(57)【要約】      （修正有）【課題】基質特異性の高いセリンプロテアーゼ活性を容易に利用することができる新規なポリヌクレオチド、ポリペプチド、組換えベクター、形質転換体及び医薬品を提供する。【解決手段】特定塩基配列のポリヌクレオチドおよびそれによりコードされたポリペプチド。前記ポリヌクレオチドを組込んだ発現ベクター。前記組換えベクターを導入することにより軽質転換された形質転換細胞。前記ポリヌクレオチド又はポリペプチドを有効成分として含有する主に抗血栓薬として利用される医薬品。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３で表される塩基配列、又はその配列と実質的に同一の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドの塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリヌクレオチドの塩基配列の一部を含有するポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１又は請求項２に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
【請求項５】
請求項１又は請求項２に記載のポリヌクレオチドが発現可能となるように組込まれたことを特徴とする組換えベクター。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームの末端に標識ペプチドをコードするヌクレオチドを組込んだことを特徴とする請求項５に記載の組換えベクター。
【請求項７】
請求項５又は請求項６に記載の組換えベクターを導入することにより形質転換された形質転換体。
【請求項８】
タンパク分解酵素を製造する方法であって、
請求項７に記載の形質転換体を増殖させた後、該形質転換体から請求項４に記載のポリペプチドを精製することを特徴とするタンパク分解酵素の製造方法。
【請求項９】
請求項１若しくは請求項２に記載のポリヌクレオチド、請求項４に記載のポリペプチド、又は請求項８に記載のタンパク分解酵素の製造方法により製造されたタンパク分解酵素を含有することを特徴とする医薬品。
【請求項１０】
請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項３に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに対する抗体、又は請求項４に記載のポリペプチドに対する抗体を含有することを特徴とする医薬品。
【請求項１１】
請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項３に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド若しくはそのポリペプチドに対する抗体、又は請求項４に記載のポリペプチド若しくはそのポリペプチドに対する抗体を含有することを特徴とする検査用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓからクローニングされたタンパク分解酵素遺伝子及びその遺伝子産物としてのタンパク分解酵素に関する知見に基づいて発明されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、組換えベクター、形質転換体、タンパク分解酵素の製造方法、医薬品及び検査用キットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、この種のセリンプロテアーゼ（ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）活性を有するタンパク分解酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ等の消化酵素や、トロンビン、プラスミン等の血液凝固、血栓溶解作用を持つ酵素が知られている（非特許文献１参照）。
【０００３】
【非特許文献１】
日経バイオ最新用語辞典  第５版、日経ＢＰ社、２００２年９月１７日、４６７頁。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
この発明は、本発明者らにより、旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓが産生する新規なタンパク分解酵素のクローニングに成功した結果なされたものである。その目的とするところは、基質特異性の高いセリンプロテアーゼ活性を容易に利用することができるポリヌクレオチド、ポリペプチド、組換えベクター、形質転換体及び医薬品を提供することにある。別の目的とするところは、基質特異性の高いセリンプロテアーゼ活性を備えたタンパク分解酵素を容易に製造することができるタンパク分解酵素の製造方法を提供することにある。その他の目的とするところは、旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓによる感染症の拡大を容易に抑えることができるポリヌクレオチド、医薬品及び検査用キットを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明のポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３で表される塩基配列、又はその配列と実質的に同一の塩基配列からなるものである。
【０００６】
請求項２に記載の発明のポリヌクレオチドは、請求項１に記載のポリヌクレオチドの塩基配列を含有するものである。
請求項３に記載の発明のポリヌクレオチドは、請求項１に記載のポリヌクレオチドの塩基配列の一部を含有するものである。
