(57)【要約】【課題】　本発明は、目標分子とジスルフィド結合を形成できるシステインを有するタイプＩリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰｓ）およびＲＩＰｓの類似体、およびそれらをコードするポリヌクレオチドを提供すること。ならびにこのポリヌクレオチドを含むベクターおよびこのベクターで形質転換した宿主細胞を提供すること。【解決手段】　タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記システインが、配列番号：１の２５０位に対応する位置から前記類似体のカルボキシ末端に至る前記類似体のアミノ酸配列にて位置する、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体が提供される【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　天然配列ゲロニンをコードする精製および単離したポリヌクレオチド。
【請求項２】
　ゲロニンをコードする挿入体を有するベクターを含む宿主細胞であって、宿主細胞が、ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６８７２１として寄託されている宿主細胞。
【請求項３】
　天然配列大麦リボソーム非活性化タンパク質をコードする精製および単離したポリヌクレオチド。
【請求項４】
　モモルディンＩＩをコードする精製および単離したポリヌクレオチド。
【請求項５】
　ゲロニンのアミノからカルボキシ方向、および抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分をコードするアミノ酸の配列を含む融合タンパク質。
【請求項６】
　ゲロニンのアミノからカルボキシ方向、および抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分をコードするアミノ酸の配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
　抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分のアミノからカルボキシ方向、およびゲロニンをコードするアミノ酸の配列を含む融合タンパク質。
【請求項８】
　抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分のアミノからカルボキシ方向、およびゲロニンをコードするアミノ酸の配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
　ゲロニンのアミノからカルボキシ方向、エンドペプチダーゼ開裂部位を有するペプチドセグメント、および抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分をコードするアミノ酸の配列を含む融合タンパク質。
【請求項１０】
　ゲロニンのアミノからカルボキシ方向、エンドペプチダーゼ開裂部位を有するペプチドセグメント、および抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分をコードするアミノ酸の配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
　抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分のアミノからカルボキシ方向、エンドペプチダーゼ開裂部位を有するペプチドセグメント、およびゲロニンをコードするアミノ酸の配列を含む融合タンパク質。
【請求項１２】
　抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分のアミノからカルボキシ方向、エンドペプチダーゼ開裂部位を有するペプチドセグメント、およびゲロニンをコードする融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
　前記ペプチドセグメントが、シガ様毒素のセグメントである請求の範囲第９項もしくは第１１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
　前記ペプチドセグメントが、ウサギ筋肉アルドラーゼのセグメントである請求の範囲第９項もしくは第１１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
　前記ペプチドセグメントが、シガ様毒素のセグメントである請求の範囲第１０項もしくは第１２項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
　前記ペプチドセグメントが、ウサギ筋肉アルドラーゼのセグメントである請求の範囲第１０項もしくは第１２項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
　前記抗体の部分が、Ｆａｂ断片のカッパ鎖である請求の範囲第９項もしくは第１１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
　前記抗体の部分が、Ｆａｂ断片のカッパ鎖である請求の範囲第１０項もしくは第１２項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
　前記抗体の部分が、Ｆｄ鎖あるいはＦａｂ断片である請求の範囲第９項もしくは第１１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
　前記抗体の部分が、Ｆｄ鎖あるいはＦａｂ断片である請求の範囲第１０項もしくは第１２項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
　前記抗体の部分が、一本鎖抗体である請求の範囲第９項もしくは第１１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
　前記抗体の部分が、一本鎖抗体である請求の範囲第１０項もしくは第１２項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
　前記抗体の部分が、Ｈ６５抗体である請求の範囲第９項もしくは第１１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
　前記抗体の部分が、Ｈ６５抗体である請求の範囲第１０項もしくは第１２項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
　前記ペプチドセグメントが、シガ様毒素のセグメントであり、さらに、前記抗体の部分が、Ｈ６５抗体のＦａｂ断片のＦｄ鎖である請求の範囲第１０項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
　請求の範囲第２５項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２７】
　請求の範囲第２６項に記載のベクターで形質転換あるいは形質変換した宿主細胞。
【請求項２８】
　ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６９１０２として寄託されている宿主細胞である、請求の範囲第２７項に記載の宿主細胞。
【請求項２９】
　前記ペプチドセグメントが、ウサギ筋肉アルドラーゼのセグメントであり、さらに、前記抗体の部分が、Ｋ６５抗体のカッパ鎖である請求の範囲第１０項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３０】
　請求の範囲第２９項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３１】
　請求の範囲第３０項に記載のベクターで形質転換あるいは形質変換した宿主細胞。
【請求項３２】
　ＡＴＣＣ受託Ｎｏ，６９１０３として寄託されている宿主細胞である、請求の範囲第３１項に記載の宿主細胞。
【請求項３３】
　前記ペプチドセグメントが、ウサギ筋肉アルドラーゼのセグメントであり、さらに、前記抗体の部分が、Ｈ６５抗体のＦｄ鎖である請求の範囲第１０項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３４】
　請求の範囲第３３項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３５】
　請求の範囲第３４項に記載のベクターで形質転換あるいは形質変換した宿主細胞。
【請求項３６】
　ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６９１０４として寄託されている宿主細胞である、請求の範囲第３５項に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
　前記抗体の部分が、一本鎖抗体である請求の範囲第５項もしくは第７項に記載の融合タンパク質。
【請求項３８】
　前記抗体の部分が、一本鎖抗体である請求の範囲第６項もしくは第８項に記載の融合タンパク質。
【請求項３９】
　ゲロニンのアミノからカルボキシ方向、および抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分をコードするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、適切な宿主にて発現する工程を含む融合タンパク質の製造方法。
【請求項４０】
　抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分のアミノからカルボキシ方向をコードするアミノ酸配列、およびゲロニンをコードするポリヌクレオチドを、適切な宿主にて発現する工程を含む融合タンパク質の製造方法。
【請求項４１】
　ゲロニンのアミノからカルボキシ方向、エンドペプチダーゼ開裂部位を有するペプチドセグメント、および抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分をコードするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、適切な宿主にて発現する工程を含む融合タンパク質の製造方法。
【請求項４２】
　抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分のアミノからカルボキシ方向をコードするアミノ酸配列、エンドペプチダーゼ開裂部位を有するペプチドセグメント、およびゲロニンをコードするポリヌクレオチドを、適切な宿主にて発現する工程を含む融合タンパク質の製造方法。
【請求項４３】
　リボソーム不活性化タンパク質と抗体の部分を含むタンパク質を精製する方法であって、前記方法が、下記工程、すなわち；
　陰イオン交換カラムに、リボソーム不活性化タンパク質と抗体の部分を含んだタンパク質の溶液を通し、
　前記溶液を通過した後に、前記タンパク質をプロテインＧカラムに適用し、および
　前記プロテインＧカラムから前記タンパク質を溶出する、
工程を含む、リボソーム不活性化タンパク質と抗体の部分を含むタンパク質を精製する方法。
【請求項４４】
　前記適用工程に先行して、陰イオン交換カラムからの流出物を陽イオン交換カラムに導入し、および
　前記タンパク質を効率的に溶出するために、陽イオン交換カラムを溶離剤に曝す、
　工程をさらに含む、請求の範囲第４４項に記載の方法。
【請求項４５】
　タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、および自然配座でのリシンＡ鎖表面での位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記類似体が、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持している、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体。
【請求項４６】
　前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンである請求の範囲第４５項に記載の類似体。
【請求項４７】
　前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の１０位にある請求の範囲第４６項に記載の類似体。
【請求項４８】
　請求の範囲第４７項に記載の類似体をコードするベクターを含む宿主細胞であって、前記宿主細胞が、ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６９００８として寄託されている宿主細胞。
【請求項４９】
　前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の６０位にある請求の範囲第４６項に記載の類似体。
【請求項５０】
　前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、単一システインを含む請求の範囲第４５項に記載の類似体。
【請求項５１】
　前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンである請求の範囲第５０項に記載の類似体。
【請求項５２】
　前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の１０位にある請求の範囲第５１項に記載の類似体。
【請求項５３】
　前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の４４位にある請求の範囲第５１項に記載の類似体。
【請求項５４】
　前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の５０位にある請求の範囲第５１項に記載の類似体。
【請求項５５】
　前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４７位にある請求の範囲第５１項に記載の類似体。
【請求項５６】
　タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、および自然配座でのリシンＡ鎖表面での位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記類似体が、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持している、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を、コードするポリヌクレオチド。
【請求項５７】
　タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、および自然配座でのリシンＡ鎖表面での位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記類似体が、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持している、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を、コードするポリヌクレオチドを適切な宿主細胞にて発現する工程を含む、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を製造する方法。
【請求項５８】
　システインを介したジスルフィド結合によって、細胞に特異的に結合する分子を結合した、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、および自然配座でのリシンＡ鎖表面での位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記類似体が、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持している、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を含む、細胞に毒性を呈する薬剤。
【請求項５９】
　タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、および自然配座でのリシンＡ鎖表面での位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記類似体が、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持しているタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を、システインを介したジスルフィド結合によって、細胞に特異的に結合する分子に結合する工程を含む細胞に毒性を呈する薬剤の製造方法。
【請求項６０】
　システインを介したジスルフィド結合によって、細胞に特異的に結合する分子を結合した、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を含む細胞毒性治療剤であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、および自然配座でのリシンＡ鎖表面での位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記類似体が、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持しているタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を含んだ細胞に毒性を呈する、ことを特徴とする細胞毒性治療剤。
【請求項６１】
　４４位および５０位の前記天然ゲロニンシステイン残基が、アラニン残基と置換される請求の範囲第４６項に記載の類似体。
【請求項６２】
　ジスルフィド結合を利用するための前記システイン残基が、前記類似体のアミノ酸配列の１０位にある請求の範囲第６１項に記載の類似体．
【請求項６３】
　前記システイン残基が、前記類似体のアミノ酸配列の１０３位にある請求の範囲第４６項に記載の類似体。
【請求項６４】
　前記システイン残基が、前記類似体のアミノ酸配列の１４６位にある請求の範囲第４６項に記載の類似体。
【請求項６５】
　前記システイン残基が、前記類似体のアミノ酸配列の１８４位にある請求の範囲第４６項に記載の類似体。
【請求項６６】
　前記システイン残基が、前記類似体のアミノ酸配列の２１５位にある請求の範囲第４６項に記載の類似体。
【請求項６７】
　前記宿主細胞が、ＡＴＣＣ６９１０１として寄託されている請求の範囲第５４項に記載の類似体をコードするベクターを含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本願出願は、放棄された１９９１年１１月４日に出願された米国特許出願第07/787,567号の一部継続出願である。係属している１９９２年７月１９日に出願された米国特許出願第07/901,707号の一部継続出願である。
（背景）
　本発明は、一般には、細胞毒性治療剤の組成物として有用な物質に関する。より具体的には、本発明は、リボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド、目標分子への接合のために特異的に修飾されたリボゾーム不活性化タンパク質の類似体をコードするポリヌクレオチド、および目標分子コードするポリヌクレオチドへのリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドの遺伝子融合に関する。
【背景技術】
【０００２】
【表１】
2004141153.tif 000002
2004141153.tif 000003
2004141153.tif 000004
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
　本発明において以下が提供される：
１．天然配列ゲロニンをコードする精製および単離したポリヌクレオチド。
２．ゲロニンをコードする挿入体を有するベクターを含む宿主細胞であって、宿主細胞が、ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６８７２１として寄託されている宿主細胞。
３．天然配列大麦リボソーム非活性化タンパク質をコードする精製および単離したポリヌクレオチド。
４．モモルディンＩＩをコードする精製および単離したポリヌクレオチド。
５．ゲロニンのアミノからカルボキシ方向、および抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分をコードするアミノ酸の配列を含む融合タンパク質。
６．ゲロニンのアミノからカルボキシ方向、および抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分をコードするアミノ酸の配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
７．抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分のアミノからカルボキシ方向、およびゲロニンをコードするアミノ酸の配列を含む融合タンパク質。
８．抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分のアミノからカルボキシ方向、およびゲロニンをコードするアミノ酸の配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
９．ゲロニンのアミノからカルボキシ方向、エンドペプチダーゼ開裂部位を有するペプチドセグメント、および抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分をコードするアミノ酸の配列を含む融合タンパク質。
１０．ゲロニンのアミノからカルボキシ方向、エンドペプチダーゼ開裂部位を有するペプチドセグメント、および抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分をコードするアミノ酸の配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
１１．抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分のアミノからカルボキシ方向、エンドペプチダーゼ開裂部位を有するペプチドセグメント、およびゲロニンをコードするアミノ酸の配列を含む融合タンパク質。
１２．抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分のアミノからカルボキシ方向、エンドペプチダーゼ開裂部位を有するペプチドセグメント、およびゲロニンをコードする融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
１３．前記ペプチドセグメントが、シガ様毒素のセグメントである第９項もしくは第１１項に記載の融合タンパク質。
１４．前記ペプチドセグメントが、ウサギ筋肉アルドラーゼのセグメントである第９項もしくは第１１項に記載の融合タンパク質。
１５．前記ペプチドセグメントが、シガ様毒素のセグメントである第１０項もしくは第１２項に記載のポリヌクレオチド。
１６．前記ペプチドセグメントが、ウサギ筋肉アルドラーゼのセグメントである第１０項もしくは第１２項に記載のポリヌクレオチド。
１７．前記抗体の部分が、Ｆａｂ断片のカッパ鎖である第９項もしくは第１１項に記載の融合タンパク質。
１８．前記抗体の部分が、Ｆａｂ断片のカッパ鎖である第１０項もしくは第１２項に記載のポリヌクレオチド。
１９．前記抗体の部分が、Ｆｄ鎖あるいはＦａｂ断片である第９項もしくは第１１項に記載の融合タンパク質。
２０．前記抗体の部分が、Ｆｄ鎖あるいはＦａｂ断片である第１０項もしくは第１２項に記載のポリヌクレオチド。
２１．前記抗体の部分が、一本鎖抗体である第９項もしくは第１１項に記載の融合タンパク質。
２２．前記抗体の部分が、一本鎖抗体である第１０項もしくは第１２項に記載のポリヌクレオチド。
２３．前記抗体の部分が、Ｈ６５抗体である第９項もしくは第１１項に記載の融合タンパク質。
２４．前記抗体の部分が、Ｈ６５抗体である第１０項もしくは第１２項に記載のポリヌクレオチド。
２５．前記ペプチドセグメントが、シガ様毒素のセグメントであり、さらに、前記抗体の部分が、Ｈ６５抗体のＦａｂ断片のＦｄ鎖である第１０項に記載のポリヌクレオチド。
２６．第２５項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
２７．第２６項に記載のベクターで形質転換あるいは形質変換した宿主細胞。
２８．ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６９１０２として寄託されている宿主細胞である、第２７項に記載の宿主細胞。
２９．前記ペプチドセグメントが、ウサギ筋肉アルドラーゼのセグメントであり、さらに、前記抗体の部分が、Ｋ６５抗体のカッパ鎖である第１０項に記載のポリヌクレオチド。
３０．第２９項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
３１．第３０項に記載のベクターで形質転換あるいは形質変換した宿主細胞。
３２．ＡＴＣＣ受託Ｎｏ，６９１０３として寄託されている宿主細胞である、第３１項に記載の宿主細胞。
３３．前記ペプチドセグメントが、ウサギ筋肉アルドラーゼのセグメントであり、さらに、前記抗体の部分が、Ｈ６５抗体のＦｄ鎖である第１０項に記載のポリヌクレオチド。
３４．第３３項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
３５．第３４項に記載のベクターで形質転換あるいは形質変換した宿主細胞。
３６．ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６９１０４として寄託されている宿主細胞である、第３５項に記載の宿主細胞。
３７．前記抗体の部分が、一本鎖抗体である第５項もしくは第７項に記載の融合タンパク質。
３８．前記抗体の部分が、一本鎖抗体である第６項もしくは第８項に記載の融合タンパク質。
３９．ゲロニンのアミノからカルボキシ方向、および抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分をコードするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、適切な宿主にて発現する工程を含む融合タンパク質の製造方法。
４０．抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分のアミノからカルボキシ方向をコードするアミノ酸配列、およびゲロニンをコードするポリヌクレオチドを、適切な宿主にて発現する工程を含む融合タンパク質の製造方法。
４１．ゲロニンのアミノからカルボキシ方向、エンドペプチダーゼ開裂部位を有するペプチドセグメント、および抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分をコードするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、適切な宿主にて発現する工程を含む融合タンパク質の製造方法。
４２．抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分のアミノからカルボキシ方向をコードするアミノ酸配列、エンドペプチダーゼ開裂部位を有するペプチドセグメント、およびゲロニンをコードするポリヌクレオチドを、適切な宿主にて発現する工程を含む融合タンパク質の製造方法。
４３．リボソーム不活性化タンパク質と抗体の部分を含むタンパク質を精製する方法であって、前記方法が、下記工程、すなわち；
　陰イオン交換カラムに、リボソーム不活性化タンパク質と抗体の部分を含んだタンパク質の溶液を通し、
　前記溶液を通過した後に、前記タンパク質をプロテインＧカラムに適用し、および
　前記プロテインＧカラムから前記タンパク質を溶出する、
工程を含む、リボソーム不活性化タンパク質と抗体の部分を含むタンパク質を精製する方法。
４４．前記適用工程に先行して、陰イオン交換カラムからの流出物を陽イオン交換カラムに導入し、および
　前記タンパク質を効率的に溶出するために、陽イオン交換カラムを溶離剤に曝す、
　工程をさらに含む、第４４項に記載の方法。
４５．タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、および自然配座でのリシンＡ鎖表面での位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記類似体が、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持している、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体。
４６．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンである第４５項に記載の類似体。
４７．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の１０位にある第４６項に記載の類似体。
４８．第４７項に記載の類似体をコードするベクターを含む宿主細胞であって、前記宿主細胞が、ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６９００８として寄託されている宿主細胞。
４９．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の６０位にある第４６項に記載の類似体。
５０．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、単一システインを含む第４５項に記載の類似体。
５１．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンである第５０項に記載の類似体。
５２．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の１０位にある第５１項に記載の類似体。
５３．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の４４位にある第５１項に記載の類似体。
５４．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の５０位にある第５１項に記載の類似体。
５５．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４７位にある第５１項に記載の類似体。
５６．タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、および自然配座でのリシンＡ鎖表面での位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記類似体が、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持している、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を、コードするポリヌクレオチド。
５７．タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、および自然配座でのリシンＡ鎖表面での位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記類似体が、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持している、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を、コードするポリヌクレオチドを適切な宿主細胞にて発現する工程を含む、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を製造する方法。
５８．システインを介したジスルフィド結合によって、細胞に特異的に結合する分子を結合した、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、および自然配座でのリシンＡ鎖表面での位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記類似体が、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持している、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を含む、細胞に毒性を呈する薬剤。
５９．タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、および自然配座でのリシンＡ鎖表面での位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記類似体が、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持しているタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を、システインを介したジスルフィド結合によって、細胞に特異的に結合する分子に結合する工程を含む細胞に毒性を呈する薬剤の製造方法。
６０．システインを介したジスルフィド結合によって、細胞に特異的に結合する分子を結合した、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を含む細胞毒性治療剤であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、および自然配座でのリシンＡ鎖表面での位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記類似体が、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持しているタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を含んだ細胞に毒性を呈する、ことを特徴とする細胞毒性治療剤。
６１．４４位および５０位の前記天然ゲロニンシステイン残基が、アラニン残基と置換される第４６項に記載の類似体。
６２．ジスルフィド結合を利用するための前記システイン残基が、前記類似体のアミノ酸配列の１０位にある第６１項に記載の類似体．
６３．前記システイン残基が、前記類似体のアミノ酸配列の１０３位にある第４６項に記載の類似体。
６４．前記システイン残基が、前記類似体のアミノ酸配列の１４６位にある第４６項に記載の類似体。
６５．前記システイン残基が、前記類似体のアミノ酸配列の１８４位にある第４６項に記載の類似体。
６６．前記システイン残基が、前記類似体のアミノ酸配列の２１５位にある第４６項に記載の類似体。
６７．前記宿主細胞が、ＡＴＣＣ６９１０１として寄託されている第５４項に記載の類似体をコードするベクターを含む宿主細胞。
【０００４】
　さらに本発明においては、以下が提供される：
１．タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記システインが、配列番号：１の２５１位に対応する位置から前記類似体のカルボキシ末端位置に至る前記類似体のアミノ酸配列中の位置にて位置する、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体。
２．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンである項目１に記載の類似体。
３．前記システインが、前記類似体の２４４位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある項目２に記載の類似体。
４．前記システインが、前記類似体の２４７位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある項目３に記載の類似体。
５．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４４位にある項目３に記載の類似体。
６．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４７位にある項目４に記載の類似体。
７．４４位および５０位での天然ゲロニンシステイン残基が、アラニン残基と置換されている項目２に記載の類似体。
８．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４８位にある項目４に記載の類似体。
９．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、大麦リボソーム不活性化タンパク質である項目１に記載の類似体。
１０．前記システインが、前記類似体の２５６位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある項目９に記載の類似体。
１１．前記システインが、前記類似体の２６０位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある項目１０に記載の類似体。
１２．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２５６位にある項目１０に記載の類似体。
１３．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２７０位にある項目１１に記載の類似体。
１４．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２７７位にある項目１１に記載の類似体。
１５．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、モモルディンＩＩである項目１に記載の類似体。
１６．前記類似体のアミノ酸配列での前記システインの前記位置が、配列番号：１の２５９位にあるアミノ酸の位置に対応する項目１に記載の類似体。
１７．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンである項目１６に記載の類似体。
１８．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、大麦リボソーム不活性化タンパク質である項目１６に記載の類似体。
１９．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、モモルディンＩＩである項目１６に記載の類似体。
２０．前記類似体のアミノ酸配列での前記システインの前記位置が、配列番号：１の２５９位に対応する項目１に記載の類似体。
２１．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、大麦リボソーム不活性化タンパク質である項目２０に記載の類似体。
２２．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、モモルディンＩＩである項目２０に記載の類似体。
