(57)【要約】【課題】光源と光ファイバの着脱を行うことなく複数の励起光で蛍光観測が可能な共焦点スキャナ顕微鏡を実現する。【解決手段】サンプルを励起する励起光を発する光源部と、前記励起光を用いてサンプルを走査するスキャナ部と、前記サンプルから発光した蛍光を受けてサンプルの画像を撮像する撮像カメラを有した共焦点スキャナ顕微鏡において、前記光源部は波長の異なるレーザを発振する複数の光源と、これら複数の光源からの光を伝送する光ファイバ束を具備し、前記光ファイバ束の一端を複数本に分離するとともに前記複数の光源のそれぞれが前記分離された光ファイバの一端に入射するように構成した。【選択図】      図１
2004212434.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルを励起する励起光を発する光源部と、前記励起光を用いてサンプルを走査するスキャナ部と、前記サンプルから発光した蛍光を受けてサンプルの画像を撮像する撮像カメラを有した共焦点スキャナ顕微鏡において、
前記光源部は波長の異なるレーザを発振する複数の光源と、これら複数の光源からの光を伝送する光ファイバ束を具備し、前記光ファイバ束の一端を複数本に分離するとともに前記複数の光源のそれぞれが前記分離された光ファイバの一端に入射するように構成したことを特徴とする共焦点スキャナ顕微鏡。
【請求項２】
前記スキャナ部は励起光を平行光とするコリメータレンズと、このコリメータレンズからの光が照射されるマイクロレンズアレイディスクと、このマイクロレンズアレイディスクで集光された光を通過させるピンホールディスクと、このピンホールディスクからの光を入射する対物レンズで構成されており、前記光ファイバ束の他端は、前記複数の光源から出射した光が前記スキャナ部を通過し前記サンプルで反射させて得られる光を撮像カメラで撮影したときの画像が画像観察に影響のない程度に近接して配置されていることを特徴とする請求項１又は2に記載の共焦点スキャナ顕微鏡。
【請求項３】
前記サンプルから発光した蛍光をその異なる波長の光ごとに分岐する分岐手段と、撮像カメラからなる複数組の検出系を備え、前記分岐手段からの分岐光を別々に前記検出系に導き、複数の分岐光を同時に観測できるように構成したことを特徴とする請求項１乃至３いずれかに記載の共焦点スキャナ顕微鏡。
【請求項４】
前記それぞれの光源と分離した光ファイバの間にスイッチング手段を設けたことを特徴とする請求項1乃至４いずれかに記載の共焦点スキャナ顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、共焦点スキャナ顕微鏡に関し、特に、光源の光を光ファイバに入射させる光源部の改善に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より共焦点スキャナ顕微鏡はよく知られている（例えば、特許文献１参照。）。図５はそのような共焦点スキャナ顕微鏡の要部の原理構成図である。図５において、レーザ光源１から発せられたレーザ光は、まず励起フィルター（図示せず）を通して、光源の余分な波長成分を取り除き励起に使用する波長成分のみを出射させる。
【０００３】
この出射光（レーザ光）は適当なビーム径に広げられた後、スキャナ部のマイクロレンズアレイディスク２のマイクロレンズアレイに入射する。入射したレーザ光は一つ一つのマイクロレンズで各々に対応配置されたピンホールディスク３のピンホール上に集光される。
【０００４】
この集光によって、ピンホールディスク３を通過できる光量は大幅に向上される。また同時に、ピンホール以外のディスク表面での反射光（ノイズ光）が減少し、Ｓ／Ｎ比も向上される。
【０００５】
マイクロレンズアレイディスク２とピンホールディスク３の間にはダイクロイックミラー４が配置されており、励起光はこのダイクロイックミラー４を透過する。
【０００６】
ピンホールディスク３のピンホールを出たレーザ光は、対物レンズ５を通過後サンプル６を励起する。サンプル６から出た蛍光は再び対物レンズ５とピンホールディスク３のピンホールを通過し、ダイクロイックミラー４で反射して観察光路系に導かれる。
【０００７】
