(57)【要約】      （修正有）【課題】骨格筋等の細胞におけるＬＰＬ遺伝子発現機構を解明し、抗糖尿病薬の開発のスクリーニングの指標となる系を確立する。【解決手段】被験物質の存在による細胞におけるＦＯＸＯファミリー遺伝子の転写の変化に基づき、又は、細胞におけるＦＯＸＯファミリーとＰＰＡＲα又はＣＢＰとの相互作用の変化に基づき、ＦＯＸＯファミリー遺伝子発現抑制剤、ＬＰＬ遺伝子発現抑制剤、又は、インシュリン抵抗性のような糖尿病治療剤を同定する方法。【選択図】        図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質の存在による細胞におけるＦＯＸＯファミリー遺伝子の転写の変化に基づき、ＦＯＸＯファミリー遺伝子発現抑制剤を同定する方法。
【請求項２】
被験物質の存在による細胞におけるＦＯＸＯファミリー遺伝子の転写の変化に基づき、ＬＰＬ遺伝子発現抑制剤を同定する方法。
【請求項３】
被験物質の存在による細胞におけるＦＯＸＯファミリー遺伝子の転写の変化に基づき、糖尿病治療剤を同定する方法。
【請求項４】
被験物質の存在による細胞におけるＦＯＸＯファミリー遺伝子の転写の変化に基づき、インシュリン抵抗性糖尿病治療剤を同定する方法。
【請求項５】
ＦＯＸＯファミリー遺伝子の転写の変化をＲＴ−ＰＣＲによりｍＲＮＡ量を測定することから判定し、該ｍＲＮＡ量を減少させる物質を特定することからなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＦＯＸＯファミリー遺伝子の転写の変化をノーザンハイブリダイゼーションによりｍＲＮＡ量を測定することから判定し、該ｍＲＮＡ量を減少させる物質を特定することからなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＦＯＸＯファミリー遺伝子の転写の変化を、その発現産物に対する抗体を用いるウェスタンブロッティングにより該発現産物量を測定することから判定し、該発現産物量を減少させる物質を特定することからなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
細胞培養系に被験物質を添加することを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＦＯＸＯファミリー遺伝子がＦＫＨＲである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
細胞が筋肉細胞である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
被験物質の存在による、細胞におけるＦＯＸＯファミリーとＰＰＡＲα又はＣＢＰとの相互作用の変化に基づき、ＦＯＸＯファミリーとＰＰＡＲα又はＣＢＰから成る複合体の作用抑制剤を同定する方法。
【請求項１２】
被験物質の存在による、細胞におけるＦＯＸＯファミリーとＰＰＡＲα又はＣＢＰとの相互作用の変化に基づき、ＬＰＬ遺伝子発現抑制剤を同定する方法。
【請求項１３】
被験物質の存在による、細胞におけるＦＯＸＯファミリーとＰＰＡＲα又はＣＢＰとの相互作用の変化に基づき、糖尿病治療剤を同定する方法。
【請求項１４】
被験物質の存在による、細胞におけるＦＯＸＯファミリーとＰＰＡＲα又はＣＢＰとの相互作用の変化に基づき、インシュリン抵抗性糖尿病治療剤を同定する方法。
【請求項１５】
細胞におけるＦＯＸＯファミリーとＰＰＡＲα又はＣＢＰとの相互作用の変化を、ＦＯＸＯファミリーとＰＰＡＲα又はＣＢＰから成る複合体量を測定することから判定し、該複合体量を減少させる物質を特定することからなる、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ＦＯＸＯファミリーとＰＰＡＲα又はＣＢＰから成る複合体量をオートラジオグラフィにより測定する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
細胞におけるＦＯＸＯファミリーとＰＰＡＲα又はＣＢＰとの相互作用の変化を、ＦＯＸＯファミリータンパク質の修飾による不活性化の程度から判定し、該タンパク質を不活性化させる物質を特定することからなる、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
細胞培養系に被験物質を添加することを含む、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＦＯＸＯファミリー遺伝子がＦＫＨＲである、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
細胞が筋肉細胞である、請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法によって同定される、ＦＯＸＯファミリー遺伝子発現抑制剤、ＬＰＬ遺伝子発現抑制剤、複合体の作用抑制剤、又は糖尿病治療剤。
【請求項２２】
請求項２１に記載の、ＦＯＸＯファミリー遺伝子発現抑制剤、ＬＰＬ遺伝子発現抑制剤、複合体の作用抑制剤、及び糖尿病治療剤から成る群から選択された一種以上の物質を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項２３】
糖尿病治療薬であることを特徴とする、請求項２２記載の医薬組成物。
【請求項２４】
