(57)【要約】【課題】　核酸増幅、核酸配列決定、および重要な特徴（例えば、低減した熱力学的安定性）を有する独特の核酸の生成に有用かつ応用可能である新規のプロセスを提供すること。【解決手段】　特定の核酸配列を直線的に増幅するためのプロセスであって、以下の工程：該特定の核酸配列、初期プライマーまたは核酸構築物であって、２つのセグメントを含む、初期プライマーまたは核酸構築物；ならびに、基質、緩衝液、およびテンプレート依存性重合化酵素；を提供する工程；ならびに、均衡または限定サイクリング条件下で該基質、緩衝液、およびテンプレート依存性重合化酵素の存在下で、該特定の核酸配列および該新規プライマーまたは核酸構築物をインキュベートし；それにより、該特定の核酸配列を直線的に増幅する工程、を包含する、プロセス。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の核酸配列を直線的に増幅するためのプロセスであって、以下の工程：
１）　該特定の核酸配列、
　　　初期プライマーまたは核酸構築物であって、以下の２つのセグメント：
　　　　（Ａ）第１のセグメントであって、（ｉ）該特定の核酸配列の第１の部分と結合またはハイブリダイズするに十分に、該部分と相補的であり、そして（ｉｉ）テンプレート依存性の伸長を提供する、セグメント、および
　　　　（Ｂ）第２のセグメントであって、（ｉ）該第１のセグメントと実質的に非同一であり、（ｉｉ）該特定の核酸配列の第２の部分と実質的に同一であり、（ｉｉｉ）該特定の核酸配列の第１の相補的コピーが該第１のセグメントのテンプレート依存性伸長により生成された後に、均衡条件下または限定サイクリング条件下で、該第２のセグメントの相補的な配列に結合し、そしてそれにより（ｉｖ）その後の別の該初期プライマーまたは核酸構築物の第１のセグメントの、該特定の核酸配列の該第１の部分への結合を均衡条件下または限定サイクリング条件下で提供し、プライマー伸長の後に第２の相補的コピーが生成されて該第１の相補的コピーを置換するようにする、セグメントを含む、初期プライマーまたは核酸構築物；ならびに、
　　　基質、緩衝液、およびテンプレート依存性重合化酵素；を提供する工程；ならびに、
２）均衡条件下または限定サイクリング条件下で、該基質、緩衝液、およびテンプレート依存性重合化酵素の存在下で、該特定の核酸配列と、該新規プライマーまたは核酸構築物とをインキュベートし；それにより、該特定の核酸配列を直線的に増幅する工程、
を包含する、プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、組換え核酸技術の分野に関し、より詳細には、核酸増幅、核酸配列決定のための終結後標識、および減少した熱力学安定性を有する核酸の生成のためのプロセスに関する。
【０００２】
　本明細書において引用または同定される全ての特許、特許明細書、特定の文献などは、本発明が属する最先端技術をより完全に記載するために、それらの全体が参考として本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００３】
　標的核酸の首尾良いインビトロ指数関数的増殖について記載されている最初の系は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である（Ｓａｉｋｉら、１９８５　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０；１３５０−１３５４）。ＰＣＲは、対立遺伝子決定、法医学的同定、遺伝子分析、診断、クローニング、直接配列決定、および他の適用に幅広く使用されている。続いて、逆転写酵素（ＲＴ）は、ＲＮＡ分子をＤＮＡコピーに形質転換するために使用され、ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ増幅のための基質としてＲＮＡ分子の使用を可能にした。さらに、特定のＤＮＡポリメラーゼがそれら自身による逆転写を行うことを可能にする条件が記載されており（Ｍｙｅｒｓ，Ｔ．Ｗ．およびＧｅｌｆａｎｄ，Ｄ．Ｈ．［１９９１］　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　３０；７６６１−７６６６）、その内容を本明細書中で参考として援用する。最後に、Ｒｏｓｅら（米国特許第５，５０８，１７８号、これもまた本明細書中で参考として援用する）は、単一のプライマーの使用が、標的核酸の各末端からポリマー化を開始して、１本鎖形態のＰＣＲアンプリコンを作製することを可能にする、ＰＣＲプライマー配列の選択としての逆反復配列の使用を記載しており、この逆反復配列は、各末端での自己相補配列を有する「パン−ハンドル（ｐａｎ−ｈａｎｄｌｅ）」として描かれ得る。逆反復を欠く標的を利用するために、この群はまた、ＰＣＲアンプリコンに配列を導入し、その結果最終産物が、各末端で自己相補配列を有するための種々の方法を記載している（米国特許第５，４３９，７９３号、同第５，５９５，８９１号、および同第５，６１２，１９９号、その各々を、本明細書中で参考として援用する）。
【０００４】
　本来のＰＣＲ増幅系および種々の改良されたＰＣＲ系の両方は、ＰＣＲ法に本来備わっている複数の温度条件を提供するための高価な専用サーモサイクラーの必要性の限定で悩む。この必要性は、プライマーの伸長が、それを作製するのに使用されたプライマーよりも強力なテンプレートとの会合を有する産物を作製するという問題に由来する。そのようなものとして、ＰＣＲの様な系において、プライマーの結合を可能にする温度は、そのテンプレートから伸長産物の分離させるためには低すぎる温度、そして伸長産物を分離させるのに十分上昇される温度は、他のプライミング事象を可能にするには高すぎる。第２のプライミング事象は、第１の伸長鎖がそのテンプレートから分離された後まで、生じ得ない。そのようなものとして、ＰＣＲ増幅において、テンプレートへのプライマー結合およびテンプレートから伸長したプライマーの続く遊離は、別々の異なった温度で行われなければならず、そして別々の温熱工程の反復配列を提供するためのサーモサイクラーが必要である。異なる条件を有する不連続サイクルの存在もまた、各個別の温度工程の至適温度ならびに各工程のための適切なタイミングを必要とする。同様の問題もまた、ＬＣＲ反応において連結が使用される場合に適用し（Ｂａｃｋｍａｎ，Ｋら、欧州特許出願公開第０　３２０　３０８号、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕ．ら、１９８８　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１；１０７７、Ｗｕ，ＤおよびＷａｌｌａｃｅ，Ｒ．Ｂ．　１９８９　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　４；５６０、Ｂａｒａｎｙ，Ｆ．　１９９１，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８；１８９）、ここで個別のプローブを結合するのに必要な温度は、連結事象によってそれらが安定化された後にそれらを遊離するのに必要な温度よりも低い。前述の文書の全てを、本明細書中で参考として援用する。
【０００５】
　他者は、これらの限定を認識しており、そして等温条件下で複数のサイクルを達成する手段を提供することによってそれらを克服することを試みている。この例は、３ＳＲ（Ｋｗｏｈ，Ｄ．Ｙ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６；１１７３−１１７７）およびＮＡＳＢＡ（Ｋｉｅｖｉｔｓ，Ｔら、１９９１　Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　３５；２７３−２８６、その各々の内容を、本明細書中で参考として援用する）。前述の各系は、増幅される核酸の構造へのＲＮＡプロモーターの導入の必要性の限定を有する。従って、これらの系が、目的の配列のＤＮＡとＲＮＡ形態との間のサイクリング反応に依存するという限定もまた存在する。ＲＮＡ中間体の生成に基づく依存性は、ＲＮａｓｅ（環境に偏在し、そして生物学的由来の試料に頻繁に存在する酵素）への感受性の限定を誘導する。さらに、これらの増幅系の設計の性質は、それらが以下の４つの別々の酵素活性を必要とするさらなる限定を有する：ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＲＮａｓｅＨ、およびＲＮＡポリメラーゼ。ＴＭＡ反応において、これらの活性は、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼ酵素によって提供されるのに対して、３ＳＲおよびＮＡＳＢＡにおいて、それらは、逆転写酵素、ＲＮａｓｅＨ、およびＲＮＡポリメラーゼ酵素によって提供される。これらの各々の活性は、機能的である系に必要であり、そしてそれ自体、各機能を個別に試験および適定する製造者の必要性が存在し、それにより単一の酵素活性を利用する系と比較してコストが増加する。さらに、最小限で、少なくとも２つの異なった酵素が、全ての必要な機能を提供するために使用されなければならず、従って、これらの系を、単一の酵素を利用するものより高価にする。さらに、これらの系は、反応のための試薬として存在するリボヌクレオチドならびにデオキシリボヌクレオチドを必要とする。複数の活性の存在はまた、生物学的試料に存在し得る種々のインヒビターによる不活化に弱いより多くの工程を作製する。
【０００６】
　Ｗａｌｋｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．　１９９２，８９；３９２−３９６、本明細書中で参考として援用する）によって記載される鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ　Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法において、等温増幅は、プライマー内の制限酵素部位の封入によって行われ、その結果制限酵素による消化は、単一の温度で所定のテンプレートからの、一連のプライミング、伸長、および置換反応を可能にする。しかし、それらの系は、ポリメラーゼおよび基質についての基本的な必要性に加えて、３つのさらなるエレメントがそれらの発明を行うために必要であるという限定を有する。第１に、プライミングが行われる部位での適切な制限酵素部位の存在の必要性が存在する；第２に、示される第２の酵素（制限酵素）の存在の必要性が存在し、そして最後に、特異的に改変された基質（例えば、存在するｄＮＴＰのチオ誘導体）の必要性が存在する。この方法のバリエーションが記載されており（米国特許第５，２７０，１８４号、本明細書中で参考として援用する）、ここで、標的における制限酵素部位の必要性の限定が、制限酵素部位を有するプライマーに隣接する第２のプライマーセットの使用によって排除されている。しかし、このバリエーションにおいて、系は、第２のプライマーセットについての必要性の新たな限定を有する一方、制限酵素および改変基質についての他の２つの限定の必要性を有することが記載される。
【０００７】
　完全なサイクル増幅の種々の工程に使用される温度は、各工程に本来備わる物理学的制約によって決定される。そのようなものとして、先行技術において、テンプレートから伸長した鎖の完全な置換に使用される温度は、代表的には約９２〜９５℃である。この高温は、分離の適切な効率を保証するために使用されており、その結果、伸長鎖は、続く反応のためのテンプレートとして使用され得る。ＰＣＲが最初に記載された場合、ポリメラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉに由来し、そしてそのようなものとして、より多くの酵素の添加を必要とする各変性工程の後のポリメラーゼの本質的に完全な熱不活化が存在した（Ｓａｉｋｉら、１９８５　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０；１３５０−１３５４）。この問題は、ＰＣＲ反応における、好熱性細菌Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼの使用によって取り組まれた（Ｓａｉｋｉら、１９８８　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９；４８７−４９１）。前述のＳａｉｋｉの刊行物の各々を、本明細書中で参考として援用する。その固有の熱安定性に起因して、酵素は、ＰＣＲサイクルを通して持続的に存在し、そしてさらなる添加を必要としなかった。この時以来、他の好熱性由来のポリメラーゼもまた単離されており、そして完全なサイクル反応において使用されている。しかし、それらは、熱不活化への耐性においてより頑強であるにもかかわらず、これらのポリメラーゼは全て、変性に使用される温度での特定の酵素についての半減期によって決定される各変性工程後に、特定のレベルの不活化の限定に苦しむ。高い変性温度もまた、加水分解によってｄＮＴＰ基質のレベルを減少し得、そして補充物に反応の効率または特異性を付加し得るタンパク質の不活化を導く。
【０００８】
　完全なサイクルのＰＣＲの条件は、より低い変性温度が使用され得るように改変されている。Ａｕｅｒら（１９９６，　Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　２４；５０２１−５０２５、本明細書中で参考として援用する）は、ｄＩＴＰ（ｄＧＴＰの天然の中性アナログ）を使用する手順を記載している。この置換によって、彼らは、それらのサンプルに存在し得る２本鎖ＤＮＡの増幅を回避することに成功し、そしてＲＮＡ標的のみ増幅した。決して、ＤＮＡ標的の有用性の認識または適用は存在しない。実際、彼らは、彼らの目的が、ＤＮＡ標的をテンプレートとして使用することを避けることである場合、教示する。彼らの教示は、ｄＩＴＰの置換もまた、アニーリングに使用される温度（５０℃）における代償的な減少を必要とする、という限定を有する。さらに、Ａｕｅｒらに記載される分野は、塩基対形成の区別を欠くことが公知であるヌクレオチドアナログの使用に依存し、それにより、増幅される配列に導入されるランダムな変化の可能性を誘導する。これらの変化がプライマー結合領域にある場合、それらはプライミング効率における問題を引き起こし得、そして変化がプライマー間の配列にある場合、変化は効率的な結合を可能にする検出プローブにおける困難を誘導し得る。本発明は、正常なレベルの塩基対形成識別を示す塩基を用い得、それにより先行技術の一部である変異原生事象を回避し得る。
【０００９】
　遺伝子およびゲノムの核酸配列の決定は、商業および非営利団体の研究室の両方における主要な働きである。この目的に使用されている２つの基本的な系は、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．　１９７７，７４，５６０−５６４）によって記載される塩基特異的切断法、およびＳａｎｇｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．　１９７７，７４，５４９３−５４６７）によって記載されるジデオキシ法である。前述の古典的な両方の文献を、本明細書中で参考として援用する。その使用の簡単さに起因して、後者の方法が、より一般的に使用される。これらの両方の方法は、最初に、配列情報を得るための放射活性基質に依存した。ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｔ配列決定について、このことは、各鎖を末端標識し、次いで各標識化末端を分離することによって最も一般的に行われた。Ｓａｎｇｅｒ配列決定について、いずれかのプライマーが標識されるか、または放射活性ｄＮＴＰが鎖伸長の間に取り込まれる。配列データは、ポリアクリルアミドゲルの電気泳動によって分離されている種々の長さの放射活性標識されたＤＮＡバンドの位置のオートラジオグラフィー決定によって生成された。
【００１０】
　より近年において、配列決定法は、非放射活性標識の代替によって改良されている。これらの標識についての非放射活性標識した潜在的な位置、およびそれらの使用の適用は、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔらによって、米国特許第５，２４１，０６０号（これは、当初、１９８２年に出願された）に記載される。このような標識は、オリゴプライマー、または合成に使用される基質（すなわち、ｄＮＴＰまたはｄｄＮＴＰヌクレオチド）に存在し得る。シグナル生成部分は、蛍光標識化プライマーの使用によって例示されるように、直接作用し得るか（Ｂｅｃｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１９８９，１７；５１１５−５１２３）、またはビオチン標識したプライマーの使用によって例示されるように間接的に作用し得る（Ａｎｓｏｒｇｅら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　１９８６，１３；３１５−３２３および）。さらに、ビオチン化ヌクレオチドは、限定されたプライマー伸長の間に取り込まれ得る（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ　ＩｍａｇｅｓTM　Ｐｒｏｔｏｃｏｌ　Ｂｏｏｋ　１９９３　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，　Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，　Ｏｈｉｏ）。前述の４つの文書を、本明細書中で参考として援用する。限定された伸長は、ヌクレオチドにおける改変によって生じるバンドシフトの量を規格化するために必要である。
【００１１】
　しかし、プライマー標識は、その位置についての適切な塩基の割り当てにおいて曖昧さを作製する、不適切な鎖終結を生じ得るテンプレート鎖において、二次構造または問題性配列が存在し得るという限定を有する。プライマーの伸長の間の標識化ｄＮＴＰの取り込みもまた、この限定で苦しむ。この限定は、放射活性または非放射活性標識が使用されるかどうかに関係なく、有効である。
【００１２】
　この限定は、標識の供給源としての鎖終結ヌクレオチド自体の選択によって回避されている。このことは、蛍光性標識化ｄｄＮＴＰについては、米国特許第５，０４７，５１９号においてＨｏｂｂｓおよびＣｏｃｕｚｚａによって、および米国特許第４，４２９，９４７号においてＭｉｄｄｅｎｄｏｒｆらによって、そして蛍光アビジンによって後に標識されるビオチン標識化ｄｄＮＴＰについては、米国特許第４，７２９，９４７においてＭｉｄｄｅｎｄｏｒｆらによって記載されている。（さらなる参照については、米国特許第５，０２７，８８０号；同第５，３４６，６０３号；同第５，２３０，７８１号；同第５，３６０，５２３号；および同第５，１７１，５３４号を参照のこと）。前出の７つの特許の各々を、本明細書中に参考として援用する。この方法によって、シグナルは、鎖終結を組み込む鎖によって作製される。ターミネーターヌクレオチドを組み込まずに終結されている鎖の存在は、現在無関係である。なぜならそれらは、シグナルを生成し得ないからである。しかし、この方法は、シグナル生成を提供するさらなる化学基の存在が、標識化ターミネーターヌクレオチドの取り込みに関するポリメラーゼについての立体的または他の阻害性問題を生じ、それにより、反応の効率を減少するという制限を有する（Ｐｒｏｂｅｒら、米国特許第５，３３２，６６６号、本明細書中に援用される）。ビオチン化ジデオキシヌクレオチドは、シグナル生成を提供するのに使用され得るが、これらの改変ターミネーターは、それらの蛍光化対応物として同じ限定を共有する（すなわち、最も一般的に使用されるポリメラーゼによる取り込みにおける困難）こと示唆されている（Ｓ．Ｂｅｃｋ　１９９０　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１８４；６１１、また、本明細書中で援用する）。取り込みのこの非効率についてのいくつかの代償は、反応におけるポリメラーゼの量を増加させること、および／またはコピーされるテンプレートＤＮＡの量を増加させることによって達成され得る。これらの代償的工程は、高価な酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）のより高い量、または高品質のテンプレートの適切な量の調製に関連して増加する費用の制限を受ける。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
　本発明は、核酸増幅、核酸配列決定、および重要な特徴（例えば、低減した熱力学的安定性）を有する独特の核酸の生成に有用かつ応用可能である新規のプロセスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
　本発明は、特定の核酸配列を直線的に増幅するためのプロセスを提供する。このプロセスは、以下の工程：該特定の核酸配列、初期プライマーまたは核酸構築物であって、以下の２つのセグメント：（Ａ）第１のセグメントであって、（ｉ）該特定の核酸配列に第１の部分に実質的に相補的であり、そして（ｉｉ）テンプレート依存性の第１の伸長をし得る、セグメント、および（Ｂ）第２のセグメントであって、（ｉ）該第１のセグメントに実質的に非同一であり、（ｉｉ）該特定の核酸配列の第２の部分に実質的に同一であり、（ｉｉｉ）該第２のセグメントの相補的な配列に結合し得、そして（ｉｖ）第２のプライマー伸長が生成され、そして第１のプライマー伸長を置換するように、均衡（ｉｓｏｓｔａｔｉｃ）または限定サイクリング条件下で、第２のプライマーまたは核酸構築物の第１のセグメントの、続く該特定の核酸配列の該第１の部分への結合を提供し得る、セグメントを含む、初期プライマーまたは核酸構築物；ならびに、基質、緩衝液、およびテンプレート依存性重合化酵素；を提供する工程；ならびに、均衡または限定サイクリング条件下で該基質、緩衝液、およびテンプレート依存性重合化酵素の存在下で、該特定の核酸配列および該新規プライマーまたは核酸構築物をインキュベートし；それにより、該特定の核酸配列を直線的に増幅する工程、を包含する。
【００１５】
　１つの実施態様では、上記初期プライマーまたは核酸構築物と上記第２のプライマーまたは核酸構築物とは同じであり得る。
【００１６】
　１つの実施態様では、上記初期プライマーまたは核酸構築物と上記第２のプライマーまたは核酸構築物とは異なり得る。
【００１７】
