(57)【要約】　　　（修正有）【課題】リンパ球の発生分化に影響を及ぼす遺伝子およびタンパク質を提供する。【解決手段】ヒトＢ細胞の膜表面に発現する新規なレセプタータンパク質を提供する。このタンパク質は、Ｎ末端側に４回膜貫通構造を持ち、Ｃ末端側に９個のｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ−ｒｅｐｅａｔｓ（ＬＲＲｓ）を有し、前記両末端は、細胞膜外に露出している。このタンパク質は、第９染色体の遺伝子にコードされている。このタンパク質は、Ｂ細胞の発生と分化に影響を与える。第９染色体と第２０染色体とで転座が起こり、前記遺伝子が変異すると、無γグロビン血症となる。この変異タンパク質は、特定のアミノ酸配列からなる。この変異タンパク質は、Ｎ末端側に４回膜貫通構造を持ち、Ｃ末端側に７個のｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ−ｒｅｐｅａｔｓ（ＬＲＲｓ）を有し、前記両末端は、細胞膜外に露出している。【選択図】　図３
2004141048.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質。
（Ａ）　配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）　配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸残基が、置換、付加若しくは欠失したアミノ酸配列からなり、リンパ球の膜表面に発現するレセプターであるタンパク質。
【請求項２】
ヒトのＢ細胞の成熟に必要な請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
４回膜貫通構造および９個のＬｅｕｃｉｎｅ−Ｒｉｃｈ−Ｒｅｐｅａｔｓ（ＬＲＲｓ）を有する請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
下記の（Ｃ）または（Ｄ）のポリペプチド。
（Ｃ）　配列番号１における第５８５アミノ酸残基から第７７１アミノ酸残基のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｄ）　配列番号１における第５８５アミノ酸残基から第７７１アミノ酸残基のアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸残基が、置換、付加若しくは欠失したアミノ酸配列からなり、請求項３に記載のタンパク質のＣ末端側の８個の連続ＬＲＲｓを形成するポリペプチド。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質もしくはポリペプチドをコードする遺伝子。
【請求項６】
下記の（Ｅ）または（Ｆ）のポリヌクレオチド。
（Ｅ）　配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（Ｆ）　配列番号２において、１以上の塩基が置換、付加若しくは欠失した塩基配列からなり、請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質もしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質もしくはポリペプチドを認識可能な抗体。
【請求項８】
モノクローナル抗体である請求項７記載の抗体。
【請求項９】
候補化合物と、請求項１から４に記載のタンパク質もしくはポリペプチドとを接触させ、その相互作用を判定する工程を含むＢ細胞関連疾患治療薬若しくは免疫抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
下記の（Ｇ）または（Ｈ）のタンパク質。
（Ｇ）　配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｈ）　配列番号３において、一つ以上のアミノ酸残基が、置換、付加若しくは欠失しているアミノ酸配列からなり、無γグロブリン血症患者のＢ細胞膜表面に発現するタンパク質。
【請求項１１】
４回膜貫通構造および７個のＬｅｕｃｉｎｅ−Ｒｉｃｈ−Ｒｅｐｅａｔｓ（ＬＲＲｓ）を有する請求項１０記載のタンパク質。
【請求項１２】
請求項１０または１１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１３】
下記の（Ｉ）または（Ｊ）のポリヌクレオチド。
（Ｉ）　配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（Ｊ）　配列番号４において、１以上の塩基が置換、付加若しくは欠失した塩基配列からなり、請求項１０または１１記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１０または１１に記載のタンパク質を含むマーカー。
