(57)【要約】【課題】同質遺伝子系統を対象とし、稲に同質遺伝子系統が配合されているかどうかの識別、及び、配合された同質遺伝子系統同士の識別を、導入形式に基づく検定によらずとも正確かつ簡便に行うことができ、かつ市場品の段階でも正確に、かつ簡便に行うことができる技術の提供、及び県産米と他県産米との識別や（県内の）特定の栽培地域の産米と（県内の）他の栽培地域の産米との識別を可能にする技術の提供。【解決手段】稲の交配系統に同一品種を５回以上戻し交配することによって育成した同質遺伝子系統（ＩＬ）を対象とし、試料である当該稲植物体、種子あるいはそれらの加工品から抽出・精製した鋳型ＤＮＡに、当該同質遺伝子系統に特異的なＤＮＡに含まれる塩基配列と相補的な塩基配列を有する識別用プライマーを共存させてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡの種類によって、試料中の同質遺伝子系統の有無を識別するとともに、試料中の同質遺伝子系統同士を互いに識別することを特徴とする稲の同質遺伝子系統識別方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
稲の交配系統に同一品種を５回以上戻し交配することによって育成した同質遺伝子系統を対象とし、試料である当該稲植物体、種子あるいはそれらの加工品から抽出・精製した鋳型ＤＮＡに、当該同質遺伝子系統に特異的なＤＮＡに含まれる塩基配列と相補的な塩基配列を有する識別用プライマーを共存させてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡの種類によって、試料中の同質遺伝子系統の有無を識別するとともに、試料中の同質遺伝子系統同士を互いに識別することを特徴とする稲の同質遺伝子系統識別方法。
【請求項２】
同質遺伝子系統が、コシヒカリのいもち病抵抗性同質遺伝子系統であることを特徴とする請求項１記載の同質遺伝子系統識別方法。
【請求項３】
識別用プライマーが、ＩＬＰ１（配列表の配列番号１記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号２記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるリバースプライマー）、ＩＬＰ２（配列表の配列番号３記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号４記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるリバースプライマー）、ＩＬＰ３（配列表の配列番号５記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号６記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるリバースプライマー）、ＩＬＰ４（配列表の配列番号７記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号８記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるリバースプライマー）、ＩＬＰ５（配列表の配列番号９記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号１０記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるリバースプライマー）、ＩＬＰ６（配列表の配列番号１１記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号１２記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるリバースプライマー）、ＩＬＰ７（配列表の配列番号１３記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号１４記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるリバースプライマー）、ＩＬＰ８（配列表の配列番号１５記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号１６記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるリバースプライマー）及びＩＬＰ９（配列表の配列番号１７記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号１８記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるリバースプライマー）から成るＳＴＳ化プライマー群の１種類あるいは２種類以上の組み合わせからなるプライマーであることを特徴とする請求項１又は２に記載の同質遺伝子系統識別方法。
【請求項４】
試料が籾、玄米、精米あるいは米粉であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の同質遺伝子系統識別方法。
【請求項５】
試料が米飯、餅あるいは米菓であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の同質遺伝子系統識別方法。
【請求項６】
１種又は複数の特定の同質遺伝子系統を配合して栽培した県内産稲品種について、前記特定の同質遺伝子系統が混合されていることを請求項１記載の同質遺伝子系統識別方法によって識別することによって、特定の同質遺伝子系統が混合していないか、もしくは混合割合が異なる他県産当該品種と識別することを特徴とする県産米と他県産米との識別方法。
【請求項７】
１種又は複数のコシヒカリのいもち病抵抗性同質遺伝子系統を配合して栽培した県内産コシヒカリについて、当該コシヒカリのいもち病抵抗性同質遺伝子系統が混合していることを請求項１記載の同質遺伝子系統識別方法によって識別することによって、当該同質遺伝子系統が混合していないか、もしくは混合割合が異なる他県産コシヒカリと識別することを特徴とする県産コシヒカリの識別方法。
【請求項８】
同一県内の複数の栽培地域で稲品種を栽培するにあたり、各栽培地域で１種又は複数の特定の同質遺伝子系統を特定割合で配合して栽培し、各地域産の当該稲品種に特定の同質遺伝子系統が特定割合で混合していることを請求項１記載の同質遺伝子系統識別方法によって判定することによって、当該品種の県産米栽培地域を判定することを特徴とする県産米の栽培地域の識別方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、同質遺伝子系統を対象とし、増幅したＤＮＡの種類によって試料中の同質遺伝子系統の有無を識別するとともに、当該系統同士を互いに識別することを特徴とする稲の同質遺伝子系統識別方法、当該識別方法を利用した県産米あるいは（県内）栽培地域の識別方法に関する。
