(57)【要約】【課題】安価な構成で蛍光寿命を測定すること。【解決手段】半導体レーザー１は、観測対象である試料６に励起光であるレーザー光を照射する。デューティー比可変器１２は、コンピュータ１０からの指令により、半導体レーザー１のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比を変化させる。また、ＣＣＤ９は、試料６から放射された蛍光を一定時間蓄積して蛍光を積分する機能を持つ。半導体レーザー１のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比を変化させて、ＣＣＤ９から積分された蛍光を複数取得する。そして、半導体レーザー１１のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比に対する積分された蛍光の変化カーブに、蛍光寿命をパラメータに含むターゲット関数をフィッテングさせることにより、コンピュータ１０が蛍光寿命を算出する。【選択図】      図１
2004212203.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＯＮとＯＦＦとを繰り返して観測対象である試料に励起光を照射する光源と、
前記光源のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比を変化させるデューティー比可変手段と、
前記試料から放射された蛍光を一定時間蓄積する蛍光の積分手段と、
前記光源のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比を変化させて前記積分手段から複数の積分された前記蛍光を取得し、前記光源のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比に対する積分された前記蛍光の関係から蛍光寿命を求める演算手段と、
を備えたことを特徴とする蛍光顕微鏡。
【請求項２】
ＯＮとＯＦＦとを繰り返して観測対象である試料に励起光を照射する光源と、
前記光源からの励起光を前記試料上の１点に収束させる対物レンズと、
前記試料から放射された蛍光を光学的に共役な位置に再収束させる手段と、
前記蛍光が再収束した位置に配置されるピンホールと、
前記ピンホールを通過した蛍光を一定時間蓄積する蛍光の積分手段と、
前記試料上に収束した励起光を当該励起光の光軸に対して垂直に２次元走査する走査手段と、
前記光源のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比を変化させ、且つ前記走査手段の１回の走査が終了するまでは所定のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比を維持するデューティー比可変手段と、
前記光源のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比を変化させて前記積分手段から複数の積分された前記蛍光を取得し、前記光源のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比に対する積分された前記蛍光の関係から蛍光寿命を求める演算手段と、
を備えたことを特徴とする蛍光顕微鏡。
【請求項３】
上記光源は一定の波長を持つ半導体レーザーであることを特徴とする請求項１又は２に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項４】
上記光源は発光ダイオードであることを特徴とする請求項１又は２に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項５】
上記励起光は、上記試料に対して全反射する角度で入射することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項６】
励起光を所定の周期でＯＮ／ＯＦＦして、観測対象である試料に照射する工程と、
前記試料から放射された蛍光を一定時間積分する工程と、
前記励起光のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比を変化させて複数の積分された蛍光を取得する工程と、
前記励起光のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比に対する複数の積分された前記蛍光の関係から蛍光寿命を求める工程と、
を有することを特徴とする蛍光寿命の測定方法。
【請求項７】
励起光を所定の周期でＯＮ／ＯＦＦして、観測対象である試料に照射する手順と、
前記試料から放射された蛍光を一定時間積分する手順と、
前記励起光のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比を変化させて複数の積分された蛍光を取得する手順と、
前記励起光のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比に対する複数の積分された前記蛍光の関係から蛍光寿命を求める手順と、
をコンピュータに実行させることを特徴とする蛍光寿命の測定用プログラム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、蛍光顕微鏡に関し、さらに詳しくは、安価な構成で蛍光寿命を測定できる蛍光顕微鏡及び蛍光寿命の測定方法、並びに蛍光寿命の測定用プログラムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
蛍光物質は適切な波長の励起光で励起するとエネルギー順位が上がるが、この状態は非常に不安定なので、再びもとの安定したエネルギー状態に戻ろうとする。このとき、蛍光物質は励起光よりも２０〜５０ｎｍ程度長い波長の蛍光を放出する。このような蛍光物質によって細胞や蛋白質等の試料を染色し、この蛍光物質を励起する励起光を照射してその蛍光を観察するものが蛍光顕微鏡である。このような蛍光顕微鏡については、例えば非特許文献１に開示されているので、必要があればこれを参照されたい。
【０００３】
