(57)【要約】【課題】ＨＩＶ−１ウイルスに感染し，ウイルス遺伝子の転写および複製が可能なモデル動物を提供すること。【解決手段】ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）感染に関連するヒト遺伝子、すなわち、ｈＣＤ４，ヒトケモカインレセプター，ｈＣｙｃｌｉｎＴ１およびｈＣＩＩＴＡ遺伝子を発現可能な様式で含有するを有するトランスジェニック動物。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ−１感染症を発症しうるトランスジェニック齧歯類動物。
【請求項２】
ＨＩＶ−１ウイルスに感染させたときに，ＨＩＶ−１ウイルスを複製しウイルス粒子を産生しうるトランスジェニック齧歯類動物。
【請求項３】
ヒトＣＤ４，ヒトケモカインレセプター，ヒトＣｙｃｌｉｎＴ１およびヒトＣＩＩＴＡ遺伝子が導入されているトランスジェニック齧歯類動物。
【請求項４】
ヒトケモカインレセプターがＣＸＣＲ４またはＣＣＲ５である，請求項３記載の動物。
【請求項５】
ＨＩＶ−１に感染しうるトランスジェニック齧歯類動物を作成する方法であって，ヒトＣＤ４，ヒトケモカインレセプター，ヒトＣｙｃｌｉｎＴ１およびヒトＣＩＩＴＡ遺伝子を齧歯類動物の胚細胞に導入し，前記胚細胞からトランスジェニック齧歯類動物を発生させることを含む方法。
【請求項６】
ＨＩＶ−１感染症を発症しうるトランスジェニック齧歯類動物を作成する方法であって，ヒトＣＤ４，ヒトケモカインレセプター，ヒトＣｙｃｌｉｎＴ１およびヒトＣＩＩＴＡ遺伝子を齧歯類動物の胚細胞に導入し，前記胚細胞からトランスジェニック齧歯類動物を発生させ，そして前記動物にＨＩＶ−１を感染させることを含む方法。
【請求項７】
試験薬剤の抗ＨＩＶ−１ウイルス活性を検定する方法であって，
試験薬剤を請求項１記載の動物に投与し，
前記動物のＨＩＶ−１  ＲＮＡ，血中ウイルス，ＣＤ４＋Ｔリンパ球，ウイルス蛋白質，およびウイルス蛋白質に対する抗体からなる群より選択される１またはそれ以上の指標のレベルをモニターする，
の各工程を含む方法。
【請求項８】
試験薬剤の抗ＨＩＶ−１ウイルス活性を検定する方法であって，
請求項２−４のいずれかに記載の動物にＨＩＶ−１ウイルスを感染させ，
試験薬剤を前記動物に投与し，
前記動物のＨＩＶ−１  ＲＮＡ，血中ウイルス，ＣＤ４＋Ｔリンパ球，ウイルス蛋白質，およびウイルス蛋白質に対する抗体からなる群より選択される１またはそれ以上の指標のレベルをモニターする，
の各工程を含む方法。
【請求項９】
抗ＨＩＶ−１活性を有する薬剤を同定する方法であって，
試験薬剤を請求項１記載の動物に投与し，
前記動物においてＨＩＶ−１感染症の１またはそれ以上の症状をモニターし，そして
ＨＩＶ−１感染症の症状を緩和しうる薬剤を抗ＨＩＶ−１活性を有する薬剤として同定する，
の各工程を含む方法。
【請求項１０】
抗ＨＩＶ−１活性を有する薬剤を同定する方法であって，
請求項２−４のいずれかに記載の動物にＨＩＶ−１を感染させ，
試験薬剤を前記動物に投与し，
前記動物においてＨＩＶ−１感染症の１またはそれ以上の症状をモニターし，そして
ＨＩＶ−１感染症の症状を緩和しうる薬剤を抗ＨＩＶ−１活性を有する薬剤として同定する，
の各工程を含む方法。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の方法により同定された薬剤。
【請求項１２】
請求項９または１０に記載の方法により同定された薬剤を含む，ＨＩＶ−１感染症の予防または治療用医薬組成物。
【請求項１３】
抗ＨＩＶ−１活性を有する薬剤を同定するための，請求項１−４のいずれかに記載の動物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は，ＨＩＶ−１ウイルス感染，転写，複製のモデルとして用いることができる動物細胞およびＨＩＶ−１感染症モデル動物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在のところ，ＨＩＶ−１が感染し，かつエイズを発症するモデル動物としては，霊長類（チンパンジーなど）しか用いることができない。チンパンジーは非常に高価である上，大型動物でありその飼育，取扱いが難しく，また十分な設備が整っている研究施設は非常に限られる。したがって，ＨＩＶ−１感染の病因論，ウイルスと宿主との相互作用，およびＨＩＶ−１感染の治療および感染の制御を研究するためには，安価で取扱いの容易な適当な動物モデルの開発が必要とされている。
【０００３】
ＨＩＶ−１感染の動物モデルとしては，トランスジェニックマウスまたは実験的に感染させたウサギ（Browning, J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94,14637-14641 (1997); Kulaga, H. et al. J. Exp. Mod. 169, 321-326 (1989);Gordon, M.R. et al. Ann. N.Y. Acad. Sci. 616, 270-280 (1990); Dunn, C.S. et al. J. Gen. Virol. 76, 1327-1336. (1995)）およびコトンラット（Langley, R.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 14355-14360 (1998)）等が報告されているが，これらの動物は，ＨＩＶ−１ウイルスを安定して複製することができず，エイズの臨床症状を発症しないためＨＩＶ−１感染症のモデル動物として用いるのには適さない。
【０００４】
一方，培養細胞系においては，マウスやラット細胞にヒトＣＤ４（ｈＣＤ４）遺伝子およびケモカインレセプター遺伝子を導入することによりＨＩＶ−１感染が可能であることが知られているが，この細胞系では，ＨＩＶ−１プロウイルス遺伝子は転写されない。
【０００５】
本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある。
【特許文献１】
特願２００１−１９１４１６（未公開）
【特許文献２】
WO98/58536
【特許文献３】
