(57)【要約】　　　（修正有）【課題】新規な硫酸基転移酵素、そのポリペプチド及びそれをコードするＤＮＡを提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号３７〜３４６からなるアミノ酸配列を含むポリペプチド又は該ポリペプチドのアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入若しくは転移を有するアミノ酸配列を含むとともに硫酸基供与体から硫酸基受容体であるグリコサミノグリカンに対して硫酸基を転移する活性を有するポリペプチドを有する硫酸基転移酵素、そのポリペプチド、及びそれをコードするＤＮＡ、かかる硫酸基転移酵素による下記式１記載の構造を含むグリコサミノグリカンの製造方法。2004141142.tif 000027【選択図】　　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号３７〜３４６を含むポリペプチド、又は該ポリペプチドのアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入若しくは転移を有するアミノ酸配列を含むとともに硫酸基供与体から硫酸基受容体であるグリコサミノグリカンに対して硫酸基を転移する活性を有する硫酸基転移酵素のポリペプチド。
【請求項２】
ポリペプチドが配列番号２記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
ポリペプチドが配列番号２記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号３７〜３４６からなることを特徴とする請求項１記載のポリペプチド。
【請求項４】
グリコサミノグリカンがヘパリン又はヘパラン硫酸であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項記載のポリペプチドを含むとともに、硫酸基供与体から硫酸基受容体であるグリコサミノグリカンに対して硫酸基を転移する活性を有する硫酸基転移酵素。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項記載のポリペプチド若しくは請求項５記載の硫酸基転移酵素をコードする核酸。
【請求項７】
配列番号１記載の塩基配列からなることを特徴とする核酸。
【請求項８】
「請求項６又は７記載の核酸又はその塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸」にストリンジェントな条件下においてハイブリダイズすることを特徴とする核酸。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか一項記載の核酸を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９記載の発現ベクターを含むことが宿主細胞に移入されていることを特徴とする組換体。
【請求項１１】
宿主細胞が真核細胞であることを特徴とする請求項１０記載の組換体。
【請求項１２】
請求項１０又は１１記載の組換体を生育させ、得られた生育物から請求項１〜４のいずれか一項記載のポリペプチド又は請求項５記載の硫酸基転移酵素を採取することを特徴とするポリペプチド又は硫酸基転移酵素の製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか一項記載のポリペプチド又は請求項５記載の硫酸基転移酵素を含むことを特徴とする、下記式１記載の構造を含むグリコサミノグリカンの合成のための酵素剤。
【化１】
2004141142.tif 000024
【請求項１４】
グリコサミノグリカンに、請求項１３記載の酵素剤を作用させて、硫酸基供与体から硫酸基受容体に硫酸基を転移することを特徴とする下記式１記載の構造を含むグリコサミノグリカンの製造方法。
【化２】
2004141142.tif 000025
【請求項１５】
請求項１〜４記載のいずれか一項記載のポリペプチド又は請求項５記載の硫酸基転移酵素の、下記式１記載の構造を含むグリコサミノグリカンの合成のための使用。
【化３】
2004141142.tif 000026
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グリコサミノグリカン硫酸基転移酵素（グリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼ）、そのポリペプチド、それをコードする塩基配列を有する核酸、上記酵素又はポリペプチドを含むグリコサミノグリカンの合成のための酵素剤、及びかかる酵素剤を用いたグリコサミノグリカンの製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
本明細書中、糖及び糖残基は特に明記しない限り、光学異性体はイズロン酸を除き全てＤ体を示す。またＤ−グルコサミン（Ｎ置換体を含む意味で使用することもある）を「ＧｌｃＮ」と、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを「ＧｌｃＮＡｃ」と、Ｄ−グルクロン酸を「ＧｌｃＡ」と、Ｌ−イズロン酸を「ＩｄｏＡ」と、ヘキスロン酸とはＧｌｃＡ、ＩｄｏＡを含む、炭素数６のウロン酸を意味し、「ＨｅｘＡ」と略記することもある。
【０００３】
ヘパリン及びヘパラン硫酸は、ＨｅｘＡ残基（ＧｌｃＡ残基又はＩｄｏＡ残基）とＧｌｃＮＡｃ残基の二糖（４ＧｌｃＡβ１／ＩｄｏＡα１→４ＧｌｃＮＡｃα１）の繰り返し構造を基本骨格（かかる基本骨格を以下「ヘパリン骨格」とも記載する）とし、そのＨｅｘＡ残基の２位ヒドロキシル基及びＧｌｃＮ残基の２位アミノ基、３位ヒドロキシル基、及び６位ヒドロキシル基のいずれか１以上が硫酸化されたグリコサミノグリカンの一種である。
【０００４】
これまで、「ヘパリン」又は「ヘパラン硫酸」の硫酸基は、下記式２中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、又はＲ４で示される位置の１以上に結合していることが知られている。しかし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の全てが硫酸基（ＳＯ３−）であるグリコサミノグリカンとその製造方法は知られていなかった。
【０００５】
【化４】
2004141142.tif 000002
【０００６】
一方、ヘパリン骨格を有するグリコサミノグリカンは様々な生理活性を有することが一般に知られている。例えばヘパリンは血液に対し抗凝固活性を示すことが古くから知られており（非特許文献１）、また各種成長因子と親和性を有していて成長因子の安定化又は活性化に働くことが知られている（非特許文献２）。ヘパラン硫酸も各種成長因子との親和性を有しており成長因子を安定化又は活性化させて創傷治癒の促進に働くこと（非特許文献３）等が知られている。またヘパリンの構成糖であるＧｌｃＮの６位に結合した硫酸基のみを特異的に脱硫酸化することで得られる６−Ｏ−脱硫酸化ヘパリンは、血液に対する抗凝固活性は失っているが創傷治癒を促進する働きを有していることが知られており（特許文献１）、また過ヨウ素酸酸化還元処理とＨｅｘＡの２位の特異的な脱硫酸化とを組み合わせて得られる過ヨウ素酸酸化還元２−Ｏ−脱硫酸化ヘパリン（主にヘパリン骨格を維持している）は各種成長因子の安定化及び神経成長の促進に働くことが知られている（特許文献２）。
これらの事実から、ヘパリン骨格を有するグリコサミノグリカンは様々な生理活性を有すると考えられ、ヘパリンの誘導体は極めて多くの可能性を有していると考えられている。
【０００７】
