(57)【要約】【課題】培養細胞における発現実験では、ｃＤＮＡクローンから目的遺伝子コード部分を発現ベクターにサブクローニングすることが必要であるが、目的のサブクローンが得られるまで数日、トランスフェクションに必要な大量プラスミドＤＮＡを調製するためにはさらに時間がかかる。【解決手段】発現用プラスミドＤＮＡを調製する代わりに、ＰＣＲ法を用いて細胞での発現に必要な配列である、プロモーター、目的遺伝子、発現マーカー遺伝子、ターミネーター配列、ポリアデニレーションシグナル配列を含むＤＮＡ断片をより短期間で調製する方法を開発した。さらに本方法では、発現用ＤＮＡ断片の環状化を細胞導入後におこる外来ＤＮＡに対するＤＮＡ分解酵素の攻撃を回避するのに有効な手段として提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーター、目的遺伝子配列、発現マーカー及びポリアデニレーションシグナル配列（ｐＡ配列）から構成される組換え細胞を産生するＤＮＡ断片。
【請求項２】
請求項１記載のＤＮＡ断片において、前記目的遺伝子がオープンリーディングフレームを含むｃＤＮＡクローンの部分配列であることを特徴とするＤＮＡ断片。
【請求項３】
請求項１記載のＤＮＡ断片において、前記プロモーターがヒトサイトメガロバイラス（ＣＭＶ）由来のものであり、リンカー中にクローニングサイトとして制限酵素配列を、前記目的遺伝子の５‘側上流ＤＮＡ配列を含むことを特徴とするＤＮＡ断片。
【請求項４】
請求項１記載のＤＮＡ断片において、　前記発現マーカーが３‘側下流にｐＡ配列を含むオワンクラゲＡｅｑｕｏｒｅａ　ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）であり、リンカー中にクローニングサイトとして制限酵素配列を前記目的遺伝子５‘上流のＤＮＡ配列に含むことを特徴とするＤＮＡ断片。
【請求項５】
請求項１記載のＤＮＡ断片において、前記プロモーター、前記目的遺伝子配列及び前記発現マーカーがＮ末端からＣ末端へ連続的に連結されていることを特徴とするＤＮＡ断片。
【請求項６】
請求項５記載のＤＮＡ断片において、　前記プロモーターが、前記目的遺伝子のコード予測最長アミノ酸の５‘側上流に作動可能な状態で連結されていることを特徴とするＤＮＡ断片。
【請求項７】
請求項５記載のＤＮＡ断片において、前記目的遺伝子配列の３‘側下流に、前記発現マーカーが融合蛋白質を形成する状態でリンカー配列を介して、または、介さずして連結していることを特徴とするＤＮＡ断片。
【請求項８】
請求項５記載のＤＮＡ断片において、前記発現マーカー下流にｐＡ配列が作動可能な状態で連結していることを特徴とするＤＮＡ断片。
【請求項９】
請求項５記載のＤＮＡ断片において、前記プロモーター配列の３‘側の配列と前記目的遺伝子配列の５’側の配列がＰＣＲにより連結された共通配列であることを特徴とするＤＮＡ断片。
【請求項１０】
請求項５記載のＤＮＡ断片において、前記目的遺伝子配列の３‘側の配列と前記ＧＦＰ配列の５’側の配列がＰＣＲにより連結された共通配列であることを特徴とするＤＮＡ断片。
【請求項１１】
請求項５記載のＤＮＡ断片において、前記発現マーカー配列の３‘側末端と前記プロモーター配列の５’末端がライゲーションにより結合可能な状態である、または、制限酵素処理によりライゲーション可能な末端が生成された配列であることを特徴とするＤＮＡ断片。
【請求項１２】
請求項５記載のＤＮＡ断片において、前記ＤＮＡ断片は、セルフライゲーションにより環状化しており、動物細胞に対し遺伝子導入可能であることを特徴とするＤＮＡ断片。
【請求項１３】
請求項１記載のＤＮＡ断片において、前記プロモータ配列は、既存のベクター、クローン、合成ＤＮＡを鋳型として増幅された増幅産物であることを特徴とするＤＮＡ断片。
【請求項１４】
