(57)【要約】【課題】目的の細胞や組織に特異的に物質を導入する中空ナノ粒子であって、安定した生産量が得られる中空ナノ粒子、およびこれを用いた薬剤を提供する。【解決手段】肝細胞などの特定の細胞に対する認識能を有し、粒子形成能を有する第１のタンパク質（例えば、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質）からなる中空ナノ粒子において、上記第１のタンパク質には、カプシド構造を形成する第２のタンパク質（例えば、Ｂ型肝炎ウィルス内部コア抗原タンパク質）と相互作用しているものが含まれている。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の細胞を認識する生体認識分子を有し、粒子形成能を有する第１のタンパク質からなる中空ナノ粒子において、上記第１のタンパク質には、カプシド構造を形成する第２のタンパク質と相互作用しているものが含まれていることを特徴とする中空ナノ粒子。
【請求項２】
上記第１のタンパク質が、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質であることを特徴とする請求項１記載の中空ナノ粒子。
【請求項３】
上記第１のタンパク質が、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質における肝細胞認識部位を他の生体認識分子に改変してなることを特徴とする請求項２記載の中空ナノ粒子。
【請求項４】
上記第１のタンパク質が、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質における肝細胞認識部位をベータセルリンまたは塩基性線維芽細胞増殖因子に改変してなることを特徴とする請求項３記載の中空ナノ粒子。
【請求項５】
上記第２のタンパク質は、Ｂ型肝炎ウィルス内部コア抗原タンパク質であることを特徴とする請求項１ないし４の何れか１項に記載の中空ナノ粒子。
【請求項６】
上記第１のタンパク質をコードする遺伝子と、第２のタンパク質をコードする遺伝子とが、ベクターにて同一の真核細胞に導入され、当該真核細胞において双方の遺伝子が発現されることで形成されることを特徴とする請求項１ないし５の何れか１項に記載の中空ナノ粒子。
【請求項７】
上記真核細胞は、酵母であることを特徴とする請求項６記載の中空ナノ粒子。
【請求項８】
上記第２のタンパク質をコードする遺伝子を、オーレオバシジンＡ感受性遺伝子を有するベクターにて導入することを特徴とする請求項６または７に記載の中空ナノ粒子。
【請求項９】
請求項１ないし８の何れか１項に記載の中空ナノ粒子に細胞導入物質が封入されていることを特徴とする薬剤。
【請求項１０】
請求項８に記載の薬剤を用いることを特徴とする疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、疾患治療用の細胞導入物質を封入することができる中空ナノ粒子に関し、より詳細には、粒子内部に封入された疾患治療用の細胞導入物質を特定細胞または組織内に特異的に導入可能な薬剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、医学の分野において、患部に直接作用し、高い効果を示す副作用の少ない薬品の開発が盛んに行われている。特に、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）と呼ばれる方法は、目的細胞、あるいは、目的組織に対して特異的に薬剤等の有効成分を運搬し、目的箇所で有効成分を作用させることのできる方法として注目されている。
【０００３】
目的細胞、あるいは、目的組織に対して特異的に薬剤となるタンパク質を送り込む方法としては、従来、当該タンパク質をコードする遺伝子が組み込まれた発現ベクターをエレクトロポレーション法等により目的細胞に導入して、この遺伝子を細胞内で発現させることによりタンパク質薬剤を細胞内に送り込むいわゆる遺伝子導入方法が開発されてきた。しかし、このような従来の遺伝子導入方法では、何れも、目的細胞、あるいは、目的組織に対して特異的にタンパク質薬剤を送り込む方法としては不十分なものであった。
【０００４】
【特許文献１】
国際公開第０１／６４９３０号パンフレット
【０００５】
【非特許文献１】
「ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー」（”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”  ），（アメリカ合衆国），１９９２年，第２６７巻，第３号，ｐ．１９５３−１９６１
【０００６】
【非特許文献２】
「ジーン」（”Ｇｅｎｅ”  ），（オランダ），１９９１年，第１０６号  ｐ．１４３−１４９
【０００７】
【非特許文献３】
「ワクチン」（”Ｖａｃｃｉｎｅ”  ），（イギリス），２００１年，第１９号，ｐ．３１５４−３１６３
【０００８】
【非特許文献４】
「ジャーナルオブバイロロジー」（”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ”  ），（アメリカ合衆国），１９９４年，第６８号，ｐ．１６４３−１６５０
【０００９】
【非特許文献５】
「バイロロジー」（”ＶＩＲＯＬＯＧＹ”  ），（アメリカ合衆国），１９９７年，第２２８号  ｐ．１１５−１２０
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
以上のような状況に鑑み、本発明者らは、特許文献１において、粒子形成能を有するタンパク質に生体認識分子が導入された中空ナノ粒子を用いて、目的とする細胞や組織に、物質（遺伝子、タンパク質、化合物等）を特異的かつ安全に運搬、導入するための方法を提案しているが、この方法を応用しつつ上記中空ナノ粒子の安定した生産量を得るためのさらなる改良が課題となっていた。
【００１１】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、安定した生産量が得られる、目的の細胞や組織に特異的に物質を導入するタンパク質中空ナノ粒子、およびこの中空ナノ粒子に細胞導入物質を包含させた薬剤を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、粒子形成能を有するタンパク質とともに、カプシド構造を形成するタンパク質を発現することにより、粒子の生産量が飛躍的に高まることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
即ち、本発明に係る中空ナノ粒子は、特定の細胞（例えば肝細胞など）に対する認識能を有し、粒子形成能を有する第１のタンパク質からなる中空ナノ粒子において、上記第１のタンパク質には、カプシド構造を形成する第２のタンパク質と相互作用しているものが含まれている事を特徴としている。
【００１４】
上記「粒子形成能を有する第１のタンパク質」としては、例えばＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を挙げることができる。このタンパク質は、真核細胞で発現させると、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積され、粒子として放出される。
【００１５】
また、上記「カプシド構造」とは、ウィルス粒子において、ウィルスゲノムを包み、保護しているタンパク質の殻を指し、上記「カプシド構造を形成する第２のタンパク質」としては、例えば、Ｂ型肝炎ウィルス内部コア抗原タンパク質を挙げることができる。上記第２のタンパク質は、上記第１のタンパク質と共発現すると、相互作用し、粒子の形成を促す。なお、ここで言う「相互作用」とは、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが直接接触をして作用しあっていることを言う。第１のタンパク質と第２のタンパク質とは少なくとも一つ直接接触していればよいが、その数は多ければ多いほど良い。また、上記相互作用は、必ずしも第２のタンパク質が、第１のタンパク質が形成する粒子の内部に包含されて行われる必要はなく、粒子の外側の第２のタンパク質と第１のタンパク質とが相互作用していても良い。これにより、第１のタンパク質の粒子形成が促され、粒子形成率が上がるとともに、中に細胞導入物質を包含させて、薬剤として利用することも可能となる。
【００１６】
