(57)【要約】【課題】正確で安定した分光測定を可能にしたレーザ走査型顕微鏡を提供する。【解決手段】標本８からの光を平面回折格子２１により波長ごとに分光し、これら分光された光のうち、所望する光の波長中心を平面回折格子２１を回転させることで選択するとともに、この選択された波長中心の光の強度を光電変換素子２６で検出するようになっていて、平面回折格子２１の回転角度からエンコーダ２３を介して制御部２８により、選択された光の波長中心を検出するとともに、この検出された光の波長中心に基づいて補正値を求め、この補正値により光電変換素子２６より出力される検出信号を補正する。【選択図】    図１
2004212600.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光源からの光を走査手段と対物レンズを介して標本に照射して得られる光を検出するレーザ走査型顕微鏡において、
前記標本から得られる光をスペクトル分解する分散素子と、
前記分散素子により生成されたスペクトル列から所望の波長範囲を選択する手段と、
前記波長範囲を選択する手段より選択された波長範囲を検出する光検出器とを備え、
前記波長範囲を選択する手段は、前記光検出器で検出する光の波長中心を調整する波長中心選択手段と、前記光検出器で検出する光の波長幅を調整する波長幅選択手段とを個別に有することを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２】
レーザ走査は、ポイントスキャン型であることを特徴とする請求項１記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項３】
ピンホールまたはスリットが多数形成されたディスクを用いてレーザ走査を行うことをことを特徴とする請求項１記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項４】
前記波長幅選択手段は、前記光検出器で検出する光の波長幅を調整する可変開口であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項５】
前記波長中心選択手段は、前記分散素子を回転させる手段であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項６】
前記分散素子は、反射グレーティングであることを特徴とする請求項５記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項７】
前記反射グレーティングは、平面回折格子または凹面回折格子であることを特徴とする請求項６記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項８】
前記反射グレーティングの角度を検出する手段と、
前記光検出器から得た出力値を前記反射グレーティングの角度に基づいて補正する補正手段とを備えたことを特徴とする請求項６または７記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項９】
前記分散素子から出射した光を前記光検出器に向けて偏向させる反射部材をさらに備え、前記波長幅選択手段は、前記反射部材を回転させる手段であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１０】
前記分散素子は、プリズムであることを特徴とする請求項９記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１１】
前記反射部材の角度を検出する手段と、
前記波長幅選択手段における単位波長幅あたりの開度を前記反射部材の角度に基づいて補正する補正手段とを備えたことを特徴とする請求項１０記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１２】
前記分散素子は、透過型直視分散素子であることを特徴とする請求項９記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１３】
前記分散素子は、グリズムであることを特徴とする請求項１２記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１４】
前記反射部材の角度を検出する手段と、
前記光検出器から得られた出力値を前記反射部材の角度に基づいて補正する補正手段とを備えたことを特徴とする請求項１３記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１５】
前記分散素子は、プリズムグレーティングプリズムであることを特徴とする請求項９記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１６】
前記標本から得られる光を所定の波長で分割する波長分割手段を、前記分散素子の手前側に配置したことを特徴とする請求項１乃至１５のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１７】
前記標本から得られる光を偏光方向に応じて分割する偏光分割手段を、前記分散素子の手前側に配置したことを特徴とする請求項１乃至１５のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１８】
