(57)【要約】      （修正有）【課題】造血幹細胞の活性化の指標として有用な細胞表面マーカーの提供。【解決手段】造血幹細胞の細胞表面に発現するＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）を分析することにより、造血幹細胞が活性化しているか否かを判定できることを見出した。すなわち、造血幹細胞の活性化をＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）の発現を分析することにより判定できる。一方、抗癌剤による骨髄毒性発現に先立って造血幹細胞が活性化することが知られている。したがって、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）を発現している造血幹細胞の割合を算出することにより、骨髄毒性発現を予測し、より適正に抗癌剤を使用する方法が提供可能となった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血幹細胞に発現するＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）を指標として、造血幹細胞が活性化しているか否かを判定する方法。
【請求項２】
造血幹細胞に発現するＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）を指標として用いることを特徴とする、骨髄毒性の評価方法および／または骨髄毒性の予測方法。
【請求項３】
造血幹細胞に発現するＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）を指標として用いることを特徴とする、癌化学療法剤による、骨髄毒性の評価方法および／または骨髄毒性の予測方法。
【請求項４】
造血幹細胞に発現するＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）を指標として用いることを特徴とする、癌化学療法剤による末梢血白血球数減少の予測方法。
【請求項５】
造血幹細胞に発現するＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）を指標として用いることを特徴とする、癌化学療法剤の骨髄毒性の予防方法。
【請求項６】
造血幹細胞に発現するＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）を指標として用いて輸血方法を決定することを特徴とする、癌化学療法剤の骨髄毒性の予防方法。
【請求項７】
造血幹細胞に発現するＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）を指標として用いて癌化学療法剤の投与方法および／または投与期間を決定することを特徴とする、癌化学療法剤の骨髄毒性の予防方法。
【請求項８】
造血幹細胞が、ヒト造血幹細胞である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
セルソーターまたはフローサイトメーターで造血幹細胞に発現するＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）を分析する、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか１に記載の方法で使用する、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）分析用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、造血幹細胞が活性化しているか否かの指標となる細胞表面マーカーに関する。更に、その細胞表面マーカーを分析することによる癌化学療法剤の骨髄毒性を予測する方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
造血幹細胞は、赤血球、白血球、血小板、Ｔリンパ球及びＢリンパ球などの全ての成熟血球細胞へ分化する能力（多分化能）とともに、細胞分裂により自己と同じ能力を持った細胞を複製する能力（自己複製能）を併せ持つ細胞である（非特許文献１）。
【０００３】
細胞表面上の発現マーカーを指標とした場合、マウスでは、分化抗原マーカー（Ｌｉｎ）陰性または弱陽性で、ｃ−Ｋｉｔ（ｃ−ｋｉｔと記述される場合もある）陽性およびＳｃａ―１陽性である細胞群に造血幹細胞が含まれている（非特許文献２）。一方、ヒトでは、Ｌｉｎ陰性あるいは弱陽性でＣＤ３４陽性との表現型を示す細胞群に造血幹細胞が含まれている（非特許文献３）とされている。分化抗原マーカーは系統特異的抗原（Ｌｉｎｅａｇｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ）とも呼称され、たとえば、マウスでは、赤血球マーカーであるＴｅｒ１１９、顆粒球マーカーであるＧｒ−１などが知られている（非特許文献４）。
【０００４】
これらの細胞表面マーカーにより分離された細胞群は、単一な細胞群ではなく、様々な性質を有する細胞が含まれている細胞集団である。造血幹細胞はこの中に含まれている一部の細胞群であると考えられている（非特許文献１）。造血幹細胞は、通常生体内においては、細胞分裂をしない休止（ｒｅｓｔｉｎｇ）状態にあるが、インビトロで、サイトカインの刺激や５−フルオロウラシル（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ、５−ＦＵ）処理により活性化する（非特許文献５）。活性化はリバーシブル（可逆的）な状態と考えられていて、休止状態の造血幹細胞に戻ることもある（非特許文献５）。また、自己複製能を失い、造血前駆細胞へ分化もするが、その詳しい分子機序は明らかではない。造血前駆細胞は、長期にわたる骨髄再構築能という造血幹細胞としての性質を失っており、造血幹細胞とは全く性質の異なる細胞群である（非特許文献６）。
