(57)【要約】【課題】細胞ダメージを防止しつつ細胞を保存することができる。【解決手段】培養を開始してから１３日目までは、培地交換を行うとき、それまでと同じグルコース濃度の培地に交換するのか、それともそれまでと異なるグルコース濃度の培地に交換するのかは、細胞集合体の回転速度に基づいて決定した。また、培養１３日目に通常培地に切り換え、その後は通常の細胞培養を行った。培養１３日目までの期間中、細胞集合体の回転速度が５０〜１００ｄｅｇ／ｈの範囲に収まるようにグルコース濃度を選択しつつ培地交換を行ったところ、概ね回転速度はその範囲内に収まった。細胞集合体の回転速度がこの範囲内に収まっているときには、細胞活性が維持されたまま細胞増殖能が十分鈍化されているといえる。【選択図】　　　　図７
2004141064.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞保存液に細胞を浸漬することにより該細胞を保存する細胞保存方法であって、
細胞保存液に細胞を浸漬させる浸漬工程と、
前記細胞保存液に浸漬中の細胞のうち隣接した２つの細胞で構成される細胞集合体の回転速度を測定する回転速度測定工程と、
前記細胞集合体の回転速度に基づいて前記細胞保存液の種類を切り換える保存液切換工程と
を含む細胞保存方法。
【請求項２】
前記回転速度測定工程では、複数の細胞集合体の回転速度を測定し、
前記保存液切換工程では、前記複数の細胞集合体の回転速度の平均値に基づいて前記細胞保存液の種類を切り換える
請求項１に記載の細胞保存方法。
【請求項３】
前記回転速度測定工程では、前記細胞集合体を構成する２つの細胞の重心を結んだ直線が時間当りに回転する角度を前記細胞集合体の回転速度とする
請求項１又は２に記載の細胞保存方法。
【請求項４】
前記浸漬工程では、細胞のエネルギ源を含有する前記細胞保存液に細胞を浸漬し、
前記保存液切換工程では、前記細胞集合体の回転速度に基づいて前記エネルギ源の濃度または量の異なる細胞保存液に切り換える
請求項１〜３のいずれかに記載の細胞保存方法。
【請求項５】
前記保存液切換工程では、細胞活性を維持しつつ細胞増殖能を鈍化させるという回転速度域に前記細胞集合体の回転速度が入るように前記細胞保存液の種類を切り換える
請求項４に記載の細胞保存方法。
【請求項６】
前記回転速度域は、前記培養液での細胞増殖能とその後通常培地に切り替えたあとの細胞増殖能とを測定することにより経験的に定めた領域である
請求項５に記載の細胞保存方法。
【請求項７】
前記回転速度域は、４０〜１２０ｄｅｇ／ｈである
請求項５又は６に記載の細胞保存方法。
【請求項８】
細胞保存液に細胞を浸漬することにより該細胞を保存する細胞保存装置であって、
前記細胞保存液に浸漬している細胞のうち隣接した２つの細胞で構成される細胞集合体の回転速度を測定する回転速度測定手段と、
前記細胞集合体の回転速度に基づいて前記細胞保存液の種類を切り換える旨を報知するか又は前記細胞保存液の種類の切換を行う対応手段と
を備えた細胞保存装置。
【請求項９】
前記細胞保存液に浸漬している細胞を撮影する撮影手段と、
前記撮影手段により撮影された画像から隣接した２つの細胞で構成される細胞集合体を抽出する抽出手段と
を備え、
前記回転速度測定手段は、前記抽出手段により抽出された前記細胞集合体の回転速度を求める
請求項８に記載の細胞保存装置。
【請求項１０】
前記回転速度測定手段は、細胞のエネルギ源を含有する前記細胞保存液に浸漬している細胞のうち隣接した２つの細胞で構成される細胞集合体の回転速度を測定し、
前記対応手段は、前記細胞集合体の回転速度に基づいて決定される前記エネルギ源の濃度または量を持つ細胞保存液に切り換える旨を報知するか又は自動的に切換を行う
請求項８又は９に記載の細胞保存装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞保存液に細胞を浸漬することにより該細胞を保存する細胞保存方法及びその装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で細胞を培養し、培養した細胞を治療のために患者に移植するとか医薬品等の毒性試験に利用するといったように、細胞培養技術が種々の領域で利用されるようになってきている。この細胞培養技術の分野では、細胞を培養して組織を構築するという組織生産について日程調整する必要があり、その日程調整を行う際に細胞を保存する必要が生じることがある。例えば、患者への移植について言えば、移植日程から逆算して組織生産を開始する時期を求め、その組織生産開始時期まで細胞の性能が変化しない状態でその細胞を保存しておくことが望ましい。通常、細胞の保存方法としては低温保存（特許文献１参照）や凍結保存（特許文献２又は３参照）が一般的に知られている。
