(57)【要約】【課題】  試料液中に含まれるＡＩＣおよびＯＩＣの影響を受けず、迅速かつ高精度に試料液液中の基質を測定することができる簡易な構造のバイオセンサを提供すること。【解決手段】  少なくとも一対の電極を含む電極系と、前記電極系を支持するための少なくとも１つの絶縁性の基板と、前記電極系の少なくとも作用極上に設けられた第一の反応層であって、電極に結合または吸着し得る官能基および疎水性の炭化水素基を含む有機化合物を含む第一の反応層と、前記第一の反応層上に設けられた第二の反応層であって、当該第一の反応層の疎水性部分に結合または吸着し得る両親媒性脂質を含む第二の反応層と、前記第一および第二の反応層によって構成される二成分膜に担持された試薬系であって、少なくとも膜結合型のピロロキノリンキノン依存型グルコースデヒドロゲナーゼおよび電子伝達体を含む試薬系と、を備える、バイオセンサ。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一対の電極を含む電極系と、
前記電極系を支持するための少なくとも１つの絶縁性の基板と、
前記電極系の少なくとも作用極上に設けられた第一の反応層であって、電極に結合または吸着し得る官能基および疎水性の炭化水素基を含む有機化合物を含む第一の反応層と、
前記第一の反応層上に設けられた第二の反応層であって、当該第一の反応層の疎水性部分に結合または吸着し得る両親媒性脂質を含む第二の反応層と、
前記第一および第二の反応層によって構成される二成分膜に担持された試薬系であって、少なくとも膜結合型のピロロキノリンキノン依存型グルコースデヒドロゲナーゼおよび電子伝達体を含む試薬系と、を備える、バイオセンサ。
【請求項２】
第一の反応層および第二の反応層は、それぞれ単分子層を形成している、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記有機化合物は、下記一般式（１）、（２）、または（３）で表される化合物である、請求項１に記載のバイオセンサ：
ＨＳ−（ＣＨ2）n−Ｘ                      （１）
Ｘ−（ＣＨ2）n−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）n−Ｘ    （２）
Ｓ−（ＣＨ2）n−Ｘ                        （３）
（但し、一般式（１）、（２）、および（３）において、ｎは１〜２０の整数、Ｘはメチル基、ベンジル基、アミノベンジル基、カルボキシベンジル基、またはフェニル基である）。
【請求項４】
前記両親媒性脂質は、Ｌ−α−ホスファチジルコリン，β−オレオイル−γ−パルミトイルである、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項５】
前記電子伝達体は１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムである、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項６】
前記作用極は、金、白金、またはパラジウムを含有する、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項７】
前記電極系の対極は、金、白金、またはパラジウムのいずれも含有していない、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項８】
前記電極系の作用極の表面全体と、対極の表面の一部が前記二成分膜で被覆されている、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項９】
前記対極の前記二成分膜で被覆されていない部分の面積が、前記作用極の面積よりも大きい、請求項８に記載のバイオセンサ。
【請求項１０】
前記電極系の作用極の表面のみが、前記二成分膜で被覆されている、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項１１】
前記一対の電極の各々は、前記試料液の供給路をその間に形成するように互いに向き合って配置された２つの絶縁性基板の対向面上にそれぞれ支持されている、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項１２】
前記試薬系は、ｐＨ緩衝剤をさらに含む、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項１３】
バイオセンサの製造方法であって、
絶縁性の基板上に少なくとも一対の電極を含む電極系を形成する工程、
前記電極系の少なくとも作用極上に第一の反応層を設ける工程であって、電極に結合または吸着し得る官能基および疎水性の炭化水素基を含む有機化合物を含む溶液を前記作用極に接触させることを含む、工程、
前記第一の反応層上に第二の反応層を設ける工程であって、両親媒性脂質を含む溶液を前記第一の反応層に接触させることを含む、工程を包含し、
ここで、前記有機化合物を含む溶液および前記両親媒性脂質を含む溶液のうちの少なくとも１つは電子伝達体を含み、前記両親媒性脂質を含む溶液はさらに膜結合型のピロロキノリンキノン依存型グルコースデヒドロゲナーゼを含む、方法。
【請求項１４】
第一の反応層および第二の反応層は、それぞれ単分子層を形成している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記有機化合物は、下記一般式（１）、（２）、または（３）で表される化合物である、請求項１３に記載の方法：
ＨＳ−（ＣＨ2）n−Ｘ                      （１）
Ｘ−（ＣＨ2）n−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）n−Ｘ    （２）
Ｓ−（ＣＨ2）n−Ｘ                        （３）
（但し、一般式（１）、（２）、および（３）において、ｎは１〜２０の整数、Ｘはメチル基、ベンジル基、アミノベンジル基、カルボキシベンジル基、またはフェニル基である）。
【請求項１６】
前記両親媒性脂質は、Ｌ−α−ホスファチジルコリン，β−オレオイル−γ−パルミトイルである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記電子伝達体は１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記作用極は、金、白金、またはパラジウムを含有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記電極系の対極は、金、白金、またはパラジウムのいずれも含有していない、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記電極系の作用極の表面全体と、対極の表面の一部が前記第一および第二の反応層で被覆されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記対極の前記第一および第二の反応層で被覆されていない部分の面積が、前記作用極の面積よりも大きい、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記電極系の作用極の表面のみが、前記第一および第二の反応層で被覆されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
前記一対の電極の各々は、前記試料液の供給路をその間に形成するように互いに向き合って配置された２つの絶縁性基板の対向面上にそれぞれ支持されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
