(57)【要約】【課題】ヒト糖尿病の内、２型糖尿病の病態モデルとして、より適切であって、しかも、代謝異常から糸球体硬化が出現し、腎不全への進行が経時的に観察可能なモデル動物及びその作製方法を提供する。【解決手段】糖尿病モデル動物は、インスリン欠乏症を引き起こす化合物を投与した後、全腎臓の１／２〜３／４を摘出することにより作製する。また、糖尿病性腎症モデル動物は、前記糖尿病モデル動物に、高脂肪食を摂取させることにより作製する。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン欠乏症を引き起こす化合物を投与した後、全腎臓の１／２〜３／４を摘出することにより作製される、糖尿病モデル動物。
【請求項２】
インスリン欠乏症を引き起こす化合物を投与した後、全腎臓の１／２〜３／４を摘出し、腎臓摘出後に血糖値を測定し、その血糖値が１５０〜２１０ｍｇ／ｄＬである動物を選択することにより作製される、境界型糖尿病モデル動物。
【請求項３】
インスリン欠乏症を引き起こす化合物を投与した後、全腎臓の１／２〜３／４を摘出し、腎臓摘出後に血糖値を測定し、その血糖値が２１５〜７００ｍｇ／ｄＬである動物を選択することにより作製される、高血糖型糖尿病モデル動物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の糖尿病モデル動物に、高脂肪食を摂取させることにより作製される、糖尿病から糖尿病性腎症に進行するモデル動物。
【請求項５】
インスリン欠乏症を引き起こす化合物を投与した後、全腎臓の１／２〜３／４を摘出する、糖尿病モデル動物の作製方法。
【請求項６】
インスリン欠乏症を引き起こす化合物を投与した後、全腎臓の１／２〜３／４を摘出し、腎臓摘出後に血糖値を測定し、その血糖値が１５０〜２１０ｍｇ／ｄＬである動物を選択する、境界型糖尿病モデル動物の作製方法。
【請求項７】
インスリン欠乏症を引き起こす化合物を投与した後、全腎臓の１／２〜３／４を摘出し、腎臓摘出後に血糖値を測定し、その血糖値が２１５〜７００ｍｇ／ｄＬである動物を選択する、高血糖型糖尿病モデル動物の作製方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の糖尿病モデル動物に、高脂肪食を摂取させる、糖尿病から糖尿病性腎症に進行するモデル動物の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖尿病モデル動物及びその作製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病は、慢性の高血糖とそれに伴う慢性の全身性代謝障害、例えば、細小血管障害（例えば、網膜症、腎症、又は神経障害等）を主な特徴とする疾患であり、インスリン依存性糖尿病（１型糖尿病）とインスリン非依存性糖尿病（２型糖尿病）とに分類される。いずれもその発症には、遺伝素因と環境因子とが関連している。
【０００３】
インスリン依存型は、若年型ともいわれ、小児期に急激に発症し、初期発症状態としては、多飲、多尿、及び／又は夜尿で、多食にもかかわらず、体重減少が著しいという特徴がある。
また、インスリン非依存型は、成人型ともいわれる。成人型は、検尿又は糖負荷試験によって肥満者に発見されることが多い。もっとも、近年においては、肥満者のみならず、比較的やせ型の者であっても、インスリン非依存型の糖尿病が発見される場合も多い。
現在、我が国の糖尿病患者数は、約５００万人で、そのうち９５％がインスリン非依存型糖尿病である。
【０００４】
糖尿病等の疾患に対する薬理作用の確認を目的とする薬効スクリーニング試験は、健常動物ではなく、一定の病態状態にある疾患モデル動物を用いて行なわれている。糖尿病モデル動物の作製方法としては、マウス、ラット、ハムスター、又はモルモット等の動物をモデル動物として、前記動物の膵臓を摘出し、インスリン欠乏症を引き起こす方法や、あるいは、前記動物に、薬物〔例えば、アロキサン又はストレプトゾトシン（ＳＴＺ）等〕、インスリン分泌を抑制する薬、又はインスリン抗体等を投与し、前記動物の膵臓のランゲルハンス島β細胞を特異的に破壊し、インスリン欠乏症を引き起こして、糖尿病を惹起する方法などが公知である。
【０００５】
例えば、特許第２９４８６６９号公報（特許文献１）には、ストレプトゾトシン及びメチルグアニジンを連続投与して作製される腎不全病態モデル動物及びその作製方法が開示されている。また、特開２０００−２７０７１３号公報（特許文献２）には、成熟した動物に、インスリン欠乏症を引き起こす物質（例えば、ストレプトゾトシン）を投与して作製される、進行性のインスリン非依存型糖尿病態モデル動物及びその作製方法が開示されている。
