(57)【要約】【課題】アレルギー反応や副作用を起こすことがなく、多形核白血球の細胞接着に起因した自己免疫疾患や医療用器具等の体内移植後の炎症反応などの予防，改善，治療に有用な、薬剤および細胞接着抑制方法を提供する。【解決手段】客体由来のタンパク質を有効成分として含有する多形核白血球の細胞接着に対する抑制機能及び／又は貪食作用に対する抑制機能を有する薬剤。客体由来のタンパク質としてはヘモペキシンが好ましい。多形核白血球の細胞接着に対する抑制機能及び／又は貪食作用に対する抑制機能を有する客体由来のタンパク質を、無血清下で客体に投与することで、アレルギー反応や副作用を起こすことなく、多形核白血球の細胞接着に起因した自己免疫疾患や医療用器具等の体内移植後の炎症反応などを予防，改善，治療できる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多形核白血球の細胞接着に対する抑制機能を有する薬剤であって、客体由来のタンパク質を有効成分として含有することを特徴とする多形核白血球の細胞接着抑制剤。
【請求項２】
前記客体由来のタンパク質は、ヘモペキシンであることを特徴とする請求項１記載の多形核白血球の細胞接着抑制剤。
【請求項３】
前記細胞接着抑制剤は、さらに多形核白血球の貪食作用に対する抑制機能を有する薬剤であることを特徴とする請求項１又は２記載の細胞接着抑制剤。
【請求項４】
多形核白血球の細胞接着に対する抑制機能及び／又は貪食作用に対する抑制機能を有する客体由来のタンパク質を、無血清下で客体に投与することを特徴とする多形核白血球の細胞接着抑制方法。
【請求項５】
前記客体由来のタンパク質は、ヘモペキシンであることを特徴とする請求項４記載の細胞接着抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、多形核白血球の細胞接着に対する抑制機能及び／又は貪食作用に対する抑制機能を有する細胞接着抑制剤および細胞接着抑制方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多形核白血球は免疫・炎症反応に関与し、細菌感染，ウイルス感染，化学物質，外傷等の様々な刺激によって細胞接着分子であるインテグリンに依存した細胞接着を起こすことが知られている。そして、この多形核白血球の細胞接着に起因した病態としては自己免疫疾患が知られており、医療用器具等の体内移植後にも多形核白血球の細胞接着に起因した炎症反応が起こることが知られている。
【０００３】
自己免疫疾患について、最も罹患患者が多いのは慢性関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＲＡ）である。その病因は不明だが、その病態形成機序は近年の分子生物学の発展によりかなり明らかとなってきている。このような背景から、慢性関節リウマチに対する新薬開発の試みが極めて盛んに行われている。従来、この慢性関節リウマチの治療には抗炎症薬や免疫抑制薬といった治療薬が一般に用いられてきたが、近年サイトカインをターゲットとした治療薬が登場している。また現在では、細胞内情報伝達系や自己免疫のきっかけとなる抗原提示部分の阻害薬が検討されている。こうした生物学的製剤は慢性関節リウマチの治療に有効であることは認められているが、非常に高価であってアレルギー反応を起こしやすいなど、タンパク製剤特有の問題点があった。また、本来生理的に働いているサイトカインなどの微量活性物質を、生物学的製剤によって強力に長期間抑制することにも問題があると考えられている。
【０００４】
一方、医療用器具等の体内移植後の多形核白血球の細胞接着に起因した炎症反応については、主にフィブリノーゲンなどの宿主タンパク質が移植器具にコーティングされることによって、白血球の接着が誘導されるためと考えられている。この場合においても、自己免疫疾患用の治療薬が有効であるが、上記と同様、非常に高価であってアレルギー反応を起こしやすいといった問題点があった。
【０００５】
