(57)【要約】【課題】本発明は、ＰＰＡＲδの転写調節活性を、特異的に評価することができる方法の提供を課題とする。また本発明は、この方法に基づくスクリーニング方法の提供を課題とする。【解決手段】ＰＰＡＲδ、ＲＸＲ、およびＰＰＡＲδのコアクチベータを発現する細胞を利用して、ＰＰＡＲδの転写調節活性を測定するための方法が提供された。コアクチベータの供給によって、ＰＰＡＲδはよりｉｎ　ｖｉｖｏに近い転写調節活性を獲得する。その結果、被験化合物が転写調節活性に与える影響を、より特異的に評価することができる。またこの方法に基づくスクリーニング方法によって、生体内におけるＰＰＡＲδの転写調節活性の調節作用を有する被験化合物を、より確実に選択することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程を含む、被験化合物がＰＰＡＲδの転写調節活性に与える影響の測定方法。
（１）　次の特徴を有する細胞を提供する工程
−ＰＰＡＲδまたはＰＰＡＲδと機能的に同等な蛋白質を発現する
−ＲＸＲまたはＲＸＲと機能的に同等な蛋白質を発現する
−ＰＰＡＲδのコアクチベータとして作用する蛋白質を発現する、および
−ＰＰＡＲδの応答配列の制御下にシグナルを生成する
（２）　（１）の細胞に被験化合物を接触させる工程、および
（３）　（２）の細胞のシグナルを測定し、被験化合物がＰＰＡＲδの転写調節活性に与える影響の大きさと関連付ける工程
【請求項２】
ＰＰＡＲδのコアクチベータとして作用する蛋白質が、ＣＢＰおよび／またはＳＲＣ−１である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＰＡＲδの応答配列がＰＰＲＥである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
次の蛋白質がいずれも外来性の蛋白質である請求項１に記載の方法。
−ＰＰＡＲδまたはＰＰＡＲδと機能的に同等な蛋白質
−ＲＸＲまたはＲＸＲと機能的に同等な蛋白質、および
−ＰＰＡＲδのコアクチベータとして作用する蛋白質
【請求項５】
次の工程を含む、ＰＰＡＲδの転写調節活性を調節する作用を有する化合物のスクリーニング方法。
（１）　請求項１に記載の方法によって、被験化合物がＰＰＡＲδの転写調節活性に与える影響を測定する工程、および
（２）　対照と比較してシグナルを上昇または低下させる被験化合物を選択する工程
【請求項６】
ＰＰＡＲδまたはＰＰＡＲδと機能的に同等な蛋白質が外来性の蛋白質であり、対照が外来性のＰＰＡＲδまたはＰＰＡＲδと機能的に同等な蛋白質を発現していない細胞である請求項５に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
次の特徴を有する、ＰＰＡＲδの転写調節活性に与える影響を評価するための細胞。
−ＰＰＡＲδまたはＰＰＡＲδと機能的に同等な蛋白質を発現する
−ＲＸＲまたはＲＸＲと機能的に同等な蛋白質を発現する
−ＰＰＡＲδのコアクチベータとして作用する蛋白質を発現する、および
−ＰＰＡＲδの応答配列の制御下にシグナルを生成する
【請求項８】
ＰＰＡＲδまたはＰＰＡＲδと機能的に同等な蛋白質が、外来性の遺伝子の発現によってもたらされる請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
次の要素を含む、ＰＰＡＲδの転写調節活性に与える影響を評価するためのキット。
（１）ＰＰＡＲδの応答配列の制御下にシグナルを生成する細胞、
（２）（１）の細胞に形質転換することによって、細胞において次の蛋白質を発現するためのベクター
−ＰＰＡＲδまたはＰＰＡＲδと機能的に同等な蛋白質
−ＲＸＲまたはＲＸＲと機能的に同等な蛋白質、および
−ＰＰＡＲδのコアクチベータとして作用する蛋白質
（３）（１）の細胞を培養するための培地
【請求項１０】
次の要素を含む、ＰＰＡＲδの転写調節活性に与える影響を評価するためのキット。
（１）請求項７に記載の細胞、および
（２）（１）の細胞を培養するための培地
【請求項１１】
更に次の要素を含む請求項９または請求項１０に記載のキット。
（３）　外来性のＰＰＡＲδまたはＰＰＡＲδと機能的に同等な蛋白質を発現していない細胞
【請求項１２】
請求項５に記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を有効成分として含むＰＰＡＲδの活性調節剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＰＰＡＲδの転写調節活性を評価する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核に局在し、リガンドに依存して転写調節活性が誘導される転写調節因子を核内受容体と言う。一般に核内受容体は、ＤＮＡ結合ドメイン、リガンド結合ドメイン等の特徴的な構造を有する。ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下ＰＰＡＲと省略する）は核内ホルモン受容体スーパーファミリーのひとつである。ＰＰＡＲは、リガンドの結合により活性化されるとレチノイドＸ受容体（ｒｅｔｉｎｏｉｄ　Ｘ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下ＲＸＲと省略する）と複合体を形成して転写活性を獲得する。なおＲＸＲには、ＲＸＲα、ＲＸＲβ、およびＲＸＲγなどのサブタイプが知られている。転写活性を獲得したＰＰＡＲは、ペルオキシソーム増殖剤応答配列　（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ、以下ＰＰＲＥと省略する）　に結合して、その下流の遺伝子の発現を誘導する。ＰＰＡＲは、脂質代謝を含む多くの生理機能の重要な調節因子であることが明らかになってきた。そして、ＰＰＡＲの機能の調節によって、様々な生理機能をコントロールできる可能性があると考えられるようになった。実際に、ＰＰＡＲγを標的とする医薬品開発が活発に行われている。
【０００３】
ＰＰＡＲには、次に示す３つのサブタイプの存在が明らかにされている。
ＰＰＡＲα
ＰＰＡＲδ（ＰＰＡＲβあるいはＮＵＣ１とも呼ばれる）、および
ＰＰＡＲγ
更にＰＰＡＲγについては、転写開始点とスプライシングの違いによってアミノ酸配列が相違するＰＰＡＲγ１とＰＰＡＲγ２の存在が知られている。ＰＰＡＲの各サブタイプの発現組織やリガンドは異なっている。たとえばＰＰＡＲαは肝臓、心筋、腸および腎近位尿細管での発現が高い。一方ＰＰＡＲδの発現は多くの組織で見られ、αやγよりも発現レベルが高い場合もある。ＰＰＡＲγは主に脂肪組織および免疫系で発現している。こうした発現特性の違いは、ＰＰＡＲサブタイプが異なる生理的役割を持つことを示唆している。
【０００４】
さて、ＰＰＡＲの活性を調節する化合物を見出し、薬剤として開発するためには、その活性を正しく評価するための方法が必要である。転写活性あるいは転写調節活性を評価するための方法として、レポータジーンアッセイが知られている。レポータジーンアッセイには、転写調節因子の認識配列とレポータ遺伝子を含むレポータコンストラクトを導入した細胞が用いられる。レポータ遺伝子には、測定可能なシグナルを生成する蛋白質をコードする遺伝子が用いられる。具体的には、ＧＦＰのような蛍光シグナル生成蛋白質などがよく利用されている。この細胞において、活性を評価すべき転写調節因子の発現を誘導すれば、その転写調節活性に応じてシグナルが生成される。シグナルの生成レベルは、転写調節因子の活性レベルを反映しているので、レポータジーンアッセイによって、リガンドやコアクチベータの同定、転写調節活性を調節する作用を有する化合物の選択などが可能となる。
【０００５】
ＰＰＡＲのためのレポータジーンアッセイは公知である。たとえばＧａｌ４−ＰＰＡＲδ（ＮＵＣ１）融合蛋白質を利用したレポータジーンアッセイが報告されている（文献１：Ｌｅｈｍａｎｎ　ＪＭ，　Ｍｏｏｒｅ　ＬＢ，　Ｓｍｉｔｈ　Ｏｌｉｖｅｒ　ＴＡ，　Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ　ＷＯ，　Ｗｉｌｌｓｏｎ　ＴＭ，　＆　Ｋｌｉｅｗｅｒ　ＳＡ．　Ａｎ　ａｎｔｉｄｉａｂｅｔｉｃ　ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅ　ｉｓ　ａ　ｈｉｇｈ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｌｉｇａｎｄ　ｆｏｒ　ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　γ　（ＰＰＡＲγ）．　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７０（１９９５）　１２９５３−１２９５６．）。この方法は酵母が有するＧａｌ４転写系を利用したワンハイブリッドレポータジーンアッセイである。すなわち、この方法においては、ＰＰＡＲが酵母の転写系を駆動する作用が評価される。
【０００６】
更に、ＰＰＲＥと非修飾ＰＰＡＲδを利用したアッセイ法も知られている（文献２：Ｄｒｅｙｅｒ　Ｃ，　Ｋｒｅｙ　Ｇ，　Ｋｅｌｌｅｒ　Ｈ，　Ｇｉｖｅｌ　Ｆ，　Ｈｅｌｆｔｅｎｂｅｉｎ　Ｇ，　＆　Ｗａｈｌｉ　Ｗ．　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ　β−ｏｘｉｄａｔｉｏｎ　ｐａｔｈｗａｙ　ｂｙ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．　Ｃｅｌｌ　６８　（１９９２）　８７９−８８７．、文献３：Ｋｌｉｅｗｅｒ　ＳＡ，　Ｆｏｒｍａｎ　ＢＭ，　Ｂｌｕｍｂｅｒｇ　Ｂ，　Ｏｎｇ　ＥＳ，　Ｂｏｒｇｍｅｙｅｒ　Ｕ，　Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ　ＤＪ，　Ｕｍｅｓｏｎｏ　Ｋ，　＆　Ｅｖａｎｓ　ＲＭ．　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　ｍｕｒｉｎｅ　ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｏｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ　９１　（１９９４）　７３５５−７３５９．、文献４：Ｄｅｖｃｈａｎｄ　ＰＲ，　Ｋｅｌｌｅｒ　Ｈ，　Ｐｅｔｅｒｓ　ＪＭ，　Ｖａｚｑｕｅｚ　Ｍ，　Ｇｏｎｚａｌｅｚ　ＦＪ，　＆　Ｗａｈｌｉ　Ｗ．　Ｔｈｅ　ＰＰＡＲα−ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ　Ｂ４　ｐａｔｈｗａｙ　ｔｏ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｎａｔｕｒｅ　３８４　（１９９６）　３９−４３．、文献５：Ｆｏｒｍａｎ　ＢＭ，　Ｃｈｅｎ　Ｊ，　＆　Ｅｖａｎｓ　ＲＭ．　Ｈｙｐｏｌｉｐｉｄｅｍｉｃ　ｄｒｕｇｓ，　ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄｓ，　ａｎｄ　ｅｉｃｏｓａｎｏｉｄｓ　ａｒｅ　ｌｉｇａｎｄｓ　ｆｏｒ　ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ａ　ａｎｄ　ｄ．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ　９４　（１９９７）　４３１２−４３１７．、文献６：　Ｂａｓｕ　Ｍｏｄａｋ　Ｓ，　Ｂｒａｉｓｓａｎｔ　Ｏ，　Ｅｓｃｈｅｒ　Ｐ，　Ｄｅｓｖｅｒｇｎｅ　Ｂ，　Ｈｏｎｅｇｇｅｒ　Ｐ，　＆　Ｗａｈｌｉ　Ｗ．　Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　β　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ａｃｙｌ−ＣｏＡ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ　２　ｉｎ　ｒｅａｇｇｒｅｇａｔｅｄ　ｒａｔ　ｂｒａｉｎ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ．　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７４　（１９９９）　３５８８１−３５８８８．、文献７：　Ｈｅ　ＴＣ，　Ｃｈａｎ　ＴＡ，　Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ　Ｂ，　＆　Ｋｉｎｚｌｅｒ　ＫＷ．　ＰＰＡＲδ　ｉｓ　ａｎ　ＡＰＣ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｔａｒｇｅｔ　ｏｆ　ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ　ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｄｒｕｇｓ．　Ｃｅｌｌ　９９　（１９９９）　３５３−３４５．）。
