(57)【要約】【課題】細胞の健全性を害することなく、生体組織補填材に細胞を効率的に播種する。【解決手段】接着性の細胞Ｃを浮遊させた状態で含有する培地１２１をポリオレフィン製の容器１２３内に貯留するとともに、培地１２１内に生体組織補填材１２２を投入して容器１２３に振動を付与する生体組織補填体の製造方法を提供する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
接着性の細胞を浮遊させた状態で含有する培地をポリオレフィン製の容器内に貯留するとともに、
該培地内に生体組織補填材を投入して容器に振動を付与する生体組織補填体の製造方法。
【請求項２】
容器に付与する振動が、容器を略水平方向に往復移動させる請求項１に記載の生体組織補填体の製造方法。
【請求項３】
容器に付与する振動が、容器を略水平軸線回りに往復揺動させる請求項１に記載の生体組織補填体の製造方法。
【請求項４】
容器に付与する振動が、超音波発生器により付与される請求項１に記載の生体組織補填体の製造方法。
【請求項５】
接着性の細胞を浮遊させた状態で含有する培地をポリオレフィン製の容器内に貯留するとともに、
該培地内に生体組織補填材を投入して、生体組織補填材に振動を付与する生体組織補填体の製造方法。
【請求項６】
生体組織補填体に付与する振動が、培地内において生体組織補填材を回転させる請求項５に記載の生体組織補填体の製造方法。
【請求項７】
培地中に張られる網状部材上に生体組織補填材を載置する請求項１から請求項６のいずれかに記載の生体組織補填体の製造方法。
【請求項８】
接着性の細胞を浮遊させた状態で含有する培地を貯留するポリオレフィン製の容器と、
該容器に振動を付与する加振装置とを備える生体組織補填体の製造装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、生体組織補填体の製造方法および装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、骨腫瘍摘出や外傷等により生じた骨の欠損部に、骨補填材を補填することにより、骨を再生させて欠損部を修復することが可能になってきている。骨補填材としては、ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）やリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）が知られているが、体内に異物を残さないとする考え方から、例えば、β−ＴＣＰのようなリン酸カルシウム多孔体からなる足場材が使用される。β−ＴＣＰを骨欠損部の骨細胞に接触させておくと、破骨細胞がβ−ＴＣＰを食べ、骨芽細胞が新しい骨を形成する、いわゆるリモデリングが行われる。すなわち、骨欠損部に補填された骨補填材は、経時的に自家骨に置換されていくことになる。
【０００３】
一方、術後の骨欠損部の修復速度を高めるために、患者から採取した骨髄間葉系細胞を骨補填材とともに培養することにより製造される培養骨を使用することが提案されている。培養されることにより骨補填材を足場にして増殖した多くの骨髄間葉系細胞を含む培養骨を骨欠損部に補填するので、手術後に体内で細胞を増殖させる方法と比較すると、自家骨に置換されるまでの日数を大幅に短縮することができる（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００４】
このような培養骨は、一般に、患者から採取した骨髄細胞をフラスコ内で一次培養して必要細胞数まで増加させた後に、トリプシンのような蛋白質分解酵素を用いて細胞をフラスコから剥離する。そして、これを骨補填材に付着させて骨形成培地内に留置して二次培養を行うことにより製造される（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００５】
【非特許文献１】
植村他２名，「生分解性β−ＴＣＰ多孔材料を用いた骨におけるティッシュエンジニアリング−生体内で強度を増す新しい材料オスフェリオン−」，メディカル朝日，朝日新聞社，２００１年１０月１日，第３０巻，第１０号，ｐ．４６−４９
【非特許文献２】
吉川，「骨髄間葉系細胞による培養真皮、培養骨−骨髄間葉系細胞による再生医療−」，バイオインダストリー，株式会社シーエムシー出版，２００１年，第１８巻，第７号，ｐ．４６−５３