また、このような自己免疫疾患の治療や医療用器具等の体内移植後の炎症反応の抑制に利用可能な薬剤として、好中球阻害因子（Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ，ＮＩＦ）を応用した阻害薬が知られている（Ｚｈｏｕ．  Ｍ．  Ｙ．，  Ｓ．  Ｋ．Ｌｏ，  Ｍ．  Ｂｅｒｇｅｎｆｅｌｄｔ，  Ｃ．  Ｔｉｒｕｐｐａｔｈｉ，  Ａ．  Ｊｓｆｆｅ，  Ｎ．  Ｘｕ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｂ．  Ｍａｌｉｋ．  ：  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０１  ：  ２４２７，  １９９８）。好中球は多形核白血球の一種であり、血中の白血球の大多数を占めるが、この好中球阻害因子は、イヌの十二指腸虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｃａｎｉｎｕｍ）から抽出したタンパク質であり、好中球がインテグリン（Ｍａｃ−１）を介して接着するのを阻害することにより、宿主の白血球からの攻撃を回避する役割を担っている。しかしながら、好中球阻害因子は外来タンパク質であるために、これを客体に投与あるいは人工発現させた場合に好中球阻害因子に対する抗体生成に起因した拒絶反応による副作用の危険性が高いという問題があった。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｚｈｏｕ．  Ｍ．  Ｙ．，  Ｓ．  Ｋ．  Ｌｏ，  Ｍ．  Ｂｅｒｇｅｎｆｅｌｄｔ，  Ｃ．  Ｔｉｒｕｐｐａｔｈｉ，  Ａ．  Ｊｓｆｆｅ，  Ｎ．  Ｘｕ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｂ．  Ｍａｌｉｋ．  ：  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０１：２４２７，  １９９８．
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記問題点を解決しようとするものであり、アレルギー反応や副作用を起こすことがなく、多形核白血球の細胞接着に起因した自己免疫疾患や医療用器具等の体内移植後の炎症反応などの予防，改善，治療に有用な、細胞接着抑制剤および細胞接着抑制方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ヘモペキシンが無血清条件下で多形核白血球のフィブリノーゲンコート表面へのインテグリン依存性接着を抑制し、さらに多形核白血球の貪食作用を抑制することを初めて見出した。また、血清条件下ではヘモペキシンの存在下でも多形核白血球の接着が見られるが、この原因として血清中に接着促進因子が存在し、この因子の存在によってヘモペキシンの接着抑制効果が損なわれることを見出し、本発明に想到したものである。
【０００９】
なお、ヘモペキシンは肝臓で産生される血清タンパクであって、溶血性の疾患においてヘモグロビンの一部が血漿タンパク質のハプトグロビンと結合できず、アルブミン、ヘモペキシンと結合してヘム−ヘモペキシン結合体を形成することが知られているが、その他の性質についてはほとんど知られていなかった。
【００１０】
本発明の請求項１記載の細胞接着抑制剤は、多形核白血球の細胞接着に対する抑制機能を有する薬剤であって、客体由来のタンパク質を有効成分として含有する。
【００１１】
また、本発明の請求項２記載の細胞接着抑制剤は、請求項１記載の細胞接着抑制剤において、前記客体由来のタンパク質がヘモペキシンである。
【００１２】
さらに、本発明の請求項３記載の細胞接着抑制剤は、請求項１又は２記載の細胞接着抑制剤において、さらに多形核白血球の貪食作用に対する抑制機能を有する薬剤である。
【００１３】
また、本発明の請求項４記載の細胞接着抑制方法は、多形核白血球の細胞接着に対する抑制機能及び／又は貪食作用に対する抑制機能を有する客体由来のタンパク質を、無血清下で客体に投与する。
【００１４】
さらに、本発明の請求項５記載の細胞接着抑制方法は、請求項４記載の細胞接着抑制方法において、前記客体由来のタンパク質がヘモペキシンである。
【００１５】
【発明の実施形態】
以下、本発明につき更に詳しく説明する。
【００１６】
本発明において、客体由来のタンパク質とは、投与対象となる客体の血液，組織などから得たものをいう。このタンパク質としては、客体の血液中に多量に存在する血清タンパク質であるヘモペキシンが好適に用いられるが、多形核白血球の細胞接着に対する抑制機能を有するもの、及び／又は貪食作用に対する抑制機能を有するものであればこれに限定されない。
【００１７】
なお、血清中にはヘモペキシンの多形核白血球の細胞接着に対する抑制機能を損なわせる接着促進因子が存在する。したがって、ヘモペキシンは血清から単離精製するのが好ましい。
【００１８】
