(57)【要約】      （修正有）【課題】アンドロゲン受容体に結合し、その転写活性化能を低下させる、新規なアンドロゲン受容体ダウンレギュレーション関連タンパク質（すなわち、ＡＲＤＡＰ）、および前記タンパク質をコードする核酸の提供。【解決手段】正常な細胞と比較して乳癌細胞で過剰に発現し、特有のアミノ酸配列を有する新規なＡＲＤＡＰタンパク質及びこれらをコードする特有の塩基配列を有する核酸に関する。転写産物をコードする核酸を含有するベクターを細胞、例えば乳房細胞、に導入し、該転写産物を細胞中で発現させること。被験者からのサンプル中のＡＲＤＡＰ遺伝子発現レベルやＡＲＤＡＰの活性レベルを測定し、乳癌の発症の危険性の有無を決定すること。乳癌治療の化合物の同定などに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４に少なくとも７０％相同なアミノ酸配列を有し、細胞中で発現すると、アンドロゲン受容体によるアンドロゲン応答性遺伝子の転写促進を減少させる、純粋なポリペプチド。
【請求項２】
前記アミノ酸配列は、配列番号４に少なくとも８０％相同である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記アミノ酸配列は、配列番号４に少なくとも９０％相同である、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記アミノ酸配列は、配列番号４に少なくとも９５％相同である、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記アミノ酸配列は、配列番号４である、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号３またはこれに相補的な配列に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする、単離された核酸。
【請求項７】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする、請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
アミノ酸配列は、配列番号４である、請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
配列番号３またはこれに相補的な配列である、請求項６に記載の核酸。
【請求項１０】
配列番号４のポリペプチドに対する抗体。
【請求項１１】
請求項６に記載の核酸を含み、前記核酸を発現する細胞。
【請求項１２】
乳房細胞である、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
転写産物をコードする核酸を含有するベクターを細胞に導入すること；および
前記転写産物を前記細胞中で発現させること；を含み、
前記転写産物は、配列番号３またはこれに相補的な配列に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする、転写産物を細胞中で発現させる方法。
【請求項１４】
前記細胞は、乳房細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記転写産物は、請求項１に記載のポリペプチドをコードする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞は、乳房細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
アンドロゲン受容体ダウンレギュレーション関連タンパク質（すなわち、ＡＲＤＡＰ）遺伝子産物を含有するサンプルを、被検者から調達すること；および
前記サンプル中のＡＲＤＡＰ遺伝子発現レベルを測定すること；を含み、  
前記サンプル中の前記ＡＲＤＡＰ遺伝子発現レベルが、正常な被検者からのサンプルよりも高ければ、前記被検者は乳癌に罹患している、または乳癌を発症する危険性があるとされる、被検者が乳癌に罹患している、または乳癌を発症する危険性があるか否かを決定する方法。
【請求項１８】
前記サンプルは、乳房組織サンプルである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＡＲＤＡＰ遺伝子産物を含有するサンプルを、被検者から調達すること；および
前記サンプル中のＡＲＤＡＰ活性レベルを測定すること；を含み、
前記サンプル中の前記ＡＲＤＡＰ活性レベルが、正常な被検者からのサンプルよりも高ければ、前記被検者は乳癌に罹患している、または乳癌を発症する危険性があるとされる、被検者が乳癌に罹患している、または乳癌を発症する危険性があるか否かを決定する方法。
【請求項２０】
前記サンプルは、乳房組織サンプルである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
化合物を、ＡＲＤＡＰ遺伝子を発現している細胞に接触させること、および
前記細胞中のＡＲＤＡＰ遺伝子発現レベルを測定することを含み、
前記化合物の存在下における前記ＡＲＤＡＰ遺伝子発現レベルが、前記化合物の不存在下におけるレベルよりも低ければ、前記化合物は乳癌を治療するための候補薬とされる、乳癌を治療するための化合物の同定方法。
【請求項２２】
前記細胞は、乳房細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
化合物を、ＡＲＤＡＰ遺伝子を発現している細胞に接触させること、および
前記細胞中のＡＲＤＡＰ活性レベルを測定することを含み、
前記化合物の存在下における前記ＡＲＤＡＰ活性レベルが、前記化合物の不存在下におけるレベルよりも低ければ、前記化合物は乳癌を治療するための候補薬とされる、乳癌を治療するための化合物の同定方法。
【請求項２４】
前記細胞は、乳房細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
乳癌に罹患している、または乳癌を発症する危険性がある被検者を同定すること、および
前記被検者におけるＡＲＤＡＰ遺伝子発現レベルを低下させるための組成物を前記被検者に投与することを含む、乳癌の治療方法。
【請求項２６】
前記組成物は、乳房細胞に投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記組成物は、転写産物をコードする核酸を含み、前記転写産物は、配列番号３に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物は、乳房細胞に投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
乳癌に罹患している、または乳癌を発症する危険性がある被検者を同定すること、および
前記被検者におけるＡＲＤＡＰ活性レベルを低下させるための組成物を前記被検者に投与することを含む、乳癌の治療方法。
【請求項３０】
前記組成物は、乳房細胞に投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記組成物は、請求項１０に記載の抗体を含有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記組成物は、乳房細胞に投与される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
薬学的に許容される担体および転写産物をコードする核酸を含み、前記転写産物は、配列番号３に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする、医薬組成物。
【請求項３４】
薬学的に許容される担体および請求項１０に記載の抗体を含む、医薬組成物。
【請求項３５】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸を含有するトランス遺伝子をゲノムに含み、野生型の動物と比較してアンドロゲン応答性が減少している、トランスジェニック動物。
【請求項３６】
齧歯動物である、請求項３５に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３７】
マウスである、請求項３６に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３８】
アミノ酸配列は、配列番号４である、請求項３５に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３９】
齧歯動物である、請求項３８に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４０】
マウスである、請求項３９に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４１】
アンドロゲン受容体遺伝子産物を含有するサンプルを、被検者から調達すること；および
前記サンプル中のアンドロゲン受容体遺伝子発現レベルを測定すること；を含み、
前記サンプル中の前記アンドロゲン受容体遺伝子発現レベルが、正常な被検者からのサンプルよりも低ければ、前記被検者は乳癌に罹患している、または乳癌を発症する危険性があるとされる、被検者が乳癌に罹患している、または乳癌を発症する危険性があるか否かを決定する方法。
【請求項４２】
前記サンプルは、乳房組織サンプルである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
アンドロゲン受容体遺伝子産物を含有するサンプルを、被検者から調達すること；および
前記サンプル中のアンドロゲン受容体活性レベルを測定すること；を含み、
前記サンプル中の前記アンドロゲン受容体活性レベルが、正常な被検者からのサンプルよりも低ければ、前記被検者は乳癌に罹患している、または乳癌を発症する危険性があるとされる、被検者が乳癌に罹患している、または乳癌を発症する危険性があるか否かを決定する方法。
【請求項４４】
前記サンプルは、乳房組織サンプルである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
化合物を、アンドロゲン受容体遺伝子を発現している細胞に接触させること、および
前記細胞中のアンドロゲン受容体遺伝子発現レベルを測定することを含み、
前記化合物の存在下における前記アンドロゲン受容体遺伝子発現レベルが、前記化合物の不存在下におけるレベルよりも高ければ、前記化合物は乳癌を治療するための候補薬とされる、乳癌を治療するための化合物の同定方法。
【請求項４６】
前記細胞は、乳房細胞である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
化合物を、アンドロゲン受容体遺伝子を発現している細胞に接触させること、および
前記細胞中のアンドロゲン受容体活性レベルを測定することを含み、
前記化合物の存在下における前記アンドロゲン受容体活性レベルが、前記化合物の不存在下におけるレベルよりも高ければ、前記化合物は乳癌を治療するための候補薬とされる、乳癌を治療するための化合物の同定方法。
【請求項４８】
前記細胞は、乳房細胞である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
乳癌に罹患している、または乳癌を発症する危険性がある被検者を同定すること、および
前記被検者におけるアンドロゲン受容体遺伝子発現レベルを上昇させるための組成物を前記被検者に投与することを含む、乳癌の治療方法。
【請求項５０】
前記組成物は、乳房細胞に投与される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記組成物は、アンドロゲン受容体タンパク質をコードする核酸を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記組成物は、乳房細胞に投与される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記組成物は、アンドロゲン受容体タンパク質を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記組成物は、乳房細胞に投与される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
乳癌に罹患している、または乳癌を発症する危険性がある被検者を同定すること、および
前記被検者におけるアンドロゲン受容体活性レベルを上昇させるための組成物を前記被検者に投与することを含む、乳癌の治療方法。
【請求項５６】
前記組成物は、乳房細胞に投与される、請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
健常な細胞と比較して腫瘍細胞において過剰発現している種々の遺伝子が同定されている。これらの遺伝子が同定されることにより、抗癌剤の開発および癌の診断のための医薬のターゲットが提供されることが期待されている。
【背景技術】
【０００２】
ステロイドホルモンは、一般に、特異的な核受容体に結合し、その後に転写因子として作用する複合体を形成することにより、その生理的な効能を発揮する。前記複合体は、ステロイド応答性遺伝子のプロモーターの特異的ヌクレオチド配列（すなわち、ステロイド応答エレメント）に結合し、これらの遺伝子の転写を促進する。
【発明の開示】
【０００３】
要約
本発明は、乳癌細胞において過剰に発現し（近傍の正常細胞と比較して）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）に結合して、前記受容体がアンドロゲン応答性遺伝子の転写を活性化する能力を低下させるヒトタンパク質の発見に基づいている。したがって、この新たに発見されたヒトタンパク質は、「アンドロゲン受容体ダウンレギュレーション関連タンパク質」または「ＡＲＤＡＰ」と称される。ヒトＡＲＤＡＰのアミノ酸配列（配列番号１）およびこれをコードする核酸配列（配列番号２）を以下に示す：
【０００４】
【化１】
2004201684.tif 000002
【０００５】
マウスのＡＲＤＡＰ遺伝子（配列番号３）もまたクローニングされている。前記遺伝子は、ヒトＡＲＤＡＰタンパク質に９０％相同のマウスＡＲＤＡＰタンパク質（配列番号４）をコードする。
【０００６】
【化２】
2004201684.tif 000003
【０００７】
したがって、本発明の特徴は、配列番号１または４に少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５または１００％）相同なアミノ酸配列を有する純粋なポリペプチドである。細胞中で発現すると、前記ポリペプチドはＡＲに結合し、その転写活性化活性を低下させる。本発明のポリペプチドは、ＡＲＤＡＰ抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）を製造するために用いられうる。これらの抗体はその後、組織中および細胞コンパートメント中のＡＲＤＡＰタンパク質の存在および分布を検出するのに有用である。例えば、このような抗体は、トランスジェニック動物におけるＡＲＤＡＰタンパク質の発現を確認するために用いられうる。
【０００８】
「純粋なポリペプチド」とは、必然的に同伴する分子を実質的に有しないポリペプチドを意味し、すなわち、乾燥重量における純度は、少なくとも７５％（例えば、少なくとも８０、８５、９０、もしくは９５、または１００％）である。純度は、例えば、カラムクロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析等の任意の適切な標準法により測定されうる。
【０００９】