　１つの実施態様では、上記第１のセグメントもしくは該第２のセグメントもしくは上記プライマー伸長、または前述の任意のものは、少なくとも１つ改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み得る。
【００１８】
　１つの実施態様では、上記第２のセグメントは、上記プライマー伸長においてその相補体に対する上記第１のセグメントの熱力学的安定性を増加する少なくとも１つ改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み得る。
【００１９】
　１つの好ましい実施態様では、上記改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログはインターカレート剤を含み得る。
【００２０】
　１つの実施態様では、上記第１のセグメントまたは上記プライマー伸長あるいはその両方は、少なくとも１つ改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み得る。
【００２１】
　１つの好ましい実施態様では、上記改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、その相補体に対する上記第１のセグメントまたは上記プライマー伸長の熱力学的安定性を減少させ得る。
【００２２】
　１つの好ましい実施態様では、上記改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、負に荷電した化学基を含み得る。
【００２３】
　１つの好ましい実施態様では、上記負に荷電した化学基はカルボン酸を含み得る。
【００２４】
　１つの実施態様では、上記初期プライマーもしくは核酸構築物、または上記第２のプライマーもしくは核酸構築物、あるいはその両方は、直鎖状核酸、分枝核酸、逆方向核酸、およびペプチド−核酸、あるいは任意の前述の組み合わせを含み得る。
【００２５】
　本発明はまた、特定の核酸配列を非直線的に増幅するためのプロセスを提供する。このプロセスは、以下の工程：該特定の核酸配列、該特定の核酸配列ついての第１の初期プライマーまたは核酸構築物であって、該第１の初期プライマーまたは核酸構築物が、以下の２つのセグメント：（Ａ）第１のセグメントであって、（ｉ）該特定の核酸配列の第１の部分に実質的に相補的であり、そして（ｉｉ）テンプレート依存性の第１の伸長をし得る、セグメント、および（Ｂ）第２のセグメントであって、（ｉ）該第１のセグメントに実質的に非同一であり、そして（ｉｉ）該特定の核酸配列の第２の部分に実質的に同一であり、（ｉｉｉ）該第２のセグメントの相補的配列に結合し得、そして（ｉｖ）第２のプライマー伸長が生成されて第１のプライマー伸長を置換するように、均衡または限定サイクリング条件下で、続く第２のプライマーまたは核酸構築物の第１のセグメントの、該特定の核酸配列の該第１の部分への結合を提供し得る、セグメント、を含む；ならびに、該特定の核酸配列の相補体に対する続く初期プライマーまたは核酸構築物であって、該続く初期プライマーまたは該核酸構築物が、以下の２つのセグメント、（Ａ）第１のセグメントであって、（ｉ）該特定の核酸配列の第１の部分に実質的に相補的であり、そして（ｉｉ）テンプレート依存性の第１の伸長をし得る、セグメント、および（Ｂ）第２のセグメントであって、（ｉ）該第１のセグメントに実質的に非同一であり、（ｉｉ）該特定の核酸配列の第２の部分に実質的に同一であり、（ｉｉｉ）該第２のセグメントの相補的配列に結合し得、そして（ｉｖ）第２のプライマー伸長が生成され、そして第１のプライマー伸長を置換するように、均衡または限定サイクリング条件下で、続くプライマーの第１のセグメントの、該特定の核酸配列の該第１の部分への結合を提供し得る、セグメント、を含む：ならびに基質、緩衝液、およびテンプレート依存性重合化酵素；を提供する工程：ならびに均衡または限定サイクリング条件下で、該基質、緩衝液、またはテンプレート依存性重合化酵素の存在下で、該特定の核酸配列および該新規プライマーまたは核酸構築物をインキュベートし；それにより、該特定の核酸配列を非線形に増幅する、工程、を包含する。
【００２６】
　１つの実施態様では、上記第１の初期プライマーまたは核酸構築物と上記第２の初期プライマーまたは核酸構築物とは同じであり得る。
【００２７】
　１つの実施態様では、上記第１の初期プライマーまたは核酸構築物と上記第２の初期プライマーまたは核酸構築物とは異なり得る。
【００２８】
　１つの実施態様では、上記第１の初期プライマーまたは核酸構築物の上記第１のセグメントまたは上記第２のセグメント、上記第２の初期プライマーまたは核酸構築物の上記第１のセグメントまたは上記第２のセグメント、および上記プライマー伸長、または前述の任意のものからなる群から選択される少なくとも１つのメンバーは、少なくとも１つの改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み。
【００２９】
　１つの好ましい実施態様では、上記第１の初期プライマーまたは上記第２の初期プライマーまたはその両方の上記第２のセグメントは、上記プライマー伸長における上記第１のセグメントのその相補体に対する熱力学的安定性を増加させる少なくとも１つの改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み得る。
【００３０】
　１つの好ましい実施態様では、上記改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログはインターカレート剤を含み得る。
【００３１】
　１つの実施態様では、上記第１の初期プライマーの上記第１のセグメント、または上記第２の初期プライマーの上記第１のセグメント、またはその両方、またはそれらのプライマー伸長、またはそれらの任意の組合せは、少なくとも１つの改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み得る。
【００３２】
　１つの好ましい実施態様では、上記改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、上記第１のセグメントまたは上記プライマー伸長、またはその両方の、その相補体に対する熱力学的安定性を減少させ得る。
【００３３】
　１つのさらに好ましい実施態様では、上記改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、負に荷電した化学基を含み得る。
【００３４】
　１つのさらにまた好ましい実施態様では、上記負に荷電した化学基は、カルボン酸を含み得る。
【００３５】
　１つの実施態様では、上記第１の初期プライマーまたは核酸構築物、あるいは上記第２の初期プライマーまたは核酸構築物、あるいはその両方が、直鎖状核酸、分枝核酸、逆方向核酸およびペプチド−核酸、または前述の任意のものの組合せからなる群から選択される核酸を含み得る。
【００３６】
　本発明はさらにまた、特定の核酸配列を非直線的に増幅するためのプロセスを提供する。このプロセスは、以下の工程：該特定の核酸配列およびその相補体；該特定の核酸配列のための第１の初期プライマーまたは核酸構築物、ここで該第１の初期プライマーまたは核酸構築物が、以下の２つのセグメント：（Ａ）第１のセグメントであって、（ｉ）該特定の核酸配列の第１の部分に実質的に相補的であり、そして（ｉｉ）テンプレート依存性の第１の伸長が可能であるセグメント、および（Ｂ）第２のセグメントであって、（ｉ）該第１のセグメントに実質的に非同一であり、（ｉｉ）該特定の核酸配列の第２の部分に実質的に同一であり、（ｉｉｉ）該第２のセグメントの相補的な配列へ結合し得、そして（ｉｖ）第２のプライマー伸長が生成されそして該第１のプライマー伸長を置換するような、均衡または限定サイクリング条件下で、続く第１のプライマーの第１のセグメントの該特定の核酸配列の該第１の部分への結合を提供し得る、セグメントを含む；および該第１のプライマー伸長に対して相補的な第２の初期プライマーまたは核酸構築物、ここで該第２の初期プライマーまたは核酸構築物が、均衡または限定サイクリング条件下で、テンプレート依存性の伸長をし得ることを特徴とするセグメントを含む；ならびに基質、緩衝液、およびテンプレート依存性の重合化酵素；を提供する工程、均衡または限定サイクリング条件下で、該基質、緩衝液、およびテンプレート依存性の重合化酵素の存在下で、該特定の核酸配列および上記新規プライマーまたは核酸構築物をインキュベートし；それにより、該特定の核酸配列を非直線的に増幅する工程、を包含する。
【００３７】
　１つの実施態様では、上記第１の初期プライマーまたは核酸構築物の上記第１のセグメントまたは上記第２のセグメント、上記第２の初期プライマーまたは核酸構築物の該セグメント、および該プライマー伸長、または前述の任意のものからなる群から選択される少なくとも１つのメンバーは、少なくとも１つの改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み得る。
【００３８】
　１つの好ましい実施態様では、上記第１の初期プライマーの上記第２のセグメントは、上記プライマー伸長において上記第１のセグメントのその相補体に対する熱力学的安定性を増加させる少なくとも１つの改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み得る。
【００３９】
　１つの好ましい実施態様では、上記改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、インターカレート剤を含み得る。
【００４０】
　１つの実施態様では、上記第１の初期プライマーの上記第１のセグメントまたは上記第２の初期プライマーの上記セグメント、またはその両方、またはそれらのプライマー伸長、またはそれらの任意の組合せは、少なくとも１つの改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み得る。
【００４１】
　１つの好ましい実施態様では、上記改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、上記第１のセグメントまたは上記プライマー伸長、またはその両方の、その相補体に対する熱力学的安定性を減少させ得る。
【００４２】
　１つのさらに好ましい実施態様では、上記改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、負に荷電した化学基を含み得る。
【００４３】
　１つのさらにより好ましい実施態様では、上記負に荷電した化学基は、カルボン酸を含み得る。
【００４４】
　１つの実施態様では、上記第１の初期プライマーまたは核酸構築物、あるいは上記第２の初期プライマーまたは核酸構築物、あるいはその両方は、直鎖状核酸、分枝核酸、逆方向核酸およびペプチド−核酸、または前述の任意のものの組合せからなる群から選択される核酸を含み得る。
【００４５】
　本発明はさらに、特定の核酸配列を非直線的に増幅するためのプロセスを提供する。このプロセスは、以下の工程：該特定の核酸配列；非直線的な増幅が可能な単一のプライマーまたは単一の核酸構築物であって、以下の３つのセグメント：（ａ）第１のセグメントであって、（ｉ）該特定の核酸配列の第１の部分に実質的に相補的であり、そして（ｉｉ）テンプレート依存性の第１の伸長が可能である、セグメント；（ｂ）該特定の核酸配列の第２の部分に実質的に同一である第２のセグメント；および（ｃ）該第１のセグメントに実質的に同一である第３のセグメント；を含み、ここで、上記第１のプライマー伸長は該第２のセグメントにハイブリダイズし得、そして該第３のセグメントに対する相補体を生成するように自己プライミングおよび自己伸長し得る配列を生成し得る、および基質、緩衝液、およびテンプレート依存性の重合化酵素；を提供する工程、ならびに該基質、緩衝液およびテンプレート依存性の重合化酵素の存在下で、該特定の核酸配列および該プライマーまたは核酸構築物をインキュベートし；それにより、該特定の核酸配列を非直線的に増幅する工程、を包含する。
【００４６】
　１つの実施態様では、上記プロセスは、均衡条件、限定サイクリング条件、および完全なサイクリング条件からなる群から選択される条件下で行われ得る。
【００４７】
　１つの実施態様では、上記第１のセグメント、上記第２のセグメント、上記第３のセグメント、上記第１のプライマー伸長、上記第２のプライマー伸長、または前述の任意のものからなる群から選択されるメンバーは、少なくとも１つの改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み得る。
【００４８】
　１つの実施態様では、上記単一プライマーまたは核酸構築物は、直鎖状核酸、分枝核酸、逆方向核酸、およびペプチド−核酸、または前述の任意のものの組合せからなる群から選択される核酸を含み得る。
【００４９】
　１つの実施態様では、上記第１のセグメント、上記第２のセグメント、上記第３のセグメント、上記第１のプライマー伸長および上記自己プライミング伸長、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択されるメンバーは、少なくとも１つの改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み得る。
【００５０】
　１つの実施態様では、上記第１のプライマー伸長は、限定された基質条件、限定された伸長持続時間、またはその両方からなる群から選択される条件下で行われ得る。
【００５１】
　１つの好ましい実施態様では、上記特定の核酸配列は、１本鎖または２本鎖の形態であり得る。
【００５２】
　１つの好ましい実施態様では、上記特定の核酸配列は、フラグメント中に見出されるかまたは含まれている。
【００５３】
　１つのより好ましい実施態様では、上記フラグメントは、物理的手段、化学的手段、物理化学的（ｐｈｙｓｉｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌ）手段、および酵素的手段、またはそれらの組合せからなる群から選択される手段によって生成され得る。
【００５４】
　１つのさらに好ましい実施態様では、上記物理的手段は、超音波処理および加熱、またはその両方からなる群から選択され得る。
【００５５】
　１つのさらにまた好ましい実施態様では、上記化学的手段は酸処理を含み得る。
【００５６】
　１つのよりさらに好ましい実施態様では、上記酵素的手段は、ヌクレアーゼおよび制限酵素によってまたはそれらを用いて行われ得る。
【００５７】
　１つのよりさらに好ましい実施態様では、上記ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼを含み得る。
【００５８】
　本発明はさらにまた、核酸の配列決定のための終結後標識プロセスを提供する。このプロセスは、以下の工程：タグ化されていないまたは標識されていない基質、タグ化されていないまたは標識されていないプライマー、重合化酵素、緩衝液、およびそれぞれのヌクレオチド塩基についての適切なタグ化されていないまたは標識されていないターミネーターの存在下で、目的の該核酸配列に対応する核酸フラグメントを生成する工程であって、ここで、該ターミネーターのそれぞれは、内部配列が該タグ化分子に対して実質的に非反応性であり、そして該化学反応が媒体またはマトリックス中で該フラグメントの分離を実質的に妨げないような条件下で、タグ化分子と共有結合する化学的な反応基を含む工程；媒体またはマトリックス中で生成された該フラグメントを分離する工程；および該媒体またはマトリックス中で該タグ化分子を検出することによって該分離されたフラグメントを検出する工程、を包含する。
【００５９】
　１つの実施態様では、上記生成工程の、上記ターミネーターの上記化学的反応基は、生成されそして任意のタグ化分子に共有結合する前に脱保護された上記フラグメントへの酵素的取り込み前に保護され得る。
【００６０】
　１つの実施態様では、上記生成工程の、上記化学的反応基は、窒素、硫黄または酸素原子を含み得る。
【００６１】
　１つの実施態様では、上記ターミネーター上の上記化学的反応基は、異なり得る。
【００６２】
　１つの実施態様では、上記ターミネーター上の上記化学的反応基は、同じであり得る。
【００６３】
　１つの実施態様では、上記生成工程の、上記タグ化分子は、それぞれのターミネーターと同じであり得る。
【００６４】
　１つの実施態様では、上記生成工程の、上記タグされた分子は、それぞれのターミネーターと異なり得る。
【００６５】
　１つの実施態様では、上記タグ化分子は、蛍光色素、化学発光色素、赤外色素、化学発光実体および電気化学発光実体、またはそれらの組合せからなる群から選択され得る。
【００６６】
　１つの実施態様では、上記分離工程は、電気泳動的に行われ得る。
【００６７】
　１つの実施態様では、上記分離工程の上記媒体またはマトリックスは、ゲルを含み得る。
【００６８】
　１つの実施態様では、上記ゲルは、ポリアクリルアミドゲルを含み得る。
【００６９】
　１つの実施態様では、上記分離工程は、キャピラリーゲル電気泳動によって行われ得る。
【００７０】
　１つの実施態様では、上記検出工程は、光度測定、分光光度測定、比色定量測定、蛍光定量測定、遅延蛍光測定および化学発光測定、またはそれらの組合せから選択される手段によって行われ得る。
【００７１】
　本発明はまた、相補的な配列に対する減少した熱力学的安定性を有する核酸配列を生成するプロセスを提供する。このプロセスは、負に荷電した化学部分を有する少なくとも１つの改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを、該生成された核酸配列へと組み込む工程を包含する。
【００７２】
　本発明はさらにまた、直鎖状核酸、分枝核酸、逆方向核酸、およびペプチド−核酸、または前述の任意のものの組合せからなる群から選択される１本鎖または２本鎖の核酸ポリマーを提供する。ここでこの核酸ポリマーは、１つまたは両方の鎖において１つの負に荷電した化学部分を含む少なくとも１つのプリンまたはピリミジン塩基を含む。
【００７３】
　本発明は、特定の核酸配列を直線的に増幅するためのプロセスを提供する。最初に、増幅されることが求められている目的の特定の核酸配列、最初のプライマーまたは２つのセグメントを含む核酸構築物が提供される。第１セグメント（Ａ）は独特であり、（ｉ）特定の核酸配列の第１の部分に実質的に相補的、および（ｉｉ）テンプレート依存性第１伸長が可能であると特徴づけられる。第２セグメント（Ｂ）は、以下の４つの事項において独自に特徴づけられる。第１に、これは、（ｉ）第１セグメントと実質的に同一でない。第２に、これは、（ｉｉ）特定の核酸配列の第２部分と実質的に同一である。第３に、第２セグメント（Ｂ）は、（ｉｉｉ）第２セグメントの相補配列に結合し得る。第４に、第２セグメント（Ｂ）は、（ｉｖ）均衡または限定サイクル条件下で、第２プライマーの第１セグメントまたは核酸構築物の、特定の核酸配列の第１部分への後続の結合を提供し得る。この方法において、第２プライマー伸長が生成され、そして第１プライマー伸長を置換する。また、この方法において提供されるのは、基質、緩衝液、およびテンプレート依存性ポリマー化酵素である。この増幅プロセスを行うために、特定の核酸配列および新規のプライマーまたは核酸構築物を、基質、緩衝液、およびテンプレート依存性ポリマー化酵素の存在下で、均衡または限定サイクル条件下で、インキュベートする；それにより、この特定の核酸配列が直線的に増幅される。
【００７４】
　本発明はまた、特定の核酸配列を非直線的に増幅するプロセスを提供する。このプロセスにおいて、増幅されることが求められている目的の特定の核酸配列、第１初期プライマーまたは目的の特定の核酸配列のための核酸構築物、後続の初期プライマーまたは目的の特定の核酸配列の相補体に対する核酸構築物、ならびに基質、緩衝液、およびテンプレート依存性ポリマー化酵素が提供される。第１初期プライマーまたは核酸構築物は、２つのセグメントを含む。第１セグメント（Ａ）は独特であり、（ｉ）特定の核酸配列の第１の部分に実質的に相補的であり、そして（ｉｉ）テンプレート依存性第１伸長が可能であると特徴づけられる。第２セグメントもまた独特であり、以下の４つの特徴で特徴づけられる。第１に、それは、（ｉ）第１セグメントと実質的に同一でない。第２に、それは、（ｉｉ）特定の核酸配列の第２部分と実質的に同一である。第３に、第２セグメントは、（ｉｉｉ）第２セグメントの相補配列に結合し得る。第４に、第２セグメントは、（ｉｖ）均衡または限定サイクル条件下で、第２プライマーの第１セグメントまたは核酸構築物の、特定の核酸配列の第１部分への続く結合を提供し得る。この方法において、第１プライマー伸長を置換するために、第２プライマー伸長を生成する。後続の初期プライマーまたはこの特定の核酸配列の相補体に対する核酸構築物はまた、２つのセグメントを含む。第１セグメント（Ａ）は、（ｉ）特定の核酸配列の第１の部分に実質的に相補的であり、そして（ｉｉ）テンプレート依存性第１伸長が可能であると特徴づけられる。第２セグメント（Ｂ）は、以下の４つの特徴で独特に特徴づけられる。第１に、第２セグメント（Ｂ）は、（ｉ）第１セグメントと実質的に同一でない。第２に、それは、（ｉｉ）特定の核酸配列の第２部分と実質的に同一である。第３に、第２セグメント（Ｂ）は、（ｉｉｉ）第２セグメントの相補配列に結合し得る。第４に、それは、（ｉｖ）均衡または限定サイクル条件下で、後続のプライマーの第１セグメントの、特定の核酸配列の第１部分への後続の結合を提供し得る。このような条件下およびこの方法において、第１プライマー伸長を置換する第２プライマー伸長が生成される。このプロセスを行うために、特定の核酸配列および新規のプライマーまたは核酸構築物が、基質、緩衝液、およびテンプレート依存性ポリマー化酵素の存在下で、均衡または限定サイクル条件下で、インキュベートされる；それにより、目的の特定の核酸配列が非直線的に増幅される。
【００７５】
