(57)【要約】【課題】７−ケトコレステロールを認識するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリッド細胞、該モノクローナル抗体の製造方法、該モノクローナル抗体を用いる７−ケトコレステロールの検査方法に関する。【解決手段】７−ケトコレステロール−高分子複合体を抗原として免疫した恒温動物から得られた抗体産生細胞と同種または異種のリンパ球様細胞とを細胞融合して得られるハイブリッド細胞が産出するモノクローナル抗体。ハイブリッド細胞を用いる７−ケトコレステロールを認識するモノクローナル抗体の製造方法。モノクローナル抗体を用いることを特徴とする７−ケトコレステロールの検査方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
７−ケトコレステロールを認識するモノクローナル抗体。
【請求項２】
７−ケトコレステロール−高分子複合体を抗原として免疫した恒温動物から得られた抗体産生細胞とリンパ球様細胞とを細胞融合して得られるハイブリッド細胞が産出する請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
抗原の７−ケトコレステロール−高分子複合体が７−ケトコレステロール−蛋白質複合体である請求項２記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
抗原の７−ケトコレステロール−高分子複合体が７−ケトコレステロールのＣ−１７位に結合する炭化水素鎖が蛋白質と結合している７−ケトコレステロール−蛋白質複合体である請求項２記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
７−ケトコレステロール−蛋白質複合体が、その構成蛋白質をヘモシアニン、牛血清アルブミン、卵白アルブミンおよびカゼインからなる群より選ばれる、少なくとも１種の蛋白質とする複合体である請求項３又は４記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
３３Ａ−４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６７３）又は３５Ａ−８株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６７４）が産出する請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
７−ケトコレステロール−高分子複合体を抗原として免疫した恒温動物から得られた抗体産生細胞と、リンパ球様細胞とを細胞融合して得られるハイブリッド細胞。
【請求項８】
恒温動物がマウスであり、リンパ球様細胞がマウスミエローマである請求項７記載のハイブリッド細胞。
【請求項９】
請求項７又は８に記載のハイブリッド細胞を用いることを特徴とする、７−ケトコレステロールを認識するモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１０】
請求項７又は８に記載のハイブリッド細胞を液体培地の中または恒温動物の腹腔内で増殖させ、モノクローナル抗体を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする７−ケトコレステロールを認識するモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１１】
恒温動物の腹腔内が、マウスの腹腔内である請求項１０記載の７−ケトコレステロールを認識するモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１２】
３３Ａ−４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６７３）又は３５Ａ−８株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６７４）を用いる７−ケトコレステロールを認識するモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする７−ケトコレステロールの検査方法。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする酸化ＬＤＬの検査方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、臨床検査に用いることができる７−ケトコレステロールを認識するモノクローナル抗体に関する。さらに、該モノクローナル抗体を産生するハイブリッド細胞、該モノクローナル抗体の製造方法および該モノクローナル抗体を用いる７−ケトコレステロールの検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
コレステロールは細胞膜の構成成分であるばかりでなくステロイドホルモンやビタミンＤをはじめとする生理活性物質の前駆物質、胆汁酸等の原料として非常に重要な脂質成分である。しかしながら、血液中に増え過ぎると動脈硬化を引き起こすと言った虚血性心疾患などの危険因子であることが知られている。
【０００３】
活性酸素は一重項酸素、スーパーオキシドラジカル、過酸化水素、ヒドロキシルラジカルなどの反応性に富んだ物質であり、体内に吸収した酸素に由来して生成するものである。これら活性酸素類は生体防御系において重要な働きをしている一方、過剰な活性酸素類が生体に有害な作用することにより老化、ガン、糖尿病、アトピー性皮膚炎など様々な疾患の原因または増悪・進展因子になっていることが明らかとなってきた。
【０００４】
脂質は活性酸素との反応性が高い物質として知られており、例えば、不飽和脂肪酸が活性酸素と反応することにより脂質過酸化反応が生じ、マロンジアルデヒド、４−ヒドロキシ−２−ノネナール、４−ヒドロキシ−２−ヘキセナール、アクロレイン等の種々の反応性カルボニル化合物が産生され、これらの反応性カルボニル化合物が蛋白質や核酸と反応することにより、それらの機能が失活あるいは低下することにより種々の障害の原因となっていることが知られている。