【０００６】
しかし、特許第２９４８６６９号公報に記載のモデル動物では、尿毒症性毒素であるメチルグアニジンを連続投与することにより、腎機能の低下（微量アルブミン尿の増加）を惹起させており、糖尿病に特徴的な代謝異常からの腎機能障害とは一致しない欠点がある。
また、特開２０００−２７０７１３号公報に記載のモデル動物にはマウスが使用され、経時的に糖尿病及び糖尿病性腎症の病態を検討するには、採血量が限定されるなどの欠点がある。
【０００７】
【特許文献１】
特許第２９４８６６９号公報
【特許文献２】
特開２０００−２７０７１３号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は、従来技術の前記の欠点を解消し、ヒト糖尿病の内、２型糖尿病の病態モデルとして、より適切であって、しかも、代謝異常から糸球体硬化が出現し、腎不全への進行が経時的に観察可能なモデル動物及びその作製方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明による、インスリン欠乏症を引き起こす化合物を投与した後、全腎臓の１／２〜３／４を摘出することにより作製される、糖尿病モデル動物によって解決することができる。
また、本発明は、前記糖尿病モデル動物に、高脂肪食を摂取させることにより作製される、糖尿病から糖尿病性腎症に進行するモデル動物に関する。
また、本発明は、インスリン欠乏症を引き起こす化合物を投与した後、全腎臓の１／２〜３／４を摘出する、糖尿病モデル動物の作製方法に関する。
また、本発明は、前記糖尿病モデル動物に、高脂肪食を摂取させる、糖尿病から糖尿病性腎症に進行するモデル動物の作製方法に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の糖尿病モデル動物には、
（１）境界型糖尿病モデル動物、
（２）高血糖型糖尿病モデル動物、及び
（３）糖尿病から糖尿病性腎症に進行するモデル動物（以下、単に、糖尿病性腎症モデル動物と称することがある）
が含まれる。
【００１１】
本明細書において、「境界型糖尿病」とは、正常な状態と糖尿病との境界に位置し、耐糖能試験から基礎インスリン分泌は或る程度保たれつつも、食後のインスリン分泌が少ないか、あるいは、分泌が遅延し、脂肪摂取量が多くなると糖尿病に移行する病態を意味する。
境界型糖尿病の症状としては、例えば、随時血糖値が正常値より若干高値であるが、尿中には糖が出現しない状態を挙げることができる。例えば、ラットの場合には、随時血糖値が正常値（１６３±２２ｍｇ／ｄＬ）より若干高値（１８８±１０ｍｇ／ｄＬ）であるが、尿中には糖が出現しない状態を挙げることができる。
【００１２】
また、本明細書において、「高血糖型糖尿病」とは、膵β細胞からのインスリン分泌が著しく低下し、基礎インスリン及び食後のインスリン不足により高血糖を呈し、尿中に糖が出現する病態を意味する。
【００１３】
また、本明細書において、「糖尿病性腎症」とは、糖代謝異常により発症・進展し、慢性の経過をとる腎臓の疾患を意味する。
糖尿病性腎症の症状としては、例えば、ＤＣＣＴ（Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｔｒｉａｌ）、熊本スタディー、ＵＫＰＤＳ（Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍ　ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ　ｄｉａｂｅｔｅｓ　ｓｔｕｄｙ）、又はＲＣＴ（ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｔｒｉａｌ）の結果からも、糖尿病性腎症の発症・進展に高血圧及び高血糖の関与が明らかにされた。高血糖の下流に大きく分けて３つの経路が推定されている：
（１）糸球体の血行動態の異常（糸球体過剰濾過又は糸球体高血圧）、
（２）糸球体細胞内の代謝異常、及び
（３）非酵素的糖化（グリケーション）による終末糖化産物の産生。
（１）〜（３）により、メサンギウム細胞の形質変換及び／又は細胞外基質産生亢進などが起こり、糸球体硬化へと進展する。
【００１４】
本発明に用いることのできるモデル動物は、ヒトの疾患に対するモデル動物として一般的に用いられている哺乳動物である限り、特に限定されるものではなく、例えば、ラット、マウス、ハムスター、又はモルモット等を用いることができ、ラットを用いることが好ましい。
【００１５】