　また、本発明によって提供されるのは、特定の核酸配列を非直線的に増幅するプロセスである。この非直線的増幅プロセスにおいて、増幅されることが求められている目的の特定の核酸配列およびその相補体が提供される。また、第１初期プライマーまたは特定の核酸配列のための核酸構築物が提供され、この第１初期プライマーまたは核酸構築物は、２つのセグメントを含む。第１セグメント（Ａ）は２つの有用かつ新規の特徴を有する。第１に、それは、（ｉ）特定の核酸配列の第１の部分に実質的に相補的である。第２に、第１のセグメントは、（ｉｉ）テンプレート依存性第１伸長が可能である。第２セグメント（Ｂ）は、４つの有用かつ新規の特徴を有する。第１に、それは、（ｉ）第１セグメントと実質的に同一でない。第２に第２セグメント（Ｂ）は、（ｉｉ）特定の核酸配列の第２部分と実質的に同一である。第３に、それは、（ｉｉｉ）第２セグメントの相補配列に結合し得る。第４に、第２セグメント（Ｂ）は、（ｉｖ）均衡または限定サイクル条件下で、続く第１プライマーの第１セグメントの、特定の核酸配列の第１の部分への続く結合を提供し得る。このような条件下およびこの方法において、第１プライマー伸長を置換する第２プライマー伸長が生成される。また、このプロセスにおいて提供されるのは、第２初期プライマーまたは第１プライマー伸長に相補的な核酸構築物である。第２初期プライマーまたは核酸構築物は、代表的には、均衡または限定サイクル条件下で、テンプレート依存性伸長を可能にすることによって特徴づけられる単一のセグメントを含む。適切な基質、緩衝液、およびテンプレート依存性ポリマー化酵素もまた提供される。本発明のこのプロセスを行うために、特定の核酸配列および新規のプライマーまたは核酸構築物が、適切な基質、緩衝液、およびテンプレート依存性ポリマー化酵素の存在下で、均衡または限定サイクル条件下で、インキュベートされる。これらの条件下で行われるこのようなインキュベーションの下で、目的の特定の核酸配列が、非直線的に増幅される。
【００７６】
　本発明はさらに、増幅されることが求められている目的の特定の核酸配列を非直線的に増幅するためのプロセスを提供する。この新規のプロセスにおいて、目的の特定の核酸配列が提供され、各プライマーまたは各核酸構築物は、非直線的増幅され得、そして３つのセグメントを含む。第１セグメント（ａ）は、（ｉ）特定の核酸配列の第１部分に実質的に相補的であり、そして（ｉｉ）テンプレート依存的に第１伸長し得る。第２セグメント（ｂ）は、特定の核酸配列の第２部分に実質的に同一である。第３セグメント（ｃ）は、第１セグメントに実質的に同一である。第１プライマー伸長は、上記の第２セグメントにハイブリダイズし得る配列を生成し得、そしてまた、第３セグメントに対する相補体を生成するように自己プライミングおよび自己伸長し得る。また、提供されるのは、適切な基質、緩衝液、およびテンプレート依存性ポリマー化酵素である。この増幅プロセスを行うために、特定の核酸配列およびプライマーまたは核酸構築物が、適切な基質、緩衝液、およびテンプレート依存性ポリマー化酵素の存在下でともにインキュベートされる。目的の特定の核酸配列は、それにより、非直線的に増幅される。
【００７７】
　また、手近に本発明によって提供されるのは、核酸配列決定のための終結後標識プロセスである。ここで、このプロセスは、未タグ化または未標識化基質、未タグ化または未標識化プライマー、ポリマー化酵素、緩衝液、および各ヌクレオチド塩基についての適切な未タグ化または未標識化ターミネーター、配列が求められている目的の核酸配列に対応する核酸フラグメントの存在下で生成される第１工程を含む。このプロセスにおいて、ターミネーターの各々は、内部配列がタグ化分子に対して実質的に非反応性であり、そして化学反応が、実質的に、媒体またはマトリックスにおけるフラグメントの分離に影響しないような条件下で、タグ化分子に共有結合する化学反応基を含む。フラグメントの生成の後、後者は媒体またはマトリックスにおいて分離され、続いて分離されたフラグメントの検出が、媒体またはマトリックスにおけるタグ化分子の検出によって達成される。
【００７８】
　本発明によって提供される別のプロセスは、相補配列に対する熱力学安定性を減少した核酸配列を生成するためのプロセスである。このプロセスにおいて、負に荷電した化学部分を有する少なくとも１つの改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、生成される核酸配列に取り込まれる。
【００７９】
　本発明の他の局面に加えて、直鎖状核酸、分枝核酸、逆方向核酸、およびペプチド−核酸またはそれらの任意の組合せからなる群より選択される１本鎖または２本鎖核酸ポリマーが提供される。この核酸ポリマーは、ポリマーの片方また両方の鎖において１つの負に荷電した化学部分を含む少なくとも１つのプリンまたはピリミジン塩基を含む。
【００８０】
　これらのプロセスおよびポリマーの全ては、以下により詳細に記載される。
【発明の効果】
【００８１】
　本発明により、核酸増幅、核酸配列決定、および重要な特徴（例えば、低減した熱力学的安定性）を有する独特の核酸の生成に有用かつ応用可能である新規のプロセスが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８２】
　以下の定義は、本発明および本開示の理解に有用である。
定義
　均衡条件は、実質的に定常な温度および／または化学条件をいう。
【００８３】
　限定サイクル条件は、使用される最高温度が、そのテンプレートから伸長プライマーを分離するのに必要な温度以下である一連の温度をいう。
【００８４】
　完全なサイクル条件は一連の温度をいい、ここで、そのテンプレートから伸長プライマーを分離するのに十分な、少なくとも１つの温度が使用される。
【００８５】
　直線的増幅は、核酸の１つの鎖のみの２つ以上のコピーが生成される場合に行われる。
【００８６】
　非直線的増幅は、核酸配列の２つ以上のコピーが、核酸およびその相補体の各鎖から生成される場合に行われる。
【００８７】
　初期プライマーは、伸長されていないプライマーまたはプライマー構築物である。
【００８８】
　標準的なプライマーは、伸長後に合成される配列での二次構造形成に実質的に関与しないプライマーである。
【００８９】
　伸長配列が、プライマーまたはプライマー構築物における任意の配列に実質的に同一でも相補的でもない、テンプレート依存性様式において合成された配列である。
【００９０】
　核酸のセグメントは、上記の他のセグメントの相補体が、上記の第１セグメントの伸長のためのテンプレートとして作用し得る場合に、別のセグメントに実質的に同一である。
【００９１】
　本発明は、ａ）自己相補的配列を有するか、またはテンプレート依存性伸長後に二次構造を形成し得る少なくとも１つのセグメントを含み、そしてｂ）適切な条件下で適切な特定のテンプレートの存在下で、適切な条件下で特定の核酸配列の２つ以上のコピーを生成し得る、新規のプライマーおよび核酸構築物のための組成物および使用法を提供する。
【００９２】
　特定の核酸配列の合成のためのプライマー結合および伸長反応を使用する標的増幅の全ての方法は、この配列の２つ以上のコピーが所望される場合、結合部位を再生するか、または新たなプライマー結合部位を合成する必要性を有する。以前に記載されている当該分野の全ての方法において、外側調節因子が、プライマー結合部位を再生または作製するために使用されている。これらの因子としては、ＰＣＲによって例示されるような熱変性、３ＳＲによって例示されるようなエンドヌクレアーゼ、およびＳＤＡによって例示されるような制限酵素および改変ヌクレオチドが挙げられている。
【００９３】
　本発明の特定の局面において、新規のプライマーおよび核酸構築物が開示され、これらは、新規のプライマーまたは核酸構築物の少なくとも１つのセグメントが、適切な条件下で二次構造形成し得るという固有の特徴を有する。本発明において、二次構造の形成は、結合部位の再生を提供し得、その結果それらは、上記の外側調節因子のいずれも必要とせずに、新規のプライマーまたは核酸構築物の複数の結合および伸長のために使用され得る。
【００９４】
　先行技術において、非直線的な増幅を達成するために、標的核酸の各相補鎖において、プライマー結合部位の存在が必要である。本発明の特定の局面において、二次構造の形成はこの限定を克服し、その結果、片方の核酸鎖にのみ相補的であるが、他方には相補的でなく、しかしなお所望の核酸配列の非直線的増幅を行い得る単一のプライマーが使用され枝る。
【００９５】
　本発明の新規のプライマーおよび核酸構築物は、均衡、限定サイクル、または完全サイクル条件下で、単一のプライマーまたは１つより多いプライマーを必要とする、直線的および非直線的な増幅系において使用され得る。二次構造の形成能は、新規のプライマーまたは核酸構築物における自己相補的配列の存在に起因するか、または新規のプライマーのセグメントまたは核酸構築物に相補的な配列の、テンプレート依存性取り込みに由来し得る。また、これは、既存および合成後の配列の両方にも由来し得る。本発明の新規のプライマーおよび核酸構築物は、単一の極性を有する線状分子、１つより多い極性または分枝核酸を有する構築物であり得る。このような構築物の合成の方法および使用例は、以前に開示されている（米国特許出願第０８／７４９，２６６号；米国特許第５，４６２，８５４号、両方の文書を本明細書中で援用する）。本発明の特定の局面において、新規のプライマーおよび核酸構築物は、少なくとも２つのセグメントを含む：テンプレートに結合し得、そして伸長のためにそれを使用し得る第１セグメント、および目的の標的の配列に実質的に同一であり、その結果、第１セグメントの伸長が伸長配列を有する第２セグメントの自己ハイブリダイゼーションによって形成される二次構造の形成を可能にする第２セグメント。本発明の特定の局面において、新規のプライマーおよび核酸構築物は、少なくとも３つのセグメントを含む：上記のように規定された第１および第２セグメント、ならびに自己伸長のための鎖内または構造内テンプレートとして作用し得る第３セグメント。
【００９６】
　セグメントは、共有または非共有のいずれかで互いに結合され得る。共有結合を介してセグメントを結合する手段としては、正常な直線核酸のリン酸骨格、１つより多い極性および分枝したＤＮＡ構築物を有する構築物が挙げられ得るがこれらに限定されない。これらの構築物を合成するための方法は、米国特許出願第０８／７４９，２６６号（１９９６年１１月１５日出願、その内容を本明細書中で援用する）に記載されている。非共有結合によりセグメントを結合する手段としては、リガンド−レセプター結合および相補的塩基対形成が挙げられ得るがこれに限定されない。セグメントは、互いに隣接し得るか、または互いに空間的に離れ得る。セグメントの配列は、互いに区別され得るか、または互いに実質的もしくは部分的に相補もしくは同一であり得る。
【００９７】
　有用な二次構造の形成は、本発明の新規のプライマーおよび核酸構築物の設計においてさらなるエレメントによって増強され得る。例えば、伸長依存性二次構造がより容易に形成されることを可能にし得る二次構造が、本発明の新規のプライマーの配列に導入され得る。補充的なエレメントもまた、適切な二次構造の形成を好むように反応混合物中に含まれ得る。これらのエレメントとしては、１本鎖結合タンパク質、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ＲｅｃＡタンパク質、および種々のヘリカーゼのようなタンパク質が挙げられ得るがこれらに限定されない。これらのエレメントとしてはまた、ホルムアミドまたはＤＭＳＯのような化学試薬が挙げられ得るがこれらに限定されない。これらのエレメントとしてはまた、核酸配列のＴｍを上昇させるか低くするかのいずれかの改変ヌクレオチドが挙げられ得るがこれらに限定されない。改変ヌクレオチドは、新規のプライマーおよび核酸構築物に予め存在し得、伸長反応の間に取り込まれ得るかその両方であり得る。
【００９８】
　本発明の種々の新規のプライマーおよび新規の核酸構築物は、以前の系の多くの制限を克服する。当該分野において以前に記載されているサーモサイクラーの使用に依存する方法とは対照的に、本発明の特定の局面は、新たなプライミング事象の前に、鎖分離事象の必要がない。さらに、本発明は、複数の酵素配置、リボヌクレオチド、またはＲＮＡ中間体（例えば、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡ、およびＴＭＡ）の生成に依存する等温系に内在するようなプロモーター配列の存在を必要としない。等温ＳＤＡ系について記載されているような、難解な改変試薬および補充的制限酵素のいずれも必要ではない。
【００９９】
　また、本発明に含まれるのは、核酸の標識のために使用され得る新規の方法および組成物である。これらは、本発明の種々の局面と組み合わせて使用され得るか、または先行技術に記載される方法と組み合わせて使用され得る。
【０１００】
　本発明は、増幅されることが求められる目的の特定の核酸配列を直線的に増幅するプロセスを提供する。このようなプロセスは、以下の成分および試薬を提供する工程を包含する：目的の特定の核酸配列、２つのセグメントを含む初期プライマーおよび核酸構築物、ならびに適切な基質、緩衝液、およびテンプレート依存性重合化酵素。初期プライマーまたは核酸構築物の２つのセグメントは、（Ａ）２つの規定された特徴を有する第１セグメントを含む。第１に、それは、（ｉ）特定の核酸配列の第１部分に実質的に相補的であり、そして第２に、それは、（ｉｉ）テンプレート依存性第１伸長を可能にする。第２セグメント（Ｂ）は、４つの規定された特徴を有する。第１に、第２セグメント（Ｂ）は、（ｉ）第１セグメントに実質的に非同一である。次に、それは（ｉｉ）特定の核酸配列の第２部分に実質的に同一である。第３に、第２セグメント（Ｂ）は、（ｉｉｉ）第２セグメントの相補配列に結合し得る。第４に、この第２セグメントは、（ｉｖ）均衡または限定サイクリング条件下で、第２プライマーまたは核酸構築物の第１セグメントの、特定の核酸配列の第１部分への続く結合を提供し得る。そうすることにおいて、第２プライマー伸長が生成され、そしてそれは第１プライマー伸長を置換する。この直線的増幅プロセスの別の重要な工程は、特定の核酸配列および新規のプライマーまたは核酸構築物を、適切な基質、緩衝液、およびテンプレート依存性重合化酵素の存在下で、均衡または限定サイクリング条件下でインキュベートすることである；それにより、増幅されることが求められる目的の特定の核酸配列が直線的に増幅される。
【０１０１】
　記載したばかりのプロセスの他の局面において、初期プライマーまたは核酸構築物と第２プライマーまたは核酸構築物とは、同じであり得るか、または異なり得る。さらに、少なくとも１つの改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、有用には、プロセスの種々の成分またはエレメント（第１セグメント、第２セグメント、またはプライマー伸長産物、またはこの様式のための前述のエレメントのいずれかを含む）に取り込まれ得る。このような改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、有用には、上記の第２セグメントに取り込まれ得る。有用には、第２セグメントに取り込まれる場合、このような改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、プライマー伸長におけるその相補体に対する第１セグメントの熱力学安定性を増加させる。改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、例えば、インターカレート剤を含み得る。
【０１０２】
　当業者は、第１セグメントまたはプライマー伸長産物、これらのエレメントの両方が、少なくとも１つの改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み得ることを認識する。このような場合において、改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、その相補物に対する第１セグメントまたはプライマー伸長産物の熱力学安定性を減少させる。このような熱力学安定性を減少させる改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、例えば、カルボン酸のような負に荷電した化学基を含む。
【０１０３】
　核酸形態に関して、初期プライマーまたは核酸構築物あるいは第２プライマーまたは核酸構築物（または両方のプライマーおよび核酸構築物）は、多数の核酸を含み得る。これらは、直鎖状核酸、分枝核酸、逆方向核酸、およびペプチド−核酸、または前述のいずれかの組合せを含むがこれらに限定されない。直線的増幅のさらなる説明を、すぐ下に記載する。
【０１０４】
　（１つのステムループ形成プライマーとの直線的増幅）
　本発明の１つの局面において、特定の核酸配列の直線的増幅は、均衡または限定サイクリング条件下で、少なくとも２つのセグメントを有する新規の単一のプライマーまたは新規の単一の核酸構築物の使用によって行われる。本発明の新規の核酸構築物は、１つより多い極性を有し得るか、またはそれらは分枝ＤＮＡであり得る。これらの構築物を合成するための方法は、米国特許出願第０８／７４９，２６６号（先に引用および本明細書中で援用される）に記載されている。新規のプライマーおよび核酸構築物の第１セグメントは、標的核酸配列に存在する配列に実質的に相補的である配列を含む。新規のプライマーまたは核酸構築物の第２セグメントは、標的核酸に存在する配列に実質的に同一である配列を含む。新規の核酸構築物は、第１セグメントおよび第２セグメントの１つ以上のコピーを有し得る。新規のプライマーまたは核酸構築物のテンプレート依存性伸長は、自己ハイブリダイゼーションによって形成されるステムループ構造、ならびに新規のプライマーまたは核酸構築物を含む配列に同一または相補的でない伸長配列を有する産物を作製し得る。
【０１０５】
　この産物は、図１に例示される、連続する一連の以下の工程によって、形成され得る。新規のプライマーまたは核酸構築物のテンプレート依存性伸長は、この新規のプライマーまたは核酸構築物の第２セグメントを含む配列に相補的である伸長部分配列において生成する。これらの自己相補性領域は、テンプレートに結合しままであり得るか、または自己相補性構造を形成し得る。二次構造の形成は、テンプレートからの、伸長した新規のプライマーの第１セグメントの全てまたは一部の除去を提供し得る。このことは、別の初期プライマーが、テンプレートからの新規の第１伸長プライマーの除去の前に、テンプレート配列に結合することを可能にする。テンプレート上の第２プライマーの伸長は、テンプレートからの第１伸長プライマーの置換を導き得る。このことは、伸長プライマーの分離が、別の結合および伸長反応のためのテンプレートの使用の前に常に起こる先行技術とは対照的である。これらの手段によって、単一のテンプレートは、均衡条件下で、２つ以上の初期事象を提供し得る。さらに、この方法は、全ての温度が伸長産物およびそのテンプレートのＴｍのものを下回る、限定サイクル条件下で使用され得る。連続するプロセスにおいて、新規の第２伸長プライマーにおける二次構造の形成は、新規の第３プライマーの結合および続く伸長を提供し得る。このようにして、変性条件の非存在下において、本発明の新規のプロセスは、核酸テンプレートの単鎖からの多重プライミング、伸長、および遊離事象を提供し得る。さらに、これらの工程の全ては、均衡条件下で、同時および連続的に起こり得る。
【０１０６】
　複数の同一の第１セグメントおよび第２セグメントを有する新規の核酸構築物はまた、図１に示されている同じプロセスによって直線的増幅を行うために使用され得る。この新規の構築物は、潜在的に、１つの極性を有する線状構築物と比較して、効率の増加に恵まれている。構築物分子の第１セグメントの１つの結合および伸長は、再生されたプライマー結合部位に結合し得る構築物の他の第１セグメントの局在化高濃度を生じる。複数のプライミングおよび伸長反応の後、１本鎖である標的ＤＮＡの複数のコピーを含む構築物が作製され得る。
【０１０７】
　新規の伸長プライマーおよび核酸構築物の、自己相補性構造を形成する能力は、適切な条件下で実現化され得る。先行技術は、その特徴が短い相補性オリゴヌクレオチドの会合および解離が、温度、塩条件、塩基含有量、および相補配列の長さによって決定される平衡反応として生じることを示している。これらの要因の影響は、Ｊ．Ｇ．Ｗｅｃｈｓｌｅｒ（［１９９１］　Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６；２７７−２５９、本明細書中で援用する）によって概説されている。相補性ＤＮＡの大きな方の鎖は、広範な条件にわたって容易に解離しない安定な立体配置における２本鎖分子として存在するが、それらは、鎖間結合の一時的および局在した弛緩を形成することが周知である。用語「呼吸」は、水素結合のこの局在化破壊を説明するために使用されている。パリンドローム配列を含む２本鎖ＤＮＡ分子における二次元構造を作製する「呼吸」のための経路は、Ａ．ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＴ．Ａ．Ｂａｋｅｒによって、「ＤＮＡ　Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，第２版」（１９９２）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏ．　ＮＹ，ＮＹ（その内容を本明細書中で参考として援用する）に記載されている。
【０１０８】
　本発明において、上記のように、線状２本鎖分子のセグメントの、鎖内ステムループ構造への転移は、プライマー開始事象を、伸長プライマーのそのテンプレートからの分離の前に起こることを可能にし得る。これらの２つの構造の間の平衡は、多数の要因に依存する。第１に、首尾良いプライマー結合のために、標的に結合する初期プライマーのセグメントは、反応に使用される温度で、安定なプライミングが可能であるように適切な長さおよび塩基組成でなければならない。第２に、初期プライマーの伸長後に自己ハイブリダイゼーションに関与するプライマーのセグメントは、適切な長さおよび塩基組成でなければならず、その結果伸長されたプライマーのテンプレートからの部分解離は、十分に安定な二次構造の形成（すなわち、ステムループ構造のステム）を可能にし得る。
【０１０９】
　これらの反応に適切な温度は、伸長プライマーのそのテンプレートからの分離に必要な温度を下回る。均衡反応において、単一の温度が、結合、伸長、および二次構造形成に使用され得る。または所望される場合、これらの事象を至適化するために異なる温度が使用される、限定サイクル条件が使用され得る。限定サイクリングのための異なる温度の使用は、プライマー結合、プライマー伸長、または伸長産物のいくつかのそのテンプレートからの局在化分離に有用であり得る。これらの工程のいずれかおよび全てに使用される温度もまた、反応において使用される特定のポリメラーゼに適切であるべきである。
【０１１０】
