(57)【要約】【課題】プローブのハイブリダイゼーション強度を低下させることなく、非特異的なハイブリッド形成を抑制し、特異的な反応によるシグナルを感度良く検出するハイブリダイゼーション検出方法を提供する。【解決手段】本発明のハイブリダイゼーション検出方法は、複数の異なったプローブが配置されたマイクロアレイに、標識されたターゲットを接触させ、ハイブリッドを形成させた後、ハイブリダイズしている標識されたターゲット分子のシグナルを測定することにより、ハイブリダイズしているターゲット分子を同定する方法において、標識されたターゲットをマイクロアレイに接触させる前に、プローブの分子内結合及び／又は分子間結合を解離させる。【選択図】　　図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の異なったプローブが配置されたマイクロアレイに、標識されたターゲットを接触させ、ハイブリッドを形成させた後、ハイブリダイズしている標識されたターゲット分子のシグナルを測定することにより、ハイブリダイズしているターゲット分子を同定する方法において、
標識されたターゲットをマイクロアレイに接触させる前に、プローブの分子内結合及び／又は分子間結合を解離させることを特徴とするハイブリダイゼーション検出方法。
【請求項２】
標識されたターゲットをマイクロアレイに接触させる前に、前記マイクロアレイに液体を接触させることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション検出方法。
【請求項３】
前記液体が界面活性剤を含有することを特徴とする請求項２に記載のハイブリダイゼーション検出方法。
【請求項４】
前記液体のｐＨが、ｐＨ５．０〜９．０の範囲であることを特徴とする請求項２又は３に記載のハイブリダイゼーション検出方法。
【請求項５】
標識されたターゲットをマイクロアレイに接触させる前に、前記プローブを加温することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のハイブリダイゼーション検出方法。
【請求項６】
標識されたターゲットをマイクロアレイに接触させる前に、前記マイクロアレイを加温することによりプローブを加温することを特徴とする請求項５記載のハイブリダイゼーション検出方法。
【請求項７】
標識されたターゲットをマイクロアレイに接触させる前に、マイクロアレイに加温された液体を接触させることにより、プローブを加温することを特徴とする請求項５記載のハイブリダイゼーション検出方法。
【請求項８】
標識されたターゲットをマイクロアレイに接触させる前に、加温されたマイクロアレイに加温された液体を接触させることにより、プローブを加温することを特徴とする請求項５記載のハイブリダイゼーション検出方法。
【請求項９】
前記マイクロアレイが、三次元的にプローブを収容し得るプローブスポットを２次元的に複数配置してなるものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のハイブリダイゼーション検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はハイブリダイゼーションの検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
マイクロアレイは、支持体に数百個〜数万個のＤＮＡプローブを格子状に配列させ、そこに核酸試料を含む溶液を接触・ハイブリダイズさせて、それを検出することで、複数の遺伝子の情報を同時に解析することができる。ハイブリダイゼーションの検出には、例えば、予め核酸試料に検出可能な標識を施し、その標識を検出することで間接的にＤＮＡ量を検出する方法がとられている。一般に、このような標識としては、蛍光や放射性同位体（ＲＩ）、化学発光等が用いられている。
このように、マイクロアレイは、核酸の持つ相補性を利用したハイブリダイゼーション反応をベースとするため、如何にして非特異的な反応を抑制し、特異的な反応のみを効率良く検出することができるかが重要な課題であった。
【０００３】
そこで、従来、ハイブリダイゼーション及びマイクロアレイにおいては、非特異的なハイブリッドの検出を抑制するために、（１）試料を接触させる前に、予め、サーモンスパーム等を非特異的に吸着させることが行われる（プレハイブリダイゼーション）（ＭＥＴＨＯＤＳ；３０３−３１２、２３、２００１）。