前記標本から得られる光を所定の波長で分割する波長分割手段と、前記標本から得られる光を偏光方向に応じて分割する偏光分割手段と、前記波長分割手段及び前記偏光分割手段の一方を光路中に切換え挿入する切換え機構とを備えることを特徴とする請求項１乃至１５のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば、蛍光色素や蛍光タンパクで識別された試料に励起光を照射して、試料からの蛍光を検出するレーザ走査型顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、この種の共焦点顕微鏡として、試料から取得した光についてスペクトルごとの輝度をとって、波長ごとのスペクトルデータを検出するようにしたものが知られている。
【０００３】
このような光のスペクトルデータを検出する方法として、特許文献１に開示されるように、蛍光物体から放射される蛍光光をミラーを介して光のスペクトル分解のためのプリズムに入射する。そして、ミラーを回転させてプリズムに入射する光の角度を変化させて、プリズムによりスペクトル分解された光線と検出器の間の相対的位置を変化させることにより、スペクトル分解された波長ごとの光を検出するようにしたものがある。
【０００４】
【特許文献１】
特開２００２−１２２７８７号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、特許文献１に開示されるように、光のスペクトル分解のためのプリズムを用いた場合、プリズムの分散の波長依存性により、図１１に示す波長と分光の振れ角度の関係で表わされる分光特性は、波長が長くなるほど振れが鈍くなる非線型を呈するようになる。このため、プリズムによりスペクトル分解された光線と検出器の間の相対的位置を単純に変化させただけでは、波長の変化に伴う分光の振れ角度の変化に対応することが難しく、正確な分光測定ができないという問題を生じる。
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、正確で安定した分光測定を行うことができるレーザ走査型顕微鏡を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、レーザ光源からの光を走査手段と対物レンズを介して標本に照射して得られる光を検出するレーザ走査型顕微鏡において、前記標本から得られる光をスペクトル分解する分散素子と、前記分散素子により生成されたスペクトル列から所望の波長範囲を選択する手段と、前記波長範囲を選択する手段より選択された波長範囲を検出する光検出器とを備え、前記波長範囲を選択する手段は、前記光検出器で検出する光の波長中心を調整する波長中心選択手段と、前記光検出器で検出する光の波長幅を調整する波長幅選択手段とを個別に有することを特徴としている。
【０００８】
請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、レーザ走査は、ポイントスキャン型であることを特徴としている。
【０００９】
請求項３記載の発明は、請求項１記載の発明において、ピンホールまたはスリットが多数形成されたディスクを用いてレーザ走査を行うことをことを特徴としている。
【００１０】
請求項４記載の発明は、請求項１乃至３のいずれかに記載の発明において、前記波長幅選択手段は、前記光検出器で検出する光の波長幅を調整する可変開口であることを特徴としている。
【００１１】
請求項５記載の発明は、請求項１乃至４のいずれかに記載の発明において、前記波長中心選択手段は、前記分散素子を回転させる手段であることを特徴としている。
【００１２】
請求項６記載の発明は、請求項５記載の発明において、前記分散素子は、反射グレーティングであることを特徴としている。
【００１３】
請求項７記載の発明は、請求項６記載の発明において、前記反射グレーティングは、平面回折格子または凹面回折格子であることを特徴としている。
【００１４】
請求項８記載の発明は、請求項６または７記載の発明において、前記反射グレーティングの角度を検出する手段と、前記光検出器から得た出力値を前記反射グレーティングの角度に基づいて補正する補正手段とを備えたことを特徴としている。
【００１５】
請求項９記載の発明は、請求項１乃至４のいずれかに記載の発明において、前記分散素子から出射した光を前記光検出器に向けて偏向させる反射部材をさらに備え、前記波長幅選択手段は、前記反射部材を回転させる手段であることを特徴としている。
【００１６】
請求項１０記載の発明は、請求項９記載の発明において、前記分散素子は、プリズムであることを特徴としている。
【００１７】
請求項１１記載の発明は、請求項１０記載の発明において、前記反射部材の角度を検出する手段と、前記波長幅選択手段における単位波長幅あたりの開度を前記反射部材の角度に基づいて補正する補正手段とを備えたことを特徴としている。
【００１８】
請求項１２記載の発明は、請求項９記載の発明において、前記分散素子は、透過型直視分散素子であることを特徴としている。
【００１９】
請求項１３記載の発明は、請求項１２記載の発明において、前記分散素子は、グリズムであることを特徴としている。
【００２０】
請求項１４記載の発明は、請求項１３記載の発明において、前記反射部材の角度を検出する手段と、前記光検出器から得られた出力値を前記反射部材の角度に基づいて補正する補正手段とを備えたことを特徴としている。
【００２１】
請求項１５記載の発明は、請求項９記載の発明において、前記分散素子は、プリズムグレーティングプリズムであることを特徴としている。
【００２２】
請求項１６記載の発明は、請求項１乃至１５のいずれかに記載の発明において、前記標本から得られる光を所定の波長で分割する波長分割手段を、前記分散素子の手前側に配置したことを特徴としている。
