(57)【要約】【課題】  角質細胞間接着に関連するポリペプチドを同定し、それを用いた化粧料及び方法を提供する。【解決手段】  本発明は、表皮に特異的で角質層細胞接着に役割を果たす少なくとも１種の精製された天然又は合成ポリペプチドを生理的に許容可能な媒体中に含有する化粧品又は製薬組成物。生成されたポリペプチドのタンパク分解から誘導されたポリペプチド混合物を含んでなる化粧品又は製薬組成物、角質層の細胞接着を強化する美容処理方法、及び角質層の細胞接着を減少させて落屑を促進する美容処理方法。ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列で表されるものである。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の精製された天然又は合成ポリペプチドを生理的に許容可能な媒体中に含有する、表皮、特に角質層の薄化を改善し、及び／又は皮膚被覆の過剰な脆さを改善し、及び／又は角質細胞間接着を強化し、及び／又は角質層の層厚化を誘導するための化粧品組成物において、上記ポリペプチドが次の配列番号１：
2004256552.tif 000007
2004256552.tif 000008
のアミノ酸配列からなることを特徴とする組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明の主題は、角質細胞間接着（intercorneocyte cohesion）にある種の役割を持つ、表皮に特異的な少なくとも１種の精製された天然又は合成ポリペプチドを生理的に許容可能な媒体中に含んでなる化粧品又は製薬組成物にある。本発明の主題は、また、精製されたポリペプチドのタンパク分解から得られたポリペプチド混合物を含有する化粧品又は製薬組成物、角質細胞間接着を強化する美容処理方法及び角質細胞間接着を減少させ、以って落屑を促進する美容処理方法にある。  
【０００２】
ヒトの皮膚は２つの区画、すなわち深部区画である真皮と表面区画である表皮からなる。
真皮は表皮に対して堅牢な支持部となる。真皮はまたフィーダー成分でもある。真皮は、主として線維芽細胞と細胞外マトリックスとからなり、細胞外マトリックス自体は主にコラーゲンとエラスチンと基底物質と呼ばれる物質とから構成され、これら成分は線維芽細胞によって合成される。白血球、肥満細胞又は組織マクロファージもまたその内部に見出される。更に、真皮には血管と神経線維も存在している。 
【０００３】
天然のヒトの表皮は、非常に支配的であるケラチノサイト、メラノサイト(メラニン形成細胞)及びランゲルハンス細胞である３種の細胞から主として構成される。これらの細胞型の各々は、その特定の機能を通して、生物において皮膚が果たす本質的な役割に寄与する。
【０００４】
表皮は、通常、表皮の胚芽層を構成するケラチノサイトの基底層と、胚芽細胞上に配された数層の多面細胞からなるいわゆる有棘細胞層と、はっきりした細胞質封入体、ケラトヒアリン顆粒を含む平坦細胞からなるいわゆる顆粒層と、最後に、角質細胞（コルネオサイト：corneocytes）と呼ばれる分化の最終段階のケラチノサイトからなる角質層（horny layer又はstratum corneum）と呼ばれる最上層とに分けられる。これら角質細胞はケラチノサイト由来の無核で乾燥化した細胞である。 
【０００５】
角質細胞は、角質又は角質化膜（エンベロープ）と呼ばれる１５ｎｍ厚の非常に強い抵抗性を示す構造体で包囲された、サイトケラチンを含む線維マトリックスから主として構成されている。これらの角質細胞が重なって、表皮の障壁機能を果たしている角質層を構成している。正常な落屑過程の間に、最も表面の角質細胞が表皮の表面から分離する。
【０００６】
角質層において、角質ソーム（corneosomes）又は角質デスモソーム（corneodesmosomes）と呼ばれるデスモソーム由来の細胞間構造が研究されている。最近の研究により、角質デスモソームが角質細胞間接着並びに落屑過程においてキーとなる重要性を有していることが明らかになった。特に、デスモグレインＩのようなある種の角質デスモソーム成分のタンパク分解と細胞解離との間に密接な相関関係がある。 
トリプシン又はキモトリプシン型の幾つかのセリンプロテアーゼ、特に角質層のキモトリプシン酵素（角質層キモトリプシン酵素）が角質デスモソームのタンパク分解に関与していると思われる。
【０００７】
皮膚の多数の病理学的症状は厚い角質層の生成と異常な落屑、すなわち角質増殖によって特徴付けられる。後者は、あらゆる解剖学的皮膚領域に多様な臨床情況で起こり得る。その生理病理学的実体及び原因は多様である。 
例えば： 
−乾燥症（すなわち皮膚の乾燥）、 
−魚鱗癬、 
−乾癬、 
−ある種の良性又は悪性腫瘍障害 
−反応性角質増殖、 
を挙げることができる。 
【０００８】
他の病理学的症状は、正常では角質化されていないが、角質化される、すなわち、異常な上皮で被覆されてその表面に角質層を形成する、粘膜、マルピーギ又は他のレベルでの分化転換又は化生により特徴付けられる。多くの場合、生殖器粘膜及び上部アエロ消化管が関与しているが、これら化生は種々の解剖学的領域に存在し得る。例としては： 
−脱出症中における子宮頸部の白血球角化症（leukokeratosis）、 
−頬の白血球角化症、 
−マルピーギ粘膜の角質化良性腫瘍障害、 
を挙げることができる。 
【０００９】
これに対して、ある病理学的症状は表皮、特に角質層の層薄化を惹起し、皮膚の被覆の過剰な脆弱化をもたらす。層薄化は様々な解剖学的領域に存在し得、その原因は様々で、構成的又は後天的でありうる。
例としては、
−血管の病理学的症状を持つ患者における下肢の栄養性皮膚疾患：結節状静脈、動脈症(糖尿病、動脈硬化症等)、
−有痛性骨萎縮症候群の意味での栄養性皮膚疾患、
−異常瘢痕化に続く栄養性疾患、
を挙げることができる。
【００１０】
角質細胞間接着に関与するポリペプチドの精製と知識は、特に皮膚表面における、この種のポリペプチドの過剰又は不足による影響に抗するための生成物の生産を可能にする一つの経路である。 
【非特許文献１】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, Vol.90, p.9470-9474
【００１１】
本発明の目的の一つは、角質細胞間接着に関与するポリペプチドを精製形態で含有する組成物を提供することにある。 
表皮のタンパク質のなかでも低いその提示、及びその高い不安定性とプロテアーゼに対するその高い感受性のために、長期に渡って鋭意研究を行った結果、本出願人は、角質化上皮に特異的なポリペプチドをヒトの表皮から生化学的方法により同定し、単離し、精製した。以後本明細書において 「角質デスモシン（corneodesmosine）」と呼ぶこのポリペプチドは表皮の角質層に発現され、角質細胞間接着に関与する。本出願人はその一次アミノ酸配列を決定した。
【００１２】
よって、本発明の主題は、生理的に許容可能な媒体中に少なくとも１種の精製された天然又は合成ポリペプチドを含有してなる化粧品又は製薬組成物であって、上記ポリペプチドが次のアミノ酸配列（配列番号：１）：
2004256552.tif 000002
2004256552.tif 000003
に対応することを特徴とする組成物にある。
【００１３】
本発明のポリペプチドは天然由来でも合成由来であってもよい。合成物とは、化学的に、又はこの生産に必要な成分を生物体に導入した後に該生物体中で生産させることによって得られる全てのポリペプチドを意味するものと理解される。 
本発明のポリペプチドは、任意の可能な起源、すなわち動物、特に哺乳類、より詳細にはヒト由来、又は植物由来、又は微生物（とりわけ、ウイルス、ファージ又は細菌）由来、又は真菌由来のものであってよく、由来する生物体中に自然に存在しているかいないかについて予め判断する必要はない。 
【００１４】
好ましくは、本発明のポリペプチドは天然由来のもので、哺乳類の組織、特に哺乳類の皮膚から精製される。 
