(57)【要約】【課題】急性膵炎や急性循環不全治療において抗酵素薬剤投薬の効果、及び投薬の時期等を正確に確認することができるモニタリング方法を提供する。【解決手段】プロテアーゼ阻害治療薬投与治療のモニタリング方法は、プロテアーゼ阻害治療薬を投与した患者由来の生体液試料中の顆粒球由来のエラスターゼによる繊維素分解産物の濃度を検出する。【選択図】　図１
2004093414.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼ阻害治療薬を投与した患者由来の生体液試料中の顆粒球由来のエラスターゼによる繊維素分解産物の濃度を検出することを特徴とする、プロテアーゼ阻害治療薬投与治療のモニタリング方法。
【請求項２】
前記の繊維素分解産物の濃度の変動経緯及び／又は変動幅を指標とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記の繊維素分解産物を免疫学的手段により検出する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
患者が急性膵炎又は急性循環不全である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プロテアーゼ阻害治療薬投与治療のモニタリング方法に関するものであり、顆粒球由来のエラスターゼにより消化・分解された繊維素分解産物（ＧＥ−ＸＤＰ）の濃度を測定することで、プロテアーゼ阻害治療薬の投薬の効果や投薬の時期等を確認することができる。
【０００２】
【従来の技術】
侵襲に対する生体防御機構のなかで、好中球はきわめて重要な位置を占めている。その主な役割は貪食であるが、その対象が大きすぎて貪食不可能な場合や防御機構に携わる様々な分子の発するシグナル刺激に対応して、好中球は細胞外へ中性プロテアーゼや活性酸素等、生体防御物質を放出する。その１つが好中球エラスターゼ（Ｇｒａｎｕｌｅ　Ｅｌａｓｔａｓｅ：ＧＥ、ＥＣ３．４．２１．３７）である。好中球エラスターゼは強力な蛋白分解酵素で、生体に侵入した異物の破壊、消化の一翼を担っている。しかし、生体内には大量にプロテアーゼインヒビターが存在することから、放出された好中球エラスターゼは特殊な状況を除いて作用していないと考えられていた。しかし、近年の研究により好中球エラスターゼの主要な抑制物質であるα１−プロテアーゼインヒビターが、好中球やマクロファージから放出される活性酸素により失活されることが判明している。緩やかな基質特異性のため、好中球エラスターゼは、生体に対して様々な障害を引き起こすことが報告されている。その顕著な例が肺気腫、成人呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、術後合併症、多臓器不全、敗血症、凝固異常（ＤＩＣ等）、急性胃粘膜病変、炎症性腸疾患、重症膵炎、急性心筋梗塞、動脈硬化、慢性関節リュウマチ、白血病等、更には急性循環不全のような症候群である。そのため、上記の疾患患者に対しては、プロテアーゼインヒビターを投与してその障害に対処する方法が効果的である。プロテアーゼインヒビターとしては、ウリナスタチン、シベレスタットナトリウム塩等、様々な物質が開発検討され、医療の現場で治療効果が検討されている。
【０００３】
上記の各疾患の内、膵炎は難治性の疾患で、膵臓の外分泌腺が産生する消化酵素の活性化による自己消化である急性炎症と、繊維化によって不可逆的な機能不全になる慢性炎症に分けられる。特に急性膵炎から続発する重症膵炎の場合、ショックや呼吸困難の症候のみならず、腎不全、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、肝不全等の合併症を併発し、死亡率も高い疾患である。そのため、重症化の程度及び転帰を早期に診断することはもとより、適切な治療を施すことが重要となる。
【０００４】
一方、急性循環不全は、出血性ショック、細菌性ショック、熱傷性ショック、外傷性ショックや心臓自体の病変、あるいはアナフィラキシーや薬物反応により心機能が高度に抑制され、生体機能を維持するのに必要な心拍出量が減少し、組織循環の不全を起こして組織細胞の低酸素症を来たし細胞代謝が傷害され、アシドーシスの発生や乳酸の蓄積などの諸症状を起こし、不可逆性の重要臓器不全に至る。早期の適切な治療を行わなければ悪循環に陥り、死亡に至る症候群である。そのため、早期診断はもとより、適切な治療を施すことが重要となる。
