(57)【要約】【課題】当技術分野において、ミトコンドリア透過性およびアポトーシスを検討および調節する方法および試薬の必要性が存在する。【解決手段】本発明は、MPTP複合体の調節物質および親和性標識としての、一般式Iの化合物【化１】2004339204.tif 000025および一般式IIの化合物【化２】2004339204.tif 000026の使用を提供する。さらに、本発明は、MPTP複合体の活性を調節する方法、MPTP複合体の成分の存在を判定する方法、およびMPTP複合体の活性を調節する活性剤を同定する方法を提供し、具体的には、VDAC1成分と相互作用させることによってMPTP複合体の活性を調節する活性剤を同定する方法を提供する。さらに、本発明により一般式Iの新規化合物が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
MPTP複合体の活性の調節物質としての、下記の(a)一般式Iおよび(b)一般式IIからなる群より選択される化合物の使用：
【化１】
2004339204.tif 000020
(式中、R1およびR2はH、ハロゲン、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、かつR3はH、DおよびTからなる群より選択される)；
【化２】
2004339204.tif 000021
(式中、RはH、ハロゲン、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択される)。
【請求項２】
化合物が一般式Iの化合物から選択され、式中、R1およびR2は、H、ハロゲン、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、かつR3はH、DおよびTからなる群より選択される、請求項1記載の使用。
【請求項３】
化合物が一般式Iの化合物であり、式中、R1およびR2はHであり、かつR3がHである、請求項2記載の使用。
【請求項４】
化合物が一般式IIの化合物から選択され、式中、RはH、ハロゲン、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択される、請求項1記載の使用。
【請求項５】
化合物が一般式IIの化合物であり、式中、RはH、Br、ClおよびCl2からなる群より選択される、請求項4記載の使用。
【請求項６】
親和性標識としての、(a)一般式Iおよび(b)一般式IIからなる群より選択される化合物の使用であって、ただし、(a)一般式Iにおいて、式中、R1およびR2はH、T、ハロゲン、ハロゲンの放射性同位体、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、R3はH、DおよびTからなる群より選択され、かつ残基R1、R2およびR3の少なくとも1つは少なくとも1つの放射性同位体を含み、(b)一般式IIにおいて、式中、RはT、ハロゲンの放射性同位体、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、かつRは少なくとも1つの放射性同位体を含む、化合物の使用。
【請求項７】
化合物が、MPTP複合体の成分の親和性標識である、請求項6記載の化合物の使用。
【請求項８】
化合物が一般式Iの化合物から選択され、式中、R1およびR2は、H、T、ハロゲン、ハロゲンの放射性同位体、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、R3はH、DおよびTからなる群より選択され、かつ残基R1、R2およびR3の少なくとも1つは少なくとも1つの放射性同位体を含む、請求項6または7記載の化合物の使用。
【請求項９】
化合物が一般式Iの化合物であり、式中、R1およびR2はHであり、かつR3はTである、請求項8記載の化合物の使用。
【請求項１０】
化合物が一般式IIの化合物から選択され、式中、RはT、ハロゲンの放射性同位体、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、かつRは少なくとも1つの放射性同位体を含む、請求項6または7記載の化合物の使用。
【請求項１１】
化合物が一般式IIの化合物から選択され、式中、RはBr、ClおよびCl2の放射性同位体からなる群より選択される、請求項10記載の化合物の使用。
【請求項１２】
(a)一般式Iおよび(b)一般式IIからなる群より選択される化合物を生物試料中の細胞または組織に添加する段階であって、ただし、(a)一般式Iにおいて、式中、R1およびR2はH、ハロゲン、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、かつR3はH、DおよびTからなる群より選択され、(b)一般式IIにおいて、式中、RはH、ハロゲン、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択される段階；ならびに
化合物が存在しない場合の活性と比較したときのMPTP複合体の活性を測定する段階
を含むMPTP複合体の活性を調節する方法。
【請求項１３】
(i) (a)一般式Iおよび(b)一般式IIからなる群より選択される化合物と、MPTP複合体の成分との結合を可能にする条件下において、該化合物を対象となる生物試料に接触させる段階であって、ただし、(a)一般式Iにおいて、式中、R1およびR2はH、T、ハロゲン、ハロゲンの放射性同位体、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、R3はH、DおよびTからなる群より選択され、かつ残基R1、R2およびR3の少なくとも1つは少なくとも1つの放射性同位体を含み、(b)一般式IIにおいて、式中、RはT、ハロゲンの放射性同位体、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、かつRは少なくとも1つの放射性同位体を含む段階；
(ii) 化合物の結合を検出する段階；ならびに
(iii) 任意で、検出された化合物の結合を定量する段階
を含む、MPTP複合体の成分の存在を判定する方法。
【請求項１４】
(i) 候補物質の存在下において、(a)一般式Iおよび(b)一般式IIからなる群より選択される化合物を、細胞およびMPTPを含有する生物試料に接触させる段階であって、ただし、(a)一般式Iにおいて、式中、R1およびR2はH、T、ハロゲン、ハロゲンの放射性同位体、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、R3はH、DおよびTからなる群より選択され、かつ残基R1、R2およびR3の少なくとも1つは少なくとも1つの放射性同位体を含み、(b)一般式IIにおいて、式中、RはT、ハロゲンの放射性同位体、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、かつRは少なくとも1つの放射性同位体を含む段階；
(ii) 候補物質の存在下における化合物とMPTPの結合を、該物質が存在しない場合の結合と比較する段階；ならびに
(iii) 任意で、細胞成分およびMPTPを含む細胞抽出物を調製する際に、MPTP活性に対する選択した物質の活性を試験する段階
を含む、MPTP複合体の活性を調節する活性剤を同定する方法。
【請求項１５】
(i) 候補物質の存在下において、(a)一般式Iおよび(b)一般式IIからなる群より選択される化合物を、細胞およびMPTPのVDAC1を含有する生物試料に接触させる段階であって、ただし、(a)一般式Iにおいて、式中、R1およびR2はH、T、ハロゲン、ハロゲンの放射性同位体、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、R3はH、DおよびTからなる群より選択され、かつ残基R1、R2およびR3の少なくとも1つは少なくとも1つの放射性同位体を含み、(b)一般式IIにおいて、式中、RはT、ハロゲンの放射性同位体、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、かつRは少なくとも1つの放射性同位体を含む段階；
(ii) 候補物質の存在下における化合物とMPTPのVDAC1との結合を、該物質が存在しない場合の結合と比較する段階；ならびに
(iii) 任意で、細胞成分およびMPTPのVDAC1を含む細胞抽出物を調製する際に、MPTP活性に対する選択した物質の活性を試験する段階
を含む、VDAC1と相互作用させることによって、MPTP複合体の活性を調節する活性剤を同定する方法。
【請求項１６】
請求項14または15記載の方法によって同定される活性剤。
【請求項１７】
一般式Iの化合物：
【化３】
2004339204.tif 000022
式中、R1およびR2はH、ハロゲン、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、かつR3はH、DおよびTからなる群より選択される。
【請求項１８】
一般式Iの化合物であり、式中、R1およびR2はHであり、かつR3はHである、請求項17記載の化合物。
【請求項１９】
残基R1、R2およびR3の少なくとも1つが少なくとも1つの放射性同位体を含む、請求項17記載の化合物。
【請求項２０】
一般式Iの化合物であり、式中、R1およびR2はHであり、かつR3はTである、請求項17記載の化合物。
【請求項２１】
MPTP複合体の活性の調節物質としての請求項17〜20記載のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２２】
親和性標識としての請求項19または20記載の化合物。
【請求項２３】
MPTP複合体の成分の親和性標識としての請求項19または20記載の化合物。
【請求項２４】
一般式IIの化合物であり、親和性標識である化合物：
【化４】
2004339204.tif 000023
式中、RはH、T、ハロゲン、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、かつRは少なくとも1つの放射性同位体を含む。
【請求項２５】
MPTP複合体の成分の親和性標識である、請求項24記載の化合物。
【請求項２６】
Rが少なくとも1つのTを含む、請求項24または25記載の化合物。
【請求項２７】
Rが、Br、ClおよびCl2の放射性同位体からなる群より選択される、請求項24または25記載の化合物。
【請求項２８】
一般式IIの化合物であり、MPTP複合体の活性の調節物質である化合物：
【化５】
2004339204.tif 000024
式中、RはH、T、ハロゲン、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択される。
【請求項２９】
RがH、Br、ClおよびCl2からなる群より選択される、請求項28記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミトコンドリアの物質透過孔複合体の調節物質および親和性標識として有用な新規化合物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは、エネルギー代謝、細胞Ca2+恒常性の調節およびアポトーシスにおける役割によって、細胞生存および組織発生においてきわめて重要な役割を果たしている。この多機能的な役割を考慮すると、各過程を誘導するためにエネルギー保存が使用されるので、細胞Ca2+の調節、代謝、および生体エネルギー論が統合された系として機能する。ミトコンドリアのエネルギー保存(ATP産生)は、呼吸複合体によるプロトンポンピングによって形成される、ミトコンドリア内膜(inner mitochondrial membrane：IMM)におけるプロトン電気化学的電位差(ΔμH)の呼吸誘導性の形成を必要とする。勾配を維持するには、ΔμHの2つの成分、すなわち、膜電位(ΔΨm)およびΔpHによって駆動される特定の搬送系によって流動が厳重に制御されるプロトン、荷電種、および溶質に対してIMMの透過性が低くなくてはならない。しかし、ミトコンドリアはインビトロにおいて、分子量約1,500 Daまたはそれ以下の溶質に対するIMM透過性亢進を容易に受けることがある。透過性遷移(permeability transition：PT)と呼ばれるこの透過性の変化は、ミトコンドリアの透過性遷移孔(mitochondrial permeability transition：MPTP)である膜の孔の開孔によって調節される。長時間持続するMPTPの開孔により、ミトコンドリアの外膜(outer mitochondrial membrane：OMM)は破壊し、チトクロームCが放出され、呼吸阻害を生じるミトコンドリアの機能に対する劇的な結果(例えば、ΔμHの崩壊、ピリジンヌクレオチドの欠損)を生ずる。この過程は、特に虚血-再潅流傷害および神経変性のようなヒトの特定の病理学的事象に関連してインビボにおけるミトコンドリア機能不全の標的として長い間検討されてきた。MPTPはまた、プログラムされた細胞死(アポトーシス)のメディエーターおよびチトクロームCの放出によるBCL2ファミリーメンバーの作用の標的としても関心を集めている(非特許文献1〜4参照)。
