(57)【要約】【課題】ヒアルロン酸またはその塩を含有する水性医薬製剤であって、防腐剤を含有しないものを提供すること。【解決手段】ヒアルロン酸またはその塩とホウ酸とを含有し、無菌容器１に充填することにより、塩化ベンザルコニウム等の防腐剤を含有する必要のない水性医薬製剤を提供することができる。この水性医薬製剤は、主として眼科用医薬品、特に点眼剤に好適に用いることができる。また、水性医薬製剤には、更にキレート剤としてＥＤＴＡを含有させることが好ましい。なお、ヒアルロン酸の分子量は、１０万〜３００万の範囲にあることが好ましい。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸またはその塩とホウ酸とを含有し、無菌容器に充填されたことを特徴とする水性医薬製剤。
【請求項２】
更にキレート剤を含有することを特徴とする請求項１に記載の水性医薬製剤。
【請求項３】
点眼剤として処方されたことを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の水性医薬製剤。
【請求項４】
前記ヒアルロン酸の分子量が１０万〜３００万の範囲にあることを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれかに記載の水性医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒアルロン酸またはその塩を含有する水性医薬製剤に関するものであり、主として眼科用医薬品、特に点眼剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヒアルロン酸は、眼の硝子体成分として発見されたグリコサミノグリカンの一種である。その構造は、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンとＤ−グルクロン酸とが交互に結合してできた直鎖状の高分子多糖がβ１→４結合で重合したポリマーである。この物質は、分子量が非常に大きく、水溶液中で抱水して強い粘性を示す。
近年ではヒアルロン酸は、医薬品として、主として眼科用に使用されるようになっている。例えば、特許第３０５０８９８号公報には、ヒアルロン酸に、ホウ酸および塩化ベンザルコニウムを含有した眼科用医薬品が開示されている。
【特許文献１】特許第３０５０８９８号公報
【特許文献２】特開２００２−２６３１６６号公報
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、上記従来技術によって提供される眼科用医薬品には、塩化ベンザルコニウム等の防腐剤が添加されている。一般的に、医薬品には防腐剤のように主作用を示さない添加物は、できるだけ含有しないことが好ましい。眼科用医薬品（特に、点眼剤）の場合には、特に防腐剤を含まないものが望まれる。
【０００４】
しかしながら従来には、防腐剤を含まない状態で、ヒアルロン酸の作用を維持しつつ長期間に渡って保存することは困難であった。
なお、例えば特開２００２−２６３１６６号には、無菌的に使用できそうな容器が開示されているが、個別の医薬品については検討されていない。
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、ヒアルロン酸またはその塩を含有する水性医薬製剤であって、防腐剤を含有しないものを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段、発明の作用、及び発明の効果】
上記の課題を解決するための発明に係る水性医薬製剤は、ヒアルロン酸またはその塩（以下の説明において、特にその塩を含まないことが明らかな場合を除いて、単に「ヒアルロン酸」という）とホウ酸とを含有し、無菌容器に充填されたことを特徴とする。
【０００６】
