(57)【要約】【課題】  骨細胞活性を薄膜上で支えるためのリン酸カルシウム材の薄膜の改良製造方法（最適焼結温度等含む）を提供する。【解決手段】  焼結すべき材料は、リン酸アンモニウムの溶液を硝酸カルシウムの溶液と合わせてヒドロキシアパタイト含有ゾル−ゲルを形成させることによって調製する。このゾル−ゲルの膜を基層の少なくとも片側に当てがい、基層上にコーティングされた膜を焼結してリン酸カルシウム材の固体膜を形成させる。焼結段階によってヒドロキシアパタイトはαリン酸三カルシウムに変換され、この変換の程度は温度依存性を示す。最適組成は、ヒドロキシアパタイトのαリン酸三カルシウムに対する比率が５０：５０〜２０：８０の範囲にあり、焼結温度はこれらの比率が得られるように選ぶ。焼結温度は９２０℃〜１１００℃の範囲から選び、この範囲では選んだ温度が高いほどαリン酸三カルシウムの割合が高い。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）リン酸アンモニウムの溶液を硝酸カルシウムの溶液と混合してヒドロキシアパタイト含有ゾル−ゲルを形成することによるゾル−ゲルの調製段階と、
ｉｉ）前記ゾル−ゲルの膜を基層の少なくとも片側にとりつける段階と、
ｉｉｉ）上記基層上にコーティングされた上記膜を焼結して上記リン酸カルシウム材の固体膜を形成する段階と
を含んでなり、
ｉｖ）上記膜内のリン酸カルシウム材の組成を最適にする温度範囲から選んだ温度で上記膜を焼結し、上記焼結段階はヒドロキシアパタイトをαリン酸三カルシウムに変換すること、このときそのような変換の程度は温度依存性であることと、
ｖ）上記最適化された組成は、ヒドロキシアパタイトのαリン酸三カルシウムに対する比率が５０：５０〜２０：８０であることと、
ｖｉ）焼結温度を９２０℃〜１１００℃の範囲から選ぶこと、このとき焼結温度が高いほど、上記変換比率は上限比率２０：８０に近づくことと
を特徴とする、リン酸カルシウム材の薄膜を、その上での骨細胞活性を支えるために基層上に作成する方法。
【請求項２】
上記選定温度を９５０℃〜１０００℃とし、約３３３：６６６の比率を達成する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記選定温度を約１１００℃とし、２０：８０の比率を達成する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記選定温度を９２０℃〜９５０℃とし、５０：５０〜３３３：６６６の範囲の比率を達成する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記選定温度を１０００℃〜１１００℃とし、３３３：６６６〜２０：８０の範囲の比率を達成する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
上記選定温度を約９７５℃とし、３３３：６６６の比率を達成する請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その薄膜上の骨細胞活性を支えることができるリン酸カルシウム材からなる薄膜製造のための改良方法に関するものである。この薄膜は最適な組成がヒドロキシアパタイト対αリン酸三カルシウムの比が５０：５０〜２０：８０の範囲にあるものである。
【背景技術】
【０００２】
骨は、無機または鉱物相と、有機マトリックス相と、水とから構成されている複合鉱化系である。無機鉱物相は結晶性リン酸カルシウムで構成されているが、有機マトリックス相は殆どコラーゲンとその他の非コラーゲン性蛋白とから成る。骨の石灰化は、有機相と無機相との緻密な結合に依存し、その結果鉱化した組織が作られる。
【０００３】