【０００３】
ミトコンドリアは、生命および細胞死(アポトーシス)の制御に重要な役割を果たしていると現在認識されている(非特許文献5)。大多数の分子がシグナル伝達に関与し、多数の代謝物およびある種のウィルスのエフェクターがミトコンドリアに作用し、ミトコンドリア膜の透過性に影響すると思われる。アポトーシスが過剰な疾患(神経変性疾患、虚血、AIDS、激症肝炎等)を治療する際には、ミトコンドリア膜を安定化する能力を利用する細胞保護分子を使用することができる。
【０００４】
ミトコンドリア膜透過性の変化は、カスパーゼ活性化因子およびカスパーゼ非依存的細胞死エフェクターの膜間腔からの放出、内側の膜電位(inner transmembrane potential)の消失、並びに酸化的リン酸化の混乱に関連するアポトーシス性細胞死の主要な事象である(非特許文献5〜7参照)。Bcl-2ファミリーのアポトーシス促進メンバーおよび抗アポトーシスメンバーは、アデニンヌクレオチド転移酵素(ANT、内側膜内)、電位依存的陰イオンチャネル(VDAC、外側膜内)との相互作用により、および／または自立的なチャネル形成活性により、ミトコンドリア膜の内側および外側の透過性を調節する(非特許文献5、6、8および9参照)。ANTおよびVDACは、2つのミトコンドリア膜が近接している部位に組織されたポリタンパク質構造であるミトコンドリア透過性遷移孔(MPTP)の主要な成分であると考えられる(非特許文献10)。
【０００５】
ミトコンドリア透過性遷移孔は、ミトコンドリア膜透過性の調節に関与するミトコンドリアの内側膜と外側膜の間の接触部位に形成されたポリタンパク質複合体である。それは、ミトコンドリア結合ヘキソキナーゼ(HK)、ポーリン(電圧-依存的陰イオンチャネル、即ちVDAC)、アデニンヌクレオチド転移(ANT)、末梢ベンゾジアゼピン受容体(PBR)、クレアチンキナーゼ(CK)、およびサイクロフィリンD、並びにBcl-2ファミリーメンバーを含むタンパク質セットを含む。生理学的条件では、MPTPは、ミトコンドリアのpH、ミトコンドリア膜電位ΔΨm、NAD/NAD(P)H酸化還元平衡、および基質タンパク質チオール酸化によるコンダクタンスの調節により、ミトコンドリアのカルシウムの恒常性を制御する(非特許文献9、10および11)。MPTPは、多数のアポトーシス促進性シグナル伝達経路を統合する能力によりおよびBcl-2/Baxファミリーのタンパク質による制御により、多数のアポトーシス例に関係しているとされている。Bcl-2ファミリーは、それぞれ、MPTP開孔を妨害または促進する細胞死阻止(Bcl-2様)メンバーおよび細胞死誘導(Bax様)メンバーを含む。BaxおよびBcl-2は、MPTP内のVDACおよびANTと相互作用することが報告されている。
【０００６】
アポトーシスおよび関連する形態の制御された細胞死は、多くの疾患に関与する。細胞死過程の過剰または不足は、自己免疫疾患および神経変性疾患、癌、虚血、並びにウィルス感染症および細菌感染症などの病理学的な感染症または疾患に関与する。神経変性疾患の分野では、非常に多くの観察により、アポトーシスのミトコンドリア制御との密接な関係が示唆されている(非特許文献5)。神経毒-メチル-4-フェニルピリジニウムは、ミトコンドリア透過性遷移およびチトクロームCの排出を誘導する(非特許文献12)。
【０００７】
ニトロプロピオン酸またはロテニンなどのミトコンドリア毒素による中毒は、霊長類およびげっ歯類においてハンチントン病型の疾患を生ずる(非特許文献13および14)。
【０００８】
生理学的条件では、ANTは、ADPおよびATPの特異的な対向輸送体である。しかし、ANTは、Ca2+、アトラクチロシド、HIV-Vpr由来ペプチド、および酸化促進物質を含む異なるアポトーシス促進剤との相互作用の結果致死的な孔を形成することもある。ミトコンドリア膜透過性は、外側膜のBcl-2/Bax様タンパク質および／またはミトコンドリア基質と細胞質の間の代謝的なATP/ADP勾配の変化によって調節される非特異的なVDAC孔によっても調節されることがある。
【０００９】
【非特許文献１】Bernardi, P.、「Mitochondrial transport of cations: channels, exchangers, and permeability transition.」、Physiol Rev、1999年、第79巻、第4号、p.1127-55
【非特許文献２】Nicholls, D. G.およびS. L. Budd、「Mitochondria and neuronal survival.」、Physiol Rev、2000年、第80巻、第1号、p.315-60
【非特許文献３】Bernardi, P.ら、「Mitochondria and cell death. Mechanistic aspects and methodological issues.」、Eur J Biochem、1999年、第264巻、第3号、p.687-701
【非特許文献４】Bernardi, P.ら、「A mitochondrial perspective on cell death.」、Trends Biochem Sci、2001年、第26巻、第2号、p.112-7
【非特許文献５】Kroemer G. & Reed J. C.、「Mitochondrial control of cell death.」、Nat Med.、2000年、第6巻、第5号、p.513-9
【非特許文献６】Vander Heiden M. G. & Thompson C. B.、「Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis?」、Nat Cell Biol.、1999年、第1巻、第8号、E209-16
【非特許文献７】Wallace D. C.、「Mitochondrial disease in man and mouse.」、Science、1999年、第283巻、第5407号、p.1482-8
【非特許文献８】Marzo I., Brenner C., Zamzami N., Jurgensmeier J. M., Susin S. A., Viera H. L., Prevost M. C., Xie Z., Matsuyama S., Reed J. C., Kroemer G., 「Bax and adenine nucleotide translocator cooperate in the mitochondrial control of apoptosis.」、Science、1998年、第281巻、第5385号、p.2027-31
【非特許文献９】Shimizu S., Narita M., Tsujimoto Y., Nature、1999年、第399巻、p.483-487
【非特許文献１０】Crompton M.、Biochem J、1999年、第341巻、p.233-249
【非特許文献１１】Ichas F., Jouaille L., Mazat J., Cell(1997), 89, 1145-53
【非特許文献１２】Cassarino D. S., Parks J. K., Parker W. D. Jr, Bennett J. P. Jr.、「The parkinsonian neurotoxin MPP+ opens the mitochondrial permeability transition pore and releases cytochrome c in isolated mitochondria via an oxidative mechanism.」、Biochim Biophys Acta 1999年、第1453巻、p.49-62
【非特許文献１３】Brouillet E., Hantraye P., Ferrante R. J., Dolan R., Leroy-Willig A., Kowall N. W., Beal M. F.、「Chronic mitochondrial energy impairment produces selective striatal degeneration and abnormal choreiform movements in primates.」、Proc Natl Acad Sci U S A.、1995年7月18日、第92巻、第15号、p.7105-9
【非特許文献１４】Berarbet R., Sherer T. B., MacKenzie G., Garcia-Osuna M., Panov A. V., Greenamyre J. T.、「Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson's disease」、Nat Neurosci.、2000年、p.1301-6
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
MPTPの関連性は、壊死性細胞死およびアポトーシス性細胞死におけるその役割に関する広い認識を得ているが、その分子の正体に関する情報の多くは間接的な証拠によるものである。また、その成分に対する親和性の高い特異的なプローブがないことにより当技術分野の進歩が阻まれている。
【００１１】
当技術分野において、ミトコンドリア透過性およびアポトーシスを検討および調節する方法および試薬の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
従って、本発明は、μM以下の範囲でMPTPを標識および調節する新規クラスの化合物を提供する。さらに、本発明は、MPTP成分としてのおよびこれらの化合物の分子標的としてのVDACのアイソフォーム1(VDAC1)を同定する。
【００１３】
本発明に係る使用においては、（１）MPTP複合体の活性の調節物質としての、下記の(a)一般式Iおよび(b)一般式IIからなる群より選択される化合物の使用であることを特徴とする：
【化１】
2004339204.tif 000002
(式中、R1およびR2はH、ハロゲン、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、かつR3はH、DおよびTからなる群より選択される)；
【化２】
2004339204.tif 000003
(式中、RはH、ハロゲン、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択される)。
【００１４】
また、本発明に係る使用においては、（２）化合物が一般式Iの化合物から選択され、式中、R1およびR2は、H、ハロゲン、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、かつR3はH、DおよびTからなる群より選択される、上記(1)記載の使用であることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明に係る使用においては、（３）化合物が一般式Iの化合物であり、式中、R1およびR2はHであり、かつR3がHである、上記(2)記載の使用であることを特徴とする。
【００１６】
