(57)【要約】【課題】特に血液浄化用カラムに用いられる材料として有用な、タンパク質もしくは有用物質の吸着を抑制することが出来る材料を提供する。【解決手段】陽性荷電をもつ官能基量にして２．０mmol/g以上１０．０ｍｍｏｌ／ｇ以下のカチオン性物質が基材に固定化されていることを特徴とするタンパク吸着抑制材料。さらには、カチオン性物質の分子量が６００以上であることを特徴とする前記のタンパク吸着抑制材料。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
陽性荷電をもつ官能基量にして２．０ｍｍｏｌ／ｇ以上１０．０ｍｍｏｌ／ｇ以下のカチオン性物質が基材に固定化されていることを特徴とするタンパク吸着抑制材料。
【請求項２】
カチオン性物質の分子量が６００以上であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク吸着抑制材料。
【請求項３】
カチオン性物質がアミノ基を有する物質であることを特徴とする請求項１または２に記載のタンパク吸着抑制材料。
【請求項４】
アミノ基を介して、生理活性物質が固定化されることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク吸着抑制材料。
【請求項５】
生理活性物質がタンパク質であることを特徴とする請求項４に記載のタンパク吸着抑制材料。
【請求項６】
タンパク質が抗体であることを特徴とする請求項５に記載のタンパク吸着抑制材料。
【請求項７】
アミノ基を有する物質がポリエチレンイミンまたはその誘導体であることを特徴とする請求項３に記載のタンパク吸着抑制材料。
【請求項８】
基材が繊維であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のタンパク吸着抑制材料。
【請求項９】
繊維が海島型繊維であることを特徴とする請求項８に記載のタンパク吸着抑制材料。
【請求項１０】
基材形状が編地、織物、不織布のいずれかであることを特徴とする請求項８または９に記載のタンパク吸着抑制材料。
【請求項１１】
基材の素材がポリスチレン、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ナイロン及びそれらの誘導体からなる群より１つ以上選ばれた物質からなることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載のタンパク吸着抑制材料。
【請求項１２】
体外循環に用いられることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載のタンパク吸着抑制材料を用いたカラム。
【請求項１３】
細胞分離あるいは細胞濃縮あるいは血液浄化のいずれかに用いられることを特徴とする請求項１２に記載のタンパク吸着抑制材料を用いたカラム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク吸着抑制材料、特に液体又は血液中に存在するタンパク質もしくは有用物質が吸着するのを抑制した材料及びそれを用いたカラムに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
血液浄化用カラムに用いられる材料、特に疎水性素材からなる材料においては、血栓形成の原因となる物質や除去対象ではない有用物質の吸着を抑制する必要がある。そのために、非イオン性の親水性高分子をグラフトするなどして、血液中のタンパク質などの吸着を抑制した材料の開発が種々試みられてきた（例えば、特許文献１、２参照）。しかし、材料に固定された非イオン性の親水性高分子を利用してさらに生理活性物質などを固定化したような機能を修飾することができていない。
【０００３】
また、抗体などのタンパク固定化材料を用いて細胞などの有用物質を捕捉し、還元などの外部刺激により該有用物質を回収する際には、材料から脱離したタンパクが材料に再吸着し、有用物質を回収できなくなる恐れがあるため、このような場合にも吸着の抑制が必要となる。
【０００４】
【特許文献１】
特開２０００−２３７５５７号公報
【０００５】
【特許文献２】