モデル動物としてラットを用いる場合には、各種試験研究用として幅広く使用されているラットである限り、特に限定されるものではなく、例えば、ジェイシーエル・スプレーグ・ドーリー（Ｊｃｌ−Ｓｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙ）系ラット、ジェイシーエル・ウィスター（Ｊｃｌ−Ｗｉｓｔａｒ）系ラット、Ｃｒｊ：ＳＤ系ラット、又はＣｒｊ：ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）系ラットなどを用いることができる。性別も特に限定されるものではないが、雄が好ましい。雄では、性周期によるホルモン量の変化がないため、病態のばらつきを抑えることができるからである。
【００１６】
本発明の糖尿病モデル動物の内、本発明の境界型糖尿病モデル動物及び本発明の高血糖型糖尿病モデル動物は、例えば、
インスリン欠乏症を引き起こす化合物（例えば、ストレプトゾトシン）を、動物に投与する工程（インスリン欠乏誘発化合物投与工程）、及び
前記インスリン欠乏誘発化合物を投与した動物から、全腎臓の１／２〜３／４を摘出する工程（腎臓摘出工程）
を少なくとも含む、本発明による、境界型又は高血糖型糖尿病モデル動物の作製方法により作製することができる。
【００１７】
より詳細には、本発明の境界型糖尿病モデル動物及び本発明の高血糖型糖尿病モデル動物は、例えば、
（１）インスリン欠乏症を引き起こす化合物を、動物に投与する工程（インスリン欠乏誘発化合物投与工程）、
（２）前記インスリン欠乏誘発化合物投与から所定日数経過後に、血糖値（初回血糖値）を測定する工程（初回血糖値測定工程）、
（３）前記初回血糖値が所定範囲内である動物を選択し、前記インスリン欠乏誘発化合物投与から所定日数経過後に、全腎臓の１／２〜３／４を摘出する工程（腎臓摘出工程）、
（４）前記腎臓摘出から所定日数経過後に、再度、血糖値（第２回血糖値）を測定する工程（第２回血糖値測定工程）、及び
（５）前記第２回血糖値が所定範囲内である動物を選択する工程（最終選択工程）
を含む、本発明による境界型又は高血糖型糖尿病モデル動物の作製方法により、作製することができる。
【００１８】
インスリン欠乏誘発化合物投与工程に用いるインスリン欠乏誘発化合物としては、例えば、ストレプトゾトシンを挙げることができる。ストレプトゾトシン〔Ｎ−（Ｍｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｏｃａｒｂａｍｏｙｌ）−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ；Ｃ８Ｈ１５Ｎ３Ｏ７；ＦＷ＝２６５．２〕は、インスリン欠乏症を引き起こす化合物であり、膵β細胞を選択的に破壊して糖尿病状態を惹起する実験的糖尿病発症剤として知られている。
【００１９】
インスリン欠乏誘発化合物投与工程において、インスリン欠乏誘発化合物の投与方法、例えば、投与手段又は投与量などは、インスリン欠乏症を引き起こすことができる限り、特に限定されるものではなく、例えば、使用するモデル動物の種類などに応じて、適宜選択することができる。
投与手段としては、例えば、静脈（例えば、頸静脈又は尾静脈）内投与、又は腹腔内投与などを用いることができる。
また、ストレプトゾトシンを用いる場合のその投与量としては、通常、ラットでは３５〜４５ｍｇ／ｋｇの投与量で単回投与することができる。
【００２０】
初回血糖値測定工程においては、インスリン欠乏誘発化合物投与から所定日数経過後に、初回血糖値を測定する。測定の時期は、インスリン欠乏誘発化合物の作用によりインスリン欠乏症が引き起こされて血糖値が安定した状態である限り、特に限定されるものではなく、例えば、使用するモデル動物の種類、インスリン欠乏誘発化合物の投与方法、又は投与量に応じて、適宜選択することができる。
例えば、モデル動物としてラットを用いる場合には、インスリン欠乏誘発化合物（例えば、ストレプトゾトシン）投与から３〜９日経過後であることが好ましく、７〜９日経過後であることがより好ましい。３日未満では、インスリン欠乏誘発化合物の効果が充分に発揮されていないことがあり、１０日を越えると、血糖値が経時的に高値となることがある。
なお、インスリン欠乏誘発化合物投与から初回血糖値の測定までの期間は、通常食を自由摂取させることが好ましい。
【００２１】
本明細書においては、血糖値の測定方法としては、グルコースオキシダーゼ法を用いることが好ましい。具体的には、グルコースがグルコン酸に変換されるのと同じ確率で酸素が消費される。この消費された酸素を電極を用いた酵素レート法によりグルコースを測定する。測定機器としては、例えば、シンクロンシステムＣＸ３デルタ（ベックマン社製）を用いることができる。
