(57)【要約】【課題】核酸アプタマーとリガンドの結合親和性を高め、試料中の標的塩基配列が低濃度でも検出を可能することができる標的塩基配列の検出方法、検出感度増強試薬及び検出用キットを提供すること。【解決手段】被検試料中の標的塩基配列を検出する方法であって、（ａ）被検試料と、標的塩基配列とハイブリダイズ可能なプローブとを混合することにより、該被検試料中の標的塩基配列とプローブとがハイブリダイズした核酸アプタマーを形成させるステップ；（ｂ）上記核酸アプタマーとリガンドとを、反応溶液中において１．８以上の双極子モーメントを有する化合物の存在下で反応させるステップ；及び（ｃ）上記核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性を指標として標的塩基配列を検出するステップ；を含むものである、上記検出方法。【選択図】  図２
2004229582.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中の標的塩基配列を検出する方法であって、以下のステップ：
（ａ）被検試料と、標的塩基配列とハイブリダイズ可能なプローブとを混合することにより、該被検試料中の標的塩基配列とプローブとがハイブリダイズした核酸アプタマーを形成させるステップ、
（ｂ）上記核酸アプタマーとリガンドとを、反応溶液中において１．８以上の双極子モーメントを有する化合物の存在下で反応させるステップ、及び
（ｃ）上記核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性を指標として標的塩基配列を検出するステップ、
を含むものである、上記検出方法。
【請求項２】
前記化合物がテトラアルキルアンモニウムフルオリドである、請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
前記テトラアルキルアンモニウムフルオリドが、テトラメチルアンモニウムフルオリド（ＴＭＡＦ）、テトラエチルアンモニウムフルオリド（ＴＥＡＦ）、テトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）、及びテトラオクチルアンモニウムフルオリド（ＴＯＡＦ）からなる群より選択されるものである、請求項２記載の検出方法。
【請求項４】
前記標的塩基配列が一塩基多型（ＳＮＰ）を含むものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項５】
前記リガンドがステロイド骨格を有する化合物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項６】
前記検出が、リガンドを標識する標識物質から発生するシグナルの変化により行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項７】
前記標識物質が蛍光分子である、請求項６記載の検出方法。
【請求項８】
前記シグナルの変化が蛍光の偏光である、請求項６記載の検出方法。
【請求項９】
溶液中において１．８以上の双極子モーメントを有する化合物を含むことを特徴とする検出感度増強試薬。
【請求項１０】
前記化合物がテトラアルキルアンモニウムフルオリドである、請求項９記載の検出感度増強試薬。
【請求項１１】
前記テトラアルキルアンモニウムフルオリドが、テトラメチルアンモニウムフルオリド（ＴＭＡＦ）、テトラエチルアンモニウムフルオリド（ＴＥＡＦ）、テトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）、及びテトラオクチルアンモニウムフルオリド（ＴＯＡＦ）からなる群より選択されるものである、請求項１０記載の検出感度増強試薬。
【請求項１２】
核酸プローブ、リガンド、及び請求項９〜１１のいずれか１項に記載の検出感度増強試薬を含むことを特徴とする標的塩基配列の検出用キット。
【請求項１３】
前記リガンドがステロイド骨格を有する化合物である、請求項１２記載の検出用キット。
【請求項１４】
前記リガンドが蛍光分子で標識されたものである、請求項１２記載の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中に存在する特定の塩基配列（以下、標的塩基配列という）を高感度で特異的に検出する方法、並びにこれに使用される検出感度増強試薬及び検出用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
標的塩基配列の検出方法としては、サザンハイブリダイゼーション法に代表される相補的な塩基配列間のハイブリダイゼーションを利用する方法がある。しかしながら、相補的な塩基配列を持つ核酸は、両者の塩基配列が完全に相補的でなくてもハイブリダイゼーションを起こすため、一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、以下ＳＮＰと称する）のような１塩基の相違はハイブリダイゼーションを利用する方法では直接検出することはできない。ＳＮＰの検出方法としては、例えばＰＣＲ−ＳＳＣＰ法等が知られているが、電気泳動を必要とすることから大量の検体の処理には不向きである。
【０００３】
