(57)【要約】【課題】ATPを必要とする酵素反応を必要とする物質の生産において、その酵素反応に関与する酵素タンパク質を微生物に生産させるとともに、前記酵素タンパク質が触媒する酵素反応を利用して効率よく物質生産を行う方法であって、前記酵素反応を進行させるために前記酵素タンパク質を生産している微生物以外の関与およびATPの添加を必要としない方法を提供すること。【解決手段】ATPを必要とする酵素反応の生成物である物質の製造方法であって、ATPを必要とする酵素反応を触媒する酵素タンパク質を微生物に産生および分泌させること、および、前記酵素タンパク質が触媒する酵素反応を進行させて反応生成物を得ることを含み、前記酵素タンパク質が触媒する反応の進行を維持するためのATPが前記酵素タンパク質を生産している微生物から供給される、前記製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ATPを必要とする酵素反応の生成物である物質の製造方法であって、ATPを必要とする酵素反応を触媒する酵素タンパク質を微生物に産生および分泌させること、および、前記酵素タンパク質が触媒する酵素反応を進行させて反応生成物を得ることを含み、前記酵素タンパク質が触媒する反応の進行を維持するためのATPが前記酵素タンパク質を生産している微生物から供給される、前記製造方法。
【請求項２】
ATPを必要とする酵素反応の生成物である物質の製造方法であって、コリネ型細菌中で機能するプロモーター配列の下流にシグナルペプチド領域をコードする核酸配列が接続され、更に前記シグナルペプチド領域をコードする核酸配列の下流にATPを基質の一つとする酵素をコードする核酸配列が接続された発現遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養すること、および、前記培養によって産生および分泌された酵素タンパク質が触媒する酵素反応を進行させて反応生成物を得ることを含み、前記酵素反応の進行を維持するためのATPが前記酵素タンパク質を産生している微生物から供給される、前記製造方法。
【請求項３】
ATPを基質の一つとする酵素のＮ末端に分泌性タンパク質のプロ構造部が付加している、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
酵素タンパク質が天然では分泌されないタンパク質である、請求項１〜３のいずれか1項に記載の製造方法。
【請求項５】
コリネ型細菌中で機能するプロモーター配列の下流にシグナルペプチド領域をコードする核酸配列が接続され、更に前記シグナルペプチド領域をコードする核酸配列の下流にキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼをコードする遺伝子配列を結合した遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養すること、および、前記培養によって産生および分泌されたキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼが触媒する酵素反応を進行させて反応生成物であるグアノシン-5'-ホスフェートを得ることを含み、前記酵素反応の進行を維持するためのATPがキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼを産生している前記コリネ型細菌から供給される、グアノシン-5'-ホスフェートの製造方法。
【請求項６】
コリネ型細菌中で機能するプロモーター配列の下流にシグナルペプチド領域をコードする核酸配列が接続され、更に前記シグナルペプチド領域をコードする核酸配列の下流にグルタミンシンテターゼをコードする遺伝子配列を結合した遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養すること、および、前記培養によって産生および分泌されたグルタミンシンテターゼが触媒する酵素反応を進行させて反応生成物であるグルタミンを得ることを含み、前記酵素反応の進行を維持するためのATPがグルタミンシンテターゼを産生している前記コリネ型細菌から供給される、グルタミンの製造方法。
【請求項７】
シグナルペプチドがコリネ型細菌由来のシグナルペプチドである請求項１〜６のいずれか1項に記載の製造方法。
【請求項８】
コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムまたはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスである請求項１〜７のいずれか1項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ATPを必要とする酵素反応によって生成される物質の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物の代謝反応を利用してヌクレオチド、例えばATPを製造する方法としては、酵母を用いてAMPを生化学的にリン酸化する方法[特許文献１]、界面活性剤で処理した酵母菌体を用いてアデノシンをリン酸化する方法[特許文献２]、予め凍結融解処理を施した酵母菌体を用いてアデノシン-5'- 一リン酸（以下AMPと略す）をリン酸化する方法[特許文献３]、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネスに属する微生物を極めて低濃度のマンガンイオンを含有する培地で培養する方法[特許文献４]、界面活性剤存在培地にATP生産能を有する微生物を培養する方法[特許文献５]、アデニン、リン酸基供与体およびエネルギー供与体とからATPを生成する能力を有する微生物を用いて界面活性剤存在下、水性媒体中にフィチン酸を添加して反応を行わせる方法[特許文献６]等が知られている。
【０００３】
また、無機リン酸を利用してAMPまたはADPからATPを再生させるATP再生系を利用した物質生産システムが開発されている。例えば、グルコースを代謝してATPを生合成する微生物と、XMPおよびATPからGMPを生成する能力を持つ微生物とを共役させてGMPを製造する方法 [非特許文献１]や、ATP再生能を有する乾燥酵母と精製したグルタミンシンテターゼを共役させてグルタミン酸とアンモニアとからグルタミンを製造する方法[非特許文献２]等が知られている。
【０００４】
一方、コリネ型細菌を利用して異種タンパク質を効率良く分泌生産するための研究としては、これまでにコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）（以後、C. glutamicumと略すことがある）によるヌクレアーゼ(nuclease)やリパーゼの分泌[特許文献７, J.Bacteriol., 174, 1854-1861(1992)]及び、サチライシン等のプロテアーゼの分泌[非特許文献３]、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質の分泌に関する研究[特許文献８]、これを利用したフィブロネクチン結合タンパク質の分泌[非特許文献４]やトランスグルタミナーゼの分泌[特許文献９]、変異型分泌装置を利用してタンパク質の分泌を向上させた報告[特許文献１０]等が知られている。一方、微生物においては、菌体内の代謝反応に関わる多くの酵素は分泌されない[非特許文献６]また、コリネ型細菌のATP生産能については、C. ammoniagenes ATCC6872がNymeen添加により糖を消費してATPを再生し、菌体外培養液中にATPを漏出させる事が知られている[非特許文献５]。
【０００５】
また、ATP依存性の菌体内酵素であるキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼ(以下、GMPシンテターゼと略すことがある)の大量発現は菌体にとって致死的である事が知られており、誘導型のプロモーターを利用したGMPシンテターゼの大量発現の方法[非特許文献１]及び、誘導型のGMPシンテターゼを搭載したXMP生産菌によるGMPの製造方法[特許文献１１]等が知られている。
しかし、微生物に菌体内酵素タンパク質を生産および分泌させ、その酵素タンパク質が触媒する反応に必要なATPをその酵素タンパク質を分泌している微生物から供給して効率よく物質生産を行った例は報告されていない。
【０００６】
【特許文献１】
特公昭40-19119号公報
【特許文献２】
特公昭46-20759号公報
【特許文献３】
特公昭55-45197号公報
【特許文献４】
特公昭44-26912号公報
【特許文献５】
特公昭49-28996号公報
【特許文献６】
特開昭59-51799号公報
【特許文献７】
米国特許第4965197号明細書
【特許文献８】
特表平6-502548号公報
【特許文献９】
国際公開第01/23591号パンフレット
【特許文献１０】
特開平11-169182号公報
【特許文献１１】
特開2000-295996号公報
【特許文献１２】
特開平10-108675号公報
【０００７】
【非特許文献１】
Tatsuro Fujioら、Biosci. Biotech. Biochem., 1997年, 第61巻,5号, 840-845頁
【非特許文献２】
Shinji Wakisakaら  Appl Environ Microbiol., 1998年, 64巻、8号, 2952-2957頁
【非特許文献３】
H Billman-Jacobeら  Appl.Environ.Microbiol., 1995年、61巻, 1610-1613頁
