(57)【要約】　　　（修正有）【課題】発現効率、操作性、安定性、形質転換体の判別が容易な性質を有する乳酸菌用シャトルベクターの提供。【解決手段】ラクトバチルス・カゼイ由来のプラスミドであって、ラクトースオペロンをコードする遺伝子と、複製必須領域と、反復配列とを有することを特徴とするプラスミド；該プラスミドの複製必須領域を含むＤＮＡと、大腸菌のプラスミド由来の複製必須領域を含むＤＮＡと、大腸菌と乳酸菌で機能する薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡとを有することを特徴とする乳酸菌用シャトルベクター。【効果】本発明の乳酸菌用シャトルベクターは、従来のシャトルベクターに比べて宿主中での安定性が高く、また操作性にも優れることから、食品又は医薬品を製造するためのベクターとして有用である。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・カゼイ由来のプラスミドであって、配列番号１で示されるラクトースオペロンをコードする遺伝子と、配列番号２で示される複製必須領域と、配列番号３で示される反復配列とを有することを特徴とするプラスミド。
【請求項２】
図１の制限酵素地図で示されるプラスミドｐＬＹ１０１。
【請求項３】
配列番号２で示されるラクトバチルス・カゼイ由来のプラスミドの複製必須領域を含むＤＮＡと、大腸菌のプラスミド由来の複製必須領域を含むＤＮＡと、大腸菌及び乳酸菌で機能する薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡとを有することを特徴とする乳酸菌用シャトルベクター。
【請求項４】
配列番号２で示されるラクトバチルス・カゼイ由来のプラスミドの複製必須領域を含むＤＮＡが、配列番号４で示されるＤＮＡ断片である請求項３記載のシャトルベクター。
【請求項５】
請求項１若しくは２記載のプラスミド又は請求項３若しくは４記載シャトルベクターを含む形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、食経験のある乳酸菌由来のプラスミド及び当該プラスミド由来の遺伝子を含むシャトルベクターに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
乳酸菌製剤の製造や発酵乳、チーズなどの製造には獣乳を培地として、乳酸菌が培養されるが、この時、乳酸菌の有する生理効果、例えば整腸効果や免疫賦活効果を得るために、乳酸菌の生菌数を高くすることが好ましい。
しかし、培養を長期間継続すると、経済性、作業性が悪く、乳酸蓄積による酸度上昇のため、生菌数が増加し難い。そこで、増殖効率を高める目的で、クロレラエキス、ビタミン類、ペプチド類等の増殖促進物質を培地に添加することが行われているが、これらの添加には、発酵乳等の風味への影響やコストの上昇といった問題があった。また、近年、遺伝子操作技術が急速に発展していることから、ベクターの移入等により乳酸菌の増殖能を高めることも期待されるが、現状では、菌の増殖に関わる遺伝子が特定できておらず、このような遺伝子操作による増殖性の向上は行われていない。
【０００３】
一方、インビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）の遺伝子操作においては、所望の外来遺伝子を宿主細胞に移入させ、その遺伝子情報を発現させるには、宿主細胞に適合したベクターを使用することが必要とされるが、乳酸菌においては、形質転換能が低い、ＤＮＡの抽出が容易でない等の理由により、大腸菌や枯草菌とは異なり、専ら乳酸菌及び他の菌の両方で複製可能なシャトルベクターとしての開発が試みられ、例えばｐＢＥ３１（特許文献１参照）やｐＨ４６１１（特許文献２参照）が知られている。
【０００４】
乳酸菌用シャトルベクターは、研究用途での使用のみならず、有用な外来遺伝子を宿主乳酸菌に導入し、これを発現させることによる乳酸菌の機能性向上等の観点からも期待されている。例えば、本出願人は、前記ｐＢＥ３１を用いてコレラ菌の線毛（ｔｏｘｉｎ　ｃｏｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｐｉｌｉ：ＴＣＰ）の構成タンパク質であるＴｃｐＡを菌体表層に発現させたラクトバチルス・カゼイを作製し、これをマウスの腹腔内へ投与することにより、血清の抗ＴｃｐＡ抗体価が上昇することを確かめている。このことは、シャトルベクターにより形質転換された宿主乳酸菌が、異種蛋白質を発現し、それがワクチンとしての活性を有することを示しており、医薬用途への利用の可能性を示唆するものである。
【０００５】
