(57)【要約】【課題】Ｌｙｓ９がメチル化されたヒストンＨ３を特異的に認識するモノクローナル抗体又はその断片を提供する。【解決手段】ヒストンＨ３のメチル化された９番目のＬｙｓを含む、４番目のＬｙｓから１４番目のＬｙｓからなる１１残基のアミノ酸を、システインを介してＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）に結合させ、これを抗原としてマウスに注射し、該マウスから得られる脾臓細胞を用いてハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を調製する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチル化されたヒストンＨ３に選択的に結合し、メチル化されたヒストンＨ３と非メチル化ヒストンＨ３を識別するモノクローナル抗体又はその断片。
【請求項２】
前記メチル化されたヒストンＨ３のメチル化部位がヒストンＨ３の９番目のリジンである請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
【請求項３】
ヒストンＨ３のメチル化された９番目のリジンと結合する請求項２に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
【請求項４】
受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１０６として独立行政法人産業技術総合研究所生物寄託センターに寄託されているハイブリドーマより得られる請求項１ないし３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
【請求項５】
ＥＬＩＳＡ法、ブロット法において、前記メチル化ヒストンＨ３に選択的に結合する請求項１ないし４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
【請求項６】
免疫蛍光法又は免疫組織化学法において、前記メチル化ヒストンＨ３に選択的に結合する請求項１ないし４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
【請求項７】
免疫沈降法において、前記メチル化ヒストンＨ３に選択的に結合して、前記メチル化ヒストンＨ３を免疫沈降させる、請求項１ないし４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
【請求項８】
前記免疫沈降法がクロマチン免疫沈降法である請求項７に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
【請求項９】
９番目のリジンがジメチル化されたヒストンＨ３の部分ペプチド（アミノ酸残基４−１４、配列番号１）をＫＬＨ（キーホールリンペットへモシアニン）にクロスリンクしたものを免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、当該哺乳動物と同種又は異種の動物由来の自己増殖能を有する細胞とを融合し、当該融合細胞をクローン化することにより得られる、請求項１ないし８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１０】
前記ハイブリドーマが受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１０６として独立行政法人産業技術総合研究所生物寄託センターに寄託されているものである、請求項９に記載のハイブリドーマ。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載のハイブリドーマを培養し、培養上清から請求項１ないし８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を調製することを特徴とする抗体の製造方法。
【請求項１２】
請求項１ないし８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその断片、及び該モノクローナル抗体又はその断片を検出する試薬を含んでなるキット。
【請求項１３】
請求項１ないし８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその断片、及び該モノクローナル抗体又はその断片が結合したヒストンＨ３を沈降させるのに必要な担体を含んでなるキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術の分野】
本発明は、９番目のリジンがメチル化されたヒストンＨ３に特異的に結合し、９番目のリジンがメチル化されていないヒストンＨ３には結合しないモノクローナル抗体、及びその用途に関する。
【０００２】
【従来技術】
真核生物の染色体ＤＮＡは、ヌクレオソーム構造をとることにより、高度に折りたたまれて核内に存在する。このような構造をとる染色体ＤＮＡ上にコードされた遺伝子の発現を促進又は抑制するためには、クロマチンの構造を局所的に弛緩させ、又は逆に堅固な構造を保持することが必要である。従って、クロマチン構造の局所的な変化及びその制御は、遺伝子の発現調節に対して多大なる影響を与えるものであり、遺伝子の機能発現にも深く関与する現象である。
【０００３】
クロマチン構造の変化を誘導する因子としては、Ｓｗｉ／Ｓｎｆ、Ｉｓｗｉなどのクロマチンリモデリング因子のようにＡＴＰを用いてヌクレオソームの構造そのものを直接変動させるものと、ヒストンアセチル化酵素（ＨＡＴ）などのようにヒストンの転写後修飾を行うことで、ヌクレオソームの構造に変動を与えるものが存在する。ヒストンの転写後修飾としては、アセチル化のほか、メチル化、リン酸化、ユビキチン化などが知られている。中でもヒストンのメチル化については近年急速に研究が進み、ＤＮＡのメチル化と共にエピジェネティックな遺伝子発現の制御において重要な役割を担うことが明らかとなりつつある（例えば、Ｚｈａｎｇ等，  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．，  １５：２３４３−２３６０，  ２００１．などを参照のこと）。ここで、「エピジェネティクス」とは、個体発生の過程において、塩基配列に変化を与えることなく遺伝子発現を変化させ、さらにこの変化を安定に維持することであると解されているが、エピジェネティックな現象には、ゲノムインプリンティングやＸ染色体不活性化などがその例として挙げられ、ＤＮＡのメチル化及びヒストンのメチル化の関与が示唆されている。
【０００４】
ゲノムインプリンティング（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ）は、ヒトを含めた哺乳類においてみられる現象であり、配偶子の形成過程において、精子又は卵子由来であることの「しるし」あるいは「記憶」を染色体への修飾という形で遺伝子に刷り込むことである。この「しるし」あるいは「記憶」は、受精又は体細胞分裂の過程を経た後にも維持されており、その情報に従って遺伝子発現が行われる。
ゲノムインプリンティングは、哺乳類において単為発生が致死となることの要因であると考えられている。哺乳類の精子及び卵子にはそれぞれ、雄性前核、雌性前核が存在しており、これら二つの前核が揃って始めて正常な個体発生が可能となるが、いずれか片方のみの場合には、胚発生の途中で致死となる。従って、哺乳類においては、ゲノムインプリンティングが正常に機能しないことにより、発生過程における奇形が生じる可能性がある（佐々木裕之：「現代以外の基礎第５巻、生殖と発生」（岩波書店）第９章）。
【０００５】
Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ症候群やＡｎｇｅｌｍａｎ症候群、Ｂｅｃｋｗｉｔｈ−Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ症候群などは、ゲノムインプリンティングの異常により発生する先天性疾患として知られている。Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ症候群は、肥満、低い身長、生後間もなくの筋肉力低下などの特徴を示す疾患で、その一因として父親由来の１５番染色体の特定の領域が欠失していること、父親由来の１５番染色体の代わりに母親由来の１５番染色体を二本とも受継いでいることなどが明らかとなっている。一方、Ａｎｇｅｌｍａｎ症候群は、失調歩行、発作的笑いなどの症状を特徴とする疾患で、母親由来の１５番染色体の一部の欠損がその一因ではないかと考えられている。また、Ｂｅｃｋｗｉｔｈ−Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ症候群は、膝ヘルニア、巨舌、巨大症、内臓肥大、悪性腫瘍の合併などの症状を特徴とする疾患で、１１番染色体におけるインプリンティングの関与が疑われている。さらに、Ｗｉｌｍｓ腫瘍などの癌においてもインプリンティングが関与している可能性が考えられている（Ｗａｌｔｅｒ等，  ２００３）。
このように、先天性疾患、ある種の腫瘍の発症においては、ゲノムインプリンティングが重要な役割を果たしていると考えられており、インプリンティングにおけるヒストンのメチル化及びＤＮＡのメチル化の機構を明らかにすることは、上記疾患等の更なる原因の解明及び予防、治療にも貢献し得ることが期待できる。
