(57)【要約】      （修正有）【課題】人体の免疫を増強するための医薬組成物の提供。【解決手段】サルノコシカケ科マツホド（Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ（Ｓｃｈｗ）Ｗｏｌｆ）の菌核からアルコール抽出、液状抽出物を濃縮、シリカゲルカラムクロマト処理し、活性成分として化学式１に示したラノスタン化合物を５〜６０質量％含有する経口投与の医薬組成物である。前記抽出物において、免疫の増強を阻害しうるセコラノスタンの含有量は、ラノスタン化合物の全量に対して５質量％未満である。2004339220.tif 000041（式中、Ｒ１は、ＨまたはＣＨ３を、Ｒ２は、ＯＣＯＣＨ３等を、Ｒ３，Ｒ５は、ＨまたはＯＨを、Ｒ４は、−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＣＨ３）２Ｒａを示す。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療上有効な量の、活性成分としての下記化学式１で示されるラノスタンと、前記活性成分のための薬学的に許容できる担体または希釈剤とを含む、哺乳動物の免疫を増強しうる医薬組成物：
【化１】
2004339220.tif 000035
（式中、Ｒ１は、ＨまたはＣＨ３を示し、Ｒ２は、ＯＣＯＣＨ３、Ｃ＝ＯまたはＯＨを示し、Ｒ３は、ＨまたはＯＨを示し、Ｒ４は、−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＣＨ３）２Ｒａ（この際、Ｒａは、ＨもしくはＯＨを示す）または−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−Ｒｂ（この際、Ｒｂは、ＣＨ３もしくはＣＨ２ＯＨを示す）を示し、Ｒ５は、ＨまたはＯＨを示し、および、Ｒ６は、ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨを示す。）
【請求項２】
セコラノスタンの含有量は、前記ラノスタンの含有量の５質量％未満である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ラノスタンは、下記化学式２〜５の少なくとも一で示される、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【化２】
2004339220.tif 000036
【請求項４】
組成物の全量に対して、前記ラノスタンの含量は０．１〜６０質量％である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
経口投与される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記哺乳動物はヒトである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
抽出物の全量に対して、下記化学式１で示されるラノスタンの含量が５〜６０質量％であり、哺乳動物の免疫を増強しうるポリア抽出物：
【化３】
2004339220.tif 000037
（式中、Ｒ１は、ＨまたはＣＨ３を示し、Ｒ２は、ＯＣＯＣＨ３、Ｃ＝ＯまたはＯＨを示し、Ｒ３は、ＨまたはＯＨを示し、Ｒ４は、−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＣＨ３）２Ｒａ（この際、Ｒａは、ＨもしくはＯＨを示す）または−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−Ｒｂ（この際、Ｒｂは、ＣＨ３もしくはＣＨ２ＯＨを示す）を示し、Ｒ５は、ＨまたはＯＨを示し、および、Ｒ６は、ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨを示す。）
【請求項８】
セコラノスタンの含有量は、前記ラノスタンの含有量の５質量％未満である、請求項７に記載のポリア抽出物。
【請求項９】
以下の工程を有する方法により製造される、請求項７または８に記載のポリア抽出物：
ａ）マツホド（Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ（Ｓｃｈｗ）Ｗｏｌｆ）の菌核を、水、メタノール、エタノールまたはこれらの混合溶媒により抽出する；
ｂ）前記工程ａ）において得られた液状抽出物を濃縮する；
ｃ）前記工程ｂ）において得られた濃縮物をシリカゲルカラムに導入する；
ｄ）前記シリカゲルカラムを、低極性溶離液を用いて溶出し、得られた溶出液を回収する；
ｅ）前記溶出液を濃縮して濃縮溶出液を得る。
【請求項１０】
ジクロロメタンおよびメタノールの混合溶媒（９６：４（体積比））を用いて展開し、紫外線ランプおよびヨウ素蒸気を用いて検出する際の、前記工程ｅ）で得られた前記濃縮溶出液の薄層クロマトグラフィによるＲｆ値が０．１以上である、請求項９に記載のポリア抽出物。
【請求項１１】
前記工程ａ）における抽出は、９５％エタノールを用いて行われる、請求項９または１０に記載のポリア抽出物。
【請求項１２】
前記工程ｂ）において得られた濃縮物を、メタノールおよびｎ−ヘキサンを１：１の体積比で含む二相溶媒を用いてさらに抽出し、この二相溶媒抽出混合物からメタノール層を分離し、さらにこのメタノール層を濃縮して濃縮液とし、前記濃縮液を工程ｃ）においてシリカゲルカラムに導入する、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のポリア抽出物。
【請求項１３】
前記低極性溶離液は、ジクロロメタンおよびメタノールを９６．５：３．５の体積比で含む混合溶媒である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のポリア抽出物。
【請求項１４】
抽出物の全量に対して、前記化学式１で示されるラノスタンの含量が１０〜２０質量％である、請求項７〜１３のいずれか１項に記載のポリア抽出物。
【請求項１５】
前記ラノスタンは、下記化学式２〜５の少なくとも一で示される、請求項７〜１４のいずれか１項に記載のポリア抽出物：
【化４】
2004339220.tif 000038
【請求項１６】
哺乳動物の免疫を増強するための医薬の製造における、下記化学式１で示されるラノスタンの使用：
【化５】
2004339220.tif 000039
（式中、Ｒ１は、ＨまたはＣＨ３を示し、Ｒ２は、ＯＣＯＣＨ３、Ｃ＝ＯまたはＯＨを示し、Ｒ３は、ＨまたはＯＨを示し、Ｒ４は、−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＣＨ３）２Ｒａ（この際、Ｒａは、ＨもしくはＯＨを示す）または−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−Ｒｂ（この際、Ｒｂは、ＣＨ３もしくはＣＨ２ＯＨを示す）を示し、Ｒ５は、ＨまたはＯＨを示し、および、Ｒ６は、ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨを示す。）
【請求項１７】
前記ラノスタンは、下記化学式２〜５の少なくとも一で示される、請求項１６に記載の使用：
【化６】
2004339220.tif 000040
【請求項１８】
哺乳動物の免疫を増強するための医薬の製造における、請求項７〜１５のいずれか１項に記載のポリア抽出物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫を増強するための有効活性成分としてラノスタンを含有する医薬組成物に関する。本発明はさらに、免疫増強を目的とする、ポリア（Ｐｏｒｉａ）、特にマツホド（Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ（Ｓｃｈｗ）Ｗｏｌｆ）の抽出物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリア（Ｐｏｒｉａ）、特にマツホド（Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ（Ｓｃｈｗ）Ｗｏｌｆ；サルノコシカケ科）の抽出物（以下、ポリア（Ｐｏｒｉａ）抽出物とも称する）は、強壮作用に加えて、胃腸障害に対する平滑作用を有する。漢方医学によれば、前記ポリア抽出物は精神安定剤および排尿促進剤に分類されている。さらに、ポリア抽出物は、生命活動のための漢方処方の必須成分として用いられている。ポリア抽出物の薬理作用に関して近年なされている研究および実験によれば、ポリア抽出物は、腫瘍の予防に好ましい作用を示し、さらに、慢性疾患に悩む患者の免疫の増強および胃腸系に対して有益であることがわかっている。
【０００３】