客体の血液中の血清からヘモペキシンを単離精製するには、例えば抽出濾過，遠心分離，透析，濃縮，乾燥，凍結，吸着，脱着，または各種溶媒に対する溶解度の差を利用する沈殿，結晶化，再結晶，転溶，クロマトグラフィー等などの通常の方法により行うことができる。さらに、得られたペモペキシンは、凍結乾燥した後、粉末状又はペースト状に調製し、適宜製剤化して用いることができる。また、このヘモペキシンは血液中に多量に存在するため、２００ｍｌ採血するだけでも十分な量を得ることができる。なお使用時には、注射用水（注射用蒸留水），電解質液（生理食塩水，リン酸緩衝生理食塩水など）などを含む輸液，栄養輸液などから選択された少なくとも１つの液体又は溶媒を用いて溶解可能である。
【００１９】
ペモペキシンは、無血清条件下で優れた細胞接着抑制機能及び貪食抑制機能を有し、抗アレルギー剤，抗炎症剤，癌転移抑制剤，免疫抑制剤，慢性関節リウマチ治療剤，慢性関節炎治療剤，動脈硬化症予防治療剤等として有用である。また、医療用器具等の体内移植後に起こる炎症性疾患を予防，治療する上で有用であり、さらに、臓器移植や再生医療における副作用を予防，治療する上でも有用である。
【００２０】
本発明において、多形核白血球の細胞接着に対する抑制機能及び貪食抑制機能を有する客体由来のタンパク質を客体に投与する際、経口投与では胃中でヘモペキシンが分解されるため、好ましい使用形態は、皮下注射などの非経口投与である。なお、本発明の細胞接着抑制剤の投与量は、投与対象の状態に応じて適宜決定すればよく、特に限定されない。
【００２１】
本発明の多形核白血球の細胞接着抑制剤は、上述したような客体由来のヘモペキシンや同様な機能を有する客体由来のタンパク質を含有するものであれば特に限定されるものではなく、他の剤と混合して用いてもよい。
【００２２】
なお、本発明は、上記実施形態に限定されるものではない。上記実施形態は、例示であり、本発明の特許請求の範囲に記載された技術的思想と実質的に同一な構成を有し、同様な作用効果を奏するものは、いかなるものであっても本発明の技術的範囲に包含される。
【００２３】
【実施例】
以下に、実施例および試験例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明するが、これによって本発明が限定されるものではない。
【００２４】
実施例１：ヒトヘモペキシン及びヘミンアガロース非吸着画分の精製（図１参照）
（１）リバノール沈殿法：ヒト血清（ＳＩＧＭＡ）１０ｍｌにリバノール（ｐＨ８．０）１０ｍｌを徐々に滴下し、４℃で５時間攪拌した後、リバノールアルブミン複合体を沈殿させた。次に、その上清中にあるフリーのリバノールを除去するため、５％ＮａＣｌを添加後、遠心分離法によりフリーのリバノールを沈殿させた。上清中に残ったタンパク質について、ＰＢＳ（Ｃａ２＋，Ｍｇ２＋，フリーのリン酸緩衝生理食塩水，ｐＨ７．４）で透析を行った。以下、これを上清タンパク質と称する。
【００２５】
（２）ヘミン・アガロースアフィニティークロマトグラフィー：５ｍｌのヘミン・アガロース（ＳＩＧＭＡ）カラムに、上記の上清タンパク質をアプライし、ヘモペキシンを吸着させた。その後カラムに吸着したタンパク質を、０．２Ｍのクエン酸（ｐＨ２．０）  を用いて抽出した。この抽出されたタンパク質に対して、０．０１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で透析を行った。以下、これを吸着タンパク質と称する。
【００２６】
なお、０．５ＭＮａＣｌを含むＰＢＳで洗浄し、非吸着タンパク質をカラムより除去した。
【００２７】
（３）弱陰イオン交換クロマトグラフィー：５ｍｌのＤＥＡＥ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｓ（東ソー）  に、上記の吸着タンパク質をアプライし、カラムを通過させ、さらに０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを用いて非吸着タンパク質を洗浄した後、０．４Ｍ  ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌで吸着したヘモペキシンを溶出・回収した。
【００２８】
蒸留水で透析後、凍結乾燥を行うことで、粉末状のヘモペキシンを得た。一方、ＣＢＢ染色を施した後ＳＤＳ−ＰＡＧＥでヘモペキシンの純度を調べた。
【００２９】
（４）実施例１の（２）ヘミン・アガロースアフィニティークロマトグラフィーで吸着せず除去された非吸着タンパク質を蒸留水で透析後、凍結乾燥し、保存した。以下これをヘミンアガロース非吸着画分と称する。
【００３０】
実施例２：細胞接着抑制剤の製造
