(57)【要約】      （修正有）【課題】洗剤用アルカリプロテアーゼ或いは従来の真性ズブチリシンと比べて分子量が大きく、且つアミノ酸配列において相同性が低い新たな洗剤用アルカリプロテアーゼ並びにこれをコードする遺伝子を提供する。【解決手段】以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：（ａ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｓｐ由来の特定のアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質；（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質；当該タンパク質をコードする遺伝子；当該遺伝子を含有する組換えベクター；該組換えベクターを有する形質転換体。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項３】
請求項１又は２記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなるアルカリプロテアーゼ遺伝子：
（ａ）配列番号４の塩基配列で示されるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項３又は４記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項６】
請求項５記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項７】
宿主が微生物である請求項６記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、産業用酵素、特に洗剤用酵素として有用な新規アルカリプロテアーゼ及びこれをコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
プロテアーゼは、衣料用洗剤をはじめとする各種洗浄剤、化粧料、浴用剤、食品改質剤、消化補助剤あるいは消炎剤といった様々な用途、分野で利用されてきている。このように工業用酵素として最も生産量の多いプロテアーゼの中でも洗剤用のアルカリプロテアーゼは、洗浄力の向上に不可欠な一成分として重要な役割を果たしてきている。現在用いられている洗剤用アルカリプロテアーゼは、バチルス属細菌由来でズブチリシンファミリーに属し、分子量が２８ｋＤａ付近の、サビナーゼ（登録商標）、カンナーゼ（登録商標）、デュラザイム（登録商標；以上ノボザイム）、マキサカル（登録商標；ジェネンコア）、ブラップ（登録商標；ヘンケル）及びＫＡＰ（花王）等が知られている（特許文献１、特許文献２参照）。また、同様にバチルス属細菌由来で、分子量４３ｋＤａ付近の酸化剤耐性を有するアルカリプロテアーゼの一群も洗剤用酵素として有用であることが知られている（特許文献３参照）。
【０００３】
しかしながら、これらのアルカリプロテアーゼは、アルカリ耐性、界面活性剤耐性、酸化剤耐性、低温活性、耐熱性、洗浄性、低い基質特異性、キレート剤耐性、金属イオン耐性等において一長一短のあるものであり、また、上記アルカリプロテアーゼのように分子量が２８〜４５ｋＤａ付近のものは、製造プロセスにおいて、培養液や酵素溶液の濃縮に用いる限外濾過膜から酵素が漏出して、濃縮収率を下げるという問題があった。
【０００４】
本発明は、上記のような洗剤用アルカリプロテアーゼ或いは従来の真性ズブチリシンと比べて分子量が大きく、且つアミノ酸配列において相同性が低い新たな洗剤用アルカリプロテアーゼ並びにこれをコードする遺伝子を提供することを目的とする。
【０００５】
【特許文献１】
特開平４−３４９８８２号公報
【特許文献２】
特開平８−５０８６４３号公報
【特許文献３】
国際公開第９９／１８２１８号パンフレット
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、好アルカリ性バチルス属細菌が生産する新規なプロテアーゼをを見出すべくスクリーニングを行ったところ、ある種の好アルカリ性バチルス属細菌が公知のズブチリシンとは異なり、分子量の大きなアルカリプロテアーゼを生産していることを見出すとともに、該酵素をコードする遺伝子を取得することに成功した。
【０００７】
すなわち本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質、配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質、当該タンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子を含有する組換えベクター及び該組換えベクターを有する形質転換体を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のタンパク質（以下、「アルカリプロテアーゼ」ともいう）は、（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質、又は配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質であり、本発明の遺伝子は、当該タンパク質をコードするＤＮＡである。
【０００９】
