(57)【要約】　　　（修正有）【課題】癌免疫検定法の分野に関する。【解決手段】前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の新たな免疫検定法。また、ＰＳＡ用の免疫検定法においてキャリブレータまたは対照として使用できるＰＳＡとα−抗キモトリプシン（ＡＣＴ）の複合体に似た複合体、および、ＰＳＡに対するポリクロナール抗体を、ＰＳＡがＡＣＴに結合することでマスクされるエピトープと結合するもの、およびこのようなエピトープと結合しないものに分別する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　αＨＥ抗体に架橋した生体サンプルからの被検体を含んで成る複合体で、該被検体は遊離被検体としても、あるいは結合分子と結合して被検体−結合分子複合体を形成した形でも存在でき、該被検体は少なくとも１つの隠れたエピトープと隠れていないエピトープを有し、αＨＥ抗体は遊離被検体に結合できるが被検体−結合分子複合体とは結合できない被検体に対する抗体である複合体。
【請求項２】
　被検体がＰＳＡおよび結合分子がＡＣＴである、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
　結合分子に架橋する生体サンプルからの被検体で、該被検体は生体サンプル中に遊離被検体としても、あるいは生体サンプルに内在性の結合分子に結合して被検体−結合分子複合体を形成した形でも存在することができ、且つ、少なくとも１つの隠れたエピトープと隠れていないエピトープを有する被検体。
【請求項４】
　請求項２に記載の複合体の被検体の検定におけるキャリブレータまたは対照としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、癌免疫検定法の分野に関する。より詳細には、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の新たな免疫検定法を提示する。また、ＰＳＡ用の免疫検定法においてキャリブレータまたは対照として使用できる、ＰＳＡとα１−抗キモトリプシン（ＡＣＴ）との複合体に似た、ＰＳＡ−抗ＰＳＡ複合体も提示する。さらに、ＰＳＡに対するポリクロナール抗体を、ＰＳＡがＡＣＴに結合することでマスクされるエピトープと結合するものおよびこのようなエピトープと結合しないものに分別する方法を提示する。
【背景技術】
【０００２】
　前立腺特異抗原（ＰＳＡ）については、Ｍ．Ｃ．ＷａｎｇらがＩｎｖｅｓｔ　Ｕｒｏｌ．１７巻１５９頁（１９７９年）で最初に記述した。これは前立腺上皮の分泌物であり、前立腺癌細胞によっても産生される。ＰＳＡは、プロテアーゼ活性を有する分子量３３，０００〜３４，０００ダルトンの糖蛋白モノマーであると解析されている（Ｍ．Ｃ．Ｗａｎｇらによる前掲文献およびＹ．ＢａｎらによるＢｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ．１２３巻４８２頁（１９８４年））。最近では、同抗原のアミノ酸配列が報告され（Ｗ．Ｋ．ＷａｔｔらによるＰｒｏｃ　Ｎａｔｌ　ＡｃａｄＳｃｉ　ＵＳＡ，８３巻３１６６頁（１９８６年））、ＰＳＡの遺伝子がクローンされている（Ａ．ＬｕｎｄｗａｌｌによるＢｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ．１６１巻１１５１頁（１９８９年））。栗山らによる酵素免疫検定法の開発によって、悪性および良性の前立腺疾患患者ならびに正常男性のかなりの部分の血中で、低濃度のＰＳＡを検出することが可能になった（栗山らによるＣａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４０巻４６５８頁（１９８０年））。
【０００３】
　ＰＳＡ試験は、前立腺癌の手術または薬物による治療後の患者で、悪性疾患または良性疾患を検出するのに大いに役立ちうる（Ｐ．Ｈ．ＬａｎｇｅらによるＵｒｏｌｏｇｙ，３３巻（補遺６）１３頁(1989 年６月）；Ｃ．Ｓ．ＫｉｌｌｉａｎらによるＣａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４５巻８８６頁（１９８５年））。治療してもＰＳＡの上昇が続く場合、あるいは治療後のＰＳＡベースラインが上昇するのであれば、疾患の再発または残留を示している（Ｍ．Ｋ．ＢｒａｗｅｒらによるＵｒｏｌｏｇｙ，３３巻（補遺５）１１頁（１９８９年５月）；Ｊ．Ｋ．ＳｉｄｄａｌらによるＥｕｒ　Ｕｒｏｌ．１２巻１号３頁（１９８６年）；Ｔ．Ａ．ＳｔａｍｅｙらによるＮ　ＥｎｇｌＪ　Ｍｅｄ．３１７巻９０９頁（１９８７年）；Ｐ．Ｈ．ＬａｎｇｅらによるＪ　Ｕｒｏｌ．１４１巻８７３頁（１９８９年）；Ｔ．Ａ．ＳｔａｍｅｙらによるＪ　Ｕｒｏｌ．１４１巻１０７６頁（１９８９年）；Ｔ．Ａ．ＳｔａｍｅｙらによるＪ　Ｕｒｏｌ．１４１巻１０８４頁（１９８９年）；Ｔ．Ａ．ＳｔａｍｅｙらによるＪ　Ｕｒｏｌ．１４１巻１０８８頁（１９８９年）；Ｄ．Ｗ．ＣｈａｎらによるＣｌｉｎ　Ｃｈｅｍ．３３巻１９１６頁（１９８７年））。
【０００４】
　ＰＳＡ検査単独では、一般集団におけるスクリーニング手順としても疾患の段階決定の指針としても推奨できない。
【０００５】
　その代わり、前立腺癌患者の管理における補助的検査としては広く受け入れられている（栗山らによるＪ　Ｎａｔｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．６８巻９９頁（１９８２年）；Ｔ．Ａ．ＳｔａｍｅｙらによるＮ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ．３１７巻９０９頁（１９８７年）；Ｐ．Ｈ．ＬａｎｇｅらによるＪ　Ｕｒｏｌ．１４１巻８７３頁（１９８９年）；Ｔ．Ａ．ＳｔａｍｅｙらによるＪ　Ｕｒｏｌ．１４１巻１０７６頁（１９８９年）；Ｔ．Ａ．ＳｔａｍｅｙらによるＪ　Ｕｒｏｌ．１４１巻１０８４頁（１９８９年）；Ｔ．Ａ．ＳｔａｍｅｙらによるＪ　Ｕｒｏｌ．１４１巻１０８８頁（１９８９年）；Ｄ．Ｗ．ＣｈａｎらによるＣｌｉｎ　Ｃｈｅｍ．３３巻１９１６頁（１９８７年）；Ｊ．Ｅ．ＯｅｓｔｅｒｌｉｎｇらによるＪ　Ｕｒｏｌ．１３９巻７６６頁（１９８８年））。
【０００６】
　血清ＰＳＡ濃度の測定は、現在では前立腺癌患者の診断に広く使用されているが、血清ＰＳＡ濃度の上昇は良性前立腺肥大症でも前立腺の外科的外傷に派生しても報告されている（ＤｕｆｆｙによるＡｎｎ　Ｃｌｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８９年）；ＢｒａｗｅｒらによるＵｒｏｌｏｇｙ　Ｓｕｐｐｌ（１９８９年））。
【０００７】
　１９９２年２月６日に公開されたＨ．ＬｉｌｊａらによるＰＣＴ特許出願ＷＯ　９２／０１９３６号「遊離および複合前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のアッセイ」では、遊離ＰＳＡならびにプロテイナーゼインヒビター複合体としてのＰＳＡの免疫検定法を開示している。遊離ＰＳＡおよびＰＳＡ複合体は、２種類以上のモノクロナール抗体を採用した非競合的免疫検定法により測定する。この発明はさらに、問題のＰＳＡプロテイナーゼインヒビター複合体がα１−抗キモトリプシン（ＡＣＴ）、α１−プロテアーゼインヒビター（ＡＰＩ）またはα２−マクログロブリンのいずれかで形成されることを特徴とする。さらに、この発明は、遊離ＰＳＡ、ＰＳＡプロテイナーゼインヒビター複合体およびその両者の総ＰＳＡに対する比を、前立腺癌患者の診断に応用することを特徴とする。