一方、グリコサミノグリカン硫酸基転移酵素の遺伝子がクローニングされ、該酵素を大量に得ることにより、硫酸基受容体となるグリコサミノグリカンに対する該酵素の基質特異性についての情報を得ることが可能となり、グリコサミノグリカンの構造と機能の関係を研究する上で有用なアプローチが提供されると考えられる。グリコサミノグリカンの生合成、その中でもヘパリン／ヘパラン硫酸の生合成には多くの硫酸化のプロセスがあることが知られており（非特許文献４）、この硫酸化には様々なグリコサミノグリカン硫酸基転移酵素が関与しているものと考えられる。ヘパリン／ヘパラン硫酸に硫酸基を転移するグリコサミノグリカン硫酸基転移酵素としては、ヘパラン硫酸Ｎ−脱アセチル／Ｎ−硫酸基転移酵素（以下「ＮＤＳＴ」と略記することもある）、ヘパラン硫酸２−Ｏ−硫酸基転移酵素（以下「ＨＳ２ＳＴ」と略記することもある）、ヘパラン硫酸３−Ｏ−硫酸基転移酵素（以下「ＨＳ３ＯＳＴ」と略記することもある）及びヘパラン硫酸６−Ｏ−硫酸基転移酵素（以下「ＨＳ６ＳＴ」と略記することもある）等が種々の生物、特にヒトから単離されており、それらのｃＤＮＡのクローニングがされている。
【０００８】
ヒトのＨＳ３ＯＳＴのｃＤＮＡは、非特許文献５において開示されており、当該文献に記載されているｃＤＮＡはＧｅｎｂａｎｋに受け入れ番号ＡＦ０１９３８６として登録されている。
【０００９】
【特許文献１】国際公開ＷＯ００／０６６０８号パンフレット
【特許文献２】特開平１１−３１０６０２号公報
【非特許文献１】Ｔｈｒｏｎｂ．　Ｒｅｓ．，　７５（１９９４），　ｐｐ．１−３２
【非特許文献２】Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，　４（１９９４），　ｐ．４５１
【非特許文献３】Ｊ．　Ｐｈｔｈｏｌ．，　１８３（１９９７），　ｐｐ．２５１−２５２
【非特許文献４】グリコテクノロジー▲５▼、５７（１９９４）、講談社サイエンティフィク発行
【非特許文献５】Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７２（１９９７），　ｐｐ．２８００８−２８０１９
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
ヘパリン骨格を有するグリコサミノグリカンに硫酸基を転移することができる酵素は、ヘパリンやヘパラン硫酸の酵素合成に使用することができる可能性が高く極めて有用であるが、そのような酵素は基質特異性が高く、様々な種類のヘパリンやヘパラン硫酸を工業的に合成するためには様々な種類の酵素を使用して効率的に合成を行う必要がある。しかし、ヘパリン骨格に硫酸基を転移する酵素のバリエーションは、まだ十分であるとはいえない。
したがって、酵素を利用することにより新たな構造を有するグリコサミノグリカンを製造することが可能となれば、かかるグリコサミノグリカンが有する生理活性を探索することが可能となる。
すなわち、本発明は新規な硫酸基転移酵素を提供するとともに、そのポリペプチドのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡをクローニングすることにより、当該酵素を簡便な方法により大量に入手する手段を提供し、それにより酵素化学的に合成することができるグリコサミノグリカンのバリエーションを増すと共に、ヘパリン骨格を有するグリコサミノグリカンの構造−機能の関係の解明に寄与することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヘパラン硫酸を硫酸化するグリコサミノグリカン硫酸基転移酵素をコードする塩基配列を有するＤＮＡを鋭意検索し、該酵素のポリペプチドをコードする塩基配列を有する新規なＤＮＡを発見し、該ＤＮＡを発現させることにより該グリコサミノグリカン硫酸基転移酵素が得られること、及びかかる該グリコサミノグリカン硫酸基転移酵素を利用することにより新たな構造を有するグリコサミノグリカンが製造されることを確認して本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち本発明は以下の通りである。
（１）　配列番号２記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号３７〜３４６を含むポリペプチド、又は該ポリペプチドのアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入若しくは転移を有するアミノ酸配列を含むとともに硫酸基供与体から硫酸基受容体であるグリコサミノグリカンに対して硫酸基を転移する活性を有する硫酸基転移酵素のポリペプチド。
（２）　ポリペプチドが配列番号２記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする（１）記載のポリペプチド。
（３）　ポリペプチドが配列番号２記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号３７〜３４６からなることを特徴とする（１）記載のポリペプチド。
（４）　グリコサミノグリカンがヘパリン又はヘパラン硫酸であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれか記載のポリペプチド。
（５）　（１）〜（４）のいずれか記載のポリペプチドを含むとともに、硫酸基供与体から硫酸基受容体であるグリコサミノグリカンに対して硫酸基を転移する活性を有する硫酸基転移酵素。
（６）　（１）〜（４）のいずれか記載のポリペプチド若しくは（５）記載の硫酸基転移酵素をコードする核酸。
（７）　配列番号１記載の塩基配列からなることを特徴とする核酸。
（８）　「（６）又は（７）記載の核酸又はその塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸」にストリンジェントな条件下においてハイブリダイズすることを特徴とする核酸。
（９）　（６）〜（８）のいずれか記載の核酸を含むことを特徴とする発現ベクター。
（１０）　（９）記載の発現ベクターを含むことが宿主細胞に移入されていることを特徴とする組換体。
（１１）　宿主細胞が真核細胞であることを特徴とする（１０）記載の組換体。（１２）　（１０）又は（１１）記載の組換体を生育させ、得られた生育物から（１）〜（４）のいずれか記載のポリペプチド又は（５）記載の硫酸基転移酵素を採取することを特徴とするポリペプチド又は硫酸基転移酵素の製造方法。
（１３）　（１）〜（４）のいずれか記載のポリペプチド又は（５）記載の硫酸基転移酵素を含むことを特徴とする、下記式１記載の構造を含むグリコサミノグリカンの合成のための酵素剤。
【化５】
2004141142.tif 000003
（１４）　グリコサミノグリカンに、（１３）記載の酵素剤を作用させて、硫酸基供与体から硫酸基受容体に硫酸基を転移することを特徴とする下記式１記載の構造を含むグリコサミノグリカンの製造方法。
【化６】
2004141142.tif 000004
（１５）　（１）〜（４）記載のいずれか記載のポリペプチド又は（５）記載の硫酸基転移酵素の、下記式１記載の構造を含むグリコサミノグリカンの合成のための使用。
【化７】
2004141142.tif 000005
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。
（１）本発明酵素／本発明ポリペプチド
本発明酵素は配列番号２記載のアミノ酸配列のうち少なくともアミノ酸番号３７〜３４６からなるアミノ酸配列を含むポリペプチドを有するとともに、硫酸基供与体から硫酸基受容体であるグリコサミノグリカンに対して硫酸基を転移する活性を有するグリコサミノグリカン硫酸基転移酵素（ＳＦＴ−１）である。
