(57)【要約】【課題】生化学解析用ユニットを利用した化学発光法における検出限界を向上させるとともに、再現性、定量性に優れたデータを得ることを可能とする。【解決手段】多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの吸着性領域に、リガンドまたはレセプタを結合させる。このリガンドまたはレセプタに、標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させる。次に、酵素標識抗体を含む反応溶液を吸着性領域を横切るように強制的に流動させて、標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させる。標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した酵素標識抗体に化学発光基質を接触させて、生化学解析用ユニットの吸着性領域から放出される化学発光を光電的に検出する。【選択図】　　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの前記リガンドまたはレセプタに、標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させ、酵素標識抗体を前記標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させ、該標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した前記酵素標識抗体に化学発光基質を反応させる化学発光法において、
前記酵素標識抗体を前記標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させる際に、前記酵素標識抗体を含む反応溶液を前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させることを特徴とする生化学解析用ユニットを利用した化学発光法。
【請求項２】
前記酵素標識抗体を含む反応溶液を前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させた後、該強制的に流動させた時間よりも長い時間、該流動を停止することを特徴とする請求項１記載の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法。
【請求項３】
リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの前記リガンドまたはレセプタに、標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させ、酵素標識抗体を前記標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させ、該標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した前記酵素標識抗体に化学発光基質を反応させる化学発光法において、
前記リガンドまたはレセプタに前記標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させる際に、前記標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドを含む反応溶液を前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させ、前記酵素標識抗体を前記標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させる際に、前記酵素標識抗体を含む反応溶液を前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させることを特徴とする生化学解析用ユニットを利用した化学発光法。
【請求項４】
リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットを内部に着脱可能に取り付ける取付部を有し、前記リガンドまたはレセプタと特異的に結合した標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドと酵素標識抗体を特異的に結合させるための反応容器と、該反応容器内に前記酵素標識抗体を含む反応溶液を流動させる流動手段とからなる化学発光法に用いられる反応装置において、
前記流動手段が、前記酵素標識抗体を含む反応溶液を前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させるものであることを特徴とする化学発光法に用いる反応装置。
【請求項５】
前記流動手段が、さらに、前記標識レセプタまたは標識リガンドを含む反応溶液を前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させるものであることを特徴とする請求項４記載の化学発光法に用いる反応装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標識レセプタまたは標識リガンドを化学発光法（ケミカルルミネッサンス法）により検出する方法に関し、詳しくは多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットを利用して、標識レセプタまたは標識リガンドを化学発光法により検出する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
