(57)【要約】【課題】本発明は、ウシ関節疾患の予防および治療のための、低コスト、高効率吸収の機能性飼料の開発を目的とする。より詳細には、ウシのための非晶化キチンを含む機能性飼料の開発を目的とする。【解決手段】本発明は、非晶化キチンを含むことを特徴とする飼料、関節疾患予防治療剤および抗炎症剤を提供する。軟骨破壊抑制剤または軟骨形成促進剤である関節疾患予防治療剤を提供する。また、本発明は、上記飼料、関節疾患予防治療剤または抗炎症剤を製造するための非晶化キチンの使用を提供する。さらに、本発明は、ウシ関節疾患の治療または予防のための、非晶化キチン、上記飼料および上記関節疾患予防治療剤の使用を提供する。さらに、本発明は、ウシ炎症の治療または予防のための、非晶化キチン、上記飼料および上記抗炎症剤の使用を提供する。さらに、本発明は、ウシの関節疾患を治療する方法であって、上記非晶化キチン、上記飼料、上記関節疾患予防治療剤を投与することを含む方法を提供する。【選択図】    図２５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
非晶化キチンを含むことを特徴とする反芻動物飼料。
【請求項２】
非晶化キチンを含むことを特徴とする反芻動物関節疾患予防治療剤。
【請求項３】
軟骨破壊抑制剤または軟骨形成促進剤である請求項２に記載の反芻動物関節疾患予防治療剤。
【請求項４】
非晶化キチンを含むことを特徴とする反芻動物抗炎症剤。
【請求項５】
請求項１に記載の飼料、請求項２に記載の反芻動物関節疾患予防治療剤または請求項４に記載の抗炎症剤を製造するための非晶化キチンの使用。
【請求項６】
ウシ関節疾患の治療または予防のための非晶化キチンの使用。
【請求項７】
ウシ関節疾患の治療または予防のための請求項１に記載の反芻動物飼料の使用。
【請求項８】
ウシ関節疾患の治療または予防のための請求項２または３に記載の反芻動物関節疾患予防治療剤の使用。
【請求項９】
ウシ炎症の治療または予防のための非晶化キチンの使用。
【請求項１０】
ウシ炎症の治療または予防のための請求項１に記載の反芻動物飼料の使用。
【請求項１１】
ウシ炎症の治療または予防のための請求項４に記載の反芻動物抗炎症剤の使用。
【請求項１２】
ウシの関節疾患を治療する方法であって、非晶化キチン、請求項１に記載の飼料または請求項２もしくは３に記載の反芻動物関節疾患予防治療剤を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、非晶化キチンを含むことを特徴とする飼料、関節疾患予防治療剤および抗炎症剤、並びにウシにおける関節疾患もしくは炎症の治療または予防のための非晶化キチンの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
我が国における泌乳牛の死廃事故件数は、年間１２万頭にのぼる。家畜共済疾病統計（平成１２年度）によると、全死廃自己件数１６１７５頭のうち、発生率上位３疾病は、１位運動器病３０１８１頭、２位消化器病２０１３９頭、３位妊娠／分娩期疾患１８１４４６頭となっている。過去３年間の統計結果を見ても、運動器病は、死廃自己の中では常に２６％前後を占め、発生率ではトップになっている。この運動器病の中で約半数を占めるのが関節損傷によって発生する疾病（以下、関節疾患と称する）である。
【０００３】
近年、酪農技術の進歩に伴い泌乳牛の泌乳能力は向上したが、同時に牛が大型化した。このため、高泌乳牛の過度の体重は、自身の関節に負担をかけ、関節疾患を増悪させていると考えられる。また、ヒト医学領域における変形性関節症の報告では、加齢に伴い女性の患者数が男性を上回ることが報告され、変形性関節症の発症にはエストロゲンの喪失の関連を示唆した報告がある。高泌乳牛では、泌乳能力の向上を目的とした品種改良によって、性ホルモンバランスの喪失が危惧されており、このことが泌乳牛において関節疾患が多いことの一因になっている可能性がある。さらに、関節疾患の予防には過度な運動が有効とされているが、ほとんどの酪農家では、搾乳の効率化のために集団多頭飼育を実施しており、泌乳牛に十分な運動スペースが与えられていない。このように泌乳牛を取り巻く環境は、関節疾患を誘発する因子が多数存在している。
【０００４】
ヒト医学領域では、こうした関節疾患の治療として、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＤＩＤｓ）の投与や、関節内ヒアルロン酸注入、外科的処置として骨切術、人工関節置換術を実施している。一方、産業動物においては、このような療法はコスト面、成果の面においても実施はきわめて困難である。また、泌乳牛の関節疾患は、いまだにその有効な予防方法は報告されていない。
【０００５】
従来から、Ｄ−グルコサミンは、軟骨組織の誘導効果を有することが知られており、欧米では変形性関節症の治療薬として認可を受けている。また、ウサギでは、経口的にグルコサミンを投与すると関節軟骨の損傷の治癒促進が見られることが明らかとなっている（非特許文献１）。しかし、飼料として配合するには、Ｄ−グルコサミンの製造コストは高く、製造コストの低下が望まれている。
【０００６】
また、反芻動物の第一胃内には、キチンを分解するキチナーゼ活性を有する細菌が存在することが知られており、ウシにグルコサミンを投与しても、ウシの第一胃内の微生物の栄養源として利用されてしまうおそれもあった。
【０００７】
【特許文献１】
特許第２９９０２４８号公報
【０００８】
【非特許文献１】
Ｔａｍａｉ，Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．、“Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｏｆ  ｃａｒｔｉｌａｇｉｎｏｕｓ  ｉｎｊｕｒｉｅｓ  ｂｙ  ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ．”、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，  （英国）、２００２年、４８巻、ｐ．３６９−３７８。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
上記問題に鑑み、本発明は、ウシ関節疾患の予防および治療のための、低コスト、高効率吸収の機能性飼料の開発を目的とする。より詳細には、ウシのための非晶化キチンを含む機能性飼料の開発を目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ウシにＧｌｃＮを投与しても第一胃内に存在する微生物により分解されてしまうが、非晶化キチンは分解されないことを見出し、さらに、Ｔａｍａｉ等によって実験的に証明されたウサギにおけるＤ−グルコサミン（ＧｌｃＮ）の関節軟骨修復効果（非特許文献１）に注目し鋭意研究を重ねた結果、ウシに非晶化キチンを投与すると軟骨修復効果を有することを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、非晶化キチンを含むことを特徴とする反芻動物のための飼料、関節疾患予防治療剤および抗炎症剤を提供する。軟骨破壊抑制剤または軟骨形成促進剤である反芻動物関節疾患予防治療剤を提供する。
