(57)【要約】【課題】消化器癌、肺癌、大腸癌等の肝転移を防ぎ、肝癌に対して効果があり、かつ経口的に投与し得と共に、長期間の持続的な投与が可能な癌の転移抑制剤、殊に癌の肝臓への転移を効果的に抑制する肝転移抑制剤を提供すること。【解決手段】イソロイシンを有効成分とする癌転移抑制剤であり、特にイソロイシンを有効成分とする癌の肝転移を抑制する癌肝転移抑制剤である。また、本発明の癌転移抑制剤は、肝臓への癌の転移を効果的に抑制する点で優れたものであり、安全であり、しかも低コストで癌転移を予防し得る点から、その医療上の価値は多大なものである。【選択図】          図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソロイシンを有効成分とする癌転移抑制剤。
【請求項２】
イソロイシンを有効成分とする癌の肝転移を抑制する請求項１に記載の癌転移抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、癌の転移を抑制する癌転移抑制剤に係り、特に癌の肝への転移を効果的に抑制する癌転移抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
肺癌、胃癌、その他の固形癌は、胸腔、腹腔内臓器（例えば、肺臓、胃、肝臓、大腸、結腸等）の主たる癌腫であり、これらの癌の治療には、外科的手術、化学療法、放射線療法、免疫学的療法等、あるいはこれらを組合せた種々の治療法が行われている。
【０００３】
それらのなかでも、化学療法によって癌の治療を行おうとする試みについては、これまで数多くの抗癌剤あるいは制癌剤が開発されてきており、化学療法のみによる治療としての抗癌剤、あるいは術後の再発を抑える制癌剤が多く使用されてきている。しかしながら、その効果は不十分なものであり、また薬剤が有する強い副作用のために、患者のＱＯＬを損なうといった問題もある。
【０００４】
したがって、癌治療法の主流は依然として原発癌腫を切除する外科的手術であり、それと共に術後の再発を抑える化学療法の併用が行われているのが現状である。ところで、近年の外科的手術の進歩はめざましいものがあり、原発癌の治癒率は著しく向上してきている。しかしながら、肉眼的には検知不可能であって、見かけ上は根治したように見える場合であっても、ごく少量取り残した癌細胞による癌の再発、あるいは手術中または手術後の他臓器への転移を完全に防止することは困難であり、手術後の再発、転移がかなりの高率で認められている。
【０００５】
そのなかでも、癌患者における癌の進行、および外科的手術に伴う肝臓への癌の転移に対する有効な化学療法は全く無く、抗腫瘍剤、例えば５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、エピアドリアマイシン等、あるいはマイトマイシンＣ、ドキソルビシン等の制癌剤の投与による補助療法に依存しているのが現状である。
【０００６】
癌の根治のためには、原発部位を切除、治癒するだけでなく、特に消化器癌、肺癌の肝転移を防ぐことが重要であり、癌の肝転移抑制に効果を示す薬剤の開発が望まれている。また、肝癌自体は、転移したものであっても、原発性のものであってもいずれも治癒し難いものであり、したがってこれらに対して効果があり、かつ経口的に投与し得と共に、長期間の持続的な投与が可能な薬剤の開発が求められている。
【０００７】
そのような薬剤として、これまでにいくつかの化合物について、癌の肝転移抑制効果が検討され、例えば、ある種のＡｒａ−Ｃ誘導体（特許文献１）あるいはサポニン誘導体（特許文献２）等が提供されているが、いまだ十分な効果を有するものではなく、さらに有効な癌の肝転移抑制剤の開発が望まれている。
【０００８】
【特許文献１】
特開平６−１０７５４８号公報
【特許文献２】
特開２００１−３９９９８号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
したがって本発明は、かかる現状を鑑み、より有効な癌の転移抑制剤、殊に癌の肝臓への転移を効果的に抑制する肝転移抑制剤を提供することを課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
そのための上記した課題を解決する本発明は、イソロイシンを有効成分とする癌転移抑制剤である。また、特にイソロイシンを有効成分とする癌の肝転移を抑制する癌転移抑制剤である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
すなわち本発明者等は、必須アミノ酸の中でも分岐鎖アミノ酸であるバリン、ロイシン、イソロイシンの３種についてその特異的作用効果を検討しているなかで、イソロイシンに特異的な癌転移抑制効果があることを新規に見出し、本発明を完成したのである。
【００１２】
本発明が提供する癌の転移抑制剤、特に癌肝転移抑制剤および肝癌の治療剤を用いる場合には、イソロイシン単独、あるいは他の賦形剤または担体と混合し、経口剤として投与することができる。賦形剤としては、製剤学的に許容されているものが選択され、その種類や組成は、投与経路、投与方法により決定することができる。
【００１３】
例えば、溶液の担体としては、水、アルコール類、または大豆油、ゴマ油、ピーナツ油、ミネラル油等の植物性あるいは合成油等が挙げられ、例えば、ゼラチンカプセルによる軟カプセル剤として製剤化することができる。
【００１４】
また、固体担体としては、乳糖、白糖、デンプン、デキストリン、結晶セルロース、ヒドロキシセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム等を挙げることができる。これらの固体担体と共に、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、粉剤、ドライシロップ剤等の形態として製剤化することができる。