しかしながら、従来の乳酸菌用シャトルベクターは、発現効率が十分でない、コロニー形成まで時間がかかる、ベクターが宿主中で不安定である等の問題を有していた。また、遺伝子操作により機能性等を向上させた乳酸菌について、ヒトへの利用を考慮した場合には、安全性の面から、ベクターとして食経験のある乳酸菌由来のプラスミド等を用いたものを利用し、乳酸菌の形質転換を行うことが望ましいが、既存のベクターには、そのようなものはなく、食経験豊富な乳酸菌由来のベクターを得ることが期待されている。
【０００６】
【特許文献１】
特開平６−２５３８６１号公報
【特許文献２】
特開平４−５８８９号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、乳酸菌の増殖性を高める遺伝子上の知見を得るとともに、発現効率、操作性、安定性、形質転換体（組換体）の判別が短時間に行える等の性質を持った良好な乳酸菌用シャトルベクターを提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、食経験豊富な乳酸菌であるラクトバチルス・カゼイにはプラスミドが存在し、当該プラスミドにより菌の増殖が高められていることを見出すと共に、当該プラスミド由来の複製必須領域を用いた乳酸菌用シャトルベクターが、優れた安定性、操作性、発現効率等を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、ラクトバチルス・カゼイ由来のプラスミドであって、配列番号１で示されるラクトースオペロンをコードする遺伝子と、配列番号２で示される複製必須領域と、配列番号３で示される反復配列とを有することを特徴とするプラスミドを提供するものである。
【００１０】
また本発明は、上記配列番号２で示されるラクトバチルス・カゼイ由来のプラスミドの複製必須領域を含むＤＮＡと、大腸菌のプラスミド由来の複製必須領域を含むＤＮＡと、大腸菌及び乳酸菌で機能する薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡとを有することを特徴とする乳酸菌用シャトルベクターを提供するものである。
【００１１】
更に本発明は、上記プラスミド又はシャトルベクターを含む形質転換体を提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明プラスミドは、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ）から単離し得るプラスミドであり、配列番号１で示されるラクトースオペロンをコードする遺伝子と、配列番号２で示される複製必須領域と、配列番号３で示される反復配列とを有する。
ラクトバチルス・カゼイとしては、例えばラクトバチルス・カゼイ　ＹＩＴ９０２９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１３６６）が挙げられ、それから得られたプラスミドｐＬＹ１０１が本発明のプラスミドに包含される。
【００１３】
本発明のプラスミドに含まれる遺伝子領域のうち、配列番号２で示されるＤＮＡ領域は、複製必須領域、すなわちプラスミドの自律複製に必須な領域であり、複製開始部位及び複製蛋白質遺伝子（ｒｅｐ遺伝子）を含む。
また、配列番号１で示されるＤＮＡ領域は、乳糖資化に必要な遺伝子を含むラクトースオペロンをコードする遺伝子領域であり、配列番号３で示されるＤＮＡ領域は、２８２塩基対を単位とする１４回の反復配列を有する。
そして、このプラスミドは、後記実施例３に示すように、それを含む乳酸菌の増殖能を向上させる作用を有する。
【００１４】
本発明プラスミドは、通常用いられる遺伝子工学的手法に従って、ラクトバチルス・カゼイから分離して調製することができる。例えば、ラクトバチルス・カゼイ　ＹＩＴ９０２９株を培養し、次いでこれを集菌し、これを乳酸菌を溶菌させる公知の方法、例えばＮ−アセチルムラミダーゼ、リゾチームを用いて溶菌し、得られた溶菌物から、例えば塩化セシウム−臭化エチジウム密度勾配遠心分離のような通常用いられる方法によって、プラスミドを分離・精製することにより得ることができる。
【００１５】
培養は、通常乳酸菌に用いられる培地や培養条件により行えばよいが、例えば、培地として、乳糖を添加したＭＲＳ培地等を用い、静置培養等の培養法により、約３４℃〜３７℃の範囲で、通常約１日間〜約２日間培養するのが好ましい。
【００１６】
得られたプラスミドは、公知のプラスミドと同様に、制限酵素による切断、リガーゼによるライゲーション等の遺伝子操作を行うことができる。
【００１７】
