(57)【要約】【課題】腹膜炎、病状等の診断、  判定、もしくは腹膜機能の判定に非常に有効な指標物質の検出方法を提供することである。詳しくは、腹腔排液中の同じ基質特異性を持つＭＭＰ−２とＭＭＰ−９を、ゼラチン分解活性を指標として、簡便かつ安価に区別して検出する方法、およびその検出方法を用いることにより、非細菌性腹膜炎を細菌性腹膜炎と区別して早期に判定するのに好適な検出方法の提供。【解決手段】マトリックスメタロプロテイナーゼ−２を、ゼラチン分解活性を指標としてマトリックスメタロプロテイナーゼ−９と区別して検知することを特徴とする検出方法。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マトリックスメタロプロテイナーゼ−２を、ゼラチン分解活性を指標としてマトリックスメタロプロテイナーゼ−９と区別して検知することを特徴とする検出方法。
【請求項２】
腹腔排液中に含まれるマトリックスメタロプロテイナーゼ−２を、ゼラチン分解活性を指標としてマトリックスメタロプロテイナーゼ−９と区別して検出することを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
腹膜硬化症、硬化性腹膜炎、硬化性被嚢性腹膜炎（ＳＥＰ）  、被嚢性腹膜硬化症（ＥＰＳ）等の非細菌性腹膜炎を鑑別するのに用いることができる、腹腔排液中に含まれるマトリックスメタロプロテイナーゼ−２を、ゼラチン分解活性を指標として検知することを特徴とする請求項１または２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記非細菌性腹膜炎または細菌性腹膜炎のどちらか一方を、他方と区別して鑑別するのに用いることができる、腹腔排液中に含まれるマトリックスメタロプロテイナーゼ−２をマトリックスメタロプロテイナーゼ−９と区別して検知することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の検出方法。
【請求項５】
自覚症状が出ていない段階で、前記非細菌性腹膜炎を鑑別するのに用いることができる、腹腔排液中に含まれるマトリックスメタロプロテイナーゼ−２を、ゼラチン分解活性を指標として検知することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の検出方法。
【請求項６】
腹膜透析における腹膜機能を判定するのに用いることができる、腹腔排液中に含まれるマトリックスメタロプロテイナーゼ−２を、ゼラチン分解活性を指標として検知することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中の指標物質の検出方法、または腹膜炎、病状等の診断、判定、鑑別もしくは腹膜機能の判定に利用できる指標物質の検出方法に関する。詳しくは、腹腔排液中のマトリックスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）を、ゼラチン分解活性を指標としてマトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）と区別して簡便かつ安価に検出する方法、および非細菌性腹膜炎を、細菌性腹膜炎と区別して早期に判定するのに用いることができる検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、金属イオン依存性の細胞外マトリックス分解酵素であり、生体内では発生、分化、血管新生、創傷治癒、生殖、組織のリモデリング等に関与していることが知られている。また、癌細胞の基底膜への浸潤、転移や増殖能、炎症性細胞の組織への浸潤や遊走等、病理学的、生理学的な組織の破壊を伴う様々な疾患にも関与している。ヒトＭＭＰは、現在までに約２０種類の分子が同定されており、１）活性中心に亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）を有し、補酵素としてカルシウムイオン（Ｃａ２＋）  を必要とする、２）前駆体酵素として産生、分泌され、細胞外で各種のＭＭＰ活性化酵素によって切断され、ＭＭＰの活性化が起こる。また、３）ＭＭＰは生体内の細胞外マトリックスを分解するが、４）その酵素活性はＴＩＭＰ（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ）、マリマスタット等により特異的に阻害される。そして、５）各ＭＭＰの一次構造は高い相同性を有するが、基質特異性の違いはこの一次構造のわずかな相違による高次構造の違いに依存する、と言われている。
【０００３】
ＭＭＰは、基質特異性の違いにより、コラゲナーゼ群、ゼラチナーゼ群、ストロメライシン群、ＭＴ−ＭＭＰ群、その他のサブファミリーに分類される。コラゲナーゼ群のＭＭＰは、一般的なプロテイナーゼでは分解されない間質系コラーゲンの初期分解を行う。ゼラチナーゼ群のＭＭＰは、コラーゲン群のＭＭＰによって初期分解したコラーゲン断片の更なる分解や、マクロファージや顆粒球等の炎症性細胞や繊維芽細胞の組織への浸潤や遊走、さらには血管新生等における基底膜の分解に関与している。ストロメライシン群のＭＭＰは、他の前駆体ＭＭＰを切断して活性化ＭＭＰにするだけでなく、プロテオグリカンのコア蛋白質やエラスチン等の様々な細胞外マトリックスの分解に関与している。
【０００４】