本発明の中空ナノ粒子は、このような粒子形成能を有する第１のタンパク質をコードする遺伝子、およびカプシド構造を形成する第２のタンパク質をコードする遺伝子を、ベクターによって同一の真核細胞（例えば酵母）に導入し、当該真核細胞に遺伝子発現させることにより製造することができる。
【００１７】
上記第２のタンパク質をコードする遺伝子を導入するベクターとしては、オーレオバシジンＡ感受性遺伝子を有するベクター（例えば、宝酒造社製のｐＡＵＲ１２３）にて導入することが望ましい。
【００１８】
上記Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質およびＢ型肝炎ウィルス内部コア抗原タンパク質を発現させて得られる粒子は、肝細胞を認識し、肝細胞に対して特異的に粒子内の物質を運搬することができるので、肝臓疾患治療用の物質（遺伝子等）を包含させることにより、肝細胞に対して特異的かつ効果的に作用する有効な治療薬となる。
【００１９】
また、例えば上記Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を、本来の肝細胞に対する感染能を欠失するように改変し、さらに増殖因子や抗体を提示するように改変し、このように改変されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を用いて粒子を形成することで、肝細胞以外の特定の細胞に対して特異的に粒子内の物質を運搬することができる。例えば、ベータセルリン（ＢＴＣ）を提示させることで、膵臓β細胞を認識し、その膵臓β細胞に対して特異的に粒子内の物質を運搬することができる。また、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を提示させることで、血管内皮あるいは脳下垂体細胞を認識し、血管内皮あるいは脳下垂体細胞に特異的に粒子内の物質を運搬することができる。
【００２０】
このような改変されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原、特にＢＴＣ提示型Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原、ｂＦＧＦ提示型Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原は、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原だけを発現させた場合には非常に粒子を形成し難いが、上記カプシド構造を形成する第２のタンパク質とともに発現することで粒子形成率が飛躍的に向上するので、その効果が特に高いといえる。
【００２１】
また、本発明の中空ナノ粒子に治療物質を包含させた薬剤では、静脈注射という簡便な方法で特定の細胞または組織における疾患を効果的に治療することができ、従来の治療方法と大きく異なり、多量の薬剤の投与や遺伝子治療等における外科手術を必要とせず、副作用の心配も極めて低く、そのまま臨床応用可能なものである。
【００２２】
本発明の治療方法は、本発明の薬剤を投与することによる疾患の治療方法である。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明の中空ナノ粒子は、粒子形成能を有する第１のタンパク質からなる中空ナノ粒子において、上記第１のタンパク質には、カプシド構造を形成する第２のタンパク質と相互作用しているものを含んでなるものであるが、その粒子形成能を有する第１のタンパク質に生体認識分子（換言すれば、特定の細胞を認識する分子）を導入することによって、目的細胞あるいは目的組織に特異的に物質を運搬することができる。上記粒子形成能を有する第１のタンパク質としては、種々のウィルスから得られるサブウィルス粒子を適用することができる。具体的には、粒子形成能を有する第１のタンパク質として、Ｂ型肝炎ウィルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ：ＨＢＶ）表面抗原タンパク質等が例示される（以下、このＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を「ＨＢｓＡｇタンパク質」と略記する場合がある）。この場合、カプシド構造を形成する第２のタンパク質としては、Ｂ型肝炎ウィルス内部コア抗原タンパク質（以下、このＢ型肝炎ウィルス内部コア抗原タンパク質を「ＨＢｃＡｇタンパク質」と略記する場合がある）を用いれば良い。
【００２４】
まず、粒子形成能を有する第１のタンパク質について説明する。粒子形成能を有するタンパク質からなるタンパク質粒子としては、真核細胞で上記第１のタンパク質を発現させることにより得られるものが挙げられる。つまり、真核細胞で粒子形成能を有するタンパク質を発現させると、同タンパク質は、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積され、粒子として放出されるのである。このとき、真核細胞としては、哺乳類等の動物細胞、酵母等が適用できる。
【００２５】
本発明者らは、遺伝子組換え酵母で上記ＨＢｓＡｇのＬタンパク質を発現させることにより、発現されたＨＢｓＡｇのＬタンパク質から酵母由来の脂質二重膜に多数の同タンパク質が埋め込まれた短径約２０ｎｍ、長径約１５０ｎｍの楕円状中空粒子（以下ＨＢｓＡｇＬ粒子という）が形成されることを見出し、報告している（非特許文献１参照）。このような粒子は、ＨＢＶゲノムを全く含まないので、ウィルスとしては機能せず、人体への安全性が極めて高い。また、ＨＢＶの肝細胞への極めて高い感染力を担う肝細胞特異的レセプターを粒子表面に提示しているため、肝細胞に対して特異的に物質を運搬する運搬体としての効果も高いのである。
【００２６】
このように遺伝子組換え酵母を用いてタンパク質粒子を形成する方法は、菌体内の可溶性タンパク質から高効率で粒子が生産される点で好適である。
【００２７】
本発明者らは、後述する実施例に示されるとおり、上記ＨＢｓＡｇのＬタンパク質を発現させる際に、ＨＢｃＡｇタンパク質を同時に発現させれば、上記ＨＢｓＡｇＬ粒子の形成率が飛躍的に高まることを見出した。これは、ＨＢｃＡｇタンパク質タンパク質がＨＢｓＡｇのＬタンパク質に作用し、ＨＢｓＡｇＬ粒子の形成を促しているためと考えられる。
【００２８】
ＨＢｃＡｇタンパク質は、図２（ａ）に示すように、Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｄｏｍａｉｎと、ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔａｍｉｎｅ  ｄｏｍａｉｎからなる。上記Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｄｏｍａｉｎは、カプシド構造を形成するための部位であり、本発明の中空ナノ粒子の形成にはこの部位が重要となる。ＨＢｃＡｇタンパク質は、図２（ｂ）に示すように自身で集まってカプシド構造を形成する能力を有しているが、必ずしもカプシド構造を形成している必要はなく、個々の分子がＨＢｓＡｇのＬタンパク質に作用していてもよい。
【００２９】
ＨＢｓＡｇのＬタンパク質やＨＢｃＡｇを導入するためのベクターとしては、様々なプロモーターを組み入れた発現ベクターがあるので、目的に応じたものを選択すればよい。特にＨＢｃＡｇタンパク質を導入するためには、ＨＢｓＡｇのＬには、例えば、ｐＡＵＲ１２３（Ｔａｋａｒａ製）のようなオーレオバシジン感受性遺伝子ａｕｒ１を有するベクターを用いれば、ＨＢｓＡｇの粒子形成の促進効果が高まることがわかっている。
【００３０】
また、本発明のタンパク質中空ナノ粒子では、以上のような方法によって得られた粒子表面のレセプターを、図１に示すように、任意の生体認識分子に改変することにより、肝細胞以外にも、任意の細胞及び組織に極めて高い特異性で物質を運搬、導入することが可能となる。
【００３１】