【０００５】
抗癌剤による化学療法は、重要な癌の治療方法の一つである。しかしながら、抗癌剤（癌化学療法剤）による治療において、抗癌剤が癌細胞のみならず骨髄の細胞にも殺作用を示すことから、長期の癌化学療法では、末梢血の白血球数が減少し、免疫能が低下するという副作用がしばしば観察され、問題となっている。抗癌剤の副作用である白血球数減少の程度を予測することが出来れば、適確に輸血を行ったり抗癌剤の投与量や投与間隔をコントロールしたりすることが可能となり、副作用の発現を予防し、さらに安全に抗癌剤を使用することができると考えられている。
【０００６】
一般に、抗癌剤による末梢血白血球数の減少に先立ち、造血前駆細胞数の減少が観察され、これを補うために造血幹細胞が活性化することが知られている（非特許文献７、非特許文献８）。
【０００７】
以上の知見に基づき、本発明者は、抗癌剤の投与により活性化した造血幹細胞の数あるいは比率が明らかになれば、それに引き続いておこる骨髄毒性や白血球数の減少を予測することができると考える。
【０００８】
骨髄毒性や白血球数が減少することが予測できれば、前もっての輸血によりこれらの副作用を軽減させることも可能になると考える。
【０００９】
また、実際に白血球数が減少し、重篤な副作用が観察されるより前に、癌化学療法剤の投与量を減らしたり、投与間隔を空けたりすることが可能となり、副作用の発現頻度の減少や程度の軽減ができるようになると考える。
【００１０】
すなわち、投与量や投与期間を適正にコントロールし、より安全に癌化学療法剤を使用することができるようになると考える。
【００１１】
【非特許文献１】大沢匡毅、他３名，「実験医学」，１９９９年，第１７巻，第９号，ｐ．１０４８−１０５５
【非特許文献２】オカダ（Ｏｋａｄａ  Ｓ）ら，「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」，１９９２年，第８０巻，ｐ．３０４４−３０５０
【非特許文献３】バーティア（Ｂｈａｔｉａ  Ｍ）ら，「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）」，１９９７年，第９４巻，ｐ．５３２０−５３２５
【非特許文献４】ランダールとワイズマン（Ｒａｎｄａｌｌ  Ｔ．＆Ｗｅｉｓｓｍａｎ  Ｉ．），「ステム・セルズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ）」，１９９８年，第１６巻，ｐ．３８−４８
【非特許文献５】グーデル（Ｇｏｏｄｅｌ，  Ｍ．），「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」，１９９９年，第９４巻，ｐ．２５４５−２５４７
【非特許文献６】コンドウ（Ｋｏｎｄｏ  Ｍ．）ら，「セル（Ｃｅｌｌ）」，１９９７年，第９１巻，ｐ．６６１−６７２
【非特許文献７】ヴェトヴィッカ（Ｖｅｔｖｉｃｋａ  Ｖ．）ら，「ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）」，１９８６年，第１３７巻，ｐ．２４０５−２４１０
【非特許文献８】ハリソンとレーナー（Ｈａｒｒｉｓｏｎ  Ｄ．＆Ｌｅｒｎｅｒ  Ｃ．），「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」，１９９１年，第７８巻，ｐ．１２３７−１２４０
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、造血幹細胞の活性化の指標として有用な細胞表面マーカーを提供することである。さらに、癌化学療法剤の骨髄毒性を予測する方法等を提供することである。
【００１３】
【課題解決のための手段】
上記課題を解決するために、本発明者は、造血幹細胞において各種細胞表面マーカーの発現を検討した結果、驚くべきことに、ＣＤ１３５とも称されるＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３が造血幹細胞活性化の指標として使用可能であることを見出し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は、
造血幹細胞に発現するＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）を指標として、造血幹細胞が活性化しているか否かを判定する方法、
に関する。
【００１５】
また、本発明は、
造血幹細胞に発現するＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）を指標として用いることを特徴とする、骨髄毒性の評価方法および／または骨髄毒性の予測方法、
さらに、
造血幹細胞に発現するＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）を指標として用いることを特徴とする、癌化学療法剤による、骨髄毒性の評価方法および／または骨髄毒性の予測方法、
あるいは、
造血幹細胞に発現するＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）を指標として用いることを特徴とする、癌化学療法剤による末梢血白血球数の減少の予測方法、
に関する。
【００１６】