【請求項１５】
請求項１０または１１に記載のタンパク質を認識可能な抗体。
【請求項１６】
モノクローナル抗体である請求項１５記載の抗体。
【請求項１７】
請求項１２記載の遺伝子または請求項１３記載のポリヌクレオチドを含むマーカー。
【請求項１８】
下記の（Ｋ）または（Ｌ）のタンパク質。
（Ｋ）　配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｌ）　配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸残基が、置換、付加若しくは欠失したアミノ酸配列からなり、リンパ球の膜表面に発現するレセプターであるタンパク質。
【請求項１９】
マウスのＢ細胞の成熟に必要な請求項１８記載のタンパク質。
【請求項２０】
４回膜貫通構造および９個のＬｅｕｃｉｎｅ−Ｒｉｃｈ−Ｒｅｐｅａｔｓ（ＬＲＲｓ）を有する請求項１８または１９に記載のタンパク質。
【請求項２１】
下記の（Ｍ）または（Ｎ）のポリペプチド。
（Ｍ）　配列番号５における第５８５アミノ酸残基から第７７１アミノ酸残基のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｎ）　配列番号５における第５８５アミノ酸残基から第７７１アミノ酸残基のアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸残基が、置換、付加若しくは欠失したアミノ酸配列からなり、請求項２０に記載のタンパク質のＣ末端側の８個の連続ＬＲＲｓを形成するポリペプチド。
【請求項２２】
請求項１８から２１のいずれかに記載のタンパク質もしくはポリペプチドをコードする遺伝子。
【請求項２３】
下記の（Ｐ）または（Ｑ）のポリヌクレオチド。
（Ｐ）　配列番号６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（Ｑ）　配列番号６において、１以上の塩基が置換、付加若しくは欠失した塩基配列からなり、請求項１８から２１のいずれかに記載のタンパク質もしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項１８から２１のいずれかに記載のタンパク質もしくはポリペプチドを認識可能な抗体。
【請求項２５】
モノクローナル抗体である請求項２４記載の抗体。
【請求項２６】
候補化合物と、請求項１８から２１に記載のタンパク質もしくはポリペプチドとを接触させ、その相互作用を判定する工程を含むＢ細胞関連疾患治療薬若しくは免疫抑制剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リンパ球の発生・分化に関係する新規タンパク質および新規遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
リンパ球は、生体の免疫系の主役を担う重要な細胞である。リンパ球は、骨髄中の幹細胞から分化してくるが、骨髄中において、Ｔ細胞およびＢ細胞への方向が決まっている。Ｔ細胞前駆細胞は、胸腺に移動し、成熟した後、末梢に分布してＴ細胞として機能する。また、Ｂ細胞前駆細胞は、骨髄中で発達し、末梢に分布してＢ細胞として機能する。ここで、Ｂ細胞の先天的な異常により発症する疾患の一つに、血清中の免疫グロブリンが異常に低い無γグロブリン血症がある。この疾患の多くは先天的であり、Ｂ細胞発生障害等の免疫系異常による抗体産生の欠陥に起因するとされるが、その発症の分子的なメカニズムはよく分かっていない（非特許文献１参照）。このため、本疾患の治療は、免疫グロブリン製剤の定期的補充注射という対処療法的な治療方法しかなく、本疾患の原因を突き止めて根本的な治療方法を確立するためには、Ｂ細胞発生の分子的メカニズムの解析が必要である。
【０００３】
【非特許文献１】
「免疫症候群−その他の免疫疾患を含めて−（下巻）　常染色体性劣性型無γグロブリン血症」別冊　日本臨床　領域別症候群シリーズＮｏ．３２　　平成１２年１２月２８日発行、金兼弘和、宮脇利男　ｐ．６３−６５
