(57)【要約】      （修正有）【課題】褐藻類に含まれる硫酸化多糖フコイダンの構造解析及び生物活性の検索に有用なフコイダンを酵素分解したオリゴ糖の提供。【解決手段】下記式（１）：2004339228.tif 000033[式中、ＸはＨ又は下記式（２）：2004339228.tif 000034で表される基を示し、Ｙはアルコール性水酸基または硫酸エステル化されたアルコール性水酸基を示す]で表される糖化合物又はその塩。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）：
2004339228.tif 000029
〔式中、ＸはＨ又は下記式（２）：
2004339228.tif 000030
で表される基を示し、Ｙはアルコール性水酸基または硫酸エステル化されたアルコール性水酸基を示す〕で表される糖化合物又はその塩。
【請求項２】
下記式（１３）で表される糖化合物又はその塩。
2004339228.tif 000031
【請求項３】
下記式（１４）で表される糖化合物又はその塩。
2004339228.tif 000032
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は糖質研究の分野において有用な糖化合物、該糖化合物の生産に有用な糖分解酵素、及び該糖化合物の製造に有用なフコイダノバクター（Ｆｕｃｏｉｄａｎｏｂａｃｔｅｒ）属細菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
フコイダンは褐藻類に含まれる硫酸化多糖であり抗血液凝固作用、脂血清澄作用、抗腫瘍作用、癌転移抑制作用、抗エイズウィルス感染作用等様々な生物活性が報告されており、医薬品として極めて有用な物質である。
【０００３】
しかしながら、フコイダンは極めて分子量が大きな硫酸化多糖であり、そのまま医薬品として用いるには抗原性、均一性、抗凝血活性等の問題があるので、フコイダンをある程度分解することを必要とされることが多い。
【０００４】
そのため、フコイダンの構造を解明し、生物活性との関係を解明することが望まれていたが、フコイダンは分岐が多い高分子であり、構成糖の種類も多く、硫酸基も様々な位置に結合しているため、構造解析は非常に困難であった。多糖の構造解析には、多糖を分解する酵素を作用させ、生成するオリゴ糖の構造を解析していく方法があるが、現在報告されているフコイダン分解酵素の中で分解生成物の糖鎖構造が判明しているものやフコイダンオリゴ糖の標準品となるものは市販品が無い。
【０００５】
上記のような理由で、構造が判明した糖化合物、該糖化合物の製造に有用な糖分解酵素、及び該糖化合物の製造に有用な微生物が求められていた。
【０００６】
本発明の目的は、フコイダンの構造解析、フコイダンの酵素分解物の同定、及び生物活性の検索に用いることができる糖化合物、フコイダンの部分分解、フコイダンオリゴ糖の生産などフコイダンに関する研究に有用な新規なエンド（ｅｎｄｏ）型のフコイダン分解酵素、及び糖化合物の製造に有用な新規微生物を提供することにある。
【０００７】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、下記一般式（１）又は（２）：
2004339228.tif 000002
2004339228.tif 000003
〔式中、ＸはＨ又は下記式（３）：
2004339228.tif 000004
で表される基を示し、ＹはＨ又は下記式（４）、若しくは（５）：
2004339228.tif 000005
2004339228.tif 000006
で表される基を示すが、ＸとＹが共にＨであることはない。また、ＺはＨ又は下記式（６）：
2004339228.tif 000007
で表される基を示す〕で表される化合物の少なくとも一つのアルコール性水酸基が硫酸エステル化している糖化合物又はその塩に関する。
前記一般式（１）又は（２）で表される化合物の例としては、下記の式（７）〜式（１５）で表される化合物が挙げられる。
2004339228.tif 000008
2004339228.tif 000009
2004339228.tif 000010
2004339228.tif 000011
2004339228.tif 000012
2004339228.tif 000013
2004339228.tif 000014
2004339228.tif 000015
2004339228.tif 000016
【０００８】
本発明の第２の発明は、下記の理化学的性質を有することを特徴とするエンド型フコイダン分解酵素に関する。
（Ｉ）作用：フコイダンに作用して、少なくとも前記式（７）及び式（８）で表される化合物を遊離させる。
（ＩＩ）至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは６から１０である。
（ＩＩＩ）至適温度：本酵素の至適温度は３０から４０℃である。
【０００９】
また本発明の第３の発明は、本発明の第１の発明である糖化合物の製造に有用な新規微生物である、電子伝達鎖にメナキノンを有し、ＧＣ含量が約６０％であるフコイダノバクター属に属する細菌に関する。
【００１０】
本明細書に記載の式（１）、（２）、（４）〜（１５）、及び（１７）〜（２５）中の「〜」は、マンノース、又はガラクトースにαアノマー、βアノマーの両アノマーが存在することを意味する。
【００１１】
本発明者らは、本発明の第２の発明である酵素又は本発明の第３の発明である細菌の菌体抽出物又は培養液上清をフコイダンに作用させると、本発明の糖化合物が得られることを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
図面の簡単な説明
図１は糖化合物（ａ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（ＰＡ−ａ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
図２は糖化合物（ｂ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（ＰＡ−ｂ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
図３は糖化合物（ｃ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（ＰＡ−ｃ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
図４は糖化合物（ｄ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（ＰＡ−ｄ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
図５は糖化合物（ｅ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（ＰＡ−ｅ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
図６は糖化合物（ｆ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（ＰＡ−ｆ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
図７は糖化合物（ｇ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（ＰＡ−ｇ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
図８は糖化合物（ｈ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（ＰＡ−ｈ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
図９は糖化合物（ｉ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（ＰＡ−ｉ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
図１０は糖化合物（ａ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図１１は糖化合物（ｂ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図１２は糖化合物（ｃ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図１３は糖化合物（ｄ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図１４は糖化合物（ｅ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図１５は糖化合物（ｆ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図１６は糖化合物（ｇ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図１７は糖化合物（ｈ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図１８は糖化合物（ｉ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図１９は糖化合物（ａ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図２０は糖化合物（ｂ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図２１は糖化合物（ｃ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図２２は糖化合物（ｄ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図２３は糖化合物（ｅ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図２４は糖化合物（ｆ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図２５は糖化合物（ｇ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図２６は糖化合物（ｈ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図２７は糖化合物（ｉ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図２８は糖化合物（ａ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す図である。
図２９は糖化合物（ｂ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す図である。
図３０は糖化合物（ｃ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す図である。
図３１は糖化合物（ｄ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す図である。
図３２は糖化合物（ｅ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す図である。
図３３は糖化合物（ｆ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す図である。  
図３４は糖化合物（ｇ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す図である。
図３５は糖化合物（ｈ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す図である。
図３６は糖化合物（ｉ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す図である。  
図３７は本発明の第２の発明である酵素のｐＨと相対活性（％）の関係を表す図である。
図３８は本発明の第２の発明である酵素の反応温度（℃）と相対活性（％）の関係を表す図である。
図３９は本発明の第２の発明である酵素を処理したｐＨと残存活性（％）の関係を表す図である。
図４０は本発明の第２の発明である酵素の処理温度（℃）と残存活性（％）の関係を表す図である。
図４１は糖化合物（ａ）〜（ｉ）をＤＥＡＥ−セファロースＦＦにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
図４２は糖化合物（ｈ）及び（ｉ）をＤＥＡＥ−セファロースＦＦにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
【００１３】
以下、本発明に関して詳細に説明する。
本発明の第２の発明に使用される菌株としてはフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属し、本発明のエンド型フコイダン分解酵素生産能を有する菌株であればいかなる菌株でも良い。また、該エンド型フコイダン分解酵素生産能を有する菌株の具体例としては、例えばフラボバクテリウム  ｓｐ．ＳＡ−００８２株が挙げられる。該菌株由来のエンド型フコイダン分解酵素をフコイダンに作用させれば、本発明の第１の発明である糖化合物を得ることができる。
【００１４】
本菌株は青森県の海水中より本発明者らが新たに検索して得た菌株で、その菌学的性質は次の通りである。
１．フラボバクテリウム  ｓｐ．ＳＡ−００８２株
ａ．形態的性質
（１）本菌は短かん菌である。
幅      ０．８〜１．０μｍ
長さ    １．０〜１．２μｍ
（２）胞子の有無      なし
（３）グラム染色性    陰性
ｂ．生理的性質
（１）生育の温度範囲
３７℃以下で生育できる。好適な生育温度は１５〜２８℃である。
（２）酸素に対する態度      好気性
（３）カタラーゼ        陽性
（４）オキシダーゼ      陽性
（５）ウレアーゼ        弱陽性
（６）酸の生成
Ｄ−グルコース      陽性
ラクトース          陽性
マルトース          陽性
Ｄ−マンニトール    陽性
スクロース          陰性
トレハロース        陰性