また、特異的な反応を促進させる目的で、（２）核酸試料を高温で数分間加温し、それを急冷することによって、核酸試料の高次構造をほぐし、プローブとのハイブリッド形成を行いやすい状態として、マイクロアレイに接触させることが行われている。
また、（３）プローブ配列の設計を工夫することにより、高次構造がハイブリダイゼーションに影響を与えないようにしていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、（１）プレハイブリダイゼーションによる方法は、バックグラウンドを下げる一方で、プローブと核酸試料とのハイブリダイゼーション強度も低くなるため、ハイブリダイゼーションの特異性を高めるのに限界がある。
また、（２）核酸試料を加温、冷却する方法では、十分な特異性を得ることができず、それに起因して再現性のある測定が困難であった。
また、（３）プローブの設計を工夫する方法では、プローブの高次構造の影響を抑えようとしても、オリジナルのＤＮＡ配列により限界があり、反応の特異性をだすことは困難であった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであって、本発明者らは、上記（２）の手段で核酸試料の高次構造をほぐしても、何故、充分な特異性および再現性を有する結果が得られないかについて鋭意検討した結果、プローブ分子が分子内結合、分子間結合していることに想到した。
そこで、プローブの分子内結合、分子間結合を解離させることにより、プローブのハイブリダイゼーション強度を低下させることなく、非特異的なハイブリッド形成を抑制し、特異的な反応によるシグナルを感度良く検出できること、更にその検出結果が再現性に優れ、信頼性が非常に高いものであることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明のハイブリダイゼーション検出方法は、複数の異なったプローブが配置されたマイクロアレイに、標識されたターゲットを接触させ、ハイブリッドを形成させた後、ハイブリダイズしている標識されたターゲット分子のシグナルを測定することにより、ハイブリダイズしているターゲット分子を同定する方法において、標識されたターゲットをマイクロアレイに接触させる前に、プローブの分子内結合及び／又は分子間結合を解離させることを特徴とする。
また、標識されたターゲットをマイクロアレイに接触させる前に、マイクロアレイに液体を接触させることが好ましい。
また、液体が界面活性剤を含有することが好ましい。
また、液体のｐＨが、ｐＨ５．０〜９．０の範囲であることが好ましい。
また、標識されたターゲットをマイクロアレイに接触させる前に、プローブを加温することが好ましい。
また、標識されたターゲットをマイクロアレイに接触させる前に、マイクロアレイを加温することによりプローブを加温することが好ましい。
また、標識されたターゲットをマイクロアレイに接触させる前に、マイクロアレイに加温された液体を接触させることにより、プローブを加温することが好ましい。
また、標識されたターゲットをマイクロアレイに接触させる前に、加温されたマイクロアレイに加温された液体を接触させることにより、プローブを加温することが好ましい。
また、マイクロアレイが、三次元的にプローブを収容し得るプローブスポットを２次元的に複数配置してなるものであることが好ましい。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の実施形態に係るハイブリダイゼーション検出方法は、複数の異なったプローブが配置されたマイクロアレイに、標識されたターゲットを接触させ、ハイブリッドを形成させた後、ハイブリダイズしている標識されたターゲット分子のシグナルを測定することにより、ハイブリダイズしているターゲット分子を同定する方法において、標識されたターゲットをマイクロアレイに接触させる前に、プローブの分子内結合及び／又は分子間結合を解離させることを特徴とする。
【０００７】
なお、本明細書において、「プローブ」とは、マイクロアレイに固定されている核酸を意味し、ＤＮＡ、ＲＮＡが含まれる。また、これらの塩基長としては、特に制限はないが、１５〜８０ｍｅｒ程度とすることが好ましい。より好ましくは、３０〜６０ｍｅｒであり、特に遺伝子の発現量解析を行う場合に、特異性と感度、プローブの合成コストのバランスの優れた範囲であり好ましい。プローブの塩基長が１５ｍｅｒ未満の場合、非特異的なハイブリッド形成が増加する傾向にあり、８０ｍｅｒを超えると、プローブの合成に要する時間、費用の観点から好ましくない。
