(57)【要約】      （修正有）【課題】インスリン様成長因子結合タンパク質とその組成物を提供する。【解決手段】関連の天然グリコシル化を伴っておらず、特定の成熟タンパク質のアミノ酸配列を有し、または前記成熟タンパク質のアミノ酸配列を欠失、置換、付加したアミノ酸配列を有し、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）と結合する生物学的性質を保持しているインスリン様成長因子結合タンパク質ＢＰ５３を提供し、またこれを含有せしめて医薬並びに診断組成物とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
関連の天然グリコシル化を伴っておらず、図３に示す成熟タンパク質のアミノ酸配列を有し、または図３に示す成熟タンパク質のアミノ酸配列を欠失、置換、付加したアミノ酸配列を有し、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）と結合する生物学的性質を保持しているインスリン様成長因子結合タンパク質ＢＰ５３。
【請求項２】
図３に示す成熟タンパク質のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
ヒトタンパク質である請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
タンパク質上の予め決めたアミノ酸残基が置換、挿入または削除されている請求項１に記載のタンパク質。
【請求項５】
インスリン様成長因子が効果的である医薬用途のための医薬組成物であって、請求項１または２に記載のタンパク質とインスリン様成長因子を薬学的に許容しうる担体中に配合してなる医薬組成物。
【請求項６】
治療学的有効量のインスリン様成長因子、請求項１または２に記載のタンパク質、および薬学的に許容しうる担体を含有する、代謝調節に有用な医薬組成物。
【請求項７】
インスリン様成長因子がＩＧＦ-ＩまたはＩＧＦ-ＩＩである請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
等張である請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項９】
滅菌濾過されている請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
インスリン様成長因子及び結合タンパク質がほぼ等モル比で存在している請求項６に記載の滅菌医薬組成物。
【請求項１１】
検出可能なラベル部分に共有結合させた請求項１または２に記載のタンパク質を含有する、循環ヒト血漿中のインスリン様成長因子の量を検定するのに有用な診断組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリン様成長因子結合タンパク質とその組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
インスリン様成長因子(ＩＧＦ)族のペプチドは、循環中の、他の体液中の、および細胞を培養することによって得た培地中の結合タンパク質と結合していることがわかっており、このペプチドの組換え製造は、例えばLee等[EP128,733(1984年12月19日公開)]が開示している。別の液中で見い出された２種類のＩＧＦ結合タンパク質が同定され、そしてその特徴が調べられている[Hintz R.L.(1984)C1inics in Endo. and Metabo1.,13:31-42; Martin,J.L. and Baxter,R.C.(1986)J.Bio1.Chem.,261:8754-8760; Povoa et a1.(1984) Eur.J.Biochem., 144：199-204]。一方は成人血清において顕著であるが、他方は羊水において最も高い濃度で見い出されている[Baxter et a1.(1987)J.C1in.Endo.and  Metabo1.,65:423-431]。
成人血清中の結合タンパク質の量は、ＧＨ欠損または先端巨大症のいずれかである個体の成長ホルモン(ＧＨ)の状態を反映するものであることがわかっている。即ち、高レベルの結合タンパク質は高レベルのＧＨと関係している[Martin and Baxter(1985)J.C1in.Endo. and Matabol.,61:799-801]。従って、この結合タンパク質はＧＨ依存性のＩＧＦ結合タンパク質と呼ばれていた。本明細書では便宜のため、ヒト血漿からのＧＨ依存性の結合タンパク質に対してはＢＰ５３なる名称を、そして羊水から初めて単離された結合タンパク質に対してはＢＰ２８なる名称を用いる。この名称は、非還元のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミトゲル電気泳動(ＳＤＳ-ＰＡＧＥ)での精製タンパク質の大きさを示している。
【０００３】
ＢＰ５３は、ＧＨによって調節され、内生ＩＧＦの大部分を担持するヒト血漿中に含まれる１２５−１５０ｋＤの糖タンパク質コンプレックスの酸安定性成分として見い出される[White et a1.(1981) J.C1in.Endo.and Matabo1.,53：49ff；Hintz et al.,J.Clin. Endo  and Matabol.,53：100ff；およびDaughaday et a1.(1982) J.Clin. Endo. and Matabo1. 55：916ff]。酸性化の後に精製したこのコンプレックスの結合成分はＳＤＳ-ＰＡＧＥで４３ｋＤ(還元)および５３ｋＤ(非還元)の分子量を有している。この精製タンパク質はＩＧＦ-ＩおよびＩＧＦ-ＩＩに対して高い親和性を有している(Ｋａ=２０−４０ｎＭ−１)[Martin and Baxter,J.Bio1.Chem．；上記]。正常な成人血漿中のＢＰ５３の濃度は６．１ｍｇ／ｌである。このＢＰ５３のレベルは、先端巨大症の患者では１３．５ｍｇ／ｌまで増加し、ＧＨ欠損の患者では２−３ｍｇ／ｌまで減少する[Baxter and Martin, J. Clin. Invest.,78:1504-1542(1986)]。羊水中ではＢＰ２８が優っているが、ＢＰ５３も羊水中に約４．６ｍｇ／ｌで見い出される。ＢＰ５３のラット相同体が精製されており、これはヒトタンパク質に対してかなりのＮ-末端アミノ酸配列の相同性を有している[Baxter and Martin(1987)Biochem. Biophys. Res. Comm.,147：408-415]。
【０００４】
ＢＰ２８は、ゲル濾過クロマトグラフィーで測定すると３５−４０ｋＤの分子量を有しており[Drop et al.(1984) J. Clin. Endo. and Metabol.,59：899ff]、ＳＤＳ-ＰＡＧＥで得られる３２ｋＤ（還元）または２８ｋＤ（非還元）の分子量に類似している。精製されたタンパク質はＩＧＦ-ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの両方に結合するが、ＢＰ５３よりも親和性が低い(Ｋａ＝３−７ｎＭ−１)。３７〜１４８ｍｇ／ｌの濃度が羊水中のＢＰ２８に対して報告されている[Baxter等;上記]。成人血清中ではＢＰ５３が優っているが、ＢＰ２８も血清中に存在し、その濃度は０．０２〜０．３５ｍｇ／ｌの範囲であり、０６００〜０８００時間で最大になる顕著な日中サイクルを有している[Baxter and Cowell(1987) J.Clin.Endo.and Metabo1.,65：432-440]。そのような日中の変化はＢＰ５３には見い出されていない。Ｎ‐末端アミノ酸配列のデータは、２つの他のヒトタンバク質、即ち胎盤から単離されたＰＰ１２[Koistinen et al.(1986) Endocrin.,118：1375ff]および肝癌セルライン(ＨＥＰ-Ｇ２)の培養培地から単離されたＩＧＦ結合タンパク質「Povoa et al.(1985)Biochem.Biophys.Res. Comm.,128：1071ff]がＢＰ２８と同一であるか、または密接に関連していることを示す。また、ラットセルラインＢＲＬ-３Ａの培養培地からもＩＧＦ結合タンパク質が単離されている[Lyons and Smith(1986) Mol.Cell.Endo.,45：263-270; Motto1a et a1.(1986) J.Biol.Chem.,261：11180-11188]。類似する大きさの性質、高い胎児血清濃度、および一部のタンパク質配列の類似性に基づくと、このＩＧＦ結合タンパク質はＢＰ２８のラット相同体であるようである。
【０００５】
ＢＰ５３の単離および精製については上記のように文献に記載されているが、ヒト血漿中のこのタンパク質の濃度が比較的低いこと、および血漿から精製タンパク質を商業的な量で回収するコストがその煩雑さと費用の点で高くつくことが、それを単独で、またはＩＧＦと組合せて広範に用いることを妨げている。
【０００６】
【非特許文献１】Journal of Biological Chemistry,261(19)(1986),p.8754-8760
【非特許文献２】Biochemical and Biophysical Research Communications,147(1)(1987),p.408-415
【発明の開示】
【０００７】
従って、本発明の目的は、治療学的に許容しうる供給源からＢＰ５３をコードしているＤＮＡを単離し、商業的に有用な量のこのタンパク質を製造し、特に天然のＢＰ５３に伴われているグリコシル化を伴っていない形態のＢＰ５３を得ることが本発明の目的である。
また、ＢＰ５３のアミノ酸配列およびこのタンパク質の生物学的活性に実質的に悪影響を及ぼさないその他の変異体を製造することも本発明の目的である。
本発明の他の目的は、他の天然の(供給源)タンパク質を全く含まないＢＰ５３を得ることである。
さらに、ＢＰ５３の組成物を提供することも本発明の目的である。
本発明のこれらの目的またその他の目的は本明細書の全体を読めば明らかとなるであろう。
【０００８】
本発明の目的を達成するために、先ず、組換え細胞培養におけるＢＰ５３の発現、即ち、基本的にＢＰ５３をコードしている核酸を得ること、ＢＰ５３をコ一ドしている核酸で宿主細胞を形質転換すること、およびこの細胞を培養して宿主細胞培養物巾にタンパク質を発現させることからなる方法が提供される。
１つの具体的な態様では、本発明の目的を達成するために、ＢＰ５３をコードしている配列を含有する単離されたＤＮＡ配列が提供され、該ＤＮＡ配列は、
(ａ)図３に示したＤＮＡ配列;および
(ｂ)厳格な条件下で(ａ)のＤＮＡ配列とバイブリダイズし、少なくとも約１０個のヌクレオチドを含有するＤＮＡ配列；
からなる群から選ばれるＤＮＡ配列を包含している。
このＤＮＡ配列は、BP５３のアミノ酸配列と十分な複製性を有するアミノ酸配列を有し、（１）ＩＧＦと結合するか、または(２)対応する天然タンパク質の少なくとも１つのエピトープに対して生成させた抗体と免疫学的に交差反応する、という生物学的性質を有するタンパク質をコードしている配列を含有するものと特徴付けることもできる。
【０００９】
他の態様では、本発明の目的を達成するために、(１)検定用のラベル化ＤＮＡ配列、(２)プロモーターに機能的に連結されたＤＮＡ配列、(３)ベクターで形質転換された宿主によって認識されるコントロール配列に機能的に連結された上記ＤＮＡ配列を含有する発現ベクター、および(４)上記発現ベクターで形質転換された宿主細胞が提供される。また、宿主細胞がＢＰ５３およびＩＧＦの両タンパク質を一緒に発現することができるようにＢＰ５３およびＩＧＦの両方を含有している発現ベクターも提供される。
【００１０】
本発明は特に新規な形態のＢＰ５３に関し、これには、関連の天然のグリコシル化を伴わず、図３に示した成熟タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約８０%の相同性を有し、そして(ａ)ＩＧＦと結合する、あるいは(ｂ)対応する天然結合タンパク質の少なくとも１つのエピトープと免疫学的に交差反応する、という生物学的性質のいずれかまたは両方を有するＢＰ５３が含まれる。通常、このようなＢＰ５３はヘテロローガスな組換え細胞培養における発現産物として得られる。組換え細胞培養の成分としてあらゆる形態のＢＰ５３が新規である。
さらに別の態様においては、本発明はＩＧＦを結合するのに有用な医薬組成物に関し、これは薬学的に許容しうる担体中に治療学的有効量の本発明のＢＰ５３タンパク質を含有している。
また、意図されているのは、哺乳動物の代謝調節に有用な医薬組成物であり、これは薬学的に許容しうる担体中に治療学的有効量の本発明のＢＰ５３およびＩＧＦを含有している。
さらに、循環ヒト血漿中のＩＧＦの量を検定するのに有用な診断組成物も本発明に含まれ、これは検出可能なラベル部分に共有結合させた本発明のＢＰ５３を含有している。
【００１１】
本発明はＢＰ５３および／またはその誘導体を組換え法によって製造することを可能にするものであり、また、そのような製造に関連する方法および産物を提供することを可能にするものである。組換えによってＢＰ５３を得るのに包含される方法は、MartinおよびBaxter(上記)によって提供された最初の１５アミノ酸のＮ‐末端配列の情報がライブラリーの正しいクローンをスクリーニングするためのプローブを得るのに十分ではなかったので、簡単なものではなかった。ＢＰ５３の完全なアミノ酸配列はこれまで知られていなかった。比較的長い内部配列が、ＢＰ５３をコードしている配列を含むクローンを同定するのに必要なバイブリダイゼーションプローブを得るために必要であった。さらに、正しいクローンの同定は３つの別プールの４つのプローブを同時に用いたときに得られるのみであり、正しいクローンを表すスポットは弱かった。
また、本発明は膜アンカーと結合したＢＰ５３の製造を可能にし、それによってＩＧＦを一層効率良く標的細胞に放出することを可能にする。これは、ＢＰ５３タンパク質のＣ末端に、組換え法またはその他の方法によって、リン脂質アンカードメインまたはＩＧＦ‐ＩもしくはＩＧＦ-ＩＩのどちらかの通常の受容体のトランスメンブランもしくは膜結合ドメインを構成するアミノ酸配列を導入することによって行うことができる。この場合、ＢＰ５３変異体は宿主細胞の膜調製物から回収される。別法によれば、ＢＰ５３を宿主細胞の細胞外培地に分泌させることができる。
【００１２】
ＢＰ５３タンパク質およびその変異体の用途は、インビトロおよびインビボで存在するＩＧＦ種を結合させる際に存在する。即ち、ＢＰ５３を用いてＩＧＦの循環半減期を長くすることができると考えられる。いずれかの特定の理論に束縛されることを意図するものではないが、この増加は、ＩＧＦのコントロールされた放出貯蔵体として働くこともあるＢＰ５３によってＩＧＦが隔離されるために生じるものと考えられる。