【０００８】
　同特許出願では、３種類のモノクロナール抗体（以下、「ＭＡＢ」という）を開示している。ＡＣＴとＰＳＡとの複合体（以下、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体という）および遊離ＰＳＡは、ＭＡＢ　２Ｅ９および２Ｈ１１とされた。ＭＡＢ　５Ａ　１０は遊離ＰＳＡを認識するが、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体を認識しない。ＭＡＢ　２Ｅ９は、免疫ブロット上の遊離ＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴ複合体を容易に識別した唯一の抗ＰＳＡ　ＭＡＢである。抗ＰＳＡ　ＭＡＢ　２Ｅ９、２Ｈ１１または５Ａ１０のいずれも、互いに結合して固相結合ＰＳＡになるのを有意に阻止しなかった。
【０００９】
　ヒト血清の非競合的免疫検定法において様々なＭＡＢを組み合わせて使用することで、遊離ＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴ複合体の双方を測定することにより臨床的特異度が上昇すること、また遊離ＰＳＡ／総ＰＳＡ比および遊離ＰＳＡ／ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体比が良性前立腺肥大症患者と前立腺癌患者とでは有意に異なることを同出願は明らかにした。
【００１０】
　遊離ＰＳＡに特異なＭＡＢおよびＰＳＡ−ＡＣＴ複合体に反応するＭＡＢは、たとえばＣａｎＡｇ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＡＢ（スウェーデン　イェテボリ）などから市販されている。自社ＭＡＢを様々な組み合わせで使用した場合の阻害試験および用量反応関係を分析したＣａｎＡｇ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＡＢは、ＰＳＡ分子上に少なくとも９種類の主要抗原決定基があることに気づいた。そのＭＡＢ決定エピトープの１つの基は、複合体化していないＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴ複合体の双方上で曝露され、またそのＭＡＢ決定エピトープのもう１つの基は遊離ＰＳＡでのみ曝露された（ＣａｎＡｇ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＡＢ、Ｎｉｌｓｓｏｎらによる「ＰＳＡのエピトープマッピング、およびＰＳＡの様々なイソ型決定のための分析法の開発」、および同表題の要約、要約Ｐ３８、Ｊ．Ｔｕｍｏｒ　Ｍａｒｋｅｒ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、第１０回ヒト腫瘍マーカー国際会議、１９９３年９月８〜１１日、於ドイツ、ボン）。
【００１１】
　ＰＳＡの競合的放射免疫検定法は市販されている（たとえば、Ｙａｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ワシントン州ベルビュー）のＰＲＯＳ−ＣＨＥＣＫ　ＰＳＡ）。ＰＲＯＳ−ＣＨＥＣＫ　ＰＳＡは、ＰＳＡに対するポリクロナールウサギ抗体、ならびに１２５Ｉ標識したＰＳＡを使用する。
【００１２】
　現在は、２種類のＰＳＡ非競合的サンドイッチ免疫検定法が上市されている。その１種類は、ＰＳＡに特異な２セットのＭＡＢを使用するもので、（１）１セットのＭＡＢ（「捕捉抗体」）は固相に結合してサンプル中のＰＳＡを捕捉し、（２）もう１セットのＭＡＢ（「プローブ抗体」）は標識されて遊離溶液の形にあって、捕捉されたＰＳＡと結合してこれを検出する。
【００１３】
　これらの検定法は、本書では「ＭＯＮＯ検定法」と呼ばれる。一般に、これらのＭＡＢのＰＳＡとの結合は、ＡＣＴがＰＳＡに結合しても妨げられない。すなわち、一般にこれらのＭＡＢは遊離ＰＳＡともＰＳＡ−ＡＣＴ複合体とも結合できるわけである。このような検定法の例としては、Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ　Ｔａｎｄｅｍ−ＥおよびＴａｎｄｅｍ−Ｒ　ＰＳＡアッセイ（Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ、カリフォルニア州ラホラ）がある。
【００１４】
　第２のタイプのサンドイッチ検定法では、固相ではＰＳＡに特異なＭＡＢを、またプローブ抗体としてＰＳＡに対するポリクロナール抗体を使用する。一般にこれらの検定法では、ＭＡＢは遊離ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴ複合体の双方と結合することができる。これに対してポリクロナール抗体のプールには、遊離ＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴ複合体の双方と結合できる抗体、ならびに遊離ＰＳＡとは結合するがＰＳＡ−ＡＣＴ複合体とは結合できない抗体が入っている。後者の場合、これらの抗体が結合したエピトープは、ＡＣＴがＰＳＡに結合すると阻止される。この種の検定法の例としては、Ａｂｂｏｔｔ　ＩＭｘ（登録商標）ＰＳＡ　Ａｓｓａｙ（本出願人）およびＡＣＳＴＭ　ＰＳＡ　ａｓｓａｙ（Ｃｉｂａ−Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州イーストワルポール）がある。
【００１５】
　第２の種類のサンドイッチ検定法はＰＳＡ−ＡＣＴ複合体よりも遊離ＰＳＡのほうを優先的に検出することがわかっている（ここではこの現象を「バイアス」と呼ぶ）。他方、一部のＭＯＮＯ検定法にはそのようなバイアスはない。Ｂ．ＢｌｕｅｓｔｅｉｎらによるＪ．Ｔｕｍｏｒ　Ｍａｒｋｅｒ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，７巻４号４１頁（１９９２年）を参照。
【００１６】
　良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）患者の血清中にはＰＳＡ−ＡＣＴ複合体よりも遊離ＰＳＡのほうが多くあることがわかっている。他方、前立腺癌患者の血清中では遊離ＰＳＡよりもＰＳＡ−ＡＣＴ複合体のほうが多い。（Ｈ．ＬｉｌｊａらによるＣｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７巻１６１８頁（１９９１年）；Ｕ．ＳｔｅｎｍａｎらによるＣａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５１巻２２２頁（１９９１年）；Ｈ．ＬｉｌｊａらによるＣａｎｃｅｒ　Ｓｕｐｐｌ．７０巻２３０頁（１９９２年）；Ａ．ＣｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎらによるＪ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１５０巻１００頁（１９９３年））。
【００１７】
　発明の要約
　本発明は１つの態様として、サンプル中のＰＳＡを検出して定量するための新しいＭＯＬＹ検定法およびＭＯＮＯ検定法を提示する。これらの方法では遊離ＰＳＡとは結合するがＰＳＡとＡＣＴの複合体（「ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体」）とは結合しないＨＥＰＳＡ抗体でサンプルを処理する。検定法にＨＥＰＳＡ抗体を加えることで、これらの検定法におけるバイアスが減るかもしくは排除される。これらの検定法を実施するためのキットも提示する。