プロモーター、目的遺伝子配列、発現マーカー及びポリアデニレーションシグナル配列（ｐＡ配列）から構成される細胞発現用合成ＤＮＡ断片作成方法において、前記プロモータの３‘側及び前記目的遺伝子配列の５’側のプライマーに第１の制限酵素配列を付加し、前記目的遺伝子配列の３‘側及び前記発現マーカーｐＡ配列の５’側のプライマーに第２の制限酵素配列を付加して、前記プロモーター、前記目的遺伝子配列、発現マーカー及びポリアデニレーションシグナル配列（ｐＡ配列）を鋳型として第１の増幅反応を行い、
前記第１の増幅反応による増幅産物をライゲーションし、
前記ライゲーションによるＤＮＡ断片を鋳型として、５‘リン酸付加をした前記プロモーターのセンスプライマー及び前記発現マーカーのアンチセンスプライマーを用いて第２の増幅反応を行い
前記第２の増幅反応による増幅産物の環状化を行うことを特徴とする細胞発現用合成ＤＮＡ断片作成方法。
【請求項１５】
プロモーター、目的遺伝子配列、発現マーカー及びポリアデニレーションシグナル配列（ｐＡ配列）から構成される細胞発現用合成ＤＮＡ断片を作成する方法において、
前記プロモータの３‘側及び前記目的遺伝子配列の５’側のプライマーに第１の共通配列を付加し、前記目的遺伝子配列の３‘側及び前記発現マーカーｐＡ配列の５’側のプライマーに第２の共通配列を付加して、前記プロモーター、前記目的遺伝子配列、発現マーカー及びポリアデニレーションシグナル配列（ｐＡ配列）を鋳型として第１の増幅反応を行い、
前記第１の増幅反応による、前記プロモーター、前記目的遺伝子配列、発現マーカー及びポリアデニレーションシグナル配列（ｐＡ配列）の増幅産物を鋳型として、前記プロモーターの５‘側プライマー及び前記発現マーカー及びポリアデニレーションシグナル配列（ｐＡ配列）の３’側プライマーを用いて、第２の増幅反応を行い、
前記第２の増幅反応による増幅産物を鋳型として、５‘リン酸付加をした前記プロモーターのセンスプライマー及び前記発現マーカーのアンチセンスプライマーを用いて第３の増幅反応を行い、
前記第３の増幅反応による増幅産物の環状化を行うことを特徴とする細胞発現用合成ＤＮＡ断片作成方法。
【請求項１６】
プロモーター、目的遺伝子配列、発現マーカー及びポリアデニレーションシグナル配列（ｐＡ配列）から構成される細胞発現用合成ＤＮＡ断片を作成する方法において、
前記プロモータの３‘側及び前記目的遺伝子配列の５’側配列を持つハイブリッドプライマーと、前記目的遺伝子配列の３‘側及び前記発現マーカーｐＡ配列の５’側配列を有するハイブリッドプライマーを用い、前記目的遺伝子配列を鋳型として第１の増幅反応を行い、
前記発現マーカー配列を有するプラスミドベクターを、前記プロモーターと前記発現マーカーの間で切断して直鎖ベクターを作成し、
前記第１の増幅反応の増幅産物及び前記直鎖ベクターを鋳型とし、５‘リン酸付加をした前記プロモーターのセンスプライマー及び前記発現マーカーのアンチセンスプライマーを用いて第２の増幅反応を行い、
前記第２の増幅反応による増幅産物の環状化を行うことを特徴とする細胞発現用合成ＤＮＡ断片作成方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は遺伝子工学の分野、組換えＤＮＡ技術を用いた培養細胞における目的遺伝子発現用ベクターの代替手段およびその効率的な調製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
高等生物由来の細胞への遺伝的形質転換に関する多くの技術が、過去に開発されている。細胞内に外来遺伝子を導入する技術、即ち、形質転換技術は、導入遺伝子の機能の解析、組み換えタンパク質の生産、遺伝子治療、有用形質転換細胞種の作出などに用いられる遺伝子工学分野における基本的な技術である。
