(57)【要約】【課題】識別素子たる酵素を均一に且つ安定的に固定することによって、この識別素子の活性を保持しつつ、正確且つ迅速な応答性、長期間の性能の安定性を備えた固定化酵素膜及びその製造方法を開発する。【解決手段】本は固定化酵素膜の製造方法は、ヒドロキシル基又はカルボキシル基を有する炭素基体の表面に、末端に硫黄原子又は窒素原子等の極性官能基を備えたシランカップリング剤を反応させてシロキサン結合による単分子膜を形成する第１工程と、金属原子を含む溶液中で金属原子を前記極性官能基の近くに配置させる第２工程と、識別素子たる酵素を含む溶液を浸し、前記金属元素との相互作用により酵素を近接位置に配属させる第３工程とからなる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロキシル基又はカルボキシル基を有する炭素基体の表面に、末端に硫黄原子又は窒素原子等の極性官能基を備えたシランカップリング剤を反応させてシロキサン結合による単分子膜を形成する第１工程と、
金属原子を含む溶液中で金属原子を前記極性官能基の近くに配置させる第２工程と、
識別素子たる酵素を含む溶液の中で、前記金属原子との相互作用により酵素を近接位置に配属させる第３工程と、
からなる固定化酵素膜の製造方法。
【請求項２】
シランカップリング剤を、  ３−メルカプトプロピルトリメキシシラン（ＭＰＳ）又は３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ）とした請求項１記載の固定化酵素膜の製造方法。
【請求項３】
第２工程において、金属原子を含む電解質溶液中で正負の電位を周期的に印加することにより金属原子を前記極性官能基の近くに配置させた請求項１又は２記載の固定化酵素膜の製造方法。
【請求項４】
炭素基体上に末端に硫黄原子又は窒素原子等の極性官能基を有するシロキサン結合による単分子膜を形成すると共に、該極性基の極性作用によって金属原子を極性基の近傍に配置し、該金属原子との相互作用により識別子たる酵素を金属原子の近傍に配属させたことを特徴とする固定化酵素膜。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、固定化酵素膜とその製造方法に関し、特にバイオセンサーにおける固定化酵素膜とその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、優れた分子識別機能をもつ生体素子と電気化学デバイス、あるいはエレクトロニクスデバイスを組み合わせて構成されるバイオセンサーの開発は、急速に発展しつつある。
バイオセンサー、特にアンペロメトリーな酵素センサーとは、グルコースオキシターゼ等を固定化酵素とし、電子伝達系によって基質の濃度変化を電流値の変化に変換し、測定するものである。
【０００３】
従来より酵素センサーにおける酵素の固定には、ゾル−ゲル法が利用されている。すなわち、生体適合性に優れるシランカップリング剤等の架橋剤をゲル状にして、メディエーター、識別素子たる酵素とともに電極内部に埋め込むことにより、酵素を固定していた。
【０００４】
図７は、従来のゾル−ゲル法によりＣｕをメディエーターとして、炭素電極内部に識別素子たるグルコースオキシターゼを固定した状態である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上述したゾル−ゲル法により作製したグルコースセンサーは、ＰＨ、温度の作製条件の微妙なズレによる、性能のばらつきが生じ易く、これはゲルが非晶質系の材料であるために、物性の制御が困難であることが要因といえる。具体的には、ゲル中に空洞が発生し、空洞表面の組成や内部構造に違いが生じるためである。
さらに電気的応答性についても誤差が生じ易く、これは識別素子たるグルコースオキシターゼ等の酵素が無秩序に配置されていることにより、個々の識別素子たる酵素の活性が保持されていないためである。
又、測定対象たるグルコース等の基質をゲル内に浸透させることにより測定するため、応答時間は数秒遅くなり、そして、識別素子たる酵素の結合状態にもバラつきがあるために、センサー等性能の長期間の安定性は、不十分である等の問題を有している。
【０００６】