請求項２１に記載の、ＦＯＸＯファミリー遺伝子発現抑制剤、ＬＰＬ遺伝子発現抑制剤、複合体の作用抑制剤、及び糖尿病治療剤から成る群から選択された一種以上の物質の有効量を対象に投与することから成る、糖尿病の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＰＰＡＲαのコファクターに属するＦＫＨＲを用いた抗糖尿病薬の新規なスクリーニング方法、及び該方法により同定されたＦＯＸＯファミリー遺伝子発現抑制剤、ＬＰＬ遺伝子発現抑制剤、複合体の作用抑制剤、及び糖尿病治療剤等の各物質に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生体は体外より摂取した食物に由来するシグナルを認識し、内分泌系を調節することにより血糖値を一定に保っている。インスリンはすい臓β細胞により分泌される血液中のブドウ糖量を制御するホルモンである。糖尿病はインスリンの分泌が悪いか、インスリンに反応しなくなるために血糖値が上昇してしまうことを主な特徴とする代謝疾患である。インスリンの感受性が低下し、インスリン効果の発現を得るのに通常量以上のインスリンを必要とする状態は「インスリン抵抗性」と呼ばれる。
【０００３】
骨格筋はインスリンの主要なターゲット器官である［１］。インスリン欠乏状態、たとえば糖尿病または絶食においては、骨格筋は、解糖を抑制すること、およびエネルギー源としてグルコースの代わりに脂肪酸などの脂質の利用に向けたシフトを引き起こす［１］ことにより、グルコースホメオスタシスに貢献する。リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ，ＥＣ３．１．１．３４）および脂肪酸輸送体であるＣＤ３６／ＦＡＴ［２］といった、脂肪酸代謝に関与するタンパク質の遺伝子発現は、糖尿病［３，４］および絶食中［５］の骨格筋においてアップレギュレートされる。
【０００４】
ＬＰＬは、脂質代謝およびエネルギー代謝において中心的な役割を果たす［６，７］。それは血漿トリグリセリドの、貯蔵または即時のエネルギー要求のために用いられる遊離脂肪酸への加水分解の責任物質である。ＬＰＬ発現は脂肪組織、心臓、および骨格筋において激しい。脂肪組織では、脂肪酸は再エステル化され細胞内トリグリセリドとして貯蔵されるが、骨格筋においては、脂肪酸は主としてβ−酸化およびエネルギー産生に利用される［６］。ＬＰＬ発現は、食事およびホルモンの変化に応じて変化する［８］。たとえば、フィブレート、魚油、および脂肪酸により活性化される［９，１０］。
【０００５】
一方、核内受容体ＰＰＡＲα（ペルオキシソームプロリファレーター活性受容体アルファ型）は、ＬＰＬ遺伝子発現の調節因子であることが知られている。絶食および糖尿病の間のＬＰＬ発現の調節は、骨格筋ＬＰＬとインスリンとの間にネガティブな関係が観察されることから［１２］、一部はインスリンの作用により仲介されるのかもしれない。しかしながら、骨格筋におけるＬＰＬ遺伝子調節の詳細な機構は明らかではない。
【０００６】
線虫（C. elegans）についての遺伝学的研究は、フォークヘッド転写因子ＤＡＦ１６がインスリン受容体シグナリングのサプレッサーとして機能することを示した［１３］。すなわち、ＤＡＦ１６におけるヌル突然変異(null mutation)は、ＤＡＦ２（哺乳類インスリン受容体の相同体）またはＡＧＥ１（哺乳類ＰＩ−３キナーゼの相同体）における突然変異の影響を抑制する［１３］。ＦＫＨＲ（横紋筋肉腫フォークヘッド類似体）（ＦＯＸＯ１）、ＡＦＸ（ＦＯＸＯ４）、およびＦＫＨＲＬ１（ＦＯＸＯ３ａ）はフォークヘッド型転写因子のサブファミリーであり、またＦＯＸＯファミリーとも呼ばれており［１４］、ＤＡＦ１６に対する哺乳類の相対物であると考えられる［１５］。したがってＦＯＸＯファミリーは、哺乳類において、インスリンシグナリングにおける下流のプレイヤーとして、たとえば代謝調節を仲介することにより、作用することが示唆される。実際、肝臓においては、ＦＫＨＲは糖新生の鍵酵素であるグルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６Ｐアーゼ）の遺伝子発現を活性化し、この発現がインスリンにより抑制されることが報告されている［１６，１７］。
【０００７】
一方、ＦＫＨＲおよびＡＦＸは種々の核内受容体に対するコファクターとして［１８，１９］、ＰＰＡＲを含めた核内受容体シグナルに重要な役割を果たす［２２〜２４］ＣＢＰ／ｐ３００を含んでいる複合体の一部として［２０，２１］作用することが報告されている。ＦＯＸＯファミリーは、骨格筋において発現される［２５］。実際、ＦＨＫＲ（横紋筋肉腫におけるフォークヘッド相同体）は元来、染色体転座ｔ（２；１３）の結果生じた別の転写因子ＰＡＸ３との異常な融合により、横紋筋肉腫からクローン化されたものである［２６］。結果として生じる融合タンパク質ＰＡＸ３−ＦＫＨＲは、筋肉細胞の形質転換および横紋筋肉腫において役割を果たすと考えられている［２６］。しかしながら、骨格筋におけるＦＯＸＯファミリータンパク質の生理学的役割は明らかではない。
【０００８】
骨格筋においてＬＰＬの発現量を減少させることが、インスリン抵抗性の改善および糖尿病の病態の改善につながると考えられる。しかし、これまで述べたことからも明らかなように、骨格筋におけるＬＰＬ遺伝子発現調節の正確な作用機構は現在まだ不明確である。
【０００９】
【非特許文献１】
Zhao, H.H., Herrera, R.E., Coronado-Heinsohn, E., Yang, M.C., Ludes-Meyers,J.H., Seybold-Tilson, K.J., Nawaz, Z., Yee, D., Barr, F.G., Diab,S.G.,Brown,P.H., Fuqua, S.A. and Osborne, C.K. (2001) J. Biol. Chem. 276, 27907-27912.
