(57)【要約】      （修正有）【課題】労力及び時間が必要なほ場での特性調査に代わる、迅速、簡便且つ正確なイタリアンライグラスの品種識別法の開発。【解決手段】イタリアンライグラスの１又は２以上の品種に高頻度に存在することを特徴とするオリゴヌクレオチド；前記オリゴヌクレオチドのそれぞれの出現頻度により、ミナミアオバ、ニオウダチ、シワスアオバ、ワセアオバ及びワセユタカからなるイタリアンライグラスの１種又は２種以上の品種を識別することを特徴とするイタリアンライグラスの品種識別法；（ａ）：イタリアンライグラスのＤＮＡを抽出する工程、（ｂ）：工程（ａ）にて抽出されたＤＮＡを制限酵素処理後、遺伝子増幅反応に付して、前記各オリゴヌクレオチドの出現頻度を調べて品種を判定する工程からなることを特徴とする前記品種識別法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１記載の塩基配列からなり、イタリアンライグラスの１又は２以上の品種に高頻度に存在することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列表の配列番号２記載の塩基配列からなり、イタリアンライグラスの１又は２以上の品種に高頻度に存在することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列表の配列番号３記載の塩基配列からなり、イタリアンライグラスの１又は２以上の品種に高頻度に存在することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
配列表の配列番号４記載の塩基配列からなり、イタリアンライグラスの１又は２以上の品種に高頻度に存在することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
配列表の配列番号５記載の塩基配列からなり、イタリアンライグラスの１又は２以上の品種に高頻度に存在することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
配列表の配列番号６記載の塩基配列からなり、イタリアンライグラスの１又は２以上の品種に高頻度に存在することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
配列表の配列番号７記載の塩基配列からなり、イタリアンライグラスの１又は２以上の品種に高頻度に存在することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
配列表の配列番号８記載の塩基配列からなり、イタリアンライグラスの１又は２以上の品種に高頻度に存在することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
配列表の配列番号９記載の塩基配列からなり、イタリアンライグラスの１又は２以上の品種に高頻度に存在することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
配列表の配列番号１０記載の塩基配列からなり、イタリアンライグラスの１又は２以上の品種に高頻度に存在することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１記載のオリゴヌクレオチド、請求項２記載のオリゴヌクレオチド、請求項３記載のオリゴヌクレオチド、請求項４記載のオリゴヌクレオチド、請求項５記載のオリゴヌクレオチド、請求項６記載のオリゴヌクレオチド、請求項７記載のオリゴヌクレオチド、請求項８記載のオリゴヌクレオチド、請求項９記載のオリゴヌクレオチド及び請求項１０記載のオリゴヌクレオチドのそれぞれの出現頻度により、ミナミアオバ、ニオウダチ、シワスアオバ、ワセアオバ及びワセユタカからなるイタリアンライグラスの１種又は２種以上の品種を識別することを特徴とするイタリアンライグラスの品種識別法。
【請求項１２】
（ａ）：イタリアンライグラスのＤＮＡを抽出する工程、（ｂ）：工程（ａ）にて抽出されたＤＮＡを制限酵素処理後、遺伝子増幅反応に付して、請求項１記載のオリゴヌクレオチド、請求項２記載のオリゴヌクレオチド、請求項３記載のオリゴヌクレオチド、請求項４記載のオリゴヌクレオチド、請求項５記載のオリゴヌクレオチド、請求項６記載のオリゴヌクレオチド、請求項７記載のオリゴヌクレオチド、請求項８記載のオリゴヌクレオチド、請求項９記載のオリゴヌクレオチド及び請求項１０記載のオリゴヌクレオチドをそれぞれ増幅する工程、及び、（ｃ）：工程（ｂ）で得られる各オリゴヌクレオチドの出現頻度を調べて品種を判定する工程からなることを特徴とする請求項１１記載の品種識別法。
【請求項１３】
工程（ｂ）が、制限酵素−ライゲーション反応と、Preselective PCR及びSelective PCRの２回のＰＣＲとからなるＡＦＬＰ（Amplified Fragment Length Polymorphism）法によって行われることを特徴とする請求項１２記載の品種識別法。
【請求項１４】
ＡＦＬＰ法において、Preselective PCRのプライマーとして配列表の配列番号１１に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号１２に記載の塩基配列からなるプライマーを用いるとともに、Selective PCRのプライマーとしてプライマーＥ０２（配列表の配列番号１３参照）、プライマーＥ０３（配列表の配列番号１４参照）、プライマーＥ０４（配列表の配列番号１５参照）、プライマーＥ０５（配列表の配列番号１６参照）、プライマーＥ０７（配列表の配列番号１７参照）、プライマーＥ１２（配列表の配列番号１８参照）、プライマーＥ１４（配列表の配列番号１９参照）、プライマーＥ１５（配列表の配列番号２０参照）及びプライマーＥ１６（配列表の配列番号２１参照）から選択されるフォワードプライマーと、プライマーＭ０５（配列表の配列番号２２参照）、プライマーＭ１０（配列表の配列番号２３参照）、プライマーＭ１３（配列表の配列番号２４参照）、プライマーＭ１４（配列表の配列番号２５参照）及びプライマーＭ１５（配列表の配列番号２６参照）から選択されるリバースプライマーを用いることを特徴とする請求項１３記載の品種識別法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、イタリアンライグラス５品種を識別できるＤＮＡマーカー及びそれを用いたイタリアンライグラスの品種識別法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