【０００３】
【特許文献１】
特表平５−５０３９３０
【特許文献２】
特表平５−５００８００
【特許文献３】
特表平５−５０７７１５
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これらの方法では温度変化による細胞ダメージを防ぐことが困難であった。このため、このような細胞ダメージを防止しつつ細胞を保存する方法の開発が望まれていたが、これまでのところ開発に至っていない。
【０００５】
本発明は、上述した問題点に鑑みなされたものであり、細胞ダメージを防止しつつ細胞を保存することができる細胞保存方法及びその装置を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段、発明の実施の形態及び発明の効果】
上述した目的を解決するため、本発明の第１は、細胞保存液に細胞を浸漬することにより該細胞を保存する細胞保存方法であって、
細胞保存液に細胞を浸漬させる浸漬工程と、
前記細胞保存液に浸漬中の細胞のうち隣接した２つの細胞で構成される細胞集合体の回転速度を測定する回転速度測定工程と、
前記細胞集合体の回転速度に基づいて前記細胞保存液の種類を切り換える保存液切換工程と
を含むものである。
【０００７】
この細胞保存方法では、細胞保存液中の細胞集合体の回転速度に基づいて細胞保存液の種類を切り換えていく。細胞集合体の回転速度は細胞増殖能に密接に関連するパラメータであるため、この細胞集合体の回転速度に基づいて例えば細胞活性を維持しつつ細胞増殖能を鈍化させるように細胞保存液の種類を切り換えていくことができる。したがって、この細胞保存方法によれば、細胞ダメージを防止しつつ細胞を保存することができる。
【０００８】
ここで、「細胞保存液の種類を切り換える」とは、例えば、今まで使用していた細胞保存液とは異なる成分を含む細胞保存液に切り換えたり、今まで使用していた細胞保存液にも含まれていた成分であるがその成分の濃度が異なる細胞保存液に切り換えたりすることをいう。また、「細胞」は、どのような細胞であっても適用可能であるが、接着依存性細胞であることが好ましい。「接着依存性細胞」とは、まず培養容器の所定の面に直接接着するか又は細胞外マトリックスを介して間接的に接着し、次いでその接着面積が広がっていき、その後細胞分裂する細胞のことをいう。例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル等の温血動物から採取された種々の細胞が挙げられる。この温血動物の細胞としては、例えば、角化細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞若しくは間質細胞、又はこれらの細胞の前駆細胞、幹細胞若しくは接着依存性のガン細胞が挙げられる。また、胚性幹細胞を使用することもできる。或いは、エリスロポエチン、成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子、インスリン、インターフェロン、血液凝固第ＶＩＩＩ因子等の血液凝固因子、グルカゴン、組織プラスミノーゲンアクチゲーター、ドーパミン、ガン遺伝子、ガン抑制遺伝子等をコードする外来遺伝子を前記細胞に導入し、それらの遺伝子を種々のプロモータを用いて強制的に又は特定の条件下で発現させるように構成した形質転換細胞を使用してもよい。また、細胞外マトリックスとしては、例えば、インテグリン、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖タンパク質等が挙げられる。
【０００９】
本発明の細胞保存方法において、前記回転速度測定工程では、複数の細胞集合体の回転速度を測定し、前記評価工程では、前記複数の細胞集合体の回転速度の平均値に基づいて前記細胞培養液が細胞に与える影響を評価してもよい。こうすれば、１つの細胞集合体の回転速度を測定して細胞培養液を評価する場合に比べて、より適正な評価を下すことができる。
【００１０】
本発明の細胞保存方法において、前記回転速度測定工程では、前記細胞集合体を構成する２つの細胞の重心を結んだ直線が時間当りに回転した角度を前記細胞集合体の回転速度としてもよい。こうすれば、細胞集合体の回転速度を比較的簡単に求めることができる。
【００１１】