【非特許文献２】
Kim, J.K., Fillmore, J.J., Chen, Y., Yu, C., Moore, I.K., Pypaert, M., Lutz, E.P.,Kako, Y., Velez-Carrasco, W., Goldberg, I.J., Breslow, J.L. and Shulman, G.I.(2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 7522-7527.
【非特許文献３】
Ferreira, L.D., Pulawa, L.K., Jensen, D.R. and Eckel, R.H. (2001) Diabetes 50,1064-1068.
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明が解決しようとする課題は、骨格筋等の細胞におけるＬＰＬ遺伝子発現機構を解明し、抗糖尿病薬の開発のスクリーニングの指標となる系を確立することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、骨格筋におけるＦＫＨＲファミリーがＬＰＬ遺伝子発現を調節する可能性を検討し、ＦＫＨＲの発現がＬＰＬの発現と一致し、インスリン欠乏状態である絶食とＳＴＺ処理糖尿病マウスの骨格筋で誘導されることを示した。
【００１２】
本発明者はさらに、ＦＫＨＲを過剰発現した培養筋肉細胞でのＬＰＬ遺伝子発現の調節を解析し、Ｃ２Ｃ１２筋肉細胞へのＦＫＨＲの外来性の発現はＬＰＬの発現を誘導することを確認した。また、ＰＰＡＲαの活性化剤はＦＫＨＲによるＬＰＬ遺伝子発現をさらに促進することも確認した。これらのデータはＦＫＨＲはＰＰＡＲαと協調してＬＰＬ遺伝子発現を活性化できることを示している。
【００１３】
本発明は、以上の知見に基づき成されたものである。
即ち、本発明は、被験物質の存在による細胞におけるＦＯＸＯファミリー遺伝子の転写の変化に基づき、ＦＯＸＯファミリー遺伝子発現抑制剤、ＬＰＬ遺伝子発現抑制剤、又は、インシュリン抵抗性のような糖尿病治療剤を同定する方法に係る。
【００１４】
更に本発明は、被験物質の存在による、細胞におけるＦＯＸＯファミリーとＰＰＡＲα又はＣＢＰとの相互作用の変化に基づき、ＦＯＸＯファミリーとＰＰＡＲα又はＣＢＰから成る複合体の作用抑制剤、ＬＰＬ遺伝子発現抑制剤、又は、インシュリン抵抗性のような糖尿病治療剤を同定する方法に係る。
【００１５】
更に本発明は、これらのＦＯＸＯファミリー遺伝子発現抑制剤、ＬＰＬ遺伝子発現抑制剤、複合体の作用抑制剤、又は糖尿病治療剤に係る。
【００１６】
更に本発明は、これらＦＯＸＯファミリー遺伝子発現抑制剤、ＬＰＬ遺伝子発現抑制剤、複合体の作用抑制剤、及び糖尿病治療剤から成る群から選択された一種以上の物質を有効成分として含有する、糖尿病治療薬等の医薬組成物に係る。
本発明医薬組成物中の有効成分の量は、その使用目的、有効成分である物質の種類、薬剤の形態、及び投与経路等に応じて当業者が適宜決めることが出来るが、通常、例えば0.0001重量％〜50重量％の範囲である。医薬組成物は、錠剤、注射液、粉末、ゲル、乳化液等の当業者に公知の任意の薬剤形態を取ることが可能である。
これらの医薬組成物には、その使用目的、有効成分である物質の種類、薬剤の形態、及び投与経路等に応じて、当業者に公知である、薬学上許容される任意の各種補助剤、添加剤、及び緩衝剤等を適宜含有させることができる。
【００１７】
尚、本明細書中で、「抑制剤」とは、対象となる現象または状態を有意に抑制、阻害、阻止、又は低減等することを意味する。また、「治療剤」とは、治療、予防、緩和、及び改善等の、対象となる疾患の病態を有意に改善し、又は有効に予防することができるものであれば、その名称に拘わらず、あらゆる使用目的又は用途のものも含む。
【００１８】
本発明は、更に、上記ＦＯＸＯファミリー遺伝子発現抑制剤、ＬＰＬ遺伝子発現抑制剤、複合体の作用抑制剤、及び糖尿病治療剤から成る群から選択された一種以上の物質の有効量をヒト、ヒトその他の哺乳類などの動物である対象に投与することから成る、糖尿病の治療方法に係る。