【００１４】
本発明酵素におけるポリペプチド（以下「本発明ポリペプチド」とも記載する）は、例えば配列番号２記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜３４６からなるポリペプチド又は配列番号２記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸番号３７〜３４６からなるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。このようなポリペプチドはほ乳類由来であることが好ましく、特にヒト由来であることが好ましい。かかるポリペプチドは、特に配列番号２記載のアミノ酸配列のうち予測される膜貫通領域（配列番号２記載のアミノ酸番号１〜３６からなる領域）を除いたアミノ酸番号３７〜３４６からなるアミノ酸配列からなるポリペプチドが、いわゆる可溶化形態となり調製及び利用が容易となるため好ましい。
【００１５】
一般に、酵素タンパク質のアミノ酸配列のうち、１又は複数（通常は２以上３４以下）の構成アミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は転位しても酵素活性が維持されることが知られ、同一酵素のバリアントであるということができる。本発明ポリペプチドにおいても配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数（２以上３４以下）の構成アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は転位等の部分的な変異が起こっていても後述の硫酸基を転移する活性を保持している限りにおいて、本発明ポリペプチドと実質的に同一の物質であるということができる（このような配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに部分的な変異を有するポリペプチドを便宜的に「修飾ポリペプチド」と記載する）。このような修飾ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに９７％以上の相同性を有することを好ましい。アミノ酸配列の相同性は、ＦＡＳＴＡのような周知のコンピュータソフトウェアを用いて容易に算出することができる（このようなソフトウェアはインターネットによっても利用に供されている）。
【００１６】
なお、上記本発明ポリペプチドは、そのアミノ酸配列が上記した通りのものであり、上記した酵素活性を有するものであればポリペプチドに糖鎖が結合していても良い。すなわち本発明ポリペプチドは糖タンパク質の形態も当然に包含する。
【００１７】
本発明酵素の反応における硫酸基供与体としては、硫酸基受容体であるグリコサミノグリカンに対して硫酸基を転移することが可能な物質であれば特に限定はされないが、一般的に生体内で硫酸基供与体として働いていることが知られている３’−ホスホアデノシン５’−ホスホ硫酸（活性硫酸：以下「ＰＡＰＳ」とも略記する）が本発明酵素の生体内における硫酸基供与体である可能性が高いため好ましい例として挙げられる。
【００１８】
本発明酵素の硫酸基受容体としてのグリコサミノグリカンは、たとえばヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリンなどが例示されるが、特にヘパラン硫酸及びヘパリンなどのいわゆる「ヘパリン骨格」を有するグリコサミノグリカンが好ましく、特にヘパラン硫酸が好ましい。なお、本発明酵素は後述の実施例からも明かであるが、サメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸、牛気管由来のコンドロイチン硫酸を脱硫酸化して得たコンドロイチン、ブタ皮由来のデルマタン硫酸、及びニワトリ鶏冠由来のデルマタン硫酸から硫酸基を除去した脱硫酸化デルマタン硫酸に硫酸基を転移する活性を実質的に有しない。
【００１９】
このような本発明酵素の硫酸基転移活性は例えば、放射能（３５Ｓ、３Ｈ（トリチウム）等）や蛍光物質等の標識物質（基質に立体障害などを起こさないことから放射能が好ましい）で標識したＰＡＰＳを用い、グリコサミノグリカンを硫酸基受容体として使用して緩衝液中で２０〜４０℃条件下で酵素反応を行って確認することが可能である。すなわち、かかる反応後に受容体が標識物質で標識されるか否かを、例えば反応後の反応溶液をゲル濾過又は高速液体クロマトグラフィー（以下「ＨＰＬＣ」とも略記する）などの分離手段と、標識物質を検出する手段（標識物質として放射能を用いる場合にはシンチレーションカウンター又はオートラジオグラフィーなどの放射能検出手段、標識物質として蛍光物質を用いる場合には螢光検出器による検出）とを組み合わせることで、容易に確認することが可能である。
【００２０】
このような本発明酵素は、グリコサミノグリカン、特にヘパリン及びヘパラン硫酸に特異的に硫酸基を転移する活性を有しているため、後述の本発明酵素剤として使用することが可能である。
なお、本発明酵素は、後述の「本発明酵素等製造方法」によって生産することが可能である。
【００２１】
（２）本発明核酸、本発明発現ベクター、及び本発明組換体
本発明核酸は、本発明酵素又は本発明ポリペプチドをコードする核酸である。
【００２２】
本発明核酸は、本発明酵素又は本発明ポリペプチドをコードする限りにおいて、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ともリボ核酸（ＲＮＡ）とも限定はされず、また１本鎖であろうと２本鎖であろうと限定はされない。しかし、上記本発明酵素及び本発明ポリペプチドがヒト由来のアミノ酸配列であるため、ヒトをはじめとする多くの生物においてポリペプチドをコードする働きを有しているＤＮＡであることが好ましい。
【００２３】
本発明における「コードする核酸」とは、一般的にはタンパク質（ポリペプチド）合成における転写の際に、ｍＲＮＡ合成の鋳型となる鋳型鎖の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸、及び該鋳型鎖の塩基配列からなる核酸のいずれも指称する。
【００２４】
このような一本鎖の核酸の塩基配列としては例えば配列番号１記載の塩基配列若しくは配列番号１記載の塩基配列中、塩基番号１０９〜１０４１からなる塩基配列（アミノ酸番号３７〜３４６のコード領域に対応している塩基配列）、又はこれらの塩基配列に相補的な塩基配列を示し、このような塩基配列からなる核酸は本発明核酸に包含される。
【００２５】
さらに、核酸は一定条件下でそれに相補的な塩基配列を有する核酸とハイブリダイズすることが知られているが、本発明核酸においても配列番号１記載の塩基配列若しくは配列番号１記載の塩基配列中、塩基番号１０９〜１０４１からなる塩基配列、又はこれらの塩基配列に相補的な塩基配列からなるヌクレオチド鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸も包含される。
【００２６】