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、骨補填材のような生体組織補填材は、一般に、ブロック状に形成されているので、表面に細胞を付着させる作業、すなわち細胞の播種作業は、生体組織補填材の全ての表面に一面ずつ行わなければならず、煩わしいものであった。また、細胞が播種された骨補填材をピンセット等の取り扱い器具によって何度も把持する必要があり、細胞の健全性が害される不都合が考えられる。
【０００７】
この発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、細胞の健全性を害することなく、生体組織補填材に細胞を効率的に播種することができる生体組織補填体の製造方法および装置を提供することを目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、この発明は、以下の手段を提供する。
請求項１に係る発明は、接着性の細胞を浮遊させた状態で含有する培地をポリオレフィン（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン等）製の容器内に貯留するとともに、該培地内に生体組織補填材を投入して容器に振動を付与する生体組織補填体の製造方法を提供する。
この発明によれば、培地内に浮遊している接着性の細胞が、培地内に投入された生体組織補填材に付着することにより生体組織補填体が製造される。この場合において、容器が、細胞の付着しにくいポリオレフィンにより構成されているので、細胞は容器に付着することなく、効率よく生体組織補填材に付着させられる。また、容器に振動が付与されることにより、培地内部の細胞および生体組織補填材に振動が伝達され、細胞が生体組織補填材に接触する機会が増加させられて、さらに効率よく付着させられることになる。
【０００９】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の生体組織補填体の製造方法において、容器に付与する振動が、容器を略水平方向に往復移動させる製造方法を提供する。
請求項３に係る発明は、請求項１に記載の生体組織補填体の製造方法において、容器に付与する振動が、容器を略水平軸線回りに往復揺動させる製造方法を提供する。
請求項４に係る発明は、請求項１に記載の生体組織補填体の製造方法において、容器に付与する振動が、超音波発生器により付与される製造方法を提供する。
これらの発明によれば、培地中に浮遊している接着性の細胞を、培地内に投入された生体組織補填材の表面に簡易かつ効率的に付着させることが可能となる。
【００１０】
請求項５に係る発明は、接着性の細胞を浮遊させた状態で含有する培地をポリオレフィン製の容器内に貯留するとともに、該培地内に生体組織補填材を投入して、生体組織補填材に振動を付与する生体組織補填体の製造方法を提供する。
この発明によれば、請求項１に係る発明と同様に、培地内における細胞と生体組織補填材との接触の機会を増加させ、細胞を生体組織補填材に効率的に付着させることが可能となる。
【００１１】
請求項６に係る発明は、請求項５に記載の生体組織補填材の製造方法において、生体組織補填体に付与する振動が、培地内において生体組織補填材を回転させる製造方法を提供する。
この発明によれば、容器に振動を与える場合と同様に、簡易かつ効率的に細胞を生体組織補填材の表面に付着させることが可能となる。
【００１２】
請求項７に係る発明は、請求項１から請求項６のいずれかに記載の生体組織補填体の製造方法において、培地中に張られる網状部材上に生体組織補填材を載置する製造方法を提供する。
この発明によれば、培地内に張られた網状部材上に生体組織補填材を載置することにより、網状部材を介して生体組織補填材の下面にも細胞が付着させられることになる。したがって、細胞を全面に付着させることが可能となる。
【００１３】
請求項８に係る発明は、接着性の細胞を浮遊させた状態で含有する培地を貯留するポリオレフィン製の容器と、該容器に振動を付与する加振装置とを備える生体組織補填体の製造装置を提供する。
この発明によれば、加振装置を作動させることにより容器に振動を付与するので、容器内に貯留されている培地およびその中に投入されている生体組織補填材が加振される。容器がポリオレフィン製なので、細胞を容器に付着させることなく、生体組織補填材に付着させて、効率的に生体組織補填体を製造することが可能となる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