投与経路、有効成分の投与量等は、投与対象の病態、体重、性別、有効成分である物質の種類、及び薬剤の形態等に応じて、当業者が適宜決めることが出来るが、通常、例えば、成人１日当たり0.0001mg〜1,000mgの範囲である。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明の同定方法において、被験物質の存在による細胞におけるＦＯＸＯファミリー遺伝子の転写の変化は、当業者に公知の任意の方法で判定することができる。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ及びノーザンハイブリダイゼーション等によりｍＲＮＡ量を測定することから判定することができる。その結果、該ｍＲＮＡ量を減少させる物質を特定することできる。
或いは、その発現産物に対する抗体を用いるウェスタンブロッティングにより該発現産物量を測定することで判定し、その結果、該発現産物量を減少させる物質を特定することができる。
こうして特定された物質を、ＦＯＸＯファミリー遺伝子発現抑制剤、ＬＰＬ遺伝子発現抑制剤、又はインシュリン抵抗性のような糖尿病治療剤として同定することが可能となる。
【００２０】
また、細胞におけるＦＯＸＯファミリーとＰＰＡＲα又はＣＢＰとの相互作用の変化も、当業者に公知の任意の方法で判定することができる。ここで、「相互作用の変化」とは、その質的及び／又は量的変化を意味する。従って、例えば、ＰＰＡＲαおよびＯＢＰをＧＳＴと融合した構築物（発現べクター）を文献の記載に従い３５Ｓ−ＦＫＨＲ（ブロメガ、ＴＮＴ）の放射性同位体で標識したＦＫＨＲと共にインキュベートした後、洗浄し、結合した３５Ｓ−ＦＫＨＲをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、例えば、オートラジオグラフィ等の当業者に公知の手段によりＦＯＸＯファミリーとＰＰＡＲα又はＣＢＰから成る複合体量を測定することによって判定し、その結果、該複合体量を減少させる物質を特定することができる。  或いは、相互作用の変化を、ＦＯＸＯファミリータンパク質の翻訳後修飾（リン酸化、糖鎖付加等）による不活性化（結合活性の低下）の程度を当業者に公知の適当な手段により測定することから判定し、その結果、該タンパク質を不活性化させる物質を特定することができる。こうして特定された物質をＦＯＸＯファミリーとＰＰＡＲα又はＣＢＰから成る複合体の作用抑制剤、ＬＰＬ遺伝子発現抑制剤、又は、インシュリン抵抗性のような糖尿病治療剤として同定することが可能となる。
【００２１】
被験物質の存在による細胞における様々な変化は、例えば、細胞培養系に被験物質を添加することによって容易に実施することができる。
培養系に使用する細胞の例としては、例えば、ヒト及びマウスなどの哺乳動物由来の骨格筋細胞のような各種筋肉細胞等を挙げることが出来る。これらの各種細胞は、株化しており、適当な公的機関に寄託されていたり、又は市販されているので、当業者は容易に入手することができる。
【００２２】
ＦＯＸＯファミリー遺伝子としては、当業者に公知の任意の遺伝子、例えば、ＦＫＨＲ、ＡＦＸ、及びＦＫＨＲＬ１等を挙げることが出来る。
これらの遺伝子は、プラスミドなど適当な発現ベクター内に組み込まれ、トランスフェクション等の適当な手段で細胞内に導入することができる。このようなベクターには遺伝子の発現に必要なプロモーター、薬剤耐性遺伝子、その他の転写調節因子などが適宜含まれている。
また、細胞の各種培養条件は、使用する細胞、遺伝子、ベクター等に応じて当業者が適宜選択することができる。
尚、本発明で用いられる、その他の各方法・手段は当該技術分野で周知のものである。
【００２３】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２４】
ＲＮＡ分析
ノーザンブロット分析は記述されているように行なわれた［８］（Kamei 1992）。マウスＬＰＬ、ＡＦＸ、ＦＫＨＲＬ１、ＣＤ３６／ＦＡＴ、ＧＰＴ２、ＧＬＵＴ４、ＳＲＥＢＰ１用のｃＤＮＡフラグメントは、マウス骨格筋全ＲＮＡおよびＡＦＸ用にはヒーラ全ＲＮＡを用いて、第１鎖ｃＤＮＡからのポリメラーゼ連鎖反応により得られた。第１鎖ｃＤＮＡはＴプライムド・ファースト・ストランド・キット（T-primed first strand kit）（アマーシャム・ファルマシア・バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech））を用いて調製された。増幅された産物はｐＧＥＭ−Ｔ・イージー（Easy）ベクター（プロメガ（Promega））内にサブクローン化され、シーケンシングにより確認された。