当分野で周知の方法を使用して発現検定目的遺伝子は取得される。まず公知の方法で細胞由来のＤＮＡ断片からｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのいずれかを調製することができる。また、特定のタンパク質をコードするＤＮＡ断片は、精製タンパク質から得られたアミノ酸配列の情報に基づく該タンパク質の一部分に相同なヌクレオチドプローブによりそのようなライブラリーをスクリーニングすることにより同定することができる。あるいは、抗体プローブを使用して、発現クローニング法により生成されたライブラリー、例えばλｇｔ１１（Ｙｏｕｎｇ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：１１９４−１１９８）をスクリーニングすることができる。対象となる遺伝子の一部をクローニング及び発現に使用することもできるが、完全長のクローン、即ち、タンパク質の全コード領域を含むものが発現のために好ましい。この目的のためには、ＤＮＡの単離、適当な制限断片の生成、クローン及びライブラリーの構築、及び組換え体のスクリーニングのために当業者に周知の技術を使用することができる。（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．に記載された技術）。
また、これまで真核細胞において多数の発現系が開発され、目的遺伝子を発現するのに使用されてきた。培養細胞への遺伝子導入法として、エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎら，１９８２，ＥＭＢＯ　Ｊ．７：８４１−８４５）、レトロウイルス（Ｓｃｈｉｍｏｔｏｈｏｎｏら，１９８１，Ｃｅｌｌ　２６：６７−７７）、直接ＤＮＡ注入（Ｂｅｎｖｅｎｓｔｙら，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：９５５１−９５５５；Ｗｏｌｆｆら，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４７：１４６５−１４６８）、特異的受容体を介するＤＮＡ取り込み（Ｗｕら，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４；Ｗｕら，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５−１６９８７）、および、より最近になってエアロゾルＤＮＡデリバリー（Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１１２７７−１１２８１）といった直接的な遺伝子導入のほかに、リン酸カルシウム沈降（Ｗｉｇｌｅｒら，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７６：１３７３−１３７６）、ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｓｏｍｐａｇｎａｃら，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：７５７５−７５７８）、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）（Ｆｅｌｇｎｅｒら，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７４１３−７４１７）、など薬剤を用いた間接的な方法がある。後者では、試薬の種類や遺伝子導入条件を細胞の種類ごとに最適化する開発が進み、昨今、トランスフェリン等の試薬を用いてＣＯＳ細胞、Ｈｅｌａ細胞でのハイスループットスクリーニングが報告されている。