（７）加水分解
デンプン      陰性
ゼラチン      陽性
カゼイン      陰性
エスクリン    陽性
（８）硝酸塩の還元          陰性
（９）インドールの生成      陰性
（１０）硫化水素の生成      陰性
（１１）ミルクの凝固        陰性
（１２）ナトリウムの要求性        陽性
（１３）塩類要求性
０％食塩培地での生育        陰性
１％食塩培地での生育        陰性
海水培地での生育            陽性
（１４）キノン系      メナキノン６
（１５）菌体内ＤＮＡのＧＣ含量      ３２％
（１６）ＯＦ−テスト    Ｏ
（１７）集落の色調      黄色系
（１８）運動性      なし
（１９）滑走性      なし
【００１５】
本菌株は、バージーズ  マニュアル  オブ  システィマティック  バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）  、第１巻（１９８４）、及びバージーズ  マニュアル  オブ  ディターミネイティブ  バクテリオロジー  （Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第９巻（１９９４）に記載のフラボバクテリウム  アクアタイル（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｑｕａｔｉｌｅ）、及びフラボバクテリウム  メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）の類縁細菌と考えられるが、前者とはスクロースを資化して酸を形成しない点、カゼインを分解できない点、エスクリンを分解できる点、ゼラチンを液化できる点、ウレアーゼが陽性である点が異なり、後者とはカゼインが分解できない点、３７℃での生育が遅い点が異なる。そこで本菌株をフラボバクテリウムに属する細菌と同定し、フラボバクテリウム  ｓｐ．ＳＡ−００８２と命名した。
【００１６】
なお、上記菌株はＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．ＳＡ−００８２と表示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所〔あて名；日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）〕にＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２（原寄託日；平成７年３月２９日、国際寄託日への移管請求日；平成８年２月１５日）として寄託されている。
本発明の第２の発明に使用する菌株の培地に加える栄養源は使用する菌株が利用し、本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素を生産するものであればよく、炭素源としては例えばフコイダン、海藻粉末、アルギン酸、フコース、グルコース、マンニトール、グリセロール、サッカロース、マルトース、ラクトース、デンプン等が利用でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、肉エキス、脱脂大豆、硫安、塩化アンモニウム等が適当である。その他にナトリウム塩、リン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩等の無機質、及び金属塩類を加えてもよい。
また本菌株は上記栄養源を含んだ海水あるいは人工海水中で非常に良く生育する。
【００１７】
本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素の生産菌を培養するに当り、生産量は培養条件により変動するが、一般に培養温度は、１５℃〜３０℃、培地のｐＨは５〜９がよく、５〜７２時間の通気かくはん培養で本発明のエンド型フコイダン分解酵素の生産量は最高に達する。培養条件は使用する菌株、培地組成等に応じ、本発明のエンド型フコイダン分解酵素の生産量が最大になるように設定するのは当然のことである。
本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素は菌体中にも培養物上清中にも存在する。
【００１８】
上記のフラボバクテリウム  ｓｐ．ＳＡ−００８２株を適当な培地で培養し、その菌体を集め、通常用いられる細胞破壊手段、例えば、超音波処理などで菌体を破砕すると無細胞抽出液が得られる。
【００１９】
次いで、この抽出液から通常用いられる精製手段により精製酵素標品を得ることができる。例えば、塩析、イオン交換カラムクロマト、疎水結合カラムクロマト、ゲルろ過等により精製を行い、他のフコイダン分解酵素を含まない純化された本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素を得ることができる。  また、上述の培養液から菌体を除去した培養液上清中にも本酵素（菌体外酵素）が大量に存在するので、菌体内酵素と同様の精製手段により精製することができる。
【００２０】
本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素の化学的及び理化学的性質は次の通りであり、菌体内酵素、菌体外酵素は分子量以外は同一の性質を示す。
（Ｉ）作用：フコイダンに作用して、少なくとも前記式（７）及び式（８）で表される糖化合物を遊離させる。
（ＩＩ）至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは６から１０である（図３７）。
すなわち図３７は、本酵素のｐＨと相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸はｐＨを示す。
（ＩＩＩ）至適温度：本酵素の至適温度は３０から４０℃である（図３８）。
すなわち図３８は、本酵素の温度と相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸は温度（℃）を示す。
（ＩＶ）ｐＨ安定性：本酵素はｐＨ６〜１１．５の間で安定である（図３９）。
すなわち図３９は、本酵素を処理したｐＨと残存活性の関係を表すグラフであり、縦軸は残存活性（％）、横軸はｐＨを示す。
（Ｖ）温度安定性：本酵素は約３０℃以下で安定である（図４０）。
すなわち図４０は、本酵素を処理した温度と残存活性の関係を表すグラフであり、縦軸は残存活性（％）、横軸は処理温度（℃）を示す。
（ＶＩ）分子量：本酵素の分子量を、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−２００（ファルマシア製）を用いたゲルろ過法により求めたところフラボバクテリウム  ｓｐ．ＳＡ−００８２株の菌体外酵素の場合は約７万であり、同菌体内酵素の場合は約４６万であった。
（ＶＩＩ）酵素活性の測定方法：
【００２１】
本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素の酵素活性の測定は次のようにして行った。
すなわち、２．５％のガゴメ昆布由来のフコイダン溶液５０μｌと、１０μｌの本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素と、６０μｌの６６７ｍＭ塩化ナトリウムを含む８３ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５を混合し、３７℃、３時間反応させた後、反応液１０５μｌと水２ｍｌを混合かくはんし、その２３０ｎｍにおける吸光度（ＡＴ）を測定した。対照として、本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素の代りに、本発明の酵素を溶解している上記緩衝液のみを用いて同様の条件により反応させたもの及びフコイダン溶液の代りに水のみを用いて反応を行ったものを用意し、それぞれ同様に吸光度を測定した（ＡＢ１及びＡＢ２）。
【００２２】
１単位の酵素は、上記反応系において１分間に１μｍｏｌのマンノースとウロン酸の間のグリコシド結合を脱離的に切断する酵素量とする。切断された結合の定量は、脱離反応の際に生じた不飽和ウロン酸のミリモル分子吸光係数を５．５として計算し行った。なお、酵素の活性は下記式により求めた。
（ＡＴ−ＡＢ１−ＡＢ２）×２．１０５×１２０／５．５×１０５×０．０１×１８０＝Ｕ／ｍｌ
２．１０５：吸光度を測定するサンプルの液量（ｍｌ）
１２０：酵素反応液の液量（μｌ）
５．５：不飽和ウロン酸の２３０ｎｍにおけるミリモル分子吸光係数（／ｍＭ）１０５：希釈に用いる反応液の液量（μｌ）
０．０１：酵素液量（ｍｌ）
１８０：反応時間（分）
【００２３】
タンパク質の定量は、酵素液の２８０ｎｍの吸光度を測定することにより行った。その際１ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液の吸光度を１．０として計算した。
【００２４】
本発明者らは、以下に述べるごとく、本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素の作用機作を決定した。
（１）ガゴメ昆布フコイダンの調製
乾燥ガゴメ昆布を自由粉砕機Ｍ−２型（奈良機械製作所製）により粉砕し、１０倍量の８５％メタノール中で７０℃、２時間処理後、ろ過し、残渣を１０倍量のメタノール中で７０℃、２時間処理し、ろ過した。残渣に２０倍量の水を加え、１００℃、３時間処理しろ過により抽出液を得た。抽出液の塩濃度を４００ｍＭの塩化ナトリウム溶液と同じにした後、セチルピリジニウムクロリドをこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し、遠心分離した。その沈殿を、エタノールで十分洗浄し、セチルピリジニウムクロリドが完全に除去できたら、限外ろ過器（ろ過膜の排除分子量１０万）（アミコン社製）により脱塩及び低分子除去を行い、この際生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清を凍結乾燥して精製ガゴメ昆布フコイダンを得た。収率は、乾燥ガゴメ昆布粉末重量に対して約４％であった。
（２）エンド型フコイダン分解酵素によるフコイダンの分解及び分解物の精製  精製したガゴメ昆布由来のフコイダンに本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素を作用させ分解物の大量調製を行った。
【００２５】
すなわち、５％のガゴメ昆布由来のフコイダン溶液６００ｍｌと、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）７５０ｍｌと４Ｍの塩化ナトリウム１５０ｍｌと１７５０ｍＵ／ｍｌの本発明のエンド型フコイダン分解酵素溶液３．４３ｍｌを混合し、２５℃で１４４時間反応させた。
【００２６】
反応液をポアサイズ３５００の透析膜を用いて透析し、分子量３５００以下の画分を集めた。この画分をマイクロアシライザーＧ３（旭化成社製）により脱塩後、ＤＥＡＥーセファロースＦＦにより９つの画分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、及び（ｉ）に分画した。その溶出パターンを図４１に示す。横軸はフラクションナンバーを示し、左の縦軸及び図中の黒丸は、フェノール硫酸法による糖含量を４８０ｎｍの吸光度で示し、右の縦軸及び図中の白丸は、不飽和グルクロン酸の含量を２３５ｎｍの吸光度で示し、最も右の縦軸及び図中の点線は、溶出液中の酢酸アンモニウム濃度（Ｍ）を示す。各画分のフラクションナンバーは、それぞれ（ａ）：４２〜４３、（ｂ）：８４〜９１、（ｃ）：５１〜５２、（ｄ）：７９、（ｅ）：１０２〜１０３、（ｆ）：６２〜６３、（ｇ）：４５、（ｈ）：７５、及び（ｉ）：７７であった。
【００２７】
画分（ｈ）及び（ｉ）については上記のフラクションナンバー６４〜７８を集め、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦにより、再精製を行った。その溶出パターンを図４２に示す。横軸はフラクションナンバーを示し、左の縦軸及び図中の黒丸は、フェノール硫酸法による糖含量を４８０ｎｍの吸光度で示し、右の縦軸及び図中の白丸は、不飽和グルクロン酸の含量を２３５ｎｍの吸光度で示し、最も右の縦軸及び図中の点線は、溶出液中の酢酸アンモニウム濃度（Ｍ）を示す。各画分のフラクションナンバーはそれぞれ（ｈ）：９２〜９６、及び（ｉ）：９９〜１０３であった。
【００２８】
（３）酵素反応生成物の構造解析
（ア）各画分の均一性の確認
上記の９つの画分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、及び（ｉ）をそれぞれ一部だけＧｌｙｃｏＴＡＧ  およびＧｌｙｃｏＴＡＧ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（共に宝酒造社製）を用いて還元性末端を２−アミノピリジル化（ＰＡ化）し、各ＰＡ化糖（ＰＡ−ａ）、（ＰＡ−ｂ）、（ＰＡ−ｃ）、（ＰＡ−ｄ）、（ＰＡ−ｅ）、（ＰＡ−ｆ）、（ＰＡ−ｇ）、（ＰＡ−ｈ）、及び（ＰＡ−ｉ）を得た。（ＰＡ−ａ）、（ＰＡ−ｂ）、（ＰＡ−ｃ）、（ＰＡ−ｄ）、（ＰＡ−ｅ）、（ＰＡ−ｆ）、（ＰＡ−ｇ）、（ＰＡ−ｈ）、及び（ＰＡ−ｉ）はＨＰＬＣ分析によりそれぞれ均一であることが判明した。
【００２９】
なお、ＨＰＬＣの条件は下記によった。
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：Ｌ−カラム（４．６ｘ２５０ｍｍ）｛（財）化学薬品検査協会｝
溶離液：前記式（７）、（８）、及び（９）〔（ＰＡ−ａ）、（ＰＡ−ｂ）、及び（ＰＡ−ｃ）〕の物質に対しては
５０ｍＭ酢酸−トリエチルアミン（ｐＨ５．５）
前記式（１０）、（１２）、（１３）、及び（１５）〔（ＰＡ−ｄ）、（ＰＡ−ｆ）、（ＰＡ−ｇ）、及び（ＰＡ−ｉ）〕の物質に対しては
１００ｍＭ酢酸−トリエチルアミン（ｐＨ５）
前記式（１１）〔（ＰＡ−ｅ）〕の物質に対しては
０から１０分までは２００ｍＭ酢酸−トリエチルアミン（ｐＨ３．８）１０から６０分までは２００ｍＭ酢酸−トリエチルアミン（ｐＨ３．８）と０．５％のテトラヒドロフランを含む２００ｍＭ酢酸−トリエチルアミン（ｐＨ３．８）の比率を１００：０から２０：８０に直線的に変化させた。
前記式（１４）〔（ＰＡ−ｈ）〕の物質に対しては