もちろん、粒子形成能を有する第１のタンパク質は、上記のＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質に限られるものではなく、粒子を形成することができるタンパク質であれば、どのようなものでもよく、動物細胞、植物細胞、ウィルス、菌類等に由来する天然タンパク質や、種々の合成タンパク質等が考慮される。また、例えばウィルス由来の抗原タンパク質等が生体内において抗体を惹起する可能性がある場合などは、改変して抗原性を減少させたものを粒子形成能を有するタンパク質として用いてもよい。例えば、粒子形成能を有するタンパク質としては、特許文献１に開示される抗原性を減少させたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質であってもよいし、特許文献１に開示されるＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を、遺伝子操作技術を用いて改変したタンパク質であってもよく、粒子構造が安定するように改変したものでもよい。また、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質や同タンパク質を改変したタンパク質に、さらに増殖因子や抗体などの他のタンパク質を付加したものを、第１のタンパク質として用いてもよい。
【００３２】
粒子形成能を有するタンパク質に導入される生体認識分子としては、例えば成長因子、サイトカイン等の細胞機能調節分子、細胞表面抗原、組織特異的抗原、レセプターなどの細胞および組織を識別するための分子、ウィルスおよび微生物に由来する分子、抗体、糖鎖、脂質などが好ましく用いられる。具体的には、癌細胞に特異的に現れるＥＧＦ受容体やＩＬ−２受容体に対する抗体やＥＧＦ、またＨＢＶの提示するレセプターも含まれる。これらは、目的とする細胞、あるいは組織に応じて適宜選択される。なお、ここで「生体認識分子」とは、特定の細胞を認識する分子（換言すれば、特定の細胞に対する認識能を本発明の中空ナノ粒子に付与する分子）のことをいう。なお、この生体認識分子は、粒子形成能を有する第１のタンパク質に生体認識分子が含まれる場合と、第１のタンパク質に生体認識分子を融合（または直接間接に結合）させる場合とを両方含む。
【００３３】
上記のように、生体認識分子をＨＢｓＡｇＬタンパク粒子に付与する方法としては、ＨＢｓＡｇＬタンパク質の有する肝細胞認識部位を任意の生体認識分子に改変して、発現させることが考えられる。このように肝細胞認識部位を改変されたＨＢｓＡｇＬタンパク質は、それだけでは粒子形成率が低いが、カプシド構造を形成する第２のタンパク質と相互作用することで、粒子形成が効果的に促進される。これは、特に、この方法でＢＴＣやｂＦＧＦを提示するように改変したＨＢｓＡｇＬタンパク質の粒子に好適である。また、第２のタンパク質は粒子内部からでなく、外側から相互作用していても良い。
【００３４】
また、カプシド構造を形成する第２のタンパク質も、上記のＢ型肝炎ウィルス内部コア抗原タンパク質に限られるものではなく、カプシド構造を形成することができるタンパク質であれば、どのようなものでもよく、動物細胞、植物細胞、ウィルス、菌類等に由来する天然タンパク質や、種々の合成タンパク質等が考慮される。例えば、Ｂ型肝炎ウィルス内部コア抗原タンパク質を、中空ナノ粒子の粒子形成能が向上するように改変したものでもよく、タンパク質の機能が変わらないように改変したものでもよい。
【００３５】
以上のように作製された本発明の中空ナノ粒子は、特定の細胞に対して特異的に細胞導入物質を送り込むものとして有用である。例えば、本発明の中空ナノ粒子として、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質からなる粒子を用い、これに細胞導入物質を包含した薬剤を静脈注射などによって体内に投与すれば、当該粒子は体内を循環し、粒子表面に提示した肝細胞特異的レセプターにより肝細胞に導かれ、感染する。そして、細胞導入物質が肝細胞中に送り込まれ、細胞導入物質の肝臓組織特異的な導入が行われる。
【００３６】
このタンパク質中空ナノ粒子に内包される細胞導入物質としては、例えばＤＮＡ、ＲＮＡなどの遺伝子、天然あるいは合成タンパク質、オリゴヌクレオチド、ぺプチド、薬剤、天然あるいは合成化合物など、どのようなものであってもよい。
【００３７】
これらの細胞導入物質を上記の中空ナノ粒子に封入する方法としては、通常の化学的、分子生物学的実験手法で用いられる様々な方法が適用される。たとえば、エレクトロポレーション法、超音波法、単純拡散法、あるいは電荷を有する脂質を用いる方法等が好ましく例示される。また、細胞導入物質としてタンパク質を用いる場合は、粒子形成能を有するタンパク質に細胞導入物質を融合させて粒子形成する方法も、上記細胞導入物質の封入に含まれると考えられる。粒子形成能を有するタンパク質に細胞導入物質を融合させる方法とは、例えば、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質をコードする遺伝子と、その下流側に上記タンパク質薬剤をコードする遺伝子とが挿入されたプラスミドを作製し、このプラスミドを用いて真核細胞に粒子を形成させることによって、粒子を形成するＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質にタンパク質薬剤が融合した薬剤を製造する方法である。
【００３８】
なお、薬剤の投与方法としては、静脈注射による投与のほかに、経口投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与等が挙げられる。
【００３９】
このように、本発明の薬剤を用いれば、ｉｎ  ｖｉｖｏあるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞、または組織に特異的に物質を導入することができ、特定細胞または組織に物質を導入することを各種疾患の治療法あるいは治療法の１ステップとして行うことも可能になるのである。
【００４０】
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【００４１】
【実施例】
以下、ＨＢｓＡｇとは、ＨＢＶの外被タンパク質であるＢ型肝炎ウィルス表面抗原（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ）を示し、ＨＢｃＡｇとは、ＨＢＶ内部でカプシド構造を形成するＢ型肝炎ウィルス内部コア抗原（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｃｏｒｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ）を示す。
【００４２】
ＨＢｓＡｇは、２２６個のアミノ酸から構成されるＳタンパク質を含んでいる。Ｓタンパク質のＮ末端側に５５アミノ酸（ｐｒｅ−Ｓ２  ｐｅｐｔｉｄｅ）が付加したものがＭタンパク質、Ｍタンパク質のＮ末端側に、１０８もしくは１１９アミノ酸（ｐｒｅ−Ｓ１  ｐｅｐｔｉｄｅ）が付加したものがＬタンパク質である。ＨＢｓＡｇＬタンパク質の塩基配列は配列番号１に、アミノ酸配列は配列番号２に示している。
【００４３】
ＨＢｓＡｇ  Ｌタンパク質の上記ｐｒｅ−Ｓ領域（ｐｒｅ−Ｓ１，  ｐｒｅ−Ｓ２）は、ＨＢＶが肝細胞に結合する際に、それぞれ重要な役割を担うことが知られている。ｐｒｅ−Ｓ１は、肝細胞に直接結合する部位を持ち、ｐｒｅ−Ｓ２は、血中の重合アルブミンを介して肝細胞に結合する重合アルブミンレセプターを有するのである。
【００４４】
真核細胞でＨＢｓＡｇＬタンパク質を発現させると、同タンパク質は、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積される。ＨＢｓＡｇのＬタンパク質は、分子間で凝集を起こし、小胞体膜を取り込みながら、出芽様式でルーメン側に粒子として放出される。以下、この粒子をＢ型肝炎ウィルス表面抗原粒子（ＨＢｓＡｇＬ粒子）という。
【００４５】
以上の方法で大量に生産したＨＢｓＡｇＬ粒子は、ウィルス由来の毒性物質を一切含まない中空のサブウィルス粒子である。発明者らはＨＢｓＡｇＬ粒子がヒト肝臓特異的に感染する能力を有することに注目して、ヒト肝臓特異的な遺伝子または薬剤の導入技術を開発した。
【００４６】
また、ＨＢｓＡｇＬ粒子表面に提示されているｐｒｅ−Ｓ１ペプチドがヒト肝臓特異的な認識を行う部位であることから、同ペプチドを任意の生体認識分子に置換した改変型ＨＢｓＡｇＬ粒子を作製し、任意の臓器や細胞特異的に遺伝子および薬剤を導入する系を作製した。この置換は、ｐｒｅ−Ｓ１ペプチドが上記ＨＢｓＡｇのＬタンパク質のＮ末端の３アミノ酸残基から７７アミノ酸残基にあたることから、ｐｒｅ−Ｓ１ペプチドを任意の生体認識分子（リガンド、レセプター、抗体など）をコードする遺伝子に置換することで行われる。任意の生体認識分子を付加されたＨＢｓＡｇのＬタンパク質を、真核生物に発現させると、任意の生体認識分子を提示したＨＢｓＡｇＬ粒子が生産される。
【００４７】