イタリアンライグラスは、家畜の飼料用に用いられる他殖性のイネ科牧草類である。イタリアンライグラスのうち、特にミナミアオバ、ニオウダチ、シワスアオバ、ワセアオバ及びワセユタカは、家畜の飼料用として需要が高いため、品種識別の必要性が高い。
【０００３】
一般的な品種識別法としては、それぞれの個体の遺伝子についてＤＮＡマーカーの有無を調査することによるＤＮＡマーカーによる品種識別法が挙げられる。ＤＮＡマーカーとは、一般的な植物（自殖性植物等）の場合は、ある品種の遺伝子中には１００％の頻度で存在し、もう一方の品種では、０％の頻度で存在する塩基配列である。
しかしながら、イタリアンライグラスをはじめとする他殖性の牧草類は、集団により育種されているため、同じ品種内でもばらつきが見られる。このため、上記のようなＤＮＡマーカーを発見するのは困難であり、これまでのところＤＮＡマーカーによる品種識別法は開発されていない。
【０００４】
一方、非特許文献１では、牧草の一種であるペレニアルライグラスのヨーロッパに生育する代表的品種のバンドを調べ、ＡＭＯＶＡ（Analysis of molecular variance ）を利用した品種識別を行っている。
しかしながら、比較的異なる品種を用いて識別を行っており、上述のイタリアンライグラスのように似かよった品種の識別にそのまま適用するのは困難である。また、品種特異的ないわゆるＤＮＡマーカーのみを調べるのではなく、１つのプライマーセットで解析し、出現した全てのバンドを調べて解析を行っている。そのため、調査に多くの労力が必要である。
【０００５】
【非特許文献１】
WORKING GROUP ON BIOCHEMICAL AND MOLECULAR TECHNIQUES AND DNA-PROFILING IN PARTICULAR; Fifth Session Beltsville, United States of America, September 28 to 30, 1998: THE POTENTIAL OF AFLP MARKERS FOR DISTINGUISHING BETWEEN RYEGRASS VARIETIES, UPOV BMT/5/4
【０００６】
このため、イタリアンライグラスの品種識別は、これまで圃場での特性調査により行われてきた。
圃場での特性調査とは、例えば一検体につき１０個体６反復計６０個体を栽培し、草丈、出穂月日等からなる重要形質６形質、調査形質４形質について調査を行い、共に栽培した標準種子の集団と比較して同品種かどうか判定を行う方法である。
しかしながら、このような圃場での特性調査は、▲１▼検定のための圃場が必要、▲２▼調査に多くの労力が必要、▲３▼検査結果が判明するまでに多くの時間が必要、等の問題点がある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明の目的は、労力及び時間が必要な圃場での特性調査に代わる迅速、簡便且つ正確なイタリアンライグラスの品種識別法を開発することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を達成するため研究を重ねた結果、イタリアンライグラスのうちの１又は２以上の品種に高頻度で存在する１０種類のオリゴヌクレオチドを見出した。
さらに、本発明者らは、これら１０種類のオリゴヌクレオチドを、いわゆるＤＮＡマーカーとして利用して、イタリアンライグラスの一種であり、特に家畜の飼料用として需要が高いミナミアオバ、ニオウダチ、シワスアオバ、ワセアオバ及びワセユタカの５品種を迅速、簡便、且つ正確に識別できることを見出した。具体的には、イタリアンライグラスのＤＮＡを抽出し、このＤＮＡを制限酵素処理後、遺伝子増幅反応に付して、上記１０種類のオリゴヌクレオチドのそれぞれを増幅し、各オリゴヌクレオチドの出現頻度を調べて品種を判定することにより、イタリアンライグラス５品種を迅速、簡便、且つ正確に識別できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
請求項１に係る本発明は、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなり、イタリアンライグラスの１又は２以上の品種に高頻度に存在することを特徴とするオリゴヌクレオチドである。
請求項２に係る本発明は、配列表の配列番号２記載の塩基配列からなり、イタリアンライグラスの１又は２以上の品種に高頻度に存在することを特徴とするオリゴヌクレオチドである。
請求項３に係る本発明は、配列表の配列番号３記載の塩基配列からなり、イタリアンライグラスの１又は２以上の品種に高頻度に存在することを特徴とするオリゴヌクレオチドである。
請求項４に係る本発明は、配列表の配列番号４記載の塩基配列からなり、イタリアンライグラスの１又は２以上の品種に高頻度に存在することを特徴とするオリゴヌクレオチドである。
請求項５に係る本発明は、配列表の配列番号５記載の塩基配列からなり、イタリアンライグラスの１又は２以上の品種に高頻度に存在することを特徴とするオリゴヌクレオチドである。
請求項６に係る本発明は、配列表の配列番号６記載の塩基配列からなり、イタリアンライグラスの１又は２以上の品種に高頻度に存在することを特徴とするオリゴヌクレオチドである。
請求項７に係る本発明は、配列表の配列番号７記載の塩基配列からなり、イタリアンライグラスの１又は２以上の品種に高頻度に存在することを特徴とするオリゴヌクレオチドである。
請求項８に係る本発明は、配列表の配列番号８記載の塩基配列からなり、イタリアンライグラスの１又は２以上の品種に高頻度に存在することを特徴とするオリゴヌクレオチドである。
請求項９に係る本発明は、配列表の配列番号９記載の塩基配列からなり、イタリアンライグラスの１又は２以上の品種に高頻度に存在することを特徴とするオリゴヌクレオチドである。
請求項１０に係る本発明は、配列表の配列番号１０記載の塩基配列からなり、イタリアンライグラスの１又は２以上の品種に高頻度に存在することを特徴とするオリゴヌクレオチドである。
【００１０】