より詳しくは、稲の交配系統に同一品種を５回以上戻し交配することによって育成した同質遺伝子系統（以下、ＩＬと略称することがある）を対象とし、試料である当該稲植物体、種子あるいはそれらの加工品から抽出・精製した鋳型ＤＮＡに、当該ＩＬに特異的なＤＮＡに含まれる塩基配列と相補的な塩基配列を有する識別用プライマーを共存させてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡの種類によって、試料中のＩＬの有無を識別するとともに、試料中のＩＬ同士を互いに識別することを特徴とする稲の同質遺伝子系統識別方法、同一県内で稲品種を栽培するにあたり、１種又は複数の特定のＩＬを配合して栽培し、県内産当該稲品種に特定のＩＬが配合されていることを上記識別方法によって識別することによって、他県産当該品種と識別することを特徴とする県産米と他県産米との識別方法、及び、（同一県内の）複数の栽培地域で稲品種を栽培するにあたり、各栽培地域で１種又は複数の特定のＩＬを特定割合で配合して栽培し、各地域産の当該稲品種に特定のＩＬが特定割合で混合していることを上記識別方法によって判定することによって、当該品種の（県産米）栽培地域を判定することを特徴とする県産米の栽培地域の識別方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
稲の同質遺伝子系統とは、一般に対象品種の特性を改良するために耐病性や耐冷性等の特定の形質のみを交配によって配合し、他の特性は当該品種の優れた特性のまま維持するために当該品種による戻し交配を繰り返した系統である。例としては、いもち病抵抗性を配合した同質遺伝子系統や白葉枯れ病抵抗性を配合した同質遺伝子系統などが挙げられる。
これらの同質遺伝子系統を識別するために、従来は、病害抵抗性などの導入形質に基づいた検定が必要とされており、籾、玄米、精米、米加工品などのような市場品の段階での識別は不可能とされてきた。また、同質遺伝子系統を配合しても、導入した遺伝子以外の基本特性、例えば稲の草型、粒型、成分などはきわめてよく類似しているために、導入形質に基づく検定であっても、同質遺伝子系統同士の識別や同質遺伝子系統を配合したか否かの有無の識別はきわめて困難であった。
【０００３】
また、コシヒカリやひとめぼれに代表される良食味米に対する市場でのニーズが強いが、最近では、品種のみならず、産地の表示も包装に義務づけられており、玄米や精米等の市場品を試料とする産地識別技術も必要とされている。従来は、稲の栽培地の土壌や水に影響される微量元素の相違による産地判別が試みられたことがあるが、東北産と九州産が同一グループに判別されたりして県産米の識別は困難とされてきた。さらに、同一県産米の中で魚沼や岩舟などの特定良食味産地を特定しようとするニーズもきわめて強いが、玄米や精米等の市場品を試料としてこれらの産地を識別することは不可能とされてきた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、同質遺伝子系統を対象とし、稲に同質遺伝子系統が配合されているかどうかの識別、及び、配合された同質遺伝子系統同士の識別を、導入形式に基づく検定によらなくとも正確、かつ簡便に行うことができ、しかも市場品の段階でも正確、かつ簡便に行うことができる技術を提供することである。
【０００５】
さらに、本発明の目的は、県産米と他県産米との識別や県内もしくは県外の特定の栽培地域の産米と他の栽培地域の産米との識別を可能にする技術を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねた。その結果、同質遺伝子系統のうち、特に、稲の交配系統に同一品種を５回以上戻し交配することによって育成したＩＬを対象とし、試料である稲植物体、種子あるいはそれらの加工品から抽出・精製した鋳型ＤＮＡに、適正プライマーを共存させてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡの種類によって試料中のＩＬの有無を識別するとともに、試料中のＩＬ同士を互いに正確、かつ識別することができることを見出し、本発明に到達した。
また、本識別技術を応用することにより、ＩＬの有無及び配合割合に基づいて県産米と他県産米との識別が可能であること、さらに、同様にＩＬの有無及び配合割合に基づいて試料米の栽培地域を識別することが可能であることを見いだし、本発明に到達した。
【０００７】
請求項１記載の本発明は、稲の交配系統に同一品種を５回以上戻し交配することによって育成したＩＬを対象とし、試料である当該稲植物体、種子あるいはそれらの加工品から抽出・精製した鋳型ＤＮＡに、当該ＩＬに特異的なＤＮＡに含まれる塩基配列と相補的な塩基配列を有する識別用プライマーを共存させてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡの種類によって、試料中のＩＬの有無を識別するとともに、試料中のＩＬ同士を互いに識別することを特徴とする稲の同質遺伝子系統識別方法である。
請求項２記載の本発明は、同質遺伝子系統が、コシヒカリのいもち病抵抗性同質遺伝子系統であることを特徴とする請求項１記載の同質遺伝子系統識別方法である。
【０００８】
請求項３記載の本発明は、識別用プライマーが、ＩＬＰ１（配列表の配列番号１記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号２記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるリバースプライマー）、ＩＬＰ２（配列表の配列番号３記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号４記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるリバースプライマー）、ＩＬＰ３（配列表の配列番号５記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号６記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるリバースプライマー）、ＩＬＰ４（配列表の配列番号７記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号８記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるリバースプライマー）、ＩＬＰ５（配列表の配列番号９記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号１０記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるリバースプライマー）、ＩＬＰ６（配列表の配列番号１１記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号１２記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるリバースプライマー）、ＩＬＰ７（配列表の配列番号１３記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号１４記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるリバースプライマー）、ＩＬＰ８（配列表の配列番号１５記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号１６記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるリバースプライマー）及びＩＬＰ９（配列表の配列番号１７記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号１８記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるリバースプライマー）から成るＳＴＳ化プライマー群の１種類あるいは２種類以上の組み合わせからなるプライマーであることを特徴とする請求項１又は２に記載の同質遺伝子系統識別方法である。
