(57)【要約】【課題】本発明は、様々なポリフェノール成分を含有する試料から、重合型ポリフェノールを重合度別に効率的に分離定量できる高速向流クロマトグラフィ（Ｈｉｇｈ−Ｓｐｅｅｄ  Ｃｏｕｎｔｅｒ−Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：  ＨＳＣＣＣ）の分析条件を見出すことを目的とする。【解決手段】本発明は、エーテル類、アセトニトリルまたはアルコール類、水または酸性水溶液を混和した二相溶媒系の上層または下層を固定相とし下層または上層を移動相に用いた真の液液分配クロマトグラフィである高速向流クロマトグラフィを用いることを特徴とするポリフェノールの分離方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エーテル類、アセトニトリルまたはアルコール類、水または酸性水溶液を混和した二相溶媒系の上層または下層を固定相とし下層または上層を移動相に用いた真の液液分配クロマトグラフィである高速向流クロマトグラフィを用いることを特徴とするポリフェノールの分離方法。
【請求項２】
ｔ−ブチルメチルエーテル、アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液を２：２：３で混和した二相溶媒系の上層または下層を固定相とし下層または上層を移動相に用いた真の液液分配クロマトグラフィである高速向流クロマトグラフィを用いることを特徴とするポリフェノールの分離方法。
【請求項３】
高速向流クロマトグラフィを逆相ＨＰＬＣ、順相ＨＰＬＣ、ＧＰＣのいずれかひとつ以上の方法と組み合わせることを特徴とするポリフェノールの分離方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項において、ポリフェノールがホップ由来のポリフェノールである分離方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項において、ポリフェノールが重合型ポリフェノールである分離方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項の分離方法を用いたポリフェノール素材の製造方法。
【請求項７】
請求項６で得られたポリフェノール素材を含有する食品、薬品、または化粧品の品質管理方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ポリフェノールの分離方法およびその産業的利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ポリフェノールとは、植物に由来する物質（フィトケミカル：ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）の１種であり、１分子中にフェノール性水酸基を２つ以上有する化合物の総称である。ポリフェノールには、大別して分子量が１，０００以下の単量体（モノマー）ポリフェノールと、単量体ポリフェノールが２つ以上結合した重合型（ポリマー）ポリフェノールが存在する。重合型ポリフェノールは一般にタンニンとも称される。代表的な単量体ポリフェノールとしては、フラボノイド類（フラボノイド類には、フラボン、フラボノール、フラバノン、フラバノロール、イソフラボン、アントシアニン、フラバノール、カルコン、オーロンを基本骨格とする化合物が含まれる）、クロロゲン酸、没食子酸、エラグ酸などがある。一方、重合型（ポリマー）ポリフェノールは単量体ポリフェノールが２個以上結合した化合物であり、炭素−炭素結合により重合した縮合型ポリフェノールと、エステル結合により重合した加水分解型ポリフェノールとに大別され、夫々代表的なポリフェノールとして縮合型ポリフェノールとしてはプロアントシアニジン類、加水分解型ポリフェノールとしてはガロタンニン、エラグタンニンが挙げられる。
【０００３】
近年、フィトケミカルにヒトの健康に寄与する性質、所謂「機能性」が存在することが明らかとなり、注目を集めている。フィトケミカルの中でも、特にポリフェノールについては、抗酸化・活性酸素消去作用、抗菌作用、抗炎症作用、抗アレルギー作用、抗う蝕作用などが報告されている。また緑茶、ワインなど身近な食材の中に含有されることから一般に認知度が高く、ポリフェノールを精製した素材、あるいはポリフェノールを含有する食品も数多く上市されてきている。
【０００４】
ポリフェノールに関する研究は、これまで、分離精製、定量化が容易な単量体ポリフェノールや、重合度がせいぜい２から３の、比較的低分子のポリフェノールについてしか行われてこなかった。一方重合度の大きなポリフェノールについては、重合度別の分離法が確立していなかったため、その含量は低分子のポリフェノールと区別できず、フォーリンデニス法などの、比色法による総ポリフェノール量としての定量値でしか表現できなかった。
【０００５】
近年、分子量１，０００以上の重合型ポリフェノールに特異な機能が存在することが明らかとなってきており、重合型ポリフェノールを重合度別に簡便に分離・定量する方法の開発が求められている。
【０００６】
例えば、効果効能を商品に表示できる特定保健用食品は、一般に消費者の購買意欲が高く、売上も高くなることが期待できるが、特定保健用食品では商品形態中の機能性成分の定量が求められるようになってきており、機能性を有する高重合ポリフェノールを分離・定量する技術が開発された場合、産業的におおいに利用されることが期待できる。
