(57)【要約】　　　（修正有）【課題】２型糖尿病患者における動脈硬化に対する易罹患性の判定方法の提供。【解決手段】２型糖尿病患者における動脈硬化に対する易罹患性を判定する方法であって、以下の工程：　（ａ）　当該２型糖尿病患者から、ゲノムＤＮＡを含有する生体試料を採取する工程、　（ｂ）　工程（ａ）において得られた生体試料中のゲノムＤＮＡ上に存在するα２インテグリン（α２　ｉｎｔｅｇｒｉｎ）遺伝子の第７エクソンの第１２９番目の塩基に相当する位置の塩基の種類を決定する工程、及び（ｃ）　工程（ｂ）において得られた結果に基づいて、当該２型糖尿病患者の動脈硬化に対する易罹患性を判定する工程、を包含することを特徴とする当該２型糖尿病患者の動脈硬化に対する易罹患性判定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２型糖尿病患者における動脈硬化に対する易罹患性を判定する方法であって、以下の工程：
（ａ）　当該２型糖尿病患者から、ゲノムＤＮＡを含有する生体試料を採取する工程、
（ｂ）　工程（ａ）において得られた生体試料中のゲノムＤＮＡ上に存在するα２インテグリン（α２　ｉｎｔｅｇｒｉｎ）遺伝子の配列番号１で表される塩基配列からなる第７エクソンの第１２９番目の塩基に相当する位置の塩基の種類を決定する工程、及び
（ｃ）　工程（ｂ）において得られた結果に基づいて、当該２型糖尿病患者の動脈硬化に対する易罹患性を判定する工程、
を包含することを特徴とする当該２型糖尿病患者の動脈硬化に対する易罹患性判定方法。
【請求項２】
２型糖尿病患者の動脈硬化に対する易罹患性の判定を、α２インテグリン遺伝子の配列番号１で表される塩基配列からなる第７エクソンの第１２９番目の塩基の種類がＴＴ型の場合に最も動脈硬化を併発し難いとし、ＴＣ型の場合には２番目に動脈硬化を併発し難いとし、ＣＣ型の場合には前記２者と比較すれば最も動脈硬化を併発し易いとする判定基準に基づいて行なうことを特徴とする請求項１記載の２型糖尿病患者の動脈硬化に対する易罹患性判定方法。
【請求項３】
配列番号１で表される塩基配列からなる第７エクソンの第１２９番目の塩基に相当する位置の塩基の種類の決定を、第７エクソンの第１２９番目の塩基に相当する位置の一塩基多型と連鎖不平衡にある遺伝子多型を決定することにより決定することを特徴とする請求項１記載の２型糖尿病患者の動脈硬化に対する易罹患性判定方法。
【請求項４】
第７エクソンの第１２９番目の塩基に相当する位置の一塩基多型と連鎖不平衡にある遺伝子多型が、α２インテグリンの配列番号２で表される第７イントロンの第３１３２番目の塩基に相当する位置の一塩基多型であることを特徴とする請求項３記載の２型糖尿病患者の動脈硬化に対する易罹患性判定方法。
【請求項５】
配列番号３の塩基配列を含むプライマー、配列番号４の塩基配列を含むプライマー及び制限酵素ＢｇｌＩＩを主要構成要素として含有してなる、２型糖尿病患者における動脈硬化に対する易罹患性判定用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、２型糖尿病患者のα２インテグリン（α２　ｉｎｔｅｇｒｉｎ）遺伝子の多型を解析し、解析結果に基づいて、２型糖尿病患者の動脈硬化に対する易罹患性を判定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病は、インスリン作用の不足に基づく慢性の高血糖状態を主徴とする代謝疾患群である。この疾患群の共通の特徴は、インスリン効果の不足であり、それによって、糖、脂質、蛋白質を含む殆ど全ての代謝系に異常をきたす。本疾患群でインスリン効果が不足する機序としては、インスリンの絶対的ないし相対的な供給不全と、インスリンが作用する臓器におけるインスリンの感受性低下（インスリン抵抗性）とがある。インスリンの供給不全は、膵ランゲルハンス島のβ細胞の量がβ細胞の破壊などによって減少した場合や、β細胞自体に内在する機能不全によって起こる。
【０００３】
