(57)【要約】【解決手段】新規チロシナーゼ遺伝子（ｍｅｌＤ）のクローニングが行われ、その塩基配列も決定された。また、このクローニングされた上記の新規遺伝子をベクターに挿入することにより宿主（大腸菌）を形質転換した。【効果】本遺伝子はチロシナーゼ活性を持っており、清酒麹の褐変防止、醸造食品の着色防止に利用することができる。また、この形質転換体を培養して本チロシナーゼを生産し、これを試薬として利用できるだけでなく、そのインヒビターのスクリーニングにも利用することができ、着色防止物質の開発も期待することができる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するチロシナーゼ酵素活性を有するタンパク質。
【請求項２】
下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示す遺伝子のＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列の内、請求項１に記載のタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ。
（Ｂ）（Ａ）に記載の遺伝子のＤＮＡ、あるいは、その一部から作製したプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、チロシナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２に記載のＤＮＡの内、少なくともコーディング領域を含んでなる組換えベクター。
【請求項４】
組換えベクターｐＥＴ２３ｂ−ｍｅｌＤ（ＦＥＲＭ Ｐ−１９０６９）。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の組換えベクターを宿主に導入してなる形質転換体。
【請求項６】
宿主が大腸菌である請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の形質転換体を利用すること、を特徴とするチロシナーゼ酵素活性を有するタンパク質を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規チロシナーゼ遺伝子に関するものである。本発明によれば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅより新規に単離したチロシナーゼ遺伝子を利用することにより、チロシナーゼを効率的に生産できるだけでなく、本チロシナーゼを用いたメラニンの製造、あるいはシミ・そばかすを防止するためのチロシナーゼ阻害剤の効率的なスクリーニングなど、様々な産業分野での利用を可能にするものである。
【０００２】
【従来の技術】
食品が褐変する機構の一つにチロシナーゼによる、メラニン物質の生産があげられる。これは食品中のチロシンがチロシナーゼにより酸化されドーパ（ＤＯＰＡ）と呼ばれる物質に変化し、これが前駆体となってメラニンが合成されることによる。この反応には酸素が必要となるため、多くの場合食品が酸素にふれることにより、急速に褐変化が起こる。チロシナーゼによる食品の褐変化は、椎茸などのキノコ類からリンゴ、ナシなどの果実類まで多くの食品で見られる現象である。食品が褐変することは外観品質を著しく低下させることであり、褐変防止には多くの努力が払われてきている。
【０００３】
清酒醸造においても、米麹が褐変し、最終的に酒粕中に黒い米粒として存在する「黒粕」現象が大きな問題となっている。清酒発酵中は米麹は清酒もろみ中に存在するため、酸素が必要なチロシナーゼによる酸化反応は起こらない。しかしもろみを圧搾し、酒粕を分離した時点で酸素に接触することになり、チロシナーゼによる酸化反応が進行し、麹部分のみが黒く褐変する。現在ではこのような褐反応を生じない、非褐変性の麹菌株を使用することにより黒粕を防止している。
【０００４】