また、「ターゲット」としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質などが含まれる。これらは蛍光、放射性同位元素、化学発光等を用いて、公知の方法により標識され、適当な手段により適宜検出・測定される。また、ターゲットが、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸試料である場合は、従来技術と同様に、３０〜９５℃で５〜１０分間程度加温して、それを氷上で数分間急冷することが好ましい。
【０００８】
従来のマイクロアレイでは、図１（Ａ）に示すように、プローブが分子内結合を形成していたり、図１（Ｂ）に示すように、分子間結合を形成していると、見かけ上の塩基配列が変化するため、ターゲットと接触・ハイブリダイゼーション反応させた際に、塩基配列特異的にハイブリッド形成が行われず、反応の特異性が充分に得られなかった。その結果、再現性のある測定を実施することが困難であった。これに対し、標識されたターゲットをマイクロアレイに接触させる前に、図２に示すように、予めプローブの分子内結合及び／又は分子間結合を解離させることにより、本来のプローブが有する塩基配列をターゲットに提示することを可能とした。これにより、プローブのハイブリダイゼーション強度を低減させることなく、非特異的なハイブリッド形成を抑制して、ハイブリダイゼーション反応の特異性を向上させ、信頼性が高い測定方法を実施することができる。
【０００９】
以下、プローブの分子内結合及び／又は分子間結合を解離させるための具体的な手段について説明する。
プローブの分子内結合及び／又は分子間結合を解離させる手段の一つとしては、標識されたターゲットをマイクロアレイに接触させる前に、マイクロアレイに液体を接触させる方法がある。具体的には、液体をマイクロアレイに接触させ、浸透攪拌し、その液体を取り除いた後、ターゲットを接触させてハイブリダイゼーション反応を行う。この際に使用する液体としては、Ｈ２Ｏ、Ｔｒｉｓ、ＳＳＰＥ溶液（２０×ＳＳＰＥ溶液の組成；３．０Ｍ塩化ナトリウム、０．２Ｍリン酸ナトリウム、０．０２ＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ等が挙げられるが、これらの中でも、非特異的なハイブリッド形成を抑制する観点から６×ＳＳＰＥが特に好ましい。
このように、ターゲットをマイクロアレイに接触させる前に、液体をマイクロアレイに接触させることによって、マイクロアレイに固定されたプローブが液体中に存在するので、プローブの分子内結合及び／又は分子間結合が解離されやすい状態となる。その結果、ハイブリダイゼーション反応における特異性を向上させることができ、信頼性のある測定を実施することができる。
【００１０】
また、上記液体は界面活性剤を含有することが好ましい。使用される界面活性剤としては、特に制限はなく、カルボン酸塩、スルホン酸塩などの陰イオン界面活性剤、脂肪族アミン塩などの陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤、Ｔｗｅｅｎ２０などの非イオン界面活性剤等が挙げられる。これらの中でも特にＴｗｅｅｎ２０が好ましい。
このように、液体が界面活性剤を含有することによって、より効果的にプローブの分子内結合及び／又は分子間結合が解離される。その結果、ハイブリダイゼーション反応における特異性を向上させることができ、信頼性のある測定を実施することができる。
【００１１】
また、上記液体のｐＨは、ｐＨ５．０〜９．０の範囲であることが好ましく、プローブに応じて、各々の至適ｐＨ範囲を決めることが特に好ましい。例えば、負電荷を有するプローブを用いる場合は、溶液中のＨ＋濃度を上げる、即ち、弱酸性の液体を用いることにより、プローブの分子内結合及び／又は分子間結合が容易に解離される。一方、正電荷を有するプローブを用いる場合は、溶液中のＯＨ−濃度を上げる、即ち、弱アルカリ性の液体を用いることにより、プローブの分子内結合及び／又は分子間結合が容易に解離される。
このように、プローブに応じて、適当なｐＨの液体を用いることにより、プローブの分子内結合及び／又は分子間結合が解離され、ハイブリダイゼーション反応における特異性を向上させることができ、信頼性のある測定を実施することができる。
【００１２】