糖尿病は、成因論的に分類すると、１型、２型、その他の特定の機序・疾患による糖尿病及び妊娠糖尿病とに分けられる。この中で、最も発症頻度の高いのが２型糖尿病である。２型糖尿病は単一の原因による説明が困難な多因子疾患とされており、成因についての詳細は不明である。遺伝的素因や加齢や過食、肥満、運動不足などの環境因子が作用することによって軽度に血糖が上昇すると、遺伝的素因と密接にかかわっているインスリン分泌障害及び肝や末梢組織におけるインスリン抵抗性が顕在化して、より血糖が上昇し発症に至るものと考えられている。
【０００４】
２型糖尿病に罹患すると、冠動脈疾患（ＣＨＤ）、脳血管疾患（ＣＶＤ）及び閉塞性動脈硬化（ＡＳＯ）等のアテローム性動脈硬化を併発する患者が多い。しかし、同じ２型糖尿病患者でも、動脈硬化を併発し易い患者と、併発しにく患者とが存在する。これらの差異は、究極的には各人の遺伝的素因、特に遺伝子多型（各人のゲノムを構成する塩基配列の微小な違い）に基づいてかなりの部分を説明できるものと考えられる。遺伝子多型は、最近の急速なゲノム解析の進歩に伴って明らかとなってきたものである。遺伝子多型には、２〜数個の塩基がまとまって挿入又は欠失しているタイプや、さらに長鎖のＤＮＡ断片が挿入又は欠失しているタイプのものがあるが、最近特に注目されているものは、一つの塩基が別の塩基への置換されて起こる、いわゆる一塩基多型（ＳＮＰ）と呼ばれるタイプである。ヒトのゲノム上には、約３００万のＳＮＰが存在すると言われている。ＳＮＰの中には、既に疾患感受性との関連が指摘されたものもあり、ＳＮＰは、各人に最適の医療（テーラーメイド医療）を実現するための診断指標として重要視されてきている。２型糖尿病患者における動脈硬化の併発予防のためにも、動脈硬化の併発に関与する遺伝的素因を明らかにし、遺伝子診断を臨床検査に有効活用していくことが極めて重要である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
２型糖尿病患者のα２インテグリン遺伝子の多型を解析し、解析結果に基づいて、２型糖尿病患者の動脈硬化に対する易罹患性を判定する方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、２型糖尿病患者において、α２インテグリン遺伝子の配列番号１で表される塩基配列からなる第７エクソンの第１２９番目の塩基の多型が、その後の動脈硬化への易罹患性に影響を与えていることを明らかにし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（５）である。
（１）　２型糖尿病患者における動脈硬化に対する易罹患性を判定する方法であって、以下の工程：
（ａ）　当該２型糖尿病患者から、ゲノムＤＮＡを含有する生体試料を採取する工程、
（ｂ）　工程（ａ）において得られた生体試料中のゲノムＤＮＡ上に存在するα２インテグリン（α２　ｉｎｔｅｇｒｉｎ）遺伝子の配列番号１で表される塩基配列からなる第７エクソンの第１２９番目の塩基に相当する位置の塩基の種類を決定する工程、及び
（ｃ）　工程（ｂ）において得られた結果に基づいて、当該２型糖尿病患者の動脈硬化に対する易罹患性を判定する工程、
を包含することを特徴とする当該２型糖尿病患者の動脈硬化に対する易罹患性判定方法。
（２）　２型糖尿病患者の動脈硬化に対する易罹患性の判定を、α２インテグリン遺伝子の配列番号１で表される塩基配列からなる第７エクソンの第１２９番目の塩基の種類がＴＴ型の場合に最も動脈硬化を併発し難いとし、ＴＣ型の場合には２番目に動脈硬化を併発し難いとし、ＣＣ型の場合には前記２者と比較すれば最も動脈硬化を併発し易いとする判定基準に基づいて行なうことを特徴とする上記（１）の２型糖尿病患者の動脈硬化に対する易罹患性判定方法。
【０００７】
（３）　配列番号１で表される塩基配列からなる第７エクソンの第１２９番目の塩基に相当する位置の塩基の種類の決定を、第７エクソンの第１２９番目の塩基に相当する位置の一塩基多型と連鎖不平衡にある遺伝子多型を決定することにより決定することを特徴とする上記（１）の２型糖尿病患者の動脈硬化に対する易罹患性判定方法。