【０００５】
従来、膵炎の診断は、血清や尿中に含まれるアミラーゼ、血清中のリパーゼ、エラスターゼ１、トリプシン、サイトカイン等を定量することで行われ、患者の病態に適した治療法（主に薬剤の投与）が施されている。重症化の判断は、厚生労働省診断基準に従い、膵炎発症から４８時間以内に全身状態、臨床所見（ＢＵＮ、ＬＤＨ、ＢＥ等）及び画像所見（ＵＳ、ＣＴ等）から重症化スコアにより判断されている。
【０００６】
一方、急性循環不全は、ショック状態の把握が診断の手がかりとなり、意識状態、収縮期血圧、脈拍数、ＢＥ、尿量及び意識状態観察からなるショックスコアによる診断が行われている。
【０００７】
これらの主な治療法は、抗酵素療法の蛋白分解酵素阻害剤（プロテアーゼインヒビター）の投与である。これは、炎症の抑制及び炎症から誘発される生体の過剰な防御反応を抑制することが主目的で、その薬剤としては、アプロチニン、メシル酸ガベキセート、ウリナスタチン、メシル酸ナファモスタット等が多く使用されている。これらの抗酵素薬剤は、急性膵炎（急性循環不全も含む）の大部分に使用されている。例えば、ウリナスタチン製剤は、急性膵炎（外傷性、術後及びＥＲＣＰ後の急性膵炎を含む）、慢性再発性膵炎の急性増悪期、及び急性循環不全（出血性ショック、細菌性ショック、外傷性ショック、熱傷性ショック）に投与することで、膵酵素や過剰防御に由来する好中球エラスターゼの働きを抑え、炎症や痛みを和らげる。
【０００８】
しかし、ウリナスタチン製剤は、その投与量や期間が厳密に規定されており、患者病態を密に観察し、その使用に注意を払う必要がある。また、他の抗酵素薬剤の投与においても、例えば、アプロチニンは分子量が大きいため、反復投与によってアナフィラキシーショックを引き起こす危険性がある。更に、メシル酸ナファモスタットは、大量持続投与により、高カリウム血症を起こすため、重症膵炎や急性循環不全の病期に応じて適切な用法、用量で治療することが救命効果を高めるためには重要になる。
【０００９】
これら薬剤投与後の患者病態を正確に把握するには、重症膵炎の診断時に定量されるＢＵＮ、ＬＤＨ、ＢＥ等、循環不全の診断時に定量されていた収縮期血圧、脈拍数、ＢＥでは不十分である。というのも、これらの物質は、重症膵炎や急性循環不全の病態を正確に示唆するものではなく、間接的に侵襲された臓器機能しか把握できず、また、侵襲臓器の代謝作用時間の遅延による状態把握のずれが生じる。
従って、薬剤投与の効果や投与時期をより正確に確認し得る炎症の範囲及び勢力を示す新しい指標が望まれている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者は、急性膵炎や急性循環不全治療において抗酵素薬剤投薬の効果や投薬の時期等を正確に確認することが可能な新しい指標を探索していたところ、顆粒球由来エラスターゼにより消化・分解された繊維素分解産物（ＧＥ−ＸＤＰ）がその指標となることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明は、
プロテアーゼ阻害治療薬を投与した患者由来の生体液試料中の顆粒球由来のエラスターゼによる繊維素分解産物の濃度を検出することを特徴とする、プロテアーゼ阻害治療薬投与治療のモニタリング方法に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で指標として利用するのは、患者由来の生体液試料中の顆粒球由来エラスターゼにより消化・分解された繊維素分解産物（以下、ＧＥ−ＸＤＰともいう）である。そもそもＧＥ−ＸＤＰは、生体内局所において白血球、特には顆粒球が活性化されたときに放出されるエラスターゼによってフィブリノーゲン又はフィブリンが分解を受けて生じるもので、肺気腫若しくは敗血症、又は外科手術に伴う多臓器不全などの予知マーカーとして有用なものであることが知られていた。
しかしながら、驚くべきことに、本発明者は、急性膵炎又は急性循環不全の患者にエラスターゼ阻害治療薬を投与した後に、ＧＥ−ＸＤＰが病態を反映する指標となることを見出した。特に架橋フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解産物は、生体中での血栓の存在を示唆するものであることは周知であるが、これは凝固線溶系の過剰反応によるものであるのに対し、その存在が循環系への侵襲の程度をも計ることができるという全く新しい知見を得たのである。
