(57)【要約】【課題】生理活性物質等の蛋白質と複合化したアパタイハイドロトゲルならびにその固化体とその製造方法を提供する。【解決手段】リン酸とカルシウムを含む過飽和な水溶液を長期間熟成させることによる、生理活性物質等の蛋白質との複合化に適した微細なアパタイトハイドロゲルの製造方法、上記方法で製造された微細なアパタイトハイドロゲルと生理活性物質等の蛋白質を混合し、任意の容器に入れ、大気中で固化させることからなる任意形状のアパタイト固化体の製造方法、及びそれらの製品。【効果】本発明では、微細で活性の高いアパタイトハイドロゲルに、生理活性物質等の蛋白質を吸着させて、大気中で固化させることにより、様々な蛋白質と複合化させた任意の形状のアパタイト固化体が得られる。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性物質に代表される蛋白質との複合化に適した微細なアパタイトハイドロゲルを製造する方法であって、リン酸とカルシウムを含む過飽和な水溶液を長期間熟成させることを特徴とする微細なアパタイトハイドロゲルの製造方法。
【請求項２】
微細なアパタイトハイドロゲルの粒径が０．０５〜１μｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リン酸とカルシウムを含む過飽和な水溶液を均一に攪拌、混合し、１０〜７０℃で反応させる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
攪拌、混合を１〜４週間行う、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
カルシウムとリン酸の比が、１．０〜２．０である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
水素イオン濃度が６以上１２以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法で製造された微細なアパタイトハイドロゲルと、生理活性物質に代表される蛋白質を混合し、任意の容器に入れ、乾燥、固化させることを特徴とする蛋白質−アパタイト複合固化体の製造方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法で製造された、蛋白質−アパタイト複合固化体からなる骨充填材。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛋白質−アパタイト複合体に関するものであり、更に詳しくは、生理活性物質等の種々の蛋白質との複合化に適した微細なアパタイトハイドロゲル、該アパタイトハイドロゲルと生理活性物質等の種々の蛋白質との複合体、ならびに該複合体を固化して得られる固化体及びそれらの製造方法に関するものである。
本発明の微細なアパタイトハイドロゲルから調製される任意形状の蛋白質複合アパタイトハイドロゲルならびにその固化体は、早期に骨と同化する骨充填材、薬物担体、あるいは濾過材等に好適に利用し得るものとして有用である。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、アパタイトは、生体適合性、生体活性に優れるとされ、例えば、骨充填材、治療用薬物担体等に広く使われている。アパタイトを骨充填材や治療用薬物担体に使用する場合、骨伝導性や薬物担持に有利な多孔体が用いられる。この多孔体は、用途に応じて気孔径を制御して製造されるが、多くは、粒径を制御したアパタイト粉体を押し固めて焼成するか、可燃性物質と混合し、熱処理することにより得られている。また、熱処理温度を高くすることにより、多孔体の機械的強度を高めることができる利点もある。一方、高温で熱処理することにより、通常は、比表面積が小さくなり、結晶性が高まり、溶解性、生体活性が低下する。
【０００３】
アパタイトは、生体内で骨と結合し、生体活性に優れるといわれるが、外科手術の際に良く使用される自家骨と比べ、骨形成は十分ではない。そのため、自家骨並に骨形成に優れた人工材料が期待されている。近年、蛋白質の一種である骨形成因子（ＢＭＰ−２，４）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β１）などの生理活性物質と材料を複合化することで、骨形成を促進させる検討が盛んに行われている。直接投与では１日で消失してしまうことから、従来技術として、これらをコラーゲンゲルに混合することが行われてきたが、体内では容易に放散してしまう欠点があった。
【０００４】
近年、コラーゲンを処理することで様々な表面電位を有するゼラチンゲルが開発され、より長期間ＢＭＰ等を保持できるようになった（非特許文献１参照）が、移植後１週間でほぼ半分以下、２週間で１〜２割程度に保持量は低下する。また、アパタイトセラックスでは、顆粒あるいは多孔性のものに、ＢＭＰ等を水溶性コラーゲンとともに付着させて用いることが行われている（非特許文献２参照）。多孔性アパタイトの気孔の働きとしては、ＢＭＰ等の保持でなく、骨細胞の侵入を誘導することが期待されている。
【０００５】
【非特許文献１】
山本、田畑ら、生体材料、Ｖｏｌ．１８、Ｎｏ．４、１９４−２００　（２０００）
【非特許文献２】