また、本発明に係る使用においては、（４）化合物が一般式IIの化合物から選択され、式中、RはH、ハロゲン、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択される、上記(1)記載の使用であることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明に係る使用においては、（５）化合物が一般式IIの化合物であり、式中、RはH、Br、ClおよびCl2からなる群より選択される、上記(4)記載の使用であることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明に係る使用においては、（６）親和性標識としての、(a)一般式Iおよび(b)一般式IIからなる群より選択される化合物の使用であって、ただし、(a)一般式Iにおいて、式中、R1およびR2はH、T、ハロゲン、ハロゲンの放射性同位体、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、R3はH、DおよびTからなる群より選択され、かつ残基R1、R2およびR3の少なくとも1つは少なくとも1つの放射性同位体を含み、(b)一般式IIにおいて、式中、RはT、ハロゲンの放射性同位体、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、かつRは少なくとも1つの放射性同位体を含む、化合物の使用であることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明に係る使用においては、（７）化合物が、MPTP複合体の成分の親和性標識である、上記(6)記載の化合物の使用であることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明に係る使用においては、（８）化合物が一般式Iの化合物から選択され、式中、R1およびR2は、H、T、ハロゲン、ハロゲンの放射性同位体、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、R3はH、DおよびTからなる群より選択され、かつ残基R1、R2およびR3の少なくとも1つは少なくとも1つの放射性同位体を含む、上記(6)または(7)記載の化合物の使用であることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明に係る使用においては、（９）化合物が一般式Iの化合物であり、式中、R1およびR2はHであり、かつR3はTである、上記(8)記載の化合物の使用であることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明に係る使用においては、（１０）化合物が一般式IIの化合物から選択され、式中、RはT、ハロゲンの放射性同位体、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、かつRは少なくとも1つの放射性同位体を含む、上記(6)または(7)記載の化合物の使用であることを特徴とする。
【００２３】
また、本発明に係る使用においては、（１１）化合物が一般式IIの化合物から選択され、式中、RはBr、ClおよびCl2の放射性同位体からなる群より選択される、上記(10)記載の化合物の使用であることを特徴とする。
【００２４】
また、本発明に係る方法においては、（１２）(a)一般式Iおよび(b)一般式IIからなる群より選択される化合物を生物試料中の細胞または組織に添加する段階であって、ただし、(a)一般式Iにおいて、式中、R1およびR2はH、ハロゲン、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、かつR3はH、DおよびTからなる群より選択され、(b)一般式IIにおいて、式中、RはH、ハロゲン、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択される段階；ならびに化合物が存在しない場合の活性と比較したときのMPTP複合体の活性を測定する段階を含む、MPTP複合体の活性を調節する方法であることを特徴とする。
【００２５】
また、本発明に係る方法においては、（１３）(i）(a)一般式Iおよび(b)一般式IIからなる群より選択される化合物と、MPTP複合体の成分との結合を可能にする条件下において、該化合物を対象となる生物試料に接触させる段階であって、ただし、(a)一般式Iにおいて、式中、R1およびR2はH、T、ハロゲン、ハロゲンの放射性同位体、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、R3はH、DおよびTからなる群より選択され、かつ残基R1、R2およびR3の少なくとも1つは少なくとも1つの放射性同位体を含み、(b)一般式IIにおいて、式中、RはT、ハロゲンの放射性同位体、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、かつRは少なくとも1つの放射性同位体を含む段階；(ii）化合物の結合を検出する段階；ならびに(iii）任意で、検出された化合物の結合を定量する段階を含む、MPTP複合体の成分の存在を判定する方法であることを特徴とする。
【００２６】
また、本発明に係る方法においては、（１４）(i）候補物質の存在下において、(a)一般式Iおよび(b)一般式IIからなる群より選択される化合物を、細胞およびMPTPを含有する生物試料に接触させる段階であって、ただし、(a)一般式Iにおいて、式中、R1およびR2はH、T、ハロゲン、ハロゲンの放射性同位体、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、R3はH、DおよびTからなる群より選択され、かつ残基R1、R2およびR3の少なくとも1つは少なくとも1つの放射性同位体を含み、(b)一般式IIにおいて、式中、RはT、ハロゲンの放射性同位体、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、かつRは少なくとも1つの放射性同位体を含む段階；(ii）候補物質の存在下における化合物とMPTPの結合を、該物質が存在しない場合の結合と比較する段階；ならびに(iii）任意で、細胞成分およびMPTPを含む細胞抽出物を調製する際に、MPTP活性に対する選択した物質の活性を試験する段階を含む、MPTP複合体の活性を調節する活性剤を同定する方法であることを特徴とする。
【００２７】
また、本発明に係る方法においては、（１５）(i）候補物質の存在下において、(a)一般式Iおよび(b)一般式IIからなる群より選択される化合物を、細胞およびMPTPのVDAC1を含有する生物試料に接触させる段階であって、ただし、(a)一般式Iにおいて、式中、R1およびR2はH、T、ハロゲン、ハロゲンの放射性同位体、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、R3はH、DおよびTからなる群より選択され、かつ残基R1、R2およびR3の少なくとも1つは少なくとも1つの放射性同位体を含み、(b)一般式IIにおいて、式中、RはT、ハロゲンの放射性同位体、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、かつRは少なくとも1つの放射性同位体を含む段階；(ii）候補物質の存在下における化合物とMPTPのVDAC1との結合を、該物質が存在しない場合の結合と比較する段階；ならびに(iii）任意で、細胞成分およびMPTPのVDAC1を含む細胞抽出物を調製する際に、MPTP活性に対する選択した物質の活性を試験する段階を含む、VDAC1と相互作用させることによって、MPTP複合体の活性を調節する活性剤を同定する方法であることを特徴とする。
【００２８】
また、本発明に係る活性剤においては、（１６）上記(14)または(15)記載の方法によって同定される活性剤であることを特徴とする。
【００２９】
また、本発明に係る化合物においては、（１７）一般式Iの化合物であることを特徴とする：
【化３】
2004339204.tif 000004
式中、R1およびR2はH、ハロゲン、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、かつR3はH、DおよびTからなる群より選択される。
【００３０】
また、本発明に係る化合物においては、（１８）一般式Iの化合物であり、式中、R1およびR2はHであり、かつR3はHである、上記(17)記載の化合物であることを特徴とする。
【００３１】
また、本発明に係る化合物においては、（１９）残基R1、R2およびR3の少なくとも1つが少なくとも1つの放射性同位体を含む、上記(17)記載の化合物であることを特徴とする。
【００３２】
また、本発明に係る化合物においては、（２０）一般式Iの化合物であり、式中、R1およびR2はHであり、かつR3はTである、上記(17)記載の化合物であることを特徴とする。
【００３３】
また、本発明に係る化合物においては、（２１）MPTP複合体の活性の調節物質としての上記(17)〜(20)記載のいずれか一項記載の化合物であることを特徴とする。
【００３４】
また、本発明に係る化合物においては、（２２）親和性標識としての上記(19)または(20)記載の化合物であることを特徴とする。
【００３５】
また、本発明に係る化合物においては、（２３）MPTP複合体の成分の親和性標識としての上記(19)または(20)記載の化合物であることを特徴とする。
【００３６】
また、本発明に係る化合物においては、（２４）一般式IIの化合物であり、親和性標識である化合物であることを特徴とする：
【化４】
2004339204.tif 000005
式中、RはH、T、ハロゲン、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、かつRは少なくとも1つの放射性同位体を含む。
【００３７】
また、本発明に係る化合物においては、（２５）MPTP複合体の成分の親和性標識である、上記(24)記載の化合物であることを特徴とする。
【００３８】
また、本発明に係る化合物においては、（２６）Rが少なくとも1つのTを含む、上記(24)または(25)記載の化合物であることを特徴とする。
【００３９】
また、本発明に係る化合物においては、（２７）Rが、Br、ClおよびCl2の放射性同位体からなる群より選択される、上記(24)または(25)記載の化合物であることを特徴とする。
【００４０】
また、本発明に係る化合物においては、（２８）一般式IIの化合物であり、MPTP複合体の活性の調節物質である化合物であることを特徴とする：
【化５】
2004339204.tif 000006
式中、RはH、T、ハロゲン、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択される。
【００４１】
また、本発明に係る化合物においては、（２９）RがH、Br、ClおよびCl2からなる群より選択される、上記(28)記載の化合物であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００４２】
本発明により、μM以下の範囲でMPTPを標識および調節する新規クラスの化合物が提供された。さらに、本発明により、MPTP成分としてのおよびこれらの化合物の分子標的としてのVDACのアイソフォーム1(VDAC1)が同定された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
本発明は、調節物質および親和性標識としての、一般式Iの化合物および一般式IIの化合物のMPTP複合体の使用を提供する。さらに、本発明は、MPTP複合体の活性を調節する方法と、MPTP複合体の成分の存在を判定する方法と、MPTP複合体の活性を調節する活性剤を同定する方法とを提供し、具体的には、VDAC1成分と相互作用させることによって、MPTP複合体の活性を調節する活性剤を同定する方法を提供する。さらに、本発明により一般式Iの新規化合物および一般式IIの新規化合物が提供される。
【００４４】
本発明は、(a)一般式I
【化６】
2004339204.tif 000007
(式中、R1およびR2はH、ハロゲン、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、かつR3はH、DおよびTからなる群より選択される)
および(b)一般式II
【化７】
2004339204.tif 000008
(式中、RはH、ハロゲン、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択される)からなる群より選択される化合物の、MPTP複合体の活性の調節物質としての使用を提供する。上記一般式Iの化合物の使用が好ましい。上記式I (式中、R1およびR2はHであり、かつR3がHである)の化合物の使用が好ましい。上記式II (式中、RはH、Br、ClおよびCl2からなる群より選択される)の化合物の使用が好ましい。
【００４５】
本発明のMPTP複合体の活性の調節物質は、MPTPの活性を阻害、低下、または増強する化合物である。MPTPの活性は、孔形成単位の閉じた状態から開いた状態への遷移またはその逆によるミトコンドリア内膜の透過性の変化であると理解される。
【００４６】
さらに、本発明は、(a)一般式(式中、R1およびR2はH、T、ハロゲン、ハロゲンの放射性同位体、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、R3はH、DおよびTからなる群より選択され、かつ残基R1、R2およびR3の少なくとも1つは少なくとも1つの放射性同位体を含む)、および上記(b)一般式II(式中、RはT、ハロゲンの放射性同位体、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、かつRは少なくとも1つの放射性同位体を含む)からなる群より選択される化合物の親和性標識としての使用を提供する。MPTP複合体の成分の親和性標識としての上記化合物の使用が好ましい。MPTP複合体のVDAC1成分の親和性標識としての上記化合物の使用がさらに好ましい。上記一般式Iの化合物が、上記使用にも好ましい。上記一般式I(式中、R1およびR2はHであり、かつR3はTである)の化合物がさらに好ましい。上記一般式II(式中、Rはハロゲンの放射性同位体であり、好ましくはBr、ClまたはCl2である)の化合物も好ましい。