また、ＢＰ５３はＩＧＦの量の診断物質としての用途が見いだされるであろう。さらに、本発明のＢＰ５３は、対応する天然のＢＰ５３によって認識されるエピトープを有する抗体調製物と免疫学的に交差反応性であり、それによって本発明のＢＰ５３をそのような抗体の診断試薬として有用なものにする。
ＢＰ５３のその他の用途は当業者には明らかであろう。
【００１３】
本明細書で用いる「インスリン様成長因子結合タンパク質」または「ＢＰ５３」なる用語は、図３のアミノ酸配列を有する哺乳動物のインスリン様成長因子結合タンパク質、および天然のＢＰ５３の生物学的活性を有するその類似体および変異体を指す。天然のＢＰ５３の生物学的活性はそのあらゆる類似体および変異体も保持しており、ＩＧＦ（通常、ＩＧＦ-ＩまたはＩＧＦ-ＩＩ）に特異的に結合することができるか、または天然ＢＰ５３の少なくとも１つのエピトープに対して生成させた抗体と免疫学的に交差反応性である。類似体または変異体とは、天然ＢＰ５３のアミノ酸配列、グリコシル化、またはその他の特徴が共有結合または非共有結合によって修飾された分子であると定義される。即ち、変異体は５３ｋＤの分子量を有していてもよいし、有していなくてもよい(例えば、β‐メルカプトエタノールまたはジチオトレイトールなどの還元剤の非存在下で行うＳＤＳ-ＰＡＧＥで測定したとき)。例えば、天然の成熟配列を有するグリコシル化されていないＢＰ５３は非還元のＳＤＳ-ＰＡＧＥで約２８．７ｋＤの分子量を有するであろう。アミノ酸配列変異体には、図３の配列のアレルだけでなく、予め決めたその突然変異が含まれる。通常、アミノ酸配列変異体は、図３の天然ＢＰ５３の配列に対して少なくとも約８０%の相同性、より普通には少なくとも約９０%の相同性を有するアミノ酸配列を有している。以後、ＢＰ５３なる用語は、特に記すことがなければ、天然配列または変異体形のいずれかを意味するものとする。
【００１４】
本発明の範囲内に含まれるのは、天然のグリコシル化および図３に示したアミノ酸配列を有するＢＰ５３、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネズミ、ネコなどの他の動物種由来の類似ＢＰ５３夕ンパク質、このようなＢＰ５３タンパク質の脱グリコシル化または未グリゴシル化誘導体、ならびにＢＰ５３の生物学的に活性なアミノ酸配列変異体であり、ＢＰ５３活性を示すＢＰ５３タンパク質のインビトロ生成の共有結合誘導体およびアレルが含まれる。
ＢＰ５３のアミノ酸配列変異体には、例えば図３に示したアミノ酸ＢＰ５３配列中の残基の削除、挿入または置換が含まれる。また、最終の構築物が所望の活性を保持しているなら、あらゆる組合せの削除、挿入および置換を行って最終構築物を得ることができる。変異ＢＰ５３をコードしているＤＮＡ中で行われる突然変異がこの配列をリーディング・フレーム(読み枠)の外に置くものであってはならず、また、好ましくは２次的なｍＲＮＡ構造を与える相補領域を生じないものであることは明らかであろう。[EP 75,444Aを参照]。
【００１５】
通常、これらの変異体は、ＢＰ５３をコードしているＤＮＡ中のヌクレオチドの部位指向性の突然変異誘発によって変異体をコードしているＤＮＡを得、次いでこのＤＮＡを組換え細胞培養において発現させることによって製造される。しかし、約１００−１５０残基までを有する変異ＢＰ５３フラグメントはインビトロの合成によって好都合に製造することもできる。通常、この変異体は、天然の類似体と同じ性質の生物学的活性を示す。
アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決められるが、突然変異それ自体は予め決める必要がない。例えば、ある部位での突然変異の実施を最適にするために、ランダム突然変異誘発を標的コドンまたは領域において行い、発現されたＢＰ５３変異体を所望の活性の最適の組合せについてスクリーニングすることができる。既知の配列を有するＤＮＡ中の予め決めた部位で置換突然変異を行う方法は、例えばＭ１３プライマー突然変異誘発のように周知である。
【００１６】
通常、アミノ酸配列の削除は約１〜３０残基の範囲内、より好ましくは１〜１０残基の範囲内であり、普通は連続している。
アミノ酸配列挿入体には、１個の残基から実質的に制限されない長さのポリペプチドまでのアミノ-および／またはカルボキシ-末端融合体、ならびに１個または複数のアミノ酸残基の配列内挿入体が含まれる。通常、配列内挿入(即ち、成熟ＢＰ５３配列内の挿入)は、約１〜１０残基の範囲内であり、より好ましくは１〜５残基である。１個の末端挿入の例は、Ｎ‐末端のメチオニルを有する成熟ＢＰ５３である。この変異体は、組換え細胞培養におけるＢＰ５３の直接発現、即ち成熟ＢＰ５３の細胞膜結合もしくは分泌させるためのシグナル配列を伴わない発現のための人工物である。末端挿入の他の例には、(１)組換え宿主からの成熟ＢＰ５３の分泌を容易にするための、成熟ＢＰ５３のＮ-末端へのシグナル配列(異種または同種)の融合、(２)免疫原性ポリペプチド(即ち、標的配列に免疫原性を付与するに十分大きいポリペプチド)、例えば細菌性ポリペプチド、例えば大腸菌(E.co1i)trp遺伝子座によってコードされている酵素あるいはβ-ラクタマーゼ、β-ガラクトシダーゼなどの融合、および(３)細胞表面結合物質、例えば膜アンカーなどとの融合が含まれる。
【００１７】
細胞表面結合物質との融合体は組換え法によって製造されることを必要とせず、ＢＰ５３との共有または非共有結合の産物であっても良い。例えばＩＧＦ-ＩまたはＩＧＦ-ＩＩの通常の細胞表面受容体由来のトランスメンブラン領域、または成熟崩壊促進因子(ｍＤＡＦ)のＣ-末端のリン脂質アンカードメイン[1987年11月4日公開のEPO公開No.244,267に記載されている]を、ＢＰ５３のＣ-末端に共有結合させるか、またはそれとの融合体として組換え細胞培養において発現させることができる。即ち、ＢＰ５３を、ｍＤＡＦとプレＢＰ５３のＣ-末端融合体として組換え細胞培養において発現させることができる。例えば、スプライスされたｃＤＮＡによって予想される膜ＤＡＦの最後の３７アミノ酸を、通常は培養培地に構成的に分泌されるpreＢＰ５３糖タンパク質のＣ-末端にフレーム内で融合させた融合タンパク質を構築することができる。分泌される代わりに、この融合構築物は細胞膜に運搬され、ホスファチジルコリンアンカーのためにそこに滞ったままになる。
【００１８】
第３の群の変異体は、ＢＰ５３分子中の少なくとも1つのアミノ酸残基(好ましくは１つだけ)が除去され、その位置に別の残基が挿入されているものである。通常、そのような置換は、ＢＰ５３の性質を微妙に調節することが所望であるときに以下の第１表に従って行われる。
【表１】
2004256541.tif 000002
【００１９】
第１表のものより保存性が少ない置換を選択することによって、即ち、(ａ)置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えばシートまたは螺旋の立体配座、(ｂ)標的部位における分子の電荷または疎水性、または(ｃ)側鎖の大きさ、を維持するその作用がもっと有意に異なっている残基を選択することによって、機能または免疫学的な独自性の実質的な変換が行われる。通常、ＢＰ５３の性質に最大の変化をもたらすと予想される置換は、(ａ)グリシンおよび／またはプロリンが他のアミノ酸によって置換されたか、または削除もしくは挿入されているもの；(ｂ)親水性の残基(例えば、セリルまたはトレオニル)が、疎水性の残基(例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニル)に代えて(または、によって)置換されているもの；(ｃ)システインまたはプロリン残基が他のいずれかの残基に代えて(または、によって)置換されているもの；(ｄ)電気陽性の側鎖を有する残基(例えば、リジル、アルギニルまたはヒスチジル)が、電気陰性の残基(例えば、グルタミルまたはアスパルチル)に代えて(または、によって)置換されているもの；または(ｅ)大きな側鎖を有する残基(例えば、フェニルアラニン)が、そのような側鎖を有さない残基(例えば、グリシン)に代えて(または、によって)置換されているものであろう。
【００２０】
ほとんどの削除および挿入、並びに特に置換は、ＢＰ５３分子の性質に激変はもたらさないであろう。しかし、置換、削除または挿入の正確な効果をそれを行う前に予測することが困難であるとき、例えばＩＧＦ結合ドメインまたは免疫エピトープを修飾するときには、通常のスクリーニング検定によってその効果を評価するのは当業者の認識するところであろう。例えば、変異体は通常、天然のＢＰ５３をコードしている核酸の部位特異的な突然変異誘発、組換え細胞培養での変異核酸の発現、および所望により、細胞培養物からの精製(例えば、少なくとも１つの残存免疫エピトープによって変異体を吸着させるためのウサギポリクローナル抗‐ＢＰ５３カラムでの免疫アフィニティー吸着による)によって調製される。次いで、細胞溶解液または精製されたＢＰ５３変異体の活性を、目的の性質に対して適切なスクリーニング検定で調べる。例えば、ある抗体に対する親和性などのＢＰ５３の免疫学的性質の変化は競合型の免疫検定で測定する。免疫モジュレーター活性の変化は適切な検定で測定する。酸化還元もしくは熱安定性、疎水性、タンパク質加水分解に対する感受性、または担体と、もしくはマルチマーに集合する傾向などのタンパク質の性質の修飾は、当業者に周知の方法によって検定する。
【００２１】
ＢＰ５３をコードしているＤＮＡは、(ａ)特定の哺乳動物のＢＰ５３ ｍＲＮＡを発現している組織からｃＤＮＡライブラリーを入手し、(ｂ)ヒトＢＰ５３をコードしているラベルしたＤＮＡまたはそのフラグメント(通常、長さが１００塩基対以上である)を用いてバイブリダイゼーション分析を行って、相同な配列を含んでいるｃＤＮＡライブラリーにおいてクローンを検出し、そして(ｃ)制限酵素分析および核酸配列決定によってクローンを分析して完全長のクロ一ンを同定すること、によってヒト以外の供給源から得ることもできる。完全長のクローンがライブラリー中に存在しないときには、初めて本願で開示した核酸配列情報を用いて種々のクローンから適当なフラグメントを回収し、クローンに共通する制限部位で連結してＢＰ５３をコードしている完全長のクローンを組み立てる。別法では、ゲノムライブラリーから所望のＤＮＡを得る。
【００２２】
合成および組換え法を含むあらゆる方法によってＢＰ５３を製造することができる。同様に、本明細書では、単離したＤＮＡとは、３’および／または５’境界領域を含むか、または含まない化学的に合成したＤＮＡ、ｃＤＮＡ、染色体ＤＮＡまたは染色体外ＤＮＡを意味するものとする。本発明では、ＢＰ５３を組換え細胞培養における合成によって製造するのが好ましい。そのような合成のためには、始めにＢＰ５３をコードしている核酸を確保することが必要である。本発明者等は、ヒトｃＤＮＡライブラリーからＢＰ５３をコードしているいずれかの核酸を同定しようとした際にかなりの困難に遭遇した。最終的に決定したＢＰ５３をコードしているヒトＤＮＡの配列を図３に示す。現時点でこの方法を再現するものはこれらの問題に会わないであろう。これは、完全に相補性のプローブを図３の配列から得ることができるからである。いくつかの合成プローブのハイブリダイゼーションを用いて、このＤＮＡが同定されたときには、ライブラリーから単離したＤＮＡを、さらにクローニングするか、または発現させるための複製可能なベクター中に連結する。
【００２３】
配列決定のために、天然のＢＰ５３を哺乳動物血漿から得、そのコーン(Cohn)ＩＶフラクションから普通に精製した。最も一般的な天然ＢＰ５３の単離および精製に用いる方法は、MartinおよびBaxter[J.Bio1.Chem.,261：8754-8760(1986)]が開示している。簡単に説明すると、コーン・ぺ一ストを酢酸、ＮａＣｌ溶液と混合し、得られたホモジネートを４２００rpmで３０分間遠心する。ｐＨ３．０に調節したホモジナイズ緩衝液で平衡化したＳＰ-Ｓephadex Ｃ-２５と共に上清を撹拌することによって内生のＩＧＦを除去する。７２時間後に、撹拌を止め、ゲルを沈降させ、そして上清を注意深くデカントする。次いで、上清をｐＨ４に調節し、沈澱を遠心により除去する。次に、この上清をｐＨ６．５に調節し、混合物をもう一度遠心する。この上清を注意深く調製したアガロース-ＩＧＦ-ＩＩのアフィニティーカラムに入れる。次いで、このカラムをｐＨ６．５のリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄する。酢酸(ｐＨ３．０)を用い、１ｍｌ／分でタンパク質を溶離する。活性の分画に合わせ、０．１％トリフルオロ酢酸中の１５％アセトニトリルで平衡化した逆相高速液体クロマトグラフィーカラムにかける。６０％アセトニトリルまでの直線勾配を直ちに開始し、１．５ｍｌ／分で３０分間行う。タンパク質の単一ピークが得られる。
【００２４】
組換え発現系の１つの例では、ＢＰ５３は、ＢＰ５３をコードしているＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換することによって、プロセッシングせず成熟タンパク質を分泌しない原核生物中で発現される。そのようなプロセッシングを行うことができる宿主細胞を形質転換して、宿主細胞の周辺質または培養培地にＢＰ５３を得るのが好ましい。通常、哺乳動物細胞などの高等真核宿主細胞は、ＢＰ５３をコードしているＤＮＡで形質転換したときにＢＰ５３をプロセッシングし、そして成熟ＢＰ５３を分泌することができる。
分泌型の成熟ＢＰ５３は、成熟ＢＰ５３をコードしているＤＮＡの５’末端を、宿主細胞によって認識されるシグナル配列をコードしているＤＮＡの３’末端に連結することによって得ることができる。連結したＤＮＡ配列を含有する発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する。この宿主細胞は、シグナル配列とＢＰ５３の第１アミノ酸の間のペプチド結合をタンパク質加水分解切断することによって発現された融合体をプロセッシングし、使用した宿主細胞に依存して培地中に、または宿主細胞周辺質中に成熟ＢＰ５３を分泌するであろう。例えば、原核性発現ベクターの構築においては、ＢＰ５３分泌リーダー(即ち、アミノ酸−２７〜−１)を細菌性アルカリホスファターゼまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーによって置き換え、酵母用には、ＢＰ５３リーダーを酵母インベルターゼ、α-因子または酸ホスファターゼリーダーによって置き換える。ホモローガスなシグナル-ＢＰ５３融合体によって形質転換されたグラム陰性生物は細胞周辺質中に成熟ＢＰ５３を分泌し、一方、酵母またはバシラス種は培養培地中に成熟ＢＰ５３を分泌するであろう。
【００２５】