上記方法により、ヒト肝細胞特異性を欠失した肝細胞認識部位欠失型ＨＢｓＡｇＬ粒子（Ｎｕｌｌ型ＨＢｓＡｇＬ粒子）や、血管内皮、脳下垂体細胞に特異的に感染する塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子、悪性度の高い癌組織に特異的に感染する上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子、ベータセルリン（ＢＴＣ）レセプターを認識して、膵臓β細胞に特異的に感染するベータセルリン（ＢＴＣ）提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子、任意の特異性を有する抗体をＨＢｓＡｇＬ粒子に付与した抗体提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子が作製できる。
【００４８】
しかしながら、以上の改変型ＨＢｓＡｇＬ粒子は粒子形成の効率が悪く、野生型のＨＢｓＡｇＬ粒子が、酒造用酵母を用いることにより全可溶性タンパク質の約４０％もの大量発現に成功しているのに対し、改変型ＨＢｓＡｇＬ粒子は大量発現を起こすことはまれで、全可溶性タンパク質の数％未満しか発現されていない。特に、ｂＦＧＦ提示型Ｌタンパク質は全可溶性タンパク質の１％未満であった。
【００４９】
これは、一般的な遺伝子組換えタンパク質の生産性と同等であるが、ドラッグデリバリーシステムとして改変型ＨＢｓＡｇＬ粒子を利用するには、より発現量を高める必要がある。また、ＨＢｓＡｇＬ粒子の生産量が付与される生体認識分子によって大きく変化することは、付与される生体認識分子がＨＢｓＡｇＬ粒子の生産に関わっていることを示し、効率的な生産を行う上で障害となる不安定な発現量を改善できる可能性を示している。
【００５０】
そこで、発明者らは、改変型ＨＢｓＡｇＬ粒子の発現率が低いのは、酵母菌体内でのＨＢｓＡｇＬ粒子形成過程で必須なｐｒｅ−Ｓ領域のＮ末端側からの小胞体膜透過を、置換した生体認識分子が立体障害を起こして妨げているためと考えた。
【００５１】
一方、非特許文献４および非特許文献５によると、Ｂ型肝炎ウィルスの内部コア抗原タンパク質（ＨＢｃＡｇ）が、ウィルス粒子形成過程において、Ｌタンパク質ｐｒｅ−Ｓ１領域のＣ末端部分と相互作用して肝細胞中の粒子形成を促すことが記されている。
【００５２】
ＨＢｃＡｇは、図２（ａ）に示すように１８３個のアミノ酸から構成され、１〜１４４（もしくは１４９）アミノ酸までのＡｓｓｅｍｂｌｙ  ｄｏｍａｉｎと、それに続くＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔａｍｉｎｅ  ｄｏｍａｉｎからなる。上記Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｄｏｍａｉｎは、カプシド構造を形成するための部位であり、ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔａｍｉｎｅ  ｄｏｍａｉｎはウィルスゲノムＤＮＡと結合して安定に保持するための部位である。ＨＢｃＡｇは、図２（ｂ）に示すように自身で集まってカプシド構造を形成する能力を有している。このカプシド構造は、一般的に、Ｂ型肝炎ウィルス粒子では、図２（ｃ）に示されるように、ウィルス粒子の内部に存在しており、カプシド構造内に含んだウィルスゲノムＤＮＡと相互作用して安定に保持するとともに、ＨＢｓＡｇ  Ｌ粒子とも相互作用して、ウィルス粒子形成を内側から促していると考えられている。そこで、以下の実施例で、ＨＢｓＡｇＬタンパク質とともにＨＢｃＡｇを発現させて粒子形成することにより、ＨＢｃＡｇがＨＢｓＡｇＬ粒子形成を助け、ＨＢｓＡｇＬ粒子が安定に発現されるかを調べるため、ＨＢｓＡｇＬタンパク質もしくは改変型ＨＢｓＡｇＬタンパク質とＨＢｃＡｇとを酵母に共発現させたＨＢｓＡｇＬ粒子の粒子形成率を観察した。
【００５３】
（実施例１）
上記改変型ＨＢｓＬタンパク質の作製方法を以下に示す。図３（ａ）に示すように、本発明者らによって報告された特許文献１記載の、ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴのｐｒｅ−Ｓ１領域（３アミノ残基から７７アミノ残基）を削除したｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ△３−７７のｐｒｅ−Ｓ領域に、制限酵素ＮｏｔＩを用いて、例えば、ＢＴＣまたはｂＦＧＦをコードする遺伝子を挿入したＨＢｓＡｇＬタンパク質発現ベクターを、酵母に発現させる。これにより、生体認識分子としてＢＴＣを提示するＨＢｓＡｇのＬタンパク質、すなわちＢＴＣ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子、あるいはｂＦＧＦを提示するｂＦＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子を得た。
【００５４】
（実施例２）ＨＢｃＡｇの酵母用発現プラスミドの作製
（２−１）プラスミドへのプロモーターＴＤＨ３の組み込み
野生型ＨＢｓＡｇ発現プラスミドｐＲＳ４０５−２−ＬＡＧに組み込まれているプロモーターＴＤＨ３のＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ法は、表１に示す組成の反応液を使用し、プライマー（＋）として配列番号３に、プライマー（−）として配列番号４に示される配列を用いた。
【００５５】
【表１】
2004175665.tif 000002
【００５６】
上記反応液を４等分し、そのうち３つをそれぞれ以下の条件にてＰＣＲ反応を行った。９４℃３０秒加熱後、９４℃１分、アニーリング１分、７２℃１分の反応サイクルを３０サイクル行い、その後７２℃で５分加熱した。アニーリング温度は、条件検討のため、５５℃、６０℃、６５℃の３種類で行った。このＰＣＲでは、これら３種類すべて同様にＤＮＡ増幅が行われたため、３条件のＰＣＲ産物をまとめて回収し、ＴＡクローニングを行った。また、４等分したうちの１つは鋳型ＤＮＡの代わりに等量の大塚蒸留水を加え、アニーリング温度６０度でネガティブコントロールとした。
【００５７】
図３（ｂ）に示すように、ＰＣＲ法にて得られたＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結し、塩基配列確認後、制限酵素ＫｐｎＩ，ＸｈｏＩ（Ｔａｋａｒａ）で切断し、得られたＤＮＡ断片をオーレオバシジンＡ耐性酵母形質転換システム用の大腸菌・酵母シャトルベクターである、ｐＡＵＲ１２３（Ｔａｋａｒａ製）にＫｐｎＩ，ＸｈｏＩで連結し、ｐＡＵＲ１２３−ＴＤＨ３を得た。ｐＡＵＲ１２３は、オーレオバシジンＡ感受性遺伝子ａｕｒ１を有しており、この遺伝子はＩＰＣ（ｉｎｏｓｉｔｏｌｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）合成酵素をコードしている。
【００５８】
（２−２）プラスミドへのＨＢｃＡｇ遺伝子の組み込み
次に、ＨＢＶ（ａｄｒ）のゲノムを鋳型としてＰＣＲ法にてＨＢｃＡｇのＤＮＡ断片を増幅した。ＨＢＶゲノムとしては、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１（６），１７４７−１７５７（１９８３）記載分のプラスミドｐＨＢｒ３３０を使用した。なお、このゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号Ｄ００６３０に登録されている。また、ＨＢｃＡｇのアミノ酸配列は、アクセッション番号ＢＡＡ００５２３に登録されている。
【００５９】
このＰＣＲ法では、表１に示す組成の反応液を使用し、プライマー（＋）として配列番号５に、プライマー（−）として配列番号６に示される配列を用いた。ここで、配列番号６には、外来遺伝子を挿入できるように設計したため、ＡＡＣＧＣＧＴＣＣ（ＡＣＧＣＧＴがＭｌｕＩサイトである）の余分な配列が含まれている。
【００６０】
上記反応液を４等分し、そのうち３つをそれぞれ以下の条件にてＰＣＲ反応を行った。９４℃３０秒加熱後、９４℃１分、アニーリング１分、７２℃１分の反応サイクルを３０サイクル行い、その後７２℃で５分加熱した。アニーリング温度は、条件検討のため、５５℃、６０℃、６５℃の３種類で行った。このＰＣＲでは、６０℃および６５℃の２種類で同様にＤＮＡ増幅が行われたため、２条件のＰＣＲ産物をまとめて回収し、ＴＡクローニングを行った。また、４等分したうちの１つは鋳型ＤＮＡの代わりに等量の大塚蒸留水を加え、アニーリング温度６５度でネガティブコントロールとしてＰＣＲを行った。
