(57)【要約】【課題】紡錘極体及び微小管中心体活性化用組成物の提供。【解決手段】リボヌクレオチド還元酵素の８５ｋＤａのサブユニット領域のタンパク質及びポロキナーゼを含む、細胞の紡錘極体及び／又は中心体活性化用組成物。【選択図】　　図３
2004141124.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボヌクレオチド還元酵素の８５ｋＤａのサブユニット領域のタンパク質及びポロキナーゼを含む、細胞の紡錘極体及び／又は中心体活性化用組成物。
【請求項２】
リボヌクレオチド還元酵素の８５ｋＤａのサブユニット領域のタンパク質が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質である請求項１記載の組成物。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、細胞の紡錘極体若しくは中心体を活性化するタンパク質
【請求項３】
ポロキナーゼが、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質である請求項１記載の組成物。
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、キナーゼ活性を有するタンパク質
【請求項４】
目的細胞を、請求項１記載の組成物の存在下で培養することを特徴とする、目的細胞中の紡錘極体及び／又は中心体の活性化方法。
【請求項５】
被検化合物を、紡錘極体及び／又は中心体を含む細胞抽出液、チューブリン並びに請求項１記載の組成物の存在下で培養し、紡錘極体及び／又は中心体の活性化を阻害する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項６】
請求項１記載の組成物を含む、紡錘極体及び／又は中心体の活性化剤。
【請求項７】
請求項１記載の組成物を含む、紡錘極体及び／又は中心体の活性化用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リボヌクレオチド還元酵素の大サブユニット及びポロキナーゼを含む組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、リボヌクレオチド還元酵素（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，　ＲＮＲ）は、塩基の種類とは無関係に、リボヌクレオチド２リン酸のリボースの２位のＯＨ基を還元して、デオキシリボース体を合成することが知られている（例えば非特許文献１及び非特許文献２参照）。この酵素は、ＤＮＡ生合成及びＤＮＡ修復をするための重要な酵素である。ＲＮＲは、８５ｋＤａの大サブユニット（ＲＮＲ−Ｒ１）と４５ｋＤａの小サブユニット（ＲＮＲ−Ｒ２）から構成されており、この２つのサブユニットが相互作用して共同で機能していることが予想されている。
【０００３】
しかし、ＲＮＲは、ＤＮＡ生合成及びＤＮＡ修復以外の機能は知られていない。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｅｌｌｅｄｇｅ　ＳＴ．　ｅｔ　ａｌ．，　ＢｉｏＡｓｓａｙ，　１５，　３３３−３３９，　１９９３
【０００５】
【非特許文献２】
Ｔａｋｅｄａ　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅｌｌ，　１１，　４１７３−４１８７，　２０００
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、リボヌクレオチド還元酵素の大サブユニットとポロキナーゼとの混合組成物を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行なった結果、ＲＮＲ−Ｒ１及びポロキナーゼを細胞分裂の反応系に加えることによってＲＮＲ−Ｒ１又はポロキナーゼの単独による活性化よりも高い活性を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）リボヌクレオチド還元酵素の８５ｋＤａのサブユニット領域のタンパク質及びポロキナーゼを含む、細胞の紡錘極体及び／又は中心体活性化用組成物。
【０００９】
ここで、リボヌクレオチド還元酵素の８５ｋＤａのサブユニット領域のタンパク質としては、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質が挙げられる。
【００１０】
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、細胞の紡錘極体若しくは中心体を活性化するタンパク質
また、ポロキナーゼとしては、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質が挙げられる。
【００１１】
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、キナーゼ活性を有するタンパク質