【０００７】
請求項４に記載の発明のポリペプチドは、請求項１又は請求項２に記載のポリヌクレオチドによりコードされるものである。
請求項５に記載の発明の組換えベクターは、請求項１又は請求項２に記載のポリヌクレオチドが発現可能となるように組込まれたことを特徴とするものである。
【０００８】
請求項６に記載の発明の組換えベクターは、請求項５に記載の発明において、前記ポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームの末端に標識ペプチドをコードするヌクレオチドを組込んだことを特徴とするものである。
【０００９】
請求項７に記載の発明の形質転換体は、請求項５又は請求項６に記載の組換えベクターを導入することにより形質転換されたものである。
請求項８に記載の発明のタンパク分解酵素の製造方法は、タンパク分解酵素を製造する方法であって、請求項７に記載の形質転換体を増殖させた後、該形質転換体から請求項４に記載のポリペプチドを精製することを特徴とするものである。
【００１０】
請求項９に記載の発明の医薬品は、請求項１若しくは請求項２に記載のポリヌクレオチド、請求項４に記載のポリペプチド、又は請求項８に記載のタンパク分解酵素の製造方法により製造されたタンパク分解酵素を含有することを特徴とするものである。
【００１１】
請求項１０に記載の発明の医薬品は、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項３に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに対する抗体、又は請求項４に記載のポリペプチドに対する抗体を含有することを特徴とするものである。
【００１２】
請求項１１に記載の発明の検査用キットは、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項３に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド若しくはそのポリペプチドに対する抗体、又は請求項４に記載のポリペプチド若しくはそのポリペプチドに対する抗体を含有することを特徴とするものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、この発明を具体化した実施形態を詳細に説明する。
実施形態の第一のポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３で表される塩基配列、又はその配列と実質的に同一の塩基配列からなるものである。これら第一のポリヌクレオチドは、いずれもセリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチド（タンパク分解酵素）をコードする。前記実質的に同一の塩基配列とは、各配列番号で表されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードするものを意味する。
【００１４】
また、この実質的に同一の塩基配列としては、各配列番号で表されるアミノ酸配列に対し僅かに異なるアミノ酸配列をコードするものであって、そのアミノ酸配列からなるポリペプチドがセリンプロテアーゼ活性を有するものまでが含まれる。例えば、ＰＣＲ反応により各配列番号で表される塩基配列を増幅したＰＣＲ産物も前記実質的に同一の概念に含まれる。このとき、前記実質的に同一の塩基配列としては、そのアミノ酸配列が各配列番号で表されるアミノ酸配列に対して、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上のホモロジーを有するのが望ましい。以下、配列番号ｎ（ｎ＝１〜３のいずれか）で表される塩基配列又はその配列と実質的に同一の配列からなるポリヌクレオチドを、ＰＮｎ（ポリヌクレオチドｎ）と記載する。
【００１５】
実施形態の第二のポリヌクレオチドは、前記第一のポリヌクレオチド（ＰＮ１、ＰＮ２又はＰＮ３）の塩基配列を含有するものである。即ち、この第二のポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３で表される塩基配列、又はその配列と実質的に同一の塩基配列を含有するものである。前記実質的に同一の塩基配列とは、前記第一のポリヌクレオチドの場合と全く同様のことを意味する。以下、ＰＮ１の塩基配列を含有する第二のポリヌクレオチドをＰＮ１＋、ＰＮ２の塩基配列を含有する第二のポリヌクレオチドをＰＮ２＋、ＰＮ３の塩基配列を含有する第二のポリヌクレオチドをＰＮ３＋と記載する。
【００１６】
実施形態の第三のポリヌクレオチドは、前記第一のポリヌクレオチド（ＰＮ１、ＰＮ２又はＰＮ３）の塩基配列の一部を含有するものであり、第一のポリヌクレオチド（ＰＮ１、ＰＮ２又はＰＮ３）の塩基配列の一部からなるものであってもよい。なお、この第三のポリヌクレオチドは、前記第一のポリヌクレオチドの塩基配列のうち連続した一連の部分配列を含有している。即ち、この第三のポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３で表される塩基配列の一部、又はその配列と実質的に同一の塩基配列を含有するものである。前記実質的に同一の塩基配列とは、各配列番号で表されるアミノ酸配列の一部と同一のアミノ酸配列をコードするものを意味する。また、この実質的に同一の塩基配列としては、そのアミノ酸配列が各配列番号で表されるアミノ酸配列の一部に対して、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上のホモロジーを有するものであってもよい。以下、ＰＮ１の塩基配列の一部を含有する第三のポリヌクレオチドをＰＮ１ｐ、ＰＮ２の塩基配列の一部を含有する第三のポリヌクレオチドをＰＮ２ｐ、ＰＮ３の塩基配列の一部を含有する第三のポリヌクレオチドをＰＮ３ｐと記載する。
