(57)【要約】【課題】粘膜免疫を誘導する経口性エイズワクチンを開発するに際して、安全な経口投与によるＨＩＶワクチンを得る。具体的には、非病原性のベクターを用い、更に、投与を終えた後に不用意に腸管に住みつく虞のないベクターを用い安価な経口投与によるＨＩＶワクチンを得る。【解決手段】乳酸菌の菌体表層にＨＩＶ由来の蛋白質を発現させたことを特徴とするものである。特に、この乳酸菌としては、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）であり、この菌体表層にＨＩＶのエンベロープ蛋白質を発現させたものである。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌の菌体表層にＨＩＶ由来の蛋白質を発現させたことを特徴とする経口投与によるＨＩＶワクチン。
【請求項２】
前記乳酸菌が、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）であることを特徴とする請求項１に記載の経口投与によるＨＩＶワクチン。
【請求項３】
前記ＨＩＶ由来の蛋白質がＨＩＶのエンベロープ蛋白質であることを特徴とする請求項１に記載の経口投与によるＨＩＶワクチン。
【請求項４】
前記ＨＩＶ由来の蛋白質がエピトープであることを特徴とする請求項３に記載の経口投与によるＨＩＶワクチン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ベクターワクチン、特にＨＩＶのエンベロープ蛋白質を乳酸菌の菌体表層に発現させたエイズワクチンの開発に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年より、ＨＩＶ感染者は増加の一途をたどっており、ＨＩＶ感染の拡散を抑えるためには、細胞性免疫及び液性免疫を誘導することのできる安全・効果的・廉価なワクチンの開発が望まれている。現在まで、ＨＩＶのサブユニットワクチンやＤＮＡワクチン、組換えウィルスをベクターとしたワクチン及び細菌をベクターとしたワクチン開発が試みられてきた。しかしながら、安全で効果の高いＨＩＶワクチン開発の必要性は今なお高い。
【０００３】
例えば、サルモネラ菌をベクターとして、ＨＩＶのエンベロープ蛋白質（ｇｐ１２０）を菌体表層に発現させ、ワクチンとして用いることが提案されている（例えば、非特許文献１参照）。また、リステリア菌をベクターとして、ＨＩＶのｇａｇ蛋白質を細胞内に発現させ、ワクチンとして用いることも提案されている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００４】
一方、本出願人は、ラクトコッカス・ラクチス  （Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）  の菌体表層のプロテアーゼ蛋白質が有するアンカー配列を利用して、任意の有用蛋白質を、宿主菌体表面に発現させる固定化方法を提案している  （例えば、特許文献１、特許文献２参照）  。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｄ．Ｍ．  Ｈｏｍｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４４（１９９６）２０３−２０７
【非特許文献２】
Ｒ．Ｓ．  Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．７４，  Ｎｏ．２１  （２０００），  ｐ．９９８７−９９９３
【特許文献１】
特開平１０−１１７７８３号公報
【特許文献２】
特開２０００−２３６８７３号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ワクチンとは安価で安全であることが基本である。先のサルモネラ菌、リステリア菌は、そもそも病原菌であり、腸感染の問題がある。また、病原菌以外であっても、腸管に住みつく菌の場合には、経口投与のワクチンとして用いることは注意が必要である。腸管内で住みついた結果、過剰に抗原にさらされる結果となり、予測しない副作用が生じる可能性があるからである。