および、本発明は、
造血幹細胞に発現するＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）を指標として用いることを特徴とする、癌化学療法剤の骨髄毒性を予防する方法、
また、
造血幹細胞に発現するＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）を指標として用いて輸血方法を決定することを特徴とする、癌化学療法剤の骨髄毒性の予防方法、
さらに、
造血幹細胞に発現するＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）を指標として癌化学療法剤の投与方法および／または投与期間を決定することを特徴とする、癌化学療法剤の骨髄毒性の予防方法、
に関する。
【００１７】
あるいは、本発明は、
造血幹細胞が、ヒト造血幹細胞である、上記のいずれかに記載の方法、
および、
セルソーターまたはフローサイトメーターで造血幹細胞に発現するＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）を分析する、上記のいずれかに記載の方法、
また、
上記のいずれかの方法で使用する、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）分析用キット、
に関する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
造血幹細胞は、前述したように、自己複製能を有し、さらに、全ての血球系の細胞に分化することができる細胞である（非特許文献1）。造血幹細胞であることは、実験的に長期にわたる骨髄再構築能があることで示される（非特許文献１）。本明細書の実施例においては、致死量の放射線を照射したマウスで長期(６ヶ月)にわたりドナー由来の血球系細胞の生存が観察される場合に、造血幹細胞であると判断した。本発明は、自己複製能と多分化能などの造血幹細胞の基本的な性質を有する限り、本実施例に限定されるものではなく、全ての造血幹細胞を対象とするものである。
【００１９】
簡便には、造血幹細胞は、骨髄、末梢血、臍帯血等を、複数の細胞表面マーカーをみ合わせて分析し、分離することにより、同定、採取することができる。このようなマーカーの例としては、マウスではＬｉｎ、Ｓｃａ−１、ｃ−ｋｉｔ、ヒトではＬｉｎ、ＣＤ３４が挙げられる。言うまでもなく、造血幹細胞の同定に用いることができる細胞表面マーカーはこれらに限られるものではない。
【００２０】
本発明においては、血液、特に、骨髄や末梢血から取得した造血幹細胞を好適に用いることができる。これらの生体材料から、フローサイトメーター等の細胞分離装置と前記の細胞表面マーカーを特異的に認識する抗体を用いて、造血幹細胞を同定、採取すればよい。例えば、マウスについては、Ｌｉｎ陰性または弱陽性であって、Ｓｃａ−１陽性であり、さらにｃ−ｋｉｔ陽性である細胞群に造血幹細胞が存在する。ヒトの場合はＬｉｎ陰性または弱陽性でＣＤ３４陽性である細胞群を造血幹細胞と同定できる。
【００２１】
胎児肝キナーゼ２（ｆｅｔａｌ  ｌｉｖｅｒ  ｋｉｎａｓｅ―２、Ｆｌｋ−２）／フムス様チロシンキナーゼ３（ｆｍｓ−ｌｉｋｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ  ３、Ｆｌｔ３）はＣＤ１３５と同一の分子であり、マクロファージコロニー刺激因子受容体（Ｍ−ＣＳＦ受容体）や血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦ受容体）と同じく３型チロシンキナーゼ受容体に属し、初期造血に関与することが知られている（ザイグラー（Ｚｅｉｇｌｅｒ）ら，「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」，１９９４年，第８４巻，ｐ．２４２２−２４３０）。マウス成体の骨髄に局在する造血幹細胞ではＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３は発現していない（アドルフソン（Ａｄｏｌｆｓｏｎ）ら，「イムニティー（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」，２００１年，第１５巻，p．６５９−６６９、クリステンセンとワイスマン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  Ｊ．＆Ｗｅｉｓｓｍａｎ  Ｉ．），「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）」，２００１年，第９８巻，ｐ．１４５４１−１４５４６）。一方、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３のリガンドは造血前駆細胞を強く刺激してその数を増加させる（ライマン（Ｌｙｍａｎ）ら，「セル（Ｃｅｌｌ）」，１９９３年，第７５巻，ｐ．１５５７−１１６７）。
【００２２】