マイクロアレイ解析システムやマクロアレイ解析システムにおいては、メンブレンフィルタなどの生化学解析用ユニットの表面の異なる位置に、特異的結合物質（ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなど、生体由来の物質と特異的に結合可能で、かつ、塩基配列や塩基の長さ、組成、特性などが既知の物質）を含む溶液を滴下して多数のスポット状領域を形成し、放射線標識物質、蛍光物質、化学発光基質と接触させることによって化学発光を生じさせる標識物質などによって標識された生体由来の物質（ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの抽出、単離などによって生体から採取された、あるいは、採取された後に化学的処理が施された物質であって、放射線標識物質、蛍光物質、化学発光基質などの標識物質によって標識された物質）を、スポット状領域に含まれている特異的結合物質にハイブリダイズ等させて特異的結合物質と特異的に結合させ、多数のスポット状領域に選択的に含まれている放射性標識物質によって蓄積性蛍光体シートの輝尽性蛍光体層を露光し、露光された輝尽性蛍光体層を励起光によって走査して、輝尽性蛍光体層に含まれている輝尽性蛍光体を励起し、輝尽性蛍光体から放出された輝尽光を光電的に検出して生化学解析用データを生成し、あるいは、多数のスポット状領域を励起光によって走査して多数のスポット状領域に選択的に含まれている蛍光物質を励起し、蛍光物質から放出された蛍光を光電的に検出して生化学解析用データを生成し、あるいは、多数のスポット状領城に選択的に含まれている標識物質を化学発光基質と接触させ、標識物質から放出される化学発光を光電的に検出して生化学解析用データを生成することが要求されている。
【０００３】
従来、生化学解析用ユニットを利用した解析システムにおいては、上記ハイブリダイゼーション等を行う際に、実験者が手作業で、特異的結合物質が固定された生化学解析用ユニットをハイブリダイゼーションバッグ内に入れ、ハイブリダイゼーションバッグ内に標識された生体由来物質を含む反応溶液を加え、ハイブリダイゼーションバッグに振動を加えて標識された生体由来物質を対流あるいは拡散によって移動させて、特異的結合物質に標識された生体由来物質を特異的に結合させ、その後、生化学解析用ユニットをハイブリダイゼーションバッグから取り出して、洗浄溶液が満たされた容器内に入れて洗浄する、いわゆる振盪方式によって行うのが一般的であった。
【０００４】
しかしながら、上述の振盪方式の場合、ハイブリダイゼーション反応溶液を特異的結合物質を含む多数のスポット状領域に、均一に接触させることは困難であり、効率的に、特異的結合物質と標識された生体由来物質標識とをハイブリダイズさせることができないという問題があった。
【０００５】
さらに、振盪方式の場合、実験者によってハイブリダイゼーションの結果がばらつき、再現性が低下するという問題があり、また、同じ実験者であっても再現性が低下するおそれがある。
【０００６】
このような問題を解決するために、本出願人は、吸着性領域に標識された生体由来物質を含む反応液を強制的に流動させ、標識された生体由来物質を生化学解析用ユニットの吸着性領域の内部にまで充分に浸透させる方法を提案している（特願２００２−２６８１６号）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、化学発光基質と接触させることによって化学発光を生じさせる標識物質によって生体由来物質を検出する化学発光法を用いた検出方法では、特異的結合物質（以下、化学発光法においてはリガンドまたはレセプタという）に標識された生体由来物質（以下、化学発光法においては標識レセプタまたは標識リガンドという）を特異的に結合した後、さらに、標識レセプタまたは標識リガンドを標識している抗原などの物質に対する抗体に、酵素のように化学発光を生じさせる標識物質で標識し（以下、酵素標識抗体という）、この酵素標識抗体を標識レセプタまたは標識リガンドの抗原と特異的に結合させ、続いて酵素標識抗体の酵素と特異的に結合する化学発光基質を接触させる手順が必要である。
【０００８】
従来の化学発光法では、蛍光物質や放射線物質を用いた生化学解析用ユニットの手順に加えてさらに、標識レセプタまたは標識リガンドが吸着性領域に結合した生化学解析用ユニットを、実験者が手作業で、再びハイブリダイゼーションバッグ内に入れ、ハイブリダイゼーションバッグ内に標識レセプタまたは標識リガンドの抗原と特異的に反応する酵素標識抗体を含む反応溶液を加え、ハイブリダイゼーションバッグに振動を加えて、酵素標識抗体を対流あるいは拡散によって移動させて、酵素標識抗体を標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させ、その後、化学発光基質を接触させて反応させる必要がある。
【０００９】
しかし、従来の振盪方式による化学発光法においては、酵素標識抗体が生化学解析用ユニットの吸着性領域の内部にまで充分に浸透せず、標識されたリガンドまたはレセプタが結合していない吸着性領域の発光量（ノイズあるいはバックグラウンド）に対する、標識された標識レセプタまたは標識リガンドが結合した量に対応する発光量（信号）の比（Ｓ／Ｎ比）が小さく、吸着性領域に結合する標識された標識レセプタまたは標識リガンドが微量（１ピコグラム以下）となると検出することが困難になるという問題があった。
【００１０】
本発明は上記事情に鑑みなされたものであり、生化学解析用ユニットに固定されたリガンドあるいはレセプタに結合した標識レセプタまたは標識リガンドに、効率的に酵素標識抗体を結合させることができ、再現性、定量性に優れたデータを得ることが可能な生化学解析用ユニットを利用した化学発光法を提供することを目的とするものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法は、リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの前記リガンドまたはレセプタに、標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させ、酵素標識抗体を前記標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させ、該標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した前記酵素標識抗体に化学発光基質を反応させる化学発光法において、前記酵素標識抗体を前記標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させる際に、前記酵素標識抗体を含む反応溶液を前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させることを特徴とする方法である。