（４）　第７エクソンの第１２９番目の塩基に相当する位置の一塩基多型と連鎖不平衡にある遺伝子多型が、α２インテグリンの配列番号２で表される第７イントロンの第３１３２番目の塩基に相当する位置の一塩基多型であることを特徴とする上記（３）の２型糖尿病患者の動脈硬化に対する易罹患性判定方法。
（５）　配列番号３の塩基配列を含むプライマー、配列番号４の塩基配列を含むプライマー及び制限酵素ＢｇｌＩＩを主要構成要素として含有してなる、２型糖尿病患者における動脈硬化に対する易罹患性判定用キット。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は、２型糖尿病患者が有するα２インテグリン遺伝子の配列番号１で表される塩基配列からなる第７エクソンの第１２９番目の塩基の多型を解析し、解析結果に基づいて、当該患者の動脈硬化ヘの易罹患性を判定することを特徴とする。ここで、「α２インテグリン遺伝子」とは、細胞接着分子であるインテグリン（αとβの２つのサブユニットからなり、現在までに１１種類のαサブユニットと１７種類のβサブユニットが知られている）を構成するαサブユニットの一種のα２といわれるタイプの蛋白質をコードし、ヒト第５番染色体の長腕２３〜３１の位置（５ｑ２３−ｑ３１）にマップされ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＡＦ５１２５５６として登録されている塩基配列を含む遺伝子をいう。「動脈硬化」とは、動脈壁の限局的な肥厚・硬化を認める病変をいい、内膜中膜複合体肥厚度（ｉｎｔｉｍａｌ　ｍｅｄｉａｌ　ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ；　ＩＭＴ）及び／又は頚動脈のプラーク保有率の上昇により特徴付けられる病態をいう。「易罹患性」とは、その疾患への罹り易さをいう。
【０００９】
本発明において、２型糖尿病患者の動脈硬化ヘの易罹患性判定の基準となる多型は、α２インテグリン遺伝子の配列番号１で表される塩基配列からなる第７エクソンの第１２９番目の塩基に相当する位置の一塩基多型である。この多型は、Ｔａｋｅｄａ及びＨｅｍｌｅｒらの文献［Ｔａｋｅｄａ，　Ｙ．　ａｎｄ　Ｈｅｍｌｅｒ，　Ｍ．　Ｅ．：Ｊ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１０９：３９７（１９８９）］に記載の塩基番号に従ってナンバリングされ、「Ｃ８０７Ｔ多型」ともいわれる。この部位の塩基は、現在のところ、チミン（Ｔ）又はシトシン（Ｃ）であることが確認されている。ヒト染色体ＤＮＡは、両親から由来する各一対が存在するので、被検者のＣ８０７Ｔ多型には、両染色体のα２インテグリン遺伝子が共にチミンであるＴＴ型（Ｔのホモ接合型あるいは８０７ＴＴ型ともいう）、一方の染色体はシトシンでもう一方の染色体はチミンであるＣＴ型（ＣとＴのヘテロ接合型あるいは８０７ＣＴ型ともいう）、そして両染色体ともシトシンであるＣＣ型（Ｃのホモ接合型あるいは８０７ＣＣ型ともいう）の３つのタイプが存在する。α２インテグリン遺伝子の配列番号１で表される塩基配列からなる第７エクソンの第１２９番目の塩基がチミンである場合の全長配列を配列番号１に示した。
【００１０】
Ｃ８０７Ｔ多型の解析方法は、当該多型の判別ができる限り、特に限定されず、公知の様々な遺伝子多型解析方法を採用することができる。例えば、被検者から採取した血液細胞及び口腔内粘膜細胞等の試料から、染色体ＤＮＡを抽出し、これを鋳型として、目的の多型を含む部分を増幅できるように設計したプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物の塩基配列を解析する方法や、その他、多型に起因する制限酵素切断パターンの違いを利用したＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＰＣＲプライマーの３’末端にミスマッチがあるとプライマーとして機能しないため増幅が起きないことを利用したアレル特異的ＰＣＲ法、蛍光標識したアレル特異的オリゴとＴａｑＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ反応とを利用したＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法等によって、遺伝子多型解析を行なうことができる。
