(57)【要約】【課題】遺伝子を解析するために有用であるＤＮＡアレイを提供する。【解決手段】本発明は、ｃＤＮＡライブラリー中の発現遺伝子の頻度を平均化する方法、および、平均化されたｃＤＮＡライブラリーを用いて作製されたＤＮＡアレイで構成される。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビオチン化ＤＮＡを用いて、臓器別又は組織別のｃＤＮＡライブラリー中の発現遺伝子を平均化する方法。
【請求項２】
ビオチン化ＲＮＡを用いて、臓器別又は組織別のｃＤＮＡライブラリー中の発現遺伝子を平均化する方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の方法を用いて作製された臓器別又は組織別の平均化ｃＤＮＡライブラリー。
【請求項４】
臓器別又は組織別の平均化ｃＤＮＡライブラリーを用いて作製されたＤＮＡアレイ。
【請求項５】
請求項３記載の臓器別又は組織別の平均化ｃＤＮＡライブラリーを用いて作製されたＤＮＡアレイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クローンの出現頻度を平均化したｃＤＮＡライブラリーおよびその作製方法、この平均化ｃＤＮＡライブラリーを用いて作製されたＤＮＡアレイに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ｃＤＮＡライブラリーは、遺伝子のｃＤＮＡを分離するための材料として使われている。遺伝子の同定又は遺伝子の機能を知るためには、タンパク質コーディング領域を解読することが必要である。そのためには、もととなるＤＮＡ自身の配列ではなく、余分な配列であるイントロンを除いたｍＲＮＡ配列の情報が必要となる。そのために、ｍＲＮＡの配列を反映しているｃＤＮＡをコードするクローンを単離し、その塩基配列を解読する必要がある。
【０００３】
一般的なｃＤＮＡライブラリーの作製は以下の通りである。組織等より抽出した全ＲＮＡより精製したｍＲＮＡを鋳型としてオリゴｄＴ（オリゴデオキシチミジン）あるいはランダムヘキサマーをプライマーとした逆転写酵素反応によりｃＤＮＡを合成する。これをさらに酵素的に二本鎖ＤＮＡとし、クローニングベクターに結合してライブラリーとして使用する（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ‐Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ−Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）。
【０００４】
こうして、作製されたｃＤＮＡライブラリーに含まれる各遺伝子の数は、基になるｍＲＮＡ量に比例しており、多量に発現している遺伝子は、ライブラリーに含まれているｃＤＮＡの数も多く、逆に、発現量の少ない遺伝子は、ライブラリー中にも少ししか含まれていない。
【０００５】
また、ＤＮＡアレイの作製においてプローブとなる遺伝子群は、種ごとに集められたイクスプレッション  シークエンス  タグ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇ、以下ＥＳＴと称する。）のクローンから調製したＤＮＡであることが多い。このＤＮＡアレイを用いて、遺伝子発現解析を行うことによって、病態に特徴的な遺伝子の発現（Ｎａｔｕｒｅ，４０３，５０３−５１１，２０００）あるいは薬剤投与等によって変化する遺伝子の挙動等を調べることが可能である（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８，６８０‐６８６，１９９７）。この技術は、種々の病態の解析に有用であり、薬剤の効果あるいは副作用を効果的に知ることができることが示されている（Ｎａｔｕｒｅ，４０３，５０３−５１１，２０００）。
【０００６】
ＤＮＡアレイの作製方法には、Ｓｔａｎｆｏｒｄ大学タイプとフォトリソグラフィーを用いた方法があり、前者のＳｔａｎｆｏｒｄ大タイプは、あらかじめ調製されたｃＤＮＡあるいはオリゴヌクレオチドをスライドガラス等の支持体に直接高密度に貼り付けていくものである（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０，４６７−４７０，１９９５）。後者は、塩基配列が明らかな遺伝子をプローブとすることができ、ＤＮＡを１８〜２５ｍｅｒの断片として、光化学反応を利用して、半導体製造技術に類似した行程で順次ヌクレオチド合成したものである（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４，１６７５−１６８０，１９９６）。
【０００７】
ＤＮＡアレイによる遺伝子発現の解析を行う場合は、病態を示す臓器あるいは組織に着目して解析を行う場合がほとんどである。培養細胞を用いた解析においても、培養細胞が由来する基の臓器あるいは組織の性質がどの程度保存されているかに着目して培養細胞を選択することが多い。ＤＮＡはどの臓器あるいは組織由来のものでも共通であるが、臓器によって発現している遺伝子の集合は異なっていることが知られている（Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，  ２０００）。
