(57)【要約】【課題】  ポリペプチドモノマーを、モノマー、およびダイマーまたはマルチマーまたは両方を含む混合物から分離する方法を提供すること。【解決手段】  ポリペプチドモノマーを、モノマー、およびダイマーまたはマルチマーまたは両方を含む混合物から分離する方法であって、該混合物を、緩衝液中でカチオンまたはアニオン交換クロマトグラフィー樹脂に付与する工程であって、ここで該樹脂がカチオン交換である場合、該緩衝液のｐＨは約４〜７であり、そしてここで該樹脂がアニオン交換である場合、該緩衝液のｐＨは約６〜９である、工程、および、該混合物を、約０〜１Ｍの溶出塩のグラジエントで溶出する工程であって、ここで該モノマーが該混合物中に存在するダイマーまたはマルチマーまたは両方から分離される工程、を包含し；クエン酸塩が緩衝液として用いられる場合、２０ｍＭ未満の濃度で用いられる方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドモノマーを、モノマー、およびダイマーまたはマルチマーまたは両方を含む混合物から分離する方法であって、
該混合物を、緩衝液中でカチオン交換またはアニオン交換クロマトグラフィー樹脂に付与する工程であって、ここで該樹脂がカチオン交換である場合、該緩衝液のｐＨは約４〜７であり、そしてここで該樹脂がアニオン交換である場合、該緩衝液のｐＨは約６〜９である、工程、および、
該混合物を、約０〜１Ｍの溶出塩のグラジエントで溶出する工程であって、ここで該モノマーが該混合物中に存在するダイマーまたはマルチマーまたは両方から分離される工程、を包含し；クエン酸塩が緩衝液として用いられる場合、２０ｍＭ未満の濃度で用いられる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、イオン交換クロマトグラフィーを用いてダイマーおよび／またはその他のマルチマーからポリペプチドモノマーを分離するプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術および関連技術の説明）
組換え宿主から、真正の適切に折り畳まれたタンパク質を精製する試みは、この分子の三次構造に起因して挫折している。この点について、組換えにより産生された分子の精製は、しばしば、大部分が、不活性で、誤って折り畳まれた、不溶性の、および／または可溶性のダイマー、マルチマー、およびジスルフィド結合した凝集体からなる不均質な混合物を生じる。フラグメント、切れ目が入った形態、酸化形態、およびグリコシル化形態のようなその他の異常分子もまた存在し得る。従って、精製は困難であり、そして真正モノマーの収率はしばしば低い。例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔら、Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．、９：９５−１０４（１９９０）を参照のこと。
【０００３】
異なる技法を用いてこれらの問題が矯正されている。例えば、ＣｈａｎｇおよびＳｗａｒｔｚ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｏｌｄｉｎｇ：ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９９３）、１７８〜１８８頁は、アルカリ緩衝液中の低濃度の尿素およびジチオトレイトール（ＤＴＴ）を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ中で産生された凝集したＩＧＦ−Ｉを可溶化する方法を記載する。米国特許第５，２３１，１７８号は、カチオン交換、疎水性相互作用，およびゲル濾過クラマトグラフィーの組み合わせを用いて、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓから正確に折り畳まれたモノマーＩＧＦ−Ｉの精製方法を記載する。ＷＯ  ９６／４０７７６は、酵母細胞培地を用いる最初のカチオン交換クロマトグラフィー、変性およびクロマトグラフィーを用い、そして逆相高速液体クロマトグラフィーを実施して、酵母から真正の適切に折り畳まれたＩＧＦを産生する方法を記載する。
【０００４】
タンパク質およびペプチドモノマーの、それらのダイマー、テトラマー、およびマルチマーからの分離は、分離の科学者に重大な挑戦を提示する。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）およびタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）（米国特許第５，２５６，２９４号および同５，４９０，９３７号）は、凝集体からモノマーを分離するために用いられているが、制限を有している。ＳＥＣは、マルチマーからモノマーを、そしていくつかの場合にはダイマーからモノマーを分離し得る。ＳＥＣの主要な制限は、１）大カラムまたは複数サイクルを必要とする、限られた負荷容積（代表的にはベッド容積の５％）。２）および負荷タンパク質濃度（低濃度の供給ストックが、予備濃縮またはカラムについて複数サイクルを必要とする。より高いタンパク質濃度は、より粘性であり得、それによって分離の効率を低減する）である。歴史的に、ＴＦＦは、モノマーより１０倍大きいタンパク質マルチマーを分離し得る。米国特許第５，２５６，２９４号。
【０００５】
米国特許第４，２２８，１５４号および同第５，２５０，６６３号は、混合物からアルブミンの分離を開示する。米国特許第４，２２８，１５４号は、マルチマーからのモノマーの分離なくして、精製のためのカチオン交換クロマトグラフィーおよびアニオン交換クロマトグラフィーステップ両方の使用を記載する。
【０００６】
日本特許出願特願平７−２８５８８５号は、免疫グロブリンモノマーを、モノマーおよびポリマーを含む混合物から分離するプロセスを記載し、ここで、この免疫グロブリンの混合物は、カチオン交換樹脂に付与される。このプロセスは、濾過を含むが、任意の材料の溶出は含まない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
良好であって、１つのイオン交換ステップのみの使用を必要とし、そしてＳＥＣまたはＴＦＦの制限を有さない、ダイマーおよびマルチマーからモノマーを分離する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