ＰＰＲＥはＰＰＡＲδの認識応答配列である。また融合蛋白質でなく、全長のＰＰＡＲδが利用されている。したがって、これらのアッセイ法は、より生体内での転写システムを忠実に再現するためのアッセイ法であると言うことができる。
【０００７】
【文献１】Ｌｅｈｍａｎｎ　ＪＭ，　Ｍｏｏｒｅ　ＬＢ，　Ｓｍｉｔｈ　Ｏｌｉｖｅｒ　ＴＡ，　Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ　ＷＯ，　ＷｉｌｌｓｏｎＴＭ，　＆　Ｋｌｉｅｗｅｒ　ＳＡ．　Ａｎ　ａｎｔｉｄｉａｂｅｔｉｃ　ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅ　ｉｓ　ａ　ｈｉｇｈ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｌｉｇａｎｄ　ｆｏｒ　ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　γ　（ＰＰＡＲγ）．　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７０　（１９９５）　１２９５３−１２９５６．）
【文献２】Ｄｒｅｙｅｒ　Ｃ，　Ｋｒｅｙ　Ｇ，　Ｋｅｌｌｅｒ　Ｈ，　Ｇｉｖｅｌ　Ｆ，　Ｈｅｌｆｔｅｎｂｅｉｎ　Ｇ，　＆　ＷａｈｌｉＷ．　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ　β−ｏｘｉｄａｔｉｏｎ　ｐａｔｈｗａｙ　ｂｙ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆｎｕｃｌｅａｒ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．　Ｃｅｌｌ　６８　（１９９２）　８７９−８８７．
【文献３】Ｋｌｉｅｗｅｒ　ＳＡ，　Ｆｏｒｍａｎ　ＢＭ，　Ｂｌｕｍｂｅｒｇ　Ｂ，　Ｏｎｇ　ＥＳ，　Ｂｏｒｇｍｅｙｅｒ　Ｕ，　Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ　ＤＪ，　Ｕｍｅｓｏｎｏ　Ｋ，　＆　Ｅｖａｎｓ　ＲＭ．　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　ｍｕｒｉｎｅ　ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｏｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ　９１　（１９９４）　７３５５−７３５９．
【文献４】Ｄｅｖｃｈａｎｄ　ＰＲ，　Ｋｅｌｌｅｒ　Ｈ，　Ｐｅｔｅｒｓ　ＪＭ，　Ｖａｚｑｕｅｚ　Ｍ，　Ｇｏｎｚａｌｅｚ　ＦＪ，　＆Ｗａｈｌｉ　Ｗ．　Ｔｈｅ　ＰＰＡＲα−ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ　Ｂ４　ｐａｔｈｗａｙ　ｔｏ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ．　Ｎａｔｕｒｅ　３８４　（１９９６）　３９−４３．
【文献５】Ｆｏｒｍａｎ　ＢＭ，　Ｃｈｅｎ　Ｊ，　＆　Ｅｖａｎｓ　ＲＭ．　Ｈｙｐｏｌｉｐｉｄｅｍｉｃ　ｄｒｕｇｓ，　ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄｓ，　ａｎｄ　ｅｉｃｏｓａｎｏｉｄｓ　ａｒｅ　ｌｉｇａｎｄｓ　ｆｏｒ　ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ａ　ａｎｄ　ｄ．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ　９４　（１９９７）　４３１２−４３１７．
【文献６】Ｂａｓｕ　Ｍｏｄａｋ　Ｓ，　Ｂｒａｉｓｓａｎｔ　Ｏ，　Ｅｓｃｈｅｒ　Ｐ，　Ｄｅｓｖｅｒｇｎｅ　Ｂ，　Ｈｏｎｅｇｇｅｒ　Ｐ，　＆　Ｗａｈｌｉ　Ｗ．　Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　β　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ａｃｙｌ−ＣｏＡ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ　２　ｉｎ　ｒｅａｇｇｒｅｇａｔｅｄ　ｒａｔ　ｂｒａｉｎ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ．　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７４　（１９９９）　３５８８１−３５８８８．
【文献７】Ｈｅ　ＴＣ，　Ｃｈａｎ　ＴＡ，　Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ　Ｂ，　＆　Ｋｉｎｚｌｅｒ　ＫＷ．　ＰＰＡＲδ　ｉｓ　ａｎ　ＡＰＣ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｔａｒｇｅｔ　ｏｆ　ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ　ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｄｒｕｇｓ．　Ｃｅｌｌ　９９　（１９９９）　３５３−３４５．
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＰＰＡＲδの転写調節活性を、特異的に評価することができる方法の提供を課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
ＰＰＲＥと全長ＰＰＡＲδを組み合せた、ＰＰＡＲδの転写調節活性の測定方法は、Ｇａｌ４転写系を利用したワンハイブリッドレポータジーンアッセイに比べると生体内に近い状態を再現していると言うことができる。そこで本発明者らは、ＰＰＡＲδの活性を調節する作用を有する化合物のスクリーニング方法にこれらの方法の応用を試みた。ところがＰＰＡＲδの転写調節活性を評価するための既知のレポータジーンアッセイでは、ＰＰＡＲδのアゴニストの作用を正しく評価できないことが明らかになった。
【００１０】
本発明者らの研究によれば、ＰＰＡＲδの発現を誘導した細胞では、確かにアゴニストの投与量に応じたレポータ遺伝子の発現の増強が観察された。しかしＰＰＡＲδの発現を誘導しない細胞においても同様に、アゴニスト依存的なレポータ遺伝子の発現増強が観察された。しかも、レポータ遺伝子の発現レベルは、ＰＰＡＲδの発現を誘導しない細胞の方がはるかに高かった。これらの知見は、ＰＰＡＲδの転写調節活性を評価するための既知のレポータジーンアッセイでは、ＰＰＡＲδの活性に与えるアゴニストの作用を特異的に評価することはできないことを意味していた。
【００１１】
本発明者らは、既知のレポータジーンアッセイによってアゴニストの作用を評価できない理由として、ＲＸＲとコアクチベータの存在に着目した。そして、細胞内にＰＰＡＲδのみならず、ＲＸＲおよびＰＰＡＲδのコアクチベータを供給することによって、ＰＰＡＲδのアゴニストの作用を正しく評価できることを見出し本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の被験化合物がＰＰＡＲδの転写調節活性に与える影響の測定方法、並びにこの方法を利用した被験化合物のスクリーニング方法、そのための細胞、並びにキットを提供する。
〔１〕次の工程を含む、被験化合物がＰＰＡＲδの転写調節活性に与える影響の測定方法。
（１）　次の特徴を有する細胞を提供する工程
−ＰＰＡＲδまたはＰＰＡＲδと機能的に同等な蛋白質を発現する
−ＲＸＲまたはＲＸＲと機能的に同等な蛋白質を発現する
−ＰＰＡＲδのコアクチベータとして作用する蛋白質を発現する、および
−ＰＰＡＲδの応答配列の制御下にシグナルを生成する
（２）　（１）の細胞に被験化合物を接触させる工程、および
（３）　（２）の細胞のシグナルを測定し、被験化合物がＰＰＡＲδの転写調節活性に与える影響の大きさと関連付ける工程
〔２〕ＰＰＡＲδのコアクチベータとして作用する蛋白質が、ＣＢＰおよび／またはＳＲＣ−１である〔１〕に記載の方法。
〔３〕ＰＰＡＲδの応答配列がＰＰＲＥである〔１〕に記載の方法。
〔４〕次の蛋白質がいずれも外来性の蛋白質である〔１〕に記載の方法。
−ＰＰＡＲδまたはＰＰＡＲδと機能的に同等な蛋白質
−ＲＸＲまたはＲＸＲと機能的に同等な蛋白質、および
−ＰＰＡＲδのコアクチベータとして作用する蛋白質
〔５〕次の工程を含む、ＰＰＡＲδの転写調節活性を調節する作用を有する化合物のスクリーニング方法。
（１）　〔１〕に記載の方法によって、被験化合物がＰＰＡＲδの転写調節活性に与える影響を測定する工程、および
（２）　対照と比較してシグナルを上昇または低下させる被験化合物を選択する工程〔６〕ＰＰＡＲδまたはＰＰＡＲδと機能的に同等な蛋白質が外来性の蛋白質であり、対照が外来性のＰＰＡＲδまたはＰＰＡＲδと機能的に同等な蛋白質を発現していない細胞である〔５〕に記載のスクリーニング方法。
〔７〕次の特徴を有する、ＰＰＡＲδの転写調節活性に与える影響を評価するための細胞。
−ＰＰＡＲδまたはＰＰＡＲδと機能的に同等な蛋白質を発現する
−ＲＸＲまたはＲＸＲと機能的に同等な蛋白質を発現する
−ＰＰＡＲδのコアクチベータとして作用する蛋白質を発現する、および
−ＰＰＡＲδの応答配列の制御下にシグナルを生成する
〔８〕ＰＰＡＲδまたはＰＰＡＲδと機能的に同等な蛋白質が、外来性の遺伝子の発現によってもたらされる〔７〕に記載の細胞。
〔９〕次の要素を含む、ＰＰＡＲδの転写調節活性に与える影響を評価するためのキット。
（１）ＰＰＡＲδの応答配列の制御下にシグナルを生成する細胞、
（２）（１）の細胞に形質転換することによって、細胞において次の蛋白質を発現するためのベクター
−ＰＰＡＲδまたはＰＰＡＲδと機能的に同等な蛋白質
−ＲＸＲまたはＲＸＲと機能的に同等な蛋白質、および
−ＰＰＡＲδのコアクチベータとして作用する蛋白質
（３）（１）の細胞を培養するための培地
〔１０〕次の要素を含む、ＰＰＡＲδの転写調節活性に与える影響を評価するためのキット。
（１）〔７〕に記載の細胞、および
（２）（１）の細胞を培養するための培地
〔１１〕更に次の要素を含む〔９〕または〔１０〕に記載のキット。
（３）　外来性のＰＰＡＲδまたはＰＰＡＲδと機能的に同等な蛋白質を発現していない細胞〔１２〕〔５〕に記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を有効成分として含むＰＰＡＲδの活性調節剤。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明は、次の工程を含む、被験化合物がＰＰＡＲδの転写調節活性に与える影響の測定方法に関する。