【０００８】
そこで、種々の臓器で遺伝子発現の解析を行うためには、全部の臓器で発現している遺伝子全体を網羅するようなアレイを用いる必要がある。また、当該解析において有効な信号が得られるのは、臓器に対応したアレイのごく一部である。特に、フォトリソグラフィーを用いたタイプのＤＮＡアレイでは、配列未知である遺伝子をプローブとすることはできないため、配列が未知である遺伝子の解析を行うことはできない。また、アレイの作製に大規模な装置が必要であるために、実験結果をフィードバックして迅速に目的にあったアレイを作製して再解析することができない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、上記の欠点を克服するために鋭意、検討した結果、臓器別又は組織別の平均化ｃＤＮＡライブラリーを用いたＤＮＡアレイを創製し、本発明を完成させた。
【００１０】
本発明は、臓器別又は組織別に発現している遺伝子を用いて遺伝子の出現頻度を平均化したｃＤＮＡライブラリーおよびその作製方法、当該ｃＤＮＡライブラリーを用いて作製されたＤＮＡアレイ、前記ＤＮＡアレイを利用した遺伝子発現の解析方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、臓器又は組織別に作製したｃＤＮＡライブラリーの各クローンの出現頻度を平均化した臓器別又は組織別の平均化ｃＤＮＡライブラリー及びその作製方法、当該臓器別又は組織別の平均化ｃＤＮＡライブラリーを用いて作製されたＤＮＡアレイに関する。
【００１２】
本発明の平均化ｃＤＮＡライブラリーの特徴は、臓器あるいは組織別に調製したｃＤＮＡライブラリーを後述する実施例１あるいは実施例２によって遺伝子の発現頻度をそろえていることにある。
【００１３】
さらに詳しくは、
（１）ビオチン化ＤＮＡを用いて、臓器別又は組織別のｃＤＮＡライブラリー中の発現遺伝子を平均化する方法、
（２）  ビオチン化ＲＮＡを用いて、臓器別又は組織別のｃＤＮＡライブラリー中の発現遺伝子を平均化する方法、
（３）  前記（１）又は（２）記載の方法を用いて作製された臓器別又は組織別の平均化ｃＤＮＡライブラリー、
（４）  臓器別又は組織別の平均化ｃＤＮＡライブラリーを用いて作製されたＤＮＡアレイ、
（５）  前記（３）記載の臓器別又は組織別の平均化ｃＤＮＡライブラリーを用いて作製されたＤＮＡアレイ、
に関する。
【００１４】
ここで、臓器とは、ヒト又は動物の内臓を構成する器官のことであり、脳、腎臓、肝臓等がこれにあたる。組織とは、臓器をより細分化したものであり、同一の機能、形態を持つ細胞の集団である。平均化とは、集団を構成する個々の要素の出現頻度が同等となるように操作を加えることである。臓器別又は組織別の平均化ｃＤＮＡライブラリーとは、臓器別あるいは組織別に調製したｃＤＮＡライブラリーに平均化の操作を加え、ｃＤＮＡライブラリーを構成する各遺伝子の出現頻度が同等となるように操作したｃＤＮＡライブラリーである。ＤＮＡアレイとは、ｃＤＮＡライブラリーを保持する大腸菌からクローンごとにプラスミドＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてｃＤＮＡ部分をポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下ＰＣＲ法と称する。）で増幅して得られたＤＮＡ溶液をスライドガラス等の上に貼り付けたものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明は、臓器あるいは組織別にｍＲＮＡを調製し、常法に従って（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ‐Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ‐Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、ｃＤＮＡライブラリーを作製したのち、例えば以下の方法に従って、遺伝子の発現頻度を平均化する操作することにより実施することができる。
【００１６】
一つめの方法は、ｃＤＮＡライブラリーより調製したＤＮＡ溶液を酵素処理により環状一本鎖ＤＮＡ化し、別にライブラリーよりＰＣＲ法で調製したビオチン化ＤＮＡとハイブリダイズし、ビオチン化ＤＮＡとハイブリダイズしたものを除き、残った環状一本鎖ＤＮＡライブラリーを二本鎖化し、大腸菌を形質転換する方法である。
【００１７】
二つめの方法は、ライブラリーより調製したＤＮＡ溶液を酵素処理により環状一本鎖ＤＮＡ化し、別にライブラリーより調製した相補的なビオチン化ＲＮＡとハイブリダイズし、ビオチン化ＲＮＡとハイブリダイズしたものを除き、残った環状一本鎖ＤＮＡライブラリーを二本鎖化し、大腸菌を形質転換する方法である。
【００１８】
