(57)【要約】【課題】本発明の目的は、細菌の同定・検出を簡便、低コストでかつ信頼性高く行なう方法を提供することにある。特に、その作用機序を調べることができることを目的になされたものである。【効果】検体より抽出したゲノムＤＮＡを基体上に固定してＤＮＡマイクロアレイを作製し、既知菌種ゲノムに固有の塩基配列を有するプローブＤＮＡとハイブリダイゼーションすることで、ゲノムレベルで正確に菌種を同定するとともに、並列的にアッセイすることで著しくコストを低減し、検出所要時間を短縮することができる。さらに、菌種ごとに異なる蛍光色素でラベルされたオリゴヌクレオチドを一度にアレイにハイブリダイゼーションさせることで、一度に複数の菌種の同定・検出ができ、大幅に検出所要時間を短縮できる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅工程を含まず、細菌純培養試料よりゲノムＤＮＡを抽出し、
前記ゲノムＤＮＡと、特定の菌種に特異的な塩基配列を有する標識付きオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションし、
前記ゲノムＤＮＡと前記オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの有無を検出し、
前記細菌純培養試料における前記特定の菌種の有無を判断する
ことを特徴とする細菌同定方法。
【請求項２】
請求項１記載の細菌同定方法において、前記特定の菌種に特異的な塩基配列を有する標識付きオリゴヌクレオチドが、１００塩基長以下であることを特徴とする細菌同定方法。
【請求項３】
細菌検体より抽出されたゲノムＤＮＡを、前記細菌検体ごとに基体上の異なる箇所に固定化したＤＮＡマイクロアレイを準備する工程と、
特定の菌種に特異的な塩基配列を有する標識付きオリゴヌクレオチドを、前記ＤＮＡマイクロアレイにかけてハイブリダイゼーションを行う工程と、
前記ＤＮＡマイクロアレイ上の標識を検出する工程と、
前記細菌検体ごとに、前記標識の強度を測定する工程と、
前記標識の強度から、前記細菌検体の菌種を判断する工程と
を有することを特徴とする細菌同定方法。
【請求項４】
請求項３記載の細菌同定方法において、前記特定の菌種に特異的な塩基配列を有する標識付きオリゴヌクレオチドが、１００塩基長以下であることを特徴とする細菌同定方法。
【請求項５】
請求項３記載の細菌同定方法において、前記標識は、蛍光標識であることを特徴とする細菌同定方法。
【請求項６】
請求項５記載の細菌同定方法において、前記オリゴヌクレオチドを複数種類用い、前記蛍光標識として、複数種類のオリゴヌクレオチドごとに蛍光波長の異なるものを用いることを特徴とする細菌同定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細菌同定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、サルモネラ菌等の菌の検出・同定は、菌を培養することで菌を増殖させ、糖の資化性検査等の生化学検査を行うことにより主として行われている。例えば、サルモネラ菌の検出・同定には増菌分離培養、生化学性状による確認培養、O（菌体）抗原、K(Vi莢膜)抗原、H（鞭毛）抗原による血清型別が行われ、各検査の総合的判断が必要とされている。しかしながら、この方法は時間と手間が掛かる上に、例外的な性状が判断を困難にする場合等があった。資化性検査用の簡便なキットも市販され広く用いられてきているが、通常１検体につき１キットが必要であり、かつ使い捨てであるため、大量の検体の検査を行うと膨大な医療廃棄物が発生してしまうという問題も残されていた。
【０００３】
また、菌種特有な塩基配列を有するプライマーを用いたポリメラーゼ・チェイン・リアクション（PCR法）により特定のＤＮＡ断片の増幅の有無から菌種を特定する方法が開発されている。しかしながら、微生物の多様性によりプライマーの伸長反応部分に変異が起こると、偽陰性の危険性を含んでいた。PCRは数百万ものDNAコピーを合成できる一方で、混入物に非常に敏感なためごく微量の鋳型DNAから反応を開始する場合、前に行った反応の生成物（生成物のキャリーオーバー）あるいは反応系の外から入ってくる物質のコンタミネーションが問題となる。例えば標的配列を含むプラスミドが反応系に１コピー混入しただけで結果の解釈を誤らせる可能性がある。また、PCR等の核酸増幅を用いる場合には、ポリメラーゼ等の高価な酵素を使用せねばならず、コストを下げることが困難であるという問題も持ち合わせていた。