骨髄細胞については、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３を細胞表面に発現している細胞には自己増殖能がなく、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３を細胞表面に発現していない細胞に長期骨髄構築能があること、すなわち、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３をマーカーとして細胞を分析することにより、造血幹細胞群とそれ以外の細胞群を分離できることが報告されている（クリステンセンとワイスマン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  Ｌ．＆Ｗｅｉｓｓｍａｎ  Ｉ．），「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）」，２００１年，第９８巻，１４５４１−１４５４６）。しかしながら、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３を分析することにより、活性化した造血幹細胞を同定できることは示されていない。
【００２３】
活性化した造血幹細胞とは、サイトカイン等の刺激を受けたり、５−ｆｌｕｏｒｕｒａｃｉｌ（５−ＦＵ）処理により、細胞周期（セルサイクル）に入った造血幹細胞を意味する（非特許文献５）。
【００２４】
マウスの骨髄より得た造血幹細胞については、Ｌｉｎ弱陽性または陰性でｃ−ｋｉｔ陽性Ｓｃａ−１陽性の細胞群中、活性化した造血幹細胞はＣＤ３４陽性の分画に認められることが報告されている（サトウ（Ｓａｔｏ  Ｔ．）ら，「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」，１９９９年，第９４巻，ｐ．２５４８−２５５４）。一方、ヒトの造血幹細胞については、ＣＤ３４陽性は造血幹細胞のマーカーである（非特許文献１）ので、ＣＤ３４を分析することにより造血幹細胞が活性化しているか否かを判定することはできない。ヒトの造血幹細胞については、活性化の指標となるマーカーは知られておらず、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３を指標として用いる本発明によって初めて、造血幹細胞が活性化しているかどうか判定する方法が提供される。
【００２５】
造血幹細胞に発現するＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３の分析は、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３に特異的な抗体を用いる免疫学的手法により行うことができる。Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３に特異的な抗体は市販されているので、例えば、フローサイトメーター等の細胞分離装置を用いれば簡便に分析することができる。同じアイソタイプのネガティブコントロールの抗体を用いた結果と比較して、これより強い蛍光強度を示した細胞をＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞と同定すればよい。
【００２６】
前述のとおり、癌化学療法に伴う骨髄毒性である末梢血白血球数の減少に先立ち、造血前駆細胞の減少が観察され、この造血前駆細胞の減少を補うために、活性化した造血幹細胞の割合が高くなることが知られている（非特許文献７、非特許文献８）。この現象は、末梢血白血球数の減少より早い時期から観察される。したがって、本発明に従い、癌化学療法剤の投与を受けた患者から採取した造血幹細胞においてＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３の発現を分析して活性化している造血幹細胞の比率を算出し、これが増加していた場合には、将来的に骨髄毒性が発現することを評価あるいは予測することができる。また、末梢血白血球の数が減少することを予測できる。このような癌化学療法剤の骨髄特性を評価・予測したり、末梢血白血球数の減少を予測する方法は本発明に含まれる。
【００２７】
また、癌化学療法に基づいた骨髄毒性に限らず、いかなる原因によって生じた骨髄毒性についても、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３の発現を指標として用いることにより評価・予測することができる。
【００２８】
さらに、本発明に従いＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３の発現を上述の方法で分析し、白血球数の減少を予測した結果に基づいて、骨髄毒性が生じることが懸念された場合には、事前に輸血を実施すればよい。輸血量や輸血時期等は、これらの予測結果に基づいて決定すればよい。また、癌化学療法剤の投与量を少なくする、あるいは、投与間隔を空ける等、投与方法をコントロールすることもできる。さらに輸血と投与方法のコントロールを適宜組み合わせて行うこともできる。
【００２９】
その結果、骨髄毒性を予防することや、末梢血白血球数の減少など副作用の程度を軽減させることができるようになる。本発明の方法により、有効な癌化学療法を患者に施すことができる。
【００３０】
本発明は、ヒト以外の哺乳類由来の造血幹細胞についても言うまでも無く適用できるが、ヒトの造血幹細胞についてが好適である。
【００３１】
本発明において、細胞表面マーカーの分析は、それぞれの細胞表面マーカーに特異的な抗体と、セルソーターやフローサイトメーターと称される細胞分取装置を用いて行うのが簡便であるが、これに限るものではなく、他の装置や方法を用いて分析してもよい。
【００３２】
また、上記目的のために造血幹細胞上のＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３の発現を分析するのに用いることができるキットも、本発明に含まれる。これらは、通常の造血幹細胞マーカーを分析する試薬とともにＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３を分析するために使用する試薬をさらに含むものである。
