(57)【要約】【課題】根粒着生能が向上した根粒菌を得るための方法と、根粒着生能が向上した根粒菌およびその子孫。【解決手段】コリンオキシダーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクターで根粒菌を形質転換する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コリンオキシダーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクターで根粒菌を形質転換して、グリシンベタインの生成能および蓄積能を向上させることを特徴とする根粒着生能を改良した根粒菌の作出方法。
【請求項２】
コリンオキシダーゼをコードする遺伝子が土壌菌アルスロバクター由来のものである請求項１に記載の根粒着生能を改良した根粒菌の作出方法。
【請求項３】
コリンオキシダーゼをコードする遺伝子が、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする配列表の配列番号１に示す塩基配列、または、配列番号２に示すアミノ酸配列に示す１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、付加および／または置換えにより修飾されているアミノ酸配列をコードする塩基配列であって、かつコリンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする配列表の配列番号１に示す塩基配列である請求項１または請求項２に記載の根粒着生能を改良した根粒菌の作出方法。
【請求項４】
請求項１ないし請求項３いずれか１項に記載の方法により作出される根粒着生能を改良した根粒菌およびその子孫。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グリシンベタインの生合成に関与するコリンオキシダーゼをコードする遺伝子を有する根粒菌の作出方法、また、この作出方法により作出された根粒菌およびその子孫に関する。
【０００２】
【従来技術】
窒素は植物の成長を最も大きく制限する元素の一つであり、作物生産に極めて重要な養分である。今日の農業において、窒素肥料のような化学肥料は欠かせない資材として広く利用され、安定的な作物生産に大きく貢献している。しかし、一方では過剰な化学肥料の施用は、硝酸態窒素（ＮＯ３−Ｎ）の地下水汚染に代表される環境問題や、土壌の劣化とそれに伴う生産力低減の原因になっている。こうした状況下で、化学肥料の軽減や持続可能な農業生産を行うための手段の１つとして生物的固定窒素を利用した根粒菌の活用が提案される。
根粒菌は、マメ科植物の生育に影響の大きい土壌微生物として古くから知られており、マメ科植物の根に根粒を形成し、着生した植物から最も生育に適した形態の炭水化物をエネルギー源として摂取し、その代わりに、根粒中に形成されたバクテロイドが空気中の窒素を植物が利用できるような形態の窒素化合物にして供給するものであり、植物に硫安や尿素などの窒素肥料を与えるのと同様な作用を自然な状態で行うものである。
【０００３】
現在では、選抜された窒素固定能の高い根粒菌を効率よく接種するための方法として各種の方法が提案されている。
例えば、根粒菌を炭材やパーライトのような多孔質担体に担持させてなる資材として土壌施用する方法がある。（特許文献１参照）
また、根粒菌を高吸水性ポリマーで製剤化してなる資材として土壌施用する方法がある。（特許文献２参照）
さらに、根粒菌をピートに混合してなる資材として土壌施用する方法がある。（特許文献３参照）
この他、根粒菌を種子に粉衣してその種子を播種する方法がある。（特許文献４）
【０００４】
【特許文献１】
特開平３−２６６９１５号公報（特許請求の範囲）
【特許文献２】
特開平６−６２６６７号公報（特許請求の範囲）
【特許文献３】
特開平８−１０９１０９号公報（特許請求の範囲）
【特許文献４】
特開平１０−２１０８０７号公報（特許請求の範囲）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、土壌に施用される根粒菌において、塩類、浸透圧、温度、乾燥等の環境ストレスや、根粒菌が宿主植物に感染する初期や共生時に宿主植物からストレスを受けている可能性がある。これらのストレスは、根粒菌の活性や宿主植物に対する感染・共生作用に大きく影響する。
このような環境からのストレスに対して、多くの生物は自己を保護するために細胞質中に適合溶質と呼ばれる特別な化合物を合成して蓄積することによって適応している。これらの化合物は、低分子で水溶性に富み、代謝されにくく、かつ代謝に影響を及ぼさないなどの特徴をもっている。適合溶質としてはグリシンベタイン、プロリンなどの両極性化合物、ピニトール、ソルビトール、マンニトールなどのポリオール類が知られている。特に、グリシンベタインは、その適合力について優れている。
しかしながら、根粒菌は、前記適合溶質の生成能或いは蓄積能が低いために、前記したストレスの影響を大きく受けてしまうと考えられる。つまり、例示したように根粒菌を各種資材に加工して接種しても、根粒菌自体のストレス耐性能が低いために、宿主植物への根粒着生、窒素固定の効果に低減やばらつきが生じる可能性がある。そのため、根粒菌のストレス耐性能力の向上が求められる。
【０００６】