プラスミドの構造決定は、通常の遺伝子工学的手法に準じた方法を用いることができる。すなわち、本発明プラスミドの各種制限酵素消化断片を大腸菌を宿主生物とするプラスミドベクターに挿入し、大腸菌を形質転換した後、当該プラスミドベクターのＤＮＡを抽出し、これを市販の塩基配列決定装置（シーケンサー）に供する。決定された塩基配列は市販のパーソナルコンピュータ用の遺伝子解析ソフトウェアなどを使用すれば、制限酵素地図の作成や既往の核酸塩基配列データとの比較検討などを行うことができる。
【００１８】
ラクトバチルス・カゼイ　ＹＩＴ９０２９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１３６６）から単離されたプラスミドｐＬＹ１０１は、約６６．８Ｋｂの大きさを持ち、その制限酵素地図は図１に示すとおりである。
【００１９】
本発明のプラスミドの複製必須領域を含むＤＮＡと、大腸菌等の細菌で自律複製可能なプラスミドの複製必須領域を含むＤＮＡとを連結し、乳酸菌及び大腸菌の双方で自律複製可能なシャトルベクターとすることにより、プラスミドの調製、目的遺伝子を組み込んだ組換えプラスミドの調製等の操作を大腸菌を用いて行うことができる。
すなわち、本発明の乳酸菌用シャトルベクターは、配列番号２で示されるラクトバチルス・カゼイ由来のプラスミドの複製必須領域を含むＤＮＡと、大腸菌のプラスミド由来の複製必須領域を含むＤＮＡと、大腸菌及び乳酸菌で機能する薬剤耐性遺伝子とを連結させてなり、乳酸菌及び大腸菌の双方で複製可能なものである。
【００２０】
配列番号２で示される複製必須領域を含むＤＮＡ及び大腸菌のプラスミド由来の複製必須領域を含むＤＮＡは、複製必須領域を含むものであれば当該プラスミドの全体であってもよく、或いは一断片であってもよい。例えば、配列番号２で示される複製必須領域を含むＤＮＡとしては、配列番号２で示される複製必須領域の他に、ｐＵＣ１９由来の複製必須領域、ｐＡＭβ１由来のエリスロマイシン耐性遺伝子等を含むＤＮＡ断片（ｐ１０１−Ｐｖｕ、配列番号４）等が挙げられる。
【００２１】
大腸菌で自律複製可能なプラスミドとしては、制限酵素地図、配列等が良く知られている、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８、ｐＡＣＹＣ１７７等が挙げられ、複製必須領域として、複製開始部位とｒｅｐ遺伝子を含み、更にマルチクローニングサイトを含むｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１７７等が好ましく、特にｐＵＣ１９が好ましい。
【００２２】
また、本発明のプラスミド若しくはシャトルベクター又はそれらの一部に、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を含むＤＮＡを連結することにより、形質転換体中でのマーカー遺伝子の表現型によって、形質転換体の検出が容易となる。乳酸菌及び大腸菌に使用可能なマーカー遺伝子としては、エリスロマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００２３】
斯かる本発明の乳酸菌用シャトルベクターは、例えば、ラクトバチルス・カゼイ　ＹＩＴ９０２９から単離されたプラスミドｐＬＹ１０１を、適当な制限酵素で切断し、得られた断片を大腸菌で複製可能でありかつ大腸菌と乳酸菌で選択可能なマーカー遺伝子を持つプラスミドに挿入し、大腸菌内で増やした後乳酸菌に形質転換することにより製造することができる。
【００２４】
かくして得られる本発明の乳酸菌用シャトルベクターの例としては、図４に示す制限酵素地図を有するｐＣＡＴ１−１が挙げられる。
【００２５】
本発明のプラスミド及びシャトルベクターは、ラクトバチルス・カゼイをはじめとする乳酸菌及び大腸菌中で複製できるので、常法によりこれらのプラスミド又はシャトルベクターのいずれかの位置に外来遺伝子を挿入し、得られる組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換すれば、その外来遺伝子の遺伝情報を宿主微生物内で発現させることが可能となる。
【００２６】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２７】
実施例１
ラクトバチラス・カゼイＹＩＴ９０２９からのプラスミドｐＬＹ１０１の単離