【式１】
2004141043.tif 000002
【００２２】
また、血糖値測定のための採血時期は、特に限定されるものではないが、モデル動物として一般的に用いられる哺乳動物は夜行性であり、夜間摂餌することから、例えば、午前９時〜午前１１時（空腹時）の一定時間に採血することが好ましい。
【００２３】
腎臓摘出工程では、初回血糖値が所定範囲内である動物を選択し、前記インスリン欠乏誘発化合物投与から所定日数経過後に、腎臓の一方を摘出する。
本工程で腎臓を摘出する動物の初回血糖値の範囲は、例えば、モデル動物の種類に応じて異なるが、糖尿病状態であることが必要である。
例えば、モデル動物としてラットを用いる場合には、初回血糖値が、好ましくは１９３〜６３４ｍｇ／ｄＬ、より好ましくは２１５〜６３４ｍｇ／ｄＬであるラットを選択し、腎臓摘出を行なうことができる。
【００２４】
初回血糖値を指標として選択した動物について、腎臓を摘出する時期は、血糖値が糖尿病状態で安定した時期である限り、特に限定されるものではなく、例えば、使用するモデル動物の種類に応じて、適宜選択することができる。
例えば、モデル動物としてラットを用いる場合には、インスリン欠乏誘発化合物投与から１０〜１６日経過後であることが好ましく、１４〜１６日経過後であることがより好ましい。１０日未満では、手術の急襲で摂餌量が減少することにより血糖値が見掛け上、低下することがある。２０日を越えると、糖尿病が重症化する（インスリン分泌不足が進行する）ことがある。
なお、初回血糖値の測定から腎臓摘出までの期間は、通常食を自由摂取させることが好ましい。
【００２５】
腎臓摘出工程で摘出する腎臓は、全腎臓（すなわち、２個の腎臓）の１／２〜３／４である。例えば、全腎臓の１／２を摘出するとは、例えば、２個の腎臓の一方を全摘出すること、２個の腎臓を各々１／２ずつ部分的に摘出すること、あるいは、２個の腎臓を各々、適当な割合で部分的に摘出し、その割合の合計が１／２となることなどを挙げることができる。一方の腎臓を全摘出するか、あるいは、一方の腎臓を全摘出すると共に、残る腎臓の一部（１個の腎臓の１／２以下）を摘出することが好ましい。一方の腎臓を全摘出する場合には、２個ある腎臓のどちらであることもできるが、右腎を摘出することが好ましい。左腎は、解剖学上、右腎より下部に位置し、病理組織学的検査での生検用として腎臓の一部の採取が容易であるからである。
【００２６】
摘出方法は、特に限定されるものではないが、例えば、ネンブタール麻酔下でラットの右腹部を横切開し、腎内部（動脈、静脈、及び尿管）を鉗子で止め、絹製縫合糸（例えば、ネスコスーチャー製１−０）で鉗子の内側を結紮し、鉗子の外側で右腎臓を全摘出することができる。また、腎臓の一部摘出又は他方の腎臓の摘出は、例えば、縫合糸（５−０）で血流を遮断し、ステンレス製のカミソリ刃で切除し、血液凝固剤（例えば、トロンビン）の滴下により摘出することができる。
【００２７】
第２回血糖値測定工程では、腎臓摘出から所定日数経過後に、第２回血糖値を測定する。測定の時期は、腎臓摘出の影響から回復し、摂餌量及び血糖値が安定した状態である限り、特に限定されるものではなく、例えば、使用するモデル動物の種類に応じて、適宜選択することができる。
例えば、モデル動物としてラットを用いる場合には、腎臓摘出から７日以上経過後であることが好ましく、７〜１０日経過後であることがより好ましい。７日未満では、手術の急襲で摂餌量が減少することにより血糖値が見掛け上、低下することがある。
なお、腎臓摘出から第２回血糖値の測定までの期間は、通常食を自由摂取させることが好ましい。
【００２８】
最終選択工程では、第２回血糖値が所定範囲内である動物を選択することにより、本発明の境界型糖尿病モデル動物又は本発明の高血糖型糖尿病モデル動物を取得することができる。
本発明の境界型糖尿病モデル動物を取得する場合には、本工程で選択する動物の第２回血糖値の範囲は、例えば、モデル動物の種類に応じて異なるが、ヒトでの耐糖能異常又は軽症糖尿病に相当し、尿中への糖の出現は認められない状態であることが必要である。
例えば、モデル動物としてラットを用いる場合には、第２回血糖値が好ましくは１５０〜２１０ｍｇ／ｄＬ（より好ましくは１７０〜２００ｍｇ／ｄＬ）であるラットを選択することができる。
【００２９】
一方、本発明の高血糖型糖尿病モデル動物を取得する場合には、最終選択工程で選択する動物の第２回血糖値の範囲は、例えば、モデル動物の種類に応じて異なるが、ヒトでの１型糖尿病に相当し、尿中への糖の出現も認められる状態であることが必要である。