従って、本発明は、ダイマーおよび／またはマルチマーを含む混合物から、ポリペプチドモノマーを分離する方法を提供し、ここでこの方法は、緩衝液中のカチオン交換またはアニオン交換クロマトグラフィー樹脂のいずれかに上記混合物を付与する工程、ここでこの樹脂がカチオン交換である場合、上記緩衝液のｐＨは約４〜７であり、そしてここでこの樹脂がアニオン交換である場合、上記緩衝液のｐＨは約６〜９であり、そして約０〜１Ｍの溶出塩のグラジエントで上記混合物を溶出する工程、ここで上記モノマーは、上記混合物中に存在するダイマーおよび／またはマルチマーから分離される工程、を包含する。
【０００９】
従って、本発明は以下を提供する。
【００１０】
（１）ポリペプチドモノマーを、モノマー、およびダイマーまたはマルチマーまたは両方を含む混合物から分離する方法であって、
該混合物を、緩衝液中でカチオン交換またはアニオン交換クロマトグラフィー樹脂に付与する工程であって、ここで該樹脂がカチオン交換である場合、該緩衝液のｐＨは約４〜７であり、そしてここで該樹脂がアニオン交換である場合、該緩衝液のｐＨは約６〜９である、工程、および、
該混合物を、約０〜１Ｍの溶出塩のグラジエントで溶出する工程であって、ここで該モノマーが該混合物中に存在するダイマーまたはマルチマーまたは両方から分離される工程、を包含し；クエン酸塩が緩衝液として用いられる場合、２０ｍＭ未満の濃度で用いられる、方法。
【００１１】
（２）前記ポリペプチドが、抗体または血清アルブミンであり；特に該抗体が、抗ＩｇＥ、抗ＩｇＧ、抗Ｈｅｒ−２、抗−ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、抗−ＣＤ２０、または抗ＶＥＧＦであるか；あるいは該血清アルブミンがウシ血清アルブミンである、項目１に記載の方法。
【００１２】
（３）前記イオン交換樹脂がカチオン交換樹脂であるか；または前記イオン交換樹脂がアニオン交換樹脂である、項目１または２に記載の方法。
【００１３】
（４）前記グラジエントが直線状または段階的である、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
【００１４】
（５）前記溶出塩がナトリウム塩であり；特に該溶出塩が塩化ナトリウムである、項目１〜４のいずれかに記載の方法。
【００１５】
（６）前記グラジエントが０〜５００ｍＭの溶出塩であり；特に該グラジエントが５０〜２００ｍＭの溶出塩であるか；または該グラジエントが０〜５０ｍＭの溶出塩である、項目１〜５のいずれかに記載の方法。
【００１６】
（７）クエン酸が緩衝液として用いられる場合、約５ｍＭの濃度で用いられる、項目１〜６のいずれかに記載の方法。
【００１７】
（８）ポリペプチドモノマーを、モノマー、およびダイマーまたはマルチマーまたは両方を含む混合物から分離する方法であって、
該混合物を、緩衝液中でアニオン交換クロマトグラフィー樹脂に付与する工程であって、ここで該緩衝液のｐＨは約６〜９である、工程、および、
該混合物を、約０〜１Ｍの溶出塩のグラジエントで溶出する工程であって、ここで該モノマーが該混合物中に存在するダイマーまたはマルチマーまたは両方から分離される工程、を包含し；クエン酸塩が緩衝液として用いられる場合、２０ｍＭ未満の濃度で用いられる、方法。  
【００１８】
（９）項目２、および４〜７のいずれかに規定された特徴をさらに含む、項目８に記載の方法。
【００１９】
（１０）ポリペプチドモノマーを、モノマー、およびダイマーまたはマルチマーまたは両方を含む混合物から分離する方法であって、
該混合物を、緩衝液中でカチオン交換またはアニオン交換クロマトグラフィー樹脂に付与する工程であって、ここで該樹脂がカチオン交換である場合、該緩衝液のｐＨは約４〜７であり、そしてここで該樹脂がアニオン交換である場合、該緩衝液のｐＨは約６〜９である、工程、および、
該混合物を、約０〜１Ｍの溶出塩のグラジエントで溶出する工程であって、ここで該モノマーが該混合物中に存在するダイマーまたはマルチマーまたは両方から分離される工程、を包含し；クエン酸塩が緩衝液として用いられる場合、２０ｍＭ未満の濃度で用いられ；そして該分離されたモノマーが、９９．５％より大きい純度を有する、方法。
【００２０】
（１１）項目２〜７のいずれかで規定される特徴をさらに含む、項目１０に記載の方法。
【００２１】
（１２）ポリペプチドモノマーを、モノマー、およびダイマーまたはマルチマーまたは両方を含む混合物からイオン交換クロマトグラフィーによって分離するためのイオン交換樹脂の使用であって；該混合物を該樹脂に付与する工程、および該混合物を、約０〜１Ｍの溶出塩のグラジエントで溶出する工程を包含する、使用。
【発明の効果】
【００２２】
この研究では、イオン交換クロマトグラフィー（アニオンまたはカチオンのいずれか）が、タンパク質またはポリペプチドモノマーを、それらのダイマーおよび／またはマルチマーから分離するための有効な手段であることを示す。分離は、段階的または直線状グラジエント溶出のいずれかを用いて実施される。イオン交換は、上記のようにＳＥＣおよびＴＦＦ法に比べいくつかの利点を有する。第１に、分離は、負荷物中のポリペプチド濃度とは独立であり、そしてそれ故予備濃縮を必要としない。第２に、樹脂には、３０ｍｇポリペプチド／ｍＬ樹脂より多く負荷し得、そしてなお、優れた分離を達成する。第３に、イオン交換樹脂は、安価でかつ容易に用い得る。代表的な分離は、９９．５％純度より大きいモノマーの濃縮、および９０％を超える収率を達成する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（好適な実施態様の詳細な説明）
（定義）
本明細書で用いるとき、「ポリペプチド」は、一般に、約１０より多いアミノ酸を有するペプチドおよびタンパク質をいう。好ましくは、ポリペプチドは、それらが「異種」、すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉにより産生されるヒトタンパク質のような、利用されている宿主細胞にとって外来であることを意味する「外因性」である。しかし、それらはまた、それらが天然に存在するネイティブな供給源由来であり得る。
【００２４】