【００６１】
ＰＣＲ法にて得られたＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒに連結し、塩基配列確認後、制限酵素ＸｈｏＩ，ＳａｃＩ（ＴａＫａＲａ）で切断し、得られたＤＮＡ断片をｐＡＵＲ１２３−ＴＤＨ３にＸｈｏＩ，ＳａｃＩで連結し、ｐＡＵＲ１２３−ＴＤＨ３−ＨＢｃＡｇを得た。
【００６２】
（実施例３）ＨＢｃＡｇとＨＢｓＡｇとの酵母による共発現
実施例１で用いたＨＢｓＡｇＬタンパク質発現ベクターを、実施例２のＨＢｃＡｇ発現ベクターとコトランスフォーメーションさせた。すなわち、上記ベクターをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＡＨ２２Ｒ−株へ以下のスフェロプラスト法（Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８）により形質転換した。
【００６３】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＡＨ２２Ｒ−株をＹＰＤＡ寒天培地（組成は表２参照）に接種し、２−３日３０℃で培養し、得られたコロニーを一晩ＹＰＤＡ培地（組成は表２参照）５０ｍｌで３０℃にて前培養した。前培養終了後、本培養開始時のＯＤ６００が０．０５程度になるようにＹＰＤＡ培地５０ｍｌに植菌し、ＯＤ６０００．４−０．８になるまで３０℃で８時間程度培養した。その後、培養液４ｍｌを１５ｍｌチューブ（ＩＷＡＫＩ製）に分注し、多本架冷却遠心機（トミー工業株式会社製）を用いて２０００回転、４℃で５分間遠心分離を行い菌体を回収し、菌体を４ｍｌの溶液Ａ（クエン酸ナトリウム０．１Ｍ、ＥＤＴＡ２ナトリウム１０ｍＭ、ソルビトール１．２Ｍ、ｐＨ  ５．８）で洗浄した後、溶液Ａ３．６ｍｌとザイモリエース１００Ｔ（生化学工業）溶液（１．０ｍｇ／ｍｌ）０．４ｍｌを加え、３０℃で１時間程度インキュベートして菌体をスフェロプラスト化させた。
【００６４】
【表２】
2004175665.tif 000003
【００６５】
その後、多本架冷却遠心機（トミー工業株式会社製）を用いて１９００回転、２０℃で５分間遠心分離を行い菌体のみを回収し、溶液Ｂ（ソルビトール１．２Ｍ、塩化カルシウム１０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．０）１０ｍＭ）４ｍｌで洗浄した後、溶液Ｂ０．１ｍｌで菌体を懸濁させ、野生型または改変型ＨＢｓＡｇＬ粒子発現用ベクター７μｇとｐＡＵＲ１２３−ＴＤＨ３−ＨＢｃＡｇ５μｇを共に加えて室温で１５分間放置した。次に溶液Ｃ（ポリエチレングリコール４０００  ２０％、Ｔｒｉｓ  （ｐＨ７．０）  １０ｍＭ、塩化カルシウム１０ｍＭ）２ｍｌを加え、さらに１５分間放置した後１９００回転、２０℃で５分間遠心分離を行い菌体を回収し、溶液Ｄ（ソルビトール  １．２Ｍ、ポリペプトン２％、粉末酵母エキス１％、グルコース２％、アデニン硫酸塩０．０１％）０．３ｍｌに懸濁して３０℃で２０分間インキュベートした。その後、菌体懸濁液に５５℃に保った重層寒天培地５ｍｌを加え、Ｙ−Ｔｆ寒天培地（組成は表２参照）に重層した。３０℃で６−１４日培養後、出現したコロニーをロイシン無添加、オーレオバシジンＡ添加ＳＤ寒天培地（組成は表２参照）に接種し、生育した菌体のみを培養し、発現株の選抜を行った。
（実施例４）ＨＢｃＡｇとＨＢｓＡｇＬタンパク質との共発現Ｌ粒子の発現量測定
実施例３の形質転換された菌体は、Ｈｉ−Ｐｉ培地（組成は表３参照）１ｍｌで３日間前培養し、多本架冷却遠心機（トミー工業株式会社製）を用いて２０００回転、４℃で５分間遠心分離を行って菌体を回収し、その後８Ｓ５Ｎ−Ｐ４００培地（組成は表３参照）１ｍｌに培地を交換し３−４日間本培養を行った。培養条件は３０℃とし、振盪培養を行った。
【００６６】
【表３】
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【００６７】
図４に、ｂＦＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬタンパク質およびＨＢｃＡｇを共発現して得た粒子を抗ｂＦＢＦ抗体、および抗―Ｌタンパク質抗体にてウェスタンブロッティングした図を図４（ａ）に、ＢＴＣ提示型ＨＢｓＡｇＬタンパク質およびＨＢｃＡｇを共発現して得た粒子を抗ＢＴＣ抗体、および抗―Ｌタンパク質抗体にてウェスタンブロッティングした図を図４（ｂ）に示す。これによれば、矢印に示されるように、ＢＴＣおよびＬタンパク質を有するＢＴＣ提示型ＨＢｓＡｇＬタンパク質、およびｂＦＧＦおよびＬタンパク質を有するｂＦＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子が良好に形成されていることがわかる。
（Ａ）１ｍｌスケール培養の発現確認
培養液１ｍｌを１．５ｍｌマイクロチューブに回収し、３０００回転、４℃で５分間遠心分離を行い菌体を回収した後、表４の緩衝液Ａ０．２５ｍｌで菌体を懸濁し、グラスビーズ（直径０．５ｍｍ、ＢｉｏＳｐｅｃ，カタログ番号１１０７９１０５）を加え、４℃で２５分間激しく攪拌（ボルテックス）して菌体を破壊した。１００００回転、４℃で５分間遠心分離を行い粗抽出液を回収し、ＩＭｘＨＢｓＡｇ・ダイナパック（Ｖ２）（血中ＨＢｓ抗原検出用キット、Ｄａｉｎａｂｏｔ）、ＩＭｘＨＢｅＡｇ・ダイナパックＡＸを用いて、それぞれ各菌体における改変型ＨＢｓＡｇ粒子、ＨＢｃＡｇの発現量を確認した。
【００６８】
なお、ＨＢｅＡｇとは、ＨＢｃＡｇのＮ末端に余分に１０アミノ酸が付加され、ＨＢｃＡｇのＣ末端の１４９アミノ酸残基より後ろのアミノ酸残基が欠失した１５９アミノ酸からなるタンパク質であり、細胞から分泌される。このＨＢｅＡｇタンパク質は、ＨＢｃＡｇとは異なり、カプシド結合をとることはないが、ＨＢｃＡｇは、Ｎ末端１０残基を除いたＨＢｅＡｇの配列と全く同じであるため、このキットを用いてＨＢｃＡｇの発現を測定可能である。ただし、このキットが測定したＨＢｃＡｇが、単量体なのか２量体なのか、あるいはカプシド構造をとっているかは判断できない。
【００６９】
また、上記ダイナパックを用いる際に、粗抽出液の希釈が必要な場合には、表４の組成のＰＢＳを用いた。
【００７０】
【表４】
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【００７１】
以上の方法を用いて、野生型ＨＢｓＡｇＬとＨＢｃＡｇとを共発現した場合の培養液５０倍希釈液１サンプルについて、ＨＢｓＡｇ抗原性を測定した。比較例として、ＨＢｃＡｇ発現ベクターを加える以外は同様の操作を行った、野生型ＨＢｓＡｇＬタンパク質を単独に発現した場合の２０倍希釈培養液８サンプルについても、ＨＢｓＡｇ抗原性を測定した。結果は、図５に示すとおりである。図５の縦軸は、上記のサンプルの平均のＩＭｘＨＢｓＡｇ（Ｖ２）値を示しており、これはＨＢｓＡｇＬ粒子の粒子が形成されているかどうかを表す値となっている。これによれば、ＨＢｓＡｇＬタンパク質単独発現（２０倍希釈）では、ＩＭｘＨＢｓＡｇ（Ｖ２）値の平均が５．２７であるのに対し、ＨＢｓＡｇＬ粒子とＨＢｃＡｇとを共発現したもの（５０倍希釈）では２１３と著しく高い値を示した。したがって、ＨＢｓＡｇＬタンパク質をＨＢｃＡｇと共発現させることで、ＨＢｓＡｇＬ粒子の形成効率が著しく上がったと言える。
【００７２】
同様の実験を、野生型ＨＢｓＡｇＬタンパク質の代わりにＥＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬタンパク質を発現させて行った結果を図６に示す。今回は、ＥＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬタンパク質を単独に発現した場合の２０倍希釈培養液３サンプルと、ＥＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子とＨＢｃＡｇとを共発現した場合の培養液５０倍希釈液１７サンプルについて、ＩＭｘＨＢｓＡｇ（Ｖ２）値を測定した。これによれば、ＨＢｓＡｇＬタンパク質単独発現（２０倍希釈）では、ＩＭｘＨＢｓＡｇ（Ｖ２）値の平均が５．３６であるのに対し、ＨＢｓＡｇＬ粒子とＨＢｃＡｇとを共発現したもの（５０倍希釈）では１６３と、著しく高い値を示した。
【００７３】