遺伝子導入手法が多様化したとはいえ、いずれも基本的には目的遺伝子の導入に発現ベクターを用いている。このため培養細胞での目的遺伝子の発現には発現用ベクターの構築及び調製といった操作が必要であり、ｃＤＮＡライブラリーから培養細胞を用いたｃＤＮＡ遺伝子発現の発現及び解析までのステップは時間がかかり、しばしば困難を伴うものであった。近年、ゲノム解析技術の進歩に伴い発現解析対象遺伝子が増加するにつれ、新規技術の開発によりこの段階で費やされる時間と労力の軽減が必要とされていることは明らかである。
通常の遺伝子導入における遺伝子発現のためには、宿主細胞の核内への外因性遺伝子の導入と組み込みを必要とする。しかし、ＤＮＡを取り込んだ細胞のうちごくわずかのものが細胞核内に外来ＤＮＡを含有するにすぎない。この問題を解消すべく開発した手法が特許として報告されている。これは導入遺伝子を工夫して宿主細胞のゲノム中に組み込まれることなく細胞の細胞質中で機能でき、遺伝子発現の開始と維持のために宿主細胞因子を必要としない真核生物細胞中における遺伝子発現系を構築した特許である「あらかじめＤＮＡに結合させたＲＮＡポリメラーゼを用いた遺伝子発現系」（特表平８−５１０１３２）。
一方、宿主を改変する特許としては、１ｋｂｐに満たない短鎖のＤＮＡ断片から１０ｋｂｐ　を超える長鎖のＤＮＡ断片まで、鎖長に係わらず一律にクローニングすることができる形質転換体の作製方法、及びそれに利用するクローニングベクターの提供法に関する「クローニングベクター及び形質転換体の作製方法」（特開平１１−９２７３）、および「ＤＮＡクローニングに用いられる宿主及びクローニング方法」（特開平１１−９２７７）がある。これらは具体的にはクローニングベクターを取り込んだ宿主菌体でリコンビナーゼを発現させて、直鎖で導入したクローニングベクターを細胞内で環状化する工程を含む形質転換体を作製する方法である。ただしこの手法は培養細胞には適用されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
前述の、ＲＮＡポリメラーゼを用いた遺伝子発現系は目的遺伝子発現系構築に手間がかかりコストも高い。発現検定を行う目的遺伝子の数も制限されてしまう。また、リコンビナーゼを用いた遺伝子発現系は培養細胞には適用されていない。そこで、培養細胞に導入可能な発現ベクター様ＤＮＡ断片の簡便かつ効率的な調製方法および培養細胞へ効率良く遺伝子を導入できるシステムの開発が必要とされていた。さらに、導入した遺伝子の機能検定の為，安定した発現を達成する遺伝子導入用組成物が希求されていた。
【０００４】
本発明は、簡便かつ効率的な培養細胞に導入可能な発現ベクター様ＤＮＡ断片の調製方法を提供することを課題とする。また、本発明は、安定した発現を達成する遺伝子導入用組成物を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明の目的は、先行技術で認められた上記問題点を克服し、高等生物ｃＤＮＡに由来し、かつその大きさが１００ｋｂ以下であるＤＮＡ断片またはその等価なＤＮＡ断片を宿主細胞に導入して細胞の染色体に組み込むことを特徴とする方法によって解決される。
本発明の別の目的は、発現マーカーと目的蛋白質の融合蛋白質発現に必要な遺伝子群を含むＤＮＡ断片を構築することである。
本発明のさらなる目的は、細胞導入時に目的蛋白質の発現をモニタリングする手段を備えた新規なサブクローニング代替手段を提供することである。
そこで、本発明者らは、ＰＣＲ法を用いて調整した、プロモーター配列、発現マーカー遺伝子と融合遺伝子を形成している外来遺伝子およびターミネーター配列の３部分を含むＤＮＡ断片は直接Ｈｅｌａ細胞に導入可能であり、さらに、リガーゼ処理によりこのＤＮＡ断片を環状化することで比較的長時間安定な遺伝子発現を行う細胞を作製し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明は、ｃＤＮＡ発現ベクターの代替ＤＮＡ断片を提供する。ＤＮＡ断片はさらに、その他の必要な配列、例えば発現マーカー遺伝子、シグナル配列、プロモーター等を包含する。
