(57)【要約】      （修正有）【課題】神経芽細胞腫に係わる新規遺伝子材料と、この材料を用いた診断方法および治療薬剤を提供する。【解決手段】ヒト１４番染色体長腕１４番染色体長腕の３２領域に存在し、特定のアミノ酸配列を有するヒトＧＲＸＬ−１タンパク質をコードするヒトＧＲＸＬ−１遺伝子と、この遺伝子の発現産物であるＧＲＸＬ−１タンパク質、これらの遺伝子および／またはタンパク質を対象とする神経芽細胞腫の診断方法、並びにこれらの遺伝子および／またはタンパク質を含有する腫瘍細胞増殖抑制剤。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト１４番染色体長腕の３２領域に存在し、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＧＲＸＬ−１タンパク質をコードするヒトＧＲＸＬ−１遺伝子。
【請求項２】
請求項１のヒトＧＲＸＬ−１遺伝子のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１の塩基配列またはその一部配列を有する請求項２のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１の塩基配列において、以下の群：
第４７９位ｇがａ；
第６４４位ｇがａ；および
第９２１位ｇがａ
より選択される１以上の塩基置換を有する変異ポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項２のポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６】
請求項４の変異ポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項７】
請求項２のポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項８】
請求項４の変異ポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項９】
請求項２のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
【請求項１０】
請求項４の変異ポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
【請求項１１】
請求項９の組換えベクターによる形質転換体細胞。
【請求項１２】
請求項１０の組換えベクターによる形質転換体細胞。
【請求項１３】
請求項１のヒトＧＲＸＬ−１遺伝子の発現産物であって、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒト精製ＧＲＸＬ−１タンパク質。
【請求項１４】
配列番号２において、第１４６位ＡｌａがＴｈｒであるアミノ酸配列を有するヒトＧＲＸＬ−１変異タンパク質。
【請求項１５】
請求項１３のヒト精製ＧＲＸＬ−１タンパク質を認識する抗体。
【請求項１６】
請求項１４のヒトＧＲＸＬ−１変異タンパク質を認識する抗体。
【請求項１７】
神経芽細胞腫の診断方法であって、被験者から単離したゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡ中に請求項４の変異ポリヌクレオチドが存在するか否かを検出する方法。
【請求項１８】
被験者から単離したゲノムＤＮＡまたはそのｍＲＮＡと、請求項６のオリゴヌクレオチドプローブがストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか否かを検出する請求項１７の方法。
【請求項１９】
被験者から単離した染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを鋳型とし、請求項８のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った場合のＰＣＲ産物の有無を検出する請求項１７の方法。
【請求項２０】
神経芽細胞腫の診断方法であって、被験者から単離した生体試料中に請求項１４の変異タンパク質が存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
【請求項２１】
被験者から単離した生体試料中に、請求項１６の抗体と反応する変異タンパク質が存在するか否かを検出する請求項２０の方法。
【請求項２２】
請求項２のポリヌクレオチドが腫瘍細胞に導入可能な形態を有する腫瘍細胞増殖抑制剤。
【請求項２３】
請求項１３のタンパク質が腫瘍細胞に導入可能な形態を有する腫瘍細胞増殖抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、神経芽細胞腫の発症に関連する遺伝子（腫瘍抑制遺伝子）ＧＲＸＬ−１と、その発現産物であるＧＲＸＬ−１タンパク質に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
神経芽細胞腫は、小児固形腫瘍（小児期の腹部悪性腫瘍）において最も多くみられる腫瘍である。この神経芽細胞腫は、神経冠細胞が交感神経系の神経節細胞や副腎髄質の細胞に分化していく過程で腫瘍化する。０〜３歳の間に７５％が発症し、早期に周囲組織、肝、肺、骨髄、骨、皮膚等に転移する。
【０００３】
従って、他の悪性腫瘍と同様に、神経芽細胞腫に対する対策としては癌腫の早期発見、さらにはその発症の危険性を事前に発見することが最も重要な課題である。
【０００４】
神経芽細胞腫は、カテコールアミンを産生するため、尿中に大量のカテコールアミン代謝産物を排出する。そこで、神経芽細胞腫の検診として、生後の早い段階（生後６ヶ月程度）での検尿によるマススクリーニングが実施されている。
【０００５】
また、神経芽細胞腫の治療方法としては、外科的治療が行われており、これに放射線治療や化学療法が併用されている（異常、例えば非特許文献１）。
【０００６】
前記のとおり、神経芽細胞腫の診断方法としては、検尿によるスクリーニングが行われているが、これはカテコールアミン代謝産物（ＶＭＡやＨＶＡ等）を検出することによって神経芽細胞腫の存在を診断する方法であって、神経芽細胞腫が発症する以前にその危険性を事前に予測する方法ではない。