（１）　次の４つの特徴を有する細胞を提供する工程
−ＰＰＡＲδまたはＰＰＡＲδと機能的に同等な蛋白質を発現する
−ＲＸＲまたはＲＸＲと機能的に同等な蛋白質を発現する
−ＰＰＡＲδのコアクチベータとして作用する蛋白質を発現する、および
−ＰＰＡＲδの応答配列の制御下にシグナルを生成する
（２）　（１）の細胞に被験化合物を接触させる工程、および
（３）　（２）の細胞のシグナルを測定し、被験化合物がＰＰＡＲδの転写調節活性に与える影響の大きさと関連付ける工程
【００１３】
本発明においては、ＰＰＡＲδ、ＲＸＲ、およびＰＰＡＲδのコアクチベータ、あるいは各蛋白質と機能的に同等な蛋白質を発現する細胞が利用される。これらの蛋白質は、人為的に導入されたものであっても、内在性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）の蛋白質であっても良い。高い発現レベルを安定に維持するためには、各蛋白質をコードする遺伝子を保持した適当な発現ベクターを導入するのが望ましい。各蛋白質をコードする遺伝子は、同一のベクターに保持させることもできるし、別々のベクターによって細胞に導入することもできる。同一のベクターに保持させることによって、各蛋白質の発現レベルを均一にすることができる。あるいは蛋白質ごとに異なるベクターを利用して、各蛋白質の発現レベルを調節することもできる。各蛋白質を誘導性（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）のベクターで導入すれば、発現レベルを容易に調節することができる。
【００１４】
発現ベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＭ３２４、プラスミドｐＳＶ２ｄｈｆｒ　（ＡＴＣＣ３７１４５）、プラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ　（ＡＴＣＣ３７２２４）、プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏ　（ＡＴＣＣ３７１４９）が挙げられる。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）は、哺乳動物細胞において外来遺伝子の高度な発現を可能とするベクターである。ＰＰＡＲδ、ＲＸＲ、およびＰＰＡＲδのコアクチベータ、あるいは各蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードする遺伝子を別のベクターに導入した場合には、各ベクターをコトランスフェクションすることによって細胞に導入する。単一の遺伝子を発現するためのベクターの構築は容易である。一過性の発現を得ることができれば、本発明の方法は実施可能である。したがって、各遺伝子を導入した複数のベクターをコトランスフェクションする方法は、本発明に必要な細胞を得るための手法として好ましい。
【００１５】
各ベクターの形質転換効率が同じレベルであれば、形質転換に用いるベクターの量の調節によって、各遺伝子の発現レベルを調節することができる。本発明においては、通常、ＰＰＡＲδ、ＲＸＲ、およびＰＰＡＲδのコアクチベータの発現レベルは、等しくなるように調節される。また、形質転換効率や発現効率に違いがあるベクターを用いた場合には、各遺伝子の発現レベルが等しくなるように、投与量を調節することもできる。
【００１６】
あるいは、各ベクターの投与量を調節することによって、各蛋白質の発現レベルの比を変動させることもできる。たとえば、コアクチベータとして機能する蛋白質の発現レベルを下げた系を利用して、コアクチベータの機能を補う作用を評価することもできる。
【００１７】
本発明においては、１つのベクターに複数の遺伝子を保持させて、細胞に導入することもできる。本発明に必要な３つの遺伝子、すなわちＰＰＡＲδ、ＲＸＲ、およびＰＰＡＲδのコアクチベータをコードする遺伝子を発現できるように、各遺伝子に対して機能的に発現調節領域を配置したベクターをデザインすることが可能である。ベクターは、形質転換細胞を選択するための選択マーカーを有することができる。選択マーカーを利用して、形質転換細胞を選択し、更にクローニングすることができる。こうして選択された形質転換細胞は、本発明の方法に必要な条件を満たす安定な細胞株として有用である。
【００１８】
各蛋白質の由来は、限定されない。ヒトのＰＰＡＲδに与える影響を評価するためには、ヒト由来のＰＰＡＲδを発現させるのが望ましい。ヒトＰＰＡＲδの塩基配列およびアミノ酸配列は公知である。ヒトＰＰＡＲδを利用する場合には、ＲＸＲおよびコアクチベータはヒトＰＰＡＲδの転写調節活性を維持できるものであれば、任意の種に由来する蛋白質、あるいはそれらの断片や変異体であっても良い。また機能的な同等性を有する蛋白質であれば、各蛋白質のサブタイプを用いることができる。たとえば、ＲＸＲにはα、β、並びにγ等の存在が明らかにされている。これらのサブタイプはいずれもＲＸＲとして本発明に利用することができる。
ヒトＲＸＲα、ＣＢＰ、およびＳＲＣ−１の塩基配列、およびアミノ酸配列は公知である。これらの配列情報は、以下に示すＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．で参照することができる。
ヒトＰＰＡＲδ：　ＮＭ＿００６２３８
ヒトＲＸＲα：　　ＮＭ＿００２９５７
ヒトＣＢＰ：　Ｕ４７７４１
ヒトＳＲＣ−１：　Ｕ４０３９６
【００１９】
ある蛋白質がＰＰＡＲδ、あるいはＲＸＲと同等の機能を有すること、またＰＰＡＲδのコアクチベータとして作用することは、レポータジーンアッセイを利用して確認することができる。本発明によって、ＰＰＡＲδのレポータジーンアッセイが確立された。したがって、本発明のレポータジーンアッセイを構成する各蛋白質に代えて、活性を確認すべき蛋白質を用いたとき、レポータ遺伝子の発現を確認することができれば、その蛋白質は機能的な同等性を有する。
【００２０】
たとえば、ＰＰＡＲδ、ＲＸＲ、およびＣＢＰ（またはＳＲＣ−１）を発現する細胞は、ＰＰＲＥの制御下にリガンドの刺激によってレポータ遺伝子を発現することができる。したがって、この細胞におけるＰＰＡＲδ、ＲＸＲ、およびＣＢＰ（またはＳＲＣ−１）のいずれかを、機能を確認すべき蛋白質に置換し、リガンドを与えてレポータ遺伝子の発現を観察すれば良い。その結果、導入された蛋白質によってレポータ遺伝子の発現が誘導されれば、その蛋白質は機能的に同等な蛋白質である。あるいはその蛋白質はコアクチベータとして作用する蛋白質である。たとえば、次のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質であって、機能的に同等な蛋白質、あるいはコアクチベータとして作用する蛋白質を、各蛋白質に代えて本発明に利用することができる。
ヒトＰＰＡＲδ、ヒトＲＸＲ、ヒトＣＢＰ、およびヒトＳＲＣ−１のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、または
ヒトＰＰＡＲδ、ヒトＲＸＲ、ヒトＣＢＰ、およびヒトＳＲＣ−１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
【００２１】
機能的に同等な蛋白質は、当業者であれば、例えば、蛋白質中のアミノ酸配列に変異を導入する方法を利用して調製することができる。変異の導入方法としては、例えば、部位特異的変異誘発法（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｅｄｉｔ．　Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８７）　Ｐｕｂｌｉｓｈ．　Ｊｈｏｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　Ｓｅｃｔｉｏｎ　８．１−８．５）等を示すことができる。また、このような蛋白質は自然界におけるアミノ酸の変異により生じることもある。本発明には、このようにＰＰＡＲδと同等の機能を有する限り、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加等によってアミノ酸配列が改変された蛋白質も含まれる。
【００２２】
蛋白質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その機能が保持される限り特に制限されない。変異数は、典型的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内である。置換されるアミノ酸は、蛋白質の機能保持の観点から、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有すると考えられる。また、非荷電性としては、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、ＡｓｐおよびＧｌｕが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓが挙げられる。
【００２３】
また、機能的に同等な蛋白質は、当業者に周知のハイブリダイゼーション技術あるいは遺伝子増幅技術を利用して単離することも可能である。即ち、当業者であれば、ハイブリダイゼーション技術　（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｅｄｉｔ．　Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８７）　Ｐｕｂｌｉｓｈ．　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　Ｓｅｃｔｉｏｎ　６．３−６．４）を用いてある塩基配列またはその一部をもとにこれと相同性の高いポリヌクレオチドを単離して、このポリヌクレオチドから機能的に同等な蛋白質を得ることは、通常行い得ることである。
【００２４】
機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチドを単離するためのハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件は、通常は洗浄のための条件として「１ｘＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、３７℃」程度であり、より厳しい条件としては「０．５ｘＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、４２℃」程度であり、さらに厳しい条件としては「０．１ｘＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、６５℃」程度であり、ハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するＤＮＡの単離を期待し得る。但し、上記ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。ストリンジェンシーに影響を与えるその他の条件として、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間などを示すことができる。