【００１８】
　本発明のもう１つの態様として、ＰＳＡとＨＥＰＳＡ抗体の複合体（「ＰＳＡ−ＨＥＰＳＡ抗体複合体」）を提示するが、これはＰＳＡ−ＡＣＴ複合体に似ている。この複合体は、ＰＳＡ免疫検定法のキャリブレーターまたは対照あるいはその両者として有用である。
【００１９】
　本発明のさらに別の態様として、ポリクロナール抗体をＰＳＡに分別して、ＰＳＡとＡＣＴの結合によってマスクされるエピトープ（「隠れるエピトープ」）を結合する抗体、およびこのようなエピトープと結合しない抗体を含有する分画を得る方法を提示する。同様に、このような分別に有用なアフィニティーカラムも提示する。
【００２０】
　本発明の上記の態様は一般に遊離状態または結合分子と複合体を形成した状態で存在することのできるあらゆる被検体に適用できる。
【００２１】
　発明の詳細な説明
　ここでいう「抗体」とは、ポリクロナール抗体およびモノクロナール抗体、免疫グロブリン全長ならびに免疫グロブリンの抗原結合フラグメントを含む。これらのフラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’２）およびＦｖがある。このようなフラグメントは、当該技術分野で既知の方法により作製できる。
【００２２】
　ここでいう「ＨＥ抗体」または「αＨＥ」とは、標的抗原（「被検体」）との結合が当該被検体に別の分子（「結合分子」）が結合することで妨げられるような抗体のことである。「非ＨＥ抗体」または「αｎＨＥ」とは、被検体への結合が当該被検体と結合分子が結合することで妨げられない抗体のことをいう。被検体に結合分子が結合することでマスクされる被検体上のエピトープのことを「隠れるエピトープ」（「ＨＥ」）という。同様に、被検体に結合分子が結合することでマスクされない被検体上のエピトープのことを「隠れないエピトープ」（「ｎＨＥ」）という。「α被検体」または「αＡ」とは、αＨＥであれαｎＨＥであれ、被検体に対する抗体のことをいう。
【００２３】
　被検体は生体サンプルで見られる抗原であることが好ましく、また当該サンプルに内在性のものであることが好ましい。結合分子は当該サンプルに内在性のものであることが好ましく、またしばしば被検体を伴う。結合分子および被検体は蛋白であることが望ましい。被検体の例としては血清プロテアーゼが、その結合分子としては血清プロテーアゼインヒビターが挙げられる。血清プロテアーゼおよびそのインヒビター（括弧内）としては、たとえばプロテインＣ（プロテインＣインヒビター）、エラスターゼ（抗トリプシン）、カテプシンＧ（ＡＣＴ）、ＰＳＡ（ＡＣＴ）、ＰＳＡ（α２−マクログロブリン）、トロンビン（抗トロンビンIII）、Ｃ１−エステラーゼ（Ｃ１−インヒビター）、ｔ−ＰＡ（ＰＡＩ−１）、ｕＰＡ（ＰＡＩ−１）、プラスミン（α２−抗プラスミン）、ＰＳＡ（α１−プロテアーゼインヒビター）、およびＰＳＡ（プロテインＣインヒビター）がある。「ＰＡＩ−１」とは、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター１型のことである。「ｔ−ＰＡ」とは、組織プラスミノーゲン活性化因子のことである。「ｕＰＡ」とは、尿中プラスミノーゲン活性化因子のことである。当業者であれば、結合分子は血清プロテアーゼでもよく、被検体は血清プロテアーゼイインヒビターでもよいことがわかるだろう。
【００２４】
　「ＭＯＬＹ検定法」とは、捕捉抗体がＭＡＢで、プローブ抗体がポリクロナール抗体である、あるいはその逆であるような免疫検定法のことをいう。
【００２５】
　本発明は、試験サンプル中にある被検体の免疫検定法を開示する。サンプルは、一般的には生体サンプルである。生体サンプルとしては、血液、血清、前立腺液、精液、尿、リンパ液、髄液がある。
【００２６】
　サンプルに結合分子と結合しない被検体（これら未結合の被検体を、ここでは「遊離被検体」ともいう）および結合分子と複合体を形成する被検体（「複合体形成被検体」または「被検体−結合分子複合体」）を含有する場合には、被検体用のＭＯＬＹ検定法および一部のＭＯＮＯ検定法はバイアスを呈し、複合体形成被検体のないサンプルでは複合体形成被検体のあるサンプルよりも読取り値が高くなる。たとえば被検体検出に使用したポリクロナール抗体の一部が遊離被検体とは結合できるが複合体形成被検体とは結合できない場合に、このようなことが生じうる。
【００２７】
　本発明者は、反応混合液に遊離ＨＥ抗体を加えることで被検体用のＭＯＬＹ検定法および一部のＭＯＮＯ検定法で見られるバイアスを是正できるのを発見した。遊離ＨＥ抗体を加えることを除いては、特定被検体用のＭＯＬＹ検定法およびＭＯＮＯ検定法は、この種の検定法の技術分野で既知の方法に従って実施することができる。さらに、サンプル中の被検体がサンプルを固相とインキュベートしたときに固相に直接結合できるのであれば、捕捉抗体は必要ない。プローブ抗体および捕捉抗体は、当該分野で既知の方法に従って作製することができる。プローブ抗体は、当該技術分野で既知の方法を使って、化学発光標識、蛍光標識、酵素および放射標識などで標識することができ、採用した標識に応じて検定法を設定する。発光標識した免疫測定法の例は、Ｗ．Ｇ．ＷｏｏｄらによるＥｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９巻７８７頁（１９９１年）に載っている。ＨＥ抗体および非ＨＥ抗体は、既知の方法、たとえば以下に述べるＨＥＰＳＡ抗体および非ＨＥＰＳＡ抗体の作製に使用する方法を使って作製できる。ＨＥ抗体は、以下に述べるようにモノクロナール抗体もしくは特異的ポリクロナールＨＥ抗体であることが望ましい。
【００２８】
　そこで本発明の１つの態様として、生体サンプル中の被検体のためのサンドイッチ非競合的免疫検定法を提示する。捕捉抗体（「αｎＨＥ」）は、当該被検体の隠れないエピトープに向けられたもので、固相に付着して、生体サンプル中に存在するかもしれない被検体を捕捉する。生体サンプルを加えながら、あるいは加えた後、捕捉抗体をＨＥ抗体（「αＨＥ」）とインキュベートする。あるいは、αＨＥを捕捉抗体に曝露する前にサンプルとインキュベートしてもよい。αＨＥはＭＡＢであることが望ましい。十分な時間インキュベートして、｛（αｎＨＥ）（被検体）（αＨＥ）｝の複合体が形成されるようにする。次いで、固相に結合していなかった試薬を反応混合液からすべて取り除く。これには、当該技術分野で既知の洗浄手順によって行う。たとえば、未結合試薬を水性媒体に溶解して固相から洗い流し、固相には｛（αｎＨＥ）（被検体）（αＨＥ）｝複合体だけを残す。
【００２９】
　次いで、ポリクロナール抗被検体抗体（「α被検体＊」）を加える。α被検体＊は、できれば検出用に標識したもの、たとえば酵素標識、放射標識、蛍光標識または化学発光標識したものが好ましい。
【００３０】
　反応混合液を十分な時間インキュベートして、｛（αｎＨＥ）（被検体）（αＨＥ）（α被検体＊）｝複合体および｛（αｎＨＥ）（被検体）（結合分子）（α被検体＊）｝複合体を形成する。｛（αＮＨＥ）（被検体）（αＨＥ）（α被検体＊）｝複合体では、αＨＥとα被検体＊の双方が複合体中の被検体に結合している点を注意すること。サンプル中に結合分子が存在するならば、別の複合体、すなわち｛（αｎＨＥ）（被検体）（結合分子）（α被検体＊）｝の複合体も形成されることがある。
【００３１】