蛍光顕微鏡における蛍光寿命の測定は、蛍光寿命によって複数の蛍光を分けたり、蛍光寿命によって生体の機能を解析したりすることに応用されている。このような蛍光寿命を測定する方法は、自家蛍光を利用して物質分析する方法に従来から用いられている。蛍光寿命は、周波数領域で測定する方法と時間領域で測定する方法とがあり、近年の蛍光顕微鏡では主として時間領域の測定法が用いられている。次に、従来の時間領域における蛍光寿命の測定手順について説明する。
【０００４】
図９は、従来の時間領域における蛍光寿命測定機能を持った蛍光顕微鏡の構成図である。まず、従来例における蛍光顕微鏡５００の構成について説明する。超短パルスで発光するチタン・サファイアレーザー等のパルスレーザー５０１から出射されるレーザー光の光路上には、ビームエキスパンダ５０２及びダイクロイックミラー５０３が配置されている。
【０００５】
ダイクロイックミラー５０３は、蛍光を励起する波長を反射し、且つ蛍光波長は透過する。そして、ダイクロイックミラー５０３の反射光路上には、第一結像レンズ５０４及び対物レンズ５０５を介して、観察対象である試料５０６が配置される。また、試料５０６から発生する蛍光がダイクロイックミラー５０３を透過した後の光路上には、第二結像レンズ５０７とイメージインテンシファイア（Ｉｍａｇｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｒ：以下Ｉ．Ｉ．）５０８とＣＣＤカメラ５０９とが配置されている。
【０００６】
ＣＣＤカメラ５０９はコンピュータ５１０に接続されており、ＣＣＤカメラ５０９の画像出力はコンピュータ５１０に取り込まれる。また、ゲート発生器５１１はパルスレーザー５０１とＰＣ５１０とＩ．Ｉ．５０８とに接続されている。そして、ゲート発生器５１１は、パルスレーザー５０１の発振のトリガーを入力として、このトリガーにコンピュータ５１０から指令された一定時間の遅延Ｔｄが与えられた所定の時間幅Ｔｗを持つゲート信号をＩ．Ｉ．５０８に出力する。
【０００７】
次に、従来例における蛍光寿命の測定手順について説明する。パルスレーザー５０１からは、試料５０６の蛍光物質を励起して蛍光を発生させるためのレーザー光が出射する。出射したレーザー光は、ビームエキスパンダ５０２を通って、ダイクロイックミラー５０３で反射される。この反射光は、第一結象レンズ５０４を通り、対物レンズ５０５によって結像された後、試料５０６へ入射する。
【０００８】
試料５０６では、入射した励起光であるレーザー光によって蛍光物質から蛍光が発生する。この蛍光は、対物レンズ５０５、第一結像レンズ５０４を介してダイクロイックミラー５０３で蛍光である長い波長の光が第二結像レンズ５０７の方向に透過して、Ｉ．Ｉ．５０８に結像する。励起光（レーザー光）がインパルス状である場合には、励起された瞬間から試料５０６から蛍光の放射が始まり、時間の経過とともに徐々に蛍光の強度が弱くなっていく。この蛍光の時間による変化は、次に示す式（１）のようになる。
Ｆ（ｔ）＝Ｆ０×ｅｘｐ（−ｔ／τ）  ・・・（１）
ここで、Ｆ０は定数、ｔは蛍光時間であり、試料５０６が励起された瞬間の蛍光時間をｔ＝０としている。τは蛍光のｌｉｆｅｔｉｍｅ（寿命）と呼ばれる定数で、蛍光物質の種類や状態によって決まる。このτを求めることが蛍光寿命の測定である。パルスレーザー５０１にはチタン・サファイアレーザーがよく使用され、パルス幅は５０〜１００ｆｓｅｃ．程度である。一般に蛍光物質において、τは数ｎｓｅｃ．であることが多いので、励起光であるレーザー光はほとんどインパルスとみなすことができる。
【０００９】
図１０は、レーザー光の発振タイミング等を示すタイミングチャートである。同図（ａ）に示すようなタイミングでレーザー光が発振されたときには、試料５０６からの蛍光は同図（ｃ）のように変化する。ここで、図１０（ａ）に示すように、パルスレーザー５０１によって、一定の周期で且つ極めて短い時間だけレーザー光が発振したとする。ゲート発生器５１１には、パルスレーザー５０１のトリガー（図１０（ｂ））が入力される。そして、ゲート発生器５１１は、コンピュータ５１０から指令された前記トリガーがＯＮとなるタイミングから一定の遅延Ｔｄをもち、且つ所定の時間幅Ｔｗのゲート信号（図１０（ｄ））をＩ．Ｉ．５０８に出力する。
【００１０】
Ｉ．Ｉ．５０８では、ゲート発生器５１１のゲートがＯＮのときだけ、Ｉ．Ｉ．５０８に結像された蛍光を増幅してＣＣＤ５０９に出力する。ＣＣＤ５０９は、出力された蛍光の像を撮像し、この像を電気信号としてコンピュータ５１０へ出力する。そして、コンピュータ５１０は、前記一定の遅延Ｔｄを次々に変化させて、上記動作を繰り返す。
【００１１】
例えば、Ｔｄ及びＴｗをともに１ｎｓｅｃ．として蛍光像をコンピュータ５１０へ取り込み、次いでＴｄを３ｎｓｅｃ．、５ｎｓｅｃ．と順次変化させて蛍光画像をコンピュータ５１０へ取り込む。このようにして得られた３個の画像のうち、それぞれの１画素に注目して測定した蛍光強度の変化を時間に対してプロットすると、図１１に示すようになる。そして、測定点に対して式（１）をフィッテング計算することにより、寿命τを求めることができる。ここで、図１１は、時間に対する蛍光強度の変化を示す説明図である。
【００１２】
ＣＣＤ５０９からコンピュータ５１０へ取り込んだ各画素に対してτを求めれば、２次元の蛍光画像における蛍光寿命を測定することができる。なお、実際にはレーザーの励起パルスの時間幅は０ではないし、受光するＩ．Ｉ．５０８のゲートも立ち上がり及び立下りに時間を要する特性である。したがって、これらの特性を考慮して解析する技術が、特許文献１に開示されている。また、特許文献２にも、蛍光寿命を測定する方法が開示されている。
【特許文献１】
米国特許第４８５５９３０号明細書
【特許文献２】
特開２００２−３９９４３号公報
【非特許文献１】
稲澤譲治、津田均、小島清嗣著「顕微鏡フル活用術イラストレイテッド」秀潤社出版、２０００年７月１５日