この発明の一実施形態に係る生体組織補填体の製造方法および装置について、図面を参照して以下に説明する。
図２に、本実施形態に係る生体組織補填体の製造装置１００の全体概要図を示す。本実施形態に係る生体組織補填体の製造装置１００は、外部から観察可能な透明な壁材により密閉された空間Ｓの内部に、複数の培養容器１０１を１つずつ収容可能な複数の培養室１０２を備えた細胞培養部１０３と、前記空間Ｓ内を走行可能な走行台車１０４と、培養容器１０１内の細胞を遠心分離するための遠心分離機１０５と、培地交換等を行うための２台のマニピュレータ１０６，１０７（培地交換手段）と、培地、トリプシンのような蛋白質分解酵素や成長因子を貯留する容器１０８を、例えば、４℃の低温状態に保持する保冷室１０９と、一次培養された細胞を生体組織補填材に付着させる播種装置１２０とを備えている。
【００１５】
図中符号１１０は、空間Ｓ内部に清浄な下降空気流を送る空気清浄部、符号１１１は、タッチパネル式のモニタを有する制御装置、符号１１２はマニピュレータ１０６，１０７の先端に着脱され、培養容器１０１毎に交換されるピペット１１３を収容するピペット収容部、符号１１４は、培地交換時に培養容器１０１を載置する作業台，符号１１５は、上記播種装置１２０を構成する加振装置を示している。
【００１６】
培養容器１０１は、例えば、上方に開口する円形シャーレ状の容器であって、内部に培地および細胞を収容できるようになっている。また、培養容器１０１は、細胞の培養過程に応じて最適な環境を細胞に与えるため、培養工程が進行するにつれて底面積の広いものに移し替えられるように、種々の大きさのものが用意されている。
【００１７】
前記細胞培養部１０３の各培養室１０２は、走行台車１０４側の開閉扉および区画壁によって密閉されることにより、他の培養室１０２等から隔離されるようになっている。また、各培養室１０２内は、所定の温度（例えば、３７±０．５℃）、湿度（例えば、１００％）およびＣＯ２濃度（例えば、５％）等の培養条件が維持されるようになっている。また、これらの培養室１０２内の実際の温度、湿度およびＣＯ２濃度等の培養室内情報を検出するセンサ（図示略）がそれぞれ備えられている。
【００１８】
前記走行台車１０４には、培養容器を搭載する載置台１１６と、該載置台１１６を昇降させる昇降機構１１７と、載置台１１６に搭載された図示しない移載機構とが設けられている。移載機構は、載置台１１６が培養室１０２に位置決めされたときに、培養室１０２に対して培養容器１０１を出し入れするように構成されている。
【００１９】
前記培地を貯留する容器１０８には、培地の溶存酸素濃度や糖度等の培地情報を検出する培地情報検出手段（図示略）が備えられている。また、培地、トリプシン、成長因子等を貯留する容器１０８は、マニピュレータ１０７に接続され、図示しないバルブの開閉によって、マニピュレータ１０７において培養容器１０１内に培地等が投入されるようになっている。
【００２０】
前記制御装置１１１は、各細胞に対する培養のメニューを記憶しているとともに、各メニュー項目に対応して、走行台車１０４、マニピュレータ１０６，１０７、バルブ等の動作を制御するようになっている。また、制御装置１１１には、各種情報を記憶するデータベース（図示略）が備えられている。また、制御装置１１１には、カレンダー機能が搭載されていて、メニュー項目に対応して細胞に対して行われた培地交換等の作業の日付をデータベースに記憶することができるようになっている。また、培地交換の際には、交換された培地、供給された成長因子、ビタミン等の量や種類等を含む培地交換情報が、メニュー項目から抽出されて、記憶されるようになっている。
【００２１】
前記播種装置１２０は、図１に示されるように、培地１２１および生体組織補填材１２２を収容可能な培養容器１２３と、該培養容器１２３を載置して、これに水平方向の振動を付与する加振装置１１５とを備えている。生体組織補填材１２２は、例えば、β−ＴＣＰ多孔体からなるブロック状の骨補填材１２２である。前記培養容器１２３は、培養容器１０１と同等の形状をしたポリプロピレン製の容器である。
【００２２】
