(57)【要約】【課題】    除神経筋キナーゼ「Ｄｍｋ」と呼ばれる新規のチロシンキナーゼを提供すること。【解決手段】    本発明は、ｄｍｋと称される遺伝子を提供する。この遺伝子は、除神経筋において高レベルで発現される新規なチロシンキナーゼレセプターをコードする。本発明はまた、ｄｍｋ遺伝子産物に結合するリガンドを検出および／または測定するために使用され得るアッセイシステムを提供する。本発明はまた、Ｄｍｋと、Ｄｍｋへの結合を通してシグナル伝達を開始する薬剤との間の相互作用に基づく診断方法および治療方法を提供する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）図１に示される核酸配列あるいは（ｂ）その配列の一部であって、図１に示されるアミノ酸配列の細胞外ドメイン、膜貫通部分、または細胞内ドメインをコードする配列あるいは（ｃ）その配列の一部であって、図１に示されるアミノ酸配列の細胞外ドメイン、膜貫通部分および細胞内ドメインをコードする配列を含む実質的に精製された組換え核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（１．序文）
本発明は、新規のオーファンレセプター分子およびその使用、ならびにこれらのレセプターと相互作用する新規のリガンドを同定するのに有用なアッセイシステムを提供する。
【０００２】
（２．発明の背景）
細胞に結合し、そしてそれによりこれらの細胞内に細胞の成長、生存、または分化のような表現型応答を誘発するポリペプチドリガンドの能力は、膜貫通チロシンキナーゼによって媒介されることが多い。各レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の細胞外部分は、リガンド識別特性を有するタンパク質を提供するため、一般に、分子のなかで最も特徴的な部分である。細胞外ドメインにリガンドが結合することによって、細胞内チロシンキナーゼ触媒ドメインを介してシグナル伝達が生じ、これは細胞内のターゲットタンパク質に生物学的シグナルを伝達する。
【０００３】
この細胞質の触媒ドメインの配列モチーフの特定の並びが、潜在的なキナーゼ基質へのアクセスを決定する（Ｍｏｈａｍｍａｄｉら、１９９０、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１１：５０６８−５０７８頁：Ｆａｎｔｌら、１９９２、Ｃｅｌｌ、６９：４１３−４１３頁）。
【０００４】
すべての公知の成長因子ＲＴＫは、リガンドの結合に続いて二量化されると考えられる（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．、１９８８、Ｔｒｅｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１３：４４３−４４７頁；ＵｌｌｒｉｃｈおよびＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、１９９０、Ｃｅｌｌ、６１：２０３−２１２頁；ＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒおよびＵｌｌｒｉｃｈ、１９９２、Ｎｅｕｒｏｎ  ９：３８３−３９１頁）。：二量化する細胞質ドメイン間の分子の相互作用により、キナーゼ機能が活性化される。血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ）のようないくつかの場合には、リガンドは２つのレセプター分子を結合させるダイマーである（Ｈａｒｔら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：１５２９−１５３１頁；Ｈｅｌｄｉｎ、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：８９０５−８９１２頁）が、例えばＥＧＦの場合には、リガンドはモノマーである（Ｗｅｂｅｒら、１９８４、Ｊ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５９：１４６３１−１４６３６頁）。
【０００５】
より高度な微生物内の特定のチロシンキナーゼレセプターの組織分布により、レセプターの生物学的機能に関する関連データが提供される。繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）のような成長および分化因子のためのチロシンキナーゼレセプターは広範に発現され、従って組織の成長および維持に一般的な役割を果たすと考えられる。レセプターのＴｒｋ  ＲＴＫファミリー（ＧｌａｓｓおよびＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ、１９９３、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、印刷中）のメンバーは、より一般的には、神経系の細胞に限定され、これらのレセプターに結合する神経栄養因子は、脳および末梢の多様なニューロン群の分化を促進する（Ｌｉｎｄｓａｙ，Ｒ．Ｍ．、１９９３、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒｓ、Ｓ．Ｅ，ＬｏｕｇｈｌｉｎおよびＪ．Ｈ，Ｆａｌｌｏｍ編、２５７−２８４頁（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ））。  このようなＴｒｋファミリーレセプターの１つ、ｔｒｋＢの組織内での局所化により、このレセプターならびにこのレセプターに結合するリガンド（本明細書では同族と呼ぶ）の潜在的な生物学的役割へのいくつかの洞察が提供された。従って、例えば、成体マウスでは、有意なレベルのｔｒｋＢ  ｍＲＮＡは肺、筋肉、および卵巣内でも観察されたが、ｔｒｋＢは脳組織内で優先的に発現されることが見出された。さらに、ｔｒｋＢ転写物は妊娠中期および後期の胎児内で検出された。１４および１８日齢のマウス胎児のインサイチュハイブリダイゼーション分析により、ｔｒｋＢ転写物は、脳、脊髄、脊髄神経節および頭蓋神経節、交感神経系の脊椎神経幹ならびに種々の神経感応経路を含む中枢神経系および末梢神経系に局在していることが示された。これは、ｔｒｋＢ遺伝子産物が、神経発生および初期の神経発達に関与するレセプターであり、そして成体の神経系で役割を果たし得ることを示唆している。
【０００６】
ＲＴＫが発現される細胞環境は、リガンドのレセプターへの結合において示される生物学的応答に影響を与え得る。従って、例えば、Ｔｒｋレセプターを発現するニューロン細胞が、そのレセプターに結合する神経栄養因子に曝される場合、ニューロンは生存し、分化する。同じレセプターが繊維芽細胞によって発現される場合には、神経栄養因子への曝露が繊維芽細胞の増殖を生じる（Ｇｌａｓｓら、１９９１、Ｃｅｌｌ  ６６：４０５−４１３頁）。従って、細胞外ドメインはリガンド特異性に関する決定因子を提供し、そして一旦シグナル伝達が開始されると、細胞環境がそのシグナル伝達の表現型の結果を決定すると考えられる。
【０００７】
多くのＲＴＫファミリーが、これらの細胞内ドメインの配列ホモロジーに基づいて同定されている。例えば、ＴＩＥ−１およびＴＩＥ−２として知られる、ＴＩＥ（免疫グロブリンおよびＥＧＦ相同ドメインを有するチロシンキナーゼ）ファミリーの２つのメンバーは、細胞内領域に７９％の配列ホモロジーを有する（Ｍａｉｓｏｍｐｉｅｒｒｅら、１９９３、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６３１−１６３７頁）。これらのレセプターは細胞外ドメインに類似したモチーフを共有するが、配列の３２％のみが同一である。これは潜在的に互いに異なる生物学的役割を示すものであって、両方の遺伝子が胎児および出生児の組織の内皮細胞内に広く発現される一方で、有意なレベルのｔｉｅ−２転写物も、水晶体上皮、心外膜および間充織の領域を含む他の胎児細胞集団中に存在するという事実に反映されている。
【０００８】
ＮＧＦによって利用されるレセプターおよびシグナル伝達の経路には、ｔｒｋプロトオンコジーンの産物が含まれる（Ｋａｐｌａｎら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ  ３５０：１５６−１６０頁；Ｋｌｅｉｎら、１９９１、Ｃｅｌｌ  ６５：１８９−１９７頁）。Ｋｌｅｉｎら（１９８９、ＥＭＢＯ  Ｊ．８：３７０１−３７０９頁）は、ヒトｔｒｋプロトオンコジーンに高度に関連することが分かっているレセプターのチオシンタンパク質キナーゼファミリーの第２のメンバーをコードする、ｔｒｋＢの単離について報告した。ＴｒｋＢは、ＢＤＮＦ、ＮＴ−４、およびより低い程度ではＮＴ−３に結合しこれらへの機能的応答を媒介する（Ｓｑｕｉｎｔｏら、１９９１、Ｃｅｌｌ  ６５：８８５−９０３頁：Ｉｐら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：３０６０−３０６４頁；Ｋｌｅｉｎら、１９９２、Ｎｅｕｒｏｎ，８：９４７−９５６頁）。アミノ酸レベルでは、ｔｒｋおよびｔｒｋＢの産物は、ｔｒｋに存在する１１個のシステインのうちの９個を含む細胞外領域中に、５７％のホモロジーを共有することが分かった。このホモロジーは、チロシンキナーゼ触媒ドメイン内では８８％に増大することが分かった。Ｔｒｋ遺伝子ファミリーは現在では拡大して、ｔｒｋＣ座ならびにｔｒｋＣのための好適なリガンドとして同定されているＮＴ−３を包含する（Ｌａｍｂａｌｌｅら、１９９１、Ｃｅｌｌ  ６６：９６７−９７９頁）。
【０００９】
２つの新規のヒト遺伝子、ｒｏｒ１およびｒｏｒ２は、細胞質部分にＴｒｋ族のチロシンキナーゼレセプタードメインに相同な領域を有するタンパク質をコードするが、これらのタンパク質は、細胞外部分においてＴｒｋファミリーとはかなり異なる（ＭａｓｉａｋｏｗｓｋｉおよびＣａｒｒｏｌｌ、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６７：２６１８１−２６１９０頁）。