【０００５】
コレステロールは不飽和脂肪酸同様酸化を受けやすい脂質であり、コレステロールの酸化により７−ケトコレステロール、７α−または７β−ヒドロキシコレステロール、５，６α−または５，６β−エポキシコレステロール、３β，５α，６β−トリヒドロキシコレステロールのほか、コレステロールの側鎖がヒドロキシル化された２４あるいは２５あるいは２７−ヒドロキシコレステロール等の酸化コレステロールが生成することが知られており、食品中、特に加工食品中に存在するばかりでなく、ヒト体内中にも見出されてきた。
【０００６】
酸化コレステロールは、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の阻害、アシルＣｏＡアシルトランスフェラーゼの活性化、ＬＤＬの結合阻害、血管上皮細胞などへの細胞毒性、コレステロールの生合成阻害、細胞内へのカルシウム流入促進作用等の作用により種々の疾病と関与することが報告されている。したがって、これら酸化コレステロールを検出することは酸化コレステロールの疾病への関与を明らかにするために非常に重要である。
【０００７】
現在、生体液中および組織中の酸化コレステロールの検出は、それらが比較的低濃度であるために困難であるが、脂質の抽出、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィーおよび質量分析等の手法を組み合わせることにより比較的高感度に実施できることが報告されており、これらの機器分析による測定方法は研究プロジェクト等における実験操作としては重要になっている。しかしながら、これらの方法は測定機器が高価であったり、測定するために誘導体化する必要があったりするなど、操作性や、一度に多数の検体を処理することには不向きである点について問題が生じており、迅速かつ経済的な臨床分析に、容易に適するものではなかった。
【０００８】
一方、抗体は特定の物質（構造）に対して特異的かつ高いアフィニティーを有する蛋白質である。また、抗体を利用することによる免疫学的手法による測定対象の検出は、一般的に利用されている技術でもあり、経済的かつ精度、感度共に臨床学的に利用可能な検出方法を提供できるものである。ゆえに、測定対象となる物質（構造）に対する抗体を取得することにより、測定対象となる物質（構造）を検出するための手段を提供できる。
しかし、臨床検査において、７−ケトコレステロール検出、定量を可能とするモノクローナル抗体の存在は知られておらず、これまで、７−ケトコレステロールとキャリアー蛋白質が結合したハプテンが提案されているにすぎなかった（非特許文献１、２参照。）。
【０００９】
【非特許文献１】
バイオオーガニック  アンド  メディカル  ケミストリー  第１０巻：第３５７頁，２０００年、
【非特許文献２】
ケミストリー  レターズ  第１巻：第４２頁，２０００年
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の第１の目的は、７−ケトコレステロールを特異的に認識できるモノクローナル抗体を提供するものである。第２の目的は、該モノクローナル抗体を多量に産生できるハイブリッド細胞を提供するものである。第３の目的は、該モノクローナル抗体の製造方法を提供するものである。そして、第４の目的は該モノクローナル抗体を用いる７−ケトコレステロールの検出、定量等の検査方法を提供するものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は以下の発明である。
（１）７−ケトコレステロールを認識するモノクローナル抗体。
（２）７−ケトコレステロール−高分子複合体を抗原として免疫した恒温動物から得られた抗体産生細胞と同種または異種のリンパ球様細胞とを細胞融合して得られるハイブリッド細胞が産出する前記（１）のモノクローナル抗体。
（３）抗原の７−ケトコレステロール−高分子複合体が７−ケトコレステロール−蛋白質複合体である前記（２）のモノクローナル抗体。
【００１２】
（４）抗原の７−ケトコレステロール−高分子複合体が７−ケトコレステロールのＣ−１７位に結合する炭化水素鎖が蛋白質と結合している７−ケトコレステロール−蛋白質複合体である前記（２）のモノクローナル抗体。
（５）７−ケトコレステロール−蛋白質複合体が、その構成蛋白質をヘモシアニン、牛血清アルブミン、卵白アルブミンおよびカゼインからなる群より選ばれる、少なくとも１種の蛋白質とする複合体である前記（３）又は（４）のモノクローナル抗体。
【００１３】
（６）３３Ａ−４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６７３）又は３５Ａ−８株（ＦＥＲＭＰ−１８６７４）が産出する前記（１）のモノクローナル抗体。
（７）７−ケトコレステロール−高分子複合体を抗原として免疫した恒温動物から得られた抗体産生細胞と、同種または異種のリンパ球様細胞とを細胞融合して得られるハイブリッド細胞。
（８）恒温動物がマウスであり、リンパ球様細胞がマウスミエローマである前記（７）のハイブリッド細胞。
【００１４】
（９）前記（７）又は（８）のハイブリッド細胞を用いることを特徴とする、７−ケトコレステロールを認識するモノクローナル抗体の製造方法。
（１０）前記（７）又は（８）のハイブリッド細胞を液体培地の中または恒温動物の腹腔内で増殖させ、モノクローナル抗体を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする７−ケトコレステロールを認識するモノクローナル抗体の製造方法。
（１１）恒温動物の腹腔内が、マウスの腹腔内である前記（１０）の７−ケトコレステロールを認識するモノクローナル抗体の製造方法。
（１２）３３Ａ−４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６７３）又は３５Ａ−８株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６７４）を用いる７−ケトコレステロールを認識するモノクローナル抗体の製造方法。