【非特許文献４】
K Salimら  Appl. Environ. Microbiol., 1997年、63巻, 4392-4400頁
【非特許文献５】
Takashi Naraら  Agric. Biol. Chem., 1969年、33巻、1198-1204頁
【非特許文献６】
掘越弘毅ら、好アルカリ性微生物、1993年、84-85頁
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ATPを必要とする酵素反応を必要とする物質の生産において、その酵素反応を触媒する酵素タンパク質を微生物に生産させるとともに、前記酵素タンパク質が触媒する酵素反応を利用して効率よく物質生産を行う方法であって、前記酵素反応を進行させるために前記酵素タンパク質を生産している微生物以外の関与も試薬としてのATPの直接的添加も必要としない前記方法の開発を目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、微生物菌体内にて大量産生させた場合に生育に悪影響を与え得る酵素の遺伝子に菌体外への輸送シグナル配列を付加して菌体内で発現させた結果、菌体の生育を損なうことなしに酵素タンパク質を分泌させ、その活性を発現させ得る事を見いだした。さらに、この酵素がその酵素反応にATPを必要とする場合、酵素を発現させるために使用した菌のATP産生能を利用してATPを供給することにより、試薬としてATPを外部から添加しなくても、その酵素が触媒する反応の進行が維持され、酵素反応生成物を効率よく生産できる事を見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、ATPを必要とする酵素反応の生成物である物質の製造方法であって、ATPを必要とする酵素反応を触媒する酵素タンパク質を微生物に産生および分泌させること、および、前記酵素タンパク質が触媒する酵素反応を進行させて反応生成物を得ることを含み、前記酵素タンパク質が触媒する反応の進行を維持するためのATPが前記酵素タンパク質を生産している微生物から供給される、前記製造方法である。
【００１１】
より具体的には、本発明は、ATPを必要とする酵素反応の生成物である物質の製造方法であって、コリネ型細菌中で機能するプロモーター配列の下流にシグナルペプチド領域をコードする核酸配列が接続され、更に前記シグナルペプチド領域をコードする核酸配列の下流にATPを基質の一つとする酵素タンパク質をコードする核酸配列が接続された発現遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養すること、および前記培養により産生および分泌された前記酵素タンパク質が触媒する酵素反応を進行させて反応生成物を得ることを含み、前記酵素反応の進行を維持するためのATPが前記酵素タンパク質を産生している微生物から供給される、前記製造方法である。
【００１２】
特に本発明は、グアノシン-5'-ホスフェートの製造方法であって、コリネ型細菌中で機能するプロモーター配列の下流にシグナルペプチド領域をコードする核酸配列が接続され、更に前記シグナルペプチド領域をコードする核酸配列の下流に菌体内酵素であるキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼをコードする遺伝子配列を結合した遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養すること、および前記培養によって産生および菌体外細胞表に分泌されたキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼが触媒する酵素反応を進行させて反応生成物であるグアノシン-5'-ホスフェートを得ることを含み、前記酵素反応の進行を維持するためのATPがキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼを産生している前記コリネ型細菌から供給される、前記製造方法である。
【００１３】
また、本発明は、グルタミンの製造方法であって、コリネ型細菌中で機能するプロモーター配列の下流にシグナルペプチド領域をコードする核酸配列が接続され、更に前記シグナルペプチド領域をコードする核酸配列の下流に菌体内酵素であるグルタミンシンテターゼをコードする遺伝子配列を結合した遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養すること、および前記培養によって産生および分泌されたグルタミンシンテターゼが触媒する酵素反応を進行させて反応生成物であるグルタミンを得ることを含み、前記酵素反応の進行を維持するためのATPがグルタミンシンテターゼを産生している前記コリネ型細菌から供給される、前記製造方法である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の一態様においては、シグナルペプチドの下流に反応にATPを必要とする酵素を結合したタンパク質を発現する遺伝子構築物が作製される。この遺伝子構築物はコリネ型細菌内に導入され、発現され、その結果、この構築物にコードされる酵素タンパク質は菌体外細胞表層又は培地中に分泌される。さらにまた本発明の方法においては、前述の酵素を発現した菌体自身が有するATP産生能により酵素反応に必要なATPが供給される。ここで、ATPは酵素タンパク質を発現させるために使用した菌が天然に有するATP産生機構、特にATP再生系によって供給されても、ATP産生能を増強させるように改変された菌によって供給されても、特定の条件下で誘導的にATP産生能が上昇するように改変された菌によって供給されてもよい。本発明の一実施態様では、ATPは菌自身が天然に有するATP再生系によって供給される。ここで、本明細書において、ATP再生系とは、ADPまたはAMPからATPを生化学的に生成させる反応系を意味する。
【００１５】
従って、本発明においては、酵素タンパク質およびその酵素タンパク質が触媒する反応に必要なATPの供給を一種類の菌によって行うことができ、その結果、前記酵素タンパク質が触媒する反応の生成物を効率よく生産する事ができる。ここで、「酵素タンパク質およびその酵素タンパク質が触媒する反応に必要なATPの供給を一種類の菌によって行う」とは、目的の反応を触媒する酵素タンパク質を発現している菌によってその反応に必要なATPが供給されることを意味する。従って、分泌された酵素タンパク質が反応に利用するATPは、反応に関与する酵素タンパク質を分泌した菌と細胞レベルで同一の菌体によって産生されたものでもよく、他の細胞（菌体）が培地中に分泌したATPでもよい。本発明の方法は外部からATPを直接添加することもATPを供給するために他の微生物（例えば、注目している酵素反応との関連においてATPの供給のみを目的とする微生物）を共存させることも必要としないが、培養中にATPを直接添加する、または、ATPを産生する他の種類の微生物を共存させることを完全に排除する必要はない。
【００１６】
細菌における菌体外へのタンパク質の輸送は、分泌性タンパク質において能動的に行われる。分泌性タンパク質は一般にはプレペプチドまたはプレプロペプチドとして翻訳され、その後、成熟型タンパク質になることが知られている。すなわち、一般に、プレペプチドまたはプレプロペプチドとして翻訳された後、シグナルペプチド（「プレ部分」）が切断されて成熟ペプチドまたはプロペプチドに変換され、プロペプチドはプロテアーゼによってさらにプロ部分が切断されて成熟ペプチドになることが知られている。本明細書において、「輸送シグナル配列」もしくは「シグナル配列」とは、分泌性タンパク質前駆体のＮ末端に存在し、かつ天然の成熟型タンパク質には存在しない配列をいい、「シグナルペプチド」とはそのようなタンパク質前駆体から切り取られるペプチドをいう。一般にはシグナル配列は菌体外への分泌に伴ってプロテアーゼ（一般にシグナルペプチダーゼと呼ばれる）によって切断される。このようなシグナルペプチドは生物種を越えて一定の共通した配列上の特徴を有する。
【００１７】
本明細書において、シグナルペプチドおよびプロ部分の両方を有するタンパク質、すなわち、一次翻訳産物を「プレプロタンパク質」と称することがあり、また、シグナルペプチドを有しないがプロ部分を有するタンパク質を「プロタンパク質」と称することがある。プロタンパク質のプロ部分は「プロ構造部」または単に「プロ構造」と称することもあり、本明細書においてタンパク質の「プロ構造部／プロ構造」とタンパク質の「プロ部分」とは互換的に使用される。プレプロタンパク質またはプレタンパク質において、そのシグナルペプチドは異なるタンパク質に由来する場合であっても、目的タンパク質に天然に存在するシグナルペプチドであってもよい。あるいは、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変してもよい。さらに本発明の目的に使用し得るシグナルペプチドは、それが由来する天然の成熟タンパク質のＮ末端アミノ酸配列を一部含んでいてもよい。
【００１８】