骨増殖の過程は構造的及び機械的ストレスに対抗できるように制御されている。骨の形成、維持、再吸収の過程に関与する細胞は、造骨細胞（osteoblast）と、骨細胞（osteocyte)と、破骨細胞（osteoclast）である。造骨細胞は骨の有機マトリックスである類骨（osteoid)を合成し、この類骨はリン酸カルシウム結晶の成長とコラーゲンの集積後石灰化された状態となる。骨細胞は骨無機質と細胞外体液との間のカルシウムとリン酸の流れを制御する。破骨細胞は骨を吸収する機能があり、骨再造形の過程に必須である。骨の形成と吸収の自然のバランスが崩れるとさまざまな骨障害が起こる。破骨細胞活性の増加は、骨粗しょう症、線維性骨炎、ページェット病にみられるような骨密度の低下が特徴的な骨疾患を来すことが証明されている。これらの疾患はすべて骨吸収増加の結果である。
【０００４】
骨細胞機能の制御に関与しているメカニズムを理解するために、骨細胞（bone cell)の正常機能と、さまざまな骨疾患におけるこの活性の混乱の程度も測定できることが重要である。そうすれば異常な骨細胞活性を正常水準内に取り戻すことを目的とする薬剤を同定することができるようになるだろう。
【０００５】
単離した破骨細胞の活性を生体外（in vitro）で直接観察する方法がいくつかの研究グループによって開発されている。骨髄細胞群から単離された破骨細胞を、マッコウクジラぞうげ質（Boyde ら、Brit. Dent. J. 156, 216, 1984)または骨（Chambersら、J. Cell Sci. 66, 383, 1984）などの自然物質の薄い切片上で培養した。後者の研究グループは、この吸収活性は単核食細胞群のその他の細胞にはないことを証明することができた（Chambers及びHorton、Calcif Tissue Int. 36, 556, 1984）。破骨細胞系統の研究にこれらとは別の細胞培養法を利用しようという最近の試みも、やはり皮質薄片を利用することに頼っており（Amano ら及び Kerbyら、Bone & Min. Res. 7(3))、その吸収活性の定量は、さまざまな深度の吸収ピット面積の二次元分析、または吸収容積の立体マッピングに基づいて行われている。このような方法を用いて、比較的厚い下層の吸収を評価するならば、精度はせいぜい５０％ほどである。そのうえこれらの分析方法は非常に時間もかかり、非常に専門的な装置と訓練が必要である。さらに、骨またはぞうげ質薄片の調製とその後の検査は、破骨細胞活性の測定法として容易でもなく実用的でもない。
【０００６】
破骨細胞培養のための基層として、人工的なリン酸カルシウム標品を用いることもこれまでほとんど成功しなかった。Jones ら（Anat. Embryol 170, 247, 1984）は、破骨細胞は合成アパタイトを生体外で吸収すると報告したが、この観察所見を裏付ける実験的証拠は提示できなかった。Shimizuら（Bone and Mineral 6, 261, 1989）は、単離した破骨細胞は失活させた骨表面のみ吸収し、合成カルシウムヒドロキシアパタイトは吸収しないと報告している。これらの成績は、機能的破骨細胞は生体外で培養が困難であることを示唆しているものと思われる。
【０００７】
出願人の公表された国際ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９４／２６８７２号公報には、薄膜上に骨細胞機能が発生するリン酸カルシウム材の薄膜を形成する焼結工程について述べられている。これは破骨細胞が薄層上で活性を拡大することができる最初の合成材料の薄層であると考えられる。前記出願の中で述べられているように、この薄膜におけるヒドロキシアパタイト対リン酸三カルシウムの好ましい比を得るためには、さまざまな要因を考慮すべきである。そのような要因として次のようなものが挙げられる。
１）ヒドロキシアパタイト含有ゾル−ゲル調製のための試薬の量
２）試薬の混合速度
３）ゾル−ゲル作成時の混合時間と撹拌速度
４）沈澱及び分離の速度と方法
５）ゾル−ゲル製造中の工程環境条件
６）その上に膜を浸せきコーティングするときのゾル−ゲルから基層を除去する速度
７）焼結温度