【０００４】
一方、最近、ＤＮＡマイクロアレイあるいはＤＮＡチップとよばれる、配列の異なる多数のＤＮＡ断片を基板のそれぞれ異なる箇所に固定したものに、遺伝子の発現状態を調べたい細胞から取り出したメッセンジャーRNAの逆転写物（蛍光標識あるいはラジオアイソトープ標識をしたもの）をふりかけ、ハイブリダイゼーションを行った後、それぞれの配列のＤＮＡ断片固定箇所にどの程度逆転写物がハイブリダイズしたかを調べ、試料細胞中の遺伝子発現を調べる方法が注目されている。この方法を利用して、菌種特有なメッセンジャーRNAを検出することで、細菌検体の菌種を識別する方法も開発されてきている。しかし、細菌の場合には、通常アレイの解析に必要な１０マイクログラム以上の十分なRNAが取れないことから実用的には大いに問題が残されている。また、逆転写反応には高価な逆転写酵素が必要であることから低コスト化が困難であるという問題もある。
【０００５】
また、特定の菌種に特異的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチドを、複数種類の菌種に対して１枚のスライドガラス上に固定してアレイを作製しておき、細菌検体のゲノムＤＮＡの特定の塩基配列部位をPCR法を用いて増幅し、増幅と同時にあるいは増幅後に常法により標識化したcＤＮＡをアレイにかけてハイブリダイゼーションさせ、アレイ上に結合した標識を検出することで、菌種を同定する方法も提案されている。この方法では、PCR法を用いるため高価な酵素が不可欠であり、低コスト化が難しい。また、１検体の検査に１アレイ必要であるため、アレイ作製費用、ハイブリダイゼーションに必要な試薬費用、検出にかかわる費用等を勘案すると非常にコストが高くなってしまうという問題があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、細菌検体に対して信頼性高く且つ高速に細菌の菌種を識別できる検出方法を低コストで提供することにある。特に、ＤＮＡマイクロアレイの技術を応用することにより、数多くの検体に対して、検出アッセイを並列的に行なうことにより、非常に高速かつ低コストで菌種の同定を行なうことが出来る細菌同定方法を提供することを目的になされたものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を行った結果、数多くの検体よりゲノムＤＮＡを抽出し、これらを基体上の異なる箇所に固定することでＤＮＡマイクロアレイを作製し、これに特定の菌種のゲノムＤＮＡに特有の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションさせることで、非常に高速に菌種の同定を行うことが出来ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、核酸増幅工程を含まず、細菌純培養試料より抽出したゲノムＤＮＡと、特定の菌種に特異的である塩基配列を有する標識付きオリゴヌクレオチドとをハイブリダイゼーションさせ、前記ゲノムＤＮＡと前記標識付きオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの有無を検出することで、前記細菌純培養試料中における前記特定菌種の有無を判断することを特徴とする細菌同定方法である。
【０００９】
また、本発明は、前記記載の細菌同定方法において、細菌純培養試料より抽出したゲノムＤＮＡとハイブリダイゼーションさせる、特定の菌種に特異的である塩基配列を有する標識付きオリゴヌクレオチドが、100塩基長以下であることを特徴とする細菌同定方法である。
【００１０】
