(57)【要約】【課題】生体組織修復材の埋入直後から浸出液がおさまるまでの期間内に粘着性を維持し、患部からの脱落を防止して、生体組織の欠損部を正常な組織で修復すること。【解決手段】水に対して異なる溶解性を有する二種以上の繊維が絡み合ったカルボキシルメチルキチンのスポンジ体からなり、３７℃の生理食塩水中に２４時間浸漬した場合に、浸漬前の外形形状をほぼ維持し、かつ、前記スポンジ体の外表面の略全体が粘着性のカルボキシルメチルキチンのゲルにより覆われることを特徴とする生体組織修復材とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水に対して異なる溶解性を有する二種以上の繊維が絡み合ったカルボキシルメチルキチンのスポンジ体からなり、３７℃の生理食塩水中に２４時間浸漬した場合に、浸漬前の外形形状をほぼ維持し、かつ、前記スポンジ体の外表面の略全体が粘着性のカルボキシルメチルキチンのゲルにより覆われることを特徴とする生体組織修復材。
【請求項２】
カルボキシルメチルキチン水溶液とアルコールを混合し、カルボキシルメチルキチンを混合液中に凝集沈降させて凝集繊維状のカルボキシルメチルキチンを得る工程と、このカルボキシルメチルキチンを乾燥させる工程と、乾燥させたカルボキシルメチルキチンを複数の部分に分けてそれぞれ各々異なる温度で熱処理する工程と、これら異なる温度で熱処理されたカルボキシルメチルキチンを蒸留水に攪拌混合したものを所定の容器内に流し込んだ後、凍結乾燥することで、水に対して異なる溶解性を有する二種以上の繊維が絡み合ったカルボキシルメチルキチンのスポンジ体を得る工程とからなる生体組織修復材の製造方法。
【請求項３】
少なくとも一部の前記乾燥したカルボキシルメチルキチンの熱処理温度が９０℃〜１１５℃であり、残りのカルボキシルメチルキチンの熱処理温度が１４０℃〜１６０℃であることを特徴とする請求項２記載の生体組織修復材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、疾患や外傷により生じた骨欠損部を修復する目的のために外科的治療に用いられる医用材料に関するものであり、特に軟骨下骨欠損を伴う関節欠損修復等に用いられる、生体組織修復材に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、変形性関節症を代表とする各種の関節疾患やスポーツ外傷などで喪失あるいは損傷した関節軟骨層の治療には軟骨下骨を穿孔し、骨髄組織内に存在する未分化な間葉系細胞を欠損部に満たして自然治癒を促す処置（骨髄活性化法）が実施されてきた。
【０００３】
また、近年では自己の関節軟骨から採取した組織片より軟骨細胞を単離し、コラーゲンゲル培地などで３次元培養した培養細胞を患部に移植する移植治療法も開発され臨床応用が開始されている。
【０００４】
しかしながら、骨髄活性化法においては軟骨下骨内から浸出した骨髄成分を欠損部に保持しづらい場合や培養細胞移植術においては培養物自体に充分な粘着性がないため、骨膜やそれに代わる膜状物によって欠損部を封鎖しないと移植物を固定できないなどの課題があった。
【０００５】
また、特許第３０６４１１６号公報（特許文献１）には粘着性を有する生体移植材が明示されており、架橋状態にあるキチン、キトサンおよびそれらの誘導体に、未架橋のキチン、キトサンおよびそれらの誘導体が被膜形成され、吸水によって粘着性を発揮するとされている。
【０００６】
しかしながら、未架橋のキチン、キトサンおよびそれらの誘導体は吸水後患部から急速に拡散してしまうため粘着性の発揮とその効果は極短時間に限られ、充填した患部からの全材料あるいはリン酸カルシウム顆粒の早期脱落が危惧される。