８）不活性ガス、真空、水蒸気存在下雰囲気など制御した雰囲気での焼結。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、上記の先行ＰＣＴ特許出願では、ヒドロキシアパタイト対リン酸三カルシウムの広範囲の比率を得るために、これらの要因の多くを１０：９０から９０：１０までの比率を達成するように検討する必要があることが示唆された。大気中焼結温度としては約８００℃から約１１００℃が示唆された。８００℃では薄膜は圧倒的にヒドロキシアパタイトが多いこと、即ち約９０：１０の比率であることが確立された。約９００℃の焼結温度では約７０：３０の比率となった。１０００℃ではこの比率は約１０：９０で、１１００℃では薄膜は圧倒的にリン酸三カルシウムが多かった。さらに、１０００℃で真空中焼結すると約６６：３４の比率となることも示唆された。今では好ましい比率は５０：５０から２０：８０であることが判明している。最適比率は約３３３：６６６である。上記の要因のうち数個の要因を考慮してこのような比率を達成することができる。しかし上記の要因のうち数個の変動を最小限にとどめ、厳密な再現性のある方法で最適な膜組成のための好ましい比率を達成することが望ましい。
【０００９】
出願人の公表されたＰＣＴ出願第ＷＯ９４／２６８７２号公報に記載された標準的方法に従い、発見された厳密な焼結温度と組み合わせてゾル−ゲル形成を行うことにより、上記の最適範囲の選ばれた望ましい比率を達成することができることを、出願人たちは現在見いだした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一態様によれば、薄膜上で骨細胞活性を支えることができるリン酸カルシウム材からなる薄膜の製造工程（このとき該薄膜は基層上に作られる）は、ｉ）リン酸アンモニウム溶液と硝酸カルシウム溶液を混合し、ヒドロキシアパタイト含有ゾル−ゲルを形成させることによってゾル−ゲルを調製する段階と、
ｉｉ）基層の少なくとも片側にゾル−ゲルの膜を当てがう段階と、
ｉｉｉ）基層にコーティングした膜を焼結し、リン酸カルシウム材の固体膜を形成する段階とを含み、
改良点として、
ｉｖ）膜中のリン酸カルシウム材の組成が最適になる温度範囲から選んだ温度で膜を焼結し、この焼結段階は膜のヒドロキシアパタイトをαリン酸三カルシウムに変換する段階であり、そのような変換の程度は温度依存性であること、
ｖ）最適な組成はヒドロキシアパタイト対αリン酸三カルシウムが５０：５０から２０：８０の範囲にあること、
ｖｉ）焼結温度を９２０℃から１１００℃までの範囲から選ぶが、このとき焼結温度は高いほど、変換比率は上限比率２０：８０に近づくこと、
を含む。
【００１１】
本発明の他の態様によれば、９２０℃から９５０℃のあいだで選択した焼結温度では、比率は５０：５０から３３３：６６６の範囲になる。
【００１２】
本発明の他の態様によれば、１０００℃から１１００℃のあいだで選択した焼結温度では、比率は３３３：６６６から２０：８０の範囲になる。
【００１３】
本発明の他の態様によれば、約３３３：６６６の比率を得るために、焼結温度は、９５０℃から１０００℃の間にあり、好ましくは約９７５℃である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
５０：５０から２０：８０の望ましい範囲内にあるリン酸カルシウム材の薄膜を安定して製造するための重要な改良を本発明は提供する。ヒドロキシアパタイト含量の比率が２０％未満になると、αリン酸三カルシウムの存在比が高くなり、可溶性の問題があるため、安定でないことを我々は見いだした。ヒドロキシアパタイトが重量比で約５０％をこえると、この膜は安定ではあるが、正常な破骨細胞活性の分析の点で吸収成績の信頼性は低くなる。骨細胞活性の観点から最適比率は３３３：６６６であるが、骨細胞活性を詳細に調べた結果では、この比率の許容範囲は５０：５０から２０：８０である。出願人たちははからずも、同出願人たちのＷＯ９４／２６８７２公開公報に記載された標準的ゾル−ゲル製造法を用い特定の温度で焼結を行うことによって、望みの比率が達成できることを見いだし、このような比率は上記の公表出願にしたがって達成されたが、焼結条件その他のパラメータの変動がこの工程の再現性に影響することを見い出した。