WO98/46734
【非特許文献１】
Browning, et al., PRNS USA 94 (26), 14637-14641, 1997
【非特許文献２】
Speck, et al., J. Virol. 72 (7), 5728-5734, 1998
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
したがって，本発明の目的は，ＨＩＶ−１ウイルスに感染し，ウイルス遺伝子の転写および複製が可能な培養細胞系ならびにモデル動物を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は，ｈＣＤ４，ヒトケモカインレセプター，ヒトＣｙｃｌｉｎＴ１（ｈＣｙｃｌｉｎＴ１）およびヒトクラスＩＩトランスアクチベータ―（ｈＣＩＩＴＡ）遺伝子を発現可能な様式で含有することによって，ＨＩＶ−１ウイルス粒子を産生しうる齧歯類動物細胞を提供する。
【０００８】
別の態様においては，本発明は，ＨＩＶ−１ウイルス粒子を産生しうる齧歯類動物細胞を作成する方法を提供する。該方法は，齧歯類動物細胞にｈＣＤ４，ヒトケモカインレセプター，ｈＣｙｃｌｉｎＴ１およびｈＣＩＩＴＡ遺伝子を導入し，そして前記細胞にＨＩＶ−１を感染させることを含む。
【０００９】
さらに別の態様においては，本発明は，ＨＩＶ−１感染症を発症しうるトランスジェニック齧歯類動物，および，ＨＩＶ−１ウイルスに感染させたときに，ＨＩＶ−１ウイルスを複製しウイルス粒子を産生しうるトランスジェニック齧歯類動物，ならびにこれらを作成する方法を提供する。好ましくは，そのようなトランスジェニック齧歯類動物には，ｈＣＤ４，ヒトケモカインレセプター，ｈＣｙｃｌｉｎＴ１およびｈＣＩＩＴＡ遺伝子が導入されている。
【００１０】
さらに別の観点においては，本発明は，試験薬剤の抗ＨＩＶ−１ウイルス活性を検定する方法を提供する。該方法は，ＨＩＶ−１ウイルスを感染させた本発明の細胞と試験薬剤とを接触させ，そして前記細胞におけるＨＩＶ−１  ＲＮＡまたはウイルス蛋白質のレベルをモニターする，の各工程を含む。別の態様においては，該方法は，ＨＩＶ−１ウイルスを感染させた本発明の動物に試験薬剤を投与し，そして，該動物におけるＨＩＶ−１の指標，例えば，ＲＮＡ，血中ウイルス，ＣＤ４＋Ｔリンパ球，ウイルス蛋白質，およびウイルス蛋白質に対する抗体のレベルをモニターする，の各工程を含む。
【００１１】
また別の観点においては，本発明は，本発明の細胞または動物を用いて，抗ＨＩＶ−１活性を有する薬剤を同定する方法，該方法により同定された薬剤，ならびに該薬剤を含む，ＨＩＶ−１感染症の予防または治療用医薬組成物を提供する。
【００１２】
また別の観点においては，本発明は，抗ＨＩＶ−１活性を有する薬剤を同定するための，本発明の細胞または動物の使用に関する。
【００１３】
本発明は，ヒトへの再感染が可能なＨＩＶ−１ウイルスを産生することができる動物細胞およびトランスジェニック動物を，当該技術分野において初めて提供するものである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明は，ＨＩＶ−１ウイルス粒子を産生しうる齧歯類動物細胞を特徴とする。本発明の動物細胞は，ｈＣＤ４，ヒトケモカインレセプター，ｈＣｙｃｌｉｎＴ１およびｈＣＩＩＴＡ遺伝子を発現可能な様式で含有しており，このことにより，ＨＩＶ−１感染，複製，およびヒト細胞に再感染しうる粒子の産生が可能である。好ましくは，ヒトケモカインレセプターはヒトＣＸＣＲ４（ｈＣＸＣＲ４）またはヒトＣＣＲ５（ｈＣＣＲ５）である。
【００１５】
ＨＩＶ−１は，感染のために種特異的かつ細胞タイプ特異的レセプターを用いて，限定された細胞に感染する。ＨＩＶ−１の侵入には，コファクターとして，ｈＣＤ４およびケモカインレセプター（ｈＣＸＣＲ４またはｈＣＣＲ５）の両方が必要である。
【００１６】
ｈＣＤ４は，ヘルパーＴ細胞のマーカーとして，ＨＩＶ−１の細胞への侵入の主となるレセプターであるが（Dalgleish, A.G. et al. Nature 312. 763-767 (1984)），ＨＩＶ−１の細胞中への侵入には，コレセプターとして働くために細胞表面に存在するケモカインレセプターもまた必要である。ｈＣＣＲ５は，マクロファージ（Ｍ−指向性）ＨＩＶ−１株の感染のコレセプターであり（Choe, H.et al. Cell 85, 1135-1148 (1996)），ｈＣＸＣＲ４はＴ−指向性ＨＩＶ−１株の感染のコレセプターである（Feng, Y., et al., Science 272, 872-877 (1996)）。
【００１７】
ラット繊維芽細胞株中でｈＣＤ４およびケモカインレセプターを共発現させると，ＨＩＶ−１の侵入およびウイルス遺伝子の宿主ゲノムへの組み込みが可能となる。しかし，ｈＣＤ４およびこれらのヒトケモカインレセプターの発現は，ラット細胞においてＨＩＶ−１プロウイルスの転写およびウイルス蛋白質産生を行わせることができなかった。
【００１８】
本発明においては，ｈＣＤ４とケモカインレセプターに加えて，さらにｈＣｙｃｌｉｎＴ１をＨＩＶ−１感染ラット細胞にトランスフェクションすると，細胞凝集およびプロウイルスの部分的転写を誘導することができることが見いだされた。この凝集物とヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）とを融合させることにより，融合細胞は，ｐ２４Ｇａｇ蛋白質をその培養上清中に産生した。このことから，ウイルスの複製にはさらに別の因子が必要であることがわかった。
【００１９】