本願発明者は、特願２００１−２３０４２９号によって、グリシンベタインやグリシンベタインを含有する物質を根粒菌に添加した資材等を提案している。そして、さらに、鋭意研究を重ねた結果、グリシンベタイン生成能或いは蓄積能が低い根粒菌に、グリシンベタイン生合成に関与するコリンオキシダーゼをコードする遺伝子を導入することにより、グリシンベタインの生成能および蓄積能が向上してストレス耐性が強化され、これにより、高い根粒着生能を有する根粒菌を作出できることを知見し、本願発明に至った。
【０００７】
本願発明は、根粒着生能が向上した根粒菌を得るための方法の提供を目的とする。
さらに、根粒着生能が向上した根粒菌およびその子孫の提供を目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記した目的を達成するために本発明は下記の技術的手段を採用した。
その技術的手段は、コリンオキシダーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクターで根粒菌を形質転換して、グリシンベタインの生成能および蓄積能を向上させることを特徴とする方法である。（請求項１）
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明におけるコリンオキシダーゼをコードする遺伝子は、根粒菌の細胞内で発現するものであり、その由来となる生物については、生来的に環境ストレス耐性を備えた微生物や植物が好ましい。
例えば、コリンオキシダーゼをコードする遺伝子として、土壌菌アルスロバクター由来のものがある。（請求項２）
コリンオキシダーゼをコードする遺伝子は、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする配列表の配列番号１に示す塩基配列、または、配列番号２に示すアミノ酸配列に示す１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、付加および／または置換により修飾されているアミノ酸配列をコードする塩基配列であって、かつコリンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする配列表の配列番号１に示す塩基配列である。（請求項３）
そして、前記の作出方法により作出される根粒着生能を改良した根粒菌およびその子孫である。（請求項４）
【００１０】
本発明では根粒菌を限定するものではなく、表１のとおり例示できる。
【００１１】
【表１】
2004229557.tif 000002
【００１２】
本発明は、例示したいずれのマメ科植物に共生する根粒菌に対しても有効なものであり、特に、マメ科植物の中でも生物的固定窒素の要求量が多い大豆に共生し、しかも、生育の遅いブラディリゾビウム  ジャポニカム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）である大豆根粒菌を得るために有効な方法である。
【００１３】
【実施例】
以下、本発明の実施例を具体的に説明する。
本実施例では、大豆根粒菌：ブラディリゾビウム  ジャポニカム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  Ｊ１０６５）および小豆根粒菌：ブラディリゾビウム  エスピー（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  Ｊ２０２）に広宿主域ベクターを用いてアルスロバクター  グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）由来のグリシンベタイン合成遺伝子（ｃｏｄＡ）を導入し、これをトリプトファンプロモーター（Ｔｒｐプロモーター）の下で強制発現させることによって、ベタインの生成能が強化された大豆根粒菌および小豆根粒菌（以下、「根粒菌」と略称する。）を構築する。
なお、本実施例では、発現ベクターにＴｒｐプロモーターを用いているが、本発明は本例に限定するものではなく、Ｔｒｐ以外のプロモーターから成る発現ベクターも用いることができる。
【００１４】
その方法は、ｃｏｄＡを含んだ遺伝子領域（約３．６ｋｂｐ）からｃｏｄＡとその発現に必要な部分を単離・加工し、根粒菌で発現が可能な広宿主域ベクターにクローニングした。
また、このとき、ベクターもインサート（ｃｏｄＡ遺伝子）が挿入可能なように加工を行った。
【００１５】
（ｃｏｄＡ領域の単離と精製、及びクローニングのための加工）
本実施例で用いたｃｏｄＡ領域には、ｃｏｄＡを含んだ遺伝子領域がｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋のマルチクローニングサイトＸｂａｌ／Ｘｈｏｌ（Ｄｅｓｈｎｉｕｍ  ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２９，８９７−９０７；ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｘ８４８９５）にクローニングされた組換えプラスミドを利用した（ｐＢＳ：ｃｏｄＡ）。
このプラスミドを宿主の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９）にエレクトロポレーション法により導入し、増幅させた後、アルカリＳＤＳ・ミニプレップ法の原理に基づき単離した（Ｗｉｚａｒｄｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ「Ｐｒｏｍｅｇａ」）。