ここでストリンジェントな条件下とは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ（塩化ナトリウム／リン酸ナトリウム／ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）緩衝液）、５×デンハルト溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、０．５％　ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、変性サケ精子ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌ存在下、４２℃の条件下及びこれと実質的に同一の条件下などが例示される。すなわちストリンジェントな条件とは、上述した条件の他に、通常の遺伝子のハイブリダイゼーションに用いられる条件も含まれ、ノザンブロット、サザンブロット、ハイブリダイゼーションを用いたスクリーニング等に使用される条件であれば、ここにいう「ストリンジェントな条件下」に包含される。
【００２７】
本発明核酸の好ましい具体的態様の一つである、配列番号１記載の塩基配列中、塩基番号１０９〜１０４１からなる塩基配列からなるＤＮＡは、後述の実施例に記載された方法によって調製することも可能であり、また本発明によりその塩基配列のすべてが明らかとされたため、例えばヒト由来のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用いて５’プライマー（配列番号３）及び３’プライマー（配列番号４）を用いて常法によりポリメラーゼチェイン反応（以下「ＰＣＲ」とも略記する）を行うことで調製することができる。また同様に５’プライマーとして配列番号５記載のプライマーを用い、３’プライマーとして配列番号４記載のプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡを調製することも可能である。
【００２８】
本発明発現ベクターは上述の本発明核酸を含むことを特徴としており、通常はＤＮＡである本発明核酸と、本発明核酸が導入される自体公知の基本ベクター（プラスミド、ファージ、ウイルス等）からなり、宿主細胞中で本発明酵素又は本発明ポリペプチドを発現しうるように構築されている。
【００２９】
上記本発明発現ベクターとして利用する基本ベクターは使用する宿主細胞に合わせて当業者であれば適宜選択することができ、選択した基本ベクターに上記本発明核酸を常法により連結して本発明発現ベクターを構築することができる。
【００３０】
また、本発明発現ベクターを発現させて本発明酵素や本発明ポリペプチドを得る際に、その分泌、単離、精製、分析が容易となるように、本発明酵素や本発明ポリペプチドを識別ペプチドとの融合タンパク質として発現しうるよう構築していてもよい。
【００３１】
この場合においては、本発明酵素及び本発明ポリペプチドと識別ペプチドとの配置は、識別ペプチドが本発明酵素及び本発明ポリペプチドのＣ末端側に結合していても或いはＮ末端側に結合していても良い。また、このような結合は、何ら生理活性を有しないアミノ酸配列（２〜１０個程度のアミノ酸からなるペプチド）からなるスペーサーを介してなされていても、本発明酵素及び本発明ポリペプチドが硫酸基供与体から硫酸基受容体であるグリコサミノグリカンに対して硫酸基を転移する活性を有する限りにおいて制限はされない。
【００３２】
識別ペプチドは、例えばシグナルペプチド（多くのタンパク質のＮ末端に存在し、タンパク質の選別のために細胞内で機能している１５〜３０アミノ酸残基からなるペプチド：例えばＯｍｐＡ、ＯｍｐＴ、Ｄｓｂ等）、プロテインキナーゼＡ、プロテインＡ（黄色ブドウ球菌細胞壁の構成成分で分子量約４２，０００のタンパク質）、グルタチオンＳ転移酵素、Ｈｉｓタグ（ヒスチジン残基を６〜１０個並べて配した配列）、ｍｙｃタグ（ｃＭｙｃタンパク質由来の１３アミノ酸配列）、ＦＬＡＧペプチド（８アミノ酸配列からなる分析用マーカー）、Ｔ７タグ（ｇｅｎｅ１０タンパク質の最初の１１アミノ酸配列）、Ｓタグ（膵臓ＲＮａｓｅＡ由来の１５アミノ酸配列）、ＨＳＶタグ、ｐｅｌＢ（大腸菌外膜タンパク質ｐｅｌＢの２２アミノ酸配列）、ＨＡタグ（ヘマグルチニン由来の１０アミノ酸配列）、Ｔｒｘタグ（チオレドキシン配列）、ＣＢＰタグ（カルモジュリン結合ペプチド）、ＣＢＤタグ（セルロース結合ドメイン）、ＣＢＲタグ（コラーゲン結合ドメイン）、β−ｌａｃ／ｂｌｕ（βラクタマーゼ）、β−ｇａｌ（βガラクトシダーゼ）、ｌｕｃ（ルシフェラーゼ）、ＨＰ−Ｔｈｉｏ（Ｈｉｓ−ｐａｔｃｈチオレドキシン）、ＨＳＰ（熱ショックペプチド）、Ｌｎγ（ラミニンγペプチド）、Ｆｎ（フィブロネクチン部分ペプチド）、ＧＦＰ（緑色蛍光ペプチド）、ＹＦＰ（黄色蛍光ペプチド）、ＣＦＰ（シアン蛍光ペプチド）、ＢＦＰ（青色蛍光ペプチド）、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２（赤色蛍光ペプチド）、ＭＢＰ（マルトース結合ペプチド）、ＬａｃＺ（ラクトースオペレーター）、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）、アビジン、プロテインＧからなる群から選択されるいずれかのペプチドを指称し、何れの識別ペプチドであっても使用することが可能である。その中でも特にシグナルペプチド、プロテインキナーゼＡ、プロテインＡ、グルタチオンＳ転移酵素、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧペプチド、Ｔ７タグ、Ｓタグ、ＨＳＶタグ、ｐｅｌＢ又はＨＡタグが、遺伝子工学的手法による本発明酵素及び本発明ポリペプチドの発現、分泌、単離、精製、分析がより容易となることから好ましい。
【００３３】
本発明発現ベクターを移入すべき宿主細胞としては原核細胞（例えば大腸菌など）であっても真核細胞（例えば酵母、昆虫細胞、ほ乳類細胞など）であっても使用することは可能である。特に原核細胞を宿主細胞として使用した場合には、本発明核酸が発現すると糖鎖の付加などがなされないため、糖鎖の付加されていない本発明ポリペプチドを得ることができる。しかし、本発明酵素又は本発明ポリペプチドは真核生物において通常に発現している酵素又はポリペプチドであるため、宿主細胞としては真核細胞が好ましく、好適には昆虫細胞（本発明酵素又は本発明ポリペプチドの大量合成の面で優れる）又はほ乳類動物細胞（本発明酵素本来の発現がなされている細胞である面で優れる）が例示される。
【００３４】
本発明組換体は、このような宿主細胞に、それに適合した基本ベクターを使用して構築した本発明ベクターを常法により導入した細胞である。
【００３５】
（３）本発明酵素等製造方法
本発明酵素等製造方法は、本発明組換体を生育させ、得られた生育物から本発明ポリペプチド又は本発明酵素を採取することを特徴とする本発明ポリペプチド又は本発明酵素の製造方法である。
【００３６】
本発明組換体を生育させる方法は、組換体に用いた宿主細胞に適した方法を当業者であれば適宜選択して行うことができる。ここで生育とは、組換体を生体外の例えば培養装置又は培養器具などを用いて培養させることの他に、宿主細胞を生体に投与し、その生体内で増殖させることも含む概念である。
【００３７】
本発明酵素等製造方法における生育物とは、細胞を生体外で培養して得られた培地、培養された組換体そのものの他、生体内で組換体を育成させた際に得られる生体の排泄物、分泌物、体液、組織なども含まれる。
【００３８】
生育物からの本発明ポリペプチド／本発明酵素の採取は例えばゲル濾過やＨＰＬＣなどの分子量の相違による分離手段、本発明ポリペプチド／本発明酵素の示す酵素反応における硫酸基供与体（ＰＡＰＳなど）を固相化したアフィニティーカラムなどの分離手段の他、本発明ポリペプチド／本発明酵素を識別ペプチドとの融合タンパク質として発現した場合においては、識別ペプチドを特異的に吸着する手段により本発明ポリペプチド／本発明酵素を分離することが可能である。例えば識別ペプチドとしてＦＬＡＧペプチドを用いた場合には、抗ＦＬＡＧ抗体を固相化したアフィニティーカラムを用いることで、容易に本発明ポリペプチド／本発明酵素をＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として得ることが可能である。