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような事情に鑑みなされたもので、リンパ球細胞発生の分子的メカニズムを解明し、本疾患の根本的な治療方法の確立に寄与することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明者等は、先天性無γグロブリン血症患者のＢ細胞の染色体を調べたところ、第９番目の染色体と第２０番目の染色体に交差が起こり、第９染色体に異常が生じていることを突き止めた。そして、第９染色体の異常について、さらに詳しく調べたところ、以下に示すように、リンパ球の成熟に必要な新規なタンパク質とこれをコードする新規な遺伝子を発見し、本発明をなすに至った。本発明者等は、前記新規タンパク質を、「ＬＲＲＣ８」と名づけた。本発明により、Ｂ細胞の発生・分化の分子的なメカニズムの一部が解明されたといえる。また、本発明の新規タンパク質および新規遺伝子は、Ｂ細胞関連疾患や免疫抑制に関する医薬品開発のターゲット物質になり得るし、これらはＢ細胞関連疾患の診断等のためのマーカーにもなり得る。また、本発明の新規タンパク質を認識可能な抗体は、前記タンパク質マーカーの検出試薬として使用でき、また前記医薬品としても使用できる可能性がある。
【０００６】
すなわち、本発明の第１のタンパク質は、下記の（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質である。
（Ａ）　配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）　配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸残基が、置換、付加若しくは欠失したアミノ酸配列からなり、リンパ球の膜表面に発現するレセプターであるタンパク質。
【０００７】
前記第１のタンパク質は、主としてヒトのＢ細胞の成熟に必要なタンパク質である。第１のタンパク質は、４回膜貫通構造および９個のＬｅｕｃｉｎｅ−Ｒｉｃｈ−Ｒｅｐｅａｔｓ（ＬＲＲｓ）を有する。
【０００８】
本発明の第１のポリペプチドは、下記の（Ｃ）または（Ｄ）のポリペプチドである。
（Ｃ）　配列番号１における第５８５アミノ酸残基から第７７１アミノ酸残基のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｄ）　配列番号１における第５８５アミノ酸残基から第７７１アミノ酸残基のアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸残基が、置換、付加若しくは欠失したアミノ酸配列からなり、前記第１のタンパク質のＣ末端側の８個の連続ＬＲＲｓを形成するポリペプチド。
【０００９】
本発明の第１の遺伝子は、前記第１のタンパク質もしくは前記第１のポリペプチドをコードする遺伝子である。
【００１０】
本発明の第１のポリヌクレオチド（例えば、ｃＤＮＡ等、以下、同じ）は、下記の（Ｅ）または（Ｆ）のポリヌクレオチドである。
（Ｅ）　配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（Ｆ）　配列番号２において、１以上の塩基が置換、付加若しくは欠失した塩基配列からなり、前記第１のタンパク質もしくは前記第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００１１】
本発明の第１の抗体は、前記第１のタンパク質もしくは前記第１のポリペプチドを認識可能な抗体である。この抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。
【００１２】
本発明の第１のスクリーニング方法は、候補化合物と、前記第１のタンパク質もしくは前記第１のポリペプチドとを接触させ、その相互作用を判定する工程を含むＢ細胞関連疾患治療薬若しくは免疫抑制剤のスクリーニング方法である。
【００１３】
本発明の第２のタンパク質は、下記の（Ｇ）または（Ｈ）のタンパク質である。
（Ｇ）　配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｈ）　配列番号３において、一つ以上のアミノ酸残基が、置換、付加若しくは欠失しているアミノ酸配列からなり、無γグロブリン血症患者のＢ細胞膜表面に発現する膜タンパク質。
【００１４】
前記第２のタンパク質は、４回膜貫通構造および７個のＬｅｕｃｉｎｅ−Ｒｉｃｈ−Ｒｅｐｅａｔｓ（ＬＲＲｓ）を有する。
【００１５】
本発明の第２の遺伝子は、前記第２のタンパク質をコードする遺伝子である。
【００１６】
本発明の第２のポリヌクレオチドは、下記の（Ｉ）または（Ｊ）のポリヌクレオチドである。
（Ｉ）　配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（Ｊ）　配列番号４において、１以上の塩基が置換、付加若しくは欠失した塩基配列からなり、前記第２のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００１７】
本発明のタンパク質マーカーは、前記第２のタンパク質を含むマーカーである。このマーカーは、例えば、無γグロブリン血症の診断に使用できる。