次に、遺伝子の発現とクローニングに適した制限酵素サイトを決定するために、ｃｏｄＡ領域を含む遺伝子塩基配列（配列番号１，  ＳａｌＩ〜ＸｈｏＩまでの２，４００ｂｐ）をネット上の遺伝子バンク（ＮＣＢＩ）からダウンロードし、リゾホーム結合部位（ＳＤ）、翻訳領域（ＯＲＦ）、終止コドン、並びに、全領域の制限酵素サイトを調べた。
その結果、図１に示すように、ｃｏｄＡを含む遺伝子領域を制限酵素ＢｓｔＥＩＩとＳｍａＩで処理すると、ｃｏｄＡのＳＤとＯＲＦ、終止コドンのすべてを含み、クローニングする発現ベクターのＴｒｐプロモーターからＳＤまでの距離が４０ｂｐ前後になるため、ＢｓｔＥＩＩとＳｍａＩ（配列番号１における３２１〜２，１７２）で処理することが最も相応しいと判断した。
なお、前記２つの制限酵素は反応条件が異なるため、ＳｍａＩ処理後、一旦ＤＮＡを回収・精製してから、改めてＢｓｔＥＩＩで処理し、アガロースゲル電気泳動で分離後、ゲルからＤＮＡを抽出・精製した（ＱＩＡＧＥＮ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｋｉｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｗｉｚａｒｄ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）。
次に、ｃｏｄＡをクローニングするベクターには、ＢｓｔＥＩＩ，ＳｍａＩの適当なサイトが無いため、ｃｏｄＡのＢｓｔＥＩＩ，ＳｍａＩ切断部位を平滑末端処理してからクローニングを行った。
則ち、Ｔ４ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの５’→３’  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ活性と、３’→５’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性を利用してＤＮＡ末端の平滑化を行った（ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ：Ｔａｋａｒａ）。
【００１６】
具体的には以下の通りである。
ｐＢＳ：ｃｏｄＡ（８０μｌ），１０×ｂｕｆｆｅｒＴ＋ＢＳＡ（１０μｌ），ＳｍａＩ（５μｌ）と、これに超純水を加えて合計１００μｌとして、３０℃で２時間反応させた。
これより、ＤＮＡを回収後、ＤＮＡ溶液を４０μｌとし、これに１０×ｂｕｆｆｅｒ  Ｈ（５μｌ），ＢｓｔＥＩＩ（５μｌ）を加えて合計５０μｌとして、６０℃で２時間反応させた。
そして、電気泳動で制限酵素処理の確認を行った後（ｃｏｄＡ領域：１，８０６ｂｐ，ベクターを含むそれ以外の部分：４，７４０ｂｐ）、全量を０．８％  アガロースによる電気泳動によってｃｏｄＡ領域をゲルから単離した（ＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩ〔Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ〕）。
単離したＤＮＡを常法に従ってエタノールで沈殿させた後、全量を超純水で８μｌに調整した。これに、１μｌ  Ｔ４ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒを加えて、７０℃で５分間保持した後、３７℃にした。
次に、１μｌ    Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加えて穏やかに混合した後、正確に３７℃で５分間反応させた。
そして、激しく攪拌して酵素を失活させ、ＥＺカラム（Ｍｉｃｒｏｐｕｒｅ−ＥＺ〔Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ〕）で遠心・ろ過して酵素を完全に除去した。
さらに、１０μｌの  ＤＮＡ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを加えて遠心し、ろ過したＤＮＡ溶液を合わせて、これを、−２０℃で保存した。
【００１７】
（ベクターの調整）
発現ベクターは、根粒菌でも安定して維持され、Ｔｒｐプロモーターを持つ発現ベクターを用いた。ｐＴＥ３（Ｔ．Ｔ．Ｅｇｅｌｈｏｆｆ  ａｎｄ  Ｓ．Ｒ．Ｌｏｎｇ  １９８５：Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ  ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅｓ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｄＡＢＣ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｄＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｄＡ  ｉｎ  Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１６４，５９１−５９９）のＴｒｐプロモーター転写下流域のクローニングサイト（ＰｓｔＩ）にインサートを挿入した。