このようにして臓器別又は組織別の平均化ｃＤＮＡライブラリーを用いて作製されたＤＮＡアレイを用いて解析を行うことにより、病態を示す臓器あるいは組織よりＲＮＡサンプルを抽出し、正常な臓器あるいは組織より抽出したＲＮＡサンプルを同時に用いて遺伝子発現解析を行うことによって、その病態に特異的な遺伝子発現の特徴をとらえることができる。さらにこれを糸口として病態の原因となる現象あるいは遺伝子を既知遺伝子あるいは未知の遺伝子の中から特定することができる。
【００１９】
上記の解析で病態の治療に有効な薬剤が存在する場合、上記の２つのサンプルに加えて、薬剤を投与した場合の臓器あるいは組織より抽出したＲＮＡサンプルも同様に、当該ＤＮＡアレイで遺伝子発現解析を行うことによって薬剤の効果を遺伝子レベルで確認することができる。表現型としては同様に治療効果を示す薬剤でも遺伝子レベルで薬効を分類することが可能となり、薬剤の効果あるいは、副作用を区別して解明することが容易となる。さらに、薬剤投与に特異的な遺伝子発現の特徴から、薬剤が直接作用する分子を既知遺伝子あるいは未知の遺伝子の中から特定することができれば、より効果の高い薬剤あるいはより副作用の少ない薬剤を開発するターゲットとして遺伝子の機能の一面を明らかにすることができる。
【００２０】
本発明は、ヒト、哺乳動物（マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、フェレット、イヌ、ネコ、サル、ヤギ、ウシ、等）のみならず、幅広く家禽を含む家畜等他の動物あるいはそれらに由来する培養細胞を用いた検討においても応用することができる。
【００２１】
【実施例】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００２２】
参考例１
ｃＤＮＡライブラリーの作製
ラット腎臓より常法に従って（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ−Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、ｍＲＮＡを調製し、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社）を用いてＺＡＰ  ＥｘｐｒｅｓｓラムダファージをベクターとしてｃＤＮＡライブラリーを作製した。つぎに、ストラタジーン社のマニュアル（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１６，７５８３−７６００，１９８８  ：  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８−６１，１９９２）に従ってヘルパーファージを感染させｉｎ  ｖｉｔｒｏでクローン化したＤＮＡ断片をｐＢＫ−ＣＭＶにサブクローニングした形で二本鎖プラスミドライブラリーとして切り出して作製した。
【００２３】
実施例１
遺伝子の発現頻度の均一化（方法１）
（ｉ）環状一本鎖ライブラリーＤＮＡの作成
雄８週齢  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット腎から抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡとＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（スタラタジーン社）を用いて、二本鎖ｃＤＮＡプラスミドライブラリー（１．６×１０．６独立クローンを含む）を作製した。このラット腎臓ｃＤＮＡライブラリーを内包する大腸菌より調製したプラスミドＤＮＡ  ４μｇをＧｅｎｅ  ＩＩ酵素（ライフテック社）で３０℃、１時間保温した後、Ｇｅｎｅ  ＩＩ酵素を熱失活（６５℃、５分間）させた。そのあと、氷中で冷却し、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩ（ライフテック社）２μｌ（６５ｕｎｉｔｓ／μｌ）を加え３７℃で３０分保温した。さらに、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．８、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＳＤＳ、１３６μｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋとなるように緩衝液およびＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ  （ロッシェ・ダイアグノティクス社）を加え、５０℃で１５分間プロテアーゼ処理を行った。次に、フェノール・クロロロホルム（等量混合物）で除蛋白処理を行い、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収した。
【００２４】
