(57)【要約】      （修正有）【課題】幼苗段階で早期選抜を可能にして、今まで以上に多くの個体を扱うことができ、また育苗コスト（肥料、水、鉢、人件費）を減少させることができ、これにより、抵抗性品種の育成を効率的に行うことのできるＤＮＡマーカーを用いたビワがんしゅ病（Ａ系統菌）抵抗性検定法を提供することにある。【解決手段】特定の塩基配列からなるＤＮＡ、そのＤＮＡの一部を含み、下記の特定配列で表されるビワがんしゅ病抵抗性検定マーカー増幅用プライマー、特定の配列を含みビワがんしゅ病抵抗性検定マーカー増幅用プライマー、下記の特定配列で表されるビワがんしゅ病（Ａ系統菌）抵抗性検定マーカー増幅用プライマー。３．ｔｇｃｇａａｇｇｃｔ  ４．ｇｇｔｇｔｇｇｔｔｃ  ５．ｔｇｇｇａｇｃｔｇａ  ａｔａｇｇａａｔａｃ  ６．ａａａｇａｔｃｇｔｔ  ｔａａｃｃｇｔｔｇｇ【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１のＤＮＡの一部を含み、配列番号３及び配列番号４で表されるビワがんしゅ病（Ａ系統菌）抵抗性検定マーカー増幅用プライマー。
【請求項４】
請求項２のＤＮＡの一部を含み、配列番号５及び配列番号６で表されるビワがんしゅ病（Ａ系統菌）抵抗性検定マーカー増幅用プライマー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、ビワがんしゅ病抵抗性遺伝子と密接に連鎖し，ビワがんしゅ病（Ａ系統菌）抵抗性または罹病性を識別するＤＮＡマーカーを用いたビワがんしゅ病（Ａ系統菌）抵抗性検定法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来の菌接種法にあっては、ビワがんしゅ病抵抗性検定は、２年以上生育させたビワの葉にがんしゅ病菌を接種し、その形成した病斑で抵抗性か罹病性を判定してきた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来の菌接種法にあっては、接種可能なステージまで生育するのに２年以上を要すること、また、接種から判定まで２ヶ月を要すること、接種可能な時期が年２回と限定される等、効率的にビワ育種を行う上で問題点があった。このように、ビワがんしゅ病抵抗性品種育成を行う場合、交配組み合わせで得られた多くの系統を接種試験で判定し、抵抗性の有無を調査しているので多大な労力と時間を要している。
【０００４】
この発明は、上記のような課題に鑑み、その課題を解決すべく創案されたものであって、その目的とするところは、幼苗段階で早期選抜を可能にして、今まで以上に多くの個体を扱うことができ、また育苗コスト（肥料、水、鉢、人件費）を減少させることができ、これにより、抵抗性品種の育成を効率的に行うことのできるＤＮＡマーカーを用いたビワがんしゅ病（Ａ系統菌）抵抗性検定法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
以上の目的を達成するために、請求項１の発明は、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡよりなる。
また、請求項２の発明は、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡよりなる。
また、請求項３の発明は、請求項１のＤＮＡの一部を含み、配列番号３及び配列番号４で表されるビワがんしゅ病（Ａ系統菌）抵抗性検定マーカー増幅用プライマーよりなる。
また、請求項４の発明は、請求項２のＤＮＡの一部を含み、配列番号５及び配列番号６で表されるビワがんしゅ病（Ａ系統菌）抵抗性検定マーカー増幅用プライマーよりなる。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明のビワがんしゅ病（Ａ系統菌）抵抗性検定法は、従来の接種検定方法と異なり、抵抗性と罹病性の違いに伴って生じるビワ間のＤＮＡ配列の差異に基づいて抵抗性の識別を行う方法である。