【０００６】
ヒストンＨ３のメチル化に関しては、４、９、２７、３６、７９番目のリジン、２、１７、２６番目のアルギニンがメチル化を受けることが知られている（Ｚｈａｎｇ等，  ２００１）。最近の研究においては、ヒストンＨ３のリジンのメチル化の役割がクロマチン構造変換との関係で明らかになりつつある。
哺乳動物細胞に存在するヒストンメチル化酵素ＳＵＶ３９Ｈ１は、転写が不活性化されているヘテロクロマチン領域に局在しており、ヘテロクロマチンタンパク質であるＨＰ１と相互作用をすることが報告されている（Ａａｇａａｒｄ等，  １９９９）。また、ＳＵＶ３９Ｈ１タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてヒストンＨ３の９番目のリジン（以下、Ｈ３−Ｌｙｓ９と称する）に特異的にメチル基を導入する酵素（ＨＭＴａｓｅ；  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）としての活性をもつことが明らかにされた。さらに、ＳＵＶ３９Ｈ１のホモログとして分裂酵母のＣｌｒ４、ショウジョウバエのＳＵ（ＶＡＲ）３−９などの存在も明らかとなっている。また、９番目のリジンと２７番目のリジンにメチル基を転移させるＧ９ａがヒトから同定され、そのショウジョウバエのホモログとしてＥ（Ｚ）の存在も報告されている。多くのＨＭＴａｓｅはＳＥＴ配列と呼ばれる保存された領域を保持しており（Ｔｓｃｈｉｅｒｓｃｈ等，  １９９４）、この領域近傍はメチル基を導入する酵素活性に重要な領域であると考えられている（Ｒｅａ等，  ２０００）。
【０００７】
Ｌｙｓ９がメチル化されたヒストンＨ３（以下、Ｈ３−ｍＫ９と称する）はへテロクロマチン領域に多く存在し（Ｎａｋａｙａｍａ等，  ２００１）、Ｈ３−Ｌｙｓ９のメチル化修飾をＨＰ１が認識して結合することで、ヘテロクロマチンに特徴的な高次のクロマチン構造を形成していると考えられている（Ｌａｃｈｎｅｒ等，  ２００１；Ｂａｎｎｉｓｔｅｒ等，  ２００１）。また、染色体凝集や一過的な遺伝子の活性化に関与していることが知られているヒストンＨ３のＳｅｒ１０のリン酸化は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＳＵＶ３９Ｈ１によるメチル基転移活性を阻害し、逆にＬｙｓ９にメチル基が転移されると１０番目のＳｅｒのリン酸化が阻害されることから、隣接するＬｙｓ９及びＳｅｒ１０の修飾はお互いに拮抗的に作用することにより近傍のクロマチンの構造に影響を与え、さらには、該クロマチン領域に存在する遺伝子の発現制御を行っていることが推測される。
また、Ｈ３−Ｌｙｓ９のメチル化活性が抑制癌遺伝子産物であるＲｂの免疫沈降によって消失することから、Ｒｂと特定のメチル化酵素（例えば、ＳＵＶ３９Ｈ１など）が相互作用している可能性が示唆された。さらに、Ｒｂによって転写抑制されているサイクリンＥのプロモーター上でＨ３−Ｌｙｓ９のメチル化と共にＨＰ１タンパク質が該プロモーター近傍にリクルートされることからも、Ｈ３−Ｌｙｓ９のメチル化が、ダイナミックに制御されて遺伝子発現の制御、特に抑制的な制御に関与していることが示唆されている（Ｎｉｅｌｓｅｎ等，  ２００１）。
【０００８】
ヘテロクロマチンに分布するＨ３−ｍＫ９に対して、Ｈ３−ｍＫ４はユークロマチン上に分布しており、遺伝子の転写活性化に関与していることが予想されている。
ヒストンＨ３のＮ末端側のテイルには、転写コリプレッサーであるＨＤＡＣ（ヒストン脱アセチル化酵素）複合体が結合し、転写を抑制的に制御することが報告されているが、Ｌｙｓ４がメチル化されたヒストンＨ３のテイルに対しては、その結合が大きく阻害され、転写の活性化状態を維持していることが示唆されている（Ｎｉｓｈｉｏｋａ等，  ２００２）。また、Ｈ３−Ｌｙｓ４のメチル化は、ＳＵＶ３９Ｈ１によるｉｎ  ｖｉｔｒｏのＨ３−Ｌｙｓ９のメチル化反応を抑制する（Ｗａｎｇ等，  ２００１；Ｎｉｓｈｉｏｋａ等，  ２００２）ことから、Ｈ３−Ｌｙｓ４とＨ３−ｌｙｓ９のメチル化が拮抗的に作用して、クロマチンの構造を制御することで遺伝子発現の制御を行っているものと考えられる。また、ＳＵＶ３９Ｈ１によるメチル化とは異なりＧ９ａによるＨ３−Ｌｙｓ９のメチル化は、Ｈ３−Ｌｙｓ４のメチル化によってその反応が阻害されない（Ｎｉｓｈｉｏｋａ等，  ２００２）。従って、Ｇ９ａが転写の活性化領域に局在していることを考え合わせると、Ｇ９ａによるＬｙｓ９のメチル化は、ユークロマチン領域の一過的な転写の制御に関わっている可能性が考えられる。
【０００９】
また、Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ症候群及びＡｎｇｅｌｍａｎ症候群の発症に関与すると思われていた第１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３の領域におけるヒストンＨ３のメチル化の状態が、最近、詳細に報告されている（Ｚｈｅｎｈａｎ等，  ２００１）。この領域の父方由来のコピーではＨ３−Ｌｙｓ４がメチル化されており、母方由来のコピーではＨ３−Ｌｙｓ９がメチル化されていることが示され、Ｌｙｓ９及びＬｙｓ４のメチル化態様が上記先天性疾患の発症に重要であることが示唆された。
さらに、雌性の哺乳類細胞にはＸ染色体が２本存在しており、そのうちの１本は不活性化されているが、この不活性化にＨ３−ｌｙｓ９のメチル化が関与していることが知られている。Ｘ染色体の不活性化は、タンパク質をコードしないＸｉｓｔ  ＲＮＡがＸ染色体上に局在することで引き起こされると考えられているが、Ｘｉｓｔ  ＲＮＡの局在化の直後にＨ３−Ｌｙｓ９がメチル化されることが明らかとなった（Ｈｅａｒｄ等，  ２００１）。
【００１０】
以上のようにヒストンＨ３のメチル化はクロマチンの構造変換を通して、遺伝子発現の制御を行う上で、重要な役割を担っている。これまでに、Ｌｙｓ９を始めとするヒストンＨ３上のメチル化状態の解析はメチル化されたアミノ酸に対して特異的な抗体を用いて、特定の遺伝子領域におけるヒストンＨ３のメチル化の有無を確認することで、その領域の転写活性化の状態などをモニターしていた（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、従来から用いられている抗体は、メチル化されているアミノ酸残基に対する特異性に問題があり、また免疫沈降による解析を行う上で、十分な結合特異性を示すものではなかったため、更なる詳細な解析を行う上で支障をきたしていた。
【００１１】
【非特許文献１】
Ｎａｋａｙａｍａ等，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９２：１１０−１１３，  ２００１．
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者等は、上記事情に鑑み、Ｌｙｓ９がメチル化されたヒストンＨ３と特異的に結合する抗体を作製すべく鋭意研究を行った結果、ヒストンＨ３のＬｙｓ９がメチル化されているものを選択的に認識して結合し、Ｌｙｓ９がメチル化されていないヒストンＨ３とは結合しないモノクローナル抗体を得ることができた。
よって、本発明はＬｙｓ９がメチル化されたヒストンＨ３を選択的に認識して結合し、Ｌｙｓ９がメチル化されていないヒストンＨ３とは結合しないモノクローナル抗体又はその断片の提供を目的とする。
また、本発明は前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供することを目的とする。
さらに、本発明は前記モノクローナル抗体の調製方法を提供することを目的とする。
またさらに、本発明は前記モノクローナル抗体又はその断片、及び前記モノクローナル抗体又はその断片を検出する試薬、又は該モノクローナル抗体又はその断片が結合したヒストンＨ３を沈降させるのに必要な担体を含んでなるキットを提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
しかして、本発明においては、以下の（１）〜（１３）が提供される。
（１）メチル化されたヒストンＨ３に選択的に結合し、メチル化されたヒストンＨ３と非メチル化ヒストンＨ３を識別するモノクローナル抗体又はその断片。