哺乳類ポリペプチドの例は、例えば、レニン、成長ホルモン（ヒト成長ホルモン；ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポプロテイン類；１−アンチトリプシン；インスリンＡ−鎖；インスリンＢ−鎖；プロインスリン；トロンボポイエチン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、およびフォン・ビルブラント因子のような凝固因子；プロテインＣのような抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性物質；ウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノゲンアクチベータ（ｔ−ＰＡ）のような、プラスミノゲンアクチベータ；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子αおよびβ；エンケファリナーゼ；ヒト血清アルブミンのような血清アルブミン；ミューラー阻害物質；レラキシンＡ−鎖；レラキシンＢ−鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；β−ラクタマーゼのような微生物タンパク質；ＤＮアーゼ；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン類または成長因子類のレセプター；インテグリン；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６）のような神経栄養因子、またはＮＧＦのような神経成長因子；カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）のようなカルジオトロフィン類（心臓肥大因子）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦおよびｂＦＧＦのような線維芽細胞成長因子；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；ＴＦＧ−１、ＴＧＦ−２、ＴＧＦ−３、ＴＧＦ−４、またはＴＧＦ−５を含む、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βのようなトランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；デス（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８、およびＣＤ−１９のようなＣＤタンパク質類；エリスロポイエチン；骨誘導性因子類；イムノトキシン類；骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−α，−β、および−γのようなインターフェロン；ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のような血清アルブミン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）類、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）類、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０；抗ＨＥＲ−２抗体；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ−細胞レセプター；表面膜タンパク質類；崩壊促進因子；例えば、ＡＩＤＳエンベロープの部分のようなウイルス抗原；輸送タンパク質類；ホーミングレセプター類；アドレシン類；調節タンパク質類；抗体類；および上記に列挙したポリペプチドの任意のフラグメントのような分子を含む。
【００２５】
目的の好ましいポリペプチドは哺乳類ポリペチドである。このような哺乳動物ポリペプチドの例は、酵素類、ホルモン類、サイトカイン類、アルブミン類、ケモカイン類、イムノトキシン類、ウイルス成分類、抗体類、ニューロトロフィン類、および抗原類を含む。適切なこのようなポリペプチドは、ＨＳＡ、ＢＳＡ、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ２０、抗ＩｇＧ、ｔ−ＰＡ、ｇｐ１２０、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、抗ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β、アクチビン、インヒビン、抗ＨＥＲ−２、ＤＮアーゼ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、脳ＩＧＦ−Ｉ、成長ホルモン、レラキシン鎖、成長ホルモン放出因子、インスリン鎖またはプロインスリン、ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＢＤＮＦ、およびウロキナーゼのようなポリペプチドを包含する。特に好適な哺乳類ポリペプチドは、例えば、ｔ−ＰＡ、ｇｐ１２０（ＩＩＩｂ）、抗ＨＥＲ−２、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、抗ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＢＳＡ、ＨＳＡ、抗ＣＤ２０、抗ＩｇＥ、抗ＩｇＧ、ＤＮアーゼ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＴＧＦ−β、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−１、成長ホルモン、ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、およびＮＴ−６を含む。より好適なポリペプチドは、抗体または血清アルブミン、より好適には、抗ＩｇＥ、抗ＩｇＧ、抗Ｈｅｒ−２、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、抗ＣＤ２０、抗ＶＥＧＦ、ＢＳＡ、またはＨＳＡである。
【００２６】
本明細書における目的のために、「混合物」は、モノマー、およびダイマーもしくはマルチマーのいずれかまたはダイマーおよびマルチマーの両方を含む。代表的には、この混合物は、細胞、細胞成分、または細胞の産物に由来するかまたはこれらを含む任意の液体を示す、生物学的液体である。生物学的液体は、発酵ブロス、細胞培養上清液、細胞溶解物、清澄化細胞溶解物、細胞抽出物、組織抽出物、血液、血漿、血清、痰、精液、粘液、ミルク、およびそれらのフラクションを含むがこれらに限定されない。この定義は、細胞が培養され、そして細胞産物を含む栄養培地を示す細胞馴化培養培地を含む。
【００２７】
本明細書における目的のために、「イオン交換クロマトグラフィー樹脂」とは、アニオン−またはカチオン−交換分離のためのクロマトグラフィー媒体をいう。
【００２８】
本明細書で用いられるとき、「溶出塩」は、アルカリ土類塩、アルカリ金属塩、またはアンモニウム塩、すなわち、アルカリ土類元素またはアルカリ金属元素またはアンモニウムカチオンからのカチオンを有し、そして無機または有機（炭化水素を基礎にした）アニオンを有する塩をいう。このような塩の例は、塩化ナトリウム、塩化アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸アンモニウム、リン酸マグネシウム、リン酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カルシウムなどを含む。本明細書において、好適な塩は、塩化物または硫酸塩である。本明細書において最も好適な塩は塩化ナトリウムである。
