(57)【要約】      （修正有）【課題】新規なプロテインキナーゼ刺激剤を提供する。【解決手段】下記式（Ｉ）：2004339214.tif 000006（式中、Ｒ1は、水素原子、アリール基等；Ｒ2は、水素原子、アリールオキシ基、アリールメルカプト基等；Ｒ3は、水素原子、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数５〜７のシクロアルキル基、炭素数１〜３のヒドロキシアルキル基、ベンジル基、ナフチル基、フェニル基等）で示されるピラゾロン誘導体若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含む、プロテインキナーゼ刺激剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）：
【化１】
2004339214.tif 000005
（式中、Ｒ1は、水素原子、アリール基、炭素数１〜５のアルキル基又は総炭素数３〜６のアルコキシカルボニルアルキル基を表し；Ｒ2は、水素原子、アリールオキシ基、アリールメルカプト基、炭素数１〜５のアルキル基又は炭素数１〜３のヒドロキシアルキル基を表し；あるいは、Ｒ1及びＲ2は、共同して炭素数３〜５のアルキレン基を表し；Ｒ3は、水素原子、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数５〜７のシクロアルキル基、炭素数１〜３のヒドロキシアルキル基、ベンジル基、ナフチル基、フェニル基、又は炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜３のヒドロキシアルキル基、総炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基、炭素数１〜３のアルキルメルカプト基、炭素数１〜４のアルキルアミノ基、総炭素数２〜８のジアルキルアミノ基、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、カルボキシル基、シアノ基、水酸基、ニトロ基、アミノ基及びアセトアミド基からなる群から選ばれる同一若しくは異なる１〜３個の置換基で置換されたフェニル基を表す。）
で示されるピラゾロン誘導体若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含む、プロテインキナーゼ刺激剤。
【請求項２】
式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体が３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンである請求項１にプロテインキナーゼ刺激剤。
【請求項３】
プロテインキナーゼがプロテインキナーゼＣである、請求項１又は２に記載のプロテインキナーゼ刺激剤。
【請求項４】
記憶機能賦活化剤として使用する、請求項３に記載のプロテインキナーゼ刺激剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピラゾロン誘導体若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含むプロテインキナーゼ刺激剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテインキナーゼ（蛋白質リン酸化酵素）は細胞増殖、発生、分化、代謝経路、遺伝子発現や細胞死など、無数のシグナル伝達をコントロールしていることが知られている。プロテインキナーゼの１種であるプロテインキナーゼＣ（以下、ＰＫＣとも称することがある）はＣａ2+及びリン脂質依存性タンパク質リン酸化酵素であり、セリン／トレオニンキナーゼとして機能する密接に関連した酵素ファミリーから構成される。ＰＫＣは、細胞内情報伝達機構、遺伝子発現、並びに細胞の分化と増殖の制御などにおいて重要な役割をもつことが知られている。現在のところ、組織分布、酵素特異性、および調節が異なる少なくとも１０種類のＰＫＣのアイソザイムが知られている。ＰＫＣは生理的条件下では、細胞膜リン脂質の加水分解により生じるジアシルグリセロール（ＤＧ）によって活性化をうける。この活性化は、ＤＧがＰＫＣのＣａ2+に対する親和性を高めることにより行なわれる。
【０００３】
ところで、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）は３種類のアイソフォームが同定されている。脳虚血では、一酸化窒素（ＮＯ）はその産生源に応じて有害作用と保護作用の両方を発揮することが知られている（非特許文献１〜３）。ＮＯＳには、一定量存在する型のＮＯＳ（constitutive ＮＯＳ：ｃＮＯＳ）と、サイトカインの刺激などにより量が増大する型のＮＯＳ（inducible  ＮＯＳ：ｉＮＯＳ）があり、ｃＮＯＳはさらに神経細胞型ＮＯＳ（ｎＮＯＳ）と血管内皮型ＮＯＳ（ｅＮＯＳ）に分類される。ｎＮＯＳ及びｉＮＯＳは細胞毒性であり、神経変性において重要な役割を担っているが、ｅＮＯＳは脳血流の維持及び改善並びに神経障害の防止に大きな役割を担っていることが実証されている（非特許文献１、２及び４）。
【０００４】
一方、下記式（Ｉ）：
【化１】
2004339214.tif 000002
（式中、Ｒ1は水素原子、アリール、炭素数１〜５のアルキル又は総炭素数３〜６のアルコキシカルボニルアルキルを表し、Ｒ2は、水素原子、アリールオキシ、アリールメルカプト、炭素数１〜５のアルキル又は１〜３のヒドロキシアルキルを表し、あるいは、Ｒ1及びＲ2は、共同して炭素数３〜５のアルキレンを表し、Ｒ3は水素原子、炭素数１〜５のアルキル、炭素数５〜７のシクロアルキル、炭素数１〜３のヒドロキシアルキル、ベンジル、ナフチル又はフェニル、又は炭素数１〜５のアルコキシ、炭素数１〜３のヒドロキシアルキル、総炭素数２〜５のアルコキシカルボニル、炭素数１〜３のアルキルメルカプト、炭素数１〜４のアルキルアミノ、総炭素数２〜８のジアルキルアミノ、ハロゲン原子、トリフルオロメチル、カルボキシル、シアノ、水酸基、ニトロ、アミノ、及びアセトアミドからなる群から選ばれる同一若しくは異なる１〜３個の置換基で置換されたフェニルを表す。）で表されるピラゾロン誘導体については、医薬の用途として、脳機能正常化作用（特許文献１参照）、過酸化脂質生成抑制作用（特許文献２参照）、抗潰瘍作用（特許文献３参照）、及び血糖上昇抑制作用（特許文献４参照）等が知られている。