【０００７】
近年、悪性腫瘍の危険性を事前に判定する方法として、腫瘍特定的な遺伝子変異や変異タンパク質を対象とした分子生物学的診断が提案されている。例えば、特許文献１（特開平７−５１０６５号公報）には、糖タンパク質３９の腫瘍マーカーとしての利用が開示されている。しかしながら神経芽細胞腫に関しては、分子生物学的診断に使用することのできる遺伝子材料を全く知られていない。
【０００８】
この出願は、神経芽細胞腫の診断に有用な新規の遺伝子材料と、これらの材料を用いた診断方法を提供することを課題としている。
【０００９】
また、神経芽細胞腫の治療法としては、前記のとおりの外科的治療法、放射線治療および化学療法が行われているが、これらは小児にとっては極めて負担の大きい治療方法である。また、化学療法には抵抗を示す症例が多いという問題点を有している。そこで、この出願はまた、前記の遺伝子材料を利用した腫瘍治療薬剤を提供することを課題としている。
【００１０】
【特許文献１】
特開平７−５１０６５号公報
【非特許文献１】
「医学大辞典」第１７版、南山堂、１９９０年２月１日発行、第９５６頁
【００１１】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するものとして、以下の（１）〜（２３）の発明を提供する。
（１）    ヒト１４番染色体長腕の３２領域に存在し、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＧＲＸＬ−１タンパク質をコードするヒトＧＲＸＬ−１遺伝子。
（２）    前記発明（１）のヒトＧＲＸＬ−１遺伝子のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチド。
（３）    配列番号１の塩基配列またはその一部配列を有する前記発明（２）のポリヌクレオチド。
（４）    配列番号１の塩基配列において、以下の群：
第４７９位ｇがａ；
第６４４位ｇがａ；および
第９２１位ｇがａ
より選択される１以上の塩基置換を有する変異ポリヌクレオチド。
（５）    前記発明（２）のポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ。
（６）    前記発明（４）の変異ポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ。
（７）    前記発明（２）のポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するオリゴヌクオチドプライマーセット。
（８）    前記発明（４）の変異ポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するオリゴヌクレオチドプライマーセット。
（９）    前記発明（２）のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
（１０）  前記発明（４）の変異ポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
（１１）  前記発明（９）の組換えベクターによる形質転換体細胞。
（１２）  前記発明（１０）の組換えベクターによる形質転換体細胞。
（１３）  前記発明（１）のヒトＧＲＸＬ−１遺伝子の発現産物であって、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒト精製ＧＲＸＬ−１タンパク質。
（１４）  配列番号２において、第１４６位ＡｌａがＴｈｒであるアミノ酸配列を有するヒトＧＲＸＬ−１変異タンパク質。
（１５）  前記発明（１３）のヒト精製ＧＲＸＬ−１タンパク質を認識する抗体。
（１６）  前記発明（１４）のヒトＧＲＸＬ−１変異タンパク質を認識する抗体。
（１７）  神経芽細胞腫の診断方法であって、被験者から単離したゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡ中に前記発明（４）の変異ポリヌクレオチドが存在するか否かを検出する方法。
（１８）  被験者から単離したゲノムＤＮＡまたはそのｍＲＮＡと、前記発明（６）のオリゴヌクレオチドプローブがストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか否かを検出する前記発明（１７）の方法。
（１９）  被験者から単離した染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを鋳型とし、前記発明（８）のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った場合のＰＣＲ産物の有無を検出する前記発明（１７）の方法。
（２０）  神経芽細胞腫の診断方法であって、被験者から単離した生体試料中に前記発明（１４）の変異タンパク質が存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
（２１）  被験者から単離した生体試料中に、前記発明（１６）の抗体と反応する変異タンパク質が存在するか否かを検出する前記発明（２０）の方法。
（２２）  前記発明（２）のポリヌクレオチドが腫瘍細胞に導入可能な形態を有する腫瘍細胞増殖抑制剤。
（２３）  前記発明（１３）のタンパク質が腫瘍細胞に導入可能な形態を有する腫瘍細胞増殖抑制剤。
【００１２】
すなわち、この出願の発明者らは、神経芽細胞腫ではヒト１４番染色体長腕の３２領域（１４ｑ３２）に高い頻度で染色体欠損が認められることに着目し、この領域の遺伝子を探索した結果、新規の遺伝子ＧＲＸＬ−１とこの遺伝子がコードするＧＲＸＬ−１タンパク質を見出した。さらに、このＧＲＸＬ−１遺伝子の発現が腫瘍細胞の増殖抑制機能を有すること、ＧＲＸＬ−１遺伝子の特定の変異（一塩基多型）が神経芽細胞腫の発症に関連することを見出した。
【００１３】