このとき、ｐＴＥ３を制限酵素ＰｓｔＩで処理後、インサート（ｃｏｄＡ）と同様に平滑末端処理をした。
そして、ライゲーション反応の際にベクター自身が閉環しないように、脱リン酸化処理を行ってクローニング用ベクターを構築した。
【００１８】
具体的には以下のとおりである。
ｐＴＥ３を宿主の大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９）にエレクトロポレーション法により導入し、増幅させた後、アルカリＳＤＳ・ミニプレップ法の原理に基づき単離した（Ｗｉｚａｒｄｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ「Ｐｒｏｍｅｇａ」）。
これに、１０×ｂｕｆｆｅｒ  Ｈ  （１０μｌ），ＰｓｔＩ（５μｌ）と、さらに、超純水を加えて５０μｌとして３７℃で２時間処理した。
そして、電気泳動でＰｓｔＩによるｐＴＥ３（２０．７ｋｂ）の切断を確認した後、ＰｓｔＩをＥＺカラムで除去し、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）カラムでＤＮＡ溶液を濃縮し、全量を超純水で８μｌに調整した。
脱リン酸化反応は、ＤＮＡ溶液にＣＩＰ（１μｌ）（ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：１２Ｕ／μｌ），１０×ＣＩＰ  ｂｕｆｆｅｒ（６μｌ）と、これに、超純水を加えて５０μｌとして、３７℃で１時間反応させた。
これに５０μｌ  ｓｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，０．１Ｍ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５％ＳＤＳ）を加えて、６８℃で１５分間処理して酵素を失活させた後、ＥＺカラム（Ｍｉｃｒｏｐｕｒｅ−ＥＺ〔Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ〕）でＣＩＰを完全に除去した。
そして、ＤＮＡを常法によりエタノール沈殿させた後、２０μｌ  ＤＮＡ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒに溶解させた。
【００１９】
（ライゲーション）
インサート：ベクターの分子数の比率を１：１〜５：１程度に調整して以下のようにライゲーションを行った（Ｔａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１）。
インサートとベクターの合計が１０μｌになるように混合し、これにｓｏｌ．Ａ  ４０μｌ，ｓｏｌ．Ｂ  １０μｌを混合して１６℃で一晩反応させた。
そして、Ｍｉｃｒｏｐｕｒｅ−ＥＺ／Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１００カラムによる除蛋白と濃縮によって、ＤＮＡのエタノール沈殿を行い、これを２０μｌ  超純水に溶解した。
【００２０】
（エレクトロポレーション）
ｃｏｄＡ組換えプラスミドをエレクトロポレーション（１２．５ｋＶ／ｃｍ，Ｃｅｌｌｊｅｃｔ  Ｂａｓｉｃ）でコンピテント細胞（Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９）に挿入し、抗生物質マーカーであるＴｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ（Ｔｃ）を含む普通寒天培地（栄研）で目的の組換えプラスミドで形質転換したコロニーを単離した。
コンピテント細胞は、５０ｍｌ  ＳＯＢ液体培地（２０．０ｇ  Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５．０ｇ  Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，０．５８４ｇ  ＮａＣｌ，０．１８６ｇ  ＫＣｌ  ／  Ｌ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ，ｐＨ７．０）を用いて、３７℃，１２０  ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎで培養し、前培養した菌液の全量を４００ｍｌの本培養培地に入れ、対数増殖後期（Ｏ．Ｄ．６６０ｎｍでの吸光値：０．７〜０．８）まで３７℃，１２０  ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎで培養した。
そして、４本の５０ｍｌ容プラスチックチューブで全ての菌を２〜３回に分けて遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ）で集菌し、上澄みを捨てた後、菌ペレットに５０ｍｌ  超純水を加えて懸濁し、再び遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ）で菌体を沈殿させて上澄みを除いた。
以上の操作を５回繰り返した後、菌体を１本のチューブに遠心により集めて、菌ペレットを１０％グリセロールで懸濁して８０μｌずつ１．５ｍｌチューブに分注した。ＤＮＡを１〜５μｌ加えた後、１２．５ｋＶ／ｃｍのパルスを与え、その直後に冷却したＳＯＣ液体培地（ＳＯＢ液体培地９８ｍｌに２Ｍ  Ｍｇ  ｓｔｏｃｋ  １ｍｌと２Ｍ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｓｔｏｃｋ  １ｍｌを加えたもの）の１ｍｌを加えて２時間、３７℃で震盪培養した。