本発明の細胞保存方法において、前記浸漬工程では、細胞のエネルギ源を含有する前記細胞保存液に細胞を浸漬し、前記保存液切換工程では、前記細胞集合体の回転速度に基づいて前記エネルギ源の濃度または量の異なる細胞保存液に切り換えてもよい。こうすれば、例えば、細胞増殖能に密接に関連するパラメータである細胞集合体の回転速度により細胞増殖能が低下傾向にあると判断されるときにはエネルギ源の濃度が高い細胞保存液に切り換えて細胞増殖能の低下を防止したり、細胞増殖能が上昇傾向にあると判断されるときにはエネルギ源の濃度が低い細胞保存液に切り換えて細胞増殖能を抑制したりすることにより適切に細胞を保存することができる。ここで、エネルギ源としては、例えばグルコースなどの糖質や、アミノ酸などが挙げられる。
【００１２】
本発明の細胞保存方法において、前記保存液切換工程では、細胞活性を維持しつつ細胞増殖能を鈍化させるという回転速度域に前記細胞集合体の回転速度が入るように前記細胞保存液の種類を切り換えてもよい。このような回転速度域は、前記細胞保存液での細胞増殖能とその後通常培地に切り換えたあとの細胞増殖能とを測定することにより経験的に定めてもよい。例えば、細胞増殖能を比増殖速度又は倍加時間として求め、細胞保存液での比増殖速度が小さく（つまり倍加時間が長く）、その後通常培地に切り換えたあとの比増殖速度が大きい（つまり倍加時間が短い）という条件を満たす回転速度域としてもよい。このような回転速度域は、４０〜１２０ｄｅｇ／ｈに設定するのが好ましく、５０〜１００ｄｅｇ／ｈに設定するのが特に好ましい。回転速度が５０ｄｅｇ／ｈ特に４０ｄｅｇ／ｈを下回ると細胞増殖能が鈍化するものの細胞活性を維持しにくくなる傾向にあるため好ましくなく、１００ｄｅｇ／ｈ特に１２０ｄｅｇ／ｈを上回ると細胞増殖能が十分鈍化しなくなる傾向にあるため好ましくない。
【００１３】
本発明の第２は、細胞保存液に細胞を浸漬することにより該細胞を保存する細胞保存装置であって、
前記細胞保存液に浸漬している細胞のうち隣接した２つの細胞で構成される細胞集合体の回転速度を測定する回転速度測定手段と、
前記細胞集合体の回転速度に基づいて前記細胞保存液の種類を切り換える旨を報知するか又は前記細胞保存液の種類の切換を行う対応手段と
を備えたものである。
【００１４】
この細胞保存装置では、細胞保存液中の細胞集合体の回転速度に基づいて細胞保存液の種類を切り換える旨を報知するか細胞保存液の種類の切換を自動的に行う。細胞集合体の回転速度は細胞増殖能に密接に関連するパラメータであるため、この細胞集合体の回転速度に基づいて例えば細胞活性を維持しつつ細胞増殖能を鈍化させるように細胞保存液の種類を切り換える旨を報知し（この場合、その報知を受けたオペレータが細胞保存液の種類の切換を行う）、又は細胞保存液の種類を自動的に切り換えていく。したがって、この細胞保存方法によれば、細胞へのダメージを防止しつつ細胞を保存することができる。
【００１５】
この細胞保存装置において、前記細胞保存液に浸漬している細胞を撮影する撮影手段と、前記撮影手段により撮影された画像から隣接した２つの細胞で構成される細胞集合体を抽出する抽出手段とを備え、前記回転速度測定手段は、前記抽出手段により抽出された前記細胞集合体の回転速度を求めてもよい。こうすれば、撮影された画像を解析することにより細胞集合体の回転速度を比較的容易に求めることができる。
【００１６】
この細胞保存装置において、前記回転速度測定手段は、細胞のエネルギ源を含有する前記細胞保存液に浸漬している細胞のうち隣接した２つの細胞で構成される細胞集合体の回転速度を測定し、前記対応手段は、前記細胞集合体の回転速度に基づいて決定される前記エネルギ源の濃度を持つ細胞保存液に切り換える旨を報知するか又は自動的に切換を行ってもよい。対応手段が細胞を保存するのに適したエネルギ源の濃度または量の細胞保存液に切り換える旨を報知する場合には、オペレータがその報知にしたがって細胞保存液を切り換えることにより適切に細胞を保存でき、また、対応手段が細胞を保存するのに適したエネルギ源の濃度または量の細胞保存液に自動的に切り換える場合には、オペレータが細胞保存液の切換操作を行うことなく適切に細胞を保存できる。
【００１７】
本発明の細胞保存装置において、前記回転速度測定手段は、複数の細胞集合体の回転速度を測定し、前記対応手段は、前記複数の細胞集合体の回転速度の平均値に基づいて前記細胞保存液の種類を切り換える旨を報知するか又は前記細胞保存液の種類の切換を行ってもよい。また、前記回転速度測定手段は、前記細胞集合体を構成する２つの細胞の重心を結んだ直線が時間当りに回転する角度を前記細胞集合体の回転速度としてもよい。更に、対応手段は、細胞活性を維持しつつ細胞増殖能を鈍化させるという回転速度域に前記細胞集合体の回転速度が入るように前記細胞保存液の種類を切り換える旨を報知するか又は前記細胞保存液の種類の切換を行ってもよい。このような回転速度域は、前記培養液での細胞増殖能とその後通常培地に切り替えたあとの細胞増殖能とを測定することにより経験的に定めてもよく、例えば４０〜１２０ｄｅｇ／ｈ、好ましくは５０〜１００ｄｅｇ／ｈに設定してもよい。