【０００７】
【特許文献１】特許第３０６４１１６号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、これら従来技術の課題を解決するためになされたものであって、生体組織修復材の埋入直後から浸出液がおさまるまでの期間内に粘着性を維持し、患部からの脱落を防止して、生体組織の欠損部を正常な組織で修復することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決するため請求項１の生体組織修復材は、水に対して異なる溶解性を有する二種以上の繊維が絡み合ったカルボキシルメチルキチンのスポンジ体からなり、３７℃の生理食塩水中に２４時間浸漬した場合に、浸漬前の外形形状をほぼ維持し、かつ、前記スポンジ体の外表面の略全体が粘着性のカルボキシルメチルキチンのゲルにより覆われることを特徴とする。
【００１０】
かかる構成によれば、生体組織修復材が生体の生体組織欠損部に埋入された直後から、生体組織修復材をなすスポンジ体において、水に対して溶解性の低い（溶け難い）カルボキシルメチルキチン（以下、ＣＭキチンと云う。）の繊維は、長期間にわたって溶出することなく、したがって、スポンジ体は、生体組織欠損部への埋入前の外形形状をほぼそのまま維持する。
【００１１】
他方、スポンジ体における、水に対して溶解性が大きい（溶け易い）ＣＭキチンの繊維は、生体内で短期間（例えば２４時間以内）に溶けてゲルとなり、前記スポンジ体の外表面に滲み出して、該外表面を覆う。このとき、ＣＭキチンのゲルは、その粘着性とスポンジ体表面の凹凸との係合により、スポンジ体表面にしばらくとどまり、すぐには体内に消失しない。
【００１２】
この粘着性のＣＭキチンのゲルがスポンジ体と欠損部の壁面との接着剤として作用するので、生体組織修復材が欠損部から脱落するのを防止することができる。材料を患部に埋入後、出血が止まって凝固するまでの一定期間内に材料が粘着性を発揮すれば、欠損部位への材料埋入作業が非常に容易となり、骨膜や合成膜材などによるカバーや生体用接着剤の使用または縫合などの手間は必要なくなる。
【００１３】
そして、生体組織修復材が長期間にわたり生体組織欠損部に残存し、細胞や組織侵入の足場的役割を果たし、良好な生体組織修復が達成できる。なお、前記生体組織修復材は、βＴＣＰ（ベータ型トリカルシウムフォスフェート）やアパタイトなどのリン酸カルシム材料の顆粒を担持していることが好ましい。なぜなら、リン酸カルシウム材料には、骨伝導能があるからである。
【００１４】
前記生体組織修復材をなすスポンジ体について、水に対して異なる溶解性を有する二種以上の繊維が絡み合った状態であることは、次のように確認することができる。
【００１５】
まず、スポンジ体の内部の組織状態を顕微鏡で撮影しておく。次に、３７℃の生理食塩水中にスポンジ体を２４時間浸漬した後に、スポンジ体の内部のほぼ同一場所を顕微鏡で撮影する。これら撮影された画像を比べて、ＣＭキチンの繊維の密度の違いが明瞭な場合には、水に溶け易いＣＭキチンの繊維が溶けて表面に滲み出したことが分かるので、この場合、前記生体組織修復材をなすスポンジ体について、水に対して異なる溶解性を有する二種以上の繊維が絡み合った状態であることが確認できる。
【００１６】
ここで、３７℃の生理食塩水中にスポンジ体を２４時間浸漬した後の状態を確認するのは、３７℃の生理食塩水というのは、疑似生体内環境であり、２４時間というのは、血液が凝固して生体組織修復材が生体組織欠損部内に固着するまでの目安の時間であるためである。
【００１７】