前記の発明（１）〜（２３）は、以上のとおりの新規な知見に基づいて完成された。以下、これらの各発明の実施形態について詳しく説明する。なお、この出願においては、１０１個以上のヌクレオチドの連続配列をポリヌクレオチド、２−１００個の連続ヌクレオチド配列をオリゴヌクレオチドと定義する。また、３１個以上のアミノ酸連続配列をポリペプチド、２−３０個の連続アミノ酸配列をオリゴペプチドと定義する。また、この発明において使用する様々な遺伝子操作技術等は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９）等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能なものである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
発明（１）は、ヒト１４番染色体長腕の３２領域に存在し、ＧＲＸＬ−１タンパク質をコードするヒトＧＲＸＬ−１遺伝子である。
【００１５】
さらに具体的には、発明（１）のヒトＧＲＸＬ−１遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＧＲＸＬ−１タンパク質をコードし、この遺伝子から転写されるｍＲＮＡからは配列番号１の塩基配列を有するｃＤＮＡが合成される。
【００１６】
発明（１）のＧＲＸＬ−１遺伝子は、例えば、配列番号１の塩基配列またはその一部配列からなる精製ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをプローブとしてヒトのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離するすることができる。得られたゲノム遺伝子は、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＮ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法およびＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。
【００１７】
なお、この発明（１）の遺伝子には、それがコードするタンパク質の発現に対する制御領域（プロモーター／エンハンサー、サプレッサー等）も含まれる。これらの発現制御領域は、ＧＲＸＬ−１遺伝子やＧＲＸＬ−１タンパク質の更なる機能の解析や、あるいはＧＲＸＬ−１タンパク質の発現を制御する物質（転写因子等）を探索するための材料として有用である。
【００１８】
発明（２）は、前記のゲノムＧＲＸＬ−１遺伝子やこのＧＲＸＬ−１遺伝子から転写されるｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡから精製されたポリヌクレオチド（ＤＮＡ断片やＲＮＡ断片）である。例えば、ｃＤＮＡはヒトの細胞から抽出したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型として合成することができる。ヒト細胞としては、人体から手術などによって摘出されたものでも培養細胞でもよい。ｃＤＮＡは、公知の方法（Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２，  １６１−１７０，  １９８２；  Ｊ．  Ｇｅｎｅ  ２５，  ２６３−２６９，  １９８３；  Ｇｅｎｅ，  １５０，  ２４３−２５０，  １９９４）を用いて合成することができる。あるいは、オリゴヌクレオチドをプライマ−として、ヒト細胞から単離したｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、目的ｃＤＮＡを合成することもできる。このようにして調製されるヒトＧＲＸＬ−１  ｃＤＮＡ（発明（３））は、具体的には配列番号１の塩基配列を有している。なお、この発明（３）のポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）には、配列番号１におけるタンパク質コード領域（ＯＲＦ）からなるＤＮＡ断片が含まれる。これらのポリヌクレオチドは、例えばこの発明のＧＲＸＬ−１タンパク質の遺伝子工学的な製造に使用することができる。また、後記実施例に示したように、このＧＲＸＬ−１遺伝子の発現は中心体の分裂に異常を生じさせ、腫瘍細胞の増殖を有意に抑制するため、腫瘍細胞の増殖抑制剤（発明（２２））の成分として有用である。
【００１９】
発明（４）は、配列番号１の塩基配列において、以下の群：
第４７９位ｇがａ；
第６４４位ｇがａ；および
第９２１位ｇがａ
より選択される１以上の塩基置換を有する変異ポリヌクレオチドである。
【００２０】
この発明（４）の変異ポリヌクレオチドは、神経芽細胞腫におけるＧＲＸＬ−１遺伝子変異に由来するポリヌクレオチドであり、例えば、神経芽細胞腫細胞から調製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法や、その細胞から単離したｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＴ法等によって取得することができる。また、発明（３）のポリヌクレオチドに対して公知のＫｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：４８８，  １９８５およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５４：３６７，  １９８７）や、ミューテーション・キット等を使用する方法、あるいは変異導入型のＰＣＲ法などを用いて前記の塩基置換を導入する方法によっても取得することができる。
【００２１】
この変異ポリヌクレオチドは、発明（１４）の変異タンパク質を遺伝子工学的に作成するための材料として使用することができる。また、発明（１７）の診断方法における診断対象となる。
【００２２】
発明（５）のオリゴヌクレオチドプローブは、前記発明（２）のポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片であり、例えば、配列番号１の塩基配列もしくはその相補配列における連続１０〜１００ｂｐのＤＮＡ断片等である。また、発明（６）のプローブは、前記発明（４）の変異ポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片であり、具体的には、配列番号１における前記の各置換塩基を含む連続１０〜１００ｂｐのＤＮＡ断片等である。この発明（６）のプローブは、後記発明（１８）の診断方法等に使用することができる。