０から６０分まで２００ｍＭ酢酸−トリエチルアミン（ｐＨ３．８）と０．５％のテトラヒドロフランを含む２００ｍＭ酢酸−トリエチルアミン（ｐＨ３．８）の比率を８０：２０から５０：５０に直線的に変化させた。
検出：蛍光検出器Ｆ−１１５０（日立製作所製）にて励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍで検出。
流速：１ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
【００３０】
（イ）酵素反応生成物の還元末端糖及び中性糖組成の分析
また、各ＰＡ化糖（ＰＡ−ａ）、（ＰＡ−ｂ）、（ＰＡ−ｃ）、（ＰＡ−ｄ）、（ＰＡ−ｅ）、（ＰＡ−ｆ）、（ＰＡ−ｇ）、（ＰＡ−ｈ）、及び（ＰＡ−ｉ）を４規定の塩酸、１００℃、３時間処理により加水分解し、ＨＰＬＣにより還元末端糖を調べた。
また、この加水分解物をグライコタッグ（宝酒造社製）及びグライコタッグ  リージェント  キット（宝酒造社製）を用いて還元性末端をＰＡ化しＨＰＬＣにより中性糖組成を調べた。なお、ＨＰＬＣの条件は下記によった。
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：パルパックタイプＡ（４．６ｍｍｘ１５０ｍｍ）（宝酒造社製）  溶離液：７００ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ  ９．０）：アセトニトリル＝９：１  検出：蛍光検出器  Ｆ−１１５０（日立製作所製）にて励起波長３１０ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍで検出。
流速：０．３ｍｌ／分
カラム温度：６５℃
【００３１】
この結果、（ＰＡ−ａ）、（ＰＡ−ｂ）、（ＰＡ−ｃ）、（ＰＡ−ｄ）、（ＰＡ−ｅ）、（ＰＡ−ｆ）、及び（ＰＡ−ｉ）の還元性末端糖はすべてマンノースであった。また中性糖組成としては（ＰＡ−ａ）、（ＰＡ−ｂ）、（ＰＡ−ｃ）、（ＰＡ−ｅ）、（ＰＡ−ｆ）、及び（ＰＡ−ｉ）がマンノースとフコースを等モル含んでおり、（ＰＡ−ｄ）はマンノースとフコースの比率が２：１であった。
（ＰＡ−ｇ）及び（ＰＡ−ｈ）の還元性末端糖は共にガラクトースであり、その中性糖組成としては（ＰＡ−ｇ）はガラクトースとフコースの比が１：２であり、（ＰＡ−ｈ）はガラクトースとフコースの比が２：１であった。
また、構成糖の一つであるマンノースの立体配置を調べるためにＦ−キット  グルコース／フルクトース及びホスホマンノースイソメラーゼ（共にベーリンガーマンハイムヤマノウチ製）を用い、説明書に従ってＤ−マンノースのみを測定できる反応系を構築し、別に（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、及び（ｉ）各１００μｇを２Ｎの塩酸で１００℃、３時間加水分解後中和したものをこの反応系で測定した。この結果（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、及び（ｉ）のすべてからＤ−マンノースが検出されたので、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、及び（ｉ）の構成糖のマンノースはすべてＤ型と判明した。
【００３２】
（ｇ）及び（ｈ）の構成糖の一つであるガラクトースの立体配置を調べるためにＤ型のガラクトースのみを検出できるＦ−キット  乳糖／ガラクトース（ベーリンガーマンハイムヤマノウチ製）を用いた。すなわち、（ｇ）及び（ｈ）各１００μｇを２Ｎの塩酸で１００℃、３時間加水分解後中和したものをこのキットを用いて測定した。この結果、（ｇ）及び（ｈ）からガラクトースが検出されたので（ｇ）及び（ｈ）の構成糖のガラクトースはすべてＤ型と判明した。
【００３３】
さらにもう一種の構成糖であるフコースの立体配置を調べるために、クリニカルケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第３６巻、第４７４−４７６頁（１９９０）に記載の方法に従って、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）各１００μｇを２Ｎの塩酸で１００℃、３時間加水分解後中和したものをこの反応系で測定した。  本反応系ではＤ−フコースは検出されずＬ−フコースのみが検出できる。この結果（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）からＬ−フコースが検出された。
【００３４】
（ウ）酵素反応生成物の分子量の分析
次に、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）をＡＰＩ−ＩＩＩ質量分析器（パーキンエルマー・サイエクス社）を用いた質量分析に供したところ、それらの分子量は、それぞれ５６４、７２４、１１２８、１０６２、１４４８、６４４、６３２、１３５８、及び１２８８であった。（ｂ）および（ｃ）は２価の陰イオンが主なシグナルを形成した。（ｄ）は１価のイオンとナトリウムがついた１価のイオン及び２価のイオンが検出された。（ｅ）はナトリウムイオンが４個ついた２価のイオン、ナトリウムイオンが３個ついた３価のイオン、及びナトリウムイオンが１個ついた４価のイオン等が検出された。（ｆ）はナトリウムイオンが２個ついた１価のイオンが検出された。（ｇ）は１価のイオンとナトリウムが結合した１価のイオン及び２価のイオンが検出された。（ｈ）はナトリウムイオンが４個、３個、２個、及び１個ついた、それぞれ１価、２価、３価、及び４価のイオン等が検出された。（ｉ）は硫酸基が２個はずれてナトリウムが１個ついた１価のイオン及び硫酸基が２個取れた２価のイオンが検出された。
【００３５】
また、ネガティブモードのマスマス（ＭＳ／ＭＳ）分析により（ａ）は一価の硫酸イオン（分子量９７）、不飽和ヘキスロン酸から水分子と水素イオンが取れた一価イオン（分子量１５７）、不飽和ヘキスロン酸から水素イオンがとれた一価イオン（分子量１７５）、フコースと硫酸が結合したものから水分子と水素イオンが取れた一価イオン（分子量２２５）、フコースと硫酸が結合したものから水素イオンが取れた一価イオン（分子量２４３）、不飽和ヘキスロン酸とマンノースが結合したものから水分子と水素イオンが取れた一価イオン（分子量３１９）、フコースと硫酸とマンノースが結合したものから水素イオンが取れた一価イオン（分子量４０５）が検出された。
【００３６】
同様にネガティブモードのＭＳ／ＭＳ分析により（ｂ）は一価の硫酸イオン（分子量９７）、不飽和ヘキスロン酸から水素イオンが取れた一価イオン（分子量１７５）、フコースと硫酸が結合したものから水素イオンが取れた一価イオン（分子量２４３）、不飽和ヘキスロン酸とフコースとマンノースと硫酸が２個結合したものから水素イオンが２個取れた２価イオン（分子量３２１）、フコースと硫酸とマンノースが結合したものから水素イオンが取れた一価イオン（分子量４０５）、不飽和ヘキスロン酸とマンノースと硫酸が結合したものから水素イオンが取れた一価イオン（分子量４１７）が検出された。
【００３７】
また、ネガティブモードのＭＳ／ＭＳ分析により（ｃ）は一価の硫酸イオン（分子量９７）、不飽和ヘキスロン酸から水素イオンが取れた一価イオン（分子量１７５）、フコースと硫酸が結合したものから水分子と水素イオンが取れた一価イオン（分子量２２５）、フコースと硫酸が結合したものから水素イオンが取れた一価イオン（分子量２４３）、マンノースとヘキスロン酸とマンノースとフコースと硫酸が結合したものから水素イオンが２個取れた２価イオン（分子量３７１）、フコースと硫酸とマンノースが結合したものから水素イオンが取れた一価イオン（分子量４０５）、フコースと不飽和ヘキスロン酸とマンノースとヘキスロン酸と硫酸が結合したものから水と水素イオンが取れた一価イオン（分子量７２１）が検出された。
【００３８】
また、ネガティブモードのＭＳ／ＭＳ分析により（ｄ）の２価イオンから、１価の硫酸イオン（分子量９７）、不飽和ヘキスロン酸から水素イオンが取れた１価イオン（分子量１７５）、フコースと硫酸が結合したものから水分子と水素イオンが取れた１価イオン（分子量２２５）、フコースと硫酸が結合したものから水素イオンが取れた１価イオン（分子量２４３）、フコースとマンノースと硫酸基が結合したものから水素イオンが取れた１価イオン（分子量４０５）、（ｄ）から硫酸基が２個取れ、水素イオンが２個取れた２価イオン（分子量４５０）、（ｄ）から硫酸基が１個取れ、水素イオンが２個取れた２価イオン（分子量４９０）が検出された。
【００３９】
また、ネガティブモードのＭＳ／ＭＳ分析により（ｅ）は一価の硫酸イオン（分子量９７）、フコースと硫酸が結合したものから水分子と水素イオンが取れた一価イオン（分子量２２５）、フコースと硫酸が結合したものから水素イオンが取れた一価イオン（分子量２４３）、フコースと２分子の硫酸基とナトリウムイオンが結合したものから水素イオンが２個取れた一価イオン（分子量３４５）、（ｅ）から２個の硫酸基がとれ、３個のナトリウムイオンがつき、６個の水素イオンがとれた３価イオン（分子量４５０）、（ｅ）から１個の硫酸基と６個の水素イオンがとれ、３個のナトリウムイオンがついた３価イオン（分子量４７６）、不飽和ヘキスロン酸とマンノースとフコースと硫酸が結合したものから水素イオンがとれた１価イオン（分子量５６３）、及び不飽和ヘキスロン酸とマンノースとフコースと３分子の硫酸が結合したものから水分子と水素イオンがとれた１価イオン（分子量７０５）が検出された。
【００４０】
また、ネガティブモードのＭＳ／ＭＳ分析により（ｆ）は、一価の硫酸イオン（分子量９７）、フコースと硫酸が結合したものから水素イオンが取れた一価イオン（分子量２４３）、不飽和ヘキスロン酸とマンノースと硫酸とナトリウムが結合したものから水と水素イオンが取れた一価イオン（分子量４２１）が検出された。
【００４１】
また、ネガティブモードのＭＳ／ＭＳ分析により（ｇ）は、フコースと硫酸とガラクトースが結合したものから水素イオンが取れた一価イオン（分子量４０５）及び、フコース２分子とガラクトース１分子と硫酸基１分子が結合したものから水素イオンが取れた１価イオン（分子量５５１）が検出された。
【００４２】
また、ネガティブモードのＭＳ／ＭＳ分析により（ｈ）に３分子のナトリウムが結合し、５分子の水素イオンが取れたものから、１価の硫酸イオン（分子量９７）、フコースと硫酸が結合したものから水分子と水素イオンが取れた一価イオン（分子量２２５）、フコース２分子とガラクトース４分子と硫酸基３分子が結合したものから水素イオンが１分子取れた一価イオン（分子量１１９７）が検出された。
【００４３】
また、ネガティブモードのＭＳ／ＭＳ分析により（ｉ）から硫酸基が２個取れた２価イオンから、１価の硫酸イオン（分子量９７）、フコースと２分子の硫酸とナトリウムが結合したものから水素イオンが取れた１価イオン（分子量３４５）が検出された。
【００４４】
（エ）酵素反応生成物の糖組成の分析
上記質量分析の結果より（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）、及び（ｉ）は分子内に不飽和ヘキスロン酸を含む可能性が極めて高いことが示唆された。酵素反応生成物の分子内に不飽和結合のあるヘキスロン酸が存在することを証明するために以下の実験を行った。不飽和結合が分子内に存在すると２３０〜２４０ｎｍに強い吸収があることが知られている。そこで、精製した（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、及び（ｉ）の各オリゴ糖の水溶液の２３０〜２４０ｎｍの吸光度を測定すると（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、及び（ｉ）の水溶液には強い吸収があり、分子内に不飽和結合があることが示唆された。また、本酵素によるフコイダンの分解反応の進行と共に２３０〜２４０ｎｍの吸光度が増加することも確認されたので、本酵素はフコイダン中のマンノースとヘキスロン酸の間あるいは、ガラクトースとヘキスロン酸の間のグリコシド結合を脱離反応により切断することが強く示唆された。
【００４５】
酵素反応生成物のほとんどが非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を持ち還元末端がマンノースであることから調製したフコイダンの中にはヘキスロン酸とマンノースが交互に並んだ分子種が存在することが示唆された。
【００４６】
フコイダンの構成糖の多くはフコースであるためフコイダンは一般の多糖より酸により分解され易い。一方、ヘキスロン酸やマンノースの結合は比較的酸に強いことが知られている。本発明者らはガゴメ昆布のフコイダンの分子内に存在するヘキスロン酸とマンノースが交互に結合している分子種中のヘキスロン酸の種類を明らかにするためにカーボハイドレート  リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）第１２５巻、第２８３−２９０頁、１９８４年の方法を参考にして、まずフコイダンを０．３Ｍのシュウ酸に溶解し１００℃、３時間処理したものを分子量分画し、分子量が３０００以上の画分を集め、さらに陰イオン交換樹脂により吸着分を集めた。この物質を凍結乾燥後４Ｎの塩酸で酸加水分解し、ｐＨ８に調整後、ＰＡ化し、ＨＰＬＣによりウロン酸の分析を行った。なおＨＰＬＣの条件は下記によった。
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：パルパックタイプＮ（４．６ｍｍｘ２５０ｍｍ）（宝酒造社製）
溶離液：２００ｍＭ酢酸−トリエチルアミン緩衝液（ｐＨ７．３）：アセトニトリル＝２５：７５
検出：蛍光検出器Ｆ−１１５０（日立製作所製）にて励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍで検出。
流速：０．８ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
【００４７】
なお、ＰＡ化ヘキスロン酸の標準物質はグルクロン酸はシグマ社製、ガラクツロン酸は和光純薬社製、イズロン酸はシグマ社製の４−メチルウンベリフェリルα−Ｌ−イズロニドを加水分解したもの、マンヌロン酸及びグルロン酸はアクタ・ケミカ・スカンヂナヴィカ（Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａｊ、第１５巻、第１３９７ー１３９８頁、１９６１年記載の方法にしたがい、和光純薬製のアルギン酸を加水分解後陰イオン交換樹脂で分離したものをＰＡ化することにより得た。