また、溶け難いＣＭキチンの量は、溶け易いＣＭキチンの量よりも多いことが好ましい。そうでない場合には、溶け易いＣＭキチンが溶解した後に生体組織修復材をなすスポンジ体が脆弱化して崩壊し、細胞や組織侵入の足場的役割を果たせなくなり、更に含有しているリン酸カルシウム顆粒も欠損部外へ流出してしまう恐れがあるためである。
【００１８】
溶け難いＣＭキチンの量に対する溶け易いＣＭキチンの量は、粘着性とスポンジ体の強度の観点から、好ましくは、水難溶解性ＣＭキチンの重量の１０％〜４０％で、更に好ましくは２０％〜３０％である。
【００１９】
また、リン酸カルシウム材顆粒の含有重量は、全ＣＭキチン重量の３倍量から７倍量で、その顆粒径が５０μｍ〜５００μｍであることが好ましい。
【００２０】
リン酸カルシウム材顆粒の重量がＣＭキチン重量の３倍量未満ですべての顆粒径が５０μｍ以下の場合には、骨内にて急速に分解されてしまい骨形成促進能が低い。
【００２１】
また、７倍量以上ですべての顆粒径が５００μｍを超える場合には、骨内で長期に残存するため新生骨置換が遅れ、膜性骨化反応の長期化による影響のため、直上の関節軟骨様組織は殆ど形成されない。
【００２２】
次に、前記請求項１の生体組織修復材は請求項２の方法により製造することができる。請求項２の製造方法は、ＣＭキチン水溶液とアルコールを混合し、ＣＭキチンを混合液中に凝集沈降させて凝集繊維状のＣＭキチンを得る工程と、このＣＭキチンを乾燥させる工程と、乾燥させたＣＭキチンを複数の部分に分けてそれぞれ異なる温度で熱処理する工程と、これら異なる温度で熱処理されたＣＭキチンを蒸留水に攪拌混合したものを所定の容器内に流し込んだ後、凍結乾燥することで、水に対して異なる溶解性を有する二種以上の繊維が絡み合ったＣＭキチンのスポンジ体を得る工程と、からなることを特徴とする。
【００２３】
尚、前記アルコールとしてはＣＭキチンが凝集繊維状となるためにエタノールを用いることができるが、その他適当なアルコールを任意に用いればよい。
【００２４】
ここで、低い温度で熱処理されたものが、水に溶け易いＣＭキチンの繊維となり、高い温度で熱処理されたものが、水に溶け難いＣＭキチンの繊維となる。
【００２５】
低い方の熱処理温度は９０℃〜１１５℃の範囲であることが好ましい。高い方の熱処理温度としては１４０℃〜１６０℃の範囲であることが好ましい。また、熱処理は、真空雰囲気で行なうことが好ましい。
【００２６】
９０℃〜１１５℃の温度範囲で熱処理したＣＭキチンは、分子間に多量の水分子を吸着し、ＣＭキチン分子に自由度が残る架橋状態であるため被着物の凹凸面に入り込むことができ、多量の水溶液中においてもＣＭキチン分子が拡散し難く、一定時間内は局所的に粘着性を維持する傾向がある。
【００２７】
９０℃未満で熱処理されるＣＭキチンは、当該分子内の水酸基に水分子が吸着し、ＣＭキチン分子が自由に動いて被着物の凹凸面に入り易く、即時に強い粘着力を発揮するが、ＣＭキチン分子間の架橋結合が極めて弱いため、生体内でＣＭキチン分子が拡散し易く、局所的な粘着性は極短時間に限られてしまう恐れがある。
【００２８】
一方、１４０℃〜１６０℃で熱処理されるＣＭキチン分子の水酸基に水分子を吸着するが、ＣＭキチン分子間の架橋結合が強すぎて分子鎖の自由度が低いため、被着物面の凹凸に入り込み難く、粘着力は発揮しない。しかし、ＣＭキチン分子間の強い架橋のため極めて水溶性に乏しいことから、生体内においては分解酵素や貪食作用によって代謝される性質を有しており、しばらくの期間は適用部位でその分子骨格を維持して残存することが可能である。したがって、比較的長期間、生体組織基質が形成されるまで残存させ得る。
【００２９】
１１５℃超過、１４０℃未満で熱処理されるＣＭキチンは、吸水によって粘着力が発揮されない恐れがある。