一方、相補的な塩基配列とは異なる原理でタンパク質などの特定の生体物質（リガンド）に特異的に結合する「アプタマー」と呼ばれる特定の構造を有する小さな核酸分子が存在する。アプタマーの探索はリガンドとの親和性を利用してより大きい核酸分子をインビトロで選択するＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）と呼ばれる手法により行われている（非特許文献１）。ＳＥＬＥＸ法は、ランダムな塩基配列を持つＲＮＡのライブラリーをリガンドに接触させ、リガンドに結合したものを回収してＲＴ−ＰＣＲ法で増幅し、増幅精製物を鋳型とするＲＮＡを転写して再びリガンドに接触させる工程を繰り返すことによって、あるリガンドに結合親和性の高い核酸を得る方法である。また、標的核酸の検出に対するまったく新しいアプローチとして、これまでの相補的な塩基配列間のハイブリダイゼーションを利用せず、この核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性を使って標的塩基配列を検出する方法（以下、「アプタマー法」という）が提案されている（特許文献１参照）。アプタマー法は、標的塩基配列とそれにハイブリダイズしうるプローブを含む核酸アプタマーを形成し、該核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性を指標として標的塩基配列を検出する方法である。核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性の大きさは核酸アプタマーの構造を維持する塩基配列に依存しており、塩基配列のわずか一塩基の置換によっても結合親和性は大きく変動するので、これを指標とすれば、標的塩基配列中のＳＮＰなどの変異を検出できる。このように、アプタマー法においては、核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性を指標として検出を行なうが、検出対象となる試料の必要量を減らすため、すなわち、極微量の試料の検出を可能とするため、核酸アプタマーとリガンドの結合親和性をさらに高めることが求められている。
【０００４】
【特許文献１】
国際公開番号ＷＯ０１／４４５０９  Ａ１
【非特許文献１】
Ｂｏｃｋ，  Ｌ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（英国），１９９２年，第３５５（６３６０）巻，ｐ．５６４−５６６
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、核酸アプタマーとリガンドの結合親和性を高め、試料中の標的塩基配列が低濃度でも検出を可能することができる標的塩基配列の検出方法、検出感度増強試薬及び検出用キットを提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
標的塩基配列を検出するアプタマー法における核酸アプタマーとリガンドの結合様式の１つとしては疎水性相互作用に基づくものがあり、疎水性相互作用の強さは周囲の環境に左右されると考えられる。特に溶媒の極性に強く左右され、溶媒の極性が低いほど疎水性相互作用は弱まり、逆に極性が高いほど疎水性相互作用は高まる傾向にある。本発明者らは反応溶液中に分子の極性が高い極性物質（１．８以上の双曲子モーメントを有する化合物）を添加することにより核酸アプタマーとリガンドの結合部位周辺の極性が高まり、疎水性相互作用が強まることによって結合親和性が高まり検出感度が向上することを見出した。本発明はかかる知見に基づき完成されたものである。
【０００７】
すなわち、本発明は、被検試料中の標的塩基配列を検出する方法であり、該検出方法は、以下のステップを含むものである。
（ａ）被検試料と、標的塩基配列とハイブリダイズ可能なプローブとを混合することにより、該被検試料中の標的塩基配列とプローブとがハイブリダイズした核酸アプタマーを形成させるステップ、
（ｂ）上記核酸アプタマーとリガンドとを、反応溶液中において１．８以上の双極子モーメントを有する化合物の存在下で反応させるステップ、及び
（ｃ）上記核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性を指標として標的塩基配列を検出するステップ。
【０００８】
上記検出方法において、反応溶液において１．８以上の双極子モーメントを有する化合物としては、例えばテトラアルキルアンモニウムフルオリドを用いることができ、テトラメチルアンモニウムフルオリド（ＴＭＡＦ）、テトラエチルアンモニウムフルオリド（ＴＥＡＦ）、テトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）、及びテトラオクチルアンモニウムフルオリド（ＴＯＡＦ）が含まれる。また上記検出方法において、標的塩基配列としては例えば一塩基多型（ＳＮＰ）を含むものが挙げられる。さらに前記リガンドとしては、ステロイド骨格を有する化合物を用いることが好ましい。
【０００９】
上記検出方法において、その検出は、例えばリガンドを標識する標識物質から発生するシグナルの変化により行われる。ここで標識物質としては蛍光分子を用いることが好ましく、その場合、シグナルの変化として蛍光の偏光を検出する。
【００１０】
また本発明は、溶液中において１．８以上の双極子モーメントを有する化合物を含むことを特徴とする検出感度増強試薬である。
【００１１】
上記検出感度増強試薬に関して、水溶液において１．８以上の双極子モーメントを有する化合物としては、例えばテトラアルキルアンモニウムフルオリドが挙げられ、それにはテトラメチルアンモニウムフルオリド（ＴＭＡＦ）、テトラエチルアンモニウムフルオリド（ＴＥＡＦ）、テトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）、及びテトラオクチルアンモニウムフルオリド（ＴＯＡＦ）が含まれる。
【００１２】
さらに本発明は、核酸プローブ、リガンド、及び上記検出感度増強試薬を含むことを特徴とする標的塩基配列の検出用キットである。
【００１３】
上記検出用キットにおいて、リガンドは、例えばステロイド骨格を有する化合物であり、好ましくは蛍光分子で標識されたものである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
本発明は、核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性が、双極子モーメントの大きい化合物（すなわち極性の大きい化合物）の存在下で増強されるという知見に基づいている。従って、そのような核酸アプタマーとリガンドとの結合反応が関与する種々の方法において本発明は有用であるが、代表的には上述の核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性を指標として標的塩基配列を検出する方法（アプタマー法）に好適に応用できる。
