(57)【要約】      （修正有）【課題】  各種の疾患に関連していると考えられる新規な脂質キナーゼ、該酵素をコードするＤＮＡ、該蛋白質に特異的に結合する抗体、該蛋白質を検出する方法、該酵素活性調節物質のスクリーニング方法、該酵素関連物質を有効成分として含むの医薬組成物等に関する。【解決手段】  ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のＤＮＡ：ａ）特定のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；ｂ）特定の配列表に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ；ｃ）上記ａ）記載のＤＮＡのヌクレオチド配列と相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該酵素活性を有する蛋白質をコードする領域を含むＤＮＡ；ｄ）上記ａ）記載のＤＮＡと９５％のヌクレオチド配列相同性を示し、該酵素活性を有する蛋白質をコードする領域を含むこＤＮＡ；ｅ）特定の配列を含むＤＮＡ。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のＤＮＡ：
ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から１５９６に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ；
ｃ）上記ａ）記載のＤＮＡのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、脂質キナーゼ活性を有する蛋白質をコードする領域を含むことからなるＤＮＡ；
ｄ）上記ａ）記載のＤＮＡと９５％のヌクレオチド配列相同性を示し、脂質キナーゼ活性を有する蛋白質をコードする領域を含むことからなるＤＮＡ；
ｅ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から１５９６に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるＤＮＡ。
【請求項２】
ａ）乃至ｃ）のいずれか一つに記載のＤＮＡ：
ａ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｃＤＮＡ３．１−ｃｅｒｋ２  ＳＡＮＫ  ７１１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２０１）が保持するプラスミドに挿入されているＤＮＡ；
ｂ）上記ａ）記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、脂質キナーゼ活性を有する蛋白質をコードする領域を含むことからなるＤＮＡ；
ｃ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｃＤＮＡ３．１−ｃｅｒｋ２  ＳＡＮＫ  ７１１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２０１）が保持するプラスミドに挿入されているＤＮＡを含むことからなるＤＮＡ。
【請求項３】
脂質キナーゼ活性が、セラミドの一位の水酸基をリン酸化する活性であることを特徴とする、請求項１乃至２のいずれか一つに記載のＤＮＡ。
【請求項４】
下記のａ）乃至ｄ）のいずれか一つに記載の蛋白質：
ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むことからなる蛋白質；
ｃ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、一つまたは二つ以上のアミノ酸が付加、挿入、欠失もしくは置換されているアミノ酸配列からなり、脂質キナーゼ活性を有することを特徴とする蛋白質；
ｄ）請求項１乃至請求項３のいずれか一つに記載のＤＮＡによりコードされ、脂質キナーゼ活性を有することを特徴とする蛋白質。
【請求項５】
脂質キナーゼ活性が、セラミドの一位の水酸基をリン酸化する活性であることを特徴とする、請求項４記載の蛋白質。
【請求項６】
下記のａ）またはｂ）に記載の蛋白質：
ａ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｃＤＮＡ３．１−ｃｅｒｋ２  ＳＡＮＫ  ７１１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２０１）が保持するプラスミド、ｐｃＤＮＡ３．１−ｃｅｒｋ２に挿入されているＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質；
ｂ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｃＤＮＡ３．１−ｃｅｒｋ２  ＳＡＮＫ  ７１１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２０１）が保持するプラスミドに挿入されているＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を含むことからなる蛋白質。
【請求項７】
請求項１乃至請求項３のいずれか一つに記載のＤＮＡを含む組換えプラスミド。
【請求項８】
発現ベクターであることを特徴とする、請求項７記載の組換えプラスミド。
【請求項９】
形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｃＤＮＡ３．１−ｃｅｒｋ２  ＳＡＮＫ  ７１１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２０１）により保持される組換えプラスミド。
【請求項１０】
請求項７乃至９のいずれか一つに記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】
原核細胞であることを特徴とする、請求項１０記載の宿主細胞。
【請求項１２】
真核細胞であることを特徴とする、請求項１０記載の宿主細胞。
【請求項１３】
哺乳動物由来の細胞であることを特徴とする、請求項１２記載の宿主細胞。
【請求項１４】
形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｃＤＮＡ３．１−ｃｅｒｋ２  ＳＡＮＫ  ７１１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２０１）であることを特徴とする請求項１０記載の宿主細胞。
【請求項１５】
請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質と特異的に結合する抗体。
【請求項１６】
ポリクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１５記載の抗体。
【請求項１７】
モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１５記載の抗体。
【請求項１８】
ヒト化抗体、キメラ抗体およびヒト抗体から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１５または１７に記載の抗体。
【請求項１９】
下記の工程１）および２）を含む、請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質の製造方法：
１）請求項１１乃至請求項１４のいずれか一つに記載の宿主細胞を、脂質キナーゼ活性を有する蛋白質の産生が可能な条件下で培養する工程；
２）１）における培養により得られた培養物から、脂質キナーゼ活性を有する蛋白質を回収する工程。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法により得られる蛋白質。
【請求項２１】
下記の工程１）乃至３）を含む、請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質の精製方法：
１）  カルモジュリンを含まない溶媒に溶解させた請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質を含む試料を、カルモジュリンを固定させた樹脂に接触させる工程；
２）  該樹脂をカルモジュリンを含まない溶媒で洗浄する工程；
３）  ２）で洗浄された樹脂から、ＥＧＴＡまたはＥＤＴＡを含む溶媒を用いて脂質キナーゼ活性を有する蛋白質を溶出させる工程。
【請求項２２】
下記の工程１）および２）を含む、試料中の請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質の検出方法；
１）請求項１５乃至請求項１８のいずれか一つに記載の抗体と試料を混合する工程；
２）該抗体と請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質の複合体を検出する工程。
【請求項２３】
下記の工程１）および２）を含む、試料中の請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質をコードするｍＲＮＡの検出方法；
１）試料からｍＲＮＡを抽出する工程；
２）１）で抽出されたｍＲＮＡ中の請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質をコードするｍＲＮＡ量を測定する工程。
【請求項２４】
下記の工程１）および２）を含む、試料中の請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質の検出方法；
１）試料、脂質基質およびリン酸供給物質を混合する工程；
２）脂質基質のリン酸化の程度を測定する工程。
【請求項２５】
下記の工程１）および２）を含む、脂質キナーゼ活性を測定する方法：
１）脂質基質、リン酸供給物質および下記のａ）乃至ｃ）から選択されるいずれか一つまたは二つ以上を含む試料を混合する工程；
ａ）請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質；
ｂ）該蛋白質を発現する細胞；
ｃ）該細胞の破砕液；
２）脂質基質のリン酸化の程度を検出する工程。
【請求項２６】
下記の工程１）乃至３）を含む、脂質キナーゼ活性を調節する活性を有する物質をスクリーニングする方法：
１）被験物質の存在下または非存在下で、脂質基質、リン酸供給物質および下記のａ）乃至ｃ）から選択されるいずれか一つまたは二つ以上を含む試料を混合させる工程；
ａ）請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質；
ｂ）該蛋白質を発現する細胞；
ｃ）該細胞の破砕液；
２）被験物質の存在下および非存在下における脂質基質のリン酸化の程度を検出し、比較する工程；
３）被験物質存在下における該リン酸化の程度が、被験物質非存在下における該リン酸化の程度よりも大きい場合または小さい場合、該被験物質を選択する工程。
【請求項２７】
下記の工程１）乃至３）を含む、神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症および動脈硬化から選択される一つ若しくは二つ以上の疾患の治療または予防効果を有する物質をスクリーニングする方法：
１）被験物質の存在下または非存在下で、脂質基質、リン酸供給物質および下記のａ）乃至ｃ）から選択されるいずれか一つまたは二つ以上を含む試料を混合させる工程；
ａ）請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質；
ｂ）該蛋白質を発現する細胞；
ｃ）該細胞の破砕液；
２）被験物質の存在下および非存在下における脂質基質のリン酸化の程度を検出し、比較する工程；
３）被験物質存在下における該リン酸化の程度が、被験物質非存在下における該リン酸化の程度よりも大きい場合、該被験物質を選択する工程。
【請求項２８】
下記の工程１）乃至３）を含む、癌および癌の転移のいずれか一つ若しくは両方の疾患の治療または予防効果を有する物質をスクリーニングする方法：
１）被験物質の存在下または非存在下で、脂質基質、リン酸供給物質および下記のａ）乃至ｃ）から選択されるいずれか一つまたは二つ以上を含む試料を混合させる工程；
ａ）請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質；
ｂ）該蛋白質を発現する細胞；
２）被験物質の存在下および非存在下における脂質基質のリン酸化の程度を検出し、比較する工程；
３）被験物質存在下における該リン酸化の程度が、被験物質非存在下における該リン酸化の程度よりも小さい場合、該被験物質を選択する工程。
【請求項２９】
脂質基質が、セラミドであることを特徴とする、請求項２４乃至請求項２８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３０】
下記の工程１）乃至３）からなる、脂質キナーゼ活性を調節する物質をスクリーニングする方法：
１）被験物質の存在下または非存在下で、リン酸供給物質および下記のａ）およびｂ）から選択されるいずれか一つまたは両方を含む試料を混合させる工程；
ａ）請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質を発現する細胞；
ｂ）ａ）に記載の細胞の破砕液；
２）該細胞に由来する脂質のリン酸化を測定し、測定結果を被験物質の存在下と非存在下で比較する工程；
３）被験物質存在下における該リン酸化の程度が、被験物質非存在下における該リン酸化の程度よりも大きい場合または小さい場合、該被験物質を選択する工程。
【請求項３１】
下記の工程１）乃至３）を含む、神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症および動脈硬化から選択される一つ若しくは二つ以上の疾患の治療または予防効果を有する物質をスクリーニングする方法：
１）被験物質の存在下または非存在下で、リン酸供給物質および下記のａ）およびｂ）から選択されるいずれか一つまたは両方を含む試料を混合させる工程；
ａ）請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質を発現する細胞；
ｂ）ａ）に記載の細胞の破砕液；
２）  該細胞に由来する脂質のリン酸化を測定し、測定結果を被験物質の存在下と非存在下で比較する工程；
３）被験物質存在下における該リン酸化の程度が、被験物質非存在下における該リン酸化の程度よりも大きい場合、該被験物質を選択する工程。
【請求項３２】
下記の工程１）乃至３）を含む、癌および癌の転移のいずれか一つ若しくは両方の疾患の治療または予防効果を有する物質をスクリーニングする方法：
１）被験物質の存在下または非存在下で、リン酸供給物質および下記のａ）およびｂ）から選択されるいずれか一つまたは両方を含む試料を混合させる工程；
ａ）請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質を発現する細胞；
ｂ）ａ）に記載の細胞の破砕液；
２）  該細胞に由来する脂質のリン酸化を測定し、測定結果を被験物質の存在下と非存在下で比較する工程；
３）被験物質存在下における該リン酸化の程度が、被験物質非存在下における該リン酸化の程度よりも小さい場合、該被験物質を選択する工程。
【請求項３３】
脂質基質が標識されていることを特徴とする、請求項２３乃至請求項２９のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３４】
リン酸供給物質が３２Ｐ−γ−ＡＴＰであることを特徴とする請求項２３乃至請求項３２のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３５】
下記の工程１）乃至３）を含む、試料中の、脂質キナーゼ活性によりリン酸化される物質を検出する方法：
１）被験試料の存在下および非存在下で、請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質、標識されたセラミドおよびリン酸供給物質を混合する工程；
２）セラミドのリン酸化の程度を検出し、該被験試料の存在下と非存在下で比較する工程；
３）該被験試料の非存在下に比べ、該被験試料の存在下において該リン酸化の程度が小さい場合、該被験試料中に脂質キナーゼ活性によりリン酸化される物質が含まれると判断する方法。
【請求項３６】
請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項３７】
請求項１５乃至請求項１８のいずれか一つに記載の抗体を有効成分として含む医薬組成物。
【請求項３８】
請求項１乃至請求項３のいずれか一つに記載の一本鎖または二本鎖ＤＮＡを有効成分として含む医薬組成物。
【請求項３９】
請求項１乃至請求項３のいずれか一つに記載のＤＮＡのアンチセンス配列からなり、かつ、１０乃至５０塩基からなることを特徴とする一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを有効成分として含む医薬組成物。
【請求項４０】
神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症、動脈硬化、癌および癌の転移から選択される一つ若しくは二つ以上の疾患の治療および／または予防剤であることを特徴とする、請求項３６乃至３９のいずれか一つに記載の医薬組成物。
【請求項４１】
下記のａ）乃至ｃ）から選択される一つもしくは複数を含む脂質キナーゼの発現検出用キット：
ａ）請求項１５乃至請求項１８のいずれか一つに記載の抗体；
ｂ）ｉ）およびｉｉ）にＰＣＲ用プライマーの組であり、且つ、請求項１乃至３のいずれか一つに記載のＤＮＡの有するヌクレオチド配列からなるヌクレオチドまたはその断片を増幅することができることを特徴とする、一組のＰＣＲ用プライマー；
ｉ）配列表の配列番号１に記載のヌクレオチド配列からなる一本鎖ＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、１０乃至５０塩基からなる一本鎖ＤＮＡ；
ｉｉ）配列表の配列番号１に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖ＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、１０乃至５０塩基からなる一本鎖ＤＮＡ；
ｃ）配列表の配列番号１に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズし、且つ、２０乃至１０００塩基からなる一本鎖ＤＮＡであることを特徴とするプローブ。
【請求項４２】
下記の工程１）乃至３）を含む、被験個体における神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症および動脈硬化から選択される一つまたは二つ以上の疾患に罹患するリスクの検出方法；
１）被験個体由来の試料（被験試料という）および正常個体由来の試料（対照試料という）中の請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質の含有量を測定する工程；
２）該含有量を被験試料と対照試料で比較する工程；
３）該含有量が、対照試料よりも被験試料において少ない場合、被験個体が神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症および動脈硬化から選択される一つまたは二つ以上の疾患に罹患するリスクが高いと判断する工程。
【請求項４３】
下記の工程１）乃至３）を含む、被験個体における、癌および癌の転移から選択される一つまたは両方の疾患に罹患するリスクの検出方法；
１）被験個体由来の試料（被験試料という）および正常個体由来の試料（対照試料という）中の請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質の含有量を測定する工程；
２）該含有量を被験試料と対照試料で比較する工程。
３）該含有量が、対照試料よりも被験試料において多い場合、被験個体が癌および癌の転移から選択される一つまたは両方の疾患に罹患するリスクが高いと判断する工程。
【請求項４４】
下記の工程１）乃至４）を含む、請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質の発現を調節する活性を有する物質をスクリーニングする方法：
１）被験物質の存在下または非存在下で、請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質を発現する細胞を培養する工程；
２）培養上清を分取するかまたは細胞破砕液を調製し、試料液とする工程；
３）該試料液中の、請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質量を測定し、測定結果を被験物質の存在下と非存在下で比較する工程；
４）被験物質存在下における該蛋白質量が、被験物質非存在下における該蛋白質量よりも大きい場合または小さい場合、該被験物質を選択する工程。
【請求項４５】
下記の工程１）乃至４）を含む、神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症および動脈硬化から選択される一つ若しくは二つ以上の疾患の治療または予防効果を有する物質をスクリーニングする方法：
１）被験物質の存在下または非存在下で、請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質を発現する細胞を培養する工程；
２）培養上清を分取するかまたは細胞破砕液を調製し、試料液とする工程；
３）該試料液中の、請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質量を測定し、測定結果を被験物質の存在下と非存在下で比較する工程；
４）被験物質存在下における該蛋白質量が、被験物質非存在下における該蛋白質量よりも大きい場合、該被験物質を選択する工程。
【請求項４６】
下記の工程１）乃至４）を含む、癌および癌の転移のいずれか一つ若しくは両方の疾患の治療または予防効果を有する物質をスクリーニングする方法：
１）被験物質の存在下または非存在下で、請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質を発現する細胞を培養する工程；
２）培養上清を分取するまたは細胞を破砕液を調製し、試料液とする工程；
３）該試料液中の、請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質量を測定し、測定結果を被験物質の存在下と非存在下で比較する工程；
４）被験物質存在下における該蛋白質量が、被験物質非存在下における該蛋白質量よりも小さい場合、該被験物質を選択する工程。
【請求項４７】
下記の工程１）乃至４）を含む、請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質をコードするｍＲＮＡ発現調節活性を有する物質をスクリーニングする方法：
