(57)【要約】【課題】ＤＮＡによってポリスルホン膜を修飾し、該膜を親水性とすることにより、血液適合性を改善した抗−凝集剤の注入の必要のないポリスルホン膜を提供する。【解決手段】本発明はＤＮＡをポリスルホン膜の表面に固定することにより該表面を親水性にしたポリスルホン膜とその製造方法に関するものである。該親水性のＤＮＡ固定化ポリスルホン膜は、未処理のポリスルホン膜をＤＮＡ溶液に、浸漬した後それを取り出し、乾燥させ、紫外線照射し、その後膜を水で十分洗浄するという、簡素で穏やかな条件下で製造できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡをポリスルホン膜の少なくとも一方の表面に固定することにより該表面を親水性にしたポリスルホン膜。
【請求項２】
多孔質の該ポリスルホン膜表面において、孔隙内部にもＤＮＡが固定されてなる請求項１記載のポリスルホン膜。
【請求項３】
ＤＮＡが一重らせんＤＮＡである請求項１記載のポリスルホン膜。
【請求項４】
ポリスルホン膜をＤＮＡ溶液に浸漬し、乾燥させた後、該膜に紫外線照射することにより、該ＤＮＡを該ポリスルホン膜に固定することからなる請求項１記載のポリスルホン膜の製造方法。
【請求項５】
請求項１ないし３のいずれか一項記載のポリスルホン膜を使用した血液透析膜。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリスルホン膜の表面をＤＮＡで固定することによって親水性にしたポリスルホン膜に関する。前記親水性表面をもつポリスルホン膜は血液適合性が良好なため、血液透析膜等に利用できる。
【０００２】
【従来の技術】
高分子材料は、先進の分離技術分野ならびに例えば、血液透析、血液透析濾過、血液濾過、血漿交換、血漿採取および心臓手術の間の血液の酸素付加のような人工器官および医療器具に関して生医学的分野で広く使用されている。現在のところ使用されているポリマーはセルロースアセテート（ＣＡ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、エチレンビニルアルコールコポリマー（ＥＶＡＬ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）およびポリスルホン（ＰＳｆ）のような慣用の材料である。
これらの材料のうち、ポリスルホン（ＰＳｆ）は最も重要な材料の１つであり、ポリスルホンおよびポリスルホンをベースとする膜は顕著な酸化安定性、熱安定性および加水分解安定性ならびに良好な機械的特性および膜形成特性を示す。そしてこの膜は血液透析中空繊維として使用したとき、低分子量タンパク質に対する高い透過性を示す（非特許文献１および２）。
【０００３】
しかしながら、ポリスルホン膜は疎水性であり、血液適合性、すなわち抗血栓性があまり良くない。従って、血液凝固反応がおこりやすく、透析に使用される中空糸膜がつまり血液の循環が不可能となることが最大の問題である。このため、ポリスルホン膜を使用する場合には血液透析の間、抗−凝集剤の注入が必要である。
血液適合性を改善するため、他のポリマーまたはモノマーによる生医学デバイスの表面を修飾することについては多数の研究が報告されている。例えばこれらの方法は６種類に分けることができる。
（１）親水性ポリマーとのブレンド、例えば２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）とのブレンド（特許文献１）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）とのブレンド、または例えば、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）およびＰＥＯ含有ブロックコポリマーを含む他の両親媒性ポリマーとのブレンド（特許文献２）、
（２）紫外線照射を含む放射線による（非特許文献３、特許文献３）もしくは低温プラズマ法による（非特許文献４）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のグラフト化のような他のポリマーによるグラフト化、
（３）モノマーのグラフト共重合（非特許文献５−７、特許文献４）、
（４）低分子量物質のグラフト化（非特許文献８）、
（５）モデルモノマーおよびキャリアーとして反応基をグラフト化し、次いで大きい分子の電子対共有的な固定が起こる（非特許文献９）、
（６）親水性コポリマーによるコーティング（非特許文献１０）。
【０００４】
また、他の特許文献としては、例えばポリスルホン膜の表面に、例えば水溶性セルロース誘導体やポリエチレングリコールである水溶性高分子物質を付着させ、かつ該水溶性高分子物質が例えばタンニン等の親水性ポリフェノールの存在により不溶化されている、親水性のポリスルホン膜を記載するもの（特許文献５）もある。
【０００５】
上記に示す膜表面の修飾は全て、修飾に使用する材料が本質的にその下にある基材よりもより親水性でかつより少ないタンパク質吸着を与えることを前提としている。これらの方法のうち、光化学的表面修飾法は魅力的であり、および数々の利点をもつ。穏やかな反応条件および低温において適用でき；反応性の基またはモノマーおよびそれぞれの励起波長を選択することにより高い選択性が可能であり；製造工程の最終段階に容易に取り入れることができる。ポリスルホンは本質的に光反応性をもち、そしてポリスルホン膜の紫外線誘導性修飾はこれまでの文献（非特許文献５−７および９、特許文献４）に報告されている。