【００１２】
また、本発明は、上記反芻動物のための飼料、関節疾患予防治療剤または抗炎症剤を製造するための非晶化キチンの使用を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、ウシ関節疾患の治療または予防のための、非晶化キチン、上記反芻動物飼料および上記反芻動物関節疾患予防治療剤の使用を提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、ウシ炎症の治療または予防のための、非晶化キチン、上記反芻動物飼料および上記反芻動物抗炎症剤の使用を提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、ウシの関節疾患を治療する方法であって、上記非晶化キチン、上記反芻動物飼料、上記反芻動物関節疾患予防治療剤を投与することを含む方法を提供する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施形態の詳細を説明する。
【００１７】
本発明に使用する非晶化キチンは、非晶質のキチンであり、どのような方法によって製造されてもよい。たとえば特許文献１に記載されているように、キチンをアルカリ処理等することによって製造することができる。まず、キチンの粉末を所定濃度のアルカリ水溶液に浸漬し、室温で数時間〜十数時間程度放置した後、塩酸等の酸で中和するか、またはアルコール類やイオン交換樹脂等で脱アルカリする。その後、アセトンやメタノール等の有機溶媒中に滴下すれば非晶質のキチンが沈殿してくるので、これを濾別し、蒸留水等で充分に洗浄して脱塩等を行えば、精製品を得ることができる。なお、アルカリ水溶液としては、アルカリ金属水酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、炭酸アルカリ金属塩等の水溶液を使用すればよいが、特にＮａＯＨ、ＫＯＨの水溶液が望ましい。
【００１８】
また、本発明に使用される非晶化キチンは、好ましくは脱アセチル化されていない非晶質のキチンであるが、これに限定されるものではなく、均一に部分脱アセチル化された非晶質のキチンであってもよい。特に好ましくは、天然に存在するキチンである。
【００１９】
上記脱アセチル化されていない非晶化キチンは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位の含量が１００％の非結晶質物質である。他方、上記均一に部分脱アセチル化されたキチンは、所定含量のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位とＤ−グルコサミン単位とからなるランダムに脱アセチル化された非晶質物質である。このような均一に部分脱アセチル化されたキチンを調製するには、たとえば上記と同様にキチンをアルカリ処理した後、これに氷を加えて攪拌するか、または分散液を直接凍結し、次に解凍する操作を繰り返して、非晶質のキチンのドープ（アルカリキチンドープ）を調製する。なお、このドープには、均一に部分脱アセチル化されたキチンの分子量低下を抑えるために、必要に応じてチオフェノールやＮａＢＨ４等をあらかじめ添加しておいてもよい。次いで、上記と同様の操作を行ってドープを５０℃以下で所定時間熟成させて脱アセチル化することにより精製品を得ることができる。
【００２０】
次に、本発明の反芻動物飼料を製造するには、たとえば上記作製した非晶化キチンを所望の飼料中に添加して混合し、必要に応じて成形すればよい。特に、上記非晶化キチンを濃厚飼料中に添加して混合し、必要に応じて成形することによって得ることもできる。また、飼料に配合する非晶化キチンは、水などの液体により膨潤した状態が望ましい。どのような形態の物であってもよく、たとえば水などの液体により膨潤した状態であってもよく、また乾燥した状態であってもよい。
【００２１】
本発明の飼料には、非晶化キチン以外にも、必要に応じて種々の材料を配合、添加することができる。たとえば、ビタミンＡ群、ビタミンＢ群、ビタミンＣもしくはビタミンＫ等のビタミン類、抽出によって得られたエキス類、着色料、香味料、油類、抗生物質などの薬剤またはその他などを添加することができる。これらの添加物等は、たとえば上記した所望の飼料と非晶化キチンの混合工程において添加することができる。
【００２２】
本発明の飼料の形態としては、上記の通り所望の飼料と非晶化キチンを単に混合して粉末状、顆粒状とした物だけでなく、たとえば水と混合して液状、練り状またはペレット状としたものであってもよい。セルロ−スもしくは乳糖等の賦型剤、卵殻カルシウムもしくはステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤を使用してもよい。
【００２３】
また、本発明の飼料には、非晶化キチンがいずれの割合で含まれていてもよく、特に制限される物ではない。
【００２４】
次に、本発明の反芻動物関節疾患予防治療剤および反芻動物抗炎症剤は、上記非晶化キチンを含有することを特徴とする。
【００２５】
また、本発明の関節疾患予防治療剤は、軟骨破壊抑制剤または軟骨形成促進剤が含まれる。
【００２６】
本発明の関節疾患予防治療剤および抗炎症剤には、非晶化キチン以外のいかなるものも必要に応じて配合、添加することができるが、非晶化キチンのみからなるものであってもよい。たとえば、上記飼料と同様に、非晶化キチンと飼料を混合しただけのものであってもよい。
【００２７】
本発明の関節疾患予防治療剤および抗炎症剤は、ウシ用製剤として通常用いられる形態のものであればいかなる形態で提供されてもよい。たとえば、粉末として、懸濁剤として、その他のいずれの形態で提供されてもよい。また、たとえば水などと混合して液状形態で提供されてもよい。さらに、錠剤として打錠したもの、またはセラック等でコ−ティングしたものなどであってもよい。本発明の製剤は、上記したうちの懸濁液であることが好ましい。また、本発明の製剤は粉末状であることが好ましい。通常、ウシに投与する場合は、経口で投与される方が便利であり、たとえば、以下の実施例において示したように濃厚飼料に混合して提供されてもよい。
【００２８】
さらに、本発明の関節疾患予防治療剤および抗炎症剤は、上記のような飼料と混合して該製剤を含む飼料として提供されてもよい。
【００２９】
また、上記記載の非晶化キチン、非晶化キチンを含む飼料または非晶化キチンを含む製剤は、ウシ関節疾患もしくは炎症の治療または予防のために使用される。上記記載の非晶化キチン、非晶化キチンを含む試料または非晶化キチンを含む製剤は、以下の実施例に示したように、水に溶解して水溶液、懸濁液として、ウシに強制給餌させてもよく、濃厚飼料等の飼料として給餌させてもよい。また、通常の給餌の際にこれらを給餌するだけでもよい。
【００３０】
上記のように、本発明の非晶化キチン、非晶化キチンを含む飼料または非晶化キチンを含む製剤をウシに投与することにより、ウシ関節疾患を治療または予防することができる。