請求項１１に係る本発明は、請求項１記載のオリゴヌクレオチド、請求項２記載のオリゴヌクレオチド、請求項３記載のオリゴヌクレオチド、請求項４記載のオリゴヌクレオチド、請求項５記載のオリゴヌクレオチド、請求項６記載のオリゴヌクレオチド、請求項７記載のオリゴヌクレオチド、請求項８記載のオリゴヌクレオチド、請求項９記載のオリゴヌクレオチド及び請求項１０記載のオリゴヌクレオチドのそれぞれの出現頻度により、ミナミアオバ、ニオウダチ、シワスアオバ、ワセアオバ及びワセユタカからなるイタリアンライグラスの１種又は２種以上の品種を識別することを特徴とするイタリアンライグラスの品種識別法である。
請求項１２に係る本発明は、（ａ）：イタリアンライグラスのＤＮＡを抽出する工程、（ｂ）：工程（ａ）にて抽出されたＤＮＡを制限酵素処理後、遺伝子増幅反応に付して、請求項１記載のオリゴヌクレオチド、請求項２記載のオリゴヌクレオチド、請求項３記載のオリゴヌクレオチド、請求項４記載のオリゴヌクレオチド、請求項５記載のオリゴヌクレオチド、請求項６記載のオリゴヌクレオチド、請求項７記載のオリゴヌクレオチド、請求項８記載のオリゴヌクレオチド、請求項９記載のオリゴヌクレオチド及び請求項１０記載のオリゴヌクレオチドをそれぞれ増幅する工程、及び、（ｃ）：工程（ｂ）で得られる各オリゴヌクレオチドの出現頻度を調べて品種を判定する工程からなることを特徴とする請求項１１記載の品種識別法である。
請求項１３に係る本発明は、工程（ｂ）が、制限酵素−ライゲーション反応と、Preselective PCR及びSelective PCRの２回のＰＣＲとからなるＡＦＬＰ（Amplified Fragment Length Polymorphism）法によって行われることを特徴とする請求項１２記載の品種識別法である。
請求項１４に係る本発明は、ＡＦＬＰ法において、Preselective PCRのプライマーとして配列表の配列番号１１に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号１２に記載の塩基配列からなるプライマーを用いるとともに、Selective PCRのプライマーとしてプライマーＥ０２（配列表の配列番号１３参照）、プライマーＥ０３（配列表の配列番号１４参照）、プライマーＥ０４（配列表の配列番号１５参照）、プライマーＥ０５（配列表の配列番号１６参照）、プライマーＥ０７（配列表の配列番号１７参照）、プライマーＥ１２（配列表の配列番号１８参照）、プライマーＥ１４（配列表の配列番号１９参照）、プライマーＥ１５（配列表の配列番号２０参照）及びプライマーＥ１６（配列表の配列番号２１参照）から選択されるフォワードプライマーと、プライマーＭ０５（配列表の配列番号２２参照）、プライマーＭ１０（配列表の配列番号２３参照）、プライマーＭ１３（配列表の配列番号２４参照）、プライマーＭ１４（配列表の配列番号２５参照）及びプライマーＭ１５（配列表の配列番号２６参照）から選択されるリバースプライマーを用いることを特徴とする請求項１３記載の品種識別法である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
まず、請求項１〜１０に係る本発明について説明する。請求項１記載の本発明のオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなり、請求項２に係る本発明のオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号２記載の塩基配列からなり、請求項３に係る本発明のオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号３記載の塩基配列からなり、請求項４に係る本発明のオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号４記載の塩基配列からなり、請求項５に係る本発明のオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号５記載の塩基配列からなり、請求項６に係る本発明のオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号６記載の塩基配列からなり、請求項７に係る本発明のオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号７記載の塩基配列からなり、請求項８に係る本発明のオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号８記載の塩基配列からなり、請求項９に係る本発明のオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号９記載の塩基配列からなり、請求項１０に係る本発明のオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号１０記載の塩基配列からなる。これらのオリゴヌクレオチドは、いずれもイタリアンライグラスの１又は２以上の品種に高頻度に存在することを特徴とするものである。
【００１２】
請求項１〜１０に係る本発明の各オリゴヌクレオチドは、それぞれ配列表の配列番号１〜１０に記載の各塩基配列からなるものであれば、天然の生物から抽出して得たものであっても良く、または人工的に合成したものであっても良い。
例えば、本発明者らは、イタリアンライグラス５品種の原原種種子（既に品種が証明されている種子）からＣＴＡＢ法で抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、制限酵素としてEcoR I及びMse Iを用いて、２５６種類のプライマー（selective primerとしてEcoR I用はアダプター結合部位に３塩基（ann）付加されたものを、Mse I用はアダプター結合部位に３塩基（cnn）付加されたものを用いる。従って、各プライマーの２塩基の組み合わせにより、４×４×４×４＝２５６種類）の組み合わせを用いて、後述するＡＦＬＰを行い、イタリアンライグラスの５品種の１又は２以上の品種に高頻度で存在するものを検索して候補マーカーとし、更に上記５品種について育種家種子、原原種種子、及び、原原種を増殖した種子である原種種子の３増殖階級各４０個体の集団で同様の方法を用いて候補マーカーの有無を調査し、その結果、品種特異的な１０種類のオリゴヌクレオチド、即ち請求項１〜１０に係る本発明の各オリゴヌクレオチドを解明した。