【０００６】
一方、生体生物の遺伝的工程に最も重要な材料の１つであるＤＮＡは、また天然のおよび高い特異な機能性生体ポリマーともみなすことができる。そしてＤＮＡはまた生体膜様の構造をもち、そして修飾物質として使用した場合に血液適合性を改善するのに役立つであろうリン酸エステル基をもつ。近年の研究では、アルギン酸またはコラーゲンと接合する水不溶性ＤＮＡ−フィルムおよびゲル、ならびに紫外線照射によってＤＮＡがその上に固定されたセルロース不織布またはガラスビーズが製造され、それが臭化エチジウム、ダイオキシン誘導体、ベンゾ［ａ］ピレン、および金属鉄のようなＤＮＡ結合性挿入材料を吸着することが見いだされている（例えば、非特許文献１１および１２）。これらの結果は、水不溶性ＤＮＡは他の物質基材上に安定に結合することにより製造できおよび固定化できることを提案するものである。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｔ．  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，  Ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍａｔｅｒｉａｌ  ｆｏｒ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｉｎ：  Ｔ．  Ｔｓｕｒｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ，  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  ＢｏｃａＲａｔｏｎ，  ＰＡ（１９９３），ｐｐ．１９１−２１８
【非特許文献２】
Ｂ．  Ｓｃｈｍｉｄｔ，  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｉｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｏｒｇａｎｓ，  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｏｒｇａｎｓ，２０（１９９６）  ３７５
【非特許文献３】
Ｆｕ  Ｚｈａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔａｉｎｌｅｓｓ  ｓｔｅｅｌ  ｂｙ  ｇｒａｆｔｉｎｇ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  ｆｏｒ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  ２２  （２００１）  １５４１
【非特許文献４】
Ｙ．  Ｑ．  Ｓｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｓｕｌｆｏｎｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｂｙ  ｌｏｗ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｐｌａｓｍａ−ｇｒａｆｔ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  ｏｎｔｏ  ｐｏｌｙｓｕｌｆｏｎｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，  Ｊ．  Ａｐｐｌ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，７８（２０００）９７９
【非特許文献５】
Ｍ．  Ｕｌｂｒｉｃｈｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｕｒｆａｃｅｓ  ｗｉｔｈ  ｇｒａｆｔｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ’ｔｅｎｔａｃｌｅｓ’；  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  １９（１９９８）１２２９
【非特許文献６】
Ｈ．  Ｙａｍａｇｉｓｈｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｐｏｌｙ（ａｒｙｌｓｕｌｆｏｎｅ）  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，  Ｊ．  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｃｉ．，  １０５（１９９５）  ２３７
【非特許文献７】
Ｂ．  Ｋａｅｓｅｌｖ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｏｔｏｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｒａｆｔｉｎｇ  ｏｆ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｅｒ  ｓｕｌｆｏｎｅ）  ａｎｄ  ｐｏｌｙ（ｓｕｌｆｏｎｅ），  Ｊ．  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｃｉ．，  １９４  （２００１），２４５
