(57)【要約】【課題】細胞のガラクトシドパーミアーゼ酵素活性及びガラクトシドパーミアーゼ遺伝子の発現を測定し、簡便、迅速かつ正確に細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性を測定・評価する方法を提供すること。【解決手段】被検細胞を、ガラクトシド型スピンプローブの存在下、スピンプローブの吸収阻害物質及び／又はスピンプローブ吸収中の異化代謝産物抑制を惹起する物質を含有しない培地で培養しながら、又はした後、ＥＳＲ（電子スピン共鳴法）により、被検細胞内に取り込まれるスピンプローブ量を測定することによって、簡便、迅速かつ正確に細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性を測定する。ＥＳＲのスピンプローブとしては、ガラクトシド型スピンプローブが用いられる。また、培地としては、ガラクトシド型スピンプローブ以外にガラクトシド類を含まない、及び／又は炭素源を制限した或いは炭素源を含まない培地が用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検細胞を、ガラクトシド型スピンプローブの存在下、スピンプローブの吸収阻害物質及び／又はスピンプローブ吸収中の異化代謝産物抑制を惹起する物質を含有しない培地で培養しながら、又は培養した後、電子スピン共鳴法による測定を行い、被検細胞内に取り込まれるスピンプローブ量を測定することを特徴とする細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性の測定方法。
【請求項２】
被検細胞内に取り込まれるスピンプローブ量の測定が、被検細胞を、ガラクトシド型スピンプローブの存在下、スピンプローブの吸収阻害物質及び／又はスピンプローブ吸収中の異化代謝産物抑制を惹起する物質を含有しない培地で培養した後、洗浄、酸化剤処理した細胞を電子スピン共鳴法により測定することによって、被検細胞内に含まれるスピンプローブ量を測定するものであることを特徴とする請求項１記載の細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性の測定方法。
【請求項３】
被検細胞内に取り込まれるスピンプローブ量の測定が、被検細胞を、ガラクトシド型スピンプローブの存在下、スピンプローブの吸収阻害物質及び／又はスピンプローブ吸収中の異化代謝産物抑制を惹起する物質を含有しない培地で培養しながら電子スピン共鳴法により測定することによって、被検細胞内に取り込まれ減衰するスピンプローブの電子スピン共鳴吸収信号を測定するものであることを特徴とする請求項１記載の細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性の測定方法。
【請求項４】
ガラクトシドパーミアーゼ活性の測定が、ガラクトシドパーミアーゼ酵素活性及び／又はガラクトシドパーミアーゼ遺伝子の発現の測定であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性の測定方法。
【請求項５】
スピンプローブの吸収阻害物質及び／又はスピンプローブ吸収中の異化代謝産物抑制を惹起する物質を含有しない培地が、ガラクトシド型スピンプローブ以外にガラクトシド類を含まない、及び／又は炭素源を制限した或いは炭素源を含まない培地であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性の測定方法。
【請求項６】
炭素源を制限した或いは炭素源を含まない培地が、グルコース、マルトース及びガラクトースからなる糖類を制限した或いは含まない培地であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性の測定方法。
【請求項７】
ガラクトシド型スピンプローブが、ガラクトシド基を有する２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ基、２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ基、又は４，４−ジメチル−３−オキサゾリニルオキシ基からなるＮ−オキシラジカル基を有する化合物であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性の測定方法。
【請求項８】
ガラクトシド型スピンプローブが、ガラクトシド基を有し、かつ、２，２，６，６−テトラメチル−１−ヒドロキシピペリジン骨格、２，２，５，５−テトラメチル−１−ヒドロキシピロリジン骨格、又は４，４−ジメチル−３−ヒドロキシオキサゾリジン骨格からなる、酸化剤処理により安定なラジカルに変換される化合物であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性の測定方法。
【請求項９】
ガラクトシド型スピンプローブが、４−β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ−２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシルであることを特徴とする請求項７又は８記載の細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性の測定方法。
【請求項１０】
被検細胞が、微生物又は動植物の細胞であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性の測定方法。
【請求項１１】
被検細胞が、大腸菌であることを特徴とする請求項１０記載の細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性の測定方法。
【請求項１２】