ここで、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列とは、配列番号１で示されるアミノ酸配列と等価のアミノ酸配列を意味し、１若しくは数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、依然としてアルカリプロテアーゼ活性を保持する配列をいい、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
【００１０】
尚、当該等価のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、部位特異的突然変異誘発法等の公知の手法を利用して調製することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット[Ｍｕｔａｎ−ｓｕｐｅｒ−Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ  キット（Ｔａｋａｒａ）]等を用いて変異を導入すればよい。
【００１１】
本発明の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質としては、例えばバチルス  エスピーＪＣＭ９１５４株由来のアルカリプロテアーゼ（ＨＫ）が挙げられ、配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼとしては、例えばバチルス  エスピー  ＳＤ５２１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１１１６２）、バチルス  エスピー  Ｙ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０２９）が生産する酵素（配列番号２、配列番号３）等が挙げられ、その相同性は、それぞれ９７．８％、９１．７％である。
【００１２】
また、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を他の公知のアルカリプロテアーゼ、すなわちバチルス  エスピー  ＫＳＭ−ＫＰ４３株由来のアルカリプロテアーゼＦＴ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０９６０９４）、バチルス  エスピー  ＫＳＭ−９８６５株由来のアルカリプロテアーゼＳＦ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０９６０９５）、バチルス  エスピー  ＫＳＭ−９８６０株由来のアルカリプロテアーゼＳＺ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０９６０９６）、バチルスエスピー  ＮＣＩＭＢ１２２８９株由来のアルカリプロテアーゼＮＶ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０９６０９７）と比較した場合、それぞれ６３．９％、６４．０％、６４．２％、６０．７％の相同性を示した。しかし、上記以外のアルカリプロテアーゼ以外には高い相同性を示すタンパク質は見当たらない。従って、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、新規なアルカリプロテアーゼであると判断され、本発明は、当該配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号１で示されるアミノ酸配列において相当する配列を適切にアライメントした時、８０％以上、好ましくは８２％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質を包含するものである。
尚、相同性の検索は、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ(ソフトウェア開発)のサーチホモロジ−プログラムやマキシマムマッチング法を用いて算出することができる。
【００１３】
本発明のアルカリプロテアーゼ遺伝子は、上記のとおり、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又は当該アミノ酸配列と等価のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものであればよいが、（ａ）配列番号４の塩基配列で示されるＤＮＡ、（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が好ましい。（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの例としては、例えば配列番号５及び配列番号６の塩基配列で示されるＤＮＡが挙げられる。
尚、配列番号４の塩基配列中、塩基番号１〜４７４は、本発明アルカリプロテアーゼのプレプロ配列をコードしており、配列番号１で示されるアミノ酸配列は塩基番号４７５〜２３９４に相当する。
【００１４】
「ストリンジェントな条件下」とは、例えばMolecular cloning - a Laboratorymanual 2nd edition (Sambrookら、1989)に記載の条件等が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％  ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００１５】
