(57)【要約】【課題】　胚性幹細胞とレシピエント細胞質間の核移植による複製動物の作出において、複製動物の作出性を向上させ得る方法を提供する。【解決手段】　 本発明は電気刺激および膜抗原マーカを用いた核移植用ドナー細胞の準備方法およびこれを用いた複製動物の作出方法に関するものである。特に、本発明は電気刺激が加えられたドナー細胞あるいは未分化ドナー細胞を用いて動物複製およびノックアウト動物の作出率を向上できる方法に関するものである。【選択図】　 図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
　（ａ）ドナー細胞に電気刺激を加える段階と、
　（ｂ）前記電気刺激を加えられたドナー細胞を細胞周期の分裂中期に同調させる段階とを含む核移植用ドナー細胞準備方法。
【請求項２】
　前記の電気刺激は２００乃至３５０Ｖの電圧、９００乃至１０００μＦのコンデンサー容量値および抵抗値無限大で、時間１０乃至３０ｍｓｅｃ間行うことを特徴とする、請求項１に記載の核移植用ドナー細胞準備方法。
【請求項３】
　前記の核移植用ドナー細胞準備方法は、前記（ａ）段階において電気刺激を加えられたドナー細胞に、未分化細胞に特異的な膜抗原マーカに対する抗体を反応させ、未分化ドナー細胞を選別する段階を（ｂ）段階以前に更に含む、請求項１に記載の核移植用ドナー細胞準備方法。 
【請求項４】
　（ａ）ドナー細胞に、未分化細胞に特異的に発現する膜抗原マーカに対する抗体を、反応させる操作を行う段階と、
　（ｂ）前記反応操作におけるドナー細胞の抗原−抗体反応状況を細胞毎に確認し、未分化ドナー細胞を選別する段階と、
　（ｃ）前記未分化ドナー細胞を細胞周期の分裂中期に同調させる段階とを含む核移植用ドナー細胞準備方法。
【請求項５】
　前記未分化細胞に特異的に発現する膜抗原マーカはＳＳＥＡ−１（stage-specific embryonic antigen-1)、ＣＤ１１７（c-kit)、ｓｃａ−１（Stem Cell Antigen)およびＣＤ３１（PECAM-1, Platelet Endothelial Cell Anhesion Molecule-1)からなる群から選択されることを特徴とする請求項４に記載の核移植用ドナー細胞準備方法。
【請求項６】
　前記ドナー細胞は、胚性幹細胞であることを特徴とする、請求項１乃至請求項５のいずれか一つに記載の核移植用ドナー細胞準備方法。
【請求項７】
　前記ドナー細胞の染色体が遺伝工学的に更に修飾されたことを特徴とする、請求項１乃至請求項５のいずれか一つに記載の核移植用ドナー細胞準備方法。
【請求項８】
　前記の核移植は細胞融合することを特徴とする、請求項１乃至請求項５のいずれか一つに記載の核移植用ドナー細胞準備方法。
【請求項９】
　（ａ）請求項１乃至請求項５のいずれか一項による方法を用いてドナー細胞を準備する段階と、
　（ｂ）準備したドナー細胞を、染色体を除去した受容体に、核移植させる段階とを含む核移植方法。
【請求項１０】
　（ａ）請求項９の方法による核移植方法で、動物の胚を再構築する段階と、
　（ｂ）前記の再構築された胚から動物を発生させる段階と
を含む動物の作出方法。
【請求項１１】
　請求項１乃至請求項５のいずれか一項による方法で作出された核移植用ドナー細胞。
【請求項１２】
　請求項９の核移植方法で作出され再構築された胚。
【請求項１３】
　請求項１０による方法で作出された動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は電気刺激および膜抗原マーカを用いた核移植用ドナー細胞の準備方法およびこれを用いた複製動物の作出に関する方法であり、ドナー細胞に電気刺激を加えるか、未分化のドナー細胞だけを選別して核移植することによりノックアウト動物または複製動物の産仔率を向上することができる方法である。 
【背景技術】
【０００２】