スピンプローブの吸収阻害物質及び／又はスピンプローブ吸収中の異化代謝産物抑制を惹起する物質を含有しない培地、及びガラクトシド型スピンプローブを装備したことを特徴とする細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性の測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞のガラクトシドパーミアーゼ（ラクトーストランスポーター）活性の測定方法、特に、細胞のガラクトシドパーミアーゼ（ラクトーストランスポーター）酵素活性及びガラクトシドパーミアーゼ（ラクトーストランスポーター）遺伝子の発現を測定し、簡便、迅速かつ正確に細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性を測定・評価する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ガラクトシドパーミアーゼ（ラクトーストランスポーター）は、ラクトースに代表されるガラクトシド類の吸収を触媒する膜蛋白質である。大腸菌のガラクトシドパーミアーゼ（ＬａｃＹ）については多くの研究があり、プロトン勾配に共役しガラクトシド類のペリプラズムからサイトプラズムへの移行を促すことが知られている。大腸菌のガラクトシドパーミアーゼ遺伝子はβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、ガラクトシドアセチルトランスフェラーゼ（ｌａｃＡ）遺伝子などと共にラクトースオペロンを構成しており、ラクトースリプレッサー（ｌａｃＩ）とオペレーター（ｌａｃＯ）により発現が支配されている。ラクトースオペロンについては詳しい研究があり、その発現機構について以下のように詳細に明らかにされている。
【０００３】
（１）ラクトースリプレッサーがオペレーター領域に結合すると、隣接するプロモーター領域にＲＮＡポリメラーゼが結合することが阻害され、遺伝子発現が抑制される。（２）ラクトースの分解産物の一つである１，６−アロラクトース（ガラクトピラノース−（β１→６）−グルコピラノース）はラクトースリプレッサーに結合することができる。この結合が起きると、ラクトースリプレッサーとオペレーター領域との結合が外れ、遺伝子発現が促進される。１，６−アロラクトースの類似体であり、かつ非代謝性のイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）は、より強くこの効果を発揮するので、実験では１，６−アロラクトースの代わりによく使われる。（３）プロモーター領域にはｃＡＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ３’，５’−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）受容蛋白質（ＣＲＰ）−ｃＡＭＰ複合体との結合部位があり、この結合ができるとＲＮＡポリメラーゼとプロモーター領域の結合が促進される。そのため、細胞内ｃＡＭＰ濃度が高い／低いと、遺伝子発現が促進／抑制される。細胞内ｃＡＭＰ濃度はさらにグルコース濃度などにより調整され、これらの濃度が高い場合は低下し、逆に低い場合は上昇する。このような機構により、例えば培地中にグルコースが豊富に有れば、ラクトース吸収代謝酵素の発現は抑えられる（異化代謝産物抑制）。
【０００４】
以上のような知識をもとに、現在では、ＩＰＴＧを投与することによりラクトース代謝酵素、さらにはラクトースプローモーター・オペレーター部位の後ろに人為的に挿入した蛋白質の発現を制御することが、遺伝子・蛋白質研究や有用蛋白質の大量調製等で普通に行われている。さらに近年、大腸菌ラクトースオペロンをマウス遺伝子に組み込むことにより、生体マウスでの遺伝子の発現をＩＰＴＧ投与／非投与により制御することも報告されている（Ｃ．  Ａ．  Ｃｒｏｎｉｎら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １５，  １５０６−１５１７，  ２００１）。
【０００５】
上記のようにｌａｃＹ遺伝子発現量は、細胞の栄養状態を反映するため、ガラクトシドパーミアーゼ（ラクトーストランスポーター）活性を測定するにより細胞の状態について情報を得ることが可能である（ｌａｃＹ遺伝子については、転写後調節または生成蛋白の構造変化等による活性変化は知られていないので、ここでは遺伝子発現量と酵素活性を同義に扱っている。しかし、もしこのような機構があったとしてもそのような調整機構も細胞の栄養状態等を反映するはずであるので、その活性測定により細胞の状態についての情報が得られる点には違いはない）。
【０００６】
従来、細胞のラクトーストランスポーター活性の測定例としては、放射性同位元素を用いた例のみが報告されている（Ｗ．  Ｇ．  Ｓｔｒｕｖｅ  ａｎｄ  Ｈ．  Ｍ．  ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ４９，  １６３１−１６３７，  １９７２）。この報告の方法では、４−β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ−２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシル（Ｇａｌ−ＴＥＭＰＯ）の一つの水素を３Ｈに置換したＧａｌ−［４−３Ｈ］ＴＥＭＰＯを用いることにより、細胞内に取り込まれたＧａｌ−ＴＥＭＰＯ量を測定している。更に、この報告においては、ＩＰＴＧ投与によりこのＧａｌ−ＴＥＭＰＯ量が大幅に増加することから、この量はラクトーストランスポーター活性と相関すると報告されている。しかし、該報告の方法では放射性同位体を用いる必要があるので、十分な設備がなければ実行は困難である。
【０００７】