【０００５】
また、上記式（Ｉ）の化合物のうち、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンを有効成分とする製剤は、２００１年６月以来、脳保護剤（一般名「エダラボン」、商品名「ラジカット」：三菱ウェルファーマ株式会社製造・販売）として上市されている。この「エダラボン」は、活性酸素に対して高い反応性を有することが報告されている（非特許文献５；非特許文献６参照）。このように、エダラボンは活性酸素をはじめとする種々のフリーラジカルを消去することで、細胞障害などを防ぐ働きをするフリーラジカルスカベンジャーである。しかしながら、現在までの所、プロテインキナーゼの活性化に及ぼすエダラボンの影響に関する報告はない。
【０００６】
【特許文献１】特公平５−３１５２３号公報
【特許文献２】特公平５−３５１２８号公報
【特許文献３】特開平３−２１５４２５号公報
【特許文献４】特開平３−２１５４２６号公報
【非特許文献１】Iadecola C, Trends Neurosci. 1997;20:132-139
【非特許文献２】Samdani AF, et al., Stroke, 1997;28:1283-1288
【非特許文献３】Veltkamp R, et al., Stroke, 2002;33:2704-2710
【非特許文献４】Endres M, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1998;95:8880-8895
【非特許文献５】Kawai, H., et al., J. Phamacol. Exp. Ther., 281(2), 921, 1997
【非特許文献６】Wu, TW. et al., Life Sci, 67(19), 2387, 2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、記憶機能の賦活化等のために有用なプロテインキナーゼ刺激剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決することを目的として、式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体によってプロテインキナーゼが刺激されるかどうかについてｅＮＯＳの発現を指標にして検討した。その結果、上記ピラゾロン誘導体の投与により、プロテインキナーゼが刺激されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明によれば、下記式（Ｉ）：
【化２】
2004339214.tif 000003
（式中、Ｒ1は、水素原子、アリール基、炭素数１〜５のアルキル基又は総炭素数３〜６のアルコキシカルボニルアルキル基を表し；Ｒ2は、水素原子、アリールオキシ基、アリールメルカプト基、炭素数１〜５のアルキル基又は炭素数１〜３のヒドロキシアルキル基を表し；あるいは、Ｒ1及びＲ2は、共同して炭素数３〜５のアルキレン基を表し；Ｒ3は、水素原子、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数５〜７のシクロアルキル基、炭素数１〜３のヒドロキシアルキル基、ベンジル基、ナフチル基、フェニル基、又は炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜３のヒドロキシアルキル基、総炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基、炭素数１〜３のアルキルメルカプト基、炭素数１〜４のアルキルアミノ基、総炭素数２〜８のジアルキルアミノ基、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、カルボキシル基、シアノ基、水酸基、ニトロ基、アミノ基及びアセトアミド基からなる群から選ばれる同一若しくは異なる１〜３個の置換基で置換されたフェニル基を表す。）
で示されるピラゾロン誘導体若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含む、プロテインキナーゼ刺激剤が提供される。
【００１０】
本発明の好ましい態様によれば、式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体は、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンであり、プロテインキナーゼはプロテインキナーゼＣである。
本発明の好ましい態様によれば、本発明のプロテインキナーゼＣ刺激剤は、記憶機能賦活化剤として使用することができる。
【００１１】
本発明のさらに別の局面によれば、上記式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物の予防及び／又は治療有効量をヒトを含む哺乳動物に投与する工程を含む、プロテインキナーゼを刺激する方法が提供される。
【００１２】
本発明のさらに別の側面によれば、プロテインキナーゼ刺激剤の製造のための式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物の使用が提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のプロテインキナーゼ刺激剤は、プロテインキナーゼＣが介在する情報伝達経路を刺激することができ、記憶機能賦活化剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明によるプロテインキナーゼ刺激剤は、本明細書に定義する式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を含む。
【００１５】
本発明で用いる式（Ｉ）で示される化合物は、互変異性により、以下の式（Ｉ'）又は（Ｉ”）で示される構造をもとりうる。本明細書の式（Ｉ）には、便宜上、互変異性体のうちの１つを示したが、当業者には下記の互変異性体の存在は自明である。本発明の医薬の有効成分としては、下記の式（Ｉ'）又は（Ｉ”）で表される化合物若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を用いてもよい。