【００１６】
以下に本発明の標的塩基配列の検出方法、並びに検出感度増強試薬及びキットについて記載する。
【００１７】
１．標的塩基配列の検出方法
本発明の標的塩基配列の検出方法は、アプタマー法に基づくものであり、被検試料中の標的塩基配列と該塩基配列にハイブリダイズできるプローブによって形成される核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性を指標に該標的塩基配列を検出する方法であって、その反応溶液に、該反応溶液中において１．８以上の双極子モーメントを有する化合物を添加することを特徴とする。アプタマー法は、特定の塩基配列とプローブとにより形成されるアプタマーの構造が、標的塩基配列を含む場合と含まない場合とで変化し、アプタマーとリガンドとの結合親和性にも変化をもたらすという現象を利用して標的塩基配列を検出するものである。このようなアプタマー法を利用して標的塩基配列を検出する方法は公知であり、その詳細に関しては例えば特許文献１を参照されたい。
【００１８】
従って、本発明の標的塩基配列の検出方法は、例えば以下のステップを含むものである：
（ａ）被検試料と、標的塩基配列とハイブリダイズ可能なプローブとを混合することにより、該被検試料中の標的塩基配列とプローブとがハイブリダイズした核酸アプタマーを形成させるステップ、
（ｂ）上記核酸アプタマーとリガンドとを、反応溶液中において１．８以上の双極子モーメントを有する化合物の存在下で反応させるステップ、及び
（ｃ）上記核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性を指標として標的塩基配列を検出するステップ。
【００１９】
本発明において、「核酸アプタマー」又は「アプタマー」とは、特定のリガンドに対する結合活性を有する核酸であり、分子内又は分子間に少なくとも１組の相補的な塩基配列を備え、この相補的な塩基配列のハイブリダイズによって構成された核酸分子を指す。本発明において好適な構造の核酸アプタマーとしては、例えば、前記相補的な塩基配列のハイブリダイズによる二本鎖部分（ハイブリッド）と、ハイブリッドを形成しない一本鎖部分とで構成され、前記一本鎖部分が水素結合、スタッキング、疎水性相互作用などにより形成されるそのアプタマーに固有の高次構造を有するものが挙げられる。かかる高次構造としては、一般的に知られている、ステム−ループ、ステム−バルジ、及びシュードノット構造のほか、特許文献１に記載されているステム−ループとステム−バルジの両者の特徴を併せ持つステム−ジャンクション構造（スリーウェイジャンクションなど）などをいい、本発明における核酸アプタマーはこれらの高次構造を有するものであれば特に限定はされないが、スリーウェイジャンクション構造を有するものが好ましい。
【００２０】
この高次構造が、核酸アプタマーのリガンドに対する結合親和性にとって重要であり、核酸アプタマーの構造をとらない（すなわち核酸ハイブリッドを形成しない）条件下では、結合親和性を失う。
【００２１】
一方、「リガンド」とは、核酸アプタマーが有する高次構造によって結合される、核酸以外のあらゆる成分を指す。現在までに、核酸アプタマーと結合親和性を有するタンパク質、種々の低分子化合物が報告されている。例えば、アミノ酸（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０，  ３６８０−３６８４，  １９９３）、ヌクレオチド（Ｎａｔｕｒｅ３６４，  ５５０−５５３，  １９９３；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４，  ６５６−６６５，  １９９５）、コエンザイムＡ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７，  ４６５３−４６６３，  １９９８）、テオフィリン（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３，  １４２５−１４２９，１９９４）、アミノグリコシド系抗生物質（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５，  １２３３８−１２３４６，  １９９６）、有機染料（Ｎａｔｕｒｅ  ３５５，  ８５０−８５２，  １９９２）、ポルフィリン誘導体（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５，  ６９１１−６９２２，  １９９６）、及びコール酸（特許文献１）が挙げられる。
【００２２】
ステップ（ａ）においては、被検試料と、標的塩基配列とハイブリダイズ可能なプローブとを混合する。それにより、該被検試料中に標的塩基配列が存在する場合にはその標的塩基配列とプローブとがハイブリダイズした核酸アプタマーが形成される。
【００２３】
本発明において「被検試料」とは、標的塩基配列が存在するか否かを判定することが望まれる試料を指し、代表的には、生体試料（例えば全血、血漿、血清、尿、体液、唾液など）や、動物又は植物の細胞又は組織の培養物など、核酸を含有するものであれば特に限定はされない。被検試料は、当技術分野で周知の方法を適宜使用して調製することができる。一般的には、被検試料は、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を抽出して調製する。例えば、ＤＮＡを抽出する場合には、フェノール抽出及びエタノール沈殿を行う方法、ガラスビーズを用いる方法など、またＲＮＡを抽出する場合には、グアニジン−塩化セシウム超遠心法、ホットフェノール法、又はＡＧＰＣ法などを利用することができる。
【００２４】