【００１５】
（１３）前記（１）〜（６）のいずれかのモノクローナル抗体を用いることを特徴とする７−ケトコレステロールの検査方法。
（１４）前記（１）〜（６）のいずれかのモノクローナル抗体を用いることを特徴とする酸化ＬＤＬの検査方法。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明のモノクローナル抗体は、特異的に７−ケトコレステロールを認識することのできるモノクローナル抗体である。詳細には、コレステロール、あるいは７β−ヒドロキシコレステロール、７−α−ヒドロキシコレステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２４−ヒドロキシコレステロール、２７−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、トリヒドロキシコレステロール、５α−エポキシコレステロール、５β−エポキシコレステロールなどのコレステロールの酸化物を認識せず、７−ケトコレステロールを特異的に認識できるモノクローナル抗体である。本発明のモノクローナル抗体は、特定のハイブリッド細胞が産出する抗体である。
本発明のモノクローナル抗体を産出するハイブリッド細胞は、例えば下記の（ａ）抗原の調製、（ｂ）免疫、（ｃ）抗体産生細胞の調製、（ｄ）ハイブリッド細胞の調製、（ｅ）スクリーニング、（ｆ）クローニングの工程にて調製できる。
以下に、各工程を説明する。
【００１７】
（ａ）抗原の調製
一般に、恒温動物の免疫系の外来抗原に対する応答能力は抗原分子の分子量に依存する。７−ケトコレステロールもそれ自体抗体産生を誘導するものではない。しかしながら、例えば、蛋白質等のような高分子についてその構造の一部としての７−ケトコレステロールは、それ自体免疫系を誘導し、抗体を産生させることができる。７−ケトコレステロールと結合する高分子としては蛋白質が好ましい。このような蛋白質としては、例えば牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略す。）、卵白アルブミン、ゼラチン、カゼイン、ヘモシアニン（以下、ＫＬＨと略す。）、ウシサイクログロブリン等の蛋白質が挙げられる。さらに、ヘモシアニン、牛血清アルブミン、卵白アルブミンおよびカゼインからなる群より選ばれる、少なくとも１種の蛋白質であるのが抗体産生に関わる免疫応答の観点から好ましい。
【００１８】
７−ケトコレステロール−蛋白質複合体において、蛋白質と７−ケトコレステロールとのモル比は、目的の７−ケトコレステロールを認識するモノクローナル抗体が効率よく産出できれば、どの様な比率で結合させても良いが、例えば、ＢＳＡやＫＬＨ等と７−ケトコレステロールのモル比が１：０．０１〜１００、好ましくは１：０．０５〜２０の割合で結合させることが好ましい。
【００１９】
７−ケトコレステロール−蛋白質複合体を調製する場合、７−ケトコレステロールを蛋白質と結合させることができるような官能基を持つ種々の縮合剤、例えば、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル等を用いることができる。
７−ケトコレステロールを認識できるモノクローナル抗体を得るための免疫原を得るためには、７−ケトコレステロールのステロール骨格のＣ−１７位に結合する炭化水素鎖に官能基を有する７−ケトコレステロール誘導体を合成して用いることが好ましい。特に、有効であるのは活性エステル等、蛋白質と混合するだけで蛋白質と複合体を形成する活性基を導入した７−ケトコレステロール誘導体であり、ステロール骨格のＣ−１７位に結合する炭化水素鎖を利用し、７−ケトコレステロール−蛋白質複合体を調製することができる。
【００２０】
７−ケトコレステロールと蛋白質と反応させて７−ケトコレステロール−蛋白質複合体を調製する場合、例えば、官能基あるいは活性基を導入した７−ケトコレステロール誘導体を溶解可能な溶媒で調製した液と、蛋白質をイオン交換水あるいは緩衝液調製などの溶解可能な溶媒に溶解した蛋白質溶液を混合し、反応する。
７−ケトコレステロール誘導体を溶解するために用いる溶媒は反応に影響を与えないものであればどのような溶媒でも使用可能であるが、蛋白質溶液と容易に混合可能なものが望ましい。例えば、エタノール、メタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等の有機溶媒が適している。蛋白質を溶解する緩衝液としては、蛋白質を溶解可能なものであり、かつ、７−ケトコレステロール誘導体と蛋白質との反応を妨害するものでなければいずれでも良く、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液等を用いることができる。
反応条件としてｐＨ、イオン強度、反応時間、反応温度は７−ケトコレステロールおよび／あるいは７−ケトコレステロール誘導体とキャリアー蛋白質が複合体を形成しうる条件であればいずれでも構わないが、ｐＨ６．０〜９．５、イオン強度は１〜２５０ｍＭ、反応時間は０．５〜７２時間、反応温度は１０〜４０℃程度が適当である。
【００２１】
このようにして得られた７−ケトコレステロール−蛋白質複合体は、カラムクロマトグラフィー、塩析や透析等公知の蛋白質精製技術を用いて精製して抗原とすることも可能であるが、未精製のまま抗原として用いることもできる。
【００２２】
（ｂ）免疫
本発明において免疫される動物として、羊、山羊、兎、モルモット、ラット、マウス、ハムスター、イヌ、ニワトリ等の動物が挙げられる。モノクローナル抗体を得るためには、ラット、マウスが好ましい。一般的に抗体産生細胞を融合するリンパ球様細胞は、抗体産生細胞と同種または異種のリンパ球様細胞であって良いが、このような目的に用いられるリンパ球様細胞は一般にマウス由来であるため、好ましくは同種であるマウス由来のものである。さらに好ましくは、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のものである。ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のものが最も好ましい理由は、多用されるマウス由来のミエローマがＢＡＬＢ／ｃマウスが起源であり、抗体産生細胞とミエローマがともにＢＡＬＢ／ｃマウス由来であれば、得られるハイブリドーマをＢＡＬＢ／ｃマウス腹腔内で増殖させることができるため、複雑な手順を経ることなしに腹水よりモノクローナル抗体が得られるためである。