【００２３】
請求項１７記載の発明は、請求項１乃至１５のいずれかに記載の発明において、前記標本から得られる光を偏光方向に応じて分割する偏光分割手段を、前記分散素子の手前側に配置したことを特徴としている。
【００２４】
請求項１８記載の発明は、請求項１乃至１５のいずれかに記載の発明において、前記標本から得られる光を所定の波長で分割する波長分割手段と、前記標本から得られる光を偏光方向に応じて分割する偏光分割手段と、前記波長分割手段及び前記偏光分割手段の一方を光路中に切換え挿入する切換え機構とを備えることを特徴としている。
【００２５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
【００２６】
（第１の実施の形態）
第１の実施の形態は、分散素子として反射回折格子を用い、この反射回折格子を回動させることにより検出する波長帯域の中心を選択するようにしたものである。さらに、本実施の形態では、反射回折格子の回折効率の波長依存性を考慮した輝度値補正も行うようにしているが、この輝度値の補正を省略したものも本発明に含まれる。
【００２７】
図１は、本発明が適用されるレーザ走査顕微鏡の概略構成を示している。
【００２８】
図において、１はレーザ光源で、このレーザ光源１から出力されるコヒーレント光の光路上には、ビーム径可変機構部２と走査光学ユニット３が配置されている。ビーム径可変機構部２は、コヒーレント光の光束径を可変するものである。走査光学ユニット３は、走査ミラー３ａ、３ｂを有し、これら走査ミラー３ａ、３ｂにより光束径を可変されたコヒーレント光を偏向するようにしている。
【００２９】
走査光学ユニット３により偏向された光の光路には、リレーレンズ４、ミラー５が配置されている。また、ミラー５の反射光路には、結像レンズ６および対物レンズ７が配置されている。
【００３０】
ミラー５で反射し結像レンズ６を通ったコヒーレント光は、対物レンズ７の瞳上で結像し、ステージ９に載置された標本８上に照射する。この場合、結像レンズ６により対物レンズ７の瞳に結像された光は、ビーム径可変機構部２で可変された光束径で標本８の断面８ａ上に集光される。
【００３１】
なお、標本８の断面８ａ上に照射される光は、走査ミラー３ａ、３ｂの動きにより断面８ａ上の所定の範囲で走査させたり、停止させてスポット的に照射させてもよく、さらには、走査ミラー３ａ、３ｂを瞬間的にスキップ動作させることで、瞬時に任意の位置にスポット的に照射させてもよい。
【００３２】
標本８は、光が照射されると、蛍光指示薬が励起され、蛍光を発するようになっている。
【００３３】
標本８から発せられた蛍光は、先の光路と逆方向に、対物レンズ７、結像レンズ６、ミラー５、リレーレンズ４、走査光学ユニット３を通ってダイクロイックミラー１０に入射する。このダイクロイックミラー１０は、ビーム径可変機構部２と走査光学ユニット３との間の光路に配置されており、ビーム径可変機構部２から入射するコヒーレント光を透過し、走査光学ユニット３より入射する蛍光を反射するような特性を有している。
【００３４】
ダイクロイックミラー１０で９０度曲げられた反射光路には、測光フィルタ１１および第１の検出部１２が配置されている。
【００３５】
測光フィルタ１１は、標本８から発せられた蛍光の波長のみを透過するものである。第１の検出部１２は、結像レンズ１３、共焦点ピンホール１４および光検出手段として光電変換素子１５を有している。測光フィルタ１１より出た蛍光は、結像レンズ１３を通って共焦点ピンホール１４面で結像する。また、共焦点ピンホール１４を通過した蛍光は、光電変換素子１５で検出される。
【００３６】
一方、レーザ光源１としてＩＲパルスレーザを使用した場合、２光子吸収による蛍光画像を取得することができる。
【００３７】
この場合、結像レンズ６と対物レンズ７との間の光路には、ダイクロイックミラー１６が配置されている。このダイクロイックミラー１６は、ミラー５から入射するＩＲパルスレーザ光を透過し、対物レンズ７より入射する可視蛍光を反射するような短波長反射の特性を有している。
【００３８】
ダイクロイックミラー１６で９０度曲げられた反射光路には、第２の検出部１７が配置されている。この場合、第２の検出部１７は、論理的に共焦点ピンホールは不要となる。
【００３９】
第２の検出部１７は、ダイクロイックミラー１６からの反射光路に沿って結像レンズ１８、ピンホール１９、コリメートレンズ２０および分散素子として反射グレーティングの平面回折格子２１が配置されている。
【００４０】
この場合、ダイクロイックミラー１６で反射した蛍光は、結像レンズ１８を通ってピンホール１９面で結像する。ピンホール１９を通った蛍光は、コリメートレンズ２０で平行光になって平面回折格子２１に入射する。
【００４１】
平面回折格子２１は、入射光を分光して波長ごとに異なる角度に光束を反射するもので、その反射効率は、上述した図１１に示すように、中心波長（λ０）をピークとして、その両側の効率が低下するような波長特性、つまり、分光された光の強度が波長によって変動するような波長特性を有している。
【００４２】
平面回折格子２１には、駆動手段としてモータ２２が設けられている。このモータ２２は、平面回折格子２１を図示矢印方向に回転させるもので、平面回折格子２１で分光された光のうち、所望する光の波長中心を選択するための波長中心選択手段を平面回折格子２１とともに構成している。
【００４３】
モータ２２には、エンコーダ２３が接続されている。このエンコーダ２３は、平面回折格子２１の回転角度に相当する信号を出力するものである。
【００４４】
