(57)【要約】    【課題】  メタノール資化性菌の育種、改良のための簡便な遺伝子置換方法を提供すること。    【解決手段】  下記工程により、染色体ＤＮＡ中に外来ＤＮＡ断片が導入されたメタノール資化性菌の組換え体を製造する。（ａ）染色体ＤＮＡ中の任意の領域の塩基配列と同一な塩基配列を含み、かつ、直鎖状の外来ＤＮＡ断片を用意し、（ｂ）前記直鎖状ＤＮＡ断片を前記メタノール資化性菌に導入して組換え体を取得し、（ｃ）染色体上の前記領域が、導入した直鎖状ＤＮＡ断片により置換された組換え体を選択する。    【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色体ＤＮＡ中に外来ＤＮＡ断片が導入されたメタノール資化性菌の組換え体の製造方法であって、下記工程を含む方法；
（ａ）染色体ＤＮＡ中の任意の領域の塩基配列と同一な塩基配列を含み、かつ、直鎖状の外来ＤＮＡ断片を用意し、
（ｂ）前記直鎖状ＤＮＡ断片を前記メタノール資化性菌に導入して組換え体を取得し、
（ｃ）染色体上の前記領域が、導入した直鎖状ＤＮＡ断片により置換された組換え体を選択する。
【請求項２】
前記メタノール資化性菌がメチロフィラス属細菌である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記メタノール資化性菌がメチロフィラス・メチロトロファスである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記外来ＤＮＡ断片が、染色体ＤＮＡ中の任意の領域と同一な塩基配列を有するセグメントと、同セグメント中に挿入された他の配列からなる請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記外来ＤＮＡ断片が、染色体ＤＮＡ中の任意の領域と同一な配列を有するが、一部を欠失しているか、又は１もしくは２以上の塩基置換を含む請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メタノール資化性菌の組換え体の製造方法に関し、詳しくは、染色体上の遺伝子が置換された組換え体の製造方法に関する。本発明は、メタノール資化性菌の育種、改良方法に有用である。
【背景技術】
【０００２】
メタノール資化性菌の染色体上の目的遺伝子を、遺伝子置換法により欠失、増幅、又は改変させるには、従来は、接合伝達が可能なプラスミド上に目的遺伝子に関連したDNA領域を搭載した組換えプラスミドをプラスミドDNA供与菌に持たせて、同組換えプラスミドをメタノール資化性菌に接合伝達させる方法、あるいは、前記目的遺伝子に関連したDNA領域を挿入したプラスミドDNAをエレクトロポレーション法によりメタノール資化性菌へ導入し、そして、染色体上の目的遺伝子と導入したプラスミド上のDNA領域との間で相同組換えを起こさせる方法が用いられてきた。例えば、セリン経路を有するメチロバクテリウム・イクストルケンス株やリブロースモノリン酸経路を有するメチロバチラス・フラジェラタス株における目的遺伝子の破壊操作において例が示されている（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００３】
前記のような環状DNAを用いた手法は、多くの原核生物の遺伝子置換法として有用なものであり（非特許文献３）、一方、以下に記載する直鎖状DNAを用いた目的遺伝子置換の方法は、殆どの原核生物には適用できないものと信じられてきた（非特許文献４）。
【０００４】
直鎖状DNAを用いた遺伝子置換等は、酵母、カビ、枯草菌などに限定されて使用されてきた。この方法は大変に簡便であり、環状DNAを用いた方法のように、環状DNAと染色体上の相同領域との１回目の相同組換え反応、そして２回目の相同組換え反応、更に、得られる組換え体の集団の中から、標的となった目的遺伝子が置換された組換え体の選択という、手間のかかる一連の操作を経ずともよいという長所があった。また、大抵の場合、この２回目の相同組換え反応により得られる組換え体は、目的とする遺伝子置換が起こらずに、操作前の遺伝子形態に戻ってしまうことが多いため、多数の組換え体の中から、頻度の低い目的遺伝子形態になった株を選択することに苦労する結果となっていた。
【０００５】