【００１６】
【化３】
2004339214.tif 000004
【００１７】
式（Ｉ）において、Ｒ1の定義におけるアリール基は単環性又は多環性アリール基のいずれでもよい。例えば、フェニル基、ナフチル基などのほか、メチル基、ブチル基などのアルキル基、メトキシ基、ブトキシ基などのアルコキシ基、塩素原子などのハロゲン原子、又は水酸基等の置換基で置換されたフェニル基等が挙げられる。アリール部分を有する他の置換基（アリールオキシ基など）におけるアリール部分についても同様である。
【００１８】
Ｒ1、Ｒ2及びＲ3の定義における炭素数1〜5のアルキル基は直鎖状、分枝鎖状のいずれでもよい。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec−ブチル基、tert−ブチル基、ペンチル基等が挙げられる。アルキル部分を有する他の置換基（アルコキシカルボニルアルキル基）におけるアルキル部分についても同様である。
【００１９】
Ｒ1の定義における総炭素数3〜6のアルコキシカルボニルアルキル基としては、メトキシカルボニルメチル基、エトキシカルボニルメチル基、プロポキシカルボニルメチル基、メトキシカルボニルエチル基、メトキシカルボニルプロピル基等が挙げられる。
【００２０】
Ｒ2の定義におけるアリールオキシ基としては、ｐ−メチルフェノキシ基、ｐ−メトキシフェノキシ基、ｐ−クロロフェノキシ基、ｐ−ヒドロキシフェノキシ基等が挙げられ、アリールメルカプト基としては、フェニルメルカプト基、ｐ−メチルフェニルメルカプト基、ｐ−メトキシフェニルメルカプト基、ｐ−クロロフェニルメルカプト基、ｐ−ヒドロキシフェニルメルカプト基等が挙げられる。
【００２１】
Ｒ2及びＲ3の定義における炭素数1〜3のヒドロキシアルキル基としては、ヒドロキシメチル基、2−ヒドロキシエチル基、3−ヒドロキシプロピル基等が挙げられる。Ｒ3の定義における炭素数5〜7のシクロアルキル基としては、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基等が挙げられる。
【００２２】
Ｒ3の定義において、フェニル基の置換基における炭素数1〜5のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基等が挙げられ、総炭素数2〜5のアルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基等が挙げられ、炭素数1〜3のアルキルメルカプト基としては、メチルメルカプト基、エチルメルカプト基、プロピルメルカプト基等が挙げられ、炭素数1〜4のアルキルアミノ基としては、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、ブチルアミノ基等が挙げられ、総炭素数2〜8のジアルキルアミノ基としては、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジプロピルアミノ基、ジブチルアミノ基等が挙げられる。
【００２３】
本発明のプロテインキナーゼ刺激剤の有効成分として好適に用いられる化合物（Ｉ）として、例えば、以下に示す化合物が挙げられる。
３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
３−メチル−１−（２−メチルフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン；
３−メチル−１−（３−メチルフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン；
３−メチル−１−（４−メチルフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン；
３−メチル−１−（３，４−ジメチルフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−エチルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
３−メチル−１−（４−プロピルフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−ブチルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（３−トリフルオロメチルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
【００２４】
１−（４−トリフルオロメチルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（２−メトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（３−メトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−メトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（３，４−ジメトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−エトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
３−メチル−１−（４−プロポキシフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−ブトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（２−クロロフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（３−クロロフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−クロロフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（３，４−ジクロロフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
【００２５】
