(57)【要約】      （修正有）【課題】病原真菌の検出に有効なオリゴヌクレオチド及びその組み合わせに関する。更に詳しくは該オリゴヌクレオチドを用いて病原真菌を検出する方法、ならびにその為の検出キットに関する。【解決手段】病原真菌特異的オリゴヌクレオチド配列の一部或いは全部を３種類同時に用いることにより、もしくは特定のオリゴヌクレオチド配列の一部或いは全部を２種類同時にプライマーとして用いることにより広範囲の病原真菌の18SrRNA遺伝子を検出することを特徴とする病原真菌遺伝子の検出方法、ならびに該オリゴヌクレオチド及び該オリゴヌクレオチドを含有する検出キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、２及び３に記載のオリゴヌクレオチド配列の一部或いは全部を３種類同時にプライマーとして用いることにより、広範囲の病原真菌の18S rRNA遺伝子をPCR法により増幅させて検出することを特徴とする病原真菌の検出方法。
【請求項２】
配列番号１、２及び３に記載のオリゴヌクレオチド配列の一部或いは全部を４：４〜１：４〜１の割合で３種類同時に用いる請求項１の検出方法。
【請求項３】
配列番号１及び４に記載のオリゴヌクレオチド配列の一部或いは全部を２種類同時にプライマーとして用いることにより、広範囲の病原真菌の18S rRNA遺伝子をPCR法により増幅させて検出することを特徴とする病原真菌の検出方法。
【請求項４】
配列番号１及び４に記載のオリゴヌクレオチド配列の一部或いは全部を１：２〜１の割合で２種類同時に用いる請求項３の検出方法。
【請求項５】
請求項１或いは３に記載のオリゴヌクレオチドの組み合わせからなる該オリゴヌクレオチドを含有することを特徴とする病原真菌遺伝子検出用キット。
【請求項６】
さらに請求項２或いは４に記載の割合で該組み合わせのオリゴヌクレオチドを含有する請求項５記載のキット。
【請求項７】
病原真菌遺伝子を検出するために用いられるオリゴヌクレオチドの組合せであって、（１）配列番号１に記載のオリゴヌクレオチド配列の一部或いは全部、或いはそれらの相補配列の一部或いは全部からなるオリゴヌクレオチド、および、（２）配列番号２〜４に記載のオリゴヌクレオチド配列より選択される１つ以上のオリゴヌクレオチドの一部或いは全部、或いはそれらの相補配列の一部或いは全部からなるオリゴヌクレオチド、からなるオリゴヌクレオチドの組合せ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は病原真菌の検出に有効なオリゴヌクレオチド及びその組み合わせに関する。更に詳しくは該オリゴヌクレオチドを用いて病原真菌を検出する方法、ならびにその為の検出キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】高度医療の普及に伴い易感染患者は増加の一途をたどり、カンジダ症、アスペルギルス症を初めとする深部（全身性）真菌症は、易感染患者が高率に罹患する重要な感染症として医療上の問題となっている。今日治療のための様々な抗菌剤が開発されているにもかかわらず、深部真菌症の診断は極めて困難であり、有効な診断法が未だに確立されていないのが現状である。現在までに市販されている深部真菌症の診断方法としては、各属或いは各種の病原真菌抗原またはこれに対する抗体を免疫学的に検出する方法、病原真菌の菌体成分または代謝産物を生化学的に検出する方法等があるが、いずれの方法においても病理学的に真菌感染が認められない患者（健常人を含む）に対しても有意に高値を示す擬陽性の問題があり、また感度においても臨床的な要請に十分に答えられる現状ではないうえに、結果が出るまでにかなりの時間を要する。
【０００３】
近年、PCR法によって特定の病原真菌のみの遺伝子を迅速かつ特異的に検出する方法が報告されているが、深部真菌症起因菌が多様化している現状を考慮すると、特定の菌種のみを検出する従来のPCR法では検出できる菌種が限られているうえに、検体に対して考えられる起因菌の種類の数だけ同時に別個の検査が必要であり、必ずしも臨床的要請に十分対応できる診断法とは言えず、より広い範囲の病原真菌感染症全体を迅速かつ特異的に診断できる方法の確立が求められていた。
【０００４】