使用されたポリメラーゼ連鎖反応プライマーは以下のとおりであった：ＬＰＬ（Ｇｅｎｂａｎｋ  アクセッション番号、Ｊ０３３０２）；（前向き）５´−ＴＡＣＣＴＧＡＡＧＡＣＴＣＧＣＴＣＴＣＡ−３´、（逆向き）５´−ＣＴＴＧＴＣＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＡＣＡＡ−３´、ＡＦＸ（Ｇｅｎｂａｎｋ  アクセッション番号、Ｘ９３９９６）；（前向き）５´−ＴＧＧＡＴＣＣＧＧＧＧＡＡＴＧＡＧＡＡＴＴＣＡＧＣＣＡＣＡＧ−３´、（逆向き）５´−ＴＣＣＡＧＧＣＡＴＧＡＣＴＣＡＧＧＧＡＴＣＴＧＧＣＴＣＡＡＡ−３´、ＫＦＨＲＬ１（Ｇｅｎｂａｎｋ  アクセッション番号、ＡＦ１１４２５９）；（前向き）５´−ＴＴＴＧＧＴＣＡＡＴＣＡＧＡＡＣＴＴＧＣ−３´、（逆向き）５´−ＧＣＴＴＡＧＣＡＣＣＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣ−３´、ＣＤ３６／ＦＡＴ（Ｇｅｎｂａｎｋ  アクセッション番号、Ｌ２３１０８）；（前向き）５´−ＴＧＣＴＡＧＡＣＡＴＴＧＧＣＡＡＡＴＧＣ−３´、（逆向き）５´−ＴＧＣＡＡＧＣＡＣＡＡＴＡＴＧＡＡＡＴＣ−３´、ＧＰＴ２（Ｇｅｎｂａｎｋ  アクセッション番号、ＡＩ３２５６０９）；（前向き）５´−ＣＴＧＡＴＧＡＧＧＴＧＴＡＣＣＡＧＧＡＣ−３´、（逆向き）５´−ＡＡＣＡＧＡＴＣＴＴＣＴＧＴＣＡＧＣＴＴ−３´；ＧＬＵＴ４（Ｇｅｎｂａｎｋ  アクセッション番号、ＡＦ０９８６３３）；（前向き）５´−ＴＣＡＴＣＣＡＴＣＡＧＧＴＣＡＴＡＣＣＡ−３´、（逆向き）５´−ＴＣＡＴＣＣＡＴＣＡＧＧＴＣＡＴＡＣＣＡ−３´；ＳＲＥＢＰ１（Ｇｅｎｂａｎｋ  アクセッション番号、ＡＦ３７４２６６）；（前向き）５´−ＣＣＴＧＴＧＡＣＣＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＣ−３´、（逆向き）５´−ＴＣＡＡＴＧＧＡＡＣＴＧＧＣＡＧＴＴＧＡ−３´。ヒトＦＫＨＲｃＤＮＡは、骨格筋ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって得られ、シーケンシングにより確認された。ＰＰＡＲαｃＤＮＡはK. Umesono博士から入手された。
【００２５】
安定な細胞系
フェニックス（Phoenix）２９３細胞［２７］は、９０ｍｍシャーレ内で培養され、７０％集密において、リポフェクトアミン・プラス（Lipofecmine plus）（インビトロジェン（Invitrogen））により、製造業者の使用説明書にしたがって、 ＦＫＨＲのｃＤＮＡかまたはベクターのみを含んでいる２μｇのｐＬＮＣＸ由来の発現プラスミド（クロンテック（Clontech））を用いてトランスフェクトされた。ウイルス上清はトランスフェクションの４８時間後に採取された。上清は、最後の５ｍｌ中に１０％ウシ胎児血清と５μｇ／ｍｌのポリブレンとを含んでいるダルベコ変法イーグル培養液（Dulbecco’s modified Eagle’s medium（ＤＭＥＭ））中の、５０％集密におけるＣ２Ｃ１２細胞のシャーレ（直径９０ｍｍ）に適用された。Ｃ２Ｃ１２細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）から購入された。細胞は感染２４時間後に１：１０に分割され、未感染細胞を除去するべく、１０％ウシ胎児血清および１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含んでいるＤＭＥＭに再播種された。薬剤選択の後、ウイルス感染された安定な細胞系は、１０％ウシ胎児血清を含んでいるＤＭＥＭ中で集密まで培養された。細胞は２日ごとに栄養補給された。感染後１週で、細胞は１０μＭのＷＹ１４６３４（カルバイオケム（Calbiochem））とともに、またはなしに６時間インキュベートされ、ＲＮＡの調製に使用された。
【００２６】
トランスフェクション検定法
ＬＰＬプロモーターは、マウスゲノムＤＮＡからＰＣＲにより取得された。用いられたポリメラーゼ連鎖反応プライマーは以下のとおりである：（前向き）５´−ＧＣＡＣＣＡＴＧＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＴＡ−３´、（逆向き、＋１３５）５´−ＧＣＡＧＧＡＧＧＣＧ  ＣＡＡＧＡＧＧＡＣＴ−３´。増幅された産物はルシフェラーゼリポータープラスミド内にサブクローン化され、シーケンシングにより確認された。Ｃ２Ｃ１２細胞、およびＦＫＨＲを過剰発現しているＣ２Ｃ１２細胞は、２４ウェルクラスター組織培養プレート内での、リポフェクトアミン・プラス試薬（インビトロジェン）を用いたトランスフェクション検定に使用された。トランスフェクション混合物は５０ｎｇのＰＰＡＲα発現プラスミド、１５０ｎｇのＬＰＬ−Ｌｕｃリポータープラスミドを含んでいた。細胞は５時間にわたってトランスフェクトされ、採取およびルシフェラーゼ活性検定に先立ち１６時間にわたりＯｐｔｉ−ＭＥＭ（インビトロジェン）中でインキュベートされた。すべての点は三重に行なわれ、独立した実験で２回繰り返された。