【００１２】
前記酵素標識抗体を含む反応溶液を前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させた後、該強制的に流動させた時間よりも長い時間、該流動を停止することが好ましい。この場合、前記酵素標識抗体を含む反応溶液を強制的に流動させた後、流動させた時間よりも長い時間、流動を停止してもよいし、前記酵素標識抗体を含む反応溶液の強制的流動と流動停止のサイクルを繰り返して、全体として強制的に流動させた時間よりも長い時間、流動を停止する態様としてもよい。
【００１３】
また、別の態様としては、本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法は、リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの前記リガンドまたはレセプタに、標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させ、酵素標識抗体を前記標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させ、該標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した前記酵素標識抗体に化学発光基質を反応させる化学発光法において、前記リガンドまたはレセプタに前記標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させる際に、前記標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドを含む反応溶液を前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させ、前記酵素標識抗体を前記標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させる際に、前記酵素標識抗体を含む反応溶液を前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させることを特徴とする方法である。
【００１４】
この場合においても、前記酵素標識抗体を含む反応溶液を前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させた後、該強制的に流動させた時間よりも長い時間、該流動を停止することが好ましい。
【００１５】
本発明の化学発光法に用いる反応装置は、リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットを内部に着脱可能に取り付ける取付部を有し、前記リガンドまたはレセプタと特異的に結合した標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドと酵素標識抗体を特異的に結合させるための反応容器と、該反応容器内に前記酵素標識抗体を含む反応溶液を流動させる流動手段とからなる化学発光法に用いられる反応装置において、前記流動手段が、前記酵素標識抗体を含む反応溶液を前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させることを特徴とするものである。
【００１６】
前記流動手段は、前記酵素標識抗体を含む反応溶液を前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させ、さらに、前記標識レセプタまたは標識リガンドを含む反応溶液を前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させるものであることが好ましい。
【００１７】
【発明の効果】
本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法は、酵素標識抗体を標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させる際に、酵素標識抗体を含む反応溶液を生化学解析用ユニットの吸着性領域を横切るように強制的に流動させることとしたので、吸着性領域の内部にまで充分に酵素標識抗体を浸透させることが可能となり、標識レセプタまたは標識リガンドの検出限界を向上させることができ、かつ標識レセプタまたは標識リガンドが微量であってもＳ／Ｎ比の大きい検出を行うことができる。従って、より正確な検出を行うことが可能となるとともに、再現性、定量性に優れたデータを得ることができる。
【００１８】
なお、酵素標識抗体を含む反応溶液を吸着性領域を横切るように強制的に流動させた後、強制的に流動させた時間よりも長い時間、流動を停止することによって、標識レセプタまたは標識リガンドの検出限界をさらに向上させることができるとともに、よりＳ／Ｎ比の大きい検出を行うことが可能となる。
【００１９】
また、リガンドまたはレセプタに標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させる際に、標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドを含む反応溶液を吸着性領域を横切るように強制的に流動させ、かつ酵素標識抗体を標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させる際に、酵素標識抗体を含む反応溶液を吸着性領域を横切るように強制的に流動させることによって、吸着性領域の内部にまで充分に標識レセプタまたは標識リガンドおよび酵素標識抗体を浸透させることが可能となるので、標識レセプタまたは標識リガンドが微量であってもよりＳ／Ｎ比の大きい検出を行うことができる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。図１は本発明のの化学発光法に用いられる生化学解析用ユニットの概略斜視図である。図１に示す生化学解析用ユニット１は、孔３が複数設けられた基板２と、孔３の内部に充填され、多孔性材料が基板２と接着された吸着性領域４とからなる。この吸着性領域４には、構造または特性が既知のリガンドまたはレセプタ５が滴下され、その後の処理により固定化されている。