前記有機化合物を含む溶液および前記両親媒性脂質を含む溶液のうちの少なくとも１つは、ｐＨ緩衝剤をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料液中に含まれる基質（測定対象物）の測定を行うためのバイオセンサに関する。特に、本発明は、試料液中に含まれるグルコースの濃度を測定するためのバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンサにより得られる基質濃度等の測定値における測定誤差は、試料液中に含まれる、測定対象物（基質）以外の他の物質の影響によって引き起こされる。
【０００３】
例えば、血液試料中のグルコース濃度を測定するために、電流検出型の電気化学センサを用いる場合、血液中に含まれるアスコルビン酸（ビタミンＣ）、尿酸、アセトアミノフェンなどの易酸化性の化学物質が、当該センサの電極（作用極）で電気化学的酸化されることにより発生する電流が、グルコースについての電流に重畳するため、グルコース濃度の測定値に正誤差が生じる。
【０００４】
これらの化合物の血中濃度は、各個人によって異なり、また同一人物であっても、日々変化するため、生ずる測定誤差を予め推測して補正することは困難である。
【０００５】
このような誤差を生む化学物質は易酸化性阻害物質（Ｏｘｉｄｉｚａｂｌｅ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ；以下、ＯＩＣと略記する）と呼ばれており、当該分野においてこれらによる影響を除去するために様々な方策が試みられている。
【０００６】
そのような方策に１つに、例えば、特許文献１に開示される方法があり、そこでは、作用極および対極以外に、ＯＩＣを測定するための第三電極をバイオセンサの基板上に設けることによってＯＩＣの影響を補正する工夫をしている。
【０００７】
また、ＯＩＣの影響を除去するための方法としては、ＯＩＣの作用極への拡散をブロックするための膜を作用極上に設けることによって、ＯＩＣによる電流を抑制する方法およびバイオセンサも開発されている。そのようなバイオセンサの例としては、例えば、非特許文献１に開示されるポリ（ｏ−フェニレンジアミン）膜を使用したバイオセンサがある。
【０００８】
一方、血液中に含まれる血球や蛋白などのペプチドは電極表面に吸着し易いため、これらペプチドが電極表面に吸着することによっても電流阻害が引き起こされる。これら吸着性の阻害物質（Ａｄｓｏｒｐｔｉｖｅ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ；以下、ＡＩＣと略記する）がグルコースセンサの電極（作用極）に吸着すると、実効の電極面積が減少し、その結果、グルコースの関与する酸化還元反応に基づく電流が減少し、測定において負誤差が生じる。その電流減少の度合いは、ＡＩＣの電極表面への吸着の度合いによって変化する。さらに、その吸着の度合いは試料液中のＡＩＣ濃度により変化するため、電流の低下の度合いを予測し、生じる誤差を補正することは非常に困難である。
【０００９】
ＡＩＣの影響を排除するために種々の方策が試みられている。例えば、血球分離用のろ紙がバイオセンサの電極系上に設けられ、これにより血球などを物理的に効率よく除去する方法が開示されている（例えば、特許文献２参照）。
【００１０】
また、バイオセンサの電極系表面にカルボキシメチルセルロースなどの親水性高分子を塗布することにより、血球や蛋白などのＡＩＣの吸着を抑制するということも行われている（例えば、特許文献３参照）。
【特許文献１】米国特許第６３４０４２８号明細書
【特許文献２】米国特許第６０３３８６６号明細書
【特許文献３】特開平３−２０２７６４号公報
【非特許文献１】Ｗａｎｇ，Ｊ．ら著、「Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｆｉｒｓｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｏｆ  ｒｈｏｄｉｎｉｚｅｄ  ｃａｒｂｏｎ  ｐａｓｔｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ  ａｎｄ  ｐｅｒｍｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｏｌｙ（ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）  ｃｏａｔｉｎｇｓ」、Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ、８巻、１９９６年、ｐ１１２７−１１３０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、前記従来のバイオセンサでは、ＯＩＣやＡＩＣを含む流体を試料液とすると、作用極における前記ＯＩＣの酸化の抑制、ならびに前記ＡＩＣの電極（作用極）表面への吸着の抑制が必ずしも完全ではなく、未だに基質濃度の測定において測定誤差が発生し、試料液中の基質の濃度を実際の濃度より、低くあるいは高く見積もってしまうという課題があった。あるいは、ＯＩＣの酸化電流の補正、ならびにＡＩＣのろ過を行うために、センサの構造が複雑になるといった課題があった。
【００１２】
本発明は、このような従来技術の課題を解決するものであり、バイオセンサにおける測定誤差を排除し、迅速かつ高精度に試料液中の基質を測定することができる簡易構造のバイオセンサを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記従来の課題を解決するために、本発明は、試料中の基質濃度を正確に再現性よく測定するためのバイオセンサを提供し、そのバイオセンサは、少なくとも一対の電極を含む電極系と、前記電極系を支持するための少なくとも１つの絶縁性の基板と、前記電極系の少なくとも作用極上に設けられた第一の反応層と、前記第一の反応層上に設けられた第二の反応層とを備えている。
【００１４】
上記バイオセンサにおいて、第一の反応層は、電極に結合または吸着し得る官能基および疎水性の炭化水素基を含む有機化合物を含む。第二の反応層は、第一の反応層の疎水性部分に結合または吸着し得る両親媒性脂質を含む。
【００１５】
さらに、本発明のバイオセンサは、第一の反応層および第二の反応層によって構成される二成分膜に担持された試薬系を備えており、この試薬系は、少なくとも膜結合型のピロロキノリンキノン依存型グルコースデヒドロゲナーゼおよび電子伝達体を含んでいることを特徴とする。
【００１６】
好ましい実施形態では、第一の反応層および第二の反応層は、それぞれ単分子層を形成している。
【００１７】
好ましい実施形態では、上記有機化合物は、下記一般式（１）、（２）、または（３）で表される化合物である：
【００１８】
ＨＳ−（ＣＨ2）n−Ｘ                      （１）
Ｘ−（ＣＨ2）n−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）n−Ｘ    （２）
Ｓ−（ＣＨ2）n−Ｘ                        （３）
（但し、上記一般式（１）、（２）、および（３）において、ｎは１〜２０の整数、Ｘはメチル基、ベンジル基、アミノベンジル基、カルボキシベンジル基、またはフェニル基である）。ｎは５〜１５の整数であることがさらに好ましい。
【００１９】
好ましい実施形態では、上記両親媒性脂質は、Ｌ−α−ホスファチジルコリン，β−オレオイル−γ−パルミトイルである。
【００２０】
好ましい実施形態では、上記電子伝達体は１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムである。
【００２１】
好ましい実施形態では、上記作用極は、金、白金、またはパラジウムを含有する。
【００２２】
好ましい実施形態では、上記電極系の対極は、金、白金、またはパラジウムのいずれも含有していない。
【００２３】