一例を挙げると、特許文献１および２には、マツホド（Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ（Ｓｃｈｗ）Ｗｏｌｆ）の培養された菌糸から得られ、腫瘍の予防に有効な抽出物が開示されている。特許文献３には、腫瘍の予防に用いるための、マツホド（Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ（Ｓｃｈｗ）Ｗｏｌｆ）から直接得られる抽出物が開示されている。特許文献４には、マツホド（Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ（Ｓｃｈｗ）Ｗｏｌｆ）をメタノールを用いて抽出することにより得られる抽出物が開示されている。前記抽出物を分離することにより、ラノスタン（ｌａｎｏｓｔａｎｅ）およびセコラノスタン（ｓｅｃｏｌａｎｏｓｔａｎｅ）のようなトリテルペン化合物が得られ、鎮吐薬として用いられる。特許文献５には、マツホド（Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ（Ｓｃｈｗ）Ｗｏｌｆ）をメタノールを用いて抽出することにより得られるトリテルペン化合物が開示されている。この化合物は、腫瘍促進の阻害剤として有用である。特許文献６には、マツホド（Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ（Ｓｃｈｗ）Ｗｏｌｆ）の抽出物が開示されており、前記抽出物を精製することによって、炎症および腫瘍促進の阻害剤として用いるためのトリテルペン化合物を得ている。
【０００４】
特許文献７には、トリテルペン化合物を含むポリア抽出物の製造方法が開示されている。前記製造方法は、酸性アルコールを用いてポリア粉末を抽出し、塩基溶液を用いて抽出物を中和し、中和された溶液を濃縮し、前記溶液のｐＨを約１０に調整し、さらにこの溶液を濾過し、濾液を酸性とすることにより沈殿を得て、濾過した後に前記沈殿を洗浄し、最後に洗浄された沈殿を乾燥する工程を含んでいる。このようにして得られたポリア抽出物は、腫瘍予防効果および免疫活性化効果を有することが知られている。
【特許文献１】特開昭５５−１１１７９１号公報
【特許文献２】特開昭５７−３８７９４号公報
【特許文献３】特開昭５５−１１１４２２号公報
【特許文献４】特開平８−１１９８６４号公報
【特許文献５】特開平９−２５２３２号公報
【特許文献６】特開平９−１７６１８４号公報
【特許文献７】中国公開特許第１００８１８３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、哺乳動物の免疫を増強しうる有効成分としてラノスタンを含有する医薬組成物を提供することである。
【０００６】
また、本発明の目的は、ラノスタンを含有するマツホド（Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ（Ｓｃｈｗ）Ｗｏｌｆ）抽出物の調製方法、および、前記有効成分を含有するポリア抽出物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、治療上有効な量の、活性成分としての下記化学式１で示されるラノスタンと、前記活性成分のための薬学的に許容できる担体または希釈剤とを含む、哺乳動物の免疫を増強しうる医薬組成物である：
【０００８】
【化１】
2004339220.tif 000002
【０００９】
（式中、Ｒ１は、ＨまたはＣＨ３を示し、Ｒ２は、ＯＣＯＣＨ３、Ｃ＝ＯまたはＯＨを示し、Ｒ３は、ＨまたはＯＨを示し、Ｒ４は、−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＣＨ３）２Ｒａ（この際、Ｒａは、ＨもしくはＯＨを示す）または−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−Ｒｂ（この際、Ｒｂは、ＣＨ３もしくはＣＨ２ＯＨを示す）を示し、Ｒ５は、ＨまたはＯＨを示し、および、Ｒ６は、ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨを示す。）
また本発明は、抽出物の全量に対して、前記化学式１で示されるラノスタンの含量が５〜６０質量％であり、哺乳動物の免疫を増強しうるポリア（Ｐｏｒｉａ）抽出物である。
【００１０】
さらに本発明は、哺乳動物の免疫を増強するための医薬の製造における、下記化学式１で示されるラノスタンの使用である。
【００１１】
また本発明は、哺乳動物の免疫を増強するための医薬の製造における、本発明のポリア（Ｐｏｒｉａ）抽出物の使用である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、脾細胞に対して毒性を示さず、哺乳動物の免疫を増強しうる、医薬組成物およびポリア（Ｐｏｒｉａ）抽出物が提供される。また本発明によれば、哺乳動物の免疫を増強するための、ポリア（Ｐｏｒｉａ）抽出物の製造方法が提供される。本発明の製造方法によれば、所望のラノスタンを高い含有量で含み、細胞に悪影響を及ぼすセコラノスタンをほとんど含まないポリア抽出物が製造されうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載に基づいて定められるべきであり、下記の形態のみには制限されない。
【００１４】
本発明は、哺乳動物の免疫を増強しうる医薬組成物を提供する。前記組成物は、治療上有効な量の、活性成分としての下記化学式１で示されるラノスタンと、前記活性成分のための薬学的に許容できる担体または希釈剤とを含む：
【００１５】
【化２】
2004339220.tif 000003
【００１６】
（式中、Ｒ１は、ＨまたはＣＨ３を示し、Ｒ２は、ＯＣＯＣＨ３、Ｃ＝ＯまたはＯＨを示し、Ｒ３は、ＨまたはＯＨを示し、Ｒ４は、−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＣＨ３）２Ｒａ（この際、Ｒａは、ＨもしくはＯＨを示す）または−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−Ｒｂ（この際、Ｒｂは、ＣＨ３もしくはＣＨ２ＯＨを示す）を示し、Ｒ５は、ＨまたはＯＨを示し、および、Ｒ６は、ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨを示す。）
前記化学式１で示されるラノスタンは、マツホドの抽出物（ポリア抽出物）中に含まれる。このラノスタンは比較的低極性の画分であり、主要な化合物であるＫ１、Ｋ２、Ｋ３およびＫ４と、微量のＫ４ａ、Ｋ４ｂ、Ｋ５、Ｋ６ａ、およびＫ６ｂを含む。これらのうち、化合物Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、およびＫ４が、免疫増強作用を有する。
【００１７】
ここで、主要な化合物である前記Ｋ１〜Ｋ４化合物の構造は以下の通りである：
【００１８】
【化３】
2004339220.tif 000004
【００１９】
また、微量成分である前記Ｋ４ａ、Ｋ４ｂ、Ｋ５、Ｋ６ａ、およびＫ６ｂ化合物の構造は以下の通りである：
【００２０】
【化４】
2004339220.tif 000005
【００２１】
前記Ｋ１〜Ｋ６化合物は、粗抽出物を得る、従来の抽出工程を利用することにより、マツホドから得られる。一例を挙げると、ラノスタン画分およびセコラノスタン画分を含む前記粗抽出物中の成分を分離するためには、クロマトグラフィによる分離が用いられうる。前記ラノスタン画分の極性は、前記セコラノスタン画分と比較して相対的に低い。このため、前記ラノスタン画分は、ジクロロメタンおよびメタノールからなる溶離液（９６：４（体積比））を用いて得られるのに対し、前記セコラノスタン画分は、ジクロロメタンおよびメタノールからなる溶離液（９０：１０または０：１００（体積比））を用いて得られる。前記ラノスタン画分の位置は、薄層クロマトグラフィにより同定され、展開溶液としてジクロロメタンおよびメタノールの混合溶液（９６：４（体積比））を用いた場合、前記ラノスタン画分の有するＲｆ値は０．１以上である。一方、前記セコラノスタン画分の有するＲｆ値は、０．１未満である。さらに、ジクロロメタンおよびメタノールからなる溶離液（９７：３〜９５：５（体積比））を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィにより、前記ラノスタン画分は種々のラノスタン化合物へと分離される。
【００２２】
本発明の方法によれば、マツホド（Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ（Ｓｃｈｗ）Ｗｏｌｆ）１ｋｇから２．６ｇのＰＣＭが得られる。前記特許文献７に記載の方法では、１ｋｇのマツホドから得られる粗抽出物は３ｇである。この粗抽出物を本発明の方法により精製すると、得られるＰＣＭはたった１ｇである。このように、詳細は後述するが、本発明によれば、ラノスタンを高い含有量で含むポリア抽出物が提供される。
【００２３】
また、本発明者らは、中国において栽培されている、マツホド（Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ（Ｓｃｈｗ）Ｗｏｌｆ）を用い、中国公開特許第１００８１８３号公報に開示されている実施例を反復実施した。酸による抽出およびアルカリ／酸処理により、マツホド（Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ（Ｓｃｈｗ）Ｗｏｌｆ）１ｋｇから３ｇの粗ポリア抽出物を得た。これは、前記文献に開示されている範囲（２．５ｇ±０．５ｇ）と一致している。さらに分離した結果、精製ラノスタン化合物を４００ｍｇ得た。換言すると、前記文献に開示された方法により得られた抽出物は、約１３％のラノスタン画分と、８７％の、セコラノスタン画分および他の未同定成分からなる抽出物とを含む。