本発明に言うコリネ型細菌とは好気性のグラム陽性かん菌であり、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属に統合された細菌を含み(Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1981))、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。コリネ型細菌を使用することの利点としては、例えば、異種タンパク質の分泌に好適と考えられてきたカビ、酵母やBacillus属細菌と比べてもタンパク質の分泌能に非常に優れていること、また糖、アンモニアや無機塩等を含むシンプルな培地で良く生育するため培地代が安価であること、簡便な培養方法が確立されていること、および生産性の点で優れていることが挙げられる。また、ATP再生能力の観点からもコリネ型細菌を使用することが好ましい。例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)は、極めて高いATP再生能力を有する。
本発明において宿主菌として使用できるコリネ型細菌には、特にL-グルタミン酸生産菌が含まれる。
【００１９】
本発明において宿主菌として使用できるコリネ型細菌としては、例えば、以下の野生株、
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム  ATCC13870、
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム  ATCC15806、
コリネバクテリウム・アルカノリティカム  ATCC21511、
コリネバクテリウム・カルナエ                ATCC15991、
コリネバクテリウム・グルタミカム  ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060、
コリネバクテリウム・リリウム  ATCC15990、
コリネバクテリウム・メラセコーラ  ATCC17965、
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス  AJ12340(FERM BP-1539)、
コリネバクテリウム・ハーキュリス  ATCC13868、
ブレビバクテリウム・ディバリカタム  ATCC14020、
ブレビバクテリウム・フラバム                ATCC13826、ATCC14067、
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム  ATCC14068、
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ATCC13869、
ブレビバクテリウム・ロゼウム  ATCC13825、
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム  ATCC14066、
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス  ATCC19240、
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス  ATCC6871、 ATCC6872、
ブレビバクテリウム・アルバム                ATCC15111、
ブレビバクテリウム・セリヌム  ATCC15112、
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム  ATCC15354、
及びこれらの野性株より誘導される変異株、例えばグルタミン酸生産性を失った変異株、更にはリジン等のアミノ酸を生産する変異株、イノシン等の核酸のような他の物質を生産する変異株も含まれる。
【００２０】
これらは、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから分譲を受けることができる。また、本発明においてこれらと同様に使用できるAJ12340株は、1987年10月27日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-1539の受託番号でブダペスト条約に基づいて寄託されている。なお、コリネバクテリウム・リリウム、ブレビバクテリウム・ディバリカタム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの各菌株は、現在では、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類されている。
【００２１】
本発明に使用される遺伝子構築物は、一般にプロモーター、適切なシグナルペプチドをコードする配列および目的酵素をコードする核酸断片、およびコリネ型細菌中で目的酵素遺伝子を発現させるために必要な制御配列（オペレーターやターミネーター等）を、それらが機能し得るように適切な位置に有するものである。目的酵素は、Ｎ末端にプロ構造部を有していてもよく、またそのプロ構造部が目的酵素以外の分泌性タンパク質ものであってもよい。この構築物のために使用できるベクターは特に制限されず、コリネ型細菌中で機能し得るものであればよく、プラスミドのように染色体外で自律増殖するものであっても細菌染色体に組み込まれるものであってもよい。コリネ型細菌由来のプラスミドは本発明で使用するベクターとして特に好ましい。そのようなプラスミドには、例えばpHM1519(Kiyoshi Miwaら、Agric, Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984))、pAM330（Agric.Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）、およびこれらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドが含まれる。また、人工トランスポゾン等も利用することができる。トランスポゾンが使用される場合は相同組換えまたはそれ自身の転移能によって目的遺伝子が染色体中に導入される。
【００２２】
本発明に使用できるプロモーターは特に限定されず、コリネ型細菌の菌体内で機能し得るプロモーターであれば一般に使用でき、更に異種由来のプロモーター、例えばE.coli由来のプロモーターであってもよい。中でも、E.coli由来のtacプロモーター等の強力なプロモーターがより好ましい。コリネ型細菌由来のプロモーターとしては、例えば、菌体外細胞表層タンパク質であるPS1、PS2、SlpAの遺伝子のプロモーター、各種アミノ酸生合成系、例えばグルタミン酸生合成系のグルタミン酸脱水素酵素遺伝子、グルタミン生合成系のグルタミン合成酵素遺伝子、リジン生合成系のアスパルトキナーゼ遺伝子、スレオニン生合成系のホモセリン脱水素酵素遺伝子、イソロイシンおよびバリン生合成系のアセトヒドロキシ酸合成酵素遺伝子、ロイシン生合成系の2-イソプロピルリンゴ酸合成酵素遺伝子、プロリンおよびアルギニン生合成系のグルタミン酸キナーゼ遺伝子、ヒスチジン生合成系のホスホリボシル-ATPピロホスホリラーゼ遺伝子、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニン等の芳香族アミノ酸生合成系のデオキシアラビノヘプツロン酸リン酸（DAHP）合成酵素遺伝子、イノシン酸およびグアニル酸のような核酸生合成系におけるホスホリボシルピロホスフェート(PRPP)アミドトランスフェラーゼ遺伝子、イノシン酸脱水素酵素遺伝子およびグアニル酸合成酵素遺伝子のプロモーターが挙げられる。
【００２３】
本発明で使用するシグナルペプチドは、宿主であるコリネ型細菌の分泌性タンパク質のシグナルペプチドが好ましく、特に好ましくは、コリネ型細菌の菌体外細胞表層タンパク質のシグナルペプチドである。コリネ型細菌の菌体外細胞表層タンパク質としては、C. glutamicumに由来するPS1及びPS2及びC. ammoniagenesに由来するSlpA（特許文献１２）が挙げられる。また、米国特許4965197号（特許文献７）によれば、コリネ型細菌由来のDNaseにもシグナルペプチドがあると言われており、そのようなシグナルペプチドも本発明に利用することができる。
【００２４】
本発明において使用するシグナルペプチドには、それが由来する分泌性タンパク質のＮ末端アミノ酸配列の一部が付加されていてもよい。シグナル配列は、翻訳産物が菌体外に分泌される際にシグナルペプチダーゼによって切断される。なお、シグナルペプチドをコードする遺伝子は、天然型のままでも使用できるが、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変してもよい。これらのシグナルペプチドを使用する場合、目的とする酵素をコードする遺伝子はシグナルペプチドをコードする遺伝子の3'-末端側に接続し、かつ、上記プロモーターにより発現の制御を受けるように配置する。
【００２５】
本発明において分泌されて物質生産に利用される酵素はその触媒する反応にATPを必要とする限り特に限定されず、動植物や微生物由来の酵素全般が含まれるが、細胞内酵素（天然では細胞外に分泌されない酵素）が好ましい。特に、細胞内酵素のうち、大量に菌体内に蓄積するとその菌の生育その他の生理機能に悪影響を及ぼす酵素であっても本発明によれば効率的に利用することができる。本発明において使用され得る酵素には、例えば、S-アデノシルメチオニンシンテターゼ（ATPとL-メチオニンを基質としてS-アデノシルメチオニンを生産する）、γ-グルタミルシステインシンテターゼ（ATPとL-システインとL-グルタミン酸を基質としてL-γ-グルタミルシステインを生産する）、グルタチオンシンテターゼ（ATPとグリシンとL-γ-グルタミルシステインを基質としてグルタチオンを生産する）、イノシン-グアノシン-キナーゼ（ATPとイノシンを基質としてイノシン-5'-ホスフェートを生産、またはATPとグアノシンを基質としてグアノシン-5'-ホスフェートを生産する）、フラビンアデニンジヌクレオチドシンテターゼ（FADシンテターゼとも称す）（ATPとリボフラビンを基質としてフラビンモノヌクレオチドまたはアデニンジヌクレオチドを生産もしくは、ATPとフラビンモノヌクレオチドを基質としてアデニンジヌクレオチドを生産する）、ATP依存性ヒダントインヒドロラーゼ（ATPとヒダントイン化合物を基質としてN-カルバモイルアミノ酸を生産する）、ポリグルタミン酸シンテターゼ（ATPとグルタミン酸を基質としてポリグルタミン酸を生産する）、ポリリン酸キナーゼ（ATPとリン酸を基質としてポリリン酸を生産する）が含まれる。