【００１５】
本発明の理解をいっそう促すために、出願人の公開ＰＣＴ出願第ＷＯ９４／２６８７２号公報を参照することもでき、その内容は引用することにより本明細書の一部をなすものとする。本発明の改良部分を詳細に説明する前に、前記薄膜のさまざまな背景を述べることが重要である。
【００１６】
本発明に従った適当な支持体に乗せた薄膜は、骨細胞機能的性質の研究と理解を大いに前進させた。本発明に従って作成した膜の構成は、その膜の上でさまざまなタイプの骨細胞の培養を可能にする。表面構成を調節して、破骨細胞活性の研究における膜のリン酸カルシウム材の吸収を、かなりの程度から無視できる程度にまでにすることができる。同様に造骨細胞活性は骨様物質の蓄積を検出することによって研究することができる。破骨細胞による材の吸収を、吸収されたリン酸カルシウム材の消失によって検出できる程じゅうぶんに薄い膜状物質を提供できるため、先行技術に比べて単純で廉価な分析方法が得られる。本発明に従って作成された組成の膜は、骨細胞の生物学的機能をサポートできる。石英やガラスなどの透明な支持基層上に膜を作ることができるという利点があるため、診断過程での評価が容易に行える。
【００１７】
理想的には、膜厚は０．１ミクロンを超えるが、膜厚が０．１ミクロン未満では、離散したボイドのない均一な膜被覆が難しいからである。膜の厚みの上限についてはその最終用途によって所望の厚みでよい。後に考察するつもりであるが、吸収程度は光の透過によって検出され、そのためには厚みが１０ミクロン未満の膜が望ましい。望ましくは基層は石英またはその他の熱的に耐性な材質のものがよいが、その理由はこの基層にいったん当てがった膜は、焼結が必要であるからである。その他の材質として、金属、ポリマー、膜材質以外のセラミック材が挙げられる。ガラスを使ってよいのは、望みのタイプの膜を作るに必要な焼結程度を達成するために、ガラス表面を非常に高い温度まで短時間加熱するような表面焼結装置を用いて膜材質を焼結するときである。石英はこれらの温度に容易に耐え、膜材質からリン酸カルシウム材の吸収程度を測定するための光透過性テストを行うのに必要な透明度を有している。
【００１８】
開発されたこの薄膜は、骨細胞活性測定のためのキットなどで使うことができる。この膜は、付着性のリン酸カルシウム薄膜で予めコーティングされた石英基層（またはその他の適当な透明な支持体）で構成された「キット」として具体化され、これは混合した骨細胞群の培養に適した系として細胞培養容器（たとえば２４ウェルのマルチウェルプレート即ち直径が約１５ｍｍのもので滅菌は随意に行う）の中で使うことができる。この装置は単純であり、通常の実験室装置と通常の使用法のみに頼るもので、定量分析に適し作成経費は安いが通常の取扱いに耐えるほどの強度があり、プラスチック製の展示用箱に（例えば）２４試料ずつまとめて包装することができる。この薄膜表面は化学構成が定められその再現性があり、適当な包装材とともに使用すれば運搬に耐えるほどの物理的強度がある。
【００１９】
この装置のいくつかの改変例を特定の用途用に設計することができよう。例えば、それぞれの基層をプラスチック性の支持リングにいれて提供することができよう。このリングは包装間隔保持材として（したがって基層とともに滅菌される）だけでなく、培養基及び細胞が基層自体から拡散するのを防ぎ、したがって吸収活性の定量に都合のよいリップ（縁）としても採用することができるであろう。そのような保護リングは同一培養ウエルに複数の基層を同時に採用することを可能にする積み重ね装置としても利用できるであろう。後者はつぎに循環培地を補給される封入した培養容器に納めることができ、重力環境が低いまたはゼロの場合にも使うこともできよう。
【００２０】
いずれの場合も培養条件は、破骨細胞（単核形または多核形）が機能状態で生存し上記膜の人工的なリン酸カルシウムを吸収すると予測できるようなものである。
【００２１】