また「標的塩基配列」とは、検出が望まれる特定の配列を含む塩基配列を指し、そのような検出が望まれる特定の配列としては、例えば変異配列、多型配列などが挙げられる。「多型」とは、遺伝子又はその一部について１種以上の形態が同時に存在することを指し、遺伝子において少なくとも２つの異なる形態、すなわち２つの異なる塩基配列が存在する部分は、多型領域と呼ばれる。多型領域としては、例えば一塩基多型（ＳＮＰ）等の遺伝子多型があり、これは種々のアレルにおいて異なる。本発明において標的塩基配列としては、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む配列が好ましい。
【００２５】
また本発明において「プローブ」又は「核酸プローブ」とは、被検試料中に含まれる標的塩基配列とハイブリダイズ可能な核酸を指す。本発明において「ハイブリダイズ」又は「ハイブリダイゼーション」とは、２つ以上の核酸がそれらの相補性に基づいて特異的に結合することを指す。従って、標的塩基配列と「ハイブリダイズ可能なプローブ」とは、標的塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸といえる。「相補的」又は「相補性」とは、塩基対合則の関係を有する核酸について用いられる概念であり、相補性は、「部分的」、すなわち核酸中のある程度の数の塩基のみが塩基対合則により一致しているようなものであってもよいし、全体が完全に相補的であってもよい。他の核酸類似体（例えば、ＩｓｏＣ／ＩｓｏＧ塩基対）又は天然の核酸と塩基対を形成するために使用される核酸類似体もまた、上記「相補性」及び「相補的」の定義内に含まれ、塩基対合するパートナーに対し相補的であるといえる。
【００２６】
プローブは、標的塩基配列とプローブとにより形成される核酸アプタマーの構造が、標的塩基配列の特定の配列の有無によって変わり、リガンドとの結合親和性が変化するように設計する。例えば、形成される核酸アプタマーの構造がスリーウェイジャンクション構造の場合には、ジャンクション部分にある３つの塩基対の結合が３つとも完全に相補的である必要がある。プローブの設計は、当業者であれば標的塩基配列の種類及びアプタマー構造を考慮して、適切なものを設計することができる。
【００２７】
例えば、標的塩基配列がＳＮＰを含み、形成される核酸アプタマーがスリーウェイジャンクション構造をとるとした場合のプローブの設計について、図１を参照しながら簡単に説明する。スリーウェイジャンクションは、３本の核酸鎖が相互に二本鎖を形成することによって、結果的に３つの二本鎖核酸が１ヶ所で交錯した構造をいう（図１Ａ）。すなわち、３本のステム（二本鎖）が１ヶ所で交差しており、６つの塩基による３組の相補塩基対がスリーウェイジャンクションを構成する。標的塩基配列の検出においては、この３本の核酸鎖のうち１本を標的塩基配列とし、２本をプローブとすることによって、アプタマー構造（すなわちスリーウェイジャンクション構造）を形成させる。そして、ジャンクション部分の相補塩基対の結合が３組とも完全に相補的である場合に、このスリーウェイジャンクション構造にリガンドが結合することができる。従って、ジャンクション部分の相補塩基対の結合が完全に相補的になるようにプローブを設計する。
【００２８】
図１Ａに示すように、ポジティブ標的塩基配列のＳＮＰ（塩基Ｇ）が検出対象となる場合、この標的塩基配列と相補的となるようなプローブＡ及びプローブａを設計する。このとき、標的塩基配列におけるＳＮＰに相当する塩基Ｇはスリーウェイジャンクションのジャンクション部分を構成し、かつジャンクション部分の結合は全て完全に相補的となることに留意されたい。プローブＡは、標的塩基配列と相補的である部分と、プローブａと相補的である部分から構成される。プローブａは、標的塩基配列と相補的である部分と、プローブＡと相補的である部分から構成される。このプローブＡとプローブａは、別々の核酸分子であってもよいし、例えばヘアピン構造をもった１本の核酸分子であってもよい。当業者であれば、標的塩基配列の塩基配列に基づいて、手動で又は公知のプローブ設計用ソフトウエアを用いて、特定の条件下にてハイブリダイズ可能なプローブの塩基配列を決定することができる。
【００２９】
以上のように設計したプローブを用いて標的塩基配列と接触させた場合、それらがハイブリダイズして図１Ａに示すアプタマー構造が形成される。このアプタマー構造のジャンクション部分は完全な相補性により結合し、アプタマーの高次構造が特定の構造に保持されるため、この構造にリガンドは結合することができる。一方、標的とするＳＮＰ（塩基Ｇ）とは異なるＳＮＰ（塩基Ｃ）を有する塩基配列（ネガティブ塩基配列）は、図１Ｂに示すように、標的塩基配列により形成されるアプタマー構造とは異なるアプタマー構造を形成する。すなわち、スリーウェイジャンクション構造のジャンクション部分において、ＳＮＰに相当する塩基Ｃが相補性によりプローブと結合していない。このようなアプタマー構造に対するリガンドの結合親和性は、上記図１Ａのものとは異なり、その親和性は低くなる。
【００３０】
また設計するプローブの長さ（サイズ）は、標的塩基配列の種類、核酸アプタマーの構造の種類、ハイブリダイゼーション条件などに応じて適宜変更する必要がある。例えば、標的塩基配列がＳＮＰを含み、核酸アプタマーがスリーウェイジャンクション構造をとるように２本のプローブを設計する場合には、各プローブの長さは、８〜６０塩基長、好ましくは１６〜３０塩基長とすることができる。
【００３１】
設計したプローブが標的塩基配列と適切にハイブリダイズするか否かは、公知のプローブ設計用ソフトウエアを用いて確認することができ、そのようなソフトウエアとしては、例えばＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス社製）などが挙げられる。
【００３２】