【００２３】
なおここで、ストリンジェント条件とは、前記のポリヌクレオチドとプローブとの特異的なハイブリッド形成を可能とする条件であり、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程における塩濃度、有機溶媒（ホルムアミド等）の濃度、温度条件によって規定される。詳しくは、米国特許Ｎｏ．  ６，１００，０３７等に詳しく規定されている。
【００２４】
発明（７）のプライマーセットは、前記発明（２）のポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するための１対のオリゴヌクレオチドである。また発明（８）は、前記発明（４）の変異ポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するためのプライマーセットであり、一方のプライマーが置換塩基またはその相補配列を含む塩基配列からなることを特徴としている。またこの発明（８）のプライマーセットは、後記発明（１９）の診断方法等に使用することができる。
【００２５】
これらのプライマーセットは、配列番号１または変異ポリヌクレオチドの塩基配列に基づき設計し、合成・精製の各工程を経て調製することができる。なお、プライマー設計の留意点として、例えば以下を指摘することができる。プライマーのサイズ（塩基数）は、鋳型ＤＮＡとの間の特異的なアニーリングを満足させることを考慮し、１５−４０塩基、望ましくは１５−３０塩基である。ただし、ＬＡ（ｌｏｎｇ  ａｃｃｕｒａｔｅ）ＰＣＲを行う場合には、少なくとも３０塩基が効果的である。センス鎖（５’末端側）とアンチセンス鎖（３’末端側）からなる１組あるいは１対（２本）のプライマーが互いにアニールしないよう、両プライマー間の相補的配列を避けると共に、プライマー内のヘアピン構造の形成を防止するため自己相補配列をも避けるようにする。さらに、鋳型ＤＮＡとの安定な結合を確保するためＧＣ含量を約５０％にし、プライマー内においてＧＣ−ｒｉｃｈあるいはＡＴ−ｒｉｃｈが偏在しないようにする。アニーリング温度はＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）に依存するので、特異性の高いＰＣＲ産物を得るため、Ｔｍ値が５５−６５℃で互いに近似したプライマーを選定する。また、ＰＣＲにおけるプライマー使用の最終濃度が約０．１〜約１μＭになるよう調整する等を留意すうことも必要である。また、プライマー設計用の市販のソフトウェア、例えばＯｌｉｇｏＴＭ［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．（米国）製］、ＧＥＮＥＴＹＸ［ソフトウェア開発（株）（日本）製］等を用いることもできる。
【００２６】
発明（９）および（１０）の組換えベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであり、インサートしてのポリヌクレオチドの種類や、その使用目的等に応じて適宜のものを使用する。例えば、ｃＤＮＡまたはそのＯＲＦ領域をインサートとしてこの発明のＧＲＸＬ−１タンパク質またはその変異タンパク質を遺伝子工学的に生産する場合には、インビトロ転写用の発現ベクターや、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞のそれぞれに適した発現ベクターを使用することができる。また、前記のゲノム遺伝子ＤＮＡをインサートとする場合には、ＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクターやコスミドベクター等を使用することもできる。これらのＢＡＣベクターやコスミドベクターを用いた組換えベクターは、例えば染色体異常を検出するためのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション診断のためのプローブとして使用することもできる。
【００２７】
発明（１１）および（１２）の形質転換体細胞は、例えば、前記発明（９）および（１０）の組換えベクターを用いてＧＲＸＬ−１タンパク質を製造する場合には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。これらの形質転換体細胞は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法によって組換えベクターを細胞に導入することによって調製することができる。
【００２８】
発明（１３）は、発明（１）のヒトＧＲＸＬ−１遺伝子の発現産物であり、配列番号２のアミノ酸配列を有する精製ヒトＧＲＸＬ−１タンパク質である。
【００２９】
このＧＲＸＬ−１タンパク質の細胞内発現は、後記の実施例に示したように、細胞分裂期の中心体の分離移動に異常を生じさせ、腫瘍細胞の増殖を有意に抑制するため、腫瘍細胞の増殖抑制剤（発明（２３））の成分として有用である。また、このＧＲＸＬ−１タンパク質は、発明（１５）の抗体を作製するための免疫源として、あるいは新規の腫瘍治療剤を開発するための標的分子等として有用である。
【００３０】
発明（１４）は、前記発明（１３）のＧＲＸＬ−１タンパク質の変異タンパク質であって、配列番号２における第１４６位ＡｌａがＴｈｒに置換されているタンパク質である。
【００３１】
この変異タンパク質は、発明（１６）の抗体を作成するための免疫原として、あるいは後記発明（２０）の診断方法における検出対象として使用することができる。
【００３２】
なお、発明（１３）および（１４）のタンパク質には、配列番号２またはその置換アミノ酸残基を含む３〜３０アミノ酸配列からなるオリゴペプチドも含まれる。
【００３３】