【００２１】
基板２の材質としては、生化学解析用ユニット内部での光の散乱を防止するために、光を透過させないか、減衰させる材質が好ましく、金属、セラミックが好ましい。また、孔を開ける加工が容易であるプラスチックを基板として用いる場合は、光をより一層減衰させるために、粒子をプラスチック内部に分散させることが好ましい。
【００２２】
金属としては、銅、銀、金、亜鉛、鉛、アルミニウム、チタン、錫、クロム、鉄、ニッケル、コバルト、タンタルあるいは、ステンレス鋼や黄銅などの合金が好ましくあげられる。セラミックとしては、アルミナ、ジルコニア、マグネシア、石英などが好ましくあげられる。プラスチックとしては、ポリエチレンやポリプロピレンなどのポリオレフィン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレートなどのアクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンナフタレートやポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル、ナイロン−６やナイロン−６，６などの脂肪族ポリアミド、ポリイミド、ポリスルフォン、ポリフェニレンサルファイド、ポリジフェニルシロキサンなどのケイ素樹脂、ノボラックなどのフェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリウレタン、酢酸セルロースやニトロセルロースなどのセルロース類、ブタジエン−スチレン共重合体などのコポリマー、さらにはプラスチックをブレンドしたものなどが好ましくあげられる。
【００２３】
基板２に開ける孔３の開口部の面積（サイズ）は、孔３の密度を高めるために、一般には５ｍｍ２　未満であり、好ましくは１ｍｍ２　未満であり、０．３ｍｍ２　未満がより好ましく、さらには０．０１ｍｍ２　未満であることが好ましい。そして、より好ましくは０．００１ｍｍ２　以上であることが好ましい。
【００２４】
孔３のピッチ（隣接する二つの孔の中心から中心までの距離）は０．０５〜３ｍｍの範囲であることが好ましく、孔３の間隔（隣接する二つの孔の端部から端部までの最短距離）は、０．０ｌ〜１．５ｍｍの範囲であることが好ましい。孔３の数（密度）は、一般には１０個／ｃｍ２　以上であり、好ましくは１００個／ｃｍ２　以上、より好ましくは５００個／ｃｍ２　以上、さらには１０００個／ｃｍ２　以上であることが好ましい。そして、好ましくは１０００００個／ｃｍ２　以下、さらには１００００個／ｃｍ２　以下であることが好ましい。なお、必ずしも、孔３は全て図１に示したように等間隔で設けられている必要はなく、幾つかのブロック（単位）に別れてブロック毎に複数の孔が設けられていてもよい。
【００２５】
本発明において、吸着性領域を形成する多孔性材料としては、多孔質材料あるいは繊維材料が好ましく使用される。また、多孔質材料と繊維材料とを併用して吸着性領域を形成することもできる。本発明において、吸着性領域を形成するために使用される多孔性材料は、有機材料、無機材料のいずれでもよく、有機／無機複合体でもよい。
【００２６】
吸着性領域を形成するために使用される有機多孔質材料は、特に限定されるものではないが、活性炭などの炭素多孔質材料あるいはメンブレンフィルタを形成可能な多孔質材料が好ましく用いられる。メンブレンフィルタを形成可能な多孔質材料としては、溶媒に溶解可能なポリマーが好ましく用いられる。溶媒に溶解可能なポリマーとしては、セルロース誘導体（例えば、ニトロセルロース、再生セルロース、セルロースアセテート、酢酸セルロース、酪酸酢酸セルロースなど）、脂肪族ポリアミド類（例えば、ナイロン６、ナイロン６，６、ナイロン４，１０など）、ポリオレフィン類（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンなど）、含塩素ポリマー類（例えば、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなど）、フッ素樹脂類（例えば、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオライドなど）、ポリカーボネート、ポリスルフォン、アルギン酸及びその誘導体（例えば、アルギン酸、アルギン酸カルシウム、アルギン酸／ポリリシンポリイオンコンプレックスなど）、コラーゲンなどがあげられ、これらポリマーの共重合体や複合体（混合体）も用いることができる。
【００２７】
また、吸着性領域を形成するための繊維材料としては、特に限定されるものではないが、好ましくは前述したセルロース誘導体類、脂肪族ポリアミド類などがあげられる。
【００２８】
吸着性領域を形成するために使用される無機多孔質材料は、特に限定されるものではないが、好ましくは、金属（例えば、白金、金、鉄、銀、ニッケル、アルミニウムなど）、金属等の酸化物（例えば、アルミナ、シリカ、チタニア、ゼオライトなど）、金属塩（例えぱ、ヒドロキシアパタイト、硫酸カルシウムなど）及びこれらの複合体などがあげられる。
【００２９】
基板２に複数の孔３を開ける方法としては、ピンで打ち抜くパンチング、電極に高電圧をパルス状に印加して基板を揮発する放電加工、エッチング、レーザー照射などがあげられる。基板の材料が、金属材料またはプラスチック材料の場合は、基板の表面にコロナ放電またはプラズマ放電を施して接着剤を塗工した後、吸着性領域を形成するための多孔性材料をプレスなどの手段により貼り合わせることで生化学解析用ユニットが作製される。貼り合わせる際に、吸着性領域を形成するための多孔性材料を加熱して軟化すると、孔内部に吸着性領域が容易に形成される。また、基板に吸着性領域を形成するための多孔性材料をプレスする場合には、基板と吸着性領域を形成するための材料を、事前に１枚毎に分割してから間欠的にプレスしてもよいし、基板と吸着性領域を形成するための材料をそれぞれ長尺帯状としたものを２つのロール間に連続搬送してもよい。
【００３０】
なお、本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法においては、上記の材料や方法によって作製した生化学解析用ユニットを使用することも可能であるが、市販されている生化学解析用ユニットを用いてもよく、また多孔性の吸着性領域にリガンドまたはレセプタがすでに結合されている生化学解析用ユニットを用いることも可能である。