【００１０】
Ｔｒｋファミリーに関連するキナーゼドメインを有する別のレセプターは、シビレエイＴｏｒｐｅｄｏ  ｃａｌｉｆｏｍｉｃａで同定され、これは、筋肉繊維上の運動ニューロン誘導シナプシスで役割を果たし得る。Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２８９５−２８９９頁（１９９３）。このキナーゼは、電気器官、筋肉に相同な組織から単離された。ｒｏｒと同様に、このタンパク質のチロシンキナーゼドメインはＴｒｋファミリーに関連するが、細胞外ドメインはＴｒｋとは幾分異なる。このタンパク質は、Ｔｏｒｐｅｄｏの骨格筋内では高レベルで発現され、そして成体Ｔｏｒｐｅｄｏの脳、脊柱、心臓、肝臓および精巣内では非常に低いレベルで発現されることが見出された。
【００１１】
ＲＴＫは発達の間に多くの重要な機能を媒介すると考えられるので、新規のＲＴＫの同定および単離は、発達に重要な役割を果たし得る新しいリガンドを同定する手段として用いられ得る。このような新規のＲＴＫは、多くの場合、例えば、Ｔｒｋファミリーのメンバー間の既知のホモロジー領域を含むＰＣＲに基づくスクリーニングを用いて、チロシンキナーゼレセプターの公知のファミリーのさらに別のメンバーを検索することによって同定および単離される（例えば、Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら、１９９３、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６３１−１６３７頁を参照のこと）。関連する公知のリガンドが存在しない、このようないわゆる「オーファン」チロシンキナーゼレセプターを単離し、続いてこのようなレセプターが発現される組織を決定することにより、標的組織内の細胞の成長、増殖、および再生の調節への洞察が提供される。さらに、このようなレセプターは、同族リガンドを単離するためにも用いられ得、これは次に、レセプターを発現する細胞の生存、成長、および再生を調節するために用いられ得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、除神経筋キナーゼ「Ｄｍｋ」と呼ばれる新規のチロシンキナーゼを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、以下の項を提供する：
項１．（ａ）図１に示される核酸配列あるいは（ｂ）その配列の一部であって、図１に示されるアミノ酸配列の細胞外ドメイン、膜貫通部分、または細胞内ドメインをコードする配列あるいは（ｃ）その配列の一部であって、図１に示されるアミノ酸配列の細胞外ドメイン、膜貫通部分および細胞内ドメインをコードする配列を含む実質的に精製された組換え核酸分子；
項２．ａ）図１の１９２〜１６１０のヌクレオチド；ｂ）図１の１６１１〜１６９７のヌクレオチド；ｃ）図１の１６９８〜２７３８のヌクレオチド；またはｄ）図１の１９２〜２７３８のヌクレオチドを含む、項１に記載の核酸；
項３．ａ）図１に示されるアミノ酸配列を含有するか；あるいはｂ）細胞外ドメイン、膜貫通部分、または細胞内ドメインを含有する（ａ）のタンパク質の一部を含有するか；あるいは；）細胞外、膜貫通および細胞内領域を含有する（ａ）のタンパク質の一部を含有するか；ｄ）ａ）、ｂ）、またはｃ）のタンパク質と機能的に等価であるか；あるいはｅ）ａ）、ｂ）、またはｃ）のタンパク質と実質的な類似性を有する、実質的に精製されたタンパク質；
項４．図１の２０〜４９２のアミノ酸を含有する、項３に記載のタンパク質；
項５．項３または４に記載のタンパク質をコードする核酸分子に、作動的に連結させた発現調節配列を含有する、発現ベクター；
項６．項１または２に記載の核酸分子に、作動的に連結させた発現調節配列を含有する、項５に記載の発現ベクター；
項７．即時性遺伝子プロモーターを含有する、項５または６に記載のベクター
項８．前記即時性遺伝子プロモーターがｆｏｓプロモーターまたはｊｕｎプロモーターである、項７に記載のベクター；
項９．項５〜８のいずれかにおいて定義される発現ベクターを保有する、細胞；
項１０．項５〜８のいずれかに記載の発現ベクターを保有する、微生物；
項１１．ＰＣ１２細胞株またはＮＩＨ  ３Ｔ３細胞株由来の細胞で、項７または８において定義されるベクターを保有する、項９に記載の細胞；
項１２．即時性遺伝子プロモーターの制御下で、発現可能な検出マーカーをコードする遺伝子をさらに含有する、項１１に記載の細胞；
項１３．無血清培地中で成長因子依存的であり、そして項６〜８のいずれかに記載の発現ベクターを含有する、繊維芽細胞株；
項１４．項１、５または６に記載の核酸分子にハイブリダイズするヌクレオチド配列であり、そして該配列が正常な筋よりも除神経筋においてより高いレベルで発現されるチロシンキナーゼをコードする、ヌクレオチド配列；
項１５．項３または４に記載のタンパク質に結合するリガンドを同定するプロセスであって、ａ）無血清培地中では生存しない成長因子依存性細胞を、項１において規定される核酸または項５〜８のいずれかにおいて規定される発現ベクターで形質転換する工程；ｂ）そのような形質転換細胞を潜在的Ｄｍｋ結合リガンドの存在下、無血清培地中で培養する工程；およびｃ）無血清培地中で該形質転換細胞の生存を支持するようなリガンドを同定する工程、を包含するプロセス；
項１６．項１５に記載の方法で同定されるリガンド；
項１７．健常人と比較した患者中のＤｍｋタンパク質の発現レベルの差が、患者の障害が一次的または二次的にＤｍｋ代謝と関連し得ることを示唆する場合において、患者のサンプル中の項３または４において定義されるＤｍｋタンパク質の発現レベルと、健常人由来の比較用サンプル中の項３または４において定義されるＤｍｋタンパク質の発現レベルとを比較する工程を包含する、患者における筋肉障害または他の障害のエクスビボ診断法；
項１８．前記障害が特発性ねじれ失調症である、項１７に記載の方法；
項１９．筋肉障害または他の障害を患うヒトあるいは動物の身体を処置する方法における用途のための、項３または４において同定されるタンパク質、あるいは該タンパク質のペプチドフラグメントまたは誘導体；
項２０．チロシンキナーゼレセプター遺伝子の少なくとも一部をクローニングする方法であって、（ｉ）ｃＤＮＡ分子の収集物をテンプレートとして用い、そしてａ）配列番号３に基づく縮重プライマー；およびｂ）配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３からなる群から選択される配列に基づく縮重プライマーを包む、オリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせ、または、以下の配列：ｃ）配列番号４；ならびにｄ）配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４からなる群から選択される配列を有するプライマーを含むオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、チロシンキナーゼをコードする核酸配列を増幅する工程；ならびに；（ｉｉ）適切なベクターに該増幅核酸をクローニングする工程、を包含する方法；
項２１．項２０に記載の方法によりクローン化された実質的に精製された核酸；
項２２．項２１に記載の核酸分子を保有する細胞；
項２３．項２１に記載の核酸分子を保有する微生物；
項２４．ＡＴＣＣ寄託番号７５４９８を有する微生物。
【００１４】
本発明は、ｄｍｋと称される遺伝子を提供する。この遺伝子は、除神経筋において高レベルで発現される新規なチロシンキナーゼレセプターをコードする。本発明はまた、ｄｍｋ遺伝子産物に結合するリガンドを検出および／または測定するために使用され得るアッセイシステムを提供する。本発明はまた、Ｄｍｋと、Ｄｍｋへの結合を通してシグナル伝達を開始する薬剤との間の相互作用に基づく診断方法および治療方法を提供する。
【００１５】
（３．発明の要旨）
本発明は、除神経筋キナーゼ「Ｄｍｋ」と呼ばれる新規のチロシンキナーゼを提供する。これは、正常な筋肉および除神経筋、ならびに心臓、脾臓および網膜を含む他の組織内で発現される。このタンパク質は、チロシンキナーゼのＴｒｋファミリーに関連すると考えられる。
【００１６】
本発明はさらに、Ｄｍｋをコードする単離された核酸分子を提供する。
【００１７】
本発明はまた、Ｄｍｋの細胞外ドメインを含むタンパク質またはペプチド、およびこのような細胞外ドメインをコードする核酸を提供する。
【００１８】
本発明はさらに、Ｄｍｋまたはその細胞外ドメインをコードする単離された核酸分子を含むベクターを提供し、これは、細菌、酵母、および哺乳動物細胞内でＤｍｋを発現するために用いられ得る。
【００１９】
本発明はさらに、Ｄｍｋと相互作用する薬物のスクリーニングにおける、Ｄｍｋレセプターもしくはその細胞外または細胞内ドメインの使用を提供する。本明細書中に記載するレセプターに結合する新規の薬物は、レセプターを天然に発現する細胞における生存および分化を媒介するだけではなく、レセプターを発現するように操作された細胞を処置するために用いられる場合に生存および増殖を提供する。
【００２０】
特定の実施態様では、Ｄｍｋの細胞外ドメイン（可溶性レセプター）は、同族リガンドのスクリーニングに利用される。
【００２１】
本発明はまた、ヒトおよび動物の組織を発現するＤｍｋの検出に有用なヒトＤｍｋをコードする核酸配列内に含まれる配列とハイブリダイズし得る核酸プローブを提供する。
【００２２】
本発明はさらに、Ｄｍｋに関する抗体を提供する。
【００２３】
本発明はまた、診断的および治療的利用性を有する。本発明の特定の実施態様では、本明細書で述べるレセプターの機能または発現の異常型を検出する方法は、筋肉の障害または他の障害の診断に用いられ得る。他の実施態様では、レセプターまたはこのレセプターに結合するアゴニストの操作は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ルーガーリック病（Ｌｏｕ  Ｇｅｈｒｉｇ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ））および突発性捻転ジストニーを含む、神経性の疾患、筋肉または神経筋ユニット障害の疾患の治療に用いられ得る。さらなる実施態様では、レセプターの細胞外ドメインは、レセプターの標的細胞への結合をブロックするブロッキング剤として利用される。
