(57)【要約】【課題】５’−ヌクレオチド類をはじめ、タンパク質やペプチド、遊離アミノ酸、糖類、有機酸等に富み、味、匂い、色等の外観等の優れた酵母エキスの工業的製造法の提供。【解決手段】食用乾燥酵母と、放線菌産生酵素類、ついで担子菌産生酵素類とを接触させる酵母エキスの製造法において、反応条件を変えて２段階で放線菌産生酵素類を酵母と接触させることを特徴とする酵母エキスの製造法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
食用乾燥酵母と、放線菌産生酵素類、ついで担子菌産生酵素類とを接触させる酵母エキスの製造法において、反応条件を変えて２段階で放線菌産生酵素類を酵母と接触させることを特徴とする酵母エキスの製造法。
【請求項２】
食用乾燥酵母の固形分に対してｐＨ６．５〜８．０にて、放線菌産生酵素類を乾燥物として、０．１〜３．０重量％添加し、３５℃〜６０℃で３〜１０時間、さらに６０℃〜７０℃で１〜８時間、酵母と接触させる請求項１記載の酵母エキスの製造法。
【請求項３】
食用乾燥酵母の固形分に対し、ｐＨ６．５〜８．０にて、放線菌産生酵素類を乾燥物として０．１〜３．０重量％添加し、３５℃〜６０℃で３〜１０時間、さらに６０℃〜７０℃で１〜８時間、酵母と接触させ、ついで、ｐＨ３．５〜５．５にて、担子菌産生酵素類を乾燥物として０．３〜１．５重量％添加し、４５℃〜６０℃で５〜２０時間酵母と接触させる請求項１記載の酵母エキスの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵母エキスの製造法、特に、食用乾燥酵母から放線菌および担子菌の産生する酵素を利用して酵母エキスを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、乾燥酵母に放線菌や担子菌類の産生する酵素を接触させて酵母エキス等の５’−ヌクレオチド類含有食品を製造する方法が知られている（特許文献１参照）。
【０００３】
【特許文献１】
特公昭４４−７９１号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、特許文献１（特公昭４４−７９１号公報）記載の５’−ヌクレオチド類含有食品の製造法を改良し、工業的生産性（収率、品質、価格等）を向上させ、５’−ヌクレオチド類をはじめ、タンパク質やペプチド、遊離アミノ酸，糖類、有機酸等に富み、味、匂い、色等の外観等の優れた酵母エキスを提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために種々検討する間に、５’−ヌクレオチド類を効率よく産生できる方法を見出し、これにより５’−ヌクレオチド類をはじめ、タンパク質やペプチド、遊離アミノ酸、糖類、有機酸等に富み、味、匂い、色等の外観等の優れた酵母エキスを工業的規模で生産できることを知り、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
【０００６】
（１）食用乾燥酵母と、放線菌産生酵素類、ついで担子菌産生酵素類とを接触させる酵母エキスの製造法において、反応条件を変えて２段階で放線菌産生酵素類を酵母と接触させることを特徴とする酵母エキスの製造法、
（２）食用乾燥酵母の固形分に対してｐＨ６．５〜８．０にて、放線菌産生酵素類を乾燥物として、０．１〜３．０重量％添加し、３５℃〜６０℃で３〜１０時間、さらに６０℃〜７０℃で１〜８時間、酵母と接触させる上記（１）記載の酵母エキスの製造法、
（３）食用乾燥酵母の固形分に対し、ｐＨ６．５〜８．０にて、放線菌産生酵素類を乾燥物として０．１〜３．０重量％添加し、３５℃〜６０℃で３〜１０時間、さらに６０℃〜７０℃で１〜８時間、酵母と接触させ、ついで、ｐＨ３．５〜５．５にて、担子菌産生酵素類を乾燥物として０．３〜１．５重量％添加し、４５℃〜６０℃で５〜２０時間酵母と接触させる上記（１）記載の酵母エキスの製造法などを提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明で用いる食用乾燥酵母は、特に限定するものではなく、ワイン酵母、パン酵母、清酒酵母、ビール酵母等いずれでもよく、これらを自体公知の方法で適宜乾燥したものが使用できる。