本発明におけるヒアルロン酸は、例えば、▲１▼ニワトリのとさか等の動物組織から抽出して得られたもの、▲２▼ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Ｓｔｒｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）その他のヒアルロン酸生産性を有する微生物の培養によって醗酵工学的に生産されたもの等によって得ることができる。ヒアルロン酸は、通常の方法によって、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩・カルシウム、マグネシウム、バリウム等のアルカリ土類金属塩として抽出し、これらの塩類に変換することができる。上記の方法によって得られたヒアルロン酸は、いずれも本発明の水性医薬製剤の原料として用いることができる。
【０００７】
ヒアルロン酸の重合度は、その起源・抽出法等によって、かなりの広範囲に渡った分子量となる。市販のヒアルロン酸は、分子量が１０万〜５００万の範囲に分布している。なお、高分子量のヒアルロン酸は、化学的または物理的手法によって、容易に低分子量化することができる。本発明の水性医薬製剤に用いるヒアルロン酸の分子量は、その目的に応じて適当なものを使用することができるが、特に点眼剤として使用する場合は、分子量１０万〜３００万程度のものが好ましく、更に分子量３０万〜２００万程度のものが更に好ましい。
【０００８】
本発明に用いるホウ酸としては、通常医薬品に使用される程度の純度のものを適宜に使用することができる。なお、ホウ酸は、主として本発明の水性医薬製剤に緩衝作用を持たせるものであるが、多少なりとも防腐作用を示さないわけではない。しかしながら、従来用いられていた防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウムなど）に比べると、防腐効果は小さいことに加え、刺激性が少ないことから、特に、本発明の水性医薬製剤を点眼剤として使用する場合には、副作用・刺激性の少ないものを提供できる。また、ホウ酸の濃度は、０．１％〜３．０％、好ましくは０．５％〜２．０％とする。
【０００９】
また、本発明には、更にキレート剤を添加することが好ましい。その際のキレート剤としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのポリアミノカルボン酸類、クエン酸などのオキシカルボン酸類が挙げられるが、このうちＥＤＴＡを添加することが好ましい。また、ＥＤＴＡを用いる場合の濃度は、０．００１％〜０．０５％、好ましくは０．００３％〜０．０３％、更に好ましくは約０．０１％である。
【００１０】
なお、本発明の水性医薬製剤には、二種の成分（ヒアルロン酸、及びホウ酸）または三種の成分（ヒアルロン酸、ホウ酸、及びキレート剤）に加えて、本発明の目的に反しない限りにおいて、他の薬効成分、等張化剤、緩衝剤、液性調整剤等を含有させることができる。「他の薬効成分」としては、例えば抗炎症剤、抗アレルギー剤、抗生物質、鎮痛剤、眼圧降下剤、免疫調節剤等が挙げられる。「等張化剤」としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、多価アルコール類等が挙げられる。「緩衝剤」としては、例えば酢酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等、あるいはこれらの塩と対応する酸とが併用される。「液性調整剤」としては、水酸化ナトリウム、塩酸等が挙げられる。
【００１１】
本発明において、「無菌容器」とは、水性医薬製剤を封入して閉止した状態で、菌の侵入・増殖を許さないことに加え、容器を開封して内容物としての水性医薬製剤の使用を開始した後にも菌の侵入・増殖を許容しない容器を意味している。そのような無菌容器としては、例えば実施例に開示した無菌容器１を挙げることができる。この無菌容器には、容器内を無菌に保つ手段として、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリビニリデンフロライド（ＰＶＤＦ）、及びポリテトラフロロエチレン（ＰＴＦＥ）等のメンブランフィルタが用いられる。