平面回折格子２１の反射光路には、集光レンズ２４、スリット２５および光検出手器して光電変換素子２６が配置されている。
【００４５】
集光レンズ２４は、平面回折格子２１の回転角度に応じて選択された波長中心の光をスリット２５面に集光するものである。スリット２５は、集光レンズ２４により集光された波長中心の光のみを選択する。ここで、平面回折格子２１での分光特性、つまり、分光された光の波長に対する分光の振れ角度の関係は、ほぼリニアになるので、スリット２５のスリット幅は一定でよい。光電変換素子２６は、スリット２５を通過した波長の光の輝度（強度）を検出し、輝度に応じた電気信号を出力する。
【００４６】
この場合、光電変換素子２６による検出信号の強度と平面回折格子２１の回転角度の関係は、図２に示すようになり、上述した図１１に示す波長特性に準じたものになっている。
【００４７】
光電変換素子２６には、信号補正手段として、補正処理部２７が接続されている。補正処理部２７には、波長検出手段として、制御部２８が接続されている。
【００４８】
制御部２８には、エンコーダ２３より平面回折格子２１の回転角度に相当する信号が入力される。制御部２８は、この信号に相当する平面回折格子２１の回転角度から選択される光の波長中心を検出し、図２に示すように光電変換素子２６の検出信号の強度がピーク値付近の一定値Ｃになるための補正値Ｈを求める。この場合、制御部２８は、平面回折格子２１の回転角度と補正値Ｈの関係を予め記憶したテーブルを用意しておき、このテーブルを用いて平面回折格子２１の回転角度から直接補正値Ｈを求めるようにしてもよい。
【００４９】
制御部２８の補正値Ｈは、補正処理部２７に送られる。補正処理部２７は、補正値Ｈを用いて光電変換素子２６の検出信号を嵩上げするような電気的な処理、例えば検出信号に対する増幅率を可変して、最終的に波長に対する出力特性がフラットになるような補正を行う。
【００５０】
次に、このように構成した実施の形態の動作を説明する。
【００５１】
まず、通常の共焦点観察を説明する。この場合、レーザ光源１からコヒーレント光が出射すると、この光は、ビーム径可変機構部２で光束径を可変され走査光学ユニット３に入射する。走査光学ユニット３に入射した光は、走査ミラー３ａ、３ｂにより偏向される。
【００５２】
走査光学ユニット３で偏向された光は、リレーレンズ４、ミラー５を通って結像レンズ６に入射する。結像レンズ６を通った光は、対物レンズ７の瞳上で結像し、ステージ９に載置された標本８上に照射する。この場合、結像レンズ６により対物レンズ７の瞳に結像された光は、ビーム径可変機構部２で可変された光束径で標本８の断面８ａ上に集光される。
【００５３】
標本８から発せられた蛍光は、先の光路と逆方向に、対物レンズ７、結像レンズ６、ミラー５、リレーレンズ４、走査光学ユニット３を通ってダイクロイックミラー１０に入射する。
【００５４】
ダイクロイックミラー１０で９０度曲げられた蛍光は、測光フィルタ１１に入射する。測光フィルタ１１では、標本８から発せられた蛍光の波長のみが透過し、結像レンズ１３を通って共焦点ピンホール１４面で結像する。そして、共焦点ピンホール１４を貫いた蛍光は、光電変換素子１５に入射する。光電変換素子１５は、入手した蛍光の輝度を検出し、これを電気信号に変換して共焦点データとして出力する。
【００５５】
次に、標本８からの蛍光について波長ごとのスペクトルデータを検出して分光測定を行う場合を説明する。
【００５６】
この場合、レーザ光源１としてＩＲパルスレーザが使用される。また、結像レンズ６と対物レンズ７との間の光路に、ダイクロイックミラー１６が配置される。
【００５７】
レーザ光源１からＩＲパルスレーザ光が出射すると、上述したと同様にして、走査光学ユニット３で偏向された光は、リレーレンズ４、ミラー５を通って結像レンズ６に入射する。結像レンズ６を通った光は、対物レンズ７の瞳上で結像し、ステージ９に載置された標本８上に照射する。
【００５８】
標本８から発せられた蛍光は、対物レンズ７を通ってダイクロイックミラー１６に入射する。
【００５９】
ダイクロイックミラー１６で９０度曲げられた蛍光は、結像レンズ１８を通ってピンホール１９面で結像する。ピンホール１９を通った蛍光は、コリメートレンズ２０で平行光になって平面回折格子２１に入射する。
【００６０】
平面回折格子２１に入射した蛍光は、波長ごとに異なる角度に反射される。この状態で、モータ２２により平面回折格子２１を図示矢印方向に回転すると、平面回折格子２１の回転角度に応じて各波長中心の光が集光レンズ２４を通ってスリット２５面に集光される。
【００６１】
スリット２５は、集光レンズ２４により集光された波長の光のみを通過させる。そして、スリット２５を通過した波長の光は、光電変換素子２６で検出され、輝度に応じた電気的な検出信号として出力される。
【００６２】
一方、平面回折格子２１が回転すると、エンコーダ２３は、平面回折格子２１の回転角度に相当する信号を出力する。この信号は、制御部２８に入力される。
【００６３】
制御部２８は、この信号に相当する平面回折格子２１の回転角度からスリット２５を通過される光の波長中心を検出し、図２に示すように光電変換素子２６の検出信号の強度がピーク値付近の一定値Ｃになるための補正値Ｈを求める。
【００６４】
制御部２８の補正値Ｈは、補正処理部２７に送られる。補正処理部２７は、補正値Ｈを用いて光電変換素子２６の検出信号を嵩上げ（増幅率の可変）するような電気的な処理を行う。
【００６５】
