(57)【要約】【課題】遺伝子の機能が破壊されている遺伝子には、トランスポゾンが存在しているものと、トランスポゾンが既に抜け出ているものがあり、前者は上述した方法により正常な遺伝子と区別が可能であるのに対して、後者は、長さが殆ど変わらないため、正常な遺伝子と区別ができない。【解決手段】そこで本発明では、これを解決するために、対象とする遺伝子に対応するＤＮＡ断片を増幅するための５’→３’向きの塩基配列に対応した第１のプライマーと、３’→５’向きの塩基配列に対応した第２のプライマーに加えて、想定されるトランスポゾンのフットプリントの塩基配列に対応した第３のプライマーを共存させてポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅されたＤＮＡ断片を電気泳動法によって分析して、ＤＮＡ断片の長さから遺伝子型を判定する遺伝子型判定方法を提案する。【選択図】      図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象とする遺伝子に対応するＤＮＡ断片を増幅するための５’→３’向きの塩基配列に対応した第１のプライマーと、３’→５’向きの塩基配列に対応した第２のプライマーに加えて、想定されるトランスポゾンのフットプリントの塩基配列に対応した第３のプライマーを共存させてポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅されたＤＮＡ断片を電気泳動法によって分析して、ＤＮＡ断片の長さの組み合わせから遺伝子型を判定することを特徴とする遺伝子型判定方法
【請求項２】
ペチュニアの主要花色素（アントシアニン）の合成系に存在する一つの酵素を作る遺伝子に対応するＤＮＡ断片を増幅するための５’→３’向きの塩基配列に対応した第１のプライマーと、３’→５’向きの塩基配列に対応した第２のプライマーに加えて、想定されるトランスポゾンのフットプリントの塩基配列に対応した第３のプライマーを共存させてポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅されたＤＮＡ断片を電気泳動法によって分析して、ＤＮＡ断片の長さの組み合わせから遺伝子型を判定することを特徴とする遺伝子型判定方法
【請求項３】
第１、第２及び第３のプライマーは下記の塩基配列を有することを特徴とする請求項２に記載の遺伝子型判定方法
第１のプライマー
５’−ＧＧＴＴＴＣＴＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧＡＡＡＧＡＣＡ−３’
第２のプライマー
５’−ＡＴＧＴＴＣＴＧＧＴＡＡＡＧＡＣＣＡＴＣＴＴＣＡＴ−３’
第３のプライマー
５’−ＧＣＴＧＧＴＧＡＣＴＣＡＣＣＡＧＴＧＧ−３’
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は遺伝子型判定方法、特に、トランスポゾンが挿入されることによって機能が停止した遺伝子を、トランスポゾンが抜けた状態であっても、正常な遺伝子と区別ができるようにした遺伝子型判定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
例えば、重要な花壇材料であるペチュニア品種の花色は、赤系、ピンク系、茶色系、青系の４系色に大別され、これらはいずれもアントシアニンと呼ばれる色素によって構成されている。
【０００３】
これらの４系色に対応するアントシアニンは、例えば以下の通りである。
cyanidin      赤系          red、salmon、coral  等
peonidin      ピンク系      pink、rose  等
delphinidin   茶色系
malvidin      青系          blue、lilac、burgundy  等
【０００４】
これらの４色素は、下記に示す通り、いずれもアントシアニン前躯体である、dihydroquercetinに、flavonol-3-rhamnosyltransferase （Ｒｔ）とflavonoid３’５’-hydroxylase （Ｆ３’５’Ｈ）という２つの酵素の働きの違いによって生成される。
2004201582.tif 000003
【０００５】
Ｒｔのみに絞って考え、夫々の色素に対応した酵素の遺伝子型を示すと次のとおりである。尚、Ｒｔは優性、ｒｔは劣性を示している。