ｈＣｙｃｌｉｎＴ１は，サイクリン依存性キナーゼ９（ＣＤＫ９）とともにヒトポジティブ転写伸長因子（ｐ−ＴＥＦｂ）複合体を形成し，ウイルス蛋白であるＴａｔの活性化ドメインに結合することによりＨＩＶ−１長末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターのＴａｔ−媒介性トランス活性化を促進する。（Wei, P, etal., Cell 92, 451-462 (1998): Garber, M.E. et al. Genes Dev. 12,3512-3527(1998)）。しかし，Ｔａｔによるこの経路を介したＨＩＶ−１のトランス活性化は，ヒトおよび霊長類細胞において認められるが，齧歯類細胞においては認められない。さらに，マウスＣｙｃｌｉｎＴ１（ｍＣｙｃｌｉｎＴ１）はこのような特異的相互作用を行わない（Fujinaga, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 1285-1290 (1999)）。したがって，このｐ−ＴＥＦｂとの相互作用を介したＴａｔによるＨＩＶ−１のトランス活性化にはヒトもしくは霊長類由来ＣｙｃｌｉｎＴ１が種特異的活性化を媒介するのに非常に重要である。しかし，ｈＣｙｃｌｉｎＴ１を強制発現させたマウス細胞においてＨＩＶ−１複製は誘導されず（Mariani, R. et al. J. Virol. 74, 3859-3870 (2000)），レセプター遺伝子およびｈＣｙｃｌｉｎＴ１遺伝子を有するＨＩＶ−１−感染齧歯類細胞におけるＨＩＶ−１プロウイルス転写に必要なＴａｔ−非依存性活性化についてはまだ明らかではない。
【００２０】
本発明においては，さらにｈｃｙｃｌｉｎＴ１に加えて，ｈＣＩＩＴＡ遺伝子を導入することにより，ＨＩＶ−１感染ラット細胞中でｐ２４が産生されることが見いだされた。
【００２１】
ＨＩＶ−１は，霊長類マクロファージおよび主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子を発現する活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞に感染する（Saifuddin, M. et al., J. Immunol. 164, 3941-3945 (2000); Saifuddin, M., et al., Clin. Exp. Immunol. 121, 324-331 (2000)）。ＨＩＶ−１発現および複製は，ＨＬＡ−ＤＲ（ヒトＭＨＣクラスＩＩ）陽性Ｔ細胞株において，ＨＬＡ−ＤＲ陰性Ｔ細胞株におけるより実質的に高い（Saifuddin, M. et al., J. Immunol. 164, 3941-3945 (2000)）。特異的転写活性化因子の１つである，ｈＣＩＩＴＡは，ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子発現を制御する。一方，ｈＣＩＩＴＡはｈＣｙｃｌｉｎＴ１のＴａｔ結合部位と同じ領域に結合し，標的遺伝子の発現のためにＣＤＫ９とともにｐ−ＴＥＦｂ複合体を形成することが示されている（Kanazawa, S., et al., Immunity 12, 61-70 (2000)）。ｈＣＩＩＴＡはまた，種々のタイプのヒト細胞においてＨＩＶ−１ＬＴＲ発現を促進する。このことは，ｈＣＩＩＴＡがｈＣｙｃｌｉｎＴ１に結合することにより，ｐ−ＴＥＦｂをリクルートし，Ｔａｔ非依存性活性化においてＨＩＶ−１発現を促進することを示唆する。
【００２２】
次に，本発明の細胞におけるウイルス粒子の産生を確認するために，ｈＣｙｃｌｉｎＴ１およびｈＣＩＩＴＡを導入したＨＩＶ−１感染ラット細胞の上清でｈＰＢＭＣを処理すると，このｈＰＢＭＣの培養上清にｐ２４ＨＩＶ−１蛋白が徐々に増加した。このことは，これらの遺伝子の導入により，感染ラット細胞から感染性ＨＩＶ−１ウイルス粒子の産生が誘導されたことを示す。
【００２３】
ＨＩＶ−１ウイルス粒子を産生しうる本発明の齧歯類動物細胞は，齧歯類動物細胞にｈＣＤ４，ヒトケモカインレセプター，ｈＣｙｃｌｉｎＴ１およびｈＣＩＩＴＡ遺伝子を導入した細胞にＨＩＶ−１を感染させることにより作成することができる。
【００２４】
各遺伝子の配列は，Ｇｅｎｂａｎｋから入手することができる（実施例の表１を参照）。これらの既知の配列に基づいて，適当なプライマーを選択してＰＣＲ増幅することにより，導入すべきＤＮＡの断片を得ることができる。これらの断片を適当な発現ベクター中に，齧歯類動物細胞中で作用しうるプロモーターの下流に挿入して，遺伝子導入用のコンストラクトを構築する。
遺伝暗号の縮重により異なる塩基配列を有する遺伝子が同じ蛋白質をコードしうることは当該技術分野においてよく知られている。すなわち、本発明においては、ｈＣＤ４，ヒトケモカインレセプター，ｈＣｙｃｌｉｎＴ１およびｈＣＩＩＴＡをコードし、かつ天然のヒト遺伝子とは異なる配列を有する遺伝子を用いることができる。さらに、導入される遺伝子にコードされる、ｈＣＤ４，ヒトケモカインレセプター，ｈＣｙｃｌｉｎＴ１およびｈＣＩＩＴＡ蛋白質は、ＨＩＶ−１により認識され、感染し、ＨＩＶウイルス粒子を産生するのに必要な活性を有する限り、天然のヒト蛋白質とは異なるアミノ酸配列を有していてもよく、天然のヒト蛋白質のアミノ酸配列から、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されていてもよい。
【００２５】
ｈＣＤ４，ヒトケモカインレセプター，ｈＣｙｃｌｉｎＴ１およびｈＣＩＩＴＡ遺伝子は，それぞれ別のコンストラクト上に含まれていてもよく，あるいは１つのコンストラクト上に含まれていてもよい。このコンストラクトを，トランスフェクション，マイクロインジェクションなど当該技術分野において知られる方法により，齧歯類動物細胞中に導入する。齧歯類動物細胞としては，マウス，ラットなどの樹立された細胞株のいずれを用いてもよい。そのような細胞としては，例えば，マウスＮＩＨ３Ｔ３やＬ細胞が挙げられる。
【００２６】
別の観点においては，本発明は，ＨＩＶ−１に感染し，エイズを発症するトランスジェニック齧歯類動物を特徴とする。このトランスジェニック動物では，ｈＣＤ４，ヒトケモカインレセプター，ｈＣｙｃｌｉｎＴ１およびｈＣＩＩＴＡ遺伝子を全体細胞中に有しており，ＨＩＶ−１に感染可能である。かつ，このトランスジェニック動物に，ＨＩＶ−１ウイルスに感染させたときに，ＨＩＶ−１ウイルスを複製しウイルス粒子を産生しうるＨＩＶ−１感染齧歯類動物モデルとなりうる。好ましくは，ヒトケモカインレセプターはｈＣＸＣＲ４またはｈＣＣＲ５である。
【００２７】