【０００７】
ＣＣＣ（向流クロマトグラフィ）を重合型ポリフェノールの分離に用いることは、すでに、プットマンらによる報告がある（非特許文献１参照）。しかし同文献で紹介された方法では分離度が悪く、また２日以上もの時間を要するなど操作が煩雑なものであり、効率的な重合型ポリフェノール類の分離条件は未だに開発されていなかった。また発明者らによる文献（非特許文献２参照）にはＨＳＣＣＣ（高速向流クロマトグラフィ）を用いた重合度別のカテキン類の分離法が示されているが、ＨＳＣＣＣに用いる二相溶媒系の適切な選択や装置条件の最適化が行われておらず、良好な分離結果を得るには至っていなかった。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｐｕｔｍａｎ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  ３１８，  ８５−９３  （１９８５）
【非特許文献２】
Ｙ．  Ｓｈｉｂｕｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ａ．，  ９１５，  ２５３−２５７  （２００１）
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、鋭意検討の結果、様々なポリフェノール成分を含有する試料から、重合型ポリフェノールを重合度別に効率的に分離定量できる高速向流クロマトグラフィ（Ｈｉｇｈ−Ｓｐｅｅｄ  Ｃｏｕｎｔｅｒ−Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：  ＨＳＣＣＣ）の分析条件を見出した。さらにＨＳＣＣＣとゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）、逆相ＨＰＬＣ、順相ＨＰＬＣ、ＭＳ、ＮＭＲなどの手法とを必要に応じて組み合わせることによっても重合型ポリフェノールを簡便に分離定量できることを見い出し、本発明を完成した。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、エーテル類、アセトニトリルまたはアルコール類、水または酸性水溶液を混和した二相溶媒系の上層または下層を固定相とし下層または上層を移動相に用いた真の液液分配クロマトグラフィである高速向流クロマトグラフィ（ＨＳＣＣＣ）を用いることを特徴とするポリフェノールの分離方法である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
ＨＳＣＣＣとは、二相溶媒系の上層または下層の一方の液層を固定相としてコイル状チューブカラム内に遠心力で保持させ、下層または上層の他方の液層を移動相として送液して成分分離を行う純粋な液液分配クロマトグラフィである。分離後の試料成分をカラムから全て回収できるほか、順相／逆相、分析／分取の切り替えも容易であるという利点を持つ。例えば順相クロマトグラフィでは、重合度の進んだプロシアニジン類は固定相であるカラム樹脂から溶出されず、分析ができないという欠点があるが、ＨＳＣＣＣでは固定相を回収できるため、試料を全量回収できるなどの利点がある。
【００１２】
本発明に用いるＨＳＣＣＣ装置は、およそ図１のように、固定相の保持をおこなうカラム部分にＪ型コイル惑星状遠心装置を備え、これに送液ポンプおよび検出器を組み合わせた構造を有する。Ｊ型コイル惑星状遠心装置はコイル部分が回転（惑星の自転に相当）するだけでなく、コイル部分の保持装置も回転（惑星の公転に相当）することを特徴とするものであれば、特に問題なくどのようなものでも利用できる。カラム部分に巻きつけて流路およびカラムとなるチューブ部には塩化ビニール、ポリエチレン、テフロン（登録商標）、ステンレスなど一般にチューブ状に成型できる素材であれば特に問題なく用いることができるが、好適な例としては内径０．５〜３ｍｍのテフロン（登録商標）チューブを挙げる事ができる。送液ポンプはロータリー型、ペリスタ型など、一般に液体の送液に用いることのできるものであれば問題なく用いることができる。まずカラム部分に二相溶媒のどちらか一方を送液し、チューブを満たして固定相とする。続いてコイル部分を惑星状に回転させ、遠心力で固定相を保持させる。この際の回転数は１０〜１０，０００ｒｐｍを用いることができるが、好適な例としては１，０００〜１，５００ｒｐｍとすることが望ましい。続いて分析する試料を二相溶媒に溶解させたサンプルをカラム部分に導入し、その後に二相溶媒の固定相に用いなかった他の相を移動相として送液する。移動相の送液速度は特に制限はないが、０．１〜１０ｍｌ／分の間とすることが望ましい。溶出する移動相を適当な分析装置で分析する。この分析装置は、ＵＶ検出器、ダイオードアレイ検出器、ＩＲ検出器、蛍光検出器などを用いることができる。
【００１３】
本発明のＨＳＣＣＣに用いる二相溶媒は、水とブタノールなどのアルコールを混合して得られるものや、水と酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類を混合して得られるもの、水とｔ−ブチルメチルエーテルなどのエーテル類を混合して得られるものなどを用いることができる。また、上記の二相溶媒を相互に混和したり、さらに酢酸、アセトニトリル、無機金属塩水溶液などを混和して用いることもできる。好適な例としては、ｔ−ブチルメチルエーテル、アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液を２：２：３の割合で混合して得られるものを挙げることができる。