腹膜炎は、腹腔内に非自己の物質である異物が侵入したり、腹腔内への透析液等の注液による刺激で引き起こされる非細菌性腹膜炎と、ブドウ球菌や緑膿菌等の細菌による細菌性腹膜炎に分類される。非細菌性腹膜炎においては、腹膜の著しい肥厚およびＭＭＰ−２活性の上昇を特徴とし、細菌性腹膜炎においてはＭＭＰ−９濃度の急上昇等、分子生物学的に異なる現象があることが知られている（例えば、特許文献１参照）  。しかし、この二種類の腹膜炎の症状は、腹痛、発熱、嘔吐、食欲不振、下痢等、いずれも共通しており、発症初期に腹部の触診等の臨床的診断により判定することは、専門家であっても極めて困難であった。
【０００５】
非細菌性腹膜炎の治療方法としては、早期に発見できれば初期療法としてステロイド剤が有効である。しかし、一般にステロイド剤は免疫力を著しく低下させるため、細菌性腹膜炎患者への誤投与は避けるべきである。また、非細菌性腹膜炎患者への抗生剤の誤投与は、抗生剤の不必要な使用や抗生物質耐性菌の発生につながり、臨床医学的に好ましくない結果をもたらす。このような流れの中で、非細菌性腹膜炎と細菌性腹膜炎を、臨床的検査により正確に判定する必要性が高まっていた。そのような判定手段の一つとして、非細菌性腹膜炎と細菌性腹膜炎の分子生物学的現象の相違、すなわち腹腔排液中におけるＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の活性を検出する方法が試みられている。腹膜硬化症、硬化性腹膜炎、硬化性被嚢性腹膜炎（ＳＥＰ）および被嚢性腹膜硬化症（ＥＰＳ）等の非細菌性腹膜炎の場合は、腹腔排液中のＭＭＰ−２の濃度が高いもののＭＭＰ−９の濃度は極めて低い。一方、細菌性腹膜炎の場合は、腹腔排液中のＭＭＰ−９は高濃度に存在するが、ＭＭＰ−２の濃度はそれ程高くない。この現象を利用して、前記先願技術（特許文献１）および特開２００１−２９２７９７号公報の方法により、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９を特異的に検出し分ける方法が提唱されている（特許文献１、２参照）  。しかし、いずれの判別法も、操作手順が煩雑で時間がかかるとともに、特殊な分析機器や熟練した技術を必要とする。そこで、腹腔排液中のＭＭＰ−２をＭＭＰ−９と区別して簡便かつ安価に検出する方法が求められていた。
【０００６】
【特許文献１】
特開２０００−１７１４６８号公報
【特許文献２】
特開２００１−２９２７９７号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、腹膜炎、腹膜炎の病状等の診断、  判定、もしくは腹膜機能の判定に非常に有効な指標物質の検出方法を提供することである。詳しくは、腹腔排液中のＭＭＰ−２とＭＭＰ−９を、ゼラチン分解活性を指標として、簡便かつ安価に区別して検出する方法、およびその検出方法を用いることにより、非細菌性腹膜炎を細菌性腹膜炎と区別して早期に判定するのに好適な検出方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
ＭＭＰ−２を、ゼラチン分解活性を指標としてＭＭＰ−９と区別して検知することを特徴とする検出方法を提供する。
【０００９】
腹腔排液中に含まれるＭＭＰ−２を、ゼラチン分解活性を指標としてＭＭＰ−９と区別して検出することを特徴とする請求項１に記載の検出方法を提供する。
【００１０】
腹膜硬化症、硬化性腹膜炎、ＳＥＰ、ＥＰＳ等の非細菌性腹膜炎を鑑別するのに用いることができる、腹腔排液中に含まれるＭＭＰ−２を、ゼラチン分解活性を指標として検知することを特徴とする請求項１または２に記載の検出方法を提供する。
【００１１】
前記非細菌性腹膜炎または細菌性腹膜炎のどちらか一方を、他方と区別して鑑別するのに用いることができる、腹腔排液中に含まれるＭＭＰ−２をＭＭＰ−９と区別して検知することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の検出方法を提供する。
【００１２】
自覚症状が出ていない段階で、前記非細菌性腹膜炎を鑑別するのに用いることができる、腹腔排液中に含まれるＭＭＰ−２を、ゼラチン分解活性を指標として検知することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の検出方法を提供する。
【００１３】
腹膜透析における腹膜機能を判定するのに用いることができる、腹腔排液中に含まれるＭＭＰ−２を、ゼラチン分解活性を指標として検知することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の検出方法を提供する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を好適な実施例に基づいて詳細に説明する。本発明は、生物個体（以下、個体と表記する）内から採取した試料中の指標物質であるＭＭＰを、個体外において生化学的方法を用い、簡便かつ安価に検出することを特徴とする（以下、本発明の検出方法と記す）  。
【００１５】
本発明の検出方法は、ＭＭＰを検出できる物質を、ＭＭＰを含んだ試料に接触させることにより行うことを特徴とする。ＭＭＰを検出できる物質は、支持体に結合させた状態で使用することもできる。ここで、ＭＭＰを検出できる物質とは、ＭＭＰの基質、ＭＭＰと反応する物質、ＭＭＰの分解、修飾、多量体化等の形状変化によって生じた物質と反応する物質またはそれぞれの反応後の生成物に反応する物質等、広くＭＭＰを検出することができる物質のことで、ＭＭＰそのものと反応する物質だけに限定されない。
【００１６】