【００２４】
本発明のさらなる実施態様では、過剰のＤｍｋを患う患者を、ｄｍｋ遺伝子コード領域に対応するアンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドの有効量を投与して、それによって過剰Ｄｍｋの発現を低減させることにより治療し得る。
【００２５】
（５．発明の詳細な説明）
本発明は、チロシンキナーゼのｔｒｋファミリーに関連する新規のチロシンキナーゼ分子を提供する。このタンパク質の配列は、配列番号１として図１に示されている。この成熟タンパク質のコード領域は、コード領域の部位２０またはその前後のセリン−グリシン−トレオニンの位置またはその前後から始まると考えられる。
【００２６】
本明細書中に記載する新規のチロシンキナーゼは、除神経骨格筋内で誘導されることが分かっている。従って、これはＤｍｋ（除神経筋キナーゼ）と称されている。正常な筋肉および除神経筋の両方、ならびに特に心臓において見出されることに加えて、Ｄｍｋは、脾臓、卵巣、および網膜に実質的に存在することも分かっているが、これらに限定されないようである。発達初期に存在するようであるが、成体の組織にも見出される。
【００２７】
Ｄｍｋは、Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、前出によって同定されたＴｏｒｐｅｄｏ  ＲＴＫに関連し得る。しかし、Ｄｍｋは除神経筋内で誘発されると考えられるが、Ｔｏｒｐｅｄｏ  ＲＴＫに関してはこのような誘発は報告されていない点で異なる。さらに、Ｔｏｒｐｅｄｏ  ＲＴＫは細胞外タリングルドメインを有するが、Ｄｍｋはこれを有しない。しかし、これらのキナーゼは、同じファミリーまたは関連するファミリーのメンバーであり得る。
【００２８】
Ｄｍｋをコードする遺伝子はクローン化されており、そのＤＮＡ配列は決定されている（図１；配列番号２）。この成熟タンパク質の細胞外ドメインは、部位１９２またはその前後で始まり部位１６１０またはその前後で終わる核酸配列によってコードされると考えられる。このタンパク質の膜貫通部分は、部位１６１１またはその前後で始まり部位１６９７またはその前後で終わる核酸配列によってコードされると考えられる。細胞内ドメインは、部位１６９８またはその前後で始まり部位２７３８またはその前後で終わる核酸配列によってコードされると考えられる。ＤｍｋをコードするｃＤＮＡクローンは、１９９３年７月１３日、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、受託番号ＡＴＣＣ  ７５４９８が与えられた。
【００２９】
本発明はまた、Ｄｍｋの細胞外ドメインを含むタンパク質またはペプチドおよびこの細胞外ドメインをコードする核酸を提供する。タンパク質の細胞外ドメインは、配列番号１として示されたコード領域の部位２０〜４９２またはその前後のアミノ酸からなると考えられる。
【００３０】
マウスのＤｍｋは、ヒトライブラリー（好ましくは筋肉由来の）を検索するための本明細書で述べる材料および方法を用いて、ヒトにおいてこれに匹敵するタンパク質を同定するために用いられ得る。さらに、ＤｍｋとＴｏｒｐｅｄｏＲＴＫとの間の類似性は、さらに別の関連するＲＴＫを検索するのに有用なプライマーを開発するためのこれらの遺伝子内の配列相同性領域の利用性を示唆する。
【００３１】
従って、本発明は、本明細書に述べるＤｍｋをコードするＤＮＡにハイブリダイズし、ストリンジェントな条件下でこれへの安定した結合を維持する、長さが約１０塩基より長い核酸またはオリゴヌクレオチドを提供する。しかし、このようなハイブリダイズする核酸は、他のチロシンキナーゼをコードする核酸またはこれらに相補的な核酸を含む任意の従来の核酸に比べて新規でありかつ自明ではない。
【００３２】
本明細書で用いるストリンジェントな条件とは、（１）洗浄には低イオン強度および高温を用いること、例えば、０．１５ＭのＮａＣｌ／０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のＮａＤｏｄＳＯ４を５０℃で用いること、または（２）ハイブリダイゼーション中に、ホルムアミドのような変性薬剤、例えば、４２℃で７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含むｐＨ６．５の、０．１％のウシ血清アルブミン／０．１％のＦｉｃｏｌｌ／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液を有する５０％（容量／容量）のホルムアミドを用いることである。
【００３３】
本発明のＤｍｋの一部またはすべてに対してコードするヌクレオチド配列を用いて、新規ファミリーメンバーまたは他の種からのＤｍｋを単離する場合、配列の長さは、少なくとも、脊椎動物の自らのｄｍｋ由来の内因性ｍＲＮＡにハイブリダイズし得るのに十分なサイズであるべきである。代表的には、十分な配列サイズは約１５個の連続塩基（ＤＮＡまたはＲＮＡ）であり得る。
【００３４】
チロシンキナーゼ中に保存されているアミノ酸を取り囲むタンパク質領域に対応する変性オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーを用いて新規のＲＴＫを同定するストラテジーは既に記載されている（Ｗｉｌｋｓら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６：１６０３−１６０７頁；Ｐａｒｔａｎｅｎ，Ｊ．ら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：８９１３−８９１７頁；ＬａｉおよびＬｅｍｋｅ、１９９１、Ｎｅｕｒｏｎ  ６：６９１−７０４頁；ＭａｓｉａｋｏｗｓｋｉおよびＣａｒｒｏｌｌ、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２６１８１−２６１９０頁）。ＤｍｋとＴｏｒｐｅｄｏＲＴＫとの間の関係が出願人らによって発見されたことにより、スクリーニング技法で用いられ得る未知のホモロジー領域が同定された。
【００３５】
ＤｍｋとＴｏｒｐｅｄｏのＲＴＫとの間のアミノ酸ホモロジードメインＡｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ（配列番号３）に基づいた以下のプライマーを、ＲＴＫに特徴的な既知のホモロジー領域に対応する別のプライマーと組み合わせて用い、これにより、関連するチロシンキナーゼ（例えば、他のファミリーのメンバー）を単離し得る［アミノ酸およびヌクレオチドを表す、本明細書で用いられるすべてのコードは、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２（ｂ）に示される通りである］：
５’ＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＣＲＷＡＮＧＣＣＣＡＮＡＣＲＴＣ−３’（配列番号４）
ＲＴＫに特徴的な既知のホモロジー領域に対応する別のプライマーとしては以下のものがある：
５’
１）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ（配列番号５）
５’−ＴＣＴＴＧＡＣＴＣＧＡＧＡＹＹＴＮＧＣＮＡＣＮＭＧＮＡＡ−３’（配列番号６）
２）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｎ（配列番号７）
５−’ＴＣＴＴＧＡＣＴＣＧＡＧＡＹＹＴＮＧＣＮＧＣＮＭＧＮＡＡ−３’（配列番号８）
３’
１）Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号９）
３’−ＣＴＲＣＡＮＡＣＣＷＳＮＡＴＲＣＣＣＴＣＧＡＧＣＴＴＡＡＧ−５’（配列番号１０）
２）Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ（配列番号１１）
３’−ＣＴＲＣＡＮＡＣＣＷＳＮＡＡＲＣＣＣＴＣＧＡＧＣＴＴＡＡＧ−５’（配列番号１２）
３）Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ（配列番号１３）
３’−ＣＴＲＣＡＮＡＣＣＷＳＮＲＡＮＣＣＣＴＣＧＡＧＣＴＴＡＡＧ−５’（配列番号１４）
もしくは、ＤｍｋおよびＴｒｋファミリーのような関連するファミリーのメンバーによって共有されるホモロジー領域は、新規のＲＴＫを単離するように設計されたストラテジーで使用され得る。
【００３６】
本発明はさらに、Ｄｍｋについて図１に示すようなアミノ酸配列（配列番号１）を実質的に含む実質的に精製されたタンパク質分子、または機能的に等価の分子を提供する。機能的に等価の分子とは、サイレント変化が生じる、配列内の残基がアミノ酸残基に置換されている分子を含む。例えば、配列内の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が、機能的な等価物として作用する類似の極性を有する別のアミノ酸によって置換され、サイレント変更が行われ得る。配列内のアミノ酸の置換基は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。正に帯電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが含まれる。負に帯電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
【００３７】
また、例えばグリコシル化、タンパク質分解性切断、抗体分子または他の細胞リガンドヘの結合などによって翻訳中または翻訳後に様々に修飾されるタンパク質あるいはその断片または誘導体も、本発明の範囲に含まれる。
【００３８】