【００１２】
本発明によれば、ヒアルロン酸を含有する水性医薬製剤が提供される。水性医薬製剤は、主として眼科用医薬品、特に点眼剤に好適に用いられる。この水性医薬製剤は、塩化ベンザルコニウム等の防腐剤が含まれていない状態で、長期間に渡って安定的に保存することができる。また特に、点眼剤として用いる場合には、眼刺激性が少ないので、従来のものに比べると好適に使用できる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、下記の実施形態によって限定されるものではなく、その要旨を変更することなく、様々に改変して実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
【００１４】
＜無菌容器＞
まず、本発明に用いられる無菌容器１の構造、及び機能について、図１〜図９を参照しつつ説明する。図１〜図３には、無菌容器１を示した。この無菌容器１には、口部２Ａと胴部２Ｂと備える積層剥離ボトル２が設けられている。口部２Ａには、吐出ノズル３Ａを備えた口栓３とキャップ４０とが装着されている。無菌容器１の使用者は、キャップ４０を取り外して容器１を倒立させ、ボトル２の胴部２Ｂを押圧すると、ボトル２内部の点眼液剤が口栓３内の吐出流路１０を通って吐出ノズル３Ａの先端から滴下される。
【００１５】
ボトル２は、ボトル本体としての外層２１と、水性医薬製剤を収容する内層２２との二層からなる積層構造とされている。両層２１，２２には、共に円筒状の口部２１Ａ，２２Ａと、断面扁平状の胴部２１Ｂ，２２Ｂとが備えられている。こうして、ボトル口部２Ａは、外層口部２１Ａと内層口部２２Ａとから構成されており、ボトル胴部２Ｂは、外層胴部２１Ｂと内層胴部２２Ｂとから構成されている。外層２１は、例えばＰＥＴやＥＶＯＨなどの硬質合成樹脂により成形することができる。また、内層２２は、外層２１から容易に剥離する性質を有する合成樹脂（例えば、ポリエチレンなどのポリオレフィン）から成形する。
【００１６】
内層口部２２Ａの上端は、外層口部２１Ａの上端に係止されている。また、外層口部２１Ａの内周に、軸方向に延びるローレット加工部を周方向に離間して複数設けることにより、内層口部２２Ａと外層口部２１Ａとの周方向への相対移動を規制できる。
外層口部２１Ａには、外層胴部２１Ｂと内層胴部２２Ｂとの間に外気を導入するための通気孔４が、直径方向にほぼ対向する位置に一対に設けられている。この通気孔４は、外層２１のみを貫通して形成されている（内層２２には形成されていない）。また、外層口部２１Ａの外周面には、ネジ山２１Ｃが形成されている。
【００１７】
内層胴部２２Ｂは、フィルム状とされており、水性医薬製剤の減少に伴って、容易にすぼみ変形し得るようになっている。一方、内層口部２２Ａは、その胴部２２Ｂに比べると、比較的肉厚状に形成されており、円筒形状への復元能力を示すようになっている。
外層口部２１Ａに形成した通気孔４は、通常時には、内層口部２２Ａによって内側から閉止されている。内層口部２２Ａは、外層胴部２１Ｂと内層胴部２２Ｂとの間に負圧が生じると、大気圧によって内方に変形して通気孔４を開く逆止弁として作用する。また、内層２２の底部中央には、外層２１の底部中央に係止する係止部２２Ｃが形成されており、内層２２の底部側が上方に捲れ上がることを防止している。
【００１８】
口栓３には、ボトル口部２Ａに内嵌される第１栓部材３１と、この第１栓部材３１に軸方向に連結されてボトル口部２Ａの外周に回し付けられる第２栓部材３２とが設けられている。第１栓部材３１は、図４に示すように、その基端部がボトル口部２Ａの先端面に当接する円筒状の第１筒部３１Ａと、この第１筒部３１Ａの内側に設けられた第２筒部３１Ｂとが、第２筒部３１Ｂの先端から径方向外方に張り出したフランジ３１Ｃを介して一体に形成されたものである。第１筒部３１Ａの内径は、第２筒部３１Ｂの外径よりも大きくされており、第１筒部３１Ａの内周面と第２筒部３１Ｂの外周面との間には空隙が形成されている。第２筒部３１Ｂの基端部は、第１筒部３１Ａの基端部よりも基端側（図１において下側）に突出しており、この第２筒部３１Ｂの基端部がボトル口部２Ａに気密かつ液密に嵌め込まれる。