プロモーターとしては、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーター等を使用し、外来遺伝子としては、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子、ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラ−ゼ遺伝子等を使用することが出来る。さらにターミネーターとしては、例えばＳＶ４０由来のターミネーター等を使用することが出来る。サイトメガロウイルスプロモーターを特定するポリヌクレオチド配列は、Ｂｏｓｈａｒｔら，Ｃｅｌｌ　４１：５２１−５３０（１９８５）に従い得ることができる。該プロモーターの後にはポリリンカー、ついでｃＤＮＡ−ＧＦＰ融合タンパク質をコードする遺伝子が続き得る。
本発明に於いては、２つ以上の外来遺伝子を使用し、かつ、そのうち１つは目的とする導入遺伝子発現細胞を選択する際に有効な、発現マーカー遺伝子を使用するのが望ましい。かかるマーカーとしては、測光による定量が可能なルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子が好ましい。
本発明に於いては、発現マーカー遺伝子と他の外来遺伝子を融合遺伝子として構築し、同一のプラスミド様ＤＮＡ断片中に有するものを使用しても良いし、発現マーカー遺伝子と他の外来遺伝子の間にＩＲＥＳ配列を挿入して同一のプラスミド様ＤＮＡ断片中に有りながら別個の遺伝子として発現させる系を利用しても良い。
さらに、本明細書中で提供されるのは、本発明の組換えベクター相当ＤＮＡ断片で遺伝子導入した宿主細胞である。宿主細胞は、高等生物の培養細胞である。適切な例は動物細胞由来の２９３−ＥＢＮＡ　Ｃｅｌｌ、２９３−Ｆ　Ｃｅｌｌｓ、２９３−Ｈ　Ｃｅｌｌｓ、ＨＩＧＨ　ＦＩＶＥ、Ｓｆ−９、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＯＳ−７Ｌ等である。
発現マーカーであるＧＦＰをコードする塩基配列としては、オワンクラゲＡｅｑｕｏｒｅａ　ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰ遺伝子を含むのが好ましい。これらの塩基配列は、対応の遺伝子を含むベクターからＰＣＲまたは酵素切断によって得ることができ、また、化学的に合成することもできる。本発明ではｐＱＢＩ２５（ＴａＫａＲａ）を鋳型としてＰＣＲによって必要なリンカー配列を付加したＧＦＰを得た。該ＧＦＰは励起波長が４７３　ｎｍで蛍光波長が５０９ｎｍとはなれているため励起光によるノイズが少なく、蛍光測定による発現検定に好適である。
発現ベクター様ＤＮＡ断片の配列は、ＣＭＶをコードするプロモーター配列の５’−末端とポリアデニレーションシグナルをコードする塩基配列の３’−末端が、得られる塩基配列の両末端となるように連続的に連結させる。この融合配列を増幅し、ＣＭＶ−ｃＤＮＡ−ＧＦＰ−ポリＡをコードする融合遺伝子を含む新規なＤＮＡ断片を発現ベクターの代替物として取得することができる。
本発明に於いては、ＣＭＶ−ｃＤＮＡ−ＧＦＰポリＡ遺伝子をコードするＤＮＡ断片の環状化により、培養細胞内導入後のエキソヌクレアーゼからの外来ＤＮＡへの攻撃を回避することが出来る。
【０００７】
本発明に於いてはＣＭＶ−ｃＤＮＡ−ＧＦＰポリＡをコードする融合遺伝子を含むＤＮＡ断片を構築するに当り、いくつかの方法を提供する。
接続サイト利用法（図１）
（Ａ）　人為的に付加した制限酵素サイトを利用して各ＤＮＡ断片を接続する方法である。