【００２９】
本明細書で用いるとき、「マルチマー」は、ｎが３〜１０であるｎマー、すなわち、ダイマーではないが凝集体を除くポリマーをいう。マルチマーに対して、凝集体は、１０より大きいｎの値、および／または２百万ダルトンより大きい分子量を有する、および／またはＳＵＰＥＲＯＳＥ６ＴＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のような分析用サイズ排除クロマトグラフィーカラムの排除容積に含まれる種である。
【００３０】
（発明を実施する形態）
本発明は、ポリペプチドのモノマーを、それらのダイマーもしくはマルチマーまたは両方から分離する方法に関する。この方法は、供給源がなんであれそこから、モノマーおよびダイマーおよび／またはマルチマーの混合物を、クロマトグラフィー分離に用いられる樹脂が、カチオン−またはアニオン−交換樹脂であるか否かに依存して、約４〜９の範囲のｐＨの平衡緩衝液中に配置することを包含する。得られる混合物を、カチオン交換またはアニオン交換クロマトグラフィー樹脂のいずれか上に負荷し、この混合物中に存在するｎマー（モノマー、ダイマー、トリマー、テトラマーなど）すべてを捕捉する。イオン交換カラムクロマトグラフィーには、通常の親和性のリガンドを用いて、所望の選択性および結合性質を達成し得る。負荷することは、樹脂がアニオン交換である場合、約６〜９のｐＨの緩衝液で、そして樹脂がカチオン交換の場合、約４〜７で行われる。正確なｐＨは、例えば、ポリペプチドの等電点に依存する。
【００３１】
樹脂がカチオン交換樹脂である場合、上記混合物を負荷する前に、マトリッスクは、数カラム容積の希釈した弱酸（例えば、４カラム容積の、２０ｍＭ酢酸、ｐＨ３、または２０ｍＭリン酸、ｐＨ約２．８）を用いて平衡化され得る。平衡の後、混合物を添加し、そして混合物の溶出の前に、カラムはまた、弱い酢酸またはリン酸溶液のような弱酸溶液を用いて１〜数回洗浄され得る。この目的のために用いられる緩衝液は、例えば、ポリペプチド、および樹脂のアニオンまたはカチオン性質に依存する。アニオン交換には、好ましくは、この緩衝液は、ＴＲＩＳまたはリン酸緩衝液であり；カチオン交換には、この緩衝液は、好ましくは、酢酸またはリン酸緩衝液である。
【００３２】
代表的には、イオン交換クロマトグラフィーは、約１８〜２５℃の温度、好ましくは約２０℃（室温）で実施される。好適なカラム負荷は、２０〜３０ｍｇ総ポリペフチドあたり約１ｍｌの樹脂である。
【００３３】
イオン交換体へのｎマー分子の吸着後、混合物は、樹脂を適切なイオン強度を有する溶出塩と接触させ、マトリックスからモノマーを置換することにより溶出される。約０〜１Ｍの溶出塩グラジエントが用いられる。このグラジエントは直線状または段階的であり得る。好ましくはこのグラジエントは、約０〜５００ｍＭ溶出塩、より好ましくは５０〜２００ｍＭ溶出塩、そして最も好ましくは０〜５０ｍＭ溶出塩である。好ましくは、この溶出塩は、塩化ナトリウムのようなナトリウム塩であるが、当業者に公知のその他の溶出塩および濃度グラジエントもまた本明細書における使用を見いだす。溶出緩衝液の量は広く変化し得、そして一般に約２〜４０カラム容積、好ましくは１０〜４０カラム容積の範囲である。溶出後、溶出物を、総モノマー濃度についてアッセイし得る。
【００３４】
本明細書における好適なカチオン交換樹脂は、当該分野で公知の広範な種類の材料を含み、広いｐＨ範囲に亘ってポリペプチドを結合し得るものを含む。例えば、カルボキシメチル化マトリックス、硫酸化マトリックス、アガロースを基礎にするマトリックス、またはポリマーのポリスチレン／ジビニルベンゼンカチオン交換マトリックスが特に好ましい。その他の有用なマトリックス材料は、繊維状マトリックス、微粒子状マトリックス、およびビーズ状マトリックスのようなセルロースマトリックス；デキストラン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリスチレン、シリカ、およびポリエーテルマトリックス；およびコンポジットを含むがこれらに限定されない。これらのマトリックスは、例えば、ＣＭ５２  ＣＥＬＬＵＬＯＳＥＴＭ（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｉｎｃ．）；Ｓ−ＨＹＰＥＲＤＴＭおよびＣＭ  ＳＰＨＥＲＯＤＥＸＴＭ（Ｓｅｃｐｒａｃｏｒ）；ＳＰ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＦＴＭ、ＤＥＡＥ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＦＴＭ、ＣＭ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ、およびＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＳＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）；およびＪＴ  ＢＡＫＥＲ  ＣＳＸＴＭ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｉｎｃ．）、ならびに機能的リガンドＲ−ＳＯ３−を含むもの、好ましくは、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＳＰ５５０ＣＴＭ（Ｔｏｓｏｈａａｓ）およびＦＲＡＣＴＯＧＥＬ  ＥＭＤＴＭＳＯ３−６５０（ｍ）（Ｍｅｒｃｋ）のようなスルホプロピル樹脂を含む。カチオン交換クロマトグラフィーにおける使用のためのその他の適切な材料は、当業者の知識内にある。
【００３５】