１）被験物質の存在下または非存在下で、請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質を発現する細胞を培養する工程；
２）培養細胞からｍＲＮＡを抽出する工程；
３）該ｍＲＮＡ中の、請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質をコードするｍＲＮＡ量を測定し、測定結果を被験物質の存在下と非存在下で比較する工程；
４）被験物質存在下における該蛋白質をコードするｍＲＮＡ量が、被験物質非存在下における該蛋白質をコードするｍＲＮＡ量よりも大きい場合または小さい場合、該被験物質を選択する工程。
【請求項４８】
下記の工程１）乃至４）を含む、神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症および動脈硬化から選択される一つ若しくは二つ以上の疾患の治療または予防効果を有する物質をスクリーニングする方法：
１）被験物質の存在下または非存在下で、請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質を発現する細胞を培養する工程；
２）培養細胞からｍＲＮＡを抽出する工程；
３）該ｍＲＮＡ中の、請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質をコードするｍＲＮＡ量を測定し、測定結果を被験物質の存在下と非存在下で比較する工程；
４）被験物質存在下における該蛋白質をコードするｍＲＮＡ量が、被験物質非存在下における該蛋白質をコードするｍＲＮＡ量よりも大きい場合、該被験物質を選択する工程。
【請求項４９】
下記の工程１）乃至４）を含む、癌および癌の転移のいずれか一つ若しくは両方の疾患の治療または予防効果を有する物質をスクリーニングする方法：
１）被験物質の存在下または非存在下で、請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質を発現する細胞を培養する工程；
２）培養細胞からｍＲＮＡを抽出する工程；
３）該ｍＲＮＡ中の、請求項４乃至請求項６のいずれか一つに記載の蛋白質をコードするｍＲＮＡ量を測定し、測定結果を被験物質の存在下と非存在下で比較する工程；
４）被験物質存在下における該蛋白質をコードするｍＲＮＡ量が、被験物質非存在下における該蛋白質をコードするｍＲＮＡ量よりも小さい場合、該被験物質を選択する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経性疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症、動脈硬化、癌および癌の転移などの疾患に関連していると考えられる脂質をリン酸化する新規な脂質キナーゼ、該脂質キナーゼをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むことからなる組換えプラスミド、該組換えプラスミドで形質転換せしめた宿主、該脂質キナーゼの製造方法、該蛋白質に特異的に結合する抗体、該蛋白質を検出する方法、該脂質キナーゼ活性の測定方法、該脂質キナーゼ活性調節物質（神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症、動脈硬化、癌および癌の転移等の疾患の治療および／または予防活性を有する物質を含む）のスクリーニング方法、神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症、動脈硬化、癌および癌の転移等の疾患に罹患するリスクを判定する方法および該脂質キナーゼ関連物質を有効成分として含むの医薬組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
スフィンゴ脂質は従来、グリセロリン脂質およびコレステロールとならぶ細胞膜の主要な構成成分の一つと考えられてきた。グリセロリン脂質は細胞膜構造の維持だけでなく、その代謝産物として多くの生理活性物質を産生させることが知られてきたが、スフィンゴ脂質についてはその代謝産物の生理活性については最近までほとんど知られていなかった。近年、いくつかのスフィンゴ脂質の代謝産物にアポトーシスの誘導や細胞増殖刺激作用などの生理活性が知られるようになり、スフィンゴ脂質の代謝酵素が生理的反応や種々の病態に密接に関連する可能性が示唆されるようになった。なかでも、セラミドは多くの細胞機能を調節するレギュレーターとして注目を集めている（非特許文献１参照）。
【０００３】
例えば、セラミドはTNF-αやIL-1βなどの炎症性サイトカインのセカンドメッセンジャーとして機能し、ホスホリパーゼＡ２等のアラキドン酸経路を活性化することが知られている（非特許文献２および非特許文献３参照）。すなわち、セラミドを各種炎症性疾患の増悪因子として捉える捕らえることができる。また、先天性免疫不全症候群に感染した患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞のアポトーシスを伴う減少や脳細胞への感染の際にもセラミドが増悪因子として機能しているという報告がある（非特許文献４および非特許文献５参照）。さらには、２型糖尿病や肥満においてTNF-αがインシュリン抵抗性を引き起こすが知られているが、セラミドはその下流においても増悪因子として機能していると考えられている（非特許文献６および非特許文献７参照）。腎臓メサンギウム細胞のアポトーシスにおいてセラミドの関与が示唆されており、腎臓疾患の発症および進展にセラミド代謝系が重要な役割を果たしていることが考えられる（非特許文献８参照）。また、LPS等が引き金になり起こる敗血症においてもセラミドがセカンドメッセンジャーとして機能していると報告されている（非特許文献９参照）。さらには、動脈硬化層形成の引き金となるLDLの凝集反応においてもスフィンゴミエリナーゼの活性化に伴うセラミドの上昇が増悪因子として機能するという報告がある（非特許文献１０参照）。またこれらとは逆に、癌治療における放射線療法や化学療法において、癌細胞のアポトーシスをセラミドが促進することが知られている（非特許文献１１、非特許文献１２および非特許文献１３参照）。
【０００４】
一方、セラミドの代謝産物であるセラミド−１−リン酸およびその生成酵素であるセラミドキナーゼに関してもいくつかの生理活性が知られている。例えば、脳のシナプスのおいて、カルシウム刺激に応答してセラミドキナーゼが活性化され、生成したセラミド−１−リン酸がシナプスからの神経伝達物質の放出を調節している（非特許文献１４および非特許文献１５参照）。従って、薬剤等によりセラミドキナーゼの活性を調節することは、アルツハイマー病を含めた各種神経性疾患の治療法となる可能性がある。また、セラミド−１−リン酸は上述した各種セラミドの機能をブロックする作用があると考えられている（非特許文献１６参照）。すなわち、慢性関節炎等の各種炎症性疾患、先天性免疫不全症候群、インシュリン抵抗性が引き金となる２型糖尿病や肥満、さらには敗血症、動脈硬化といったをセラミドが増悪因子として作用する疾患をセラミド−1−リン酸により抑制できると考えられる。従って、薬剤等によりセラミドキナーゼを活性化することは、各種炎症性疾患、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症や動脈硬化等の治療法となる可能性がある。逆に、癌の放射線療法や化学療法においてはセラミドキナーゼ活性を抑制する事によって、セラミド量を保つことが出来れば、細胞のアポトーシスを促進し、治療効果を向上させる可能性も考えられる。
【特許文献１】国際公開第０１／７４８３７号パンフレット
【非特許文献１】ハヌン（Hannun,  Y.  A.）およびオベイド（Obeid,  L.  M.）、「トレンズ・イン・バイオケミカル・サイエンシィズ（Trends  in  Biochemical  Sciences）」、1995年、20巻、p.73-77
【非特許文献２】シュピーゲルら（Spiegel,  S.  et  al.）、「カレント・オピニオン・オブ・セル・バイオロジー（Current  Opinion  of  Cell  Biologies）」、1996年、8巻、p.159-167
【非特許文献３】マティアスら（Mathias,  S.  et  al.）、「サイエンス（Science）」、1993年、259巻、p.519-522
【非特許文献４】コリネら（Coline,  M.  G.  et  al.）、「プロシーディングズ・オブ・ザ・アソシエーション・オブ・アメリカン・フィジシャンズ（Proceedings  of  the  Association  of  American  Physicians）」、1997年、109巻、p.146-153
【非特許文献５】ウィルトら（Wilt,  S.  et  al.）「アナルズ・オブ・ニューロロジー（Annals  of  Neurology」，1995年、37巻、p.381-394
【非特許文献６】ベガムら（Begum,  N.  et  al.）「ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（European  Journal  of  Biochemistry）」、1996年、238巻、p.214-220
【非特許文献７】ホタミスリギルら（Hotamisligil,  G.  S.  et  al.）「サイエンス（Science）」、1996年、271巻、p.665-668
【非特許文献８】ゲネロら（Gennero,  I.  et  al.）「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journal  of  Biological  Chemistry）」、2002年、277巻、p.12724-12734
【非特許文献９】ビュートラー（Beutler,  B.）とクルース（Kruys,  V.）「ザ・ジャーナル・オブ・カルディオバスキュラー・ファーマコロジー（The  Journal  of  Cardiovascular  Pharmacology）」、1995年、25巻、S1-S8
【非特許文献１０】シッセルら（Schissel,  S.  L.  et  al.）「ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Journal  of  Clinical  Investigation）」、1996年、98巻、p.1455-1464
【非特許文献１１】マイケルら（Michael,  J.  M.  et  al.）「キャンサー・リサーチ（Cancer  Reseach)  、1997年、57巻、p.3600-3605
【非特許文献１２】ボーズら（Bose,  R.  et  al.）「セル（Cell）」、1995年、82巻、p.405-414
【非特許文献１３】ジャフリゾウら（Jaffrezou,  J.  P.  et  al.）「イー・エム・ビー・オー・ジャーナル（EMBO  Journal）」、1996年、15巻、p.2417-2424
【非特許文献１４】バジャリーら（Bajjalieh,  S.  M.  et  al.）「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journal  of  Biological  Chemistry）」、1989年、264巻、p.14354-14360
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らはヒトセラミドキナーゼと部分的にホモロジーを有する新規蛋白質をコードするｃＤＮＡをクローニングし、この新規蛋白質の全一次構造を解明することに成功した。さらにこの新規蛋白質を発現させ、該蛋白質が脂質キナーゼ活性を有することを確認することに成功し、本発明を完成させた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、
(１)  ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のＤＮＡ：
ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から１５９６に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ；
ｃ）上記ａ）記載のＤＮＡのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、脂質キナーゼ活性を有する蛋白質をコードする領域を含むことからなるＤＮＡ；
ｄ）上記ａ）記載のＤＮＡと９５％のヌクレオチド配列相同性を示し、脂質キナーゼ活性を有する蛋白質をコードする領域を含むことからなるＤＮＡ；
ｅ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から１５９６に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるＤＮＡ、
(２)  ａ）乃至ｃ）のいずれか一つに記載のＤＮＡ：
ａ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｃＤＮＡ３．１−ｃｅｒｋ２  ＳＡＮＫ  ７１１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２０１）が保持するプラスミドに挿入されているＤＮＡ；
ｂ）上記ａ）記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、脂質キナーゼ活性を有する蛋白質をコードする領域を含むことからなるＤＮＡ；
ｃ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｃＤＮＡ３．１−ｃｅｒｋ２  ＳＡＮＫ  ７１１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２０１）が保持するプラスミドに挿入されているＤＮＡを含むことからなるＤＮＡ、
（３）  脂質キナーゼ活性が、セラミドの一位の水酸基をリン酸化する活性であることを特徴とする、（１）乃至（２）のいずれか一つに記載のＤＮＡ、
（４）  下記のａ）乃至ｄ）のいずれか一つに記載の蛋白質：
ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むことからなる蛋白質；
ｃ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、一つまたは二つ以上のアミノ酸が付加、挿入、欠失もしくは置換されているアミノ酸配列からなり、脂質キナーゼ活性を有することを特徴とする蛋白質；
ｄ）（１）乃至（３）のいずれか一つに記載のＤＮＡによりコードされ、脂質キナーゼ活性を有することを特徴とする蛋白質、
（５）  脂質キナーゼ活性が、セラミドの一位の水酸基をリン酸化する活性であることを特徴とする、（４）記載の蛋白質、
（６）  下記のａ）またはｂ）に記載の蛋白質：
ａ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｃＤＮＡ３．１−ｃｅｒｋ２  ＳＡＮＫ  ７１１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２０１）が保持するプラスミド、ｐｃＤＮＡ３．１−ｃｅｒｋ２に挿入されているＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質；
ｂ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｃＤＮＡ３．１−ｃｅｒｋ２  ＳＡＮＫ  ７１１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２０１）が保持するプラスミドに挿入されているＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を含むことからなる蛋白質、
（７）  （１）乃至（３）のいずれか一つに記載のＤＮＡを含む組換えプラスミド、
（８）  発現ベクターであることを特徴とする、（７）記載の組換えプラスミド、
（９）  形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｃＤＮＡ３．１−ｃｅｒｋ２  ＳＡＮＫ  ７１１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２０１）により保持される組換えプラスミド、
（１０）  （７）乃至（９）のいずれか一つに記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞、
（１１）  原核細胞であることを特徴とする、（１０）記載の宿主細胞、
（１２）  真核細胞であることを特徴とする、（１０）記載の宿主細胞、
（１３）  哺乳動物由来の細胞であることを特徴とする、（１２）記載の宿主細胞、
（１４）  形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｃＤＮＡ３．１−ｃｅｒｋ２  ＳＡＮＫ  ７１１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２０１）であることを特徴とする（１０）記載の宿主細胞、
（１５）  （４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質と特異的に結合する抗体、
（１６）  ポリクローナル抗体であることを特徴とする、（１５）記載の抗体、
（１７）  モノクローナル抗体であることを特徴とする、（１５）記載の抗体、
（１８）  ヒト化抗体、キメラ抗体およびヒト抗体から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、（１５）または（１７）に記載の抗体、
（１９）  下記の工程１）および２）を含む、（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質の製造方法：
１）（１１）乃至（１４）のいずれか一つに記載の宿主細胞を、脂質キナーゼ活性を有する蛋白質の産生が可能な条件下で培養する工程；
２）１）における培養により得られた培養物から、脂質キナーゼ活性を有する蛋白質を回収する工程、
（２０）  （１９）に記載の方法により得られる蛋白質、
（２１）  下記の工程１）乃至３）を含む、（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質の精製方法：
１）  カルモジュリンを含まない溶媒に溶解させた（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質を含む試料を、カルモジュリンを固定させた樹脂に接触させる工程；
２）  該樹脂をカルモジュリンを含まない溶媒で洗浄する工程；
３）  ２）で洗浄された樹脂から、ＥＧＴＡまたはＥＤＴＡを含む溶媒を用いて脂質キナーゼ活性を有する蛋白質を溶出させる工程、
（２２）  下記の工程１）および２）を含む、試料中の（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質の検出方法；
１）（１５）乃至（１８）のいずれか一つに記載の抗体と試料を混合する工程；
２）該抗体と（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質の複合体を検出する工程、
（２３）  下記の工程１）および２）を含む、試料中の（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質をコードするｍＲＮＡの検出方法；
１）試料からｍＲＮＡを抽出する工程；
２）１）で抽出されたｍＲＮＡ中の（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質をコードするｍＲＮＡ量を測定する工程、
（２４）  下記の工程１）および２）を含む、試料中の（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質の検出方法；
１）試料、脂質基質およびリン酸供給物質を混合する工程；
２）脂質基質のリン酸化の程度を測定する工程、
（２５）  下記の工程１）および２）を含む、脂質キナーゼ活性を測定する方法：
１）脂質基質、リン酸供給物質および下記のａ）乃至ｃ）から選択されるいずれか一つまたは二つ以上を含む試料を混合する工程；
ａ）（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質；
ｂ）該蛋白質を発現する細胞；
ｃ）該細胞の破砕液；
２）脂質基質のリン酸化の程度を検出する工程、
（２６）  下記の工程１）乃至３）を含む、脂質キナーゼ活性を調節する活性を有する物質をスクリーニングする方法：
１）被験物質の存在下または非存在下で、脂質基質、リン酸供給物質および下記のａ）乃至ｃ）から選択されるいずれか一つまたは二つ以上を含む試料を混合させる工程；
ａ）（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質；
ｂ）該蛋白質を発現する細胞；
ｃ）該細胞の破砕液；
２）被験物質の存在下および非存在下における脂質基質のリン酸化の程度を検出し、比較する工程；
３）被験物質存在下における該リン酸化の程度が、被験物質非存在下における該リン酸化の程度よりも大きい場合または小さい場合、該被験物質を選択する工程、
（２７）  下記の工程１）乃至３）を含む、神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症および動脈硬化から選択される一つ若しくは二つ以上の疾患の治療または予防効果を有する物質をスクリーニングする方法：
１）被験物質の存在下または非存在下で、脂質基質、リン酸供給物質および下記のａ）乃至ｃ）から選択されるいずれか一つまたは二つ以上を含む試料を混合させる工程；
ａ）（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質；
ｂ）該蛋白質を発現する細胞；
ｃ）該細胞の破砕液；
２）被験物質の存在下および非存在下における脂質基質のリン酸化の程度を検出し、比較する工程；
３）被験物質存在下における該リン酸化の程度が、被験物質非存在下における該リン酸化の程度よりも大きい場合、該被験物質を選択する工程、
（２８）  下記の工程１）乃至３）を含む、癌および癌の転移のいずれか一つ若しくは両方の疾患の治療または予防効果を有する物質をスクリーニングする方法：
１）被験物質の存在下または非存在下で、脂質基質、リン酸供給物質および下記のａ）乃至ｃ）から選択されるいずれか一つまたは二つ以上を含む試料を混合させる工程；
ａ）（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質；
ｂ）該蛋白質を発現する細胞；
２）被験物質の存在下および非存在下における脂質基質のリン酸化の程度を検出し、比較する工程；
３）被験物質存在下における該リン酸化の程度が、被験物質非存在下における該リン酸化の程度よりも小さい場合、該被験物質を選択する工程、