２３．タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記システインが、配列番号：１の２５１位に対応する位置から前記類似体のカルボキシ末端位置に至る前記類似体のアミノ酸配列中の位置にて位置する、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体をコードするポリヌクレオチド。
２４．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンである項目２３に記載のポリヌクレオチド。
２５．前記システインが、前記類似体の２４４位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある項目２４に記載のポリヌクレオチド。
２６．前記システインが、前記類似体の２４７位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある項目２５に記載のポリヌクレオチド。
２７．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４４位にある項目２５に記載のポリヌクレオチド。
２８．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４７位にある項目２６に記載のポリヌクレオチド。
２９．４４位および５０位での天然ゲロニンシステイン残基が、アラニン残基と置換されている項目２４に記載のポリヌクレオチド。
３０．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４８位にある項目２６に記載のポリヌクレオチド。
３１．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、大麦リボソーム不活性化タンパク質である項目２３に記載のポリヌクレオチド。
３２．前記システインが、前記類似体の２５６位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある項目３１に記載のポリヌクレオチド。
３３．前記システインが、前記類似体の２６０位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある項目３２に記載のポリヌクレオチド。
３４．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２５６位にある項目３２に記載のポリヌクレオチド。
３５．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２７０位にある項目３３に記載のポリヌクレオチド。
３６．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２７７位にある項目３３に記載のポリヌクレオチド。
３７．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、モモルディンＩＩである項目２３に記載のポリヌクレオチド。
３８．タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記システインが、配列番号：１の２５１位に対応する位置から前記類似体のカルボキシ末端位置に至る前記類似体のアミノ酸配列中の位置にて位置する、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体をコードするベクター。
３９．タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記システインが、配列番号：１の２５１位に対応する位置から前記類似体のカルボキシ末端位置に至る前記類似体のアミノ酸配列中の位置にて位置する、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡベクターを含む宿主細胞。
４０．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンである項目３９に記載の宿主細胞。
４１．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４７位にある項目４０に記載の宿主細胞。
４２．前記宿主細胞が、ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６９００９として寄託されたタイプの細胞である項目４１に記載の宿主細胞。
４３．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、大麦リボソーム不活性化タンパク質である項目３９に記載の宿主細胞。
４４．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２７７位にある項目４３に記載の宿主細胞。
４５．前記宿主細胞が、ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６８７２２として寄託されたタイプの細胞である項目４４に記載の宿主細胞。
４６．細胞に毒性を呈する薬剤であって、システインを介して前記細胞に特異的に結合する分子にジスルフィド結合によって連結されたタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を含み、前記システインが、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて位置しており、そして、前記システインが、配列番号：１の２５１位に対応する位置から前記類似体のカルボキシ末端位置に至る前記類似体のアミノ酸配列中に位置する、細胞に毒性を呈する薬剤。
４７．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンである項目４６に記載の薬剤。
４８．前記システインが、前記類似体の２４７位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある項目４７に記載の薬剤。
４９．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４７位にある項目４８に記載の薬剤。
５０．４４位および５０位での天然ゲロニンシステイン残基が、アラニン残基と置換されている項目４７に記載の薬剤。
５１．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４８位にある項目４８に記載の薬剤。
５２．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、大麦リボソーム不活性化タンパク質である項目４６に記載の薬剤。
５３．前記システインが、前記類似体の２６０位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある項目５２に記載の薬剤。
５４．前記システインが、前記類似体の２７０位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある項目５３に記載の薬剤。
５５．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２５６位にある項目４６に記載の薬剤。
５６．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２７０位にある項目５４に記載の薬剤。
５７．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２７７位にある項目５４に記載の薬剤。
５８．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、モモルディンＩＩである項目４６に記載の薬剤。
５９．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、抗体に結合している項目４７に記載の薬剤。
６０．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、Ｈ６５抗体に結合している項目５９に記載の薬剤。
６１．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、抗体断片に結合している項目４７に記載の薬剤。
６２．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、キメラおよびヒト型化抗体断片からなるグループから選択された抗体断片に結合している項目６１に記載の薬剤。
６３．前記抗体断片が、Ｆａｂ抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片、およびＦ（ａｂ’）２抗体断片からなるグループから選択される項目６１に記載の薬剤。
６４．前記抗体断片が、Ｆａｂ抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片、およびＦ（ａｂ’）２抗体断片からなるグループから選択される項目６２に記載の薬剤。
６５．タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインに置換した、そして、前記システインが、配列番号：１の２５１位に対応する位置から前記類似体のカルボキシ末端位置に至る前記類似体のアミノ酸配列中の位置にて位置する、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、適切な宿主細胞にて発現する工程を含む、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体の製造方法。
６６．タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインに置換した、そして、前記システインが、配列番号：１の２５１位に対応する位置から前記類似体のカルボキシ末端位置に至る前記類似体のアミノ酸配列中の位置にて位置する、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、適切な宿主細胞にて発現する工程を含む、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体の製造方法による生成物。
６７．タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にてシステインを有しており、そして、前記システインが、配列番号：１の２５１位に対応する位置から前記類似体のカルボキシ末端位置に至る前記類似体のアミノ酸配列中の位置にて位置する、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を、システインを介して細胞に特異的に結合する分子に結合する工程を含む細胞に毒性を呈する薬剤の製造方法。
６８．システインを介して細胞に特異的に結合する分子を結合したタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を含む細胞毒性治療剤であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記システインが、配列番号：１の２５１位に対応する位置から前記類似体のカルボキシ末端位置に至る前記類似体のアミノ酸配列中の位置にて位置する、細胞毒性治療剤。
６９．ジスルフィド結合を利用するための前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４７位にある項目７に記載の類似体。
【０００５】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】 
【化１】
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【図２】 
【化２】
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【図３】 
【化３】
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【図４】 
【化４】
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【図５】 
【化５】
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【図６】 
【化６】
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【図７】 
【化７】
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【図８】 
【化８】
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【図９】 
【化９】
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（配列表）
【０００７】
【数１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年10月27日(2003.10.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
　天然配列ゲロニンをコードする精製および単離したポリヌクレオチド。
【請求項２】
　ゲロニンをコードする挿入体を有するベクターを含む宿主細胞であって、宿主細胞が、ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６８７２１として寄託されている宿主細胞。
【請求項３】
　天然配列大麦リボソーム非活性化タンパク質をコードする精製および単離したポリヌクレオチド。
【請求項４】
　モモルディンＩＩをコードする精製および単離したポリヌクレオチド。
【請求項５】
　ゲロニンのアミノからカルボキシ方向、および抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分をコードするアミノ酸の配列を含む融合タンパク質。
【請求項６】
　ゲロニンのアミノからカルボキシ方向、および抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分をコードするアミノ酸の配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
　抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分のアミノからカルボキシ方向、およびゲロニンをコードするアミノ酸の配列を含む融合タンパク質。
【請求項８】
　抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分のアミノからカルボキシ方向、およびゲロニンをコードするアミノ酸の配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
　ゲロニンのアミノからカルボキシ方向、エンドペプチダーゼ開裂部位を有するペプチドセグメント、および抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分をコードするアミノ酸の配列を含む融合タンパク質。
【請求項１０】
　ゲロニンのアミノからカルボキシ方向、エンドペプチダーゼ開裂部位を有するペプチドセグメント、および抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分をコードするアミノ酸の配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
　抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分のアミノからカルボキシ方向、エンドペプチダーゼ開裂部位を有するペプチドセグメント、およびゲロニンをコードするアミノ酸の配列を含む融合タンパク質。
【請求項１２】
　抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分のアミノからカルボキシ方向、エンドペプチダーゼ開裂部位を有するペプチドセグメント、およびゲロニンをコードする融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
　前記ペプチドセグメントが、シガ様毒素のセグメントである請求の範囲第９項もしくは第１１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
　前記ペプチドセグメントが、ウサギ筋肉アルドラーゼのセグメントである請求の範囲第９項もしくは第１１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
　前記ペプチドセグメントが、シガ様毒素のセグメントである請求の範囲第１０項もしくは第１２項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
　前記ペプチドセグメントが、ウサギ筋肉アルドラーゼのセグメントである請求の範囲第１０項もしくは第１２項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
　前記抗体の部分が、Ｆａｂ断片のカッパ鎖である請求の範囲第９項もしくは第１１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
　前記抗体の部分が、Ｆａｂ断片のカッパ鎖である請求の範囲第１０項もしくは第１２項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
　前記抗体の部分が、Ｆｄ鎖あるいはＦａｂ断片である請求の範囲第９項もしくは第１１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
　前記抗体の部分が、Ｆｄ鎖あるいはＦａｂ断片である請求の範囲第１０項もしくは第１２項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
　前記抗体の部分が、一本鎖抗体である請求の範囲第９項もしくは第１１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
　前記抗体の部分が、一本鎖抗体である請求の範囲第１０項もしくは第１２項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
　前記抗体の部分が、Ｈ６５抗体である請求の範囲第９項もしくは第１１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
　前記抗体の部分が、Ｈ６５抗体である請求の範囲第１０項もしくは第１２項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
　前記ペプチドセグメントが、シガ様毒素のセグメントであり、さらに、前記抗体の部分が、Ｈ６５抗体のＦａｂ断片のＦｄ鎖である請求の範囲第１０項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
　請求の範囲第２５項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２７】
　請求の範囲第２６項に記載のベクターで形質転換あるいは形質変換した宿主細胞。
【請求項２８】
　ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６９１０２として寄託されている宿主細胞である、請求の範囲第２７項に記載の宿主細胞。
【請求項２９】
　前記ペプチドセグメントが、ウサギ筋肉アルドラーゼのセグメントであり、さらに、前記抗体の部分が、Ｋ６５抗体のカッパ鎖である請求の範囲第１０項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３０】
　請求の範囲第２９項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３１】
　請求の範囲第３０項に記載のベクターで形質転換あるいは形質変換した宿主細胞。
【請求項３２】
　ＡＴＣＣ受託Ｎｏ，６９１０３として寄託されている宿主細胞である、請求の範囲第３１項に記載の宿主細胞。
【請求項３３】
　前記ペプチドセグメントが、ウサギ筋肉アルドラーゼのセグメントであり、さらに、前記抗体の部分が、Ｈ６５抗体のＦｄ鎖である請求の範囲第１０項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３４】
　請求の範囲第３３項に記載のポリヌクレオチドを含む、請求の範囲第１０項に記載のベクター。
【請求項３５】
　請求の範囲第３４項に記載のベクターで形質転換あるいは形質変換した宿主細胞。
【請求項３６】
　ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６９１０４として寄託されている宿主細胞である、請求の範囲第３５項に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
　前記抗体の部分が、一本鎖抗体である請求の範囲第５項もしくは第７項に記載の融合タンパク質。
【請求項３８】
　前記抗体の部分が、一本鎖抗体である請求の範囲第６項もしくは第８項に記載の融合タンパク質。
【請求項３９】
　ゲロニンのアミノからカルボキシ方向、および抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分をコードするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、適切な宿主にて発現する工程を含む融合タンパク質の製造方法。
【請求項４０】
　抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分のアミノからカルボキシ方向をコードするアミノ酸配列、およびゲロニンをコードするポリヌクレオチドを、適切な宿主にて発現する工程を含む融合タンパク質の製造方法。
【請求項４１】
　ゲロニンのアミノからカルボキシ方向、エンドペプチダーゼ開裂部位を有するペプチドセグメント、および抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分をコードするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、適切な宿主にて発現する工程を含む融合タンパク質の製造方法。
【請求項４２】
　抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分のアミノからカルボキシ方向をコードするアミノ酸配列、エンドペプチダーゼ開裂部位を有するペプチドセグメント、およびゲロニンをコードするポリヌクレオチドを、適切な宿主にて発現する工程を含む融合タンパク質の製造方法。
【請求項４３】
　リボソーム不活性化タンパク質と抗体の部分を含むタンパク質を精製する方法であって、前記方法が、下記工程、すなわち；
　陰イオン交換カラムに、リボソーム不活性化タンパク質と抗体の部分を含んだタンパク質の溶液を通し、
　前記溶液を通過した後に、前記タンパク質をプロテインＧカラムに適用し、および
　前記プロテインＧカラムから前記タンパク質を溶出する、
工程を含む、リボソーム不活性化タンパク質と抗体の部分を含むタンパク質を精製する方法。
【請求項４４】
　前記適用工程に先行して、陰イオン交換カラムからの流出物を陽イオン交換カラムに導入し、および
　前記タンパク質を効率的に溶出するために、陽イオン交換カラムを溶離剤に曝す、
　工程をさらに含む、請求の範囲第４３項に記載の方法。
【請求項４５】
　タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、および自然配座でのリシンＡ鎖表面での位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記類似体が、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持している、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体。
【請求項４６】
　前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンである請求の範囲第４５項に記載の類似体。
【請求項４７】
　前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の１０位にある請求の範囲第４６項に記載の類似体。
【請求項４８】
　請求の範囲第４７項に記載の類似体をコードするベクターを含む宿主細胞であって、前記宿主細胞が、ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６９００８として寄託されている宿主細胞。
【請求項４９】
　前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の６０位にある請求の範囲第４６項に記載の類似体。
【請求項５０】
　前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、単一システインを含む請求の範囲第４５項に記載の類似体。
【請求項５１】
　前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンである請求の範囲第５０項に記載の類似体。
【請求項５２】
　前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の１０位にある請求の範囲第５１項に記載の類似体。
【請求項５３】
　前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の４４位にある請求の範囲第５１項に記載の類似体。
【請求項５４】
　前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の５０位にある請求の範囲第５１項に記載の類似体。
【請求項５５】
　前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４７位にある請求の範囲第５１項に記載の類似体。
【請求項５６】
　タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、および自然配座でのリシンＡ鎖表面での位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記類似体が、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持している、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を、コードするポリヌクレオチド。
【請求項５７】
　タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、および自然配座でのリシンＡ鎖表面での位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記類似体が、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持している、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を、コードするポリヌクレオチドを適切な宿主細胞にて発現する工程を含む、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を製造する方法。
【請求項５８】
　システインを介したジスルフィド結合によって、細胞に特異的に結合する分子を結合した、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、および自然配座でのリシンＡ鎖表面での位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記類似体が、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持している、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を含む、細胞に毒性を呈する薬剤。
【請求項５９】
　タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、および自然配座でのリシンＡ鎖表面での位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記類似体が、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持しているタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を、システインを介したジスルフィド結合によって、細胞に特異的に結合する分子に結合する工程を含む細胞に毒性を呈する薬剤の製造方法。
【請求項６０】
　システインを介したジスルフィド結合によって、細胞に特異的に結合する分子を結合した、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を含む細胞毒性治療剤であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、および自然配座でのリシンＡ鎖表面での位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記類似体が、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持しているタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を含んだ細胞に毒性を呈する、ことを特徴とする細胞毒性治療剤。
【請求項６１】
　４４位および５０位の前記天然ゲロニンシステイン残基が、アラニン残基と置換される請求の範囲第４６項に記載の類似体。
【請求項６２】
　ジスルフィド結合を利用するための前記システイン残基が、前記類似体のアミノ酸配列の１０位にある請求の範囲第６１項に記載の類似体．
【請求項６３】
　前記システイン残基が、前記類似体のアミノ酸配列の１０３位にある請求の範囲第４６項に記載の類似体。
【請求項６４】
　前記システイン残基が、前記類似体のアミノ酸配列の１４６位にある請求の範囲第４６項に記載の類似体。
【請求項６５】
　前記システイン残基が、前記類似体のアミノ酸配列の１８４位にある請求の範囲第４６項に記載の類似体。
【請求項６６】
　前記システイン残基が、前記類似体のアミノ酸配列の２１５位にある請求の範囲第４６項に記載の類似体。
【請求項６７】
　前記宿主細胞が、ＡＴＣＣ６９１０１として寄託されている請求の範囲第５４項に記載の類似体をコードするベクターを含む宿主細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本願出願は、放棄された１９９１年１１月４日に出願された米国特許出願第07/787,567号の一部継続出願である。係属している１９９２年７月１９日に出願された米国特許出願第07/901,707号の一部継続出願である。
（背景）
　本発明は、一般には、細胞毒性治療剤の組成物として有用な物質に関する。より具体的には、本発明は、リボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド、目標分子への接合のために特異的に修飾されたリボゾーム不活性化タンパク質の類似体をコードするポリヌクレオチド、および目標分子コードするポリヌクレオチドへのリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドの遺伝子融合に関する。
【背景技術】
【０００２】
　リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰｓは、高等植物に偏在するタンパク質クラスを含む。ＲＩＰｓは、細菌からも単離されている。ＲＩＰｓは、真核タンパク質合成の阻害剤である。アデニン塩基に特異的なＮ−グリコシド結合は、真核リボソームの２８ＳｒＲＮＡの高度に保存されたループ領域において、ＲＩＰｓによって加水分解的に開裂され、これにより、翻訳を促進する。
【０００３】
　Ｓｔｒｉｐ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９５（１，２），１−８（１９８６）では、植物ＲＩＰｓを二つのタイプに分類している。タイプＩタンパク質はそれぞれ一本鎖ペプチドから構成され、リボソーム不活性化活性を有しており、そして、タイプＩＩタンパク質はそれぞれ、実質的にタイプＩタンパク質と同等の、Ｂ鎖にジスルフィド結合したＡ鎖から構成されており、細胞結合特性を有している。ゲロニン、ドデカンドリン、トリコサンチン、トリコキリン、ブリオディン、Ｍｉｒａｂｉｌｉｓ抗ウィルスタンパク質（ＭＡＰ）、大麦リボソームを不活性化するタンパク質（ＢＲＩＰ）、ヨウシュヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質（ＰＡＰｓ）、サポリン、ラフィン、およびモモルディンは、タイプＩＲＩＰｓの例であり、そして、リシンとアブリンが、タイプＩＩＲＩＰｓの例である。少なくとも活性部位の三次構造が、タイプＩＲＩＰｓ、細菌ＲＩＰｓ、およびタイプＩＩＲＩＰｓのＡ鎖の中に保存されており、そして多くの場合、一次構造相同体が認められる。Ｒｅａｄｙｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９（２４），１５２５２−１５２５６（１９８４）および他の報告は、ＲＩＰｓの二つのタイプが発展的に関連していることを示唆している。
【０００４】
　それらの固有の性質とは別に、タイプIリボソーム不活性化タンパク質は、細胞毒性治療剤の組成物としての使用に特に適している。ＲＩＰは、ｉｎ ｖｉｖｏにて、ＲＩＰを特定の細胞型に誘導する目標分子へ、これら細胞を選択的に殺傷するために接合する。典型的には、標的物質（例えば、抗体）は、タンパク質毒性のｉｎｖｉｖｏでの誘導抗体からの分離、および細胞間での活性化を抑制するジスルフィド結合により毒素へ結合される。細胞毒性物質を製造するための他の方法として、標的物質部分をコードする遺伝子を融合したＲＩＰをコードする遺伝子を発現する方法がある。得られるタンパク質生成物は、例えば、抗体の少なくとも一つの鎖に結合したＲＩＰを含んだ一本鎖ポリペプチドである。タンパク質毒素配列を含んだ様々な遺伝子融合物は、最近のＰａｓｔｅｎｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４，１１７３−1１７７（１９９１）の論文にて議論されている。
【０００５】
　タイプＩＲＩＰゲロニンのようなある種のＲＩＰｓは、希少植物物質のみからしか入手できないので、そのタンパク質の組み換え生成を可能にするために、ＲＩＰｓをコードする遺伝子をクローニングするのが望ましい。ほとんどのタイプＩ　ＲＩＰｓには目標物質の接合するための天然部位（すなわち、利用可能なシステイン残基）が備わっていないので、目標物質に容易に接合しつつも、その固有の生物学的活性を保持している天然タンパク質の類似体を開発することも望ましい。あるいは、毒素としてのタイプＩ　ＲＩＰｓおよび目標部分としての抗体基質を含んだ遺伝子融合物を作成するのが望ましい。
【０００６】
　このように、目標分子へ容易に接合されるタイプＩ　ＲＩＰｓの類似体およびタイプＩ　ＲＩＰｓを含む遺伝子融合生成物のための、タイプＩ　ＲＩＰｓをコードするクローニングした遺伝子が、当該技術分野では要望されているのである。
【非特許文献１】Ｓｔｒｉｐ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９５（１，２），１−８（１９８６）
【非特許文献２】Ｒｅａｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９（２４），１５２５２−１５２５６（１９８４）
【非特許文献３】Ｐａｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４，１１７３−1１７７（１９９１）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
　本発明において以下が提供される：
１．天然配列ゲロニンをコードする精製および単離したポリヌクレオチド。
２．ゲロニンをコードする挿入体を有するベクターを含む宿主細胞であって、宿主細胞が、ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６８７２１として寄託されている宿主細胞。
３．天然配列大麦リボソーム非活性化タンパク質をコードする精製および単離したポリヌクレオチド。
４．モモルディンＩＩをコードする精製および単離したポリヌクレオチド。
５．ゲロニンのアミノからカルボキシ方向、および抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分をコードするアミノ酸の配列を含む融合タンパク質。
６．ゲロニンのアミノからカルボキシ方向、および抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分をコードするアミノ酸の配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
７．抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分のアミノからカルボキシ方向、およびゲロニンをコードするアミノ酸の配列を含む融合タンパク質。
８．抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分のアミノからカルボキシ方向、およびゲロニンをコードするアミノ酸の配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
９．ゲロニンのアミノからカルボキシ方向、エンドペプチダーゼ開裂部位を有するペプチドセグメント、および抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分をコードするアミノ酸の配列を含む融合タンパク質。
１０．ゲロニンのアミノからカルボキシ方向、エンドペプチダーゼ開裂部位を有するペプチドセグメント、および抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分をコードするアミノ酸の配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
１１．抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分のアミノからカルボキシ方向、エンドペプチダーゼ開裂部位を有するペプチドセグメント、およびゲロニンをコードするアミノ酸の配列を含む融合タンパク質。
１２．抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分のアミノからカルボキシ方向、エンドペプチダーゼ開裂部位を有するペプチドセグメント、およびゲロニンをコードする融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