【００１３】
本発明のモニタリング方法は、プロテアーゼ阻害治療薬を投与した患者に対して実施する。ここで「患者」は、プロテアーゼ阻害治療薬の投与が行われる疾患を罹病した患者であれば特に限定されないが、例えば、肺気腫、成人呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、術後合併症、多臓器不全、敗血症、凝固異常（ＤＩＣ等）、急性胃粘膜病変、炎症性腸疾患、重症膵炎、急性心筋梗塞、動脈硬化、慢性関節リュウマチ、白血病等、更には急性循環不全のような症候群の患者である。特には、膵炎（特には、重症膵炎）、あるいは急性循環不全の患者である。
【００１４】
本発明方法は、プロテアーゼ阻害治療薬を投与した治療のモニタリングに使用する。ここで、プロテアーゼ阻害治療薬としては、例えば、抗酵素療法に用いる蛋白分解酵素阻害剤（プロテアーゼインヒビター）である。すなわち、炎症の抑制及び炎症から誘発される生体の過剰な防御反応を抑制する目的で使用される蛋白分解酵素阻害剤である。具体的には、アプロチニン、メシル酸ガベキセート、ウリナスタチン、メシル酸ナファモスタット等を挙げることができる。
【００１５】
本発明のモニタリング方法では、指標（マーカー）として、顆粒球由来エラスターゼにより消化・分解された繊維素分解産物（ＧＥ−ＸＤＰ）を利用する。顆粒球エラスターゼは、顆粒球のアズール顆粒（一次顆粒）又は特殊顆粒（二次顆粒）に含まれ、炎症局所に誘導され活性化された顆粒球より放出されるセリンプロテアーゼであって、その生理的な基質である、細胞外マトリックスに含まれるエラスチン、コラーゲン、フィブロネクチン、若しくはプロテオグリカン、又は血漿中タンパク質のフィブリノーゲン、フィブリン、プラスミノーゲン、若しくはアンチトロンビンＩＩＩなどを、主に疎水性アミノ酸であるバリン、アラニン、ロイシン、又はイソロイシンなどのＣ末端側で加水分解する。
【００１６】
本発明のモニタリング方法では、顆粒球由来エラスターゼによる繊維素分解産物、すなわち、フィブリノーゲンやフィブリンの分解産物を利用する。顆粒球由来エラスターゼによる繊維素分解産物としては、具体的には、フィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー、顆粒球エラスターゼ分解フラグメントＸ、顆粒球エラスターゼ分解フラグメントＹ、及び顆粒球エラスターゼ分解フラグメントＥ、並びに安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物を挙げることができる。モニタリングとしては、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー、及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメインを捉える。
【００１７】
本発明のモニタリング方法で指標（マーカー）として好適なＧＥ−ＸＤＰは、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物に共通して存在するＣ末端領域にエピトープを有する抗体と反応するＧＥ−ＸＤＰである。特に、特開２０００−４１６７３号公報に記載されているとおり、前記の顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマーは、少なくとも４種類のポリペプチドの混合物で、アミノ酸残基Ａα１１２より始まるＳｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−、アミノ酸残基Ａα１００より始まるＳｅｒ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−、アミノ酸残基Ａα１０２より始まるＡｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−、及びアミノ酸残基Ａα１０８より始まるＴｙｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−からなり、これらを捉える必要がある。
また、これらの顆粒球エラスターゼ分解ＤモノマーのＣ末端領域には、
Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ
