(57)【要約】【課題】新規の癌転移抑制剤を提供する。【解決手段】前記癌転移抑制剤は、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質若しくはその機能的等価改変体、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質若しくはその機能的等価改変体をコードするポリヌクレオチド、又はそのポリヌクレオチドを含む組換えベクターを有効成分として含有する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質若しくはその機能的等価改変体、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質若しくはその機能的等価改変体をコードするポリヌクレオチド、又はそのポリヌクレオチドを含む組換えベクターを有効成分として含有する、癌転移抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、癌転移抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＡＤＡＭＴＳ−１（ａ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｔｙｐｅ  １ｍｏｔｉｅｆｓ）タンパク質は、ＡＤＡＭタイプのメタロプロテネース（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ；ＭＭＰ）活性とトロンボスポンジン（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）タイプ１モチーフとを有するＡＤＡＭＴＳファミリーの最初のタンパク質として見つけられた〔「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，（米国），１９９７年，第２７２巻，ｐ．５５６−５６２（非特許文献１）〕。ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質は細胞外マトリックス結合型のＭＭＰであり、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質は細胞外マトリックス成分の代謝に関与すると思われた。
【０００３】
実際に、最近の我々の研究結果から、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質は、関節のプロテオグリカンの主成分であるアグリカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）を分解する活性（ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ）を有することが判明した〔「フェブス・レターズ（ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ）」，（英国），２０００年，第４７８巻，ｐ．２４１−２４５（非特許文献２）〕。また、癌の転移において、正常組織への浸潤にＭＭＰが関与していることが知られている〔「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」，（米国），２００２年，第２９５巻，ｐ．２３８７−２３９２（非特許文献３）〕。
【０００４】
【非特許文献１】
「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，（米国），１９９７年，第２７２巻，ｐ．５５６−５６２
【非特許文献２】
「フェブス・レターズ（ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ）」，（英国），２０００年，第４７８巻，ｐ．２４１−２４５
【非特許文献３】
「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」，（米国），２００２年，第２９５巻，ｐ．２３８７−２３９２
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このような状況下、本発明者は、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質の癌転移に与える作用を検討していたところ、予想に反して、マウスの実験的肺転移の系で、ＡＤＡＭＴＳ−１遺伝子を導入された癌細胞の肺への転移が、コントロールに比べて有意に抑制されることを見出し、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質が、癌の抗転移剤として有用であることを見出した。本発明は、このような知見に基づくものである。
従って、本発明の課題は、新規の癌転移抑制剤を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明による、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質若しくはその機能的等価改変体、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質若しくはその機能的等価改変体をコードするポリヌクレオチド、又はそのポリヌクレオチドを含む組換えベクターを有効成分として含有する、癌転移抑制剤によって解決することができる。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の癌転移抑制剤は、有効成分として、
（１）ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質、
（２）ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質の機能的等価改変体、
（３）ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（４）ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質の機能的等価改変体をコードするポリヌクレオチド、
（５）ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクター、又は
（６）ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質の機能的等価改変体をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクター
を含有する。
【０００８】
本明細書において「ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質」とは、特開平１１−４６７８１号公報に開示されているヒトＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質、及びこのヒトＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質に相当する種々の動物におけるタンパク質、例えば、マウスＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，５５６−５６２，１９９７）を意味する。すなわち、ヒトを含む種々の動物の天然型ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質を意味する。前記ヒトＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質はアミノ酸残基７２７個からなり、そのアミノ酸配列は前記特開平１１−４６７８１号公報に開示されている。