２つのアミノ酸配列の「百分率相同性（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）およびオルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）により修正された（（１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０，  ５８７３−５８７７）、カーリンおよびオルトシュルのアルゴリズム（（１９９０）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７，  ２２６４−２２６８）を用いて決定されうる。このようなアルゴリズムは、オルトシュル等のＸＢＬＡＳＴプログラム（（１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５，  ４０３−４１０）に組み込まれる。ＢＬＡＳＴタンパク質探索は、ＸＢＬＡＳＴプログラムを用い、スコア＝５０、ワード長＝３で行われる。２つの配列間にギャップが存在する場合には、オルトシュル等（（１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５，  ３３８９−３４０２）に記載されているように、ギャップＢＬＡＳＴ（Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ）が用いられる。ＢＬＡＳＴおよびギャップＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ）の初期値パラメータが用いられる。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。
【００１０】
本発明のさらなる特徴は、配列番号２もしくは３、またはこれに相補的な配列に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする、単離された核酸、および、本発明の核酸を含有する細胞（培養中またはトランスジェニック動物中）である。かような核酸の長さは、少なくとも１５（例えば、少なくとも３０、５０、１００、２００、５００、または１０００）ヌクレオチドである。本発明に含まれる核酸の例としては、本発明のポリペプチドをコードする、単離された核酸（例えば、ベクター）、例えば、配列番号２または３を含有する核酸、が挙げられる。これらの核酸および細胞は、本発明のポリペプチドを製造するために、またはトランスジェニック動物を作製するために、用いられうる。例えば、本発明の核酸は、組織または細胞中に、ＡＲＤＡＰｍＲＮＡが発現しているか否かを決定するために用いられうる。前記核酸は、ＰＣＲベースの検出方法におけるプライマーとして、または核酸ブロット（例えば、ノーザンブロット）における標識プローブとして用いられうる。
【００１１】
「単離された核酸」は、その構造が、自然に発生する任意の核酸の構造、または自然に発生するゲノム核酸の任意の断片の構造とは相同でない核酸である。よってこの語は、例えば、（ａ）自然に発生するゲノムＤＮＡ分子の一部の配列を有するが、自然に発生する生物のゲノム中で、前記分子のその部分に隣接して位置するコード配列が、双方とも存在しない、ＤＮＡ；（ｂ）得られる分子が、自然に発生する任意のベクターまたはゲノムＤＮＡに対して相同でないような方法により、ベクターまたは原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれた核酸；（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により製造された断片、または制限断片のような、分離された分子；および（ｄ）ハイブリッド遺伝子、すなわち、融合タンパク質をコードする遺伝子、の一部である組換えヌクレオチド配列、を含む。
【００１２】
「ストリンジェントな条件」下でのハイブリダイゼーションとは、６５℃、０．５×ＳＳＣでのハイブリダイゼーションと、それに続く、４５℃、０．１×ＳＳＣでの洗浄、を意味する。
【００１３】
さらに、本発明の特徴は、（１）配列番号２または３に対して上記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする転写産物、すなわち、転写産物Ｉを細胞（例えば、乳房細胞）中で発現させる方法、または（２）転写産物Ｉに相補的な転写産物、すなわち、転写産物ＩＩを細胞（例えば、乳房細胞）中で発現させる方法、である。転写産物Ｉは、細胞中に発現すると、外来のＡＲＤＡＰｍＲＮＡに対して結合し、このｍＲＮＡが機能タンパク質に翻訳されるのを阻害する、アンチセンスＲＮＡとして機能しうる。したがって、この方法は、癌（例えば、乳癌）を治療するための遺伝子療法において用いられうる。転写産物ＩＩはＡＲＤＡＰタンパク質をコードすることができ、そして細胞中に発現すると、ＡＲＤＡＰタンパク質に翻訳されうる。よって、この方法は、本発明のポリペプチドを製造するために用いられうる。
【００１４】
ＡＲＤＡＰは、乳癌においては発現しているが、正常な乳房組織においては発現していないことがわかっている。よって、ＡＲＤＡＰは、癌（例えば、乳癌）の診断および治療に有用である。
【００１５】
一形態において、本発明の特徴は、被検者（すなわち、動物またはヒト）が乳癌に罹患している、または乳癌を発症する危険性があるか否かを決定する方法である。一例を挙げれば、前記の方法は、サンプル（例えば、乳房サンプル）を被検者から調達すること、および、前記サンプル中のＡＲＤＡＰ発現レベルを測定することを含む。前記サンプル中のＡＲＤＡＰ発現レベルが正常な被検者からのサンプルよりも高ければ、それによって、前記被検者は乳癌に罹患している、または乳癌を発症する危険性があるとされる。前記ＡＲＤＡＰ発現レベルは、ＡＲＤＡＰｍＲＮＡまたはＡＲＤＡＰタンパク質の量を測定することにより決定されうる。前記ＡＲＤＡＰｍＲＮＡレベルは、例えば、インサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、またはノーザンブロット分析により決定されうる。前記ＡＲＤＡＰタンパク質レベルは、例えば、ウエスタンブロット分析により決定されうる。別の例を挙げれば、前記の方法は、サンプル（例えば、乳房サンプル）を被検者から調達すること、および、前記サンプル中のＡＲＤＡＰ活性レベルを測定することを含む。前記サンプル中のＡＲＤＡＰ活性レベルが正常な被検者からのサンプルよりも高ければ、それによって、前記被検者は乳癌に罹患している、または乳癌を発症する危険性があるとされる。前記ＡＲＤＡＰ活性レベルは、ＡＲに結合する能力、またはＡＲによる転写活性化活性を阻害する能力を測定することにより決定されうる。
【００１６】
他の形態において、本発明の特徴は、乳癌を治療するための化合物の同定方法である。
【００１７】
前記の方法は、化合物を細胞（例えば、乳房細胞）に接触させること、および、前記細胞中のＡＲＤＡＰの発現または活性レベルを決定することを含む。前記化合物の存在下における前記ＡＲＤＡＰの発現または活性レベルが、前記化合物の不存在下におけるレベルよりも低ければ、前記化合物は乳癌を治療するための候補薬とされる。
【００１８】
さらに他の形態において、本発明の特徴は、乳癌を治療する方法である。前記の方法は、乳癌に罹患している、または乳癌を発症する危険性がある被検者（すなわち、動物またはヒト）を同定すること、および、前記被検者におけるＡＲＤＡＰの発現または活性レベルを低下させるための組成物を前記被検者に投与することを含む。前記組成物は、ストリンジェントな条件下で、ＡＲＤＡＰ遺伝子のセンス鎖に対してハイブリダイズすることを特徴とする転写産物をコードする核酸を含有しうる。この転写産物は、細胞（例えば、乳房細胞）中に発現すると、外来のＡＲＤＡＰｍＲＮＡに対して結合し、このｍＲＮＡが機能タンパク質に翻訳されるのを阻害する、アンチセンスＲＮＡとして機能しうる。したがって、この方法は、乳癌を治療するための遺伝子療法において用いられうる。ＡＲＤＡＰタンパク質の活性は、ＡＲＤＡＰ抗体により阻害されうる（例えば、乳房細胞にデリバリーされる）。
【００１９】
乳癌を治療するための医薬組成物もまた、本発明の範囲に含まれる。一例を挙げれば、前記組成物は、薬学的に許容される担体、および、ＡＲＤＡＰ遺伝子のセンス鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする転写産物をコードする核酸を含む。他の例を挙げれば、前記組成物は、薬学的に許容される担体、およびＡＲＤＡＰ抗体を含有する。
【００２０】
本発明のさらなる特徴は、本発明の核酸を含有するトランス遺伝子をゲノムに含み、野生型の動物と比較してアンドロゲン応答性が減少している、トランスジェニック動物（例えば、マウスのような齧歯動物）である。前記トランスジェニック動物は、本発明の核酸から転写産物が産生され、前記転写産物がタンパク質へ翻訳されるように、前記核酸を細胞に導入することにより作製されうる。これらのトランスジェニック動物は、癌（例えば、乳癌）を治療するための薬剤を開発するためのモデルとして用いられうる。
【００２１】
本発明はまた、乳房腫瘍細胞におけるアンドロゲン受容体（ＡＲ）の数が、近傍の健常乳房細胞に比べて減少しているという予期せぬ知見に基づいている。
【００２２】
したがって、一形態において、本発明の特徴は、被検者が乳癌に罹患している、または乳癌を発症する危険性があるか否かを決定する方法である。一例を挙げれば、前記の方法は、サンプル（例えば、乳房サンプル）を被検者から調達すること、および、前記サンプル中のアンドロゲン受容体遺伝子発現レベルを測定することを含む。前記サンプル中の前記アンドロゲン受容体遺伝子発現レベルが、正常な被検者からのサンプルよりも低ければ、それによって、前記被検者は乳癌に罹患している、または乳癌を発症する危険性があるとされる。前記アンドロゲン受容体遺伝子発現レベルは、アンドロゲン受容体ｍＲＮＡ、またはアンドロゲン受容体タンパク質の量を測定することにより決定されうる。前記アンドロゲン受容体ｍＲＮＡレベルは、例えば、インサイチュハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、またはノーザンブロット分析により決定されうる。前記アンドロゲン受容体タンパク質レベルは、例えば、ウエスタンブロット分析により決定されうる。他の例を挙げれば、前記の方法は、サンプルを被検者から調達すること、および、前記サンプル中のアンドロゲン受容体タンパク質活性レベルを決定することを含む。前記サンプル中の前記アンドロゲン受容体タンパク質活性レベルが、正常な被検者からのサンプルよりも低ければ、それによって、前記被検者は乳癌に罹患している、または乳癌を発症する危険性があるとされる。前記アンドロゲン受容体タンパク質活性は、例えば、アンドロゲン応答性遺伝子の発現を促進させる能力を測定することにより決定されうる。他の形態において、本発明の特徴は、乳癌を治療するための化合物の同定方法である。一例を挙げれば、前記の方法は、化合物を細胞（例えば、乳房細胞）に接触させること、および、前記細胞中のアンドロゲン受容体遺伝子発現レベルを決定することを含む。前記化合物の存在下における前記アンドロゲン受容体遺伝子発現レベルが、前記化合物の不存在下におけるレベルよりも高ければ、前記化合物は乳癌を治療するための候補薬とされる。他の例を挙げれば、前記の方法は、化合物を細胞に接触させること、および、前記細胞中のアンドロゲン受容体タンパク質活性レベルを決定することを含む。前記化合物の存在下における前記アンドロゲン受容体タンパク質活性レベルが、前記化合物の不存在下におけるレベルよりも高ければ、前記化合物は乳癌を治療するための候補薬とされる。
【００２３】
さらに他の形態において、本発明の特徴は、乳癌の治療方法である。一例を挙げれば、前記の方法は、乳癌に罹患している、または乳癌を発症する危険性がある被検者を同定すること、および、前記被検者におけるアンドロゲン受容体レベルを上昇させるための組成物を前記被検者に投与することを含む。前記組成物は、アンドロゲン受容体タンパク質またはアンドロゲン受容体それ自体をコードする核酸を含有しうる。「アンドロゲン受容体タンパク質」とは、野生型のアンドロゲン受容体タンパク質、および同等の生物学的機能を有するその変異体（例えば、野生型のアンドロゲン受容体タンパク質の断片）の双方を意味する。前記組成物は、被検者の乳房細胞に直接投与されうる。他の例を挙げれば、前記の方法は、乳癌に罹患している、または乳癌を発症する危険性がある被検者を同定すること、および、前記被検者におけるアンドロゲン受容体活性レベルを上昇させるための組成物を前記被検者に投与することを含む。
【００２４】
本発明の１以上の実施形態の詳細は、以下に添付された説明に示される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、下記の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【００２５】
詳細な説明
本発明は、正常な乳房細胞と比べて乳癌細胞で過剰に発現している、新規なＡＲＤＡＰタンパク質およびこれらをコードする核酸に関する。予期せぬことに、ＡＲＤＡＰはＡＲに結合し、ＡＲの転写促進活性を低下させることがわかった。これらの観察によれば、ＡＲＤＡＰは、ＡＲを介して、アンドロゲン応答性であるマイトジェニック（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ）遺伝子（すなわち、プロモーターがアンドロゲン応答性エレメントを含有する遺伝子）を阻害するということ、ＡＲによるアンドロゲン応答性マイトジェニック遺伝子の転写促進が低下することにより、ＡＲＤＡＰが過剰に発現して癌が発生するということ、および、ＡＲＤＡＰの発現または活性を阻害すると、これらのアンドロゲン応答性マイトジェニック遺伝子の発現が増加し、癌細胞がより正常な表現型に回復しうるということが示唆される。よって、ＡＲＤＡＰは、抗癌剤の新規なターゲットである。
【００２６】
一形態において、本発明の特徴は、機能ＡＲＤＡＰポリペプチドを含む純粋なＡＲＤＡＰポリペプチド（例えば、配列番号１）である。「機能ポリペプチド」とは、野生型のＡＲＤＡＰタンパク質（例えば、野生型のＡＲＤＡＰタンパク質の断片）と同等の生物学的活性を有するポリペプチドを意味する。
【００２７】
他の形態において、本発明の特徴は、配列番号２もしくは３、またはこれに相補的な配列に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする、単離されたＡＲＤＡＰ核酸（すなわち、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびＲＮＡ）である。本発明の核酸には、遺伝コードの結果としての変性物である配列が含まれる。
【００２８】
本発明の核酸は、周知の方法による、適切な宿主細胞へのＤＮＡ転移により、インビトロで発現しうる。例えば、前記核酸は、組換え発現ベクター中に挿入されうる。本発明の核酸を発現させる目的で、種々の宿主発現ベクターシステムが用いられうる。これらには、これに制限されないが、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌のような微生物；組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；および組換えウイルスまたはプラスミド発現ベクターに感染したヒト細胞系が含まれる。本発明により提供される、組換えポリペプチドまたはその断片の単離および精製は、分取クロマトグラフィ、およびモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いた免疫学的分離のような従来の方法により行われうる。
【００２９】
本発明のさらなる特徴は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む、ＡＲＤＡＰポリペプチドに対する抗体である。「抗体」の語は、ＡＲＤＡＰポリペプチドに存在するエピトープ決定部位に結合しうる、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖのような、完全な分子およびその断片を含む。モノクローナルおよびポリクローナル抗体並びにその断片を作製する方法は周知である。例えば、ハーロウおよびレーン著、（１９８８）抗体：ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  （１９８８）  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと。ＡＲＤＡＰ抗体は、ＡＲＤＡＰタンパク質の活性を阻害する目的で用いることができ、そのため、癌（例えば、乳癌）の予防および治療に有用である。
【００３０】
さらに、本発明は、癌（例えば、乳癌）を診断および治療する方法、並びに、ＡＲＤＡＰ核酸およびポリペプチドを用いて、このような疾患を治療するための治療用化合物を同定する方法を提供する。
【００３１】