プラスミドの抽出は、文献（Ａｐｐ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　５３：　２９８７−２９９１，　１９８７）に従って行った。即ち、０．１％ブドウ糖を含むＩＬＳ培地で３４℃、定常期初期まで培養した菌体を集菌、洗浄し、同量の１Ｍ蔗糖を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）に懸濁した。リゾチームとＮ−アセチルムラミダーゼＳＧをそれぞれ４０μｇ／ｍｌ及び２μｇ／ｍｌになるよう加え、３７℃、２０分間保温してプロトプラストを作製した。プロトプラストを２５分の１量の５０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）−２０ｍＭＥＤＴＡ溶液に懸濁し、ＳＤＳを０．１％になるよう加え、６０℃、１０分間インキュベートして溶菌した。溶菌液のアルカリ処理、中和処理、フェノール抽出をＡｎｄｅｒｓｏｎ　ａｎｄ　ＭｃＫａｙの方法（Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　４６：　５４９−５５２，　１９８３）に従って行った後、２度の塩化セシウム−臭化エチジウム密度勾配遠心分離によりプラスミドＤＮＡを精製した。
【００２８】
実施例２　ｐＬＹ１０１のシークエンシング
ｐＬＹ１０１のＤＮＡをＤＮＡ分解酵素Ｉ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　　Ｉ）で部分分解して得たＤＮＡ断片をベクターＭ１３ｍｐ１８にクローン化し、各クローンからＤＮＡを調製した。ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（ＰＥバイオシステムズ社）でシークエンシング反応を行い、ＡＢＩ３７７型ＤＮＡシークエンサー（ＰＥバイオシステムズ社）で塩基配列の読み取りを行った。塩基配列データの編集連結はソフトウェアＡｕｔｏＡｓｓｅｍｂｌｅｒ（ＰＥバイオシステムズ社）を用いて行った。
【００２９】
得られたプラスミドＤＮＡ（ｐＬＹ１０１）の全塩基配列からコンピューターにより制限酵素切断部位を検索し、まとめたものが図１の制限酵素地図である。全体の長さは約６６．８キロ塩基対（Ｋｂ）である。
【００３０】
また、塩基配列データから検索したＯＲＦ（Ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ）のうち、公開されている遺伝子配列データベースと相同性検索をすることにより、乳糖資化に必要な遺伝子を含むラクトースオペロン（配列番号１）及びＤＮＡ複製起点とＤＮＡ複製に必須の遺伝子が隣接している複製必須領域（配列番号２）を同定した。また、反復配列の検索から、２８２塩基対を単位とする１４回の反復配列（配列番号３）を見出した。
【００３１】
実施例３　ラクトバチルス・カゼイＹＩＴ９０２９とｐＬＹ１０１が欠失した株との増殖性の比較
ラクトバチルス・カゼイＹＩＴ９０２９を、ブドウ糖を糖源とした培地で長期間継代培養するとｐＬＹ１０１が欠失した株ラクトバチルス・カゼイＹＩＴ０２９１が得られた。この株は乳糖を糖源とした培地では増殖できない。しかし、この株を、乳糖を糖源とした寒天培地で培養することにより乳糖を資化できる様な復帰株ラクトバチルス・カゼイＹＩＴ１００２４が得られた。即ち、ｐＬＹ１０１を有しているのはラクトバチルス・カゼイＹＩＴ９０２９だけで、他の２株（ラクトバチルス・カゼイＹＩＴ０２９１とラクトバチルス・カゼイＹＩＴ１００２４）はｐＬＹ１０１を有していない。以下に、この３株を用いて乳糖を糖源とした培地での増殖性を比較した。
ＭＲＳ培地で前培養した菌体を生理的食塩水で２回洗浄後、ＢａｓｅＬＴ培地に２％接種し、経時的にクレット値を測定しながら２４時間培養した。クレット値の経時変化を図２に示す。
用いたＢａｓｅＬＴ培地の組成は表１の通りである。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
ＹＩＴ９０２９が良い増殖を示したのに対し、ＹＩＴ０２９１は低い増殖性しか示さなかった。乳糖を資化できるとされているＹＩＴ１００２４はＹＩＴ９０２９とＹＩＴ０２９１の中間の値を示したが、増殖性はＹＩＴ９０２９のレベルまで回復しなかった。ＹＩＴ９０２９とＹＩＴ１００２４の、乳糖培地での増殖性の差は、ＹＩＴ９０２９が有しているｐＬＹ１０１の為であると考えられる。更に、２４時間後の培養上清のｐＨを比較した。表２にその結果を示す。ＹＩＴ０２９１では、ｐＨの低下は僅かであったが、ＹＩＴ１００２４及びＹＩＴ９０２９では、大きく酸性側に傾いていた。ここでも、ＹＩＴ１００２４とＹＩＴ０９２９とでは、ｐＨの下がり具合に違いが見られた。
【００３４】
【表２】
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【００３５】
次にこのｐＨの変化は何によるものかを調べる為に、２４時間後の培養上清の有機酸測定を行った。酢酸、コハク酸は僅かながら検出されたが、ここでは主要の有機酸である乳酸の値のみを表３に示す。
【００３６】
【表３】