しかしながら、大腸菌（エシェリヒア・コリ）では専ら、環状DNAによる目的遺伝子の置換法が主流の方法であった。その原因は、大腸菌には導入した直鎖状のDNAを強力に分解する酵素活性がある為といわれている。従って、大腸菌では、その酵素活性を減じた特殊な菌株においてのみ、直鎖状DNAによる遺伝子置換、欠失、改変が可能となっていた（非特許文献５、非特許文献６）。
【０００６】
一方、メタノール資化性菌においても、上記のように、現在までは、環状DNAによる遺伝子置換方法のみ知られていた。
【非特許文献１】J. Bacteriol., vol.176, pp.4052-4065, (1994)
【非特許文献２】Microbiology vol.146, pp.233-238, (2000)
【非特許文献３】Nature vol. 289, pp.85-88, (1981)
【非特許文献４】Proc.Natl.Acad.Sci.USA. vol97, pp.6640-6645, (2000)
【非特許文献５】Marinus M.G., et al., Mol. Gen. Genet., 192, pp288-289 (1983)
【非特許文献６】Russell C.B., et al., J. Bacteriol., 171, pp2609-2613 (1989)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
直鎖状DNAを用いた遺伝子置換がメタノール資化性菌においても実施可能ならば、メタノール資化性菌の産業利用目的の育種・改良工程において、染色体操作を含めた遺伝子操作が迅速に実施可能となり、菌株の育種過程で大きな時間、費用の削減が行え、メリットを生じることになる。
【０００８】
本発明は、メタノール資化性菌の育種、改良のための簡便な遺伝子置換方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、メチロフィラス属細菌において、直鎖状DNAであっても、効率よく同一な配列をもつDNA間で組換え反応が起こり、目的の遺伝子の置換、欠失、改変が行えることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
【００１０】
（１）染色体ＤＮＡ中に外来ＤＮＡ断片が導入されたメタノール資化性菌の組換え体の製造方法であって、下記工程を含む方法；
（ａ）染色体ＤＮＡ中の任意の領域の塩基配列と同一な塩基配列を含み、かつ、直鎖状の外来ＤＮＡ断片を用意し、
（ｂ）前記直鎖状ＤＮＡ断片を前記メタノール資化性菌に導入して組換え体を取得し、
（ｃ）染色体上の前記領域が、導入した直鎖状ＤＮＡ断片により置換された組換え体を選択する。
（２）前記メタノール資化性菌がメチロフィラス属細菌である（１）に記載の方法。
（３）前記メタノール資化性菌がメチロフィラス・メチロトロファスである（１）に記載の方法。
（４）前記外来ＤＮＡ断片が、染色体ＤＮＡ中の任意の領域と同一な塩基配列を有するセグメントと、同セグメント中に挿入された他の配列からなる（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記外来ＤＮＡ断片が、染色体ＤＮＡ中の任意の領域と同一な配列を有するが、一部を欠失しているか、又は１もしくは２以上の塩基置換を含む（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、メタノール資化性菌の形質転換、特に遺伝子置換を、効率よくかつ簡便に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、メタノール資化性菌の組換え体の製造方法である。また、本発明の方法は、メタノール資化性菌の形質転換方法、又はメタノール資化性菌における遺伝子置換方法でもある。
【００１３】
本発明でいうメタノール資化性菌とは、メタノールを炭素源として利用可能な細菌であり、偏性メタノール資化性菌が好ましい。偏性メタノール資化性菌としては、例えば、グ