そこで以上の問題を解説すべく、本発明者の一人である山口英世(帝京大学)が出願した登録番号2110122「病原真菌遺伝子増幅プライマー」の特許では、18S リボゾームRNA（以下、18S rRNA）遺伝子の配列の中から、特に広範囲の病原真菌に共通に保存され、ヒトや細菌には共通性の少ない領域から設計した2種類のプライマーを用いてPCR法にて検出する方法が提示された。しかし、一部の属においてプライマー配列の異なりが原因と思われる感度不足が認められ、更なる感度向上が求められた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】各種病原真菌の特徴はその遺伝子により規定されているが、各々の病原真菌に共通した特徴的な遺伝子領域に対応するオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いてPCR法を施行し、各種病原真菌に共通した特徴的遺伝子を検出する事ができれば、そのような菌の存在を確定することができる。
【０００６】
本発明の目的は、上記特許にて試料中の病原真菌を簡便、迅速かつ高感度、特異的に検出するための方法及びそれに用いるオリゴヌクレオチド、ならびに検出用キットを改良し、一部の属においてプライマー配列の異なりが原因と思われる感度不足を解消するための方法及びそれに用いるオリゴヌクレオチド、ならびに検出用キットを提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題解決のため真菌及びその他の生物の18S rRNA遺伝子に関し種々の検討を重ね、一部の属においてプライマー配列の異なりが原因と思われる感度不足を解消する検出方法を確立し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の各項の病原真菌の検出方法等を提供する。
項１. 配列番号１、２及び３に記載のオリゴヌクレオチド配列の一部或いは全部を３種類同時にプライマーとして用いることにより、広範囲の病原真菌の18S rRNA遺伝子をPCR法により増幅させて検出することを特徴とする病原真菌の検出方法。
項２. 配列番号１、２及び３に記載のオリゴヌクレオチド配列の一部或いは全部を４：４〜１：４〜１の割合で３種類同時に用いる項１の検出方法。
項３. 配列番号１及び４に記載のオリゴヌクレオチド配列の一部或いは全部を２種類同時に用いることにより、広範囲の病原真菌の18S rRNA遺伝子をPCR法により増幅させて検出することを特徴とする病原真菌の検出方法。
項４. 配列番号１及び４に記載のオリゴヌクレオチド配列の一部或いは全部を１：２〜１の割合で２種類同時に用いる請求項４の検出方法。
項５. 請求項１或いは３に記載のオリゴヌクレオチドの組み合わせからなる該オリゴヌクレオチドを含有することを特徴とする病原真菌遺伝子検出用キット。
項６. さらに請求項２或いは４に記載の割合で該組み合わせのオリゴヌクレオチドを含有する項５記載のキット。
項７. 病原真菌遺伝子を検出するために用いられるオリゴヌクレオチドの組合せであって、（１）配列番号１に記載のオリゴヌクレオチド配列の一部或いは全部、或いはそれらの相補配列の一部或いは全部からなるオリゴヌクレオチド、および、（２）配列番号２〜４に記載のオリゴヌクレオチド配列より選択される１つ以上のオリゴヌクレオチドの一部或いは全部、或いはそれらの相補配列の一部或いは全部からなるオリゴヌクレオチド、からなるオリゴヌクレオチドの組合せ。
【０００９】
本発明を概説すれば、カンジダ属、ハンセヌラ属、サッカロマイセス属、トリコスポロン属、クリプトコッカス属、アスペルギルス属、ペニシリウム属、ブラストマイセス属、コクシジオイデス属及びニュウモシスチス属等を含む広範囲の病原真菌、特に好適にはカンジダ属、クリプトコッカス属、アスペルギルス属を含む病原真菌の検出方法に関し、配列番号１〜４に記載のオリゴヌクレオチド配列の一部或いは全部からなる該オリゴヌクレオチドの適した組み合わせをプライマーとして用い、該真菌の18S rRNA遺伝子をPCR法により、より高感度に検出することを特徴とする。更に、病原真菌の検出用キットに関し、上記方法にて該病原真菌の検出を行うための検出キットであって、該病原真菌の18S rRNA遺伝子をPCR法により、より増幅させるための上記オリゴヌクレオチドの組み合わせ及び増幅されたDNAを検出することを特徴とする。
【００１０】
18S rRNA遺伝子中の、病原真菌に共通する特徴的なオリゴヌクレオチドの配列は、以下の手順で決定することができる。
（１）遺伝子配列データバンク（GenBank）に登録されている遺伝子配列のうち、各種病原真菌、ヒト及び大腸菌の18S rRNA遺伝子（DNA）を各々の塩基配列間で比較し、表１に示す各種病原真菌に共通であって、ヒト（登録番号M10098）及び大腸菌（登録番号M24996）には共通しない配列領域を限定する。
表１
アスペルギルス・フミガタス                M５５６２６
ペニシリウム・ノタツム                    M５５６２８
カンジダ・アルビカンス                    M６０３０２