この結果、上記フコイダンの分子種中に含まれているヘキスロン酸はグルクロン酸のみであることが判明した。
【００４８】
さらに上記分子種の加水分解物中のグルクロン酸を陰イオン交換樹脂によりＤ−マンノースと分離し凍結乾燥後その比旋光度を測定したところ右旋性でありグルクロン酸はＤ−グルクロン酸であることが判明した。
【００４９】
また、ガゴメ昆布由来のフコイダンをあらかじめ本発明の第二の発明であるエンド型フコイダン分解酵素で処理したものについても上記と同様にシュウ酸で酸加水分解したが、Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノースが交互に結合したポリマーは検出されなかった。このことから、本発明の酵素が脱離反応により切断するフコイダンの分子種の骨格構造はＤ−グルクロン酸とＤ−マンノースが交互に結合した構造を持つことが判明した。
【００５０】
さらに、Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノースのそれぞれの結合位置とグリコシド結合のアノメリック配置を調べるため、シュウ酸分解により得られたポリマーをＮＭＲ分析した。
【００５１】
ポリマーのＮＭＲの測定結果を以下に示す。但し、１Ｈ−ＮＭＲでの化学シフト値はトリエチルアミンのメチル基の化学シフト値を１．１３ｐｐｍに、１３Ｃ−ＮＭＲではトリエチルアミンのメチル基の化学シフト値を９．３２ｐｐｍとして表した。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）
δ５．２５（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，１−Ｈ）、４．３２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１′−Ｈ）、４．００（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，２−Ｈ）、３．７１（１Ｈ，ｍ，５′−Ｈ）、３．６９（１Ｈ，ｍ，５−ＣＨのＨ）、３．６８（１Ｈ，ｍ，３−Ｈ）、３．６３（１Ｈ，ｍ，５−ＣＨのＨ）、３．６３（１Ｈ，ｍ，４′−Ｈ）、３．５７（１Ｈ，ｍ，４−Ｈ）、３．５４（１Ｈ，ｍ，３′−Ｈ）、３．５３（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ）、３．２５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２′−Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）
δ１７５．３（５′−ＣＯＯＨのＣ）、１０２．５（１′−Ｃ）、９９．６（１−Ｃ）、７８．５（２−Ｃ）、７７．９（４′−Ｃ）、７７．０（３′−Ｃ）、７６．７（５′−Ｃ）、７３．９（５−Ｃ）、７３．７（２′−Ｃ）、７０．６（３−Ｃ）、６７．４（４−Ｃ）、６１．０（５−ＣＨ２ＯＨのＣ）
なお、ピークの帰属の番号は下記式（１６）の通りである：
2004339228.tif 000017
Ｄ−グルクロン酸の１位の立体配置はそのビシナル結合定数が７．６ＨｚであることからβーＤ−グルクロン酸であると決定した。
また、マンノースの１位の立体配置はその化学シフト値が５．２５ｐｐｍであることからαーＤ−マンノースであると決定した。
構成糖の結合様式は１Ｈ検出異種核検出法であるＨＭＢＣ法を用いて行った。１Ｈ−ＮＭＲの帰属にはＤＱＦ−ＣＯＳＹ法及びＨＯＨＡＨＡ法を、１３Ｃ−ＮＭＲの帰属にはＨＳＱＣ法を用いた。
ＨＭＢＣスペクトルにより１ーＨと４’−Ｃの間及び４’−Ｈと１ーＣの間、１’−Ｈと２−Ｃの間及び２ーＨと１’−Ｃの間にそれぞれクロスピークが認められた。このことからＤ−グルクロン酸はβ結合でＤ−マンノースの２位に、Ｄ−マンノースはα結合でＤ−グルクロン酸の４位にそれぞれ結合していることが明らかとなった。
【００５２】
（オ）酵素反応生成物の糖結合様式及び硫酸基の結合位置の分析
構成糖および硫酸基の結合様式を調べるために酵素反応生成物を５００ＭＨｚの核磁気共鳴装置ＪＮＭ−α５００型（日本電子製）によるＮＭＲスペクトル分析に供した。この分析結果より（ａ）は前記式（７）、（ｂ）は前記式（８）、（ｃ）は前記式（９）、（ｄ）は前記式（１０）、（ｅ）は前記式（１１）、（ｆ）は前記式（１２）、（ｇ）は前記式（１３）、（ｈ）は前記式（１４）、及び（ｉ）は前記式（１５）で表されるものであることが判明した、すなわち（ａ）は、還元末端残基であるＤ−マンノースに不飽和Ｄ−グルクロン酸と、硫酸基が結合したＬ−フコースが結合した構造を持つこと、（ｂ）は、硫酸基が結合した還元末端残基であるＤ−マンノースに不飽和Ｄ−グルクロン酸と２個の硫酸基が結合したＬ−フコースが結合した構造を持つこと、（ｃ）は、還元末端残基であるＤ−マンノースにＤ−グルクロン酸と、硫酸基が結合したＬ−フコースが結合し、そのＤ−グルクロン酸にＤ−マンノースが結合し、さらにそのＤ−マンノースに不飽和Ｄ−グルクロン酸と硫酸基が結合したＬ−フコースが結合した構造を持つこと、（ｄ）は、還元末端残基であるＤ−マンノースに硫酸基とＤ−グルクロン酸と、硫酸基が２分子結合したＬ−フコースが結合し、そのＤ−グルクロン酸に、Ｄ−マンノースが結合し、さらにそのＤ−マンノースに不飽和Ｄ−グルクロン酸が結合した構造を持つこと、（ｅ）は、還元末端残基であるＤ−マンノースに硫酸基とＤ−グルクロン酸と、硫酸基が２分子結合したＬ−フコースが結合し、そのＤ−グルクロン酸に、硫酸基が結合したＤ−マンノースが結合し、さらにそのＤ−マンノースに、硫酸基が２分子結合したＬ−フコースと不飽和Ｄ−グルクロン酸が結合した構造を持つこと、（ｆ）は、硫酸基が結合した還元末端残基であるＤ−マンノースに不飽和Ｄ−グルクロン酸と硫酸基が結合したＬ−フコースが結合した構造を持つこと、（ｇ）は、還元末端残基であるＤ−ガラクトースに、硫酸基が結合したＬ−フコースが結合し、そのＬ−フコースに、硫酸基が結合したＬ−フコースが結合した構造を持つこと、（ｈ）は、硫酸基が結合した還元末端残基であるＤ−ガラクトースを起点に２本に分岐した構造を持ち、一方の糖鎖は、Ｄ−ガラクトースに、硫酸基が結合したＬ−フコースが結合し、そのＬ−フコースに、硫酸基が結合したＬ−フコースが結合しており、他方の糖鎖は、硫酸基が結合したＤ−ガラクトースに、硫酸基が結合したＤ−ガラクトースが結合した構造を持つこと、（ｉ）は、還元末端残基であるＤ−マンノースに硫酸基とＤ−グルクロン酸と、硫酸基が結合したＬ−フコースが結合し、そのＤ−グルクロン酸に、Ｄ−マンノースが結合し、さらにそのＤ−マンノースに、硫酸基が２個結合したＬ−フコースと不飽和Ｄ−グルクロン酸が結合した構造を持つことが判明した。
【００５３】
本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素をフコイダンに作用させることにより、本発明の第１の発明である糖化合物に含まれる化合物を得た。  下記に、本発明の第１の発明の糖化合物の例である式（７）、式（８）、式（９）、式（１０）、式（１１）、式（１２）、式（１３）、式（１４）、及び式（１５）で表される化合物、すなわち（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、及び（ｉ）の物性を示す。
【００５４】
図１、２、３、４、５、６、７、８、及び９には各ピリジル（−２−）アミノ化糖化合物（ＰＡ−ａ）、（ＰＡ−ｂ）、（ＰＡ−ｃ）、（ＰＡ−ｄ）、（ＰＡ−ｅ）、（ＰＡ−ｆ）、（ＰＡ−ｇ）、（ＰＡ−ｈ）、及び（ＰＡ−ｉ）、のＨＰＬＣの溶出パターンを示し、図において縦軸は相対蛍光強度、横軸は保持時間（分）を示す。さらに図１０に（ａ）の、図１１に（ｂ）の、図１２に（ｃ）の、図１３に（ｄ）の、図１４に（ｅ）の、図１５に（ｆ）の、図１６に（ｇ）の、図１７に（ｈ）の、図１８に（ｉ）のマススペクトルを示し、図１９に（ａ）の、図２０に（ｂ）の、図２１に（ｃ）の、図２２に（ｄ）の、図２３に（ｅ）の、図２４に（ｆ）の、図２５に（ｇ）の、図２６に（ｈ）の、図２７に（ｉ）のマスマスのスペクトルを示し、各図において縦軸は相対強度（％）、横軸はｍ／ｚ値を示す。
【００５５】
更に図２８は（ａ）の、図２９は（ｂ）の、図３０は（ｃ）の、図３１は（ｄ）の、図３２は（ｅ）の、図３３は（ｆ）の、図３４は（ｇ）の、図３５は（ｈ）の、図３６は（ｉ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示し、各図において縦軸はシグナルの強度、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。
なお、１Ｈ−ＮＭＲでの化学シフト値はＨＯＤの化学シフト値を４．６５ｐｐｍとして表した。
【００５６】
（ａ）の物性
分子量５６４
ＭＳ  ｍ／ｚ  ５６３［Ｍ−Ｈ＋］−
ＭＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ９７［ＨＳＯ４］−、１５７［不飽和Ｄ−グルクロン酸−Ｈ２Ｏ−Ｈ＋］−、１７５［不飽和Ｄ−グルクロン酸−Ｈ＋］−、２２５［Ｌ−フコース硫酸−Ｈ２Ｏ−Ｈ＋］−、２４３［Ｌ−フコース硫酸−Ｈ＋］−、３１９［不飽和Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノースが結合したもの−Ｈ２Ｏ−Ｈ＋］−、４０５［Ｍ−不飽和Ｄ−グルクロン酸−Ｈ＋］−、４８３［Ｍ−ＳＯ３−Ｈ＋］−
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）
δ５．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，４″−Ｈ）、５．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１−Ｈ）、５．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１′−Ｈ）、５．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，１″−Ｈ）、４．４７（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．４，１０．４Ｈｚ，３′−Ｈ）、４．２１（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，２−Ｈ）、４．１２（１Ｈ，ｍ，５′−Ｈ）、４．１０（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．７，５．８Ｈｚ，３″−Ｈ）、４．０３（（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，４′−Ｈ）、３．８６（１Ｈ，ｍ，３−Ｈ）、３．８３（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝４．０，１０．４Ｈｚ，２′−Ｈ）、３．７２（１Ｈ，ｍ，４−Ｈ）、３．７２（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ）、３．７０（２Ｈ，ｍ，５−ＣＨ２のＨ２）、３．６５（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝５．８，６．１Ｈｚ，２″−Ｈ）、１．０８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，５′−ＣＨ３のＨ３）
糖組成  Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸：Ｄ−マンノース＝１：１：１（各１分子）
硫酸基  １分子（Ｌ−フコースの３位）
なお、  １Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（１７）の通りである。
2004339228.tif 000018
【００５７】
（ｂ）の物性
分子量  ７２４
ＭＳ  ｍ／ｚ  ７２３〔Ｍ−Ｈ＋〕−、３６１〔Ｍ−２Ｈ＋〕２−
ＭＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ９７〔ＨＳＯ４〕−、１７５〔不飽和Ｄ−グルクロン酸−Ｈ＋〕−、２４３〔Ｌ−フコース硫酸−Ｈ＋〕−、３２１〔Ｍ−ＳＯ３−２Ｈ＋〕２−、４０５〔Ｍ−不飽和Ｄ−グルクロン酸−２ＳＯ３−Ｈ＋〕−、４１７〔Ｍ−Ｌ−フコース−２ＳＯ３−Ｈ＋〕−
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）
δ５．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，４″−Ｈ）、５．２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１″−Ｈ）、５．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１−Ｈ）、５．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１′−Ｈ）、４．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，４′−Ｈ）、４．３２（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，５′−Ｈ）、４．２７（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．７，１０．４Ｈｚ，２′−Ｈ）、４．２１（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．４，６．７Ｈｚ，３″−Ｈ）、４．１８（（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝１．８，１１．０Ｈｚ，５−ＣＨのＨ）、４．１５（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，２−Ｈ）、４．１０（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝５．８，１１．０Ｈｚ、５−ＣＨのＨ）、３．９９（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．１，１０．４Ｈｚ、３′−Ｈ）、３．９０（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ）、３．８２（１Ｈ，ｍ，３−Ｈ）、３．８２（１Ｈ，ｍ，４−Ｈ）、３．５４（１Ｈ，ｂｒ−ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２″−Ｈ）、１．１１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，５′−ＣＨ３のＨ３）