本発明の診断方法は、被検者（すなわち、動物またはヒト）から調製されたサンプル（例えば、乳房サンプル）中のＡＲＤＡＰ遺伝子発現レベルまたはＡＲＤＡＰタンパク質活性レベルを、正常な被検者、すなわち、乳癌に罹患していない被検者から調製されたサンプルと比較することを含む。ＡＲＤＡＰ遺伝子発現レベルまたはＡＲＤＡＰタンパク質活性レベルが高ければ、その被検者は、乳癌に罹患している、または乳癌を発症する危険性があるとされる。本発明の方法は、単独で、または適切な被検者において乳癌を診断するための他の手法と組み合わせて用いられうる。
【００３２】
ＡＲＤＡＰ遺伝子発現レベルは、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで決定されうる。組織サンプル中のｍＲＮＡレベルを測定する方法は周知である。ｍＲＮＡを測定するためには、細胞を溶解させ、これに制限されないが、検出できるように標識された、ＡＲＤＡＰ特異的ＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションアッセイ、および、適切なＡＲＤＡＰ特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いた定量的または半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法のような種々の任意の方法により、溶解物中の、または溶解物から精製されたもしくは半精製されたＲＮＡ中のＡＲＤＡＰｍＲＮＡレベルが決定されうる。あるいは、定量的または半定量的インサイチュハイブリダイゼーションアッセイが、例えば、組織切片または未溶解細胞懸濁液および検出できるように標識された（例えば、蛍光的にまたは酵素）ＤＮＡもしくはＲＮＡプローブを用いて行われうる。ｍＲＮＡを定量するためのさらなる方法としては、ＲＮＡ保護アッセイ（ＲＰＡ）およびＳＡＧＥが挙げられる。
【００３３】
組織サンプル中のタンパク質レベルを測定する方法もまた周知である。このような方法の多くは、ＡＲＤＡＰタンパク質に特異的に結合する抗体（例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体）を用いる。かようなアッセイにおいては、抗体自体、または前記抗体に結合しうる二次抗体が、検出できるように標識されうる。あるいは、抗体はビオチンと共役してもよく、このビオチン化抗体の存在を検出するためには、検出できるように標識されたアビジン（ビオチンに結合するポリペプチド）が用いられうる。手法の感度を向上させるためには、これらのアプローチの周知の組み合わせ（「多層サンドイッチ」アッセイを含む）が用いられうる。これらのタンパク質測定アッセイのうちのいくつか（例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット）は、細胞の溶解物に適用することができ、またいくつか（例えば、免疫組織化学的手法または蛍光フローサイトメトリー）は、組織切片または未溶解細胞懸濁液に適用することができる。ラベルの量を測定する方法は、前記ラベルの性質によるが周知である。適当なラベルとしては、これに制限されないが、放射性核種（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ、もしくは３２Ｐ）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、もしくはβ−ガラクトシダーゼ）、蛍光性の成分またはタンパク質（例えば、フルオレセイン、ロダミン、フィコエリトリン、ＧＦＰ、もしくはＢＦＰ）、あるいは発光性の成分（例えば、クアンタム  ドット  コーポレイション、パロ  アルト、カリフォルニア（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）により供給される、ＱｄｏｔＴＭナノ粒子）が挙げられる。適用可能な他のアッセイとしては、定量的免疫沈降アッセイまたは補体結合アッセイが挙げられる。
【００３４】
ＡＲＤＡＰタンパク質の活性レベルは、ＡＲに対する結合能、またはＡＲの転写促進活性を阻害する能力を測定することにより決定されうる。例えば、下記の実施例を参照のこと。
【００３５】
本発明はまた、細胞（例えば、乳房細胞）中のＡＲＤＡＰ遺伝子発現レベルまたはＡＲＤＡＰタンパク質活性レベルを低下させる化合物（例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチドミメティクス、ペプトイド、抗体、または小分子）を同定し、製造する方法を提供する。こうして同定された化合物は、例えば、乳癌を予防および治療するために用いられうる。
【００３６】
本発明の候補化合物は、周知の組み合わせライブラリー法（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ）の多くのアプローチのいずれかを用いて得られる。かようなライブラリーとしては、ペプチドライブラリー、ペプトイドライブラリー（ペプチドの機能を有するが、酵素による分解に対して耐性を有する新規な非ペプチド主鎖を有する分子のライブラリー）、空間的にアドレス可能なパラレル固相もしくは液相ライブラリー、逆重畳積分もしくはアフィニティークロマトグラフィ選抜により得られた合成ライブラリー、および、「１ビーズ１化合物」ライブラリーが挙げられる。例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３７，  ２６７８−８５；  ａｎｄ  Ｌａｍ  （１９９７）  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．  １２，  １４５を参照のこと。
【００３７】
分子ライブラリーを合成するための方法の例は、本技術分野では例えば、ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０，  ６９０９；Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９１，  １１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３７，  ２６７８；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１，  １３０３；Ｃａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ３３，  ２０５９；Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ３３，  ２０６１；および、Ｇａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３７，１２３３にみられる。化合物のライブラリーは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  （１９９２）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３，  ４１２−４２１）、または、ビーズ（Ｌａｍ  （１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４，  ８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ  （１９９３）  Ｎａｔｕｒｅ  ３６４，  ５５５−５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ，  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．  ５，２２３，４０９）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ，  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．  ５，２２３，４０９）、プラスミド（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９，  １８６５−１８６９）、もしくはファージ（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  （１９９０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９，  ３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ  （１９９０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９，  ４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７，  ６３７８−６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ  （１９９１）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２，  ３０１−３１０；および、Ｌａｄｎｅｒ  ｓｕｐｒａ）上に提示されうる。
【００３８】
細胞中のＡＲＤＡＰ遺伝子発現レベルまたはＡＲＤＡＰタンパク質活性レベルを低下させる化合物を同定するためには、細胞（例えば、乳房細胞）を候補化合物に接触させ、ＡＲＤＡＰ遺伝子発現レベルまたはＡＲＤＡＰタンパク質活性レベルを、前記候補化合物の不存在下におけるレベルと比較して評価する。前記細胞は、ＡＲＤＡＰを本来発現している細胞であってもよく、または、例えばマーカー遺伝子に融合されたＡＲＤＡＰプロモーターを有する、組換え核酸を発現するように修飾されている細胞であってもよい。ＡＲＤＡＰ遺伝子発現レベル、マーカー遺伝子発現レベル、ＡＲＤＡＰタンパク質活性レベル、またはマーカータンパク質活性レベルは、上記の方法、および、本技術分野において周知の他の任意の方法により決定されうる。前記候補化合物の存在下におけるＡＲＤＡＰ遺伝子発現レベル、マーカー遺伝子発現レベル、ＡＲＤＡＰタンパク質活性レベル、またはマーカータンパク質活性レベルが、前記候補化合物の不存在下におけるレベルよりも低い場合には、前記候補化合物は、乳癌を予防および治療するために有用であると同定される。
【００３９】
本発明はまた、乳癌の予防および治療方法を提供する。治療されるべき被検者は、例えば、被検者から調製されたサンプル中のＡＲＤＡＰ遺伝子発現レベルまたはＡＲＤＡＰタンパク質活性レベルを、上記の方法により決定することによって同定されうる。前記被検者から調製されたサンプル中のＡＲＤＡＰ遺伝子発現レベルまたはＡＲＤＡＰタンパク質活性レベルが、正常な被検者からのサンプル中のレベルよりも高い場合には、前記被検者は、有効量の、被検者におけるＡＲＤＡＰ遺伝子発現レベルまたはＡＲＤＡＰタンパク質活性レベルを低下させる化合物を用いた治療の候補者である。この方法は、単独で行われてもよく、他の薬剤または他の療法と組み合わせて行われてもよい。
【００４０】
１つのインビボアプローチにおいては、治療用組成物（例えば、細胞中のＡＲＤＡＰ遺伝子発現レベルまたはＡＲＤＡＰタンパク質活性レベルを低下させる化合物を含有する組成物）が被検者に対して投与される。前記化合物は、通常、薬学的に許容される担体（例えば、生理食塩水）中に懸濁され、経口的にもしくは静脈内注射により、あるいは、皮下に、筋肉内に、クモ膜下に、腹腔内に、直腸内に、膣内に、鼻腔内に、胃内に、気管内に、または肺内に、注射されもしくは移植されるであろう。乳癌を予防および治療するために、前記化合物は乳房組織に対して直接送達されうる。
【００４１】
必要な投与量は、投与経路の選択、製剤の性質、被検者の疾患の性質、被検者のサイズ、体重、表面積、年齢、および性、投与されている他の薬剤、並びに、主治医の判断に依存する。適当な投与量は、０．０１〜１００．０μｇ／ｋｇである。入手可能な化合物は様々であり、種々の投与経路の有効性も異なることを考慮すると、必要な投与量は広く変動することが予想される。例えば、経口投与では、静脈内（ｉ．ｖ．）注射よりも多くの投与量が必要であると予想される。これらの投与量レベルの変動は、本技術分野においてよく理解されているように、最適化のための標準経験的基準を用いて補正されうる。適切な送達媒体（例えば、ポリマー微粒子または移植可能な装置）中へ前記化合物を封入することにより、特に経口送達の際の、送達効率が上昇しうる。
【００４２】
あるいは、アンチセンスＡＲＤＡＰ  ＲＮＡをコードする核酸配列を含有するポリヌクレオチドが、例えば、本技術分野において周知の、ポリマー性の、生分解性ミクロ粒子またはミクロカプセル送達装置を用いて、被検者に対して送達されうる。
【００４３】
前記核酸の取り込みを達成するための他の方法は、標準法により調製された、リポソームを用いるというものである。ベクターは、単独で、または組織特異的抗体と共に、これらの送達媒体中に組み込まれうる。あるいは、静電気力または共有結合によりポリ−Ｌ−リジンに付着したプラスミドまたは他のベクターからなる分子抱合体を調製してもよい。ポリ−Ｌ−リジンは、標的細胞上の受容体に結合しうるリガンドに対して結合する（Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ７３，  ４７９）。あるいは、本技術分野において周知の組織特異的転写調節領域（ＴＲＥ）を用いることにより、組織特異的なターゲティングが達成されうる。インビボの発現を達成するための他の手段としては、経筋肉的な、経皮的な、または経皮下的な部位に対して、「裸のＤＮＡ」（すなわち、送達媒体を用いずに）を送達することが挙げられる。
【００４４】
適切なポリヌクレオチド（例えば、発現ベクター）中で、アンチセンスＡＲＤＡＰ  ＲＮＡをコードする核酸配列は、プロモーターまたはエンハンサー−プロモーターの組み合わせに対して、動作可能な形で連結している。エンハンサーにより、時間、場所、およびレベルの点での発現の特異性が提供される。エンハンサーは、プロモーターとは異なり、転写開始部位から様々な距離に位置していても、プロモーターの存在する条件下で機能しうる。エンハンサーはまた、転写開始部位の下流にも位置しうる。
【００４５】
適切な発現ベクターとしては、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、弱毒化ワクシニアウイルス、カナリア痘瘡ウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスなどのようなプラスミドおよびウイルスベクターが挙げられる。
【００４６】
ポリヌクレオチドは、薬学的に許容される担体中で投与されうる。薬学的に許容される担体とは、例えば、生理食塩水またはリポソームのような、動物またはヒトに対する投与に適切な生物学的に適合性の担体である。治療上の有効量とは、処置される被検者において医学的に好ましい結果（例えば、ＡＲＤＡＰ遺伝子発現レベルまたはＡＲＤＡＰタンパク質活性レベルの低下）を引き起こしうるポリヌクレオチドの量である。医学の分野において周知のように、任意の１の被検者への投与量は、被検者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性、投与の時間および経路、身体全体の健康状態、並びに、同時に投与される他の薬剤のような、多くの因子に依存する。投与量は多岐にわたるが、ポリヌクレオチドの好ましい投与量は、約１０６〜１０１２コピーのポリヌクレオチド分子である。この用量は、必要であれば、繰り返し投与されうる。投与経路は、上記の任意の経路である。
【００４７】
ヒトＡＲＤＡＰ遺伝子の相同体として、動物のＡＲＤＡＰ遺伝子（例えば、マウスのＡＲＤＡＰ遺伝子）が、癌（例えば、乳癌）の治療薬を開発するための動物モデルとして機能するトランスジェニック動物（例えば、トランスジェニックマウス）を作成するために用いられうる。
【００４８】
ここで用いられているように、「トランスジェニック動物」は、初代のトランスジェニック動物、および前記初代の子孫、並びに、これらの動物からの細胞および組織を含む。トランスジェニック動物は、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、およびウサギのような家畜、ラット、モルモット、およびマウスのような齧歯動物、並びに、ヒヒ、サル、およびチンパンジーのようなヒト以外の霊長類であってもよい。トランスジェニックブタおよびマウスが特に有用である。
【００４９】