１３．前記ペプチドセグメントが、シガ様毒素のセグメントである第９項もしくは第１１項に記載の融合タンパク質。
１４．前記ペプチドセグメントが、ウサギ筋肉アルドラーゼのセグメントである第９項もしくは第１１項に記載の融合タンパク質。
１５．前記ペプチドセグメントが、シガ様毒素のセグメントである第１０項もしくは第１２項に記載のポリヌクレオチド。
１６．前記ペプチドセグメントが、ウサギ筋肉アルドラーゼのセグメントである第１０項もしくは第１２項に記載のポリヌクレオチド。
１７．前記抗体の部分が、Ｆａｂ断片のカッパ鎖である第９項もしくは第１１項に記載の融合タンパク質。
１８．前記抗体の部分が、Ｆａｂ断片のカッパ鎖である第１０項もしくは第１２項に記載のポリヌクレオチド。
１９．前記抗体の部分が、Ｆｄ鎖あるいはＦａｂ断片である第９項もしくは第１１項に記載の融合タンパク質。
２０．前記抗体の部分が、Ｆｄ鎖あるいはＦａｂ断片である第１０項もしくは第１２項に記載のポリヌクレオチド。
２１．前記抗体の部分が、一本鎖抗体である第９項もしくは第１１項に記載の融合タンパク質。
２２．前記抗体の部分が、一本鎖抗体である第１０項もしくは第１２項に記載のポリヌクレオチド。
２３．前記抗体の部分が、Ｈ６５抗体である第９項もしくは第１１項に記載の融合タンパク質。
２４．前記抗体の部分が、Ｈ６５抗体である第１０項もしくは第１２項に記載のポリヌクレオチド。
２５．前記ペプチドセグメントが、シガ様毒素のセグメントであり、さらに、前記抗体の部分が、Ｈ６５抗体のＦａｂ断片のＦｄ鎖である第１０項に記載のポリヌクレオチド。
２６．第２５項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
２７．第２６項に記載のベクターで形質転換あるいは形質変換した宿主細胞。
２８．ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６９１０２として寄託されている宿主細胞である、第２７項に記載の宿主細胞。
２９．前記ペプチドセグメントが、ウサギ筋肉アルドラーゼのセグメントであり、さらに、前記抗体の部分が、Ｋ６５抗体のカッパ鎖である第１０項に記載のポリヌクレオチド。
３０．第２９項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
３１．第３０項に記載のベクターで形質転換あるいは形質変換した宿主細胞。
３２．ＡＴＣＣ受託Ｎｏ，６９１０３として寄託されている宿主細胞である、第３１項に記載の宿主細胞。
３３．前記ペプチドセグメントが、ウサギ筋肉アルドラーゼのセグメントであり、さらに、前記抗体の部分が、Ｈ６５抗体のＦｄ鎖である第１０項に記載のポリヌクレオチド。
３４．第３３項に記載のポリヌクレオチドを含む、第１０項に記載のベクター。
３５．第３４項に記載のベクターで形質転換あるいは形質変換した宿主細胞。
３６．ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６９１０４として寄託されている宿主細胞である、第３５項に記載の宿主細胞。
３７．前記抗体の部分が、一本鎖抗体である第５項もしくは第７項に記載の融合タンパク質。
３８．前記抗体の部分が、一本鎖抗体である第６項もしくは第８項に記載の融合タンパク質。
３９．ゲロニンのアミノからカルボキシ方向、および抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分をコードするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、適切な宿主にて発現する工程を含む融合タンパク質の製造方法。
４０．抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分のアミノからカルボキシ方向をコードするアミノ酸配列、およびゲロニンをコードするポリヌクレオチドを、適切な宿主にて発現する工程を含む融合タンパク質の製造方法。
４１．ゲロニンのアミノからカルボキシ方向、エンドペプチダーゼ開裂部位を有するペプチドセグメント、および抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分をコードするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、適切な宿主にて発現する工程を含む融合タンパク質の製造方法。
４２．抗原に特異的に結合する能力のある抗体部分のアミノからカルボキシ方向をコードするアミノ酸配列、エンドペプチダーゼ開裂部位を有するペプチドセグメント、およびゲロニンをコードするポリヌクレオチドを、適切な宿主にて発現する工程を含む融合タンパク質の製造方法。
４３．リボソーム不活性化タンパク質と抗体の部分を含むタンパク質を精製する方法であって、前記方法が、下記工程、すなわち；
　陰イオン交換カラムに、リボソーム不活性化タンパク質と抗体の部分を含んだタンパク質の溶液を通し、
　前記溶液を通過した後に、前記タンパク質をプロテインＧカラムに適用し、および
　前記プロテインＧカラムから前記タンパク質を溶出する、
工程を含む、リボソーム不活性化タンパク質と抗体の部分を含むタンパク質を精製する方法。
４４．前記適用工程に先行して、陰イオン交換カラムからの流出物を陽イオン交換カラムに導入し、および
　前記タンパク質を効率的に溶出するために、陽イオン交換カラムを溶離剤に曝す、
　工程をさらに含む、第４３項に記載の方法。
４５．タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、および自然配座でのリシンＡ鎖表面での位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記類似体が、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持している、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体。
４６．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンである第４５項に記載の類似体。
４７．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の１０位にある第４６項に記載の類似体。
４８．第４７項に記載の類似体をコードするベクターを含む宿主細胞であって、前記宿主細胞が、ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６９００８として寄託されている宿主細胞。
４９．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の６０位にある第４６項に記載の類似体。
５０．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、単一システインを含む第４５項に記載の類似体。
５１．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンである第５０項に記載の類似体。
５２．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の１０位にある第５１項に記載の類似体。
５３．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の４４位にある第５１項に記載の類似体。
５４．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の５０位にある第５１項に記載の類似体。
５５．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４７位にある第５１項に記載の類似体。
５６．タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、および自然配座でのリシンＡ鎖表面での位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記類似体が、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持している、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を、コードするポリヌクレオチド。
５７．タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、および自然配座でのリシンＡ鎖表面での位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記類似体が、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持している、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を、コードするポリヌクレオチドを適切な宿主細胞にて発現する工程を含む、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を製造する方法。
５８．システインを介したジスルフィド結合によって、細胞に特異的に結合する分子を結合した、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、および自然配座でのリシンＡ鎖表面での位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記類似体が、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持している、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を含む、細胞に毒性を呈する薬剤。
５９．タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、および自然配座でのリシンＡ鎖表面での位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記類似体が、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持しているタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を、システインを介したジスルフィド結合によって、細胞に特異的に結合する分子に結合する工程を含む細胞に毒性を呈する薬剤の製造方法。
６０．システインを介したジスルフィド結合によって、細胞に特異的に結合する分子を結合した、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を含む細胞毒性治療剤であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、および自然配座でのリシンＡ鎖表面での位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記類似体が、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持しているタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を含んだ細胞に毒性を呈する、ことを特徴とする細胞毒性治療剤。
６１．４４位および５０位の前記天然ゲロニンシステイン残基が、アラニン残基と置換される第４６項に記載の類似体。
６２．ジスルフィド結合を利用するための前記システイン残基が、前記類似体のアミノ酸配列の１０位にある第６１項に記載の類似体．
６３．前記システイン残基が、前記類似体のアミノ酸配列の１０３位にある第４６項に記載の類似体。
６４．前記システイン残基が、前記類似体のアミノ酸配列の１４６位にある第４６項に記載の類似体。
６５．前記システイン残基が、前記類似体のアミノ酸配列の１８４位にある第４６項に記載の類似体。
６６．前記システイン残基が、前記類似体のアミノ酸配列の２１５位にある第４６項に記載の類似体。
６７．前記宿主細胞が、ＡＴＣＣ６９１０１として寄託されている第５４項に記載の類似体をコードするベクターを含む宿主細胞。
【０００８】
　さらに本発明においては、以下が提供される：
１．タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記システインが、配列番号：１の２５１位に対応する位置から前記類似体のカルボキシ末端位置に至る前記類似体のアミノ酸配列中の位置にて位置する、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体。
２．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンである項目１に記載の類似体。
３．前記システインが、前記類似体の２４４位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある項目２に記載の類似体。
４．前記システインが、前記類似体の２４７位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある項目３に記載の類似体。
５．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４４位にある項目３に記載の類似体。
６．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４７位にある項目４に記載の類似体。
７．４４位および５０位での天然ゲロニンシステイン残基が、アラニン残基と置換されている項目２に記載の類似体。
８．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４８位にある項目４に記載の類似体。
９．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、大麦リボソーム不活性化タンパク質である項目１に記載の類似体。
１０．前記システインが、前記類似体の２５６位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある項目９に記載の類似体。
１１．前記システインが、前記類似体の２６０位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある項目１０に記載の類似体。
１２．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２５６位にある項目１０に記載の類似体。
１３．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２７０位にある項目１１に記載の類似体。
１４．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２７７位にある項目１１に記載の類似体。
１５．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、モモルディンＩＩである項目１に記載の類似体。
１６．前記類似体のアミノ酸配列での前記システインの前記位置が、配列番号：１の２５９位にあるアミノ酸の位置に対応する項目１に記載の類似体。
１７．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンである項目１６に記載の類似体。
１８．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、大麦リボソーム不活性化タンパク質である項目１６に記載の類似体。
１９．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、モモルディンＩＩである項目１６に記載の類似体。
２０．前記類似体のアミノ酸配列での前記システインの前記位置が、配列番号：１の２５９位に対応する項目１に記載の類似体。
２１．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、大麦リボソーム不活性化タンパク質である項目２０に記載の類似体。
２２．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、モモルディンＩＩである項目２０に記載の類似体。
２３．タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記システインが、配列番号：１の２５１位に対応する位置から前記類似体のカルボキシ末端位置に至る前記類似体のアミノ酸配列中の位置にて位置する、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体をコードするポリヌクレオチド。２４．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンである項目２３に記載のポリヌクレオチド。
２５．前記システインが、前記類似体の２４４位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある項目２４に記載のポリヌクレオチド。
２６．前記システインが、前記類似体の２４７位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある項目２５に記載のポリヌクレオチド。
２７．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４４位にある項目２５に記載のポリヌクレオチド。
２８．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４７位にある項目２６に記載のポリヌクレオチド。
２９．４４位および５０位での天然ゲロニンシステイン残基が、アラニン残基と置換されている項目２４に記載のポリヌクレオチド。
３０．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４８位にある項目２６に記載のポリヌクレオチド。
３１．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、大麦リボソーム不活性化タンパク質である項目２３に記載のポリヌクレオチド。
３２．前記システインが、前記類似体の２５６位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある項目３１に記載のポリヌクレオチド。
３３．前記システインが、前記類似体の２６０位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある項目３２に記載のポリヌクレオチド。
３４．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２５６位にある項目３２に記載のポリヌクレオチド。
３５．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２７０位にある項目３３に記載のポリヌクレオチド。
３６．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２７７位にある項目３３に記載のポリヌクレオチド。
３７．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、モモルディンＩＩである項目２３に記載のポリヌクレオチド。
３８．タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記システインが、配列番号：１の２５１位に対応する位置から前記類似体のカルボキシ末端位置に至る前記類似体のアミノ酸配列中の位置にて位置する、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体をコードするベクター。
３９．タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記システインが、配列番号：１の２５１位に対応する位置から前記類似体のカルボキシ末端位置に至る前記類似体のアミノ酸配列中の位置にて位置する、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡベクターを含む宿主細胞。
４０．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンである項目３９に記載の宿主細胞。
４１．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４７位にある項目４０に記載の宿主細胞。
４２．前記宿主細胞が、ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６９００９として寄託されたタイプの細胞である項目４１に記載の宿主細胞。
４３．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、大麦リボソーム不活性化タンパク質である項目３９に記載の宿主細胞。
４４．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２７７位にある項目４３に記載の宿主細胞。
４５．前記宿主細胞が、ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６８７２２として寄託されたタイプの細胞である項目４４に記載の宿主細胞。
４６．細胞に毒性を呈する薬剤であって、システインを介して前記細胞に特異的に結合する分子にジスルフィド結合によって連結されたタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を含み、前記システインが、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて位置しており、そして、前記システインが、配列番号：１の２５１位に対応する位置から前記類似体のカルボキシ末端位置に至る前記類似体のアミノ酸配列中に位置する、細胞に毒性を呈する薬剤。
４７．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンである項目４６に記載の薬剤。
４８．前記システインが、前記類似体の２４７位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある項目４７に記載の薬剤。
４９．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４７位にある項目４８に記載の薬剤。
５０．４４位および５０位での天然ゲロニンシステイン残基が、アラニン残基と置換されている項目４７に記載の薬剤。
５１．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４８位にある項目４８に記載の薬剤。
５２．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、大麦リボソーム不活性化タンパク質である項目４６に記載の薬剤。
５３．前記システインが、前記類似体の２６０位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある項目５２に記載の薬剤。
５４．前記システインが、前記類似体の２７０位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある項目５３に記載の薬剤。
５５．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２５６位にある項目４６に記載の薬剤。
５６．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２７０位にある項目５４に記載の薬剤。
５７．前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２７７位にある項目５４に記載の薬剤。
５８．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、モモルディンＩＩである項目４６に記載の薬剤。
５９．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、抗体に結合している項目４７に記載の薬剤。
６０．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、Ｈ６５抗体に結合している項目５９に記載の薬剤。
６１．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、抗体断片に結合している項目４７に記載の薬剤。
６２．前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、キメラおよびヒト型化抗体断片からなるグループから選択された抗体断片に結合している項目６１に記載の薬剤。
６３．前記抗体断片が、Ｆａｂ抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片、およびＦ（ａｂ’）２抗体断片からなるグループから選択される項目６１に記載の薬剤。
６４．前記抗体断片が、Ｆａｂ抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片、およびＦ（ａｂ’）２抗体断片からなるグループから選択される項目６２に記載の薬剤。
６５．タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインに置換した、そして、前記システインが、配列番号：１の２５１位に対応する位置から前記類似体のカルボキシ末端位置に至る前記類似体のアミノ酸配列中の位置にて位置する、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、適切な宿主細胞にて発現する工程を含む、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体の製造方法。
６６．タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインに置換した、そして、前記システインが、配列番号：１の２５１位に対応する位置から前記類似体のカルボキシ末端位置に至る前記類似体のアミノ酸配列中の位置にて位置する、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、適切な宿主細胞にて発現する工程を含む、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体の製造方法による生成物。
６７．タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にてシステインを有しており、そして、前記システインが、配列番号：１の２５１位に対応する位置から前記類似体のカルボキシ末端位置に至る前記類似体のアミノ酸配列中の位置にて位置する、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を、システインを介して細胞に特異的に結合する分子に結合する工程を含む細胞に毒性を呈する薬剤の製造方法。
６８．システインを介して細胞に特異的に結合する分子を結合したタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を含む細胞毒性治療剤であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記システインが、配列番号：１の２５１位に対応する位置から前記類似体のカルボキシ末端位置に至る前記類似体のアミノ酸配列中の位置にて位置する、細胞毒性治療剤。
６９．ジスルフィド結合を利用するための前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４７位にある項目７に記載の類似体。
【０００９】
　（発明の概要）
　本発明は、目標分子およびタイプＩＲＩＰｓを含む融合生成物ヘジスルフィド結合するための利用可能なシステインを有するタイプＩＲＩＰｓ、タイプＩＲＩＰｓをコードする精製および単離したポリヌクレオチドを提供する。そのポリヌクレオチドを含むベクター、およびそのベクターで形質転換された宿主細胞も提供される。
【００１０】
　ゲロニンの固有配列をコードする精製および単離したポリヌクレオチド、およびＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６８７２１として寄託されたタイプのゲロニンをコードするベクターを含んだ宿主細胞が提供される。大麦リボソーム不活性化タンパク質の固有配列をコードする精製および単離したポリヌクレオチド、およびモモルディンＩＩをコードする精製および単離したポリヌクレオチドもさらに提供される。
【００１１】
　タイプＩ植物ＲＩＰの類似体を、本明細書では、天然タンパク質のリボソーム不活性化活性を有する非自然発生のポリペプチドであり、天然タンパク質のアミノ酸配列とは異なるものとして定義している。本発明による好ましい類似体は、配列番号：１の２５１位に相当する位置から類似体のカルボキシ末端までのアミノ酸配列内に位置するジスルフィド結合のためのシステインを有しているタイプＩ植物ＲＩＰの類似体である。本発明による他の好ましい類似体は、自然配座におけるタンパク質表面にあり、固有の折り畳み構造ならびにリボソーム不活性化タンパク質の生物学的活性が付与されていない類似体においてジスルフィド結合が利用可能なシステインを有するタイプＩＲＩＰｓである。最近ＲＩＰｓの類似体も、本願発明にて意図されている。
【００１２】
　本発明は、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を提供するものであり、その類似体とは、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、当該システインは、配列番号：１の２５９位に対応する類似体のアミノ酸の位置、あるいは配列番号：１の２５１位に対応する位置から類似体のカルボキシ末端に至る位置に対応する類似体におけるアミノ酸配列内の位置に存在している。
【００１３】
　本発明の類似体は、ゲロニンの類似体である。本発明によるゲロニンの類似体では、システインは、２４４位から類似体のカルボキシ末端に至る類似体における位置、より好ましくは、２４７位から類似体のカルボキシ末端に至る類似体における位置、そして、これら領域において、最も好ましくは、類似体のアミノ酸配列の２４４位、２４７位、あるいは２４８位に位置する。４４位および５０位でのゲロニン・システイン残基が、アラニン残基と置換されるのが好ましい。
【００１４】
　本発明の類似体は、大麦リボソーム不活性化タンパク質の類似体である。かような類似体では、好ましくは、システインは、２５６位から類似体のカルボキシ末端に至る類似体における位置、より好ましくは、システインは、２６０位から類似体のカルボキシ末端に至る類似体のアミノ酸配列内に位置する。最も好ましくは、これら領域において、類似体のアミノ酸配列の２５６位、２７０位、あるいは２７７位にシステインは位置する。本発明の類似体は、モモルディンＩＩの類似体である。
【００１５】
　本発明の類似体は、配列番号：１の２５９位の一つのアミノ酸に対応する位置での類似体のアミノ酸配列においてシステインを有する。かような類似体は、ゲロニン、大麦リボソーム不活性化タンパク質、あるいはモモルディンＩＩの類似体である。本発明は、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体をコードするポリヌクレオチドも提供するものであり、その類似体とは、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、当該システインは、配列番号：１の２５１位に対応する位置から類似体のカルボキシ末端に至る位置に対応する類似体におけるアミノ酸配列内の位置に存在している。このポリヌクレオチドは、ゲロニンの類似体をコードし、システインが、２４４位から類似体のカルボキシ末端に至る類似体における位置、より好ましくは、２４７位から類似体のカルボキシ末端に至る類似体における位置、そして、最も好ましくは、類似体のアミノ酸配列の２４４位、２４７位、あるいは２４８位に位置する類似体が好ましい。本発明によるポリヌヌクレオチドは、４４位および５０位でのゲロニン・システイン残基がアラニン残基と置換されているゲロニン類似体をコードす
るものが好ましい。
【００１６】
　本発明のポリヌクレオチドは、大麦リボソーム不活性化タンパク質の類似体をコードし、システインが、２５６位から類似体のカルボキシ末端に至る類似体における位置、より好ましくは、２６０位から類似体のカルボキシ末端に至る類似体における位置、そして、最も好ましくは、類似体のアミノ酸配列の２５６位、２７０位、あるいは２７７位に位置する類似体が好ましい。
【００１７】
　本発明のポリヌクレオチドは、モモルディンＩＩの類似体をコードする。
【００１８】
　本発明は、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供するものであり、その類似体とは、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、当該システインは、配列番号：１の251位に対応する位置から類似体のカルボキシ末端に至る位置に対応する類似体のアミノ酸配列内の位置に存在している。
【００１９】
　本発明は、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体をコードするＤＮＡベクターを含む宿主細胞をさらに提供するものであり、その類似体とは、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、当該システインは、配列番号：１の２５１位に対応する位置から類似体のカルボキシ末端に至る位置に対応する類似体のアミノ酸配列内の位置に存在している。かような宿主細胞にて、ベクターは、ゲロニンの類似体をコードし、特に、ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６９００９として寄託された宿主細胞のような類似体のアミノ酸配列の２４７位にシステインがある類似体をコードする。
【００２０】
　本発明の宿主細胞は、大麦リボソーム不活性化タンパク質をコードするベクターを含み、特に、ＡＴＣＣ受託ＮＯ．６８７７２として寄託された宿主細胞のような類似体のアミノ酸配列の２７７位にシステインがある宿主細胞である。
【００２１】
　本発明は、細胞に特異的に結合した分子へのシステインを介したジスルフィド結合により結合したタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を含む細胞に毒性を呈する薬剤も提供するものであり、そのシスティンは、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応する類似体のアミノ酸位置にあり、そして、当該システインは、配列番号：１の２５１位に対応する位置から類似体のカルボキシ末端に至る位置に対応する類似体におけるアミノ酸配列内の位置に存在している。この薬剤は、ゲロニンの類似体を含み、システインが、２４７位から類似体のカルボキシ末端に至る類似体における位置、そして、類似体のアミノ酸配列の２４７もしくは２４８位に位置するのがより好ましい。４４位および５０位での本来のゲロニン・システイン残基が、アラニン残基と置換されている類似体を含む薬剤が好ましい。
【００２２】
　本発明の薬剤は、大麦リボソーム不活性化タンパク質の類似体を含み、システインが、２６０位から類似体のカルボキシ末端に至る類似体における位置、より好ましくは、２７０位から類似体のカルボキシ末端に至る類似体における位置、そして、最も好ましくは、類似体のアミノ酸配列の２５６位、２７０位、あるいは２７７位に位置する類似体が好ましい。
【００２３】
　本発明の薬剤は、モモルディンＩＩの類似体を含む。
【００２４】
　本発明は、抗体、特に、Ｈ６５抗体あるいは抗体断片、より好ましくは、キメラおよびヒト型化抗体からなるグループから選択された抗体断片、そして最も好ましくは、Ｆａｂ抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片、あるいはＦ（ａｂ’）２　抗体断片にタイプＩリボソーム不活性化タンパク質が結合している薬剤を提供する。本発明の薬剤が、Ｆａｂ抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片、あるいはＦ（ａｂ’）２抗体断片からなるグループから選択されたキメラあるいはヒト型化抗体を含むのが非常に好ましい。
【００２５】
　タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を調製するための本発明の方法は、配列番号：１の２５１位に対応する位置から類似体のカルボキシ末端に至る位置に対応する類似体におけるアミノ酸配列内の位置に存在し、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応する類似体のアミノ酸位置にて（例えば、ＲＩＰをコードする天然ＤＮＡ配列の特定部位の突然変異誘発あるいはＲＩＰ類似体をコードするＤＮＡ配列の化学的合成により）置換された分子間ジスルフィド結合のために利用可能なシステインを有する、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドを適切な宿主細胞で発現する工程を含んでいる。
【００２６】
　本発明による生成物は、配列番号：１の２５１位に対応する位置から類似体のカルボキシ末端に至る位置に対応する類似体におけるアミノ酸配列内の位置に存在し、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応する類似体のアミノ酸位置にて置換された分子間ジスルフィド結合のために利用可能なシステインを有する、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドを適切な宿主細胞で発現する工程を含んだ方法による生成物である。
【００２７】
　本発明は、細胞に特異的に結合した分子ヘシステインを介してタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を結合する工程を含んだ細胞に毒性を呈する薬剤の製造方法を提供するものであり、その類似体は、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にシステインを有しており、そして、当該システインは、配列番号：１の２５１位に対応する位置から類似体のカルボキシ末端に至る位置に対応する類似体におけるアミノ酸配列内の位置に存在している。
【００２８】
　本発明によると、特定の細胞の消失が目標とする疾患の治療方法は、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にシステインを有しており、そして、当該システインは、配列番号：１の２５１位に対応する位置から類似体のカルボキシ末端に至る位置に対応する類似体におけるアミノ酸配列内の位置に存在している、細胞に特異的に結合した分子ヘシステインを介して結合したタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を含んだ細胞に毒性を呈する薬剤の治療上有効量を投与を患者に投与する工程を含む。
【００２９】