2004201582.tif 000004
これから、例えば、cyanidinは、遺伝的には劣性ホモ（ｒｔ ｒｔ）ということになる。
尚、遺伝子は、イタリックで記すルールであるが、ここでは便宜的に通常の書体で記すものとしている。
【０００６】
上述したペチュニアの主要花色素（アントシアニン）の合成系に存在する一つの酵素flavonol-3-rhamnosyltransferase （Ｒｔ）を作る上述した遺伝子Ｒｔが正常であると、アントシアニンの３位に糖の一種であるラムノース(rhamnose)が付き、遺伝子Ｒｔの機能が停止していると、このことが起こらない。
これをまとめると以下のとおりである。
2004201582.tif 000005
ここで、▲１▼と▲２▼は遺伝子型が異なるものの、表現型は同じであるので、その遺伝子型は子孫の表現型を調べなければ分からない。
【０００７】
このように従来は、子孫の表現型を調べなければ、ペチュニアの色に対応する遺伝子型が分からなかったので、品種改良に要する時間が長く掛かっており、このため、対象とする遺伝子を直接に調べて、遺伝子型を判定できる方法が望まれていた。
【０００８】
本発明者は市販されているペチュニア品種の遺伝子を調べた結果、上記遺伝子Ｒｔの途中にトランスポゾンが挿入されることによって、その働きが阻止されて機能が停止され、遺伝子rｔが生じたとの知見を得た。尚、このトランスポゾンにより生じた遺伝子rｔは、The Plant Journal (1994)
5(1),69-80にも報告されている。
【０００９】
そして本発明者は、正常な遺伝子Ｒｔにトランスポゾンが挿入されて破壊された遺伝子rｔは、その長さが正常な遺伝子Ｒｔよりも長いため、その長さを比較することにより、それらを区別する方法を創案した。
【００１０】
この方法は、遺伝子Ｒｔの途中に挿入されたトランスポゾンの両脇の塩基配列に特異的に構築した一対のプライマーを用いて、ＰＣＲ法によりＲｔ遺伝子を増幅し、これを電気泳動法を用いて、バンドの位置により長さを比較することにより、正常な遺伝子Ｒｔとトランスポゾンにより破壊された遺伝子Ｒｔを区別する方法である。
【００１１】
尚、この方法において一対のプライマーは、夫々下記のような塩基配列を有する、５’→３’向きの塩基配列に対応した第１のプライマーと、３’→５’向きの塩基配列に対応した第２のプライマーを用いている。
第１のプライマー：
５’−ＣＴＣＡＧＡＣＣＴＣＴＧＴＴＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＧ−３’
第２のプライマー：
３’−ＡＧＡＡＡＣＴＧＡＡＣＴＣＴＣＡＴＣＣ−５’
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながらトランスポゾンは動き回る遺伝子であり、挿入された遺伝子上に必ずしも常に留まってはおらず、遺伝子から抜け出てしまう場合が少なからず生じる。
【００１３】
このようにトランスポゾンが遺伝子から抜け出る際には、それまで存在した遺伝子の位置に足跡(フットプリント)を残して行くのであるが、その足跡はせいぜい１０数塩基程度しか存在しないため、正常な遺伝子と殆ど長さが変わらない。そして、一度、トランスポゾンが挿入された遺伝子は、トランスポゾンが抜け出てしまった後も機能は破壊されて停止したままである。
【００１４】
このように、遺伝子の機能が破壊されている遺伝子には、トランスポゾンが存在しているものと、トランスポゾンが既に抜け出ているものがあり、前者は上述した方法により正常な遺伝子と区別が可能であるのに対して、後者は、長さが殆ど変わらないため、正常な遺伝子と区別ができない。
【００１５】
本発明は、このような点に鑑みて創案されたもので、トランスポゾンが挿入されることによって機能が停止した遺伝子を、トランスポゾンが抜けた状態であっても、正常な遺伝子と区別ができるようにした遺伝子型判定方法を提供することを第１の目的とする。
【００１６】
また本発明では、重要な花壇材料であるペチュニアの主要花色素(アントシアニン)の合成系に存在する一つの酵素flavonol-3-rhamnosyltransferaseを作る遺伝子に関し、トランスポゾンが挿入されることによって機能が停止した遺伝子を、トランスポゾンが存在する状態では勿論のこと、トランスポゾンが抜けた状態であっても、正常な遺伝子と区別ができるようにした遺伝子型判定方法を提供することを第２の目的とする。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