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、時間領域において蛍光寿命を測定する場合には、式（１）で表される蛍光の光量変化カーブを用いて解析するので、励起光であるパルスレーザーは、５０〜１００ｆｓｅｃ．程度という非常に小さいパルス幅であることが要求される。このようなパルス幅でレーザー光を出射できるチタン・サファイアレーザーは、２０００万円程度と非常に高価である。さらに、ゲートを高速で切り替えることのできるＩ．Ｉ．５０８が必要になるが、このようなＩ．Ｉ．も５００万円程度であり、相当の金額を要する。このため、従来の方法によって蛍光寿命を測定しようとすると、２５００〜３０００万円の機材が必要となってしまう。
【００１４】
そこで、この発明は、上記に鑑みてなされたものであって、安価に蛍光寿命を測定できる蛍光顕微鏡及び蛍光寿命の測定方法、並びに蛍光寿命の測定用プログラムを提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
上述の目的を達成するために、この発明に係る蛍光顕微鏡は、ＯＮとＯＦＦとを繰り返して観測対象である試料に励起光を照射する光源と、前記光源のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比を変化させるデューティー比可変手段と、前記試料から放射された蛍光を一定時間蓄積する蛍光の積分手段と、前記光源のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比を変化させて前記積分手段から複数の積分された前記蛍光を取得し、前記光源のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比に対する積分された前記蛍光の関係から蛍光寿命を求める演算手段と、を備えたことを特徴とする。
【００１６】
この蛍光顕微鏡は、励起光の光源のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比を変化させるデューティー比可変手段を有し、前記光源のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比を変化させて、それぞれの比に対応する複数の一定時間積分された蛍光を取得する。そして、演算手段によって、前記光源のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比に対する積分された蛍光の関係に、蛍光寿命をパラメータとして含むターゲット関数をフィッテングさせることにより蛍光寿命を求める。このように、蛍光の積分値を用いて、ターゲット関数を前記光源のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比と蛍光の積分値との関係にフィッテングさせて蛍光寿命を求めるので、従来のように、極めて高速に励起光の光源をＯＮ／ＯＦＦさせる必要はない。本発明においては、励起光の光源は１００ＭＨｚ程度でＯＮ／ＯＦＦさせればよく、Ｉ．Ｉ．のゲートをＯＮ／ＯＦＦすることも不用である。これにより、励起光の光源に高価なチタン・サファイアパルスレーザーや高速ゲートのＩ．Ｉ．を使用する必要がないので、従来と比較して極めて安価に蛍光顕微鏡を構成することができる。
【００１７】
また、次の発明に係る蛍光顕微鏡は、ＯＮとＯＦＦとを繰り返して観測対象である試料に励起光を照射する光源と、前記光源からの励起光を前記試料上の１点に収束させる対物レンズと、前記試料から放射された蛍光を光学的に共役な位置に再収束させる手段と、前記蛍光が再収束した位置に配置されるピンホールと、前記ピンホールを通過した蛍光を一定時間蓄積する蛍光の積分手段と、前記試料上に収束した励起光を当該励起光の光軸に対して垂直に２次元走査する走査手段と、前記光源のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比を変化させ、且つ前記走査手段の１回の走査が終了するまでは所定のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比を維持するデューティー比可変手段と、前記光源のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比を変化させて前記積分手段から複数の積分された前記蛍光を取得し、前記光源のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比に対する積分された前記蛍光の関係から蛍光寿命を求める演算手段と、を備えたことを特徴とする。
【００１８】
この蛍光顕微鏡は、いわゆる共焦点形の蛍光顕微鏡である。このように、蛍光の積分値を用いて、ターゲット関数を前記光源のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比に対する蛍光の積分値の関係にフィッテングさせて蛍光寿命を求めるので、従来のように、極めて高速に光源をＯＮ／ＯＦＦさせる必要はない。その結果、励起光の光源に高価なチタン・サファイアパルスレーザーや高速ゲートのＰＭＴ（Ｐｈｏｔｏ  Ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  Ｔｕｂｅ：ホトマルチプライヤーチューブ）を使用する必要がないので、従来と比較して極めて安価に共焦点形の蛍光顕微鏡を構成することができる。
【００１９】
また、次の発明に係る蛍光顕微鏡は、上記蛍光顕微鏡において、上記光源は一定の波長を持つ半導体レーザーであることを特徴とする。半導体レーザーはチタン・サファイアパルスレーザーと比較して極めて安価であるので、励起光の光源に要するコストを低減できる。その結果、従来と比較して極めて安価に蛍光顕微鏡を構成することができる。また、次の発明に係る蛍光顕微鏡のように、上記蛍光顕微鏡において、上記光源に発光ダイオードを使用すれば、さらに安価に蛍光顕微鏡を構成することができる。また、半導体レーザーや発光ダイオードは波長の種類が比較的豊富なので、蛍光物質との組み合わせの自由度を高くして、観測の幅を広げることができる。
【００２０】
また、次の発明に係る蛍光顕微鏡は、上記蛍光顕微鏡において、上記励起光は、上記試料に対して全反射する角度で入射することを特徴とする。このように、試料上で励起光を全反射させれば、試料中の蛍光物質が発する蛍光のみを観測できるので、蛍光寿命の測定精度を高くできる。
【００２１】