ＭＭＰを検出できる物質は支持体に支持されていることが好ましい。ＭＭＰを検出できる物質を結合させる支持体としては、本発明の検出方法を実施するにあたり、検出反応を阻害しない範囲で広く公知のものを使用することができる。具体的には、鉄、アルミニウム、銅、チタン等の金属またはその化合物；ホウ素、ケイ素、炭素、カルシウム等の非金属またはその化合物；上記金属または非金属を含有した合金またはその化合物；ナイロン、綿、ポリエステル、レーヨン、ポリアミド等の繊維；フィルム、ガラス、ゴム、樹脂、紙等が挙げられる。これらの支持体は、１種単独でも２種以上を組み合わせて使用してもよい。ＭＭＰを検出できる物質の支持体への結合様式としては、共有結合、疎水結合、水素結合、分子間力等、種々の物質間または物体間に作用するエネルギーを利用した結合方法を用いることができる。
また、ＭＭＰを検出することができる物質そのものを、前記物体として使用することも可能である。
【００１７】
前記物体と試料とを接触させる方法としては、広く公知の方法を使用することができる。具体的には、流動性のない試料中に前記物体の全体または一部を一時的または定常的に浸す方法、物体の全体または一部に試料を滴下する方法、流動性のある試料中に物体を一時的に入れるまたは定置させる方法、物体を試料が揮発した雰囲気下に置く方法等である。物体の一部に試料を接触させる場合は、物体の１ヶ所に限らず２ヶ所以上と試料を接触させることができる。この場合、試料は同一のものであっても、それぞれ異なる由来の試料であっても良い。これらの方法の中でも好ましくは、前記物体の全体または一部を試料に浸す方法、物体上に試料を滴下する方法である。試料と物体上のＭＭＰを検出する物質とが効率的に反応し、検出の必要な試料の量を少なくできるからである。
【００１８】
本発明で試料を採取する個体とは、自立的および／または寄生的生活形態を持つ広く個体全般のことを指し、ヒト、サル、ラットなど哺乳動物や実験動物に限られない。具体的には、ヒト、サル、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ネコ、ブタ等の哺乳動物；メダカ、フナ等の魚類；カエル（オタマジャクシ）、イモリ、アシナシイモリ等の両生類；ハト、インコ、オウム、カナリア、ニワトリ等の鳥類；その他爬虫類等を含めた脊椎動物、無脊椎動物、植物等が挙げられる。これらの個体の中でも、ヒト等の哺乳動物や実験動物が好ましい。より好ましくは、透析を行っているヒト等の疾患を有する哺乳動物である。
【００１９】
上記のような個体から採取された試料は、本発明の特性に合致するものであれば、特に制限なく用いることができる。また、試料の採取場所、採取方法、液体、個体等の試料の形態についても、特に制限はない。本発明に用いることができる試料として具体的には、透析排液、腹水等の腹腔排液；肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、甲状腺癌、肝臓癌、膵臓癌、口腔癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌等の悪性腫瘍または良性腫瘍由来の細胞抽出液；肺、食道、胃、小腸、大腸、肝臓、腎臓、膵臓、乳房等の疾患が疑われていない器官由来の試料；胸水、血液、リンパ液、唾液、関節液等である。これらの中でも、治療、手術、検査目的で採取された試料が好ましい。そのような試料は、必然的に得られることから、個体に新たな苦痛等を与えなくてもすむからである。より好ましくは、透析等により得られる腹腔排液；胸水である。腹腔内膜または胸腔内膜は、ＭＭＰ−２が多量に含まれているので、本発明を実施するのに必要な試料の量が少なくてすむ。
【００２０】
本発明の検出方法で使用される試料の温度は、検査対象とするＭＭＰが、好適に検出できる温度であることが好ましい。極端に高温であるとＭＭＰが熱エネルギーによって分解されたり、変性を受けてしまい、極端に低温であるとＭＭＰと検査試薬との反応性が悪くなるからである。試料を採取したときの試料の温度が試料中のＭＭＰを測定するのに好ましくない範囲にある場合は、適当な加温器を用いて試料の温度を好適な範囲にすることもできる。具体的には、ＭＭＰはタンパク質であるので０〜６０℃、好ましくは１０〜５０℃、より好ましくは試料中のＭＭＰの活性が測定の目的に反映される温度範囲である３０〜４０℃である。至適温度をもつＭＭＰについては、その温度で測定を行うこともできる。
【００２１】
試料のｐＨは、ＭＭＰがｐＨによる変性、分解等を受けない範囲であればよい。好ましくは、ＭＭＰを検出するにあたり、検出試験系で使用される他の試薬、物質等に大きな影響を与えないｐＨである。具体的にはｐＨ３〜９、好ましくは、ｐＨ５〜８である。
【００２２】
本発明の検出方法は、個体から採取した試料に対して、広く適用することができる。特に、試料を採取した個体内で、検出対象であるＭＭＰの変化がある条件が好適である。一例として、上記疾患の一つである腹膜炎発症時のＭＭＰの検出が挙げられる。腹膜炎とは、腹膜の炎症等のことで、医学的な定義と同義である。また、腹膜機能の低下とは、腹膜透析において腹膜平衡試験におけるＤ／Ｄ０グルコース値や透析排液量などが低下する状態のことであり、一般に腹膜透析の臨床医学において用いられている定義と同義である。
【００２３】
ＭＭＰのゼラチナーゼ活性を解析するためには、特異的基質が必要である。このようなゼラチナーゼ活性を測定するための基質としては、ゼラチナーゼが基質として認識し、認識した物質を分解することができるものであれば、広く公知のものを使用できる。このような基質として具体的には、ゼラチンそのものだけでなく、化学合成されたゼラチナーゼ合成基質やラベルされたゼラチン等の人工物やゼラチナーゼが認識するのと同じ認識部位を持つ天然物である。好ましくは、これらの基質を使用してゼラチナーゼを用いて酵素活性を調べたとき、ゼラチナーゼのＫｍ値が小さい基質である。ゼラチナーゼが、これらの基質をより効率よく認識し、酵素反応が極めて早く進行すると共に、検出に要する時間が短くなるからである。本明細書では、ゼラチナーゼの基質となるすべての物質をゼラチン群と表記することがある。