上述した第１の目的を達成するために、請求項１に記載の発明では、対象とする遺伝子に対応するＤＮＡ断片を増幅するための５’→３’向きの塩基配列に対応した第１のプライマーと、３’→５’向きの塩基配列に対応した第２のプライマーに加えて、想定されるトランスポゾンのフットプリントの塩基配列に対応した第３のプライマーを共存させてポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅されたＤＮＡ断片を電気泳動法によって分析して、ＤＮＡ断片の長さの組み合わせから遺伝子型を判定する遺伝子型判定方法を提案する。
【００１８】
また上述した第２の目的を達成するために、請求項２に記載の発明では、ペチュニアの主要花色素（アントシアニン）の合成系に存在する一つの酵素を作る遺伝子に対応するＤＮＡ断片を増幅するための５’→３’向きの塩基配列に対応した第１のプライマーと、３’→５’向きの塩基配列に対応した第２のプライマーに加えて、想定されるトランスポゾンのフットプリントの塩基配列に対応した第３のプライマーを共存させてポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅されたＤＮＡ断片を電気泳動法によって分析して、ＤＮＡ断片の長さの組み合わせから遺伝子型を判定する遺伝子型判定方法を提案する。
【００１９】
また請求項３に記載の発明では、請求項２の発明において、第１、第２及び第３のプライマーは下記の塩基配列を有するものとすることを提案する。
第１のプライマー
５’−ＧＧＴＴＴＣＴＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧＡＡＡＧＡＣＡ−３’
第２のプライマー
５’−ＡＴＧＴＴＣＴＧＧＴＡＡＡＧＡＣＣＡＴＣＴＴＣＡＴ−３’
第３のプライマー
５’−ＧＣＴＧＧＴＧＡＣＴＣＡＣＣＡＧＴＧＧ−３’
【００２０】
本発明においては、第１と第２のプライマーにより、対象とする遺伝子に対応するＤＮＡ断片が増幅され、また第３のプライマーによってはトランスポゾンのフットプリントに対応するＤＮＡ断片が増幅される。
【００２１】
対象とする遺伝子にトランスポゾンが挿入された状態では、対象とする遺伝子に対応するＤＮＡ断片の全体のみが増幅され、トランスポゾンに対応する部分は増幅されない。そして、そのＤＮＡ断片の長さは正常の遺伝子に対応するＤＮＡ断片の長さよりも長いため、これらは電気泳動法によって長さを分析することにより容易に区別することができる。
【００２２】
一方、対象とする遺伝子にトランスポゾンが一度挿入されたものの、それが抜けてしまった状態においては、対象とする遺伝子に対応するＤＮＡ断片の全体と共に、トランスポゾンのフットプリントに対応するＤＮＡ断片も増幅される。即ち、この状態においては、正常の遺伝子と同程度の長さのＤＮＡ断片と、それよりも短い、フットプリントに対応するＤＮＡ断片が増幅され、これら長さのＤＮＡ断片が電気泳動法の結果として現れる。
【００２３】
こうして本発明では、遺伝子にトランスポゾンが挿入された状態の長いＤＮＡ断片、遺伝子にトランスポゾンが挿入されたものの抜けた状態又は正常な中くらいの長さのＤＮＡ断片及びトランスポゾンのフットプリントに対応する短いＤＮＡ断片の長さを電気泳動法によって分析し、その組み合わせにより、これらを区別して、遺伝子型を判定することができる。
【００２４】
【発明の実施の形態】
次に本発明を、重要な花壇材料であるペチュニアの遺伝子型判定に適用した場合につき、詳細に説明する。
図１はペチュニアの主要花色素（アントシアニン）の合成系に存在する一つの酵素flavonol-3-rhamnosyltransferase （Ｒｔ）を作る遺伝子Ｒｔを模式的に示すもので、上側は正常な遺伝子Ｒｔである。一方、下側は遺伝子Ｒｔの中にトランスポゾンと称される動き回るＤＮＡが、ＤＮＡ上の遺伝子Ｒｔの部分に挿入された状態を模式的に示すもので、このように遺伝子Ｒｔの部分にトランスポゾンが挿入されると、その遺伝子の働きを阻止し、従って遺伝子は機能を停止してしまい、劣性の遺伝子ｒｔが生じる。即ち、ペチュニアの（Ｒｔ）発現が止まっているのは（Ｒｔ）をコードする遺伝子上にトランスポゾンが挿入されてしまっているためである。この場合、図示しているように、トランスポゾンは塩基配列が長いため、遺伝子ｒｔの長さは正常な遺伝子Ｒｔの長さよりも長くなる。