【００２３】
免疫方法は、通常公知の免疫方法を用いて実施可能である。投与経路は皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射等を選択することができるが、好ましくは腹腔内、皮下もしくは筋肉内に注入して行う投与形態である。より好ましくは前記投与経路を２ないし３組み合わせた投与経路、例えば、腹腔内注射、皮下注射および筋肉注射全ての投与経路を組み合わせる投与形態である。免疫間隔，免疫量等も可変度は高く、種々の方法が可能であるが、たとえば７ないし３０日、特に１２ないし１６日間隔で約２〜６回免疫する方法がよく用いられる。抗原投与量は免疫される動物により異なるが、１回つき、０．００１〜２ｍｇ、好ましくは０．０１〜０．５ｍｇ程度用いる。
【００２４】
なお、この場合、抗原は適当な緩衝液、例えばフロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、水酸化アルミ等の通常用いられるアジュバントの少なくとも１種を含有するリン酸緩衝液、生理食塩水等に溶解して用いることができるが、上記のようなアジュバントを使用しなくとも良い。ここで、アジュバントとは抗原と共に投与した時、非特異的にその抗原に対する免疫反応を増強する物質である。
【００２５】
上記の抗原を免疫した恒温動物を１〜３０日間処置せずに飼育した後、抗体価を測定、抗体価が上昇してきたら、状況に応じて抗原の投与を適当回数実施する。例えば、０．００１〜１ｍｇ、好ましくは、０．０１〜０．５ｍｇの抗原の投与量で１もしくは２回の追加投与を行う。
なお、抗体産生細胞を調製する場合、抗体価が十分高くなった動物を抗体産生細胞の供給原として用いることが望ましい。以降の操作効率の向上や良好な性能を有する目的とするモノクローナル抗体を得ることができるからである。
【００２６】
抗体価の評価は、例えば、以下に行うことができる。
免疫した恒温動物の血清等を少量採取し、ウエスタンブロット法、凝集法、酵素免疫化学的測定法、一元放射状免疫拡散法等から選ばれた測定法により抗体価を測定することができる。より簡便には酵素免疫化学的測定法が利用できる。
【００２７】
プレート法による酵素免疫化学的測定法により抗体価の測定を行う場合、免疫に用いた恒温動物としてマウスを用い、例えば以下のような手順により行うことができる。すなわち、例えば、マウスに投与する抗原が７−ケトコレステロールとカギアナカサガイのヘモシアニンの複合体の場合、７−ケトコレステロールと牛血清アルブミンの複合体（以下、７ＫＣ−ＢＳＡと略す。）のような抗原とは蛋白質が異なる７−ケトコレステロール−蛋白質複合体を１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと略す。）に溶解した液をプレートのウェルに分注（１００ｕＬ／ウェル）し、４℃で一昼夜、室温で６時間程度あるいは３７℃で２時間程度インキュベートする事により、固相に７ＫＣ−ＢＳＡ複合体を吸着結合させる。ＰＢＳで洗浄後、非特異的な吸着反応を抑制することを目的として、抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係な物質、例えばゼラチン、ＢＳＡ、カゼインあるいはスキムミルク等の蛋白質を０．１〜１０％の濃度で含有するＰＢＳあるいはブロッキング試薬Ｎ１０１（日本油脂社製）、ブロッキング試薬Ｎ１０２（日本油脂社製）を推奨の濃度に希釈した液を加えることによりブロッキングする。続いて、例えばマウス血清をＰＢＳで段階希釈した試料をウェルに分注（１００ｕＬ／ウェル）し、４℃、室温あるいは３７℃で０．５時間〜一昼夜インキュベートする。０．０５％のトゥイーン２０を含有するＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴと略す。）等で洗浄後、さらに第二抗体としてペルオキシダーゼ標識されたマウス抗体に対する抗体を含有するＰＢＳを分注（１００ｕＬ／ウェル）し、４℃、室温あるいは３７℃で０．５時間〜一昼夜インキュベートすることにより固定化された７−ケトコレステロールと反応したマウス血清中の抗体に結合させる。ＰＢＳＴ等で洗浄後、ペルオキシダーゼの基質を加えて発色反応を行い、酵素−基質反応に基づく発色等をプレートリーダーで測定することにより抗体価を求めることができる。
【００２８】
（ｃ）抗体産生細胞の調製
抗体産生可能な細胞は以下のように調製することができる。抗体産生細胞としては、例えば、形質細胞、その前駆細胞であるリンパ球が挙げられる。このような抗体産生細胞は免疫された恒温動物のいずれの部位から得ても良いが、脾臓、リンパ節、末梢血組織等から得ることができる。最も一般的なのは、脾臓で、本発明においても、抗原の最終投与の１ないし３０日後、特に好ましくは１〜７日後に免疫された恒温動物から脾臓を摘出し、目的の抗体の産生細胞に調製することができる。
【００２９】
（ｄ）ハイブリッド細胞の調製
抗体の産生細胞を、例えば、「単クローン抗体実験操作法入門」（講談社サイエンティフィック    安藤民衛ら、１９９１年）等に記載されている方法により、継代培養可能な細胞とするために、例えば、仙台ウイルスやポリエチレングリコール存在下、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（ＨＧＰＲＴ−）や、チミジンキナーゼ欠損（ＴＫ−）の様なマーカーを持った骨髄腫細胞（以下、ミエローマ細胞と表記する。）と細胞融合させて、ハイブリッド細胞を調製することができる。
【００３０】