　伸長プライマーにおける分子内相補領域は、ＰＣＲ増幅に単一のプライマーの使用を可能にするために、標的核酸の各鎖において同一の結合部位を提供するようにＲｏｓｅら（米国特許第５，５９５，８９１号、同第５，６１２，１９９号、両方を本明細書中で援用する）によって以前に利用されている。しかし、Ｒｏｓｅらによって提供されたすべての例および教示は、次のプライマー結合および伸長事象のためのテンプレートの使用の前にそのテンプレートから伸長プライマーを分離するために、加熱工程（すなわち、サーモサイクラーにおける完全な変性の複数のサイクル）を必要とする。１本鎖ＲＮＡでの研究は、ループのサイズが増加するにつれて鎖内ステム形成の減少した機会が存在することを示している（Ｒ．Ｌ　Ｐ．Ａｄａｍｓら、「Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ」［１９９２］　Ｃｈａｐｍａｎ　＆　Ｈａｌｌ，　Ｌｏｎｄｏｎ，　Ｕ．Ｋ．、本明細書中で援用する）。なお、Ｒｏｓｅらによって提供された、プライマー部位として天然または人工的のいずれかで導入された逆方向反復配列を用いるＰＣＲ増幅のための方法は、ステムループ構造のステムを形成する相補配列間の１００〜２，０００ヌクレオチド、およびより好ましくは５００〜１０，０００塩基の好ましい分離を利用する。このような方向付けは、ステムループ構造の形成が、伸長プライマーの第１セグメントのそのテンプレートからの除去または部分除去を容易にし、伸長プライマーのそのテンプレートからの完全分離を提供する条件の負担を必要とすることなく結合部位を再生し得るのに十分に相補配列が近位であるという、本発明に開示される方法および組成物を教示しない。さらに、Ｒｏｓｅらによって提供される教示は、等温または限定サイクル条件下での増幅を可能にする手段として、プライマーにおける自己相補性の使用を除外する。なぜなら、それらの操作範囲は、等温または限定サイクル条件下で、エネルギー的に不利な二次構造形成をなす。安定なステム構造の形成によって生成されるエネルギーの増加は、ステムループ構造のループ部分を形成するためにその相補体から長鎖を置換するエネルギーコストによって妥協され、そして上回る。従って、完全サイクル条件は、プライマー結合部位を再生するために必要である。Ｒｏｓｅらの教示およびプロセスの帰結は、伸長配列が、常にステムループ構造のループに存在する産物を導くのに対して、本発明のこの局面では、新規のプライマーおよびプロセスの産物は、潜在的なステムループ構造の本質的に外側の伸長配列を有する。
【０１１１】
　上記の本発明の局面は、標識化１本鎖ＤＮＡプローブの調製、および核酸の配列の決定のための特定の有用性を見いだす。本発明の開示の前に、１本鎖ＤＮＡプローブを得るために最も一般的に使用された方法は、サーモサイクラーによって、またはＲＮＡプロモーターを含むテンプレートとのＲＮＡポリメラーゼの使用によって提供される複数鎖変性事象に依存している。複数鎖変性事象に依存するプロセスは、テンプレートの変性に必要な高温で、試薬および酵素活性の特定の量の損失という制限を受ける。熱安定性ポリメラーゼさえ、変性条件温度の効果に対して完全に免疫性ではなく、そしてこれらの温度で種々の半減期を有する。このような条件の使用もまた、このような温度によって完全に不活化されるいくつかの酵素の使用を除外する。これらのプロセスはまた、サーモサイクラーの必要性の制限を有する。ＲＮＡの生成に依存するプロセスは、プローブに所望される配列に関連してＲＮＡプロモーターを導入する必要性に関連する制限、およびＤＮＡより不安定な産物に本来備わっている制限を受ける。等温または限定サイクル条件の使用について、本発明に開示される方法は、サーモサイクラーを伴うかまたは伴わずに使用され得る。それらは、酵素のより広範なアレイの使用を可能にし、試薬は、極度に不安定な条件に供されず、そして安定な再利用ＤＮＡプローブが、最終産物である。
【０１１２】
　本発明のこの局面はまた、テンプレートを、均衡または限定サイクル条件下で、複数回使用することを可能にすることによって、配列決定に使用され得る。先行技術は、サーモサイクラーにおける複数鎖変性事象の使用によって、これを達成し得たのみであった。複数鎖変性事象について以前に引用された制限もまた、この使用に適用可能である。さらに、変性に必要な高温が、配列の曖昧性を創出し得る熱誘導脱プリン化または脱アミノ化事象に寄与し得るという、さらなる制限が存在する。テンプレートからの複数回の配列決定についての本発明の方法の適用は、サーモサイクラーの必要性、酵素の広範なアレイの有用性、およびテンプレートおよび試薬の整合性に対する熱効果の節度から独立しているという利点を提供する。
【０１１３】
　本発明はまた、特定の核酸配列を非直線的に増幅するためのプロセスを提供する。非直線的増幅は、以下の成分または試薬を提供する最初の工程を含む：増幅されることが求められる目的の特定の核酸配列、特定の核酸配列のための第１初期プライマーまたは核酸構築物、この特定の核酸配列の相補体に対する続く初期プライマーまたは核酸構築物、ならびに適切な基質、緩衝液、およびテンプレート依存性重合化酵素。記載したばかりの第１初期プライマーまたは核酸構築物は、２つのセグメントを含む。第１に、２つの規定された特徴を有する第１セグメント（Ａ）が存在する。それは、（ｉ）この特定の核酸配列の第１の部分に実質的に相補的であり、そして（ｉｉ）テンプレート依存性第１伸長が可能である。第１初期プライマーの第２セグメントは、４つの規定された特徴を有する。第１に、それは、（ｉ）第１セグメント（Ａ）と実質的に同一でない。第２に、それは、（ｉｉ）特定の核酸配列の第２部分と実質的に同一である。第２セグメントの第３の特徴は、（ｉｉｉ）第２セグメントの相補配列に結合し得るその能力である。第２セグメントの第４の特徴は、（ｉｖ）均衡または限定サイクル条件下で、第２プライマーまたは核酸構築物の第１セグメントの、特定の核酸配列の第１部分への続く結合を提供するためのその能力である。このような条件下で、第２プライマー伸長が生成されて、第１プライマー伸長を置換する。
【０１１４】
　続く初期プライマーまたは核酸構築物に関して、このエレメントは２つのセグメント、第１セグメント（Ａ）および第２セグメント（Ｂ）を含む。第１セグメント（Ａ）は、（ｉ）特定の核酸配列の第１の部分に実質的に相補的であり、そしてそれは、（ｉｉ）テンプレート依存性第１伸長が可能である。４つの特徴は、第２セグメント（Ｂ）を規定する。第１に、第２セグメント（Ｂ）は、（ｉ）第１セグメントと実質的に同一でない。第２に、それは、（ｉｉ）特定の核酸配列の第２部分と実質的に同一である。第３に、第２セグメント（Ｂ）は、（ｉｉｉ）第２セグメントの相補配列に結合し得る。第２セグメント（Ｂ）の第４の特徴は、（ｉｖ）均衡または限定サイクル条件下で、続くプライマーの第１セグメントの、特定の核酸配列の第１部分への続く結合を提供するその能力である。このような条件下で、第２プライマー伸長が生成され、そしてそれは第１プライマー伸長を置換する。このプロセスの第２工程は、特定の核酸配列および新規のプライマーまたは核酸構築物を、適切な基質、緩衝液、およびテンプレート依存性重合化酵素の存在下で、均衡または限定サイクル条件下で、インキュベートすることを含む。それにより、目的の特定の核酸配列は、非直線的に増幅される。
【０１１５】
　記載したばかりの非直線的増幅プロセスにおいて、第１初期プライマーまたは核酸構築物および第２初期プライマーまたは核酸構築物は、同じであり得るか、または異なり得る。改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、通常、さらなるエレメントとして取り込まれ得る。例えば、これらは、第１初期プライマーまたは核酸構築物の第１セグメントまたは第２セグメント、あるいは第２初期プライマーまたは核酸構築物の第１セグメントまたは第２セグメントに取り込まれ得る。または、改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、任意のプライマー伸長産物に取り込まれ得る。さらに言えば、改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、先行エレメントのいずれかに取り込まれ得るか、または先行エレメントのいずれかを改変するために使用され得る。
【０１１６】
　上に記載したばかりのこの非直線的増幅プロセスのさらなる実施態様において、第１初期プライマーまたは第２初期プライマーの第２セグメントは、改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み得、これはプライマー伸長産物におけるその相補体に対する第１セグメントの熱力学安定性を増加することを提供する。このような改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、例えば、インターカレート剤を含むか、またはその形態をとる。
【０１１７】
　目前にあるプロセスの他の局面において、第１初期プライマーの第１セグメントまたは第２初期プライマーの第１セグメント（または両方）、あるいはプライマー伸長産物（または、さらに言えば前述の要素のいずれかの組合せ）は、改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み得る。ここに、改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、それらの対応する相補体に対する第１セグメントまたはプライマー伸長、あるいはその両方の熱力学安定性を減少させることを提供する。このような安定性を減少する改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、カルボン酸のような負に荷電した化学基を含み得る。
【０１１８】
　記載したばかりの非直線的増幅プロセスの別の局面は、核酸の型または形態である。ここに、第１初期プライマーもしくは核酸構築物または第２初期プライマーもしくは核酸構築物、あるいはその両方は、任意の数または任意の形態の核酸を含む。このようなメンバーは、直鎖状核酸、分枝核酸、逆方向核酸、およびペプチド−核酸、または前述のいずれかの組合せを含むがこれらに限定されない。
【０１１９】
　別の有意な非直線的増幅プロセスが、本発明によって提供される。このプロセスは、特定の核酸配列を非直線的に増幅し、そして以下の成分および試薬を提供する第１工程を含む：特定の核酸配列およびその相補体：特定の核酸配列のための第１初期プライマーまたは核酸構築物、第１プライマー伸長に相補的な第２初期プライマーまたは核酸構築物、ならびに適切な基質、緩衝液、およびテンプレート依存性重合化酵素。第１初期プライマーまたは核酸構築物は、２つのセグメントを含む：第１セグメント（Ａ）および第２セグメント（Ｂ）。前者に関して、２つの特徴がそれを規定する。第１に、それは、（ｉ）特定の核酸配列の第１の部分に実質的に相補的であり、そして第２に、それは、（ｉｉ）テンプレート依存性第１伸長が可能である。第２セグメント（Ｂ）に関して、４つの特徴がこのエレメントを規定する。第１に、それは、（ｉ）第１セグメントと実質的に同一でない。第２に、それは、（ｉｉ）特定の核酸配列の第２部分と実質的に同一である。第２セグメント（Ｂ）の第３の特徴は、（ｉｉｉ）第２セグメントの相補配列に結合し得るその能力である。第２セグメント（Ｂ）の第４の特徴は、（ｉｖ）均衡または限定サイクリング条件下で、続く第１プライマーの第１セグメントの、特定の核酸配列の第１部分への続く結合を提供するためのその能力である。このような条件下で、第２プライマー伸長が生成され、そしてそれが第１プライマー伸長を置換する。第２初期プライマーまたは核酸構築物は、均衡または限定サイクリング条件下で、テンプレート依存性伸長についてのその能力によって特徴づけられるセグメントを含む。このプロセスの重要な工程は、もちろん、特定の核酸配列および新規のプライマーまたは核酸構築物を、適切な基質、緩衝液、およびテンプレート依存性重合化酵素の存在下で、均衡または限定サイクリング条件下でインキュベートする工程である。
【０１２０】
　他の局面または特徴は、非直線的増幅のために、後記のプロセスに取り込まれ得る。１つの重要な特徴は、改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含有させることである。例えば、少なくとも１つの改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログが取り込まれ得るか、またはプロセスにおける以下のメンバーエレメントのいずれかを改変するために使用され得る：第１初期プライマーまたは核酸構築物の第１セグメントまたは第２セグメント、第２初期プライマーまたは核酸構築物のセグメント、プライマー伸長、あるいは、前述のいずれかまたは前述のいずれかの組合せ。一様に重要なことは、少なくとも１つの改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを第１初期プライマーの第２セグメントに含有させることである。このような改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含有させることは、プライマー伸長におけるその相補体に対する第１セグメントの熱力学安定性を増加させることを提供する。改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、当該分野で周知であり、そして例えば、インターカレート剤を含む。
【０１２１】
　さらに、第１初期プライマーの第１セグメントまたは第２初期プライマーのセグメント（または両方）、あるいは、それらのプライマー伸長（または、さらに言えば、前述のいずれかの組合せ）は、少なくとも１つの改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログで改変されるかまたは取り込まれ得る。このような改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、それらのそれぞれの相補体に対する第１セグメントまたはプライマー伸長（または両方）の熱力学安定性を減少させることを提供する。安定性を減少させることを提供する改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、負に荷電した化学基（例えば、カルボン酸）を含み得る。
【０１２２】
　本願に記載される非直線的増幅のための他のプロセスの場合におけるように、核酸の形態または型は変化し得る。第１初期プライマーもしくは核酸構築物、または第２初期プライマーまたは核酸構築物、あるいは両方は、以下のいずれかから選択される核酸を含み得る：直鎖状核酸、分枝核酸、逆方向核酸、およびペプチド−核酸（または、前述のいずれかの組合せ）。
【０１２３】
　本発明はまた、増幅されることが探索される目的の特定の核酸配列を非直線的に増幅するための別のプロセスを提供する。このプロセスは、以下の成分および試薬を提供する第一工程を含む：目的の特定の核酸配列；非直線的に増幅し得る単一のプライマーまたは単一の核酸構築物、ならびに適切な基質、緩衝液、およびテンプレート依存性重合化酵素。この単一のプライマーまたは核酸構築物は、３つのセグメント、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）を含む。第１セグメント（ａ）は、（ｉ）特定の核酸配列の第１部分に実質的に相補的であり、そして（ｉｉ）テンプレート依存性第１伸長が可能である。第２セグメント（ｂ）は、特定の核酸配列の第２部分に実質的に同一である。第３セグメント（ｃ）は、第１セグメントに実質的に同一である。第１プライマー伸長は、第２セグメントにハイブリダイズし得る配列を生成し得、そして自己プライミングおよび自己伸長をして、第３セグメントに対する相補体を生成するその能力によっても特徴づけられる。このプロセスの第１工程に続いて、特定の核酸配列およびプライマーまたは核酸構築物は、適切な基質、緩衝液、およびテンプレート依存性重合化酵素の存在下でインキュベートされる。インキュベーション後；特定の核酸配列は、それにより非直線的に増幅される。
【０１２４】
　非直線的増幅について最後に記載されるプロセスについての他の実施態様が、本発明によって提供される。例えば、プロセスは、均衡条件、限定サイクル条件、および完全サイクル条件から選択される条件下で行われ得る。
【０１２５】
　さらに、改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、プロセスの種々のエレメントの改変において使用され得る。例えば、第１セグメント、第２セグメント、第３セグメント、第１プライマー伸長、第２プライマー伸長のいずれかまたは全ては、少なくとも１つの改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み得るかまたは包含し得る。さらに、改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、第１セグメント、第２セグメント、第３セグメント、第１プライマー伸長、および自己プライミング伸長のいずれかまたは全てに取り込まれ得る。
【０１２６】
　当業者はまた、単一のプライマーまたは核酸構築物が、多数の核酸形態（例えば、直鎖状核酸、分枝核酸、逆方向核酸、およびペプチド核酸、または前述のいずれかの組合せが挙げられる）を含み得ることを認識する。当業者はさらに、第１プライマー伸長が、種々の条件下（例えば、限定された基質条件、限定された伸長持続時間、またはその両方を含む）で行われ得ることをさらに認識する。
【０１２７】
　目的の特定の核酸配列の増幅についての上記のいずれかのプロセス（直線的または非直線的増幅であれ）に関して、特定の核酸配列は、１本鎖または２本鎖形態であり得る。さらに、特定の核酸配列は、フラグメントに見いだされ得るか、または含まれる。このようなフラグメントは、多数の手段によって生成され得、これらの手段としては、物理的手段（超音波処理、加熱、またはその両方）、化学的手段（酸処理）、物理化学的手段、および酵素的手段（ヌクレアーゼ（例えばエンドヌクレアーゼ）および制限酵素）が挙げられる。
【０１２８】
　非直線的増幅は、以下にさらに記載される。
【０１２９】
　（ステムループ形成プライマーおよび構築物との非直線的増幅）
　所望の配列の非直線的増幅は、各鎖における結合部位がプライマーまたは核酸構築物によって使用される場合に、行われ得る。本発明の別の局面において、非直線的増幅は、均衡または限定サイクル条件下で、少なくとも１つの上記のプライマーまたは構築物が、第１および第２セグメントを有する新規のプライマーまたは構築物である場合に、行われ得る。本発明の新規の核酸構築物は、１つより多い極性を有し得るか、または分枝ＤＮＡであり得る。これらの構築物を合成するためのプロセスは、米国特許出願第０８／７４９，２６６号（前に引用および本明細書中で援用する）に記載されている。第１および第２セグメントは、以前に定義されている。新規のプライマーまたは核酸構築物の第１セグメントは、標的核酸配列に存在する配列に実質的に相補的である配列を含む。新規のプライマーまたは核酸構築物の第２セグメントは、標的核酸に存在する配列と実質的に同一である配列を含む。
【０１３０】
　プライマーが非直線的増幅に使用される場合、一方の鎖における結合部位は、第１および第２セグメントを有する新規のプライマーによって使用され、そして他方の鎖における結合部位は、標準的なプライマーまたは別の新規のプライマーのいずれかによって使用され得る。新規の単一のプライマーは、各鎖における結合部位が実質的に互いに類似する場合に、それ自身によって使用され得る。構築物が非直線的増幅に使用される場合、構築物は、標的核酸の一方の鎖に相補的な１つ以上の第１セグメントおよび他方の鎖に相補的な１つ以上の第１セグメントを含む、新規の構築物である。構築物はまた、一方の鎖に同一である１つ以上の第２セグメントも含み、そして他方の鎖における配列に同一である１つ以上の第２セグメントもまた含み得る。新規の構築物の第１セグメントは、互いに実質的に同一であり得るか、または互いに実質的に異なり得る。新規の構築物の第２セグメントは、互いに実質的に同一であり得るか、または互いに実質的に異なり得る。標準的なプライマー、新規のプライマー、構築物および新規の構築物の組合せもまた、少なくともそれらの１つが第１および第２セグメントを含む限りは、ともに使用され得ることもまた理解される。
【０１３１】
　以前に記載されるように、新規のプライマーまたは核酸構築物の結合および伸長は、均衡または限定サイクル条件下で、複数のプライマー結合および伸長事象についてのテンプレートの使用を可能にし得る。新規の結合および伸長事象が生じるので、それらは、以前にそのテンプレートに対して伸長している核酸鎖の分離を可能にする。このことは、変性事象に必要ではない第２プライマーまたは核酸構築物の結合についてのテンプレートとして使用され得る１本鎖核酸鎖の生成を生じる。なぜなら、それらは既に、１本鎖形態であるからである。一方のプライマーが標準的なプライマーであり、そして他方が新規のプライマーである場合、テンプレート依存性結合および伸長の最終産物は、一方の末端において、各鎖のステムループ構造を含む２本鎖分子であり得る。両方のプライマーが新規のプライマーである場合、テンプレート依存性結合および伸長の最終産物は、各末端において、各鎖のステムループ構造を含む２本鎖分子であり得る。構築物が、その各々が一方の鎖または他方に相補的である２つの第１セグメント、および一方の鎖のみに相補的である１つの第２セグメントを含む場合、最終産物は、相補的なステムループ構造を有する単一の分子であり得る。構築物が、その各々が、一方の鎖または他方に相補的である２つの第１セグメントおよびその各々が、一方の鎖または他方と同一である２つの第２セグメントを含む場合、最終産物は、相補的なステムループ構造の２つの対を有する単一の分子であり得る。
【０１３２】
　非直線的増幅産物は、均衡または限定条件下で、連続した一連の以下の工程によって、新規のプライマーおよび標準的なプライマーによって合成され得る。新規のプライマーは標的鎖に結合し、そして新規の単一プライマーとの直線的増幅について以前に記載されるのと、同じ一連の伸長、二次構造形成、プライマー結合部位の再生、第２結合、第２伸長、およびテンプレートからの第１伸長プライマーの分離が存在する。新規の伸長プライマーは、他方の新規のプライマーの連続する結合および伸長によって置換されるので、これらの１本鎖産物は標準的なプライマーに結合し得、そしてそれらを伸長させて、完全な２本鎖アンプリコンを作製し得る。この潜在的な一連の事象を、図２に示す。得られる２本鎖構造は一方の鎖において新規のプライマーについてのプライマー結合部位に相補的な配列と、および他方の鎖において新規のプライマーについてのプライマー結合部位に同一の配列と隣接する各鎖自己相補配列を含む。この結果として、各鎖は、アンプリコンの一方の末端で、ステムループ構造を形成し得る。次いで、１本鎖ループ構造におけるプライマー結合部位の露出は、図１において以前に示した同じプロセスによって、さらなる一連のプライマー結合および置換反応をもたらし、それにより均衡または限定サイクル条件下で、目的の配列の非直線的増幅の生成を可能にする。この産物は、非直線的増幅によって、Ｒｏｓｅらによって作製されたものとは異なる。なぜなら、それらのプロセスは、伸長配列が自己相補領域間に常に位置するように導くのに対して、本発明のこの局面において、伸長配列は、ステムループ領域の外側にあるからである。さらに、本発明のこの局面のプロセスは、二次構造情報によって結合部位を再生するのに対して、Ｒｏｓｅらにおいては、結合部位は潜在的なステムループ構造のステム領域に存在し、そして増幅産物の変性なしでは別の結合事象には決して利用可能ではない。