【００２７】
血清グルコースレベルの測定
血液は腹部大動脈より採取され、グルコースはＴｉｄｅｘキット（サンキョー社（Sankyo Co.））を用いて測定された。
【００２８】
統計的分析
統計的比較は、スチューデントのｔ検定を用いて行なわれた。統計的有意性はｐ＜０．０５として定義される。
【００２９】
【実施例１】
骨格筋におけるＬＰＬ遺伝子発現についての、血中インスリンレベルに影響を及ぼす栄養状態による調節における、ＦＯＸＯファミリーの役割を研究するため、本発明者らは絶食および再給餌を受けたマウスを調べた。血糖値は絶食により低下され、再給餌により回復された（対照；１５５±８．９ｍｇ／ｍｌ、絶食２４時間；８１±２．２ｍｇ／ｍｌ、Ｐ＜０．０１、再給餌；１３７±５．９ｍｇ／ｍｌ）。予期したように、２４時間および４８時間の絶食はＬＰＬのｍＲＮＡの発現を増大した。脂肪酸利用タンパク質、ＣＤ３６／ＦＡＴの発現もまた断食によりアップレギュレートされた。アラニンからのピルビン酸塩などの肝臓における糖新生のための材料の補給を増大することにより、骨格筋におけるグルコースホメオスタシスに貢献してもよいグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ２）［２８］もまた増大された。興味深いことに、絶食はＦＫＨＲおよびＦＫＨＲＬ１ｍＲＮＡにおいて共に７〜８倍の増加を誘導した。ＡＦＸｍＲＮＡ発現は絶食により２倍にアップレギュレートされた。ＰＰＡＲα発現もまた３倍にアップレギュレートされた。これらの誘導はすべて再給餌により取り消された。インスリン依存性グルコース輸送体であるグルコース輸送体４（ＧＬＵＴ４）［２９］発現は、絶食により有意に変えられなかったが、再給餌はＧＬＵＴ４の発現をアップレギュレートした。脂質生成の調整剤、ＳＲＥＢＰ１［３０］は絶食により低下され、再給餌により増大された。
【００３０】
【実施例２】
次に、本発明者らは最も一般的に使用される糖尿病の実験モデルである、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）［３１］で処理されたマウスの筋肉におけるＦＫＨＲのレベルを調べた。ＳＴＺ処理されたマウスの血糖値（５４３±２０ｍｇ／ｍｌ）は、対照（１８１±６．５ｍｇ／ｍｌ、Ｐ＜０．００１）に比較して高く、実験に用いられたＳＴＺがよく効いてインスリン分泌を混乱させたことを示唆している。さらに、ＳＴＺ処理されたマウスの体重（１５．６±０．５４ｇ）は、対照のそれ（１９．５±０．３９ｇ、Ｐ＜０．０５）に比較して低かった。予期したように、ＬＰＬのｍＲＮＡレベルは図２に示されたように増加した。ＣＤ３６／ＦＡＴおよびＧＴＰ２発現も双方とも有意に増大された。さらに、ＦＫＨＲのｍＲＮＡレベルは、これらのマウスの骨格筋において著しく増大された。ＡＦＸおよびＦＫＨＲＬ１レベルもまた増大された。ＰＰＡＲαレベルはほんのわずか増大された。
【００３１】
【実施例３】
ＦＯＸＯファミリーの中ではＦＫＨＲが絶食および糖尿病の双方において最もアップレギュレートされたことから、骨格筋においてＦＫＨＲ発現と共に増加した他の遺伝子との間の因果関係を決定するため、ＦＫＨＲがＣ２Ｃ１２筋細胞系において異所性に過剰発現された。Ｃ２Ｃ１２細胞は、ＦＫＨＲをコードしている組換え粒子か、またはベクターのみを用いて感染された。導入されたＦＫＨＲ遺伝子の発現を確認するべく、ノーザンブロット分析が行なわれた（図３）。ＦＫＨＲの発現は、ベクターのみを用いて感染された細胞におけるレベルと比較して、ＬＰＬｍＲＮＡに著しい増加をもたらした。したがって、ＬＰＬが骨格筋におけるＦＫＨＲの標的であると考えられる。ＬＰＬとは対照的に、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるＣＤ３６／ＦＡＴおよびＧＰＴ２レベルに対しては、過剰発現されたＦＫＨＲの影響のみはをごくわずかに見い出されたにすぎない（図４）。
【００３２】
【実施例４】