【０００７】
本発明は、粘膜免疫を誘導する経口性エイズワクチンを開発するに際して、安全な経口投与によるＨＩＶワクチンを得ることを目的とする。具体的には、非病原性のベクターを用い、更に、投与を終えた後に不用意に腸管に住みつく虞のないベクターを用い安価な経口投与によるＨＩＶワクチンを得ることを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
請求項１に記載された発明に係る経口投与によるＨＩＶワクチンは、乳酸菌の菌体表層にＨＩＶ由来の蛋白質を発現させたことを特徴とするものである。
【０００９】
請求項２に記載された発明に係る経口投与によるＨＩＶワクチンは、請求項１に記載の乳酸菌が、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）であることを特徴とするものである。
【００１０】
請求項３に記載された発明に係る経口投与によるＨＩＶワクチンは、請求項１に記載のＨＩＶ由来の蛋白質がＨＩＶのエンベロープ蛋白質であることを特徴とするものである。
【００１１】
請求項４に記載された発明に係る経口投与によるＨＩＶワクチンは、請求項３に記載のＨＩＶ由来の蛋白質がエピトープであることを特徴とするものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明においては、ベクターワクチンとして、安全且つ非病原性であり、発酵乳製品で長らく用いられてきた乳酸菌、好適にはラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）を選んだ。しかし、乳酸菌をベクターワクチンとして用いて、ＨＩＶのワクチン開発に成功した報告はまだない。
【００１３】
好ましいことに、この種の菌はヒトや動物に投与すると、胃腸管内でコロナイゼーションせず、速やかに体外に排出される、極めて安全な菌である。よって、粘膜免疫を刺激し、局所の免疫応答を惹起させるベクターワクチンとしては極めて有効であると考えられる。また、乳酸菌は、培養が容易で、培養に係るコストも低く、経済的である。病原菌と異なり、乳酸菌を培養する施設もＰ１レベルで培養が可能である。病原菌を宿主とした場合には、その配布ルートを確保するのが困難であり、管理を厳重に行う必要もあり、経済的に効率的ではない。しかし、乳酸菌なら配布ルートは既に確立されており、また、酸を生成するため、他の菌のコンタミネーションの危険性も低く、ワクチンとして配布するには適している。
【００１４】
好ましい本発明では、経口摂取しても安全な非病原性細菌であるラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）をベクターワクチンに用い、ＨＩＶのエンベロープ蛋白質を乳酸菌の菌体表層に発現させ、宿主の粘膜免疫を刺激してＨＩＶに対する免疫応答を高め、有用なベクターワクチンであることを確認した。
【００１５】
具体的には、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）の菌体表層にＨＩＶのエンベロープ蛋白質を発現させ、この組換え乳酸菌をマウスに経口投与した所、ＨＩＶに特異的な血清ｌｇＧ及び糞便ＩｇＡ抗体が高いレベルで誘導され、同様に、脾臓や腸間膜リンパ節でも細胞性免疫応答が惹起されたことを確認した。また、ワクチン効果を測定するために、ＨＩＶのエンベロープ蛋白質を発現するワクシニアウィルスを腹腔内感染させた。コントロールに比べ、ワクチンを摂取させたマウスではウィルス量が１／３００以下に抑えられた。更に、組換え乳酸菌で樹状細胞を刺激した所、この樹状細胞はＨＩＶペブチドをＴ細胞に提示し、ＨＩＶ特異的なｌＦＮ−γ産生Ｔ細胞が誘導された。これらの結果より、Ｌ．ｌａｃｔｉｓの菌体表層にＨＩＶエンベロープ蛋白質を発現させた組換え乳酸菌はＨＩＶワクチンとして有効であることが支持された。
【００１６】