従って本発明は、固定化酵素膜において、識別素子たるグルコースオキシターゼ等の酵素を均一に且つ安定的に固定することによって、この識別素子の活性を保持しつつ、固定化酵素材料の性能のバラつきを抑制し、正確且つ迅速な応答性、長期間の性能の安定性を確保することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上述した課題を解決すべく、請求項１記載のバイオセンサーの製造方法は、ヒドロキシル基又はカルボキシル基を有する炭素基体の表面に、末端に硫黄原子又は窒素原子等の極性官能基を備えたシランカップリング剤を反応させてシロキサン結合による単分子膜を形成する第１工程と、金属原子を含む溶液中で金属原子を前記極性官能基の近くに配置させる第２工程と、識別素子たる酵素を含む溶液を浸し、前記金属元素との相互作用により酵素を近接位置に配属させる第３工程とから成る。
【０００８】
請求項２記載の発明は、シランカップリング剤が、  ３−メルカプトプロピルトリメキシシラン（ＭＰＳ）又は３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ）で構成される。
【０００９】
請求項３記載の発明は、第２工程おいて、金属原子を含む溶液中で正負の電位を周期的に印加することにより金属原子を前記極性官能基の近くに配置させて構成される。
【００１０】
請求項４に記載の固定化酵素膜は、炭素基体上に末端に硫黄原子又は窒素原子等の極性官能基を有するシロキサン結合を形成すると共に、該極性基の極性作用によって金属原子を極性基の近傍に配置し、該金属原子との相互作用により識別子たる酵素を金属原子の近傍に配属させて構成される。
【００１１】
【作用】
上述の製造方法は、識別素子たる酵素を、（炭素電極／シランカップリング剤／金属）表面上で、金属の近傍に分散し、安定な結合状態を形成する。単分子膜上の固定であるために酵素が表面に均一に固定され、測定対象と識別素子の接触が良く、酵素の活性が保持される。さらに表面で反応が起こるために、応答速度は速く、バラツキも少ない。結合状態も一定であるために、長期間の性能の安定性も確保される。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
先ず、図１は固定化酵素膜（基体／ＭＰＳ／金属／グルコースオキシターゼ）の表面構造を示したものである。
【００１３】
固定化酵素膜の製造方法は、第１に基体表面にシランカップリング剤を用いてシロキサン結合による単分子膜を形成する工程と、第２にシロキサン結合の末端メルカプト基、アゾ基に金属原子を結合させる工程と、第３に該金属イオンに識別素子たる酵素を固定化する工程より成る。
【００１４】
第１工程においては、炭素電極にヒドロキシル基又はカルボキシル基を有する炭素基体を、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）又は３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ）を始めとする末端に硫黄原子又は窒素原子等の極性官能基を備えたシランカップリング剤の０．０１Ｍ〜０．１Ｍ程度の溶液に、５〜１０時間浸す。すると、電極表面のヒドロキシル基とシラノール基とが反応して、シロキサン結合を形成し、表面に単分子膜が形成される。
図２には当該製造方法により使用可能なシランカップリング剤を示したが、ＡＰＳ、ＭＰＳに限られず、Ｘについてアルコキシル基又はクロライド基、ＹについてＳ又はＮを含む極性官能基であれば使用可能である。また、−ＣＨ２−鎖上ｎは数を問わない。
ここで単分子膜とは、厳密には１分子の膜をいうが、本発明シランカップリング剤の場合、Ｘの反応性が高いので単分子膜に混じって多層膜領域が形成されることもある。
【００１５】
第２工程においては、メディエーターたる金属を固定するために、３ｍＭから１０ｍＭ程度のＣｕ、Ｆｅ等の金属原子を溶かした電解質溶液に基体を浸し、正負１Ｖ以下の電位を５０ｍＶ／ｓ程度の速度で周期的に印加する方法を１０〜１５回繰り返す。すると、その周期的電位の印加の繰り返しにより、金属イオンが表面の末端−ＳＨ基−ＮＨ２基に配されると共に、その後、当該金属原子は官能基の極性作用によって末端官能基の近傍に安定して配置される。但しかかる工程においては、電位を印加しなくても金属原子を表面に結合させることは可能である。
また、上記金属は、Ｃｕ、Ｆｅの他、Ｃｏ、Ａｕ、Ｏｓ、Ａｇ、Ｎｉ、Ｒｕ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ｍｎ、Ｌａ、Ａｌ等、種々可能であり、複数の金属を合金として使用することも可能である。