【００３９】
（４）本発明酵素剤
本発明酵素剤は「本発明酵素又は本発明ポリペプチドを含むことを特徴とする、下記式１記載の構造を含むグリコサミノグリカンの合成のための酵素剤」である。
【００４０】
【化８】
2004141142.tif 000006
【００４１】
上記本発明酵素剤における「本発明ポリペプチド」及び「本発明酵素」は、それぞれ「硫酸基供与体から硫酸基受容体であるグリコサミノグリカンに硫酸基を転移して、上記式１記載の構造を含むグリコサミノグリカンを生成する活性（硫酸基転移酵素活性）を有する酵素のポリペプチド」及び該ポリペプチドを含む「酵素」であり、本発明酵素剤の活性成分として含まれる。
また、本発明酵素剤による酵素反応における「硫酸基供与体」としては、「硫酸基受容体であるグリコサミノグリカンに対して硫酸基を転移することが可能な物質」であれば特に限定はされないが、一般的に生体内で本発明酵素の硫酸基供与体として働いていることが知られているＰＡＰＳが好ましい。
【００４２】
なお、「本発明酵素剤」は、活性成分の他に、例えば本発明酵素又は本発明ポリペプチドを保持する担体（セルロースゲル、アガロースゲル、シリカゲル、ガラスビーズ等）やこれらを安定化したり、製剤化するための安定化剤、賦形剤や、他のポリペプチド（例えば遺伝子工学的に「本発明ポリペプチド」を合成する場合に「本発明ポリペプチド」との融合タンパク質を形成するための識別ペプチド等）或いは糖鎖（例えば遺伝子工学的に「本発明酵素」又は「本発明ポリペプチド」を合成する場合に宿主として真核生物由来の細胞を用いると、本発明ポリペプチドに糖鎖が付加されることがある）を含んでいても、本発明ポリペプチド又は本発明酵素が有する硫酸基転移酵素活性を妨げない限りにおいて支障はない。
【００４３】
このような本発明酵素剤は、グリコサミノグリカンに、「硫酸基供与体」から硫酸基を転移して下記式１記載の構造を含むグリコサミノグリカンの製造方法（本発明糖鎖製造方法）に使用することができる。
【００４４】
【化９】
2004141142.tif 000007
【００４５】
（５）本発明糖鎖製造方法
本発明糖鎖製造方法によって得られるグリコサミノグリカンは、「基本骨格中に前記式１で示される二糖を含むことを特徴とする、グリコサミノグリカン」である。
【００４６】
前記式１は、より具体的には下記式３及び４記載の二糖であり、何れかの二糖が「本発明糖鎖製造方法による生産物」一分子につき１以上、好ましくは３以上、最も好ましくは５以上含まれている。
【００４７】
【化１０】
2004141142.tif 000008
【００４８】
【化１１】
2004141142.tif 000009
【００４９】
「本発明糖鎖製造方法による生産物」は、グリコサミノグリカン、好ましくはヘパリン又はヘパラン硫酸に前記「本発明酵素剤」を触媒として作用させて生産される。したがって、その重量平均分子量は原料として使用したグリコサミノグリカン、ヘパリン及びヘパラン硫酸に近い重量平均分子量である。たとえばヘパリン又はヘパラン硫酸に本発明製造方法に用いた場合、ゲル濾過によって測定した「本発明糖鎖製造方法による生産物」の重量平均分子量は、３０００乃至３００００Ｄａ、好ましくは４０００乃至２７０００Ｄａ、最も好ましくは５０００乃至２５０００Ｄａである。
【００５０】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
１．遺伝子データベースの検索と本発明核酸の塩基配列決定
既知のヒト由来のヘパラン硫酸３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ（ＨＳ３ＯＳＴ）遺伝子を用いて、遺伝子データベースから類似遺伝子の検索をおこなった。用いた配列はＨＳ３ＯＳＴ遺伝子の配列番号：ＡＦ０１９３８６である。なお、検索は、Ｂｌａｓｔ［Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　２１５，　４０２−４１０（１９９０）］を用いた。
【００５１】
その結果、ゲノム配列ＧｅｎｅＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＬ３５５４９８の中に類似した配列が見いだされ、ＨＳ３ＯＳＴ遺伝子に相同性を有する新規遺伝子が同定された。遺伝子解析プログラム（ＧＥＮＳＣＡＮ：　Ｓｔａｎｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ製）によってこの新規遺伝子は２つのエクソンによってコードされていることが予測された。
【００５２】
（１）本発明ポリペプチドのコード領域の確認
Ｈｕｍａｎ　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い、付属のＡＰ１プライマーと（ｃＤＮＡ断片の両側にＡＰ１、ＡＰ２のアダプターがついている）、第２エクソンの５’末端付近の配列部分に設定したプライマー（ＧＰ−２２６：配列番号６）でＰＣＲ（９４℃５秒、６８℃４分を３５サイクル）をおこなった。さらにＭａｒａｔｈｏｎ　ｃＤＮＡ付属のＡＰ２プライマーと配列部分に設定したプライマー（ＧＰ−２２４：配列番号７）でｎｅｓｔｅｄＰＣＲ（９４℃５秒、６８℃４分を４０サイクル）をおこなった。その結果得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、約４５０ｂのバンドをＧｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて回収した。得られたＤＮＡ断片の塩基配列を常法により解析した結果、第１エクソンの配列（Ｎ−末端の３６アミノ酸がコードされていた）に続き第２エクソンの配列が確認された。これは遺伝子解析プログラムによって予測されたものと同じであった。従って、本発明ポリペプチドのコード領域は第１エクソンと第２エクソンを結合した配列番号１に示す配列であることが確認された。
【００５３】
（２）第２エクソンのクローニング
上記の結果から第１エクソンにコードされているのはＮ−末端の３６アミノ酸だけである。第２エクソンが本発明ポリペプチドの大部分をコードしており、活性領域を含む酵素の主要部分は第２エクソン中に含まれていることが予測された（第２エクソンにコードされた本発明ポリペプチドを便宜的にＳＦＴ−１と記載する）。そこで遺伝子ＤＮＡを鋳型として第２エクソン部分のクローニングをおこなった。
【００５４】
Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を鋳型として第２エクソンを含む領域のＰＣＲ（９４℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃１分を３５サイクル）をおこなった。使用したプライマーは第２エクソンの上流部分（ＳＦＴｅｘ２Ｆ：配列番号８）と停止コドンの下流部分（ＳＦＴｅｘ２Ｒ：配列番号９）のゲノム配列に設定した。得られた約１ｋｂの断片を常法により精製し、塩基配列を解析した結果、第２エクソンの配列を得られていることが確認された。
【００５５】
２．ＳＦＴ−１遺伝子の発現ベクターへの組込み
遺伝子の発現系を作製するため、まず上記で得られた第２エクソンのＤＮＡをインビトロジェン社製のＧａｔｅｗａｙシステムの発現ベクターｐＤＯＮＲ２０１に組込み、さらにインビトロジェン社製のＢａｃ−ｔｏ−ＢａｃシステムによるＢａｃｍｉｄを作製した。以下詳細に説明する。
【００５６】
（１）新規硫酸基転移酵素のエントリークローンの作製