これらのタンパク質またはオリゴペプチドは、ヒトの細胞から単離する方法、配列番号２またはその変異配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法等によって得ることができるが、好ましくは、前記発明（９）（１０）の発現ベクターおよび／または発明（１１）（１２）の形質転換細胞を用いた遺伝子工学的方法（たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系や宿主−ベクター系を用いる方法）によって大量に生産することができる。例えば、宿主−ベクター系を用いる方法の場合には、形質転換体細胞を培養し、その培養物から、例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等によって単離、精製することによりこの発明の精製ＧＲＸＬ−１タンパク質および変異タンパク質を大量に得ることができる。なお、このような遺伝子工学的手法によって得られたタンパク質や変異タンパク質には、他の任意のタンパク質との融合タンパク質も含まれる。例えば、グルタチン−Ｓ−トランスフェラ−ゼ（ＧＳＴ）や緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）との融合蛋白質などが例示できる。また、精製等を容易にするためにＦｌａｇやＨｉｓ  ｔａｇ等のエピトープタグをつけて発現させたＧＲＸＬ−１タンパク質もこの発明のタンパク質の範囲に含まれる。さらに、細胞で発現したタンパク質は、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾されたタンパク質もこの発明のＧＲＸＬ−１タンパク質の範囲に含まれる。このような翻訳後修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテア−ゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などである。
【００３４】
発明（１５）および（１６）の抗体は、それぞれ前記のＧＲＸＬ−１タンパク質およびその変異タンパク質を認識するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、ＧＲＸＬ−１タンパク質および変異タンパク質のエピトープにそれぞれ結合することができる全体分子、およびＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片等が全て含まれる。このような抗体は、前記のタンパク質またはオリゴペプチドを抗原として用いて動物を免役した後、血清から得ることができる。あるいは、上記の真核細胞用発現ベクターを注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどが用いられる。また、モノクローナル抗体は、公知のモノクローナル抗体作成法（「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、１９９０年；  ”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ”  Ｊａｍｅｓ  Ｗ．  Ｇｏｄｉｎｇ，  ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９６）に従って作成することができる。なお、これらの抗体には、各種の標識化抗体も発明の範囲に含まれる。
【００３５】
この出願の発明（１７）は、被験者が神経芽細胞腫を発症するか否かを発症以前に診断する方法である。すなわち、被験者の生体試料から染色体ＤＮＡを単離し、このＤＮＡ中に、発明（４）の変異ポリヌクレオチドが存在する場合に、この被験者を神経芽細胞腫ハイリスクと判定する。被験者は、０〜３歳児全員を対象とすることもでき、あるいは神経芽細胞腫患者の家族、親族を特に対象とすることもできる。変異ポリヌクレオチドの検出は、それを直接シークエンシングする方法によっても行うことができるが、発明（１８）または（１９）の方法が好ましい。
【００３６】
発明（１８）の方法では、被験者から単離した染色体ＤＮＡまたはそのｍＲＮＡと、前記発明（６）のオリゴヌクレオチドプローブがストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか否かを検出する。被験者が神経芽細胞腫に関連した遺伝子変異を有している場合には、染色体ＤＮＡまたはそのｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドプローブは、ストリンジェントな条件下でもハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションは公知の方法によって検出することができ、またオリゴヌクレオチドプローブを備えたＤＮＡチップを用いて簡便かつ高精度で行うことができる。標識ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション法としては、具体的には、例えばＡｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅ法、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法等の公知の方法を採用することができる。また、ＤＮＡチップは、発明（６）のオリゴヌクレオチドプローブを基盤上に直接合成したものであってもよく、あるいはヌクレオチドが結合するような素材でコーティングした基盤上にオリゴヌクレオチドをスポットしたものであってもよい。そして、標識化した被験サンプルＤＮＡと基盤上のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの有無を指標として、被験サンプルＤＮＡにおけるヌクレオチド変異を同定することができる。
【００３７】
また発明（１９）の方法では、被験者から単離した染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを鋳型とし、前記発明（８）のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った場合のＰＣＲ産物の有無を検出する。被験者が神経芽細胞腫に関連した遺伝子変異を有している場合には、プライマーセットによって規定されるポリヌクレオチドのＰＣＲ産物が得られる。ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲは公知の方法により行うことができる。ヌクレオチド変異の検出は、ＰＣＲ産物を直接シークエンシングする方法の他に、例えばＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法等を行ってもよい。また、Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｏｌｉｇｏ  Ｂａｓｅ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ法の公知の方法を採用することもできる。