本発明のトランスジェニック動物は，以下のようにして作製することができる。齧歯類動物としては，マウスまたはラットを用いることができる。採卵用のマウスまたはラットに，ＰＭＳＧ／ｈＣＧを腹腔内投与した後，雄と交尾させる。受精卵を採取し，ｈＣＤ４，ヒトケモカインレセプター，ｈＣｙｃｌｉｎＴ１およびｈＣＩＩＴＡ遺伝子をマイクロインジェクションする。これらの遺伝子は，１つのコンストラクト上に含まれていてもよく，またはそれぞれの遺伝子を有する複数のコンストラクトを同時に受精卵に導入してもよい。受精卵をｍ−ＫＲＢ培地中で数時間から一晩インキュベートした後，偽妊雌の卵管に移植する。仔が生まれたら，目的とする遺伝子が組み込まれているか否かについてスクリーニングする。スクリーニングは，各個体の尾部等から少量の血液を採取し，ＰＣＲ，サザンブロッティング等の方法を用いてＤＮＡを分析することにより行うことができる。導入遺伝子のコピー数，組み込みパターンなどを分析し，所望のトランスジンを有する個体を選択する。得られたトランスジェニック動物と，正常動物とを交配させてＦ１を得ることができる。
【００２８】
あるいは，胚幹細胞にＤＮＡを導入し，胚盤胞にマイクロインジェクションしてキメラを作成し，これを適切な種と交配させてトランスジェニック動物を作成してもよい。
【００２９】
得られたトランスジェニック動物にＨＩＶ−１ウイルスを感染させることにより，本発明のエイズ発症を可能にするＨＩＶ−１感染モデル動物を得ることができる。
【００３０】
本発明のＨＩＶ−１感染モデル動物は，ヒトＨＩＶ−１感染症の病因的研究に，ＨＩＶ−１感染症の治療方法の研究に，およびＨＩＶ−１感染症の発症の予防または治療のための新規薬剤の開発に用いることができる。
【００３１】
さらに別の観点においては，本発明は，試験薬剤の抗ＨＩＶ−１ウイルス活性を検定する方法を提供する。該方法は，ＨＩＶ−１に感染させた本発明の細胞と試験薬剤とを接触させ，そして前記細胞におけるＨＩＶ−１  ＲＮＡまたはウイルス蛋白質のレベルを測定する，の各工程を含む。
【００３２】
薬剤のスクリーニングを行う場合には，ＨＩＶ−１に感染させた本発明の細胞を例えば９６ウエルプレート中で培養し，各ウエルに試験薬剤を加えて所定の時間インキュベートした後，ＨＩＶ−１  ＲＮＡの転写をＲＴ−ＰＣＲなどの方法により確認する。より定量的なアッセイを行うためには，ＥＬＩＳＡにより各種ウイルス蛋白のレベルを測定することができる。
【００３３】
さらに別の観点においては，このような検定は，本発明の動物を用いて行うことができる。ＨＩＶ−１に感染させた本発明のトランスジェニック動物に試験薬剤を投与し，前記動物におけるＨＩＶ−１感染症の指標をモニターする。このような指標としては，ＨＩＶ−１  ＲＮＡのレベル，血中ウイルスレベル，ＣＤ４＋Ｔリンパ球の数，ウイルス蛋白のレベル，およびウイルス蛋白に対する抗体のレベルなどが挙げられる。
【００３４】
トランスジェニック動物へのＨＩＶ−１ウイルス感染は，経粘膜或いは血行性に感染させることにより行うことができる。感染後，適当な時間間隔で（例えば２週，４週，６週）血清を採集し，例えば，ＲＴ−ＰＣＲ  ＨＩＶ−１キット（ＲＯＣＨＥ）を用いて，血清中のウイルスの量を評価する。あるいは，ｐ２４，ｐ１２０，ｐ５６などのウイルス蛋白またはそれに対する抗体をＥＬＩＳＡで検出してもよい。さらに，再感染可能なウイルス粒子が産生されているか否かを検出するためには，電子顕微鏡によりＨＩＶの粒子を検出するか，または感染トランスジェニック動物の血液あるいは血清を用いて，ＨＩＶ−１に感染可能なヒト末梢血リンパ球，本発明で作製したｈＣＤ４，ヒトケモカインレセプター，ｈＣｙｃｌｉｎＴ１およびｈＣＩＩＴＡ遺伝子導入齧歯類動物細胞あるいは未感染トランスジェニック動物の再感染実験を行うことによってできる。
【００３５】
本発明のトランスジェニック動物を用いるＨＩＶ−１感染症の病理学的研究，あるいはＨＩＶ−１感染症治療薬の試験のためには，感染させたトランスジェニック動物を長期間飼育して，ＣＤ４，ＣＤ８などリンパ球の変化，免疫能力，及びＨＩＶ−１に関連する諸症状の発症を調べる。
【００３６】
さらに，本発明の動物を用いて，新規試験薬剤と種々の抗ＨＩＶ−１剤（例えばプロテアーゼ阻害剤および逆転写酵素阻害剤）との組み合わせについて，ＨＩＶ−１感染症の発症予防および治療効果を調べることができる。
【００３７】
さらに，本発明の細胞または動物を使用するスクリーニング方法により同定された薬剤，ならびにこの薬剤を含むＨＩＶ−１感染症の予防または治療用医薬組成物もまた本発明の範囲内である。
【００３８】
【実施例】
以下に，実施例により本発明をより詳細に説明するが，これらの記載は例示の目的にのみ提供されるものであり，本発明の範囲はこれらに限定されない。
【００３９】
実施例１  ｈＣＤ４，ｈＣＸＣＲ４，ｈＣＣＲ５ｈ，ｈＣｙｃｌｉｎＴ１およびｈＣＩＩＴＡ遺伝子の発現用コンストラクトの作成
ｈＣＤ４発現コンストラクトは，Ｈ．Ｋａｒａｓｕｙａｍａ（東京都臨床医学総合研究所）により供与された（Yamamura, Y. et al. Int. Immunol. 3:1183-1187 (1991)）。ｈＣＸＣＲ４，ｈＣＣＲ５，ｈＣｙｃｌｉｎＴ１およびｈＣＩＩＴＡのｃＤＮＡは，既知の配列に基づいてＲＴ−ＰＣＲによりクローニングした。
【表１】
2004201546.tif 000002
【００４０】
総ＲＮＡは，ＩＳＯＧＥＮキット（ＮＩＰＰＯＮｇｅｎｅ，Ｃｏ．，Ｔｏｙａｍａ．Ｊａｐａｎ）を用いてｈＰＢＭＣから単離し，Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を用いてオリゴ−（ｄＴ）プライマーを用いるＲＴ反応に供した。ｃＤＮＡ産物は，ｈＣＣＲ５，ｈＣＸＣＲ４，ｈＣｙｃｌｉｎＴ１およびｈＣＩＩＴＡの各ＤＮＡ配列にしたがって設計した遺伝子特異的プライマーで増幅し，各増幅ｃＤＮＡを，ｐＵＣ１８またはｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）中に，適当な制限酵素を用いてサブクローニングするか，またはＴＡクローニングを行った。各クローン化ｃＤＮＡは，ＤＮＡ配列決定により各遺伝子の正しいＤＮＡ配列であることを確認した。適当な制限酵素で消化した後，各ｃＤＮＡをサイトメガロウイルスプロモターあるいはヒトelongation factor 1aプロモターを持つ発現ベクターのマルチクローニング部位中にライゲーションした。表２に，使用したプライマーおよび作成したベクターを示す。