本発明のトランスジェニック動物は、そのゲノム中に組み込まれた、ＡＲＤＡＰタンパク質をコードする核酸を含む。ここで用いられるように、「ＡＲＤＡＰタンパク質」の語は、野生型のＡＲＤＡＰタンパク質、または機能的に同等の変異体、例えば、全長タンパク質の断片、を意味する。
【００５０】
もしあれば、ゲノム中のイントロン配列を同定し、それらをＡＲＤＡＰタンパク質をコードする核酸中に含めることは有効であると考えられる。
【００５１】
本発明のトランスジェニック動物において、核酸は、例えば乳房中のＡＲＤＡＰ遺伝子の発現を促進しうる調節領域に、動作可能な形で連結している。ここで用いられるように、「動作可能な形で連結する」とは、核酸が転写されるような形で、調節領域および前記核酸が配置されることを意味する。前記調節領域は、ＭＭＴＶ−ｒａｓまたはＭＭＴＶ−ｍｙｃのような、乳房特異的なプロモーターであってもよい。
【００５２】
本発明のさらなる特徴は、本発明のトランスジェニック動物を作製するのに適当な発現ベクターである。前記発現ベクターは、乳房において、上記のようにＡＲＤＡＰタンパク質をコードする核酸に動作可能な形で連結しているプロモーターを含む。
【００５３】
トランスジェニック動物の初代の系を製造する目的で、動物に発現ベクターを導入するためには、本技術分野において周知の種々の技術が用いられうる。かような技術としては、特に制限されないが、前核顕微注射（米国特許第４，８７３，１９１号）、生殖細胞系へのレトロウイルス媒介性遺伝子移入（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２，  ６１４８）、胚性幹細胞への遺伝子ターゲティング（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｃｅｌｌ  ５６，  ３１３）、胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ，  （１９８３）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３，  １８０３）、および、インビトロでの体細胞の形質転換とそれに続く核移植（Ｗｉｌｍｕｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎａｔｕｒｅ  ３８５（６６１９），  ８１０−８１３；およびＷａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３９４，  ３６９−３７４）が挙げられる。一例を挙げれば、前記発現ベクターは、動物の卵もしくは胚中に、または動物の胚性幹細胞中に、顕微注射されうる。
【００５４】
トランスジェニック動物（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  （Ｗｉｌｅｙ，  ＵＳＡ）  ａｎｄ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  （Ｈｏｇａｎ  Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ  Ｌａｃｙ，  ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓに従って作製されたトランスジェニックマウス）がひとたび作製されれば、ＡＲＤＡＰ遺伝子の発現は、標準的な技術を用いて評価されうる。トランス遺伝子の導入が起こったか否かを決定するための初期のスクリーニングは、サザンブロット分析またはＰＣＲ技術により行われうる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，  ＮＹを参照のこと。トランスジェニック動物の組織中の、ＡＲＤＡＰタンパク質をコードする核酸の発現は、特に制限されないが、前記動物から得られた組織サンプルのノーザンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析、および逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）のような技術を用いて評価されうる。
【００５５】
本発明のトランスジェニック動物は、癌（例えば、乳癌）のモデルとして用いられうる。特に、これらの動物は、癌（例えば、乳癌）の治療または予防のために有効な化合物または組成物を同定するために用いられうる。化合物または組成物は、本発明のトランスジェニック動物に試験化合物または組成物を投与することにより、または、前記試験化合物または組成物を、前記トランスジェニック動物から得られた器官、組織（例えば、乳房）、または細胞（例えば、乳房細胞）に接触させることにより、同定されうる。前記トランスジェニック動物、器官、組織または細胞の癌（例えば、乳癌）に対する前記試験化合物または組成物の効果が評価される。例えば、トランスジェニック動物において、臨床病理学の確認により癌のサイズが評価されうる。癌の症状を緩和する試験化合物または組成物が、癌の治療または予防に有効である。
【００５６】
試験化合物は、前記化合物を薬学的に許容される非毒性の賦形剤または担体と混合することにより医薬組成物に調製され、任意の投与経路により本発明のトランスジェニック動物に対して投与されうる。例えば、皮下、筋肉内、血管内、皮内、鼻腔内、吸入、クモ膜下、または腹腔内投与のような非経口経路や、舌下、経口、または経直腸投与のような経腸経路が用いられうる。
【００５７】
本発明はまた、乳房腫瘍においてはアンドロゲン受容体レベルが低下しているという知見に基づく、乳癌の診断および治療方法、並びに乳癌を治療するための治療用化合物の同定方法を提供する。
【００５８】
本発明の診断方法は、被検者から調製されたサンプル（例えば、乳房サンプル）中のアンドロゲン受容体遺伝子発現レベルまたはアンドロゲン受容体タンパク質活性レベルを、正常な被検者、すなわち、乳癌に罹患していないヒトから調製されたサンプル中のレベルと比較することを含む。アンドロゲン受容体の遺伝子発現レベルまたは活性レベルが低ければ、その被検者は乳癌に罹患している、または乳癌を発症する危険性があるということが示唆される。本発明の方法は、単独で、または適切な被検者において乳癌を診断するための他の方法と組み合わせて、用いられうる。
【００５９】
前記アンドロゲン受容体遺伝子発現レベルは、上記の方法と同様の方法を用いて、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルのいずれかで決定されうる。前記アンドロゲン受容体タンパク質レベルは、本技術分野において周知の方法により、例えば、アンドロゲン応答性遺伝子の転写を活性化する能力を測定することにより、決定されうる。例えば、下記の実施例を参照のこと。
【００６０】
本発明はまた、上記の方法と同様の方法を用いて、細胞（例えば、乳房細胞）中のアンドロゲン受容体遺伝子発現レベルまたはアンドロゲン受容体タンパク質活性レベルを増加させる候補化合物（例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチドミメティクス、ペプトイド、抗体、または小分子）の同定方法を提供する。こうして同定された化合物は、乳癌を治療するために用いられうる。
【００６１】
本発明はまた、乳癌の予防および治療方法を提供する。治療されるべき被検者は、例えば、被検者から調製されたサンプル中のアンドロゲン受容体遺伝子発現レベルまたはアンドロゲン受容体タンパク質レベルを、上記の方法により決定することによって、同定されうる。被検者からのサンプル中の前記アンドロゲン受容体遺伝子発現レベルまたは前記アンドロゲン受容体タンパク質レベルが、正常なヒトからのサンプル中のレベルよりも低い場合には、前記被検者は、前記被検者におけるアンドロゲン受容体レベルを調節する有効量の化合物を用いた治療の候補者である。前記治療方法は、インビボまたはエクスビボで、単独でまたは他の薬剤もしくは療法と組み合わせて、行われうる。
【００６２】
１つのインビボアプローチにおいては、上記の方法と同様の方法を用いて、被検者に対して治療用組成物（例えば、細胞中のアンドロゲン受容体遺伝子発現レベルもしくはアンドロゲン受容体タンパク質活性レベルを増加させる化合物を含有する組成物、アンドロゲン受容体タンパク質をコードする核酸配列を含有するポリヌクレオチド、またはアンドロゲン受容体タンパク質自体）が投与される。
【００６３】
不充分なアンドロゲン受容体レベルに関連した乳癌の被検者を治療するためのエクスビボの方法は、前記被検者から得られた細胞に、アンドロゲン受容体をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクションまたは形質導入することを含んでもよい。あるいは、新規な、活性なプロモーターを、前記細胞のゲノム中に自然に発生する内因性のアンドロゲン受容体遺伝子の転写開始部位の上流に挿入するように相同組換えによって設計されたベクターを、インビトロで、細胞にトランスフェクションしてもよい。そうでなければ主にサイレントな遺伝子のスイッチを入れる、かような方法は、本技術分野において周知である。アンドロゲン受容体を所望のレベルで発現する細胞を選抜し、増殖させた後、次いで、トランスフェクションされた、または形質導入された細胞を、被検者に戻す。前記細胞は、特に制限されないが、ネラル（ｎｅｒａｌ）細胞、造血細胞（例えば、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｔ細胞、またはＢ細胞）、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、角化細胞、または筋細胞のような広範囲のタイプのいずれでもよい。これらの細胞は、被検者中で生存している限り、アンドロゲン受容体タンパク質の源として機能する。
【００６４】
前記エクスビボの方法は、被検者から細胞を回収する段階、前記細胞を培養する段階、それらに発現ベクターを形質導入する段階、および前記細胞をアンドロゲン受容体遺伝子の発現に適切な条件下に保持する段階を含む。これらの方法は、分子生物学の分野においては周知である。前記形質導入段階は、リン酸カルシウム、リポフェクション、エレクトロポレーション、ウイルス感染、およびパーティクルガン（遺伝子銃）を用いた遺伝子移入のような、エクスビボの遺伝子療法に用いられる任意の標準的な方法により達成されうる。あるいは、リポソームまたはポリマー性のミクロ粒子が用いられうる。首尾よく形質導入された細胞は、次いで、例えばアンドロゲン受容体遺伝子の発現により、選抜されうる。前記細胞は、次いで、被検者に注射または移植されうる。
【００６５】
下記の具体例は、単に例示のためのものであり、開示の範囲を制限するものではないと解釈されるべきである。当業者であれば、さらなる労力なしで、本明細書の記載に基づき、本発明を全範囲にわたって実施することができると考えられる。本明細書中に引用されている全ての文献は、その全体が参照によりここに組み込まれる。
【００６６】
実施例
ヒトＡＲＤＡＰは、染色体１ｑ１３．３−２１の領域に位置している。
【００６７】
正常なヒト組織および種々の腫瘍組織におけるヒトＡＲＤＡＰｍＲＮＡレベルを、ノーザンブロッティングを用いて評価した。ＡＲＤＡＰは、ヒト乳房腫瘍においてのみ検出され、正常な乳房、食道、胸腺、肝臓、脳、胎盤、子宮、睾丸、肺、前立腺、胃、および心臓の組織、または食道、胸腺、肝臓、脳の腫瘍組織においては検出されなかった。
【００６８】
一対の、乳房腫瘍組織および前記腫瘍に隣接する正常組織を、乳癌の患者から単離した。ノーザンブロッティングを用いることにより、前記腫瘍においては、近傍の正常な乳房組織と比べてＡＲＤＡＰｍＲＮＡが過剰に発現していることが判明した。いくつかのサンプルでは長さの短いＡＲＤＡＰの変異体が検出され、ＡＲＤＡＰはオルタナティブスプライシングを受けているかもしれないということが示唆された。また、ＡＲＤＡＰｍＲＮＡのインサイチュハイブリダイゼーションによれば、ＡＲＤＡＰｍＲＮＡは腫瘍細胞においては豊富であるが、正常細胞においてはまれであることが示される。
【００６９】
ＡＲＤＡＰタンパク質の細胞の局在化を調べるために、ＡＲＤＡＰのコード領域を発現ベクター中のＧＦＰに連結し、前記ベクターをヒト乳房ＭＣＦ−７細胞にトランスフェクションした。この融合タンパク質は、核に局在しており、ＡＲＤＡＰタンパク質は核タンパク質であることが示された。
【００７０】
ＡＲＤＡＰとは逆に、ＡＲは、乳房腫瘍において正常な乳房組織よりも発現が低下していた。酵母ツーハイブリッドシステムを用いて、ＡＲＤＡＰがＡＲに結合するか否かを調べた。この実験により、インビボにおけるＡＲとＡＲＤＡＰとの相互作用が確認された。ＡＲＤＡＰがＡＲに結合することをさらに確認するために、ＡＲＤＡＰおよびＡＲを融合タンパク質として共発現させた。ＡＲの免疫沈降によりＡＲＤＡＰが単離され、ＡＲＤＡＰの免疫沈降によりＡＲが単離されたことから、ＡＲＤＡＰとＡＲとの物理的な相互作用が確認された。
【００７１】
ＡＲタンパク質とＡＲＤＡＰタンパク質との間の物理的な結合が生化学的に重要であるか否かを調べるために、ルシフェラーゼレポーターコンストラクトにおいて、α−胎児性タンパク質（ＡＦＰ）プロモーターを用いた。前記ＡＦＰプロモーター中のエンハンサー領域は、アンドロゲン応答性領域（ＡＲＥ）を含んでいる。この実験においては、変異したＡＲＥを含む同一遺伝子のコントロールルシフェラーゼレポーターをも用いて、前記ＡＲＥがいずれかの生化学的効果のを媒介するのに寄与しているか否かを調べた。
【００７２】
ＭＣＦ７（乳癌細胞）およびＧ２細胞（肝癌細胞）に、野生型のまたはコントロールのレポーター、並びに、（１）モックＤＮＡ、（２）ＡＲをコードするＤＮＡ、（３）ＡＲＤＡＰをコードするＤＮＡ、または（４）ＡＲをコードするＤＮＡおよびＡＲＤＡＰをコードするＤＮＡをトランスフェクションした。（１）〜（４）のＤＮＡと組み合わせてコントロールレポーターを用いた場合、全ての細胞においてルシフェラーゼ活性の変化はほとんど観察されず、変異ＡＲＥはＡＲにより調節される転写活性化を引き起こさないことが確認された。しかし、野生型のレポーターを用いた場合には、ＡＲが発現していると、ルシフェラーゼ活性は６倍（コントロールレポーターに対して）に増加した。ＡＲＤＡＰが発現していると、ルシフェラーゼ活性の増加はほとんど観察されなかった（コントロールレポーターに対して、約３０％）。驚くべきことに、ＡＲおよびＡＲＤＡＰが同時に発現していると、ＡＲが単独で発現している場合よりもルシフェラーゼ活性の増加量が減少した（コントロールレポーターに対して、約２倍）。この結果から、ＡＲＤＡＰは、ＡＦＰプロモーター上のＡＲの転写活性化能を低下させることが示された。
【００７３】
他の実施形態
本明細書中に開示されている全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合わされうる。本明細書中に開示されているそれぞれの特徴は、同一の、等価な、または類似の目的に適う代わりの特徴により置換されうる。よって、明示されていない限り、開示されているそれぞれの特徴は、一連の、一般的な、等価なまたは類似の特徴の単なる一例である。
【００７４】
上記の記載から、当業者であれば、本発明の本質的な特徴を容易に確定することができ、また、本発明の意図および範囲から逸脱することなく、種々の用途および条件に本発明を適合させる目的で、本発明に種々の変更および修飾をなしうる。よって、他の実施形態もまた、特許請求の範囲内のものである。
【配列表】
2004201684000001.app
【外国語明細書】
TREATING BREAST CANCER
BACKGROUND
A variety of genes that are overexpressed in tumor cells relative to healthy cells have been identified.  It is expected that the identification of such genes will provide drug targets for anti-cancer drug development and for cancer diagnostics.  