（２）目的細胞を、前記（１）に示す組成物の存在下で培養することを特徴とする、目的細胞中の紡錘極体及び／又は中心体の活性化方法。
（３）被検化合物を、紡錘極体及び／又は中心体を含む細胞抽出液、チューブリン並びに前記（１）に示す組成物の存在下で培養し、紡錘極体及び／又は中心体の活性化を阻害する化合物をスクリーニングする方法。
（４）前記（１）に示す組成物を含む、紡錘極体及び／又は中心体の活性化剤。
（５）　前記（１）に示す組成物を含む、紡錘極体及び／又は中心体の活性化用キット。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＲＮＲ−Ｒ１とポロキナーゼとを含む組成物であり、当該組成物は、紡錘極体又は中心体の活性化を促進する作用を有するものである。
【００１４】
紡錘極体（スピンドル極体ともいう）は、酵母に存在する微小管形成中心であり、中心体は、ほぼすべての動物細胞に存在する微小管形成中心である。どちらも間期に複製され、２つになる。２つになった紡錘極体・中心体は有糸分裂の開始時に核の両側に移動して紡錘体の２つの極（紡錘体極）になる。
【００１５】
本発明者は、有糸分裂期（Ｍ期）の紡錘極体・微小管中心体の活性化に関与するタンパク質の同定を試み、従来ＤＮＡ生合成及びＤＮＡ修復に関係していることが知られているＲＮＲ−Ｒ１タンパク質を同定した。そして、遺伝子組換え技術により作成したＲＮＲ−Ｒ１タンパク質単体を細胞に作用させたときに、同様の紡錘極体活性又は微小管中心体の活性化が起こるか定量的に評価した。その結果、上記ＲＮＲの大サブユニットタンパク質ＲＮＲ−Ｒ１が、細胞分裂の際に起こる紡錘体活性及び微小管中心体活性に必須であるタンパク質であることを明らかにした。さらに、ＲＮＲ−Ｒ１及びポロキナーゼの存在下で細胞を培養すると、紡錘極体活性及び微小管中心体活性が増強されることが分かった。
【００１６】
ＲＮＲ−Ｒ１は、動物培養細胞、分裂酵母等に挿入又は添加することで、微小管中心・紡錘極体が活性化されるので、そのメカニズムを解明するための研究試薬として使用できる。この場合、純品としてのタンパクとして提供してもよく、使用者にそのタンパクを容易に作成できるように、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴ（グルタチオン　Ｓ−トランスフェラーゼ）及び、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク）等を付加し、Ｓｆ９細胞や大腸菌等で発現するプラスミドにＤＮＡとして挿入したプラスミドとして提供してもよい。
１．ＲＮＲ−Ｒ１
ＲＮＲ−Ｒ１は、公知の遺伝子組換え技術を用いて調製することができる。例えば、マウスやアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）のｃＤＮＡライブラリーからＲＮＲ−Ｒ１領域を増幅させるのに必要なプライマーを設計し、ＰＣＲによって目的のＤＮＡを増幅する。ＲＮＲ−Ｒ１のアミノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡ配列は公知であるため、プライマーは、ＲＮＲ−Ｒ１のアミノ酸配列から設計することも、ＲＮＲ−Ｒ１をコードするＤＮＡから設計することもできる。
【００１７】
配列番号２にマウスＲＮＲ−Ｒ１のアミノ酸配列を、配列番号１に該ＲＮＲ−Ｒ１をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。但し、上記配列番号２に示すアミノ酸配列からなるＲＮＲ−Ｒ１において、紡錘極体又は中心体を活性化させる機能を有する限り、当該アミノ酸配列の一部（例えば１個又は数個（２〜９個程度）のアミノ酸）に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列から１個又は数個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２に示すアミノ酸配列の１個又は数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよく、配列番号２に示すアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸が付加してもよい。
【００１８】
ここで、紡錘極体又は中心体の活性化機能とは、紡錘極体とチューブリンが重合して微小管を形成させる機能を意味し、紡錘極体の構成成分であるαチューブリン及びγチューブリン抗体を用いた蛍光抗体法で、紡錘極体とチューブリンが重合して形成された微小管が確認された場合に上記活性を有するものとする（以下同様である）。
【００１９】
なお、当該活性がない場合には、γチューブリンの存在は確認できるが、そこからのびた微小管がほとんど確認できない。
【００２０】
上記アミノ酸配列の変異は、部位特異的変異誘発法により行なうことができる。部位特異的変異誘発法は公知であり、市販のキットを用いて突然変異を引き起こすこともできる。市販のキットとしては、例えばＭｕｔａｎ−Ｋ（宝酒造社）、ＬＡ−ＰＣＲ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（宝酒造社）などのＴａＫａＲａ　Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍを使用することができる。