１−（４−ブロモフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−フルオロフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（３−クロロ−４−メチルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（３−メチルメルカプトフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−メチルメルカプトフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
４−（３−メチル−５−オキソ−２−ピラゾリン−１−イル）安息香酸；
１−（４−エトキシカルボニルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−ニトロフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
３−エチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−フェニル−３−プロピル−２−ピラゾリン−５−オン；
【００２６】
１，３−ジフェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
３−フェニル−１−（ｐ−トリル）−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−メトキシフェニル）−３−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−クロロフェニル）−３−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
３，４−ジメチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
４−イソブチル−３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
４−（２−ヒドロキシエチル）−３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
３−メチル−４−フェノキシ−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
３−メチル−４−フェニルメルカプト−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
【００２７】
３，３'，４，５，６，７−ヘキサヒドロ−２−フェニル−２H−インダゾール−３−オン；
３−（エトキシカルボニルメチル）−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１，３−ジメチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−エチル−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−ブチル−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（２−ヒドロキエチル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−シクロヘキシル−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−ベンジル−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
【００２８】
１−（α−ナフチル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−メチル−３−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
３−メチル−１−（４−メチルフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−ブチルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−メトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−ブトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−クロロフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（２−ヒドロキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（３−ヒドロキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
【００２９】
１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（３，４−ヒドロキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−ヒドロキシメチルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−アミノフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−メチルアミノフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−エチルアミノフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−ブチルアミノフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−ジメチルアミノフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（アセトアミドフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；及び
１−（４−シアノフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