ベクターは、適合する宿主細胞と協力して２つの機能を発揮するのに有用である(宿主‐ベクター系)。機能の１つはＢＰ５３をコードしている核酸のクローニングを容易にすること、即ち利用可能な量の核酸を産生させることである。他の機能はＢＰ５３を発現させることである。これら機能の一方または両方はベクター-宿主系によって行われる。ベクターは、それらが発揮する機能ならびにクローニングまたは発現用に選択した宿主細胞に依存して異なる成分を含有しているであろう。
それぞれのベクターは上に記したようにＢＰ５３をコードしている核酸を含有しているであろう。通常、これはアミノ末端が分泌シグナルに結合している成熟形のＢＰ５３をコードしているＤＮＡであろう。この分泌シグナルは、通常インビボでヒト細胞からＢＰ５３を分泌させるＢＰ５３プレ配列であるのが好ましい。しかし、適当な分泌シグナルには、他の動物ＢＰ５３由来のシグナル、ウイルス性シグナル、または同一もしくは関連の種の分泌型ポリペプチド由来のシグナルも含まれる。
【００２６】
発現およびクローニングベクターは、１またはそれ以上の選択した宿主細胞中でのベクターの複製を可能にする核酸配列を含んでいる。通常、クローニングベクターにおいては、この配列は宿主染色体とは独立してベクターが複製することを可能にする配列であり、複製起源または自律的に複製する配列を含んでいる。このような配列は種々の細菌、酵母およびウイルスについて周知である。周知のプラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起源がほとんどのグラム陰性細菌に適しており[Bo1ivar et a1.,Gene,2：95-113(1977)]、酵母に対しては2μプラスミド起源が、そして種々のウイルス性起源(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ)は哺乳動物細胞中のクローニングベクターに有用である。起源は哺乳動物発現ベクターには必要ではない(ＳＶ４０起源が実施例で用いられているが、これはそれが初期プロモーターを含んでいるからである)。ほとんどの発現ベクターは「シャトル(往復)」ベクターである：即ち、それらは少なくとも一群の生物中で複製が可能であり、発現のために別の生物中にトランスフェクションすることができる。例えば、ベクターを大腸菌中でクローンし、次に同じベクターを、それが宿主細胞染色体とは独立して複製することができないものであっても、発現用に酵母または哺乳動物細胞中にトランスフェクションする。
【００２７】
また、ＤＮＡは宿主ゲノム中への挿入によってクローンすることもできる。このクローニングは、バシラス種を用い、例えばバシラスのゲノムＤＮＡ中に見い出される配列に相補性であるＤＮＡ配列をベクター中に含ませることによって行うことができる。このベクターを用いてバシラスをトランスフェクションすると、ゲノムとの相同組換えが起こり、ＢＰ５３ＤＮＡが挿入されることになる。しかし、ＢＰ５３ＤＮＡの切り出しには制限酵素消化が必要なので、ＢＰ５３をコードしているゲノムＤＮＡの回収は外部で複製されたベクターのそれよりも複雑である。通常は、ＢＰ５３発現のための安定なセルラインまたは微生物を調製する目的でＤＮＡを宿主ゲノム中に挿入する。
【００２８】
発現およびクローニングベクターは選択遺伝子(選択マーカーとも呼ばれる)を含んでいるべきである。これは、ベクターで形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードしている遺伝子である。この遺伝子の存在は、ベクターを欠いているすべての宿主細胞が形質転換宿主を越える増殖または複製の利益を受けないことを確実なものにする。通常の選択遺伝子は、(ａ)抗生物質またはその他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質、(ｂ)栄養要求欠損を補足するタンパク質、または(ｃ)コンプレックス培地から入手できない必須栄養物質を供給するタンパク質、例えばバシラスのためのＤ-アラニン  ラセマーゼをコードしている遺伝子、をコードしている。
酵母で用いるのに適した選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在しているｔｒｐ１遺伝子である[Stinchcomb et a1.,(1979)，Nature 282: 39; Kingsman et al.,(1979)，Gene 7：141；またはTschemper et al.,(1980)，Gene  10：157]。このtrp１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の突然変異株、例えばＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４‐１[Jones,(1977),Genetics 85：12]の選択マーカーを与える。次いで、酵母宿主細胞ゲノム中のtrp１欠損の存在は、トリプトファンの非存在下での増殖により形質転換の検出に有効な環境を与える。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株(ＡＴＣＣ ２０，６２２または３８，６２６)は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補足される。
【００２９】
哺乳動物細胞に適した選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素(ＤＨＦＲ)またはチミジンキナーゼである。これらのマーカーは、ＢＰ５３の核酸の取込みに対してコンピテントである細胞の同定を可能にする。哺乳動物細胞形質転換体を、形質転換体だけがマーカーを取込んだために唯一生存に適応する選択圧下に置く。選択圧は、培地中の選択物質の濃度を連続的に変化させ、それによって選択遺伝子とＢＰ５３をコードしているＤＮＡの両方の増幅が導かれる条件下で形質転換体を培養することによって課される。増幅とは、増殖に必須であるタンパク質を産生することが強く要求されている遺伝子が組換え細胞の代々の世代の染色体内に直列して反復される過程のことである。一層多量のＢＰ５３が増幅されたＤＮＡから合成される。
【００３０】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、始めにヒポキサンチン、グリシン、およびチミジンを欠く培養培地ですべての形質転換体を培養することによって同定する。この場合の適切な宿主細胞は、Ur1aubおよびChasin[Proc.Nat’l. Acad.Sci.USA 77：4216(1980)]の記載のように調製し、増殖させた、ＤＨＦＲ活性を欠くチャイニーズ・ハムスター卵巣(ＣＨＯ)セルラインである。特に有用なＤＨＦＲは、ＭＴＸに対して耐性が高い突然変異ＤＨＦＲである(EP117,060A)。この選択物質は、内生のＤＨＦＲの存在にかかわらず、その他の点では適切なあらゆる宿主、例えばＡＴＣＣ No.ＣＣＬ６１ ＣＨＯ-Ｋ１で用いることができる。次に、ＤＨＦＲを不活性化する物質(メトトレキセートまたはＭＴＸ)に暴露することによって、ＤＨＦＲとＢＰ５３コード化ＤＮＡを増幅する。連続回の逐次増大するＭＴＸ濃度で増殖することができる細胞だけを選択することによって、細胞がさらにＤＨＦＲを必要とする(従って、すべての外来ＤＮＡを増幅する)のを確実なものにする。
【００３１】
クローニングベクターとは異なり、発現ベクターは、宿主生物によって認識され、そしてＢＰ５３の核酸に機能的に結合したプロモーターを含有しているべきである。プロモーターは、その支配下にある核酸配列の転写および翻訳をコントロールする、構造遺伝子の開始コドンの上流(通常、約１００〜１０００ｂｐ以内)に位置している翻訳されない配列である。これらは普通２つの群、即ち誘導性および構成性に分けられる。誘導性のプロモーターは、培養条件のある変化、例えば栄養素の存在もしくは非存在または温度の変化に応答してそれらの支配下のＤＮＡから増大レベルの転写を開始させるプロモーターである。構成性のプロモーターは培養条件の変化によっては誘導されない。現在では、多種の可能性ある宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。これらのプロモーターは、制限酵素消化によってこれらをこれらの元の遺伝子から取り、次いでＢＰ５３の開始コドンの５’に挿入することによって、ＢＰ５３をコードしているＤＮＡに機能的に結合させることができる。これは、ゲノムＢＰ５３プロモーターが使用できないと言うものではない。しかし、一般にＢＰ５３に対して異種のプロモーターは、一層高い転写および一層高い収量の発現ＢＰ５３を与える結果になる。
【００３２】
原核性宿主で用いるのに適したプロモーターには、β-ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系[Chang et al.,Nature 275：615(1978)およびGoeddel et al.,Nature 281：544(1979)]、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系[Goedde1,Nuc1eic Acids Res. 8：4057(1980)およびＥＰＯ出願公開No.36,776]、およびtacプロモーターなどのハイブリッドプロモーター[H.de Boar et al., Proc.Nat'l .Acad.Sci.USA 80：21-25(1983)]が含まれる。しかし、その他の既知の細菌性プロモーターも適している。これらのヌクレオチド配列は公表されており、従って当業者はこれらを、あらゆる必要な制限部位を供給するためのリンカーまたはアダプターを用いて、ＢＰ５３をコードしているＤＮＡに機能的に連結することができる[Sieben1ist et al.,Cell 20：269(1980)]。また、細菌性の系で用いるためのプロモーターは、ＢＰ５３コードしているＤＮＡに機能的に結合させたシャインーダルガルノ(ＳＤ)配列を含有している。
【００３３】
酵母宿主で用いるのに適した促進配列には、３‐ホスホグリセレート キナーゼのためのプロモーター[Hitzeman et a1.,J.Bio1.Chem. 255：2073(1980)]、またはその他のグルコース分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベート デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェート イソメラーゼ、３−ホスホグリセレート ムターゼ、ピルベート キナーゼ、トリオセホスフェート イソメラーゼ、ホスホグルコース イソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどのプロモーター[Hess et al.,J.Adv.Enzyme Reg. 7：149(1968)およびHo11and,Biochemistry 17：4900(1978)]が含まれる。
増殖条件によってコントロールされる転写の別の利点を有している誘導性プロモーターであるその他の酵母プロモーターは、アルコ一ルデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関与する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素群のプロモーター領域である[Ho11and；上記]。酵母発現において用いるのに適したベクターおよびプロモーターはR.Hitzeman et a1.(EP 73,657A)がさらに開示している。また、酵母エンハンサーを酵母プロモーターとともに用いるのが有利である。
【００３４】
哺乳動物宿主細胞中のベクターからのＢＰ５３の転写は、種々の供給源、例えばポリオーマ、サルウイルス４０(ＳＶ４０)、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはサイトメガロウイルスなどのウイルスのゲノムから、または、例えばβアクチンプロモーターなどのヘテロローガスな哺乳動物プロモーターから得られるプロモーターによってコントロールされる。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０のウイルス性複製起源をも含有するＳＶ４０制限フラグメントとして好都合に得られる[Fiers et a1.,Nature, 273：113(1978)]。ヒトサイトメガロウイルスの即時型プロモーターはＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限フラグメントとして好都合に得られる[Greenaway,P.J.et a1.,Gene, 18：355-360(1982)]。また、宿主細胞またはその関連種由来のプロモーターが本発明において有用であるのは勿論である。
高等真核生物によるＢＰ５３をコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増大する。エンハンサーは、通常約１０〜３００ｂｐのシス作用性のＤＮＡ要素であり、プロモーターに作用してその転写開始能力を増強する。エンハンサーは、その配向および位置には比較的依存せず、転写単位の５’[Laimins,L.et a1., Proc.Nat1.Acad.Sci.,78：993(1981)]および３’[Lusky,M.L. et a1.,Mo1.Cell Bio.,3：1108(1983)]に、イントロン内[Banerji,J.L.et a1.,Ce11,33：729(1983)]に、ならびに暗号配列それ自体内[0sborne,T.F.,et a1.,Mo1.Ce11 Bio.,4：1293(1984)]に見い出されている。現在では多数のエンハンサー配列が哺乳動物遺伝子(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテインおよびインスリン)から既知となっている。しかし、真核細胞ウイルスからのエンハンサーを用いるのが普通である。その例には、ＳＶ４０の複製起源の後期側のエンハンサー(ｂｐ１００〜２７０)、サイトメガロウイルスの複製起源の後期側の初期プロモーターエンハンサー、およびアデノウイルスのエンハンサーが含まれる。エンハンサーはベクターのＢＰ５３をコードしている配列の５’または３’の位置に継ぎ合わせてよいが、プロモーターの５’の位置に設置するのが好ましい。
【００３５】
また、真核宿主細胞(酵母、菌類、昆虫、植物、動物、ヒト、または有核細胞)で用いる発現ベクターは、ｍＲＮＡの発現に影響を及ぼす転写の終止に必要な配列をも含んでいるであろう。これらの領域は、ＢＰ５３をコードしているｍＲＮＡの非翻訳化部分中のポリアデニル化されたセグメントとして転写される。また、３’非翻訳化領域は転写終止部位をも含んでいる。
