(57)【要約】【課題】塩基配列をスクリーニングするためのシステム、そのための方法、プログラム、記録媒体および塩基配列のスクリーニングを実行させるためのサーバを提供する。【解決手段】ターゲット塩基配列データおよびプローブ塩基配列とを格納するステップ（Ｓ１０）と、ターゲット塩基配列に対して結合する可能性のあるプローブ塩基配列から相補配列データを生成し、ターゲット塩基配列とプローブ塩基配列との間に許容する最大の編集距離を格納するステップ（Ｓ１２）と、各塩基配列データおよび最大編集距離を各格納部から読み出してターゲット塩基配列データと相補配列データとを編集距離の大きな順に結合可能性を評価するステップ（Ｓ１４）と、結合性の評価の結果を記憶部に格納するステップ（Ｓ１６）とを含む。【選択図】  図３
2004259119.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基配列のスクリーニングを実行するためのコンピュータ・システムであって、該システムは、
ターゲット塩基配列データを格納するターゲット塩基配列格納部と、
ターゲット塩基配列に対して結合する可能性のあるプローブ塩基配列から相補配列データを生成して格納する相補配列データ格納部と、
前記ターゲット塩基配列データと前記相補配列データとを編集距離の大きな順に評価して、前記プローブ塩基配列の前記ターゲット塩基配列に対する結合可能性を判断する処理を実行する評価処理部と、
前記評価処理部により得られた評価結果を格納する記憶部と
を含む塩基配列のスクリーニングを実行するためのコンピュータ・システム。
【請求項２】
前記コンピュータ・システムは、前記ターゲット塩基配列と前記プローブ塩基配列との間に許容する最大の編集距離を格納する最大編集距離格納部を含む、
請求項１に記載のコンピュータ・システム。
【請求項３】
前記評価処理部は、評価停止を動的に判断する停止判断部を含み、前記停止判断部は、前記最大編集距離を越えて前記相補配列データの評価が行われることを判断する、
請求項２に記載のコンピュータ・システム。
【請求項４】
塩基配列のスクリーニングを実行するためのコンピュータ・システムであって、該システムは、
ターゲット塩基配列データを格納するターゲット塩基配列格納部と、
ターゲット塩基配列に対して結合する可能性のあるプローブ塩基配列から相補配列データを生成して格納する相補配列データ格納部と、
前記ターゲット塩基配列データから短鎖の部分配列を指定すると共に、前記部分配列ごとに前記相補配列データとを編集距離の大きな順に評価して、前記プローブ塩基配列の前記ターゲット塩基配列に対する結合可能性を判断する処理を実行する評価処理部と、
前記評価処理部により得られた評価結果を格納する記憶部と
を含む塩基配列のスクリーニングを実行するためのコンピュータ・システム。
【請求項５】
前記コンピュータ・システムは、前記ターゲット塩基配列と前記プローブ塩基配列との間に許容する最大の編集距離を格納する最大編集距離格納部を含む、
請求項４に記載のコンピュータ・システム。
【請求項６】
前記評価処理部は、評価停止を動的に判断する停止判断部を含み、前記停止判断部は、前記最大編集距離を越えて前記相補配列データの評価が行われることを判断する、
請求項５に記載のコンピュータ・システム。
【請求項７】
前記評価処理部は、前記動的停止判断部の判断に応答して、前記部分配列指定部に対して直前に評価を実行していた部分配列と所定の重なり合いを有する他の部分配列を指定させる、
請求項５に記載のコンピュータ・システム。
【請求項８】
コンピュータ・システムに対して塩基配列のスクリーニングを実行させるためのコンピュータ制御方法であって、該方法は、コンピュータ・システムに対して、
ターゲット塩基配列データおよびプローブ塩基配列を格納するステップと、
ターゲット塩基配列に対して結合する可能性のあるプローブ塩基配列から相補配列データを生成して格納するステップと、
前記ターゲット塩基配列と前記プローブ塩基配列との間に許容する最大の編集距離を格納するステップと、
前記各塩基配列データおよび前記最大編集距離を各格納部から読み出して前記ターゲット塩基配列データと前記相補配列データとを編集距離の大きな順に結合可能性を評価するステップと、
前記評価の結果を記憶部に格納するステップと
を実行させる、コンピュータ制御方法。
【請求項９】
前記評価ステップは、さらに前記最大編集距離を越えて前記相補配列データの評価が行われることを判断するステップと、
前記判断結果に応答して停止信号を生成するステップと
を含む請求項８に記載のコンピュータ制御方法。
【請求項１０】
コンピュータ・システムに対して塩基配列のスクリーニングを実行させるためのコンピュータ制御方法であって、該方法は、コンピュータ・システムに対して、
ターゲット塩基配列データおよびプローブ塩基配列を格納するステップと、
ターゲット塩基配列に対して結合する可能性のあるプローブ塩基配列から相補配列データを生成して格納するステップと、
前記ターゲット塩基配列と前記プローブ塩基配列との間に許容する最大の編集距離を格納するステップと、
前記ターゲット塩基配列データから短鎖の部分配列を指定すると共に、前記部分配列ごとに前記相補配列データとを編集距離の大きな順に評価して、前記プローブ塩基配列の前記ターゲット塩基配列に対する結合可能性を評価するステップと、
前記評価の結果を記憶部に格納するステップと
を実行させる、コンピュータ制御方法。
【請求項１１】
前記評価ステップは、少なくとも前記部分配列のうちの１つについて前記最大編集距離を越えて前記相補配列データの評価が行われることを判断するステップと、
前記判断の結果に応答して動的に評価を停止するステップとを含む、
請求項１０に記載のコンピュータ制御方法。
【請求項１２】
前記評価ステップは、さらに評価の停止を判断するステップと、
前記評価の停止の判断に応答して、直前に評価を実行していた部分配列と所定の重なり合いを有する他の部分配列を指定するステップと
を含む、請求項１１に記載のコンピュータ制御方法。
【請求項１３】
コンピュータ・システムに対して塩基配列のスクリーニングを実行させるためのコンピュータ制御方法のためのコンピュータ実行可能なプログラムであって、該プログラムは、前記コンピュータ・システムを制御して、
ターゲット塩基配列データおよびプローブ塩基配列を格納するステップと、
ターゲット塩基配列に対して結合する可能性のあるプローブ塩基配列から相補配列データを生成して格納するステップと、
前記ターゲット塩基配列と前記プローブ塩基配列との間に許容する最大の編集距離を格納するステップと、
前記各塩基配列データおよび前記最大編集距離を各格納部から読み出して前記ターゲット塩基配列データと前記相補配列データとを編集距離の大きな順に結合可能性を評価するステップと、
前記評価の結果を記憶部に格納するステップと
を実行させる、コンピュータ実行可能なプログラム。
【請求項１４】
前記評価ステップは、さらに前記最大編集距離を越えて前記相補配列データの評価が行われることを判断するステップと、
前記判断結果に応答して評価を停止させるステップと
を含む請求項１３に記載のコンピュータ実行可能なプログラム。
【請求項１５】
コンピュータ・システムに対して塩基配列のスクリーニングを実行させるためのコンピュータ制御方法のためのコンピュータ実行可能なプログラムであって、該プログラムは、コンピュータ・システムを制御して、
ターゲット塩基配列データおよびプローブ塩基配列を格納するステップと、
ターゲット塩基配列に対して結合する可能性のあるプローブ塩基配列から相補配列データを生成して格納するステップと、
前記ターゲット塩基配列と前記プローブ塩基配列との間に許容する最大の編集距離を格納するステップと、
前記ターゲット塩基配列データから短鎖の部分配列を指定すると共に、前記部分配列ごとに前記相補配列データとを編集距離の大きな順に評価して、前記プローブ塩基配列の前記ターゲット塩基配列に対する結合可能性を評価するステップと、
前記評価の結果を記憶部に格納するステップと
を実行させる、コンピュータ実行可能なプログラム。
【請求項１６】
前記評価ステップは、少なくとも前記部分配列のうちの１つについて前記最大編集距離を越えて前記相補配列データの評価が行われることを判断するステップと、
前記判断の結果に応答して動的に評価を停止するステップと、
前記評価の停止の判断に応答して、直前に評価を実行していた部分配列と所定の重なり合いを有する他の部分配列を指定するステップと
を含む、請求項１５に記載のコンピュータ実行可能なプログラム。
【請求項１７】
請求項１３に記載のプログラムを記録したコンピュータ可読な記憶媒体。
【請求項１８】
請求項１５に記載のプログラムを記録したコンピュータ可読な記憶媒体。
【請求項１９】
塩基配列のスクリーニングをネットワークを介して実行するためのサーバであって、該サーバは、
ターゲット塩基配列データを格納するデータベースと、
ネットワークを介してターゲット指定データとターゲット塩基配列に結合する可能性のあるプローブ塩基配列を受け取ると共に、スクリーニングの結果を前記ネットワークを介して送出する送受信部と、
前記プローブ塩基配列から相補配列データを生成して格納する相補配列データ格納部と、
前記ターゲット指定データを使用して前記データベースを検索し、検索されたターゲット塩基配列データと前記相補配列データとを編集距離の大きな順に評価して、前記プローブ塩基配列の前記ターゲット塩基配列に対する結合可能性を判断する処理を実行すると共に、前記送受信部に伝送する評価処理部と、