【００１１】
さらに、Ｃ８０７Ｔ多型と連鎖不平衡の関係にある多型を解析することによって、Ｃ８０７Ｔ多型を間接的に解析することができる。ここで、「連鎖不平衡」とは、メンデルの独立の法則に従わない遺伝現象、すなわち交雑において生ずる遺伝子の組合せが予想されるだけ起こらず、両親の示した遺伝子の組合せ（本発明においては、遺伝子多型の組み合わせ）がそのまま次の代に残される現象をいい、組み合わわって行動する遺伝子群（遺伝子多型群）が、互いに同一染色体上の近傍に存在するために起こる場合が多い。例えば、第７エクソン上に存在するＣ８０７Ｔ多型と配列番号２で表される第７イントロンの第３１３２番目の塩基に相当する位置の一塩基多型とは連鎖不平衡の関係にある。具体的には、配列番号２で表される第７イントロンの第３１３２番目の塩基がグアニン（Ｇ）である場合にはＣ８０７Ｔ多型はシトシン（Ｃ）であり、一方、第３１３２番目の塩基がアデニンである場合にはＣ８０７Ｔ多型はチミンである。
【００１２】
例えば、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によるＣ８０７Ｔ多型の解析は、以下のようにして行うことができる。まず、ＰＣＲ法等の核酸増幅法により、Ｃ８０７Ｔ多型と連鎖不平衡の関係にある、配列番号２で表される第７イントロンの第３１３２番目の塩基に相当する位置の塩基を含む遺伝子断片を増幅する。鋳型となる遺伝子は、ヒト染色体ＤＮＡであればどのような細胞から採取されたものでもよい。また、ＰＣＲによって増幅する場合には、センスプライマー（ｆｏｒｗａｒｄプライマーともいう）として、上記連鎖不平衡多型部位の上流側に相補的な配列を含むものを用い、アンチセンスプライマー（ｒｅｖｅｒｓｅプライマーともいう）としては、上記連鎖不平衡多型部位の下流側に相補的な配列を含むものを用いることができる。具体的には、センスプライマーとしては、５’−ｇａｔｔｔａａｃｔｔｔｃｃｃｇａｃｔｇｃｃｔｔｃ−３’（配列番号３）、アンチセンスプライマーとしては、５’−ｃａｔａｇｇｔｔｔｔｔｇｇｇｇａａｃａｇｇｔｇｇ−３’（配列番号４）等を用いることができるが、これらに限定されない。次いで、増幅されたＰＣＲ断片を制限酵素ＢｇｌＩＩで消化する。図１に示すように、８０７Ｃ型遺伝子では、第７イントロンの第３１３２番目の塩基がグアニンであるが、これがアデニンである場合（８０７Ｔ型遺伝子）には、制限酵素ＢｇｌＩＩによって認識・切断される制限酵素部位５’−ａｇａｔｃｔ−３’が出現する。よって、増幅断片を制限酵素ＢｇｌＩＩで消化した場合、図２のように、８０７Ｃ型遺伝子と８０７Ｔ遺伝子とでは異なったサイズの断片が生じる。具体的には、上記のプライマーペアを用いた場合、ＰＣＲ増幅断片のＢｇｌＩＩ消化物のゲル電気泳動後のバンドパターンは図３のようになる。すなわち、８０７ＣＣ型の場合には未消化の５８１ｂｐの一本のバンドが検出され、８０７ＴＴ型の場合には３４３ｂｐ及び２３８ｂｐの二本のバンドが検出され、８０７ＣＴ型の場合には５８１ｂｐ、３４３ｂｐ及び２３８ｂｐの三本のバンドが検出される。
【００１３】
また、アレル特異的ＰＣＲ法によるＣ８０７Ｔ多型の解析は、以下のようにして行うことができる。本方法は、より詳細にはプライマーの３’末端に一塩基のミスマッチがあるとプライマーのアニーリングが良好に起こらなくなり、結果としてＰＣＲによる増幅が生じないことを利用した方法である。この方法の成否に大きな影響を及ぼすのは、プライマーの３’末端のミスマッチである。そこで、プライマーを３’末端に変異がくるように設計することで、アレルの型により増幅の可否が決定されるため、アレル特異的ＰＣＲによれば増幅産物の有無によりアレルの型が確認できる。