ラム陰性のかん菌である、メチロフィラス属細菌、例えばメチロフィラス・メチロトロファス(Methylophilus methylotrophus)、及びメチロバチラス属細菌、例えば、メチロバチラス・グリコゲネス(Methylobacillus glycogenes)、メチロバチラス・フラゲラタム(Methylobacillus flagellatum)等が挙げられる。具体的には、メチロフィラス・メチロトロファスAS1株(NCIMB10515)、メチロバチラス・グリコゲネス NCIMB11375株、 ATCC 21276株、 ATCC 21371株、ATR80株、A513株（Appl. Microbiol. Biotechnol., (1994)、42巻, p67-72に記載）、メチロバチラス・フラゲラタムKT株（Arch. Microbiol., (1988), 149巻、p441-446に記載）等が挙げられる。なお、これらの内、NCIMB10515株、NCIMB11375株は、ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア（National Collections of Industrial and Marine Bacteria、住所NCIMB Lts., Torry Research Station 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom）から入手可能である。
【００１４】
本発明において「外来（foreign）DNA断片」とは、メタノール資化性菌に細胞外から導入されるDNA断片を意味する。外来DNA断片の由来は、宿主メタノール資化性菌と異なる生物に由来するものであってもよい、宿主メタノール資化性菌自体又は同種の細菌に由来するものであってもよい。
【００１５】
本発明において「組換え体」とは、外来DNA断片が相同組換えにより染色体DNA中に導入されたメタノール資化性菌を意味する。外来DNA断片が塩基置換を含む場合は、本発明の方法により得られる組換え体は、変異処理により得られる変異株と構造上区別できない場合があるが、本発明の方法により得られる限り、「組換え体」である。
【００１６】
本発明に用いる外来DNAは、染色体DNA中の任意の領域（以下、「標的領域」ともいう）の塩基配列と同一な塩基配列を含み、かつ、直鎖状DNA断片である。
「直鎖状（linear）DNA断片」とは、遊離の５’末端と３’末端をもつDNA断片のことであり、「環状（circular）DNA」ではないことを意味する。また、直鎖状DNA断片の実際の形状としては、必ずしも直線状ではなく、湾曲や、ねじれがあってもよい。メチロフィラス属細菌への導入時の直鎖状DNA断片の形態は、二本鎖であっても、一本鎖であってもよいが、二本鎖が好ましい。
【００１７】
本発明に用いる直鎖状DNA断片の一つの形態は、例えば、標的領域と同一な塩基配列を有するセグメントと、同セグメント中に挿入された他の配列からなる。他の配列としては、後述するマーカー遺伝子が挙げられる。また、他の形態では、直鎖状DNA断片は、標的領域と同一な配列を有するが、一部を欠失しているか、又は１もしくは２以上の塩基置換を含む。この形態においては、好ましくは、直鎖状DNA断片は、前記欠失又は塩基置換以外の部位は、標的領域と同一の塩基配列を有する。
【００１８】
前記標的領域と同一な塩基配列を有するセグメントは、メタノール資化性菌の染色体の標的領域をクローニングすることによって取得することができる。標的領域は、例えば、これを染色体DNAから一旦、プラスミドにクローニングし組換えプラスミドを取得してから、同組換えプラスミドから制限酵素で切り出してもよいし、あるいは、PCR法により直接、ゲノムDNAから目的断片を増幅することによって取得しても構わない。
【００１９】
上記のような直鎖状DNA断片（以下、「導入DNA断片」ともいう）を宿主メタノール資化性菌に導入し、導入DNA断片の少なくとも一部と同一性を有する宿主染色体DNA上の配列（以下、「標的領域」ともいう）と、導入DNA断片との間で相同組換え反応が起こると、導入DNA断片の挿入と標的領域の脱落が同時に起こる。その結果、標的領域が導入DNA断片で置換される。
【００２０】
前記標的領域が遺伝子（以下、「標的遺伝子ともいう」）であり、導入されるDNA断片が、前記遺伝子と同一性を有するが一部配列が異なる遺伝子（以下、「導入遺伝子」ともいう）である場合は、標的遺伝子は導入遺伝子によって置換される（以下、「遺伝子置換」ともいう）。導入遺伝子は、２また３以上の遺伝子からなる融合遺伝子、または２又は３以上の遺伝子を含む遺伝子複合体であってもよい。
【００２１】
前記標的領域がタンパク質をコードする構造遺伝子であり、前記導入遺伝子が、その一部を欠失するか、又は他の配列が挿入されることにより活性のあるタンパク質をコードしない遺伝子（以下、「破壊型遺伝子」ともいう）である場合は、遺伝子置換によって標的遺伝子が破壊される。また、標的遺伝子の発現調節配列の塩基配列を改変することによって、標的遺伝子の発現を低下させることができる。