【００１６】
第３工程においては、上記金属原子を配置した基体を、グルコースオキシターゼ等の過酸化水素を生成する酵素を０．１Ｍ程度の濃度に調整した水溶液に、２０〜３０分間程度浸す。これによって、メルカプト基又はアゾ基等と酵素間において、金属を相互作用させて、識別子たる酵素を金属原子の近傍に配属させる。
このとき、識別素子たる酵素はグルコースオキシターゼに限られず、酸化還元反応系において過酸化水素を生成する酵素であれば、種々の酵素が応用可能である。すなわち、ラクタートを識別するラクタートオキシターゼ、エタノールを識別するアルコールオキシターゼ、コレステロールを識別するコレステロールオキシターゼ、アミノ酸を識別するアミノアシッドオキシターゼ、グルタル酸を識別するグルタメートオキシターゼ等の酵素が、識別素子として金属により固定化できる。
【００１７】
但し本発明は、自己組織化膜により酵素を固定する固定化酵素膜の製造に関するものであり、バイオセンサーに限らず、ゲル表面に過酸化水素を生成するものに限られない酵素を固定することを基礎とする、バイオリアクターにおいても応用が可能である。
【００１８】
次に、本固定化酵素膜の実施形態の作用をバイオセンサーを例に説明する。
過酸化水素を生成する反応系を備えたバイオセンサーにおける電子伝達系を表した図３に示す如く、例えば測定対象である溶液中のグルコースが、炭素電極表面に固定化されたオキシターゼ等の酵素に接触すると、以下に示す酸化還元反応の化学式１によってグルコン酸を生成する。
【００１９】
【化１】
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【００２０】
このとき、表面に固定化された酵素は、内部に配置された酵素に比して浸透等に時間をとられず応答時間の速いものとなる。
又、ヒドロキシル基を有する炭素電極の表面にＭＰＳ、ＡＰＳ等のシランカップリング剤で形成されたシロキサン結合は、三次元構造的にアミメ構造等の金属原子を比較的均一に分散させ得る構造を形成するので、酵素を電極表面に分散させて配置させることができ、反応の均一性が確保できる。
このとき、酵素とこれを固定する金属原子との間は、金属原子と酵素内に存する極性基との間の相互作用で結ばれるので、懸念される酵素を失活させる虞がなく、酵素の活性を維持する。
そして、電解液中の過酸化水素は、以下の化学式２に示すような反応を起こす。
【００２１】
【化２】
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【００２２】
これによって、トランスデューサーたる炭素電極表面の電流値を変化させる。
このとき、酵素の近傍に配属された金属イオンの存在は、過酸化水素の酸化還元反応による電流値の変化を捕捉すると共に、それを電極での電流値変化に敏感に反映させる。
又、当該酵素及び金属原子は、シロキサン結合による単分子膜の末端に存するので、識別素子としての酵素と電極との間隔が極めて近く、メディエーターたる金属を始めとする電子伝達系において高効率及び高速の電子供受が行われ得る。
そして、バイオセンサーとしては、基質の付加に対して電流の差によりグルコース濃度を測定する。
また、固定化酵素膜としては、バイオセンサー以外に単分子レベルの膜としてバイオリアクター等の多様な応用が可能である。
【００２３】
【実施例】
以下に、グルコースオキシターゼを識別素子とした固定化酵素膜の実施例を示す。
【００２４】
先ず、トランスデューサーたる炭素電極の表面を、紙やすり等により物理的に研磨した。次にエタノールにより５分間の超音波洗浄を行った。さらに、０．１Ｎ硫酸の酸性溶液中で正負の電位を周期的に印加し、ＯＨ基を付加し、電極の表面を活性化させた。その後０．１ＭのＡＰＳ溶液に６時間浸した。
この結果ＡＰＳの結合した電極（ＧＣ／ＡＰＳ）を水で洗浄した後に、３．０ｍＭの金属原子（Ｃｕ  ｏｒ  Ｆｅ）を含む電解質溶液（０．１ＭのＫＮＯ３）に浸し、＋０．６Ｖから−０．４Ｖの間で、５０ｍＶ／ｓの速度による正負の電位を周期的に印加する工程を１２回行った。
最後に、電極（ＧＣ／ＡＰＳ／Ｍｅｔａｌ）をグルコースオキシターゼ溶液（２ｍｌの超純水中に２５ｍｇのグルコースオキシターゼを溶かしたもの）に２０分から３０分浸した。これにより固定化酵素膜（ＧＣ／  ＡＰＳ／Ｍｅｔａｌ／ＧＯｘ）は完成した。