【００１７】
これら第一から第三のポリヌクレオチドはいずれも、一本鎖ＤＮＡや二本鎖ＤＮＡ等のＤＮＡ、又は一本鎖ＲＮＡやｍＲＮＡ等のＲＮＡの形態で利用される。また、アンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡの形態で利用することもできる。これら第一から第三のポリヌクレオチドは、その全長又はその一部をサザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、インサイチュ（ｉｎｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション等に用いられる標識用のプローブとして利用することができる。また、ＤＮＡチップ（マイクロアレイ）に利用することもできる。
【００１８】
配列番号１で表される塩基配列は、旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓからクローニングされたタンパク分解酵素の遺伝子配列であり、全長１４４５塩基の塩基配列からなる。この塩基配列は、１〜１２６３番目までの１２６３塩基（４２１アミノ酸）からなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、１２６４〜１２６６番目までの終止コドンと、１２６７〜１４４５番目までの１７８塩基からなる３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）とを備えている。３’ＵＴＲには、１４１１〜１４１６番目までの６塩基からなるポリＡシグナル配列（ＡＡＴＡＡＡ）と、１４２９番目以降のポリＡ配列とが含まれている。
【００１９】
さらに、この塩基配列には、Ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，  Ｇ．  １９８６．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４：４６８３−４６９０．のアルゴリズムに基づいて、１〜８１番目までの８１塩基からなるＮ端シグナル配列が存在する。その結果、この塩基配列がコードするポリペプチドは、２７番目のＳｅｒと２８番目のＧｌｎとの間で前記Ｎ端シグナル配列が切断される翻訳後修飾を受ける可能性が高い。また、この塩基配列がコードするポリペプチドは、公知のセリンプロテアーゼに対するホモロジー検索の結果より、４７番目のＧｌｎと４８番目のＩｌｅとの間で翻訳後修飾により切断される可能性が高い。また、この塩基配列がコードするポリペプチドには、前記ホモロジー検索の結果より、８８〜９０番目、２３１〜２３３番目、２４７〜２４９番目及び２９３〜２９５番目の４カ所に糖鎖結合部位（Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）が存在し、翻訳後修飾される可能性が高い。
【００２０】
配列番号２で表される塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列の１４２〜１２６３番目までの１１２２塩基、即ち配列番号１で表されるアミノ酸配列の４８番目のＩｌｅから４２１番目のＴｙｒまでの３７４アミノ酸からなるポリペプチドをコードする。この塩基配列は、種々の翻訳後修飾を受けた後の成熟（ｍａｔｕｒｅ）タンパクとしてのセリンプロテアーゼ活性を有するタンパク分解酵素をコードしている。このタンパク分解酵素は、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１番目のＩｌｅから２３４番目のＩｌｅまでの２３４アミノ酸からなる触媒ドメインと、２３５番目のＴｙｒから３７４番目のＴｙｒまでの１４０アミノ酸からなるＣ端ドメインとを備えている。Ｃ端ドメインは、触媒ドメインの酵素活性を安定化したり、感染宿主から保護したりする役割を果たすものと推測される。
【００２１】
配列番号３で表される塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列の１４２〜８４３番目までの７０２塩基、即ち配列番号１で表されるアミノ酸配列の４８番目のＩｌｅから２８１番目のＩｌｅまでの２３４アミノ酸からなるポリペプチドをコードする。つまり、この塩基配列は、前記タンパク分解酵素の触媒ドメインをコードする。
【００２２】
実施形態の第一のポリペプチドは、前記第一のポリヌクレオチド（ＰＮ１、ＰＮ２又はＰＮ３）によりコードされるアミノ酸配列からなるものであり、例えば配列番号１、配列番号２又は配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるものが挙げられる。これら第一のポリペプチドは、いずれもセリンプロテアーゼ活性を有するタンパク分解酵素として利用することができる。
【００２３】
実施形態の第二のポリペプチドは、前記第二のポリヌクレオチド（ＰＮ１＋、ＰＮ２＋又はＰＮ３＋）によりコードされるアミノ酸配列からなるものである。この第二のポリペプチドは、前記第一のポリペプチドの５’末端又は３’末端（好ましくは３’末端）に融合ペプチド（ポリペプチド）が融合されたものである。前記融合ペプチドとしては、第二のポリヌクレオチドを導入した形質転換体を用いて第二のポリペプチドを産生させたときそのポリペプチドの精製が容易となることから、オリゴヒスチジン、ポリヒスチジン、チオレドキシン（ＴＲＸ）等の標識ペプチドが好適に用いられる。また、前記融合ペプチドとしては、スクリーニング等に利用するのが容易であることから、種々のレポーター遺伝子や薬剤耐性遺伝子の遺伝子産物を用いてもよい。この第二のポリペプチドも、セリンプロテアーゼ活性を有している。