本発明のアルカリプロテアーゼは、上述したアルカリプロテアーゼ産生菌、例えばバチルス属に属する微生物、例えばバチルス  エスピー  ＪＣＭ９１５４株の染色体ＤＮＡからショットガン法、ＰＣＲ法を用いることによりクローニングし、適当なベクターと宿主菌を用いて大量に生産することができる。
【００１６】
本発明遺伝子を用いてアルカリプロテアーゼを生産するには、目的とする宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクターに、上記アルカリプロテアーゼ遺伝子を組込み、該組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、当該培養液からアルカリプロテアーゼを採取すればよい。
【００１７】
培養は微生物の資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従って行えばよい。
【００１８】
斯くして得られた培養物中からのアルカリプロテアーゼの採取及び精製は、一般の方法に準じて行うことができる。即ち、培養物から遠心分離または濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段により目的酵素を濃縮することができる。このようにして得られた酵素液または乾燥粉末はそのまま用いることもできるが更に公知の方法により結晶化や造粒化することができる。
【００１９】
本発明のアルカリプロテアーゼの特徴としては、次のような性質が好ましい。即ち、分子量６８，０００±２，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）、合成基質（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐＮＡ）を用いた場合、最適反応ｐＨを１１付近（炭酸緩衝液）、最適温度を４５−５０℃付近に有し、耐熱性は５０℃付近まで安定（ｐＨ１０、５ｍＭ塩化カルシウム存在下、１５分間の処理）であるのが好ましく、段落〔００３０〕〜〔００３２〕に示す性質を有しているのがより好ましい。
【００２０】
【実施例】
実施例１  バチルス  エスピー  ＪＣＭ９１５４株由来のアルカリプロテアーゼＨＫ遺伝子のクローニング
【００２１】
バチルス  エスピー  ＪＣＭ９１５４株（Bacillus sp.JCM9154）をＬＢに０．０５％炭酸ナトリウムを添加した培地に接種し、３０℃で適当な時間振盪培養を行い菌体を集めた。斎藤と三浦の方法（Biochim. Biophys. Acata, 72, 619-629, 1963）に準じ菌体からゲノムＤＮＡを調製した。これを鋳型とし、バチルスエスピー  ＫＳＭ−ＫＰ４３株由来のアルカリプロテアーゼＦＴ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０９６０９４）の塩基配列情報を元に合成したプライマーＡ及びＢ（配列番号７及び８）を用いてＥｘＴａｑ（Ｔａｋａｒａ）によりＰＣＲを行った。反応は９４℃で２分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃１分間、５０℃１分間、７２℃１分３０秒間を１サイクルとし３０サイクル行った。その結果、約１ｋｂのＤＮＡ増幅断片が認められた。ＰＣＲ産物を精製し、プライマーＡ及びＢを用いて塩基配列の解析を行った。次にインバースＰＣＲにより全構造遺伝子の塩基配列を決定した。即ち、バチルス  エスピー  ＪＣＭ９１５４株のゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ或いはＨｉｎｄIIIにより３７℃にて完全分解した後、７０℃で１５分間処理し制限酵素を熱失活させた。その後、反応液と等量のＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  キット  ｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ）を加え、１６℃で１昼夜ライゲーション反応を行い、インバースＰＣＲ用の鋳型を調製した。約１ｋｂの部分遺伝子配列からプライマーＣ及びＤ（配列番号９及び１０）を合成し、得られたインバースＰＣＲ用の鋳型を用いてＬａＴａｑ（Ｔａｋａｒａ）によりＰＣＲを行った。反応は９４℃で２分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃１分間、５０℃１分間、７２℃４分間を１サイクルとし３０サイクル行った。その結果、ＥｃｏＲＩ分解物のセルフライゲーションＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、約４ｋｂのＤＮＡ増幅断片、又、ＨｉｎｄIII分解物のセルフライゲーションＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、約３．５ｋｂのＤＮＡ増幅断片が認められた。ＰＣＲ産物を精製し、プライマーＣ及びＤを用いて２８４１ｂｐの塩基配列を決定した。次いでプロモーター領域からターミネーター領域を包含する領域を増幅出来るプライマーＥ及びＦ（配列番号１１及び１２）を合成した。その際にプライマーＥの５’末端にはＳａｌＩリンカーをプライマーＦの５’末端側にＸｂａＩリンカーを付与した。
