(57)【要約】【課題】既存のインスリンあるいはインスリン分泌促進剤が有する低血糖障害などの副作用が少なく、かつ糖尿病に有効な血糖降下治療薬を提供すること。【解決手段】サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ）５阻害剤を含有してなる糖尿病治療薬、特には、オロモーシン、ロスコビチン、パーバラノールＡまたはそれらの類似体を含有してなる糖尿病治療薬。Ｃｄｋ５阻害剤を含有してなるインスリン分泌促進剤、特には、オロモーシン、ロスコビチン、パーバラノールＡまたはそれらの類似体を含有してなるインスリン分泌促進剤。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ）５阻害剤を含有してなる糖尿病治療薬。
【請求項２】
Ｃｄｋ５阻害剤がオロモーシン、ロスコビチン、パーバラノールＡまたはそれらの類似体である請求項１記載の治療薬。
【請求項３】
Ｃｄｋ５阻害剤を含有してなるインスリンの分泌促進剤。
【請求項４】
Ｃｄｋ５阻害剤がオロモーシン、ロスコビチン、パーバラノールＡまたはそれらの類似体である請求項３記載の促進剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、副作用の少ない糖尿病治療薬に関する。詳しくは、サイクリン依存性キナーゼ（以下、Ｃｄｋと略す）５阻害剤を有効成分とする糖尿病治療薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病は膵臓インスリンの絶対的または相対的欠乏により起こる。もっとも有効な糖尿病治療法としては、ヒトインスリンの皮下投与が知られている。特に糖尿病性昏睡、インスリン依存性糖尿病などにおいては、ヒトインスリンの皮下投与が絶対に必要な治療法である。
【０００３】
また、軽症の成人型糖尿病においては、食事療法、運動療法だけでは調節できない場合、血糖値の正常化、尿糖消失などを目的として、経口血糖降下薬が用いられている。代表的な経口血糖降下薬として、トルブタミドなどのスルホニル尿素類が知られている（たとえば、非特許文献１参照）。
【０００４】
スルホニル尿素類は、ランゲルハンス島β細胞にあるＡＴＰで抑制されるＫチャネルを抑制することにより、β細胞を脱分極し、電位依存性カルシウムチャネルを開き、細胞内カルシウムを上昇することにより内因性インスリン分泌を促進して血糖を降下する（たとえば、非特許文献１参照）。
【０００５】
このような作用機構から、インスリンやスルホニル尿素類は、過血糖、糖尿、多尿、多飲、血管障害などの症状を呈する代謝疾患である糖尿病には有効であるが、インスリン過剰によって引き起こされる低血糖により意識障害、痙攣、心悸亢進などの副作用が問題となっている（たとえば、非特許文献２参照）。これらの副作用は、脳を障害するものであり、特に注意が必要とされる。
【０００６】
一方、オロモーシンは、式（Ｉ）：
【０００７】
【化１】
2004339157.tif 000002
【０００８】
の構造を有する化合物であり、一般にサイクリン依存性キナーゼの阻害剤として知られている（たとえば、非特許文献３参照）。
【０００９】
現在オロモーシンは、前記作用にもとづき細胞の増殖の同期、インターロイキンに刺激されたリンパ細胞のＤＮＡ合成の阻害を目的に研究で使用されている（たとえば、非特許文献３参照）のみであり、医薬としての使用は報告されていない。
【００１０】
オロモーシンによって阻害されるサイクリン依存性キナーゼとしては、Ｃｄｋ２／サイクリンＡ（ＩＣ５０＝７μＭ）、Ｃｄｋ２／サイクリンＥ（ＩＣ５０＝７μＭ））およびＣｄｋ５（ＩＣ５０＝３μＭ）があり、このうち、Ｃｄｋ２／サイクリンＡおよびＣｄｋ２／サイクリンＥは、通常増殖する細胞でのみ働き、分化した膵臓β細胞では活性をもたないことが知られている（たとえば、非特許文献３参照）。一方、Ｃｄｋ５は、主に分化した神経細胞や膵臓β細胞に豊富に存在しているが、神経細胞におけるＣｄｋ５の機能がよく研究されているものの、β細胞においてＣｄｋ５の活性がインスリン分泌を調節していることは、これまでまったく報告されていない。
【００１１】
【非特許文献１】
「スティミュレーション  オブ  インスリン  リリース  バイ  レパグリニドアンド  グリベングラミド  インボルブズ  ボス  コモン  アンド  ディスティンクト  プロセシズ（Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｂｙ  Ｒｅｐａｇｌｉｎｉｄｅ  ａｎｄ  Ｇｌｉｂｅｎｃｌａｍｉｄｅ  Ｉｎｖｏｌｖｅｓ  Ｂｏｔｈ  Ｃｏｍｍｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）」、ダイアビース（Ｄｉａｂｅｔｅｓ）、１９９８年、５月、４７巻、ｐ．３４５〜３５１