【００３１】
図２は、本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法に用いられるリアクタ（反応装置）の一の実施の形態を示す概略断面図である。リアクタは、反応容器１０と流動手段２０とからなり、反応容器１０は、反応容器上半部１３と反応容器下半部１４とからなり、反応容器上半部１３は反応容器下半部１４に取り外し可能に設けられている。また、反応容器１０は、リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニット１を内部に着脱可能に取り付ける、上側挟持片１１と下側挟時片１２からなる取付部を有し、生化学解析用ユニット１は反応容器上半部１３を取り外すことによってセットすることができるように構成されている。さらに、反応容器下半部１４の底壁には反応溶液が流通可能な溶液流入口１５が形成され、反応容器上半部１３の頂壁には同様に反応溶液が流通可能な溶液流出口１６が形成されている。
【００３２】
流動手段２０は溶液循環パイプ２１とポンプ２２から構成され、溶液循環パイプ２１の一端は反応容器１０の溶液流入口１５に、他端は溶液流出口１６に取り外し可能に取り付けられている。反応溶液はポンプ２２によって溶液流入口１５から反応容器１０内に入り、生化学解析用ユニット１の吸着性領域４を横切るように強制的に流動した後、溶液流出口１６から出て、溶液循環パイプ２１を通って循環するように構成されている。
【００３３】
図３は、本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法に用いられるリアクタの別の実施の形態を示す概略断面図である。このリアクタは、図２に示すポンプの代わりにシリンジ２３とピストン２４が設けられているもので、反応溶液が反応容器内で往復流動するように構成したものである。このように、反応溶液の強制的流動は、生化学解析用ユニット１の吸着性領域４を往復流動するものであってもよい。
【００３４】
なお、図２および図３はともに、反応溶液が生化学解析用ユニットを循環するタイプのリアクタを示しているが、反応溶液が生化学解析用ユニットの下から上（あるいは上から下）に通過するのみで、反応溶液が循環しないタイプのリアクタを用いることも可能である。
【００３５】
次に、本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法を順を追って説明する。
本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法では、まず、多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの吸着性領域にリガンドまたはレセプタを結合させる。
【００３６】
多孔性の吸着性領域に結合されるリガンドまたはレセプタは、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなどであって、特性、組成、構造あるいは塩基配列や塩基の長さなどが既知のものである。リガンドまたはレセプタは、吸着性領域に滴下した後、紫外線の照射などによって吸着性領域に固定することができる。なお、上述したように、多孔性の吸着性領域にリガンドまたはレセプタがすでに結合されている生化学解析用ユニットを用いる場合には、この段階は省略される。
【００３７】
次に、吸着性領域に結合されたリガンドまたはレセプタに標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させる。標識レセプタまたは標識リガンドは、多孔性の吸着性領域に結合されるリガンドまたはレセプタと特異的に結合するホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの抽出、単離などによって生体から採取された、あるいは、採取された後に化学的処理が施され、標識物質によって標識されたものである。レセプタまたはリガンドを標識する標識物質としては、ジゴキシゲニン、ビオチン、アビジン、フルオロセインなどの抗原、及びこれらの抗原に対する抗体などを好ましくあげることができる。
【００３８】
なお、標識レセプタまたは標識リガンドが、多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプタとではなく、生化学解析用ユニットに設けられた吸着性領域に直接結合または吸着することを防止するために、標識レセプタまたは標識リガンドを含む溶液を生化学解析用ユニットに接触させる前に、いわゆるブロッキング剤を生化学解析用ユニットの吸着性領域に接触させておくことが好ましい。ブロッキング剤は、後述する酵素標識抗体と同様に濾過して用いることが好ましい。
【００３９】
標識レセプタまたは標識リガンドを多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプタと特異的に結合させた後、生化学解析用ユニットを上記図２または図３等に示す、反応溶液を吸着性領域を横切るように強制的に流動させることが可能な反応容器に取り付ける。なお、標識レセプタまたは標識リガンドが吸着性領域を閉塞させるようなものではない、例えば標識ＤＮＡのような場合には、吸着性領域に結合したリガンドまたはレセプタに標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させる段階から生化学解析用ユニットを反応容器に取り付けてもよい。この場合には、吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプタに、標識レセプタまたは標識リガンドを効率的かつ均一に接触させることができるので、標識レセプタまたは標識リガンドの検出限界を向上させることができるとともに、標識レセプタまたは標識リガンドが微量であっても、よりＳ／Ｎ比の大きい検出を行うことができる。
【００４０】