（２９）  脂質基質が、セラミドであることを特徴とする、（２４）乃至（２８）のいずれか一つに記載の方法、
（３０）  下記の工程１）乃至３）からなる、脂質キナーゼ活性を調節する物質をスクリーニングする方法：
１）被験物質の存在下または非存在下で、リン酸供給物質および下記のａ）およびｂ）から選択されるいずれか一つまたは両方を含む試料を混合させる工程；
ａ）（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質を発現する細胞；
ｂ）ａ）に記載の細胞の破砕液；
２）該細胞に由来する脂質のリン酸化を測定し、測定結果を被験物質の存在下と非存在下で比較する工程；
３）被験物質存在下における該リン酸化の程度が、被験物質非存在下における該リン酸化の程度よりも大きい場合または小さい場合、該被験物質を選択する工程、
（３１）  下記の工程１）乃至３）を含む、神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症および動脈硬化から選択される一つ若しくは二つ以上の疾患の治療または予防効果を有する物質をスクリーニングする方法：
１）被験物質の存在下または非存在下で、リン酸供給物質および下記のａ）およびｂ）から選択されるいずれか一つまたは両方を含む試料を混合させる工程；
ａ）（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質を発現する細胞；
ｂ）ａ）に記載の細胞の破砕液；
２）  該細胞に由来する脂質のリン酸化を測定し、測定結果を被験物質の存在下と非存在下で比較する工程；
３）被験物質存在下における該リン酸化の程度が、被験物質非存在下における該リン酸化の程度よりも大きい場合、該被験物質を選択する工程、
（３２）  下記の工程１）乃至３）を含む、癌および癌の転移のいずれか一つ若しくは両方の疾患の治療または予防効果を有する物質をスクリーニングする方法：
１）被験物質の存在下または非存在下で、リン酸供給物質および下記のａ）およびｂ）から選択されるいずれか一つまたは両方を含む試料を混合させる工程；
ａ）（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質を発現する細胞；
ｂ）ａ）に記載の細胞の破砕液；
２）  該細胞に由来する脂質のリン酸化を測定し、測定結果を被験物質の存在下と非存在下で比較する工程；
３）被験物質存在下における該リン酸化の程度が、被験物質非存在下における該リン酸化の程度よりも小さい場合、該被験物質を選択する工程、
（３３）  脂質基質が標識されていることを特徴とする、（２３）乃至（２９）のいずれか一つに記載の方法、
（３４）  リン酸供給物質が３２Ｐ−γ−ＡＴＰであることを特徴とする（２３）乃至（３２）のいずれか一つに記載の方法、
（３５）  下記の工程１）乃至３）を含む、試料中の、脂質キナーゼ活性によりリン酸化される物質を検出する方法：
１）被験試料の存在下および非存在下で、（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質、標識されたセラミドおよびリン酸供給物質を混合する工程；
２）セラミドのリン酸化の程度を検出し、該被験試料の存在下と非存在下で比較する工程；
３）該被験試料の非存在下に比べ、該被験試料の存在下において該リン酸化の程度が小さい場合、該被験試料中に脂質キナーゼ活性によりリン酸化される物質が含まれると判断する方法、
（３６）  （４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質を有効成分として含有する医薬組成物、
（３７）  （１５）乃至（１８）のいずれか一つに記載の抗体を有効成分として含む医薬組成物、
（３８）  （１）乃至（３）のいずれか一つに記載の一本鎖または二本鎖ＤＮＡを有効成分として含む医薬組成物、
（３９）  （１）乃至（３）のいずれか一つに記載のＤＮＡのアンチセンス配列からなり、かつ、１０乃至５０塩基からなることを特徴とする一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを有効成分として含む医薬組成物、
（４０）  神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症、動脈硬化、癌および癌の転移から選択される一つ若しくは二つ以上の疾患の治療および／または予防剤であることを特徴とする、（３６）乃至（３９）のいずれか一つに記載の医薬組成物、
（４１）  下記のａ）乃至ｃ）から選択される一つもしくは複数を含む脂質キナーゼの発現検出用キット：
ａ）（１５）乃至（１８）のいずれか一つに記載の抗体；
ｂ）ｉ）およびｉｉ）にＰＣＲ用プライマーの組であり、且つ、（１）乃至（３）のいずれか一つに記載のＤＮＡの有するヌクレオチド配列からなるヌクレオチドまたはその断片を増幅することができることを特徴とする、一組のＰＣＲ用プライマー；
ｉ）配列表の配列番号１に記載のヌクレオチド配列からなる一本鎖ＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、１０乃至５０塩基からなる一本鎖ＤＮＡ；
ｉｉ）配列表の配列番号１に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖ＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、１０乃至５０塩基からなる一本鎖ＤＮＡ；
ｃ）配列表の配列番号１に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズし、且つ、２０乃至１０００塩基からなる一本鎖ＤＮＡであることを特徴とするプローブ、
（４２）  下記の工程１）乃至３）を含む、被験個体における神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症および動脈硬化から選択される一つまたは二つ以上の疾患に罹患するリスクの検出方法；
１）被験個体由来の試料（被験試料という）および正常個体由来の試料（対照試料という）中の（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質の含有量を測定する工程；
２）該含有量を被験試料と対照試料で比較する工程；
３）該含有量が、対照試料よりも被験試料において少ない場合、被験個体が神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症および動脈硬化から選択される一つまたは二つ以上の疾患に罹患するリスクが高いと判断する工程、
（４３）  下記の工程１）乃至３）を含む、被験個体における、癌および癌の転移から選択される一つまたは両方の疾患に罹患するリスクの検出方法；
１）被験個体由来の試料（被験試料という）および正常個体由来の試料（対照試料という）中の（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質の含有量を測定する工程；
２）該含有量を被験試料と対照試料で比較する工程、
３）該含有量が、対照試料よりも被験試料において多い場合、被験個体が癌および癌の転移から選択される一つまたは両方の疾患に罹患するリスクが高いと判断する工程、
（４４）  下記の工程１）乃至４）を含む、（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質の発現を調節する活性を有する物質をスクリーニングする方法：
１）被験物質の存在下または非存在下で、（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質を発現する細胞を培養する工程；
２）培養上清を分取するかまたは細胞の破砕液を調製し、試料液とする工程；
３）該試料液中の、（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質量を測定し、測定結果を被験物質の存在下と非存在下で比較する工程；
４）被験物質存在下における該蛋白質量が、被験物質非存在下における該蛋白質量よりも大きい場合または小さい場合、該被験物質を選択する工程、
（４５）  下記の工程１）乃至４）を含む、神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症および動脈硬化から選択される一つ若しくは二つ以上の疾患の治療または予防効果を有する物質をスクリーニングする方法：
１）被験物質の存在下または非存在下で、（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質を発現する細胞を培養する工程；
２）培養上清を分取するかまたは細胞の破砕液を調製し、試料液とする工程；
３）該試料液中の、（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質量を測定し、測定結果を被験物質の存在下と非存在下で比較する工程；
４）被験物質存在下における該蛋白質量が、被験物質非存在下における該蛋白質量よりも大きい場合、該被験物質を選択する工程、
（４６）  下記の工程１）乃至４）を含む、癌および癌の転移のいずれか一つ若しくは両方の疾患の治療または予防効果を有する物質をスクリーニングする方法：
１）被験物質の存在下または非存在下で、（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質を発現する細胞を培養する工程；
２）培養上清を分取するまたは細胞の破砕液を調製し、試料液とする工程；
３）該試料液中の、（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質量を測定し、測定結果を被験物質の存在下と非存在下で比較する工程；
４）被験物質存在下における該蛋白質量が、被験物質非存在下における該蛋白質量よりも小さい場合、該被験物質を選択する工程、
（４７）  下記の工程１）乃至４）を含む、（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質をコードするｍＲＮＡ発現調節活性を有する物質をスクリーニングする方法：
１）被験物質の存在下または非存在下で、（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質を発現する細胞を培養する工程；
２）培養細胞からｍＲＮＡを抽出する工程；
３）該ｍＲＮＡ中の、（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質をコードするｍＲＮＡ量を測定し、測定結果を被験物質の存在下と非存在下で比較する工程；
４）被験物質存在下における該蛋白質をコードするｍＲＮＡ量が、被験物質非存在下における該蛋白質をコードするｍＲＮＡ量よりも大きい場合または小さい場合、該被験物質を選択する工程、
（４８）  下記の工程１）乃至４）を含む、神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症および動脈硬化から選択される一つ若しくは二つ以上の疾患の治療または予防効果を有する物質をスクリーニングする方法：
１）被験物質の存在下または非存在下で、（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質を発現する細胞を培養する工程；
２）培養細胞からｍＲＮＡを抽出する工程；
３）該ｍＲＮＡ中の、（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質をコードするｍＲＮＡ量を測定し、測定結果を被験物質の存在下と非存在下で比較する工程；
４）被験物質存在下における該蛋白質をコードするｍＲＮＡ量が、被験物質非存在下における該蛋白質をコードするｍＲＮＡ量よりも大きい場合、該被験物質を選択する工程、
（４９）  下記の工程１）乃至４）を含む、癌および癌の転移のいずれか一つ若しくは両方の疾患の治療または予防効果を有する物質をスクリーニングする方法：
１）被験物質の存在下または非存在下で、（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質を発現する細胞を培養する工程；
２）培養細胞からｍＲＮＡを抽出する工程；
３）該ｍＲＮＡ中の、（４）乃至（６）のいずれか一つに記載の蛋白質をコードするｍＲＮＡ量を測定し、測定結果を被験物質の存在下と非存在下で比較する工程；
４）被験物質存在下における該蛋白質をコードするｍＲＮＡ量が、被験物質非存在下における該蛋白質をコードするｍＲＮＡ量よりも小さい場合、該被験物質を選択する工程、
に関する。
すなわち、本発明は脂質キナーゼ活性を有する新規な蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えプラスミド、該プラスミドで形質転換された宿主細胞、該蛋白質の製造方法、該蛋白質に特異的に結合する抗体、該蛋白質を検出する方法、該蛋白質の活性を測定する方法、該蛋白質の活性を調節する物質（神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症、動脈硬化、癌および癌の転移等の疾患の治療および／または予防剤を含む）のスクリーニング方法、神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症、動脈硬化、癌および癌の転移等の疾患に罹患するリスクを判定する方法、および本発明に関連した医薬組成物等を提供するものである。
【０００７】
本発明において、「脂質キナーゼ活性」とは、各種脂質をリン酸化する活性をいい、好適には、下記の化１の反応式に示すように、セラミドの１位の水酸基をリン酸化し、セラミド−１−リン酸を生成せしめる反応を触媒する活性をいう。
【０００８】
【化１】
2004201681.tif 000002
【０００９】
本発明において「脂質基質」とは、本発明の蛋白質が有する脂質キナーゼ活性によりリン酸化される脂質をいう。このような脂質としては、本発明の脂質キナーゼ活性を有する蛋白質によりリン酸化される脂質であれば特に限定されないが、好適には、上記化１の一般式（Ｉ）により示されるすべてのセラミドを挙げることができる。より好適には、上記式（Ｉ）においてＲがＣＨ２ＣＨ３で示されるセラミド、上記式（Ｉ）においてＲが（ＣＨ２）５ＣＨ３で示されるセラミド、上記式（Ｉ）においてＲが（ＣＨ２）７ＣＨ３で示されるセラミドおよび上記式（Ｉ）においてＲが（ＣＨ２）１５ＣＨ３で示されるセラミドが挙げられ、もっとも好ましくは、上記式（Ｉ）においてＲが（ＣＨ２）５ＣＨ３で示されるセラミドである。また、ウシ胎児脳由来セラミドは、主成分として上記式（Ｉ）においてＲが（ＣＨ２）１７ＣＨ３で示されるセラミドを含む脂質混合物であり、これも本発明の脂質基質として用いる事ができる。また、各種セラミドの各種光学異性体も本発明に含まれる。また本発明の脂質キナーゼ活性を有する蛋白質は、セラミドに類似した他の脂質もリン酸化すると考えられ、本発明の脂質基質はセラミドに限定されない。又、これらの物質が検出可能に標識されたものも本発明に含まれる。
【００１０】
また、本発明において「リン酸供給物質」とは、上記化１に示されるリン酸化反応で、リン酸基を供給する物質（化１式中で、「Ｘ−Ｐ」と示される物質）をいう。このような物質は、該リン酸化反応においてリン酸を供給できるものであれば特に限定されないが、好適にはＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰまたはＴＴＰであり、より好適にはＡＴＰである。また、リン酸供給物質には、例えば３２Ｐ−γ−ＡＴＰのような各種標識体も含まれる。
【００１１】
「本発明の蛋白質」とは、脂質キナーゼ活性を有する蛋白質を意味し、本明細書において「新規脂質キナーゼ」とは本発明の蛋白質を指すものとする。
本発明において、「本発明のヌクレオチド」とは、本発明の蛋白質が有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むものをいい、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。ＤＮＡである場合は「本発明のＤＮＡ」と呼ぶ。ＤＮＡとしては、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、人工的に改変されたＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡなど、現在知られる限りどのような形態をとっていても良い。また、本発明のＤＮＡには二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡを両方含むが、特に断りが無い限り、二本鎖ＤＮＡを指す。二本鎖ＤＮＡは、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であるセンス配列からなる一本鎖ＤＮＡ（センス鎖）、および、センス配列と相補的なヌクレオチド配列であるアンチセンス配列からなる一本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）が静電的に結合して二本鎖になったものである。本発明において、ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表におけるヌクレオチド配列を示す配列において、Ｔ（チミン）をＵ（ウラシル）に読み替えるものとする。本発明のヌクレオチドは、脂質キナーゼ活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むようなヌクレオチドも含む。
本発明のヌクレオチドの一つの例としては、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から１５９６に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡを挙げることができる。又、該ヌクレオチド配列を含むことからなるＤＮＡも、脂質キナーゼ活性を有する蛋白質をコードする限り、本発明に含まれる。
また、本発明のヌクレオチドの別の例としては、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から１５９６に示されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、脂質キナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが挙げられる。
本発明のヌクレオチドの他の例としては、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から１５９６に示されるヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９５％以上のヌクレオチド配列相同性を有するＤＮＡが挙げられる。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見される変異型ＤＮＡ、人為的に改変した変異型ＤＮＡ、異種生物由来の相同ＤＮＡなどが含まれる。
また、本発明のヌクレオチドの他の例としては、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡが挙げられる。なお、所望のアミノ酸に対応するコドンは、その選択も任意でよく、例えば利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定できる。（Grantham,  R.  et  al.  (1981)  Nucleic  Acids  Res.  9,  143-174）。さらに、これらヌクレオチド配列のコドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した、部位特異的変異導入法（site  specific  mutagenesis／Mark,  D.  F.  et  al.  (1984)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  81,  5662-5666）などに従うことができる。
また、本発明のヌクレオチドのさらに別の例としては、形質転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｃＤＮＡ３．１−ｃｅｒｋ２  ＳＡＮＫ  ７１１０２が保持する組換えプラスミドに挿入されているＤＮＡを挙げることができる。この形質転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｃＤＮＡ３．１−ｃｅｒｋ２  ＳＡＮＫ  ７１１０２株は、平成１４年１０月１０日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１-１-１  中央第６）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２０１が付されている。したがって、該ＤＮＡは、該菌株から取得することが可能である。また、該ＤＮＡを含むことからなるＤＮＡ、及び、該菌株の保持する組換えプラスミドに挿入されているＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも、コードする蛋白質が脂質キナーゼ活性を有する限り、本発明に含まれる。
本発明のヌクレオチドとして好適なものは、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から１５９６に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、および、形質転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｃＤＮＡ３．１−ｃｅｒｋ２  ＳＡＮＫ  ７１１０２が保持する組換えプラスミドに挿入されているＤＮＡであり、より好適には、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から１５９６に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、および、形質転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｃＤＮＡ３．１−ｃｅｒｋ２  ＳＡＮＫ  ７１１０２が保持する組換えプラスミドに挿入されているＤＮＡである。
また、本発明のヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質は本発明の蛋白質の一つの例として挙げられる。該ヌクレオチドにコードされる蛋白質において、任意の一つもしくは二つ以上のアミノ酸を欠失させた改変体を作製するためには、エキソヌクレアーゼＢａｌ３１等を用いてＤＮＡを末端から削る方法（岸本  利光ら“続生化学実験講座１・遺伝子研究法ＩＩ”335-354)、カセット変異法（岸本  利光、“新生化学実験講座２・核酸ＩＩＩ  組換えＤＮＡ技術  ”242-251）などにの方法を適用できる。このように、本発明のヌクレオチドを元に遺伝子工学的手法により得られる蛋白質であっても、該蛋白質が脂質キナーゼ活性を有する限り本発明に含まれる。このような蛋白質は、必ずしも配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列の全てを有するものである必要はなく、例えばその部分配列からなる蛋白質であっても、該蛋白質が脂質キナーゼ活性を示す限り本発明の蛋白質に包含される。また、該蛋白質をコードするＤＮＡも本発明に含まれる。