好ましい実施形態では、上記電極系の作用極の表面全体と、対極の表面の一部が上記二成分膜で被覆されている。さらに好ましくは、対極の二成分膜で被覆されていない部分の面積が、作用極の面積よりも大きい。
【００２４】
好ましい実施形態では、上記電極系の作用極の表面のみが、二成分膜で被覆されている。
【００２５】
好ましい実施形態では、上記一対の電極の各々は、上記試料液の供給路をその間に形成するように互いに向き合って配置された２つの絶縁性基板の対向面上にそれぞれ支持されている。
【００２６】
好ましい実施形態では、上記試薬系は、ｐＨ緩衝剤をさらに含む。
【００２７】
本発明は、さらに別の局面において、バイオセンサの製造方法を提供する。本発明のバイオセンサの製造方法は、絶縁性の基板上に少なくとも一対の電極を含む電極系を形成する工程、前記電極系の少なくとも作用極上に第一の反応層を設ける工程であって、電極に結合または吸着し得る官能基および疎水性の炭化水素基を含む有機化合物を含む溶液を前記作用極に接触させることを含む、工程、前記第一の反応層上に第二の反応層を設ける工程であって、両親媒性脂質を含む溶液を前記第一の反応層に接触させることを含む、工程を包含し、ここで、前記有機化合物を含む溶液および前記両親媒性脂質を含む溶液のうちの少なくとも１つは電子伝達体を含み、前記両親媒性脂質を含む溶液はさらに膜結合型のピロロキノリンキノン依存型グルコースデヒドロゲナーゼを含むことを特徴とする。
【００２８】
本発明のバイオセンサの製造方法の好ましい実施形態では、第一の反応層および第二の反応層は、それぞれ単分子層を形成している。
【００２９】
さらに好ましい実施形態では、上記有機化合物は、下記一般式（１）、（２）、または（３）で表される化合物である：
【００３０】
ＨＳ−（ＣＨ2）n−Ｘ                      （１）
Ｘ−（ＣＨ2）n−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）n−Ｘ    （２）
Ｓ−（ＣＨ2）n−Ｘ                        （３）
（但し、上記一般式（１）、（２）、および（３）において、ｎは１〜２０の整数、Ｘはメチル基、ベンジル基、アミノベンジル基、カルボキシベンジル基、またはフェニル基である）。ｎは５〜１５の整数であることがさらに好ましい。
【００３１】
本発明のバイオセンサの製造方法の好ましい実施形態では、上記両親媒性脂質は、Ｌ−α−ホスファチジルコリン，β−オレオイル−γ−パルミトイルである。
【００３２】
本発明のバイオセンサの製造方法の好ましい実施形態では、上記電子伝達体は１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムである。
【００３３】
本発明のバイオセンサの製造方法の好ましい実施形態では、上記作用極は、金、白金、またはパラジウムを含有する。
【００３４】
本発明のバイオセンサの製造方法の好ましい実施形態では、上記電極系の対極は、金、白金、またはパラジウムのいずれも含有していない。
【００３５】
本発明のバイオセンサの製造方法の好ましい実施形態では、上記電極系の作用極の表面全体と、対極の表面の一部が上記第一および第二の反応層で被覆されている。さらに好ましくは、対極の上記第一および第二の反応層で被覆されていない部分の面積が、作用極の面積よりも大きい。
【００３６】
本発明のバイオセンサの製造方法の好ましい実施形態では、上記電極系の作用極の表面のみが、第一および第二の反応層で被覆されている。
【００３７】
本発明のバイオセンサの製造方法の好ましい実施形態では、上記一対の電極の各々は、上記試料液の供給路をその間に形成するように互いに向き合って配置された２つの絶縁性基板の対向面上にそれぞれ支持されている。
【００３８】
本発明のバイオセンサの製造方法の好ましい実施形態では、上記有機化合物を含む溶液および上記両親媒性脂質を含む溶液のうちの少なくとも１つは、ｐＨ緩衝剤をさらに含む。
【００３９】
本発明は、ピロロキノリンキノン依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＰＱＱ−ＧＤＨと略記）が、基体上の電極表面に結合させた硫黄原子を含む有機化合物の膜と、さらにその有機化合物の膜の上に設けられた両親媒性脂質の膜とからなる二成分膜を利用することにより、上記電極表面に安定的に固定化され得ることを本発明者らが見出したことに基づいている。
【００４０】
電極表面で起こる酸化還元反応に対するＯＩＣの影響および電極表面に吸着するＡＩＣの影響を効果的に防止し、且つ、電極との間でグルコースの関与する酸化還元反応のみを選択的に行う手段として、本発明は、電極上に設けられた上記二成分膜とその二成分膜に結合または吸着させた酵素、すなわち、膜結合型のＰＱＱ−ＧＤＨを使用する。本発明者らの知る限り、このような二成分膜と膜結合型ＰＱＱ−ＧＤＨとをグルコースセンサへ適用した例は、本発明以前にはなかった。
【００４１】
このように、電極上に形成された二成分膜中にＰＱＱ−ＧＤＨが固定化されているバイオセンサ用電極を用い、かつ、適切な電子伝達体をその二成分膜中に合わせて用いることにより、基質であるグルコースに対して高度に選択的な電気化学酸化を可能とする系が実現する。
【００４２】
一般に、グルコースの選択的な酸化反応を触媒する酵素は、その反応の様式から、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）、およびグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）に大別される。さらに、ＧＤＨには、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）依存型ＧＤＨ（ＮＡＤ−ＧＤＨ）とＰＱＱ−ＧＤＨが存在することが知られている。
【００４３】
さらに、ＰＱＱ−ＧＤＨには、従来からそのバイオセンサへの適用が公知であった水溶型ＰＱＱ−ＧＤＨと、それとは別に、膜結合型のＰＱＱ−ＧＤＨが存在することが知られている（例えば、Ｏｕｂｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｖｏｌ．１８  Ｎｏ．１９  ｐｐ．５１８７−５１９４，  １９９９、およびＭａｔｓｕｓｈｉｔａ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８９，２８（１５），６２７６−８０を参照のこと）。膜結合型のＰＱＱ−ＧＤＨとは、その蛋白質分子の表面に疎水性ドメインを有しており、その疎水性ドメインが、例えば、細胞膜のような脂質二重層の疎水性部分と疎水相互作用により高親和性で結合することで、生体内において生体膜への安定的な固定が実現されているようなＰＱＱ−ＧＤＨのことである。一方、ＧＯｘおよびＮＡＤ−ＧＤＨには、このような膜結合型のものは知られておらず、水溶型のみが現在利用可能である。
【００４４】
これらの酵素、すなわち、ＧＯｘ、ＮＡＤ−ＧＤＨ、およびＰＱＱ−ＧＤＨのうち、本発明における硫黄を含む有機化合物／両親媒性脂質を主成分とする二成分膜への固定には、膜結合型のＰＱＱ−ＧＤＨを用いることが最も好適である。なぜなら、膜結合型であれば、上記二成分膜の疎水性部分へ、グルコースの選択的酸化反応を触媒する酵素を安定的に結合または吸着させることができるからである。他方、水溶型では、酵素分子表面に実質的に疎水性ドメインがないため、上記二成分膜の疎水性部分に高親和性で結合させることが困難である。
【発明の効果】
【００４５】
本発明は、ＯＩＣやＡＩＣを含む流体を試料液とするバイオセンサにおいて、前記ＯＩＣが作用極で酸化されることにより発生する測定誤差、ならびに該ＡＩＣが電極（作用極）表面に吸着することにより発生する測定誤差を排除し、迅速かつ高精度に試料液中の基質を測定することができる簡易な構造のバイオセンサを提供する。
【００４６】