好ましくは、本発明のポリペプチドはヒトの皮膚、さらに好ましくはヒトの表皮から精製される。 
【００１５】
上述したように、角質細胞間の接着は、とりわけ、角質細胞間結合（junction）に関連した構造に特異的なポリペプチドが角質層中に存在するために生じることは明らかである。 
従って、本発明のポリペプチドは角質層と顆粒層に特異的であり、好ましくは本発明に係るポリペプチドは角質細胞間結合、特に角質デスモソームの結合に関連した構造に特異的である。
【００１６】
一般に、細胞中に見出される成熟ポリペプチドは、その配列に成熟ポリペプチドの配列を含む先駆物質の成熟から派生することが知られている。 
従って、本発明は、また、配列が部分的に本発明のポリペプチドの配列からなる任意のポリペプチドを生理的に許容可能な媒体中に含有してなる化粧品又は製薬組成物にも関する。  
【００１７】
更に、ポリペプチドは、翻訳後に修飾を受けてもよく、例えばジスルフィド結合の形成、特定のタンパク分解による切断、炭水化物の添加（グリコシル化）、リン酸化で、特にセリン及び／又はスレオニン及び／又はチロシンのレベルでのもの、及び／又は脂質との組合せによるものを受けてもよいことも知られている。 
【００１８】
よって、本発明は、より詳細には、翻訳後の修飾を受けた又は受けていない、本発明の少なくとも１種のポリペプチドを生理的に許容可能な媒体中に含有する化粧品又は製薬組成物に関する。  
本発明のポリペプチドは、一又は複数の翻訳後の修飾を受けていてよい。 
好ましくは、本発明のポリペプチドはグリコシル化及び／又はリン酸化される。 
ポリペプチドをその等電点に従って分類することが知られている。好ましくは本発明のポリペプチドは塩基性である。
【００１９】
もちろん、一次アミノ酸配列並びにポリペプチドが受ける様々な翻訳後修飾のために、上記ポリペプチドがキロダルトンで表されるその分子量により特徴付けられるということになる。
本発明のポリペプチドは、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）により測定して、５０と６０キロダルトンの間、好ましくは５２と５６キロダルトンの間の見掛け分子量を有している。
最も好ましくは、本発明のポリペプチドは、５０と６０キロダルトンの間、好ましくは５２と５６キロダルトンの間の見掛け分子量を有している塩基性のリン酸化されたグルコシル化ポリペプチドである。
【００２０】
従って、好ましくは、本発明の主題は、生理的に許容可能な媒体中に本発明の少なくとも１種のポリペプチドを含有する化粧品又は製薬組成物にあり、該ポリペプチドは、リン酸化され、塩基性でグリコシル化され、５０と６０キロダルトンの間、好ましくは５２と５６キロダルトンの間の見掛け分子量を有している。
【００２１】
ポリペプチドの一次アミノ酸配列がプロテアーゼにより特異的に認識される部位を決定し、ひとたびこれらの部位が認識されると、プロテアーゼが該ポリペプチドに付着しあるいは付着しないで、タンパク分解によるその切断を誘発することも知られている。
従って、本発明は、生理的に許容可能な媒体中に本発明のポリペプチドのタンパク分解から誘導される少なくとも１種のポリペプチド混合物を含有する化粧品又は製薬組成物にも関する。
【００２２】
上述したように、ある種の病理学的症状は角質細胞間接着に関与するポリペプチドの欠乏によると思われる過剰な落屑によるものであり得る。
ある種の病理学的症状は表皮、特に角質層の薄層化を引き起こし、皮膚の被覆を過剰に脆いものとする結果となるが、これはあらゆる解剖学的皮膚領域に存在し得、構成的であれ後天的であれ、様々な原因を有する。
従って、本発明に係る組成物は、表皮、特に角質層の薄層化を治療し、及び／又は皮膚の被覆の過剰な脆さを治療し、及び／又は角質細胞間接着を強化し、及び／又は角質層の層厚化を誘発するためのものである。
【００２３】
同様に、本発明に係る組成物は、表皮、特に角質層の薄層化を治療し、及び／又は皮膚の被覆の過剰な脆さを治療し、及び／又は角質細胞間接着を強化し、及び／又は角質層の層厚化を誘発するためのものである。
同様に、本発明の組成物は、繰り返し微小外傷(microtraumas)を受けなければならない皮膚領域のレベルでの角質層の局在的層厚化を生じさせるために使用することができる。
例としては、スポーツ愛好家における表皮下疱疹（「膨大部」）の予防的治療が挙げられる。
【００２４】
本発明の主題は、また、表皮、特に角質層の薄層化を治療し、及び／又は皮膚の被覆の過剰な脆さを治療し、及び／又は角質細胞間接着を強化し、及び／又は角質層の層厚化を誘発するための美容処理方法であって、本発明に係る化粧品組成物を処理されるヒトの皮膚に塗布することを特徴とする方法である。
本発明の主題は、また、例えば結節状静脈、動脈症(糖尿病、動脈硬化症等)のような血管の病理学的症状を持つ患者の栄養性皮膚疾患、有痛性骨萎縮症候群を持つ患者の栄養性皮膚疾患又は異常瘢痕化に続く栄養性疾患を持つ患者の栄養性皮膚疾患を処置する美容処理方法にある。
【００２５】
本発明に係るタンパク質の一次アミノ酸配列の分析により、タンパク質が既知のプロテアーゼに対する認識及び結合部位又は化学試薬による切断に対する特異的部位を有していることが示される。例えば、キモトリプシン、カテプシン、プロテアーゼＫ、サブチリシン、プロテアーゼＶ８、サーモリシン、トロンビン、トリプシン、パパイン、ペプシン、プロリン-エンドペプチダーゼ、エンドプロテアーゼＧｌｕＣ、エンドプロテアーゼＬｙｓＣ、エンドプロテアーゼＡｓｐＮ、エンドプロテアーゼＡｒｇＣ（クロストリペイン）、粘液細菌(Myxobacter)ＡＬ１１７、エラスターゼ、角質層のキモトリプシン酵素、臭化シアン、Ｎ-クロロスクシンイミドに対する部位又は酸加水分解（７０％蟻酸、７Ｍグアニジン-ＨＣｌ、４０℃、２４時間）に対する特異的部位が挙げられる。
【００２６】
角質細胞間接着は、例えば特に本発明のポリぺプチドのような角質細胞間結合に関連した構造に特異的なポリペプチドが角質層に存在するために生じることは明らかである。ある種の角質増殖病理症状は、特に本発明のポリペプチドによる、過度の角質細胞間接着に関係していることが分かった。 
従って、本発明の主題は、エンドプロテアーゼＬｙｓＣ、エンドプロテアーゼＧｌｕＣ、プロリン-エンドペプチダーゼ、トロンビン、ペプシン、粘液細菌ＡＬ１１７及びエラスターゼから選ばれる、本発明のポリペプチドに対して活性な少なくとも１種のプロテアーゼの有効量を生理的に許容可能な媒体中に含有する化粧品又は製薬組成物である。
これらのプロテアーゼは植物、動物、細菌、ウィルス又は真菌から単離することができる。
【００２７】
本発明のポリペプチドはグリコシル化されていてもよい。従って、上述の組成物は、植物、動物、真菌又は微生物、特に細菌から単離されるものから選択することができるグリコシダーゼを加えて含有していてもよい。例として、ノイラミニダーゼ、マンノシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、Ｎ-アセチルグルコサミニダーゼ及びＮ-アセチルガラクトサミニダーゼを挙げることができる。
【００２８】
上記において見たように、ある種の病理学的症状は、層厚化した表皮角質層の生産及び異常な落屑、すなわち任意の解剖学的皮膚領域、様々な臨床態様において生じ得、その生理病理学的基層及び原因が変わりうる角質増殖により特徴付けられる。
また本発明は、例えば角質増殖、乾燥症（すなわち皮膚の乾燥）、魚鱗癬、乾癬、ある種の良性又は悪性腫瘍障害による角質増殖、及び反応性角化症を治療するための、上述のプロテアーゼを含有する化粧品又は製薬組成物に関する。
【００２９】
さらに本発明は、通常は角質化されていないが、角質化される粘膜、マルピーギ又は他のレベルでの分化転換又は化生により特徴付けられる病理学的症状、例えば脱出症中における子宮頸部の白血球角化症、頬の白血球角化症、マルピーギ粘膜の角質化良性又は悪性腫瘍障害を治療するための、上述のプロテアーゼを含有する化粧品又は製薬組成物に関する。