（２）前記メチル化されたヒストンＨ３のメチル化部位がヒストンＨ３の９番目のリジンである上記（１）に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（３）ヒストンＨ３のメチル化された９番目のリジンと結合する上記（２）に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（４）受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１０６として独立行政法人産業技術総合研究所生物寄託センターに寄託されているハイブリドーマより得られる上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（５）ＥＬＩＳＡ法、ブロット法において、前記メチル化ヒストンＨ３に選択的に結合する上記（１）ないし（４）のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（６）免疫蛍光法又は免疫組織化学法において、前記メチル化ヒストンＨ３に選択的に結合する上記（１）ないし（４）のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（７）免疫沈降法において、前記メチル化ヒストンＨ３に選択的に結合して、前記メチル化ヒストンＨ３を免疫沈降させる、上記（１）ないし（４）のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（８）前記免疫沈降法がクロマチン免疫沈降法である上記（７）に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（９）９番目のリジンがジメチル化されたヒストンＨ３の部分ペプチド（アミノ酸残基４−１４、配列番号１）をＫＬＨ（キーホールリンペットへモシアニン）にクロスリンクしたものを免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、当該哺乳動物と同種又は異種の動物由来の自己増殖能を有する細胞とを融合し、当該融合細胞をクローン化することにより得られる、上記（１）ないし（８）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
（１０）前記ハイブリドーマが受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１０６として独立行政法人産業技術総合研究所生物寄託センターに寄託されているものである、上記（９）に記載のハイブリドーマ。
（１１）上記（９）又は（１０）に記載のハイブリドーマを培養し、培養上清から請求項１ないし８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を調製することを特徴とする抗体の製造方法。
（１２）上記（１）ないし（８）のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその断片、及び該モノクローナル抗体又はその断片を検出する試薬を含んでなるキット。
（１３）上記（１）ないし（８）のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその断片、及び該モノクローナル抗体又はその断片が結合したヒストンＨ３を沈降させるのに必要な担体を含んでなるキット。
【００１４】
本願明細書中の「メチル化」には、モノメチル化、ジメチル化、トリメチル化が含まれるが、好ましくは、ジメチル化である。
本願明細書中の「ヒストンＨ３」には、真核生物由来のヒストンＨ３全てが含まれるが、好ましくは、植物又は動物由来のものであり、さらに好ましくは、哺乳動物由来のものであり、最も好ましくはヒト由来のものである。
本願明細書中で言及されるヒストンＨ３のアミノ酸番号は、Ｎ末端のアラニンを１番目として、Ｃ末端側に向かって順次番号付けが行われたものである。従って、例えば、「９番目のリジン」とは、ヒストンＨ３のＮ末端のアラニンを１とした場合、９番目に相当するリジンのことである。
本願明細書中の「ＥＬＩＳＡ法」には、当業者が通常の知識を用いて実施できるあらゆる形式の手法が含まれる。限定はしないが、直接又は間接ＥＬＩＳＡ法及び捕獲ＥＬＩＳＡ法などが含まれる。ＥＬＩＡＳ法の詳細は、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ．  ７２６  ｐｐ，  １９８８．及びＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，  Ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．  １９９９．等を参照のこと。
本願明細書中の「ブロット法」には、当業者が通常の知識を用いて実施できるあらゆる形式の手法が含まれる。限定はしないが、例えば、ナイロン膜又はニトロセルロース膜等に、抗原を直接スポットするドットブロット法、又は電気泳動的に抗原を転写させるウェスタンブロット法などが含まれる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明は、メチル化されたヒストンＨ３、特に９番目のリジン（Ｌｙｓ９）においてジメチル化されたヒストンＨ３と特異的に結合するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、及び該モノクローナル抗体を検出する試薬、又は該モノクローナル抗体が結合したヒストンＨ３を沈降させるのに必要な担体を含んでなるキットである。
従って、以下に本発明のモノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの調製法について詳述する。
【００１６】
１．モノクローナル抗体の調製
（１）免疫原の調製及び免疫
本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法を用いて調製される（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びＣｕｅｌｌｏ，  １９８３）。
この方法には以下に示す４つの工程が含まれる；
（ａ）宿主動物または、宿主動物由来のリンパ球を免疫する、
（ｂ）モノクローナル抗体分泌性（又は潜在的に分泌性）のリンパ球を回収する、
（ｃ）リンパ球を不死化細胞に融合させる、
（ｄ）所望のモノクローナル抗体を分泌する細胞を選択する。
免疫原としては、Ｌｙｓ９のみがメチル化されたヒストンＨ３を用いてもよいが、このましくは、Ｌｙｓ９を含む約２０アミノ酸残基からなるペプチドであって、Ｌｙｓ９のみがメチル化されているペプチドであり、最も好ましくは、ヒストンＨ３の４番目のアミノ酸から１４番目のアミノ酸からなるペプチドであって、Ｌｙｓ９のみがメチル化されているペプチドである。ペプチドを抗原として用いる場合には、ペプチドの免疫性を上げるために該ペプチドをキャリアータンパク質に結合させたものを、実際の免疫には使用するのが好ましい。キャリアータンパク質としては、当業者が選択可能なあらゆるタンパク質を使用することができるが、例えば、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）、ＯＶＡ（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）、ＫＬＨ  （キーホールリンペットへモシアニン）などが使用可能であり、ＫＬＨが最も好ましい。
ペプチドをキャリアータンパク質に結合する方法としては、カルボジイミド法、グルタルアルデヒド法、ジアゾ縮合法、マレイミドベンゾイルオキシスクシンイミド（ＭＢＳ）法などが利用可能であるが、ＭＢＳ法が最も好ましい。この方法は、免疫原として用いるペプチドのＣ末端部分にあらかじめＣｙｓを結合させておき、ＫＬＨのアミノ基とペプチドに結合させたＣｙｓのＳＨ基とを連結させる方法である。
【００１７】
免疫原を免疫するための哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、又は他の適当な宿主動物が免疫動物として選択され得る。免疫を行う場合、免疫原の注射経路は、当業者ならば容易に選択することができ、特に限定はしないが、例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内などのいずれの経路であってもよい。免疫の回数は、数日から数週間おきに数回行うのがよい。一回の免疫に用いる免疫原の量は、一匹あたり１〜１０００μｇの免疫原を使用するのが好ましい。
或いは、免疫動物から取得したリンパ球をインヴィトロで免疫化してもよい。ヒト細胞が望ましい場合には、末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）が一般に使用される。しかしながら、他の哺乳類由来の脾臓細胞又はリンパ球がより一般的で好ましい。
【００１８】
（２）ハイブリドーマの調製
免疫後、宿主動物から得られた抗体産生細胞（脾臓細胞）を、ポリエチレングリコールなどの融合剤を用いて不死化細胞株と融合させ、抗体産生能と自己増殖能を併せ持つハイブリドーマ細胞を樹立する（Ｇｏｄｉｎｇ，  １９９６）。融合細胞として用いる不死化細胞株としては、トランスフォーメーションによって不死化されたヒト、ラットもしくはマウスのミエローマ細胞株が使用される。細胞融合を行った後、融合しなかったリンパ球及び不死化細胞株の成長又は生存を阻害するために、該阻害を可能ならしめる因子を含む適切な培地中で細胞を生育させる。通常は、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く親細胞を不死化細胞株として使用する。この場合、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンがＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻害し、ハイブリドーマの成長を許容する培地（ＨＡＴ培地）に添加される。
【００１９】
（３）抗体産生ハイブリドーマの選択