ここで用いられるミエローマ細胞は、同じ恒温動物でも同種の恒温動物のミエローマ細胞を用いることが好ましく、例えばマウスを免疫動物として得られた脾臓細胞と融合させる場合、マウスミエローマ細胞を用いることが好ましい。８−アザグアニン耐性マウス（  ＢＡＬＢ／ｃ由来）  ミエローマ株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３−Ｕ１）（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  第８１巻：第１頁，１９７８年）、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ−１（ＮＳ−１）（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  第６巻：第５１１頁，１９７６年）、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４（Ｓｐ−２）（Ｎａｔｕｒｅ  第２７６巻：２６９頁，１９７８年）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  第１２３巻：１５４８頁，１９７９年）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ  第２５６巻：４９５頁，１９７５年）等を用いることができる。
【００３１】
細胞融合の方法としては、公知の技術（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ    第３９巻：第２８５頁，１９８０年、Ｎａｔｕｒｅ  第２５６巻：４９５頁，１９７５年）を用いることができる。例えば、免疫されたマウスから得られた抗体産生細胞とマウスミエローマ細胞とを２０：１〜２：１の割合で融合する。ここで、約１０８個の抗体産生細胞に対して０．１〜５ｍＬ、好ましくは０．５〜１．５ｍＬの融合媒体の使用が適当であり、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ培地とハムＦ−１２培地を１：１に混合した培地等に細胞を懸濁させて融合を行う。融合は、センダイウイルスやポリエチレングリコール等の融合剤を用いて細胞融合させるが、ジメチルスルホキシドやその他の融合促進剤を加えてもよい。融合剤としてポリエチレングリコールを用いる場合、一般的に平均分子量１０００〜６０００のポリエチレングリコールを１０％〜８０％の濃度で０．５〜３０分処理する方法が用いられ、好ましくは、ポリエチレングリコール１５４０を３５〜５５％で４〜１０分処理することで、効率よく融合させることができる。その他、細胞融合剤を用いる以外に電気刺激を用いる方法により細胞融合を行っても良い。その後、別の容器で未融合の抗体産生細胞およびハイブリッド細胞の混合物をハイブリッド細胞のみが生育可能であるＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン添加培地）により選択的にハイブリッド細胞を増殖させることができる。
【００３２】
（ｅ）スクリーニング
ハイブリッド細胞がコロニーを形成した後、培養上清中の抗体をスクリーニングすることで目的の抗体を産生するハイブリッド細胞を得る。ハイブリッド細胞のスクリーニングの方法としては、例えば、ウエスタンブロット法あるいは酵素免疫化学的測定法等が挙げられる。
【００３３】
（ｆ）クローニング
スクリーニングにより選ばれたハイブリッド細胞は、次にクローニングする。例えば、プレートの１穴に１個のハイブリッド細胞が含まれるように希釈して培養する限界希釈法、軟寒天培地中で培養しコロニーを回収する軟寒天法、マイクロマニュピレーターによって１個づつの細胞を取り出し培養する方法、セルソーターによって１個の細胞を分離する「ソータクローン」などによりクローニングできる。好ましいのは、限界希釈法である。クローニングにより、目的の抗体を産生する単一のハイブリッド細胞を得ることができる。
【００３４】
本発明により調製されたハイブリッド細胞として、例えば、３３Ａ―４株、３５Ａ−８株を挙げることができる。３３Ａ−４株は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許微生物寄託センターに平成１４年１月１１日に寄託番号（ＦＥＲＭＰ−１８６７３）として、３５Ａ−８株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに平成１４年１月１１日に寄託番号（ＦＥＲＭ    Ｐ−１８６７４）として寄託されている。
【００３５】
本発明のモノクローナル抗体は、上述の方法にて調製したハイブリッド細胞が産出するが、その製造方法を（ｇ）ハイブリッド細胞の培養、（ｈ）モノクローナル抗体の精製の工程に分けて以下に説明する。
【００３６】
（ｇ）ハイブリッド細胞の培養
上述の方法にて調製したハイブリッド細胞は、液体培地中で増殖できる。例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地に約０．１〜４０％の牛血清を加えた培地等で約２〜１０日間、好ましくは約３〜５日間培養し増殖したハイブリッド細胞を得ることができる。
また、ハイブリッド細胞と主要組織適合性が一致する恒温動物を用いて腹水形成法等の方法により培養することもできる。例えば、哺乳動物の腹腔内に接種し、細胞を増殖させ、腹水を採取することにより増殖したハイブリッド細胞を得ることができる。例えばマウスの場合、プリスタン等のネラルオイル等を前もって接種したＢＡＬＢ／ｃ等のマウスに約１×１０４〜１×１０７個、好ましくは約５×１０５〜２×１０６個のハイブリッド細胞を腹腔内に接種し、約７〜２０日後、好ましくは約１０〜１４日後に腹水液を採取することで、増殖したハイブリッド細胞を得ることができる。
【００３７】
（ｈ）モノクローナル抗体の精製
