬ２の２変数密度プロットに基づき５つの集団にさらに分けられた細胞を示している。直前に分離捕集されたサイトスパン（cytospun）細胞はディフ−クイック（Diff-Quik）染色キットで形態学的に染色された。倍率１００倍。
【図４−２】図４は、ＯＸ−４３に対して陽性の集団と陰性の集団に分けるために分別され、次いで蛍光およびＦＬ１対ＦＬ２の２変数密度プロットに基づき５つの集団にさらに分けられた細胞を示している。直前に分離捕集されたサイトスパン（cytospun）細胞はディフ−クイック（Diff-Quik）染色キットで形態学的に染色された。倍率１００倍。
【図４−３】図４は、ＯＸ−４３に対して陽性の集団と陰性の集団に分けるために分別され、次いで蛍光およびＦＬ１対ＦＬ２の２変数密度プロットに基づき５つの集団にさらに分けられた細胞を示している。直前に分離捕集されたサイトスパン（cytospun）細胞はディフ−クイック（Diff-Quik）染色キットで形態学的に染色された。倍率１００倍。
【図４−４】図４は、ＯＸ−４３に対して陽性の集団と陰性の集団に分けるために分別され、次いで蛍光およびＦＬ１対ＦＬ２の２変数密度プロットに基づき５つの集団にさらに分けられた細胞を示している。直前に分離捕集されたサイトスパン（cytospun）細胞はディフ−クイック（Diff-Quik）染色キットで形態学的に染色された。倍率１００倍。
【図５−１】図５は、胎児肝臓実質細胞に非常に富んだ集団を表しているが、これらの細胞はＦＡＣＳにより得られたものであり(全てのＯＸ−４３-の閉め出し後のＲ４細胞)、血清を含まないホルモン既知の培地中、タイプＩコラーゲンで被覆した皿の上に５ｘ１０4細胞/ｃｍ2として蒔いたものである。パネルＡは、培養４日後の典型的な上皮細胞コロニーおよび極僅かの肝葉細胞を示す位相差顕微鏡写真である（倍率５０倍）。パネルＢは、生体内における間接免疫蛍光であり、培養２４時間後の培養実質細胞の約２５％の核内へのＢｒｄＵの取り込みを示している（倍率５０倍）。
【図５−２】パネルＣはパネルＢの位相差顕微鏡写真である。
【図６】図６は、本発明の方法を利用した肝芽細胞濃縮のフローダイアグラムを表している。
【図７】図７において、パネルＡは位相差顕微鏡写真を表しており、そして妊娠１５日における肝芽細胞のＡＦＰに対する免疫蛍光を表している。ＡＦＰ陽性細胞は、卵形核と造血細胞よりも僅かに多い貧弱な細胞質とを有する小さな細胞から、大量の空胞化細胞質を有する細胞までの形態学的範囲に亘っていた。陰性対照は第一の抗体としてウサギＩｇＧを付着させた細胞からなっていた。
【図８】図８は、パンニング前後に胎児肝細胞から単離された直後に、α−フェト蛋白質およびアルブミンをコードするｃＤＮＡとハイブリダイゼーションさせた総ＲＮＡ（５μｇ／レーン）のノーザンブロット分析を表している。レーン１は、単離直後の胎児肝細胞を示している。レーン２は、抗ラットＲＢＣ抗体を用いて２回パンニングした後の細胞調製物を示している。また、１８Ｓに対して示したブロットは、総ＲＮＡ量に対する内標準として用いたものである。
【図９−１】図９は、細胞質の複雑さの測定を側面散乱とし、これに対してＯＸ−４３およびＯＸ−４４に対する蛍光の対数をプロットした２変数分析を表している。パネルＡは未染色細胞を示し、パネルＢは単離直後（最初の懸濁液）の細胞を示し、そしてパネルＣは最終パンニング後の細胞を示している。単離直後の細胞の殆どは無顆粒状であり、かつマーカーに対して陽性であった（Ｒ１細胞集団）。濃縮に伴い、ＯＸ４３／ＯＸ４４マーカーに対して陰性な顆粒状（ＳＳＣ＞５０Ａ.Ｕ.）の細胞集団が増加した（Ｒ３細胞集団）。この集団に対する分離捕集は７５％がＡＦＰに対して陽性であることを明らかにした。顆粒状細胞の自己蛍光がより高いために、無顆粒状集団よりも顆粒状集団の方において、陽性と陰性との間の分画はより高くなる。
【図９−２】図９は、細胞質の複雑さの測定を側面散乱とし、これに対してＯＸ−４３およびＯＸ−４４に対する蛍光の対数をプロットした２変数分析を表している。パネルＡは未染色細胞を示し、パネルＢは単離直後（最初の懸濁液）の細胞を示し、そしてパネルＣは最終パンニング後の細胞を示している。単離直後の細胞の殆どは無顆粒状であり、かつマーカーに対して陽性であった（Ｒ１細胞集団）。濃縮に伴い、ＯＸ４３／ＯＸ４４マーカーに対して陰性な顆粒状（ＳＳＣ＞５０Ａ.Ｕ.）の細胞集団が増加した（Ｒ３細胞集団）。この集団に対する分離捕集は７５％がＡＦＰに対して陽性であることを明らかにした。顆粒状細胞の自己蛍光がより高いために、無顆粒状集団よりも顆粒状集団の方において、陽性と陰性との間の分画はより高くなる。
【図１０】図１０は、血清を含まずホルモン既知の培地中、タイプIVコラーゲン上で５日間培養され、ＲＢＣ類をパンニングして除去してすることにより肝芽細胞が濃縮された妊娠１５日目の細胞を表している。細胞は胆細管の形成を含む典型的な上皮細胞形態を示した。周りを取り囲む上皮細胞は繊維芽細胞様細胞である。図中の棒線は２５μを表す。
【図１１】図１１は、培養１６日目にその場での免疫蛍光によりアルブミンに対する陽性染色を示した上皮細胞の小さな島を表している。その周りを取り囲む繊維芽細胞様細胞はアルブミンの存在に対して陰性であった。図中の棒線は１００μを表している。
【図１−１】
2004339227.tif 000006
【図１−２】
2004339227.tif 000007
【図２−１】
2004339227.tif 000008
【図２−２】
2004339227.tif 000009
【図３】
2004339227.tif 000010
【図４−１】
2004339227.tif 000011
【図４−２】
2004339227.tif 000012
【図４−３】
2004339227.tif 000013
【図４−４】
2004339227.tif 000014
【図５−１】
2004339227.tif 000015
【図５−２】
2004339227.tif 000016
【図６】
2004339227.tif 000017
【図７】
2004339227.tif 000018
【図８】
2004339227.tif 000019
【図９−１】
2004339227.tif 000020
【図９−２】
2004339227.tif 000021
【図１０】
2004339227.tif 000022
【図１１】
2004339227.tif 000023