モノクローナル抗体の調製にあたり、好ましい不死化細胞株はマウスミエローマ株で、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）などより入手可能である。ヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株による、ヒトモノクローナル抗体産生に関しては、Ｋｏｚｂｏｒ等，  １９８４；Ｓｃｈｏｏｋ，  １９８７を参照されたい。
ハイブリドーマ細胞は細胞外に抗体を分泌するため、モノクローナル抗体の産生の有無を培養液を用いて確認することができる。産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などの免疫沈降法、又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などのインヴィトロでの結合アッセイにより評価することができる（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，  １９８８；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，  １９９９）。
Ｌｙｓ９がメチル化されたヒストンＨ３に対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞は、限界希釈法及びサブカルチャーにより単一クローンとして単離され得る（Ｇｏｄｉｎｇ，  １９９６）。適切な培地にはダルベッコ改変イーグル培地、ＲＰＭＩ−１６４０、場合によっては、タンパク質を含まない培地若しくは無血清培地などが含まれる（例えば、Ｕｌｔｒａ  ＤＯＭＡ  ＰＦ  又はＨＬ−１；Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ；Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）。また、ハイブリドーマ細胞は、適切な宿主動物の腹水中で増殖させてもよい。なお、ヒストンＨ３のジメチル化９番目リジンに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株（名称：Ｈ３−ｍＫ９  ５．１．１）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、平成１４年１１月１４日付で受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１０６として寄託されている。
【００２０】
（４）モノクロ−ナル抗体の調製
本発明のモノクローナル抗体は、培地又は腹水からプロテインＡアガロース（セファロース）、プロテインＧアガロース（セファロース）、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、硫安沈殿又はアフィニティークロマトグラフィー（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，  １９８８；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，  １９９９）などの当業者にとって周知の方法によって単離、精製される。
また、モノクローナル抗体は、目的のハイブリドーマが取得できれば、遺伝子組換え技術によっても作製することができる（米国特許第４１６６４５２号，  １９７９）。Ｈ３−Ｌｙｓ９を認識するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株から該モノクローナル抗体ポリペプチドをコードする遺伝子を同定するのに、例えば、マウスの重鎖及び軽鎖抗体遺伝子と特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングすることができる。スクリーニングの結果、抗体重鎖及び軽鎖遺伝子が取得された場合は、その遺伝子の配列を決定することにより目的の抗体遺伝子を同定することができる。単離されたＤＮＡ断片は、モノクローナル抗体を発現させるために、適当な発現ベクターに抗体遺伝子を導入し、該ベクターを他のＩｇタンパク質を生産しないｓｉｍｉａｎ  ＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はミエローマ細胞などのホスト細胞中へトランスフェクトする。
【００２１】
（５）モノクローナル抗体の活性断片
本発明のモノクローナル抗体は、そのまま使用することもできるが、活性フラグメントとして断片化して使用することもできる。活性フラグメントとしては、メチル化されたヒストンＨ３に対する特異的結合活性が失われていないものであればよい。これら活性フラグメントの調製は、精製されたモノクローナル抗体に対してパパイン、ペプシン、トリプシン処理などの公知の方法を適用することで行うことができる（「免疫生化学研究法（続生化学実験講座５）」、日本生化学会編、８９頁（１９８６年）を参照のこと）。
【００２２】
２．免疫沈降法
（１）免疫沈降
本発明のモノクローナル抗体は免疫沈降法にも使用可能である。免疫沈降法は当業者の通常の技術常識の範囲内で実施可能な方法である。
細胞又は組織ホモジネートから、抗原タンパク質（本発明においては、ヒストンＨ３）、及び一次抗体とアガロース結合プロテインＡ、Ｇなどとの結合体を含む複合体として沈降させる。アガロース結合体は用いる抗体の生物種の由来、アイソタイプにより選択してもよい。
まず、アガロース結合体を洗浄用バッファー（例えば、ＰＢＳ、ＲＩＰＡ緩衝液）で数回洗浄（例えば、洗浄用バッファーを添加後、１２，０００ｘｇ、２分間遠心を行い洗液を除去する。この工程を数回（３回以上）繰り返す）し、例えば、１２，０００ｘｇ、１０分間遠心し、沈殿に回収する。洗浄したアガロース結合体に適当な濃度に希釈した抗体を添加し、穏やかに振とう攪拌しながら、室温又は４℃にて、６０分〜数時間インキュベートする。アガロース結合体−抗体複合体を遠心（例えば、１２，０００ｘｇ、２分間）により回収した後、洗浄用バッファーで数回（３回以上）洗浄（上述）する。洗浄後、抗原を含むサンプル（組織又は細胞のホモジネートなど）を適量添加し、穏やかに振とう攪拌しながら４℃にて、数時間〜一晩インキュベートする。インキュベーション後、アガロース結合体−抗体複合体を遠心（例えば、１２，０００ｘｇ、２分間）により回収した後、洗浄用バッファーで数回（３回以上）洗浄（上述）する。
【００２３】
（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
アガロース結合体−抗体複合体のペレットを定法に従ってサンプル処理を行い、室温にて遠心（例えば、１２，０００ｘｇ、３０秒間）後、その上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかける。必要に応じて、引き続きウェスタンブロッティングなどを行ってもよい。
【００２４】
２．クロマチン免疫沈降法
本発明のモノクローナル抗体には、ヒストンＨ３のジメチル化されたＬｙｓ９と特異的に結合する抗体（Ｈ３−ｍＫ９  ５．１．１）が含まれる。該モノクローナル抗体及びその断片は、クロマチン構造を介した転写制御機構を解析する上で有力な手段である、クロマチン免疫沈降法においても利用可能である。クロマチン免疫沈降法は、当業者にとって通常の知識の範囲において実施可能である。具体的には、（１）ホルマリンによる細胞の固定、（２）免疫沈降、（３）固定の解除とＤＮＡの回収、（４）ＰＣＲによるＤＮＡの増幅検出、の各工程から成る。
【００２５】
（１）ホルマリンによる細胞の固定
クロマチン免疫沈降法は、当業者において実施可能な如何なる方法を用いて行ってもよいが、例えば、Ｕｐｓｔａｔｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社の  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  （ＣｈＩＰ）  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを用いて行うことができる。
具体的には、目的の細胞を１０ｃｍ  ｄｉｓｈで適切な培地中（例えば、ＤＭＥＭ，  ５％  ＦＢＳ）で、２日間培養後、無血清培地（ＤＭＥＭ，  ０％ＦＢＳ）で１日培養する。培養後、培地に１０％ホルムアルデヒド／ＰＢＳを１／１０量添加し、終濃度１％で３７℃、１０分間インキュベートして、細胞内のタンパク質とＤＮＡをクロスリンクさせる。
１０分後に培地を吸引し、プロテアーゼインヒビター（例えば、１ｍＭ  ＰＭＳＦ，  １μｇ／ｍｌ  アプロチニン）を含む氷冷ＰＢＳで洗浄する。以降の全操作は氷上で行い、ＰＢＳやｂｕｆｆｅｒは全て同濃度のプロテアーゼインヒビターを用時調製して添加したものを用いる。
【００２６】
（２）免疫沈降
ｄｉｓｈに１ｍｌ  ＰＢＳを加え、細胞をかき取り、チューブに移した後、７００×ｇ，  ４℃、３分間遠心する。上清を除去し、Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ  （１％  ＳＤＳ，  １０  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ  ８．１，  １  ｍＭ  ＰＭＳＦ，  １  μｇ／ｍｌ  アプロチニン）  １５０  μｌを添加し撹拌する後、氷上で１０分間静置する。