【０００９】
請求項４記載の本発明は、試料が籾、玄米、精米あるいは米粉であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の同質遺伝子系統識別方法である。
請求項５記載の本発明は、試料が米飯、餅あるいは米菓であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の同質遺伝子系統識別方法である。
【００１０】
請求項６記載の本発明は、１種又は複数の特定のＩＬを配合して栽培した県内産稲品種について、前記特定のＩＬが混合されていることを請求項１記載の同質遺伝子系統識別方法によって識別することによって、特定のＩＬが混合していないか、もしくは混合割合が異なる他県産当該品種と識別することを特徴とする県産米と他県産米との識別方法である。
請求項７記載の本発明は、１種又は複数のコシヒカリのいもち病抵抗性同質遺伝子系統を配合して栽培した県内産コシヒカリについて、当該コシヒカリのいもち病抵抗性同質遺伝子系統が混合していることを請求項１記載の同質遺伝子系統識別方法によって識別することによって、当該同質遺伝子系統が混合していないか、もしくは混合割合が異なる他県産コシヒカリと識別することを特徴とする県産コシヒカリの識別方法である。
請求項８記載の本発明は、同一県内の複数の栽培地域で稲品種を栽培するにあたり、各栽培地域で１種又は複数の特定のＩＬを特定割合で配合して栽培し、各地域産の当該稲品種に特定のＩＬが特定割合で混合していることを請求項１記載の同質遺伝子系統識別方法によって判定することによって、当該品種の県産米栽培地域を判定することを特徴とする県産米の栽培地域の識別方法である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下において、本発明を詳細に説明する。
請求項１記載の本発明の同質遺伝子系統識別方法は、稲の交配系統に同一品種を５回以上戻し交配することによって育成した同質遺伝子系統（ＩＬ）を対象とし、試料である当該稲植物体、種子あるいはそれらの加工品から抽出・精製した鋳型ＤＮＡに、当該ＩＬに特異的なＤＮＡに含まれる塩基配列と相補的な塩基配列を有する識別用プライマーを共存させてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡの種類によって、試料中のＩＬの有無を識別するとともに、試料中のＩＬ同士を互いに識別することを特徴とする。
請求項１記載の本発明の同質遺伝子系統識別方法の対象は稲であり、品種は特に限定されず、例えばコシヒカリ、ササニシキ、ひとめぼれ、ヒノヒカリ、あきたこまち、きらら３９７、キヌヒカリ、ほしのゆめ、はえぬき、むつほまれ、日本晴などを対象とすることができる。
【００１２】
ここで、本発明における同質遺伝子系統（ＩＬ）とは、稲の交配系統に同一品種を５回以上戻し交配することによって育成した系統、即ち、対象品種の特性を改良するために耐病性や耐冷性等の特定の形質のみを交配によって導入し、他の特性は当該品種の優れた特性のまま維持するために当該品種による戻し交配を繰５回以上くり返した系統である。
戻し交配とは、交配した片方の親品種を交配して得られた子品種に再度交配することを言い、本発明においては５回以上、好ましくは７回以上繰り返すものを用いることが必要である。一回の交配で遺伝子の５０％が組み換わり、（０．５）５＝０．０３１２となるので、５回戻し交配して育成した試料の遺伝子は、９６％以上が戻し交配した品種の遺伝子と同一であり、３．２％未満のみが導入された遺伝子と考えられる。
このように、同質遺伝子系統（ＩＬ）は、遺伝子の大部分が同質であるので、導入した遺伝子以外の基本特性、例えば稲の草型、粒型、成分などはきわめてよく類似している。そのため、前述のように、従来の方法では同質遺伝子系統の識別はきわめて困難とされてきたものである。
【００１３】
同質遺伝子系統（ＩＬ）の例としては、いもち病抵抗性を導入した同質遺伝子系統のほか、白葉枯れ病抵抗性を導入した同質遺伝子系統などが挙げられるが、本発明の識別方法においては、これらの中でも特に、請求項２に記載するように、コシヒカリのいもち病抵抗性同質遺伝子系統を対象とすることが好ましい。
コシヒカリのいもち病抵抗性同質遺伝子系統とは、いもち病の病原菌に対して抵抗性を示す品種を交配することによって抵抗性遺伝子を導入し、その後、コシヒカリを５回以上戻し交配することによって、基本特性はコシヒカリに近く、いもち病に対しては抵抗性を有する系統のことである。いもち病の病原菌は数種類の異なる菌株（レース）があり、１種類の抵抗性遺伝子では全ての菌株に対して抵抗性を期待することが不可能であるので、４〜８種類の異なる抵抗性遺伝子をそれぞれ別の系統に導入し、戻し交配することによって４〜８種類のコシヒカリのいもち病抵抗性同質遺伝子系統が育成されている。このような８種類のコシヒカリのいもち病抵抗性同質遺伝子系統を以下ＩＬ１〜ＩＬ８と呼ぶことにする。
【００１４】
請求項１に記載の本発明の同質遺伝子系統識別方法においては、試料である稲植物体、種子あるいはそれらの加工品から抽出・精製した鋳型ＤＮＡに、当該同質遺伝子系統に特異的なＤＮＡに含まれる塩基配列と相補的な塩基配列を有する識別用プライマーを共存させてＰＣＲを行う。
ここで、本発明におけるＰＣＲとは、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎの略称であり、遺伝子の本体であるＤＮＡを、９４〜９８℃における「変性」（ＤＮＡの２本鎖を１本鎖に分離する）、３６〜７２℃の「アニーリング」（プライマーが相補性に従ってＤＮＡに結合する）、７０〜７５℃の「伸長」（プライマーがＤＮＡに結合して２本鎖になった部分からＤＮＡ鎖を伸ばしていく）という３段階の工程を２０〜５０サイクル繰り返すことによって１００万倍から１０兆倍程度にＤＮＡを増幅する操作を指す。
【００１５】
本発明における鋳型ＤＮＡとは、試料である稲植物体、種子あるいはそれらの加工品のＤＮＡを指し、ＰＣＲにおいてプライマーが結合し、増幅されるものをいう。鋳型ＤＮＡの試料からの抽出・精製は、ＣＴＡＢ法、酵素法、アルカリＳＤＳ法等によって行うことができる。
【００１６】