さらに、同様の実験を、野生型ＨＢｓＡｇＬタンパク質の代わりにＮｕｌｌ型ＨＢｓＡｇＬタンパク質を発現させて行った結果を図７に示す。Ｎｕｌｌ型ＨＢｓＡｇＬタンパク質を単独に発現した場合の２０倍希釈培養液４サンプルと、Ｎｕｌｌ型ＨＢｓＡｇＬ粒子とＨＢｃＡｇとを共発現した場合の培養液１００倍希釈液６サンプルについて、ＩＭｘＨＢｓＡｇ（Ｖ２）値を測定した。これによれば、ＨＢｓＡｇＬタンパク質単独発現（２０倍希釈）では、ＩＭｘＨＢｓＡｇ（Ｖ２）値の平均が２．７５であるのに対し、ＨＢｓＡｇＬ粒子とＨＢｃＡｇとを共発現したもの（１００倍希釈）では１５１と、非常に高い値を示した。
（４−２）４００ｍｌスケール培養の発現確認
ＢＴＣ提示型ＨＢｓＡｇＬタンパク質およびＨＢｃＡｇを発現した菌体を培養しているＳＤプレート、ｂＦＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬタンパク質およびＨＢｃＡｇを発現した菌体を培養しているＳＤプレートは２枚分の菌体を全てＨｉ−Ｐｉ培地５０ｍｌに植菌し、３日間培養した後、Ｈｉ−Ｐｉ培地４００ｍｌで１日培養し、その後８Ｓ５Ｎ−Ｐ４００培地４００ｍｌで３．５日間（８６．５時間）培養した。培養終了後、それぞれを集菌し、菌体湿重量を測定した。また、培養終了前日（８Ｓ５Ｎ−Ｐ４００培地にて５４時間培養後）に、各クローンの培養液を１ｍｌずつサンプリングし菌体湿重量を測定後、グラスビーズにて菌体を破砕しＨＢｓＡｇ粒子の発現量をＩＭｘＨＢｓＡｇ・ダイナパック（Ｖ２）にて測定した。破砕方法および発現量の測定方法は、上記（４−１）の方法と同様である。
【００７４】
得られたＢＴＣ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子とＨＢｃＡｇとを共発現した場合の培養液１００倍希釈液、および、比較例として、ＨＢｃＡｇ発現ベクターを加える以外は同様の操作を行ったＢＴＣ提示型ＨＢｓＡｇＬタンパク質を単独に発現した場合の培養液１００倍希釈培養液との、ＨＢｓＡｇ抗原性を測定した。結果は、図８に示すとおりである。これによれば、ＨＢｓＡｇＬタンパク質単独発現では、ＩＭｘＨＢｓＡｇ（Ｖ２）値が０で発現菌体を獲得できなかったのに対し、ＨＢｓＡｇＬ粒子とＨＢｃＡｇとを共発現したものでは８１．９２と高い値を示した。
【００７５】
同様に、ｂＦＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬタンパク質を単独に発現した場合の培養液１００倍希釈培養液と、ｂＦＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子とＨＢｃＡｇとを共発現した場合の培養液１００倍希釈液について、ＨＢｓＡｇ抗原性を測定した。結果は、図９に示すとおりである。これによれば、ＨＢｓＡｇＬタンパク質単独発現では、ＩＭｘＨＢｓＡｇ（Ｖ２）値が２．７７であるのに対し、ＨＢｓＡｇＬ粒子とＨＢｃＡｇとを共発現したものでは３７．４と高い値を示した。
【００７６】
野生型ＨＢｓＡｇＬ粒子を１００としたときのＩＭｘＨＢｓＡｇ値の相対値は図１０のとおりである。
【００７７】
以上のように、ＨＢｃＡｇと改変型ＨＢｓＡｇＬタンパク質とを酒造酵母内で共発現すると、改変型ＨＢｓＡｇＬ粒子の発現量が数１０倍も亢進し、その量は全可溶性タンパク質の数十％に達した。
（実施例５）ＨＢｓＡｇＬ粒子の大量精製
まず、以下の方法で、ＨＢｃＡｇをＬタンパク質あるいは改変型Ｌタンパク質と共発現して形成した、野生型ＨＢｓＡｇＬ粒子、Ｎｕｌｌ型ＨＢｓＡｇＬ粒子、ＢＴＣ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子、ｂＦＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子、ＥＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子を作製して、粗サンプルを得る。なお、以下のＨＢｓＡｇＬ粒子、Ｌタンパク質とは、上記の５種類の粒子およびそれを構成するＬタンパク質を言う。
【００７８】
ＨＢｃＡｇと改変型ＨＢｓＡｇＬタンパク質との共発現菌体を培養した培養液４００−１０００ｍｌから、上記菌体を取り出し、１００ｍｌの緩衝液Ａ（表４参照）に懸濁し、氷冷しながら、ビードビーダー（ＢＥＡＤ  ＢＥＡＴＥＲ）を用いてグラスビーズ（直径０．５ｍｍ）で５分間破砕、氷上放置５分間というサイクルを３回繰返して菌体を破砕した。その後、４℃で、５０００回転にて１０分間遠心分離を行い、回収した上清に、３３％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール６０００（ナカライテスク）を溶液容量の７５％（ｖ／ｖ）加えて３０分間氷冷した。さらに、ローターＮｏ．１７Ｎ（トミー精工）を用いて、遠心分離機ＣＸ−２５０（トミー精工）により、４℃で５０００回転の遠心分離を１０分間行い、沈殿を回収して、緩衝液Ａ１５ｍｌに懸濁した粗サンプルを得た。
【００７９】
上記粗サンプルからＨＢｓＡｇＬ粒子を精製するために、以下に示すように、塩化セシウム密度勾配遠心分離、スクロース密度勾配遠心分離、および限外ろ過を行った。
【００８０】
まず、塩化セシウム密度勾配遠心分離を行った。この方法は、密度勾配をつけた塩化セシウム溶液内でサンプルに超遠心を行うことで、ＨＢｓＡｇＬ粒子の浮揚密度と等しい密度のＣｓＣｌ溶液の画分にＨＢｓＡｇＬ粒子を集めて精製を行うものである。
【００８１】
密度勾配をつけた塩化セシウム溶液は、図１２（ａ）に示すように、４０ＰＡチューブ（日立工機製）に下から４０％（ｗ／ｖ）塩化セシウム溶液８ｍｌ、３０％（ｗ／ｖ）塩化セシウム溶液８ｍｌ、２０％（ｗ／ｖ）塩化セシウム溶液７ｍｌ、１０％（ｗ／ｖ）塩化セシウム溶液７ｍｌを重層させたものであり、その後上記粗サンプルを液表面に５−６ｍｌ重層した。その後、ローターＰ２８ＳＸ（日立工機製）を用いて、超遠心分離機５５Ｐ−７２Ｈ（日立工機製）により２４０００回転、１６℃で１２−１６時間密度勾配超遠心を行った。
【００８２】
塩化セシウム密度勾配遠心を行った３−６本のチューブを、上層から２ｍｌずつの画分に分けて回収し、各画分ごとに１本にまとめ、ＩＭｘＨＢｓＡｇダイナパック（Ｖ２）で測定した。この中で、ＨＢｓＡｇＬ粒子が検出された画分を回収し、１５ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａを含むＰＢＳにより、４℃下で３−５時間透析した。透析した溶液は、ローターＮｏ．１７Ｎを用いて、遠心分離機ＣＸ−２５０により５０００回転、４℃で１０分間の遠心分離を行って上清を回収した。
【００８３】
次に、上記上清をスクロース密度遠心勾配にかけた。この方法は、密度勾配をつけたスクロース溶液内でサンプルに超遠心を行うことで、ＨＢｓＡｇＬ粒子はその沈降係数に従った速度で沈降し、その他の大きさが違う沈降速度の異なる分子から分離される。密度勾配をつけたスクロース溶液は、４０ＰＡチューブに５０％（ｗ／ｖ）スクロース溶液６ｍｌ、４０％（ｗ／ｖ）スクロース溶液５ｍｌ、３０％（ｗ／ｖ）スクロース溶液６ｍｌ、２０％（ｗ／ｖ）スクロース溶液５ｍｌ、１０％（ｗ／ｖ）スクロース溶液５ｍｌを重層させたものであり、その液表面に透析後の上清を８−９ｍｌ重層した。その後、ローターＰ２８ＳＸを用いて、超遠心分離機５５Ｐ−７２Ｈにより２４０００回転、４℃で８−１０時間密度勾配超遠心を行った。
【００８４】
スクロース密度勾配超遠心終了後、塩化セシウム密度勾配遠心の時と同様に、３−６本のチューブの上層から２ｍｌずつの画分に分けて回収し、画分ごとに１本にまとめて、ＩＭｘＨＢｓＡｇ・ダイナパック（Ｖ２）で測定し、ＨＢｓＡｇＬ粒子が存在する画分を回収した。
【００８５】
最後に、得られた画分を４℃で一晩、ＰＢＳで透析し、ＵＬＴＲＡ  ＦＩＬＴＥＲ  ＵＫ−２００（Ａｄｖａｎｔｅｃ社製）を用いて限外ろ過を行い、容量が１０ｍｌになるまで濃縮した。
【００８６】
以上の操作により、野生型ＨＢｓＡｇＬ粒子（Ｌタンパク質推定分子量５２ｋＤａ）、Ｎｕｌｌ型ＨＢｓＡｇＬ粒子（Ｎｕｌｌタンパク質推定分子量４０．２ｋＤａ）、ＢＴＣ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子（ＢＴＣ融合型Ｌタンパク質推定分子量４５．７ｋＤａ）、ｂＦＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子（ｂＦＧＦ融合型Ｌタンパク質推定分子量５７．３ｋＤａ）、ＥＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子（ＥＧＦ融合型Ｌタンパク質推定分子量４７．２ｋＤａ）が得られた。