このようなハイブリダイゼーション技術を利用して単離される蛋白質は、前記蛋白質と比較して、通常、そのアミノ酸配列または該蛋白質をコードする塩基配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、たとえば８０％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上）の配列の同一性を指す。相同性の特定は、ＢＬＡＳＴ２検索アルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，　Ｓ．Ｆ．　ｅｔ　ａｌ，　　１９９７　　　Ｇａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴ　ａｎｄ　ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：　ａ　ｎｅｗ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｄａｔａｂａｓｅ　ｓｅａｒｃｈ　ｐｒｏｇｒａｍｓ．　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２５：３３８９−３４０２．）を用いて決定することができる。
【００２５】
また、遺伝子増幅技術（ＰＣＲ）（Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　　ｅｄｉｔ．　Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８７）　Ｐｕｂｌｉｓｈ．　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　Ｓｅｃｔｉｏｎ　６．１−６．４）を用いて、ある遺伝子の塩基配列の一部をもとにプライマーを設計し、これら塩基配列またはその一部と相同性の高いＤＮＡ断片を単離して、これをもとに前記遺伝子によってコードされる蛋白質と機能的に同等な蛋白質を得ることも可能である。
【００２６】
本発明における機能的に同等な蛋白質として、各蛋白質の機能的な断片を用いることもできる。本発明において機能的な断片とは、転写調節活性の発現に必要な最小の領域を含む部分アミノ酸配列を含む断片を言う。先に述べたように、ドメインが核内受容体の機能を支えている。したがって、目的とする活性をもたらしているドメインを含んでいれば、たとえ断片であっても、転写調節機能を期待できる。
【００２７】
たとえば、ＰＰＡＲδは、全長のみならずリガンド結合ドメイン（Ｌｉｇａｎｄ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｄｏｍａｉｎ；ＬＢＤ）も、転写調節活性の評価に用いることができる。具体的には、全長アミノ酸配列４４１残基（ＧｅｎＢａｎｋ　ＮＭ＿００６２３８）のうち、Ｇｌｕ（２５４番残基）−　Ｔｙｒ（４３７番残基）　の１８４残基を含む断片アミノ酸配列を、機能的に同等な蛋白質として用いることができる（Ｓｃｈｍｉｄｔ　Ａ，　Ｅｎｄｏ　Ｎ，　ｒｕｔｌｅｄｇｅ　ＳＪ，　Ｖｏｇｅｌ　Ｒ，　ＳｈｉｎａｒＤ　＆　Ｒｏｄａｎ　ＧＡ．　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｎｅｗ　ｍｅｍｂｅｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｔｅｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ　ｔｈａｔ　ｉｓ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｂｙ　ａ　ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ　ａｎｄ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄｓ．　Ｍｏｌ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．　６　（１９９２）　１６３４−１６４１）。
【００２８】
また、コアクチベータについては、ＣＢＰの２４４３アミノ酸総残基中、Ｎ末の１７１残基の断片のみで活性を有していることが報告されている（Ｓｃｈｕｌｍａｎ　ＩＧ，　Ｓｈａｏ　Ｇ　＆　Ｈｅｙｍａｎ　ＲＡ．　Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｒｅｔｉｎｏｉｄ　Ｘ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　γ　（ＰＰＡＲγ）　ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ：　ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｓｙｎｅｒｇｙ　ｒｅｑｕｉｒｅｓｏｎｌｙ　ｔｈｅ　ＰＰＡＲγ　ｈｏｒｍｏｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ．　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．１８（１９９８）　３４８３−３４９４）。この報告においては、ＳＲＣ−１が１０６２総アミノ酸残基中３８１−８９１残基断片のみで活性を有することも明らかにされている。したがって、これらの活性を有するＣＢＰまたはＳＲＣ−１の断片アミノ酸配列をコアクチベータとして用いることができる。
更にこの報告は、ＲＸＲとＰＰＡＲγとの相乗作用の解析によってＲＸＲのリガンド結合ドメインのみでＰＰＡＲγに対する相乗効果が出ることを開示している。したがって、ＰＰＡＲδにおいても、ＲＸＲのリガンド結合ドメインを用いることができる。
【００２９】
上記蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ合成装置を用いて、部分合成または全合成することによって得ることができる。或いは、ヒトｃＤＮＡライブラリーより、各ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設定したプローブやプライマーを用いて取得することができる。更に、ゲノムＤＮＡを常法通り処理することによって、必要な蛋白質をコードするゲノムＤＮＡを調製することができる。ゲノムＤＮＡの処理方法としては、例えば、制限酵素による消化、細菌アルカリホスファターゼによる脱燐酸化、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによる燐酸化、およびＴ４ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーション等の工程を含む処理方法を示すことができる。
【００３０】
本発明の実施に必要な、ＤＮＡのクローニング、各プラスミドの構築、宿主のトランスフェクション、形質転換体の培養等の操作は、当業者既知の方法、あるいは文献記載の方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ．　ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ．ａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇｓ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８９），　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＤＭ．Ｇｌｏｖｅｒ，ＩＲＬ　ＰＲＥＳＳ（１９８５）他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　３ｒｄ．　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ．ａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇｓ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（２００１）］に準じて行なうことができる。
宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｅｄｉｔ．　Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８７）　Ｐｕｂｌｉｓｈ．　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ　９．１−９．９）、リポフェクタミン法（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）、マイクロインジェクション法等の方法で行うことが可能である。
【００３１】
次に、本発明の測定方法を構成する、ＰＰＡＲδの応答配列の制御下にシグナルを生成する細胞について説明する。まず、ＰＰＡＲδの応答配列とは、ＰＰＡＲδがＲＸＲおよびコアクチベータの存在下で、転写制御配列として認識する配列を言う。転写調節因子の応答配列の同定方法は公知である。たとえばゲルシフトアッセイなどによって、転写調節因子の応答配列を同定することができる。実際にＰＰＡＲδの応答配列として、ＰＰＲＥが同定されている（Ｔｕｇｗｏｏｄ　ＪＤ，　Ｉｓｓｅｍａｎｎ　Ｉ，　Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ＲＧ，Ｂｕｎｄｅｌｌ　ＫＲ，　ＭｃＰｈｅａｔ　ＷＬ　＆　Ｇｒｅｅｎ　Ｓ．　Ｔｈｅ　ｍｏｕｓｅ　ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ　ａ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　５’　ｆｌａｎｋｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒａｔ　ａｃｙｌ　ＣｏＡ　ｏｘｉｄａｓｅ　ｇｅｎｅ．　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１１　（１９９２）　４３３−４３９．）。ＰＰＲＥは本発明における好ましい応答配列である。
【００３２】
応答配列の制御下にシグナルを生成させるためには、応答配列の下流にシグナルを生成することができる蛋白質をコードする遺伝子を配置すれば良い。なお本発明におけるシグナルの生成とは、リガンドに応答してＰＰＡＲδの転写調節活性によってシグナルが生成されることを言う。つまり、たとえばＰＰＡＲδ以外の転写調節因子の作用に起因するシグナルは、バックグランドシグナルである。バックグランドシグナルは、対照のシグナルレベルを参照することによって明らかにすることができる。
本発明において、核内受容体の転写調節作用によって、その応答配列の制御下にレポータ遺伝子が転写されるように配置された、応答配列とレポータ遺伝子の組み合せを発現カセットと言う。発現カセットは、プラスミドとして細胞に導入することもできるし、細胞のゲノムにインテグレートしすることもできる。
【００３３】
応答配列の制御下にレポータ遺伝子を発現させるためには、その応答配列の制御下に発現している遺伝子をレポータ遺伝子に組み換えれば良い。応答配列の下流にレポータ遺伝子を配置した発現カセットを有するプラスミドを、レポータプラスミドと呼ぶ。
【００３４】
レポータプラスミドは、レポータベクターを用いれば容易に構築することができる。レポータベクターは、レポータ遺伝子と、その上流に任意の応答配列を挿入するためのクローニングサイトを有するベクターである。たとえば、レポータ遺伝子としてルシフェラーゼを有するレポータベクターＰＧＶＰ２（東洋インキ製造）が市販されている。レポータベクターのクローニングサイトに、前記応答配列を挿入することによって、本発明に用いるレポータプラスミドとすることができる。応答配列は、タンデムに、複数個を挿入することによって、対応する核内受容体の応答性を高めることができる。その結果、転写調節活性に対するより高い検出感度を期待できる。挿入すべき応答配列は、化学的に合成することができる。
【００３５】