アニオン交換クロマトグラフィーは、当該分野で公知のような、そのために適切な媒体を用いて実施される。適切な媒体は、例えば、ポリマーのポリスチレン／ジビニルベンゼン樹脂およびアガロースを基礎にした樹脂、ならびにアガロースビーズ、デキストランビーズ、ポリスチレンビーズ、第三または第四アミン基で誘導体化された不溶性の粒子状基体を含む媒体、およびトリメチルアミノエチル基で誘導体化された支持体を含む。適切なこのような媒体の例は、ＤＥ９２ＴＭ（ジエチルアミノエチルセルロース、Ｗｈａｔｍａｎ）；ＤＥＡＥ−ＣＥＬＬＵＬＯＳＥＴＭ（Ｓｉｇｍａ）、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤ  ＡＢＸ  ４０ｍｕＴＭ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｉｎｃ．）；ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ  ＥＭＤ  ＤＥＡＥ−６５０ＴＭ（ＥＭ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）、ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ−６５０（Ｓ）ＴＭ（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）、ＴＳＫゲルＤＥＡＥ−ＳＰＷＴＭ（Ｔｏｓｏｈａａｓ）、ＤＥＡＥ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＣＬ−６ＢＴＭおよびキレート化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）、ＤＥＡＥ  ＭＥＲＥ  ＳＥＰ．１０００ＴＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、およびＤＥＡＥ  ＳＰＨＥＲＯＤＥＸＴＭ（Ｓｅｐｒａｃｏｒ）のようなＤＥＡＥ樹脂；ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＱＴＭおよびＱ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ（ＱＳＦＦ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）；およびＭＡＣＲＯ−ＰＥＰ  ＱＴＭ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）；Ｑ−ＨＹＰＥＲＤＴＭ（ＢｉｏＳｅｐｒａ、Ｉｎｃ．、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、Ｍａｓｓ）などを含む。その他の適切なアニオン交換クロマトグラフィー材料、ならびに本出願のためのこれらの材料の選択および使用は、当該分野では通常である。
【００３６】
イオン交換クロマトグラフィーから得られたモノマーの精製されたフラクションは、これらを、下流プロセッシングおよび精製のために設計された任意の適切な技法に供することによりさらにプロセッシングされ得る。これは、ポリペプチドのタイプおよびその意図された使用に大いに依存する。混合物中のダイマーおよび／またはマルチマーからモノマーの所望の分離を行うために、１回のイオン交換ステップが必要であるに過ぎないが、本発明では、所望であれば、このポリペプチドの上流または下流プロセッシングにおいてより多いこのようなステップを用いることを排除しない。
【００３７】
本発明は、以下の実施例への参照によってより完全に理解される。しかし、それらは本発明の範囲を制限するとして解釈されるべきではない。本明細書におけるすべての文献および特許の引用は参考として援用される。
【実施例】
【００３８】
（実施例Ｉ）
この実施例は、抗ＩｇＥモノマーおよびウシ血清アルブミンモノマーのダイマーおよびマルチマーからの分離を示す。
【００３９】
（材料および方法：）
（樹脂：）
Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｑ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＡＳＴ  ＦＬＯＷＴＭ。４ｍＬ〜２３５Ｌ評価ベッド容積
Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＳおよびＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＱＴＭ：１ｍＬ充填カラム
ＪＴ  Ｂａｋｅｒ  ＣＳＸＴＭ、０．４６×５ｃｍ、５μ粒子
（タンパク質：）
Ａ．Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．から入手可能なヒト化抗ＩｇＥモノクローナル抗体（ＩｇＧ１）：ｐＩ約７．５、Ｅ２５およびＥ２６と称される。１９９３年３月４日に公開されたＷＯ９３／０４１７３は、ヒト化抗ＩｇＥ抗体、ここでは、ヒトＩｇＥ（ＭａＥ１１）に対して惹起されたマウス抗体を用いてＣＤＲ領域を提供し、これをＩｇＧ１免疫グロブリンフレーム枠中に置き換えた（ｒｈｕＭａＥ２５）、を記載する。Ｅ−２５の研究およびさらなる記載のために、Ｃａｃｉａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５：１８９７〜１９０３（１９９６）もまた参照のこと。
【００４０】
Ｂ．不死化ヒトミエローマ細胞株Ｕ２６６Ｂ１（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ  １９６）の培養上清液から、単離された抗ＩｇＥ抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  ＭＡＥ１）上のアフィニティークロマトグラフィー精製を用いて調製されたモノクローナル抗ＩｇＥ抗体。詳細には、６週齢の５匹のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスを、それらの足蹠中に、Ｒｉｂｉのアジュバント中の１０μｇの精製ＩｇＥで免疫化した。次の注射を、最初の免疫化の後、１週間および３週間目に同様に行った。最後の注射の３日後、鼠径リンパ節および膝窩リンパ節を取り出してプールし、そしてこの組織を、スチールガーゼを通過させることにより単一細胞懸濁液を作製した。この細胞を、４：１の比でマウスミエローマＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）と、５０％Ｗ／Ｖポリエチレングリコール４０００を含む高グルコース（ＤＭＥＭ）中で融合した。あるいは、注射あたり３０μｇのＩｇＥを用い、そしてＩｇＥフラグメント３１５〜３４７（Ｋｏｂａｔ）を灌流追加免疫としてアッセイしたか；または注射を、１００μｇの２回の投与量および５０μｇの最終追加免疫を皮下に行い、そして脾臓細胞を融合に用いたことを除いて同様の方法で免疫を行った。
【００４１】
次いで、融合細胞を、９６ウェルの組織培養プレート中ウェルあたり２×１０５の密度でプレートに入れた。２４時間後、ＨＡＴ選択培地ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン、Ｓｉｇｍａ、＃Ｈ０２６２を添加した。プレートした１４４０のウェルのうち、ＨＡＴ選択の後、３６５が増殖細胞を含んでいた。