組換え脊椎動物細胞培養における異種タンパク質の合成に用いるのに適した他のベクターは開示されている[M.J.Gething et a1.,Nature,293：620-625(1981)；N.Mantei et a1.,Nature,281：40-46；およびA.Levinson et a1.,EP117,060Aおよび117,058A]。ＢＰ５３の哺乳動物細胞培養発現に特に有用な出発プラスミドはｐＵＣ１１８であり、これをVieiraおよびMessing[MethEnzymo1.,153：3-11(1987)]が開示している。簡単に説明すると、ｐＵＣ１１８は、アンピシリン耐性およびＭ１３ ＩＧ領域、ならびにクローニングのための唯一の制限部位を含有するｌａｃＺペプチドをコードしている配列を含む３．２ｋｂのプラスミドである。pＵＣ１１８は、pＵＣの唯一のＮｄｅＩ部位(２４９９)に挿入されたＨｇｉＡＩ部位(５４６５)からＤｒａＩ部位(５９４１)までのＭ１３のＩＧ領域を含むｐＵＣ１８[Norrander et al.,Gene,26：101(1983)が開示]である。Ｍ１３ＩＧ領域の配向は、ｓｓＤＮＡとしてパッケージングされるｌａｃ領域の鎖がＭ１３ｍｐベクターにおけるときと同じになるようになっている。
【００３６】
本発明のベクターのクローニングまたは発現に適した宿主細胞は、原核生物、酵母または高等真核細胞である。原核生物にはグラム陰性またはグラム陽性生物、例えば大腸菌またはバシラスが含まれる。好ましいクローニング宿主は大腸菌２９４(ＡＴＣＣ No.３１，４４６)であるが、その他のグラム陰性またはグラム陽性原核生物、例えば大腸菌Ｂ、(大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ No.３１，５３７) 、大腸菌Ｗ３１１０(Ｆ−、λ−、原栄養株；ＡＴＣＣ No.２７，３２５)、バシラス、例えば、Baci11us subtilus、Sa1mone11a tryphimurium、Pseudomonas種、またはSerratia Marcesansなども適している。原核細胞を発現用の宿主として用いるときには、発現ベクターは培養培地中にタンパク質を運搬するためのシグナル配列を合んでいるのが好ましい。他の方法では、１８システイン残基を含有しているタンパク質が、タンパク質の回収には特別の処理が必要な屈折体の形態で調製される(この処理にはタンパク質の再折り畳みが含まれる)。
【００３７】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核性微生物もＢＰ５３をコードしているベクターに適した宿主である。Saccharomyces cerevisiaeまたは普通のパン酵母が最も普通に用いられる真核微生物であるが、その他多数の菌株も普通に用いられる。Saccharomyces中での発現のためには、プラスミドＹＲｐ７[Stinchcomb,et a1., Nature,282：39(1979)；Kingsman et al., Gene,7：141(1979)；Tschemper et a1., Gene, 10：157(1980)]を用いるのが普通である。このプラスミドは、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の突然変異株、例えばＡＴＣＣNo.４４，０７６またはＰＥＰ４−１[Jones,Genetics,85：12(1977)] のための選択マーカーを与えるｔｒｐ１遺伝子を既に含有している。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてｔｒｐ１損傷が存在すると、次にトリプトファンの非存在下での増殖によって有効な選択手段が与えられる。
ＢＰ５３の発現用に好ましい宿主細胞は多細胞生物由来の細胞である。上記のように、ＢＰ５３上の多数のシステイン残基により、もし天然ＢＰ５３に対して最も忠実な立体配座を示すことを組換えタンパク質に期待するときには、宿主細胞は原核生物よりもさらに高等な系統発生オーダーのものであるのが最適であることが示唆される。また、ＢＰ５３のグリコシル化を確保することが必要であることもある。これら機能のすべては高等真核細胞によって最もうまく行うことができる。原則的には、あらゆる高等真核細胞培養物が脊椎動物あるいは非脊椎動物培養物の由来を問わず使用可能であるが、サル、ラット、ハムスターおよびヒトなどの哺乳動物由来の細胞が好ましい。これら細胞の培養中での増殖はそれ自体周知である[Tissue Cu1ture, Academic Press, KruseおよびPatterson編(1973)を参照]。有用な哺乳動物宿主セルラインの例には次のものが含まれる：ＳＶ４０で形質転換されたサル腎ＣＶ１ライン[ＣＯＳ-７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１]；ヒト肝腎セルライン[293, Graham,F.L. et a1.,J.Gen Viro1.36：59(1977)]；新生ハムスター腎細胞[ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０]；チャイニーズ・ハムスター卵巣細抱-ＤＨＦＲ[ＣＨＯ, Ur1aubおよびChasin, Proc.Nat1.Acad.Sci.USA 77：4216(1980)]；マウス  セルトーリ細胞[ＴＭ４, Mather,J.P., Bio1.Reprod. 23：243-251(1980)]；サル腎細胞[ＣＶ１、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０]；アフリカミドリザル腎細胞[ＶＥＲＯ-７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ-１５８７]；ヒト子宮頸癌細胞[ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２]、イヌ腎細胞[ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４]；バッファロラット肝細胞[ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２]；ヒト肺細胞[Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５]、ヒト肝細胞[ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５]；マウス乳腫瘍[ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１細胞]；およびＴＲＩ細胞Mather, J.P. et al., Annals N.Y.Acad.Sci. 383：44−68(1982)]。
【００３８】
所望の暗号配列およびコントロール配列を含有している適当なべクターの構築には通常の連結法を用いる。単離したプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを切断し、加工し、そして所望の形態に再連結して必要なプラスミドを得る。
構築したプラスミド中の正しい配列を確認する分析のために、連結混合物を用いて大腸菌Ｋ１２株２９４(ＡＴＣＣ ３１，４４６)または他の適当な宿主を形質転換する。プラスミド構築の様式に依存して、適当なところでアンピシリン、テトラサイクリン、もしくはその他の抗生物質耐性によって、またはその他のマーカーによって成功裏の形質転換体を選択する。次に、形質転換体からのプラスミドを、所望によりクロラムフェニコール増幅[C1ewe11,D.B.et a1., J.Bacterio1.,110：667(1972)]の後に、C1ewe11等[Proc.Nat1.Acad  Sc1.(USA)62：1159(1969)]の方法に従って調製する。単離したＤＮＡを制限分析し、そして／またはMessing等のジデオキシ法[Messing et a1.,Nuc1eic Acids Res.,9：309(1981)]またはMaxam等の方法[Maxam et a1., Methods in Enzymo1ogy,65：499(1980)]によって配列決定する。
【００３９】
宿主細胞を本発明の発現ベクターで形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または遺伝子の増幅に適するように修飾された通常の栄養培地で培養する。温度、pHなどの培養条件は、クローニングまたは発現のために選択した宿主細胞でこれまで用いられている条件が適当であり(それぞれの場合に応じて)、当業者には明らかであろう。
ＢＰ５３は分泌型タンパク質として培養培地または周辺質から回収するのが好ましい。また、分泌シグナルなしで直接発現させるときには宿主細胞溶菌液から回収することもできるが、この場合には第１段階として、培養培地または溶菌液を遠心して個々の細胞残骸を除去する。また、ＢＰ５３は不純な可溶性タンパク質から、例えば選別カラム(ＣｏｎＡなど)による吸着とそれからの溶離、または抗-ＢＰ５３免疫アフィニティーカラムによる吸着とそれからの溶離によって精製することができる。これとは別に、他の方法、例えばアルキル・セファロース、シリカまたはアニオンもしくはカチオン交換樹脂によるクロマトグラフィーまたはゲル電気泳動を用いてＢＰ５３を不純物から分離することができる。膜アンカーがＢＰ５３タンパク質に結合しているＢＰ５３の変異体は、ＢＰ５３と同じ方法で回収することができる。
【００４０】
必要なら安定化の目的で、少量のノニオン系界面活性剤、例えばツイーン(Tween)またはポリエチレングリコールをＢＰ５３の分離中に加えてもよい。また、ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害物質は精製中のタンパク質加水分解を阻害するのに有用であり、抗生物質を含有させて外来不純物の増殖を防止してもよい。
天然のＢＰ５３に適した精製方法が、組換え細胞培養で発現させたＢＰ５３またはその変異体の性質の変化に鑑みて、修飾を必要とすることもあることは当業者の認めるところであろう。例えば、原核細胞の培養中に産生されたＢＰ５３ポリペプチドはグリコシル化されていないので、Ｃｏｎ-Ａセファロースに吸着しないであろう。この場合には、他の方法、例えばゲル電気泳動、イオン交換または免疫アフィニティー精製などを用いるべきである。適切な精製法は特定の組換えＢＰ５３の性質に依存しており、当業者には明らかであろう。
【００４１】
実施例および請求の範囲を簡単にするため、一部の頻繁に出てくる用語および方法を簡略して表す。
「トランスフェクション」とは、宿主細胞による発現ベクターの取込みを意味し、任意の暗号配列が実際に発現されると否とを問わない。例えば、ＣａＰＯ４法および電気穿孔法などの多数のトランスフェクション法が当業者に知られている。原核細胞または強固な細胞壁構造を含む細胞が使用されるときには、好ましいトランスフェクンョン法はCohen等が開示している塩化カルシウムによるカルシウム処理である[Cohen,F.N.et a1.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)69：2110(1972)]。通常、このベクターの作用のいずれかの指標が宿主細胞内に現れたときに、トランスフェクションの成功が認められる。
「形質転換」とは、染色体外要素として、または染色体組込みのいずれかによって、複製可能なように生物中にＤＮＡを導入することを意味する。使用される宿主細胞に依存して、そのような細胞に適した常法を用いて形質転換を行う。原核生物または強固な細胞壁障害を有するその他の細胞のためには、通常、Cohenが開示している塩化カルシウム使用のカルシウム処理法[Cohen,S.N. et al.,Proc. Natl.Acad.Sci(USA) 69：2110(1972)]が用いられる。そのような細胞壁を持たない哺乳動物細胞のためには、Grahamおよびvan der Ebのリン酸カルシウム沈澱法[Graham,F.and van der Eb,A.Virology 52：456-457(1978)]が好ましい。哺乳動物細胞宿主系の形質転換の全般についてはAxel[米国特許No.4,399,216；1983年8月16日発行]が開示している。酵母での形質転換は、通常、Van So1ingen等[Van So1ingen,P.,et a1., J.Bact.,130：946(1977)]およびHsiao等[Hsiao,C.L.,et al.,Proc. Natl. Acad.Sci.(USA) 76：3829(1979)]の方法に従って行われる。しかし、細胞中にＤＮＡを導入するための他の方法、例えば核注射による方法またはプロトプラスト融合による方法なども用いることができる。
【００４２】
本発明の範囲内に含まれるある種のＤＮＡ配列を記述するための、本明細書で用いる「厳格な条件下でバイブリダイズ」という表現は、４２℃の温度、５ｘＳＳＣの５０%ホルムアミド中でバイブリダイズざせ、そして６０℃の０．２ｘＳＳＣ中でフィルターを洗浄することを指す[1ｘＳＳＣは、０．１５M  ＮａＣｌ、０．０１５M  クエン酸ナトリウムである]。これらの条件は、ＢＰ２８配列にハイブリダイズする配列を排除することを意図したものである。
「部位指向性の突然変異誘発」はこの分野では普通の方法であり、所望の突然変異を示す限定された誤対合を除いて突然変異誘発を行おうとする１本鎖ファージＤＮＡに相補性の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて行う。簡単に説明すると、合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてファージに対して相補性である鎖を合成させ、得られた２本鎖ＤＮＡをファージを維持する宿主細菌中に導入する。導入した細菌の培養物をトップ寒天で培養すると、ファージを保持している１個の細胞からプラークが形成される。理論的には、新しいプラークの５０%が突然変異形を１本鎖として有するファージを含有し、５０%は元の配列を有する。このプラークを、正確な対合はハイブリダイズさせるが元の鎖との誤対合がハイブリダイズするのを妨げるに十分な温度で、キナーゼ処理した合成プライマーとハイブリダイズさせる。次いで、プローブとハイブリダイズするプラークを選択し、培養し、ＤＮＡを回収する。
【００４３】