このよう褐変反応を遺伝子レベルで解析するため麹菌のチロシナーゼ遺伝子（ｍｅｌＯ）が取得されている（例えば、非特許文献１参照）。このｍｅｌＯ遺伝子には、チロシナーゼ活性を持つ蛋白がコードされており、確かにチロシナーゼ遣伝子であることが確認されている。しかしながら、本発明者らはこのｍｅｌＯ遺伝子の発現条件を検討した結果、本遺伝子は液体培養で強力に発現する遺伝子であり、固体培養（麹培養）ではほとんど発現していないことを明らかにした。これは米麹の褐変に関与するチロシナーゼはｍｅｌＯ遺伝子とは異なる新規なチロシナーゼ遺伝子にコードされていることを強く示唆するものである。またこの新規チロシナーゼこそが、米麹の褐変現象はもとより味噌、醤油など麹を用いる食品の着色に大きく関与していると考えられる。従ってこれら醸造食品の褐変を防止するためには、ｍｅｌＯとは異なる新規なチロシナーゼを単離して解析する必要がある。
【０００５】
そこでフスマを用いた固体培養を行い、常法に従いｍＲＮＡを調製し、これよりｃＤＮＡライブラリーを作成した。このｃＤＮＡを網羅的に配列を決定し、ＥＳＴ情報を収集した。この中から、マッシュルームのチロシナーゼ遺伝子に対してホモロジーを示すクローンを抽出することができた。このＥＳＴクローンの配列を用いて、Ａ．ｏｒｙｚａｅゲノムライブラリーからチロシナーゼ遺伝子の単離を試みた。具体的には、ＥＳＴ配列情報から２種類のプローブを作成し、Ａ．ｏｒｙｚａｅゲノムＤＮＡをテンペレートとしてＰＣＲ反応を行う。増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、抽出したＥＳＴクローンに対応したゲノムＤＮＡであることを確認する。
【０００６】
次に、このＤＮＡ断片をプローブとして、Ａ．ｏｒｙｚａｅのＥＭＢＬ３ファージライブラリーから、プラークハイブリダイゼーションにより目的（ポジティブ）クローンを抽出する。得られたポジティブクローンをテンペレートとして塩基配列を決定する。シーケンス解析用のプローブをいくつか作成することにより、プロモーター、ターミネーター領域を含むチロシナーゼ遺伝子の全塩基配列の決定に成功した。
【０００７】
本チロシナーゼ遣伝子は、６つのイントロンに分断された７つのエキソンとして存在し、そのコーディング領域には６１６アミノ酸がコードされていた。ｍｅｌＯ遺伝子とのアミノ酸レベルでのホモロジーは２４％であったが、マッシュルームのチロシナーゼなどで保存性の高い領域については、さらに高いホモロジーを示した。以上の結果より、この遺伝子はチロシナーゼ遺伝子である可能性が高く、ｍｅｌＢ遺伝子と命名した。
【０００８】
このｍｅｌＢ遺伝子の発現条件を検討するためノザン解祈を行った。ＤＰＹ培地を用いた液体培養と白米を用いた麹培養を行い、それぞれの培養物から常法に従いＲＮＡを抽出した。先のｍｅｌＢ遺伝子の一部をプローブとして、両方のＲＮＡに対してノザンハイブリダイゼーションを行った。その結果液体培養から得られたＲＮＡには全くシグナルが認められないのに対して、固体培養から得られたＲＮＡには非常に強いハイブリダイズシグナルが検出された。これはｍｅｌＢ遺伝子が液体培養ではほとんど発現せず、固体培養（麹培養）で非常に強く発現していることを示すものである。
【０００９】
本発明者らは、ｍｅｌＢ遺伝子について上記のことを見出し、これを特願２０００−３９８６１６としてすでに出願してある（特許文献１参照）。
【００１０】
【非特許文献１】
Biochim. Biophys. Acta., 1261(1), p.151, 1995
【００１１】
【特許文献１】
特開２００２―１９１３６６
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