【００２４】
ここでゼラチン群とは、ゼラチンそのものだけでなく、上記のような方法で得られたゼラチナーゼの基質になるすべての物質を指す。本発明の検出方法においては広く公知のゼラチン群を使用することができる。また、ゼラチン群は架橋されたものでもよく、その架橋度は、本発明の検出方法に用いたときに、ＭＭＰによる分解で後に詳述の染料等による着色で、分解したゼラチン群と分解していないゼラチン群が判別できる範囲であれば良い。そのようなゼラチン群の中でも、動物の皮、腱、骨、軟骨、筋膜、しっぽ等、コラーゲンを含有する物質を熱湯で長時間処理し、コラーゲン分子間の塩類結合や水素結合の少なくとも一部が開裂した結果、非可逆的に水溶性タンパク質に変化したものが好ましい。より好ましくは、概ね分子量１０万以上で温水中ではゾルの状態だが、室温ではゲルとなるものである。このようなゼラチンであれば、ゼラチナーゼによって分解された時、その変化が視覚的に観察でき、特殊な機器を使用しなくともゼラチナーゼの活性を測定できるからである。
【００２５】
本発明の検出方法に使用されるゼラチン群は、検出に適した形状に加工して用いることができる。ここで加工とは具体的に、ゼラチン群の塊状物質を薄層にスライスしたり、フィルム、ガラスや樹脂等の支持体上に薄層コートしたり、アガロースゲルやポリアクリルアミドゲル中に混合する等、一般に認識される意味での加工である。検出に適した形状に加工された基質であるゼラチン群を、本明細書では基質フォームと表記することがある。このようなゼラチン群を加工する場合は、フィルム、ガラスや樹脂等の支持体上に薄層コートする方法が好ましい。本発明の検出方法では、試料中に上述の基質フォームの全体または一部を接触させることから、試料中での基質フォームの安定性が重要で、支持体が非水溶性であれば、水溶液中で十分な安定性を得られるからである。また、易崩壊性の支持体に薄層コートする方法も好ましい。易崩壊性であれば、基質フォームを試料中に完全に浸し、検出に要する時間経過後、試料中に溶解させることにより廃棄が容易に行えるからである。
【００２６】
本発明の検出方法においては、染料着色、蛍光修飾等の着色を行うことによって、簡便にＭＭＰを検出することができる。前記基質フォームを使用する場合には、ＭＭＰの染料着色、蛍光修飾による検出は、ゼラチン分解反応の前に、あらかじめ前記基質フォームを着色しておくことも、ＭＭＰによるゼラチン群の分解反応を行った後、または分解反応と同時に行うこともできる。また、着色はゼラチン分解反応の前、反応と平行して、反応後の３つのうち、任意の少なくとも１回以上行うことができる。
このようなゼラチン分解活性を観察するためには、ゼラチン分解反応を行った後に、ゼラチン群が分解された部分が上記の染料等によって染色されなくなる場合だけでなく、逆にゼラチン群が分解された部分が上記の染料等によって染まる場合を含む。さらに、ゼラチン群の分解された部分と分解されなかった部分が、異なる染料により染色される場合も含む。
【００２７】
このような目的に用いられる染料、顔料および／または蛍光試薬は、広く公知のものを使用することができる。具体的には、アゾ染料、アゾメチン染料、インドアニリン染料、ベンゾキノン染料、ナフトキノン染料、アントラキノン染料、ジフェニルメタン染料、トリフェニルメタン染料、キサンテン染料、アクリジン染料、アジン染料、アリザリン染料、オキサジン染料、チアジン染料、チアゾール染料、メチン染料、オキソノール染料、メロシアニン染料、シアニン染料、アリーリデン染料、スチリル染料、スチルベン染料、フタロシアニン染料、ペリノン染料、ピラゾロン染料、インジゴ染料、インジゴイド染料、チオインジゴ染料、キノリン染料、ニトロ染料、ニトロソ染料、硫化染料などを挙げることができる。これらの中でも、工業的に比較的大量に生産されているためコストも低く、フィルム、ガラス板等に塗布して使用したときに、他に特殊な検出機器等がなくとも視覚的に標的物質の存在、活性、消失等を分析できるものが好ましい。これらの染料、顔料または蛍光試薬は、１種単独でも２種以上を併用して使用することもできる。
【００２８】
以下に、腹腔排液を試料として用いた本発明の好適な実施形態を一例にして、本発明を具体的に述べていく。発明者が鋭意研究を行った結果、ゼラチンザイモグラフィーの解析から、非細菌性腹膜炎の腹腔排液中のゼラチン分解活性は、活性型ＭＭＰ−２によるものであることが明らかとなった。特開２０００−１７１４６８号公報で公知であるように、非細菌性腹膜炎においてＭＭＰ−２は高濃度で存在するが、ＭＭＰ−９は極めて低濃度である。しかし、図２の結果が示すように、後に詳述する非細菌性腹膜炎の実験動物モデルであるグルコン酸クロルヘキシジン投与群およびタルク投与群とも、コントロール群と比較して前駆体ＭＭＰ−２，活性型ＭＭＰ−２の濃度が上昇している。腹腔排液のような溶液状態では、活性型プロテイナーゼは前駆体プロテイナーゼは活性を有さないので、溶液中のＭＭＰ−２の活性は活性型ＭＭＰ−２に依存すると考えられる。また、ＭＭＰ−９のゼラチン分解活性は、コントロール群と比較してグルコン酸クロルヘキシジン投与群では検出されず、タルク投与群でのみ前駆体ＭＭＰ−９活性が検出されるに止まる。したがって、前駆体ＭＭＰ−９がゼラチン分解活性を有さないことに加えて、活性型ＭＭＰ−９はほとんど存在しないことから、ＭＭＰ−９のゼラチン分解活性は極めて低いと考えられる。全体として、腹腔排液中のゼラチン分解活性は、活性型ＭＭＰ−２に支配される。
【００２９】