このように構成された本実施形態に係る細胞培養装置１００の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る細胞培養装置１００に、患者から採取された骨髄液が投入されると、骨髄液は所定の培養容器１０１あるいは遠心分離容器（図示略）に収容された状態で、走行台車１０４によって遠心分離機まで搬送され、そこで旋回されることにより、比重の重い骨髄細胞を抽出される。
【００２３】
抽出された骨髄細胞は、予め調製されている培地とともに適当な培養容器１０１内に投入され混合される。培地の一部は取り出されて感染検査に送られる。そして、骨髄細胞および培地を投入した培養容器１０１は走行台車１０４の載置台１１６に搭載されて、空いている培養室１０２まで搬送される。
この状態で、培養室１０２内においては骨髄液および培地が所定の温度、湿度およびＣＯ２濃度等の培養条件に維持される。
【００２４】
そして、これにより、所定時間にわたって一定培養条件下で細胞が一次培養される。細胞の培養途中の所定の交換時期には、培養室１０２から培養容器１０１が移載機構の作動により取り出される。
【００２５】
培養室１０２から取り出された培養容器１０１は、走行台車１０４によって搬送されて、作業台１１４上に載置される。そこで、ピペット収容部１１２から新たなピペット１１３を装着したマニピュレータ１０６が、該ピペット１１３を培養容器１０１まで搬送して、ピペット１１３の先端を培養容器１０１内の培地に接触させ吸引する。ピペット１１３を充分な内容量のものとしておくことにより、吸引した培地をピペット１１３内のみに収容してピペット１１３ごと廃棄することができる。これにより、マニピュレータ１０６に培地を付着させることが防止できる。なお、吸引した廃棄培地を廃棄することなく感染検査に送ることにしてもよい。
【００２６】
そして、この状態において、同じ培養容器１０１内でさらに培養することが必要な場合には、マニピュレータ１０７およびバルブの作動により培養容器１０１内に新たな培地等が供給される。培地等が供給されたときには、その量および種類、培地情報検出手段により検出された培地内の溶存酸素濃度や糖度等の培地情報がデータベースに記憶される。そして、新たな培地が供給された培養容器１０１は、再度、走行台車１０４によって空いている培養室１０２まで運ばれる。
【００２７】
上記状態において、培養容器１０１を変えることが必要となった場合には、マニピュレータ１０７とバルブの作動により、トリプシンの容器１０８からトリプシンを供給される。これにより、培養容器１０１の底面に付着していた細胞が剥離される。この状態で、培養容器１０１は、再度、走行台車１０４の作動により、遠心分離機１０５に移動され、そこで、細胞とトリプシン入りの培地とが分離される。分離された培地は、マニピュレータ１０６の作動により吸引されて廃棄される。分離された細胞は、ピペット１１３を持ち替えたマニピュレータ１０６の作動により、ピペット１１３内に吸引され、作業台１１４上に用意された新たな培養容器１０１内に投入される。また、この培養容器１０１内には、マニピュレータ１０７とバルブの作動により新たな培地が供給される。
細胞を収容した新たな培養容器１０１は、走行台車１０４の作動により空いている培養室１０２まで搬送されて収容される。
【００２８】
所定の培養期間が終了すると、上記と同様にして、培養容器１０１内から培地が廃棄された後に、培養容器１０１内にトリプシンが投入・混合される。これにより、培養容器１０１の底面に付着して成長していた間葉系幹細胞が、培養容器１０１の底面から剥離される。そして、このように剥離された間葉系幹細胞は、遠心分離機１０５にかけられることにより抽出される。
【００２９】
抽出された間葉系幹細胞Ｃは、細胞数調整が行われた後に、図１に示されるように、骨補填材１２２と適当な培地１２１が投入された培養容器１２３内に混合される。骨補填材１２２は、予めそれを収容した培養容器１２３を用意しておいてもよく、いずれかのマニピュレータ１０６，１０７により培養容器１２３内に投入することにしてもよい。
【００３０】
この場合において、培養容器１２３は、接着性の細胞である間葉系幹細胞Ｃの付着しにくいポリプロピレンにより製造されているので、該培養容器１２３内においては、間葉系幹細胞Ｃは、培養容器１２３の内表面に付着することなく、培地１２１内において浮遊させられることになる。
そして、この状態で、播種装置１２０を構成する加振装置１１５を作動させることにより、培養容器１２３に水平方向に往復移動する微細な振動を付与する。