　次いで、未結合試薬を分離する。標識したα被検体＊を検出して、固相上に｛（αｎＨＥ）（被検体）（αＨＥ）（α被検体＊）｝および｛（αｎＨＥ）（被検体）（結合分子）（α被検体＊）｝の複合体が形成されていることを検出する。サンプル中に被検体が存在しなければ、これらの複合体は生じない。これらの複合体の存在量は、サンプル中の被検体濃度に正比例する。あるいは、残っている未結合の標識α被検体＊の存在量を定量すれば、この量はサンプル中に存在する被検体の量に反比例する。
【００３２】
　上記の検定形式は、バイアスを呈するＭＯＮＯ検定法でも使用することができる。ＭＯＮＯ検定法では、α被検体＊を標識したαｎＨＥ（すなわち「αｎＨＥ＊」）とするだけで、それ以外は上記の方法をそのまま適用することができる。
【００３３】
　捕捉抗体がポリクロナール抗体でプローブ抗体がＭＡＢの場合には、捕捉抗体をα被検体またはαｎＨＥにし（αｎＨＥはたとえば以下に述べる分別方法でポリクロナール抗体から分別することができる）、またプローブ抗体をαｎＨＥ＊にする以外は上記の方法をそのまま適用できる。捕捉抗体のα被検体にαＨＥのサブ集団が含まれる場合には、上記の検定手順によって得られる｛（αＨＥ）（被検体）（αｎＨＥ＊）｝の追加複合体もある。
【００３４】
　これまでに述べたことでは、被検体上に１つしかＨＥがないと仮定している。しかし、特定のαＨＥが被検体上の全ＨＥをマスクしない場合には、被検体上の他のＨＥ部位に向けた追加ＨＥ抗体を使用することになる。
【００３５】
　当業者であれば、プローブ抗体が標識してある別の分子によって特異的に結合されうるのであれば、プローブ抗体は標識を要しないことがわかるだろう。さらに、被検体を固相に直接結合できれば、捕捉抗体を使用する必要はない。
【００３６】
　本特許出願では、上記の検定法を実施するための検定用キットも提示する。検定用キットには、未標識ＨＥ抗体の入った容器、また当該被検体に対する捕捉抗体が入っている別の容器があることが望ましく、これらの抗体は非ＨＥに対するものであることが好ましく、またＭＡＢであればさらに好ましく、最も望ましいのは固相に結合したものである。未標識ＨＥ抗体は、捕捉抗体またはプローブ抗体と同じ容器に入っていても別の容器に入れてもよい。ＭＯＬＹ検定法のためには、キットにはこの他に被検体に対するプローブポリクロナール抗体で、できれば検出用に標識されている抗体が入っている容器、ならびに抗体上の標識と反応して信号を発生する試薬が入っている容器がある。たとえば、ポリクロナール抗体はアルカリホスファターゼなどの酵素で標識することができ、それと反応する試薬は酵素基質となる。アルカリホスファターゼの場合、４−メチルウンベリフェリルリン酸（ＭＵＰ）が便利なことがわかっており、その反応については以下の例IIで述べる。あるいは、プローブ抗体はモノクロナール抗体で、捕捉抗体がポリクロナール抗体でもよい。このような場合、モノクロナールプローブ抗体は非ＨＥ抗体であるのが好ましい。ＭＯＮＯ検定法のためには、プローブ抗体および捕捉抗体は被検体に対するＭＡＢとする。プローブＭＡＢおよび捕捉ＭＡＢは非ＨＥ抗体であることが好ましい。上記のキットでは、抗体は溶液、たとえば緩衝液で、免疫検定法の有害作用をもたらさないものに入っていることが好ましい。上記のキットには、さらにキャリブレーターの入った容器（１ないし複数）または対照の入った容器（１ないし複数）あるいはその両者を追加することもできる。被検体検定のためのキャリブレーターおよび対照には、以下に述べるように遊離被検体、被検体−ＨＥ抗体の複合体、あるいは被検体−結合分子の複合体が入っていることが望ましい。
【００３７】
　発明の好ましい実施例では、被検体はＰＳＡで、結合分子はＡＣＴである。ＰＳＡに対するＨＥ抗体は、遊離ＰＳＡとは結合するがＰＳＡ−ＡＣＴ複合体とは結合しない抗体である。これらの抗体をここでは「ＨＥＰＳＡ抗体」と呼ぶ。対応する比ＨＥ抗体のことは「非ＨＥＰＳＡ抗体」と呼ぶ。
【００３８】
　ＨＥＰＳＡ抗体（および非ＨＥＰＳＡ抗体）を得る方法は、当該技術分野で既知のものである。たとえば、Ｈ．Ｌｉｌｊａらによる前掲のＰＣＴ特許出願ＷＯ　９２／０１９３６号、また　ＣａｎＡｇ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＡＢ、Ｎｉｌｓｓｏｎらによる「ＰＳＡのエピトープマッピング、およびＰＳＡの様々なイソ型決定のための分析法の開発」、および同表題の要約（前掲）で述べられている。ＨＥＰＳＡ抗体の例としては、（１）ＷＯ　９２／０１９３６号に記載のＭＡＢ　５Ａ１０、（２）Ｋ．Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎらによる「早期前立腺癌と良性前立腺肥大症の判別を向上させるためのＰＳＡに関する免疫蛍光法の開発」（第１５回臨床化学国際会議、於オーストラリア　メルボルン、１９９３年１１月１４〜１９日）に述べられているＭＡＢ　９Ｂ１０（同論文ではＭＡＢ　Ｈ１１７およびＨ５０についても述べている）、（３）ＣａｎＡｇ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＡＢ（スウェーデン　イェーテボリ）から市販されているＭＡＢ　ＰＳＡ６、ＰＳＡ３０、ＰＳＡ　１７、ＰＳＡ１９、ＰＳＡ２０、およびＰＳＡ２５がある。米国特許出願０８／０９４，９０１号（１９９３年７月２２日出願）でＭ．ＭａｔｉｋａｉｎｅｎらはＭＡＢ　５Ａ１０および９Ｂ１０の双方と、これらの生産および特徴について開示している。そこでは、これらのＭＡＢを分泌するハイブリドーマはそれぞれ５Ａ１０Ｅ７Ｆ１１Ｈ４および９Ｂ１０Ａ９Ｈ３と名付けられている。これらのハイブリドーマは１９９３年３月１２日に公衆衛生研究部応用微生物学研究センターの欧州動物細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ）（Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ　ＳＰ４　０ＪＧ、英国）に寄託され、それぞれ９３０３１２０１および９３０３１２０２のＥＣＡＣＣ受託番号を付された。上記の出版物および特許出願をここで引用して本書の一部ととする。
【００３９】
　このように本発明では特にＰＳＡ検定法に有用な３つの発明、すなわちＨＥＰＳＡ抗体を用いた新しいＰＳＡ検定法、特異的ポリクロナールＨＥＰＳＡ抗体および隠れないエピトープ用の抗体の選択方法、ならびにＰＳＡ−ＡＣＴ複合体に似ているＰＳＡ−ＨＥＰＳＡ抗体複合体を提供する。最初の２つの発明では、従来技術のＭＯＬＹ検定法で見られるバイアスを回避するかもしくは減らす。最後の発明はＭＯＮＯおよびＭＯＬＹの双方の　ＰＳＡ検定法のキャリブレーターまたは対照あるいはその両者として有用である。第２の方法で選択した特異的ポリクロナール非ＨＥＰＳＡ抗体は、ＰＳＡ用のＭＯＬＹ免疫検定法でも（プローブ抗体または捕捉抗体のいずれかとして、あるいは両者として）、非競合的免疫検定法でも（捕捉抗体として）利用できる。他方、ＨＥＰＳＡ抗体は遊離ＰＳＡに特異な検定法で使用することもできれば、先に述べたようにバイアスをもたらしやすいＰＳＡ免疫検定法（ＭＯＬＹまたはＭＯＮＯのいずれでも）でこのようなバイアスを緩和または排除するために利用することができる。
【００４０】
　本出願においては、ＰＳＡ、ＡＣＴおよびＨＥＰＳＡ抗体と非ＨＥＰＳＡ抗体を使って本発明を説明する。ただし、当業者であれば、本発明をいかなる被検体、結合分子、およびＨＥ抗体と非ＨＥ抗体にも応用できることがわかるだろう。
Ｉ．新しいＰＳＡ免疫検定法