【００３０】
本発明の他の目的は、過剰な角質細胞間接着に抗し、よって落屑を増大させ、特に本発明のポリペプチドによる過剰を増大させる美容処理方法を提供するものであり、該方法は、本発明のポリペプチドの一次アミノ酸配列内に特異的な認識及び／又は結合及び切断部位を持つ少なくとも１種のプロテアーゼを含有する化粧品組成物を皮膚に塗布することからなる。 
【００３１】
タンパク質は該タンパク質をコードするデオキシリボ核酸の鋳型から細胞中において合成されることが知られている。遺伝子コードが変性していることもまた知られている。従って、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列は、様々な天然又は合成のデオキシリボ核酸配列から誘導することができる。ここで、合成のデオキシリボ核酸配列とは化学的に又は遺伝子工学的に得られる任意の配列を意味するものと理解される。
【００３２】
上記デオキシリボ核酸配列は、あらゆる可能な由来、すなわち動物、特に哺乳動物、更に詳細にはヒト由来あるいは植物由来又は微生物由来（とりわけウィルス、ファージ、又は細菌）又は真菌由来のものから、上記由来の生物中に天然に存在する等の事実を前もって判断しなくとも、誘導することができる。
【００３３】
本出願人は、本発明のポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸断片を、分子生物学の技術、特にヒトの表皮から調製した相補デオキシリボ核酸の発現のためのライブラリのスクリーニング法を利用して、単離、精製し、配列決定した。
従って、本発明の主題は、また、その全て又は一部が本発明のポリペプチドの一次アミノ酸配列をコードする天然もしくは合成の任意のデオキシリボ核酸を生理的に許容可能な媒体中に含有する化粧品又は製薬組成物である。
【００３４】
これらの研究の間、本出願人は本発明のポリペプチドの一次アミノ酸配列をコードするデオキシリボ核酸をヒトの皮膚から単離し精製することができた。
特に、本発明の主題は、次のコードヌクレオチド配列（配列番号２）：
2004256552.tif 000004
を少なくとも含んでなる単離されたデオキシリボ核酸断片を生理的に許容可能な媒体中に含有する化粧品又は製薬組成物にある。
【００３５】
本発明の主題はまた上記配列番号２に対応するセンス又はアンチセンスリボ核酸配列を生理的に許容可能な媒体中に含んでなる化粧品又は製薬組成物にある。
本発明の主題は、また、例えば再構成培地からのインビトロ合成、又は生物による合成のような任意の既知の方法による本発明のポリペプチド又は対応するリボ核酸の生産に対しての上記デオキシリボ核酸配列の使用にある。
【００３６】
また本発明の主題は、上記の精製されたポリペプチド又は上記の精製されたタンパク分解断片又は上記合成ペプチドに特異的に結合可能な任意の構造又は機能分子を、必要に応じて表皮から、調製又は精製するために、本発明のポリペプチド、又はそのタンパク分解断片、及びその配列から推論された任意の合成ペプチドを使用することにある。この分子は、「プロテアーゼ」、「グリコシダーゼ」又は「ホスファターゼ」型の、角質デスモソーム及び角質層の種々の酵素に特異的な他の構造タンパク質に特に相当し得るものである。 
【００３７】
更に本発明の主題は、特にそのタンパク質とその断片の精製を目的とした特異的モノクローナル抗体及び抗血清を調製するために、本発明のポリペプチド又はそのタンパク分解断片及びその配列から推論される任意の合成ペプチドを使用することにある。広義には、本発明の主題は、その産生に使用する生物学的系にかかわらず、組換え抗体又は抗体断片を産生するための、上記配列のあらゆる使用にもある。
【００３８】
その性質が何であれ、本発明の組成物は、摂取され、注射され、又は皮膚（体の任意の皮膚領域）もしくは粘膜（頬、頬骨、歯肉、生殖、結膜等）へ塗布することができる。
好ましくは、本発明の組成物は皮膚又は粘膜に塗布される。
投与方法に応じて、本発明の組成物は、通常使用される任意のガレノス形態（galenical forms）で提供することができる。
【００３９】
皮膚への局所適用用には、本組成物は、特に、水性又は油性の溶液、又は漿液型又はローションの分散液、水性相に脂肪相を分散（Ｏ／Ｗ）して、又はその逆（Ｗ／Ｏ）によって得られる、液状又は半液状のコンシステンシーのミルク型のエマルション、又は軟性のコンシステンシーの水性又は無水のクリーム又はゲル型のエマルション又は懸濁液、又はマイクロカプセルもしくはマイクロ粒子、又はイオン性及び／又は非イオン性の小胞分散液、あるいは加圧された噴霧剤を更に含有するエアゾール組成物の形態とすることができる。これらの組成物は常法により調製される。 
【００４０】
注射用には、本組成物は、水性又は油性のローションの形態又は漿液の形態で提供することができる。眼用には点滴薬の形態、摂取用には、カプセル、顆粒、シロップ又は錠剤の形態で提供することができる。 
本発明の組成物の種々の成分の量は、考慮される分野で、従来より使用されている量である。
【００４１】
これらの組成物は、特に、顔、手、足、大きな解剖学上のヒダ又はボディのクレンジング、保護、トリートメント又は手入れ用のクリーム（例えば、デイクリーム、ナイトクリーム、メークアップ除去用クリーム、ファンデーションクリーム、抗日光用クリーム）、液状ファンデーション、メークアップ除去用ミルク、ボディ保護又は手入れ用ミルク、抗日光用ミルク、スキンケア用ローション、ゲル又はムース、例えばクレンジングローション、抗日光用ローション、人工的な日焼け用ローション、入浴用組成物（bath composition）、殺菌剤を含有する脱臭用組成物、アフターシェービングゲル又はローション、脱毛クリーム、昆虫忌避用組成物、鎮痛用組成物又はある種の皮膚疾患、例えば湿疹、しゅさ、乾癬、苔蘚及び激しい痒みの治療用の組成物を構成することができる。
【００４２】
更に、本発明の組成物は、クレンジングソープ又はケーキを構成する固体状の調製物からなるものであってもよい。
また、本組成物は、加圧された噴霧剤を更に含有するエアゾール組成物の形態に包装されてもよい。
【００４３】
また更に、本発明の組成物は、頭皮の手入れ用組成物、特にシャンプー、ヘアセット用ローション、トリートメントローション、スタイリングクリーム又はゲル、染毛シャンプーの形態であってもよい染色（特に酸化染色用）組成物、髪の再構成用(restructuring)ローション、パーマネントウエーブ用組成物（特に、パーマネントウエーブ施術の第１工程用の組成物）、抜毛防止用のゲル又はローション、駆虫用シャンプー等々にすることもできる。 
【００４４】
また、本組成物は、頬歯（dentibuccal）用、例えば、練り歯磨きに使用することもできる。この場合、本組成物は、頬用の組成物に一般的なアジュバントと添加剤、特に、界面活性剤、増粘剤、保湿剤、研磨剤、例えばシリカ、種々の活性成分、例えばフッ化物、特にフッ化ナトリウム、及び任意の甘味料、例えばサッカリンナトリウムを含有してもよい。 
【００４５】
本組成物がエマルションである場合、脂肪相の割合は、組成物の全重量に対して５〜８０重量％、好ましくは５〜５０重量％である。エマルションの形態の組成物に使用される油、ロウ、乳化剤及び共乳化剤は、化粧品の分野で従来より使用されているものから選択される。乳化剤及び共乳化剤は、組成物中に、組成物の全重量に対して０．３〜３０重量％、好ましくは０．５〜２０重量％の範囲の割合で存在する。エマルションは、脂質小胞体を更に含有していてもよい。  
【００４６】
本組成物が油性ゲル又は溶液である場合、脂肪相は組成物の全重量に対して９０％より多くしてもよい。 
また、公知の方法に従って、本化粧品用組成物は、化粧品の分野で一般的なアジュバント、例えば親水性又は親油性のゲル化剤、親水性又は親油性の添加剤、防腐剤、酸化防止剤、溶媒、香料、フィラー、遮蔽剤、臭気吸収剤及び着色物質を含有してもよい。これら種々のアジュバントの量は、化粧品の分野において常套的に使用されている量、例えば、組成物の全重量に対して０．０１〜１０％である。これらのアジュバントは、その性質に応じて、脂肪相、水性相及び／又は脂質小球体に取り込まれ得る。