【０１３３】
　本発明のこの局面を行うのに適切なプライマー配列は、直線的増幅について以前に記載された因子に依存する。標的に結合するプライマーのセグメントは、反応に使用される温度で安定なプライミングを可能にするために、適切な長さおよび塩基組成のものでなければならない。プライマーの伸長後の自己ハイブリダイゼーションに関与するプライマーのセグメントは、テンプレートからの伸長プライマーの部分解離が、安定な二次構造（すなわち、ステムループ構造のステム）の作製に十分である適切な長さおよび塩基組成でなければならない。この構造は、恒久でなくても良いが、別のプライミング事象を可能にし得るのに充分安定でなければならない。さらに、本発明のこの局面は、新規の伸長プライマーのステムループ配列の相補的コピーの作製を含む。このことは、プライマーの伸長後の自己ハイブリダイゼーションに関与するプライマーのセグメントが、二次構造に関与する配列がテンプレートとして使用され得るように適切な長さおよび塩基組成のものでなければならないことを必要とする。塩基組成および長さに加えて、一次および二次構造の安定性は、プライマー、伸長配列、またはその両方への改変塩基の取り込みによって影響され得る。これらは、それらが存在するセグメントのＴｍを、上昇または低下させ得る。セグメントのＴｍを上昇させ得る塩基の改変の例は、ＥＮＺ　ＸＸに記載されるようなエチジウムブロマイド部分の添加であり得るがこれに限定されない。セグメントのＴｍを低下させ得る塩基の改変の例は、Ａｕｅｒら（１９９６，　Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２４；５０２１−５０２５、内容は本明細書中で既に引用されている）によって記載されるような、イノシンの使用であり得るがこれに限定されない。
【０１３４】
　非直線的増幅産物はまた、均衡または限定サイクル条件下で、２つの第１セグメントおよび１つの第２セグメントを含む新規の核酸構築物によって合成され得る。第１セグメントの各々は、核酸の鎖またはその相補体に相補的であり、そして第２セグメントは、第１セグメントの１つの伸長後に、二次構造を形成し得る。この構築物は、一対の相補的な潜在的ステムループ構造を有する産物を作製し得る。この産物は、連続する一連の以下の工程によって形成され得る。新規の構築物の１つの第１セグメントおよび１つの第２セグメントは、新規の単一プライマーによる直線的増幅について以前に記載されているのと同様の連続する一連の結合、伸長、二次構造形成、プライマー結合部位の再生、第２結合、第２伸長、および鎖分離工程を行い得る。さらに、この合成の産物は、一連の結合および伸長工程のためのテンプレートとして、新規のプライマーおよび標準的なプライマーでの非直線的増幅について上に記載されているような他方の第１セグメントによって使用され得る。これらの工程が作製し得る潜在的な一連の異なる形態は、図３および４に与えられる。この新規の構築物が潜在的に行い得る一連の事象は、以前に記載されたのと同じであり、そして図４に示される最終産物は、ともに結合したプライマーの２つの５'末端を有する図２の最終産物の位相的等価体である。
【０１３５】
　非直線的増幅産物は、標的核酸の異なる鎖に相補的な２つの新規のプライマーの使用によって、連続する一連の以下の工程によって、均衡または限定サイクル条件下で合成され得る。新規のプライマー（Ａ）は、標的鎖に結合し、そして新規の単一プライマーでの直線的増幅について以前に記載されたのと同様の一連の伸長、二次構造形成、プライマー結合部位の再生、第２結合、第２伸長、伸長プライマーのテンプレートからの分離が存在する。新規の伸長プライマーは、他の新規のプライマーの結合および伸長と置き換えられるので、これらの１本鎖産物は、新規のプライマー（Ｂ）と結合し得、そして伸長させて完全な２本鎖アンプリコンを作製することを可能にする。この潜在的な一連の事象は、図５に示される。以前に記載したように、伸長して置換したプライマーの相補体の形成は、均衡または限定サイクル条件下で、複数の結合、伸長、および置換事象を可能にするべき二次構造を有するテンプレートを作製する。新規の第１プライマーおよびその相補体から寄与される配列に由来する一方の末端での二次構造、および新規の第２プライマーおよびその相補体によって寄与される配列に由来する他方の末端での二次構造を有する産物が形成され得る。この構造は、プライマー結合部位として使用され得る１本鎖セグメントを再生する各鎖において、ループ構造を有するので、新規のプライマーまたは核酸構築物のさらなる結合および伸長が、均衡または限定サイクル条件下で、いずれかの鎖において開始され得る。例示するために、図５に示される一連の事象は、新規のプライマー（Ａ）による一方の末端での最初の開始事象の結果であるが、相補的なテンプレート鎖の利用可能性とともに、一連の事象が、新規のプライマー（Ｂ）による、相補的な標的鎖のプライマー結合部位での最初の開始と、類似の様式で示されている。
【０１３６】
　新規のプライマーはまた、第２セグメントはテンプレートとして使用され得ないが、自己ハイブリダイゼーションを介する二次構造形成になお関与し得るように改変され得る。このような改変を誘導するのに使用され得る手段としては、無塩基性部位およびペプチド−核酸の封入が挙げられ得るがこれに限定されない。このようなプライマーの合成の方法は、米国特許出願番号第０８／７４９，２６６号（先に引用および既に本明細書中で援用されている）に記載されている。このような新規のプライマーまたはプライマー構築物のテンプレート依存性結合および伸長によって作製され得る産物は、各鎖において一方の末端での単一ステムループおよび他方の末端での１本鎖プライマー結合部位を有し得る２本鎖アンプリコンである。
【０１３７】
　この産物は、これらの改変された新規のプライマーによって、連続する一連の以下の工程において合成され得る。第１の一連の潜在的なプライマー結合、伸長、二次構造形成、プライマー結合部位の再生、第２結合、第２伸長、および伸長プライマーのテンプレートからの分離は、新規の単一プライマーでの直線的増幅について以前に記載されたものと同様であり得る。第２の改変した新規のプライマーとの一連の反応は、図６に示される。テンプレートとして使用され得るので、新規の改変プライマーの第２セグメントは、伸長によって作製された配列との第２セグメントの自己ハイブリダイゼーションに対して別の方法で競合する相補鎖を有さず、それにより二次構造のより効果的な形成を可能にする。従って、分子の３'末端でステムループ構造が存在しないとしても、よりさらなるプライミング事象に使用され得るセグメントが、十分に曝露される。
【０１３８】
　非直線的増幅産物は、均衡または限定サイクル条件下で、２つの第１セグメントおよび２つの第２セグメントを含む新規の核酸構築物によって形成され得る。第１セグメントの各々は、一方の鎖またはその相補体に実質的に相補的であり、そして第２セグメントの各々は、第１セグメントの１つの伸長後に二次構造を形成し得る。この構築物は、相補的な潜在的ステムおよびループ構造の２つの対を有する産物を形成し得る。この産物は、新規の単一プライマーによる非直線状増幅について以前に記載されているものと同じ連続する一連の結合、伸長、二次構造形成、プライマー結合部位の再生、第２結合、および第２伸長工程を行う、一方の第１セグメントおよび一方の第２セグメントによって合成される。次いで、上記の一連の反応を行うために、このセットの反応の産物は、新規の構築物の他方の第１セグメントおよび第２セグメントによって使用され得る。これらの工程が生成し得る潜在的な一連の異なる形態は、図７および８に与えられる。この新規の構築物が潜在的に行われ得る一連の事象は、以前に記載されたものと同様であり、そして図８に示される最終産物は、ともに結合したプライマーの２つの５'末端を有する図６の最終産物の位相的等価体である。１つより多い極性を有する新規の構築物が使用されて、等温または限定サイクル条件下で、直線的および非直線的増幅が行われ得る種々の配置が例示されているが、分枝ＤＮＡを有する構築物もまた、同様のプロセスに使用され得ることが理解される。
【０１３９】
　上に記載されている本発明の局面の使用の組成物および方法は、以前に記載された技術のいずれの限定も伴わずに、直線的または非直線的増幅を行い得る。本発明のこれらの局面において、先行技術に必要であった、完全サイクル条件、ＲＮＡ中間体、改変ヌクレオチド、または複数の酵素は必要ではない。
【０１４０】
　（自己複製する新規のプライマーおよび核酸構築物）
　先行技術において記載されている全ての他の増幅系において、２つの結合部位（各標的鎖におけるもの）を必要としない非直線的増幅を開示しているものはない。この必要性は、各鎖からの配列の提示の必要性に起因する。この必要性を伴う系としては、ＰＣＲおよびＬＣＲのような温熱系ならびに３ＳＲおよびＳＤＡのような等温系が挙げられている。このように、ＰＣＲ反応は、２つのプライマーで行われ、ここで標的核酸の各鎖は、一方または他方のプライマーによって使用される。Ｒｏｓｅらの開示においてさえ、２つの同一な結合部位は、ＰＣＲを行うのに必要であり、同じプライマーが各鎖について使用され得る。
【０１４１】
　本発明の１つの局面は、非直線的増幅のための使用の組成物および方法を開示し、ここで新規のプライマーおよび核酸構築物についての１つ以上の結合部位は、標的核酸の一方の鎖のみに限定される。本発明のこの局面の新規のプライマーおよび新規の構築物は、少なくとも３つのセグメントを有する。これらのセグメントは、共有的または非共有的のいずれかでともに結合され得る。共有結合を介してセグメントを結合する手段としては、正常な直鎖状核酸のリン酸骨格、１つより多い極性を有する構築物、および分枝ＤＮＡ構築物が挙げられ得るがこれらに限定されない。このような構築物の合成の方法は、（ＩＮＶ特許）に記載されている。非共有結合によってセグメントを結合する手段としては、リガンド−レセプター結合および相補的塩基対形成が挙げられ得るがこれらに限定されない。セグメントは互いに隣接し得るか、または互いに空間的に離れ得る。セグメントの配列は互いに異なり得るか、または互いに相補的もしくは同一であり得る。
【０１４２】
　新規の単一プライマーが単一の極性を有する場合、以下の特徴を有する３つのセグメントを有する：
　１）新規のプライマーの第１セグメントは、結合および伸長され得、そして目的の標的の一方の鎖のみにおける配列に実質的に相補的である配列を含み、その結果、標的に結合し得、そしてテンプレートのような標的配列を用いて伸長され得る。
【０１４３】
　２）新規のプライマーの第２セグメントは、目的の標的における配列に実質的に同一である配列を含み、その結果、第２セグメントは、第１セグメントの標的依存性伸長によって作製される配列と自己ハイブリダイゼーションし得、自己プライミング事象を促進する二次構造を形成することを可能にする。
【０１４４】
　３）新規のプライマーの第３セグメントは、鎖内テンプレートとして作用し得、そしてそれにより自己伸長を可能にする。
【０１４５】
　これらの特徴によって、適切な標的分子の一方の鎖の存在は、新規の単一プライマーを非直線的増幅し得る自己複製核酸に変換し得る。本発明の新規の単一プライマーは、標的に結合し得、そして伸長のためのテンプレートとしてそれを利用する。次いで、第２および第３セグメントの存在に起因して、この産物は、一連の鎖内および鎖間の結合および伸長反応を経験し得る。これらの反応の産物は、自己複製する１本鎖核酸または自己複製する２本鎖核酸である。１本鎖核酸産物は、ステムループ構造を形成し得、そして２本鎖核酸は、１本鎖にされた後、ステムループ構造を形成し得る。
【０１４６】
　標的核酸の適切な鎖の存在によって直線状の新規のプライマーからこのような形態を合成するのに使用され得る一連の工程は、図９、１０、および１１に示される。新規のプライマーはテンプレートに結合し得、そして伸長して、図９の工程２の構造を形成し得る。ここで合成は、利用可能なテンプレートのばらばらの部分のみをコピーすることに限定される。合成の限界の制限は、種々の手段によって行われ得る。これらの手段は、サイズ、時間、および基質制限からなり得るがこれらに限定されない。サイズ制限のために、標的は、ランダムまたは部位特異的末端を作製する手段による伸長の前に処理され得る。ランダムな部位は、選択平均サイズを有するプールを作製するために使用され得る。標的核酸においてランダムな中断を生じるための手段としては、剪断のような物理的方法およびヌクレアーゼのような酵素的方法が挙げられ得るがこれらに限定されない。部位特異的部位は、ばらばらのサイズを有する標的核酸を作製するために使用され得る。部位特異的末端を作製するための手段としては、制限酵素が挙げられるがこれらに限定されない。時間の制約のために、反応は、結合および合成の所望の長さ、続く温度の調製が反応を停止するに十分な時間間隔で行われ得る。時間間隔の持続は、緩衝液および塩条件、結合および伸長に使用される温度の選択、正常な基質と比較して異なる効率で使用される改変基質の使用、および特定のポリメラーゼの選択を含み得るがこれらに限定されない要因によって決定される。基質制限のために、プライマー配列が選択され得、その結果伸長反応の所望の限度は、限定された数の特定のヌクレオチドによって行われ得、そして反応から、所望の程度を越える合成をさらに可能にする特定のヌクレオチドを除外する。例えば、反応混合物からのｄＴＴＰの除去は、ｄＴＴＰが必要とされる点で生じる伸長鎖の終結とともに、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＡＴＰでのプライマーのテンプレート依存性伸長を可能にする。
【０１４７】
　伸長が適切な部位で停止される効率は、反応の全体の効率に影響する。このプロセスについてさらに記載される反応の工程に関与し得る中間体の最大量を生成するために、標的テンプレートが使用されていることを保証するためのできるだけ完全な停止が所望されることが理解される。一方では、制限は全く絶対的である必要はないことに注意されるべきである。いくつかの伸長反応が適切に制限される限りは、以下に記載されるさらなる工程を経験し得る反応産物が作製される。
【０１４８】
　プライマーが所望の程度まで伸長された後、プライマーは、そのテンプレートから分離される（図９、工程３）。この図に示されないが、このことは、伸長配列と新規のプライマーの第２セグメント（図９に示される新規のプライマーのａ'−ｂ'およびａ−ｂセグメント）との間に自己ハイブリダイゼーションを介する二次構造の形成によって潜在的に起こり得る。このことは、同じ標的分子を有する他方の新規の単一プライマーの結合および伸長、続いて、本発明の以前の局面に記載されているような、均衡または限定サイクル条件下で、伸長プライマーを置換することを可能にする。しかし、この事象が生じることを可能にする新規のプライマーにおける配列の設計の非存在下で、伸長プライマーのそのテンプレートからの分離は、図９の工程３における温熱変性（すなわち、完全サイクル条件）によって行われ得る。　それらは、標的または図９に例示されるようなｃ−ｄ配列に隣接する配列であり、それらは、適切な長さに設計されたｘ−ｙのセグメントによってこれらの配列から分離され得るように、ａ−ｂについての配列が選択され得る。
【０１４９】
　自己触媒または熱放出工程のいずれかの後、部分的に伸長したプライマーは、図９の工程４に示されるような相補的セグメントのハイブリダイゼーションによって、自己プライミング事象が可能である。このことは、テンプレートとして新規の単一プライマーの第３のセグメントを用いるプライマーの自己伸長を可能にする。４つのｄＮＴＰの限定されたサブセットが、図９の工程２における伸長長さの制御のために使用される場合、欠失ヌクレオチドは、このさらなる伸長工程に付加される必要があり得る。同様に、反応条件における調整もまた、緩衝液、塩、温度、ポリメラーゼ、または改変ヌクレオチドのような要因が、限定された伸長工程についての時間間隔に影響を及ぼすために使用されている場合、必要であり得る。図９の工程５におけるプライマーの第２伸長は、非伸長プライマーの３'末端に相補的である配列を付加する。工程６は、図９の工程５の産物の変性を示す。次いで、伸長プライマーは、鎖内自己ハイブリダイゼーション事象または鎖間ハイブリダイゼーション事象のいずれかを経験する。鎖内自己ハイブリダイゼーションは、伸長末端と、伸長プライマーの第１セグメントまたは第３セグメントのいずれかとの間であり得る。伸長プライマーの第１セグメントとの自己ハイブリダイゼーションは、図１０の工程７に見られる構造を形成する自己プライミング事象である。この形態は、自己伸長を経験し得る（図１０の工程８）。これらの潜在的な鎖内事象による配列の自己複製に加えて、自己複製は、鎖間ハイブリダイゼーションによって起こり得る。新規の初期プライマーの新規の伸長プライマーへの結合は、図１０の工程９に示され、続いて、新規の初期プライマーの伸長および新規の伸長プライマーのさらなる伸長は図１０の工程１０に示される。この図に示されないが、各々の伸長を可能にし得る新規の伸長プライマー間の鎖間ハイブリダイゼーションもまた存在し得る。それゆえ、分子内および分子間アニーリングの両方によって、伸長プライマーは、変性事象後の、配列の連続付加を経験し得る。図９および図１０に示されるような一連の反応の産物は、とられた伸長の経路（分子内または分子間）および何回の変性／伸長が行ったかに依存して種々のサイズを有する一連のアンプリコンである。
【０１５０】
　本発明の別の局面において、３つのセグメントを有する新規のプライマーが改変され得、その結果、自己プライミングおよび自己伸長が、限定された合成工程および自己複製が分子内結合および伸長によって行われる間にのみ、行われる。このことは、テンプレートとしてその使用を部分的または全体的にブロックするプライマーにおいてセグメントを有することによって行われ得る（図１１）。この目的のために新規のプライマーを改変するための方法は、以前に記載されている。伸長テンプレートとしてブロックされる部位の存在は、図９の工程１〜６に示されたのと同じ潜在的な一連の反応をいっそう可能にし得る。しかし、新規の初期プライマーの新規の伸長プライマーとの分子間ハイブリダイゼーション（図１１の工程９）の後、非伸長プライマーのみが、その３'末端に付加される新たな配列を有し得るのに対して、以前の伸長プライマーは、同じ長さのままである（図１１の工程１０）。この事象は、同様に、さらなる伸長事象のためのテンプレートであり得る伸長プライマーのさらなる生成を可能にし、それにより自己複製構築物を作製する。この方法において、１本鎖５'テイルに隣接する２本鎖セグメントを含むばらばらなサイズを有するアンプリコンの非直線的増幅が存在し得る。
【０１５１】
　（自己プライミングヘアピンを有する構築物）
　自己複製する核酸の、標的核酸の１本鎖からの形成もまた、１つ以上の第１、第２、または第３セグメントを含む核酸構築物によって行われ得る。これらの構築物は、１つより多い極性を有し得るか、または分枝ＤＮＡであり得る。本発明のこの局面において、構築物のセグメントは、以下の特徴を有する：
　１）１つ以上の第１セグメントは、目的の標的の一方の鎖のみにおいて配列に実質的に相補的であり、その結果、それらは結合し得、そしてテンプレートとして標的配列の上記の鎖のみを用いて伸長され得る。
【０１５２】
　２）構築物の１つ以上の第２セグメントは、目的の標的において配列に実質的に同一であり、その結果それらは、構築物の第１セグメントの標的依存性伸長によって作製される配列と自己ハイブリダイゼーションが可能であり、二次構造が、自己プライミング事象を促進する形態を可能にする。
【０１５３】
　３）構築物の１つ以上の第３セグメントは、鎖内テンプレートとして作用し得、そしてそれにより自己伸長が可能である。
【０１５４】
　構築物の第１セグメントは、互いに実質的に同一であり得るか、または互いに実質的に異なり得る。第２および第３セグメントもまた、この方法において記載され得る。配列の種々の配置が、このような構築物に使用され得る。例示の目的で、このような配置の例が、複数の極性を有する構築物について与えられる。本発明のこの局面において、テンプレート依存性結合および伸長、続く鎖内および鎖間結合および伸長の最終産物は、分子内ハイブリダイゼーションによって１つ以上のステムおよび１つ以上のループを形成し得る構築物である。
【０１５５】
　自己複製する核酸は、１つの第１、第２、および第３セグメントを有する新規の核酸構築物によって形成され得る。この例において、第２セグメントは、その３'末端自身を有する。なぜなら、それは、１つより多い極性を有する構築物の一部であるからである。しかし、それは、３'末端の障害物に起因して、第２セグメントとしてのみ機能するままである。伸長のこの障害物は、当業者に公知の多数の手段のいずれかによって行われ得る。
【０１５６】
　この構築物が適切な標的鎖と接触される場合に起こり得る潜在的な一連の事象は、図１２に示される。適切な標的鎖に結合した後、第１セグメントは、限定された伸長を経験し得る。サイズ、時間、および基質制限によって合成の程度を制限する、限定された合成について以前に記載されたのと同じ潜在的な手段もまた、この構築物とのプロセスにおける有用性を見いだす。次いで、伸長鎖は、同じ構築物の第２セグメントとの鎖内結合（工程４ａ）、または別の構築物分子の第２セグメントとの鎖間結合（工程４ｂ）のいずれかが可能である。これらの配置のいずれかとともに、さらなる伸長は、テンプレートとして第３セグメントを用いることによって起こり得る（工程５ａおよび５ｂ）。これらのプロセスのいずれかの産物は、より初期のプライマー構築物の結合および伸長のためのテンプレートとして用いられることによる自己複製し得る伸長構築物である（図１２の工程６）。
【０１５７】