原料となる酵母は、前処理なしにそのまま使用してもよく、また、前処理を行なった後に使用してもよい。例えば、水洗後に使用しても、酸、アルカリ、低級アルコール等での洗浄後、水洗して使用してもよい。さらに、例えば、６０Ｐａ〜５００Ｐａの高圧ホモジナイザーで処理した後に使用してもよい。
例えば、５’−ヌクレオチド類高含有の酵母エキスを得るには、酵母そのものの核酸（ＲＮＡ）量と、酵母の前処理でＲＮＡ以外の成分を除くことで酵母中に占めるＲＮＡ量の比率をいかに高めるかにかかる。例えば、パン酵母として主に利用されているトルラ属の乾燥酵母を使用する場合、本発明の方法により酵母エキスを製造すると５％〜１０％程度の５’−ヌクレオチド類を含有する酵母エキスを造ることが出来、同トルラ属酵母をあらかじめ水洗処理して水溶性成分を除いて本発明の方法により酵母エキスを製造すると、１０％〜２０％の５’−ヌクレオチド類を含有するものが得られる。水洗の回数またはその他の前処理等により３０％〜４０％等の高い５’−ヌクレオチド類を含有するものを得ることができる。
アミノ酸についても同様、使用する原料酵母がまず影響し、ついで原料の前処理やタンパク分解酵素等の種類、質、反応条件に影響される。
原料酵母は、工業的生産性を考慮し、例えば、乾燥酵母の場合、通常、５〜３０重量％、好ましくは、１０〜２０重量％の濃度で、水（例えば、イオン交換水等）に懸濁し、酵素類と接触させる。懸濁液の濃度が低すぎる場合は生産性の低下を招き、また、濃度が高すぎる場合は、粘度が高くなりすぎ、撹拌等が困難となる。とりわけ、乾燥酵母は、所謂「ままこ状」になりやすく、仕込み容器（タンク）およびその容量に対する仕込み量や攪拌機械の攪拌翼等を考慮し、常に均一の懸濁状態が保たれるようにすることが放線菌の産生する酵素および担子菌の産生する酵素と酵母の反応性から必要である。
【０００８】
本発明で用いる放線菌産生酵素類としては、５’−リン酸生成型ヌクレアーゼ、デアミナーゼおよびプロテアーゼを必須構成酵素とする酵素類が挙げられ、例えば、ストレプトミセス属に属する菌株を自体公知の方法により培養し、５’−リン酸生成型ヌクレアーゼ、デアミナーゼおよびプロテアーゼを含有する培養物をそのまま、または培養濾液、菌体、菌体破砕物、これらの抽出液、その濃縮物、乾燥物等を使用することができ、あるいは公知の方法により５’−リン酸生成型ヌクレアーゼ、デアミナーゼおよびプロテアーゼを必須構成酵素とする酵素類を採取し、粗製のまま、または精製酵素として用いることができる。
培養液は、嵩張る、腐敗防止のため冷凍保存等の対策が必要、添加量が多くなることから生産現場での計量等が大変である等の問題があり、これらの問題のない工業的生産に適した乾燥酵素、特に、酵素力価を落とさず粉末化した酵素として用いることが望ましい。乾燥方法としては、品温が８０℃以下で、酵素を失活させない乾燥方法あれば、公知の例えば、恒温乾燥、減圧（真空）乾燥、凍結乾燥等いずれの方法でもよいが、凍結乾燥等が好ましい。
放線菌産生酵素類として、例えば、培養液の水溶性部分を乾燥した乾燥物を使用する場合、通常、酵母に対して、０．１〜３．０重量％程度使用する。この乾燥物換算の力価を基準として、培養液の水溶性部分を乾燥したものを適宜、水で希釈して使用することもでき、また、培養液そのものとして使用する場合は、通常、酵母に対して５．０〜５０．０重量％程度の割合で使用できる。
【０００９】
担子菌産生酵素類としては、プロテアーゼ、セルラーゼおよびグルカナーゼを必須構成酵素とする酵素類が挙げられ、例えば、ホウロクタケ属に属する担子菌、好ましくはヒイロタケを自体公知の方法により培養し、プロテアーゼ、セルラーゼおよびグルカナーゼ含有する培養濾液、その抽出物、濃縮物、上記放線菌産生酵素類と同様な乾燥物等を使用することができ、あるいは自体公知の方法により、プロテアーゼ、セルラーゼおよびグルカナーゼ必須構成酵素とする酵素類を採取し、粗製のまま、または精製酵素として用いることができる。