発明者はさらに鋭意研究した結果、ゼラチンザイモグラフィーから、細菌性腹膜炎の透析排液には、前駆体ＭＭＰ−９、前駆体ＭＭＰ−２が含まれることが明らかとなった。特開２０００−１７１４６８号公報で公知の通り、細菌性腹膜炎においてはＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９とも高濃度に存在する。図３の結果が示す通り、コントロール群と比較して細菌性腹膜炎の透析排液では、前駆体ＭＭＰ−２の顕著な変化はなく、活性型ＭＭＰ−２は検出されない。したがって、ＭＭＰ−２全体のゼラチン分解活性は極めて低いことがわかる。同様に、ＭＭＰ−９を前駆体および活性型に分けて考えると、前駆体ＭＭＰ−９はコントロール群と比較して顕著に増加しているが、活性型ＭＭＰ−９は検出されない。したがって、全体として、透析排液中のゼラチン分解活性は、極めて低いと考えられる。
【００３０】
本発明の検出方法により、腹腔排液中に含まれるＭＭＰ−２のゼラチン分解活性を、ＭＭＰ−９のゼラチン分解活性を検出しないことにより検出することができる。前記の通り、非細菌性腹膜炎モデルの腹腔排液から採取された検体中には、活性型ＭＭＰ−２が存在するため、ゼラチン分解活性を示すと推測され、図４の結果が示すようにゼラチン分解活性が認められる。一方、細菌性腹膜炎の透析排液中には、前記ゼラチンザイモグラフィーの解析結果より前駆体ＭＭＰ−９が存在するが、活性型ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９は検出限界以下である。図４の結果が示すように、細菌性腹膜炎の透析排液ではゼラチン分解活性は観察されない。故に腹腔排液の試料を用い、本発明の検出方法を行ってゼラチン分解活性が認められると、それは活性型ＭＭＰ−２、すなわちＭＭＰ−２によるものであると判断できる。つまり、腹腔排液については、ＭＭＰ−９と区別してＭＭＰ−２を検出することができる。
【００３１】
本発明の検出方法に従って、腹腔排液中のゼラチン分解活性を解析することにより、腹膜硬化症、硬化性腹膜炎、ＳＥＰ、ＥＰＳ等の非細菌性腹膜炎の合併症を判定するすることができる。腹腔排液から得られた試料について、本発明の検出方法を行いゼラチン分解活性が認められた場合、このゼラチン分解活性はＭＭＰ−２に由来するものと推測されるので、試料を採取した個体は非細菌性腹膜炎を発症していると判定できる。即ち、本発明は、ＭＭＰ−２のゼラチン分解活性を指標として非細菌性腹膜炎発症の判定に有効な検出方法を提供することができる。
【００３２】
本発明の検出方法を、個体からの腹腔排液を試料として用いることにより、非細菌性腹膜炎を細菌性腹膜炎と区別して判別するのに、有効な検出方法を提供することができる。前記の通り、非細菌性腹膜炎においては、ＭＭＰ−２の中でも活性型ＭＭＰ−２がゼラチン分解活性を示す。したがって、腹腔排液から得られた試料について、本発明の検出方法によりゼラチン分解活性を測定することにより、ゼラチン分解活性が認められれば非細菌性腹膜炎を発症していることを判定できる。一方、細菌性腹膜炎においては、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９のゼラチン分解活性は、本発明の検出方法では検知されない。したがって、非細菌性腹膜炎または細菌性腹膜炎の、  どちらかであることが不明の腹膜炎を発症した個体から採取した腹腔排液について、本発明の検出方法によりゼラチン分解活性を測定しゼラチン分解活性が認められれば、個体は非細菌性腹膜炎を発症していると判別することができる。逆に、ゼラチン分解活性が認められない腹膜炎の場合は、個体は細菌性腹膜炎を発症していると判別することができる。つまり、本発明の検出方法は、腹膜炎を発症した個体について、非細菌性腹膜炎と細菌性腹膜炎のどちらか一方の腹膜炎を、他方の腹膜炎と区別して判定するのに必要な検出方法を提供できる。
【００３３】
腹膜炎を発症していない個体または腹膜透析などを行っている個体から採取した腹腔排液について、本発明の検出方法を適用しゼラチン分解活性を測定することで、具体的な腹膜炎の症状が現れていない段階でも、腹膜炎を検知できる検査方法を提供することができる。本発明の検出方法の対象であるＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９は、腹痛、発熱、嘔吐等の腹膜炎の具体的症状に先立ち、腹膜排液中の濃度が増加または活性化される分子である。したがって、これにより、具体的な腹膜炎等の症状が現れていない段階でも、腹膜炎が起こる可能性が高いと予測できる。
【００３４】
本発明の検出方法には、ＭＭＰ−２および／またはＭＭＰ−９に特異的に作用する阻害剤を使用することにより、ＭＭＰ−２をＭＭＰ−９と区別して、より正確に非細菌性腹膜炎を判定するために用いることができる検出方法を実施することができる。本発明の検出方法によるゼラチン分解活性が、他のゼラチナーゼでなくＭＭＰ−２によることが、より明確となるからである。このような目的に使用されるＭＭＰ特異的な阻害剤により、本発明の検出方法のゼラチン分解活性が、どのＭＭＰによるものであるかがより明確になり、非細菌性腹膜炎発症の診断をさらに確度高く行うことができるからである。
【００３５】