次に、制限酵素Ｐｖｕ  ＩＩで消化（３７℃、３０分）の後、２ｍｌのハイドロキシアパタイトローディング緩衝液（０．１２Ｍ    Ｎａ−Ｐｈｏａｐｈａｔｅ緩衝液  ｐＨ  ７．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）で希釈し、６０℃でハイドロキシアパタイトカラム（バイオラッド社）にかけ、カラムを通過した画分を６ｍｌ回収し凍結乾燥した。凍結乾燥後のサンプルを２ｍｌの水で溶解し、１ｍｌづつをゲル濾過カラムＮＡＰ−１０（アマシャム・ファルマシア社）各１本にかけて緩衝液を水に置換し、２−ブタノールで濃縮後、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収した。沈殿を水に溶かして２６０ｎＭの吸光度を測定し、一本鎖ＤＮＡ濃度を測定した。再度エタノール沈殿を行い、沈殿を５０ｎｇ／５μｌとなるように脱イオン化したホルムアミドに溶解し、−２０℃で凍結保存した。
【００２５】
（ｉｉ）ビオチン化二本鎖ＤＮＡの作製
５ｎｇの二本鎖ｃＤＮＡライブラリーＤＮＡを鋳型として用いて、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰを２００μＭ、ｄＴＴＰを１４０μＭとなるように加えた。ビオチン化基質としてＢＩＯＴＩＮ−１１−ｄＵＴＰ（Ｅｎｚｏ社）を６０μＭとなるように加えた。２０μＭとなるようにＴ３プライマー（配列番号：１）あるいはＴ７プライマー（配列番号：２）を加え、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ロッシェ・ダイアグノティクス社）を用いて、所定の条件下、２．６ｕｎｉｔｓの酵素を加えて、以下の反応条件でＰＣＲ反応を行った。反応槽は、Ｔａｋａｒａ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０（宝酒造）を用い、反応条件は、９４℃で４分の後、９４℃で１分、５５℃で２分、７２℃で３分を１サイクルとして、これを２０サイクル行った後、７２℃で７分伸長反応を行った。
【００２６】
次に、未反応のプライマーおよび基質を除くためにマイクロスピンカラムＨＲ−３００（アマシャム・ファルマシア社）でゲル濾過を行い、ビオチン化二本鎖ＤＮＡをエタノール沈殿で回収を行った。沈殿をＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解して２６０ｎｍの吸光度を測定した。同時に、ビオチン化基質を含まないような反応系でｄＮＴＰを各２００μＭとしてＰＣＲ反応を行い、ビオチン化基質を含む場合と同様にゲル濾過の後、エタノール沈殿を行い、ＴＥ緩衝液に溶かし、２６０ｎｍの吸光度を測定した。これを基にしてビオチン化二本鎖ＤＮＡの濃度を推定し、エタノール沈殿を行い、沈殿を０．５μｇ／１．５μｌとなるようにＴＥ緩衝液に溶解した。
【００２７】
（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション
５０ｎｇ／５μｌとなるように脱イオン化したホルムアミドに溶解した環状一本鎖ライブラリーＤＮＡと０．５μｇ／１．５μｌとなるようにＴＥ緩衝液に溶解したビオチン化二本鎖ＤＮＡに５’  ブロッキングオリゴ（配列番号：３）および３’  ブロッキングオリゴ（配列番号：４）を各１０μｇ加えて全体を７．５μｌ  とした。８０℃で３分間保温した後、緩衝液Ｂ（１．２Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％  ＳＤＳ）を１μｌ、水を１．５μｌ加え、３０℃で２４時間保温した。
【００２８】
（ｉｖ）ビオチン化ＤＮＡおよびこれとハイブリダイズしたＤＮＡの除去
ハイブリダイゼーションを終了した溶液１０μｌにＴＥ１００（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）を１０μｌ、０．１％ストレプトアビジン溶液を１０μｌ加え、１０分間室温で攪拌した。３０μｌのフェノール・クロロホルムを加えて除蛋白を行い、上清に０．１％ストレプトアビジン溶液を１０μｌ加えてさらに５分間室温で攪拌を行った。次に４０μｌのフェノール・クロロロホルム（等量混合物）で除蛋白処理を行い、上清をエタノール沈殿して、ハイブリダイズしなかった一本鎖環状ＤＮＡを回収した。
【００２９】
（ｖ）二本鎖化と大腸菌の形質転換
一本鎖環状ＤＮＡをＳｅｑｕｅｎａｓｅ  ｖｅｒ．２（アマシャム・ファルマシア社）のシステムで二本鎖化した。一本鎖環状ＤＮＡを所定の緩衝液に溶かし、Ｆ２３プライマー（配列番号：５）１μｇ存在下で、６５℃で５分間熱変性させ、３７℃で３分以上放置してから、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｖｅｒ．２を１μｌ、０．１Ｍ  ＤＴＴを１μｌ、ｄＮＴＰ混合物を最終濃度１０ｍＭになるように加えて、３７℃で、３０分間保温した。ＴＥ緩衝液で１００μｌに容量を調節した後、フェノール・クロロホルムで除蛋白を行い、エタノール沈殿でＤＮＡを回収して、水３μｌに溶かした。このＤＮＡ溶液を１．５μｌづつ用いて、エレクトロポレーション法で大腸菌ＤＨ１０Ｂ（エレクトロマックス・ライフテック社）を形質転換した。形質転換した菌の一部を希釈してプレートに撒いて、コロニーの数を計数した。この結果から、全体の形質転換体の数を計算し、その値を臓器別平均化ライブラリーの独立クローン数とした。