【００２６】
特に、キサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼや、グルタミンシンテターゼは本発明によって分泌生産される酵素として好ましい。キサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼは、微生物の菌体内で多量に蓄積すると一般に致死的であることが知られているが、本発明によれば、生産されたキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼは分泌されるため、致死的影響を受けることなく菌体は生育できる。
キサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼは、キサントシン-5'-ホスフェート（以下XMPと称することもある）からグアノシン-5'-ホスフェート（以下GMPと称することもある）を生成する酵素であり、グルタミンシンテターゼは、グルタミン酸からグルタミンを生成する酵素である。キサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼやグルタミンシンテターゼを含むDNA断片としては、原核生物、バクテリオファージ、またはプラスミドに由来するものが挙げられる。なかでもコリネ型細菌由来のキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼ遺伝子（以下guaAと称することもある）やグルタミンシンテターゼ遺伝子（以下gsと称することもある）が好適である。
なお、本発明において利用される酵素は、そのＮ末端に分泌性タンパク質のプロ構造部が付加した形で分泌させることもできる。例えば、トランスグルタミナーゼのプロ配列を含む融合タンパク質として分泌させることができる。
【００２７】
このような遺伝子のクローニング技術、生産された酵素の検出技術を含む、一般的な分子生物学的手法は当業者によく知られたものであり、例えば、Sambrooket al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York、DNA cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985)、F.M. Ausubel et al.(eds), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)、PCR Technology:Principles and Application for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press等を参照することができる。
【００２８】
本発明に使用し得る遺伝子構築物のコリネ型細菌への導入方法は特に限定されず、一般に使用される方法、例えば、プロトプラスト法(Santamaria R,らJ. Bacteriol, 162(1), 463-467, 1985)、エレクトロポレーション法(Kurusu Y.ら、Agric. Biol. Chem., Feb; 54(2), 443-447, 1990)等を使用することができる。得られた遺伝子導入形質転換体は通常用いられる方法および条件に従って培養することができる。例えば、形質転換体は炭素源、窒素源、無機イオンを含有する通常の培地で培養することができる。さらにビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を必要に応じて添加することもできる。
【００２９】
培地の炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュークロース、糖蜜、廃糖蜜、澱粉加水分解物等の炭水化物、エタノール、グリセリン、ソルビトール等のアルコール類、ピルビン酸、乳酸、酢酸等の有機酸、グリシン、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸等、上記微生物が資化可能であればいずれも使用できる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニア、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機及び有機アンモニウム塩、尿素、各種アミノ酸、ペプトン、NZアミン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、フィッシュミール又はその消化物等が使用できる。無機物としては、リン第一カリウム、リン第二カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、炭酸カルシウム等を用いることができる。用いる微生物がアミノ酸、核酸、ビタミン等特定の栄養物質を生育に要求する場合には、培地にこれら物質を適量添加する。培養はpH 5.0〜8.5、15℃〜37℃の適切な範囲にて好気的条件下で、１〜７日間程度行えばよい。このような条件下で形質転換体を培養することにより、本発明による物質生産に利用すべき酵素は菌体内で多量に生産され効率よく分泌される。
【００３０】
このようにして培養された菌体を含む培養物は、そのまま本発明による物質生産のための酵素反応に使用することができる。培地中に分泌された酵素を反応に使用する場合、菌のATP再生および培地中の酵素タンパク質の活性が維持される限り外培養物を処理して得られる種々の処理物を前記反応に用いてもよい。更に、菌によって生産および分泌された酵素が菌体外表層に保持されていてもよく、菌のAPT産生能および菌体外細胞表層に保持された酵素タンパク質の活性が維持される限り該培養物を処理して得られる種々の処理物を前記反応に用いてもよい。例えば、本発明による物質生産効率を高めるために菌体濃度を高めてもよく、菌体外細胞表層の透過性に変化を与える処理をしてもよく、あるいは、菌体の取り扱いを容易とするため菌体を担体に固定化してもよい。そのような処理物としては、培養物の濃縮物、乾燥物、界面活性剤処理物もしくは溶菌酵素処理物、さらには培養物を遠心分離器で処理して得られる菌体、その菌体の乾燥物、アセトン処理物、界面活性剤処理物、溶菌酵素処理物および固定化菌体などが含まれる。
【００３１】
培地中に分泌された酵素、および菌体外細胞表層に保持された酵素による反応は水性媒体中で行うことができる。好適には微生物の培養液中に基質となる前駆体物質、さらに必要に応じて界面活性剤および/または有機溶媒を同時に存在させるか、または培養終了後に菌体、菌体を含む培養物、菌体濃縮物、もしくは上述したそれらの処理物に基質となる前駆体物質、さらに必要に応じて界面活性剤および/または有機溶媒を加え、例えば20〜50℃にて１〜48時間反応させることにより、培地中または反応液中に酵素反応生成物を蓄積させることができる。この際、反応中のpHを６〜９に調節することが望ましい。培地中または反応液中の各基質濃度は、通常0.1〜80g/Lにするのが好ましい。なお、基質が水に難溶性であって水に完全には溶解していない場合であっても、例えば基質が懸濁された状態にある等の場合には、本発明の目的を達することができる。
【００３２】
酵素反応に使用する基質源としては、高度精製品のほか、当該基質を含有する微生物発酵液又はその濃縮物、あるいはその部分精製標品など、基質を含みかつ酵素反応を著しく妨げない限りどのようなものであってもよい。例えばキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼにおいてはXMP、グルタミンシンテターゼにおいては基質であるグルタミン酸は精製品や微生物の発酵液の形態で使用することができる。
界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンステアリルアミン（例えばNymeen S-215、日本油脂社製）、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド、セチルピリジウムクロライド、カチオンFB、カチオンF2-40Eなどのカチオン性界面活性剤、ナトリウムラウリル硫酸、ナトリウムオレイルアミド硫酸、ニューレックスTAB、ラピゾール80などのアニオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（例えばノニオンST221、日本油脂社製）などの非イオン性界面活性剤、ラウリルベタイン（例えばアノンBF、日本油脂社製）などの両性界面活性剤などが用いられ、これらは通常0.1〜50 g/L、好ましくは1〜20 g/Lの濃度にて用いられる。有機溶剤としては、例えばトルエン、キシレン、アセトン、脂肪族アルコール、酢酸エチルが用いられ、これらは通常0.1〜50 ml/L、好ましくは1〜20 ml/Lの濃度で使用される。