糖組成  Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸：Ｄ−マンノース＝１：１：１（各１分子）
硫酸基  ３分子（Ｌ−フコースの２位と４位及びＤ−マンノースの６位）
なお、１Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（１８）の通りである。
2004339228.tif 000019
【００５８】
（ｃ）の物性
分子量  １１２８
ＭＳ  ｍ／ｚ  １１２７〔Ｍ−Ｈ＋〕−
ＭＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ９７〔ＨＳＯ４〕−、１７５〔不飽和Ｄ−ヘキスロン酸−Ｈ＋〕−、２２５〔Ｌ−フコース硫酸−Ｈ２Ｏ−Ｈ＋〕−、２４３〔Ｌ−フコース硫酸−Ｈ＋〕−、３７１〔Ｍ−不飽和Ｄ−グルクロン酸−Ｌ−フコース−ＳＯ３−２Ｈ＋〕２−、４０５〔硫酸化Ｌ−フコースとＤ−マンノースが結合したもの−Ｈ＋〕−、７２１〔Ｍ−Ｄ−マンノース−Ｌ−フコース−ＳＯ３−Ｈ２Ｏ−Ｈ＋〕−
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）
δ５．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，（４）″−Ｈ）、５．３４（１Ｈ，ｓ，（１）−Ｈ）、５．１６（１Ｈ，ｓ，１−Ｈ）、５．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，（１）′−Ｈ）、５．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ、１′−Ｈ）、４．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，（１）″−Ｈ）、４．５０（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．４，１０．７Ｈｚ、３′−Ｈ）、４．４７（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．４，１０．４Ｈｚ，（３）′−Ｈ）、４．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１″−Ｈ）、４．３３（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，（２）−Ｈ）、４．１４（１Ｈ，ｍ，２−Ｈ）、４．１２（１Ｈ，ｍ，（３）″−Ｈ）、４．１２（１Ｈ，ｍ，５′−Ｈ）、４．１２（１Ｈ，ｍ，（５）′−Ｈ）、４．０４（１Ｈ，ｍ，４′−Ｈ）、４．０３（１Ｈ，ｍ，（４）′−Ｈ）、３．８５（１Ｈ，ｍ，２′−Ｈ）、３．８５（１Ｈ，ｍ，（２）′−Ｈ）、３．８２（１Ｈ，ｍ，３−Ｈ）、３．８２（１Ｈ，ｍ，（３）−Ｈ）、３．７３（１Ｈ，ｍ，４−Ｈ）、３．７３（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ）、３．７３（１Ｈ，ｍ，（４）−Ｈ）、３．７０（２Ｈ，ｍ，５−ＣＨ２のＨ２）、３．７０（２Ｈ，ｍ，（５）−ＣＨ２  のＨ２  ）、３．６７（１Ｈ，ｍ，５″−Ｈ）、３．６２（１Ｈ，ｍ，４″−Ｈ）、３．６２（１Ｈ，ｍ，（２）″−Ｈ）、３．６２（１Ｈ，ｍ，（５）−Ｈ）、３．５１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，３″−Ｈ）、３．２８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２″−Ｈ）、１．０９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，（５）′−ＣＨ３のＨ３）、１．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，５′−ＣＨ３のＨ３）
糖組成  Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸：Ｄ−グルクロン酸：Ｄ−マンノース＝２：１：１：２（Ｌ−フコースとＤ−マンノース各２分子と不飽和Ｄ−グルクロン酸とＤ−グルクロン酸各１分子）
硫酸基  ２分子（各Ｌ−フコースの３位）
なお、１Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（１９）の通りである。
2004339228.tif 000020
【００５９】
（ｄ）の物性
分子量  １０６２
ＭＳ  ｍ／ｚ    １０６１［Ｍ−Ｈ＋］−
ＭＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ９７［ＨＳＯ４］−、１７５［不飽和ヘキスロン酸−Ｈ＋］−、２２５［Ｌ−フコース硫酸−Ｈ２Ｏ−Ｈ＋］−、２４３［Ｌ−フコース硫酸−Ｈ＋］−、４０５［Ｌ−フコースとＤ−マンノースと硫酸基が結合したもの−Ｈ＋］−、４５０［Ｍ−２ＳＯ３  −２Ｈ＋］２−、４９０［Ｍ−ＳＯ３−２Ｈ＋］２−
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）
δ５．６７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，（４）″−Ｈ）、５．３２（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，（１）−Ｈ）、５．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１′−Ｈ）、５．１７（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，１−Ｈ）、４．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，（１）″−Ｈ）、４．７１（１Ｈ，ｍ，１″−Ｈ）、４．５３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，４′−Ｈ）、４．３３（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，５′−Ｈ）、４．２８（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．５，１１．０Ｈｚ，２′−Ｈ）、４．１８（１Ｈ，ｍ，５−ＣＨ２のＨ）、４．１３（１Ｈ，ｍ，（２）−Ｈ）、４．１２（１Ｈ，ｍ，（３）″−Ｈ）、４．０８（１Ｈ，ｍ，５−ＣＨ２のＨ）、４．０７（１Ｈ，ｍ，２−Ｈ）、３．９８（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．４，１１．０，３′−Ｈ）、３．８８（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ）、３．８２（１Ｈ，ｍ，４″−Ｈ）、３．７８（１Ｈ，ｍ，３−Ｈ）、３．７８（１Ｈ，ｍ，４−Ｈ）、３．７８（１Ｈ，ｍ，（３）−Ｈ）、３．６７（２Ｈ，ｍ，（５）−ＣＨ２のＨ２）、３．６３（１Ｈ，ｍ，（２）″−Ｈ）、３．６０（１Ｈ，ｍ，３″−Ｈ）、３．５９（１Ｈ，ｍ，５″−Ｈ）、３．５７（１Ｈ，ｍ，（４）−Ｈ）、３．５７（１Ｈ，ｍ，（５）−Ｈ）、３．１６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２″−Ｈ）、１．１０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，５′−ＣＨ３のＨ３）
糖組成  Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸：Ｄ−グルクロン酸：Ｄ−マンノース＝１：１：１：２（Ｌ−フコースと不飽和Ｄ−グルクロン酸とＤ−グルクロン酸各１分子とＤ−マンノース２分子）
硫酸基  ３分子（Ｌ−フコースの２位と４位及び還元性末端側のＤ−マンノースの６位）
なお、１Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（２０）の通りである。
2004339228.tif 000021
【００６０】
（ｅ）の物性
分子量  １４４８
ＭＳ  ｍ／ｚ    ７６７［Ｍ＋４Ｎａ−６Ｈ＋］２−
５０３．７［Ｍ＋３Ｎａ−６Ｈ＋］３−
３６６．５［Ｍ＋Ｎａ−５Ｈ＋］４−
ＭＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ９７［ＨＳＯ４］−、２２５［Ｌ−フコース硫酸−Ｈ２Ｏ−Ｈ＋］−、２４３［Ｌ−フコース硫酸−Ｈ＋］−、３４５［Ｌ−フコースジ硫酸＋Ｎａ−２Ｈ＋］−、４５０［Ｍ＋３Ｎａ−２ＳＯ３−６Ｈ＋］３−、４７７［Ｍ＋３Ｎａ−ＳＯ３−６Ｈ＋］３−、５６３［不飽和Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノースとＬ−フコースと硫酸が結合したもの−Ｈ＋］−、７０５［不飽和Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノース硫酸とＬ−フコースジ硫酸が結合したもの−Ｈ２Ｏ−Ｈ＋］−
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）
δ５．５８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，（４）″−Ｈ）、５．３５（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，（１）−Ｈ）、５．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，（１）″−Ｈ）、５．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１′−Ｈ）、５．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，（１）′−Ｈ）、５．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１−Ｈ）、４．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１″−Ｈ）、４．５０（１Ｈ，ｍ，４′−Ｈ）、４．５０（１Ｈ，ｍ，（４）′−Ｈ）、４．３０（１Ｈ，ｍ，５′−Ｈ）、４．３０（１Ｈ，ｍ，（５）′−Ｈ）、４．３０（１Ｈ，ｍ，（５）−ＣＨ２のＨ）、４．２５（１Ｈ，ｍ，２′−Ｈ）、４．２５（１Ｈ，ｍ，（２）−Ｈ）、４．２５（１Ｈ，ｍ，（２）′−Ｈ）、４．２０（１Ｈ，ｍ，（５）−ＣＨ２のＨ）、４．１８（１Ｈ，ｍ，５−ＣＨ２のＨ）、４．１６（１Ｈ，ｍ，（３）″−Ｈ）、４．０８（１Ｈ，ｍ，５−ＣＨ２のＨ）、４．０７（１Ｈ，ｍ，２−Ｈ）、４．０２（１Ｈ，ｍ，３′−Ｈ）、４．０２（１Ｈ，ｍ，（３）′−Ｈ）、３．８５（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ）、３．８５（１Ｈ，ｍ，（５）−Ｈ）、３．７８（１Ｈ，ｍ，３−Ｈ）、３．７８（１Ｈ，ｍ，（３）−Ｈ）、３．７６（１Ｈ，ｍ，４″−Ｈ）、３．７６（１Ｈ，ｍ，５″−Ｈ）、３．７５（１Ｈ，ｍ，４−Ｈ）、３．７５（１Ｈ，ｍ，（４）−Ｈ）、３．５８（１Ｈ，ｍ，３″−Ｈ）、３．５５（１Ｈ，ｍ，（２）″−Ｈ）、３．１８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２″−Ｈ）、１．１０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，（５）′−ＣＨ３のＨ３）、１．０９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，５′−ＣＨ３のＨ３）
糖組成  Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸：Ｄ−グルクロン酸：Ｄ−マンノース＝２：１：１：２（Ｌ−フコースとＤ−マンノース各２分子と不飽和Ｄ−グルクロン酸とＤ−グルクロン酸各１分子）
硫酸基  ６分子（各Ｌ−フコースの２位と４位及び各Ｄ−マンノースの６位）
なお、１Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（２１）の通りである。
2004339228.tif 000022
【００６１】
（ｆ）の物性
分子量  ６４４
ＭＳ  ｍ／ｚ  ６８７［Ｍ＋２Ｎａ−３Ｈ＋］−
ＭＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ９７［ＨＳＯ４］−、２４３［Ｌ−フコース硫酸−Ｈ＋］−、４２１［不飽和Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノース硫酸＋Ｎａ−Ｈ２Ｏ−２Ｈ＋］−
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２０）
δ５．６０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，４″−Ｈ）、５．２４（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，１−Ｈ）、５．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１′−Ｈ）、４．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１″−Ｈ）、４．４５（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．１，１０．４Ｈｚ，３′−Ｈ）、４．２０（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，２−Ｈ）、４．１４（２Ｈ，ｍ，５−ＣＨ２のＨ２）、４．１４（１Ｈ，ｍ，５′−Ｈ）、４．０９、（１Ｈ，ｍ，３″−Ｈ）、４．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，４′−Ｈ）、３．９１（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ）、３．８５（１Ｈ，ｍ，３−Ｈ）、３．８５（１Ｈ，ｍ，２′−Ｈ）、３．７５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，４−Ｈ）、３．５９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２″−Ｈ）、１．０６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，５′−ＣＨ３のＨ３）