【００３０】
本発明のプロテインキナーゼ刺激剤の有効成分としては、式（Ｉ）で表される遊離形態の化合物のほか、生理学的に許容される塩を用いてもよい。生理学的に許容される塩としては、塩酸、硫酸、臭化水素塩、リン酸等の鉱酸との塩；メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、酢酸、グリコール酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、シュウ酸、アスコルビン酸、クエン酸、サリチル酸、ニコチン酸、酒石酸等の有機酸との塩；ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩；マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属との塩；アンモニア、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、N，N−ビス（ヒドロキシエチル）ピペラジン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、エタノールアミン、N−メチルグルタミン、L−グルタミン等のアミンとの塩が挙げられる。また、グリシンなどのアミノ酸との塩を用いてもよい。
【００３１】
本発明のプロテインキナーゼ刺激剤の有効成分としては、上記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその生理学的に許容される塩の水和物、又は上記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその生理学的に許容される塩の溶媒和物を用いてもよい。溶媒和物を形成する有機溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、メタノール、エタノール、エーテル、ジオキサン、テトラヒドロフランなどを例示することができる。また、上記式（Ｉ）で表される化合物は、置換基の種類により１以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。本発明のプロテインキナーゼ刺激剤の有効成分としては、純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などを用いてもよい。
【００３２】
式（Ｉ）で表される化合物はいずれも公知の化合物であり、特公平５−３１５２３号公報などに記載された方法により当業者が容易に合成できる。
【００３３】
本発明のプロテインキナーゼ刺激剤の投与量は特に限定されないが、通常は、有効成分である式（Ｉ）で示される化合物の重量として一般に経口投与の場合には一日あたり0.1〜1000mg/kg体重、好ましくは一日あたり0.5〜50mg/kg体重、であり、非経口投与の場合には一日あたり0.01〜100mg/kg体重、好ましくは0.1〜10mg/kg体重である。上記投与量は１日１回又は2〜3回に分けて投与するのが好ましく、年齢、病態、症状により適宜増減してもよい。
【００３４】
本発明のプロテインキナーゼ刺激剤としては、上記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物をそのまま投与してもよいが、一般的には、有効成分である上記の物質と薬理学的及び製剤学的に許容される添加物を含む医薬組成物を調製して投与することが好ましい。
【００３５】
薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等を用いることができる。
【００３６】
経口投与に適する医薬組成物には、添加物として、例えば、ブドウ糖、乳糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、又は結晶セルロース等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、デンプン、又はカルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム又はタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール又は酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードファット等の基剤を用いることができる。
【００３７】
注射あるいは点滴用に適する医薬組成物には、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール等の水性あるいは用時溶解型注射剤を構成しうる溶解剤又は溶解補助剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、Ｄ−マンニトール、グリセリン等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等のｐＨ調節剤等の添加物を用いることができる。
【００３８】
本発明のプロテインキナーゼ刺激剤の形態は特に限定されず、当業者に利用可能な種々の形態をとることができる。経口投与に適する医薬として、例えば、固体の製剤用添加物を用いて錠剤、散剤、顆粒剤、硬ゼラチンカプセル剤、坐剤、又はトローチ剤などを調製することができ、液状の製剤用添加物を用いてシロップ剤、乳剤、軟ゼラチンカプセル剤などを調製することができる。また、非経口投与に適する医薬として、注射剤、点滴剤、吸入剤、坐剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤などを調製することができる。なお、上記の式（Ｉ）の化合物を有効成分とする脳保護剤（点滴剤）が、すでに臨床において使用されているので（一般名「エダラボン」、商品名「ラジカット」：三菱ウェルファーマ株式会社製造・販売）、本発明の医薬において上記市販製剤をそのまま用いることができる。
【００３９】
本発明のプロテインキナーゼ刺激剤の投与経路は特に限定されず、経口的又は非経口的に投与することができる。非経口投与の投与経路も特に限定されず、静脈内、筋肉内、皮内、皮下に注射投与することができる。
【００４０】