【００３１】
本発明の非晶化キチン、飼料、関節疾患予防治療剤および抗炎症剤をウシに対して投与する場合、非晶化キチンが１日当たり通常約５０ｇ程度摂取される量で含有されていることが好ましいが、この量に制限されず、当業者であれば体重、年齢、その他の因子を考慮して適切な投与量で投与することができるであろう。たとえば、非特許文献１に記載されたウサギ関節損傷モデルにおけるＧｌｃＮの関節軟骨修復効果を参考に定めればよい。
【００３２】
また、軟骨修復効果は、本発明の飼料、関節疾患予防治療剤および抗炎症剤を一過性に大量投与するよりも、低容量で長期間持続的に投与することが好ましい。したがって、非晶化キチンの投与は、一回に大量投与するよりも、数回に分けて持続的に投与することが好ましい。また、関節疾患のウシだけでなく健康なウシに投与してもよく、この場合は予防として使用される。
【００３３】
本発明の非晶化キチン、非晶化キチンを含む飼料または製剤は、専らウシに対して有効であるが、ウシ以外にも有効であればその他の反芻動物における関節疾患もしくは炎症の治療または予防に使用されてもよい。
【００３４】
ウシの関節疾患を治療する方法として、上記記載のように、非晶化キチン、非晶化キチンを含む飼料または製剤をウシに投与することにより、関節疾患を治療することもできる。
【００３５】
【発明の効果】
本発明の非晶化キチンを含有する飼料、関節疾患予防治療剤および抗炎症剤は、優れた軟骨形成促進作用、軟骨破壊抑制作用、破骨細胞減少作用、抗炎症作用を有するので、関節疾患（軟骨疾患およびそれらの類似疾患における関節軟骨の破壊等）の予防，治療に用いることができる。本発明の飼料、関節疾患予防治療剤および抗炎症剤は、他の関節疾患治療剤と共に用いることもできる。たとえば、軟骨破壊抑制・軟骨細胞分化誘導促進剤として使用する場合、他の関節疾患治療剤と組み合わせて使用することにより、さらなる治療効果も期待できる。本発明の非晶化キチンを含有する飼料、関節疾患予防治療剤および抗炎症剤は、軟骨疾患の予防、治療、軟骨組織の修復再生等に合致した、安全で効能の高い製剤として用いられる。たとえば軟骨形成促進作用を効率的に発揮させ、関節軟骨の疲弊あるいは破壊により支障をきたしているウシの死廃事故を改善することが可能である。
【００３６】
また、本発明の飼料、関節疾患予防治療剤および抗炎症剤をウシに給餌または投与することにより、ウシ関節疾患を治療または予防することができる。
【００３７】
【実施例】
（１）  材料
１）  供試動物
臨床的に健康なウシ１１頭（ホルスタイン，体重約  ３００  ｋｇ，雄，平均  ７ヶ月齢）を用いた。供試動物は搬入後１週間環境馴化した後、実験に供した。
【００３８】
２）  供試薬
・Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮ）  ：  甲陽ケミカル（株）（東京）より提供された。
本供試薬はカニ殻から抽出したキチンを塩酸で処理して得られたＤ−グルコサミンの塩酸塩でｐＨ３．８である。またＤ−グルコサミンの純度は１００  ％で、タンパク質等の異物の混入は認められなかった。
【００３９】
・Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）  ：  甲陽ケミカル（株）（東京）より提供された。本供試薬はカニ殻から抽出したキチンを酵素分解して得られたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの塩酸塩でｐＨ６．５である。またＮ−アセチルＤ−グルコサミンの純度は１００  ％で、タンパク質等の異物の混入は認められなかった。
【００４０】
・キチン  ：  サンファイブ（株）（鳥取）より提供された。
【００４１】
本供試薬は平均粒径２７．６  μｍのキチン微粉末で、脱アセチル化度（以下、ＤＡＣ度）は２％である。
【００４２】
・キトサン  ：  サンファイブ（株）（鳥取）より提供された。
【００４３】
本供試薬は平均粒径５１．４  μｍのキトサン粉末で、ＤＡＣ度は８７．９  ％である。
【００４４】
・非晶化キチン（ＮＣ−キチン）  ：  キチン微粉末を強アルカリ処理により、キチン分子間の水素結合を解離し得られた物質で、ｐＨ  ７．２である。以下に作製法を示す。キチン微粉末１００ｇに対し、４０  ％（１６．７Ｎ）水酸化ナトリウム水溶液１ｋｇ、および氷１ｋｇを加え１２時間室温で放置する。その後、濃塩酸８００  ｇと１ｋｇの氷を加え、中和した。最後に熱水にて洗浄をしてＮＣ−キチンを得た。
【００４５】
・キチンオリゴマー（ＮＡＣＯＳ）：  ６量体のキトサンオリゴマー（ＮＡＣＯＳ６）（キトヘキサオース，焼津水産化学工業，静岡）を使用した。
【００４６】
（２）  方法
１）Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮ）の経口投与後の血中動態
ａ．投与方法および採血
ＧｌｃＮ  １５０  ｇを５００  ｍｌの水道水に溶解し、ウシ１頭に経口投与後、経時的に頸静脈から採血した。採血は、投与前（ｐｒｅ）、投与後  １０、３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、３６０、７２０、１４４０  分に行った。
【００４７】
ｂ．血中ＧｌｃＮ測定
血中に含まれるＧｌｃＮ量の測定は本学工学部物質工学科重政研究室に依頼した。測定方法を以下の１〜３に示す。
【００４８】
１．  採取した血液を遠心（３，０００  ｒｐｍ×１５  ｍｉｎ）した後、得られた血漿を濾過  （Ｍｉｌｌｅｘ  ０．４５  μｍ，ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）した。
【００４９】
２．さらに血漿を遠心（１１，０００  ｇ×９０  ｍｉｎ）による限外濾過（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ  Ｃｕｔ
ｏｆｆ  ５０００，ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）した。
【００５０】
３．限外濾過した血漿の５０  μｌを投入量とし、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を実施した。設定条件を以下に示す。
【００５１】
・カラム：ＮＨ２Ｐ‐５０  ４Ｅ（ＳＨＯＤＥＸ，昭和電工，東京）
・流速：０．６  ｍｌ／ｍｉｎ
・温度：４０℃
・移動相：ＣＨ３ＣＮ（アセトニトリル）：Ｈ２Ｏ  ＝  ８０：２０
２）第１胃胃汁による非晶化キチン（ＮＣ−キチン）の分解実験
ａ．第１胃胃汁採取方法
２頭のウシの左けん部（寛結節と最後肋骨間）より、１４Ｇ注射針（長さ  ２０  ｃｍのものを特別注文により作製，ＧＯＴＯ＆ＣＯ，東京）を体軸と垂直方向に刺入し、第１胃胃汁（以下、胃汁とする）５０  ｍｌ採取した。採取した胃汁の２５  ｍｌについて、ホモジナイザー（ＰＯＬＹＴＲＯＮ，ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ  ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、胃汁内プロトゾアを破壊（室温下、胃汁５ｍｌに対し５分間）した。これら微生物の破壊は胃汁の直接鏡検により確認した。