【００２４】
実施形態の第三のポリペプチドは、前記第三のポリヌクレオチド（ＰＮ１ｐ、ＰＮ２ｐ又はＰＮ３ｐ）によりコードされるアミノ酸配列からなるものである。この第三のポリペプチドは、前記第一のポリペプチドのアミノ酸配列のうち連続した一連の部分配列を含有するものである。この第三のポリペプチドは、抗体作製のための抗原やプロテインチップ（マイクロアレイ）等に利用される。
【００２５】
実施形態の組換えベクターは、前記ポリヌクレオチド（ＰＮ１、ＰＮ２、ＰＮ３、ＰＮ１＋、ＰＮ２＋、ＰＮ３＋、ＰＮ１ｐ、ＰＮ２ｐ又はＰＮ３ｐ）をプラスミドベクターやレトロウィルスベクター等の種々の発現ベクター内に発現可能となるように組込んだものである。この組換えベクターは、公知のインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）タンパク合成系を利用して前記ポリペプチドを製造することができる。
【００２６】
実施形態の形質転換体は、前記組換えベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞等の種々の宿主細胞内に導入することにより該細胞を形質転換することにより得られる。なお、前記宿主細胞としては、セリンプロテアーゼ活性の低下を抑えつつ、ＰＮ１〜ＰＮ３及びＰＮ１＋〜ＰＮ３＋がコードするポリペプチドを迅速かつ容易に大量生産できることから、大腸菌や酵母等の微生物を用いるのが好ましく、大量生産に特に適していることから大腸菌を用いるのが最も好ましい。
【００２７】
実施形態のタンパク分解酵素の製造方法は、形質転換体を増殖させる増殖工程と、その増殖工程で増殖した形質転換体からタンパク分解酵素を精製する精製工程とを備えている。前記形質転換体としては、前記第一又は第二のポリヌクレオチド（ＰＮ１、ＰＮ２、ＰＮ３、ＰＮ１＋、ＰＮ２＋又はＰＮ３＋）が発現可能となるように組込まれた組換えベクターを導入して形質転換した細胞が用いられる。この形質転換体としては、セリンプロテアーゼ活性の低下を抑えつつ、ＰＮ１〜ＰＮ３及びＰＮ１＋〜ＰＮ３＋がコードするポリペプチドを迅速かつ容易に大量生産できることから、微生物を用いるのが好ましく、大量生産に特に適していることから大腸菌を用いるのが最も好ましい。また、前記組換えベクター内に導入されるポリヌクレオチドとしては、精製工程が容易であることから、前記標識ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第二のポリヌクレオチドであるのが好ましい。
【００２８】
前記精製工程は、前記形質転換体により産生されたポリペプチドをクロマトグラフィー等の分離精製技術を用いて精製する工程である。この精製工程では、前記形質転換体が産生するポリペプチドを効率的に精製し得る任意の分離精製技術が適用されるが、前記標識ペプチドと特異的に結合するアフィニティクロマトグラフィーを用いて前記タンパク分解酵素を精製するのが最も好ましい。なお、前記形質転換体により産生されたポリペプチドを精製した後、該ポリペプチドから標識ペプチドを分離させてタンパク分解酵素のみを単離する操作を行うとよい。
【００２９】
実施形態の医薬品としては、脳血栓や心筋梗塞等の血栓症の予防若しくは治療に利用される抗血栓薬、又は旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓによる感染症を治療するための感染症治療薬が挙げられる。
【００３０】
抗血栓薬は、前記タンパク分解酵素のセリンプロテアーゼ活性による血栓溶解作用を利用することにより血栓症の予防や治療を行うものである。この抗血栓薬は、前記第一若しくは第二のポリヌクレオチド（ＰＮ１、ＰＮ２、ＰＮ３、ＰＮ１＋、ＰＮ２＋若しくはＰＮ３＋）、前記第一若しくは第二のポリペプチド、又は前記タンパク分解酵素の製造方法により製造されたタンパク分解酵素を有効成分として含有する。
【００３１】
感染症治療薬は、前記タンパク分解酵素の発現抑制、又は該タンパク分解酵素の活性阻害を引き起こすことにより、旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓによる感染症の治療を行うものである。この感染症治療薬は、前記第一、第二若しくは第三のポリヌクレオチド（ＰＮ１、ＰＮ２、ＰＮ３、ＰＮ１＋、ＰＮ２＋、ＰＮ３＋、ＰＮ１ｐ、ＰＮ２ｐ若しくはＰＮ３ｐ）に対するアンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡ、或いは前記第一、第二又は第三のポリペプチドに対する抗体を有効成分として含有する。前記抗体としては、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体が挙げられる。前記モノクローナル抗体はハイブリドーマにより容易かつ大量に供給され得る。
【００３２】
実施形態の検査用キットとしては、ヒトや家畜等が旋毛虫症に罹患しているか否かを検査（診断）するための診断キット、又は食肉や食肉加工品等に対する食品検査を行うための食品検査キットが挙げられる。これらの検査用キットは、ヒト、家畜、食肉、食肉加工品等から採取した検査用サンプルに、旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓが産生するタンパク分解酵素が存在するか否かを検査することにより診断又は食品検査を行うものである。これらの検査用キットとしては、遺伝子検査キット又はタンパク検査キットが挙げられる。
【００３３】