また、β−ガラクトシダーゼ活性を測定し間接的にラクトーストランスポーター活性を評価する方法も考えられる。β−ガラクトシダーゼ活性測定法には、Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）や５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）の呈色反応がよく使われている。しかし、細胞を対象とした場合、定量性はあまり良くない上、ラクトーストランスポーター活性測定として見た場合、あくまで間接的測定でしかない。この他、細胞での活性測定には、ルシフェラーゼや緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）等をレポータ蛋白とし、これらが発する蛍光強度から測定する方法が感度面で優れている。しかし、これらの蛋白は遺伝子組み換え実験により標的細胞に導入する必要があるため、簡便に実行できるとは言えない。この他、もちろん、細胞から単離したり、人工膜上に再構成するなどすれば、様々な方法で活性を測定することは出来るであろうが、これらにより、簡便、迅速かつ正確な測定を行うのは難しい。
【０００８】
一方で、物質の測定法として、電子スピン共鳴現象を利用して、その電磁波の吸収スペクトルから物質の定量的測定等を行う方法、すなわち電子スピン共鳴法（ＥＳＲ）が知られている。この方法は、不対電子を有するラジカル化合物等において、電子のスピン運動に基づく、磁場（外部磁場）中での電磁波の吸収（電子スピン共鳴）を利用して、ラジカル化合物等を測定するものであるが、該測定には、スピンプローブ（スピン標識化合物）を用いて測定を行う方法が知られている。一般にラジカル化合物は、不対電子を有する性質上、反応性が高く不安定であるが、ラジカル化合物の中には、半永久的に安定なラジカル基を持つものが知られている。そこで、この安定なラジカル基を持つ化合物の性質を利用し、すなわち、該化合物をスピンプローブ（スピン標識化合物）として、物質の測定を行う方法が開発されている。
近年、スピンプローブで標識した化合物を用いて、糖質、脂質、タンパク質、ホルモン、ビタミン、酵素及び抗体等の生体成分を測定する方法が公開されている（特開平６−２４２１１３号公報、特開平７−２３９３１１号公報）。
【０００９】
【特許文献１】
特開平６−２４２１１３号公報。
【特許文献２】
特開平７−２３９３１１号公報。
【非特許文献１】
Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １５，  １５０６−１５１７，  ２００１。
【非特許文献２】
Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ４９，  １６３１−１６３７，  １９７２。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、細胞のガラクトシドパーミアーゼ（ラクトーストランスポーター）活性を、簡便、迅速かつ正確に測定する方法、特に、細胞のガラクトシドパーミアーゼ酵素活性及びガラクトシドパーミアーゼ遺伝子の発現を測定し、簡便、迅速かつ正確に細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性を測定・評価する方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
従来、細胞のガラクトシドパーミアーゼ（ラクトーストランスポーター）活性の測定例としては、放射性同位元素を用いた例のみが報告されている。しかし、この従来の方法では、放射性同位体を用いる必要があるので十分な設備がなければ実行は困難であり、簡便、迅速かつ正確に細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性を測定・評価することはできなかった。そこで、本発明者は、前記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、被検細胞を、ガラクトシド型スピンプローブの存在下、スピンプローブの吸収阻害物質及び／又はスピンプローブ吸収中の異化代謝産物抑制を惹起する物質を含有しない培地で培養しながら、又は培養した後、ＥＳＲ（電子スピン共鳴法）により、被検細胞内に取り込まれるスピンプローブ量を測定することによって、簡便、迅速かつ正確に細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性を測定することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
本発明において、被検細胞内に取り込まれるスピンプローブ量を測定する方法としては、被検細胞を本発明において用いられる特定の培地で培養した後、洗浄、酸化剤処理した細胞をＥＳＲにより測定して、被検細胞に含まれるスピンプローブ量を測定する方法、或いは、被検細胞を本発明において用いられる特定の培地で培養しながらＥＳＲにより測定することによって、被検細胞内に取り込まれ、減衰するスピンプローブのＥＳＲ信号を測定する方法を挙げることができる。
【００１２】
ＥＳＲによる測定には、スピンプローブとして、４−β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ−２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシル（Ｇａｌ−ＴＥＭＰＯ）を用いることができるが、該Ｇａｌ−ＴＥＭＰＯは、前記のように放射性同位元素を用いた測定例では、該Ｇａｌ−ＴＥＭＰＯの一つの水素を３Ｈに置換したものを標識として用いられているから、該Ｇａｌ−ＴＥＭＰＯがラクトーストランスポーターにより吸収されることはわかっており、かつＧａｌ−ＴＥＭＰＯの２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシル（ＴＥＭＰＯ）はＥＳＲのスピンプローブとして知られているものであるから、該Ｇａｌ−ＴＥＭＰＯをＥＳＲにより測定できることが原理的には可能であることが考えられる。しかし、現実にはこれまでそのような報告はなかった。実際、上に述べたＳｔｒｕｖｅとＭｃＣｏｎｎｅｌｌ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ４９，  １６３１−１６３７，  １９７２）の論文中にはＥＳＲ測定の記述はない。