次に、サンプルを氷中にて、１０秒間超音波処理した後、約２０秒間の間隔をおきながら、合計４回程度超音波処理する。超音波処理中は、サンプル温度の上昇及び泡立ちを避ける。この操作により、クロスリンクされたＤＮＡ断片が断片化される。ＤＮＡ断片は、後のＰＣＲによる増幅効率を考慮して、２００−１０００ｂｐの長さが好ましい。このＤＮＡ断片長を得るために、種々の強度・回数を試し、最適な条件を決定する。
【００２７】
サンプルをＣｈＩＰ  Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  （０．０１  ％  ＳＤＳ，  １．１  ％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  １．２  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  １６．７  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ  ８．１，  １６７  ｍＭ  ＮａＣｌ，  １  ｍＭ  ＰＭＳＦ，  １μｇ／ｍｌ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）で１０倍に希釈する。これに４０μｌ  プロテインＡ又はＧ  アガロース  （１．５ｍｌ  プロテインＡ又はＧアガロースビーズ，  ６００μｇ  超音波処理サケ精子ＤＮＡ，  １．５ｍｇ  ＢＳＡ，  ４．５ｍｇ  組換体プロテイン  Ａ又はＧ  ／  １．５ｍｌ  ｂｕｆｆｅｒ；１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ  ８．０，  １  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．０５％  アジ化ナトリウム）を添加し、４℃，  ３０分間インキュベートする。
１５００  ｒｐｍ，  １５秒，４℃で遠心して上清を除き、抗体を適量（例えば、１μｇ）添加し、４℃で６時間から一晩インキュベートする。インキュベート後、５０μｌの  プロテイン  Ａ又はＧ  アガロースを加え、４℃で１時間インキュベートする。
次にプロテインＡ又はＧアガロースを、４段階の洗浄条件にて洗浄を行う。それぞれ、４℃で３分間インキュベートする；
（ａ）Ｌｏｗ  Ｓａｌｔ  ｂｕｆｆｅｒ  （０．１  ％  ＳＤＳ，  １  ％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  ２  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ  ８．１，  １５０  ｍＭ  ＮａＣｌ）、
（ｂ）Ｈｉｇｈ  Ｓａｌｔ  ｂｕｆｆｅｒ  （０．１  ％  ＳＤＳ，  １  ％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  ２  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ  ８．１，  ５００  ｍＭ  ＮａＣｌ）、
（ｃ）ＬｉＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ  （０．２５  Ｍ  ＬｉＣｌ，  １  ％  ＮＰ４０，  １  ％  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，  １  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  １０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ  ８．１）、
（ｄ）ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ  （１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  １  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ｐＨ  ８．０）×２回、
洗浄後、５０μｌ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  （１０  ｍＭ  ＤＴＴ，  １  ％  ＳＤＳ，  ０．１  Ｍ  ＮａＨＣＯ３）を添加し、室温にて１５分間、溶出を行う。遠心で上清を除き、レジンに再び５０μｌ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを添加して再度、上記溶出を繰り返す。
【００２８】
（３）クロスリンクの解除とＤＮＡの回収
サンプルに０．２  ＭとなるようにＮａＣｌを加え、６５℃で６時間インキュベートする。この操作により、タンパク質・ＤＮＡ複合体のクロスリンクを外す。
０．５Ｍ  ＥＤＴＡを２μｌ、  １Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを４μｌ、  ｐＨ  ６．５，  ６ｍｇ／ｍｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを０．６μｌ加え、４５℃で１時間インキュベートする。
ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（例えば、ＱＩＧＥＮ社）あるいはフェノール−クロロホルム法によりＤＮＡを抽出し、５０μｌの精製水で溶出する。このうちの５μｌまたは１０μｌをＰＣＲに用いる。
【００２９】
（４）ＰＣＲによるＤＮＡの増幅検出
上記（３）の記載の方法により得られたＤＮＡを鋳型とし、解析したいゲノム上の特定領域を増幅するために適当なプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行う。反応条件等は、増幅する領域、増幅する長さに依存し個別に検討する必要がある。例えば、反応混合液（ＤＮＡ  ５μｌ，  ＰＣＲ用ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ，  ＮＴＰｓ  ４μｌ，  プライマー  （各１００ｐｍｏｌ），  蒸留水  ３６μｌ  ，  ｒＴａｑ  ０．５μｌ  ／５０μｌ  ）を、反応条件、９６℃５分間を１サイクル、  ９６℃３０分間、５６℃３０分間、７２℃３０分間を２５サイクルから４０サイクル、７２℃３分間で反応させて、目的のＤＮＡ断片を増幅させる。
反応の途中で適量（１０μｌ）ずつサンプリングし、例えば２５サイクル、３３サイクル、  ４０サイクルの３点での増幅産物（増幅ＤＮＡ断片）をアガロース電気泳動でチェックし、増幅に最適なサイクル数を決定する。得られたＤＮＡ断片のＤＮＡ配列等を決定することにより、ヒストンＨ３の９番目のリジンのメチル化によって、転写制御されていることが予想される遺伝子の特定が可能となる。
【００３０】
８．免疫蛍光法及び免疫組織化学法
（１）免疫蛍光法
凍結組織切片を蛍光染色する場合は、当業者の通常の知識に基づいて実施することが可能である。限定はしないが、以下のような方法を用いて実施することができる。例えば、観察対象の組織切片を液体窒素で冷却したイソペンタンなどに浸して凍結させる。次に、凍結組織をクリオスタットのチャンバーに移し、温度が平衡に達するまで約３０分程度静置させる。包埋剤を用いて組織ブロックをスタブにマウントした後、ブロックの表面を対象の組織に適した温度でトリミングを行い、５．３〜５μｍの切片を作製する。作製した切片は、清浄なスライドグラス上に置き、室温で５〜１６時間乾燥させる。
本発明のモノクローナル抗体を至適濃度に希釈後、該希釈液を適量（５０〜７０μｌ）切片上に重層し、チャンバーに蓋をした後、３７℃でインキュベートする。インキュベートション後、ＰＢＳにて２〜３回程度スライドグラスを洗浄する。
次に、蛍光（例えば、フルオレセイン、ローダミン、カルボシアニン（Ｃｙ３，  Ｃｙ５など）、テキサスレッドなど）標識した二次抗体を至適濃度に希釈後、該希釈液を適量（５０〜７０μｌ）切片上に重層し、チャンバーに蓋をした後、３７℃でインキュベートする。インキュベートション後、遮光状態で、ＰＢＳにて２〜３回程度スライドグラスを洗浄する。染色後、蛍光顕微鏡で観察を行う。
【００３１】
細胞を染色する場合には、スライドグラス又はカバーグラス上に対象の細胞を付着状態で成長させるか、浮遊細胞の場合は、スライドグラス上に遠心により付着させる。細胞を付着させたスライドグラス又はカバーグラスは、例えば、アルコール、アセトン、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドなどを用いて細胞内タンパク質の固定を行う。その後必要ならば、適当な界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００など）処理により細胞膜及び／又は核膜の透過性を上げてもよい。本発明のモノクローナル抗体（直接法の場合は、該モノクローナル抗体に蛍光標識を行ったものを用いる）を至適濃度に希釈後、該希釈液を適量（５０〜７０μｌ）スライドグラス又はカバーグラス上の細胞に重層し、室温にて６０分間インキュベートする。インキュベートション後、ＰＢＳにて２〜３回程度スライドグラスを洗浄する。