【００２２】
また、導入遺伝子として、１または２以上の任意の変異を有する変異型遺伝子を用いると、遺伝子置換によって標的遺伝子に任意の変異を導入することができる。この「変異の導入」には、宿主メタノール資化性菌が有している標的遺伝子の変異を、野生型又は他の変異に置換することも含まれる。
【００２３】
前記導入遺伝子における欠失、挿入、又は変異は、一塩基であっても、２塩基以上からなる領域であってもよい。これらの導入遺伝子における改変は、例えば、部位特的置換法によって行うことができる。
【００２４】
標的領域と導入DNA断片との置換が意図したように進行したことが判別できるように、例えば抗生物質に対する薬剤耐性マーカー遺伝子を、導入DNA断片中に組み込んでもよい。但し、そのようなマーカー遺伝子は、それぞれ、標的領域と同一性を有するDNA領域で挟まれた構造をしている必要がある。薬剤耐性マーカーを使用する場合は、カナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン、ストレプトマイシンなどの薬剤に対する耐性をメタノール資化性菌に付与する遺伝子が使用される。上記のようなマーカー遺伝子は、導入遺伝子中に挿入されることによって、破壊型遺伝子の作製に用いることができる。
【００２５】
尚、マーカー遺伝子が挿入された破壊型遺伝子は、後記実施例に示すようにプラスミドDNAを用いた遺伝子組換え手法によって作製してもよいが、クロスオーバーPCRにより導入遺伝子の増幅とマーカー遺伝子の挿入を同時に行うことによっても、作製することができる。
【００２６】
一方、導入DNA断片により染色体上の目的遺伝子が置換された株を、簡単に表現型や遺伝子型で選別できる場合は、必ずしも、薬剤耐性マーカー遺伝子を利用する必要性はない。遺伝子型は、例えば、ハイブリダイゼーションやＰＣＲによって簡単に確認することができる場合がある。
【００２７】
また、導入DNA断片における、標的領域と同一なDNA領域の長さは、メタノール資化性菌の細胞内で相同組換えが起こる程度である必要がある。具体的にはたとえば、通常20塩基以上、好ましくは500塩基以上、より好ましくは1000塩基以上である。このようなDNA断片は、宿主細胞中の相同組換え酵素により認識され、導入DNA断片と染色体上の標的領域との間で、相同組換えが進行するものと考えられる。なお、導入DNA断片は、標的領域と同一なDNA領域の上流及び／又は下流域に、同一でないDNA領域を含んでいてもよい。
【００２８】
導入遺伝子が変異又は挿入を含む場合は、変異部位又は挿入部位の上流及び下流域のそれぞれの長さは、好ましくは500塩基以上で、最大5000塩基程度である。また、薬剤耐性マーカー遺伝子が導入遺伝子に挿入される場合は、マーカー遺伝子の上流及び下流域の、
標的領域と同一なそれぞれのセグメントの長さは、好ましくは500塩基以上である。
【００２９】
更に、本発明の遺伝子置換法では、染色体上の不要な遺伝子中へ、宿主メタノール資化性菌がもともと保持していない遺伝子を導入することも可能である。導入遺伝子を含むDNAの両端に、染色体上の不要な遺伝子の上流及び下流側のDNAを連結させて直鎖状DNA断片を作製し、これでメタノール資化性菌を形質転換する。こうして導入したDNA断片は、その両端の塩基配列と同一な染色体上の遺伝子と組換え反応を起こし、これにより、不要な遺伝子が欠損する代わりに、その位置へ新たな遺伝子が挿入される。
【００３０】
DNA断片の切断、連結、ハイブリダイゼーション、PCR等の手法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition",
Cold Spring Harbor Laboratory Press,  (1989)等に記載されている。
【００３１】
直鎖状DNA断片のメタノール資化性菌への導入方法としては、エレクトロポレーション法（Canadian Journal of Microbiology, 43. 197 (1997)に記載）などが挙げられる。例えば、市販の装置（BioRad社製のGenePulser等）用いて、所定の方法に従って、直鎖状DNA断片をメタノール資化性菌へ導入することが可能である。
【００３２】
染色体上の目的遺伝子の置換が起きた株は、上記のごとく、標的遺伝子、又は導入遺伝子もしくはマーカー遺伝子の表現型、又はそれぞれの遺伝子の遺伝子型により選択することが可能である。
【００３３】