例えば、モデル動物としてラットを用いる場合には、第２回血糖値が好ましくは２１５〜７００ｍｇ／ｄＬ（より好ましくは２１５〜６３４ｍｇ／ｄＬ）であるラットを選択することができる。
【００３０】
最終選択工程において第２回血糖値を指標として選択することにより得られる、本発明の境界型糖尿病モデル動物は、随時血糖値が正常値より若干高値であるが、尿中には糖が出現しない。また、インスリン分泌低下と、インスリン抵抗性とが観察され、ヒト境界型糖尿病に類似する症状を示す。
また、最終選択工程において第２回血糖値を指標として選択することにより得られる、本発明の高血糖型糖尿病モデル動物は、１型糖尿病、すなわち、インスリン依存性の糖尿病の症状を示す。
【００３１】
本発明の糖尿病性腎症モデル動物は、本発明の境界型糖尿病モデル動物又は高血糖型糖尿病モデル動物に高脂肪食を摂取させることにより作製することができる。すなわち、本発明の糖尿病性腎症モデル動物は、例えば、
インスリン欠乏症を引き起こす化合物（例えば、ストレプトゾトシン）を、動物に投与する工程（インスリン欠乏誘発化合物投与工程）、
前記インスリン欠乏誘発化合物を投与した動物から、全腎臓の１／２〜３／４を摘出する工程（腎臓摘出工程）、及び
腎臓を摘出した動物に、高脂肪食を摂取させる工程（高脂肪食摂取工程）
を少なくとも含む、本発明による、糖尿病性腎症モデル動物の作製方法により作製することができ、より詳細には、
（１）インスリン欠乏症を引き起こす化合物を、動物に投与する工程（インスリン欠乏誘発化合物投与工程）、
（２）前記インスリン欠乏誘発化合物投与から所定日数経過後に、血糖値（初回血糖値）を測定する工程（初回血糖値測定工程）、
（３）前記初回血糖値が所定範囲内である動物を選択し、前記インスリン欠乏誘発化合物投与から所定日数経過後に、全腎臓の１／２〜３／４を摘出する工程（腎臓摘出工程）、
（４）前記腎臓摘出から所定日数経過後に、再度、血糖値（第２回血糖値）を測定する工程（第２回血糖値測定工程）、
（５）前記第２回血糖値が所定範囲内である動物を選択する工程（最終選択工程）、及び
（６）高脂肪食を摂取させる工程（高脂肪食摂取工程）
を含む、本発明による、糖尿病性腎症モデル動物の作製方法により、作製することができる。
【００３２】
本発明による糖尿病性腎症モデル動物の作製方法における、前記工程（１）〜工程（５）は、それぞれ、本発明による境界型又は高血糖型糖尿病モデル動物の作製方法における、前記工程（１）〜工程（５）と同じ工程である。
高脂肪食摂取工程では、最終選択工程で選択された動物（すなわち、本発明の境界型糖尿病モデル動物又は高血糖型糖尿病モデル動物）に、高脂肪食を摂取させる。
本発明の境界型糖尿病モデル動物に高脂肪食を摂取させると、境界型糖尿病から糖尿病性腎症に進行するモデル動物を取得することができる。一方、本発明の高血糖型糖尿病モデル動物に高脂肪食を摂取させると、高血糖型糖尿病から糖尿病性腎症に進行するモデル動物を取得することができる。
【００３３】
前記高脂肪食としては、例えば、用いるモデル動物に対する通常飼料に、脂肪含有量が高くなるように、脂肪を更に添加した飼料を挙げることができる。例えば、モデル動物としてラットを使用する場合には、脂肪含有量が好ましくは４〜５８％、より好ましくは８．６〜１１．３％の高脂肪食を用いることができる。高脂肪食としては、例えば、ラボＭＲ−ＤＢＴ（脂肪含量＝１１．３％，タンパク質含量＝１３．５％；日本農産工業）を用いることができる。
また、糖尿病性腎症の進行を早めるために、更にタンパク質含量を高くした飼料を用いることができる。高タンパク質食としては、例えば、ラボＨ−スタンダード（脂肪含量＝８．６％，タンパク質含量＝３０．４％；日本農産工業）を挙げることができる。
【００３４】
高脂肪食を与える期間としては、糖尿病性腎症の症状が現われるのに充分な期間である限り、特に限定されるものではなく、例えば、使用するモデル動物の種類、又は高脂肪食の種類に応じて、適宜選択することができる。
例えば、モデル動物としてラットを用いる場合には、高脂肪食の摂取を開始してから２０〜３５週間であることが好ましく、３０〜３５週間であることがより好ましい。２０週間未満では、糖尿病性腎症の症状が現われないことがある。
高脂肪食を与える方法も特に限定されるものではないが、病態を一定に保つには、一日当たり４０〜６０ｇに制限することが好ましい。
【００３５】
高脂肪食摂取の結果、本発明による糖尿病性腎症モデル動物が得られたか否かは、糖尿病性腎症に見られる各種症状を指標として判断することができる。例えば、尿中へのアルブミンを主体としたタンパクの出現が認められれば、本発明による糖尿病性腎症モデル動物が得られたと判断することができる。
【００３６】