本発明における識別用プライマーは、当該同質遺伝子系統に特異的なＤＮＡに含まれる塩基配列（同質遺伝子系統同士で相違する部分）と相補的な塩基配列を有することにより、ＰＣＲの結果同質遺伝子系統の種類によって増幅ＤＮＡの分子量が相違するように設計されるものである。増幅ＤＮＡの分子量が相違するようにすることにより、同質遺伝子系統の有無による塩基配列の相違や同質遺伝子系統同士の塩基配列の相違がわずかであっても、後述の増幅したＤＮＡの種類による識別を正確に行うことができる。
識別用プライマーは１０量体から５０量体の遺伝子断片であり、ＰＣＲにおいて、試料から抽出・精製した鋳型ＤＮＡの特定部位に結合することによって２本鎖を形成し、ＤＮＡポリメラーゼによる遺伝子伸長の開始点となる。
【００１７】
このような識別用プライマーとしては、同質遺伝子系統に特異的なＤＮＡに含まれる塩基配列（同質遺伝子系統同士で相違する部分）のみが増幅されるように５’側及び３’側の両側から識別バンドＤＮＡを挟み込む形で塩基配列を設計したフォワード・リバースの対をなすプライマー（対合プライマー）であるＳＴＳ化プライマーが好ましい。
ＳＴＳ化プライマーの設計は、例えば、後述の増幅したＤＮＡの種類の識別を電気泳動による検出結果によった場合に、同質遺伝子系統に特異的な識別バンドからＤＮＡを抽出してその塩基配列を決定し、ＰＣＲにおいて当該ＤＮＡのみが増幅されるように５’側及び３’側の両側から当該ＤＮＡを挟み込むような形で行うことができる。ＳＴＳ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｔａｇｇｅｄ　Ｓｉｔｅ）化プライマーの構成塩基の残基数は、通常は８〜３０量体のものが使用される。
【００１８】
より具体的には、請求項３に記載するように、ＩＬＰ１（配列表の配列番号１記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号２記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるリバースプライマー）、ＩＬＰ２（配列表の配列番号３記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号４記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるリバースプライマー）、ＩＬＰ３（配列表の配列番号５記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号６記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるリバースプライマー）、ＩＬＰ４（配列表の配列番号７記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号８記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるリバースプライマー）、ＩＬＰ５（配列表の配列番号９記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号１０記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるリバースプライマー）、ＩＬＰ６（配列表の配列番号１１記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号１２記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるリバースプライマー）、ＩＬＰ７（配列表の配列番号１３記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号１４記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるリバースプライマー）、ＩＬＰ８（配列表の配列番号１５記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号１６記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるリバースプライマー）及びＩＬＰ９（配列表の配列番号１７記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号１８記載の塩基配列或いは該配列の一部からなるリバースプライマー）から成るＳＴＳ化プライマー群の１種類あるいは２種類以上の組み合わせからなるプライマーであることが好ましい。
これらのＳＴＳ化プライマーは、上述したコシヒカリのいもち病抵抗性同質遺伝子系統ＩＬ１〜ＩＬ８のそれぞれに特異的な識別バンドから抽出したＤＮＡに対応して設計したものである。各ＳＴＳ化プライマーのコシヒカリのいもち病抵抗同質遺伝子系統に対する識別性をまとめたものを第１表に示す。
【００１９】
【表１】
第１表〔各ＳＴＳ化プライマーの識別性〕
2004141079.tif 000002
＋：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが出現することを示す。
−：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが出現しないことを示す。
ＤＮＡの長さの単位はｋｂｐである。
【００２０】
各種のＳＴＳ化プライマーの識別性については、下記のとおりである。
（１）識別バンドＩＬＰ１（０．７ｋｂｐ）
このバンドは、ＳＴＳ化プライマーＩＬＰ１共存下のＰＣＲにおいて、コシヒカリ同質遺伝子系統に普遍的に出現するが、ＩＬ３のみには特異的に出現しない。
（２）識別バンドＩＬＰ２（０．８ｋｂｐ）
このバンドは、ＳＴＳ化プライマーＩＬＰ２共存下のＰＣＲにおいて、コシヒカリ同質遺伝子系統に普遍的に出現しないが、ＩＬ５のみには特異的に出現する。
（３）識別バンドＩＬＰ３（０．７ｋｂｐ）
このバンドは、ＳＴＳ化プライマーＩＬＰ３共存下のＰＣＲにおいて、コシヒカリ同質遺伝子系統に普遍的に出現するが、ＩＬ６のみには特異的に出現しない。
（４）識別バンドＩＬＰ４（０．３ｋｂｐ）
このバンドは、ＳＴＳ化プライマーＩＬＰ４共存下のＰＣＲにおいて、コシヒカリ同質遺伝子系統に普遍的に出現しないが、ＩＬ１及びＩＬ２のみには特異的に出現する。
（５）識別バンドＩＬＰ５（０．５ｋｂｐ）
このバンドは、ＳＴＳ化プライマーＩＬＰ５共存下のＰＣＲにおいて、コシヒカリ同質遺伝子系統に普遍的に出現するが、ＩＬ４及びＩＬ７のみには特異的に出現しない。
（６）識別バンドＩＬＰ６（０．６ｋｂｐ）
このバンドは、ＳＴＳ化プライマーＩＬＰ６共存下のＰＣＲにおいて、コシヒカリ同質遺伝子系統に普遍的に出現するが、コシヒカリ及びＩＬ７のみには特異的に出現しない。
（７）識別バンドＩＬＰ７（１．０ｋｂｐ）
このバンドは、ＳＴＳ化プライマーＩＬＰ７共存下のＰＣＲにおいて、コシヒカリ同質遺伝子系統に普遍的に出現しないが、ＩＬ３のみには特異的に出現する。
（８）識別バンドＩＬＰ８（１．６ｋｂｐ）
このバンドは、ＳＴＳ化プライマーＩＬＰ８共存下のＰＣＲにおいて、コシヒカリ同質遺伝子系統に普遍的に出現しないが、ＩＬ２のみには特異的に出現する。
（９）識別バンドＩＬＰ９（０．４ｋｂｐ）
このバンドは、ＳＴＳ化プライマーＩＬＰ９共存下のＰＣＲにおいて、コシヒカリ同質遺伝子系統に普遍的に出現するが、コシヒカリには特異的に出現しない。