上記で第２エクソンを増幅して得られたＰＣＲ産物を鋳型として、再度ＰＣＲ（９４℃１５秒、６８℃３分を３０サイクル）をおこないＧａｔｅｗａｙシステム用のＤＮＡ断片を得た。使用したプライマーは第２エクソンの５’末端近くの配列と停止コドン付近の配列にＧａｔｅｗａｙシステム用の配列を付加した５’プライマー（ＳＦＴｇａｔｅＦ２：配列番号１０）および３’プライマー（ＳＦＴｇａｔｅＲｓｔｏｐ：配列番号１１）である。常法により精製したＤＮＡ断片を用い、ＢＰクロナーゼ反応によってｐＤＯＮＲ２０１へ組み込み、エントリークローンを作製した。反応は目的とするＤＡＮ断片１μｌ、ｐＤＯＮＲ２０１を１μｌ（１５０ｎｇ）、反応緩衝液２μｌ、トリス−エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）緩衝液（以下「ＴＥ」とも略記する）　４μｌ、ＢＰクロナーゼミックス２μｌを２５℃で１時間インキュベートして行った。プロテイナーゼＫを１μｌ加えて３７℃で１０分保って反応を停止させた。
【００５７】
その後上記反応液５μｌをコンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α）１００μｌと混合し、ヒートショック法による形質転換の後、カナマイシンを含むＬＢプレートにまいた。翌日コロニーをとり、カナマイシンを含むＬＢ培地３ｍｌで培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）によりプラスミドを抽出精製した。得られたプラスミドの一部を使って常法により塩基配列を測定し、目的とするＤＮＡが組み込まれていることを確認した。
【００５８】
（２）発現クローンの作製
上記エントリークローンは挿入部位の両側にλファージが大腸菌から切り出される際の組換部位であるａｔｔＬを持つもので、ＬＲクロナーゼ（λファージの組換酵素Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓを混合したもの）とデステイネーションベクターとを混合することで、挿入部位がデステイネーションベクターに移り、発現クローンが作製される。具体的工程は以下の通りである。
【００５９】
まずエントリークローン１μｌ、ｐＦＢＩＦを０．５μｌ（７５ｎｇ）、ＬＲ反応緩衝液２μｌ、ＴＥ　４．５μｌ、ＬＲクロナーゼミックス２μｌを２５℃で１時間反応させ、プロテイナーゼＫを１μｌ加えて３７℃で１０分間インキュベートして反応を終了させた（この組換反応でｐＦＢＩＦ−ＳＦＴ−１が精製される）。ｐＦＢＩＦはｐＦａｓｔＢａｃ１にＩｇκシグナル配列（配列番号１２）及びＦＬＡＧペプチド（配列番号１３）を挿入したもので、ＯＴ３（配列番号１４）を鋳型とし、プライマーＯＴ２０（配列番号１５）とＯＴ２１（配列番号１６）によって得られたＤＮＡ断片を上記と同様にＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ部位に挿入し、Ｇａｔｅｗａｙ配列を挿入するため、Ｇａｔｅｗａｙ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）を用いてＣｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　ｃａｓｓｅｔｔｅを挿入した。Ｉｇκシグナル配列は発現タンパク質を分泌型にするため、ＦＬＡＧタグは生成を容易とするために挿入した。
【００６０】
その後上記反応液５μｌをコンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α）５０μｌと混合し、ヒートショック法による形質転換の後、アンピシリンを含むＬＢプレートにまいた。翌日コロニーをとり、アンピシリンを含むＬＢ培地５ｍｌで培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）によりプラスミド（ｐＦＢＩＦ−ＳＦＴ−１）を抽出精製した。得られたプラスミドの一部を使って常法により塩基配列を測定し、目的とするＤＮＡが組み込まれていることを確認した。
【００６１】
（３）Ｂａｃ−ｔｏ−ＢａｃシステムによるＢａｃｍｉｄの作製
続いてＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（インビトロジェン社製）を用いて上記ｐＦＢＩＦ−ＳＦＴ−１とｐＦａｓｔＢａｃとの間で組換を行い、昆虫細胞中で増殖可能なＢａｃｍｉｄにＳＦＴ−１の配列を挿入した。このシステムはＴｎ７の組換部位を利用して、Ｂａｃｍｉｄを含む大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ１０ＢＡＣ）に目的遺伝子を挿入させたｐＦａｓｔＢａｃを導入するだけで、ヘルパープラスミドから産生される組換タンパク質によって目的とする遺伝子がＢａｃｍｉｄへ取り込まれるシステムである。またＢａｃｍｉｄにはｌａｃＺ遺伝子が含まれており、古典的なコロニーの色（青（挿入なし）−白（挿入あり））による選択が可能である。
【００６２】
すなわち、上記精製ベクター（ｐＦＢＩＦ−ＳＦＴ−１）をコンピテントセル（大腸菌ＤＨ１０ＢＡＣ）５０μｌと混合し、ヒートショック法による形質転換の後、カナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、５−ブロモインドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｂｌｕｏ−ｇａｌ）、及びイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢプレートにまき翌日白い単独コロニーをさらに培養し、Ｂａｃｍｉｄを回収した。
【００６３】
３．Ｂａｃｍｉｄの昆虫細胞への導入とＳＦＴ−１の回収
上記白いコロニーから得られたＢａｃｍｉｄを昆虫細胞Ｓｆ２１（インビトロジェン社製）に導入した。すなわち３５ｍｍのシャーレにＳｆ２１細胞が９×１０５個／２ｍｌの抗生物質を含むＳｆ−９００ＩＩＳＦＭ（インビトロジェン社製）となるように添加し、２７℃で１時間培養して細胞を接着させた。溶液Ａとして精製したＢａｃｍｉｄ　ＤＮＡ５μｌに抗生物質を含まないＳｆ−９００ＩＩＳＦＭを１００μｌ加えた。溶液ＢとしてＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ溶液（インビトロジェン社製）６μｌに抗生物質を含まないＳｆ−９００ＩＩＳＦＭ　１００μｌを加えた。その後、溶液Ａ及び溶液Ｂを丁寧に混合して１５〜４５分間、室温でインキュベートした。細胞が接着したことを確認して、培養液を吸引して抗生物質を含まないＳｆ−９００ＩＩＳＦＭを２ｍｌ添加した。溶液Ａと溶液Ｂとを混合して作製した溶液（ｌｉｐｉｄ−ＤＮＡ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）に抗生物質を含まないＳｆ９００ＩＩＳＦＭ　８００μｌを加えて丁寧に混和した。細胞から培養液を吸引し、希釈したｌｉｐｉｄ−ＤＮＡ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ溶液を細胞に加え、２７℃で５時間インキュベーションした。その後、トランスフェクション混合物を除き、抗生物質を含むＳｆ−９００ＩＩＳＦＭ培養液２ｍｌを加えて７２時間後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを１，２００×ｇで１０分間遠心処理し、上清を別のチューブに保存した（これを一次ウイルス液とした）。
【００６４】