【００１８】
【実施例】
１．使用培地
本実施例で使用した培地（細胞保存液）について説明する。グルコース濃度０ｍｏｌ／ｍ３の培地としては、グルコースを添加していないグルコースフリー無血清培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＢ２特注培地、クラボウ社製）を用いた。また、グルコース濃度が６．０×１０−３、６．０×１０−２ｍｏｌ／ｍ３の無血清培地としては、グルコースフリー無血清培地とグルコース濃度が３×１０３ｍｏｌ／ｍ３の溶液とを用いて濃度調整を行い作製した。更に、通常培地としては、無血清培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２、クラボウ社製）を使用した。この通常培地のグルコース濃度は６．０ｍｏｌ／ｍ３である。なお、便宜上、各培地を下記表１のように培地Ａ〜Ｄと称する。
【００１９】
【表１】
2004141064.tif 000003
【００２０】
２．細胞観察装置
図１は細胞観察装置１０の概略構成を表す説明図である。この細胞観察装置１０は、後述する細胞濃度Ｘや細胞集合体の回転速度ωなどを算出するのに用いる装置であり、Ｔ型フラスコ２０を支持する支持台１１と、Ｔ型フラスコ２０を照らし出すＬＥＤランプ１３と、Ｔ型フラスコ２０の底面を撮影するＣＣＤカメラ１５と、これらを内包し所定温度を維持するインキュベータ１７と、ＣＣＤカメラ１５によって撮影した画像を解析する制御装置１９とを備えている。
【００２１】
支持台１１は、培地で培養された接着依存性細胞（以下単に細胞という）が底面に接着しているＴ型フラスコ２０を、その底面が下方に視覚的に露出した状態で支持している。即ち、支持台１１は、Ｔ型フラスコ２０の底面縁部のみを支持したり、Ｔ型フラスコ２０の底面部分に相当する箇所を透明部材としたりすることで、ＣＣＤカメラ１５による撮影が妨げられないように構成されている。ＬＥＤランプ１３は、支持台１１に支持されたＴ型フラスコ２０を上方から照らすことによりＴ型フラスコ２０内の個々の細胞をＴ型フラスコ２０の底面に投影させる。ＣＣＤカメラ１５は、Ｔ型フラスコ２０の底面を撮影できるようにＴ型フラスコ２０の下方に設置されている。このＣＣＤカメラ１５は、制御装置１９からの指令信号を受信すると、ＬＥＤランプ１３によって上方から照らされたＴ型フラスコ２０の下方から底面を撮影し、Ｔ型フラスコ２０内の個々の細胞がＴ型フラスコ２０の底面に投影された投影画像を得、その投影画像のデータを制御装置１９に送信する。また、ＣＣＤカメラ１５は、三次元ステージ１６に取り付けられ、上下・左右・前後に移動可能である。この三次元ステージ１６は制御装置１９からの指令信号によって作動して所定の位置にＣＣＤカメラ１５を位置決めする。インキュベータ１７は、支持台１１とＬＥＤランプ１３とＣＣＤカメラ１５とを内包した温度調節が可能なケースであり、５％ＣＯ２含有エアを支持台１１に支持されているＴ型フラスコ２０に供給するラインとＴ型フラスコ２０からガスを排出するラインとを備えている。制御装置１９は、周知のＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ等で構成されている。この制御装置１９は、三次元ステージ１６に指令信号を出力してＣＣＤカメラ１５を所定の位置に位置決めしたあと、ＣＣＤカメラ１５に指令信号を出力して投影画像を撮影させ、その投影画像をＣＣＤカメラ１５から入力して画像解析処理を施し、画像解析処理後の投影画像に基づいて後述する細胞濃度Ｘや細胞集合体の回転速度ωや比増殖速度μを算出する。
【００２２】
３．グルコース濃度制限下及び通常培地切換後の増殖
３−１．Ｔ型フラスコへの細胞接種