【００１５】
本発明が提供する癌の転移抑制剤、特に癌肝転移抑制剤および肝癌の治療剤としての有効成分であるイソロイシンの投与量は、一概に限定できず、患者の年齢、体重、症状、治療目的等により決定することができる。イソロイシンは、必須アミノ酸として既にその安全性が確保されていることより、その一般的な治療量は、経口投与で、５００〜１５００ｍｇ／人／１回程度とすることができる。
【００１６】
以下に、本発明の癌転移抑制剤の薬理作用を、実験例により示す。
実験例１：マウス大腸癌Ｃｏｌｏｎ２６の肝臓への転移抑制効果
【００１７】
［方法］
マウスの脾臓内に癌細胞を移植すると、選択的に肝臓に転移巣が形成される。したがって、このモデルを用いて、肝転移の抑制を目的とした種々の治療実験を行うことができる。
すなわち、６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ系雄性マウスを用い、マウスに対して０．２ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に溶解したイソロイシン３ｍｇ、または陰性コントロールとして０．２ｍｌのＰＢＳを１５日後に屠殺するまで、連日、経口投与した。投与開始後第３日目に、５×１０５個のＣｏｌｏｎ２６細胞（０．１ｍｌのＰＢＳに溶解）を、麻酔下開腹下に脾臓に注入した。Ｃｏｌｏｎ２６細胞を注入後１２日後（試験開始後１５日目）に再び開腹し、肝転移の有無を観察した。また、転移が認められたばあいには、肝重量が増大するため、同時に肝重量を測定した。
【００１８】
［結果］
癌の肝転移が認められたマウスの肝臓は著明に肥大することから、これらの試験によるマウスの摘出肝臓の状況を、写真として図１に示した。また、未処理マウス、イソロイシン投与マウスならびＰＢＳ投与マウスの摘出肝臓の重量比較を図２に示した。
【００１９】
図から判明するように、陰性コントロール群（１群４匹）としてのＰＢＳ投与群では、全例に肝への移転を認め、肝は著明に腫大しているのが観察される。また、肝重量は、未処理マウス（１群６匹）と比較して、２倍から３倍に有意に増加していた。
一方、イソロイシン投与群（１群６匹）では、肝転移率は５０％であり、肝重量も転移の無かったマウスでは、未処理マウスと同等であった。
以上の結果から、本発明の有効成分であるイソロイシンは、癌の肝への転移を有効に抑制していることが理解される。
【００２０】
実験例２：血管増殖因子（ＶＥＧＦ：Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）に対するイソロイシンの効果
［方法］
癌細胞（腫瘍）は、特異的に新生血管を増殖させることが知られている。したがって、この腫瘍が産生する血管増殖因子（ＶＥＧＦ）に対するイソロイシンの効果を検討するために、肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２またはＳＫ−Ｈｅｐ１）をイソロイシンの存在下で培養し、ＶＥＧＦ濃度を検討した。
なお、比較のため分岐鎖必須アミノ酸であるロイシンの存在下での培養も検討した。
【００２１】
すなわち、肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２またはＳＫ−Ｈｅｐ１）を９６穴ｆｌａｔ  ｂｏｔｔｏｍ  ｐｌａｔｅにて培養し、細胞が密集群成長になった時点（すなわち、ｃｏｎｆｌｕｅｎｔになった時点）で培養液のみ、あるいは各濃度のイソロイシンまたはロイシンを添加し、さらに４８時間培養した。培養上清液を採取し、ＥＬＩＳＡ法にて上清液中のＶＥＧＦ濃度を測定した。同時に、培養後の細胞を用いて、イソロイシンまたはロイシンの肝細胞株（ＨｅｐＧ２またはＳＫ−Ｈｅｐ１）に対する直接的な細胞障害を、ＭＴＴ法［３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｅ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｅｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ法］にて確認した。
【００２２】
［結果］
使用した肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２またはＳＫ−Ｈｅｐ１）において、イソロイシンまたはロイシンを添加し培養した場合におけるＶＥＧＦ（血管増殖因子）の産生の結果を、図３〜５に示した。
図３は肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２）を用いた場合の結果を示し、図４は同様肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２）を用いた場合であって、上清液サンプルを希釈した後のＥＬＩＳＡ法による結果を示し、図５は肝癌細胞株（ＳＫ−Ｈｅｐ１）を用いた場合の結果を示した。
【００２３】
図３〜５の結果からも判明するように、使用した肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２またはＳＫ−Ｈｅｐ１）では、培養上清液中において、腫瘍細胞が産生するＶＥＧＦ（血管増殖因子）の濃度は、イソロイシンの添加濃度に依存して低下していた。一方、ロイシンの添加により培養上清液中のＶＥＧＦ濃度には、変化は認められなかった。
これらの結果から判断すると、イソロイシンの添加は、腫瘍（癌細胞）が産生するＶＥＧＦ（血管増殖因子）の濃度を低下させるものであり、したがって、イソロイシンには、癌転移を抑制する効果があると共に、新生血管増殖抑制効果も認められることが判明する。