【００３０】
実施例２
遺伝子の発現頻度の均一化（方法２）
（ｉ）環状一本鎖ライブラリーＤＮＡの作成
ラット肝臓よりｍＲＮＡを調製し、参考例１と同様の方法で作製したｃＤＮＡライブラリーを用いて作製し、実施例１と全く同様の方法で一本鎖化を行った。
【００３１】
（ｉｉ）相補的なビオチン化ＲＮＡの調製
１μｇのｃＤＮＡライブラリーを制限酵素ＥｃｏＲＩで３７℃  １時間消化し、直鎖状とした。フェノール・クロロホルムで除蛋白を行い、エタノール沈殿でＤＮＡを回収した。このＤＮＡをＤＩＧ  ＲＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ロッシェ・ダイアグノティクス社）を用いて相補的なビオチン化ＲＮＡの調製を行った。ＤＮＡを１３μｌの水に溶かし、ビオチン化−１６−ＵＴＰを含むｂｉｏｔｉｎ  ＲＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  混合物（ロッシェ・ダイアグノティクス社）２μｌ、１０×Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ緩衝液を２μｌ、ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを１μｌ、Ｔ７  ＲＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを２μｌ加え、３７℃で２時間反応させた。このあとＤＮａｓｅ  Ｉを２μｌ加えて３７℃、１５分間  ＤＮａｓｅ処理を行い、０．２Ｍ  ＥＤＴＡを２μｌ加えて反応を停止させた。産物の一部を変性ゲル電気泳動にかけて一つの反応系で約１０μｇ相補的ＲＮＡが合成できていることを確認した。濃度を推定した後、エタノール沈殿を行い、沈殿を０．５μｇ  ／  １．５μｌとなるようにＴＥ緩衝液に溶解した。
このあとのハイブリダイゼーション、二本鎖化と大腸菌の形質転換は、実施例１と同様に行った。
【００３２】
試験例１
大量に発現している遺伝子の特定
平均化の効果を検定するために、高頻度に発現している遺伝子を特定しこの遺伝子の増減を指標として平均化の効果を確認することにした。まず、各臓器で高頻度に発現している遺伝子を調べた。
【００３３】
平均化処理をする前のｃＤＮＡライブラリーＤＮＡよりｃＤＮＡ部分を制限酵素ＥｃｏＲＩ、Ｘｈｏ  Ｉで切り出し、ゲル電気泳動で分離し、ジーンクリーン法（ＢＩＯ１０１社）でＤＮＡを回収した。これをランダムプライマーＤＮＡラベリングキットｖｅｒ２（宝酒造）および［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ  １１１    Ｔｂｑ／ｍｍｏｌ（アマシャム・ファルマシア社）を用いてラジオアイソトープ標識した。
【００３４】
アトラス  ＲＡＴ    ｃＤＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｒｒａｙ（クローンテック社）のフィルターおよびハイブリダイゼーションのシステムを用いて、ラジオアイソトープ標識したｃＤＮＡをプローブとしてＳｏｕｔｈｅｒｎハイブリダイゼーションを行った。フィルターを洗浄し、残った放射活性をＢＡＳシステム（富士写真フィルム）で測定し、強いシグナルを示すクローンを数種類ピックアップしてＰＣＲプライマーを合成した。
【００３５】
平均化処理前のｃＤＮＡライブラリー  １ｎｇを鋳型としてプラチナＰＣＲミックス（ライフテック社）を用いて以下の条件でアトラスによるＳｏｕｔｈｅｒｎ解析の結果からピックアップした数種類のプライマーセットを用いて反応槽は、Ｔａｋａｒａ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０（宝酒造）を用い、反応条件は、９４℃で２分の後、９４℃  １分、５５℃  １分、          ７２℃            ２分を１サイクルとしてこれを２０サイクルあるいは、２５サイクルＰＣＲ反応を行い、０．６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画し、ＤＮＡバンドの濃さを比較し、本当に大量に発現している遺伝子を臓器ごとに２種類選んだ。
【００３６】
ラット腎臓では、サイクロフィリン遺伝子Ｐ１、Ｐ２（配列番号：６、７）およびフェリチンＨ遺伝子Ｐ１、Ｐ２（配列番号：８、９）を指標とし、ラット肝臓では、血清アルブミン遺伝子Ｐ１、Ｐ２（配列番号：１０、１１）およびα１プロテアーゼインヒビター遺伝子Ｐ１、Ｐ２（配列番号：１２、１３）を指標として検定を行うことにした。
【００３７】
試験例２
平均化効果の確認
実施例１および２の方法でｃＤＮＡライブラリーに含まれる遺伝子の出現頻度が平均化されているかどうかＰＣＲ法を応用して検定した。
【００３８】