特開平６−２１２０７８号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明では上記の従来技術の欠点を解消するものであり、タンパク質もしくは有用物質の吸着を抑制することが出来る材料を提供することを目的としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明は下記構成を有する。
（１）陽性荷電をもつ官能基量にして２．０ｍｍｏｌ／ｇ以上１０．０ｍｍｏｌ／ｇ以下のカチオン性物質が基材に固定化されていることを特徴とするタンパク吸着抑制材料。
（２）カチオン性物質の分子量が６００以上であることを特徴とする（１）に記載のタンパク吸着抑制材料。
（３）カチオン性物質がアミノ基を有する物質であることを特徴とする（１）または（２）に記載のタンパク吸着抑制材料。
（４）アミノ基を介して、生理活性物質が固定化されることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載のタンパク吸着抑制材料。
（５）生理活性物質がタンパク質であることを特徴とする（４）に記載のタンパク吸着抑制材料。
（６）タンパク質が抗体であることを特徴とする（５）に記載のタンパク吸着抑制材料。
（７）アミノ基を有する物質がポリエチレンイミンまたはその誘導体であることを特徴とする（３）に記載のタンパク吸着抑制材料。
（８）基材が繊維であることを特徴とする（１）〜（７）のいずれかに記載のタンパク吸着抑制材料。
（９）繊維が海島型繊維であることを特徴とする（８）に記載のタンパク吸着抑制材料。
（１０）基材形状が編地、織物、不織布のいずれかであることを特徴とする（８）または（９）に記載のタンパク吸着抑制材料。
（１１）基材の素材がポリスチレン、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ナイロン及びそれらの誘導体からなる群より１つ以上選ばれた物質からなることを特徴とする（１）〜（１０）のいずれかに記載のタンパク吸着抑制材料。
（１２）体外循環に用いられることを特徴とする（１）〜（１１）のいずれかに記載のタンパク吸着抑制材料を用いたカラム。
（１３）細胞分離あるいは細胞濃縮あるいは血液浄化のいずれかに用いられることを特徴とする（１２）に記載のタンパク吸着抑制材料を用いたカラム。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は、陽性荷電をもつ官能基量にして２．０ｍｍｏｌ／ｇ以上１０．０ｍｏｌ／ｇ以下のカチオン性物質が基材に固定化されていることを特徴とするタンパク吸着抑制材料である。
【０００９】
本発明で用いられるカチオン性物質は、カチオン性を有する物質（陽性荷電をもつ官能基を有する物質）であれば特に限定されないが、なかでも窒素原子を含有する物質、すなわち１級、２級、３級アミノ基、４級アンモニウム塩のいずれか１種以上を有するアミノ基含有物、イミノ基含有物、アミド基含有物などが好ましく用いられる。
【００１０】
本発明で用いられるカチオン性物質については、タンパク非吸着性における効果から、分子量６００以上のものポリマーが好ましく用いられる。中でもアミノ基を含有するポリマーが入手しやすく、好適に用いられる。
【００１１】
アミノ基含有ポリマーの例としては、ポリアルキレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ジアルキルアミノアルキルデキストラン、キトサン、ポリオルニチン、ポリリジンおよびそれらに置換基の導入されたもの、およびこれらを構成するモノマー単位からなる共重合体、またはノニオン、アニオン性化合物との共重合体などが挙げられる。ここで、該ポリマーは直鎖状、分岐状、環状のいずれであってもよい。また、分子量は好ましくは６００以上１０００万以下である。より好ましくは１０００以上１０万以下が望ましい。
【００１２】
アミノ基含有ポリマーの中でも毒性の低さ、入手のしやすさ、取り扱いのしやすさなどから、分岐状のポリエチレンイミンやジエチルアミノエチルデキストランが特に好適に用いられる。
【００１３】
ポリエチレンイミンには、分子量６００以上１０００万以下の直鎖状、分岐状のものが好ましく用いられる。また、ポリエチレンイミン誘導体としては、ポリエチレンイミンをアルキル化、カルボキシル化、フェニル化、リン酸化、スルホン化など、所望の割合で誘導体化したものが挙げられる。
【００１４】