【００３８】
この出願の発明（２０）もまた、被験者が神経芽細胞腫を発症する危険性を事前に診断する方法であり、被験者から単離した生体試料中に、前記発明（１４）の変異タンパク質が存在する場合に、その被験者を神経芽細胞腫ハイリスクと判定する。変異タンパク質の存在は様々な公知方法によって行うことができるが、発明（２１）の方法が好ましい。発明（２１）の方法は、発明（１６）の抗体を用いる方法であって、簡便かつ高精度の検出が可能となる。変異タンパク質と抗体との結合は、抗体に結合させた標識を検出することによって行うことができる。標識は、酵素、放射性同位体または蛍光色素を使用することができる。酵素は、ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ｎｕｍｂｅｒが大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常のＥＩＡに用いられる酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。放射性同位体としては、１２５Ｉや３Ｈ等の通常のＲＩＡで用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルオレッセンスイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。放射生同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。また、蛍光色素を用いる場合には、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。さらに、１次抗体と標識化２次抗体を用いたサンドイッチ法（標識として酵素を用いた場合には「ＥＬＩＳＡ法」）も好ましく用いることができる。
【００３９】
発明（２２）は、前記発明（２）のＧＲＸＬ−１ポリヌクレオチドが腫瘍細胞に導入可能な形態を有する腫瘍細胞増殖抑制剤である。具体的は、例えばＧＲＸＬ−１ポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに挿入し、このベクターを、生体認識分子を提示した中空ナノ粒子、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等に組み込み、遺伝子治療の手法により腫瘍細胞に導入発現させる。
【００４０】
また発明（２３）は、前記発明（１３）のＧＲＸＬ−１タンパク質が腫瘍細胞に導入可能な形態を有する腫瘍細胞増殖抑制剤である。例えば、ＧＲＸＬ−１タンパク質と薬理学的に許容される担体溶液とを混合し、マイクロインジェクション法により腫瘍組織に導入することができる。あるいは、脂質による細胞内導入法（ＢｉｏＰＯＲＴＥＲ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）、Ｃｈａｒｉｏｔ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ社、米国）等）を採用することができる。
【００４１】
以上のとおりの構成からなるこの発明の抗腫瘍剤は、例えば以下の良性または悪性腫瘍に対して有効である。
2004229602.tif 000002
これらの各種腫瘍のうち、この発明の抗腫瘍剤は特に、神経芽細胞腫をはじめ、癌腹膜播腫および固形癌等に対して有効である。
【００４２】
以下、実施例としてＧＲＸＬ−１遺伝子およびＧＲＸＬ−１タンパク質の構造および機能についての解析データを示す。
【００４３】
【実施例】
実施例１：遺伝子クローニング
ヒト１４番染色体長腕３２領域では神経芽細胞種においてしばしばヘテロ接合性欠失（ＬＯＨ）が観察される。この領域の中でもＤ１４Ｓ６２とＤ１４Ｓ９８７という２つのマーカーに挟まれる約６００Ｋｂの領域は、最小欠失領域として知られている（Ｍｅｄ  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｏｎｃｏｌ  ３５，  ５２２−５２５，  ２０００）。この領域に含まれる１４番染色体長腕遺伝子の探索過程で、新規遺伝子を見出した。この遺伝子クローニングの具体的手続は以下のとおりである。
【００４４】
ヒト１４番染色体長腕３２領域由来のＤＮＡ塩基配列を用いてＥＳＴデーターベースに対して相同性検索を行った結果、単離したＴＣＬ−６遺伝子座近傍に新規遺伝子の存在が予測された。そこでこの遺伝子の全長をクローン化するため、ＥＳＴデーターベースより得られた部分塩基配列を基にプライマーを設計し、遺伝子断片を増幅した。この遺伝子断片をプローブとして、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることで配列番号１の塩基配列を有するクローンを得た。また得られたｃＤＮＡクローンの塩基配列を基に５’−ＲＡＣＥ（５’端ｃＤＮＡ増幅ＰＣＲ）を行い、実施例２に示したエクソン１ａを有するｃＤＮＡクローンも得た。
実施例２：新規遺伝子の構造
配列番号１の塩基配列とヒトゲノムデーターベースの塩基配列を比較することにより、遺伝子のエクソンーイントロン構造を決定した。
【００４５】
実施例１でクローニングした新規遺伝子はエクソン１ａ（２８９ｂｐ）、１ｂ（２９７ｂｐ）、２（６７９ｂｐ）が関与する選択的スプライシングによって２種類の遺伝子転写産物をもたらす（図１）。このうちタンパク質をコードするのはエクソン１ｂと２から転写されたｍＲＮＡである。
実施例３：ＧＲＸＬ−１タンパク質の構造