遺伝子検査キットは、前記第一、第二又は第三のポリヌクレオチド（ＰＮ１、ＰＮ２、ＰＮ３、ＰＮ１＋、ＰＮ２＋、ＰＮ３＋、ＰＮ１ｐ、ＰＮ２ｐ又はＰＮ３ｐ）、好ましくは第三のポリヌクレオチドを検出用プローブとして利用するものである。この遺伝子検査キットとしては、ＤＮＡチップ、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション等の公知の検査技術が適用され、迅速かつ簡便に検査を行うことができることからＤＮＡチップが最も好適に適用される。
【００３４】
タンパク検査キットは、前記第一、第二若しくは第三のポリペプチド（検査用サンプルとしてヒトや家畜の血清が用いられる）、又は該ポリペプチドに対する抗体を検出用ツールとして利用するものである。このタンパク検査キットとしては、免疫沈降反応、ゲル内二重拡散法、免疫電気泳動法、定量沈降反応、放射免疫定量法、酵素免疫定量法、ウェスタンブロッティング、プロテインチップ等の公知の検査技術が適用され、迅速かつ簡便に検査を行うことができることからプロテインチップが最も好適に適用される。
【００３５】
上記実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
・  実施形態のポリヌクレオチドは、旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓよりクローニングされた配列番号１で表される新規な塩基配列に基づいて提供されたものである。第一及び第二のポリヌクレオチド（ＰＮ１、ＰＮ２、ＰＮ３、ＰＮ１＋、ＰＮ２＋及びＰＮ３＋）は、いずれもセリンプロテアーゼ活性を有する（第一又は第二の）ポリペプチドをコードしていることから、血栓溶解作用を発揮する可能性が高く、抗血栓薬として血栓症の予防や治療に利用することができる。特に、これら第一及び第二のポリペプチドは、新規な基質特異性を備えたセリンプロテアーゼ活性が大いに期待されることから、血栓症の予防や治療を目指した創薬の研究や開発に役立てることができる。
【００３６】
一方、第三のポリヌクレオチド（ＰＮ１＋、ＰＮ２＋又はＰＮ３＋）は、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡチップ、検査用プローブ等の感染症治療薬や検査用キットに好適に利用することができる。同様に、第三のポリペプチドは、抗体作製やプロテインチップ等の検査用キットに好適に利用することができる。従って、これら第三のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓによる感染症の早期発見や効果的な治療や予防に役立てることによって、感染症の拡大を容易に抑えることができる。
【００３７】
・  実施形態の組換えベクターは、第一、第二又は第三のポリヌクレオチド（ＰＮ１、ＰＮ２、ＰＮ３、ＰＮ１＋、ＰＮ２＋、ＰＮ３＋、ＰＮ１ｐ、ＰＮ２ｐ又はＰＮ３ｐ）が発現可能となるように組込まれたものである。実施形態の形質転換体は、前記組換えベクターが導入されたものである。これら組換えベクター及び形質転換体は、前記第一、第二又は第三のポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを大量生産するのに著しく適していることから、医薬品や検査用キット等の原材料を容易かつ大量に提供することができる。また、取り扱いや保存が極めて容易である。
【００３８】
【実施例】
以下、前記実施形態を具体化した実施例及び比較例について説明する。
＜タンパク分解酵素の同定＞
旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ（ＩＳＳ４１３）感染３０日後のマウスから筋肉幼虫（ｍｕｓｃｌｅ  ｌａｒｖａｅ）を採取してｍＲＮＡを抽出した。続いて、前記ｍＲＮＡをＴｉｍｅｓａｖｅｒ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、λＺＡＰＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に組込み、Ｇｉｇａｐａｃｋ  Ｇｏｌｄ  ＩＩＩ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）にパッケージすることにより、ｃＤＮＡライブラリー（２０万プラーク）を作製した。このライブラリーの作製方法の詳細はＮａｇａｎｏ，Ｉ．ｅｔ．ａｌ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  １２３：７７−８３を参照。
【００３９】
次に、前記Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓの幼虫３００匹を２ヶ月間感染させたＢＡＬＢ／ｃマウスから採取した抗Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ血清にて前記ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによりポジティブクローンが１１個得られた。このスクリーニング法はＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．  ｅｔ．ａｌ．Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．ｐ．１２．１−１２．４４に従って行った。これらポジティブクローンをｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｘｃｉｓｉｏｎによりプラスミドに組込んだ後、大腸菌ＳＯＬＲ株に導入し、自動シークエンサーとＤＮＡＳＩＳソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社製）にてシークエンスして塩基配列を決定した。
【００４０】
