(57)【要約】【課題】植物成分であって、抗腫瘍活性が高く、副作用が少ない抗腫瘍剤を提供すること。【解決手段】センダン科（Ｍｅｌｉａｃｅａｅ）に属する植物、つまり、センダンの葉、茎、枝、樹皮及び実の乾燥粉砕物、若しくはその水又は酢酸エチル、四塩化炭素、クロロフォルム、ジクルロメタン、メタノール、エタノール、（イソ）プロピルアルコール、ブタノール、アセトン又はＤＭＳＯなどの有機溶剤での抽出物を含有する抗腫瘍剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
センダン科植物又はその抽出物を含有することを特徴とする抗腫瘍剤。
【請求項２】
センダン科植物の抽出物が、センダン科植物の葉、実、枝又樹皮の水性抽出物である請求項１記載の抗腫瘍剤。
【請求項３】
センダン科植物の抽出物が、センダン科植物の葉、実、枝又樹皮の有機溶剤抽出物である請求項１記載の抗腫瘍剤。
【請求項４】
有機溶剤が、酢酸エチル、四塩化炭素、クロロフォルム、ジクルロメタン、メタノール、エタノール、（イソ）プロピルアルコール、ブタノール、アセトン又はＤＭＳＯである請求項３記載の抗腫瘍剤。
【請求項５】
センダン科植物の抽出物中の有効成分が、分子量１００００以下のものである請求項１〜４のいずれか１項記載の抗腫瘍剤。
【請求項６】
大腸癌、胃癌又は肺癌を治療するためのものである請求項１〜５のいずれか１項記載の抗腫瘍剤。
【請求項７】
抗腫瘍剤を調製するためのセンダン科植物又はその抽出物の使用。
【請求項８】
センダン科植物又はその抽出物を含有する食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗腫瘍剤、特に、植物由来の成分を含有し、ヒトの大腸癌、胃癌及び肺癌に対して優れた効果を有する抗腫瘍剤、及び食品に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
医療技術が進歩し、高齢化が更新されている現在において、癌は依然として重大な病気として存在している。もちろん、癌の治療技術も大いに進歩し、合成医薬、漢方、天然物からの抽出物などをベースとする数多くの医薬が開発されている。合成医薬に対して、天然物からの抽出物は副作用の点で優れており、例えば、西洋イチイからタキソールが発見され、抗癌剤の有効成分として用いられている（特開昭６３−３０４７８号公報や特開平７−２３３０６４号公報など）が、その副作用は依然として大きいものである。
【特許文献１】
特開昭６３−３０４７８号公報
【特許文献２】
特開平７−２３３０６４号公報
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、植物成分であって、抗腫瘍活性が高く、副作用が少ない抗腫瘍剤を提供することを目的とする。
本発明は、又、植物成分を含有する食品を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、植物成分における抗癌物質を探索している過程で、センダン科植物（以下センダン）成分が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで癌細胞を強く殺傷すること、特に、ヒトの大腸癌、胃癌及び肺癌細胞を殺傷し、かつセンダン抽出物が高い希釈においても癌細胞を殺傷するとの知見に基づいてなされたのである。
すなわち、本発明は、センダン科植物又はその抽出物を含有することを特徴とする抗腫瘍剤を提供する。
本発明は、又、抗腫瘍剤を調製するためのセンダン科植物又はその抽出物の使用を提供する。
本発明は、又、センダン科植物又はその抽出物を含有する食品を提供する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明で用いるセンダン科植物は、センダン科（Ｍｅｌｉａｃｅａｅ）に属する植物であって、太い枝先に羽状複葉をもち、円錐花序を有する常緑または落葉の高木が中心であるが、低木や草本状のものも存在している。これらのうち、特に、センダン（Ｍｅｌｉａ  Ａｚｅｄａｒａｃｈ  Ｌ．やＭｅｌｉａ  Ａｚｅｄａｒａｃｈ  ｖａｒ．  ｓｕｂｔｒｉｐｉｎｎａｔａ）を用いるのが好ましい。本発明では、センダン科植物の葉、茎、枝、樹皮及び実を用いることができる。又、根皮を用いることもできる。センダン科植物自体を抗腫瘍剤の有効成分として使用する場合には、これらを乾燥した後、微細に粉砕して用いるのが好ましい。
【０００６】