【００２４】
さらなる実験の結果、本発明者らは、前記ラノスタン画分はラット脾細胞に対して毒性を示さず、薬理学的に有効であることを見出した。しかしながら、前記セコラノスタン画分は、ラット脾細胞に対して毒性を示すことを見出した。
【００２５】
以下、本発明の医薬化合物およびポリア抽出物について、より詳細に説明する。
【００２６】
本発明は、哺乳動物の免疫を増強しうる医薬組成物を提供する。前記組成物は、治療上有効な量の、活性成分としての下記化学式１で示されるラノスタンと、前記活性成分のための薬学的に許容できる担体または希釈剤とを含む：
【００２７】
【化５】
2004339220.tif 000006
【００２８】
（式中、Ｒ１は、ＨまたはＣＨ３を示し、Ｒ２は、ＯＣＯＣＨ３、Ｃ＝ＯまたはＯＨを示し、Ｒ３は、ＨまたはＯＨを示し、Ｒ４は、−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＣＨ３）２Ｒａ（この際、Ｒａは、ＨもしくはＯＨを示す）または−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−Ｒｂ（この際、Ｒｂは、ＣＨ３もしくはＣＨ２ＯＨを示す）を示し、Ｒ５は、ＨまたはＯＨを示し、および、Ｒ６は、ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨを示す。）
なお、Ｒ２は通常は１価の官能基であるが、上述の化合物Ｋ３のように、Ｒ２がＣ＝Ｏを示す場合には、Ｒ２の結合している炭素原子に結合する水素原子が脱離し、Ｒ２の結合および前記水素原子の脱離に伴う結合の双方が、Ｃ＝Ｏを形成するための二重結合に関与する。
【００２９】
前記化学式１において、Ｒ１は、好ましくはＨであり、Ｒ３は、好ましくはＯＨであり、Ｒ４は、好ましくは−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＣＨ３）２Ｒａ（この際、Ｒａは、好ましくはＨである）であり、Ｒ５は、好ましくはＨであり、Ｒ６は、好ましくはＣＨ３である。
【００３０】
また、前記化学式１には、連続する４個の炭素原子にわたる、点線で示される３本の結合が示されているが、これは、上述のＫ１およびＫ２のそれぞれの主成分のように、前記連続する４個の炭素原子の２番目と３番目の炭素原子、すなわち２つの六員の縮合に関与している２個の炭素原子間に二重結合が存在する形態と、上述のＫ１およびＫ２の微量成分並びにＫ３〜Ｋ６（Ｋ６ｂを除く）のように、前記連続する４個の炭素原子の、１番目および２番目の炭素原子間、並びに３番目および４番目の炭素原子間に二重結合が存在する形態との双方を含む概念である。
【００３１】
本発明に係る医薬組成物は、１種または２種以上のラノスタン化合物を含有する。好ましくは、前記組成物は、前記組成物の全量に対して、前記ラノスタンを０．１〜６０質量％含有する。また、本発明の医薬組成物において、好ましくは、セコラノスタンの含有量は、前記ラノスタンの含有量の５質量％未満である。かような形態によれば、脾細胞に対して毒性を示す虞のあるセコラノスタンの含有量が低減されているため、ラノスタンによる免疫増強効果がより一層向上しうる。
【００３２】
本発明の医薬組成物に含有される薬学的に許容できる担体または希釈剤は、特に制限されず、従来公知の形態が適宜採用されうる。担体としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤；乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリン、澱粉等の保湿剤；澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポリエチレングリコール等の潤沢剤等が挙げられる。また、希釈剤としては、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。なお、これらの担体および希釈剤はあくまでも例示であり、これらには全く制限されない。
【００３３】
本発明の医薬組成物は、常法に従い、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、着色剤、ｐＨ緩衝剤、防腐剤、ゲル化剤、界面活性剤、コーティング剤等、医薬の製剤分野において通常使用し得る公知の補助剤を用いて製剤化されうる。また、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤、他の医薬等と混合されてもよい。
【００３４】
本発明の医薬組成物は、ヒト又はヒト以外の動物に対し、経口または非経口により安全に投与され、免疫を調節または増強しうる。好ましくは、例えば錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の形態で経口投与されうる。ただし、経皮投与や皮下投与の形態で非経口により投与されてもよい。また、従来公知の手法により徐放剤の形態とされてもよい。
【００３５】
本発明において、「哺乳動物」としては、特に制限されず、例えばヒト、サル、マウス、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギおよびラット等が例示される。なかでも、ヒト、サル並びに、イヌおよびネコ等の愛玩動物、モルモット、ウサギおよびラット等の実験動物がより好ましく、ヒトが特に好ましい。
【００３６】
本発明はまた、哺乳動物の免疫を増強しうるポリア抽出物を提供する。前記抽出物は、前記抽出物の全量に対して、前記化学式１で示されるラノスタンを５〜６０質量％、好ましくは１０〜２０質量％含有する。また、本発明のポリア抽出物において、好ましくは、セコラノスタンの含有量は、前記ラノスタンの含有量の５質量％未満である。上述したように、かような形態によれば、ラノスタンによる免疫増強効果がより一層向上しうる。
【００３７】
本発明は、前記ポリア抽出物の製造方法をも提供する。前記製造方法ではまず、マツホド（Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ（Ｓｃｈｗ）Ｗｏｌｆ）の菌核を、水、メタノール、エタノールまたはこれらの混合溶媒により抽出して液状抽出物を得る。この際、マツホドの菌核は、例えば、従来公知の漢方薬であるブクリョウとして得られ、粉砕して粉末として用いるとよい。ここで、菌核とは、菌糸が集まって生じた塊であり、通常は硬く黒色である。また、菌核には、菌糸に加えて、菌糸の代謝物および発酵産物が含まれていてもよい。次いで、前記液状抽出物を濃縮して濃縮物を得る。なお、本発明において「濃縮」は、例えば、液状物を加熱または真空乾燥することにより行われ、前記液状物の質量がほとんど低下しなくなる程度まで行われれば充分である。
【００３８】
さらに、前記濃縮物をシリカゲルカラムに導入し、低極性溶離液を用いて溶出する。その結果生成した溶出液を回収する。前記溶出液は濃縮されて濃縮溶出液とされる。ジクロロメタンおよびメタノールの混合溶媒（９６：４（体積比））を用いて展開し、紫外線ランプおよびヨウ素蒸気を用いて検出する際の、前記濃縮溶出液の薄層クロマトグラフィによるＲｆ値は、好ましくは０．１以上である。
【００３９】
本発明の製造方法において、抽出は、エタノール水溶液、特に好ましくは９５％エタノールを用いて行われることが好ましい。その他の抽出条件は特に制限されず、従来公知の知見が適宜参照されうる。
【００４０】
上記の調製方法において、好ましくは、前記濃縮物を、メタノールおよびｎ−ヘキサンを１：１の体積比で含む二相溶媒を用いてさらに抽出する。この際、目的とするラノスタンは、メタノール層に移行することから、この二相溶媒抽出混合物からメタノール層を分離し、さらにこのメタノール層を濃縮して濃縮液とし、前記濃縮液をシリカゲルカラムに導入する。
【００４１】
前記低極性溶離液は、ジクロロメタンおよびメタノールを、好ましくは９７：３〜９５：５、より好ましくは９７：３〜９６：４、特に好ましくは９６．５：３．５の体積比で含む混合溶媒である。
【００４２】
このような工程により調製される抽出物は、前記化学式１で示されるラノスタンを、抽出物の全量に対して１０〜２０質量％という高い含有量含み、かつ、セコラノスタンをほとんど含まない。
【００４３】
前記ラノスタンは、好ましくは、下記化学式２〜５の少なくとも一で示される：
さらに本発明は、哺乳動物の免疫を増強するための医薬の製造における、下記化学式１で示されるラノスタンの使用である。ここで、前記ラノスタンは、前記化学式２〜５の少なくとも一で示される化合物であることが好ましい。
【００４４】
また本発明は、哺乳動物の免疫を増強するための医薬の製造における、本発明のポリア（Ｐｏｒｉａ）抽出物の使用である。
【実施例】
【００４５】
実施例