細胞としてヒト乳腺上皮由来テロメアーゼ不死化細胞（ｈＴＥＲＴ−ＨＭＥ１）を使用し、７５ｃｍ２Ｔ型フラスコ中で通常培地である培地Ｄで培養し、コンフルエントに達した後フラスコ内部をリン酸緩衝溶液で２回洗浄後、トリプシン溶液を２ｍｌ滴下した。インキュベータ内で３７℃のもと、５分間インキュベートした後、細胞をフラスコ底面から剥離した。続いてトリプシンの作用を停止させるため、得られた細胞懸濁液に０．１％トリプシンインヒビターを２ｍｌ添加した。この細胞懸濁液を遠沈管に移し、室温にて１０００ｒｐｍで８分間遠心分離を行い、各酵素を除去した。これをグルコースフリー無血清培地（培地Ａ）で懸濁した。その後、トレパンブルー染色法により、この細胞懸濁液中の細胞を血球計算盤上に滴下し、顕微鏡観察下で細胞をカウントした。そして、細胞濃度が０．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２となるように２５ｃｍ２のＴ型フラスコに接種した。このとき、細胞懸濁液の接種量と培地Ａの培地量とが１０ｍｌとなるようにした。また、培地Ｂ〜Ｄについても同様にして同濃度の細胞懸濁液を含むＴ型フラスコを調製した。
【００２３】
３−２．細胞増殖
各Ｔ型フラスコを細胞観察装置１０のインキュベータ１７内で培養した。インキュベータ１７内のＴ型フラスコは、ＣＯ２濃度５％の加湿空気で満たした状態とした。また、接種後３日目、５日目に新たに同じグルコース濃度の培地に交換し、接種後７日目に通常培地である培地Ｄに切り換え、その後９日目、１２日目に新たな通常培地（培地Ｄ）に交換した。なお、培地Ｄについては７日目までで培養を中止した。これらのＴ型フラスコでの培養において、接種後毎日、フラスコ底面の状態を細胞観察装置１０のＣＣＤカメラ１５を用いて画像撮影を行い、各フラスコごとに投影面積Ｓに占める細胞数ｎをカウントして細胞濃度（＝ｎ／Ｓ）を求めた。具体的には、１つのフラスコにつき３箇所で画像撮影を行い、その３箇所の細胞濃度の平均値をそのときの細胞濃度Ｘとした。このときの培養時間（日数）と細胞濃度Ｘとの関係を図２に示す。図２から明らかなように、グルコース濃度が低い培地Ａ〜Ｃで培養した場合には通常培地である培地Ｄで培養した場合に比べて細胞増殖能は鈍化したが、接種後７日目に通常培地（培地Ｄ）に切り換えたあとは良好な細胞増殖能を示した。このことから、グルコース濃度の低い培地に細胞を浸漬することにより細胞増殖能を鈍化させた状態で細胞を保存しておき、その後通常培地に切り換えることにより通常と同等の増殖能をもって細胞を増殖させることが可能なことが明らかになった。
【００２４】
４．グルコース濃度制限下における細胞の挙動
４−１．概要
細胞観察装置１０を用いて各培地で培養している個々の細胞を経時的に観察し、細胞を撮影した画像のうち２つの細胞が隣接した細胞集合体のみを抽出し、細胞集合体をなす両細胞の重心位置を結んだ直線が経時に伴い回転する角度を算出し、１時間あたりの回転角度を回転速度（ｄｅｇ／ｈ）として求め、使用培地のグルコース濃度と比増殖速度と細胞集合体の回転速度との関係を調べた。
【００２５】
４−２．画像撮影
上述した３−１と同様にして、各培地Ａ〜Ｃを用いてヒト乳腺上皮由来テロメアーゼ不死化細胞を細胞濃度が０．３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２となるように２５ｃｍ２のＴ型フラスコに接種し、培養した。培養日数は５日、７日、１３日、１９日とした。培養日数がＮ日（Ｎ＝５，７，１３，１９）のものは、常温でＮ日目までグルコース濃度制限培地である培地Ａ〜Ｃで培養し、培地交換を２日又は３日ごとに行い、Ｎ日目に通常培地である培地Ｄに切り換え、その培地切換の前２日間で１５分ごとに画像撮影を行い、また、培地切換の直後に１５分ごとに画像撮影を行った。
【００２６】
４−３．画像処理
細胞観察装置１０の制御装置１９は、Ｔ型フラスコ２０の底面の投影画像を２値化したあとクロージング処理やフィリングホール処理を施すことにより個々の細胞像を明確化した。ここで、２値化とは、ある閾値以下のグレイレベル値をもつピクセルを値１に設定しそれ以外のピクセルを値０に設定して画像を白と黒の２つの領域に区画分離する処理である。本実施例では、閾値として、ピクセルのグレイレベル値を横軸、ピクセル数を縦軸とするヒストグラムを作成し、ピクセル数のピークにおけるグレイレベル値を採用した（図３参照）。また、細胞及び細胞境界近辺ではグレイレベル値が局所的に変化して分散が大きいことに着目し、ピクセルのグレイレベル値の分散ヒストグラムを作成し（図４参照）、この分散ヒストグラムを分散が大きい領域と小さい領域に分け、分散が大きい領域つまり図４のａより右側の領域を細胞及び細胞境界近辺とみなし、この領域を上述した閾値を用いて２値化した。２値化後、最も大きな黒色体を細胞とみなし、その黒色体についてクロージング処理により小さな穴を埋めて境界の平滑化を行い、更にフィリングホール処理により孤立した穴を埋めることにより細胞像とした。
【００２７】
４−４．回転速度の測定