　本発明はまた、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置およびその自然配座においてリシンＡ鎖表面位置に対応するアミノ酸位置に、分子間ジスルフィド結合のためのシステインを有し、そして、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持しているタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を提供する。
【００３０】
　かような類似体は、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質がゲロニンである類似体、そして好ましくは、ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６９００８として寄託された宿主細胞におけるベクターにてコードされた類似体のアミノ酸配列の１０位にシステインがあるゲロニンの類似体である。他のかようなゲロニン類似体には、ゲロニン類似体のアミノ酸配列における６０、１０３、１４６、１８４および２１５位にシステインがあるゲロニンの類似体がある。４４および５０位のゲロニンシステインが、これら類似体にて、アラニン残基と置換されたものが好ましい。
【００３１】
　本発明は、単一システインのみを含んだ類似体である、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体をさらに提供する。かような類似体は、ゲロニンの類似体であり、好ましくは、類似体のアミノ酸配列の１０、４４、５０もしくは２４７位に単一システインが位置し、さらに本発明によって規定した他の位置にシステインがある類似体が好ましい。
【００３２】
　本発明は、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、およびその自然配座においてリシンＡ鎖表面位置に対応するアミノ酸位置に、分子間ジスルフィド結合のためのシステインを有し、そして、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持しているタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００３３】
　本発明によると、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を調製する方法は、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置にて置換された分子間ジスルフィド結合のために利用でき、およびその自然配座においてリシンＡ鎖表面位置に対応するアミノ酸位置に分子間ジスルフィド結合のためのシステインを有し、そして、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持しているタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体をコードするポリヌクレオチドを適切な宿主細胞で発現する工程を含んでいる。
【００３４】
　本発明は、細胞に特異的に結合した分子ヘシステインを介してタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を含んだ細胞に毒性を呈する薬剤を提供するものであり、その類似体は、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、およびその自然配座においてリシンＡ鎖表面位置に対応するアミノ酸位置にシステインを有しており、そして、当該類似体は、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持している。
【００３５】
　細胞に毒性を呈する薬剤を調製するための本発明の方法は、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、およびその自然配座においてリシンＡ鎖表面位置に対応するアミノ酸位置にシステインを有し、そして、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持している、細胞に特異的に結合した分子ヘシステインを介してタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を結合する工程を含む。
【００３６】
　特定の細胞の消失が目標とする疾患の治療のための本発明の方法は、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、およびその自然配座においてリシンＡ鎖表面位置に対応するアミノ酸位置にシステインを有し、そして、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持している、細胞に特異的に結合した分子ヘシステインを介したジスルフィド結合によって結合したタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を含んだ細胞に毒性を呈する薬剤の治療上有効量を投与を患者に投与する工程を含む。
【００３７】
　ＲＩＰ類似体は、細胞毒性治療用薬剤の組成物としての用途に特に適している。本発明による細胞毒性用薬剤は、ＲＩＰ組成物を第二成分の特異的結合能力によって標的とするタイプの細胞を、ｉｎｖｉｖｏにて選択的に消失させるために使用できる。細胞毒性ＲＩＰ類似体を形成するために、キメラ、およびＣＤＲ−移植した抗体、および抗体領域／断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体、およびＦｖあるいは単一可変領域）へ接合すること、ならびに遊離システイン残基を含むように遺伝子工学的に調製したモノクローナル抗体へ接合することも、本発明の範疇に含まれる。本発明にて有用なＦａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片の例が、本明細書に参考までに組み込んだ、係属中の共願に係る１９９１年６月１４日に出願した米国特許出願Ｎｏ．０７／７１４，１７５および１９８９年２月９日付発行の国際公開Ｎｏ．Ｗｏ８９／００９９９に記載されている。本発明によるＲＩＰｓは、抗体以外の他の目標物質、例えば、特定の表面炭水化物を有する細胞に結合するレクチン、あるいは、ホルモン、リンフォカイン、成長因子、あるいは特定のレセプターを有する細胞に特異的に結合する他のポリペプチドにも接合する。ＲＩＰｓを含む免疫接合を、免疫毒素として記している。免疫毒素は、免疫接合よりもむしろ、融合タンパク質から構成されている。
【００３８】
　本発明は、抗体の抗原結合部分（例えば、抗体Ｌ鎖あるいは切除したＨ鎖、もしくは一本鎖抗体）、あるいはタイプＩＲＩＰに結合した、先のパラグラフに列挙した目標物質の遺伝子融合物を提供する。遺伝子融合物は、抗体遺伝子の５’端あるいは３’端のいずれかに結合したＲＩＰ遺伝子を含む。ペプチドセグメントをコードするＤＮＡリンカーは、毒素と抗体遺伝子の間に挿入あるいは挿入されない。好ましくは、リンカーは、ジスルフィド結合に関与し、プロテアーゼ感受性アミノ酸配列（例えば、配列番号：５８）を形成する二つのシステイン、あるいは幾つかのカテプシン開裂部位（例えば、配列番号：５９）を含むウサギ筋肉アルドラーゼのセグメントを含んだＥ．ｃｏｌｉシガ様毒素のセグメントをコードする。融合した遺伝子のタイプＩＲＩＰ部分は、好ましくは、ゲロニン、ＢＲＩＰ、あるいはモモルディンＩＩをコードする。さらに好ましくは、融合した遺伝子の抗体部分は、抗体Ｆａｂ断片の鎖の一つ（すなわち、カッパあるいはＦｄ）をコードする配列を含み、そして融合した遺伝子は、他のＦａｂ遺伝子によって宿主細胞にて共発現され、あるいは、抗体部分は一本鎖抗体をコードする配列を含む。
【００３９】
　本発明は、陰イオン交換カラムに免疫毒素を含む溶液を通し、プロテインＧカラムに流し込み、そして、プロテインＧカラムから免疫毒素を溶出する工程を含むリボソーム不活性化タンパク質と抗体部分を含む免疫毒素を精製する方法も提供する。この方法はさらに、陰イオン交換カラムでの流体を陽イオン交換カラムに導入し、前記タンパク質を効果的に溶出するために陽イオン交換カラムを溶離剤に曝し、そして、陰イオン交換カラムでの流体を直接プロテインＧカラムに適用するよりもむしろ、流体をプロテインＧカラムに適用する工程を含む。　
【００４０】
　本発明による免疫毒素は細胞毒性物質を含み、そして、融合タンパク質は、自己免疫疾患、癌、および対宿主性移植片病のような、特定の細胞型の消失を目標とする疾患の治療に適している。免疫毒素はまた、免疫抑制の発生への使用、ならびにヒト免疫不全ウィルスなどのウィルスによる感染の治療での使用に適している。
【００４１】
　本発明にて特に説明したポリヌクレオチドは、共に、１２３０１パークローン　ドライブ、ロックビル、メリーランドに所在のＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に、１９９１年１０月２日に寄託され、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託Ｎｏ．６８７２１および６８７２２がそれぞれ付与された、Ｅ.ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１（Ｇ２７４株と称する）中のプラスミドｐＩＮＧ３７３１およびＥ．ｃｏｌｉ Ｅ１０４（Ｇ２７５株と称する）中のプラスミドｐＩＮＧ３８０３での挿入体である。本発明にてさらに説明を行ったポリヌクレオチド配列は、ＡＴＣＣに、１９９２年６月９日に寄託され、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託Ｎｏ．６９００８および６９００９がそれぞれ付与された、Ｅ．ｃｏｌｉＥｌ０４（Ｇ２７７株と称する）中のプラスミドｐｌＮＧ３７４６およびＥ．ｃｏｌｉ Ｅｌ０４（Ｇ２７６株と称する）中のプラスミドｐＩＮＧ３７３７での挿入体である。本発明にてさらに説明を行っているポリヌクレオチド配列は、ＡＴＣＣに、１９９２年１０月２７日に寄託され、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託Ｎｏ．６９１０１、６９１０２、６９１０２および６９１０４がそれぞれ付与された、Ｅ．ｃｏｌｉＥ１０４（Ｇ２７８株と称する）中のプラスミドｐＩＮＧ３７４７、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｅｌ０４（Ｇ２７９株と称する）中のプラスミドｐＩＮＧ３７５４、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｅｌ０４（Ｇ２８０株と称する）中のプラスミドｐＩＮＧ３７５８、およびＥ．ｃｏｌｉＥ１０４（Ｇ２８１株と称する）中のプラスミドｐＩＮＧ３７５９での挿入体である。
【００４２】
　（詳細な説明）
　三つの植物型ＲＩＰｓをコードする遺伝子のヌクレオチド配列、およびその遺伝子を含む発現ベクターが、本発明によって提供される。最初の植物ＲＩＰ、ゲロニンは、東アジアの熱帯雨林に自生するトウダイグサ科のＧｅｌｏｎｉｕｍｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍの種によって生成され、そして、第二の植物ＲＩＰ、ＢＲＩＰは、穀物グレインによって一般にわずかに合成される。モモルディンＩＩ、三番目の植物ＲＩＰは、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａｂａｌｓａｍｉｎａの種に生成される。ＢＲＩＰの類似体は、本発明によって提供される。分子間ジスルフィド結合に関与させるために、遊離システインを含めるよう、類似体は遺伝子工学的に処理され、そして、架橋剤によるＲＩＰの非特異的化学誘導無しに、抗体分子の接合される。
【００４３】
　本発明のタイプＩＲＩＰ類似体は、免疫毒素の組成物として有用な天然タンパク質との顕著な相違を示す。遊離システインが欠如した天然タンパク質における遊離メルカプト基を導入するための化学処理は通常、アミノ酸側鎖の非選択的修飾を含む。非選択性はしばしば、異なるＲＩＰ分子（例えば、接合体の異種集団）の異なる部位に接合した抗体をもたらす結果となり、また、抗体がＲＩＰの重要領域あるいはその近傍（例えば、細胞膜を横断する位置にて含まれる活性部位あるいは領域）に接合した場合には、ＲＩＰ活性が減少することになる。これに対して、本発明のＲＩＰ類似体は、類似体の特異的残基へのジスルフィド結合を介して単一抗体に接合でき、免疫接合の態様に対応した変異体の減少を招き、場合によっては、向上した性質（例えば、大きな細胞毒性あるいは溶解性）を備えた免疫接合体をもたらす。
【００４４】
　タイプＩ植物ＲＩＰｓ、ならびにシガおよびシガ様毒素Ａ鎖のような細菌ＲＩＰｓは、リシンＡ鎖と相同であり、そして、本発明において有用である。
【００４５】
　タイプＩＲＩＰｓは決定され、ＲＩＰにおけるシステインの置換のための部位も、ＲＩＰの一次アミノ酸配列と天然リシンＡ鎖アミノ酸配列との比較により同定され、その三次構造は、本明細書に参考までに組み込んだＫａｔｚｉｎｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，１０，２５１−２５９（１９９１）に記されている。
【００４６】
　アミノ酸配列の比較は、タイプＩＲＩＰｓを、リシンＡ鎖とタイプＩ植物ＲＩＰｓが、同一の九つのアミノ酸を有することで定義している。リシン配列に基づくと、同一のアミノ酸は、チロシン２１、アルギニン２９、チロシン３０、チロシン１２３、ロイシン１４４、グルタミン酸１７７、アラニン１７８、アルギニン１８０、およびトリプトファン２１１であった。リシンＡ鎖は、タイプＩＲＩＰｓの三次元構造のためのモデルとして使用できる。接合のために利用できるシステインが欠落しているものの、リボソーム不活性化活性、ならびにその一次配列がリシンＡ鎖の一次配列と〔Ａｔｌａｓｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５補遺版３、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ワシントンＤ．Ｃ．（１９７８）のＳｃｈｗａｒｔｚｅｔ ａ１．，ｐｐ．３５３−３５８に記載のＤａｙｈｏｆｆ　Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄａｔａ Ｍａｔｒｉｘ（ＭＤＭ−７８）を用いて、ＰＣ／ＧＥＮＥプログラムＰＡＬＩＧＮ（インタージェネティック社、マウンテイン・ビュー、カリフォルニア州）によって提供されたＭｅｙｅｒｓｅｔ ａｌ．，ＣＡＢＩＯＳ ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴｌＯＮＳ，（４）１，１１−１７（１９８８）に従って〕比較した時に九つの同一のアミノ酸を有しているタンパク質を、タイプＩＲＩＰとして定義され、そして、本発明においての有用性が期待される。本明細書にて使用している「対応する」の語彙は、前出のＭｅｙｅｒｓｅｔ ａｌの方法によって二つのアミノ酸配列を比較したときの相対するアミノ酸位置を意味する。
【００４７】
　タイプＩＲＩＰｓゲロニン、ＢＲＩＰ、モモルディンＩＩ、ラフィン〔Ｉｓｌａｍｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．，５４（５），１３４３−１３４５（１９９）を参照〕、αトリコサンティン〔Ｃｈｏｗ ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２６５，８６７０−８６７４（１９９０）を参照〕、モモルディンＩ〔Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，ＢＢＡ，１０８８，３１１−３１４（１９８９）を参照〕、Ｍｉｒａｂｉｌｉｓ抗ウィルスタンパク質〔Ｈａｂｕｋａｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４（１２），６６２９−６６３７（１９８９）を参照〕、種から単離したヨウシュヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質〔Ｋｕｎｇｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４（１２），３３０１−３３１８（１９９０）を参照〕、およびサポリン〔Ｂｅｎａｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８３，４５６−４７０（１９８９）を参照〕の一次アミノ酸配列を、上述したように、前出のＭｅｙｅｒｓｅｔ ａｌの方法によって、図１〜９それぞれに、リシンＡ鎖の一次配列との比較を個別に行った。
【００４８】
　図１〜９は、システイン残基が置換されるであろうタイプＩＲＩＰｓのアミノ酸位置の予測に役立つであろう。システイン置換のための好ましいアミノ酸は、分子表面に存在し、システインと置換された時にタンパク質の折り畳みを妨げない親溶媒性のアミノ酸を含む。かようなアミノ酸を含むリシンＡ鎖の領域は、カルボキシ末端領域である。置換のために使用を避けなければならないアミノ酸は、プロリンのような、適切なタンパク質の折り畳みが不安定であるもの、および非溶媒性のアミノ酸である。さらに使用を避けるべきものとしては、ＲＩＰｓ中で不変の九つのアミノ酸、および前出のＫａｔｚｉｎｅｔ ａｌ．，の図６に記載されたようなリシンＡ鎖の活性部位を含む領域あるいはその近傍にあるアミノ酸がある。
【００４９】
　それ故、タイプＩＲＩＰｓのための置換の好ましい領域は、親溶媒性で、タイプＩＩＲＩＰＡ−鎖およびＢ−鎖が、ジスルフィド結合により自然に結合されたカルボキシ末端領域に対応するカルボキシ末端領域である。実施例に示した通り、配列番号：１の２５１位に対応する位置からタイプＩＩＲＩＰのカルボキシ末端位置に至るアミノ酸配列内にてシステインは置換され、そして、酵素活性を保持し、ジスルフィド架橋能力を備えたＲＩＰ類似体が得られるのである。ある好ましいシステイン置換位置は、リシンＡ鎖の２５９位のシステインの相当する位置の近傍である。
【００５０】
　本発明で特に説明した免疫毒素は細胞毒性物質を含み、遺伝子融合生成物は、Ｔ細胞機能が関連するヒト自己免疫疾患の治療における使用に特に適している。免疫毒素による自己免疫疾患の治療は、本明細書に参考までに組み込んだ、共願に係る、１９９１年９月１３日出願の米国特許出願Ｎｏ．０７／３０６，４３３および１９８９年８月１０日発行の国際公開Ｎｏ．Ｗｏ８９／０６９６８に記載されている。自己免疫疾患の例として、全身系紅斑性狼瘡、（苔蘇硬化症、形態および苔蘇プラナスを含む）硬皮症、慢性関節リューマチ、慢性甲状腺炎、天疱瘡、真性糖尿病タイプＩ、進行性全身系硬化症、再生不能性貧血、重症性筋無力症、筋緊張症、ショーグレン疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、および胆汁硬変症がある。自己免疫は、多重硬化症、ブドウ膜炎、乾蘇、およびメニエーラ病のも関連している。様々な自己免疫疾患の一般的な記述が、Ｒｏｓｅ　＆　Ｍａｃｋｅｙ，Ｅｄｓ．，ＴｈｅＡｕｔｏｉｍｍｕｎｅＤｉｓｅａｓｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８５）に寄せられている。
【００５１】
　免疫毒素は、患者に対して、単独に、あるいは、次のものに限定されるものではないが、免疫抑制剤、耐性誘発剤、薬効強化剤および副作用緩和剤を含む、二種類以上の免疫毒素、他の治療剤、組成物などを含んだ混合物として投与できる。宿主のアレルギー反応の抑制に有用な免疫抑制剤が、特に好ましい。好ましい、免疫抑制剤としては、プレドニソン、プレドニソロン、ＤＥＣＡＤＲＯＮ（Ｍｅｒｃｋ，Ｓｈａｒｐ　＆　Ｄｏｈｍｅ社、ウェストポイント、ペンシルベニア州）、サイクロホスファミド、サイクロスポリン、６−メルカプトプリン、メトトリキシエート、アザチオプリン、およびｉ．ｖ．γグロブリンあるいはこれらの混合物がある。好ましい薬効強化剤としては、モネンシン、塩化アンモニウム、ペルヘキシリン、ベラパミル、アマンタジン、およびクロロキンがある。これら薬剤のすべては、ＥｄｗａｒｄＲ．Ｂａｒｎｈａｒｔの発行に係るＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，４１ｓｔ Ｅｄ．，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９８７）に開示されたような、一般的に効果が認められた用量にて投与される。本明細書に参考として組み込んだ、１９８９年８月１０日に発行された国際（ＰＣＴ）出願ＷＯ８９／０６９７６７は、免疫抑制剤として免疫毒素の投与を開示している。
【００５２】
　抗Ｔ細胞免疫毒素は、注射用あるいは局所用製剤として調製される。非経口用製剤は公知であり、本発明において、好ましくは、筋内あるいは血管内投与での使用に適している。抗Ｔ細胞免疫毒素の治療上効果的な量を含む製剤は、滅菌水溶液、懸濁液、あるいは凍結乾燥体のいずれかであり、任意に、安定剤あるいは賦形剤を含む。凍結乾燥した組成物は、網状赤血球溶解物分析にて測定した際に２０ｎｇ／ｍｌ以下の生物学的活性を有し、約０．０１ｍｇ／宿主体重ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇのレベルになるように、適切な希釈液、例えば、注射用水、生理食塩水、０．３％グリシンなどで復元する。抗Ｔ細胞免疫毒素を含む薬学的組成物は、典型的には、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／患者ｋｇの範囲における治療上効果的な量が投与される。抗Ｔ細胞免疫毒素を含む薬学的組成物の治療上効果的な量は、好ましくは、患者への投与量を段階的に増大する方法にて、数日間から二週間にわたる毎日の約１時間の点滴によって投与された患者において、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／患者体重ｋｇの範囲にある。
【００５３】
　抗Ｔ細胞免疫毒素は、皮膚用の担体に抗Ｔ細胞免疫毒素の治療上効果的な量を含有せしめることで、局所療法用の局所用製剤が調製される。投与すべき抗Ｔ細胞免疫毒素の量、および局所用製剤における抗Ｔ細胞免疫毒素の濃度は、選択した担体、患者の臨床状態、全体的毒性、および製剤中の抗Ｔ細胞免疫毒素の安定性に依存している。このように、投与対象の患者あるいは同様の疾患の患者の臨床状態によって、医師は、製剤中の抗Ｔ細胞免疫毒素の適切な濃度ならびに投与する製剤の適切な量を含んだ製剤を使用するのである。局所用製剤のための抗Ｔ細胞免疫毒素の濃度は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ以上の範囲にある。典型的には、局所用製剤のための抗Ｔ細胞免疫毒素の濃度は、約1ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ以上の範囲にある。抗Ｔ細胞免疫毒素の固形分散液ならびに安定化製剤が使用できる。そして、治療効果を最高ならしめるために、担体に使用される正確な濃度は、適当な実験的操作の対象となる。約１０ｍｇ抗Ｔ細胞免疫毒素／１００ｇ担体以上を、１％ｗ／ｗ水和ゲル担体と併用すれば、皮膚炎症の治療において有用である。ゲルに加えて、適切な担体としては、鉱物油、石油などを用いた水中油あるいは油中水エマルジョンがある。
【００５４】
　抗Ｔ細胞免疫毒素は、経皮治療システムを使用することで、局所的に効果的に投与される〔Ｂａｒｒｙ，Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃ　Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，ｐ．１８１（１９８３）およびそこで引用された文献〕。かような局所的誘導システムは、低分子量薬剤の経皮投与のために設計されたものであるが、経皮誘導することができる。それらは、抗Ｔ細胞免疫毒素あるいはその誘導体の投与に非常に適しており、律速御微小孔膜の適切な選択による治療用タンパク質と関連する。
【００５５】
　全身もしくは局所誘導用いずれかの抗Ｔ細胞免疫毒素の局所用製剤が使用され、上述したような非経口投与用の賦形剤、および共溶媒、界面活性剤、油、湿潤剤、緩和薬、防腐剤、安定化剤、および抗酸化剤のような局所用調製物に使用される他の賦形剤を含む。薬学的に許容される緩衝液、例えば、Ｔｒｉｓあるいは燐酸緩衝液が使用される。局所用製剤は、強化剤、界面活性剤、促進剤、吸着増進剤、あるいは抗Ｔ細胞免疫毒素または他の薬剤の皮膚への浸透を促進する薬剤のような浸透促進剤と称する様々な薬剤の一つ以上も任意に含む。かような薬剤は、当業者に周知の下記特性のすべてあるいはいずれかを備えているのが望ましい。すなわち、薬理学的不活性、体液の不活化あるいは電界質損失、抗Ｔ細胞免疫毒素（非不活性化）との拮抗性、およびクリーム、ゲル、あるいは他の所望の局所用誘導システムヘの調剤のなじみやすさ。
【００５６】
　抗Ｔ細胞免疫毒素は、肺への局所的誘導のためにエアロゾルとして投与することができる。これは、水溶性エアロゾル、リポソーム調製物、あるいは免疫毒素を含んだ固形粒子を調製することで得られる。通常は、水溶性エアロゾルは、抗Ｔ細胞免疫毒素の水溶液あるいは懸濁液を、従来の薬学的に許容される担体と安定化剤と共に調剤することで作られる。担体と安定化剤は、特定の抗Ｔ細胞免疫毒素の要求によって変化するが、典型的には、非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎｓ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓあるいはポリエチレングリコール）；血清アルブミン、ソルビン酸エステル、オレイン酸、レシチンのような無害のタンパク質；グリシンなどのアミノ酸；および、緩衝液、塩類、糖類、あるいは糖アルコールなどが含まれる。製剤には、ムコ多糖類分解酵素剤ならびに気管支拡張剤が含まれる。製剤は滅菌している。一般にエアロゾルは、等張液から調製される。粒子は、標準的な肺の界面活性剤を任意に含む。
【００５７】
　エアロゾルは、水溶性あるいは非水溶性懸濁液（例えば、過フッ化炭化水素薬剤）中の粒子から形成される。かような粒子は、例えば、抗Ｔ細胞免疫毒素、またはその誘導体、またはリポソーマル、またはマイクロカプセル封入した抗丁細胞免疫毒素、またはその誘導体、の分子間凝集体を含む。エアロゾルは、肺の刺激物、例えば、急性気管支収縮、咳、肺浮腫、あるいは組織破壊を引き起こす物質、を含んではならない。しかしながら、非刺激性吸着促進剤は、本発明での使用において好適である。音波振動噴霧器は、抗Ｔ細胞免疫毒素またはその誘導体を剪断する状態下への暴露を最小限にし、抗Ｔ細胞免疫毒素の分解を可能にする。
【００５８】
　抗Ｔ細胞免疫毒素は、筋内、皮下、包膜内、あるいは腹膜内、あるいは管内空間、特に、関節内へ、例えば、約１μｇ／関節の体液ｃｃ／ｄａｙ以上の用量の関節内注射などの注射により、局所的よりもむしろ、全身的に投与される。用量は、使用する抗Ｔ細胞免疫毒素の特性、例えば、その活性おとび生物学的半減期、抗Ｔ細胞免疫毒素の製剤中の濃度、投与部位および速度、患者の容体、患者が患っている自己免疫疾患など、医師の裁量に関わるものにもよる。
【００５９】
　本発明の抗Ｔ細胞免疫毒素は、溶液にて投与される。溶液のｐＨは、ｐＨ５〜９．５、好ましくは、ｐＨ６．５〜７．５である。抗Ｔ細胞免疫毒素またはその誘導体は、燐酸、Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸、あるいはクエン酸などの薬学的に許容される緩衝液を含んだ溶液中に置く。緩衝液濃度は、１〜１００ｍＭの範囲とする。抗Ｔ細胞免疫毒素の溶液は、５０〜１５０ｍＭの濃度の塩化ナトリウム、塩化カリウムのような塩類も含む。アルブミン、グロブリン、ゼラチン、プロトアミンあるいはプロトアミンの塩類のような安定化剤の効果的な量も含ませることができ、また、抗Ｔ細胞免疫毒素を含んだ溶液、あるいは溶液から調製した組成物に添加することもできる。
【００６０】
　抗Ｔ細胞免疫毒素の全身的投与は、管内注入も可能であるが、一般には、筋内注射によって毎日行われる。抗Ｔ細胞免疫毒素は、ミクロスフェア、リポソーム、あるいは血液を含む特定の組織にある他の微粒子誘導システムを経由しても投与される。局所用調製物は、肌あるいは粘膜に直接、毎日、適用され、そして好ましくは遮蔽、すなわち、絆創膏、ポリオレフィンフィルム、または他の局所用調製物への浸透を阻害する被覆材によって保護される。
【００６１】
　下記の実施例は、本発明の実施を説明するものであり、発明を限定する旨のものではない。実施例１には、タイプＩＲＩＰゲロニンをコードするｃＤＮＡのクローニングを記載している。実施例２は、ゲロニン遺伝子を含む組み換え発現ベクターの構築を記載している。実施例３に記載したのは、ジスルフィド結合に利用できる単一システインを含むゲロニンの様々な類似体である。実施例４には、網状赤血球溶解分析における、タンパク合成の阻害能力に関する組み換えゲロニンおよびゲロニン類似体に関して行った試験について記載している。実施例５は、様々なゲロニン免疫接合体調製物の記載がなされている。実施例６は、全細胞殺傷検定における、細胞毒性剤として機能する能力に関する免疫接合体に関して行った試験について記載している。実施例７では、免疫接合体の溶解および安定特性に関して説明している。実施例８では、ゲロニン免疫接合体のｉｎｖｉｖｏ薬物動力学および免疫原性試験の結果に関して説明を行い、そして、実施例９では、ヒト末梢血リンパ球復元した厳正に組み合わせた免疫不全マウスモデルでのヒトＴ細胞を消耗する能力に関する免疫接合体の試験の結果に関して説明を行っている。実施例１０に記載したのは、ゲロニンＤＮＡ配列の様々な遺伝子融合と抗体断片をコードする配列である。遺伝子融合生成物の生成物の発現と、網状赤血球および全細胞殺傷検定における生成物の試験を、実施例１１に記した。実施例１２には、一本鎖抗体に対するゲロニン遺伝子融合体の構築に関して記載している。実施例１３には、タイプＩＲＩＰｓをコードするｃＤＮＡのクローニング、ＢＲＩＰ遺伝子を含む発現ベクターの構築、ジスルフィド結合を利用できる単一システインを有するＢＲＩＰ類似体の生成、網状赤血球分析における類似体の試験、およびＢＲＩＰの構築ならびに全細胞殺傷検定におけるその活性の試験に関して記載している。実施例１４には、モモルディンＩＩをコードするｃＤＮＡおよびモモルディンＩＩ遺伝子を含む発現ベクターの構築に関して記載している。
【実施例１】
【００６２】
　本発明によるゲロニン遺伝子のクローニングは、比較的稀な天然採取源であるＧ．ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍの種から、ＲＩＰ遺伝子生成物の精製を不要にすると共に、先行する化学的誘導ならびにゲロニン遺伝子融合生成物の調製無しに、抗体に接合可能なゲロニン類似体の生成を許容する。遺伝子のクローニングにおける厄介な問題は、入手可能なＧｅｌｏｎｉｕｍ種子が古く、生存不能であり、種子からの無傷のメッセンジャーＲＮＡの調製ができないことにある。メッセンジャーＲＮＡから調製したｃＤＮＡからの遺伝子のクローニングは実行できず、よって、ｃＤＮＡを得るために、全ＲＮＡを使用した。全ＲＮＡは通常、約９５％のリボソームＲＮＡを含んでいるので、正常環境下にて、すなわち、ｍＲＮＡを使用する時に、ｃＤＮＡを作製するために全ＲＮＡを使用することは望ましくない。
【００６３】
　Ｇ．ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ種子からのＲＮＡの調製
　全ＲＮＡを、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９８９に記載された植物ＲＮＡの調製のための手順の変法によって、Ｇｅｌｏｎｉｕｍ種子（Ｄｒ．ＭｉｃｈａｅｌＲｏｓｅｎｂｌｕｍ，Ｍ．Ｄ．アンダーソン癌センター、ヒューストン、テキサス州）から調製した。要約すれば、４．０グラムの種子を、液体窒素で予冷した（−７０℃）モーターと乳棒で微粉末に粉砕した。この粉末に、２５ｍｌの粉砕用緩衝液（０．１８ＭＴｒｉｓ、０．０９Ｍ塩化リチウム、４．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ、ｐＨ８．２）を、ＴＬＥ（０．２Ｍ Ｔｒｉｓ、０．１Ｍ塩化リチウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２）で平衡化した８．５ｍｌのフェノールと共に加えた。混合物を、（＃５にセットした）ＰｏｌｙｔｒｏｎＰＴ−１０３５を用いて均質化した。８．５ｍｌのクロロホルムを加え、混合し、５０℃で、２０分間インキュベートした。混合物を、４℃に予冷したローターに置き、３Ｋで、２０分間遠心分離し、水層を新しい試験管に移した。８．５ｍｌのフェノールに続いて、８．５ｍｌのクロロホルムを加え、混合物を再度遠心分離した。この抽出を三度繰り返した。水層中のＲＮＡを、１／３容の８Ｍ塩化リチウムを加えて沈殿させ、４℃で、１６時間インキュベートした。次に、ＲＮＡを４℃で、２０分間遠心分離することでペレットにした。このペレットを、５ｍｌの２Ｍ塩化リチウムで洗浄し、再遠心し、そして２ｍｌの水中で再懸濁した。０．３Ｍまでの蟻酸ナトリウムおよび２容のエタノールの添加により、ＲＮＡを沈殿させた。ＲＮＡを−７０℃にて、７０％エタノール中にて保存した。
【００６４】
　ｃＤＮＡ調製
　ｃＤＮＡは、全Ｇｅｌｏｎｉｕｍ ＲＮＡから同様の二つの方法によって調製された。
【００６５】
　第一の方法は、ＬｉｂｒａｒｉａｎＩＩ ｃＤＮＡライブラリー構築システムキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて細菌発現プラスミドｐｃＤＮＡＩＩにてｃＤＮＡライブラリーを作製することを含んでいた。約５μｇの全ＲＮＡを、ランダムプライマーとオリゴ−ｄＴの１：１混合物で、第一鎖状ｃＤＮＡに変換した。ＤＮＡポリメラーゼＩによる第二鎖の合成は、システムの使用説明書に従って行った。二本鎖ｃＤＮＡを、ＢｓｔＸＩリンカーに連結して、特定の大きさに断片化した。約５００ｂｐ以上の大きさの断片を、キットに備え付けられていた発現ベクターに連結した。各ベクターを、非常に効果的な反応能を有する細胞への形質転換あるいは電気的反応能を有する細胞への電気泳動のいずれかにより、Ｅ．ｃｏｌｉに導入された。電気泳動は、Ｄｏｗｅｒｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７−６１４５（１９８８）の方法に基づいてＢＴＸ社が勧めるようにして、０．５６μフラットパック細胞中のＢＴＸ１００ユニット（ＢＴＸ社、サンジエゴ、カリフォルニア州）で、８５０Ｖの電圧ならびに５ｎＳのパルス長にて行った。得られたライブラリーは、約１５０，０００コ口ニーから構成されていた。
【００６６】
　第二の方法は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ社が販売しているＲＮＡ−ＰＣＲキットを用いてｃＤＮＡを生成することを含んでいる。
【００６７】
　ゲロニンタンパク質配列の決定
　天然ゲロニンタンパク質の部分的配列を、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓｍｏｄｅｌ４７０Ａタンパク質配列分析器を用いて、製造業者によって勧められるようにして、自動化Ｅｄｍａｎ分解による、直接アミノ酸配列分析により決定した。（全ＲＮＡと同じ種子のバッチから単離した）ゲロニンのタンパク質分解ペプチド断片を、配列決定した。
【００６８】
　ゲロニン遺伝子のクローニング
　三つの重複するゲロニンｃＤＮＡ断片をクローニングし、三つの断片から混成ゲロニン遺伝子を作製した。
【００６９】
　（１）ベクターｐＩＮＧ３８２３中のゲロニンの中間アミノ酸をコードする
断片のクローニング
　部分的ゲロニンアミノ酸配列に基づいた変性ＤＮＡプライマーを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓキットで生成したｃＤＮＡのセグメントを、ＰＣＲによる増幅のために用いた。プライマーの変性が最も小さい、ゲロニンアミノ酸配列の領域に基づいて、六つのプライマーがデザインされた。プライマーの適切な対が、ゲロニン遺伝子断片の増幅に関して試験された。予想していたＤＮＡサイズの生成物が、アガロースゲル上での臭化エチジウム染色したＤＮＡバンドとして同定された時に、ＤＮＡをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、そしてアガロースゲルから精製した。ｇｅｌｏ−７とｇｅｌｏ−５と称するプライマーから構成されるプライマー対のみが、予想された大きさの比較的純粋な生成物を生成していた。変性プライマーｇｅｉｏ−７とｇｅｌｏ−５の配列を、ＩＵＰＡＣヌクレオチド表記を用いて下記に示した。
【００７０】
　　Ｇｅｌｏ−７（配列番号：１４）
　　５’ＴＴＹＡＡＲＧＡＹＧＣＮＣＣＮＧＡＹＧＣＮＧＣＮＴＡＹＧＡＲＧＧ ３’
　　Ｇｅｌｏ−５（配列番号：１５）
　　３’ＴＴＹＴＴＹＡＴＲＡＴＲＣＡＮＴＧＮＣＧＮＣＡＮＣＴＲＧＴＹＣＡ５’　
　プライマーｇｅｌｏ−７は、ゲロニンのアミノ酸８７〜９７に対応し、一方、プライマーｇｅｌｏ−５は、アミノ酸２２６〜２３６に対応する。プライマーｇｅｌｏ−７とｇｅｌｏ−５で生成した、平滑末端化したＤＮＡ断片（ゲロニンのアミノ酸８７〜２３６に対応する）を、ｐＵＣ１８（ＢＲＬ社、ゲティズバーグ、メリーランド州）にクローニングした。挿入体のＤＮＡ配列を決定し、得られたＤＮＡ配列に基づいた推定アミノ酸配列は、実験的に決定したゲロニンアミノ酸配列と符合した。このゲロニンセグメントを含むクローンを、ｐＩＮＧ３７２６と命名した。
【００７１】
　クローンｐＩＮＧ３７２６の挿入体を ３２Ｐで標識し、１５０，０００個のゲロニンｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いた。ただ一つのクローンだけが、複製しておいたライブラリーとハイブリダイズした。このクローンをライブラリーから精製し、そのＤＮＡ配列を決定した。このクローンは、ゲロニン（残基２５〜２０９）のアミノ酸２７０個の内の１８５個をコードする断片を含んでおり、ｐＩＮＧ３８２３と命名した。
【００７２】
　（２）ゲロニンのＮ末端アミノ酸をコードする断片のクローニング
　ｐＩＮＧ３７２６中のゲロニン遺伝子セグメントに関して決定された配列に基づいて、正確なオリゴヌクレオチドプライマーを、５’ゲロニン遺伝子断片を増幅するための変性プライマーおよび３’ゲロニン遺伝子断片を増幅するための非特異性プライマーでの接合に用いるためのＰＣＲ増幅用プライマーとしてデザインした。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−ＣｅｔｕｓＲＮＡ−ＰＣＲキットを用いて生成したｃＤＮＡを増幅した。
【００７３】
　ゲロニン遺伝子の５’端を増幅するために、変性プライマーｇｅｌｏ−１と正確なプライマーｇｅｌｏ−１０を用いたＰＣＲ増幅を行った。プライマーの配列を以下に示した。
【００７４】
　　Ｇｅｌｏ−１（配列番号：１６）
　　５’ＧＧＮＹＴＮＧＡＹＡＣＮＧＴＮＷＳＮＴＴＹＷＳＮＡＣＮＡＡＲＧＧ ３’
　　Ｇｅｌｏ−１０（配列番号：１７）
　　３’ＴＧＴＣＴＧＡＡＣＣＣＧＴＡＡＣＴＴＧＧＴＡＡ ５’