　自己複製する核酸もまた、２つ以上の第１、第２、および第３セグメントを有する新規の核酸構築物によって形成され得る。構築物の設計に依存して、自己ハイブリダイゼーション事象は、同じ伸長鎖内で生じ得るか、または構築物の異なる伸長鎖間に生じ得る。複数の極性または分枝ＤＮＡを有する構築物は、１本鎖を物理的に含むが、明確にするために、構築物における鎖は、単一の極性を有する核酸の連続するストレッチをいう。上記の鎖配置で２つの第１、第２，および第３セグメントを有する構築物の例は、図１３および図１５に与えられる。本発明のこの局面において使用される構築物は、図９、１０、および１１に例示された以前の局面に関連する。これらに共通して、合成は、利用可能なテンプレートのばらばらな部分のみをコピーすることに制限される。合成を制限するための以前に記載された同じサイズ、時間、および基質限定はまた、本発明のこれらの局面における有用性を見いだす。それにより、図１３および１５の工程３は、単一テンプレート分子が、１つのみではなく２つの３'末端の伸長に使用されることを除いて、図９の工程２に等しい。テンプレートからの放出は、構築物における自己ハイブリダイゼーション、続くさらなる鎖伸長を可能にし得る。図１３における配置は、構築物内の鎖内結合および伸長を可能にするのに対して、図１５においては、構築物内に鎖間結合および伸長が存在する。これらの配置の両方について、構築物の反復セグメントの異なるコピーの使用による、さらなる自己プライミングおよび自己伸長反応を可能にし得る変性事象が存在し得る。しかし、図１４および図１６は、非伸長構築物に結合し、そして相互伸長事象を開始することによる自己複製の能力を実証する一連の事象を例示する。
【０１５８】
　図９〜１６に例示される標的依存性伸長反応の産物は、初期構築物におけるセグメントの特定の配置に依存して異なる。しかし、それらは、一般的な二次構造特徴を共有する。本発明の産物は、１本鎖領域ならび自己相補的２本鎖領域を構成する分子内形態を有する。これらの１本鎖領域は、ループとして描かれ得る（図９、１０、１１、１３、および１４の産物）。それらは、環の一部であり得る（図１２の産物）。それらは、２つの２本鎖領域の間に位置する非相補的配列からなる二重の１本鎖ループの一部であり得る（図１４および１５）。この特徴は、複数の極性を有する以前に記載された構築物の産物（ＩＮＶ特許）と対照的であり、ここで分子内産物は、自己相補的配列から完全に構成されていた。
【０１５９】
　反応を進行するために１つより多い極性を使用している新規の酸構築物が以前に記載されているが、分枝ＤＮＡ構築物が、同じ一連の反応および等しい産物に使用され得ることが理解される。また、本発明のこの局面に記載されている１つより多い極性を有する構築物は、（ＩＮＶ特許）に記載されているものとは異なる。以前に記載された技術において、伸長可能なセグメントは、標的核酸の両方の鎖に相補的であったのに対して、本発明では、全体の反応が、標的核酸の１つであって唯一の鎖に相補的であるセグメントのテンプレート依存性プライミングおよび伸長によって行われる。
【０１６０】
　（反応の単純化および反応産物）
　本発明を含む全ての増幅において、反応の間にも起こり得る副反応が存在する。これらは、高分子量産物の複雑な多様性を形成し得る。それらは、所望の配列の合成の効率またはこれらの配列の検出の効率のいずれかを減少する点において有害であり得る。合成の効率の減少は、副反応が、所望の配列の合成の量を、ポリメラーゼおよび基質資源についての競合によって減少する場合に起こり得る。副反応はまた、適切な配列が合成されるが、反応のいくつかの工程に阻害的な二次構造にある場合、効率を減少し得る。このことは、プライマーの結合または伸長のいずれかを妨害する構造によって起こり得る。後者の場合において、プライムされたテンプレートを使用できないことに起因して、そして酵素が結合するが進行し得ない場合のポリメラーゼ活性の欠失にも起因して、効率が失われ得る。不適切な二次構造もまた、適切な配列の検出における問題を生じ得る。
【０１６１】
　新規の方法が開示され、これは、これらの二次反応の効果を減少するために使用され得る。これらの方法は、以前に開示されている本発明の種々の局面とともに使用され得、そして他者によって記載されている増幅の方法と組み合わせても使用され得ることが理解される。自己複製する系が、さらなる反応のためのテンプレートとして産物を使用するので、任意の産物の合成の限度は、反応へのターミネーターヌクレオチドの限定された量を含むことによる平均サイズにおける減少によって制御され得る。この方法において、副反応伸長を経験し得ないが、他のプライマーまたはプライマー構築物による伸長のためのテンプレートとして使用され得るままである産物が合成され得る。このことは、合成される適切な配列の量を増加し得、そして潜在的に阻害性のエレメントの量を減少し得る。二次構造の効果の抑止はまた、二次構造を除去するかまたはこのような構造との会合から標的配列を放出するかのいずれかの合成後の方法によって行われ得る。前者の方法の例は、二次構造のループおよび結合部を消化する１本鎖特異的ヌクレアーゼで処理され得る。解離は、他のＤＮＡ配列から所望のセグメントを単利し得る制限酵素での消化によって行われ得る。除去および解離は、ＤＮａｓｅでの限定消化または脱プリン化のような物理的処理によって同時に行われ得る。次いで、これらの処理の産物は、種々の検出手段によるシグナル生成の点でより効率的にされる。
【０１６２】
　（負に荷電した改変ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド）
　本発明の別の局面において、対応する未置換の２本鎖セグメントの変性温度未満である変性温度を用いる場合に、２本鎖ＤＮＡ標的の増幅を可能にするヌクレオチドアナログを使用する方法および組成物が開示される。このことは、伸長産物のＴｍを減少する負に荷電した構成物によって改変された塩基の導入によって行われる。以前に記載されるＡｕｅｒらの教示とは対照的に、本発明の塩基の改変塩基の置換は、結合のための温度が、未改変塩基とともに一般的に使用される範囲内であることを可能にする。Ａｕｅｒらに記載されたものより低い温度は、プライマーの核酸標的への結合のためのより低い温度の使用が、非標的核酸テンプレートでの非特異的プライミングおよび増加したプライマー−タイマー形成に寄与し得るということが当該分野で周知であるという限定を有する。本発明は、改変塩基の存在下でより高い結合温度を使用する能力を保持することによってこれらの限定を回避する。以前に記載された技術において、完全サイクルＰＣＲに使用される最も高い温度と最も低い温度との間の差は、２５〜５０℃の範囲であり得るのに対して、本発明は、１０℃未満の異なる圧縮された一連のサイクルを使用し得る。従って、本発明は、プライマーの効率的な特異的アニーリングを保存するのに十分高い温度の使用を提供する一方、同時に、反応に使用される時間の間、相当なレベルの不活化を可能にする温度への、酵素およびヌクレオチド基質の曝露を回避するのに十分低い温度である。
【０１６３】
　（合成後標識）
　本発明において、配列情報を得るのに以前に使用されている大きなかさ高い基の使用に固有の先行技術の限定を克服する、非放射性シグナルを生成するための新規の組成物および方法が開示される。一般的に、鎖ターミネーターは、ポリメラーゼによって取り込まれる問題を有することが、当該分野で以前から公知である。シグナル生成に有用な大きなかさ高い基の存在が、取り込み効率においてさらなる減少を引き起こすこともまた、長い間公知である。この例は、ＡＭＶ逆転写酵素およびＴ７ポリメラーゼによって使用され得るが、ポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントのための基質ではない、蛍光標識化デオキシヌクレオチドの基である（Ｐｒｏｂｅｒら、１９８７，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３８；３３６−３４１、内容を本明細書中で援用する）。両方のこれらの要因は、取り込みの全体のレベルを減少し得、これは、順に、終結およびシグナル生成の量を減少する。特に、ＤＮＡのより長い鎖は、悪影響を受ける。なぜなら、これらの遺伝子座の終結は、通常、正常なヌクレオチドに比べて、終結ヌクレオチドの量が減少することによって生じるからである；それにより、それらの取り込みの可能性にさらなる圧力を付加する。
【０１６４】
　本発明において、これらの限定は、鎖伸長および終結事象が完了した後に、ターミネーターヌクレオチドにおける反応基へのシグナル生成部分の共有結合によって克服される。このことは、鎖延長の前か間のいずれかに標識を取り込む以前の方法とは対照的である。
【０１６５】
　本発明のこの局面において、反応基としては、ａ）内部ヌクレオチドではなく末端ヌクレオチドへのシグナリング部分の実質的に特異的な共有結合を提供するもの、およびｂ）改変ターミネーターヌクレオチドの取り込みを実質的に阻害しないか、または電気泳動による分析を妨害しないものが挙げられる。ターミネーターヌクレオチドに付加され得る反応基の例としては、チオール、ハロゲン化アルキル、遊離または保護した一級および二級アミン基が挙げられ得るがこれらに限定されない。反応基を有する誘導体を作製するための方法は、Ｗａｒｄらによって、米国特許第５，４７６，９２８号；同第５，２４１，０６０号；同第５，２６０，４３３号、および同第４，７０７，４４０号（先に引用、および既に本明細書中で参考として援用される）に記載されるものであり得るが、これらに限定されない。次いでシグナル生成に有用な基は、酵素活性または基質利用におけるいずれの阻害効果にも関することなく、終結した鎖に結合され得る。検出に有用な基としては、ハプテン、リガンド、レセプター、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ）、ローダミン、クマリンおよび他の蛍光分子、赤外蛍光基、化学発光部分、エネルギー移動系、ならびに酵素が挙げられ得るがこれらに限定されない。他の有用な反応基としては、終結ヌクレオチドに取り込まれた場合に、それらを酵素基質としては使用不可能にするかさ高い基または荷電した基が挙げられる。このような基としては、Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ、および遅延蛍光のためのドナー結合体が挙げられる。シグナル生成基の反応基への結合のための方法は、Ｗａｒｄらによって、米国特許第５，４７６，９２８号において、また米国特許第５，２４１，０６０号；同第５，２６０，４３３号、および同第４，７０７，４４０号（既に本明細書中で援用されている）において記載される。本発明のこの局面は、均衡または限定サイクル条件下で、単一テンプレートからの複数のコピーの生成について以前に開示された方法と組み合わせて行われ得る。さらに、ポリマー化後標識もまた、本発明の開示に対して以前に記載されている任意の手段を用いる場合に行われ得ることが理解される。
【０１６６】
　この方法は、ＨｏｂｂｓおよびＣｏｃｕｚｚａによって、米国特許第５，０４７，５１９号（本明細書中で援用する）に記載されるような、シグナル生成の供給源として鎖ターミネーターを用いる本来の説明とは対照的である。これは、本発明とは異なることを教示し、ここで彼らは、「蛍光に基づくＤＮＡ配列決定のための鎖終結基質として有用であるために、基質は蛍光標識を含まなければならない…。」と明らかにのべている。本発明の方法は、ｄＮＴＰまたはｄｄＮＴＰのいずれかが、標識化ＤＮＡ鎖の配列分析の一般的に使用される手段のいずれかにおける取り込みの前に、標識される必要があるという限定を克服する。これらは、静止系およびリアルタイム分析の両方を含み得る。静止系の例としては、アクリルアミドゲル分離、続く写真または化学発光検出を含むがこれに限定されない。リアルタイム分析の例は、アクリルアミドゲル分離、続くＡｎｓｏｒｇｅら（１９８６）によって使用されるような１つの色素（または、色素は、Ｓｍｉｔｈら、米国特許第５，１７１，５３４号、およびＰｒｏｂｅｒら、米国特許第５，３３２，６６６号によって記載されるような各塩基終結についての異なる色素であり得る）の検出が挙げられ得るがこれに限定されない。前述の刊行物および２つの特許書類の内容を、本明細書中で参考として援用する。本発明は、ジデオキシヌクレオチドによる鎖終結に関して記載されているが、他の鎖ターミネーターもまた使用され得ることもまた理解される。種々の鎖ターミネーターの説明は、Ａ．ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＴ．Ａ．Ｂａｋｅｒによる「ＤＮＡ　Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」第２版（１９９２，　４４７−４４９，　Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　ＣＯ．，　ＮＹ，　ＮＹ、本明細書中で援用される）に与えられる。糖環における変化の例としては、アシクロ（ａｃｙｃｌｏ）およびアラビノシル（ａｒａｂｉｎｏｓｙｌ）ｄＮＴＰが挙げられ得るがこれらに限定されない。末端ヌクレオチドとして使用される場合、これらの誘導体は、特定の使用のためのものであり得る。なぜなら、化学的および生化学的に、それらは、ＤＮＡ鎖の他の部分を含む正常なヌクレオチドとは十分に区別されるべきであるからである。蛍光標識化アシクロ誘導体が、放射活性標識によって誘導されるものに等しい配列ラダー（ｌａｄｄｅｒ）を生じ得ることもまた、米国特許第５，３３２，６６６号（本明細書中で援用される）に示されている。さらに、ターミネーターヌクレオチドの３'位置におけるアミノ基の存在による鎖終結の障壁はまた、シグナル生成部分の合成後の結合のための官能基を提供し得る。鎖の活性な３'−ＯＨ末端を再生し得る他のブロック基が使用され得る。例えば、光切断可能（ｐｈｏｔｏｃｌｅａｖａｂｌｅ）基が含まれる場合、当該分野に記載されるように、反応が終結され、そして標識の結合に使用された後、３'ＯＨが再生され得る。この機能に使用され得る系としては、蛍光標識化ジデオキシヌクレオチドの末端トランスフェラーゼによる取り込みが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１６７】
　本発明の別の局面は、適切に終結されているプライマー標識化伸長産物の、終結されていないものからの分離によって、プライマー標識系に固有の限定を克服することに関する。このような分離は、改変ターミネーターヌクレオチドの特性を用いることによって達成され得る。このことは、ターミネーターヌクレオチドに予め存在するマーカー、または上記の合成後改変によって行われ得る。マーカーの存在と非存在との間の適切な物理的分離を可能にし得る任意の手段は、本発明の範囲内であると考えられる。このような予め存在するマーカーの例は、ビオチン、イミノビオチン、フルオレセイン、ハロゲン、チオール、およびアミンからなり得るがこれらに限定されない。このようなマーカーを有する鎖を物理的に配列決定する手段は、ハロゲン、チオール、またはアミンに結合するアビジン、ストレプトアビジン、抗体、および物理的マトリックスからなり得るがこれらに限定されない。標識化鎖のターミネーターヌクレオチドを欠く鎖からの分離の後、産物は、配列に適切な形態において放出され得る。このような放出のための手段の例は、抗体のようなタンパク質の、加熱または化学処理を介する物理的変性からなるがこれらに限定されない。放出はまた、ジスルフィド架橋またはイミノビオチンのような切断可能な（ｓｃｉｓｓａｂｌｅ）結合の使用によって行われ得る。切断可能な結合の使用の方法は、Ｗａｒｄの開示（先に引用）に記載される。精製した鎖からのシグナル生成は、プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドにおいて、またはプライマーに付加されているｄＮＴＰもしくはｄｄＮＴＰヌクレオチドにおいて、マーカーによって行われ得る。
【０１６８】
　本発明のプロセスは、単一のチャンネルおよび４つの異なる色素を使用する手順を含む全ての配列決定手順、ならびに４つのチャンネルおよび１つの色素を使用する手順のために、シグナル生成に適用され得る。このような手順において生成されるシグナルは、走査によってリアルタイムで分析され得る。
【０１６９】
　従って、本発明は、核酸配列決定のための、終結後標識プロセルを提供し、これは３つの工程を含む。第１に、目的の核酸配列に対応する核酸フラグメントは、各ヌクレオチド塩基についての、非タグ化または非標識化基質、非タグ化または非標識化プライマー、ポリマー化酵素、緩衝液、および適切な非タグ化または非標識化ターミネーターの存在下で生成される。ターミネーターの各々は、内部配列がタグ化分子に実質的に非反応性であり、そして化学反応が媒体またはマトリックスにおけるフラグメントの分離を実質的に妨害しない条件下で、タグ化分子に共有結合する化学反応基を含む。次に、媒体またはマトリックスにおいて生成されるフラグメントが分離され、続いて、この媒体またはマトリックスにおいてタグ化分子を検出する手段によって、分離したフラグメントが検出される。
【０１７０】
　種々の実施態様は、上記の終結後標識プロセスに含まれ得る。生成工程において、例えば、ターミネーターの化学反応基は、生成されるフラグメントへのそれらの酵素的取り込みの前に保護され得、次いで任意のタグ化分子に共有結合する前に脱保護され得る。化学反応基は、窒素、硫黄、または酸素原子を含み得る。さらに、上記のターミネーターにおける化学反応基は異なり得るか、または同じであり得る。さらに、タグ化分子は同じであり得るか、または各ターミネーターとは異なり得る。当業者には、このようなタグ化分子が公知であり、そして蛍光色素、化学発光色素、赤外色素、化学発光実体、および電子化学発光実体、またはそれらの組合せからなる群から選択され得ることが容易に明らかである。
【０１７１】
　終結後標識プロセスの記載されたばかりの実施態様および特徴に加えて、分離工程は電気泳動的に行われ得、そして媒体またはマトリックスは、ポリアクリルアミドゲルのようなゲルを含み得る。分離はまた、キャピラリーゲル電気泳動によって行われ得る。
【０１７２】
　検出に関して、この工程は、光度測定、分光光度測定、比色測定、蛍光定量測定、遅延蛍光測定、および化学発光測定、またはそれらの組合せから選択される手段によって行われ得る。
【０１７３】
　（発明の有用性）
　核酸配列の直線的および非直線的増幅を行い得る、本発明の種々の局面は、等温およびサーモサイクラー依存性方法についての先行技術に記載される方法によって以前に行われている多くの機能を満たし得る。これらとしては、配列決定、プローブ合成および標識、法医学的同定、対立遺伝子同定、遺伝的スクリーニング、所望の遺伝子の単離およびクローニング、人工遺伝子構築、遺伝子発現、ならびに診断用同定が挙げられ得るがこれらに限定されない。逆転写酵素または逆転写が可能なＤＮＡポリメラーゼは、開始基質としてＲＮＡ分子を用いて、本発明を実行するために使用され得る。反応は、プライマーまたは試薬の任意の改変の非存在下で行われ得るか、あるいは所望であれば、標識または他の改変がなされ得る。増幅した配列の存在は、標識化部分の取り込みまたは直接的視覚化のいずれかによって直接アッセイされ得る。同定の間接的手段もまた、適切なプローブとのハイブリダイゼーションによって行われ得る。これらの間接的手段としては、ドットブロット、スロットブロット、サザンブロットおよびプレートアッセイ形式が挙げられ得るがこれらに限定されない。
【０１７４】
　特定の核酸配列は、テンプレートに結合するプライマーに存在すること、または複数のプライミング事象のための自己相補領域を作製することを必要とするが、さらなる核酸配列は、プライマー配列に含まれて、それらの存在により所望の特性が提供され得る。これらとしては、所望の核酸配列およびアンプリコンの同定または単離に使用される配列のさらなる増幅を可能にするファージＲＮＡプロモーターが挙げられ得るがこれに限定されない。配列は、各末端で逆方向反復を有するアンプリコンを作製するプライマーまたはプライマー構築物に含まれ得る。次いで、このセグメントは、結合および伸長のためにいずれかの鎖を使用し得る単一プライマーまたはプライマー構築物のための結合部位として使用され得る。挿入された配列の選択は任意であるので、このセグメントは、間の配列とは関係なく増幅に使用され得る普遍的な標的であり得る。
【０１７５】
　本発明によって提供されるのはまた、相補的配列に対する熱力学的安定性が減少されている核酸配列を生成するためのプロセスである。このプロセスにおいて、負に荷電した化学部分を有する少なくとも１つの改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログが、生成される核酸配列に取り込まれる。
【０１７６】
　本発明のさらなる提供は、直鎖状核酸、分枝核酸、逆方向核酸、およびペプチド−核酸、または前述のいずれかの組合せからなる群より選択される１本鎖または２本鎖核酸ポリマーである。核酸ポリマーは、少なくとも１つのプリンまたはピリミジン塩基を含み、これらはポリマーの１つまたは両鎖において、１つの負に荷電した化学部分を含む。
【０１７７】
　本発明はさらに、上記の種々のプロセスにおける使用のために組成物およびキットを意図しそして包含する。
【０１７８】
　以下の実施例は、本発明の種々の局面を例示するために示されるが、本明細書下記の請求の範囲においてより詳細に示され、そして規定されるような範囲を限定することを決して意図されない。
【実施例】
【０１７９】
　（実施例１　５３℃および６３℃でのＢｓｔポリメラーゼによるＰＣＲ産物の等温増幅）
　（ｉ）ＨＢＶプラスミドＤＮＡのＰＣＲ増幅
　ＨＢＶマイクロタイタープレートアッセイ（ＥＮＺＯ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＮＹ，ＮＹ）からのＨＢＶポジティブコントロールを、ＰＣＲによる増幅のための標的として使用した。製造業者によると、このＤＮＡは８０ｐｇ／ｕｌ（ｕｌにつき１．２×１０7コピーのＨＢＶと同量）である。１ｕｌのＨＢＶ標的、１×ＰＥ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）、４ｍＭのＭｇＣｌ2、２５０ｕｍのｄＮＴＰ、６単位のアンプリサーム（Ａｍｐｌｉｔｈｅｒｍ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）、ならびに１０ピコモルのＨＢＶオリゴプライマーＦＣおよびＲＣからなる５０ｕｌのＰＣＲ反応を実施した。
ＦＣ配列＝５’−ＣＡＴＡＧＣＡＧＣＡ　ＧＧＡＴＧＡＡＧＡＧ　ＧＡＡＴＡＴＧＡＴＡ　ＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴ　ＧＣＧＧＣＧＴＴＴ−３’
ＲＣ配列＝５’−ＴＣＣＴＣＴＡＡＴＴ　ＣＣＡＧＧＡＴＣＡＡ　ＣＡＡＣＡＡＣＣＡＧ　ＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡ　ＴＧＧＴＣＣＣＧＴＡ−３’。