Steroid hormones generally exert their physiological effects by binding to their specific nuclear receptors to form complexes that in turn act as transcriptional factors.  The complexes bind to specific nucleotide sequences (i.e., steroid responsive elements) in the promoters of steroid-responsive genes to facilitate transcription of those genes.  
SUMMARY
The invention is based on the discovery of a human protein that is overexpressed in breast cancer cells (relative to adjacent normal cells), and binds to an androgen receptor (AR) and reduces the ability of the receptor to transactivate an androgen-responsive gene.  Thus, this newly discovered human protein is named “androgen receptor down-regulatory-associated protein” or “ARDAP.”  The human ARDAP amino acid sequence (SEQ ID NO:1) and the nucleic acid sequence encoding it (SEQ ID NO:2) are shown below:
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atc cgg caa gac ttc tga (SEQ ID NO:2)
ile arg gln asp phe (SEQ ID NO:1) 
A mouse ARDAP gene (SEQ ID NO:3) has also been cloned.  It encodes a mouse ARDAP protein (SEQ ID NO:4) that is 90% identical to the human ARDAP protein.
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661/221                                 
atc cgc caa gac ttc taa (SEQ ID NO:3)
ile arg gln asp phe (SEQ ID NO:4)
Accordingly, the invention features a pure polypeptide including an amino acid sequence at least 70% (e.g., at least 75, 80, 85, 90, 95, or 99; or 100%) identical to SEQ ID NO:1 or 4.  When expressed in a cell, the polypeptide binds to an AR and decreases its transactivation activity.  The polypeptides of the invention can be used for producing ARDAP antibodies (either monoclonal or polyclonal).  These antibodies in turn are useful for detecting the presence and distribution of ARDAP proteins in tissues and in cellular compartments.  For example, such antibodies can be used to verify the expression of ARDAP proteins in a transgenic animal.
A "pure polypeptide" refers to a polypeptide substantially free from naturally associated molecules, i.e., it is at least 75% (e.g., at least 80, 85, 90, or 95; or 100%) pure by dry weight.  Purity can be measured by any appropriate standard method, for example, by column chromatography, polyacrylamide gel electrophoresis, or HPLC analysis.
The "percent identity" of two amino acid sequences is determined using the algorithm of Karlin and Altschul ((1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2264-2268), modified as in Karlin and Altschul ((1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5877).  Such an algorithm is incorporated into the XBLAST programs of Altschul, et al. ((1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410).  BLAST protein searches are performed with the XBLAST program, score = 50, wordlength = 3.  Where gaps exist between two sequences, Gapped BLAST is utilized as described in Altschul, et al. ((1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402).  When utilizing BLAST and Gapped BLAST programs, the default parameters of the respective programs (e.g., XBLAST) are used.  See www.ncbi.nlm.nih.gov.
The invention further features an isolated nucleic acid characterized in that it hybridizes under stringent conditions to SEQ ID NO:2 or 3, or a complementary sequence thereof, as well as a cell (in a culture or in a transgenic animal) containing a nucleic acid of the invention.  Such a nucleic acid can be at least 15 (e.g., at least 30, 50, 100, 200, 500, or 1000) nucleotides in length.  An example of a nucleic acid within the invention is an isolated nucleic acid (e.g., a vector) encoding a polypeptide of the invention, e.g., a nucleic acid that contains SEQ ID NO: 2 or 3.  These nucleic acids and cells can be used for producing the polypeptides of the invention or generating a transgenic animal.  For example, the nucleic acids of the invention can be used to determine whether an ARDAP mRNA is expressed in a tissue or cell.  The nucleic acids can be used as primers in PCR-based detection methods, or as labeled probes in nucleic acid blots (e.g., Northern blots). 
An "isolated nucleic acid" is a nucleic acid the structure of which is not identical to that of any naturally occurring nucleic acid or to that of any fragment of a naturally occurring genomic nucleic acid.  The term therefore covers, for example, (a) a DNA which has the sequence of part of a naturally occurring genomic DNA molecule but is not flanked by both of the coding sequences that flank that part of the molecule in the genome of the organism in which it naturally occurs; (b) a nucleic acid incorporated into a vector or into the genomic DNA of a prokaryote or eukaryote in a manner such that the resulting molecule is not identical to any naturally occurring vector or genomic DNA; (c) a separate molecule such as a cDNA, a genomic fragment, a fragment produced by polymerase chain reaction (PCR), or a restriction fragment; and (d) a recombinant nucleotide sequence that is part of a hybrid gene, i.e., a gene encoding a fusion protein.
By hybridization under "stringent conditions" is meant hybridization at 65°C, 0.5 X SSC, followed by washing at 45°C, 0.1 X SSC.
In addition, the invention features a method of (1) expressing in a cell (e.g., a breast cell) a transcript, i.e., transcript I, that hybridizes under above-described stringent conditions to SEQ ID NO:2 or 3, or (2) expressing in a cell (e.g., a breast cell) a transcript, i.e., transcript II, that is complementary to transcript I.  Transcript I, when expressed in a cell, can serve as an anti-sense RNA that binds to endogenous ARDAP mRNA to prevent it from being translated into a functional protein.  Therefore, this method can be used in gene therapy for treating cancer (e.g., breast cancer).  Transcript II can encode an ARDAP protein, and when expressed in a cell, is translated into an ARDAP protein.  Thus, this method can be used for producing a polypeptide of the invention.
ARDAP has been found to be expressed in breast cancer but not in normal breast tissue.  It is thus useful for diagnosing and treating cancer (e.g., breast cancer).
In one aspect, this invention features a method of determining whether a subject (i.e., an animal or a human) is suffering from or at risk for developing breast cancer.  In one example, the method includes providing a sample (e.g., a breast sample) from a subject and determining the ARDAP expression level in the sample.  If the ARDAP expression level in the sample is higher than that in a sample from a normal subject, it indicates that the subject is suffering from or at risk for developing breast cancer.  The ARDAP expression level can be determined by measuring the amount of the ARDAP mRNA or the ARDAP protein.  The ARDAP mRNA level can be determined, for example, by in situ hybridization, PCR, or Northern blot analysis.  The ARDAP protein level can be determined, for example, by Western blot analysis.  In another example, the method includes providing a sample (e.g., a breast sample) from a subject and determining the ARDAP activity level in the sample.  If the ARDAP activity level in the sample is higher than that in a sample from a normal subject, it indicates that the subject is suffering from or at risk for developing breast cancer.  The ARDAP activity level can be determined by measuring its ability to bind AR or to inhibit the transactivation activity of AR.   