また、上記以外のプローブの分子内結合及び／又は分子間結合を解離させる手段としては、標識されたターゲットをマイクロアレイに接触させる前に、プローブを加温する方法がある。具体的には、標識されたターゲットをマイクロアレイに接触させる前に、マイクロアレイに加温された液体を接触させることにより、プローブを加温することができる。
このときの加温温度としては、３０〜９５℃の範囲が好ましく、より好ましくは５０〜７０℃である。加温温度が３０℃未満の場合、プローブの分子内結合及び／又は分子間結合が十分に解離されず、９５℃を超えるとハイブリダイゼーション強度が低下するため、本来の特異的なハイブリッド形成までもが阻害されてしまう傾向にある。
ただし、ＲＮＡはＤＮＡに比べて壊れ易いため、類似の配列を有するＤＮＡ、ＲＮＡをプローブとして用いる場合でも、液体の加温温度は各々検討し、各々の至適温度範囲を決めることが特に好ましい。例えば、プローブとして用いる核酸の種類（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、塩基長、Ｔｍ値（二重鎖解離温度）、液体のｐＨ、塩濃度など種々の条件を考慮して、液体の加温温度を適宜決定する。
このように、加温された液体を用いることにより、プローブが加温され、プローブの分子運動が激しくなり、プローブの分子内結合及び／又は分子間結合が解離される。また、予め加温された液体を用いるため、目的の温度まで上げやすく、より効率良く、確実にプローブの分子内結合及び／又は分子間結合が解離される。その結果、ハイブリダイゼーション反応における特異性を向上させることができ、信頼性のある測定を実施することができる。
【００１３】
また、本発明においては、標識されたターゲットをマイクロアレイに接触させる前に、マイクロアレイに常温の液体を接触させ、次いで、マイクロアレイを加温して、間接的にマイクロアレイ中の液体を加温することによって、プローブを加温することもできる。この場合、液体中でプローブが柔軟になり、更に加温するので、より確実にプローブの分子内結合及び／又は分子間結合が解離される。
【００１４】
また、標識されたターゲットをマイクロアレイに接触させる前に、マイクロアレイを直接加温することにより、プローブを加温することができる。このときの加温温度としては、３０〜９５℃の範囲が好ましく、より好ましくは５０〜７０℃である。加温温度が３０℃未満の場合、プローブの分子内結合及び／又は分子間結合が十分に解離されず、９５℃を超えるとハイブリダイゼーション強度が低下するため、本来の特異的なハイブリッド形成までもが阻害されてしまう傾向にある。また、上記と同様の理由から、プローブとして用いる核酸の種類（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、塩基長、Ｔｍ値（二重鎖解離温度）など種々の条件を考慮して、加温温度を適宜決定することが特に好ましい。なお、マイクロアレイを直接加温する方法としては、特に制限はなく、例えば、マイクロアレイに接触して配置されるヒーター部（インキュベーター部）を介してマイクロアレイの温度を調節する温度コントローラを具備した、一連の操作を自動的に実施することができる自動検出装置や、ハイブリダイゼーションの直前に、別途ヒーターなどを用いて加温する方法もある。
このように、マイクロアレイを直接加温することにより、確実にプローブが加温され、プローブの分子運動が激しくなり、プローブの分子内結合及び／又は分子間結合が解離される。その結果、ハイブリダイゼーション反応における特異性を向上させることができ、信頼性のある測定を実施することができる。
【００１５】
また、標識されたターゲットをマイクロアレイに接触させる前に、加温されたマイクロアレイに加温された液体を接触させることにより、プローブを加温することが好ましい。この場合、すばやくプローブの分子内結合及び／又は分子間結合が解離される。その結果、ハイブリダイゼーション反応における特異性を向上させることができ、信頼性のある測定を実施することができる。
【００１６】
以上、プローブの分子内結合及び／又は分子間結合を解離させるための手段について説明したが、これらは単独で実施されることもできるが、上記手段を複数組み合わせることにより、より確実にプローブの分子内結合及び／又は分子間結合を解離させることができる。
【００１７】
本発明のハイブリダイゼーション検出方法が適用されるマイクロアレイとしては、複数の異なるプローブが平面上に固定されたマイクロアレイ（以下、二次元マイクロアレイという）、三次元的にプローブを収容し得るプローブスポットを二次元的に複数配置してなるマイクロアレイ（以下、三次元マイクロアレイという）が挙げられるが、特に三次元マイクロアレイが好ましい。三次元マイクロアレイは、二次元マイクロアレイに比べ、プローブの固相化量が多く、分子内結合及び／又は分子間結合を形成しやすいため、より多くのプローブの分子内結合及び／又は分子間結合を確実に解離させる必要がある。