本発明の糖尿病性腎症モデル動物は、高血糖の持続と高脂血症を呈する。また、尿中タンパク質の増加と同時に、血圧の上昇が認められ、高脂肪食負荷直後から亢進していた腎臓機能（クレアチニンクリアランス；Ｃｃｒ）も低下する。腎臓は肥大し、組織病理所見によれば、糸球体には、び慢性病変から硬化性病変が認められ、ヒトの糖尿病性腎症と類似した症状を示す。
【００３７】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《境界型糖尿病モデルラットの作製》
ジェイシーエル・スプレーグ・ドーリー（Ｊｃｌ−Ｓｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙ）系の雄性ラット（８週齢，体重＝約３００ｇ；日本クレア）２０匹に、インスリン欠乏症を引き起こすストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を４０ｍｇ／ｋｇの量で頸静脈内に注射した。通常食（ＣＥ−２；日本クレア）を自由摂取させ、ストレプトゾトシン投与から９日経過後に、各ラットの血糖値を測定した。この時の血糖値が２１５〜６３４ｍｇ／ｄＬ以上を呈したラット（１９匹）について、血糖値測定から５日経過後（すなわち、ストレプトゾトシン投与から２週間経過後）に、右腎臓の摘出を行なった。腎臓摘出から１０日経過後に、再度、血糖値を測定し、血糖値が２０８ｍｇ／ｄＬ以下であるラット（１４匹）を、本発明の境界型糖尿病モデルラットとして選択した。
なお、ストレプトゾトシンを投与したラットに対する、右腎摘出を行なったラットの割合（すなわち、作製確立の割合）は９５％であり、右腎摘出を行なったラットに対する、血糖値が２０８ｍｇ／ｄＬ以下であるラットの割合は７４％（ストレプトゾトシンを投与したラットに対する、血糖値が２０８ｍｇ／ｄＬ以下であるラットの割合は７０％）であった。
【００３８】
得られた本発明の境界型糖尿病モデルラットでは、再度血糖値を測定した２日後から１０週経過時まで、血中インスリン値が上昇している（右腎摘出時の血中インスリン値に比べて）にもかかわらず血糖値が上昇していることと、後述のトログリタゾン投与実験とから、前記期間の間、末梢骨格筋、肝臓、及び脂肪細胞においてインスリン抵抗性の存在が判明した。
【００３９】
すなわち、得られた本発明の境界型糖尿病モデルラットについて、インスリン感受性を亢進させることが知られているチアゾリジン誘導体であるトログリタゾンを２００ｍｇ／ｋｇ／日の量で２週間にわたって混餌投与したところ、インスリン分泌を増加させないで血糖値を低下させた。結果を表１に示す（各群の個体数＝３匹）。
なお、チアゾリジン誘導体は、膵臓ランゲルハンス島β細胞からのインスリン分泌に影響を与えることなく、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αによるインスリンシグナル伝達系の阻害、あるいは、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）によるグルコース輸送担体（ＧＬＵＴ）−４のトランスロケーションへの阻害を抑える働きがある薬剤であり、インスリン抵抗性の有無を評価するのに一般的に使用される薬剤である。すなわち、ストレプトゾトシン投与により膵β細胞を破壊したラットでは、チアゾリジン誘導体により糖尿病は改善されず、チアゾリジン誘導体が作用するには、インスリン分泌が保たれている必要がある。境界型糖尿病モデルラットでは、トログリタゾンによって血糖値の上昇が抑えられたことから、インスリン抵抗性の存在が判明した。
【００４０】
これまで述べたように、得られた本発明の境界型糖尿病モデルラットは、インスリン分泌低下（正常ラットに比べて）と、インスリン抵抗性とが確認され、ヒト境界型糖尿病に類似する症状を示した。
【００４１】
2004141043.tif 000003
【００４２】
【実施例２】
《糖尿病性腎症モデルラットの作製（１）》
実施例１と同様の操作により得られた、本発明の境界型糖尿病モデルラットを、２群（各群の個体数＝１４匹）、すなわち、脂肪含有量が４．１％である通常食（ラボＭＲストック；日本農産工業）を自由摂取させる通常食群（ＵＣ群）と、脂肪含有量が１１．３％である高脂肪食（ラボＭＲ−ＤＢＴ；日本農産工業）を自由摂取させる高脂肪食群（ＵＨＬ群）とに分け、３７週間観察した。なお、対照群として、右腎臓を摘出し、前記高脂肪食を自由摂取させる右腎臓摘出群（Ｕｎｉ群）を設けた。
【００４３】
結果を図１〜図１６に示す。
図１〜図５は、それぞれ、血清中血糖値（Ｓ−Ｇｌｕ）、インスリン、血圧（ＢＰ）、尿中タンパク排泄量（Ｕ−Ｐｒｏ）、及びクレアチニンクリアランス（Ｃｃｒ）の推移を示すグラフである。