また、プロテインキナーゼＣの活性化により記憶機能が賦活化されることが一般に知られている。例えば、A.Pascale et al., Molecular Neurobiology, Vol.16, No.1, 49-62, 1998には、ＰＫＣは記憶機能に関与する鍵酵素であり、ＰＫＣのリン酸化活性は脳の老化により低下していくことが示唆されている。また、Justin Shobe, Neurobiology of Learning and Memory 77, 291-312 (2002)には、３種類のキナーゼ（プロテインキナーゼＡ、カルシウム・カルモジュリン依存性キナーゼＩＩ、及びプロテインキナーゼＣ）と学習・記憶との相関関係が議論されており、例えば、プロテインキナーゼＣは扁桃に仲介された受動回避条件付けに関与していることが示唆されている。さらに、Yoshiro Tomimatsu et al., Life Science 72 (2002) 355-361では、長期増強（long-term potentiation）に関与するプロテアーゼについて議論されており、例えば、トロンビンがＰＡＲ−１のタンパク質分解による活性化を誘導し、これによりプロテインキナーゼＣが活性化し、ＮＭＤＡ受容体チャネルの電位依存性のＭｇ2+遮断が減少することが記載されている。上記の通り、プロテインキナーゼＣの活性化は記憶機能を賦活化できることから、本発明のプロテインキナーゼＣ活性化剤は記憶機能賦活化剤として有用である。
【実施例】
【００４１】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は下記の実施例により限定されるものではない。
【００４２】
合成例：３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン（以下、エダラボンと称す）の合成
エタノール５０ｍｌ中にアセト酢酸エチル１３．０ｇ及びフェニルヒドラジン１０．８ｇを加え、３時間還流攪拌した。反応液を放冷後、析出した結晶をろ取し、エタノールより再結晶して、表題の化合物１１．３ｇを無色結晶として得た。
収率  ６７％
融点  １２７．５〜１２８．５℃
【００４３】
試験例１：
（方法）
内皮細胞を用いた実験では、Clonetics社（サンジエゴ、カリフォルニア）のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を使用し、ＥＧＭ−２培地（Clonetics社）で培養した。ＨＵＶＥＣ仲介ＬＤＬ酸化の実験では、ほぼ密集のＨＵＶＥＣを、エダラボン（６，１２又は２４μＭ）の存在下及び非存在下においてＨａｍ  Ｆ−１０培地中でＬＤＬ（１００μｇ／ｍｌ）と一緒に２４時間培養した。ＬＤＬは、既報の通り（Yoshida H, et al., Biochem Pharmacol. 1999; 58: 1695-1703；及び、Takeo E, et al., J Atheroscler Thromb. 2002; 9: 114-120）、健常男性血漿から超遠心法により調製し、ＬＤＬ酸化実験前にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析してＥＤＴＡを除去した。酸化ＬＤＬは、ＬＤＬを１０μＭの銅（ＰＢＳ中）とともに３７℃で２４時間インキュベートすることにより調製した。ＨＵＶＥＣ仲介ＬＤＬ酸化は、既報の通り（Yoshida H, et al., Biochem Pharmacol. 1999; 58: 1695-1703；及び、Takeo E, et al., J Atheroscler Thromb. 2002; 9: 114-120）、アガロースゲル電気泳動および培地中の過酸化脂質の測定により評価した。実験は全て３回以上行った。データは平均±ＳＤで示す。実験群間の相違はFisher法を用いてANOVAにより試験し、有意差の度合いはｐ＜０．０５とした。
【００４４】
（結果）
結果を図１及び図２に示す。図１及び図２に示す通り、エダラボンと一緒にインキュベーションすることにより、ＨＵＶＥＣ仲介ＬＤＬ酸化は著しく阻害された。１２μＭ程度の濃度で最大の効果が十分に発揮されたため、試験例２では、この濃度を用いてＨＵＶＥＣでのｅＮＯＳ発現に対するエダラボンの効果を調べる実験を行った。
【００４５】
試験例２：
（方法）
ｅＮＯＳ発現の実験では、ほぼ密集のＨＵＶＥＣを、４０μｇ／ｍｌの酸化ＬＤＬの存在下又は非存在下において１２μＭのエダラボンとともに５％リポプロテイン不完全培地（ＬＰＤＳ）を含有するＭ１９９培地中で２０時間培養した。また、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）経路がｅＮＯＳ発現に対するエダラボンの作用に関与しているか否かを調べるために、ＨＵＶＥＣを、ＰＫＣ阻害剤である２０ｎＭのＨ−７（Tocris Cookson社）の存在下又は非存在下において、１２μＭのエダラボン又は１０ｎＭのホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）（Calviochem社）に２０時間露出させた。細胞タンパク質及び全ＲＮＡをＨＵＶＥＣから調製した。タンパク質阻害剤カクテル（和光純薬）を含有する４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）（２００μｌ）中で細胞を溶解し、超音波処理した。細胞タンパク質はBradford assay（BioRad）で測定した。細胞タンパク質（２０μｇ）を１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ニトロセルロース膜に電気転写した。ｅＮＯＳのウエスタン分析は、マウスモノクローナル抗体（BIOMOL)を用いて行った。ＧＡＰＤＨのウエスタン分析をマウスモノクローナル抗体（Chemicon）を用いて行うことにより、内部対照タンパク質を観察した。全ＲＮＡは酸グアニジンチオシアネート−フェノール−クロロホルム法（Yoshida H, et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1998; 18: 794-802）によりＨＵＶＥＣから単離した。ＲＮＡはSuperscriptII（Life Technologies）を用いて逆転写した。