糖組成  Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸：Ｄ−マンノース＝
１：１：１（Ｌ−フコースとＤ−マンノースと不飽和Ｄ−グルクロン酸各１分子）
硫酸基  ２分子（Ｌ−フコースの３位及びＤ−マンノースの６位）
なお、１Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（２２）の通りである。
2004339228.tif 000023
【００６２】
（ｇ）の物性
分子量  ６３２
ＭＳ  ｍ／ｚ  ６３１［Ｍ−Ｈ＋］−
ＭＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４０５［Ｄ−ガラクトースとＬ−フコース硫酸が結合したもの−Ｈ＋］−、５５１［Ｌ−フコース硫酸とＬ−フコースとＤ−ガラクトースが結合したもの−Ｈ＋］−
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２０）
δ５．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，Ｆ１１−Ｈ）、４．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，Ｆ２１−Ｈ）、４．５３（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝２．４，１０．４Ｈｚ，Ｆ１３−Ｈ）、４．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ  Ｇ１１−Ｈ）、４．４６（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．１，１０．７Ｈｚ，Ｆ２３−Ｈ）、４．３６（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ  Ｆ２  ５−Ｈ）、４．１４（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ  Ｆ１  ５−Ｈ）、４．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ  Ｆ１  ４−Ｈ）、４．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ  Ｆ２  ４−Ｈ）、３．９７（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝４．３，１０．４Ｈｚ，Ｆ１  ２−Ｈ）、３．９０（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ１  ４−Ｈ）、３．８１（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．７，１０．７Ｈｚ，Ｆ２  ２−Ｈ）、３．５９（１Ｈ，ｍ，Ｇ１  ３−Ｈ）、３．５９（１Ｈ，ｍ，Ｇ１  ５−Ｈ）、３．５９（２Ｈ，ｍ，Ｇ１  ５−ＣＨ２のＨ２）、３．５６（１Ｈ，ｍ，Ｇ１  ２−Ｈ）、１．１９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｆ１  ５−ＣＨ３のＨ３）、１．１４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｆ２  ５−ＣＨ３のＨ３）
糖組成  Ｌ−フコース：Ｄ−ガラクトース＝  ２：１
（Ｌ−フコース２分子とＤ−ガラクトース１分子）
硫酸基  ２分子（各Ｌ−フコースの３位）
なお、１Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（２３）の通りである。
2004339228.tif 000024
【００６３】
（ｈ）の物性
分子量  １３５８
ＭＳ  ｍ／ｚ  １４４５［Ｍ＋４Ｎａ−５Ｈ＋］−
ＭＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ９７［ＨＳＯ４］−、２２５［Ｌ−フコース硫酸−Ｈ２Ｏ−Ｈ＋］−、１１９７［Ｍ−２ＳＯ３−Ｈ＋］−
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２０）
δ５．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，Ｆ１  １−Ｈ）、４．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，Ｆ２  １−Ｈ）、４．６２（１Ｈ，ｍ，Ｇ２  １−Ｈ）、４．５９（１Ｈ，ｍ，Ｇ１  １−Ｈ）、４．５４（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝２．７，１０．６Ｈｚ，Ｆ１  ３−Ｈ）、４．４６（１Ｈ，ｍ，Ｆ２  ３−Ｈ）、４．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ  Ｇ３  １−Ｈ）、４．４１（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ１  ４−Ｈ）、４．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｇ４  １−Ｈ）、４．３７（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ  Ｆ２  ５−Ｈ）、４．２７（１Ｈ，ｍ，Ｇ１  ３−Ｈ）、４．２４（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ３  ４−Ｈ）、４．２１（１Ｈ，ｍ，Ｇ３  ３−Ｈ）、４．１９（１Ｈ，ｍ，Ｇ４  ３−Ｈ）、４．１５（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ４  ４−Ｈ）、４．１３（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｆ１  ５−Ｈ）、４．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，Ｆ１  ４−Ｈ）、４．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，Ｆ２  ４−Ｈ）、３．９８（１Ｈ，ｍ，Ｇ１  ５−ＣＨ２のＨ）、３．９６（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝４．３，１０．６Ｈｚ，Ｆ１  ２−Ｈ）、３．８８（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ２  ４−Ｈ）、３．９３（１Ｈ，ｍ，Ｇ３  ５−ＣＨ２のＨ）、３．８６（１Ｈ，ｍ，Ｇ１  ５−Ｈ）、３．８１（１Ｈ，ｍ，Ｆ２  ２−Ｈ）、３．８１（１Ｈ，ｍ，Ｇ１  ５−ＣＨ２のＨ）、３．８０（１Ｈ，ｍ，Ｇ３  ５−Ｈ）、３．８０（１Ｈ，ｍ，Ｇ３  ５−ＣＨ２のＨ）、３．６６（１Ｈ，ｍ，Ｇ２  ３−Ｈ）、３．６５（１Ｈ，ｍ，Ｇ１  ２−Ｈ）、３．６４（１Ｈ，ｍ，Ｇ２  ５−ＣＨ２のＨ）、３．６４（１Ｈ，ｍ，Ｇ４  ５−ＣＨ２のＨ）、３．６１（１Ｈ，ｍ，Ｇ４  ５−Ｈ）、３．５８（１Ｈ，ｍ，Ｇ２  ２−Ｈ）、３．５６（１Ｈ，ｍ，Ｇ２  ５−ＣＨ２のＨ）、３．５６（１Ｈ，ｍ，Ｇ４  ５−ＣＨ２のＨ）、３．５５（１Ｈ，ｍ，Ｇ４  ２−Ｈ）、３．５４（１Ｈ，ｍ，Ｇ２  ５−Ｈ）、３．５４（１Ｈ，ｍ，Ｇ３  ２−Ｈ）、１．２０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｆ１  ５−ＣＨ３のＨ３）、１．１４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，Ｆ２  ５−ＣＨ３のＨ３）
糖組成  Ｌ−フコース：Ｄ−ガラクトース＝１：２
（Ｌ−フコース２分子とＤ−ガラクトース４分子）
硫酸基  ５分子（各Ｌ−フコースの３位、還元性末端のＤ−ガラクトースの３位、及び還元性末端のＤ−ガラクトースの６位に結合したＤ−ガラクトースの３位、及びそのＤ−ガラクトースの６位に結合したＤ−ガラクトースの３位）
なお、１Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（２４）の通りである。
2004339228.tif 000025
【００６４】
（ｉ）の物性
分子量  １２８８
ＭＳ  ｍ／ｚ  １１４９［Ｍ＋Ｎａ−２ＳＯ３−２Ｈ＋］−
ＭＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ９７［ＨＳＯ４］−、３４５［Ｌ−フコースジ硫酸＋Ｎａ−２Ｈ＋］−、
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２０）
δ５．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，（４）″−Ｈ）、５．３４（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，（１）−Ｈ）、５．１９（１Ｈ，ｍ，１−Ｈ）、５．１９（１Ｈ，ｍ，（１）′−Ｈ）、４．９４（１Ｈ，ｍ，１′−Ｈ）、４．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，（１）″−Ｈ）、４．７２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ、１″−Ｈ）、４．５４（１Ｈ，ｍ，（４）′−Ｈ）、４．４８（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．３，１０．６Ｈｚ，３′−Ｈ）、４．３８（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，５′−Ｈ）、４．３４（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，（５）′−Ｈ）、４．２９（１Ｈ，ｍ，（２）′−Ｈ）、４．２０（１Ｈ，ｍ，５−ＣＨ２のＨ）、４．１４（１Ｈ，ｍ，（２）−Ｈ）、４．１３（１Ｈ，ｍ，（３）″−Ｈ）、４．０９（１Ｈ，ｍ，５−ＣＨ２のＨ）、４．０８（１Ｈ，ｍ，２−Ｈ）、４．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，４′−Ｈ）、３．９９（１Ｈ，ｍ，（３）′−Ｈ）、３．８９（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ）、３．８３（１Ｈ，ｍ，４″−Ｈ）、３．８１（１Ｈ，ｍ，２′−Ｈ）、３．８０（１Ｈ，ｍ，４−Ｈ）、３．７８（１Ｈ，ｍ，３−Ｈ）、３．７８（１Ｈ，ｍ，（３）−Ｈ）、３．６８（２Ｈ，ｍ，（５）−ＣＨ２のＨ２）、３．６２（１Ｈ，ｍ，（２）″−Ｈ）、３．６０（１Ｈ，ｍ，３″−Ｈ）、３．６０（１Ｈ，ｍ，５″−Ｈ）、３．５８（１Ｈ，ｍ，（５）−Ｈ）、３．５６（１Ｈ，ｍ，（４）−Ｈ）、３．１７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２″−Ｈ）、１．１５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，５′−ＣＨ３のＨ３）、１．１１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，（５）′−ＣＨ３のＨ３）
糖組成  Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸：Ｄ−グルクロン酸：Ｄ−マンノース＝２：１：１：２（Ｌ−フコースとＤ−マンノース各２分子と不飽和Ｄ−グルクロン酸とＤ−グルクロン酸各１分子）
硫酸基  ４分子（還元性末端のＤ−マンノースに結合したＬ−フコースの３位ともう一方のＬ−フコースの２位と４位及び還元性末端側のＤ−マンノースの６位）
なお、１Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（２５）の通りである。
2004339228.tif 000026
【００６５】
また、本発明の第１の発明である糖化合物は、本発明の第３の発明であるフコイダノバクター属に属する細菌から得られる菌体抽出物又は培養液上清をフコイダンに作用させた場合にも製造することができる。
本発明の第３の発明である菌株としては、フコイダノバクター属に属する本発明の菌株であればいかなる菌株でも良く、該菌株の具体例としては、例えば、フコイダノバクター・マリナス（Ｆｕｃｏｉｄａｎｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｉｎｕｓ）ＳＩ−００９８株が挙げられる。
【００６６】
本菌株は青森県の海水中より本発明者らが新たに検索して得た菌株で、その菌学的性質は次の通りである。
２．フコイダノバクター  マリナス  ＳＩ−００９８
ａ．形態的性質
（１）本菌は球〜短桿菌であり、時に双球菌の形態をとることがある。
幅      ０．５〜０．７μｍ
長さ    ０．５〜０．７μｍ
（２）胞子の有無      なし
（３）グラム染色性    陰性
ｂ．生理的性質
（１）生育の温度範囲
３７℃で生育できる。好適な生育温度は１５〜２８℃である。
（２）酸素に対する態度      好気性
（３）カタラーゼ        陽性
（４）オキシダーゼ      陰性
（５）ウレアーゼ        陰性
（６）加水分解
デンプン        陽性
ゼラチン        陰性
カゼイン        陰性