ＦＫＨＲは、ＣＢＰ／ｐ３００を含む核内受容体補助因子複合体の一部として［２０，２１］、核内ホルモン受容体の補助因子タンパク質として作用することが可能である［１８，１９］。本発明者らは、ＦＫＨＲがＣＢＰ［８］のＮ末端（ａａ１〜７２１）およびＣ末端（１８２４〜２４４１）とは物理的に相互作用することができたが、他の領域とはできなかったことを、ＧＳＴプルダウン法により観察した（示さず）。 このような絶食中または糖尿病をもつものにおいては、ＰＰＡＲα活性剤である遊離脂肪酸の血中レベルが高いことが知られているため［３２］、本発明者らは、ＬＰＬ遺伝子発現の増強がＰＰＡＲαの活性化により生じたと推測した。この可能性に取り組むため、ＦＫＨＲ−Ｃ２Ｃ１２細胞は合成ＰＰＡＲα活性剤であるＷＹ１４６４３とともにインキュベートされ、ＬＰＬの発現レベルが調べられた。基準の、およびＷＹ１４６４３に誘導されたＬＰＬ発現レベルは、ＦＫＨＲを過剰発現している細胞においては著しく高められることが見い出された（図４）。ＣＤ３６／ＦＡＴ発現もまたＷＹ１４６４３により増大されており、そのことはＣＤ３６／ＦＡＴ発現がＰＰＡＲにより増強されるという先の発見と一致する［３３］。このＷＹ１４６３４に誘導されるＣＤ３６／ＦＡＴ発現は、ＦＫＨＲを過剰発現している細胞においてはごくわずかしか増大されなかった（図４）。ＧＰＴ２発現は、ＷＹ１４６３４によりごくわずかに増大された。
【００３３】
【実施例５】
次に、ＬＰＬプロモーターによるＦＫＨＲの転写調節を評価するべく、一過性のトランスフェクション−リポーター検定が行なわれた。ルシフェラーゼリポーター遺伝子に対するＰＰＡＲ応答エレメント（ＰＰＲＥ、−１６９〜−１５７、［１１］）を含んでいるマウスＬＰＬプロモーターを結合しているプラスミド構築物が分析された。予期したように、ＰＰＡＲαは、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるトランスフェクション検定において、ＬＰＬプロモーター（−４８７〜＋１３５）に駆動されるリポーター活性を増大した（図５）。ＦＫＨＲを過剰発現しているＣ２Ｃ１２細胞では、ＰＰＡＲαはリポーター活性をさらに増大した（４．５倍、ＬＰＬプロモーターなしのルシフェラーゼリポーターが標準として用いられた）。これらの結果は、ＦＫＨＲに仲介されるシスエレメントが、ＬＰＬプロモーターの−４８７〜＋１３５に局在することを示している。ＰＰＡＲαプラスミドのない場合、ＬＰＬプロモーターに駆動されるリポーター活性は、対照の細胞とＦＫＨＲを過剰発現している細胞との間で差異がなかった。すなわち、この実験ではＦＫＨＲ単独ではＬＰＬプロモーター領域に影響を及ぼさなかった。ＦＫＨＲはＤＢＥ（ＤＡＦ１６ファミリー結合性エレメント、［２５］）に結合することが示されている。しかし、ＬＰＬプロモーター（−４８７〜＋１３５、［３４，３５］）にはコンセンサスＤＢＥはない。これらの結果は、ＦＫＨＲはＰＰＡＲαとともに、ＬＰＬプロモーターのＰＰＲＥ配列を介してＬＰＬ遺伝子発現をアップレギュレートするかもしれないことを示唆している。
【００３４】
【発明の効果】
ＦＯＸＯファミリーの標的、ＦＯＸＯファミリーにより活性化されるその遺伝子は、ＩＧＦＢＰ１［３６，３７］、Ｇ６Ｐアーゼ［１６，１７］ｐ２７／ＫＩＰ１［３８］ＧＡＤＤ４５［３９，４０］アルカリ性ホスファターゼ［４１］、ミトコンドリアの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ［４２］を含む。骨格筋におけるＦＫＨＲの生理学的役割は、明らかにされていなかった。本発明者らの、 血液の乳状脂粒トリグリセリドからの脂肪酸を取り込む重要な酵素であるＬＰＬの、ＦＫＨＲの標的としての発見は、骨格筋におけるＦＫＨＲの機能について手がかりを与える。絶食および糖尿病においては、ＦＫＨＲは肝臓におけるＧ６Ｐアーゼ発現を増大することにより糖新生を活性化してよく、またＬＰＬ発現を増大することにより骨格筋における脂肪酸の利用を活性化し、人体における全グルコース代謝において役割を果たすのかもしれない。
【００３５】