【００１８】
本発明の第１の抗体は、前記第２のタンパク質を認識可能な抗体である。この抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。
【００１９】
本発明の遺伝子マーカーは、前記本発明の第２の遺伝子若しくは前記第２のポリヌクレオチドを含むマーカーである。このマーカーは、例えば、無γグロブリン血症の遺伝子診断に使用できる。
【００２０】
本発明の第３のタンパク質は、下記の（Ｋ）または（Ｌ）のタンパク質である。
（Ｋ）　配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｌ）　配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸残基が、置換、付加若しくは欠失したアミノ酸配列からなり、リンパ球の膜表面に発現するレセプターであるタンパク質。
【００２１】
前記第３のタンパク質は、マウスのＢ細胞の成熟に必用であり、４回膜貫通構造および９個のＬｅｕｃｉｎｅ−Ｒｉｃｈ−Ｒｅｐｅａｔｓ（ＬＲＲｓ）を有する。
【００２２】
本発明の第３のポリペプチドは、下記の（Ｍ）または（Ｎ）のポリペプチドである。
（Ｍ）　配列番号５における第５８５アミノ酸残基から第７７１アミノ酸残基のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｎ）　配列番号５における第５８５アミノ酸残基から第７７１アミノ酸残基のアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸残基が、置換、付加若しくは欠失したアミノ酸配列からなり、前記第３のタンパク質のＣ末端側の８個の連続ＬＲＲｓを形成するポリペプチド。
【００２３】
本発明の第３の遺伝子は、前記第３のタンパク質若しくは前記第３のポリペプチドをコードする遺伝子である。
【００２４】
本発明の第３のポリヌクレオチドは、下記の（Ｐ）または（Ｑ）のポリヌクレオチドである。
（Ｐ）　配列番号６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（Ｑ）　配列番号６において、１以上の塩基が置換、付加若しくは欠失した塩基配列からなり、前記第３のタンパク質もしくは前記第３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００２５】
本発明の第３の抗体は、前記第３のタンパク質もしくは前記第３のポリペプチドを認識可能な抗体である。この抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。
【００２６】
本発明の第２のスクリーニング方法は、候補化合物と、前記第３のタンパク質もしくは前記第３のポリペプチドとを接触させ、その相互作用を判定する工程を含むＢ細胞関連疾患治療薬若しくは免疫抑制剤のスクリーニング方法である。
【００２７】
【発明の実施の形態】
つぎに、本発明の新規タンパク質（ＬＲＲＣ８）およびそれをコードする新規遺伝子について、これらを発見するまでの具体的な解析データをあげて説明する。なお、前記データを得るための手法は、以下の通りである。
【００２８】
（先天性無γグロブリン血症患者）
免疫不全の家族歴のない先天性無ガンマグロブリン血症の女児から白血球を採取し、解析した。患児の末梢血はＢリンパ球を欠損していた。染色体核型はＧバンド分染法で、４６，ＸＸ，ｔ（９；２２）（ｑ３３．２；ｑ１２）であり、両親は正常核型であった。なお、本解析は、本人およびその両親にインフォームド・コンセントを得て行った。
【００２９】
（変異体の分離方法）
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）解析のために、サンガーセンターのコンティグ地図とＮＣＢＩの遺伝子マップ’９９の物理地図とに基づき、染色体２０の長腕に位置するＢＡＣおよびＰＡＣクローンを選択し、それらをＢＡＣＰＡＣＲｅｓｏｕｒｃｅｓ社から購入した。ゲノミックサザン法におけるプローブＥＴ１０３３は、プライマーＥＴ１０３３ｓ（配列番号７）とＥＴ１０３３ａ（配列番号８）とを使用したＰＣＲにより増幅した。インバースＰＣＲでは、ジェノミックＤＮＡを、ＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩとを用いて制限酵素処理し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてセルフライゲーションさせた。次に、染色体２０の逆向きのプライマーの組み合わせを用いてＰＣＲ増幅を行い、誘導体２０の変異を検出した。