【表２】
2004201546.tif 000003
【００４１】
実施例２  ｈＣＤ４，ｈＣＸＣＲ４，ｈＣＣＲ５ｈのトランスフェクション
実施例１で得られたｈＣＤ４，ｈＣＸＣＲ４，ｈＣＣＲ５ｈの発現コンストラクトを，ラット繊維芽細胞株，Ｗ３１（Yagihashi, A. et al. Cancer Res. 48,2798-804 (1988)）（Ｎ．Ｓａｔｏ（札幌医科大学）より供与）にトランスフェクトした。トランスフェクションは，Ｓｕｐｅｒ  Ｆｅｃｔ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて，製造元の指針にしたがって行った。トランスフェクタントを選択し，１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ），４００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ），４０μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）および／または５μｇ／ｍｌのブラスチシジン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で維持した。高レベルのトランスジン発現を有する安定なトランスフェクタントを，標準的な限界希釈法によりクローニングした。
【００４２】
１０6個の細胞を各分子に特異的なモノクローナル抗体で染色し，各トランスジンの発現レベルをフローサイトメトリにより確認した。フローサイトメトリは，一次抗体として，マウス抗−ＣＣＲ５（２Ｄ７，Ｐｈａｒ  Ｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）または抗−ｈＣＸＣＲ４（１２Ｇ５，Ｐｈａｒ  Ｍｉｎｇｅｎ）モノクローナル抗体を用い，二次抗体としてフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−結合ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を用いて行った。ｈＣＤ４の直接染色には，フィコエリスリン（ＰＥ）−結合抗ｈＣＤ４モノクローナル抗体（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いた。細胞は，ＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて分析した。陰性対照としては，一次抗体として正常マウスＩｇＧを，または直接染色としてＰＥ標識マウスＩｇＧを用いた。図１に，ｈＣＤ４およびｈＣＸＣＲ４またはＣＣＲ５遺伝子を有するＷ３１の細胞表面におけるｈＣＤ４，ｈＣＸＣＲ４またはｈＣＣＲ５の発現をフローサイトメトリで示す。
【００４３】
実施例３  ｈＣＤ４−ｈＣＸＣＲ４またはｈＣＤ４−ｈＣＣＲ５を有するＷ３１へのＨＩＶ−１感染
ｈＣＤ４−ｈＣＸＣＲ４またはｈＣＤ４−ｈＣＣＲ５のいずれかを発現するＷ３１細胞に，Ｔ−指向性ＨＩＶ−１分離株であるＳＦ３３（Tateno, M. & Levy,J.A. Virology 167, 299-301 (1988)），またはＭ−指向性ＨＩＶ−１分離株であるＪＲＦＬおよびＪＲＣＳＦ（O'Brien.W.A. et al. Nature 348, 69-73 (1990)）（Ｙ．Ｋｏｙａｎａｇｉ（東北大学）より供与）を感染させた。トランスフェクタントを４０μｇ／ｍｌのＤＥＡＥデキストランで処理した後，リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し，各ＨＩＶ−１液（約１００ＴＣＩＤ−５０／ｍｌ）とともに３７℃で２時間インキュベートした。次に，トランスフェクタントをＰＢＳで３回洗浄し，１０％ＦＣＳを含有する新鮮なＲＰＭＩ−１６４０培地を加えた。２４時間ごとにトリプシン−ＥＤＴＡ溶液で処理することにより再播種し，これを３回繰り返した。このようにして，３つの感染Ｗ３１細胞，ｈＣＤ４−ｈＣＸＣＲ４SF33，ｈＣＤ４−ｈＣＣＲ５JRFL，およびｈＣＤ４−ｈＣＣＲ５JRCSFを樹立した。
【００４４】
感染後５日間ごとに，これらの細胞からのＤＮＡおよび総ＲＮＡを抽出して，ＨＩＶ−１用ＰＣＲ増幅キット（ＡＢＢＯＴＴ，Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ−Ｄｅｌｋｅｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＨＩＶ−１プロウイルスのＤＮＡまたはｍＲＮＡを測定した。
【００４５】
ＨＩＶ−１を感染させたＷ３１トランスフェクタントにおけるＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡは，ＨＩＶ−１のＬＴＲ，ｇａｇ，ｐｏｌ，ｖｉｆ，ｔａｔ，ｒｅｖ，ｅｎｖおよびｎｅｆ領域をカバーする一連のプライマー対を用いて，ＰＣＲにより検出した。感染の１週間後に全ての感染Ｗ３１細胞のゲノム中でＨＩＶ−１プロウイルスが出現し，これは細胞を長期培養したとき，８週間以上にわたって存在していた。
【００４６】