本発明のＨＩＶのエンベロープ蛋白質を乳酸菌の菌体表層への発現については、前述の特許文献１及び２の発明を利用することができる。即ち、特許文献１及び２で示されたアンカー配列をコードする遺伝子配列にＨＩＶのエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子配列を繋いで宿主となる乳酸菌内に導入することにより発現することができる。
【００１７】
本発明では、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）  ＮＣＤＯ  ７６３株由来の  ７６３プロテアーゼのアンカー配列について、既に使用可能であることが確認された３８〜２４５アミノ酸残基（特許文献１より）、及び３３２アミノ酸残基（特許文献２より）の各々のアンカー配列を比較した結果、３３２アミノ酸残基のアンカー配列は他のアンカー配列に比べ、菌体表層への発現量及び菌体表層での蛋白質の安定性が優れていることを見出し、本発明では、３３２アミノ酸残基を用いた。
【００１８】
従って、本発明では、好ましくは、ＨＩＶのエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子に、配列番号１に示された３３２アミノ酸残基のアンカー配列をコードする遺伝子又はＮ末端側のアミノ酸残基の一部を切断したアミノ酸残基をコードする遺伝子を繋いで宿主となる乳酸菌内に導入してＨＩＶのエンベロープ蛋白質を乳酸菌の菌体表層へ発現させる。
【００１９】
本発明の好適な例として、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）をベクターワクチンに用いた例を示したが、菌体表層にＨＩＶ由来の蛋白質を発現させることができるのであれば、他の乳酸球菌・乳酸桿菌でも安全で投与を終えた後に不用意に腸管に住みつく虞のないベクターワクチンを構築することができる。
【００２０】
また、本発明のＨＩＶ由来の蛋白質としては、ＨＩＶのエンベロープ蛋白質、より好適な例として、抗原として認識されるエピトープである。この蛋白質をターゲットとして免疫応答を惹起できれば、効率の良いワクチン開発が期待できる。そのため、エンベロープ蛋白質の部分のＶ２ループからＶ４ループ領域（以下、「Ｖ２−Ｖ４領域」と記す）に着目して、この領域の蛋白質を発現させた乳酸菌の経口投与により、ＨＩＶに対するマウスの液性免疫が誘導されることを確認した。尚、「Ｖ２−Ｖ４領域」をコードするアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００２１】
尚、エピトープと考えられるＶ２−Ｖ４領域を菌体表層に発現させた例を示したが、発現させる蛋白質としては、この部分（Ｖ２−Ｖ４領域）だけでなく、例えば、全体の蛋白質でも良い。また、ＨＩＶウィルスは逆転写酵素によって読み取り間違いを起こし、エンベロープ蛋白質等が変異しやすい。従って、最も変異し難い部分の蛋白質を発現させることが有用なワクチンとなるが、逆に変異を予測してＨＩＶのエンベロープ蛋白質の誘導体を発現させてもよい。
【００２２】
以上のように、乳酸菌の菌体表層に異種蛋白質を発現させる系を用いて、ＨＩＶのエンベロープ蛋白質を乳酸菌の菌体表層に発現させることが可能であれば、この組換え乳酸菌は腸管内粘膜や他の粘膜上で粘膜免疫を刺激し、ひいては局所免疫及び全身性免疫を惹起し、ＨＩＶに対する効果的なワクチンになり得る。
【００２３】
【実施例】
実施例１．組換え乳酸菌の構築及び発現蛋白質の解析
まず、ＨＩＶのエンベロープ蛋白質のＶ２からＶ４のループ領域をＰＣＲで増幅した。使用したプライマーは以下の通りであり、Ｖ２−ＥｃｏＲＩは  ＥｃｏＲＩ部位を、Ｖ４−ＳａｌＩはＳａｌＩ部位を導入した。
Ｖ２−ＥｃｏＲＩ：ＡＧＡＡＴＴＣＧＴＡＡＣＴＣＡＧＴＣＡＴＴＡＣ
Ｖ４−ＳａｌＩ  ：ＡＧＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣ
【００２４】