本発明はさらに、本明細書で記載するＤｍｋタンパク質に実質的な類似性を有するタンパク質の単離を意図する。本明細書で用いられる実質的な類似性とは、異なる種由来のＤｍｋであるタンパク質、または少なくとも４０％の位置が同じである種内のファミリーのメンバーであるタンパク質を意味する。タンパク質レベルでの実質的な類似性としては、Ｄｍｋのエピトープに対して生じるいくつかのモノクローナル抗体への結合についてＤｍｋと競合する被験体タンパク質の能力が含まれる。
【００３９】
本明細書で述べるＤｍｋタンパク質は、１）スクリーニングストラテジー、２）精製ストラテジーおよび３）診断用途において有用である。スクリーニングストラテジーに関しては、細胞生存アッセイおよび増殖アッセイに基づく発現クローニングストラテジーにより、同族リガンドをスクリーニングする方法が提供される（Ｇｌａｓｓら、（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６６：４０５−４１３頁）。Ｄｍｋに結合するリガンドは膜に結合し得るため、このようなレセプターを同定する他のストラテジーの方がさらに適切であり得る（Ａｒｍｉｔａｇｅら、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：８０−８２頁；Ｓｍｉｔｈら、１９９３、Ｃｅｌｌ  ７３：１３４９−１３６０頁）。好適な実施態様では、Ｄｍｋの細胞外ドメインをマーカーに融合して、同族体に結合された場合の細胞外ドメインの同定および精製を可能にするキメラタンパク質を作製する。
【００４０】
例えば、Ｓｍｉｔｈら（前出）に記載されているように、同族リガンドが膜に結合する場合は、Ｄｍｋの細胞外部分を、短縮型免疫グロブリンの重鎖（Ｆｃ）に融合し得る。次に、この融合産物を、例えばフローサイトメトリーによって、レセプターに結合する表面リガンドを発現する細胞を同定するために用い得る。もしくは、Ｄｍｋ結合リガンドのスクリーニングおよび精製には、Ｄｍｋの細胞外ドメインを標識するために用いられるｍｙｃのような他のタグもまた有用である（Ｄａｖｉｓら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：５９−６３頁；Ｓｑｕｉｎｔｏら、１９９０、Ｎｅｕｒｏｎ  ５，：７５７−７６６頁）。
【００４１】
他の実施態様において、公知のリガンドに結合するＲＴＫの細胞外部分をＤｍｋの細胞外部分で置換する。通常はレセプターに対する公知のリガンドの結合に関連する、表現型の変化または初期応答遺伝子の誘導のような測定可能な効果を用いて、類似する効果を誘導する同族リガンドについてスクリーニングし得る。
【００４２】
例えば、導入されたＤｍｋレセプター、または膜貫通ドメインに融合したＤｍｋの細胞外ドメインおよびもう１つのＲＴＫの細胞内ドメインを含むキメラタンパク質（Ｄｍｋ−キメラレセプター）を保持する細胞株、ならびにレセプターを有さない親細胞株を、レセプターを通じて作動し得る薬剤の任意の可能な供給源に曝し得る；レセプターまたはキメラを保持する細胞株に対する任意の特異的効果（例えば、細胞の生存または増殖）を用いて、そのレセプターに作用する薬剤を同定し、そして最終的にこのような薬剤を精製し得る。一旦、特定のレセプター／リガンド系が定義されれば、種々のさらなる特異的アッセイ系を利用して、例えば、Ｄｍｋのさらなるアゴニストまたはアンタゴニストについて検査し得る。
【００４３】
本発明に従って、ＤｍｋまたはＤｍｋ−ＲＴＫキメラレセプターを通常発現しない細胞にこのレセプターを導入すれば、このレセプターを用いて、細胞の識別可能な応答に基づき、レセプターに結合するリガンドを同定することができる。本発明は、誘導された応答のタイプは、細胞に導入された特異的レセプターではなく利用した細胞に依存すると考える。従って、例えば、ＰＣ１２褐色細胞腫細胞におけるＤｍｋレセプターの発現の結果、このレセプターに結合するリガンドヘの曝露に際し、ＰＣ１２細胞の分化が起こり得、他方、繊維芽細胞において、同じレセプターが、Ｄｍｋ結合リガンドに応答して、生存および増殖の両方を媒介し得る。適切な細胞株を選択して、アッセイのための最大の利用性を有する応答が得られ得、そしてチロシンキナーゼレセプターに作用し得る薬剤を発見し得る。「薬剤」とは、レセプター依存性様式で記載される系で作用するペプチド分子および非ペプチド分子を包含する（しかしこれらに限定されない）任意の分子を言う。
【００４４】
開発されるべきより有用な系の１つは、成長因子依存性繊維芽細胞株への所望のレセプターの導入を包含する；通常は増殖応答を媒介しないこのようなレセプターは、それにも拘わらず、繊維芽細胞への導入の後、繊維芽細胞成長因子の効果を定量するのに用いられる種々の十分に確立された方法によってアッセイし得る（例えば、チミジンの取り込みまたは他のタイプの増殖アッセイ；ｖａｎ  Ｚｏｅｌｅｎ，１９９０，「ポリペプチド成長因子の検出のための生物学的アッセイの使用」Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第２巻，１３１−１５２頁；ＺｈａｎおよびＭ．Ｇｏｌｄｆａｒｂ，１９６６，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，第６巻，３５４１−３５４４頁参照）。これらのアッセイは、導入されたレセプターを有する細胞株およびレセプターを欠く親細胞株の両方について、任意の調製物をアッセイし得るというさらなる利点を有する；レセプターを有する細胞株に対する特異的効果のみが、導入されたレセプターを通じて媒介されると判断される。
【００４５】
本明細書に記載するオーファンレセプターを発現する細胞は、天然にこのレセプターを発現し得るか、あるいはこのレセプターを発現するように遺伝子的に操作され得る。例えば、第６節または第８節（下記）に記載のように得られる核酸配列を、当該分野で公知の任意の方法を用い、トランスジェニック動物などを介して、トランスフェクション、形質導入、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションによって細胞に導入し得る。
【００４６】
オーファンレセプターへのテスト薬剤の特異的結合を多数の方法で測定し得る。例えば、テスト薬剤の細胞への実際の結合を、（ｉ）インタクトな細胞の表面に結合したテスト薬剤；（ｉｉ）細胞溶解物中のレセプタータンパク質に架橋したテスト薬剤；または（ｉｉｉ）インビトロでレセプターに結合したテスト薬剤を検出または測定することによって検出または測定し得る。テスト薬剤とレセプターとの間の特異的相互作用を、その相互作用の固有の特性を示す試薬を用いることによって評価し得る。
【００４７】
あるいは、レセプターに対するテスト薬剤の特異的結合を、神経突起発芽の誘導、即時性遺伝子発現またはレセプターのリン酸化を包含する（しかしこれらに限定されない）レセプター／リガンド結合の二次的な生物学的効果を評価することによって測定し得る。例えば、神経突起発芽を誘導するテスト薬剤の能力を、レセプターを欠く細胞、および例えば、Ｄｍｋ細胞外ドメインおよびＴｒｋファミリーのメンバーの細胞内ドメインを含むキメラレセプターを発現する比較細胞においてテストし得る；レセプターを欠く比較細胞においては起こらず、レセプター発現細胞において起こる神経突起発芽は、特異的テスト薬剤／レセプター相互作用の指標となる。レセプターマイナス細胞およびレセプタープラス細胞における即時性遺伝子（例えば、ｆｏｓおよびｊｕｎ）を検出することによって、あるいは当該分野で公知の標準的なリン酸化アッセイを用いてレセプタータンパク質のリン酸化を検出することによって、同様の分析を行い得る。
【００４８】
同様に、本発明は、（ｉ）本明細書に記載するようなチロシンキナーゼレセプターを発現する細胞をテスト薬剤に曝露する工程、および（ｉｉ）レセプターヘのテスト薬剤の特異的結合を検出する工程を包含し、ここでレセプターへの特異的結合がシグナル伝達活性に正に相関する、シグナル伝達活性を有する薬剤の同定方法を提供する。特異的結合を、上記のように、直接結合または結合の二次的な生物学的効果のいずれかについてアッセイすることによって検出し得る。このような方法は、新たな神経栄養因子または心臓保護活性のような他の薬学的活性を有する因子の同定、あるいは、製薬業、このような活性についての多数のペプチド薬剤および非ペプチド薬剤（例えば、ペプチドミメティック（ｍｉｍｅｔｉｃ））のスクリーニングにおいて特に有用であり得る。
【００４９】
本発明の、特定の非限定的な、好適な実施態様おいて、レセプターマイナスであるか、遺伝子操作によりレセプタープラスにされたＰＣ１２（または繊維芽細胞、下記参照）を交互に横列に含む大きな格子状の培養ウェルを調製し得る。次いで、グリッドの各縦列またはその一部が、異なるテスト薬剤を含むように、種々のテスト薬剤を添加し得る。次いで、各ウェルを、神経突起発芽の存在または非存在についてスコア取りし得る。極めて多くのテスト薬剤を、このようにして、シグナル伝達活性についてスクリーニングし得る。
【００５０】
また、本発明は、上記の方法に従って使用し得るアッセイ系を提供する。このようなアッセイ系は、例えば固体支持体に固定されたレセプターのインビトロ調製物を含み得、あるいは、好ましくは、本明細書に記載するレセプタータンパク質を発現する細胞を含み得る。
【００５１】
さらに、本発明は、Ｄｍｋを包含する（しかしこれに限定されない）上記組換え核酸分子を保持する宿主細胞および微生物ならびにベクターを提供する。上記のように、適切な発現ベクター中のＤｍｋをコードする核酸の、トランスジェニック動物などを介するトランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションによって、レセプタータンパク質を発現する細胞に遺伝子操作を施してレセプターが得られ得る。特定の実施態様において、組換え核酸を保持する宿主細胞はＣＯＳのような動物細胞である。他の実施態様において、宿主細胞は細菌、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである。