【００１３】
請求項１〜１０に係る本発明の各オリゴヌクレオチドは、イタリアンライグラスの５品種であるミナミアオバ、ニオウダチ、シワスアオバ、ワセアオバ及びワセユタカのうちの１又は２以上の品種中に高頻度で存在する。ここで高頻度とは、一義的には定義できないが、強いて言えばシワスアオバ及びワセアオバでは５０％以上、ニオウダチ及びミナミアオバでは４０％以上、ワセユタカでは３０％以上の頻度で出現し、他の品種の頻度が少ないことをいう。
イタリアンライグラス５品種について育種家種子、原原種種子、及び、原原種を増殖した種子である原種種子の３増殖階級各４０個体の集団における請求項１〜１０に係る本発明の各オリゴヌクレオチドの出現頻度（％）、即ちＤＮＡマーカーＮｏ．１〜１０の出現頻度（％）は、第１表に示す通りである。尚、以下の記載において、請求項１〜１０記載の各オリゴヌクレオチドを、ＤＮＡマーカーＮｏ．１〜１０と称する場合がある。
【００１４】
【表１】
第１表  標準種子におけるオリゴヌクレオチドの出現頻度（％）
2004201624.tif 000002
【００１５】
第１表から明らかなように、請求項１に係る本発明のオリゴヌクレオチド（ＤＮＡマーカーＮｏ．１）は、シワスアオバに高頻度に出現する。請求項２に係る本発明のオリゴヌクレオチド（ＤＮＡマーカーＮｏ．２）は、ニオウダチに高頻度に出現する。請求項３に係る本発明のオリゴヌクレオチド（ＤＮＡマーカーＮｏ．３）は、ニオウダチ及びワセアオバに高頻度に出現する。請求項４に係る本発明のオリゴヌクレオチド（ＤＮＡマーカーＮｏ．４）は、ニオウダチに高頻度に出現する。請求項５に係る本発明のオリゴヌクレオチド（ＤＮＡマーカーＮｏ．５）は、ミナミアオバに高頻度に出現する。請求項６に係る本発明のオリゴヌクレオチド（ＤＮＡマーカーＮｏ．６）は、ワセユタカに高頻度に出現する。請求項７に係る本発明のオリゴヌクレオチド（ＤＮＡマーカーＮｏ．７）は、シワスアオバに高頻度に出現する。請求項８に係る本発明のオリゴヌクレオチド（ＤＮＡマーカーＮｏ．８）は、ニオウダチに高頻度に出現する。請求項９に係る本発明のオリゴヌクレオチド（ＤＮＡマーカーＮｏ．９）は、ミナミアオバに高頻度に出現する。請求項１０に係る本発明のオリゴヌクレオチド（ＤＮＡマーカーＮｏ．１０）は、ニオウダチ及びワセアオバに高頻度に出現する。
【００１６】
このように、請求項１〜１０記載の各オリゴヌクレオチドを、いわゆるＤＮＡマーカーとして用いることにより、イタリアンライグラスの品種、特にミナミアオバ、ニオウダチ、シワスアオバ、ワセアオバ及びワセユタカの５品種を識別することができ、このような品種識別法を提供するのが、請求項１１〜１３記載の本発明である。
【００１７】
即ち、請求項１１記載の本発明のイタリアンライグラスの品種識別法は、請求項１記載のオリゴヌクレオチド、請求項２記載のオリゴヌクレオチド、請求項３記載のオリゴヌクレオチド、請求項４記載のオリゴヌクレオチド、請求項５記載のオリゴヌクレオチド、請求項６記載のオリゴヌクレオチド、請求項７記載のオリゴヌクレオチド、請求項８記載のオリゴヌクレオチド、請求項９記載のオリゴヌクレオチド及び請求項１０記載のオリゴヌクレオチドのそれぞれの出現頻度により、ミナミアオバ、ニオウダチ、シワスアオバ、ワセアオバ及びワセユタカからなるイタリアンライグラスの１種又は２種以上の品種を識別することを特徴とするものである。
【００１８】
ここで、ＤＮＡマーカーを用いた一般的（自殖性作物等）な品種識別の場合、図１に示すように、各ＤＮＡマーカーは、ある品種の遺伝子中には１００％の頻度で存在し、もう一方の品種では０％の頻度で存在する塩基配列なので、それぞれの個体に対応するＤＮＡマーカーを使えば、品種識別が可能である。
一方、請求項１１に係る本発明の品種識別法の場合、図２に示すように、請求項１〜１０に係る本発明の各オリゴヌクレオチドは、イタリアンライグラスの１又は２以上の品種に高頻度に存在するものであって、上述のような一般的なＤＮＡマーカーのようにそれぞれの個体に対応するものではないため、各オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、それぞれの出現頻度を調べることにより、品種識別を行う必要がある。
【００１９】
本発明のイタリアンライグラスの品種識別法において、各オリゴヌクレオチドの出現頻度を調べるには、請求項１２記載の本発明のように、（ａ）：イタリアンライグラスのＤＮＡを抽出する工程、（ｂ）：工程（ａ）にて抽出されたＤＮＡを制限酵素処理後、遺伝子増幅反応に付して、請求項１記載のオリゴヌクレオチド、請求項２記載のオリゴヌクレオチド、請求項３記載のオリゴヌクレオチド、請求項４記載のオリゴヌクレオチド、請求項５記載のオリゴヌクレオチド、請求項６記載のオリゴヌクレオチド、請求項７記載のオリゴヌクレオチド、請求項８記載のオリゴヌクレオチド、請求項９記載のオリゴヌクレオチド及び請求項１０記載のオリゴヌクレオチドをそれぞれ増幅する工程、及び、（ｃ）：工程（ｂ）で得られる各オリゴヌクレオチドの出現頻度を調べて品種を判定する工程からなる方法により行うことが望ましい。
【００２０】
第一に、工程（ａ）について述べる。工程（ａ）では、イタリアンライグラスのＤＮＡを抽出する。
ここで、イタリアンライグラスのＤＮＡとしては、検体となるイタリアンライグラスの茎、根、葉、種子等適当な部位に由来する組織又は細胞由来のゲノミックＤＮＡを用いることができる。尚、正確な品種識別を行うためには、検体として、少なくとも３０個の組織又は細胞からなる検体集団を準備することが好ましい。
イタリアンライグラスのＤＮＡの抽出は、公知の方法、例えばＣＴＡＢ（Cetyltrimetylammonium bromide）法（Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Res. 8, 4321-4325（1980）Murray, M. G. and Tompson, W. F.）に記載の方法により行うことができる。
【００２１】