これらの塩基配列及びそのアミノ酸配列についてホモロジー検索したところ、１つのクローンＴｓ２３−２が新規な配列を有していることが判明した。このクローンは、配列番号１で表される全長１４４５ｂｐの塩基配列からなるものであった。さらに、このクローンは前記ホモロジー検索からセリンプロテアーゼ活性を有するタンパク分解酵素であるらしいことも判明した。
【００４１】
＜リコンビナントタンパクの発現と精製＞
前記クローンＴｓ２３−２が組込まれたプラスミドからＥｃｏＲＩフラグメントを切り出し、ｐＴｒｃＨｉｓ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にサブクローニングして組換えベクターを作製した後、大腸菌ＤＨ５α株に導入した。この大腸菌の培養液にＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎａｓｉｄｅ）を終濃度１ｍＭ添加して３７℃で３時間インキュベートした。この大腸菌を集菌して２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で超音波処理により破砕した後、同緩衝液中に終濃度６Ｍの尿素を添加して可溶化させ、Ｈｉｓ  Ｔｒａｐ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を充填したカラムにヒスチジン標識タンパクを吸着させた。
【００４２】
次に、Ｃｏｌａｎｇｅｌｉ，Ｒ．ｅｔ．ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｂ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｓｃｅｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ７１４：２２３−２３５の方法に従って、前記カラムに対して尿素を段階的に薄めた緩衝液でゆっくりと洗浄した後、５００ｍＭイミダゾールを含有する溶出液を用いてヒスチジン標識タンパクを溶出させた。この溶出液中のイミダゾールをＰＤ−１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）カラムにて取り除くことにより、ポリヒスチジン標識リコンビナントタンパクが得られた。このタンパクは、前記抗Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ血清により免疫沈降反応を引き起こし、さらにウェスタンブロッティングにても前記抗血清に特異的に反応したことが確認された。
【００４３】
＜活性ドメインの発現と精製＞
前記クローンＴｓ２３−２が組込まれたプラスミドを、配列番号４及び配列番号５で表される塩基配列からなる一対のＰＣＲプライマーにてＰＣＲ反応することによりＰＣＲ産物を得た。このＰＣＲ産物は、配列番号１で表される塩基配列の８２〜８４３番目（配列番号１で表されるアミノ酸配列の２８番目のＧｌｎから２８１番目のＩｌｅ）までの配列からなるポリヌクレオチドである。次に、前記ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで切り出し、チオレドキシン（ＴＲＸ）標識発現ベクターｐＥＴ−３２（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．社製）に組込んで組換えベクターを作製した後、大腸菌ＡＤ４９４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（Ｎｏｖａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．社製）に導入した。この大腸菌の培養液にＩＰＴＧを終濃度１ｍＭ添加して２０℃で１８時間インキュベートした。
【００４４】
この大腸菌を集菌して２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で超音波処理して破砕した後、遠心上清をＨｉｓ  Ｔｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＨＰカラムに添加することにより、該カラムにＴＲＸ融合タンパクを吸着させた。次に、５００ｍＭイミダゾールを含有する溶出液で前記カラムからＴＲＸ標識タンパクを溶出させた。この溶出液中のイミダゾールをＰＤ−１０カラムにて取り除くことにより、ＴＲＸ標識リコンビナントタンパクが得られた。このタンパクは、ＳＤＳゲル電気泳動にて純度検定したところ、目的とするタンパクが高純度で得られていたことが確認された。
【００４５】
＜活性ドメインのプロテアーゼ活性＞
前記ポリヒスチジン標識リコンビナントタンパク（Ｔｓ２３−２）及びＴＲＸ標識リコンビナントタンパクのプロテアーゼ活性について、セリンプロテアーゼ活性基質としての合成ペプチドと、プロテアーゼ活性阻害剤とを用いて検証した。なお、コントロールとして、ＴＲＸリコンビナントタンパク（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）及びセリンプロテアーゼ活性を有するトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社製）を用いた。
【００４６】
（セリンプロテアーゼ活性の測定）