【００５２】
ｂ．ＮＣ−キチンの分解実験
採取した胃汁およびそれをホモジナイズして得られた液（以下胃汁ホモジナイズ液）によるキチンの分解実験は鳥取県産業技術センターに依頼した。方法の概略を以下の１〜３に示す。
【００５３】
１．    ０．１  ｇ／５０  ｍｌとなるように蒸留水で調整したＮＣ−キチン懸濁液５  ｍｌ（絶乾重量で０．０１  ｇ）、０．２  Ｍ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．７）２．５  ｍｌ、胃汁または胃汁ホモジナイズ液１  ｍｌ、蒸留水１．５  ｍｌを混和し、３７℃の振盪下でインキュベートした。
【００５４】
２．  １７および６６時間後に反応液の一部を採り、１５分間沸騰水にて温浴後、遠心（６，０００  ｒｐｍ×１５  ｍｉｎ）した。
【００５５】
３．  遠心分離した上清の５０  μｌをカラムに投入し、ＨＰＬＣ分析をした。設定を以下に示す。
【００５６】
・カラム：ＮＨ２Ｐ‐５０  ４Ｅ（ＳＨＯＤＥＸ、昭和電工、東京）
・流速：１  ｍｌ／ｍｉｎ
・温度：３０℃
・移動相：ＣＨ３ＣＮ（アセトニトリル）：Ｈ２Ｏ  ＝  ７０：３０
３）第１胃胃汁によるキチンオリゴマー（ＮＡＣＯＳ）の分解実験
２頭のウシより採取した胃汁および胃汁ホモジナイズ液によるＮＡＣＯＳ６の分解実験を鳥取県産業技術センターに依頼した。方法の概略を以下の１〜３に示す。
【００５７】
１．    ６  ｍｇ／  ３  ｍｌとなるように蒸留水で調整したＮＡＣＯＳ６水溶液  ０．５  ｍｌ、  ０．２  Ｍ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．７）０．２５  ｍｌ、胃汁または胃汁ホモジナイズ液１  ｍｌ、蒸留水０．１５  ｍｌを混和し、３７℃の振盪下でインキュベーとした。
【００５８】
２．  １６および４８時間後に反応液の一部を採り、遠心（６，０００  ｒｐｍ×５  ｍｉｎ）した。
【００５９】
３．  遠心分離した上清の５０  μｌをカラムに投入し、ＨＰＬＣ分析をした。設定はＮＣ‐キチンの分解実験の場合と同条件で行った。
【００６０】
４）Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮ）およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）と胃汁との反応
１頭のウシより採取した胃汁および胃汁ホモジナイズ液によるＧｌｃＮおよびＧｌｃＮＡｃと胃汁との反応実験を鳥取県産業技術センターに依頼した。方法の概略を以下の１〜３に示す。
【００６１】
１．  ６．４  ｍｇ／３  ｍｌとなるように蒸留水で調整した単糖（ＧｌｃＮおよびＧｌｃＮＡｃ）水溶液０．５  ｍｌ、０．２  Ｍ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．７）０．２５  ｍｌ、胃汁または胃汁ホモジナイズ液  ０．１  ｍｌ、蒸留水０．１５  ｍｌを混和し、３７℃の振盪下で反応させた。胃汁または胃汁ホモジナイズ液は加熱処理（沸騰水による１５分間の温浴）を行ったものについても同様に実施した。
【００６２】
２．  １４．５および３９時間後に反応液の一部を採り、遠心（６，０００  ｒｐｍ×５  ｍｉｎ）した。
【００６３】
３．  遠心分離した上清の５０  μｌをカラムに投入し、ＨＰＬＣ分析をした。設定はＮＣ−キチンの分解実験と同条件で行った。
【００６４】
５）Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮ）およびその類似物質の経口投与による軟骨修復実験
ａ．実験群
供試薬投与期間を２週間とし、計１０頭のウシを実験に供した。１０頭のウシは、コントロール群（以下、Ｃ群）、ＧｌｃＮ投与群（以下、ＧｌｃＮ１群）、ＧｌｃＮＡｃ投与群（以下、ＧｌｃＮＡｃ群）に各２頭ずつ、ＧｌｃＮ３倍量投与群（以下、ＧｌｃＮ２群）、キチン微粉末投与群（以下、Ｃｈｉｔｉｎ群）、キトサン微粉末投与群（以下、Ｃｈｉｔｏｓａｎ群）、ＮＣ−キチン投与群（以下、ＮＣＣ群）に各１頭ずつ群分けした。
【００６５】
ｂ．関節軟骨損傷の作製法
Ｉ）麻酔
全身麻酔は、キシラジン（セラクタール，バイエル（株），東京）０．２  ｍｇ／ｋｇを筋肉内投与（以下、Ｉ．Ｍ．）で鎮静した後、塩酸ケタミン（ケタラール５０，三共（株），東京）３ｍｇ／ｋｇの静脈内投与（以下、Ｉ．Ｖ．）によって実施した。さらに第四固有掌側指静脈からリドカイン（キシロカイン注射液２％，ゼネカ薬品（株），大阪）２００  ｍｇ／ｈｅａｄ、Ｉ．Ｖ．による局所静脈内麻酔を実施した。手術終了直後に塩酸アチパメゾール（アンチセダン，明治製菓（株），東京）０．５  ｍｇ／ｋｇ  Ｉ．Ｍ．でキシラジンの作用を拮抗し、麻酔からの覚醒を促進させた。
【００６６】
ＩＩ）手術方法および術後管理
麻酔鎮静下において供試ウシを左側に横臥させ、右前肢を除く四肢の
球節を平打縄で緊縛した。右前肢は平打縄で球節上部を柱に縛定し、提挙させた。この状態で、供試ウシの右側球節部を剪毛し、グルコン酸クロルヘキシジン（ヒビスクラブ，ゼネカ薬品（株），大阪）と５０％イソプロピルアルコール液（イソプロ５０，日本新薬（株），京都）で交互に消毒後、球節外側からアプローチし、皮膚を中手骨遠位骨幹端から基節骨に向かって縦切開した。さらに、関節包を切開し、第四中手骨関節部を露出した。第四中手骨関節部の外側滑車稜、滑車溝、縦稜の計３カ所に直径２  ｍｍ、深さ５  ｍｍの孔をパワードリル（マイクロエンジンＤ−２，オサダメデイカル（株），東京）で作製した（図１）。その後、手術創を生理食塩水で十分洗浄し、関節包を合成吸収糸（３−０  ＭＡＸＳＯＮ，Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  Ｄａｖｉｓ＆Ｇｅｃｋ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて縫合、閉鎖した。皮下組織と皮膚はナイロン糸（０  Ｓｕｐｒｙｌｏｎ，Ｖｏｍｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で縫合した。
【００６７】
術後１週間は、１日１回、創面をポビドンヨード（イソジン液，明治製菓（株），東京）で消毒し、抗菌剤としてベンジルペニシリンプロカイン１万単位、硫酸ジヒドロストレプトマイシン１２．５  ｍｇ（マイシリンゾル明治，明治製菓（株），東京）を感染予防の目的で１日２回７日間Ｉ．Ｍ．によって行った。
【００６８】
ｃ．供試薬の投与方法
試験物質は、ＮＣ−キチンを除き、全て５００  ｍｌペットボトルを用いて強制給餌した。ＮＣ−キチンについては濃厚飼料に混合して給餌した。ＮＣ−キチンを除いた全てのサンプル群には、それぞれ１日量の試験物質を５００  ｍｌの水道水に溶解し、それらを完全に飲水させたことを確認した後に、水道水を自由飲水とした。