第二に、工程（ｂ）について述べる。工程（ｂ）では、工程（ａ）にて抽出されたＤＮＡを制限酵素処理後、遺伝子増幅反応に付して、請求項１に係る本発明のオリゴヌクレオチド、請求項２に係る本発明のオリゴヌクレオチド、請求項３に係る本発明のオリゴヌクレオチド、請求項４に係る本発明のオリゴヌクレオチド、請求項５に係る本発明のオリゴヌクレオチド、請求項６に係る本発明のオリゴヌクレオチド、請求項７に係る本発明のオリゴヌクレオチド、請求項８に係る本発明のオリゴヌクレオチド、請求項９に係る本発明のオリゴヌクレオチド及び請求項１０に係る本発明のオリゴヌクレオチドをそれぞれ増幅する。
【００２２】
制限酵素処理は、工程（ａ）にて抽出されたＤＮＡを、EcoR I、Mse I等の制限酵素を２種類用いて、それぞれの制限酵素に適した処理条件で切断するものである。制限酵素処理により、各制限酵素に対応する制限酵素切断部位を両端に持つ制限酵素断片が生成する。
【００２３】
遺伝子増幅反応（ＰＣＲ）は、上記制限酵素処理により得られた制限酵素断片のうち、請求項１に係る本発明のオリゴヌクレオチド、請求項２に係る本発明のオリゴヌクレオチド、請求項３に係る本発明のオリゴヌクレオチド、請求項４に係る本発明のオリゴヌクレオチド、請求項５に係る本発明のオリゴヌクレオチド、請求項６に係る本発明のオリゴヌクレオチド、請求項７に係る本発明のオリゴヌクレオチド、請求項８に係る本発明のオリゴヌクレオチド、請求項９に係る本発明のオリゴヌクレオチド及び請求項１０に係る本発明のオリゴヌクレオチドを増幅するように適宜設計されたプライマーを用いる必要がある。
【００２４】
各オリゴヌクレオチドが増幅されたかどうかは、遺伝子増幅反応の後にポリアクリルアミド電気泳動等により分画して、増幅断片の長さの違いを検出し、第２表に示す各オリゴヌクレオチドのフラグメントサイズに対するバンドの有無によって確認することができる。
【００２５】
このような工程（ｂ）の一連の操作は、請求項１３に係る本発明のように、制限酵素−ライゲーション反応と、Preselective PCR及びSelective PCRの２回のＰＣＲとからなる、いわゆるＡＦＬＰ（Amplified Fragment Length Polymorphism）法によって行うと、迅速に、簡便且つ正確に処理できるので、望ましい。ＡＦＬＰ法とは、ＰＣＲにより増幅された制限酵素断片の長さの違いを検出する手法であり、AFLP：a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res. Vol. 23. 4407-4414（1995）Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M. et al. に記載された条件に従って行うことができる。また、ＡＦＬＰ法は、市販のキットを用いても行うことができ、その場合には、キット製造業者あるいはキット販売業者により明らかにされているプロトコールに従って実施することができる。
【００２６】
ＡＦＬＰ法は、制限酵素−ライゲーション反応と、Preselective PCR及びSelective PCRの２回のＰＣＲとからなる。制限酵素−ライゲーション反応は、上述の制限酵素により上記工程（ａ）で得られたイタリアンライグラスのＤＮＡを切断し、得られた制限酵素断片を各制限酵素に対応した２組の二本鎖アダプターにライゲーションする反応である。
二本鎖アダプターとしては、例えば、制限酵素としてEcoR I及びMse Iを用いる場合には、配列表の配列番号２７及び２８に記載の配列からなる二本鎖アダプター（EcoR Iアダプター）及び配列表の配列番号２９及び３０に記載の配列からなる二本鎖アダプター（Mse Iアダプター）を用いることができる。
制限酵素−ライゲーション反応は、具体的には例えば、抽出したＤＮＡについて、２種類の二本鎖アダプターの他、ＤＮＡリガーゼ等の酵素その他の試薬を混合した反応液を調製し、これをＰＣＲマシーン等により２０〜３０℃で８〜１０時間インキュベートした後、制限酵素を失活させ、所望により水で希釈することにより、達成できる。
【００２７】
Preselective PCR及びSelective PCRにおいては、まず、Preselective PCRにおいて上記制限酵素−ライゲーション反応により得られるＤＮＡをテンプレートとして増幅し、続くSelective PCRにおいてイタリアンライグラス５品種を識別できるＤＮＡマーカー部分を選択的に増幅する。
各ＰＣＲに用いるプライマーの設計に際しては、Preselective PCRのプライマーの場合は、アダプター結合部位の３'末端に、各制限酵素に対応した特定塩基を１塩基付加することが必要である（例えば、EcoR Iの場合はaを付加し、Mse Iの場合はcを付加する）。また、Selective PCRの場合は、アダプター結合部位の３'末端に、各制限酵素に対応した特定塩基を３塩基付加することが必要である（例えば、EcoR Iの場合はannを付加し、Mse Iの場合はcnnを付加する）。このように、各プライマーの３'末端に特定塩基を付加すると、制限酵素切断部位の塩基配列と付加された塩基配列を合わせ持つオリゴヌクレオチドを選択的に増幅することができ、付加する塩基の種類や数を変えることにより、増幅されるオリゴヌクレオチドの数を変えることができる。
【００２８】
これら２回のＰＣＲにより増幅されたオリゴヌクレオチドは、上述したようにポリアクリルアミド電気泳動により分画して、ＵＶ照射等により増幅断片の長さの違いを検出し、第２表に示す各オリゴヌクレオチドのフラグメントサイズに対するバンドの有無によって確認することができる。
【００２９】
後述の実施例に示すように、本発明者らは、ＡＦＬＰ法によって工程（ｂ）を行った。即ち、制限酵素−ライゲーション反応は、EcoR I及びMse Iの二種類の制限酵素を用いて行った。また、Preselective PCRのプライマーには、EcoR I及びMse Iの制限酵素切断部位に対応して、それぞれ配列表の配列番号１１に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列表の配列番号１２に記載の塩基配列からなるプライマーを用いた。また、Selective PCRのプライマーには、プライマーＥ０２（配列表の配列番号１３参照）、プライマーＥ０３（配列表の配列番号１４参照）、プライマーＥ０４（配列表の配列番号１５参照）、プライマーＥ０５（配列表の配列番号１６参照）、プライマーＥ０７（配列表の配列番号１７参照）、プライマーＥ１２（配列表の配列番号１８参照）、プライマーＥ１４（配列表の配列番号１９参照）、プライマーＥ１５（配列表の配列番号２０参照）及びプライマーＥ１６（配列表の配列番号２１参照）から選択されるフォワードプライマーと、プライマーＭ０５（配列表の配列番号２２参照）、プライマーＭ１０（配列表の配列番号２３参照）、プライマーＭ１３（配列表の配列番号２４参照）、プライマーＭ１４（配列表の配列番号２５参照）及びプライマーＭ１５（配列表の配列番号２６参照）から選択されるリバースプライマーを、本願請求項１〜１０記載の各オリゴヌクレオチド（ＤＮＡマーカーＮｏ．１〜１０）に対応して、後述の第４表に示すような１０種類の組み合わせで用いた。