上述のようにハイブリッド細胞を培養することにより得られた培養液や腹水に生成蓄積した抗体は、免疫グロブリンの分離精製法、例えば、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等による塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例えば、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、アフィニティー精製法（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、抗原結合担体）による特異的吸脱着法等により容易に目的の純度のモノクローナル抗体を得ることができる。
【００３８】
例えば、上述した（ａ）〜（ｈ）工程により本発明の７−ケトコレステロールを認識するモノクローナル抗体を製造することができる。このようにして得られたモノクローナル抗体は、当該事業者が通常用いる技術を利用することにより、生体内外の７−ケトコレステロールを免疫学的に容易に検出し、その量を定量することができる。
【００３９】
また、本発明のモノクローナル抗体はヒトの７−ケトコレステロールの検出だけでなく、ヒト以外の異種の恒温動物、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリなどの生体中に存在する７−ケトコレステロールの検出にも応用することができる。
【００４０】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は本実施例に限定されるものではない。
【００４１】
〔実施例１〕
（ａ）抗原の調製
７−ケトコレステロールと蛋白質よりなる７−ケトコレステロール−（カギアナカサガイのヘモシアニン）複合体（以下、７ＫＣ−ＫＬＨ複合体と略す。）は、森田らの方法（非特許文献１、２）により作製した。まず、マレイミドベンゾイル−ヒドロキシ−スクシンイミド化７−ケトコレステロールを調製し、カギアナカサ貝ヘモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と略す。）と反応させて作製した。詳細には、５０ｍｇのＫＬＨを１０ｍＬの１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２に加え、室温で３０分間撹拌し、遠心分離によって上清を得、これに、７．５ｍｇの活性化７−ケトコレステロールを０．２ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドで溶解した液を加え、３７℃、２４時間撹拌させた。反応液は、未反応の活性化７−ケトコレステロールを除去するためにセファデックスＧ−２５（ファルマシア社製）に通し、７ＫＣ−ＫＬＨ複合体分画を回収した（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２）。
【００４２】
（ｂ）免疫
７ＫＣ−ＫＬＨ複合体（１ｍｇ／ｍｌ）は等量のフロイントの完全アジュバントとよく混合してエマルジョンとし、これをマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、６〜８週齢）の腹膜腔内に１００μｌ免疫した。初回免疫から１０〜１４日後、抗原とフロイントの不完全アジュバントをよく混合してエマルジョンとして、追加免疫を行った。この操作を２回繰り返した。最後の追加免疫から３週間後、抗原とＰＢＳを混合して最終免疫を行った。なお、抗体価は、追加免疫の７日後、マウス眼孔静脈から血液を採取し、得られた血清を用いて酵素免疫化学的方法で抗原に対する抗体が産生されていることを確認した。
【００４３】
抗体価は７−ケトコレステロールと７ＫＣ−ＢＳＡ複合体を固相とした酵素免疫測定法により確認した。まず、抗原の調製に記載した方法と同様に牛血清アルブミンと活性化７−ケトコレステロール誘導体を反応させて、７ＫＣ−ＢＳＡ複合体を得た。これをＰＢＳを用い適当な濃度に希釈し、９６穴イムノプレート（Ｎｕｎｃ社製、マキシソープタイプ）に分注（１００ｕＬ／ウェル）して４℃で一昼夜インキュベートすることにより物理吸着させた。ＰＢＳで２回洗浄した後、イオン交換水で５倍希釈したブロッキング試薬Ｎ１０１（日本油脂社製）を分注（２００ｕＬ／ウェル）し、室温で２〜４時間インキュベートしてブロッキング後、内容液を除去して乾燥させた。このプレートのウェルにマウスから得られた血清（１００μｌ／ウェル）のＰＢＳによる段階希釈液を入れて、４℃で一昼夜インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで４回洗浄後、ペルオキシダーゼで標識されているマウス抗体に対するヤギ抗体をＰＢＳＴで５０００〜１００００倍希釈した液を分注し（１００μｌ／ウェル）、室温で４時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで４回洗浄した後、ペルオキシダーゼ用発色液Ｔ（住友ベークライト社製）を分注し（１００ｕＬ／ウェル）、室温で１５〜２０分間インキュベートした。発色反応はキットに添え付けの反応停止液を分注（１００μｌ／ウェル）することで停止し、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定して抗体価の確認を行った。
本実施例において免疫したマウスでは、未感作のマウスから得た血清と比較して、吸光度の差が認められ抗体価が上昇していた。抗体価の十分高くなったマウスを抗体産生細胞の供給原として次の工程に用いた。
【００４４】
（ｃ）抗体産出細胞の調製
免疫したマウスからマウス脾臓を摘出し、よくほぐして脾細胞を得た。得られた脾細胞はＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄した。
（ｄ）ハイブリッド細胞の調製
脾細胞とＲＰＭＩ−１６４０培地でよく洗浄したミエローマ細胞であるマウス６５３細胞（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８，６５３）を細胞数が７：１の割合になるように混和し、培地に対して５０ｗ／ｖ％のポリエチレングリコール１５４０溶液を徐々に加えて５分間混和した。これにＲＰＭＩ−１６４０培地を加えて反応を停止させた後、５分間遠心分離して上清を廃棄した。これにＲＰＭＩ−１６４０培地を加えた後、５分間遠心分離を行い、上清を廃棄した。この操作を２回繰り返して細胞を洗浄し、ハイブリッド細胞を調製した。