本発明によれば、プローブの分子内結合及び／又は分子間結合が確実に解離され、高感度で且つ信頼性の高い測定が可能となる。特に、三次元マイクロアレイでは、例えば液体を用いてプローブの分子内結合及び／又は分子間結合を解離させる場合、プローブスポットの空間に容易に液体を流動させることができるため、作業性良く、確実にプローブの分子内結合及び／又は分子間結合が解離される。
【００１８】
本発明において、ターゲットをマイクロアレイに接触させる以降の工程は、公知の方法が適用される。
マイクロアレイを用いたこのような検出方法は、疾病の予知・診断、ウィルスのタイピング等を行う遺伝子診断に利用でき、非常に有用であるといえる。
【００１９】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２０】
（ターゲットの調製（Ｉ））
ラット肝臓ｍＲＮＡ２．０μｇについて、ｏｌｉｇｏ　ｄＴプライマーを用いて逆転写法によりｍＲＮＡに相補的な、ＦＩＴＣ蛍光標識されたｃＤＮＡを合成した。これを９５℃で５分間加温後、氷上で５分間冷却した。
【００２１】
なお、後段の実施例１〜１０、及び比較例で使用したマイクロアレイは、特定３遺伝子（ポジティブコントロールとしてラットＧＡＰＤＨ、及びＡＣＴＩＮ−β、ネガティブコントロールとしてウミシイタケｐＲＬ−ＴＫ）の一部分を固定した、アルミニウム陽極酸化膜を基板に用いた三次元マイクロアレイである。
【００２２】
（試験例１）
上記三次元マイクロアレイにターゲットを接触させ、ハイブリッドを形成させた後、ハイブリダイズしている蛍光標識されたターゲット分子のシグナルを測定、及びハイブリダイズしているターゲット分子を同定する一連の操作を自動検出装置にて行った。
ターゲットをマイクロアレイに接触・ハイブリダイズさせる前に、マイクロアレイと接触するインキュベーター部を５０℃に加温することにより、直接マイクロアレイを５０℃に温めた後、マイクロアレイとターゲットを接触させ、ハイブリダイゼーションを行った。検出結果を図３に示す。
【００２３】
（試験例２）
上記三次元マイクロアレイにターゲットを接触させ、ハイブリッドを形成させた後、ハイブリダイズしている蛍光標識されたターゲット分子のシグナルを測定、及びハイブリダイズしているターゲット分子を同定する一連の操作を自動検出装置にて行った。
ターゲットをマイクロアレイに接触・ハイブリダイズさせる前に、ｐＨを弱酸性（ｐＨ６．５）にした６×ＳＳＰＥ５０μｌをマイクロアレイに接触させ、浸透攪拌した後、６×ＳＳＰＥを取り除き、５０℃に温めたターゲットをマイクロアレイに接触させ、ハイブリダイゼーションを行った。検出結果を図３に示す。
【００２４】
（試験例３）
６×ＳＳＰＥとして、ｐＨが弱アルカリ性（ｐＨ８．０）の６×ＳＳＰＥを用いた以外は、試験例２と同様にしてハイブリダイゼーションを行った。検出結果を図３に示す。
【００２５】
（試験例４）
上記三次元マイクロアレイにターゲットを接触させ、ハイブリッドを形成させた後、ハイブリダイズしている蛍光標識されたターゲット分子のシグナルを測定、及びハイブリダイズしているターゲット分子を同定する一連の操作を自動検出装置にて行った。
ターゲットをマイクロアレイに接触・ハイブリダイズさせる前に、マイクロアレイと接触するインキュベーター部を５０℃に加温することにより、直接５０℃にマイクロアレイを温めた。そのマイクロアレイに、別途５０℃に温めた弱酸性（ｐＨ６．５）の６×ＳＳＰＥ５０μｌを接触させ、浸透攪拌した後、６×ＳＳＰＥを取り除き、５０℃に温めたターゲットをマイクロアレイに接触させ、ハイブリダイゼーションを行った。検出結果を図３に示す。
【００２６】
（試験例５）
６×ＳＳＰＥとして、ｐＨが弱アルカリ性（ｐＨ８．０）の６×ＳＳＰＥを用いた以外は、試験例４と同様にしてハイブリダイゼーションを行った。検出結果を図３に示す。
【００２７】
（試験例６）
上記三次元マイクロアレイにターゲットを接触させ、ハイブリッドを形成させた後、ハイブリダイズしている蛍光標識されたターゲット分子のシグナルを測定、及びハイブリダイズしているターゲット分子を同定する一連の操作を自動検出装置にて行った。