乾燥粉末のヘモペキシン１ｍｇをリン酸緩衝生理食塩水で速やかに溶解させ、全量を１ｍｌに調製した。得られた液（１ｍｌ）をバイアルまたはアンプルに充填し、細胞接着抑制剤を製造した。
【００３１】
試験例１
プラスチックプレートにフィブリノーゲンをコーティングしたものを用い、多形核白血球の細胞接着を誘導するホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）及び２価の陽イオン（Ｍｇ２＋及び／又はＣａ２＋）を添加して、２価の陽イオンの存在下又は非存在下における多形核白血球の細胞接着を調べた。
【００３２】
なお、プラスチックプレートにフィブリノーゲンをコーティングする方法として、ブタフィブリノーゲンをＰＢＳ（１ｍｇ／ｍｌ）に溶解し、これを９６穴プラスチックプレートに３００μｌずつ分注し、４℃で一晩静置後、ＰＢＳでよく洗浄したものをフィブリノーゲンコートプレートとして用いた。
【００３３】
また、ＰＭＡ（和光純薬）は、５００μｇ／ｍｌとなるようにジメチルスルフォキシドに溶解したものを冷凍保存し、使用時にはこれをＰＢＳで５０μｇ／ｍｌに希釈し、これを細胞に１μｇ／ｍｌとなるように添加した。
【００３４】
まず、上記のように作製したフィブリノーゲンコートプレートを用いて、無血清条件下で、Ｍｇ２＋（１．２ｍＭ）及び／又はＣａ２＋（２ｍＭ）の存在下又は非存在下において、ＰＢＳに懸濁した多型核白血球（３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）にＰＭＡ（１μｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で３０分間静置した。その後、クリスタルバイオレット染色（関東化学）を施し、波長５４０ｎｍでの吸光度を測定した。この時の細胞接着を１００％として、上記条件において細胞非存在下で同様に測定したものを０％とした時の割合を算出し、これを相対接着率（％）とした。なお、検定は５回行いスタンダードエラー・バーを付した。結果を図２に示す。図２に示されるように、インテグリンに依存した多形核白血球の細胞接着では、ＰＭＡが細胞を刺激し、Ｍｇ２＋が存在するとインテグリンがＭｇ２＋と結合して、インテグリンが活性化することにより多形核白血球が細胞に接着するものと考えられる。
【００３５】
試験例２
フィブリノーゲンコートプレートを用いて、試験例１の結果よりＭｇ２＋がインテグリンに依存した多形核白血球の細胞接着を活性化することから、Ｍｇ２＋及びＰＭＡを添加し、多形核白血球が細胞に接着する条件下で、ヘモペキシン，ａｐｏ型のトランスフェリン，ヘミンアガロース非吸着画分の添加による細胞接着を調べた。
【００３６】
なお、フィブリノーゲンコートプレートは試験例１と同様の方法で作製し、ＰＭＡも試験例１と同様の方法で調製した。
【００３７】
（Ａ）フィブリノーゲンコートプレートを用いて、ＰＢＳに溶解させたａｐｏ型のトランスフェリン、又は上記実施例１で得た粉末ヘモペキシンをＰＢＳに溶解させたヘモペキシンの存在下、多型核白血球（３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）にＰＭＡ（１μｇ／ｍｌ）及びＭｇ２＋（１．２ｍＭ）を添加し、３７℃で３０分間静置した。その後、試験例１と同様の方法でクリスタルバイオレット染色（関東化学）を施し、波長５４０ｎｍでの吸光度を測定した。また、試験例１と同様の方法で相対接着率（％）を算出した。なお、検定は４回行いスタンダードエラー・バーを付した。結果を図３−Ａに示す。図３−Ａには、ヘモペキシンの濃度を変化させ、種々の濃度でのヘモペキシンの細胞接着抑制活性を調べた結果を示すものである。図３−Ａに示されるように、ヘモペキシンの細胞接着抑制作用には濃度依存性があり、ヘモペキシン濃度を低下させると細胞接着抑制は減少する。血清中の主な既知糖タンパク質であるａｐｏ型のトランスフェリンにおける細胞接着抑制は見られなかった。
【００３８】
（Ｂ）上記実施例１で得た粉末ヘモペキシンをＰＢＳに溶解させたヘモペキシン（１ｍｇ／ｍｌ）及び／又は上記実施例１で得たヘミンアガロース非吸着画分の存在又は非存在下、多型核白血球（３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）にＰＭＡ（１μｇ／ｍｌ）及びＭｇ２＋（１．２ｍＭ）を添加し、３７℃で３０分間静置した。その後、試験例１と同様の方法でクリスタルバイオレット染色（関東化学）を施し、波長５４０ｎｍでの吸光度を測定した。また、試験例１と同様の方法で相対接着率（％）を算出した。なお、検定は４回行いスタンダードエラー・バーを付した。結果を図３−Ｂに示す。図３−Ｂに示されるように、ヘミンアガロース非吸着画分における細胞接着抑制は見られず、ヘモペキシンを添加したときのみ細胞接着抑制が見られた。ａｐｏ型のトランスフェリン及びヘミンアガロース非吸着画分と比較して、有意にヘモペキシンが多形核白血球の接着を抑制していることが認められた。