また、本発明は、細菌検体を培養して増殖する工程と、少なくとも１種類以上の細菌検体より抽出したゲノムＤＮＡを、細菌検体ごとに基体上の異なる箇所に固定化してＤＮＡマイクロアレイを作製する工程と、特定の菌種に特異的である塩基配列を有しかつ検出可能な標識を有するオリゴヌクレオチドを、前記細菌検体ゲノムＤＮＡを固定化したＤＮＡマイクロアレイにかけてハイブリダイゼーションを行う工程と、前記ＤＮＡマイクロアレイ上のハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを検出する工程と、前記基体上に固定化した細菌検体ごとに、ハイブリダイズした前記オリゴヌクレオチドの量を定量化する工程と、前記ハイブリダイズした前記オリゴヌクレオチドの量から前記細菌検体の菌種を判断する工程を、少なくとも含むことを特徴とする細菌同定方法である。
【００１１】
さらに、本発明は、前記の細菌同定方法において、特定の菌種に特異的である塩基配列を有するオリゴヌクレオチドに付ける検出可能な標識として蛍光色素を用い、複数種類の菌種を検出する場合には発光波長の異なる色素をそれぞれ標識として付け、標識した複数種類のオリゴヌクレオチドを同一のＤＮＡマイクロアレイにかけてハイブリダイゼーションを行なうことで、複数の菌種の検出を行なうことを特徴とする細菌同定方法である。
【００１２】
検体の菌種を識別しうるプローブＤＮＡを複数種類基体表面に固定化したＤＮＡマイクロアレイに、検体より抽出したゲノムＤＮＡあるいは、部分的にPCRで増幅したＤＮＡ断片をアレイにかけてハイブリダイゼーションすることで、被検体の菌種を同定する方法が報告されている。しかしながら、この方法では、１枚のアレイで１検体の菌種の同定が行なわれる。そのため、たとえば５０００検体について５０種類の菌種について菌種の同定を行うためには、５０種類のプローブＤＮＡを固定した５０００枚のアレイを用いて５０００回のハイブリダイゼーションを行ない検査を行う必要があり、非常に高額な費用が掛かり、かならずしも、ＤＮＡマイクロアレイの並列で大多数のアッセイができるというメリットが活かされていない。そこで、発明者らは、たとえば５０００検体について５０種類の菌種について菌種の同定を行なうという大規模な検査においては、検体由来のゲノムＤＮＡ５０００種類を基体表面に固定して５０００スポットのＤＮＡマイクロアレイを作製し、特定の菌種を識別しうる塩基配列を持つオリゴヌクレオチドを５０種類用意し、５０回のハイブリダイゼーションを行なえば検査が完了する方法を見出した。この方法では、検体数に依存せず、同定する菌種数の数だけアレイを作製してアッセイすればよいため、数多くの検体に対して検査する場合に大きなコストメリットを出すことが出来るという大きな特徴を有する。
【００１３】
発明の考え方を図１に纏めて示す。まず、細菌純培養試料を平板培養によるコロニー（集落）から最適菌濃度に調整する。細菌の種類によって、培地の種類や培養条件を最適化することで、目的の細菌検体を増殖することも出来る。ゲノムＤＮＡを固定化したマイクロアレイを作る上で必要なゲノムＤＮＡの量は、０．１マイクログラム以上であるため、この程度のゲノムＤＮＡをとるために必要な細菌検体の量をあらかじめ調べておき、細菌検体の培養を行うことが好ましい。
【００１４】
次に、細菌検体よりゲノムＤＮＡを抽出する。抽出方法として、例えば、酵素溶菌―スルフォドデシルサルフェイト（ＳＤＳ）処理、フェノール処理、エタノール処理、RNase処理、フェノール処理、イソプロパノール沈殿の工程からなる、常法を用いることが出来る。
【００１５】
次に、抽出したゲノムＤＮＡごとに基体上の異なる箇所に固定化してＤＮＡマイクロアレイを作製する。作製手順は、次のとおりである。蒸留水とジメチルホルムアミドを１対１に混合した液にゲノムＤＮＡを濃度が０．１から５マイクログラム/マイクロリットルの範囲になるように溶かす。これらの溶液を９６穴あるいは３８４穴マイクロタイタープレートに移す。液量は１０から６０マイクロリットルが好ましい。これらのマイクロタイタープレートに入れたＤＮＡ溶液を市販のスポッターを用いてスライドガラス等の基体表面にスポットすればよい。基体表面には、あらかじめＤＮＡを固定化しやすいようにアミノシランやポリリジンを薄くコートしておくことが好ましい。
【００１６】