【非特許文献２】
「ニュー  ドラッグ  ターゲッツ  フォー  タイプ２  ダイアビース  アンドザ  メタボリック  シンドローム（Ｎｅｗ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）」、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２００１年、１２月、４１４巻、ｐ．８２１〜８２７
【非特許文献３】
「インヒビション  オブ  サイクリン−ディペンデント  キナーゼズ  バイ  プリン  アナログズ（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ    ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｂｙ  ｐｕｒｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ）」、ユーロピアン  ジャーナル  オブ  バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９４年、２２４巻、ｐ．７７１〜７８６
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はかかる従来の問題点を解決し、既存のインスリンあるいはインスリン分泌促進剤が有する低血糖障害などの副作用が少なく、かつ糖尿病に有効な血糖降下治療薬を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、オロモーシンなどのＣｄｋ５阻害剤が糖尿病の治療薬として極めて有用であり、低血糖を引き起こす副作用がまったくなく、インスリンの分泌を促進させ、血糖値を正常な値にまで降下させることを見出した。
【００１４】
すなわち本発明は、サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ）５阻害剤を含有してなる糖尿病治療薬に関する。
【００１５】
前記治療薬において、Ｃｄｋ５阻害剤がオロモーシン、ロスコビチン（Ｒｏｓｃｏｖｉｔｉｎｅ）、パーバラノールＡ（Ｐｕｒｖａｌａｎｏｌ  Ａ）またはそれらの類似体であることが好ましい。
【００１６】
本発明はまた、Ｃｄｋ５阻害剤を含有してなるインスリンの分泌促進剤に関する。
【００１７】
前記促進剤において、Ｃｄｋ５阻害剤がオロモーシン、ロスコビチン、パーバラノールＡまたはそれらの類似体であることが好ましい。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明に使用するＣｄｋ５阻害剤としては、Ｃｄｋ５の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が５０μＭ以下のものであれば、特に制限なく使用することができる。具体的には、オロモーシン、ロスコビチン、パーバラノールＡ
【００１９】
【化２】
2004339157.tif 000003
【００２０】
およびそれらの類似体などがあげられ、Ｃｄｋ５に対する特異性や作用機構の点からオロモーシンが好ましい。
【００２１】
候補分子のＣｄｋ５に対するＩＣ５０は、以下の方法により決定することができる。
【００２２】
トレーサーとして放射性同位体であるガンマ３２Ｐ−ＡＴＰを用いて、Ｃｄｋ５およびその活性化サブユニットであるｐ３５を含有する溶液に基質となるヒストンＨ１を添加する。異なる濃度のＣｄｋ５阻害剤存在下におけるヒストンＨ１のガンマ３２Ｐの取り込みを測定することによりＣｄｋ５のＩＣ５０を決定することができる。
【００２３】
本発明によれば、Ｃｄｋ５阻害剤はβ細胞に存在するＣｄｋ５に作用し、Ｃｄｋ５の酵素活性を阻害することによって細胞内のインスリン貯蓄を増加させ、高血糖の刺激を受け最終的にインスリンの分泌量を増大させ、血糖値を降下させる。
【００２４】
Ｃｄｋ５阻害剤の１つであるオロモーシンは、前述したように、式（Ｉ）：
【００２５】
【化３】
2004339157.tif 000004
【００２６】
の構造を有する化合物である。
【００２７】
また、オロモーシンは細胞の異常増殖を引き起こすことがなく、その安全性は高い。