【００１９】
第２筒部３１Ｂの軸方向中途部の内面には、水平板状の支持壁部３１Ｄが設けられている。この支持壁部３１Ｄには、中央部の周囲４ヵ所に、軸方向に貫通する通孔６が設けられている。また、支持壁部３１Ｄの上部側には、分与弁８のコネクタリーブ８３とバルブヘッド８２とが嵌め込まれる凹部が形成されている。
第２栓部材３２は、先端側に行くに連れて徐々に小径となる略筒状とされており、その軸方向先端部にはノズル部３Ａが形成された天板が一体に成形されている。この栓部材３２の内周面には、ボトル口部２Ａに設けたネジ山２１Ｃに係合するネジ山３２Ａが設けられている。第２栓部材３２の軸方向中央の内周には、第１筒部３１Ａが嵌め付けられている。第２栓部材３２の先端部外周は、段差を介して小径筒状に形成されており、この外周にはキャップ４０を回し付けるためのネジ山３２Ｂが形成されている。
【００２０】
また、第２筒部３１Ｂの先端は、径方向外方に進むに連れて徐々に基端側に移行するテーパー状のテーパー面１２とされている。一方、第２栓部材３２には、第２筒部３１Ｂのテーパー面１２に対して、上下に対向するとともに径方向外方に進むに連れて徐々に先端側に移行するテーパー面１３が形成されている。
第２栓部材３２の天板の下面中央には、薄板状のフィルタ７が設けられている。このフィルタ７は、無菌容器１の外方から内方への細菌類の透過を防止し得るものである。フィルタ７は、分与弁８よりも吐出下流側に配設されており、ノズル部３Ａに隣接して配置されており、第１栓部材３１の上方で第２栓部材３２の内側に形成された空洞部９に嵌め込まれた保持部材５０によって保持されている。この保持部材５０には、水性医薬製剤を通すための通孔５０Ａが形成されている。
【００２１】
ノズル部３Ａ内の流路は、フィルタ７の中央部から先端側（吐出下流側）に延設されている。ノズル内流路の容積は、ノズル先端から滴下される点眼液の１滴分の容量に相当する５０μｌ以下とされている。
口栓３の吐出流路１０は、通孔６、空洞部９、通孔５０Ａ及びノズル内流路によって構成されており、この吐出流路１０の下流端開口部は、ノズル内流路によって構成されている。
【００２２】
分与弁８は、図５に示すように、バルブフランジ８１と、バルブヘッド８２と、コネクタスリーブ８３とがシリコンゴムなどの弾性材料によって一体に成形されたものである。バルブフランジ８１は、略リング状とされており、その断面形状は、径方向外側に至るほど肉厚となる三角形状とされている（図５（ｂ）を参照）。このバルブフランジ８１は、両栓部材３１，３２の間に上下から気密かつ液密状に挟持される。より詳細には、バルブフランジ８１は、上下に対向する一対のテーパー面１２，１３に挟み込まれている。
【００２３】
バルブヘッド８２は、略円形状とされており、ボトル内面側に向かって凸状に湾曲する球面上に成形されている。その中央部には、十字状の切り込みからなるオリフィス８２Ａが設けられている。このオリフィス８２Ａは、ヘッド８２の内面に予め定められた分与圧力が作用すると内層２２内部の水性医薬製剤の流れを許容するように開き、その分与圧力が除去されると（つまり、ヘッド８２の内面に作用する圧力が分与圧力以下になると）流体の流れを遮断するように閉じる。また、バルブヘッド８２の中央下面は略平坦に形成されており、オリフィス８２Ａは、この平坦面が形成された範囲内に設けられている。バルブヘッド８２の平坦面は、通常の状態においては、支持壁部３１Ｄの上面に面接している。
【００２４】