　胚性幹細胞（Embryonic Stem cell）は受精卵が５日間成長した初期段階の胚盤胞（Blastocyst）の内部細胞塊（Inner Cell Mass）から分離した細胞であり、全ての細胞に分化できる可能性を持つ全能性（Totipotency）を有する。胚性幹細胞は人為的に生殖細胞に注入することができ、生殖細胞にも分化させることができる。従って、このような胚性幹細胞の有用性に基づいて以前から胚性幹細胞を分離するための研究が始まり、以後、胚性幹細胞を用いた遺伝子の固体レベルへの機能解明を目的にしたノックアウトマウスも作出可能になった。
【０００３】
　ノックアウトマウスは特定の遺伝子だけを除去した形質転換マウスであり、相同組替えにより特定遺伝子を除去できるベクターを胚性幹細胞に注入し、形質転換された胚性幹細胞を選別して胚盤胞期の受精卵に注入し、代理母へ移植・着床させ、産まれて来た形質転換マウス間の交配により作出される。
【０００４】
　しかし, ノックアウトマウスを作出するまでには、多くの努力と時間および経費が要求されるだけではなくノックアウトマウスが不妊になる確率が高い。
【０００５】
　また、核移植法を用いてノックアウト動物を作出することができる。核移植法はドナー細胞の核を、奪核したレシピエント細胞質に移植することであり、通常、細胞融合法（Cell fusion）と細胞質内直接注入法（IntraCytoplasmic Cell Injection; ICCI）が用いられる。細胞融合法は 科学物質への曝露、不活性化センダイウイルス（Sendai　Virus）の注入および電気刺激などがあり、細胞質内直接注入法には、精子直接注入法（IntraCytoplasmic Sperm Injection; ICSI)を応用した細胞内の核注入方法がある。しかし、このような核移植方法は、低い胎子の作出率と非正常的な胎子の分娩など様々な問題点を持っている。
【非特許文献１】Develop. Growth Differ. 1999. 41:293
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
　本発明の課題は上記従来技術の問題点を解決することであり、胚性幹細胞とレシピエント細胞質間の核移植による複製動物の作出において、複製動物の作出性を向上させ得る方法の提供を目的とする。
【０００７】
　また、本発明は複製動物の作出性を向上させ得る胚性幹細胞処理方法の提供を目的とする。
【０００８】
　また、本発明はノックアウト動物を効率よく安定して作出できる方法の提供を目的とする。 
【課題を解決するための手段】
【０００９】
　上記の目的を達成するために、本発明は（ａ）ドナー細胞に電気刺激を加える段階および（ｂ）上記電気刺激を加えられたドナー細胞を、細胞周期の分裂中期に同調させる段階を含む核移植用ドナー細胞準備方法を提供する。
【００１０】
　また、本発明は（ａ）ドナー細胞に、未分化細胞に特異的に発現する膜抗原マーカに対する抗体を反応させる段階、（ｂ）上記反応させたドナー細胞の抗原−抗体反応を確認し、未分化のドナー細胞を選別する段階および（ｃ）上記未分化ドナー細胞を細胞周期の分裂中期に同調させる段階を含む核移植用ドナー細胞準備方法を提供する。
【００１１】
　また、本発明は（ａ）上記の核移植用ドナー細胞準備方法でドナー細胞を準備する段階および（ｂ）準備したドナー細胞を染色体が除去されたレシピエント細胞質に核移植させる段階を含む核移植方法を提供する。
【００１２】
　また、本発明は（ａ）上記の核移植方法により動物の胚を再構築する段階および（ｂ）上記の胚から動物を発生させる段階を含む動物の作出方法を提供する。
【００１３】
　また、本発明は上記の核移植用ドナー細胞の準備方法で作出し、再構築された核移植用のドナー細胞を提供する。
【００１４】
　また、本発明は上記の核移植方法で作出し、再構築された胚を提供する。