【００６９】
Ｃ群には、水道水５００  ｍｌ／ｈｅａｄ／ｄａｙを投与した。ＧｌｃＮ１群には、ＧｌｃＮ  ５０  ｇ／ｈｅａｄ／ｄａｙを投与した。ＧｌｃＮＡｃ群には、ＧｌｃＮＡｃ  ５０  ｇ／ｈｅａｄ／ｄａｙを投与した。ＧｌｃＮ２群には、ＧｌｃＮ  １５０  ｇ／ｈｅａｄ／ｄａｙを投与した。Ｃｈｉｔｉｎ群にはキチン微粉末５０  ｇ／ｈｅａｄ／ｄａｙを投与した。Ｃｈｉｔｏｓａｎ群にはキトサン微粉末５０  ｇ／ｈｅａｄ／ｄａｙを投与した。ＮＣＣ群にはＮＣ−キチン５００  ｇ／ｈｅａｄ／ｄａｙ（キチン乾物重量として  ５０  ｇ／ｈｅａｄ／ｄａｙ）を投与した。
【００７０】
すべての群において投与期間は２週間とした。
【００７１】
ｄ．  損傷部位の肉眼的および組織学的検索
Ｉ）肉眼的検索
キシラジン  ０．２  ｍｇ／ｋｇ，  Ｉ．Ｍ．、塩酸ケタミン  ３ｍｇ／ｋｇ、Ｉ．Ｖ．による全身麻酔下で頸静脈カテーテル留置法により放血殺を行い、右側第四中手骨を採材した。第四中手骨関節部に作製した欠損孔の修復程度について肉眼的に観察した。修復程度は欠損孔における結合組織等の充填程度を肉眼的に評価し、以下のように点数化を行った。
【００７２】
５０  ％  未満：０点、７５  ％  未満：１点、１００  ％  未満：２点
１００  ％  完治：３点。
【００７３】
ＩＩ）組織学的検索
１．  染色方法
右側第四中手骨関節部を、１０  ％中性緩衝ホルマリン水溶液（ホルムアルデヒド液，和光純薬工業（株），大阪）で固定した。固定後、組織片の厚さを５ｍｍにトリミングし、５％蟻酸溶液（蟻酸，和光純薬工業（株），大阪）で１日振盪下で脱灰した。脱灰終了後５％硫酸ナトリウム溶液（硫酸ナトリウム，和光純薬工業（株），大阪）に１日浸漬して中和し、その後約１０時間水洗した。脱灰の完了した組織片を修復部位が縦断面になるように切り出した。切り出しを行った組織切片について、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色、サフラニンＯ染色（プロテオグリカンの特異染色）およびアルシアンブルー染色（ｐＨ２．５）（グリコサミノグリカンの特異染色）の標本作製をファルコバイオシステムズ（株）（京都）に依頼した。
【００７４】
２．  修復率の測定
顕微鏡観察下でマイクロメーターを用いて損傷孔の深度を測定し、当初の５ｍｍの深さに対する修復度（％）を求めた（図２）。
【００７５】
３．  破骨細胞数の測定
顕微鏡観察下で欠損孔損傷部位におけるすべての破骨細胞数を計測した。
【００７６】
４．  損傷孔周囲における火傷領域の計測
顕微鏡観察下でマイクロメーターを用いて損傷孔周囲にドリリングにより発生した関節軟骨の火傷領域の幅を測定した（図３）。
【００７７】
５．    特殊染色標本を用いた画像解析
サフラニンＯ染色およびアルシアンブルー染色（ｐＨ２．５）標本において損傷部位および関節軟骨における２００倍像を  Ｐｈｏｔｏｇｒａｂ  ａｂ−３００  ｖｅｒｓｉｏｎ    １．０（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ，東京）を用いて画像を取り込み、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ５．０    （Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍ，東京）を用いてデジタル化し、全画像領域（２０４８×    １５３６ピクセル）に対し１０  ヶ所を無作為に設定し、目的とする色調（プロテオグリカン：マゼンタ（赤）、グリコサミノグリカン：シアン（青））の占有率（％）を画像処理により測定した。
【００７８】
６．  統計処理
求めた数値は統計処理（スチューデント  ｔ  検定，マイクロソフト  エクセル  ２０００，Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を実施し、５％未満を有意な変化と判定した。
【００７９】
（３）  成績
１）Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮ）の経口投与による吸収
ＧｌｃＮ  １５０  ｇ経口投与後の血中ＧｌｃＮの経時的変化を図４に示した。いずれの採血時間においてもＧｌｃＮは検出されなかった。
【００８０】
２）第１胃胃汁によるＮＣ−キチンの分解
胃汁または胃汁ホモジナイズ液とＮＣ−キチンによる反応の分析結果（１７および６６時間後）を図５および６に示した。１７および６６時間後のいずれにおいてもＮＣ−キチンの分解は確認できなかった。
【００８１】
３）第１胃胃汁によるキチンオリゴマー（ＮＡＣＯＳ）の分解
胃汁とＮＡＣＯＳ６による反応液の分析結果（１６および４５時間後）を図７および８に示した。１６時間後において、両者でＮＡＣＯＳ６の分解が確認された（図７）。４５時間後においてはこれらの分解が進んでいることが確認された（図８）。
【００８２】
４）Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮ）およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）と第１胃胃汁の反応
ＧｌｃＮおよびＧｌｃＮＡｃと胃汁または胃汁ホモジナイズ液との反応液の分析結果（１４．５および３９時間後）を図９〜１２に示した。ＧｌｃＮおよびＧｌｃＮＡｃの両方とも、胃汁および胃汁ホモジナイズ液との反応により分解（図９および１１）、消失（図１０および１２）することが確認された。しかし、加熱処理胃汁および胃汁ホモジナイズ液では分解されないことが確認された。
【００８３】
５）Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮ）および類似物質の経口投与による軟骨修復実験
１．  肉眼所見
２週間後の各群の欠損孔を図１３および１４に示した。Ｃ群において欠損孔は作製時とほぼ同様の外観を呈し、周囲組織では炎症が認められた。
【００８４】
ＧｌｃＮ１およびＧｌｃＮ２群においては欠損孔の修復部分は光沢を呈し、Ｃ群と比較して明らかに高い修復度を示すものもあった。ＧｌｃＮＡｃ、  Ｃｈｉｔｉｎ、  Ｃｈｉｔｏｓａｎ群についてはＣ群とほぼ同様の所見であった。ＮＣＣ群はＧｌｃＮ１およびＧｌｃＮ２群と比較して修復度は劣るものの、欠損孔の修復部分に光沢がみられ、明らかに欠損孔の修復は認められた。
【００８５】
肉眼的な修復程度を点数化したものを表１および図１５に示した。ＧｌｃＮ１およびＮＣＣ群ではＣ群に対する修復程度の有意な増加が認められた。しかし、他群では有意な増加はみられなかった。
【００８６】
【表１】
2004256402.tif 000003
【００８７】
２．  修復率
修復率を表２および図１６に示した。ＧｌｃＮ１、ＧｌｃＮ２、ＧｌｃＮＡｃおよびＮＣＣ群において、Ｃ群に対して高い修復率を示したが、有意差はみられなかった。また、各群間での有意差はみられなかった。