鋳型ＤＮＡとして、ＣＭＶプロモーター及びＧＦＰ遺伝子についてはｐＱＢＩ２５（ＴａＫａＲａ）を用いた。ｃＤＮＡについてはｈｕｍａｎ　ｌｕｎｇ由来のｍＲＮＡ（フナコシ）よりクローニングしたＨｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｍｏｓａｉｃ　ｓｅｒｉｎｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　（ＭＳＰ）遺伝子（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　　　ＮＭ＿０３２０４６）を用いた。
ＣＭＶ断片、ｃＤＮＡ断片、ＧＦＰポリＡ断片をＰＣＲ増幅するにあたり、プライマーに特異的制限酵素の配列を組み込み、各断片の末端に付加した。
すなわち、プロモーター３‘側とｃＤＮＡ５’側には制限酵素Ａ（例えばＣｌａＩ　Ｉ）、ｃＤＮＡ３‘側とＧＦＰポリＡ５’側には制限酵素Ｂ（例えばＡｇｅ　Ｉ）を用いて、付加した。
（Ｂ）このＰＣＲ産物を制限酵素Ａ、Ｂで処理して末端に認識配列を突出させたのち、ライゲーションを行う。必要に応じてアガロースゲル電気泳動によるバンド精製などの手段を用いてＣＭＶ−ｃＤＮＡ−ＧＦＰ−ポリＡの発現ベクター用ＤＮＡ断片を精製する。トランスフェクションに必要なＤＮＡ量を得るため、得られたＣＭＶ−ｃＤＮＡ−ＧＦＰ−ポリＡＤＮＡ断片を鋳型にさらにＰＣＲ増幅を行う。再度ＣＭＶ−ｃＤＮＡ−ＧＦＰ−ポリＡＤＮＡ断片を増幅する際、最終的に環状化するための準備として、５‘末端をリン酸化したＣＭＶ部分のセンスプライマーを用いる。
（Ｃ）　セルフのブラントライゲーションによる環状化を行う。
別法として、ライゲーション効率を挙げる為にＣＭＶ部分のセンスプライマーとＧＦＰポリＡ側のアンチセンスプライマーに制限酵素Ｃ（例えばＸｂａ　Ｉ）配列を組み込み、突出末端をもつＤＮＡ断片を用いる方法が挙げられる。
アニーリング法（図２）
（Ａ）ＣＭＶ断片、ｃＤＮＡ断片、ＧＦＰポリＡ断片のプライマーとして、それぞれに隣接する予定の配列を付加したハイブリッドプライマーを用いてＰＣＲ反応を行う。これによりプライマー部分が共通配列となり、ＰＣＲ産物同士のアニーリングが可能となる。
すなわち、（ａ）ＣＭＶの場合：ＧＦＰポリＡの３’側下流２０〜３０ｂｐを５’側上流に付加したセンスプライマーとｃＤＮＡ５’側配列を３’側下流に付加したアンチセンスプライマー、（ｂ）　ｃＤＮＡの場合：ＣＭＶ３’側配列を５’上流に付加したセンスプライマーとＧＦＰポリＡ５’側配列を３’下流に付加したアンチセンスプライマー、（ｃ）ＧＦＰポリＡの場合：ｃＤＮＡ３’側配列を付加したセンスプライマーとＣＭＶ３’側配列を付加したアンチセンスプライマー、以上３組のプライマーセットを用いることによりＣＭＶとｃＤＮＡおよびＧＦＰポリＡの各末端配列が接続部分となったＣＭＶ−ｃＤＮＡ−ＧＦＰ−ポリＡ発現ベクター様ＤＮＡ断片が合成可能となる。
（Ｂ）共通配列を付加した３種類のＤＮＡ断片を鋳型とし、プロモーターのセンスプライマーとＧＦＰポリＡのアンチセンスプライマーを用いて２次ＰＣＲを行う。標準法では、ＣＭＶとｃＤＮＡ、ｃＤＮＡとＧＦＰポリＡのように２断片を連結した接続断片を構築後に、３次ＰＣＲでＣＭＶ−ｃＤＮＡ−ＧＦＰ−ポリＡ３断片接続断片を構築するが、検討の結果いずれの方法を用いても目的ＤＮＡ断片の増幅効率に大きな違いが見られなかったことから、本特許では効率化のため３断片１段階連結を行うこととする。
（Ｃ）必要に応じてアガロースゲル電気泳動によるバンド精製などの手段を用いてＣＭＶ−ｃＤＮＡ−ＧＦＰ−ポリＡの発現ベクター用ＤＮＡ断片を精製する。トランスフェクションに必要なＤＮＡ量を得るため、得られたＣＭＶ−ｃＤＮＡ−ＧＦＰ−ポリＡＤＮＡ断片を鋳型にさらにＰＣＲ増幅を行う。再度ＣＭＶ−ｃＤＮＡ−ＧＦＰ−ポリＡＤＮＡ断片を増幅する際、最終的に環状化するための準備として、５‘末端をリン酸化したＣＭＶ部分のセンスプライマーを用いる。