本発明において、レポータ遺伝子としては、容易にシグナルを測定することができる任意のレポータ遺伝子を利用することができる。遺伝子の発現調節機構を解析するためのレポータ遺伝子は公知である。具体的には、例えばルシフェラーゼ、カタラーゼ、βガラクトシダーゼ、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）等の遺伝子がレポータ遺伝子として一般に用いられる。
【００３６】
ＰＰＲＥの制御下にレポータ遺伝子を発現するレポータコンストラクトは公知である（Ｃｅｌｌ　６８　（１９９２）　８７９−８８７．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ　９１　（１９９４）　７３５５−７３５９．，　Ｎａｔｕｒｅ　３８４　（１９９６）　３９−４３．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ　９４　（１９９７）　４３１２−４３１７．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７４　（１９９９）　３５８８１−３５８８８．，　Ｃｅｌｌ　９９　（１９９９）　３５３−３４５．）。
本発明においては、シグナルを生成することができる任意の蛋白質を利用することができる。シグナルとは、観察可能なあらゆるシグナルを含む。具体的には、物理化学的に、あるいは肉眼的に観察可能な変化を生成することができる蛋白質をシグナルとして利用することができる。シグナルは、蛋白質そのものが観察可能な特徴を有する蛋白質と、触媒作用などによって観察可能な変化をもたらすことができる蛋白質が含まれる。物理化学的な変化には、光学的な変化や電気的な変化が含まれる。光学的に観察可能な変化としては、発光、蛍光、あるいは着色等を示すことができる。また電気的な変化としては、酸化還元酵素の触媒作用による電位の変化を示すことができる。たとえば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどをレポータ遺伝子として利用することができる。本発明において、こうして用意された、次の４つの要素を有する細胞を、ＰＰＡＲδの転写調節活性発現細胞と言う。
−ＰＰＡＲδまたはＰＰＡＲδと機能的に同等な蛋白質を発現する
−ＲＸＲまたはＲＸＲと機能的に同等な蛋白質を発現する
−ＰＰＡＲδのコアクチベータとして作用する蛋白質を発現する、および
−ＰＰＡＲδの応答配列の制御下にシグナルを生成する
【００３７】
ＰＰＡＲδの転写調節活性発現細胞を作製するための宿主細胞には、上記４つの要素を導入し、その活性の発現が期待できる細胞であれば任意の細胞を利用することができる。具体的には、たとえば上記４つの要素を備える任意の真核細胞を、本発明のＰＰＡＲδの転写調節活性発現細胞とすることができる。真核細胞として、哺乳動物、酵母、植物、昆虫、あるいは線虫などの細胞を示すことができる。本発明には、細胞株のみならず初代培養細胞を用いることもできる。これらの真核細胞に、上記４つの要素を付与するための方法は公知である。すなわち、適当な発現ベクターに必要な遺伝子を保持させ、目的の細胞に導入することができる。あるいは、必要な遺伝子を発現する形質転換動物を作製し、その細胞を本発明に利用することもできる。
【００３８】
たとえば次のような細胞を宿主細胞に用いることができる。
パン酵母
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＡＨ２２（ＡＴＣＣ　３８６２６）等
アフリカミドリザル腎由来細胞株ＣＶ−１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ−７０）
ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞
マウスＬ９２９細胞
チャイニーズ・ハムスター・オバリー（ＣＨＯ）細胞
【００３９】
本発明の方法は、こうして提供された細胞に、ＰＰＡＲδの転写調節活性に与える影響を測定すべき被験化合物を接触させる工程を含む。被験化合物は、細胞培養物に添加することによって細胞に接触させることができる。あるいは、被験化合物が蛋白質の場合には、当該蛋白質をコードする遺伝子を、前記細胞中で発現させることによって、被験化合物を接触させることもできる。あるいは、被験化合物を発現する細胞や、その培養上清を、前記細胞の培養物に加えることによって、被験化合物と細胞とを接触させることもできる。その後、被験化合物を接触させた細胞のシグナルレベルが測定される。
【００４０】
更に本発明の方法は、（２）の細胞のシグナルを測定し、被験化合物がＰＰＡＲδの転写調節活性に与える影響の大きさと関連付ける工程を含む。レポータ遺伝子のシグナルは、シグナルの種類に応じた方法で測定することができる。本発明において、シグナルの大きさは、ＰＰＡＲδの転写調節活性の大きさを反映している。したがって、シグナルのレベルを測定することによって、ＰＰＡＲδの転写調節活性に与える影響が明らかにすることができる。
【００４１】
本発明において、シグナルのレベルは、対照との比較によって、より正しく評価することができる。本発明の方法における対照として、前記ＰＰＡＲδの転写調節活性発現細胞の作製に利用されたＰＰＡＲδの発現手段を欠く細胞を利用することができる。すなわち前記４つの要素のうち、ＰＰＡＲδに関する要素のみを欠いた細胞は、本発明の方法における対照として好ましい。
【００４２】
たとえば、ＰＰＡＲδをコードする外来性の遺伝子の導入によって作製された細胞に対しては、ＰＰＡＲδ遺伝子を導入していない細胞を対照として利用することができる。より具体的には、ＰＰＡＲδ遺伝子の発現ベクターを導入していない細胞、あるいは空ベクターを導入した細胞（Ｍｏｃｋ）が対照として用いられる。空ベクターとしては、たとえば次のようなベクターを示すことができる。
−ＰＰＡＲδ遺伝子の発現ベクターの構築に利用されたベクターであって、ＰＰＡＲδ遺伝子を挿入していないベクター、
−ＰＰＡＲδ遺伝子の発現ベクターにおける、ＰＰＡＲδ遺伝子の開始コドンを欠失させたベクター、および
−ＰＰＡＲδ遺伝子の発現ベクターにおける、ＰＰＡＲδ遺伝子に代えて、ＰＰＡＲδ活性を有しないことが明らかで、かつ宿主細胞に毒性を示さない蛋白質をコードする遺伝子を挿入したベクター
【００４３】
既知のレポータジーンアッセイにおいては、しばしば被験化合物を接触させない細胞が対照として利用されていた。実施例に示すように、ＰＰＡＲδのアゴニストと接触した細胞は、ＰＰＡＲδが導入されていなくてもシグナルの上昇を示すことが本発明者らによって明らかにされた。つまり既知のアッセイ系においては、被験化合物のＰＰＡＲδに対する作用のみならず、ＰＰＡＲδとは無関係に細胞そのものに対する作用も合わせて評価されていた可能性がある。これに対して本発明の評価方法は、前記４つの要素を有する細胞の利用によって、ＰＰＡＲδの転写調節活性をより特異的に評価することができる。そして前記４つの要素のうち、ＰＰＡＲδに関する要素のみを欠いた細胞を対照とすることで、本発明の評価方法のＰＰＡＲδに対する特異性は更に向上する。
【００４４】
本発明の測定方法は、目的とする活性を有する化合物のスクリーニング方法や、化合物のキャラクタリゼーション等に利用することができる。たとえば、幅広い物質に対して本発明に基づく評価方法を実施し、目的とする活性に優れる化合物の選択を繰り返すことにより、スクリーニングを実施することができる。あるいは、前記検出方法を利用して、特定の化合物の特性を解析することもできる。
【００４５】
このように本発明による前記測定方法は、ＰＰＡＲδの転写調節活性を調節する作用を有する化合物のスクリーニング方法に有用である。すなわち本発明は、次の工程を含む、ＰＰＡＲδの転写調節活性を調節する作用を有する化合物のスクリーニング方法に関する。
（１）　本発明の方法によって、被験化合物がＰＰＡＲδの転写調節活性に与える影響を測定する工程、および
（２）　対照と比較してシグナルを上昇または低下させる被験化合物を選択する工程
【００４６】
本発明のスクリーニング方法において、被験物質は、培養物に添加することにより、前記細胞に接触させることができる。あるいは、被験物質が蛋白質であれば、それをコードする遺伝子を同じ細胞に導入することで、核内受容体に接触させることができる。更に、被験物質を発現する細胞を、前記核内受容体を発現する細胞とともに共培養することによって、接触させることもできる。
【００４７】
核内受容体がＲＸＲおよびコアクチベータとともに発現すれば、リガンドの存在下でレポータ遺伝子が転写され蛋白質が発現する。レポータ遺伝子の発現レベルは、この蛋白質に由来するシグナルの大きさに基づいて測定することができる。たとえばレポータ遺伝子としてルシフェラーゼを用いた場合は、ルシフェラーゼ活性を発光強度として測定することができる。あるいはレポータ遺伝子がＧＦＰであれば、ＧＦＰの蛍光強度を測定することができる。
【００４８】
このとき、共存する被験物質が転写調節活性を調節する作用を有していれば、レポータ遺伝子の転写レベルは変化する。この変化の程度に基づいて、被験物質が転写を阻害する場合には、レポータ遺伝子の転写は抑制され、レポータ遺伝子のシグナルが低下する。逆に転写活性化作用を増強する作用を有する被験物質は、レポータ遺伝子のシグナルを上昇させる。したがって、レポータ遺伝子の転写レベルを指標として、被験物質の転写調節活性に及ぼす影響を評価することができる。
【００４９】
あらかじめ転写調節活性に与える影響がわかっている物質を利用して、転写調節活性に与える影響の大きさとレポータ遺伝子のシグナル強度の関係を明らかにしておけば、転写調節活性に与える影響が未知の物質について、その作用をシグナルの強度から定量的に評価することもできる。
【００５０】
上記の各種のベクターを導入した細胞は、核内受容体の発現に伴って、レポータ遺伝子によるシグナルを生成する。得られた細胞を９６ウエルマルチプレートに播種し、細胞に導入した遺伝子の発現を誘導する条件下で培養を開始する。このとき評価すべき被験物質を各ウエルに加えることにより、核内受容体複合体の転写調節活性に作用して、発現を抑制する、あるいは促進する活性をレポータ遺伝子を指標として容易に検出することができる。
【００５１】
例えば、レポータ遺伝子としてＧＦＰを用いた場合、被験物質を加えたときのＧＦＰの発光量を対照と比較することにより、発現制御領域に対する影響を評価することができる。比較にあたっては、たとえば２倍以上若しくは１／２以下、好ましくは５倍若しくは１／５以下、より好ましくは１０倍以上若しくは１／１０以下の発光量比を示す場合に、有意な差があると判定することができる。本方法は動物細胞ばかりでなく、導入された核内受容体の転写調節作用を再現できる宿主であれば、真核生物・原核生物を問わず応用することができる。このとき、細胞はレポータ遺伝子が発現可能な条件下で培養される。
【００５２】
本発明の評価方法に用いる被験物質は特に制限されない。具体的には、たとえば細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物等が挙げられる。
【００５３】
一方、本発明のスクリーニング方法における対照には、転写調節活性に与える影響がわかっている化合物を用いることができる。より具体的には、たとえば転写調節活性に影響を与えないことが明らかな物質を対照とすることができる。被験物質をなんら与えない場合の測定結果を、転写調節活性に影響を与えない場合の対照とすることもできる。
あるいは予め目的とする作用を有することがわかっている物質を対照として、その物質よりもシグナルの変化が大きい物質を探索することによって、より大きな作用を有する物質を選択することもできる。
【００５４】
これらの対照実験に用いる細胞には、前記４つの要素のうち、ＰＰＡＲδに関する要素のみを欠いた細胞を用いるのが望ましい。既に述べたように、ＰＰＡＲδに関する要素を欠く細胞を対照とすることで、ＰＰＡＲδに対する特異性は更に向上する。言いかえれば、被験化合物のＰＰＡＲδの転写調節活性に与える影響が、より特異的に評価される。