図１に示すように、３０ｋｇの中国産マツホド（Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ（Ｓｃｈｗ）Ｗｏｌｆ）からポリア（Ｐｏｒｉａ）粉末を調製した。１２０Ｌの９５％エタノールを用いて、前記ポリア粉末を２４時間抽出した。得られた混合物を濾過し、濾液を得た。残渣をさらに３回抽出および濾過した。全ての濾液を合わせ、濃縮して、２６５．２ｇの乾燥抽出物を得た。二相抽出剤（９５％メタノール：ｎ−ヘキサン＝１：１）を用いて前記乾燥抽出物を分配抽出して、メタノール層を分取し、前記メタノール層を濃縮して２４６．９ｇの乾燥固形物を得た。前記乾燥固形物の１０〜４０倍の質量のシリカゲルが充填されたシリカゲルカラムを用いて、前記乾燥固形物の分離を行った。前記シリカゲルは、粒径が７０〜２３０メッシュであり、Ｍｅｒｃｋ社製（シリカゲル６０）であった。次いで、ジクロロメタンおよびメタノールの混合溶媒（９６：４（体積比））と、ジクロロメタンおよびメタノールの混合溶媒（９０：１０（体積比））と、１００％メタノールとをこの順に溶離液として用いて、前記シリカゲルカラムを溶出した。溶出液の確認は薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）により行い、この際、展開溶媒としてはジクロロメタンおよびメタノールの混合溶媒（９６：４（体積比））を用い、検出には紫外線ランプおよびヨウ素蒸気を用いた。ＴＬＣにおいて同様の成分を有することが確認された溶出液どうしを合わせた。
【００４６】
ジクロロメタンおよびメタノールの混合溶媒（９６：４（体積比））を用いた溶出により、比較的低極性の画分（本明細書中「ＰＣＭ」とも称する）を、７８ｇ得た。前記ＰＣＭは、薄層クロマトグラフィにおいて微量のポイントが６箇所確認された。また、ジクロロメタンおよびメタノールの混合溶媒（９０：１０（体積比））並びに１００％メタノールを用いた溶出により得られた溶出液を混合し、前記ＰＣＭよりも比較的高極性の画分（本明細書中「ＰＣＷ」とも称する）を、１６８ｇ得た。
【００４７】
前記ＰＣＭを、ジクロロメタンおよびメタノールの混合溶媒（９６．５：３．５（体積比））並びにシリカゲルカラムを用いてさらに分離した。ここで得られた溶出液は、薄層クロマトグラフィにより３個の画分として回収され、前記画分は、それぞれ、Ｋ１（Ｒｆ＝０．６４）、ＰＣＭ−１（微量のＫ１、Ｋ３（Ｒｆ＝０．５５）およびＫ５（Ｒｆ＝０．４９）を含有）、並びにＰＣＭ−２（Ｋ２（Ｒｆ＝０．３０）、Ｋ４（Ｒｆ＝０．２４）およびＫ６（Ｒｆ＝０．１９）を含有）であった。さらに、前記Ｋ１画分を、カーボン−１８カラムおよびメタノール−水（９０：１０（体積比））の移動相を用いた高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）に供した。その結果、３．０ｇのＫ１成分を得た。
【００４８】
上記と同様のＨＰＬＣおよびメタノール−水（８７：１３（体積比））の移動相を用いて、前記ＰＣＭ−１画分を、Ｋ３成分、Ｋ５成分、および微量のＫ１成分に分離した。同様のＨＰＬＣおよびメタノール−水（８４：１６（体積比））の移動相を用いて前記Ｋ３成分をさらに精製し、１．９３ｇのＫ３成分を得た。また、同様のＨＰＬＣ並びにメタノール−水（９３：７（体積比）および９１：９（体積比）をこの順）の移動相を用いて前記Ｋ５画分をさらに精製し、４７．６ｍｇのＫ５成分を得た。
【００４９】
上記と同様のＨＰＬＣおよびメタノール−水（８７：１３（体積比））の移動相を用いて、前記ＰＣＭ−２画分を、Ｋ６微量成分（Ｋ６ａ＋Ｋ６ｂ）、Ｋ４微量成分（Ｋ４ａ＋Ｋ４ｂ）、Ｋ２成分、およびＫ４成分に分離した。同様のＨＰＬＣおよびメタノール−水（８４：１６（体積比））の移動相を用いて、前記Ｋ２成分および前記Ｋ４成分をさらに精製し、６．２ｇのＫ２成分および０．５５ｇのＫ４成分を得た。
【００５０】
上記と同様のＨＰＬＣおよびＣＨ３ＣＮ−水（６８：３２（体積比））の移動相を用いて、前記Ｋ６微量成分をさらに精製し、２１．４ｍｇのＫ６ａ成分および９０．７ｍｇのＫ６ｂ成分を得た。また、同様のＨＰＬＣおよびメタノール−水（７６：２４（体積比））の移動相を用いて、６６．０ｍｇのＫ４ａ成分および８６．８ｍｇのＫ４ｂ成分を得た。
【００５１】
図１からわかるように、本発明のポリア抽出物（ＰＣＭ（７８ｇ）に相当）中の、ラノスタン（Ｋ１〜Ｋ６（合計約１２ｇ）に相当）の含有量の割合は、１２／７８×１００＝約１５．４質量％である。
【００５２】
なお、本実施例において得られたＫ１〜Ｋ６成分の構造は以下の通りである：
【００５３】
【化７】
2004339220.tif 000007
【００５４】
また、上記のＫ１〜Ｋ６成分の分析データは以下の通りである：
【００５５】
【表１】
2004339220.tif 000008
【００５６】
【表２】
2004339220.tif 000009
【００５７】
【表３】
2004339220.tif 000010
【００５８】
【表４】
2004339220.tif 000011
【００５９】
【表５】
2004339220.tif 000012
【００６０】
【表６】
2004339220.tif 000013
【００６１】
【表７】
2004339220.tif 000014
【００６２】
【表８】
2004339220.tif 000015
【００６３】
【表９】
2004339220.tif 000016
【００６４】
【表１０】
2004339220.tif 000017
【００６５】
【表１１】
2004339220.tif 000018
【００６６】
参考例
２ｋｇの中国産マツホド（Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ（Ｓｃｈｗ）Ｗｏｌｆ）からポリア粉末を調製した。中国公開特許第１００８１８３号公報に記載の方法を用いて、図２に示すように、６．０ｇの粗抽出物を得た。前記実施例と同様の手法により、前記粗抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィに供し、ジクロロメタンおよびメタノールの混合溶媒（９６：４（体積比））で溶出して２．０ｇのＰＣＭ−Ｅ画分を得、さらにジクロロメタンおよびメタノールの混合溶媒（９０：１０（体積比））並びに１００％メタノールで順に溶出して２．３ｇのＰＣＷ−Ｅ画分を得た。
【００６７】
本参考例において調製された前記ＰＣＭ−Ｅおよび前記ＰＣＷ−Ｅを、一日あたり４０ｍｇ／ｋｇの量で動物に投与し、前記動物の脾細胞（免疫細胞）の増殖に対するこれら２つの画分の効果を確認した。前記動物の脾細胞の増殖が仮に促進されれば、この動物の免疫系は増強されており、逆に前記動物の脾細胞の増殖が阻害されれば、前記免疫系は悪影響を受けている、すなわち、前記脾細胞は毒性により死滅しているということになる。
【００６８】
前記脾細胞をインビトロで５日間培養し、ＭＴＴ分析により細胞増殖を比較した。この際、前記ＭＴＴ分析は以下に示す免疫学的研究法により行った。結果を以下の表１２に示す。マウスの脾臓の細胞増殖は、ＰＣＭ−Ｅの経口投与後３日目および４日目には明らかに促進されていた。統計的見地からは、対照群と実験群との間では細胞増殖に差は見られなかった。しかしながら、生存しているマウス脾細胞の数は、対照群と比較して、ＰＣＷ−Ｅの経口投与後３日目および４日目には明らかに減少していた。言い換えれば、実験群の脾臓の細胞増殖は、対照群と比較して明らかに弱っていた。これは、ＰＣＷ−Ｅが毒性を有するということを意味する。
【００６９】
これに対し、ラノスタン含有低極性画分であるＰＣＭは、脾臓の細胞増殖に対して阻害作用を示さないことが予想される。前記ＰＣＭ画分はむしろ、脾臓の細胞増殖に対して促進作用を示す。また、セコラノスタン含有高極性画分（Ｒｆ＜０．１）は、脾臓の細胞増殖に対して阻害作用を示す。本発明のポリア抽出物は、前記セコラノスタン画分（ＰＣＷ−Ｅ）を含有しない。その一方で、従来の方法により得られたポリア抽出物は、脾臓の細胞増殖を阻害しうるＰＣＷ−Ｅを含有する。
【００７０】
【表１２】
2004339220.tif 000019
【００７１】
上記の実施例および参考例の結果の比較から、以下の２点が示される。
【００７２】
・マツホド（Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ（Ｓｃｈｗ）Ｗｏｌｆ）の有効成分はラノスタン含有低極性画分であり、これは人体の免疫系を増強しうる。
【００７３】
・マツホド（Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ（Ｓｃｈｗ）Ｗｏｌｆ）の促進成分を阻害成分から分離する目的で、シリカゲル薄層クロマトグラフィおよびシリカゲルカラムクロマトグラフィが用いられうる。
【００７４】
本発明の方法により得られるポリア抽出物は、阻害成分を実質的に含有しない。ここで、前記阻害成分とは、高極性画分であるＰＣＷ−Ｅに含まれるセコラノスタンおよび高極性分子である。このため、本発明の方法は、従来の方法と比較して優れている。
【００７５】
インビボ実験例
ＰＣＭ−ＥおよびＰＣＷ−Ｅを動物に経口投与することにより、動物実験を行った。言い換えると、ＰＣＭ−ＥおよびＰＣＷ−Ｅの投与を、インビトロではなくインビボで行った。これは、脾細胞に対する医薬化合物のインビトロの研究では、細胞代謝と医薬化合物との間の相互作用がなく、脾臓の細胞増殖に対する医薬化合物の実際の効果が反映されないためである。これにより、本発明は信頼性が高く、有意義であることが容易に示される。