放線菌産生酵素類と同様、担子菌産生酵素類も酵素力価を落とさず粉末化して使用することが望ましい。
担子菌産生酵素類として、例えば、培養液の水溶性部分を乾燥した乾燥物を使用する場合、通常、酵母に対して、０．３〜１．５重量％程度使用する。この乾燥物換算の力価を基準として、培養液の水溶性部分を乾燥したものを適宜、水で記載して使用することもでき、また、培養液そのものとして使用する場合は、通常、酵母に対して７．５〜３７．５重量％程度の割合で使用できる。
【００１０】
本発明によれば、放線菌産生酵素類や担子菌産生酵素類と対酵母との反応条件を連続的に同一反応容器（タンク）内で変えることにより、酵母内の旨味成分を効率よく取り出すことができる。さらに詳しくは、本発明においては、放線菌産生酵素類を酵母と反応させる際、同一反応容器（タンク）内で最初に一次反応させ、ついで反応条件を変え、二次反応させることにより旨味成分の核酸（５’−イノシン酸、５’−グアニル酸）を効率よく取り出すことができる。
【００１１】
かくして、本発明の方法により、酵母エキスを製造するには、食用乾燥酵母の固形分に対し、ｐＨ６．５〜８．０にて、放線菌産生酵素類を０．１〜３．０重量％添加し、３５℃〜６０℃で３〜１０時間、ついで６０℃〜７０℃で１〜６時間酵母と接触させた後、ｐＨ３．５〜５．５にて、担子菌産生酵素類を０．３〜１．５重量％添加し、４５℃〜６０℃で５〜２０時間酵母と接触させる。
例えば、食用乾燥酵母５〜３０％、好ましくは１０〜２０％の水懸濁（ｐＨ６．５〜８．０）に３５℃〜６０℃、好ましくは３５〜４５℃の初期温度で、酵母固形分に対し０．１〜３．０％、好ましくは０．２〜２．０％の放線菌産生酵素類を添加し、３〜１０時間、好ましくは３〜８時間で６０〜７０℃に昇温させる。ついで同液を６０〜７０℃、好ましくは６２〜６８℃で、１〜８時間、好ましくは２〜５時間作用させた後、同液のｐＨを３．５〜５．５に調整し、４５℃〜６０℃、好ましくは４５〜５５℃で０．３〜１．５％、好ましくは０．３〜１．０％の担子菌産生酵素類を５〜２０時間、好ましくは８〜１５時間接触させ、得られた酵母エキスを常法により、濃縮および乾燥等の処理に付して、所望の酵母エキスを得る。
ｐＨの調整は、常法に従い、必要に応じて酸（例、塩酸等）またはアルカリ（例、水酸化ナトリウム等）を用いて行なう。
【００１２】
本発明の製造法で得られた酵母エキスは、公知の酵母エキスと同様に使用することができ、例えば、得られた酵母エキスを農産加工食品（野菜、果実、穀物等の加工品を含む）、水産加工食品（魚介類、海藻等の加工品を含む）、畜産加工食品（畜肉・卵・乳製品等の加工品を含む）、だし・つゆ・ソース・醤油・みそ、あらゆる合わせ調味料等に使用することができる。
【００１３】
【実施例】
以下の参考例、実施例および試験例により、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、特に断らない限り、「％」は重量％を意味する。
以下の実施例および試験例において、固形分濃度は、食品衛生検査指針  理化学編  厚生省監修  社団法人日本食品衛生協会（１９９１年）の試験法  １．水分（３）乾燥助剤法に従って、１０５℃３時間で水分を測定し、１００から測定水分を差し引いて算出した。
食塩濃度は、衛生試験法注解  日本薬学会編  金原出版（１９９０年）（１０）塩素イオン１）モール法により測定した。
全窒素量はミクロケルダール法により測定した。また、全窒素量に６．２５を乗じてタンパク質量とした。
ＲＮＡ含量は、試料を適宜蒸留水で希釈し、メンブランフィルター（０．４５μｍ）で濾過して調製した検液を、社団法人  日本化学会編、生化学実験講座２、核酸の化学Ｉ−分離精製−、９〜１１頁（１９７５年、株式会社  東京化学同人発行）に記載の方法で測定した。
全糖は、試料を適宜蒸留水で希釈し、メンブランフィルター（０．４５μｍ）で濾過して調製した検液を、日立製作所製高速液体クロマトグラフィーＬ−５０２０型で測定した。