図２は，感染の１ヶ月後の例を示す。すべてのトランスフェクタントにおいてそれぞれ予測されたサイズの増幅されたバンドが存在した。レーン１；ＬＴＲ（ＳＫ２９／ＳＫ３０（Psallidopoulos, M.C. et al. J. Virol. 63,4626-4631 (1989)）），２；ｇａｇ（ＬＡＶ１／ＬＡＶ２，Ｇｅｎｓｅｔ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ），３；ｐｏｌ（ＨＩＶ１６０／ＨＩＶ１６１（Courgnaud, V. et al. AIDS Res. Hum. Retroviruses 7, 337-341. (1991)）），４；ｖｉｆ（ＨＩＶ１５６／ＨＩＶ１５７（Kwoh, D.Y. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,1173-1177 (1989)）），５；ｔａｔ（ＨＩＶ１４６／ＨＩＶ１４８，Ｇｅｎｓｅｔ），６；ｅｎｖ（ＨＩＶ１０４／ＨＩＶ１０５（Jason, J. et al. J. Infect. Dis. 160,789-794 (1989)），７；ｅｎｖ（ＳＫ６８／ＳＫ６９（Plummer, F.A. et al. J. Infect. Dis. 161, 810-811 (1990)）），８；ｅｎｖ／ｔａｔ／ｒｅｖ（ＨＩＶ１７９／ＨＩＶ１８０（Steuler, H., et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 8, 53-59 (1992)））および９；ｎｅｆ（ＨＩＶ１４０／ＨＩＶ１４１（Murakawa, G.J. et al. DNA 7, 287-295 (1988)））。Ｍは分子サイズマーカーである１００ｂｐラダーＤＮＡであり，Ｎは陰性対照のＷ３１細胞である。ＳＦ３３感染（ＨＵＴ７８SF33）を有するＨＵＴ７８を陽性対照として用いた。なお，ｈＣＤ４，ｈＣＸＣＲ４またはｈＣＣＲ５を単独で発現するＷ３１細胞には，ＨＩＶ−１は感染しなかった（データ示さず）。
【００４７】
次に，サザンブロットによりプロウイルスＤＮＡを調べた。各感染細胞からのゲノムＤＮＡをＳｍａＩおよびＳｔｕＩで消化し，０．８％アガロースゲル電気泳動により分離した。ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｙｌｅｓｂｕｒｙ，Ｅｎｇｌａｎｄ）に移した後，膜を32Ｐ−放射性標識ＨＩＶ−１ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションからオートラジオグラフィーまでの方法は，標準的な方法にしたがって行った。
【００４８】
図３は，ＨＩＶ−１感染の１ヶ月後における，ＨＩＶ−１プローブを用いるサザンブロットを示す。ｅｎｖ／ｔａｔ領域（６７７ｂｐ）からのＰＣＲ産物をプローブとして用いたとき，各ゲノム中において約９ｋｂのバンドが検出され，ｈＣＤ４−ＣＸＣＲ４SF33，ｈＣＤ４−ＣＣＲ５JRCSFおよびｈＣＤ４−ＣＣＲ５JRFLの各感染Ｗ３１細胞のゲノム中にＨＩＶ−１プロウイルスが組み込まれていることが確認された。図中，マーカーは１ｋｂＤＮＡラダー分子サイズマーカーであり，ＮＣは陰性対照のｈＰＢＭＣである。ＨＵＴ７８は陽性対照であるヒトリンパ腫細胞株である。
【００４９】
プロウイルスのｍＲＮＡ発現はＲＴ−ＰＣＲを用いて検出した。感染細胞からのＤＮａｓｅ処理済総ＲＮＡを，Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴ（Ｇ１ＢＣＯ−ＢＲＬ）により，ランダムプライマーセット（ＴＡＫＡＲＡ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて転写させ，上述のプライマー対を用いてＰＣＲにより増幅したところ，ＨＩＶ−１プロウイルスの転写産物は増幅されなかった（データ示さず）。
【００５０】
培養液または細胞溶解物中のｐ２４は，ＥＬＩＳＡキット（ＡＢＢＯＴＴ）により測定した。細胞溶解物を調製するためには，細胞をウイルス破壊バッファー（０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８），０．１５ｍｇ／ｍｌジチオスレイトールおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）により溶解し，１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。回収した上清を細胞溶解物として用いた。いずれの感染Ｗ３１細胞の培養液においても，ウイルス性ｐ２４Ｇａｇ蛋白質は認められなかった（図４）。図中，ＨＵＴ７８SF33は陽性対照である。
【００５１】
これらの結果は，ラット繊維芽細胞株においてｈＣＤ４と，ｈＣＣＲ５またはｈＣＸＣＲ４とを共発現させると，ＨＩＶ−１が侵入し，宿主ゲノム中に組み込まれるが，ウイルスＲＮＡは転写されないことを示す。
【００５２】
実施例４  ｈＣｙｃｌｉｎＴ１の導入
ｈＣｙｃｌｉｎＴ１発現コンストラクト（表１）をｈＣＤ４−ｈＣＸＣＲ４SF33，ｈＣＤ４−ｈＣＣＲ５JRFL，およびｈＣＤ４−ｈＣＣＲ５JRCSF細胞にトランスフェクトした。ｈＣｙｃｌｉｎＴ１の発現はＲＴ−ＰＣＲにより評価し，すべてのトランスフェクタントについてｍＲＮＡ発現を確認した（データ示さず）。感染Ｗ３１細胞は，トランスフェクションの４８時間後から凝集しはじめ，１週間後には細胞凝集塊の形成が見られた（図５）ａはトランスフェクション前，ｂとｃとｄはｈＣｙｃｌｉｎＴ１のトランスフェクション後である。ａとｂは，ｈＣＤ４−ｈＣＸＣＲ４SF33細胞の，ｃとｄは，ｈＣＤ４−ｈＣＣＲ５JRCSF細胞の結果である。
【００５３】
感染Ｗ３１細胞におけるＨＩＶ−１転写産物はＲＴ−ＰＣＲにより検出した。総ＲＮＡは，トランスフェクションの１週間後に，各培養物の凝集塊から得た。すべてのトランスフェクタントについて，ＬＴＲ，ｐｏｌ，ｅｎｖ，ｅｎｖ／ｔａｔ／ｒｅｖ，およびｎｅｆ領域のプライマーにより転写産物が検出されたが，ｇａｇ，ｖｉｆおよびｔａｔ領域の転写産物は検出されなかった（図６）。レーン番号および用いたプライマー対は，図２と同じである。Ｍは，分子サイズマーカーの１００ｂｐＤＮＡラダーであり，Ｎは陰性対照としての，各細胞におけるＲＴなしのＰＣＲである。ＨＵＴ７８SF33は，陽性対照である。
【００５４】
次に，ＨＩＶ−１−感染Ｗ３１細胞における感染性ＨＩＶ−１ウイルスの産生を調べるために，ｈＣＩＩＴＡおよびｈＣｙｃｌｉｎＴ１の二重トランスフェクションの２日後に，ｈＣＤ４−ｈＣＸＣＲ４SF33細胞からの上清を回収し，ＰＨＡ−活性化ｈＰＢＭＣ培養物に加えた。一晩インキュベートした後，ｈＰＢＭＣをＰＢＳで洗浄し，５％のヒトインターロイキン−２（ＨｅｍａｇｅｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＩｎｃ．，Ｃｏｌｕｍｂｉａ．Ｍａｒｙｌａｎｄ）とともに培養し，実施例３と同様に，培養液中のｐ２４を４日ごとに測定した。培養液または細胞溶解物中には検出可能な量のｐ２４は存在しなかった。