【００２５】
しかしながらトランスポゾンは動き回る遺伝子であり、挿入された遺伝子Ｒｔにずっと留まっていることはなく、そこから抜け出てしまう場合が少なからず生じる。そして一度、トランスポゾンが挿入された遺伝子ｒｔは、それが抜けてしまった後も機能は停止したままである。従ってこの遺伝子ｒｔも劣性である。
【００２６】
一方、トランスポゾンは、遺伝子Ｒｔから抜ける時、自己がそれまで存在していた位置にフットプリント(足跡)を残して行くのであるが、フットプリントはせいぜい１０数塩基しか存在しないため、図２に示すように正常な遺伝子Ｒｔと殆ど長さが変わらない。即ち、図２も上記遺伝子Ｒｔを模式的に示すもので、上側は正常な遺伝子Ｒｔ、下側はそこからトランスポゾンが抜けた状態を示すものである。従って遺伝子全体の長さを単に比較しても正常な遺伝子Ｒｔと、トランスポゾンが抜けた状態の遺伝子ｒｔを区別することはできない。
【００２７】
図３は以上の遺伝子を纏めて示すもので、上側は正常な遺伝子Ｒｔ、中側はトランスポゾンが挿入されている遺伝子ｒｔ、下側はトランスポゾンが抜けた遺伝子ｒｔである。
【００２８】
本発明では、このような３つの異なる長さの遺伝子を区別するために、図３に示すように、対象とする遺伝子、この場合、遺伝子Ｒｔに対応するＤＮＡ断片を増幅するための５’→３’向きの塩基配列に対応した第１のプライマー▲１▼と、３’→５’向きの塩基配列に対応した第２のプライマー▲２▼に加えて、トランスポゾンのフットプリントの塩基配列に対応した第３のプライマー▲３▼を共存させてポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅されたＤＮＡ断片を電気泳動法によって分析して、ＤＮＡ断片の長さの組み合わせから遺伝子型を判定するのである。
【００２９】
これらの第１、第２、第３のプライマー▲１▼、▲２▼、▲３▼は下記の塩基配列を有するものとしている。
第１のプライマー
５’−ＧＧＴＴＴＣＴＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧＡＡＡＧＡＣＡ−３’
第２のプライマー
５’−ＡＴＧＴＴＣＴＧＧＴＡＡＡＧＡＣＣＡＴＣＴＴＣＡＴ−３’
第３のプライマー
５’−ＧＣＴＧＧＴＧＡＣＴＣＡＣＣＡＧＴＧＧ−３’
【００３０】
これらの第１、第２、第３のプライマー▲１▼、▲２▼、▲３▼は上記塩基配列を有するものであれば、５’側には５０％程度まで長くすることも可能である。
【００３１】
以上の第１、第２、第３のプライマー▲１▼、▲２▼、▲３▼により、判定対象のペチュニアのＤＮＡ資料に対してポリメラーゼ連鎖反応を行うと、第１と第２のプライマーにより、対象とする遺伝子に対応するＤＮＡ断片が増幅され、また第３のプライマーによってはトランスポゾンのフットプリントに対応するＤＮＡ断片が増幅される。
【００３２】
図３の上側の正常な遺伝子Ｒｔでは、その遺伝子に対応するＤＮＡ断片の全体が増幅される。また、図３の中側のトランスポゾンが挿入された遺伝子ｒｔでは、遺伝子に対応するＤＮＡ断片の全体のみが増幅され、トランスポゾンに対応する部分は増幅されない。そして、そのＤＮＡ断片の長さは正常の遺伝子Ｒｔに対応するＤＮＡ断片の長さよりも長いため、これらは電気泳動法によって長さを分析することにより容易に区別することができる。即ち、図３の右側に示すように、電気泳動法の結果として発現するバンドにより、正常の遺伝子Ｒｔでは、中くらいの長さのＤＮＡ断片が検出され、またトランスポゾンが挿入された遺伝子ｒｔでは長いＤＮＡ断片が検出される。
【００３３】
一方、図３の下側のトランスポゾンが一度挿入されたものの、それが抜けてしまった遺伝子ｒｔにおいては、対象とする遺伝子に対応するＤＮＡ断片の全体と共に、トランスポゾンのフットプリントに対応するＤＮＡ断片も増幅される。即ち、この状態においては、正常の遺伝子と同程度の長さのＤＮＡ断片と、それよりも短い、フットプリントに対応するＤＮＡ断片が増幅され、これら長さのＤＮＡ断片が電気泳動法の結果として現れる。即ち、図３の右側に示すように、電気泳動法の結果として発現するバンドにより、トランスポゾンが一度挿入されたものの、それが抜けてしまった遺伝子ｒｔにおいては、中くらいの長さのＤＮＡ断片と短いＤＮＡ断片が検出される。