【００４７】
本発明において使用することができる油又はロウとしては、鉱物性油（ワセリン）、植物性油（シェアバターの液状留分、ヒマワリ油）、動物性油（ペルヒドロスクワレン）、合成油（プルセリン油：Purcellin oil）、シリコーン油又はロウ（シクロメチコーン）及びフッ化油（ペルフルオロポリエーテル）、ミツロウ、カルナウバ又はパラフィンロウを挙げることができる。脂肪アルコールと脂肪酸（ステアリン酸）をこれらの油に添加してもよい。 
【００４８】
本発明において使用することができる乳化剤としては、例えば、ステアリン酸グリセロール、ポリソルベイト（polysorbate）６０及びガッテフォセ（Gattefosse）社からテフォース（Tefose）Ｒ６３の名称で販売されているＰＥＧ−６／ＰＥＧ−３２／ステアリン酸グリコールの混合物を挙げることができる。 
本発明で使用可能な溶媒としては、低級アルコール、特に、エタノール及びイソプロパノール及びプロピレングリコールを挙げることができる。 
【００４９】
本発明で使用可能な親水性のゲル化剤としては、カルボキシビニルポリマー類（カーボマー：carbomer）、アクリルコポリマー類、例えば、アクリレート／アルキルアクリレートのコポリマー類、ポリアクリルアミド類、多糖類、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、天然ガム類及びクレー類を挙げることができ、また、親油性のゲル化剤としては、変性クレー類、例えば、ベントーン類、脂肪酸の金属塩、例えば、ステアリン酸アルミニウム、疎水性シリカ、エチルセルロース、ポリエチレンを挙げることができる。 
【００５０】
本組成物は、他の親水性の活性剤、例えばタンパク質又はタンパク質の加水分解物、アミノ酸、多価アルコール、尿素、アラントイン、糖類と糖類誘導体、水溶性ビタミン類、植物エキス及びヒドロキシ酸を含有してもよい。 
親油性の活性剤としては、レチノール（ビタミンＡ）とその誘導体、トコフェロール（ビタミンＥ）とその誘導体、必須脂肪酸、セラミド類、精油、サリチル酸とその誘導体を使用することができる。 
【００５１】
本発明の組成物においては、皮膚疾患の予防及び／又は治療を特に意図した他の活性剤と、少なくとも１種のアヤメ科の少なくとも１種の抽出物とを組み合わせてもよい。このような活性剤としては、例えば： 
−皮膚の分化及び／又は増殖及び／又は色素沈着を減少させる薬剤、例えば、レチノイン酸とその異性体、レチノールとそのエステル類、ビタミンＤとその誘導体、エストロゲン類、例えば、エストラジオール、コウジ酸又はヒドロキノン； 
−抗菌剤、例えば、リン酸クリンダマイシン、エリスロマイシン又はテトラサイクリン類の抗生物質； 
−駆虫剤、特に、メトロニダゾール、クロタミトン又はピレスロイド類； 
−抗真菌剤、特にイミダゾール類に属する化合物、例えば、エコナゾール、ケトコナゾール又はミコナゾール又はそれらの塩類、ポリエン化合物、例えばアンホテリシンＢ、アリルアミン群の化合物、例えばテルビナフィン、又はオクトピロックス（octopirox）； 
−抗ウィルス剤、例えばアシクロビル； 
−ステロイド系の抗炎症剤、例えばヒドロコルチゾン、吉草酸ベタメタゾン又はプロピオン酸クロベタゾール、又は非ステロイド系の抗炎症剤、例えばイブプロフェンとその塩類、ジクロフェナクとその塩類、アセチルサリチル酸、アセトアミノフェン又はグルシルリジン酸； 
−麻酔剤、例えば塩酸リドカインとその誘導体； 
−止痒剤、例えば、テナルジン、トリメプラジン又はシプロヘプタジン； 
−角質溶解剤、例えばα−及びβ−ヒドロキシカルボン酸又はβ−ケトカルボン酸、それらの塩類、アミド類又はエステル類、特に、ヒドロキシ酸、例えば、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、クエン酸、及び一般には果実酸類及び５−ｎ−オクタノイルサリチル酸；  
−抗フリーラジカル剤、例えばα−トコフェロール又はそのエステル類、スーパーオキシド−ジスムターゼ、ある種の金属キレート剤又はアスコルビン酸とそのエステル類；
−抗脂漏剤、例えばプロゲステロン； 
−抗フケ剤、例えばオクトピロックス又はジンクピリチオン； 
−抗ざ瘡剤、例えばレチノイン酸又は過酸化ベンゾイル； 
を挙げることができる。 
【００５２】
したがって、特定の実施態様において、本発明の組成物は、抗菌剤、駆虫剤、抗真菌剤、抗ウィルス剤、抗炎症剤、止痒剤、麻酔剤、角質溶解剤、抗フリーラジカル剤、抗脂漏剤、抗フケ剤及び抗ざ瘡剤、及び／又は皮膚の分化及び／又は増殖及び／又は色素沈着を低減させる薬剤から選択される少なくとも１種の薬剤をさらに含有する。
【実施例】
【００５３】
モノクローナル抗体：
本発明のポリペプチドである角質デスモシンに対して特異的であるマウスモノクローナル抗体Ｇ３６-１９、Ｆ２８-２７及びＢ１７-２１（ＩｇＧ１）が、ヒトの足底の角質層ホモジェネートでマウスを免疫化した後に生産され、ついで特徴付けられた表皮分化抗原に対する一連の抗体の一部を形成する。モノクローナル抗体ＭＯＰＣ-２１（ＩｇＧ１）の腹水（シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリー州）を負の対照として使用した。バイオモール・ファインヒェヌカリエン・ゲーエムベーハ（Biomol Feinchenukalien GmbH）の抗ホスホセリン抗体キット（モノクローナル抗体１Ｃ８、４Ａ３、４Ａ９及び４Ｈ４）及びシグマのモノクローナル抗体ＰＳＲ４５をまた使用した。
【００５４】
ポリペプチドの単離と特徴付け： 
系列タンパク質抽出：
（復元乳房形成術から得られた）乳房の皮膚を元にして、皮膚をリン酸塩バッファー中で５６℃で５分間加熱処理した後に真皮から表皮を機械的に分離し、続いて等容量の次のバッファー（各バッファーで三回）：i）ＴＥバッファー：４０ｍＭトリス-ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）；０．２５ｍＭフェニルメチルスルホニルフロリド及び２μｇ／ｍｌの次の各阻害剤：アプロチニン、ペプスタチンＡ及びロイペプチン；ii）ＴＥＮＰバッファー：洗浄剤、ノニデット(Nonidet)Ｐ-４０を０．５％で含むＴＥ；iii)ＴＥＵバッファー：様々な濃度(２から８Ｍ)の尿素を含むＴＥで、４℃で連続的にホモジェナイズした。各抽出後、ホモジェネートを１５０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を収集した。各抽出物からの最初の上清を使用時まで−３０℃に保持した。最後に、８Ｍの尿素を含有するバッファーでの最後の抽出に対応するペレットをＴＵＤＴＴバッファー：３５ｍＭトリス-ＨＣｌ、ｐＨ６．８；８Ｍ尿素；５０ｍＭジチオスレイトール；５％グリセロール；０．２５ｍＭフェニルメチルスルホニルフロリド及び２μｇ／ｍｌの各同一の阻害剤中でホモジェナイズし、９５℃で３０分間インキュベートし、上記のようにして遠心分離した。タンパク質濃度を、ピアスシステム(クーマシープラスプロテインアッセイ、ピアス(Pierce)ケミカル社、ロックフォード、イリノイ州)を使用して測定した。
【００５５】
タンパク質の電気泳動と免疫検出：
ファーマシアシステム(ファーストシステム(PhastSystem)ＴＭ；Pharmacia LKB)を使用して、７．５又は１０％アクリルアミドゲル中のＳＤＳ(ＳＤＳ-ＰＡＧＥ)の存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動法又は尿素の存在下での二次元電気泳動法によりタンパク質を分離した。等電フォーカシング(ＩＥＦ)又は非平衡ｐＨゲル電気泳動法(ＮＥｐＨＧＥ)を第一の次元において実施し、ついで１２．５％ポリアクリルアミドゲルで第二の次元において実施した。二次元電気泳動法において、ＴＥＮＰバッファー中の抽出物をエタノールで沈殿させ、遠心分離で収集し、５０ｍＭトリス-ＨＣｌ、ｐＨ７．４；８Ｍ尿素及び０．５％β-メルカプトエタノール中に溶解させた。バイオ-ラッドからの二次元電気泳動標準(２-ＤのＳＤＳ-ＰＡＧＥ標準ＴＭ)並びにマーカータンパク質を等電点基準として又は分子量マーカーとして使用した。