次に、検出目的の菌種に特有な塩基配列を有する検出用のオリゴヌクレオチド（プローブ）をアレイにかけてハイブリダイゼーションを行う。プローブＤＮＡを作製するには、ゲノム塩基配列のどの部分の配列をプローブとするかを決める必要がある。設計対象の塩基配列には、１６SリボゾーマルRNA遺伝子、II型トポイソメラーゼの構造遺伝子（gyrB）などの塩基配列を用いることが出来る。NCBI（National Center of Biological Information）等の公共データベースから、特定の菌種のこれらの配列情報を取得することが出来る。あるいは、各菌種のゲノムDNAを制限酵素などで断片化し、これらをゲル電気泳動に流すことで、特異性の高い配列断片を選び出すこともできる。これらの菌種に固有な塩基配列を対象として、融解温度(Tm, melting temperature)とクロスハイブリダイゼーションを十分考慮して配列を設計する。ＤＮＡマイクロアレイ上に固定化されたゲノムＤＮＡとプローブＤＮＡとの間での、ハイブリダイゼーションを高精度（ないしは高ストリンジェント、highly stringent）に行うためには、ハイブリダイゼーション温度(Th, hybridization temperature)とプローブＤＮＡの融解温度(Tm, melting temperature)の関係が重要であり、プローブＤＮＡの融解温度とハイブリダイゼーション温度との差異が３０℃を超えないことが必要である。また、クロスハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ配列同士のホモロジーが高いために生じるので、クロスハイブリダイゼーションを防ぐためには、プローブＤＮＡと相当菌種以外の菌種のゲノムＤＮＡとの相同性が十分低いことが必要である。さらには、ミニヘアピン構造をとるような配列や、繰り返し配列と相同性が有意に高い部分が含まれないことが望ましい。また、検出予定の菌種を対象としたプローブ配列同士のホモロジーを計算するのみならず、プローブ配列とＧＥＮＢＡＮＫ等の対象となる生物種のゲノム配列とのホモロジーを計算する必要もある。ＤＮＡマイクロアレイ上に固定化するＤＮＡ断片候補の配列と、測定対象菌試料に含まれている可能性のある菌種群のゲノムＤＮＡ配列とを比較して、ホモロジーが有意に高いＤＮＡ配列は、プローブＤＮＡとしては選択しないことが望ましい。
【００１７】
プローブとする塩基配列が決まれば、その配列に従い、オリゴヌクレオチドを作製すれば、容易にプローブＤＮＡを作製できる。塩基長としては２０塩基以上が好ましい。より好ましくはハイブリダイゼーションの安定性を考慮すると、５０塩基以上が好ましい。標識には、オリゴヌクレオチドの末端を、Cy3やCy5等の蛍光色素や、放射性同位元素（RI）で修飾する方法が好ましい。
【００１８】
検出対象となる菌種としては、特に限定されるものではないが、例えば、ヒトから分離される病原微生物として、Proteus mirabilis、 Proteus vulgaris、 Morganella morganii、Providencia stutzeri、Providencia rettgeri、Salmonella enteritidis、Salmonella typhi、Salmonella paratyphi A、Citrobacter freundii、Citrobacter amalonaticus、Citrobacter braakii、Citrobacter diversus、Escherichia coli、Edwardsiella tarda、Klebsiella pneumoniae、Klebsiella oxytoca、Serratia marcescens、Enterobacter cloacae、Enterobacter aerogenes、Hafnia alvei、Yersinia enterocolitica、Cedecea davisae、Kluyvera ascorbata、Shigella sonnei、Shigella dysenteriae、Vibrio cholerae、Vibrio fluvialis、Vibrio parahaemolyticus、Vibrio vulnificus、Aeromonas hydrophila、Aeromonas caviae、Aeromonas sobria、Pasteurella multocida、 Haemophilus influenzae、Campylobacter jejuni、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas fluorescens、Burkholderia cepacia、Burkholderia