【００８８】
【表２】
2004256402.tif 000004
【００８９】
３．  破骨細胞数
損傷部位における破骨細胞の出現数を表３および図１７に示した。ＧｌｃＮ１、ＧｌｃＮ２およびＮＣＣ群においてＣ群に対し、破骨細胞数の有意な減少が認められた。ＣｈｉｔｉｎおよびＣｈｉｔｏｓａｎ群ではＣ群と比較して破骨細胞数は少なかったが、有意差は認められなかった。ＧｌｃＮＡｃ群ではＣ群とほぼ同様の破骨細胞の出現が確認された。各群間の比較を行った結果、ＮＣＣ群に対しＧｌｃＮ１群において破骨細胞数の有意な減少が認められた。しかし、ＧｌｃＮ２とＮＣＣ群間には有意差はみられなかった。
【００９０】
【表３】
2004256402.tif 000005
【００９１】
４．  火傷領域幅
火傷領域幅の測定結果を表４および図１８に示した。ＧｌｃＮ１、ＧｌｃＮ２および  Ｃｈｉｔｉｎ群においてＣ群に対する火傷領域幅の有意な減少が認められた。ＧｌｃＮ１、ＧｌｃＮ２およびＣｈｉｔｉｎ群間での比較を行った結果、ＧｌｃＮ群がＮＣＣ群よりも火傷領域幅の有意な減少を認めた。  しかしＧｌｃＮ１  とＧｌｃＮ２群、  ＧｌｃＮ２とＣｈｉｔｉｎ群の間では有意差はみられなかった。
【００９２】
【表４】
2004256402.tif 000006
【００９３】
５．  組織学的所見
各群の組織像を図１９〜２４に示した。Ｃ群では欠損孔の肉芽組織による充填、炎症像が観察された。損傷部において正常軟骨、骨小柱の欠損を認めた。骨小柱損傷部には破骨細胞の浸潤が多数見られた（図１９）。サフラニンＯおよびアルシアンブルー染色においては、軟骨損傷部において濃染部位はほとんど確認できなかった（図１９）。ＧｌｃＮ１群では、炎症性細胞が多く観察されたが、欠損孔周囲における骨小柱の内骨膜において幼弱な線維芽細胞の増生が確認された（図２０）。サフラニンＯ染色においては肉眼的に各群間の染色性に差異は認められなかった。
しかし、アルシアンブルー染色においてはＣ群と比べて各群において明らかに組織の濃染が確認された。ＧｌｃＮ２群では、ＧｌｃＮ１群とほぼ同様な組織像が観察された。ＧｌｃＮＡｃ群では、Ｃ群と同様の組織像が観察されたが、標本によっては出血および欠損孔周囲における破骨細胞の浸潤が著しく、Ｃ群よりも激しい炎症反応がみられるものもあった（図２２）。サフラニンＯ染色およびアルシアンブルー染色においても肉眼での評価ではＣ群と同様であった。ＣｈｉｔｉｎおよびＣｈｉｔｏｓａｎ群においては、Ｃ群と同様の組織所見であった。ＮＣＣ群においてはＧｌｃＮ１およびＧｌｃＮ２群と同様に欠損孔周囲の骨小柱の内骨膜より、幼弱な線維芽細胞の増殖が見られた。ＮＣＣ群のサフラニンＯ染色においてはＣ群と同様で、組織の濃染はみられなかったが、アルシアンブルー染色において、Ｃ群よりもわずかに組織が濃染しているものがみられた（図２５）。
【００９４】
６．画像解析
ａ．軟骨損傷部位
軟骨損傷部位における画像解析結果を表５〜６および図２６〜２７に示した。サフラニンＯ染色ではＧｌｃＮ１群にのみＣ群に対して有意な組織の濃染を示した。ＣｈｉｔｉｎおよびＮＣＣ群では、Ｃ群よりもサフラニンＯの濃染が認められたが、有意差は認められなかった。
【００９５】
【表５】
2004256402.tif 000007
【００９６】
【表６】
2004256402.tif 000008
【００９７】
アルシアンブルー染色では画像解析の結果、Ｃｈｉｔｉｎ群を除く全ての群でＣ群に対する組織の濃染が確認された。また、濃染の程度はＧｌｃＮ  およびＮＣＣ群が最も良好であった。Ｃ群に対して有意差を示した群間で比較を行った結果、ＧｌｃＮ１およびＧｌｃＮ２群が他の群に対して、有意なアルシアンブルーの濃染が認められた。しかし、ＧｌｃＮ１とＧｌｃＮ２群間には有意差は認められなかった。また、ＧｌｃＮＡｃがＣｈｉｔｏｓａｎ群に対して有意な組織の濃染を示した。上記以外の群間には有意差はみられなかった。
【００９８】
ｂ．正常軟骨部位
正常軟骨における画像解析結果を表７〜８および図２８〜２９に示した。サフラニンＯ染色では全ての群間で有意差はみられなかった。
【００９９】
アルシアンブルー染色ではＧｌｃＮ１およびＧｌｃＮ２群がＣ群に対して有意な組織の濃染を示した。ＧｌｃＮ１群とＧｌｃＮ２群との間には有意差はみられなかった。
【０１００】
【表７】
2004256402.tif 000009
【０１０１】
【表８】
2004256402.tif 000010
【０１０２】
（４）  考察
今回、Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮ）および各種キチン，キトサン関連物質の経口投与を行い、ＧｌｃＮおよび非晶化キチン（ＮＣ−キチン）においてウシにおける関節軟骨修復効果が認められた。今回各種試料の一日の投与量を５０  ｇと定めたが、この用量はＧｌｃＮの関節軟骨修復効果をウサギにおける関節損傷モデルで報告した、非特許文献１に記載の用量を参考にして定めた。ＧｌｃＮの用量は、ヒト領域で臨床的に効果があると認められている成人１日あたり  １．０〜１．５  ｇと比較すると、体重あたりの用量ははるかに多いが、実験期間中、食欲不振、下痢などの副作用を示唆する兆候は認められなかった。これはその他の試料についても同様であった。
【０１０３】
肉眼的観察においてはＧｌｃＮ１群、ＮＣＣ群においてＣ群に対する有意な損傷孔の修復が認められた。一方、ＧｌｃＮ２群においては有意な修復効果はみられなかった。
また組織学的に修復率の測定を行った結果、Ｃ群に対して有意な修復率の上昇を示すものがみられなかった。このことから、今回の実験において、ＧｌｃＮのウシに対する経口投与ではウサギで見られるような著明な損傷孔の修復（非特許文献１）はみられないことが明らかとなった。
【０１０４】
破骨細胞数の測定結果では、ＧｌｃＮ１、ＧｌｃＮ２およびＮＣＣ群でＣ群に対する有意な減少がみられた。破骨細胞は、破壊された骨および軟骨の処理に出現することから、骨および軟骨における炎症の強さの指標になると考え、今回測定を行った。
ＧｌｃＮの単独投与では損傷した骨小柱の処理が速やかに行われることが分かっており（非特許文献１）、今回の実験でも破骨細胞は早期に活性化され、遊走が終了した時期であったと推察された。ＮＣＣ群についても、後に記す第４胃でのＧｌｃＮへの変換により同様の結果になったものと思われる。これらの投与群では、組織学的にもＣ群に比べ損傷部位の炎症が消失しているのが観察された。軟骨損傷が発生すると、表面から剥離した微小な軟骨片が滑膜を刺激し、白血球を遊走させ、さらにフリーラジカルやサイトカイン、プロスタグランジンの産生が誘起されることによって関節症が進行することが報告されている  （Ｃａｎａｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．  Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｒｅｓ．  ６０：１５５２−１５５７，  １９９９）。炎症が消失している背景には、グルコサミンの持つシクロオキシゲナーゼ非依存性の抗炎症作用（Ｓｅｔｎｉｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ．  ４１  ：１５７−  １６１．  １９９１）およびフリーラジカルのスカベンジャーとしての働きが関係しているものと思われた。