本発明では、センダン科植物の葉、茎、枝、樹皮及び実を、例えば、乾燥し、粉砕した後、又は未乾燥の生の状態で、水、例えば、蒸留水やイオン交換水で、又は親水性若しくは疎水性有機溶媒で抽出した液自体又はその乾燥物を用いることができる。ここで用いる有機溶媒としては、酢酸エチル、四塩化炭素、クロロフォルム、ジクルロメタン、メタノール、エタノール、（イソ）プロピルアルコール、ブタノール、アセトン又はＤＭＳＯがあげらる。ここで親水性溶媒は、含水形態で用いることもできる。使用する水や溶媒の量は任意とすることができるが、５分の１〜５倍量で用いるのがよく、特に約等量で用いるのが好ましい。又、抽出は、６０℃以下であるのがよく、さらに室温で行うのが好ましく、特に、ミキサーなどで攪拌しながら行うのがよい。
センダン科植物の抽出物中の有効成分が、分子量１００００以下のものであるのが好ましく、より好ましくは、分子量４０００〜１００００又は３０００以下であり、最も好ましくは約５千である。
水又は溶媒抽出物は、そのままの液体状態で使用することもできるが、乾燥し、粉末、顆粒などの固形状で用いることもできる。
【０００７】
尚、センダン科植物又はその抽出物を含有する抗腫瘍剤とする場合、これらに加えて、医薬上許容される各種の製剤用物質、例えば、賦形剤、希釈剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑走剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、可溶化剤等を補助剤として含むことができる。具体的には、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトール及びその他の糖類、タルク、ミルク蛋白、ゼラチン、澱粉、セルロース及びその誘導体、動物及び植物油、ポリエチレングリコール、グリセロールなどがあげられる。
【０００８】
本発明の抗腫瘍剤は、経口投与によるのが好ましいが、これに限定されるものではない。本発明の抗腫瘍剤は、体重１Ｋｇ当たり、０．２５〜２ｇ程度の量で用いるのがよい。
又、センダン科植物又はその抽出物を含有する食品とする場合、健康食品や抗腫瘍活性を有する機能食品とすることができる。食品中のセンダン科植物又はその抽出物は、特に限定されないが、０．０１〜５質量％程度含有させるのがよい。
【０００９】
【発明の効果】
本発明によれば、センダン科植物又はその抽出物を有効成分として含有することにより、抗腫瘍活性が高く、副作用が少ない抗腫瘍剤が提供される。センダン抽出粗画成分は高い希釈においても大腸癌細胞を殺傷し、その力価は対照に用いた抗癌剤のマイトマイシンＣよりも１０，０００倍以上も高いことが示された。一方、抗癌物質の探索に用いたヒトの胃癌および肺癌細胞に対し、本成分は対照に用いたマイトマイシンとほぼ同じ抗癌作用を有することも示された。
このように本発明によれば、各種腫瘍、特に、大腸癌、胃癌および肺癌に対して優れた抗腫瘍剤が提供される。
次に本発明を実施例により詳細に説明する。
【００１０】
【実施例】
実施例１
植物成分の抽出
沖縄県名護市郊外で自生しているセンダン（Ｍｅｌｉａ  Ａｚｅｄａｒａｃｈ  Ｌ．）の実、葉、枝、幹皮及び根皮の部分を採集して無乾燥の生の状態で秤量し、包丁でほぼ数ミリ程度の幅になるよう細切した。これに等重量の蒸留水を加えた上で市販の大型ミキサーを用いて毎分１０，０００回転で１０分間処理した。この混合物を１５〜５０ｍｌ容量のプラスチック遠心管に分注し、ベックマンの遠心機（ＧＳ−１５Ｒ）を用いて毎分５，０００回転で６０分間遠心した。これをセンダンの粗画総成分として、さらにザルトルウスのミニザルト（０．４５μｍ）で濾過滅菌後試験に供した。蒸留水による成分抽出に加え、クロロフォルム、イソプロピルアルコール、酢酸エチル、アセトン、ブタノール、エタノール、メタノール、ジクロロメタン、ベンゼン、エーテルの溶媒等も抽出実験に使用した。
【００１１】
比較対照
比較対照として、すでに抗癌剤として広く使用されている市販のマイトマイシンＣ（協和発酵）を１ｍｌ当たり１ｍｇになるよう−ＰＢＳに溶解させた。又、蒸留水で抽出する方法でスベリヒユ科（Ｐｏｒｔｕｌａｃａｃｅａｅ）のマツバボタン（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ  ｐｉｌｏｓａ  Ｌ．  ｓｓｐ．  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ  Ｇｅｅｓｉｎｋ）についても粗画成分を抽出し、比較対照として検査に供した。
細胞と培養
ヒトの大腸癌細胞（ＨＴ−２９）、胃癌細胞（ＭＫＮ１）及び肺癌細胞（Ａ５４９）は（財）癌研究会癌化学療法センター分子薬理部の矢守隆夫博士から分与を受け、それぞれの細胞を、５％ウシ胎児血清を含む市販のＲＰＭＩ−１６４０（ＧＩＢＣＯ）の培地を用い５ｃｍ２フラスコ（イワキ）中で継代維持した。