本発明のバイオセンサは、ＯＩＣの作用極での酸化、ならびにＡＩＣの電極（または、作用極）表面への吸着を上記二成分膜によって阻止し、なおかつ、使用する酵素と作用極との間の電子伝達を達成することによって、これまでの課題であった基質濃度測定における測定誤差を排除する。特筆すべきことに、本発明は、酸素によるＰＱＱ−ＧＤＨからの電子受容は起こらないので、従来のグルコースオキシダーゼを用いたときのようなグルコース酸化に対する溶存酸素の影響もまた発生しないという利点を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
本発明の一実施の形態におけるバイオセンサは、少なくとも一対の電極を含む電極系と、上記電極系を支持するための少なくとも１つの絶縁性の基板と、上記電極系の少なくとも作用極上に設けられた第一の反応層であって、電極に結合または吸着し得る官能基および疎水性の炭化水素基を含む有機化合物を含む第一の反応層と、上記第一の反応層上に設けられた第二の反応層であって、当該第一の反応層の疎水性部分に結合または吸着し得る両親媒性脂質を含む第二の反応層と、上記第一および第二の反応層によって構成される二成分膜に担持された試薬系であって、少なくとも膜結合型のピロロキノリンキノン依存型グルコースデヒドロゲナーゼおよび電子伝達体を含む試薬系とを備えている。
【００４８】
以下、図面を参照しながら、本発明について説明する。
【００４９】
図１は、本発明の一実施の形態に係るバイオセンサにおいて、二成分膜およびそれに内包される試薬系を取り除いた状態の分解斜視図である。基板１上には、作用極２及び対極３が設けられている。このような電極を形成するには、ガラスのような電気絶縁性の基板１上に、電極パターンを形成すべき基板上の部分以外の基板表面を覆うための樹脂のようなものでできた電極パターンマスクを置き、その上から金のような金属をスパッタリングすればよい。このような方法は、当該分野で常法として用いられるものである。なお、本願において、用語「作用極」は、主として電子伝達体の酸化反応を起こさせる電極（アノード）のことを、用語「対極」は、主としてその他の反応を起こさせる電極（カソード）のことを指すものとして用いられる。但し、還元反応を、基質の検出および／または定量に用いる場合は、アノードとカソードとは上記と逆になる。
【００５０】
代替的に、特許文献１に記載されているように、例えば樹脂製の基板１上にスクリーン印刷により金属ペーストを印刷して電極パターンを形成してもよい。なお、金とガラスとの接着をよくするために、金とガラスとの間にクロムの層を形成して両者間の密着性を高めてもよい。これら作用極２及び対極３は、それぞれリード４及び５によって、バイオセンサ外部の測定用端子と電気的に接続される。なお、本明細書中で文脈に応じて作用極２と対極３とを特に区別せずに、単に電極ということがある。また、図１からもわかるように、電極とリードとは、同じ材料によって一体的に形成されていることが多いが、そのような場合、本発明では、電極とは、そうした構造のうちの試料液と接触するための部分をいうものとする。
【００５１】
次に、図２及び図３を参照して説明する。図２は、本発明の一実施形態に係るバイオセンサの長手方向断面図であり、図３は、本発明の一実施形態に係るバイオセンサ作製スキームの一部と本発明の原理の概略を示した模式図である。
【００５２】
基板１上に形成された作用極２上に、硫黄原子を含む有機化合物の膜１０と、さらにその上に、両親媒性脂質の膜１１が形成される。試薬系としてＰＱＱ−ＧＤＨのような酵素及び１−メトキシ−５−メチルフェナジウムのような電子伝達体は、膜１０および膜１１からなる二成分膜に内包されている。
【００５３】
図３に示すように、硫黄原子を含む有機化合物の膜１０は、硫黄原子（図中Ｓで示される）を介して作用極２に結合している。前述の一般式であらわされるこの有機化合物は、疎水性部分（図３中で一本の折れ線で示されている）を有している。上記有機化合物は、基板上に上記両親媒性脂質との均一な二成分層を形成させるために、この疎水性部分が均一な長さのものを使用することが好ましい。それにより、上記有機化合物の単分子層が基板上に形成されやすくなり、結果として、二成分層が均一になり、安定したブロッキング効果が得られる。上記疎水性部分を形成する炭化水素鎖の長さは、上記一般式（１）、（２）、または（３）におけるｎの大きさに依存する。ｎは、１〜２０の整数であることが好ましく、５〜１５の整数であることがさらに好ましい。最適なｎは、ＯＩＣによる妨害電流の排除とともに、グルコースの酸化還元に基づく電流を検出し易くするという観点から、上記範囲内で適宜選択され得る。
【００５４】
硫黄原子を含む有機化合物としては、前述の一般式（１）、（２）、または（３）で表される化合物であることが好ましい。これらには、例えば、エチルチオール、プロピルチオール、ブチルチオール、ペンチルチオール、ヘキシルチオール、ヘプチルチオール、オクチルチオール、ノニルチオール、デカンチオール、ウンデカンチオール、ドデカンチオール、トリデカンチオール、テトラデカンチオール、ペンタデカンチオール、ヘキサデカンチオール、ヘプタデカンチオール、オクタデカンチオール、ノナデカンチオール、イコサンチオール、およびそれら各々に対応するジスルフィド（同一構造の上記チオールがＳ−Ｓカップリングした構造を有する）、ならびにそれらの末端がベンジル基、アミノベンジル基、カルボキシベンジル基、あるいはフェニル基などであるチオールおよびジスルフィドなどが例として挙げられる。これらの有機化合物は、当業者に周知の供給業者から市販品として入手可能である。上記チオール化合物及びジスルフィド化合物は金属表面に非可逆的に強く吸着、結合し、実質的に単分子膜を形成する傾向が強いため好ましい。さらに、このような単分子膜からなる薄膜は、規則性を持って配列しているため、その膜表面と両親媒性脂質の親和性を利用して、両親媒性脂質の膜をその上にさらに形成させる上で好都合である。
【００５５】
図３を再び参照して、硫黄原子を含む有機化合物の膜１０で基板１上の作用極２を被覆した後、さらにその上に疎水性部分（図３中、二本の折れ線で示す）と親水性部分（図３中、白抜きの楕円で示す）とを有する両親媒性の脂質が均一に単層を成した膜１１を形成する。その手順については、後述する。図３からわかるように、両親媒性脂質の疎水性部分が上記硫黄原子を含む有機化合物の疎水性部分と疎水相互作用により結合することによって、二成分膜（１０、１１）を形成する。二成分膜の中には、電子伝達体１２が散りばめられて内包されている。さらに、膜結合性ＰＱＱ−ＧＤＨが、二成分膜の疎水性部分と疎水相互作用により高親和性で結合し、膜に埋め込まれている。実施例では、その両親媒性脂質として、Ｌ−α−ホスファチジルコリン，β−オレオイル−γ−パルミトイルを使用しているが、他の両親媒性脂質であってもよい。その疎水性部分の長さは、二成分膜を形成した際に、酵素を埋め込める程度に長いものが選択される。その長さは、使用する酵素の大きさおよびその疎水ドメインの大きさに依存する。
【００５６】
上記のように、本発明に使用する前記両親媒性脂質としては、Ｌ−α−ホスファチジルコリン，β−オレオイル−γ−パルミトイルが好ましい。Ｌ−α−ホスファチジルコリン，β−オレオイル−γ−パルミトイルは、二本の疎水鎖の長さが比較的揃っているため、両親媒性脂質の膜１１の厚さが均一となり、より安定したＯＩＣ  １５とＡＩＣ  １４に対するブロッキング効果が得られる。本発明に使用するために好適な他の両親媒性脂質の例としては、例えば、Ｌ−α−フォスファチジン酸、Ｌ−α−フォスファチジルコリン、Ｌ−α−フォスファチジルエタノールアミン、およびＬ−α−フォスファチジル−ＤＬ−グリセロールのそれぞれのジオレオイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジラウロイル、ジミリストイル、ジリノレオイル誘導体などのリン脂質、または糖脂質、胆汁酸などが挙げられる。このような両親媒性脂質は、当業者に周知の供給業者から市販品として入手可能である。