本発明に用いられる基材は特に限定しないが、耐薬品性や耐熱性、耐放射線性あるいは安価であることを考えると、有機高分子化合物が好ましい。例えば、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリウレタン、ナイロンおよびそれらの誘導体が挙げられる。体外循環カラムとして用いる場合には、上記有機高分子化合物を、繊維、中空繊維、ネット、編地、織物、カットファイバー、不織布等にしたものが好ましく用いられるが、表面積が大きくかつ血液を流した場合にも詰まることなく、流路抵抗の低いことを考慮すると、繊維、中空繊維、編地、織物、不織布がより好ましく用いられる。
【００１５】
海島型複合繊維は、強度の弱い材料を用いる場合でも、芯材（島部分）に強度をもった材料を用いることによりある程度の強度を付与することができるため、基材として利用することができる。例えば、ポリスチレンのような材料にリガンドを固定化する場合は、芯材にポリプロピレンやポリエチレンを用いて補強することにより、基材として利用することができる。
【００１６】
本発明において、基材にカチオン性物質を固定化する方法として、基材表面にカチオン性物質と反応する活性基を導入し、それに続いてカチオン性物質を含有する溶液に浸漬または付着させて導入する方法を挙げることができる。また、繊維を編地状や不織布に加工した後に活性基を導入し、カチオン性物質を含有する溶液に浸漬または付着させ固定化することも可能である。さらに、ナイロンのようなポリアミド系の材料であれば、アミノ基含有物と加熱して、アミド交換反応により該アミノ基含有物を固定化することが出来る。また、アミノ基を有するビニルモノマーやポリマーとともに材料を光または放射線によりグラフトすることもできる。
【００１７】
本発明において、基材へのカチオン性物質の固定化量は陽性荷電をもつ官能基量にして２．０ｍｍｏｌ／ｇ以上であることが必要である。カチオン性物質の固定化量が陽性荷電をもつ官能基量にして２．０ｍｍｏｌ／ｇ以上であると医療用材、特に血液浄化用カラムとして用いる場合に問題ない程度にまでタンパクの吸着が抑制される。カチオン性物質の固定化量が２．０ｍｍｏｌ／ｇ未満であると、基材へのタンパク吸着が増加してしまい、医療用材、特に血液浄化用カラムとして用いる場合に必要な程度に吸着抑制が出来ない。また、カチオン性物質の固定化量が多すぎると、材料自身が大きく陽性荷電を帯びることにより、生体物質、特に細胞への悪影響や材料の変性などが懸念されるため、陽性荷電をもつ官能基量にして１０．０ｍｍｏｌ／ｇ以下であることが望ましい。
【００１８】
ここで吸着が抑制されるとは、基材１ｇあたりのタンパク吸着量が０．５ｍｇ未満である状態のことをいう。基材１ｇあたりのタンパク吸着量が０．５ｍｇ以上になると、血液中の有用物質の損失が大きくなり、また外部刺激により材料からタンパクを脱離させる場合、タンパクが固定化材料から脱離出来なくなる。
【００１９】
基材へのタンパクの吸着量は、所定の濃度のタンパクの溶液に基材を３０分以上浸漬させ、基材を浸漬した前後のタンパク溶液の濃度を親水性シリカの充填された東ソー製、ＴＳＫ−ＧＥＬ  ＳＷシリーズなどの生体高分子用カラムなどを利用して、ｐＨの安定した緩衝液を溶離液として、高速液体クロマトグラフィーで測定することにより測定することが出来る。
【００２０】
陽性荷電をもつ官能基量については、固定化するカチオン性物質の種類とその基材への固定化量により算出される。
【００２１】
基材へのカチオン性物質の固定化量は、反応前後の重量を測定し、重量増加分から固定化量を求めたり、分子内にカルボン酸やスルホン酸をもつアシッドオレンジ７などの酸性染料を用いて染色し、その染色量から求めたり、基材を希塩酸に浸漬して、希塩酸中のＨＣｌを基材に結合させ、基材を取り出し、消費されたＨＣｌを水酸化ナトリウム水溶液で中和滴定することによって求めたりすることが出来る。
【００２２】
本発明の材料、すなわちカチオン性物質、特にアミノ基含有物が固定化された材料によると、アミノ基を利用して種々のリガンドを固定化して、血液浄化カラムや細胞分離カラムに利用することが出来る。
【００２３】