また、次の発明に係る蛍光寿命の測定方法は、励起光を所定の周期でＯＮ／ＯＦＦして、観測対象である試料に照射する工程と、前記試料から放射された蛍光を一定時間積分する工程と、前記励起光のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比に対する複数の積分された前記蛍光の関係から蛍光寿命を求める工程と、複数の積分された前記蛍光と前記励起光のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比との関係から蛍光寿命を求める工程と、を有することを特徴とする。
【００２２】
また、次の発明に係る蛍光寿命の測定用プログラムは、励起光を所定の周期でＯＮ／ＯＦＦして、観測対象である試料に照射する手順と、前記試料から放射された蛍光を一定時間積分する手順と、前記励起光のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比を変化させて複数の積分された蛍光を取得する手順と、前記励起光のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比に対する複数の積分された前記蛍光の関係から蛍光寿命を求める手順と、をコンピュータに実行させることを特徴とする。
【００２３】
この蛍光寿命の測定方法又は蛍光寿命の測定用プログラムは、励起光のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比を変化させて、それぞれの比に対応する複数の一定時間積分された蛍光を取得する。そして、励起光のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比と、積分された蛍光との関係に、蛍光寿命を含むターゲット関数をフィッテングさせることにより蛍光寿命を求める。このように、蛍光の積分値を用いて、ターゲット関数を前記光源のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比と蛍光の積分値との関係にフィッテングさせるので、従来のように、極めて高い周期で励起光を試料に照射する必要はない。その結果、励起光の光源は従来よりも低速でＯＮ／ＯＦＦできるものが使用できる。これにより、励起光の光源に高価なチタン・サファイアパルスレーザーを使用する必要がないので、従来と比較して極めて安価な構成で蛍光寿命を測定することができる。また、本発明に係る蛍光寿命の測定用プログラムによれば、本発明に係る蛍光寿命の測定方法がコンピュータ上で実現できる。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以下、この発明につき図面を参照しつつ詳細に説明する。なお、以下の実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。また、下記実施の形態における構成要素には、当業者が容易に想定できるもの或いは実質的に同一のものが含まれる。
【００２５】
（実施の形態１）
図１は、この発明の実施の形態１に係る蛍光顕微鏡の構成を示す説明図である。この蛍光顕微鏡１００は、光源のデューティー比（ＯＮ時間とＯＦＦ時間との比）を変化させて複数の蛍光強度データを取得し、デューティー比に対する積分された蛍光の関係にターゲット関数をフィッテングさせて蛍光寿命を求める点に特徴がある。
【００２６】
試料６中の蛍光物質を励起して蛍光を発生させるための励起光を発生する光源として、半導体レーザー１を用いる。半導体レーザー１は、発振器１１からの信号に基づいて、所定の周期（例えば数１０〜数１００ＭＨｚ）でＯＮ／ＯＦＦされる。励起光の波長は、例えば４０５、４５０、４８８、５５０ｎｍ程度のものが使用される。
【００２７】
半導体レーザー１から出射されるレーザー光の光路上には、ビームエキスパンダ２及びダイクロイックミラー３が配置されている。ダイクロイックミラー３は、試料６中の蛍光物質を励起するレーザーの波長を反射し、且つ励起された蛍光物質から発生する蛍光の波長は透過するようになっている。
【００２８】
また、前記ダイクロイックミラー３の反射光路上には、第一結像レンズ４と対物レンズ５とが配置され、これらを介して観察対象である試料６が配置されている。試料６からの蛍光がダイクロイックミラー３を透過した後の透過光路上には、第二結像レンズ７とＩ．Ｉ．８とＣＣＤ９とが配置されている。そして、第二結像レンズ７を通過した蛍光は、Ｉ．Ｉ．８に結像しＣＣＤ９で撮像される。ＣＣＤ９の画像出力は、これに接続されたコンピュータ１０に取り込まれる。
【００２９】
本発明の実施の形態１に係る蛍光顕微鏡１００は、励起光の光源に安価な半導体レーザー１を用いる。また、光増幅機能を持つＩ．Ｉ．８は高速ゲートを持つ必要はない。このため、５０〜１００ｆｓｅｃ．という高速でＯＮ／ＯＦＦできる高価なパルスレーザーや、高速ゲートを持つＩ．Ｉ．を必要とした従来の蛍光顕微鏡と比較して、およそ１／１０程度のコストで蛍光顕微鏡１００を構成することができる。また、５０〜１００ｆｓｅｃ．という高速でレーザーをＯＮ／ＯＦＦする必要はなく、また、高速でＩ．Ｉ．のゲートをＯＮする必要もないので、比較的簡易な技術で蛍光顕微鏡１００を構成することができる。
【００３０】
半導体レーザー１には、デューティー比可変手段であるデューティー比可変器１２を介して発振器１１が接続されており、この発振器１１は一定の周期のＯＮ／ＯＦＦ信号を発信する。また、デューティー比可変器１２は、前記ＯＮ／ＯＦＦ信号のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比を変化させて半導体レーザー１へ入力する。ここで、デューティー比とは、発振器１１から発信される一定の周期のＯＮ／ＯＦＦ信号におけるＯＮ時間とＯＦＦ時間との比をいい、Ｔ／Ｐで表される。Ｔは半導体レーザー１のＯＮ時間であり、Ｐは半導体レーザー１のＯＮ／ＯＦＦの一周期に要する時間である（図２参照）。なお、発振器１１のＯＦＦ時間をＴＯＦＦとすれば、ＴＯＦＦ＝Ｐ−Ｔである。デューティー比可変器１２は演算手段であるコンピュータ１０に接続されており、コンピュータ１０からの指令によって、デューティー比可変器１２が発するデューティー比Ｔ／Ｐ比が変化する。