（配列表の配列番号１の配列に記載のアミノ酸配列）で表されるアミノ酸配列が共通して存在し、このアミノ酸配列は、フィブリノーゲンのアミノ酸残基Ａα１９２〜２０４に相当するアミノ酸配列である。従って、本発明のモニタリング方法で指標（マーカー）として好適なＧＥ−ＸＤＰは、フィブリノーゲンの前記アミノ酸残基Ａα１９２〜２０４に相当するアミノ酸配列を有するものが好ましい。
【００１８】
重症の急性膵炎や急性循環不全の患者は、重症スコア、ショックスコアが高レベルを呈する。このとき、血中内のＧＥ−ＸＤＰレベルが高値を示す。これらの患者にプロテアーゼ阻害治療薬の投薬を開始すると、重症スコア、ショックスコアも軽減され、同時にＧＥ−ＸＤＰの血中レベルは低下する。ここで、投薬治療の効果が充分であれば、プロテアーゼ阻害治療薬の投薬を止めても、各スコアとＧＥ−ＸＤＰレベルは低値を維持する。しかしながら、投薬治療の効果が不充分の場合は、プロテアーゼ阻害治療薬の投薬を止めると、各スコアは低値を示したままか、あるいは急激な上昇は示さず、ＧＥ−ＸＤＰレベルのみが再度上昇するケースがある。このような場合は、重篤な状態に陥る危険性が高い。
この傾向は、急性膵炎や急性循環不全の双方とも顕著に表れる。従って、治療のモニタリングとしてＧＥ−ＸＤＰは十分活用することができる。
【００１９】
本発明では、ＧＥ−ＸＤＰを免疫学的に検出することができる。詳細には、ＧＥ−ＸＤＰに特異的な抗体であればポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、特異抗体を用いて、それぞれを検出する。このような抗体は既に公知であり、例えば、フィブリノーゲンのｅ−Ｄモノマーを免疫して得られたポリクローナル抗体より、ｐ−Ｄモノマー、ｐ−Ｄダイマー、及びｐ−ＤＤ／Ｅ複合体、並びにフィブリノーゲンに反応する抗体を除去したポリクローナル抗体（Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，第１０２巻，８５８頁，１９８３年）、顆粒球エラスターゼがフィブリノーゲンに作用した際にフィブリノーゲンのＡα鎖上に新たに生ずるＮ末端部位（Ａα２２〜）に反応するモノクローナル抗体（Ｂｌｏｏｄ　Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，第６巻、２５９頁，１９９５年）、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー、及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメインに特異的に反応するモノクローナル抗体（特開２０００−４１６７３号公報）等が利用できる。
特にＧＥ−ＸＤＰについては正確に検出する必要性があることから、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物と特異的に反応するが、フィブリノーゲン、並びにフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解フラグメントＸ、顆粒球エラスターゼ分解フラグメントＹ、及び顆粒球エラスターゼ分解フラグメントＥと反応しない抗体を用いることが好ましい。
【００２０】
本発明の免疫学的分析方法に用いる被検試料は、ＧＥ−ＸＤＰを含む可能性のある試料であれば特に限定されるものでないが、例えば、生体液試料、特には血液、血漿、血清、又は尿、好ましくは血漿又は血清である。本発明の免疫学的分析方法においては、被検試料中にｐ−ＸＤＰが存在する場合であっても、ＧＥ−ＸＤＰに特異的な抗体を用いることで、それらの影響を受けることなく、ＧＥ−ＸＤＰを検出することができる。
【００２１】
本発明のモニタリング方法では、プロテアーゼ阻害治療薬を投与した患者から生体試料を採取する。本発明のモニタリング方法では、プロテアーゼ阻害治療薬を投与した患者から、定期的に生体試料を採取する。一般的には、プロテアーゼ阻害治療薬を投与した日から採取を開始し、毎日１回ないし数回の採取を続け、モニタリングが必要な期間に亘って継続する。例えば、投与日から１日１回の割合で隔日毎に採取して、モニタリングすることができる。
【００２２】