５’−ヌクレオチド含量は、試料を適宜蒸留水で希釈し、メンブランフィルター（０．４５μｍ）で濾過して調製した検液を、日立製作所製高速液体クロマトグラフィーＬ５０２０型で測定した。なお、カラムはＤｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−ＵＧ５（野村化学製）、検出は、２５４ｍｍで行い、移動相液は、８５％リン酸１３ｍｌとリン酸一カリウム０．３４ｇを蒸留水で溶かし１Ｌにメスアップしたものを使用した。
全アミノ酸は、試料（タンパク質５ｍｇに相当）を２０％塩酸１ｍｌと共に耐熱性ガラス容器に入れ、密栓して、１１０℃、２０時間加水分解した後、エバポレーターで塩酸を除去し、以下の遊離アミノ酸の測定と同様にしてに測定した。
遊離アミノ酸は、試料を適宜蒸留水で希釈し、最終希釈はｐＨ２のクエン酸緩衝液で希釈し、メンブランフィルター（０．４５μｍ）で濾過して調製した検液を、島津製作所製高速液体クロマトグラフィーＬＣ−１０アミノ酸分析システムを使用して測定した。
【００１４】
参考例１
放線菌産生酵素類の調製
（１）ストレプトミセス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＩＦＯ  ３１７５）の胞子懸濁液（１０７個／ｍｌ以上）１白金耳を種培地（可溶性コーンスターチ３０ｇ／ｌ、コーン・スティープ・リカー３０ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム０．５ｇ／ｌ、炭酸カルシウム３ｇ／ｌ、ｐＨ７．０）２０ｍｌに接種し、２００ｍｌ容三角フラスコで２８℃、２００ｒｐｍで２４時間培養し、種培養終了液を得た。
（２）得られた種培養終了液１ｍｌを主培地（可溶性コーンスターチ３０ｇ／ｌ、コーン・スティープ・リカー１５ｇ／ｌ、脱脂大豆粉２５ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム０．５ｇ／ｌ、炭酸カルシウム３ｇ／ｌ、ｐＨ７．０）２０ｍｌに移植し、２００ｍｌ容フラスコで２８℃、２００ｒｐｍで４０時間培養し、主培養終了液を得た。
（３）得られた主培養終了液２０ｍｌを２８℃、２００ｒｐｍで３時間撹拌し、ついでイソブタノール１．６ｍｌを加え、さらに２８℃、２００ｒｐｍで３時間撹拌して溶菌し、酵素処理液を得た。これを品温が８０℃以下で乾燥し、放線菌産生酵素類の乾燥粉末を得た。
【００１５】
ヒイロタケ産生酵素類の調製
（１）ヒイロタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｓａｎｇｕｉｎｅａ）の胞子懸濁液（１０７個／ｍｌ以上）２ｍｌを種培地（塩化カルシウム１ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム１ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／ｍｌ、リン酸一カリウム２ｇ／ｌ、ショ糖５０ｇ／ｌ、コーン・スティープ・リカー３０ｇ／ｌ、ｐＨ７．０）２０ｍｌに接種し、２００ｍｌ容フラスコ中２８℃、２００ｒｐｍで４８時間培養し、種培養終了液を得た。
（２）得られた種培養終了液２ｍｌを主培地（塩化カルシウム１ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム１ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／ｌ、リン酸一カリウム２ｇ／ｌ、ショ糖８０ｇ／ｌ、脱脂大豆粉３５ｇ／ｌ、ｐＨ６．０）２０ｍｌに移植し、２００ｍｌ容フラスコで２８℃、２００ｒｐｍで９６時間培養し、主培養終了液を得た。
主培養終了液を、濾紙で濾過し、得られた酵素液を真空乾燥してヒイロタケ産生酵素類の乾燥粉末を得た。
【００１６】
実施例１
乾燥ビール酵母（ＲＮＡ含量約４．３％、タンパク質含量約４８．５％）を純水に懸濁して１１％懸濁液を調製し、３０％水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．７に調整した。これに、酵母固形分に対して０．２５％の割合で、上記で得られた放線菌産生酵素乾燥粉末を加え、４０℃から６５℃まで５時間で昇温させ、ついで６５℃で３時間保持した。このときのｐＨは６．７〜６．８であった。