【００４７】
さらに別の態様において、本発明は、(a)一般式I(式中、R1およびR2はH、ハロゲン、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、かつR3はH、DおよびTからなる群より選択される)、および(b)一般式II(式中、RはH、ハロゲン、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択される)からなる群より選択される化合物を生物試料中の細胞または組織に添加する段階と、化合物が存在しない場合の活性と比較したときのMPTP複合体の活性を測定する段階とを含む、MPTP複合体の活性を調節する方法を提供する。
【００４８】
本明細書において使用する「生物試料」とは、MPTP複合体を含むミトコンドリアを含む、動物またはヒトから採取した組織、細胞、および生体液の全ての試料を含む。
【００４９】
MPTP複合体の活性を判定または測定する方法は当技術分野において既知であり、Ca2+または他の物質によって誘導されるミトコンドリアの膨潤および縮みの測定、放射性標識したスクロースの取り込みの測定、ミトコンドリアのCa2+保持能力の測定、あるいは蛍光プローブまたは標識もしくは非標識の親油性陽イオンを使用したミトコンドリア膜電位の測定を含む(Bernardi, P.ら、「Mitochondoria and cell death. Mechanistic aspects and methodological issues.」 Eur J Biochem, 1999. 264(3): p. 687-701)。
【００５０】
別の態様において、(i)(a)一般式I(式中、R1およびR2はH、T、ハロゲン、ハロゲンの放射性同位体、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、R3はH、DおよびTからなる群より選択され、かつ残基R1、R2およびR3の少なくとも1つは少なくとも1つの放射性同位体を含む)、および(b)一般式II(式中、RはT、ハロゲンの放射性同位体、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、かつRは少なくとも1つの放射性同位体を含む)からなる群より選択される化合物を、MPTP複合体の成分への化合物の結合を可能にする条件下において関心対象の生物試料に接触させる段階；(ii)化合物の結合を検出する段階；ならびに(iii)任意で、検出された化合物の結合を定量する段階を含む、MPTP複合体の成分の存在を判定する方法が提供される。
【００５１】
ミトコンドリア透過性遷移孔複合体の成分に対する化合物の結合は、当技術分野において既知の方法によって培養中の細胞または単離したミトコンドリアを生理的な条件下において標識した化合物に暴露し、結合化合物から非結合体を分離することを含む種々の条件下において判定することができる。脳または肝臓などの組織から単離したミトコンドリアを放射性標識した化合物と所定の期間インキュベーションすることが好ましい。標識反応のためには、ミトコンドリアは脱励起(de-energized)状態、すなわち、任意の呼吸基質が存在しない場合のインキュベーションであっても、またはコハク酸塩またはグルタミン酸塩／リンゴ酸塩などの呼吸基質が存在する場合には励起(energized)状態であってもよい。MPTP複合体の成分に対する化合物の結合は、ミトコンドリア分画に結合した放射能を測定することによって定量することができる。定量は、遊離の標識親和性化合物から分離することによって促進される。分離方法には、洗浄、ろ過および遠心分離が挙げられるが、これらに限定されない。分離方法は、均一系法、例えば、遊離の標識親和性化合物をインサイチューにおいて、結合した標識親和性化合物から分離しない、シンチレーション近接アッセイ法(scintillation proximity assay：SPA)を含むことも意図されている。化合物の結合は、特異的結合および非特異的結合を含む化合物の総結合を意味する。非特異的結合は、同一または別の既知の化合物の飽和濃度との競合によって評価される。親和性化合物の総結合から非特異的結合を引くことによって、親和性化合物の特異的な結合が求められる。放射性標識した化合物が、ミトコンドリア遷移孔複合体の成分と共有結合を形成する場合には、まず、ミトコンドリアタンパク質はドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動によって分離され、タンパク質バンドに結合した放射能をオートラジオグラフィーによって測定することができる。
【００５２】
さらに別の態様は、(i)候補物質の存在下において、(a)一般式I(式中、R1およびR2はH、T、ハロゲン、ハロゲンの放射性同位体、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、R3はH、DおよびTからなる群より選択され、かつ残基R1、R2およびR3の少なくとも1つは少なくとも1つの放射性同位体を含む)、および(b)一般式II(式中、RはT、ハロゲンの放射性同位体、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、かつRは少なくとも1つの放射性同位体を含む)からなる群より選択される化合物を、細胞およびMPTPを含有する生物試料に接触させる段階；(ii)候補物質の存在下における化合物とMPTPの結合を、物質が存在しない場合の結合と比較する段階；ならびに(iii)任意で、細胞成分およびMPTPを含む細胞抽出物を調製する際に、MPTP活性に対する選択した物質の活性を試験する段階を含む、MPTP複合体の活性を調節する活性剤を同定する方法を提供する。
【００５３】
MPTP活性に対する選択した物質の活性は、上記方法によって、物質が存在する場合および存在しない場合において測定したMPTPの活性を比較することによって求めることができる。
【００５４】
さらに、(i)候補物質の存在下において、(a)一般式I(式中、R1およびR2はH、T、ハロゲン、ハロゲンの放射性同位体、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、R3はH、DおよびTからなる群より選択され、かつ残基R1、R2およびR3の少なくとも1つは少なくとも1つの放射性同位体を含む)、および(b)一般式II(式中、RはT、ハロゲンの放射性同位体、アルキル、シクロアルキルからなる群より選択され、かつRは少なくとも1つの放射性同位体を含む)からなる群より選択される化合物を、細胞およびMPTPのVDAC1を含有する生物試料に接触させる段階；(ii)候補物質の存在下における化合物とMPTPのVDAC1との結合を、この物質が存在しない場合の結合と比較する段階；ならびに(iii)任意で、細胞成分およびMPTPのVDAC1を含む細胞抽出物を調製する際に、MPTP活性に対する選択した物質の活性を試験する段階を含む、VDAC1と相互作用させることによって、MPTP複合体の活性を調節する活性剤を同定する方法が提供される。
【００５５】
本明細書において使用する「活性剤」とは、MPTP複合体の活性を調節することについてスクリーニングされる任意の化合物を意味することが意図される。調節とは、MPTP複合体の活性が阻害、低下、または増強されることと理解される。MPTP複合体の活性を調節するために本発明の方法において活性である「活性剤」は、結果として、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、ハンチントン病、およびパーキンソン病からなる群より選択される神経変性疾患の治療または糖尿病性神経障害、脳低酸素症、脳炎、および髄膜炎からなる群より選択される神経障害の治療のための薬学的組成物に使用することができる。
【００５６】
興奮毒性傷害が生じた場合のカルシウムの流入は、神経細胞の細胞死の本質的な媒介因子となる。ミトコンドリア機能不全は、興奮毒性細胞死において重要な役割を果たしている。MPTPの阻害剤は神経保護性であると報告されており、シクロスポリンAはNMDA誘導性のミトコンドリア膜脱分極および細胞死を遅延／低下し、ある種の動物モデル(虚血、低血糖、および脳外傷)において神経保護作用を示すことが見出されている。CsA非免疫抑制類似体であるN-Me-Val4-CsAも神経保護性を示すことが示されている。従って、MPTPの調節物質、特に阻害剤は、新規神経保護治療法となりうる(Murphy A. N., Fiskum G., Beal M. F.、「Mitochondria in neurodegeneration: bioenergetic function in cell life and death」 J Cereb Blood Flow Metab. 1999、19、231-45；およびTatton W. G., Chalmers-Redman R. M.、「Mitochondria in neurodegenerative apoptosis: an opportunity for therapy?」 Ann Neurol. 1998、44(3 補遺l): S134-41)。
【００５７】
本発明はまた、上記の本発明の方法によって同定された活性剤を提供する。
【００５８】
一般式(式中、R1およびR2はH、ハロゲン、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、かつR3はH、DおよびTからなる群より選択される)の化合物は新規である。
【化８】
2004339204.tif 000009
【００５９】
一般式I(式中、R1およびR2はHであり、かつR3はHである)の化合物が好ましい。記載されている化合物は、MPTPの活性の調節物質として使用することができる。
【００６０】
一般式I(式中、R1およびR2はH、ハロゲン、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシであり、R3はH、DおよびTからなる群より選択され、かつ残基R1、R2およびR3の少なくとも1つは少なくとも1つの放射性標識を含む)の化合物は新規である。一般式I(式中、R1およびR2はHであり、かつR3はTである)の化合物が好ましい。記載されている化合物は、親和性標識として使用することができる。好ましくは、記載されている化合物はMPTPの成分の親和性標識として使用することができる。
【００６１】
一般式Iの化合物は、図示する合成スキームにより合成することができる：
【化９】
2004339204.tif 000010
【００６２】
一般式Iの化合物は、中間体IVから3段階で製造することができる：水素化、重水素化、または三重水素化により、飽和化合物IIIを得、次にピロリジン塩酸塩などの二級アミン塩酸塩と縮合してマンニッヒ付加物を得、最後に酸性触媒として例えばシリカゲルを使用することによって酸性条件下においてIに変換する。中間体IVは、Denmarkら、Organic Synthesis、第74巻, 33に記載されているように、化合物VIIからの標準的な化学的変換を使用して製造することができる：リチウムジイソプロピルアミンおよび4-ブロモブチロニトリルなどの塩基でVIIを処理してVIを得、次いで塩基性条件下において環化して、Vを得る。Vの酸性加水分解により中間体IVが得られる。出発物質VIIは、Regnier G. J., J. Med.、Chem. 1992、35、2481-2496によって記載されている既知の手法によって製造することができる。一般式I(式中、R1、R2は放射性標識(D, T)である)の化合物は、化合物III(式中、R1およびR2はハロゲンである)を重水素化または三重水素化して、化合物III(式中、R1およびR2はDまたはTである)を提供することによって製造することができる。
【００６３】
一般式IIの化合物は、欧州特許第118685号および欧州特許第117412号に植物生長阻害物質として記載されており、その明細書に記載されているように合成することができる。一般式II(式中、Rは、H、T、D、ハロゲン、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択される)の化合物は、MPTP複合体の活性の調節物質として使用することができる。式II(式中、Rは、H、Br、ClおよびCl2からなる群より選択される)の記載されている化合物が好ましい。
【化１０】
2004339204.tif 000011
【００６４】