評価用細胞の培養
直径１００ｍｍプラスチックシャーレ（イワキ）に上記ＨＴ−２９、ＭＫＮ１及びＡ５４９細胞を、５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で培養し、２日後に細胞をマイナス燐酸緩衝食塩水（−ＰＢＳ）で洗滌、これにトリプシン−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ）を加えて細胞を分散、次いで５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０に浮遊させ細胞数を算定した。上記３種の細胞濃度は１０５／ｍｌと定め、９６穴（ウェル）の細胞培養用プラスチックプレート（イワキ）の１ウェルにつき０．１ｍｌずつ分注した。例えば、各プレートのＡ列とＨ列、番号プレート１列と２列には培地のみ、２番から１１番、Ｂ列からＧ列までに各試験用細胞を分注して、３７℃で２４時間培養した。
【００１２】
評価方法
被検体センダン及びマツバボタン成分と比較対照のマイトマイシンＣを血清の入っていないＧＩＢＣＯのＭｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）で１０−１から１０−８、あるいは、１０−１から１０−４まで希釈し、各ウェルに１００μｌずつ分注した。各検体につき２列のウェルを用意し、Ｂ、Ｃ列の１１番から８番目に被検体の１０−１、１０−２、１０−３、１０−４希釈液を、さらに２番、３番、４番、５番ウェルに１０−５、１０−６、１０−７、１０−８希釈液を添加、６番と７番目のウェルには培地のみを分注してそれぞれの被検体の対照とした。同様な手順に沿って、ＤとＥ列、ＦとＧ列に被検体の希釈液シリーズを配した。被検体を分注して２日間培養後、各ウェルに５０％のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を５０μｌ加えて４℃で１時間静置した。次に水道水を２００μｌ加えて回洗滌してプレートを乾燥、それぞれのウェルにスルフォローダミン染色液を５０μｌ加えて１０分間静置、続いて１％酢酸を１００μｌずつ加えて５回洗滌してプレートを乾燥させた。最後に、各プレートに１０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ［ｈｉｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）液１５０μｌを加えて毎分７５０回転で５分間振り、５２５ｎｍの波長で吸光度を測定した。細胞の生存率は次のように算定した。
細胞の生存率  ＝  １００×（各希釈点の被検体の平均吸光度−各希点に対応する培地対照の平均の吸光度）／（細胞対照の平均吸光度−各希釈点に対応する培地対照の平均の吸光度）
センダン成分の大腸癌（ＨＴ−２９）、胃癌（ＭＫＮ１）及び肺癌（Ａ５４９）細胞に対する殺傷効果についての結果をまとめて表−１に示す。
【００１３】
【表１】
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【００１４】
表−１から、センダンの葉由来の原液を１０−８倍に希釈しても大腸癌はほぼ７０％の致死率を見せており、比較対照のマイトマイシンＣの実に１０万倍以上の高い殺傷効果を奏することがわかる。
５０％以上の致死率の値を算定するため、原液を１００倍に希釈し、さらに１０−１から１０−８に希釈して再試験を実施した結果、１０６．３の５０％致死率も示してあるが、センダン成分の高い大腸癌（ＨＴ−２９）に対する殺傷効果が改めて実証されていることがわかる。
尚、センダンの葉成分の被検体の大腸癌に対する致死効果は希釈が進むに従って減少し、希釈と殺傷効果との間には用量反応曲線が成立した。一方、このセンダン成分の肺癌（Ａ５４９）及び胃癌（ＭＫＮ１）に対する殺傷効果は低いながらも確認され、肺癌細胞に対する５０％致死率は１０１．９、さらに後者の胃癌細胞に対する細胞致死率も１０２．８であることが確認された。以上の結果から、センダン成分の中には大腸癌細胞を特異的に破壊する物質のあることが明らかとなり、また、その選択性の高い作用様式が他の正常細胞に対する副作用の小さいことが示唆された。同時に、センダン樹木成分の実、葉、枝、幹皮及び根皮にも大腸癌に対する強い殺傷効果があることがわかる。また、抽出効率に差はあるが、大腸癌、胃癌及び肺癌細胞に対する殺傷効果は、酢酸エチル、イソプロピルアルコール、アセトン、ブタノール、エタノール及びメタノール等の溶媒で抽出したセンダンの実、葉、枝、幹皮及び根皮の成分にも確認されている。