【００３１】
ここで、コンピュータ１０には、周辺機器として入力装置、表示装置などを接続し（いずれも図示省略）、これらの制御プログラムをメモリにロードして実行することにより前記周辺機器の機能を実現させてもよい。また、このコンピュータ１０には、周辺機器として入力装置、表示装置など（いずれも図示省略）が接続されるものとする。ここで、入力装置とはキーボード、マウス等の入力デバイスのことをいう。表示装置とはＣＲＴ（Ｃａｔｈｏｄｅ  Ｒａｙ  Ｔｕｂｅ）や液晶表示装置などのことをいう。
【００３２】
また、図１（ｂ）に示すように、コンピュータ１０の代わりに、処理部２１と記憶部２２とを含む専用のハードウェアとして演算手段である演算処理装置２０を構成して、上記手順を実行させてもよい。記憶部２２は、ハードディスク装置や光磁気ディスク装置、フラッシュメモリ等の不揮発性のメモリや、ＣＤ−ＲＯＭ等のような読み出しのみが可能な記憶媒体、あるいはＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｍｅｍｏｒｙ）のような揮発性のメモリ、あるいはこれらの組み合わせにより構成することができる。また、この処理部２１はメモリ及びＣＰＵ（中央演算装置）により構成され、処理部２１の機能を実現するためのプログラム（図示省略）をメモリにロードして実行することによりその機能を実現させるものであってもよい。
【００３３】
半導体レーザー１から出射されたレーザー光は、ビームエキスパンダ２を通ってダイクロイックミラー３で反射される。ここで反射したレーザー光は第一結像レンズ４を通った後、対物レンズ５によって結像されて試料６へ入射する。試料６においては、この入射した励起光であるレーザー光によって試料６内の蛍光物質が励起され、この蛍光物質から蛍光が発生する。この蛍光は、対物レンズ５及び第一結像レンズ４を介してダイクロイックミラー３へ導かれる。ダイクロイックミラー３では、励起光よりも長い波長の蛍光が第二結像レンズ７の方向に透過してＩ．Ｉ．８に結像する。
【００３４】
このような蛍光顕微鏡１００の構成により、蛍光寿命を測定する手順について説明する。図２は、この発明の実施の形態１に係る蛍光顕微鏡の励起光の出射タイミング等を示すタイミングチャートである。また、図３は、この発明の実施の形態１に係る蛍光の測定方法を示すフローチャートである。図２（ａ）に示すように、発振器１１は、一定周期でデューティー比Ｔ／Ｐが５０％のＯＮ／ＯＦＦ信号を半導体レーザー１へ繰返し出力する。ここで、デューティー比可変器１２は、このデューティー比Ｔ／Ｐをコンピュータ１０からの指令によって変化させる。
【００３５】
本発明に係る蛍光寿命の測定手順においては、複数の異なるデューティー比Ｔ／Ｐで蛍光強度を測定する。次に、ターゲット関数に含まれる蛍光寿命τを変化させることにより、デューティー比Ｔ／Ｐに対する所定の時間積分された蛍光の変化カーブに対してターゲット関数をフィッテングさせる。そして、両者の誤差が最小になったときのτを、求める蛍光寿命とする。このため、まず、所定のデューティー比Ｔ／Ｐで蛍光強度を求める。なお、ターゲット関数については後述する。
【００３６】
コンピュータ１０から、所定のデューティー比Ｔ／Ｐ（例えば１０％）とする指令をデューティー比可変器１２に与え、デューティー比Ｔ／Ｐを設定する（ステップＳ１０１）。すると、図２（ｂ）に示すように、デューティー比可変器１２の出力は、ＯＮ時間とＯＦＦ時間との比が１：９になる。半導体レーザー１は、デューティー比可変器１２の出力信号に従って、ＯＮの時間とＯＦＦの時間とが１：９の比率でレーザー光を出射する。Ｉ．Ｉ．８は、このときに試料６から発する蛍光を増幅してからＣＣＤ９へ出力する。
【００３７】
一般に、測定する蛍光寿命は数ｎｓｅｃ．程度であることが多い。この場合には、発振器１１の周波数を１００ＭＨｚ程度にする。なお、発振器１１の周波数は蛍光寿命の長さに応じて、数１０〜数１００ＭＨｚの範囲で適宜選択できる。ここで、例えば、蛍光寿命が１ｎｓｅｃ．程度の場合を考える。この場合、励起光である半導体レーザー光がデューティー比Ｔ／Ｐ＝１０％でＯＮ／ＯＦＦしているとすると、図２（ｃ）に示すように試料６の蛍光物質から発生する蛍光は変化する。
【００３８】
Ｉ．Ｉ．８は周波数特性が良好であるので、このように変化する信号をそのまま増幅してＣＣＤ９へ取り込むことができる。一方、ＣＣＤ９の周波数特性はＩ．Ｉ．８よりも劣るので、ＣＣＤ９はローパスフィルタとして作用する。すなわち、ＣＣＤ９は蛍光の積分手段として機能する。その結果、蛍光の強度変化（図２（ｃ）参照）に対するＣＣＤ９の出力（蛍光の強度変化の積分値）は、図２（ｄ）のようになる。これが所定のデューティー比における積分された蛍光となる（ステップＳ１０２）。コンピュータ１０は、このＣＣＤ９からの出力を取り込み、所定のデューティー比Ｔ／Ｐに対する蛍光強度のデータを取得する。
【００３９】
本発明に係る蛍光寿命の測定方法においては、複数の異なるデューティー比Ｔ／Ｐに対して蛍光強度を取得する必要がある。したがって、所定のデューティー比Ｔ／Ｐに対する蛍光強度のデータ数が揃っていない場合には、ステップＳ１０４へ移行する（ステップＳ１０３：Ｎｏ）。ステップＳ１０４では、先のデューティー比Ｔ／Ｐと異なるデューティー比Ｔ／Ｐを新たに設定して（ステップＳ１０４）、積分された蛍光を測定する（ステップＳ１０２）。
【００４０】
例えば、デューティー比Ｔ／Ｐを５０％（ＯＮ：ＯＦＦ＝１：１）とする指令をコンピュータ１０からデューティー比可変器１２へ送る。このとき、半導体レーザー１からの出力は図２（ｅ）のようになり、また、試料６から発する蛍光の強度は図２（ｆ）のように変化する。この蛍光は、Ｉ．Ｉ．８で増幅され、さらにＣＣＤ９で積分されて、図２（ｇ）に示すような信号となって、コンピュータ１０へ取り込まれる。
【００４１】
このように、１０％〜１００％の範囲で何点かデューティー比Ｔ／Ｐを変化させ、上述したステップＳ１０１〜Ｓ１０４を繰り返し実行することにより、所定数のデューティー比Ｔ／Ｐに対する積分された蛍光のデータを取得したら、次のステップへ移行する（ステップＳ１０３：Ｙｅｓ）。
【００４２】