【０００９】
また、本明細書において「ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質の機能的等価改変体」とは、天然型ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質のアミノ酸配列において１又はそれ以上（好ましくは１又は数個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、前記天然型ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質と同じ活性を有するタンパク質を意味する。ここで、「ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質と同じ活性」とは、例えば、造血機能に影響を与える活性、例えば、白血球及び血小板の数を低下させ、同時に、赤血球の数を増加させる活性（特開平１１−４６７８１号公報）、あるいは、アグリカナーゼ活性（特開２００１−３０２５３６号公報）を意味する。
【００１０】
本発明の癌転移抑制剤に含有される前記ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体の形状は、その癌転移抑制活性が維持されている限り、特に限定されるものではなく、例えば、天然型のＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質それ自体であることもできるし、あるいは、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体と融合用パートナー（例えば、タンパク質又はペプチド）との融合タンパク質であることもできる。
前記融合用パートナーとしては、例えば、精製用のタンパク質又はペプチド［例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）又はヒスチジンのヘキサペプチド］、検出用のタンパク質又はペプチド［例えば、β−ガラクトシダーゼαペプチド（ＬａｃＺ）］、又は発現用のタンパク質又はペプチド（例えば、シグナル配列）を挙げることができる。
【００１１】
本発明の癌転移抑制剤の有効成分として用いることのできる、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体をコードするポリヌクレオチドは、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体をコードすることができる限り、特に限定されるものではないが、例えば、天然に存在するＡＤＡＭＴＳ−１遺伝子、あるいは、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体のアミノ酸配列に基づいて化学的に合成したポリヌクレオチドなどを挙げることができる。なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
【００１２】
本発明の癌転移抑制剤において、有効成分としてＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体を用いる場合には、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体を、それ単独で、あるいは、所望により薬剤学的若しくは獣医学的に許容することのできる通常の担体と共に、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）に投与することができる。
【００１３】
投与剤型としては、特に限定がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。
【００１４】
これらの経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
【００１５】
非経口投与方法としては、注射（皮下、静脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなかで、注射剤が最も好適に用いられる。
例えば、注射剤の調製においては、有効成分としての前記ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることができる。
また、本発明の癌転移抑制剤は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明の癌転移抑制剤をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療又は予防すべき組織中に外科的に移植することができる。
【００１６】
本発明の癌転移抑制剤は、これに限定されるものではないが、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体を、０．０１〜９９重量％、好ましくは０．１〜８０重量％の量で含有することができる。
本発明の癌転移抑制剤を用いる場合の投与量は、例えば、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができ、経口的に又は非経口的に投与することが可能である。
更に、形態も医薬品に限定されるものではなく、種々の形態、例えば、機能性食品や健康食品、又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。
【００１７】
本発明の癌転移抑制剤において、有効成分として、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質若しくはその機能的等価改変体をコードするポリヌクレオチド、又はそれを含む組換えベクターを用いる場合には、前記ポリヌクレオチド又は組換えベクターを、それ単独で、あるいは、所望により遺伝子治療に用いることのできる通常の担体と共に、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）に投与することができる。
【００１８】
例えば、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体をコードするポリヌクレオチドを注射により直接投与する方法の他、前記ポリヌクレオチドが組込まれた組換えベクターを投与する方法を挙げることができる。前記組換えベクターを調製するために用いることのできるベクターとしては、遺伝子治療に一般的に用いることのできるベクター、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、又はレトロウイルスベクター等を挙げることができ、これらのウイルスベクターを用いることにより、効率よく投与することができる。
【００１９】
また、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体をコードするポリヌクレオチドを、リポソームなどのリン脂質小胞に導入し、そのリポソームを投与する方法を採用することもできる。すなわち、リポソームは、生物的に分解可能な素材を含む閉鎖小胞であるため、リポソームと前記ポリヌクレオチドとを混合することにより、リポソーム内部の水層や脂質二分子層に前記ポリヌクレオチドを保持させることができる（リポソーム−遺伝子複合体）。次に、前記複合体を細胞とともに培養すると、複合体中の遺伝子が細胞内に取り込まれる（リポフェクション法）。得られる細胞を、以下の投与方法により体内に投与することができる。
【００２０】