【００３９】
試験例３
フィブリノーゲンコートプレートを用いて、Ｍｇ２＋及びＰＭＡを添加し、多形核白血球が細胞に接着する条件下で、ヒト血清アルブミン及び／又はヘモペキシンの添加による細胞接着を調べた。
【００４０】
ＰＢＳに溶解させたヒト血清アルブミン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，４０ｍｇ／ｍｌ）及び／又は上記実施例１で得た粉末ヘモペキシン（１ｍｇ／ｍｌ）の存在又は非存在下、多型核白血球（３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）にＰＭＡ（１μｇ／ｍｌ）及びＭｇ２＋（１．２ｍＭ）を添加し、３７℃で３０分間静置した。その後、試験例１と同様の方法でクリスタルバイオレット染色（関東化学）を施し、波長５４０ｎｍでの吸光度を測定した。また、試験例１と同様の方法で相対接着率（％）を算出した。なお、検定は５回行いスタンダードエラー・バーを付した。結果を図４に示す。図４に示されるように、ヒト血清アルブミンも、ＰＭＡの誘導による多形核白血球の接着を抑制した。この結果は、活性化マクロファージなどが産生する代表的なサイトカインの一種で、マクロファージを細菌やウイルス、寄生虫で刺激したときに産生される腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が誘導する接着好中球の伸展（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）を、ヒト血清アルブミンが抑制するというＮａｔｈａｎらの発見（Ｎａｔｈａｎ，  Ｃ．，  Ｑ．  Ｗ．  Ｘｉｅ，  Ｌ．  Ｈａｌｂｗａｃｈｓ−Ｍｅｃａｒｅｌｌｉ，  ａｎｄ  Ｗ．  Ｗ．  Ｊｉｎ．  １９９３．  Ａｌｂｕｍｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｓｐｒｅａｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｂｙ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｈｅｄｄｉｎｇ  ｏｆ  ＣＤ４３  （ｓｉａｌｏｐｈｏｒｉｎ，  ｌｅｕｋｏｓｉａｌｉｎ）．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １２２：２４３）と一致した。通常、細胞接着とは、細胞が基質に付着（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）し、かつ伸展（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）を起こしている状態を示すものであるため、ヒト血清アルブミンは伸展（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）のみを抑制し、付着（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）は抑制していないと考えられる。一方、ヘモペキシンの細胞接着抑制はヒト血清アルブミンの細胞接着抑制より強い（図４参照）ことから、ヘモペキシンは付着（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）及び伸展（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）の双方を抑制し、全体として細胞接着を抑制していると推察される。さらに、ヒト血清アルブミンとヘモペキシン（１．０ｍｇ／ｍｌ）の共存下についても、著しい細胞接着抑制を示した。
【００４１】
試験例４
フィブリノーゲンコートプレートを用いて、Ｍｇ２＋及びＰＭＡを添加し、多形核白血球が細胞に接着する条件下で、ヘム結合したヘモペキシン及び／又はヘモペキシンの添加による細胞接着を調べた。
【００４２】