【００５５】
これらの結果は，ｈＣｙｃｌｉｎＴ１は，感染Ｗ３１細胞の凝集およびＨＩＶ−１プロウイルスの部分的転写を誘導するが，ｐ２４の産生およびウイルス複製は誘導しないことを示す。
【００５６】
実施例５  ｈＣｙｃｌｉｎＴ１を有するＨＩＶ−１感染Ｗ３１細胞とｈＰＢＭＣまたはｒＰＢＭＣとの細胞融合
組み込まれたＨＩＶ−１プロウイルスが，侵入後に複製の能力を有しているか否かを調べるために，感染細胞をＰＨＡ−処理ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）またはラットＰＢＭＣ（ｒＰＢＭＣ）と融合させた。
【００５７】
ｈＣｙｃｌｉｎＴ１トランスフェクションを有するＨＩＶ−１−感染細胞を，フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ，３μｇ／ｍｌ）活性化ｈＰＢＭＣまたはｒＰＢＭＣ（それぞれ１０6個の細胞）とおだやかに混合し，１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を完全に除去した後，０．５ｍｌのあらかじめ暖めたポリエチレングリコール１５００を細胞混合物に滴加し，次に９０秒間放置した。あらかじめ暖めたＲＰＭＩ培地をゆっくり加えることにより反応を停止させた。融合細胞は，１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後，１０％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中におだやかに再懸濁し，ペトリ皿に播種した。細胞融合の３日後における培養液中のウイルスｐ２４Ｇａｇ蛋白質産生を，実施例３と同様に，ＥＬＩＳＡを用いて検出した。陽性対照としては，ｈＰＢＭＣと融合させたＨＵＴ７８SF33の培養物を用いた。
【００５８】
ｈＣｙｃｌｉｎＴ１を有するＨＩＶ−１感染Ｗ３１は，ｈＰＢＭＣと融合させたとき，対照のほぼ半分のレベルのｐ２４産生を誘導した。これに対し，ｒＰＢＭＣとの融合ではｐ２４産生は見られなかった（図７）。これらの結果は，ｈＣＤ４，ケモカインレセプターおよびｈＣｙｃｌｉｎＴ１を発現するラット細胞に組み込まれたＨＩＶ−１プロウイルスが複製するためには，追加のヒト因子が必要であることを示唆する。
【００５９】
実施例６  ｈＣＩＩＴＡの導入
蛍光−コンジュゲート化発現ベクターを用いてｈＣＩＩＴＡおよびｈＣｙｃｌｉｎＴ１遺伝子の両方をｈＣＤ４−ｈＣＸＣＲ４SF33細胞にコトランスフェクトした。ｈＣｙｃｌｉｎＴ１およびｈＣＩＩＴＡで二重トランスフェクトしたｈＣＤ４−ｈＣＸＣＲ４SF33はシンシチウムを形成し，トランスフェクションの２４時間後から死に始めた。蛍光測定は，細胞の核内でのｈＣＩＩＴＡおよびｈＣｙｃｌｉｎＴ１の二重発現を示した。
【００６０】
図８は，ｈＣｙｃｌｉｎＴ１およびｈＣＩＩＴＡの導入によるｈＣＤ４−ｈＣＸＣＲ４SF33のシンシチウム形成を示す。黄色（ｈＣｙｃｌｉｎＴ１について）または緑色（ｈＣＩＩＴＡについて）蛍光を有する発現ベクター（ｐＥＹＦＰ−ｃｌまたはｐＥＧＦＰ−ｃｌ）を用いた。写真は，二重トランスフェクションの２４時間後に，位相差顕微鏡により（ａ），または蛍光顕微鏡により，フィルターなし（ｂ）または黄色（ｃ）または緑色（ｄ）蛍光用のフィルターを用いて撮影した。矢印は，３以上の核を有するシンシチウム細胞を示す（ａ）。
【００６１】
二重トランスフェクションの２４時間後，細胞溶解物中のｐ２４Ｇａｇ蛋白質をＥＬＩＳＡにより検出した。図９に示されるように，ｈＣＤ４−ｈＣＸＣＲ４SF33−ｈＣｙｃｌｉｎＴ１−ｈＣＩＩＴＡの細胞溶解物からｐ２４が検出された。ＨＵＴ７８SF33は陽性対照である。
【００６２】
実施例７  感染性ＨＩＶ−１粒子の産生
ＨＩＶ−１粒子の産生を確認するために，実施例６で得られたトランスフェクタントｈＣＤ４−ｈＣＸＣＲ４SF33−ｈＣｙｃｌｉｎＴ１−ｈＣＩＩＴＡの培養上清の存在下でｈＰＢＭＣを一晩感染させた後，感染ｈＰＢＭＣの培養液中のｐ２４をＥＬＩＳＡにより測定した。ｐ２４は，感染の４日後から徐々に増加した。さらに，培養細胞プールに新鮮なＰＨＡ−処理ｈＰＢＭＣを加えたとき，ｐ２４の量は，陽性対照であるＨＩＶ−１−感染ＨＵＴ７８におけるレベルと匹敵するレベルに達した（図１０）。
【００６３】
実施例８  トランスジンの構築
４個のＨＩＶ−１感染関連ヒト遺伝子を有するトランスジェニックラットを作製するために，３種類のトランスジンコンストラクトを作製した。マウスＨ−２Ｋdプロモーター領域，ＨＴＬＶ−ＩｐＸｃＤＮＡおよびＳＶ４０ポリＡシグナルを有するｐＨ２／ｔａｘ．ｒｅｘ発現コンストラクト（Ｙａｍａｄａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５：２５２４−２５２７）から，ＥｃｏＲ１消化によりｐＸｃＤＮＡ挿入物を取り除き，次にクローニングした全長ｈＣＸＣＲ４，ｈＣＣＲ５，ｈＣＩＩＴＡまたはｈＣｙｃｌｉｎＴ１のｃＤＮＡをその部位にライゲーションした。適当な制限酵素（ＫｐｎＩおよびＳａｌＩ）で消化した後，Ｈ−２ＫdプロモーターとＳＶ４０ポリＡシグナル配列との間にｈＣＸＣＲ４，ｈＣＣＲ５，ｈＣＩＩＴＡまたはｈＣｙｃｌｉｎＴ１のｃＤＮＡを含む各発現カセットを用いて，以下に示す３種類のトランスジンを構築した。
【００６４】
トランスジン１：最初に，ｈＣｙｃｌｉｎＴ１発現ユニットを有するｐＵＣ１１９（ｐＵＣ／ＣｙｃＴ１）は，ｐＵＣ１１９ベクターのマルチクローニング部位のＢａｍＨＩとＳａｌＩ部位との間にｈＣｙｃｌｉｎＴ１の発現カセットを挿入することにより作成した。次に，ｈＣＸＣＲ４発現カセットをｐＵＣ／ＣｙｃＴ１のＫｐｎＩ部位にライゲーションした（図１１ａ）。
【００６５】
トランスジン２：ｈＣＣＲ５発現カセットをｐＵＣ／ＣｙｃＴ１に挿入するため，ｐＵＣ／ＣｙｃＴ１のｈＣｙｃｌｉｎＴ１発現ユニット部位の後のＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位との間にマルチクローニング配列を挿入し，次にｈＣＣＲ５発現カセットをマルチクローニング部位のＫｐｎＩとＳａｌＩ部位との間に挿入した（図１１ｂ）。