を含むサーバ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、塩基配列のスクリーニングに関し、より詳細には所定の塩基配列が、他の塩基配列の一部分を構成するか否かを効率よく判定するために、所定の塩基配列をスクリーニングするためのシステム、そのための方法、該方法をコンピュータに対して実行させるためのプログラム、該プログラムを記憶したコンピュータ可読な記録媒体およびネットワークを介して塩基配列のスクリーニングを実行させるためのサーバに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡは、Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）からなる４種類の塩基から構成される塩基鎖であり、ＲＮＡはＡ、Ｕ（ウラシル）、Ｇ、Ｃからなる４種類の塩基から構成されることが知られている。これらの合計５種類の塩基は、相補塩基と呼ばれる組み合わせでそれぞれ特異的に結合することが知られており、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）（ＲＮＡの場合にはアデニン（Ａ）とウラシル（Ｕ））、シトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）とが、それぞれ結合し、２重鎖を形成することが知られている。この２重鎖がハイブリダイゼーションとして参照されており、２重鎖を生成することをハイブリダイズする、として参照されている。また、所与の塩基配列に対して、２重鎖を形成するように結合することが可能な塩基配列は、相補配列として参照されている。
【０００３】
上述した各塩基間の相補性という性質を利用することにより、所定のＤＮＡや、ＲＮＡを含む可能性のある試料中において、目的とするＤＮＡやＲＮＡ（以下、本発明においては、被検査対象とされる塩基配列のことを、ターゲット塩基配列として参照する。）が存在するか否か、を判断することが必要とされる場合がある。さらに、本発明においてはプローブとして参照され、ＤＮＡやＲＮＡの所与の領域の塩基に対して特異的に結合する塩基鎖を用意し、この塩基鎖がターゲット配列に対して結合、すなわちハイブリダイゼーションするかどうかを判断する必要が生じることもある。上述した判断を、結合性判断またはハイブリダイゼーション判断として参照する。また、ターゲット塩基配列を検出するために使用する相補配列をプローブとして参照する。
【０００４】
上述した結合性の判断は、種々の目的のために利用されており、例えばＤＮＡチップは、上述したハイブリダイゼーションの性質を利用する情報処理チップである。情報処理チップは、多くの場合様々なＤＮＡ、ＲＮＡといった塩基配列に対する相補配列を用意し、同時に大量のハイブリダイゼーション判断を行わせることにより、目的とする処理を実行する。また、いわゆるＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）は、ＤＮＡの配列上の２箇所の部分の配列に対して相補配列を作成し、これらの相補配列で囲まれる領域を大量にコピーすることにより、ＤＮＡの配列に対する判断・評価を行う手法である。
【０００５】
これらの相補配列を使用する判断・評価において多くの場合、対象とされる現実の試料に目的とは異なる別のＤＮＡやＲＮＡの配列が混在する場合がある。このような場合、作成または提供されるプローブが、混在する塩基配列には結合しないことを保証することにより、判断・評価の効率化・高精度化、および高信頼化を達成することが可能となる。また、所定のＤＮＡに対して特異的なプローブＰを作成するためにＤＮＡやＲＮＡのシンセサイザが使用される場合もあり、目的以外のプローブＰを効率よく排除してゆくことにより、タンパク合成およびスクリーニングを含めた効率は、著しく高められるものと考えられる。
【０００６】
図１８は、ターゲット塩基配列と、プローブとの関係を示した図である。図１８においては、ターゲット塩基配列が符号Ｔで示されており、プローブが符号Ｐで示されている。ターゲット塩基配列Ｔは、例えば数千の塩基が結合した長鎖の塩基配列とすることができる（以下、本発明においては塩基数のことを、ｂａｓｅ  ｐａｉｒ：  ｂｐとして記述する。）。本質的には図１８に示されるプローブ１０２は、ターゲット塩基配列Ｔのうち、Ｔｐで示される領域の配列の完全な相補配列となっていることが理想的である。
【０００７】
しかしながら、所定の塩基配列と別の塩基配列とは、現実的には完全な相補配列でなくても結合する性質がある（８０％−９０％の一致でも結合する）。また、シーケンサなどの塩基配列決定装置における分析誤差もあるので、必ずしも１００％完全に一致しないからといって、プローブの候補となり得ないとして排除することは妥当ではない。このため、プローブＰとターゲット塩基配列とが結合しないことを確認するためには、従来は、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ法などの高精度アラインメント・アルゴリズムを適用して相互の塩基配列の解析を行い、プローブの相補配列に近い配列がターゲット塩基配列に全くないことを保証する必要とされていた。
【０００８】
また、これまで相互に近似する塩基配列を検索する手法として、ＢＬＡＳＴ  （Ａｌｔｃｈｕｌ  ＳＦ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，  ＧＷ．，  Ｍｙｅｒｓ  ＥＷ．，  Ｌｉｐｍａｎ  ＤＪ．，  “Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ”，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９９０，  Ｏｃｔ．  ５，  ２１５  （３），  ４０３−４１０）、ＦＡＳＴＡ  （Ｐｅａｒｓｏｎ，  ＷＲ．，  Ｌｉｐｍａｎ，  ＤＪ．，  “Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ”，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １９８８，  Ａｐｒ；  ８５（８），  ２４４４−２４４８  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ａｒｔｉｃｌｅｓ，  Ｌｉｎｋｓ）などの高速検索アルゴリズムが提案されている。しかしながら、これらのアルゴリズムでも上述したようなターゲット塩基配列中における類似する部分配列を全部発見できるわけではなく、ターゲット配列に対してプローブが結合しないという保証を行うスクリーニング用途には適するものではない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、従来技術の上述した不都合に鑑み、プローブＰが与えられた場合に、プローブＰとターゲット塩基配列Ｔとが少なくとも結合しないという評価の結果を、ユーザに対して迅速に提供することを可能とするものである。すなわち、プローブＰとターゲット塩基配列Ｔとが少なくとも結合しないことをユーザに対して示すことができれば、迅速にプローブの有効性および信頼性についての情報をユーザに対して提供することが可能となる。これまで種々の検索手法が提案されていたものの、ユーザの許容する範囲の誤差で所与のターゲット塩基配列に対して結合しないこと、または結合するという情報に加え、結合する場合には、可能性のあるプローブＰの配列をユーザに対して提示することを可能とする塩基配列のスクリーニング・システム、そのための方法、該方法をコンピュータに対して実行させるためのプログラム、該プログラムを記録したコンピュータ可読な記憶媒体、およびそのためのサーバが必要とされていた。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ユーザが要求する精度内ではプローブＰとターゲット塩基配列Ｔとが少なくとも結合しないことをおよびユーザが指定する許容範囲内で互いに結合する可能性がある場合には、結合する可能性と、相似度および該当するサブシーケンスの情報をユーザに対して提示することができれば、高速なプローブのスクリーニングが可能になるという着想のもとになされたものである。
【００１１】
本発明の上記課題を解決するために、本発明においては、ユーザが最大の編集距離を指定し、最大編集距離だけ相違するか否かの評価から評価を始め、降順にプローブＰとターゲット塩基配列Ｔとの結合性についての評価を行う。その結果、ユーザが指定する最大編集距離よりも編集距離が大きくなることが明らかになった時点でターゲット塩基配列全体の評価を行わずに「結合しない」ことについての情報を提供することができる。さらに、本発明においては、評価停止条件をサブシーケンスと相補配列Ｑとの間の塩基差に対応させて動的に変更させることにより、結合する可能性があると判断された場合には、それらの相似度、塩基配列といった付帯的データをユーザに対して提供することが可能となる。
【００１２】
さらに、本発明においてはさらに精度を向上させ、より長鎖のターゲット塩基配列に対しても高速化、高精度化を確実に提供することを可能とする。すなわち、本発明の他の態様では、ターゲット塩基配列は、一定の重複を持つ部分配列Ｔｐに分割され、部分配列ＴｐごとにプローブＰと結合しないことを判定する。より具体的には、評価したいターゲット塩基配列Ｔを適当なオーバーラップを与えた複数の部分配列Ｔｐ（ｐ＝１〜ｗ）に分割する。分割された部分配列Ｔｐごとに、プローブＰの配列の相補配列が部分配列Ｔｐに含まれるか否かの判断を実行することで、さらに信頼性を高めることが可能となる。また、ターゲット塩基配列を部分配列Ｔｐに分割する場合の鎖長について、本発明の方法を使用することができる。
【００１３】