【００４５】
（ｅ）スクリーニング
前述の得られたハイブリッド細胞に３０ｍｌのＨＡＴ培地を加えて細胞を懸濁し、９６穴イムノプレートの各ウェルに１００ｕｌずつ分注し、ＨＡＴ培地により選択的にハイブリッド細胞を増殖させた。融合から１０日後、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたもの）でウェル中の１／２量の培養上清を置換した。この操作を２〜３回繰り返した。この培養上清を用いて抗体活性に関するスクリーニングを行い、ウェル中の融合細胞を好ましいものを選別した。
【００４６】
（ｆ）クローニング
抗体活性の確認されたウェルの細胞は限界希釈を行い培養し、７−ケトコレステロールに対して高い抗体活性を有し、且つ単一の細胞からなるクローン２株（３３Ａ−４株、３５Ａ−８株）を得た。
【００４７】
（ｇ）ハイブリッド細胞の培養
得られたハイブリッド細胞３３Ａ−４株および３５Ａ−８株のそれぞれをあらかじめ０．５ｍｌのミネラルオイルを腹腔内に投与しておいたＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に１匹あたり１×１０６個接種することにより腹水化を行った。ハイブリッド細胞を腹腔に投与して１０日後、腹水を採取することができた。
（ｈ）モノクロナル抗体の精製
得られた３３Ａ−４株、３５Ａ−８株のモノクローナル抗体について、マウスＩｇＧサブクラスの検討を行った。培養上清を試料としてマウスＩｇＧサブクラス検定キット（商品名：Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  ｋｉｔ  ＲＰＮ２９、アマシャム社製）で抗体のサブクラスの検討を行ったところ、いずれもＩｇＧ１、κ（カッパー）鎖であった。この培養上清について、硫酸アンモニウムによる塩析、及びプロテインＡをリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーを常法通り行うことにより本発明のモノクローナル抗体を精製した。
すなわち、培養上清および腹水は、１００００ｒｐｍで遠心分離して上清を得、上清をＰＢＳで２倍希釈した。これに、攪拌しながら硫酸アンモニウムを穏やかに加え、最終的に４０％飽和硫酸アンモニウム濃度とした。最後の硫酸アンモニウムを加えてから４℃で３０分間撹拌を継続、その後、３０分間４℃で静置して十分に塩析、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、沈殿物を回収した（４０％硫安分画）。沈殿物は、適量のＰＢＳで再溶解し、１００倍量以上のＰＢＳに対し、４℃で１２時間透析を行った。透析外液を１２時間毎に６回交換して、硫酸アンモニウムを除去した。透析内液を０．４５ｕｍでフィルター濾過後、その液をプロテインＡをリガントとするアフィニティーカラムを通した。続いてカラム容積の４倍量のＰＢＳで洗浄、１０ｍＭグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）でモノクローナル抗体を溶出させ、モノクローナル抗体の変性を防ぐために１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ９．０）で溶液のｐＨを中性として４℃で保存した。腹水中のモノクローナル抗体がなくなるまで、つまりは上記アフィニティーカラムクロマトグラフィーによるプロテインＡ結合成分が回収されなくなるまでこの操作を繰り返した。最終的に集めた１０ｍＭグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）溶出液（ｐＨ調製液）は、上記と同様、４０％硫安分画、透析をする事により最終的にモノクローナル抗体を得ることができた。得られたモノクローナル抗体は、２−メルカプトエタノールで還元し、アクリルアミド濃度１０％のゲルを用いて２０ｍＡで１．５時間泳動を行なった。その結果、どちらのモノクローナル抗体も６０ｋＤａ前後にＨ鎖，３０ｋＤａ前後にＬ鎖の２つのバンドが認められた。
【００４８】
〔実施例２〕
実施例１で得た３３Ａ−４株および３５Ａ−８株由来のモノクローナル抗体の反応特異性について下記の方法で確認した。
すなわち、トリヒドロキシコレステロール（表１、２中、ＴｒｉＯＨと略す。以下に同じ。）、７β−ヒドロキシコレステロール（７βＯＨ）、コレステロール（ＣＨＯＬ）、５β−エポキシコレステロール（β―Ｅｐｏｘ）、５α−エポキシコレステロール（α−Ｅｐｏｘ）、２５−ヒドロキシコレステロール（２５ＯＨ）、７−ケトコレステロール（７ＫＣ）を試料（全てシグマ社製）として下記の（モノクローナル抗体の反応性評価法−１）により測定した。
試料は、上記の物質のエタノール溶液を０．１Ｍトリス緩衝液（ＰＨ８．０）に混合して目的の濃度に調製した液（エタノール濃度としては５％以内）を用いた。３３Ａ−４株由来のモノクローナル抗体を用いた結果を表１に、３５Ａ−８株由来のモノクローナル抗体を用いた結果を表２に示す。
【００４９】
（モノクローナル抗体の反応性の評価法−１）
９６穴イムノプレートにウェル当たり１００μｌの７ＫＣ−ＢＳＡ複合体溶液（１０ｕｇ／ｍｌ）を加え、４℃で一昼夜静置してプレートに物理吸着させ、ウェル当たり２００ｕｌの０．１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８．０（以下、トリス緩衝液と略す。）で２回洗浄した後、ブロッキング試薬Ｎ１０１（日本油脂社製）あるいはブロッキング試薬Ｎ１０２（日本油脂社製）をイオン交換水で５倍希釈した液をウェル当たり２００ｕｌ加えて室温でインキュベートすることによりブロッキング処理した。このプレートのウェルに、試料とトリス緩衝液で希釈した本モノクローナル抗体溶液（蛋白質濃度として０．０１〜１ｕｇ／ｍｌ）を１：１の容量比で予め混合した液をウェルあたり１００ｕＬ加え、４℃で一昼夜インキュベートした。このプレートを０．０５％の濃度でトゥイーン２０を含有するトリス緩衝液（以下、ＴｒｉｓＴと略す。）で４回洗浄した後、ウェル当たり１００ｕｌのペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体−ＴｒｉｓＴ溶液を加えて室温で４時間インキュベートした。このプレートをＴｒｉｓＴで４回洗浄した後、ペルオキシダーゼ用発色試薬Ｔ（住友ベークライト社製）を用いて発色反応を行い、４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。