【００３３】
【実施例】
以下に、実施例で本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限られるものではない。
（実施例１）
（骨髄細胞の採取）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｌｙ５．１マウス（ジャクソンラボラトリーズ社）の大腿骨と脛骨より採取した骨髄細胞を５％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ ＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ、以下ＦＢＳと略す。免疫生物研究所）を含む、ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋｓ’  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｓ、以下ＨＢＳＳと略す。ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）に懸濁後、２２ゲージの注射針を付けた１ｍｌのシリンジを用いて細胞浮遊液とした。ポアサイズ４０μmのナイロンメッシュ（ファルコン社）を通過して細胞塊を除去した後、１１００ｒｐｍで５分間遠心することにより細胞を洗浄した。得られた細胞をＨＢＳＳに再度懸濁し、単細胞浮遊液を得た。
【００３４】
（分化抗原陰性または弱陽性細胞の精製）
上記単細胞浮遊液から、マウス造血前駆細胞調製用のＳｔｅｍ  ＳｅｐTM（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を用いて、添付のマニュアルに従って分化抗原陰性または弱陽性細胞を調製した。すなわち、まず、上記単細胞浮遊液に分化抗原に対するビオチン標識抗体カクテルを加え、氷上で２０分間反応後、ＨＢＳＳで洗浄し、１１００ｒｐｍで５分間遠心した。得られた細胞をＨＢＳＳに再懸濁し、ビオチン標識抗体結合用Ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ抗体複合体を加え、氷上で４０分間反応後、磁気コロイドを加え、さらに４０分間反応させた。ＭＡＣＳ−ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ．社）で細胞懸濁液を処理し、標識細胞を吸着させ、未標識の分化抗原陰性および弱陽性細胞を回収した。
【００３５】
（セルソーターによる造血幹細胞の精製）
造血幹細胞はｃ−ｋｉｔ陽性・Ｓｃａ−１陽性の細胞集団である。そこで、回収した上記分化抗原陰性または弱陽性細胞を、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）で標識した抗マウスｃ−ｋｉｔ抗体（ファーミジェン社）、ＰＥ(フィコエリスリン、ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ)−Ｃｙ５で標識した抗マウスＳｃａ−１抗体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ社）、およびＰＥで標識した抗マウスＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３抗体（ファーミジェン社）で染色後、ＥＰＩＣＳ−Ｅｌｉｔｅ（ベックマンコールター社）により、ｃ−ｋｉｔ陽性・Ｓｃａ−１陽性・Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性と、ｃ−ｋｉｔ陽性・Ｓｃａ−１陽性・Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞を得た。得られたｃ−ｋｉｔ陽性・Ｓｃａ−１陽性・Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性とｃ−ｋｉｔ陽性・Ｓｃａ−１陽性・Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞の比率は、約３：２であった（図１）。
【００３６】
（分離した造血幹細胞のマウスへの移植）
２５００個のｃ−ｋｉｔ陽性・Ｓｃａ−１陽性・Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性細胞と、１7００個のｃ−ｋｉｔ陽性・Ｓｃａ−１陽性・Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞をＨＢＳＳに懸濁し、ここにＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｌｙ５．２マウス（日本クレア社）から採取した５×１０５個の新鮮骨髄細胞を加えて１１００ｒｐｍで５分間遠心した。得られた細胞を４００μｌの１ｍMＨＥＰＥＳ含有ＨＢＳＳに懸濁し、致死量放射線（８００レントゲン）を照射したＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｌｙ５．２マウスに尾静脈より移植した。それぞれ3匹のマウスに対し移植を実施した。
【００３７】
（移植した細胞に由来する白血球の検出）