サンドイッチ法を利用する本発明の免疫学的測定法では、具体的には、前記の抗体それぞれを適当な不溶性担体に固定化する（第１抗体）。次に、不溶性担体と被検試料との非特異的結合を避けるために、適当なブロッキング剤［例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やゼラチン等］で不溶性担体の表面を被覆する。続いて、被検試料を加えて一定時間（例えば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ反応させる（１次反応）。続いて、前記第１抗体とは異なるエピトープに反応する抗体に標識を付した第２抗体を加えて一定時間（例えば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ反応させる（２次反応）。これを適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含む生理食塩水）で洗浄してから、不溶性担体上に存在する標識抗体の量を定量する。その値から、被検試料中のＧＥ−ＸＤＰの量を算出することができる。
【００２３】
前記サンドイッチ法による免疫学的測定法に使用することのできる不溶性担体は特に限定されるものでなく、例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子、その他ニトロセルロース、紙、アガロース、及びこれらの組み合わせ等を例示することができる。
【００２４】
標識物質としては、酵素、蛍光物質、又は発光物質を使用するのが有利である。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等、また、蛍光物質としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート等、また、発光物質としては、例えば、アクリジニウムエステル、ルシフェリン等を使用することができる。
【００２５】
凝集反応を利用する本発明の免疫測定法において、不溶性担体としては、一般に抗原抗体反応の凝集反応を利用する免疫学的分析方法において用いられる任意の不溶性担体を用いることができ、例えば、ラテックス粒子（特には、ポリスチレンラテックス粒子）を挙げることができる。前記抗体を不溶性担体に固定化させるには、公知の方法、例えば、化学結合法（架橋剤としてカルボジイミド、グルタルアルデヒド等を用いる）又は物理吸着法を用いることができる。スライド板を用いる場合には目視的に、又は反応セルを用いる場合には特定の波長を用いて分光学的に凝集反応を測定し、被検試料中のＧＥ−ＸＤＰの量を検出・定量することができる。
【００２６】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《ＧＥ−ＸＤＰモノクローナル抗体の調製》
特開２０００−４１６７３号公報に記載の方法により取得した。詳細には以下の操作によった。
（１）免疫用抗原の調製
アミノ酸配列：
Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ
（配列表の配列番号２の配列に記載のアミノ酸配列）で表されるペプチド（以下、ハプテンペプチドと称する）をアミノ酸合成機により合成した。得られたハプテンペプチドを、以下に示す手順に従って、Ｎ末端のＣｙｓを介して、担体タンパク質であるスカシガイ（Ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン（以下、ＫＬＨと称する）に結合させることにより、ハプテン化した。すなわち、ＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ社）５ｍｇを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）２．５ｍＬに溶解し、次いで、ジメチルホルムアミドに溶解した架橋剤スクシニミジル６−（Ｎ−マレイミド）−ｎ−ヘキサノエート［ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ６−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏ）−ｎ−ｈｅｘａｎｏａｔｅ，以下、ＭＨＳと称する］（濃度１００ｍｇ／ｍＬ，同仁化学）０．１ｍＬを添加した。撹拌しながら、２５℃で３０分間反応させた後に、２．５ｍＭ−ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（直径１．６ｃｍ×長さ１０．０ｃｍ，ファルマシア・バイオテク）に充填し、ゲル濾過法にて未反応のＭＨＳを除去した。