プローブは、標的塩基配列とハイブリダイズして核酸アプタマーを形成することができるものであれば、どのような核酸分子又はその誘導体であってもよい。具体的には、核酸分子は、天然源から単離された核酸分子（例えばＤＮＡ、ＲＮＡなど）又は化学的に合成された核酸分子（例えば増幅産物など）、合成ヌクレオチド誘導体を含む核酸の誘導体、あるいは骨格がペプチド結合又はアルキル鎖などからなる核酸の誘導体など、とすることができる。プローブは、当技術分野で公知の任意の手法、例えば化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、ＰＣＲ、又はこれらの組み合わせにより生成することができる。
【００３３】
上述のように調製された被検試料とプローブとを混合する方法は、特に限定されない。例えば被検試料をプローブを含有する溶液に添加したり、被検試料とプローブ含有溶液とを混合する方法が挙げられる。また混合する条件は、被検試料中の標的塩基配列とプローブとがハイブリダイズ可能な条件下であれば特に限定されない。ハイブリダイゼーションは、核酸間の相補性、採用する条件のストリンジェンシー、及び形成されるハイブリッドのＴｍなどの要因により影響を受けるため、これらの要因を考慮して適宜ハイブリダイゼーション条件を決定する。「ストリンジェンシー」とは、ハイブリダイゼーションを実施する際の、温度、イオン強度及び他の化合物の存在の条件について用いられる概念である。「高ストリンジェンシー」条件では、相補的な塩基を高頻度で有する配列からなる核酸の間でのみ塩基対合が起こる。例えばＳＮＰなどの一塩基の差を検出することが必要な場合には、この「高ストリンジェンシー条件」を採用する。ストリンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件とその決定は当技術分野で周知であり、一般的な実験プロトコールに記載されている。
【００３４】
以上のようにして、被検試料とプローブとを混合して、被検試料中の標的塩基配列とプローブとをハイブリダイズさせることにより、核酸アプタマーを形成させる。
【００３５】
ステップ（ｂ）においては、上記核酸アプタマーとリガンドとを、反応溶液中において１．８以上の双極子モーメントを有する化合物の存在下で反応させる。
【００３６】
本発明は特定の原理又は機構に限定されるものではないが、本発明者はその１つとして次の反応機構を推測している。アプタマー法における核酸アプタマーとリガンドとの結合様式は疎水性相互作用に基づくものであり、この疎水性相互作用の強さは周囲の環境に左右されると考えられる。特に溶媒の極性に強く左右され、溶媒の極性が低いほど疎水性相互作用は弱まり、逆に極性が高いほど疎水性相互作用は高まる傾向にある。そこで本発明者は、試料溶液中に分子の極性が高い極性物質を添加することにより核酸アプタマーとリガンドの結合部位周辺の極性が高まり、疎水性相互作用が強まることによって結合親和性が高まり検出感度が向上すると推測した。
【００３７】
極性物質の極性の強さは一般に双極子モーメントによって表すことができる。「双極子」とは、原子又は分子において正負の電荷の重心が一致しない場合に双極子を有するという。極性物質の双極子モーメントは、以下のように定義されている。まず物質分子内の正電荷及び負電荷それぞれの重心位置と正負等しい電気量を求め、重心位置間距離ｌ（単位はストロングオーム）と電気量±ｑ（単位はクーロン）の積（ｑｌ）を計算した値が双極子モーメント（単位はデバイ）である。従って、極性をもたない物質は双極子モーメントが０である。一般的に正負電荷の重心位置及び電気量は、物質分子の原子配置及び電子状態を半経験的電子軌道法などで計算をすることにより求められる。この計算方法を適用すると、例えば水の双極子モーメントは１．８６０デバイと求められ、これは実測値の１．８５５デバイとよく一致している。しかしながら双極子モーメントの上記計算方法は、あくまでも予測された近似値であり、真に正確な値が必要の場合には、物質の誘電率を実験によって測定し、誘電率から正確な双極子モーメントの値を求めることが可能である。
【００３８】
本発明においては、核酸アプタマーとリガンドとを反応させる溶液中で双極子モーメントが大きい化合物を使用することができる。そのような化合物としては、上記溶液中でその溶液よりも大きい双極子モーメントを有する化合物が好ましい。核酸アプタマーとリガンドとを反応させる溶液の双極子モーメントはほぼ水のものと等しいと考えられるので、本発明において好ましい化合物の双極子モーメントは、溶液中において約１．８以上、より好ましくは約２．０〜約６．０である。本明細書中、「双極子モーメントを有する化合物」「双極子モーメントが大きい化合物」及び「極性化合物」という記載はいずれも溶液中において約１．８以上の双極子モーメントを有する化合物を表す。
【００３９】
双極子モーメントが大きな化合物として、以下に示すものが挙げられ、括弧内に双極子モーメントの実測値を示す：テトラアルキルアンモニウムフルオリド（テトラメチルアンモニウムフルオリド（ＴＭＡＦ）、テトラエチルアンモニウムフルオリド（ＴＥＡＦ）、テトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）、テトラオクチルアンモニウムフルオリド（ＴＯＡＦ）など）、ジメチルスルホン（４．４３）、ピリダジン（４．２２）、ニトロベンゼン（４．２１）、β−プロピオラクトン（４．１８）、ベンゾニトリル（４．１４）、シス−２−ブテンニトリル（４．０８）、プロピオニトリル（４．０２）、アセトニトリル（３．９３）、アクリロニトリル（３．８９）、イソシアン化メチル（３．８３）、マロノニトリル（３．７４）、シアノアセチレン（３．７２）、ホルムアミド（３．７１）、ニトロエチレン（３．７０）、ニトロメタン（３．４６）、ピルボニトリル（３．４５）、シクロペンタノン（３．３０）、１，３，４−チアジアゾール（３．２８）、ｓ−ｔｒａｎｓ−ホルミルシクロプロパン（３．２６）、イソシアン酸メチル（３．１８）、チオシアン酸メチル（３．１６）、アクリルアルデヒド（３．１２）、硝酸メチル（３．０８）、アセトフェノン（３．００）、フッ化アセチル（２．９６）、イソオキサゾール（２．９５）、ショウノウ（２．９５）、アセトン（２．９０）、ベンズアルデヒド（２．７６）、アセトアルデヒド（２．