上述した通り、Ｆ０を定数、ｔを蛍光時間（試料６が励起された瞬間の蛍光時間をｔ＝０とする）、蛍光の寿命をτとすれば、インパルス状の励起光における蛍光時間に対する蛍光の強度Ｆ（ｔ）は、Ｆ（ｔ）＝Ｆ０×ｅｘｐ（−ｔ／τ）で表される。ここで、励起光であるレーザー光は一定時間照射されている。したがって、励起光がＯＮとなっている時間をＴとすると、蛍光の時間変化は式（２）で表される。
【数１】
2004212203.tif 000003
【００４３】
これをＯＮ／ＯＦＦの１発振周期Ｐの区間で積分すると、
【数２】
2004212203.tif 000004
となる。
【００４４】
ここで、発振器１１の発振周期Ｐ＝１、蛍光の明るさＦ０＝１と規格化する。図４は、デューティー比Ｔ／Ｐに対する積分された蛍光の変化を示す説明図である。このとき、式（３）から、蛍光寿命τ＝０．１としたときのデューティー比Ｔ／Ｐに対する積分された蛍光Ｆの変化は、図４（ａ）に示すようになる。また、蛍光寿命τ＝０．５としたときの積分された蛍光Ｆの変化は、図４（ｂ）のようになる。なお、Ｐ＝１０ｎｓｅｃ．のときとすれば、図４（ａ）はτ＝１ｎｓｅｃ．、図４（ｂ）はτ＝５ｎｓｅｃ．に相当する。
【００４５】
上記ステップＳ１０１〜Ｓ１０４によって得られたデューティー比Ｔ／Ｐに対する積分された蛍光Ｆの変化カーブに、式（３）をターゲット関数としてフィッテングさせる（ステップＳ１０５）。すなわち、ターゲット関数である式（３）においてＰとＴとは既知であるので、τをある値に定めることによりデューティー比Ｔ／Ｐに対する積分された蛍光Ｆの変化カーブを得ることができる。そして、このターゲット関数の変化カーブと前記積分された蛍光Ｆの変化カーブとの誤差が最小になるまで、ターゲット関数に含まれるτを変化させる（ステップＳ１０６：Ｎｏ）。そして、両者の誤差が最小となったときのτが、求める蛍光寿命τとなる（ステップＳ１０６：Ｙｅｓ、ステップＳ１０７）。なお、フィッテングは演算手段であるコンピュータ１０が実行する。
【００４６】
このように、周期的に励起光をＯＮ／ＯＦＦして、さらに試料６から放射される蛍光の光量変化を積分した画像を得る。これをＯＮ／ＯＦＦのデューティー比Ｔ／Ｐを変化させて繰り返し、得られた蛍光の積分値のデューティー比Ｔ／Ｐに対する変化カーブから蛍光寿命を求めることができる。
【００４７】
なお、半導体レーザー１の代わりに光源として発光ダイオード（以下ＬＥＤ）を使用してもよい。ＬＥＤも半導体レーザー１と同様に数１００ＭＨｚの周波数特性を持っているので、本発明に係る蛍光顕微鏡１００及び蛍光寿命の測定方法に対して十分適用できる。また、ＬＥＤは波長の種類が比較的多いので、蛍光試料との組み合わせの自由度を高くして、観測の幅を広げることができる。なお、本発明は、ピンホールやスリットを持つディスクを組み合わせて、ディスク走査型の共焦点顕微鏡に適用することもできる。
【００４８】
なお、実施の形態１に係る本発明の蛍光寿命の測定方法は、予め用意されたプログラムをパーソナル・コンピュータやワークステーションなどのコンピュータで実行することによって上記測定手順を実現することができる。このプログラムは、インターネットなどのネットワークを介して配布することができる。また、このプログラムは、ハードディスク、フレキシブルディスク（ＦＤ）、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＤＶＤなどのコンピュータで読み取り可能な記録媒体に記録され、コンピュータによって記録媒体から読み出されることによって実行することもできる。また、上記プログラムは、上記測定手順をコンピュータ１０にすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるものであってもよい。
【００４９】
（変形例１）
図５は、実施の形態１の第１変形例に係る蛍光顕微鏡を示す説明図である。この蛍光顕微鏡１０１は、実施の形態１に係る蛍光顕微鏡１００と略同様の攻勢であるが、励起光であるレーザー光を、試料６の観測領域に対して全反射する角度で入射させてエバネッセント照明を行い、試料６の蛍光物質が発する蛍光のみを観測する点が異なる。次の説明においては、実施の形態１に係る蛍光顕微鏡１００と同一の構成には同一の符号を付すとともに、その説明を省略する。また、蛍光の測定方法は実施の形態１で説明した通りなので、その説明を省略する。
【００５０】
半導体レーザー１から出射された励起光であるレーザー光は、ビームエキスパンダ２を構成するレンズの周辺部に向かって出射される。ビームエキスパンダ２を通ったレーザー光はダイクロイックミラー３で反射される。ここで反射したレーザー光は第一結像レンズ４を通った後、全反射対物レンズ５ａの周辺部へ入射する。
【００５１】
全反射対物レンズ５ａの周辺部から出射したレーザー光は、試料６の観測領域に対して全反射する角度で入射する。試料６においては、この入射したレーザー光（励起光）によってエバネッセント光が発生して試料６内の蛍光物質が励起され、この蛍光物質から蛍光が発生する。ここで、全反射対物レンズ５ａの周辺部から出射する光は全反射して、全反射対物レンズ５ａの光軸に対して対称な位置に入射し、第１結像レンズ４を通ってビームストッパ５１により止められる。これにより、試料６中の蛍光物質から発生した蛍光だけが全反射対物レンズ５ａと第１結像レンズ４とを通って、ダイクロイックミラー３へ入射する。
【００５２】
ダイクロイックミラー３では、蛍光である長い波長が第二結像レンズ７の方向に透過してＩ．Ｉ．８に結像する。この蛍光顕微鏡１０１では、励起光であるレーザー光の影響を最小限にして、蛍光のみをＩ．Ｉ．８に結像させることができるので、より高い精度で蛍光寿命を求めることができる。
【００５３】
（変形例２）
図６は、実施の形態１の第２変形例に係る蛍光顕微鏡を示す説明図である。この蛍光顕微鏡１０２は、実施の形態１に係る蛍光顕微鏡１００と略同様の構成であるが、波長の異なる複数の光源を用意して、それぞれの光源に対応する複数の蛍光物質が発する複数の蛍光寿命を求めることを、１個のダイクロイックミラーで可能とした点に特徴がある。なお、簡略化のため、図６においては、結像レンズ、対物レンズその他のレンズ類は省略してある。また、蛍光の測定方法は実施の形態１で説明した通りなので、その説明を省略する。