「機能的に結合」とは、構成成分の正常な機能を発揮させることができるように並べることを指す。即ち、コントロール配列群に「機能的に結合」した暗号配列とは、この暗号配列がこれらの配列群のコントロールのもとで発現することができ、結合されているＤＮＡ配列が隣接しており、分泌リーダーの場合には隣接してリーディング相内にある立体配置を意味する。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関係するプレタンパク質として発現されるならばポリペプチドのＤＮＡに機能的に結合しており；プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼすならば暗号配列に機能的に結合しており；また、リボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように設置されているならば暗号配列に機能的に結合している。結合は都合のよい制限部位での連結によって行う。そのような部位が存在しないときには、常法に従って合成オリゴヌクレオチド  アダプターまたはリンカーを用いる。
「コントロール配列」とは、特定の宿主生物における機能的に結合した暗号配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適したコントロール配列には、例えば、プロモーター、所望によるオペレーター配列、リボソーム結合部位、そして恐らくは今のところはよくわかっていないその他の配列が含まれる、真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することがわかっている。
【００４４】
「発現系」とは、所望の暗号配列および機能的に結合したコントロール配列を含有するＤＮＡ配列を指し、これらの配列で形質転換された宿主はコードされているタンパク質を産生することができる。形質転換を行うためには、発現系はベクター上に含まれているであろう；しかし、関連のＤＮＡが次いで宿主染色体中に組込まれることもある。
本明細書で用いる「細胞」、「セルライン」および「細胞培養物」は交換可能なように用い、これら表示の全てはその子孫を含んでいる。従って、「形質転換体」または「形質転換細胞」は、転移の数とは無関係に１次対象細胞およびそれから導いた培養物を含んでいる。また、意図的あるいは偶然の突然変異により、全ての子孫がそのＤＮＡ内容において正確に一致していないこともあることは理解されよう。元の形質転換された細胞中のものについてスクリーニングしたときに同一の機能を有する突然変異子孫は包含される。別の意味が意図されているときには、その文脈から明らかであろう。
【００４５】
「プラスミド」は、小文字p、それに続く英数文字で表す。本発明の出発プラスミドは、市販品から入手可能であるが、制限のない状態で誰でも入手可能であるか、またはそのような入手可能なプラスミドから公知の方法に従って構築することができる。さらに、公表されているものと等価なプラスミドが当分野で知られているが、これらは当業者には明らかであろう。
ＤＮＡの「消化」とは、ＤＮＡ中のある配列のところでのみ作用する制限酵素によるＤＮＡの触媒的切断を意味する。本発明で用いられる多種の制限酵素は市販品から入手可能であり、それらの反応条件、補助因子、およびその他の必要なものは、当業者に既知であるものを用いた(例えば、製造元の指示に従った)。分析用には、通常、１μｇのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを約２０μｌの緩衝液中、約２単位の酵素とともに用いる。プラスミド構築用のＤＮＡフラグメントの単離のためには、通常、５〜５０μｇのＤＮＡをもっと大きな容量中、２０〜２５０単位の酵素で消化した。特定の制限酵素のための適切な均衡液および其質量は製造元によって指定されている。通常は３７℃で約１時間のインキュベート時間を用いたが、供給元の指示に従って変えてもよい。消化の後、反応混合物を直接ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて所望のフラグメントを単離する。
【００４６】
「脱ホスホリル化」とは、細菌性アルカリホスファターゼ(ＢＡＰ)による処理によって末端５’ホスフェートを除去することを意味する。この操作によって、ＤＮＡフラグメントの２つの制限切断末端が「環状化」または閉じた環を形成すること(この制限部位における別のＤＮＡフラグメントの挿入が妨げられる)が妨げられる。脱ホスホリル化のための方法および試薬は通常のものである[T.Maniatis et al.,1982, Molecular Cloning：A Laboratory Manual(New York：Co1d Spring Harbor Laboratories,1982),pp.133-134]。ＢＡＰを用いる反応を５０ｍＭトリス中、６８℃で行って、酵素調製物中に存在していることもあるあらゆるエキソヌクレアーゼの活性を抑制することもできる。反応は１時間行う。反応の後、フェノール／クロロホルムで調製物を抽出し、エタノールで沈澱させることによってＤＮＡフラグメントを回収することができる。脱ホスホリル化の代わりとしては、望ましくないフラグメントの別の制限酵素消化によって２重に消化されたベクターにおいて再連結を妨げることができる。
制限消化物からのあるＤＮＡフラグメントの「回収」または「単離」とは、電気泳動によるポリアクリルアミドまたはアガロースゲルでの消化物の分離、その移動度と既知分子量のマーカーＤＮＡフラグメントの移動度の比較による目的フラグメントの同定、目的のフラグメントを含有しているゲル切片の取り出し、およびゲルからのＤＮＡの分離を意味する。この方法は広く知られている。例えば、Lawn等[R.Lawn et al.,(1981), Nuc1eic Acids Res.9：6103−6114] およびGoedde1等[D.Goedde1 et a1.,(1980)Nuc1eic Acids Res.8：4057]を参照。
【００４７】
「サザーン分析」とは、既知のラベルされたオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡフラグメントヘのバイブリダイゼーションによって消化物またはＤＮＡ含有組成物中のＤＮＡ配列の存在を確認する方法である。本発明のためには、他に記載がなければ、サザーン分析は、Southernの方法[E.Southern(1975) J.Mo1.Biol. 98：503-517]による１%アガロースでの消化物の分離、変性およびニトロセルロースヘの移動、ならびにManiatis等[T.Maniatis et al.,(1978) Cell 15：687-701]が記載しているようなハイブリダイゼーションを意味する。
「連結(ライゲート)」とは、２つの２本鎖核酸フラグメントの間でホスホジエステル結合を形成させる過程を指す[T.Maniatis et al.,Molecu1ar Cloning：A Laboratory Manual,p.146；上記]。特に記さなければ連結は、連結しようとするほぼ等しい量のＤＮＡフラグメント(０．５μｇ)に対してＴ４ ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)（１０単位）を用い、既知の緩衝液および条件を用いて行う。「接着末端」連結は通常０℃で行い、一方、「平滑末端」連結は通常１４℃で行う。
【００４８】
「充填」または「平滑化」は、制限酵素切断した核酸の付着末端の１本鎖末端が２本鎖に変換される操作を意味する。これにより付着末端が削除され、平滑末端が形成される。この方法は、１つだけまたはいくつかの別の制限酵素によって創製される末端に付着することができる制限切断末端を、いずれかの平滑切断する制限エンドヌクレアーゼの末端または他の充填された付着末端と適合する末端に変換するための多用途の方法である。通常、平滑化は、１OｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオトレイトール、５０mM  ＮａＣｌ、１０ｍMトリス(ｐＨ７．５)緩衝液中、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ・フラグメント(８単位)および４種のデオキシヌクレオシド三リン酸(それぞれ２５０μＭ)の存在下、約３７℃で標的ＤＮＡ(２〜１５μｇ)をインキュベートすることによって行う。通常、このインキュベートは３０分後に停止させ、反応混合物をフェノールおよびクロロホルム抽出ならびにエタノール沈澱にかける。
形質転換体からのＤＮＡの「調製」とは、微生物培養物からのプラスミドＤＮＡの単離を意味する。他に記載がなければ、Maniatis等[Mo1ecu1ar C1oning：A Laboratory Manua1,P.90;上記]のアルカリ／ＳＤＳ法を用いてよい。
「オリゴヌクレオチド」とは、既知の方法によって化学的に合成され、次いでポリアクリルアミドゲルで精製された短い１本鎖または２本鎖のポリデオキシヌクレオチドである。
【００４９】
組換え法によってＢＰ５３を得た方法の要約を以下に挙げる。
１．ヒト血漿からの精製ＢＰ５３を部分的に配列決定した。
２．ＢＰ５３のアミノ末端部分およびＢＰ５３の多数の内部配列に対応するそれぞれのアミノ酸に対して単一のコドン選択を示す一連のオリゴヌクレオチドプローブを化学的に合成し、３２Ｐでラベルした。
３．２種類の成人肝臓ｃＤＮＡライブラリーをαλｇｔ１０ベクターにおいて構築した：１つはオリゴ(ｄＴ）プライムしたライブラリーであり、１つはランダムにプライムしたライブラリーである。
４．それぞれのライブラリーを３種類のプローブプールでスクリーニングした。プローブのそれぞれのプールは、それぞれのライブラリーで強度の異なる３００〜１０００のスポットを与えた。３８のスポットが３種類のプローブプールの２つで重複し、２つのスポットが３重複して現れた(両方ともオリゴ(ｄＴ)プライムしたライブラリー由来)。これらクローンの２つを、３種類のプローブプールと、および第４の合成プローブとバイブリダイズするものと同定した。２重複および３重複クローンのいくつかをサブクローンし、マッピングした。
５．４種類のプローブプールの全てにハイブリダイズした２つのサブクローンのうちの１つを配列決定し、ＢＰ５３の完全なＤＮＡ配列を決定した。
６．ＢＰ５３をコードしている完全長のｃＤＮＡをプラスミド中に構築し、複製した。図３の完全なＤＮＡ配列を知ることによりＢＰ５３ｃＤＮＡと完全な相同性を有する極めて長いプローブを調製することが可能になり、それによって他の種由来のゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡをプローブすることがかなり容易になり、その効率を増大させ、そしてＢＰ５３の精製、配列決定およびプローブプールの調製を不要なものにすることができた。
７．ＢＰ５３をコードしているｃＤＮＡをクローニングプラスミドから切り出し、発現媒体に連結し、これを用いて適当な宿主細胞を形質転換し、次いでこの宿主細胞を培養増殖させて目的のＢＰ５３を産生させた。
８．上記方法に従って得た生物学的に活性な成熟ＢＰ５３は２６４個のアミノ酸残基を有しており、そのうちの１８個はシステインである。
【実施例】
【００５０】
以下に挙げる実施例は、今わかっている本発明の実施の最良の態様を単に説明するためのものであり、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）ＢＰ５３をコードしているｃＤＮＡクローンの同定およびヒト血清ＢＰ５３のクローニング
ＢＰ５３をコードしているＤＮＡは、完全なＤＮＡ配列が既知であるときには化学合成によって、ヒト肝臓由来のｍＲＮＡの逆転写体のスクリーニングによって、または任意の細胞由来のゲノムライブラリーのスクリーニングによって得ることができる。ＢＰ５３タンパク質の完全なアミノ酸配列もＤＮＡ配列も本発明時には知られていなかったので、その時点ではＢＰ５３をコードしている完全なＤＮＡ配列の化学合成は不可能であった。
ヒト血清結合タンパク質ＢＰ５３を、Commonwea1th Serum Laboratories(Melbourne Austra1ia)から入手したヒト血漿のコーン・フラクションＩＶペーストから、MartinおよびBaxter[J.Bio1.Chem.；上記]の記載のようにして精製した。精製されたＢＰ５３を示す単一のＨＰＬＣピークを単離した。この物質から得たアミノ酸配列を第２表に示す。
【００５１】
得られた６０アミノ酸のＮ-末端配列は、５位を除いて(アラニン残基が以前に見い出されていた)、BaxterおよびMartin[Biochem.Biophys.Res.Comm.,147：408-415(1987)]が既に報告している１５アミノ酸の配列と一致した。今回の配列はほぼ等しい量のアラニンおよびグリシンを与え、今回単離したタンパク質がこの位置に両残基を有する混合物であることを示唆した。６０残基のＮ-末端配列を完全なものにした後、配列決定機のフィルターに残っているタンパク質を、GrossおよびWitkup[J.Am.Chem.Soc.,83：1510-1511(1961)]の記載のようにして臭化シアンで切断した。次に、明確な内部配列を見い出した(第２表を参照；ＣＮＢｒ)。
タンパク質のトリプシンおよびリジン-Ｃタンパク質加水分解切断とそれに続く逆相クロマトグラフィーによるペプチドの単離によって、別の９つの内部ペプチドの単一の配列および３つの混合配列が得られた。トリプシン消化のためには、精製ＢＰ５３(８．４μｇ)を、１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、１０ｍＭ塩化カルシウム(１００μｌ)中、トリプシン(０.５μｇ)と共に３７℃で２４時間インキュベートした。リジン-Ｃペプチダーゼ消化のためには、精製ＢＰ５３(６μｇ)を、１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、０．１％ＳＤＳ、１０mMジチオトレイトール(ＤＴＴ)(１００μｇ)中、リジン-Ｃペプチダーゼ(０．３μｇ)と共に３７℃で２４時間インキュベートした。消化物を直接Sychropak３００ＡＣ４ＨＰＬＣカラム(２ｘ１００ｍｍ)にかけ、続いて０．１％トリフルオロ酢酸中の1〜７０%アセトニトリルまたは１-プロパノールの直線勾配液で溶離することによってこれらのフラグメントを分離した。この消化法およびＲＰ-ＨＰＬＣ精製法はAggarwa1等[J.Bio1.Chem.,260：2334-2344(1985)]がさらに詳しく記載している。ＢＰ５３アミノ酸配列のセグメントは、Henze1等[Chromatography,404：41-52(1987)]の記載のように、Ne1son３００データ・システムおよび１２０Ａ ＰＴＨアミノ酸分析機を装着した４７０Ａ App1ied Biosystems気相配列決定機によって得た。
【００５２】
【表２】
2004256541.tif 000003
【００５３】
１文字のコードはアミノ酸に対して用い、当分野で既知のコード・システムを使用した。Ｘは同定することができなかった残基を示す。丸括弧は不確定の残基を示す。角括弧は配列を与えなかったＡｓｎ残基を示し、従ってグリコシル化されているかもしれない。Ｔ２-１０-８、Ｔ２-２０、およびＫＣ-２０の混合配列はｃＤＮＡ配列の助けによって分離した。