【００３０】
１６０℃を超える温度で熱処理されるＣＭキチンは、分子間の架橋結合が非常に強く、長期間残存してしまい、結果として生体内での炎症反応がひどくなる恐れがある。
【００３１】
【実施例】
次に、本発明を以下の実施例に基づいて具体的に説明する。
【００３２】
実施例
室温にて４重量％濃度のＣＭキチン水溶液を調製し、ここに純度９９．５％以上のエタノールを注ぎ込んで凝集沈降させたＣＭキチンを回収した。このＣＭキチンを低温乾燥機内で十分に乾燥させた後、９０℃で１２時間、１１５℃で１２時間、１４０℃で１２時間、１６０℃で１２時間の条件で、それぞれ別々に真空加熱処理を行った。
【００３３】
次に、９０℃で熱処理したＣＭキチン１．０ｍｇ、１４０℃で熱処理したＣＭキチン４．０ｍｇとβＴＣＰ顆粒２５．０ｍｇ、並びに１６０μｌの蒸留水を攪拌混合し、プラスチック製の鋳型容器内に流し込み、即時に−８０℃一定の冷凍庫内で冷凍させ、１２時間の凍結乾燥を行った。
【００３４】
以上より、直径４ｍｍ、長さ１０ｍｍの円筒形状、スポンジ体からなる生体組織修復材（実施例品１）を得た。
【００３５】
また、１１５℃で熱処理したＣＭキチン１．０ｍｇ、１６０℃で熱処理したＣＭキチン４．０ｍｇ、βＴＣＰ２５．０ｍｇ、１６０μｌの蒸留水を攪拌混合した以外は、実施例品１と同様に作成した別の生体組織修復材（実施例品２）を得た。
【００３６】
実施例品１と実施例品２を５０ｍｌの生理食塩水に２４時間浸漬し、経過観察すると、スポンジの外形はほぼ維持しており、かつ、前記スポンジ体の外表面は粘着性のカルボキシメチルキチンのゲルに覆われていた。
【００３７】
比較例
室温にて４重量％濃度のＣＭキチン水溶液を調製し、ここに９９．５％以上のエタノールを注ぎ込んで凝集沈降させたＣＭキチンを回収した。このＣＭキチンを低温乾燥機内で十分に乾燥させた後、１４０℃で１２時間の条件で真空加熱処理を行った。
【００３８】
次に、１４０℃で熱処理したＣＭキチン５．０ｍｇとβＴＣＰ顆粒２５．０ｍｇ、並びに１６０μｌの蒸留水を攪拌混合し、プラスチック製の鋳型容器内に流し込み、即時に−８０℃一定の冷凍庫内で冷凍させ、１２時間の凍結乾燥を行った。
【００３９】
以上より、直径４ｍｍ、長さ１０ｍｍの円筒形状、スポンジ体からなる生体組織修復材（比較例品）を得た。
【００４０】
比較例品を５０ｍｌの生理食塩水に２４時間浸漬し、経過観察すると、スポンジの外形はほぼ維持していたものの、前記スポンジ体の外表面は粘着性を有していなかった。
【００４１】
実験例（動物膝関節欠損孔への材料埋入実験）
ペントバルビタールナトリウム注射液による全身麻酔下で、家兎（ニュージーランドホワイトラビット、オス）の右大腿膝関節骨顆間部に径５ｍｍ、深さ５ｍｍの関節欠損孔を形成し、生理食塩水にて孔内を充分に洗浄して、実施例品１および実施例品２並びに比較例品を直径４ｍｍ、長さ４ｍｍに調整して、軟骨下骨欠損開口部と面一となるように埋入し、２、４、８週間後に犠牲死させ組織学的な検討を実施した。
【００４２】
各埋入期間における材料のｎ数は３個とした。
【００４３】
別の比較例として左大腿膝関節面に同形状の欠損孔を形成し、生理食塩水にて孔内を充分に洗浄した後、何も埋入せずにそのまま縫合した。
【００４４】
パラフィン切片作製による組織学的な検討の結果、実施例品１と実施例品２は２、４、８週間例の合計９個ともに脱落例は存在せず、また、すべての症例で関節腔へのβＴＣＰ顆粒の脱落も認めなかった。
【００４５】