【００３３】
培地中または反応液中に蓄積した酵素反応生成物を回収する方法としては、菌体を除去して濃縮晶析する方法、活性炭処理法、イオン交換樹脂法などを用いる通常の方法を用いることができる。
本発明は以下の実施例によって、更に具体的に説明されるが、これらはいかなる意味でも本発明を限定するものと解してはならない。
【００３４】
【実施例】
実施例１：C. ammoniagenes(コリネバクテリウム・アンモニアゲネス) ATCC6872由来のキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼのC. ammoniagenes ATCC6872での分泌発現
（１）C. ammoniagenes ATCC6872由来キサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼ遺伝子のクローニングと分泌発現用プラスミドの構築
C. ammoniagenes ATCC6872株由来キサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼ遺伝子の配列は既に決定されている（Genbank アクセッション番号AB003155）。この配列を参考にして、配列番号１と配列番号２に示したプライマーを合成し、常法（斉藤、三浦の方法[Miuraら、Biochim. Biophys. Acta, 72, 619(1963)]）に従って調製したC. ammoniagenes ATCC6872の染色体DNAからキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼをコードする配列とBam HI認識配列を含む断片をPCR法にて増幅した。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase（宝酒造社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。
【００３５】
（配列番号１）5'-GTGACTCAACCTGCAACAACTCCGC-3'
（配列番号２）5'-GGCGGATCCAGGCGAAGCCCCAGTTCAGATAAAT-3'
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号１、２：PCRプライマー
【００３６】
次にWO01-23591記載のpPKSPTG1（プロモーターの配列はC. glutamicum） ATCC13869由来、シグナルペプチドの配列はC. ammoniagenes ATCC6872由来）からプロモーターとシグナル配列を含む領域を配列番号３と配列番号４に示したプライマーを用いPCR法にて増幅した。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase（宝酒造社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。なお、配列番号４に示したプライマーはキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼとの融合遺伝子を構築するために、キサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼのＮ末端側のアミノ酸配列をコードする配列を含んでいる。
【００３７】
（配列番号３）5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
（配列番号４）5'-GGAGTTGTTGCAGGTTGAGTCACTGCCGTTGCCACAGGTGCGGCCA-3'
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号３、４：PCRプライマー
【００３８】
次に、C. ammoniagenes ATCC6872のキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼ配列をコードする領域のPCR増幅反応液と、プロモーター及びシグナル配列を含む領域のPCR反応液１μlを混ぜ、配列番号３と配列番号２を用いてクロスオーバーPCRを行い、C. glutamicum ATCC13869のプロモーターとC. ammoniagenes ATCC6872のシグナル配列に接続されたキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼ遺伝子とからなる融合遺伝子を増幅させた。アガロースゲル電気泳動により約2.3ｋｂの増幅断片を検出した。この断片をEASYTRAP Ver.2（宝酒造社製）を用いてアガロースゲルから回収し、特開平9-322774記載のpPK4のKpnI−XbaI部位に挿入することによって、pPSguaA1を得た。挿入断片の塩基配列決定の結果、目的の融合遺伝子が構築されていることを確認した。尚、塩基配列の決定はダイターミネーターサイクルシークエンシングキット（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）とDNAシークエンサー373A（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。
【００３９】
（２）キサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼ遺伝子のC. ammoniagenes ATCC6872での発現
実施例１（１）で構築したpPSguaA1（C. ammoniagenes ATCC6872由来の菌体外細胞表層タンパク質(SlpA)のシグナル配列とC. ammoniagenes ATCC6872由来のキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼ遺伝子を連結）及び対照とするpPK4でC. ammoniagenes ATCC6872をそれぞれ形質転換し、25 mg/lのカナマイシンを含むCM2G寒天培地（酵母エキストラクト  10ｇ、トリプトン  10g、グルコース  ５g、NaCl 5g、寒天  15g、水で１Lにする）で生育した菌株を選択した。次に、選択したpPSguaA1もしくはpPK4を有するC. ammoniagenes ATCC6872を、25 mg/lのカナマイシンを含むＭＭ液体培地（グルコース  30g、硫酸マグネシウム七水和物  0.4g、硫酸アンモニウム  30g、リン酸二水素カリウム  １g、硫酸鉄七水和物  0.01g、硫酸マンガン五水和物  0.01g、チアミン塩酸塩  200μg、ビオチン  500μg、DL-メチオニン  0.15g、炭酸カルシウム  ５０g、水で１LにしてｐＨ7.5に調整）でそれぞれ30℃、48時間培養した。培養終了後、pPSguaA1もしくはpPK4を有するC. ammoniagenes ATCC6872の各菌体の培養上清を粗酵素液としてキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼ活性を測定した。尚、酵素活性測定は表１に示す系にて行い、生成物の分析はHPLC（Asahipak GS-220(7.6 mmφ, 500 mm)を使用）を用いて行った。その結果、pPSguaA1もしくはpPK4を有するC. ammoniagenes ATCC6872について、いずれもその培養上清中に酵素活性を検出できなかった。
一方、上述した培養後菌体を集菌した後、生理食塩水で菌体を洗浄し、菌体を破砕せずに、洗浄菌体を粗酵素液としてキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼ活性を測定した。その結果、表２に示す通り、pPSguaA1を有するC.ammoniagenes ATCC6872は有意に酵素活性が認められ、菌体外細胞表層においてキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼ活性を保持していることが確認できた。
【００４０】
【表１】
表１. キサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼ活性測定系
2004201577.tif 000002
【００４１】
【表２】
表２. C. ammoniagenes ATCC6872洗浄菌体を用いたキサントシン-5'-ホスフェートからグアノシン-5'-ホスフェートへの転換量
2004201577.tif 000003
【００４２】
実施例２：S. mobaraense（ストレプトバーチシリウム・モバラエンス） IFO13819由来のプレプロトランスグルタミナーゼ遺伝子およびC. ammoniagenes ATCC6872由来のキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼ遺伝子からなる融合遺伝子を用いた活性型キサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼの分泌生産
（１）S. mobaraense IFO13819由来のプレプロトランスグルタミナーゼ遺伝子とC. ammoniagenes ATCC6872由来のキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼ遺伝子との融合遺伝子の構築