サイクルシーケンス法では、鋳型を、Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｉｘを用いて標識し、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製、商品名ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３１０ジェネティックアナライザーにより、塩基配列を読み取った。トータルｍＲＮＡは、Ｗａｋｏ社製、商品名ＩＳＯＧＥＮを使用して、前記患者および正常提供者の末梢単核球から分離した。ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーは、野生型に対してはエキソン１に位置するＮＧ１０４４（配列番号９）とエキソン２に位置するＰＨ２２１（配列番号１０）とを用いて、変異型に対してはエキソン１に位置するＮＧ４５９（配列番号１１）と染色体２０に位置するＴＷＩＮ２（配列番号１２）とを用いて、それぞれ行った。
【００３０】
（無γグロブリン血症原因タンパク質（ＬＲＲＣ８）の検出方法）
ヒトＬＲＲＣ８の３４２−５８９アミノ酸に対するラビットポリクローナル抗体を常法で作製し、これをウェスタンブロットまたはフローサイトメトリー解析における一次抗体として使用した。前記ポリクローナル抗体は、マウスのオーソログにも反応した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ロバ抗ラビット二次抗体と、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、商品名ＥＣＬウェスタンブロッティング検出試薬とを使用して、ウェスタンブロット解析を行った。フローサイトメトリー解析では、細胞を、ヤギ血清とプレ−インキュベーションした。抗ＢＨＲポリクローナル抗体で処理した前記細胞を、フィコエリトリン結合ヤギ抗ラビットグロブリン抗体（シグマ社製）で処理し、ついで、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社製商品名ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで分析した。細胞は、フィコエリスリンまたはアロフィコシアニンが結合した系統特異的モノクローナル抗体（ＢＤ　ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）により、分類した。すなわち、ヒトおよびマウスのＢ系統細胞に対しては、それぞれ、抗ＣＤ１９および抗Ｂ２２０抗体、Ｔ細胞に対しては抗ＣＤ３抗体、顆粒球に対しては抗Ｇｒ−１抗体、単核球に対しては抗Ｍａｃ−１抗体を使用した。
【００３１】
（レトロウイルスベクターＭＩＹおよびＭｕｔＹの調製方法）
変異型ｃＤＮＡを、プライマーＮＦ９（配列番号１３）とＡＩＮ２（配列番号１４）との組み合わせを用いたＰＣＲにより増幅した。リン酸カルシウム共沈法を利用して、ＥｃｏｔｒｏｐｉｃＰｈｏｅｎｉｘパッケージング細胞に、ＭｕｔＹをトランスフェクトした。翌日、培地を、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ培地（Ｄ−ＭＥＭ）に、交換した。そして、２４時間ごとに３日間、ウイルスを含む上清を、０．２０μｍシリンジフィルターを使用して清浄化し、−８０℃で保存した。
【００３２】
（遺伝子導入および骨髄移植方法）
８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、３ｍｇの５−ＦＵを、静脈注射した。３日後、マウス大腿骨および脛骨の骨髄細胞を、２０％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌステムセルファクター、１００ｎｇ／ｍｌトロンボポイエチンおよび１００ｎｇ／ｍｌＦｌｔ３−Ｌ（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）を含む３ｍｌのＤ−ＭＥＭと共に、３５ｍｍレトロネクチン（登録商標）ディッシュ（Ｔａｋａｒａ社製）中で、２４時間、前刺激として培養した。培地を、翌日から、同濃度のＦＢＳとサイトカインを含むウイルス上清に、３日間に渡り毎日交換し、その後、ディッシュ内の細胞を回収した。そして、８ＧｙのＸ線を照射した８週齢の同系マウスに尾静脈より、前記細胞を注入した。造血の再構築をフローメトリーで解析するため、移植３か月後に、末梢血は、眼窩静脈洞より採取し、骨髄細胞は大腿骨および脛骨から採取した。
【００３３】
（無γグロビン血症原因遺伝子の解析結果）