【００２１】
（ｃｏｄＡの存在と配向の確認）
制限酵素（ＢａｍＨＩ）処理およびＰＣＲ法により、ｃｏｄＡの挿入の有無とその個数、そしてｃｏｄＡの挿入方向を確認した。単離されたコロニーの中からｃｏｄＡの挿入されたコロニーが確認され、同時に、制限酵素ＢａｍＨＩで１，６６５ｂｐのバンドが確認されたことから、ｃｏｄ  Ａは正しい向きに挿入されていると考えられた。また、ベクターのＴｒｐプロモーター領域とｃｏｄＡ領域にそれぞれプライマーを設計し、ｃｏｄＡが正しい向きに挿入されると約１ｋｂｐの増幅断片が見られる条件でＰＣＲ増幅を行い確認した。
【００２２】
（ｃｏｄＡ発現の確認）
ｃｏｄＡが導入されたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９においてｃｏｄＡ遺伝子の発現を確認するために、Ｅ．ｃｏｌｉ培養細胞からトータルＲＮＡを調製し（ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ）、これを用いてＲＴ−ＰＣＲ法（ＱＩＡＧＥＮ  ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ）で、ｃｏｄＡ遺伝子の発現を確認した。
【００２３】
（遺伝子の根粒菌への導入〔接合伝達法〕）
ｃｏｄ  Ａの発現が確認された組み換えプラスミドをヘルパープラスミド（ｐＲＫ２０１３）を用いたｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ  ｍａｔｉｎｇ（接合伝達）法で根粒菌に導入した。
Ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ（根粒菌）は、５ｍｌ  ＨＭ液体培地（０．２５ｇ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，０．１８ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．１２５ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４，０．２５ｇ  Ｎａ２ＳＯ４，０．３２ｇ  ＮＨ４Ｃｌ，０．００４ｍｇ  ＦｅＣｌ３，０．０１３ｇＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ，１．３ｇ  ＨＥＰＥＳ，１．１ｇ  ＭＥＳ，１．０ｇ  Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ  ／  Ｌ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ，ｐＨ７．０）で３０℃，１００ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎで振とう培養した。
Ｄｏｎｏｒ（Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９  ｐＴＥ３：：  ｃｏｄＡ）は、５ｍｌＬＢ液体培地（１０．０ｇ  Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５．０ｇ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，１０．０ｇ  ＮａＣｌ  ／  Ｌ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ，ｐＨ７．０）に終濃度２０μｇ／ｍｌ  Ｔｃを加えた培地で３７℃，１００ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎで振とう培養した。
また、Ｈｅｌｐｅｒ（Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＭＭ２９４：：ｐＲＫ２０１３）は、５ｍｌ  ＬＢ液体培地に終濃度５０μｇ／ｍｌ  ｋａｎａｍｙｃｉｎｅ（Ｋｍ）を加えた培地で３７℃，１００ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎで振とう培養した。
そして、対数増殖後期（Ｏ．Ｄ．６６０ｎｍでの吸光値：０．６〜０．８）まで増殖したそれぞれの菌株３ｍｌを遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，４℃，１ｍｉｎ）した。
次に、得られたペレットを１ｍｌ  ＨＭ液体培地に懸濁させた後、ＨＭに寒天を加えた寒天培地上のフィルター（０．４５μｍ）に載せて３０℃で２日間静置培養した。