In another aspect, this invention features a method of identifying a compound for treating breast cancer.  The method includes contacting a compound with a cell (e.g., a breast cell) and determining the ARDAP expression or activity level in the cell.  If the ARDAP expression or activity level in the presence of the compound is lower than that in the absence of the compound, the compound is a candidate for treating breast cancer.
In still another aspect, this invention features a method of treating breast cancer.  The method includes identifying a subject (i.e., an animal or a human) suffering from or being at risk for developing breast cancer and administering to the subject a composition to decrease the ARDAP expression or activity level in the subject.  The composition can contain a nucleic acid encoding a transcript characterized in that it hybridizes under stringent conditions to the sense strand of the ARDAP gene.  This transcript, when expressed in a cell (e.g., a breast cell), can serve as an anti-sense RNA that binds to endogenous ARDAP mRNA to prevent it from being translated into a functional protein.  Therefore, this method can be used in gene therapy for treating breast cancer.  The activity of an ARDAP protein can be inhibited by an ARDAP antibody (e.g., delivered to a breast cell).    
Also within the scope of this invention is a pharmaceutical composition for treating breast cancer.  In one example, the composition contains a pharmaceutically acceptable carrier and a nucleic acid encoding a transcript characterized in that it hybridizes under stringent conditions to the sense strand of the ARDAP gene.  In another example, the composition contains a pharmaceutically acceptable carrier and an ARDAP antibody.
The invention also features a transgenic animal (e.g., a rodent such as a mouse) whose genome includes a transgene containing a nucleic acid of this invention and that exhibits a decreased androgen response as compared to a wild-type animal.  The transgenic animal can be generated by introducing a nucleic acid of the invention into a cell such that a transcript is produced from the nucleic acid and the transcript is translated into a protein.  These transgenic animals can be used as models for developing drugs to treat cancer (e.g., breast cancer).
This invention is also based on the unexpected finding that the number of androgen receptors (ARs) in breast tumor cells decreases relative to their adjacent healthy breast cells.
Accordingly, in one aspect, this invention features a method of determining whether a subject is suffering from or at risk for developing breast cancer.  In one example, the method includes providing a sample (e.g., a breast sample) from a subject and determining the androgen receptor gene expression level in the sample.  If the androgen receptor gene expression level in the sample is lower than that in a sample from a normal subject, it indicates that the subject is suffering from or at risk for developing breast cancer.  The androgen receptor gene expression level can be determined by measuring the amount of the androgen receptor mRNA, or the androgen receptor protein.  The androgen receptor mRNA level can be determined, for example, by in situ hybridization, PCR, or Northern blot analysis.  The androgen receptor protein level can be determined, for example, by Western blot analysis.  In another example, the method includes providing a sample from a subject and determining the androgen receptor protein activity level in the sample.  If the androgen receptor protein activity level in the sample is lower than that in a sample from a normal subject, it indicates that the subject is suffering from or at risk for developing breast cancer.  The androgen receptor protein activity can be determined, e.g., by measuring its ability to transactivate the expression of an androgen-responsive gene.  
In another aspect, this invention features a method of identifying a compound for treating breast cancer.  In one example, the method includes contacting a compound with a cell (e.g., a breast cell) and determining the androgen receptor gene expression level in the cell.  If the androgen receptor gene expression level in the presence of the compound is higher than that in the absence of the compound, the compound is a candidate for treating breast cancer.  In another example, the method includes contacting a compound with a cell and determining the androgen receptor protein activity level in the cell.  If the androgen receptor protein activity level in the presence of the compound is higher than that in the absence of the compound, the compound is a candidate for treating breast cancer.
In still another aspect, this invention features a method of treating breast cancer.  In one example, the method includes identifying a subject suffering from or being at risk for developing breast cancer and administering to the subject a composition to increase the androgen receptor level in the subject.  The composition can contain a nucleic acid encoding an androgen receptor protein or an androgen receptor itself.  An “androgen receptor protein” refers to both a wild-type androgen receptor protein and its variants with an equivalent biological function (e.g., a fragment of a wild-type androgen receptor protein).  The composition can be administered directly to a breast cell in the subject.  In another example, the method includes identifying a subject suffering from or being at risk for developing breast cancer and administering to the subject a composition to increase the androgen receptor activity level in the subject.    
The details of one or more embodiments of the invention are set forth in the accompanying description below.  Other features, objects, and advantages of the invention will be apparent from the detailed description, and from the claims.
DETAILED DESCRIPTION
The invention relates to new ARDAP proteins and nucleic acids encoding them that are overexpressed in breast cancer cells relative to normal breast cells.  Unexpectedly, ARDAP was found to bind to and reduce the transactivation activity of an AR.  These observations suggest that ARDAP inhibits, via an AR, mitogenic genes that are androgen-responsive (i.e., genes whose promoters contain androgen responsive elements), that overexpression of ARDAP leads to cancer by reducing AR-mediated transactivation of androgen-responsive mitogenic genes, and that inhibition of ARDAP expression or activity would increase expression of these androgen-responsive mitogenic genes and revert cancer cells to a more normal phenotype.  Consequently, ARDAP is a new cancer drug target.
In one aspect, the present invention features pure ARDAP polypeptides (e.g., SEQ ID NO:1), including functional ARDAP polypeptides.  A "functional polypeptide" refers to a polypeptide which possesses biological activity equivalent to that of a wild-type ARDAP protein, e.g., a fragment of a wild-type ARDAP protein.
In another aspect, the invention features isolated ARDAP nucleic acids (i.e., DNA, cDNA, and RNA) characterized in that they hybridize under stringent conditions to SEQ ID NO:2 or 3, or a complementary sequence thereof.  The nucleic acids of the invention include sequences that are degenerate as a result of the genetic code.
A nucleic acid of the invention can be expressed in vitro by DNA transfer into a suitable host cell by methods known in the art.  For example, the nucleic acid can be inserted into a recombinant expression vector.  A variety of host-expression vector systems can be utilized to express a nucleic acid of the invention.  These include, but are not limited to, microorganisms such as bacteria transformed with recombinant bacteriophage DNA, plasmid DNA, or cosmid DNA expression vectors; yeast transformed with recombinant yeast expression vectors; and human cell lines infected with recombinant virus or plasmid expression vectors.  Isolation and purification of recombinant polypeptides, or fragments thereof, provided by the invention, can be carried out by conventional means including preparative chromatography and immunological separations involving monoclonal or polyclonal antibodies.
The invention also features antibodies against the ARDAP polypeptide, including monoclonal antibodies and polyclonal antibodies.  The term "antibody" includes intact molecules as well as fragments thereof, such as Fab, F(ab')2, and Fv which are capable of binding to an epitopic determinant present in the ARDAP polypeptide.  Methods of making monoclonal and polyclonal antibodies and fragments thereof are known in the art.  See, for example, Harlow and Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.  The ARDAP antibodies can be used to inhibit ARDAP protein activity, and thus useful for preventing and treating cancer (e.g., breast cancer).
In addition, the invention provides methods for diagnosing and treating cancer (e.g., breast cancer), and identifying therapeutic compounds for treating such a disease using ARDAP nucleic acids and polypeptides.
A diagnostic method of this invention involves comparing the ARDAP gene expression level or the ARDAP protein activity level in a sample (e.g., a breast sample) prepared from a subject (i.e., an animal or a human) with that in a sample prepared from a normal subject, i.e., a subject who does not suffer from breast cancer.  A higher ARDAP gene expression level or ARDAP protein activity level indicates that the subject is suffering from or at risk for developing breast cancer.  The methods of this invention can be used on their own or in conjunction with other procedures to diagnose breast cancer in appropriate subjects.
The ARDAP gene expression level can be determined at either the mRNA level or at the protein level.  Methods of measuring mRNA levels in a tissue sample are known in the art.  In order to measure mRNA levels, cells can be lysed and the levels of ARDAP mRNA in the lysates or in RNA purified or semi-purified from the lysates can be determined by any of a variety of methods including, without limitation, hybridization assays using detectably labeled ARDAP-specific DNA or RNA probes and quantitative or semi-quantitative RT-PCR methodologies using appropriate ARDAP-specific oligonucleotide primers.  Alternatively, quantitative or semi-quantitative in situ hybridization assays can be carried out using, for example, tissue sections or unlysed cell suspensions, and detectably (e.g., fluorescently or enzyme) labeled DNA or RNA probes.  Additional methods for quantifying mRNA include RNA protection assay (RPA) and SAGE.  
Methods of measuring protein levels in a tissue sample are also known in the art.  Many such methods employ antibodies (e.g., monoclonal or polyclonal antibodies) that bind specifically to the ARDAP protein.  In such assays, the antibody itself or a secondary antibody that binds to it can be detectably labeled.  Alternatively, the antibody can be conjugated with biotin, and detectably labeled avidin (a polypeptide that binds to biotin) can be used to detect the presence of the biotinylated antibody.  Combinations of these approaches (including "multi-layer sandwich" assays) familiar to those in the art can be used to enhance the sensitivity of the methodologies.  Some of these protein-measuring assays (e.g., ELISA or Western blot) can be applied to lysates of cells, and others (e.g., immunohistological methods or fluorescence flow cytometry) applied to histological sections or unlysed cell suspensions.  Methods of measuring the amount of label will be depend on the nature of the label and are well known in the art.  Appropriate labels include, without limitation, radionuclides (e.g., 125I, 131I, 35S, 3H, or 32P), enzymes (e.g., alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, luciferase, or β-glactosidase), fluorescent moieties or proteins (e.g., fluorescein, rhodamine, phycoerythrin, GFP, or BFP), or luminescent moieties (e.g., QdotTM nanoparticles supplied by the Quantum Dot Corporation, Palo Alto, CA).  Other applicable assays include quantitative immunoprecipitation or complement fixation assays.
The ARDAP protein activity level can be determined by measuring its ability to bind the AR or to inhibit the transactivation activity of the AR.  See, e.g., the Example below.  
The invention also provides a method for identifying and manufacturing compounds (e.g., proteins, peptides, peptidomimetics, peptoids, antibodies, or small molecules) that decrease the ARDAP gene expression level or ARDAP protein activity level in a cell (e.g., a breast cell).  Compounds thus identified can be used, e.g., for preventing and treating breast cancer.
The candidate compounds of the present invention can be obtained using any of the numerous approaches in combinatorial library methods known in the art.  Such libraries include: peptide libraries, peptoid libraries (libraries of molecules having the functionalities of peptides, but with a novel, non-peptide backbone that is resistant to enzymatic degradation); spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries; synthetic libraries obtained by deconvolution or affinity chromatography selection; and the “one-bead one-compound” libraries.  See, e.g., Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37, 2678-85; and Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12, 145.
Examples of methods for the synthesis of molecular libraries can be found in the art, for example, in: DeWitt et al. (1993) PNAS USA 90, 6909; Erb et al. (1994) PNAS USA 91, 11422; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37, 2678; Cho et al. (1993) Science 261, 1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; and Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37,1233.
Libraries of compounds may be presented in solution (e.g., Houghten (1992) Biotechniques 13, 412-421), or on beads (Lam (1991) Nature 354, 82-84), chips (Fodor (1993) Nature 364, 555-556), bacteria (Ladner, U.S. Patent No. 5,223,409), spores (Ladner, U.S. Patent No. 5,223,409), plasmids (Cull et al. (1992) PNAS USA 89, 1865-1869), or phages (Scott and Smith (1990) Science 249, 386-390; Devlin (1990) Science 249, 404-406; Cwirla et al. (1990) PNAS USA 87, 6378-6382; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222, 301-310; and Ladner supra).