ターゲットをマイクロアレイに接触・ハイブリダイズさせる前に、弱酸性（ｐＨ６．５）の６×ＳＳＰＥ５０μｌを接触させた後、マイクロアレイと接触するインキュベーター部を５０℃に加温し、浸透攪拌した後、６×ＳＳＰＥを取り除き、５０℃に温めたターゲットをマイクロアレイに接触させ、ハイブリダイゼーションを行った。検出結果を図３に示す。
【００２８】
（試験例７）
６×ＳＳＰＥとして、ｐＨが弱アルカリ性（ｐＨ８．０）の６×ＳＳＰＥを用いた以外は、試験例６と同様にしてハイブリダイゼーションを行った。検出結果を図３に示す。
【００２９】
（試験例８）
上記三次元マイクロアレイにターゲットを接触させ、ハイブリッドを形成させた後、ハイブリダイズしている蛍光標識されたターゲット分子のシグナルを測定、及びハイブリダイズしているターゲット分子を同定する一連の操作を自動検出装置にて行った。
ターゲットをマイクロアレイに接触・ハイブリダイズさせる前に、マイクロアレイと接触するインキュベーター部を５０℃に加温することにより、直接５０℃にマイクロアレイを温めた。そのマイクロアレイに、別途５０℃に温めた６×ＳＳＰＥ（ｐＨ７．０）を接触させ、浸透攪拌した後、バッファーを取り除き、５０℃に温めたターゲットをマイクロアレイに接触させ、ハイブリダイゼーションを行った。検出結果を図３に示す。
【００３０】
（試験例９）
上記三次元マイクロアレイにターゲットを接触させ、ハイブリッドを形成させた後、ハイブリダイズしている蛍光標識されたターゲット分子のシグナルを測定、及びハイブリダイズしているターゲット分子を同定する一連の操作を自動検出装置にて行った。
ターゲットをマイクロアレイに接触・ハイブリダイズさせる前に、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％含む６×ＳＳＰＥ（ｐＨ７．０）５０μｌをマイクロアレイに接触させ、浸透攪拌した後、６×ＳＳＰＥを取り除き、５０℃に温めたターゲットをマイクロアレイに接触させ、ハイブリダイゼーションを行った。検出結果を図３に示す。
【００３１】
（試験例１０）
上記三次元マイクロアレイにターゲットを接触させ、ハイブリッドを形成させた後、ハイブリダイズしている蛍光標識されたターゲット分子のシグナルを測定、及びハイブリダイズしているターゲット分子を同定する一連の操作を自動検出装置にて行った。
ターゲットをマイクロアレイに接触・ハイブリダイズさせる前に、マイクロアレイと接触するインキュベーター部を加温することにより、直接５０℃にマイクロアレイを温めた。そのマイクロアレイに、別途５０℃に温めたＴｗｅｅｎ２０を０．０５％含む６×ＳＳＰＥ（ｐＨ７．０）５０μｌを接触させ、浸透攪拌した後、６×ＳＳＰＥを取り除き、５０℃に温めたターゲットをマイクロアレイに接触させ、ハイブリダイゼーションを行った。検出結果を図３に示す。
【００３２】
（比較試験例）
上記三次元マイクロアレイにターゲットを接触させ、ハイブリッドを形成させた後、ハイブリダイズしている蛍光標識されたターゲット分子のシグナルを測定、及びハイブリダイズしているターゲット分子を同定する一連の操作を自動検出装置にて行った。検出結果を図３に示す。
【００３３】
図３の結果から、マイクロアレイを直接加温した試験例１では、マイクロアレイに固定されたプローブが加温されるため、比較試験例に比べ、ポジティブコントロールとネガティブコントロールとの間に差が生じ、特異的に反応を検出できたことが判明した。
また、試験例２及び３では、６×ＳＳＰＥを用いたことにより、比較試験例に比べ、ポジティブコントロールとネガティブコントロールとの間に差が生じ、特異的に反応を検出できたことが判明した。また、僅かな差ではあるが、実施例２で用いた弱酸性の６×ＳＳＰＥより、試験例３で用いた弱アルカリ性の６×ＳＳＰＥのほうが、今回用いたプローブにおいては、より特異的に反応を検出できることが推測される。
また、試験例４では、マイクロアレイを直接加温し、且つ、別途加温した６×ＳＳＰＥ（ｐＨ６．５）を用いたことにより、試験例２に比べ、非特異的な反応が大幅に低減され、より特異的に反応を検出できたことが判明した。
また、試験例５では、マイクロアレイを直接加温し、且つ、別途加温した６×ＳＳＰＥ（ｐＨ８．０）を用いたことにより、試験例３に比べ、非特異的な反応の検出が大幅に低減され、より特異的に反応を検出できたことが判明した。
６×ＳＳＰＥを接触させた後、マイクロアレイを加温し、浸透攪拌した試験例６及び７では、上記試験例１〜５に比べ、より特異的に反応を検出できたことが判明した。