発明者が解決しようとする課題は、上記ｍｅｌＯ、ｍｅｌＢのチロシナーゼ遺伝子以外にも褐変を起こすチロシナーゼ遺伝子が麹菌に存在する可能性を探り、その遣伝子を特定することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記した目的を達成するためになされたものであって、ゲノム情報よりＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ中に存在するチロシナーゼ遺伝子を見つけ出すことにある。具体的には麹菌ゲノム解析コンソーシアムにより配布されたゲノム情報の結果を解析し、その結果、チロシナーゼに相同性を示した予測遺伝子を見出した。これをｍｅｌＤと命名した。
【００１４】
次に、このｍｅｌＤ遺伝子の機能を推定するため、本遺伝子の大腸菌への導入を試みた。ｍｅｌＤ遺伝子コード領域（１．７ｋｂ）を大腸菌高発現用ベクターｐＥＴ２３ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入し、常法に従って形質転換体の培養を行った。その結果、得られた形質転換体の菌体破砕液はｐＥＴ２３ｂで形質転換したものの菌体破砕液に比べて極めて高いチロシナーゼ活性を示した。
【００１５】
従って、我々が単離したｍｅｌＤ遺伝子には、チロシナーゼ活性を有する蛋白がコードされており、このチロシナーゼが麹菌における褐変現象に関与していることが示された。このように本発明に係るｍｅｌＤ遺伝子は新規なものであって、従来既知のチロシナーゼとは異なる新規チロシナーゼをコードする遺伝子、該新規チロシナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、これらの遺伝子あるいはその一部から作製したプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし且つチロシナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、これらの遺伝子の少なくともひとつを含有する遺伝子、から選ばれる少なくともひとつを指示するものである（以下、単にｍｅｌＤ遺伝子ということもあり、その塩基配列を配列表の配列番号２、及び、図面の図４、図５に示す。）
【００１６】
本発明において、このようにして単離したｍｅｌＤ遺伝子は、これを宿主に導入して発現せしめ、チロシナーゼ又はチロシナーゼ酵素活性を有するタンパク質を製造するものである。なお、本発明において、チロシナーゼ酵素活性を有するタンパク質にはチロシナーゼも包含するものであって、そのアミノ酸配列は配列番号１（図１〜図３）に示される。
【００１７】
本発明によれば、このようにして製造した新規チロシナーゼ（又はその酵素活性を有するタンパク質）は、試薬として各方面で有効に利用することができるほか、メラニンの製造に用いることができる。また、そのインヒビターをスクリーニングすることにより、麹や各種飲食品の褐変防止剤あるいはシミ、そばかすなどの防止剤を新たに開発することも期待される。
【００１８】
以下、本発明の詳細について述べる。
【００１９】
まず、麹菌ゲノム解析コンソーシアムにより配布されたゲノム解析結果のうち、チロシナーゼに相同性を示した予測遺伝子Ｃｏｎ１５３４  ｍｉｄ−Ｃｏｎ１５３４−３９７３−ｒ１について妥当性を検討した。
【００２０】
本遺伝子はゲノムコンティグ１５３４番の逆鎖上にコードされ、３６３９６−３５３９７ｂｐがプロモーター領域、３５３９６−３４０２０ｂｐがコード領域、３４０１９−３３７２０ｂｐがターミネーター領域、イントロンは含まないと予測されている。推定されるアミノ酸配列は、既に知られているＡ．ｏｒｙｚａｅのチロシナーゼｍｅｌＯと３７％の相同性を示した。
【００２１】
しかしながら、予測されるアミノ酸配列を詳細に検討したところ、上記アミノ酸配列はチロシナーゼ活性に必要とされる銅原子の配位領域Ｃｕ（Ａ）を欠いていることが明らかとなった。そこで、ｍｅｌＯおよび同じく既に知られているＡ．ｏｒｙｚａｅのチロシナーゼｍｅｌＢのアミノ酸配列を元に改めて解析を行ったところコード領域は３５７９９−３４０２０ｂｐであることが示され、新たに予測されたアミノ酸配列にはＣｕ（Ａ）領域が含まれており正しく予測されていると考えられた。
【００２２】