これにより、平面回折格子２１の回転角度に応じて選択される各波長中心の光に対する光電変換素子２６からの検出信号について、それぞれ求められた補正値Ｈを用いて嵩上げ（増幅）するような電気的な処理を施すことで、最終的に分光された光の強度が波長に関わらず、ほぼ一定な波長特性を得られるような補正が行われることとなる。
【００６６】
このような第１の実施の形態によれば、反射回折格子を回動させることで、検出器に導く光の波長中心を選択すると共に、スリット幅を調整することで検出される波長幅を選択することができる。波長の中心と幅をそれぞれ個別に調整することができるので、正確で安定した分光測定が可能になる。しかも、回折格子の回折光率を考慮した補正を行うようにすれば、平面回折格子２１の回転角度に応じた各波長中心に対する出力特性をフラットにできるので、光電変換素子２６の検出信号がピークを呈する中心波長付近での分光測定は勿論、中心波長から離れた波長域についても、常に正確で安定した分光測定を行うことができる。
【００６７】
なお、上述した第１の実施の形態では、反射グレーティングとして平面回折格子２１を用いたが、例えば、図１と同一部分には同符号を付した図３に示すように凹面回折格子３１を用いることもできる。この場合、結像レンズ１８とピンホール１９を通った光は、凹面回折格子３１に直接入射する。凹面回折格子３１は、入射光の波長ごとに異なる角度に光束を反射するもので、図示矢印方向に回転可能に設けられ、この回転角度に応じた波長の光束を直接スリット２５面に集光するようにしている。
【００６８】
このようにしても、第１の実施の形態で述べたと同様にして、凹面回折格子３１の回転角度に相当する信号を出力するエンコーダ２３、凹面回折格子３１の回転角度からスリット２５で選択される光束の波長を検出して補正値Ｈを求める制御部２８、制御部２８の補正値Ｈを用いて光電変換素子２６の検出信号を嵩上げする電気的な処理を行う補正処理部２７をそれぞれ設けることにより、凹面回折格子３１の回転角度に応じた各波長に対する出力特性をフラットにできるという効果を期待でき、さらに、凹面回折格子３１を用いことにより、コリメートレンズ２０と集光レンズ２４を省略できることで、構成の簡素化も期待できる。
【００６９】
また、上述した第１の実施の形態では、第２の検出部１７に、平面回折格子２１（凹面回折格子３１）を配置して、標本８からの蛍光について分光測定を行う場合を述べたが、第１の検出部１２側に平面回折格子２１（凹面回折格子３１）を配置して、分光測定を行うような構成も容易に得ることができる。
【００７０】
（第２の実施の形態）
次に、本発明の第２の実施の形態を説明する。
【００７１】
図４は、第２の実施の形態の要部の概略構成を示している。この場合、図４は、図１で述べたレーザ走査顕微鏡の第２の検出部１７の概略構成のみを示すもので、その他の構成については、図１と同様なので、ここでは省略している。
【００７２】
この場合、図１に示す結像レンズ６と対物レンズ７との間の光路に配置されたダイクロイックミラー１６の反射光路には、図４に示すように結像レンズ４１、ピンホール４２、コリメートレンズ４３および分光手段として透過プリズム４４が配置されている。ここでは、ダイクロイックミラー１６で反射した蛍光は、結像レンズ４１を通ってピンホール４２面で結像する。ピンホール４２を通った蛍光は、コリメートレンズ４３で平行光になって分光手段としてのプリズム４４に入射する。
【００７３】
プリズム４４は、光のスペクトル分解を行うもので、波長と分光の振れ角度の関係で表わされる分光特性は、プリズムの透過率の波長依存性により、図１２に示すように非線型（波長が長いほど振れが鈍くなる。）を呈している。つまり、例えば、青色の波長域λｂの振れ角度Ｔｂに対して赤色の波長域λｒの振れ角度Ｔｒは、著しく小さいものとなっている。
【００７４】
プリズム４４の透過光路には、集光レンズ４５、波長中心選択手段としてのミラー４６が配置され、ミラー４６の反射光路には、可変スリットとしてのスリット４７および光検出手段として光電変換素子４８が配置されている。
【００７５】
集光レンズ４５は、プリズム４４によりスペクトル分解された波長中心の光をミラー４６を介してスリット４７面に集光するものである。
【００７６】
ミラー４６には、駆動手段としてモータ４９が設けられている。このモータ４９は、ミラー４６を図示矢印方向に回転させるものである。モータ４９には、エンコーダ５０が接続されている。このエンコーダ５０は、ミラー４６の回転角度に相当する信号を出力するものである。そして、ミラー４６は、モータ４９による回転される角度に応じてプリズム４４によりスペクトル分解された光のうち、所望する波長中心の光をスリット４７面上に照射させるようになっている。
【００７７】
スリット４７は、光電変換素子４８の光検出部の前面に配置されていて、ミラー４６の回転角度に応じてスリット幅が調整され、プリズム４４でスペクトル分解された光のうち、選択された波長中心の光のみを通過させるようになっている。この場合、スリット４７は、図５に示すようにスリット中心４７ａに対してスリット片４７ｂ、４７ｃが図示矢印Ｓ１、Ｓ２の方向、つまり光の波長帯域方向に移動自在に設けられ、スリット幅を調整できるようになっている。
【００７８】
エンコーダ５０には、波長検出手段として制御部５１が接続されている。
【００７９】
制御部５１には、エンコーダ５０よりミラー４６の回転角度に相当する信号が入力される。制御部５１は、この信号に相当するミラー４６の回転角度からスリット４７に入射される光の波長中心を検出し、この検出された波長中心からプリズム４４でスペクトル分解された波長に対応する振れ角度を求める。この場合、制御部５１は、ミラー４６の回転角度と振れ角度の関係を予め記憶したテーブルを用意しておき、このテーブルを用いてミラー４６の回転角度から直接振れ角度を求めるようにしてもよい。
