(57)【要約】【課題】  簡便なアラビノビオースの製造方法に使用可能な新規タンパク質の提供を目的とする。【解決手段】  前記目的を解決するために、本発明のタンパク質は、エキソアラビナナーゼ活性を有するタンパク質である。前記エキソアラビナナーゼ活性とは、直鎖状Ｌアラビナンの非還元末端からアラビノース二量体を遊離させる作用をいい、本発明のタンパク質によれば、農産廃棄物等由来のアラビノース含有多糖からアラビノビオースを簡便かつ安価に製造できる。また、本発明のタンパク質は、遊離アラビノビオースを他の物質に付加するアラビノビオース転移活性を示すことができ、この活性により、新規アラビノビオース付加物質が製造できる。さらに、本発明のタンパク質は、アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質との共同作用能力を示すことができ、この機能により、アラビノース含有多糖の分解によるアラビノース製造の効率を向上できる。【選択図】  図１ 
2004229660.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エキソアラビナナーゼ活性を有するタンパク質であって、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなり、エキソアラビナナーゼ活性が、アラビノースポリマーの末端から選択的にアラビノースの二量体（アラビノビオース）を遊離させる活性であるタンパク質。
（ａ）配列番号１または配列番号１の２４番目から３７８番目に示すアミノ酸配列。
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列。
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載のアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入若しくは欠失したアミノ酸配列。
【請求項２】
さらに、遊離させた前記アラビノビオースを他の物質に付加するアラビノビオース転移活性を有する請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載のタンパク質をコードする下記（ｄ）〜（ｇ）のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号３または配列番号３の７０番目から１１３４番目に記載の塩基配列。
（ｅ）配列番号４に記載の塩基配列。
（ｆ）（ｄ）または（ｅ）の塩基配列において、１個以上の塩基が、置換、付加、挿入若しくは欠失した塩基配列。
（ｇ）（ｄ）〜（ｆ）のいずれかに記載の塩基配列の相補配列。
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１または２に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項７】
アラビノビオースの製造方法であって、請求項１または２に記載のタンパク質のエキソアラビナナーゼ活性によりアラビノース含有多糖をアラビノビオースに分解する工程を含む製造方法。
【請求項８】
アラビノース含有多糖が、農産廃棄物由来のものである請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
糖付加物質の製造方法であって、請求項２に記載のタンパク質のアラビノビオース転移活性により、アラビノビオースを他の物質に転移させる工程を含むアラビノビオース付加物質の製造方法。
【請求項１０】
糖付加物質の製造方法であって、アラビノース含有多糖と、ヒドロキシル基を有する化合物と、請求項２に記載のタンパク質とで酵素反応させることにより、前記化合物にアラビノビオースを転移させる工程を含むアラビノビオース付加物質の製造方法。
【請求項１１】
ヒドロキシル基を有する化合物が、糖またはアルコールである請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
ヒドロキシル基を有する化合物が、メタノール、エタノール、2-メトキシエタノール、1-プロパノール、1,2-プロパンジオール、1,3-プロパンジオール、2-メチル-1-プロパノール、1-ブタノール、1,2-ブタンジオール、1,3-ブタンジオール、1,4-ブタンジオール、2,3-ブタンジオール、3-メチル-1-ブタノール、1-ペンタノール、1,5-ペンタジオール、グリセロール、ソルビトール、キシリトール、アラビノース、フルクトース、ガラクトース、グルコース、ラムノースおよびキシロースからなる群から選択される少なくとも１種類である請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記酵素反応を、酸性バッファーを用いて行う請求項１０から１２のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１４】
アラビノース含有多糖が、農産廃棄物由来のものである請求項１０から１３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１５】
アラビノースの製造方法であって、請求項１または２に記載のタンパク質と、アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質とにより、アラビノース含有多糖をアラビノースに分解する工程を含む製造方法。
【請求項１６】
アラビノース含有多糖が、農産廃棄物由来のものである請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質が、ペニシリウム属（Penicillium）の菌体由来のタンパク質である請求項１５または１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