【非特許文献８】
Ｙ．  Ｊ．  Ｋｉｍａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｔｅｒｅｐｈｔａｌａｔｅ）  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎｄ／ｏｒ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｕｓｉｎｇ  ｐｌａｓｍａ  ｇｌｏｗ  ｄｉｓｃｈａｒｇｅ，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２１（２０００），１２１
【非特許文献９】
Ｍ．  Ｕｂｒｉｃｈｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｏｖｅｌ  ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｓｕｌｆｏｎｅ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  Ｊ．  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｃｉ．，  １２０（１９９６），２３９
【非特許文献１０】
Ａ．  Ｌｅｗｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｕｓｅｆｕｌ  ｆｏｒ  ｃｏａｔｉｎｇ  ｂｌｏｏｄ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅｓ，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２１（２０００）  １８４７
【非特許文献１１】
Ｋ．  Ｉｗａｔａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ：  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｌｔｅｒｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＤＮＡ  ｉｎｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｌｇｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｇｅｌ  Ｉｎｔ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，１８（１９９６）１４９
【非特許文献１２】
Ｍ．  Ｙａｍａｄａ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＵＶ−  ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｏｎ  ｎｏｎｗｏｖｅｎ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｆａｂｒｉｃ，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２２（２００１）３１２１
【特許文献１】
特開平１０−２９６０６３号公報（第２頁−第８頁）
【特許文献２】
特開平９−２３４２４４号公報（第２頁、第４頁−第１１頁）
【特許文献３】
特開平６−２３８１３９号公報（第２頁−第５頁）
【特許文献４】
特開平１０−６０１４２号公報（第２頁、第４頁−第８頁）
【特許文献５】
特開平７−１８５２８０号公報（第２頁−第５頁）
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
これらの従来技術をふまえ、本発明の目的はポリスルホン膜の表面を親水性とすることにより、血液適合性が改善され、特に中空糸状の血液透析膜として利用されたとき、血液透析器への抗−凝集剤の不在下にあっても目詰まりは血栓形成反応を起こしにくいポリスルホン膜を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明は、ＤＮＡをポリスルホン膜の少なくとも一方の表面に固定することにより該表面を親水性にしたポリスルホン膜に関するものである。本発明のポリスルホン膜のＤＮＡによる表面修飾は、多孔質のポリスルホン膜表面においては、孔隙内部にもＤＮＡが固定されているものも含まれる。
本発明で特に使用されるＤＮＡは、一重らせん、二重らせんのいずれでもよいが、反応性のある一重らせんＤＮＡが好ましく、またリン酸エステル基を有し、反応性をもつＤＮＡ類似体等も使用可能である。
本発明の表面をＤＮＡにより修飾されたポリスルホン膜即ち、ＤＮＡ固定化ポリスルホン膜は、紫外線照射による光反応によりＤＮＡが不溶化して固定化することにを利用して製造するものである。
本発明の表面を親水性にしたポリスルホン膜は、具体的には、まず製造した未処理のポリスルホン膜を、ＤＮＡ溶液に浸漬した後それを取り出し、乾燥させた後、該膜に紫外線照射し、その後該膜を水で十分洗浄することによって得られる。
従って、本発明による表面を親水性にしたポリスルホン膜は極めて穏やかな条件下で製造できる。