【００１５】
　また、本発明は上記の動物作出方法により作出される動物を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
　本発明の核移植用ドナー細胞準備方法は、核移植法による動物の産仔率を向上できるドナー細胞を、より簡単に作出できるようにして複製動物あるいはノックアウト動物を効率良く作出することを可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
　以下、本発明を詳しく説明する。
【００１８】
　本発明者らは核移植を用いた動物作出方法において、核移植用ドナー細胞に電気刺激を加えたり、未分化のドナー細胞を選別することにより動物の産仔率を向上させ得るドナー細胞の準備方法を開発した。
【００１９】
　ドナー細胞とは、レシピエント細胞質に核を伝達する細胞を意味し、通常の体細胞および生殖細胞などが該当する。望ましいものは胚性幹細胞または幹細胞であり、もっと望ましいのは細胞分裂中期に同調した胚性幹細胞または幹細胞が良い。また、上記のドナー細胞は野生形動物細胞であってもよく、野生形動物細胞に特定の遺伝子を挿入したり、組替える操作をして、染色体を遺伝工学的に修正したものでもよい。遺伝子移植によるトランスジェニック方法やノックアウト方法は通常用いられる技術であり、本発明が属する技術分野の当業者であれば容易に実施できる。
【００２０】
　レシピエント細胞質は脱核過程によって本来の核が除去され、ドナー細胞から核を受け取る細胞を意味する。通常、全ての細胞がレシピエント細胞質に成れるが、本発明には核移植で胚を再構築して、以後、動物を発生できる潜在力を持った細胞がレシピエント細胞質として望ましく、代表例には卵子がある。もっと望ましいのは、減数分裂II 中期の卵子、それも未受精卵の方がよい。 
【００２１】
　上記ドナー細胞およびレシピエント細胞質は動物細胞が望ましく、具体的にはマウス、ラット、羊、ヤギ、豚、牛、猿およびヒトを含む全ての哺乳類由来細胞である。ドナー細胞およびレシピエント細胞質は、通常、核移植方法に用いられる方法によって培養または前処理することができる。
【００２２】
　本発明のドナー細胞準備方法は、ドナー細胞に電気刺激を加える段階および上記電気刺激で処理したドナー細胞を細胞周期の分裂中期に同調させる段階を含む。また、核移植用ドナー細胞準備方法は、電気刺激で処理した（つまり、電気刺激を加えられた）ドナー細胞に、未分化細胞に特異的な膜抗原マーカに対する抗体を反応させ、未分化のドナー細胞を選別する段階を含むことができ、選別された未分化ドナー細胞は、以降、減数分裂中期に同調することができる。
【００２３】
　本発明の電気刺激は電圧２００乃至３５０Ｖ、コンデンサー容量値９００乃至１０００μＦ、抵抗値は無限大で、時間１０乃至３０ｍｓｅｃ間実施することが可能で、特に望ましい条件は電圧２６６乃至３００Ｖ、コンデンサー容量値９７５μＦ、抵抗値無限大、処理時間が１７．８乃至２１．６ｍｓｅｃである。上記の電圧、コンデンサー容量値および電気刺激処理時間の範囲を守らない場合、それ以後は、核移植による動物作出率が低下する可能性もある。
【００２４】
　また、さらなる核移植用ドナー細胞の準備方法は（ａ）ドナー細胞において、未分化細胞に特異的に発現する膜抗原マーカに対する抗体を、ドナー細胞と反応させる段階、（ｂ）上記で反応させたドナー細胞の抗原−抗体反応を確認し、未分化状態のドナー細胞を選別する段階および（ｃ）上記未分化状態のドナー細胞を細胞周期の分裂中期に同調させる段階を含む。また、本発明の他の例では、核移植用ドナー細胞の準備方法は（ａ）段階以前にドナー細胞に電気刺激を加える段階を含む。
【００２５】