【０１８０】
　この実施例において、ＦＣプライマーの３’末端における２９塩基、およびＲＣプライマーの３’末端における３０塩基は、テンプレートとしてＨＢＶ標的ＤＮＡを使用して伸長し得る第１のセグメントである。ＦＣおよびＲＣプライマーの５’末端における３０塩基は、テンプレートとしてＨＢＶ　ＤＮＡを使用して、プライマーの伸長によって合成された最初の３０塩基に相補的な第２のセグメントである。熱循環条件は、９４℃を１’、５６℃を１５”、および６８℃を３０”を３０サイクル行った。ＨＢＶ配列に基づいて、予想されたＰＣＲ産物は長さが２１１ｂｐであるべきである。ステムループ構造は、それぞれ、第２のセグメントおよびその相補体により与えられる３０塩基対のステム、ならびにＦＣおよびＲＣの第１のセグメントにより与えられる２９および３０塩基のループを伴って、この生成物のそれぞれの末端において起こり得る。
【０１８１】
　（ｉｉ）ＰＣＲ産物の分析
　増幅は、０．５ｕｇ／ｍｌの臭化エチジウムの存在下で、０．５×ＴＢＥ緩衝液を用いて流した４％Ｍｅｔａｐｈｏｒアガロースゲル（ＦＭＣ　ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）中の１０ｕｌのサンプルのゲル電気泳動によってアッセイした。ＵＶ照射下で、３つのバンドが出現し、それらはＤＮＡサイズマーカーによる判定で、長さがおよそ２１０、１８０、および１７０ｂｐであった。２１０ｂｐに対応するバンドは、予想された線状ＰＣＲ産物であり、そしておそらく他の２つのバンドは、同じサイズのアンプリコンに対応しており、ここで、二次構造が一方または両方のいずれかの末端上で形成され、それによってそれらの効果的な移動度が変化している。
【０１８２】
　（ｉｉｉ）ＰＣＲ産物の等温増幅
　上記のＰＣＲ産物の種々の希釈物５ｕｌは、１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液（ＮＥ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、２００ｕＭのｄＮＴＰ、２０ピコモルの正方向および逆方向プライマー、８単位のＢｓｔポリメラーゼ（ＮＥ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ　ＭＡ）からなる１００ｕｌの反応混合物中で使用された。正方向プライマーはＦＣまたはＬＦＣのどちらかであり、逆方向プライマーはＲＣまたはＬＲＣのどちらかであった。ＦＣおよびＲＣプライマーの配列は上記に示した。ＬＦＣおよびＬＲＣプライマーは、ＦＣおよびＲＣプライマーだけの第１のセグメントに対応する配列を有している。そのような配列は以下のとおりである：
ＬＦＣ＝５’−ＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴ　ＧＣＧＧＣＧＴＴＴ−３’
ＬＲＣ＝５’−ＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡ　ＴＧＧＴＣＣＣＧＴＡ−３’。
【０１８３】
　インキュベーションは、３０分、１８０分、もしくは終夜のインキュベーションであった。反応温度は５３℃もしくは６３℃のどちらかであった。３０分反応したものは２％アガロースゲルを用いてゲル電気泳動で分析した；１８０分反応したものは４％Ｍｅｔａｐｈｏｒアガロースを用いて分析した。
【０１８４】
　この分析結果を図１７に示す。３０分インキュベーションの後に取り出したサンプルの最初の組の中で、ＰＣＲ産物の１０-2希釈物だけが５３℃でいくらかの合成を示すが、６３℃からの反応物は、１０-2、１０-3および１０-4希釈物で合成を示している。これらのデータは、合成量は加えた標的ＤＮＡの量に依存するということを示している。１８０分の合成の後に取り出されたサンプルの組では、実質的により多くの合成が行われている。これらの反応の生成物は、分離したパターンを形成する一連のバンドである。これは、通常ＰＣＲで見られる単一の分離したバンド、またはＰＣＲ増幅の後でＬＣおよびＲＣプライマーを用いて以前に見られた２つもしくは３つのバンドと対照をなしている。この複数のバンドは、おそらく、アンプリコンをプライマーおよびテンプレートとして機能させる二次構造の存在に起因し得るか、またはストランドスイッチングの徴候であり得る。５３℃で３時間インキュベーションした後、標的が少しもないようなコントロールでさえ、実質的な合成の証拠を示している。しかし、標的テンプレートを有するすべての５３℃の反応物に見られる、単一の標的依存性パターンが存在し、そして標的なしのコントロールに存在するパターンは実質的に異なることが留意され得る。これはおそらく標的が合成を開始した経路が異なっていることに起因する。６３℃でインキュベーションしたものは、全てのテンプレート希釈物で実質的な合成を示し、そして同じパターンが５３℃の反応によって生成されることを証明する。しかし、本実施例においては、６３℃では、標的非依存性増幅の証拠はない。１０-5の希釈でさえ実質的な量の合成があるということは、この系が実質的な増幅をし得ることを示している。終夜のインキュベーションもまたゲルによって分析され、そして３時間インキュベーションと同じパターンおよび同じ量を示した（データ表示なし）。
【０１８５】
　（実施例２　ＨＢＶ配列の等温増幅の時間経過／感度）
　（ｉ）増幅
　Ｅｃｏ　Ｒ１であらかじめ消化されたＨＢＶプラスミドＤＮＡを、等温増幅のテンプレートとして使用した。ＤＮＡ混合物は、　ＦＣおよびＲＣプライマーがそれぞれ４０ｐＭ、１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液（Ｎ．Ｅ．Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ　ＭＡ）および４×１０6、４×１０4、または０　ＨＢＶ分子を含む１００ｕｌからなった。これらはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）製のサーモサイクラーモデル４８０を使用して５分間で９４℃まで熱した。次いで装置を６３℃で４８０分セットした。ブロックを６３℃に調節した後、酵素混合物２５ｕｌを含有する個々のチューブをサーモサイクラーブロックの中に置いた。それぞれの酵素混合物チューブは、４単位のＢｓｔポリメラーゼ（Ｎ．Ｅ．Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ　ＭＡ）、１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液（Ｎ．Ｅ．Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ　ＭＡ）、および４００ｕＭのｄＮＴＰを含有した。ＤＮＡ混合物、および酵素混合物を６３℃に調節した後、２５ｕｌのサンプルをそれぞれのＤＮＡ混合物から採取し、合計容量がそれぞれ５０ｕｌになるようにそれぞれの酵素混合物チューブに加えた。ＤＮＡ混合物のそれぞれのチューブ用として、３件のサンプルを採取した。それぞれのＤＮＡ濃度用についてひとつのサンプルを、２、４、および８時間後に６３℃のブロックの外に取り出した。
【０１８６】
　（ｉｉ）増幅のアッセイ
　標的依存性増幅と標的非依存性増幅とを区別するために、マイクロタイタープレートアッセイを標的特異的配列の存在を検出するために使用した。このアッセイ用に使用される試薬および説明書は、ＬＣおよびＲＣプライマーによって作られたアンプリコンに特異的なプレートおよびシグナルプローブを置換して、ＥＮＺＯ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）製のＨＢＶマイクロタイタープレートアッセイから得られた。
【０１８７】
　（ｉｉｉ）マイクロタイタープレートの調製
　プレートを、それぞれにおいて１２個の（ダイネル？）ストリップ（製造業者）を有する５個のフレームを使用したバッチプロセスで調製した。これらのプレートに使用した捕獲オリゴヌクレオチドの配列は、ＦＣおよびＲＣプライマーの間にあるＨＢＶの領域に由来し、そして以下のとおり記載される：
５’−ＣＴＣＡＴＣＴＴＣＴ　ＴＡＴＴＧＧＴＴＣＴ　ＴＣＴＧＧＡＴＴＡＴ　ＣＡＡＧＧＴＡＴ−３’。
【０１８８】
　それぞれのマイクロタイタープレートのウェルを１Ｍ酢酸アンモニウム２００ｕｌで２回リンスし、次いで室温で２時間逆さにしておいた。上記捕獲オリゴヌクレオチド１００ｕＭを含有する溶液１０ｕｌを、１Ｍ酢酸アンモニウム２７．５ｍｌと混合した。この溶液の５０ｕｌをそれぞれのウェルに加え、そしてプレートを、１Ｍ酢酸アンモニウム入りの開口容器と共にインキュベーター中で３７℃で終夜インキュベートした。翌日、それぞれのウェルを１Ｍ酢酸アンモニウム２００ｕｌで一回洗浄し、およびプレートを終夜乾燥した。次いでストリップは将来使用するために乾燥剤と共にポーチ中に放置した。
【０１８９】
　（ｉｖ）プローブの調製
　増幅のためのプライマーとして使用されるＲＣオリゴヌクレオチドは、プレートアッセイのためのシグナルプローブとしても使用される。ＲＣオリゴヌクレオチド１００ｕＭのＴ−テーリングは、ＥＮＺＯ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）からの末端テーリングキットの使用によって達成された。テーリングしたＲＣオリゴヌクレオチド２６ｕｌを、シグナルプローブ緩衝液（３３％脱イオン化ホルムアミド、５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、２．５％デキストラン硫酸、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．１２ＭのＨＥＰＥＳ（遊離酸）、０．０１％フェノールレッド）１２．８ｍｌと混合した。
【０１９０】
　ｅ）反応物からのサンプルを用いたマイクロタイタープレートアッセイの結果を以下に示す：
　　　　　　　　　　２時間　　　　　４時間　　　　　８時間
１×１０6標的　　　０．４１３　　　１．４９１　　　１．４１９
１×１０4標的　　　０．２０３　　　０．０９８　　　１．０１７
標的なし　　　　　　０．０８６　　　０．０８５　　　０．０６３
　上記に見られるように、生成物の量は、初期の標的の量および反応が進行する時間量の両方と関係があった。標的がないときに形成された任意の生成物から発生したシグナルもなかった。またこのアッセイでは１．４以上の値は飽和値であり、そして生成物の量は、はるかに大きくなり得る。生成物の全量の評価には、それがアッセイのダイナミックレンジに入るまで生成物を希釈することが要求される。しかし、この実施例の目的のために、これを実行しなかった。上記の増幅反応は、Ｂｓｔポリメラーゼの使用には依存しない。違う酵素Ｂｃａポリメラーゼ（ＰａｎＶｅｒａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）が置換される場合、実質的な量の合成もプレートアッセイ（データ表示なし）に見られ得る。さらに、Ｂｓｔ反応の最大温度は６３℃であるようであるが、　Ｂｃａポリメラーゼが置換された場合、増幅が６８℃で達成され得る。それぞれの酵素に添付された文献によると、ＢｓｔおよびＢｃａポリメラーゼの最適な温度はそれぞれ６５℃および７０℃である。このことはそれらの最高温度が５℃違うことを説明し得る。
【０１９１】
　（実施例３　ΔＴｔｈのポリメラーゼでの増幅）
　ＢｓｔまたはＢｃａポリメラーゼの熱不安定性により、前実施例における反応は２つの段階で達成されなければならなかった。標的ＤＮＡの変性は、ポリメラーゼの不存在下で行われ、続いてより低温での平衡の後に酵素が添加された。取り扱う工程を減少させ、およびアンプリコンキャリーオーバーの混入の機会を減少させるように、初期の段階においてポリメラーゼを含め得ることが所望される。従って、等温増幅を達成するためのＴｔｈのポリメラーゼの５’−３’エキソ誘導体の使用を許容する条件が確立された。この特定の実施例において、ＦＪおよびＲＪと称される２つのプライマーを使用し、これは以下の配列を有していた：
ＦＪ配列＝５’−ＣＡＴＡＧＣＡＧＣＡ　ＧＧＡＴＧＡＡＧＡＧ　ＧＡＡＴＡＴＧＡＴＡ　ＧＣＴ　ＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴ　ＧＣＧＧＣＧＴＴＴ−３’
ＲＪ配列＝５’−ＴＣＣＴＣＴＡＡＴＴ　ＣＣＡＧＧＡＴＣＡＡ　ＣＡＡＣＡＡＣＣＡＧ　ＴＧＣ　ＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡ　ＴＧＧＴＣＣＣＧＴＡ−３’。
【０１９２】
　これらのプライマーのそれぞれは上記のＦＣおよびＦＪプライマーと、それらが各々の第１のセグメント中に３つ多いヌクレオチド（上記下線部）を有していることを除いて類似している。反応を１×１０6、１×１０4、または１×１０2ＨＢＶ標的分子を用いて設定した。１つの反応物は、ＨＢＶ　ＤＮＡの代わりにＴ７　ＤＮＡを５０ｎｇ含有し、そしてこれを標的なしのコントロールとして使用した。反応条件は以下のとおりである：２つの相で実施されなければならない等温増幅を制限する；第１の工程は標的分子の９４℃の高温変性であった。
【０１９３】
　（ΔＴｔｈのポリメラーゼでの増幅）
　ＢｓｔまたはＢｃａポリメラーゼの熱不安定性により、前実施例における反応は２つの段階で実施されなければならなかった。標的ＤＮＡの変性を、ポリメラーゼの不存在下で実施し、続いてより低温での平衡の後に酵素を添加した。取り扱う工程を減少させ、およびアンプリコンキャリーオーバーの混入の機会を減少させるように、初期の段階においてポリメラーゼを含め得ることが所望される。従って、等温増幅を行うためのＴｔｈのポリメラーゼの５’−３’エキソ誘導体の使用を許容するように条件が確立された。この特定の実施例において、ＦＪおよびＲＪと称される２つのプライマーを使用し、これは以下の配列を有していた：
ＦＪ配列＝５’−ＣＡＴＡＧＣＡＧＣＡ　ＧＧＡＴＧＡＡＧＡＧ　ＧＡＡＴＡＴＧＡＴＡ　ＧＣＴ　ＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴ　ＧＣＧＧＣＧＴＴＴ−３’
ＲＪ配列＝５’−ＴＣＣＴＣＴＡＡＴＴ　ＣＣＡＧＧＡＴＣＡＡ　ＣＡＡＣＡＡＣＣＡＧ　ＴＧＣ　ＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡ　ＴＧＧＴＣＣＣＧＴＡ−３’。
【０１９４】
　これらのプライマーのそれぞれは上記のＦＣおよびＦＪプライマーと、それらが各々の第１のセグメント中に３つ多いヌクレオチド（上記下線部）をそれぞれ有していることを除いて類似している。等温反応またはＰＣＲ反応のいずれかが、５０ｕｌの反応容積中で１×１０6、１×１０4、または１×１０2ＨＢＶ標的分子と共に行われた。標的なしのコントロールはＨＢＶ　ＤＮＡの代わりに５０ｎｇのＴ７　ＤＮＡを含有したものも含んだ。それぞれの標的濃度は、ΔＴｔｈのポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）１０単位、１×ΔＴｔｈのポリメラーゼ緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）、２５０ｕＭのｄＮＴＰ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ2、１×ＰＣＲエンハンサー（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ならびにそれぞれが２０ピコモルのＦＪおよびＲＪプライマーを含む１００ｕｌの反応混合物中で設定した。それぞれの混合物を２つの５０ｕｌの部分に分けた。一方の５０ｕｌの部分は、９４℃までの５分間の加熱、続いてサーモサイクラーの中で６８℃で２４０分間置くことによる等温反応で使用した。他方の部分は、等温反応が終了するまで４℃で保持し、そしてサーモサイクラーを用いて、９４℃で１分間、そして６８℃で４５秒間を３５サイクル行い、この部分でのＰＣＲを実施した。
【０１９５】
　等温反応の程度は、前記実施例で説明したように、ゲル電気泳動およびプレートアッセイによって測定した。プレートアッセイは、Ｔ−テイル化プローブが、ＬＦＣプライマーに由来することを除いて上記のとおりに実施した。各々のこれらの方法に基づく結果を図１８に示す。ゲル電気泳動は、等温増幅後に１×１０6および１×１０4の標的反応物について広範な合成を示す。写真ではよく見えないが、ゲルは１×１０2の標的反応物についてより小さなレベルの増幅も示した。ＰＣＲ反応も同じゲル中で調査した。そして１×１０6および１×１０4の標的反応物について高いレベルの増幅を伴った本質的に類似の結果を示す。これらの条件下では、適切なアンプリコンの合成量とは反対に増加するより小さいアンプリコンを作り出した非特異的反応も見られた。等温反応がプレートアッセイによってアッセイされた場合も、より高いレベルの標的が飽和レベルを示し、そして１×１０4の標的レベルがポジティブな反応を与えると明確に示され得る。ネガティブなコントロールは、２つのアッセイのいずれによってもシグナル発生の徴候を示さないことに留意するべきである。
【０１９６】
　（実施例４　増幅のための単一プライマーの使用）
　それぞれのサンプルは、１×Ｔａｑ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）、５ｍＭのＭｇＣｌ2、２００ｕＭのｄＮＴＰｓ、および５単位のＡｍｐｌｉｔａｑ　Ｇｏｌｄ（　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ　）を含む５０ｕｌの反応物からなった。それぞれの反応は、以下の配列を有する５ｐＭのオリゴヌクレオチドプライマーも有している：
５’ＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡ　ＴＧＣＣＴＣＡＴＣＴ　ＧＡＣＡＡＡＣＧＧＧ　ＣＡＡＣＡＴＡＣＣＴ　ＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡ　ＴＧＣＣＴＣＡＴＣＴ−３’。
【０１９７】
　単一プライマー増幅は、標的ＤＮＡ（実施例１で上記の１ｕｌのコントロールＨＢＶ）ありもしくは無しで２連で実施した。反応は、サーモサイクラー中で９４℃で１サイクル、次いで９４℃１分間、６０℃１５秒間、および６８℃１５秒間を５０サイクル行うことで実施した。非特異的プライミングを還元するために、サンプルは初めのサイクルの間に９０℃に達するまで、サーモサイクラーブロックに加えなかった。
【０１９８】
　反応の程度を、実施例２で説明した同じプレート、プローブ、および形式を使用してマイクロタイタープレートアッセイによって分析した。反応（２連）の結果を以下に示した：
ＨＢＶ＋　　　　　１．４０７　　　０．３７７
標的なし　　　　　０．０８３　　　０．０８７。
【０１９９】
　上記に見られるように、２連の反応物から生じるシグナルの量においていくらか変動が存在するが、単一プライマーを伴う増幅を実行した後、標的配列の存在の明らかな指標が存在した。
【０２００】
　（実施例５　カルボキシ−ｄＵＴＰを伴うプライマー伸長）
　（ｉ）カルボキシ−ｄＵＴＰの合成
　０．２Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．２）中に１００マイクロモルのアリルアミン−ｄＵＴＰ（ＥＮＺＯ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）を含む溶液５ｍｌを、５ｍｌのジクロロメタン（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）に溶解した２０倍モル過剰の無水コハク酸（　Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ　）と共に混合した。この懸濁液を５０ｍｌのファルコンチューブに移し、そしてボルテックスした。水相のｐＨを、適量のトリエチルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）を添加することで９．２の値に再調整した。振盪および再調整をｐＨ値が安定するまで継続した。一定分量を採取し、アリルアミンのピークの消滅、およびカルボキシ改変生成物を表す遅れたピークの出現に対してＨＰＬＣで試験した。水相を取り除き、そして水で１０倍に希釈し、そして０．０５Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ７．８）で前もって平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ａ−５０カラム中へ充填した。生成物を炭酸水素トリエチルアンモニウムの０．０５Ｍ〜０．７０Ｍの勾配で抽出した。フラクションを採取し、２９０ｎＭでのＵＶ吸収で分析した。適切なフラクションはＨＰＬＣで純度をチェックした。＞９９．５％の純度を有するフラクションを一緒にプールし、そして塩を３０℃の真空中でロータリーエバポレーターで除去した。残留している固形物は適切な量の水に溶解し、および２９０ｎＭでの吸収により判定した場合に最終的に１０ｍＭの濃度に調整した。一定分量を調製し、そして使用するまで−７０℃で貯蔵した。
【０２０１】
　（ｉｉ）プライマー伸長反応
　プライマー伸長のためのテンプレートは、ＨＢＶの１．４ｋｂ挿入断片を含んだｍｐ１８クローンに由来するファージ粒子のＰＥＧ沈澱によって得られた１本鎖ＤＮＡであった。伸長のためのプライマーは、その配列がｍｐ１８ベクターのｌａｃ領域の部分に対して相補的であるＰＭ−１であった。このプライマーに由来する配列は以下の通りである：
５’−ＣＧＣ　ＣＡＧ　ＧＧＴ　ＴＴＴ　ＣＣＣ　ＡＧＴ　ＣＡＣ　ＧＡＣ−３’。
【０２０２】
　７．５ｕｇの１本鎖ＤＮＡおよび６０ｐＭのＰＭ１プライマーを含有するＤＮＡ混合物３００ｕｌを作製した。０．５ｕｌのポリメラーゼ、２×緩衝液、および２００ｎＭのｄＮＴＰを含有する分離した酵素混合物２５ｕｌを作製した。ここでそれぞれの条件についてひとつの反応物は通常のＴＴＰを有し、およびひとつの反応物はカルボキシ−ｄＵＴＰを有した。２５ｕｌのＤＮＡ混合物を、２５ｕｌの酵素混合物と混合し、そして３０分間適切な温度でインキュベートした。
【０２０３】
　次のポリメラーゼをこの実施例で使用した：Ｅｘｏ（−）　Ｋｌｅｎｏｗ（Ｑ単位／ｍｌ、ＮＥ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡより）、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔ単位／ｕｌ、ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤより）、およびＢｓｔポリメラーゼ（４単位／ｕｌ、ＮＥ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡより）。