　プライマーｇｅｌｏ−１は、ゲロニン遺伝子のアミノ酸１〜ｌｌに対応し、一方で、プライマーｇｅｌｏ−１０は、アミノ酸１２６〜１３３に対応する。反応による生成物は、反応生成物に特異性を付与するために、ｇｅｌｏ−１（配列番号：１６）とｇｅｌｏ−１１（ゲロニンのアミノ酸１１９〜１２５をコードする配列を含む正確なプライマー）で再増幅した。
【００７５】
　　Ｇｅｌｏ−１１（配列番号：１８）
　　３’ＣＡＣＴＣＴＴＣＣＧＴＡＴＡＴＣＴＣＴＣＴＧＴ ５’
　中間プローブによるハイブリダイゼーションが、所望の特異的なゲロニンＤＮＡ断片が増幅されていたことを確認した。この断片をｐＵＣ１８にクローニングし、生成したベクターをｐＩＮＧ３７２７と命名した。断片が配列決定され、プライマーｇｅｌｏ−１を根幹を成しているアミノ酸配列を生成する、変性プライマーｇｅｌｏ−１の一部に対応する断片（最初の２７個のヌクレオチド）の領域が翻訳されていないことが示された。これは予期していなかったことでなく、プライマーの変性によるものと考えられる。この断片は、正確なプライマーｇｅｌｏ−１１（配列番号：１８）とｇｅｌｏ−５’（ゲロニンの１６個のアミノ酸のコードに加え、ゲロニン遺伝子の５’端の上流にまで延びている）で、ゲロニンｃＤＮＡから再増幅された。プライマーｇｅｌｏ−５’の配列を、以下に示した。
【００７６】
　　Ｇｅｌｏ−５’（配列番号：１９）
　　５’ＴＣＡＡＣＣＣＧＧＧＣＴＡＧＡＴＡＣＣＧＴＧＴＣＡＴ
　　ＴＣＴＣＡＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＣＣＡＣＴＴＡＴＡＴＴＡ ３’
　得られたＤＮＡ断片は、ゲロニンの最初の１２５個のアミノ酸をコードする。配列の大半は天然ゲロニン遺伝子と同一であるが、ＤＮＡ断片の最初の３２個のヌクレオチドは相違していた。本出願において、Ｎ−末端断片を断片ＧＥＬ１−１２５と称する。
【００７７】
　（３）ゲロニンのＣ末端アミノ酸をコードする断片のクローニング
　ゲロニン遺伝子の３’端ならびに３’非翻訳配列を増幅するために、正確なプライマーｇｅｌｏ−９とＸＥ−ｄＴを用いたＰＣＲ増幅を行った。これらプライマーの各配列を、以下に示した。
【００７８】
　　Ｇｅｌｏ−９（配列番号：２０）
　　５’ＣＴＴＣＡＴＴＴＴＧＧＣＧＧＣＡＣＧＴＡＴＣＣ ３’
　　ＸＥ−ｄＴ（配列番号：２１）
　　３’ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧ
　　ＧＧＴＧＣＡＴＴＣＧＡＡＣＧＴＣＧＧＡＧＣＴＣ ５’　　　
　プライマーｇｅｌｏ−９は、ゲロニンのアミノ酸１０７〜１１３に対応する。プライマーＸＥ−ｄＴは、制限部位ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩを含む３’オリゴ−ｄＴ部分および５’部分から構成され、ｃＤＮＡを含むポリＡと相補する。反応生成物を、正確なプライマーｇｅｌｏ−８およびＸＥで再増幅した。プライマーｇｅｌｏ−８およびＸＥの配列を、以下に示した。
【００７９】
　　Ｇｅｌｏ−８（配列番号：２２）
　　５’ＣＴＣＧＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＡＧＡＡ３’
　　ＸＥ（配列番号：２３）
　　３’ＡＧＧＧＴＧＣＡＴＴＣＧＡＡＣＧＴＣＧＧＡＧＣＴＣ５’
　プライマーｇｅｌｏ−８は、ゲロニンのアミノ酸１１５〜１２０をコ一ドする配列から構成され、そして、プライマーＸＥは、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ制限部位を含むＸＥ−ｄＴプライマーの５’部分に対応する。内部プローブでのハイブリダイゼーションは、所望のゲロニン遺伝子断片が増幅されたことを確認した。この断片は、二つの異なる方法によってｐＵＣ１８ヘクローニングされた。すなわち、平滑末端化した断片としてｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位にクローニグする方法（得られたベクターを、ｐＩＮＧ３７２８と命名した）と、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてｐＵＣ１８にクローニングする方法（得られたベクターを、ｐＩＮＧ３７２９と命名した）である。双方のベクター挿入体を配列決定した。ｐＩＮＧ３７２８の挿入体は、ゲロニンのアミノ酸１１４〜２７０をコードし、一方で、ｐＩＮＧ３７２９の挿入体は、ゲロニンと一方の３’配列ののアミノ酸１８４〜２７０をコードする。
【００８０】
　（４）重複ゲロニンＤＮＡ断片の混成ゲロニン遺伝子への組み込み
　ゲロニン遺伝子のＣ末端の２／３を再構築するために、ベクターｐＩＮＧ３７２９をＳｓｐＩ（一つのＳｓｐＩ部位がベクター内にあり、二つ目がベクターヘの挿入体の終始コドンの約８０ｂｐ下流に位置している）で切断し、得られた自由端にＸｈｏＩリンカー（８ｂｐ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社）を連結した。そして、ＤＮＡをＸｈｏＩとＥｃｏＲＩで切断し、ゲロニンのアミノ酸１８５〜２７０をコードする３５０ｂｐ断片が生成し、単離された。この３５０ｂｐ断片は、ｐＩＮＧ３７３０と称する中間ベクター内にあるゲロニンのアミノ酸３７〜１８５をコードするｐＩＮＧ３８２３からのＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片の近傍に連結され、そして、ゲロニン遺伝子（アミノ酸３７〜２７０）の末端の８７％を再構築した。
【００８１】
　次に、断片ＧＥＬ１−１２５をＳｍａＩとＮｃｏＩで切断し、ｐＩＮＧ３７３０のＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ断片にてベクターｐＩＣ１００へ連結されたゲロニンのアミノ酸１〜３６をコードする断片が得られた。〔ｐＩＣ１００は、ｐｃｌＢリーダー配列の３７ｂｐ上流が欠如している以外は、Ｂｅｔｔｅｒｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１０４１−１０４３（１９８８）に記載されたｐＩＮＧ１５００と同一である。３７ｂｐは、ＳｐｈＩとＥｃｏＲＩによるｐＩＮＧ１５００の消化、Ｔ４ポリメラーゼによる処理、およびベクターの再結合により消失される。この操作で、ベクター中のＥｃｏＲＩ部位が再生され、他の不要な制限部位が消失する。〕連結する以前に、ｐＩＣ１００は、予めＳｓｔＩで消化され、Ｔ４ポリメラーゼで処理され、そしてＸｈｏＩで切断される。この連結で、プラスミドｐＩＮＧ３７３１（ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６８７２１）と称する全ゲロニン遺伝子を含む新しいベクターが生成した。ゲロニン遺伝子の全ＤＮＡ配列を、配列番号：１１に示した。
【実施例２】
【００８２】
　ゲロニン遺伝子を含む発現ベクターの構築
　最初のＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターは、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖａｒａｐｅｌＢリーダー配列、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｒｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ａｒａＢプロモーターに結合したゲロニン遺伝子を含むようにして構築された。ａｒａＢプロモーターを含む基本ベクターは、本明細書に参考として組み込んだ、共願に係る、１９９１年７月２日発行の米国特許Ｎｏ．５，０２８，５３０に記載されている。ａｒａＢプロモーターを含むベクターは、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断された。そして、二つのＤＮＡ断片は、プロモーターの下流側近傍に連繋して結合された。プロモーターに近接して結合された断片は、ＳｓｔＩ消化、Ｔ４ポリメラーゼ処理、Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａｐｅｌＢ遺伝子のリーダー配列を含むｐＩＣ１００ベクターのＥｃｏＲＩ消化によって誘導された１３１ｂｐ断片であった。翻訳したリーダー配列は、細胞質膜を通して各タンパク質の分泌のためのシグナルである。リーダー配列の下流に連結した断片は、全ゲロニン遺伝子を含むｐＩＮＧ３７３１からのＳｍａＩ−ＸｈｏＩ断片であった。このように、発現ベクターは、ｐｅｌＢリーダー配列およびａｒａＢプロモーターに結合したゲロニン遺伝子を含んでいる。このプラスミドを、ｐＩＮＧ３７３３と命名した。
【００８３】
　二つ目の発現ベクターは、ゲロニンの１９個のＣ末端アミノ酸をコードするゲロニン遺伝子配列を含まない以外は、最初のベクターと同一になるように構築した。ゲロニン遺伝子のｃＤＮＡ配列から、ゲロニンアミノ酸配列の決定のために生成したペプチド断片にて検出されなかった１９個のＣ末端セグメントを想到された。これら１９個のアミノ酸は、翻訳後の、すなわち、天然タンパク質には存在しない成熟毒素から開裂されたペプチドセグメントを意味する。同様のＣ末端アミノ酸セグメントが、植物毒素αトリコサンティンにおいて同定されている〔Ｃｈｏｗｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，８６７０−８６７４（１９９０）〕。それ故、Ｃ末端断片を含まない発現生成物は重要である。
【００８４】
　ゲロニンの１９個のＣ末端アミノ酸を有さないゲロニン発現ベクターの構築のために、遺伝子の３’端を増幅および改変するためにＰＣＲを用いた。ｐＩＮＧ３７２８を、プライマーｇｅｌｏ−１４およびｇｅｌｏ−９（配列番号：２０）を用いて増幅した。プライマーｇｅｌｏ−１４の配列を、以下に示した。
【００８５】
　　Ｇｅｌｏ−１４（配列番号：２４）
　　５’ＴＧＡＡＣＴＣＧＡＧＴＡＣＴＡ ＴＴＴＡＧＧＡＴＣＴＴＴＡＴＣＧＡＣＧＡ ３’　　　
　ゲロニンアミノ酸２４５〜２５６に対応すプライマーｇｅｌｏ−１４は、ゲロニンの末端の１９個のアミノ酸をコードする配列の手前の遺伝子の転写を停止するゲロニン遺伝子配列における（プライマー配列中に下線を付した）停止コドンを導入し、また、終始コドンの下流近傍にＸｈｏＩ部位も導入した。ＰＣＲ生成物を、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、そして、得られたゲロニンのアミノ酸１８５〜２５１をコードする２０８ｂｐ断片を、アガロースゲルから精製した。この断片を、プラスミドｐＩＮＧ３７３２を生成するために、ゲロニンのアミノ酸３７〜１８５をコードするｐＩＮＧ３８２３のＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片の近傍に結合した。改変した３’端を備えたゲロニン遺伝子を含む最終発現ベクター、ｐｌＮＧ３７３４を、ｐＩＮＧ３７３２からのゲロニンのアミノ酸３７〜２５１をコードするＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ断片を、ｐＩＮＧ３７３３へ置換した。
【００８６】
　天然ゲロニン５’端の同定
　成熟ゲロニン遺伝子の５’端をコードするｃＤＮＡクローンを同定するために、逆ＰＣＲを用いた。全Ｇ．ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍＲＮＡの５μｇを、プライマーとしてＧｅlｏ−１１（配列番号：１８）とＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＲＬ社、ゲティズバーグ、メリーランド州）を用いて、ｃＤＮＡに変換した。ゲロニンｃＤＮＡを、共有環状ＤＮＡを生成するために自己結合させ、結合したＤＮＡを、オリゴヌクレオチドＧｅｌｏ−９（配列番号：２０）およびＧｅｌｏ−１６を用いたＰＣＲで増幅した。プライマーＧｅｌｏ−１６の配列を、以下に示した。
【００８７】
　　Ｇｅｌｏ−１６（配列番号：２５）
　　５’ＧＴＡＡＧＣＡＧＣＡＴＣＴＧＧＡＧＣＡＴＣＴ ３’
　ＰＣＲ生成物はアガロースゲルにてサイズ画分化され、３００ｂｐより大きいＤＮＡｓを、ＳｍａＩ切断したｐＵＣ１８ヘクローニングした。いくつかのクローンを、下記に示す配列を有するプライマーＧｅｌｏ−１８で配列決定した。
【００８８】
　　Ｇｅｌｏ−１８（配列番号：２６）
　　５’ＣＡＴＴＣＡＡＧＡＡＡＴＴＣＡＣＧＴＡＧＧ ３’
　最も大きなゲロニン特異的挿入体を有する同定したクローンを、ｐＩＮＧ３８２６と命名した。ｐＩＮＧ３８２６のＤＮＡ配列は、ゲロニン発現プラスミドｐＩＮＧ３７３３およびｐＩＮＧ３７３４に存在する必要の無い天然の成熟ゲロニン遺伝子の最初の３２個のヌクレオチドを含んでいた。天然ゲロニン遺伝子の全ＤＮＡ配列を、配列番号：５７に示した。
【００８９】
　天然５’端を有するゲロニン遺伝子を含む発現ベクターの構築
　天然５’配列を有するゲロニン遺伝子を含んだ（上述した）発現ベクターｐＩＮＧ３７３３およびｐＩＮＧ３７３４の誘導体を、以下のようにして作製した。ゲロニンの５’端を、ＰＣＲプライマーＧｅｌｏ−１６（配列番号：２４）および、下記の配列を備えたＧｅｌｏ−１７により、ｐＩＮＧ３８２６から増幅した。
【００９０】
　　Ｇｅｌｏ−１７（配列番号：２７）
　　５’ＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＣＣＧＴＣＡＧＣＴＴＴＡＧ ３’
　２８５ｂｐのＰＣＲ生成物を、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、ＮｃｏＩで切断した。得られた１００ｂｐ５’端ＤＮＡ断片を、アガロースゲルより単離し、（ＳｓｔＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、およびＰｓｔｌで切断した）ｐＩＣ１００からの１２０ｂｐｐｅｌＢリーダー断片の近傍を、ＰｓｔＩおよびＮｃｏＩで消化したｐＩＮＧ３７３３あるいはｐＩＮＧ３７３４のいずれかに結合した。得られたプラスミドｐＩＮＧ３８２４およびｐＩＮＧ３８２５それぞれは、ｐｅｌＢリーダーに結合し、そして、ａｒａＢプロモーターの制御条件下にて、１９個のアミノカルボキシル伸長を除く全天然ゲロニン遺伝子を含んでいる。ｐｌＮＧ３７３４およびｐＩＮＧ３８２５双方において、１９個のアミノカルボキシル伸長を含まない遺伝子構築物は、本願にて「組み換えゲロニン」と称するタンパク質生成物をコードする。
【００９１】
　組み換えゲロニンの精製　
　組み換えゲロニンを、以下のようにして精製した。Ｅ．ｃｏｌｉ培養用肉汁を濃縮し、ＤＣ１０ユニット（Ａｍｉｃｏｎ社）のＳ１０Ｙ１０カートリッジを用いて、ｐＨ７．０にて、１０ｍＭ燐酸ナトリウムで緩衝液交換を行い、濃縮および緩衝液交換した物質を、ＣＭ５２カラム（１００ｇ、５×１０ｃｍ）に適用した。カラムを、１Ｌの出発緩衝液で洗浄し、出発緩衝液（全容７５０ｍｌ）での、０〜３００ｍＭ塩化ナトリウム勾配で溶出した。画分を含む純粋ゲロニンをプールし（１００〜２５０ｍＭ塩化ナトリウムからの溶出）、Ａｍｉｃｏｎ ＹＭ１０膜にて濃縮し、１０ｍＭ、ｐＨ７．０の燐酸ナトリウム緩衝液で平衡化し、−２０℃で凍結して保存した。さらなる精製工程を、ＢｌｕｅＴｏｙｏｐｅａｒｌクロマトグラフィーを用いて試みた。しかしながら、この手順は、物質の純度を向上させずに、出発部室の約５０％の損失をもたらした。
【実施例３】
【００９２】
　接合のために利用できるシステイン残基によるゲロニン遺伝子の組み立て
　ゲロニンパク質は、４４および５０位に、内因性ジスルフィド結合により結合された二つのシステイン残基を有している。このタンパク質は、抗体あるいは他のタンパク質への接合に直接利用できる遊離システイン残基を含んでいない。接合のために利用できる遊離システイン残基を含むゲロニンの類似体を、三つの異なる方法によって生成した。最初の方法において、ゲロニンの一次配列に沿った様々な残基をシステイン残基と置換し、奇数のシステイン残基を含んだ一連の類似体を生成した。他の方法では、二つの内因性システイン残基の一つを、アラニンと置換し、鎖間ジスルフィド結合が欠落し、単一の無対のシステインを含む分子を生成した。さらに他の方法は、双方の内因性システインがアラニンによって置換され、三番目の非システイン残基がシステインによって置換され、単一の無対のシステインを生成した。
【００９３】
　ゲロニンの１５個の類似体を構築した。ゲロニンのｌ０個の非システイン残基を、システイン残基との置換のための目標に据えた。ゲロニンのアミノ酸配列と、天然アミノ酸配列およびリシンＡ鎖（図１参照）の三次構造との比較は、これら位置が分子表面上にあり、接合のために利用できることを示唆している。１０個のゲロニン類似体のそれぞれは、下記残基の一つと置換されたシステインを含んでいる。すなわち、リシン１０　、アスパラギン６０　、イソロイシン１０３　、アスパラギン酸１４６　、アルギニン１８４　、セリン２３５　、アスパラギン２３９　、リシン２４４　、アスパラギン酸２４７　、およびリシン２４８　、そして、ＧｅｌＣ１０、Ｇｅ１Ｃ６０　、ＧｅｌＣ１０３　、ＧｅｌＣ１４６　、ＧｅｌＣ１８４　、ＧｅｌＣ２１５　、ＧｅｌＣ２３９　、ＧｅｌＣ２４４　、ＧｅｌＣ２４７　、ならびにＧｅ１Ｃ２４８　と称する各々の類似体である。
【００９４】
　内因性ジスルフィド結合に関与している天然ゲロニンシステインの一つが、非システイン残基で置換された、ゲロニンの二つの類似体を構築した。特に、５０位のシステインをアラニン残基で置換したものは、４４位でのジスルフィド結合のために利用できるシステインを含んだ（ＧｅｌＣ４４と称する）ゲロニン類似体を生成した。逆に言えば、４４位のシステインはアラニン残基と置換され、５０位でのジスルフィド結合のために利用できるシステインを有する（ＧｅｌＣ５０と称する）類似体を生成するのである。前述した１２個の類似体の結合は、成熟ゲロニンタンパク質の全長に達するのである。
【００９５】
　本来のゲロニンシステイン双方がアラニンと置換された他のゲロニンタンパク質（ＧｅｌＣ４４ＡＣ５０Ａ）を構築した。本来のシステイン双方の代わりに置換されたアラニン残基と、１０位での本来のリシンの代わりに置換されたシステイン残基（ＧｅｌＣ１０Ｃ４４ＡＣ５０Ａ）あるいは２４７位での本来のアスパラギンの代わりに置換されたシステイン残基（ＧｅｌＣ２４７Ｃ４４ＡＣ５０Ａ）のいずれかを有する、他の二つの類似体が構築された。
【００９６】
　組み換えゲロニンの変異体を、制限断片操作あるいは合成オリゴヌクレオチドを用いた重複伸長ＰＣＲによって構築した。ＰＣＲのために用いたプライマーの配列を、以下に示した。各突然変異誘発用のプライマー配列において、システインあるいはアラニン残基のいずれかに改変したアミノ酸に対応するヌクレオチドに下線を付した。
【００９７】
　　Ｇｅｌｏ−９（配列番号：２０）
　　Ｇｅｌｏ−１１（配列番号：１８）
　　Ｇｅｌｏ−１６（配列番号：２５）
　　Ｇｅｌｏ−１７（配列番号：２７）
　　Ｇｅｌｏ−１８（配列番号：２６）
　　Ｇｅｌｏ−１９（配列番号：６０）
　　５’ＣＡＧＣＣＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＴＴＧＣＴＧ ３’
　　ＧｅｌｏＣ−１（配列番号：２８）
　　５’ＴＣＧＡＴＴＧＣ ＧＡＴＣＣＴＡＡＡＴＡＧＴＡＣＴＣ ３’
　　ＧｅｌｏＣ−２（配列番号：２９）
　　５’ＴＴＡＡＧＧＡＴＣＧＣＡＡＴＣＧＡＣＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧ ３’
　　ＧｅｌｏＣ−３−２（配列番号：３０）
　　５’ＧＴＴＣＧＴＣＴＧＴ ＡＡＡＧＡＴＣＣＴＡＡＡＴＡＧＴＡＣＴＣＧＡ 
　　３’
　　ＧｅｌｏＣ−４（配列番号：３１）
　　５’ＧＧＡＴＣＴＴＴ ＡＣＡ ＧＡＣＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＴ３’
　　ＧｅｌｏＣ−５（配列番号：３２）
　　５’ＴＣＴＴＧＴＧＣＴＴＣＧＴＣＧＡＴＡＡＡＧＡＴＣＣ ３’
　　ＧｅｌｏＣ−６（配列番号：３３）
　　５’ＡＴＣＧＡＣＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＡＧＴＧＣＴＡＴＴＴＴ３’
　　ＧｅｌｏＣ−７（配列番号：３４）
　　５’ＧＴＡＡＡＡＣＣＡＴＧＣＡ ＴＡＧＣＡＣＴＣＴＴＧＡＡＧＴＴＣＧＴ 
　　３’
　　ＧｅｉｏＣ−１０（配列番号：３５）
　　５’ＡＧＴＧＣＴＡＴ ＧＣＡ ＴＧＧＴＴＴＴＡＣＴＴＧＡＴＣＡＡＣＴＧＣ
　　３’
　　ＧｅｌｏＣ−１３（配列番号：３６）
　　５’ＡＧＣＡＣＡ ＴＧＴＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＡＴＴＡＣＣＴＡ ３’
　　ＧｅｌｏＣ−１４（配列番号：３７）
　　５’ＴＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＡＣＡ ＴＧＴＧＣＴＡＡＡＧＣＴＣＡＣＧＧＴＧ
　　３’
　　ＧｅｌｏＣ−１５（配列番号：３８）
　　５’ＴＧＡＣ ＴＧＴ ＧＧＡＣＡＧＴＴＧＧＣＧＧＡＡＡＴＡ ３’
　　ＧｅｌｏＣ−１６（配列番号：３９）
　　５’ＧＣＣＡＡＣＴＧＴＣＣＡＣＡ ＧＴＣＡＴＴＴＧＡＡＡＧＣＧＣＴＡＣＣ
　　３’
　　ＧｅｌｏＣ−１７（配列番号：４０）
　　５’ＧＡＴＧＡＴＣＣＴＧＧＡＡＡＧＧＣＴ ＴＴＣＧＴＴＴＴＧＧＴＡＧＣＧ
　　ＣＴＴ ３’
　　ＧｅｌｏＣ−１８（配列番号：４１）
　　５’ＡＡＧＣ ＣＴＴＴＣＣＡＧＧＡＴＣＡＴＣ ＡＧＣ ＴＴＴＴＴＴＧＣＧＣ
　　ＡＧＣＡＡＴＧＧＧ ３’
　　ＧｅｌｏＣ−１９（配列番号：４２）
　　５’ＡＡＧＣＣＴＴＴＣＣＡＧＧＡＴＣＡＴＣＡＣＡＴ ３’
　　ＧｅｌｏＣ−２０（配列番号：６1）
　　５’ＣＡＣＡ ＴＧＴ ＡＡＡＡＣＡＡＧＡＣＴＴＣＡＴＴＴＴＧＧＣ ３’
　　ＧｅｌｏＣ−２１（配列番号：６２）
　　５’ＴＧＡＡＧＴＣＴＴＧＴＴＴＴ ＡＧＡ ＴＧＴＧＴＴＴＴＧＡＡＧＡＧＧＣ
　　ＣＴ ３’
　　ＧｅｌｏＣ−２２（配列番号：６３）
　　５’ＡＴＧＣＣＡＴＡ ＴＧＣ ＡＡＴＴＡＴＡＡＡＣＣＡＡＣＧＧＡＧＡ３’
　　ＧｅｌｏＣ−２３（配列番号：６４）
　　５’ＧＧＴＴＴＡＴＡＡＴＴＧＣＡＴＡＴＧＧＣＡＴＴＴＴＣＡＴＣＡＡＧＴＴ
　　ＴＣＴＴＧ ３’
　　ＧｅｌｏＣ−２４（配列番号：６５）
　　５’ＣＴＴＴＣＡＡＣＡＡ ＴＧＣ ＡＴＴＣＧＣＣＣＧＧＣＧＡＡＴＡＡＴＡＣ
　  ３’
　　ＧｅｌｏＣ−２５（配列番号：６６）
　　５’ＧＣＧＡＡＴ ＧＣＡ ＴＴＧＴＴＧＡＡＡＧＴＴＡＴＴＴＣＴＡＡＴＴＴＧ 
　　３’
　　ＧｅｌｏＣ−２６（配列番号：６７）
　　５’ＧＴＴＴ ＴＧＴ ＧＡＧＧＣＡＧＴＴＧＡＡＴＴＧＧＡＡＣ ３’
　　ＧｅｌｏＣ−２７（配列番号：６８）
　　５’ＴＴＣＡＡＣＴＧＣＣＴＣ ＡＣＡ ＡＡＡＣＡＴＴＣＣＡＴＴＴＧＣＡＣＣ
　　Ｔ ３’
　　ＧｅｌｏＣ−２８（配列番号：６９）
　　５’ＡＡＡＡ ＧＣＴ ＧＡＴＧＡＴＣＣＴＧＧＡＡＡＧＴＧ ３’
　　ＧｅｌｏＣ−２９（配列番号：７０）
　　５’ＴＣＣＡＧＧＡＴＣＡＴＣ ＡＧＣ ＴＴＴＴＴＴＧＣＧＧＡＧＣＡＡＴＧＧ
　　ＧＡ ３’
　　ａｒａ Ｂ２（配列番号：４３）
　　５’ＧＣＧＡＣＴＣＴＣＴＡＣＴＧＴＴＴＣ ３’
　　ＨＩＮＤＩＩＩ−２（配列番号：４４）
　　５’ＣＧＴＴＡＧＣＡＡＴＴＴＡＡＣＴＧＴＧＡＴ３’
　（１）特に、プライマーＨＩＮＤＩＩＩ−２（ｐＩＮＧ３７３４あるいはｐＩＮＧ３８２５のベクター部分に位置する）、ＧｅｌｏＣ−９およびＧｅｌｏＣ−８と連繋した突然変異誘発用プライマーＧｅｌｏＣ−３−２およびＧｅｌｏＣ−４を用いたＰＣＲによって、ゲロニンの２４７位のアミノ酸（リシンＡ鎖の２５９位のシステインに対応するアスパラギン酸）にシステインが導入された。鋳型ＤＮＡ（ｐＩＮＧ３７３４）を、ＧｅｌｏＣ−３−２およびＨＩＮＤＩＩＩ−２で増幅し、ＧｅｌｏＣ−４およびＧｅｌｏＣ−９で同時に反応させた。これら反応の生成物を混合し、外部プライマーＧｅｌｏ−８およびＨＩＮＤＩＩＩ−２で増幅した。反応生成物を、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断し、精製し、三片結合にてプラスミドｐＩＮＧ３８２５へ挿入した。ＧｅｌＣ２４７変異体のＤＮＡ配列が、検証された。ＧｅｌＣ２４７をコードする配列を含むプラスミドを、ｐＩＮＧ３７３７（ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６９００９）と命名した。
【００９８】
　（２−３）同様の方法で、プラスミドｐＩＮＧ３７４１中の類似体ＧｅｌＣ２４８を生成するために、突然変異誘発用ＧｅｌｏＣ−１およびＧｅｌｏＣ−２で、ゲロニンの２４８位のアミノ酸（リシン）の代わりにシステイン残基を導入し、そして、プラスミドｐＩＮＧ３７４４中の類似体ＧｅｌＣ２３９を生成するために、突然変異誘発用ＧｅｌｏＣ−９およびＧｅｌｏＣ−１０で、ゲロニンの２３９位のアミノ酸（リシン）の代わりにシステイン残基を導入した。　
【００９９】
　（４）さらに同様の方法で、ｐＩＮＧ３７３６と称するプラスミド中の類似体ＧｅｌＣ２４４生成するために、突然変異誘発用ＧｅｌｏＣ−５およびＧｅｌｏＣ−６で、ゲロニンの２４４位のアミノ酸（リシン）の代わりにシステイン残基を導入した。この変異体は、ｐＩＮＧ３８２５よりもむしろ、プラスミドｐＩＮＧ３７３４を鋳型ＤＮＡとして用いたＰＣＲによって調製された。それ故、それは、プラスミドｐＩＮＧ３７３７、ｐＩＮＧ３７４１、およびｐＩＮＧ３７４４と同様のＮ末端ゲロニンアミノ酸配列をコードするが、天然ゲロニン５’ヌクレオチドの代わりに、ＰＣＲプライマー誘導５’端の３２個のヌクレオチドを含む。
【０１００】
　（５）同様の方法によって、ゲロニンの１０位のアミノ酸（リシン）の代わりにシステイン残基を導入した。システインは、ａｒａＢ２（ベクタープライマー）およびＧｅｌｏＣ−１４でｐＩＮＧ３８２４を増幅することで、突然変異誘発用プライマーＧｅｌｏＣ−１３およびＧｅｌｏＣ−１４で、そして、ＧｅｌｏＣ−１３およびＧｅｌｏＣ−１１によって他の反応によって導入した。これら反応生成物を混合し、外部プライマーａｒａＢ２およびＧｅｌｏ−１１で増幅した。ＰＣＲ生成物をＰｓｔＩおよびＮｃｏＩで切断し、精製し、そして、ｐＩＮＧ３７４６（ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６９００８）と称するプラスミドにて類似体ＧｅｌＣ１０を生成するために、ｐＩＮＧ３８２５ヘクローニングのために戻した。
【０１０１】
　（６）ゲロニンの６０位のアスパラギンを、ＧｅｌＣ１０変異体に関する方法と同様にして、オリゴａｒａＢ２およびＧｅｌｏ−１１と連繋した二つの突然変異誘発用オリゴＧｅｌｏＣ−１５およびＧｅｌｏＣ−１６を用いてシステインと置換した。ＧｅｌＣ６０類似体をコードするプラスミドを、ｐｌＮＧ３７４９と命名した。
【０１０２】
　（７）プライマーａｒａ Ｂ２およびＨＩＮＤＩＩＩ−２と連繋した二つの突然変異誘発用プライマーＧｅｌｏＣ−２０およびＧｅｌｏＣ−２１を用いたＰＣＲによって１０３位のアミノ酸（イソロイシン）の位置にシステインを導入した。鋳型ＤＮＡ（ｐＩＮＧ３７３３）を、ＧｅｌｏＣ−２１およびａｒａＢ２で、そして、ＧｅｌｏＣ−２０およびＨＩＤＩＩＩ−２で別途増幅した。これら反応の生成物を混合し、外部プライマーａｒａＢ２およびＨＩＮＤＩＩＩ−２で増幅した。反応生成物を、ＮｃｏＩおよびＢｃＩＩで切断し、精製し、ＮｃｏＩおよびＢｃＩＩで消化したｐＩＮＧ３８２５へ挿入した。１０３位の残基にシステインを置くために用いたオリゴヌクレオチドも、クローニングした遺伝子にて実証されたＡｆｌＩＩＩ制限部位に導入した。ＧｅｌＣ１０３類似体を含むプラスミドを、ｐＩＮＧ３７６０と命名した。
【０１０３】
　（８）同様の方法によって、１４６位（アスパラギン酸）にシステインを導入した。鋳型ＤＮＡ（ｐＩＮＧ３７３３）を、突然変異誘発用ＧｅｌｏＣ−２２およびＧｅｌｏ−１４で、そして、突然変異誘発用ＧｅｌｏＣ−２３およびＧｅｌｏ−１９で別途増幅した。これら反応の生成物を混合し、突然変異誘発用プライマーＧｅｌｏＣ−２３およびＧｅｌｏ−１９で増幅した。反応生成物を、ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、そして、三片結合にてｐＩＮＧ３８２５へ挿入することができた。１４６位の残基にシステインを置くために用いたオリゴヌクレオチドも、クローニングした遺伝子にて実証されたＮｄｅＩ制限部位に導入した。
【０１０４】
　（９）ゲロニンの１８４位（アルギニン）にシステインを導入するために、鋳型ＤＮＡ（ｐＩＮＧ３７３３）を、突然変異誘発用ＧｅｌｏＣ−２５およびａｒａＢ−２で、そして、突然変異誘発用ＧｅｌｏＣ−２４およびＨｉｎｄＩＩＩ−２で別途増幅した。これら反応の生成物を混合し、ａｒａＢ２およびＧｅｌｏ−１４で増幅した。反応生成物を、ＮｃｏＩおよびＢｃｌＩで切断し、そして、ＮｃｏＩおよびＢｃｌＩで予め消化したｐＩＮＧ３８２５へ挿入した。１８４位の残基にシステインを置くために用いたオリゴヌクレオチドも、クローニングした遺伝子にて実証されたＮｓｌＩ制限部位に導入した。ＧｅｌＣ１84変異体をコードする配列を含むプラスミドを、ｐＩＮＧ３７６１と命名した。
【０１０５】
　（１０）同様の方法によって、２１５位（セリン）にシステインを導入した。鋳型ＤＮＡ（ｐＩＮＧ３７３３）を、突然変異誘発用ＧｅｌｏＣ−２７およびａｒａＢ２で、そして、突然変異誘発用ＧｅｌｏＣ−２６およびＨｉｎｄＩＩＩ−２で別途増幅した。これら反応の生成物を混合し、ａｒａＢ２およびＨｉｎｄＩＩＩ−２で増幅した。反応生成物を、ＥｃｏＲＩおよびＢｃｌＩで切断し、そして、三片結合にてｐＩＮＧ３８２５へ挿入することができた。　
【０１０６】
　（１１）遊離システイン残基を含まない他のゲロニン変異体を、自然に生成する二つのゲロニンシスティン残基の一つ、５０位のシスティンをアラニンと置換することにより生成した。プラスミドｐＩＮＧ３８２４を、プライマーＧｅｌｏＣ−１９およびａｒａＢ２で、そして、突然変異誘発用ＧｅｌｏＣ−１９およびａｒａ　Ｂ２で別途同時に増幅した。反応生成物を混合し、ａｒａ Ｂ２およびＧｅｌｏ−１１で増幅した。この生成物をＮｃｏＩおよびＢｇｌＩＩで切断し、ｐＩＮＧ３７４７（ＡＴＣＣ６９１０１）を生成するために、ｐＩＮＧ３８２５のベクター部分にクローニングするために戻した。４４位のアミノ酸位置にジスルフィド結合のために利用できるシステインを有していたので、この類似体をＧｅｌＣ４４と命名した。
【０１０７】
　（１２）４４位の天然システインをアラニンに改変したゲロニン変異体を、プライマーａｒａＢ２およびＨＩＮＤＩＩＩ−２と連繋した突然変異誘発用オリゴＧｅｌｏＣ−２８およびＧｅｌｏＣ−２９を用いてｐＩＮＧ３７３３によって増幅することで構築した。増幅したＤＮＡを、ＮｃｏＩおよびＢｇｌＩＩで切断し、ゲロニンベクターヘクローニングし、そして、ＩｐＩＮＧ３７５６を生成した。生成した変異体を、ＧｅｌＣ５０と命名した。
【０１０８】
　（１３）ゲロニンの４４位のシステインと５０位のシステイン双方がアラニンに改変されたゲロニン変異体を、プライマーａｒａＢ２およびＧｅｌｏ−１１と連繋した突然変異誘発用オリゴＧｅｌｏＣ−１７およびＧｅｌｏＣ−１８を用いてｐＩＮＧ３８２４の重複ＰＣＲによって構築した。天然ゲロニンタンパク質と同様、この類似体は、接合のために利用できるシステイン残基を有していなかった。生成した類似体を、ＧｅｌＣ４４ＡＣ５０Ａと命名した。
【０１０９】
　（１４）三箇所変異させたゲロニンＣ２４７Ｃ４４ＡＣ５０Ａを、プラスミドｐＩＮＧ３８２４、ｐＩＮＧ３７５０、およびｐＩＮＧ３７３７から構築した。この変異体は２４７位に導入されたシステインを有しており、４４位および５０位に自然に発生したシステイン残基の双方がアラニンと置換されており、そして、抗体へのジスルフィド結合が、ゲロニン類似体の単一システイン残基にのみ確保されるので好ましい。プラスミドｐＩＮＧ３８２４は、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで切断され、ベクター断片がアガロースゲルにて精製された。ｐＩＮＧ３７５０が、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで切断され、そして、ｐＩＮＧ３７３７が、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断された。ＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片は、４４位および５０位のアラニンをコードし、一方で、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片は、２４７位のシステインをコードする。これら断片の各々は精製され、そして、ＮｃｏＩ−ＸｈｏＩベクター断片に結合された。得られたプラスミドを、ｐＩＮＧ３７５２と名付けた。
【０１１０】
　（１５）三箇所変異させたゲロニンＣ１０Ｃ４４ＡＣ５０Ａも、先に構築したプラスミドからの構築物から構築した。この場合、ｐＩＮＧ３７４６が、ＰｓｔＩおよびＮｃｏＩで切断され、そして、ｐＩＮＧ３７５０が、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで切断された。挿入断片の各々を、アガロースゲル中の電気泳動で精製し、そして、ＰｓｔＩおよびＸｈｏＩ消化したベクター断片に、その断片を連結した。得られたベクターを、ｐＩＮＧ３７５３と命名した。
【０１１１】
　構築したゲロニン変異体の各々を、Ｅ．ｃｏｌｉ 株Ｅｌ０４に形質転換した。アラビノースで細菌培養を誘発次第、ゲロニンポリペプチドは、ゲロニン特異性抗体で培養上清において検出することができる。プラスミドｐＩＮＧ３７３４およびｐＩＮＧ３８２５からのゲロニンの発現レベルあるいはゲロニン変異体からのレベルには、顕著な相違は認められなかった。各タンパク質は、約1ｇ／1のレベルでＥ．ｃｏｌｉ にて生成された。
【実施例４】
【０１１２】
　ゲロニンおよび組み換えゲロニン類似体の、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのタンパク合成阻害能力を、Ｐｒｅｓｓｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，１４，３７−４１（１９８６）に記載された網状赤血球溶解物検定（ＲＬＡ）を用いて試験した。分析では、ウサギ赤血球細胞溶解物からの内因性グロブリンｍＲＮＡを用いた細胞を含まないシステムにて、タンパク合成の阻害を測定した。トリチウム化したロイシン（３Ｈ−Ｌｅｕ）の減少した取り込みが、毒素濃度の機能として測定された。標準毒素（ＲＴＡ３０と略称される、リシンＡ鎖の３０ｋＤ形態）、天然ゲロニン、組み換えゲロニン（ｒＧｅｌｏｎｉｎ）、およびゲロニン類似体の連続対数希釈、１μｇ／ｍｌ〜１ｐｇ／ｍｌの範囲にわたって試験された。氷上にて試料を三つずつ作成し、３７℃で、３０分間インキュベートし、そして、ＩｎｏｔｅｃＴｒａｃｅ９６カスケードイオン化計測器で計測を行った。非阻害試料との比較により、タンパク合成の５０％阻害（ＩＣＣ５０）に対応する毒素（ｐＭ）のピコモル単位の濃度を算出した。下記表２に示したように、組み換えゲロニンおよびその大半の類似体のＲＬＡにおける活性は、天然ゲロニンの活性に匹敵するものである。ある種の類似体（ＧｅｌＣ239のような）では、ＲＬＡ活性は減少していた。
【０１１３】
【表１】
2004141153.tif 000178
【実施例５】
【０１１４】
　ゲロニン免疫接合体の調製
　本発明のゲロニン類似体を、マウス（ＡＴＣＣ ＨＢ９２８６）、およびキメラＨ６５抗体、ヒトＴ細胞決定基ＣＤ５に特異的な反応性を有する（ＣＨ６５）および（ｃＦａｂ、ｃＦａｂ’およびｃＦ（ａ’ｂ）２断片を含む）ｃＨ６５抗体領域などに、多様に接合させた。Ｈ６５抗体は、前出の米国特許出願Ｎｏ．０７／３０６，４３３および前出の国際公開Ｎｏ．ＷＯ８９／０６９６８に記載された方法に従って調製および精製された。キメラＨ６５抗体は、Ｒｏｂｉｎｓｏｎｅｔ ａｌ，，Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，２，８４−９３（１９９１）に記載されたのと同様の方法に従って調製された。
Ｈ６５抗体への接合
　反応性メルカプト基を露出するために、ゲロニン類似体の非対システイン残基を、０．１〜２ｍＭＤＴＴを用いたインキュベーション（室温にて３０〜６０分間）により先ず還元し、そして、サイズ篩クロマトグラフィーによって脱塩した。
【０１１５】
　具体的には、ＧｅｌＣ２４８類似体（３．８ｍｇ／ｍｌ）を、０．１Ｍ燐酸ナトリウム、０．２５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５緩衝液中の２ｍＭＤＴＴで６０分間処理した。ＧｅｌＣ２４４変異体（７．６ｍｇ／ｍｌ）を、０．1Ｍ燐酸ナトリウム、０．２５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５緩衝液中の２ｍＭＤＴＴで３０分間処理した。ＧｅｌＣ２４７類似体（４ｍｇ／ｍｌ）を、０．１Ｍ燐酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５緩衝液中の２ｍＭＤＴＴで、０．５ｍＭＥＤＴＡと共に３０分間処理した。ＧｅｌＣ２３９変異体（３．２ｍｇ／ｍｌ）を、０．１Ｍ燐酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５緩衝液中の２ｍＭＤＴＴで、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡと共に３０分間処理した。ＧｅｌＣ４４類似体（４．２ｍｇ／ｍｌ）を、０．１Ｍ燐酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５緩衝液中の０．ｌｍＭＤＴＴで、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡと共に３０分間処理した。最後に、ＧｅｌＣ１０変異体（３．1ｍｇ／ｍｌ）を、０．１Ｍ燐酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５緩衝液中の１ｍＭＤＴＴで、１ｍＭ ＥＤＴＡと共に２０分間処理した。
【０１１６】
　遊離メルカプト基の存在は、ＤＴＮＢとの反応によって証明され、１．４±０．６５ＳＨ／分子の平均値が得られた。還元されなかった場合には、遊離チオールは検出されなかった。
【０１１７】
　Ｇｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１，３８１−３８６（１９９０）に記載されたようにして、反応性メルカプト基を、リシン部位に導入するために、Ｈ６５抗体およびキメラ抗体を、遮蔽リンカー５−メチル−２−イミノチオレン（Ｍ２ＩＴ）で化学的に修飾した。
【０１１８】
　具体的には、ＧｅｌＣ２８４およびＧｅｌＣ２４４による接合のために、４ｍｇ／ｍｌのマウスＨ６５抗体を、２５ｍＭＴＥＯＡ中の１８×Ｍ２ＩＴおよび２．５ｍＭ ＤＴＮＢ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８緩衝液にて、２３℃にて、１時間誘導させた。この反応により、ＤＴＮＢ分析によって決定された、抗体当たり１．９リンカーが得られた。ＧｅｌＣ２４７およびＧｅｌＣ２３９による接合のために、４．７ｍｇ／ｍｌのＨ６５抗体を、２５ｍＭＴＥＯＡ中の２０×Ｍ２ＩＴおよび２．５ｍＭ ＤＴＮＢ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８緩衝液にて、２３℃にて、５０分間誘導させた。この反応により、ＤＴＮＢ分析によって決定された、抗体当たり１．６リンカーが得られた。ＧｅｌＣ４４との反応前に、５．８ｍｇ／ｍｌのＨ６５抗体を、２５ｍＭＴＥＯＡ中の２０×Ｍ２ＩＴおよび２．５ｍＭ ＤＴＮＢ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８緩衝液にて、２３℃にて、３０分間誘導させた。この反応により、ＤＴＮＢ分析によって決定された、抗体当たり１．５リンカーが得られた。ＧｅｌＣ１０による接合のために、２．２ｍｇ／ｍｌのＨ６５抗体を、２５ｍＭＴＥＯＡ中の１０×Ｍ２ＩＴおよび２．５ｍＭＤＴＮＢ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８緩衝液にて、２３℃にて、１時間誘導させた。この反応により、ＤＴＮＢ分析によって決定された、抗体当たり１．４リンカーが得られた。