まず、室温で６０分間、１００μＭのヘミン塩化物を含むヘモペキシンの培養によりヘム結合したヘモペキシン（ヘム−ヘモペキシン）を調製した。ＰＢＳに溶解させたヘム−ヘモペキシン（１ｍｇ／ｍｌ）及び上記実施例１で得た粉末ヘモペキシン（１ｍｇ／ｍｌ）の存在又は非存在下、多型核白血球（３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）にＰＭＡ（１μｇ／ｍｌ）及びＭｇ２＋（１．２ｍＭ）を添加し、３７℃で３０分間静置した。その後、試験例１と同様の方法でクリスタルバイオレット染色（関東化学）を施し、波長５４０ｎｍでの吸光度を測定した。また、試験例１と同様の方法で相対接着率（％）を算出した。なお、検定は３回行いスタンダードエラー・バーを付した。結果を図５に示す。ヘム−ヘモペキシンもヘモペキシンと同様に細胞接着を抑制した。
【００４３】
試験例５
オプソニン化ザイモザンを用いて、Ｍｇ２＋及びＣａ２＋を添加し、多形核白血球がオプソニン化ザイモザンを貪食する条件下で、ヘモペキシンの添加による貪食作用を調べた。
【００４４】
（１）オプソニン化ザイモザンの作成：フルオレッセインによる蛍光ラベルを施したザイモザンＡ（ＳＩＧＭＡ）を１０ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに懸濁し、ブタ血清を等量（濃度にして５０％になるように）加え、３７℃で３０分間反応させた。次に、３０００ｒｐｍで２０分間遠心し、上清を捨てた。ここで得られる沈殿物をＰＢＳに懸濁し、再び遠心して上清を捨てた。２×１０８ザイモザンＡ／ｍｌとなるようにＰＢＳに懸濁したオプソニン化ザイモザンを下記の多形核白血球による貪食測定に用いた。
【００４５】
（２）多形核白血球による貪食測定：プラスチックシャーレに多形核白血球を播き、３７℃で３０分間静置し、多形核白血球をシャーレの底面に付着させた。その後、ＰＢＳで軽く３回シャーレを洗浄し、付着していない多形核白血球を除去した。次に、上記実施例１で得た粉末ヘモペキシンをＰＢＳに溶解させたヘモペキシン（１ｍｇ／ｍｌ）の存在又は非存在下、試験例５の（１）で作成したオプソニン化ザイモザン（２×１０７ザイモザンＡ／ｍｌ），Ｍｇ２＋（１．２ｍＭ），Ｃａ２＋（１．３ｍＭ）を添加し、３７℃で４０分間静置し、多形核白血球にオプソニン化ザイモザンを貪食させた。その後、シャーレをＰＢＳで３回洗浄し、貪食されていないオプソニン化ザイモザンを除去し、２．５％グルタルアルデヒドで室温にて３０分間固定後、蒸留水で洗浄した。次に、エタノールで多形核白血球試料を脱水し、風乾した。蛍光顕微鏡を用いて、明視野（付着した多形核白血球の総数が見える）及び蛍光像（オプソニン化ザイモザンを貪食した多形核白血球が見える）を撮影し、蛍光白血球数／総白血球数×１００（％）として、貪食率（％）を算出した。なお、カウントに際しては、ランダムに８エリアを撮影したものについてそれぞれ行い、その平均値±標準偏差で示した。結果を図６に示す。図６に示されるように、多形核白血球はＭｇ２＋及びＣａ２＋存在下でオプソニン化ザイモザンをよく貪食し、Ｍｇ２＋及びＣａ２＋の非存在下で貪食は起こらなかった。一方、ヘモペキシン（１ｍｇ／ｍｌ）を添加したときのみＭｇ２＋及びＣａ２＋によって引き起こされるオプソニン化ザイモザンの貪食を完全に抑制した。ザイモザンや細菌の貪食にもインテグリンが関与していることは既に知られており、ヘモペキシンはこのインテグリンを抑制することによって細胞接着抑制と同様に、貪食をも抑制すると考えられる。このことから、ヘモペキシンは細胞接着抑制効果だけではなく、貪食抑制効果も有しており、抗炎症剤として、より幅広く利用可能な薬剤である。
【００４６】
【発明の効果】
本発明の細胞接着抑制剤と細胞接着抑制方法によれば、アレルギー反応や副作用を起こすことがなく、多形核白血球の細胞接着に起因した自己免疫疾患や医療用器具等の体内移植後の炎症反応などの予防，改善，治療を行うことができ、さらに多形核白血球の貪食抑制効果も有しており、抗炎症剤として、より幅広く利用可能な薬剤である。さらに、臓器移植や再生医療における副作用を予防，治療する上で有効である。また、免疫応答等の副作用を回避でき安全性が高い。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例１のヘモペキシンの精製方法を示すフロー図である。
【図２】本発明の試験例１の結果を示すグラフである。
【図３】本発明の試験例２の結果を示すグラフである。
【図４】本発明の試験例３の結果を示すグラフである。
【図５】本発明の試験例４の結果を示すグラフである。
【図６】本発明の試験例５の結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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