【０００７】
陽玉（罹病性）×７４−１７３７（抵抗性）を交配し、抵抗性と罹病性に分離する８９個体の交配実生集団を得た。接種検定で抵抗性と罹病性のグループに分類し、そのグループのＤＮＡから約３０００種類のＲＡＰＤプライマーを用いてＰＣＲ機器でＤＮＡを増幅させた。両グループ間で増幅パターンが違うＲＡＰＤプライマーの探索を行ったところ、ＡＹ０２（５’−ｔｇｃｇａａｇｇｃｔ−３’）（配列番号３）とＡＹ１６（５’−ｇｇｔｇｔｇｇｔｔｃ−３’）（配列番号４）の２種類のプライマーを組み合わせて用いたＰＣＲ反応の場合のみががんしゅ病（Ａ系統菌）抵抗性遺伝子と強く連鎖していることがわかった（表１）。
【０００８】
【表１】
2004229571.tif 000002
【０００９】
発見されたＤＮＡマーカーの塩基配列情報を解読したところ、このマーカーは両端にＡＹ０２（５’−ｔｇｃｇａａｇｇｃｔ−３’）とＡＹ１６（５’−ｇｇｔｇｔｇｇｔｔｃ−３’）の塩基配列（表２）を持つ８５７ｂｐからなる塩基であった（配列番号１）。この塩基配列をもとに２０塩基のＳＴＳプライマー、すなわちＳＴＳ−０２（５’−ｔｇｇｇａｇｃｔｇａａｔａｇｇａａｔａｃ−３’）（配列番号５）及びＳＴＳ−１６（５’−ａａａｇａｔｃｇｔｔｔａａｃｃｇｔｔｇｇ−３’）（配列番号６）を設計、合成した。上記の８９個体を設計したＳＴＳプライマーのＳＴＳ−０２（５’−ｔｇｇｇａｇｃｔｇａａｔａｇｇａａｔａｃ−３’）及びＳＴＳ−１６（５’−ａａａｇａｔｃｇｔｔｔａａｃｃｇｔｔｇｇ−３’）を用いて検定した結果、ＲＡＰＤプライマーとＳＴＳプライマーの抵抗性検定結果は全て同じであった（図１）。これらのことからＲＡＰＤマーカーよりも信頼性の高い、ＳＴＳマーカーに置換することができた。
【００１０】
【表２】
2004229571.tif 000003
【００１１】
果樹試験場で遺伝資源として保存している多くの品種を用いてビワがんしゅ病（Ａ系統菌）抵抗性検定をＳＴＳマーカーにより行った結果、ほとんどの品種で接種検定と同じ結果になった（表３）。これらのことから交配育種におけるビワがんしゅ病（Ａ系統菌）抵抗性系統の選抜にこのＤＮＡマーカーを用いた選抜技術の有効性が確認された。
【００１２】
【表３】
2004229571.tif 000004
【００１３】
【実施例】
（１）ビワの葉からのＤＮＡ抽出
ビワの葉０．２ｇからＣＴＡＢ法を用いてＤＮＡを抽出した。抽出に用いたビワは長崎県果樹試験場で遺伝資源として保有している３２品種を供試した。
【００１４】
（２）ＲＡＰＤ法による抵抗性マーカーの探索
上記より抽出したＤＮＡ１０ｎｇを鋳型とし、ＡＹ０２（５’−ｔｇｃｇａａｇｇｃｔ−３’）とＡＹ１６（  ５’−ｇｇｔｇｔｇｇｔｔｃ−３’）を用いてＰＣＲを行った。すなわち、ＰＣＲは２０μｌ反応液で行い、１０ｎｇテンプレートＤＮＡ、ｌ０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１  ｕｎｉｔ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）、２００μＭ  ｄＮＴＰｓおよび２０μＭプライマーを添加した。ＰＣＲの反応条件は始めに９３℃で１分間の熱変性を行った。続いて９３℃で２０秒の熱変性、３７℃で２０秒のアニーリング、７２℃で１分間の伸長反応を４５サイクル行い、さらに７２℃で１０分間の伸長反応を行った。なお、温度設定にはヒートブロック式のプログラム温度制御装置ＰＣＲ  Ｔｈｅｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（宝酒造製）を用いた。得られたＰＣＲ産物は１．５％アガロースゲルを用いてＴＡＥ緩衝液中で電気泳動を行った後、エチジウムブロマイドで染色を行った。紫外線光下においてポラロイドフィルムで撮影後、増幅断片を検出した。
【００１５】
（３）がんしゅ病抵抗性マーカーのクローニング