【００２８】
本発明において、「類似体」とは、オロモーシン、ロスコビチンまたはパーバラノールＡと類似した構造を有し、Ｃｄｋ５の酵素活性を阻害し、それぞれオロモーシン、ロスコビチンまたはパーバラノールＡと同様の作用を有するものを言う。
【００２９】
これらのオロモーシン類似体は、当業者に既知の方法を用いて製造することができる。
【００３０】
糖尿病はインスリン依存型とインスリン非依存型にわけられる。インスリン依存型は若年に発症し、膵臓ランゲルハンス島β細胞の病変によりインスリンの絶対的欠如によって起こる。インスリン非依存型は肥満や遺伝子の変異などにより、体細胞のインスリンに対する応答性が悪化したり、インスリンの分泌が低下するなどして起こる。Ｃｄｋ５阻害剤は、β細胞に作用してインスリンの分泌を促進することができるため、β細胞がすべて消失していないかぎりすべての型の糖尿病において大きな治療効果が期待できる。
【００３１】
本発明の治療薬の投与経路としては、経皮、静脈内、筋肉内、皮下、経口があげられる。高血糖時にすみやかに作用できるように食前の経口投与が好ましい。
【００３２】
治療剤の剤形は、投与方法によって適宜設定することができる。具体的には、たとえば、水溶液、乳剤、懸濁液などの液剤、または錠剤などがあげられる。通常は、経口投与が好ましいため、水溶液または錠剤が好ましい。
【００３３】
投与量は、投与方法、適用する患者の年齢、体重、病状などによって適宜設定することができるが、有効成分に換算して一回に０．０００３〜０．０３ｍｇ／ｋｇ体重が好ましく、０．００３ｍｇ／ｋｇ体重〜０．０１５ｍｇ／ｋｇ体重がより好ましい。０．０００３ｍｇ／ｋｇ体重より少ないと糖尿病治療薬としての効果が得られなくなる恐れがある。
【００３４】
本発明の治療剤としての製剤化には、その剤形に合わせて通常当業者により使用される様々な添加物を使用することができる。たとえば、希釈剤、等張化剤、担体、ｐＨ安定剤などがあげられる。
【００３５】
投与方法の具体例としては、点滴静注する場合、一回につき有効成分０．００３〜０．０１５ｍｇ／ｋｇ体重を生理食塩水に溶解して１０〜５０μＭとし投与することができる。筋肉注射の場合、一回につき有効成分０．００３〜０．０１５ｍｇ／ｋｇ体重を生理食塩水に溶解して投与することができる。投与は一日三回、食前に行われることが好ましい。
【００３６】
Ｃｄｋ５阻害剤、たとえば、オロモーシンまたはオロモーシン類似体の血糖降下作用は、単離したランゲルハンス島における糖負荷に対するインスリンの分泌量を測定することにより評価することができる。オロモーシン存在下でインスリンの分泌量が増加すると、結果的に糖の代謝を促すことになり、血糖値が降下する。
【００３７】
【実施例】
ここで、本発明の糖尿病治療薬の効果を実施例にもとづいて、さらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。
【００３８】
実施例１
低糖濃度時におけるオロモーシンの作用
（１）ランゲルハンス島の調製
後藤らの文献（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｏｎ、第４３巻、７２５〜７３０頁、１９８７年）にしたがい、６週齢のオスのウィスターラットよりランゲルハンス島を単離した。ラットをエーテル麻酔下で開胸し、總胆管を剥離してコラゲナーゼ溶液（３２０Ｕ／ｍｌ、シグマ社製）をゆっくり注入し、膨らんだ膵臓を摘出した。コラゲナーゼを含んだ膵臓を３７℃のウォーターバスにて３０分間消化したのち、ピペットで分散し、Ｆｉｃｏｌｌ溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）の濃度勾配を用いてランゲルハンス島を単離した。ランゲルハンス島を、９５％Ｏ２および５％ＣＯ２の混合ガスで飽和させたリンガー液（１１９ｍＭ  塩化ナトリウム、４．７４ｍＭ  塩化カリウム、１．１９ｍＭ  リン酸二水素一ナトリウム、２５ｍＭ  炭酸水素ナトリウム、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２．５４ｍＭ  塩化カルシウム、１．１９ｍＭ  塩化マグネシウム、０．２％  ＢＳＡ）中に３７℃に保ちながら３０分インキュベーションした。
【００３９】
（２）オロモーシンの作用