S. mobaraense IFO13819由来のプレプロトランスグルタミナーゼの塩基配列は既に決定されており、C. glutamicum ATCC13869において異種融合プレプロトランスグルタミナーゼの分泌生産が報告されている[WO 01/23591]。そこで、配列番号３と配列番号５に示したプライマーを合成し、WO 01/23591記載のpPKSPTG1から、C. glutamicum ATCC13869のcspBのプロモーター領域を含む5'-上流域、C.ammoniagenes ATCC6872のSlpAのシグナル配列、およびS. mobaraense IFO13819のプロトランスグルタミナーゼコード領域を含む領域をPCR法にて増幅した。なお、配列番号５に示したプライマーは増幅した断片とキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼ遺伝子断片からなる融合遺伝子を構築するために、キサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼのＮ末端側のアミノ酸配列をコードする配列を含んでいる。
【００４３】
（配列番号５）5'- GGAGTTGTTGCAGGTTGAGTCACGGGGGCCCGGAACGACGGGCCGG-3'
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号５；PCRプライマー
【００４４】
次に、増幅させたプロモーター領域を含む5'-上流域、シグナル配列、そしてプロトランスグルタミナーゼをコードする領域と、実施例１（１）で増幅させたC. ammoniagenes ATCC6872のキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼ配列をコードする領域のPCR反応液１μlを混ぜて鋳型とし、配列番号３と配列番号２を用いてクロスオーバーPCRを行い、C. glutamicum ATCC13869のcspBのプロモーターとC. ammoniagenes ATCC6872のSlpAのシグナル配列とS. mobaraense IFO13819由来のプロトランスグルタミナーゼ遺伝子配列とを含む断片に接続されたキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼの融合遺伝子を増幅させた。アガロースゲル電気泳動により約2.4kbの増幅断片を検出した。この断片をEASYTRAP Ver.2（宝酒造社製）を用いてアガロースゲルから回収し、特開平9-322774記載のpPK4のKpnI−XbaI部位に挿入することによって、pPSPTGguaA1を得た。前述の方法に従って、挿入断片の塩基配列の決定を行った結果、目的の融合遺伝子が構築されていることを確認した。
【００４５】
また、配列番号６に示したプライマーを合成し、配列番号３と配列番号６を用いてWO 01/23591記載のpPKSPTG1からC. glutamicum ATCC13869のcspBのプロモーター領域を含む5'-上流域、C. ammoniagenes ATCC6872のSlpAのシグナル配列、そしてS. mobaraense IFO13819のプロトランスグルタミナーゼのＮ末端側アミノ酸118残基をコードする領域をPCR法にて増幅した。また配列番号６に示したプライマーは増幅断片とキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼ遺伝子断片から構成される融合遺伝子を構築するために、キサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼのＮ末端側のアミノ酸配列をコードする配列を含んでいる。
【００４６】
（配列番号６）5'-GGAGTTGTTGCAGGTTGAGTCACACCCGAATTGACCCAGGTGACAC-3'
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号６；PCRプライマー
【００４７】
次に、C. glutamicum ATCC13869のcspBのプロモーター領域を含む5'-上流域とC. ammoniagenes ATCC6872のSlpAのシグナル配列とS. mobaraense IFO13819のプロトランスグルタミナーゼのＮ末端側アミノ酸118残基をコードする領域のPCR増幅反応液と、実施例１（１）で増幅させたC. ammoniagenes ATCC6872のキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼコードする領域のPCR増幅反応液１μlとを混ぜ、配列番号３と配列番号２を用いてクロスオーバーPCRを行い、C. glutamicum ATCC13869のcspBのプロモーター領域を含む5'-上流域とC. ammoniagenes ATCC6872のSlpAのシグナル配列とS. mobaraense IFO13819のプロトランスグルタミナーゼのＮ末端側アミノ酸118残基をコードする領域を含む断片に接続されたキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼ遺伝子からなる融合遺伝子を増幅させた。アガロースゲル電気泳動により約2.7ｋｂの増幅断片を検出した。この断片をEASYTRAP Ver.2（宝酒造社製）を用いてアガロースゲルから回収し、特開平9-322774記載のpPK4のKpnI−XbaI部位に挿入することによって、pPSPTGguaA2を得た。前述の方法に従って、挿入断片の塩基配列の決定を行った結果、目的の融合遺伝子が構築されていることを確認した。
【００４８】
更に、同様に配列番号７に示したプライマーを合成し、配列番号３と配列番号７を用いてWO 01/23591記載のpPKSPTG1からC. glutamicum ATCC13869のcspBのプロモーター領域を含む5'-上流域とC. ammoniagenes ATCC6872のSlpAのシグナル配列とS. mobaraense IFO13819のプロトランスグルタミナーゼのプロ構造をコードする領域とをこの順に含む断片をPCR法にて増幅した。また配列番号７に示したプライマーはキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼとの融合遺伝子を構築するために、キサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼのＮ末端側のアミノ酸配列をコードする配列を含んでいる。
（配列番号７）5'-GGAGTTGTTGCAGGTTGAGTCACCGGCCAGCCCTGCTTTACCTTG-3'
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号７；PCRプライマー
【００４９】
次に、C. glutamicum ATCC13869のcspBのプロモーター領域を含む5'-上流域とC. ammoniagenes ATCC6872のSlpAのシグナル配列とS. mobaraense IFO13819のプロトランスグルタミナーゼのプロ構造をコードする領域を含む断片のPCR増幅反応液と、実施例１（１）で増幅させたC. ammoniagenes ATCC6872のキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼ配列をコードする領域のPCR反応液１μｌを混ぜて鋳型とし、配列番号３と配列番号２を用いてクロスオーバーPCRを行い、C. glutamicum ATCC13869のcspBのプロモーター領域を含む5'-上流域とC. ammoniagenes ATCC6872のSlpAのシグナル配列とS. mobaraense IFO13819のプロトランスグルタミナーゼのプロ構造をコードする領域とをこの順に含む断片に接続されたキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼの融合遺伝子を増幅させた。アガロースゲル電気泳動により約3.4ｋｂの増幅断片を検出した。この断片をEASYTRAP Ver.2（宝酒造社製）を用いてアガロースゲルから回収し、特開平9-322774記載のpPK4のKpnI−XbaI部位に挿入することによって、pPSPguaA1を得た。前述の方法に従って、挿入断片の塩基配列の決定を行った結果、目的の融合遺伝子が構築されていることを確認した。
【００５０】
（２）プレプロトランスグルタミナーゼとキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼとの融合遺伝子のC. ammoniagenes ATCC6872での発現
実施例２（１）で構築したpPSPTGguaA1、あるいはpPSPTGguaA2あるいはpPSPguaA1（いずれもプロモーターはC. glutamicum ATCC13869のcspB由来で、シグナルペプチドはC. ammoniagenes ATCC6872のSlpA由来、プロトランスグルタミナーゼ遺伝子の全長又はＮ末端側部分配列をコードする断片はS. mobaraense IFO13819由来で、キサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼ遺伝子はC. ammoniagenes ATCC6872由来）及び対照とするpPKSPTG1（プロトランスグルタミナーゼのみを分泌）でC. ammoniagenes ATCC6872を形質転換し、25 mg/lのカナマイシンを含むCM2G寒天培地で生育した菌株を選択した。