【００５６】
電気泳動後に、タンパク質をクーマシーブルーで又は硝酸銀の助けをかりて(銀染色プラスキットバイオラッドラボ)染色するか、強化ニトロセルロース膜に移された(シュライヒャー・アンド・シュエル(Schleicher & Schuell)、ダッセル、ドイツ)。ついで膜を紅赤色(Ponceau red)又はプロトゴールド(ブリティッシュ・バイオセル・インターナショナル、カーディフ、英国)で染色し、上述のようにして、モノクローナル抗体で免疫検出した。反応性はアメルシャムのＥＣＬＴＭキット(ＥＣＬＴＭウェスタンブロットキット、アメルシャム・インターナショナル、アイレスベリー、英国)により、製造者のプロトコールに従って明らかにされた。
【００５７】
結果：
５２−５６ｋＤａのポリペプチドが、(６Ｍに等しい尿素濃度から始めた)ＴＥ及びＴＥＵバッファーの抽出物において検出されたが、ＴＥＮＰ４０とＴＵＤＴＴバッファーの連続抽出物中には検出されなかった。更に、ＴＥバッファー中の抽出物を１０００００ｘｇで３０分間遠心分離すると、ポリペプチドが上清中に完全に存在していた。モノクローナル抗体Ｇ３６-１９もまたより低い見掛け分子量の幾つかのポリペプチドを認識し、これは(８Ｍの濃度でさえ)尿素の存在下で部分的にのみ抽出され、還元剤の存在下で部分的に抽出された。ＴＥバッファー中であろうと尿素の存在下であろうと、産生された３種の抽出物の最後のものにはポリペプチドは免疫検出できなかった。これは、抽出が各段階で完全であったことを示している。一次抗体の不存在下であるいは抗体ＭＯＰＣ-２１で実施された対照実験は常に陰性であった。おそらく、低分子量のポリペプチドの免疫検出形態は、それらの割合が一割合から他の割合へ変化せず、抽出が常にプロテアーゼ阻害剤の存在下で実施されたので、抽出工程の間に産生された分解物ではなかったのであろう。
【００５８】
ヒト角質デスモシンは角質エンベロープの成分である：
角質デスモシンが角質エンベロープに共有的に結合していることを生化学レベルで確認するために、ヒトの足底の表皮により高度に精製されたエンベロープのタンパク分解により産生された断片をモノクローナル抗体Ｇ３６-１９で分析した。
【００５９】
角質エンベロープの調製と分析：
ヒトの角質エンベロープを、上述したように、足底の角質層と乳房の表皮から精製した。簡単に言えば、２％のＳＤＳ(ｗ／ｖ)と２５ｍＭの濃度のジチオスレイトールを含む溶液において激しく攪拌しながら繰り返して沸騰させ、ついで８Ｍの濃度の尿素と２５ｍＭの濃度のジチオスレイトールを含む溶液中で７２時間の間３７℃で試料を抽出した。尿素中に抽出されたエンベロープを沈降させ、０．１％のＳＤＳ、１９２ｍＭの濃度のグリシン及び１２５ｍＭの濃度のトリスを含む溶液中に懸濁させた。最後に、これらを７２時間の間この同じバッファーに対して電気透析した。精製された角質エンベロープをついで遠心分離により収集し、蒸留水で洗浄し、計数した。これらを形態学的に、ついで、先行技術において開示されているようにして、間接的免疫蛍光法により分析した。プロテアーゼＶ８での消化とタンパク分解産物の免疫検出を従来技術において開示されているようにして実施した。
【００６０】
結果：
エンベロープをプロテアーゼＶ８と共に増加した期間の間インキュベートし、得られた断片をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離し、免疫検出した。モノクローナル抗体Ｇ３６-１９は５０ｋＤａより大なる見掛け分子量を持つ多数の帯域を強く標識し、その幾つかがゲルの上限に位置していた。これは、角質デスモシンがエンベロープのタンパク分解から生じる大なるサイズのヘテロポリマー構造の内部に組み込まれていることを示している。プロトゴールドで染色されている幾つかの帯域が免疫検出されておらず、このことが反応の特異性を確認している。タンパク分解のない場合はモノクローナル抗体Ｇ３６-１９でどの帯域も明らかに免疫検出されず、これは角質デスモシンと角質エンベロープの他の成分の間の共有結合の存在を証明している。
【００６１】
乳房の表皮から精製された角質エンベロープの消化により産生された断片はモノクローナル抗体Ｇ３６-１９により全く免疫検出されなかった。この結果と一致して、これらのエンベロープは、間接的免疫蛍光法でモノクローナル抗体Ｇ３６-１９で分析した場合、標識が少ないものが多く、その周辺にのみであった。
【００６２】
５２−５６ｋＤａのヒト角質デスモシンは塩基性リンタンパク質である：
角質デスモシンの等電点を測定するために、ヒトの表皮を、洗浄剤を含むバッファー(ＴＥＮＰ４０バッファー)中に直接抽出し、抽出したタンパク質を二次元電気泳動法(ＮＥｐＨＧＥ／ＳＤＳ-ＰＡＧＥ)により分離し、モノクローナル抗体Ｇ３６-１９で免疫検出した。５２−５６ｋＤａの角質デスモシンは８を越える塩基性等電点を示した。この結果は、ＩＥＦ／ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分離後に免疫検出により確認された。モノクローナル抗体Ｇ３６-１９により免疫検出されたタンパク質は、ＴＥＮＰ４０バッファー中の抽出物の１００μｇのタンパク質をゲルに負荷したときでさえ、クーマシーブルー染色後に可視できなかった。従って、これは、５２−５６ｋＤａの角質デスモシンが、抽出されたタンパク質の０．１％未満を表す定量的に少ないタンパク質であることを示唆している。更に、免疫反応性タンパク質は幾つかの重ねられた斑点の形態で遊走し、翻訳後修飾の存在を示唆している。ヒトの角質デスモシンの可能なリン酸化を分析するために、後者をＮ-ヒドロキシスクシンイミド基で活性化され、ついでモノクローナル抗体Ｇ３６-１９と結合されたセファロースマトリックス(ＨｉＴｒａｐ-ＮＨＳ、ファーマシア)でアフィニティー精製した。次に、ホスホセリン又はホスホチロシンに対して特異的な抗体でのイムノトランスファーによりこれを分析した。用いられた５つの抗ホスホセリンモノクローナル抗体が、特異的に角質デスモシンを免疫検出した。これに対して、モノクローナル抗体ＰＹ２０もホスホチロシンに対する抗血清も角質デスモシンを認識しなかった。
【００６３】
５２−５６ｋＤａのヒト角質デスモシンは糖タンパク質である：
レクチンでの親和性検出(affinodetection)：
５２−５６ｋＤａの角質デスモシンをアフィニティークロマトグラフィーによりＴＥＮＰ４０バッファーの抽出物から部分的に精製した。結合している角質デスモシンを３％ＳＤＳで溶出させ、電気泳動ゲル上に付着させ、ニトロセルロース膜上に移した。膜を阻害バッファーでインキュベートし、ついでピアスケミカル社から市販の次のビオチン化レクチンで１μｇ／ｍｌまで希釈した：エンドウマメ由来(ＰＳＡ)、コムギ胚芽由来(ＷＧＡ)、トウゴマ由来(ＲＣＡ)、ドリコバイフルオラス由来(Dolichos bifluorus(ＤＢＡ))及びピーナッツ由来(ＰＮＡ)のアグルチニン。すすいだ後、レクチンをペルオキシダーゼ(１／４０００００に希釈)で標識化したストレプトアビジン及びアマシャムのＥＣＬＴＭキットで、上述のようにして検出した。
【００６４】
脱グリコシル化実験：