【００５２】
ＤＮＡフラグメントのベクターへの挿入についての当業者に公知の任意の方法を用いて、レセプターをコードする発現ベクターを構築し得る。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡ法および合成技術およびインビボ組換え（遺伝的組換え）を包含し得る。レセプタータンパク質またはペプチドフラグメントをコードする核酸配列の発現は、レセプタータンパク質またはペプチドを組換えＤＮＡ分子で形質転換した宿主中で発現させるように第２の核酸配列によって調節し得る。例えば、レセプターの発現は、当該分野で公知の任意のプロモーター／エンハンサーエレメントによって制御し得る。レセプター発現を制御するのに使用し得るプロモーターは、Ｓｑｕｉｎｔｏら（１９９１、Ｃｅｌｌ  ６５：１−２０）に記載された長末端反復（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）；ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０）、ＣＭＶプロモーター、Ｍ−ＭｕＬＶ５’末端反復、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０、Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）；β−ラクタマーゼプロモーターのような原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７５：３７２７−３７３１）、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５）（「組換え細菌由来の有用なタンパク質」ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃａｎ、１９８０、２４２：７４−９４参照）；Ｇａｌ４プロモーターのような酵母または他の菌類由来のプロモーターエレメント、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリフォスファターゼプロモーター、ならびに組織特異性を呈しかつトランスジェニック動物で利用されてきた以下の動物転写制御領域：膵臓腺房細胞で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら、１９８４、Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−６４６；Ｏｒｎｉｔｚら、１９８６、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ、１９８７、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５）；膵臓β細胞で活性なインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−１２２）、リンパ系細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｉら、１９８４、Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−６５８；Ａｄａｍｅｓら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４）、精巣、乳房、リンパ系細胞および肥満細胞で活性なマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら、１９８６、Ｃｅｌｌ  ４��：４８５−４９５）、肝臓で活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．、１：２６８−２７６）、肝臓で活性なα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８；Ｈａｍｍｅｒら、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：５３−５８）；肝臓で活性なα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１）、骨髄系細胞で活性なβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａｓら、１９８６、Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４）；脳における稀突起膠芽細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７、Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−７１２）；骨格筋で活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−２８６）、および視床下部で活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−１３７８）を包含するが、これらに限定されない。
【００５３】
レセプターをコードする遺伝子挿入物を含有する発現ベクターは、以下の３つの一般的アプローチ：（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在または非存在、および（ｃ）挿入された配列の発現によって同定できる。第１のアプローチにおいて、発現ベクターに挿入された外来遺伝子の存在を、挿入された遺伝子に相同な配列を含むプローブを用いてＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションによって検出し得る。第２のアプローチにおいて、ベクター中の外来遺伝子の挿入によって引き起こされるある種の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける封入体形成など）の存在または非存在に基づいて、組換えベクター／宿主系を同定し、そして選択し得る。例えば、レセプターをコードする遺伝子がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、遺伝子挿入物を含む組換え体を、マーカー遺伝子機能の非存在によって同定し得る。第３のアプローチにおいて、組換えベクターによって発現された外来遺伝子産物をアッセイすることによって、組換え発現ベクターを同定し得る。このようなアッセイは、例えば、レセプターをコードする遺伝子産物の物理的または機能的特性に基づき得る（例えば、神経栄養因子への、またはレセプターを直接認識する抗体へのレセプターの結合による）。本発明の細胞は一時的にまたは、好ましくは、構成的かつ永続的にレセプターまたはその一部を発現し得る。
【００５４】
好ましい実施態様において、本発明は、本明細書に記載するレセプターまたはその一部を発現し、さらに即時性遺伝子プロモーター［例えば、ｆｏｓまたはｊｕｎプロモーター（Ｇｌｌｍａｎら、１９８６、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：４３０５−４３１６）］を含む組換え核酸を含む細胞を提供する。このような細胞を、レセプターに結合するリガンドに曝露すると、結合は二次的に即時性プロモーターの転写を誘導する。このような細胞を用いて、例えば、核ラン−オフ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｕｎ−ｏｆｆ）分析、ノーザンブロット分析により即時性遺伝子プロモーターの転写活性を測定することによって、あるいはプロモーターによって制御される遺伝子のレベルを測定することによって、レセプター／リガンド結合を検出することができる。即時性遺伝子プロモーターを用いて、神経栄養活性の検出または測定のための、ｆｏｓまたはｊｕｎ、あるいはヒグロマイシン耐性を付与する遺伝子（ＭｕｒｐｈｙおよびＥｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：８２７７−８２８１）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどのような任意の公知のレポーター遺伝子を包含する（しかし、これらに限定されない）任意の検出可能な遺伝子産物の発現を制御できる。
【００５５】
さらに、本発明のアッセイシステムで用いられた細胞は、神経系の細胞であるかもしれないか、またはそうでないかもしれない。例えば、本発明の詳細な、限定されない実施態様では、成長因子依存性線維芽細胞は、シグナル伝達アッセイシステムについての基礎として用いられ得る。無血清培地中で成長因子依存性である線維芽細胞株（例えば、ＺｈａｍおよびＧｏｌｄｆａｌｂ、１９８６、Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｌ．６：３５４１−３５４４に記載される）を、レセプターコード遺伝子でトランスフェクトし得る。これは例えば、ｄｍｋ遺伝子を含有するＣＭＶ−プロモーターベースの発現ベクターのＤＮＡ（５μｇ）およびハイグロマイシン耐性遺伝子含有発現ベクター（１μｇ）を用いるＣａＰＯ４トランスフェクションプロトコルを用いる。約４８時間後、次いで細胞をハイグロマイシン耐性について選択し、陽性のトランスフェクタントを同定し得る。次いで細胞を、ハイグロマイシンの存在下で約３週間培養し、次いで耐性コロニーをプールし得る。次いでこれらの細胞を、ポリ−Ｄ−リジンおよびヒトフィブロネクチンでコートされた組織培養プレートに置き、そして１０％仔ウシ血清を加えたＤＭＥＭ中で約４時間増殖させ、細胞をプレートに結合し得る。次いで血清含有培地を吸引し得、細胞をＰＢＳで約三回洗浄し、すべての残った血清を除去し得る。次いで、細胞を無血清規定培地（８ｍＭ重炭酸ナトリウム、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４×１０−６ＭｎＣｌ２、３ｍＭヒスチジン、１０−５Ｍエタノールアミン、１０−７Ｍ亜セレン酸ナトリウム、１リットルあたり５ｍｇのトランスフェリン、１リットル当たり２００ｍｇのウシ血清アルブミン−リノレン酸複合体、ゲンタマイシン、ペニシリン、およびストレプトマイシン、２０ｍＭ  Ｌ−グルタミンを追加した、ＤＭＥＭとＨａｍｓＦ１２の３：１混合物）に移し得る。この方法で生成され、次いでＤｍｋと結合可能な因子とともにインキュベートされた細胞は、約５日間の培養（４８時間毎に培地および成長因子を取り替える）の後、成長および増殖していることが期待され得る；しかし、１００ｎｇ／ｍｌで無関係のリガンドで処理した、または無血清培地中の細胞は、増殖しないはずである。