【００１３】
更に、この報告から既に３０年も経っているが、その後、彼ら又は他の人たちが細胞内Ｇａｌ−ＴＥＭＰＯ量をＥＳＲにより測定した報告もない。これは、細胞内のスピンプローブをきちんとＥＳＲで測定することは、現実には簡単ではないからである。その最大の理由としては、細胞内に取り込まれたＧａｌ−ＴＥＭＰＯなどのスピンプローブは、細胞内で還元などの代謝作用を受け、ＥＳＲで観測できない形に変化してしまうことが挙げられる。このため、放射性物質を用い測定出来るからといって、ＥＳＲで検出可能とは限らないのである。また、もしＥＳＲで測定できたとしても、ＥＳＲから得られたＧａｌ−ＴＥＭＰＯ量がラクトーストランスポーター発現量に相関している保証もない。しかし、本発明者は、鋭意努力の結果、被検細胞をスピンプローブＧａｌ−ＴＥＭＰＯの存在下、特定の培地で培養した後、ＥＳＲで測定することにより、細胞内スピンプローブ量を正確に測定する方法、及び、被検細胞をＧａｌ−ＴＥＭＰＯの存在下、特定の培地で培養しながら同時にＥＳＲで測定することにより、細胞へのスピンプローブ取り込みを経時的に測定する方法を確立することに成功した。更に、この方法で測定された細胞内スピンプローブ量、及び細胞のスピンプローブ取り込み速度は、ガラクトシドパーミアーゼ（ラクトーストランスポーター）発現に対応して増加することを確認することにも成功した。
【００１４】
本発明で用いられるＥＳＲのスピンプローブとしては、ガラクトシド型スピンプローブが用いられる。また、本発明で用いられる、被検細胞をガラクトシド型スピンプローブの存在下で培養するための培地としては、スピンプローブの吸収阻害物質及び／又はスピンプローブ吸収中の異化代謝産物抑制を惹起する物質を含有しない培地であり、ガラクトシド型スピンプローブ以外にガラクトシド類を含まない、及び／又は炭素源を制限した或いは炭素源を含まない培地が用いられる。該炭素源を制限した或いは炭素源を含まない培地としては、グルコース、マルトース及びガラクトースからなる糖類を制限した或いは含まない培地を挙げることができる。
【００１５】
すなわち具体的には本発明は、被検細胞を、ガラクトシド型スピンプローブの存在下、スピンプローブの吸収阻害物質及び／又はスピンプローブ吸収中の異化代謝産物抑制を惹起する物質を含有しない培地で培養しながら、又は培養した後、電子スピン共鳴法による測定を行い、被検細胞内に取り込まれるスピンプローブ量を測定することを特徴とする細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性の測定方法（請求項１）や、被検細胞内に取り込まれるスピンプローブ量の測定が、被検細胞を、ガラクトシド型スピンプローブの存在下、スピンプローブの吸収阻害物質及び／又はスピンプローブ吸収中の異化代謝産物抑制を惹起する物質を含有しない培地で培養した後、洗浄、酸化剤処理した細胞を電子スピン共鳴法により測定することによって、被検細胞内に含まれるスピンプローブ量を測定するものであることを特徴とする請求項１記載の細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性の測定方法（請求項２）や、被検細胞内に取り込まれるスピンプローブ量の測定が、被検細胞を、ガラクトシド型スピンプローブの存在下、スピンプローブの吸収阻害物質及び／又はスピンプローブ吸収中の異化代謝産物抑制を惹起する物質を含有しない培地で培養しながら電子スピン共鳴法により測定することによって、被検細胞内に取り込まれ減衰するスピンプローブの電子スピン共鳴吸収信号を測定するものであることを特徴とする請求項１記載の細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性の測定方法（請求項３）や、ガラクトシドパーミアーゼ活性の測定が、ガラクトシドパーミアーゼ酵素活性及び／又はガラクトシドパーミアーゼ遺伝子の発現の測定であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性の測定方法（請求項４）や、スピンプローブの吸収阻害物質及び／又はスピンプローブ吸収中の異化代謝産物抑制を惹起する物質を含有しない培地が、ガラクトシド型スピンプローブ以外にガラクトシド類を含まない、及び／又は炭素源を制限した或いは炭素源を含まない培地であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性の測定方法（請求項５）や、炭素源を制限した或いは炭素源を含まない培地が、グルコース、マルトース及びガラクトースからなる糖類を制限した或いは含まない培地であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性の測定方法（請求項６）や、ガラクトシド型スピンプローブが、ガラクトシド基を有する２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ基、２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ基、又は４，４−ジメチル−３−オキサゾリニルオキシ基からなるＮ−オキシラジカル基を有する化合物であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性の測定方法（請求項７）や、ガラクトシド型スピンプローブが、ガラクトシド基を有し、かつ、２，２，６，６−テトラメチル−１−ヒドロキシピペリジン骨格、２，２，５，５−テトラメチル−１−ヒドロキシピロリジン骨格、又は４，４−ジメチル−３−ヒドロキシオキサゾリジン骨格からなる、酸化剤処理により安定なラジカルに変換される化合物であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性の測定方法（請求項８）や、ガラクトシド型スピンプローブが、４−β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ−２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシルであることを特徴とする請求項７又は８記載の細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性の測定方法（請求項９）からなる。