　図１では、従来のＰＳＡ　ＭＯＬＹ検定法（パートＡ）および本発明のＰＳＡ　ＭＯＬＹ検定法（パートＢ）を比較して、ＨＥＰＳＡ抗体が遊離ＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴ複合体に特異な検定法をいかに改良するかを示している。
【００４１】
　パートＡは、バイアスを生じやすい従来のＭＯＬＹ検定法を示している。パートＢに工程Ｂ１が追加される点を除けば、パートＡの手順とパートＢの手順は同じである。
【００４２】
　パートＡの手順は次のとおりである。
【００４３】
　工程Ａ１：ＰＳＡ分子上の隠れないエピトープ（ｎＨＥ１と命名）に特異な非ＨＥ抗体（αｎＨＥ１）を固相に結合させる。遊離ＰＳＡまたはＰＳＡ−ＡＣＴ複合体のいずれかを含有するサンプルを固相に結合したαｎＨＥ１と反応させると、遊離ＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴ複合体の双方が、ｎＨＥ１エピトープを通じて排他的に結合できる。他方、その後に他の抗体と反応するために遊離ＰＳＡ上でＨＥがいまだに利用できる。
【００４４】
　工程Ａ２：その後、ＨＥに特異な標識抗体（αＨＥ＊）および非ＨＥ２に特異な抗体（αｎＨＥ２＊）の双方を含有する標識したＰＳＡに対するポリクロナール抗体（「標識ポリクロナール」）を追加すると、両方のタイプの抗体が遊離ＰＳＡに結合する。それに対して、ＨＥはＰＳＡ−ＡＣＴ複合体中のＡＣＴによってマスクされるので、同じ標識ポリクロナールは隠れないエピトープｎＨＥ２とのみ結合できる。これらの標識ポリクロナールは、検出の目的で標識に接合されている。標識の例としては、当該技術分野で既知の化学発光標識、放射標識および酵素標識がある。この実施例では、標識は酵素である。未結合の試薬を、たとえば当該技術分野で既知の方法を使って固相から洗い流すなどして固相から取り除く。
【００４５】
　工程Ａ３：引続き固相に酵素基質を加えると酵素産物が信号を発生するので、それをモニターする。２つの標識ポリクロナールと結合している遊離ＰＳＡは、１つの標識ポリクロナールとしか結合していないＰＳＡ−ＡＣＴ複合体に比べ信号を２倍発生し、このために遊離形式のＰＳＡについてプラス方向のバイアス（数値のずれ）をもたらす。
【００４６】
　パートＢは本発明の検定法を示したもので、パートＡで述べた検定法にさらに未標識ＨＥＰＳＡ抗体を加えており（工程Ｂ　１）、それによって検定法にバイアスが生じなくなっている。
【００４７】
　パートＢの工程は次のとおりである。
【００４８】
　工程Ｂ１：サンプルを未標識ＨＥＰＳＡ抗体（αＨＥ）で事前処理する。この抗体は遊離ＰＳＡ上のＨＥとは反応するが、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体とは結合しない。あるいは、未標識αＨＥを工程Ｂ２または工程Ｂ３で追加してもよい。
【００４９】
　工程Ｂ２：パートＡのようにしてαｎＨＥ１抗体に結合した固相にサンプルを加える。
【００５０】
　工程Ｂ３：さらに、ＨＥを認識する標識抗体（αＨＥ＊）および非ＨＥを認識する抗体（αｎＨＥ２＊）を含有する標識ポリクロナールを加えると、遊離ＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴ複合体の双方にαｎＨＥ２＊が結合する。αＨＥ＊は遊離ＰＳＡともＰＳＡ−ＡＣＴ複合体とも結合できない。これは、ＨＥが遊離ＰＳＡ中の未標識αＨＥで、またＰＳＡ−ＡＣＴ複合体中のＡＣＴでそれぞれマスクされているからである。
【００５１】
　工程Ｂ４：基質を加え、信号をモニターする。遊離ＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴ複合体のいずれもαｎＨＥ２＊としか結合していないので、双方が等しい信号を発生する。そのため、検定でＰＳＡ−ＡＣＴ複合体に比べて遊離ＰＳＡにバイアスが生じることがない。
【００５２】
　固相の材料は、免疫検定法に使用する材料であれば何でもよい。天然材料、合成材料、天然材料を合成修飾したものが使える。たとえば、多糖類（たとえば紙、セルロース、セルロース誘導体［酢酸セルロースやニトロセルロース］などのセルロース材料）、シリカ、ガラス繊維、無機材料（不活性化アルミニウム、けい藻土、あるいは塩化ビニル、塩化ビニル−プロピレン共重合体、塩化ビニル−酢酸ビニル共重合体などの重合体でできた多孔性高分子マトリックス中に均一に拡散した微粉砕した他の無機材料、天然布地（たとえば木綿）および合成布地（たとえばナイロン）、多孔性ゲル（シリカゲル、アガロース、デキストラン、ゼラチン）、高分子フィルム（たとえばポリアクリルアミド）、磁性粒子、微量定量プレート、ポリスチレンチューブ、蛋白結合膜、アガロース、セファデックス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカッタウェイ）、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ（Ｐｏｉｎｔｅｔ−Ｇｉｒａｒｄ、フランス）、シリコン粒子、多孔性繊維マトリックスなどである。固相は合成微粒子が好ましく、直径０．１〜１０ミクロンのポリスチレン、塩化ビニルまたはラテックスでできた合成微粒子が望ましい。
II．被検体に対するポリクロナール抗体の分別方法
　本発明は、被検体に対するポリクロナール抗体を分別してそれぞれＨＥ抗体および非ＨＥ抗体を含有する分画をもたらす方法も提示する。被検体に対するポリクロナール抗体は、当該技術分野で既知の方法を使って産生できる。たとえば、ウサギ、ラット、ヤギ、マウス、等々の宿主動物に被検体またはそのフラグメントを単独であるいは必要に応じて適当な担体に接合させて注入し、抗体反応を引き起こして抗体を生み出すことができる。
【００５３】
　この方法では、ＨＥ部位を結合分子またはＨＥ抗体のいずれかでマスクされた被検体（「マスクされた被検体」）に対してポリクロナール抗体を曝露する。マスクされた被検体と結合し、しかも溶出できる抗体は、遊離被検体および被検体−結合分子の複合体の双方と結合する非ＨＥ抗体である。したがって、遊離状態であるいは複合体の形であっても、被検体を検出するための非ＨＥ抗体を使った免疫検定法ではバイアスが生じない。こうして得られた非ＨＥ抗体は、ＭＯＬＹ免疫検定法でも（プローブ抗体または捕捉抗体、あるいはその両者として）、競合的免疫検定法でも（捕捉抗体として）使用することができる。他方、マスクされた被検体と結合しないポリクロナール抗体はＨＥ抗体である。ＨＥ抗体は、遊離被検体に特異な検定法で使用するか、もしくは前述のようにバイアスの生じる被検体検定法（ＭＯＬＹ免疫検定法であれＭＯＮＯ免疫検定法であれ）に加えてそのようなバイアスを緩和もしくは解消するのに利用できる。
【００５４】