これらの基層は、破骨細胞の吸収活性を測定し、疾患進行の結果として、あるいは、培養基において、例えば直接的または間接的に破骨細胞吸収活性に影響すると思われる薬剤のような物質の封入の結果として、この吸収活性程度の変化を監視するのに使用できる。
【００２２】
この装置は、破骨細胞の吸収活性の定量手段として、または造骨細胞の活性による骨様物質の増強の定量手段として利用できる。そのような活性分析は、連続リアルタイム監視中、低速度撮影期間中、エンドポイント決定時に行われる。破骨活性定量のステップは、骨細胞（動物やヒトの）が特定条件下で一つ以上の装置で培養されるという点で上記の監視スケジュールのいずれにも共通である。培養期間は数時間から何日間にも及び、望ましくは約２〜１０日間であり（最適時間は細胞の種類及び実験条件によって左右される）、この期間中破骨細胞活性の程度を連続的に監視してもよいし、定期的に監視してもよく、あるいは単に最終のエンドポイント測定の利用により進行中監視は行わないでもよい。同様に造骨細胞活性は骨様物質増強の程度を測定することによって観察できる。
【００２３】
純粋な、または実質的に純粋なヒドロキシアパタイトという条件は膜を作成するうえでより抜きのリン酸カルシウム材であると理解されていたが、我々は、ヒドロキシアパタイトが支配的な膜は破骨細胞及び造骨細胞の正常機能を促すものではなく、事実、破骨細胞存在下では活性はほとんど観察できないことを明らかにした。しかし、ヒドロキシアパタイト及びαリン酸三カルシウムを含むリン酸カルシウム材混合物を提供することによって、吸収の程度は広範囲にわたる。すなわち、αリン酸三カルシウムが支配的な膜では吸収程度が最高であるが、ヒドロキシアパタイトが支配的な膜では吸収の度合いは無視できるほどである。本発明によれば、αリン酸三カルシウムについてのこの理解により、他のリン酸カルシウム膜がその膜上で培養されている破骨細胞の機能的性質を促すことができないということが説明できる。この態様は、例えば光を透過させたり光を反射させる薄膜を提供する本発明のその他の態様と組み合わせて、本発明に従って膜上で培養されている骨細胞の機能的性質を評価するための診断過程の実施を可能にする。
【００２４】
意外にも、ゾル−ゲル調製を標準化し非常に特定の焼結温度範囲を選ぶと、所望の比率が達成されるばかりでなく、ゾル−ゲル工程によって調製されるヒドロキシアパタイトがαリン酸三カルシウムに変換されることによって最適な組成が形成されることも示している。これらの好ましい最適化された膜組成にはβ−リン酸三カルシウムはほとんどあるいは全く検出されていない。ヒドロキシアパタイトとαリン酸三カルシウムの組み合わせであるゾル−ゲルを調製する必要は全くない。そうではなく、ＰＣＴ出願第ＷＯ９４／２６８７２号公報に記載されているような技法がヒドロキシアパタイトのゾル−ゲル調製に十分である。ｐＨの高い媒質中でヒドロキシアパタイトが生まれる化学反応は次の通りである。
【００２５】
【化１】
2004209261.tif 000002
【００２６】
ヒドロキシアパタイトは中性やアルカリ性の媒質中では安定である。この反応媒質を高いｐＨ（通常は約１２）とすることが好ましい。リン酸塩溶液をカルシウム溶液に滴加して、三リン酸一水素四カルシウム（tetracalcium monohydrogen triphosphate）の形成を防ぎ、それによって所望のヒドロキシアパタイトの均一な生成物を得る。
【００２７】
ゾル−ゲルがいったん調製されると、さまざまな技法によって基層に薄膜としてそれを当てがうことができる。例えば、浸せきコーティング法（C.J. Brinker他、Fundamentals of Sol-Gel Dip Coating, Thin Solid Films, Vol.201, No.1, 97-108, 1991)は、次のような一連の工程から成る。即ち、基層をゾルまたは溶液から一定速度で除去し、コーティングされた液体膜を適当な温度で乾燥し、膜を最終セラミックに焼成する。
【００２８】