【０２０４】
　緩衝液およびそれらの組成は以下のとおりである：
　１×ＮＥ緩衝液２（Ｎ．Ｅ．Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）は、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、５０ｍＭのＮａＣｌ、および１ｍＭのＤＴＴ（２５℃でｐＨ７．９）からなる。
【０２０５】
　緩衝液２Ａは、ｐＨが７．１であり、そしてＭｇＣｌ2が２ｍＭだけであること以外はＮＥ緩衝液２と同じであった。
【０２０６】
　緩衝液２Ｍは、ＭｇＣｌ2が２ｍＭだけであり、そして１ｍＭのＭｎＳＯ4も含んでいること以外はＮＥ緩衝液２と同じであった。
【０２０７】
　１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液（Ｎ．Ｅ．Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）は、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4、２ｍＭのＭｇＳＯ4、および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００からなる。
【０２０８】
　（ｉｉｉ）プライマー伸長反応の分析
　様々なポリメラーゼが基質としてカルボキシ−ｄＵＴＰを利用する能力の評価は、多数の違った方法で実施され得る。本実施例において、これは、標識された前駆体を使用せずに、ゲル分析による１本鎖ＤＮＡの２本鎖形態への転換の評価によって定性的に観察された。この転換現象は、１本鎖前駆体と比較してのアガロースゲル中でのその移動の遅延によって、およびより効率的に臭化エチジウムに結合するその能力に起因する蛍光の増加によって見られ得る。この方法は、カルボキシ−ｄＵＴＰの取り込みの研究の初期の評価で使用されたが、さらなる情報が、制限酵素で伸長生成物を消化することで得られ得る。この分析で使用される特定の制限酵素は１本鎖ＤＮＡを消化出来ないので、フラグメントの生成が制限酵素部位で２本鎖領域の指標である。環状ＤＮＡの線状小片への変形によって、異なったポリメラーゼによる転換量の比較評価をするのがより容易になる。加えて、様々な制限フラグメントの位置がプライマーに関連して知られているので、伸長した生成物の長さの評価が可能となる。
【０２０９】
　（ｉｖ）制限酵素での消化
　プライマー伸長反応からのテンプレートが改変していないＤＮＡからなるので、カルボキシ−ｄＵＴＰの反応は、正常である一方の鎖、およびどのＴも認識部位の部分である限り半置換された制限部位を生成するカルボキシ−ｄＵ誘導体で完全に置換された相補鎖を含む。評価のために使用した酵素は、ＢｓｔＮ１であり、その認識配列は、ＧＧ　Ａ／Ｔ　ＣＣである。コンピュータープログラムＭａｃＤＮＡＳＩＳ（Ｈｉｔａｃｈｉ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ａｍｅｒｉｃａ，Ｌｔｄ，Ｓｏｕｔｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ，ＣＡ）を個別にＧＧ（Ｔ）ＣＣ　およびＧＧ（Ａ）ＣＣ部位の位置を予測するために用いた。
【０２１０】
　（ｖ）反応の分析
　図１９は、種々の緩衝液、酵素および温度を用いた伸長反応の結果を示す。はじめに非置換ｄＮＴＰを用いた反応が、カルボキシ−ｄＵＴＰを用いた反応と異なるパターンを形成することが認められ得た。生成物におけるＧＧ（Ｔ）ＣＣおよびＧＧ（Ａ）ＣＣ配列の位置の分析によって、非置換反応のＢｓｔＮ１消化からのパターンが、ＧＧ（Ｔ）ＣＣおよびＧＧ（Ａ）ＣＣ部位の両方での期待された消化に起因するが、カルボキシ−ｄＵＴＰの反応がＧＧ（Ａ）ＣＣ配列でのみ消化を示したことが示された。反応はまた、基質としてｄＵＴＰを使用して行い、そして全ての部位に消化が存在し、このことはＢｓｔＮ１による消化に対する耐性の原因がｄＵの使用よりはむしろカルボキシおよびそのリンカーの存在であったことを示す（データは示していない）。図２０は、非合成についての（−）から、わずかに可視についての（＋／−）および（＋＋＋＋）の評価付けまでの評価された合成のレベルに関する図１９からの結果の編集である。一般に、カルボキシ−Ｕ取り込みのための最もよい合成は、Ｂｓｔポリメラーゼ／Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液条件で見られた。
【０２１１】
　（実施例６　ＰＣＲにおけるＭｇ＋＋の必要性に対するカルボキシル−Ｕの効果）
　ＰＣＲ増幅を、テンプレートとして２本鎖Ｔ７　ＤＮＡ、ならびにプライマーとして２つのオリゴヌクレオチドＴＳ−１およびＴＳ−４を用いて行った。これらのオリゴヌクレオチドは、１９９５年１２月１５日出願された米国出願第０８／５７４，４４３号に以前に記載され、そして６２２塩基対産物を生成する。４００ｎｇのＴ７　ＤＮＡ、５０ｐＭのＴＳ−１、５０ｐＭのＴＳ−４、１×ＰＥ緩衝液（ＢＲＬ）２００ｍＭ　ｄＮＴＰ、および１５ユニットのＴａｑポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）からなる１００μｌの反応を行った。サイクリング条件は、９４℃で５０秒間、５０℃で２５秒間および６８℃で３分間の２５サイクルであった。図２１にこの合成の結果を示す。通常のヌクレオチドを反応についての基質として使用した場合、１ｍＭ　ＭｇＣｌ2は増幅に適切であった。対照的に、反応をカルボキシ−ｄＵＴＰを用いて行った場合、２ｍＭ　ＭｇＣｌ2はオリゴのダイマーのみ生成し、最低３ｍＭ　ＭｇＣｌ2が適切なサイズのアンプリコンの合成に必要であった。
【０２１２】
　（実施例７　種々の熱安定ポリメラーゼ）
　増幅を、全ての反応を３ｍＭ　ＭｇＣｌ2の存在で行い、そして５ユニットのポリメラーゼのみを各反応に使用したことを除いて実施例Ｘ−２２で記載されているように行った。Ｔａｑポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）をＴｆｌ、Ｔｔｈ、ＡｍｐｌｉｔｈｅｒｍおよびＲｅｐｌｉｔｈｅｒｍポリメラーゼ（全てＥｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ　ＷＩから）と比較した。全ての反応は、各酵素とともに供給された緩衝液を使用した。反応のゲル分析を、図２２に示す。Ｔａｑの量を少なくさせると、実施例６で見られた反応と比較してカルボキシ−ＵＴＰの存在下で合成がかなり減少した。通常のＴＴＰでは全く効果がなかった。他のポリメラーゼについて、評価可能な量の生成物を与えたたった１つの酵素はＴｔｈポリメラーゼであり、そしてこれは使用した条件下でＴａｑポリメラーゼよりもより活性であった。
【０２１３】
　（実施例８）
　実施例７において、種々のポリメラーゼを用いる反応を、３ｍＭ　ＭｇＣｌ2の存在下で行った。しかし、これらのポリメラーゼのいくつかによる合成の欠失は、カルボキシ−ＵＴＰが基質の場合、異なるＭｇ++の濃度の必要性を反映し得る。カルボキシ−ＵＴＰの存在下で合成を示さなかったが、通常のＴＴＰで多量の合成を与えた酵素の１つは、Ｔｆｌポリメラーゼであった。この酵素を、上記と同じ反応条件下で試したが、２ｍＭ、４ｍＭおよび６ｍＭのＭｇＣｌ2レベルを反応に使用した。さらに、同じ力価測定を、ＰＥ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）中のＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）および５μｌのＰＣＲ　Ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ，Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を添加したＴｆｌポリメラーゼを用いて使用した。この結果を、図２３に示す。使用した条件下で、６ｍＭ　ＭｇＣｌ2がＴａｑポリメラーゼの合成に最良の量を与え、そしてＴｆｌ単独では、２、４、または６ｍＭ　ＭｇＣｌ2で合成を示さなかった。しかし、ＰＣＲ　Ｅｎｈａｎｃｅｒをその反応に含ませた場合、Ｔｆｌポリメラーゼは、検出可能な合成量を生成し得た。Ｔａｑと同様に、最も高いレベルを６ｍＭ　ＭｇＣｌ2で達成した。Ｔｆｌ／ＰＣＲ　Ｅｎｈａｎｃｅｒ反応について示された合成のレベルはまた、Ｔａｑ反応よりも高かった。ＰＣＲ　Ｅｎｈａｎｃｅｒをカルボキシ−ＵＴＰを用いる増幅のために、他の熱安定ポリメラーゼＴｔｈ、ＡｍｐｌｉｔｈｅｒｍおよびＲｅｐｌｉｔｈｅｒｍを用いて試した。この結果を、図２４に示す。　Ａｍｐｌｉｔｈｅｒｍポリメラーゼによって増幅を回復し得なかったが、　Ｒｅｐｌｉｔｈｅｒｍポリメラーゼについては、ここで合成が示された。　実施例７でカルボキシ−ＵＴＰを用いて増幅を示す唯一のＴａｑ以外のポリメラーゼであったＴｔｈポリメラーゼは、ＰＣＲ　Ｅｎｈａｎｃｅｒを用いた最も高いレベルの増幅を示した。また、一連のＴｔｈ／ＰＣＲ　Ｅｎｈａｎｃｅｒについて、８ｍＭ　ＭｇＣｌ2を用いた反応が６ｍＭ　ＭｇＣｌ2の反応よりも多い増幅を与えた。
【０２１４】
　（実施例９　増幅の温度条件の改変）
　２つのオリゴヌクレオチド、ＴＳ１３およびＴＳ１４は（これらはまた、ＥＮＺに記載された（？））を、カルボキシ−ｄＵＴＰの存在下でバクテリオファージＴ７　ＤＮＡの異なったセグメントの増幅のために使用した。これらのプライマーの生成物は、以前の実施例で合成された生成物より小さな１３６ｂｐのアンプリコンである。連続的な一連のＰＣＲ反応は、２相で行った。各反応はＴｔｈポリメラーゼならびに上記のＰＣＲ　Ｅｎｈａｎｃｅｒを使用した。各反応における第１相は、両方の鎖にカルボキシ−ｄＵを含むテンプレートを作製するために上記のサイクリング条件を使用する一連の５サイクルである。各反応における第２相は、アニーリング工程、伸長工程または変性の工程についての種々のより低い温度を使用した。変動温度の予備的な試みは、８０℃未満の温度がこのアンプリコンを用いて増幅を行うにおいて首尾良くないことを示し、その結果、最も高い温度と最も低い温度の間の差を近づける努力を、アニーリング温度を上げることによって行った。各セットの温度条件について、ＭｇＣｌ2レベルもまた、変化させた。３セットのこれらの反応のゲル分析から得た結果の編集を、以下に与える：
【０２１５】
【表１】
2004141170.tif 000002
　上記の反応に加えて、一連の反応を、６８℃で２分間のアニーリング／伸長工程と組み合わせた８０℃で２分間の変性工程を用いて行った。種々の因子もまた、反応の効率が増大し得るか否かを見るために、この圧縮サイクルに含ませた。これらの反応からの生成物を伴うゲルを、図２５に示す。最高と最低の温度の間の１２℃ほどの小さな差でもアンプリコンの増幅がなお存在し、そしてこれらの温度条件下での合成を増幅するようである唯一の因子は、さらなるポリメラーゼの添加であると理解され得る。
【０２１６】
　（実施例１０　プライマー配列における改変による圧縮温度増幅条件に対する効果）
　上記のＴＳ１３およびＴＳ１４プライマーに加えて、最高温度と最小温度の間の範囲がさらに圧縮され得るか否かを見るためにこれらの配列の変化を有するプライマーを設計した。ＴＳ１３、ＴＳ１４プライマーのための配列およびそれらの改変ならびにそれらが由来したＴ７ゲノムの領域を、図２６に示す。これらのプライマーの配列の違いは、アンプリコンのサイズにおいていくつかの小さな変化をつくるが、本質的に同じＴ７セグメントはこれらのプライマーを用いた各反応で増幅された。
【０２１７】
　一連の反応を、図２６からプライマーの種々の組み合わせを用いて行った。８０℃で２分間および６８℃で２分３０秒間の２０サイクルを用い、変性工程とアニーリング／伸長工程との間で１２℃の分離のみであった。これらの反応のゲル分析を、図２７に示す。全てのプライマーの組み合わせは、適切なバンドの増幅を示したがそれらの効率に違いが存在した。コントロールもまた、正常のｄＴＴＰまたはアリルアミン−ｄＵＴＰのいずれかがカルボキシ−ｄＵＴＰの代わりに使われた反応のこのセットに含まれた；これらの反応は、検出可能なレベルの増幅を与えなかった。
【０２１８】
　プライマーの同じ組み合わせを、８０℃で２分間および７２℃で２分３０秒間の２０サイクルで増幅反応において試した。これらの反応のゲル分析を、図２８に示す。これらの温度条件において、ほとんどのプライマーの組み合わせは増幅し得なかった。しかし、プライマー対の１つとしてＴＳ２３プライマーを含んでいた全ての反応は、増幅を与えた。ＴＳ２３プライマーとともに用いられた他のプライマーに関して、増幅の相対的レベルは、ＴＳ２１＞ＴＳ２２＞ＴＳ１３の順番であった。他の因子が含まれることもあり得るが、この順番付けは、テンプレート鎖のセグメント中に存在するカルボキシ−ｄＵＴＰ部分、ここに、プライマーが結合する数に対して逆の関係に関し得る。なぜなら、ＴＳ２１、ＴＳ２２、ＴＳ１３プライマーについてそれぞれ１０、１１、１４であるからである。図２８に示した結果は、カルボキシ−ｄＵＴＰを基質として用いる場合、増幅が変性温度とアニーリング／伸長温度との間がたった８℃の違いで行われ得ることを示す。
【０２１９】
　（実施例１１　プライマー伸長生成物の合成後の改変）
　プライマー伸長反応を、アリルアミンｄＵＴＰの存在で行った。反応のためのテンプレートは、以下の配列を有した；
５’−ＡＧＧＴＡＡＣＴＴＡ　ＡＧＡＴＧＧＴＣＡＧ　ＧＣＴＧＡＡＡＧＧＡ　ＧＧＡＡＣＴＡＴＡＴＣ　ＴＧＣＡＧＡＡ−３’。
【０２２０】
　反応に用いたプライマーは、前記のＴＳ１４であった。反応混合物は、各反応についての１２μｌの最終容量について１μｌのＴＳ１４プライマー（１００ｐｍｏｌｅｓ）、１μｌのテンプレート（１００ｐｍｏｌｅｓ）、２μｌの２５ｍＭ　ＭｇＣｌ2、２μｌの４００μＭ　ｄＧＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＡＴＰ、２μｌアリルアミン　ｄｄＵＴＰ（ＥＮＺＯ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）、１μｌのＡｍｐｌｉｔａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）、１〜３μｌのＴＡＰＳ緩衝液および０〜２μｌのＨ2Ｏからなった。ＴＡＰＳ緩衝液は、他の指示がない限りｐＨ９．６で２００ｍＭ　ＴＡＰＳ（ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、５００ｍＭ　ＫＣｌからなった。反応は、種々のレベルのＴＡＰＳ緩衝液を有し、そしてｐＨもまた種々であった。各反応についての詳細を与え、そして反応における量を評価し、そして図２９および３０に記載する。コントロールとして、酵素を含まないまたはアリルアミンｄｄＵＴＰの代わりにフルオレセインｄｄＵＴＰ（ＥＮＺＯ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）を用いた反応もまた含んだ。反応混合物を、９４℃で１分間加熱し、次に６８℃で１時間インキュベートした。
【０２２１】
　反応物を、微小遠沈管中で短時間遠心分離し、そして１μｌの５０ｍＭフルオレセイン−５（６）カルボキシアミド−カプロン酸　Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｆ１−ＮＨＳエステル）を各反応物に添加し、そして３７℃で３時間インキュベートした。合成および標識の程度を、アクリルアミドゲル電気泳動により評価した。フルオレセイン標識は、ＵＶ照射器上にゲルを置き、そしてＷｒａｔｔｅｎ　５８　Ｋｏｄａｋ　Ｆｉｌｔｅｒ（ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いてポラロイド写真を撮ることにより同定した。次いでゲルを、２０分間エチジウムブロミドで染色し、続いて２０分間脱染色し、そして通常のフィルターを用いて写真を撮った。図２９は種々の反応条件の各々の取り込まれたフルオレセイン（一番上のゲル）およびエチジウムブロミド染色（底のゲル）により提供される蛍光を示す。これらのゲルの写真はまた、スキャンし、そしてそれら各々のネガを作った。この結果を、図３０に示す。ネガは、実験の結果のよりよい評価を提供する。反応に用いられる種々の条件下で蛍光シグナルを生成し得る、生じた伸長生成物が存在することが写真上に見られ得る。最も高いレベルは、ｐＨ９．７で３×ＴＡＰＳで達成されたようである。この実験はまた、フルオレセインで予め改変したｄｄＵＴＰを用いたコントロールよりも合成後改変でより高いシグナルの生成があることを示した（レーン８）。下方のゲル中で見られる合成の程度はまた、たとえ予め改変したｄｄＵＴＰの最小の取り込みが存在したとしても、通常の塩基の取り込みが存在したレーン８における上位のバンドの存在で見られ得、このアプローチの有用性を示す。
【０２２２】
　多くの明らかな改変は、本発明の上記の詳細な説明を鑑みて当業者に示唆される。全てのそのような明らかな改変は、十分に考えられ、これ以下の請求の範囲に示す本発明の範囲および精神により包含される。
【０２２３】
　本発明は、直線的および非直線的な増幅を含む、目的の核酸配列を増幅させるための新規プロセスを提供する。直線的な増幅において、単一の初期プライマーまたは核酸構築物が増幅プロセスを行うために利用される。非直線的な増幅においては、第１の初期プライマーまたは核酸構築物は続く初期プライマーおよび核酸構築物を用いて使用される。本発明によって提供される他の非直線増幅プロセスにおいて、第１の初期プライマーまたは核酸構築物は、提供される目的の特定の核酸配列およびその相補体を増幅するために第２の初期プライマーまたは核酸構築物を用いて配置される。非直線的な増幅が可能な単一のプライマーまたは単一の核酸構築物はまた、本発明に従う非直線的な増幅を行うためにも使用され得る。核酸配列決定のための終結後標識プロセスもまた、鎖ターミネーターとして提供された化学的反応基に共有結合したタグ化分子の検出に基づく本発明中で開示される。相補的な配列に対する熱力学的安定性が減少した核酸配列を生成するためのプロセスもまた提供され、そして本発明によって達成される。他の新規組成物、キット等に加えて、独特の核酸ポリマーもまた開示され、そして提供される。
【図面の簡単な説明】
【０２２４】
【図１】新規のプライマーによる直線的増幅を示す模式図である。
【図２】新規のプライマーおよび標準的なプライマーによる非直線的増幅を示す模式図である。
【図３】一対の新規のプライマーによる非直線的増幅を例示する模式図である。
【図４】それらの配列の一部を、テンプレートとして使用されることから防ぐ改変を含む、一対の新規のプライマーによる非直線的増幅を示す模式図である。
【図５】構築物の一部がテンプレート依存性伸長後にヘアピン形成し得る２つの３'末端を有する核酸構築物によって行われ得る一連の反応を示す模式図である。
【図６】図５に示されるプロセスおよび事象の続きを示す模式図である。
【図７】２つの３'末端を有する核酸構築物によって行われ得る一連の反応を示す模式図である。ここで、３'末端の各々は、テンプレート依存性伸長後にヘアピンを形成し得る。
【図８】図７に示されるプロセスおよび事象の続きを示す模式図である。
【図９】非直線的に増幅し得る単一のプライマーの、テンプレート依存性伸長および自己プライミング／自己伸長を例示する模式図である。
【図１０】図９のプロセスおよび事象の続きを示す模式図である。潜在的な分子内アニーリングおよび分子間アニーリングは、配列の連続付加を可能にする。
【図１１】図１０におけるプロセスおよび事象の改変をさらに例示する模式図である。ここで、初期プライマーは、プライマーの部分がテンプレートとして使用されることを可能にしない改変を含む。
【図１２】非直線的に増幅し得る２つの３'末端を有する新規の核酸構築物を例示する模式図である。
【図１３】非直線的に増幅し得る２つの３'末端を有する新規の核酸構築物についての別の設計の例示を示す模式図である。
【図１４】図１３に示されるプロセスおよび事象の続きを示す模式図である。
【図１５】非直線的に増幅し得る２つの３'末端を有する新規の核酸構築物についての別の設計を例示する模式図である。
【図１６】図１５に示されるプロセスおよび事象の続きを示す模式図である。
【図１７】ＰＣＲによって作製される標的の等温増幅のゲルアッセイを示す電気泳動写真である。
【図１８】ＨＰＶプラスミドＤＮＡの等温増幅についてのゲルアッセイおよびプレートアッセイの結果をそれぞれ示す電気泳動写真および表である。
【図１９】そこで規定される種々の反応条件下での、カルボキシｄＵＴＰおよび正常なｄＴＴＰでのＰＣＲ反応についてのゲルアッセイの結果を示す電気泳動写真である。
【図２０】図１９の結果を要約する表である。
【図２１】カルボキシｄＵＴＰの存在下での、ＰＣＲ合成における種々のレベルのＭｇＣｌ2の効果を示す電気泳動写真である。
【図２２】カルボキシｄＵＴＰの存在下でＰＣＲ合成を行うための、種々のポリメラーゼの能力についてのゲルアッセイの結果を示す電気泳動写真である。
【図２３】カルボキシｄＵＴＰの存在下での、種々の酵素でのＰＣＲ合成における種々のレベルのＭｇＣｌ2の効果を示す電気泳動写真である。
【図２４】カルボキシｄＵＴＰおよびＰＣＲエンハンサーの存在下での、種々の酵素でのＰＣＲ合成における種々のレベルのＭｇＣｌ2の効果を示す電気泳動写真である。
【図２５】カルボキシｄＵＴＰの存在下での、ＰＣＲ合成における種々の添加物の効果を示す電気泳動写真である。
【図２６】カルボキシｄＵＴＰの存在下でのＰＣＲ合成に使用される、テンプレートおよびプライマーの配列を示す図である。
【図２７】カルボキシｄＵＴＰの存在下での、ＰＣＲ合成のためのプライマーの種々の組合せについてのゲルアッセイの結果を示す電気泳動写真である。
【図２８】そこに示される異なる温度での、カルボキシｄＵＴＰの存在下での、ＰＣＲ合成のためのプライマーの種々の組合せについてのゲルアッセイの結果を示す電気泳動写真である。
【図２９】蛍光マーカーの合成的な付着後に使用される種々の条件についてのゲルアッセイの結果を示す電気泳動写真である。
【図３０】図２９の結果のネガティブ画像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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