合成ペプチド（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）は、ペプチド研究所製のＬ−ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｙｌ−Ｇｌｙｃｙｌ−Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ−４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｙｌ−７−Ａｍｉｄｅ（Ｐｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ），  Ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ｌ−Ｌｅｕｃｙｌ−Ｌ−Ｌｅｕｃｙｌ−Ｌ−Ｖａｌｙｌ−Ｌ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ−４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｙｌ−７−Ａｍｉｄｅ（Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＭＣＡ），  Ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ｌ−Ａｌａｎｙｌ−Ｌ−Ａｌａｎｙｌ−Ｌ−Ａｌａｎｉｎｅ−４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｙｌ−７−Ａｍｉｄｅ（Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＭＣＡ），  ｔ−Ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｙｌ−Ｌ−Ｌｙｓｙｌ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ−４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｙｌ−７−Ａｍｉｄｅ（Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＭＣＡ），  ｔ−Ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｙｌ−Ｌ−Ａｌａｎｙｌ−Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ−４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｙｌ−７−Ａｍｉｄｅ（Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＭＣＡ），  ｔ−Ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−Ｌ−Ｖａｌｙｌ−Ｌ−Ｌｅｕｃｙｌ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ−４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｙｌ−７−Ａｍｉｄｅ（Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＭＣＡ），  ｔ−Ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−Ｌ−Ｖａｌｙｌ−Ｌ−Ｐｒｏｌｙｌ−Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ−４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｙｌ−７−Ａｍｉｄｅ（Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡ）の７種類を用いた。
【００４７】
５０ｎｇ／μｌのリコンビナントタンパク溶液２０μｌ、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（１ｍＭ  ＣａＣｌ２，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，（ｐＨ８．０））及び終濃度１００μＭの合成ペプチドを混合した後、３７℃で１６時間インキュベートした。次に、ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｆｌｕｏｒｏｒｅａｄｅｒ（ＴＥＣＡＮ社製）にて３６０ｎｍの波長で励起させて４６５ｎｍの波長の蛍光強度を測定することにより、ＭＣＡの加水分解量（酵素活性（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ））を定量した。なおこのとき、全ての測定結果は、適切なブランクテストを用いた非酵素的な加水分解を行った際の測定結果を用いて適正に補正した。結果を表１に示す。なお、表１に示される各データは、合計３回試験を行って得られた蛍光強度（×１０−２）の平均値と標準偏差とが示されている。また、リコンビナントタンパクＴｓ２３−２及びＴＲＸ標識リコンビナントタンパクは終濃度５μｇ／ｍｌ、トリプシンは終濃度０．２μｇ／ｍｌで試験を行った。
【００４８】
【表１】
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（プロテアーゼ活性阻害剤による阻害試験）