【００５４】
半導体レーザー１１、１２、１３は、それぞれ波長の異なる励起光を出射する。ここで、励起光は３種類に限られるものではなく、観測対象の個数や蛍光物質の種類に応じて、励起光の波長及び個数を適宜選択できる。それぞれの半導体レーザー１１、１２、１３には、デューティー比可変器１２が接続されている。そして、デューティー比可変器１２は、コンピュータ１０からの指令によって、発振器１１が発するＯＮ／ＯＦＦ信号のデューティー比を変化させて、それぞれの半導体レーザー１１、１２、１３へ入力する。
【００５５】
半導体レーザー１１、１２、１３から出射したレーザー光は、それぞれ励起光用ダイクロイックミラー３１、３２、３３へ導かれる。前記３色のレーザー光は、励起光用ダイクロイックミラー３１、３２、３３を通過する過程で合成され、白色のレーザー光となって反射ミラー１９へ入射する。反射ミラー１９へ入射した励起光であるレーザー光は、第一結像レンズ４を通った後、全反射対物レンズ５ａの周辺部へ入射する。そして、全反射対物レンズ５ａから出射したレーザー光は、透明のテンプレート６ｐ上に載せられた試料６の観測領域に対して全反射する角度で入射する。試料６においては、この入射したレーザー光（励起光）によってエバネッセント光が発生して試料６内の蛍光物質が励起され、この蛍光物質から蛍光が発生する。蛍光物質を励起した後のレーザー光は試料６の表面で全反射するので、蛍光物質から発生した蛍光だけが蛍光用ダイクロイックミラー３３１へ導かれる。
【００５６】
蛍光用ダイクロイックミラー３３では半導体レーザー１１、１２、１３からのレーザー光によって励起された蛍光が反射して、Ｉ．Ｉ．８へ導かれる。Ｉ．Ｉ．８等で増幅された蛍光は、ＣＣＤ９で積分された後、コンピュータ１０へ取り込まれ、実施の形態１で説明した手順で、各蛍光の寿命が求められる。
【００５７】
このような構成により、この蛍光顕微鏡１０２では、複数の異なる複数の光源を用意して、それぞれの光源に対応する複数の蛍光物質が発する蛍光寿命を求めることで、蛍光寿命長さにより複数の蛍光を分離することができる。これにより、受光部に必要だった複数のダイクロイックミラーとＩ．Ｉ．とＣＣＤとを、それぞれ単独で測定できるようになる。また、蛋白質が結合した場合におけるエネルギー移動の観測に対しても応用できる。
【００５８】
（実施の形態２）
図７は、この発明の実施の形態２に係る蛍光顕微鏡を示す構成図である。また、図８は、この発明の実施の形態２に係る蛍光の測定方法を示すフローチャートである。この蛍光顕微鏡１０３は、本発明を共焦点形の蛍光顕微鏡に適用したものである。次の説明においては、実施の形態１と同一の構成要素には同一の符号を付する。
【００５９】
半導体レーザー１から出射されるレーザー光の光路上には、ダイクロイックミラー３が配置されている。このダイクロイックミラー３の反射光路上にはＸ及びＹ方向に走査可能な２個のガルバノミラー１５ｘ、１５ｙ、瞳リレーレンズ１６ａ、１６ｂ及び対物レンズ５が配置されている。そして、対物レンズ５の先には試料６が配置される。また、試料６の蛍光物質から発生した蛍光がダイクロイックミラー３を透過した後における透過光路上には、レンズ１７、ピンホール１８及びＰＭＴ１３が配置されている。ＰＭＴ１３は、積分回路１４を介してコンピュータ１０に接続されている。また、半導体レーザー１にはデューティー比可変回路１２ｓを介して発振器１１が接続されており、発振器１１はＯＮ／ＯＦＦ信号を半導体レーザー１へ入力する。
【００６０】
このような蛍光顕微鏡１０３の構成により、蛍光寿命を測定する手順について説明する。半導体レーザー１から出射されたレーザー光は、ダイクロイックミラー３で反射される。この反射光は、２個のガルバノミラー１５ｘ、１５ｙによってさらに反射された後、瞳リレーレンズ１６ａ、１６ｂを通って対物レンズ５に入射する。ここで、瞳リレーレンズ１６ａ、１６ｂは、ガルバノミラー１５ｘ、１５ｙの位置が、対物レンズ５の瞳面と共役にするような光学配置である。そして、ガルバノミラー１５ｘ、１５ｙの角度を変化させることにより、対物レンズ５の瞳面へ入射するレーザー光の入射角度が変化する。このようにすれば、焦点面でのレーザースポットは、光軸に対して垂直な平面内で２次元に走査することができる。
【００６１】
対物レンズ５に入射したレーザー光は、対物レンズ５の焦点近傍に配置された試料６へ入射する。試料６へ入射したレーザー光（励起光）により試料６内の蛍光物質が蛍光を発生する。この蛍光は、対物レンズ５、瞳リレーレンズ１６ａ、１６ｂ及びガルバノミラー１５ｘ、１５ｙを介してダイクロイックミラー３へ入射する。この蛍光は、励起光であるレーザー光よりも波長が長いので、ダイクロイックミラー３へ入射した後、レンズ１７の方向に透過して、レンズ１７でピンホール１８へ収束される。
【００６２】
ピンホール１８は、対物レンズ５の焦点と光学的に共役の位置に配置されているので、試料６からの蛍光のうち合焦の成分（焦点の合っている成分）はピンホール１８を通過できる。しかし、非合焦の成分はピンホール１８の面で広がってしまうので、ほとんどピンホール１８を通過できない。ピンホール１８を通過した焦点の合っている蛍光の成分は、ＰＭＴ１３で光電変換された後、電気信号として積分回路１４へ入力される。
【００６３】
上述した手順で得られるのは、試料６上の１点の情報である。ここで、ガルバノミラー１５ｘ、１５ｙは、互いに垂直な方向に動作し、一方がＸ軸を高速に、もう一方がＹ軸を低速に走査できるようになっている。例えば、１０００×１０００点の画素を得るときには、Ｘ軸のガルバノミラー１５ｘを１ｋＨｚで振動させ、Ｙ軸のガルバノミラー１５ｙは１秒間でＹ軸を走査させる。このとき、Ｘ軸は１秒間に１０００回往復走査されるので、画像の１ライン分の走査時間は約０．５ｍｓｅｃ．となる。また、１０００×１０００点の画素を得るので、１画素の情報取得に要する時間は約０．５μｓｅｃ．となる。
【００６４】
発振器１１は、デューティー比Ｔ／Ｐが５０％のＯＮ／ＯＦＦ信号を１００ＭＨｚでデューティー比可変回路１２ｓに出力する。コンピュータ１０は、所定のデューティー比Ｔ／Ｐを設定して（ステップＳ２０１）、この指令信号をデューティー比可変回路１２ｓへ入力する。すると、デューティー比可変回路１２ｓは、デューティー比Ｔ／Ｐを例えば１０％、すなわちＯＮ時間とＯＦＦ時間との比を１：９として、半導体レーザー１に出力する。