例えば、メチロフィラス・メチロトロファスの場合、薬剤耐性の評価に用いる基本的な培地としては、以下の実施例に記載のSEII培地が使用できる。その基本培地へ、適当な薬剤を添加し、２０℃から４０℃の間の適当な温度で、１２〜１００時間程度培養し、同薬剤に対する耐性株を選択することにより、目的遺伝子が導入したDNA断片により置換された株の取得が可能となる。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。
＜実施例１＞直鎖状DNAを用いたrecA遺伝子の破壊方法
メチロフィラス・メチロトロファス（Methylophilus methylotrophus）の野生株であるAS1株（NCIMB No.10515）に、以下に示すような手順で、直鎖状DNAを用いてrecA遺伝子の欠損株を取得した。
【００３５】
AS1株を、50 mLのSEII培地（組成：K2HPO4 1.9g/L; (NH4)2SO4 5.0g/L; NaH2PO4・2H2O
1.56g/L; MgSO4・7H2O 0.2g/L; CaCl2・6H2O 0.72mg/L; CuSO4・5H2O, 5μg/L MnSO4・5H2O 25μg/L ZnSO4・7H2O 23μ/L; FeCl3・6H2O 9.7mg/L; CH3OH 1%(v/v)）に植菌し、培養温度37℃にて一晩振とう培養した。その後、培養液を遠心し、菌体を回収した。得られた菌体から、市販のキット（Genomic DNA purification kit (Edge Biosystems社製)）を用いて、染色体DNAを精製した。
【００３６】
この染色体DNAを鋳型にして、配列番号１と２に記したプライマーDNA（mRecA-F3、mRecA-R3）を用いてPCR反応を行った。反応条件は、変性94℃-10秒、アニーリング55℃-30秒、伸長反応70℃-2分で28サイクル実施した。なお、耐熱性DNAポリメラーゼは、市販のキット（Pyrobest taq (Takara Bio Inc.社製)）を使用した。
【００３７】
上記PCRにより、約1.3キロ塩基対（以下「kbp」と略する場合もある）のrecA遺伝子を含むDNA断片を取得した。このDNA断片の塩基配列を配列番号１９に、それがコードするア
ミノ酸配列を配列番号２０に示した。このDNA断片の両末端を、BKL kit（Takara Bio Inc.）を用いて平滑末端化とリン酸化を行った。一方、プラスミドpUC19（Takara Bio Inc.）を制限酵素BamHIで処理後、同じく平滑末端化した後、切断端の5'リン酸を脱リン酸化した。
【００３８】
以上の２つのDNA断片を、Ligation kit（Takara Bio Inc.）を用いて連結し、pUC-MrecA1を構築した。なお、このプラスミド中のrecA遺伝子の向きは、プラスミド中のlacプロモーターからの転写の向きと同方向のものである。
【００３９】
次に、pUC-MrecA1を、制限酵素BamHIで消化し、更に切断端を脱リン酸化処理することで、recA遺伝子を分断した形のDNA断片を調製した。一方、プラスミドpUC4K（Amersham Biosciences社製）を同じく制限酵素BamHIで処理し、カナマイシン耐性遺伝子（KmR）を含むDNA断片（1.3kbp）を調製した。以上の両DNA断片をLigation kitを用いて連結することで、pUC-MrecA1::Kmを取得した。
【００４０】
プラスミドpUC-MrecA1::Kmを、制限酵素XbaIとKpnIで消化し、消化物を電気泳動することで、カナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片が挿入されたrecA遺伝子DNA断片（recA::KmR）を精製し、取得した。このDNA断片はエタノール沈殿により濃縮し、脱塩処理を施した。
【００４１】
一方、メチロフィラス・メチロトロファスAS1株をSEII液体培地（但しメタノール濃度は0.5%(v/v)）で37℃、16時間振とう培養し、その培養液20mlを10,000rpm×10分間の遠心にかけ、菌体を集菌した。これに、1mM HEPES（pH7.2）緩衝液（20 ml）を加えて懸濁後、遠心するという操作を２回行い、最後に、菌体に1mlの同溶液を加え、菌体懸濁液を調製し、エレクトロポレーション用のエレクトロセルとした。
【００４２】