コネクタスリーブ８３は略円筒状とされており、その上端側はバルブフランジ８１の内周縁に、下端側はバルブヘッド８２の外周縁に、それぞれ一体的に接続されている。また、コネクタスリーブ８３は容易に変形し得るように比較的薄肉の柔軟な構造となっている。これにより、分与圧力よりも小さい所定の圧力がバルブヘッド８２内面に作用すると、オリフィス８２Ａが閉じた状態を維持したままでバルブヘッド８２が下流側（先端側）へ変位し、その結果、コネクタスリーブ８３は捲れるように弾性変形する。また、この圧力が除去されると、コネクタスリーブ８３は復帰変形し、オリフィス８２Ａが閉じた状態でバルブヘッド８２が上流側（基端側）へ変位し、その結果、ノズル内流路に残存する水性医薬製剤（流体）をフィルタ７の上流側へ吸い戻す。
【００２５】
キャップ４０は、第２栓部材３２の先端外周部に着脱自在に回し付けられており、無菌容器１の不使用時にはキャップ４０によりノズル部３Ａの周囲を外気から密閉して、埃や細菌類の付着を防止する。キャップ４０の天板部中央の下面には、キャップ４０を第２栓部材３２に螺着したときにノズル内流路に嵌まり込んで、流路を埋める突起４１が設けられている。
【００２６】
無菌容器１では、その持ち運びや温度変動などを起因として所定の分与圧力以下の小さな範囲で内圧が上昇すると、図６に示すように、分与弁８のオリフィス８２Ａが閉じたままでバルブヘッド８２が上流側へ変位し、この変位量に応じて内圧が小さくなり、圧力上昇が緩和される。内部の水性医薬製剤をノズル３Ａから吐出させるには、使用者がボトル２を倒立させ、その胴部２Ｂを例えば短径方向から径内方に押圧する。すると、ヘッド８２の内面に所定の分与圧力以上の内圧を生じ、図７に示すように、内層２２内の水性医薬製剤が分与弁８のオリフィス８２Ａを開いて、ノズル３Ａの先端から滴下する。また、ボトル２への押圧を止めると、オリフィス８２Ａが閉じるようにバルブヘッド８２が復帰変形し、次いでコネクタスリーブ８３が復帰変形する。このスリーブ８３の復帰変形の際に、ノズル内流路に残留する水性医薬製剤は、フィルタ７の上流側の空洞部９に吸い込まれ、図８に示すように、フィルタ７によって外気から遮断された空洞部９に保存される。
【００２７】
また、ボトル２の押圧を止めると、外層２１は元の形状に復元するものの、オリフィス８２Ａが閉じてしまう。このため、内層２２の内部には、水性医薬製剤の逆流、及び外気の流入は生じることなく、内層２２は元の形状に復帰しないで内部の水性医薬製剤の容積減少に伴って収縮していく。
【００２８】
一方、外層２１が元の形状に復帰する際には、外層胴部２１Ｂと内層胴部２２Ｂとの間の空間に負圧が生じるため、図８に示すように、大気圧によって内層口部２２Ａが径方向内方に変形させられ、外層２１の通気孔４が開いて、内層２２と外層２１との間に通気孔４を介して空気が入り込む。このとき、内層２２の内部も負圧となり、分与弁８のバルブヘッド８２には容器内部側に変形させようとする力が作用するが、ヘッド８２は支持壁部３１Ｄにより当接支持されている。このため、ヘッド８２は柔軟であるものの、内側に変形することが規制されている。こうして、外気等が内層２２の内部に流入することが防止される。
【００２９】
また、通気孔４から十分な外気が導入されて外層胴部２１Ｂが元の形状に復帰すると、内層口部２２Ａ自体の復元性によって、内層口部２２Ａの変形が解消されて円筒形状に復帰することで、内層口部２２Ａによって通気孔４が閉塞される。
使用者が、再びボトル２を押圧するときには、内層口部２２Ａが通気孔４を押し塞いでいるため、外層胴部２１Ｂと内層胴部２２Ｂとの間の空気がボトル外へ漏れ出ることがなく、その空気は外層胴部２１Ｂの変形による容積縮小によって圧縮され、この加圧空気によって内層胴部２２Ｂが外側から加圧される。また、空洞部９の内容液は、図６に示す状態に至るまでに、ノズル３Ａから排出される。
【００３０】
＜微生物増殖性の評価試験−１＞
次に、上記無菌容器１が、微生物二次汚染に対して有効であることを確認するために、実験を行った。この実施例では、メンブランフィルタに捕らえられた微生物が、そのフィルタ上で増殖するか否かを確認した。
Ａ．試験方法
１．無菌容器、及びフィルタ
無菌容器は、上記無菌容器１を用いた。また、無菌容器１のフィルタ７として用いることが可能なメンブランフィルタとして、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）製フィルタを用いた。