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【００３７】
ＢａｓｅＬＴ培地での増殖性・ｐＨ・有機酸濃度のどの項目を見てもＹＩＴ１００２４とＹＩＴ９０２９には違いが見られた。両株とも乳糖を資化し得るが、その資化性に関しては差があり、その差はプラスミドｐＬＹ１０１を保持しているか否かの差である。
乳酸菌は乳糖などの糖源を資化して乳酸を産生する事が特徴であり、工業的にも乳酸菌が産生する乳酸は重要であり、効率良く乳酸を産生する菌は有用性が高い。以上、プラスミドｐＬＹ１０１を有する事により、乳糖を糖源とした培地（例えば、脱脂粉乳培地）で優れた増殖性を発揮し、効率良く乳酸を産生する事が判明し、ｐＬＹ１０１の有用性が明らかにされた。
【００３８】
実施例４　シャトルベクターｐＣＡＴ１−１の作製
大腸菌で複製するベクターｐＮＤＥ４（特願２００２−０４３４１４号明細書）を制限酵素ＢｓｐＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、エリスロマイシン耐性遺伝子を含む１７６８ｂｐの断片を得た。大腸菌で複製するプラスミドｐＢＲ３２２を制限酵素ＢｓｐＨＩとＡｖａＩで切断し、大腸菌用複製領域を含む１４１４ｂｐの断片を得た。両断片を連結し、ｐＢＲＥ１とした。ｐＢＲＥ１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑化した後再連結することによって、ＨｉｎｄＩＩＩサイトがＮｈｅＩサイトに変換したｐＢＲＥ２を得た。ｐＢＲＥ２を制限酵素ＢａｍＨＩとＳｐｈＩで切断し、ｐＳＧ−ＴＥＲＭ（特開平１０−１１７７８３号公報）を制限酵素ＢａｍＨＩとＮｓｐＶで切断して得られたエリスロマイシン耐性遺伝子由来プロモーターを含む１２０ｂｐの断片と、黄色ブドウ球菌由来のプラスミドｐＣ１９４のクロラムフェニコール耐性遺伝子をＰＣＲで増幅して得られた７２２ｂｐのＮｓｐＶ−ＳｐｈＩ断片を挿入して、ｐＢＲＥ３−ｃａｔを得た。ｐＢＲＥ３−ｃａｔをＮｈｅＩで切断後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑化し、同じく平滑化したｐＬＹ１０１の複製領域を含む４９８３ｂｐのＰｖｕＩ断片（配列番号２）と連結して、ｐＣＡＴ１−１を得た（図３、図４）。
【００３９】
実施例５　シャトルベクターｐＣＡＴ１−１の安定性
シャトルベクターｐＣＡＴ１−１を保持したラクトバチルス・カゼイＹＩＴ９０２９をエリスロマイシンを含むＭＲＳ培地で定常期（２〜５×１０９ｃｆｕ／ｍｌ）まで培養し、薬剤を含まないＭＲＳ培地で１０６倍に希釈したのち再び定常期に達するまで３６〜４８時間培養した。それを適宜希釈し、薬剤を含まないＭＲＳ寒天培地上でコロニーを作らせ、そのうち１６４コロニーをエリスロマイシンを含む同寒天培地に釣菌した。その結果、薬剤耐性を保持してコロニーを形成し得たものは、１６４個中１６１個であり、耐性保持率は９８．２％であった。一方、エンテロコッカス・フェカリス由来のプラスミドｐＡＭβ１の複製領域を持つシャトルベクターｐＳＡＫ−ＮＳ（特開平１０−１１７７８３号公報）を保持したラクトバチルス・カゼイＹＩＴ９０２９株について同様の操作を行った。その結果、調べた１５４個のコロニーのうち薬剤耐性を保持していたものは１３個であり、耐性保持率は８．４％であった。以上の結果から、ｐＬＹ１０１の複製領域を持つシャトルベクターがラクトバチルス・カゼイＹＩＴ９０２９内で安定に保持されることが明らかとなり、ｐＡＭβ１の複製領域を持つベクターに比べて優れていることがわかった。
【００４０】
【配列表】
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【００４１】
【発明の効果】
本発明プラスミドは、乳酸菌の増殖能を向上させる作用を有し、食経験のある乳酸菌から分離されたものであることから安全性も高い。そして、当該プラスミドを用いて構築された乳酸菌用シャトルベクターは、従来のシャトルベクターに比べて宿主中での安定性が高く、また操作性にも優れることから、食品又は医薬品を製造するためのベクターとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、プラスミドｐＬＹ１０１の制限酵素地図である。
【図２】図２は、各菌株のクレット値の変化を示すグラフである。
【図３】図３は、シャトルベクターｐＣＡＴ１−１の作成工程を示す図である。
【図４】図４は、シャトルベクターｐＣＡＴ１−１の制限酵素地図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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