ＴＥＮＰ４０バッファーの抽出物(１０μｇ)を１％(ｗ／ｖ)のＳＤＳを含むｐＨ７．２のリン酸ナトリウムバッファーの２０μｌ中で３分間沸騰させた。それぞれ１％と２０ｍＭの最終濃度を得るためにノニデット(Nonidet)Ｐ４０とＥＤＴＡを加えた。２．４単位のＮ-グルコシダーゼＦ（ＥＣ３.２.２.１８、ベーリンガー・マンハイム）を添加し、反応混合物を３７℃で６時間インキュベートした。ＴＥＮＰ４０バッファーの抽出物のタンパク質(３４μｇ)を、製造者(オックスフォード・グリコシステム社、アビンダン、英国)により開示された条件下、Ｎ-グリコシダーゼＦ又はノイラミニダーゼ(ＥＣ.３.２.１.１８)の存在下又は不存在下で、５ｍＵのエンド-α-Ｎ-アセチルガラクトサミニダーゼ(ＥＣ.３.２.１.９７)でまたインキュベートした。反応を試料バッファー中で２分間沸騰させることにより停止した。正の対照として使用されるフェツイン(fetuin)の脱グリコシル化をＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びビオチン化レクチンにより試験した。
【００６５】
処理した試料と未処理の試料を電気泳動法により分離し、上述のようにして免疫検出と親和性検出により分析した。
コンカナバリンＡ-セファロースでのクロマトグラフィー
ＴＥＮＰ４０バッファーの抽出物を、０．５ｍｌ／分の流量で、０．２ＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．４の２０ｍＭのトリス-ＨＣｌである洗浄バッファーで予め平衡化させたコンカナバリンＡセファロース４Ｂカラム(ＣｏｎＡセファロース、シグマ)内に直接注入した。１５ｍｌのこのバッファーで１ｍｌ／分の流量での洗浄後、吸着したタンパク質を、洗浄バッファーに０．５Ｍまで希釈したメチル-α-Ｄ-マンノピラノシド(シグマ)で０．５ｍｌ／分の流量で溶出させた。ついで、タンパク質を上述のようにＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離し分析した。
【００６６】
結果：
５２−５６ｋＤａの角質デスモシンを含むＴＥＮＰ４０バッファーの抽出物のタンパク質を様々なグリコシダーゼで処理し、ポリペプチドに対する２つのモノクローナル抗体でのイムノトランスファーで分析した。抽出物の総タンパクの染色は、インキュベーション中の明らかな変性を示さなかった。Ｎ-グリコシダーゼＦでの処理は角質デスモシンの見掛けの分子量の約５ｋＤａの低下を誘発した。この結果は、Ｎ-グリコシル化を非常に強く示唆している。これに対して、エンド-α-Ｎ-アセチルガラクトサミニダーゼ及び／又はノイラミニダーゼでの処理は角質デスモシンの遊走を改変しなかった。この結果を確認するために、ヒト角質デスモシンを親和精製し、ビオチン化レクチンで分析した。コムギ胚芽アグルチニン(ＷＧＡ)が、それを認識しないか非常に弱く認識した試験した他のレクチンと異なり、精製されたタンパク質に強く結合していた。更に、コンカナバリンＡに結合した角質デスモシンはセファロースマトリックスに結合した。０．５Ｍの濃度の、このレクチンに対して特異的である糖であるメチルα-Ｄ-マンノピラノシドでこれを溶出させることができ、これは結合の特異性を立証する。
【００６７】
角質デスモシンの精製：
皮膚表皮の開裂後、表皮を、４０ｍＭトリス-ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１０ｍＭのＥＤＴＡ；１０μｇ／ｍｌのアプロチニン及び０．８ｍＭの４-(２-アミノエチル)ベンゼンスルホニルフロリドを含んでなる(アンテルシム、パリ、フランス)ＴＥＡバッファー中でホモジェナイズした。上清を、孔サイズが０．４５μｍのフィルター(ピュラディスク(PuradiscＴＭ)２５ＡＳ；ワットマン、クリフトン、ニュージャージー)での濾過により清浄化し、２０ｍＭのトリス-ＨＣｌ、ｐＨ７．５の洗浄バッファー中で平衡化したアニオン交換カラム(ハイトラップ(Hi Trap)Ｑ、ファーマシア・LKB)上で０．３ｍｌ／分の流量で注入した。保持されなかった（つまり抽出物の総タンパク質の約５％）タンパク質を次のようにして調製されたアフィニティーカラム内に同じ流量で直接注入した：約２ｍｇのモノクローナル抗体Ｆ２８-２７を、製造者であるファーマシア・LKBにより推奨されたようにして、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド基により活性化された１ｍｌのセファロース４Ｂマトリックスに結合させた。カラムを１ＭのＮａＣｌの存在下で、ついで不存在下で、洗浄バッファーで１ｍｌ／分の流量で徹底的に洗浄した。免疫吸着したタンパク質をｐＨ２．５の０．２Ｍのグリシンで０．３ｍｌ／分の流量で溶出させた；溶出したフラクションのｐＨを２Ｍの濃度のトリス塩基で直ぐに中和した。異なったフラクションのタンパク質を、モノクローナル抗体Ｇ３６-１９又は対照モノクローナル抗体ＭＯＰＣ-２１でのイムノトランスファーで分析した。このようにして溶出させたタンパク質を含むフラクションを混合し、ついで凍結乾燥させた。凍結乾燥物のタンパク質を、一次元又は二次元電気泳動法により、上述のようにして分析した。ついで角質デスモシンをゲルから切り出して配列決定に供した。
【００６８】
結果：
５２−５６ｋＤａの角質デスモシンをアニオン交換カラム、続いてアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。抽出した全角質デスモシンはアフィニティーカラムに特異的に結合し、それから、グリシンの存在下でそれを溶出させることができた。移したタンパク質のプロトゴールドでの染色により、角質デスモシンがこれらのフラクション中に非常に支配的であるので、高い精製度が得られることが示された。アフィニティークロマトグラフィーをモノクローナル抗体Ｆ２８-２７又はモノクローナル抗体Ｇ３６-１９と結合したマトリックス上で実施したとき同様の結果が得られた。二次元ゲル分析により、精製された角質デスモシンの塩基性等電点が確認され、それが５２−５６ｋＤａの見掛け分子量を有する唯一の溶出タンパク質であることが示された。このようにして精製された角質デスモシンを電気泳動法により分離し、このタンパク質を含むゲルバンドを切り出し、ついでタンパク質を配列決定した。
【００６９】
精製したポリペプチドの不安定性：
角質デスモシンを精製する無数の試行の間、本出願人は二つの主要な問題に遭遇した：(１)表皮タンパク質のなかでのこのタンパク質の低い割合及び(２)おそらくはプロテアーゼの作用に対するその高感受性のためであろうその不安定性である。
異なった試験を角質デスモシンを安定化させようとして使用した：亜鉛(角質層のキモトリプシン酵素の阻害剤)、還元剤(β-メルカプトエタノール又はジチオスレイトール)、変性剤(ＳＤＳ)、グリセロール、セリンプロテアーゼに特異的な阻害剤(ＰＭＳＦ、アプロチニン)又は様々なプロテアーゼの阻害剤のカクテル(アプロチニン、ロイペプチン、ペプスタチン、ベンズアミジン、フェナントロリン、ＰＭＳＦ)の添加又は凍結／融解工程の抑制。最後に、凍結／融解工程の不存在、２％のＳＤＳの存在又は阻害剤のカクテルの存在、及び好ましくはこれらの条件の組み合わせが角質デスモシンを安定化するために最も効果的であることが分かった。
【００７０】
精製したポリペプチドの配列決定：  
配列決定に対しては、電気泳動ゲル上に同定された角質デスモシン又は角質デスモシンの断片(５２−５６ｋＤａ、４５ｋＤａ)に対応するバンドを切り出した。ついでタンパク質をエンドペプチダーゼｌｙｓ-Ｃ(ＥＣ３.４.９９.３０)でゲルで直接消化させ、産生されたペプチドをＤＥＡＥ-Ｃ１８カラムを使用するＨＰＬＣにより精製した。このようにして選択したペプチドを、アプライドバイオシステムズ社のプロサイス(Procise)シーケンサー装置で、供給者の指示に従って、エドマン分解サイクル法により配列決定した。
【００７１】
結果：
ＮＨ２-末端からの配列決定はできず、この末端でタンパク質が保護されていることが示唆された。
内部の配列決定により、２つの断片の配列：すなわち
2004256552.tif 000005
（各々、配列番号：３及び４）を決定することができた。
この結果は、ヌクレオチド配列から本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の推論を可能にする分子生物学法により得られたものを確認する。