骨格筋においてＬＰＬを特別に過剰発現している興味の表現型をもつトランスジェニックマウスが報告されている。高レベルの骨格筋ＬＰＬをもつトランスジェニックマウスにおいては、筋肉におけるグリコゲン貯蔵、ミトコンドリアおよびペルオキシソームの増殖に関連したミオパシーが見られた［４３］。Ｍｕｓ−ＬＰＬマウスのいくつかの特徴は、グリコゲン量の増加および異常な形のミトコンドリアといった、横紋筋肉腫における観察にいくぶん類似していることから［４４］、ＬＰＬの過剰発現はＰＡＸ３−ＦＫＨＲに誘導される横紋筋肉腫に関与しているのかもしれない。しかしながら、Jensenら［４５］により、Ｍｕｓ−ＬＰＬマウスの骨格筋においてはミオパシーの証拠は観察されていない。この不一致は、骨格筋におけるＬＰＬ発現レベルにおける差異によって生じることも可能である。ＬＰＬ発現レベルがアップレギュレートされた、すなわち絶食および糖尿病の条件下では、ミトコンドリアのマーカータンパク質（シトクロームＣオキシダーゼＩＶ）の遺伝子発現には増加が観察されず（示さず）、本発明者らの実験においてはミオパシーが起きなかったことが示唆される。一方、Ｍｕｓ−ＬＰＬが骨格筋におけるインスリン抵抗性を引き起こすことが示された［４６，４７］。Ｍｕｓ−ＬＰＬマウスは骨格筋トリグリセリド含有量において３倍の増加を有しており、骨格筋におけるインスリン刺激によるグルコースの取り込みの低減のため、インスリンに対し抵抗性であった［４６］。骨格筋は人体における最大の器官であり、骨格筋におけるインスリン抵抗性は糖尿病の病理発生に関与すると考えられる。
【００３６】
ＳＴＺ処理された糖尿病マウスにおいては、ＦＫＨＲ発現は骨格筋において増強されたＬＰＬ発現と結びつけて誘導された（図３）。これらの観察に基づき、骨格筋における亢進されたＦＫＨＲの発現が糖尿病の病理発生に関係することが考えられる。増大されたＦＫＨＲ発現は、一部は糖尿病における亢進されたＬＰＬ発現による鈍化されたインスリンシグナリングに寄与していることが考えられる。
【００３７】
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【００３８】
【配列表】
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2004201595.tif 000004
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＦＯＸＯファミリー遺伝子発現は栄養状態により調節されることを示すノーザン分析の電気泳動の写真を示す。マウスは４つの実験群に分割された。それらはアドリビタム（adlibitum）を給餌されるか（対照）、または２４時間絶食または４８時間絶食を受けた。他は４８時間絶食とそれに続く８時間の給餌（再給餌）を受けた。ノーザン分析は、骨格筋（大腿四頭筋）より単離された全ＲＮＡ（レーンあたり２０μｇ）について行なわれた。
【図２】図１と同じ系で、ＦＯＸＯファミリー遺伝子発現は栄養状態により調節されることを示すオートラジオグラムの結果を示す。オートラジオグラムについてのデンシトメトリーによる相対的なレベルが示されている。各々の値は平均±Ｓ．Ｅ．（ｎ＝４）を表す。
【図３】図３は、ＦＫＨＲ遺伝子発現はインスリン欠乏マウスの骨格筋において増大されることを示すノーザン分析の電気泳動の写真を含む。
ストレプトゾトシン糖尿病マウスの骨格筋から単離された全ＲＮＡ（レーンあたり２０μｇ）について、ノーザン分析が行なわれた。雌の９週齢のマウスは、３日間にわたり毎日クエン酸ナトリウム溶液（対照）またはＳＴＺ（体重グラムあたり１００μｇ）を用いた腹腔内注射を受けた。１０日後、動物は殺された。典型的なオートラジオグラムおよびその相対的なレベルが示される。各々の値は６匹のマウスの平均±Ｓ．Ｅ．を表す。
【図４】図４は、ＬＰＬ遺伝子発現はＦＫＨＲを過剰発現している培養筋細胞において増大されることを示すノーザン分析の電気泳動の写真を含む。
ＦＫＨＲはＣ２Ｃ１２細胞において異所性に発現された。該細胞は１０μＭのＷＹ１４６４３で６時間にわたり処理された。該細胞より全ＲＮＡが単離され、３２Ｐ標識されたＦＫＨＲ、ＬＰＬ、およびＣＤ３６／ＦＡＴを用いたノーザンブロッティングにより分析された。グラフはＬＰＬｍＲＮＡのノーザッンブロットについてのデンシトメトリーによる値を表している。各々の値は２枚のシャーレの平均±Ｓ．Ｅ．を表す。
【図５】図５は、ＬＰＬプロモーターに対するＦＫＨＲおよびＰＰＡＲαの影響についての一過性トランスフェクション−リポーター検定の結果を示す。
ＰＰＡＲαの影響は、リポータープラスミドＬＰＬ−Ｌｕｃを、Ｃ２Ｃ１２細胞およびＦＫＨＲを過剰発現しているＣ２Ｃ１２細胞において同時トランスフェクションすることにより調べられた。ｌｕｃリポーター遺伝子の活性化は、相対的な光単位において測定された。三重の実験からの平均値が示されており、ＦＫＨＲおよびＰＰＡＲαの不在下での活性が基準値（１００％）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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