図６〜図１１は、それぞれ、各群における血糖、ヘモグロビンＡ１Ｃ（ＨｂＡ１Ｃ）、中性脂肪（ＴＧ）、総コレステロール（Ｔ−ｃｈｏ）、動脈硬化指数〔Ｔ−ｃｈｏ−ＨＤＬ−ｃ／ＨＤＬ−ｃ（−）〕、及び血中クレアチニン（Ｓ−Ｃｒ）を示すグラフである。
図１２は、各群における腎重量（絶対重量）を示すグラフであり、図１３は、各群における腎重量（相対重量）を示すグラフである。図１４は、各群における肝臓重量（絶対重量）を示すグラフであり、図１５は、各群における肝臓重量（相対重量）を示すグラフである。
なお、図６〜図１５は、３７週間経過後における結果である。
図１６は、３５週間経過後の各群における尿中ペントシジン排泄量を示すグラフである。図１６において、記号「＊」は、ＵＣ群に対する有意差が、ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ検定）であることを意味し、記号「＋」は、Ｕｎｉ群に対する有意差が、ｐ＜０．１（スチューデントのｔ検定）であることを意味する。
【００４４】
この間のラットの状態を観察したところ、持続的に高脂血症を伴う高血糖の糖尿病を発症し、２０週経過時から尿中タンパク質の増加と同時に血圧も上昇し、３０週以降、腎臓の機能（クレアチニンクリアランス；Ｃｃｒ）低下が認められた。
剖検時の腎臓は肥大（高脂肪食群で約３倍増加）し、更に、腎臓の組織病理所見では、通常食群では、メサンギウムの融解像は見られるものの、メサンギウム領域へのマトリックスの増加は認められなかった。高脂肪食群では、メサンギウムの融解とメサンギウム領域の拡大が見られ、その内部は、硬化したマトリックスで置換され、硝子化や硬化が広範囲に認められた。高血糖状態で、しかも、血圧が１５０ｍｍＨｇ以上且つ尿中タンパク質量が１００ｍｇ／日以上のラットでは、糸球体に硝子化や硬化性病変が広範囲に認められた。
【００４５】
以上の結果から明らかなように、本発明の境界型糖尿病モデルラットに高脂肪食を摂取させることにより得られた本発明の糖尿病性腎症モデルラットは、早期ではインスリン分泌不全とインスリン抵抗性が存在し、経時的な高脂肪食の負荷の影響により、高血糖が持続し、脂質代謝異常から高脂血症を呈した。この症状は、ヒトの２型糖尿病の患者の病態を反映する。また、腎症への進行に関係する血圧の上昇と、高血糖により産生が増加する終末糖化産物（ＡＧＥ）の１つであるペントシジンの産生も増加が認められ、腎機能の低下と、腎臓の糸球体における硬化性病変とが認められたことから、糖尿病性腎症モデル（腎症ＩＩ期、ＩＩＩ期から腎不全期まで反映する）として有用であることが判明した。
【００４６】
【実施例３】
《糖尿病性腎症モデルラットの作製（２）》
ジェイシーエル・スプレーグ・ドーリー系の雄性ラット（８週齢，体重＝約３００ｇ；日本クレア）６７匹に、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を５０ｍｇ／ｋｇの量で頸静脈内に注射した。通常食（ＣＥ−２；日本クレア）を自由摂取させ、ストレプトゾトシン投与から５日経過後に、各ラットの血糖値を測定した。この時の血糖値が３００ｍｇ／ｄＬであったラット（６２匹；作製確立の割合＝９０％以上）について、ストレプトゾトシン投与から２週間経過後に、右腎臓の全摘出と左腎臓の１／２の摘出、すなわち、全腎臓の３／４の摘出を行なった。腎臓摘出から１週間経過後に、再度、血糖値を測定し、血糖値が２４６〜５９４ｍｇ／ｄＬであるラット（２９匹）を、本発明の高血糖型糖尿病モデルラットとして選択した。
得られた高血糖型糖尿病モデルラット（１０匹）に、高脂肪食（ラボＭＲ−ＤＢＴ；日本農産工業）を与え、糖尿病を促進させることにより、本発明の糖尿病性腎症モデルラットを得た。
なお、比較のために、全腎臓の３／４の摘出を行なわなかったこと以外は、前記操作をそのまま繰り返した（以下、ＳＴＺ群と称する）。
【００４７】
本モデル群では、１７週間の試験期間中、合併症の一つである白内障が高率に発症した。ＳＴＺ群では発症率が７８％であったのに対して、本モデルでは全例に発症した。
本モデル群及びＳＴＺ群の両方において、摂餌量が、３０ｇ／日／匹から増加し、高脂肪食の摂取開始から２週目以降、５０ｇ／日／匹以上摂取した。
血糖値は、本モデル群及びＳＴＺ群のいずれも、６００〜８００ｍｇ／ｄＬと高値で推移した。
本モデル群及びＳＴＺ群において、同程度の脂質代謝異常が認められた。具体的には、総コレステロールが平均２００〜３００ｍｇ／ｄＬで推移し、中性脂肪が平均２０００ｍｇ／ｄＬで推移した。
本モデル群では、血圧が上昇した（２００ｍｍＨｇ）。ＳＴＺ群では、血圧上昇は認められなかった。