なお、同時に、肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２またはＳＫ−Ｈｅｐ１）を用いて実施したＭＴＴ法による解析では、イソロイシンおよびロイシンともに細胞の生存を変化させていなかった。
特に、ＨｅｐＧ２、ＳＫ−Ｈｅｐ１細胞とも、イソロイシン１０００ｕｇ／ｍｌまで、ＭＴＴ法による細胞数の評価に対してほとんど影響を与えなかった。
【００２４】
実験例３：イソロイシン投与による免疫細胞の変動の確認
［方法］
生体の免疫的な防御機構として、生体内に異物の侵入等の危険性が生じた場合には、デフェンシンなどいくつかのタイプの抗菌ペプチドが上皮細胞表面において産生され、この抗菌ペプチドが内因性免疫（ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）のエフェクターとして作用していることが知られている。このような生体内抗菌ペプチドの分泌が、イソロイシンの投与により促進されることが確認されている。
そこで、３日間連続でイソロイシンまたはＰＢＳをマウスに投与し、屠殺後、肝臓および脾臓を摘出して、リンパ球を分離し、肝および脾におけるリンパ球のｐｏｐｕｌａｔｉｏｎを検討し、併せてＹａｃ−１細胞に対するＮＫ細胞障害活性（ナチュラルキラー細胞障害活性）またはＣｏｌｏｎ２６に対する細胞障害活性を検討した。また、同時に、得られたリンパ球をｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ＣＤ３固相化９６穴ｆｌａｔ  ｐｌａｔｅで４８時間培養後、培養上清液を用いて産生されるサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−２）をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００２５】
［結果］
肝臓および脾臓内リンパ球の個体群は、イソロイシン投与群、非投与群（ＰＢＳ投与群）共に有意な変化は認められなかった。また、Ｙａｃ−１細胞およびＣｏｌｏｎ２６に対する細胞障害活性は、イソロイシン投与群、非投与群（ＰＢＳ投与群）で有意な差は認められなかった。
【００２６】
以上の各試験の結果から、本発明の有効成分であるイソロイシンは、マウス大腸癌Ｃｏｌｏｎ２６を用いた肝転移マウスモデルにおいて、有意に肝転移を抑制していることが理解される。本発明の有効成分であるイソロイシンには、肝臓内のリンパ球を中心とした免疫細胞に対しては、直接的影響は認められないが、その作用機序の一つとして、イソロイシンには癌細胞に対する直接的な細胞障害性活性ではなく、ＶＥＧＦ（血管増殖因子）の産生を直接抑えることによるものであると考えられる。
【００２７】
【実施例】
以下に本発明の癌転移抑制剤の製剤例を示す。
製剤例：顆粒剤
組成：
イソロイシン                                          ３０ｇ
乳糖                                              １３４０ｇ
結晶セルロース                                      ２００ｇ
トウモロコシ澱粉                                    ２００ｇ
３％ヒドロキシプロピルメチルセルロース水溶液      １０００ｍｌ
ステアリン酸マグネシウム                              ３０ｇ
【００２８】
製法：
イソロイシンに乳糖、結晶セルロースおよびトウモロコシ澱粉を６０メッシュのふるいで篩化し、均一に混合した後、練合機に入れ、３％ヒドロキシプロピルメチルセルロース水溶液を注加して、さらに練合した。次いで１６メッシュのふるいで篩化し、造粒を行い、５０℃で通風乾燥した。乾燥後、造粒をおこない顆粒剤を得た。
【００２９】
【発明の効果】
以上記載のように、本発明により、イソロイシンを有効成分とする癌転移抑制剤、特にイソロイシンを有効成分とする癌の肝転移を抑制する癌転移抑制剤が提供される。肝癌自体は、転移したものであっても、原発性のものであってもいずれも治癒し難いものであることからみれば、本発明の癌転移抑制剤は、肝臓への癌の転移を効果的に抑制する点で優れたものであり、安全であり、しかも低コストで癌転移を予防し得る点から、その医療上の価値は多大なものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実験例１におけるマウス大腸癌Ｃｏｌｏｎ２６の肝臓への転移抑制効果確認試験における、マウスの摘出肝臓の状況を示す写真である。
【図２】図２は、実験例１におけるマウス大腸癌Ｃｏｌｏｎ２６の肝臓への転移抑制効果確認試験における未処理マウス、イソロイシン投与マウスならびＰＢＳ投与マウスの摘出肝臓の重量比較を示したグラフである。
【図３】図３は、実験例２における血管増殖因子（ＶＥＧＦ）に対するイソロイシンの効果を示すグラフであり、肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２）を用いた場合の結果を示した。
【図４】図４は、実験例２における血管増殖因子（ＶＥＧＦ）に対するイソロイシンの効果を示すグラフであり、肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２）を用いた場合であって、上清液サンプルを希釈した後のＥＬＩＳＡ法による結果を示した。
【図５】図５は、実験例２における血管増殖因子（ＶＥＧＦ）に対するイソロイシンの効果を示すグラフであり、肝癌細胞株（ＳＫ−Ｈｅｐ１）を用いた場合の結果を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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