このＰＣＲ産物を  ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで切断し、菌体表層発現ベクター  ｐＳＧＡＮＣ３３２の  ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ部位に挿入した。図１は菌体表層発現ベクター  ｐＳＧＡＮＣ３３２にＨＩＶのエンベロープ蛋白質のＶ２−Ｖ４ループ領域の遺伝子を組み込んだｐＨＩＶの構成を示す制限酵素地図である。このプラスミドｐＨＩＶをＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓＩＬ１４０３にエレクトロポレーション法で導入して形質転換した。用いた機械はバイオラッド社のジーンパルサーで、条件は０．１ｃｍキュベットを用い、２５μＦ，２０００Ｖ，２００Ωで行った。
【００２５】
この様にして作製した菌株を以下、ＩＬ１４０３−ｐＨＩＶと呼ぶ。尚、得られたＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＩＬ１４０３／ｐＨＩＶは、ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３５０  として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１５年５月１４日付けで寄託されている。また、陰性対照として、ベクター  ｐＳＧＡＮＣ３３２のみを導入した菌株ＩＬ１４０３−ｐＥｍｐｔｙも作製した。同様にして、細胞質内にエンベロープ蛋白質を発現する菌株ＩＬ１４０３−ｐＣｙＨＩＶを作製した。
【００２６】
培地はＭ１７培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に０．５％のグルコースを添加したＧＭ１７を用い、３２℃で静置培養した。目的通りにエンベロープ蛋白質が発現されているかを、得られた組換え乳酸菌（ＩＬ１４０３−ｐＨＩＶ）の全蛋白質を抽出し、抗ＨＩＶ抗体を用いたウエスタン解析により検証した。具体的には、菌体を培養、集菌、洗浄後、２ｘＳＤＳ溶液（１２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８），４％ＳＤＳ，２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．０１％ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ，１０％β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）に菌を懸濁し、１０分間煮沸して、溶菌させた。
【００２７】
上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、泳動物をＥＣＬニトロセルロース膜に電気的に転写した。転写した膜に、一次抗体としてヒト抗ＨＩＶ抗体を、二次抗体としてＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）で標識した抗ヒトＩｇＧ抗体を加え、ＥＣＬウエスタンブロット解析キットを用いて、エンベロープ蛋白質を検出した。
【００２８】
図２はその結果を示す電気泳動写真を模式的に示した説明図であり、図２に示す通りに、ＩＬ１４０３−ｐＨＩＶの全蛋白質で、抗ＨＩＶ抗体と反応するバンドが確認された。一方、ベクターのみを形質転換した株ＩＬ１４０３−ｐＥｍｐｔｙでは抗ＨＩＶ抗体と反応するバンドは検出されなかった。この結果より、ＨＩＶエンベロープ遺伝子を組み込んだ乳酸菌では菌体内でエンベロープ蛋白質が発現していることが明らかになった。
【００２９】
また、菌体表層にエンベロープ蛋白質が発現しているかを次に調べた。菌体を集菌、洗浄後、一次抗体としてヒト抗ＨＩＶ抗体で処理し、次いで、二次抗体としてＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）で標識した抗ヒトｌｇＧ抗体で菌体を処理後、フローサイトメトリーで菌体表層に結合している抗体を解析した。
【００３０】
図３はエンベロープ蛋白質が菌体表層に発現しているかフローサイトメトリーを用いて解析した結果を示す説明図であり、図に示す通り、９８．３％の菌が表層にエンベロープ蛋白質を発現していたことが判った。