【００１５】
さらに、それぞれの癌細胞に対する殺傷効果を比較するため、５０％の癌細胞を殺傷する値を被検体の最高希釈倍数で概算し、その結果も表１に示してある。これによると、比較対照として用いた抗癌剤マイトマイシンＣの上記３種の癌細胞（ＨＴ−２９，  ＭＫＮ１，  Ａ５４９）に対する殺傷効果はｌｏｇ１０でおよそ１．８から３．６の範囲の致死率で、この効果はセンダン成分に比べて小さいことがわかる。一方、比較対照として評価されたマツバボタンの成分は大腸癌、胃癌及び肺癌細胞に対する５０％致死率は１０１以下で、その殺傷効果はほとんどないことがわかる。
以上のことから、センダン樹木の実、葉、枝、幹皮及び根皮には大腸癌、胃癌または肺癌細胞を致死させる成分が含まれることが明らかである。従って、センダン科植物又はその抽出物を含有させることにより、癌の予防と治療に必要な健康食品、健康飲料、健康菓子類等を提供することができ、又、注射剤や錠剤などの形態の抗癌剤として用いることができる。
【００１６】
熱安定性試験
濾過滅菌したセンダン粗画総成分を各試験管に１ｍｌずつ分注、それぞれの成分をウォーターバス（温浴）中で４０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃及び１００℃で３０分間加熱して、細胞の生存率についての評価試験に供した。センダン成分を４０℃から１００℃までの間を４点に分けて加熱、その後の大腸癌細胞への殺傷効果を調べた結果をまとめて表―２に示す。
【００１７】
【表２】
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【００１８】
表−２の結果から、４０℃の加熱での抗癌活性はほとんど変化せず、５０％細胞致死率の値は１０８以上の希釈点にあることが分かる。６０℃の５０％細胞致死率はおよそ１０７．７、７０℃以上でもほぼ同じ値となっていた。これに対し、８０℃では１０５．８の５０％致死率があり、９０℃ではさらに減少し、その値は１０５．１近くにあることが示された。以上のことから、センダン成分中に含まれる抗大腸癌物質は８０℃から緩やかに活失する傾向が認められたが、９０℃あるいは１００℃の加熱でも１０５近くの細胞致死率を示し、本成分は加熱に対しても比較的安定な物質を含んでいることが示唆された。
【００１９】
分子量の予備測定
センダン成分中に存在する大腸癌を特異的に殺傷する物質の分子量を予測するため、遠心濃縮器を用いて成分を予備的に粗分画して抗癌活性を調べた。
まず、遠心濃縮器（ビバスピン２０）の０．２μｍの膜を用いて毎分５，０００回転で５０分間遠心（ベックマンＧＳ−１５Ｒ遠心機）してセンダン粗画総成分を濾過濃縮し、ビバスピン（ＶＳ２０６：分子量１，０００，０００）、ビバスピン（ＶＳ２０５：分子量３００，０００）、ビバスピン６（ＶＳ０６４：分子量１００，０００）、ビバスピン２（ＶＳ０１３：分子量５０，０００）、ビバスピン２（ＶＳ０１２：分子量３０，０００）、ビバスピン２（ＶＳ０１０：分子量１０，０００）及びビバスピン２（ＶＳ０２１：分子量５，０００）中でベックマンＧＳ−１５Ｒ遠心機を用いて、毎分５，０００回転６０分間で遠心濃縮後、細胞の生存率についての評価試験に供した。結果をまとめて表―３に示す。
【００２０】
【表３】
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【００２１】
表−３より、粗分画する前の２２０μｍの濾過膜に通過によって得られたセンダン成分の５０％細胞致死率は１０５．７付近にあり、これを基礎にしても、分子サイズ分別膜を通過してきた成分の抗癌活性は依然として高く、分子サイズ１，０００，０００から１０，０００までの５０％細胞致死率はおよそ１０５．８から１０８以上の間にあることがわかる。この時のマイトマイシンＣの細胞殺傷効果は１０３を越えた付近にあり、センダン成分の抗癌活性が非常に高いことがわかる。ところが、分子サイズ５，０００の物質を分別する濾過膜を使用した検体について調べてみると、大腸癌細胞に対する生存率は依然として高かったが、胃癌と肺癌に対する殺傷効果は消失していることがわかった。この原因が、センダン成分中に含まれる抗癌因子が複数存在し、大腸癌に対する殺傷因子が分子量５，０００以下と小さく、残り２種の癌細胞に作用する癌細胞殺傷因子が分子量５，０００以上のより大きい分子であることが示唆された。以上の結果から、センダン科植物成分中に含まれる単一、あるいは複数の抗大腸癌活性物質の分子サイズは５，０００前後のものであると想定した。