λｇｔ１０ベクター中の２種類のヒト成人肝臓ｃＤＮＡライブラリーを用いてＢＰ５３のクローンをスクリーニングした。その１つは、Leung等[Nature,330:537-543(1987)]の記載のようにして調製したランダムにプライムしたライブラリーである。他方のヒト肝臓オリゴ(ｄＴ)プライムのｃＤＮＡライブラリーは、長さが１２〜１８ヌクレオチドのオリゴ(ｄＴ)プライマーおよびＡＭＶ逆転写酵素を用いて肝臓ＲＮＡから普通に調製した。得られたＲＮＡ-ＤＮＡコンプレックスをＤＮアーゼ不含のＲＮアーゼＡで処理した後、当分野で周知の方法を用い、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ・フラグメントおよび追加のＡＭＶ逆転写酵素の両方を用いて第２のＤＮＡ鎖を合成した。このようにして調製した２本鎖のｃＤＮＡ(ｄｓ-ｃＤＮＡ)をＳ１ヌクレアーゼで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ・フラグメントで処理した。平滑末端になっているｄｓ-ｃＤＮＡを、ホスホリル化した１６ヌクレオチドのオリゴマーに、ならびにＳａ１Ｉ、ＳｓｔＩおよびＸｈｏＩの制限部位、およびＥｃｏＲＩ突出末端を含むホスホリル化されていない２０ヌクレオチドのオリゴマーに連結した。これらオリゴマーは次の配列を有していた：
２０mer：                5’-AATTCTCGAGCTCGTCGACC
ホスホリル化１６mer：         5’-GGTCGACGAGCTCGAG。
この連結生成物を、市販のＤＮＡパッケージング・キット[Stratagene；San Diego,CA；カタログ＃ＧＴ-１０]中の指示書に記載されているようにして、また、Maniatis等[Mo1ecu1ar Cloning：A Laboratory Manual；上記]が記載している方法を用いて、λｇｔ１０のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。
【００５４】
Ｎ-末端アミノ酸配列および多数の内部配列(Ｃ-末端およびＮ-末端領域の両方に対応)のそれぞれに対して単一のコドン選択を示すオリゴヌクレオチドプローブの４つのプールを合成した。これらの合成オリゴマーは、上記第２表に示したアミノ酸配列データに基づくものであった。これらのプローブを、正しいｃＤＮＡクローンに対する対合と共に図１に示す。
図１では、それぞれの組について、上部の配列は精製ＢＰ５３から決定したアミノ酸配列である。上部のヌクレオチド配列は、アミノ酸配列データに基づきLathe,R.[J.Mo1.Bio1.,183：1-12(1985)]に従って合成したオリゴヌクレオチドプローブ(oibp.６、７、８、９、および２)のものである。ＢＰ５３と表示した配列はクローンしたｃＤＮＡのＤＮＡ配列であり、下方のアミノ酸配列はＢＰ５３の翻訳された配列である。点は、プローブとｃＤＮＡ配列の間のＤＮＡ配列の一致を示す。
【００５５】
プールＡは３種類の重複オリゴヌクレオチド、即ち長さがそれぞれ６９、６９、および７０ヌクレオチドであるoibp.６.１、６.２、および６.３のプールである。これらのオリゴヌクレオチドは、第２表に示したいくつかの重なり合うトリプシン、リジン-Ｃ、およびＣＮＢｒフラグメントからなるＢＰ５３の６０アミノ酸配列に基づいている。これらフラグメントの位置は上部アミノ酸配列の上に示した。最後のフラグメント(Ｔ３-１４)の２アミノ酸(Ｙ,Ｋ)の重なりは正しくないことがわかり、実際にはこのペプチドはこのタンパク質中の他の場所に位置している。従って、第２の下方の配列をアミノ酸４１−６０の下に示している。
プールＢは、長さがそれぞれ４５および３６ヌクレオチドである２つのオリゴヌクレオチドoibp.７および８のプールである。
プールＣは、長さがそれぞれ６３、６３、および６４ヌクレオチドである３種類の重複オリゴヌクレオチドoibp.９.１、９.２、および９.３のプールである。
プールＤは長さが６０ヌクレオチドである１種類のオリゴヌクレオチドoibp.２からなる。
【００５６】
これらの新たに合成したオリゴマーを３２Ｐでラベルし、３つのプールＡ、ＢおよびＣを用いて上記のヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
６００,０００クローンのオリゴ(ｄＴ)プライムのライブラリーおよび６００,０００クローンのランダムにプライムしたヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーを、オリゴヌクレオチドプローブの３つのプールで３重にスクリーニングした。３重のニトロセルロースフィルターを３２Ｐ-末端ラベルしたプローブのプールとハイブリダイズさせた。このハイブリダイゼーションは、２０%ホルムアミド、１０%硫酸デキストラン、５ｘＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ６．５)、５ｘDenhardt溶液、２ｍＭピロリン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、および０.０４ｍｇ／ｍｌの煮沸して超音波処理したサケ精子ＤＮＡを含む緩衝液中で行った。このフィルターを４２℃で一晩ハイブリダイズさせた。バイブリダイゼーションの後、このフィルターを、Maniatis等[Mo1ecu1ar C1oning: A Laboratory Manua1; 上記]の記載のように、１ｘＳＳＣ中、３７℃で２時間洗浄した。
【００５７】
プールＡ、ＢおよびＣのそれぞれは、それぞれのライブラリーについて強度の異なる３００−１０００のハイブリダイズしたポジティブを与えた。３８のハイブリダイズ２重ポジティブが３つのプールのうちの２つで観察された。２つのハイブリダイズ３重ポジティブがオリゴ(ｄＴ)プライムしたライブラリーで観察され、４つのプール全てとハイブリダイズした。多数のこれら２重および３重のクローンを、Messing等[Nuc1eic Acids Res.,9：309-321(1981)]の記載のように、プラーク精製し、ジデオキシ鎖終止法によるＤＮＡ配列決定のためにｐＵＣ１１８[VieiraおよびMessing；上記]ベクター中にサブクローンした。クローンのいくつかをマッピングし、制限マッピングおよび配列分析の両方によってクローンの１つ(ibp.１１８と命名)がＢＰ５３を含有していることがわかった(図２)。このクローンに含まれているのは、図３に示すように、ＢＰ５３の暗号領域および３'-非翻訳化領域であった。
【００５８】
実施例２  ＢＰ５３ｃＤＮＡのＤＮＡ配列
ＢＰ５３ｃＤＮＡクローンの完全なヌクレオチド配列を図３に示す。配列決定したクローンは、メチオニン残基で始まる８７３ｂｐの１つの長いオープン・リーディング・フレームを含んでいる。精製したタンパク質から決定した１８のアミノ末端および内部配列の全てはこのリーディング・フレーム中に存在しており、実際のところ、タンパク質配列の約７５%が第２表に挙げたペプチド中に示される。精製したタンパク質から決定したアミノ酸配列は、不確定または決定することができなかった一部の残基を除き、ｃＤＮＡクローンに基づくＢＰ５３の推定のアミノ酸配列に正確に一致する(第２表)。ＢＰ５３のアミノ末端配列の前には、メチオニンで始まる２７アミノ酸の配列が存在する。この配列は、Per1manおよびHa1 vorson[J.Mo1.Biol., 167；309(1983)]が示しているような、分泌シグナル配列の指標である荷電残基で囲まれた１４アミノ酸の疎水性のコアーを含有している。推定の開始ＡＴＧの５’の３番目のヌクレオチドは、翻訳開始一致(コンセンサス)配列から予想されるようにプリンである[Kozak,Nuc1.Acids Res., 12：857-872(1984)を参照]。オープン・リーディング・フレームは、１５００ｂｐの３’-非翻訳化領域を含む約２５００ｂｐのメッセンジャーＲＮＡの５’末端の近くに含まれている。単離した３つのＢＰ５３クローン(ibp.１１８を含む)は、AAATAAAポリ(Ａ)付加シグナルに先行されるその３’末端にポリ(Ａ)配列を含んでいる。
【００５９】
ｃＤＮＡクローンから推定されるＢＰ５３の完全長成熟配列は２６４残基であり、そのうち１８はシステインであり、このタンパク質がシステインに富んでいることを示す。これらのシステイン残基は、Ｎ-末端付近に１２個が、そしてＣ-末端付近に６個が集まっている(図２を参照)。この配列の翻訳された分子量は２８．７ｋＤであり、還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥで測定された分子量４３ｋＤに比べてかなり小さい。この分子量の不一致の全てまたは大部分は、恐らくはグリコシル化によって説明される。天然タンパク質はレクチン・コンカナバリンＡに結合し[MartinおよびBaxter(J.Bio1.Chem.)；上記]、アミノ酸配列は、３つの可能性あるＮ-結合グリコシル化部位(NXSまたはT)、ならびに同じようにＯ-結合グリコシル化に用いられうるセリンおよびトレオニン残基の２つのクラスター[Russe11等(Ce11,37:577-585(1984))が示唆している]を含有している(図２)。ペプチドＴ１５-３およびＴ３-１４のアミノ酸配列中のアミノ酸１０９および１７２のアスパラギンシグナルの欠如(第２表)は、３つの可能性あるＮ-結合グリコシル化部位のうちの少なくとも2つが用いられていることを示唆する。
【００６０】
ＢＰ５３のアミノ酸配列は、ラットＢＲＬ-３Ａ細胞によって産生されるＩＧＦ-結合タンパク質の公表配列に類似している[LyonsおよびSmith(Mo1.Cell.Endo.,45:263-270(1986))およびMotto1a等(J.Bio1.Chem.,261:11180-11188(1986))を参照]。この比較を以下に挙げるが、星印は配列が相同であるところを示す：
【化１】
2004256541.tif 000004
ラット結合タンパク質について配列決定された３４アミノ酸のうち、２１個がヒトＢＰ５３の配列と一致する。このラットタンパク質は、ＢＰ２８、即ちＢＰ５３とは代謝および抗原性の点から別個のものであるヒトＩＧＦ-結合タンパク質の相同体であると考えられている[Baxter等(J.C1in. Endo. and Metabo1.；上記)、ならびにBaxterおよびMartin(Biochem. Biophys. Res. Comm.;上記)を参照]。いくつかのタンパク質配列データベース[Protein Identification Resource, Nationa1 Biomedica1 Research Foundation, Georgetown Univ. Med. Center, Washington,D.C. 20007およびGenBank, Bo1t.Beranek and Newman, Inc. Cambridge, MA 02231]のコンピューターによる検索によって、他のあらゆる既知タンパク質に対して明確な類似性が存在しないことが示された。特に、ＩＧＦ-IおよびＩＧＦ-ＩＩ受容体結合ドメインに類似性が見い出されなかった。このことは、受容体の細胞外ホルモン結合ドメインが循環成長ホルモン結合タンパク質と同一であることが示されている成長ホルモン受容体についての最近の研究とは対照的である[Leung等(Nature,330：537-543(1987))]。
【００６１】
実施例３  ヒトＢＰ５３の発現
最終的な発現ベクターｐＲＫ５.ibp１.１をpibp.１１８.１およびｐＲＫ５から図９に示したようにして構築した。これらプラスミドおよび最終プラスミドのそれぞれの構築を以下に詳しく説明する。
Ａ．pibp.１１８.１の構築
完全長のヒトＢＰ５３タンパク質のｃＤＮＡはクローンλibp.１１８中に含まれている。λibp.１１８のＥｃｏＲＩ消化、２５８５ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントのアガロースゲル電気泳動による単離、及びこのフラグメントのＥｃｏＲＩ消化ｐＵＣ１１８へのＴ４リガーゼによる連結によってこのｃＤＮＡ挿入体をサブクローンし、プラスミドpibp.１１８.１を得た(図９)。
【００６２】
Ｂ．ｐＲＫ５の構築
Ｂ．１．ｐＦ８ＣＩＳの構築
出発プラスミドｐＦ８ＣＩＳの最初の３部分構築を以下に説明し、図４に示す。
１）最終ベクターのアンピシリン耐性マーカーおよび複製起源は、出発プラスミドｐＵＣ１３ｐＭＬ、即ちプラスミドｐＭＬの変異体[Lusky,MおよびBotchen,M.,Nature,293:79(1981)]から導いた。ｐＵＣ１３ｐＭＬは、ｐＵＣ１３のポリリンカー[Vieira,J.およびMessing,J.,Gene,19：259(1982)]をｐＭＬのＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位に移すことによって構築した。第２の出発プラスミドｐＵＣ８-ＣＭＶは、ＣＭＶエンハンサー、プロモーターおよびスプライス供与配列の供給源である。ｐＵＣ８-ＣＭＶは、ＣＭＶエンハンサー、プロモーターおよびスプライス供与配列の約８００ヌクレオチドをｐＵＣ８の平滑にしたＰｓｔＩおよびＳｐｈＩ部位に挿入することによって構築した[Vieira,J.およびMessing,J；上記]。合成のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩリンカー(New Eng1and Bio1absの市販品から入手可能)を付着ＢａｍＨＩ末端に連結してＨｉｎｄＩＩＩ部位を創製した。この連結に続いて、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｃＩＩ消化を行った。この消化によって、ＣＭＶエンハンサー、プロモーターおよびスプライス供与部位を含有する約８００ｂｐのフラグメントが得られた。ゲル単離の後、この８００ｂｐフラグメントをｐＵＣ１３ｐＭＬの２９００ｂｐ片に連結した。ｐＦ８ＣＩＳの構築に必要なフラグメントは、上記中問プラスミドのＳａ１ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる消化によって得た。この３１２３ｂｐ片は、エンハンサー、プロモーター、およびスプライス供与部位を含むＣＭＶのコントロール配列、ｐＵＣ１３ｐＭＬ由来の複製起源、ならびにアンピシリンに対する耐性マーカーを含有していた。
【００６３】
２）Ｉｇ可変領域イントロンおよびスプライス受容配列は、図４の中央部分に示すような合成オリゴマーを用いて構築した。ＩｇＧイントロンおよびスプライス受容部位のための次の配列を有するように９９ｍｅｒおよび３０ｍｅｒを化学的に合成した[Bothwe11等(Nature, 290：65-67(1981))]：
1   5'  AGTAGCAAGCTTGACGTGTGGCAGGCTTGA....