久保木、蛋白　核酸　酵素，Ｖｏｌ．１４、Ｎｏ．５、４７５−９１　（１９９５）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、生体活性が高く、生理活性物質等の蛋白質を保持する機能に優れ、自家骨並みに骨形成に優れた新しい人工材料を開発することを目標として鋭意研究を積み重ねた結果、微細なアパタイトハイドロゲルと生理活性物質等の蛋白質とを複合化することにより所期の目的を達成し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、前述した背景を鑑みて、生体活性が高く、生理活性物質等の種々の蛋白質と複合化したアパタイトハイドロゲルあるいはその固化体及びそれらを製造する方法を提供することを目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するための本発明は、生理活性物質等に代表される蛋白質との複合化に適した微細なアパタイトハイドロゲルを製造する方法であって、リン酸とカルシウムを含む過飽和な水溶液を長期間熟成させることを特徴とする微細なアパタイトハイドロゲルの製造方法、であり、微細なアパタイトハイドロゲルの粒径が０．０５〜１μｍである上記方法、リン酸とカルシウムを含む過飽和な水溶液を均一に攪拌、混合し、１０〜７０℃で反応させる上記方法、攪拌、混合を１〜４週間行う上記方法、カルシウムとリン酸の比が、１．０〜２．０である上記方法、水素イオン濃度が６以上１２以下である上記方法、を好ましい態様とするものである。
また、本発明は、上記方法で製造された微細なアパタイトハイドロゲルと、生理活性物質に代表される蛋白質を混合し、任意の容器に入れ、乾燥、固化させることを特徴とする蛋白質アパタイト複合固化体の製造方法、上記方法で製造された、蛋白質−アパタイト複合固化体からなる骨充填材、である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
次に、本発明を更に詳細に説明する。
本発明は、リン酸とカルシウムを含む過飽和な水溶液を長期間熟成させることにより微細なアパタイトハイドロゲルを製造することを特徴とするものである。また、本発明は、微細なアパタイトハイドロゲルを調製し、それに所定の蛋白質を添加し、所定時間後保持し、任意の形状の容器に入れ、固化させることで蛋白質−アパタイト複合体を製造することを特徴とするものである。
本発明で使用するアパタイトは、一般式Ｃａ１０（ＰＯ４　）６　Ｘ２　（式中のＸは、水酸基、炭酸、フッ素等である）で表される物質であり、好適には、水酸アパタイト、炭酸アパタイトが例示される。
【０００９】
本発明では、リン酸とカルシウムを含む過飽和な水溶液を長期間熟成させる。リン酸カルシウムに対し、過飽和なリン酸を含む水溶液と、カルシウムを含む水溶液を混合すると、アパタイト構造を持つリン酸カルシウムが得られる。得られたリン酸カルシウムは、水を多く含むゲル（アパタイトハイドロゲル）であり、結晶性が低く、反応性に富んでいる。出発原料のリン酸として、例えば、リン酸水素ナトリウム水和塩等、可溶性の塩が、カルシウムとして、例えば、塩化カルシウム水和塩等、可溶性の塩が用いられるが、可溶性であれば特に限定されるものではない。
【００１０】
リン酸水溶液とカルシウム水溶液を混合するために撹拌するが、撹拌手法、撹拌の程度は特に限定されるものではなく、これらが均一に混合されればよい。また、反応温度は、１０〜７０℃が好ましく、より好適には２０〜５０℃が望ましい。２０℃未満では反応が遅く、５０℃を越えると水の蒸発により濃度を均一に保持することは困難になる。水素イオン濃度６以上１２以下が好ましいが、これは、水素イオン濃度が小さくなるとアパタイトハイドロゲルが析出しにくくなるためであり、操作の容易さから中性付近がより好適である。
水素イオン濃度の調整は、例えば、過飽和水酸化ナトリウム水溶液等を用いることで容易に行うことができる。カルシウムとリン酸の比は、好適には、１．０から２．０であるが、より好ましくは、１．３から１．６７のものが好適に蛋白質を吸着しうる。
【００１１】
アパタイトハイドロゲルを含む混合溶液は、大気中で撹拌するが、撹拌時間を長くし、長期間熟成すると、後記する試験例に示されるように、その平均粒径は小さくなり、蛋白質との混合に適した０．０５〜１μｍの微細な形態になる。撹拌を１週間以上行うことで、粒径０．０５μｍ程度の微細な粒子を得ることができる。しかしながら、撹拌時間が４週間を越えると過飽和なカルシウムと大気中の炭酸が反応して、炭酸カルシウムの析出が見られるため、撹拌時間は１〜３週間程度が望ましい。本発明において、長期間熟成させるとは、１〜３週間に亘って熟成させることを意味する。また、大気中からの炭酸根の混入により、水溶液の水素イオン濃度は、低下するが、過剰なリン酸と炭酸による緩衝作用により、大きく低下することはない。従来、アパタイトハイドロゲルの調製が種々行われているが、このような微細なアパタイトハイドロゲルを調製することを目的とするものではない。
【００１２】
次いで、微細なアパタイトハイドロゲルと生理活性物質等の種々の蛋白質を混合させるが、蛋白質固有の等電点に適した水素イオン濃度のアパタイトハイドロゲルを供することにより、最適に吸着させることができる。混合温度は、特に限定されるものではないが、混合を蛋白質の変性温度以下で行うことが望ましい。生理活性物質等の蛋白質としては、骨形成因子（ＢＭＰ−２，４）、トランフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β１）等、サイトカインと呼ばれる生理活性物質が例示されるが、これらに制限されるものではない。