【００２７】
続いて、ＭＨＳを付加したＫＬＨ５ｍｇに対して、ハプテンペプチド５ｍｇ［２．５ｍＭ−ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）２．５ｍＬに予め溶解したもの］を添加した。撹拌しながら、２５℃で３時間反応させた後に、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ含有１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に対して充分に透析し、未反応のハプテンペプチドを除去した。このようにして調製したハプテンペプチド−ＫＬＨコンジュゲートを抗体作製のための免疫用抗原として使用した。
【００２８】
（２）ハイブリドーマの調製
（ａ）免疫化した脾臓細胞の調製
上記（１）で得られたハプテンペプチド−ＫＬＨコンジュゲート免疫抗原溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ）を、等量のフロインド氏完全アジュバンドと乳化するまで混和し、その混合液０．１ｍＬをマウス腹腔内に投与することにより免疫を行った（第１回免疫）。２１日経過した後に、そのマウスに前記と同様の方法で調製した混合液０．１ｍＬを腹腔内に投与した（第２回免疫）。第２回免疫から２１日経過した後に、ハプテンペプチド−ＫＬＨコンジュゲート溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ）を等量の生理的食塩水で希釈し、その希釈液０．１ｍＬを、マウスの静脈内に投与した（最終免疫）。最終免疫から３日経過した後に、マウスから脾臓を無菌的に摘出し、以下の工程に使用した。
【００２９】
（ｂ）細胞融合
無菌的に摘出した前記の脾臓を、１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地５ｍＬを入れたシャーレーに入れた。次に、脾臓を１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地約１５ｍＬで還流して脾細胞を流出させた後、この脾細胞懸濁液をナイロンメッシュに通した。この脾細胞を５０ｍＬ遠心チューブに集めて５００×ｇで１０分間遠心した。こうして得たペレットにヘモライジング溶液（１５５ｍＭ−ＮＨ４Ｃｌ，１０ｍＭ−ＫＨＣＯ３，及び１ｍＭ−Ｎａ２ＥＤＴＡ；ｐＨ７．０）５ｍＬを加え、懸濁させた。０℃で５分間放置すると、懸濁液中の赤血球が破壊された。１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地１５ｍＬを加えてから遠心分離した。このようにして得た細胞ペレットをＤＭＥ培地で遠心法によって洗浄し、生きている脾細胞数を測定した。
【００３０】
一方、予め培養しておいたマウス骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）ＳＰ２／０−Ａｇ１４（約２×１０７個）に前記脾臓細胞（１×１０８個）を加え、ＤＭＥ培地中でよく混合し、遠心分離を行った（５００×ｇ，１０分間）。その上清を吸引し、ペレットをよく解きほぐし、３８℃に保温しておいた４０％ポリエチレングリコール４０００溶液０．５ｍＬを滴下し、遠心チューブを手で、１分間穏やかに回転することによってポリエチレングリコール溶液と細胞ペレットとを混合させた。次に、３８℃に保温しておいたＤＭＥ培地を３０秒毎に１ｍＬずつ加えてチューブを穏やかに回転させた。この操作を１０回繰り返した後、１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地２０ｍＬを加えて、遠心分離（５００×ｇ，１０分間）を行った、上清を除去した後、細胞ペレットを１５％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭＥ培地にアミノプテリン４×１０−７Ｍ、チミジン１．６×１０−５Ｍ、及びヒポキサンチン１×１０−４Ｍになるように添加したもの）で、遠心法によって２回洗浄した後、前記ＨＡＴ培地４０ｍＬに懸濁した。
【００３１】