時刻ｔ１に得られた投影画像を画像処理した２値化画像から、図５に示すように２つの細胞像が隣接した細胞集合体のみを抽出し、細胞集合体をなす両細胞の重心位置を求め、両細胞の重心同士を直線で結び、これを時刻ｔ１における直線とした。その後、所定時間Δｔが経過した時刻ｔ２に得られた投影画像を画像処理した２値化画像から、先ほどと同じ細胞集合体について両細胞の重心同士を直線で結び、これを時刻ｔ２における直線とした。そして、時刻ｔ１における直線から時刻ｔ２における直線までの回転角度Δθを求め、その細胞集合体の回転速度Δθ／Δｔを求めた。なお、実際には投影画像中に含まれる複数の細胞集合体について個々の回転速度Δθ／Δｔを求め、それらの平均値を細胞集合体の回転速度ω［ｄｅｇ／ｈ］とした。また、Δｔは１時間とした。
【００２８】
４−５．比増殖速度
比増殖速度μは、下記数１により求めた。下記数１で、Ｘ（ｔ２）は時刻ｔ２における細胞濃度であり、Ｘ（ｔ１）は時刻ｔ１における細胞濃度あり、Δｔは時刻ｔ２と時刻ｔ１との時間間隔（本実施例では２日間）である。
【００２９】
【数１】
2004141064.tif 000004
【００３０】
４−６．細胞の挙動
図６は、細胞集合体の回転速度ωとグルコース濃度制限下の比増殖速度μとグルコース濃度制限を解除して通常培養したとき（再増殖時ともいう）の比増殖速度μ’との関係を表すグラフである。図６のグラフにおいて、培養日数Ｎ日目（Ｎ＝５，７，１３，１９）のデータは、常温でＮ日目までグルコース濃度制限培地である培地Ａ〜Ｃで培養し、Ｎ日目に通常培地である培地Ｄに切り換え、その培地切換の直前に回転速度ωと比増殖速度μとを測定してそれをプロットし、培地切換の直後に比増殖速度μ’を測定して切換直前の回転速度ωと比増殖速度μ’をプロットしたものである。この図６から明らかなように、グルコース濃度制限下の比増殖速度μはいずれも通算培養日数が長いほどあるいは回転速度が小さいほど低くなる傾向にあった。また、細胞集合体の回転速度ωが図６に示した網掛け範囲（回転速度ωが５０〜１００ｄｅｇ／ｈの範囲）に入るときには、グルコース濃度制限下では比増殖速度μが低く抑えられ細胞増殖能が鈍化している状態であるが、再増殖時には比増殖速度μ’が高く当初から通常培地で培養したときと同等の細胞増殖能を発揮することがわかった。
【００３１】
具体的には、グルコース濃度制限下での培養期間中つまり保存期間中を通して細胞集合体の回転速度ωが５０〜１００ｄｅｇ／ｈの範囲に入るときには、その培養条件は細胞保存に適していると評価し、このときに用いた培地は細胞保存に適していると評価する。一方、細胞集合体の回転速度ωが５０ｄｅｇ／ｈ未満になったときには、その培養条件は細胞活性が十分維持されないため細胞保存に適さないと評価し、このときに用いた培地も細胞保存に適さないと評価する。また、細胞集合体の回転速度ωが１００ｄｅｇ／ｈを越えるときには、その培養条件は細胞増殖能を十分に鈍化させることはできないものの細胞活性は十分維持されると評価する。但し、回転速度ωが培養工程初期に１００ｄｅｇ／ｈを越えたとしても、その後５０〜１００ｄｅｇ／ｈの範囲に入るときには、その培養工程初期にある程度細胞が増殖するものの、増殖後暫くするとその状態で維持されることになる。したがって、そのような保存の仕方が好ましい場合には、その培養条件も細胞を保存する条件として採用し得る。
【００３２】
５．細胞保存方法
５−１．培養開始前の操作
上述した３−１と同様にしてヒト乳腺上皮由来テロメアーゼ不死化細胞（ｈＴＥＲＴ−ＨＭＥ１）を使用して細胞懸濁液を調製し、Ｔ型フラスコ内にこの細胞懸濁液とグルコース濃度が６．０×１０−３ｍｏｌ／ｍ３である培地Ｂとを用いて全体が１０ｍｌで細胞濃度が０．３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２となるように調製したあと、細胞観察装置１０のインキュベータ１７内で培養した。インキュベータ１７内のＴ型フラスコ２０は、ＣＯ２濃度５％の加湿空気で満たした状態とし、培養を開始した。
【００３３】
５−２　培養開始後の操作
１回目の培地交換は培養開始後１日目に行い、１回目の培地交換における細胞集合体の回転速度は培養開始後２日目に測定し、２回目の培地交換は培養開始後３日目に行い、２回目の培地交換における細胞集合体の回転速度は培養開始後４日目に測定し、その後同様にして培地交換の回数を重ねていった。つまり、ｎ回目（ｎ＝１，２，…，６）の培地交換は培養開始後（２ｎ−１）日目に行い、ｎ回目の培地交換における細胞集合体の回転速度は培養開始後２ｎ日目に測定した。そして、７回目の培地交換のとき（１３日目）に通常培地である培地Ｄに切り換え、その後、培養開始後１６日目に通常培地（培地Ｄ）で交換し、１８日目まで観察した。なお、通常培地に切り換えたあとは細胞集合体の回転速度を測定しなかった。