しかしながら、ポリスルホン膜へのＤＮＡの固定化は、上述の紫外線の他、プラズマまたは放射線を照射することによる物理的手法、あるいはそのほかの化学的手法によっても可能である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明におけるポリスルホン膜は代表的には例えば、
下記式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表される繰り返し単位で構成されるポリスルホンから構成されるものであるが、かかる例示のみに限定されるものではない。
【化１】
2004209423.tif 000002
【００１１】
ポリスルホン膜表面に不溶化ＤＮＡを固定するには、上述のように得られたポリスルホン膜を濃度として１０〜４０ｍｇ／ｍｌ程度、好ましくは２０ｍｇ／ｍｌの水性ＤＮＡ溶液に１２時間〜３０時間程度、好ましくは２４時間程度浸漬し、これを室温で乾燥後、例えば２５４ｎｍの紫外線で２時間程度照射後、水で洗浄することによって行われる。また、固定されたＤＮＡは中性ないし塩基性条件下においてはポリスルホン膜表面からの溶出量は少なく、安定である。得られたＤＮＡを固定したポリスルホン膜表面は十分な親水性をもち、血栓形成の原因となるタンパク質吸着量も減少するので、ポリスルホン膜の血液適合性を向上させる。
本発明の表面をＤＮＡで修飾したポリスルホン膜の形状は様々な形状が可能であり、例えば、通常の血液透析膜のような中空糸状の他、フィルム状、チューブ状などが挙げられる。さらにいえば、該ポリスルホン膜表面におけるＤＮＡの固定は膜が有する二つの面の両方でもよいが、いずれか一方についても行うことができる。
本発明はまた、これらの様々な形態および形状をもつ、本発明に係る膜表面にＤＮＡを固定したポリスルホン膜を使用した医療器具のための濾過膜、特に中空糸膜としての血液透析膜にも関する。
【００１２】
【実施例】
以下に示す実施例により、本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は本発明の例示であり、本発明を限定することを目的とするものではない。
［主な使用試薬］
これらの材料は全て精製せずにそのまま使用した。
１．ポリスルホン膜製造に用いたポリスルホン（ＰＳｆ）：数平均分子量Ｍｎ約２６０００，  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｃ．製。
２．溶媒
１）Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）：化学試薬等級品，関東化学株式会社製
２）Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）：ＨＰＬＣ用等級品、９９＋％，  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｃ．製
３．ＤＮＡ（ＤＮＡ−Ｎａ）：一本鎖ＤＮＡ、サルデ薬品株式会社製
４．牛血清アルブミン（ＢＳＡ）：ＲＩＡ等級品、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．製
５．ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）：化学試薬等級品、和光純薬工業株式会社製
【００１３】
［例］ポリスルホン膜の製造
ポリスルホン膜は転相法（ｐｈａｓｅ  ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）により製造した。ポリスルホンをＤＭＦに溶解し、１５重量％のポリスルホン溶液を得た。次いでこのポリマー溶液をガラスプレートにキャストしそして２５℃で均一な５００μｍ厚さ広げ、膜を製造した。
本実施例では、転相法を変更することにより４種類のポリスルホン膜を製造した。膜１（Ｍ１）は真空炉中５０℃で１日間ＤＭＦを蒸発させることにより製造した。膜２（Ｍ２）、膜３（Ｍ３）および膜４（Ｍ４）は全て１日間室温中で溶媒溶液の入った沈殿浴中に上記キャスティング溶液（２５℃で１５分蒸発後）を浸漬することにより製造した。膜Ｍ２、Ｍ３およびＭ４それぞれに対する沈殿溶媒溶液は水、アセトン、ならびにＤＭＦ溶液（ＤＭＦ／Ｈ２Ｏ（体積／体積）＝１：２）を使用した。本実施例には脱イオン蒸留水を使用した。アセトンは化学試薬等級品のもので、さらに精製はしないで使用した。
蒸発（Ｍ１）および沈殿（Ｍ２〜Ｍ４）が完了した後、各膜をガラスプレートから取り外し、次いで８０℃で１時間、脱イオン水中でアニーリング及び抽出を行った。次に各膜を０．１Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液１００ｍｌに、次いで０．０１Ｍ塩酸（ＨＣｌ）１００ｍｌにそれぞれ３０分間浸漬し、そして次に蒸留水ですすぎ（１００ｍｌ×５回）そして使用するまで水中で保持した。
それぞれ得られた４種類の膜の厚みはミクロメーターで直接測定した。孔隙率はポリマー密度および乾燥前後の変化重量から下記式を使用して計算した。
2004209423.tif 000003
ＷＢ：乾燥前の膜重量（ｇ）
ＷＡ：乾燥後の膜重量（ｇ）
ρＷ：水の密度、ρＷ＝１．０ｇ／ｃｍ３
ρＰ：ポリスルホンの密度、ρＰ＝１．２４ｇ／ｃｍ３
【００１４】