カンジダ・ギリエルモンディイ              M６０３０４
カンジダ・ケフィル                        M６０３０３
カンジダ・クルゼイ                        M６０３０５
カンジダ・ルシタニエ                      M６０３０６
カンジダ・パラプシローシス                M６０３０７
カンジダ・ヴィスワナティイ                M６０３０９
カンジダ・グラブラータ                    M６０３１１
ハンセヌラ・ポリモルファ                  M６０３１０
サッカロマイセス・セレビシエ              Ｖ０１３３５
クリプトコッカス・ネオフォルマンス        M５５６２５
ブラストマイセス・デルマチチジス          M５５６２４
コクシジオイデス・イミチス                M５５６２７
ニュウモシスチス・カリニイ                Ｘ１２７０８
【００１１】
（２）上記の病原真菌に特異的な配列領域から、表１に示した全ての病原真菌の18S rRNA遺伝子のみを特異的に増幅することのできるオリゴヌクレオチドの組み合わせ（配列番号１、２及び３或いは１及び４）を決定する。オリゴヌクレオチドはDNA合成機により合成でき、カラムやＨＰＬＣ等にて精製できる。
【００１２】
検出する病原真菌DNAは、血液等の病原真菌感染試料より調製する事ができる。PCR法については、タック・ポリメラーゼ（Taq polymerase）を含む遺伝子増幅キット及び自動遺伝子増幅装置が市販されており、これと本発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用い、病原真菌DNAの増幅反応が可能である。PCR法では、酵素として、例えば、耐熱性タック・ポリメラーゼを用い、DNAの変性（約９５℃）の工程、オリゴヌクレオチドDNAのアニーリング（約５９℃）の工程及びDNA合成（約７２℃）の工程よりなるサイクルを任意の回数繰り返すことで、目的遺伝子のみを指数的に増幅させることができる。例えばサイクルを２５回繰り返せば、目的DNAは約１０万倍に増幅される。微量試料より高感度にDNAを検出するには、現在このPCR法が最も有効な方法である。増幅後の目的DNAの検出は、例えばアガロースゲル電気泳動やポリアクリルアミドゲル電気泳動等、或いは増幅領域内に特異的なDNA配列がありこれをプローブとして用いることができればスポット法やサザンブロット法等で行うことができる。
【００１３】
本発明の配列番号１のオリゴヌクレオチドはフォワードプライマー、配列番号２および３のオリゴヌクレオチドはそれぞれリバースプライマーである。従来の配列番号１のフォワードプライマーと配列番号２のリバースプライマーの組合せでは、広範囲の病原真菌、とくにクリプトコッカス属を含む広範囲の18S rRNA遺伝子を検出するには十分ではなかったが、配列番号３のリバースプライマーを併用すると、クリプトコッカス属に対するプライマーの特異結合性が増大することの理由によりクリプトコッカス属に対しても十分な感度が得られる。あるいは、配列番号１のフォワードプライマーと配列番号４のリバースプライマーの組合せを用いることにより、より少ないプライマー数で同等の結果が得られる。
【００１４】
本発明でプライマーとして用いる、配列番号１〜４のいずれかのオリゴヌクレオチドは、その目的を十分満たすのであれば、その一部分を用いても良い。
【００１５】
本発明の病原真菌の検出方法では、クリプトコッカス属に対するプライマーの特異結合性が増大することの理由により、配列番号１、２及び３に記載のオリゴヌクレオチド配列の一部或いは全部を４：４〜１：４〜１の割合で３種類同時に用いることが好ましい。
【００１６】
本発明の病原真菌の検出方法では、クリプトコッカス属に対するプライマーの特異結合性が増大することの理由により、配列番号１及び４に記載のオリゴヌクレオチド配列の一部或いは全部を１：２〜１の割合で２種類同時に用いることが好ましい。
【００１７】
本願発明の病原真菌遺伝子検出用キットは、請求項１或いは３に記載のオリゴヌクレオチドの組み合わせからなる該オリゴヌクレオチドを含有することを特徴とする。
【００１８】
このように病原真菌の18S rRNA遺伝子に特有な塩基配列から設計したオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いたPCR法によって、一部の属におけるプライマー配列の異なりが原因と思われる感度不足を解消し、より多くの病原真菌を高感度に検出することができるとともに病原遺伝子検出用キットを作製することが可能である。