前記ランゲルハンス島を実体顕微鏡（オリンパス光学工業（株）製）下で１５個を一組としてピックアップし、図１に示した各濃度のオロモーシン（シグマ社製）を含むリンガー液（３．３ｍＭグルコース）０．５ｍｌに入れ３０分間インキュベーションしたのち、同じ糖濃度およびオロモーシン濃度のリンガー液０．５ｍｌを刺激液として入れ替えた。入れ替えから３０分後の刺激液中に含まれるインスリンをインスリン検出キット（Ａｂビーズインスリン、栄研化学（株）製）を用いて、該キットのプロトコールにしたがって検出した。各濃度群につきｎ＝６で試験を行なった。
【００４０】
図１に示したように、３．３ｍＭグルコース下でのインスリン濃度はオロモーシンの存在に関わらずほぼ同程度であった。すなわち、低糖濃度時においてオロモーシンはランゲルハンス島のインスリン分泌にまったく影響を及ぼさなかった。これは、オロモーシンは低血糖時に服用しても、より低血糖になり重大な副作用を引き起こすことがまったくないということを示す。
【００４１】
実施例２
高糖濃度時におけるオロモーシンの作用
実施例１の（１）と同様にして調製したランゲルハンス島を、実体顕微鏡（オリンパス光学工業（株）製）下で１５個を一組としてピックアップし、図２に示した各濃度オロモーシンを含むリンガー液（３．３ｍＭグルコース）０．５ｍｌに入れ３０分間インキュベーションしたのち、同じ濃度のオロモーシン（シグマ社製）を含む高糖濃度リンガー液（１７．３ｍＭグルコース）０．５ｍｌを刺激液として入れ替えた。入れ替えから３０分後の刺激液中に含まれるインスリンをインスリン検出キット（Ａｂビーズインスリン、栄研化学（株）製）を用いて、該キットのプロトコールにしたがって検出した。各濃度群につきｎ＝６で試験を行なった。
【００４２】
図２に示したように、オロモーシン存在下でのインスリン分泌量は、オロモーシン非存在下と比べて有意に上昇した。またインスリン分泌量はオロモーシンの濃度の高さに依存して増加した。これは、オロモーシンの濃度を調節することにより異なる症状の糖尿病に対応できることを示す。
【００４３】
実施例３
ロスコビチンのインスリン分泌促進作用
（１）インスリン分泌細胞ＭＩＮ６の培養
インスリン分泌能を有するＭＩＮ６細胞（千葉県千葉市稲毛区弥生町１−３３、千葉大学大学院医学研究院先端応用医学講座細胞分子医学の清野進教授より提供）を南らの方法（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎａｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、２０００年、第２７４巻、７７３〜７８１頁）に従って培養した。５×１０５個の細胞をＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製）に懸濁し、直径３５ミリのカルチャーディッシュ（コーニング社製）に撒き５％ＣＯ２濃度のインキュベーター（サンヨウ社製）の中で２日間培養した。
【００４４】
（２）ロスコビチンの作用
（１）で培養したＭＩＮ６細胞の培養液を、予め２０μＭのロスコビチン（カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）社製）を含む低糖濃度のリンガー液（３．３ｍＭグルコース）０．５ｍｌおよび２０μＭのオロモーシン（シグマ社製）を含む低糖濃度のリンガー液（３．３ｍＭグルコース）０．５ｍｌでそれぞれ入れ替え３０分インキュベーションしたのち、同じ濃度のロスコビチンを含む高糖濃度のリンガー液（１７．６ｍＭグルコース）０．５ｍｌおよび同じ濃度のオロモーシンを含む高糖濃度のリンガー液（１７．６ｍＭグルコース）０．５ｍｌをそれぞれ刺激液として入れ替えた（それぞれ、ｎ＝６）。対照としてはロスコビチンおよびオロモーシンのいずれも含有しないリンガー液を用いた（ｎ＝６）。２時間培養したのち、培地中に含まれるインスリンをインスリン検出キット（Ａｂビーズインスリン、栄研化学（株）製）を用いて、該キットのプロトコールに従って検出した。
【００４５】
図３に示したように、ロスコビチン存在下ではＭＩＮ６細胞のインスリン分泌が促進された。このことは、ロスコビチンは同じＣｄｋ５阻害剤であるオロモーシンと同様にインスリン分泌を促す作用を有することを意味するものである。
【００４６】
試験例１