【００１６】
また本発明は、被検細胞が、微生物又は動植物の細胞であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性の測定方法（請求項１０）や、被検細胞が、大腸菌であることを特徴とする請求項１０記載の細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性の測定方法（請求項１１）からなる。
【００１７】
さらに本発明は、スピンプローブの吸収阻害物質及び／又はスピンプローブ吸収中の異化代謝産物抑制を惹起する物質を含有しない培地、及びガラクトシド型スピンプローブを装備したことを特徴とする細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性の測定用キット（請求項１２）からなる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明は、被検細胞を、ガラクトシド型スピンプローブの存在下、スピンプローブの吸収阻害物質及び／又はスピンプローブ吸収中の異化代謝産物抑制を惹起する物質を含有しない培地で培養しながら、又は培養した後、ＥＳＲ（電子スピン共鳴法）による測定を行い、被検細胞のスピンプローブ吸収速度、又は被検細胞内に含まれるスピンプローブ量を測定し、ガラクトシドパーミアーゼ酵素活性及び／又はガラクトシドパーミアーゼ遺伝子の発現を測定して、細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性を測定することよりなる。
被検細胞として、本発明の対象となる細胞としては、まず大腸菌等の微生物が挙げられる。その他、ガラクトシドパーミアーゼが発現する可能性のある動植物の細胞、更にはガラクトシドパーミアーゼ遺伝子を導入した微生物及び動植物細胞も対象となる。
【００１９】
本発明で用いる、被検細胞をガラクトシド型スピンプローブの存在下で培養するための培地としては、スピンプローブの吸収阻害物質及び／又はスピンプローブ吸収中の異化代謝産物抑制を惹起する物質を含有しない培地であり、ガラクトシド型スピンプローブ以外にガラクトシド類を含まない、及び／又は炭素源を制限した或いは炭素源を含まない培地が用いられる。該炭素源を制限した或いは炭素源を含まない培地としては、グルコース、マルトース及びガラクトースからなる糖類を制限した或いは含まない培地を挙げることができる。
すなわち、本発明で用いる培地の条件として、まずスピンプローブ以外にガラクトシド類を含まないことが必要である。これは、これらガラクトシド類は、ガラクトシドパーミアーゼによるスピンプローブの吸収を競争阻害するためである。また、グルコース、マルトース、及びガラクトースなどの糖類を含んでいると、スピンプローブ吸収中に異化代謝産物抑制が起こりガラクトシドパーミアーゼ活性に変化が起こる可能性がある。このため、正確な活性測定のためには、これらも含まれないことが望ましい。もっとも望ましい形は、ガラクトシド型スピンプローブ以外の炭素源を全て除いた溶液を培地とすることである。
【００２０】
本発明で、ＥＳＲにより測定するためのスピンプローブとしては、ガラクトシド型スピンプローブが用いられる。該ガラクトシド型スピンプローブの例としては、ガラクトシド基を有する２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ基、２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ基、又は４，４−ジメチル−３−オキサゾリニルオキシ基からなるＮ−オキシラジカル基を有する化合物が挙げられる。また、その他に、ガラクトシド基を有し、かつ、２，２，６，６−テトラメチル−１−ヒドロキシピペリジン骨格、２，２，５，５−テトラメチル−１−ヒドロキシピロリジン骨格、又は４，４−ジメチル−３−ヒドロキシオキサゾリジン骨格からなる、酸化剤処理により安定なラジカルに変換される化合物もスピンプローブとして用いることができる。本発明で用いる特に望ましいスピンプローブの例としては、４−β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ−２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシル（Ｇａｌ−ＴＥＭＰＯ）を挙げることができる。
【００２１】
本発明の測定方法を実施するためには、被検細胞を、スピンプローブの吸収阻害物質及び／又はスピンプローブ吸収中の異化代謝産物抑制を惹起する物質を含有しない培地で培養し、該培養後、洗浄、酸化剤処理した細胞を電子スピン共鳴法により測定する。
該方法について、更に詳述すると、測定に際しては、まず、ガラクトシドパーミアーゼ（ラクトーストランスポーター）発現量を測定したい細胞を適当量公知の方法に従い分離・採取する。対象となる細胞としては、上記のように、大腸菌等の微生物や、ガラクトシドパーミアーゼを発現する可能性のある動植物の細胞又はガラクトシドパーミアーゼの遺伝子を導入した微生物或いは動植物細胞が挙げられる。
【００２２】