また、本発明の蛋白質の別の例としては、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質を挙げることができる。また、該アミノ酸配列を含むことからなる蛋白質も、該蛋白質が脂質キナーゼ活性を示す限り本発明の蛋白質に包含される。
また、本発明の蛋白質のさらに別の例としては、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質において、１個または数個の部位に、１個または数個のアミノ酸残基が、置換、欠失、挿入および／または付加した蛋白質も、該蛋白質が脂質キナーゼ活性を有する限り、本発明に含まれる。数個とは、１０を超えない個数を表し、好適には５を超えない個数を示す。置換したアミノ酸配列を有する蛋白質が、天然型蛋白質と同等の活性を有する例として、例えば、インターロイキン２（ＩＬ−２）遺伝子のシステインに相当するヌクレオチド配列をセリンに相当するヌクレオチド配列に変換して得られた蛋白質が、ＩＬ−２活性を保持することが知られている（Wang,  A.  et  al.  (1984)  Science  224,  1431-1433）。
「本発明の抗体」とは、本発明の蛋白質と特異的に結合する抗体をいい、このような抗体にはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体等が含まれる。また、これらの抗体の断片であっても、本発明の蛋白質と特異的に結合するものであれば本発明に含まれる。このような抗体の断片の例としては、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントなどが挙げられる。
本発明の蛋白質をコードするＤＮＡの一部の配列を知るためには、例えば、既知のヒトセラミドキナーゼの配列に基づいて、ＮＣＢＩ（National  Center  for  Biotechnology  Information,  米国）のｄｂＥＳＴデータベースに対して相同性検索を行う事により該配列を知る事ができる。また、例えば、ヒトセラミドキナーゼのｃＤＮＡの全配列または部分配列に基づいてプローブを作成し、該プローブを用いてｃＤＮＡライブラリーに対してストリンジェンシィの弱い条件でのコロニーハイブリダイゼーションを行い、該ハイブリダイゼーションにより得られたクローンの配列を解析することにより、その一部又は全部の配列を知ることができる。また、既知のヒトセラミドキナーゼの配列、より好適には系統発生的に保存された領域の配列、に基づいてプライマーを作成し、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という。Saiki,  R.  K.  et  al.  (1988)  Science  239,  487-491参照）を行う、または、該プライマーを用いて、全ＲＮＡを鋳型にリバーストランスクリプターゼ−ポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＲＴ−ＰＣＲ」という。）を行いその産物の配列を解析することにより、その一部の配列を知ることができる。本発明の蛋白質をコードするＤＮＡの全配列は、例えば、上記の様にして得られた部分配列に基づいてプローブを作成し、適当なｃＤＮＡライブラリーを用いたストリンジェントな条件でのコロニーハイブリダイゼーション法により得られたクローンの配列を解析することにより知ることができる。また、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡの全配列は、例えば、上記の様にして得られた部分配列に基づいて適当なプライマーを作成し、適当なｃＤＮＡライブラリーを鋳型にＰＣＲを行うか、適当なｍＲＮＡを鋳型にＲＴ−ＰＣＲを行いその産物の配列を解析することにより知ることができる。また、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡの全配列は、例えば、上記の様にして得られた部分配列に基づいてプライマーを作成し、ｍＲＮＡを用いたRapid  Amplification  of  cDNA  Ends  （以下「ＲＡＣＥ」という。実験医学,  (1994),  12(6),  35-38参照)、または市販のキットとｃＤＮＡライブラリーを用いたＲＡＣＥを行うことにより得られたクローンの配列を解析することにより知ることができる。
【００１２】
本発明のヌクレオチドは、例えば、本発明の蛋白質を発現する培養細胞などからｍＲＮＡを調製した後、これを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、その中から本発明の蛋白質をコードするｃＤＮＡを公知の方法によりスクリーニングすることにより得ることができる。このｍＲＮＡの供給源となる動物細胞は、本発明においては、ＨＥＫ２９３細胞株が好適であるが、各種の細胞または組織、あるいは他の培養細胞株を使用することもできる。また市販のｃＤＮＡライブラリーを用いることもできる。たとえばクロンテックより市販の各種ｃＤＮＡライブラリーを用いることができるが、これに限定されない。
【００１３】
ｍＲＮＡの抽出にあたっては、チオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法も採用しうるが、市販のｍＲＮＡ分離キットを用いることもできる。
【００１４】
真核細胞の細胞質に存在するｍＲＮＡの多くは、その３’末端にポリ（Ａ）配列を持つことが知られているので、この特徴を利用してビオチン化したオリゴ（ｄＴ）プローブにｍＲＮＡを吸着させ、さらにストレプトアビジンを固定化した常磁性粒子に、ビオチン／ストレプトアビジン間の結合を利用してｍＲＮＡを捕捉し洗浄操作の後、ｍＲＮＡを溶出することにより精製することができる。また、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムにｍＲＮＡを吸着させて、次にこれを溶出して精製する方法も採用し得る。さらにショ糖密度勾配遠心法などにより、ｍＲＮＡをさらに分画することもできる。
【００１５】
上記のごとくして得られたｍＲＮＡが脂質キナーゼ活性を有する蛋白質をコードするものであることを確認するためには、ｍＲＮＡを蛋白質に翻訳させ酵素活性を調べるか、該蛋白質に特異的な抗体を用いてその蛋白質を同定する等の方法を用いることができる。例えば、アフリカツメガエル（Xenopus  laevis）の卵母細胞にｍＲＮＡを注入して翻訳させることができ（Gardon,  j.  B.  et  al.  (1972)  Nature  233,  177-182)、あるいは、ウサギ網状赤血球系やコムギ胚芽系といった無細胞翻訳系を利用できる（Schleif,  R.  F.  and  Wensink,  P.  C.  (1981):  “  Practical  Methods  in  Molecular  Biology  “  ,  Springer-Verlag,  NY.)。
【００１６】
また、上記方法で得たｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、この一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成することができる。その方法としては、Ｓ１ヌクレアーゼ法（Efstratiadis,  A.  et  al.  (1976)  Cell  7,  279-288)、Land法（Land,  H.  et  al.  (1981)  Nucleic  Acids  Res.  9,  2251-2266)、O.  Joon  Yoo法（Yoo,  O.  J.  et  al.  (1983)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  79,  1049-1053）なども採用し得るが、本発明の目的にはOkayama-Berg法（Okayama,  H.  and  Berg,  P.  (1982)  Mol.  Cell.  Biol.  2,  161-170)が好適である。
【００１７】
次に、得られたｃＤＮＡ断片をラムダファージベクターに挿入し自己複製させることによりｃＤＮＡ断片を持つ組換えファージを安定に保持し、増幅させることができる。例えば、ラムダファージλＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社製）を用いる場合、宿主大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’株やＪＭ１０９株にプラークを作らせ、それらのプラークの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside（Ｘ−ｇａｌ））代謝による発色の有無から組換え体を選別することができる。なお、ベクターとしては、ラムダ系のファージベクター以外に、プラスミドベクターも用いることができる。
【００１８】
上記のようにして得られる組換えファージから、目的の脂質キナーゼ活性を有する蛋白質をコードするｃＤＮＡを有するクローンを選別する方法としては、例えば以下に示す各種方法のいずれかを採用できる。
【００１９】
１）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング法
目的の蛋白質のアミノ酸配列の全部、または一部が解明されている場合（該配列は、目的の蛋白質に特異的な複数個連続した配列であれば、目的の蛋白質のどの部分のアミノ酸配列でもよい）、該アミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドを合成し（コドンの縮重のあるアミノ酸に対しては、使用頻度の高いコドンを用いても、または考えられるコドンを組み合わせて複数個のヌクレオチド配列を合成してもよく、また後者の場合、イノシンを含ませてその種類を減らすこともできる）、これを３２Ｐ、３５Ｓまたはビオチン等で標識したものをプローブとして、ニトロセルロースフィルターまたはナイロンフィルター上に変性固定した組換えファージＤＮＡとハイブリダイズさせ、得られた陽性クローンを検索して、これを選択する。
２）ポリメラーゼ連鎖反応により作製したプローブを用いるスクリーニング法
目的の蛋白質のアミノ酸配列の全部または一部が解明されている場合、該アミノ酸配列のＮ末端側の一部に対応するセンス鎖と、同じくＣ末端側の一部に対応するアンチセンス鎖のオリゴヌクレオチドを合成し、ＰＣＲを行い、目的の蛋白質をコードするＤＮＡ断片を増幅する。ここで用いる鋳型ＤＮＡとしては、本発明の蛋白質を産生する細胞のｍＲＮＡより逆転写反応にて合成したｃＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡを用いることができる。このようにして調製したＤＮＡ断片を、３２Ｐ、３５Ｓまたはビオチン等で標識し、これをプローブとして用いたプラークハイブリダイゼーションまたはコロニーハイブリダイゼーションによるｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリーのスクリーニングを実施して、目的のクローンを選択する。
３）他の動物細胞株で脂質キナーゼ活性を有する蛋白質を産生させてスクリーニングする方法
前記のようにして得たｃＤＮＡを発現ベクターに挿入したプラスミド（自己複製可能で、転写プロモーター領域を含むプラスミド、もしくは動物細胞の染色体に組み込まれ得るようなプラスミドのいずれも使用できる）で動物細胞宿主を形質転換し、それらｃＤＮＡにコードされた蛋白質を産生させ、その培養上清または細胞抽出物中の、脂質キナーゼ活性を測定するか、または、本発明の蛋白質に特異的に結合する抗体、および該抗体に対する二次抗体を用いて、本発明の蛋白質の存在を検出することにより、本発明の蛋白質をコードするｃＤＮＡを有する株を選択する。なお、動物細胞宿主としてはＣＯＳやＣＨＯ等の汎用される細胞株を使用できるが、外来遺伝子産物としての本発明の蛋白質の検出を容易にするため、宿主自体は一定の培養条件下で本発明の蛋白質を産生しない細胞であることが好ましい。
【００２０】
４）セレクティブ・ハイブリダイゼーション・トランスレーションの系を用いる方法
形質転換株から得られるｃＤＮＡを、ニトロセルロースフィルターまたはナイロンフィルターなどにブロットし、本発明の蛋白質の産生能を有する組織または細胞から抽出したｍＲＮＡをハイブリダイズさせた後、ｃＤＮＡに結合したｍＲＮＡを解離させ、回収する。回収したｍＲＮＡを、蛋白質翻訳系（例えば、アフリカツメガエルの卵母細胞への注入や、ウサギ網状赤血球ライゼートや、コムギ胚芽などの無細胞系）で蛋白質に翻訳させ、その蛋白質の脂質キナーゼ活性を調べるか、または脂質キナーゼ活性を有する蛋白質に対する抗体を用いて検出し、目的の株を選択する。
【００２１】
上記のようにして得られた目的の形質転換株からの本発明のヌクレオチドの採取は、公知の方法（Maniatis,  T.  et  al.（1982）:  “Molecular  Cloning  A  Laboratory  Mannual”，Cold  Spring  Harbor  Laboratory,  NY）に従い実施できる。例えば、細胞よりプラスミドＤＮＡに相当する画分を分離し、該プラスミドＤＮＡよりｃＤＮＡ領域を切り出すことにより行い得る。
【００２２】
また、本発明のヌクレオチドの取得に際しては、ＰＣＲ法によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法も好適に利用できる。殊にライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られないような場合には、５’ＲＡＣＥ法および３’ＲＡＣＥ法を組み合わせることにより全長のｃＤＮＡを得ることができる。かかるＰＣＲ法の採用に際して使用されるプライマーは、本発明遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定することができ、常法に従い合成することができる。
【００２３】
このようにして得られるＤＮＡのヌクレオチド配列の決定は、例えば、マキサム―ギルバートの化学修飾法（Maxam,  A.  M.  and  Gilbert,  W.  (1980)  :  “Methods  in  Enzymology“  65,  499-559）やM13ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Messing,  J.  and  Vieira,  J.  (1982)  Gene  19,  269-276）などにより行うことができる。また、ラジオアイソトープの代わりに蛍光色素を用いた自動ＤＮＡ配列解析装置（例えば、パーキンエルマー・ジャパン・アプライドバイオシステムズ社製モデル３７３Ａ等）を使用することもできる。
【００２４】
上記のように得られた本発明のＤＮＡがベクターに挿入された組換えプラスミドも本発明に含まれる。このような目的に用いるベクターとしては、一般に知られているさまざまなベクターを用いることができる。好適なものとしては、原核細胞用ベクター、真核細胞用ベクター、哺乳動物由来の細胞用ベクターなどが挙げられるが、これに限定されない。このような組換えプラスミドにより、他の原核生物、または真核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。さらに、適当なプロモーター配列および／または形質発現に関わる配列を有するベクターを用いるか、もしくはそのような配列を導入することにより、発現ベクターとすることで、それぞれの宿主において遺伝子を発現させることが可能である。このような発現ベクターは、本発明の組換えプラスミドの好適な態様である。
【００２５】
本発明の組換えプラスミドは、各種細胞に導入し、宿主細胞とすることができる。このような細胞は、プラスミドを導入することができる細胞であれば原核細胞であっても真核細胞であってもよい。
【００２６】
原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌（Escherichia  coli）や枯草菌（Bacillus  subtilis）などが挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。また、ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与することができる配列を有するものが好ましい。
【００２７】
例えば、大腸菌としてはＫ１２株などがよく用いられ、ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドが用いられるが、これらに限定されず、公知の各種菌株、およびベクターがいずれも使用できる。
【００２８】
プロモーターとしては、大腸菌においては、トリプトファン（trp）プロモーター、ラクトース（lac）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（tac）プロモーター、リポプロテイン（lpp）プロモーター、ポリペプチド鎖伸張因子Tu（tufB）プロモーター等が挙げられ、どのプロモーターも本発明の蛋白質の産生に使用することができる。
【００２９】
枯草菌としては、例えば２０７−２５株が好ましく、ベクターとしてはｐTUB２２８（Ohmura,  K.  et  al.  (1984)  J.  Biochem.  95,  87-93）などが用いられるが、これに限定されるものではない。
【００３０】
プロモーターとしては、枯草菌のα−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能となる。
【００３１】
真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、哺乳動物由来の細胞、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Gluzman,  Y.  (1981)  Cell  23,  175-182、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Urlaub,  G.  and  Chasin,  L.  A.  (1980)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  77,  4126-4220）等がよく用いられているが、これらに限定されない。
【００３２】
脊椎動物細胞の発現プロモーターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列等を有するものを使用でき、さらにこれは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Subramani,  S.  et  al.  (1981)  Mol.  Cell.  Biol.  1,  854-864）等が挙げられるが、これに限定されない。
【００３３】
宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自立増殖が可能であり、さらに、転写プロモーター、転写終結シグナル、およびＲＮＡスプライス部位を具えたものを用いることができる。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Luthman,  H.  and  Magnusson,  G.  (1983)  Nucleic  Acids  Res,  11,  1295-1308)、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Graham,  F.  L.  and  van  der  Eb,  A.  J.  (1973)  Virology  52,  456-457）、および電気パルス穿孔法（Neumann,  E.  et  al.  (1982)  EMBO  J.  1,  841-845）などによりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えばｐＲＳＶｎｅｏ（Sambrook,  J.  et  al.  (1989)  :  “Molecular  Cloning  A  Laboratory  Manual“  Cold  Spring  Harbor  Laboratory,  NY）やｐＳＶ２−ｎｅｏ（Southern,  P.  J.  and  Berg,  P.  (1982)  J.  Mol.  Appl.  Genet.  1,  327-341）などをコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、本発明の蛋白質を安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
【００３４】
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、鱗翅類ヤガ科のSpodoptera  frugiperdaの卵巣細胞由来株化細胞（Ｓｆ−９またはＳｆ−２１）やTrichoplusia  niの卵細胞由来High  Five細胞（Wickham,  T.  J.  et  al,  (1992)  Biotechnol.  Prog.  I:  391-396）などが宿主細胞としてよく用いられ、バキュロウイルストランスファーベクターとしてはオートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリン蛋白質のプロモーターを利用したｐＶＬ１３９２／１３９３がよく用いられる（Kidd,  I.  M.  and  V.C.  Emery  (1993)  The  use  of  baculoviruses  as  expression  vectors.  Applied  Biochemistry  and  Biotechnology  42,  137-159)。この他にも、バキュロウイルスのＰ１０や同塩基性蛋白質のプロモーターを利用したベクターも使用できる。さらに、ＡｃＮＰＶのエンベロープ表面蛋白質ＧＰ６７の分泌シグナル配列を目的蛋白質のＮ末端側に繋げることにより、組換え蛋白質を分泌蛋白質として発現させることも可能である（Zhe-mei  Wang,  et  al.  (1998)  Biol.  Chem.,  379,  167-174)。
【００３５】