上記のrecA遺伝子DNA断片の約１μgを、エレクトロセル100μLに加え、18.5kV/cm, 25μF, 200Ωで電気パルスを与え、エレクトロポレーション処理を行った。この菌体懸濁液には、直ちにSEII液体培地を加え、37℃で３時間培養した。その後、この培養液を、SEII＋Km寒天培地（20μg/mlのカナマイシンと1.5%(w/v)の寒天を含むSEII培地）に塗布し、37℃で３日間培養することで、カナマイシン耐性の形質転換体を約50株取得した。また、このうちの７株を、改めて、SEII＋Km寒天培地に広げ、更にコロニーを純化した。
【００４３】
その内の一つのコロニーから、染色体DNAを抽出し、recA遺伝子の構造をPCR法により解析した。使用したDNAプライマーは、mRecA-F2, mRecA-R2, Km4-F1, Km4-R1（それぞれ、配列番号３、４、５、６の配列を持つ）であった。まず、DNAプライマーの対として、mRecA-F2とKm4-R1を用いて候補株のゲノムDNAを鋳型としてPCR反応を行ったところ、1530bpの大きさのDNA断片が増幅される事が確認された（反応条件は、変性94℃-10秒、アニーリング反応 50℃-30秒、伸長反応 72℃-2 分）。また、Km4-F1とmRecA-R2を用いた場合は、1950bpの大きさのDNA断片が増幅できた。このことは、本候補株のゲノム上のrecA遺伝子領域がKmR遺伝子で破壊されていることを示していた。
【００４４】
更に、上記候補株のrecA遺伝子が破壊されたことで生じると予想される菌株の表現型を確認した。つまり、Rec遺伝子産物はDNAの相同性組換えに関与する酵素であるが、同時に、細胞のSOS修復機能にも関与することから、もし本菌株のrecA遺伝子が破壊され、その機能が欠損しているならば、紫外線(UV)に高い感受性を持つことになる。そこで、それら候補株のUV感受性を、野生株AS1と比較した。
【００４５】
recA破壊候補株とAS1株をそれぞれ、3mLのSEII培地で16時間培養した後、その一部、300μLの培養液を、3mLの同じ培地に植菌した。その後、37℃で対数増殖期（ODはおよそ0.5
）まで培養を行った。次に、この培養液を、SEII液体培地で順次希釈し、そのままの培養液（１倍希釈）から106倍にまで希釈した希釈液を作製した。そして、それぞれから15μLを、SEII寒天培地のプレート面へスポットし、しばらく放置することで各菌液を寒天へ染み込ませ、乾燥させた。その後、菌液をスポットした寒天プレートを、UV灯（東芝製殺菌灯GL15型）下80cmの位置に置き、15秒のUV照射を行った。一方、UV照射しない対照実験区も用意した。それら両寒天プレートを37℃で１日間培養することで、各スポットした部分から生じる菌のコロニーの形成状況を観察したところ、予想通り、recA破壊株の候補株はAS1株に比べ、約1000倍のUV感受性を示すことが判明し、取得したカナマイシン耐性株は、表現型としても、recA破壊株であることが解った。
【００４６】
こうして、直鎖状DNAによる、メチロフィラス・メチロトロファスのrecA遺伝子破壊が確認された。
【００４７】
＜実施例＞直鎖状DNAを用いたmtdA遺伝子（メチレンテトラヒドロメタノプテリン・テトラヒドロ葉酸脱水素酵素)の破壊方法
実施例１と同様にしてAS1株より染色体DNAを調製した。このDNAを鋳型に、DNAプライマーとしてMmtdA-F1とMmtdA-R1（それぞれ配列番号１１と１２）を用い、PCRを市販のキットPyrobest taq (Takara Bio Inc.社製)で行った（反応条件：変性94℃-10秒、アニーリング50℃-30秒、伸長反応 70℃-3分）。その結果、約2.1kbpのmtdA遺伝子のDNA断片が増幅できた。なお、このDNA断片の塩基配列を配列番号２１に、それがコードするアミノ酸配列を配列番号２２に示した。次に、このDNA断片を制限酵素BamHIとSalIで消化した後、精製した。
【００４８】
一方、汎用型プラスミドベクターpBluescriptIISK-（Stratagene社）を、同様にBamHIとSalIで消化した。このベクター断片と、上記のmtdA遺伝子断片をLigation kitを用いて連結し、pBS-MmtdA1を構築した。次に、このプラスミドを制限酵素EcoRV、MluIで切断し、mtdA遺伝子領域を分断した形で、DNA断片を調製した。
【００４９】