さらに製法条件の異なるこれらの膜試料の形態を観察するため、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した。おのおのの膜試料を試料液体窒素で破壊し試料支持体上に取り付けおよび金層でコートした。ＳＥＭ画像はＳ−２５００Ｃ顕微鏡（電圧＝６ｋＶ、倍率３００倍、日立製作所製）を使用して記録した。
【００１５】
異なる製造法で製造されたそれぞれの膜には顕著な違いが見られた。顕微鏡的には溶媒（ＤＭＦ）蒸発法により製造された膜Ｍ１は透明で薄く、そしてポリマー溶液を沈殿浴中で浸漬することによって製造したＭ２，Ｍ３およびＭ４は乳白色を呈した。膜の構造もまた異なる製造方法で変化した。Ｍ１はち密でなめらかであるが、Ｍ２，Ｍ３およびＭ４は多孔質であった。異なる方法により得られたポリスルホン膜の厚みおよび孔隙率を表１に示す。
【表１】
2004209423.tif 000004
厚みおよび孔隙率の順番はＭ２，Ｍ４，Ｍ３，およびＭ１であった。Ｍ１は非常に薄く約０．０７４ｍｍであり、非常に低い孔隙率であり、すなわち膜中に殆ど孔はなかった。一方膜Ｍ２，Ｍ３およびＭ４は厚くそして孔隙率も大きかった。なかでもＭ２の厚みおよび孔隙率はこれらの膜中でもっとも大きく、それぞれ６８．４％および０．３１２ｍｍであった。
【００１６】
図１にポリスルホン膜の横断面（図１中、左列）と上面（図１中、右列）のＳＥＭ写真を示す。得られたポリスルホン膜の表面および本質的な構造も膜の形態に示されるように、膜Ｍ１，Ｍ２，Ｍ３およびＭ４間で異なるものであった。これらの写真から、各膜の表面および構造を理解しおよび、後述する固定化ＤＮＡおよびタンパク質吸着の量における膜の形態の効果を理解することは容易である。
Ｍ１の横断面および上面は密で、孔はみられなかった。Ｍ２およびＭ４ではスポンジ状構造が見いだされ、上面に多くの孔が見いだされた。Ｍ３の表面には窪みが見いだされた。
以上のとおり、異なる方法により製造された膜の形態は異なるものであった（表１および図１）。これらの違いは膜形成速度により説明しうる。初期の膜が水に浸漬される場合、表皮層は表面で速やかに形成され、ついで溶媒と非溶媒との交換が起こり、その結果孔隙率および厚みは非常に大きくなる。Ｍ４については、ＤＭＦを含む溶媒系の添加により、表皮層形成がＭ２よりもよりゆっくりである。Ｍ３およびＭ１については、表皮層の形成は非常に起こりにくく、その結果孔隙率および厚みの程度は非常に小さい。さらに、アセトンに浸漬することにより形成した膜Ｍ３は他とは異なり、初期の膜は特別なホルダーを使用しない場合には収縮した。
【００１７】
実施例１：ポリスルホン膜表面への不溶化ＤＮＡの固定
上記例により得られたＭ１〜Ｍ４の未処理のポリスルホン膜（２×２ｃｍ２）を水性ＤＮＡ溶液（水中、２０ｍｇ／ｍｌＤＮＡ）中に２４時間浸漬した。室温で乾燥後、膜を紫外線（Ｒ−５２Ｇ、米国、Ｕｌｔｒａ  ｖｉｏｌｅｔ  Ｉｎｃ．  社製）で各々の表面につき２５４ｎｍにて２時間照射した。紫外線強度は試料の位置において５６００μＷ／ｃｍ２とした。紫外線処理膜を水中に浸漬しそしてヤマトウォーターバスインキュベータモデル１３７−２５により４８時間１２０回／分で振とうし、水を数回交換し、次いで蒸留水（１００ｍｌ×５回）で洗浄した。これを膜の使用時まで、水中で保存した。
【００１８】
以下、ＤＮＡを固定したポリスルホン膜の性能を評価する。
Ｉ．測定法
（１）固定されたＤＮＡの濃度の測定
ポリスルホン膜表面に適用され、固定されたＤＮＡの量は以下の方法により測定した：ＤＮＡを固定した膜を１Ｍ  ＨＣｌ溶液で１００℃で１時間加水分解した。溶液中のＤＮＡの量はＵＶ−ＶＩＳ分光光度計Ｕ−２００Ａ（（株）日立製作所製）２６０ｎｍの吸光度により定量した。
（２）接触角の測定
上述のＭ１〜Ｍ４よりなる異なる転相法で製造されたポリスルホン膜の表面およびＤＮＡを固定したポリスルホン膜の表面の水接触角測定を行った。
表面の湿潤性、即ち親水性の指標となる水接触角は２５℃で、接触角計ＣＡ−Ｄ（協和界面科学（株）製）を使用してセサイルドロップ（ｓｅｓｓｉｌｅ  ｄｒｏｐ）法により測定した。蒸留水の液滴を膜表面に置き、接触角の直接顕微鏡測定をゴニオメーターにて行った。
角度は、膜の２表面における接触角を測定し、２表面における８−１０滴の測定値の平均をデータとした。
（３）タンパク質の吸着量の測定
おのおのの膜へのタンパク質吸着性をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）中１０ｇ／ｌ濃度の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて測定した。
ＤＮＡを固定していないポリスルホン膜をＢＳＡ溶液に２４時間、浸漬した。タンパク質を吸着させた膜をＰＢＳで注意して洗浄し、および蒸留水ですすいだ。吸着されたタンパク質を１６時間４．０ｍｌＳＤＳ溶液（２重量％）で定量的に溶出する。ＳＤＳ溶液中のＢＳＡの量をＵＶ−ＶＩＳ分光光度計Ｕ−２００Ａ（（株）日立製作所製）を使用して２７９ｎｍにおける吸光度により定量し、膜表面に吸着されたＢＳＡを計算する。
ＤＮＡを表面に固定した膜もまた２４時間ＢＳＡ溶液（１０ｇ／ｌ）に浸漬した。ここでＳＤＳ溶液が吸着されたタンパク質を膜から除去するために使用された場合、ＤＮＡの一部はＳＤＳ溶液に溶出する。そのためＢＳＡの量を測定する場合、波長２６０ｎｍ、２７０ｎｍおよび２８０ｎｍを使用することによるＵＶ−ＶＩＳ分光光度計Ｕ−２００Ａの多成分決定機能が使用された。
（４）  ＢＳＡ吸着膜の赤外分光分析