【００５５】
本発明のスクリーニング方法により単離される化合物は、ＰＰＡＲδの転写調節作用を促進または阻害する化合物（アゴニスト、アンタゴニスト）の候補となる。また、生体内において、ＰＰＡＲδと他の核内受容体間、ＰＰＡＲδとその応答配列間、ＰＰＡＲδとコファクター間等の相互作用を促進または阻害する化合物の候補となる。これら化合物は、ＰＰＡＲδが関連する疾患の予防や治療のための医薬品として有用である。
【００５６】
ＰＰＡＲδは、細胞内において次のような生理的役割を有すると考えられている。（１）ＰＰＡＲδの特異的アゴニストＬ−１６５０４１は、血糖やトリグリセリド濃度に影響を与えずにＨＤＬ−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ濃度を上昇させる。このことから、ＰＰＡＲδは脂質代謝の調節に関わっていることが推定される（Ｌｅｉｂｏｗｉｔｚ　ＭＤ，　Ｆｉｅｖｅｔｄ　Ｃ，　Ｈｅｎｎｕｙｅｒｄ　Ｎ　ｅｔ　ａｌ．　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰＰＡＲδ　ａｌｔｅｒｓ　ｌｉｐｉｄ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｉｎ　ｄｂ／ｄｂ　ｍｉｃｅ．　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　４７３　（２０００）　３３３−３３６．）。
【００５７】
（２）ＰＰＡＲδは、着床前期の子宮において発現が誘導される。また、着床不能の表現型を呈するＣＯＸ−２ノックアウトマウスに対して、ＰＰＡＲδのアゴニストｃａｒｂａｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎあるいはＬ−１６５０４１とＲＸＲアゴニスト９−ｃｉｓ　ｒｅｔｉｎｏｉｃ　ａｃｉｄを併用投与すると、着床能力が回復する。これらの情報を考慮すると、ＰＰＡＲδは受精に重要な役割を担っていることが推定される（Ｌｉｍ　Ｈ，　Ｇｕｐｔａ　ＲＡ，　Ｍａ　ＷＧ　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｙｃｌｏ−ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎ　ｍｅｄｉａｔｅｓ　ｅｍｂｒｙｏ　ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｏｕｓｅ　ｖｉａ　ＰＰＡＲδ　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　１３　（１９９９）　１５６１−１５７４．）。
【００５８】
（３）ＰＰＡＲδは破骨細胞において発現される主要ＰＰＡＲサブタイプである。またＰＰＡＲδアゴニストｃａｒｂａｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎは骨吸収活性を顕著に誘導し、破骨細胞特異的遺伝子（ｃａｒｂｏｎｉｃ　ａｎｈｙｄｒａｓｅ　ｔｙｐｅＩＩ，　ｃａｔｈｅｐｓｉｎ　Ｋ）の発現を誘導する。更にこれらの作用はＰＰＡＲδのアンチセンスで阻害される。このことから、ＰＰＡＲδは破骨細胞による骨吸収の調節を担っていることが推定される（Ｓｈｉ　Ｙ，　Ｈｏｎ　Ｍ，　Ｅｖａｎｓ　ＲＭ　Ｔｈｅ　ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｄｅｌｔａ，　ａｎ　ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ　ｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　９９（２００２）　２６１３−２６１８．）。
【００５９】
（４）ＰＰＡＲδは他のＰＰＡＲサブタイプの応答配列結合に対して競合阻害することにより、ＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγの活性を阻害する。ＰＰＡＲδはＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγの生理的役割の調節作用を担っていることが推定される（Ｓｈｉ　Ｙ，　Ｈｏｎ　Ｍ，　Ｅｖａｎｓ　ＲＭ　Ｔｈｅ　ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｄｅｌｔａ，　ａｎ　ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　９９（２００２）　２６１３−２６１８．）。
【００６０】
上記のような役割を有するＰＰＡＲδと、各種の疾患との関連性についての研究が進められている（Ｇｕａｎ　ＹＦ，　Ｂｒｅｙｅｒ　ＭＤ．　Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（ＰＰＡＲｓ）：　Ｎｏｖｅｌ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｔａｒｇｅｔｓ　ｉｎ　ｒｅｎａｌ　ｄｉｓｅａｓｅ．　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　６０（２００１）１４−３０．　ＲＥＶＩＥＷ）。これらの知見に基づけば、ＰＰＡＲδはたとえば次のような疾患の治療や予防のための標的分子となりうる。
（ａ）高脂血症・動脈硬化
ＰＰＡＲδはＨＤＬ−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ濃度を上昇させる活性を有する。ＨＤＬ濃度の上昇は高脂血症の改善につながるから、ＰＰＡＲδアゴニストは高脂血症治療薬として利用することができる。また高脂血症は動脈硬化の発症因子であるため、ＰＰＡＲδアゴニストは動脈硬化の予防薬としても有用である（Ｌｅｉｂｏｗｉｔｚ　ＭＤ，　Ｆｉｅｖｅｔｄ　Ｃ，　Ｈｅｎｎｕｙｅｒｄ　Ｎ　ｅｔ　ａｌ．　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰＰＡＲｄｅｌｔａ　ａｌｔｅｒｓ　ｌｉｐｉｄ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｉｎ　ｄｂ／ｄｂ　ｍｉｃｅ．　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　４７３　（２０００）　３３３−３３６．）。
【００６１】
（ｂ）腫瘍
ＰＰＡＲδは結腸癌において発現が亢進している（Ｇｕｐｔａ　ＲＡ，　Ｔａｎ　Ｊ，　Ｋｒａｕｓｅ　ＷＦ　ｅｔａｌ．　Ｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｄｅｌｔａ　ｉｎ　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｎｃｅｒ．　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　９７（２０００）　１３２７５−１３２８０．）。一方、ＰＰＡＲδのアンタゴニスト作用を有するＮＳＡＩＤ　ｓｕｌｉｎｄａｃは結腸の癌化を抑制する（Ｊａｎｎｅ　ＰＡ，　Ｍａｙｅｒ　ＲＪ．　Ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｎｃｅｒ．　Ｎ．　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．　３４２（２０００）　１９６０−１９６８．）。したがって、ＰＰＡＲδアンタゴニストは結腸癌の治療薬として有用である。
【００６２】
（ｃ）　骨粗鬆症
ＰＰＡＲδアゴニストは破骨細胞の骨吸収活性を誘導するが、逆にアンタゴニストは骨吸収活性を抑制する可能性がある。したがって、ＰＰＡＲδアンタゴニストは、骨粗鬆症に対する治療薬として有用である。
【００６３】
ＰＰＡＲγなどの転写調節因子と、その応答配列の制御下にレポータ遺伝子を発現する発現カセットを有する細胞は公知である。しかし、この発現カセットを導入した細胞において、更に転写調節因子のコアクチベータを積極的に供給した試みは無い。そして、コアクチベータの積極的な供給によって、ＰＰＡＲδの転写調節活性を正しく評価できることも知られていなかった。すなわち本発明は、次の特徴を有する、ＰＰＡＲδの転写調節活性に与える影響を評価するための細胞に関する。
−ＰＰＡＲδまたはＰＰＡＲδと機能的に同等な蛋白質を発現する
−ＲＸＲまたはＲＸＲと機能的に同等な蛋白質を発現する
−ＰＰＡＲδのコアクチベータとして作用する蛋白質を発現する
−ＰＰＡＲδの応答配列の制御下にシグナルを生成する
【００６４】
本発明において、上記条件を有する細胞は転写調節活性発現細胞と呼ばれる。転写調節活性発現細胞の条件となる、ＰＰＡＲδまたはＰＰＡＲδと機能的に同等な蛋白質の発現は、外来性の遺伝子の発現によることが望ましい。外来性の遺伝子を人為的に強制発現することにより、高い発現レベルを容易に維持することができる。更に本発明の望ましい細胞は、次の２つの要素についても、人為的に導入された外来性の遺伝子によってもたらされる。
−ＲＸＲまたはＲＸＲと機能的に同等な蛋白質を発現する、および
−ＰＰＡＲδのコアクチベータとして作用する蛋白質を発現する、
このような特徴を有する細胞の調製方法は既に述べたとおりである。
【００６５】
本発明の転写調節活性発現細胞は、ＰＰＡＲδの転写調節活性に与える影響を評価するために必要なその他の要素と組み合せてキットとすることができる。すなわち本発明は、次の要素を含む、ＰＰＡＲδの転写調節活性に与える影響を評価するためのキットに関する。
（１）ＰＰＡＲδの応答配列の制御下にシグナルを生成する細胞、
（２）（１）の細胞に形質転換することによって、細胞において次の蛋白質を発現するためのベクター
−ＰＰＡＲδまたはＰＰＡＲδと機能的に同等な蛋白質
−ＲＸＲまたはＲＸＲと機能的に同等な蛋白質、および
−ＰＰＡＲδのコアクチベータとして作用する蛋白質
（３）（１）の細胞を培養するための培地
【００６６】
あるいは本発明は次の要素を含む、ＰＰＡＲδの転写調節活性に与える影響を評価するためのキットに関する。
（１）本発明の転写調節活性発現細胞、および
（２）（１）の細胞を培養するための培地
本発明において、前記培地には、転写調節活性発現細胞の作製に利用した宿主細胞の培養に好適な任意の培地を用いることができる。たとえば、宿主細胞が動物細胞の場合には、ＤＭＥＭやＲＰＭＩ１６４０などの培地を利用することができる。これらの培地には、細胞の要求性に応じて、ウシ胎児血清などの補助的な成分を加えることができる。
【００６７】
本発明のキットには、ＰＰＡＲδの転写調節活性に与える影響の評価に有用なその他の要素を付加的に組み合わせることができる。たとえば、対照として用いる細胞や、被験化合物を組み合せることができる。具体的には、外来性のＰＰＡＲδまたはＰＰＡＲδと機能的に同等な蛋白質を発現していない細胞は、対照実験に有用である。ＰＰＡＲδまたはＰＰＡＲδと機能的に同等な蛋白質の発現をベクターの導入によって誘導するキットにおいては、当該蛋白質の発現を誘導するためのベクターを使わない細胞を対照とすることができる。また対照に用いる被験化合物としては、ＰＰＡＲδの転写調節活性の促進作用が知られている化合物（陽性対照）、あるいは転写調節活性を有していないことが確認されている化合物（陰性対照）を用いることができる。また、ＰＰＡＲδの転写調節活性を阻害する作用が確認された化合物を、被験化合物として用いることもできる。
【００６８】
本発明のキットには更に細胞の培養のための培地、および培養容器をパッケージすることができる。培養容器は、ハイスループットスクリーニングに適用できる形状とするのが有利である。更に本発明のキットには、アッセイ方法を説明するためのインストラクションマニュアル、核内受容体の転写調節活性に対する影響の大きさが予め確認されている物質を対照として組み合せることもできる。