実施例１の（１）と同様にして調製したランゲルハンス島を、実体顕微鏡（オリンパス光学工業（株）製）下で１５個を一組としてピックアップし、１０μＭのオロモーシンまたは１０μＭのイソオロモーシン（カルバイオケム社製）を含むリンガー液（３．３ｍＭグルコース）０．５ｍｌに入れ３０分間インキュベーションしたのち、同じ濃度のオロモーシン（シグマ社製）またはイソオロモーシン（カルバイオケム社製）を含む低糖濃度リンガー液（３．３ｍＭグルコース）０．５ｍｌを刺激液として入れ替えた（それぞれ、ｎ＝６）。対照としては、オロモーシンおよびイソオロモーシンのどちらも含まないリンガー液を用いた（ｎ＝６）。入れ替えから３０分後の刺激液中に含まれるインスリンをインスリン検出キット（Ａｂビーズインスリン、栄研化学（株）製）を用いて、該キットのプロトコールにしたがって検出した。
【００４７】
オロモーシンと類似した構造を持ちながらもＣｄｋ５阻害効果のない異性体であるイソオロモーシンを用いて、インスリン分泌促進効果はオロモーシンの作用によるものであること確認した。結果を図４に示す。イソオロモーシンの構造は以下の通りである。
【００４８】
【化４】
2004339157.tif 000005
【００４９】
オロモーシン（１０μＭ）存在下で高糖濃度のリンガー液はインスリン分泌を有意に促進したが、オロモーシンの異性体であるイソオロモーシン（１０μＭ）はまったくインスリンの分泌を促進しなかった。これは、オロモーシンのＣｄｋ５阻害効果がインスリンの分泌を促進していることを意味するものである。
【００５０】
試験例２
実施例１の（１）と同様にして調製したランゲルハンス島を、実体顕微鏡（オリンパス光学工業（株）製）下で１５個を一組としてピックアップし、それぞれ対照（ｎ＝６）、試料Ａ（ｎ＝６）、試料Ｂ（ｎ＝６）、試料Ｃ（ｎ＝６）とした。対照および試料Ａは、リンガー液（３．３ｍＭグルコース）０．５ｍｌに入れ、試料Ｂおよび試料Ｃは、１０μＭのオロモーシンを含むリンガー液０．５ｍｌに入れ３０分間インキュベーションしたのち、対照はオロモーシンもグリベングラミドも含まない低糖濃度リンガー液（３．３ｍＭグルコース）０．５ｍｌを用い、試料Ａは２００ｎＭのグリベングラミドを含有する低糖濃度リンガー液（３．３ｍＭグルコース）０．５ｍｌ、試料Ｂは１０μＭのオロモーシンを含有する低糖濃度リンガー液（３．３ｍＭグルコース）０．５ｍｌ、試料Ｃは２００ｎＭのグリベングラミドと１０μＭのオロモーシンとを含有する低糖濃度リンガー液（３．３ｍＭグルコース）０．５ｍｌを刺激剤として入れ替えた。入れ替えから３０分後の刺激液中に含まれるインスリンをインスリン検出キット（Ａｂビーズインスリン、栄研化学（株）製）を用いて、該キットのプロトコールにしたがって検出した。さらに、ランゲルハンス島を超音波処理することにより細胞を破壊し、ランゲルハンス島内のインスリン含有量を前記と同様にインスリン検出キット（Ａｂビーズインスリン、栄研化学（株）製）を用いて、該キットのプロトコールにしたがって検出した。
【００５１】
低糖濃度時においてオロモーシンと糖尿病治療薬として使用されているスルホニル尿素類であるグリベングラミドとの効果を、ランゲルハンス島内のインスリン含有量に対するインスリンの分泌割合により比較した。なお、インスリンの分泌割合は以下の式により算出した。
【００５２】
【数１】
2004339157.tif 000006
【００５３】
結果を図５に示す。
【００５４】
グリベングラミドは、低濃度におけるランゲルハンス島のインスリン分泌を有意に上昇させたが、オロモーシンは、インスリン分泌に影響を及ぼさなかった。これは、オロモーシンはスルホニル尿素類の治療薬と異なり、低血糖を引き起こすことがまったくなく、高糖濃度時にのみインスリン分泌を促進することを意味するものである。
【００５５】
【発明の効果】
本発明による、Ｃｄｋ５阻害剤を有効成分とする糖尿病治療剤は、副作用が少なく、ほとんどの型の糖尿病にたいして有効であり、高血糖を改善させる。
【図面の簡単な説明】
【図１】単離ランゲルハンス島を低糖濃度刺激する時のインスリン分泌量に対するオロモーシンの効果を示した図である。
【図２】単離ランゲルハンス島を高糖濃度刺激する時のインスリン分泌量に対するオロモーシンの効果を示した図である。図中の＊はＰ＜０．０５を示す。
【図３】ＭＩＮ６細胞を高糖濃度刺激する時のインスリン分泌量に対するロスコビチンおよびオロモーシンの効果を示した図である。
【図４】オロモーシンとイソオロモーシンのインスリン分泌量に対する効果を示した図である。
【図５】低糖濃度時においてオロモーシンとグリベングラミドとの効果を比較した図である。
【図１】
2004339157.tif 000007
【図２】
2004339157.tif 000008
【図３】
2004339157.tif 000009
【図４】
2004339157.tif 000010
【図５】
2004339157.tif 000011