【００５７】
上記のような二成分膜を使用すると、ＯＩＣ  １５のバイオセンサ電極表面への拡散を完全（または、ほぼ完全）にブロックすることができ、ＰＱＱ−ＧＤＨとグルコースとの反応に続く、電子伝達体１２と作用極２との反応という一連の反応のみを選択的に行うことができる。その結果、作用極２でＯＩＣ  １５が酸化されることにより生じる測定誤差が排除され、高精度な測定を行うことが可能となる。さらに、ＡＩＣ  １４の作用極２表面への吸着も完全（または、ほぼ完全）にブロックできる。また、ＡＩＣ  １４の両親媒性脂質１１に対する親和性は、ＡＩＣ  １４の金属に対する親和性に比べて著しく低いため、作用極２の表面にＡＩＣ  １４が吸着することによる測定誤差が低減され、高精度な測定を行うことが可能となる。
【００５８】
ここで、本発明において使用する二成分膜について、さらに説明する。
【００５９】
まず、硫黄原子を含有する有機化合物の膜１０に関して、硫黄原子は、この有機化合物において電極への接着を確保する役割を果たしている。また、上記一般式（１）、（２）、または（３）から明らかなように、上記有機化合物は、−（ＣＨ2）n−Ｘで表される疎水性部分を有している。この疎水性部分は、先に説明したように両親媒性の膜１１の疎水性部分と疎水相互作用により高い親和性で結合することによって、二成分膜を安定的に維持するのに役立っている。したがって、このような考察によれば、本発明において膜１０を形成するために使用され得る化合物は、上記の硫黄原子を含有する有機化合物に限定されず、これと機能的に等価なものでも同様に使用され得ることは理解され得る。すなわち、電極との安定的な接着を実現する官能基と、両親媒性脂質との高親和性の結合を実現し得る疎水性部分とを有する化合物であれば、本発明の二成分膜を形成するために使用することができる。さらに、先に説明したように、そのような機能的に等価な化合物は、電極表面上に単分子層を形成し得るような構造を有することが好ましい。それにより、層の厚さが均一となり、より安定したＯＩＣのブロッキング効果を得ることができる。しかしながら、膜１０は必ずしも単分子層である必要はない。例えば、膜１０は、一部の上記有機化合物分子の官能基が電極と接しておらず、かつ前記分子の疎水性部分が実質的な単分子層の隙間に挿入されているような状態を有する層であってもよい。あるいは、基板および電極の表面ラフネスの影響により、膜１０を構成する層が全体として波打っているような構造、もしくは層の一部あるいは全部が多分子層を形成しているような構造をとりうる場合が考えられる。以上のような場合でも、本願発明の効果は得られるものと考えることができる。電極上に形成された硫黄原子を含有する有機化合物の膜１０およびこれと機能的に等価な膜を包括的にいう概念を指して、本明細書において、「第一の反応層」という用語を使用する。
【００６０】
さらに、上記膜１０上に形成される両親媒性脂質の膜１１に関して、両親媒性脂質の疎水性部分は、上記第一の反応層を形成する化合物の疎水性部分と、疎水相互作用により高い親和性で結合する役割を担っている。ここで、膜１１は必ずしも図３に示したような単分子層である必要はない。例えば、膜１１は、一部の上記両親媒性脂質分子の疎水性基の先端が膜１０と接しておらず、かつ前記分子の疎水性部分が実質的な単分子層の隙間に挿入されているような状態を有する層であってもよい。あるいは、基板および電極の表面ラフネス、あるいは膜１０の構造の影響により、膜１１を構成する層が全体として波打っているような構造、もしくは層の一部あるいは全部が多分子層を形成しているような構造をとりうる場合が考えられる。このような場合でも、本願発明の効果は得られるものと考えることができる。第一の反応層上に形成される両親媒性脂質の膜１０およびこれと機能的に等価な膜を包括的にいう概念を指して、本明細書において、「第二の反応層」という用語を使用する。
【００６１】
「二成分膜」とは、要するに、電極上に形成されたこのような第一の反応層と第二の反応層とからなるものをいう概念である。代表的には、図２および図３で模式的に示すように、細胞膜などに見られる脂質二重層に似た環境を提供するものである。それにより、膜結合型の酵素が、天然の細胞膜などで見られるように、二成分膜の中に埋め込まれた状態をとることができる。ただし、前述したように、膜１０および膜１１は必ずしも単分子層である必要はないため、二成分膜は必ずしも図３に示したような２つの単分子層の組合せから成る二分子層である必要はない。さらには、第一の反応層と第二の反応層の境界部分付近が、前記官能基を有する有機化合物の分子と両親媒性脂質分子とが複雑に混合・分散されたような構造を有していてもよい。本発明の二成分膜は、電極表面で起こるグルコースの酸化還元反応に対するＯＩＣの影響および電極表面に吸着するＡＩＣの影響を効果的に防止し、且つ、電極との間でグルコースの関与する酸化還元反応のみを選択的に行うという機能を実現するものである。本発明において、二成分膜にはさらに、上記酵素と作用極２との間で電子輸送を実現するための電子伝達体１２が含まれている。
【００６２】
本発明において使用される電子伝達体１２としては、ＰＱＱ−ＧＤＨから作用極２への電子輸送を実現する化合物が用いられる。本発明において使用される電子伝達体１２としては、１−メトキシ−５−メチルフェナジウムのような化合物が、分子の平面性が高く、膜の内部に挿入されるので、作用極近傍に存在し、効率の高い電子伝達をするため、好ましい。さらに、フェナジン誘導体、フェノチアジン誘導体（アズールおよびチオニンなど）、およびキノン誘導体なども同様に分子の平面性が高く、好ましい。これらの化合物は、当業者に周知の供給業者から市販品として入手可能である。
【００６３】
さらに、前記電子伝達体１２は、ポリマーバックボーンに結合した形態（図４Ａを参照）、またはそれ自身の一部もしくは全部がポリマー鎖を形成するような形態（図４Ｂを参照）であってもよい。このような電子伝達体は、当業者に周知の供給業者から市販品として入手可能である。
【００６４】
電子伝達体１２は、これらの一種または二種以上が使用される。また、これらは一例であって、本発明の実施に用いる電子伝達体１２は上記の例に限定されない。
【００６５】
次に、電極上への二成分膜の形成の仕方について説明する。
【００６６】
図２に模式的に示すように、作用極２の表面のほぼ全部が硫黄原子を含む有機化合物の膜１０で被覆されていることが好ましい。硫黄原子を含む有機化合物の膜１０の被覆は、作用極２表面を前記有機物の溶液に浸漬する方法あるいは作用極２表面にその溶液を滴下する方法によって達成される。あるいは、前記有機物の蒸気に表面をさらすことによっても同様の被覆を行うことができる。しかしながら、図１および図２に示すように作用極２と対極３とが同一基板上に配置されている場合、作用極表面のみ、あるいは対極の一部と作用極の表面の全体またはほぼ全体を被覆するといった場合には、前記有機化合物の溶液による被覆領域を正確に規定するためには、次のようにすることが好ましい。
【００６７】
すなわち、作用極２および必要に応じて対極３とほぼ同じ形状を有する面であって、それらと所望の接触面積を形成し得る面を有する樹脂製の棒状の部材のその表面に、前記有機化合物の溶液を少量塗布し、この部材の当該表面を作用極２の表面および必要に応じて対極３を含む所望の領域に接触させることにより、前記部材の表面上に塗布された前記有機化合物の溶液を、作用極２表面上に転写することができる。このようにして、有機化合物の膜で覆われる電極上の領域が正確に規定され、バイオセンサの測定精度を保持することができる。このような、いわゆる転写法は当該分野でよく用いられており、当業者の周知の技術である。
【００６８】
作用極表面を被覆している、硫黄原子を含む有機化合物の膜１０を両親媒性脂質によってさらに被覆するには、両親媒性脂質のベシクル（リポソーム）分散液に、前記の、表面が硫黄原子を含む有機化合物の膜により被覆された作用極を浸漬すればよい。