実施例品１と実施例品２を埋入した４週間後の軟骨下骨欠損底部では旺盛な新生骨形成が認められ、下骨欠損中央部から上部にかけては内軟骨性骨化のメカニズムによる新生組織形成が進行していた。８週間後には下骨欠損上部でも骨化が進行し、その直上には関節軟骨様組織が形成されていた。欠損両端では周囲の正常な関節軟骨形態との不連続性を認めるが、欠損中央部に生成した軟骨には厚みがあり、周囲正常軟骨と類似の組織形態であった。
【００４６】
組織修復状態は実施例品１と実施例品２との間では有為な差は認められなかった。ただし、実施例品１、２は、欠損部埋入直後、粘着性の効力により欠損部位に留まっていた。
【００４７】
一方、比較例品では埋入直後、出血による圧力で、欠損部位からはみ出す傾向が認められた。
【００４８】
また、生体組織修復材を用いなかった自然治癒による比較例では、両端の既存軟骨層と連続する新生の軟骨様組織が極端に下方に向かって伸展し、中央部には繊維性結合組織が充満していた。関節欠損上部が全体的に下方に陥没し、両関節軟骨面との段差がかなり大きかった。
【００４９】
以上の結果から、粘着性を有し、組織修復状態も良好である実施例品１と実施例品２が非常に有用であった。
【００５０】
【発明の効果】
以上のように本発明の生体組織修復材によれば、水に対して異なる溶解を有する二種以上の繊維が絡み合ったカルボキシルメチルキチンのスポンジ体からなり、３７℃の生理食塩水中に２４時間浸漬した場合に、浸漬前の外形形状をほぼ維持し、かつ、前記スポンジ体の外表面の略全体が粘着性のカルボキシルメチルキチンのゲルにより覆われるものであることから、生体組織修復材が生体の生体組織欠損部に設置された直後から、生体組織修復材をなすスポンジ体において、水に対して溶解性の低いカルボキシルメチルキチンの繊維は、長期間にわたって溶出することなく、したがって、スポンジ体は、生体組織欠損部への設置前の外形形状をほぼそのまま維持するとともに、水に対して溶解性が大きいカルボキシルメチルキチンの繊維は、生体内で短期間に溶けてゲルとなり、前記スポンジ体の外表面に滲み出して、該外表面を覆う。このとき、カルボキシルメチルキチンのゲルは、その粘着性とスポンジ体表面の凹凸との係合により、スポンジ体表面にしばらくとどまり、すぐには体内に消失しない。そして、この粘着性のカルボキシルメチルキチンのゲルがスポンジ体と欠損部の壁面との接着剤として作用するので、生体組織修復材が欠損部から脱落するのを防止することができる。したがって、材料を患部に埋入後、出血が止まって凝固するまでの一定期間内に生体組織修復材が粘着性を発揮すれば、生体組織修復材が長期間にわたり生体組織欠損部に残存し、細胞や組織侵入の足場的役割を果たし、良好な生体組織修復が達成できる。また、欠損部位への材料埋入作業が非常に容易となり、骨膜や合成膜材などによるカバーや生体用接着剤の使用または縫合などの手間は必要なくなる。
【００５１】
また、本発明の生体組織修復材の製造方法によれば、カルボキシルメチルキチン水溶液とアルコールを混合し、カルボキシルメチルキチンを混合液中に凝集沈降させて凝集繊維状のカルボキシルメチルキチンを得る工程と、このカルボキシルメチルキチンを適宜乾燥させる工程と、乾燥させたカルボキシルメチルキチンを複数部分に分けてそれぞれ異なる温度で熱処理する工程と、これら異なる温度で熱処理されたカルボキシルメチルキチンを蒸留水に攪拌混合したものを所定の容器内に流し込んだ後、凍結乾燥することで、水に対して異なる溶解性を有する二種以上の繊維が絡み合ったカルボキシルメチルキチンのスポンジ体を得る工程とからなるもので、低い温度で熱処理されたものが、水に溶け易いカルボキシルメチルキチンの繊維となり、高い温度で熱処理されたものが、水に溶け難いカルボキシルメチルキチンの繊維となる。これにより、前記生体組織修復材を比較的簡単に製造することができる。