【００３４】
また、培地交換を行うとき、それまでと同じグルコース濃度の培地に交換するのか、それともそれまでと異なるグルコース濃度の培地に交換するのかは、細胞集合体の回転速度が５０〜１００ｄｅｇ／ｈの範囲に収まるように決定した。具体的には、培地交換するに当たって、前回の細胞集合体の回転速度から前々回の細胞集合体の回転速度を減じた値Δωが負（Δω＜０）のときには、前回と比べて１０倍のグルコース濃度を持つ培地に切り換え、Δωがほぼゼロ（Δω≒０）のときには、前回と比べて５倍のグルコース濃度を持つ培地に切り換え、Δωが正（Δω＞０）のときには、前回と同じグルコース濃度を持つ培地に切り換えた。これをまとめると下記表２のとおりである。
【００３５】
【表２】
2004141064.tif 000005
【００３６】
５−３．結果
以上のようにして培養１３日目まではグルコース濃度を制限した培地中で細胞を保存し、その後通常培地（培地Ｄ）でその細胞を培養したときの結果を図７のグラフに示す。なお、図７の培養日数を横軸、細胞濃度Ｘを縦軸とするグラフにおける黒丸に付されたアルファベットａ〜ｅは、それぞれグルコース濃度が６．０×１０−３，６．０×１０−２，６．０×１０−１，３．０，６．０［ｍｏｌ／ｍ３］の培地を使用したことを示す。図７から明らかなように、培養１３日目までは表２のように細胞集合体の回転速度ωに基づいて算出したグルコース濃度を持つ培地に交換することにより、細胞集合体の回転速度ωは概ね５０〜１００ｄｅｇ／ｈの範囲内に収まった。また、通常培地（培地Ｄ）に切り換えたあとは良好に細胞数が増加していった。このように細胞集合体の回転速度が５０〜１００ｄｅｇ／ｈに収まるようにグルコース濃度を選択することにより、細胞の活性を維持した状態で細胞増殖を鈍化させて良好に細胞を保存できること、換言すれば、細胞へのダメージを防止しつつ細胞を保存できることがわかった。
【００３７】
６．細胞保存装置
図８は細胞保存培養装置３０の概略説明図である。この細胞保存培養装置３０は、細胞観察装置１０に、グルコースフリー無血清培地（培地Ａ）を蓄えた第１タンク４１と、グルコース濃度が３×１０３ｍｏｌ／ｍ３の溶液を蓄えた第２タンク４２と、第１タンク４１内に蓄えられた液体が第１電磁弁４１ａを介して投入されると共に第２タンク４２内に蓄えられた液体が第２電磁弁４２ａを介して投入される濃度調整タンク４３と、濃度調整タンク４３からＴ型フラスコ２０へ培地供給ライン４４ａを介して培地を供給する培地供給ポンプ４４と、Ｔ型フラスコ２０内の培地を培地排出ライン４５ａを介して排出する培地排出ポンプ４５とを付加したものである。
【００３８】
次に、細胞保存培養装置３０を用いて細胞を保存したあと通常通り培養して増殖させるときの操作を説明する。ここでは、上述した５−２と同様の操作を細胞保存培養装置３０に実行させる場合を例に挙げて説明する。オペレータは、まず、上述した５−１と同様にして培養開始前の準備を行ったあと、インキュベータ１７内で培養を開始すると共に、制御装置１９に培養を開始した旨を入力する。すると、制御装置１９は、所定タイミングごと（例えば数分ごと）に保存培養プログラムを読み出して実行する。図９は保存培養プログラムのフローチャートである。このプログラムが開始されると、まず、予め定められた培地交換時期になったか否かを判定する（ステップＳ１００）。ここでは、培地交換時期は、上述した５−２と同様、培養開始後１，３，５，７，９，１１日目と定められており、培養を開始した旨の入力があったときに計時をスタートする内蔵タイマのカウント数によって判定される。ステップＳ１００で培地交換時期になったと判定されたときには今回の培地交換時期が初回又は２回目であるか、それとも３回目以降であるかを判定する（ステップＳ１１０）。そして、ステップＳ１１０で培地交換時期が初回又は２回目のときには、前々回と前回の細胞集合体の回転速度ωが未測定のため、グルコース濃度を当初と同じ値に決定する（ステップＳ１２０）。一方、ステップＳ１１０で培地交換時期が３回目以降のときには、前々回と前回の細胞集合体の回転速度ωが測定され記憶されているため、前回の回転速度ωから前々回の回転速度ωを減算した値Δωを算出し（ステップＳ１３０）、このΔωを表２に照らして今回のグルコース濃度を決定する（ステップＳ１４０）。この表２は制御装置１９の図示しないＨＤＤに記憶されている。