【００２１】
なお、上記ＩＬＰ１〜９のうち、各配列の一部からなるものを設計する場合には、各配列の１５〜４０塩基、好ましくは１５〜３０塩基を任意に選択して行うことができる。例えば、各配列番号の５’末端側から１５〜４０塩基、好ましくは１５〜３０塩基を選択して行う。
また、本発明で用いるＳＴＳ化プライマーは、上記したＳＴＳ化プライマーに限定されるものではなく、識別性、識別バンドの位置あるいは融解温度の点で使用可能なプライマーを新たに設計して使用することもできる。
【００２２】
請求項１記載の本発明の同質遺伝子系統識別方法において、試料としては、同質遺伝子系統に対応する稲の品種の植物体、種子あるいはそれらの加工品を用いることができるが、特に、従来の方法で識別は不可能とされていた請求項４に記載するような、籾、玄米、精米あるいは米粉といった加工品（市場品）をも用いることができる。これらの加工品（市場品）からの鋳型ＤＮＡの抽出法としては、ＣＴＡＢ法が最適であり、また、簡易炊飯した後に酵素法で抽出・精製することも可能である。
【００２３】
また、請求項４に記載するような籾、玄米、精米あるいは米粉といった加工品（市場品）をさらに加工したもの、即ち、請求項５に記載するような米飯、餅あるいは米菓を試料とすることも可能である。これらの加工品（これらも市場品ともなりうる）の場合には、特許第３０４８１４９号に記載されたアミラーゼ処理及びプロテアーゼ処理を行う酵素法によって、試料から鋳型ＤＮＡを抽出・精製することが可能である。
【００２４】
請求項１記載の本発明の同質遺伝子系統識別方法においては、上述のようなＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡの種類によって試料中の同質遺伝子系統の有無を識別するとともに、試料に導入された同質遺伝子系統同士を互いに識別する。
具体的には例えば、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡを、アガロースゲルあるいはポリアクリルアミドゲルを用いる電気泳動等による検出結果において、識別することができる。
電気泳動では、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡがアガロースやポリアクリルアミドのゲル中を直流電圧の負荷の下で陽極に引かれて移動する際に、ＤＮＡの分子量の相違に応じて分離され、臭化エチジウムによって帯状に染色されて同質遺伝子系統間の相違を示す識別用ＤＮＡバンドとして可視化され、増幅されたＤＮＡの相違が検出される。
【００２５】
請求項１記載の本発明の同質遺伝子系統識別方法は、上述のような特色を有するものであり、これによって、試料中の同質遺伝子系統の有無を識別するとともに、試料中に配合された同質遺伝子系統同士を互いに識別することができる。
このような、請求項１記載の本発明の同質遺伝子系統識別方法を応用することにより、県産米と他県産米との識別が可能となる。
すなわち、請求項６記載の本発明の県産米と他県産米との識別方法のように、１種又は複数の特定のＩＬを配合して栽培した県内産稲品種について、前記特定のＩＬが混合されていることを請求項１記載の同質遺伝子系統識別方法によって識別することによって、特定のＩＬが混合していないか、もしくは混合割合が異なる他県産当該品種と識別することができる。
例えば、請求項７記載の本発明の県産コシヒカリの識別方法のように、１種又は複数のコシヒカリのいもち病抵抗性同質遺伝子系統を配合して栽培した県内産コシヒカリについて、当該コシヒカリのいもち病抵抗性同質遺伝子系統が混合していることを請求項１記載の同質遺伝子系統識別方法によって識別することによって、当該同質遺伝子系統が混合していないか、もしくは混合割合が異なる他県産コシヒカリと識別することができる。
【００２６】
具体例としてコシヒカリにいもち病抵抗性同質遺伝子系統の一つであるＩＬ１を配合して栽培した場合で説明すると、試料米各１粒ごとにＤＮＡを抽出して鋳型ＤＮＡとし、プライマーとしてＩＬＰ６共存下でＰＣＲを行い、電気泳動及び臭化エチジウム染色によって増幅ＤＮＡを検出すると、他県産米はコシヒカリのみ（ＩＬ１は配合されていない）であるので０．６ｋｂｐの識別バンドが出現しないが、当該県産米の場合は、ＩＬ１に起因して０．６ｋｂｐの識別バンドが出現するので、他県産コシヒカリと識別することが可能である。
【００２７】
また別の具体例としてコシヒカリにいもち病抵抗性同質遺伝子系統の一つであるＩＬ４を配合して栽培した場合で説明すると、試料米各１粒ごとにＤＮＡを抽出して鋳型ＤＮＡとし、プライマーとしてＩＬＰ５共存下でＰＣＲを行い、電気泳動及び臭化エチジウム染色によって増幅ＤＮＡを検出すると、他県産米はコシヒカリのみ（ＩＬ４は配合されていない）であるので０．５ｋｂｐの識別バンドが出現するが、当該県産米の場合は、ＩＬ４に起因して０．５ｋｂｐの識別バンドが出現しない粒が混合して出現するので、他県産コシヒカリと互いに識別することが可能である。
【００２８】
また、請求項１記載の本発明の同質遺伝子系統識別方法によって、同一県内の特定の栽培地域の産米と他の栽培地域の産米との識別も可能となる。
すなわち、請求項８記載の本発明の識別方法のように、同一県内の複数の栽培地域で稲品種を栽培するにあたり、各栽培地域で１種又は複数の特定のＩＬを特定割合で配合して栽培し、各地域産の当該稲品種に特定のＩＬが特定割合で混合していることを請求項１記載の同質遺伝子系統識別方法によって判定することによって、当該品種の県産米栽培地域を判定することができる。
【００２９】
例えば当該県において、Ａ地域ではコシヒカリ、ＩＬ１及びＩＬ２を１：１：１の割合で配合して栽培し、Ｂ地域では１：２：１の割合で配合して栽培した場合、収穫された米各１粒ごとにＤＮＡを抽出して鋳型とし、ＩＬＰ４及びＩＬＰ８共存下でＰＣＲを行い、電気泳動及び臭化エチジウム染色を行って増幅ＤＮＡを検出すると、Ａ地域の米にはＩＬＰ４及びＩＬＰ８のどちらも識別バンドが出現しない米（コシヒカリ）、ＩＬＰ４では０．３ｋｂｐの識別バンドが出現するがＩＬＰ８では識別バンドが出現しない米（ＩＬ１）及びＩＬＰ４、ＩＬＰ８のどちらの場合も０．３ｋｂｐあるいは１．６ｋｂｐの識別バンドが出現する米（ＩＬ２）の割合が１：１：１であるのに対し、Ｂ地域では割合が１：２：１となるので栽培地域を識別することができる。
【００３０】
【実施例】
以下、実施例により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１（コシヒカリのいもち病抵抗性同質遺伝子系統の識別）
新潟県産のコシヒカリ、コシヒカリのいもち病抵抗性同質遺伝子系統ＩＬ１及び同ＩＬ２の３種類の米を試料とした。試料玄米を試験用精米機（山本製作所製、ライスパルＶＰ３１Ｔ）を用いて歩留まり９０％に精白して精米を得た。
【００３１】