一般式II(式中、Rは、T、D、ハロゲン、アルキル、シクロアルキルおよびアルコキシからなる群より選択され、かつRは少なくとも1つの放射性同位体を含む)の化合物は新規である。RがTを含む、記載されている化合物が好ましい。式II(式中、RはCl、Cl2またはBrの放射性同位体である)の記載されている化合物も好ましい。これらの化合物は親和性標識として使用することができる。好ましくは、これらの化合物は、MPTP複合体の成分の親和性標識として使用することができる。
【００６５】
本明細書において使用する「親和性標識」とは、アッセイ系において、または哺乳類に投与した結果検出に好適な放射性同位体で標識されている、マイクロモル濃度または好ましくはそれ以下の範囲のMPTPの成分に対する親和性を有する化合物を意味することが意図される。好適な放射性同位体は、当業者に既知であり、例えば、ハロゲン(塩素、フッ素、臭素、およびヨウ素など)の同位体、並びにテクネチウムおよびインジウムを含む金属の同位体が挙げられる。好ましい放射性同位体には3Hおよび14Cが挙げられる。3Hが最も好ましい。本発明の放射性標識化合物は、当業者に既知の標準的な放射性標識手法を使用して製造することができる。好適な合成方法は詳細に記載されている。
【００６６】
このような放射性標識はかなり安定でなければならず、当技術分野に認識された標準を化学的および代謝的に適用する。また、当業者が認識しているように、本発明の化合物は種々の異なる放射性同位体により種々の様式で標識することができるが、このような放射性標識は、MPTPの成分に対する非標識親和性化合物の高い結合親和性および特異性が、著しく影響されることのない方法で実施されなければならない。著しく影響されないとは、結合親和性および特異性が、約3 log単位を超えて影響されない、好ましくは約2 log単位を超えて影響されない、より好ましくは約1 log単位を超えて影響されない、さらに好ましくは約500%を超えて影響されない、さらにより好ましくは約250%を超えて影響されない、最も好ましくは結合親和性および特性は全く影響されないことを意味する。
【００６７】
MPTPの成分の放射性標識した親和性化合物は、500 mCi/mmole〜100 Ci/mmoleの範囲の比活性を有してもよい。好ましくは、それは65 mCi/mmoleの比活性を有する。結合した放射性標識親和性化合物はシンチレーターを添加することによって測定することができる。
【００６８】
本明細書において、本発明を一般的に記載してきたが、添付の図面に関連して、具体的な実施例を参照することによってより良く理解されると思われる。これらの実施例は、特に明記しない限り例示のためだけに本明細書に加えられているものであって、限定する意図のものではない。
【実施例】
【００６９】
実施例において言及する市販の試薬は、特に示さない限り、製造業者の指示に従って使用した。[3H]-テトラフェニルホスホニウム([3H]-TPP、24〜29Ci/mmol)はAmersham Biosciences(Switzerland)から購入した。CsA、TFP、ユビキノン0(Ub0)、ユビキノン5(Ub5)は、Sigma(Switzerland)から入手し、アトラクチロシド(ATR)およびボンクレキン酸(BKA)はBioMol(Anawa、Switzerland)から入手した。カルシウム-グリーン5N(六カリウム塩)、ローダミン-123、および4,4'-ジイソチオシアナートスチルベン-2,2'-二スルホン酸(DIDS、二ナトリウム塩)はMolecular Probes(Juro、Switzerland)から入手した。
【００７０】
実施例1：スクリーニングアッセイ法
MPTPの新規阻害剤を同定するための試みにおいて、機能アッセイ法として、(2μMロテノンの存在下において)コハク酸塩で励起したラット肝ミトコンドリアの(Piの存在下における)Ca2+誘導性膨潤を使用して、化合物ライブラリーをスクリーニングした。
【００７１】
肝ミトコンドリアおよび脳ミトコンドリアは、雄性アルビノ(Albino)RoRoラットまたはMoRoマウス(BRL、Fullinsdorf、Switzerland)から調製した。膨潤実験のためには、肝ミトコンドリアは、標準的な手法により、ディファレンシャル遠心分離によって単離した(Costantini, P., Petronilli, V., Colonna, R & Bernardi, P. (1995) Toxicology 99, 77-88)。10mM Tris-HClでpH 7.4に調整した250mMスクロースにミトコンドリアペレットを懸濁させ、使用時まで氷中で保存した。ラットおよびマウスの脳ミトコンドリアは、(Sims, N. R. (1990) J. Neurochem. 55, 698-707)に記載する方法によりパーコール(Percoll)濃度勾配を使用して得た。肝ミトコンドリアにおける親和性標識実験のためには、この組織のオルガネラもパーコール濃度勾配で単離した。タンパク質含量は、Pierceビシンコニン酸タンパク質アッセイキットを使用して測定した。
【００７２】
SOFTmaxPRO(商標)ソフトウェア(Molecular Devices、Switzerland)によって制御されるSPECTRAMax 250分光光度計によって540nmの吸光度の変化を測定することにより、96ウェルプレートにおいて25℃で励起状態のミトコンドリアのCa2+誘導性膨潤(スクロース透過性)をアッセイした。インキュベーション培地は0.2Mスクロース、10mM Tris-Mops、pH7.4、1mM Pi-Tris、5μM  EGTAを含有した。TrisでpH7.4に調整したコハク酸塩(5mM、2μMロテノンの存在下)または5mMグルタミン酸塩／2.5mMリンゴ酸塩を呼吸基質として使用した。試験化合物の存在下または非存在下において短時間(〜5分間)のプレインキュベーション後、呼吸基質およびミトコンドリア調製物のCa2+感受性に応じて、最終濃度範囲40〜80μMのCaCl2を20μl添加することによって、ミトコンドリアの膨潤を誘導した。最終インキュベーション容量は0.2mlであり、ミトコンドリアの濃度は〜0.5mgミトコンドリアタンパク質ml-1であった。25℃において30分まで膨潤動態を追跡した。吸光度の読み取りは12秒ごとに行い、実験中酸素を拡散させ、ミトコンドリアの沈降を回避するために読み取りの合間に3秒間プレートを振とうした。膨潤実験は、Chernyak, B. V. & Bernardi, P. (1996) Eur. J. Biochem. 238, 623-630により十分に脱励起した肝ミトコンドリアにおいても実施した。
【００７３】
単離した肝ミトコンドリア(〜0.5mgタンパク質ml-1)を、20 nM [3H]TPP(Amersham Biosciences(Switzerland)製の[3H]-テトラフェニルホスホニウム([3H]TPP、24〜29Ci/mmol))の存在下において25℃において15分間バッチ様式でインキュベーションした。次いで、混合物のアリコート(100μl)を、100μlの試験化合物を含有する96ウェルプレートに入れ、25℃においてインキュベーションをさらに15分間行った。次いで、96チャネルのセルハーベスターを使用して、0.3%(v/v)ポリエチレンイミン処理したGF/Bグラスファイバーフィルターで試料をろ過し、フィルターを1mlの緩衝液で2回洗浄した。次いで、各ウェルに50μlのMICROSCINT40(Packard)を添加してから、TopCountシンチレーションカウンター(Packard)で放射能を計数した。非特異的な取り込みは、1mMの非標識TPPまたは1μMのカルボニルシアニド-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン(FCCP)の存在下で測定した。Clark型電極を使用して、25℃においてミトコンドリアの酸素消費をポーラログラフにより測定した。
【００７４】
化合物がMPTPを阻害することが見出されたら、次いでそれらがミトコンドリアの呼吸(例えば、プロトノフォア)を妨害するかどうかを、半定量的であるが、迅速な方法で判定するために、電位差測定プローブ[3H]-TPP(Hoek, J. B., Nicholls, D. G. & Williamson, J. R. (1980) J. Biol. Chem. 255, 1458-1564)の取り込みを使用してカウンタースクリーニングした。これにより、例えば、ミトコンドリア膜電位を低下することによって、MPTP開孔に必要なミトコンドリア内へのCa2+流入を低下する可能性のある「偽陽性」を棄却することができた。MPTPを阻害する濃度でミトコンドリアの呼吸(O2消費)を妨害しなかった化合物を、さらに特徴づけるために選択した。一般式Iを有する化合物および一般式IIを有する化合物がスクリーニングにおいて同定された。μM以下の範囲のEC50を有する活性な数多くの化合物が、Michaelアクセプターとしてのエノンなどの共通のファルマコホリックな(pharmacophoric)要素を示した。
【００７５】
実施例2：スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレン-
【化１１】
2004339204.tif 000012
スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-(0.3g, 1.14mmol)、塩酸ピロリジン(0.146g, 1.37mmol)およびパラホルムアルデヒド(0.1g, 4.42mmol)をDMF(1ml)に溶解した。反応混合物を80℃の油浴に浸して、アルゴン雰囲気下で2.5時間撹拌し、次いで溶媒を高真空下で留去した。残渣をMeCl2に取り、1N NaOHを添加した。水相をMeCl2で抽出して、有機相を合わせて水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、真空下で濃縮した。残渣を4mlのCH2Cl2に溶解し、SiO2(1.3g)の存在下で20分間室温において撹拌した。ろ過後、SiO2をCH2Cl2で洗浄した。ろ液を濃縮し、残渣をシリカゲルでクロマトグラフィーにかけて(ヘキサン-酢酸エチル48:02)、スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレン(0.138g, 44%)を白色固体、MS:m/2=274(M+)として得た。
【００７６】
実施例3：スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-t2-10',11'-ジヒドロ-3-メチレン-
【化１２】
2004339204.tif 000013
スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-t2-10',11'-ジヒドロ-(2.2Ci)，塩酸ピロリジン(3.5mg, 0.033mmol)およびパラホルムアルデヒド(3mg, 0.1mmol)をDMF(0.1ml)に溶解した。反応混合物を80℃の油浴に浸して、アルゴン雰囲気下で2.5時間撹拌し、次いで溶媒を高真空下で留去した。残渣をMeCl2に取り、1N NaOHを添加した。水相をMeCl2で抽出して、有機相を合わせて水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、真空下で濃縮した。残渣を4mlのCH2Cl2に溶解し、SiO2(200mg)の存在下で2時間室温において撹拌した。ろ過後、ろ液を1gのLichroprep Si60 25-40μm(ヘキサン-酢酸エチル48:02)でクロマトグラフィーにかけた。精製した生成物の総放射能は1.376Ciであり、質量分析計で測定したときの比活性および放射化学的純度は、それぞれ、65.1Ci/mmolおよび98.4%であった。
【００７７】
実施例4：スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-
【化１３】
2004339204.tif 000014
スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン(0.02g, 0.077mmol)を酢酸エチル(2ml)に溶解し、大気圧の水素雰囲気下でPd/C(0.01g, 炭素に対して10%)の存在下で36時間還流した。触媒をろ過し、ろ液を留去した。残渣をシリカゲル(ヘキサン-酢酸エチル48:02)でクロマトグラフィーにかけて、スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-(0.017g, 84%)を無色の油状物質、MS:m/e=262(M+)として得た。
【００７８】
実施例5：スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-t2-10',11'-ジヒドロ-
【化１４】
2004339204.tif 000015
スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン(0.01g, 0.034mml)をDMF(0.8ml)に溶解し、大気圧の三重水素雰囲気下でPd/C(6mg, 炭素に対して10%)の存在下で80℃で3時間加熱した。粗生成物(2.5Ci)を1gのLichroprep Si60 25-40μmのカラムでクロマトグラフィーにかけて(ヘキサン-酢酸エチル48:02)、総放射能2.2Ciのスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-t2-10',11'-ジヒドロ-を得た。
【００７９】
実施例6：スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン
【化１５】
2004339204.tif 000016
2'-アミノスピロ/5H-ジベンゾ<A,D>シクロヘプテン-5,1'-<2>-シクロペンテン/-3'-カルボニトリル(0.96g, 3.38mmol)をジオキサン(33ml)に溶解した。水(16ml)およびHCl(16ml, 37%)を添加した。反応混合物をアルゴン雰囲気下で18時間還流し、室温に冷却し、水および酢酸エチルで反応を停止した。水相を酢酸エチルで抽出し、有機相を合わせて水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、真空下で濃縮した。このようにして得られた固体をヘキサン中で1時間撹拌し、ろ過して、スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン(0.324g, 36%)を白色固体、MS:m/e=260(M+)として得た。
【００８０】
実施例7：2'-アミノスピロ/5H-ジベンゾ<A,D>シクロヘプテン-5,1'-<2>-シクロペンテン/-3'-カルボニトリル
【化１６】
2004339204.tif 000017
5-(3-シアノ-プロピル)-5H-ジベンゾ[a,d]シクロペンテン-5-カルボニトリル(2g, 7mmol)をTHF(8ml)およびtBuOH(17ml)に溶解し、tBuOK(0.78g, 7mmol)で処理した。反応混合物を65℃において2時間加熱し、次いで室温に冷却し、水およびエーテルで反応を停止した。水相をエーテルで抽出し、有機相を合わせて水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、真空下濃縮した。残渣を0℃においてCH2Cl2で結晶化させて、2'-アミノスピロ/5H-ジベンゾ<A,D>シクロヘプテン-5,1'-<2>-シクロペンテン/-3'-カルボニトリル(0.47g, 24%)を白色の固体MS:m/e=284(M+)として得た。
【００８１】
実施例8：5-(3-シアノ-プロピル)-5H-ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン-5-カルボニトリル
【化１７】
2004339204.tif 000018
ジイソプロピルアミン(0.143ml, 1mmol)のTHF(1ml)溶液に、nBuLi(0.67ml, 1.06mmol, 1,6Mヘキサン溶液)を滴下した。-5℃において20分間撹拌後、5H-ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン-5-カルボニトリル(Regnier G. Jら、J. Med. Chem. 1992, 35, 2481-2496により製造)(0.2g, 0.9mmol)のTHF(1ml)溶液を滴下した。-5℃において15分間後、4-ブロモブチロニトリル(0.1ml, 1mmol)のTHF(1ml)溶液を徐々に添加した。反応混合物を室温まで徐々に加温させ、一晩撹拌し、水およびエーテルで反応を停止した。水相をエーテルで抽出し、有機相を合わせて水で洗浄し、Na2SO4で乾燥して、真空下濃縮した。残渣をシリカゲル(ヘキサン-酢酸エチル 9:1)でクロマトグラフィーにかけて、5-(3-シアノ-プロピル)-5H-ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン-5-カルボニトリル(0.2g, 76%)を無色の油状物質、MS:m/e=284(M+)を得た。  
【００８２】
実施例9：ラット肝ミトコンドリアのCa2+誘導性膨潤に対するスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンの影響
インキュベーション培地は、0.2Mスクロース、10mM Tris-Mops、pH7.4、1mM Pi-Tris、5μM EGTA、およびCPI呼吸基質としてTrisでpH 7.4に調整した5mMグルタミン酸塩／2.5mMリンゴ酸塩を含有した。スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンの存在下で短時間(〜5分間)プレインキュベーションした後、40μMのCaCl2を添加することによってミトコンドリアの膨潤を誘導し、540nmの吸光度の低下としてMPTPの開孔をモニターした(図2)。
【００８３】
実施例10：ラット肝ミトコンドリアのCa2+誘導性膨潤に対するスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレン、6-ブロモ-3-メチレン-クロマン-4-オン、およびCsAの影響
実験条件は、実施例9のとおりであった。EC50値は、SigmaPlotコンピュータプログラムを使用した4パラメーターロジスティック等式を使用して、非線形回帰分析にデータを適合することによって、40μM CaCl2添加の20分後の540 nmにおける吸光度変化(ΔA540)対ベースライン(CaCl2なし)の割合(％)として求めた。示した値は、異なる肝ミトコンドリア調製物を使用して2本組みで実施した3〜5回の実験の平均±SEMである(図3、表1)。
【００８４】
スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンはCa2+誘導性のミトコンドリアの膨潤を強力に阻害した(図2)。従って、スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンは、NADH結合基質(グルタミン酸塩／リンゴ酸塩)で励起した肝ミトコンドリアのMPTP開孔をEC50が98±10で阻害した(図3)。同様の条件下では、CsAおよびエノン類似体6-ブロモ-3-メチレン-クロマン-4-オンは、それぞれ、EC50が160±9nMおよび930±30nMであった。表1は、既知のMPTP阻害剤と比較した、スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレン、6-ブロモ-3-メチレン-クロマン-4-オン、6-クロロ-3-メチレン-クロマン-4-オン、6,8-ジクロロ-3-メチレン-クロマン-4-オンのコハク酸塩で励起したミトコンドリアで得られたEC50を示す。これらの実験条件下でも、スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンは肝ミトコンドリアのMPTPの阻害において少なくともCsAと同じくらいの効果があり、試験した他のMPTP阻害剤よりはるかに強力であると思われた。しかし、報告したEC50は相対的な値であり、膨潤を誘導するために添加したCa2+の量(および呼吸基質、(Fontaine, E., Ichas, F., Bernardi, P. (1998) J. Biol. Chem. 273, 25734-25740)を参照されたい)に依存すると思われることを覚えておく必要がある。それでも、種々の阻害剤の相対的な効力は、Ca2+負荷を変更したとき維持された。
【００８５】
スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンおよびその類似体6-ブロモ-3-メチレン-クロマン-4-オンは、MPTPを間接的に調節する部位との相互作用を排除すべき条件である、脱励起状態のミトコンドリアのMPTPの阻害においても有効で(Linder, M. D., Morkunaite-Haimi, S., Kinnune, P. K., Bernardi, P. & Eriksson, O. (2002) J. Biol. Chem. 277, 937-942)、EC50値は、それぞれ0.37μMおよび2.8μMであった(n=2、200μMのCa2+を添加して30分後に測定した値)。比較のために、この実験条件下におけるCsAおよびUb0のEC50は0.22μMおよび4.9μMであった。スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンはまた、フェニルアルシンオキシド(25μM)およびATR(50μM)によって誘導されたMPTPも阻害し、従ってこの化合物は種々の誘導条件下においてMPTPを阻害することができることを証明している。
【００８６】
スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンおよび6-ブロモ-3-メチレン-クロマン-4-オンは、MPTPを完全に遮断する濃度では、ミトコンドリアの呼吸(基底状態、ADP誘導性で、非結合)またはCyp-Dペプチジルプロリルcis-transイソメラーゼ酵素活性を阻害しなかった。
【００８７】
実施例11：ラット脳ミトコンドリアのCa2+保持能力に対するスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンおよびCsAの影響(図4)
FL WinLabコンピュータプログラムによって制御されたPerkin-Elmer LS-50B蛍光光度計を使用してミトコンドリア外Ca2+を測定した。インキュベーション培地は、0.2 Mスクロース、1mM Pi-Tris、10 mM Tris-Mops、5mMグルタミン酸塩-Tris、2.5mMリンゴ酸塩-Tris、pH 7.4を含有し、0.01%(w/v)BSAおよび1μM低親和性Ca2+インジケーターカルシウムグリーン-5Nを含有した(Fontaine, E., Eriksson, O., Ichas, F. & Bernardi, P. (1998) J. Biol. Chem. 273, 12662-12668)。最終容量は2.5mlで、キュベットは25℃で保温した。次いで、脳ミトコンドリアに5μM Ca2+を連続添加した(〜150nmol mgタンパク質-1)。505〜535の励起／発光波長でミトコンドリア外Ca2+をモニターした。Ca2+シグナルの較正は、色素のCa2+KDが14μMであると仮定して、製造業者の指示に従って実施した。肝ミトコンドリア(a)および脳ミトコンドリア(b)のCa2+保持能力も比較した(図4B)。
【００８８】
MPTPの阻害におけるスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンの影響を、ラット前脳から単離したミトコンドリアにおいても検討した。この組織からミトコンドリアは低収率でしか得られないので、膨潤実験を実施するのは困難であるが、スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンは、80μMのCaCl2を添加することによって誘導した脳ミトコンドリアの膨潤を、肝ミトコンドリアで観察された範囲の効力で阻害した。上記の困難さのために、ラット前脳から単離したミトコンドリアを一連のCa2+パルス(5μM、〜150nmol mgタンパク質-1)にかけ、およびミトコンドリア外Ca2+をモニターするかまたは蛍光プローブを使用することによって、脳ミトコンドリアのMPTPに対するスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンの影響をさらに正確に検討した。これらの条件下では、MPTPの開孔によると示されている影響である脱分極を伴う迅速なCa2+放出過程をミトコンドリアが受けるまで、ミトコンドリアはCa2+を取り込み、保持する。図4は、これらの実験におけるCsAおよびスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンの影響を示す。スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンおよびCsAは、1μM(すなわち、その化合物で観察された最大有効濃度)において、Ca2+が取り込まれなくなった閾値に達するまで、ミトコンドリアがCa2+を中和する能力を増大した。両化合物は、脳ミトコンドリアによって取り込まれるCa2+の量をほぼ2倍にした。従って、対照のミトコンドリアは530±70nmol Ca2+/mgタンパク質を蓄積することができたが、1μMのCsAおよびスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンの存在下では、Ca2+中和能力は、それぞれ、1130±80nmol Ca2+mgタンパク質-1および1200±120nmol Ca2+mgタンパク質-1まで増加した(3回の独立した実験の平均±SEM)。スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンおよびCsA(各1μM)の組み合わせは相加効果を有し、ミトコンドリアは2050±450 nmol Ca2+mgタンパク質-1を蓄積することができた。スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンはCyp-D活性を阻害しないという事実に矛盾することなく、これは、スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンはCyp-Dではない部位に作用することを示している。予測されるように、スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンおよびその類似体6-ブロモ-3-メチレン-クロマン-4-オンの存在下では、相加効果は観察されなかった。一連のCa2+添加(各5μM)後にΔΨmをモニターした実験から実質的に同一の結果が得られた。MPTP開孔が完全にΔΨmを崩壊し、プロトノフォアFCCPの添加後にさらなる蛍光の増加が観察されなくなるまで、各Ca2+添加はΔΨmの可逆的な低下を生じた。これらの条件下でも、スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンおよびCsAは、完全な脱分極を誘導するのに必要なCa2+添加数��増加し、2つの化合物の組み合わせにより相加効果が観察された。一方、同じ手法を使用したとき、他のMPTP阻害剤と組み合わせたスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンの試験は、スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンの影響がBKA、ADP、TFPおよびタモキシフェンと相加的であることから、スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンの異なる作用部位を示している。唯一の例外は、このような相加効果が見られなかった以前に特徴づけたMPTP遮断剤であるUb0であった。
【００８９】
Ub0とに相加効果が見られないことは、スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンの結合部位が、Fontaineら(Walter, L., Nogueira, V., Leverve, X., Heitz, M. P., Bernardi, P. & Fontaine, E. (2000) J. Biol. Chem. 275, 29521-29527)によってMPTP開孔を調節することが報告されているユビキノン部位に対応する可能性があることを示唆した。これにさらに対処するために、Ub0の阻害作用を軽減することが示されているユビキノン誘導体であるUb5も、スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンによるMPTP阻害に拮抗することができるかどうかを検討した。ラット肝ミトコンドリアについて図5Aに示すように、Ub5 (50μM)はスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンによる阻害に拮抗することができ、スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンのEC50を290nMから2.4μMにシフトさせた(n=2、60μM Ca2+、呼吸基質としてグルタミン酸塩／リンゴ酸塩)。また、ラット脳ミトコンドリア(図5B)では、300nMのスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンはCa2+誘導性脱分極を阻害したが、この阻害は50μMのUb5の存在によって軽減された。Ub5単独では影響なかった。これらの結果は、スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンおよびユビキノン誘導体はMPTPの同一部位または機能的に関連する部位に作用する可能性があるという概念を裏付けている。
【００９０】
実施例12：スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-t2-10',11'-ジヒドロ-3-メチレンを使用したミトコンドリアの親和性標識
パーコール精製したミトコンドリア(試料あたり〜30μgタンパク質)を、最終容量200μlとして、10nMのスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-t2-10',11'-ジヒドロ-3-メチレンの存在下でインキュベーションした。25℃において15分間インキュベーションした後、試料を25000xgで遠心分離し、ミトコンドリアペレットを緩衝液で2回洗浄した。次いで、試料を、β-メルカプトエタノールを含有する試料緩衝液に溶解し(37℃で1時間)、Tris-グリシンNovexプレキャストミニゲル(12%モノマー濃度、Invitrogen BV、Netherlands)におけるSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)にかけた。クーマシーブルー染色後、Amplify(商標)(Amersham Biosciences)に浸漬することによってゲルを蛍光間接撮影用に処理し、乾燥させ、-80℃でBioMax MS増感スクリーン(Kodak)付きのX線BioMax MSフィルムに適当な時間露出した。
【００９１】
単離したミトコンドリア(パーコール濃度勾配、〜5mgタンパク質)を、25℃において20nMのスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-t2-10',11'-ジヒドロ-3-メチレンの存在下で15分間標識した。次いで、0.5 mMフェニルメチルスルホニルフルオライド(PMSF)、1μg/mlロイペプチン、1.8/mlμgアプロチニン、および1μg/mlペプスタチンAを含有する3%Triton X-100(Surfact-Amps X-100, Pierce)の10mM NaPO4、pH6.8溶液3 mlでミトコンドリアペレットを溶解した。次いで、溶解した膜を、0.3%TritonX-100を含有する10 mM NaPO4、pH6.8で平衡化させたセラミックヒドロキシアパタイトCHT-II 1×5cmカラム(Bio-Rad、Switzerland)に注入した。次いで、3%Triton X-100を含有する400 mM NaPO4、pH6.8までの濃度勾配を用いて0.5ml分-1の流速でカラムを溶出した。分画(1分)を採取し、アリコート(5μl)を放射能計数した。次いで、放射性分画をSDS-PAGEにかけ、次に染色および／または蛍光間接撮影を行った。
【００９２】
スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-t2-10',11'-ジヒドロ-3-メチレン標識したタンパク質を同定するためには、放射性のクロマトグラフ分画中のタンパク質を、トリクロロ酢酸(最終濃度20%)で沈降させた。SDS-PAGE試料緩衝液で再構成し、ヨードアセタミドを使用してカルボキシアミドメチル化した後、タンパク質をSDS-PAGEに付した。以前に記載されているように(Fountoulakis, M. & Langen, H. (1997) Anal. Biochem. 250, 153-156、Yoo, B. C., Fountoulakis, M.、Cairns, N. & Lubec, G. (2001) Electrophoresis 22, 172-179)、コロイド状のクーマシーブルー(Novex)で染色し、脱染した後、ゲルスポットを切り取り、修飾トリプシン(Promega)を使用してゲル内で(in-gel)消化したタンパク質をマトリックス支援レーザーイオン化-質量分析計(MALDI-MS)によって分析した。試料は、リフレクタを備えた時間飛行型PerSeptive Biosystems質量分析計で分析した。得られたペプチドの質量は、SWISS-PROTおよびTrEMBLデータベースにおける全ての種の全てのタンパク質の理論的なペプチドの質量に一致した(http://us.expasy.org/sprot/)。タンパク質検索のためには、モノアイソトピック質量を使用し、0.0075%の質量の交差を許容した。一致しないペプチドまたはミス切断部位は考慮しなかった。トリプシン断片のいくつかについては、以前に記載されているように(Krapfenbauer, K., Berger, M., Friedlein, A., Lubec, G. & Fountoulakis, M. (2001) Eur J Biochem. 268, 3532-3537)、API 365トリプル四重極質量分析計(Sciex, Toronto、Canada)によるナノエレクトロスプレータンデムMS(Wilm, M. & Mann, M. (1996) Anal. Chem. 68, 1-8)によって確認した。
【００９３】
図6は、ラット脳(パネルA)および肝臓(パネルB)から単離した無傷のミトコンドリアの10nMスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-t2-10',11'-ジヒドロ-3-メチレンによる標識後に得られた結果を示す。小数のタンパク質だけが標識されていると思われ、両方の調製物では、〜32kDaのタンパク質が主に標識されたと思われた。非標識スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンの濃度を増加させると、このバンドの標識が阻害された。タンパク質の標識はミトコンドリアの可溶性分画では観察されなかったので、この32kDaのタンパク質は膜タンパク質であった。マウス脳および肝臓から、ならびにSHSY-5Yヒト神経芽細胞腫細胞から単離したミトコンドリアを使用しても、〜32kDaバンドが主に標識されたようであった。呼吸基質(グルタミン酸塩／リンゴ酸塩またはコハク酸塩／ロテノン)の存在により、標識パターンは変更されなかった。
【００９４】
上記組織から調製されたミトコンドリアのこのタンパク質は、ヒドロキシアパタイトカラムを使用すると、1回のFPLCクロマトグラフィー工程で精製することができた。図7に示すように、大部分の放射能はカラムに保持されず、カラムの先端から溶出した。これらの分画をSDS-PAGE分析した後、銀染色および蛍光間接撮影を行ったところ、主要な1つのタンパク質の存在が示された(図7、挿入図)。ゲル内で消化したトリプシン断片のMALDI-MS分析およびナノエレクトロスプレータンデムMSは、タンパク質がVDACのアイソフォーム1(電位依存的陰イオン選択チャネルタンパク質1またはミトコンドリア外側膜タンパク質1、POR1_RAT, Q9Z2L0)に対応することを示した。
【００９５】
実施例13：
ラット脳ミトコンドリアにおけるスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-t2-10',11'-ジヒドロ-3-メチレンによるVDAC1標識に対するモノブロモビマノおよびフェニルアルシノオキサイドの影響
実験条件は実施例12のとおりであった(図8A)。
ラット脳ミトコンドリアにおけるスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-t2-10',11'-ジヒドロ-3-メチレンによるVDAC1標識に対する種々のMPTP阻害剤、アトラクチロシド(ATR)、およびDIDSの影響
ミトコンドリアはDIDSに5分間暴露してから、遊離の物質を除去するために洗浄し、スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-t2-10',11'-ジヒドロ-3-メチレンで標識した(図8B)。
【００９６】
スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-t2-10',11'-ジヒドロ-3-メチレンを用いたVDAC1の標識と、この化合物のMPTP遮断剤としての機能的な影響とを相関させるために、ラット脳ミトコンドリアにおけるスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-t2-10',11'-ジヒドロ-3-メチレンによるVDAC1の標識に対する複数のMPTP阻害剤およびMPTP誘導剤ATRの影響を検討した。図8Bに示すように、放射能の取り込みは、スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレン-類似体6-ブロモ-3-メチレン-クロマン-4-オン(並びにβ-アミノケトン誘導体6-ブロモ-3-ジエチルアミノメチル-クロマン-4-オン)によって阻害された。スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-t2-10',11'-ジヒドロ-3-メチレン標識の阻害は、MPTPを遮断するUb0濃度の存在下において観察された。この後者の所見は、上記に報告した機能実験と一致しており(図5参照)、VDACはユビキノン阻害剤の分子標的となる可能性があることを示す。CsA、AdNTリガンド(ADP、BKAおよびATR)、およびTFPは放射能の取り込みに影響しなかった。興味深いことに、ミトコンドリアからのスーパーオキシド誘導性VDAC依存的チトクロームC放出を阻害することが示されている陰イオンチャネル阻害剤DIDS(Madesh, M. & Hajnoczky, G. (2001) J. Cell. Biol. 155, 1003-1015)も、スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-t2-10',11'-ジヒドロ-3-メチレンの取り込みを阻害するようであった(図8B)。実質的に同一の結果が、生きているミトコンドリアを使用した親和性標識実験で得られた。
【００９７】
実施例14：酵母ミトコンドリアにおけるスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-t2-10',11'-ジヒドロ-3-メチレン標識
VDAC1をスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンのタンパク質標的としてさらに確認するために、酵母から調製したミトコンドリアのタンパク質のスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-t2-10',11'-ジヒドロ-3-メチレンによる標識を検討した。酵母の主要なVDACアイソフォーム、YVDAC1の発現が、por1遺伝子の欠損によって排除されている株(Δpor1)では、実質的に標識は観察されなかった。しかし、YVDAC1の発現を仲介するプラスミドを含むΔpor1株から調製した酵母ミトコンドリアは、YVDAC1に対して形成した抗体を使用したイムノブロット分析で確認した場合、酵母VDACの予測されたサイズである29kDaにおいて著しい標識が示された。非標識スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンの濃度を増加させると、放射能の取り込みが阻害された(図9)。しかし、驚いたことに、ヒトVDAC1の発現を仲介するプラスミドで形質転換したΔpor1株から調製した酵母ミトコンドリアでは明らかな標識は観察されなかった。これは、イムノブロット分析はタンパク質が実際に発現されたことを示した事実を無視するものである。
【００９８】
（表１）コハク酸塩で励起したラット肝ミトコンドリアのCa2+誘導性MPTPに対する種々の阻害剤の影響
2004339204.tif 000019
*ADPを用いた実験は、1μg/mlオリゴマイシンの存在下で実施した。
【００９９】
インキュベーション培地は、0.2Mスクロース、10mM Tris-Mops、pH7.4、1 mM Pi-Tris、5μM EGTAを含有した。コハク酸塩(5mM、2μMロテノンの存在下)を呼吸基質として使用した。種々の化合物との〜5分間のインキュベーション後、80μM Ca2+を添加することによって膨潤を誘導し、A540をモニターした。EC50値は、SigmaPlotコンピュータプログラムを使用した4パラメーターロジスティック等式を使用して、非線形回帰分析にデータを適合することによって、CaCl2添加の20分後の540 nmにおける吸光度変化(ΔA540)対ベースライン(CaCl2なし)の割合(％)として求めた。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】MPTP基本単位の提案されている略図である。
【図２】ラット肝ミトコンドリアにおけるCa2+誘導性膨潤に対するスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンの影響を示す図である。インキュベーション培地は、0.2 Mスクロース、10 mM Tris-Mops、pH 7.4、1 mM Pi-Tris、5μM EGTA、およびTrisで7.4に調整したCPI呼吸基質としての5 mMグルタミン酸塩／2.5 mMリンゴ酸塩を含有した。スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンの存在下で、25℃で短時間(〜5分間)プレインキュベーションした後、40μM CaCl2を添加することによってミトコンドリアの膨潤を誘導し、540 nmの吸光度の減少としてMPTP開孔をモニターした。
【図３】ラット肝ミトコンドリアにおけるCa2+誘導性膨潤に対するスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレン、その類似体6-ブロモ-3-メチレン-クロマン-4-オン、およびCsAの影響を示す図である。実験条件は図2と同様であった。EC50値は、SigmaPlotコンピュータプログラムを使用した4パラメーターロジスティック等式を使用して、非線形回帰分析にデータを適合することによって、40μM CaCl2添加の20分後の540 nmにおける吸光度変化(ΔA540)対ベースライン(CaCl2なし)の割合(％)として求めた。示した値は、異なる肝ミトコンドリア調製物を使用して2本組みで実施した3〜5回の実験の平均±SEMである。
【図４Ａ】ラット脳ミトコンドリアのCa2+保持能力に対するスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンおよびCsAの影響を示す図である。インキュベーション培地は、0.2 Mスクロース、10 mM Tris-Mops、pH 7.4、1 mM Pi-Tris、5μM EGTA、およびTrisで7.4に調整した5 mMグルタミン酸塩／2.5 mMリンゴ酸塩を含有し、0.01%(w/v)ウシ血清アルブミンおよび1μMカルシウムグリーン-5Nを含有した。最終容量は2.5mlであった。トレース(a)対照、(b)1μM CsA、(c)1μMスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレン、ならびに(d)1μM CsAおよび1μMスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレン。各蛍光スパイクは、5μM Ca2+の添加に対応する。
【図４Ｂ】肝臓(a)と脳ミトコンドリア(b)のCa2+保持能力の比較を示す図である。
【図５】スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンによるMPTPの阻害に対するUb5の影響を示す図である。(Ａ)ラット肝ミトコンドリアにおけるCa2+誘導性膨潤である。実験条件は、MPTPを誘導するために60μM Ca2+を添加したことを除いて、図2と同様であった。トレース(a)および(b)では、Ca2+を添加せず、(b)では50μMのUb5が存在した。他のトレースでは、60μM Ca2+を、単独(c)、50μM Ub5の存在下(d)、300nMスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンの存在下(e)、および300nMスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンおよび50μM Ub5の存在下(f)において添加した。化合物は、Ca2+の〜5分前までに添加した。(Ｂ)ラット脳ミトコンドリアのCa2+誘導性脱分極である。使用した培地は、カルシウムグリーン-5Nの変わりに0.5μMローダミン-123を添加し、20μM Ca2+を添加することによってMPTPを誘導したことを除いて、図4の説明と同様であった。トレース(a)、対照(Ca2+単独)、(b)300 nMスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレン、(c)300 nMスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレンおよび50μM Ub5。
【図６】単離したラット脳(A)および肝(B)ミトコンドリアの親和性標識を示す図である。ミトコンドリア調製物を、種々の濃度のスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレン(非標識)の存在下または非存在下で、25℃で15分間10nMのスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-t2-10',11'-ジヒドロ-3-メチレンの存在下でインキュベーションした。試料をSDS-PAGE(詳細は実験方法の記載を参照)および蛍光間接撮影法にかけた。ゲルの蛍光写真を示す。分子量目盛り(kDa)は縦軸に示す。
【図７】スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-t2-10',11'-ジヒドロ-3-メチレン標識32kDaタンパク質の精製を示す。予め20nMのスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-t2-10',11'-ジヒドロ-3-メチレンで標識し、TritonX-100で溶解したミトコンドリアをヒドロキシアパタイトFPLCカラムに注入した。溶出は、リン酸ナトリウム緩衝液、pH6.8の直線濃度勾配(25分間で250mMにし、次いで5分後に400mMにした)を用いて0.5ml/分で実施し、1分の分画を自動的に採取した。ヒストグラムは、アリコート(5μl)の分画を計数した後の放射能溶出プロフィールを示す。挿入図は、TritonX-100で溶解したミトコンドリア(出発材料、レーンa)およびカラムフロー-スルー(分画7〜9、レーンb)の銀染色を示す。対応する精製物質の蛍光写真をレーンcに示す。
【図８】(Ａ)ラット脳ミトコンドリアにおけるスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-t2-10',11'-ジヒドロ-3-メチレンによるVDAC1標識に対するモノブロモビマノ(monobromobimano：MBBM)およびフェニルアルシノオキサイド(phenylarsino oxide：PhAO)の影響を示す図である。実験条件は、図5の説明と同様であった。(Ｂ)ラット脳ミトコンドリアにおけるスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-t2-10',11'-ジヒドロ-3-メチレンによるVDAC1標識に対する種々のMPTP阻害剤、アトラクチロシド(ATR)、およびDIDSの影響を示す図である。遊離の物質を除去するために洗浄し、スピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-t2-10',11'-ジヒドロ-3-メチレンで標識する前に、ミトコンドリアを5分間DIDSに暴露した。
【図９】異なる濃度のスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-ジヒドロ-3-メチレン(非標識)の存在下または非存在下における、YVDAC1のpor1遺伝子を欠損する(Δpor1)酵母ミトコンドリアおよびYVDAC1をトランスフェクトしたΔpor1酵母ミトコンドリアのスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-t2-10',11'-ジヒドロ-3-メチレン親和性標識を示す図である。SDS-PAGE後のゲルの蛍光写真を示す。酵母株から単離したミトコンドリアを、10 nMのスピロ[シクロペンタン-1,5'-[5H]ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン]-2-オン,10',11'-t2-10',11'-ジヒドロ-3-メチレンの存在下で、25℃にて15分間インキュベーションした。数字は、添加した種々の化合物の濃度(μM)を示す。
【図１】
2004339204.tif 000027
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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