　上記の膜抗原マーカは、未分化細胞において特異的に発現し、細胞膜に位置している全ての種類のタンパク質であり、ＳＳＥＡ−１（stage-specific embryonic antigen-1)、ＣＤ１１７（c-kit)、ｓｃａ−１（Stem Cell Antigen）およびＣＤ３１（PECAM-1, Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1）から成る群から選択されたタンパク質が望ましい。特にＳＳＥＡ−１は８細胞期から発現を始め、未分化状態の桑実胚（morula）および内部細胞塊（inner cell mass）に至るまで発現して、細胞が分化することにより発現が消失する（Develop. Growth Differ. 1999. 41:293）。
【００２６】
　未分化ドナー細胞の選別段階において、ドナー細胞膜に位置する膜抗原マーカと抗体との間に、抗原−抗体複合体が形成されたか否かを確認して、未分化状態のドナー細胞を分離することにより、通常の免疫分析法で確認できる。抗体は膜抗原マーカに対しモノクロナル抗体またはポリクロナル抗体である。
【００２７】
　本発明には一例として磁石を用いる抗原−抗体複合体分析方法を用いた（図１および 図２）。磁石を用いた方法は、超微細磁性粒子（マイクロビーズ）が標識として付けられた抗体をドナー細胞に反応させ、磁石を用いて、抗原−抗体複合体の形成されたドナー細胞だけを分離するか、あるいは一次抗体を使用した後、マイクロビーズで標識された二次抗体を用いて抗原−抗体複合体の形成されたドナー細胞だけを分離する方法である。　
【００２８】
　詳細なことは図１に示す通りである。すなわち、膜抗原マーカの抗体にバイオチンが接合された形で製造し、これを膜抗原マーカに反応させた後、マイクロビーズが結合された抗−バイオチン抗体を二次結合させることができる（図１ａ）。また、膜抗原マーカの抗体を膜抗原マーカに反応させた後、マイクロビーズが結合された抗−ＩｇＭ抗体を二次結合させることができる（図１ｂ）。上記の方法により形成された抗原−抗体の複合体は、複合体内に含まれたマイクロビーズを用いて、膜抗原マーカを発現する未分化ドナー細胞を選別できる。　
【００２９】
　本発明のドナー細胞の準備方法において、作出したドナー細胞は細胞融合または細胞質内の直接注入法によって、レシピエント細胞質に核を移植することができ、これらの方法の中では細胞融合が最も望ましい。
【００３０】
　また、本発明は、（ａ）本発明におけるドナー細胞の準備方法によりドナー細胞を準備する段階、（ｂ）ドナー細胞を、染色体が除去されたレシピエント細胞質に、核移植させる段階を含む核移植方法および上記方法で作出された再構築胚を提供する。
【００３１】
　上記（ｂ)段階は、公知技術を用いて実施可能であり、本発明には具体的な例としてノコダゾール処理による方法を用いた。
【００３２】
　上記（ｂ）段階は化学物質、センダイウイルス（Sendai Virus）または電気刺激を用いた細胞融合や細胞質内に直接注入する方法を用い得る。上記の技術は本発明に属する技術分野の当業者なら誰でも実施することが可能である。
【００３３】
　また、本発明は上記の核移植方法で動物の胚を再構築する段階および上記の胚から動物を発生させる段階を含む動物の作出方法を提供する。上記の動物を発生させる段階は再構築された胚を偽妊娠した動物の子宮へ着床させ、これらを出産させることにより実施することができる。
【００３４】
　本発明における核移植用ドナー細胞の準備方法は、動物複製やノックアウト動物の作出において、産仔率を向上させ効率的に動物複製を実施することができる。
【００３５】
　以下、本発明の実施例を記載する。下記の実施例は本発明を例示のためのものに過ぎず、本発明が実施例に限られるものではない。 
【００３６】
実施例 : 電気刺激処理したドナー細胞を用いた核移植
　１−１. 胚性幹細胞の培養と電気刺激処理