【０１０５】
今回、損傷部位の細胞外マトリックスの修復状態を、特殊染色した切片を用いて画像解析を行った。特殊染色のうち、サフラニンＯ染色はプロテオグリカンを赤色に染め、アルシアンブルー染色（ｐＨ  ２．５）ではアルシアンブルー色素がカルボキシル基と硫酸基にイオン結合し、酸性のグリコサミノグリカンが青色に染色される。軟骨損傷部ではＧｌｃＮ１群にのみ、Ｃ群に対するプロテオグリカンの有意な増加が認められた。一方、損傷部のグリコサミノグリカンはＣｈｉｔｉｎ群を除く全ての群で増加が認めらた。これらの結果を総合して考えると、アルシアンブルー染色における青色（シアン）の検出感度が高すぎる感があるが、ＧｌｃＮおよびＮＣＣ群においてグリコサミノグリカンが増加したものの、ＮＣＣ群ではグリコサミノグリカンの集合体であるプロテオグリカンの形成までには至らなかったと考えられた。軟骨正常部位についても同様の画像解析を行ったところ、サフラニンＯ染色においては有意な増加が見られなかったが、アルシアンブルー染色においては有意な増加が見られた。非特許文献１にはウサギへの    ＧｌｃＮ経口投与により正常軟骨でのプロテオグリカンおよびグリコサミノグリカンの有意な上昇を報告している。今回の結果より、ウシにおいては、ＧｌｃＮ経口投与により正常軟骨のプロテオグリカンには影響を与えないが、グリコサミノグリカンには影響を与えることが示唆された。また、今回の実験ではグルコサミンの用量を５０および１５０  ｋｇ／ｈｅａｄ／ｄａｙの２つの場合で検討したが、両者の成績に有意差はみられず、用量依存性の軟骨修復効果は認められなかった。ラットによる実験でグルコサミンの経口投与では、経口投与後３０分で血漿中ＧｌｃＮ濃度が最大となり、その後、急速に代謝されることが確かめられている  （Ａｇｈａｚａｄｅｈ−Ｈａｂａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  Ｍａｙ−Ａｕｇ  ５：１８１−１８４．，  ２００２）。この報告は、ＧｌｃＮの軟骨修復効果には一過性の大量投与よりも、低用量の長期間持続的投与が適することを示唆するものである。
【０１０６】
今回、ＧｌｃＮと同じく、キチン、キトサン関連天然アミノ多糖として、  Ｎ−アセチルＤ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を投与した。ＧｌｃＮＡｃはグルクロン酸と並んで軟骨細胞外マトリックスの主要成分の１つであるヒアルロン酸の構成成分である（Ｌａｕｒｅｎｔ，  Ｔ．  Ｃ．  １９８７．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ．  Ａｃｔａ．  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．    Ｓｕｐｐｌ．  ４４２：７−２４．）。ヒトではその積極的な補充によって変形性関節症の治療効果があると報告されている（Ｔａｌｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｔｈｅｒ．  １８：１１８４−１１９０．  １９９６）が、今回の実験では軟骨修復効果は認められなかった。本実験では軟骨損傷モデルとして、関節軟骨にパワードリルで損傷孔を作製しているため、孔およびその周囲では炎症が起きている。ＧｌｃＮＡｃには、ＧｌｃＮのような好中球による過剰なフリーラジカルを抑制する効果はないとされている（Ｈｕａ    ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ｌｅｕｋｏｃ．  Ｂｉｏｌ．  ７：６３２−６４０．  ２００２）。ＧｌｃＮＡｃ群の軟骨損傷部位の組織像がＧｌｃＮ１、ＧｌｃＮ２およびＮＣＣ群にみられるように抗炎症効果を示さなかったことはＨｕａ  ｅｔ  ａｌ  の報告を裏付けるものと思われる。
【０１０７】
ＧｌｃＮの経口投与による血中ＧｌｃＮ濃度の測定で、ＧｌｃＮは検出されなかった。このことは血漿中ＧｌｃＮ濃度が高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の検出限界よりも低かったためと推察された。少量の液体が摂取される場合、液体は食道溝（第二胃溝）の二つの粘膜ヒダにより形成される管を通じて、食道から直接第３胃に通じることが知られている（加藤  嘉太郎，  山本  昭二．  １９９６．  複胃の形態（内景）．  ｐｐ．  ２３４−２３５．  改著  家畜比較解剖図説  上巻（第二版），  養賢堂，  東京）。
この反応は食道溝反射（第２胃溝反射）と呼ばれ、離乳後５週間程度までは健在であるが  （Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｎｉｍ．  Ｓｃｉ．  ７８：  ２７２２−２７３０．  ２０００）、その後は年齢が進むにつれて減少していく。今回、実験に用いたウシは生後  ７ヶ月齢のものであることを考えると食道溝反射が十分であったとは考えにくく、投与したＧｌｃＮ水溶液のうち、かなりの量が第一胃に流入したと考えられた。従って、実際に第３胃および４胃を経由して、腸管から吸収されたＧｌｃＮがわずかであったため、ＨＰＬＣでは検出できなかったと考えられる。
【０１０８】
第一胃における吸収動態検索として、胃汁とＮＣ−キチン、ＮＡＣＯＳ６、  ＧｌｃＮおよびＧｌｃＮＡｃを反応させたが、ＮＣ−キチンを除く全ての試料は分解あるいは代謝された。反芻動物の第一胃内には、キチンを分解するキチナーゼ活性を有する細菌が存在することが知られている（Ａｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５３：１９５５−１９５８．  １９８４）。またＹｏｓｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．  Ｆａｃ．  Ａｇｒｉｃ．，  Ｔｏｔｔｏｒｉ  Ｕｎｉｖ．  ２７：４７−５１．（１９９１）は、ナイロンバッグ試験によりキチンが第一胃内で消化されることを観察している。しかし、その消化速度は２４時間で約５％、９６  時間でも約５０  ％と極めて緩徐であることを報告している。今回ＮＣ−キチンが分解されなかった原因として以下の事が考えられる。第一に今回の実験では分解産物の指標として、  ＮＡＣＯＳおよびＣＯＳを用いたが、こうした６糖のレベルまでキチンが分解されなかった可能性がある。第二に今回の反応が嫌気培養下でなかったため、分解速度は非常に緩徐で、微量のＮＡＣＯＳやＣＯＳを検出できなかった可能性がある。
【０１０９】