【００２１】
２．ポロキナーゼ
細胞周期は、タンパク質の巧妙なリン酸化と脱リン酸化が関与することにより制御されている。タンパク質のリン酸化、脱リン酸化反応は、細胞分化・増殖、放出反応、収縮反応等の多くの生命反応を制御する。このタンパク質リン酸化／脱リン酸化反応を触媒する酵素をキナーゼといい、ポロキナーゼは、脱リン酸化酵素であるＣｄｃ２５タンパク質を制御する機能を果たす酵素である。なお、本発明において使用するポロキナーゼをＰｌｘ１ともいう。
【００２２】
ポロキナーゼをコードするｃＤＮＡは、例えばアフリカツメガエルの卵から公知方法（例えばオリゴキャップ法等）により得ることができる。
【００２３】
本発明において、ポロキナーゼのアミノ酸配列を配列番号４に、該ポロキナーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号３に示す。但し、上記配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポロキナーゼがそのキナーゼ活性を有する限り、当該アミノ酸配列の一部（例えば１個又は数個（２〜９個程度）のアミノ酸）に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。例えば、配列番号４に示すアミノ酸配列から１個又は数個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号４に示すアミノ酸配列の１個又は数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよく、配列番号２に示すアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸が付加してもよい。
【００２４】
キナーゼ活性は、リン酸化部位特異抗体を用いたウエスタンブロッティングなどにより測定することができ、細胞刺激及び／又は免疫沈降と組み合わせることも可能である。
【００２５】
３．ＲＮＲ−Ｒ１又はポロキナーゼの製造
ＲＮＲ−Ｒ１又はポロキナーゼは、これらのタンパク質をコードするＤＮＡを適当なベクター（プラスミド　ＤＮＡ、ファージ　ＤＮＡ等）に組み込んで組換えベクターを作製し、これを適当な宿主に組み込んで形質転換体を作製した後、該形質転換体を培養することにより得ることができる。
【００２６】
ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。プラスミド　ＤＮＡとしては、大腸菌、枯草菌又は酵母由来のプラスミドなどが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージが挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００２７】
ベクターに遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター　ＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。
【００２８】
形質転換に使用する宿主としては、目的の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。
【００２９】
宿主へのベクターの導入方法は公知であり、任意の方法（例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等）を適宜選択して導入する。
【００３０】
本発明において、ＲＮＲ−Ｒ１又はポロキナーゼは、これらをコードする遺伝子を保有する前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、（ａ）培養上清、（ｂ）培養細胞若しくは培養菌体又はその破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などにより行われる。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３１】
ＲＮＲ−Ｒ１又はポロキナーゼが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕する。菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、ＲＮＲ−Ｒ１又はポロキナーゼを単離精製することができる。
【００３２】
４．混合組成物