Ｔ７５培養フラスコにＳｆ２１細胞６×１０６個／１５ｍｌ　Ｓｆ−９００ＩＩＳＦＭ（インビトロジェン社製）（抗生物質を含む）を入れ、一次ウイルス液を１ｍｌ添加し、２７℃で９６時間培養した。培養後、ピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを１，２００×ｇで１０分間遠心処理し、上清をチューブに保存した（これを二次ウイルス液とした）。
【００６５】
さらに、Ｔ７５培養フラスコにＳｆ２１細胞６×１０６個／１５ｍｌ　Ｓｆ−９００ＩＩＳＦＭ（インビトロジェン社製）（抗生物質を含む）を入れ、二次ウイルス液を１ｍｌ添加し、２７℃で７２時間培養した。培養後、ピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを１，２００×ｇで１０分間遠心処理し、上清をチューブに保存した（これを三次ウイルス液とした）。
【００６６】
加えて、１００ｍｌ用スピナーフラスコにＳｆ２１細胞６×１０５個／ｍｌ濃度で１００ｍｌを入れ、三次ウイルス液を１ｍｌ添加して２７℃で約９６時間培養した。培養後に、細胞及び培養液を回収した。これを１，２００×ｇで１０分間遠心処理し、上清を回収した。
【００６７】
この培養上清１０ｍｌにアジ化ナトリウム、塩化ナトリウムおよび塩化カルシウムを加え、終濃度をアジ化ナトリウムを０．０５％、塩化ナトリウムを１５０ｍｍｏｌ／ｌ、塩化カルシウムを２ｍｍｏｌ／ｌとした。抗ＦＬＡＧ抗体ゲル（Ａｎｔｉ−Ｆｌａｇ　Ｍ１　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ａｇａｒｏｓｅ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｇｅｌ，　ＳＩＧＭＡ社製）５０μｌを加えて１２時間静かに撹拌した。遠心分離（１，０００×ｇ、３分、４℃）して上清を除去した後、１ｍｍｏｌ／ｌの塩化カルシウムを含むトリス緩衝生理的食塩水（ＴＢＳ）で３回洗浄した。これを遠心分離（１，０００×ｇ、３分、４℃）して余分な洗浄液を除きＳＦＴ−１−ＦＬＡＧ融合タンパク質を得、活性測定用の本発明酵素剤とした。
【００６８】
４．ＳＦＴ−１−ＦＬＡＧの確認と酵素活性の測定
（１）ＳＦＴ−１の確認
上記で精製した融合タンパク質（ＳＦＴ−１−ＦＬＡＧ）を結合したゲル５μｌを使い、ペルオキシダーゼ標識抗ＦＬＡＧ抗体（Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ　Ｍ２　Ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ，　ＳＩＧＭＡ社製）を用いて常法に従ってウエスタンブロッティングをおこなった（図１）。その結果、培養上清中に発現しているＦＬＡＧタンパク質と新規硫酸基転移酵素との融合タンパク質が回収精製されていることが確認された。
【００６９】
（２）本発明酵素剤のヘパラン硫酸およびヘパリンへの硫酸転移活性測定
７５μｇ／ｍｌのプロタミン塩酸を含む５０ｍｍｏｌ／ｌのイミダゾール塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）に、培養上清から精製した融合タンパク質（ＳＦＴ−１−ＦＬＡＧ）を添加し、硫酸供与体として［３５Ｓ］−ＰＡＰＳ（５ｘ１０５　ｃｐｍ，　ＮＥＮ社製）、硫酸受容体としてヘパラン硫酸（ウシ腎臓由来：生化学工業株式会社製）及びヘパリン（ブタ腸由来：ＳＩＧＭＡ社製）（ヘキソサミン量に換算して５００μｍｏｌ／ｌ）を添加して、全量を５０μｌとなるように蒸留水で調整した。この反応液を３７℃で２０分反応させ、その後、１００℃で３分加熱して酵素を失活させて反応を停止した。１．３％酢酸カリウムと０．５ｍｍｏｌ／ｌ　ＥＤＴＡを含むエタノールを１３０μｌ加えて撹拌した後、遠心分離して得られた沈殿を蒸留水５０μｌに溶解した。再度エタノール沈殿を行い、水５０μｌに溶解した後、ポアサイズ０．２２μｍのマイクロフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、ＨＰＬＣで分離した。カラムはＧ２５００ＰＷ（東ソー株式会社製）を使用し、移動相は０．２ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、流速０．６ｍｌ／分、カラム温度３５℃で分離を行った。カラムからの溶出液を０．３ｍｌ毎の画分として回収し、各画分の放射能をシンチレーションカウンターにより計数した（図２）。その結果、溶出時間約１２分の位置に放射能のピークが検出された。この溶出時間は硫酸受容体であるヘパラン硫酸またはヘパリンの溶出時間と一致することから、これら２種類の受容体に対して硫酸基を転移する活性を示すことが確認された。
【００７０】
また、コンドロイチン硫酸Ｄ（サメ軟骨由来：生化学工業株式会社製）、コンドロイチン（牛気管由来コンドロイチン硫酸をＪ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　７９，　１５２−１５３（１９５７）記載の方法に従って完全脱硫酸化して調製した）、デルマタン硫酸（ブタ皮由来：生化学工業株式会社製）、及び脱硫酸化デルマタン硫酸（ニワトリ鶏冠由来デルマタン硫酸をＪ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　７９，　１５２−１５３（１９５７）記載の方法に従って完全脱硫酸化して調製した）を硫酸受容体とし、上記活性測定法と同じ条件で硫酸転移活性を測定した結果、これら受容体に対して硫酸基転移酵素活性は観察されなかった（図３）。したがってＳＦＴ−１はヘパラン硫酸およびヘパリンに対して特異的活性を持つことが示唆された。
【００７１】
５．本発明酵素剤によるヘパリンの修飾
本発明酵素剤を用いてヘパリンの硫酸化反応を行なった。反応溶液は５０ｍＭイミダゾール塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）１５０μｌ中に、プロタミン塩酸　１１μｇ、ヘパリン（シグマ社製）０．３ｍｇ、［３５Ｓ］−ＰＡＰＳ（２．３×１０７　ｄｐｍ：パーキンエルマー社製）および本発明酵素剤１（２０μｌ）を含む。３７℃で３時間インキュベートした後、７０％エタノール沈殿を２回行なってヘパリンを回収した。室温に放置してエタノールを蒸発させ、ヘパリン分解酵素反応用緩衝液３０μｌ（２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０：２ｍＭ酢酸カルシウムを含む））に溶解した後、ヘパリン分解酵素（ヘパリナーゼ１５０ｍＵ（生化学工業株式会社製）、ヘパリチナーゼＩ　９０ｍＵ（生化学工業株式会社製）及びヘパリチナーゼＩＩ　６０ｍＵ（生化学工業株式会社製）：これらの酵素はヘパリン骨格中のＧｌｃＮとウロン酸（ＨｅｘＡ）とのβ１，４グリコシド結合部分（ＧｌｃＮβ１，４ＨｅｘＡ）を加水分解して、不飽和ウロン酸（ΔＨｅｘＡ）とＧｌｃＮが１，４グリコシド結合した不飽和二糖（ΔＨｅｘＡ１，４ＧｌｃＮ）を生ずる）を加えて３７℃で２時間インキュベートした。その後、１００℃で１分間加熱して反応を停止し、ポアサイズ０．２２μｍのフィルター（ミリポア社製）でろ過した後、ＨＰＬＣで分離した。使用したカラムはＣａｒｂｏＰａｃ　ＰＡ１（４×２５０ｍｍ：ダイオネクス社製）、ＣａｒｂｏＰａｃ　ＰＡ１ガードカラム（ダイオネクス社製）、流速　０．８ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度４０℃の条件下で、０−５−８−１５−２０−２８−４０分の溶出時間に対して１−６−１９−３８−７０−７６−７６％の３ｍｏｌ／ｌリチウム塩酸で濃度勾配により溶出した。溶出液を０．２ｍｌずつ分取し、そのうち１０μｌをシンチレーションカウンターで分析して放射能の溶出位置を確認した（図４）。その結果、保持時間３０分に強い放射能を有するピークが現れた。