投与方法は、その有効量が患部に到達するような方法で投与される限り、特に限定されるものではなく、例えば、全身的投与（例えば、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、又は経口投与など）、局所投与、経粘膜投与、又は腸管内投与などを挙げることができる。更に、カテーテル技術又は外科的手術等と組み合わせた投与方法を採用することもできる。
【００２１】
本発明の癌転移抑制剤の投与量は、例えば、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、又は剤型などによって適宜決定することができるが、通常は、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体をコードするポリヌクレオチドの重量にして、成人１日当たり０．１〜１００ｍｇ／個体の範囲が適当である。
【００２２】
本発明の癌転移抑制剤により転移を抑制することのできる癌としては、例えば、胃癌、大腸癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、口腔癌、膵臓癌、食道癌、膀胱癌、子宮癌、又は肺癌等を挙げることができる。
本発明の癌転移抑制剤が癌転移抑制作用を示す機構としては、有効成分として含有するＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体それ自体が、あるいは、有効成分として含有するＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質若しくはその機能的等価改変体をコードするポリヌクレオチド又はそれを含む組換えベクターから、体内で産生されるＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体が、癌転移抑制に関与しているものと考えられるが、その詳細は現段階では不明である。
【００２３】
後述の実施例２で示すように、マウスの実験的肺転移の系において、肺癌由来培養細胞にＡＤＡＭＴＳ−１遺伝子を導入すると、ＡＤＡＭＴＳ−１遺伝子の発現量依存的に、肺への転移が抑制された。従来技術欄で先述したように、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質が細胞外マトリックス結合型のＭＭＰであることを考慮すると、培養細胞内に導入されたＡＤＡＭＴＳ−１遺伝子が発現することにより、培養細胞の細胞外にＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質が産生される。前記実施例２では、この細胞外のＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質が肺への癌転移を抑制したものと考えられる。従って、実施例２に示すように、癌転移の抑制対象である標的癌細胞の内部にＡＤＡＭＴＳ−１遺伝子を導入しなくても、例えば、体内にＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質それ自体を投与することにより、あるいは、体内にＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質をコードするポリヌクレオチド又はそれを含む組換えベクターを投与し、体内でＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質を産生させることにより、実施例２と同様に、癌転移を抑制することができる。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《ＡＤＡＭＴＳ−１遺伝子導入癌細胞の調製》
マウスＡＤＡＭＴＳ−１発現ベクター（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１３９１２−１３９１７，１９９８）又はコントロールベクター〔ｐｃＤＮＡ３；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（サンディエゴ，カリフォルニア州，米国）〕を、それぞれ別々に、５μｇの量で、市販のトランスフェクション試薬〔ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，メリーランド州，米国）〕にてマウスルイス肺癌株（ＬＬＣ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６４２）にトランスフェクトした。２４時間後、最終濃度が２００μｇ／ｍＬになるようにＧ−４１８〔Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，メリーランド州，米国）〕を添加し、培養した。３週間後、Ｇ−４１８耐性トランスフェクタントを単離し、培養した。
【００２５】
７種類のＡＤＡＭＴＳ−１遺伝子導入ＬＬＣトランスフェクタントとコントロールベクター導入ＬＬＣトランスフェクタントから、定法により全ＲＮＡを抽出及び精製した。それぞれ１０μｇのＲＮＡを変性アガロースゲル電気泳動した後、ＲＮＡをナイロン（登録商標）メンブレン上にトランスファーした。メンブレンを真空下８０℃で２時間処理した後、３２ＰでラベルしたマウスＡＤＡＭＴＳ−１  ｃＤＮＡ（プローブ）を用いて、定法によりハイブリダイズした後、洗浄し、Ｘ線フィルムに対してオートラジオグラフィーを行なった。その後、熱水処理によりメンブレン上のプローブを取り去った後、更に、ヒトβ−アクチンｃＤＮＡとハイブリダイズし、先と同様にオートラジオグラフィーを実施した。
【００２６】
このノーザンハイブリダイゼーションの結果、ＡＤＡＭＴＳ−１遺伝子を弱く発現しているトランスフェクタントＬＬＣ／ＡＤＡＭＴＳ−１／Ｃ−１３、ＡＤＡＭＴＳ−１遺伝子を強く発現しているトランスフェクタントＬＬＣ／ＡＤＡＭＴＳ−１／Ｃ−１２、及びコントロールベクター導入トランスフェクタントＬＬＣ／Ｖｅｃｔｏｒを選別し、以下のマウスの肺転移実験に用いた。選別した３種類のトランスフェクタントに関するノーザンハイブリダイゼーションの結果を、図１に示す。
【００２７】
【実施例２】
《マウスの実験的肺転移の抑制》
生理的食塩水２００μＬに浮遊させた１×１０６個のＬＬＣ／ＡＤＡＭＴＳ−１／Ｃ−１２、ＬＬＣ／ＡＤＡＭＴＳ−１／Ｃ−１３、及びＬＬＣ／ベクターを、それぞれ、７匹、７匹、及び８匹のＣ５７ＢＬ／６マウス（９週齢）に尾静脈注射した後、１４日目に屠殺し、肺転移結節数を算出した。
【００２８】
結果（平均値±標準誤差）を図２に示す。図２に示すように、ＡＤＡＭＴＳ−１遺伝子を強く発現しているＬＬＣ／ＡＤＡＭＴＳ−１／Ｃ−１２は、ＬＬＣ／Ｖｅｃｔｏｒ（コントロール）に比して、有意（ｐ＜０．０３４）に転移が抑制されていた。ＡＤＡＭＴＳ−１遺伝子を弱く発現しているＬＬＣ／ＡＤＡＭＴＳ−１／Ｃ−１３は、有意差はないが、コントロールより転移が抑制されていた。これらの結果から、ＡＤＡＭＴＳ−１を遺伝子導入されたＬＬＣは、コントロールに比して有意に肺転移が抑制されることが判明した。また、抑制の程度は、ＡＤＡＭＴＳ−１遺伝子の発現量に正の相関を示した。このことから、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質は、癌の抗転移剤として有用であることが判明した。
【００２９】
【発明の効果】
本発明の癌転移抑制剤によれば、癌の転移を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】マウスＡＤＡＭＴＳ−１遺伝子導入マウスルイス肺癌株におけるノーザンハイブリダイゼーションの結果を示す、図面に代わる写真である。
【図２】マウスＡＤＡＭＴＳ−１遺伝子導入マウスルイス肺癌株の肺転移抑制の結果を示すグラフである。
【図１】
2004175689.tif 000002
【図２】
2004175689.tif 000003