アレル特異的ＰＣＲにおけるこのようなプライマーの設計は、α２インテグリン遺伝子の公知の塩基配列に基づいて行うことができる。α２インテグリン遺伝子の第７エクソンの第１２９番目の塩基が、シトシン及びチミンのいずれであるのかを決定する場合のプライマーの例としては、５’−ｔｇｇｔｇｇｇｇａｃｃｔｃａｃａａａｃａｃａｔｔｔ−３’（配列番号５）及び５’−　ｔｇｇｔｇｇｇｇａｃｃｔｃａｃａａａｃａｃａｔｔｃ−３’（配列番号６）に示す塩基配列を有するものが挙げられる。配列番号５及び配列番号６に示す塩基配列を有するプライマーはその３’末端の塩基が相違している。これらのプライマーと、適宜選択した逆方向のプライマー、例えば、５’−ａｃｔｔｃａｃａｔａａａｔｔｃａｔｔｔａａａｔａｔ−３’（配列番号７）に示す塩基配列を有するプライマーとを組合わせてＰＣＲを行い、配列番号５及び配列番号７のプライマーでＰＣＲを行った場合のみ３００ｂｐの増幅産物が確認された場合は８０７ＴＴ型、配列番号６及び配列番号７のプライマーでＰＣＲを行った場合のみ３００ｂｐの増幅産物が確認された場合は８０７ＣＣ型、両方の場合で増幅産物が確認された場合は８０７ＣＴ型と判定することができる。
【００１４】
解析の結果、α２インテグリン遺伝子の配列番号１で表される塩基配列からなる第７エクソンの第１２９番目の塩基（Ｃ８０７Ｔ多型）の種類がＴＴ型の場合に最も動脈硬化を併発し難いと判定し、ＴＣ型の場合には２番目に動脈硬化を併発し難いと判定し、ＣＣ型の場合には前記２者と比較すれば最も動脈硬化を併発し易いと判定することができる。
【００１５】
上記のＣ８０７Ｔ多型をタイピングするためのプライマーを主要構成要素として含むキットは、２型糖尿病患者における動脈硬化に対する易罹患性判定用キットとして使用することができ、これも本発明の好ましい実施態様である。以下に、Ｃ８０７Ｔ多型タイピング用キットの具体的構成例を例示した。
〔Ｃ８０７Ｔ多型タイピング用キット〕
▲１▼　配列番号３の塩基配列を含むプライマー
▲２▼　配列番号４の塩基配列を含むプライマー
▲３▼　制限酵素ＢｇｌＩＩ
以上の構成要素には、さらに必要に応じて、各ヌクレオチド混液、希釈溶液等を追加補充することができる。
【００１６】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を示して具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕
本研究は、大阪市立大学病院の倫理委員会より承認を受けたものであり、協力いただいた全ての被検者から、適切なインフォームドコンセントを得た上で行った。この研究には、地域健康チェックプログラムに参加された２６５名の健常人〔男性９３名、女性１７２名；平均年齢は５４．０±１０．０歳（平均±ＳＤ）；循環器疾患歴及び糖尿病歴のいずれもない健常人〕と、大阪市立大学糖尿病センターの糖尿病教育プログラムに参加している２７２名の２型糖尿病患者の日本人〔男性１６２名、女性１１０名；；平均年齢は５５．６±１２．６歳（平均±ＳＤ）；世界健康組織基準（Ｗｏｒｌｄ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ｃｒｉｔｅｒｉａ）によって２型糖尿病と認定された患者〕にご協力いただいた。
【００１７】
Ｃ８０７Ｔ多型の決定は、配列番号２で表される第７イントロンの第３１３２番目の塩基に相当する位置に存在し、Ｃ８０７Ｔ多型と連鎖不平衡の関係にある一塩基多型を決定することにより行った。具体的には、まずゲノムＤＮＡを末梢血白血球から常法に従って抽出した。得られたゲノムＤＮＡを鋳型として、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、上記多型部位を含む領域を増幅した。増幅反応は、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２，　５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ，　２０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ８．