【００２５】
図４は、実施例によって作製された固定化酵素膜（ＧＣ／ＡＰＳ／Ｍｅｔａｌ／ＧＯｘ）について測定した電流電位曲線である。ａ、ｂ、ｃ、の結果は電解質溶液中において、グルコース濃度が各々、０、３．８、７．０ｍＭの濃度により測定し、ｄ、ｅは、（ＧＣ／ＡＰＳ／Ｍ）、ｆ、ｇは（ＧＣ／ＡＰＳ／ＧＯｘ）に対して、０、７．０ｍＭの濃度により測定した結果である。電極表面において、電子伝達系における酸化、還元反応による電子供受に起因する図中凸部位がａ、ｂ、ｃ、においてグルコース濃度の変化に起因する電流値に顕著な違いが現れているのに対し、ｄとｅ、ｆとｇにおいては電流値の変動が確認できない。したがって、シランカップリング剤、金属原子、グルコースオキシターゼの相互作用により、電子伝達系における反応が活性化し、バイオセンサーとしての応答性が向上したことを表している。
【００２６】
図５は、（イ）は研磨及びＯＨ基付加後の炭素電極（ＧＣ）、（ロ）はＡＰＳ処理後の炭素電極（ＧＣ／ＡＰＳ）の原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）測定の結果を表したものである。表面の平坦性から、シランカップリング剤を結合させた時点で、単分子レベルで均一な表面が得られていることが示されている。すなわち、図２（ロ）で示した模式図の如き構造となっている蓋然性が高い。
【００２７】
図６は完成した固定化酵素膜（ＧＣ／ＡＰＳ／Ｆｅ／ＧＯｘ）によって、複数回にわたりグルコースを添加し、８００μＭづつのグルコースの濃度変化に伴う電流値の変化を測定したものである。図示の如く８００μＭのグルコースの濃度変化に伴って階段状に電流値が鋭く変化しており、短時間で電流値は安定する。又、１０回の測定について、同様の結果が得られているため、センサー材料として、広範囲の測定が可能であることが表されている。すなわち本発明により作成されたバイオセンサーは、高感度、且つ高安定性を有し、広範囲の測定が可能であることが証明された。
尚、固定化酵素膜（ＧＣ／ＡＰＳ／Ｆｅ／ＧＯｘ）は、最適化条件下で作製された同様の構造を有するセンサーが、７．３×１０−５Ｍから８．９×１０−３Ｍと広範囲のグルコース濃度について反応し、広範囲な測定が可能であった。
【００２８】
【発明の効果】
本発明においては、固定化酵素膜の製造工程において、識別素子たる酵素を、（炭素電極／シランカップリング剤／金属）表面上で金属の近傍に分散し、安定な結合状態を形成し、長時間の使用に耐え得る。
また、単分子膜上の固定であるために酵素が表面に均一に固定され、測定対象と識別素子の接触が良く、酵素の活性が保持され、さらに表面で反応が起こるためにセンサーとしての感度は良好で、応答速度が速く、ばらつきも少ない。
更に、酵素センサー等作製工程として構造的に単純であるために、再現性が良く、薄膜状の構造を形成するため、バイオチップとしての微細化も可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の製造方法に従って変化する固定化酵素膜の表面構造の模式図で、（イ）が炭素電極表面上にヒドロキシル基を結合させた状態、（ロ）が（イ）にＭＰＳを結合させた状態、（ハ）が末端の−Ｓ基に近接させた状態、（ニ）が（ハ）に識別素子たる酵素を配置させた状態を示す。
【図２】本発明で使用可能なシランカップリング剤の構造図である。
【図３】固定化酵素膜の表面で起こる酸化還元反応の電子伝達系を示す模式図である。
【図４】固定化酵素膜（ＧＣ／ＡＰＳ／Ｍｅｔａｌ／ＧＯｘ）について測定した電流電位曲線図である。
【図５】固定化酵素膜の原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）測定の結果を表した写真で、（イ）は研磨した炭素電極表面（ＧＣ）、（ロ）は（ＧＣ／ＡＰＳ）の電極表面を示す。
【図６】固定化酵素膜（ＧＣ／ＡＰＳ／Ｆｅ／ＧＯｘ）によって、グルコースの濃度変化に伴う電流値の変化を測定したグラフ図である。
【図７】従来のゾル−ゲル法によりＣｕをメディエーターとして、炭素電極内部にグルコースオキシターゼを固定した状態の模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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