試験例８では、マイクロアレイを直接加温し、かつ、別途加温した６×ＳＳＰＥ（ｐＨ７．０）を用いたことにより、試験例１〜７と比較して、より特異的に反応を検出できたことが判明した。
試験例９では、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％含む６×ＳＳＰＥ（ｐＨ７．０）を用いたことにより、比較試験例に比べ、ポジティブコントロールとネガティブコントロールとの間に明らかな差が生じ、特異的に反応を検出できたことが判明した。
また、試験例１０では、マイクロアレイを直接加温し、且つ、別途加温したＴｗｅｅｎ２０を０．０５％含む６×ＳＳＰＥ（ｐＨ７．０）を用いたことにより、試験例９に比べ、より特異的に反応を検出できたことが判明した。
【００３４】
（ターゲットの調製（ＩＩ））
ヒト正常胃細胞のｔｏｔａｌＲＮＡについて、特定３遺伝子（ポジティブコントロールとしてＧＡＰＤＨ、及びＡＣＴＩＮ−β、ネガティブコントロールとしてウミシイタケｐＲＬ−ＴＫ）の発現量の差を比較する実験を行った。
上記ｔｏｔａｌＲＮＡ４μｇをＴ７増幅系（Ｅｂｅｒｗｉｎｅ　ｍｅｔｈｏｄ）を用いて増幅し、ＦＩＴＣ蛍光標識ｃＲＮＡを合成して、ハイブリダイゼーションバッファーに溶解させたものをターゲットとした。
【００３５】
（試験例１１）
二次元マイクロアレイに、ターゲットを接触させ、ハイブリッドを形成させた後、ハイブリダイズしている蛍光標識されたターゲット分子のシグナルを測定、及びハイブリダイズしているターゲット分子を同定する一連の操作を自動検出装置にて行った。この際に、ターゲットをマイクロアレイに接触・ハイブリダイズさせる前に、インキュベーター部を加温することにより、マイクロアレイを５０℃に加温した。別途加温した６×ＳＳＰＥ（ｐＨ７．０）を、このマイクロアレイの多孔質基板内に十分に接触させ、プローブの分子結合及び／又は分子間結合を解離させた後に、６×ＳＳＰＥ（ｐＨ７．０）を取り除き、５０℃に温めたターゲットをマイクロアレイに接触させ、ハイブリダイゼーションを行った。検出結果を図４に示す。なお、ここで使用した二次元マイクロアレイとは、スライドグラス上にプローブをスポットしたものを示す。
【００３６】
（試験例１２）
三次元マイクロアレイを用いた以外は、試験例１１と同様の方法で、ハイブリダイゼーションを行った。検出結果を図４に示す。
【００３７】
図４の結果から、二次元マイクロアレイ、三次元マイクロアレイともに、ポジティブコントロールとネガティブコントロールとの間に差が生じ、特異的に反応を検出できたことが判明した。特に、三次元マイクロアレイを用いた試験例１２では、非特異的な反応が大幅に低減され、本発明による効果が顕著であった。
また、以上の試験例においては、プローブ及びターゲットとして、共に核酸を用いて説明したが、プローブとして核酸、ターゲットとしてポリペプチド、タンパク質などを用いた場合においても、同様の効果、すなわち非特異的な結合を抑制し、特異性が高い反応を効率良く、且つ再現性良く測定することができると推測される。
【００３８】
【発明の効果】
本発明によれば、プローブの分子内結合及び／又は分子間結合を解離させて、プローブの高次構造をほぐすことにより、プローブのハイブリダイゼーション強度を低下させることなく、非特異的なハイブリッド形成を抑制し、特異的な反応によるシグナルを感度良く検出できる。
更に、本発明のハイブリダイゼーション検出方法は、再現性に優れ、信頼性が非常に高い。
また、本発明のハイブリダイゼーション検出方法は、疾病の予知・診断、ウィルスのタイピング等を行う遺伝子診断に利用でき、非常に有用なものといえる。
【図面の簡単な説明】
【図１】（Ａ）は、分子内結合を形成しているプローブの概略図であり、（Ｂ）は、分子間結合を形成しているプローブの概略図である。
【図２】分子内結合又は分子間結合が解離されたプローブの概略図である。
【図３】試験例１〜１０、及び比較試験例における反応の特異性を示したグラフである。
【図４】試験例１１及び１２における反応の特異性を示したグラフである。
【符号の説明】
１　プローブ
【図１】
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【図２】
2004093165.tif 000004
【図３】
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【図４】
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