細胞分離カラムに用いる場合は、リガンドで捕捉した細胞を回収するために、外部刺激によりリガンドと材料間の結合を切断して、細胞が捕捉されたリガンドが脱離されることが好ましい。化学反応を利用して結合が切断される反応としては、加水分解反応、酸化反応、還元反応、酵素反応などが挙げられるが、水中での安定性や細胞のバイアビリティ維持が必要であることから還元反応が好ましい。特に、ジスルフィド結合を還元剤による還元反応により切断させる反応は、タンパク質のリフォールディングなど生体内で良く行われる反応であり、リガンドを脱離する反応として好適に用いられうる。このような還元反応をおこす還元剤としてジチオスレイトール、メルカプトエタノール、システイン、還元型グルタチオンなどがあげられるが、これらに限定されない。
【００２４】
本発明の材料によって吸着を抑制できるタンパク質は種々挙げられる。例えば、血栓の形成を引き起こすタンパク質として、フィブリノーゲン、コラーゲン、フォン・ウィル・ブラインド因子、フィブロネクチン、血小板由来成長因子などが挙げられる。アルブミンや抗体などは、除去すべきでないことが多い。材料に抗体を固定化して、細胞分離用途に用いる場合、回収する際に外部刺激により脱離された抗体は再吸着されないようにされなければならない。
【００２５】
本発明のカラムの形態は積層型、スパイラル型、プリーツ型、管状型、プレートアンドプレート型などが挙げられ、例えば、円柱型のモジュール内径と同径の円形に打ち抜いた編み地または不織布を積層し、両端部に細胞群を流せる開口部を作製したり、片側に細胞群を流せる入り口を有し、側方に細胞群の出口となる開口部を有する筒に編み地または不織布を巻き付けたものをモジュールに組み込んで、モジュールにヘッダーを取り付けてカラムを作製する。
【００２６】
本発明で得られる材料を用いたカラムは、人工腎臓や血液吸着材などに利用される。また、外部刺激により脱離できる抗体などのリガンドを固定化した材料を用いたカラムは、細胞分離。濃縮用途または細胞活性化などに利用される。
【００２７】
本発明の基材を用いた体外循環カラム材料の製造方法をポリスチレン繊維にポリエチレンイミンを固定化する場合を例に以下説明する。
【００２８】
【実施例】
以下に実施例を用いて詳細に説明を加えるが、発明の内容は実施例に限定されるものではない。
【００２９】
なお、実施例におけるカチオン物質の固定化量およびタンパク質の濃度はそれぞれ、以下の中和滴定、高速液体クロマトグラフィーによって求めた。
【００３０】
（中和滴定）
純水でよく洗浄した材料０．５ｇを、０．１Ｎの希塩酸２０ｍｌに一晩浸漬した後、１０ｍｌを取り出し、その１０ｍｌについて０．１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液でフェノールフタレインを指示薬として滴定した。
【００３１】
（高速液体クロマトグラフィー）
測定条件は次の通り。溶離液：０．５Ｍ  酢酸緩衝液、ｐＨ４．５、カラム：東ソー製  Ｇ３０００ＳＷＸＬ、装置：東ソー社、ＨＰＬＣシステム、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ。
【００３２】
作製例１．クロロアセトアミドメチル化架橋ポリスチレン編地１の作製
５０重量比の海成分（４６重量比のポリスチレンと４重量比のポリプロピレンの混合物）と５０重量比の島成分（ポリプロピレン）とからなる海島型複合繊維（厚さ：２．６デニール、島の数１６）を、３５ｇのＮ−メチロール−α−クロロアセトアミド、２３２．５ｇのニトロベンゼン、２３２．５ｇの９８％硫酸、０．５ｇのパラホルムアルデヒドの混合液を１０℃で２時間反応させた。繊維をニトロベンゼンで洗浄し、メタノールで反応を停止させた。これによりクロロアセトアミドメチル化架橋ポリスチレン繊維（以下ＡＭＰＳｔ繊維と略す）を得た。得られたＡＭＰＳｔ繊維を編地とした（以下ＡＭＰＳｔ編地１と略す）。
【００３３】
作製例２．クロロアセトアミドメチル化架橋ポリスチレン編地２の作製
ポリエチレンイミン（分子量１万、和光純薬製）１０．０ｇを、トリエチルアミン０．９５ｇ、ジメチルスルホキシド３９．０ｇに溶解し、この溶液に作製例１で作製したＡＭＰＳｔ編地１を１．０ｇ加え攪拌した。反応は３０℃で３時間行った。その後ジメチルスルホキシド、メタノール、純水で洗浄し、アミノ基を含有するＡＭＰＳｔ編地２を得た。滴定によりアミノ基の導入量を求めたところ、３．０ｍｍｏｌ／ｇ導入されていた。
【００３４】
作製例３．クロロアセトアミドメチル化架橋ポリスチレン編地３の作製