逆転写したｃＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅を行い、ｅＮＯＳ及びグリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現を評価した。ｅＮＯＳの同定と増幅のためのプライマーとしては、５’−ＡＴＧＧＧＣＡＡＣＴＴＧＡＡＧＡＧＣＧＴＧＧＣ−３’（配列番号１）と５’−ＡＣＴＧＧＴＴＧＡＴＧＡＡＧＴＣＣＣＧＧＧＣＣ−３’（配列番号２）を使用した。ＧＡＰＤＨの同定と増幅のためのプライマーとしては、５’−ＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴＡ−３’（配列番号３）と５’−ＡＴＧＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＴＣＣＴＴＣ−３’（配列番号４）を使用した。増幅した転写物をアガロースゲル電気泳動で分析した。
【００４６】
（結果）
結果を図３から図５に示す。
図３の結果は、１２μＭのエダラボンによりｅＮＯＳタンパク質発現が上昇し、ｅＮＯＳタンパク質発現の酸化ＬＤＬに誘導された減少は保持されることを示す。同様に、エダラボンにより生じたこの変化は、ｍＲＮＡ量でも同様であった（図４）。ＰＫＣ刺激剤であるＰＭＡはｅＮＯＳ発現を増大させることが報告されている。図５の結果から、Ｈ−７により抑制されたｅＮＯＳの発現がエダラボンまたはＰＭＡにより増大することを示された。
【００４７】
過去の研究から、ＰＭＡがｅＮＯＳの発現を増大させること（Leikert JF, et al., Circulation, 2002; 106: 1614-1617）、並びに、ＰＫＣ阻害剤によるｅＮＯＳの発現上昇が抑制されること（Shen B-Q, et al., J Biol Chem., 1999; 274: 33057-33063）が知られている。本発明では、ＰＫＣ阻害剤であるＨ−７（Inagaki M, et al., J Biol Chem., 1984: 259: 14321-14323、Kawamoto S. et al., Biochem Biophys Res Commun, 1984: 125: 258-264）により抑制されたｅＮＯＳの発現がエダラボンの投与により増大することが初めて示された。この結果は、エダラボンがＰＫＣ刺激剤として有効であることを実証するものである。
【００４８】
また、既に述べたようにＨ−７はＰＫＣの阻害剤として知られているが、最近の研究によると、Ｈ−７はＰＫＣ以外のプロテインキナーゼ（プロテインキナーゼＡ（以下、ＰＫＡ）やプロテインキナーゼＢ（以下、ＰＫＢ）など）に対しても阻害作用を有することが知られている（Quick J, et al., Biochem Biophys Res Commun, 1992; 187: 657-63、Li PM et al., Anticancer Res, 1993; 1957-64）。ＰＫＡやＰＫＢを刺激した場合も同様にｅＮＯＳ発現を増大させることが知られている（Boo YC, Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2002; 283(5):H1819-1828、Du XL. et al., J Clin Invest, 2001; 108(9): 1341-1348、Gallis B, et al., J Biol Chem, 1999;274:30101-30108）ので、エダラボンはＰＫＣ以外のプロテインキナーゼを刺激している可能性もある。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、ＨＵＶＥＣを、図示した濃度のエダラボンの存在下又は非存在下においてＬＤＬ（１００μｇ／ｍｌ）とともにＨａｍＦ−１０培地中で２４時間インキュベートし、ＬＤＬを含む培地中の過酸化脂質の量を測定した結果を示す。結果は、ｎｍｏｌ／ｍｇＬＤＬタンパク質として示した。全ての値は平均±ＳＤ（ｎ＝４）を示す。ａ；対照と比較してｐ＜０．０００１ｂ；６μＭエダラボンと比較してｐ＜０．０１
【図２】図２は、アガロースゲル電気泳動中のＬＤＬの負電荷の変化を示す。ＨＵＶＥＣを、図示した濃度のエダラボンの存在下又は非存在下においてＬＤＬ（１００μｇ／ｍｌ）とともにＨａｍＦ−１０培地中で２４時間インキュベートし、ＬＤＬを含有する培地を回収し、アガロースゲル電気泳動（９０Ｖで２５分間）を行い、電気泳動後、ゲルをFat Red 7Bで染色した。レーン１；対照レーン２；６μＭエダラボンレーン３；１２μＭエダラボンレーン４；２４μＭエダラボンレーン５；天然ＬＤＬ（参考）レーン６；銅酸化ＬＤＬ（参考）
【図３】図３は、ＨＵＶＥＣをエダラボン又は酸化ＬＤＬとともに２０時間インキュベートし、細胞タンパク質をＨＵＶＥＣから調製し、ｅＮＯＳ及びＧＡＰＤＨの発現をタンパク質レベルで観察した結果を示す。レーン１；対照レーン２；１２μＭエダラボンレーン３；４０μｇ／ｍｌ酸化ＬＤＬレーン４；１２μＭエダラボン及び４０μｇ／ｍｌ酸化ＬＤＬ  また、上記で得られた結果をグラフ化したものも併記する。
【図４】図４は、ＨＵＶＥＣをエダラボン又は酸化ＬＤＬとともに２０時間インキュベートし、全ＲＮＡをＨＵＶＥＣから調製し、ｅＮＯＳ及びＧＡＰＤＨの発現をｍＲＮＡレベルで観察した結果を示す。レーン１；対照レーン２；１２μＭエダラボンレーン３；４０μｇ／ｍｌ酸化ＬＤＬレーン４；１２μＭエダラボン及び４０μｇ／ｍｌ酸化ＬＤＬ
【図５】図５は、ＨＵＶＥＣをＰＫＣ阻害剤であるＨ−７の存在下又は非存在下においてエダラボン又はＰＭＡとともに２０時間インキュベートし、全ＲＮＡをＨＵＶＥＣから調製し、ｅＮＯＳ及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲにより評価した結果を示す。レーン１；対照レーン２；２０ｎＭ  Ｈ−７レーン３；１２μＭエダラボンレーン４；１２μＭエダラボン及び２０ｎＭ  Ｈ−７レーン５；１０ｎＭ  ＰＭＡレーン６；１０ｎＭ  ＰＭＡ及び２０ｎＭ  Ｈ−７
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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