【００６６】
トランスジン３：ｈＣＤ４ｃＤＮＡ発現用の約１ｋｂのヒトＣＤ４プロモーター領域（Ｈａｎｎａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４，  １０８４−１０９４；，ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｓ６８０４３）を，ＰＣＲクローニング法を用いてヒト末梢血単核細胞のゲノムＤＮＡからクローニングした。クローンのＤＮＡ配列が正しいものであることを確認した後，ｐＨ２／ｔａｘ．ｒｅｘ中のマウスＨ−２Ｋdプロモーターをクローン化ＣＤ４プロモーターで置き換えた。次に，ｐＸｃＤＮＡ挿入物をクローン化全長ｈＣＤ４ｃＤＮＡで置き換えた。ＫｐｎＩおよびＳａｌＩ消化によりヒトＣＤ４プロモーターを有するｈＣＤ４発現カセットを得た。ｈＣＩＩＴＡ発現カセットおよびｈＣＤ４発現カセットをｐＵＣ１１９のマルチクローニング部位のＥｃｏＲＩとＳａｌＩ部位との間に一緒にライゲーションした（図１１ｃ）。
【００６７】
ラット線維芽細胞株Ｗ３１へのインビトロトランスフェクションおよびＲＴ−ＰＣＲ検出により，すべてのトランスジンコンストラクトがそれぞれのｍＲＮＡを発現することを確認した。
【００６８】
実施例９  ＨＩＶ−１感染に関連する４種類のヒト遺伝子を有するトランスジェニックラットの樹立
実施例８で作製した各トランスジンをＳａｌＩ消化により線状とした後，Ｔ−指向性ＨＩＶ−１感染についてはトランスジン１（ｐＵＣ／ＣＸＣＲ４−ＣｙｃＴ１）および３（ｐＵＣ／ＣＩＩＴＡ−ＣＤ４）の混合物を，Ｍ−指向性ＨＩＶ−１感染についてはトランスジン２（ｐＵＣ／ＣｙｃＴ１−ＣＣＲ５）および３（ｐＵＣ／ＣＩＩＴＡ−ＣＤ４）の混合物を，先に記載された方法（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）（上掲），Ｙａｍａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７），Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：３３９−３４６）にしたがって，雌ラットの受精可能な卵子にマイクロインジェクションした。
【００６９】
精管結紮法により精索を結紮した雄ＳＤラットと交配させることにより偽妊娠ラットを作製し，マイクロインジェクションした卵子を偽妊娠ラットの卵管に移した。移植の２１−２２日後に仔が生まれた。各遺伝子特異的プライマーセットを用いるＰＣＲを用いて，トランスジンのインテグレーションを検出した。トランスジン２（ｐＵＣ／ＣｙｃＴ１−ＣＣＲ５）および３（ｐＵＣ／ＣＩＩＴＡ−ＣＤ４）を卵子にインジェクションすることにより得られた１匹のラット（ＴｇＭ１２２）が，４種類のヒト遺伝子，すなわち，ｈＣＤ４，ｈＣＣＲ５，ｈＣｙｃｌｉｎＴ１およびｈＣＩＩＴＡを有していることが確認された（図１２）。ラットの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から全ＲＮＡを抽出し，リバーストランスクリプターゼ（ＲＴ）により処理したところ，４つの遺伝子のそれぞれの転写産物が検出された（図１３）。
【００７０】
次に，雌ラットを非トランスジェニック雄ＳＤラットと交配させて，Ｆ１を作成し，１２匹の仔を得た。生後４週目に，１２匹のラットのうち４匹において４つすべてのトランスジンが確認され，４つのトランスジンの分離は認められなかった（図１４）。この結果は，これらのトランスジンが一緒に同じ染色体に安定にインテグレーションされたことを示す。
【００７１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は，Ｗ３１の細胞表面におけるｈＣＤ４，ｈＣＸＣＲ４またはｈＣＣＲ５の発現をフローサイトメトリで示す。
【図２】図２は，ＨＩＶ−１感染トランスフェクタントにおける，ＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡのＰＣＲによる検出を示す電気泳動の写真図面である。
【図３】図３は，ＨＩＶ−１感染トランスフェクタントにおける，ＨＩＶ−１プローブを用いるサザンブロットを示す電気泳動の写真図面である。
【図４】図４は，ＥＬＩＳＡによる，ＨＩＶ−１感染トランスフェクタント培養液中のｐ２４のレベルを示す。
【図５】図５は，ｈＣｙｃｌｉｎＴ１トランスフェクション後の，感染Ｗ３１細胞を表す顕微鏡写真の写真図面である。
【図６】図６は，ＲＴ−ＰＣＲによる感染Ｗ３１細胞におけるＨＩＶ−１転写産物の検出を示す電気泳動の写真図面である。
【図７】図７は，ｈＣｙｃｌｉｎＴ１およびｈＰＢＭＣまたはｒＰＢＭＣを有する，感染Ｗ３１凝集物の融合細胞の培養液におけるウイルスｐ２４Ｇａｇ蛋白質のレベルを示す。
【図８】図８は，ｈＣｙｃｌｉｎＴ１およびｈＣＩＩＴＡを導入した感染Ｗ３１を表す顕微鏡写真の写真図面である。
【図９】図９は，ｈＣｙｃｌｉｎＴ１およびｈＣＩＩＴＡを導入した感染Ｗ３１の細胞溶解物中のｐ２４Ｇａｇ蛋白質のレベルを示す。
【図１０】図１０は，ｈＣＤ４−ｈＣＸＣＲ４SF33−ｈＣｙｃｌｉｎＴ１−ｈＣＩＩＴＡの培養上清で感染した後のｈＰＢＭＣの培養液におけるｐ２４のレベルを示す。
【図１１】図１１は，４個のＨＩＶ−１感染関連ヒト遺伝子を有するトランスジェニック動物を作製するために用いる３種類のトランスジンコンストラクトを示す。
【図１２】図１２は，トランスジェニックラットにおける，４種類のヒト遺伝子，すなわち，ｈＣＤ４，ｈＣＣＲ５，ｈＣｙｃｌｉｎＴ１およびｈＣＩＩＴＡの検出を示す写真図面である。
【図１３】図１３は，トランスジェニックラットにおける，４種類のヒト遺伝子，すなわち，ｈＣＤ４，ｈＣＣＲ５，ｈＣｙｃｌｉｎＴ１およびｈＣＩＩＴＡのそれぞれの転写産物の検出を示す写真図面である。
【図１４】図１４は，Ｆ１ラットにおける４種類のヒト遺伝子の検出を示す写真図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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