【００３１】
これにより、培養容器１２３内に投入されている骨補填材１２２および間葉系幹細胞Ｃに振動が付与される。その結果、間葉系幹細胞Ｃが骨補填材１２２に接触する機会が増加させられ、骨補填材１２２の各面に間葉系幹細胞Ｃが付着させられることになる。
このようにして、間葉系幹細胞Ｃが付着させられた骨補填材１２２は、培地１２１内に浸漬された状態で、走行台車１０４によって空いている培養室１０２まで搬送され、所定の温度、湿度およびＣＯ２濃度等の培養条件に維持することにより、所定時間にわたって一定培養条件下で細胞が二次培養される。
【００３２】
二次培養工程においても、一次培養工程と同様にして、定期的に培地１２１の交換が行われ、投入される培地１２１の一部および廃棄される培地１２１の一部がそれぞれ、感染検査に送られる。そして、所定の培養期間が経過したところで、出荷用の品質検査と感染検査のための検体抽出が行われ、製造された培養骨は所定の密封容器（図示略）に密封されて製品として提供される。
【００３３】
このように、本実施形態に係る細胞培養装置１００によれば、多数の検体である細胞が同時に培養され、各細胞から製品としての培養骨が自動的に製造されることになる。
この場合において、骨補填材１２２に細胞Ｃを播種する播種装置１２０が、間葉系幹細胞Ｃの付着しにくいポリプロピレン製の培養容器１２３と、該培養容器１２３を振動させる加振装置１１５とから構成されているので、培養容器１２３内面に付着して回収されない間葉系幹細胞Ｃをなくし、無駄なく骨補填材１２２に付着させることができる。
【００３４】
なお、例えば、作業台１１４に培養容器１０１が載せられたときに、該培養容器１０１内の細胞数を検出する細胞数検出手段を作業台１１４に設けておき、培地交換を行う毎に細胞数を検出して記憶することにしてもよい。このようにすることにより、培養過程における細胞の成長度合いを履歴として残すことができ、また、細胞の活性度を把握するための指標とすることも可能となる。
【００３５】
また、培養容器１０１内の細胞の感染検査を行う感染検査手段（図示略）を設けておき、その検査結果を記憶することにしてもよい。このようにすることにより、培養過程における感染症の発生の時期を履歴として残すことができる。
【００３６】
さらに、図１においては、加振装置１１５として機械的に培養容器１２３に振動を加えるものを例示したが、これに代えて、超音波振動子を培地１２１内に投入することにより、培地１２１を介して間葉系幹細胞Ｃや骨補填材１２２に振動を加えることにしてもよい。
【００３７】
次に、この発明の第２の実施形態に係る生体組織補填材の製造装置について、図３を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る製造装置は、播種装置１３０において、第１の実施形態に係る製造装置１００と相違している。
【００３８】
本実施形態に係る製造装置において、播種装置１３０は、図３に示されるように、第１の実施形態と同様のポリプロピレン製の培養容器１３１と、該培養容器１３１を傾斜させる揺動装置１３４とから構成されている。揺動装置１３４は、前記培養容器１３１を固定した状態に載置する載置台１３５と、該載置台１３５を所定角度範囲にわたって往復揺動させる揺動機構１３６とを備えている。
揺動機構１３６は、例えば、モータ（図示略）等により駆動されるようになっている。
【００３９】
このように構成された本実施形態に係る製造装置によれば、揺動機構１３６を作動させて載置台１３５を傾斜させることにより、該載置台１３５に固定されている培養容器１３１も傾斜させられる。したがって、培養容器１３１内に貯留されている培地１３２が培養容器１３１の傾斜に合わせて流動させられるので、その流動により、培地１３１内の間葉系幹細胞Ｃが骨補填材１３３に接触させられる機会が増加し、それによって、間葉系幹細胞Ｃが骨補填材１３３に効率的に播種されることになる。
【００４０】
なお、本実施形態においては、シャーレ状の培養容器１３１を例に挙げて説明したが、これに代えて、図４に示されるように蓋１３７により密封可能な培養容器１３１を採用してもよい。このように構成することにより、揺動装置１３４による培養容器１３１，１３７の傾斜角度を上記実施形態よりも大きくすることができる。その結果、培地１３２内において骨補填材１３３を移動させ、あるいは、図４に示されるように、培養容器１３１底面に沿って転がらせることができる。これにより、培地１３２内に浮遊している間葉系幹細胞Ｃをさらに効率的に骨補填材１３３の表面に付着させることができる。特に、骨補填材１３３を転がらせることにより、骨補填材１３３の全ての表面に間葉系幹細胞Ｃを付着させることが可能となる。