本発明の組成物は、上記ＲＮＲ−Ｒ１とポロキナーゼとの混合物である。両者の混合量は特に限定されるものではなく、両者がそれぞれ機能する範囲で適宜設定することができる。また、適当な緩衝液、ＡＴＰ、プロテアーゼ阻害剤等を添加してもよい。このようにして得られるＲＮＲ−Ｒ１とポロキナーゼとの混合物は、紡錘極体及び／又は中心体の活性化剤として、あるいは紡錘極体及び／又は中心体の活性化用キットとして使用することができる。上記組成物又は活性化剤若しくは活性化用キットとして使用する場合は、ＲＮＲ−Ｒ１の濃度は０．１−１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５−１ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは０．８ｍｇ／ｍｌである。また、ポロキナーゼの濃度は、１−５０μｇ／ｍｌ、好ましくは５−３０μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１０−２０μｇ／ｍｌである。両者の組み合わせは、ＲＮＲ−Ｒ１が０．８ｍｇ／ｍｌ、ポロキナーゼが１０μｇ／ｍｌであることが好ましい。
【００３３】
５．細胞中の紡錘極体及び／又は中心体の活性化
本発明の組成物を細胞とともに培養すると、目的細胞中の紡錘極体及び／又は中心体を活性化して微小管を形成させることができる。
【００３４】
使用する細胞としては分裂酵母、例えばシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）が挙げられる。目的とする細胞の細胞周期は特に限定されるものではないが、間期であることが好ましい。また、細胞壁を有する細胞を使用する場合は、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅなどの細胞壁消化酵素で処理しておく。次に、細胞を適当な界面活性剤で処理して細胞膜、核膜等を可溶化し、細胞内の可溶性成分を取り除く。その後、ＲＮＲ−Ｒ１及びポロキナーゼを加え、さらに精製したチューブリンを加えて所定時間懸濁する。但し、ＲＮＲ−Ｒ１及びポロキナーゼのいずれか一方を反応液中に添加した後に他方を添加してもよく、必ずしも両者を同時に添加する必要はない。続いて、上記処理をした細胞を固定し、紡錘極体の構成成分であるγチューブリン及びαチューブリン抗体を用いた蛍光抗体法によって、紡錘極体とチューブリンが重合して微小管が形成されたか否かを確認する。
【００３５】
本発明においては、上記の活性化方法を応用して、紡錘極体及び／又は中心体をの活性化を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。例えば、上記活性化方法において使用される反応液中にスクリーニングの対象となる化合物を添加し、微小管が形成されたか否かを確認する。微小管が形成された場合は上記化合物は紡錘極体及び／又は中心体の活性化を阻害しないと判断することができ、微小管が形成されない場合は、当該活性化を阻害すると判断することができる。
【００３６】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
配列を含むものである。
【００３７】
〔実施例１〕　　ＲＮＲ−Ｒ１の単離
Ｈｉｓ−ｔａｇ（６個のＨｉｓ）が付加したマウスＲＮＲ−Ｒ１を、ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ　バキュロウイルス発現システム（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）を用いて作成した。
【００３８】
マウスから得られた全長ｃＤＮＡを、バキュロウイルスに特異的なポリヘドリンプロモーターを有するｐＦＡＳＴＢＡＣＨベクターに挿入した。このプラスミドを、ａｔｔＴｎ７　標的部位を有するバキュロウイルス　シャトルベクター　（ｂａｃｍｉｄ）及びヘルパープラスミドを持つ、ＤＨ１０ＢＡＣ大腸菌コンピテントセルにトランスフォームした。次いで、大腸菌内で、ｐＦＡＳＴＢＡＣＨベクターのｍｉｎｉ−Ｔｎ７　エレメントが、ヘルパープラスミドから産出された組換えタンパクによって、ｂａｃｍｉｄのａｔｔＴｎ７　標的部位に組換えられる。つまり、ここで相同的組換えによって外来遺伝子をウイルスゲノム中に組込むことができる。Ｓｆ９昆虫細胞を、５％　ウシ胎児血清，　５０Ｕ／ｍｌ　ペニシリン及び５０ｕｇ／ｍｌ　ストレプトマイシンを加えたｓｆ−９００ＩＩＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）液体培地で培養し、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ試薬（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）を用いて組み換えウイルスゲノムを導入した。４８時間後に、上清をウイルスストックとして回収した。Ｓｆ９細胞にウイルスを感染させ、４〜５日後に培養プレートから細胞を集めて、ＰＢＳでサスペンドして遠心分離を行い、洗い作業を行った。この細胞を液体窒素で凍結させた後、−８０℃で保存した。凍結Ｓｆ９細胞からタンパクの分離・回収を行った。−８０℃で保存した細胞を氷上で溶解し、１％　ＴｒｉｔｏｎＸ−１００とタンパク分解酵素阻害剤を添加した結合バッファー（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．９，　　５０ｍＭ　ＮａＣｌ，　５ｍＭ　イミダゾール）に懸濁した。その後、ソニケーションで細胞を完全に破壊し、遠心分離（４００００ｇ，３０ｍｉｎ，４℃）をし、その上清液を分離した。