一方、ＮＡＣＯＳ６、ＧｌｃＮ、ＧｌｃＮＡｃと胃汁を反応させた場合では、分解および代謝が確認された。ＮＡＣＯＳ６、ＧｌｃＮおよびＧｌｃＮＡｃを利用する菌についてはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属をはじめ数多くの報告がある  （Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｏｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，  Ｓｔｒｕｇｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）。しかしウシの胃汁内の微生物について、その利用性を報告したものはＧｌｃＮＡｃについてのみであり（Ｋｏｐｅｃｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｏｌｉａ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４５：４６５−４６８．  １９９６，Ｏｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）、ＮＡＣＯＳ６およびＧｌｃＮ利用性を報告したものは筆者の知る限りではない。今回の実験で  ＮＡＣＯＳ６およびＧｌｃＮを分解する微生物が第一胃内に存在することを実際に確認できたことは非常に有用であったと考えられた。
【０１１０】
以上よりキチンについてはＮＡＣＯＳ６より小さな分子量であれば第一胃内で完全に分解されると考えられた。また胃汁とキチン、キトサン関連物質の反応については、今後嫌気培養下での分解実験ならびに  ＮＣ−キトサン、ＣＯＳ６の分解についても検討する必要があると思われる。
【０１１１】
今回、ウシ関節症予防を目的としてＮＣ−キチンを新たに作製し、その経口投与で軟骨修復効果を確認することができた。キチンを低分子化する方法については、希酢酸‐メタノール溶液にカルボン酸無水物を加えるアシル化による方法（Ｈｉｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｏｌｙｍｅｒ．  １６：６２２．  １９７５）、アルデヒドを加えるシッフ塩基形成による方法（Ｈｉｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．  ７１：３３９−３４３．  １９７９）が一般的である。今回作製したＮＣ−キチンは、均一系部分脱アセチル化キチンの作製過程で作られるアルカリキチンを濃塩酸で中和して得られる物質である。作製工程中に強アルカリ作用により、キチン分子間の水素結合が解裂しているため、低分子化されている。今回の実験でＮＣ−キチンが軟骨修復効果を示した背景には、ウシの第４胃内での分解によるＧｌｃＮの産生が期待される。キチンを濃塩酸で加水分解するとＧｌｃＮが得られる    （Ｓｔａｃｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｃｈｅｍ．  ２：２２８−２３０．  １９６２）。ウシの第４胃内のｐＨは３と強い酸性状態にあり（Ｓｉｅｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔａ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｐｏｌ．  ２９：５８１−５８８．  １９７８）、ＧｌｃＮの産生が軟骨修復効果を示した可能性がある。しかし、ＮＣ−キチンがそのままの形で腸管で分解、吸収され、体内でグリコサミノグリカンに変換された可能性も否定できず、今後この点について更なる検討が必要であると思われる。今回の実験ではキチン微粉末の経口投与も行っているが、軟骨修復効果は得られていない。キチンは分子鎖間および分子間に強固な分子間力を保持しており、巨大な結晶構造を有する（Ｂｕｆｆｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １０１：５１５９−５１６２．  １９７９）。キチンではこの強固な分子間力のため、第４胃における塩酸の加水分解に対して、非常に抵抗性であったと考えられた。またキトサン微粉末についてもキチンと同様、関節軟骨修復効果は認められなかった。キチナーゼ同様、キトサナーゼ活性をもつ細菌も反芻獣の第一胃に存在する（Ｋｏｐｅｃｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）が、ＮＣ−キチンの胃汁による分解実験を参考に考えると、単糖のレベルにまで分解することはできなかったものと思われた。
【０１１２】
今回、ＧｌｃＮ、ＮＣ−キチンはウシの関節症予防のための機能性飼料として、商品価値の可能性を見出すことができた。効果としてはＧｌｃＮの方が高かったが、製造コストの面から考えると、ＮＣ−キチンの方が機能性飼料としては適していると考えられた。今後の研究課題として、投与期間を延長させた場合の効果や、非晶化キトサンの効果、さらには軟骨細胞においてプロテオグリカンの合成を促進するといわれているアスコルビン酸  （ビタミンＣ）（Ｍｃｄｅｖｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｏｒｔｈｏｐ．  Ｒｅｓ．  ６：５１８−５２４．  １９８８）を合わせて添加した飼料の軟骨修復効果についての検討が必要である。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例における手術箇所を示す画像。
【図２】修復率の測定法を示す画像。
【図３】火傷領域幅の測定方法を示す画像。
【図４】ＧｌｃＮの経時的変化を示す図。
【図５】ＮＣ−キチンの分解を示す図。
【図６】ＮＣ−キチンの分解を示す図。
【図７】ＮＡＣＯＳ６の分解を示す図。
【図８】ＮＡＣＯＳ６の分解を示す図。
【図９】ＧｌｃＮの分解を示す図。
【図１０】ＧｌｃＮの分解を示す図。
【図１１】ＧｌｃＮＡｃの分解を示す図。
【図１２】ＧｌｃＮＡｃの分解を示す図。
【図１３】２週間後の欠損孔を示す画像。
【図１４】２週間後の欠損孔を示す画像。
【図１５】修復程度を点数化した図。
【図１６】修復率を示す図。
【図１７】損傷部位における破骨細胞の出現数を示す図。
【図１８】火傷領域幅の測定結果を示す図。
【図１９】Ｃ群の組織学的所見を示す顕微鏡写真。
【図２０】ＧｌｃＮ１群の組織学的所見を示す顕微鏡写真。
【図２１】ＧｌｃＮ２群の組織学的所見を示す顕微鏡写真。
【図２２】ＧｌｃＮＡｃ群の組織学的所見を示す顕微鏡写真。
【図２３】Ｃｈｉｔｉｎ群の組織学的所見を示す顕微鏡写真。
【図２４】Ｃｈｉｔｏｓａｎ群の組織学的所見を示す顕微鏡写真。
【図２５】ＮＣＣ群の組織学的所見を示す顕微鏡写真。
【図２６】軟骨損傷部位の画像解析結果を示す画像。
【図２７】軟骨損傷部位の画像解析結果を示す画像。
【図２８】軟骨損傷部位の画像解析結果を示す画像。
【図２９】軟骨損傷部位の画像解析結果を示す画像。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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