培養後、菌株が載ったフィルターを切断し、これを５００μｌ  ＨＭ液体培地に懸濁した後、終濃度１００μｇ／ｍｌ    Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ（Ｃｍ）と終濃度１００μｇ／ｍｌ  Ｔｃを加えたＡＧ寒天培地（０．１８ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ，０．１２５ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４，０．２５ｇ  Ｎａ２ＳＯ４，０．３２ｇ  ＮＨ４Ｃｌ  ，０．００４ｍｇ  ＦｅＣｌ３，０．０１３ｇ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ，１．３ｇ  ＨＥＰＥＳ，１．１ｇ  ＭＥＳ，１．０ｇ  Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ，１．０ｇ  Ｎａ  ｇｌｕｃｏｎａｔｅ  ／  Ｌ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ，ｐＨ７．０）に植菌して、３０℃で６日間静置培養し、増殖したコロニーを得た。
【００２４】
（導入の確認）
培養後のコロニーをチップの先端でつつき、１．５ｍｌチューブ中の１００μｌ滅菌水に懸濁させ、このチューブを１００℃，３０ｍｉｎ処理した後、遠心分離（１４，０００ｒｐｍ，４℃，５ｍｉｎ）を行い、上澄みを得てこれを菌熱水抽出液とした。
そして、ＰＣＲ法を用いて遺伝子の増幅を行い、１％アガロース電気泳動により遺伝子のバンドの確認を行った。
このとき、鋳型のＤＮＡとして前記のＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｐＴＥ３：ｃｏｄＡ）の菌熱水抽出液をポジティブコントロール、根粒菌（Ｊ１０６５，Ｊ２０２）野生株の菌熱水抽出液をネガティブコントロールとしてそれぞれ用いた。
その結果、遺伝子導入を行って得られた根粒菌（Ｊ１０６５およびＪ２０２）のコロニーの中から、目的の遺伝子領域の１，６１７ｂｐ付近にバンドが出現し、前記した根粒菌にｃｏｄＡが導入されたことが確認された。
【００２５】
次に、前記で得られた根粒菌のコリンオキシダーゼの活性を測定した。その測定方法は以下のとおりである。
【００２６】
（超音波処理による菌抽出液の作成）
根粒菌の野生株および前記で得られたｃｏｄＡ導入菌株を白金耳で釣菌し、０．６７ｕｎｉｔ／ｍｌ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅを加えた５ｍｌ  ＨＭ液体培地に植菌し、３０℃で１００ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎ、約７２時間振とう培養した（前培養）。
そして、対数増殖後期（Ｏ．Ｄ．６６０ｎｍでの吸光値：０．６〜０．８）に達した前培養菌液（２ｍｌ）を、０．６７ｕｎｉｔ／ｍｌ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅを加えた２００ｍｌ  ＨＭ液体培地に加え、３０℃で１００ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎ、約７２時間振とう培養した（本培養）。
また、対数増殖後期（Ｏ．Ｄ．６６０ｎｍでの吸光値：０．６〜０．８）に達した本培養菌液（２００ｍｌ）を遠心分離（７，７００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ）して集菌して上澄みを捨てた後、菌ペレットを２０ｍｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２０ｍＭ，ｐＨ８．０）を加えて懸濁し、再び、遠心分離（７，７００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ）する操作を２度行い菌の洗浄をした。
次に、１ｍｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２０ｍＭ，ｐＨ８．０）にペレットを懸濁し、超音波処理（２００Ｗ，２０ｍｉｎ×３）を行った後、遠心分離（１９，０００ｒｐｍ，４℃，３０ｍｉｎ）し、その上澄みを得てこれを菌抽出液とした。
【００２７】
（タンパク質量の測定）
ＢｒａｄｆｏａｒｄのＣＢＢ染色法に基づいて測定した（Ｂｉｏｒａｄ社のＣＢＢ溶液を使用）。ＣＢＢ溶液５ｍｌに前記の菌抽出液５０μｌ混合し、Ｏ．Ｄ．５９５ｎｍでの吸光値から定量した。
標準タンパクとして牛血清アルブミンを用いた。
【００２８】
（菌抽出液中のコリンオキシダーゼ活性の測定）
比色定量用試薬３ｍｌ｛３００μｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２００ｍＭ），ｐｈｅｎｏｌ（２１ｍＭ），３００μｌ  ４−ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ（１５ｍＭ），１０．２μｌ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（２．０ｕｎｉｔ），９６μｌ  塩化コリン（６００ｍＭ），２．２９３８ｍｌ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ｝に、２０μｌ菌抽出液を加え、Ｏ．Ｄ．５００ｎｍでの吸光値を測定した。
定量は以下の反応式（式１）および計算式（式２）により算出した。
【００２９】
【式１】
2004229557.tif 000003
【００３０】
【式２】
2004229557.tif 000004
【００３１】
（式２の説明）
【外１】
2004229557.tif 000005
１２．０  ：キノンイミン色素のミリモル係数