スキャナ部から観察光路系に出射した蛍光は、そこに混入している励起光の反射や迷光成分がバリアフィルタ２５で除去されて高感度撮像カメラ８に入り、サンプル６の蛍光像がこのカメラ８で観測される。
なお、マイクロレンズアレイディスク２とピンホールディスク３は一体構造化されており、回転により観察領域全体をスキャンすることができるようになっている。
【０００８】
【特許文献１】
特開平５−６０９８０号公報  （第３頁及び図１）
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このような従来の装置においては、その共焦点光スキャナ部分については結像特性の向上や、ピンホールディスク面からの表面反射の低減が図れるなどの利点を有するものの、サンプル照射のための励起光源は一つであり、波長の異なる光（レーザ）を用いて励起を行う場合は、光ファイバに接続する光源を交換して行っている。
図６はシングルモード光ファイバに対し例えば４８８ｎｍの波長のレーザと５３２ｎｍの波長のレーザを切り替えて入射している状態を示す構成図である。
【００１０】
そのため同時に他の励起光の蛍光観測ができないという問題があり、光源と光ファイバの着脱に要する時間がかかるとともに着脱時に生じる振動でサンプルが動いてしまうという問題があった。
【００１１】
本発明の目的は、上記の課題を解決するもので、従来の共焦点スキャナ顕微鏡の光ファイバの導入口は一つのままで、光源と光ファイバの着脱を行うことなく複数の励起光で蛍光観測が可能な共焦点スキャナ顕微鏡を実現することにある。本発明の他の目的は、光検出部にフィルタを配置し、このフィルタの特性を変えることにより、容易にサンプルの蛍光物質の種類を同定することができるようにした共焦点スキャナ顕微鏡を実現することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
この目的を達成するために、本発明の共焦点スキャナ顕微鏡は、請求項１においては、
サンプルを励起する励起光を発する光源部と、前記励起光を用いてサンプルを走査するスキャナ部と、前記サンプルから発光した蛍光を受けてサンプルの画像を撮像する撮像カメラを有した共焦点スキャナ顕微鏡において、
前記光源部は波長の異なるレーザを発振する複数の光源と、これら複数の光源からの光を伝送する光ファイバ束を具備し、前記光ファイバ束の一端を複数本に分離するとともに前記複数の光源のそれぞれが前記分離された光ファイバの一端に入射するように構成したことを特徴とする。
【００１３】
請求項２においては、請求項１又は2に記載の共焦点スキャナ顕微鏡において、
前記スキャナ部は励起光を平行光とするコリメータレンズと、このコリメータレンズからの光が照射されるマイクロレンズアレイディスクと、このマイクロレンズアレイディスクで集光された光を通過させるピンホールディスクと、このピンホールディスクからの光を入射する対物レンズで構成されており、前記光ファイバ束の他端は、前記複数の光源から出射した光が前記スキャナ部を通過し前記サンプルで反射させて得られる光を撮像カメラで撮影したときの画像が画像観察に影響のない程度に近接して配置されていることを特徴とする。
【００１４】
請求項３においては、請求項１乃至３いずれかに記載の共焦点スキャナ顕微鏡において、
前記サンプルから発光した蛍光をその異なる波長の光ごとに分岐する分岐手段と、撮像カメラからなる複数組の検出系を備え、前記分岐手段からの分岐光を別々に前記検出系に導き、複数の分岐光を同時に観測できるように構成したことを特徴とする。
【００１５】
請求項４においては、請求項１乃至４いずれかに記載の共焦点スキャナ顕微鏡において、
前記それぞれの光源と分離した光ファイバの間にスイッチング手段を設けたことを特徴とする。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下図面を用いて本発明を詳しく説明する。図１は本発明に係る共焦点スキャナ顕微鏡の一実施例を示す概念的構成図である。図１において、図５と同等部分には同一符号を付してある。図５と異なるところは、光源部１０、光検出部２０である。
【００１７】
光源部１０は、複数の多波長光源１１ａ，１１ｂ，１１ｃと、光源からの光の通過と遮断を制御するスイッチング手段１４と、光透過帯域の異なるフィルタ１２ａ，１２ｂ，１２ｃから構成されている。