平均化処理前のｃＤＮＡライブラリーと平均化処理後のｃＤＮＡライブラリー各１ｎｇを鋳型としてプラチナＰＣＲミックス（ライフテック社）を用いてラジオアイソトープ標識のｄＣＴＰを系あたり０．２μｌ加えて以下の条件で１２サイクルから２７サイクルまで３サイクルごとにサンプリングしながらＰＣＲ反応を行った。各サンプルを６％ポリアクリルアミド電気泳動により分画し、酸アルコール固定の後ゲル乾燥し、ＢＡＳシステム（富士写真フィルム）でＰＣＲ産物由来のバンドの放射活性測定し、平均化の効果を定量化した。その結果、腎臓のライブラリーでは、サイクロフィリンの遺伝子は平均化によって２分の１、フェリチンの遺伝子は５分の１に減少していた。また、肝臓のライブラリーでは、血清アルブミン遺伝子は平均化によって５分の１、α１プロテアーゼインヒビター遺伝子は２０〜３０分の１に減少していた。どちらのライブラリーでも平均化の効果が確認することができた。
【００３９】
肝臓のライブラリーでは、平均化処理前のｃＤＮＡライブラリーと平均化処理後のｃＤＮＡライブラリーで、各２００クローンづつランダムにピックアップし、ＤＮＡ配列を決定することによって平均化の効果を確認した。この結果、平均化前では、血清アルブミン遺伝子が３８個も含まれていたのに対して平均化後では、１個しか含まれておらず、しかも平均化後では、２００個全部のクローンがそれぞれただ一個のみ含まれていた。この結果からも平均化の効果が得られていることを確認した。
【００４０】
実施例３
ＤＮＡチップの作製および解析
（ｉ）プラスミドＤＮＡ溶液の調製
ラット腎臓の標準ｃＤＮＡライブラリーより４２２４クローンをピックアップし、２×ＬＢ（ＢａｃｔｏＴｒｙｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ社）    ２０ｇ／ｌ、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社）１０ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／ｌを含む）各１ｍｌ入ったディープウェルプレート（コーニングコースター社）で３７℃、２０時間振とう培養を行った。遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分）により菌体を回収する。上清を除き、バイオメック２０００（ベックマンコールター社）のシステムを用いて以下の操作を行った。各ウェルに８０μｌの溶液１（３０ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、１．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０、３０ｍＭ  ＥＤＴＡ、６０μｇ／ｍｌ  ＲｎａｓｅＡ（ロッシェ・ダイアグノティクス社））を加えよく混ぜ、各ウェルに８０μｌの溶液２（１％  ＳＤＳ  ０．２Ｎ  ＮａＯＨ）を加えよく混ぜた。さらに、各ウェルに８０μｌの溶液３（３．６Ｍ  Ｐｏｔａｓｉｕｍ、６．０Ｍ  Ａｃｅｔａｔｅ）を加えよく混ぜ、懸濁液をＭＡＦＣマルチスクリーンプレート（ミリポアジャパン）に移した。ＭＡＦＢマルチスクリーンプレート（ミリポアジャパン）に１００μｌ／ウェルのＢｉｎｄｉｎｇ  緩衝液（８Ｍ  Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ）を加え、ＭＡＦＣマルチスクリーンプレートを上、ＭＡＦＢマルチスクリーンプレートを下にして、マルチスクリーンマニホールド（ミリポアジャパン）を用いて吸引し、ＭＡＦＢマルチスクリーンプレートに回収した。さらに、ＭＡＦＢマルチスクリーンプレート上で、溶菌液とＢｉｎｄｉｎｇ緩衝液を十分混ぜた。次に、ＭＡＦＢマルチスクリーンプレートをマルチスクリーンマニホールドにて吸引し、混合液を濾過する。２５０μｌの８０％エタノールをＭＡＦＢマルチスクリーンプレートに加え、マルチスクリーンマニホールドにて吸引した。８０％エタノールを加えてマルチスクリーンマニホールドにて吸引する操作を計３回繰り返した。プレートの底について液を拭き取り、廃液用のプレートの上に、遠心フレーム、ＭＡＦＢマルチスクリーンプレートを順に重ね、遠心（２０００ｒｐｍ、５分）し、余分の水分を除く。７０μｌのＴＥ緩衝液を加え、室温で１０分間放置した後、遠心（２０００ｒｐｍ、５分）にて溶出液を回収した。
【００４１】
（ｉｉ）ＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅
（ｉ）で調製したプラスミドＤＮＡの一部を鋳型として用いて、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを２００μＭとなるように加えた。次に、２０μＭとなるように５‘端にアミノリンクをほどこした４−ＡＭプライマー（配列番号：１４）あるいはＲＶ−ＡＭプライマー（配列番号：１５）を加え、ＥｘＴａｑシステム（宝酒造）を用いて、所定の緩衝液条件下、５ｕｎｉｔｓの酵素を加えて、以下の反応条件でＰＣＲ反応を行った。反応槽は、Ｔａｋａｒａ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰ（宝酒造）を用いた。反応条件は、９４℃で１分１０秒の後、９４℃  ４０秒、５８℃  ４０秒、７２℃  １分３０秒を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った後、７２℃で７分伸長反応を行った。