【００３１】
実施例２．組換え乳酸菌の経口投与と血清ｌｇＧ及び糞便ＩｇＡの抗体価の測定上記で作製した組換え乳酸菌を８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに２週間間隔で１０８  ｃｆｕ、計５回経口投与した。尚、乳酸菌を経口投与する際に、５μｇのコレラ毒素もアジュバントとして、一緒に経口投与した。最終投与の２週間後に血清及び糞便を採取した。糞便は１００μｇを０．５ｍｌのＰＢＳに懸濁し、遠心上清を以降の解析に用いた。血清及び糞便中の抗体価の解析は以下の通りに行った。
【００３２】
まず、ＨＩＶのエンベロープ蛋白質のＶ３領域のペプチド（ＮＮＴＲＫＲＱＲＧＰＧＲＱＦＶＴＩＧＫＩＧＮ）を予め９６穴プレートにコーティングした。次に各穴を１％ＢＳＡでブロッキングし、段階希釈した血清又は糞便上清を加えた。更にＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）で標識した抗マウスＩｇＧ（血清用）又は抗マウスＩｇＡ（糞便用）を加え、最後に基質を加え、血清中のｌｇＧの抗体価及び糞便中のＩｇＡの抗体価を測定した。
【００３３】
図４は血清中のｌｇＧの抗体価及び糞便中のＩｇＡの抗体価を測定した結果を示す説明図である。図に示す通り、ベクター  ｐＳＧＡＮＣ３３２のみを組み込まれた乳酸菌（ＩＬ１４０３−ｐＥｍｐｔｙ）を投与されたマウスに比べ、ＨＩＶエンベロープ蛋白質を発現している乳酸菌（ＩＬ１４０３−ｐＨＩＶ）を投与されたマウスの血清ｌｇＧは約３００倍、糞便ＩｇＡでは約１００倍の抗体価が検出され、有意な差が認められた。この結果はＨＩＶエンベロープ蛋白質を菌体表層に発現している乳酸菌の経口投与により、ＨＩＶに対するマウスの液性免疫が誘導されていることを示している。
【００３４】
実施例３．ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
上記で述べた様に経口免疫したマウスのリンパ細胞が抗原刺激に応じてＩＦＮ−γを産生するかをＭａｂＴｅｃｈ社のＥＬＩＳｐｏｔアッセイキットを用いて測定した。
【００３５】
まず、ミリポア社のＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ−ＩＰプレートを７０％エタノールで処理し、ＰＢＳで洗浄した。次に、プレートを１０μｇ／ｍｌの抗マウスｌＦＮ−γ抗体でコーティングした。洗浄後、１０％ウシ胎児由来の血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地でプレートをブロッキングした。経口免疫したマウスの脾臓及び腸間膜リンパ節からリンパ細胞を単離し、各ウェルに加えた。
【００３６】
リンパ細胞をＨＩＶエンベロープ蛋白質のＶ３ペプチド（ＮＮＴＲＫＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫＩＧＮ）で２４時間刺激後、ビオチンで標識した抗マウスＩＦＮ−γ抗体を加え、更に、ストレプトアビジンを結合させたアルカリフォスファターゼを加え、最後に基質を加えた。陽性スポットの数を画像処理機械で読み取り、抗原刺激によりＩＦＮ−γを産生する細胞数を測定した。
【００３７】
図５は抗原刺激によりＩＦＮ−γを産生する細胞数を測定した結果を示す説明図である。図に示す通り、非投与群及びＩＬ１４０３−ｐＥｍｐｔｙ投与群に比ベ、ＩＬ１４０３−ｐＨｌＶ投与群ではＩＦＮ−γ産生リンパ細胞の数は有意に（ｐ＜０．０５）増加していた。また、脾臓よりも腸間膜リンパ節の方がＩＦＮ−γ産生リンパ細胞の数が多く、全身性の免疫応答よりも、粘膜局所の免疫応答が強く惹起されていることが判明した。
【００３８】
実施例４．細胞質内サイトカイン染色（Ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ；ＩＣＣＳ）アッセイ
上記で述べた様に経口免疫したマウスのＣＤ８陽性Ｔ細胞のうち、抗原刺激に対してＩＦＮ−γを産生するＴ細胞をＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社のＣｙｔｏｆｉＸ／ＣｙｔｏＰｅｒｍ  Ｐｌｕｓキットを用いて検出した。