【００８７】
（実施例６）精製により得られたｂＦＧＦ提示型Ｌ粒子の物性解析
（６−１）ウェスタンブロットによる解析
ｂＦＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子がＨＢｃＡｇタンパク質と相互作用しているかどうかを調べるため、ｂＦＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子をＳ抗体で免疫沈降した後、ｂＦＧＦ抗体とＨＢｃＡｇタンパク質抗体とでウェスタンブロットを行ったのが、図１１である。その結果、ｂＦＧＦＨＢｓＡｇＬ粒子は、矢印で示すように、ｂＦＧＦ抗体により検出され、ＨＢｃＡｇタンパク質抗体にも検出された。従って、ｂＦＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子は、ｂＦＧＦ、ＨＢｓＡｇ領域、ＨＢｃＡｇタンパク質を併せ持つことが分かった。すなわち、ＨＢｃＡｇタンパク質は粒子上のｂＦＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬタンパク質と何らかの相互作用をしていることが分かった。
【００８８】
（６−２）密度勾配遠心法によるＨＢｓＡｇＬ粒子の密度測定
ｂＦＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子がＨＢｃＡｇタンパク質を含んでいるかを調べるため、以下の方法で塩化セシウム密度勾配遠心を行って、ｂＦＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子の密度を推定した。
【００８９】
得られたｂＦＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子を、精製時に用いた塩化セシウム密度勾配遠心法と同様の方法で分離した結果を、図１２（ｂ）に示す。これは、遠心後のＣｓＣｌ密度勾配沈殿の各画分の５０倍希釈液のＩＭｘＨＢｓＡｇ値およびＩＭｘＨＢｅＡｇ値をプロットしたグラフである。上記、ＣｓＣｌ密度勾配沈殿の画分とは、上層から２ｍｌずつ１７個の画分に分けられたものであるが、ＩＭｘＨＢｓＡｇ値のピークは、フラクション３、すなわち上層から４ｍｌから６ｍｌの層に明確に示された。図１２（ａ）のように重層した遠心管の上部より２ｍｌずつ回収したため、フラクション３のサンプルは１０％ＣｓＣｌ溶液中に存在すると考えられる。この１０％ＣｓＣｌ溶液の密度は約１．２０ｇ／ｍｌであるから、フラクション３に集まったｂＦＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子の密度は約１．２０ｇ／ｍｌと考えられる。これは、１．２１ｇ／ｍｌの野生型ＨＢｓＡｇＬ粒子の密度と同程度である（非特許文献１参照）。
【００９０】
一方、酵母にてＳ，Ｍ，ＬおよびＨＢｃＡｇタンパク質の４つを同時に発現させ、ＨＢｃＡｇタンパク質をＨＢｓＡｇ粒子内に包含させたビリオン様粒子の密度は約１．２５ｇ／ｍｌである（非特許文献２参照）。よって、Ｌタンパク質およびＨＢｃＡｇタンパク質を共発現させて得られたＨＢｓＡｇＬ粒子が、ＨＢｃＡｇタンパク質を包含して形成されているならば、約１．２５ｇ／ｍｌの密度と等しい画分に含まれるはずである。したがって、推定密度約１．２０ｇ／ｍｌのｂＦＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子はＨＢｃＡｇタンパク質を包含していないことが示された。
（６−３）プロテイナーゼによる解析
さらに、ｂＦＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子がＨＢｃＡｇタンパク質を含んでいるかをプロテイナーゼ処理によって調べた。
【００９１】
ｂＦＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子精製サンプル７２０μｌに、抗ＨＢｓマウスモノクローナル抗体固定化マイクロパーティクルのＩＭｘの抗体２４０μｌを加えた計９６０μｌの溶液をチューブ２本に分け、４℃で９時間振とうして免疫沈降し、プロテアーゼ阻害剤とＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含まないリシスバッファーで３回洗浄し、沈殿物を４等分、計８等分した。これにより、ｂＦＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子の沈殿物を得た。
【００９２】
１０μｇ／ｍｌのＰ．Ｋ．（プロテイナーゼＫ）を含むバッファー液（５０ｍＭトリス塩酸、５ｍＭ塩化カルシウム、ｐＨ７．６）を６つの沈殿物に２０μｌずつ加え、３７℃にて、それぞれ５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分の時間で保温した。
【００９３】
参照実験として、Ｐ．Ｋ．を含まない溶液（５０ｍＭトリス塩酸、５ｍＭ塩化カルシウム、ｐＨ７．６）を沈殿物に加え、保温しなかったもの（参照サンプル１）、および３０分間３７℃で保温したもの（参照サンプル２）を作製した。さらに別の参照実験として、ＰＢＳ７２０μｌに抗体２４０μｌを加えた計９６０μｌの溶液を遠心し、抗ＨＢｓＡｇマウスモノクローナル抗体固定化マイクロパーティクルに結合した沈殿物にＰ．Ｋ．を含まない溶液（５０ｍＭトリス塩酸、５ｍＭ塩化カルシウム、ｐＨ７．６）を加えて保温しなかったもの（参照サンプル３）も用意した。
【００９４】
これらのサンプルをウェスタンブロットした図を図１３に示す。図１３（ａ）は、抗Ｌタンパク質Ａｂによる、（ｂ）は抗ｂＦＧＦＡｂによる、（ｃ）は抗−ＨＢｃＡｇＡｂによるウェスタンブロットである。レーン１に上記の参照サンプル３、レーン２に参照サンプル１、レーン３に参照サンプル２の参照サンプルを、レーン４からレーン９がＰ．Ｋ．を加えたサンプルである。なお、レーン４からレーン９は、レーン数の小さいものから順に、Ｐ．Ｋ．の加熱時間が５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分としたサンプルとなっている。
【００９５】
これによれば、図１３（ａ）、（ｂ）に矢印に示されるｂＦＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬタンパク質のバンドが示される。また、矢頭に示すように、図１３（ａ）の２０ｋＤａあたり、および図１３（ｃ）の２０ｋＤａより小さい部分にＰＫによる分解産物と考えられるバンドがある。これらのバンドは、参照サンプルであるレーン１から３には認められないのに対し、レーン４から９には認められる。
【００９６】
図１３（ｃ）のＰＫによる分解産物のバンドはＨＢｃＡｇタンパク質の分解物であると考えられるが、プロテイナーゼＫ処理の時間経過に従いバンドが薄くなっており、処理時間３０分（レーン９）では、ほぼ完全になくなっている。つまり、ＨＢｃＡｇタンパク質がＰ．Ｋ．に短時間で分解されている。
【００９７】
仮に、ＨＢｓＡｇＬ粒子内にＨＢｃＡｇタンパク質が包含されているならば、ＨＢｃＡｇタンパク質は外部に晒されていないので、プロテイナーゼＫによる分解を受けにくくなると考えられる。したがって、プロテイナーゼＫにより、加温３０分後にほぼ完全分解されているこの結果から判断するとｂＦＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子内にＨＢｃＡｇタンパク質は包含されていないと考えられる。
【００９８】
（実施例７）精製により得られたＢＴＣ提示型Ｌ粒子の物性解析
ｂＦＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子で行った実験を同様の方法で、ＢＴＣ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子も塩化セシウム密度勾配遠心法による分離を行った。結果を、図１４に示す。図１４にＣｓＣｌ密度勾配沈殿の各画分の２００倍希釈液のＩＭｘＨＢｓＡｇ値およびＩＭｘＨＢｃＡｇ値をプロットしたグラフを示している。ＩＭｘＨＢｓＡｇ値のピークは、フラクション５，６に明確に示された。このように、ＩＭｘＨＢｓＡｇ値がフラクションの途中でピークを形成しているので、ＢＴＣ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子が粒子を形成していると言える。また、ＩＭｘＨＢｃＡｇ値のピークがこのＩＭｘＨＢｓＡｇ値と一部重なっていることから、ＢＴＣ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子の一部がＨＢｃＡｇタンパク質と相互作用している可能性がある。