精米試料を超遠心粉砕器（レッチェ社製）を用いて粉砕し、その６ｇからＣＴＡＢ法によってゲノムＤＮＡを抽出・精製した。すなわち、７０℃の２％ＣＴＡＢ溶液（０．１Ｍトリス塩酸、２ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二ナトリウム、１．４Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）６ｍｌを加えて撹拌し、５５℃の恒温槽に入れ、上記ＣＴＡＢ溶液（１％溶液）６ｍｌを加え、３０分間ＤＮＡを抽出した。その後、ＤＮＡ抽出液にクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を加えて撹拌した後、遠心分離して上清をとり、ＤＮＡ沈殿液（１％ＣＴＡＢ、２０ｍＭトリス塩酸、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を加えて４℃で一晩静置してＤＮＡを沈殿させた。その後、遠心分離して得られたＤＮＡ沈殿物に１Ｍ　ＮａＣｌによって抽出し、イソプロピルアルコール、エタノールによる洗浄、沈殿の後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）２００μｌに溶解してＤＮＡ試料液とした。
【００３２】
抽出したＤＮＡを鋳型とし、識別用ＤＮＡバンドＩＬＰ４及びＩＬＰ８の２種類に対応するＳＴＳ化プライマーを用いてＰＣＲ沈殿を４０μｌの１０倍希釈ＴＥに溶解してＤＮＡ試料液とした。
ＰＣＲは以下のように行った。ＰＣＲの反応液組成は、ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ（株）製Ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ））０．２μｌ、反応用緩衝液（１２ｍＭトリス塩酸、６０ｍＭ　ＫＣｌ、ｐＨ８．３）２．５μｌ、ＭｇＣｌ２２．０μｌ、鋳型ＤＮＡ２００ｎｇ／１μｌ、ｄＮＴＰｓ（１００μＭ）１μｌを混合し、ＰＣＲに用いるＳＴＳ化プライマーとして、配列表の配列番号７に記載された塩基配列の１番目〜２９番目の配列からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号８に記載された塩基配列の１番目〜２７番目の配列からなるリバースプライマーの組合せからなるＩＬＰ４　各０．４μｌ、あるいは配列表の配列番号１５に記載された塩基配列の１番目〜２２番目の配列からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号１６に記載された塩基配列の１番目〜２７番目の配列からなるリバースプライマーの組合せからなるＩＬＰ８　各０．５μｌを使用し、滅菌水を加えて合計２５μｌとした。反応装置はタカラバイオ（株）製ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰを使用し、変性（９４℃、１分）、アニーリング（６２℃、１分）、伸長（７２℃、２分）を３５サイクル反応させた。増幅ＤＮＡの電気泳動はコスモバイオ（株）製ミューピッドＩＩを使用し、２％アガロースゲルで４０分間泳動し、臭化エチジウム染色後の紫外線照射によりバンドパターンを検出した。各試料の各プライマーによる識別結果を第２表に示す。また、図１及び２にＳＴＳ化プライマーＩＬＰ４及びＩＬＰ８のそれぞれが共存した場合のＰＣＲにより増幅されたＤＮＡの電気泳動の結果を示した。図１及び２中、Ｍは分子量マーカーを示し、レーン１はコシヒカリの結果を示し、レーン２及び３はそれぞれコシヒカリのいもち病抵抗性同質遺伝子系統ＩＬ１及びＩＬ２の結果を示す。
【００３３】
【表２】
第２表〔コシヒカリのいもち病抵抗性同質遺伝子系統の識別結果〕
2004141079.tif 000003
＋：識別バンドが出現
−：識別バンドが出現せず
【００３４】
第２表、図１及び図２から明らかなように、コシヒカリのみの場合（すなわち、同質遺伝子系統が配合されていない場合）はどちらのＳＴＳ化プライマーの場合も識別バンドが出現しなかった。一方、ＩＬ１の場合はＳＴＳ化プライマーＩＬＰ４共存下でＰＣＲを行った場合のみ識別バンドが出現し、ＩＰ８共存下でＰＣＲを行った場合には識別バンドが出現しなかった。一方、ＩＬ２の場合はＳＴＳ化プライマーＩＬＰ４及びＩＬＰ８のどちらの共存下でＰＣＲを行った場合にも識別バンドが出現した。
このような実施例１の結果から、ＳＴＳ化プライマーとしてＩＬＰ４及びＩＬＰ８を用いることにより、コシヒカリのみ、或いは、ＩＬ１及びＩＬ２の２種類の同質遺伝子系統同士を互いに識別することが可能であることが明らかとなった。
【００３５】
実施例２（当該県産米と他県産米との識別）
特定のＩＬを配合して栽培した県内産コシヒカリに特定のＩＬが混合されていることを請求項１記載の同質遺伝子系統識別方法によって識別することによって、県内産コシヒカリと他県産コシヒカリとを識別することができるか否かを確認すべく、以下の試験を行った。
コシヒカリにＩＬ４を配合して栽培し、試料米各１粒ごとにＤＮＡを抽出して鋳型ＤＮＡとし、ＳＴＳ化プライマーＩＬＰ５（配列表の配列番号１０及び１１参照）共存下でＰＣＲを行い、電気泳動及び臭化エチジウム染色によって増幅ＤＮＡを検出した。栽培、ＤＮＡの抽出・精製、ＰＣＲ及び検出の条件は、実施例１と同様とした。
その結果、他県産コシヒカリは同質遺伝子系統を含まないので０．５ｋｂｐの識別バンドが出現するが、新潟県産コシヒカリの場合は、ＩＬ４に起因して０．５ｋｂｐの識別バンドが出現しない粒が混合して出現した。
このことから、請求項１記載の同質遺伝子系統識別方法によって、ＩＬ４を混合した県産コシヒカリと、同質遺伝子系統を含まない他県産コシヒカリとを識別することができることが明らかとなった。
【００３６】
実施例３（当該県内における栽培地域の識別）
新潟県内の複数の栽培地域で稲品種を栽培するにあたり、各栽培地域で１種又は複数の特定のＩＬを特定割合で配合して栽培し、各地域産の当該稲品種に特定のＩＬが特定割合で混合していることを請求項１記載の同質遺伝子系統識別方法によって判定することによって、当該品種の（県産米）栽培地域を判定することができるか否かを確認すべく、以下の試験を行った。
【００３７】
新潟県において、試験圃場Ａではコシヒカリ、ＩＬ１及びＩＬ２を１：１：１の割合で配合して栽培し、試験圃場Ｂでは１：２：１の割合で配合して栽培した。収穫された米各１粒ごとにＤＮＡを抽出して鋳型とし、ＩＬＰ４及びＩＬＰ８共存下でＰＣＲを行い、電気泳動及び臭化エチジウム染色を行って増幅ＤＮＡを検出した。栽培、ＤＮＡの抽出・精製、ＰＣＲ及び検出の条件は、実施例１と同様とした。
【００３８】
その結果、Ａ圃場の米にはＩＬＰ４及びＩＬＰ８のどちらも識別バンドが出現しない米（コシヒカリ）、ＩＬＰ４では０．３ｋｂｐの識別バンドが出現するがＩＬＰ８では識別バンドが出現しない米（ＩＬ１）及びＩＬＰ４、ＩＬＰ８のどちらの場合も０．３ｋｂｐあるいは１．６ｋｂｐの識別バンドが出現する米（ＩＬ２）の割合が１：１：１であったのに対し、Ｂ圃場では割合が１：２：１となった。
このことから、請求項１記載の同質遺伝子系統識別方法によって栽培地域を識別することができることが明らかとなった。
【００３９】
実施例４（米飯粒１粒を試料とする識別例）
コシヒカリ及び８種類のコシヒカリのいもち病抵抗性同質遺伝子系統ＩＬ１〜ＩＬ８の精米試料を１粒ずつプラスチックチューブ（アシスト、１．５ｍｌ容）に取り、脱イオン水３５μｌを加え、スタンドに立てて１時間浸漬した後、開封状態で電気炊飯器（東芝製、ＲＣ−１８３、外釜に脱イオン水７５ｍｌ添加）にて１５分間炊飯し、１５分間蒸らし、米飯試料とした。