すなわち、本発明によれば、塩基配列のスクリーニングを実行するためのコンピュータ・システムであって、該システムは、
ターゲット塩基配列データを格納するターゲット塩基配列格納部と、
ターゲット塩基配列に対して結合する可能性のあるプローブ塩基配列から相補配列データを生成して格納する相補配列データ格納部と、
前記ターゲット塩基配列データと前記相補配列データとを編集距離の大きな順に評価して、前記プローブ塩基配列の前記ターゲット塩基配列に対する結合可能性を判断する処理を実行する評価処理部と、
前記評価処理部により得られた評価結果を格納する記憶部と
を含む塩基配列のスクリーニングを実行するためのコンピュータ・システムが提供される。
【００１４】
本発明の前記コンピュータ・システムは、前記ターゲット塩基配列と前記プローブ塩基配列との間に許容する最大の編集距離を格納する最大編集距離格納部を含むことが好ましい。
【００１５】
本発明の前記評価処理部は、評価停止を動的に判断する停止判断部を含み、前記停止判断部は、前記最大編集距離を越えて前記相補配列データの評価が行われることを判断することができる。
【００１６】
本発明によれば、塩基配列のスクリーニングを実行するためのコンピュータ・システムであって、該システムは、
ターゲット塩基配列データを格納するターゲット塩基配列格納部と、
ターゲット塩基配列に対して結合する可能性のあるプローブ塩基配列から相補配列データを生成して格納する相補配列データ格納部と、
前記ターゲット塩基配列データから短鎖の部分配列を指定すると共に、前記部分配列ごとに前記相補配列データとを編集距離の大きな順に評価して、前記プローブ塩基配列の前記ターゲット塩基配列に対する結合可能性を判断する処理を実行する評価処理部と、
前記評価処理部により得られた評価結果を格納する記憶部と
を含む塩基配列のスクリーニングを実行するためのコンピュータ・システムが提供される。
【００１７】
本発明によれば、コンピュータ・システムに対して塩基配列のスクリーニングを実行させるためのコンピュータ制御方法であって、該方法は、コンピュータ・システムに対して、
ターゲット塩基配列データおよびプローブ塩基配列を格納するステップと、
ターゲット塩基配列に対して結合する可能性のあるプローブ塩基配列から相補配列データを生成して格納するステップと、
前記ターゲット塩基配列と前記プローブ塩基配列との間に許容する最大の編集距離を格納するステップと、
前記各塩基配列データおよび前記最大編集距離を各格納部から読み出して前記ターゲット塩基配列データと前記相補配列データとを編集距離の大きな順に結合可能性を評価するステップと、
前記評価の結果を記憶部に格納するステップと
を実行させる、コンピュータ制御方法が提供される。
【００１８】
本発明によれば、コンピュータ・システムに対して塩基配列のスクリーニングを実行させるためのコンピュータ制御方法であって、該方法は、コンピュータ・システムに対して、
ターゲット塩基配列データおよびプローブ塩基配列を格納するステップと、
ターゲット塩基配列に対して結合する可能性のあるプローブ塩基配列から相補配列データを生成して格納するステップと、
前記ターゲット塩基配列と前記プローブ塩基配列との間に許容する最大の編集距離を格納するステップと、
前記ターゲット塩基配列データから短鎖の部分配列を指定すると共に、前記部分配列ごとに前記相補配列データとを編集距離の大きな順に評価して、前記プローブ塩基配列の前記ターゲット塩基配列に対する結合可能性を評価するステップと、
前記評価の結果を記憶部に格納するステップと
を実行させる、コンピュータ制御方法が提供される。
【００１９】
本発明によれば、コンピュータ・システムに対して塩基配列のスクリーニングを実行させるためのコンピュータ制御方法のためのコンピュータ実行可能なプログラムであって、該プログラムは、前記コンピュータ・システムを制御して、
ターゲット塩基配列データおよびプローブ塩基配列を格納するステップと、
ターゲット塩基配列に対して結合する可能性のあるプローブ塩基配列から相補配列データを生成して格納するステップと、
前記ターゲット塩基配列と前記プローブ塩基配列との間に許容する最大の編集距離を格納するステップと、
前記各塩基配列データおよび前記最大編集距離を各格納部から読み出して前記ターゲット塩基配列データと前記相補配列データとを編集距離の大きな順に結合可能性を評価するステップと、
前記評価の結果を記憶部に格納するステップと
を実行させる、コンピュータ実行可能なプログラムが提供される。
【００２０】
本発明によれば、コンピュータ・システムに対して塩基配列のスクリーニングを実行させるためのコンピュータ制御方法のためのコンピュータ実行可能なプログラムであって、該プログラムは、コンピュータ・システムを制御して、
ターゲット塩基配列データおよびプローブ塩基配列を格納するステップと、
ターゲット塩基配列に対して結合する可能性のあるプローブ塩基配列から相補配列データを生成して格納するステップと、
前記ターゲット塩基配列と前記プローブ塩基配列との間に許容する最大の編集距離を格納するステップと、
前記ターゲット塩基配列データから短鎖の部分配列を指定すると共に、前記部分配列ごとに前記相補配列データとを編集距離の大きな順に評価して、前記プローブ塩基配列の前記ターゲット塩基配列に対する結合可能性を評価するステップと、
前記評価の結果を記憶部に格納するステップと
を実行させる、コンピュータ実行可能なプログラムが提供される。
【００２１】
本発明によれば、コンピュータ・システムに対して塩基配列のスクリーニングを実行させるコンピュータ制御方法のためのコンピュータ実行可能なプログラムが記録されたコンピュータ可読な記憶媒体であって、該プログラムは、前記コンピュータ・システムを制御して、
ターゲット塩基配列データおよびプローブ塩基配列を格納するステップと、
ターゲット塩基配列に対して結合する可能性のあるプローブ塩基配列から相補配列データを生成して格納するステップと、
前記ターゲット塩基配列と前記プローブ塩基配列との間に許容する最大の編集距離を格納するステップと、
前記各塩基配列データおよび前記最大編集距離を各格納部から読み出して前記ターゲット塩基配列データと前記相補配列データとを編集距離の大きな順から結合可能性を評価するステップと、
前記評価の結果を記憶部に格納するステップと
を実行させる、コンピュータ可読な記憶媒体が提供される。
【００２２】
本発明によれば、コンピュータ・システムに対して塩基配列のスクリーニングを実行させるコンピュータ制御方法のためのコンピュータ実行可能なプログラムが記録されたコンピュータ可読な記憶媒体であって、該プログラムは、コンピュータ・システムを制御して、
ターゲット塩基配列データおよびプローブ塩基配列を格納するステップと、
ターゲット塩基配列に対して結合する可能性のあるプローブ塩基配列から相補配列データを生成して格納するステップと、
前記ターゲット塩基配列と前記プローブ塩基配列との間に許容する最大の編集距離を格納するステップと、
前記ターゲット塩基配列データから短鎖の部分配列を指定すると共に、前記部分配列ごとに前記相補配列データとを編集距離の大きな順に評価して、前記プローブ塩基配列の前記ターゲット塩基配列に対する結合可能性を評価するステップと、
前記評価の結果を記憶部に格納するステップと
を実行させる、コンピュータ可読な記憶媒体が提供される。
【００２３】
本発明によれば、塩基配列のスクリーニングをネットワークを介して実行するためのサーバであって、該サーバは、
ターゲット塩基配列データを格納するデータベースと、
ネットワークを介してターゲット指定データとターゲット塩基配列に結合する可能性のあるプローブ塩基配列を受け取ると共に、スクリーニングの結果を前記ネットワークを介して送出する送受信部と、
前記プローブ塩基配列から相補配列データを生成して格納する相補配列データ格納部と、
前記ターゲット指定データを使用して前記データベースを検索し、検索されたターゲット塩基配列データと前記相補配列データとを編集距離の大きな順に評価して、前記プローブ塩基配列の前記ターゲット塩基配列に対する結合可能性を判断する処理を実行すると共に、前記送受信部に伝送する評価処理部と、
を含むサーバが提供される。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につき図面に示した具体的な実施の形態をもって説明するが、本発明は、後述する実施の形態に限定されるものではない。本発明における結合性判断において、ターゲット塩基配列から得られるコンピュータ処理可能なターゲット塩基配列データを、以下、ターゲット塩基配列Ｔとして参照し、プローブである塩基配列から得られるコンピュータ処理可能な塩基配列データを、プローブＰとして参照する。さらに、プローブＰのコンピュータ処理可能な相補配列データを相補配列Ｑとして参照する。
【００２５】
Ａ：本発明における使用パラメータおよび本質的処理の概説
図１は、ターゲット塩基配列Ｔと、プローブＰと、相補配列Ｑとの関連性を示した図である。図１（ａ）に示すように、本発明の特定の実施の形態において、プローブＰをＰ＝ＡＴＧＧＣＣＴＧＡＣとすると、Ｐの相補配列Ｑは、Ｑ＝ＧＴＣＡＧＧＣＣＡＴとなる。図１（ａ）に示すようにプローブＰと相補配列Ｑとの関係は、各塩基を相補塩基に置き換えただけではなく、配列の向きが図１（ａ）に示される矢線ＡＬにしたがい、逆となっていることに留意されたい。また、相補配列Ｑは、ユーザが指定する最大編集距離内においてターゲット塩基配列Ｔの一部を構成する配列部分となっていることが、本発明の評価の本質的な処理となる。
【００２６】