移植後６ヶ月経過したマウスの尾末端から、ヘパリンコート毛細管を用いて約２５μｌの末梢血を採取し、ただちに、１０ユニット／ｍｌのヘパリンを含む５００μｌのリン酸緩衝液（ＰＢＳ（−）、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）に懸濁した。１１００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去後、細胞を５００μｌのＨＢＳＳに懸濁した。ここに、ＰＢＳ（−）で１０倍に希釈したＦＩＴＣ標識抗マウスＬｙ５．１抗体（ファーミジェン社）を１０μｌ添加し、遮光条件下、氷中で３０分間放置した。１１００rpmで５分間遠心して細胞を回収し、ここに１５５ｍＭ塩化アンモニウム、１０ｍＭ重炭酸カリウム、０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液を５００μｌ加え、溶血した。この溶血操作を２回行った。得られた細胞を、ＨＢＳＳで洗浄した後、２μｇ／ｍｌ  ７−アミノアクチノマイシンＤ、０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０.０５%アジ化ナトリウム、０.０２%ＥＤＴＡを含むＨＢＳＳに懸濁してＥＰＩＣＳ−ＸＬフローサイトメータ−にてＬｙ５．１の発現を分析し、Ｌｙ５．１を発現している細胞の割合を算出した。結果を表１に示す。
【００３８】
表１．Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３の発現分析による造血幹細胞活性の分析
2004201574.tif 000002
【００３９】
表１に示したように、ｃ−ｋｉｔ陽性・Ｓｃａ−１陽性・Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性細胞を移植したマウスにはドナー由来の白血球が多く認められ、ｃ−ｋｉｔ陽性・Ｓｃａ−１陽性・Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞を移植したマウスにはドナー由来の白血球はほとんど認められなかった。したがって、成体マウス骨髄中においては、造血幹細胞はＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性の分画に存在することが確認できた。これらの成績は、すでに論文にて報告されている結果とほぼ同じであった。（アドルフソン（Ａｄｏｌｆｓｏｎ  Ｊ．）ら，「イムニティー（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」，２００１年，第１５巻，p.６５９−６６９、クリステンセンとワイスマン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  Ｊ．＆Ｗｅｉｓｓｍａｎ  Ｉ．），「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）」，２００１年，第９８巻，ｐ．１４５４１−１４５４６）
【００４０】
（実施例２）
（サイトカインによるインビトロでの造血幹細胞の活性化）
実施例１と同じ手法で、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｌｙ５．１マウスの骨髄から、ＥＰＩＣＳ−Ｅｌｉｔｅを用いてｃ−ｋｉｔ陽性・Ｓｃａ−１陽性・Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性細胞を分離、調製した。これらの細胞を、１０μg/mlのゲンタマイシンを含有する５％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ１６４０に懸濁し、組織培養用６ウェルプレートに１ウェルあたり２．７×１０4個を播種し、５%ＣＯ２存在下３７℃で培養した。ただし、培養液にステムセルファクター（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ、ＳＣＦ、Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）とインターロイキン１１（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ―１１、ＩＬ−１１、Ｐｅｐｒｏ  ｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）を、いずれも１００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加して培養した。
【００４１】
（造血幹細胞の精製）
６日間培養後、増殖した細胞を、セルスクレイパーを用いて回収した。得られた細胞をＰＥ標識抗マウスＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３抗体で実施例１と同様の方法で染色し、ＥＰＩＣＳ−Ｅｌｉｔｅを用いてＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性細胞と陽性細胞を分離、取得した。Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性細胞とＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞の存在比率は、約４：１であった（図２）。
【００４２】
（インビトロで活性化した造血幹細胞のマウスへの移植）
これらＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性細胞とＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞を実施例１に記載した方法に従って、致死量放射線を照射したＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｌｙ５．２マウスに移植した。ただし、一匹あたり、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性細胞は２．２×１０4個、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞は５．３×１０３個を移植した。それぞれ4匹のマウスに移植を実施した。