ポリエチレンイミン（分子量１万、和光純薬製）２．０ｇを、トリエチルアミン０．９５ｇ、ジメチルスルホキシド４７．０ｇに溶解し、この溶液に作製例１で作製したＡＭＰＳｔ編地１を１．０ｇ加え攪拌した。反応は３０℃で３時間行った。その後ジメチルスルホキシド、メタノール、純水で洗浄し、アミノ基を含有するＡＭＰＳｔ編地３を得た。滴定によりアミノ基の導入量を求めたところ、２．０ｍｍｏｌ／ｇ導入されていた。
【００３５】
作製例４．クロロアセトアミドメチル化架橋ポリスチレン編地４の作製
ポリエチレンイミン（分子量１万、和光純薬製）０．５ｇを、トリエチルアミン０．９５ｇ、ジメチルスルホキシド４８．５ｇに溶解し、この溶液に作製例１で作製したＡＭＰＳｔ編地１を１．０ｇ（クロロ含量２．６ｍｍｏｌ相当）加え攪拌した。反応は３０℃で３時間行った。その後ジメチルスルホキシド、メタノール、純水で洗浄し、アミノ基を含有するＡＭＰＳｔ編地４を得た。滴定によりアミノ基の導入量を求めたところ、１．５ｍｍｏｌ／ｇ導入されていた。
【００３６】
（実施例１〜２、比較例１〜２）
作製例１〜４で得られた編地１〜４について０．０５ｇをリン酸緩衝液（ニッスイ製、”ダルベッコ”）に０．１ｍｇ／ｍｌに溶解した精製ヒト免疫グロブリンＧ（シグマ社製、以下、ＩｇＧと略す）１ｍｌに浸漬し２時間、室温で吸着させ、吸着前後での濃度の変化を高速液体クロマトグラフィーで調べたところ、編地２では、ＩｇＧは全く吸着されず（実施例１）、編地３では０．４ｍｇしか吸着しなかった（実施例２）。一方、編地１では抗体がすべて吸着され（比較例１）、編地４では、ＩｇＧの１．２ｍｇが吸着された（比較例２）。
【００３７】
作製例５．還元により脱離できる抗体を有するポリスチレン編地５および６の作製
０．０５ｇの上記のＡＭＰＳｔ編地１およびＡＭＰＳｔ編地２を、それぞれＮａＣｌを０．１５ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ピアース社製、以下ＳＰＤＰ）を２７ｍＭに溶解したジメチルスルホキシド溶液１ｍｌに０．５時間浸漬した（室温）。反応させた編地を上記のリン酸緩衝液で洗浄した後、１００ｍＭのジチオスレイトールを含む上記のリン酸緩衝液で還元し、その後１００ｍｌの上記のリン酸緩衝液で洗浄し、表面にメルカプト基を有するポリスチレン編地を得た。
【００３８】
さらに０．１５ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に１．１ｍｇ／ｍｌとなるように抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体（シグマ社）を溶解した溶液に、ジメチルスルホキシドに溶解した２７ｍＭのＳＰＤＰを抗体１モルに対してＳＰＤＰが１０モルになるように添加し、室温で３０分反応させた。その後、ＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）でゲル濾過し高分子量分画のみを分画してＳＰＤＰ化抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体を精製した。
【００３９】
上記で作製したメルカプト基が導入されたＡＭＰＳｔ編地をＳＰＤＰ化抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に室温で１８時間浸漬し、基材のメルカプト基と抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体のＳＰＤＰ基をジスルフィド交換反応させて、抗体をＡＭＰＳｔ編地上にジスルフィド結合を介して固定化した編地（抗体固定化編地５および６）を作製した。
【００４０】
（実施例３、比較例３）
抗体固定化編地５および６それぞれ０．０５ｇを、１ｍＭのジチオスレイトールを含む上記のリン酸緩衝液に室温で３０分間浸漬し、還元液中に脱離したＣＤ４抗体の量を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、抗体固定化編地５では抗体が脱離されなかった（比較例３）が、抗体固定化編地６からは１０μｇの抗体が脱離された（実施例３）。
【００４１】
【発明の効果】
本発明により、液体および血液中のタンパク質もしくは有用物質の吸着を抑制された材料を提供することが可能である。