【００７６】
本発明の方法により調製されたクロマトグラフィによるポリア抽出物、および前記ポリア抽出物から精製された化合物を、以下に示す種々の免疫応答実験により試験した。実施例１において得られた、ポリア抽出物のＰＣＭ画分、およびそこから精製されたラノスタン化合物Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、およびＫ４は、下記の表２および表１０に示すように、以下の免疫応答試験において、免疫細胞（Ｔ細胞／Ｂ細胞）に対して免疫増強活性を示し、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、およびＫ４化合物は、２．５または５．０ｍｇ／ｋｇ未満の量で有効であった。
【００７７】
実験
実験動物
全ての実験を通して、６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを用いた。このマウスは、財団法人国家実験研究院国家実験動物センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）より購入した。マウスは独立換気ケージシステム（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｖｅｎｔｉｌａｔｉｏｎ  Ｃａｇｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）により飼育され、これにより特定病原体未感染（ＳＰＦ）の環境が提供された。施設は１２時間昼／夜リズムを有し、温度２４〜２６℃および湿度３０〜７０％に維持した。マウスには飼料としてオートクレーブ処理した水および齧歯動物用食餌（ｒｏｄｅｎｔ  ｃｈｏｗ）を与え、布団も同様にオートクレーブにより滅菌処理した。国立台湾大学動物センターより購入した原料は、粗タンパク質（＞２３．０％）、粗脂肪（＜３．０％）、粗繊維（＜６．０％）、灰分（＜８．０％）、添加ミネラル（＜３．０％）および水（＜１２％）からなっていた。輸送後、実験を開始する前にマウスを２週間休ませた。
【００７８】
動物の処置
薬剤を処理するために、マウスを４つの群に分け、４日間、１０、４０、および８０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの濃度範囲のＰＣＭ（１ｍＬ）を経口投与した。精製ＰＣＭ−Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、およびＫ４については、経口投与量をＰＣＭの場合の４分の１の２．５、５、１０、および２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで変化させた。対照群は、等量の食塩水（０．８５％ＮａＣｌ）を与えたマウスであった。マウスを５日目に屠殺し、血清および脾細胞を回収した。次いで、前記血清を用いてＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡの濃度を測定した。前記脾細胞を１００ｍｍ直径培養プレートに播種し、３７℃で３時間インキュベートした。Ｔリンパ球、Ｂリンパ球およびＮＫ細胞を含有する非接着細胞を回収し、各分析に記載のように適切に希釈した。
【００７９】
薬剤の調製
ＰＣＭ、ＰＣＭ−Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、およびＫ４の乾燥粉末を滅菌水に懸濁させ、超音波処理により大きい粒子を破壊した。マウスへの投与にはこの微粒子懸濁液を用いた。
【００８０】
脾臓リンパ球の単離
マウスの屠殺は、頸部を脱臼させることにより行い、次いで７０％エタノールを用いて消毒した。次いでまず心臓の穿刺を行い、血液を回収した。血球凝集後、血液サンプルを遠心分離に供し、血清を回収した。脾細胞を単離するため、腹膜を切開して脾臓を取り出した。新鮮な脾臓を、１０ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０培地を含む培養プレートに移した。次いでこの脾臓を細かいメッシュ上に置き、各脾細胞を分離させた。次いで、培地中に懸濁している脾細胞を取り出し、５０ｍＬコニカル遠心チューブに移した。このチューブを、１３００ｒｐｍで１０分間の遠心分離に供した。上清を捨て、ＥＤＴＡ−ＮＨ４Ｃｌを含有する冷ＲＢＣ溶解緩衝液１ｍＬにペレットを再懸濁させた。この細胞を室温で１０分間インキュベートした後、培地を用いた遠心分離により細胞を３回洗浄した。脾細胞を１００ｍｍ直径培養プレートに播種し、３７℃で３時間インキュベートした。Ｔリンパ球、Ｂリンパ球およびＮＫ細胞を含有する非接着細胞を回収し、各分析に記載のように適切に希釈した。
【００８１】
ＭＴＴ分析
ＭＴＴ分析は、生細胞数および培養細胞の生存能力の評価のために一般に用いられている方法である。その基本原理は、生細胞のミトコンドリアのみが生物学的に活性な酸化還元酵素を含んでいるということである。この酵素はＭＴＴ試薬と相互作用し、この化合物を相対的に不溶性の青色結晶に変換する。次いでこの結晶を酸性イソプロパノール中に可溶化し、ＥＬＩＳＡ検出器（ＥＬ３１１、ＢｉｏＴｅｋ、ＶＴ）を用いて各ウェルにおける５７０ｎｍでの吸光度を測定する。簡単に言えば、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、抗生物質および１μｇ／ｍＬコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）が添加されたＲＰＭＩ−１６４０を含有する培地中に懸濁させた脾細胞を、９６ウェル平底プレート（５×１０５細胞／１００μＬ／ウェル）中で５日間培養した。ＭＴＴ分析は、３、４、および５日目に行った。ＭＴＴテトラゾリウム（臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム）（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中、５ｍｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｅｕｉｓ、ＭＯ）を脾細胞に添加し（細胞１００μＬあたりＭＴＴ２０μＬ）、プレートを３７℃で４時間インキュベートした。全てのウェルに酸−イソプロパノール（０．０４Ｎ  ＨＣｌイソプロパノール溶液１００μＬ）を添加し、完全に混合して、暗青色結晶を溶解させた。室温で２０分間放置して全ての結晶の溶解を確認した後、ＥＬＩＳＡ検出器を用いてプレートの各ウェルの５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００８２】
ＥＬＩＳＡによる免疫グロブリンの濃度の測定
免疫グロブリン濃度を測定するために、ＥＬＩＳＡを行った。簡単に言えば、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、抗生物質および５μｇ／ｍＬリポ多糖（ＬＰＳ；１μｇ／１０５細胞）が添加されたＲＰＭＩ−１６４０を含有する培地中で、脾細胞（５×１０５細胞／ｍＬ）を５日間培養した。ＬＰＳは、Ｂリンパ球のポリクローナル活性化剤の一つである。培養された脾細胞の上清を、３、４、および５日目に回収した。サンドイッチＥＬＩＳＡ技術を用い、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡの濃度を測定した。
１．ＩｇＧ分析
９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅ、ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｎｕｎｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を４℃で一晩、１００ｎｇ／ウェルの捕捉抗体を用いてプレコートした。前記捕捉抗体は、ウサギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭ抗体（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣＡ）であった。ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液を用いて前記プレートを洗浄し、ＰＢＳ−１％ゼラチンを用いてブロックした。ブロッキング後、適切に希釈したサンプル（１／１０５希釈）および０．２５〜０．０３９μｇ／ｍＬの範囲のスタンダードＩｇＧを添加した（１００μＬ／ウェル）。次いで、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。インキュベートの最後に、ＨＲＰ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：２０００希釈；抗全ＩｇＧ分子；Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣＡ）を添加した（１００μＬ／ウェル）。３７℃で１時間インキュベート後、０．１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ４．５、０．０３％Ｈ２Ｏ２および０．１％ｏ−フェニレンジアミンを含有する基質溶液を用いて現像した。ＥＬＩＳＡ検出器（Ｅｌ３１１、ＢｉｏＴｅｋ、ＶＴ）を用いて各ウェルの４９０ｎｍにおける吸光度を測定し、ｌｏｇ−ｌｏｇｉｔモデルを用いてデータを分析した。