【００５６】
Ｄｍｋの生理学的役割への更なる洞察は、そのリガンドの定義から来る。Ｄｍｋタンパク質のキナーゼドメインは、他のレセプターチロシンキナーゼに関連していると思われるので、このタンパク質は、それが発現される細胞内でシグナル伝達に関係するようである。従って、本明細書中で記載されるレセプターを用いてスクリーニングされたＤｍｋ結合リガンドを用いて、天然に生じるＤｍｋ発現細胞内でシグナル伝達を誘導し得る。この細胞としては、筋肉組織、心臓、脾臓、卵巣および網膜内の細胞、ならびにＤｍｋタンパク質を発現するように操作された細胞が挙げられる。このようなリガンドは、このような細胞の成長または生存を促進し得る。
【００５７】
上記のように、本発明は、除神経筋で発現されると思われるチロシンキナーゼレセプターに関する。本発明に従って、これらのレセプターを認識できるプローブを用いて、細胞および組織内のレセプターの変化したレベルを測定することにより疾患または障害を同定し得る。このような疾患または障害は、次いで、これらのレセプターと結合するリガンドを用いて処置され得る。このような疾患としては、筋肉の萎縮性変化またはジストロフィー性変化が、その根本的な病理学的所見である疾患が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、筋肉萎縮は、神経損傷による除神経（筋肉によるその神経との接触の消失）；変性、代謝性または炎症性神経障害（例えば、ギヤン−バレー症候群）、末梢神経障害、または環境の毒物または薬物により生じる神経への障害から起こり得る。他の実施態様では、筋肉萎縮は、運動ニューロン障害による除神経から生じる。このような運動神経疾患としては、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳまたはルーガーリック病（Ｌｏｕ  Ｇｅｈｒｉｇ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ））を含む成人運動ニューロン疾患；幼年性および若年性棘筋萎縮、および多病巣性伝達遮断（ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｌｏｃｋ）による自己免疫運動神経障害が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施態様では、筋肉萎縮は、慢性的な不使用から生じる。このような不使用による萎縮は、以下に挙げるが、それらに限定されない状態から生じ得る：卒中による麻痺、脊髄損傷；損傷（例えば、骨折、捻挫、または脱臼）または長期のベッドでの安静による骨格の不動化。さらなる他の実施態様では、筋肉萎縮は、代謝ストレスまたは栄養不全から生じる。以下にこれらの例を挙げるが、それらに限定されない：ガンおよび他の慢性病の悪液質、絶食または横紋筋融解症、内分泌障害（例えば、甲状腺の障害および糖尿病であるがこれらに限定されない）。筋肉萎縮はまた、筋ジストロフィー症候群に起因し得る。以下に例を挙げるが、それらに限定されない：デュシェーヌ、ベッカー、筋緊張性、顔面肩甲上腕（ｆａｓｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ）、Ｅｍｅｒｙ−Ｄｒｅｉｆｕｓｓ、眼球咽頭、肩甲上腕、肢帯および先天性タイプならびに遺伝性末梢筋傷害として知られるジストロフィー。さらなる実施態様では、筋萎縮は、先天性筋傷害に起因する。以下にその例を挙げるが、それらに限定されない：良性先天性低血圧症、中心コア病、ネマリン筋障害、および筋細管（中心核）筋障害。さらに、Ｄｍｋおよびその関連するリガンドは、後天性（毒性または炎症性）筋障害の処置に用いられ得る。筋肉の炎症性疾患の結果として生じる筋障害としては、多発性筋炎および皮膚筋炎が挙げられるが、これらに限定されない。毒性筋障害は、薬剤に起因し得る。以下にその例を挙げるが、それらに限定されない：ａｄｉｏｄａｒｏｎｅ、クロロキン、クロフィブレート、コルヒチン、ドキソルビシン、エタノール、ヒドロキシク口口キン、オルガノホスフェート、ｐｅｒｉｈｅｘｉｌｉｎｅ、およびビンクリスチン。
【００５８】
理論により結びつけられることは望まないが、マウス内のＤｍｋの予備的なマッピングは、この遺伝子が、ヒト染色体９ｑと相同の領域中のマウス第４染色体に位置付けられることを明かにした。第４染色体のこの領域に関連するマウス内の変異体としては、シェーカー（ｓｈａｋｅｒ）症候群の徴候（聴覚消失、頭部トシング（ｈｅａｄ−ｔｏｓｓｉｎｇ）、サークリング（ｃｉｒｃｌｉｎｇ）、および機能亢進（ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ）を包含する）を生ずる「ｗｉ」変異（旋回（ｗｈｉｒｌｅｒ））が挙げられる（Ｌａｎｅ、Ｐ．Ｗ．、９６３、Ｊ，Ｈｅｒｅｄ．５４；２６３−２６６）。第４染色体のこの領域に関連するマウス内の他の変異は、歩く際の激しい震えの徴候および後ろ足の揺れと関係する「ｖｃ」変異（動揺（ｖａｃｉｌｌａｎｓ））である（Ｓｉｒｌｉｎ，Ｊ．Ｌ．、１９５６、Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．５４：４２−４８）。
【００５９】
ヒトでは、特発性ねじれ失調症（ＩＴＤ）として知られる疾患は、ヒト染色体９ｑバンド３４へ連鎖分析によりマップされた遺伝子と関連する。この疾患は、頻繁にねじれおよび反復運動、あるいは異常な姿勢を起こす、持続性の不随意の筋肉収縮により特徴づけられる。
【００６０】
ｄｍｋ内の欠損が、これらの疾患と関連することが見いだされれば、本発明は、インサイチュでのこのような遺伝子の置換のための遺伝子治療において有用であると判明し得る。あるいは、Ｄｍｋ遺伝子の独特のセグメントを利用するプローブは、このような障害のための診断薬として有用であると判明し得る。
【００６１】
本発明は、患者試料中のＤｍｋの発現のレベルと健常人由来の比較サンプル中のＤｍｋの発現のレベルとを比較する工程を包含する、患者の神経障害または他の障害の診断方法を提供する。この方法において、健常人と比較した、患者中のＤｍｋの発現のレベルの違いは、患者における障害が、Ｄｍｋ代謝に１次的または２次的に関連し得ることを示す。患者試料は、任意の細胞、組織、または体液であり得るが、筋肉組織または脳脊髄液が好ましい。
【００６２】
用いられ得るプローブの一種は、抗体の結合ドメインを含む抗Ｄｍｋ抗体またはそのフラグメントである。
【００６３】
本発明に従って、Ｄｍｋタンパク質、あるいはそのフラグメントまたは誘導体は、抗Ｄｍｋ抗体を生成するための免疫原として用いられ得る。タンパク質合成のための組換え技術（本発明のＤｍｋ核酸配列に基づいた）を用いる比較的多量のＤｍｋタンパク質の産生を提供することにより、Ｄｍｋの限定された量の問題が、取り除かれた。
【００６４】
抗Ｄｍｋ免疫応答を生じる可能性をさらに改善するために、Ｄｍｋのアミノ酸配列を、増加した免疫原性と関連し得る分子の部分を同定するために分析し得る。例えば、このアミノ酸配列を、コンピューター分析に供し、Ｄｍｋの親水性、表面確率、可撓性、抗原性指数、両親媒性ヘリックス、両親媒性シート、および２次構造のコンピューター生成プロットを示す表面エピトープを同定し得る。あるいは、異なる種由来のＤｍｋの推定アミノ酸配列を比較して、そして比較的非相同性の領域を同定し得る。これらの非相同性領域は、様々な種に渡って免疫原性である可能性がより高い。
【００６５】
Ｄｍｋに対するモノクローナル抗体の調製のために、培養中の連続的細胞株による抗体分子の産生を供給する任意の技術が、用いられ得る。例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによりもともと開発されたハイブリドーマ技術（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）、ならびにトリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２）、およびヒトモノクロナール抗体を産生するＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．７７−９６頁）などは、本発明の範囲内である。
【００６６】
治療的使用のためのモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体またはキメラヒト−マウス（または他の種）モノクローナル抗体であり得る。ヒトモノクローナル抗体は、当該分野で公知の任意の多くの技術（例えば、Ｔｅｎｇら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：７３０８−７３１２；Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２−７９；Ｏｌｓｏｎら、１９８２、Ｍｅｔｈ，Ｅｎｚｙｍｏｌ，９２：３−１６）により作製され得る。ヒト定常領域を有するマウス抗原結合ドメインを含有するキメラ抗体分子が、調製され得る（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１、Ｔａｋｅｄａら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２）。
【００６７】