【００３４】
こうして本発明では、遺伝子にトランスポゾンが挿入された状態の長いＤＮＡ断片、遺伝子にトランスポゾンが挿入されたものの抜けた状態又は正常な中くらいの長さのＤＮＡ断片及びトランスポゾンのフットプリントに対応する短いＤＮＡ断片の長さを電気泳動法によって分析することにより、これらを区別して、遺伝子型を判定することができるのである。
【００３５】
図４は上述した遺伝子Ｒｔと遺伝子ｒｔの組み合わせによるバンドの発現を示すものである。図中、符号Ｎは正常な遺伝子Ｒｔ、Ｔはトランスポゾンが挿入されている遺伝子ｒｔ、Ｆはトランスポゾンが抜けて遺伝子ｒｔを示すものである。また○は発現、×は非発現を示すものである。この図３は、例えばＮＮの組み合わせでは中くらいの長さのＤＮＡ断片を示す位置にのみバンドが発現し、ＴＦでは長、中、短の全ての長さのＤＮＡ断片を示す位置にバンドが発現するということを示すものである。その他の組み合わせにおけるバンドの発現のパターンは、○、×により表されるものである。
【００３６】
図４に示すように、上記全ての遺伝子の組み合わせ、即ち、ＮＮ，ＮＴ，ＮＦ，ＴＴ，ＴＦ，ＦＦに対してバンドの発現のパターンが異なるため、バンドの発現パターンにより、遺伝子の組み合わせ、従って遺伝子型が判定されることがわかる。
【００３７】
図５は、上述した第１、第２、第３のプライマーを用いて、本発明を実施した結果を電気泳動後のバンドのイメージにより表した説明図である。
図中、ＢＹ，ＢＬ，ＰＵ，ＰＫ，ＲＳ，ＲＤ，ＷＴは、判定対象のペチュニアの色を示すもので、右側にバンドの位置を示している。尚、各色は次の通りである。
ＢＹ：burgundy
ＢＬ：blue
ＰＵ：plum
ＰＫ：pink
ＲＳ：rose
ＲＤ：red
ＷＴ：white
【００３８】
図４を図３と照らし合わせて判断すると、ＢＬ、ＰＵ、ＷＴは正常の遺伝子Ｒｔのみのホモ個体、ＢＹ、ＰＫ、ＲＳは正常な遺伝子Ｒｔとトランスポゾンが挿入された遺伝子ｒｔのヘテロ個体、ＲＤはトランスポゾンが挿入された遺伝子ｒｔとトランスポゾンが抜けた遺伝子ｒｔのヘテロ個体であることが分かる。
【００３９】
即ち、上述したとおり、ＲＤの色素はcyanidinで構成されており、遺伝子ｒｔの劣性ホモで発現するものであり、機能的には遺伝子ｒｔの劣性ホモであるが、遺伝子型では、トランスポゾンが挿入された遺伝子ｒｔとトランスポゾンが抜けた遺伝子ｒｔのヘテロ個体であることが分かった。
【００４０】
このように本発明によれば、ペチュニアの個体の中に、正常な遺伝子Ｒｔとトランスポゾンが抜けた遺伝子ｒｔのヘテロ個体であったとしても、正常な遺伝子Ｒｔのホモ個体と明確に区別をつけることができる。
【００４１】
【発明の効果】
本発明は以上のとおり、遺伝子にトランスポゾンが挿入された状態の長いＤＮＡ断片、遺伝子にトランスポゾンが挿入されたものの抜けた状態又は正常な中くらいの長さのＤＮＡ断片及びトランスポゾンのフットプリントに対応する短いＤＮＡ断片の長さを電気泳動法によって分析し、その組み合わせにより、これらを区別して、遺伝子型を判定することができる。そのため対象とする遺伝子を直接に調べて、遺伝子型を判定することができ、品種改良に要する時間を短縮することができ、育種的に大いに意義がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】ペチュニアの主要花色素（アントシアニン）の合成系に存在する一つの酵素を作る遺伝子Ｒｔの状態を模式的に示す説明図である。
【図２】ペチュニアの主要花色素（アントシアニン）の合成系に存在する一つの酵素を作る遺伝子Ｒｔの状態を模式的に示す他の説明図である。
【図３】ペチュニアの主要花色素（アントシアニン）の合成系に存在する一つの酵素を作る遺伝子Ｒｔの状態を模式的に示す更に他の説明図である。
【図４】遺伝子Ｒｔと遺伝子ｒｔの組み合わせによるバンドの発現を示す説明図である。
【図５】本発明を実施した結果を電気泳動後のバンドのイメージにより表した説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2004201582.tif 000009
【図５】
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