【００５０】
【表１】
2004175754.tif 000002
【００５１】
【表２】
2004175754.tif 000003
【００５２】
表１、２から明らかなように、競合酵素免疫化学的測定法において、７−ケトコレステロールのみ、本発明によるモノクローナル抗体と固相化された７ＫＣ−ＢＳＡとの反応を阻害した。
本発明のモノクローナル抗体は、７−ケトコレステロールのみ特異的に認識できることがわかる。
【００５３】
〔実施例３〕
実施例１で得た３５Ａ−８株由来のモノクローナル抗体を用いて、銅酸化ＬＤＬにおける７−ケトコレステロール量を評価した。
【００５４】
（銅酸化ＬＤＬの調製）
１ｍｇ／ｍＬのヒト低比重リポ蛋白質（以下、「ｈＬＤＬ」と略す。）溶液０．５ｍＬと５０ｕＭの銅イオン溶液０．１ｍＬを混合し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）およびイオン交換水で全量を１ｍＬ（終リン酸濃度１０ｍＭ）とした後、３７℃でインキュベ−トし、Ｃｕ＋＋酸化ＬＤＬを調製した。任意時間にサンプリングを行い、ＥＤＴＡ（２Ｎａ）およびブチルヒドロキシトルエンを含有する液を加えて反応を停止させ、銅酸化ＬＤＬを得た。
【００５５】
（検量線の作成）
既知濃度の７−ケトコレステロールの用いて、下記の（モノクローナル抗体の反応性の評価法−２）により、吸光度を測定して検量線を作成した。検量線を図１に示す。
【００５６】
（銅酸化ＬＤＬにおける７−ケトコレステロール量の評価）
得られた銅酸化ＬＤＬをＰＢＳで４倍希釈した液を試料として、下記の（モノクローナル抗体の反応性評価法−２）により測定した。図１の検量線を用い、得られた吸光度より、試料中の７−ケトコレステロール量を求めた。結果は、検量線より見積られた７−ケトコレステロール量を縦軸に、インキュベーション時間を横軸にとり、図２に示す（図２中「＋Ｃｕ＋＋」で表示。）。
【００５７】
（モノクローナル抗体の反応性の評価法−２）
９６穴イムノプレートにウェル当たり１００ｕｌの７ＫＣ−ＢＳＡ複合体溶液（１０ｕｇ／ｍｌ）を加え、４℃で一昼夜静置してプレートに物理吸着させ、ウェル当たり２００μｌのＰＢＳを用いて２回洗浄した後、ブロッキング試薬Ｎ１０１（日本油脂社製）あるいはブロッキング試薬Ｎ１０２（日本油脂社製）をイオン交換水で５倍希釈した液をウェル当たり２００ｕｌ加えて室温でインキュベートすることによりブロッキング処理した。このプレートのウェルに、試料とＰＢＳで希釈した本モノクローナル抗体溶液（蛋白質濃度として０．０１〜１ｕｇ／ｍｌ）を１：１の容量比で予め混合した液をウェルあたり１００ｕＬ加え、４℃で一昼夜インキュベートした。このプレートを０．０５％の濃度でＰＢＳＴを用いて４回洗浄した後、ウェル当たり１００ｕｌのペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体−ＰＢＳＴ溶液を加えて室温で４時間インキュベートした。このプレートをＰＢＳＴで４回洗浄した後、ペルオキシダーゼ用発色試薬Ｔ（住友ベークライト社製）を用いて発色反応を行い、４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。
【００５８】
〔比較参考例１〕
比較参考例として銅イオン溶液のかわりに１０ｍＭリン酸緩衝液にする以外は実施例３と同様にして銅酸化していないＬＤＬに対する本発明によるモノクローナル抗体の反応性を測定した。結果を図２に示す（図２中「−Ｃｕ＋＋で表示。」）。
【００５９】
図１に示すような検量線が得られたことから、本発明によるモノクローナル抗体を用いることにより、７−ケトコレステロール量を測定するための測定キットを構築できることがわかる。
図２から明らかなように、本発明によるモノクローナル抗体を用いて銅酸化ＬＤＬ中に生じた７−ケトコレステロール量を定量することができ、銅酸化したＬＤＬ中にはインキュベート時間に応じて７−ケトコレステロール量が増加することが示すことができた。
【００６０】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明により７−ケトコレステロールを特異性高く認識するモノクローナル抗体を提供することができる。また、該モノクローナル抗体を多量に産生できる、ハイブリッド細胞を提供することができる。そして、該モノクローナル抗体の製造方法を提供することができる。
本発明のモノクローナル抗体は、７−ケトコレステロールを検出、定量する用途に有用であり、例えば、高感度の７−ケトコレステロールの検査方法を提供できるので、免疫染色、臨床診断、臨床病理、分析等において利用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明による７−ケトコレステロールを特異性高く認識する、３５Ａ−８由来のモノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定系の検量線を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明による７−ケトコレステロールを特異性高く認識する、３５Ａ−８由来のモノクローナル抗体の、銅酸化ＬＤＬ中の７−ケトコレステロール量を測定したグラフである。
【図１】
2004175754.tif 000004
【図２】
2004175754.tif 000005