そして、ステップＳ１２０又はステップＳ１４０でグルコース濃度を決定したあと、第１電磁弁４１ａ及び第２電磁弁４２ａを開閉制御して第１タンク４１及び第２タンク４２からそれぞれ所望量の培地を濃度調整タンク４３に流入させることにより、所望のグルコース濃度の培地を作製する（ステップＳ１５０）。続いて、培地排出ポンプ４５を駆動してＴ型フラスコ２０から今まで使用していた培地を培地排出ライン４５ａを介して排出する（ステップＳ１６０）。排出終了後、今度は培地供給ポンプ４４を駆動してＴ型フラスコ２０へ濃度調整タンク４３内の培地を培地供給ライン４４ａを介して供給し（ステップＳ１７０）、このプログラムを終了する。一方、ステップＳ１００で培地交換時期でないと判定されたときには、続いて回転速度測定時期か否かを判定する（ステップＳ１８０）。ここでは、回転速度測定時期は、上述した５−２と同様、培養開始後２，４，６，８，１０，１２日目と定められている。ステップＳ１８０で回転速度測定時期でないと判定されたときにはこのプログラムを終了し、一方、回転速度測定時期であると判定されたときには、ＣＣＤカメラ１５の投影画像を画像処理した２値化画像から細胞集合体の回転速度ωを算出し、これを所定の記憶領域（例えばＨＤＤ）に記憶し（ステップＳ１９０）、このプログラムを終了する。
【００３９】
以上の細胞保存培養装置３０によれば、図７と同様の結果が得られ、細胞集合体の回転速度ωが５０〜１００ｄｅｇ／ｈに収まるようにグルコース濃度を自動的に切り換えることにより、細胞活性を維持したまま細胞増殖能を鈍化させて良好に細胞を保存することができるうえ、オペレータが培地の切換操作を行う手間をかけることなく適切に細胞を保存できる。
【００４０】
なお、上述した細胞保存培養装置３０では、所望のグルコース濃度を持つ培地を濃度調整タンク４３に自動的に調整してＴ型フラスコ２０へ供給したが、濃度調整タンク４３を用いる代わりに、予めグルコース濃度の異なる培地を蓄えているタンクを多数用意しておき、所望のグルコース濃度に応じてそれらのうちのどのタンクからＴ型フラスコ２０へ培地を供給するかを決めるようにしてもよい。また、自動的に培地交換する代わりに、オペレータが培地交換を行ってもよく、その場合、制御装置１９が交換培地のグルコース濃度をディスプレイに表示したりスピーカから音声出力したりして報知を行い、この報知にしたがってオペレータが培地交換を行ってもよい。
【００４１】
また、上述の実施例では、培地交換時期を予め特定することで、細胞集合体の回転速度に基づいた培地成分の調製を行ったが、培地成分を固定し、培地交換時期を細胞集合体の回転速度に基づいて決定するようにしてもよい。具体的には、所定のタイミングごとに細胞集合体の回転速度を観察し、回転速度が所定閾値（例えば、５０ｄｅｇ／ｈ）を下回った時点で新たな培地に交換するプログラムなどが挙げられる。
【００４２】
以上、本発明の実施の形態や実施例について説明したが、本発明はこれらに何等限定されるものではなく、本発明の技術的範囲を逸脱しない範囲内において、種々なる形態で実施し得ることはいうまでもない。
【図面の簡単な説明】
【図１】細胞観察装置１０の概略構成を表す説明図である。
【図２】培養時間（日数）と細胞濃度との関係を表すグラフである。
【図３】ピクセルのグレイレベル値のヒストグラムである。
【図４】ピクセルのグレイレベル値の分散ヒストグラムである。
【図５】細胞集合体の回転速度の説明図である。
【図６】回転速度と比増殖速度との関係を表すグラフである。
【図７】グルコース濃度制限培地で保存したあと通常培地で増殖したときの様子を表すグラフである。
【図８】細胞保存培養装置３０の概略構成を表す説明図である。
【図９】保存培養プログラムのフローチャートである。
【符号の説明】
１０　細胞観察装置、１１　支持台、１３　ＬＥＤランプ、１５　ＣＣＤカメラ、１６　三次元ステージ、１７　インキュベータ、１９　制御装置、２０　Ｔ型フラスコ、４１　第１タンク、４２　第２タンク、４３　濃度調整タンク、４４培地供給ポンプ、４５　培地排出ポンプ。
【図１】
2004141064.tif 000006
【図２】
2004141064.tif 000007
【図３】
2004141064.tif 000008
【図４】
2004141064.tif 000009
【図５】
2004141064.tif 000010
【図６】
2004141064.tif 000011
【図７】
2004141064.tif 000012
【図８】
2004141064.tif 000013
【図９】
2004141064.tif 000014