【００４２】
未反応のプライマーおよび基質を除くためにＭＡＮＵマルチスクリーンＰＣＲ（ミリポアジャパン）で精製を行った。ＰＣＲ反応液を、ＭＡＮＵマルチスクリーンＰＣＲに移し、マルチスクリーンマニホールドにて吸引した。１００μｌの水を加えたのち、マルチスクリーンマニホールドにて吸引し、再度１００μｌの水を加えたのち、マルチスクリーンマニホールドにて吸引した。さらに１１０μｌの水を加え激しくピペティングして８０μｌを回収した。さらに、５０μｌの水を加え激しくピペティングしてさらに、８０μｌを回収した。
【００４３】
（ｉｉｉ）ＤＮＡのスポッティング
回収したＤＮＡ溶液を３８４ウェルのプレートに分注し、乾固させた。次に、１．５μｌの３×ＳＳＣを加え、ＤＮＡを溶解させた。ＧＭＳ４１７アレイヤー（宝酒造）を用いて、機械のプロトコールに従い、ＤＮＡをＭＡＳコートのスライドガラスにスポットした。スポット終了後はデシケーターで７２時間以上乾燥させ、８０℃で１時間ベーキングを行い、ＵＶクロスリンカー（ストラタジーン社）で６０ｍＪの紫外線を照射した。
【００４４】
（ｉｖ）ブロッキング
固定化を終了したスライドガラスを染色バスケットに入れ、０．２％ＳＤＳ中に２分間浸し、洗浄した。さらに、水中で２分２回洗浄した。次に、ブロッキング溶液（無水コハク酸２．７ｇに、１−ｍｅｔｈｙｌ−２−Ｐｙｒｏｌｉｄｉｎｏｎｅを１６４．７ｍｌ加えて溶解し、さらに１Ｍホウ酸溶液（ｐＨ  ８．０）を１５．３ｍｌ加えよく混合した。）を染色壺に移して、その中にスライドガラスを２０分間浸した。水中で１分の洗浄を３回繰り返し、次に、沸騰水中で２分間スライドグラスを浸した。このあと、９５％エタノールに１分間浸した後、スライドグラスをスライドケースに移し、遠心にて乾燥させた。
【００４５】
（ｖ）ターゲットＤＮＡの調製
ｍＲＮＡを２μｇ用意し、Ｒａｎｄｏｍｅ    Ｐｒｉｍｅｒ  （９ｍｅｒ：宝酒造）を０．６μｌ、５×Ｆｉｒｓｔ    Ｓｔｒａｎｄ緩衝液（ライフテック社ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩに添付されていたもの）を６μｌ、０．１Ｍ  ジチオスレイトール（ライフテック社ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩに添付されていたもの）  を３μｌ、ｄＮＴＰ混合物を０．６μｌ、Ｃｙ３  あるいは  Ｃｙ５−ｄＵＴＰ  （アマシャム・ファルマシア社）を３μｌ加えＤＥＰＣ処理水で３０μｌに容量をあわせたところに、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（ライフテック社）を２μｌ加えた。４２℃で２時間反応させた後、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１０Ｎ    ＮａＯＨ  １００μｌ、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ４０μｌを加え、ＤＥＰＣ処理水で１０００μｌに容量をあわせた。）を１．５μｌ加え、混合した後、６５℃で１０分反応させた。次に１Ｎ  ＨＣｌを１．５μｌ加えて中和した後、Ｃｙ３およびＣｙ５で標識した反応液を１つにまとめて、ＴＥ緩衝液を２７０μｌ加えた。混合した液をＭｉｃｒｏｃｏｎ−ＹＭ３０（ミリポアジャパン）の上のカップに移し、室温で１２０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。遠心の結果、カップを通り抜けた溶液を新しい、エッペンドルフチューブに移し、上のカップに、ＴＥ緩衝液５００μｌ、サケ精子ＤＮＡを２０μｇ加え、室温で１２０００ｒｐｍ、１３分間遠心した。この後で、カップを取り出し新しいエッペンドルフチューブに逆さまにセットした。  室温で３０００ｒｐｍ、５分間遠心し、溶液を回収した。回収した溶液に、次の試薬を加えた。Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ    ａｃｉｄ    ｔｒａｎｓｆｅｒ（シグマ社）を１μｌ、Ｐｏｌｙ（Ａ）（ロッシェ・ダイアグノティクス社）１μｌ、２０×ＳＳＣを１．７μｌ、１０％  ＳＤＳを０．３μｌ、各々加えた後、ＴＥ緩衝液にて１０μｌに容量をあわせた。
【００４６】
（ｖｉ）ハイブリダイゼーションおよび洗浄
蛍光標識したターゲットを１００℃で２分間変性させた後、室温で３０分放置した。ターゲット溶液をスライドガラスに滴下し、泡が入らないようにカバーガラスをかけた。次に、カバーガラスの周囲にペーパーボンドをつけ乾燥を防いだ。スライドグラスをタッパーウエアに入れ、ふたをして、６５℃のインキュベーターにいれた。１分間に３、４回振とうしながら１２時間から１６時間ハイブリダイゼーションを行った。反応終了後ペーパーボンドを除き、２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ溶液中で振とうしながら５分間２回洗浄した。次に、４０℃の０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ溶液中で振とうしながら５分間２回洗浄した。さらに、０．２×ＳＳＣ溶液中で３分間リンスした。最後に、スライド保存ケースにペーパータオルをしき、スライドを移し、遠心にて乾燥させたあと（１０００ｒｐｍ、５分）直ちにスキャナーでスキャンした。