【００１８】
スイッチング手段１４を通過した光はフィルタ１２ａ，１２ｂ，１２ｃを透過して光ファイバ束１５から光源の数に対応して複数本に分離された光ファイバ１５ａ，１５ｂ，１５ｃに入射し、光ファイバ束１５の他端から出射して.ミラー１６に入射する。ミラー１６はこの光を反射してコリメータレンズ１７に入射する。コリメータレンズ１７は入射光を平行光として、マイクロレンズアレイディスク２に入射する。
【００１９】
光検出部２０は、ダイクロイックミラー２２ａ，２２ｂ，２２ｃと、バリアフィルタ２５ａ，２５ｂ，２５ｃと、レンズ２４ａ，２４ｂ，２４ｃと撮像カメラ８ａ，８ｂ，８ｃより構成されている。
バリアフィルタ２５は透過波長特性の異なる複数のフィルタから構成されている。バリアフィルタ２５を透過した出力光はレンズ２４により集光されて撮像カメラ８に入射する。撮像カメラ８は、撮像画像を増幅し、電気信号に変換して出力する。
【００２０】
画像収集装置３０は撮像カメラ８が出力する電気信号を画像データに変換して保存する。
画像表示装置４０は、通常コンピュータが用いられ、画像収集装置３０に格納された画像を読み出し、適宜に処理を行って表示画面に表示する。
【００２１】
このような構成における動作を次に説明する。
光源部１０では３つの多波長光源１１ａ，１１ｂ，１１ｃから発せられた光をそれぞれスイッチング手段１４およびフィルタ１２ａ，１２ｂ，１２ｃを介して複数に分離された光ファイバ１５ａ，１５ｂ，１５ｃの一端に入射する。
【００２２】
光ファイバ束１５から出射された光はミラー１６で反射しコリメータレンズ１７に入射する。コリメータレンズ１７により平行光となった光はマイクロレンズアレイディスク２に入射する。なお、光ファイバ１５の出力光を直接レンズ１７に入射させることができる場合には、ミラー１６は不要である。
【００２３】
サンプル６から発せられる蛍光には通常複数の波長が含まれている。例えば、第１のダイクロイックミラー２２ａでは波長λ１の光を透過し、他の波長の光は反射する。次に、第２のダイクロイックミラー２２ｂでは、第１のダイクロイックミラー２２ａで反射した光を受けて、波長λ２の光を反射し、他の波長の光を透過する。第３のダイクロイックミラー２２ｃでは第２のダイクロイックミラー２２ｂを透過した光を受けて、波長λ３の光を反射する。
【００２４】
このようにして３つのダイクロイックミラー２２ａ，２２ｂ，２２ｃにより分岐して、３つの波長の蛍光をそれぞれ個別に出力する。ダイクロイックミラー２２からの出力はバリアフィルタ２５ａ，２５ｂ，２５ｃに入力する。このバリアフィルタ２５で透過波長領域を狭めることにより、目的とする波長以外を除去し目的とする波長のみを撮像カメラ８に入射させることができ、画像のＳＮ比を向上することができる。
【００２５】
バリアフィルタを透過したそれぞれの出力光はレンズ２４ａ，２４ｂ，２４ｃによってそれぞれ集光され撮像カメラ８ａ，８ｂ，８ｃに入射する。３台の撮像カメラはそれぞれ撮像画像を電気信号に変換して出力する。画像収集装置３０は、この電気信号をデジタル画像データに変換し、ダイクロイックミラーで分岐した蛍光の色と対応付けて保存する。
【００２６】
画像表示装置４０は、画像収集装置３０に保存された画像データとフィルタの情報を読み出し、元の蛍光色に再構成（カラー再構成）して蛍光画像を画面表示する。また、カラー再構成しないで蛍光画像を表示させることももちろん可能である。
このようにして、ダイクロイックミラーにより分岐した波長の各蛍光像を同時計測することができる。
【００２７】
次に光ファイバ束から出力した光のずれ量について説明する。図２ａは従来から使用されているシングルモードの光ファイバを示し、図２ｂは本実施例で使用した３本の光ファイバを示している。図２ａの場合コアは一つなのでずれはない。
【００２８】
図２ｂでは３本を束ねたときにコア間に１２５μｍのずれがある。このずれは少ないほうが鮮明な画像表示には有利である。しかし、これ以上クラッドを細くしてコア間を近づけるのは技術的、経済的に難しい。
【００２９】
図３はコリメータレンズ１７と、マイクロレンズアレイディスク２と、ピンホールディスク３と、対物レンズで構成された従来のスキャナ部において、コアの間隔が１２５μｍのずれを有する場合に光ファイバ束から出射した光軸のずれ量の変化を演算により求めた結果を示すイメージ図である。