前記無γグロビン血症患者の白血球を用い、前記手法により、その原因遺伝子を調べた。すなわち、まず、図１ａに示すように、スペクトラル核型分析およびＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）分析によって、第９染色体と第２０染色体の長腕部との間の転座が確認された。同図において、ｄｅｒ（９）およびｄｅｒ（２０）で表している染色体が、転座している第９染色体および第２０染色体であり、ｃｈｒ＿９およびｃｈｒ＿２０が、通常の第９染色体および第２０染色体であり、この符号は、その他の図でも同じである。図１ｂに示すように、ＦＩＳＨ分析によると、転座した第２０染色体においてｄＪ８９０Ｏ１５に転座点があった。同図において、赤四角で表した部分は、プローブとｃｈｒ＿２０およびｄｅｒ（２０）とがハイブリダイズした部分であり、黄色四角で表した部分は、プローブとｃｈｒ＿２０およびｄｅｒ（９）とがハイブリダイズした部分であり、灰色四角で表した部分は、ハイブリダイズしなかった部分である。つぎに、ｄＪ８９０Ｏ１５から得たＥＴ１０３３プローブによるサザンブロット分析により、図１ｃに示すように、転座点は、ｄＪ８９０Ｏ１５のセントロメア側から第３７３４５塩基対および第３８０００塩基対の間に存在する。同図において、矢印で示す部分が変異部分である。つぎに、前記患者のＤＮＡをインバースＰＣＲで解析した結果、図１ｄに示すように、転座している第２０染色体（ｄｅｒ（２０））から変異バンドを検出した。そのシーケンスデータを用い、転座している第９染色体（ｄｅｒ（９））からの変異ＤＮＡ断片を通常のＰＣＲで増幅した。この増幅産物のシーケンス解析を行った。その結果、図１ｅに示すように、第９染色体のＢＡＣクローンＲＰ１１−９８Ｈ２３（アンチセンスシーケンスはＧｅｎＢａｎｋに登録されている）の第１２２２１４塩基対と第１２２２１５塩基対の間が転座点であり、また第２０染色体においてＰＡＣクローンｄＪ８９０Ｏ１５の第３７６３２塩基対と第３７６３３塩基対の間も転座点であり、この転座においてＴが挿入されている。なお、同図において、ｃｅｎはセントロメア方向を示し、ｔｅｌはテロメア方向を示す。
【００３４】
（ＬＲＲＣ８遺伝子の構造解析）
前記位置で転座している既知の遺伝子は未だ報告されていない。ＦＬＪ１０３３７とＦＪＬ２０９９６という名前の全長ｍＲＮＡおよび数個のスプライシングされたｍＲＮＡが報告されている（ｇｏｌｄｅｎＰａｔｈ参照　　ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ　”ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ”　ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ）。これらは、第９染色体の転座点を含み、ＧＥＮＳＣＡＮおよびＨＭＭＧＥＮＥによって新規タンパク質が予測されている（ＨＧＲＥＰ参照　　ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ　”ｈｔｔｐ：／／ｈｇｒｅｐ．ｉｍｓ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ”　ｈｔｔｐ：／／ｈｇｒｅｐ．ｉｍｓ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ）。第２０染色体において、転座点の周り２０ｋｂｐの範囲にｍＲＮＡは無い。野性型と変異型のシーケンスを得るために、前記患者の全ｍＲＮＡに対し、３´ＲＡＣＥ（３´ｒａｐｉｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ）を行った。その結果得られた、ヒトの新規Ｂ細胞膜表面タンパク質遺伝子の構造を、野性型（本発明の第１の遺伝子）と変異型（本発明の第２の遺伝子）に分けて、図２ａに示す。図示のように、野性型の前記遺伝子は、エキソン１とエキソン２を有し、その間にはイントロンがある。同図において、黒四角で表す部分は、タンパク質コード領域であり、白四角で表す部分は、非コード領域であり、斜線で表す部分は新規翻訳領域であり、黒丸で示すのはストップコドンである。野性型の前記遺伝子から生じるｍＲＮＡ（本発明の第１のポリヌクレオチド）は、図示のように、エキソン１と２が連結した構造を有する。これに対し、変異型遺伝子は、エキソン１だけでエキソン２を欠き、その代わりに転座によって第２０染色体一部が連結した構造になっている。そのｍＲＮＡは、エキソン１と、イントロン部分の一部と、前記第２０染色体の一部とが連結した構造である。なお、図２ｂに示すように、前記のＲＴ−ＰＣＲによって、前記患者の細胞において、この変異遺伝子が転写されることが確認された。