【００５１】
次に、選択したpPSPTGguaA1、あるいはpPSPTGguaA2あるいはpPSPguaA1あるいはpPKSPTG1を有するC. ammoniagenes ATCC6872を、25 mg/lのカナマイシンを含むＭＭ液体培地でそれぞれ30℃、48時間培養した。培養終了後、各菌体の培養上清を粗酵素液としてキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼ活性を測定した。尚、酵素活性測定は表１に示す系にて行い、生成物の分析はHPLC（Asahipak GS-220(7.6 mmφ, 500 mm)を使用）を用いて行った。その結果、pPSPTGguaA1、pPSPTGguaA2、pPSPguaA1またはpPKSPTG1を有するC. ammoniagenes ATCC6872については、いずれも培養上清中に酵素活性を検出できなかった。
一方、上述した培養後菌体を集菌した後、生理食塩水で菌体を洗浄し、菌体を破砕せずに、洗浄菌体についてキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼ活性を測定した。その結果、表３に示す通り、pPSPTGguaA1あるいはpPSPguaA1を有するC. ammoniagenes ATCC6872は有意に酵素活性が認められ、無破砕菌体においてキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼ活性が確認できた。
【００５２】
【表３】
表３. C. ammoniagenes ATCC6872洗浄菌体を用いたキサントシン-5'-ホスフェートからグアノシン-5'-ホスフェートへの転換量
2004201577.tif 000004
【００５３】
実施例３：C. ammoniagenes ATCC6872におけるキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼの菌体外細胞表層での活性発現及びATP再生を利用したキサントシン-5'-ホスフェートからグアノシン-5'-ホスフェートへの転換
（１）シグナル配列及びキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼ遺伝子あるいはシグナル配列及びプレプロトランスグルタミナーゼとキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼをコードする融合遺伝子を用いたキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼの菌体外細胞表層における活性発現
キサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼを菌体内で大量発現させると細胞にとって致死的であることが知られている（Biosci Biotechnol Biochem 1997 May; 61(5):840-5）。ところが、pPSPTGguaA1、pPSPTGguaA2、pPSPguaA3あるいはpPSguaAを有するC. ammoniagenes ATCC6872は特に顕著な生育遅延は示さなかった。
キサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼは菌体内酵素であるため、通常、菌体外には活性は認められない。一方、実施例２（２）において、pPSPTGguaA1あるいはpPSPguaA1を有するC. ammoniagenes ATCC6872は、菌体外細胞表層においてキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼ活性を保持している事が確認された。また、キサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼのＸ線結晶構造解析からは同一のサブユニットからなる２量体構造をとることがわかっており（Tesmer J.J.ら、Proteins. 1994 Apr; 18(4):394-403）、菌体内での活性発現にも同様の２量体構造をとっていると考えられている。
【００５４】
そこで、実施例２（２）で構築したpPSPTGguaA1、あるいはpPSPTGguaA2あるいはpPSPguaA1（いずれもプロモーターはC. glutamicum ATCC13869のcspBに由来し、シグナルペプチドはC. ammoniagenes ATCC6872のSlpAに由来し、プロトランスグルタミナーゼ遺伝子の全長又はＮ末端側部分配列をコードする断片はS. mobaraense IFO13819に由来し、キサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼ遺伝子はC. ammoniagenes ATCC6872に由来する）を有するC. ammoniagenes ATCC6872を、25 mg/lのカナマイシンを含むＭＭ液体培地でそれぞれ30℃、48時間培養した。
【００５５】
培養終了後10μlの培養上清をSDS-PAGEに供したところ、いずれの株においても培養上清中に目的とする分子量を有するタンパク質を検出することはできなかった。次に、各株の培養上清10μlをSDS-PAGEに供してから、Washizu K.ら、Biosci.Biotechnol.Biochem., 58, 82-87(1994)記載の抗成熟トランスグルタミナーゼ抗体を用いて、常法に従ってウエスタンブロットを行った。また、培養後の菌体をPeyret J.L.ら、Mol. Microbiol. 1993 Jul.; 9(1):97-109記載の方法で処理して細胞表層タンパクを分画し、培養上清と同様にSDS-PAGEに供してからウエスタンブロットを行った。
その結果、pPSPTGguaA1及びpPSPTGguaA2を有する菌株において細胞表層画分に目的の融合タンパク質とほぼ同じ分子量を有する、キサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼ活性を示すタンパク質を検出する事ができた。すなわち、シグナル配列を連結した菌体内酵素が細胞表層画分に局在し、活性を保持していることが確認された。
【００５６】
（２）C. ammoniagenes ATCC6872の菌体外細胞表層におけるキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼ活性とATP再生系の利用
キサントシン-5'-ホスフェートをグアノシン-5'-ホスフェートに変換する酵素であるキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼは、同時にATPを消費してAMPを生成する酵素であり、ATPの供給なしでは酵素反応は進行しない。一方、上述したように、C. ammoniagenes ATCC6872は、Nymeen添加により糖を消費してATPを再生し、菌体外培養液中にATPを漏出させる事が知られている（Takashi Naraら、Agric.Biol.Chem., 33, 1198-1204(1969)（非特許文献５））。そこで、実施例２（２）で確認できた菌体外細胞表層におけるキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼ活性とこのATP再生を利用し、ATP無添加条件で酵素反応が進行するかを調べた。
【００５７】
反応は、特に高いキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼ活性を示したpPSPguaA1を有するC. ammoniagenes ATCC6872、および、対照としてプロトランスグルタミナーゼを分泌するpPKSPTG1を有するC. ammoniagenes ATCC6872を上述したＭＭ培地にて30℃、48時間培養した後、表４に示す反応系に培養液を加えて行った。その結果、表５および表６に示すように、Nymeen S-215の添加の有無によらず、pPKSPTG1を有するC. ammoniagenes ATCC6872では、反応が進行しなかったのに対して、pPSPguaA1を有するC. ammoniagenes ATCC6872では、キサントシン-5'-ホスフェートからグアノシン-5'-ホスフェートへの変換が確認できた。すなわち、pPSPguaA1を有するC. ammoniagenes ATCC6872はATP無添加条件で、菌体外細胞表層に分泌したキサントシン-5'-ホスフェート-アンモニアリガーゼによってキサントシン-5'-ホスフェートからグアノシン-5'-ホスフェートへの変換を行える事が確認できた。
【００５８】
【表４】
表４. ATP無添加条件におけるキサントシン-5'-ホスフェートからグアノシン-5'-ホスフェートへの転換反応液組成
2004201577.tif 000005
【００５９】
【表５】
表５. C. ammoniagenes ATCC6872培養液を用いたキサントシン-5'-ホスフェートからグアノシン-5'-ホスフェートへの転換量
2004201577.tif 000006
【００６０】
【表６】
表６. C. ammoniagenes ATCC6872培養液とNymeen S-215を用いたキサントシン-5'-ホスフェートからグアノシン-5'-ホスフェートへの転換量
2004201577.tif 000007
【００６１】