このとき、本発明においてはターゲット塩基配列Ｔと、プローブＰまたは相補配列Ｑとの間に相似度ｒを定義する。本発明においては、ターゲット塩基配列ＴとプローブＰとが結合するために、少なくともターゲット塩基配列Ｔが、プローブＰとの相似度でｒ以上の配列部分を含むことを要求する。すなわち、本発明では、ターゲット塩基配列ＴとプローブＰとは、ターゲット塩基配列中に相似度ｒの配列部分がなければ、結合できないものとされる。
【００２７】
相似度ｒを決定するためには種々の方法を使用することができ、本発明において具体的には、以下の基準を使用して相似度ｒを決定することができる。ターゲット塩基配列Ｔに含まれるサブシーケンスＳとすると、サブシーケンスＳから相補配列Ｑを生成するために、塩基の置換、欠失、挿入といった文字解析・判断処理が合計で最低でｋ回必要であるものとする。値ｋは、サブシーケンスＳと相補配列Ｑとの間の最大編集距離として参照することができる。ここで、プローブＰに対する相補配列Ｑの塩基鎖長をｍとして定義すれば、相似度ｒは、ｒ＝（ｍ−ｋ）／ｍとして定義することができる。したがって相似度がｒ以上とは、ｒについての上記式を参照して、最大編集距離がｍ（１−ｒ）以下のサブシーケンスＳと相補配列Ｑとを指定することに対応する。
【００２８】
図１（ｂ）は、上述した編集距離の決定する処理を具体的な実施の形態を使用して説明した図である。図１（ｂ）には、サブシーケンスＳ＝ＡＴＧＣＧＣＧＴＡＡＧＴであって、相補配列Ｑ＝ＡＴＧＣＧＴＴＡＡＣＴである場合の実施の形態をもって説明されている。図１（ｂ）に示した実施の形態では、サブシーケンスＳと、相補配列Ｑとの間の編集距離は４となり、相似度ｒは、ｒ＝（１１−４）／１１＝０．６３６４となる。図１（ｂ）には、部分配列Ｔｐと相補配列Ｑとをそれぞれ整列（以下、上述した処理を、アラインメントとして参照する。）させて示している。図１（ｂ）に示した実施の形態では、欠失が２回あり、置換および挿入がそれぞれ１回なので、編集距離は４である。
【００２９】
本発明においては、所定のターゲット塩基配列Ｔにおいて、ターゲット塩基配列Ｔと、相補配列Ｑとの間には、ターゲット塩基配列Ｔに相補配列Ｑの（ｍ−ｋ）個以上の塩基が順番を違えずに出現することがない場合、ターゲット塩基配列Ｔには相補配列Ｑとの編集距離がｋ以下のものは存在しないということができる。プローブＰと相補配列Ｑとの間には、図１（ａ）に示した関係が存在するため、プローブＰから生成された相補配列Ｑとターゲット塩基配列Ｔについての情報を得ることができれば、プローブＰとサブシーケンスＳとについての関係を容易に得ることが可能となる。
【００３０】
一方で、本発明においては、所与のプローブＰが結合してしまう可能性のあるターゲット塩基配列をスクリーニングすることもできる。図２は、本発明において部分配列Ｔｐと相補配列Ｑとの関係において、相補配列Ｑの特異性を判断する場合の処理を示した図である。図２では、複数のターゲット塩基配列がスクリーニングの対象とされており、プローブＰがターゲット塩基配列Ｔ１のみに特異的に結合するか否かを判断する実施の形態の概略図である。ターゲット塩基配列Ｔ１には、プローブＰの相補配列Ｑがそのまま含まれているのが示されており、またＴａについても、相補配列Ｑａが、ちょうど（ｍ−ａ）の編集距離（ａは、ｋよりも大きい正の正数である。）で存在しているのが示されている。また、ターゲット配列Ｔｂには、（ｍ−ｂ）（ｂは、ｋよりも小さい正の整数である。）の編集距離部分配列が存在しており、この結果、プローブは、ターゲット塩基配列Ｔ１およびＴｂについて結合する可能性があることが示される。この場合、本発明によれば、結合可能性の情報と共にサブシーケンスとの相似度および塩基鎖長がユーザに提示されるので、プローブＰをさらに特性を付与するべく設計することも可能である。
【００３１】
Ｂ．本発明のスクリーニング方法の処理
上述した特性を効率的に利用することにより、本発明では、ターゲット塩基配列が、プローブＰとして適切か否か、また他のプローブＰを提供する必要があるか否かの判断を、高精度な逐次的解析するよりも、より高速に確認することが可能となる。すなわち、本発明によれば、ターゲット塩基配列ＴにプローブＰがハイブリダイズしないことの保証が可能になる。図３には、本発明の方法の本質的な処理のフローチャートを示す。図３に示すように、本発明の塩基配列のスクリーニング方法は、ステップＳ１０においてプローブＰとするべき塩基配列およびターゲット塩基配列Ｔを受け取る。この際の入力としては、シーケンサなどによって実際に得られた塩基配列でも良い。さらに、プローブＰは、塩基配列のシンセサイザなどによって合成することもできる。また、ターゲット塩基配列については、例えばＤＮＡまたはＲＮＡといった塩基配列を格納したデータベースから、インタラクティブにユーザがターゲット塩基配列を選択することもできるし、ほ乳類、真核微生物などのｌｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅから採取したＤＮＡサンプルを使用することもできる。図３における本発明のスクリーニング方法は、次いで、ステップＳ１２へと進み、プローブＰから相補配列Ｑを生成し、適切な記憶領域に格納すると共に、最大編集距離ｋを受け取り、適切な記憶領域に格納する。
【００３２】
ステップＳ１４では、検査するべきターゲット塩基配列Ｔについて、関数ｌａｒｇｅｓｔ＿ｐｒｅｆｉｘ＿ｗｉｔｈ＿ｃｏｍｍｏｎ＿ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ（）を適用して、その時点で検討を加えているターゲット塩基配列Ｔについて、相補配列Ｑがターゲット塩基配列Ｔのサブシーケンスとして存在するか否かを判断することにより、結合性の評価を行なう。さらの本発明の処理は、ステップＳ１６へと進み、評価結果をコンピュータにおける適切な記憶領域に格納する。さらにステップＳ１６では、格納された評価結果を読み出して「結合する」、「結合しない」の判断を実行し、その結果がユーザに返され、ユーザに対して判断の結果が提供される。
【００３３】
図４は、本発明のスクリーニング方法の第２の実施の形態の処理を示したフローチャートである。図４に示した実施の形態では、対象とされるターゲット塩基配列Ｔは、複数Ｔ１〜Ｔｗとして存在し、ターゲット塩基配列ごとに評価結果が作成され、記憶領域に格納される。図４に示した実施の形態ではステップＳ２０において、プローブＰとするべき塩基配列および複数のターゲット塩基配列Ｔ１〜Ｔｗを受け取り、それぞれの格納部に格納する。ステップＳ２２において、プローブＱから相補配列Ｑを決定し、さらに編集距離ｋ、評価を繰り返して実行する部分配列の長さの単位（ｌｅｎｇｔｈ）と、重なり合いの長さ（ｏｖｅｒｌａｐ＿ｌｅｎｇｔｈ）といった変数の入力を受け取る。ステップＳ２４においてカウンタｔを、ｔ＝１に設定し、ステップＳ２６においてターゲット塩基配列に対して結合性の評価を実行する。ステップＳ２６においてターゲット塩基配列について評価を行い、その結果を記憶部に格納する。ステップＳ２８では、評価結果にアクセスして結合可能なサブシーケンスの有無などの情報を生成する。
【００３４】
ステップＳ３０においてカウンタｔをインクリメントし、ステップＳ３２において、ｔがｗよりも小さいか否かを判断する。ステップＳ３２の判断においてｔ≦ｗの場合（ｙｅｓ）には、ステップＳ３４に進み、Ｔｔ＋１のターゲット塩基配列を記憶領域から読み出し、ステップＳ２６へと戻り、Ｔｔ＋１のターゲット塩基配列についての評価結果を作成して格納する。ステップＳ３２の判断がｔ＞ｗ場合（ｎｏ）には、すでに評価を行うターゲット塩基配列について評価を終了しているので、ステップＳ３６へと進み、評価結果を判断してユーザに結合性の判断結果を提示する。
【００３５】
図５は、本発明において結合性を評価する処理を実行する関数である、ｌａｒｇｅｓｔ＿ｐｒｅｆｉｘ＿ｗｉｔｈ＿ｃｏｍｍｏｎ＿ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ（）のフローチャートを示した図である。図５に示した本発明における結合性の評価の処理は、ステップＳ４０の初期化処理から開始し、ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［ｉ］の値および編集距離カウンタｉの値を初期化する。ここで、ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［ｉ］は、関数ｎｅｘｔ＿ｃｈａｒ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎ（）で与えられる値を返すか、または関数ｎｅｘｔ＿ｃｈａｒ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎ（）で与えられる値とｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［ｉ−１］で与えられる値のうちの小さい方の値を返す関数である。また、関数ｎｅｘｔ＿ｃｈａｒ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎ（）は、引数としてターゲット塩基配列、編集距離カウンタｉ、相補配列に存在する塩基の文字ｃとを引数として使用し、ｎｅｘｔ＿ｃｈａｒ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎ（Ｔ，  ｉ，  ｃ）は、ターゲット塩基配列Ｔの塩基鎖の先頭から数えて、Ｔ［ｉ．．ｎ］の中で最初に出てくる文字ｃの位置を返す関数である。また、文字ｃの塩基がＴ［ｉ．．ｎ］の中に出現しない場合には、値（ｎ＋１）を返す関数である。
【００３６】