この野生型の新規遺伝子のコード領域の全長は、２４３０塩基対と予想され、そのタンパク質は８１０アミノ酸残基（９４．２ｋＤａ）からなる。このタンパク質に対するポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット解析の結果を図２ｃに示す。同図において、ＢＭは骨髄細胞を示し、その他の図でも同様である。前述のように、前記野性型の新規遺伝子は、２つのエキソン１，２を持ち、エキソン１は７１９アミノ酸残基をコードし、エキソン２は９１アミノ酸残基をコードする。また、図２ｄに示すように、このタンパク質は、末梢血細胞（ＰＢ）よりも、骨髄細胞（ＢＭ）において高いレベルで発現し、マウスの場合は、それが顕著であった。つぎに、図２ｅに示すように、前記患者の末梢血細胞では、野性型および変異型のタンパク質の双方が発現していた。なお、同図において、ＣＢＢは色素（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ）を示す。転座している第９染色体の転座点では、１４７６番目の塩基対においてＣからＴへの変異が起こっており、これはアミノ酸残基の変異をもたらすものではない。これ以外に、顕著な変異はない。しかし、前記患者は、末梢血Ｂ細胞を完全に欠いているので��変異遺伝子から発現するタンパク質は、Ｂ細胞の発生に悪影響を及ぼすと推測できる。
【００３５】
（新規タンパク質（ＬＲＲＣ８）の構造）
図３ａに、野性型の新規タンパク質のアミノ酸配列を、ヒトとマウスを並べて示す。同図において、黒四角の中に白色で示す部分は、ヒトとマウスで異なるアミノ酸残基を示し、四角で囲った領域は、膜貫通領域若しくはＬＲＲを示し、ＬｘｘＬｘＬｘｘＮｘＬｘｘＬＰｘｘＬｘｘは、それぞれＬＲＲを示し、ｘはいずれかのアミノ酸を示す。図示のように、ヒトとマウスの間で遺伝子の保存は高く、ヌクレオチドの塩基配列で９３％の相同性を示し、アミノ酸配列で９９％の相同性を示す。図３ｃに、変異型の新規タンパク質のアミノ酸配列を示す。図示のように、変異型の新規タンパク質は、７５４アミノ酸残基からなり、７１９番目のアミノ酸残基までは、タンパク質の配列であるが、７２０から７５４までのアミノ酸配列は、イントロン部分が翻訳されたものである。つぎに、これらの新規タンパク質の一次構造から高次構造を予測した結果を、図３ｂに示す。この予測は、ＴＭＨＭＭおよびＰｆａｍによって行った。図示のように、野性型の新規タンパク質は、Ｎ末端側に４回膜貫通構造を有し、Ｃ末端側に９個のＬＲＲを有し、１番目のＬＲＲは離れて存在するが、２番目から９番目のＬＲＲは連続して存在する。これに対し、変異型の新規タンパク質は、Ｎ末端側に４回膜貫通構造を有する点は同じであるが、Ｃ末端側には７個のＬＲＲしかない点で、野性型と異なっている。なお、前記両新規タンパク質において、Ｎ末端およびＣ末端は共に、細胞外に位置する。
【００３６】
（マウスでの変異遺伝子の発現）
図４ａに示すように、前記のようにして調製したＭＩＹとＭｕｔＹの２つのベクターを用いた。ＭＩＹは、マウスの幹細胞ウイルス（ｍｏｕｓｅ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｖｉｒｕｓ：ＭＳＣＶ）に、リボソーム分子内結合サイト（ＩＲＥＳ）と黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）を連結したものであり（ＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＹＦＰ）、コントロールとして使用した。ＭｕｔＹは、ＭＩＹのＭＳＣＶとＩＲＥＳとの間に、変異ｃＤＮＡ（配列番号４）を挿入したものである（ＭＳＣＶ−Ｍｕｔａｎｔ−ＩＲＥＳ−ＹＦＰ）。同図において、ＬＴＲは、ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔを示す。これらのＭＩＹおよびＭｕｔＹをＥ８６細胞株に遺伝子導入し、ウェスタンブロット法で調べたところ、図４ｂに示すように、変異型のタンパク質の発現が確認された。Ｂ細胞の発生と分化を調べるために、ＭＩＹ若しくはＭｕｔＹを感染させた骨髄細胞をマウスに移植した。その３ヶ月後、末梢血細胞をフローサイトメーターで分析し、各細胞種のＹＦＰ陽性を算出した。この結果を、図４ｃに示す。同図において、細線はＹＦＰ−ｎｅｇａｔｉｖｅコントロールを示し、Ｇｒは顆粒球を示し、Ｍｏは単球を示し、百分率（％）は、全細胞におけるＹＦＰ陽性の割合を示す。図示のように、変異ｃＤＮＡを導入したマウスでは、Ｂ細胞およびＣ細胞の割合が顆粒球および単球に比べて著しく低かった。各マウスにおいて、造血細胞への遺伝子導入効率が異なり、また、骨髄細胞におけるＹＦＰ陽性細胞の比率が遺伝子導入効率に影響を受けているか可能性があるため、細胞毎に、ＹＦＰ陽性細胞の比率を統計学的（ｓｔｕｄｅｎｔ´ｓ　ｔｅｓｔ：ＭＩＹ，ｎ＝３、ＭｕｔＹ，ｎ＝４）に示した（図４ｄ参照）。図示のように、Ｂ細胞およびＴ細胞において、変異ｃＤＮＡを導入したＹＦＰ陽性細胞は、著しく低かった。一方、前記患者の末梢血を調べたところ、Ｔ細胞に異常は見られなかった。