また、多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプタと標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合する段階から、標識レセプタまたは標識リガンドに酵素標識抗体に特異的に結合する段階まで、吸着性領域にそれぞれの反応溶液を強制的に流動させる方法により行うことができるので、工程を単純化することができるとともに、より精度の高い検出が可能となる。
【００４１】
なお、多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプタと標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合する段階から、上記図２または図３等に示す反応容器等を用いて標識レセプタまたは標識リガンドを含む反応溶液を強制的に流動させて行う場合には、その前段階のブロッキング剤を生化学解析用ユニットの吸着性領域に接触させる段階も、反応容器を用いて、ブロッキング剤を含む反応溶液を強制的に流動させて行うことが可能である。このようにすれば、工程を単純化することができるとともに、より正確で、再現性、定量性に優れたデータを得ることが可能となる。
【００４２】
反応容器に取り付けた生化学解析用ユニットは、多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプタに特異的に結合しなかった標識レセプタまたは標識リガンドを除去するために、吸着性領域にいわゆる洗浄液を強制的に流動させて洗浄することが好ましい。吸着性領域を洗浄液が強制的に流動するので、多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプタに特異的に結合していない標識レセプタまたは標識リガンドを、効率的に剥離させ、除去することが可能になり、洗浄効率を大幅に向上することができる。
【００４３】
なお、この洗浄工程は、後述する酵素標識抗体を吸着性領域を横切るように強制的に流動させて標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させた後、特異的に結合しなかった酵素標識抗体を除去する場合にも行うことが好ましい。これによって、標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合していない酵素標識抗体を、効率的に剥離させ、除去することが可能になり、洗浄効率を大幅に向上することができる。
【００４４】
吸着性領域に結合したリガンドまたはレセプタに特異的に結合した標識レセプタまたは標識リガンドに、酵素標識抗体を結合させる前に、吸着性領域の孔径よりも小さい孔径のフィルターで酵素標識抗体を濾過することが好ましい。酵素標識抗体は凝集しやすいため多孔性の吸着性領域に詰まる場合があるが、このように濾過することで吸着性領域の内部にまで充分に酵素標識抗体を浸透させることができる。
【００４５】
吸着性領域の孔径はＰＭＩ（Ｐｏｒｏｕｓ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，　Ｉｎｃ．）社製の多孔質材料自動細孔測定システムにより測定できる。測定手順は、試液で濡らした多孔性の吸着性領域に徐々に圧力を上げて空気を送り込んで空気透過流量を測定し（濡れ流量曲線）、一方、同じ圧力で吸着性領域が試液で濡れていない時の空気透過流量を測定する（乾き流量曲線）。この２つの透過流量を比較することによって（乾き流量曲線の１／２の傾きの曲線と濡れ流量曲線の交わる点の圧力を求め）、圧力と細孔細孔径の関係式から平均細孔径を計算により求めることができる。酵素標識抗体を濾過するフィルターは通常、ある大きさの粒子を通して粒子が通るか通らないかで孔径が規定されているから、上記により測定した吸着性領域の孔径よりも小さい孔径のフィルターを選択し、このフィルターで酵素標識抗体を濾過して用いる。選択されるフィルタの孔径は、吸着性領域の孔径の半分以下であることがより好ましい。
【００４６】
次に、酵素標識抗体を吸着性領域を横切るように強制的に流動させて標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させる。酵素標識抗体を含む反応溶液を吸着性領域を横切るように強制的に流動させた後、強制的に流動させた時間よりも長い時間、流動を停止することが好ましい。強制的に流動させる時間および流動を停止する時間は、リガンドまたはレセプタ、標識レセプタまたは標識リガンドの種類、量等によって異なり一概には言えないが、強制的に流動させる時間が１分〜３０分の場合、流動を停止する時間は３０分〜１時間が好ましい。なお、１分間強制的に流動させた後、３０分間流動を停止し、再び１分間強制的に流動させた後、３０分間流動を停止するといったように、流動と停止をサイクルで繰り返し行ってもよい。
【００４７】
酵素標識抗体は、標識レセプタまたは標識リガンドの標識物質に対する抗体（標識レセプタまたは標識リガンドが抗体である場合には抗原）を酵素で標識したものである。酵素標識抗体の酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼなどの酵素を好ましく用いることができる。
【００４８】
続いて、生化学解析用ユニットを反応容器から取り出して、標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した酵素標識抗体に化学発光基質を接触させる。酵素標識抗体に反応させる化学発光基質は、酵素がアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼである場合には、特に限定するものではないが、それぞれジオキセタン、ルミノール、ルシフェリンを用いることができる。
【００４９】
化学発光基質と酵素との接触によって可視光波長領域の化学発光を生ずるので、これを光電的に検出して生化学解析用画像データを生成すれば、標識レセプタまたは標識リガンドを検出、測定することができる。
以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００５０】
【実施例】
（実施例１）
大きさが９０ｍｍ×９０ｍｍ、厚み１００μｍのＳＵＳ３０４シート（基板材料シート）に、孔径０．３ｍｍの開口部が円形の微細孔を、エッチングによって孔ピッチ０．４ｍｍ、孔間隔０．１ｍｍで、計４００個形成した。
【００５１】