エスクリン      陽性
（７）硝酸塩の還元          陰性
（８）インドールの生成      陰性
（９）硫化水素の生成        陽性
（１０）ミルクの凝固        陰性
（１１）ナトリウムの要求性        陽性
（１２）塩類要求性
０％食塩培地での生育        陰性
１％食塩培地での生育        陰性
海水培地での生育            陽性
（１３）キノン系      メナキノン７
（１４）菌体内ＤＮＡのＧＣ含量      ６１％
（１５）細胞壁のジアミノピメリン酸      陰性
（１６）グリコリル試験        陰性
（１７）ヒドロキシ脂肪酸の存在          陽性
（１８）ＯＦ−テスト          Ｏ
（１９）集落の色調      特徴的な集落色素を生成せず
（２０）運動性      あり
（２１）滑走性      なし
（２２）鞭毛        極単毛
【００６７】
本菌株は、バージーズ  マニュアル  オブ  ディターミネイティブ  バクテリオロジー、第９巻（１９９４）記載の基本分類によればグループ４（グラム陰性好気性かん菌及び球菌）に分類される。しかしながら本菌株は、電子伝達鎖にメナキノン７を有し、ＧＣ含量が６１％の点でグループ４に属する菌と大いに異なる。基本的にグラム陰性細菌は電子伝達鎖にユビキノンを有し、グラム陽性細菌はメナキノンを有している。
【００６８】
グラム陰性細菌であるフラボバクテリウム属及びシトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）属は例外的に電子伝達鎖にメナキノンを有しているが、これらの属に属する細菌のＧＣ含量は、土壌細菌であるシトファーガ  アーベンシコラ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ａｒｖｅｎｓｉｃｏｌａ）が４３〜４６％、海洋細菌であるシトファーガ  ジフルエンス（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｄｉｆｆｌｕｅｎｓ）、シトファーガ  ファーメンタンス（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、シトファーガ  マリーナ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｍａｒｉｎａ）、及びシトファーガ  ウリギノーサ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｕｌｉｇｉｎｏｓａ）が４２％であり、本菌株の性質とは全く異なる。更に、本菌株と既同定株の１６ＳｒＤＮＡ配列の相同性を比較したところ、最も相同性の高い既同定株ベルコミクロビウム  スピノサム（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｓｐｉｎｏｓｕｍ）においてもその相同性は、７６．６％であった。１６ＳｒＤＮＡ配列の相同性が９０％以下の場合、両細菌の属が異なることは一般に広く知られていることから、本発明者らは、本菌株は既存の属に属さない新属の細菌であると断定し、よって本菌株をフコイダノバクター  マリナス  ＳＩ−００９８と命名した。
【００６９】
なお、上記菌株は  Ｆｕｃｏｉｄａｎｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＳＩ−００９８と表示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所〔あて名；日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）〕にＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０３（原寄託日；平成７年３月２９日、国際寄託日への移管請求日；平成８年２月１５日）として寄託されている。
【００７０】
本発明の第３の発明であるフコイダノバクター属細菌を培養し、その菌体抽出物、又は培養液上清をフコイダンに作用させることにより、本発明の第１の発明の糖化合物を遊離させることができる。培養する菌株としては、フコイダノバクター属に属し、その菌体抽出物又は培養液上清をフコイダンに作用させた場合、本発明の第１の発明である糖化合物が得られる菌株であればいかなる菌株でも良く、該菌株の具体例としては、例えば、Ｆｕｃｏｉｄａｎｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＳＩ−００９８株が挙げられる。
【００７１】
フコイダノバクター属細菌株の培地に加える栄養源は該菌株が利用し、該菌株がフコイダンから本発明の第１の発明である糖化合物の生成が可能な菌体内抽出物及び培養上清を生産するものであればよく、炭素源としては例えばフコイダン、海藻粉末、アルギン酸、フコース、グルコース、マンニトール、グリセロール、サッカロース、マルトース、ラクトース、デンプン等が利用でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、肉エキス、脱脂大豆、硫安、塩化アンモニウム等が適当である。その他にナトリウム塩、リン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩等の無機質、及び金属塩類を加えてもよい。
【００７２】
また本菌株は上記栄養源を含んだ海水あるいは人工海水中で非常に良く生育する。
【００７３】
本発明の第３の発明であるフコイダノバクター属細菌を培養するに当り、一般に培養温度は、１５℃〜３０℃、培地のｐＨは５〜９がよく、５〜７２時間の通気かくはん培養で、該菌株の菌体内抽出物及び培養上清のエンド型フコイダン分解酵素活性は最大に達する。培養条件は使用する菌株、培地組成に応じ、該菌株が生産する菌体内抽出物及び培養上清のエンド型フコイダン分解活性が最大になるように設定することは当然のことである。
【００７４】
フコイダノバクター属  ＳＩ−００９８株を適当な培地で培養し、培養終了後、遠心分離すれば菌体及び培養液上清が得られる。更に得られた菌体を通常用いられる細胞破壊手段、例えば、超音波破砕後、遠心分離すれば菌体抽出液が得られる。
【００７５】
限外ろ過により濃縮した培養液上清又は菌体抽出液を塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液と混合し、これにフコイダンを加え、反応させる。
【００７６】
反応終了後、反応液を分子量分画用のカラムを用いて分画することにより本発明の第１の発明である糖化合物を得ることができる。
【００７７】
本発明の第１の発明である糖化合物は糖鎖工学用試薬として有用であり、特公平５−６５１０８号記載の方法によりＰＡ化を行い、ＰＡ化物を調製すれば、糖鎖工学用試薬として極めて有用な物質が提供される。更に本発明の糖化合物は抗ガン剤、癌転移抑制剤、抗ウィルス剤としての生理活性の適用が期待される。
【００７８】
本発明を実施するための最良の形態
以下に、本発明の第１の発明である糖化合物の例の製造方法を実施例をもって示すが本発明が以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。
【００７９】
実施例１
フラボバクテリウム  ｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）を、グルコース０．１％、ペプトン１．０％、酵母エキス０．０５％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）ｐＨ７．５からなる培地６００ｍｌを分注して殺菌した（１２０℃、２０分）２リットルの三角フラスコに接種し、２４℃で２０時間培養して種培養液とした。ガゴメ昆布由来のフコイダン０．３％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．０１％、及び消泡剤（信越化学工業製ＫＭ７０）０．０１％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）ｐＨ７．５からなる培地２０リットルを３０リットル容のジャーファーメンターに入れ１２０℃で２０分殺菌した。冷却後、上記の種培養液６００ｍｌを接種し、２４℃で２０時間、毎分１０リットルの通気量と毎分１２５回転のかくはん速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養液上清を得た。
【００８０】
この培養液上清を限外ろ過（ろ過膜の排除分子量１万）（アミコン社製）により濃縮し、本発明のエンド型フコイダン分解酵素を測定したところ培養液１ｍｌ当り６ミリユニットの活性が検出された。
【００８１】
一方、本培養で得られた菌体を、２００ｍＭの食塩を含む２０ｍＭの酢酸−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して菌体抽出液を得た。この菌体抽出液中の本発明のエンド型フコイダン分解酵素の活性を測定したところ、培地１ｍｌ中に２０ｍＵの活性が検出された。
【００８２】
上記の培養液上清の濃縮液に、終濃度が９０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、かくはん溶解後遠心分離し、沈殿を上記菌体抽出液と同じ緩衝液に懸濁して、５０ｍＭの食塩を含む２０ｍＭの酢酸−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で十分透析した。透析により生じた沈殿を遠心分離により除去後、あらかじめ５０ｍＭの食塩を含む２０ｍＭの酢酸−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＦＦのカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液にて十分洗浄後、５０ｍＭから６００ｍＭの食塩のグラジエントにより溶出させ、活性画分を集めた。次にこの活性画分に終濃度が４Ｍとなるように食塩を加え、あらかじめ４Ｍの食塩を含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したフェニルセファロース  ＣＬ−４Ｂのカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液で十分洗浄後、４Ｍから１Ｍの食塩のグラジエントにより溶出させ、活性画分を集めた。次にこの活性画分を限外ろ過器（アミコン社製）で濃縮後、あらかじめ５０ｍＭ食塩を含む１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したセファクリル  Ｓ−２００でゲルろ過を行い活性画分を集めた。次にこの活性画分に終濃度が３．５Ｍとなるように食塩を加え、あらかじめ３．５Ｍの食塩を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡化したフェニルセファロース  ＨＰのカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液で洗浄後、３．５Ｍから１．５Ｍの食塩のグラジエントにより溶出させ、活性画分を集めて精製酵素を得た。この酵素の分子量をセファクリル  Ｓ−２００の保持時間から求めたところ約７万であった。以上の精製工程を表１に示す。
【００８３】
【表１】
2004339228.tif 000027
【００８４】
実施例２
フラボバクテリウム  ｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）をグルコース０．２５％、ペプトン１．０％、酵母エキス０．０５％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）ｐＨ７．５からなる培地６００ｍｌを分注して殺菌した（１２０℃、２０分）２リットルの三角フラスコに接種し、２４℃で２４時間培養して種培養液とした。グルコース０．２５％、ペプトン１．０％、酵母エキス０．０５％、及び消泡剤（信越化学工業製ＫＭ７０）０．０１％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）ｐＨ７．５からなる培地２０リットルを３０リットル容のジャーファーメンターに入れ１２０℃で２０分殺菌した。冷却後、上記の種培養液６００ｍｌを接種し、２４℃で２４時間、毎分１０リットルの通気量と毎分１２５回転のかくはん速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養液上清を得た。
【００８５】
この培養液上清を限外ろ過（ろ過膜の排除分子量１万）（アミコン社製）により濃縮し、本発明のエンド型フコイダン分解酵素を測定したところ培養液１ｍｌ当り１ｍＵの活性が検出された。
【００８６】
一方、本培養で得られた菌体を、２００ｍＭの食塩を含む２０ｍＭの酢酸−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して菌体抽出液を得た。この菌体抽出液中の本発明のエンド型フコイダン分解酵素の活性を測定したところ、培地１ｍｌ中に５ｍＵの活性が検出された。
【００８７】
本抽出液に、終濃度が９０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、かくはん溶解後遠心分離し、沈殿を上記菌体抽出液と同じ緩衝液に懸濁して、５０ｍＭの食塩を含む２０ｍＭの酢酸−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で十分透析した。透析により生じた沈殿を遠心分離により除去後、あらかじめ５０ｍＭの食塩を含む２０ｍＭの酢酸−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＦＦのカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液にて十分洗浄後、５０ｍＭから６００ｍＭの食塩のグラジエントにより溶出させ、活性画分を集めた。次にこの活性画分に終濃度が４Ｍとなるように食塩を加え、あらかじめ４Ｍの食塩を含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したフェニルセファロースＣＬ−４Ｂのカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液で十分洗浄後、４Ｍから１Ｍの食塩のグラジエントにより溶出させ、活性画分を集めた。次にこの活性画分を限外ろ過器で濃縮後、あらかじめ５０ｍＭ食塩を含む１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したセファクリル  Ｓ−３００でゲルろ過を行い活性画分を集めた。この酵素の分子量をセファクリル  Ｓ−３００の保持時間から求めたところ約４６万であった。次にこの活性画分に２５ｍＭの食塩を含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）で透析した。この酵素液を、あらかじめ２５０ｍＭの食塩を含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したモノ（Ｍｏｎｏ）  Ｑ  ＨＲ５／５のカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液で十分洗浄後、２５０ｍＭから４５０ｍＭの食塩のグラジエントにより溶出させ、活性画分を集め、精製酵素を得た。以上の精製工程を表２に示す。