ＢＳＡの立体配座変化を調べるため、フーリエ変換赤外分光装置ＦＴ−２１０（４ｃｍ−１分解能で１２０スキャン、２５±２℃、（株）堀場製作所製）によってＢＳＡ吸着膜の赤外分光スペクトルを測定した。ポリマー溶液をキャスティングすることによって、ポリスルホンの薄い高密度のフィルムをセレン化亜鉛（ＺｎＳｅ）プレート（１０ｍｍ幅、５０ｍｍ長）上にコートした。このポリマー溶液濃度はＮＭＰ溶液中１％（重量／体積）であった。使用前にコーティングを真空炉中４０℃で１２時間乾燥させ、室温にてＰＢＳですすいだ。ＤＮＡによる修飾のために、２％ＤＮＡ溶液２滴をコーティング上に加え、室温で乾燥し、紫外線で照射し、ついで水とＰＢＳ溶液ですすいだ。バックグラウンドスペクトルは結晶とポリマーから得た。吸着性の試験のために、ＢＳＡ溶液（ＰＢＳ溶液中１０ｇ／ｌ）１滴をコーティング上に加え、室温にて３０分チャンバー中に貯蔵し、次にＢＳＡ溶液を注意深く取り除き、そしてＰＢＳ溶液で注意深くすすぎ、室温で乾燥後にスペクトルを測定した。
【００１９】
ＩＩ測定結果
Ａ．  固定されたＤＮＡの量に関するＤＮＡ濃度の効果
膜表面に固定されたＤＮＡの量と空気−水（ａｉｒ−ｗａｔｅｒ）接触角におけるＤＮＡ濃度の効果をＭ２について試験した。図２はポリスルホン膜表面に固定されたＤＮＡの量および接触角と、ＤＮＡ処理溶液濃度との関係を示すグラフである。図２に示すように膜（１６時間浸漬）を処理するのに使用したＤＮＡ溶液の濃度が増加するにつれ、膜表面に固定されるＤＮＡの量は増加し、そしてＤＮＡ固定化ポリスルホン膜表面に対する接触角は減少した。固定されるＤＮＡの量はＤＮＡ濃度に非常に影響を受け、そして２０ｍｇ／ｍｌまではＤＮＡ濃度の増加とともに増加がみられた。接触角の減少は、ＤＮＡ溶液の濃度が１５ｍｇ／ｍｌを越えるとき、顕著な違いは示さなかった。
空気−水接触角およびポリスルホン膜表面に固定されたＤＮＡ量に関するＤＮＡ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）中に浸漬されるポリスルホン膜に対する浸漬時間の効果はＤＮＡ濃度の効果と同様の傾向を示した（データは示さず）。開始時には速やかに接触角は減少しおよび膜表面に固定されるＤＮＡの量は増加したが、１２時間後には変化は見られなかった。
【００２０】
Ｂ．  膜表面に固定されたＤＮＡの安定性
膜表面に固定されたＤＮＡの安定性をＨ２Ｏ、ＮａＣｌ溶液、ＳＤＳ溶液およびＨＣｌ溶液を含む種々の溶液を使用して試験し、ＤＮＡを固定した膜表面から溶出したＤＮＡの量を測定した（図３ａは膜Ｍ１についてのデータ；図３ｂはＭ２についてのデータに基づく）。Ｍ１およびＭ２についてはＤＮＡを固定した膜は水およびＮａＣｌ溶液（０．９重量％）中では安定であり、９６時間インキュベート後も層から溶出したのは当初固定化されたＤＮＡの１０％以下であった。しかし酸性条件下でインキュベートした場合には大量のＤＮＡが溶液に溶出し、そして当初固定化されたＤＮＡの約８０％が溶出した。
図３ａおよび図３ｂを比較すると、膜表面に固定されたＤＮＡの安定性は、特にＳＤＳ溶液において、Ｍ１とＭ２で異なることが見いだされた。当初固定されたＤＮＡの約２０％がＭ１からＳＤＳ溶液に溶出し、一方４５％以上が、Ｍ２からＳＤＳ溶液に溶出した。２つの膜表面から溶出したＤＮＡの量は４８時間インキュベート後、徐々に平衡値に到達した。平衡値はインキュベートした溶液および膜に依存して異なる。
また、殆ど全ての固定されたＤＮＡがＨＣｌ溶液（１Ｍ）中に溶出したが、これはＤＮＡのホスホジエステルが加水分解されたと考えられうる。ＤＮＡの一部はまたＳＤＳの表面活性のため、２重量％ＳＤＳ溶液にも溶出した。これらの結果は表面にＤＮＡを固定したポリスルホン膜が中性および塩基性条件下で生体材料として使用に利用できるであろうことおよび血液精製用のような生医学的材料として使用可能であることを示す。
【００２１】
Ｃ．  異なる膜表面におけるＤＮＡ固定化量
異なる製造方法により得られた異なる形態および構造をもつ膜表面における、紫外線によるＤＮＡ固定化量は図４に示される。表１に示したように孔隙率は膜ごとに著しく異なりおよびＤＮＡは膜の孔に存在するであろうことから、膜表面に固定されたＤＮＡ量（および後述するＢＳＡ吸着量）を評価するのに２つの単位μｇ／ｃｍ２およびｍｇ／ｇを使用した。ポリスルホン膜表面の固定化ＤＮＡの量は膜構造に依存して顕著に異なることが示された。その密でない構造および大きい孔隙率により、Ｍ２表面には約２．８６ｍｇ／ｇのＤＮＡが固定されたが、Ｍ１表面には単に０．３９ｍｇ／ｇ（１．２５μｇ／ｃｍ２）のＤＮＡが固定された。
【００２２】
なお、本発明によるＤＮＡのポリスルホン膜表面への固定化の機構は以下のように考えられる。
紫外線照射後にＤＮＡは水不溶性になり、および上記結果からポリスルホン膜表面に固定されたと結論づけられる。ポリスルホン膜表面に固定されたＤＮＡは２つの部分からなる：膜表面へ物理的に吸着されたＤＮＡおよび膜表面における電子共有化により固定されたＤＮＡである。紫外線照射後に水不溶性となるであろうとされるにもかかわらず、物理的に吸着されたＤＮＡはＳＤＳ溶液により溶出できる。
ＤＮＡと膜表面の電子共有化による固定はＤＮＡとポリスルホン間の化学反応によるものであり、ＤＮＡとポリスルホンの光反応性によるものである。ポリスルホン膜表面に電子共有化により固定されたＤＮＡの存在は以下の手順により、証明される。ＤＮＡ固定化膜を４８時間ＳＤＳ溶液中でインキュベートし、およびＳＤＳ溶液を数回交換し、ついで蒸留水で数回洗浄し、水で２４時間インキュベートし、水で洗浄し、固定されたＤＮＡの量が測定された。結果（データ示さず）はＳＤＳ溶液により一部分が溶出したが、ＤＮＡの殆どがポリスルホン膜表面に存在した。