【００３０】
尚、上記例示列挙したプライマーはほんの一例に過ぎず、アダプター部分の塩基配列に結合する結合部位を設けるとともに、各プライマーの３'末端に特定塩基を付加することができるものであれば使用できる。また、例示列挙したプライマーは、後述の第２表に示す組み合わせ以外の組合せでも用いることができる。例えば、ＤＮＡマーカーＮｏ．４を増幅するには、プライマーＥ０７と配列表の配列番号３０に記載された塩基配列からなるプライマーの組み合わせも用いることができる。
【００３１】
増幅された各オリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミド電気泳動により分画して、イメージアナライザー等により増幅断片の長さの違いを検出し、後述の第２表に示す請求項１〜１０に係る本発明の各オリゴヌクレオチド（ＤＮＡマーカーＮｏ．１〜１０）の各フラグメントサイズに対応するバンドの有無によって確認した。
尚、請求項７に係る本発明のオリゴヌクレオチド（即ち、ＤＮＡマーカーＮｏ．７）については、ＡＦＬＰ法を経なくとも、即ち、制限酵素切断を行わずに通常のＰＣＲ反応を行うことにより、より簡易的に所望のオリゴヌクレオチドを得ることができる。この場合、上述のように、請求項７に係る本発明のオリゴヌクレオチドを増幅するように適宜設計されたプライマーを用いる必要がある。例えば、配列表の配列番号３１に記載の塩基配列からなるフォーワードプライマー及び配列番号３２に記載の塩基配列からなるリバースプライマーで構成される１組のＳＴＳ化プライマーを用いることができる。
【００３２】
第３に、工程（ｃ）について述べる。工程（ｃ）においては、工程（ｂ）で得られる各オリゴヌクレオチドの出現頻度を調べて品種を判定する。
工程（ｂ）で得られるオリゴヌクレオチドの出現頻度は、工程（ｂ）で得られた各オリゴヌクレオチドに対応するバンドの有無を求めて、百分率（％）として算出することができる。
【００３３】
品種の判定は、上述の工程（ｂ）で得られるオリゴヌクレオチドの出現頻度を、予め用意しておいた標準種子集団におけるオリゴヌクレオチドの出現頻度と比較し、検体集団と標準種子集団の集団間差の統計量とその統計量の有意水準を求め、集団間差の統計量、或いはその統計量の有意水準を基準として、その基準を満たしているか否かによって行うことができる。
標準種子集団とは、イタリアンライグラス各品種の種子、好ましくは育種家種子、原原種種子、及び、原原種を増殖した種子である原種種子の３増殖階級について、少なくとも３０個体以上の集団における請求項１〜１０に係る本発明の各オリゴヌクレオチドの出現頻度（％）であり、標準種子集団におけるオリゴヌクレオチドの出現頻度とは、標準種子集団についても前記工程（ａ）（ｂ）を行い、工程（ｂ）で得られた請求項１〜１０に係る本発明の各オリゴヌクレオチドに対応するバンドの有無等から、百分率（％）として算出したものである。これは、例えば第１表に示すようなものである。
【００３４】
集団間差の統計量は、ＡＭＯＶＡ（Analysis of molecular variance ）により求めることができる。
即ち、ｉ集団、ｊ番目個体、ｋ番目マーカーをｘｉｊとし、そのマーカーの有無に従ってｘｉｊ＝１又は０とすると、マーカーハプロタイプは下記式（１）で表される。
【００３５】
【数１】
Ｘ１＝（ｘｉｊ１，ｘｉｊ２…  …ｘｉｊｎ）´    ・・・（１）
【００３６】
本発明のように１０種類のＤＮＡマーカーを用いる場合は、下記式（２）で表される。
【００３７】
【数２】
Ｘ１＝（１，０，１，１，０，０，１，１，０，１）´    ・・・（２）
【００３８】
個体間の距離は、下記式（３）の重みつけ行列（Ｗ）に単位行列を用い、ユークリッドの距離として計算を行う。
【００３９】
【数３】
ｄ（ＩＪ）２＝（ＸＩ−ＸＪ）´Ｗ（ＸＩ−ＸＪ）    ・・・（３）
【００４０】
統計モデルを下記式（４）とし、式（５）により集団間差の統計量を求める。
【００４１】
【数４】
ｘｉｊ＝μ＋ｂｉ＋ｃｉｊ    ・・・（４）
【００４２】
【数５】
ΦＳＴ＝σｂ２／（σｂ２＋σｃ２）    ・・・（５）
【００４３】
尚、式（４）中、ｂは集団の変量効果を、ｃは個体の変量効果を示す。
ＡＭＯＶＡの詳細については、Analysis of molecular variance inferred from metrix distances among DNA haplotypes：Application to human mitochondrial DNA restriction data. Genetics 131：479-491 Excoffier L, P. E. Smouse and J. M. Quattro（1992）に記載されている。
【００４４】
集団間差の統計量の有意水準は、集団間でハプロタイプのrandom permutationを行って得られる結果から求められる。
ここで、random permutationとは、検体集団と標準種子集団のマーカーハプロタイプを集団間でランダムに並べかえを行い、２つの仮想集団を作成する処理のことである。集団間差の検定は、その２つの仮想集団の集団間差の統計量が、検体集団と標準種子集団の集団間差の統計量より大きくなる。例えば、５００回のrandom permutationを行い、２つの仮想集団の集団間差の統計量が検体集団と標準種子集団の集団間差の統計量を５回上回った場合、５／５００＝０．０１で検体集団と標準種子集団の集団間差の統計量の有意水準は、１％ということになる。有意水準は２００〜１０００回のrandom permutationを行って得られる結果から求められる。
【００４５】
集団間差の統計量の有意水準は、例えば０．１〜５％の範囲で適宜定めることができる。例えば集団間差の統計量の有意水準０．１％とした場合、０．１％水準で有意であれば、同じ品種ではなく、０．１％水準で有意でなければ、同じ品種であると判定することができる。