この細胞懸濁液を９６ウェル細胞培養プレートの各ウェルに２００μＬずつ分注し、５％炭酸ガスを含む３７℃の炭酸ガス培養器で培養を開始した。培養中、２〜３日間隔で各ウェルの培地約１００μＬを除き、新たに前記のＨＡＴ培地１００μＬを加えることによりＨＡＴ培地中で増殖するハイブリドーマを選択した。８日目頃から１５％ウシ胎児血清を含むＨＴ培地（ＤＭＥ培地にチミジン１．６×１０−５Ｍ及びヒポキサンチン１×１０−４Ｍになるように添加したもの）に交換し、ハイブリドーマの増殖を観察するとともに、約１０日目に、ＥＬＩＳＡ法により、ＧＥ−ＸＤＰに特異的なモノクローナル抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングし、限界希釈法によりクローニングした。これらのクローンの中から、増殖性が良好で、抗体分泌能が高く、しかも安定なクローンを選んだ。
【００３２】
（３）モノクローナル抗体の製造
（ａ）上記で選択したマウスハイブリドーマを、１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地で３７℃にて５％二酸化炭素雰囲気中において７２〜９６時間培養した。培養物を遠心分離（１０，０００×ｇ，１０分間）した後、上清に固形の硫酸アンモニウムを５０％最終濃度となるように徐々に加えた。混合物を氷冷下で３０分間攪拌した後、６０分間放置し、遠心分離（１０，０００×ｇ，１０分）した。得られた沈渣を少量の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、１０００倍量の１０ｍＭリン酸緩衝液に対して透析した。透析物を、１０ｍＭリン酸緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥ−セルロースのカラムに充填した。モノクローナル抗体の溶出は、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）と０．２Ｍ−ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）との間で濃度勾配法により行った。溶出されたモノクローナル抗体を限外濾過法で濃縮し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析した。ウシ血清ＩｇＧを除くために、透析物をヤギ抗ウシ血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂのカラムに通した。次に通過液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したプロテインＡ−セファロース４Ｂのカラムに充填した。カラムをｐＨ３．５の緩衝液で溶出して、精製した抗ＧＥ−ＸＤＰモノクローナル抗体を得た。得られた抗ＧＥ−ＸＤＰモノクローナル抗体は、顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー（ｅ−Ｄモノマー）、ヒト安定化フィブリンのｅ−Ｄダイマー、及びヒト安定化フィブリンのｅ−ＤＤ／Ｅ複合体に特異的に反応した。
【００３３】
【実施例２】
《抗ＧＥ−ＸＤＰモノクローナル抗体結合ラテックスの調製》
実施例１のモノクローナル抗体（２．０ｍｇ／ｍＬ）を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２ｍＬと、ラテックス溶液（２％ポリスチレンラテックス，日本合成ゴム，粒径０．３１０μｍ）２ｍＬとを混合し、マグネチックスターラーにて２時間撹拌し、抗体をラテックス粒子上に固定化した。遠心分離（２０，０００×ｇ，２０分間）した後、沈殿を、０．１％ＢＳＡを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、１時間撹拌した。遠心分離（２０，０００×ｇ，２０分間）を繰り返すことにより、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で沈殿を３回洗浄した後、沈殿を、０．０５％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁させ（１重量／容量％）、抗ＧＥ−ＸＤＰモノクローナル抗体結合ラテックス含有液を得た。前記モノクローナル抗体結合ラテックス含有液は、使用するまで４℃で保存した。
【００３４】
【実施例３】
《患者生体液試料中のＧＥ−ＸＤＰの検出》
（１）測定操作