本発明の検出方法は、  ＭＭＰ−２の基質であるゼラチン群を支持体に結合させた基質フォームを試薬として含有した試薬一式（キット）を用いて行えば、さらに容易に実施することもできる。試薬一式（キット）は、  ゼラチン分解活性を測定するために広く用いられる公知の試薬を含有していても、バット、シャーレ、エッペンドルフチューブ等の他の器具が付属していてもよい。具体的に試薬としては、ゼラチン群、支持体、基質フォーム、試料希釈用緩衝液、ゼラチン分解活性測定用緩衝液、染料・顔料・蛍光含有試薬、染色用緩衝液、脱染用試薬、ポジティブコントロール用試薬、  ネガティブコントロール用試薬、蒸留水等が挙げられる。これらの試薬は試薬一式（キット）の中で、  それぞれ独立に梱包されて提供されてもよいし、２種以上の試薬が混合された形で提供されてもよい。試薬一式（キット）中のそれぞれの試薬の濃度に特に制限はなく、  本発明を実施するについて可能な範囲であればよい。また、試薬一式（キット）には、好適なゼラチン分解活性測定条件等の情報がさらに添付されていてもよいし、  基質フォームのみであってもよい。
【００３６】
【実施例】
以下に、具体的実施例を詳細に示すが、本発明はこれらの実施例に限られない。また、実施例において使用した試薬の濃度「％」は、特に明示のない限り試薬の体積に対する質量パーセント、すなわちＷ／Ｖ％で表記した。
【００３７】
本発明者は、ＭＭＰ−２のゼラチン分解活性を指標とした非細菌性腹膜炎の簡便な判定法の開発を目的として、非細菌性腹膜炎の実験動物モデル系の作製を試みた。ヒトの腎臓機能障害の治療法の１つとして腹膜透析を行うと、前述の通り、腹膜硬化症、硬化性腹膜炎、ＳＥＰ、ＥＰＳ等、腹膜肥厚を伴いうる様々な非細菌性腹膜炎等の合併症を引き起こす。しかし、これらの非細菌性腹膜炎の原因は、可塑剤、粒子状物質等の異物の腹膜への侵襲、腹膜透析液による腹腔内ｐＨの急激な変化、腹膜洗浄液の腹膜への浸潤等、非常に多岐に及ぶ。また、実験動物モデル系はあくまで非ヒトの実験系であるため、本発明ではすでに確立された二種類の実験動物モデル系を、非細菌性腹膜炎のモデル系として使用することにした。
【００３８】
第１の実験動物モデル系では、ラットに対し消毒剤であるグルコン酸クロルヘキシジンをアルコールに溶解した溶液を、腹腔内に注射器で直接投与して非細菌性腹膜炎を発症させるモデル系である。この実験動物モデル系は、腹膜に直接化学的刺激を与えることで、腹膜肥厚および腹膜機能の低下を引き起こす。
【００３９】
第２の実験動物モデル系は、ラットに対し異物であるタルク（ケイ酸マグネシウムの三斜晶系結晶）を生理食塩水に懸濁し、注射器を用いて腹腔に直接投与することにより、非細菌性腹膜炎に相当する炎症を引き起こすモデル系である。この実験動物モデル系では、腹膜の線維性肥厚、腹膜機能の低下、腹膜癒着までいたる比較的重症の非細菌性腹膜炎のモデル系である。
【００４０】
第１および第２の実験動物モデル系で使用したのは、ＳＰＦ／ＶＡＰのラット（Ｃｒｊ：（ＳＤ）ＩＧＳ、８週齢、オス）である。本発明で使用したラットは、給餌および給水を十分行い飢餓状態にせず、飼育する衛生環境にも十分注意した。また、ラットは細菌感染などによる細菌性腹膜炎等の疾患が発症しないように留意した。
【００４１】
実験で使用したグルコン酸クロルヘキシジン溶液は、１５％エタノール水溶液（Ｖ／Ｖ％蒸留水）中で、グルコン酸クロルヘキシジンの濃度が０．１％となるように無菌的に調製した。この溶液をラットの腹腔に注射器を用いて、無菌的に３ｍｌずつ投与し、これを１日に１回で、３週間継続して行った。投与は、ラットにエーテル麻酔をかけた状態で行い、極力ラットに肉体的、精神的苦痛を与えないように配慮した。
【００４２】
実験で使用したタルク溶液は、１ｇの粉末タルクを１５ｍｌの生理食塩水で懸濁した後、高圧蒸気滅菌を２０分間行った。このようにして用意したタルク溶液を、ラットの腹腔に注射器を用いて、無菌的に一回に１５ｍｌ投与した。一回の投与後は６日間休息を与え、このサイクルを１回とすると、３サイクル行った。投与はラットにエーテル麻酔をかけた状態で行い、ラットに肉体的、精神的苦痛を与えないように配慮し、投与自体に伴う副反応を極力抑えた。
【００４３】
コントロール群としては、生理食塩水（ペリトリックＰ２５０、テルモ社製）のみを投与したものを設定した。投与スケジュールは、グルコン酸クロルヘキシジン投与群と同様の条件で行い、毎日１回１５ｍｌずつ投与した。
【００４４】
コントロール群、グルコン酸クロルヘキシジン投与群およびタルク投与群のいずれも、各群に使用するラットは４匹（ｎ＝４）とし、最初の投与から２２日目に、下記の腹膜平衡試験を行った。本実施例では、腹膜平衡試験実施時に試料となる腹腔排液の無菌試験を行い、好気性細菌、嫌気性細菌、真菌が感染していないことを確認した。
【００４５】
腹膜機能は、腹膜におけるグルコースの透過性、すなわちＤ／Ｄ０グルコース値で評価した。Ｄ／Ｄ０グルコース値を算出するための腹膜平衡試験は以下のようにして行った。ラットの体重当たり５０ｍｌ／ｋｇの２．５％グルコース含有透析溶液（ペリトリックＰ２５０、テルモ社製）を、注射器を使用して消毒したラットの腹部に注液した。注液直後、腹腔から０．５ｍｌを回収し、回収液中のグルコース濃度（Ｄ０％）を測定した。次に、透析溶液の注液９０分後、ラットの腹腔に注射針を指して腹腔内の溶液を採取し、採取した溶液のグルコース濃度（Ｄ％）を測定した。そして、このグルコース濃度Ｄを、注液直後の腹腔排液中のグルコース濃度（Ｄ０＝２．５％）で除して、Ｄ／Ｄ０グルコース値を算出する。なお、グルコース濃度は、ムロターゼ酵素法により測定した。この結果を下記図１に示す。
【００４６】
図１の結果が示すように、グルコン酸クロルヘキシジン投与群およびタルク投与群では、コントロール群と比較して著しくＤ／Ｄ０グルコース値が小さく、腹膜機能が低下していることが明らかとなった。
【００４７】