次に、間接法の場合には、標識した二次抗体を至適濃度に希釈後、該希釈液を適量（５０〜７０μｌ）細胞上に重層し、室温でインキュベートする。インキュベートション後、ＰＢＳにて２〜３回程度スライドグラスを洗浄する。染色後、蛍光顕微鏡で観察を行う。
【００３２】
（２）免疫組織化学法
ホルマリン固定、パラフィン包埋された組織切片のスライドを５６〜６０℃のオーブン中に１５分間静置する。その後、スライドをキシレン槽に移し、５分間毎、２回キシレンを交換する。余分な液を除いたのち、スライドを３分間ずつ２回、新しい無水エタノール中で再水和させる。次に余分な液を除いたのち、スライドを新しい９０％エタノール中に３分間静置する。ついで、余分な液を除いたのち、スライドを新しい８０％エタノール中に３分間静置させ、静置後、弱い流水で３０秒間リンスする。次に、ＰＢＳ中、室温にて３０分間静置して、さらに再水和させる。内在性ペルオキシダーゼの不活性化を行うために、３  ％  過酸化水素水を切片全体に充分量滴下して切片全体に重層したのち、室温で５分間インキュベートする。その後、ＰＢＳでリンスし、さらにＰＢＳ中で２分間静置する。
【００３３】
ＰＢＳを充分に除いたスライド上の切片に、本発明のモノクローナル抗体を至適濃度に希釈後、該希釈液を適量（１００μｌ）、均一に重層し、３７℃の加湿チャンバー中にて６０分間以上インキュベートする。インキュベートション後、ＰＢＳで２〜３回程度スライドグラスを洗浄する。
一次抗体を反応させたスライドは余分な液を除いたのち、例えば、ビオチンで標識化した二次抗体を至適濃度に希釈後、適量、切片上に均一に重層する。加湿チャンバー中、室温で３０分間以上インキュベートする。その後、ＰＢＳでリンスし、さらにＰＢＳ中で２分間静置する。
二次抗体を反応させたスライドは余分な液を除いたのち、例えば、アルカリホスファターゼもしくはセイヨウワサビペルオキシダーゼを結合させたアビジンを至適濃度に希釈後、適量、切片上に均一に重層する。加湿チャンバー中、室温で２０分間以上インキュベートする。その後、ＰＢＳでリンスし、さらにＰＢＳ中で５分間静置する。
次に、基質混合液（例えば、ジアミノベンチジンなどを含む）を切片に十分量添加し、５〜１０分間程度反応させ、バックグラウンドが上昇する前に、蒸留水で穏やかにリンスし、反応を終了させる。
【００３４】
９．キット
（１）試薬等
本発明の対象には、キットも含まれる。一般に、本発明のキットには、メチル化ヒストンＨ３と非メチル化ヒストンＨ３を識別するモノクローナル抗体又はその断片と、該モノクローナル抗体を検出する試薬が含まれる。モノクローナル抗体は、Ｌｙｓ９においてメチル化されたヒストンＨ３と選択的に結合するものが好ましく、最も好ましくは、メチル化されたＬｙｓ９と結合するモノクローナル抗体である。
本発明のキットには、細胞核内のヒストンＨ３に本発明のモノクローナル抗体をアクセス可能にするための試薬、限定はしないが、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００などの界面活性剤などを含んでもよい。
【００３５】
また、本発明のキットには、免疫蛍光試薬、例えば、本発明のモノクローナル抗体を認識する免疫グロブリン（二次抗体）であって、フルオレセイン、ローダミン、カルボシアニン（Ｃｙ３，  Ｃｙ５など）、テキサスレッドなどを用いて誘導体化した抗免疫グロブリン抗体、又はアビジンやストレプトアビジンと組み合わせたビオチニル化免疫グロブリン抗体などを含んでもよい。また、本発明のキットには、免疫組織化学的又は免疫細胞化学的検出試薬、限定はしないが、例えば、本発明のモノクローナル抗体を認識する免疫グロブリン（二次抗体）であって、アルカリホスファターゼもしくはセイヨウワサビペルオキシダーゼを用いて誘導体化したアビジンやストレプトアビジンと組み合わせたビオチニル化抗免疫グロブリン抗体を含んでもよい。
また、本発明のキットには、１種類以上の免疫組織化学的試薬、限定はしないが、セイヨウワサビペルオキシダーゼを用いて誘導体化した抗免疫グロブリン抗体、または、セイヨウワサビペルオキシダーゼを用いて誘導体化したアビジンやストレプトアビジンと組み合わせたビオチニル化抗免疫グロブリン抗体、並びに前記免疫ペルオキシダーゼ試薬のための発色基質、例えば、ジアミノベンジジンなどを含む。
【００３６】
また、本発明のキットには、ヒストンＨ３を免疫沈降させるのに必要な担体を含んでもよい。適当な担体としては、プロテインＡ又はＧアガロース結合体が挙げられる。さらに、キャリアーＤＮＡ（例えば、サケ精子ＤＮＡなど）、その他必要なバッファー類（タンパク質を変性させるために必要なバッファー、抗原−抗体複合体の洗浄に必要なバッファーなど）、塩類（例えば、適当濃度のＮａＣｌ溶液など）を含んでもよい。
【００３７】
（２）容器等
キット中に含まれる試薬は、個々の構成成分の長期保存が可能で、キットに含まれる試薬を吸着しない材質であって、該容器に収納される物質の特性を変化させない任意の材質で形成される容器中に供給される。例えば、限定はしないが、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、又は試薬を保持するために典型的に用いられる他の任意の適切な材料などにより構成される。
（３）使用説明書
また、キットには使用説明書も供給されている。使用説明は、紙又は他の材質上に印刷され、及び／又はフロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどの電気的又は電磁的に読み取り可能な媒体として供給されてもよい。また、詳細な指示は、キットに物理的に付随しない場合もあり得るが、その場合には、使用者はキットの製造者又は提供者によって指定され又は電子メールで供給されるウェッブサイトを利用することで、適切な指示を得ることができる。
【００３８】
【実施例】
以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３９】
実施例１：本発明のモノクローナル抗体の調製
（１）免疫原の調製及び免疫
免疫原には、９番目のリジンがジメチル化されたヒストンＨ３の部分ペプチド（残基４−１４、配列番号１（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｂｅｒｎｅ氏により合成された。Ｔｕｆｔｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＵＳＡ）；ＫＱＲＴＡＲ［ジメチル化Ｋ］ＳＴＧＧＫ）のＣ末端にＣｙｓを付加させ、これにＫＬＨ（キーホールリンペットへモシアニン、Ｐｉｅｒｃｅ社）のアミノ基とＣｙｓのＳＨ基とをクロスリンクしたものを用いた。作製した抗原はアジュバント（ＴｉｔｅｒＭａｘ社）と混合したのち、マウスに免疫した。数回の免疫後、抗体価が好ましい値になった時点で、免疫したマウスから脾臓を取り出し、定法に従って、ミエローマ細胞（ＮＳ−１細胞株）と融合を行った。
（２）抗体のスクリーニング
次に、目的のモノクローナル抗体をスクリーニングするための抗原の調製を行った。ＧＳＴを融合させたヒストンＨ３の部分ペプチド（ＧＳＴ−Ｈ３（１−５７））を基質とし、ＳＡＭ（Ｓ−アデノシルメチオニン）をメチル基のドナー、ＧＳＴ−Ｇ９ａ（Ｇ９ａのアミノ酸７０６番目からＣ末端までを含むポリペプチドとＧＳＴとの融合体）をメチル化酵素として用い、５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ，  ｐＨ８．５，  ２０  ｍＭ  ＫＣｌ，  １０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  １０  ｍＭ  β−メルカプトエタノール，  ２５０  ｍＭ  ｓｕｃｒｏｓｅからなる反応液３０μｌ中で、３７℃、６０分間、ヒストンＨ３のＬｙｓ９のメチル化反応を行った（Ｔａｃｈｉｂａｎａ等，  ２００１．）。
ＳＡＭの存在下又は非存在下で調製したメチル化−又は非メチル化ＧＳＴ−Ｈ３（１−５７）を用いて、イムノブロット法により、Ｈ３−ｍＫ９を特異的に認識する抗体の抗体価の上昇を確認したのち、ＥＬＩＳＡ法により目的のクローンのスクリーニングを行った（Ｕｒａｎｏ等，  １９９３）。さらに、ＥＬＩＳＡ法により得られたクローンについて、Ｈ３−ｍＫ９に対するポリクローナル抗体（ＵＢＩ社）（図１、αＨ３−ｍＫ９（マウスポリクロ））をポジティブコントロールに用い、抗ＥＧＦＰ抗体（αＥＧＦＰ）をネガティブコントロールに用いて、メチル化の有無による抗原への結合性の差異により、イムノブロット法によるスクリーニングを行った（図１）。その結果、クローン５．１．１がＨ３−ｍＫ９に特異的に結合する抗体（以下、Ｈ３−ｍＫ９  ５．１．１と称する）として選択された（図１、５．１．１）。
【００４０】
（３）Ｈ３−ｍＫ９  ５．１．１の抗原特異性