当該分野で公知の種々の手順が、Ｄｍｋのエピトープヘのポリクローナル抗体の産生のために用いられ得る。抗体の産生のために、種々の宿主動物が、Ｄｍｋタンパク質、あるいはそのフラグメントまたは誘導体の注射により免疫され得る。以下にその例を挙げるが、それらに限定されない：ウサギ、マウス、ラットなど。種々のアジュバントは、宿主種に依存し、免疫学的応答を増大するのに用いられ得る。以下にアジュバントの例を挙げるが、それらに限定されない：フロイントアジュバンド（完全および不完全）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン）、ｐｌｕｒｏｎｉｃポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント（例えば、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ））およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ。
【００６８】
Ｄｍｋエピトープに対する抗体の分子クローンは、公知の技術により調製され得る。組換えＤＮＡ方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を用いて、モノクローナル抗体分子またはその抗原結合領域をコードする核酸配列を構築し得る。
【００６９】
抗体分子は、公知の技術により精製され得る。例えば、免疫吸着またはイムノアフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）のようなクロマトグラフィー法、またはそれらの組み合わせなど。
【００７０】
本発明は、抗体分子およびそのような抗体分子のフラグメントを提供する。分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは、公知の技術により生成され得る。例えば、このようなフラグメントとして、以下に例を挙げるが、それらに限定されない：抗体分子のペプシン消化により生成されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成され得るＦａｂ’フラグメント、および抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することにより生成され得るＦａｂフラグメント。
【００７１】
上記のプローブを実験的に用い、Ｄｍｋを発現することが今まで示されなかった細胞または組織を同定し得る。さらに、これらの方法は、異常組織（例えば、悪性腫瘍）によるＤｍｋの発現を同定するのに用いられ得る。別の実施態様では、これらの方法は、障害を被る患者由来の細胞、液、または組織のＤｍｋの発現と、健常人由来の比較される細胞、液、または組織内でのＤｍｋの発現とを比較するために、診断的に用いられ得る。液は、特に血液または髄液以外の任意の体液をいうと解釈される。健常人と比較した患者におけるＤｍｋの発現のレベルの違いは、患者の障害が、１次的または２次的に、Ｄｍｋ代謝に関係し得ることを示す。例えば、Ｄｍｋのレベルの増加は、患者の障害が、Ｄｍｋ結合リガンドの正常レベルに対する増加した感受性に関係することを示し得るか、あるいは患者のＤｍｋ結合リガンドレベルが低く、その結果レセプターの数が代償として増加することを示唆し得る。
【００７２】
本発明は、Ｄｍｋ発現細胞に対するリガンドの効果に逆らうための可溶性レセプター（細胞外ドメイン）の使用をさらに提供する。例えば、同族体（ｃｏｇｎａｔｅ）が所望されないマイトジェン性特性を有することが見出される場合、このようなブロッキングが所望される。
【発明の効果】
【００７３】
本発明により、除神経筋キナーゼ「Ｄｍｋ」と呼ばれる新規のチロシンキナーゼが提供される。
【実施例】
【００７４】
（６．実施例：ＤｍｋをコードするｃＤＮＡのクローニング）
（６．１  材料および方法）
チロシンキナーゼ相同ドメインを、Ｈａｎｋｓら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１、４２−５２によるアラインメントに基づいて同定した。高度に保存された領域Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｎ（配列番号７）およびＡｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ（配列番号１３）は、以下の縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計するのに用いられ：
５’−ＴＣＴＴＧＡＣＴＣＧＡＧＡＹＹＴＮＧＣＮＧＣＮＭＧＮＡＡ−３’（配列番号８）
５’−ＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＣＲＴＡＮＳＷＣＣＡＮＡＣＲＴＣ−３’（配列番号１０）
これを用いて除神経された筋肉のｃＤＮＡを用いるＰＣＲ反応をプライムした。得られた増幅ＤＮＡフラグメントを、プラスミドヘの挿入によりクローン化し、配列決定し、そしてＤＮＡ配列を、全ての公知のチロシンキナーゼの配列と比較した。ｃＤＮＡテンプレートを、オリゴｄ（Ｔ）プライマーを用いて、除神経筋組織のＲＮＡの逆転写により生成した。ＰＣＲ反応を、４０℃のプライマーアニーリング温度で行った。ＰＣＲ反応物のアリコートを、アガロースゲルでの電気泳動に供した。
【００７５】
これらのＰＣＲ反応由来のサイズ選択された増幅ＤＮＡフラグメントを、以下のようにプラスミド中にクローン化した：各ＰＣＲ反応物を上記のように再増幅し、ＸｈｏＩおよびＳａｃＩで消化して、プライマーの末端における部位を切断した（以下を参照のこと）。ＸｈｏＩ／ＳａｃＩ−切断ＤＮＡを、Ｍａｇｉｃ  ＰＣＲキット（Ｐｒｏｍｅｇａより）により精製し、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）プラスミド内の適合するＸｈｏＩ／ＳａｃＩ部位ヘクローン化し、エレクトロポレーションにより、ＤＨ１０Ｂ  Ｅ．ｃｏｌｉへ導入し、次いで選択寒天上に形質転換体をプレートした。ＰＣＲ形質転換由来のアンピシリン耐性細菌コロニーを、９６−ウエルマイクロタイタープレートに接種し、そしてチロシンキナーゼ挿入物に隣接するベクタープライマー（Ｔ３およびＴ７）を用いるＰＣＲのために用い、そしてこれらのＰＣＲフラグメントを、配列決定により分析した。
【００７６】
クローン化されたフラグメント配列の１つは、Ｄｍｋと命名された新規のチロシンキナーゼドメインのセグメントを含有していた。Ｄｍｋに対応するＰＣＲ由来フラグメントの配列を用いてＰＣＲプライマーを生成し、ＲＡＣＥ手順によりより長いＤｍｋ特異的フラグメントを得た。これらのより長いＤｍｋプローブをハイブリダイゼーションプローブとして用いて、ラットの除神経された骨格筋のｃＤＮＡライブラリーから完全長Ｄｍｋ  ｃＤＮＡクローンを得た。ＡＢＩ  ３７３Ａ  ＤＮＡシーケンサーおよびＴａｑＤｙｅｄｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＡｐＰｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて、ＤＮＡを配列決定した。Ｄｍｋの配列（図１；配列番号１）は、タンパク質のｔｒｋファミリーのメンバーと高度の相同性を有する。これは、筋肉内で見られるＪｅｎｎｉｎｇｓら、Ｔｏｒｐｅｄｏ  ＲＴＫに類似することもまた見出された。
【００７７】
（６．２  結果と考察）
既知のチロシンキナーゼ分子の保存領域に相当するオリゴヌクレオチドプライマーを、新規なオーファンチロシンキナーゼレセプター分子をコードするＤＮＡ配列を増幅およびクローン化するために使った。チロシンキナーゼファミリーの分枝の代表物のアミノ酸配列、およびこれらのタンパク質の触媒ドメイン内の相同的な範囲を縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計に使用した。次いでこれらのプライマーを、ラットの除神経筋ｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして用いる、ＰＣＲ反応の開始に使用した。次いで、その結果得られた増幅ＤＮＡフラグメントをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）プラスミドにクローン化して配列決定し、そのＤＮＡ配列を既知のチロシンキナーゼのＤＮＡ配列と比較した。Ｄｍｋと命名した新規チロシンキナーゼをコードするＰＣＲフラグメントの配列を、さらに隣接するＤＮＡ配列を取得するのに使用した。Ｄｍｋ配列を含有するＤＮＡフラグメントを、除神経骨格筋ライブラリーからｃＤＮＡクローンを取得するためのプローブとして使用した。このクローンは、ｔｒｋファミリーのタンパク質のメンバーに対して高度の相同性を有する新規チロシンキナーゼレセプターをコードしている。それはまた、ＪｅｎｎｉｎｇらのＴｏｒｐｅｄｏ  ＲＴＫとも相同的であることが見出された。
【００７８】
図１はＤｍｋクローンのヌクレオチド配列（配列番号２）を表している。
【００７９】
（７．実施例：さらなるチロシンキナーゼの同定）
他の相同的セグメントと組み合わせて、現在使い得るチロシンキナーゼレセプター中の相同的セグメントを得るために、新規Ｄｍｋ配列を使用した。例えば、Ｔｏｒｐｅｄｏ  ｔｒｋ−関連キナーゼとＤｍｋとのアラインメントは以下の保存されたタンパク質セグメントを示す：
Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ（配列番号３）
この相同性「ボックス」は他のいかなる哺乳動物チロシンキナーゼレセプターにも存在しない。本質的にこの「ボックス」に基づく縮重オリゴヌクレオチドは、既知または新規なチロシンキナーゼ相同性セグメントのいずれかと組み合わせて、新規のチロシンキナーゼレセプターを同定するのに使用し得る。
【００８０】
（７．１  材料と方法）