【００３９】
経口免疫したマウスの脾臓及び腸間膜リンパ節からリンパ細胞を単離し、ＨＩＶエンベロープ蛋白質のＶ３ペプチドで２４時間刺激した。細胞を洗浄し、４％のマウス血清でブロッキング後、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ；ＰＥ）  で標識した抗マウスＣＤ８抗体を加えた。洗浄後、細胞をＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液で懸濁・固定化し、洗浄後、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）で標識した抗ＩＦＮ−γ抗体を加え、フローサイトメトリーで解析した。
【００４０】
図６はＩＦＮ−γを産生する細胞の割合をフローサイトメトリーで測定した結果を示す説明図である。図に示す通り、ＩＬ１４０３−ｐＥｍｐｔｙ投与群では０．０１±０．０１％がＩＦＮ−γ産生細胞であったが、ＩＬ１４０３−ｐＨＩＶ投与群の脾臓のＴ細胞では０．１２±０．０３％、腸間膜リンパ節のＴ細胞では０．２６±０．０３％がＩＦＮ−γ産生細胞であり、ＩＬ１４０３−ｐＨＩＶ投与群では有意に（ｐ＜０．０５）ＩＦＮ−γ産生細胞が増加していた。この実験でも、脾臓より腸間膜リンパ節の方がＩＦＮ−γ産生リンパ細胞の数が多く、全身性の免疫応答よりも、粘膜局所の免疫応答が強く惹起されていることを示している。
【００４１】
実施例５．テトラマーアッセイ
上記で述べた様に経口免疫したマウスの、ＭＨＣクラスＩで拘束されているＴ細胞が、抗原ペプチドを含むテトラマーと結合できるかを調べた。
【００４２】
まず、Ｈ−２Ｄｄ  ／ｐ１８テトラマー（ＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩ）をフィコエリトリンに結合させ、以下の実験に用いた。リンパ細胞を４％のマウス血清でブロッキング後、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）で標識した抗マウスＣＤ８抗体を加えた。洗浄後、フィコエリトリンで標識したテトラマー試薬を加え、フローサイトメトリーで解析した。
【００４３】
図７はＭＨＣクラスＩ拘束のＴ細胞が抗原ペプチドを含むテトラマーと結合できるかを検証した説明図である。図に示す通り、ＩＬ１４０３−ｐＥｍｐｔｙ投与群では０．０２±０．０１％のＴ細胞が結合可能であったが、ＩＬ１４０３−ｐＨＩＶ投与群の脾臓のＴ細胞では０．１５±０．０２％、腸間膜リンパ節のＴ細胞では０．２１±０．０３％が結合可能であり、ＩＬ１４０３−ｐＨＩＶ投与群では、有意に（ｐ＜０．０５）抗原ペプチドを認識可能なＴ細胞の割合が増加していた。
【００４４】
また、エンベロープ蛋白質を菌体表層に発現している株を経口投与した場合と、細胞質内に発現している株を経口投与した場合のＴ細胞の応答を同様の方法で比較した。図８はエンベロープ蛋白質を菌体表層に発現している株と細胞質内に発現している株との比較を示す説明図である。図において、各々の菌株の投与量を１０６，１０７，１０８，１０９とした場合のテトラマーと結合可能なＴ細胞の割合を示す。
【００４５】
図に示す通り、１回の投与量が１０８  ｃｆｕの時が一番高い応答を示し、菌体表層発現菌株（ＩＬ１４０３−ｐＨＩＶ）を経口投与した群では、細胞内発現菌株（ＩＬ１４０３−ｐＣｙＨＩＶ）と比ベ、有意に（ｐ＜０．０５）テトラマーと結合可能なＴ細胞の割合が増加していた。この結果は、細胞内で抗原蛋白質を発現させるよりも、菌体表層に抗原蛋白質を発現させた方が効率の良いワクチンになり得ることを示している。
【００４６】
実施例６．組換えワクシニアウィルスに対する防御効果
経口投与された組換え乳酸菌が防御効果を有するかを検討した。ＨＩＶはマウスには感染しないので、代わりにＨＩＶのエンベロープ蛋白質を発現する様に遺伝子を組み込まれたワクシニアウィルスｖＰＥ１６を用いた。
【００４７】