ステップＳ４２においては、評価を行う相補塩基の塩基位置を示す変数であるｐｒｏｂｅ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎの値およびｍｉｎ＿ｋの値を初期化する。このｍｉｎ＿ｋの値は、ｍｉｎ＿ｋよりも小さな編集距離はありえない値を規定するものであり、部分配列と相補配列Ｑとの間の塩基の不致の最小値を与える尺度である。すなわち、ｍｉｎ＿ｋ＝０は、サブシーケンスＳと、相補配列Ｑとが完全に一致することに対応する。同時にｍｉｎ＿ｋは、停止判断を行うための停止条件値としても使用され、さらにプローブＰとサブシーケンスＳとの間の塩基誤差の尺度を与える。ステップＳ４４においては、相補塩基Ｑに含まれる塩基数に対応する変数ｐｒｏｂｅ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎが相補塩基Ｑの塩基数であるｍよりも大きいか否かを判断する。ステップＳ４４における判断において変数ｐｒｏｂｅ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎがｍよりも大きくなった場合（ｙｅｓ）には、すでに評価するべき相補塩基の塩基は残されていないので、ステップＳ４８へと進む。この段階では、編集距離カウンタｉはｍｉｎ＿ｋよりも大きいので、ｍ−ｋ以上の鎖長のサブシーケンスが存在する可能性がまだ残されているので、ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［ｋ］の値を出力し、記憶部に格納する。
【００３７】
一方、ステップＳ４４の判断において変数ｐｒｏｂｅ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎがｍ以下の場合（ｎｏ）には、ステップＳ５２に示す評価処理を実行する。評価処理は、より詳細には後述するが、ｐｏｓｉｔｉｏｎ［ｉ］の値を決定し、評価結果を記憶部に格納する処理を実行させる。詳細には後述するように評価処理が所定の停止条件を満たすことにより終了すると、処理はステップＳ４６においてｍｉｎ＿ｋの値が最大編集距離ｋよりも大きくなったか否かを判断する。ｍｉｎ＿ｋがｋよりも大きい場合（ｙｅｓ）には、（ｍ−ｋ）以上の共通サブシーケンスが存在しないので、ステップＳ５０に進んで、（ｎ＋１）をｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［ｉ］の値として出力させ、評価処理を停止させる。ステップＳ４６の判断における“ｔｒｕｅ”の値が評価停止を行うための信号として生成される。また、ステップＳ４６の判断において、ｍｉｎ＿ｋの値がｋより大きくない場合（ｎｏ）には、その後処理は、ステップＳ５４へと進み、ｐｒｏｂｅ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎの値をインクリメントして、処理をステップＳ４４へと戻し、相補配列Ｑにおける次の塩基の評価を再度実行させる。ステップＳ４４からステップＳ５２の処理は、ｍｉｎ＿ｋの値を動的に変化させることで評価処理の停止条件を動的に変更させながら、ステップＳ４６の判断が肯定的な結果（ｙｅｓ）を返すまで繰り返される。
【００３８】
図６は、図５のステップＳ４０に示した初期化処理の処理を示した図である。図６において示した初期化処理は、ステップＳ６０において編集距離カウンタｉを０に初期化し、ステップＳ６２およびステップＳ６４において、編集距離カウンタｉが最大編集距離ｋよりも大きくなるまでｐｏｓｉｔｉｏｎ［ｉ］＝０としてセットする。同時に編集距離カウンタｉを、ｉ＝ｉ＋１へとインクリメントする。この初期化処理は、編集距離ｋ以下に対し、ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［ｉ］の値が確実に０となるように設定するために使用される。
【００３９】
図７は、図５において説明したステップＳ５２の評価処理の詳細なプロセスを示したフローチャートである。図７に示した評価処理は、ステップＳ７０においてｍａｘ＿ｋを最大編集距離の値ｋ、またはｐｒｏｂｅ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎの値のうち、小さい方の値として設定する。ステップＳ７２では、編集距離カウンタｉが停止条件であるｍｉｎ＿ｋよりも小さいか否かを判断する。編集距離カウンタｉの値がｍｉｎ＿ｋ以上の場合には（ｎｏ）には、ステップＳ７４に進んで編集距離カウンタｉが０か否かを判断する。また、ステップＳ７２の判断において編集距離カウンタｉがｍｉｎ＿ｋより小さいと判断される場合（ｙｅｓ）には、評価処理を停止し、図５のステップＳ５４へと分岐する。
【００４０】
ステップＳ７４の判断において、編集距離カウンタｉが０の場合（ｙｅｓ）には、ステップＳ７６へと進んでｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［ｉ］の値をｎｅｘｔ＿ｃｈａｒ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎ（Ｔ，  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［ｉ］＋１，Ｑ（ｐｒｏｂｅ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎ））として与える。
【００４１】
一方、ステップＳ７４の判断において、ｉ＝０ではないと判断された場合（ｎｏ）には、処理は、ステップＳ７８へと分岐し、ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［ｉ］の値を、ｎｅｘｔ＿ｃｈａｒ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎ（Ｔ，  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［ｉ］＋１，Ｑ（ｐｒｏｂｅ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎ））の値、またはｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［ｉ−１］の値のいずれか小さい方の値として設定する。したがって、ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［ｉ］がその時点で評価している塩基数ｎ以下の値を返す場合には、所定の最大編集距離ｋ内において一致する塩基配列が存在する可能性があることを意味する。ステップＳ７６およびステップＳ７８において算出されたｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［ｉ］の値は、評価結果として適切な記憶部に格納される。
【００４２】
その後、処理はステップＳ８０へと進んで、ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［ｉ］がｎよりも大きくなったか否かを判断する。上述したように、関数ｎｅｘｔ＿ｃｈａｒ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎ（）は、評価している塩基に該当するものが見出されない場合であてもその値として相補配列Ｑの塩基数であるｎ以下の値を返す。したがって、ステップＳ８０の判断において、ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［ｉ］の値がｍ以下である場合（ｎｏ）には、さらに適合する可能性を判断するために、ステップＳ８４において編集距離カウンタｉを、ｉ＝ｉ−１として降順に設定し、ステップＳ７２へと処理を戻してさらに判断を続行させる。また、ステップＳ８０の判断が（ｙｅｓ）の場合には、図５に示したｌａｒｇｅｓｔ＿ｐｒｅｆｉｘ＿ｗｉｔｈ＿ｃｏｍｍｏｎ＿ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ（）によりｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［ｉ］の値がｎ＋１として与えられ、図７の評価処理を終了させるべく、ステップＳ８２においてｍｉｎ＿ｋ＝ｉ＋１として設定した後、ステップＳ８４へと処理を戻す。ステップＳ８４では、ｉ＝ｉ−１に設定した後、処理をステップＳ７２へと戻すので、ステップＳ７２において確実に判断結果として真の値（ｙｅｓ）を返し、図５に示したステップＳ５４へと分岐させ、処理を繰り返す。
【００４３】
図８には、本発明のスクリーニング方法において、ターゲット塩基配列の評価を部分配列ごとに実行させる実施の形態を示す。図８に示した実施の形態では、ターゲット塩基配列Ｔに対して部分配列の所定の長さを規定する変数ｌｅｎｇｔｈと、部分配列のターゲット塩基配列における位置を指定するｐｏｓｉｔｉｏｎと、部分配列間の末端部における重なり合いを与える変数であるｏｖｅｒｌａｐ＿ｌｅｎｇｔｈとを定義する。図８に示す本発明のスクリーニング方法の処理は、ターゲット塩基配列の塩基位置を、変数ｐｏｓｉｔｉｏｎ、変数ｌｅｎｇｔｈ、変数ｏｖｅｒｌａｐ＿ｌｅｎｇｔｈを使用して部分配列ごとに評価をすることを除き、図５〜図７に示した処理を適用することができるので、本発明の部分配列ごとに区切って評価を行う処理の本質的な部分のみを説明する。ステップＳ９０において、まず部分配列を指定する変数ｐｏｓｉｔｉｏｎを初期設定する。次いでステップＳ９２において変数ｐｏｓｉｔｉｏｎがｎ以下であるか否かを判断する。ステップＳ９２の判断では、ターゲット塩基配列の最末端であるｎまで評価が実行されるまではｐｏｓｉｔｉｏｎはｎ以下なので、ステップＳ９２の判断は、真（ｙｅｓ）とされ、ステップＳ９４へと進み変数ｌｅｎｇｔｈを定義する。この変数ｌｅｎｇｔｈは、あらかじめ実験条件などを考慮して設定またはユーザ入力により定めることができるし、本発明においては、他の適切な関数、例えば図５に示したｌａｒｇｅｓｔ＿ｐｒｅｆｉｘ＿ｌｅｎｇｔｈ＿ｗｉｔｈ＿ｃｏｍｍｏｎ＿ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ（）の返り値を使用して、ステップＳ９４に示すようにして定めることもできる。