To identify compounds that decrease the ARDAP gene expression level or ARDAP protein activity level in a cell, a cell (e.g., a breast cell) is contacted with a candidate compound and the ARDAP gene expression level or ARDAP protein activity level is evaluated relative to that in the absence of the candidate compound.  The cell can be a cell that naturally expresses ARDAP, or a cell that is modified to express a recombinant nucleic acid, for example, having the ARDAP promoter fused to a marker gene.  The ARDAP gene expression level, the marker gene expression level, the ARDAP protein activity level, or the marker protein activity level can be determined by methods described above and any other methods well known in the art.  If the ARDAP gene expression level, the marker gene expression level, the ARDAP protein activity level, or the marker protein activity level is lower in the presence of the candidate compound than that in the absence of the candidate compound, the candidate compound is identified as being useful for preventing and treating breast cancer. 
This invention also provides a method for preventing and treating breast cancer.  Subjects to be treated can be identified, for example, by determining the ARDAP gene expression level or ARDAP protein activity level in a sample prepared from a subject by methods described above.  If the ARDAP gene expression level or ARDAP protein activity level is higher in the sample from the subject than that in a sample from a normal subject, the subject is a candidate for treatment with an effective amount of compound that decreases the ARDAP gene expression level or ARDAP protein activity level in the subject.  This method can be performed alone or in conjunction with other drugs or therapy.
In one in vivo approach, a therapeutic composition (e.g., a composition containing a compound that decreases the ARDAP gene expression level or ARDAP protein activity level in a cell) is administered to the subject.  Generally, the compound will be suspended in a pharmaceutically-acceptable carrier (e.g., physiological saline) and administered orally or by intravenous infusion, or injected or implanted subcutaneously, intramuscularly, intrathecally, intraperitoneally, intrarectally, intravaginally, intranasally, intragastrically, intratracheally, or intrapulmonarily.  For prevention and treatment of breast cancer, the compound can be delivered directly to the breast tissue.
The dosage required depends on the choice of the route of administration; the nature of the formulation; the nature of the subject's illness; the subject's size, weight, surface area, age, and sex; other drugs being administered; and the judgment of the attending physician.  Suitable dosages are in the range of 0.01-100.0 μg/kg.  Wide variations in the needed dosage are to be expected in view of the variety of compounds available and the different efficiencies of various routes of administration.  For example, oral administration would be expected to require higher dosages than administration by i.v. injection.  Variations in these dosage levels can be adjusted using standard empirical routines for optimization as is well understood in the art.  Encapsulation of the compound in a suitable delivery vehicle (e.g., polymeric microparticles or implantable devices) may increase the efficiency of delivery, particularly for oral delivery.
Alternatively, a polynucleotide containing a nucleic acid sequence encoding an anti-sense ARDAP RNA can be delivered to the subject, for example, by the use of polymeric, biodegradable microparticle or microcapsule delivery devices known in the art.
Another way to achieve uptake of the nucleic acid is using liposomes, prepared by standard methods.  The vectors can be incorporated alone into these delivery vehicles or co-incorporated with tissue-specific antibodies.  Alternatively, one can prepare a molecular conjugate composed of a plasmid or other vector attached to poly-L-lysine by electrostatic or covalent forces.  Poly-L-lysine binds to a ligand that can bind to a receptor on target cells (Cristiano et al. (1995) J. Mol. Med. 73, 479).  Alternatively, tissue specific targeting can be achieved by the use of tissue-specific transcriptional regulatory elements (TRE) which are known in the art.  Delivery of "naked DNA" (i.e., without a delivery vehicle) to an intramuscular, intradermal, or subcutaneous site is another means to achieve in vivo expression.
In the relevant polynucleotides (e.g., expression vectors), the nucleic acid sequence encoding an anti-sense ARDAP RNA is operatively linked to a promoter or enhancer-promoter combination.  Enhancers provide expression specificity in terms of time, location, and level.  Unlike a promoter, an enhancer can function when located at variable distances from the transcription initiation site, provided a promoter is present.  An enhancer can also be located downstream of the transcription initiation site.
Suitable expression vectors include plasmids and viral vectors such as herpes viruses, retroviruses, vaccinia viruses, attenuated vaccinia viruses, canary pox viruses, adenoviruses and adeno-associated viruses, among others.  
Polynucleotides can be administered in a pharmaceutically acceptable carrier.  Pharmaceutically acceptable carriers are biologically compatible vehicles that are suitable for administration to an animal or a human, e.g., physiological saline or liposomes.  A therapeutically effective amount is an amount of the polynucleotide that is capable of producing a medically desirable result (e.g., a decreased ARDAP gene expression level or ARDAP protein activity level) in a treated subject.  As is well known in the medical arts, the dosage for any one subject depends upon many factors, including the subject's size, body surface area, age, the particular compound to be administered, sex, time and route of administration, general health, and other drugs being administered concurrently.  Dosages will vary, but a preferred dosage for administration of polynucleotide is from approximately 106 to 1012 copies of the polynucleotide molecule.  This dose can be repeatedly administered, as needed.  Routes of administration can be any of those listed above.
As a homolog to the human ARDAP gene, an animal ARDAP gene (e.g., the mouse ARDAP gene) can be used to generate a transgenic animal (e.g., a transgenic mouse) that serves as an animal model for developing drugs to treat cancer (e.g., breast cancer).
As used herein, “transgenic animal” includes the founder transgenic animals and progeny of the founders, as well as cells and tissues from such animals.  Transgenic animals can be farm animals such as pigs, goats, sheep, cows, horses, and rabbits, rodents such as rats, guinea pigs, and mice, and non-human primates such as baboons, monkeys, and chimpanzees.  Transgenic pigs and mice are particularly useful.
A transgenic animal of the invention contains a nucleic acid encoding an ARDAP protein integrated within its genome.  As used herein, the term “ARDAP protein” refers to a wild-type ARDAP protein or a functionally equivalent variant, e.g., a fragment of the full-length protein.  
It is contemplated that it may be useful to identify intron sequences, if any, in a genome and include them in a nucleic acid encoding an ARDAP protein.
In transgenic animals of the invention, the nucleic acid is operably linked to a regulatory element that can promote expression of the ARDAP gene, e.g., in breast.  As used herein, the term “operably linked” refers to the placement of the regulatory element and nucleic acid in such a manner that the nucleic acid is transcribed.  The regulatory element can be a breast-specific promoter, such as an MMTV-ras or MMTV-myc promoter.
The invention also features expression vectors suitable for generating transgenic animals of the invention.  The expression vectors can include a promoter capable of mediating expression in breast operably linked to a nucleic acid encoding an ARDAP protein as described above.  
Various techniques known in the art can be used to introduce expression vectors into animals to produce the founder lines of the transgenic animals.  Such techniques include, but are not limited to, pronuclear microinjection (U.S Patent No. 4,873,191), retrovirus mediated gene transfer into germ lines (Van der Putten et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148), gene targeting into embryonic stem cells (Thompson et al. (1989) Cell 56, 313), electroporation of embryos (Lo, (1983) Mol. Cell. Biol. 3, 1803), and transformation of somatic cells in vitro followed by nuclear transplantation (Wilmut et al. (1997) Nature 385(6619), 810-813; and Wakayama et al. (1998) Nature 394, 369-374).
In one example, the expression vector is microinjected into an ovum or embryo of an animal or into embryonic stem cells of an animal.
Once transgenic animals have been generated (e.g., a transgenic mouse generated according to the Current Protocol (Wiley, USA) and Manipulate the Mouse Embryo (Hogan Beddington and Costantini Lacy, CSHL Press), expression of the ARDAP gene can be assessed using standard techniques.  Initial screening can be accomplished by Southern blot analysis or PCR techniques to determine whether or not integration of the transgene has taken place.  See, for example, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY.  Expression of the nucleic acid encoding an ARDAP protein in the tissues of the transgenic animals can be assessed using techniques that include, but are not limited to, Northern blot analysis of tissue samples obtained from the animal, in situ hybridization analysis, and reverse-transcriptase PCR (RT-PCR).
Transgenic animals of the invention can be used as cancer (e.g., breast cancer) models.  In particular, these animals can be used to identify a compound or composition effective for treatment or prevention of cancer (e.g., breast cancer).  Compounds or compositions can be identified by administering a test compound or composition to a transgenic animal of the invention or by contacting the test compound or composition with an organ, a tissue (e.g., breast) or cells (e.g., breast cells) derived from the transgenic animal.  Effects of the test compound or composition on cancer (e.g., breast cancer) of the transgenic animal, organ, tissues or cells are evaluated.  For example, the size of the cancer from clinical pathology identification can be assessed in the transgenic animals.  Test compounds or compositions that palliate the cancer symptoms can be effective for treatment or prevention of cancer.
Test compounds can be formulated into pharmaceutical compositions by admixing the compounds with pharmaceutically acceptable non-toxic excipients or carriers and administered to transgenic animals of the invention by any route of administration.  For example, parenteral routes such as subcutaneous, intramuscular, intravascular, intradermal, intranasal, inhalation, intrathecal, or intraperitoneal administration, and enteral routes such as sublingual, oral, or rectal administration can be used.
This invention also provides methods for diagnosing and treating breast cancer and identifying therapeutic compounds for treating breast cancer based on the finding that the androgen receptor level decreases in breast tumors.
A diagnostic method of this invention involves comparing the androgen receptor gene expression level or the androgen receptor protein activity level in a sample (e.g., a breast sample) prepared from a subject with that in a sample prepared from a normal person, i.e., a person who does not suffer from breast cancer.  A lower androgen receptor gene expression or activity level indicates that the subject is suffering from or at risk for developing breast cancer.  The methods of this invention can be used on their own or in conjunction with other procedures to diagnose breast cancer in appropriate subjects.
The androgen receptor gene expression level can be determined at either the mRNA level or at the protein level using methods similar to those described above.  The androgen receptor protein activity can be determined by methods well known in the art, e.g., by measuring its ability to transactivate an androgrn-responsive gene.  See, e.g., the Example below.
This invention also provides a method for identifying candidate compounds (e.g., proteins, peptides, peptidomimetics, peptoids, antibodies, or small molecules) that increase the androgen receptor gene expression level or androgen receptor protein activity level in a cell (e.g., a breast cell) using methods similar to those described above.  Compounds thus identified can be used to treat breast cancer. 
This invention also provides a method for preventing and treating breast cancer.  Subjects to be treated can be identified, for example, by determining the androgen receptor gene expression level or the androgen receptor protein level in a sample prepared from a subject by methods described above.  If the androgen receptor gene expression level or the androgen receptor protein level is lower in the sample from the subject than that in a sample from a normal person, the subject is a candidate for treatment with an effective amount of compound that modulates the androgen receptor level in the subject.  The treatment method can be performed in vivo or ex vivo, alone or in conjunction with other drugs or therapy.
In one in vivo approach, a therapeutic composition (e.g., a composition containing a compound that increases the androgen receptor gene expression level or the androgen receptor protein activity level in a cell, a polynucleotide containing a nucleic acid sequence encoding an androgen receptor protein, or a androgen receptor protein itself) is administered to the subject using methods similar to those described above.
An ex vivo strategy for treating subjects with breast cancer associated with inadequate androgen receptor level can involve transfecting or transducing cells obtained from the subject with a polynucleotide encoding an androgen receptor protein.  Alternatively, a cell can be transfected in vitro with a vector designed to insert, by homologous recombination, a new, active promoter upstream of the transcription start site of the naturally occurring endogenous androgen receptor gene in the cell’s genome.  Such methods, which “switch on” an otherwise largely silent gene, are well known in the art.  After selection and expansion of a cell that expresses androgen receptor at a desired level, the transfected or transduced cells are then returned to the subject.  The cells can be any of a wide range of types including, without limitation, neral cells, hemopoietic cells (e.g., bone marrow cells, macrophages, monocytes, dendritic cells, T cells, or B cells), fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, keratinocytes, or muscle cells.  Such cells act as a source of the androgen receptor protein for as long as they survive in the subject.