【０１１９】
　キメラＨ６５抗体を、マウスＨ６５抗体と同様の方法にて接合のために調製した。
【０１２０】
　免疫接合体の調製における組み換えゲロニンとの接合効率に関して、先ず、二つの方法が比較された。最初に、組み換えゲロニン中の天然ジスルフィド結合を、室温にて、３０分間かけて２ｍＭＤＴＴを添加することで還元した。還元したゲロニンを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＣＦ−０５ＬＳのカラムにてサイズ篩クロマトグラフィーにて再生し、そして、ＤＴＮＢ分析による遊離メルカプトの存在に関して検定した。１．４遊離ＳＨ基が検出された。そして、この還元したゲロニンを、Ｈ６５−（Ｍ２ＩＴ）−Ｓ−Ｓ−ＴＮＢ（１．８ＴＮＢ基／Ｈ６５）と反応させた。これら実験条件下にて、還元ゲロニンとチオール活性化したＨ６５抗体との間には接合はほとんど形成されなかった。
【０１２１】
　これに対して、組み換えゲロニンおよびＨ６５抗体が、まず、架橋剤Ｍ２ＩＴ（ゲロニン−（Ｍ２ＩＴ）−ＳＨおよびＨ６５−（Ｍ２ＩＴ）−Ｓ−Ｓ−ＴＮＢを生成する）で誘導し、そして、一緒に混合した場合には、Ｈ６５−（Ｍ２ＩＴ）−Ｓ−Ｓ−（Ｍ２ＩＴ）−ゲロニンが良好な収率（１．６の毒素／抗体比率）で調製される。この接合のための出発物質（ゲロニン−（Ｍ２ＩＴ）−ＳＨおよびＨ６５−（Ｍ２ＩＴ）−Ｓ−Ｓ−ＴＮＢ）は、それぞれ、１．２および1．４のリンカー／タンパク質比率を有する。マウスもしくはキメラＨ６５抗体への接合に先行して、同様の方法にて、天然ゲロニンを誘導した。
【０１２２】
　還元ゲロニン類似体を、接合を許容するためにＨ６５−（Ｍ２ＩＴ）−Ｓ−Ｓ−ＴＮＢと共に混合した。各類似体のための下記の接合反応を設定した。すなわち、（７．２ｍｌ中の）Ｈ６５−Ｍ２ＩＴ−ＴＮＢの２３ｍｇを、室温にて、２時間、そして、４℃にて、１８時間一晩、５倍モル過剰のＧｅｌＣ2４８（６ｍｌ中の２３ｍｇ）と混合し；（７．３ｍｌ中の）Ｈ６５−Ｍ２ＩＴ−ＴＮＢの２３ｍｇを、室温にて、３時間、そして、４℃にて、１８時間一晩、５倍モル過剰のＧｅｌＣ２４４（３ｍｌ中の２３ｍｇ）と混合し；（２．８ｍｌ中の）Ｈ６５−Ｍ２ＩＴ−ＴＮＢの９ｍｇを、室温にて、２時間、そして、４℃にて、５昼夜、５倍モル過剰のＧｅｌＣ２４7（２．２５ｍｌ中の９ｍｇ）と混合し；（２．８ｍｌ中の）Ｈ６５−Ｍ２１Ｔ−ＴＮＢの９ｍｇを、室温にて、２時間、そして、４℃にて、３日間、５倍モル過剰のＧｅｌＣ２３９（２．６ｍｌ中の９ｍｇ）と混合し；（１．９ｍｌ中の）Ｈ６５−Ｍ２ＩＴ−ＴＮＢの１２ｍｇを、室温にて、４．５時間、そして、４℃にて、一晩、５．６倍モル過剰のＧｅｌＣ４４（３．２ｍｌ中の１３．４４ｍｇ）と混合し；そして、Ｈ６５−Ｍ２ＩＴ−ＴＮＢの１１ｍｇを、室温にて、４時間、そして、４℃にて、一晩、５倍モル過剰のＧｅｌＣ１０（３．５ｍｌ中の１１ｍｇ）と混合した。
【０１２３】
　接合に続いて、抗体の非反応性Ｍ２ＩＴリンカーを、１５分間、室温にて、リンカーに対して１．１モルのシステアミンで冷却した。冷却した反応溶液は、ゲル濾過カラムに適用した〔ＧｅｌＣ２４８　、ＧｅｌＣ２４７　、ＧｅｌＣ２４４　、およびＧｅｌＣ２３９の場合には、ＳｅｏｐｈａｄｅｘＧ−１５０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を、ＧｅｌＣ４４およびＧｅｌＣ１０の場合には、ＡｃＡ−４４カラム（ＩＢＦ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃｓ社、フランス）を使用した〕。ゲル濾過カラムにて反応を進行させ、そして、１０ｍＭＴｒｉｓ、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７で溶出した。各カラムで得られた最初のピークを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７中のＢｌｕｅ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）樹脂（ＴｏｓｏＨａａｓ社、フィラデルフィア、ペンシルベニア州）に適用し、そして、生成物を１０ｍＭＴｒｉｓ、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５で溶出した。
【０１２４】
　最終接合生成物の試料を、５％非還元ＳＤＳ ＰＡＧＥに適用し、クーマシー染色し、そして、抗体当たりの毒素の数（Ｔ／Ａ比）を定量するために、島津社のレーザー濃度計で走査した。各類似体の接合体に関する最終生成物の収率は、以下の通りであった。Ｇｅｌｃ２４８、１７ｍｇでの１．６のＴ／Ａ比；Ｇｅｌｃ２４７、１．1ｍｇでの１のＴ／Ａ比； Ｇｅｌｃ２４４、４．５ｍｇでの１．４６のＴ／Ａ比；Ｇｅｌｃ２３９、２．９ｍｇでの２．４のＴ／Ａ比； Ｇｅｌｃ４４、７．３ｍｇでの１．２２のＴ／Ａ比；および Ｇｅｌｃ１０、６．２ｍｇでの１．３７のＴ／Ａ比。接合効率（すなわち、遊離抗体の免疫接合体への変換）は、ある類似体（ＧｅｌＣ１０、Ｇｅｌｃ４４、Ｇｅｌｃ２３９、Ｇｅｌｃ２４７、およびＧｅｌｃ２４８）では、その他の類似体（Ｇｅｌｃ２４４、〜１０％）より非常に（〜８０％）大きかった。
（２）抗体断片への接合
　類似体Ｇｅｌｃ２４７およびＧｅｌｃ４４を、様々なキメラ［ｃＦａｂ、ｃＦａｂ’およびｃＦ（ａｂ’）２］ならびに「ヒト型化」［ｈｅｌ　Ｆａｂ、ｈｅ２Ｆａｂ、ｈｅ３ Ｆａｂ、ｈｅｌ Ｆａｂ’およびｈｅｌ Ｆ（ａｂ’）２ ］抗体断片に接合した。キメラＨ６５抗体断片を、前出の米国特許出願Ｎｏ．０７／７１４，１７５および前出の国際公開Ｎｏ．Ｗｏ８９／００９９９に記載された方法に従って調製した。本明細書に参照として組み込んだ、１９９１年１２月１３日出願の、係属中で、共願に係る米国特許出願Ｎｏ．０７／８０８，４５４に記載された（ヒトに対して免疫原性の小さいＨ６５抗体を作成するための選択したマウスをコードするアミノ酸の置換を述べた）方法に従ってヒト型化したＨ６５ 抗体断片の可変領域をコードするＤＮＡ配列を、配列番号：７１（ｈｅ1およびｈｅ２のカッパ鎖）、配列番号：７２（ｈｅ1のガンマ鎖）、配列番号：７３（ｈｅ２ およびｈｅ３ のガンマ鎖）、および配列番号：７４（ｈｅ３のカッパ鎖）に示した。
【０１２５】
　キメラＨ６５ 抗体断片を、基本的に、Ｇｅｌｃ２４７およびＧｅｌｃ２４４へのヒト型化したＦａｂおよびＦａｂ’断片の接合に関して述べた下記手順に従って、Ｇｅｌｃ２４７類似体に接合した。
【０１２６】
　（ａ）ｈｅｌ Ｆａｂ−Ｇｅｌｃ２４７
　ｈｅｌ Ｆａｂを、２５ｍＭ ＴＥＯＡ緩衝液、２５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８にて透析し、Ｍ２ＩＴ架橋剤での誘導に先行して６．８ｍｇ／ｍｌにまで濃縮した。リンカー反応のために、２．５ｍＭＤＴＮＢの存在下にて、２０倍過剰モルのＭ２ＩＴを用いた。室温にて、３０分間、反応を進行せしめ、ＧＦ０５（ゲル濾過用樹脂）にて脱塩し、そして、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５にて平衡化した。ＤＴＮＢ分析に基づいて、Ｆａｂ当たり１．８のリンカー数が算出された。ｈｅｌＦａｂ−Ｍ２ＩＴ−ＴＮＢを、Ｇｅｌｃ２４７での接合に先行して、３．７ｍｇ／ｍｌにまで濃縮した。
【０１２７】
　１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．３Ｍ塩化ナトリウム中の１２．８ｍｇ／ｍｌのＧｅｌｃ２４７を、接合のための反応性メルカプト基を露出させるために、室温にて、２０分間、１ｍＭＤＴＴ、 ０．５ｍＭ ＥＤＴＡで処理し、ＧＦＯ５にて脱塩し、そして、０．1Ｍリン酸ナトリウム、０．２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５にて平衡化した。遊離チオール含量を、ＤＴＮＢ分析法を用いて、Ｇｅｌｃ２４７のモル当たりの遊離ＳＨが０．７４モルになるよう決定した。活性化抗体との接合に先行して、ゲロニンを、８．３ｍｇ／ｍｌにまで濃縮した。
【０１２８】
　Ｇｅｌｃ２４７に関する遊離チオールと誘導したｈｅｌＦａｂ−Ｍ２ＩＴ−ＴＮＢとの間の接合反応の条件は、以下の通りである。５倍過剰量のゲロニン類似体を、活性化ｈｅｌ Ｆａｂ−Ｍ２ＩＴ−ＴＮＢ（双方のタンパク質を、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５中にある）に添加し、そして、反応混合物を、室温にて、３．５時間、そして、４℃にて一晩インキュベートした。接合に続いて、未処理Ｍ２ＩＴリンカーを、室温にて、１５分間、１：１モル比のシステインとリンカーで冷却した。冷却した反応溶液を、１０ｍＭＴｒｉｓ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７で平衡化したゲル濾過カラム（Ｇ−７５）に適用した。このカラムで生じた最初のピークを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７で３０ｍＭ塩化ナトリムにまで希釈し、そして、ＢｌｕｅＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）に適用した。生成物を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ塩化ナトリム、ｐＨ７．５で溶出した。
（ｂ）ｈｅｌ Ｆａｂ’−Ｇｅｌｃ２４７
　同様に、Ｈ６５ ｈｅｌ Ｆａｂ’を、Ｍ２ＩＴ架橋剤での誘導に先行して、２５ｍＭＴＥＯＡ緩衝液、４００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８にて透析した。リンカー反応のために、２．５ｍＭ ＤＴＮＢの存在下にて、２０倍過剰モルのＭ２ＩＴを用いた。室温にて、１時間、反応を進行せしめ、ＧＦ０５（ゲル濾過用樹脂）にて脱塩し、そして、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５にて平衡化した。ＤＴＮＢ分析に基づいて、Ｆａｂ’当たり１．６のリンカー数が算出された。ｈｅｌＦａｂ’−Ｍ２ＩＴ−ＴＮＢを、Ｇｅｌｃ２４７での接合に先行して、３．７ｍｇ／ｍｌにまで濃縮した。
【０１２９】
　１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム中の７７ｍｇ／ｍｌのＧｅｌｃ２４７を、接合のための遊離チオールを露出させるために、室温にて、３０分間、１ｍＭＤＴＴ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡで処理し、ＧＦ０５にて脱塩し、そして、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５にて平衡化した。遊離チオール含量を、ＤＴＮＢ分析法を用いて、Ｇｅｌｃ２４７のモル当たりの遊離ＳＨが１．４８モルになるよう決定した。活性化ｈｅｌＦａｂ’−Ｍ２ＩＴ−ＴＮＢとの接合に先行して、Ｇｅｌｃ２４７を、１０ｍｇ／ｍｌにまで濃縮した。
【０１３０】
　Ｇｅｌｃ２４７に関する遊離チオールと誘導したｈｅｌＦａｂ’−Ｍ２ＩＴ−ＴＮＢとの間の反応の条件は、以下の通りである。５．７倍過剰量のゲロニンを、活性化ｈｅｌ Ｆａｂ’−Ｍ２ＩＴ−ＴＮＢに添加し、そして、最終塩濃度を０．２５Ｍに調整した。反応混合物を、室温にて、１．５時間、そして、４℃にて、一晩インキュベートした。接合に続いて、未処理Ｍ２ＩＴリンカーを、室温にて、１５分間、１：１モル比のシステインとリンカーで冷却した。冷却した反応溶液を、１０ｍＭＴｒｉｓ、２５０ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ７で平衡化したゲル濾過カラム（ＡｃＡ５４）に適用した。このカラムで生じた最初のピークを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７で２０ｍＭ塩化ナトリムにまで希釈し、そして、１０ｍＭＴｒｉｓ、２０ｍＭ塩化ナトリム、ｐＨ７で平衡化したＢｌｕｅ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）に適用した。次いで、カラムを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３０ｍＭ塩化ナトリム、ｐＨ７．５で洗浄した。生成物を、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１Ｍ塩化ナトリム、ｐＨ７．５で溶出した。
（ｃ）ｈｅ２ Ｆａｂ−Ｇｅｌｃ２４７
　ｈｅ２ Ｆａｂを、Ｍ２ＩＴ架橋剤での誘導に先行して、２５ｍＭＴＥＯＡ緩衝液、０．２５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８にて一晩透析した。リンカー反応のために、２．５ｍＭ ＤＴＮＢの存在下にて、２０倍過剰モルのＭ２ＩＴを用いた。室温にて、２０分間、反応を進行せしめ、ＧＦＯ５−ＬＳ（ゲル濾過）カラムにて脱塩し、そして、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％アジドナトリウムで平衡化した。誘導およびゲル濾過後のｈｅ２Ｆａｂ濃度は、５．２ｍｇ／ｍｌであった。
【０１３１】
　１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２中の８．３３ｍｇ／ｍｌのＧｅｌｃ４４を、接合のための遊離チオールを露出させるために、室温にて、３０分間、５ｍＭＤＴＴ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡで処理し、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．２Ｍ塩化ナトリウムにて平衡化したＧＦ０５−ＬＳ樹脂を、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡと０．０２％アジドナトリウム、ｐＨ７．５で脱塩した。遊離チオール含量を、ＤＴＮＢ分析法を用いて、Ｇｅｌｃ２４７のモル当たりの遊離ＳＨが０．８３モルになるよう決定した。活性化ｈｅ２Ｆａｂ との接合に先行して、ゲロニンを、１１．４ｇ／ｍｌにまで濃縮した。
【０１３２】
　Ｇｅｌｃ４４に関する遊離チオールと誘導したｈｅ２Ｆａｂ−Ｍ２ＩＴ−ＴＮＢとの間の反応の条件は、以下の通りである。３倍過剰量のゲロニン類似体を、活性化ｈｅ２ Ｆａｂ−Ｍ２ＩＴ−ＴＮＢ（双方のタンパク質を、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５中にあるが、ゲロニン溶液はさらに０．５ｍＭＥＤＴＡを含んでいた）に添加した。反応混合物を、当初の容量の半分にまで濃縮し、そして、室温にて、４時間、次いで、４℃にて、７２時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、接合効率を、ＳＤＳＰＡＧＥによる検定で、７０〜７５％と見積もった。
【０１３３】
　接合に続いて、過剰のＭ２ＩＴリンカーを、室温にて、１５分間、１：１モル比のシステインとリンカーで冷却した。冷却した反応溶液を、１０ｍＭＴｒｉｓ、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７で平衡化したゲル濾過カラム（Ｇ−７５）に適用した。このカラムで生じた最初のピークを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７で３０ｍＭ塩化ナトリムにまで希釈し、そして、ＢｌｕｅＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）カラムに適用した。生成物を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１Ｍ塩化ナトリム、ｐＨ７．５で溶出した。
（ｄ）ｈｅ３ Ｆａｂ−Ｇｅｌｃ４４
　同様に、ｈｅ３ Ｆａｂを、Ｍ２ＩＴ架橋剤での誘導に先行して、２５ｍＭＴＥＯＡ、０．２５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８にて一晩透析した。リンカー反応のために、２．５ｍＭＤＴＮＢの存在下にて、１０倍過剰モルのＭ２ＩＴを用いた。室温にて、４５分間、反応を進行せしめ、ＧＦ０５−ＬＳ（ゲル濾過）カラムにて脱塩し、そして、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．２Ｍ塩化ナトリウム中にて０．０２％アジドナトリウムで平衡化した。ＤＴＮＢ分析に基づいて、Ｆａｂ−Ｍ２ＩＴ−ＴＮＢ当たり１のリンカー数が算出された。誘導およびゲル濾過の後のｈｅ３Ｆａｂ濃度は、５．３ｍｇ／ｍｌにまで濃縮した。
【０１３４】
　０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５中の７．８ｍｇ／ｍｌのＧｅｌｃ４４を、接合のための遊離チオールを露出させるために、室温にて、３０分間、１．５ｍＭＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡで処理し、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．２Ｍ塩化ナトリウム、および０．０２％アジドナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化したＧＦ０５−ＬＳ樹脂にて脱塩した。遊離チオール含量を、ＤＴＮＢ分析法を用いて、Ｇｅｌｃ４４のモル当たりの遊離ＳＨが０．６６モルになるよう決定した。活性化ｈｅ３Ｆａｂとの接合に先行して、ゲロニンを、５．２ｍｇ／ｍｌにまで濃縮した。
【０１３５】
　Ｇｅｌｃ４４に関する遊離チオールと誘導したｈｅ３Ｆａｂ−Ｍ２ＩＴ−ＴＮＢとの間の接合反応の条件は、以下の通りである。５倍過剰量のゲロニン類似体を、活性化ｈｅ３　Ｆａｂ−Ｍ２ＩＴ−ＴＮＢ（双方のタンパク質は、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５中にある）に添加した。反応混合物を、室温にて、２時間、そして、４℃にて、７２時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、接合効率を、ＳＤＳＰＡＧＥによる検定で、７０〜７５％と見積もった。
【０１３６】
　接合に続いて、過剰のＭ２ＩＴリンカーを、室温にて、１５分間、１：１モル比のシステインとリンカーで冷却した。冷却した反応溶液を、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７で平衡化したＧａｍｍｍＢｉｎｄ Ｇ（Ｇｅｎｅｘ社、ゲテスバーグ、メリーランド州から入手した固定化タンパクＧ親和性樹脂）に適用した。これを、０．５Ｍ蟻酸ナトリウム、ｐＨ３で溶出し、Ｔｒｉｓで中和した。そして、これを１０ｍＭＴｒｉｓ、０．１５Ｍ塩化ナトリム、ｐＨ７にて一晩透析し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７で３０ｍＭ塩化ナトリムにまで希釈し、Ｂｌｕｅ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）カラムに適用した。生成物を、１０ｍＭＴｒｉｓ、１Ｍ塩化ナトリム、ｐＨ７．５で溶出した。
【実施例６】
【０１３７】
　全細胞殺傷検定
　ゲロニンおよびゲロニン類似体で調製した免疫接合体を、急性リンパ球白血病T細胞系（ＨＧＢ２細胞）およびヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）に対する細胞毒性に関して試験した。リシンＡ鎖とＨ６５抗体（Ｈ６５−ＲＴＡ）および抗体断片との免疫接合体も試験された。リシンＡ鎖（ＲＴＡ）ならびにＨ６５−ＲＴＡ免疫接合体を、前出の米国特許出願Ｎｏ．０７／３０６，４３３および前出の国際公開Ｎｏ．Ｗｏ８９／０６９８９に記載された方法に従って調製および精製した。
【０１３８】
　要約すれば、ＨＳＢ２細胞を免疫毒素と共にインキュベートし、免疫毒素の存在下でのタンパク質合成の阻害を、非処置対照細胞との比較にて測定した。標準Ｈ６５−ＲＴＡ（ＲＴＡに結合したＳＰＤＰで誘導したＨ６５）、Ｈ６５−ゲロニンならびにＨ６５−ｒゲロニン、Ｈ６５断片免疫接合体、およびゲロニン免疫接合体試料を、ロイシンを用いずに、２０００〜０．６３２ｎｇ／ｍｌの範囲の半減期濃度でのＲＰＭＩで希釈した。すべての希釈物を、１×１０５ＨＳＢ２細胞を含むマイクロ滴定用プレートに、それぞれ三つずつ加えた。ＨＳＢ２プレートを、３７℃にて、２０時間インキュベートし、そして、回収前に ３Ｈ−ロイシンを適用した。試料を、ＩｎｏｔｅｃＴｒａｃｅ ９６カスケードイオン化計測器で計測した。非処置試料との比較により、タンパク合成の５０％阻害（ＩＣ５０）に至る免疫毒素のピコモル濃度（ｐＭ）を算出した。異なる量の毒素あるいは毒素類似体を含む接合体を標準化するために、細胞毒素データを、各接合体調製物に固有の毒素／抗体比率を、接合体ＩＣ５０（ｐＭ）をかけることで、ピコモルの毒素（ｐＭＴ）濃度に変換した。
【０１３９】
　Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．ａｎｄ Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８６，５０６−５１３（１９９１）による記載と、ＰＢＭＣｓでの免疫接合体の合計で９０時間のインキュベーションを含めて、ＰＢＭＣ検定を行った。インキュベーションの最後の１６時間の間に３Ｈ−チミジンを添加し、添加が完了次第、ＤＮＡ合成の免疫接合誘導した阻害を定性検定した。ＨＳＢ２細胞およびＰＢＭＣ細胞に対して接合するＨ６５およびキメラＨ６５抗体の活性を、下記表２に示した。
【０１４０】
【表２】
2004141153.tif 000179
　ＨＳＢ２細胞に対して、多くのゲロニン類似体免疫接合体は、天然ゲロニンあるいは組み換え、非修飾ゲロニンで調製した接合体より、低いＩＣ５０値に加え、大きな細胞殺傷レベルにおいて、はるかに良好な成績を示している。ヒトＰＢＭＣｓに対して、ゲロニン類似体接合体は、少なくとも、天然および組み換えゲロニン接合体と同様の活性を示している。しかしながら、重要なことに、接合体のいくつか（例えば、ＧｅｌＣ１０、Ｇｅｌｃ４４およびＧｅｌｃ２４７）は、天然および組み換えゲロニン接合体と比較して、ＰＢＭＣｓに対して向上した値を示し、また、向上した細胞殺傷レベルも示した（データ示さず）。
【０１４１】
　ＨＳＢ２細胞およびＰＢＭＣ細胞に対するＨ６５抗体断片接合体の活性を、下記表３および４に示し、表４の殺傷の程度は、試験した内で最も高い免疫毒素濃度（１μｇ／ｍｌ）でのＨＳＢ２細胞における阻害されたタンパク合成の百分率で表している。
【０１４２】
【表３】
2004141153.tif 000180
【０１４３】
【表４】
2004141153.tif 000181
　ｃＦａｂ’−Ｇｅｌｃ２４７免疫接合体は、組み換えゲロニンあるいはＲＴＡ３０とのｃＦａｂ’接合体よりも、明らかに細胞毒性が大きい。
【実施例７】
【０１４４】
　溶解性
　組み換えゲロニンおよびゲロニン類似体は、天然ゲロニンおよびＲＴＡ３０双方との比較において、向上した溶解性を示した。加えて、組み換えゲロニンおよびゲロニン類似体免疫接合体は、天然ゲロニンおよびＲＴＡ３０で調製した免疫接合体と比較して、向上した溶解性を示した。この向上した溶解性は、キメラＦａｂ断片で調製した組み換えゲロニンおよび類似体において、特に顕著であった。
【０１４５】
　ジスルフィド結合安定性検定
　ＲＩＰを（抗体のような）目標分子に結合するジスルフィド結合の安定性が、免疫接合体のｉｎｖｉｖｏでの残存期間に影響を与えることは周知のことである〔Ｔｈｏｒｐ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４７，５９２４−５９３１（１９８７）を参照のこと〕。例えば、ジスルフィド結合が、ｉｎｖｉｔｒｏでの還元によって容易に壊される接合は、安定性が小さく、また、動物モデルでの効果も小さくなる〔Ｔｈｏｒｐ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４８，６３９６−６４０３（１９８８）を参照のこと〕。
【０１４６】
　それ故、天然ゲロニン、組み換えゲロニン、およびゲロニン類似体で調製した免疫接合体は、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋｅｔ ａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５０，７５１９−７５２６（１９９０）に記載されたのと同様のｉｎ ｖｉｔｒｏでのジスルフィド結合安定性検定に供した。接合体を、高い濃度のグルタチオンにて、３７℃にて、１時間インキュベートし、ヨードアセトアミドとの反応を終えてから、放出されたＲＩＰの量を、ＴｏｓｏＨａａｓＴＳＫ−Ｇ２０００ＳＷカラムでのサイズ篩ＨＰＬＣによって定量した。
【０１４７】
　高濃度の２−メルカプタノール（１００％放出を決定するめの）によって、放出したＲＩＰの量を比較することで、ＲＩＰの５０％放出のために求められるグルタチオンの濃度（ＲＣ５０）を算出した。Ｈ６５抗体接合体の検定結果を、下記表５に示した。
【０１４８】
【表５】
2004141153.tif 000182
　前記した結果は、異なるゲロニンタンパク質とＨ６５抗体の間の結合の安定性が、多様に変化していることを示している。Ｇｅｌｃ１０とＧｅｌｃ２３９の例外を除けば、ゲロニン類似体の大半が、このｉｎｖｉｔｒｏ分析において、その結合により生じた接合体が、二重リンカー化学接合よりもやや劣る安定性を有している旨の結果に至った。しかしながら、Ｇｅｌｃ２３９類似体の安定性は、際立って向上している。
【０１４９】
　Ｈ６５抗体断片接合体に関する分析結果を、下記表６に示した。
【０１５０】
【表６】
2004141153.tif 000183
　表５および６に示したＲＣ５０の値から、各免疫毒素の特定のＲＩＰ類似体の要素が、ｉｎｖｉｔｒｏにて、免疫毒素ジスルフィド結合の安定性に関与しているものと思われる。
【実施例８】
【０１５１】
　Ｈ６５抗体に対する接合体の薬物動力学
　全Ｈ６５抗体に結合したゲロニン類似体の薬物動力学を、ラットを用いて研究した。１２５Ｉ−標識した免疫接合体Ｈ６５−（Ｍ２ＩＴ）−Ｓ−Ｓ−Ｇｅｌｃ２４７、Ｈ６５−（Ｍ２ＩＴ）−Ｓ−Ｓ−Ｇｅｌｃ４４、あるいはＨ６５−（Ｍ２ＩＴ）−Ｓ−Ｓ−Ｇｅｌｃｌ０の０．1ｍｇ／ｋｇのＩＶ丸薬を、体重１３４〜１４８ｇのオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに投与した。３、１５、３０および４５分、そして、１．５、２、４、６、８、１８、２４、４８、７２および９６時間目にて、ラットから血清試料を採取した。各試料の放射能活性（ｃｐｍ／ｍｌ）を測定し、そして、全免疫接合体に関連する放射能活性の画分を決定するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。血清放射能活性に関連した免疫接合体を、コンピューター・プログラムＰＣＮＯＮＬＩＮ（ＳＣＩＳｏｆｔｗａｒｅ社、レキシントン、ケンタッキー州）を用いて解析した。下記表７には、免疫接合体の薬物動力学のパラメーターを列挙している。表において、各数値の標準誤差を示し、そして、変数の片側解析を示し、ＩＣとは（免疫接合体の一部であるゲロニン変異体に関する略語によって特定した）免疫接合体であり、ｎとは研究に用いた動物の数であり、Ｖｃとは分散の中間値であり、Ｃ１とは浄化値、ＭＲＴとは中間残存時間の総計であり、αとは免疫接合体のα半減期を、そして、βとは免疫接合体のβ半減期を示している。
【０１５２】
【表７】
2004141153.tif 000184
　Ｇｅｌｃ２４７免疫接合体が、２．３および２０時間のαおよびβ半減期をそれぞれ有しており、中間残存時間の総計が１７時間に及ぶことが判明した。血清試料に関するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでの放射能活性に関連した免疫接合体の取得が乏しかったので、７２および９６時間目での試料を、分析対照から除外した。
【０１５３】
　Ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究が、ＧｅｌＣ１０免疫接合体が大きなジスルフィド結合安定性を有していることを示唆していたので、そのｉｎｖｉｖｏでの半減期が、免疫接合体のｃｙｓ２４７形態に深く関与しているものと考えられる。Ｇｅｌｃ２４７接合体の２０時間に対して、免疫接合体のβ半減期は約３３時間であった。中間残存時間の総計も、Ｇｅｌｃ１０免疫接合体のそれとほぼ同様であった（Ｇｅｌｃ２４７接合体の４２時間に対して、４２時間）。加えて、Ｇｅｌｃ１０免疫接合体の浄化値も２．５ｍｌ／ｈｒ／ｋｇと、Ｇｅｌｃ２４７接合体のそれ（１１ｍｌ／ｈｒ／ｋｇ）よりも４倍程度小さかった。Ｉｎｖｉｔｒｏジスルフィド結合安定性のデータから読み取れるように、Ｇｅｌｃ４４免疫接合体の浄化値は、Ｇｅｌｃ１０およびＧｅｌｃ２４７接合体のそれの中間である。
【０１５４】
　これら研究に基づいて、Ｇｅｌｃ４４免疫接合体の特性が、Ｇｅｌｃ２４７免疫接合体よりもむしろ、Ｇｅｌｃ１０免疫接合体の特性に近似しているにもかかわらず、Ｈ６５抗体に接合したＧｅｌｃ１０類似体が（長い残存時間と浄化値によって決定したように）、Ｈ６５抗体に接合したＧｅｌｃ１０およびＧｅｌｃ２４７接合体よりも大きなｉｎｖｉｖｏでの安定性を有している。
【０１５５】
　Ｈ６５抗体断片に対する接合体の薬物動力学
　ヒト型化Ｈ６５Ｆａｂ断片に結合したゲロニンＧｅｌｃ２４７およびＧｅｌｃ４４類似体の薬物動力学も、ラットを用いて研究した。１２５Ｉ−標識したｈｅｌＨ６５−Ｆａｂ−Ｇｅｌｃ２４７、ｈｅ２ Ｈ６５−Ｆａｂ−Ｇｅｌｃ４４、あるいはｈｅ３Ｈ６５−Ｆａｂ−Ｇｅｌｃ４４の０．１ｍｇ／ｋｇのＩＶ丸薬を、体重１５０〜１８０ｇのオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに投与した。３、１５、２０、３０および４０分、そして１、１．５、３、６、８、１８、２４、３２、４８、および７２時間目にて、ラットから血清試料を採取し、そして、捕獲抗体としてのウサギ抗ゲロニン抗体と、二次抗体としてのビオチン標識したヤギ抗ヒトカッパＬ鎖抗体を用いたＥＬＩＳＡによって解析を行った。下記表８に、その結果を示した。表において、各数値の標準誤差を示し、ＩＣとは免疫接合体であり、ｎとは研究に用いた動物の数であり、Ｖｃとは分散の中間値であり、Ｖｓｓとは分散値の定常状態であり、Ｃｌとは浄化値、ＭＲＴとは中間残存時間の総計であり、αとは免疫接合体のα半減期を、そして、βとは免疫接合体のβ半減期を示している。
【０１５６】
【表８】
2004141153.tif 000185
　三つの免疫接合体を比較すると、ｈｅｌ Ｈ６５−Ｆａｂ−Ｇｅｌｃ２４７、ｈｅ２Ｈ６５−Ｆａｂ−Ｇｅｌｃ４４、あるいはｈｅ３ Ｈ６５−Ｆａｂ−Ｇｅｌｃ４４の薬物動力学は非常に近似しており、特に、ＥＬＩＳＡ分析曲線から得たパラメーターを比較した際に、αおよびβ半減期、中間残存時間および浄化値が非常に近接していた。このことは、Ｇｅｌｃ２４７免疫接合体の浄化値（１１ｍｌ／ｋｇ／ｈｒ）が、Ｇｅｌｃ４４免疫接合体（４ｍｌ／ｋｇ／ｈｒ）の三倍以上あったという、これら抗体免疫接合体対応物の結果とは対照的である。このことは、Ｆａｂ断片を結合するジスルフィド結合の開裂と、全抗体免疫接合体に関して、Ｆａｂ免疫接合体の血清浄化値にとってゲロニンが重要でないことを示唆している。
【０１５７】
　免疫接合体の免疫原性
　異系交配したＳｗｉｓｓ／Ｗｅｂｓｔｅｒマウスに、ＲＴＡ、ＲＴＡ３０および組み換えゲロニンで調製したマウスＨ６５抗体接合体（各注射にて０．２ｍｇ／ｋｇを）を再三注射した。第１日目および第２日目に各動物に注射を行い、そして、２８および２９日後に注射を繰り返すサイクルとした。動物に、かような注射のサイクルを５回行った。各一連の注射後の一週間および三週間後に、採血を行い、存在する抗−ＲＩＰ抗体の量をＥＬＩＳＡにより決定し、各サイクルでの各滴定量を表９に示した。ＲＴＡとＲＴＡ３０は、注射の一回目のサイクル後に直ちに始まる強力な応答を示し、そして、実験期間中にわたってその強力な応答が維持された。これに対して、注射を５サイクルを経た後でも、ゲロニン接合体に関する応答は検出されなかった。接合体を完全フロインドアジュバンドと共に混合し、そして、腹膜にてマウスに注射した場合、抗−ＲＴＡおよびＲＴＡ３０抗体は、数週間後には容易に検出された。これらデータは、抗ゲロニン抗体がもし生成されれば、ＥＬＩＳＡ分析によって検出されることを示し、そして、組み換えゲロニンが、ＲＴＡよりも、動物において免疫原性が小さいことを示唆するものである。
【０１５８】
【表９】
2004141153.tif 000186
【実施例９】
【０１５９】
　ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を再構成し、厳正に結合した免疫不全マウスモデルを、ゲロニン類似体Ｇｅｌｃ２４７およびＧｅｌｃ４４を含む様々な免疫接合体のｉｎｖｉｖｏでの効果を評価するために用いた。免疫接合体を、ＣＤ５抗原を発現するヒト血液細胞を消耗する能力に関して試験した。
【０１６０】
　ヒトＰＢＬドナーおよび細胞単離
　ヒト末梢血細胞を、リンパ球試料（ＨｅｍａＣａｒｅ社、シェルマンオークス、カリフォルニア州）あるいは健康なドナーから採取した静脈血液試料（ＳｔａｎｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ、パロアルト、カリフォルニア州）から取得した。血液細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（登録商標）；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ピスカータウェイ、ニュージャージー州）を用いてＰＢＬｓを豊富に含ませ、ＰＢＳで４回連続して洗浄した。残留赤血球を、二回目の洗浄において、ＢＢＣ溶解用緩衝液（１６μｌ塩化アンモニウム、１ｍＭ重炭酸カリウム、１２．５μｌ　ＥＤＴＡ）で溶解した。最終懸濁液での細胞生存度は、トリパンブルー染色による＞９５％と評価された。
【０１６１】
　動物およびヒトＰＢＬ転移
　ＣＢ．１７ ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ（ＳＣＩＤ）マウスを、Ｔａｃｏｎｉｃ社（ゲルマンタウン、ニューヨーク）から購入、あるいは、特定の病原が存在しない動物用施設における無菌状態下での採血（飼育用動物は、ＨａｎａＢｉｏｌｏｇｉｃｓ社、アラメダ、カリフォルニア州から入手した）によって取得した。動物を濾過装置を供えたカゴに入れ、予防用の抗生物質処置を施さなかった。動物に対するすべての操作を、層流フード中にて行った。
【０１６２】
　非処置ＳＣＩＤマウスを、マウスＩｇレベルの決定のために採血した。ヒトＰＢＬを注射したマウスを、ヒト1ｇおよびｓＩＬ−２Ｒの定量のために様々な間隔で採血を行った。採取した血液を、眼窩後片腔から凝血防止加工したチューブに送られた。血液試料を、３００×ｇにて、１０分間、遠心分離し、そして、血漿を回収し、−７０℃にて保存した。マウスとヒトＩｇを、標準的なサンドウィッチＥＬＩＳＡｓを用いて定量した。要約すれば、平底マイクロ滴定用プレート（ＭａｘｉＳｏｒｐＩｍｍｕｎｏ−Ｐａｔｅｓ、Ｎｕｎｃ社、ロスキルド、カリフォルニア州）を、重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６中のヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州）あるいは、ヤギ抗ヒトＩｇｓ（Ｔａｇｏ社、バーリンゲーム、カリフォルニア州）でコートし、４℃で、一晩インキュベートした。プレートを、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．５（ＴＢＳ）中の１％ＢＳＡで、室温にて、２時間ブロックし、そして、標準試薬あるいはＴＢＳ／１％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で連続的に希釈した試料で、３７℃で、１時間インキュベートした。使用した標準試薬は、モノクローナルマウスＩｇＧ２ａ（ＩＮＤ１抗メラノーマ；ゾーマ社、バークレイ、カリフォルニア州）およびポリクローナルヒトＩｇ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ社、セントルイス、ミズーリー州）であった。続いて、プレートを、ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、アルカリ性フォスファターゼ接合したヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭ、あるいはヤギ抗ヒトＩｇｓ（ＣａｌｔａｇＬａｂｏｒａｒｔｏｒｉｓ社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州）で、３７℃で、１時間インキュベートした。１０％ジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ９．８、中の1ｍｇ／ｍｌｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ社）でのインキュベートに続いて、４０５ｎｍでの吸収の測定により検出を行った。正常ＢＡＬＢ／ｃマウスからの血漿を、マウスＩｇＥＤＴＡでの正の対照として用いた。天然ＳＣＩＤマウスあるいは正常ＢＡＬＢ／ｃマウスからの血漿試料は、検出可能なレベルのヒトＩｇを有していなかった。ヒトｓＩＬ−２Ｒを、
ＥＬＩＳＡキット（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ Ｓ．Ａ．，マルセイユ、フランス）を、その使用説明書に従って使用して定量した。
【０１６３】
　低血漿レベル（＜１０μｇ／ｍｌ）のマウスＩｇを有する５〜７週齢のマウスを、２００ｍｇ／ｋｇのサイクロホスファミド（Ｓｉｇｍａ社）の腹膜注射によって前処置した。二日後、それらマウスに、０．８ｍｌのＰＢＳ中に懸濁させた２５〜４０×１０６の新たに単離したヒトＰＢＬを腹膜注射した。
【０１６４】
　免疫接合体処置
　ヒトＰＢＬ移植後、約２週間の時点でＳＣＩＤマウスの採血を行った。検出できない１０ｐＭ未満のヒトｓＩＬ−２Ｒあるいは低血漿レベルのマウスを研究対象から除外した。検出可能であるが、ヒトｓＩＬ−２Ｒのレベルが低いマウスの除外の基準は、各研究において経験的に決定されるものであるが、概ね２０ｐＭである。残ったマウスをグループ分けし、５日間連続して、毎日、静脈用薬剤（０．２ｍｇ／ｋｇ）としての担体あるいは免疫接合体を投与した。組織中のヒトＴ細胞および血漿中のヒトｓＩＬ−２Ｒの定量のために、処置を中止して１日後に、動物を屠殺した。