実施例１でクローニングした遺伝子にコードされたタンパク質は１５７アミノ酸配列（配列番号２）からなる推定分子量１６．６ｋＤａのタンパク質で、チオールトランスフェラーゼの一種であるグルタレドキシン（ＧＲＸ）とアミノ酸レベルで２７％の相同性を有する（図２、３）。そこで、この遺伝子をＧＲＸ−ｌｉｋｅ  １（ＧＲＸＬ−１）遺伝子と命名し、この遺伝子のコードするタンパク質をＧＲＸＬ−１タンパク質と命名した。立体構造予測プログラムによる解析の結果、ＧＲＸＬ−１タンパク質は分子の中心を形成する４つのβシートとこの周囲を取り巻く４本のαヘリックスから構成されており、ＧＲＸと非常に類似した構造を有すことが明らかになった（図４）。またＧＲＸＬ−１タンパク質にはＮ端に疎水性アミノ酸からなるシグナル配列が存在する（図３）。
実施例４：ＧＲＸＬ−１タンパク質の酵素化学的解析
ＧＲＸタンパク質ファミリーには、チオールトランスフェラーゼの活性中心である−Ｃｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓの配列が１本目のβシートと２本目のαヘリックスとを連結する長いループ上に存在することが知られている。しかしＧＲＸＬ−１タンパク質ではこの保存された配列がＧｌｎ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓ−となっており、６７番目のシスチンのみが保存されていた（図３）。ＧＲＸＬ−１タンパク質のグルタレドキシン活性の有無を調べるため、ＧＲＸＬ−１  ｃＤＮＡ（配列番号１）を発現ベクター（ｐＥＴ−４２）にクローニングして組換えベクターを作製し、これを大腸菌に形質導入し、組換えＧＲＸＬ−１タンパク質を調製した。グルタチオンと２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅを基質とし、組換えＧＲＸＬ−１タンパク質の酵素活性を測定したが、グルタレドキシン活性は検出されなかった（図５）。
実施例５：ＧＲＸＬ−１タンパク質の細胞内局在
ＧＲＸＬ−１タンパク質の細胞内局在を調べるため、ＧＲＸＬ−１  のＣ端に蛍光緑色タンパク質ＧＦＰが結合した融合タンパク質を発現する組換えＤＮＡ断片を作製し、これを発現ベクター（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１）に挿入し組換えベクター（ｐＥＦ−ＧＲＸＬ−ＧＦＰ）を作製した。これら発現ベクターをＣＯＳ細胞にトランスフェクションし、ＧＲＸＬ−１／ＧＦＰ融合タンパク質（ＧＲＸＬ−ＧＦＰ）を発現させた（図６）。その結果、ＧＲＸＬ−ＧＦＰタンパク質は主にミトコンドリアに局在した。ＧＲＸＬ−１タンパク質のミトコンドリア局在化シグナル配列を同定するため、ＧＲＸＬ−１タンパク質のＮ端から５２番目までの配列をＧＦＰに結合させた発現ベクター（ｐＭ３−ＧＦＰ）を作成しこれをＣＯＳ細胞にトランスフェクションした。さらにＧＲＸＬ−１タンパク質のＮ端から２５番目までの配列を除いた配列をＧＦＰに結合させた発現ベクターを作成しこれをＣＯＳ細胞にトランスフェクションした（ｐＭ１−ＧＦＰ）。その結果、Ｎ端の１−２４番目のアミノ酸がミトコンドリアに局在化シグナルとして働いていることが明らかになった。
実施例６：ＧＲＸＬ−１タンパク質の生理活性
（１）細胞周期制御機能
ＧＲＸＬ−１タンパク質の機能を解析するため、実施例５で示したＧＲＸＬ−１発現ベクター（ｐＥＦ−ＧＲＸＬ−ＧＦＰ）をＣＯＳ細胞にトランスフェクションし、３６時間後の細胞の形態変化を蛍光顕微鏡で観察した。その結果、ｐＥＦ−ＧＲＸＬ−ＧＦＰ  発現ベクター導入細胞ではＭ期に留まる細胞数がコントロールであるＧＦＰ発現ベクター導入細胞に比べ４倍に増えていた。（図７）。蛍光免疫染色法による詳細な観察の結果、ｐＥＦ−ＧＲＸＬ−ＧＦＰ発現ベクター導入細胞では中心体の分裂・移動に異常が生じ、これにより染色体不分離が引き起こされていることが明らかとなった（図８）。
実施例７：ＧＲＸＬ−１タンパク質の癌抑制作用
ＧＲＸＬ−１遺伝子の癌抑制作用を調べるため、ｐＥＦ−ＧＲＸＬ−ＧＦＰおよびコントロールであるＧＦＰ発現ベクター（ｐＥＧＦＰ）をＨｅｌａ細胞に導入し、遺伝子発現による癌細胞の増殖抑制効果をコロニー形成実験法により検討した。その結果ｐＥＦ−ＧＲＸ−ＬＧＦＰを多量に発現する癌細胞の増殖は、コントロールであるＧＦＰ発現細胞に比べ著しく減少することが観察された（図９）。ＧＲＸＬ−ＧＦＰを発現する細胞の形態を観察したところ、細胞内に異常な形態を示す多数の核が存在することが明らかになった。これはＧＲＸＬ−ＧＦＰタンパク質の多量発現により、中心体の分離・移動に異常が生じ、これにより正常な細胞分裂が阻害された結果と推測された（図１０）。
（２）ミトコンドリア形態制御
ｐＥＦ−ＧＲＸＬ−ＧＦＰ発現ベクターをＣＯＳ細胞に導入したところ、ミトコンドリアの顆粒化並びに膨大化が観測された（図１１）。興味深いことにＧＲＸＬ−１タンパク質のＣ端１５アミノ酸配列を欠失させた変異型タンパク質（ＧＲＸＬＤＢａｍ−ＧＦＰ）を発現させると、さらに著しいミトコンドリアの形態異常が観察された（図１１）。この結果から、Ｃ端１５アミノ酸配列もＧＲＸＬ−１タンパク質の生理活性に必要であることが判明した。
実施例８：ＧＲＸＬ−１遺伝子の発現
各組織におけるＧＲＸＬ−１遺伝子の発現量を調べるため、ＧＲＸＬ−１染色体遺伝子のエクソン１ｂとエクソン２の塩基配列を基にＰＣＲ用のプライマーを設計した。各組織より調整したｃＤＮＡを鋳型としたＲＴ−ＰＣＲ法による遺伝子発現解析の結果、ＧＲＸＬ−１遺伝子はほとんどの正常ヒト組織で恒常的に発現していた。しかし一部の癌細胞株では発現量の著しい減少が認められた（図１２）。
実施例９：ＧＲＸＬ−１遺伝子の一塩基多型
癌組織におけるＧＲＸＬ−１遺伝子の変異を調べるため、ＧＲＸＬ−１染色体遺伝子の塩基配列を基にＰＣＲ用のプライマーを設計した。すなわち、エクソン１ｂ、２および各エクソンのスプライシングドナー・アクセプター配列の塩基配列を解析するためのプライマーを、プロモーター領域、イントロン領域、エクソン領域に設定した。正常組織および癌組織より抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡの塩基配列を決定した。その結果、ＧＲＸＬ−１  ｃＤＮＡ（配列番号１）には、第４７９位、第６４４位および９２１位のＧがそれぞれＡに置換（１塩基置換）することが明らかになった（図２）。このうち第４７９位の塩基置換は、アミノ酸１４６番目のアラニンからスレオニンへの置換（Ａ１４６Ｔ）を伴うものであった（この変異を有するＧＲＸＬ−１遺伝子およびタンパク質をＧＲＸＬ−１Ａ１４６Ｔと呼ぶ）。このアミノ酸の置換がＧＲＸＬ−１タンパク質の機能にどのような影響を与えるかを調べるため、ＧＲＸＬ−Ａ１４６Ｔ遺伝子を発現するベクター（ｐＥＦ−ＧＲＸＬ−Ａ１４６Ｔ−ＧＦＰ）を作成しこれをＣＯＳ細胞に導入し、Ｍ期停滞作用をＧＲＸＬ−１と比較した。その結果ｐＥＦ−ＧＲＸＬ−Ａ１４６Ｔ−ＧＦＰ発現細胞では、Ｍ期停滞作用が６５％に減少していることが明らかになった（図１３）。