31       GATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGA... 
60       CATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGT...
88       GTCCACTCCCAG  3'
1   3'  CAGGTGAGGGTGCAGCTTGACGTCGTCGGA 5'。
ＤＮＡポリメラーゼＩ(クレノウ・フラグメント)によってこの合成片を充填し、２本鎖フラグメントを創製した[Wartell,R.M.およびW.S.Reznikoff,Gene,9:307(1980)]。これに続いて、ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで２重消化した。この合成リンカーを、ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位のところでｐＵＣ１３中にクローンした[VeiraおよびMessing；上記]。合成オリゴヌクレオチドを含有するクローン、ラベルしたｐＵＣＩｇ.１０をＰｓｔＩで消化した。ＰｓｔＩ−Ｃ１ａＩリンカーを用いてこのフラグメントにＣ１ａＩ部位を付加した。ＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、Ｉｇ可変領域スプライス受容体およびＩｇイントロンの一部を含有する１１８ｂｐ片をゲル単離した。
【００６４】
３）構築工程の第３の部分によって、肝炎表面抗原の３’末端を、ＳＶ４０の初期領域のポリアデニル化部位および転写終止部位で置き換えた。ＳＶ４０配列を含有するベクターｐＵＣ.ＳＶ４０は、VieiraおよびMessing(上記)の記載のようにｐＵＣ８のＢａｍＨＩに挿入された。次いで、ｐＵＣ.ＳＶ４０をＥｃｏＲＩおよびＨｐａＩで消化した。ＳＶ４０のポリアデニル化配列を含有している１４３ｂｐのフラグメントをこの消化物からゲル単離した。２つの別のフラグメントはｐＳＶＥ.８ｃ１Ｄ[欧州特許公開No.160,457]の消化に続いてゲル単離した。ＥｃｏＲＩおよびＣ１ａＩ消化によって生成した４．８ｋｂフラグメントは、ＳＶ４０-ＤＨＦＲ転写単位、ｐＭＬの複製起源およびアンピシリン耐性マーカーを含有している。ＣｌａＩおよびＨｐａＩによる消化の後に得られる７．５ｋｂフラグメントは、因子ＶＩＩＩのｃＤＮＡを含有している。３部分の連結によってｐＳＶＥ.８ｃ２４Ｄが得られた。この中間プラスミドをＣ１ａＩおよびＳａ１Ｉで消化して、因子ＶＩＩＩのｃＤＮＡ、ＳＶ４０ポリＡ部位、それに続くＳＶ４０ＤＨＦＲ転写単位を含有する９６１１ｂｐのフラグメントを得た。
【００６５】
ｐＦ８ＣＩＳを得るための最終的な３部分連結には次のフラグメントを用いた：即ち、(ａ)複製起源、アンピシリン耐性マーカー、ならびにＣＭＶエンハンサー、プロモーター、およびスプライス供与部位を含有する３１２３ｂｐのＳａ１Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント；(ｂ)Ｉｇイントロンおよびスプライス受容部位を含有する１１８ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｃ１ａＩフラグメント；および(ｃ)因子ＶＩＩＩのｃＤＮＡ、ＳＶ４０のポリアデニル化部位、およびＳＶ４０ＤＨＦＲの転写単位を含有する９６１１ｂｐのＣ１ａＩ−Ｓａ１Ｉフラグメントを用いた。
【００６６】
Ｂ.２.  ｐＣＩＳ２.８ｃ２８Ｄの構築
ｐＣＩＳ２.８ｃ２８Ｄは、因子ＶＩＩＩの７３ｋＤサブユニットに結合した因子ＶＩＩＩの９０ｋＤサブユニットを含有している。この９０ｋＤはアミノ酸１〜７４０を含有しており、７３ｋＤサブユニットはアミノ酸１６９０〜２３３２を含有している。この構築物は次のフラグメントの３部分連結によって調製した：即ち、(ａ)ｐＦ８ＣＩＳの１２６１７ｂｐのＣ１ａＩ−ＳｓｔＩＩフラグメント(ｄａｍ株から単離およびＢＡＰ処理)；(ｂ)ｐＦ８ＣＩＳの２１６ｂｐのＳｓｔＩＩ−ＰｓｔＩフラグメント；および(ｃ)キナーゼ処理した短いＰｓｔＩ−Ｃ１ａＩ合成オリゴヌクレオチドである(図５を参照；ここで、星印は変えられたヌクレオチドを示す)。
また、図５は、ｐＣＩＳ２.８ｃ２８Ｄを調製するために融合される因子ＶＩＩＩの５’および３’ＤＮＡ領域を含有するｐＳＶＥＦＶＩＩＩＩ(欧州特許公開No.160,457)の４０８ｂｐ ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩおよび４１６ｂｐ ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩフラグメントのサブクローニングをも示すものである。
【００６７】
図６は、ｐＣＩＳ２.８ｃ２８Ｄの融合領域を構築するために用いる３部分連結を示すものである。２種類の異なるフラグメントＡおよびＢを、同じｐＵＣ１１８ ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ ＢＡＰベクターにクローンした。このＡフラグメントはｐＵＣ４０８ＢＨの４０８ｂｐ ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントであり、ＢフラグメントはＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩオリゴヌクレオチドであった。この２本鎖のオリゴヌクレオチドは図６に示されている。末端制限部位の完全なＤＮＡ配列が図６に示されているが、実際のオリゴヌクレオチドは制限部位のところで線によって示されている塩基を含んでいない。このオリゴヌクレオチドをキナーゼ処理することなく用いて連結の間のポリマー化を防止した。
図６に示したようにＡおよびＢフラグメントをベクター中に連結した後、予想される連結配列をヌクレオチドによって包含される領域のＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００６８】
プラスミドｐＣＩＳ２.８ｃ２８Ｄは、図７に示したように、４部分連結によって構築した。図６からの融合プラスミドをＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断し、４４３ｂｐのフラグメントを単離した。４部分連結の残りの３つのフラグメントは次のフラグメントである：即ち、(１)ｐＳＶＥＦＶＩＩＩＩ(欧州特許公開No.160,457)の１９４４ｂｐ Ｃ１ａＩ−ＢａｍＨＩフラグメント； (２)ｐＳＶＥＦＶＩＩＩＩの２２０２ｂｐ ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩフラグメントであって、これをさらにＰｓｔＩで部分消化し、１７８６ｂｐのＰｓｔＩ−ＸｂａＩフラグメントを単離；および(３)図６由来のｐＣＩＳ２.８ｃ２４Ｄの５８２８ｂｐ ＸｂａＩ−Ｃ１ａＩ ＢＡＰフラグメントである。ｐＣＩＳ２.８ｃ２８Ｄの正確な融合連結領域において得られた変異体の翻訳されたＤＮＡ配列を決定し、図６に示した配列と関係付けた。
【００６９】
Ｂ.３.  ｐＲＫ５の構築
ｐＲＫ５の構築を図８に示す。ｐＲＫ５構築のための出発プラスミドはｐＣＩＳ２.８ｃ２８Ｄである。パラグラフ１〜６中の塩基番号は、ＣＭＶプロモーターの前のＥｃｏＲＩ部位の最初のＴが塩基１であるｐＣＩＳ２.８ｃ２８Ｄを指す。サイトメガロウイルスの初期プロモーターおよびイントロンおよびＳＶ４０起源およびポリＡシグナルは別々のプラスミド上に配置した。
１．サイトメガロウイルスの初期プロモーターを、ｐＣＩＳ２.８ｃ２８Ｄ由来のＥｃｏＲＩフラグメント(９９９９−１２０１)として上記のｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩ部位にクローンした。１２のコロニーを取り、その配向(ｐＵＣ１１８から調製した１本鎖ＤＮＡが１２０１のＥｃｏＲＩ部位から９９９９のＥｃｏＲＩ部位までを配列決定させる)についてスクリーニングした。このクローンをｐＣＭＶＥ／Ｐと命名した。
２．部位指向性の突然変異誘発によってＳＰ６[Green, MR等(Cell, 32：681-694(1983))]プロモーターを挿入するために、ｐＣＭＶＥ／Ｐから1本鎖のＤＮＡを調製した。ＳＰ６プロモーターの−６９から＋５までの配列[Nuc1eic Acids Res., 12：7041(1984)、図１を参照]を含有する合成の１１０ｍｅｒを、ＣＭＶＥ／Ｐ配列に対応するオリゴマーのいずれかの末端の１８ｂｐのフラグメントと共に用いた。突然変異誘発を常法によって行い、ラベルした１１０ｍｅｒを用いて高および低厳格性のもとでスクリーニングした。６つの可能性あるクローンが選択され、配列決定した。ポジティブなクローンを同定し、ｐＣＭＶＥ／ＰＳＰ６と命名した。
【００７０】
３．例えば、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを加え、適切な大きさのＲＮＡを調べることによって、ＳＰ６プロモーターをチェックし、そして活性であることが示された。
４．ｐＵＣ１１８のＣ１ａＩ部位(９１２)からＳｍａＩ部位までの配置をｐＣＭＶＥ／Ｐ(行程１)およびｐＣＭＶＥ／ＰＳＰ６(行程２)中に包含させるためにＣ１ａ−ＮｏｔＩ−Ｓｍａアダプターを合成した。このアダプターをｐＵＣ１１８のＣ１ａＩ−ＳｍａＩ部位に連結し、正しいクローンについてスクリーニングした。このリンカーを両者において配列決定し、クローンをｐＣＭＶＥ／ＰＳＰ６−ＬおよびｐＣＭＶＥ／Ｐ−Ｌと命名した。
５．ｐＣＭＶＥ／ＰＳＰ６−ＬをＳｍａＩ(リンカー／ｐＵＣ１１８連結点)およびＨｉｎｄＩＩＩ(ｐＵＣ１１８中)で切断した。以下に記載するｐＳＶＯＲＡＡΔＲＩ １１由来のＨｐａＩ(５５７３)−ＨｉｎｄＩＩＩ(６１３６)フラグメントをｐＣＭＶＥ／ＰＳＰ６−ＬのＳｍａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ中に挿入した。この連結をスクリーニングし、クローンを単離し、ｐＣＭＶＥ／ＰＳＰ６−Ｌ−ＳＶＯＲＡＡΔＲＩと命名した。
ａ)ＳＶ４０起源およびポリＡシグナルを、ｐＣＩＳ２.８ｃ２８ＤからＸｍｎＩ(５４７５)−ＨｉｎｄＩＩＩ(６１３６)フラグメントとして単離し、ｐＵＣ１１９(VieiraおよびMessing；上記)のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩ部位にクローンした。このクローンをｐＳＶＯＲＡＡとして命名した。
ｂ)５７１６のＥｃｏＲＩ部位をＥｃｏＲＩによる部分消化によって除去し、クレノウで充填した。充填後の自己連結によって得られるコロニーをスクリーニングし、正しいクローンを単離し、ｐＳＶＯＲＡＡΔＲＩ １１と命名した。削除したＥｃｏＲＩ部位を配列決定によってチェックし、正しいものであることがわかった。
ｃ)ｐＳＶＯＲＡＡΔＲＩ １１のＨｐａＩ(５５７３)−ＨｉｎｄＩＩＩ(６１３６)フラグメントを単離し、ｐＣＭＶＥ／ＰＳＰ６−Ｌ(上記の４を参照)中に挿入した。
【００７１】
６．ｐＣＭＶＥ／ＰＳＰ６−Ｌ−ＳＶＯＲＡＡΔＲＩ(行程５)をＥｃｏＲＩにより９９９９のところで切断し、平滑にし、そして自己連結させた。ＥｃｏＲＩ部位を持たないクローンを同定し、ｐＲＫと命名した。
７．ｐＲＫをＳｍａＩおよびＢａｍＨＩで切断した。これをクレノウで充填し、再連結した。このコロニーをスクリーニングした。ポジティブのクローン同定し、ｐＲＫΔＢａｍ／Ｓｍａ３と命名した。
８．コンバーターを用いてｐＲＫＤＢａｍ／Ｓｍａ３のＨｉｎｄＩＩＩ部位をＨｐａＩ部位に変換した(コンバーターは、ある制限部位を別のものに変換する際に用いるＤＮＡ片である；ここでは、一方の末端はＨｉｎｄＩＩＩ接着末端に相補性であり、他方の末端はＨｐａＩの認識部位を有している)。ポジティブのクローンを同定し、ｐＲＫΔＢａｍ，ＨＩＩＩ−ＨｐａＩ１と命名した。
【００７２】
９．ｐＲＫΔＢａｍ，ＨＩＩＩ−ＨｐａＩ１をＰｓｔＩおよびＮｏｔＩで切断し、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩリンカーおよびＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩリンカーをその中に連結した。それぞれのリンカーについてクローンが見い出された。しかし、多すぎるＨｐａＩコンバーターが入っていることもわかった(２またはそれ以上のコンバーターはＰｖｕＩＩ部位を創製する)。従って、これらのクローンはＨｐａＩで切断し、自己連結しなければならなかった。
１０．ＲＩ−ＨＩＩＩクローン３およびＨＩＩＩ−ＲＩクローン５をＨｐａＩで切断し、希釈し、そして自己連結させた。ポジティブを同定した。ＲＩ−ＨＩＩＩクローンをｐＲＫと命名した。
【００７３】
Ｃ．ｐＲＫ５.ｉｂｐ１.１の構築
図９はｐＲＫ５.ｉｂｐ１.１の構築を示すものである。ｐＲＫ５の４７１０ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩフラグメントを単離した。ｐＲＫ５フラグメントを単離した後、ＢＰ５３暗号領域のほぼ全てを含有している９３４ｂｐのＰｆ１ＭＩ／ＰｖｕＩＩフラグメントをｐｉｂｐ.１１８.１から単離した。このフラグメントは、始めにｐｉｂｐ.１１８.１をＢａｍＨＩ(隣接のフラグメントを除去するため)およびＰｖｕＩＩで切断し、次いでＰｆ１ＭＩで消化することによって得た。暗号領域のすぐ３’側のＰｖｕＩＩおよびＰｆ１ＭＩ部位は重なっているので、始めにＰｖｕＩＩで切断するとＰｆ１ＭＩによる次の切断が妨げられ、９３４ｂｐの単離されたフラグメント上に１つの平滑末端を残す。暗号領域の５’末端のＰｆ１ＭＩ切断によって開始コドンＡＴＧが除去されるので、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドｏｉｂｐ.１１を用いて５’末端を再構築した：