　凍結保存していた胚性幹細胞（６×１０５ cells)を解凍し、マウスの繊維芽細胞から得たフィーダー細胞存在下の直径６０ｍｍディッシュ３枚に播種した。培養液は１５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Fetal Bovine serum, Gibco)、１０３ｕ／ｍｌ白血病阻害因子（leukemia inhibitory factor, Wako Pure Chemical Industries, Osaka)、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Gibco）、１％（ｖ／ｖ）非必須アミノ酸溶液（non-essential amino acid solution, Gibco）および５．５×１０−５ Ｍ ２−メルカプトエタノール（Wako）を含むノックアウト−ＤＭＥＭ（Knockout-DMEM, Gibco BRL, Grand Island, NY）を使用した。
【００３７】
　胚性幹細胞は、一日に一回ずつ培養液を交換しながら、５％ ＣＯ２、５％ Ｏ２および９０％ Ｎ２の条件下にある培養器内で２日間培養した。胚性幹細胞がコンフルエント状態（細胞が増殖して基質が完全に覆われた状態）になると０．０５−０．５３ＭトリプシンＥＤＴＡ溶液を用いて５分間処理して細胞をディッシュ（培養皿）から分離し、０．４ｍｌ ＨＢＳ緩衝液にて希釈して電気刺激を加えた。
【００３８】
　電気刺激の条件は、電圧２６６Ｖ、コンデンサー（蓄電器）容量値９７５ μＦ、抵抗値無限大で２０ｍｓｅｃ間実施した。胚性幹細胞は電気刺激の後、氷の上に１０分間静置した上、直径６０ｍｍディッシュのフィーダー細胞の上に播種して培養を行った。
【００３９】
　１−２. 胚性幹細胞の分裂中期（Meta-phase stage）への細胞中期同調
　胚性幹細胞は電気刺激処理の後、フィーダー細胞と共に培養を行い、培養３日目にノコダゾール（Nocodazole, 0.4 μｇ/ml）を添加した培養液で２−４時間培養した。分裂中期の細胞は接着性を失って培養液中に浮遊するために、上層部分だけを回収し遠心分離機を用いて１，０００ｒｐｍで５分間遠心することにより分裂中期の胚性幹細胞が、ほとんど単一群の細胞として得られる。 
【００４０】
１−３.核移植と体外培養
　雌Ｂ６ＣＢＦ１（Ｃ５７ＢＬ／６×ＣＢＡ）マウスにＰＭＳＧ（Pregnant Mare Serum Gonadotropin）とｈＣＧ（Human Chorionic Gonadotropin）を４８時間間隔で投与し、ｈＣＧ投与１４時間の後、卵管膨大部から未受精卵を回収した。マイクロマニピュレーター（微細操作用機具）を用いて、未受精卵の細胞質の中において若干突起している部分あるいは細胞質よりも透明な部分(染色体が存在する部分はこのように見える) にもっとも近い部分の透明帯を１／５程度切開した。この後、サイトカラシンＢ（５μｇ／ｍｌ）を含む Ｍ２液内で、切開した透明帯の隙間に微細操作用ガラス管（ピペット）を挿入し、若干の細胞質と共に染色体を吸引除去した。染色体を除去した未受精卵は、分裂中期の胚性幹細胞と共にセンダイウイルス（Sendai Virus：ＨＶＪ）を用いて融合させた（Kono, T., Kwon, OY., & Nakahara, T. (1991) Journal of Reproduction Fertility および Kono, T., Sotomaru, Y., Aono, F., Takahashi, T., Ogiwara, I., Sekizawa, F., Arai, T., & Nakahara, T. (1994) Theriogenology 41, 1463-1471）。核移植操作は、サイトカラシンＢ（cytochalasin B, 5 μｇ/ml, Sigma）およびノコダゾール（０．４μｇ／ｍｌ）を添加したＭ２培養液にて実施した。
【００４１】