【００８０】
制御部５１には、スリット幅調整手段としてスリット駆動部５２が接続されている。スリット駆動部５２は、図５に示すスリット４７のスリット片４７ｂ、４７ｃを図示矢印Ｓ１、Ｓ２方向へ駆動するもので、制御部５１より与えられる振れ角度に応じてスリット幅を調整するようになっている。
【００８１】
光電変換素子４８は、スリット４７で選択された波長の光の輝度を検出し、輝度に応じた電気信号を出力する。
【００８２】
次に、このように構成した実施の形態の動作を説明する。
【００８３】
この場合も標本８からの蛍光について波長ごとのスペクトルデータを検出して分光測定を行う場合を説明する。
【００８４】
この場合、レーザ光源１としてＩＲパルスレーザが使用される。また、結像レンズ６と対物レンズ７との間の光路に、ダイクロイックミラー１６が配置される。
【００８５】
レーザ光源１からＩＲパルスレーザ光が出射すると、上述したと同様にして、走査光学ユニット３で偏向された光は、リレーレンズ４、ミラー５を通って結像レンズ６に入射する。結像レンズ６を通った光は、対物レンズ７の瞳上で結像し、ステージ９に載置された標本８上に照射する。
【００８６】
標本８から発せられた蛍光は、対物レンズ７を通ってダイクロイックミラー１６に入射する。
【００８７】
ダイクロイックミラー１６で９０度曲げられた蛍光は、結像レンズ４１を通ってピンホール４２面で結像する。ピンホール４２を通った蛍光は、コリメートレンズ４３で平行光になってプリズム４４に入射する。
【００８８】
プリズム４４に入射した蛍光は、スペクトル分解され、波長ごとに異なる角度に曲げられる。そして、プリズム４４でスペクトル分解された光束は、集光レンズ４５を通り、ミラー４６で反射し、スリット４７面で集光される。
【００８９】
この状態で、モータ４９によりミラー４６を図示矢印方向に回転すると、ミラー４６の回転角度により、スペクトル分解された各波長中心の光が順にスリット４７面に集光される。一方、ミラー４６が回転すると、エンコーダ５０は、ミラー４６の回転角度に相当する信号を出力する。この信号は、制御部５１に入力される。
【００９０】
制御部５１は、この信号に相当するミラー４６の回転角度からスリット４７面に集光される光束の波長中心を検出し、この検出された波長からプリズム４４でスペクトル分解された波長に対応する振れ角度を求める。
【００９１】
制御部５１で求められた振れ角度は、スリット駆動部５２に送られる。スリット駆動部５２は、制御部５１より与えられる振れ角度に応じて、図５に示すスリット４７のスリット片４７ｂ、４７ｃを図示矢印Ｓ１、Ｓ２方向へ駆動し、スリット幅を調整する。
【００９２】
スリット４７を通った波長の光は、光電変換素子４８で検出され、輝度に応じた電気的な検出信号として出力される。
【００９３】
これにより、分光特性が非線形なプリズム４４によりスペクトル分解された被測定光を角度可変のミラー４６を介してスリット４７に導く際に、ミラー４６の回転角度の検出値により、例えば図１２に示す青色の波長域λｂの振れ角度Ｔｂに対してはスリット幅を狭め、赤色の波長域λｒの振れ角度Ｔｒに対してはスリット幅を広げるようなスリット調整を行うことにより、結果的にスリット４７を通過する光の波長帯域幅を常に一定にすることができる。
【００９４】
従って、このようにすれば、ミラー４６を回動させることで光電変換素子４８に導く光の波長中心を選択すると共に、スリット４７の幅を調整することで検出される波長幅を選択することができる。波長の中心と幅をそれぞれ個別に調整することができるので、正確で安定した分光測定が可能になる。しかもプリズム４４の分散の波長依存性（すなわち、波長に対する分光の振れ角度の非線型性）を考慮してスリット幅を調整するので、検出する波長帯域に関わらず正確な波長幅で検出を行うことができる。
【００９５】
なお、第２の実施の形態では、ミラー４６の回転角度の検出値により、スリット４７のスリット片４７ｂ、４７ｃを左右方向へ駆動してスリット幅を調整するようにしたが、例えばミラー４６を固定し、スリット４７全体を図示矢印Ｓ３方向へ直線移動させることで、プリズム４４でスペクトル分解された各波長中心の光を順にスリット４７面に集光させるようにすることもできる。この場合は、スリット４７の移動量に応じてスリット片４７ｂ、４７ｃを図示矢印Ｓ１、Ｓ２方向へ駆動してスリット幅を調整する。
【００９６】
（第３の実施の形態）
次に、本発明の第３の実施の形態を説明する。
【００９７】
図６は、第３の実施の形態の要部の概略構成を示している。この場合、図６は、図１で述べたレーザ走査顕微鏡の第２の検出部１７の概略構成のみを示すもので、その他の構成については、図１と同様なので、ここでは省略している。
【００９８】
この場合、図１に示す結像レンズ６と対物レンズ７との間の光路に配置されたダイクロイックミラー１６の反射光路には、図６に示すように結像レンズ６１、ピンホール６２、コリメートレンズ６３および分光手段としてプリズムグレーティングプリズム（以下、ＰＧＰと略称する。）６４が配置されている。ここでは、ダイクロイックミラー１６で反射した蛍光は、結像レンズ６１を通ってピンホール６２面で結像する。ピンホール６２を通った蛍光は、コリメートレンズ６３で平行光になってＰＧＰ６４に入射する。
【００９９】