【００８３】
２．ＩｇＭ分析
サンプルを１／１０４に希釈し、１〜０．０１５６μｇ／ｍＬの濃度範囲を有するスタンダードＩｇＭを添加した（１００μＬ／ウェル）こと以外は、上記のＩｇＧ分析と同様の手法を用いて、ＩｇＭ分析を行った。この分析用の二次抗体としては、ＨＲＰ共役ヤギ抗マウスＩｇＭ（１：１０００希釈；重鎖特異的；Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣＡ）を用いた。
【００８４】
３．ＩｇＡ分析
サンプルを１／１０４に希釈し、１〜０．０１５６μｇ／ｍＬの濃度範囲を有するスタンダードＩｇＡを添加した（１００μＬ／ウェル）こと以外は、上記のＩｇＧ分析と同様の手法を用いて、ＩｇＡ分析を行った。この分析用の二次抗体としては、ＨＲＰ共役ヤギ抗マウスＩｇＡ（１：１０００希釈；Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣＡ）を用いた。
【００８５】
ＥＬＩＳＡによるサイトカインの濃度の測定
ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０の定量分析を行うため、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、抗生物質および１μｇ／ｍＬコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）が添加されたＲＰＭＩ−１６４０を含有する培地中で、脾細胞（１×１０６細胞／ｍＬ）を３日間培養した。ＣｏｎＡは、Ｔリンパ球のポリクローナル活性化剤の一つである。次いで、培養された脾細胞の上清を回収した。さらに、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ、ＵＳＡ）より購入したサイトカインＥＬＩＳＡセットを用いて、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０の濃度を測定した。
【００８６】
１．ＩＬ−１０分析
ＣｙｔｏＳｅｔＥＬＩＳＡを以下の通り行った：９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅ、ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｎｕｎｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を４℃で一晩、捕捉抗体を用いてプレコートした。前記捕捉抗体は、マウスＩＬ−１０に対するラットモノクローナル抗体であった。試験サンプルおよび５００〜１５．６ｐｇ／ｍＬの濃度範囲のスタンダードＩＬ−１０を添加した（１００μＬ／ウェル）。次いで、プレートを３７℃で２０分間インキュベートした。インキュベートの最後に、プレートを５回洗浄し、さらにビオチン化ヤギ抗ＩＬ−１０ポリクローナル抗体を添加した。ＨＲＰ共役ストレプトアビジン（Ｚｙｍｅｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用い、次いで過酸化水素およびテトラメチルベネジジン（ＴＭＢ）を含有する基質溶液を用いてプレートをインキュベートすることにより現像を行った。室温で３０分間反応を進行させ、２Ｎ硫酸を１００μＬ添加することにより反応を停止させた。ＥＬＩＳＡ検出器（Ｅｌ３１１、ＢｉｏＴｅｋ、ＶＴ）を用いて各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、ｌｏｇ−ｌｏｇｉｔモデルを用いてデータを分析した。
【００８７】
２．ＩＮＦ−γ分析
捕捉抗体としてマウスＩＦＮ−γに対するラットモノクローナル抗体を用い、二次抗体としてビオチン化ヤギ抗ＩＦＮ−γポリクローナル抗体を用いたこと以外は、上記のＩＬ−１０分析と同様の手法を用いて、ＩＮＦ−γのＣｙｔｏＳｅｔＥＬＩＳＡを行った。
【００８８】
フローサイトメトリー分析によるＴ細胞群の分析
Ｔリンパ球上へのＣＤ３（ｐａｎ−Ｔマーカー）、ＣＤ４（ヘルパーＴ細胞マーカー）、およびＣＤ８（細胞障害性Ｔ細胞マーカー）分子の発現に対するＰＣＭのインビボの効果をフローサイトメトリーにより評価した。ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８の発現はそれぞれ、ＣＹ−クロム共役ハムスター抗マウスＣＤ３抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）、ＰＥ共役ハムスター抗マウスＣＤ４抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）、およびＦＩＴＣ共役ハムスター抗マウスＣＤ８抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いてモニターした。簡単に言えば、非接着の脾細胞を滅菌冷ＰＢＳを用いて３回洗浄し、細胞濃度を１×１０６細胞／ｍＬに調節した。１×１０６細胞毎に１μＬの所定の蛍光共役抗体と混合し、暗所にて室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を冷ＰＢＳを用いて洗浄し、２００×ｇで１０分間遠心分離することによりペレットを得た。前記ペレットを分散させ、１．０％のパラホルムアルデヒド５００μＬと混合した。脾臓リンパ球におけるＣＤ３＋細胞の百分率およびＣＤ３＋細胞群におけるＣＤ４＋８−細胞およびＣＤ４−８＋細胞の百分率をフローサイトメトリーにより分析した。
【００８９】
ＮＫ細胞毒性の分析
ＮＫ細胞媒介性の細胞毒性を測定するため、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ細胞媒介性細胞毒性キット（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｋｉｔ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を用いて分析を行った。この二色蛍光分析により、細胞媒介性細胞毒性の直接の評価が可能となり、５１Ｃｒ放出分析と相関性のよい細胞毒性の測定が可能となる。本分析に用いた標的細胞はＹＡＣ−１細胞（ＡＴＣＣ、ＴＩＢ−１６０）である。簡単に言えば、指数増殖ＹＡＣ−１細胞を回収し、完全培地（１０％胎児ウシ血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび抗生物質が添加されたＲＰＭＩ−１６４０）を用いて洗浄した。細胞濃度を１×１０６細胞／ｍＬに調節し、標的細胞１ｍＬあたり２０μＬのＤｉＯＣ１８（３，３’−ジオクタデシルオキサカルボシアニン）を添加した。次いで、細胞を３７℃で２０分間インキュベートした。ＤｉＯＣ１８試薬によって、標的細胞上に膜状の緑色蛍光着色が形成された。次いで、ＰＢＳを用いて細胞を２回洗浄し、２×１０５細胞／ｍＬの濃度で完全培地中に懸濁させた。非接着の脾細胞（エフェクター細胞）をハンクスバランス塩溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を用いて３回洗浄し、１×１０７細胞／ｍＬの濃度で完全培地中に懸濁させた。次いで、前記エフェクター細胞を２度２倍希釈して５×１０６細胞／ｍＬおよび２．５×１０６細胞／ｍＬの濃度とした。分析を開始するために、等量（例えば、２００μＬ）のエフェクター細胞と標的細胞とを混合して、最終のエフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ比）をそれぞれ５０：１、２５：１、および１２．５：１とした。この細胞混合液を３７℃で２時間インキュベートし、５０μＬのヨウ化プロピジウムを添加した。前記ヨウ化プロピジウムは細胞膜に障害を及ぼして細胞内に浸透し、核を赤色蛍光に染色することができる。この細胞を１０００×ｇで３０秒間遠心分離することによりペレットとし、室温でさらに１０分間インキュベートした。インキュベーション後、チューブを優しくタッピングすることによりペレットを剥がし、次いでボルテックスすることにより完全に再懸濁した。このようにして、サンプルのフローサイトメトリーによる分析の準備が整った。死滅した標的細胞は、緑色の細胞膜と赤色の核の双方を有していた。生存している標的細胞は細胞膜が緑色であった。しかしながら、赤色に染色された核を有しているのは死滅したエフェクター細胞のみであった。
【００９０】
ファゴサイトーシスの分析