スピンコーティング法の場合、上記ゾル−ゲルを、遠心運動によって溶液を均一に分布するのに十分な速度で回転しているプレート上に滴下する。その後の処理は浸せきコーティング法と同じである。
【００２９】
幸いにも、このほかに上記ゾル−ゲルの薄膜を基層に当てがうために利用できるさまざまな技法がある。これらの技法として、上記ゾル−ゲルのスプレー法、上記ゾル−ゲルのローラーコーティング法、上記ゾル−ゲルの拡散法、上記ゾルーゲルのペイント法などが挙げられる。
【００３０】
個々のサイズの個々のディスクをコーティングする代わりに、広範囲の基層を上記ゾル−ゲルの膜でコーティングすることもできる。そして基層上の膜全体を焼結する。次に格子のような装置をこの膜の上に当てがい、多数の個々の検査域に分ける。この方法に関する改良は出願人の同時出願中の米国出願「骨細胞活性測定に使用するためのマルチウエル骨細胞培養装置」（出願番号第０８／５１８９１２号、出願日１９９５年８月２４日）に記述されている。
【００３１】
これらのさまざまな技法でゾル−ゲルを当てがう際に、形成される膜の厚みと品質（孔度、微細構造、結晶状態、均一性）は、多数の要因の影響を受ける。そのような要因として、出発ゾルの物性、組成、濃度、基層表面の清浄度、基層の除去速度、焼成温度などがある。一般に厚みは、浸せきコーティング工程については、主として除去速度及びゾル粘度に依存する。ゾルの不均一は肉眼で認められるほどの孔やひびの形成の原因となるため、コーティング操作はゾルの汚染を避けるためにクリーンルームで行うべきである。熱処理段階では、望みの微細構造を作るには高温が必要である。
【００３２】
リン酸カルシウム膜を作成するために浸せきコーティング法を利用する目的は次の三つである。即ち（ａ）要求品質（均一性、厚み、孔度、など）を持った膜を作ること、（ｂ）生物学的実験用に、透明な基層上に半透明なリン酸カルシウム膜を作ることである。
【００３３】
意外にも、ヒドロキシアパタイトの乾燥膜の焼結は炉の雰囲気を制御する必要なく、標準タイプの高温炉で行うことができることが見いだされた。新しい炉を使うか、他の目的のために前回使用したために炉が汚染されている場合、炉を空にして、焼結温度範囲で数回サイクル運転するのが好ましい。このような炉の予備調整によって揮発物質があれば除かれ、利用準備が整う。これ以外のステップは必要でない。このなじみ運転期間中、及びコーティングした基層の焼結のために正常使用中は、炉には大気があり、大気の存在は工程の妨げとはならず、所望の比率が一定して得られる。これらの条件下、焼結温度は９２０℃から最高１１００℃までで所望の比率５０：５０〜２０：８０が得られる。温度が上がればヒドロキシアパタイトからαリン酸三カルシウムへの変換も増加することが認められている。９２０℃〜９５０℃の範囲の焼結温度では比率は５０：５０から３３３：６６６に向かって変動する。９５０℃〜１０００℃の範囲内で選ばれた焼結温度では比率は約３３３：６６６である。１０００℃を超え最高１１００℃まで温度を上げると、変換がさらに進み、３３３：６６６〜２０：８０の範囲の比率の組成物が生成する。
【００３４】
好ましい焼結温度は約９７５℃で、このとき３３３：６６６の比率が達成される。
【００３５】
次の諸手順は、焼結薄膜について所望の最適組成を達成するために本発明の好ましい具体例を示す。
【実施例１】
【００３６】
手順１
次の手順は有限数の基層ディスクをコーティングするに十分なゾル−ゲルの調製に基づいて行われる。前記の化学反応に従って、溶液Ａは硝酸カルシウム、好ましくは硝酸カルシウム四水和物を含む。溶液Ｂはリン酸アンモニウム、好ましくはオルトリン酸二水素アンモニウム（ammonium dihydrogen orthophosphate）（一塩基酸）を含む。溶液Ａを溶液Ｂと混合して目的のゾル−ゲルである溶液Ｃを生成する。溶液Ａは２回蒸留した水４０ｍｌを硝酸カルシウム（Ｃａ（ＮＯ３）２）４．７２２グラムに添加して作成する。この溶液を中等度の速度で硝酸カルシウムすべてを溶解するに充分な時間撹拌するが、これは通常は３分程度である。この溶液に水酸化アンモニア（ＮＨ４ＯＨ）３ｍｌを添加し、さらに約３分間ほど撹拌する。この溶液のｐＨを調べ、約１２のｐＨであることが望ましい。この溶液に２回蒸留した水３７ｍｌを添加し、全溶液量を約８０ｍｌとする。この溶液をさらに７分間撹拌し、カバーをかける。