当初の５時間は、５’−ヌクレオチド類の生成量が経時的に上昇したが、その後、５’−ヌクレオチド類の生成量はほぼ横這状態であった。
ついで、５０℃に冷却し、３５％塩酸でｐＨ４．０に調整し、酵母固形分に対して０．６４％の割合で、上記で得られた担子菌産生酵素乾燥粉末を加え、５０℃で１２時間反応させた。
反応終了後、９０℃で１０分間加熱殺菌し、６０℃に冷却した。反応液を０．１〜０．２μｍの孔径を有するセラミック膜で濾過した。残渣を３倍量の純水と共に撹拌し、再度濾過して、濾液を上記の濾液と合した。この液のｐＨは４．０、エキス濃度はＢｘ５．０であった。３０％水酸化ナトリウム溶液でｐＨ５．５に調整し、薄膜流下式真空濃縮によりＢｘ３０〜３５まで濃縮した。これを９０℃まで急速加熱した後、６０℃まで急速冷却し、固形分に対して１．５％の活性炭を加えて濾過し、濾液をさらに薄膜流下式真空濃縮によりＢｘ５５〜６０まで濃縮した。
濃縮物を、２５℃で２週間熟成し、濾過して所望の酵母エキスを得た。
得られた酵母エキスの成分分析値を表１に示す。
【００１７】
【表１】
2004229540.tif 000002
１）：Ｌ−グルタミン酸ナトリウムとして
２）：５’−イノシン酸２ナトリウム（無水物）として
３）：５’−グアニル酸２ナトリウム（無水物）として
４）：全アミノ酸  −  遊離アミノ酸
【００１８】
試験例１
市販の乾燥トルラ酵母（ＲＮＡ含量１４％）の１０％水懸濁液に、参考例１における放線菌産生酵素乾燥粉末を乾燥酵母に対して１．６％の濃度で添加し、種々の温度条件で反応させ、反応液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）し、その上澄液中の５’−ヌクレオチド含量を測定した。
初発温度４０℃で、５℃／時で５時間を要して６５℃まで昇温させ、その後、７時間、６５℃に保持した場合の反応液の５’−ヌクレオチド含量を１００とし、各条件における反応液中の５’−ヌクレオチド含量の相対割合を算出した。
結果を表２に示す。
【表２】
2004229540.tif 000003
表２に示すごとく、放線菌産生酵素類を２段階で反応させることにより、５’−ヌクレオチドの生成が著しく増加する。
このように、原料酵母と放線菌産生酵素類とを接触させ、反応条件を変化させた２段階で反応させることにより、５’−ヌクレオチド類の生成量が著しく高まる。
【００１９】
試験例２
乾燥ビール酵母の放線菌産生酵素類による酵母エキス中の５’−イノシン酸、５’−グアニル酸の生成
上記と同様な乾燥ビール酵母を水酸化ナトリウムでｐＨ７．７に調整しながら１１％水懸濁液とし、これに参考例１の放線菌産生酵素類を対乾燥酵母に０．６％加え、保温容器中で撹拌下（３０ｒｐｍ）、初発温度４０℃以下において反応させ、５時間を要して６５℃に上昇させ、ついで６５℃で保持した。この間、懸濁液中の水溶性部分を分取し、経時ごとに５’−イノシン酸、５’−グアニル酸の量と味の強さ、苦味の強さ、匂いの強さについて官能評価した。
官能検査は、７名の専門パネルによるプロファイル法で風味評価（味の強弱、匂いの強弱、苦味の強弱）、異味の強弱（収斂味の強弱、酸味の強弱、むれ臭の強弱）、総合評価について、以下の基準に従って５段階評価した。
０：なし、１：わずかに強い、２：やや強い、３：強い、４：かなり強い
結果を表３に示す。
【表３】
2004229540.tif 000004
【００２０】
表３に示すごとく、５’−ヌクレオチドで調味料として有用な旨味である５’−イノシン酸、５’−グアニル酸の生成は経過時間と共に高くなり、ほぼ３時間で生成のピークに達し、その後は、徐々に生成されていることが分かった。
官能評価では、反応経過時間と共に味が強くなってきたが、反応が８時間以降変化は認められなかった。苦味は、ほとんど感じられず、ビール特有の匂いは減少した。
【００２１】
【発明の効果】
本発明の製造法により、５’−ヌクレオチド類をはじめ、タンパク質やペプチド、遊離アミノ酸、糖類、有機酸等に富み、味、匂い、色等の外観等の優れた酵母エキスを工業的に製造することができる。