【００４７】
実施例４
ＤＮＡマクロアレイの作製および解析
（ｉ）プラスミドＤＮＡ溶液の調製はＤＮＡチップの作製および解析に述べたのと同様の方法で行った。
ＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅はＤＮＡチップの作製および解析に述べたのと同様の方法で行った。
【００４８】
（ｉｉ）マクロアレイのスポット
回収したＤＮＡを乾固させ、３×ＳＳＣに再溶解させた。バイオメック２０００（ベックマンコールター社）のシステムを用いて、メンブランフィルター（ミリポアジャパン）にスポットした。スポットを終了したフィルターは、紫外線クロスリンカー（ストラタジーン社）で６０ｍＪの紫外線を照射した。
【００４９】
（ｉｉｉ）ターゲットＤＮＡの調製はＤＮＡチップの作製および解析に述べたのと同じである。ただし、ターゲットＤＮＡはＣｙ３あるいはＣｙ５のかわりに３２Ｐで標識を行った。常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  −  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）にしたがってハイブリダイゼーションおよびフィルター洗浄を行い、残った放射活性をＢＡＳシステム（富士写真フィルム）で測定した。
【００５０】
試験例３
平均化されたｃＤＮＡライブラリーを用いて作製したＤＮＡアレイと、平均化されていないｃＤＮＡライブラリーを用いて作製したＤＮＡアレイとの比較
比較のために、ラットＥＳＴライブラリーより１７２８クローンをピックアップし同様の方法で、ＤＮＡアレイを作製した。ラット腎臓よりｍＲＮＡを調製し、スーパースクリプト（ライフテック社）を用いた逆転写（Ｒｅｖｅｒｓｅ    Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）の反応中にＣｙ５化した基質を取り込ませてプローブを作製し、上記の２つのアレイでハイブリダイズを行い、洗浄後、スキャンアレイ３０００（ビーエム機器）で蛍光強度を測定した。その結果、かなり強いシグナルが得られたスポットは、臓器別平均化ＤＮＡアレイでは、１２．８％であったが、ＥＳＴのアレイでは、１．７％であった。解析に適する強いシグナルが得られたスポットは、臓器別平均化ＤＮＡアレイでは、３４．７％であったが、ＥＳＴのアレイでは、７．８％であった。
【００５１】
【発明の効果】
本発明の臓器別平均化ｃＤＮＡライブラリーおよびＤＮＡアレイは、臓器あるいは組織とそれに由来する培養細胞での遺伝子発現解析を行う上で有効である。
【００５２】
ヒト由来のサンプルあるいは実験動物、家畜由来のサンプルを用いて薬剤の投与前後で遺伝子発現解析を行えば、薬剤の効果を遺伝子のレベルで確認し、表現型としては、同様の治療効果を示す薬剤でも、薬効を分類しさらに有効な治療法の開発を可能とする。また、薬剤投与に特異的な遺伝子を特定につながれば、より効果の高い薬剤、より副作用の少ない薬剤を開発するターゲットとなりうる。
【００５３】
また、病態を示すヒトあるいは実験動物、家畜由来のサンプルと正常なものの間で遺伝子発現解析を行うことにより、その病態に深く関わる遺伝子を明らかにすることにつながれば、新しい治療指標をもたらすことになり産業上非常に有用である。
【００５４】
また、本発明により、実験の目的に合致したＤＮＡアレイを迅速に用意することが可能となる。さらに、実験の結果をフィードバックしてより適したＤＮＡアレイを用意することもできるようになり、検出の感度、信頼性がより高まると考えられる。
【００５５】
【配列表】
2004229501.tif 000002
【００５６】
2004229501.tif 000003
【００５７】
2004229501.tif 000004
【００５８】
2004229501.tif 000005
【００５９】
2004229501.tif 000006
【００６０】
2004229501.tif 000007
【００６１】
2004229501.tif 000008
【００６２】
2004229501.tif 000009
【００６３】
2004229501.tif 000010
【００６４】
2004229501.tif 000011
【００６５】
2004229501.tif 000012
【００６６】
2004229501.tif 000013
【００６７】
2004229501.tif 000014
【００６８】
2004229501.tif 000015
【００６９】
2004229501.tif 000016
【００７０】
2004229501.tif 000017