【００３７】
溶液Ｂは２回蒸留した水６０ｍｌを、１．３８２グラムのＮＨ４Ｈ２ＰＯ４を含む２５０ｍｌ容のビーカーに加えて作成する。このビーカーにカバーをかけ、中等度の速度ですべてのＮＨ４Ｈ２ＰＯ４が溶解するまで３〜４分間撹拌する。この溶液にＮＨ４ＯＨを７１ｍｌ加え、次にこのビーカーにカバーをかけさらに７分間ほど撹拌を続ける。この溶液のｐＨを調べ、約１２のｐＨが望ましい。これにさらに２回蒸留した水６１ｍｌを加え、ビーカーにカバーをする。全溶液量は約１９２ｍｌとなる。次にこの溶液をさらに７分間撹拌し、カバーをかける。
【００３８】
次に所望のゾル−ゲルを溶液Ｂと溶液Ａとを合わせて作成する。溶液Ａの全部を５００ｍｌ容の試薬瓶に入れる。撹拌を中等度の速度で開始し、溶液Ｂの全部１９２ｍｌを、この試薬瓶の中に毎時約２５６ｍｌの速度で溶液Ａに添加する。２５０ｍｌのビーカー内や移す過程で使用した管などに残っているかもしれない溶液を補充するために過剰の溶液Ｂを用いてもよい。この添加と溶液Ｂの溶液Ａへの添加が終了したのち、生じた溶液を中等度の速度で約２３〜２４時間撹拌する。生じたゾル−ゲルに異常な沈澱や塊がないか調べる。異常な沈澱や塊が発生していた場合は、その溶液は廃棄し調製を再び開始しなければならない。次にこのゾルを、このゾルが入っている試薬瓶の壁に存在するかもしれない粒子状の塊が入り込まないように、慎重に別の５００ｍｌの試薬瓶に移す。生じたゾルである溶液Ｃの約２４０ｍｌを遠心管に入れ、室温で約５００ｒｐｍで２０分間遠心する。遠心後、上清１８０ｍｌを沈渣を乱さないように廃棄する。約３０分間なめらかに回転しながら混合することによって沈渣を静かに再懸濁する。次にこのゾルの粘度を測定し、２０〜６０ｃＰの範囲であることが好ましい。こうしてゾルは選んだ基層の浸せきコーティングに使える状態になっている。
【００３９】
手順２
好ましい基層としての石英ディスクの洗浄。いくつかのディスクをガラス製ビーカーに入れ、すべてのディスクがおおわれるようにクロム酸洗浄液をこのガラス製ビーカーに入れる。次にこのビーカーに蓋をする。つぎにディスクを水浴中で１時間超音波処理する。上記の酸を水道水で２０分間洗い流す。残っている水道水は２回蒸留した水で３回リンスして除去する。２回蒸留水の最後のリンス後、個々のディスクを糸くずのないタオルで拭きとり、石英表面にきずがないか調べる。表面に残っている微粒子があれば必要に応じて圧縮窒素または空気で取り除く。このディスクをカバーをかけたトレー内に無菌環境で保存する。
【００４０】
手順３
好ましい基層としての石英ディスクを手順１で作成したゾルに浸す。ディスクは表面に触れないようにしてつかむ。ディスクは好ましくは機械によってゾルに浸す。ディスクを所定の除去速度でゾルから取り出す。ディスクの片側のコーティングを除去する。次にコーティングされた基層を清潔なペトリ皿に入れ、蓋をし、室温で乾燥する。焼結前に形成された状態の膜は亀裂、塊、ボイドのない均一なものでなければならない。ディスクの面に施されたこの浸漬コーティング工程は他の形の基層、例えば平坦な四角形の石英基層にも適用できると理解される。
【００４１】
手順４
次の焼結工程は、環境温度から少なくとも１１００℃までの温度で操作でき、特に８００℃〜１１００℃のあいだで正確で安定した内部温度を維持するように設計されたさまざまなサイズの標準的実験室用炉で行うことができる。そのような炉として例えばＬｉｎｄｂｅｒｇモデル５１７４４または８９４−Ｂｌｕｅ