予め、２．５ｍｌのＰｒｏ−Ｂｏｎｄ　ｍｅｔａｌ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｒｅｓｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の入ったカラムを、タンパク分解酵素阻害剤を添加した結合バッファーで平衡化をした後、洗浄バッファー（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５００ｍＭ　ＮａＣｌ，６０ｍＭ　イミダゾール）で洗い作業を行い、カラムの準備をした。このカラムに上記の上清液を流し、イミダゾールの濃度勾配を用いて精製した。さらに、ＸＢ／ＥＢバッファーで平衡化したｍｉｃｒｏｓｐｉｎ　Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｌｔｄ．）を用いて、Ｈｉｓ−ｔａｇの付いたタンパク（Ｈｉｓ−ＲＮＲ−Ｒ１）を精製した。このようにして、ほぼ純品であるＲＮＲ−Ｒ１（８５ｋＤａ）（配列番号２）を得て、以下に行う紡錘極体活性化の試験に用いた。
【００３９】
〔実施例２〕　Ｐｌｘ１の紡錘極体活性化試験
本実施例は、単体のＰｌｘ１が紡錘極体活性化因子であることを試験した例である。
（１）　Ｐｌｘ１の単離
アフリカツメガエル卵からＰｌｘ１全長ｃＤＮＡを得たのち、キナーゼ機能を持たない不活性型変異、分裂期型に活性化された変異を部位特異的突然変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって作成した。キナーゼ機能を持たない不活性型変異ｃＤＮＡは、Ｐｌｘ１のアミノ酸配列（配列番号４）のうち第１７２番目のアスパラギンをアラニンに置換するように（Ｎ１７２Ａという）、分裂期型に活性化された変異ｃＤＮＡは、Ｐｌｘ１のアミノ酸配列のうち第２０１番目のスレオニンをアスパラギン酸に（Ｔ２０１Ｄという）、第１２８番目のセリンをアスパラギン酸に置換するように（Ｓ１２８Ｄという）変異を施した。
Ｈｉｓ−ｔａｇ（６個のＨｉｓ）が付加したＰｌｘ１を、ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ　バキュロウイルス発現システム　（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）を用いて作成した。バキュロウイルスに特異的なポリヘドリンプロモーターを有するｐＦＡＳＴＢＡＣＨベクターに挿入した。このプラスミドを、ａｔｔＴｎ７　標的部位を有するバキュロウイルス　シャトルベクター（ｂａｃｍｉｄ）及びヘルパープラスミドを持つ、ＤＨ１０ＢＡＣ大腸菌コンピテントセルにトランスフォームした。大腸菌内で、ｐＦＡＳＴＢＡＣＨベクターのｍｉｎｉ−Ｔｎ７　ｅｌｅｍｅｎｔが、ヘルパープラスミドから産出された組換えタンパクによって、ｂａｃｍｉｄのａｔｔＴｎ７　標的部位に組換えられる。つまり、ここで相同的組換えによって外来遺伝子をウイルスゲノム中に組込むことができる。Ｓｆ９昆虫細胞は、５％　ウシ胎児血清，　５０Ｕ／ｍｌ　ペニシリン及び５０ｕｇ／ｍｌ　ストレプトマイシンを加えたｓｆ９００ＩＩＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）液体培地で培養した。Ｓｆ９細胞にＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ　試薬（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）を用いて組み換えウイルスＤＮＡを導入した。２日後に培養上清を集めて、ウイルスストックとした。
Ｓｆ９細胞にウイルスストックを用いてウイルスを感染させ、２日間培養した後に１００　ｎＭ　ｏｋａｄａｉｃ　ａｃｉｄを加えて３時間後にＳｆ９細胞を回収した。溶解バッファー（４０　ｍＭ　β−グリセロホスフェート，　１５　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，　５　ｍＭ　ＥＧＴＡ，　０．１　ｍＭ　Ｎａ　ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ，　１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ，　１％　ＣＨＡＰＳ，　５　ｍＭ　β−メルカプトエタノール（ｂｅｔａ−Ｍｅという），　３　μＭ　ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎ　ＬＲ，　プロテアーゼ阻害剤，　ｐＨ７．５）で細胞を溶解した。細胞溶解液の遠心上清（１５，０００ｒｐｍ　ｘ　５　ｍｉｎ）を溶解バッファーで平衡化したＰｒｏ−Ｂｏｎｄ　ｍｅｔａｌ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｒｅｓｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に加え、３０分間、４Ｃで懸濁した。