そこで、Ｃｏｎ１５３４  ｍｉｄ−Ｃｏｎ１５３４−３９７３ーｒ１に含まれる遺伝子をｍｅｌＤと命名し、全長２６７７ｂｐのうち、そのプロモーター領域は１−５９８ｂｐ、コード領域は５９９−２３７４ｂｐ、ターミネーター領域は２３７５−２６７７ｂｐとした。開始コドンの−１２２ｂｐにはＴＡＴＡ  ｂｏｘが存在した。
【００２３】
新たに予測した遺伝子ｍｅｌＤの配列を元にｍｅｌＤ遺伝子の単離を試みた。具体的には、ゲノム配列情報から２種類のプライマーを作成し、Ａ．ｏｒｙｚａｅゲノムＤＮＡをテンペレートとして宝酒造株式会杜製Ｐｙｒｏｂｅｓｔを用いてＰＣＲ反応を行った。上記２種類のオリゴＤＮＡの内、一方は、オリゴＤＮＡ＃１であって、その塩基配列は配列番号３（図６）に示され、他方は、オリゴＤＮＡ＃２であって、その塩基配列は配列番号４（図７）に示される。増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、予測したｍｅｌＤ遣伝子に対応したゲノムＤＮＡであることを確認した。
【００２４】
ｍｅｌＤチロシナーゼ遺伝子は予測どおりイントロンを含まず、そのコーディング領域には５９２アミノ酸がコードされていた。ｍｅｌＯ遺伝子とのアミノ酸レベルでのホモロジーは３６％、ｍｅｌＢ遺伝子とは２３％であったが、銅原子配位領域であるＣｕ（Ａ）、Ｃｕ（Ｂ）領域においてはいずれにおいてもアミノ酸配列が極めて良く保存されていた。
【００２５】
次に、ｍｅｌＤ遺伝子の機能を確認するため、本遺伝子の大腸菌への導入を試みた。ｍｅｌＤ遺伝子のコード領域（１７７６ｂｐ）を大腸菌高発現用ベクターｐＥＴ２３ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＩサイトに挿入し、ｍｅｌＤ発現プラスミドｐＥＴ２３ｂ−ｍｅｌＤを新たに構築した（図１２）。これを特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１９０６９として寄託した。この新規組換えプラスミドｐＥＴ２３ｂ−ｍｅｌＤを常法にしたがって大腸菌に導入した。得られた新規形質転換体をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＴｍｅｌＤ−１４と命名した。
【００２６】
得られた形質転換体を培養した。その結果、得られた形質転換体の菌体破砕液はｐＥＴ２３ｂで形質転換したものの菌体破砕液に比べてきわめて高いチロシナーゼ活性を示した。
【００２７】
従って、我々が単離したｍｅｌＤ遺伝子には、チロシナーゼ活性を有するタンパク質がコードされていることが明らかとなった。このように本発明に係るｍｅｌＤ遺伝子は新規なものであって、既述のように、従来既知のチロシナーゼとは異なる新規チロシナーゼをコードする遺伝子、該新規チロシナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、これらの遺伝子の少なくとも１つを含有する遺伝子、から選ばれる少なくとも一つを支持するものである。
【００２８】
さらに、本遺伝子産物であるｍｅｌＤチロシナーゼの諸性質を検討したところ、ｐＨ依存性、酸活性化条件、基質反応性などいずれにおいても既存のチロシナーゼ（ｍｅｌＢ）とは異なる性質を有していた。
【００２９】
以上のように、我々は既に単離されているチロシナーゼ遺伝子（ｍｅｌＯ、ｍｅｌＢ）とは異なる新規チロシナーゼ遺伝子（ｍｅｌＤ）を単離する事に成功した。
【００３０】
【実施例１】
ｍｅｌＤ遺伝子の大腸菌への導入
ｍｅｌＤ遺伝子のコード領域（１７７６ｂｐ）をＡ．ｏｒｙｚａｅゲノムＤＮＡをテンペレートとして宝酒造株式会社製ＰｙｒｏｂｅｓｔによりオリゴＤＮＡ＃３（配列番号５：図８）、オリゴＤＮＡ＃４（配列番号６：図９）を用いて増幅した断片を制限酵素ＥｃｏＲＩで処理し、大腸菌高発現用ベクターｐＥＴ２３ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＩサイトに挿入し、得られた組換えベクターｐＥＴ２３ｂ−ｍｅｌＤ（ＦＥＲＭ Ｐ−１９０６９）を用いて常法にしたがって大腸菌の形質転換を行った。