ポリスルホンは光反応性を有し、ポリスルホン膜材料のそして紫外線スペクトルは、ポリスルホンが最大吸光度２６８ｎｍを持つことを示した。ポリスルホンフィルムおよび膜における紫外線照射の効果は紫外線吸光光度計により測定でき、全体の崩壊過程は試料の黄変（黄変の度合いは明らかに観察される、データは示さない）を伴うが、従来の研究によれば特定の構造情報は得られていない（非特許文献９）。
紫外線照射によるポリスルホン膜の修飾は例えば文献（非特許文献５−６，９）に報告されている。ビニルモノマーが紫外線照射下、直接的な化学結合により直接的にポリスルホン鎖に結合できることが見出されている。ポリスルホン膜の開裂に対する機構は従来以下のように提案されている。第一ステップとしてポリマー鎖のバックボーンにあるフェノキシフェニルスルホン発色団による光の吸収を含む。光励起はスルホン結合において炭素−硫黄結合のホモリティック開裂を発生させる。このステップは各々のポリマー鎖のそれぞれの末端に２つのラジカル部位を発生するポリマーバックボーンのランダム開裂を生じる。開裂において発生したアリールラジカルおよびスルホニルラジカルの両方は反応性であり、そして化学反応がそれぞれの部位に生じる。
ＤＮＡ鎖におけるピリミジン塩基中の二重共有結合が励起する。弱いπ結合が紫外線によって崩壊する。単にＤＮＡのみが励起する場合、ＤＮＡ鎖における隣接するピリミジン塩基のサイトは紫外線により損傷をうけて、これらの塩基の間に二量体を形成する：シクロブタンピリミジン二量体（ＣＰＤ）、６−４光生成物（６−４ＰＰ）またはそのデュワー（Ｄｅｗｅｒ）体のいずれかである。ピリミジン二量体の主要部は特定の短波紫外線に対し特異性をもつと考えられている。上述したアリールラジカルおよびスルホニルラジカルの存在下で、これらのラジカルとピリミジン塩基との反応が起こりうる。
これらの反応はＤＮＡの水不溶への変換を誘導しそしてポリスルホン膜へ結合し得ると考えられる。
【００２３】
Ｄ．  異なる製造方法における、接触角への影響
膜表面の湿潤性の指標となる水接触角は異なるポリスルホン膜表面に対するＤＮＡの固定化の前後に測定され、図５にまとめられた。データは８−１２滴に対する膜の２表面の平均である。いずれの膜においても、ＤＮＡ固定化後の接触角は固定化前の接触角よりも減少し、ＤＮＡ固定化ポリスルホン膜は親水性になったことが判る。
ＤＮＡ固定化前では膜Ｍ１表面の接触角は大きく、同時に膜Ｍ２、Ｍ３およびＭ４表面の接触角はわずかに小さかった。相転法により形成された膜の間に顕著な違いはみられなかった。これは沈殿法により製造された膜は溶媒蒸発法により製造された膜（Ｍ１）に比べてわずかにより親水性であること示す。それはＭ１表面が非常に滑らかである一方Ｍ３は非常に粗く、Ｍ２およびＭ４の表面には多くの孔があることによるものであろう（図２）
膜表面にＤＮＡが固定されると接触角は約８０度から約５５度に減少し、親水性が増加する。しかし、ＤＮＡを固定した後に減少した接触角の程度は、Ｍ１，Ｍ２、Ｍ３およびＭ４間に違いはみられなかった。これは接触角が表面特性によるためと考えられる。さらに、接触角は同じ膜の２表面間にわずかな違いが見られることは注目するべきである。これは空気への曝露時間が異なることよるものであろう。
【００２４】
Ｅ．タンパク質吸着量および立体配座変化
血漿タンパク質吸着は生体材料のトロボゲン生成性（ｔｈｒｏｂｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を決定する１つの重要な事象である。そして物質の表面において吸収されたタンパク質の量は物質の血液適合性を評価する主要な因子の１つであることがよく知られている。さらに表面で吸着されたタンパク質の立体配座変化もまた血液適合性を評価するのに重要である。
図６に示すようにＤＮＡを固定する前後における上記４種類のポリスルホン膜に関し、膜表面に吸着されたＢＳＡの量を測定した。その結果、いずれの製造方法の膜においても、ＤＮＡの固定後の膜表面に吸着されるタンパク質の量は固定化前の量よりも減少することが見出された。
なお、膜の種類によって吸着量は、固定化ＤＮＡの量における膜形態の効果と同様に変化することが見出された。膜の表面構造および多孔性の違いにより、膜Ｍ２、次にＭ４、Ｍ３およびＭ１の順にかなりのＢＳＡが吸着された。これらの結果はＢＳＡが膜表面だけでなく膜に存在する孔の表面にも吸着されることが推定される。
吸着されたタンパク質の量は親水性に相関性があり、一般的にはより親水性であれば、反対により少ない量のタンパク質が吸着されるといわれる。しかし、図６からは、ＤＮＡの固定による修飾後、膜表面に吸着されたＢＳＡの量の減少割合に比べて、親水性の増加割合の方が大きい（図６）。この理由は接触角は表面特性であり、そしてＤＮＡとタンパク質間の相互作用がこのような結果を招いたと推定される。タンパク質はＤＮＡと、部位または非部位にて結合し、それらの相互作用は共有結合ではないが、例えば静電結合、水素結合、ファンデルワールス力および疎水力のような他の弱い力である。修飾前のＢＳＡとポリスルホン膜との相互作用に比べ、ＤＮＡ固定化膜にはより多くの水素結合が存在するであろうし、他方疎水力は弱くなっている。
【００２５】