ペニシリウム属（Penicillium）の菌体であって、請求項１または２に記載のタンパク質、および、請求項１５に記載のアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質を培養液中に分泌するペニシリウム クリソジェナム ３１Ｂ（Penicillium Chrysogenum 31B)(ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３）。
【請求項１９】
ペニシリウム属（Penicillium）の菌体を培養し、その培養液中に分泌されるタンパク質を精製する工程を含む、請求項１または２に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項２０】
ペニシリウム属（Penicillium）の菌体が、ペニシリウム クリソジェナム ３１Ｂ（Penicillium Chrysogenum 31B)(ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３）である請求項１９に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規タンパク質、および、それらを用いたアラビノビオースの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品工業から大量に排出される植物由来の廃棄物は、日本だけでも、年間約２０００万ｔ発生すると推定されている。その廃棄物としては、例えば、コーンスターチ製造時のとうもろこし粕や、製糖時のシュガービートパルプ等があげられ、これらは、セルロース、ペクチン、ヘミセルロース含量が多いため再生利用が可能な物質である。しかし、現状では、これらの廃棄物の一部は動物の飼料や微生物の発酵原料に使用されているが、ほとんどは廃棄処分されている。
【０００３】
前記ペクチンおよびヘミセルロースは、高等植物の一次細胞壁を構成する重要な要素であり、ウロン酸およびヘテロ多糖が含まれる。前記へテロ多糖としては、例えば、アラビノース、ガラクトース、キシロース等の糖残基が、直鎖または分枝状のポリマーを形成したものがあげられる。このヘテロ多糖に含まれるアラビナン、アラビノキシラン、アラビノガラクタン等のＬ−アラビノース含有多糖の低分子化は、例えば、酸または酵素等による分解により行われていた（例えば、特許文献１、２参照。）。しかし、前記の方法では、重合度が異なるアラビノオリゴ糖が精製されるため、例えば、カラム等によりアラビノビオースの精製を行うと、著しく収量が低下し、そのため、精製されたアラビノビオースは、大変高価である。また、アラビノビオースの精製は、煩雑な工程が必要であったため、農産廃棄物の再生利用としての経済性も低かった。
【特許文献１】特開平１１−３１３７００号公報
【特許文献２】特開２００１−２８６２９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、簡便なアラビノビオースの製造方法に使用可能な新規タンパク質の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は、前記目的を達成するために、新規アラビナナーゼ活性を持つ新規タンパク質の分離を試み、鋭意研究を重ねた結果、腐敗したシュガービートから単離したペニシリウム属（Penicillium）の菌体；ペニシリウム クリソジェナム ３１Ｂ（Penicillium Chrysogenum 31B)(受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３）が、複数のアラビナン分解酵素を培養液中に分泌することを見出した。そして、本発明者等は、それらの酵素の一つが、アラビノースポリマーの末端から選択的にアラビノースの二量体（アラビノビオース）を遊離させるエキソ-１,５-α-Ｌ-アラビナナーゼ活性を有する新規タンパク質であることを見出し、本発明に到達した。
【０００６】
本発明のタンパク質は、エキソアラビナナーゼ活性を有するタンパク質であって、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなり、エキソアラビナナーゼ活性が、アラビノースポリマーの末端から選択的にアラビノースの二量体（アラビノビオース）を遊離させる活性であるタンパク質である。
（ａ）配列番号１または配列番号１の２４番目から３７８番目に示すアミノ酸配列。
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列。
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載のアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入若しくは欠失したアミノ酸配列。
【０００７】
本発明のタンパク質は、前記菌株由来のものに限定されず、例えば、遺伝子工学的に、大腸菌等の他の宿主により組換えタンパク質として大量発現させてもよい。また、本発明のタンパク質は、アラビノビオースを他の物質に付加するというアラビノビオース転移活性を示すことができる。この酵素機能を利用すれば、例えば、アラビノビオースを付加することを含む新規なアラビノビオース付加物質の合成が可能となる。さらに、本発明のタンパク質は、アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質との共同作用的機能を示すことができる。この機能を利用すれば、例えば、効率よくアラビノースが製造できる。
【０００８】