洗浄バッファー（４０　ｍＭ　β−グリセロホスフェート，　１５　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，　５　ｍＭ　ＥＧＴＡ，　０．１　ｍＭ　Ｎａ　ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ，　５００　ｍＭ　ＮａＣｌ，　０．１％　ＣＨＡＰＳ，　５　ｍＭ　ｂｅｔａ−Ｍｅ，　ｐＨ７．５）で洗った後、溶出バッファー（４０　ｍＭβ−グリセロホスフェート，　１５　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，　５　ｍＭ　ＥＧＴＡ，　０．１　ｍＭ　Ｎａ　ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ，　２５　ｍＭ　ＮａＣｌ，　５　ｍＭ　ｂｅｔａ−Ｍｅ，　３００　ｍＭ　イミダゾール，　ｐＨ７．５）でＰｌｘ１を溶出した。溶出液を透析バッファー　（１０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，　１０　ｍＭＮａＣｌ，　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ，　１　ｍＭ　ＤＴＴ）で透析した後、液体窒素中で凍結して、−８０℃で保存した。活性型変異Ｐｌｘ１は、ｏｋａｄａｉｃ　ａｃｉｄ処理なしでＳｆ９細胞から単離した。以下、ｏｋａｄａｉｃ　ａｃｉｄ処理してえられたＰｌｘ１と不活性型変異Ｐｌｘ１を、それぞれＰｌｘ１とＰｌｘ１．ＫＤ　（ｋｉｎａｓｅ−ｄｅａｄ）と呼ぶ。また、活性型変異Ｐｌｘ１は、Ｐｌｘ１．ＣＡ　（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ　ａｃｔｉｖｅ）　と呼ぶ。
（２）　活性化のチェック
精製されたタンパクが紡錘極体活性・微小管中心体の活性化を引き起こすか否かを評価した。紡錘極体又は中心体活性化の測定方法は、以下の通り行なった。
【００４０】
間期の分裂酵母細胞を等張条件下で、細胞壁を消化するＺｙｍｏｌｙａｓｅで処理し、細胞壁を部分破壊した。次に、酵母細胞を界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００で処理をして細胞膜、核膜等を可溶化し、細胞内の可溶性成分を取り除いた。ここで、精製したタンパク質を加え、一定時間懸濁し、そのタンパク溶液をおよそ取り除いた後に、ブタ脳若しくはウシ脳から精製したチューブリンを加えて、再度一定時間懸濁した。続いて、上記処理をした酵母細胞を固定し、紡錘極体の構成成分であるγチューブリン及びαチューブリン抗体を用いた蛍光抗体法によって、紡錘極体とチューブリンが重合して形成された微小管を顕微鏡下で、当該微小管を持つ紡錘極体の割合をカウントした。
【００４１】
Ｐｌｘ１による活性化を観察するために、上述した酵母細胞の処理を行い、Ｐｌｘ１、Ｐｌｘ１．ＫＤ、　Ｐｌｘ１．ＣＡの添加の影響を、抗α−チューブリン抗体で染色することによって確認した。その結果、Ｐｌｘ１とＰｌｘ１．ＣＡによって活性化が起こることがわかった（図１）。活性化はＡＴＰに依存して起こり、Ｐｌｘ１．ＫＤでは起こらなかったことから、キナーゼ活性によることが確認された。
次に、Ｐｌｘ１添加による活性化の濃度依存性を測定した。Ｐｌｘ１．ＣＡの濃度を高くすると活性の上昇が見られたが、１０μｇ／ｍｌ以上の濃度では、ほぼ同程度であった（図２）。Ｐｌｘ１．ＣＡによる活性化は、アフリカツメガル卵分裂期抽出液の２００Ｋフラクションによるものに比べて、低かった。Ｐｌｘ１でも同様な結果が得られた。
【００４２】
〔実施例３〕　Ｐｌｘ１及びＲ１の混合組成物による紡錘極体活性化試験
本実施例では、Ｐｌｘ１及びＲ１の両者を反応系に添加することによって、それぞれの単独添加に比べて紡錘極体の活性化の程度が上昇することを試験した。
【００４３】
０．８　ｍｇ／ｍｌのマウスＲＮＲ−Ｒ１の単独添加によって、スピンドル極体は３０％弱程度活性化された。また、１０μｇ／ｍｌ　のＰｌｘ１．ＣＡ　単独添加によって、スピンドル極体は４０％弱程度活性化された。それに対して、ＲＮＲ−Ｒ１及びＰｌｘ１の両者を加えることによって、５０％以上のスピンドル極体の活性化が確認できた（図３）。
【００４４】
【発明の効果】
ＲＮＲ−Ｒ１が、紡錘極体活性化を引き起こす過程で重要なタンパクであることを初めて明らかにした。本タンパクを用いることで、任意に紡錘極体活性化を引き起こす試薬として提供できる。
【００４５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】スピンドル極体の活性化の結果を示す図である。
【図２】スピンドル極体の活性化の結果を示す図である。
【図３】スピンドル極体の活性化の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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