　融合した再構築胚（細胞）は、ＣＺＢ培養液の中で２時間培養し、１０ｍＭストロンチウム（Strontium）液で６時間培養した。培養後、１極体および１前核を有する再構築胚（卵子）をＣＺＢ培養液に移し、５％ ＣＯ２、５％ Ｏ２および９０％ Ｎ２の条件下にある培養器内で４日間培養した。胚盤胞期胚（卵子）は、精管結紮雄マウスと交配させて２．５日目の代理母（偽妊娠雌マウス）の子宮へ移植し、妊娠１９．５日目に帝王切開して胎仔の有無を確認した。 
【００４２】
実施例２：膜抗原マーカを用いた未分化細胞を選別後における核移植
　核移植は、上記の実施例１と同様に行ったが、電気刺激は実施しなかった。実施例１の１−３段階以前に下記の実験を行った。
【００４３】
膜抗原マーカを用いた未分化細胞選別
　胚性幹細胞は、磁気分離型カラム（Magnetic column, Milteniyi Biotec）を用い膜表面抗原に対して陽性（＋）細胞と陰性（−）細胞を分離するために前出マイクロビーズを用いて磁性標識を付与した。
【００４４】
　分裂中期の胚性幹細胞は、温度３７℃で濃度７μｇ／100μｌの抗体（抗マウス ＳＳＥＡ−１）と１時間反応させた。死んだ細胞を除去し（Dead Cell　Removal Kit; Milteniyi Biotec #130-090-101）、マイクロビーズにより標識された２次抗体（Rat anti-Mouse IgM Micro Beads:　Milteniyi Biotec #130-047-302）を添加し６−１２℃で１５分間反応させた。この後、反応させた胚性幹細胞は磁界内に設置された分離カラム（ＭＳカラム）に通して抗原−抗体反応が形成された胚性幹細胞だけを分離した（図１）。
【００４５】
実施例３：電気刺激および膜抗原マーカを実施した未分化細胞の選別後核移植
　実施例１と同一方法で実施し、実施例１の１−３段階以前に実施例２に記載された膜抗原マーカを用いた未分化細胞の選別実験を行い、未分化細胞をドナー細胞として核移植し、偽妊娠雌マウス（代理母）の子宮へ着床させた後、産仔率を確認した。
【００４６】
比較例１
　実施例１と同一方法で行い、胚性幹細胞の電気刺激は実施しなかった。
【００４７】
比較例２
　実施例３と同一方法で核移植を行なったが、核移植時に使用したドナー細胞は膜抗原を用いた未分化細胞の選別法で陰性と判断した細胞、すなわち、分化胚性幹細胞を用いた。 
【００４８】
実験例
　（１）胚性幹細胞の電気刺激処理による産仔率を検証
　実施例１と比較例１の方法で核移植を行い、確認した再構築胚（卵子）の着床数、妊娠率および産仔数を測定して下記の表１に示す。
【００４９】
【表１】
2004141164.tif 000003
【００５０】
　表１に示す通り、胚性幹細胞に電気刺激を行った実施例１における着床数および産仔数が、比較例の場合に比べて高率であった。
【００５１】
　（２）胚性幹細胞の分化による産仔率検証
　ドナー細胞として用いた胚性幹細胞の分化有無による産仔率を検証するため、実施例３および比較例２の方法による再構築卵の着床数、妊娠率および産仔数を測定して下記の表２に示す。
【００５２】
【表２】
2004141164.tif 000004
【００５３】
　表２に示す通り、ドナー細胞として未分化胚性幹細胞を使った実施例３の方法が、分化胚性幹細胞を用いた比較例２と比較して、胚盤胞期胚の発生率, 着床率および産仔率が高率であった。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ドナー細胞の膜に存在する膜抗原マーカを選別できる抗体および抗原−抗体の複合体を示している。
【図２】磁性微粒子で標識された抗体をドナー細胞に反応させた後、未分化ドナー細胞を選別する方法を示している。
【図１】
2004141164.tif 000005
【図２】
2004141164.tif 000006