採取した細胞を、ガラクトシド型スピンプローブを含み、かつそれ以外の炭素源を含まない又は制限された液体培地に懸濁し、所定の時間培養（インキュベート）する。ガラクトシド型スピンプローブの例としては、前記のようなものを用いることができるが、特に好ましいスピンプローブとして、４−β−Ｄ−ガラクトシルオキシ−２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシル（Ｇａｌ−ＴＥＭＰＯ）を挙げることができる。ここで用いる培地の条件として、まずスピンプローブ以外にガラクトシド類を含まないことが必要である。これは、これらガラクトシド類は、ガラクトシドパーミアーゼによるスピンプローブの吸収を競争阻害するためである。また、グルコース、マルトース、及びガラクトースなどの糖類を含んでいると、スピンプローブ吸収中に異化代謝産物抑制が起こりガラクトシドパーミアーゼ活性に変化が起こる可能性がある。このため、正確な活性測定のためには、これらも含まれないことが望ましい。
【００２３】
もっとも望ましい形は、ガラクトシド型スピンプローブ以外の炭素源を全て除いた溶液を培地とすることである。スピンプローブの濃度は、０．３ｍＭ〜３ｍＭが標準であるが、細胞にスピンプローブの毒性が現れない範囲で濃度を上げることが出来る。また、逆に後のＥＳＲ測定感度の範囲内で濃度を下げることも出来る。ここでの培養時間は、３０分〜１時間が標準であるが、細胞の活性が持続する範囲でこの培養時間を延長することも可能である。また、この培養時間を３０分よりも短くとることも可能であるが、測定感度が悪くなるので特殊な場合（炭素源制限培地では急速に細胞活性が失われてしまうなど。）を除けば意味がない。
【００２４】
所定の時間培養した細胞を常法により集菌する。得られた菌体は、洗浄・遠心を十分に行い、培養液中に残るスピンプローブを完全に除去する。ここで最後の洗浄液を取っておけば、後で、洗浄が十分だったかのチェックに用いることが出来る。洗浄用の液としては、上で用いた炭素源を含まない又は制限された培地も用いても良いし、簡単にリン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）を用いても良い。この洗浄・遠心の操作の間菌体を低温（０〜１０℃）に保つことが望ましい。また、下で述べる酸化剤をこれらの洗浄液に加えておくことにより、より正確な測定が可能である。
【００２５】
このような操作を施した細胞に酸化剤を加えた後、これを適量取りＥＳＲ測定を行う。酸化剤としては、Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６が最適であるが、その他、ヒドロシシルアミン類をニトロキシルラジカルに酸化するに十分な酸化力を持ち、かつ細胞内に浸透可能な物質であれば使用可能である。但し、過酸化水素は十分な酸化力を持ち細胞内にも浸透可能であるが、細胞に加えると酸素が発生し測定がしづらくなるので適当でない。
得られたＥＳＲスペクトルから常法に従い測定に供した細胞内のスピンプローブ量を定量する。さらにＥＳＲ測定に用いた細胞の体積又は重量を併せて常法に従い求めることにより、最終的に細胞内のスピンプローブ濃度を決定することができる。このようにして得られたスピンプローブ濃度が細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性を表している。
【００２６】
また、変法として、以下のように最後の菌体の遠心分離・洗浄・酸化剤処理を省略することも可能である。この方法では、精度は少し落ちる可能性があるが、少ない手順で測定が可能であり、また少量のスピンプローブ量で測定することができる（０．０１〜１ｍＭ）。すなわち、被検細胞を、上に挙げたガラクトシド型スピンプローブを含む何れかの培地に懸濁した後、直ちにその懸濁液ごと適宜かき混ぜながら経時的にＥＳＲ測定を行う。細胞に吸収されたスピンプローブは還元されＥＳＲ信号を与えなくなるので、スピンプローブＥＳＲ信号の減衰速度から、細胞のスピンプローブ吸収速度を測定することができる。このスピンプローブ吸収速度が、ガラクトシドパーミアーゼ活性を示している。
【００２７】
本発明の細胞のガラクトシドパーミアーゼ（ラクトーストランスポーター）活性の測定方法は、スピンプローブの吸収阻害物質及び／又はスピンプローブ吸収中の異化代謝産物抑制を惹起する物質を含有しない培地、及びガラクトシド型スピンプローブ等を装備した、細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性の測定用キットとして製品化することができる。
【００２８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
（実施例１）
前培養として、まず、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＬＥ−３９２株（プロメガ社；Ｎ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙら、Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  １５０，５３−６１，１９７７）又はＸＬ１−ｂｌｕｅＭＲＦ´株（ＴＯＹＯＢＯ社；Ｂ．  Ｊｅｒｐｓｅｔｈら、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ５，  ８１−８３，１９９２）をＬＢ培地（１リットル中：バクトトリプトン  １０ｇ、イーストエクストラクト  ５ｇ、塩化ナトリウム  １０ｇ）を用い、３７℃で一晩振とう培養した。ＭｇＳＯ４（１０ｍＭ）を含むＬＢ培地（５０ｍＬ）を２つ用意し、それぞれに前培養液を０．１ｍＬづつ加えた。混合液はともに３７℃で４時間震盪培養したが、一方には２時間３０分経過時にＩＰＴＧ（最終濃度０．３ｍＭ）を加えた。４時間の振とう培養終了後、それぞれから６ｍＬとり集菌した（３×１０００ｒｐｍで５分遠心した後、上澄みを捨てた）。得られた大腸菌ペレットは、それぞれ１ｍＭ  ４−β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ−２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシル（Ｇａｌ−ＴＥＭＰＯ）を含むＭ９（−Ｇｌｃ）最小培地１ｍＬに懸濁し、さらに１時間３７℃で震盪培養した。ここで、Ｍ９（−Ｇｌｃ）最小培地とは表１のような組成を持つ培地である。