【００４３】
（移植した細胞に由来する白血球の検出）
移植後６ヶ月が経過したマウスから実施例１と同様に末梢血を採取し、Ｌｙ５．１の発現を分析した。結果を表２に示す。サイトカインの存在下インビトロで培養しＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞に変化した細胞を移植したマウスにもドナー由来の白血球が認められた。以上の結果から、成体マウス骨髄中では、造血幹細胞はＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性である（実施例１）が、これらをインビトロにおいてＳＣＦとＩＬ−１１で活性化した場合、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞にも造血幹細胞としての性質が確認されること、すなわち、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性のフェノタイプを示す造血幹細胞が出現することがわかった。これらの結果は、造血幹細胞のＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３の発現を分析することにより、活性化した造血幹細胞を同定することができることを示している。したがって、造血幹細胞におけるＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３の発現を分析すれば、どれくらいの割合の造血幹細胞が活性化しているのかを知ることができる。
【００４４】
表２．インビトロで活性化後の造血幹細胞活性の分析
2004201574.tif 000003
【００４５】
（実施例３）
（インビトロで活性化した造血幹細胞の移植後のフェノタイプ変化）
実施例２と同様の方法で、ｃ−ｋｉｔ陽性・Ｓｃａ−１陽性・Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性細胞を、ＳＣＦとＩＬ−１１の存在下インビトロで６日間培養後、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性細胞と陽性細胞を分離したところ、それぞれの細胞数の比は約２：１であった。そこで、Ｗ４１／W４１マウス（ジャクソンラボラトリーズ）から取得した１.０×１０６個の骨髄細胞とともに、1匹あたり、ＦＬＫ−２／Ｆｌｔ３陰性細胞は８×１０４個、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞は４×１０４個を、それぞれ４匹の致死量放射線を照射したＬｙ５．２マウスに移植した。移植から６ヵ月後、末梢血中のＬｙ５．１を分析する（表３）と、実施例２とほぼ同様の結果が得られ、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性および陽性細胞の両方に造血幹細胞としての活性が認められた。
【００４６】
表３．活性化造血幹細胞上のＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３の発現
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【００４７】
そこで、インビトロでＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性からＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性に変化した細胞を移植したマウスから骨髄を採取し、実施例１で記載したようにＬｉｎ弱陽性または陰性細胞を精製した。そして、Ｌｙ５．１陽性・Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞とＬｙ５．１陽性・Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性細胞に分離すると、それぞれの細胞数の比は、約１：５であった（図3）。そこで、一匹あたり、Ｌｙ５．１陽性・Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性細胞は５×１０４個、Ｌｙ５．１陽性・Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞は１×１０４個を、Ｗ４１/Ｗ４１マウスから取得した１.０×１０６個の骨髄細胞とともに致死量放射線を照射したＬｙ５．２マウスに移植した。６ヵ月後に末梢血を採取し、Ｌｙ５．１の発現を分析した。
【００４８】
表４．Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性造血幹細胞のＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性細胞への変化
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【００４９】