【００４４】
関数ｌａｒｇｅｓｔ＿ｐｒｅｆｉｘ＿ｌｅｎｇｔｈ＿ｗｉｔｈ＿ｃｏｍｍｏｎ＿ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ（）は、上述したようにランダムで充分に長いターゲット塩基配列と、ランダムな相補配列Ｑとが与えられた場合、４ｍの値を返す関数である。本発明においては上述した特定の関数を使用するのではなく、適切な値を取るようにｌｅｎｇｔｈを設定することができる。また、図８に示した実施の形態においても編集距離カウンタｉについては、指定された部分配列ごとに初期化設定を行い、ターゲット塩基配列Ｔとして部分配列Ｔｗを使用することにより、図５〜図７に示した処理を繰り返して実行させることができる。ステップＳ９６では、変数ｌｅｎｇｔｈの値が、塩基相互の距離にかかわらず結合する可能性がある程度高いことが想定される塩基鎖長であるｃｈｅｃｋ＿ｌｅｎｇｔｈよりも短いか否かを判断する。
【００４５】
ステップＳ９６の判断において、ｌｅｎｇｔｈがｃｈｅｃｋ＿ｌｅｎｇｔｈよりも短い場合（ｙｅｓ）には、ステップＳ１０４へと進んでＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｐ．Ｄ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ｍ．Ｓ．  Ｗａｔｅｒｍａｎ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １４７：１９５−１９７，  １９８１．）などの高精度な手法を使用して結合性の判断を行ない、ｃｈｅｃｋ＿ｌｅｎｇｔｈを加えて新たなｐｏｓｉｔｉｏｎ値を生成して、ステップＳ９２へと処理を戻すこともできる。この際、ｃｈｅｃｋ＿ｌｅｎｇｔｈの値をｍ／ｒ以上の値とすることもできる。また、４ｍの値として設定すると、部分配列すべてについて「結合する可能性がある」と判断し、ステップＳ１０４の評価を高頻度に実行することになるので、本発明の高速性が阻害されてしまうことになる。このため、本発明においてはｃｈｅｃｋ＿ｌｅｎｇｔｈの値をｍ／ｒ〜４ｍの間の値として設定することができ、ｃｈｅｃｋ＿ｌｅｎｇｔｈの値として概ね２ｍ程度の値を採用することが、安定した結果を与えることが多いことが見出された。
【００４６】
一方、ステップＳ９６の判断においてｌｅｎｇｔｈがｃｈｅｃｋ＿ｌｅｎｇｔｈ以上の場合（ｎｏ）には、ステップＳ９８においてｌｅｎｇｔｈと残りの塩基鎖長とを比較し、ｌｅｎｇｔｈが残りの塩基鎖長よりも短い場合（ｙｅｓ）には、さらにステップＳ１０２へと進んで、それまで評価を行った塩基位置にｌｅｎｇｔｈを加え、さらに適切な重なり合いを与えることができるようにｏｖｅｒｌａｐ＿ｌｅｎｇｔｈ分を考慮して次の部分配列を指定する。図８に示した実施の形態では、その後再度ステップＳ９２へと処理を戻し、ステップＳ９２〜ステップＳ９８までの処理を繰り返す。また、ｌｅｎｇｔｈが残りの塩基鎖長を越えた場合（ｎｏ）には、ステップＳ１００においてｐｏｓｉｔｉｏｎ＝ｎ＋１に設定し、処理をステップＳ９２へと戻す。この場合、ステップＳ９２の判断において偽の値が返され（ｎｏ）、ステップＳ１０６において結合しないという評価結果が与えられる。
【００４７】
図９には、図５〜図７に示した処理を実行させるための擬似コードを示す。また、図１０には、図８に示した部分配列ごとに評価を実行するための処理の擬似コードを示す。図１０において使用された関数ｃｈｅｃｋ＿ｅｘａｃｔｌｙ（Ｔ，  Ｑ，  ｋ）は、ステ図８のステップＳ１０２において使用される高精度の判定手法を示す。関数ｃｈｅｃｋ＿ｅｘａｃｔｌｙ（Ｔ，  Ｑ，  ｋ）は、ターゲット塩基配列Ｔと相補配列Ｑとが実際に結合するかどうかの判定を、従来の時間はかかるものの、正確に計算できるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎなどの方法を使用して計算し、結合しないならばｔｒｕｅを、結合するならばｆａｌｓｅを返す。本発明においては、ｃｈｅｃｋ＿ｅｘａｃｔｌｙ（Ｔ，  Ｑ，  ｋ）としては、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎの方法を具体的には挙げることができるが、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎの方法以外にでも、いかなる方法を使用しても構成することができる。また、関数ｃｈｅｃｋ＿ｅｘａｃｔｌｙ（Ｔ，  Ｑ，  ｋ）について、結合しないことを高精度にユーザに対して提示するために、この関数を常にＦＡＬＳＥを返す関数にすることもできる。この場合には、「結合しない」という結果が出た場合は必ず結合しない、ということが言えるので、ハイブリダイゼーションの判定にも有用である。
【００４８】
図１１は、本発明のスクリーニング方法により与えられる評価結果をテーブルの形式で示した図である。図１１に示した実施の形態においては、ターゲット塩基配列ＴがＣＧＣＧＣＡＴＧＡＡであり、相補配列ＱがＧＣＣＣＡＴＧＣであって、編集距離ｋ＝３の場合に得られる実施の形態である。以下、図１１を使用して本発明のスクリーニング方法により得られる評価結果について説明する。図１１に示した表の縦欄は、編集距離カウンタｉの値に対応し、横欄は、相補配列中位置を表すｐｒｏｂｅ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎの値を示し、表中の値は、図７における評価処理の終了時のｐｏｓｉｔｉｏｎ［ｉ］の値を示している。図１１に示した実施の形態では、最大編集距離ｋ＝３なので、編集距離カウンタｉが３以下のものについてのみ計算が行われている。図１１に示した実施の形態では、ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［ｉ，  ｐｒｏｂｅ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎ］の計算は、最終的に図１１に示した擬似コードの▲２▼まで計算が進み、ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［３］の値として７が得られているため、返り値として７を返し、このときｍｉｎ＿ｋの最終的な値は、２となる。上述したｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［ｉ，  ｐｒｏｂｅ＿ｐｏｓｉｉｔｏｎ］は、ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［ｉ，  ｐｒｏｂｅ＿ｐｏｓｉｉｔｏｎ］が、ｊの時のｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［ｉ］の値を、ｐｒｏｂｅ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎ［ｉ，  ｊ］とする。この配列データは、テーブルとして格納しておくこともできるし、本発明において説明するように、評価を行っているｐｒｏｂｅ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎの変数に対するｐｏｓｉｔｉｏｎ［ｉ］の値のみを格納させておいても良い。
【００４９】
図１２（ａ）、（ｂ）には、図１１に示したｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［０］およびｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［１］についての値を返す処理を図式的に示す。図１２（ａ）に示されるように、ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［０］の場合には、相補配列Ｑにおいて出現する塩基が単純にターゲット塩基配列において出現する位置となり、２，  ３，  ５で与えられる値がｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［１，  ｍ］の値として与えられている
【００５０】
一方でｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［１］についてみれば、ｉ≧２については、ｎｅｘｔ＿ｃｈａｒ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎと、ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［ｉ−１］の値のうちの小さい方の値が返り値とされるので、ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［０，  １］の値は２であるものの、相補配列Ｑのシトシン（Ｃ）がターゲット塩基配列の１番目に出現しているので小さい方の１が得られている。同様に相補配列Ｑの２番目のシトシン（Ｃ）は、ターゲット塩基配列Ｔの４番目に出現しており、ｎｅｘｔ＿ｃｈａｒ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎの返り値は４となるものの、これは対応するｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［０，  ２］の値が３のため、小さい方の値３が返されている。