なお、キットに用いる試薬は溶液状、凍結乾燥物或いはプレート等に固定化された状態でもよい。、以上、本発明によって病原真菌の早期発見が可能となり、早期治療に結びつく。
【００１９】
【実施例】以下、本発明を実施例をもって詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって制限されるものではない。
【００２０】
実施例１
主用病原真菌カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガタス及びクリプトコッカス・ネオフォルマンスの18S rRNA遺伝子のPCR法による検出
（１）オリゴヌクレオチド（DNA）の合成及び精製
配列表の配列番号１〜３に示したオリゴヌクレオチド（DNA）の合成及び精製は、日本バイオサービスに依頼した。
（２）カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガタス及びクリプトコッカス・ネオフォルマンスのゲノムDNAの調製
カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガタス及びクリプトコッカス・ネオフォルマンスの培養及びゲノムDNAの調製は、槇村らの方法 [ 真菌症遺伝子診断 編集／槇村浩一 発行／メジカルセンス ] により行い、100、10及び1pg/5μLに調製した。
（３）カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガタス及びクリプトコッカス・ネオフォルマンスの18S rRNA遺伝子に特異的な領域のPCR法による増幅
実施例１の（２）で調製したカンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガタス及びクリプトコッカス・ネオフォルマンスのDNAを各々5μLずつ0.2ｍL用PCRチューブに取り、3μLの10×増幅用緩衝液（100mM Tris-HCl（pH8.3）、500mMKCl）、3μLの2mM dNTPs（dATP、dGTP、dTTP、dCTP）、1.8μLの25mM MgCl2、0.6μLの15pmol/μL オリゴヌクレオチド１、0.3μLの15pmol/μL オリゴヌクレオチド２、0.3μLの15pmol/μL オリゴヌクレオチド３及び0.3μLの5U/μL タックポリメラーゼ（東洋紡製）を加え、更に滅菌水を加えて30μLの溶液にした。対象として、上記組成中オリゴヌクレオチド２を0.6μL、オリゴヌクレオチド３は混合しない溶液も調製した（登録番号2110122の組成）。反応条件は95℃・5分間の変性後、95℃・30秒の変性→59℃・30秒のアニーリング→72℃・1分の合成反応を34サイクル行い、72℃・7分間伸長反応を行った。以上の反応を自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（Perkin-Elmer社 PCR System 9700）により実施した。
（４）カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガタス及びクリプトコッカス・ネオフォルマンスの18S rRNA遺伝子に特異的な領域のPCR法による増幅後の検出
10μLの反応液を2%アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線による蛍光で増幅されたDNAを確認した。その結果、３種類のオリゴヌクレオチドを用いた反応液ではカンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガタス及びクリプトコッカス・ネオフォルマンスともに1pg/5μL添加まで687bp付近に単一の増幅が確認できたが、２種類のオリゴヌクレオチド（登録番号2110122の組成）を用いた反応液ではカンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガタスでは1pg/5μL添加まで増幅が確認できたが、クリプトコッカス・ネオフォルマンスでは100pg/5μL添加しか増幅が確認できなかった。
このことは、本発明によりクリプトコッカス・ネオフォルマンスにおいて更なる感度向上ができたことを示していると考える。
【００２１】
【発明の効果】以上詳細に説明したように、本発明により、病原真菌の18SrRNA遺伝子を検出することによる、試料中の病原真菌の更なる高感度な検出法及び検出キットが提供される。
【００２２】
【配列表】
2004201637.tif 000002
2004201637.tif 000003