【００４６】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。以下の記載において、特に説明がない場合には、Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Res. 8, 4321-4325(1980)、Murray, M. G. and Tompson, W. F., AFLP：a new techniquefor DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res. Vol.23.4407-4414 (1995)、Vos, P., Hogers, R. ,Bleeker, M. et al., Analysis of molecular variance inferred from metrix distances among DNA haplotypes:Application to human mitochondrial DNA restriction data. Genetics 131:479-491及びExcoffier L, P.E. Smouse and J.M.Quattro (1992) の各文献に記載の方法、或いはそれらの方法を修飾又は改変した方法により行ったものとする。また、市販の試薬キットや測定装置を用いるとした場合に、特に説明がないときは、それらに添付のプロトコールの指示に従って行ったものとする。
【００４７】
実施例１
育種家種子を増殖した種子である原原種及び原原種を増殖した種子である原種についてＤＮＡマーカーによる品種識別を行い、ＤＮＡマーカーの識別力の確認を行った。なお、今回用いた原原種、原種は、ほ場の特性調査で品種の確認が行われているものである。
【００４８】
イタリアンライグラス５品種（ミナミアオバ、ニオウダチ、シワスアオバ、ワセアオバ、ワセユタカ）について育種家種子、原原種及び原種各４０個体の葉身からＣＴＡＢ法でゲノミックＤＮＡを抽出した。
抽出したＤＮＡをＰＥ（パーキンエルマー）社のキットを用いてＡＦＬＰ解析を行った。
制限酵素−ライゲーション反応では、制限酵素としてEcoR I及びMse Iを用いて、以下のようにして行った。
抽出したＤＮＡについて、下記の組成で試薬を配合、調製し、ＰＣＲマシーンを用いて２５℃で８〜１０時間インキュベートした後、制限酵素を失活させるため、６５℃、２０分間インキュベートした。その反応液にＨ２Ｏ  １８９μｌを加え、希釈した。
【００４９】
〔制限酵素−ライゲーション反応  各試薬の組成〕
ＤＮＡサンプル（０．５μｇ／μｌ）                      １    μｌ
10×T4 buffer DNA Ligase Buffer with ATP                １    μｌ
０．５Ｍ  ＮａＣｌ                                      １    μｌ
１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ                                    ０．５μｌ
Mse I Adapter Pairs（配列表の配列番号２７及び２８参照） １    μｌ
EcoR I Adapter Pairs（配列表の配列番号２９及び３０参照）１    μｌ
酵素混合液（マスターミックス）                          １    μｌ
Ｈ２Ｏ                                                   ４．５μｌ
Ｔｏｔａｌ                                            １１  μｌ
【００５０】
〔酵素混合液（マスターミックス）の組成〕（１００反応分）
10×T4 buffer DNA Ligase Buffer with ATP  １０    μｌ
０．５Ｍ  ＮａＣｌ                        １０    μｌ
１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ                        ５    μｌ
２０Ｕ／μｌ  Mse I                         ５    μｌ
１００Ｕ／μｌ  EcoR I                      ５    μｌ
４００Ｕ／μｌ  T4 DNA Ligase               ２．５μｌ
Ｈ２Ｏ                                     ６２．５μｌ
Ｔｏｔａｌ                              １００    μｌ
【００５１】
次に、Preselective PCRを行った。Preselective PCRにおいては、上記制限酵素−ライゲーション反応により得られた希釈液をテンプレートとして、これを配列表の配列番号１１及び１２に示される塩基配列からなるプライマーを用いて行った。ＰＣＲの反応条件は、AFLP Core MIXを使用して、７２℃２分→９４℃２０秒・５６℃３０秒・７２℃２分からなる工程を１サイクルとした反応を３０サイクル→６０℃３０分として行った。反応終了後、得られた反応液１０μｌにＨ２Ｏ  １９０μｌを加え希釈した。
【００５２】
続いて、Selective PCRを行った。Selective PCRにおいては、上記Preselective PCRにより得られた希釈液をテンプレートとして、これをプライマーＥ０２（配列表の配列番号１３参照）、プライマーＥ０３（配列表の配列番号１４参照）、プライマーＥ０４（配列表の配列番号１５参照）、プライマーＥ０５（配列表の配列番号１６参照）、プライマーＥ０７（配列表の配列番号１７参照）、プライマーＥ１２（配列表の配列番号１８参照）、プライマーＥ１４（配列表の配列番号１９参照）、プライマーＥ１５（配列表の配列番号２０参照）及びプライマーＥ１６（配列表の配列番号２１参照）から選択されるフォワードプライマーと、プライマーＭ０５（配列表の配列番号２２参照）、プライマーＭ１０（配列表の配列番号２３参照）、プライマーＭ１３（配列表の配列番号２４参照）、プライマーＭ１４（配列表の配列番号２５参照）及びプライマーＭ１５（配列表の配列番号２６参照）から選択されるリバースプライマーを、配列表の配列番号１〜１０に記載の塩基配列からなる各オリゴヌクレオチド（ＤＮＡマーカーＮｏ．１〜１０）に対応して、第２表に示すような１０種類の組み合わせで用いて行った。尚、これらのプライマーのうち、プライマーＥ０２、プライマーＥ０３、プライマーＥ０４、プライマーＥ０５、プライマーＥ０７、プライマーＥ１２、プライマーＥ１４、プライマーＥ１５及びプライマーＥ１６は、ＦＡＭで蛍光標識したものを用いた。