【００６９】
更に本発明は、本発明のスクリーニング方法によって得ることができる物質の医薬用途に関する。すなわち本発明は、前記方法によって選択される化合物の、ＰＰＡＲδの転写調節活性制御における使用に関する。あるいは本発明は、これらの化合物を有効成分として含有することを特徴とする、ＰＰＡＲδの異常に特徴付けられる疾患の治療剤に関する。ＰＰＡＲδを標的分子として治療効果を達成することができる疾患は、すでに述べたとおりである。
【００７０】
本発明のスクリーニング方法により単離される物質は、ＰＰＡＲδの転写調節活性を調節するために有用である。また、本発明においてこれらを医薬品として用いる場合には、それ自体を医薬品として用いることも可能である。あるいは当該物質を、公知の製剤学的方法により製剤化して用いることもできる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤などと適宜組み合わせて製剤化して用いることができる。
【００７１】
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等、当業者に公知の方法により行い得る。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することができる。また、該物質がＤＮＡによりコードされ得るものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うこともできる。
投与量や投与方法は、患者の体重や年齢、症状等により変動する。当業者であれば、必要に応じて投与量や投与方法を適宜選択することができる。
以下本発明を実施例として更に具体的に説明するが、本発明は該実施例に限定されない。また本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【００７２】
【実施例】
比較例１．全長ＰＰＡＲδあるいはＰＰＡＲδ　ＬＢＤ　（リガンド結合ドメイン）−Ｇａｌ４　ワンハイブリッド転写系レポータジーンアッセイによるアゴニスト活性の評価
Ｇａｌ４結合領域を有するルシフェラーゼレポータプラスミド（ｐＧ５ｌｕｃ）で形質転換したＣＶ−１（アフリカミドリザル腎由来細胞株）に各種の薬剤を加えることによってレポータジーンアッセイを実施した。ＰＰＡＲδを発現するためのプラスミドとして、次の３種類のプラスミドを用いた。
Ｇａｌ４−全長ＰＰＡＲδ融合蛋白発現プラスミド
Ｇａｌ４−ＰＰＡＲδＬＢＤ融合蛋白発現プラスミド
ｐＲＬ−ＴＫ（補正用）
Ｇａｌ４−全長ＰＰＡＲδ融合蛋白発現プラスミドは、次のようにして調製した。すなわち、市販Ｇａｌ４融合蛋白発現ベクターｐＢＩＮＤ　（Ｐｒｏｍｅｇａ）のｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｓｉｔｅに存在するＭｌｕＩ，　ＢａｍＨＩ　ｓｉｔｅに、全長ＰＰＡＲδＤＮＡ断片を挿入した。またＧａｌ４−ＰＰＡＲδ　ＬＢＤ融合蛋白発現プラスミドは、次のようにして調製した。すなわち、市販Ｇａｌ４融合蛋白発現ベクターｐＢＩＮＤ　（Ｐｒｏｍｅｇａ）のｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｓｉｔｅに存在するＭｌｕＩ，　ＢａｍＨＩ　ｓｉｔｅに、ＰＰＡＲδ−ＬＢＤ　ＤＮＡ断片を挿入した。全長ＰＰＡＲδのＤＮＡ断片およびＰＰＡＲδ−ＬＢＤ断片は、前記文献（Ｍｏｌ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．　６　（１９９２）　１６３４−１６４１）記載の方法に順じて調製した。
【００７３】
補正のためのベクターｐＲＬ−ＴＫは、市販のベクターを用いた（Ｓｈｅｒｆ　Ｂ，　Ｎａｖａｒｒｏ　Ｓ　＆　Ｗｏｏｄ　ＫＶ．　Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ＴＭ）　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ａｓｓａｙ：　ａｎ　ａｄｖａｎｃｅｄ　ｃｏ−ｒｅｐｏｒｔｅｒｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．　Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｎｏｔｅｓ　５７（１９９６）２−５．　ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＦ０２５８４５）。
形質転換細胞を各種濃度（０，　１０−６−１０−４　Ｍ）のｂｅｚａｆｉｂｒａｔｅあるいはｃａｒｂａｃｙｃｌｉｎに２４時間被曝させた後、細胞のルシフェラーゼ活性を測定した。
【００７４】
形質転換は下記の通り行った。ＣＶ−１細胞を次の成分を加えたＤＭＥＭ培地中に２×１０５ｃｅｌｌｓ／２．５ｍｌ　の濃度になるように懸濁した。
１０％牛胎児血清、
２０００Ｕ／ｌ　ペニシリンＧ、
１００　ｍｇ／ｌ　ストレプトマイシン
【００７５】
細胞懸濁液を、２．５　ｍｌ　６ウェルプレートにまき、ＣＯ２インキュベーター（３７℃，５％　ＣＯ２）で１８〜２４時間培養した。次のプラスミドをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（　Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ社　）で全量１５０μｌになるように溶解し、細胞形質転換用試薬　Ｌｉｐｏｆｅｃｔ　ＡＭＩＮＥ　２０００（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ社　）　７　μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ　１４３μｌに希釈した液に対し、攪拌しながら滴下、混合し、２０分放置してＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ−ＤＮＡ混合液を得た。
ＰＰＡＲδ発現プラスミド（ｐＧ５ｌｕｃ）　１μｇ、
ルシフェラーゼレポータプラスミド　１μｇ、および
測定値補正用ルシフェラーゼレポータプラスミド（ｐＲＬ−ＴＫ）　１μｇ
【００７６】
ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ−ＤＮＡ混合液をＯｐｔｉ−ＭＥＭ　１．５　ｍｌに希釈して、ＰＢＳ（−）１　ｍｌで２回洗浄した細胞に添加し４時間培養した。培養後、上清を除き、細胞にＴｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ　２００μｌ　を添加して、３７℃で５分保温した。更にＤＭＥＭ培地１　ｍｌを加え、細胞懸濁液を遠心チューブに回収し、１０００ｒｐｍ、　３分間遠心した。遠心後、１．６×１０４　ｃｅｌｌｓ／１００μｌの濃度になるように再度ＤＭＥＭ培地に懸濁し、その１００μｌ　を９６ウェルプレートにまいた。薬剤を評価のためには、２倍濃度の薬剤溶液５０μｌ　に１．６×１０４　ｃｅｌｌｓ／５０μｌ　の濃度の細胞懸濁液５０μｌを添加した。２倍濃度の薬剤溶液は、予め終濃度の１０００倍希釈濃度薬剤ＤＭＳＯ溶解液を培地で希釈して調製した。薬剤溶液を加えた細胞は、ＣＯ２インキュベーター（３７℃，５％　ＣＯ２）で２４時間培養した。
【００７７】
ルシフェラーゼ活性測定試薬として　Ｄｕａｌ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＴＭ　　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ　（Ｐｒｏｍｅｇａ社）　を使用した。９６ウェルプレート各ウェルの上清を除き、ＰＢＳ（−）　１００μｌ　で１回洗浄し、×１　ＰＬＢ（Ｐａｓｓｉｖｅ　Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ）２０μＬ　を加え、１５分間室温放置後、測定時まで−２０℃のフリーザーに保存した。ルミノメーターとしてＡＲＶＯＴＭ　ＨＴＳ　１４２０　マルチラベルカウンタ（Ｗａｌｌａｃ社）を使用した。測定プロトコールは次のとおりである。
１ウェルにＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ＩＩ　５０μｌ　を添加、
０．３秒振とう、
１秒測定、
Ｓｔｏｐ＆ＧｌｏＴＭ　Ｒｅａｇｅｎｔ　５０μｌ　添加、
０．３秒振とう、
１秒測定
得られたホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼの測定値は、内部対照としてのウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ　の測定値で除することにより補正した。例数３で平均値および標準誤差を算出した。
【００７８】
ＰＰＡＲδを、Ｇａｌ４とその全長あるいはＬＢＤとの融合蛋白として発現させた場合、　ｃａｒｂａｃｙｃｌｉｎおよびｂｅｚａｆｉｂｒａｔｅはＰＰＡＲδに対してアゴニスト活性を示した（図１および図２）。Ｇａｌ４−全長ＰＰＡＲδ融合蛋白（図１）の場合、１０−４　Ｍ添加時では薬剤非添加と比較して、ｃａｒｂａｃｙｃｌｉｎでは２．４倍、ｂｅｚａｆｉｂｒａｔｅでは１．９倍のルシフェラーゼ活性の上昇が見られた。しかし１０−５Ｍ添加時においては、薬剤非添加の結果と大きな差は見られなかった。同様にＧａｌ４−　ＰＰＡＲδＬＢＤ融合蛋白（図２）の場合、ｃａｒｂａｃｙｃｌｉｎでは２．８倍、ｂｅｚａｆｉｂｒａｔｅでは３．０倍のルシフェラーゼ活性の上昇が見られた。しかし１０−５Ｍ添加時においては、薬剤非添加の結果と大きな差は見られなかった。
【００７９】
比較例２．　ＰＰＡＲδ単独あるいはＲＸＲと共発現したレポータジーンアッセイ系の評価
ＰＰＲＥ（ＰＰＡＲ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ）を有するルシフェラーゼレポータプラスミド（ｐＧＶＰ２−ＰＰＲＥ−１）で形質転換したＣＶ−１（アフリカミドリザル腎由来細胞株）に各種の薬剤を加えることによってレポータジーンアッセイを実施した。ＰＰＡＲδまたはＲＸＲγ発現プラスミドとして、次の３種類のプラスミドを導入した。
ヒト由来ＰＰＡＲδ発現プラスミド（ｐＣＤＭ８−ｈＰＰＡＲβ）、
ヒト由来ＲＸＲγ発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＲＸＲγ）、および
ｐＲＬ−ＴＫ（補正用）
【００８０】
ヒト由来ＰＰＡＲδ発現プラスミド（ｐＣＤＭ８−ｈＰＰＡＲβ）は、次のようにして調製した。市販ヒト心臓ｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法によりＰＰＡＲδのｃＤＮＡを得た。ＰＣＲに使用したプライマーの塩基配列を以下に示す。
ＰＰＡＲδ　ｃＤＮＡ増幅用プライマー：
５’−ＧＧＧＡＧＡＴＣＡＧＣＣＡＴＧＧＡＧＣＡＧＣＣＡＣ−３’　／配列番号：１
５’−ＧＣＣＴＧＧＧＴＧＣＣＧＣＣＧＴＴＡＧＴＡＣＡＴＧ−３’　　／配列番号：２
得られたｃＤＮＡを、市販ＴＡクローニングベクターｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし塩基配列を確認した。更にクローニングしたｃＤＮＡを市販の動物細胞発現ベクターｐＣＤＭ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｓｉｔｅ中のＢｓｔＸＩ　ｓｉｔｅに挿入した。ヒト由来ＲＸＲγ発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＲＸＲγ）は、市販プラスミドをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入した。