【００８８】
【表２】
2004339228.tif 000028
【００８９】
実施例３
精製したガゴメ昆布由来のフコイダンに本発明の実施例１で得られたエンド型フコイダン分解酵素（菌体内酵素）を作用させ分解物の調製を行った。
すなわち、２．５％のフコイダン溶液１６ｍｌと、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１２ｍｌと４Ｍの塩化ナトリウム４ｍｌと３２ｍＵ／ｍｌの本発明のエンド型フコイダン分解酵素溶液８ｍｌを混合し、２５℃で４８時間反応させた。
反応液をセルロファインＧＣＬ−３００（生化学工業社製）のカラムにより分子量分画し、分子量２０００以下の画分を集めた。この画分をマイクロアシライザーＧ３（旭化成社製）により脱塩後、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦにより３つの画分に分離した。この結果前記した物質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）をそれぞれ４１ｍｇ、６９ｍｇ、及び９．６ｍｇ得た。
【００９０】
実施例４
精製したガゴメ昆布由来のフコイダンに本発明の実施例２で得られたエンド型フコイダン分解酵素（菌体外酵素）を作用させ分解物の調製を行った。
【００９１】
すなわち、２．５％のフコイダン溶液１６ｍｌと、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１２ｍｌと４Ｍの塩化ナトリウム４ｍｌと３２ｍＵ／ｍｌの本発明のエンド型フコイダン分解酵素溶液８ｍｌを混合し、２５℃で４８時間反応させた。
【００９２】
反応液をセルロファインＧＣＬ−３００（生化学工業社製）のカラムにより分子量分画し、分子量２０００以下の画分を集めた。この画分をマイクロアシライザーＧ３（旭化成社製）により脱塩後、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦにより３つの画分を分離し、凍結乾燥した。この結果前記した物質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）をそれぞれ４０ｍｇ、６５ｍｇ、及び９．２ｍｇ得た。
【００９３】
実施例５
フコイダノバクター  マリナス  ＳＩ−００９８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０３）を、ガゴメ昆布由来のフコイダン０．３％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．０５％、及び消泡剤（信越化学工業製ＫＭ７０）０．０１％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）ｐＨ７．５からなる培地６００ｍｌを２リットル容の三角フラスコに入れ１２０℃で２０分殺菌した培地に接種し、２５℃で４８時間、毎分１２０回転のかくはん速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養液上清を得た。
【００９４】
この培養液上清を限外ろ過（ろ過膜の排除分子量１万）（アミコン社製）により濃縮し、本発明のエンド型フコイダン分解酵素を測定したところ培養液１ｍｌ当り０．２ｍＵ活性が検出された。
【００９５】
一方、本培養で得られた菌体を、２００ｍＭの食塩を含む２０ｍＭの酢酸−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して菌体抽出液を得た。この菌体抽出液中の本発明のエンド型フコイダン分解酵素の活性を測定したところ、培地１ｍｌ中に２０ｍＵの活性が検出された。
【００９６】
実施例６
精製したガゴメ昆布由来のフコイダンに本発明の実施例５で得られたフコイダノバクター  マリナス  ＳＩ−００９８株の菌体内酵素を作用させ分解物の調製を行った。
【００９７】
すなわち、２．５％のフコイダン溶液１６ｍｌと、８００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）２０ｍｌと２０ｍＵ／ｍｌの本発明の実施例５で得られたフコイダノバクター  マリナス  ＳＩ−００９８株の菌体内酵素溶液４ｍｌを混合し、２５℃で４８時間反応させた。
【００９８】
反応液をセルロファインＧＣＬ−３００のカラムにより分子量分画し、分子量２０００以下の画分を集めた。この画分をマイクロアシライザーＧ３により脱塩後、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦにより３つの画分を分離し、凍結乾燥した。この結果前記した物質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）をそれぞれ３８ｍｇ、６０ｍｇ、及び８．２ｍｇ得た。
【００９９】
本発明により、フコイダンの構造解析、フコイダンの酵素分解物の同定、及び生物活性の検索に用いることができる糖化合物、フコイダンの部分分解及びフコイダンオリゴ糖の生産などフコイダンに関する研究に有用な新規なエンド型のフコイダン分解酵素及び糖化合物の製造に有用な新規微生物が提供された。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】糖化合物（ａ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（ＰＡ−ａ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
【図２】糖化合物（ｂ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（ＰＡ−ｂ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
【図３】糖化合物（ｃ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（ＰＡ−ｃ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
【図４】糖化合物（ｄ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（ＰＡ−ｄ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
【図５】糖化合物（ｅ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（ＰＡ−ｅ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
【図６】糖化合物（ｆ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（ＰＡ−ｆ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
【図７】糖化合物（ｇ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（ＰＡ−ｇ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
【図８】糖化合物（ｈ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（ＰＡ−ｈ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
【図９】糖化合物（ｉ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（ＰＡ−ｉ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
【図１０】糖化合物（ａ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
【図１１】糖化合物（ｂ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
【図１２】糖化合物（ｃ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
【図１３】糖化合物（ｄ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
【図１４】糖化合物（ｅ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
【図１５】糖化合物（ｆ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
【図１６】糖化合物（ｇ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
【図１７】糖化合物（ｈ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
【図１８】糖化合物（ｉ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
【図１９】糖化合物（ａ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
【図２０】糖化合物（ｂ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
【図２１】糖化合物（ｃ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
【図２２】糖化合物（ｄ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
【図２３】糖化合物（ｅ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
【図２４】糖化合物（ｆ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
【図２５】糖化合物（ｇ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
【図２６】糖化合物（ｈ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
【図２７】糖化合物（ｉ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
【図２８】糖化合物（ａ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す図である。
【図２９】糖化合物（ｂ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す図である。
【図３０】糖化合物（ｃ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す図である。
【図３１】糖化合物（ｄ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す図である。
【図３２】糖化合物（ｅ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す図である。
【図３３】糖化合物（ｅ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す図である。
【図３４】糖化合物（ｇ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す図である。
【図３５】糖化合物（ｈ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す図である。
【図３６】糖化合物（ｉ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す図である。
【図３７】本発明の第２の発明である酵素のｐＨと相対活性（％）の関係を表す図である。
【図３８】本発明の第２の発明である酵素の反応温度（℃）と相対活性（％）の関係を表す図である。
【図３９】本発明の第２の発明である酵素を処理したｐＨと残存活性（％）の関係を表す図である。
【図４０】本発明の第２の発明である酵素の処理温度（℃）と残存活性（％）の関係を表す図である。
【図４１】糖化合物（ａ）〜（ｉ）をＤＥＡＥ−セファロースＦＦにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
【図４２】糖化合物（ｈ）及び（ｉ）をＤＥＡＥ−セファロースＦＦにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2004339228.tif 000040
【図７】
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【図８】
2004339228.tif 000042
【図９】
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【図１０】
2004339228.tif 000044
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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