【００３１】
２．試験溶液
試験溶液として、ホウ酸系基剤溶液［ホウ酸１．０％、ホウ砂０．０６％、塩化ナトリウム０．３５％、精製水適量；ｐＨ６．９、浸透圧比  約１〕、リン酸系基剤溶液〔リン酸水素ナトリウム２．８５％、結晶リン酸ニ水素ナトリウム０．６１％、塩化ナトリウム０．１０％、精製水適量；ｐＨ７．０、浸透圧比約１〕、ヒアルロン酸溶液〔ヒアルロン酸ナトリウム０．１％、ε−アミノカプロン酸０．２％、ＥＤＴＡ０．０１％、塩化ナトリウム０．７％、塩化カリウム０．１５％、精製水適量；ｐＨ６．５、浸透圧比約１〕、及びＳＣＤ  Ｂｒｏｔｈ［Ｔｒｉｐｔｉｃａｓｅ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ  ／  日本べクトン・ディッキンソン株式会社  Ｌｏｔ  Ｎｏ．１２３４００４  〕を用いた。
【００３２】
３．試験菌株
試験菌株として、緑膿菌であるシュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、ＡＴＣＣ  ９０２７）及び、表皮ブドウ球菌であるスタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、ＡＴＣＣ  ３５９８４（バイオフィルム形成菌））を用いた。
緑膿菌は、点眼剤の二次汚染による眼感染症を引き起こすことが知られている。また、表皮ブドウ球菌も点眼剤の二次汚染の発症原因となる。さらには、目の前眼部・外眼部のみならず、身体の皮膚全体からも検出される常在菌の最優勢種の一つでもある。上記理由から、これらの試験菌株を指標として選択した。ここで、バイオフィルムとは、細菌・真菌などの微生物と多糖類・タンパク質などの有機物からなる粘性ゲルとから形成された複合体を意味する。このバイオフィルム形成菌を使用することにより、過酷な実施条件を設定した。
【００３３】
４．菌の調製及び接種菌数の測定
ＳＣＤ寒天培地（Ｔｒｉｐｔｉｃａｓｅ  Ｓｏｙ  Ａｇｅｒ  ／  日本べクトン・ディッキンソン株式会社製）で、３３℃、１８〜２４時間静置培養させた試験菌株を白金耳にて掻き取り、濁度計にて６６０ｎｍにおける濁度が０．６〜０．７となるように、滅菌生理食塩水４．５ｍＬ中に加えて、撹拌分散した。この分散液を１０２〜１０４倍に希釈して１０３〜１０４ｃｆｕ／２５μＬの接種菌液とした。
【００３４】
５．フィルタ上における微生物増殖性評価試験
上記２に示した試験溶液を充填、密栓した無菌容器１から、内溶液を５滴滴下させ、フィルタを湿らせた。その後、ノズルから上記４に示した菌液を２５μＬ接種し、この無菌容器を下記６の条件で培養した。培養後、０，７，１４，２１，及び２８日目にサンプリングを行い、無菌容器１の内容液全量を滅菌した試験管内に滴下し、下記５に従って、滴下液中の菌数を測定した。なお、予備試験の結果から、フィルタ上で微生物が増殖していると予想されるサンプルについては、１プレートに３０〜３００ｃｆｕのコロニーが生じるように、適当に滴下液を滅菌生理食塩水で希釈した後に菌数を測定した。この滴下液中の菌数の経時変化により、フィルタ上での微生物増殖の有無を判定した。サンプリングは、１時点１試験溶液について、６サンプルについて行った。
【００３５】
６．培養条件
上記５に示した菌液接種後の無菌容器１は、２２℃で容器を正立させた状態で培養した。また、滴下液中の菌数測定は、滴下液または滴下液を希釈した液１ｍＬをＳＣＤ寒天培地２０ｍＬと混釈して、３３℃、３〜７日間培養し、生じたコロニー数を計測した。繰り返し３回のコロニー数の平均値を濃度換算して滴下液菌数を求めた。
【００３６】
Ｂ．試験結果
１．シュードモナス・アエルギノサのＰＥＳ製フィルタ上における増殖性の確認
表１及び図９に示したように、ＰＥＳフィルタ上に接種した菌は、ＳＣＤ  ｂｒｏｔｈでは、速やかに増殖した。７日目以降のＳＣＤ  ｂｒｏｔｈサンプルでは、各時点６サンプル中、７日目の２サンプル、１４日目の４サンプル、２１日目及び２８日目の全てのサンプルで、菌の代謝物によるフィルタの詰まりが認められた。そのため、５ｍＬ全量を滴下することが困難であり、実際には０．１ｍＬ若しくは０．５ｍＬを滴下して、菌数を測定した。