なお、前記エキソアラビナナーゼ活性とは、α-１,５-Ｌ-アラビノフラノース単位で構成された基質において、その基質の非還元性末端からアラビノース二量体を遊離させる作用をいう。また、前記アラビノビオース転移活性とは、前述のようにアラビノビオース遊離させ、そのアラビノビオースを他の物質に付加することを触媒する作用を言う。また、前記アラビノフラノシダーゼ活性とは、α-Ｌ-アラビノフラノシダーゼ(AFase；EC 3.2.1.55）活性であって、非還元性末端のα結合Ｌ-アラビノフラノシル残基を加水分解する活性をいう。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のタンパク質は、エキソアラビナナーゼ活性を有するから、例えば、大量発現した組換えタンパク質を用いれば、付加価値の高いアラビノビオースを、簡便かつ安価で製造できる。また、本発明のタンパク質は、アラビノビオース転移活性を発揮することができるから、この活性によれば、例えば、新規化合物を含むアラビノビオース付加物質を製造できる。さらにまた、本発明のタンパク質は、アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質の活性を共同作用により高めることができるから、例えば、効率のよいアラビノースの製造が可能となる。そして、これらの製造方法は、例えば、植物由来の廃棄物を原料にできるから、植物由来廃棄物の資源化が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に、本発明のタンパク質、その組換えタンパク質、それらをコードする遺伝子、および、それらを用いたアラビノビオース、アラビノースまたはアラビノビオース付加物質の製造方法について、さらに説明をする。
【００１１】
（本発明のタンパク質の精製方法）
本発明のタンパク質の精製方法を説明する。本発明のタンパク質の精製は、例えば、ペニシリウム属（Penicillium）の菌体であって、本発明のアラビナナーゼを培養液中に分泌する、本発明の菌であるペニシリウム クリソジェナム ３１Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３）を利用して行うことができる。以下に、本発明のタンパク質の精製方法の形態の一例を示す。プレ培養した本発明のペニシリウム クリソジェナム ３１Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３）を、下記表１に記載する組成からなる３Ｌの液体培地に接種し、５Ｌの三角フラスコ中、３０℃で１２日間、静置培養する。培養後、その培養液をろ過し、そのろ液を限外ろ過法（１０ｋＤａカットオフ）によって濃縮し、さらに、その濃縮液を２０ｍＭの酢酸バッファー（pH 5.0)に対して透析したものを酵素溶液として以下の精製に使用する。
（表１）  ０．２％    ＮＨ4ＮＯ3
０．１％    Ｋ2ＨＰＯ4
０．０５％    ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ
０．０５％    ＫＣｌ
０．００１％    ＦｅＳＯ4
０．１％    トリプトン
０．１％    グルコース
２％    シュガービートパルプ
（ｐＨ  ５．０）
また、精製中、本発明のタンパク質の存在する画分は、例えば、アラビナン分解活性を指標とすることができ、このアラビナン分解活性は、例えば、遊離してくる還元糖を測定することで行うことができる。前記還元糖の測定は、例えば、０.１％の脱分枝アラビナン（Megazyme International Ireland Ltd.製）を加えた２０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５.０）１９５μｌに、酵素試料を５μｌ加えた反応溶液を、３７℃で反応させて、遊離してきた還元糖を測定することで行うことができる。還元糖の測定方法としては、特に限定されず、例えば、Somogyi法によって測定できる。以下、アラビナン分解活性とは、前述のような方法で測定される活性をいう。また、本明細書においては、Ｌ-アラビノース１μmolに相当する還元糖を１分間に遊離できる酵素の量を、アラビナン分解活性の１単位（Ｕ）と定義する。
【００１２】
本発明のタンパク質の精製の第一段階として、前述の酵素溶液に、粉状にした硫酸アンモニウムの結晶を、８０％飽和まで、約２ｇ/minの割合で加える。出現する沈殿物を、５８,８００ｍ/ｓ2（６,０００  ｇ）、１５分の遠心分離により回収し、２０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５.０）に溶解させ、前記バッファーに対して透析をする。この透析後の溶液を、前記バッファーで平衡化したＤＥＡＥ-Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍカラム（４x１０ｃｍ、Tosoh Corp.製）に充填し、０〜０.４ＭのＮａＣｌ直線濃度勾配を加えた前記バッファーによって溶出する。前記アラビナン分解活性を指標にすると、前記溶出液分画には、２つのピークが存在するが、溶出ＮａＣｌ濃度が低いほうのピークが、本発明のタンパク質のピークである。次に、前記ピークの分画溶液を、２０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５.０）に対して透析し、その後、減圧濃縮し、さらに、粉状にした硫酸アンモニウムの結晶を３０％飽和まで加える。その溶液を、３０％飽和の硫酸アンモニウムを含む前記バッファーで平衡化したＰｈｅｎｙｌ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ＨＲ 5/5カラム（Amersham Pharmacia社製）に充填し、３０から０％飽和までの硫酸アンモニウムの直線濃度勾配を加えた２０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５.０）を用いて、流速０.５ｍｌ/minで溶出する。そして、溶出分画の中で、本発明のタンパク質を含む画分を集め、２０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５.０）に対して透析した後、濃縮して、前記バッファーで平衡化したＭｏｎｏＱ ＨＲ 5/5カラム（Amersham Pharmacia社製）に充填する。前記ＭｏｎｏＱカラムに結合したタンパク質を０〜０.１５ＭのＮａＣｌ直線濃度勾配を加えた前記バッファーを用いて、流速１.０ｍｌ/minで溶出する。本発明のタンパク質は、例えば、以上のようにして得ることができる。