【００６９】
ＰＱＱ−ＧＤＨ、及び電子伝達体を上記両親媒性脂質膜内に包埋するには、それぞれの膜の形成過程において、ＰＱＱ−ＧＤＨ、及び電子伝達体を溶存させておく方法が効果的である。
【００７０】
本発明の実施において測定対象となる基質を含む試料液としては、グルコースを含有する試料液が好ましい。例としては、血液、血漿、血清、細胞間質液、唾液や尿などの生体試料液、あるいは食品や飲料水などが挙げられる。さらには、通常の実験室レベルで使用される電解液、環境測定に使用される液体なども用いることが可能である。特にグルコースの測定においては、全血や血漿、あるいは尿など、グルコースの他にＯＩＣやＡＩＣを含む液体を試料液とすることが多い。
【００７１】
ここで、試料液中に含まれる基質の測定における指標は、電気化学反応により変化する出力であればよく、例えば、電流や通電電荷量を用いることができる。
【００７２】
本発明のバイオセンサにおいて、作用極２は金、白金またはパラジウムを含有することが好ましい。このようにすると、作用極２に印加される電位が安定するため、より精度の良い測定が実現される。
【００７３】
また、上記硫黄原子を含む有機化合物の吸着が強固であるという観点から、作用極２が金、パラジウム、白金等の貴金属や、銀、銅、カドミウムなどの他の遷移金属を含有することが好ましい。したがって、実質的に作用極２のみを前記有機化合物の膜１０で被覆する目的においては、対極３にこれら金属を含有させないことが好ましい。
【００７４】
さらに、対極３の表面の少なくとも一部が、硫黄原子を含む有機化合物の膜１０、および両親媒性脂質の膜１１で被覆されていないことが好ましい。このようにすると、対極３の表面において、前記膜で覆われていない部分では、前記膜に覆われている部分に比べて、試料液中に含まれる還元される物質が到達しやすくなるため、対極３での還元反応（カソード反応）が進行しやすくなり、より安定な測定を行うことが可能となる。また、対極３における、硫黄原子を含む有機化合物の膜１０、および両親媒性脂質の膜１１で被覆されていない部分の面積が、作用極２の面積よりも大きいことがより好ましい。さらには、対極３上に硫黄原子を含む有機化合物の膜１０、および両親媒性脂質の膜１１が実質的に存在しないことが好ましい。さらには、実質的に作用極２のみが硫黄原子を含む有機化合物の膜１０、および両親媒性脂質の膜１１で被覆されていることが好ましい。このようにすると、対極３での還元反応がより円滑に進行し、さらに安定な測定を行うことが可能となる。
【００７５】
図１を参照して、上記のように調製した基板１に、スリット６を有するスペーサー７、および空気孔８を備えたカバー９を図１の一点鎖線で示すような位置関係をもって接着することにより、本発明のバイオセンサが作製される。スペーサー７のスリット６の部分に試料液供給路が形成される。バイオセンサの端部におけるスリット６の開放端部は、試料液供給路への試料液供給口となる。
【００７６】
図１に示す構造のバイオセンサの試料液供給路となるスリット６の開放端に試料液を接触させると、試料液は、試料液供給路内へ毛細管現象により導入され、試薬系の作用によって酵素反応が進行する。このように、電極系を設けた基板１に、スペーサー７およびカバー９からなるカバー部材を組み合わせて試料液供給路を形成すると、測定対象となる基質を含む試料液のバイオセンサへの供給量を一定にすることができるので、測定の精度を向上させることができる。また、試料液供給路を設けたバイオセンサにおいては、ｐＨ緩衝剤をカバー部材側に設けることもできる。
【００７７】
また、図７に示すように、対極３または作用極２のうちどちらか一方を、それに対応するリード５または４とともに形成した絶縁性の第２の基板を、カバー９のかわりに用いてもよい。この場合も、基板１、スペーサー７及び第２の基板により試料液供給路が形成されるので、試料液のバイオセンサへの供給量を一定にすることができ、測定の精度を向上させることができる。このような形態のバイオセンサの例は、例えば、米国特許第６，４５８，２５８号に記載されている。
【００７８】
さらに、上記のように試料液供給路を形成せず、基板１のみでバイオセンサを構成することもできる。この場合、試薬系は電極系上またはその近傍に設ける。このような形態のバイオセンサの例は、例えば、前述の特許文献３に記載されている。
【００７９】
以下、実施例を用いて本発明を説明するが、これらの実施例は、本発明の例示であって本発明を制限するものではない。
【実施例１】
【００８０】
（本発明のバイオセンサの作製）
（ａ．プロテオソーム懸濁液の調製）
以下の調製法は、一例であって、これのみに限定されるわけではない。
【００８１】
まず、Ｌ−α−ホスファチジルコリン，β−オレオイル−γ−パルミトイル（以下、ＰＣＯＰと略記する）（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（和光純薬工業（株））から入手）のリポソームを以下のようにして調製した。ＰＣＯＰを、その濃度が１０ｍＭとなるように丸底フラスコ中のトリクロロメタンに溶解した。ロータリーエバポレーターを用いて、減圧下、溶媒を完全に蒸発させた。次いで、ＰＣＯＰ濃度が４０ｍＭとなるよう、２−プロパノールを用いてフラスコ中のＰＣＯＰを再度溶解し、得られた溶液の０．５ｍＬを、０．１５ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ＝７．３）１０ｍＬに加えた。この溶液を１０分間激しく攪拌することにより、ＰＣＯＰのリポソームの縣濁液を得た。
【００８２】
次いで、酵素と電子伝達体を上記のリポソームに組み込むために、上記のＰＣＯＰのリポソーム縣濁液１０ｍＬにＰＱＱ−ＧＤＨ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓから前述のＭａｔｓｕｓｈｉｔａ  ｅｔ．  ａｌ（１９８９）に記載のように精製した）１ｍｇと、電子伝達体である１−メトキシ−５−メチルフェナジニウム（以下、ＭＭＰと略記）（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（株式会社  同仁化学研究所）から入手）３０ｍｇとを添加し、この溶液を１０分間激しく攪拌した。このようにして得たＰＱＱ−ＧＤＨとＭＭＰとを含むＰＣＯＰのリポソーム縣濁液を、以下、ＭＭＰ−プロテオソーム縣濁液と表記する。
【００８３】
（ｂ．基板の調製）
一方、作用極および対極を基板上に作製するために、まず、ガラス製の電気絶縁性の基板１上に、樹脂製の電極パターンマスクを設置し、その上からクロムをスパッタリングしてクロム層を形成した。さらにその上に金をスパッタリングすることにより、作用極２およびリード４ならびに対極３およびリード５を形成した。
【００８４】
（ｃ．電極の加工）
このように形成した作用極２を、ｎ−オクチルチオール（以下、ＯＴと表記する）により、前述の転写法に従って、以下のように被覆した。まず、基板１上の作用極２とほぼ同じ形状の平面を有する棒状の樹脂製器具の該平面に、ＯＴのエタノール溶液（濃度５ｍＭ）を少量塗布した。次いで、そのＯＴを塗布した面を、作用極２表面のほぼ全面と重なるように、注意深く位置調節してから重ね合わせた。次いで、作用極２上にＯＴ溶液を残存させるようにして前記棒状の器具を作用極２から引き離し、ＯＴが作用極表面へ吸着されるまで放置した。
【００８５】
これにより、分子内に硫黄原子を含む有機化合物の膜１０、すなわちＯＴの膜を形成し、１時間後、エタノール、超純水を順に用いて作用極２をリンスした。得られた基板１を１０ｍＭのＭＭＰ水溶液に１時間浸漬し、ＯＴ膜内へのＭＭＰの浸入を促進した。超純水を用いて基板１を十分にリンスした後、上記のＭＭＰ−プロテオソーム縣濁液に８時間浸漬し、作用極２上のＯＴの膜１０とＭＭＰ−プロテオソーム１７との融合を行った（図３を参照）。
【００８６】