真核微生物を宿主細胞とした発現系としては、酵母が一般によく知られており、その中でもサッカロミセス属酵母、例えばパン酵母Saccharomyces  cerevisiaeや石油酵母Pichia  pastorisが好ましい。該酵母などの真核微生物の発現ベクターとしては、例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Bennetzen,  J.  L.  and  Hall,  B.  D.  (1982)  J.  Biol.  Chem.  257,  3018-3025）や酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター（Miyanohara,  A.  et  al.  (1983)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  80,  1-5）などを好ましく利用できる。また、分泌型蛋白質として発現させる場合には、分泌シグナル配列と宿主細胞の持つ内在性プロテアーゼあるいは既知のプロテアーゼの切断部位をＮ末端側に持つ組換え体として発現することも可能である。例えば、トリプシン型セリンプロテアーゼのヒトマスト細胞トリプターゼを石油酵母で発現させた系では、Ｎ末端側に酵母のαファクターの分泌シグナル配列と石油酵母の持つＫＥＸ２プロテアーゼの切断部位をつなぎ発現させることにより、活性型トリプターゼが培地中に分泌されることが知られている（Andrew,  L.  Niles,et  al.  (1998)  Biotechnol.Appl.  Biochem.  28,  125-131)。
【００３６】
上記のようにして得られる形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内、または細胞外に本発明の蛋白質が産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば、上記ＣＯＳ細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地やダルベッコ改変イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という）などの培地に、必要に応じウシ胎児血清などの血清成分を添加したものを使用できる。培養条件としては、ＣＯ２濃度は０乃至５０％の範囲であればよく、好適には１乃至１０％でありより好適には５％である。培養温度は０乃至９９℃であればよく、好適には２０乃至５０℃であり、より好適には３５乃至４０℃である。
【００３７】
上記培養により形質転換体の細胞内または細胞外に産生される組換え蛋白質は、培養産物中から、その蛋白質の物理化学的性質、化学的性質、生化学的性質(酵素活性など）等を利用した各種の分離操作（「生化学データブックII」、1175-1259項、第１版第１刷、1980年6月23日株式会社東京化学同人発行;Biochemistry,  vol.  25,  No.25,  p8274-8277  (1986);  Eur.  J.  Biochem.,  163,  p313-321  (1987)等参照）により分離、精製することができる。該分離操作としては、具体的には例えば通常の再構成処理、蛋白沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、凍結融解法、超音波破砕、限外ろ過、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アッフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、それらの組み合わせ等を例示できる。上記分離操作により、高収率で所望の組換え蛋白質を工業的規模で製造できる。また、発現させる組換え蛋白質に６残基からなるヒスチジンを繋げることにより、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。上記分離操作を組み合わせることにより容易に高収率、高純度で本発明の蛋白質を大量に製造できる。本発明の蛋白質の製造過程に用いる分離操作としては、本発明の蛋白質がカルモジュリンに結合する性質を有することから、好適には、カルモジュリン・セファロース等の担体を充填させたカラムを用いた分離操作を挙げることができる。具体的には、カルモジュリンを含まない溶媒に溶解させた本発明の蛋白質を含む試料を、カルモジュリンを結合させた樹脂に吸着させ、次にこの樹脂をカルモジュリンを含まない溶媒で洗浄する。さらに、ここで洗浄された樹脂から、ＥＧＴＡまたはＥＤＴＡを含む溶媒を用いて脂質キナーゼ活性を有する蛋白質を溶出させるという方法であるが、本発明はこれに限定されない。
【００３８】
あるＤＮＡが配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から１５９６に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするか否かは、例えば目的とするＤＮＡをランダムプライマー法（Anal.  Biochem.,  132:  6013  (1983)）やニックトランスレーション法（Maniatis,  T.  et  al.  (1982)  in  “  Molecular  Cloning  A  Laboratory  Mannual  “  Cold  Spring  Harbor  Laboratory,  NY.）等に従い、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ等で標識したプローブを用いてハイブリダイゼーションを行い調べることができる。ハイブリダイゼーションに用いるＤＮＡは、公知の方法、例えばニトロセルロース膜やナイロン膜等に吸着させ、加熱あるいは紫外線照射により固相化させる。次いで、その膜を例えば６×ＳＳＣ、５％  デンハート（Denhardt）溶液および０．１％  ドデシル硫酸ナトリウム（以下「ＳＤＳ」という）を含むプレハイブリダイゼーション溶液に浸し、５５℃で４時間以上保温する。その後、先に作成した標識プローブを同様のプレハイブリダイゼーション溶液に最終比活性１×１０６ｃｐｍ／ｍｌとなるように加え、６０℃で一晩保温する。膜を５７℃で５分間洗浄する操作を５回繰り返し、さらに５７℃で２０分間洗浄後、オートラジオグラフィーを行うことにより、ハイブリダイズしたか否かを判定することができる。この方法を利用して、各種動物細胞由来のｃＤＮＡライブラリーから、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から１５９６に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするｃＤＮＡを単離することができる。（Maniatis,  T.  et  al.  (1982)  in  “  Molecular  Cloning  A  Laboratory  Mannual  “  Cold  Spring  Harbor  Laboratory,  NY.）。また、ハイブリダイゼーションの条件は上記の条件に限定されず，ストリンジェントな条件下であればよい。本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションとは、ハイブリダイゼーションを、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  塩化ナトリウム、０．０７５Ｍ  クエン酸ナトリウム）またはこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、３７℃乃至４２℃の温度条件下、約１２時間行い、５×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。また、さらに０．１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うこともできる。
このような各種の本発明のＤＮＡは、上記脂質キナーゼ活性を有する蛋白質の情報に基づいて、例えばホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller,  M.  et  al.  (1984)  Nature  310,  105-111）などの常法に従い、化学合成により製造することもできる。
【００３９】
本発明の蛋白質が脂質キナーゼ活性を有することは、例えばリン酸供給物質として放射性の３２Ｐ−ＡＴＰを用いたスフィンゴシンキナーゼ活性測定用のシュピーゲルらの方法（Olivera,  A.  and  Spiegel,  S.  (1993)  Nature  365,  557-560参照）を改変した次の方法に従って確認することができる。具体的には、本発明の蛋白質を含む溶液と、塩化マグネシウム、エチレンジアミン四酢酸（以下「ＥＤＴＡ」という）、ジチオスレイトール、フッ化ナトリウム、バナジン酸ナトリウム、４−デオキシピリドキシン、コンプリートTM(プロテアーゼインヒビター  ベーリングマンハイム社製)、２００ｍＭ  塩化カリウムを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．５）、およびウシ胎児血清（以下、ＢＳＡ）に溶解した基質Ｄ−ヘキサノイルスフィンゴシン、Ｄ−エリスロ(以下単にＣ6  セラミドと略す)もしくはオクチルグルコシドを用いてミセル化したセラミド(ウシ胎児脳よりの精製品、Sigma社製)さらには放射標識３２Ｐ−γ−ＡＴＰを混合し、３７℃で保温することにより脂質キナーゼ反応を行う。次に、1Ｎ塩酸を加えることにより反応を停止させ、クロロホルム：メタノール：濃塩酸（100：200：1、ｖ／ｖ）を加えて抽出操作を施し、得られた下層（クロロホルム層）を薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣ）で展開、分析する。セラミドキナーゼ活性は上記ＴＬＣにおいて、生成物であるセラミド-１−リン酸（以下、Cer-1-P）のスポットを定量することにより得られる。このような活性の測定方法については脂質のリン酸化を検出できる方法であればどんな方法を用いることもでき、ここに挙げた方法に限定されない。３２Ｐ−ＡＴＰを用いる代わりに、脂質基質が標識されたもの、たとえば、３Ｈセラミド、１４ＣセラミドまたはＮＢＤ−セラミド（カタログ番号：２１９５４５、カルビオケム社製）などを用いて、上記の方法と同様にＴＬＣで分離することにより活性を測定できる。さらにリン酸供給物および脂質基質共に未標識のものを用いても、反応液から脂質基質が含まれる画分をＨＰＬＣなどにより抽出し、質量分析をすることでリン酸化を検出することができ、脂質キナーゼ活性を測定することができる。上記のような脂質キナーゼ活性の測定方法において、本発明の蛋白質の供給源としては、本発明の蛋白質の精製品または粗精製品、本発明の蛋白質を発現する細胞、または該細胞の破砕液などを用いてもよい。このような方法においては、細胞由来の脂質中に、本発明の蛋白質の有する脂質キナーゼ活性によりリン酸化される脂質を含む場合は、外部から脂質基質を加えることなく、細胞内の脂質のリン酸化を指標としたアッセイをすることもできる。ただし、新規脂質キナーゼの脂質キナーゼ活性検出方法、または該活性を調節する物質のスクリーニング方法は、これらの方法に限定されず、本発明の蛋白質が特異的にリン酸化し得る他の基質を使用することも可能である。このようなセラミド以外の基質を探索する方法としては、下記のような方法が挙げられる。すなわち、該基質を含む可能性のある試料（試料Ａ）および該基質を含まない試料（試料Ｂ）に、本発明の蛋白質、セラミドおよびリン酸供給物を混合し、セラミドのリン酸化の程度を上記方法により検出し、試料Ａの該リン酸化の程度が試料Ｂよりも小さい場合、試料��中に脂質キナーゼ活性によりリン酸化されるうる物質が含まれると判断するすることができる。このような本発明の蛋白質の基質は、標識されたリン酸供給物質を用いて、上記の反応を行い、ＴＬＣなどの各種方法で分離し、リン酸化を受けた画分を抽出して単離することができる。
【００４０】
また、上記の脂質キナーゼ活性検出方法において、合成された化合物や微生物の二次代謝産物等の被験物質を基質リン酸化反応時に共存させ、該被験物質が本発明の蛋白質の脂質キナーゼ活性を活性化または阻害するか否かを調べることにより、脂質キナーゼ活性調節活性を有する物質の評価またはスクリーニングが可能である。このような脂質キナーゼ活性を調節する物質は、神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症、動脈硬化、癌および癌の転移などの疾患の治療および／または予防剤として有用である。特に、該活性を促進する物質は神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症および動脈硬化などの疾患の治療および／または予防剤として有用であり、該活性を抑制する物質は癌および／または癌の転移の治療または予防剤として有用である。
【００４１】
脂質キナーゼ活性の抑制の程度は、通常活性抑制率にして１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらにより好ましくは７０％以上、さらにより一層好ましくは９０％以上、さらによりなお一層好ましくは９５％以上であり、最適には１００％である。活性抑制率の算出式の代表的なものとしては以下の式、数１が挙げられる。
［数１］
活性抑制率（％）＝（被験物質存在下のリン酸化の程度／被験物質非存在下のリン酸化の程度）×１００
また、リン酸化活性の促進の程度は、活性促進率にして１５０％以上を適用できるが、好ましくは２００％以上、より好ましくは３００％以上、より一層好ましくは５００％以上、最適には１０００％以上である。活性促進率の算出式の代表的なものとしては以下の式、数２が挙げられる。
［数２］
活性促進率（％）＝（被験物質存在下のリン酸化の程度／被験物質非存在下のリン酸化の程度）×１００
該脂質キナーゼ活性を調節する物質としては、本発明の蛋白質の脂質キナーゼ活性を特異的に調節する活性が高く、他のリン酸化酵素（キナーゼ）の活性に影響しないような物質が好ましい。また、上記のような脂質キナーゼ活性の測定方法を利用して、試料中の本発明の蛋白質の検出または定量をすることもできる。
【００４２】
また、この他にも、試料中の本発明の蛋白質の検出または定量の方法としては、試料に本発明の抗体を添加し、公知の方法を用いて、蛋白質と抗体の複合体を検出する方法が挙げられる。該複合体の検出方法としては、ウェスタンブロット法、免疫沈降法、免疫染色法等を挙げることができる。
【００４３】
また、試料中の本発明の蛋白質の遺伝子レベルでの発現を検出または定量する方法としては、試料からｍＲＮＡを単離し、単離したｍＲＮＡ中の本発明の蛋白質をコードするｍＲＮＡを検出または定量する方法が挙げられる。本発明の蛋白質をコードするｍＲＮＡを検出または定量する方法としては、本発明のＤＮＡのヌクレオチドを元に設計されたＰＣＲプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を利用した各種方法（ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ法、定量的ＰＣＲ法等）を利用することができる。さらに、本発明のＤＮＡを元に設計されたプローブを用いたドットブロット法やｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法などによっても、同様に試料中の本発明の蛋白質をコードする遺伝子の発現を検出または定量することができる。このような方法に用いる試料としては、培養細胞、生検組織、血液などの体液、実験動物から得られる臓器または組織の破砕液などが挙げられるが、これに限定されない。
【００４４】
また、上記のような蛋白質レベルまたは遺伝子レベルでの本発明の蛋白質の発現の検出または定量方法において、合成された化合物や微生物の二次代謝産物等の被験物質と試料をあらかじめ共存させることにより、本発明の蛋白質の蛋白質レベルまたは遺伝子レベルでの発現を調節する活性を有する物質のスクリーニングを行なうことができる。このように、本発明の蛋白質の発現を調節する活性を有する物質は、神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症、動脈硬化、癌および癌の転移等の疾患の治療および／または予防剤としての効果が期待できる。特に、発現を亢進する活性を有する物質であれば、神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症および動脈硬化等の疾患の治療および／または予防剤として有用であり、発現を抑制する活性を有する物質であれば、癌および癌の転移のいずれか一つ若しくは両方の疾患の治療または予防剤として有用である。
【００４５】
発現の抑制の程度は、発現抑制率にして１０％以上を適用することができるが、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらにより好ましくは７０％以上、さらにより一層好ましくは９０％以上、さらによりなお一層好ましくは９５％以上であり、最適には１００％である。発現抑制率の算出式の代表的なものとしては以下の式、数３が挙げられる。
［数３］
発現抑制率（％）＝（被験物質存在下の発現量／被験物質非存在下の発現量）×１００
また、発現の亢進の程度は、発現亢進率にして１５０％以上を適用できるが、好ましくは２００％以上、より好ましくは３００％以上、より一層好ましくは５００％以上、最適には１０００％以上である。発現亢進率の算出式の代表的なものとしては以下の式、数４が挙げられる。
［数４］
発現亢進率（％）＝（被験物質存在下の発現量／被験物質非存在下の発現量）×１００
本発明において、「部分ヌクレオチド」とは、本発明のヌクレオチドの一部からなるヌクレオチドの断片であり、このような部分ヌクレオチドは天然のＤＮＡを切断することによって得ることもできるし、化学的に合成することもできる。
【００４６】
本発明のＤＮＡのセンス配列からなる部分ヌクレオチドの例としては、センスプライマーなどが挙げられる。また、本発明のＤＮＡのアンチセンス配列からなる部分ヌクレオチドの例としては、プローブ、アンチセンスプライマー，アンチセンスヌクレオチドなどが挙げられる。これら部分ヌクレオチドは、蛋白質をコードしていなくてもよい。
【００４７】
本発明のプローブとしては、蛍光物質、放射性同位体等により標識されているものが望ましく、該プローブの長さは特に限定されないが、通常２０乃至１０００残基であり，好ましくは５０乃至５００残基である。本発明のプローブとして好適なものは、配列表の配列番号１に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡである。
【００４８】
本発明において「ＰＣＲ用プライマー」とは、ＰＣＲ反応に用いることにより本発明のヌクレオチドの部分，または全体を増幅することができる部分ヌクレオチドをいう。該ＰＣＲ用プライマーは、基本的に、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーを一組として用いるが、既知のプライマーと組み合わせて使うこともできる。該ＰＣＲ用プライマーの長さとしては，通常１０乃至５０塩基であり，好ましくは１５乃至４０塩基である。本発明のＰＣＲ用センスプライマーとして好ましいものは、配列表の配列番号１に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖ＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡであり、本発明のＰＣＲ用アンチセンスプライマーとして好ましいものは、配列表の配列番号１に記載のヌクレオチド配列からなる一本鎖ＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡである。
【００４９】
本発明のアンチセンスヌクレオチドとは、本発明のＤＮＡのセンス鎖と生体内でハイブリダイズし、本発明の蛋白質の発現を抑制する作用を持つ部分ヌクレオチドである。このようなアンチセンスヌクレオチドとしては、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびアンチセンスｓｉＲＮＡなどが挙げられる。このようなアンチセンスヌクレオチドは、本発明の蛋白質の翻訳を抑制する活性を有していれば長さを限定されないが、好適には１０乃至４０塩基からなるものであり、より好適には２０乃至３０塩基からなるものである。本発明のアンチセンスヌクレオチドとして好ましいものは、本発明のＤＮＡのアンチセンス配列からなることを特徴とする一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡであり，これらのアンチセンスヌクレオチドを含む医薬組成物も本発明に含まれる。
これらのプローブおよびＰＣＲ用プライマーは、本発明の蛋白質の遺伝子レベルでの発現を検出する際のツールとして有用であり、これらのプローブとＰＣＲ用プライマーおよび本発明の抗体を単独もしくは複合して含むことからなる本蛋白質の発現検出キットも、該発現の検出に有用である.。
さらに、このような部分ヌクレオチド、本発明のヌクレオチドなどを用いて本発明の蛋白質の発現を調節することにより、神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症、動脈硬化、癌および癌の転移等の疾患の遺伝子治療を行なうことも可能である。例えば本発明のＤＮＡを挿入したアデノウィルスを用いて，疾患部位における本発明の蛋白質の発現量を増加させることにより、神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症および動脈硬化等の疾患の治療か可能であろう。
また、セラミドは神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症および動脈硬化等の疾患において増悪因子として働くと考えられている。本発明の蛋白質は、セラミドのリン酸化を促進する活性を有しており、セラミドによる該疾患の増悪効果を打ち消す活性をもつことが期待されるため、該疾患の患部において発現が低下していることが予想される。これとは逆に、癌や癌の転移などの疾患においては、患部にセラミドが蓄積することにより、疾患の増悪が抑制されると考えられている。本発明の蛋白質は、セラミドのリン酸化を促進する活性を有し、セラミドによる該疾患の患部における増悪抑制活性を打ち消す活性を有すると考えられるため、該疾患の患部において発現が亢進していることが予想される。何らかの疾患に罹患している恐れのある個体から採取した試料（被験試料）中の本発明の蛋白質の発現量を検出し、正常個体由来の試料（対照試料）における該発現量と比較して少ない場合は、該個体が神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症および動脈硬化などの疾患に罹患していると判断する、または、これらの疾患に罹患するリスクが高いと判断することができるだろう。また、該比較の結果、対照試料におけるより、被験試料における発現量が大きい場合、該個体が癌および癌の転移などの疾患に罹患していると判断する、または、これらの疾患に罹患するリスクが高いと判断することができるだろう。このような、疾患またはその疾患に罹患するリスクの検出に供する個体由来の試料として好ましいものは、疾患ごとに異なるが、疾患の患部から得られるものが望ましいが、これに限定されない。例えば、対象疾患が腎臓疾患である場合は、腎臓の生検組織が望ましいが、血液、尿、唾液などの体液であっても良い。