【０１６５】
　組織の回収およびＰＢＬ消耗の解析
　血液を眼窩後片腔から回収し、凝血防止加工したチューブに送った。頸部脱臼によりマウスを屠殺し、無菌的に脾臓を除去した。脾臓細胞の単一細胞懸濁液を、無菌顕微鏡用スライドの凍結した端の間で脾臓を押圧することによりＨＢＳＳ中に調製した。回収した細胞を、ＰＢＳで二度洗浄した。ＲＢＣ溶解用緩衝液を用いて、血液および脾臓細胞懸濁液から赤血球を除去した。次いで、計測のために、細胞をＰＢＳ中に再懸濁した。復元した細胞を、血球計算器を用いてＡｇ発現に関して検定を行った。
【０１６６】
　ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．１％アジドナトリウムの１００μｌ中の２０〜５０万個の細胞を、氷上にて、３０分間、様々なＦＩＴＣ−あるいはフィコエリトリン（ＰＥ）−接合した抗体（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、マウンティンビュー、カリフォルニア州）の飽和量を用いてインキュベートした。染色のために用いた抗体としては、ＨＬｅ−1−ＦＩＴＣ（ＩｇＧ抗ＣＤ４５）、Ｌｅｕ２−ＦＩＴＣ（ＩｇＧ１抗ＣＤ８）、Ｌｅｕ３−ＰＥ（ＩｇＧ１抗ＣＤ４）、およびＬｅｕＭ３−ＰＥ（ＩｇＧ２ａ 抗ＣＤ１４）がある。対数増幅器を用いたＦＡＣｓｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）にて試料を分析した。陽性細胞を定量するための領域を、天然ＳＣＩＤマウスから取得した細胞の染色に基づいて設定した。ＳＣＩＤ組織から復元したヒトＡｇ−陽性細胞の絶対数を、各組織試料から復元した細胞の総数に、陽性細胞の百分率を乗じることで決定された。血液中の白血球の総数を、１．４ｍｌ／マウスの血液体積理論値を用いて算出した。ＳＣＩＤマウス組織中のヒト細胞の正確な定量のための検出限界は、０．０５％であった。処置グループ間の統計学的比較を、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙＵ 試験を用いて行った。ｐ値が０．０５未満であれば、処置グループは緩衝液対照グループから有為の相違があるとした。その結果を、下記表１０に示し、その表において、＋は対照との間に有為の相違が認められたこと、−は有為の相違が認められなかったこと、そして、ＮＴは接合体が試験されなかったことを意味する。ＣＤ５Ｐｌｕｓ（ゾーマ社、バークレー、カリフォルニア州）は、化学的にＲＴＡに結合したマウスＨ６５抗体であり、また、正の対照でもある。ＯＸ１９Ｆａｂ−Ｇｅｌｃ２４７は、負の対照免疫接合体である。ＯＸ１９抗体（ＥＣＡＣＣＮｏ．８４１１２０１２）は、ヒトＣＤ５と交差反応しない、マウス抗ラットＣＤ５抗体である。
【０１６７】
【表１０】
2004141153.tif 000187
　すべてのゲロニン免疫接合体は、マウスモデルにおいて、ヒト細胞の消失能力があった。
【実施例１０】
【０１６８】
　それぞれが、末端を切除したＨ６５ Ｈ鎖遺伝子（Ｆｄ）あるいはＨ６５Ｌ鎖遺伝子（カッパ）に融合した天然配列ゲロニン遺伝子を含んでいる、９つの遺伝子構築物を作製した。Ｈ６５Ｆｄ配列は、マウスＨ６５ Ｌ鎖可変（Ｌ）、共有（Ｊ）ならびにヒトＩｇＧ１、定常（Ｃ）ドメイン１領域をコードするヌクレオチドから構成されている。Ｈ６５ＦｄのＶおよびＪ領域およびｐｅｌＢリーダーに結合したカッパ断片遺伝子のＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ ＮａｔｉｏｎａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ロスアラモス、ニューメキシコ州）から、受託Ｎｏ．Ｍ９０４６８およびＭ９０４６７それぞれから入手した。遺伝子融合体の４つが、Ｈ６５ Ｆｄ断片遺伝子の５’端に結合したゲロニン遺伝子を含み、そして、他のものは、Ｈ６５Ｆｄ断片遺伝子の３’端に結合したゲロニン遺伝子を含んでいた。ジスルフィド結合に関与する二つのシステイン残基を含み、プロテアーゼ感受性アミノ酸配列を含んだループを形成するＥ．ｃｏｌｉシガ様毒素（ＳＬＴ）（配列番号：５８）、あるいは、いくつかのカテプシン開裂部位を含んだウサギ筋肉アルドラーゼ（ＲＭＡ）（配列番号：５９）のペプチドセグメントを、コードするＤＮＡリンカーを、ゲロニン遺伝子および構築物申の抗体遺伝子の間に挿入した。あるいは、ゲロニン遺伝子とペプチドリンカーセグメントを含まないＨ６５Ｆａｂ断片遺伝子の間にて直接融合体を作製した。下記表１１には、各遺伝子融合体の名称と、遺伝子離合体が含む発現ベクターを示した。各プラスミドはまた、各特定の遺伝子融合体が共発現する（表１１にて括弧内に示した）Ｆａｂ断片遺伝子を含む。
【０１６９】
【表１１】
2004141153.tif 000188
　抗体遺伝子のカルボキシル末端でのゲロニンの融合
Ｆｄ：：ＳＬＴ：：ゲロニン（カッパ）
　２３個のアミノ酸ＳＬＴリンカー配列を有するＨ６５ Ｆｄ鎖の３’端へのゲロニン遺伝子融合体を、プラスミドｐＶＫ１、ｐＩＮＧ３７３１（ＡＴＣＣ６８７２１）、およびｐＩＮＧ４０００からの三片連結にて作製した。プラスミドｐＶＫ１は、ＳＬＴリンカー配列の枠内に結合したＦｄ遺伝子を含み、ｐＩＮＧ３７３１はゲロニン遺伝子を含み、そして、ｐＩＮＧ４０００はジシストロンメッセージとしてのａｒａＢプロモーターの制御下でｐｅｌＢリーダー配列にそれぞれ結合したＨ６５カッパおよびＦｄ遺伝子を含んでいる。
【０１７０】
　鎖内ジスルフィド結合を形成する二つのシステイン残基によって結合されたＳＬＴ遺伝子のプロテアーゼ感受性セグメントに、ヒトＩｇＧＦｄ１定常領域枠内の３’端を結合するように、プラスミドｐＶＫ１を設計した。ＳＬＴ遺伝子セグメント（クローニングを促進するために導入した三つのアミノ酸とシステイン残基によって結合したＳＬＴからの２０個のアミノ酸）を、二つのオリゴヌクレオチド、ＳＬＴリンカー１およびＳＬＴリンカー２から作製した。
【０１７１】
ＳＬＴリンカー１（配列番号：７５）
５’ＴＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＣＡＴＣＧＣＧＡＧＴＴＧＣＣＡＧＡＡＴＧＧＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＴＴＣＣＴＴＣＴＡＴＧＴＧＣＧＣＡＡＧＴＡＣＴＣ３’
ＳＬＴリンカー２（配列番号：７６）
５’ＴＣＧＡＧＡＧＴＡＣＴＴＧＣＧＣＡＣＡＴＡＧＡＡＧＧＡＡＡＣＴＣＡＴＣＡＧＡＴＧＣＣＡＴＴＣＴＧＧＣＡＡＣＴＣＧＣＧＡＴＧＣＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣＡＴＧＣＡ３’
　二つのオリゴヌクレオチドをアニールし、ＰｓｔＩおよびＸｈｏＩ粘着末端を含むベクターに結合し、ＰｓｔＩ部位を壊し、そして、ＸｈｏＩ部位を残した。ベクター、ｐＩＮＧ３１８５は、Ｆｄ遺伝子の３’端に加工したＰｓｔＩ部位を、また、Ｆｄ遺伝子の下流にＸｈｏＩ部位を有していた。この結合による生成物、ｐＶＫ１は、ＳＬＴリンカーセグメントと共に枠内に（ｐｅｌＢリーダーに融合した）Ｈ６５Ｆｄ遺伝子と、ＳＬＴリンカーの３’端に、ＦｓｐＩおよびＳｃａＩの二つの制限部位を含んでいた。
【０１７２】
　プラスミドｐＶＫ１をＳａuＩおよびＳｃａＩで消化し、Ｆｄ定常領域部分とＳＬＴ遺伝子全セグメントを含んだ２１７ｂｐの断片を、アガロースゲルでの電気泳動で精製した。ｐＩＮＧ３７３１を、ＳｍａＩおよびＸｈｏＩで消化し、７６０ｂｐのゲロニン遺伝子を同様に精製した。プラスミドｐＩＮＧ４０００をＳａｕＩおよびＸｈｏＩで消化し、全カッパ遺伝子とＦｄ遺伝子部分を含むベクターセグメントも精製した。これら三つのＤＮＡ断片の結合にて、Ｆｄ：：ＳＬＴ：：ゲロニン（カッパ）
遺伝子融合ベクターを含んだｐＩＮＧ４４０６が得られた。
カッパ：：ＳＬＴ：：ゲロニン（Ｆｄ）
　２５個のアミノ酸ＳＬＴリンカー配列（クローニングを促進するために導入した５つのアミノ酸とシステイン残基によって結合したＳＬＴからの２０個のアミノ酸）を有するＨ６５カッパ鎖の３’端へのゲロニン遺伝子融合体を、ｐＩＮＧ３７３１（ＡＴＣＣ６８７２１）、およびｐＩＮＧ３７１３中のＤＮＡセグメントから作製した。
【０１７３】
　プラスミドｐＩＮＧ３７３１は、Ｈ６５Ｆｄおよびカッパ遺伝子が、カッパ遺伝子の３’端にて枠内でクローニングしたＳＬＴリンカーセグメントを含んだジシストロン転写ユニットにて結合しているＦａｂ発現ベクターである。このプラスミドは、以下のようにして構築した。Ｈ６５Ｆｄおよびカッパ遺伝子を含んだ起源プラスミドにて、コードしたアミノ酸を改変せずに、特定部位の突然変異誘発によって、カッパ遺伝子の３’端にＥａｇＩ部位を置いた。ｐＶＫ１からのＳＬＴ遺伝子セグメントは、カッパ遺伝子の３’端でのＥａｇＩ部位への枠内結合のためのプライマーＳＬＴ−ＥａｇＩ５’およびＳａｌＩで増幅した。
【０１７４】
ＳＬＴ Ｅａｇ−５’（配列番号：７７）
５’ＴＧＴＴＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＣＡＴＣＧ ３’
ＳａｌＩ（配列番号：７８）
５’ＡＧＴＣＡＴＧＣＣＣＣＧＣＧＣ ３’
　１４０ｂｐのＰＣＲ生成物をＥａｇＩおよびＸｈｏＩで消化し、ＳＬＴ遺伝子セグメントを含んだ７５ｂｐの断片を、ｐＩＮＧ３７１３を生成するために、起源プラスミドでのＦｄおよびカッパ遺伝子近傍にてクローニングした。
【０１７５】
　ゲロニンヘの遺伝子融合体の構築のために、ｐＩＮＧ３７３１をＳｃａＩおよびＸｈｏＩで消化し、Ｆｄ遺伝子およびカッパ：：ＳＬＴ融合体を含んだベクター断片を精製した。ｐＩＮＧ３７３１を、ＳｍａＩおよびＸｈｏＩで消化し、ゲロニン遺伝子を含むＤＮＡ断片も精製した。これら二つの断片の結合による生成物、ｐＩＮＧ４４０７は、Ｆｄおよびカッパ：：ＳＬＴ：：ゲロニン遺伝子を含んでいる。
（３）Ｆｄ：：ＲＭＡ：：ゲロニン（カッパ）
　２１個のアミノ酸ＲＭＡリンカー配列（クローニングを促進するために導入した１つのアミノ酸を有するＲＭＡからの２０個のアミノ酸）を有するＨ６５Ｆｄ鎖の３’端へのゲロニン遺伝子融合体を、プラスミドｐＳＨ４、ｐＩＮＧ３７３１（ＡＴＣＣ６８７２１）、およびｐＩＮＧ４０００からの三片結合によって作製した。
【０１７６】
　プラスミドｐＳＨ４は、ＲＭＡリンカー配列に枠内にて結合したＦｄ遺伝子を有している。ＲＭＡ遺伝子セグメントを、以下のようにして、重複延伸ＰＣＲによって、Ｆｄの３’端に結合した。Ｆｄ遺伝子の３’端（定常領域）を、プライマーＫＢＡ−γ２およびＲＭＡＧ−１を有する起源プラスミドから、ＰＣＲによって増幅した。すべてのヒトＩｇＧ１抗体の定常領域は同一であるので、どのＦｄ定常領域でも使用できる。
【０１７７】
ＫＢＡ−γ２（配列番号：７９）
５’ＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴ ３’
ＲＭＡＧ−１（配列番号：８０）
５’ＴＣＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＡＧＡＴＧＧＴＧＴＧＴＧＡＧＴＴＴＴＧＴＣＡＣＡＡ３’
　この反応の生成物を、第一反応の増幅生成物にアニールするためのプライマーＲＭＡ−７６と共に混合し、混合物をＫＢＡ−γ２およびＲＭＡＨ−２で増幅した。
【０１７８】
ＲＭＡ−７６（配列番号：８１）
５’ＣＴＡＡＣＴＣＧＡＧＡＧＴＡＣＴＧＴＡＴＧＣＡＴＧＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡＡＣＡＡＡＧＡＴＴＣＴＧＡＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＡＧＡＴＧＧ３’
ＲＭＡＫ−２（配列番号：８２）
５’ＣＴＡＡＣＴＣＧＡＧＡＧＴＡＣＴＧＴＡＴ ３’
　このＰＣＲ生成物は、ＲＭＡ遺伝子セグメントに枠内にて結合したＦｄ定常領域の部分を含んでいた。この生成物は、ゲロニンのようなタンパク質への枠内での融合に有用なＳｃａＩ制限部位、および後続のクローニングに有用なＸｈｏＩ部位も含んでいた。このＰＣＲ生成物をＳａｕＩおよびＸｈｏＩで切断し、ｐＳＨ４を生成するために、Ｆｄの残りの部分の近傍に連結した。
【０１７９】
　Ｆｄ：：ＲＭＡ：：ゲロニン、カッパ遺伝子を含んだ遺伝子融合ベクターの作製のために、、ｐＳＨ４をＳａｕＩおよびＳｃａＩで切断し、Ｆｄ：：ＲＭＡセグメントを精製した。プラスミドｐＩＮＧ３７３１を、ＳｍａＩおよびＸｈｏＩで切断し、ゲロニン遺伝子を含む７６０ｂｐＤＮＡ断片を精製し、そして、ｐＩＮＧ４０００をＳａｕＩおよびＸｈｏＩで切断し、さらに、ベクターを精製した。これら断片の連結による生成物、ｐＩＮＧ４４０８は、Ｆｄ：：ＲＭＡ：：ゲロニンとカッパ遺伝子を含んでいた。
カッパ：：ＲＭＡ：：ゲロニン（Ｆｄ）
　２１個のアミノ酸ＲＭＡリンカー配列を有するＨ６５カッパ鎖の３’端へのゲロニン遺伝子融合体を、プラスミドｐＳＨ６、ｐＩＮＧ４４０８（先のパラグラフを参照）、およびｐＩＮＧ３７１３からの三片結合によって作製した。
【０１８０】
　プラスミドｐＳＨ６は、ＲＭＡリンカー配列に枠内にて結合したカッパ遺伝子を有している。ＲＭＡ遺伝子セグメントを、以下のようにして、重複延伸ＰＣＲによって、カッパの３’端に結合した。カッパ遺伝子の３’端（定常領域）を、プライマーＫＢＡ−Ｋ２およびＲＭＡＫ−１を有する起源プラスミドから、ＰＣＲによって増幅した。
ＲＭＡＫ−１（配列番号：８３）
５’ＴＣＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡ ３’
ＫＢＡ−Ｋ２（配列番号：８４）
５’ＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴ ３’
　この反応の生成物を、第一反応の増幅生成物にアニールするためのプライマーＲＭＡ−７６（配列番号：８１）と共に混合し、混合物をＫＢＡ−Ｋ２およびＲＭＡＫ−２（配列番号：８２）で増幅した。このＰＣＲ生成物は、ＲＭＡ遺伝子セグメントに枠内にて結合したカッパ定常領域の部分を含んでいた。この生成物は、ゲロニンのようなタンパク質への枠内での融合に有用なＳｃａＩ制限部位、および後続のクローニングに有用なＸｈｏＩ部位も含んでいた。このＰＣＲ生成物をＳａｔＩおよびＸｈｏＩで切断し、ｐＳＨ６を生成するために、カッパ遺伝子の残りの部分の近傍に連結した。
【０１８１】
　Ｆｄ：：ＲＭＡ：：ゲロニン、Ｆｄ遺伝子を含んだ遺伝子融合ベクターの作製のために、ｐＳＨ６をＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで切断し、カッパ定常領域とＲＭＡリンカーセグメント（ＰｓｔＩＲＭＡリンカーセグメントは、ＰｓｔＩ部位を含む）部分を含んだＤＮＡ断片を精製した。プラスミドｐＩＮＧ４４０８を、ＰｓｔＩおよびＳａｌＩで切断し、ＲＭＡリンカーのセグメント、ゲロニン遺伝子、およびベクターセグメント中のテトラサイクリン耐性遺伝子部分を含む断片を精製した。これら三つの断片の連結による生成物、ｐＩＮＧ４４１０は、カッパ：：ＲＭＡ：：ゲロニンとＦｄ遺伝子を含んでいた。
【０１８２】
　抗体遺伝子のアミノ末端におけるゲロニンの融合
　（１）ゲロニン：：ＳＬＴ：：Ｆｄ（カッパ）
　２５個のアミノ酸ＳＬＴリンカー配列（クローニングを促進するために導入した５つのアミノ酸とシステイン残基によって結合したＳＬＴからの２０個のアミノ酸）を有するＨ６５Ｆｄ鎖の５’端へのゲロニン遺伝子融合体を、プラスミドｐＩＮＧ３７４８、ｐＩＮＧ３２１７、およびｐＩＮＧ３２１７のＦｄ遺伝子の可変領域であるＨ６５γ可変領域（ＶＨ）遺伝子セグメントをコードするＰＣＲ断片からの三片連結にて作製した。プラスミドｐＩＮＧ３７４８は、ＳＬＴリンカー配列の枠内にて結合したゲロニン遺伝子を含み、ｐＩＮＧ３２１７はジシストロン転写ユニットのＨ６５Ｆｄおよびカッパ遺伝子を含んでいる。
【０１８３】
　プラスミドｐＩＮＧ３８２５（実施例２参照）を、ゲロニン遺伝子の３’端にＥａｇＩ部位をＰＣＲ変異法にて導入するために、ＰＣＲプライマーｇｅｌｏ３’−Ｅａｇおよびｇｅｌｏ−９を用いて増幅した。
【０１８４】
ｇｅｌｏ３’−Ｅａｇ（配列番号：８５）
５’ＣＡＴＧＣＧＧＣＣＧＡＴＴＴＡＧＧＡＴＣＴＴＴＡＴＣＧＡＣＧＡ３’
　このＰＣＲ生成物をＢｃｌＩおよびＥａｇＩで切断し、５６ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。プラスミドｐＩＮＧ３７１３をＥａｇＩおよびＸｈｏＩで切断し、ＳＬＴリンカーを含む７７ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。５６ｂｐのＢｃｌＩ−ＥａｇＩ断片および７７ｂｐのＥａｇＩ−ＸｈｏＩ断片を、ＳＬＴリンカー配列に枠内にて結合したゲロニン遺伝子を含むＰＩＮＧ３７４８を生成するために、ＢｃｌＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＩＮＧ３８２５に連結した。
【０１８５】
　ゲロニン：：ＳＬＴ：：Ｆｄおよびカッパ遺伝子を含んだ遺伝子融合ベクターの作製のために、Ｈ６５ＶＨ を、プライマーＨ６５−Ｇ１およびＨ６５−Ｇ２を用いてｐＩＮＧ３２１７からＰＣＲによって増幅し、そして、生成物を、Ｔ４ポリメラーゼ処理し、そしてＮｄｅＩで消化した。
【０１８６】
Ｈ６５−Ｇｌ（配列番号：８６）
５’ＡＡＣＡＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧ ３’
Ｈ６５−Ｇ２（配列番号：８７）
５’ＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴ ３’
　Ｈ６５Ｈ鎖Ｖ領域の５’−端を含んだ１７６ｂｐの断片を精製した。同時に、ｐＩＮＧ３２１７をＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化し、Ｆｄ遺伝子部分と全カッパ遺伝子を含んだ１３０７ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。ゲロニン：：ＳＬＴ：：Ｆｄおよびカッパ遺伝子を含む、三片結合にてｐＩＮＧ３７５４（ＡＴＣＣ６９１０２）を生成する、ＳｃａＩとＸｈｏＩで消化されたＰＩＮＧ３７８４にこの二つの断片を連結した。
【０１８７】
　（２）ゲロニン：：ＳＬＴ：：カッパ（Ｆｄ）
　２５個のアミノ酸ＳＬＴリンカー配列を有するＨ６５カッパ鎖の５’端へのゲロニン遺伝子融合体を、ｐＩＮＧ３７４８（前節を参照）、ｐＩＮＧ４０００、およびＨ６５カッパ可変領域（ＶＬ）遺伝子セグメントをコードするＰＣＲ断片からの三片連結にて作製した。ｐＩＮＧ３７１３中のＤＮＡセグメントから作製した。
【０１８８】
　ゲロニン：：ＳＬＴ：：カッパおよびＦｄ遺伝子を含んだ遺伝子融合ベクターの作製するために、Ｈ６５ＶＬ を、プライマーＨ６５−Ｋ１およびＪＫ１−ＨｉｎｄＩＩＩを用いてｐＩＮＧ３２１７からＰＣＲによって増幅し、そして、生成物を、Ｔ４ポリメラーゼ処理し、そしてＨｉｎｄＩＩＩで消化した。
【０１８９】
Ｈ６５−Ｇｌ（配列番号：８８）
５’ＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴ ３’
Ｈ６５−Ｇ２（配列番号：８９）
５’ＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＡＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣ ３’
　Ｌ鎖Ｖ領域を含んだ３０６ｂｐの断片を精製した。同時に、ｐＩＮＧ４０００をＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで消化し、カッパ定常領域と全Ｆｄ遺伝子を含んだ１１７９ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。ゲロニン：：ＳＬＴ：：カッパおよびＦｄ遺伝子を含む、三片結合にてｐＩＮＧ３７４８を生成する、ＳｃａＩとＸｈｏＩで消化されたＰＩＮＧ３７４８にこの二つの断片を連結した。
【０１９０】
　（３）ゲロニン：：ＲＭＡ：：Ｆｄ（カッパ）
　２４個のアミノ酸ＲＭＡリンカー配列（クローニングを促進するために導入した４つのアミノ酸とシステイン残基によって結合したＲＭＡからの２０個のアミノ酸）を有するＨ６５Ｆｄ鎖の５’端へのゲロニン遺伝子融合体を、ｐＩＮＧ３７５５、ｐＩＮＧ３２１７、およびＨ６５ ＶＨ 遺伝子セグメントをコードするＰＣＲ断片からの三片連結にて作製した。プラスミドｐＩＮＧ３７５５は、ＲＭＡリンカー配列に枠内にて結合したゲロニン遺伝子を含み、また、ｐＩＮＧ３２１７は、ジシストロン転写ユニットでのＨ６５Ｆｄおよびカッパ遺伝子を含んでいる。
【０１９１】
　プラスミドｐＩＮＧ３７５５を、ＲＭＡリンカー遺伝子セグメントに結合したゲロニン遺伝子を含むように作製した。ＲＭＡリンカー遺伝子セグメントを、プライマーＲＭＡ−ＥａｇＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ−２を用いてｐＳＨ４からＰＣＲによって増幅した。
【０１９２】
ＲＭＡ−ＥａｇＩ（配列番号：９０）
５’ＡＣＴＴＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧ ３’
ＨｉｎｄＩＩＩ−２（配列番号：９１）
５’ＣＧＴＴＡＧＣＡＡＴＴＴＡＡＣＴＧＴＧＡＴ ３’
　１９８ｂｐのＰＣＲ生成物を、ＥａｇＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、得られた１５３ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。ｐＩＮＧ３７４８からのＰｓｔＩ−ＥａｇＩ断片およびｐＩＮＧ３８２５からのＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩベクター断片を用いて、このＲＭＡ遺伝子セグメントを、ゲロニン近傍にクローニングした。この三片連結の生成物は、ｐＩＮＧ３２１７であった。
【０１９３】
　ゲロニン：：ＲＭＡ：：Ｆｄおよびカッパ遺伝子を含んだ遺伝子融合ベクターを作製するために、Ｈ６５ＶＨを、プライマーＨ６５−Ｇ１（配列番号：８６）およびＨ６５−Ｇ２（配列番号：８７）を用いてｐＩＮＧ３２１７からＰＣＲによって増幅し、そして、生成物を、Ｔ４ポリメラーゼ処理し、そしてＮｄｅＩで消化した。Ｈ鎖Ｖ領域の５’端を含んだ１８６ｂｐの断片を精製した。同時に、ｐＩＮＧ４０００をＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化し、Ｆｄ遺伝子と全カッパ定常領域を含んだ１３０７ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。ゲロニン：：ＲＭＡ：：Ｆｄおよびカッパ遺伝子を含む、三片結合にてｐＩＮＧ３７５９（ＡＴＣＣ６９１０４）を生成する、ＳｃａＩとＸｈｏＩで消化されたＰＩＮＧ３７５５にこの二つの断片を連結した。
【０１９４】
　（４）ゲロニン：：ＲＭＡ：：カッパ（Ｆｄ）
　２４個のアミノ酸ＲＭＡリンカー配列を有するＨ６５カッパ鎖の５’端へのゲロニン遺伝子融合体を、ｐＩＮＧ３７５５、ｐＩＮＧ４０００、およびＨ６５ＶＬ遺伝子セグメントをコードするＰＣＲ断片からの三片連結にて作製した。
【０１９５】
　ゲロニン：：ＲＭＡ：：カッパおよびＦｄ遺伝子を含んだ遺伝子融合ベクターを作製するために、Ｈ６５ＶＬセグメントを、プライマーＨ６５−１（配列番号：８８）およびＪＫ１−ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号：８９）を用いてｐＩＮＧ３２１７からＰＣＲによって増幅し、そして、生成物をＴ４ポリメラーゼ処理し、そしてＨｉｎｄＩＩＩで消化した。Ｌ鎖Ｖ領域の５’端を含んだ３０６ｂｐの断片を精製した。同時に、ｐＩＮＧ４０００をＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで消化し、カッパ定常領域と全Ｆｄ遺伝子を含んだ１１７９ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。ゲロニン：：ＲＭＡ：：カッパおよびＦｄ遺伝子を含む、三片結合にてｐＩＮＧ３７５８（ＡＴＣＣ６９１０３）を生成する、ＳｃａＩとＸｈｏＩで消化されたＰＩＮＧ３７５５にこの二つの断片を連結した。
【０１９６】
　（５）ゲロニン：：Ｆｄ（カッパ）
　ｐＩＮＧ３７５４から、ゲロニン遺伝子融合体を直接構築した。ｐＩＮＧ３７５４を、Ｂｇ１ＩとＸｈｏＩで消化し、ベクターセグメントを精製した。同時に、ｐＩＮＧ３７５４を、ＥａｇＩで消化し、Ｔ４ポリメラーゼ処理し、ＢｇｌＩで切断し、そして、ゲロニン遺伝子セグメントを精製した。ｐＩＮＧ３７５４はまた、ＦｓｐＩとＸｈｏＩで切断し、Ｆｄおよびカッパ遺伝子セグメントを精製した。カッパ遺伝子と関連するＦｄへのゲロニンの直接遺伝子融合体を含む、三片結合にてｐＩＮＧ３３３４を生成するために、これら断片を組み合わせた。
【実施例１１】
【０１９７】
　実施例１０に記載した構造を有する８つのゲロニン遺伝子融合体のそれぞれを、Ｈ６５　Ｆａｂ遺伝子との組み合わせにて、アラビノース誘導したＥ．ｃｏｌｉ株Ｅ１０４にて共発現した。
【０１９８】
　遺伝子融合体の発現生成物は、ＥＬＩＳＡによる誘導培養の上清から検出された。典型的には、プレートを抗体を認識するゲロニンで被覆した。培養上清を適用し、結合したＦａｂをセイヨウワサビペルオキシダーゼを結合したヒト・カッパを認識する抗体で検出された。ゲロニンに化学的に接合されたＨ６５　Ｆａｂ断片を、標準として用いた。他のＥＬＩＳＡ方法は、カッパあるいはＦｄのいずれかを認識する抗体によるプレートの被覆、あるいは同様の結果を招く抗ヒトカッパよりもむしろ、抗ヒトＦｄによる検出工程を含んでいる。ゲロニン、カッパおよびＦｄを含んだ適切に作製された融合タンパク質だけが、この方法によって検出される。非会合鎖は検出されなかった。
【０１９９】
　誘導した培養基から生成した融合タンパク質は、約２０〜２５ｎｇ／ｍｌの濃度にてＥ．ｃｏｌｉＥ１０４に蓄積された、発現ベクターｐＩＮＧ４４０６、４４０７、４４０８および４４１０を含んでいた。ｐＩＮＧ３７５４、３３３４、３７５８および３７５９（ｐＩＮＧ３７５７ではなく）の誘発次第に発現した融合タンパク質は、約１００〜５００ｎｇ／ｍｌという高いレベルで発現した。抗ヒトカッパあるいは抗ゲロニン抗体のいずれかを用いたウェスターンプロットの免疫染色によって、濃縮Ｅ．ｃｏｌｉ培養上清中にて、約７０，０００Ｋｄの融合タンパク質を検出した。
【０２００】
　ｐＩＮＧ３７５４（ＡＴＣＣ ６９１０２）からのゲロニン：：ＳＬＴ：：Ｆｄ（カッパ）融合タンパク質を、誘導した１０Ｌ醗酵培養基から精製した。１０Ｌの醗酵培養基は濃縮され、そして、Ｓ１０Ｙ１０カートリッジ（Ａｍｉｃｏｎ社）とＤＣ１０濃縮器を用いて１０ｍＭ燐酸緩衝液、ｐＨ７．０に緩衝液交換された。１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０で平衡化したＤＥ５２カラム（２０×５ｃｍ）に濃縮した上清を通すことで、上清を精製した。１０ｍＭ燐酸緩衝液中のＣＭ５２（５×１０ｃｍ）のカラムクロマトグラフィーによって、流出液をさらに精製および濃縮した。塩化ナトリウムの０〜０．２Ｍ直線勾配を、融合タンパク質を溶出するために用い、融合タンパク質を含んだ画分をプールし、それを、プロテインＧカラム（１ｍｌ）に適用した。融合タンパク質は、０．２ＭのグリシンでプロテインＧから溶出した。ＣＭ５２カラム工程を省略し、ＤＥ５２カラムを１００ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０で平衡化したこと以外は同様である方法によって、醗酵用培養基からゲロニン：：ＲＭＡ：：Ｆｄ（カッパ）およびゲロニン：：ＲＭＡ：：カッパ（Ｆｄ）融合タンパク質を精製した。融合タンパク質は、均質化するまでは精製されなかった。
【０２０１】
　三つの精製融合タンパク質のそれぞれを、ＲＬＡ分析にて活性を、そして、Ｔ細胞系ＨＳＢ２に対する細胞毒性に関して分析した。（Ｔ細胞は、Ｈ６５抗体によって認識されるＣＤ５抗原を発現する。）ＲＬＡ分析は実施例４に従って行い、その結果を、下記表１２に示した。
【０２０２】
【表１２】
2004141153.tif 000189
　実施例６に従って行った全細胞・細胞毒性分析にて、融合タンパク質は活性を呈し、そして、二つのＴ細胞、ＨＳＢ２およびＣＥＭを、それぞれ、Ｈ６５に化学的に結合したゲロニンよりも、２倍（ＨＳＢ２）あるいは１０倍（ＣＥＭ）も低いＩＣ５０にて死滅せしめた。各試料での融合タンパク質の量に比例して調製したＩＣ５０値を示した結果を、下記表１３に示した。
【０２０３】
【表１３】
2004141153.tif 000190
　融合タンパク質は、末梢血単各細胞に関しても同様の活性を示した（データ示さず）。
【実施例１２】
【０２０４】
　天然配列ゲロニン遺伝子も、ヒト型化ｈｅ３ Ｈ６５可変領域の一本鎖形態に融合した。ゲロニン遺伝子は、融合遺伝子のＮ末端に位置し、そして、ＳＬＴあるいはＲＭＡリンカーペプチドを、後続のゲロニンのサイトソル放出によって、融合タンパク質の細胞間処理できるように、ゲロニンと抗体領域との間に位置させた。
【０２０５】
　ｈｅ３　Ｈ６５可変領域の一本鎖抗体（ｓｃＡｂ）形態を、先に構築した遺伝子から作製した。この一本鎖抗体セグメントは、１５個のアミノ酸可撓性ペプチド［（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ］３を介して他方の鎖（ＨあるいはＬ）からのＶあるいはLの全セグメントに結合した一方の鎖（ＨあるいはＬ）のＶあるいはしの全領域から構成されている。このペプチドは、Ｈｕｓｔｏｎｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５８７９−５８８３（１９８８）；Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ ｅｔ ａ１．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９，１３６２−１３６７（１９９０）；およびＣｈｅａｄｌｅｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２９，２１−３０（１９９２）に記載されたものと同一である。この一本鎖抗体は、Ｖ−ＪＫａｐｐａ：：［（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ］３：：Ｖ−ＪＧａｍｍａ およびＶ−ＪＧａｍｍａ：：［（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ］３：：Ｖ−ＪＫａｐｐａ の二つの配向で作製した。各一本鎖抗体セグメントが作製され、そして、ゲロニンに融合された。
【０２０６】
　一本鎖抗体セグメントＶ−ＪＫａｐｐａ：：［（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ］３：：Ｖ−ＪＧａｍｍａの作製のために、１０ｍＭ塩化カリウム、２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．８、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、２ｍＭ硫酸マグネシウム、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００．，１００ｎｇ／ｍｌ ＢＳＡ、２００μＭの各ｄＮＴＰ、および２単位のＶｅｎｔポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、バークレイ、マサチューセッツ州）を含む全量１００μｌの反応液にて、ＰＣＲによって、ｐＩＮＧ４６２７から、ｈｅ３Ｖ／Ｊカッパ配列を含む３５２ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するために、プライマーＨＵＫ−７およびＳＣＦＶ−１を用いた。
【０２０７】
ＳＣＦＶ−１（配列番号：９４）
５’ＣＧＧＡＣＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＡＧＡＴＣＣＡＣＣＧＣ
ＣＡＣＣＴＴＴＣＡＴＣＴＣＡＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣ ３’
ＨＵＫ−７（配列番号：９５）
５’ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴ ３’
　同時に、ｐＩＮＧ４６２３からｈｅ３Ｈ鎖Ｖ／Ｊガンマセグメントを増幅するために、プライマーＳＣＦＶ−２およびＳＣＦＶ−３を用い、４００ｂｐの断片を生成した。
【０２０８】
ＳＣＦＶ−２（配列番号：９６）
５’ＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡ
ＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＴ ３’
ＳＣＦＶ−３（配列番号：９７）
５’ＴＧＴＡＣＴＣＧＡＧＣＣＣＡＴＣＡＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴ３’
　これら反応からの生成物を混合し、そして外部プライマーＨＵＨ−７とＳＣＦＶ−３を用いて増幅した。この反応の生成物を、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、そして、ＸｈｏＩで切断した。得られた７２８ｂｐの断片を、アガロースゲルでの電気泳動で精製した。この断片を、ＳｃａＩおよびＸｈｏＩで消化したベクターｐＩＮＧ３７５５およびｐＩＮＧ３７４８（実施例１０参照）に連結した。得られたベクターｐＩＮＧ４６３７およびｐＩＮＧ４４１２は、ゲロニン：：ＲＭＡ：：一本鎖抗体Ｖ−ＪＫａｐｐａ：：［（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ］３：：Ｖ−ＪＧａｍｍａ とゲロニン：：ＳＬＴ：：一本鎖抗体Ｖ−ＪＫａｐｐａ：：［（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ］３：：Ｖ−ＪＧａｍｍａ 、融合遺伝子のそれぞれを含んでいた。
【０２０９】
　同様に、ｈｅ３Ｖ／Ｊカッパ配列を含む３６７ｂｐ断片を生成する、一本鎖抗体Ｖ−Ｖ−ＪＧａｍｍａ：：［（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ］３：：Ｖ−ＪＫａｐｐａを、プライマーＳＣＦＶ−５およびＳＣＦＶ−６を用いてｐＩＮＧ４６２７の増幅により作製し、
ＳＣＦＶ−５（配列番号：９８）
５’ＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＴＣＴ ３’
ＳＣＦＶ−６（配列番号：９９）
５’ＴＧＴＡＣＴＣＧＡＧＣＣＣＡＴＣＡＴＴＴＣＡＴＣＴＣＡＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣ３’
　そして、ｈｅ３ガンマＶ／Ｊ配列を含む３８５ｂｐ断片を生成する、ｐＩＮＧ４６２３を、プライマーＨ６５−Ｇ３およびＳＣＦＶ−４を用いて、Ｖｅｎｔポリメラーゼを用いたＰＣＲにより作製した。
【０２１０】
Ｈ６５−Ｇ３（配列番号：１００）
５’ＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧ ３’
ＳＣＦＶ−４（配列番号：１０１）
５’ＣＧＧＡＣＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＡＧＡＴＣＣ
ＡＣＣＧＣＣＡＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴ３’
　これら反応からの生成物を混合し、そしてＨ６５−Ｇ３とＳＣＦＶ−６を用いて増幅した。７３７ｂｐの断片を、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、そして、ＸｈｏＩで切断した。（ＳｃａＩおよびＸｈｏＩで消化した）ｐＩＮＧ３７５５およびｐＩＮＧ３７４８（実施例１０参照）への連結により、ゲロニン：：ＲＭＡ：：一本鎖抗体Ｖ−ＪＧａｍｍａ：：［（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ］３：：Ｖ−ＪＫａｐｐａとゲロニン：：ＳＬＴ：：一本鎖抗体Ｖ−ＪＧａｍｍａ：：［（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ］３：：Ｖ−ＪＫａｐｐａ融合遺伝子のそれぞれが作製された。
【０２１１】
　開裂可能なリンカーを含まないゲロニン：：一本鎖抗体融合体が、制限酵素ＥａｇＩおよびＦｓｐＩを用いてｐＩＮＧ４４１２中のＳＬＴリンカーを削除することで構築された。これら部位での消化ならびにプラスミドの再連結は、ＳＬＴ配列の枠内削除をもたらした。
【実施例１３】
【０２１２】
　ＢＲＩＰは、免疫毒素の有力な候補に成りうる特性を保持している。ＢＲＩＰは、肝臓や健全な循環器系におけるｉｎｖｉｖｏでの残留時間を減縮するという天然非グリコシル化タンパク質である。加えて、ＢＲＩＰは、リシンのＡ鎖よりも、動物に対する毒性、ならびに免疫原性が小さい。Ｅ．ｃｏｌｉ発現系でのＢＲＩＰ遺伝子のクローニング及び組み換えＢＲＩＰの発現は、大麦から直接取り出した天然ＢＲＩＰの精製の必要性を解消し、抗体への接合のために利用できるシステイン残基と接合するＢＲＩＰの類似体の発生を可能ならしめる。
【０２１３】
　ＢＲＩＰの生成およびＢＲＩＰに対するポリクローナル抗体の生成
　天然ＢＲＩＰは、精白玉麦粉から精製した。４キログラムの小麦粉を、１６リットルの抽出緩衝液（１０ｍＭ燐酸ナトリウム、２５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）により、４℃で、２０時間かけて抽出した。沈殿物を遠心分離機により除去し、２００ｍｌの装填したＳ一セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ピスカタウェイ、ニュージャー’ジー州）を、ＢＲＩＰを吸収するために添加された。４℃で、２０時間撹拌したのち、樹脂を除去し、抽出用緩衝液で数回洗浄し、そして、２．６×４．０ｃｍのカラムに装填された。一旦装填すれば、カラムは、抽出用緩衝液（１５０ｍｌ／ｈ）で排出物の吸収度が零に接近するまで洗浄した。そして、ＢＲＩＰを、抽出用緩衝液中の０．０２５〜０．３Ｍの塩化ナトリウムの直線勾配で溶出され、５ｍｌの画分が回収された。ＢＲＩＰを含むピーク（カラム画分のウェスターン分析により同定された）をプールし、約２０ｍｌにまで濃縮したものを、１０ｍＭ燐酸ナトリウム、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４（１０ｍｌ／ｈｒ）で平衡化した２．６×１００ｃｍＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）カラムにてクロマトグラフィーに適用した。ＢＲＩＰを含むピークは再度プールされ、濃縮され、−７０℃で保存された。
【０２１４】
　得られた精製ＢＲＩＰタンパク質は、クーマシー染色タンパク質バンドの移動度、およびそれに続くＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果からして、約３０，０００ダルトンの分子量を有していた。アミノ酸組成は、Ａｓａｎｏｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，４９，６１９−６２６（１９８４）の記載と一致していた。