７５）、ｓ−ｃｉｓ−ホルミルシクロプロパン（２．７４）、イソキノリン（２．５３）、プロピオンアルデヒド（２．４６）、ｃｉｓ−１，２−ジフルオロエチレン（２．４２）、１，１，１−トリフルオロエタン（２．３５）、ピリミジン（２．３３）、ホルムアルデヒド（２．３３）、トリフルオロ酢酸（２．３）、キノリン（２．２２）、臭化ｔ−ブチル（２．２１）、ピリジン（２．１５）、臭化プロピル（２．１３）、塩化ｔ−ブチル（２．１２）、塩化プロピル（２．１０）、フッ化ホルミル（２．０８）、インドール（２．０８）、クロロシクロペンタン（２．０８）、１，３，５−トリオキサン（２．０８）、塩化エチル（２．０５）、ｔｒａｎｓ−フッ化プロピル（２．０５）、臭化エチル（２．０１）、ヨウ化プロピル（２．０１）、プロピレンオキシド（２．００）、ｔｒａｎｓ−ギ酸エチル（１．９８）、ジフルオロメタン（１．９８）、フッ化エチル（１．９６）、メチルチイラン（１．９５）、オキセタン（１．９３）、ｇａｕｃｈｅ−フッ化プロピル（１．９０）、塩化メチル（１．８９）、アジリジン（１．８９）、ｃｉｓ−１，２−ジクロロエチレン（１．８９）、エチレンオキシド（１．８８）、フッ化メチル（１．８６）。
【００４０】
双極子モーメントを有する化合物としては、テトラアルキルアンモニウムフルオリド（ＴＭＡＦ，ＴＥＡＦ，ＴＢＡＦ，ＴＯＡＦなど）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グリセリンを使用することが好ましい。
【００４１】
本発明の標的塩基配列の検出方法において、双極子モーメントを有する化合物は、核酸アプタマーとリガンドとの反応時にその反応溶液中に該化合物が存在する限り、その使用形態は特に限定されない。例えば、核酸アプタマーを含む反応溶液にリガンドを添加する前、添加と同時又は添加後に、双極子モーメントを有する化合物を反応溶液中に添加することができる。あるいは、ステップ（ｂ）はステップ（ａ）の前、同時又は後に行うことが可能であり、双極子モーメントを予め反応溶液中に添加し、その後、ステップ（ａ）の核酸アプタマー形成を行い、続いて核酸アプタマーとリガンドとを反応させることも可能である。さらに、標的塩基配列を含む試料、プローブ、リガンド及び双極子モーメントを有する化合物を一緒に混合して反応溶液を調製してもよい。
【００４２】
双極子モーメントを有する化合物の添加量は、例えば、種々の濃度の該化合物の存在下における結合親和性の強度、すなわち結合親和性の化合物濃度依存性を測定することにより最適量を決定することができる。
【００４３】
また反応させるリガンドは、上述したように核酸アプタマーが有する高次構造によって結合される、核酸以外の成分であれば特に限定されず、任意のものを用いることができる。本発明においては、スリーウェイジャンクション構造をとる核酸アプタマーと好適に結合することが知られているコール酸、及びコール酸の構造と同じステロイド骨格を有する化合物を用いることが好ましい。そのようなステロイド骨格を有する化合物としては、限定するものではないが、コール酸及びその誘導体、例えばリトコール酸、ケノデオキシコール酸、コール酸メチルエステル、リトコール酸メチルエステルなど、並びにその他のステロイド骨格を有する化合物、例えば５β−プレグナン−３α−オール−２０−オン、ｔｒａｎｓ−アンドロステロンなどが挙げられる。
【００４４】
リガンドの量は、反応させる核酸アプタマーの量を考慮して適宜決定することができる。またリガンドは、後述する核酸アプタマーとの結合親和性を指標とする標的塩基配列の検出のために、標識物質で標識されていてもよい。そのような標識物質としては、蛍光分子（フルオレセン（ＦＩＴＣ）、スルホローダミン（ＴＲ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）など）、発光物質（ルシフェリンなど）、酵素（アルカリホスファターゼなど）、複合体系（ビオチンーアビジン系など）などが挙げられる。
【００４５】
反応溶液中において１．８以上の双極子モーメントを有する化合物の存在下で核酸アプタマーとリガンドとを反応させることによって、それらの結合が増強され、後述する結合親和性の変化を良好に観察できるようになる。
【００４６】
ステップ（ａ）及びステップ（ｂ）の後、核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性を指標として標的塩基配列を検出する（ステップ（ｃ））。本発明の検出方法においては、この核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性を指標とすることにより、標的塩基配列とプローブとのハイブリダイゼーション、すなわち標的塩基配列を検出することができる。本発明において、「検出」とは、被検試料中に標的塩基配列が存在しているか否かを判定することを指し、場合により被検試料中に含まれる標的塩基配列の量（又は割合）を測定することをも指す。
【００４７】
核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性の変化の検出には、公知のあらゆる結合分析の原理を応用することができ、例えば限定されるものではないが、不均一系、均一系、表面プラズモン共鳴などが挙げられる。
【００４８】
不均一系においては、標識プローブと標的塩基配列とのハイブリダイゼーションの結果として生じる核酸アプタマーを、固相上に固定化したリガンドにより捕捉することができる。固相に捕捉された（又は液相に残った）標識プローブを検出することによって、アプタマーとリガンドとの結合親和性の変化、すなわち標的塩基配列を検出することができる。
【００４９】
均一系においては、蛍光分子と他の分子との結合によって生じる蛍光偏光という現象を利用することができる。蛍光偏光は、具体的には、プローブ又はリガンドを蛍光分子で標識し、核酸アプタマーとリガンドとの結合の結果生じる蛍光偏光を測定することによって、その結合親和性の変化を検出、すなわち標的塩基配列を検出することができる。蛍光分子としては、当該技術分野で公知のあらゆる蛍光分子を用いることができ、例えばフルオレセインイソチオシアネートなどが挙げられる。リガンドがそれ自体で蛍光を発するような化合物（例えばポルフィリン誘導体）である場合には、その蛍光を利用してアプタマーとの結合を検出することができる。