まず、組換え乳酸菌（ＩＬ１４０３−ｐＨＩＶ又はＩＬ１４０３−ｐＥｍｐｔｙ）をマウスに２週間間隔で１０８  ｃｆｕ、計５回経口投与した。乳酸菌を経口投与する際に、５μｇのコレラ毒素もアジュバントとして、一緒に経口投与した。最終投与の１週間後に１０８  個のｖＰＥ１６をマウスの腹腔内に投与した。
【００４８】
６日後、マウスの卵巣を単離し、卵巣内の感染したワクシニアウィルス数をＣＶ１細胞を宿主として測定した。図９は６日後の感染したワクシニアウィルス数の結果を示す説明図である。図に示す通り、ＩＬ１４０３−ｐＨＩＶ投与群では、ＩＬ１４０３−ｐＥｍｐｔｙ投与群に比ベ、卵巣から検出されたウィルス量が１／１０００以下に抑制されており、有意な（ｐ＜０．０５）抑制効果が認められた。
【００４９】
実施例７．樹状細胞の、Ｔ細胞に対するＨＩＶ抗原提示能の解析
マウスの骨髄から樹状細胞を抽出し、ＣＤｌｌｃマイクロビーズでＣＤｌｌｃ陽性細胞を単離した。この細胞１に対し、１００個の組換え乳酸菌（ＩＬ１４０３−ｐＨＩＶ又はＩＬ１４０３−ｐＥｍｐｔｙ）を加え、２時間放置した。洗浄後、５×１０６  個の細胞を経静脈で別のマウスに移植した。１週間後、前述のＩＣＣＳ法により、ＨＩＶ特異的にＩＦＮ−γを産生する脾臓のＴ細胞を測定してＩＦＮ−γ産生能を調べた。
【００５０】
図１０はＩＦＮ−γ産生能の結果を示す説明図である。図に示す通り、ＩＬ１４０３−ｐＨＩＶ投与群では、ＩＬ１４０３−ｐＥｍｐｔｙ投与群に比べ、ＨＩＶ特異的なＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞が約１２倍増加しており、有意な差（ｐ＜０．０５）が見られた。この結果は菌体表層にＨＩＶエンベロープ蛋白質を発現する乳酸菌が樹状細胞に取り込まれ、樹状細胞がエンベロープ蛋白質を抗原として認識し、刺激された樹状細胞がエンベロープ蛋白質を抗原としてＴ細胞に提示し、提示されたＴ細胞は抗原特異的にＩＦＮ−γを産生していることを示してＨＩＶに対する防御効果を発揮するものと考えられる。
【００５１】
【発明の効果】
本発明は以上説明した通り、粘膜免疫を誘導する経口性エイズワクチンを開発するに際して、安全な経口投与によるＨＩＶワクチンを得ることができる。具体的には、非病原性のベクターを用い、更に、投与を終えた後に不用意に腸管に住みつく虞のないベクターを用い安価な経口投与によるＨＩＶワクチンを得ることができるという効果がある。
【００５２】
【配列表】
2004339160.tif 000003
【００５３】
2004339160.tif 000004
2004339160.tif 000005
【００５４】
2004339160.tif 000006
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【図面の簡単な説明】
【図１】菌体表層発現ベクター  ｐＳＧＡＮＣ３３２にＨＩＶのエンベロープ蛋白質のＶ２−Ｖ４ループ領域の遺伝子を組み込んだｐＨＩＶの構成を示す制限酵素地図である。
【図２】エンベロープ蛋白質の検出結果を示す電気泳動写真を模式的に示した説明図である。
【図３】エンベロープ蛋白質が菌体表層に発現しているかフローサイトメトリーを用いて解析した結果を示す説明図である。
【図４】血清中のｌｇＧの抗体価及び糞便中のＩｇＡの抗体価を測定した結果を示す説明図である。
【図５】抗原刺激によりＩＦＮ−γを産生する細胞数を測定した結果を示す説明図である。
【図６】ＩＦＮ−γを産生する細胞の割合をフローサイトメトリーで測定した結果を示す説明図である。
【図７】ＭＨＣクラスＩ拘束のＴ細胞が抗原ペプチドを含むテトラマーと結合できるかを検証した説明図である。
【図８】エンベロープ蛋白質を菌体表層に発現している株と細胞質内に発現している株との比較を示す説明図である。
【図９】６日後の感染したワクシニアウィルス数の結果を示す説明図である。
【図１０】ＩＦＮ−γ産生能の結果を示す説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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