ＰＧＰ６４は、光のスペクトル分解を行うもので、例えば、図７に示すように２層構造をしたグレーティング６４ａの両側をプリズム６４ｂ、６４ｃで挟み込んだ構成からなっている。また、ＰＧＰ６４は、光の波長に対する振れ角度の関係で表わされる分光特性を図８に示すようにリニアに設計することができ、青色側の波長域の振れ角度と赤色側の波長域の振れ角度をほぼ同じにすることができる。また、分光された光の強度が波長に関わらずほぼ一定な波長特性をも得られるようになっている。ちなみに、このようなＰＧＰ６４の詳細は、例えば、特開平９−１２７３２１号公報や特開平９−１２７３２２号公報に開示されている。
【０１００】
ＰＧＰ６４の透過光路には、波長選択手段として、ミラー６５が配置され、ミラー６５の反射光路には、集光レンズ６６、スリット６７および光検出手段として光電変換素子６８が配置されている。
【０１０１】
ミラー６５には、図示しない駆動手段により図示矢印方向に回転可能になっている。集光レンズ６６は、ミラー６５の回転角度に応じて各波長中心の光をスリット６７面に集光するものである。スリット６７は、集光レンズ６６により集光された波長の光束のみを通過させる。ここで、ＰＧＰ６４の分光特性は、リニアなので、スリット６７の幅は一定でよく、この状態で、光電変換素子７８は、スリット６７を通った波長中心の光の輝度（強度）を検出し、輝度に応じた電気信号を出力する。
【０１０２】
従って、このようにしても、ミラー６５を回動させることで光電変換素子６８に導く光の波長中心を選択すると共に、スリット６７の幅を調整することで検出される波長幅を選択することができる。波長の中心と幅をそれぞれ個別に調整することができるので、正確で安定した分光測定が可能になる。しかも、分光された光の強度が波長に関わらずほぼ一定な波長特性と、分光された光の波長に対する分光の振れ角度の関係がほぼリニアな分光特性を有するＰＧＰ６４を用いることにより、ミラー６５を回転角度を可変させて所望する光の波長中心を選択するだけで、正確な分光を行うことができるとともに、光電変換素子６８で検出される光の輝度値も正確なものとなり、常に、正確で安定した分光測定を行うことができる。
【０１０３】
（第４の実施の形態）
次に、本発明の第４の実施の形態を説明する。
【０１０４】
図９は、第４の実施の形態の要部の概略構成を示している。この場合、図９は、図１で述べたレーザ走査顕微鏡の第２の検出部１７の概略構成のみを示すもので、その他の構成については、図１と同様なので、ここでは省略している。
【０１０５】
この場合、図１に示す結像レンズ６と対物レンズ７との間の光路に配置されたダイクロイックミラー１６の反射光路には、図６に示すように結像レンズ７１、ピンホール７２、コリメートレンズ７３および分光手段として透過グリズム７４が配置されている。ここでは、ダイクロイックミラー１６で反射した蛍光は、結像レンズ７１を通ってピンホール７２面で結像する。ピンホール７２を通った蛍光は、コリメートレンズ７３で平行光になって分光手段としてのグリズム７４に入射する。
【０１０６】
グリズム７４は、光のスペクトル分解を行うもので、例えば、図１０に示すようにグレーティング７４ａの片側にプリズム７４ｂを接合した構成からなっている。この場合、グリズム７４は、波長と分光の振れ角度の関係で表わされる分光特性を図８でに示すようにリニアになるように設計することができ、青色側の波長域の振れ角度と赤色側の波長域の振れ角度をほぼ同じにすることができる。しかし、透過率の波長特性は、上述した図１１に示すように、中心波長をピークとして、その両側の効率が低下するような特性、つまり、分光された光の強度が波長によって変動するような特性を有している。
【０１０７】
グリズム７４の透過光路には、波長選択手段としてミラー７５が配置され、ミラー７５の反射光路には、集光レンズ７６、スリット７７および光検出手段として光電変換素子７８が配置されている。
【０１０８】
ミラー７５には、駆動手段としてモータ７９が設けられている。このモータ７９は、ミラー７５を図示矢印方向に回転させるものである。
【０１０９】
モータ７９には、エンコーダ８０が接続されている。このエンコーダ８０は、ミラー７５の回転角度に相当する信号を出力するものである。
【０１１０】
集光レンズ７６は、ミラー７５の回転角度に応じて波長中心ごとの光をスリット７７面に集光するものである。スリット７７は、集光レンズ７６により集光された波長の光束のみを通過させる。ここで、グリズム７４の分光特性は、ほぼリニアなので、スリット７７のスリット幅は一定でよい。光電変換素子７８は、スリット７７で選択された波長の光の輝度（強度）を検出し、輝度に応じた電気信号を出力する。
【０１１１】
光電変換素子７８には、信号補正手段としての補正処理部８２が接続されている。補正処理部８２には、波長検出手段としての制御部８１が接続されている。
【０１１２】
制御部８１には、エンコーダ８０よりミラー７５の回転角度に相当する信号が入力される。制御部８１は、この信号に相当するミラー７５の回転角度から集光レンズ７６を通ってスリット７７で選択される光の波長中心を検出し、光電変換素子７８の検出信号の強度がピーク値付近の一定値になるための補正値を求める。この場合、制御部８１は、ミラー７５の回転角度と補正値の関係を予め記憶したテーブルを用意しておき、このテーブルを用いてミラー７５の回転角度から直接補正値を求めるようにしてもよい。
【０１１３】
制御部８１の補正値は、補正処理部８２に送られる。補正処理部８２は、補正値を用いて光電変換素子７８の検出信号を嵩上げする電気的な処理、例えば検出信号に対する増幅率を可変して、最終的に波長に対する出力特性がフラットになるような補正を行う。
【０１１４】