【００５０】
表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）は、物質の結合を光学的に直接検出することができる方法であり、当該技術分野において周知である。表面プラズモン共鳴センサーは、金属薄膜近傍の媒質の屈折率の変化を測定することにより、生体分子の相互作用を測定する技術として知られている。ＳＰＲは、表面プラズモンが金属／液体界面（センサー表面）で励起した場合に起こり、試料と接触していない表面の側に光を当てて、そこから光を反射させると、ＳＰＲによって特定の組合せの角度及び波長で反射光強度が低下する（ＳＰＲシグナル発生）。センサー表面に結合した分子により、表面層近くでの屈折率に変化が生じ、それがＳＰＲシグナルの変化として検出される。生体分子の相互作用によって、屈折率とＳＰＲシグナルにさらなる変化が生じ、このシグナルの変化を検出することにより、生体分子の相互作用を測定することができる。本発明においては、例えば核酸アプタマーにより捕捉されるリガンドをチップ上に固定化することにより、標的塩基配列とプローブとのハイブリダイゼーションによって形成される核酸アプタマーの量（結合量）を、ＳＰＲシグナルの変化から測定することができる。ＳＰＲを利用することによって、標識物質を用いることなく検出を行うことが可能となる。
【００５１】
上記の双極子モーメントを有する化合物の効果を、本発明の好ましい一実施態様により具体的に説明する。図２は、標的塩基配列を含む核酸アプタマー又は標的塩基配列と一塩基違いの塩基配列を含む核酸アプタマーに、蛍光分子（フルオレセインイソチオシアネート：ＦＩＴＣ）で標識したコール酸を異なる濃度のＴＭＡＦの存在下で結合させ、蛍光分子の偏光度をそれぞれ測定し、標的塩基配列を含むアプタマーと標的塩基配列と一塩基違いの塩基配列を含む核酸アプタマーとの蛍光偏光度の差をＴＭＡＦ濃度毎に示した図である。蛍光分子の偏光度は、蛍光分子の結合した物質の分子量に依存する傾向にあり、偏光度の値が大きい場合には、大きな分子量の物質に蛍光分子が結合していることを意味する。従って、蛍光分子を結合させたリガンドが、スリーウェイジャンクション構造を取る核酸アプタマーに結合した場合、核酸アプタマーの分子量がリガンドの分子量に比べて十分に大きいため、蛍光分子の偏光度が増大することになる。一方、核酸アプタマーがスリーウェイジャンクション構造を取らず、リガンドが結合しない場合には、蛍光分子の偏光度の変化は小さくなる。図２に示されるように、ＴＭＡＦの添加によって、標的塩基配列を含む核酸アプタマーと標的塩基配列と一塩基違いの塩基配列を含む核酸アプタマーとの間の蛍光偏光度の差が大きく表れている。すなわち、本発明によれば、標的塩基配列の変異（例えば一塩基置換）に起因する核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性の変化を、顕著な蛍光偏光度の差として検出することが可能となる。
【００５２】
２．検出感度増強試薬
上記の核酸アプタマーとリガンドとの結合反応溶液中で１．８以上の双極子モーメントを有する化合物は、該化合物をそのまま、又は該化合物を含む溶液若しくは緩衝溶液の形態として、核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性を増強し、その結合親和性の変化の検出感度を増強するための試薬として提供できる。
【００５３】
また、本発明の検出感度増強試薬は、本明細書において詳述した標的塩基配列の検出方法だけではなく、核酸アプタマーとリガンドとの結合反応が関与する種々の方法に適用することができる。例えば、上記ＳＥＬＥＸ法において、特定のリガンドに対し結合親和性の高い核酸アプタマーをスクリーニングする場合に本発明の検出感度増強試薬を使用することができる。検出感度増強試薬の存在下にてリガンドと核酸アプタマーとの反応を行うことによって、スクリーニング時の結合親和性の測定を高感度に行うことができる。また、本発明の検出感度増強試薬を使用することにより、微量のリガンド又は核酸アプタマーを用いた場合であってもその結合親和性を高感度に検出することができる。
【００５４】
３．標的塩基配列の検出用キット
本発明の検出用キットは、核酸プローブ、リガンド、及び検出感度増強試薬を含むことを特徴とする。本検出用キットは、アプタマー法を利用して標的塩基配列を検出するために有用である。
【００５５】
「キット」とは、物質を供給するための供給システムを指し、容器に入れた反応試薬及び／又は補助物質を保管、輸送又は供給することができるシステムである。本発明の検出用キットにおいて、反応試薬としては、核酸プローブ、リガンド、検出感度増強試薬が含まれる。また補助物質として、限定されるものではないが、標識物質、緩衝液、使用説明書などが含まれていてもよい。本発明の検出用キットを利用することにより、標的塩基配列を非常に容易に検出することができる。
【００５６】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は下記実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００５７】
〔実施例１〕双極子モーメントが大きい化合物の存在下におけるＤＮＡアプタマーとリガンドの結合親和性の蛍光偏光度による測定
本実施例においては、双極子モーメントが大きい化合物の存在下における、標的塩基配列とプローブにより形成されたアプタマーと、リガンドとの結合の変化を調べた。すなわち、下記のポジティブ又はネガティブ標的塩基配列（下線部分がＳＮＰに対応）と、下記の２分子のプローブにより、スリーウェイジャンクション構造を含む核酸アプタマーを形成させ、双極子モーメントが大きい化合物を添加した条件下で、ポジティブ標的塩基配列とネガティブ標的塩基配列とを用いた場合の核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性の差異を、蛍光偏光度を測定して観察した。本実施例においては、ポジティブ標的塩基配列に含まれるＳＮＰを検出することを目的とした。