【００２２】
バチルス  エスピー  ＪＣＭ９１５４株のゲノムＤＮＡを鋳型としプライマーＥ及びＦを用いてＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによりＰＣＲを行った。反応は９４℃で２分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃３分間を１サイクルとし、３０サイクル行った。その結果、約２．８ｋｂのＤＮＡ増幅断片が認められた。ＰＣＲ産物を精製し、得られた約２．８ｋｂのＤＮＡ断片を、ＳａｌＩ、ＸｂａＩにより処理し、同様に処理したプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫと混合した後、ライゲーション反応（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ：東洋紡）を行い、ｐＨＹＨＫを作製した。
【００２３】
実施例２  バチルス  エスピー  ＳＤ５２１株由来のアルカリプロテアーゼＳＤ遺伝子のクローニング
バチルス  エスピー  ＳＤ５２１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１１１６２）から実施例１と同様にゲノムＤＮＡを調製した。これを鋳型としプライマーＧ及びＨ（配列番号１３及び１４）を用いてＥｘＴａｑによりＰＣＲを行った。プライマーＧ及びＨは、バチルス  エスピー  ＫＳＭ−ＫＰ４３株由来のアルカリプロテアーゼＦＴ、バチルス  エスピー  ＫＳＭ−９８６５株由来のアルカリプロテアーゼＳＦ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０９６０９５）、バチルス  エスピー  ＫＳＭ−９８６０株由来のアルカリプロテアーゼＳＺ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０９６０９６）、及び実施例１で取得したバチルス  エスピー  ＪＣＭ９１５４株由来のアルカリプロテアーゼＨＫの各遺伝子配列間において相同性の高い領域からデザインした。反応は９４℃で２分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃１分間、５０℃１分間、７２℃２分間を１サイクルとし３０サイクル行った。その結果、約２．２ｋｂのＤＮＡ増幅断片が認められた。ＰＣＲ産物を精製し、プライマーＧ及びＨを用いて塩基配列の解析を行った。次にインバースＰＣＲにより全構造遺伝子の塩基配列を決定した。インバースＰＣＲ用の鋳型は、バチルス  エスピー  ＳＤ５２１株ゲノムＤＮＡの制限酵素ＨｉｎｄIIIによる完全分解物を用いて、実施例１と同様に調製した。約２ｋｂの部分遺伝子配列からプライマーＩ及びＪ（配列番号１５及び１６）を合成し、得られたインバースＰＣＲ用の鋳型を用いてＬａＴａｑによりＰＣＲを行った。その結果、約２．２ｋｂのＤＮＡ増幅断片が認められた。得られたＰＣＲ産物を精製し、プライマーＩ及びＪを用いて３０６９ｂｐの塩基配列を決定した。プロモーター領域からターミネーター領域を包含する領域を増幅出来るプライマーＫ及びＬ（配列番号１７及び１８）を合成し、実施例１と同様にリンカーを付与した。
【００２４】
バチルス  エスピー  ＳＤ５２１株のゲノムＤＮＡを鋳型としプライマーＫ及びＬを用いてＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによりＰＣＲを行った。約２．８ｋｂのＤＮＡ増幅断片を精製し、実施例１と同様にｐＨＹＳＤを作製した
【００２５】
実施例３  バチルス  エスピー  Ｙ株由来のアルカリプロテアーゼＹＫ遺伝子のクローニング
バチルス  エスピー  Ｙ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０２９）から実施例１と同様にゲノムＤＮＡを調製した。これを鋳型としプライマーＧ及びＭ（配列番号１３及び１９）を用いてＥｘＴａｑにより実施例２と同様にＰＣＲを行った。プライマーＭは、プライマーＧ及びＨと同様に各アルカリプロテアーゼの遺伝子配列間において相同性の高い領域からデザインした。ＰＣＲ産物を精製し、プライマーＧ及びＭを用いて塩基配列の解析を行った。次にインバースＰＣＲにより全構造遺伝子の塩基配列を決定した。インバースＰＣＲ用の鋳型はバチルス  エスピーＹ株のゲノムＤＮＡの制限酵素ＥｃｏＲＩ或いはＨｉｎｄIIIによる完全分解物を用いて、実施例１と同様に調製した。約２ｋｂの部分遺伝子配列からプライマーＮ及びＯ（配列番号２０及び２１）を合成し、得られたインバースＰＣＲ用の鋳型を用いてＬａＴａｑによりＰＣＲを行った。その結果、ＥｃｏＲＩ分解物のセルフライゲーションＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、約４ｋｂのＤＮＡ増幅断片、又、ＨｉｎｄIII分解物のセルフライゲーションＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、約６．６ｋｂのＤＮＡ増幅断片が認められた。得られたＰＣＲ産物を精製し、プライマーＮ及びＯを用いて２８９７ｂｐの塩基配列を決定した。次いでプロモーター領域からターミネーター領域を包含する領域を増幅可能なプライマーＰ及びＱ（配列番号２２及び２３）を合成し、実施例１と同様にリンカーを付与した。