４，　２００μｍｏｌ／Ｌの各デオキシヌクレオチド三リン酸及び０．０１ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡを含む反応液に、５０ｎｇのゲノムＤＮＡ，　２０ｐｍｏｌの各ＰＣＲプライマー：　ｆｏｒｗａｒｄプライマー５’−ｇａｔｔｔａａｃｔｔｔｃｃｃｇａｃｔｇｃｃｔｔｃ−３’（配列番号３）とｒｅｖｅｒｓｅプライマー５’−ｃａｔａｇｇｔｔｔｔｔｇｇｇｇａａｃａｇｇｔｇｇ−３’（配列番号４）及び１ｕｎｉｔのＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を加え、初めに９４℃で１０分間の変性処理の後、９４℃で１分間の変性・６５℃で１分間のアニーリング及び７２℃で２分間の伸長を１サイクルとして、合計３５サイクルを行った。次いで、多型をタイピングするために、ＰＣＲ増幅産物（５８１ｂｐ）をＢｇｌＩＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂ）を用い、３７℃で少なくとも２時間消化した。次いで、１×トリス酢酸ＥＤＴＡバッファー中、２％アゲロースゲルにより電気泳動分離した。泳動後、ゲルを臭化エチジウムで染色し、紫外光下で可視化した。
【００１８】
α２インテグリンの遺伝子型の分布は、８０７ＣＣ型、８０７ＣＴ型、８０７ＴＴ型が正常群（２６５名）でそれぞれ、８６名（３２．５％）、１２２名（４６．０％）、５７名（２１．５％）、２型糖尿病群（２７２名）ではそれぞれ９４名（３２．５％）、１３１名（４８．２％）、４７名（１７．３％）と両群間で分布に差は認めなかった（ｐ＝０．４６１）。また、全対象（５３７名）において、年齢、喫煙指数、体格指数（ｂｏｄｙ　ｍａｓｓ　ｉｎｄｅｘ；　ＢＭＩ）、血圧、空腹時血糖値、糖化ヘモグロビン値、ｎｏｎ−ＨＤＬコレステロール値、ＨＤＬコレステロール値、性別、高血圧・糖尿病・高脂血症の有無の分布は３群間で有意な差を示さなかった。
【００１９】
図４にＣ８０７Ｔ遺伝子多型と頚動脈ＩＭＴの関連を示した。健常者２６５名と２型糖尿病患者２７２名を対象に、血管超音波法を用いて右頚動脈ＩＭＴを測定した。白カラム：８０７ＣＣ、グレーカラム：８０７ＣＴ、黒カラム：８０７ＴＴ。Ｔアレル数の影響はＡＮＯＶＡにより検討し、全対象、糖尿病群において有意な影響が認められた（ｐ＜０．０５）。すなわち、全対象における右頚動脈の内膜中膜複合体肥厚度（ｉｎｔｉｍａｌ　ｍｅｄｉａｌ　ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ；　ＩＭＴ）は８０７Ｔアレルの存在数に依存して有意に低下していた（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０５）。８０７ＴＴ群のＩＭＴ値は８０７ＣＣ群に比べて有意な低値を示した（Ｓｃｈｅｆｆｅ型多群比較、ｐ＜０．０５）。糖尿病患者のみにおいても、同様の８０７Ｔアレルの作用が認められた（図４）。また、右頚動脈のプラーク保有率とＣ８０７Ｔ遺伝子多型の関連を示したのが図５である。糖尿病患者において８０７ＴＴ群は有意にプラーク保有率が低値を示した（Χ２試験）。すなわち、Ｔアレル数とプラーク保有率は有意な負の関連を示した。白カラム：８０７ＣＣ、グレーカラム：８０７ＣＴ、黒カラム：８０７ＴＴ。
【００２０】
次に、全対象においてＩＭＴと各種パラメーターの相関関係（単回帰解析）を検討した（表１）。ＩＭＴは８０７Ｔアレルとの関連に加えて、年齢、喫煙指数、収縮期血圧、空腹時血糖値、糖化ヘモグロビン値と有意な正の相関関係を示した。糖尿病患者のみを対象とした場合、８０７Ｔアレルに加えて、年齢がＩＭＴと有意な正の関連を示した。全対象において、男性（０．７６６±０．０２３，　平均±標準誤差）は女性（０．６７９±０．０２０）に比べて、糖尿病群（０．８３３±０．０２６）は非糖尿病群（０．６１３±０．０１４）に比べて、高血圧群（０．８２９±０．０３０）は非高血圧群（０．６７１±０．０１７）に比べてそれぞれＩＭＴが有意に高値を示した（ｐ＜０．０００１，　Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ）。高脂血症の有無でＩＭＴは有意な差異を示さなかった。