次に、基板材料シートの片面に接着剤を塗工し、続いて基板材料シートに形成した孔内部に入り込んだ接着剤を吸引除去した後、乾燥した。続いて、基板材料シートの接着剤を塗工した面に、ポアサイズ０．４５μｍ、厚み１７０μｍのナイロン６，６メンブレンを重ね、１５０℃に加熱しながら、圧力が１ｃｍ２　当たり３００ｋｇとなるようにプレスして、基板材料シートの孔内部にナイロン６，６メンブレンを圧入することで、ステンレス障壁と多数孔のポリマー充填領域とからなる生化学解析用ユニットを作製した。
【００５２】
ジゴキシゲニンで標識されたｐＢＲ３２８−ＤＮＡ溶液（ロッシュ株式会社製）をＴＥバッファ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌと１ｍＭのＥＤＴＡの混合溶液：ニッポンジーン株式会社製）で希釈して濃度を５０ｐｇ／μｌとした後、熱変性を行ってジゴキシゲニンで標識されたｐＢＲ３２８−ＤＮＡを１本鎖とし、ジゴキシゲニン標識ｐＢＲ３２８−ＤＮＡ溶液を上記で作製した生化学解析用ユニットの吸着性領域に１０ｎｌづつ滴下し、その後紫外線を照射（２５４ｎｍ、３３ｍＪ／ｃｍ２　）して吸着性領域に１本鎖のジゴキシゲニン標識ｐＢＲ３２８／ＢｇＩＩ，ＨｉｎｆＩを固定した。
【００５３】
上記生化学解析用ユニットを図２に示す反応容器に収容し、洗浄バッファ（ロッシュ株式会社製）を滅菌された純水で濃度が１／１０となるように希釈して洗浄液を調整し、生化学解析用ユニットが収容されている反応容器内にこの洗浄液を供給し、ポンプを駆動して生化学解析用ユニットの吸着性領域を洗浄した。
【００５４】
続いて、滅菌された純水で濃度が１／１０となるように希釈したマレイン酸バッファ（ロッシュ株式会社製）を用いて、ブロッキングバッファ溶液（ロッシュ株式会社製）を濃度が１／１０となるように希釈した後、ポリエーテルスルフォン製のフィルター（φ＝０．２μｍ）で濾過してブロッキング剤とした。これを洗浄液を廃棄した後の反応容器内に供給し、所定時間ポンプを駆動した後、所定時間静置することでブロッキング反応を行った。
【００５５】
次に、アンチ−ジゴキシゲニン−ＡＰ−コンジュゲイト（アルカリホスファターゼ標識ジゴキシゲニン抗体）を、ポリビニリデンフルオライド製のフィルター（φ＝０．２μｍ）で遠心濾過後、上記のブロック剤で濃度が１／１００００になるように希釈して酵素標識抗体溶液を調整した。これをブロッキング剤を廃棄した後の反応容器内に供給し、所定時間ポンプを駆動した後、所定時間静置することで抗原抗体反応を行った。
【００５６】
抗原抗体反応の完了後、洗浄バッファを反応容器内に供給し、ポンプを駆動して生化学解析用ユニットの吸着性領域を１５分間洗浄し、これを３回繰り返した。生化学解析用ユニットを取り出して、化学発光基質であるＣＤＰ−ｓｔａｒ（ＣＤＰ−ｓｔａｒ，ｒｅａｄ　ｔｏ　ｕｓｅ：ロッシュ株式会社製）を含む溶液と接触させて、生化学解析用ユニットの吸着性領域から放出される化学発光を冷却ＣＣＤカメラ（ＬＡＳ１０００：富士写真フィルム社製）によって光電的に検出し、デジタル信号を生成した。
【００５７】
（比較例１）
実施例１の１本鎖のジゴキシゲニン標識ｐＢＲ３２８／ＢｇＩＩ，ＨｉｎｆＩが固定された生化学解析用ユニットをハイブリダイゼーションバッグに入れて、実施例１と同じ洗浄液を供給し、ハイブリダイゼーションバッグに振動を加えて５分間振盪させた。続いて、洗浄液を廃棄し、ここに実施例１と同じブロッキング剤を供給して１時間振盪させ、ブロッキング反応を行った。次に、実施例１と同じ酵素標識抗体溶液を供給し、１時間振盪させて抗原抗体反応を行った。抗原抗体反応の完了後、洗浄バッファを反応容器内に供給して１５分間振盪して洗浄し、これを３回繰り返した。洗浄後、生化学解析用ユニットをハイブリダイゼーションバッグから取り出して、化学発光基質であるＣＤＰ−ｓｔａｒを含む溶液と接触させて、生化学解析用ユニットの吸着性領域から放出される化学発光を冷却ＣＣＤカメラＬＡＳ１０００によって光電的に検出し、デジタル信号を生成した。
【００５８】
実施例１において、上記ブロッキング反応および抗原抗体反応のそれぞれのポンプ駆動時間および静置時間を変えた場合のバックグラウンドおよびシグナルのデジタル信号量とＳ／Ｎ比、従来のハイブリダイゼーションバッグの振盪方式で実施した比較例２のバックグラウンドおよびシグナルのデジタル信号量とＳ／Ｎ比をまとめたものを表１に示す。
【００５９】
【表１】
2004093152.tif 000002
【００６０】
表１から明らかなように、酵素標識抗体を標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させる際に、酵素標識抗体を含む反応溶液を生化学解析用ユニットの吸着性領域を横切るように強制的に流動させた実施例１では、酵素標識抗体を含む反応溶液を生化学解析用ユニットの吸着性領域を横切るように強制的に流動させたので、吸着性領域の内部にまで充分に酵素標識抗体を浸透させることが可能となり、反応溶液を強制的に流動させた時間の長短にかかわらず、従来のハイブリダイゼーションバッグを用いた振盪方式の比較例１よりもシグナルが大きく検出され、バックグラウンドは小さく検出された。
【００６１】
また、実施例１から、抗原抗体反応のシグナルの大きさはポンプ駆動時間の長さよりもポンプ駆動後の静置時間の長さに、より大きな影響を受けていた。これは、酵素標識抗体を含む反応溶液を生化学解析用ユニットの吸着性領域を横切るように強制的に流動させた後、その状態で流動を停止すること、さらに言えば、強制的に流動した時間よりも長く流動を停止することによって、酵素標識抗体は標識レセプタまたは標識リガンドと多く接触することができ、かつその結合を強固なものとすることができ、Ｓ／Ｎ比の大きい検出を行うことができたものと推察される。
【００６２】
また、ブロッキング反応においても、反応溶液を生化学解析用ユニットの吸着性領域を横切るように強制的に流動させた後に、その状態で流動を停止した方がよりバックグラウンドが小さく検出された。これは、静置することによって、ブロッキング剤が吸着性領域により安定に結合または吸着したものと推察される。
【００６３】
（実施例２）