【００４２】
融合の１５日後、上清液を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いてヒトＩｇＥに特異的な抗体の存在について試験した。このＥＬＩＳＡは、すべてのインキュベーションを室温で行って以下のように実施した。試験プレート（Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ）を、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６中の１μｇ／ｍｌのラット抗マウスＩｇＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、＃６０５〜５００）で２時間の間コートし、次いでリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の０．５％ウシ血清アルブミンで３０分間ブロックし、次いで０．０５％ＴＷＥＥＮ２０ＴＭを含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で４回洗浄した。試験上清液を添加し、そして振盪しながら２時間インキュベートし、次いでＰＢＳＴで４回洗浄した。ヒトＩｇＥ（上記のようにＵ２６６細胞から精製した）を、０．５μｇ／ｍｌで添加し、そして振盪しながら１時間インキュベートし、次いでＰＢＳＴ中４回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＥ（Ｋｉｒｋｅｇａｒｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｓ、＃１４−１０−０４、０．５ｍｇ／ｍｌ）を１：２５００希釈で添加し、そして１時間インキュベートし、次いでＰＢＳＴで４回洗浄した。このプレートに、２５ｍｌリン酸クエン酸緩衝液、ｐＨ５．０中１０ｍｇのｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロライド（Ｓｉｇｍａ、＃Ｐ８２８７）および１０μｌの３０％過酸化水素溶液を含む溶液を１００μｌ／ウェル添加し、そして１５分間インキュベートすることにより発色した。反応を、２．５Ｍ硫酸を１００μｌ／ウェル添加することにより停止した。データは、このプレートを、自動化ＥＬＩＳＡプレートリーダー中４９０ｎｍの吸光度で読みとることにより得た。１つの抗体に対して、３６５個の上清液を試験し、そして１００個がヒトＩｇＥに特異的であった。その他の抗体に対してクスリーニングしたとき、ＩｇＥ特異性の同様の頻度が得られた。
【００４３】
Ｃ．ウシ血清アルブミン：ｐＩ  ４．７および４．９（Ｒａｄｏｌａ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、２９５：４１２〜４２８（１９７３））
・Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐ．Ｐ／Ｎ  ８１−０２４−２、「ウシアルブミン、スルフヒドリル修飾」（ＢＳＡ  Ｍｉｘ、ブロック化）
・ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．Ｐ／Ｎ  ８１００１３、「アルブミンウシ」（ＢＳＡ  Ｍｉｘ、ネイティブ）
・Ｂａｙｅｒ  ＢＳＡから実験室で調製したＢＳＡモノマーおよびダイマー（それぞれＢＳＡモノマーおよびＢＡＳダイマー）
（クロマトグラフィーシステム：）
Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  １０９０ＴＭＨＰＬＣ
ＰｈａｒｍａｃｉａＴＭＦＰＬＣ
２１５または２８０ｎｍにおける検出
（緩衝液：（詳細は表Ｉを参照のこと））
精製水
Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ
酢酸ナトリウム
塩化ナトリウム
リン酸ナトリウム
クエン酸ナトリウムおよびクエン酸
（試料調製：）
試料を、平衡に用いた緩衝液（以下の表１に示される）で希釈しｐＨを確実にし、そして電導度を開始カラム条件に一致させた。すべての試料を負荷前に０．２μｍ濾過した。
【００４４】
（クロマトグラフィー：）
試料を、自動または手動インジェクターのいずれかを用いてカラムに導入した。すべての操作は室温で行った。フラクションは、手動またはＰＨＡＲＭＡＣＩＡ  ＦＲＡＣ  １００ＴＭコレクターで集めた。
【００４５】
クロマトグラフィーの分離性能は、ＢＳＡストック試薬の溶出プロフィールと精製ＢＳＡモノマーおよびダイマーの溶出プロフィールを比較することにより評価した；同じことをＩｇＥおよびモノクローナル抗体（ＭＡｂ）について行った。ＩｇＥおよびＭＡｂの、それらのダイマーおよびマルチマーからの分離を、分析用サイズ排除クロマトグラフィーを用いて溶出フラクションを分析することによってさらに評価した。ＭＡｂ  ＭＷ形態  対  フラクション数のプロットを作成した。ＩｇＥおよびＭＡｂの回収は、２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより分光学的に測定した。
【００４６】
（結果：）
結果を以下の表１に要約する。
【００４７】
【表１Ａ】
2004175806.tif 000002
【００４８】
【表１Ｂ】
2004175806.tif 000003
分離は、ポリマーのポリスチレン／ジビニルベンゼン樹脂（ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＱおよびＳＴＭ）、シリカを基礎にした樹脂（ＪＴ  ＢＡＫＥＲ  ＣＳＸＴＭ）、およびアガロースを基礎にした樹脂（Ｑ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＡＳＴ  ＦＬＯＷＴＭ、ＱＳＦＦ）を用いて評価した。分離は、これら樹脂のいずれを用いても達成されたが、特に、分離はＱ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＡＳＴ  ＦＬＯＷＴＭ、ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＱＴＭ、およびＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＳＴＭ上で良好に行われた。ＢＳＡモノマーおよびダイマーの両方の供給者からの分離は、非常に類似して見え、Ｂａｙｅｒからの「スルフヒドリル修飾」材料は、分子種がより容易に分離されるようにはこのタンパク質を改変しなかったことを示唆した。ｐＨ６でリン酸緩衝液が良好に作用したことが観察され得るが、平衡緩衝液として、ｐＨ６で２０ｍＭクエン酸緩衝液を用いた場合、タンパク質は、カチオンまたはアニオン交換カラムに結合しなかった。クエン酸緩衝液は、より低濃度、例えば約５ｍＭでアニオンおよびカチオン交換の両方について作用することが期待される。