mallei、Alcaligenes faecalis、Chryseobacterium indologenes、Chryseobacterium meningosepticum、Stenotrophomonas maltophilia、Legionella pneumophila、Neisseria gonorrhoeae、Acinetobacter calcoaceticus、Bordetella pertussis、Bordetella bronchiseptica、Clostridium perfringens、Bacteroides fragilis を挙げることが出来るが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
細菌純培養試料を直接基体表面上に固定したＤＮＡアレイを用いて、細菌の同定・検出を行なうには、以下の手順で行うことができる。まず、前記アレイに対して、検出用の標識の付いたオリゴヌクレオチドを含む溶液をかけて、所定の温度、時間の間ハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイゼーション温度は４５−７０℃、ハイブリダイゼーション時間は６−１８時間が好ましい。ハイブリダイゼーション後、標識が蛍光色素であれば蛍光スキャナーにより各細菌検体をスポットした箇所の蛍光強度を測定する。前記ＤＮＡアレイ上には、あらかじめ、ポジティブ及び／またはネガティブコントロールとなるＤＮＡをスポットしておくことが好ましい。各検体のスポットにおける蛍光強度とポジティブ及び／またはネガティブコントロールのスポットにおける蛍光強度とを比較検討することで、プローブＤＮＡのハイブリダイゼーションの程度、すなわち、菌の有無を判断する事が出来る。あらかじめ、各スポットの蛍光強度とポジティブ及びネガティブコントロールの蛍光強度とを比較検討し、菌の有無を判断するようなソフトウエアを作製し、それを用いることが好ましい。スポット間の強度比較が必要ない場合には、蛍光ラベルの変わりに、ビオチン・ストレプトアビジン-アルカリフォスファターゼによる基質・発色系などの化学発色系を用いることもできる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態について、以下具体例を示して詳細に説明する。
（実施例１）
検出対象の菌種として、Proteus vulgaris、Morganella morganii、Pseudomonas aeruginosa、Clostridium perfringens、Campylobacter jejuni、Bacteroides fragilis、の６種類を選んだ。
【００２１】
GENBANKより、各菌種の１６SリボゾーマルRNAの塩基配列を取得し、Tmの設定値を７５℃±５℃、塩基長を８０merとして、各菌種に対するプローブＤＮＡを設計した。得られた塩基配列を表１に配列番号１〜６として示す。これらの塩基配列に従いオリゴヌクレオチドを合成した。合成に際して、５’末端を蛍光色素（Cy5）で標識した。
【００２２】
【表１】
2004201589.tif 000003
【００２３】
各プローブＤＮＡを濃度が1μMになるように3.4×SSC、0.3%SDSに溶かし、液量20μlの検出用プローブＤＮＡ溶液を作製した。
一方、選定した各種細菌を、常法により、液体培養で培養した。その後、12000rpm、4℃、10分間遠心して菌体を集めた。これを精製水50μlに溶解し、100℃、10分間加熱した。これを15000rpm、4℃、10分間遠心して、上清を新しいチューブに移した。次に、ＤＮＡの濃度が0.５μg/μlになるよう濃縮し、濃縮後の液を10μlの新しいチューブに移した後ドライアップした。このチューブにDMSOと精製水を１：１に混合した液を10μl加えた後、十分に攪拌することでＤＮＡを溶解させ、スポッティング溶液とした。
【００２４】
各種細菌検体のスポッティング溶液を３８４穴プレートに移した後、スポッター（日立ソフトエンジニアリング社製SPBIO-2000）を用いて、ポリリジンコートスライドガラス（松浪ガラス社製）上にスポットした。風乾後、UV光を照射（500mJ）してＤＮＡを固定化した。次に、無水コハク酸をピロリドンに溶解させた溶液を用いてブロッキング処理を行ない、精製水で洗浄後風乾して、ＤＮＡマイクロアレイを合計10枚作製した。