ＴＥバッファに溶解した分子量マーカーｐＢＲ３２８／ＢｇＩＩ，ＨｉｎｆＩ（２５ｎｇ／μｌ：ロッシュ株式会社製）を５分間煮沸後、１分間氷冷しｐＢＲ３２８／ＢｇＩＩ，ＨｉｎｆＩを１本鎖とした。これを実施例１で作製した生化学解析用ユニットの吸着性領域にスポットし、その後紫外線を照射（２５４ｎｍ、３３ｍＪ／ｃｍ２　）して、吸着性領域に１本鎖のｐＢＲ３２８／ＢｇＩＩ，ＨｉｎｆＩを固定した。
【００６４】
次に、１００ｍｌ中に、滅菌された純水５２ｍｌ、２０×ＳＳＣ（ニッポンジーン株式会社製）３０ｍｌ、０．５ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２ｍｌ、５０×ｄｅｎｈａｒｄ’ｓ　溶液１０ｍｌ、１０％のＳＤＳ溶液５ｍｌ、濃度１００μｇ／ｍｌのサケ精子の変性ＤＮＡ１ｍｌの割合で含むハイブリダイゼーション溶液を調整した。
【００６５】
ジゴキシゲニンで標識されたｐＢＲ３２８−ＤＮＡ溶液５ｎｇ／μｌをＴＥバッファによって希釈してジゴキシゲニンによって標識されたｐＢＲ３２８−ＤＮＡ溶液の濃度を所定値に調整し、熱変性を行って１本鎖にした後、ハイブリダイゼーション溶液によりさらに希釈して、所定の濃度のジゴキシゲニンによって標識されたｐＢＲ３２８−ＤＮＡ溶液（ハイブリダイゼーション反応溶液）を調整した。
【００６６】
上記生化学解析用ユニットをハイブリダイゼーションバッグに入れて、ここに調整したハイブリダイゼーション反応溶液を満たし、ハイブリダイゼーションバッグに振動を加えて１８時間に亘って振盪し、ハイブリダイゼーション反応を行った。
【００６７】
上記生化学解析用ユニットを図２に示す反応容器に固定し、以下、実施例１と同様に洗浄、ブロッキング反応、抗原抗体反応後、化学発光基質と接触させて、生化学解析用ユニットの吸着性領域から放出される化学発光を冷却ＣＣＤカメラＬＡＳ１０００によって光電的に検出し、デジタル信号を生成した。
【００６８】
（実施例３）
実施例２において、ハイブリダイゼーション反応を図２に示す反応容器に収容してポンプを駆動し、１８時間に亘ってハイブリダイゼーション反応を行った以外は、洗浄、ブロッキング反応、抗原抗体反応、化学発光基質との接触全て実施例２と同様に行って、生化学解析用ユニットの吸着性領域から放出される化学発光を冷却ＣＣＤカメラＬＡＳ１０００によって光電的に検出し、デジタル信号を生成した。
【００６９】
（比較例２）
実施例２のハイブリダイゼーション反応が終了した生化学解析用ユニットを、そのままハイブリダイゼーションバッグに入れたまま、実施例２と同じ洗浄液を供給して５分間振盪した。続いて、洗浄液を廃棄し、ここに実施例１と同じブロッキング剤を供給して１時間振盪しブロッキング反応を行った。次に、実施例１と同じ酵素標識抗体溶液を供給して１時間振盪し、抗原抗体反応を行った。抗原抗体反応の完了後、洗浄バッファを反応容器内に供給して１５分間振盪して洗浄し、これを３回繰り返した。洗浄後、生化学解析用ユニットを取り出して、化学発光基質であるＣＤＰ−ｓｔａｒを含む溶液と接触させて、生化学解析用ユニットの吸着性領域から放出される化学発光を冷却ＣＣＤカメラＬＡＳ１０００によって光電的に検出し、デジタル信号を生成した。
【００７０】
実施例２，３および比較例２において、ジゴキシゲニンで標識されたｐＢＲ３２８−ＤＮＡ量を変化させた場合の、バックグラウンドおよびシグナルのデジタル信号量とＳ／Ｎ比をまとめたものを表２に示す。
【００７１】
【表２】
2004093152.tif 000003
【００７２】
表２から明らかなように、ハイブリダイゼーション反応を従来のハイブリダイゼーションバッグを用いた振盪方式、抗原抗体反応を本発明の反応装置で実施した実施例２およびハイブリダイゼーション反応、抗原抗体反応ともに本発明の反応装置で実施した実施例３は、ハイブリダイゼーション反応、抗原抗体反応ともに従来のハイブリダイゼーションバッグを用いた振盪方式で実施した比較例２に比べて、はるかに微量のジゴキシゲニン標識ｐＢＲ３２８−ＤＮＡをＳ／Ｎ比を大きく検出することができた。
【００７３】
以上のように、本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法は、酵素標識抗体を標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させる際に、酵素標識抗体を含む反応溶液を生化学解析用ユニットの吸着性領域を横切るように強制的に流動させることとしたので、吸着性領域の内部にまで充分に酵素標識抗体を浸透させることが可能となり、標識レセプタまたは標識リガンドが微量であってもＳ／Ｎ比の大きい検出を行うことができた。
【００７４】
また、実施例３からも明らかなように、リガンドまたはレセプタに標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させる際にも、標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドを含む反応溶液を吸着性領域を横切るように強制的に流動させることによって、標識レセプタまたは標識リガンドがさらに微量であってもよりＳ／Ｎ比の大きい検出を行うことができた。
【００７５】
また、酵素標識抗体を含む反応溶液を吸着性領域を横切るように強制的に流動させた後、強制的に流動させた時間よりも長い時間、流動を停止することによって、よりＳ／Ｎ比の大きい検出を行うことが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の化学発光法に用いられる生化学解析用ユニットの概略斜視図
【図２】本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法に用いられるリアクタの一の実施の形態を示す概略断面図
【図３】本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法に用いられるリアクタの別の実施の形態を示す概略断面図
【符号の説明】
１　　生化学解析用ユニット
２　　基板
３　　孔
４　　吸着性領域
５　　リガンドまたはレセプタ
１０　反応容器
１１　上側挟持片
１２　下側挟持片
２０　流動手段
２２　ポンプ
【図１】
2004093152.tif 000004
【図２】
2004093152.tif 000005
【図３】
2004093152.tif 000006