【００５８】
ポジティブ標的塩基配列（ポジティブコントロール用）：５’−ＣＣＴＡＧＣＡＧＣＧＧＧＡＧＣＧＧＴＧＧ−３’（配列番号１）
ネガティブ標的塩基配列（ネガティブコントロール用）：５’−ＣＣＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＣＧＧＴＧＧ−３’（配列番号２）
プローブａ：５’−ＣＣＡＣＣＧＣＴＣＣＡＣＴＣＡＡＣＴＧＧ−３’（配列番号３）
プローブＡ：５’−ＣＣＡＧＴＴＧＡＧＴＣＧＣＴＧＣＴＡＧＧ−３’（配列番号４）
【００５９】
操作を簡単に説明すると、上記ポジティブ標的塩基配列又はネガティブ標的塩基配列と、プローブａ及びプローブＡの３分子のＤＮＡをそれぞれ４０ｎＭ含有するバッファー（組成：ｐＨ＝７．６，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１Ｍ  ＮａＣｌ，３０ｍＭ  ＫＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）溶液を作製し、９５℃で５分間かけて上記ＤＮＡを変性させ、３０分間かけて２０℃まで徐冷することによりスリーウェイジャンクション構造をとるアプタマーを形成した（図１）。この核酸アプタマー４０ｎＭを含むＤＮＡ溶液に、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識したリガンドを１ｎＭ、極性物質としてテトラメチルアンモニウムフルオリド（ＴＭＡＦ；和光製）を０、０．１、０．３、１．０、３．０、１０．０又は２０．０％（ｗ／ｖ）の濃度になるように加えて、最終ＤＮＡ濃度は２０ｎＭとなるようにした。この混合溶液１００μｌの蛍光偏光度を測定したところ、以下の表１に示す結果が得られた。
【００６０】
なお、リガンドのＦＩＴＣ標識は以下の通りに行った。まず、コール酸（和光製）又はリトコール酸（和光製）１ｍｍｏｌを、ｔｅｒｔ−ブチルＮ−（３−アミノプロピル）カルバミド１ｍｍｏｌ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）２ｍｍｏｌ、１−ハイドロキシベンゾトリアゾール２ｍｍｏｌ、及びジイソプロピルエチルアミン０．２ｍｌと混合して、室温で２４時間撹拌した。この混合液を酢酸エチル／１Ｎ水酸化ナトリウムで抽出し、有機層を１Ｎ塩酸で洗浄後、乾固した。得られた有機層を塩化メチレンとトリフルオロ酢酸に溶解し、１時間攪拌した。溶媒を留去後、酢酸エチル／１Ｎ水酸化ナトリウムで抽出し、有機層を濃縮乾固した。この粗生成物を精製後、ＦＩＴＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ製）と等モルでアセトニトリル中に溶解し、１時間攪拌後、濃縮乾固してＦＩＴＣ標識したリガンドを得た。
【００６１】
【表１】
2004229582.tif 000003
【００６２】
ポジティブ標的塩基配列又はネガティブ標的塩基配列により形成されるアプタマーをそれぞれ図１Ａ及びＢに示す。ポジティブ標的塩基配列の場合にはＳＮＰの塩基においてプローブとの結合が起こり、このスリーウェイジャンクション構造にリガンドは結合することができる。一方、ネガティブ標的塩基配列の場合にはＳＮＰの塩基においてプローブとの結合がおこらず、リガンドは結合することはできない。従って、ポジティブ標的塩基配列とネガティブ標的塩基配列とではリガンドの結合親和性が異なるはずである。表１から明らかなように、ポジティブ配列又はネガティブ配列を用いた場合に、核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性の変化が、リガンドを標識した蛍光の偏光度の差により証明された。すなわち、一塩基の違い（ポジティブ配列とネガティブ配列の差）により、核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性が変化することが示された。また、偏光度の差異は極性物質の添加量に依存することが確認され、極性物質の存在下では核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性の検出感度が向上することが示された。極性物質としてＴＭＡＦを用いた場合の添加量の最適領域は、表１に示すように、約１〜３％と評価される。表１のデータから逆算すると、極性物質を添加剤として試薬に加えることにより感度が２桁以上向上することが示された。
【００６３】
【発明の効果】
本発明により、アプタマー法において、標的塩基配列を高感度に特異的に検出するための方法、並びに検出感度増強剤及び検出用キットが提供される。本発明では、微量の標的塩基配列に対しても高感度で検出を行うことができるため、あらゆる試料中の標的塩基配列の検出に有用である。
【００６４】
【配列表】
2004229582.tif 000004
2004229582.tif 000005
【００６５】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１〜４：合成オリゴヌクレオチド
【図面の簡単な説明】
【図１】標的塩基配列とプローブとにより形成されるアプタマーの構造を示す図である。Ａはポジティブ標的塩基配列の場合、Ｂはネガティブ標的塩基配列の場合のアプタマーの構造を示す。
【図２】双極子モーメントが大きい化合物としてテトラメチルアンモニウムフルオリド（ＴＭＡＦ）を種々の濃度（％）で添加した場合の、アプタマーとリガンドとの結合親和性の変化（偏光度差）を示すグラフである。
【図１】
2004229582.tif 000006
【図２】
2004229582.tif 000007