プロテアーゼ活性阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）は、ｔｒａｎｓ−ｅｐｏｘｙｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｙｌａｍｉｄｏ−（４−ｇｕａｎｉｄｉｎｏ）  ｂｕｔａｎｅ  （Ｅ−６４，  ５μＭ），  ４−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）  ｂｅｎｚｅｎｅ−ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ  （ＡＥＢＳＦ，  ２００μＭ），  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ  （５０μＭ），  ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  （１０μＭ），  １，１０−ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ  （１ｍＭ）．の５種類を用いた。ＴＲＸ標識リコンビナントタンパク（１μｇ）、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（１ｍＭ  ＣａＣｌ２，５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））及びプロテアーゼ活性阻害剤を上記括弧内の終濃度となるように混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。次に、基質としての合成ペプチドＰｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡを添加した後、引き続き１６時間インキュベートを行った。酵素活性の測定は上記セリンプロテアーゼ活性の測定と同様に行った。また、各プロテアーゼ活性阻害剤による阻害効果は、該阻害剤なしのブランクテストに対するＴＲＸ標識リコンビナントタンパクのプロテアーゼ活性の割合（％  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）で表した。結果を表２に示す。なお、表２に示される各データは、合計３回試験を行って得られた蛍光強度（×１０−２）の平均値と標準偏差とが示されている。
【００４９】
【表２】
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以上の結果より、ポリヒスチジン標識リコンビナントタンパクＴｓ２３−２及び前記ＴＲＸ標識リコンビナントタンパクはいずれも、ペプチダーゼ活性及びセリンプロテアーゼ活性を発揮することが確認された。また、特異的な基質の存在は未だ不明であるが、セリンプロテイナーゼ活性を発揮する可能性は著しく高い。従って、これらリコンビナントタンパクは、大腸菌にて発現させることにより、酵素活性を保持したまま大量生産が可能であることが示された。また、前記ポリヒスチジン標識リコンビナントタンパクＴｓ２３−２の至適ｐＨを調べたところ約８．０であったことも確認された。
【００５０】
さらに、前記実施形態より把握できる技術的思想について以下に記載する。
・  配列番号１で表される塩基配列の８２〜１２６３番目の配列、又はその配列と実質的に同一の塩基配列からなるポリヌクレオチド。配列番号１で表される塩基配列の８２〜８４３番目の配列、又はその配列と実質的に同一の塩基配列からなるポリヌクレオチド。このように構成した場合、基質特異性の高いセリンプロテアーゼ活性を容易に利用することができる。
【００５１】
・  請求項１又は請求項２に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、セリンプロテアーゼ活性を有することを特徴とするポリペプチド。
【００５２】
・  請求項３に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。請求項３に記載のポリヌクレオチドが発現可能となるように組込まれた組換えベクター。請求項３に記載のポリヌクレオチドが発現可能となるように組込まれた組換えベクターが導入された形質転換体。
【００５３】
なお、この明細書において、ポリヌクレオチドとは１０個以上のヌクレオチドからなるものを指し、ポリペプチドとは１０個以上のアミノ酸からなるものを指すものとする。
【００５４】
【発明の効果】
以上詳述したように、この発明によれば、次のような効果を奏する。
請求項１及び請求項２に記載の発明のポリヌクレオチドによれば、基質特異性の高いセリンプロテアーゼ活性を容易に利用することができる。請求項３に記載の発明のポリヌクレオチドによれば、旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓによる感染症の拡大を容易に抑えることができる。
【００５５】
請求項４に記載の発明のポリペプチドによれば、基質特異性の高いセリンプロテアーゼ活性を容易に利用することができる。
請求項５及び請求項６に記載の発明の組換えベクターによれば、基質特異性の高いセリンプロテアーゼ活性を容易に利用することができる。
【００５６】
請求項７に記載の発明の形質転換体によれば、基質特異性の高いセリンプロテアーゼ活性を容易に利用することができる。
請求項８に記載の発明のタンパク分解酵素の製造方法によれば、基質特異性の高いセリンプロテアーゼ活性を備えたタンパク分解酵素を容易に製造することができる。
【００５７】
請求項９に記載の発明の医薬品によれば、基質特異性の高いセリンプロテアーゼ活性を利用することにより血栓症の治療に利用することができる。請求項１０に記載の発明の医薬品によれば、旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓによる感染症の拡大を容易に抑えることができる。
【００５８】
請求項１１に記載の発明の検査用キットによれば、旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓによる感染症の拡大を容易に抑えることができる。
【００５９】
【配列表】
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