２    ：酸素反応で生成した過酸化水素の１分子から形成するキノンイミン色素は１／２分子であることによる係数
３．０２：総液量
０．０２：菌抽出液の量
Ｓ：菌抽出液中のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）
【００３２】
その結果、大豆根粒菌（Ｊ１０６５）のコリンオキシダーゼ活性は、図２に示すように、野生株では、０．０６  ｍ  ｕｎｉｔｓ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであり、ｃｏｄＡ導入株では、４．６４ｍ  ｕｎｉｔｓ  ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであった。
また、小豆根粒菌（Ｊ２０２）のコリンオキシダーゼ活性は、図３に示すように、野生株では５．７８  ｍ  ｕｎｉｔｓ  ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであり、ｃｏｄＡ導入株では、２５．４０  ｍ  ｕｎｉｔｓ
／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであった。
したがって、ｃｏｄＡ導入株は十分なコリンオキシダーゼ活性を発揮した。
【００３３】
次に、根粒菌の野生株（Ｊ１０６５およびＪ２０２）と前記ｃｏｄＡ導入菌株を用い、菌体中におけるベタイン含量を測定した。
【００３４】
（菌体の増殖と集菌）
根粒菌（野生株及びｃｏｄＡ導入菌株）を白金耳で釣菌し、１０ｍＭ塩化コリンを加えた５００ｍｌ  ＨＭ液体培地（前記記載）で３０℃，  １００  ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎで対数増殖後期（Ｏ．Ｄ．６６０ｎｍ：０．６〜０．８）まで培養した。集菌は５０ｍｌ容プラスチックチューブで２〜３回に分けて遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ）する操作で行った。
【００３５】
（菌体中のベタイン含量の測定）
回収した菌体に１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を７８０μｌ加えて軽く超音波処理後、２４時間震盪した。試料を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，  ４℃，  １５ｍｉｎ）後、上澄みを新しい１．５ｍｌ容チューブに移し、ＫＩ／Ｉ２溶液（２０ｇ  ＫＩ，  １５．７ｇ  Ｉ２を１００ｍｌの超純水に溶解して調製した）の５２０μｌを加えて混合後、２時間氷冷した。試料を遠心処理（１５，０００ｒｐｍ，  ４℃，  １５ｍｉｎ）後、上澄みを捨て、吸引乾燥した（６０℃、３０ｍｉｎ）。沈澱に重水を５００μｌ加え、混合後、再び吸引乾燥（６０℃、２時間）させ、この操作をもう一度繰り返した。沈澱に重水を５９７μｕｌ加え、１／１００量のｔ−ブタノール（スタンダード）を３μｌ加え、軽く超音波処理して混合後、遠心した上澄みに含まれるベタイン含量をＮＭＲで測定した。
【００３６】
菌体中のベタイン含量の結果を以下の表２に示した。ｃｏｄＡ遺伝子を持たない野生株からベタインは検出されなかったが、ｃｏｄＡ導入菌株から細胞乾重量ｍｇあたり約０．２５０μｇのベタインが検出された。
したがって、コリンオキシダーゼをコードする遺伝子を導入して得られる根粒菌からベタインが生成されていることが確認された。
【００３７】
【表２】
2004229557.tif 000006
【００３８】
次に、根粒菌の野生株（Ｊ１０６５およびＪ２０２）と前記ｃｏｄＡ導入菌株をそれぞれ宿主マメ科植物である大豆（トヨムスメ・トヨコマチ）及び小豆（エリモショウズ・きたのおとめ）に接種・栽培し、根粒着生および植物体の比較を行った。
【００３９】
（菌株の培養）
野生株の培養は、ＹＭＡ寒天培地（１０．０ｇ  Ｍａｎｎｉｔｏｌ，０．５ｇ  Ｋ２ＨＰＯ４，０．２ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．１ｇ  ＮａＣｌ，０．４ｇ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，３５．７ｍｇ  Ｃｏｎｇｏ  ｒｅｄ，２０ｇ  Ａｇａｒ  ／  Ｌ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ，  ｐＨ６．８）に植菌して、２８℃で８日間静置培養した。次に、ＹＭＡ寒天培地上で増殖させた各菌株１コロニーを白金耳でそれぞれ釣菌し、４０ｍｌ  ＹＭＢ液体培地（１０．０ｇ  Ｍａｎｎｉｔｏｌ，０．５ｇ  Ｋ２ＨＰＯ４，０．２ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．１ｇ  ＮａＣｌ，０．５ｇ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ／  Ｌ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ，  ｐＨ６．８）に移植し２８℃で１５０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎ，７２時間振とう培養した。また、ｃｏｄＡ導入株は、終濃度５０μｇ／ｍｌ  Ｔｃを加えたＹＭＡ寒天培地およびＹＭＢ液体培地を用いて前記野生株と同様に培養した。