【００１３】
生理活性物質等の種々の蛋白質を吸着したアパタイトハイドロゲルを、任意形状の容器に入れ、放置することにより、固定させる。この場合、上記容器としてポリエチレン製容器など、固化したアパタイトハイドロゲルを容易に取り出し得る容器が例示されるが、これらに制限されない。固化温度、時間は、特に限定されるものではないが、相対湿度が特に高くなければ室温では１週間〜２週間程度で固化させることができる。５℃程度では湿度が低いため１日程度で固化させることができる。固化は、水を含むハイドロゲルから水が次第に喪失されるためであり、後記する実施例に示されるように、アパタイトハイドロゲルは固化に伴い収縮するが、２週間を越えると固化にはほとんど変化が見られなくなる。
【００１４】
【作用】
本発明では、リン酸とカルシウムを含む過飽和な水溶液を長期間熟成させることで、生理活性物質に代表される種々の蛋白質との複合化に適した微細なアパタイトハイドロゲルを調製することが可能となる。この場合、上記リン酸とカルシウムを含む過飽和な水溶液を１０〜７０℃で均一に攪拌、混合し、好適には１〜４週間に亘る長期間熟成させることが重要であり、これにより、粒径０．０５〜１μｍの微細なアパタイトハイドロゲルを調製することが可能となる。
上記熟成期間が短いと、微細なアパタイトハイドロゲルを得ることはできない。上記方法により得られた微細なアパタイトハイドロゲルは、生理活性物質等の種々の蛋白質との複合化に好適であり、これらを混合し、任意の容器に入れ、乾燥、固化させることで蛋白質−アパタイト複合固化体を調製することが可能となる。
【００１５】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は、これらによってなんら限定されるものではない。
試験例
リン酸水素ナトリウム（Ｎａ２　ＨＰＯ４　・１２Ｈ２　Ｏ）１０９ｇを７５０ｍＬの蒸留水に溶解し、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２　・２Ｈ２　Ｏ）２１．８ｇを２５０ｍＬの蒸留水に溶解した。両者を混合したところ、直ちに白色の生成物が得られた。ｐＨ値を水酸化ナトリウム水溶液で７．４０に調整し、１〜１５日間攪拌、混合し、熟成した後、ろ過することによりジェル状の生成物を得た。図１に、熟成時間と得られたアパタイトハイドロゲルの平均粒径の関係を示す。図１に示されるように、少なくとも１週間以上熟成することで、平均粒径１μｍ以下の微細なアパタイトハイドロゲルが得られることが判明した。
【００１６】
実施例１
リン酸水素ナトリウム（Ｎａ２　ＨＰＯ４　・１２Ｈ２　Ｏ）１０９ｇを７５０ｍＬの蒸留水に溶解し、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２　・２Ｈ２　Ｏ）２１．８ｇを２５０ｍＬの蒸留水に溶解した。両者を混合したところ、直ちに白色の生成物が得られた。ｐＨ値を水酸化ナトリウム水溶液で７．４０に調整し、７日間攪拌、混合し、熟成した後、ろ過することによりジェル状の生成物を得た。これを蒸留水でよく洗浄し、過剰なナトリウムと塩素を除去した後、得られたゲルは、平均粒径４μｍの生成物であった。これに、牛血清アルブミンを添加した。これを３時間保持した後、径３３ｍｍ、深さ９ｍｍのポリエチレン製キャップに入れ、室温、大気中で１０日程度自然乾燥させることにより、蛋白質−アパタイト複合固化体を得た。図２に、アパタイトハイドロゲルの固化に伴う収縮と乾燥時間の関係を示す。
【００１７】
実施例２
実施例１と同様にして得た白色の生成物について、ｐＨ値を水酸化ナトリウム水溶液で７．４０に調整し、室温で１０日間放置した。これを、ろ過することによりジェル状の生成物を得た。これを蒸留水でよく洗浄し、過剰なナトリウムと塩素を除去した後、得られたゲルは、平均粒径０．４μｍ以下の微細な生成物であった。これに、牛血清アルブミンを添加した。これを３時間保持した後、径３３ｍｍ、深さ９ｍｍのポリエチレン製キャップに入れ、室温、大気中で１０日程度自然乾燥させることにより、蛋白質−アパタイト複合固化体を得た。
【００１８】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明は、生理活性物質等の蛋白質との複合化に適した微細なアパタイトハイドロゲル、該アパタイトハイドロゲルと生理活性物質等の蛋白質との複合体、ならびに該複合体を固化して得られる固化体に係るものであり、本発明によれば、様々な蛋白質と複合化させた任意の形状のアパタイト固化体が得られる。また、専用の装置を必要としないため、製品の製造においてランニングコストダウンを果たすことができる。本発明は、特に、少量多品種が特長である生体関連材料等の製造に適している。本発明の微細なアパタイトハイドロゲルから調製する任意形状の蛋白質複合アパタイトハイドロゲルならびに固化体は、早期に骨と同化する骨充填材、薬物担体、あるいは濾過材等各種の医用材料に好適に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】熟成時間と得られたアパタイトハイドロゲルの平均粒径の関係を示す。
【図２】アパタイトハイドロゲルの固化に伴う収縮と乾燥時間の関係を示す。
【図１】
2004141359.tif 000002
【図２】
2004141359.tif 000003