　前述の分別は、アフィニティークロマトグラフィーを利用して行うのが好ましい。マスクされた被検体は、結合分子、ＨＥ抗体、または非ＨＥ抗体と架橋するのが好ましい。架橋は、当該分野で既知の方法もしくは当業者であれば知っているその改良法により行うことができる。分子の架橋の方法を開示している文献の例としては、Ｔ．Ｈ．ＪｉによるＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ９１巻５８０頁（１９８３年）；Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇらによる「Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ　Ｄｅｓｉｇｎ　ｆｏｒ　Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」（Ｍ．Ｅ．Ｈｉｍｍｅｌ、Ｇ．Ｇｅｒｏｇｉｏｕ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ、ワシントンＤＣ（１９９３年））第２２章２６６〜２８２頁；Ｍ．Ｎ．Ｇｕｐｔａによる同書第２６章３０７〜３２６頁；「Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ」第２版（Ｒ．Ｌ．Ｌｕｎｄｂｌａｄ、ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ、ボストン）がある。これらの発表文献は、引用して本書の一部とする。
【００５５】
　こうして得られた複合体は、固相に直接結合するか、もしくは固相上に固定化したＨＥ抗体などの結合剤を利用して固相に結合し、アフィニティークロマトグラフィーで利用してＨＥ抗体を選択するのが好ましい。アフィニティークロマトグラフィーの一般的方法、たとえば抗体および固相の準備、およびその手順は、当該技術分野で既知のものであり、たとえば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　１０９９「Ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｗｉｔｈ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｓｕｐｐｏｒｔｓ」（１９９０年）；Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ「Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　＆　Ｍｅｔｈｏｄｓ」（１９９３年）；および「分子生物学の方法」第１０巻「Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｒｏｔｏｃｏｓ」（Ｍ．Ｍ．Ｍａｎｓｏｎ編）８９〜９１頁（１９９２年）；「Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｉｎ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ」のＡ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅらによる第１０章２０２〜２３２頁（Ｓｉｅｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、オックスフォード、１９８２年）；および「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」第２巻「蛋白分離用アフィニティークロマトグラフィー（Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）」のＷ．Ｈ．Ｓｃｏｕｔｅｎによる３７〜４３頁（１９９１年）を参照されたい。これらの公表文献は本願中で引例とする。
【００５６】
　図２に、例としてＰＳＡ、ＡＣＴおよびＨＥＰＳＡ抗体を使ってＨＥ抗体および非ＨＥ抗体にポリクロナール抗体を分別する３種類の方法を示している。この方法は次のとおりである。
【００５７】
　パートＡ：ＡＣＴを使ったＰＳＡとの結合
　ＡＣＴを、臭化シアン活性化セファロース−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、スウェーデンから市販）などの固相に抱合させる。精製したＰＳＡをＡＣＴと反応させて、隠れるエピトープ（ＨＥ）をマスクするＰＳＡ−ＡＣＴ複合体が生成する。この複合体を化学的架橋によりさらに安定させることもできる。ＰＳＡに対するポリクロナール抗体をＰＳＡ−ＡＣＴ−固相とインキュベートすると、ＨＥＰＳＡ抗体は未結合である。隠れていないエピトープに特異な非ＨＥＰＳＡ抗体、たとえばｎＨＥ１およびｎＨＥ２は結合し、低ｐＨなどの標準的方法で溶出できる。こうして、ポリクロナール抗ＰＳＡ抗体がＨＥＰＳＡ抗体および非ＨＥＰＳＡ抗体に分離される。
【００５８】
　パートＢ：ＨＥＰＳＡ抗体（αＨＥ）を使ったＰＳＡとの結合ＨＥＰＳＡ抗体（αＨＥ）を、臭化シアン活性化セファロース−４Ｂなどの固相に抱合させる。精製したＰＳＡをαＨＥと反応させて、隠れているエピトープ（ＨＥ）をマスクするＰＳＡ−αＨＥ複合体を生成する。この複合体を化学的架橋によりさらに安定させることもできる。ＰＳＡに対するポリクロナール抗体をＰＳＡ−αＨＥ−固相とインキュベートすると、ポリクロナールＨＥＰＳＡ抗体は固体相に結合しない。他方、ポリクロナール非ＨＥＰＳＡ抗体は結合し、低ｐＨなどの標準的方法で溶出できる。特定のαＨＥがＰＳＡ上のＨＥすべてをマスクしない場合には、他のＨＥ部位に向けた追加のＨＥ抗体を同時に、あるいは好ましくは順次分画カラムで使用することができる点に注目されたい。
【００５９】
　パートＣ：非ＨＥＰＳＡ抗体（αｎＨＥ１）を使ったＰＳＡとの結合とその後のＨＥＰＳＡ抗体（αＨＥ）を使ったＨＥのブロック
　隠れていないエピトープ１（ｎＨＥ１）に向けた非ＨＥＰＳＡ抗体（αｎＨＥ１）を、臭化シアン活性化セファロース−４Ｂなどの固相に抱合させる。精製したＰＳＡをαｎＨＥ１と反応させて、ＰＳＡ−αｎＨＥ１複合体を生成する。ＨＥＰＳＡ抗体（αＨＥ）をＰＳＡ−αｎＨＥ１と反応させて、隠れているエピトープ（ＨＥ）をマスクする複合体を精製する。この複合体を化学的架橋によりさらに安定させることもできる。ＰＳＡに対するポリクロナール抗体を固相−αｎＨＥ１−ＰＳＡ−αＨＥとインキュベートすると、ＨＥおよびｎＨＥ１に対する抗体は固相に結合しない。ｎＨＥ１以外の隠れないエピトープに対する非ＨＥＰＳＡ抗体は固相に結合し、低ｐＨなど標準的な方法で溶出できる。固相に結合しない抗体は、方法ＡまたはＢによってさらに分離することができる。こうして、ポリクロナール抗ＰＳＡ抗体はＨＥＰＳＡ抗体、ｎＨＥ１に対する抗体、およびｎＨＥ１以外のｎＨＥに分離される。特定のαＨＥがＰＳＡ上のＨＥすべてをマスクしない場合には、他のＨＥ部位に向けた追加のＨＥ抗体を同時に、あるいは好ましくは逐次分画カラムで使用することができる点に注目されたい。
III．ＰＳＡ検定のキャリブレーターおよび対照として有用な被検体−ＨＥ抗体の複合体
　本発明では、被検体の検定におけるキャリブレーターおよび対照として役立つ被検体−ＨＥ抗体の複合体も提示する。この複合体は、被検体に過剰なＨＥ抗体を加えることで生成できる。ＨＥ抗体は、被検体の２倍から１００倍多いことが好ましく、１０倍多いことがより望ましい。あるいは、被検体をＨＥ区隊に架橋することができる。前述の被検体と結合分子の架橋方法が、被検体とＨＥ抗体の架橋にも同じく適用できる。複合体は、リン酸緩衝食塩水、トリス−ＨＣｌ、またはＨＥＰＥＳなどの不活性緩衝液中に保存するのが好ましい。貯蔵温度は２〜２５℃が望ましい。ｐＨは５〜９が望ましい。被検体の検定でキャリブレーターまたは対照の役もなす被検体とその結合分子の架橋複合体も、同じようにして生成できる。
【００６０】
　以下に、本発明の実施例を示すが、これらに限定されるものではない。
【００６１】
　実施例
【実施例１】
【００６２】
　新しいＰＳＡ検定方法