また、PCR用のDNAプライマー、Km4-F2とKm4-R2（それぞれ配列番号７と８）を作製し、鋳型DNAとしてpUC4K2を用いてPCRを行い（条件：変性94℃-10秒、アニーリング50℃-30秒、伸長反応70℃-1.5分）、KmR（カナマイシン耐性）遺伝子が搭載されているDNA断片を増幅した。更に、このDNA断片の両端を、EcoRV、MluIで消化し、DNA断片を精製した。
【００５０】
以上の２断片をLigation kitで連結し、pBS-MmtdA1Δを構築した。そして、プラスミドpBS-MmtdA1Δを制限酵素BamHIとSalIで消化し、mtdA遺伝子中にKmR遺伝子が挿入されたmtdA::KmR遺伝子断片を作製した。この消化物をエタノール沈殿法で濃縮し、更に脱塩処理を行い、これをエレクトロポレーションのDNAサンプルとした。
【００５１】
実施例１と同様にして、AS1株に上記DNAサンプルをエレクトロポレーションにより導入し、KmR株として形質転換体を約50株取得した。その中から6株を選び、ゲノムDNAを鋳型にしてPCRを行い（条件は変性94℃-10秒、アニーリング50℃-30秒、伸長反応72℃-2.5分）、各候補株のmtdA遺伝子領域の構造を調べた。なお、この検定用のPCRに使用したDNAプライマーは、MmtdA-F2、MmtdA-R2、Km4-F1とKm4-R1（それぞれ配列番号９、１０、５、６）である。その結果、予想どおり、MmtdA-F2 とKm4-R1の組み合わせでは2kbの大きさのDNA断片、そしてMmtdA-R2とKm4-F1の組み合わせでは1.6 kbの大きさのDNA断片が増幅されたことで、破壊の標的遺伝子であったmtdA遺伝子の欠損が確認された。
【００５２】
＜実施例３＞直鎖状DNAを用いたmch遺伝子（メテニル テトラヒドロメタノプテリン シクロヒドロレース遺伝子）の破壊
実施例１と同様にしてAS1株より染色体DNAを調製した。このDNAを鋳型に、DNAプライマ
ーとして、Mmch-F1とMmch-R1（それぞれ配列番号１３と１４)を用い、PCRを行った（反応条件：変性94℃-10秒、アニーリング50℃-30秒、伸長反応70℃-2分）。その結果、約1.8kbpのmch遺伝子のDNA断片が増幅できた。なお、このDNA断片の塩基配列を配列番号２３に、それがコードするアミノ酸配列を配列番号２４に示した。次に、このDNA断片を制限酵素BamHIとSalIで消化した後、精製した。
【００５３】
一方、汎用型プラスミドベクターpBluescriptIISK-（Stratagene社）を、同様にBamHIとSalIで消化した。このベクター断片と、上記のmch遺伝子断片をLigation kitを用いて連結し、pBS-Mmch1を構築した。次に、このプラスミドを制限酵素EcoRI、PstIで切断し、mch遺伝子領域を分断した形で、DNA断片を調製した。
【００５４】
また、PCR用のDNAプライマー、Km4-F3とKm4-R3（それぞれ配列番号１５と１６）を作製し、鋳型DNAとしてpUC4K2を用いてPCRを行い（条件：変性94℃-10秒、アニーリング50℃-30秒、伸長反応70℃-1.5分）、KmR遺伝子の搭載されているDNA断片を増幅し、更にそのDNA断片の両端を、EcoRI、PstIで消化し、DNA断片を精製した。
【００５５】
以上の２断片をLigation kitで連結し、pBS-Mmch1Δを構築した。そして、プラスミドpBS-Mmch1Δを制限酵素BamHIとSalIで消化し、mch遺伝子中にKmR遺伝子が挿入されたmch::KmR遺伝子断片を作製した。この消化物をエタノール沈殿法にて濃縮し、更に脱塩処理を行い、これをエレクトロポレーションのDNAサンプルとした。
【００５６】
実施例１と同様にして、AS1株に上記DNAサンプルをエレクトロポレーションにより導入し、KmR株として形質転換体を約50株取得した。その中から6株を選び、ゲノムDNAを鋳型にしてPCRを行い（条件は変性94℃-10秒、アニーリング50℃-30秒、伸長反応72℃-1.5分）、各候補株のmch遺伝子領域の構造を調べた。なお、PCRに使用したDNAプライマーは、Mmch-F2、Mmch-R2、Km4-F1とKm4-R1（それぞれ配列番号１７、１８、５、６）である。その結果、予想どおり、Mmch-F2とKm4-R1の組み合わせでは1.8 kbの大きさのDNA断片、及びMmch-R2とKm4-F1の組み合わせでは2.5 kbの大きさのDNA断片の増幅が確認され、破壊の標的遺伝子であるmchの欠損株が作製されたことが確認された。
【配列表】
2004229662000001.app