【００４０】
ＤＮＡの抽出・精製は下記のように行った。試料米飯各１粒をマイクロチューブに取り、トリス／塩酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ　ＮａＣｌ含有）３００μｌを加え、ペレットミキサーで粉砕した。次いで耐熱性アミラーゼ（シグマ製α−アミラーゼ，７９０ｕｎｉｔｓ／ｍｇ　ｓｏｌｉｄ，１ｍｇ／ｍｌ）を５μｌ添加し、６０℃で１時間反応させた。次いでＴｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ　ａｌｂｕｍ由来のプロテアーゼＫ（オンコー製，２０ｍｇ／ｍｌ）を５μｌ添加し、３７℃で２時間反応させた。酵素反応終了後、−２０℃に冷却したエタノール１ｍｌを添加し、−２０℃で１５分間静置した後、微量遠心機で遠心分離（１５０００Ｇ、４℃、１５分間、以下同様）し、沈殿を得た。この沈殿を３００μｌのＴＥ（１０ｍＭトリス／塩酸、ｐＨ８．０、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に溶解し、フェノール４００μｌを加え、回転撹拌機で３０分間ＤＮＡを抽出した。次いで遠心分離（１５０００Ｇ、４℃、１５分間）して上清を採取し、等量のＰＣＩ（フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール：２５／２４／１）を加え、３０分間抽出し、遠心分離（１５０００Ｇ、４℃、１５分間）して得た上清に５Ｍ　ＮａＣｌを６ｍｌ添加し、冷却したエタノール４００μｌを加え、遠心分離して得た沈殿を７０％エタノールで２回洗浄し、最後の沈殿を４０μｌの１０倍希釈ＴＥに溶解してＤＮＡ試料液とした。
【００４１】
ＰＣＲは以下のように行った。ＰＣＲの反応液組成は、ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ（株）製Ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ））０．２μｌ、反応用緩衝液（１２ｍＭトリス塩酸、６０ｍＭ　ＫＣｌ、ｐＨ８．３）２．５μｌ、ＭｇＣｌ２２．０μｌ、鋳型ＤＮＡ２００ｎｇ／１μｌ、ｄＮＴＰｓ（１００μＭ）１μｌを混合し、ＰＣＲに用いるＳＴＳ化プライマーとして、配列表の配列番号１に記載された塩基配列の１番目〜１９番目の配列からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号２に記載された塩基配列の１番目〜１６番目の配列からなるリバースプライマーの組合せからなるＩＬＰ１を各０．４μｌ、配列表の配列番号３に記載された塩基配列の１番目〜２８番目の配列からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号４に記載された塩基配列の１番目〜２４番目の配列からなるリバースプライマーの組合せからなるＩＬＰ２を各０．５μｌ、配列表の配列番号５に記載された塩基配列の１番目〜２９番目の配列からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号６に記載された塩基配列の１番目〜２３番目の配列からなるリバースプライマーの組合せからなるＩＬＰ３を各０．６μｌ、配列表の配列番号７に記載された塩基配列の１番目〜２９番目の配列からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号８に記載された塩基配列の１番目〜２７番目の配列からなるリバースプライマーの組合せからなるＩＬＰ４を各０．５μｌ、配列表の配列番号９に記載された塩基配列の１番目〜２０番目の配列からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号１０に記載された塩基配列の１番目〜１５番目の配列からなるリバースプライマーの組合せからなるＩＬＰ５を各０．４μｌ、配列表の配列番号１１に記載された塩基配列の１番目〜２８番目の配列からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号１２に記載された塩基配列の１番目〜２４番目の配列からなるリバースプライマーの組合せからなるＩＬＰ６を各０．４μｌ、配列表の配列番号１３に記載された塩基配列の１番目〜１７番目の配列からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号１４に記載された塩基配列の１番目〜１８番目の配列からなるリバースプライマーの組合せからなるＩＬＰ７を各０．５μｌ、配列表の配列番号１５に記載された塩基配列の１番目〜２２番目の配列からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号１６に記載された塩基配列の１番目〜２７番目の配列からなるリバースプライマーの組合せからなるＩＬＰ８を各０．５μｌ、配列表の配列番号１７に記載された塩基配列の１番目〜２８番目の配列からなるフォワードプライマー及び配列表の配列番号１８に記載された塩基配列の１番目〜２６番目の配列からなるリバースプライマーの組合せからなるＩＬＰ９を各０．５μｌ使用し、滅菌水を加えて合計２５μｌとした。反応装置はタカラバイオ（株）製ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰを使用し、変性（９４℃、１分）、アニーリング（６２℃、１分）、伸長（７２℃、２分）を３５サイクル反応させた。増幅ＤＮＡの電気泳動はコスモバイオ（株）製ミューピッドＩＩを使用し、２％アガロースゲルで４０分間泳動し、臭化エチジウム染色後の紫外線照射によりバンドパターンを検出し��。
【００４２】
各ＳＴＳ化プライマーの識別性を第３表に示した。また、図３〜１１にＳＴＳ化プライマーＩＬＰ１〜ＩＬＰ９のそれぞれが共存した場合のＰＣＲにより増幅されたＤＮＡの電気泳動の結果を示した。図３〜１１中、Ｍは分子量マーカーを示し、レーン１はコシヒカリの結果を示し、レーン２〜８はそれぞれコシヒカリのいもち病抵抗性同質遺伝子系統ＩＬ１〜ＩＬ８の結果を示す。
【００４３】
【表３】
第３表〔米飯粒一粒を試料とした場合の各ＳＴＳ化プライマーの識別性〕
2004141079.tif 000004
＋：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが出現することを示す。
−：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが出現しないことを示す。
ＤＮＡの長さの単位はｋｂｐである。
【００４４】
第３表及び図３〜１１から、以下のことが分かる。
第３表及び図３から、ＳＴＳ化プライマーＩＬＰ１共存下のＰＣＲにおいて、コシヒカリ同質遺伝子系統に識別バンドが出現するが、ＩＬ３のみには特異的に出現しないことが分かる。従って、ＩＬ３と他の同質遺伝子系統との相違がＩＬＰ１によって示されることが明らかである。
【００４５】