以下に本発明の抗体の作製法について述べる。
【００５０】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の製造にあたっては、一般に下記のような作業工程が必要である。すなわち、
（ａ）抗原として使用する生体高分子の精製、
（ｂ）抗原を動物に注射することにより免疫した後、血液を採取しその抗体価を検定して脾臓摘出の時期を決定してから、抗体産生細胞を調製する工程、
（ｃ）骨髄腫細胞（以下「ミエローマ」という）の調製、
（ｄ）抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、
（ｅ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、
（ｆ）単一細胞クローンへの分割（クローニング）、
（ｇ）場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、またはハイブリドーマを移植した動物の飼育、
（ｈ）このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性、およびその認識特異性の検討、あるいは標識試薬としての特性の検定、
等である。ポリクローナル抗体は、（ｅ）の工程で得られるハイブリドーマを培養し、その培養上清を分取することにより得ることができる。
【００５１】
以下、モノクローナル抗体の作製法を上記工程に沿って詳述するが、該抗体の作製法はこれに制限されず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞およびミエローマを使用することもできる。
【００５２】
（ａ）抗原の精製
抗原としては、前記したような方法で調製した本発明の蛋白質またはその一部を使用することができる。さらに、本発明により本発明の蛋白質の一次構造が明らかにされたので、当業者に周知の方法を用いて、本発明の蛋白質の部分ペプチドを化学合成し、これを抗原として使用することもできる。
【００５３】
（ｂ）抗体産生細胞の調製
工程（ａ）で得られた抗原と、フロインドの完全または不完全アジュバント、またはカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物としては、マウスが最も好適に用いられるが、これに限定されない。
【００５４】
マウス免疫の際の免疫原投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射いずれでもよいが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。
【００５５】
免疫は、一回、または、適当な間隔で（好ましくは１週間から５週間間隔で）複数回繰返し行なうことができる。その後、免疫した動物の血清中の抗原に対する抗体価を測定し、抗体価が十分高くなった動物を抗体産生細胞の供給原として用いれば、以後の操作の効果を高めることができる。一般的には、最終免疫後３〜５日後の動物由来の抗体産生細胞を後の細胞融合に用いることが好ましい。
【００５６】
ここで用いられる抗体価の測定法としては、放射性同位元素免疫定量法（以下「ＲＩＡ法」という）、固相酵素免疫定量法（以下「ＥＬＩＳＡ法」という）、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法など種々の公知技術があげられるが、検出感度、迅速性、正確性、および操作の自動化の可能性などの観点から、ＲＩＡ法またはＥＬＩＳＡ法がより好適である。
【００５７】
本発明における抗体価の測定は、例えばＥＬＩＳＡ法によれば、以下に記載するような手順により行うことができる。まず、精製または部分精製した抗原をＥＬＩＳＡ用９６穴プレート等の固相表面に吸着させ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係なタンパク質、例えばウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）により覆い、該表面を洗浄後、第一抗体として段階希釈した試料（例えばマウス血清）に接触させ、上記抗原に試料中のモノクローナル抗体を結合させる。さらに第二抗体として酵素標識されたマウス抗体に対する抗体を加えてマウス抗体に結合させ、洗浄後該酵素の基質を加え、基質分解に基づく発色による吸光度の変化等を測定することにより、抗体価を算出する。
【００５８】
（ｃ）ミエローマの調製工程
ミエローマとしては、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）ミエローマ株P3X63Ag8U.1(P3-U1)［Yelton,  D.E.  et  al.  Current  Topics  in  Microbiology  and  Immunology,  81,  1-7(1978)］、P3／NSI  ／1-Ag4-1(NS-1)  ［Kohler,  G.  et  al.  European  J.  Immu  nology,  6,  511-519  (1976)  ］、Sp2  ／O-Ag14  (SP-2)  ［Shulman,  M.  et  al.  Nature,  276,  269-270  (1978)］、P3X63Ag8.653  (653)  ［Kearney,  J.  F.  et  al.  J.  Immunology,  123,  1548-1550  (1979)］、P3X63Ag8(X63)  ［Horibata,  K.  and  Harris,  A.  W.  Nature,  256,  495-497  (1975)］などを用いることが好ましい。これらの細胞株は、適当な培地、例えば８−アザグアニン培地［ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン、２−メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、およびウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」という）を加えた培地に８−アザグアニンを加えた培地]  、イスコフ改変ダルベッコ培地（Iscove's  Modified  Dulbecco's  Medium  ；以下「ＩＭＤＭ」という）、またはダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's  Modified  Eagle  Medium；以下「ＤＭＥＭ」という）で継代培養するが、細胞融合の３乃至４日前に正常培地［例えば、１０％  ＦＣＳを含むＡＳＦ１０４培地（味の素（株）社製）］で継代培養し、融合当日に２×１０７以上の細胞数を確保しておく。
【００５９】
（ｄ）細胞融合
抗体産生細胞は、形質細胞、およびその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体のいずれの部位から得てもよく、一般には脾、リンパ節、末梢血、またはこれらを適宜組み合わせたもの等から得ることができるが、脾細胞が最も一般的に用いられる。
【００６０】
最終免疫後、所定の抗体価が得られたマウスから抗体産生細胞が存在する部位、例えば脾臓を摘出し、抗体産生細胞である脾細胞を調製する。この脾細胞と工程（ｃ）で得られたミエローマを融合させる手段として現在最も一般的に行われているのは、細胞毒性が比較的少なく融合操作も簡単なポリエチレングリコールを用いる方法である。この方法は、例えば以下の手順よりなる。
【００６１】
脾細胞とミエローマとを無血清培地（例えばＲＰＭＩ１６４０）、またはリン酸緩衝生理食塩液（以下「ＰＢＳ」という）でよく洗浄し、脾細胞とミエローマの細胞数の比が５：１〜１０：１程度になるように混合し、遠心分離する。上清を除去し、沈澱した細胞群をよくほぐした後、撹拌しながら１ｍｌの５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（分子量１０００〜４０００）を含む無血清培地を滴下する。その後、１０ｍｌの無血清培地をゆっくりと加えた後遠心分離する。再び上清を捨て、沈澱した細胞を適量のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（以下「ＨＡＴ」という）液およびマウスインターロイキン−２（以下「ＩＬ−２」という）を含む正常培地（以下「ＨＡＴ培地」という）中に懸濁して培養用プレート（以下「プレート」という）の各ウェルに分注し、５％  炭酸ガス存在下、３７℃で２週間程度培養する。途中適宜ＨＡＴ培地を補う。
【００６２】
（ｅ）ハイブリドーマ群の選択
上記ミエローマ細胞が、８−アザグアニン耐性株である場合、すなわち、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損株である場合、融合しなかった該ミエローマ細胞、およびミエローマ細胞どうしの融合細胞は、ＨＡＴ含有培地中では生存できない。一方、抗体産生細胞どうしの融合細胞、あるいは、抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマは生存することができるが、抗体産生細胞どうしの融合細胞には寿命がある。従って、ＨＡＴ含有培地中での培養を続けることによって、抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマのみが生き残り、結果的にハイブリドーマを選択することができる。
【００６３】
コロニー状に生育してきたハイブリドーマについて、ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地（以下「ＨＴ培地」という）への培地交換を行う。以後、培養上清の一部を採取し、例えば、ＥＬＩＳＡ法により抗体価を測定する。
【００６４】
以上、８−アザグアニン耐性の細胞株を用いる方法を例示したが、その他の細胞株もハイブリドーマの選択方法に応じて使用することができ、その場合使用する培地組成も変化する。
【００６５】
（ｆ）クローニング
工程（ｂ）の記載と同様の方法で抗体価を測定することにより、特異的抗体を産生することが判明したハイブリドーマを、別のプレートに移しクローニングを行う。このクローニング法としては、プレートの１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように希釈して培養する限界希釈法、軟寒天培地中で培養しコロニーを回収する軟寒天法、マイクロマニュピレーターによって１個づつの細胞を取り出し培養する方法、セルソーターによって１個の細胞を分離する「ソータクローン」などが挙げられるが、限界希釈法が簡便でありよく用いられる。
【００６６】
抗体価の認められたウェルについて、例えば限界希釈法によるクローニングを２〜４回繰返し、安定して抗体価の認められたものを本発明のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
【００６７】
（ｇ）ハイブリドーマ培養によるモノクローナル抗体の調製
クローニングを完了したハイブリドーマは、培地をＨＴ培地から正常培地に換えて培養される。大量培養は、大型培養瓶を用いた回転培養、あるいはスピナー培養で行われる。この大量培養における上清を、ゲル濾過等、当業者に周知の方法を用いて精製することにより、本発明の蛋白質に特異的に結合するモノクローナル抗体を得ることができる。また、同系統のマウス（例えば、上記のＢＡＬＢ／ｃ）、あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内で該ハイブリド−マを増殖させることにより、本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることができる。精製の簡便な方法としては、市販のモノクローナル抗体精製キット（例えば、ＭＡｂＴｒａｐ  ＧIIキット；ファルマシア社製）等を利用することもできる。
【００６８】
かくして得られるモノクローナル抗体は、本発明の蛋白質に対して高い抗原特異性を有する。
【００６９】
（ｈ）モノクローナル抗体の検定
かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプおよびサブクラスの決定は以下のように行うことができる。まず、同定法としてはオクテルロニー（Ouchterlony）法、ＥＬＩＳＡ法、またはＲＩＡ法が挙げられる。オクテルロニー法は簡便ではあるが、モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。一方、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法を用いた場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに第二次抗体として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対応する抗体を用いることにより、モノクローナル抗体のアイソタイプ、サブクラスを同定することが可能である。また、さらに簡便な方法として、市販の同定用のキット（例えば、マウスタイパーキット；バイオラッド社製）等を利用することもできる。
【００７０】
さらに、タンパク質の定量は、フォーリンロウリー法、および２８０ｎｍにおける吸光度［１．４（ＯＤ２８０）＝イムノグロブリン１ｍｇ／ｍｌ］より算出する方法により行うことができる。
【００７１】
このようにして得られる本発明の抗体は、その特異性を利用した本発明の蛋白質の検出や分離精製に用いることができる。
【００７２】
新規脂質キナーゼに対する抗体をヒトに対する医薬として用いる場合、抗原性の問題からヒトの体内で免疫原性を示さない抗体作製することが望ましい。このような抗体の例として、キメラ抗体、ヒト型抗体およびヒト抗体が挙げられる。
【００７３】
本発明において、「キメラ抗体」とは、その可変領域がヒト以外の動物の免疫グロブリン由来であり且つその定常領域がヒト免疫グロブリン由来であることを特徴とする、組換型モノクローナル抗体を意味する。好適なキメラ抗体は、その可変領域がマウス免疫グロブリン由来であり且つその定常領域がヒト免疫グロブリン由来であることを特徴とするマウス／ヒトキメラモノクローナル抗体である。定常領域が由来するヒト免疫グロブリンとしては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等のアイソタイプを例示することができ、好適にはＩｇＧ及びＩｇＭである。そのようなキメラ抗体を製造する方法としては、ヒト以外の動物のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマより該抗体をコードするＤＮＡを単離し、次いで該ＤＮＡより活性なＶＨ遺伝子（Ｈ鎖可変領域をコードする再配列されたＶＤＪ遺伝子）及びＶＬ遺伝子（Ｌ鎖可変領域をコードする再配列されたＶＪ遺伝子）を単離し、ＶＨ遺伝子の下流にヒト免疫グロブリンをコードするＤＮＡ由来のＣＨ遺伝子（Ｈ鎖定常領域をコードするＣ遺伝子）を、ＶＬ遺伝子の下流にＣＬ遺伝子（Ｌ鎖定常領域をコードするＣ遺伝子）をそれぞれ機能発現が可能なように適宜連結し、次いで同一又は別個の発現ベクターへ挿入し、得られた組換発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換宿主細胞の培養物より単離精製する方法（特公平３−７３２８０号公報等参照）を例示することができるが、その方法に限定されるものではない。
【００７４】
本発明において、「ヒト型抗体（humanized  antibody  via  CDR-grafting）」とは、可変領域内の相補性決定領域（Complementarity-determining  region：以下、ＣＤＲ）の一部又は全部がヒト以外の動物のモノクローナル抗体由来であり、且つその可変領域内のＣＤＲ以外の領域すなわち枠組領域（Framework  region：以下、ＦＲ）の大部分又は全部がヒトイムノグロブリン由来であり、且つその定常領域がヒトイムノグロブリン由来であることを特徴とする、組換型モノクローナル抗体を意味する。好適なヒト型抗体は、ＣＤＲの一部又は全部がマウスモノクローナル抗体由来であり、且つＦＲがヒトイムノグロブリン由来であり、且つその定常領域がヒトイムノグロブリン由来であることを特徴とする、ヒト型モノクローナル抗体である。
【００７５】
本発明において、ＣＤＲとは、抗体の可変領域中に存在する、抗原と相補的に直接結合する部位である領域を意味する。
【００７６】
定常領域が由来するヒト免疫グロブリンとしては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等のアイソタイプを例示することができ、好適にはＩｇＧ及びＩｇＭである。そのようなヒト型モノクローナル抗体の製造方法としては、マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマより少なくとも１つのマウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子及びそれに対応する少なくとも１つマウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子を、ヒト免疫グロブリン遺伝子から前記マウスＨ鎖ＣＤＲに対応するヒトＨ鎖ＣＤＲ以外の全領域をコードするヒトＨ鎖遺伝子及び前マウスＬ鎖ＣＤＲに対応するヒトＬ鎖ＣＤＲ以外の全領域をコードするヒトＬ鎖遺伝子をそれぞれ単離し、次いでマウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子とヒトＨ鎖遺伝子を、マウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子とヒトＬ鎖遺伝子をそれぞれ機能発現が可能なように適宜連結し、次いで同一又は別個の組換えベクターへ挿入し、得られた組換発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換宿主細胞の培養物より単離精製する方法（特表平４−５０６４５８号公報、特開昭６２−２９６８９０号公報等参照）等を例示することができるが、その方法に限定されるものではない。
【００７７】
このようなヒト型抗体の作成法の具体例を以下に挙げるが、本発明はこれに限定されない。Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いて、常法（Kohler  et  al.:  Nature  256,  p.495-497,  1975）により本発明の蛋白質に対するマウス型モノクローナル抗体を作製し、脂質キナーゼ活性を調節し、かつ高親和性を有するモノクローナル抗体を選択する。この脂質キナーゼに対する高親和性マウス型モノクローナル抗体のＣＤＲ−領域（ＣＤＲ−１、２および３）をヒトＩｇＧのＣＤＲ領域に移植するＣＤＲ−ｇｒａｆｔｉｎｇ（Winter  and  Milstein:  Nature  349,  p293-299,  1991）の手法を駆使することによりヒト型抗体を得ることができる。
【００７８】
本発明において、「ヒト抗体」とは、免疫グロブリンを構成するＨ鎖の可変領域及びＨ鎖の定常領域並びにＬ鎖の可変領域及びＬ鎖の定常領域を含む全ての領域がヒト免疫グロブリンをコードする遺伝子に由来する免疫グロブリンを意味する。そのようなヒト抗体の製造方法としては、ヒト免疫グロブリン遺伝子をヒト以外の哺乳動物の遺伝子座中に組込むことにより作製されたトランスジェニック動物をヒト抗原で免疫感作することにより、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として取得する方法（ＷＯ９４／２５５８５号公報、特表平６−５００２３３号公報等参照）等を例示することができるが、その方法に限定されるものではない。このような抗新規脂質キナーゼヒトモノクローナル抗体の作成法の一つの具体例を以下に挙げる。ヒト末梢血あるいは脾臓から採取したヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＬ−４存在下、抗原である新規脂質キナーゼまたは該キナーゼに特異的なアミノ酸配列からなるペプチドで感作し、感作したヒトリンパ球をマウスとヒトとのヘテロハイブリドーマであるＫ６Ｈ６／Ｂ５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１８２３）と細胞融合させることにより目的の抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングする。得られた抗体産生ハイブリドーマが生産する抗体は、ヒト抗新規脂質キナーゼモノクローナル抗体である。これらの抗体の中から脂質キナーゼ活性を調節する抗体を選別する。しかしながら、このようにヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで感作する方法では、一般的に抗原に対して高親和性の抗体を得るのは困難である。従って、新規脂質キナーゼに高親和性のモノクローナル抗体を得るには、上記のようにして得られた低親和性のヒト抗新規脂質キナーゼモノクローナル抗体を高親和化する必要がある。それには、上記のようにして得られ、中和抗体であるものの低親和性であるヒト抗新規脂質キナーゼモノクローナル抗体のＣＤＲ領域（特にＣＤＲ−３）にランダム変異を導入し、これをファージで発現させて本発明の蛋白質を固相化したプレートを用いてファージディスプレー法により、抗原である本発明の蛋白質に強力に結合するファージを選択し、そのファージを大腸菌で増やし、その塩基配列から高親和性を有するＣＤＲのアミノ酸配列を決定すればよい。このようにして得られたヒト抗新規脂質キナーゼモノクローナル抗体をコードする遺伝子を一般的に使用されている哺乳動物細胞用発現ベクターに組み込んで、発現させることによりヒト抗新規脂質キナーゼモノクローナル抗体が得られる。これらの中から、脂質キナーゼ活性を調節し、かつ高親和性である目的の抗新規脂質キナーゼヒトモノクローナル抗体を選別することができる。ヒト末梢血リンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する代わりに、Ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（ＳＣＩＤ）マウスに移植し、このＳＣＩＤマウスを新規脂質キナーゼまたは該キナーゼに特異的なアミノ酸配列からなるペプチドを用いて感作することによってもヒト抗体を得ることができる（Mosier  D.  E.  et  al.:  Nature  335,  p256-259,  1988;  Duchosal  M.  A.  et  al.:  Nature  355,  p258-262,  1992）。