【００２９】
【表１】
2004229613.tif 000002
【００３０】
Ｍ９（−Ｇｌｃ）最小培地にＧａｌ−ＴＥＭＰＯを加えた溶液中１時間震盪培養後、大腸菌を集菌し、さらにリン酸緩衝食塩水での洗浄、遠心、上澄み除去操作を２回ずつ行った。最後の上澄みは洗浄のチェックのため、一部取っておき、後でＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６を加えＥＳＲ測定を行った、これにより、上澄みからはスピンプローブの信号は観測されないか、又は菌体からの信号の強度と比べ無視できるほど小さいことを確認した。このようにして得られた大腸菌ペレットそれぞれに、２０ｍＭ  Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６水溶液を数μＬ加えた後、懸濁液をパスツールピペットで吸いとりＥＳＲ測定に供した。得られたスピンプローブのＥＳＲ信号強度（図１．Ａ）と、別に測定して得たＥＳＲ強度−スピンプローブ量検量線から、試料内スピンプローブ量を定量した。この際、Ｍｎ２＋マーカーの信号強度を用い実験条件の違いを補正した。このスピンプローブ量を大腸菌ペレット体積で割ることにより、細胞内スピンプローブ量を見積もった。大腸菌ペレット体積は、測定した菌をパスツールピペットごと遠心分離器にかけ、得られたペレットのピペット内での高さから求めた。
【００３１】
以上のようにして得られた細胞内スピンプローブ量を図１．Ｂに示した。なお、ここでＬＥ−３９２株はガラクトシドパーミアーゼ遺伝子（ｌａｃＹ）欠損株であるのに対し、ＸＬ１−ｂｌｕｅ  ＭＲＦ´株はｌａｃＹを正常に保有している。ＩＰＴＧを加えなかった場合（ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＬＥ３９２株、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ´株での細胞内スピンプローブ濃度は、それぞれ１３０、及び２０μＭ程度であった。これに対し、ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を加えた場合、ＸＬ１−ｂｌｕｅ  ＭＲＦ´株で約１２．５倍も細胞内スピンプローブ濃度が上昇しており、ＩＰＴＧによりｌａｃＹの発現が促進されガラクトシドパーミアーゼ活性が顕著に上昇したことを示している。これと対照的に、ＬＥ３９２ではＩＰＴＧを加えても細胞内スピンプローブ濃度が上昇は観測されなかった（却って減少した）。これは、ＬＥ３９２がｌａｃＹ欠損であることと一致しており、ＸＬ１−ｂｌｕｅ  ＭＲＦ´株での細胞内スピンプローブ濃度の上昇は確かにガラクトシドパーミアーゼ活性によることを示している。
【００３２】
（実施例２）
ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ´株に対して、実施例１における４時間振とう培養を、ＭｇＳＯ４（１０ｍＭ）とともにマルトース（０．２％）も含むＬＢ培地（５０ｍＬ）を用いて行った。それ以外は、実施例１と全く同じ様に実験を行った。その結果を図２に示す。これによりマルトースにも、グルコースと同じく、ガラクトシドパーミアーゼ活性抑制能が有ることが分かる。ここで、スピンプローブを含む液で培養した時には、マルトースは既に系から除かれていることに注意すべきである。また、特に、ＩＰＴＧが無くマルトースがあるという条件で培養された菌での細胞内スピンプローブ濃度は２０μＭ程度で、ｌａｃＹ欠損のＬＥ３９２で得られた細胞内スピンプローブ濃度（図１）と同程度である。この程度はこの測定法のバックグランド量に対応し、この条件下ではＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ´でもｌａｃＹはほとんど発現していないと考えられる。
【００３３】
（実施例３）
実施例１においてＩＰＴＧを加えて培養した後、Ｍ９（−Ｇｌｃ）＋Ｇｌｃ−ＴＥＭＰＯ溶液にさらにＩＰＴＧ（最終濃度：０．３ｍＭ）を加えた液で１時間培養した。それ以外は、実施例１と全く同じ様に実験を行った。その結果を図３に示す。これにより、スピンプローブとＩＰＴＧが共存すると、細胞内スピンプローブ量が小さくなってしまうことを示している。これは、同じガラクトシドであるＩＰＴＧが、スピンプローブＧａｌ−ＴＥＭＰＯの吸収を競争阻害したためと考えられる。これにより、スピンプローブを吸収させる際には、少なくとも他のガラクトシド類は共存してはいけないことが分かる。
【００３４】
（実施例４）
実施例１の通りに４時間震とう培養したＸＬ１−ｂｌｕｅ  ＭＲＦ´株とＬＥ−３９２株を含む培養液をそれぞれ１ｍＬと０．５ｍＬ取り、遠心分離により集菌し、リン酸緩衝食塩水で一回洗浄した（両株の発育速度が異なるのでそれに合わせて異なる量を取った。ＸＬ１−ｂｌｕｅ  ＭＲＦ´株とＬＥ−３９２株のＯＤ値はそれぞれ、ＯＤ６００＝０．８９４〜０．８９８、１．６０〜１．６６であった）。得られた大腸菌ペレットそれぞれに、スピンプローブ０．１ｍＭを含むリン酸緩衝食塩水を４μＬ加え、両者を良く混合させた後、パスツールピペットに取り直ちにＥＳＲ測定を行った。該液を取ったパスツールピペットは適宜上下を反転させ、菌と培養液が分離しないようにした。この結果得られたＥＳＲ信号強度の時間変化を図４（図４．Ａ、Ｂ）に示す。ｔ＝０が大腸菌ペレットとスピンプローブを含む培養液を混合した時間である。
【００３５】
ここでは、菌内外のスピンプローブを同時に測定しているが、菌に吸収されたスピンプローブは菌体内で直ちに還元されＥＳＲ信号を与えなくなるので、信号強度の減衰速度から、菌のスピンプローブ吸収速度を知ることができる。該培養液のみによるスピンプローブ信号強度の減少速度は無視できる程度であることも確認した。この結果から、ＥＳＲ信号の減衰速度−特に、ｔ＝０近傍の初期減衰速度−が、ガラクトシドパーミアーゼ活性と相関していることが分かる。比較のためスピンプローブとして、４−α，β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ−２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシル（Ｇｌｃ−ＴＥＭＰＯ）を用いた結果も示した。図に示すように、同じ配糖体型スピンプローブであってもＧｌｃ−ＴＥＭＰＯでは、差は観測されない。