図１において、投与９０分後に得られた腹腔排液について、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の存在を調べるためにザイモグラフィー法による解析を行った。ザイモグラフィーの基質としては、ゼラチンを用い、腹腔排液中でゼラチナーゼ活性をもつ酵素の存在、およびその活性化レベルの検索を行った。腹腔排液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料用緩衝液（０．０９Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）／３％ＳＤＳ／１０％グリセリン／ブロモフェノールブルー、サンプルバッファー）で１６倍に希釈した。次に、１４％ゼラチンを含有した０．１％ＳＤＳ／１０％ポリアクリルアミドゲルに、１レーンにつき４μｌをアプライし電気泳動を行った。電気泳動で用いる電気泳動用緩衝液は、０．１９Ｍグリシン／０．００１％ＳＤＳ／０．０２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）（ランニングバッファー）の組成のものを使用した。１００Ｖの定電圧（Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｖｏｌｔａｇｅ）で４時間電気泳動を行った後、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／０．１Ｍ塩化ナトリウム／２．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（リナチュレーションバッファー）の溶液に泳動済みのゲルを浸し、卓上振盪器で４５回転／分の速度で１．５時間振盪し、ゲル中のＭＭＰのリナチュレーションを行った。この処理により、ゲル中の前駆体ＭＭＰ−２および前駆体ＭＭＰ−９が、それぞれ強制的に活性型に転換する。次に、ゲルの表面を蒸留水で３回洗浄し、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／１０ｍＭ塩化カルシウム溶液（リアクションバッファー）に浸し、３７℃で１８時間反応させた。ゼラチン分解反応終了後、ゲルの表面を蒸留水で３回洗浄し、クマシー染色を行った。染色液としては、１．２５％クマシーブリリアントブルーＲ−２５０／４５％エタノール／１０％酢酸水溶液を用い、この染色液中にゲルを浸し、ゆっくりと２０分間振盪した。染色終了後、過剰の染色液を除去するために、２５％エタノール／８％酢酸水溶液中にゲルを浸して脱染し、最後に蒸留水でゲルを洗浄した。
【００４８】
前記のとおりに行ったゼラチンザイモグラフィーの結果を図２に示す。電気泳動により指標物質が分離され、ゼラチナーゼ活性をもつ指標物質は、その固有の位置に、クマシー染色により染色されない透明なバンドとして同定された。図２の結果が示すように、グルコン酸クロルヘキシジン投与群およびタルク投与群から調製した腹腔排液中には、コントロール群と比較して前駆体ＭＭＰ−２が高濃度に含まれ、活性型ＭＭＰ−２も若干検出された。一方、ＭＭＰ−９は、タルク投与群の一部で前駆体が確認できるものの、その濃度は極めて低く、また、活性型ＭＭＰ−９については検出できなかった。グルコン酸クロルヘキシジン投与群では、ＭＭＰ−９は前駆体および活性型とも検出できなかった。以上の結果から、非細菌性腹膜炎モデルのラットから採取した腹腔排液中には、ゼラチナーゼ活性を持つ酵素のうち、少量ではあるが活性型ＭＭＰ−２が存在し、ＭＭＰ−９の活性型は検出されなかった。
【００４９】
細菌性腹膜炎での指標物質およびその変化を調べるために、以下の実験を行った。まず、ヒトの腹膜透析に伴う細菌性腹膜炎と同様に、実験動物に腹膜透析を行い、細菌性腹膜炎が発症した個体について解析した。細菌性腹膜炎の発症のコントロール群は、腹膜透析を実施して腹膜炎を発症しなかった個体を用いた。
【００５０】
実験動物としてＳＰＦ／ＶＡＰのラット（Ｃｒｊ：（ＳＤ）ＩＧＳ、６週齢、オス）を選択した。本発明で使用したラットは、給餌および給水を十分行い飢餓状態にせず、飼育する衛生環境にも十分注意した。また、ラットは１匹ずつ個別に飼育し、腹膜透析以外の原因による細菌性腹膜炎やそれ以外の疾患が発症しないように留意した。
【００５１】
ラットにエーテル麻酔を行った後、腹部の体毛を剃ってイソジン（明治製菓製）消毒し、透析溶液を注排液するためのシリコンカテーテルを移植した。このカテーテルを使用して、１日１回ラットの体重当たり５０ｍｌ／ｋｇの透析溶液（ペリトリック１３５、テルモ社製）を注排液し、透析排液については継続的に細菌試験と光学顕微鏡観察による顆粒球の細胞計数を行った。腹膜透析を連日行った結果、透析開始１０日目の透析排液中で、顆粒球が著しく増加していることが判明した。このときの細菌試験の結果から、透析排液中にはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａが同定されたため、この細菌が原因である細菌性腹膜炎と判断した。
【００５２】
細菌性腹膜炎発症時の透析排液について、前記のとおり、ゼラチンザイモグラフィーを行った結果を図３に示した。この透析排液中には、高濃度の前駆体ＭＭＰ−９が含まれているが、活性型ＭＭＰ−９は検出限界以下であった。一方、非細菌性腹膜炎発症時に顕著に増加していたＭＭＰ−２は、細菌性腹膜炎では前駆体は若干濃度が上昇しているものの、活性型は検出されなかった。したがって、細菌性腹膜炎を誘発した透析排液中では、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９の活性型は極めて少ないため、全体としてゼラチン分解活性が低いことが示唆された。
【００５３】