得られたモノクローナル抗体の特異性を図２に示す。Ｈ３−ｍＫ９  ５．１．１は、メチル基のドナーであるＳＡＭ非存在下でメチル化反応をさせたペプチドは全く認識せず（図２、ＩＢ：−のレーン）、ＳＡＭ存在下でメチル化させたペプチドのみを認識した（図２、ＩＢ：＋のレーン）。なお、Ｈ３−ｍＫ９  ５．１．１が反応するバンドが数本確認されるのは、ＧＳＴ−Ｈ３（１−５４）の調製時に生じたプロテアーゼ分解産物を認識したためであり、Ｈ３−ｍＫ９  ５．１．１の抗原特異性とは関係ない。
さらに、Ｈ３−ｍＫ９  ５．１．１の、Ｌｙｓ９がメチル化されたヒストンＨ３に対する特異性について検討した。
ヒストンＨ３の４番目、９番目、２７番目、及びヒストンＨ４の２０番目のリジンがジメチル化されたペプチド（各々、Ｈ３−ｍ２Ｋ４；ＡＲＴ［ジメチル化Ｋ］ＱＴＡＲＫ；配列番号２、Ｈ３−ｍ２Ｋ９；ＫＱＴＡＲ［ジメチル化Ｋ］ＳＴＧＧＫ；配列番号１、Ｈ３−ｍ２Ｋ２７；ＴＫＡＡＲ［ジメチル化Ｋ］ＳＡＰＡＴ；配列番号３、Ｈ４−ｍ２Ｋ２０；ＡＫＲＨＲ［ジメチル化Ｋ］ＶＬＲＤＮ；配列番号：４（ここで用いたペプチドはＭｉｃｈａｅｌ  Ｂｅｒｎｅ氏により合成された。Ｔｕｆｔｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＵＳＡ））を用いて、Ｈ３−ｍＫ９  ５．１．１の特異性をビアコアシステム（ＢＩＡｃｏｒｅ３０００、Ｂｉａｃｏｒｅ社）による解析を行った。ペプチドは１０ｍＭ酢酸ナトリウム，  ｐＨ４．０中で希釈し、ＣＭ５センサーチップにカップルさせ、残りの結合部位は１Ｍ  エタノールアミン，  ｐＨ８．５でブロッキングを行った。コントロールには、ペプチド無しで同じ操作を行ったものを使用した。ペプチドとＨ３−ｍＫ９  ５．１．１との結合は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ２０（ｖ／ｖ）中で行った。
解析の結果、Ｈ３−ｍＫ９  ５．１．１は、Ｈ３−ｍ２Ｋ９とのみ反応し、Ｈ３−ｍ２Ｋ４、Ｈ３−ｍ２Ｋ２７、Ｈ４−ｍ２Ｋ２０とは反応しなかった（図３）。ここで用いたペプチドのメチル化はすべてｄｉ−ＣＨ３（ジメチル化）されたものであるが、メチル化されていないペプチド及びｔｒｉ−ＣＨ３（トリメチル化）されたペプチドに対して、弱いながらＨ３−ｍＫ９  ５．１．１が反応した。しかし、この反応はビアコアシステムの高感度性によるものであって、Ｈ３−ｍＫ９  ５．１．１の本質的な抗原特異性に影響を与えるものではない。
また、ＨｅＬａ細胞の酸抽出によって調製したヒストンＨ３に対してＨ３−ｍＫ９  ５．１．１を用いてイムノブロッティングを行った。
その結果、Ｈ３−ｍＫ９  ５．１．１は内在性のヒストンＨ３を特異的に認識し（図４、レーン２）、他のヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ４を認識しなかった（図４、レーン１及び２）。
【００４１】
実施例２：Ｈ３−ｍＫ９  ５．１．１による免疫沈降
Ｈ３−ｍＫ９  ５．１．１が細胞内に存在するＬｙｓ９がメチル化されたヒストンＨ３を特異的に免疫沈降させることができるかどうか検討を行った。
プロテインＧアガロース（１：１  懸濁液２０μｌ）にＨ３−ｍＫ９  ５．１．１（２μｌ）を添加し、  ４℃で７５分間インキュベートして、プロテインＧアガロースにＨ３−ｍＫ９  ５．１．１を結合させる。
ＨｅＬａ細胞の抽出液は、適量の細胞ペレットに対し、適量のＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１  ％  ＳＤＳ，  ０．５  ％  ＤＯＣ，  １  ％  ＮＰ−４０，  １５０  ｍＭ  ＮａＣｌ，  ５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０）を添加し、ホモジナイズ（必要な場合は超音波処理又はヌクレアーゼ処理によりＤＮＡを切断する）後、１００，０００  ｇで６０分間遠心することで上清に回収した。
プロテインＧアガロースとＨ３−ｍＫ９  ５．１．１の複合体に、ＨｅＬａ細胞の抽出液を添加し、４℃で７５分間インキュベートした後、遠心（  １，２００  ｇで１分間）により、免疫沈降産物を沈殿に回収した。定法に従って、免疫沈降物をサンプル処理したのち、ＳＤＳ非添加のポリアクリルアミドゲル（濃度１５％、ゲルのｐＨは８．８）にて電気泳動を行った。
電気泳動終了後、泳動されたタンパク質をナイロン膜に転写し、Ｈ３−ｍＫ９  ５．１．１（図４、レーン４）を用いてイムノブロッティングを行った。
その結果、Ｈ３−ｍＫ９  ５．１．１で免疫沈降を行わせた場合のみ（図４、レーン４）ヒストンＨ３が沈殿に回収された（図４、矢印）。従って、Ｈ３−ｍＫ９  ５．１．１は細胞に内在するヒストンＨ３  ｍＫ９（Ｌｙｓ９がメチル化されたもの）を特異的に認識し、かつ、免疫沈降法にも利用可能であることが明らかとなった。
【００４２】
また、Ｈ３−ｍＫ９  ５．１．１を用いた免疫沈降法は、ホルムアルデヒドにより細胞内のタンパク質とＤＮＡが予めクロスリンクされた状態においても、実施することができる（図５）。細胞抽出液を調製する前に、１％のホルムアルデヒド中で細胞を処理したのち、Ｈ３−ｍＫ９  ５．１．１（図５、ＩＰ；５．１．１）及びネガティブコントロールとしてプロテインＧビーズのみ（図５、ＩＰ；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｂｅａｄｓ）を用いて、免疫沈降を行った。ＨｅＬａ細胞の抽出液を調製する前に、１  ％のホルムアルデヒドを用いて細胞を処理した以外は、前述の項目［００４１］に記載の方法に従った。その結果、クロスリンク後の細胞抽出液を用いた場合でも、Ｈ３−ｍＫ９  ５．１．１はＬｙｓ９がメチル化されたヒストンＨ３を特異的に認識して免疫沈降させることが明らかとなった。
【００４３】
実施例３：クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）
本発明のＨ３−ｍＫ９  ５．１．１は、ＣｈＩＰによる解析にも利用可能であることから、ヒストンＨ３のＬｙｓ９のメチル化によって転写制御を受けている遺伝子の解析において、非常に有用なツールとして利用することができる。
本実施例におけるＣｈＩＰによる解析は、Ｕｐｓｔａｔｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から販売されているＣｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  （ＣｈＩＰ）  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔに添付されているプロトコールに従って行った。
ＨｅＬａ細胞を、１０ｃｍ  ｄｉｓｈでＤＭＥＭ培地（５％ＦＢＳ）中で培養した後、無血清培地（ＤＭＥＭ，  ０％ＦＢＳ）に換えてさらに培養した。無血清培地中での培養後、培地にホルムアルデヒドを終濃度１％になるよう添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。
その後、培地を除去し、プロテアーゼインヒビター（１ｍＭ  ＰＭＳＦ，  １μｇ／ｍｌ  アプロチニン）を含む氷冷ＰＢＳで洗浄した。
次に、ｄｉｓｈに１ｍｌ  ＰＢＳを加え、細胞をかき取りチューブに移した後、７００×ｇ，  ４℃、３分間遠心して、細胞を回収した。上清を捨て、回収された細胞にＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ  （１％  ＳＤＳ，  １０ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ  ８．１，  １ｍＭ  ＰＭＳＦ，  １μｇ／ｍｌ  アプロチニン）  適量加え、ボルテックスミキサーで撹拌後、氷上で１０分間静置した。
その後、氷中でサンプルを２０秒間隔のインターバルをおいて、１０秒間づつ超音波処理を、合計４回行った。得られるＤＮＡ断片を、２００−１０００ｂｐの長さになるように、電気泳動などでチェックしながら行った。
【００４４】
サンプルをＣｈＩＰ  Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  （０．０１％  ＳＤＳ，  １．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  １．２ｍＭ  ＥＤＴＡ，  １６．７  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ  ８．１，  １６７  ｍＭ  ＮａＣｌ，  １  ｍＭ  ＰＭＳＦ，  １μｇ／ｍｌ  アプロチニン）で１０倍希釈した。これに４０μｌ  のプロテインＧビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）  （１．５  ｍｌ  ビーズ，  ６００μｇ  超音波処理サケ精子ＤＮＡ，  １．５ｍｇ  ＢＳＡ，  ４．５ｍｇ  組換体プロテインＧ  ／  １．５  ｍｌ  ｂｕｆｆｅｒ；  １０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ  ８．０，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．０５％  アジ化ナトリウム）を加え、４℃，で３０分間インキュベートした。