【００４９】
代表的には、アニオン交換樹脂上のモノマーＩｇＥおよびＩｇＥに対するＭＡｂの回収は、９９．５％より大きい純度で９０％より多い。図１Ａおよび１Ｂは、ＩｇＥモノマーのダイマーおよびマルチマーからの分離におけるアニオン交換（ＲＥＳＯＵＲＣＥＴＭＱ）クロマトグラムを示す。図２Ａ１および２Ａ２は、抗ＩｇＥ  ＭＡｂモノマーのダイマーおよびマルチマーからの分離におけるアニオン交換（ＲＥＳＯＵＲＣＥＴＭＱ）クロマトグラムを示す。図２Ｂは、抗ＩｇＥ  ＭＡｂモノマーのダイマーおよびマルチマーからの分離におけるアニオン交換（Ｑ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＡＳＴ−ＦＬＯＷＴＭ）クロマトグラムを示す。ＳＥＣ（ＳＵＰＥＲＤＥＸ  ２００  ＨＲ  １０／３０ＴＭ）を、イオン交換分離からの試料中のモノマーおよびマルチマーの量を測定する分析方法として用い、そして図２Ｃは、図２ＢからのフラクションのＳＥＣ分析を示す。ダイマーからのＢＳＡモノマーの分離は、ｐＨ８およびｐＨ６におけるアニオン交換樹脂上で容易に達成された。ｐＨ８（Ｔｒｉｓ緩衝液）およびｐＨ６（リン酸緩衝液）におけるアニオン交換（ＲＥＳＯＵＲＣＥＴＭＱ）によるダイマーおよびマルチマーからのＢＳＡモノマーの分離におけるクロマトグラムについては、図３Ａ〜Ｃおよび４Ａ〜Ｃをそれぞれ参照のこと。
【００５０】
カチオン交換樹脂からのＭＡｂモノマーの回収および純度は、アニオン交換樹脂のそれに匹敵した。図５Ａ〜Ｂは、ｐＨ６（リン酸緩衝液）におけるダイマーおよびマルチマーからの抗ＩｇＥＭＡｂモノマーの分離におけるカチオン交換（ＲＥＳＯＵＲＣＥＴＭ  Ｓ）クロマトグラムを示す。カチオン交換樹脂上のＢＳＡの分離は、ｐＨ４．６および４．３（４．３が幾分良好）で実施され得る。図６Ａ〜Ｂは、ｐＨ４．３（酢酸緩衝液）におけるダイマーおよびマルチマーからのＢＳＡモノマーの分離におけるカチオン交換（ＲＥＳＯＵＲＣＥＴＭＳ）クロマトグラムを示す。
【００５１】
要約すれば、ポリペプチド多量体の混合物を、種々の樹脂を用い、および種々のｐＨおよび溶出塩条件の下で、カチオンまたはアニオン交換クロマトグラフィーに供し、そして首尾よく分離が達成された。塩基性および酸性等電点を持つ４つのタンパク質（２つのＩｇＧ１  ＭＡｂ、ＩｇＥおよび血清アルブミン）からの結果に基づき、この方法が、ポリペプチドモノマーのそれらのダイマーおよびマルチマーからの分離に一般に適用可能であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１Ａ】図１Ａは、ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＱＴＭアニオン交換カラム上での、Ｕ２６６  ＩｇＥモノマーの、ダイマーおよびマルチマーからの分離を示す。カラムを、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ｐＨ８中で平衡化し、そして１０カラム容積に亘って０〜０．５Ｍの塩化ナトリウムのクラジエントで溶出した。図１Ａは、ダイマー類およびマルチマー類を示すフルスケールの図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＱＴＭアニオン交換カラム上での、Ｕ２６６  ＩｇＥモノマーの、ダイマーおよびマルチマーからの分離を示す。カラムを、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ｐＨ８中で平衡化し、そして１０カラム容積に亘って０〜０．５Ｍの塩化ナトリウムのクラジエントで溶出した。図１Ｂは、ダイマー類およびマルチマー類を示すクローズアップの図である。
【図２Ａ１】図２Ａ１は、抗ＩｇＥモノクローナル抗体モノマーの、ダイマーおよびマチルマーからの分離を示す。図２Ａ１は、ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＱＴＭアニオン交換カラム上で行う。図２Ａ１は、ダイマー類およびマルチマー類を示すフルスケールの図である。カラムは２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ｐＨ８中で平衡化した。図２Ａのパネルで用いたグラジエントは、４０カラム容積に亘る０〜０．５Ｍ塩化ナトリウムであった。
【図２Ａ２】図２Ａ２は、抗ＩｇＥモノクローナル抗体モノマーの、ダイマーおよびマチルマーからの分離を示す。図２Ａ２は、ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＱＴＭアニオン交換カラム上で行う。図２Ａ２は、ダイマー類およびマルチマー類を示すクローズアップの図である。カラムは２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ｐＨ８中で平衡化した。図２Ａのパネルで用いたグラジエントは、４０カラム容積に亘る０〜０．５Ｍ塩化ナトリウムであった。
【図２Ｂ】図２Ｂは、抗ＩｇＥモノクローナル抗体モノマーの、ダイマーおよびマチルマーからの分離を示す。図２Ｂは、Ｑ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＡＳＴ−ＦＬＯＷＴＭ樹脂上で行う。カラムは２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ｐＨ８中で平衡化した。図２Ｂで用いたグラジエント（Ｑ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＡＳＴ−ＦＬＯＷＴＭ）は、１０カラム容積に亘る０．０５〜０．２Ｍ  ＮａＣｌであった。
【図２Ｃ】図２Ｃは、抗ＩｇＥモノクローナル抗体モノマーの、ダイマーおよびマチルマーからの分離を示す。図２Ｃは、フラクション中で観察されたモノマーおよびダイマー／マルチマーのプロットである。白丸はモノマーであり、黒四角はダイマーである。このモノマーおよびダイマー／マルチマーを、ＳＵＰＥＲＤＥＸ  ２００ＨＲＴＭ  １０／３０分析用サイズ排除カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて測定した。カラムは２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ｐＨ８中で平衡化した。