【００７２】
そこで保持時間３０分に現れたピークを回収し、セルロファインＧ２５ｓｆカラム（１×２４ｃｍ：生化学工業株式会社販売）で脱塩した。脱塩した試料を凍結乾燥器で０．１ｍｌに濃縮して「濃縮試料」とした。「濃縮試料」の２μｌをΔ４，５−グルクロン酸−２−スルファターゼ（不飽和ウロン酸残基の２位硫酸エステルを特異的に加水分解して脱硫酸化する酵素：Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ，　１４５（１９８４），　６０７−６１５の方法に従って精製した）で消化した。反応溶液は２０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５：０．１５％ウシ血清アルブミン、ヘパリン二脱硫酸化酵素４．１ｍＵを含む）５ｍｌを使用した。３７℃で２時間反応させた後、１００℃で１分間加熱して反応を停止した。蒸留水１８μｌを加えてポアサイズ０．２２μｍのフィルター（ミリポア社製）でろ過し、上記と同じ条件でＨＰＬＣで分離した（図５）。その結果、ヘパリン二脱硫酸化酵素で消化していない対照では、保持時間約３０．５分にピークが認められた（図５Ａ）が、Δ４，５−グルクロン酸−２−スルファターゼで処理した濃縮試料で、ピークの保持時間が約２２分に移動していた（図５Ｂ）。すなわち、不飽和ウロン酸の２位硫酸基を特異的に脱硫酸化する酵素で処理してピークの移動が観察されたことから、濃縮試料に含まれる不飽和二糖には下記式５のΔＨｅｘＡ（２Ｓ）構造が含まれることが確認された。
【００７３】
【化１２】
2004141142.tif 000010
【００７４】
次に、上記「濃縮試料」のうち２μｌを７０ｍＭ酢酸水銀（ｐＨ５．０）２μｌと混合して室温で１０分間放置することにより不飽和ウロン酸を除去し（この反応により不飽和二糖中の不飽和ウロン酸のみが特異的に分解される：Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．，　２４５（１９８７），　７９５−８０４）、１ｍｏｌ／ｌ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）２μｌ及び０．５ｍｏｌ／ｌテトラヒドロほう酸ナトリウム（０．１ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム溶液）２μｌを加え、５０℃で３０分インキュベートして還元反応を行なった後、上記と同じ条件でＨＰＬＣで分離を行なった（図６）。不飽和ウロン酸を分解した後の「濃縮試料」の溶出パターン（図６Ａ）と、［３Ｈ］テトラヒドロほう酸ナトリウムによる還元反応でラベルした標準品（ＧｌｃＮ（ＮＳ，３Ｓ）：１４分近辺のピーク１、ＧｌｃＮ（ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ）：２２〜２３分近辺のピーク２）の溶出パターン（図６Ｂ）とを対比すると、試料の保持時間はＧｌｃＮ（ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ）のもの（ピーク２）と一致していた。このことから、不飽和ウロン酸を分解した後の「濃縮試料」は２位アミノ基、３位ヒドロキシル基、及び６位ヒドロキシル基が硫酸化されているＧｌｃＮであることが明かとなった。
【００７５】
図５及び図６の結果から、濃縮試料に含まれていた不飽和二糖は下記式６に示す不飽和二糖（ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）−　ＧｌｃＮ（ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ））であったことが確認され、ヘパリン分解酵素で分解をする前のグリコサミノグリカンには、上記式１で示される構造が含まれていたことが示された。
【００７６】
【化１３】
2004141142.tif 000011
【００７７】
上記と同様の硫酸化反応条件によって本発明酵素剤でヘパラン硫酸（シグマ社製）を硫酸化し、上記同様にヘパリン分解酵素で消化した試料をＨＰＬＣで分離したところ、ヘパリンに比べて生成量は少ないが、保持時間約３０．５分にピークが検出された（図７矢印で示したピーク）。これはヘパリンで確認されたΔＨｅｘＡ（２Ｓ）−　ＧｌｃＮ（ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ）と同じ保持時間であることから、ヘパラン硫酸を硫酸基受容体にした場合にも上記式１で示される構造を含むグリコサミノグリカンが生成していたことが明かとなった。
【発明の効果】
本発明により、ヘパラン硫酸に硫酸基を選択的に転移する新規なヘパラン硫酸硫酸基転移酵素のポリペプチドをコードする塩基配列を有する核酸が得られる。また更に該核酸から発現されるポリペプチドが得られる。
【００７８】
本発明により、新規なヘパラン硫酸硫酸基転移酵素のポリペプチドをコードする塩基配列を有する核酸が得られたので、該酵素を工業的に使用可能な程度まで大量生産できることが期待される。また、該酵素の有する酵素活性により、新たな構造を有するグリコサミノグリカンが提供される。
【配列表】
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【００７９】
【図面の簡単な説明】
【図１】精製したＳＦＴ−１−ＦＬＡＧをウエスタンブロッティングにより解析した図である。
【図２】ヘパラン硫酸及びヘパリンに対する硫酸基転移活性を示す図である。丸はヘパラン硫酸に対する硫酸基転移活性を示し、四角はヘパリンに対する硫酸基転移活性を示す。
【図３】コンドロイチン硫酸Ｄ、コンドロイチン、デルマタン硫酸、及びデルマタンへの硫酸基転移活性を示す図である。白丸はコンドロイチン硫酸Ｄ、黒四角はコンドロイチン、黒丸はデルマタン硫酸を、白四角はデルマタンに対する硫酸基転移活性を示す。
【図４】ヘパリンに対して、本発明酵素剤により、放射能で標識した硫酸基を転移して得られたグリコサミノグリカンを、ヘパリン分解酵素で分解して得た分解物を高速液体クロマトグラフィーで分画した際の、各画分における放射能分布を示す図。縦軸は３５Ｓの放射能（ｄｐｍ×１０−３）を示し、横軸は保持時間（分）を示す。
【図５】「濃縮試料」をヘパリン二脱硫酸化酵素で消化した産物を再度、高速液体クロマトグラフィーで分画した際の、各画分における放射能分布を示す図である（Ｂ）。Ａはヘパリンに脱硫酸化酵素で処理していない対照を示す。縦軸は３５Ｓの放射能（ｄｐｍ×１０−３）を示し、横軸は保持時間（分）を示す。
【図６】「濃縮試料」の不飽和ウロン酸のみを特異的に分解した試料を、高速液体クロマトグラフィーで分画した際の、各画分における放射能分布を示す図である（Ａ）。Ｂは放射能で標識した標準品を同様に高速液体クロマトグラフィーで分画した際の、各画分における放射能分布を示す図である。縦軸は３５Ｓ又は３Ｈの放射能（ｄｐｍ×１０−３）を示し、横軸は保持時間（分）を示す。
【図７】本発明酵素剤１で「放射能で標識した硫酸基」を転移したヘパラン硫酸を分解して得られる不飽和二糖を、高速液体クロマトグラフィーで分画した際の、各画分における放射能分布を示す図である。縦軸は３５Ｓの放射能（ｄｐｍ×１０−３）を示し、横軸は保持時間（分）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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