ＡＹ０２＋ＡＹ１６プライマーを用いて増幅させた約８００ｂｐのバンド（配列番号１）は１．５％アガロースゲルで分離した。目的のバンドをＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（キアゲン）により、分離精製し、インビトロゲンの方法の手順に従い、ｐＣＲ２．１ベクターに組み込んだ。組換えたＤＮＡ断片の塩基配列はＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ    Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、シークエンス反応を行った後にＰＲＩＳＭ  ３７７  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて解析した。解析した塩基配列は表２に示した。
【００１６】
（４）ＰＣＲ法によるがんしゅ病抵抗性識別
得られた塩基配列をもとにＯｌｉｇｏ  ｖｅｒ．６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．）を用いて設計した。すなわちＳＴＳ−０２（５’−ｔｇｇｇａｇｃｔｇａａｔａｇｇａａｔａｃ−３’）（配列番号５）及びＳＴＳ−１６（５’−ａａａｇａｔｃｇｔｔｔａａｃｃｇｔｔｇｇ−３’）（配列番号６）を合成した。一方、被検ビワ葉の０．２ｇを乳鉢に移し、摩砕した後、ＣＴＡＢ法によりＤＮＡを抽出した。抽出に用いたビワは表３の通りである。抽出したＤＮＡを鋳型にＳＴＳ−０２及びＳＴＳ−１６プライマーを用いたＰＣＲ反応により目的ＤＮＡを増幅した（配列番号２）。すなわち反応は２０μｌ反応液で行い、１０ｎｇ鋳型ＤＮＡ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．）、  ５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１  ｕｎｉｔ  Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）、２００μＭ  ｄＮＴＰｓおよび２０μＭプライマーを添加した。ＰＣＲの各サイクルは９３℃で１分間の熱変性、続いて９３℃で１分間の熱変性、５５℃で１分間のアニーリング、７２℃で２分間の伸長反応を３５サイクル行い、さらに７２℃で１０分間の伸長反応を行った。得られたＰＣＲ産物は１．５％アガロースゲルを用いてＴＡＥ緩衝液中で電気泳動を行った後、エチジウムブロマイドで染色を行った。ポラロイドフィルムで撮影後、バンドの観察を行った。
上記の８９個体をＳＴＳプライマーを用いて検定した結果、ＲＡＰＤプライマーとＳＴＳプライマーの抵抗性検定結果は全て同じであった（図１）。これらのことからＲＡＰＤマーカーよりも信頼性の高い、ＳＴＳマーカーに置換することができた。以上のことから、ＰＣＲ法による本発明のがんしゅ病（Ａ系統菌）抵抗性識別マーカーの解析に基づいてビワのがんしゅ病（Ａ系統菌）抵抗性の判定を行うことができると判明した。
【００１７】
【発明の効果】
以上の記載より明らかなように、この発明によれば、遺伝資源として保有している多くの品種交配実生集団のビワがんしゅ病（Ａ系統菌）抵抗性の有無の判定が、ＤＮＡマーカーを用いて可能となった。これにより、接種試験と比較して迅速化かつ労力の省力化となり、育種効率を高めることができ、抵抗性新品種の育成を効率化することができる。
【００１８】
【配列表】
2004229571.tif 000005
2004229571.tif 000006
2004229571.tif 000007
【００１９】
【配列表フリーテキスト】
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明のがんしゅ病抵抗性と２種類のＤＮＡマーカーの関係を示す図である。
【図１】
2004229571.tif 000008