The ex vivo methods include the steps of harvesting cells from a subject, culturing the cells, transducing them with an expression vector, and maintaining the cells under conditions suitable for expression of the androgen receptor gene.  These methods are known in the art of molecular biology.  The transduction step is accomplished by any standard means used for ex vivo gene therapy, including calcium phosphate, lipofection, electroporation, viral infection, and biolistic gene transfer.  Alternatively, liposomes or polymeric microparticles can be used.  Cells that have been successfully transduced can then be selected, for example, for expression of the androgen receptor gene.  The cells may then be injected or implanted into the subject.
The specific example below is to be construed as merely illustrative, and not limitative of the remainder of the disclosure in any way whatsoever.  Without further elaboration, it is believed that one skilled in the art can, based on the description herein, utilize the present invention to its fullest extent.  All publications recited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.
EXAMPLE
The human ARDAP is located in the region of chromosome 1q13.3-21.   
The human ARDAP mRNA levels were assessed in normal human tissues and in various tumor tissues using Northern blotting.  ARDAP was detected only in human breast tumor, but not in normal breast, esophagus, thyroid, liver, brain, placenta, uterus, testis, lung, prostate, stomach, and heart tissues or esophagus, thyroid, liver, and brain tumor tissues.
Paired breast tumor and normal tissue adjacent to the tumor were isolated from breast cancer patients.  Using Northern blotting, it was discovered that ARDAP mRNA is overly expressed in the tumor compared to the adjacent normal breast tissue.  An ARDAP variant that is shorter in length was detected in some of the samples, suggesting that ARDAP may be alternatively spliced.  In situ hybridization of ARDAP mRNA also indicates that ARDAP mRNA is abundant in tumor cells but rare in normal cells.
To determine cellular localization of the ARDAP protein, the ARDAP coding region was fused to GFP in an expression vector, and the vector transfected into human breast MCF-7 cells.  The fusion protein was localized in the nucleus, indicating that ARDAP is a nuclear protein.
Contrary to ARDAP, AR was found to be under-expressed in breast tumors compared to normal breast tissues.  A yeast two-hybrid system was used to determine whether ARDAP binds to AR.  The interaction of AR and ARDAP in vivo was confirmed by this study.  To further confirm that ARDAP binds to AR, ARDAP and AR were co-expressed as fusion proteins.  Since immunoprecipitation of AR led to isolation of ARDAP and immunoprecipitation of ARDAP led to isolation of AR, the physical interaction of ARDAP and AR was confirmed.
To determine whether the physical association between the AR and ARDAP proteins is biochemically significant, the α-fetoprotein gene (AFP) promoter was used in a luciferase reporter construct.  An enhancer region in the AFP promoter contains an androgen responsive element (ARE).  A control isogenic luciferase reporter containing a mutated ARE was also used in the study to determine whether the ARE is responsible for mediating any biochemical effects.
MCF7 (breast cells) and G2 cells (hepatoma cells) were transfected with the wild type or control reporter and (1) mock DNA, (2) DNA encoding AR, (3) DNA encoding ARDAP, or (4) DNA encoding AR and DNA encoding ARDAP.  Little change in luciferase activity was observed in all cells when the control reporter was used in combination with DNA (1)-(4), confirming that the mutant ARE is defective for AR-regulated transactivation.  However, when the wild type reporter was used, luciferase activity increased about 6 times (relative to the control reporter) when AR was expressed.  Little increase (about 30%, relative to the control reporter) in luciferase activity was observed when ARDAP was expressed.  Surprisingly, the simultaneous expression of AR and ARDAP resulted in less increase (about 2 times, relative to the control reporter) in luciferase activity than when AR was expressed alone.  This result indicated that ARDAP reduces the transactivation activity of AR on the AFP promoter.
OTHER EMBODIMENTS
All of the features disclosed in this specification may be combined in any combination.  Each feature disclosed in this specification may be replaced by an alternative feature serving the same, equivalent, or similar purpose.  Thus, unless expressly stated otherwise, each feature disclosed is only an example of a generic series of equivalent or similar features.
From the above description, one skilled in the art can easily ascertain the essential characteristics of the present invention, and without departing from the spirit and scope thereof, can make various changes and modifications of the invention to adapt it to various usages and conditions.  Thus, other embodiments are also within the scope of the following claim.
WHAT IS CLAIMED IS:
1.   A pure polypeptide comprising an amino acid sequence at least 70% identical to SEQ ID NO: 4, wherein the polypeptide, when expressed in a cell, decreases transactivation of an androgen-responsive gene by an androgen receptor.
2.   The polypeptide of claim 1, wherein the amino acid sequence is at least 80% identical to SEQ ID NO: 4.
3.   The polypeptide of claim 2, wherein the amino acid sequence is at least 90% identical to SEQ ID NO: 4.
4.   The polypeptide of claim 3, wherein the amino acid sequence is at least 95% identical to SEQ ID NO: 4.
5.   The polypeptide of claim 4, wherein the amino acid sequence is SEQ ID NO: 4.
6.   An isolated nucleic acid characterized in that it hybridizes under stringent conditions to SEQ ID NO: 3 or a complementary sequence thereof.
7.   The nucleic acid of claim 6, wherein the nucleic acid encodes a polypeptide of claim 1. 
8.   The nucleic acid of claim 7, wherein the amino acid sequence is SEQ ID NO: 4.
9.   The nucleic acid of claim 6, wherein the nucleic acid is SEQ ID NO: 3 or a complementary sequence thereof.
10.   An antibody against the polypeptide of SEQ ID NO: 4.
11.   A cell comprising a nucleic acid of claim 6, wherein the cell expresses the nucleic acid.
12.   The cell of claim 11, wherein the cell is a breast cell.
13.   A method of expressing a transcript in a cell, the method comprising:
introducing a vector into a cell, the vector containing a nucleic acid encoding a transcript; and
expressing the transcript in the cell;
wherein the transcript is characterized in that it hybridizes under stringent conditions to SEQ ID NO:3 or a complementary sequence thereof.
14.   The method of claim 13, wherein the cell is a breast cell.
15.   The method of claim 13, wherein the transcript encodes a polypeptide of claim 1.
16.   The method of claim 15, wherein the cell is a breast cell.
17.   A method of determining whether a subject is suffering from or at risk for developing breast cancer, the method comprising:
providing a sample from a subject, the sample containing an androgen receptor down-regulatory-associated protein (i.e., ARDAP) gene product; and 
determining an ARDAP gene expression level in the sample;
wherein the ARDAP gene expression level in the sample, if higher than that in a sample from a normal subject, indicates that the subject is suffering from or at risk for developing breast cancer.
18.   The method of claim 17, wherein the sample is a breast tissue sample.
19.   A method of determining whether a subject is suffering from or at risk for developing breast cancer, the method comprising:
providing a sample from a subject, the sample containing an ARDAP gene product; and 
determining an ARDAP activity level in the sample;
wherein the ARDAP activity level in the sample, if higher than that in a sample from a normal subject, indicates that the subject is suffering from or at risk for developing breast cancer.
20.   The method of claim 19, wherein the sample is a breast tissue sample.
21.   A method of identifying a compound for treating breast cancer, the method comprising:
contacting a compound with a cell expressing an ARDAP gene, and
determining an ARDAP gene expression level in the cell,
wherein the ARDAP gene expression level in the presence of the compound, if lower than that in the absence of the compound, indicates that the compound is a candidate for treating breast cancer.
22.   The method of claim 21, wherein the cell is a breast cell.
23.   A method of identifying a compound for treating breast cancer, the method comprising:
contacting a compound with a cell expressing an ARDAP gene, and
determining an ARDAP activity level in the cell,
wherein the ARDAP activity level in the presence of the compound, if lower than that in the absence of the compound, indicates that the compound is a candidate for treating breast cancer.
24.   The method of claim 23, wherein the cell is a breast cell.
25.   A method of treating breast cancer, the method comprising:
identifying a subject suffering from or being at risk for developing breast cancer, and
administering to the subject a composition to decrease an ARDAP gene expression level in the subject.
26.   The method of claim 25, wherein the composition is administered into a breast cell.
27.   The method of claim 25, wherein the composition includes a nucleic acid encoding a transcript, the transcript being characterized in that it hybridizes under stringent conditions to SEQ ID NO:3.
28.   The method of claim 27, wherein the composition is administered into a breast cell.
29.   A method of treating breast cancer, the method comprising:
identifying a subject suffering from or being at risk for developing breast cancer, and
administering to the subject a composition to decrease an ARDAP activity level in the subject.
30.   The method of claim 29, wherein the composition is administered into a breast cell.
31.   The method of claim 29, wherein the composition contains an antibody of claim 10.
32.   The method of claim 31, wherein the composition is administered into a breast cell.
33.   A pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier and a nucleic acid encoding a transcript, wherein the transcript is characterized in that it hybridizes under stringent conditions to SEQ ID NO: 3.
34.   A pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier and an antibody of claim 10.
35.   A transgenic animal whose genome comprises a transgene containing a nucleic acid encoding a polypeptide of claim 1, wherein the transgenic animal exhibits a decreased androgen response as compared to a wild-type animal.
36.   The transgenic animal of claim 35, wherein the animal is a rodent.
37.   The transgenic animal of claim 36, wherein the animal is a mouse.
38.   The transgenic animal of claim 35, wherein the amino acid sequence is SEQ ID NO:4.
39.   The transgenic animal of claim 38, wherein the animal is a rodent.
40.   The transgenic animal of claim 39, wherein the animal is a mouse.
41.   A method of determining whether a subject is suffering from or at risk for developing breast cancer, the method comprising:
providing a sample from a subject, the sample containing an androgen receptor gene product; and 
determining an androgen receptor gene expression level in the sample;
wherein the androgen receptor gene expression level in the sample, if lower than that in a sample from a normal subject, indicates that the subject is suffering from or at risk for developing breast cancer.
42.   The method of claim 41, wherein the sample is a breast tissue sample.
43.   A method of determining whether a subject is suffering from or at risk for developing breast cancer, the method comprising:
providing a sample from a subject, the sample containing an androgen receptor gene product; and 
determining an androgen receptor activity level in the sample;
wherein the androgen receptor activity level in the sample, if lower than that in a sample from a normal subject, indicates that the subject is suffering from or at risk for developing breast cancer.
44.   The method of claim 43, wherein the sample is a breast tissue sample.
45.   A method of identifying a compound for treating breast cancer, the method comprising:
contacting a compound with a cell expressing an androgen receptor gene, and
determining an androgen receptor gene expression level in the cell,
wherein the androgen receptor gene expression level in the presence of the compound, if higher than that in the absence of the compound, indicates that the compound is a candidate for treating breast cancer.
46.   The method of claim 45, wherein the cell is a breast cell.
47.   A method of identifying a compound for treating breast cancer, the method comprising:
contacting a compound with a cell expressing an androgen receptor gene, and
determining an androgen receptor activity level in the cell,
wherein the androgen receptor activity level in the presence of the compound, if higher than that in the absence of the compound, indicates that the compound is a candidate for treating breast cancer.
48.   The method of claim 47, wherein the cell is a breast cell.
49.   A method of treating breast cancer, the method comprising:
identifying a subject suffering from or being at risk for developing breast cancer, and
administering to the subject a composition to increase an androgen receptor gene expression level in the subject.
50.   The method of claim 49, wherein the composition is administered into a breast cell.
51.   The method of claim 49, wherein the composition includes a nucleic acid encoding an androgen receptor protein.
52.   The method of claim 51, wherein the composition is administered into a breast cell.
53.   The method of claim 49, wherein the composition includes an androgen receptor protein.
54.   The method of claim 53, wherein the composition is administered into a breast cell.
55.   A method of treating breast cancer, the method comprising:
identifying a subject suffering from or being at risk for developing breast cancer, and
administering to the subject a composition to increase an androgen receptor activity level in the subject.
56.   The method of claim 55, wherein the composition is administered into a breast cell.
ABSTRACT
New androgen receptor down-regulatory-associated proteins (i.e., ARDAPs) that bind to and reduce the transactivation activity of androgen receptors, and nucleic acids encoding them.
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2004201684000002.app