【図３Ａ】図３Ａは、ｐＨ８における、ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＱＴＭアニオン交換カラム上のＢＳＡモノマーおよびダイマーの分離を示す。カラムを２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ｐＨ８中で平衡化し、そして４０カラム容積に亘って０．１２５〜０．２７５Ｍ塩化ナトリウムのグラジエントで溶出した。図３Ａは精製されたモノマーである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ｐＨ８における、ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＱＴＭアニオン交換カラム上のＢＳＡモノマーおよびダイマーの分離を示す。カラムを２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ｐＨ８中で平衡化し、そして４０カラム容積に亘って０．１２５〜０．２７５Ｍ塩化ナトリウムのグラジエントで溶出した。図３Ｂは精製されたダイマーである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ｐＨ８における、ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＱＴＭアニオン交換カラム上のＢＳＡモノマーおよびダイマーの分離を示す。カラムを２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ｐＨ８中で平衡化し、そして４０カラム容積に亘って０．１２５〜０．２７５Ｍ塩化ナトリウムのグラジエントで溶出した。図３Ｃはモノマーおよびダイマーの両方を含むＢＳＡの市販の調製物（Ｂａｙｅｒ）である。
【図４Ａ】図４Ａは、ｐＨ６における、ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＱＴＭアニオン交換カラム上のＢＳＡモノマーおよびダイマーの分離を示す。カラムを２０ｍＭ  リン酸ナトリウム／ｐＨ６中で平衡化し、そして１０カラム容積に亘って０〜０．５Ｍ塩化ナトリウムの直線状グラジエントで溶出した。図４Ａは精製されたモノマーである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ｐＨ６における、ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＱＴＭアニオン交換カラム上のＢＳＡモノマーおよびダイマーの分離を示す。カラムを２０ｍＭ  リン酸ナトリウム／ｐＨ６中で平衡化し、そして１０カラム容積に亘って０〜０．５Ｍ塩化ナトリウムの直線状グラジエントで溶出した。図４Ｂは精製されたダノマーである。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ｐＨ６における、ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＱＴＭアニオン交換カラム上のＢＳＡモノマーおよびダイマーの分離を示す。カラムを２０ｍＭ  リン酸ナトリウム／ｐＨ６中で平衡化し、そして１０カラム容積に亘って０〜０．５Ｍ塩化ナトリウムの直線状グラジエントで溶出した。図４Ｃはモノマーおよびダイマーの両方を含むＢＳＡの市販の調製物（Ｂａｙｅｒ）である。
【図５Ａ】図５Ａは、ｐＨ６における、ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＳＴＭカチオン交換カラム上の抗ＩｇＥモノクローナル抗体モノマーの、ダイマーおよびマルチマーからの分離を示す。カラムは２０ｍＭ  リン酸ナトリウム／ｐＨ６中で平衡化し、そして３０カラム容積に亘って０〜０．０５Ｍ塩化ナトリウムの直線状グラジエントで溶出した。図５Ａは分離からのクロマトグラムである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ｐＨ６における、ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＳＴＭカチオン交換カラム上の抗ＩｇＥモノクローナル抗体モノマーの、ダイマーおよびマルチマーからの分離を示す。カラムは２０ｍＭ  リン酸ナトリウム／ｐＨ６中で平衡化し、そして３０カラム容積に亘って０〜０．０５Ｍ塩化ナトリウムの直線状グラジエントで溶出した。図５Ｂは、図２Ａ１〜図２Ｃに記載したのと同じ方法を用い、フラクション中で観察されたモノマーおよびダイマー／マルチマーのプロットであり、白丸はモノマーであり、そして黒丸はダイマーである。
【図６Ａ】図６Ａは、ｐＨ４．３における、ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＳＴＭカチオン交換カラム上のＢＳＡモノマーおよびダイマーの分離を示す。カラムは２０ｍＭ  酢酸ナトリウム／ｐＨ４．３中で平衡化し、次いで２０カラム容積に亘って０〜１Ｍ塩化ナトリウムのグラジエントで溶出した。図６Ａは精製されたモノマーである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ｐＨ４．３における、ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＳＴＭカチオン交換カラム上のＢＳＡモノマーおよびダイマーの分離を示す。カラムは２０ｍＭ  酢酸ナトリウム／ｐＨ４．３中で平衡化し、次いで２０カラム容積に亘って０〜１Ｍ塩化ナトリウムのグラジエントで溶出した。図６Ｂは精製されたダイマーである。
【図１Ａ】
2004175806.tif 000004
【図１Ｂ】
2004175806.tif 000005
【図２Ａ１】
2004175806.tif 000006
【図２Ａ２】
2004175806.tif 000007
【図２Ｂ】
2004175806.tif 000008
【図２Ｃ】
2004175806.tif 000009
【図３Ａ】
2004175806.tif 000010
【図３Ｂ】
2004175806.tif 000011
【図３Ｃ】
2004175806.tif 000012
【図４Ａ】
2004175806.tif 000013
【図４Ｂ】
2004175806.tif 000014
【図４Ｃ】
2004175806.tif 000015
【図５Ａ】
2004175806.tif 000016
【図５Ｂ】
2004175806.tif 000017
【図６Ａ】
2004175806.tif 000018
【図６Ｂ】
2004175806.tif 000019