【００２５】
次に、10枚のアレイに対して各々１種類の検出用プローブＤＮＡ溶液20μlを載せた後、カバーガラスを載せてプローブＤＮＡ溶液がアレイ上の全スポットに行き渡るようにした後、密閉容器に入れ、62℃に設定したハイブリインキュベータに入れてハイブリダイゼーションを12時間行なった。
ハイブリダイゼーション終了後、以下の３種類の洗浄液で各々５分間ずつ洗浄した後、遠心機を用いて乾燥した。
洗浄液１：1×SSC、0.1%SDS
洗浄液２：0.1×SSC、0.1%SDS
洗浄液3：0.1×SSC
【００２６】
次に、蛍光スキャナー（GSI-Lumonics社製ScanArray5000）を用いて、アレイ上の蛍光画像を読み取った後、数値化ソフトウエア（GSI-Lumonics社製 QuantArray）を用いて各スポットにおけるハイブリダイゼーション量を評価した。結果を表２に示す。表２から明らかなように、本検討で用いた６種類の細菌を正確に同定・検出できていることが分かった。
【００２７】
【表２】
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【００２８】
（実施例２）
実施例１に記載した方法により、６種類の細菌のゲノムＤＮＡをスポットしたＤＮＡマイクロアレイを作製した。
検出する細菌として、Clostridium perfringens、Campylobacter jejuni、Bacteroides fragilisの３種類の細菌を選定し、表１に記載の配列（それぞれ配列番号４〜６）を有するプローブＤＮＡを作製した。ただし、蛍光ラベルとしてClostridium perfringensにはCy3、Campylobacter jejuniにはCy5、Bacteroides fragilisにはFITCで５’末端を標識した検出プローブ用オリゴヌクレオチドを作製した。これら３種類のプローブＤＮＡを各濃度が1μMになるように3.4×SSC、0.3%SDSに溶かし、液量20μlの混合プローブＤＮＡ溶液を作製した。
【００２９】
混合プローブＤＮＡ溶液20μlを１枚の上記ＤＮＡマイクロアレイに載せた後、カバーガラスを載せて混合プローブＤＮＡ溶液がアレイ上の全スポットに行き渡るようにした後、密閉容器に入れ、62℃に設定したハイブリインキュベータに入れてハイブリダイゼーションを12時間行なった。
ハイブリダイゼーション終了後、実施例１で用いたものと同様の組成の３種類の洗浄溶液で各々５分間ずつ洗浄した後、遠心機を用いて乾燥した。
【００３０】
次に、蛍光スキャナー（GSI-Lumonics社製ScanArray5000）を用いて、３種類のレーザー光源を用いることでアレイ上のCy3、Cy5、及びFITCの３種類の蛍光画像を読み取った後、数値化ソフトウエア（GSI-Lumonics社製 QuantArray）を用いて各スポットにおけるハイブリダイゼーション量を評価した。結果を表３に示す。表３から明らかなように、各々異なる蛍光標識が付いた３種類のプローブＤＮＡを一度にアレイにかけて１回のハイブリダイゼーションを行うことで３種類の細菌を正確に同定・検出できることが明らかとなった。このように、複数の蛍光標識を併用することで、一度のハイブリダイゼーションで複数の菌種の検出・同定を行なえることが明らかとなった。
【００３１】
【表３】
2004201589.tif 000005
【００３２】
【発明の効果】
本発明の方法を用いることで、ＤＮＡ増幅工程を用いずに、数多くの細菌検体に対して１回のアッセイで同定・検出することができる。また、菌種ごとに異なる蛍光色素でラベルされたオリゴヌクレオチドを一度にアレイにハイブリダイゼーションさせることで、一度に複数の菌種の同定・検出ができ、大幅に検出所要時間を短縮できる。
【００３３】
【配列表】
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2004201589.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法の概要を示す。
【図１】
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