　以下の実験は、ＩＭｘ（登録商標）ＰＳＡ　Ａｓｓａｙ用試薬を使用し、ＩＭｘ（登録商標）ＰＳＡ　Ａｓｓａｙ添付書の手順に従ってＩＭｘ（登録商標）機器（本出願人）で実施したが、本発明では遊離ＰＳＡとは結合するがＰＳＡ−ＡＣＴ複合体とは結合しないＭＡＢ　９Ｂ１０または５Ａ１０（前述）０〜２０μｇ／ｍＬを追加含有する検定用希釈剤を使用した点のみ異なる。ＩＭｘ（登録商標）ＰＳＡ　Ａｓｓａｙ試薬としては次のものがある。（１）遊離ＰＳＡおよび複合体化ＰＳＡ（すなわちＡＣＴと複合体を形成したＰＳＡ）の双方と結合し捕捉する捕捉抗体ＭＡＢ　Ｈ５０で被覆された微粒子（「抗ＰＳＡ被覆微粒子」）、および（２）検出用にアルカリホスファターゼで標識されたＰＳＡに対するヤギポリクロナール抗体（プローブ抗体として働く）（「ヤギポリクロナール抗ＰＳＡ：アルカリホスファターゼ抱合体」または「プローブポリクロナール抗体」）。
【００６３】
　前立腺癌患者から採取した血清試料を試験サンプルとした。
【００６４】
　ＩＭｘ（登録商標）機器の説明、操作および一般手順は、ＢａｒｎｅｓらによるＪ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍ．１４巻２号１１５〜１１９頁（１９９１年）およびＥＰ−Ａ−２８８，７９３；ＬｕｄｉｎｇｔｏｎらによるＣｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３４巻９号１７２６〜１７３２頁（１９８８年）に記載されている。反応セルの構成要素はＣｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３４巻９号１７２７頁の図２（ａ）に示されている。この場合、反応方法は微粒子酵素免疫検定法（ＭＥＩＡ）のものと同じで以下のとおりである。
【００６５】
　（１）ＩＭｘ（登録商標）機器のプローブ／電極アセンブリで、サンプル、抗ＰＳＡ被覆微粒子および検定希釈剤を反応セルのインキュベーションウェルに入れる。この反応混合液をインキュベートしている間に、サンプル中の遊離ＰＳＡおよび複合体化ＰＳＡが抗ＰＳＡ被覆微粒子と結合して抗体−抗原複合体を形成する。ＭＡＢ　９Ｂ１０が次いで抗ＰＳＡ被覆微粒子と結合しているＰＳＡ（ＡＣＴと複合体を形成していない）と結合して、抗体−抗原−抗体複合体を形成する。
【００６６】
　（２）反応混合液のアリコートをＩＭｘ（登録商標）機器のガラス繊維マトリックスに移す。微粒子はガラス繊維マトリックスと不可逆的に結合する。
【００６７】
　（３）マトリックスを洗浄して未結合物質、たとえば血清蛋白、検定希釈剤、および微粒子に結合していないＭＡＢ　９Ｂ１０を除去する。
【００６８】
　（４）ヤギポリクロナール抗ＰＳＡ：アルカリホスファターゼ接合体をマトリックスに加え、抗体−抗原−抗体複合体に結合させる。
【００６９】
　（５）マトリックスを洗浄して未結合物質を除去する。
【００７０】
　（６）基質である４−メチルウンベリフェリルリン酸（ＭＵＰ）をマトリックスに加えると、表面結合アルカリホスファターゼが非蛍光発生ＭＵＰを４−メチルウンベリフェロン（ＭＵ）に変換し、その蛍光をＩＭｘ（登録商標）機器のＭＥＩＡ光学アセンブリで測定する。
【００７１】
　上記の検定の工程は別々に行ったが、サンプルの代わりに遊離ＰＳＡを含有するキャリブレーターおよび対照を同時に使用した。サンプル（すなわちパネル）の読取り値をキャリブレーターから読み取って（表１）、ＰＳＡ値を求めたところ、表２および表３に報告するとおりになった。
【００７２】
【表１】
2004093563.tif 000002
【００７３】
【表２】
2004093563.tif 000003
【００７４】
【表３】
2004093563.tif 000004
【００７５】
　上記の表から、検定における遊離ＭＡＢ　９Ｂ１０の量が増えるとキャリブレーション曲線の信号が減り、サンプルパネル値が高くなることがわかる。ＭＡＢ　９Ｂ１０がパネルの値に及ぼす影響は、１０μｇ／ｍｌ付近で飽和するようである。上記の実験を、ＭＡＢ　９Ｂ１０の代わりにＭＡＢ　５Ａ１０を使って繰り返し行ったが、同じ様な結果が出た。
【００７６】
　次の実験では、前記の検定希釈剤中のＭＡＢ　９Ｂ１０が　１０μｇ／ｍｌという飽和レベルを使って、遊離ＰＳＡと複合体ＰＳＡの間のバイアスを実証した。遊離ＰＳＡを含有するサンプルを精製したＡＣＴと混和して、複合体を形成させた。精製ＰＳＡおよびＡＣＴはマルモ大学のＨａｎｓ　Ｌｉｌｊａ博士から入手した。ＰＳＡおよびＡＣＴの精製ならびにＰＳＡとＡＣＴの複合体の生成はすでに述べられているとおりである（Ａ．ＣｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎらによるＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９４巻７５５〜７６３頁（１９９０年））。精製した精液ＰＳＡを７．５％ウシ血清アルブミンおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含有するｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸緩衝液に入れ、これに１００モル倍過剰の精製ＡＣＴを混和した。ＰＳＡの対照サンプルをＡＣＴの代わりに緩衝液と混和した。これらのサンプルを３５℃で一晩インキュベートした。インキュベートした後に、これらの試料をＩＭｘ（登録商標）ＰＳＡ　Ａｓｓａｙに以下の修正を施した方法でで検定した。
【００７７】
　ａ．Ａｂｂｏｔｔ　ＩＭｘ（登録商標）ＰＳＡ　Ａｓｓａｙ（修正なし）
　ｂ．Ａｂｂｏｔｔ　ＩＭｘ（登録商標）ＰＳＡ　Ａｓｓａｙおよび９Ｂ１０の入った検定希釈剤（すなわち検定希釈剤に１０μｇ／ｍＬの９Ｂ１０を添加）
　ｃ．Ａｂｂｏｔｔ　ＩＭｘ（登録商標）ＰＳＡ　ＡｓｓａｙおよびＭＡＢ　Ｈ５０プローブ抗体ならびにＭＡＢ　Ｈ１１７捕捉抗体（すなわちＨ１１７被覆微粒子および標識Ｈ５０を使用）
　前述のようにして検定を行った。表４に、遊離ＰＳＡサンプルおよびＡＣＴを添加したＰＳＡサンプルで得られたＰＳＡの量を示す。ＰＳＡ対照に比べて、ＡＣＴを含有するサンプルで検出されたＰＳＡの量が少ない場合、バイアスが生じているのを示す。
【００７８】
【表４】
2004093563.tif 000005
【００７９】
　表４のデータから、ＭＯＮＯ検定法（ＭＡＢ　Ｈ５０をプローブ抗体とし、ＭＡＢ　Ｈ１１７を捕捉抗体とする）にはバイアスがないことがわかる。それに対して、ＭＯＬＹ検定法（Ａｂｂｏｔｔ　ＩＭｘ（登録商標）ＰＳＡ　Ａｓｓａｙ）では３６．８％のバイアスが見られ、この検定法に遊離ＭＡＢ　９Ｂ１０を加えるとそのバイアスが劇的に減少することがわかる。
【００８０】
　ＭＯＮＯ検定法でＭＡＢ　Ｈ５０を捕捉抗体として、ＭＡＢ　Ｈ１１７をプローブ抗体として利用して前記の実験を繰り返し行った。このようなＭＯＮＯ検定法でもバイアスが生じ、また検定希釈剤に遊離９Ｂ１０を加えるとそのバイアスを無くすことができるのがわかった。
【実施例２】
【００８１】
　キャリブレーターおよび対照として有用なＰＳＡ−ＨＥ抗体複合体
　ＨＥＰＳＡ抗体をＰＳＡと混和するとＰＳＡ−ＨＥＰＳＡ抗体複合体が形成され、そこでは隠れるエピトープはＰＳＡ−ＡＣＴ複合体と同様にブロックされる。この物質を、ＰＳＡ検定でキャリブレーターまたは対照として利用することができる。
【００８２】
　精液ＰＳＡをｐＨ７．４の０．０１Ｍリン酸緩衝食塩水に入れたものを１０倍過剰にある９Ｂ１０と混和し、２〜８℃で一晩インキュベートする。インキュベートした後、ＰＳＡ−ＨＥＰＳＡ抗体複合体をＩＭｘ（登録商標）ＰＳＡキャリブレーター希釈剤で０、２、１０、３０、６０および１００ｎｇ／ｍＬに希釈する。これらのキャリブレーターをＩＭｘ（登録商標）ＰＳＡ　Ａｓｓａｙで使って、ＰＳＡ上のＨＥをマスクすることでＰＳＡ−ＡＣＴ複合体を模倣する。