【００３０】
コリメータレンズ１７でコリメートされた光はマイクロディスクレンズ2に入射する。この入射時点でずれは３３.５μｍとなる。ここで絞られた光がピンホールディスク３を通過した時点では７μｍに減少し、対物レンズ（４０倍）５を経てサンプルを照射する時点では０.２６μｍのずれになる。これらの値は現在使用しているレンズのデータから計算した値である。
【００３１】
図４はピンホールディスク３面上での集光スポット（ａ）とピンホールディスク３を透過した直後（ｂ）の光の断面強度分布を示すもので、現在使用しているピンホールの直径の場合、７μｍのずれを有する光の透過（減衰）具合を示している（ｂ図に示すＧ点はずれによる波形カットの状態を示している）。発明者らの計算によればずれがない場合の透過率は８６.９％、７μｍ、ずれた場合の透過率は８６.３％であり、光軸のずれが７μｍあったとしてもほとんど影響がないことが分かる。
【００３２】
本発明の以上の説明は、説明および例示を目的として特定の好適な実施例を示したに過ぎない。したがって本発明はその本質から逸脱せずに多くの変更、変形をなし得ることは当業者に明らかである。例えば本実施例では光ファイバのずれを１２５μｍとして説明したが、技術的、経済的に可能ならばずれは少ないほうが望ましい。
【００３３】
また、実施例では光ファイバを３本、撮像カメラを３台とし、ダイクロイックミラー、バリアフィルタ、レンズもそれぞれに対応して３組設けた例について説明したが、撮像カメラ、ダイクロイックミラー、バリアフィルタ、レンズはそれぞれ一つとし蛍光を時分割で受け取るようにしても良い。また、光源を２又は４以上とし、それに対応した光ファイバの数を設けてもよい。また、スイッチング手段により何れか一つの波長の光源のみを用いればＳ／Ｎ比を向上させることができる。
特許請求の範囲の欄の記載により定義される本発明の範囲は、その範囲内の変更、変形を包含するものとする。
【００３４】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば次のような効果がある。
従来の共焦点スキャナ顕微鏡の光ファイバの導入口は一つのままで、光源と光ファイバの着脱を行うことなく複数の励起光で蛍光観測が可能な共焦点スキャナ顕微鏡を実現することができる。
【００３５】
また、光源と分離した光ファイバの間にスイッチング手段を設け、選択的にスイッチングすることによりＳ／Ｎ比を向上させることができる。
また、ダイクロイックミラーで分岐した画面を複数種類得ることにより、容易に撮像画像のカラー化を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る共焦点スキャナ顕微鏡の一実施例を示す構成図である。
【図２】光ファイバを３本としたときのコアの間隔を示す拡大断面図である。
【図３】レンズの組み合わせによりコアの間隔が狭まる様子を示すイメージ図である。
【図４】ピンホールディスク面上およびピンホール透過直後の光の断面強度分布を示す図である。
【図５】従来の共焦点スキャナ顕微鏡の要部構成図である。
【図６】従来の共焦点スキャナ顕微鏡のレーザの交換例を示す図である。
【符号の説明】
２  マイクロレンズアレイディスク
３  ピンホールディスク
４  ダイクロイックミラー
５  対物レンズ
６  サンプル
８，８ａ，８ｂ，８ｃ  撮像カメラ
１０  光源部
１１ａ，１１ｂ，１１ｃ  多波長光源
１２ａ，１２ｂ，１２ｃ  フィルタ
１３ａ，１３ｂ，１３ｃ  ダイクロイックミラー
１４  スイッチング手段
１５  光ファイバ
１６  ミラー
１７  レンズ
２０  光検出部
２２ａ，２２ｂ，２２ｃ  ダイクロイックミラー
２４，２４ａ，２４ｂ，２４ｃ  レンズ
２５ａ，２５ｂ，２５ｃ  バリアフィルタ
３０  画像収集装置
４０  画像表示装置
【図１】
2004212434.tif 000003
【図２】
2004212434.tif 000004
【図３】
2004212434.tif 000005
【図４】
2004212434.tif 000006
【図５】
2004212434.tif 000007
【図６】
2004212434.tif 000008