ポリスルホン膜上に吸着されたＢＳＡの立体配座の変更はＦＴ−ＩＲによって検討した。ペプチド基の振動から生じるアミドバンドはタンパク質の二次構造における情報を与える。タンパク質の構造研究に最も広く使用される様態は中赤外領域にあり、アミドＩ（１７００−１６００ｃｍ−１）、アミドＩＩ（１６００−１５００ｃｍ−１）およびアミドＩＩＩ（１３２０−１２３０ｃｍ−１）である。ペプチド基のアミドＩバンドは主にＣ＝Ｏ伸縮振動から起こる。アミドＩＩバンドは主にＣ−Ｎ伸縮振動が関与するＮ−Ｈベンディングであり、吸光強度は吸着されたタンパク質の量に比例する。赤外において主にＮ−ＨベンディングおよびＣ−Ｎ伸縮振動から生じるアミドＩＩＩ吸収は通常非常に弱い。
図７に示すのは、ＺｎＳｅプレート、ならびにポリスルホン膜を吸着したＺｎＳｅプレートおよびＤＮＡを表面に固定したポリスルホン膜を吸着したＺｎＳｅプレートにおけるアミドＩおよびアミドＩＩ領域におけるＢＳＡの赤外スペクトルである。スペクトルを比較すると違いは明らかである。約１６５４ｃｍ−１および１５４２ｃｍ−１に中心をおくアミドＩおよびアミドＩＩバンドの関連する吸収強度はそれぞれ変化した。ポリスルホン膜上のＢＳＡのアミドＩおよびアミドＩＩバンドの吸収強度の比は２．０１±０．２８であるが、ＤＮＡ固定化ポリスルホン膜およびＺｎＳｅプレート上のＢＳＡの前記比はそれぞれ１．５４±０．０８と、１．４６±０．０６である。アミドＩおよびアミドＩＩピークの強度比の違いは第二次および第三次構造の不特定の変化による。ポリスルホン膜における吸着されたＢＳＡに対するバンド高さの７０％におけるアミドＩのバンド幅（３４±２ｃｍ−１）は、ＤＮＡ固定化膜およびＺｎＳｅプレート（それぞれ２９±２ｃｍ−１および２９±１ｃｍ−１）におけるタンパク質に対するものと比較して、より大きい。吸着におけるバンドの拡張はある種の構造的変更を示唆するより広い領域の振動度数を示した。
強度比が増大しおよびバンド幅が拡張したこれらの結果は、ポリスルホン膜におけるＢＳＡ吸着の立体配座において、ＤＮＡ固定化ポリスルホン膜の場合よりもより大きい変化があったことが示される。
以上のとおり、未処理のポリスルホン膜に比べて、ＤＮＡ−固定化ポリスルホン膜に表面に吸着されるタンパク質の量はより少ないことは、ＤＮＡ修飾ポリスルホン膜がより血栓形成性が低いことを示し、また、未処理のポリスルホン膜に吸着したタンパク質よりもＤＮＡ−固定化ポリスルホン膜に吸着したタンパク質が小さい立体配座変化を示すことは、より血漿性タンパク質の変性が小さいことを示すので、ＤＮＡを固定化したポリスルホン膜は血液適合性が改善されたことがわかる。
【００２６】
【発明の効果】
本発明によって、ポリスルホン（ＰＳｆ）膜の表面ないし孔隙部分に生体成分であるＤＮＡを固定することにより、該表面ないし孔隙部分を親水性にしたポリスルホン膜であって、かつ、膜表面へのタンパク質吸着量もより少なく、立体配座変化もより少ない血液適合性の改善されたポリスルホン膜が提供できる。従って、本発明の表面にＤＮＡを固定したポリスルホン膜を、特に中空糸状の血液透析膜として利用すれば、抗−凝集剤を使用しなくとも、目詰まりや、血栓形成反応を起こしにくい血液透析器が提供できる。
さらに本発明は人工器官および医療器具、例えば血液透析濾過、血漿交換、血漿採取および手術中の血液酸素付加のための装置への濾過膜としても使用することができる。またその他の工学的、医学的、バイオテクノロジー分野における、分離技術分野、例えば限外濾過膜、精密濾過膜、ならびに逆浸透膜の支持膜等への適用も可能である。
また、本発明の膜表面を親水性にしたポリスルホン膜は、ポリスルホン膜を、ＤＮＡ溶液中に浸漬し、室温において乾燥し、紫外線照射しおよび次いで蒸留水により洗浄しおよび水に貯蔵するという、極めて簡素な工程と、穏やかな条件下で製造できるので、製造に大規模な装置などを必要とせずに親水性ポリスルホン膜を効率よく生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は異なる製法で製造したポリスルホン膜の横断面と上面の形態を示す、ＳＥＭの写真（電圧６．０ｋＶ，倍率３００倍）である。
【図２】図２はポリスルホン膜表面に固定されたＤＮＡの量と接触角における、ＤＮＡ処理溶液濃度の効果を示すグラフである。
【図３】図３（ａ）は膜Ｍ１における種々の溶液中のＤＮＡ−固定化ポリスルホン膜の安定度を示すグラフである。図３（ｂ）は膜Ｍ２における種々の溶液中のＤＮＡ−固定化ポリスルホン膜の安定度を示すグラフをである。
【図４】図４は異なる方法で製造されたポリスルホン膜表面に固定化されたＤＮＡの量を示すグラフである。
【図５】図５はＤＮＡを固定する前後の、異なるポリスルホン膜表面における接触角を示すグラフである。
【図６】図６はＤＮＡを固定する前後における異なるポリスルホン膜に吸着されたタンパク質の量を示すグラフであり、Ａはμｇ／ｃｍ２単位で、Ｂはμｇ／ｍｇ単位で示すものである。
【図７】図７はＳｅＺｎプレート、その上にポリスルホン膜を吸着させたプレート、およびその上にＤＮＡを固定したプレートそれぞれに吸着された牛血清アルブミン（ＢＳＡ）のアミドＩおよびアミドＩＩ領域における赤外線吸収スペクトルを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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