上記の基板１を超純水にてリンスし、乾燥させた後、基板１にスペーサー７およびカバー９を組み合わせて図２のようなバイオセンサを作製した。
【００８７】
また、比較例として、ＰＱＱ−ＧＤＨ１ｍｇとＭＭＰ３０ｍｇを２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ＝７．３）１０ｍＬに溶解した溶液１μＬを、基板１上の作用極２の表面に滴下し乾燥させ、基板１にスペーサー７およびカバー９を組み合わせてバイオセンサを作製した。
【実施例２】
【００８８】
（本発明のバイオセンサに対するＡＩＣの影響）
一定量のＤ−グルコース（４００ｍｇ／ｄＬ）を含む血液を試料液として、上記のような調製した本発明の一実施形態に係るバイオセンサおよび比較例のバイオセンサの試料液供給路の開口部、すなわちスペーサー７のスリット８の開放端部に供給した。なお、血液中の赤血球容積比（ヘマトクリット、以下Ｈｃｔと略記する）が２５、４０、６０％と異なる試料液を用いた。一定時間（反応時間２５秒）経過後に対極３に対して５００ｍＶの電圧を作用極２に印加し、その５秒後に流れた電流値を測定した。図５に示すように、比較例のバイオセンサの場合には、Ｈｃｔの増加に伴い、電流が低下する傾向が見られた。
【００８９】
これは、作用極表面に吸着する赤血球の量がＨｃｔの増加に伴い増大する傾向があり、その傾向に対応して電極反応が阻害されていることを示唆している。その結果、グルコース濃度が同一であっても、電流値はＨｃｔの存在によって変化し、測定誤差が生じたものと考えられる。
【００９０】
一方、本実施例のバイオセンサは、Ｈｃｔの存在に拘わらずほぼ同一の電流値が得られた。よって、赤血球の作用極２表面への吸着は、作用極２表面に存在するＯＴとＰＣＯＰの膜によって抑制されたものと考えられる。有機化合物であるＯＴとＰＣＯＰの膜で被覆された電極表面の物性は、未被覆の金の表面から大きく変化している。あるいは、電極の界面は被覆膜の末端基によって、正もしくは負に帯電している。
【００９１】
これらの変化の両方、あるいはどちらか一方の効果により、血球の吸着が抑制されるようになったものと考えることができる。また、ＯＴとＰＣＯＰの膜内に取り込まれたＭＭＰは、ＰＱＱ−ＧＤＨと作用極との間の電子伝達を達成する能力があることがわかった。このように、ＯＴとＰＣＯＰの膜で被覆することにより、ＡＩＣの吸着による測定誤差を排除することが可能であった。
【実施例３】
【００９２】
（本発明のバイオセンサに対するＯＩＣの影響）
さらに、Ｈｃｔが４０％の血液にＯＩＣのひとつであるアスコルビン酸を添加し、元から血液中に含まれている量とあわせた全濃度が１、１．５、２ｍＭとなるよう調整した。これらの血液を使用し、上記と同様にして、電流値を測定した。図６に示すように、比較例のバイオセンサの場合には、アスコルビン酸濃度の増加に伴い、電流が増大する傾向が見られた。これは、作用極でアスコルビン酸の酸化反応が進行していることを示唆している。その結果、グルコース濃度が同一であっても、電流値はアスコルビン酸濃度によって変化し、測定誤差が生じたものと考えられる。
【００９３】
一方、本実施例のバイオセンサは、アスコルビン酸濃度に拘わらずほぼ同一の電流値が得られた。これは、作用極２の金電極表面が分子鎖長の長い有機化合物であるＯＴとＰＣＯＰの膜で被覆されているため、金電極表面へのアスコルビン酸の接近がこの膜によって抑制されたために得られた結果であると考えられる。このように、ＯＴとＰＣＯＰの膜で被覆することにより、ＡＩＣの吸着による誤差だけでなく、ＯＩＣの電気化学酸化による測定誤差を排除することが可能であった。
【実施例４】
【００９４】
（参照極の使用）
本実施例では、実施例１と同様の手順により作製した本発明の一実施形態に係るバイオセンサに試料液を供給した直後に、塩化カリウムと寒天からなる塩橋を介して、銀／塩化銀電極を試料液供給口付近の試料液と接触させた。銀／塩化銀電極はその電位が安定しており、参照極として用いることが可能である。
【００９５】
一定量のＤ−グルコース（４００ｍｇ／ｄＬ）を含む、種々のＨｃｔの血液を試料液としてバイオセンサの試料液供給路の開口部、すなわちスペーサー７のスリット８の開放端部に供給した。２５秒経過後に銀／塩化銀電極に対して５００ｍＶの電圧を作用極２に印加し、５秒後に流れた電流値を測定した。
【００９６】
その結果、Ｈｃｔに拘わらずほぼ同一の電流値が得られた。同一条件下における電流値のばらつきは、実施例２で得られた結果と比較してより小さいものであった。よってバイオセンサ系への参照極の導入により、測定値の安定性がより向上したことがわかった。
【００９７】
Ｈｃｔが４０％、アスコルビン酸濃度が１、１．５、２ｍＭの血液を用い、上記と同様にして、電流値を測定した。その結果、アスコルビン酸濃度に拘わらずほぼ同一の電流値が得られた。同一条件下における電流値のばらつきは、実施例３で得られた結果と比較してより小さいものであった。バイオセンサ系への参照極の導入により、アスコルビン酸濃度の変化に対する測定値の安定性も、より向上することがわかった。
【実施例５】
【００９８】
（ｎ−オクチルジスルフィドの使用）
本実施例では、ｎ−オクチルジスルフィドをＯＴの代わりに用いて、実施例１に示した方法でバイオセンサを作製した。血液中のグルコースに対する応答は、実施例２および３に述べた方法と同様にして測定した。
【００９９】
その結果、本実施例においても、実施例２および３と同様に、Ｈｃｔおよびアスコルビン酸濃度に拘わらずほぼ同一の電流値が得られた。ＯＴはｎ−オクチルジスルフィドのＳ−Ｓ結合が開裂することにより得られる化合物である。このような対応関係にあるチオールとジスルフィドは同様の膜を形成することが知られている。
【実施例６】
【０１００】
（異なる基板上に形成した作用極および対極）
本実施例ではカバー９上に対極３を形成した。作用極２の表面は実施例１に述べたように修飾した。血液中のグルコースに対する応答の測定を、実施例２および３に述べた方法と同様にして行った。
【０１０１】
その結果、本実施例においても、実施例２および３と同様に、Ｈｃｔおよびアスコルビン酸濃度に拘わらずほぼ同一の電流値が得られた。よって複数の基板上に電極を形成させた場合も、同様の効果が得られることが分かった。本実施例の場合、作用極２と対極３は異なる基板上に存在する。よって、対極３を膜で被覆せず、実質的に作用極２のみを膜で被覆するセンサを作製するにあたって、作用極２を配置した基板１をＯＴ溶液に浸漬する、あるいは基板１上の作用極２表面をＯＴの蒸気にさらす方法を用いることが可能である。このように、本実施例の形態よれば、同一面上に作用極と対極とが設けられたセンサと比べて、実質的に作用極のみが膜で被覆されたセンサを容易に製造することができる。
【実施例７】
【０１０２】
（白金またはパラジウムの使用）
本実施例では、白金あるいはパラジウムを用いて、作用極２および対極３を作製した。ガラス製の電気絶縁性の基板１上に樹脂製の電極パターンマスクを設置してクロムの層を形成し、さらに白金またはパラジウムをスパッタリングすることによって各電極を形成した。さらに、実施例１に述べた方法と同様にして作用極２表面を被覆した。血液中のグルコースに対する応答の測定を、実施例２および３に述べた方法と同様にして行った。
【０１０３】
その結果、白金を用いた場合、電流値はＨｃｔに対して若干の依存性を示したが、アスコルビン酸濃度を変化させてもほぼ同一の電流値を示した。一方、金の代わりに白金を用いて、実施例１に記載した比較例と同様にして作製したバイオセンサでは、電流がより大きくＨｃｔおよびアスコルビン酸濃度に対して依存した。
【０１０４】
このことから、白金を作用極の材料として用いた場合にも、本発明の膜で被覆することによるＯＩＣ、ＡＩＣの影響抑制効果が得られることがわかった。また、パラジウムを作用極の材料として用いた場合には、金で得られた結果と比較して同程度のＨｃｔ、およびアスコルビン酸濃度に対する非依存性が観測され、パラジウムもまた、本発明における非常に好適な電極材料であることがわかった。