【表１】
2004141112.tif 000002
【００２１】
Ｃ８０７Ｔ遺伝子多型がＩＭＴと独立して関連するかどうかを検討するため重回帰分析を施行した（表２）。全対象において年齢、性別、喫煙指数、収縮期血圧、糖化ヘモグロビン、ｎｏｎ−ＨＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロール、８０７Ｔアレル数を変数とした場合（モデルＡ）、８０７Ｔアレル数は年齢、糖化ヘモグロビン、ＨＤＬコレステロールとともに独立してＩＭＴと関連していた。また、年齢、性別、喫煙指数、糖尿病有無、高血圧有無、高脂血症有無を変数とした場合においても（モデルＢ）、８０７Ｔアレル数は年齢、糖尿病の有無とともに独立してＩＭＴと関連していた。
【表２】
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【００２２】
最後に、頚動脈プラークの保有に寄与する因子を多変量ロジスティック解析により検討した（表３）。年齢、性別、喫煙指数、収縮期血圧、糖化ヘモグロビン、ｎｏｎ−ＨＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロール、８０７Ｔアレル数を変数とした場合（モデルＡ）、Ｔアレルは負に独立して頚動脈プラーク保有に関連していた（オッズ比０．４９４）。また、年齢、性別、喫煙指数、糖尿病の有無、高血圧の有無、高脂血症の有無、８０７Ｔアレル数を変数とした場合でも（モデルＢ）、Ｔアレル数は頚動脈プラークの保有と有意に独立して負の関連を示していた（オッズ比０．４８６）。これらの結果より８０７ＴＴ遺伝子型は頚動脈プラーク発症の予防的因子であることが判明した。このＴアレルのプラーク保有との関連は、糖尿病患者のみを対象とした解析においても認められた。
【表３】
2004141112.tif 000004
【００２３】
【発明の効果】
本発明により、２型糖尿病患者の動脈硬化に対する易罹患性の判定方法が提供される。本方法は、２型糖尿病患者の治療方針の策定において有用である。
【００２４】
【配列表】
2004141112.tif 000005
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【００２５】
【配列表フリーテキスト】
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号９：合成ＤＮＡ
【図面の簡単な説明】
【図１】α２インテグリン遺伝子の第７エクソンの第１２９番塩基（Ｃ８０７Ｔ多型）及び第７イントロンの第３１３２番塩基近傍の８０７Ｃ型及び８０７Ｔ型遺伝子の塩基配列を制限酵素部位とともに示した図である。
【図２】α２インテグリン遺伝子の第７エクソン上でのＣ８０７Ｔ多型位置及びそれと連鎖不平衡の関係にある第７イントロン上の第３１３２番塩基の位置、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法におけるプライマー設定位置及びＰＣＲ増幅断片を示した模式図である。
【図３】ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によりＣ８０７Ｔ多型をタイピングしたときに見られる各遺伝子型ごとのバンドパターンを模式的に示した図である。
【図４】Ｃ８０７Ｔ遺伝子多型と頚動脈ＩＭＴとの関連を示した図である。
【図５】Ｃ８０７Ｔ遺伝子多型と頚動脈プラーク保有率との関連を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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