【００４６】
神経芽細胞腫では１４番染色体長腕３２領域にヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）が高頻度に認められる。ＧＲＸＬ−１遺伝子はこの領域に存在することからＧＲＸＬ−１遺伝子の欠失・変異が神経芽細胞腫の発生に関与する可能性が考えられた。そこで神経腫瘍においてＧＲＸＬ−１遺伝子の変異の有無を調べたところ、５０症例中８症例にＡ１４６Ｔの変異が同定された。これら８症例のうち数例について非癌部および癌部組織における遺伝子型を決定した結果、非癌部組織では正常およびＡ１４６Ｔの両遺伝子型が同定されたのに対し、癌部組織においてはＡ１４６Ｔの遺伝子型のみが検出された。これは神経芽細胞腫において正常な方の対立遺伝子が消失（ヘテロ接合性の消失；ＬＯＨ）し、Ａ１４６Ｔの遺伝子型を有する対立遺伝子が残った為であると考えられた。よってＧＲＸＬ−Ａ１４６Ｔ遺伝子型を有することが神経芽細胞腫の危険因子である可能性が強く示唆された。
【００４７】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、神経芽細胞腫に係わる新規遺伝子ＧＲＸＬ−１と、この遺伝子の発現産物であるＧＲＸＬ−１タンパク質が提供される。このＧＲＸＬ−１タンパク質は、ミトコンドリアに主に存在し、ミトコンドリアの形態を制御する機能をし、しかもＭ期チェックポイントに作用することで細胞分裂を制御する機能を有する新親癌抑制タンパク質である。さらにこの出願の発明によって、ＧＲＸＬ−１遺伝子およびタンパク質を用いた神経芽細胞腫の診断方法および腫瘍増殖抑制剤が提供される。
【００４８】
【配列表】
2004229602.tif 000003
2004229602.tif 000004
2004229602.tif 000005
2004229602.tif 000006
2004229602.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【図１】ＧＲＸＬ−１遺伝子のエクソン−イントロン構造を示す。
【図２】ＧＲＸＬ−１  ｃＤＮＡの塩基配列（配列番号１と同一）である。エクソン１ｂおよび２の境界を矢印で示した。括弧内塩基は一塩基多型、下線はポリＡシグナルを示す。
【図３】ＧＲＸＬ−１タンパク質とＧＲＸタンパク質のアミノ酸配列の比較である。黒枠内は両者で共通するアミノ酸残基、枠で囲んだ部分はＧＲＸＬ−１タンパク質Ｎ端のミトコンドリア局在化配列、＊はチオールトランスフェラーゼ活性中心の２つのシスチンを示す。
【図４】ＧＲＸＬ−１タンパク質およびＧＲＸタンパク質の立体構造予測である。
【図５】Ａは、大腸菌で発現させ、精製したＧＲＸＬ−１タンパク質およびＧＲＸタンパク質の電気泳動像、Ｂは各タンパク質のグルタレドキシン活性の測定結果である。
【図６】融合タンパク質ＧＲＸＬ−ＧＦＰと、ミトコンドリア局在マーカーＤｓＲｅｄ−２をＣＯＳ細胞に発現させ、ＧＲＸＬ−１タンパク質の細胞内局在を調べた結果である。
【図７】ＧＲＸＬ−１遺伝子発現ベクター（ｐＥＦ−ＧＲＸＬ−ＧＦＰ）およびコントロールベクター（ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ）をそれぞれトランスフェクションしたＣＯＳ細胞の、３６時間後のＭ期の細胞数を示す。
【図８】ＧＲＸＬ−１発現により中心体の不分離と染色体の不分離が観察された結果である。コントロールベクター導入細胞ではＭ期での中心体の分離と染色体の分離が正常に行われている。これに対しＧＲＸＬ−ＧＦＰ発現細胞では、Ｍ期においても中心体が１つしか観察されない場合や、中心体が２つに分離していても染色体に不分離が観察される細胞が多く認められる。
【図９】ＧＲＸＬ−ＧＦＰ発現ベクター及びコントロールベクターが導入されたＨｅｌａ細胞のコロニー形成率を測定した結果である。ＧＲＸＬ−ＧＦＰの発現により癌細胞の増殖が抑制されている。
【図１０】ＧＲＸＬ−ＧＦＰ発現ベクターを導入後７日後のＣＯＳ細胞を蛍光顕微鏡により観察した結果である。ＧＲＸＬ−ＧＦＰの発現により細胞分裂が抑制され、細胞内に異常な形態を示す多数の核が観察された。
【図１１】融合タンパク質ＧＲＸＬ−ＧＦＰ、ＧＲＸＬ−ＤＢａｍ−ＧＦＰを発現させた細胞におけるミトコンドリアの形態異常（膨大化）を観察した結果である。ＧＲＸＬ−ＤＢａｍ−ＧＦＰでは、ミトコンドリアの膨大化に加え、著しい顆粒化も認められる。
【図１２】ヒトの各組織および癌細胞株におけるＧＲＸＬ−１遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲ法により測定した結果である。
【図１３】ＧＲＸＬ−１のアミノ酸１４６番目のアラニンからスレオニンへの置換により、Ｍ期停滞作用が減弱することを示した結果である。
【図１】
2004229602.tif 000008
【図２】
2004229602.tif 000009
【図３】
2004229602.tif 000010
【図４】
2004229602.tif 000011
【図５】
2004229602.tif 000012
【図６】
2004229602.tif 000013
【図７】
2004229602.tif 000014
【図８】
2004229602.tif 000015
【図９】
2004229602.tif 000016
【図１０】
2004229602.tif 000017
【図１１】
2004229602.tif 000018
【図１２】
2004229602.tif 000019
【図１３】
2004229602.tif 000020