（Ｄ）　セルフのブラントライゲーションによる環状化を行う。
別法として、ライゲーション効率を挙げる為にＣＭＶ部分のセンスプライマーとＧＦＰポリＡ側のアンチセンスプライマーに制限酵素Ｃ（例えばＸｂａ　Ｉ）配列を組み込み、突出末端をもつＤＮＡ断片を用いる方法が挙げられる。
（３）ベクター利用法（図３）
培養細胞で利用可能なプロモーター配列および発現マーカー遺伝子配列を具備したプラスミドベクターが商業的に入手可能である場合に用いうる方法である。
（Ａ）ベクター由来のプロモーター３’側配列とｃＤＮＡ５’側配列、ｃＤＮＡ３’側配列と発現マーカー遺伝子５’側配列をもつハイブリッドプライマーを用いてｃＤＮＡ遺伝子を鋳型としてＰＣＲ増幅を行う。ＰＣＲ産物にはプロモーター由来の配列と発現マーカー遺伝子由来の配列が組み込まれる。
（Ｂ）商業的に入手した発現マーカー遺伝子配列を具備したプラスミドベクターをＣＭＶ配列と発現マーカー遺伝子の間で切断し直鎖化する。ＧＦＰ発現ベクターｐＱＢＩ２５においては、制限酵素ＳａｃＩＩを用いた切断が好ましい。
（Ｃ）（Ｂ）で直鎖化したベクターと、（Ａ）で増幅したベクター由来配列を組み込んだｃＤＮＡ遺伝子断片を鋳型とし、ＣＭＶ−ｃＤＮＡ−ＧＦＰ−ポリＡ発現ベクター様ＤＮＡ断片を構築するための２次ＰＣＲを行う。
この方法は他の方法に比べ非特異的増幅産物が少ない為、スケールアップして直接トランスフェクション用のＤＮＡ断片を得ることも可能である。このトランスフェクション用ＤＮＡ増幅の際、最終的に環状化するため、５‘末端をリン酸化したＣＭＶ部分のセンスプライマーを用いる。また、鋳型であるｃＤＮＡの量や配列、ＰＣＲ条件によってはＣＭＶ−ｃＤＮＡ−ＧＦＰ−ポリＡ発現ベクター様ＤＮＡ断片の精製が必要になる場合もある。この場合は必要に応じて好適な手法により精製し、以降の実験に供する。
（Ｄ）　セルフのブラントライゲーションによる環状化を行う。
別法として、ライゲーション効率を挙げる為にＣＭＶ部分のセンスプライマーとＧＦＰポリＡ側のアンチセンスプライマーに制限酵素Ｃ（例えばＸｂａ　Ｉ）配列を組み込み、突出末端をもつＤＮＡ断片を用いる方法が挙げられる。
（１）接続サイト利用法（２）アニーリング法（３）ベクター利用法いずれの手法を用いた場合でも、数日から１週間を要してトランスフェクション用プラスミドＤＮＡをサブクローニングして調製する場合に比べ短時間でＣＭＶ−ｃＤＮＡ−ＧＦＰ−ポリＡ発現ベクター様ＤＮＡ断片を調製できる。また、環状化ＤＮＡは直鎖化ＤＮＡに比べ、培養２日目の生存率が３０−４０％高いため、ＣＭＶ−ｃＤＮＡ−ＧＦＰ−ポリＡ発現ベクター様ＤＮＡ断片の環状化は目的遺伝子ｃＤＮＡの発現及び機能検定に有効な材料を提供する。
【０００８】
【発明の効果】
本発明の方法に従うと、目的遺伝子が致死遺伝子のようなサブクローンを得にくい遺伝子であった場合でも、他の遺伝子と同等の作業内容および作業期間で発現検定を行うことが可能である。また、サブクローニング操作が不要であるため、発現検定までの期間が短縮され、１次スクリーニング等多種類の遺伝子についての発現検定に好適である。さらに直鎖のＰＣＲ産物を環状化することにより細胞内での導入ＤＮＡ断片の寿命を延ばすことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】接続サイト利用法についての簡単な説明図。
【図２】アニーリング法についての簡単な説明図。
【図３】ベクター利用法についての簡単な説明図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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