【００７２】
ヒト表皮発現ライブラリの構築：
ヒト角質デスモシンに対するｃＤＮＡのクローニングは以前に存在する発現ライブラリを使用して実施することはできなかった。実際、後者はマウスの表皮からか、表皮終末分化の特性を持つ遺伝子の発現を許容しない単層条件で培養されたヒトのケラチノサイトから生産された。従って、本出願人はヒト表皮発現ライブラリを構築した。
【００７３】
ヒト表皮からのポリ(Ａ)＋リボ核酸(ＲＮＡ)の抽出：
整形施術後に得られた乳房の皮膚の外科廃棄物の試料を使用してこれを行った。皮下脂肪組織を解剖し、ついで皮膚片を真皮節の助けをかりて切り出し、上方を向く表皮面をトリプシン溶液(溶液Ａ、ギブコBRL)中で３７℃で２時間インキュベートした。皮膚表皮開裂をついでピンセットで実施した。得られた表皮シートをリン酸塩バッファー(ＰＢＳ、ｐＨ７．４)ですすいだ。提供されたバッファー(溶解／結合バッファー)中で直接、「テュラックス(Turax)」でのシートのホモジェナイゼーション後にダイナール(Dynal)(オスロ)から市販のキット「ｍＲＮＡ精製キット」において提案されたプロトコールに従ってポリ(Ａ)＋ＲＮＡの抽出を行った。このキットの原理は、オリゴ(ｄＴ)２５で被覆した磁性ビーズに対してポリ(Ａ)末端を含むメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)の親和性を利用する。溶解液中で室温での５分のインキュベーション後、ビーズを磁石で単離し、３回の洗浄を施した。２ｍＭのＥＤＴＡ溶液(ｐＨ８)中で２分間６５℃でビーズをインキュベーションすることによって溶出させたポリ(Ａ)＋ＲＮＡを、インビトロゲン(サンジアゴ、カリフォルニア)により市販されている「ＤＮＡディップスティック（DipStick）」比色キットを使用して検定した。
【００７４】
ライブラリの構築：
ストラタジーン(ラホイヤ、カリフォルニア)により市販されているキット「ＺＡＰエクスプレス(Express)ｃＤＮＡギガパックIIゴールドクローニングキット」により、供給者の提案したプロトコールに従って、ライブラリを構築した。酵素ＸｈｏＩに対する制限酵素を含むオリゴ(ｄＴ)１８プライマーを使用して、三リン酸５-メチルシチジンの存在下でモロニーマウス白血病ウィルス逆転写酵素(ＭＭＬＶ-ＲＴ)で、２μｇのポリ(Ａ)＋ＲＮＡから相補ＤＮＡ(ｃＤＮＡ)を合成した。第二の鎖の合成を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩにより実施し、ｃＤＮＡの末端を組換えｐｆｕポリメラーゼで平滑末端化した。ＥｃｏＲＩアダプターの付加(Ｔ４ＤＮＡリガーゼ)と５'末端のリン酸化(Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ)の後に、ｃＤＮＡを酵素ＸｈｏＩで消化させた。５００塩基対を越えるサイズのｃＤＮＡの選択をセファクリルＳ-５００カラムで実施した。ＺＡＰエクスプレスファージの２つの腕とのｃＤＮＡのライゲーションをＴ４ファージリガーゼで実施した。組換えファージのカプセル化をストラタジーンにより提供された「ギガパックIIゴールドパッケージングエキストラクト」なる抽出物で実施した。大腸菌株ＸＬ-１ブルーＭＲＦ'を滴定とライブラリの延展に対して使用した。
【００７５】
結果：
このライブラリは、ＺＡＰエクスプレスファージへの一方向性クローニングにより、その収集に続く時間内でヒト表皮の断片から抽出した２μｇのｍＲＮＡから調製した。これは、約２ｘ１０５の独立したクローンからなる。
角質デスモシンをコードしている相補デオキシリボ核酸(ｃＤＮＡ)のクローニング：
【００７６】
免疫学的スクリーニング：
先の増幅工程を伴わないで実施される免疫学的スクリーニングを、１０ｍＭのイソプロピル-１-チオ-β-Ｄ-ガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ、ストラタジーン)溶液中で１０分間インキュベートし、乾燥させ、延展ライブラリで３７℃で４時間インキュベートしたニトロセルロース膜(シュライヒャー・アンド・シュエル、ダッセル、ドイツ)で実施した。０．２、０．２及び２μｇ／ｍｌの各濃度で使用される３種のモノクローナル抗体Ｇ３６-１９、Ｆ２８-２７及びＢ１７-２１のカクテルで先行技術において開示されたようにして、免疫学的スクリーニング法を実施した。正のクローンを常法により単離し、３種のモノクローナル抗体の各々で別個に試験した。
【００７７】
配列決定：
精製されたクローンに対応するＺＡＰエクスプレスファージを、ストラタジーンにより示されたように、ＥｘＡｓｓｉｓｔファージの助けをかりてインビボで切除した。得られたプラスミドをキアジェン(Ｑｉａｇｅｎ)キット(ヒルデン、ドイツ)で増幅し、ついで、パーキン-エルマーキット(ＡＢＩプリズム・ダイ・ターミネーター・サイクル・シーケンシングキット、パーキンエルマー、フォスターシティ、カルフォルニア)を使用して、プライマーＴ３及びＭ１３(ストラタジーン)で、挿入の末端で配列決定をした。得られた配列の国際的なデータベースとの比較をブラスト(Blast)プログラムで実施した。
【００７８】
結果：
ライブラリを前もって増幅しなかった場合、スクリーニングにより５つの独立したクローンを単離することが可能であった。クローンに含まれるヒトｃＤＮＡ断片を末端から部分的に配列決定し、これによりそれらが全てオーバーラップし、従って全てが同じタンパク質の断片をコードしたことを示すことができた。５つのクローンをまた３つのモノクローナル抗体の各々で別個に試験した。３つのクローン(１.１、４.４及び５.１)は３つのモノクローナル抗体と反応性があり、クローン５.５は２つのモノクローナル抗体(Ｆ２８-２７及びＧ３６-１９)と反応性があり、最後にクローン１.２はモノクローナル抗体Ｆ２８-２７によってのみ認識された。これらの結果は、３つのモノクローナル抗体が同じタンパク質を認識し、よって過去の生化学的研究により強く示唆されていたことを確認することを結論的に証明している。この結果はまた各モノクローナル抗体により認識されたエピトープを分子に要求することを可能にする。実際、タンパク質のＣＯＯＨ末端に相当するｍＲＮＡの３'末端から始まる逆転写によりクローンが構築された場合、Ｆ２８-２７により認識されたエピトープがこの末端に最も近く、これにＧ３６-１９のエピトープが続き、最後にＢ１７-２１のものが続くと結論付けることができる。これらの異なったｃＤＮＡ断片のサイズの酵素制限分析により、３つのモノクローナル抗体により認識される３つのクローンが最も長い配列(２から１．５ｋｂ)を有しており、Ｆ２８-２７のみが認識するものは最も短く(１ｋｂ)、２つのモノクローナル抗体により認識される最後のものは１．３ｋｂの中間のサイズを有していることが確認された。
【００７９】
従って、ヒトの角質デスモシンをコードしているｃＤＮＡの全部又は一部がクローン化され、ＮＨ２末端からＣＯＯＨ末端まで、示された順でタンパク質に要求される異なったエピトープを認識する３つのモノクローナル抗体Ｂ１７-２１、Ｇ３６-１９及びＦ２８-２７によりタンパク質が特性付けられる。  国際的データバンクに含まれる配列と比較した各クローンの部分的配列は、ジェンバンクデータバンクに番号Ｌ２０８１５で登録されていたＳ遺伝子の配列と９９％の同一性が明らかになった。この分析により、得られた５つのクローンのなかで、４つがｍＲＮＡの短型に対応し、クローン５.１の一つだけが長型に対応していることがまた示された。これらの型は一次転写の非翻訳３'部分のレベルでポリアデニル化部位の他の選択から誘導された。この分析により、３つのモノクローナル抗体により認識されるエピトープの位置を特定することが可能になり、Ｂ１７-２１により認識されるエピトープがヌクレオチド５９４から７６２に対応するタンパク質の部分に位置し、Ｇ３６-１９とＦ２８-２７が７６２−１０４４及び１０４４−停止コドン領域にそれぞれ位置している。最後に、最も長いコード配列を含むクローン１.１がヌクレオチド３４８から始まる。