【００４８】
腎臓機能の中で、尿中タンパク質排泄量は、ＳＴＺ群では増加が認められなかったのに対して、本モデル群では、高脂肪食の摂取開始から１０週経過時から増加した。クレアチニンクリアランス（Ｃｃｒ）は、両群とも開始時から亢進した状態であり、クレアチニン（Ｃｒ）及び血液尿素窒素（ＢＵＮ）上昇も認められなかった。
腎臓の重量は、ＳＴＺ群では正常ラットより肥大（左腎比で約２倍）したが、本モデル群では約３．６倍に達した。測定結果を表２に示す。
【００４９】
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【００５０】
腎臓の組織病理所見では、ＳＴＺ群では、メサンギウムの拡大とメサンギウム領域への細胞外基質の増加とが認められるものの、糸球体硬化は認められなかった。一方、本モデル群では、ヒト糖尿病性腎症に特徴的なメサンギウム融解像が見られ、ＳＴＺ群の像で認められた所見の他、糸球体硬化も広範囲に認められた。
本モデルラットは、インスリン依存性、すなわち、１型糖尿病から腎症に陥る動物モデルとして有用であることが判明した。
【００５１】
【発明の効果】
本発明のモデル動物によれば、糖尿病又は糖尿病性腎症に対する、例えば、薬効スクリーニング試験を行なうことができる。また、本発明によるモデル動物の作製方法によれば、短期間で容易に糖尿病性腎症に進行するモデル動物を作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、血清中血糖値（Ｓ−Ｇｌｕ）の推移を示すグラフである。
【図２】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、インスリンの推移を示すグラフである。
【図３】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、血圧（ＢＰ）の推移を示すグラフである。
【図４】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、尿中タンパク排泄量（Ｕ−Ｐｒｏ）の推移を示すグラフである。
【図５】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、クレアチニンクリアランス（Ｃｃｒ）の推移を示すグラフである。
【図６】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、血糖を示すグラフである。
【図７】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、ヘモグロビンＡ１Ｃ（ＨｂＡ１Ｃ）を示すグラフである。
【図８】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、中性脂肪（ＴＧ）を示すグラフである。
【図９】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、総コレステロール（Ｔ−ｃｈｏ）を示すグラフである。
【図１０】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、動脈硬化指数〔Ｔ−ｃｈｏ−ＨＤＬ−ｃ／ＨＤＬ−ｃ（−）〕を示すグラフである。
【図１１】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、血中クレアチニン（Ｓ−Ｃｒ）を示すグラフである。
【図１２】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、腎重量（絶対重量）を示すグラフである。
【図１３】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、腎重量（相対重量）を示すグラフである。
【図１４】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、肝臓重量（絶対重量）を示すグラフである。
【図１５】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、肝臓重量（相対重量）を示すグラフである。
【図１６】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、尿中ペントシジン排泄量を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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