従って、このようにしてもグリズム７４を用いた場合も、ミラー７５を回動させることで光電変換素子７８に導く光の波長中心を選択すると共に、スリット７７の幅を調整することで検出される波長幅を選択することができる。波長の中心と幅をそれぞれ個別に調整することができるので、正確で安定した分光測定が可能になる。しかも、ミラー７５の回転角度に応じた各波長中心に対する出力特性をフラットにできるので、光電変換素子７８の検出信号がピークを呈する中心波長付近での分光測定は勿論、中心波長から離れた波長域についても正確で安定した分光測定を行うことができる。
【０１１５】
なお、上述した実施の形態では、図１で述べたレーザ走査顕微鏡の第２の検出部１７に分光測定を行う手段を設けた例を述べたが、図１で述べたレーザ走査顕微鏡の第１の検出部１２側に、第１乃至第４の実施の形態で述べたような分光測定手段を設けるようにすることもできる。
【０１１６】
また、このような第１の検出部１２に対して、図１に示すようにダイクロイックミラー１０と測光フィルタ１１との間の光路にダイクロイックミラー９１を挿入し、このダイクロイックミラー９１の反射光路に偏光板９２を介して第３の検出部９３を接続するようにしてもよい。この場合、第３の検出部９３には、第１乃至第４の実施の形態で述べたような分光測定手段が設け、また、偏光板９２によりｓ偏光とｐ偏光に分離することにより、これらｓ偏光とｐ偏光についても分光測定により波長解析を行うことができる。なお、これらダイクロイックミラー９１および偏光板９２は、ターレット式や水平移動可能な駆動手段により光路に対して挿脱可能に設けるようにしてもよい。
【０１１７】
さらに、図１の補正処理部２７、図９の補正処理部８２は、光電変換素子からの検出信号を電気的に補正するのではなく、検出信号をＡ／Ｄ変換した後の画像生成を行う過程において、ソフトウェアによって各画素の輝度値に係数を乗じて補正するといったものにしてもよい。
【０１１８】
その他、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。例えば、上述した第１の実施の形態および第２の実施の形態では、ディスクに透過部、遮光部が縞上に形成されたものを用いたが、透過部分がピンホール状の形状をしたディスクを使用してもよい。
【０１１９】
さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。
【０１２０】
【発明の効果】
以上述べたように本発明によれば、正確で安定した分光測定を行うことができるレーザ走査型顕微鏡を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態が適用されるレーザ走査顕微鏡の概略構成を示す図。
【図２】第１の実施の形態の光電変換素子による検出信号の強度と回折格子の回転角度の関係を示す図。
【図３】第１の実施の形態の変形例の要部の概略構成を示す図。
【図４】本発明の第２の実施の形態の要部の概略構成を示す図。
【図５】第２の実施の形態に用いられるスリットの概略構成を示す図。
【図６】本発明の第３の実施の形態の要部の概略構成を示す図。
【図７】第３の実施の形態に用いられるＰＧＰの概略構成を示す図。
【図８】第３の実施の形態に用いられるＰＧＰの分光特性を示す図。
【図９】本発明の第４の実施の形態の要部の概略構成を示す図。
【図１０】第４の実施の形態に用いられるグリズムの概略構成を示す図。
【図１１】一般的なプリズムの分光特性を示す図。
【符号の説明】
１…レーザ光源
２…ビーム径可変機構部
３…走査光学ユニット
３ａ．３ｂ…走査ミラー
４…リレーレンズ
５…ミラー
６…結像レンズ
７…対物レンズ
８…標本
８ａ…断面
９…ステージ
１０…ダイクロイックミラー
１１…測光フィルタ
１２…第１の検出部
１３…結像レンズ
１４…共焦点ピンホール
１５…光電変換素子
１６…ダイクロイックミラー
１７…第２の検出部
１８…結像レンズ
１９…ピンホール
２０…コリメートレンズ
２１…平面回折格子
２２…モータ
２３…エンコーダ
２４…集光レンズ
２５…スリット
２６…光電変換素子
２７…信号処理部
２８…制御部
３１…凹面回折格子
４１…結像レンズ
４２…ピンホール
４３…コリメートレンズ
４４…プリズム
４５…集光レンズ
４６…ミラー
４７…スリット
４７ａ…スリット中心
４７ｂ．４７ｃ…スリット片
４８…光電変換素子
４９…モータ
５０…エンコーダ
５１…制御部
５２…スリット駆動部
６１…結像レンズ
６２…ピンホール
６３…コリメートレンズ
６４…ＰＧＰ
６４ａ…グレーティング
６４ｂ．６４ｃ…プリズム
６５…ミラー
６６…集光レンズ
６７…スリット
６８…光電変換素子
７１…結像レンズ
７２…ピンホール
７３…コリメートレンズ
７４…グリズム
７４ａ…グレーティング
７４ｂ…プリズム
７５…ミラー
７６…集光レンズ
７７…スリット
７８…光電変換素子
７９…モータ
８０…エンコーダ
８１…制御部
８２…補正処理部
９１…ダイクロイックミラー
９２…偏光板
９３…第３の検出部
【図１】
2004212600.tif 000003
【図２】
2004212600.tif 000004
【図３】
2004212600.tif 000005
【図４】
2004212600.tif 000006
【図５】
2004212600.tif 000007
【図６】
2004212600.tif 000008
【図７】
2004212600.tif 000009
【図８】
2004212600.tif 000010
【図９】
2004212600.tif 000011
【図１０】
2004212600.tif 000012
【図１１】
2004212600.tif 000013