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｃｏ．（Ｅｒｇｅｎｅ、ＯＲ）より購入したビブラントファゴサイトーシス分析キット（Ｖｙｂｒａｎｔ  Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）を用いて、腹膜のマクロファージの食細胞作用を分析した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを４つの群に分け、連続する４日間、２．５〜２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの濃度範囲のＰＣＭ−Ｋ１（１ｍＬ）を経口投与した。対照群は、等量の食塩水（０．８５％ＮａＣｌ）を注射されたマウスであった。２日目に、１０％プロテオースペプトンを２．５ｍＬ、マウスの腹腔内に投与し、５日目に、頸部を脱臼させることによりマウスを屠殺した。このマウスの腹腔に、２価カチオンおよび血清を含まないＤＭＥＭを２ｍＬ注射した。次いで、腹腔を３０秒間優しくマッサージし、２５Ｇシリンジを用いて腹水を培地および腹腔滲出細胞とともに回収した。得られた細胞を完全ＤＭＥＭ培地により洗浄し、１×１０７細胞／ｍＬの濃度に調節した。この細胞を氷浴上で１０分間インキュベートし、さらに１×１０６個の細胞を５×１０６個の蛍光ラベル粒子と混合した。ファゴサイトーシス分析用の粒子は、蛍光ラベル化大腸菌（Ｋ−１２株）バイオパーティクル（ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）であった。この細胞を、実験群と対照群とに分けた。前記実験群を３７℃で１５分間インキュベートし、さらに氷冷クエンチ溶液（１．２５ｍｇ／ｍＬトリパンブルー）１００μＬを添加した。前記対照群については、０℃で同様にインキュベートした。両群からの細胞をＰＢＳを用いて２回洗浄し、１５０×ｇで５分間遠心分離することによりペレットとした。さらに、ＡＣＫ溶解溶液を添加することにより、不純物である赤血球を除去した。細胞を１５０×ｇで５分間遠心分離することにより、再度ペレットとし、このペレットを分散させて１．０％のパラホルムアルデヒド５００μＬと混合した。腹膜のマクロファージにより貪食された粒子の量を、フローサイトメトリーにより分析した。
【００９１】
統計
対照群および薬剤処理群から得られたデータをＡＮＯＶＡ（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｃｅ）分散分析により検定した。２つの平均値の差については、マン−ホイットニーランクサム検定（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙｓ  ｒａｎｋ  ｓｕｍ  ｔｅｓｔ）を用いて評価した。
【００９２】
結果
（１）脾細胞増殖−ＰＣＭ並びにＰＣＭ−Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、およびＫ４の効果
下記の表１３および１４に示すように、インビトロ培養の３日目において、４０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのＰＣＭ、５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上の量のＰＣＭ−Ｋ１、Ｋ３、およびＫ４、１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上の量のＰＣＭ−Ｋ２で処置されたマウスから単離された脾細胞はそれぞれ、細胞増殖に対する効果が有意に増大していた。この結果から、ＰＣＭ、またはＰＣＭ−Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、もしくはＫ４のような精製化合物は、一般に、脾細胞に対して毒性を示さず、経口投与されるとリンパ系器官の免疫細胞の増殖に影響を及ぼすことが示唆される。
【００９３】
【表１３】
2004339220.tif 000020
【００９４】
【表１４】
2004339220.tif 000021
【００９５】
（２）免疫グロブリンの血清レベル−ＰＣＭ並びにＰＣＭ−Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、およびＫ４の効果
下記の表１５および１６のデータは、４０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのＰＣＭを経口投与されたマウスでは、ＩｇＧの血清レベルが有意に上昇したことを示している。５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上の量のＰＣＭ−Ｋ１、Ｋ２、およびＫ４を投与されたマウスでもまた、ＩｇＧの血清レベルが有意に上昇している。これに対し、５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上の量のＰＣＭ−Ｋ３を投与されたマウスでは、ＩｇＧの血清レベルが有意に減少している。
【００９６】
また、４０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上の量のＰＣＭ、１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのＰＣＭ−Ｋ１、２．５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上の量のＰＣＭ−Ｋ２、５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上の量のＰＣＭ−Ｋ３、および５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上の量のＰＣＭ−Ｋ４を経口投与されたマウスでは、ＩｇＭの血清レベルが有意に上昇していた。
【００９７】
さらに、８０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのＰＣＭの経口投与では、マウス血清中のＩｇＡレベルが有意に減少した。しかしながら、１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのＰＣＭ−Ｋ１を投与されたマウスでは、ＩｇＡの血清レベルが有意に上昇した。なお、この実験において、ＰＣＭ−Ｋ２、Ｋ３、およびＫ４は、ＩｇＡの血清濃度に影響を及ぼさなかった。
【００９８】
【表１５】
2004339220.tif 000022
【００９９】
【表１６】
2004339220.tif 000023
【０１００】
（３）脾臓Ｂリンパ球により分泌される免疫グロブリン−ＰＣＭ並びにＰＣＭ−Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、およびＫ４の効果
３．１  インビトロにおける脾臓によるＩｇＧ分泌
下記の表１７および１８に示すように、インビトロ培養３日目には、４０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのＰＣＭ、５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上の量のＰＣＭ−Ｋ１、および１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上のＰＣＭ−Ｋ２で処置されたマウスから単離された脾細胞で、ＩｇＧ分泌が有意に増加した。一方、ＰＣＭ−Ｋ３によってＩｇＧ分泌は抑制された。５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上のＰＣＭ−Ｋ４で処置されたマウスから単離された脾細胞では、５日目にＩｇＧ分泌が有意に増加した。本実験の結果から、ＰＣＭまたはＰＣＭ−Ｋ１、Ｋ２、もしくはＫ４のような精製化合物を経口投与することにより、脾臓のＢ細胞のＩｇＧ分泌能を向上させうることが示唆される。
【０１０１】
【表１７】
2004339220.tif 000024
【０１０２】
【表１８】
2004339220.tif 000025
【０１０３】
３．２  インビトロにおける脾臓によるＩｇＭ分泌
表１９および２０に示すように、インビトロ培養３日目には、４０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上の量のＰＣＭ、１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのＰＣＭ−Ｋ１、２．５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上の量のＰＣＭ−Ｋ２、１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上の量のＰＣＭ−Ｋ３、および５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上の量のＰＣＭ−Ｋ４で処置されたマウスから単離された脾細胞で、ＩｇＭ分泌が有意に増加した。本実験の結果から、ＰＣＭまたはＰＣＭ−Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、もしくはＫ４のような精製化合物を経口投与することにより、脾臓のＢ細胞のＩｇＭ分泌能を向上させうることが示唆される。
【０１０４】
【表１９】
2004339220.tif 000026
【０１０５】
【表２０】
2004339220.tif 000027
【０１０６】
３．３  インビトロにおける脾臓によるＩｇＡ分泌