【００７９】
本発明において、「抗体の断片」とは、本発明における抗体の一部を意味し、好適には本発明のモノクローナル抗体の一部を意味する。抗体の断片には、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ（variable  fragment  of  antibody）、ｓｃＦｖ等が含まれる。「Ｆ（ａｂ’）２」及び「Ｆａｂ’」とは、免疫グロブリン又はモノクローナル抗体を、ペプシンやパパイン等のタンパク質分解酵素又はペプチド分解酵素で処理することにより、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の前後が切断されて生じる抗体断片を意味する。
このようにして得られたハイブリドーマを培養することにより、目的のヒト抗新規脂質キナーゼモノクローナル抗体を大量に製造でき、該タンパク質の物理的性質や化学的性質などを利用した各種の公知の分離操作法により分離・精製することができる。更に、上述の方法で得られた抗新規脂質キナーゼモノクローナル抗体の中から、新規脂質キナーゼの活性を活性化または中和する抗体を得ることができる。これら新規脂質キナーゼの活性を調節する抗体は、神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症、動脈硬化、癌および癌の転移などの疾患の治療および／または予防効果を期待できる。特に新規脂質キナーゼの活性を活性化する抗体は、新規脂質キナーゼによるセラミドの代謝を促進する為、神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症および動脈硬化に対する治療及び／または予防剤として期待される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗新規脂質キナーゼ抗体による新規脂質キナーゼの生物活性の調節活性は、上記のような、脂質キナーゼ活性測定方法を利用して測定することができる。
【００８０】
本発明の蛋白質は、神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症および動脈硬化の患部においてこれらの疾患の増悪因子であると考えられているセラミドをリン酸化し、セラミド−１−リン酸へと変換するため、適切な方法で製剤化することにより、神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症および動脈硬化等の疾患の治療および／または予防剤の有効成分となりうる。本発明における神経性疾患の具体例としては、アルツハイマー、脳虚血傷害、網膜芽細胞種、網膜色素変性、糖尿病網膜症、緑内障等が挙げられ、腎臓疾患の例としては、慢性糸球体腎炎、急性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、慢性腎不全、急性腎不全、ネフローゼ症候群などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、本発明の抗体のうち、本発明の蛋白質と結合することにより該蛋白質の有する脂質キナーゼ活性を活性化させるようなものは、セラミドのリン酸化を亢進することにより、神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症および動脈硬化等の疾患の治療および／または予防剤の有効成分になりうる。また、本発明の抗体のうち、本発明の蛋白質と結合することにより、該蛋白質の有する脂質キナーゼ活性を抑制するような抗体は、癌および／または癌の転移の治療および／または予防剤の有効成分となりうる。これらの蛋白質や抗体は、製剤化して経口的あるいは非経口的に投与することができる。このような製剤は、本発明の蛋白質および本発明の抗体を有効成分として含有する医薬組成物（以下、本蛋白質製剤という）として、ヒトあるいは動物に対し安全に投与されるものである。医薬組成物の形態としては、点滴を含む注射剤、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤などが挙げられる。本蛋白製剤の有効成分は蛋白質であるため、バイアル瓶などのガラス容器や注射筒などへの吸着が著しい上に不安定であり、種々の物理化学的因子、例えば、熱、ｐＨ及び湿度等により容易に失活する。従って、安定な形で製剤化するために、安定化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、可溶化剤、界面活性剤などを添加する。安定化剤としてはグリシン、アラニン等のアミノ酸類、デキストラン４０及びマンノース等の糖類、ソルビトール、マンニトール、キシリトール等の糖アルコール等が挙げられ、またこれらの二種以上を併用してもよい。これらの安定化剤の添加量は、本蛋白質製剤の有効成分の重量に対して０．０１〜１００倍、特に０．１〜１０倍添加するのが好ましい。これら安定化剤を加えることにより、液状製剤あるいは凍結乾燥製剤の保存安定性を向上することができる。緩衝剤としては、例えばリン酸バッファー、クエン酸バッファー等が挙げられる。緩衝剤は、液状製剤あるいは凍結乾燥製剤の再溶解後の水溶液のｐＨを調製し、本蛋白質製剤の有効成分の安定性、溶解性に寄与する。緩衝剤の添加量としては、例えば液状製剤あるいは凍結乾燥製剤を採用解した後の水量に対し、１〜１０ｍＭとするのが好ましい。界面活性剤としては、好ましくはポリソルベート２０、プルロニックＦ−６８、ポリエチレングリコール等、特に好ましくはポリソルベート８０が挙げられ、またこれらの２種以上を併用してもよい。高分子蛋白質は容器の材質であるガラスや樹脂などに吸着しやすい。従って、界面活性剤を添加することによって、液状製剤あるいは凍結乾燥製剤の再溶解後における蛋白質の、容器への吸着を防止することができる。界面活性剤の添加量としては、液状製剤あるいは凍結乾燥製剤の再溶解後の水重量に対して０．００１〜１．０％添加することが好ましい。以上のような安定化剤、緩衝剤、あるいは吸着防止剤を加えて本蛋白質製剤を調製することができるが、特に医療用または動物用注射剤として用いる場合は、浸透圧として許容される浸透圧比は１〜２が好ましい。浸透圧比は、製剤化に際して塩化ナトリウムの増減により調製することができる。製剤中の蛋白質含量は、適用疾患、適用投与経路などに応じて適宜調整することができる。たとえば、ヒトに対するヒト型抗体の投与量は、抗体の新規脂質キナーゼに対する親和性、即ち、新規脂質キナーゼに対する解離定数（Ｋｄ値）に対し、親和性が高い（Ｋｄ値が低い）ほど、ヒトへの投与量を少なく薬効を発揮することができる。ヒト型抗新規脂質キナーゼ抗体をヒトに対して投与する際には、例えば、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇを１〜３０日間に１回投与する。
【００８１】
また、本発明のアンチセンスヌクレオチドは、癌のように脂質キナーゼの発現を抑制することで治療または予防効果が期待できる疾患の治療または予防剤の有効成分として有用である。アンチセンスヌクレオチドを含む医薬として有用な組成物は、医薬として許容できる担体の混合などの公知の方法によって製造され得る。このような担体と製造方法の例は、Applied  Antisense  Oligonucleotide  Technology（1998  Wiley−Liss、Inc．）に記載されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む製剤は、それ自体あるいは適宜の薬理学的に許容される、賦形剤、希釈剤等と混合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤等により経口的に、または、注射剤、坐剤、貼付剤、若しくは、外用剤等により非経口的に投与することができる。これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトールのような糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、α澱粉、デキストリンのような澱粉誘導体；結晶セルロースのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルランのような有機系賦形剤；及び、軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、珪酸カルシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体；燐酸水素カルシウムのような燐酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；硫酸カルシウムのような硫酸塩等の無機系賦形剤を挙げることができる。）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイ蝋のようなワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；ＤＬロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；及び、上記澱粉誘導体を挙げることができる。）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、及び、前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。）、乳化剤（例えば、ベントナイト、ビーガムのようなコロイド性粘土；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムのような金属水酸化物；ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウムのような陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウムのような陽イオン界面活性剤；及び、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルのような非イオン界面活性剤を挙げることができる。）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、ク��ゾールのようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及び、ソルビン酸を挙げることができる。）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。）、希釈剤等の添加剤を用いて周知の方法で製造される。
【００８２】
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを患者へ導入する方法については、上記に加えてコロイド分散系を用いることができる。コロイド分散系は該ポリヌクレオチドの生体内の安定性を高める効果や、特定の臓器、組織または細胞へ該ポリヌクレオチドを効率的に輸送する効果が期待される。コロイド分散系は、通常用いられるものであれば限定しないが、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを包含する脂質をベースとする分散系を挙げる事ができ、好ましくは、特定の臓器、組織または細胞へ該ポリヌクレオチドを効率的に輸送する効果のある、複数のリポソーム、人工膜の小胞である（Mannino  et  al.,Biotechniques,1988,6,682;Blume  and  Cevc,Biochem.et  Biophys.Acta,1990,1029,91;Lappalainen  et  al.,Antiviral  Res.,1994,23,119;Chonn  and  Cullis,Current  Op.Biotech.,1995,6,698  ）。０．２−０．４  μｍのサイズ範囲をとる単膜リポソームは、巨大分子を含有する水性緩衝液のかなりの割合を被包化し得、該ポリヌクレオチドはこの水性内膜に被胞化され、生物学的に活性な形態で脳細胞へ輸送される（Fraley  et  al.,Trends  Biochem.Sci.,1981,6,77  ）。リポソームの組成は、通常、脂質、特にリン脂質、とりわけ相転移温度の高いリン脂質を１種またはそれ以上のステロイド、特にコレステロールと通常複合したものである。リポソーム生産に有用な脂質の例は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルエタノールアミン、セレブロシド及びガングリオシドのようなホスファチジル化合物を包含する。特に有用なのはジアシルホスファチジルグリセロールであり、ここでは脂質部分が１４−１８の炭素原子、特に１６−１８の炭素原子を含有し、飽和している（１４−１８の炭素原子鎖の内部に二重結合を欠いている）。代表的なリン脂質は、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリンを包含する。
【００８３】
リポソームを包含するコロイド分散系の標的化は、受動的または能動的のいずれかであってもよい。受動的な標的化は、洞様毛細血管を含有する臓器の網内系細胞へ分布しようとするリポソーム本来の傾向を利用することによって達成される。一方、能動的な標的化は、例えば、ウイルスの蛋白質コート（Morishita  et  al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.),1993,90,8474  ）、モノクローナル抗体（またはその適切な結合部分）、糖、糖脂質または蛋白質（またはその適切なオリゴペプチドフラグメント）のような特定のリガンドをリポソームへ結合させること、または天然に存在する局在部位以外の臓器及び細胞型への分布を達成するためにリポソームの組成を変えることによってリポソームを修飾する手法等を挙げる事ができる。標的化されたコロイド分散系の表面は様々なやり方で修飾され得る。リポソームで標的したデリバリーシステムでは、脂質二重層との緊密な会合において標的リガンドを維持するために、リポソームの脂質二重層へ脂質基が取込まれ得る。脂質鎖を標的リガンドと結びつけるために様々な連結基が使用され得る。本発明のオリゴヌクレオチドのデリバリーが所望される細胞の上に支配的に見出される特定の細胞表面分子に結合する標的リガンドは、例えば、（１）デリバリーが所望される細胞によって支配的に発現される特定の細胞受容体と結合している、ホルモン、成長因子またはその適切なオリゴペプチドフラグメント、または（２）標的細胞上で支配的に見出される抗原性エピトープと特異的に結合する、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、またはその適切なフラグメント（例えば、Ｆａｂ  ；Ｆ  （ａｂ'）2  ）、であり得る。２  種またはそれ以上の生物活性剤は、単一のリポソーム内部で複合し、投与することもできる。内容物の細胞内安定性及び／または標的化を高める薬剤をコロイド分散系へ追加することも可能である。
【００８４】
その使用量は症状、年齢等により異なるが、経口投与の場合には、１回当り１mg乃至２０００mg、好適には３０mg乃至１５００mg、注射の場合には、１回当り０．１mg乃至１０００mg、好適には５mg乃至５００mg）を皮下注射、筋肉注射または静脈注射によって投与することができる。
【００８５】
また、本発明の蛋白質をワクチン製剤として投与することにより、神経性疾患、腎臓疾患、炎症、先天性免疫不全症候群、２型糖尿病、肥満、敗血症、動脈硬化、癌、および癌の転移などの治療または予防効果が期待できるだろう。
また、本発明の蛋白質に結合する物質は脂質キナーゼ活性の調節活性を有すると考えられるが、このような物質をスクリーニングする場合、本発明の蛋白質の部分アミノ酸配列からなるペプチドを使用することができ、該部分ペプチドも本発明に含まれる。該部分ペプチドは、本発明の蛋白質の部分アミノ酸配列からなっていれば特に限定されず、キナーゼ活性を有している必要は無い。該部分配列の好適な例としては、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列の部分からなるペプチドを挙げることができる。また、このようなペプチドを含むことからなるペプチドも本発明に含まれる。このようなペプチドとしては精製の為、または樹脂などに固定する為にタグを結合させて発現させたペプチド等を挙げることができるが、これに限定されない。
【発明の効果】
【００８６】
以上述べたごとく、本発明により、新規脂質キナーゼおよび該蛋白質を使用した脂質キナーゼ活性化または阻害剤の新規試験方法および該蛋白質を使用した特異的かつ高感度な脂質定量方法が提供された。本発明は、脂質キナーゼに対して特異的な活性化または阻害活性を有する、神経性疾患治療薬、腎臓疾患治療薬、抗炎症剤、先天性免疫不全症候群の治療薬、抗２型糖尿病薬、抗肥満薬、抗敗血症薬、抗動脈硬化薬および制癌剤の候補化合物のスクリーニングに有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８７】
以下に記載する実施例をもって、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【実施例】
【００８８】
実施例１．ｃＤＮＡのクローニング
１）ヒトセラミドキナーゼと相同性をもつｃＤＮＡクローンの検索と塩基配列の解析
既知のヒトセラミドキナーゼのアミノ酸配列に基づいて、ＮＣＢＩのゲノムデータベースに対してtblastnのアルゴリズムを用いて相同性検索を行い、ヒトセラミドキナーゼに相同性のあるゲノム配列（GenBankTM  accession  number  AC017116）を見出した。このゲノム配列部分に相当するｍＲＮＡの転写を確認するために、複数の市販ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用いて以下のＰＣＲを行った。
【００８９】
２）ＰＣＲによるｃＤＮＡ断片の増幅
既知のセラミドキナーゼに相同性の高い、ゲノム配列AC017116中の領域から以下の２つのオリゴヌクレオチドプライマー、C2-SおよびC2-Aを合成した。
【００９０】
C2-S：5’-GACCGAAGTCATTAAAATA；（配列表の配列番号３）
C2-A：5’-AGCCTCTAGGTGCCACTGA；（配列表の配列番号４）
次いで、市販ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、C2-Sをセンスプライマー、C2-Aをアンチセンスプライマーとして用いて、ＴａｋａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造（株）社製）を用いたＰＣＲ反応を行った。すなわち、５μｌのMarathon-ReadyＴＭ  human  fetal  kidneyやfetal  lung  (クロンテック社製)ｃＤＮＡと、オリゴヌクレオチドプライマー（C2-SおよびC2-A）各０．４μＭ、ならびにｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ各４００μＭ、２．５ｍＭ  塩化マグネシウム、１×ＬＡ  ＰＣＲ緩衝液、０．０５単位のＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（以上キットに添付）からなる５０μｌの反応液を調製した。この反応液をタカラ  ＰＣＲ    ＭＰ(宝酒造(株)社製)を使用して、９４℃で２分間加熱した後、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で２分のサイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間保温した。この反応液を１％アガロースゲル電気泳動で解析した結果、約７００ｂｐのＤＮＡ断片のバンドが観察された。このバンド内のＤＮＡ断片をゲルよりＱＩＡクイックゲルエクストラクションキット(キアゲン社製)により回収し、Ｔ／Ａクローニング法（Clark,  J.  M.  et  al.  (1988)  Nucleic  Acid  Res.  16,  9677-9686）によりｐＣＲ２．１ベクター（真核生物用  ＴＡ  クローニングキット（インビトロゲン社製）に添付）に連結し、大腸菌ＩＮＶα’株（キットに添付）に導入した。得られた形質転換株よりプラスミドＤＮＡ  ｐＣＲ２．１−ＣＥＲＫ２Ｓを抽出し、挿入されているｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列をジデオキシヌクレオチド鎖終結法によりヌクレオチド配列を決定した。その結果、得られたヌクレオチド配列は、上記１）のゲノム配列AC017116上に存在する配列であり、セラミドキナーゼに相同性を有するアミノ酸配列をコードするものであった（配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４９４〜１２５２に示される領域）。次に、このＤＮＡ断片を含む完全なｃＤＮＡを取得するために、以下に示すような５’ＲＡＣＥ法および３’ＲＡＣＥ法を利用して、完全長ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を決定した。
３）５’ＲＡＣＥ法
本発明遺伝子の５’部分を含むｃＤＮＡクローンは、市販キット（5’RACE  System  for  Rapid  Amplification  of  cDNA  ends  Version  2.0,  ライフテクノロジー社（現在はインビトロゲン社）製）を用いて、その添付の５’ＲＡＣＥ法に従い、所望の全長ｃＤＮＡを単離した。まず、２）で得られた配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４９４〜１２５２に記載のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ断片（ＣＥＲＫ２−ＰＣＲと呼ぶ）の配列をもとに、下記のような3種のアンチセンスプライマー（GSP-a1、GSP-a2およびGSP-a3）を合成した。
【００９１】
GSP-a1:5’-GTGCCTTAACAACAGC；（配列表の配列番号５）
GSP-a2:5’-CAGAGCCAAAGTTCTTCCACCAAAGCC；（配列表の配列番号６）
GSP-a3:5’-AGAACCCAAAGCGAAGAAGCTTGCC；（配列表の配列番号７）