【００８０】
角質デスモシンをコードしている完全ｃＤＮＡのクローニング：
先の分析は、得られたクローンがヌクレオチド１からヌクレオチド３４７まで延びるｃＤＮＡ部分をカバーしなかったことを示していた。従って、本出願人はこの欠落した部分をクローン化しなければならなかった。
【００８１】
上述のようにしてヒト表皮から抽出された８０ｎｇのポリ(Ａ)＋ＲＮＡに、ギブコBRLにより市販されている「スーパースクリプト(SuperScript)キット」を使用する、ランダムプライマーで開始する逆転写を施した。角質デスモシンに対するｃＤＮＡの５'末端の増幅を、配列２−２０(ジェンバンクＬ２０８１５)に対応するオリゴヌクレオチドを上流にし、またＳｐｅＩアダプターを含み、配列１０１７−１０３５に相補のオリゴヌクレオチドを下流にする１／２０の第一鎖合成反応で開始して実施した。ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)条件は次の通りであった：９４℃で３分に続き、９４℃で８０秒、５７℃で８０秒、７２℃で２分の３５サイクル。得られ、アガロース-ＴＳＥゲル電気泳動後に精製され、ＳｐｅＩ及びＥｃｏＮＩで消化された単一の断片(ヌクレオチド２から１００３)を、プラスミドｐＳ１１への到達を可能にする、同じ酵素で消化されたプラスミドｐＢＫ-ＣＭＶ-１.１(ライブラリのスクリーニングにより単離)にクローン化した。プラスミドｐＳ１１に含まれる完全ｃＤＮＡをヌクレオチド１７００まで少なくとも３回配列決定した。以前に刊行された配列と比較した結果、ゲノムレベルで分析された４つの局在的な差異が明らかになった。
【００８２】
角質デスモシンのゲノム解析：
４つの局在的な差異が本出願人により単離された完全ｃＤＮＡの配列と先行技術(Zhou Y. とChaplin D.D.,P.N.A.S.ｕｓａ,vol.90,pp.9470-9474,1993年１０月)において刊行されたＳ遺伝子のものとの間に観察された。これらの４つの局在的差異を、常法に従ってヒトの血液から抽出したＤＮＡの１０の参照試料を元にしてゲノムレベルで、ＰＣＲにより分析した。
【００８３】
位置１５１４へのグアニンの可能な挿入の分析を、通常の条件下で実施されたヌクレオチド１４４６と１７８６(ジェンバンク、L20815)の間のゲノム領域のＰＣＲ増幅後に実施した。各試料に対して得られたＤＮＡ断片を一方ではＢｓｉＭＩで他方ではＮｃｉＩで消化させた。３％のNuSieve GTGゲル(ＦＭＣ,ロックランド,ＭＥ)での電気泳動法をＴＢＥバッファーで実施した。
【００８４】
位置６６の配列の試験をＡＳＡ(対立遺伝子特異的増幅)法に従って実施した。２つのＰＣＲ反応を、配列５７２−９１に相補のオリゴヌクレオチドを下流に、配列５２−６５に対応し、Ａ又はＴの何れかで位置６６で終端するオリゴヌクレオチドを上流にして実施された。０．５μｇのゲノムＤＮＡ、２．５ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチド及び０．５ＵのＴａｑポリメラーゼ(Appligene)でＰＣＲ反応を実施した。増幅条件は９４℃、２分で、ついで９４℃で５０秒、５６℃で１分、７２℃で２．５分の３０サイクルである。
【００８５】
位置１１１８及び１２３６の塩基の分析を単一のオリゴヌクレオチド対：センスオリゴヌクレオチド９０８−２７、アンチセンス１５７３−９３での増幅後に実施した。ＰＣＲ条件は上記と同じで、重合時間は１分に限った。断片を、位置１１１８及び１２３６の各試験に対してＢｓｍＩ又はＨｉｎ６Ｉで消化させ、ついで３％のNuSieveゲルでの電気泳動法により分離した。
【００８６】
結果：
位置１５１４へのグアニンの挿入は読み枠のシフトを引き起こし停止コドンを位置１５２３から位置１６０３へ移動させる。この配列により生産されるタンパク質は最後の２つのアミノ酸(Ｉ及びＳ)のレベルで異なり、これは、刊行された配列に対して２７のアミノ酸の付加に相当する配列：
2004256552.tif 000006
により置換される。先に単離された５つのｃＤＮＡは全てこの挿入を示した；試験は他の個体に対しても拡張された。１０の個体から得られたヒトゲノムＤＮＡの対照試料をこの領域で増幅し酵素制限により分析した。実際、刊行された配列は付加的なグアニンを含む配列では消える位置１５１０におけるＢｓｉＭＩ制限部位の存在に対応する一方、ＮｃｉＩ部位は１５１２であるようである。結果は１０の固体に対して同一であり、すなわちＮｃｉＩ部位のみが存在している。これは、これらの１０の個体において、角質デスモシンがＳ遺伝子の刊行された型よりも長い型で生産されることを意味する。
【００８７】
置換型の３つの他の局在的差異はクローンと刊行された配列の間で見いだされた。１０の対照ゲノム試料のＰＣＲ及び酵素制限又はＡＳＡによる分析により、遺伝子の多型性が関与していることが示された。本出願人は、位置６６に保存的突然変異Ｔ／Ａ(ロイシン-メチオニン)を、位置１１１８に沈黙突然変異アラニン-アラニンに対応する多型性Ａ／Ｇを、最後に１２３６に非保存的突然変異セリン-アラニンに対応する多型性Ｔ／Ｇを同定した。
【００８８】
組換え角質デスモシンの生産：
角質デスモシンをコードしている完全ｃＤＮＡを、プラスミドｐＳ１１から、２１０６の塩基対のＥｃｌ１３６Ｉ／ＮｏｔＩ断片の形態で単離した。サブクローニングを、ＥｃｏＲｖ及びＮｏｔＩで以前に消化されたベクターｐＣＤＮＡａｍｐ(インビトロゲン)内に実施し、プラスミドｐ１４-９に至る。
【００８９】
角質デスモシンのインビトロ翻訳を、プラスミドｐ１４-９で初めてプロメガ(Promega)により市販されているキット「ＴＮＴ Ｔ７クイック結合転写／翻訳システム」で実施した。このキットは一回の工程でＴ７ファージＲＮＡポリメラーゼでの転写をウサギ網状赤血球ライセートでの翻訳と結合させる。これらの反応は、製造者の指示に従って、２５μｌの容積中の０．６μｇのプラスミドで実施した。
【００９０】
角質デスモシンをプラスミドｐ１４-９での形質移入後にＣＯＳ-７細胞中に発現した。１μｇのプラスミド／３ｘ１０５細胞を使用するクロロキンとＤＭＳＯショックの添加により補填した通常のＤＥＡＥ-デキストランプロトコールに従って細胞に形質移入した。４８時間の発現後、細胞を、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄し、１０ｍＭのＥＤＴＡと０．５％のＮＰ４０を含み、プロテアーゼ阻害剤のカクテル(ファーミンジェン(Pharmingen)インク)を含む４０ｍＭのトリス-ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．５中に溶解させた。ＳＤＳ-ＰＡＧＥでの分離及びエレクトロトランスファー後に試料を上述したように免疫検出した。
【００９１】
結果：
タンパク質の新しい完全な配列は、あらゆる翻訳後の修飾がない場合に５１．４５ｋＤａの分子量を予想する。ミクロソーム膜の不存在下でインビトロで合成された角質デスモシンは、約６０ｋＤａの見掛け分子量で遊走する。これは、このタンパク質がＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルにおいて異常な遊走を有していることを示している。低イオン強度で抽出された主要な表皮形態での共遊走は、タンパク質のかなり広範に切断された型に後者が対応することを証明し、出願人はこの表皮形態がグリコシル化されていることを示したので一層しかりである。
【００９２】
ＣＯＳ-７細胞のプラスミド１４-９での形質移入は６０ｋＤａの範囲にまた遊走する免疫反応性タンパク質を明らかにする。同じ結果が、電気穿孔法により形質移入されたヒト神経上皮腫株で得られた。これら全ての結果は、表皮では、角質デスモシンが、早発性にかつその成熟の間に特異的タンパク分解を受けることを強く示唆している。
【配列表】
2004256552000001.app