EcoRI                             Pf1MI
5'- AATTCCACC ATGCAGCGGG CGCGACCCAC GCT -3'
3' - GGTGG TACGTCGCCC GCGGTGGGTG -5'
これらフラグメントの３部分連結によって発現ベクターｐＲＫ５.ｉｂｐ１.１が得られた。
【００７４】
Ｄ．ヒトＢＰ５３の発現
アデノウイルスＥ１ａｄｎＥ１ｂ(２９３ｓ)で形質転換したヒト胚腎細胞はGraham等[J.Gen.Viro1.,36；59-73(1977)]が開示している。この細胞およびサル腎細胞(ＣＯＳ細胞)を、Gorman[DNA Cloning, D.M Glover,ed.(IRC Press, Oxford,1985),vol.2,PP.143-190]のリン酸カルシウム法により、上記の発現ベクターｐＲＫ５.ｉｂｐ１.１[または、Leung等(上記)が開示している分泌型のヒト成長ホルモン受容体を発現する対照プラスミド]でトランスフェクションした。２４時間後に、この細胞を血清不含の培地に換え、さらに４８時間インキュベートした。次いで、この血清不含の培地をＢＰ５３について検定した(図１０)。
【００７５】
実施例４  ＢＰ５３の検定
ＢＰ５３の放射免疫検定(図１０ａ)は、１：１０,０００の最終希釈で、抗血清Ｒ-７[抗血清Ｒ１-４を生成する同じウサギからの別の血液；MartinおよびBaxter(1985)、上記]を用い、BaxterおよびMartin[J.C1in.lnvest.;上記]の記載のようにして行った。それぞれの検定に添加された放射活性は７６３３ｃｐｍであり、非特異的なバックグラウンドは３４３ｃｐｍであり、１００%の特異的な結合は１７１１ｃｐｍである。結合検定および結合競争検定(図１０ｂ〜図１０ｄ)は、MartinおよびBaxter[J.Bio1.Chem.;上記]の開示のようにして行った。遊離配位子および結合配位子は、１：３００の最終希釈における抗血清Ｒ-７による免疫沈澱によって分離した。添加した放射活性は、約１４,５００ｃｐｍの１２５Ｉ-ＩＧＦ-Ｉ(２００Ｃｉ／ｇ)または６３００ｃｐｍの１２５Ｉ-ＩＧＦ-ＩＩ(８０Ｃｉ／ｇ)であった。スカッチャード分析は、MunsonおよびRodbard[Ana1.Biochem.,107：220-239(1980)]の開示のようにコンピュータープログラムＬＩＧＡＮＤを用いて行った。一時的に発現されたＢＰ５３のスカッチャードデータを図１０ｃおよび図１０ｄに示す。
【００７６】
実施例５  ＩＧＦの結合タンパク質検定
次のプロトコールに従い、ＢＰ５３を用いてＢＰ５３に結合しうるＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩが試料中に存在しているか否かを調べることができる。この検定はいくつかの方法で行うことができる。例えば、ＢＰ５３を９６ウェルの微量滴定プレートに結合させ、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩを含む試料の一部を、一定量の真正ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩとそれに結合したビオチンの存在下で結合ＢＰ５３とインキュベートする。４〜６時間のインキュベートの後、溶液を除き、プレートを洗浄して未結合のＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩを除去する。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したアビジンを加え、インキュベートすると、ＩＧＦ−ビオチンコンジュゲートとのコンプレックスが生成する。もう一度、プレートを洗浄し、ＨＲＰ基質を加える。発色はＩＧＦを含まない試料を含有しているウェルで最も大きい。試料をインキュベートし続けると、ビオチン−ＩＧＦコンジュゲートの結合量は減少し、従って発色は少なくなる。これによって、既知濃度の真正ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ(適当として)を用いて測定することができる用量依存性の応答が得られる。
【００７７】
医薬組成物
ＢＰ５３および所望によるＩＧＦを既知の方法に従って製剤化し、ＢＰ５３(および所望によりＩＧＦ)を薬学的に許容しうる担持担体と混合した薬学的に有用な組成物を製造することができる。適当な担体およびそれらの製剤(血清アルブミンなどの他のヒトタンパク質を含む)は、例えばE.W.Martin[Remington's Pharmaceutica1 Sciences]が開示している。通常、ＢＰ５３は、糖アルコール(例えば、マンニトールまたはソルビトール)、単糖(例えば、グルコース、マンノース、ガラクトースまたはフルクトース)、オリゴ糖(例えば、マルトース、ラクトースまたはスクロース)、およびタンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン)を含む賦形剤の存在下で凍結乾燥されるか、またはリン酸緩衝食塩水中で保存される。
また、上記の賦形剤は水性保存時の不活性化または沈澱化に対するＢＰ５３の安定性に寄与することもでき、自体普通の他の安定化剤と共に用いることもできる。そのような安定化剤には、キレート化剤(例えば、ＥＤＴＡ)、抗酸化剤(例えば、アスコルベートまたはジチオトレイトール)、アミノ酸、およびノニオン性界面活性剤(例えば、ポリエチレングリコールまたはポリエチレンおよびポリプロピレングリコールのブロック共重合体)が含まれる。
【００７８】
ＢＰ５３は、インビボ中に存在する循環または膜結合のＩＧＦに結合させるのに、そして恐らくは上記のようにインビボでのＩＧＦの半減期を長くするのに使用するためにヒトまたは動物に投与される。さらに、哺乳動物の循環系に代謝的に影響を与えるために、ＩＧＦ(好ましくは、ＩＧＦ−Ｉおよび／またはＩＧＦ−ＩＩ)と共にＢＰ５３を投与することもある。また、ＢＰ５３を用いて組織にＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩをさらに効果的に放出させることができる。
治療用のＢＰ５３組成物は、治療学的有効量のＢＰ５３を薬学的に許容しうる担体中に含有しているであろう。用量、担体、選択した投与経路および投与スケジュールは、特に、それぞれが互いに依存し、そして治療しようとする疾患または症状、患者の病歴、および選択したＢＰ５３変異体の活性に依存するであろう。これらの因子は、治療中に治療を行っている医師によって容易に決定され、モニターされる。通常の用量は、上記の因子に依存して、ヒト治療に対しては約５０〜約２００μｇ／ｋｇ、好ましくは８０〜１５０μｇ／ｋｇの範囲内であろう。ＢＰ５３とＩＧＦが一緒に投与されるときには、通常はそれらを等モル量で投与して、ＩＧＦのモル用量が投与されるＢＰ５３のモル用量とほぼ同じになるようにする。
【００７９】
ＢＰ５３の非経口投与のための担体は、滅菌等張水溶液、例えば注射用食塩水または５%デキストロースである。これらの調製物は、鼻内、皮下、静脈内、腹腔内、またはその他の通常の投与経路で注射または注入される。
また、ＢＰ５３を持続放出担体製剤に供してもよい。適当な例には、一定の形状を有する半透過性のポリマーマトリックスが含まれる(例えば、座剤またはマイクロカプセル)。移植しうるか、またはマイクロカプセル性の持続放出マトリックスには、ポリラクチド類[米国特許No.3,773,919, EP58,481]、L−グルタミン酸とγ−エチル−L−グルタメートのコポリマー[U.Sidman等(Biopo1ymers,22(1)：547-556(1983))]、ポリ(２-ヒドロキシエチルメタクリレート) [R.Langer等(J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981))およびR.Langer等(Chem.Tech.,12：98-105(1982))]、エチレン酢酸ビニル[R.Langer等；同上]、あるいはポリ−Ｄ−(―)−３−ヒドロキシ酪酸[EP133,988A]が含まれる。また、持続放出ＢＰ５３組成物にはリポソ一ム封入されたＢＰ５３が含まれる。ＢＰ５３を含有するリポソームは次の自体既知の方法によって製造される：DE3,218,121A;Epstein等[Proc.Nat'1.Acad.Sci.(USA),82：3688-3692(1985)]；Hwang等[Proc.Nat'1.Acad.Sci.(USA),77：4030-4034(1980)]；EP52,322A; EP36,676A; EP88,046A; EP143,949A; EP142,641A；日本特許出願83-118,008；米国特許No.4,485,045および4,544,545;およびEP102,324A。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１Ａ】ＢＰ５３のｃＤＮＡクローンのためのヒト肝臓ライブラリーをスクリーニングするのに用いたオリゴヌクレオチドプローブ配列、ならびに得られたｃＤＮＡ配列との対応を示すものである。
【図１Ｂ】図１Ａの続きである。
【図２】ＢＰ５３ ｃＤＮＡの略図および翻訳されたアミノ酸を示すものである。白の箱は成熟ＢＰ５３をコードしている領域を示し、黒の箱は推定のシグナル配列を示す。ハイドロパシープロットは１０個の残基のウィンドウのKyteおよびDoo1itt1e法[J.Mo1. Bio1.,157：105-132(1982)]によるものである。
【図３Ａ】ｃＤＮＡクローンibp.１１８からのヒトＢＰ５３のヌクレオチド配列および予想アミノ酸配列を示すものである。タンパク質の予想アミノ酸はＤＮＡ配列の下に示し、タンパク質配列のＮ‐末端の第１の残基から番号を付した。負のアミノ酸番号は推定のリーダーシグナル配列またはプレタンパク質を指し、一方、正の番号は成熟タンパク質を指す。配列決定したペプチドの位置は下線で示した。アミノ酸配列決定によって同定または確定されなかった残基は点で示した。
【図３Ｂ】図３Ａの続きである。
【図４Ａ】最終的な発現ベクターを構築するのに用いた出発発現ベクターｐＦ８ＣＩＳの構築を示すものである。
【図４Ｂ】図４Ａの続きである。
【図４Ｃ】図４Ｂの続きである。
【図５】C1aI部位がdamメチル化によって影響を受けない因子ＶＩＩＩの中間ベクターｐＣＩＳ２.８ｃ２４Ｄの構築を示すものである。また、融合プラスミドを構築するための因子ＶＩＩＩ暗号領域の４０８および４１６ｂｐフラグメントのサブクローニングも示されている。
【図６】ｐＵＣベクター中に因子ＶＩＩＩ変異体の融合領域を含有する中間プラスミドｐＵＣ.８ｄ２８の構築を示すものである。
【図７】因子ＶＩＩＩ変異タンパク質をコードしている中間発現ベクターｐＣＩＳ２.８ｃ２８Ｄの構築を示すものである。
【図８Ａ】ＢＰ５３をコードしているＤＮＡが挿入された発現べクターｐＲＫ５の構築を示すものである。
【図８Ｂ】図８Ａの続きである。
【図９】哺乳動物宿主細胞を形質転換してＢＰ５３を製造するために用いる発現ベクターｐＲＫ５.ｉｂｐ１.１の構築を示すものである。
【図１０】哺乳動物細胞におけるＢＰ５３の発現の検定結果を示すものである。図１０ＡはＢＰ５３の放射免疫検定のグラフであり、円、四角、および三角はそれぞれ精製ＢＰ５３の添加(ｎｇ)、ｐＲＫ５.ｉｂｐ１.１トランスフェクションされた培養培地の添加(μｌ)、および対照トランスフェクションされた培養培地の添加(μｌ)を意味する。図１０ＢはラベルしたＩＧＦ-Ｉ(黒記号)またはＩＧＦ-ＩＩ(白記号)へのＢＰ５３の結合を示すグラフであり、円、四角、および三角はそれぞれ精製ＢＰ５３の添加(ｎｇ)、ｐＲＫ５.ｉｂｐ１.１トランスフェクションされた培養培地の添加(μｌ)、および対照、トランスフェクションされた培養培地の添加(μｌ)を意味する。図１０Ｃは、ｐＲＫ５.ｉｂｐ１.１トランスフェクションした培養培地へのラベルしたＩＧＦ-Ｉの結合の未ラベルＩＧＦ-Ｉによる競争検定のグラフである。挿入されているのは同じデータのScatchardプロットである。図１０Ｄは、結合がＩＧＦ-Iに代えてＩＧＦ-ＩＩによるものであることを除き図１０Ｃと同じものを示す。
【図１Ａ】
2004256541.tif 000005
【図１Ｂ】
2004256541.tif 000006
【図２】
2004256541.tif 000007
【図３Ａ】
2004256541.tif 000008
【図３Ｂ】
2004256541.tif 000009
【図４Ａ】
2004256541.tif 000010
【図４Ｂ】
2004256541.tif 000011
【図４Ｃ】
2004256541.tif 000012
【図５】
2004256541.tif 000013
【図６】
2004256541.tif 000014
【図７】
2004256541.tif 000015
【図８Ａ】
2004256541.tif 000016
【図８Ｂ】
2004256541.tif 000017
【図９】
2004256541.tif 000018
【図１０】
2004256541.tif 000019
【配列表】
2004256541000001.app