【００５１】
さらに、相補配列Ｑの４番目の塩基であるシトシン（Ｃ）は、５番目に出現し、アデニン（Ａ）は、６番目に出現し、チミン（Ｔ）は、７番目に出現し、７番目のグアニン（Ｇ）は、８番目に出現しており、これらの番号がｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［１］の行を構成し、１，  ３，  ５，  ６，  ７，  ８の行が与えられることになる。同様にして、ｐｏｓｉｔｉｏｎ［２］については、相補配列Ｑの３番目のシトシン（Ｃ）がターゲット塩基配列Ｔの１番目に出現し１の値を与え、４番目のシトシン（Ｃ）が３番目に出現し、５番目のアデニン（Ａ）が６番目に出現しているが、対応するｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［１］のｍ＝４の値である５が採用され、６番目のチミン（Ｔ）が７番目に出現しているもののｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［１］のｍ＝５の値である６が採用されるので図１１に示されるように、０，  １，  ３，  ５，  ６，  ７，  ８の列が与えられているのが示される。
【００５２】
図１１に示された実施の形態であるｋ＝３の場合、ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［１］の値がｐｒｏｂｅ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎ＝７の地点で８の値をとる。そのため、ｎｅｘｔ＿ｃｈａｒ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎ  （Ｔ，  ９，  “Ｃ”の値がｎ＋１＝１１となり、ｎよりも大きな値なので、最終的なｐｒｏｂｅ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎ＝８の処理の際には、ｍｉｎ＿ｋの値が１だけインクリメントされ、２が与えられる。このｍｉｎ＿ｋ＝２の値は、ターゲット塩基配列および相補配列に共通するサブシーケンスの長さがｍ−２＝６である、ということを示している。また、同じターゲット塩基配列と相補配列とを使用し、最大編集距離ｋ＝１として同様の計算を実行させると、編集距離カウンタｉ＝０，１についてのｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［１］およびｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［０］の計算が実行され、評価結果が得られ処理を終了する。この場合、擬似コードの▲１▼まで計算が進み、ｎ＋１＝１１という値を返す。これは、ｍ−１＝７以上の長さの共通するサブシーケンスが存在しないことを示す。本発明においては、図１１に示した評価結果テーブルとして必ずしも評価結果を蓄積する必要はなく、上述したように最大のｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［ｉ］の値についてだけ格納させるデータ形式で記憶部に評価結果を格納しておくこともできる。
【００５３】
Ｃ．本発明の塩基配列スクリーニング・システム
図１３は、本発明のスクリーニング方法を実装した塩基配列スクリーニング・システムの該略的な機能ブロック図である。図１３に示された塩基配列スクリーニング・システム（以下、システムと略する。）１０は、概ね中央処理装置（ＣＰＵ）および必要な記憶装置とを含むコンピュータを含んで構成されており、ターゲット塩基配列や相補配列の入力を受けて、スクリーニングのための評価処理を実行させている。
【００５４】
さらに詳細に説明すると、本発明のシステム１０は、相補配列格納部１４と、ターゲット塩基配列格納部１６と、最大編集距離格納部１８と、評価処理部２０とを含んで構成されている。相補配列格納部１４、ターゲット塩基配列格納部１６および最大編集距離格納部１８は、ぞれぞれ適切なメモリまたはメモリ領域として構成されている。図１３においては、機能ブロックを明確に表示させるべく、異なるブロックとして記述されているものの、本発明においては、実装上の都合により、単一のランダム・アクセス・メモリなどに割り当てられたメモリ領域として構成することもできる。相補配列格納部１４は、入力部１２からのプローブＰの入力を受け取り、相補性の関係を使用して生成された相補配列Ｑを格納する。また、ターゲット塩基配列格納部１６および最大編集距離格納部は、入力されたターゲット塩基配列のデータおよび最大編集距離ｋを、それぞれ格納している。上述した入力部１２は、本発明においては、キーボード、データ読み取り装置などを含んで構成することができ、データ読み取り装置は、例えばフロッピー（登録商標）・ディスク、ハードディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤといった入出力媒体などに記憶されたプローブＰの塩基配列を読み出し、本発明のシステムへとプローブＰのデータを送っている。
【００５５】
評価処理部２０は、本発明のスクリーニング方法を実行させるためのプログラムを、図示しないハードディスクなどからＣＰＵが読み出して、ソフトウエア的に構成される機能ブロックとして実装される。評価処理部２０は、図５に示したｌａｒｇｅｓｔ＿ｐｒｅｆｉｘ＿ｗｉｔｈ＿ｃｏｍｍｏｎ＿ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅにより構成され、動的に評価を停止させる停止判断部２０ａと、評価実行部２０ｂとを含んで構成されている。評価処理部２０は、相補配列格納部１４、ターゲット塩基配列格納部１６、および最大編集距離格納部１６から、それぞれ相補配列Ｑ、ターゲット塩基配列Ｔ、最大編集距離ｋを読み出し、本発明のスクリーニング方法を適用して、共通するサブシーケンスの評価・判断を実行する。停止判断部２０ａは、ｍｉｎ＿ｋの値と最大編集距離ｋとを比較して、ｍｉｎ＿ｋの値がｋよりも大きくなった場合には、ユーザの要求する範囲内において「結合する」と判断されるシーケンスがないものと判断して、評価実行部２０ｂに対してそれ以後のｐｒｏｂｅ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎについて評価を行わないように指令する。この指令を受け取った評価処理部２０は、計算された評価結果を、本発明における特定の実施の形態では、ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［ｉ，  ｐｒｏｂｅ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎ］のフォーマットとして記憶部２２へと書き込みを行なう。本発明の特定の実施の形態においては、評価結果は、図１１に示した評価結果テーブルとして構成することが後のさらなる評価のための情報を与える点では好ましいが、本発明においてはまた、必要とされるｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［ｉ，  ｐｒｏｂｅ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎ］の値だけを選択して格納することもできる。
【００５６】
評価処理部２０は、評価結果テーブルの作成を終了すると、ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［ｉ］の値を参照し、所定のｐｒｏｂｅ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎの値に対応するｐｏｓｉｔｉｏｎ［ｉ］の値をルックアップし、ｐｒｏｂｅ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎに対応するコラムにおいてｐｒｏｂｅ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎ以上の返り値が含まれているか否かを判断する。ｐｒｏｂｅ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎ＞ｍで、かつｍｉｎ＿ｋの値がｋよりも大きくなった場合には、要求された最大編集距離ｋに対応する範囲内で共通するサブシーケンスが見出されないと判断し、「結合しない」という判断結果をユーザに対して表示部２４において表示させる。また、ｐｒｏｂｅ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎ＞ｍであって、ｍｉｎ＿ｋ＜ｋである場合には、当該ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［ｉ］の編集距離カウンタｉにおいて、ｍｉｎ＿ｋ＝ｉ＋１であり、シーケンス長が（ｍ−ｍｉｎ＿ｋ）で与えられる共通するシーケンスがあるものと判断される。この判断結果は、表示部２４を通してユーザに「結合する」画面表示と共に、シーケンスの塩基配列およびシーケンス長といった付帯的情報を表示させることにより、提供される。ユーザに対して提供された判断結果は、ユーザの必要性に応じて、プリンタからハードコピーされるか、またはフロッピー（登録商標）・ディスク、ハードディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、フラッシュメモリなどの記憶媒体に格納することができる。