細胞に各種濃度（０，　１０−７−１０−３　Ｍ）のｂｅｚａｆｉｂｒａｔｅに２４時間被曝させた後、細胞のルシフェラーゼ活性を測定した。形質転換及びルシフェラーゼ活性測定は比較例１にしたがった。
【００８１】
レポータプラスミド単独ではｂｅｚａｆｉｂｒａｔｅ　１０−５　Ｍ濃度以上で、内在性のＰＰＡＲαあるいはγに起因すると考えられる転写活性の増強が認められるが、ＰＰＡＲδ発現により、本バックグラウンド活性は抑制される。ＰＰＡＲδ及びＲＸＲγ共発現により更に転写活性の抑制傾向が認められた（図３）。
【００８２】
実施例１．ＰＰＡＲδ、ＲＸＲ、コアクチベータの共発現によるＰＰＡＲδレポータジーンアッセイの評価
レポータジーンアッセイには、下記のプラスミドで形質転換したＣＶ−１を使用した。
ＰＰＲＥ（ＰＰＡＲ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ）を有するルシフェラーゼレポータプラスミド（ｐＧＶＰ２−ＰＰＲＥ−１）、
ヒト由来ＰＰＡＲδ発現プラスミド（ｐＣＤＭ８−ｈＰＰＡＲβ）、
ヒト由来ＲＸＲα発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＲＸＲα）、及び
３種類のコアクチベータ発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１−ＣＢＰ，　ｐｃＤＮＡ３．１−ＰＧＣ−１，　ｐｃＤＮＡ３．１−ＳＲＣ−１）
ｐＲＬ−ＴＫ（補正用）
【００８３】
ＰＰＲＥ（ＰＰＡＲ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ）を有するルシフェラーゼレポータプラスミド（ｐＧＶＰ２−ＰＰＲＥ−１）は、次のようにして調製した。ＣＡＴレポータベクターｐＢＬＣＡＴ２（Ｌｕｃｋｏｗ　Ｂ　＆　Ｓｃｈｕｔｓ　Ｇ．　ＣＡＴ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ　ｗｉｔｈ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｕｎｉｑｕｅ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｓｉｔｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ　ａｎｄ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１５（１９８７）　５４９０．）のｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｓｉｔｅ中のＳａｌＩｓｉｔｅにＰＰＲＥに対応する合成ＤＮＡ断片を３個ｔａｎｄｅｍに挿入してｐＢＬＰＰＲＥＣＡＴ−１を作製した。ＰＰＲＥに対応する合成ＤＮＡの塩基配列は次のとおりである（配列番号：３および配列番号：４）。
５’−ＴＣＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＧＧＡＣＡＡＡＧＧＴＣＡＣＧＴＴＣＧＴＣＧＧＧＡＧ−３’
３’−ＧＴＣＣＣＣＴＧＧＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＡＧＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＣＣＴＣＡＧＣＴ−５’更に、本プラスミドよりＰＰＲＥ断片を単離し、市販レポータ（ルシフェラーゼ）ベクターｐＧＶＰ２−Ｌｕｃ（東洋インキ製造）のｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｓｉｔｅ中のＥｃｏＲＩ，　ＢｇｌＩＩ　ｓｉｔｅに挿入した。
【００８４】
ヒト由来ＰＰＡＲδ発現プラスミド（ｐＣＤＭ８−ｈＰＰＡＲβ）の調製方法は前述のとおりである。ヒト由来ＲＸＲα発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＲＸＲα）は、次のようにして調製した。ヒト腎臓由来ｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法によりＲＸＲαのｃＤＮＡを得た。ＰＣＲに使用したプライマーの塩基配列を以下に示す。
ＲＸＲα　ｃＤＮＡ合成用プライマー：
５’−ＧＡＧＡＡＧＣＴＴＡＧＴＣＧＣＡＧＡＣＡＴＧＧＡＣＡＣ−３’　　／配列番号：５
５’−ＧＣＧＴＣＴＡＧＡＣＡＡＡＧＴＣＣＡＡＡＣＡＧＧＣＣＡ−３’　　／配列番号：６
得られたｃＤＮＡを市販動物細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｓｉｔｅ中のＨｉｎｄＩＩＩ，　ＸｂａＩ　ｓｉｔｅに挿入した。塩基配列を決定して、ＰＣＲに起因する塩基配列の変異の無いことを確認した。
【００８５】
更にコアクチベータ発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１−ＣＢＰ，　ｐｃＤＮＡ３．１−ＳＲＣ−１）の調製方法は、次のとおりである。市販ヒトｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により各コアクチベータのｃＤＮＡを得た。ＰＣＲに使用したプライマーの塩基配列を以下に示す。
ＣＢＰ　ｃＤＮＡ合成用プライマー：
５’−ＧＡＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣＴＴＧＣＴＧＧＡＣＧ−３’　／配列番号：７
５’−ＧＡＧＧＡＴＣＣＴＡＣＡＡＧＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＡＣＴＴＣＴＣ−３’　／配列番号：８
ＳＲＣ−１　ｃＤＮＡ合成用プライマー：
５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＡＧＴＧＧＣＣＴＣＧＧＧＧＡＣＡＧＴＴＣＡＴ−３’　／配列番号：９
５’−ＣＧＣＧＧＧＧＣＣＣＴＧＧＴＴＡＴＴＣＡＧＴＣＡＧＴＡＧＣＴＧＣＴＧＡＡ−３’　／配列番号：１０
得られたｃＤＮＡを、上述の市販発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１のｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｓｉｔｅに挿入した。塩基配列を決定して、ＰＣＲに起因する塩基配列の変異の無いことを確認した。
形質転換細胞を各種濃度（０，　１０−１０−１０−４　Ｍ）のｂｅｚａｆｉｂｒａｔｅに２４時間被曝させた後、細胞のルシフェラーゼ活性を測定した。形質転換及びルシフェラーゼ活性測定は、比較例１にしたがった。
【００８６】
ＰＰＡＲδとコアクチベータを共発現した細胞のルシフェラーゼ活性は、レポータプラスミド単独のルシフェラーゼ活性よりも上昇することはなかった。しかし更にＲＸＲαを共発現することによりルシフェラーゼ活性は大きく上昇し、レポータプラスミド単独のルシフェラーゼ活性に対し２倍以上のレベルに達した。またＰＰＡＲδとともにコアクチベータとＲＸＲαを共発現させた細胞においては、ｃａｒｂａｃｙｃｌｉｎによる活性増強も明瞭に識別された（図４）。コアクチベータがＣＢＰの場合、１０−５Ｍのｃａｒｂａｃｙｃｌｉｎ添加時に薬剤非添加と比較して２．１倍の活性の上昇が見られた。また１０−６−１０−７Ｍの低濃度の添加時においても、活性増強を識別することができた。本条件により、ＰＰＡＲδのアゴニスト・アンタゴニストのスクリーニングが可能と判断された。
【００８７】
実施例２．バックグランド活性に対するＲＸＲ、コアクチベータの効果の評価
形質転換及びルシフェラーゼ活性測定は実施例１にしたがった。
実施例１におけるＲＸＲαとコアクチベータを共発現下でのＰＰＡＲδの転写調節活性は、ＰＰＡＲδに依存せず、バックグランドとして存在しているＰＰＡＲαあるいはＰＰＡＲγに起因する可能性がある。この可能性を否定するために、ＰＰＡＲδ存在下と非存在下におけるＲＸＲαとコアクチベータの影響を検討した（図５）。ＰＰＡＲδ非存在下ではＲＸＲαとコアクチベータ共発現してもレポータ活性の顕著な増強は認められず、実施例１で認められたＲＸＲαとコアクチベータを共発現下でのＰＰＡＲδの転写調節活性はＰＰＡＲδ由来であると結論された。
【００８８】
【発明の効果】
本発明は、ＰＰＡＲδの転写調節活性を調節する作用を評価するための方法を提供する。既知の転写調節活性の評価方法では、ＰＰＡＲδの転写調節活性の評価に必要なコアクチベータが十分に供給されないことがあった。そのため、既知の方法をＰＰＡＲδの転写調節活性の評価に応用した場合、その転写調節活性を正しく評価できないことが、本発明者らによって明らかにされた。
【００８９】
本発明は、ＰＰＡＲδとそのコアクチベータとを、ともに高度に発現することができる転写調節活性発現細胞を提供した。本発明の転写調節活性発現細胞を利用することによって、ＰＰＡＲδの転写調節活性が特異的に評価される。たとえば既知の方法は、被験化合物の転写調節作用に与える作用を見落とす可能性があった。転写調節活性の発現に必要なコアクチベータの供給が不充分な場合には、ＰＰＡＲδの発現が他の転写調節因子の活性を阻害する恐れがあるためである。このようなケースでは、薬物スクリーニングにおいて見出すべき候補化合物が偽陰性と判定されてしてしまう。一方本発明においては、ＰＰＡＲδの活性発現に必要なコアクチベータが十分に供給されている。そのため、ＰＰＡＲδの転写調節活性に与える被験化合物の作用が見落とされる心配は無い。すなわち、既知の方法においては見落とされてしまう可能性がある化合物であっても、本発明の方法ではレスキューすることができる。
【００９０】
更に本発明においては、ＰＰＡＲδが生体内で活性を発現する条件が再現されている。したがって本発明を利用することによって、生体内におけるＰＰＡＲδの転写調節活性に与える影響を、より正確に評価することができる。
【００９１】
ＰＰＡＲα、あるいはＰＰＡＲγについては、公知の活性評価方法の利用により、これらの転写調節活性に選択的に作用する薬剤が開発されている。本発明により、ＰＰＡＲδの転写調節活性に与える影響の評価方法が確立された。本発明は、ＰＰＡＲδの転写調節活性に選択的に作用する薬剤の開発に貢献する。
【００９２】
【配列表】
2004141120.tif 000002
2004141120.tif 000003
2004141120.tif 000004
2004141120.tif 000005
2004141120.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｇａｌ４−全長ＰＰＡＲδ融合蛋白発現細胞における、ｃａｒｂａｃｙｃｌｉｎおよびｂｅｚａｆｉｂｒａｔｅが転写調節活性に与える影響を示す。縦軸はルシフェラーゼ活性（補正値）、横軸は薬剤濃度を示す。
【図２】Ｇａｌ４−ＰＰＡＲδ　ＬＢＤ融合蛋白発現細胞における、ｃａｒｂａｃｙｃｌｉｎおよびｂｅｚａｆｉｂｒａｔｅが転写調節活性に与える影響を示す。縦軸はルシフェラーゼ活性（補正値）、横軸は薬剤濃度を示す。
【図３】ＰＰＡＲδ発現細胞におけるＲＸＲγの共発現が転写調節活性に与える影響を示す。縦軸はルシフェラーゼ活性（補正値）、横軸はｂｅｚａｆｉｂｒａｔｅ濃度を示す。
【図４】ＰＰＡＲδ発現細胞における、ＲＸＲαおよびコアクチベータの共発現が転写調節活性に与える影響を示す。縦軸はルシフェラーゼ活性（補正値）、横軸はｃａｒｂａｃｙｃｌｉｎ濃度を示す。
【図５】ＰＰＡＲδ存在下と非存在下における、ＲＸＲαとコアクチベータが転写調節活性に与える影響を示す。縦軸はルシフェラーゼ活性（補正値）、横軸はｃａｒｂａｃｙｃｌｉｎ濃度を示す。
【図１】
2004141120.tif 000007
【図２】
2004141120.tif 000008
【図３】
2004141120.tif 000009
【図４】
2004141120.tif 000010
【図５】
2004141120.tif 000011