１，５００  ｒｐｍ，  １５秒，４℃で遠心して上清を除き、Ｈ３−ｍＫ９  ５．１．１を１μｇ添加し、４℃で一晩インキュベートした。インキュベート後、５０μｌのプロテインＧビーズを加え、４℃で１時間インキュベートした。
次にプロテインＧ  ビーズを、４段階の洗浄条件にて、各々、４℃で３分間洗浄を行った；
（ａ）Ｌｏｗ  Ｓａｌｔ  ｂｕｆｆｅｒ  （０．１  ％  ＳＤＳ，  １  ％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  ２  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ  ８．１，  １５０  ｍＭ  ＮａＣｌ）、
（ｂ）Ｈｉｇｈ  Ｓａｌｔ  ｂｕｆｆｅｒ  （０．１  ％  ＳＤＳ，  １  ％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  ２  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ  ８．１，  ５００  ｍＭ  ＮａＣｌ）、
（ｃ）ＬｉＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ  （０．２５  Ｍ  ＬｉＣｌ，  １  ％  ＮＰ４０，  １  ％  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，  １  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  １０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ  ８．１）、
（ｄ）ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ  （１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  １  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ｐＨ  ８．０）×２  Ｗａｓｈ
洗浄後、５０μｌ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  （１０  ｍＭ  ＤＴＴ，  １％  ＳＤＳ，  ０．１  Ｍ  ＮａＨＣＯ３）で、室温、１５分間、溶出を行った。
【００４５】
溶出されたサンプルに対し４μｌ，  ５Ｍ  ＮａＣｌを加え、６５℃で６時間インキュベートし、タンパク質・ＤＮＡ複合体のクロスリンクを除去した。さらに、２μｌの０．５  Ｍ  ＥＤＴＡ，  ４μｌの１  Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ６．５，  ０．６μｌの  ６ｍｇ／ｍｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを加え、４５℃で１時間インキュベートし、タンパク質を消化した。
定法に従って、ＤＮＡを抽出し、５０μｌの精製水で溶解した。
得られたＤＮＡを鋳型とし、インプリンティング遺伝子であるＬｉｔ  １領域を増幅させるための以下に示すプライマー（各１００  ｐｍｏｌ）を用いて、ＰＣＲ反応を行った。
正方向（Ｌｉｔ１  ＣＨＩＰ−Ｆ）；５’−ＧＣＣ  ＧＡＧ  ＴＣＡ  ＧＡＡ  ＣＧＣ  ＡＣＴ  ＧＧ−３’（配列番号５）
逆方向（Ｌｉｔ１  ＣＨＩＰ−Ｒ）；５’−ＴＴＣ  ＣＣＡ  ＡＴＣ  ＣＣＣ  ＣＡＣ  ＡＣＣ  ＴＧ−３’（配列番号６）
反応条件は、９６℃５分間を１サイクル、  ９６℃３０分間、５６℃３０分間、７２℃３０分間を２５サイクルから４０サイクル、７２℃３分間で増幅反応を行った。増幅されたＤＮＡ断片の配列確認を行ったところ、Ｌｉｔ  １遺伝子領域が増幅されていることが確認され、ＣｈＩＰ法においても、Ｈ３−ｍＫ９  ５．１．１は高い特異性を有することが明らかとなった。
【００４６】
（４）実施例４：免疫蛍光染色
本発明のモノクローナル抗体により、Ｌｙｓ９がメチル化されたヒストンＨ３の細胞内における局在を免疫蛍光染色法によって観察した。ＨｅＬａ細胞を、−２０℃保存の１００％メタノールで、１５秒間処理して固定を行い、ＰＢＳで３回洗浄した後、０．０５  ％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で２分間処理して細胞膜及び核膜の透過性処理を行った。ＰＢＳで１０００倍に希釈したＨ３−ｍＫ９  ５．１．１及びＨ３−ｍＫ４に対する抗体（ウサギポリクローナル抗体、ＵＢＩ社）を、各々細胞上に重層し、細胞の乾燥を防ぎながら３７℃で、６０分間、反応させた。次に、抗体の反応後、細胞をＰＢＳで４回洗浄し、２５０倍に希釈したＦＩＴＣ標識化抗マウス−ヤギ抗体（Ｓｉｇｍａ社）及びＴＲＩＴＣ標識化抗ウサギ−ヤギ抗体（Ｓｉｇｍａ社）を、各々、Ｈ３−ｍＫ９  ５．１．１及びＨ３−ｍＫ４を反応させた細胞上に重層し、細胞の乾燥を防ぎながら３７℃で、４５分間反応させた。反応後、細胞をＰＢＳで４回洗浄した後、蛍光保存剤を用いてマウント後、蛍光顕微鏡で観察を行った。
【００４７】
顕微鏡観察の結果、Ｈ３−ｍＫ９  ５．１．１では、ヘテロクロマチン領域が染色され（図６、Ｈ３−ｍＫ９（ｄｉ−））、Ｈ３−ｍＫ４に対する抗体（ＵＢＩ社）では、ユークロマチン領域が染色された（図６、Ｈ３−ｍＫ４（ｄｉ−））。この結果は、ヒストンＨ３のＬｙｓ９のメチル化がヘテロクロマチン領域に多く認められるというこれまでの見解と一致するものであった（Ｎａｋａｙａｍａ等，  ２００１）。
【００４８】
2004339109.tif 000002
【００４９】
【発明の効果】
本発明のモノクローナル抗体は、Ｌｙｓ９がメチル化されたヒストンＨ３に対して、特異性が高く、ウェスタンブロッティング、免疫蛍光染色、免疫組織化学的染色などに使用可能であり、さらに、免疫沈降法、クロマチン免疫沈降法などによる解析に使用可能である。
従って、ヒストンＨ３のＬｙｓ９のメチル化が重要な要因と考えられるインプリンティング遺伝子、及び該インプリンティングの異常による先天性疾患などの解析に有用である。
さらに、最近インプリンティング遺伝子の異常と特定の腫瘍との関連性が明らかとなっているため、Ｈ３のＬｙｓ９のメチル化の有無を確認することで、かかる腫瘍の発生の可能性等の診断にも有効に用いることができる。
【００５０】
参考文献
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Ｚｈａｎｇ等，  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．，  １５：２３４３−２３６０，  ２００１．
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【００５１】
【配列表】
2004339109.tif 000003
2004339109.tif 000004
2004339109.tif 000005
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｈ３−ｍＫ９に対するモノクローナル抗体のスクリーニングの経過を示すイムノブロットの結果である。ＳＡＭは、Ｓ−アデノシルメチオニンのことであり、ＩＢは、イムノブロットのことを意味する。
【図２】図２は、Ｈ３−ｍＫ９  ５．１．１の抗原特異性を示した図である。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅとは、クマジーブリリアントブルーのことであり、タンパク染色したことを意味する。
【図３】図３は、Ｈ３−ｍＫ９  ５．１．１の抗原特異性についてビアコアシステム（Ｂｉａｃｏｒｅ社）を用いて検討した結果を示す。
【図４】図４は、ＨｅＬａ細胞から酸抽出を行ったヒストン画分に対するＨ３−ｍＫ９  ５．１．１の特異性を確認した結果、及びＨｅＬａ細胞抽出液から、Ｈ３−ｍＫ９  ５．１．１によって、Ｌｙｓ９がメチル化されたヒストンＨ３が特異的に免疫沈降されることを示す図である。ＩｇＬは、イムノグロブリン軽鎖の位置を示す。ｌｙｓａｔｅは、抽出液そのものをイムノブロットしたこと示す。また、矢印はヒストンＨ３の位置を示す。
【図５】図５は、細胞内タンパク質とＤＮＡをクロスリンクした細胞内抽出液を用いて、Ｈ３−ｍＫ９  ５．１．１により免疫沈降を行った結果を示す。
【図６】図６は、Ｈ３−ｍＫ９  ５．１．１を用いて細胞の免疫染色を行った結果を示す。Ｈ３−ｍＫ９（ｄｉ−）及びＨ３−ｍＫ４（ｄｉ−）は、それぞれＨ３−ｍＫ９  ５．１．１及びＨ３−ｍＫ４に対する抗体（ＵＢＩ社）を用いて染色をした結果を示し、ｍｅｒｇｅは、両染色像を重ね合わせた結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
2004339109.tif 000009
【図４】
2004339109.tif 000010
【図５】
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【図６】
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