【００４１】
また、上記各実施形態においては、培養容器１２３，１３１の底面に直接骨補填材１２２，１３３を配置したが、これに代えて、図５に示されるように、培養容器１２３，１３１の底面から所定距離をあけた位置に、網状部材１３８を配置することにしてもよい。このように構成することで、網状部材１３８上に骨補填材１２２，１３３を載置して、骨補填材１２２，１３３を培養容器１２３，１３１の底面から浮かせることができる。その結果、骨補填材１２２，１３３の下面にも、網の目を介して間葉系幹細胞Ｃを付着させることができる。また、そのままの状態で培養室１０２内に配置して二次培養を行うことにより、骨補填材１２２，１３３の下面においても間葉系幹細胞Ｃを成長させることが可能となり、骨補填体を効率よく製造することができる。なお、網状部材１３８は、多数の貫通孔を有する膜状部材でもよい。
【００４２】
また、上記各実施形態において、生体組織補填材１２２，１３３として、β−ＴＣＰの多孔質体からなるブロック状の骨補填材１２２，１３３を例に挙げて説明したが、これに限定されるものではなく、生体組織に親和性のある材料であれば任意のものでよく、生体吸収性の材料であればさらに好ましい。特に、生体適合性を有する多孔性のセラミックスや、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒアルロン酸、またはこれらの組合せを用いてもよい。また、チタン、タンタルの様な金属またはサンゴ由来のスポンジ状材料等であってもよい。
【００４３】
また、上記各実施形態においては、骨補填材１２２，１３３に付着させる細胞として、骨髄液から抽出した間葉系幹細胞Ｃを例示したが、これに代えて、ＥＳ細胞、体性幹細胞、骨細胞や軟骨細胞等の体細胞を採用してもよい。また、自家細胞でも、他家細胞でもよい。なお、培養容器１２３，１３１としてポリプロピレン製の容器を例に挙げて説明したが、これに代えて、ポリエチレン等の他のポリオレフィン製の容器を採用してもよい。
【００４４】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明に係る生体組織補填体の製造方法および装置によれば、細胞を生体組織補填材に塗布するのではなく、培地中に浮遊させた細胞を生体組織補填材に付着させるので、細胞を外力によって損傷させることがなく、細胞の健全性を維持しながら、生体組織補填材に播種することができるという効果を奏する。また、細胞を生体組織補填材に滴下するのと異なり、生体組織補填材の多くの表面に細胞を付着させることができる。さらに、ポリオレフィン製の容器内において播種することにより、容器に付着する無駄な細胞をなくし、効率的に播種することができるという効果もある。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の一実施形態に係る生体組織補填体の製造装置における播種装置を示す一部を破断した正面図である。
【図２】図１の播種装置を備える生体組織補填体の製造装置を示す斜視図である。
【図３】この発明の第２の実施形態に係る生体組織補填体の製造装置における播種装置を一部を破断した正面図である。
【図４】図３の播種装置の変形例を示す一部を破断した正面図である。
【図５】図１〜図４の播種装置に用いられる容器の変形例を示す縦断面図である。
【符号の説明】
Ｃ  間葉系幹細胞（細胞）
１００  生体組織補填体の製造装置
１１５  加振装置
１２１，１３２  培地
１２２，１３３  骨補填材（生体組織補填材）
１２３，１３１  培養容器（容器）
１３４  揺動装置（加振装置）
１３８  網状部材
【図１】
2004229962.tif 000003
【図２】
2004229962.tif 000004
【図３】
2004229962.tif 000005
【図４】
2004229962.tif 000006
【図５】
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