表２１および２２に示すように、インビトロ培養３日目には、ＰＣＭで処置されたマウスから単離された脾細胞で、ＩｇＡ分泌が対照群と比較して有意に減少した。しかしながら、精製化合物で処置されたマウスは、これとは異なる結果を示した。すなわち、１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのＰＣＭ−Ｋ１の経口投与では、インビトロ培養３〜５日目において、脾細胞によるＩｇＡ分泌が有意に増加した。また、１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上の量のＰＣＭ−Ｋ２、および５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上の量のＰＣＭ−Ｋ４で処置されたマウスから単離された脾細胞では、ＩｇＡ分泌が有意に増加した。一方、ＰＣＭ−Ｋ３は、ＩｇＡ分泌を有意に抑制した。これらの結果から、ＰＣＭ−Ｋ１、Ｋ２、およびＫ４のような精製化合物は、脾臓のＢ細胞のＩｇＡ分泌能を向上させうることが示唆される。
【０１０７】
【表２１】
2004339220.tif 000028
【０１０８】
【表２２】
2004339220.tif 000029
【０１０９】
（４）脾臓Ｔリンパ球により分泌されるＴＨ１型およびＴＨ２型サイトカイン−ＰＣＭ並びにＰＣＭ−Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、およびＫ４の効果
インターロイキン−２（ＩＬ−２）およびインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）のようなＴＨ１型サイトカインは、細胞性の免疫応答を誘導する。これに対し、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）のようなＴＨ２型サイトカインは、Ｂリンパ球により媒介される液性の免疫応答を促進する。免疫調節に対するＰＣＭおよびその精製化合物の作用を調べる目的で、脾臓のＴリンパ球により分泌されるＴＨ１型およびＴＨ２型サイトカインの昨日を解析した。まず、ＰＣＭ並びに、ＰＣＭ−Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、およびＫ４のような精製化合物で処置されたマウスから単離された脾細胞を、ＣｏｎＡの存在下で５日間培養した。次いで、脾臓のＴリンパ球により分泌されるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ；ＴＨ１型サイトカイン）およびインターロイキン−１０（ＩＬ−１０；ＴＨ２型サイトカイン）の量を測定した（表２３および２４）。その結果、１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙおよび８０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのＰＣＭ、２．５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上のＰＣＭ−Ｋ１、２．５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上のＰＣＭ−Ｋ２、５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙおよび１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのＰＣＭ−Ｋ３、並びに２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのＰＣＭ−Ｋ４をマウスに投与した場合に、ＣｏｎＡによって刺激された脾臓のＴ細胞によるＩＦＮ−γの分泌が有意に増加した。一方、ＰＣＭで処置されたマウスから単離された脾細胞では、ＩＬ−１０の分泌に有意な変化は見られなかった。２．５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上のＰＣＭ−Ｋ１、並びに５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙおよび２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのＰＣＭ−Ｋ２により処置されたマウスでは、脾細胞によるＩＬ−１０の分泌が有意に増加した。これらの結果から、ＰＣＭは、比較的少量でＴＨ１型サイトカインを増加させるように調節することができるが、ＴＨ２型サイトカインの分泌を調節することはできない。これに対し、ＰＣＭ−Ｋ１およびＫ２のような精製化合物は、分泌されるＴＨ１型サイトカインおよびＴＨ２型サイトカインの双方を増加させることが可能であることが示される。
【０１１０】
【表２３】
2004339220.tif 000030
【０１１１】
【表２４】
2004339220.tif 000031
【０１１２】
（５）脾臓のＴリンパ球群−ＰＣＭの効果
ＣＤ４＋８−Ｔ細胞は、大部分がヘルパーＴ細胞（ＴＨ）であり、ＣＤ４−８＋Ｔ細胞は、主に細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）である。Ｔリンパ球のモジュレーションに対するＰＣＭおよびその精製化合物の作用を調べる目的で、非接着脾細胞中のＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の百分率をＦＡＣＳにより分析した。まず、マウスに、１０〜８０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの濃度範囲のＰＣＭを４日連続して与えた。５日目にこのマウスを屠殺し、非接着脾細胞を単離した。ＰＣＭで処置されたマウスでは、ＣＤ４＋８−細胞の百分率に変化は見られなかった（表２５）が、ＰＣＭの量が８０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙへと増加するにつれて、前記百分率も増加する傾向が見られた。これに対し、ＰＣＭで処置されたマウスにおいて、ＣＤ４−８＋細胞サブセットの百分率は有意に増加した（表２５）。言い換えると、マウスにＰＣＭを投与すると、細胞障害性Ｔリンパ球群が増加した。ここで、ＣＴＬの分化は主にＴＨ１型サイトカインにより誘導される。したがって、この知見は、ＩＦＮ−γの分泌に対するＰＣＭの促進効果と優れた相関がみられる。なお、ＣＤ４＋８−細胞サブセットもまた増加する傾向を示したため、非細胞リンパ球群におけるＣＤ４／ＣＤ８比の増加は確認されなかった。
【０１１３】
【表２５】
2004339220.tif 000032
【０１１４】
（６）ＮＫ細胞の細胞障害活性−ＰＣＭの効果
ＮＫ細胞は、先天性の免疫において極めて重要な役割を担っている。ＮＫ細胞は、腫瘍細胞（形質転換された細胞）およびウイルスに感染した細胞を区別なく殺傷する。ＰＣＭで処置されたマウスから単離された非接着脾細胞を用いて、すぐにＮＫ媒介性細胞障害性分析を行った。この結果から、ＰＣＭは、１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの量でＮＫ媒介性細胞障害活性を増加させることが示された（表２６）。ＰＣＭの量を増加させると、ＮＫ細胞の活性は基礎レベルに戻った。ここで、ＮＫ細胞の活性化は主にＴＨ１型サイトカインの刺激による。したがって、この知見は、ＩＦＮ−γの分泌に対するＰＣＭの促進効果と優れた相関がみられる。
【０１１５】
【表２６】
2004339220.tif 000033
【０１１６】
マクロファージの食作用活性−ＰＣＭの効果
食細胞は、侵入してきた病原体に対する最前線での防御に関与している。先天性の免疫における主な食細胞は、好中球およびマクロファージである。本研究においては、腹膜に滲出したマクロファージに蛍光ラベルした大腸菌を与え、誘導されたマクロファージの食作用活性を分析した。その結果、対照群から単離されたマクロファージでは平均して２０．８８％が食作用活性を示した（表２７）。これに対し、４０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙおよび８０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのＰＣＭを与えたマウスでは、それぞれ２７．４９％および３８．２２％のマクロファージが食作用活性を示した。これにより、ＰＣＭが腹膜マクロファージの食作用活性を有意に向上させることが示唆される。
【０１１７】
【表２７】
2004339220.tif 000034
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】マツホド（Ｐｏｒｉａ  ｃｏｃｏｓ（Ｓｃｈｗ）Ｗｏｌｆ）からラノスタン化合物を製造するための本発明の方法のフロー図である。
【図２】中国公開特許第１００８１８３号公報に記載の方法によるポリア抽出物の製造方法、および本発明によるポリア抽出物の低極性部分の製造方法のフロー図である。
【図１】
2004339220.tif 000042
【図２】
2004339220.tif 000043