【００３７】
ホウ酸系基剤溶液では、日数が経過するごとに、菌数は減少して、ついには死滅し、増殖は認められなかった。
リン酸系基剤溶液では、７日目以降６サンプルの生菌数のバラツキが大きかった。具体的には、７日目以降の生菌数が、０日目の１／１０〜１／１００になったサンプル、０日目と同程度のサンプル、及び０日目の１０〜２００倍となったサンプルに分かれた。全体的には、日数の経過に伴って、生菌数が増加したサンプルの方が多く、リン酸系基剤では増殖傾向を認めた。
ヒアルロン酸溶液では、７日目以降６サンプルの生菌数のバラツキがほとんど見られず、一様に０日目の１０〜１００倍程度まで生菌数が増加した。
【００３８】
【表１】
2004256502.tif 000003
【００３９】
２．スタフィロッコカス・エピデミディスのＰＥＳ製フィルタ上における増殖性の確認
表２及び図１０に示したように、ＰＥＳフィルタ上に接種した菌は、ＳＣＤ  ｂｒｏｔｈでは速やかに増殖した。なお、１．シュードモナス・アエルギノサの結果とは異なり、フィルタが詰まることは無かったものの、バイオフィルムと思われる膜が滴下液に回収されるサンプルが一部存在した。
ホウ酸系基剤溶液では、速やかに菌数は減少、死滅し、増殖は認められなかった。
リン酸系基剤溶液では、ホウ酸系基剤溶液よりは緩やかであるが、１４日目以降に菌は死滅し、増殖は認められなかった。
ヒアルロン酸溶液では、菌数は緩やかに減少を続け、増殖は認められなかった。
【００４０】
【表２】
2004256502.tif 000004
【００４１】
Ｃ．考察
この実施例は、無菌容器のフィルタ上に捕らえられた微生物が、内溶液を栄養源として増殖するかどうかを検討するために実施された。その結果、２菌種共にコントロールとして設定したＳＣＤ  Ｂｒｏｔｈでは速やかに増殖したが、ホウ酸系基剤溶液では菌数は減少し、増殖は認められなかった。ホウ酸は微生物の必須代謝系を阻害することから、上記結果に至ったものと考えられる。また、２菌種で増殖に差が出たのは、リン酸系基剤溶液とヒアルロン酸溶液であった。スタフィロコッカス・エピデルミディスは、シュードモナス・アエルギノサに比べると栄養要求性が高いため、リン酸やヒアルロン酸を資化する事が出来なかったと考えられる。このため、リン酸やヒアルロン酸は、ホウ酸のように殺菌的には働かないものの、スタフィロコッカス・エピデルミディスの栄養源とはなることができず、増殖しなかったものと推察される。また、ヒアルロン酸溶液では、ヒアルロン酸が保水力を持つために、菌体が生育できる環境をより長く維持していたと思われ、リン酸系基剤溶液に比べると菌数の減少も緩やかになったと考えられる。
【００４２】
一方、シュードモナス・アエルギノサは、ヒアルロン酸を資化することが判明した。また、リン酸系基剤においても挙動は一定でないものの、同様に栄養源となり、増殖する可能性があり得ることがわかった。
この試験結果から、フィルタに捕らえられた微生物は、ホウ酸系基剤の充填された無菌容器のフィルタ上では増殖することなく、死滅していくことが確認できた。しかし、リン酸系基剤やヒアルロン酸溶液が充填された無菌容器のフィルタ上では、菌種によって増殖を認めた。但し、リン酸系基剤の点眼薬では、主剤が入ることによって、その有効成分によっては増殖が抑制されるものと推察される。また、ヒアルロン酸溶液では、この処方では微生物が増殖する可能性が否定できないので、処方を変更して適当なものに変更することが考えられる。そこで、次に、この試験と同様の試験をホウ酸系処方のヒアルロン酸製剤について、シュードモナス・アエルギノサについて実施した。
【００４３】
＜微生物増殖性の評価試験−２＞
上記「微生物増殖性の評価試験−１」の結果を受けて、上記「Ａ．試験方法」と同様の方法で、ホウ酸系処方のヒアルロン酸製剤について、シュードモナス・アエルギノサが増殖するか否かを確認する試験を行った。