【００５３】
ＰＣＲの反応条件は、AFLP Core MIXを使用して、９４℃２分→９４℃２０秒・６６℃３０秒（＊）・７２℃２分からなる工程を１サイクルとした反応を１０サイクル（＊：但し、アニーリングは１サイクルごとに１℃ずつ下げて行った。）→９４℃２０秒・５６℃３０秒・７２℃２分からなる工程を１サイクルとした反応を２０サイクル→６０℃３０分として行った。
Selective PCRは、６％アクリルアミドゲル電気泳動で分画した後、イメージアナライザーを用いてシグナルの検出を行った。
【００５４】
【表２】
第２表  ＤＮＡマーカーのサイズ及びプライマーセット
2004201624.tif 000003
【００５５】
ＰＣＲで増幅された各ＤＮＡ断片を、６％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動で分画し、第２表に示す各オリゴヌクレオチドのフラグメントサイズに対するバンドの有無によってそれぞれの個体について増幅断片の長さの違いを検出し、ＤＮＡマーカーＮｏ．１〜１０のそれぞれの有無を調査した。尚、泳動像ではＤＮＡマーカーにプライマーが結合しているため、ＤＮＡマーカーサイズにプライマーの塩基数を加えたサイズの部分にバンドが現れた。
その結果をＡＭＯＶＡにより集団間差の統計量を求め、また、５００回のrandom permuitationを行い集団間差の検定を行った。結果を第３表に示す。
【００５６】
【表３】
第３表  実施例１の結果（その１）
2004201624.tif 000004
数字は集団間差の統計量
＊は５００回random permutationでの有意水準（*…P＜0.05、**…P＜0.01、***…P＜0.001、N.S.…non-significance）
【００５７】
【表４】
第３表  実施例１の結果（その２）
2004201624.tif 000005
数字は集団間差の統計量
＊は５００回random permutationでの有意水準（*…P＜0.05、**…P＜0.01、***…P＜0.001、N.S.…non-significance）
【００５８】
第３表から明らかなように、異品種間では、全ての組み合わせにおいて０．１％の水準で有意差が認められた。同品種では、ワセユタカの育種家種子と原原種の組み合わせにおいて５％の水準で有意差が認められたものの、０．１％水準では、全ての品種の育種家種子と原原種、原種の間には有意差は認められなかった。このことから、１０種類のＤＮＡマーカーを用いてイタリアンライグラス５品種を識別できることが明らかになった。
【００５９】
実施例２
表示品種がワセアオバの流通種子２件（検体１及び検体２）について、表示内容検査を行った。標準種子としてイタリアンライグラスの５品種（ミナミアオバ、ニオウダチ、シワスアオバ、ワセアオバ、ワセユタカ）の育種家種子を用いた。育種家種子５品種及び検体種子各３０個体の葉身からＣＴＡＢ法でゲノミックＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡをＰＥ（パーキンエルマー）社のキットを用いてＡＦＬＰ解析を行った。制限酵素にはEcoR I及びMse Iを用いた。また、Preselective PCRのプライマーには配列表の配列番号１１及び１２に記載の塩基配列からなるプライマーを用いた。また、Selective PCRのプライマーには、配列表の配列番号１３〜２６に示されるものを第２表に示した１０種類の組み合わせで用いた。
【００６０】
ＰＣＲで増幅された各ＤＮＡ断片を、６％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動で分画し、それぞれの個体についてＤＮＡマーカーＮｏ．１〜１０のそれぞれの有無を調査し、ＡＭＯＶＡを用いて集団間差の統計量を求めた。また、５００回のrandom permuitationを行い、集団間差の検定を行った。本実施例においては、有意水準０．１％を判定基準とした。結果を第４表に示す。
【００６１】
【表５】
第４表  実施例２のＡＭＯＶＡ結果
2004201624.tif 000006
数字は集団間差の統計量
＊は５００回random permutation での有意水準（***  Ｐ＜0.001）
【００６２】
第４表から明らかなように、検体１及び検体２ともに０．１％水準でワセアオバとは有意差が認められず、その他の品種とは、有意差が認めらた。このことから、検体１、検体２ともにワセアオバであることが確認できた。
【００６３】
【発明の効果】
本発明により、特定のイタリアンライグラスを識別できるＤＮＡマーカーが提供され、これを用いることにより、圃場での特性調査のように労力及び時間を必要とせずに、イタリアンライグラス５品種の品種識別を迅速、簡便且つ正確に行うことが可能となる。
【００６４】
【配列表】
2004201624.tif 000007
2004201624.tif 000008
2004201624.tif 000009
2004201624.tif 000010
2004201624.tif 000011
2004201624.tif 000012
2004201624.tif 000013
2004201624.tif 000014
2004201624.tif 000015
2004201624.tif 000016
2004201624.tif 000017
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＮＡマーカーを用いた一般的（自殖性作物等）品種識別モデルである。
【図２】ＤＮＡマーカーを用いた他殖性牧草類の品種識別モデルである。
【図１】
2004201624.tif 000018
【図２】
2004201624.tif 000019