実施例２で得られた抗ＧＥ−ＸＤＰモノクローナル抗体結合ラテックス含有液と、患者由来の生体液試料（血漿）とを混合し、全自動免疫血清検査システム（三菱化学株式会社製ＬＰＩＡ−２００）を用いて、凝集の反応速度を測定することにより、定量を実施した。
【００３５】
（２）急性循環不全患者の回復例
急性循環不全（熱傷）患者にウリナスタチン製剤（持田製薬）を投与し、熱傷例の予後が順調に回復した１０症例について、その投薬治療期間における生体試料（３．８％クエン酸血漿）中のＧＥ−ＸＤＰの変動度（測定値を正常基準値で除した値）及びショックスコアについて平均値を求めた。急性循環不全のショックの診断についてはショックスコアに基づいて行った。結果を図１に示す。
図１に示すとおり、熱傷発症日（０日）においてはショックスコアは６となり、抗酵素阻害薬の投薬が開始された。投薬に従い、ショックスコアが低下してゆき、それに伴い、ＧＥ−ＸＤＰも低下している。ショックスコア及びＧＥ−ＸＤＰの低下とともに患者の臨床状態も正常に回復した。
【００３６】
（３）急性循環不全患者の予後不良例
急性循環不全（熱傷）患者にウリナスタチン製剤（持田製薬）を投与し、熱傷例の予後が不良の１０症例について、前述（２）の回復例と同様に投薬治療期間における３．８％クエン酸血漿中のＧＥ−ＸＤＰの変動度及びショックスコアについて平均値を求めた。診断基準は前述（２）と同様に行った。その結果を図２に示す。
熱傷発症日（０日）からショックスコアが８と高く、ショックスコアが低下するまで抗酵素阻害薬を投与した。その結果、ショクスコアは６日目において２まで低下したが、投薬期間の前半まで低値であったＧＥＸＤＰの変動度が後半に亘って上昇してきた。これらの予後不良症例中には死亡例も含まれている。
【００３７】
（４）急性膵炎の軽症例
急性膵炎の軽症例（１０例）についてウリナスタチン製剤（持田製薬）の投薬治療期間における生体試料（３．８％クエン酸血漿）中のＧＥ−ＸＤＰの変動度及び重症度スコアについて平均値を求めた。急性膵炎の重症度については厚生労働省の重症度判定基準に基づいて判定を行った。結果を図３に示す。
急性膵炎発症日（０日）においては重症度スコアは３であり、投薬開始によりスコアは１まで低下した。スコア及びＧＥ−ＸＤＰの変動度の低下に従い、膵炎も治まり患者の臨床状態も正常に回復した。
【００３８】
（５）急性膵炎の重症例
急性膵炎の重症例（１０例）についてウリナスタチン製剤（持田製薬）の投薬治療期間における３．８％クエン酸血漿中のＧＥ−ＸＤＰの変動度及び重症度スコアについて平均値を求めた。診断基準は前述（４）と同様に行った。結果を図４に示す。
急性膵炎発症日（０日）に高値を示したＧＥ−ＸＤＰの変動度も投薬に従い、一度は低下傾向を示したが６日目より上昇し始めた。重症度スコアにおいても、１０日目に高値を示し始め、１４日目においては６と高値示していた。患者の臨床状態も重篤な症例が多く死亡例もあり、膵炎を回復した例でも長時間を要している。
【００３９】
【発明の効果】
本発明によれば、急性膵炎、急性循環不全治療において抗酵素薬剤投薬の効果、投薬の時期等を正確に確認することができる。特に急性膵炎から重症化へ進行する過程を正確に把握できるため、より適切な治療を施すことができるようになるという、格別なる効果を有するものである。
【００４０】
【配列表フリーテキスト】
配列表の配列番号２の配列に記載のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１の配列に記載のアミノ酸配列におけるＮ末端のＡｓｐをＣｙｓに置換したアミノ酸配列である。
【００４１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】急性循環不全患者の回復例におけるＧＥ−ＸＤＰの変動度及びショックスコアの変化を示すグラフである。
【図２】急性循環不全患者の予後不良例におけるＧＥ−ＸＤＰの変動度及びショックスコアの変化を示すグラフである。
【図３】急性膵炎の軽症例におけるＧＥ−ＸＤＰの変動度及びショックスコアの変化を示すグラフである。
【図４】急性膵炎の重症例におけるＧＥ−ＸＤＰの変動度及びショックスコアの変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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