【００５７】
図１４は、本発明のスクリーニング方法の第２の実施の形態を実装したシステムの実施の形態を示した図である。図１４に示したシステム１０は、評価処理部２０の構成を除き、概ね図１３において説明したと同一の構成とされている。このため、図１４に示したシステム１０について、評価処理部２０について詳細に説明する。図１４に示した評価処理部２０は、停止判断部２０ａと、評価実行部２０ｂと、部分配列指定部２０ｃとを含んで構成されている。部分配列指定部２０ｃは、まず最初に評価を開始する部分配列を、指定データ格納部２８からｐｏｓｉｔｉｏｎの値およびｌｅｎｇｔｈの値などを読み出して決定する。指定された部分配列は、評価実行部２０ｂへと渡されて、図１３において説明したと同様に評価が実行される。停止判断部２０ａは、評価実行部２０ｂへと評価の停止を指令すると共に、部分配列指定部２０ｃに対しても部分配列について評価が終了したことを指令し、さらに評価を行うべき部分配列がある場合には、次に評価する部分配列を指定して、評価実行部２０ｂに部分配列のデータを転送する。
【００５８】
図１５は、本発明のシステム１０の第２の実施の形態を示した図である。図１４に示した本発明の第２の実施の形態のシステムは、ネットワーク３０を介して、ターゲット塩基配列ＴおよびプローブＰの塩基配列のデータをユーザから受信する。受信されたデータは、送受信部３４の入力バッファに格納された後、相補配列格納部１４、ターゲット塩基配列格納部１６、最大編集距離格納部１８、および指定データ格納部２８に格納される。この場合、ユーザは直接ターゲット塩基配列Ｔを送信することもできるが、ｃＤＮＡデータベースなど、システム１０がターゲット塩基配列Ｔについての情報を格納したデータベースを含んで構成される場合には、評価処理部２０は、ネットワークを介してユーザから受け取ったターゲット指定データを参照して、データベース３２にアクセスして該当するターゲット塩基配列を取得し、取得したターゲット塩基配列Ｔをターゲット塩基配列格納部１６に格納する。評価処理部２０は、図１４において説明したと同様の処理を実行して評価結果を生成し、記憶部２２に格納すると共に、評価結果を送受信部３４へと送り、ネットワーク３０を介してユーザに評価結果を送出して、塩基配列データベースに格納された塩基配列をスクリーニングするためのプローブＰの有効性についての情報をユーザに返す構成とされている。
【００５９】
【実施例】
本発明のスクリーニング方法の効果を検証するため、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）２０００を搭載したパーソナル・コンピュータ（Ｉｎｔｅｌ社製のＰｅｔｉｎｕｍ（登録商標）４：２．２ＧＨｚプロセッサを実装）に本発明のプログラムを実装して、従来の高精度法（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ法）と対比して計算速度の評価検討を行った。使用したターゲット塩基配列は、ライブラリから入手した４，６３９，２２１ｂｐの塩基鎖長の大腸菌のゲノム（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＣ＿０００９１３）を使用した。実験用のパーソナル・コンピュータには、部分配列ごとに評価を実行する図９および図１０で示した擬似コードのアルゴリズムを実装した。なお、ｃｈｅｃｋ＿ｅｘａｃｔｌｙの関数としては、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ法を使用した。
【００６０】
入力する相補配列Ｑは、大腸菌の上述したゲノムの一部を使用して塩基を削除することにより塩基鎖長が約５８０ｂｐ程度の塩基鎖を生成し、複数のプローブＰとした。最小のウィンドウサイズ（ｃｈｅｃｋ＿ｌｅｎｇｔｈ）をプローブの長さの約２倍に相当する１１５８と固定した。ハイブリダイゼーションすることができる塩基鎖の相似度を、編集距離ｋを設定して、相似度を０．８０、０．８５、０．９０、０．９５となるように設定し、相補配列の相似度の異なる４回の実験を行った。また、比較のため、従来技術のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ法の計算時間も計測した。その結果を図１６に示す。
【００６１】
図１６に示された結果によれば、本発明の方法によるスクリーニングの計算速度は、約２倍〜約２０倍であることが確認された。計算速度は、相似度を高く設定できる場合は、最大編集距離ｋを小さく設定するので、プローブＰの塩基配列についての反復計算を制限することができ（すなわち、編集距離カウンタの反復回数がｋ以下となる）、判断を行う塩基の絶対数が減少することから高速化が可能であることが示された。すなわち、本発明によれば、従来手法とは異なり、相似度を高くすればするほど高精度な計算が可能となることがわかる。
【００６２】
図１７には、図１６に示された表の結果を、縦軸を計算時間（ｓ）、横軸を相似度（％）としてプロットしたグラフ図である。図１７に示されるように、相似度が高くなればなるほど判断結果を得るための時間が短縮することが示されている。また、相似度１００％における判断結果を得るための時間は、比較例であるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ法の結果に比べて少なくとも数１０倍改善されているのが示された。
【００６３】
以上、本発明について、図面に示した具体的な実施の形態をもって説明してきたが、本発明の上述した各機能を実現する手段または部分は、コンピュータ実行可能なプログラム言語により記述されたソフトウエアまたはソフトウエア・モジュール群として構成することができ、必ずしも図面に記載した機能ブロックとして構成される必要はない。また、本発明の塩基配列スクリーニング・システムでは、各機能要素は、必要に応じていかなる機能モジュールと共に構成することができ、図面に示された特定の実施の形態に限定されるものではない。
【００６４】
さらに、本発明のプログラムは、種々のプログラミング言語、例えばＦＯＲＴＲＡＮ、Ｃ言語、Ｃ＋＋言語、ＪＡＶＡ（登録商標）などを使用して記述することができ、本発明のプログラムを記述したコードは、磁気テープ、フレキシブル・ディスク、ハードディスク、コンパクト・ディスク（ＣＤ）、光磁気ディスク、デジタル・バーサタイル・ディスク（ＤＶＤ）といったコンピュータ可読な記録媒体に保持させることができるし、伝送媒体としても頒布することができる。
【００６５】
本発明によれば、少なくとも相補性の低いプローブを選択的に排除することにより、従来の高精度なアラインメントによる手法よりも高速に健全性の高いプローブに関する情報をユーザに提供することが可能となる。また、本発明の方法をプローブの１次スクリーニングとして適用し、スクリーニング後に従来の高精度なアラインメントによる手法と組み合わせることで、プローブのスクリーニング処理を、より高速化することが可能な塩基配列をスクリーニングするためのシステム、そのための方法、該方法をコンピュータに対して実行させるためのプログラム、該プログラムを記憶したコンピュータ可読な記録媒体およびネットワークを介して塩基配列のスクリーニングを実行させるためのサーバを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明におけるターゲット塩基配列と、プローブと、相補配列との関係を示した図。
【図２】本発明におけるターゲット塩基配列のスクリーニングを行う実施の形態の概略図。
【図３】本発明のスクリーニング方法の第１の実施の形態の処理を示したフローチャート。
【図４】本発明のスクリーニング方法の第２の実施の形態の処理を示したフローチャート。
【図５】本発明において結合性の評価を行う処理の概略的なフローチャート。
【図６】本発明において結合性の評価を行う処理のための初期化処理を示した図。
【図７】本発明において結合性の評価のための評価処理の詳細を示したフローチャート。
【図８】本発明のスクリーニング方法の第２の実施の形態の詳細な処理を示したフローチャート。
【図９】本発明の結合性の評価を行うための処理を実行させるプログラムの擬似コード。
【図１０】本発明の第２の実施の形態において部分配列を指定して結合性を評価するためのプログラムの擬似コード。
【図１１】本発明における評価結果の出力データ構造の実施の形態を示した図。
【図１２】本発明における評価結果を得るための図９に示した擬似コードの実行する処理を示した図。
【図１３】本発明の塩基配列スクリーニング・システムの第１の実施の形態を示した図。
【図１４】本発明の塩基配列スクリーニング・システムの第２の実施の形態を示した図。
【図１５】本発明の塩基配列スクリーニング・システムの第３の実施の形態を示した図。
【図１６】本発明の実施例の結果を比較例の結果と共に示した図。
【図１７】本発明の実施例および比較例の結果をプロットして、評価結果を得るまでに必要な時間を、相似度１００％において比較した図。
【図１８】ターゲット塩基配列と、プローブとの関係を示した図。
【符号の説明】
１０…塩基配列スクリーニング・システム
１２…入力部
１４…相補配列格納部
１６…ターゲット塩基配列格納部
１８…最大編集距離格納部
２０…評価処理部
２２…記憶部
２４…表示部
２６…出力部
２８…指定データ格納部
３０…ネットワーク
３２…データベース
３４…送受信部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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