その結果、表４に示すようにＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性分画にのみ造血幹細胞としての活性が強く検出され、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性分画の細胞中の造血幹細胞としての活性は低いことがわかった。以上の結果から、インビトロで活性化されＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞に変化した造血幹細胞は、移植されたマウスの生体中でその表現型をＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性へと再度変化することがわかった。
【００５０】
これらの結果により、自己複製能と多分化能を併せ持った造血幹細胞は、インビトロで活性化したときにはＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性にも変化するが、移植後生体内ではＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性フェノタイプへと戻ることが確認された。
【００５１】
（実施例４）
５−ＦＵ等の抗癌剤の投与を受けた患者の末梢血あるいは骨髄から、定法にしたがって造血幹細胞を分離する。例えば、Ｌｉｎ陰性あるいは弱陽性でＣＤ３４陽性の細胞を分画する。得られた造血幹細胞について、さらに、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３に対する蛍光標識抗体とフローサイトメーターを用いて、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３を発現している細胞の比率を算出する。あるいは、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３を発現している細胞の平均蛍光強度を算出する。発現している細胞の比率が高いほど、あるいは、平均蛍光強度が高いほど、重篤な骨髄毒性が生じる可能性が高いと考えられる。その場合は、輸血を行ったり、投与量を少なくしたり、投与間隔をあけたりする。このような処置を施すことにより、骨髄毒性の程度は軽減する。あるいは、骨髄毒性の発症を予防することができる。
【００５２】
【発明の効果】
本発明において、造血幹細胞表面上のＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３の発現を分析することにより、当該造血幹細胞が活性化しているか否かが判明する。活性化している造血幹細胞が同定できれば、癌化学療法剤で問題となっている末梢血白血球数の減少を未然に予測することができる。そして、投与量や投与期間をコントロールし、適切にこれらの薬剤を投与することができる。また、タイミングよく、輸血を実施することができ、骨髄毒性の程度を軽減したり、発症を未然に防止したりすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】８週令のＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｌｙ５．１マウスの骨髄より採取した細胞を、実施例１に記載した方法に従って各種蛍光色素で標識した抗マウス細胞表面抗原抗体で染色し、フローサイトメーターにて分析した結果を示す。Ｌｉｎ弱陽性または陰性でｃ−ｋｉｔ陽性かつＳｃａ−１陽性の分画を、さらにＰＥ標識したＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３で分析したヒストグラムである。
【図２】図１のＬｉｎ弱陽性または陰性ｃ−ｋｉｔ陽性・Ｓｃａ−１陽性でＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性の分画を、実施例２に記載した方法に従って６日間サイトカイン存在下で培養した細胞をＰＥ標識抗マウスＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３抗体で染色した結果を示す。濃いグレーで示したヒストグラムがサイトカイン存在下で培養した細胞の分析結果であり、白抜きのヒストグラムがＰＥ標識したアイソタイプコントロール抗体で染色した分析結果である。Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性細胞をサイトカイン存在下で培養するとＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞が生じていることがわかる。
【図３】実施例２に記載した方法に従って、ｃ−ｋｉｔ陽性・Ｓｃａ−１陽性・Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陰性細胞をインビトロで活性化した後、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ３陽性細胞を分取し、Ｗ４１/Ｗ４１マウスから取得した１.０×１０６個の骨髄細胞とともに致死量の放射線を照射したＬｙ５．２マウスに移植した。６ヵ月後、ドナー由来の細胞におけるＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３の発現を調べるために、それらのマウス骨髄からＬｉｎ弱陽性または陰性細胞を分離し、ＦＩＴＣ標識抗マウスＬｙ５．１抗体およびＰＥ標識抗マウスＦｌｋ−２／Ｆｌｔ３抗体で染色した細胞の分析結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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