【０２１５】
　ポリクローナル抗血清を生成するために、ウサギを精製したＢＲＩＰで免疫処置した。
【０２１６】
　ＢＲＩＰ遺伝子のクローニング
　ファージλ発現ベクターλＺＡＰＩＩの発芽大麦種子から調製したｃＤＮＡ発現ライブラリーを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラヨラ、カリフォルニア州から購入した。およそ７００，０００ファージプラークが、抗ＢＲＩＰポリクローナル抗血清でスクリーニングされ、６個の免疫反応性プラークが同定された。ひとつのプラークが選択され、それを含有するｃＤＮＡがＥｃｐＲＩを用いてλＺＡＰＩＩから切り出し、ベクターｐＢＳ１を生成するｐＵＣ１８にサブクローニングした。ｃＤＮＡ挿入体は、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社、クリーブランド、オハイオ州）で配列決定された。天然ＢＲＩＰ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を、配列番号：１２に示した。ｃＤＮＡが天然のＢＲＩＰ遺伝子をコードすることを確認するために、ｃＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉプラスミドｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）中で発現させた。ＢＲＩＰタンパク質が、プラスミドで形質転換したＩＰＴＧ誘発細胞にて、前述のウサギ抗ＢＲＩＰ抗血清を用いたウェスターン分析によって検出された。
【０２１７】
　ＢＲＩＰ遺伝子を含むＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターの構築
　ＢＲＩＰ遺伝子を含む大麦ｃＤＮＡをｐｅｌＢリーダー配列に連結され、バクテリア分泌ベクター中にて、ａｒａＢプロモーターの制御下に置かれた。
【０２１８】
　ｐｅｌＢリーダー配列に連結したＢＲＩＰ遺伝子を含む中間ベクターが生成した。プラスミドｐＢＳ１をＮｃｏＩで切断し、マングビーンヌクリーゼ処理され、ＢａｍＨＩで切断され、ＢＲＩＰのアミノ酸１〜２５６に対応する７６０ｂｐ断片がアガローズゲルから精製された。同時に、唯一のＸｈｏＩ部位が、ｐＵＣ１８ベクタープライマー（ＮＥＢまたはＢＲＬによって販売されているＲｅｖｅｒｓｅ（登録商標）同一であるが、ＣｙｃｌｏｎｅＭｏｄｅｌ ８４００ＤＮＡ合成装置で合成した）および特異性プライマーＢＲＩＰ ３’Ｘｈｏを用いたＰＣＲ増幅により、ｐＢＳ１中のＢＲＩＰ遺伝子の３’端の下流に導入した。それぞれのプライマーの塩基配列を、以下に示した。
【０２１９】
Ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号：４５）
５’ＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ ３’
ＢＲＩＰ３’Ｘｈｏ（配列番号：４６）
５’ＴＧＡＡＣＴＣＧＡＧＧＡＡＡＣＴＡＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＡＣ３’
　プライマーＢＲＩＰ ３’Ｘｈｏは、ＢＲＩＰ遺伝子の最後の８ｂｐに対応する部分、ＢＲＩＰ遺伝子下流の終始コドン及びいくつかの塩基対、そして、ＰＣＲ断片をＸｈｏＩ部位に導入する他の部分を含む。ＰＣＲ反応生成物は、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化され、ＢＲＩＰ遺伝子の３’末端を含む８７ｂｐ断片が、５％アクリルアミド上で精製された。７６０および８７ｂｐの精製ＢＲＩＰ断片が、ｐｅｌＢリーダー配列近傍のｐＩＮＧ１５００ベクターに連結された。ｐＩＮＧ１５００は予めＳｓｔＩで切断され、Ｔ４ポリメラーゼで処理され、ＸｈｏＩで切断され、そして精製されていた。ｐｅｌＢリーダー連結点およびＢＲＩＰ遺伝子の５’末端のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ塩基配列解析によって確認した。このベクターを、ｐＩＮＧ３３２１−１と命名した。
【０２２０】
　誘発可能なａｒａＢプロモーターの制御下で、ＢＲＩＰ遺伝子を置くことで、最終発現ベクターを作製した。プラスミドｐＩＮＧ３３２１−１を、ＰｓｔＩおよびＸｈｏＩで切断し、ｐｅｌＢリーダーに連結したＢＲＩＰ遺伝子を、アガローズゲルから精製した。ａｒａＢプロモーターを含む発現ベクターｐＩＮＧ３２１７を、ＰｓｔＩおよびＸｈｏＩで切断し、ＢＲＩＰ遺伝子に連結した。この発現ベクターをｐＩＮＧ３３２２と命名した。
【０２２１】
　発酵装置内でのプラスミドｐＩＮＧ３３２２を含むＥ．ｃｏｌｉ細胞のアラビノース誘導は、１リットルあたり約１００ｍｇの組み換えＢＲＩＰの生成をもたらした。Ｅ．ｃｏｌｉが産生したＢＲＩＰは、大麦の種から直接精製されたＢＲＩＰと同等の特性を示した。
【０２２２】
　遊離システイン残基によるＢＲＩＰ類似体の構築
　ＢＲＩＰタンパク質はシステイン残基を含まないので、抗体やその他のタンパク質へのジスルフィルド結合を形成する、直接利用可能な残基が無いことになる。タンパク質のＣ末端近くの遊離システイン残基を含む組み換えＢＲＩＰの類似体を生成した。ＢＲＩＰタンパク質の三つのアミノ酸が、アミノ酸置換の対象となった。ＢＲＩＰのアミノ酸配列とリシンＡ鎖（図２参照）の公知の三次構造との比較は、分子表面近くで、３つの利用可能な位置の存在を示唆している。この３つのＢＲＩＰ類似体は、天然タンパク質のセリン２７７、アラニン２７０、ロイシン２５６の代わりに置換され、それぞれＢＲＩＰｃ２７７、ＢＲＩＰｃ２７０、ＢＲＩＰｃ２５６と命名した。
（１）ＢＲＩＰｃ２７７類似体を発現する能力があるプラスミドベクターを、ＢＲＩＰ遺伝子の３’末端と、アミノ酸改変を起こすＤＮＡセグメントとの交換によって構築した。ｐＢＳ１からのＢＲＩＰ遺伝子を含むＥｃｏＲＩ断片が、Ｍ１３ｍｐ１８ヘサブクロ一二ングされ、一本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）を、プライマーＯＢＭ２（ＢＲＩＰ遺伝子のヌクレオチド−１１〜＋８に対応する）及びＯＭＢ４（ＢＲＩＰの２６４〜２８０およびＢＲＩＰの終始コドンに対応し、、天然ＢＲＩＰのセリン２７７のための天然コドンのシステインの置換を組みこんでいる）を用いて、ＰＣＲにより増幅された。プライマーＯＢＭ２およびＯＭＢ４の配列は下記のとおりであり、下線部は置換したシステインをコードするヌクレオチドである。
【０２２３】
ＯＢＭ２（配列番号：４７）
５’ＧＣＡＴＴＡＣＡＴＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣ ３’
ＯＢＭ４（配列番号：４８）
５’ＧＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＣＴＡＴＴＴＣＣＣＡＣＣＡＣＡ ＣＧ
ＣＡＴＧＧＡＡＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＧＣＣＴＴＧＧＣＣＡＣＣＧＴＣ３’
　２７７位のアミノ酸のためのコドンが、システインコドンに変えたＢＲＩＰ遺伝子を含む断片を増幅した。その断片を、ｐＵＣ１９（ＢＲＬ）のＳｍａＩ部位にクローニングし、生成されたプラスミドをｐＭＢ２２と命名した。ｐＭＢ２２を、ＥｃｏＲＩで消化し、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩリンカー（Ｃｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社、パロアルト、カリフォルニア州）をベクターに連結した。ＸｈｏＩでの消化と再連結によって、ベクターｐＩＮＧＭＢ２Ｘを生成した。改変アミノ酸を伴ったＢＲＩＰの３’端をコードするＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片を、ｐＭＢ２Ｘから切り出し、断片を５％アクリルアミドゲルにて精製した。ｐｅｌＢリーダー配列およびＢＲＩＰの最初の２５６個のアミノ酸をコードする配列を含むＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片に沿ったこの断片を、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断したｐＩＮＧ３３２２での三片連結にて置換した。ＢＲＩＰｃ２７７類似体を含む得られたベクターを、ｐＩＮＧ３８０３（ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６８７２２）と命名した。
（２）２５６位に遊離システインを有するＢＲＩＰ類似体を、アミノ酸置換を誘発するＰＣＲを用いて構築した。発現プラスミドｐＩＮＧ３３２２の部分を、プライマーＢＲＩＰ−２５６およびＨＩＮＤＩＩＩ−２を用いて増幅した。各プライマーの配列を、以下に示した。
【０２２４】
ＢＲＩＰ−２５６（配列番号：４９）
５’ＴＧＴＣＴＧＴＴＣＯＴＧＧＡＧＧＴＧＣＣＧ ３’
ＨＩＮＤＩＩＩ−２（配列番号：５０）
５’ＣＧＴＴＡＧＣＡＡＴＴＴＡＡＣＴＧＴＧＡＴ ３’
　プライマーＢＲＩＰ−２５６のヌクレオチド４〜２１は、ＢＲＩＰの２５６〜２６２のアミノ酸をコードし、一方で、下線を付けたヌクレオチドは、天然ＢＲＩＰタンパク質の対応するロイシンに置換されるシスティンを特定する。プライマーＨＩＮＤＩＩＩ−２は、プラスミドの部分に対応する。ＢＲＩＰ類似体のカルボキシ末端部分をコードするＰＣＲ生成物を、Ｔ４ポリメラーゼ処理し、ＸｈｏＩで切断し、そして、得られた断片を５％アクリアミドゲルにて精製した。同時に、プラスミドｐＩＮＧ３３２２を、ＢａｍＨＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼ処理し、ＥｃｏＲＩで切断し、そして、ｐｅｌＢリーダー配列とＢＲＩＰの最初の２５６個のアミノ酸をコードする配列を含んだ断片を精製した。この二つの断片を、類似体ＢＲＩＰｃ２５８をコードする遺伝子を生成するために、ｐＩＮＧ３３２２へ戻した。このプラスミドを、ｐＩＮＧ３８０１と命名した。
【０２２５】
　（３）２７０位にシステインを有するＢＲＩＰ類似体も、ＰＣＲを用いて作製した。発現プラスミドｐＩＮＧ３３２２の部分を、プライマーＢＲＩＰ−２７０およびＨＩＮＤＩＩＩ−２プライマー（配列番号：５０）を用いて増幅した。プライマーＢＲＩＰ−２７０の配列を、以下に示した。
【０２２６】
ＢＲＩＰ−２７０（配列番号：５１）
５’ＣＣＡＡＧＴＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＣＡＴＧＣＧＡ３’
　プライマーＢＲＩＰ−２７０は、２７０位の残基を除いて、ＢＲＩＰの２６８〜２７６のアミノ酸に対応する。２７０位に対応するプライマーのコドンは、天然ＢＲＩＰでの対応する位置に存在するアラニンの代わりのシステインを特定する。ＰＣＲ生成物を、Ｔ４ポリメラーゼ処理し、ＸｈｏＩで切断し、そして、類似体のカルボキシル末端部分をコードする５１ｂｐの断片を５％アクリアミドゲルにて精製した。（ＢＲＩＰｃ２７０の２６８〜２７６のアミノ酸に対応する）断片を、プラスミドｐＩＮＧ３３２２での（ＢＲＩＰの２１７〜２６７のアミノ酸に対応する）ＳｓｔＩＩ−ＭｓｃＩからの１５１ｂｐの中間ＢＲＩＰ制限断片およびＢＲＩＰ遺伝子の残りの部分を含むｐＩＮＧ３３２２でのＳｓｔＩＩ−Ｘｈｏｌからの制限断片に沿った三片接合にてクローニングした。生成したプラスミドは、ＢＲＩＰｃ２７０をコードする遺伝子を含み、ｐＩＮＧ３８０２と命名した。
【０２２７】
　組み換えＢＲＩＰおよびＢＲＩＰ類似体の精製
　遊離システイン残基を有する組み換えＢＲＩＰ（ｒＢＲＩＰ）およびＢＲＩＰ類似体を、濃縮した培養基から調製したことを除いて、実質的に天然ＢＲＩＰの場合と同様にて精製した。ｒＢＲＩＰのために、１０Ｌ醗酵器からの濃縮培養基を、１０ｍＭＴｒｉｓ、２０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５にて交換し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００カラムに適用し、そして、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５での２０〜５００ｍＭ塩化ナトリウム勾配で溶出した。プールしたｒＢＲＩＰを、２０ｍＭ塩化ナトリウムを加えたＢｌｕｅＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）カラム（ＴｏｓｏＨａａｓ社）にてさらに精製し、そして、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５での２０〜５００ｍＭ塩化ナトリウム勾配で溶出した。ＢＲＩＰ類似体のために、濃縮した醗酵用培養基を、１０ｍＭ燐酸緩衝液、ｐＨ７．５を用いたＣＭ５２カラム（Ｗｈａｔｍａｎ社）に適用し、そして、０〜０．３Ｍ塩化ナトリウム直線勾配で溶出した。ＢｌｕｅＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）カラムでのクロマトグラフィーにより、さらに精製を行った。
【０２２８】
　網状赤血球溶解物分析
　ｒＢＲＩＰとＢＲＩＰ類似体のｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク合成を阻害する能力を、実施例１に記載の網状赤血球溶解物分析によって試験した。標準毒素（ＲＴＡ　３０）、天然ＢＲＩＰ、ｒＢＲＩＰ、およびＢＲＩＰ類似体の連続対数希釈を、１μｇ／ｍｌ〜１ｐｇ／ｍｌの範囲にわたって試験した。非阻害試料と比較して、タンパク合成の５０％阻害（ＩＣ５０）に対応する毒素のピコモル濃度（ｐＭ）を算出した。この分析の結果を、下記表１４に示した。
【０２２９】
【表１４】
2004141153.tif 000191
　ＲＬＡの結果は、ＢＲＩＰ類似体が、組み換えおよび天然ＢＲＩＰ毒素に匹敵するリボソーム不活性化活性を呈したことを示している。タンパク合成を阻害する天然ＢＲＩＰの本来の能力をすべての類似体が保持していることは、これら位置でのアミノ酸置換がタンパク質の折り畳みと活性に影響を与えるものでないことを示唆している。
【０２３０】
　ＢＲＩＰ免疫接合体の構築
　天然ＢＲＩＰと４Ａ２（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２９，１０９１（1９８２）に記載された）およびＴ細胞決定基ＣＤ７とＣＤ５それぞれを認識するＨ６５抗体（ハイブリドーマＡＴＣＣ ＨＢ９２８６から取得した）との免疫接合体を構築した。リシンＡ鎖（ＲＴＡｓ）と４Ａ２およびＨ６５抗体との免疫接合体を、対照として構築した。Ｈ６５抗体とリシンＡ鎖ならびにＲＴＡ免疫接合体を調製し、そして、前出の米国特許出願Ｎｏ．０７／３０６，４３３および国際公開Ｎｏ．ＷＯ８９／０６９６８に記載の方法に従って精製した。
【０２３１】
　天然ＢＲＩＰの免疫接合体を調製するために、抗体（４Ａ２またはＨ６５）の双方と天然ＢＲＩＰを、Ｇｏｆｆｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１，３８１−３８６（１９９０）に記載の反応性メルカプト基を誘発するために、リシン残基を、遮蔽リンカー５−メチル−２−イミノチオレン（Ｍ２ＩＴ）で化学的に修飾した。まず、ＢＲＩＰ（３ｍｇ／ｍｌ）を、２５ｍＭトリエタノールアミン、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０中にて、０．５ｍＭＭ２ＩＴと１ｍＭ ＤＴＮＢで、２５℃で、３時間インキュベートした。そして、誘導したＢＲＩＰ−（Ｍ２ＩＴ）−Ｓ−Ｓ−ＴＮＢを、ＳｅｐｈａｄｅｘＧＦ−０５ＬＳのカラムで脱塩し、導入されたチオール基の数を、０．1ｍＭ ＤＴＴの添加により定量した。平均として、各ＢＲＩＰ分子は０．７ＳＨ／ｍｏｌを含んでいた。
【０２３２】
　トリエタノールアミン緩衝液中の４Ａ２またはＨ６５抗体（４ｍｇ／ｍｌ）を、同様に、Ｍ２ＩＴ（０．３ｍＭ）とＤＴＮＢ（１ｍＭ）で、２５℃で、３時間インキュベートした。そして、抗体−（Ｍ２ＩＴ）−Ｓ−Ｓ−ＴＮＢを脱塩し、ＴＮＢ：抗体の比率を決定した。接合体を調製するために、ＢＲＩＰ−（Ｍ２ＩＴ）−Ｓ−Ｓ−ＴＮＢをまず、０．５ｍＭＤＴＴでの、２５℃で、１時間の処理で、ＢＲＩＰ−（Ｍ２ＩＴ）−ＳＨに還元し、還元剤を除去するためにＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）ＧＦ−０５ＬＳのゲル濾過で脱塩し、そして、抗体−（Ｍ２ＩＴ）−Ｓ−Ｓ−ＴＮＢと共に混合した。
【０２３３】
　２５℃での３時間、さらに４℃での１８時間のインキュベーションに続いて、接合体を、ＡｃＡ４４（ＩＢＦ社）とＢｌｕｅＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）での連続クロマトグラフイーによって精製した。最終生成物の試料を、５％非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、クーマシー染色し、そして、抗体当たりの毒素の数を定量するために島津社のレーザー濃度計で走査した。
【０２３４】
　遊離システインを含むＢＲＩＰ類似体は、４Ａ２およびＨ６５抗体にも接合した。類似体を、システインの反応性メルカプト基を露出させるために、２５℃で、２時間、あるいは４℃で、１８時間のいずれかの条件で、５０ｍＭＤＴＴで処理し、そして、脱塩した。遊離メルカプト基の存在を、ＤＮＴＢとの反応〔Ｅｌｌｍａｎ ｅｔ ａ１．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，８２，７０−７７（１９５９）〕により確認した。上記したようにＭ２ＩＴで誘導した４Ａ２またはＨ６５抗体を、１：５の比率の還元ＢＲＩＰで、室温にて、３時間、および４℃にて、一晩インキュベートした。免疫接合体Ｈ６５−ＢＲＩＰｃ２５６、４Ａ２−ＢＲＩＰｃ２５６、Ｈ６５−ＢＲＩＰｃ２７７を、２５ｍＭトリエタノールアミン、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８にて調製し、一方で、免疫接合体Ｈ６５−ＢＲＩＰｃ２７０、４Ａ２−ＢＲＩＰｃ２７０、および４Ａ２−ＢＲＩＰｃ２７７を、０．１Ｍ燐酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５にて調製した。接合に続いて、抗体の未反応Ｍ２ＩＴリンカーを凍結するために、１０μ１メルカプトエチルアミンを、２５℃にて、１５分間かけて添加した。凍結した反応溶液を、未接合リボソーム不活性化タンパク質を除去するために、迅速にゲル濾過カラム（ＡｃＡ４４）に適用した。Ｋｎｏｗｌｅｓｅｔ ａ１．，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６０，４４０（１９８７）と同様の方法を用いた、Ｂｌｕｅ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）でのソフトゲルクロマトグラフィーを用いて、精製を完了した。最終生成物の試料を、５％非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、クーマシー染色し、そして、抗体当たりの毒素の数を定量するために島津社のレーザー濃度計で走査した。接合効率は、二つの類似体ＢＲＩＰｃ２７０およびＢＲＩＰｃ２５６（いずれも約１０％程度）のいずれよりも、ＢＲＩＰｃ２７７（７８％）の方が実質的に良好であった。さらに、ＢＲＩＰｃ２７７はポリ接合体、すなわち、一つの抗体に数個のＢＲＩＰ分子が接合しているにの対し、ＢＲＩＰｃ２７０およびＢＲＩＰｃ２５６生成物はモノ接合体であった。
【０２３５】
　全細胞殺傷分析
　天然ＢＲＩＰおよびＢＲＩＰ類似体の免疫接合体を、実施例１に記載の全細胞殺傷分析法により、そのＨＳＢ２細胞でのタンパク合成阻害能力に関して試験を行った。標準免疫接合体Ｈ６５−ＲＴＡ（ＲＴＡに結合したＳＰＤＰで誘導したＨ６５）、および４ＭＲＴＡ（ＲＴＡに結合したＭ２ＩＴで誘導した４Ａ２抗体）、およびＢＲＩＰ免疫接合体試料を、２０００〜０．６３２ｎｇ／ｍｌの半減期濃度範囲のロイシンを含まないＲＰＭＩで希釈した。すべての希釈液を、１×１０５ＨＳＢ２細胞を含むマイクロ滴定プレートに三回ずつ添加した。試料を、Ｉｎｏｔｅｃ　Ｔｒａｃｅ　９６カスケードイオン化計測器にて計測を行った。未処理試料との比較により、タンパク合成の５０％阻害（ＩＣ５０）を招く免疫接合体のピコモル毒素濃度（ｐＭＴ）を算出した。その分析結果を、下記表１５に示した。
【０２３６】
【表１５】
2004141153.tif 000192
　ＢＲＩＰ類似体の接合体では、対照のリシン接合体程度の結果は得られなかった（データ示さず）。抗体４Ａ２とＢＲＩＰｃ２７０あるいはＢＲＩＰｃ２７７類似体いずれかを含む免疫毒性は、天然ＢＲＩＰを含む免疫毒性に匹敵する、目標細胞に対する向上した特異的な免疫毒性を示した。４Ａ２−ＢＲＩＰｃ２５６は、４Ａ２−ＢＲＩＰ、４Ａ２−ＢＲＩＰｃ２７０よりも活性が小さかったが、４Ａ２−ＢＲＩＰｃ２７７は３〜４倍の活性を示した。同様に、ＢＲＩＰｃ２７７に対するＨ６５の免疫接合体は、天然ＢＲＩＰに対するＨ６５の免疫接合体よりも大きな、目標細胞に対する毒性を示した。このように、適切な位置に利用可能なシステイン残基を有するＢＲＩＰ誘導体に対する抗体の結合は、天然ＢＲＩＰとの接合に関する目標細胞への特異的毒性を供えた免疫毒性をもたらすのである。
【０２３７】
　ジスルフィド結合の安定性の検定
　天然ＢＲＩＰとＢＲＩＰ類似体で調製した免疫接合体を、実施例１に記したジスルフィド結合の安定性分析によって検定した。要約すれば、接合体を、高濃度のグルタチオンで、３７℃で、１時間インキュベートし、ヨードアセトアミドでの反応終了後に、放出されたＲＩＰの量を、ＴｏｓｏＨａａｓＴＳＫ−ＦＧ２０００ＳＷカラムでのサイズ篩ＨＰＬＣによって定量した。
【０２３８】
　高濃度の２−メルカプトエタノールにより放出されたＲＩＰの量と（１００％放出を決定するために）比較することで、ＲＩＰの５０％放出に必要なグルタチオン濃度（ＲＣ５０）を算出した。下記表１６に示したように、ＢＲＩＰｃ２７０あるいはＢＲＩＰｃ２７７で調製した接合体は、ＲＴＡ接合体あるいは天然ＢＲＩＰで調製したものよりも有為に安定していた。
【０２３９】
【表１６】
2004141153.tif 000193
　これら予期していなかった結果は、本発明に従って、タイプＩＲＩＰ類似体で調製した接合体が、ｉｎｖｉｖｏでの安定性と効率を向上させることを示唆するものである。
【実施例１４】
【０２４０】
　Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ属の植物は、タイプＩ ＲＩＰｓであるモモルディンあるいはモモチャリンスとして知られている多くの関連タンパク質を生成する。モモルデインＩＩをコードする遺伝子を、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａｂａｌｓａｍｉｎａの種からクローニングした。
【０２４１】
　Ｍ．ｂａｌｓａｍｉａＲＮＡの調製
　前出のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａ１．，文献記載の方法で、４ｇのＭ．ｂａｌｓａｍｉａの種から、全ＲＮＡを調製した。ＲＮＡを含むＰｏｌｙＡを、ｌｍｇの全ＲＮＡのオリゴ−（ｄＴ）−セルロース上でのクロマトグラフィーによって調製した。４０ｍｇのオリゴ−（ｄＴ）−セルロースタイプ７（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に、０．１Ｎの水酸化ナトリウムを加え、そして、使い捨てカラム（Ｂｉｏｒａｄ社）へ注いだ。カラムを、溶出液がｐＨ５．５になるまで水で洗浄し、そして、溶出液がｐＨ７．０になるまで１×付加用緩衝液（５０ｍＭクエンナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳ、ｐＨ７．０）で洗浄した。１ｍｇの全ＲＮＡを、３００μｌの水に懸濁し、６５℃で、５分間加熱し、そして、２×付加用緩衝液（１００ｍＭクエンナトリウム、１Ｍ塩化ナトリウム、２ｍＭＥＤＴＡ、および０．２％ ＳＤＳ）を添加した。ＲＮＡはカラムに適用し、カラム流出物を、６５℃にて再加熱し、室温にまで冷却し、そしてカラムに再適用した。カラムに結合したＲＮＡを、０．５ｍｌの１×付加用緩衝液で５回洗浄し、そして、０．５ｍｌの０．０５Ｍクエンナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳで二回洗浄した。ＲＮＡを含むポリＡを、０．５ｍｌの２５ｍＭクエン酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、および０．５％ＳＤＳで２度洗浄してカラムから溶出した。
【０２４２】
　ライブラリー調製
　Ｍ．ｂｌａｓａｍｉｎａ ＲＮＡを含むポリＡからのｃＤＮＡライブラリーを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔプラスミドシステム（ＢＲＬ社、ゲティズバーグ、メリーランド州）の細菌発現プラスミド中で調製した。２μｇのＲＮＡを含むポリＡからｃＤＮＡを合成し、サイズ面分し、ＮｏｔＩ消化し、そして、ベクター製造社であるＢＲＬ社の使用説明書に従って、発現ベクターｐＳＰＯＲＴへ連結した。
【０２４３】
　モモルディンＩＩ遺伝子のクローニング
　モモルディンＩＩの最初の２７個のアミノ酸をコードするＤＮＡ断片を、ＰＣＲによって、Ｍ．ｂａｌｓａｍｉｎａｃＤＮＡから増幅した。第一鎖ｃＤＮＡを、ＲＮＡを含む１００ｎｇのポリＡから、ＲＮＡ−ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社）を用いて調製した。
【０２４４】
　二つの部分的に変性したプライマーを、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ，３６，５２４−５２７（１９８０）に記載のモモルディンＩＩの最初の２７個のアミノ酸のアミノ基配列に基づいて合成した。モモルディンＩＩの１〜２７のアミノ酸のアミノ酸配列は、モモルディンＩの１〜１７のアミノ酸と５２％が相同であるので〔Ｈｏｅｔ ａｌ．，ＢＢＡ，１０８８，３１１−３１４（１９９１）］、変性プライマーのコドンの割当のいくつかは、対応するアミノ酸との相同性ならびにモモルディンＩ遺伝子のコドン選択性に基づく。ＩＵＰＡＣヌクレオチド表示を用いたプライマーｍｏｍｏ−３およびｍｏｍｏ−４の配列を、以下に示した。
【０２４５】
ｍｏｍｏ−３（配列番号：５２）
５’ＧＡＴＧＴＴＡＡＹＴＴＹＧＡＹＴＴＧＴＣＮＡＣＤＧＣＴＡＣ ３’
ｍｏｍｏ−４（配列番号：５３）
５’ＡＴＴＧＧＮＡＧＤＧＴＡＧＣＣＣＴＲＡＡＲＴＣＹＴＣＤＡＴ３’
　得られた８１ｂｐのＰＣＲ生成物を、５％アクリルアミドゲルにて精製し、そして、ｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位にクローニングした。三つの候補クーロンを配列決定し、モモルディンＩＩのＮ末端の２７個のアミノ酸をコードする、一つのクローンｐＭＯ１１０を同定した。
【０２４６】
　ｐＭＯ１１０モモルディンＩＩ ＤＮＡ断片の配列に基づいて、モモルディンＩＩｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのためのハイブリダイゼーション用のプローブを設計した。プライマーｍｏｍｏ−５の配列を、以下に示した。
【０２４７】
ｍｏｍｏ−５（配列番号：５４）
５’ＧＣＣＡＣ ＴＧＣＡＡＡＡＡＣＣＴＡＣＡＣＡＡＡＡＴＴＴＡＴＴＧＡ３’
　プライマーｍｏｍｏ−５は、成熟モモルディンＩＩの９〜１８のアミノ酸に対応する。プライマーの下線部分のヌクレオチドは、モモルディンＩＩ遺伝子のＤＮＡ塩基配列と正確に適合すると思われる。この配列はＡ／Ｔが多くを占め、モモルディンＩＩ遺伝子とはわずかにしかハイブリダイズしないので、プライマーには近接するヌクレオチドをさらに含ませている。３および３０位（下線部）の塩基は、モモルディンＩＩのそれぞれ９位（アラニン）および１８位（イソロイシン）のアミノ酸という「不安定」な位置（すなわち、コドン中の三番目のヌクレオチド）にあり、天然遺伝子中のヌクレオチド塩基とは同一でない。
【０２４８】
　ｓＳＰＯＲＴの９０，０００個のｃＤＮＡライブラリーを、３２Ｐキナーゼｍｏｍｏ−５でスクリーニングし、８つの陽性候補クローンを同定した。ひとつのクローン、ｐＩＮＧ３６１９を配列決定し、モモルディンＩＩの予想されるＮ末端の２７残基に部分的に対応する読取枠を有していた。完全なモモルディン遺伝子は、２８６個のアミノ酸を有し、最初の２３個はリーダーシグナルであると考えられる（成熟モモルディンＩＩは、２６３残基である）。モモルディンＩＩ遺伝子のＤＮＡ配列を、配列番号：１３に示した。
【０２４９】
　モモルディンＩＩ遺伝子を含む発現ベクターの構築
　モモルディンＩＩ遺伝子の細菌発現ベクターを、構築した。二つのＰＣＲプライマーが合成され、一つのプライマー（ｍｏｍｏ−９）は、成熟モモルディンＩＩアミノ酸配列の＋１残基からプライムし、そして、もう一つは、ＸｈｏＩ制限部位に導入するモモルディンＩＩのＣ末端（ｍｏｍｏ−１０）であった。
【０２５０】
ｍｏｍｏ−９（配列番号：５５）
５’ＧＡＴＧＴＴＡＡＣＴＴＣＧＡＴＴＴＧＴＣＧＡ ３’
ｍｏｍｏ−１０（配列番号：５６）
５’ＴＣＡＡＣＴＣＧＡＧＧＴＡＣＴＣＡＡＴＴＣＡＣＡＡＣＡＧＡＴＴＣＣ３’
　ｐＩＮＧ３６１９を、ｍｏｍｏ−９およびｍｏｍｏ−１０で増幅し、そして、生成物をＴ４ポリメラーゼ処理し、ＸｈｏＩで切断し、アガローズゲルにて精製した。この遺伝子断片を、ＳｓｔＩ消化、Ｔ４ポリメラーゼ処理、およびＥｃｏＲＩ消化によってｐＩＣ１００から生成した１３１ｂｐｐｅ１Ｂリーダー断片に沿って、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで開裂したａｒａＢ発現ベクターに連結した。この三片連結での生成物を、ｐｅｌＢ連結点とモモルディンＩＩコード配列が正しいことを確認するために配列決定を行った。モモルディンＩＩ発現プラスミドｐｌＮＧ３６２１を含む細胞のアラビノース誘発は、Ｅ．ｃｏｌｉでのモモルディンＩＩ生成を招いた。
【０２５１】
　モモルディンＩＩの類似体
　モモルディンＩＩは、抗体に接合可能な天然システインを保持していない。抗体に接合するための遊離システインを有するモモルディンの類似体が構築された。システイン残基の置換に適切であると考えられる位置は、図３に示したように、リシンＡ鎖システイン２５９付近の位置、および親溶媒性のモモルディンＩＩの最後の２６個のアミノ酸を含む位置である。例えば、モモルディンＩＩの２４２位のアルギニンは、２５９位のリシンＡ鎖システインに対応し、置換の好適な目標となる。モモルディンＩＩの他の好ましい置換位置は、２４１位のセリンおよび２４３位置のアラニンを含む。
【０２５２】
　本願発明は、好適な実施例に関して記述してきたが、修正や変更が当業者によってなされるものと考えられる。それ故、請求した発明の範疇と等価の発明をすべて包含する添付した請求の範囲を希求する次第である。
【０２５３】
【表１７】
2004141153.tif 000194
【０２５４】
【表１８】
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【図面の簡単な説明】
【０２５５】
【図１】図１は、リシンＡ鎖（ＲＴＡ）（配列番号：１）のアミノ酸配列とタイプＩリボソーム不活性化タンパク質ゲロニン（配列番号：２）のアミノ酸配列をコンピューターにて調製・整列させたものであり、星印位置は、リシンＡ鎖とタイプＩＲＩＰｓのアミノ酸が一致していることを示す。
【図２】図２は、リシンＡ鎖（ＲＴＡ）（配列番号：１）のアミノ酸配列とタイプＩリボソーム不活性化タンパク質ＢＲＩＰ（配列番号：３）のアミノ酸配列をコンピューターにて調製・整列させたものであり、星印位置は、リシンＡ鎖とタイプＩＲＩＰｓのアミノ酸が一致していることを示す。
【図３】図３は、リシンＡ鎖（ＲＴＡ）（配列番号：１）のアミノ酸配列とタイプＩリボソーム不活性化タンパク質モモルディンＩＩ（ＭＯＭＯＩＩ（配列番号：４）のアミノ酸配列をコンピューターにて調製整列させたものであり、星印位置は、リシンＡ鎖とタイプＩＲＩＰｓのアミノ酸が一致していることを示す。
【図４】図４は、リシンＡ鎖（ＲＴＡ）（配列番号：１）のアミノ酸配列とタイプＩリボソーム不活性化タンパク質ラフィン（配列番号：５）のアミノ酸配列をコンピューターにて調製・整列させたものであり、星印位置は、リシンＡ鎖とタイプＩＲＩＰｓのアミノ酸が一致していることを示す。
【図５】図５は、リシンＡ鎖（ＲＴＡ）（配列番号：１）のアミノ酸配列とタイプＩリボソーム不活性化タンパク質αトリコサンチン（ＴＲＩＣＨＯ）（配列番号：６）のアミノ酸配列をコンピューターにて調製・整列させたものであり、星印位置は、リシンＡ鎖とタイプＩＲＩＰｓのアミノ酸が一致していることを示す。
【図６】図６は、リシンＡ鎖（ＲＴＡ）（配列番号：１）のアミノ酸配列とタイプＩリボソーム不活性化タンパク質モモルディンＩ（ＭＯＭＯＩ）（配列番号：７）のアミノ酸配列をコンピューターにて調製・整列させたものであり、星印位置は、リシンＡ鎖とタイプＩＲＩＰｓのアミノ酸が一致していることを示す。
【図７】図７は、リシンＡ鎖（ＲＴＡ）（配列番号：１）のアミノ酸配列とタイプＩリボソーム不活性化タンパク質Ｍｉｒａｂｉｌｉｓ抗ウィルスタンパク質（ＭＡＰ）（配列番号：８）のアミノ酸配列をコンビューターにて調製・整列させたものであり、星印位置は、リシンＡ鎖とタイプＩＲＩＰｓのアミノ酸が一致していることを示す。
【図８】図８は、リシンＡ鎖（ＲＴＡ）（配列番号：１）のアミノ酸配列と種から採取したタイプＩリボソーム不活性化タンパク質ヨウシュヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質（ＰＡＰＳ）（配列番号：９）のアミノ酸配列をコンピューターにて調製・整列させたものであり、星印位置は、リシンＡ鎖とタイプＩＲＩＰｓのアミノ酸が一致していることを示す。
【図９】図９は、リシンＡ鎖（ＲＴＡ）（配列番号：１）のアミノ酸配列と種から採取したタイプＩリボソーム不活性化タンパク質サポニン６（ＳＡＰ６）（配列番号：１０）のアミノ酸配列をコンピューターにて調製・整列させたものであり、星印位置は、リシンＡ鎖とタイプＩＲＩＰｓのアミノ酸が一致していることを示す。（配列表）
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【化１７】
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【化１８】
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【化１９】
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【化２０】
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【化２１】
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【化２２】
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【化２３】
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【化２４】
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【化２５】
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【化２６】
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【化２７】
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【化２８】
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【化２９】
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【化３０】
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【化３１】
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【化３２】
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【化３３】
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【化３４】
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【化３５】
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【化３６】
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【化３７】
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【化３８】
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【化３９】
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【化４０】
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【化４１】
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【化４２】
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【化４３】
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【化４４】
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【化４５】
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【化４６】
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【化４７】
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【化４８】
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【化４９】
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【化５０】
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【化５１】
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【化５２】
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【化５３】
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