【００３７】
つぎに、変異タンパク質のＢ細胞分化への影響を調べるために、遺伝子導入したマウスの骨髄細胞のＢ細胞前駆細胞をフローサイトメトリーで分析した。この分析では、ＣＤ４３（ロイコシアリン）およびＢ２２０（ＣＤ４５）を指標にした。この分析の結果、図４ｅに示すように、Ｐｒｏ−Ｂ細胞のステージ（Ｂ２２０＋、ＣＤ４３＋）の段階で分化が止められ、次の段階であるＰｒｅ−Ｂ細胞（Ｂ２２０＋、ＣＤ４３−）が著減していた。このように、本タンパク質は、Ｂ前駆細胞の段階で機能していると考えられるが、Ｂ細胞の発生・分化系列において、本タンパク質の発現が、末梢血に出たあとでは激減している（図４ｆ参照）ことからも伺える。
【００３８】
（まとめ）
以上のように、本発明の第１のタンパク質（ヒトＬＲＲＣ８）および第３のタンパク質（マウスＬＲＲＣ８）は、それぞれ、ヒトとマウスのＢ細胞の発生をサポートするタンパク質であることが確認された。また、本発明の第２のタンパク質（ヒトＬＲＲＣ８の変異型）は、Ｂ細胞を消失させることが確認され、前記第１のタンパク質に対しドミナントネガティブに働いていた。なお、ヒトとマウスでは、Ｔ細胞の発生において、前記データにおいて違いがみられた。
【００３９】
（配列番号１から６の説明）
配列番号１：ヒトＬＲＲＣ８のアミノ酸配列の一例
配列番号２：ヒトＬＲＲＣ８をコードするポリヌクレオチドの塩基配列の一例
配列番号３：変異型ヒトＬＲＲＣ８のアミノ酸配列の一例
配列番号４：変異型ヒトＬＲＲＣ８をコードするポリヌクレオチドの塩基配列の一例
配列番号５：マウスＬＲＲＣ８のアミノ酸配列の一例
配列番号６：マウスＬＲＲＣ８をコードするポリヌクレオチドの塩基配列の一例
【００４０】
【発明の効果】
以上のように、本発明の新規タンパク質（ＬＲＲＣ８）および新規遺伝子は、リンパ球の発生分化に関与する。したがって、これらは、Ｂ細胞関連疾患若しくは免疫抑制に関する医薬品開発のターゲット物質になり、また先天性無γグロブリン血症のマーカーとしても使用可能である。
【００４１】
【配列表】
2004141048.tif 000003
2004141048.tif 000004
2004141048.tif 000005
2004141048.tif 000006
2004141048.tif 000007
2004141048.tif 000008
2004141048.tif 000009
2004141048.tif 000010
2004141048.tif 000011
2004141048.tif 000012
2004141048.tif 000013
2004141048.tif 000014
2004141048.tif 000015
2004141048.tif 000016
2004141048.tif 000017
2004141048.tif 000018
2004141048.tif 000019
2004141048.tif 000020
2004141048.tif 000021
2004141048.tif 000022
2004141048.tif 000023
2004141048.tif 000024
2004141048.tif 000025
2004141048.tif 000026
2004141048.tif 000027
2004141048.tif 000028
2004141048.tif 000029
2004141048.tif 000030
2004141048.tif 000031
2004141048.tif 000032
2004141048.tif 000033
2004141048.tif 000034
2004141048.tif 000035
2004141048.tif 000036
【図面の簡単な説明】
【図１】図１ａからｅは、本発明の遺伝子の染色体における位置を説明するための図である。
【図２】図２ａからｅは、本発明の遺伝子の構造を説明するための図である。
【図３】図３ａからｃは、本発明のタンパク質の構造を説明するための図である。
【図４】図４ａからｆは、本発明のタンパク質および遺伝子がリンパ球の発生分化に及ぼす影響を説明するための図である。
【図１】
2004141048.tif 000037
【図２】
2004141048.tif 000038
【図３】
2004141048.tif 000039
【図４】
2004141048.tif 000040