【００９９】
ＣｓＣｌ密度勾配遠心後は、図１４（ａ）のように重層した遠心管の上部より２ｍｌずつ回収したため、フラクション６のサンプルは１０％ＣｓＣｌ（密度１．２０ｇ／ｍｌ）と２０％ＣｓＣｌ（密度約１．２７ｇ／ｍｌ）とのほぼ境界線付近に相当する。したがって、このグラフから求めた推定密度にてＨＢｃＡｇタンパク質がＨＢｓＡｇＬ粒子内に包含されているかの判断は不可能と考えられる。
【０１００】
上記のフラクション５，６を含めたフラクション４〜７を回収し、ＰＢＳ（１５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）で透析した後、抗ＨＢｓＡｇＬ粒子Ａｂによるウェスタンブロットを行ったものを図１４（ｃ）のレーン２に示している。これは、ＢＴＣ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子の粗抽出液を、抗ＨＢｓＡｇＬ粒子Ａｂによりウェスタンブロットしたもの（レーン１）とほぼ同程度の濃さのバンドであった。
【０１０１】
一方、同様にレーン２のサンプル（フラクション４〜７を回収し、透析したもの）を抗ＨＢｃＡｇＡｂによりウェスタンブロットしたもの（レーン４）は、ＢＴＣ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子の粗抽出液を抗ＨＢｃＡｇＡｂによりウェスタンブロットしたもの（レーン３）より著しく検出量が低かった。つまり、ＢＴＣ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子がフラクション４〜７に固まって存在しているのに対し、ＨＢｃＡｇはこれ以外の画分にも分散しているといえる。従って、ＨＢｃＡｇタンパク質が、ＢＴＣ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子内に図１５（ｂ）のように内部に包含されている可能性は非常に低いと考えられ、仮に包含されているＨＢｃＡｇタンパク質が存在した場合においてもその割合はきわめて低いと考えられる。すなわち、得られた粒子のほとんどは、図１５（ａ）のように、粒子外部からＨＢｓＡｇＬタンパク質と相互作用していると考えられる。
【０１０２】
すなわち、得られる改変型ＨＢｓＡｇＬ粒子は、一部にしかＨＢｃＡｇが含まれておらず、ほとんどが中空であったので、本発明の中空ナノ粒子は遺伝子等導入物質の運搬に好適に使用できることが示唆された。
【０１０３】
【発明の効果】
本発明の中空ナノ粒子は、以上のように、物質を細胞特異的に運搬するという機能を保ちつつ、粒子の形成を促進することで、効率的に粒子を製造できるという効果を奏する。
【０１０４】
さらに、本発明によれば、中空ナノ粒子の生体認識分子を置換した場合にも、粒子の形成能が落ちることがなく、安定した粒子形成が可能となる。中空ナノ粒子の形成が促進されると、中空ナノ粒子の安定した生産ができ、薬剤として利用するなどの応用が有効となるので、本技術の幅広い普及が期待できる。
【０１０５】
中空ナノ粒子に物質導入した薬剤は、静脈注射などといった簡便な方法で、特定の細胞または組織に対して選択的かつ効率的に疾患治療用の細胞導入物質を送り込むことができるので、従来の遺伝子治療と大きく異なり、外科手術を必要とせず、副作用の心配も極めて低く、そのまま臨床応用可能なものである。
【０１０６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施の形態に係るＨＢｓＡｇＬ粒子の生体認識分子の改変を説明する図面である。
【図２】本発明の一実施の形態に係る中空ナノ粒子を構成するＨＢｃＡｇタンパク質を示す図面であって、（ａ）はＨＢｃＡｇタンパク質の概略図を示し、（ｂ）はＨＢｃＡｇが構成するカプシド構造を示し、（ｃ）がカプシド構造を有するＢ型肝炎ウィルスをしている。
【図３】本発明の一実施の形態に係る中空ナノ粒子を作製するためのベクターを示した図面であり、（ａ）はＨＢｓＡｇＬタンパク質をコードする遺伝子を有するベクターを示し、（ｂ）はＨＢｃＡｇＬタンパク質をコードする遺伝子を有するベクターを示す。
【図４】ＢＴＣ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子およびｂＦＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子のウェスタンブロッティング図を示す図面である。
【図５】本発明の一実施の形態に係る中空ナノ粒子である、ＨＢｃＡｇと野生型ＨＢｓＡｇＬタンパク質とを共発現して得たＨＢｓＡｇＬ粒子の抗原性を示す図面である。
【図６】本発明の一実施の形態に係る中空ナノ粒子である、ＨＢｃＡｇとＥＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬタンパク質とを共発現して得たＥＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子の抗原性を示す図面である。
【図７】本発明の一実施の形態に係る中空ナノ粒子である、ＨＢｃＡｇとＮｕｌｌ型ＨＢｓＡｇＬタンパク質とを共発現して得たＮｕｌｌ型ＨＢｓＡｇＬ粒子の抗原性を示す図面である。
【図８】本発明の一実施の形態に係る中空ナノ粒子である、ＨＢｃＡｇとＢＴＣ提示型ＨＢｓＡｇＬタンパク質とを共発現して得たＢＴＣ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子の抗原性を示す図面である。
【図９】本発明の一実施の形態に係る中空ナノ粒子である、ＨＢｃＡｇとｂＦＧＦ型ＨＢｓＡｇＬタンパク質とを共発現して得たｂＦＧＦ型ＨＢｓＡｇＬ粒子の抗原性を示す図面である。
【図１０】本発明の一実施の形態に係るＢＴＣ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子およびｂＦＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子の抗原性を、野生型ＨＢｓＡｇＬタンパク質の単独発現により形成された粒子の抗原性を１００としたときの相対値で示した図面である。
【図１１】本発明の一実施の形態に係るｂＦＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子のウェスタンブロッティング図を示す図面である。
【図１２】本発明の一実施の形態に係るｂＦＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子のＣｓＣｌ密度勾配遠心を示す図面であり、（ａ）はＣｓＣｌ密度勾配チューブを示しており、（ｂ）はＣｓＣｌ密度勾配遠心した後の画分ごとの抗原性を示している。
【図１３】本発明の一実施の形態に係るｂＦＧＦ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子をプロテイナーゼ処理した後、ウェスタンブロットを行った結果を示す図面であり、（ａ）は抗Ｌタンパク質抗体を、（ｂ）は抗ｂＦＧＦ抗体を、（ｃ）は抗ＨＢｃＡｇ抗体を用いてウェスタンブロットを行った結果を示している。
【図１４】本発明の一実施の形態に係るＢＴＣ提示型ＨＢｓＡｇＬ粒子のＣｓＣｌ密度勾配遠心の結果を示す図面であり、（ａ）はＣｓＣｌ密度勾配チューブを示しており、（ｂ）はＣｓＣｌ密度勾配遠心した後の画分ごとの抗原性を示しており、（ｃ）は粗抽出液または密度勾配遠心画分のウェスタンブロットの結果を示す図面である。
【図１５】本発明の一実施の形態に係るＨＢｓＡｇＬ粒子を示す図面であり、（ａ）はＨＢｃＡｇが、ＨＢｓＡｇＬ粒子の外側からＨＢｓＡｇＬタンパク質と相互作用している様子をあらわし、（ｂ）はＨＢｃＡｇが、ＨＢｓＡｇＬ粒子の内側に包含されてＨＢｓＡｇＬタンパク質と相互作用している様子をあらわしている。
【符号の説明】
１  Ｂ型肝炎ウィルス内部コア抗原タンパク質
３  Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質
４  生体認識分子
５  Ｂ型肝炎ウィルス粒子
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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