実施例４：C. ammoniagenes ATCC6872における異種グルタミンシンテターゼの菌体外細胞表層における活性発現及びATP再生を利用したグルタミン酸からグルタミンへの転換
（１）C. flavum ATCC14067由来グルタミンシンテターゼ遺伝子のクローニングと分泌発現用プラスミドの構築
C. flavum ATCC14067由来グルタミンシンテターゼ遺伝子の配列は既に決定されている（EP1229121）。この配列を参考にして、配列番号８と配列番号９に示したプライマーを合成し、常法に従って（斉藤、三浦の方法[Biochim. Biophys.Acta, 72, 619(1963)]）調製したC. flavum ATCC14067の染色体DNAからグルタミンシンテターゼ配列をコードする領域をPCR法にて増幅した。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase（宝酒造社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。
【００６２】
（配列番号８）5’-GTGGCGTTTGAAACCCCGGAAGAA-3'
（配列番号９）5’-TTAGCAGTCGAAGTACAATTCG-3'
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号８、９：PCRプライマー
【００６３】
次にWO 01/23591記載のpPKSPTG1からC. glutamicum ATCC13869のcspBのプロモーター領域を含む5'-上流域とC. ammoniagenes ATCC6872のSlpAのシグナル配列とS. mobaraense IFO13819のプロトランスグルタミナーゼのプロ構造とをコードする領域を含む断片を配列番号３と配列番号１０に示したプライマーを用いPCR法にて増幅した。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase（宝酒造社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。なお、配列番号４に示したプライマーは増幅した断片とグルタミンシンテターゼとの融合遺伝子を構築するために、グルタミンシンテターゼのＮ末端側のアミノ酸配列をコードする配列を含んでいる。
【００６４】
（配列番号１０）5’-TCTTCCGGGGTTTCAAACGCCACTGCCGTTGCCACAGGTGCGGCCAGC-3'
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号１０：PCRプライマー
【００６５】
次に、C. flavum ATCC14067のグルタミンシンテターゼをコードする領域のPCR反応液と、C. glutamicum ATCC13869のcspBのプロモーター領域を含む5'-上流域とC. ammoniagenes ATCC6872のSlpAのシグナル配列とS. mobaraense IFO13819のプロトランスグルタミナーゼのプロ構造部をコードする領域とを含む断片のPCR反応液１μｌを混ぜ、配列番号３と配列番号９を用いてクロスオーバーPCRを行い、C. glutamicum ATCC13869のcspBのプロモーター領域を含む5'-上流域とC. ammoniagenes ATCC6872のSlpAのシグナル配列とS. mobaraense IFO13819のプロトランスグルタミナーゼのプロ構造部をコードする領域とをこの順に含む断片に接続されたグルタミンシンテターゼ遺伝子からなる融合遺伝子を増幅させた。アガロースゲル電気泳動により約2.2ｋｂの増幅断片を検出した。この断片をEASYTRAP Ver.2（宝酒造社製）を用いてアガロースゲルから回収し、特開平9-322774記載のpPK4のKpnI−XbaI部位に挿入することによって、pPSPgs1を得た。挿入断片の塩基配列決定の結果、目的の融合遺伝子が構築されていることを確認した。尚、塩基配列の決定はダイターミネーターサイクルシークエンシングキット（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）とDNAシークエンサー３７３Ａ（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。
【００６６】
（２）プレプロトランスグルタミナーゼとグルタミンシンテターゼとの融合遺伝子のC. ammoniagenes ATCC6872での発現
実施例４（１）で構築したpPSPgs1（プロモーターはC. glutamicum ATCC13869のcspBに由来し、シグナルペプチドはC. ammoniagenes ATCC6872のSlpAに由来し、プロトランスグルタミナーゼのプロ構造部遺伝子はS. mobaraense IFO13819に由来し、グルタミンシンテターゼ遺伝子はC. glutamicum ATCC13869に由来する）及び対照とするpPKSPTG1（プロトランスグルタミナーゼのみを分泌）でC. ammoniagenes ATCC6872を形質転換し、25 mg/lのカナマイシンを含むCM2G寒天培地で生育した菌株を選択した。
【００６７】
次に、選択したpPSPgs1、あるいはpPKSPTG1を有するC. ammoniagenes ATCC6872を、25 mg/lのカナマイシンを含むＭＭ液体培地でそれぞれ30℃、48時間培養した。培養終了後、各菌体の培養上清を粗酵素液としてグルタミンシンテターゼ活性を測定した。尚、酵素活性測定はMethods in Enzymology Vol.XVIIA 910-915 ACADEMIC PRESS(1970)記載の方法を用いて行った。その結果、pPSPgs1、あるいはpPKSPTG1を有するC. ammoniagenes ATCC6872については、その培養上清中に酵素活性を検出できなかった。また、上述した培養後菌体を集菌し、生理食塩水で菌体を洗浄し、菌体を破砕せずに、洗浄菌体を粗酵素液としてグルタミンシンテターゼ活性を表７に示す系にて測定した。その結果、表８に示す通り、pPSPgs1を有するC. ammoniagenes ATCC6872について有意に酵素活性が認められ、無破砕菌体において活性なグルタミンシンテターゼが発現している事が確認できた。
【００６８】
一方、上述した培養終了後の培養上清10μlをSDS-PAGEに供したところ、いずれの株においても培養上清中に目的とする分子量を有するタンパク質を検出することはできなかった。次に、各株の培養上清10μlをSDS-PAGEに供してから、抗プロトランスグルタミナーゼ抗体を用いて、常法に従ってウエスタンブロットを行った。また、培養後の菌体をMol. Microbiol. 1993 Jul;  9(1):97-109記載の方法で細胞表層タンパクを分画して、培養上清と同様にSDS-PAGEに供してからウエスタンブロットを行った。その結果、シグナル配列を連結したグルタミンシンテターゼがpPSPgs1を保持する菌細胞表層画分に局在し、その活性を維持ていることが確認できた。
【００６９】
【表７】
表７. グルタミンシンテターゼ活性測定系
2004201577.tif 000008
【００７０】
【表８】
表８. C. ammoniagenes ATCC6872洗浄菌体を用いたグルタミン酸からグルタミンへの転換量
2004201577.tif 000009
【００７１】
（３）C. ammoniagenes ATCC6872の菌体外細胞表層におけるグルタミンシンテターゼ活性とATP再生系の利用
グルタミン酸をグルタミンに変換する酵素であるグルタミンシンテターゼは、同時にATPを消費してADPを生成する酵素であり、ATPの供給なしでは酵素反応は進行しない。そこで、実施例４（２）で確認できた菌体外細胞表層におけるグルタミンシンテターゼ活性とC. ammoniagenes ATCC6872のATP再生系を利用し、ATP無添加条件で反応が進行するかを調べた。
【００７２】
反応は、グルタミンシンテターゼ活性を示したpPSPgs1を有するC. ammoniagenes ATCC6872並びに、対照としてプロトランスグルタミナーゼを分泌するpPKSPTG1を有するC. ammoniagenes ATCC6872を上述したＭＭ培地にて30℃、48時間培養した後、集菌した菌体を表９に示す反応系に加えて行った。その結果、表10に示すように、pPSPgs1を有するC. ammoniagenes ATCC6872は有意に酵素活性が認められた。すなわち、ATP無添加条件で、菌体外細胞表層に分泌されたグルタミンシンテターゼによってグルタミン酸からグルタミンへの変換が行える事が確認できた。
【００７３】
【表９】
表９. ATP無添加条件におけるグルタミン酸からグルタミンへの転換反応液組成
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【００７４】
【表１０】
表１０. C. ammoniagenes ATCC6872洗浄菌体を用いたグルタミン酸からグルタミンへの転換量
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【００７５】
【発明の効果】
本発明の方法により、その反応にATPを必要とする酵素を分泌させ、外部からAPTを直接添加することなく、効率よくその酵素反応生成物である物質の製造を行う事ができる。
【００７６】
【配列表】
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