【００６５】
このとき半導体レーザー１の出力は、実施の形態１と同様にＯＮ／ＯＦＦされる（図２（ｂ）参照）。試料６からの蛍光の寿命が１ｎｓｅｃ．のときを考えると、図２（ｃ）に示すような信号がＰＭＴ１３で受信され、積分回路１４で積分されるので、積分回路１４の出力は実施の形態１と同様になる（図２（ｄ）参照）。この積分回路１４からの出力は、Ａ／Ｄ変換されてからコンピュータ１０へ取り込まれ、上記デューティー比Ｔ／Ｐにおける積分された蛍光が測定される（ステップＳ２０２）。ステップＳ２０１とＳ２０２との動作を、ガルバノミラー１５ｘ、１５ｙが試料６上を走査している間繰り返し（ステップＳ２０３：Ｎｏ）、例えば１０００×１０００の画素から構成される１枚の画像を得る。ガルバノミラー１５ｘ、１５ｙの走査が終了したら次のステップに移行する（ステップＳ２０３：Ｙｅｓ）。
【００６６】
次のステップでは、所定数のデューティー比Ｔ／Ｐに対する積分された蛍光のデータを取得したか否かを判定し（ステップＳ２０４）、所定数に満たない場合にはステップＳ２０５に移行する（ステップＳ２０４：Ｎｏ）。ステップＳ２０５では、コンピュータ１０からデューティー比可変回路１２ｓへ指令を送り、異なるデューティー比Ｔ／Ｐを設定する。例えばデューティー比Ｔ／Ｐを５０％、すなわち、ＯＮ時間とＯＦＦ時間との比を１：１とする。
【００６７】
このとき、半導体レーザー１の出力は実施の形態１と同様になり（図２（ｅ）参照）、また試料６からの蛍光は図２（ｆ）、積分回路１４の出力は図２（ｇ）のようになる。積分回路１４の出力は、Ａ／Ｄ変換されてからコンピュータ１０へ取り込まれ、ガルバノミラー１５ｘ、１５ｙが試料６上を走査している間繰り返し（ステップＳ２０３：Ｎｏ）、同様に１０００×１０００の画素から構成される１枚の画像を得る。
【００６８】
上記ステップＳ２０１からＳ２０５までの動作を、デューティー比Ｔ／Ｐを０〜１００％の範囲で変化させて繰り返し、複数枚の試料６の画像データをコンピュータ１０に取り込んだら、次のステップへ移行する（ステップＳ２０４：Ｙｅｓ）。そして、実施の形態１と同様に、積分された蛍光のデューティー比Ｔ／Ｐに対する変化を上記ターゲット関数にフィッテングさせて蛍光寿命τを求める（ステップＳ２０６〜Ｓ２０８）。この蛍光顕微鏡１０３では、各画素に対して蛍光寿命を求めることができるので、所定領域における蛍光寿命の分布を求めることができる。
【００６９】
ここで、上記蛍光寿命の測定方法においては、１つのデューティー比Ｔ／Ｐに対して１回の走査を行うことにより画像を得ている。このとき、上記説明において半導体レーザー１のＯＮ／ＯＦＦの周期は１点につき５０回となる。これを、画像１点における前半の２５回は１０％のデューティー比Ｔ／Ｐで、後半は２０％のデューティー比Ｔ／Ｐで２回データを取り込んでもよい。このようにすれば、上記蛍光の測定方法と比較して半分の時間で蛍光寿命を測定することができる。また、蛍光寿命の測定時間が同じであれば、さらに多くのデューティー比Ｔ／Ｐで蛍光寿命を測定して、測定精度を向上させることができる。
【００７０】
このような蛍光顕微鏡１０３及び蛍光寿命測定手順によれば、走査型の共焦点顕微鏡においても、励起光であるレーザー光のデューティー比を変化させて得られた試料６から放射される蛍光の光量変化を積分することにより、蛍光寿命を安価な光源を用いて測定することができる。
【００７１】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明に係る蛍光顕微鏡によれば、従来と比較して極めて安価に蛍光顕微鏡や共焦点形の蛍光顕微鏡を構成することができる。
【００７２】
また、この発明に係る蛍光寿命の測定方法又は蛍光寿命の測定用プログラムによれば、従来と比較して極めて安価な構成で蛍光寿命を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の実施の形態１に係る蛍光顕微鏡の構成を示す説明図である。
【図２】この発明の実施の形態１に係る蛍光顕微鏡の励起光の出射タイミング等を示すタイミングチャートである。
【図３】この発明の実施の形態１に係る蛍光の測定方法を示すフローチャートである。
【図４】デューティー比Ｔ／Ｐに対する積分された蛍光の変化を示す説明図である。
【図５】実施の形態１の第１変形例に係る蛍光顕微鏡を示す説明図である。
【図６】実施の形態１の第２変形例に係る蛍光顕微鏡を示す説明図である。
【図７】この発明の実施の形態２に係る蛍光顕微鏡を示す構成図である。
【図８】この発明の実施の形態２に係る蛍光の測定方法を示すフローチャートである。
【図９】従来の時間領域における蛍光寿命測定機能を持った蛍光顕微鏡の構成図である。
【図１０】レーザー光の発振タイミング等を示すタイミングチャートである。
【図１１】時間に対する蛍光強度の変化を示す説明図である。
【符号の説明】
１  半導体レーザー
２  ビームエキスパンダ
３  ダイクロイックミラー
４  第一結像レンズ
５  対物レンズ
５ａ  全反射対物レンズ
６  試料
７  第二結像レンズ
９  ＣＣＤ
１０  コンピュータ
１１  発振器
１２  デューティー比可変器
１２ｓ  デューティー比可変回路
１４  積分回路
１５ｘ、１５ｙ  ガルバノミラー
１６ａ、１６ｂ  瞳リレーレンズ
１７  レンズ
１８  ピンホール
１００、１０１、１０２、１０３、５００  蛍光顕微鏡
【図１】
2004212203.tif 000005
【図２】
2004212203.tif 000006
【図３】
2004212203.tif 000007
【図４】
2004212203.tif 000008
【図５】
2004212203.tif 000009
【図６】
2004212203.tif 000010
【図７】
2004212203.tif 000011
【図８】
2004212203.tif 000012
【図９】
2004212203.tif 000013
【図１０】
2004212203.tif 000014
【図１１】
2004212203.tif 000015