第３表及び図４から、ＳＴＳ化プライマーＩＬＰ２共存下のＰＣＲにおいて、コシヒカリ同質遺伝子系統には識別バンドが普遍的に出現しないが、ＩＬ５のみには特異的に出現することが分かる。従って、ＩＬ５と他の同質遺伝子系統との相違がＩＬＰ２によって示されることが明らかである。
【００４６】
第３表及び図５から、ＳＴＳ化プライマーＩＬＰ３共存下のＰＣＲにおいて、コシヒカリ同質遺伝子系統に識別バンドが普遍的に出現するが、ＩＬ６のみには特異的に出現しないことが分かる。従って、ＩＬ６と他の同質遺伝子系統との相違がＩＬＰ３によって示されることが明らかである。
【００４７】
第３表及び図６から、ＳＴＳ化プライマーＩＬＰ４共存下のＰＣＲにおいて、コシヒカリ同質遺伝子系統に識別バンドが普遍的に出現しないが、ＩＬ１及びＩＬ２のみには特異的に出現することが分かる。従って、ＩＬ１及びＩＬ２と他の同質遺伝子系統との相違がＩＬＰ４によって示されることが明らかである。
【００４８】
第３表及び図７から、ＳＴＳ化プライマーＩＬＰ５共存下のＰＣＲにおいて、コシヒカリ同質遺伝子系統に識別バンドが普遍的に出現するが、ＩＬ４及びＩＬ７のみには特異的に出現しないことが分かる。従って、ＩＬ４と他の同質遺伝子系統との相違がＩＬＰ５によって示されることが明らかである。
【００４９】
第３表及び図８から、ＳＴＳ化プライマーＩＬＰ６共存下のＰＣＲにおいて、コシヒカリ同質遺伝子系統に識別バンドが普遍的に出現するが、コシヒカリ及びＩＬ７のみには特異的に出現しないことが分かる。従って、ＩＬ７と他の同質遺伝子系統との相違がＩＬＰ６によって示されることが明らかである。
【００５０】
第３表及び図９から、ＳＴＳ化プライマーＩＬＰ７共存下のＰＣＲにおいて、コシヒカリ同質遺伝子系統に識別バンドが普遍的に出現しないが、ＩＬ３のみには特異的に出現することが分かる。従って、ＩＬ３と他の同質遺伝子系統との相違がＩＬＰ７によって示されることが明らかである。
【００５１】
第３表及び図１０から、ＳＴＳ化プライマーＩＬＰ８共存下のＰＣＲにおいて、コシヒカリ同質遺伝子系統に識別バンドが普遍的に出現しないが、ＩＬ２のみには特異的に出現することが分かる。従って、ＩＬ２と他の同質遺伝子系統との相違がＩＬＰ８によって示されることが明らかであり、ＩＬ１と他の同質遺伝子系統との相違も、この結果を上述のＩＬＰ４共存下のＰＣＲの結果と比較することにより明らかである。
【００５２】
そして、第３表及び図１１から、ＳＴＳ化プライマーＩＬＰ９共存下のＰＣＲにおいて、コシヒカリ同質遺伝子系統に識別バンドが普遍的に出現するが、コシヒカリには特異的に出現しない。従って、コシヒカリと同質遺伝子系統との相違がＩＬＰ９によって示されることが明らかである。
【００５３】
この結果から、試料が米飯粒一粒であった場合でも、試料から抽出・精製した鋳型ＤＮＡに、ＩＬＰ１〜ＩＬＰ９の組み合わせからなるＳＴＳ化プライマーを共存させてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡの種類によって、試料中の同質遺伝子系統の有無を識別できるとともに、試料に配合されたコシヒカリのいもち病抵抗性同質遺伝子系統ＩＬ１〜ＩＬ８を互いに識別することができることが明らかとなった。
【００５４】
以上、実施例１〜４の結果から、請求項１に係る本発明の同質遺伝子系統識別方法により、試料中の同質遺伝子系統の有無を識別するとともに、試料中の同質遺伝子系統同士を互いに識別することができることが明らかとなった。
また、この請求項１に係る本発明の同質遺伝子系統識別方法を応用すれば、新潟県でコシヒカリを同質遺伝子系統で置き換えることにより、新潟県産コシヒカリを他県産コシヒカリと識別することができることが明らかとなった。
さらに、この請求項１に係る本発明の同質遺伝子系統識別方法を応用すれば、新潟県産米同士でも、産地別にＩＬの配合割合を変えることによって産地同士の識別を行うことも可能となった。
【００５５】
【発明の効果】
請求項１に係る本発明の稲の同質遺伝子系統識別方法によれば、稲の交配系統に同一品種を５回以上戻し交配することによって育成した同質遺伝子系統（ＩＬ）を対象とし、試料である当該稲植物体、種子あるいはそれらの加工品から抽出・精製した鋳型ＤＮＡに、当該同質遺伝子系統に特異的なＤＮＡに含まれる塩基配列と相補的な塩基配列を有する識別用プライマーを共存させてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡの種類によって、試料中の同質遺伝子系統の有無の識別や、試料に配合された同質遺伝子系統同士の識別を、導入形式に基づく検定によらずとも正確かつ簡便に行うことが可能であり、かつ市場品の段階でも正確にかつ簡便に識別することが可能である。
たとえば、請求項２に記載するように、同質遺伝子系統がコシヒカリのいもち病抵抗性同質遺伝子系統の場合には、コシヒカリと８種類の同質遺伝子系統との識別及び同質遺伝子系統同士の識別が可能となる。
【００５６】
本発明によれば、当該県のコシヒカリを同質遺伝子系統で置き換えることにより、当該県のコシヒカリと他県のコシヒカリとを識別することが可能となる。
【００５７】
本発明によれば、同一県内産でも、産地ごとに同質遺伝子系統の配合割合を変えることにより、産地ごとの産米を識別することが可能となる。
【００５８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＴＳ化プライマーＩＬＰ４が共存する場合のＰＣＲにより増幅されたＤＮＡの電気泳動の結果である。
【図２】ＳＴＳ化プライマーＩＬＰ８共存する場合のＰＣＲにより増幅されたＤＮＡの電気泳動の結果である。
【符号の説明】Ｍは分子量マーカーを示し、レーン１はコシヒカリの結果を示し、レーン２及び３はそれぞれコシヒカリのいもち病抵抗性同質遺伝子系統ＩＬ１及びＩＬ２の結果を示す。
【図３】ＳＴＳ化プライマーＩＬＰ１が共存する場合のＰＣＲにより増幅されたＤＮＡの電気泳動の結果である。
【図４】ＳＴＳ化プライマーＩＬＰ２が共存する場合のＰＣＲにより増幅されたＤＮＡの電気泳動の結果である。
【図５】ＳＴＳ化プライマーＩＬＰ３が共存する場合のＰＣＲにより増幅されたＤＮＡの電気泳動の結果である。
【図６】ＳＴＳ化プライマーＩＬＰ４が共存する場合のＰＣＲにより増幅されたＤＮＡの電気泳動の結果である。
【図７】ＳＴＳ化プライマーＩＬＰ５が共存する場合のＰＣＲにより増幅されたＤＮＡの電気泳動の結果である。
【図８】ＳＴＳ化プライマーＩＬＰ６が共存する場合のＰＣＲにより増幅されたＤＮＡの電気泳動の結果である。
【図９】ＳＴＳ化プライマーＩＬＰ７が共存する場合のＰＣＲにより増幅されたＤＮＡの電気泳動の結果である。
【図１０】ＳＴＳ化プライマーＩＬＰ８が共存する場合のＰＣＲにより増幅されたＤＮＡの電気泳動の結果である。
【図１１】ＳＴＳ化プライマーＩＬＰ９が共存する場合のＰＣＲにより増幅されたＤＮＡの電気泳動の結果である。
【符号の説明】Ｍは分子量マーカーを示し、レーン１はコシヒカリの結果を示し、レーン２〜８はそれぞれコシヒカリのいもち病抵抗性同質遺伝子系統ＩＬ１〜ＩＬ８の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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