【００１４】
溶出した移動相はそのままあるいは溶出時間毎に分画し、逆相ＴＬＣ、順相ＴＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、順相ＨＰＬＣ、ＧＰＣ、アフィニティークロマトグラフィ、ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ、ＴＯＦ−ＭＳなどの分析を行うことにより、さらに詳細な分離、分析を行うことができる。その際に必要があれば移動相を減圧乾固などの方法により取り除いてから分析を行ってもよい。
【００１５】
また溶出した移動相をそのまま、あるいは溶出時間毎に分画し、必要があれば移動相を減圧乾固などの方法により取り除いて、ポリフェノール画分として利用することもできる。
【００１６】
またかくして得られた分析データは、ポリフェノールの重合体ごとの含量を表すものであり、この情報を品質管理、品質保証に役立てることができる。この情報をポリフェノールを含有する食品、薬品、化粧品などの品質管理、品質保証に役立てることができる。
【００１７】
【発明の効果】
本発明のポリフェノールの分離方法は、簡便かつ迅速にポリフェノール、特に重合型ポリフェノールを効率的に分離できるので、ポリフェノールの精製方法、ポリフェノール素材の品質管理方法などとして産業的に利用することができる。
【００１８】
【実施例】
以下、実施例を示すが本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１：以下に記載したＨＳＣＣＣ条件で、緑茶、ウーロン茶に由来するポリフェノール素材を分離分析した。その結果を別添の図２に示す。これらのクロマトグラムのピーク面積を求めることにより、各ポリフェノール素材中の含有成分の含量を測定することができた。
ＨＳＣＣＣ条件：二相系，ｔ−ブチルメチルエーテル：アセトニトリル：０．１％ＴＦＡ水溶液＝２：２：３；
固定相，下層；初期移動相，上層；
カラム，１．０  ｍｍＩＤ  ×  ３０  ｍ  （容量２３．５  ｍＬ）；流速，１．０  ｍｌ／ｍｉｎ；
回転，１，０００  ｒｐｍ；検出，日立Ｌ−７４５５  ｄｉｏｄｅ−ａｒｒａｙ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ
図２に示されるように、茶に由来するポリフェノール素材をＨＳＣＣＣにより効率よく分離したことにより、重合型ポリフェノール（クロマトグラム上、約８０分に現れるピーク）は緑茶由来ポリフェノール素材には含まれないが、ウーロン茶由来ポリフェノール素材にはピーク面積比で約３０％含まれることが明らかとなった。緑茶由来ポリフェノール素材は、ピーク面積比で９５％以上がカテキンの単量体であることがわかる。また、ウーロン茶由来ポリフェノール素材にはカフェインもピーク面積比で約４０％含まれることが明らかとなった。
【００１９】
実施例２：実施例１と同様のＨＳＣＣＣ条件で、ホップポリフェノールを分離し、さらにその一部を逆相のＨＰＬＣで分離分析した。その結果を別添の図３に示す。逆相ＨＰＬＣクロマトグラムのピーク面積を求めることにより、さらに詳細な含有成分の定量が実現した。
逆相ＨＰＬＣ条件：カラム，Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ  ＲＰ−１８  ＧＰ  （４．６ｍｍｘ１５０ｍｍ，５ｕｍ，関東化学）；移動相，
Ａ：  ０．１％  ＴＦＡ：ＣＨ３ＣＮ  （９０：１０）、Ｂ：  ０．１％  ＴＦＡ：ＣＨ３ＣＮ  （５０：５０）を用いた直線グラディエント
０−２０ｍｉｎ：  １００％  Ａ，  ２０−６０ｍｉｎ：  １００％  Ａ−５０％  Ａ；流速，１  ｍｌ／ｍｉｎ；検出，ＤＡＤ  （２８０，３２０，３５０ｎｍ）
図３Ａ図より、ホップ由来ポリフェノールには重合型ポリフェノールがピーク面積比で５０％以上含まれることが判る。また、各フラクションを逆相ＨＰＬＣでさらに分析した結果（図３Ｂ図）、さらに詳細な成分比が明らかとなった。例えば、Ｆｒ．５のＨＳＣＣＣでのピーク面積比は約７％であり、Ｆｒ．５中の主要成分（ケンフェロール−３−ｏ−ルチノース）の逆相ＨＰＬＣでのピーク面積比が９２％であったことから、ホップ由来ポリフェノール中のケンフェロール−３−ｏ−ルチノースの含量はおよそ６．４％であることが判った。
【００２０】
【発明の効果】
本発明のポリフェノールの分離方法は、特に重合型のポリフェノールを効率的に分離することにより、従来は不可能であったポリフェノールの製造、ポリフェノール素材の品質管理に優れた効果を表す。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｊ型コイル惑星状遠心装置を配置した高速向流クロマトグラフィ（ＨＳＣＣＣ）装置の概略図。
【図２】Ａ）緑茶由来ポリフェノール素材のＨＳＣＣＣクロマトグラム
Ｂ）ウーロン茶ポリフェノール素材のＨＳＣＣＣクロマトグラム
【図３】Ａ）ホップポリフェノールのＨＳＣＣＣクロマトグラムと分画パターン
Ｂ）ＨＳＣＣＣ分取画分（分画１〜７）の逆相ＨＰＬＣクロマトグラム
【図１】
2004256481.tif 000002
【図２】
2004256481.tif 000003
【図３】
2004256481.tif 000004