【００３６】
【発明の効果】
ガラクトシドパーミアーゼ（ラクトーストランスポーター）は、ラクトースに代表されるガラクトシド類の吸収を触媒する膜蛋白質であり、プロトン勾配に共役しガラクトシド類のペリプラズムからサイトプラズムへの移行を促す。したがって、ガラクトシドパーミアーゼ遺伝子（例えば、大腸菌のＬａｃＹ遺伝子）の発現量は細胞の栄養状態を反映するため、ガラクトシドパーミアーゼ（ラクトーストランスポーター）活性を測定するにより細胞の状態について情報を得ることが可能である。
【００３７】
また、例えば、大腸菌のガラクトシドパーミアーゼ遺伝子（ＬａｃＹ遺伝子）は、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、ガラクトシドアセチルトランスフェラーゼ（ｌａｃＡ）遺伝子などと共にラクトースオペロンを構成している。現在では、該ラクトースオペロンを利用して、ＩＰＴＧのような遺伝子発現調節物質を投与することにより、ラクトース代謝酵素、更にはラクトースプローモーター・オペレーター部位の後ろに人為的に挿入した蛋白質の発現を制御することが、遺伝子・蛋白質研究や有用蛋白質の大量調製等で普通に行われており、また、近年、大腸菌ラクトースオペロンをマウス遺伝子に組み込むことにより、生体マウスでの遺伝子の発現をＩＰＴＧ投与／非投与により制御するようなことも行われている。したがって、ガラクトシドパーミアーゼ（ラクトーストランスポーター）活性を測定し、これらの遺伝子発現制御の情報を検知することは、該遺伝子操作において重要な事項となる。
【００３８】
従来、細胞のガラクトシドパーミアーゼ（ラクトーストランスポーター）活性の測定例としては、放射性同位元素を用いた例が報告されていたが、この従来の方法では、放射性同位体を用いる必要があるので十分な設備がなければ実行は困難であった。そこで、本発明においては、ＥＳＲ（電子スピン共鳴法）により、被検細胞内に取り込まれるスピンプローブ量を測定する方法を開発することにより、従来法のように放射性物質を用いず、簡便、迅速かつ正確に細胞のラクトーストランスポーター酵素活性及びラクトーストランスポーター遺伝子発現を測定し、細胞のガラクトシドパーミアーゼ（ラクトーストランスポーター）活性を測定することを可能にした。本発明の測定方法は、ＥＳＲ法に基づくものであるため、マイクロ波と磁場が透過しさえすれば、光の透過しにくい試料であっても測定することができる。そこで、本発明の方法は、通常の細胞はもとより、発色団や色素の多い細胞についても定量性良く測定できるという利点を有する。
本発明の方法は、簡便、迅速かつ正確に細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性を測定することを可能とするものであるため、実用的な方法として、上記のようなガラクトシドパーミアーゼ活性の測定のみならず、広い範囲の細胞のガラクトシドパーミアーゼ活性の測定に供し得るものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＸＬ１−ｂｌｕｅ  ＭＲＦ´株（ラクトーストランスポーター遺伝子有りｌａｃＹ＋）とＬＥ−３９２株（ラクトーストランスポーター遺伝子欠損ｌａｃＹ−）について、本測定法によりラクトーストランスポーター活性を測定したものである。Ａに、ＥＳＲスペクトルの生データ（同じ倍率での強度に合わせている）、Ｂに、この結果から求められた細胞内スピンプローブ量を示す。「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は、ＬＢ培地で４時間培養した大腸菌細胞に対する結果。「＋ＩＰＴＧ」は２．５時間ＬＢ培地で培養した後、培地にＩＰＴＧ（最終濃度：０．３ｍＭ）を加え、さらに１．５時間培養した大腸菌細胞に対する結果である（トータルの培養時間は同じく４時間）。
【図２】ラクトーストランスポーター活性に対するマルトースの影響を見たものである。通常のＬＢ培地及びマルトース（最終濃度０．２％）を添加したＬＢ培地で４時間培養した大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ  ＭＲＦ´株について、本測定法によりラクトーストランスポーター活性を測定した。
【図３】スピンプローブＧａｌ−ＴＥＭＰＯとＩＰＴＧを同時に加えたときの影響をみたものである。ともに、２．５時間ＬＢ培地で培養した後、培地にＩＰＴＧ（最終濃度：０．３ｍＭ）を加え、さらに１．５時間培養した。その後、「ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ＩＰＴＧ」では、Ｇａｌ−ＴＥＭＰＯ（１ｍＭ）のみを含むＭ９（−Ｇｌｃ）最小培地で培養したが、「ｗｉｔｈ  ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ＩＰＴＧ」では、Ｇａｌ−ＴＥＭＰＯ（１ｍＭ）とＩＰＴＧ（０．３ｍＭ）を含むＭ９（−Ｇｌｃ）最小培地で培養した。
【図４】ガラクトシドパーミアーゼ活性の違いを、スピンプローブのＥＳＲ信号の減衰速度の差として見たものである。ＥＳＲ信号強度は、ＥＳＲ試料中のスピンプローブ量に換算している。ガラクトシドパーミアーゼ活性が高いほど、スピンプローブＧａｌ−ＴＥＭＰＯのＥＳＲ信号の減衰速度（特に、ｔ＝０における初速度）が大きい。これは、他のスピンプローブＧｌｃ−ＴＥＭＰＯでは検出できない。
【図１】
2004229613.tif 000003
【図２】
2004229613.tif 000004
【図３】
2004229613.tif 000005
【図４】
2004229613.tif 000006