Ｍが挙げられる。手順３で作成したコーティングした基層を、標準的セラミック製プレートの上に（上記のＬｉｎｄｂｅｒｇ炉では一般に行われるように）の上に、コーティングされた面に触れないようにして、例えばピンセットを用いて慎重に移す。このセラミック製プレートは、多数の基層を炉に入れやすいように、またそこから取り出しやすいように焼結工程中キャリヤーとして用いる。炉温度は望みのＨＡ：αＴＣＰ比率を達成するのに必要な温度に設定する。Ｌｉｎｄｂｅｒｇモデル８９４−Ｂｌｕｅ  Ｍのようなプログラミング可能な炉を用いると、通常は９２０℃〜１１００℃のあいだで選ばれる所望の温度を、典型的な場合１時間をこえることなく炉が維持するように設定することができる。プログラミングできない炉の場合、別個にタイマーを用いて、選んだ温度で必要な焼結時間の終わりに操作者に炉を切るよう警告させる。炉の運転を開始し、必要な操作温度まで加熱していくとき、基層を乗せたセラミック製プレートを、炉が例えば８００℃という焼結温度に近づいた時点で炉に入れる。そして炉の扉を直ちに再び閉める。炉が必要な時間のあいだ選んだ操作温度になるようにし、次に運転を自動的または手動で終わらせる。焼結した基層を乗せたセラミック製プレートは炉内温度が約６０℃の触れてもがまんできる安全な温度まで冷えてからいつでも取り出してよい。つぎに個々の基層は保存してもよく、最終の用途に向けて包装してもよい。
【００４２】
この改良方法により、ヒドロキシアパタイト／αリン酸三カルシウムの薄膜は、一貫性を確保するためにさまざまな加工パラメータの変動を最小限に抑えれば、一貫して所望の組成を有するものを生産することができる。
【００４３】
本発明の好ましい具体例をここに詳細に述べてあるが、本発明の技術的思想または添付の特許請求の範囲から逸脱することなくこれに変更を加えることができることは、技術に熟練した人たちにより理解されるであろう。
【手続補正書】
【提出日】平成16年2月25日(2004.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）リン酸アンモニウムの溶液を硝酸カルシウムの溶液と混合してヒドロキシアパタイト含有ゾル−ゲルを形成することによるゾル−ゲルの調製段階と、
ｉｉ）前記ゾル−ゲルの膜を基層の少なくとも片側にとりつけ、該基層上にコーティングされた該膜を約８００〜１１００℃の炉に入れる段階と、
ｉｉｉ）上記基層上にコーティングされた上記膜を焼結して、破骨細胞によって再吸収可能なリン酸カルシウム材の固体膜を形成する段階と
を含んでなる方法であって、
ｉｖ）上記膜内のリン酸カルシウム材の組成を最適にする、９２０〜１１００℃の温度範囲から選んだ温度で大気の存在下で上記膜を焼結し、ヒドロキシアパタイトをαリン酸三カルシウムに、ヒドロキシアパタイトのαリン酸三カルシウムに対する比率を５０：５０〜２０：８０の範囲で変換すること、
を特徴とする、リン酸カルシウム材の薄膜を、その上での骨細胞活性を支えるために透明な基層上に作成する方法。
【請求項２】
上記選定温度を９５０℃〜１０００℃とし、約３３３：６６６の比率を達成する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記選定温度を約１１００℃とし、２０：８０の比率を達成する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記選定温度を９２０℃〜９５０℃とし、５０：５０〜３３３：６６６の範囲の比率を達成する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記選定温度を１０００℃〜１１００℃とし、３３３：６６６〜２０：８０の範囲の比率を達成する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
上記選定温度を約９７５℃とし、３３３：６６６の比率を達成する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
破骨細胞が、リン酸カルシウム材の上記固体膜の上にシードされ、該膜の再吸収が分析される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
造骨細胞が、リン酸カルシウム材の上記固体膜の上にシードされ、分泌骨様物資が分析される請求項１に記載の方法。