上記のようにして得られた、非細菌性腹膜炎の動物実験モデル系であるグルコン酸クロルヘキシジン投与群およびタルク投与群の腹腔排液と、細菌性腹膜炎の発症時の透析排液について、本発明の検出方法によりゼラチナーゼ活性を測定した。その結果を図４に示す。コントロール群としては、非細菌性腹膜炎を発症させたときに使用したものを用いた。むらなく均一に薄層塗布したゼラチン薄層コ−トフィルムを、２ｍｍ×５０ｍｍの大きさに切断し、実験で使用するゼラチン薄層コートフィルム片にする。前記の各透析排液を、ピペットマンを使用してエッペンドルフチューブに２００μｌ分注する。そして、このチューブの中に、上述のゼラチン薄層コートフィルム片の先端が溶液に触れる形で浸し、３７℃で３０時間反応させた。所定時間経過後、ゼラチン薄層コートフィルム片をチューブから取り出し、Ｂｉｅｂｒｉｃｈ  Ｓｃａｌｅｔ染色液（０．２％Ｂｉｅｂｒｉｃｈ  Ｓｃａｌｅｔ／２．５％トリクロロ酢酸／５０％エタノール）に４分間浸した後、蒸留水中に５分間浸して、余分な色素を除去した。
【００５４】
本発明の検出方法によるゼラチン分解活性の測定結果を、図４に示す。グルコン酸クロルヘキシジン投与群およびタルク投与群においては、ゼラチン薄層コートフィルム片が腹腔排液に浸っていた先端領域の染色抜けが観察される。したがって、先に行ったゼラチンザイモグラフィーによる解析結果から、ＭＭＰ−２が含有されていた。一方、図４の結果が示すように、細菌性腹膜炎を発症したラットから採取した透析排液中では染色抜けが起こらず、本発明の検出方法で検出されるゼラチン分解活性を持つ酵素は、検出限界レベル以下であった。また、コントロール群のフィルム片では染色抜けが観察されなかった。
【００５５】
本発明の検出方法によりゼラチン分解活性を測定することにより、腹腔排液中のＭＭＰ−２をＭＭＰ−９と区別することができ、非細菌性腹膜炎と細菌性腹膜炎を区別して判別することができる。これは、非細菌性腹膜炎時は活性型および前駆体ＭＭＰ−２が増加し、細菌性腹膜炎時は前駆体ＭＭＰ−９のみが増加したことによる。図４の結果が示すように、非細菌性腹膜炎の２つの実験動物モデルを用いて得られた腹腔排液のゼラチン分解活性を、本発明の検出方法で測定すると、高いゼラチン分解活性が観察される。しかし、細菌性腹膜炎を発症したラットから得られた透析排液では、ゼラチン分解活性は極めて低く、検出限界以下であった。したがって、例えば、本発明の検出方法を用いて、腹膜透析を行っている患者から採取した透析排液のゼラチン分解活性を測定し、ゼラチン分解活性が観察されたときには、腹膜硬化症、硬化性腹膜炎、ＳＥＰ、ＥＰＳ等の非細菌性腹膜炎を併発していることが判定される。逆に、ゼラチン分解活性が観察されなければ、全く腹膜炎を併発していないまたは細菌性腹膜炎を併発している、のどちらかであると判断される。すなわち、非細菌性腹膜炎を細菌性腹膜炎と区別して鑑別できる。一方、腹膜機能の低下をＭＭＰ−２のゼラチン分解活性を指標として判定することができる。
【００５６】
腹膜透析は、わが国で認可されてから１５年以上も経過するが、透析患者の多くが血液透析を選択しており、腹膜透析を行っている患者は全体の５％に満たない。その理由として、上述の腹膜透析に伴う合併症発症などが挙げられるが、本発明の検出方法の指標物質としてＭＭＰ−２を適用することで、非細菌性腹膜炎等の合併症を早期に発見できる事に加えて、細菌性腹膜炎との判別がきわめて容易に行え、仮に合併症を併発したとき、または併発する恐れが高いときに、正確な診断の予備的判定として用いることができる。また、逆に腹膜炎を診断されている場合には、非細菌性腹膜炎であるか細菌性腹膜炎であるかを、正確に判定することができ、治療の方針が的確に立てられる効果がある。さらに、腹膜透析は血液透析と異なり、患者の自宅や職場等、病院以外の場所でも比較的簡便に行えることから、通院の頻度を減らすことができ、患者のＱＯＬ（クオリティー・オブ・ライフ）向上に貢献できる利点を持っている。本発明の検出方法で合併症早期発見の技術を確立することにより、これらの利点を持つ腹膜透析の普及を促進し、患者のＱＯＬをさらに向上させることができる。
【００５７】
【発明の効果】
本発明の検出方法は、操作手順が簡便で特殊な分析機器などを用いずに、迅速に操作を行うことができる。また、高価な試薬や特殊機器を使用しないので、一検体あたり非常に安価で、かつ病院や研究所等場所を選ばず、熟練した技術を持っていなくても簡便に検査ができる。腹膜透析患者の透析排液を検体として使用することで、早期に非細菌性腹膜炎等の合併症を発見でき、確実な治療方針を提供し、患者のＱＯＬの向上に貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、グルコン酸クロルヘキシジン投与群およびタルク投与群の２つの非細菌性腹膜炎実験動物モデルを使用した時の、腹膜平衡試験の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、グルコン酸クロルヘキシジン投与群およびタルク投与群の２つの非細菌性腹膜炎実験動物モデルを使用した時に回収された、腹腔排液中のゼラチナーゼをゼラチンザイモグラフィー法により解析した結果を示す染色像である。
【図３】図３は、細菌性腹膜炎を発症させたラットから回収された透析排液について、ゼラチナーゼのゼラチンザイモグラフィー法による解析を行った染色像である。
【図４】図４は、グルコン酸クロルヘキシジン投与群およびタルク投与群の２つの非細菌性腹膜炎実験動物モデルから回収された腹腔排液および細菌性腹膜炎を発症させたラットから回収された透析排液について、本発明の検出方法によりゼラチン薄層コートフィルム片を使用してゼラチン分解活性を解析した結果を示す染色像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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