Ａ．試験方法
試験方法は、上記「微生物増殖性の評価試験−１、Ａ．試験方法」に準じて行ったので、記載を省略する。
但し、試験溶液（水性医薬製剤）として以下の処方を用い、試験菌株としてシュードモナス・アエルギノサを用いた。
【００４４】
▲１▼０．５％ホウ酸処方水性医薬製剤
水性医薬製剤中には、０．１％ヒアルロン酸Ｎａ、０．５％ホウ酸、０．０１１％ホウ砂、０．６３％ＮａＣｌ、及び０．０１％ＥＤＴＡを含有する。この水性医薬製剤のｐＨは６．５５、浸透圧は２８９ｍＯｓｍであった。
▲２▼１％ホウ酸処方水性医薬製剤
水性医薬製剤中には、０．１％ヒアルロン酸Ｎａ、１％ホウ酸、０．０２５％ホウ砂、０．４％ＮａＣｌ、及び０．０１％ＥＤＴＡを含有する。この水性医薬製剤のｐＨは６．５０、浸透圧２９８ｍＯｓｍであった。
【００４５】
▲３▼１．５％ホウ酸処方水性医薬製剤
水性医薬製剤中には、０．１％ヒアルロン酸Ｎａ、１．５％ホウ酸、０．０８％ホウ砂、０．１５％ＮａＣｌ、０．０１％ＥＤＴＡを含有する。この水性医薬製剤のｐＨは６．６８、浸透圧は３０１ｍＯｓｍであった。
▲４▼２％ホウ酸処方水性医薬製剤
水性医薬製剤中には、０．１％ヒアルロン酸Ｎａ、２％ホウ酸、０．０１％ＥＤＴＡ、水酸化ナトリウム水溶液適量を含有する。この水性医薬製剤のｐＨは６．７６、浸透圧は３１８ｍＯｓｍであった。
【００４６】
Ｂ．試験結果
表３及び図１１に示したように、ＰＥＳフィルタ上に接種した菌は、コントロールであるＳＣＤ  Ｂｒｏｔｈでは、上記「微生物増殖性の評価試験−１」とほぼ同様の結果（速やかに増殖した）を示した。一方、ホウ酸系ヒアルロン酸水性医薬製剤（０．５％〜２．０％ホウ酸）では、いずれの濃度においても、菌数は増殖することなく減少した。
この結果、ホウ酸系処方を用いたヒアルロン酸水性医薬製剤を無菌容器に充填することにより、開封前の密閉時及び非使用時（開封後に栓を施した状態）においても、微生物が内溶液中で増殖することを防止できることが判明した。
さらに、医療現場で二次汚染が発生しやすく危険度の高い微生物との認識がある緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及び表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の増殖を防止できることを見出したことには、本発明の意義があると考える。
【００４７】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本実施形態における無菌容器の一部破断正面図である。
【図２】無菌容器の側面図である。
【図３】無菌容器の口部の拡大断面図である。
【図４】無菌容器に装着される第１口栓部材を示す図である。（ａ）は平面図、（ｂ）は半断面正面図、（ｃ）は底面図である。
【図５】無菌容器に装着される分与弁を示す図である。（ａ）は平面図、（ｂ）は半断面正面図、（ｃ）は底面図である。
【図６】分与弁が完全に伸び、オリフィスが閉じた状態の無菌容器口部の拡大断面図である。
【図７】分与弁が完全に伸び、オリフィスが開いた状態の無菌容器口部の拡大断面図である。
【図８】内部の水性医薬製剤の滴下が行われた後、分与弁が復帰変形した状態の無菌容器口部の拡大断面図である。
【図９】フィルタ上のシュードモナス・アエルギノサの増殖性を示すグラフ図である。
【図１０】フィルタ上のスタフィロコッカス・エピデルミディスの増殖性を示すグラフ図である。
【図１１】ホウ酸系水性医薬製剤を用いた場合のおいて、フィルタ上のシュードモナス・アエルギノサの増殖性を示すグラフ図である。
【符号の説明】
１…無菌容器
２…ボトル
３…口栓
４…通気孔
７…フィルタ
２１…外層
２２…内層
４０…キャップ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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