【００４０】
（接種菌液の調整）
そして、対数増殖後期（Ｏ．Ｄ．６６０ｎｍでの吸光値：０．６〜０．８）に達した培養菌液（４０ｍｌ）を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，４℃，５ｍｉｎ）して集菌して上澄みを捨てた後、菌ペレットを２０ｍｌ  リン酸緩衝化生理食塩水｛  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ  ：  ＰＢＳ（８．０ｇ  ＮａＣｌ，  ０．２ｇ  ＫＣｌ，  ０．２ｇ  ＫＨ２ＰＯ４，  １．１５ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ／  Ｌ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ，  ｐＨ  ７．４）｝を加えて懸濁し、再び、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，４℃，５ｍｉｎ）する操作を２度行い菌の洗浄をした。さらに、洗浄された菌ペレットをＰＢＳ  で１０６ｃｆｕ／ｍｌに希釈し、これを接種菌液とした。
【００４１】
（ポットの準備と栽培実験）
一方、高さ１３．５ｃｍ×内径１１ｃｍ  のプラスチック製ポットに給水パイプを立て、ポット底部にガラスビーズ（１０〜１２ｍｍ）を敷き詰め、その上に、ろ紙を敷いてから、約１，２００ｇの砂質土を充填した。そして、ポットにＣｌｏｎｅ氏栽培液｛０．７５ｇ  Ｋ２ＳＯ４，０．１８７５ｇ  ＣａＳＯ４，０．１８７５ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．１８７５ｇ  Ｃａ３（ＰＯ４）  ２，０．１８７５ｇ  ＦｅＰＯ４・４Ｈ２Ｏ，０．５ｇ  Ｋ２ＨＰＯ４  ／  Ｌ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ，  ｐＨ  ６．８｝を１００ｍｌ加えた後、アルミホイルを被せて、オートクレーブにより１．２気圧、１２１℃で１時間滅菌した。
種子は５％過酸化水素水で１分間殺菌した後、滅菌水で２〜３回洗浄した。殺菌した種子を１ポット当たり４粒ずつ播種し、１０６ｃｆｕ／ｍｌに調製した培養菌液を１種子あたり１ｍｌ接種し覆土した（１処理区１０反復）。発芽後、アルミホイルをとりはずして植物体の間引きし、ポットあたり２個体とした。
栽培期間中は、室温２２℃、湿度７０〜８０％の人工気象室において、明期：１４時間，暗期：１０時間の照射条件下で栽培した。また、１０日に１度の間隔で滅菌栽培液を加え、適宜滅菌水を加えてポットの土壌水分を一定に保たせた。そして、大豆は播種日から３０日後、小豆は播種日から３５日後、ポットから植物体を取り出し、根に着生した根粒数、根粒重および植物体重について測定した。
その結果、表３、４で明らかなように、ｃｏｄＡ遺伝子を導入した根粒菌を接種すると、根粒数、根粒重および植物体重が増加している。
以上のことから、ｃｏｄＡ遺伝子を導入した根粒菌を接種すると、根粒着生量が増加し、窒素固定機能が向上することによって大豆・小豆の生育が明らかによくなることが証明された。
【００４２】
【表３】
2004229557.tif 000007
【００４３】
【表４】
2004229557.tif 000008
【００４４】
【発明の効果】
以上説明したとおり本発明は下記の優れた効果を有する。
本発明の方法によれば、グリシンベタインの生成能および蓄積能が向上することによって、根粒菌の耐塩性、耐浸透圧性、耐温度性等のストレス耐性が強化される。
したがって、優れた根粒着生能を有する根粒菌およびその子孫を得ることができるとともに、その根粒菌およびその子孫を提供することができる。
そして、前記方法によって、根粒菌のグリシンベタインの生成能および蓄積能が向上し、この根粒菌を接種すると、根粒数、根粒重が増加し、マメ科植物の生育が促進されることが明らかにされた。
以上のことから、根粒菌のグリシンベタインの生成能および蓄積能が向上してストレス耐性が強化された根粒菌は、優れた根粒着生能を備えているので、マメ科植物の収量・牧草の生産量の増加に期待ができ、かつ、化学肥料の依存度を低減化し、農業コストの削減と環境汚染の緩和にも役立てることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｃｏｄＡ遺伝子領域のＯＲＦと制限酵素部位を示す。
【図２】大豆根粒菌抽出液中のコリンオキシダーゼ活性を示す比較図。
【図３】小豆根粒菌抽出液中のコリンオキシダーゼ活性を示す比較図。
【配列表】
2004229557.tif 000009
2004229557.tif 000010
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2004229557.tif 000014
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2004229557.tif 000016
2004229557.tif 000017
【図１】
2004229557.tif 000018
【図２】
2004229557.tif 000019
【図３】
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