【００２６】
バチルス  エスピー  Ｙ株のゲノムＤＮＡを鋳型としプライマーＰ及びＱを用いてＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによりＰＣＲを行った。約２．８ｋｂのＤＮＡ増幅断片を精製した後、実施例１と同様にｐＨＹＹＫを作製した。
【００２７】
実施例４  アルカリプロテアーゼの組換え生産
ｐＨＹＨＫ、ｐＨＹＳＤ、及びｐＨＹＹＫを用いて、バチルス  エスピー  ＫＳＭ−９８６５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６６）の変異株（分子量２８ｋＤａ、７２ｋＤａの２種類のアルカリプロテアーゼ遺伝子を破壊した株）をエレクトロポレーション法で形質転換した。スキムミルク含有アルカリＬＢ寒天培地（０．０５％炭酸ナトリウム並びに１５ｐｐｍテトラサイクリンを含む）に塗沫し、スキムミルク溶解斑の有無からプロテアーゼ遺伝子が導入された形質転換体を選抜した。得られた各形質転換体を５ｍLの種母培地[６．０％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ、０．１％酵母エキス、１．０％マルトース、０．０２％硫酸マグネシウム７水和物、０．１％リン酸２水素カリウム、０．３％無水炭酸ナトリウム、３０ｐｐｍテトラサイクリン]に植菌し、３０℃で１６時間振盪培養を行った。次いで３０ｍLの主培地[８％ポリペプトンＳ、０．３％酵母エキス、１０％マルトース、０．０４％硫酸マグネシウム７水和物、０．２％リン酸２水素カリウム、１．５％無水炭酸ナトリウム、３０ｐｐｍテトラサイクリン]に種母培養液を１％（ｖ／ｖ）植菌し、３０℃で３日間振盪培養を行った。
【００２８】
実施例５  組換えアルカリプロテアーゼの調製
実施例４で得られたＪＣＭ９１５４株由来の組換えプロテアーゼＨＫを含む培養液８０ｍＬに氷冷下で９０％飽和となるように硫酸アンモニウムを徐々に添加した。添加後、約３０分間攪拌し、遠心分離（１２，０００×ｇ、２０分、４℃）により沈殿したタンパク質を集めた。これを約２ｍＬの１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、約１ｍＬを０．１Ｍ塩化カリウムを含む１０ｍＭＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．０）にて平衡化しておいたＢｉｏＧｅｌＡ０．５ｍゲル濾過カラム（バイオラッド：１．５×７０ｃｍ）へ掛けた。分子量の大きな画分にプロテアーゼ活性が認められ、この部分を集め諸性質を検討した。尚、この段階で宿主菌の生産する分子量４３ｋＤａのプロテアーゼは除くことが可能であった。アルカリプロテアーゼＳＤ、ＹＫは、それぞれの培養液から同様の操作により調製した。
【００２９】
実施例６  組換えアルカリプロテアーゼの酵素学的性質
実施例５で得られた精製アルカリプロテアーゼの活性を測定する場合は合成基質法により行った。即ち、０．２５ｍＬの０．１Ｍ緩衝液、０．０２５ｍＬの５０ｍＭＡＡＰＬ（N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide）、０．２ｍＬの脱イオン水からなる反応液を３０℃で５分間、恒温した後、適当に希釈した酵素液を０．０２５ｍＬ添加し、反応を開始した。３０℃で１０分間恒温した後、２ｍＬの５％(w/v)クエン酸を添加し、反応を停止した。次いで反応中に生成されたｐ−ニトロアニリンの４２０ｎｍにおける吸光度を測定した。酵素１単位（Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏＬのｐ−ニトロアニリンを生成する量とした。
【００３０】
（１）最適反応ｐＨ
ｐＨ４−１２．５の各緩衝液中にて酵素反応を行った結果、いずれの酵素もｐＨ１１の炭酸緩衝液において最も高い分解活性を示した。
【００３１】
（２）最適温度
５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）中、２０〜７０℃の範囲で酵素反応を行った結果、いずれの酵素も４５〜５０℃において最も高い分解活性を示した。また、反応液に２ｍＭ塩化カルシウムを添加した場合、最大活性を与える反応温度は５０℃にシフトし、カルシウム無添加系に比べ２０％程度の活性化が認められた。
【００３２】
（３）耐熱性
５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）中、２０〜６０℃の範囲で各酵素を１５分間恒温した。その後、氷冷し酵素反応を行った結果、いずれの酵素も４０℃までは安定であった。また、５ｍＭ塩化カルシウムを添加した場合は、５０℃まで安定であった。
【００３３】
【発明の効果】
本発明のアルカリプロテアーゼは、従来のズブチリシンとはアミノ酸配列において相同性の低い、分子量の大きい新規な酵素である。従って、その製造プロセスにおいて、培養液や酵素溶液の濃縮に用いる限外濾過膜からの酵素の漏出を防止でき、また分画分子量の大きな膜やモジュール等を使用できることから濾過速度の向上が図られ、失活や自己消化を起こす時間を短縮できる。
【００３４】
【配列表】
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