【００３１】
得られた形質転換体（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＴｍｅｌＤ−１４）をＬＢ培地にて２日間液体培養した後、菌体破砕液のチロシナーゼ活性を常法にしたがって測定した。その結果、得られた形質転換体の菌体破砕液は、ベクター（ｐＥＴ２３ｂ）のみで形質転換したものの菌体破砕液に比べてきわめて高いチロシナーゼ活性を示した（表１）。
【００３２】
2004201545.tif 000002
【００３３】
【実施例２】
ｍｅｌＢとｍｅｌＤの至適ｐＨの同定
ｍｅｌＢとｍｅｌＤの精製酵素を用いてＬ−ＤＯＰＡと反応液中でそれぞれ反応させた。反応のｐＨを３．２から７．６まで変化させ、その至適ｐＨを調べた。いずれの酵素もｐＨ５．６の時に活性が最大になった。その結果を図１０（ｍｅｌＢ）、図１１、（ｍｅｌＤ）に示す。図中、ＮａＯＡｃ−ＡｃＯＨは酢酸ナトリウム緩衝液、ＮａＰＢはリン酸ナトリウム緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは塩酸トリス緩衝液をそれぞれ示す。
【００３４】
【実施例３】
ｍｅｌＢ、ｍｅｌＤの酸処理による活性化
チロシナーゼは酸処理によって活性化する。そこで、ｐＨを２．２から６．０と変化させ、酸処理を行い、活性化させた。その結果を表２、表３に示す。
活性の大きさは最大の活性を１００とした時の相対値（比活性）で示す。その結果、最大の活性化には、ｍｅｌＤの方がより中性に近いｐＨが有効であった。
【００３５】
2004201545.tif 000003
【００３６】
2004201545.tif 000004
【００３７】
【実施例４】
ｍｅｌＢ、ｍｅｌＤのＤＯＰＡに対する反応性
ｍｅｌＢ、ｍｅｌＤそれぞれの反応液中の酵素濃度は０．１ｍｇ／ｍｌであり、いずれも酸処理活性化したものを用いた。また、反応は１５℃で行った。その結果を表４、表５に示す。これによるとｍｅｌＤはｍｅｌＢに比べてＤＯＰＡに対する反応性が高いといえる。
【００３８】
2004201545.tif 000005
【００３９】
2004201545.tif 000006
【００４０】
【発明の効果】
本発明により、麹菌の褐変性を示すチロシナーゼ（ｍｅｌＤ）を大量に生産することが可能となり、清酒麹の褐変防止、醸造食品の着色防止、着色防止物質の開発など様々な産業分野に利用することを可能にするものである。また本発明は、食品、医薬品、化粧品産業などへも応用が可能な画期的な技術である。
【００４１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】新規チロシナーゼ（ｍｅｌＤ）のアミノ酸配列を示す。
【図２】同上続きを示す。
【図３】同上続きを示す。
【図４】新規チロシナーゼ遺伝子ｍｅｌＤの塩基配列を示す。
【図５】同上続きを示す。
【図６】オリゴＤＮＡ＃１を示す。
【図７】オリゴＤＮＡ＃２を示す。
【図８】オリゴＤＮＡ＃３を示す。
【図９】オリゴＤＮＡ＃４を示す。
【図１０】ｍｅｌＢ由来酵素の至適ｐＨを示すグラフである。
【図１１】ｍｅｌＤ由来酵素の至適ｐＨを示すグラフである。
【図１２】ｍｅｌＤ発現用プラスミドｐＥＴ２３ｂ−ｍｅｌＤを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2004201545.tif 000019
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2004201545.tif 000022
【図１１】
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【図１２】
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