ＤｍｋとＴｏｒｐｅｄｏ  ＴＲＫ  Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ（配列番号３）間で高度に保存された領域、および配列番号５、７、９または１１のような相同的な既知の領域に基づくさらなるプライマーを、ｃＤＮＡを用いるＰＣＲ反応を開始するのに使われる縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計するために使用する。ｃＤＮＡテンプレートは、オリゴｄ（Ｔ）あるいは他の適当なプライマーを用いて、組織ＲＮＡの逆転写によって作製する。ＰＣＲ反応物のアリコートをアガロースゲルにおける電気泳動に供する。得られた増幅ＤＮＡフラグメントをプラスミドに挿入してクローン化して配列決定し、そしてそのＤＮＡ配列を全ての既知のチロシンキナーゼの配列と比較する。
【００８１】
これらのＰＣＲ反応由来の、サイズ選択した増幅ＤＮＡフラグメントを次のようにプラスミドにクローン化した：各ＰＣＲ反応は、上記実施例１のように再増幅し、プライマーの末端で部位を切断するためにＸｈｏＩおよびＳａｃＩで消化する（下記参照）。
【００８２】
ＸｈｏＩ／ＳａｃＩ切断ＤＮＡをプラスミド内の適合性のＸｈｏＩ／ＳａｃＩ部位にクローン化し、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉに導入し、引き続いて選択寒天培地に形質転換体をプレート化する。ＰＣＲ形質転換由来のアンピシリン耐性の細菌コロニーを９６ウエルマイクロタイタープレートに接種し、そしてこれらＰＣＲクローン由来の各コロニーを、標準的なプラスミドミニプレップ手順で精製したプラスミドＤＮＡの配列決定によって分析する。
【００８３】
新規なチロシンキナーゼドメインのセグメントを含有するクローン化フラグメントを、ｃＤＮＡライブラリーから全長ｃＤＮＡクローンを得るために、ハイブリダイゼーション用プローブとして使用する。
【００８４】
（８．実施例：Ｄｍｋの組織特異的発現）
（８．１  材料および方法）
Ｄｍｋのチロシンキナーゼドメインを含有する６８０ｎｔフラグメントを放射性標識し、様々なラット組織特異的ＲＮＡのノーザン分析に利用した。ラット組織特的ＲＮＡを１％アガロース−ホルムアルデヒドゲルによる電気泳動によって分画し、引き続いて１０×ＳＳＣを用いてナイロン膜の毛管現象を利用してトランスファーした。ＲＮＡを紫外線照射によって膜に架橋し、そして放射性標識したＤｍｋプローブを、０．５ＭＮａＰＯ４（ｐＨ７）、１％牛血清アルブミン（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ，Ｓｉｇｍａ）、７％ＳＤＳ、ｌｍＭ  ＥＤＴＡ、および１００ｎｇ／ｍ１超音波処理した変性サケ精子ＤＮＡの存在下で、６５℃でハイブリダイズした。そのフィルターを２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用い６５℃で洗い、そして−７０℃で１枚の増強スクリーン、Ｘ線フィルムを用いた５日間のオートラジオグラフィーに供した。ゲルのエチジウムブロマイド染色は、等レベルの総ＲＮＡが、異なった試料に対してアッセイされていることを示した。
【００８５】
（８．２  結果）
Ｄｍｋプローブは、成体組織中（図２）において除神経骨格筋由来の７ｋｂの転写物には強く、正常な筋肉、網膜、卵巣、心臓そして脾臓由来の転写物には弱く、ハイブリダイズした。また、より弱いレベルの発現が、肝臓、腎臓および肺にも見られ得た。それはまた、大脳、脊髄および小脳中の約６ｋｂのより短いＤｍｋ転写物に、弱くハイブリダイズする。
【００８６】
胚組織においては（図３）、Ｄｍｋ転写物は、胴体（ｂｏｄｙ）、脊髄、胎盤、および頭部（Ｅ１２およびＥ１３において）に見られ得る。
【００８７】
筋および神経組織中でのヒトＤｍｋの高発現は、本発明あるいはＤｍｋに関連したリガンドが、神経系の障害、特に運動ニューロン（考察、上記を参照）および神経筋接合部に影響を及ぼす広範な神経障害を処置することに利用し得ることを示唆する。さらに、心臓組織でのＤｍｋの高発現は、本発明、あるいはＤｍｋに関連するリガンドが、心臓病の処置に利用し得ること、そして、例えば心疾患（ｃａｒｄｉａｃ  ｅｖｅｎｔ）中または心疾患後の筋損失の防止における予防的用途（考察、上記を参照）を有し得ることを示唆する。網膜組織でのＤｍｋの発現は、本発明が、色素性網膜炎を包含するがこれに限定されない、網膜に関連した障害の治療に利用し得ることを示唆するものである。卵巣でのＤｍｋの発現は、Ｄｍｋ、あるいはＤｍｋに関連したリガンドが、卵巣に関連した疾病あるいは障害の処置に有用であり得ることを示唆するものである。最後に、脾臓でのＤｍｋの発現は、Ｄｍｋ、あるいはＤｍｋに関連したリガンドが、脾臓に関連した疾病あるいは障害の処置に有用であり得ることを示唆する。
【００８８】
（９５．微生物の寄託）
以下のクローンは、Ａｍｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ２０８５２）に、１９９３年７月１３日に寄託した。
【００８９】
（受託番号）
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｄｍｋ
本発明は本明細書中に記載した特定の実施態様による範囲内に限定されるものではない。実際、本明細書中に記載したものに加えて、様々な本発明の改変が前記の説明および添付の図から、当業者には明らかとなる。そのような改変は添付の請求の範囲内にあることが意図される。
【００９０】
様々な参考文献が本明細書に引用される（これらの開示内容は、そのまま参考として援用される）。
（配列表）
【００９１】
【数１】
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【００９２】
【数２】
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【００９３】
【数３】
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【００９４】
【数４】
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【００９５】
【数５】
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【００９６】
【数６】
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【００９７】
【数７】
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【００９８】
【数８】
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【００９９】
【数９】
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【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１−１】図１−１は、ｄｍｋの核酸および推定アミノ酸（単一文字コード）配列を示す。成熟Ｄｍｋをコードするヌクレオチド配列は、ヌクレオチド１９２の前後で始まる。
【図１−２】図１−２は、ｄｍｋの核酸および推定アミノ酸（単一文字コード）配列を示す。成熟Ｄｍｋをコードするヌクレオチド配列は、ヌクレオチド１９２の前後で始まる。
【図１−３】図１−３は、ｄｍｋの核酸および推定アミノ酸（単一文字コード）配列を示す。成熟Ｄｍｋをコードするヌクレオチド配列は、ヌクレオチド１９２の前後で始まる。
【図１−４】図１−４は、ｄｍｋの核酸および推定アミノ酸（単一文字コード）配列を示す。成熟Ｄｍｋをコードするヌクレオチド配列は、ヌクレオチド１９２の前後で始まる。
【図１−５】図１−５は、ｄｍｋの核酸および推定アミノ酸（単一文字コード）配列を示す。成熟Ｄｍｋをコードするヌクレオチド配列は、ヌクレオチド１９２の前後で始まる。
【図１−６】図１−６は、ｄｍｋの核酸および推定アミノ酸（単一文字コード）配列を示す。成熟Ｄｍｋをコードするヌクレオチド配列は、ヌクレオチド１９２の前後で始まる。
【図１−７】図１−７は、ｄｍｋの核酸および推定アミノ酸（単一文字コード）配列を示す。成熟Ｄｍｋをコードするヌクレオチド配列は、ヌクレオチド１９２の前後で始まる。
【図１−８】図１−８は、ｄｍｋの核酸および推定アミノ酸（単一文字コード）配列を示す。成熟Ｄｍｋをコードするヌクレオチド配列は、ヌクレオチド１９２の前後で始まる。
【図１−９】図１−９は、ｄｍｋの核酸および推定アミノ酸（単一文字コード）配列を示す。成熟Ｄｍｋをコードするヌクレオチド配列は、ヌクレオチド１９２の前後で始まる。
【図２】図２は、発育初期のＤｍｋの分布を示すノーザンブロットを示す。レーン１：胎児全体Ｅ９；レーン２：胎児全体Ｅ１１；レーン３：胎盤Ｅ１１；レーン４：胎児頭Ｅ１２；レーン５：胎児体Ｅ１２；レーン６：胎児脊髄Ｅ１２；レーン７：胎盤Ｅ１２；レーン８：胎児頭Ｅ１３；レーン９：胎児体Ｅ１３；レーン１０：胎児脳Ｅ１７；レーン１１：胎児脳Ｐｌ；レーン１２：胎児脳Ｐ１０；レーン１３：胎児脳Ｐ１９；レーン１４：成体脳；レーン１５：成体筋肉；レーン１６：成体除神経筋、ここでは、受精の日を日Ｅｌとし、誕生の日を日Ｐｌとする。
【図３】図３は、成体組織のＤｍｋの分布を示すノーザンブロットを示す。レーン１：脳；レーン２：嗅球；レーン３：皮質；レーン４：海馬；レーン５：視床／視床下部；レーン６：中脳；レーン７：後脳；レーン８：小脳；レーン９：脊髄；レーン１０：胸腺；レーン１１：脾臓；レーン１２：肝臓；レーン１３：腎臓；レーン１４：肺；レーン１５：座骨神経；レーン１６：網膜；レーン１７：心臓；レーン１８：卵巣；レーン１９：筋肉；レーン２０：除神経筋。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図２】
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【図３】
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