【実施例８】
【０１０５】
（ｐＨ緩衝剤の効果）
ｐＨ緩衝剤をバイオセンサ系内にさらに包含させた場合のバイオセンサ特性を評価した。本実施例において調製したバイオセンサは、ｐＨ緩衝剤としてリン酸水素二カリウムとリン酸二水素カリウムの混合物を試薬系としてＰＱＱ−ＧＤＨおよび電子伝達体を含む両親媒性脂質の膜１１内に担持した以外、実施例１で用いたものと同様である。
【０１０６】
一定量のＤ−グルコース（４００ｍｇ／ｄＬ）を含み、Ｈｃｔの異なる血液を試料液としてバイオセンサの空間部に供給した。一定時間経過後に対極３に対して５００ｍＶの電圧を作用極２に印加し、その際に流れた電流値を測定した。その結果、得られた電流値はＨｃｔに依存しないものであった。
【０１０７】
実施例２および３で得られた結果と比較すると、電流値のアスコルビン酸濃度に対する依存性はほぼ変わらないが、Ｈｃｔ依存性はさらに軽減された。すなわち、よりＨｃｔに依存しない一定の電流値が同一グルコース濃度に対して得られた。
【０１０８】
このような結果が得られた理由は以下のようにして考えることができる。ｐＨ緩衝剤をバイオセンサ系内に包含させることにより、バイオセンサ内の試料液のｐＨは安定する。そのため、電極上に存在する膜の末端基の荷電状態が安定化し、血液中のＡＩＣに対する吸着防止効果が試料液ごとに一定となったものと考えられる。
【０１０９】
さらに、そのようなｐＨの安定により、酵素活性も安定し、一定時間後に生成する電子伝達体の還元体の量もまた試料液ごとに一定となったものと考えられる。ｐＨ安定化によるこれら二つの両方あるいは一方の安定化効果により、電流値のＨｃｔに対する依存性が軽減されたものと考えられる。本実施例において特に安定化効果が見られたのは、測定液のｐＨが４〜９であるときであった。したがって、好ましいｐＨ領域は、ｐＨ４〜９である。酵素活性が最も安定という観点からは、さらに好ましいｐＨ領域は、ｐＨ５〜８の範囲である。
【０１１０】
なお、上記実施例２〜８では電流値の測定を行ったが、電流値に代えて電荷量を測定した場合についても、上述の電流値と同様の傾向が見られた。
【０１１１】
また、上記実施例では、電極系への印加電圧を５００ｍＶとしたが、印加電圧はこの値に限定されることはない。電子伝達体が作用極において酸化される電圧であればよい。
【０１１２】
上記実施例においては反応時間を２５秒あるいは５５秒、電圧印加時間と電流検出時間をその５秒後としたが、これに限定されず、観測可能な大きさの電流を得ることのできる時間であればよい。
【０１１３】
さらに、必要に応じて、上記試薬系または試薬系に含まれる試薬のうち一つあるいは複数を作用極に固定化することによって、酵素、電子伝達体を不溶化または非溶出化させることが好ましい。その場合には、膜との間のファンデルワールス力による相互作用を利用する方法、共有結合法、架橋固定法または配位結合や特異的結合性の相互作用を用いた固定化法を用いることができる。特に本発明を実施するにおいては、電極上の硫黄原子を含む有機化合物の膜に前記試薬を共有結合固定する方法もまた好ましい。
【０１１４】
膜結合型ＰＱＱ−ＧＤＨが本発明の実施において好適な酵素であることを記載したが、これは、必ずしも本発明において使用すべき酵素は、膜結合型ＰＱＱ−ＧＤＨのみに限定されるという意図ではない。膜結合型ＰＱＱ−ＧＤＨ以外の他の酵素であっても、分子表面の少なくとも一部に疎水性ドメインを有しており、上記のような二成分膜の疎水性部分と高親和性で結合し得る酵素（あるいは、二成分膜に埋め込まれる形態が実現できる酵素）であって、且つ、グルコースの選択的酸化反応を触媒する酵素あれば、同様に使用し得る。もちろん、好適な二成分膜を構成する成分の組み合わせは、そのような酵素に応じて変化し得る。
【０１１５】
上記試薬系にＰＱＱ−ＧＤＨ以外の酵素を含ませることにより、グルコース以外の基質の測定を行うことも可能である。例えば、スクロースをグルコースとフルクトースに分解する機能を有するインベルターゼを試薬系に追加することにより、スクロースの定量を行うことができる。
【０１１６】
上記実施例においては、電極およびそれらのパターンの作製方法としてマスクを通したスパッタリング法を用いたが、それに限定されず、例えば、スパッタリング法、イオンプレーティング法、蒸着法、化学蒸着法のいずれかで作製した金属膜をフォトリソグラフィーおよびエッチングと組み合わせてパターン作製をしてもよい。パターン形成はレーザーによる金属のトリミングによっても行うことができる。金属ペーストを用いて基板にスクリーン印刷を施し、電極パターンを形成してもよい。さらには、パターン化した金属箔をそのまま絶縁性基板上に接着させてもよい。
【０１１７】
これら電極系の形状、配置、個数等は上記実施例に示したものに限定されるものではない。例えば、作用極と対極をそれぞれ異なる絶縁性基板上に形成させてもよいし（図７を参照）、作用極と対極をそれぞれ複数個形成させてもよい。また、リードおよび端子の形状、配置、個数等も上記実施例に示したものに限定されるものではない。
【０１１８】
測定精度を向上させる目的においては、測定対象となる基質を含む溶液の量を容易に一定量に規定することができるため、スペーサーが上記バイオバイオセンサの構成要素として含まれていることが好ましい。しかし、一定体積の試料液を採取することのできる器具と合わせて本発明のバイオセンサを用いる場合には、スペーサー及びカバーからなるカバー部材は必ずしも必要ではない。これらのスペーサー、カバー、または基板に使用する材料は、実施例で基板の材料として使用したガラスのみに限らず、その他、例えば、シリコンおよびその酸化物などの無機材料、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）およびポリプロピレン（ＰＰ）などの樹脂のような電気絶縁性の材料も同様に本発明のバイオセンサの実施に使用され得る。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
以上のように本発明のバイオセンサは、試料液中に含まれるＡＩＣおよびＯＩＣの影響を受けず、迅速かつ高精度に試料液中の基質を測定することができる簡易な構造のバイオセンサ等として適している。特に、本発明のバイオセンサは、試料液中のグルコース濃度を検出するための使い捨てタイプのバイオセンサ等として適している。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】本発明の一実施の形態におけるバイオセンサの試薬系を除いた分解斜視図
【図２】本発明の一実施の形態におけるバイオセンサの長手方向断面図
【図３】本発明の一実施の形態におけるバイオセンサ作製スキームの一部と、本発明の原理の概略とを示した模式図
【図４】本発明のバイオセンサにおいて使用する電子伝達体の例を示す図：（Ａ）電子伝達体（図中Ａで示される）がポリマーバックボーンに結合した形態；（Ｂ）電子伝達体（全部）同士が互いに結合してポリマー鎖を形成した形態
【図５】本発明の一実施の形態において得られた電流のＨｃｔ依存性を示す図
【図６】本発明の一実施の形態において得られた電流のアスコルビン酸濃度依存性を示す図
【図７】本発明の一実施の形態におけるバイオセンサの試薬系を除いた分解斜視図
【符号の説明】
【０１２１】
１  基板
２  作用極
３  対極
４，５  リード
６  スリット
７  スペーサー
８  空気孔
９  カバー
１０  硫黄原子を含む有機化合物の膜
１１  試薬系としてＰＱＱ−ＧＤＨおよび電子伝達体を含む両親媒性脂質の膜
１２  電子伝達体
１３  ＰＱＱ−ＧＤＨ
１４  ＡＩＣ
１５  ＯＩＣ
１６  グルコース
１７  プロテオソーム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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