アマシャムファルマシアのクイックプレップ  ｍＲＮＡ分離キットを用いて、キットに添付されたプロトコールに従って、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡをＨＥＫ２９３細胞から分離した。第１鎖ｃＤＮＡの合成は次のように行った。５μｇのＨＥＫ２９３ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ及びプライマーGSP-a1  ２．５ｐmolを体積１５．５μｌになるよう混合し、７０℃  １０分間プレインキュベートした後、氷上で急速冷却し、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを変性させた。これに、反応混合物（２．５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（ｐＨ８．４、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＫＣｌ)、２．５μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ１０ｍＭ  ｄＡＴＰ、１０ｍＭ  ｄＧＴＰ、１０ｍＭ  ｄＴＴＰおよび５ｍＭｄＣＴＰ）および２．５μｌの０．１ｍＭ  ＤＴＴの混合液）を加え、４２℃で１分間インキュベートし、１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ）を加え、４２℃で５０分間、７０℃で１５分間インキュベートした。反応終了後，１μｌのリボヌクレアーゼＨを加え３７℃で３０分間反応させた。GlassMax  isolation  spin  cartridgeで過剰のヌクレオチドとプライマーを除いた反応液を減圧乾燥させ、１６．５μｌの滅菌水に溶解した。この溶液に、５μｌの５×tailing緩衝液（ｐＨ８．４、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１２５ｍＭ  ＫＣｌ、７．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、２．５μｌの２ｍＭ  ｄＣＴＰを加え、９４℃で３分間インキュベートし、氷上で急速冷却し、ＤＮＡを変成させた。この溶液に、１μｌのterminal  deoxynucleotidyl  transferaseを加え、３７℃で１０分間、６５℃で１０分間インキュベーションし、ｃＤＮＡの３’末端にポリ（Ｃ）を付加した。次いで、このｃＤＮＡを鋳型として、ＴａｋａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造（株）社製）を用いて、１回目のＰＣＲ反応を行なった。すなわち、５μｌの反応液とプライマー  GSP-a2および5’RACE  Abriged  Anchor  Primer各０．４μＭ、ならびにｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ各４００μＭ、２．５ｍＭ  塩化マグネシウム、１×ＬＡ  ＰＣＲ緩衝液、０．０５単位のＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（以上キットに添付）からなる５０μｌの反応液を調製した。この反応液を９４℃で２分間加熱した後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、７２℃で２分の温度サイクルで３０サイクル繰り返してから、７２℃で１０分保温した。続いて、１回目のＰＣＲ反応液を鋳型として２回目のＰＣＲを行った。１回目のＰＣＲ反応液を１００分の１に希釈し、そのうち、５μｌを用いて、GSP-a3及びAbriged  Universal  Amplification  Primer（AUAP）各０．４μＭを加え、その他の溶液は１回目のＰＣＲ反応と同様に加えた。この反応液を９４℃で２分間加熱した後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、７２℃で２分の温度サイクルで３０サイクル繰り返してから、７２℃で１０分保温した。ＰＣＲ産物をマイクロ  バイオ−スピンカラム  ３０  クロマトグラフィーカラム(バイオラド社製)を用いて精製し、Ｔ／Ａクローニング法（Clark,  J.  M.  et  al.  (1988)  Nucleic  Acid  Res.  16:9677-9686）によりｐＣＲ２．１ベクター（オリジナル  ＴＡ  クローニングキット（インビトロゲン社製）に添付）に連結し、大腸菌ＩＮＶαＦ’株（キットに添付）に導入した。陽性のクローンにつき、挿入された���ＤＮＡの全ヌクレオチド配列をジデオキシヌクレオチド鎖終結法により決定した。
４）３’ＲＡＣＥ法
本発明遺伝子の３’部分を含むｃＤＮＡクローンは、市販ｃＤＮＡライブラリーMarathon-ReadyTM  human  kidney  (クロンテック社製）を用いて、その添付の３’ＲＡＣＥ法のプロトコールに従い単離した。まず、ＣＥＲＫ２−ＰＣＲの塩基配列に基づき２種のセンスプライマー、GSP-S1およびGSP-S2を合成した。
【００９２】
GSP-S1:5’-TGGGATGGAAACAGACCGAATCCTGAC；（配列表の配列番号８）
GSP-S2:5’-CACAGCTTCCACTTGGCTAATAC；（配列表の配列番号９）
次いで、ＴａｋａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造（株）社製）を用いて２回のＰＣＲ反応を行った。すなわち、１回目は５μｌのMarathon-ReadyＴＭ  human  fetal  kidney  (クロンテック社製)ｃＤＮＡと、GSP-S1およびAdaptor  Primer  1（AP1）各０．４μＭ、ならびにｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ各４００μＭ、２．５ｍＭ  塩化マグネシウム、１×ＬＡ  ＰＣＲ緩衝液、０．０５単位のＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（以上キットに添付）からなる５０μｌの反応液を調製した。この反応液を９４℃で２分間加熱した後、９４℃で30秒、７２℃で２分の温度サイクルを５サイクル、９４℃で30秒、７０℃で２分の温度サイクルを５サイクル、９４℃で30秒、６８℃で４分の温度サイクルを２０サイクル繰り返してから、７２℃で１０分間保温した。続いて、１回目のＰＣＲ反応液を鋳型として２回目のＰＣＲを行った。１回目のＰＣＲ反応液を１００分の１に希釈し、そのうち、５μｌを用いて、GSP-S2及びNested  Adaptor  Primer  2（AP2）各０．４μＭを加え、その他の溶液は１回目のＰＣＲ反応と同様に加えた。この反応液を９４℃で２分間加熱した後、９４℃で３０秒、６８℃で４分の温度サイクルで２０サイクル繰り返してから、７２℃で１０分保温した。ＰＣＲ産物をマイクロ  バイオ−スピンカラム  ３０  クロマトグラフィーカラム（バイオラド社製）を用いて精製し、Ｔ／Ａクローニング法（Clark,  J.  M.  et  al.  (1988)  Nucleic  Acid  Res.  16:9677-9686）によりｐＣＲ２．１ベクター（オリジナル  ＴＡ  クローニングキット（インビトロゲン社製）に添付）に連結し、大腸菌ＩＮＶαＦ’株（キットに添付）に導入した。陽性のクローンにつき、挿入されたｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列をジデオキシヌクレオチド鎖終結法により決定した。その結果、ＰＣＲ断片ＣＥＲＫ２−ＰＣＲの配列とポリＡ配列を含む配列が得られた。
５）全長ｃＤＮＡの決定
３）、４）で得られた５’部分の配列と３’部分の配列より、本発明遺伝子のｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列を決定した。本発明遺伝子のｃＤＮＡを以下ＣＥＲＫ２と称する。ＣＥＲＫ２は合計３３１３塩基からなり、１５９６塩基からなるオープンリーディングフレーム（以下「ＯＲＦ」という）を含んでおり、３’末端側の非翻訳領域にポリ（Ａ）鎖を有している。そのＯＲＦのヌクレオチド配列を配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から１５９６に示す。また、該ＯＲＦのヌクレオチド配列に対応するアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。さらに、これらの配列について、ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬのＤＮＡデータベースならびにＳＷＩＳＳ−ＰＬＯＴプロテインデータベースに対して相同性検索を行った結果、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列には、特に高い相同性を有する既知の蛋白質はなかった。また、本発明遺伝子とセラミドキナーゼの全長にわたる相同性は２８％しかないものの、脂質リン酸化酵素であるセラミドキナーゼおよびスフィンゴシンキナーゼに種を越えて系統的に保存されたドメイン部分（Sugiura  M.  et  al(2002)  J.  Biol.  Chem.  277,  23294-23300  参照）については相同性を有していた。
実施例２．ＣＥＲＫ２の発現の組織特異性
市販の調整済みノーザンブロット  ヒト  １２レーン  ＭＴＮＴＭ  ブロット（クロンテック社製）を用いて、ＣＥＲＫ２の組織における発現を調べた。配列番号１の５８４から９４０番目までのＤＮＡ断片をＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡ  ラベリングキット（宝酒造（株）社製）と［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを用いて放射標識した。これをプローブとして、６×ＳＳＣ、５％  デンハート（Denhardt）溶液および０．５％  ドデシル硫酸ナトリウム（以下「ＳＤＳ」という）、５０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液でハイブリダイゼーションを行った。ブロットを洗浄後、イメージングアナライザー（ＢＡＳ2000、富士フィルム）で解析した。その結果、ＣＥＲＫ２は腎臓に特異的に発現していることが示唆された。
実施例３．組換え体の発現
１）発現ベクターの作製
脊椎動物細胞発現系を利用して、実施例１で得られたＣＥＲＫ２によりコードされる蛋白質を得た。まず、サイトメガロウイルスのプロモーターの下流に、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から１５９６に示すヌクレオチド配列からなるＤＮＡ領域を有し、該ｃＤＮＡを発現させるための真核生物発現ベクターを構築した。上記ベクター作製のために、配列番号１の１から１７７４番目までの塩基配列を増幅するための下記の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー、CERK2-S、CERK2-Aを合成した。
【００９３】
CERK2-A：5’-ATGCCTGATGATCTGAGGTGG；（配列表の配列番号１１）
次いで、市販ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＴａｋａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造（株）社製）を用いたＰＣＲ反応を行なった。すなわち、５μｌのMarathon-ReadyTM  human  fetal  lung  (クロンテック社製)ｃＤＮＡと、オリゴヌクレオチドプライマー（CERK2-SおよびCERK2-A）各０．４μＭ、ならびにｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ各４００μＭ、２．５ｍＭ  塩化マグネシウム、１×ＬＡ  ＰＣＲ緩衝液、０．０５単位のＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（以上キットに添付）からなる５０μｌの反応液を調製した。この反応液を９４℃で２分間加熱した後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、７２℃で２分の温度サイクルを３０サイクル繰り返してから、７２℃で１０分間保温した。ＰＣＲ産物を、Ｔ／Ａクローニング法によりｐＣＲ２．１ベクター（真核生物用  ＴＡ  クローニングキット（インビトロゲン社製）に添付）に連結し、大腸菌ＩＮＶαＦ’株（キットに添付）に導入した。陽性のクローンにつき、挿入されたｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列をジデオキシヌクレオチド鎖終結法により確認した。このプラスミドをｐＣＲ２．１‐ＣＥＲＫ２と命名した。ｐＣＲ２．１‐ＣＥＲＫ２を制限酵素Ｘho  ＩとKpn  Ｉで消化し、挿入ｃＤＮＡを含む約1.7ｋｂｐの断片を単離し、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（インビトロゲン社製）に挿入し、大腸菌ＪＭ１０９株に導入した。得られた形質転換株よりプラスミドＤＮＡ  ｐｃＤＮＡ３．１−ｃｅｒｋ２を抽出し、挿入されているｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列をジデオキシヌクレオチド鎖終結法により確認した。なお、この発現用プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｃｅｒｋ２を保持する形質転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｃＤＮＡ３．１−ｃｅｒｋ２  ＳＡＮＫ  ７１１０２は、平成１４年１０月１０日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２０１が付された。
２）ＸｐｒｅｓｓＴＭエピトープタグ付き発現ベクターの作製
サイトメガロウイルスのプロモーターの下流に、配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から５３２に示すアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ領域を有し、Ｎ末端に６残基のＨｉｓタグ部位とＸｐｒｅｓｓＴＭエピトープタグ部位をもつ蛋白質を発現させるための真核生物発現ベクターを構築した。
【００９４】
上記ベクター作製のために、５’側に制限酵素認識部位を付加したオリゴヌクレオチドプライマー、His-SおよびHis-Aを合成した。
【００９５】
His-A：5’-AACTCGAGTTACTTTGGAATCATTTCTTCCATGC；（配列表の配列番号９）
次いで、ｐｃＤＮＡ３．１−ｃｅｒｋ２を鋳型として、Pfu  TurboＴＭ  DNA  polymerase（ストラタジーン社製）を用いたＰＣＲ反応を行なった。すなわち、１００ｎｇのプラスミドＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ３．１−ｃｅｒｋ２）と、オリゴヌクレオチドプライマー（His-SおよびHis-A）各０．５μＭ、ならびにｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ各２００μＭ、１×Ｐｆｕ緩衝液、２．５単位のＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  ポリメラーゼからなる１００μｌの反応液を調製した。この反応液を９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分、６８℃で４分の温度サイクルを３０サイクル繰り返してから、７２℃で１０分間保温した。ＰＣＲ産物を、ゲルよりＱＩＡクイックゲルエクストラクションキット（キアゲン社製）により回収し、Ｋｐｎ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉで消化し、ｐｃＤＮＡ３．１／ＨｉｓＡベクターに挿入し、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’株に導入した。得られた形質転換株よりプラスミドＤＮＡ  ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ−ｃｅｒｋ２を抽出し、挿入されているｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列をジデオキシヌクレオチド鎖終結法により確認した。
３）動物細胞での発現
本発明の蛋白質が脂質キナーゼ活性を有するかを確認するために、上記２）で作成した発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１/Ｈｉｓ−ｃｅｒｋ２をヒト胚子腎臓細胞ＨＥＫ２９３に、リポフェクタミン  プラス(ライフテクノロジー社製)を用いて、添付のプロトコールに従ってトランスフェクションし、本発明の蛋白質のＮ末端にＸｐｒｅｓｓＴＭエピトープタグのついた融合蛋白質を発現させた。すなわち、１プレートあたり６×１０６個のＨＥＫ２９３細胞を組織培養用ポリリジンコート１０ｃｍディッシュにまいた２４時間後に、４μｇのｐｃＤＮＡ３．１/Ｈｉｓ−ｃｅｒｋ２をトランスフェクションした。３７℃で２日間培養した後、緩衝液Ａ（２０％  グリセロール、１ｍＭ  β―メルカプトエタノール、1ｍＭ  ＥＤＴＡ、1ｍＭ  バナジン酸ナトリウム、１５ｍＭ  フッ化ナトリウム、０．５ｍＭ  ４−デオキシピリドキシン、コンプリートＴＭ（プロテアーゼインヒビター、ベーリングマンハイム社製）、１００ｍＭ  トリス緩衝液、ｐＨ7.５）にて細胞を回収し、プローブ型ソニケーター（ブランソン社製、cell  disruptor  200）にて超音波破砕を行い、細胞破砕液を調整した。この細胞破砕液を超遠心（１０５０００＊ｇ、６０分）により細胞質画分と膜画分に分画した。また、ｐｃＤＮＡ３．１/ＨｉｓＡ発現ベクター上には、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子があり、ｐｃＤＮＡ３．１/Ｈｉｓ−ｃｅｒｋ２トランスフェクション後のＨＥＫ２９３細胞より、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、本発明の蛋白質を安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
実施例４．ＣＥＲＫ２の局在
本発明の蛋白質の局在を、上記実施例３  ３）で調製した、本発明の蛋白質のＮ末端にＸｐｒｅｓｓＴＭエピトープタグがついた融合蛋白質を含む細胞質画分と膜画分を用いて、ウェスタンブロッティングにて調べた。抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体（インビトロゲン社製）を用いることにより、ウェスタンブロッティングによりＮ末側にＸｐｒｅｓｓＴＭエピトープタグをもつ本発明の蛋白質を検出した。その結果、本発明の蛋白質は、膜画分に多く局在することが示唆された（図１参照）。
実施例５．セラミドキナーゼ活性の測定
セラミドキナーゼ活性の測定は、上記実施例３で調製した膜画分から、抗Ｘｐｒｅｓｓタグ抗体を用いて免疫沈降により本発明の蛋白質を回収し、その蛋白質を用い、[３２Ｐ]-γ―ＡＴＰ（ＮＥＮ社製）およびＣ６セラミドを基質として、以下に記載する方法に従って行った。
【００９６】
具体的には、まず、実施例３で調整した本発明の蛋白質を含む膜画分より、抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体とプロテインＧセファロース  ファーストフロー（ファルマシアバイオテク社製）を用いて免疫沈降を行い、本発明の蛋白質を回収した。この回収した蛋白質を含む緩衝液Ｂ（１ｍＭ  β―メルカプトエタノール、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  バナジン酸ナトリウム、１５ｍＭ  フッ化ナトリウム、０．５ｍＭ  ４−デオキシピリドキシン、コンプリートＴＭ（プロテアーゼインヒビター  ベーリングマンハイム社製）、２００ｍＭ  塩化カリウム、１００ｍＭ  トリス緩衝液、ｐＨ７．５）  １８０μl、およびウシ胎児血清（以下、ＢＳＡ）を用いて調整した１ｍＭ  Ｃ６セラミド  １０μｌさらには１００ｍＭ  塩化マグネシウムおよび２ｍＭ  放射標識[３２Ｐ]-γ―ＡＴＰの混合液  １０μｌを添加し、３７℃で２０分間保温することによりセラミドキナーゼ反応を行った。次に、1Ｎ塩酸  ２０μｌを加えることにより反応を停止させ、クロロホルム：メタノール：濃塩酸（100：200：1、ｖ／ｖ）８００μｌおよび２．５Ｍ  塩化カリウム  ２５０μｌ、クロロホルム  ２５０μｌを加えて抽出操作を施し、２０００×ｇで遠心後、得られた下層（クロロホルム層）を薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣ）で展開、分析した。展開溶媒としては、クロロホルム／アセトン／メタノール／酢酸/水（１０：４：３：２：１）である。セラミドキナーゼ活性は上記ＴＬＣにおいて、生成物であるセラミド−１−リン酸（Cer-1-P）のスポットの放射活性をイメージングアナライザー（ＢＡＳ２０００、富士フィルム）等で定量することにより得られる。
【００９７】
この方法で測定したところ、本発明の蛋白質を含む膜画分の免疫沈降産物は、ｐｃＤＮＡ３．１／ＨｉｓＡベクターのみをＨＥＫ２９３細胞に、リポフェクタミン  プラス（ライフテクノロジー社製）を用いて、トランスフェクションした際の対照細胞破砕液より同様に調整した免疫沈降産物と比較して、有意に高いＣ６セラミドリン酸化活性を持っていた。（図２参照）
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体を用いたウェスタンブロッティングによる、Ｘｐｒｅｓｓ融合脂質キナーゼの細胞内分布（レーン１：未分画試料、レーン２：細胞質画分、レーン３：膜画分（レーン３）
【図２】Ｘｐｒｅｓｓ融合脂質キナーゼの脂質キナーゼ活性を示すＴＬＣ図、Ｃ１Ｐ；セラミド−１−リン酸、ＰＡ：ホスファチジン酸  （レーン１およびレーン２：ｐｃＤＮＡ３．１／ＨｉｓＡベクターで形質転換したＨＥＫ２９３細胞破砕液（対照）、レーン３およびレーン４：Ｘｐｒｅｓｓ融合脂質キナーゼを発現させたＨＥＫ２９３細胞破砕液）
【配列表フリーテキスト】
【００９９】
配列番号３：  C2-S  primer
配列番号４：  C2-A  primer
配列番号５：  GST-A1  primer
配列番号６：  GST-A2  primer
配列番号７：  GST-A3  primer
配列番号８：  His-S  primer
配列番号９：  His-A  primer
配列番号１０：  CERK2-S  primer
配列番号１１：  CERK2-A  primer
【図１】
2004201681.tif 000003
【図２】
2004201681.tif 000004
【配列表】
2004201681000001.app