【実施例３】
【００８３】
　ＰＳＡ　ＨＥおよびＰＳＡ非ＨＥに対するポリクロナール抗体を選択するための遊離ＰＳＡへのＨＥ抗体の架橋
　本実施例では、前記図２のパートＢで示した分別方法の実行について説明する。方法を説明するのにＭＡＢ　５Ａ１０を使用するが、これの代わりにどのようなＨＥＰＳＡ抗体でも、たとえばＭＡＢ　９Ｂ１０などを使用することができる。
【００８４】
　最初の工程では、製造業者の推奨事項に従って臭化シアン活性化セファロース−４Ｂに５Ａ１０を架橋させる。（Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、スウェーデン、２３〜３０頁（１９９３年））。
【００８５】
　その手順は次のとおりである。
【００８６】
　アフィニティーカラム用の５Ａ１０を０．１Ｍリン酸水素ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）と混和し、ｐＨを９．０に調整する。それから５Ａ１０を臭化シアン活性化セファロース−４Ｂゲルと、ゲル１ｍＬに対して５Ａ１０を２ｍｇの割合で混ぜる。混合液を静かに振盪させながら２〜８℃で一晩インキュベートする。
【００８７】
　５Ａ１０をセファロースゲルに結合させた後、ゲルを０．１Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．０）で洗浄して未結合リガンドを除き、それから１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．０）と２〜８℃で混和して、ゲル中に残っている活性基をブロックする。ゲルを蒸留水または脱イオン水で洗浄してから、０．１Ｍ酢酸ナトリム緩衝液と１Ｍ　ＮａＣｌ（ｐＨ４．０）、および０．１Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４と１Ｍ　ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）で交互に２回洗浄する。カラムにＰＢＳ溶液（０．０１Ｍ　ＮａＨＰＯ４、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）を充填して洗浄し、次いで０．１Ｍグリシン、０．１Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ２．５で溶出する。それからカラムを０．１％アジ化ナトリウムを含有するｐＨ７．２のＰＢＳで洗浄する。５Ａ１０アフィニティーカラムは２〜８℃で保存する。
【００８８】
　手順の次の工程では、ＰＳＡをセファロース４Ｂ−５Ａ１０に結合させてから、化学的架橋によって５Ａ１０−ＰＳＡ複合体を安定させる。ＰＳＡが５Ａ１０に結合すると、ＰＳＡ上のＨＥがブロックされるので、ＨＥは他のＨＥＰＳＡ抗体と結合できない。架橋剤としてジメチルパレミデート（ＤＭＰ）を使って不溶性蛋白を架橋する手順については、すでに述べられている（Ｃ．ＳｃｈｎｅｉｄｅｒらによるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５巻１０７６６〜１０７６９頁（１９８２年））。
【００８９】
　その手順は次のとおりである。
【００９０】
　カラムからセファロース４Ｂ−５Ａ１０ゲルを取り除き、それをメスシリンダーに入れる。ゲルが落ち着いたならば、残留緩衝液を除く。パックされたゲル１ｍＬにつき精製ＰＳＡ１０ｍｇを、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で最初の濃度が２ｍｇ／ｍＬで加える。三角フラスコに移し、静かに振盪させながら２〜８℃で一晩インキュベートする。
【００９１】
　一晩インキュベートした後に、ブフナー漏斗で１０容の０．２Ｍトリエタノールアミン、ｐＨ９．０（ＴＥＡ）でゲルを２回洗浄する。ゲルをビーカーに移し、ＴＥＡ中に入った４０ｍＭ　ＤＭＰ（ｐＨ９．０）５部を加える。室温で振盪させながら１時間インキュベートする。ブフナー漏斗を使って１０〜２０容のＴＥＡ（ｐＨ９．０）および１０〜２０容の０．０１Ｍリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４％）および０．０２％アジ化ナトリウムで洗浄する。
【００９２】
　このプロセスの最終工程では、以下のような標準的アフィニティー手順でセファロース４Ｂ−５Ａ１０−ＰＳＡカラム上のＰＳＡに対するポリクロナール抗体を精製する。
【００９３】
　抗ＰＳＡポリクロナール抗体をカラム緩衝液（０．０１Ｍリン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４）で１：１希釈する。（ポリクロナール抗体の例としては、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、マウスおよびラットのポリクロナール抗体が挙げられる。）サンプルをゆっくりとカラムに注入する。カラムに結合しなかった蛋白を採集する。この分画にはＨＥ抗体が入っている。カラムをカラム緩衝液で洗浄し、２８０ｎｍで光学密度をモニターする。吸光度がベースラインまで下がったならば、結合している非ＨＥ抗体を０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）で素早く溶出させる。分画を等容の０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）に採集し、素早くｐＨを中性に調整する。精製したＨＥ抗体および非ＨＥ抗体の双方を希望する緩衝液に対して透析し、０．２ミクロンの滅菌フィルターを通して濾過してから２〜８℃で保存する。あるいは、抗体は凍結させてもよい。
【００９４】
　本明細書で言及するあらゆる公表文献および特許出願は、個別に引例として指示した場合と同様に、本明細書に参照として引用する。
【００９５】
　前述の発明は、明確にしてわかりやすくする目的で図や例を使ってある程度詳しく述べたが、当業者の技能の範囲内で様々な修正や変更を施すことも添付の請求の範囲に入るものであることは明らかである。ここに示す基本的発明に対する明らかな変更を可能にする今後の技術の進歩も請求の範囲に入る。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１Ａ】ＰＳＡ検定のための従来の方法（パートＡ）と本発明の方法（パートＢ）を比較し、ＨＥＰＳＡ抗体によって遊離ＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴ複合体に対する検定法の特異度が改変されたことを示している。
【図１Ｂ】ＰＳＡ検定のための従来の方法（パートＡ）と本発明の方法（パートＢ）を比較し、ＨＥＰＳＡ抗体によって遊離ＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴ複合体に対する検定法の特異度が改変されたことを示している。
【図２】ＰＳＡ上の隠れるエピトープと隠れないエピトープに対するポリクロナール抗体を獲得する方法を示している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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