【００１３】
前述のように精製して得た本発明のタンパク質について、そのアラビナン分解活性の温度条件としては、例えば、３０℃〜５０℃が好ましく、より好ましくは３５℃〜４５℃である。また、ｐＨ条件としては、例えば、ｐＨ３〜８が好ましく、ｐＨ４〜ｐＨ６がより好ましい。また、前記アラビナナーゼ活性の金属への感受性については、前述した標準アラビナナーゼアッセイ法の反応バッファーに、１ｍＭのＨｇＣｌ2を加えると、アラビナン分解活性の約７０％が阻害される。一方、Ｂａ2+、Ｃａ2+、Ｃｄ2+、Ｃｏ2+、Ｆｅ3+、Ｋ+、Ｍｇ2+、Ｎａ+、Ｎｉ2+およびＺｎ2+の塩化物塩、ＡｇＮＯ3ならびにＣｕＳＯ4のそれぞれについては、同濃度で添加しても、アラビナン分解活性に影響はない。さらに、１ｍＭのＮａＮ3の添加も、前記活性に影響を与えない。
【００１４】
本発明のタンパク質が、直鎖状アラビナンへ作用する形態は、例えば、下記のようにして確認できる。まず、０.０８ｍＵの本発明のタンパク質を、０．２％の還元型脱分枝アラビナンを含む２００μｌの２０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５.０）中、３７℃で、さまざまな時間反応させる。次に、その反応液を、例えば、Ｃａｒｂｏｐａｃ ＰＡ-１カラム（Dionex社製）等を使用した高性能陰イオン交換クロマトグラフィーで、解析する。その場合、溶出は、例えば、最初の５分は、０.１Ｍ ＮａＯＨ、流速１.０ｍｌ/minで行い、その後、０〜０.４５Ｍの酢酸ナトリウム直線濃度勾配を加えた３０ｍｌの０.１Ｍ ＮａＯＨで行う。溶出液中の溶出物は、例えば、アンペロメトリー等によって検出できる。その検出パターンの一例として、アラビノースからアラビノヘキソースまでのそれぞれの基準試料と、反応後０、３０、９０分後の結果とを、図１に示す。図１に示すように、遊離される糖としては、アラビノビオースのみが検出され、また、還元型脱分枝アラビナンを分解しても、アラビノフラノシルアラビトールは検出されない。このようにして、本発明のタンパク質が、α-１,５-Ｌ-結合アラビノフラノース残基を、非還元性末端からエキソ様式で切断する活性を有することが確認できる。なお、前述した脱分枝アラビナンの還元性末端の還元は、例えば、１０ｍＭ ＮａＢＨ4を含む２５ｍＭ ＮａＯＨ中、３０℃で、４時間処理することで行うことができる。
【００１５】
（アラビノビオース転移活性）
本発明のタンパク質がアラビノビオース転移活性は、例えば、本発明のタンパク質と、グリセロールと、直鎖型アラビナンとをインキュベートし、その結果、前記グリセロールとアラビノビオースとの結合物質を検出することで確認できる。
【００１６】
より具体的には、前記アラビノビオース転移反応は、例えば、本発明のタンパク質と、直鎖型アラビナンと、アラビノビオースの受容物質（アクセプター）と、バッファーとからなる組成の反応液で行うことができる。前記アクセプターとしては、特に制限されないが、例えば、ヒドロキシル基を有する化合物があげられ、好ましくは、糖およびアルコール類である、前記糖およびアルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、2-メトキシエタノール、1-プロパノール、1,2-プロパンジオール、1,3-プロパンジオール、2-メチル-1-プロパノール、1-ブタノール、1,2-ブタンジオール、1,3-ブタンジオール、1,4-ブタンジオール、2,3-ブタンジオール、3-メチル-1-ブタノール、1-ペンタノール、1,5-ペンタジオール、グリセロール、ソルビトール、キシリトール、アラビノース、フルクトース、ガラクトース、グルコース、ラムノース、キシロース等があげれる。これらの中で、転移産物の生成量がより多いアクセプターとしては、2-メトキシエタノール、1,2-プロパンジオール、1,3-プロパンジオール、1,2-ブタンジオール、1,3-ブタンジオール、グリセロール、ソルビトール、キシリトール、フルクトース、およびグルコース等があげられ、特に多いアクセプターとしては、グリセロール、ソルビトール、およびキシリトールがあげられる。前記転移反応の反応温度としては、例えば、２０℃〜５０℃であって、より好ましくは、３０℃〜５０℃である。バッファーとしては、例えば、酢酸バッファーを使用でき、そのｐＨとしては、例えば、ｐＨ３〜７であって、より好ましくは、ｐＨ３〜５である。
【００１７】
（アラビノース製造における共同作用）
α-Ｌ-アラビノフラノシダーゼ(AFase；EC 3.2.1.55）は、非還元性末端のα結合Ｌ-アラビノフラノシル残基を加水分解する酵素であるから、例えば、アラビナン、アラビノガラクタンもしくはアラビノキシランまたはそれらを含む農産廃棄物等から、アラビノースを遊離させることができる。この反応系に、本発明のタンパク質が加わると、両者の共同作用により、その反応効率を向上できる。前記アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質としては、例えば、ペニシリウム属の菌体が培養液中に分泌するタンパク質であるＡＦＱ１またはＡＦＳ１等があげられる。共同作用の効果が大きい点から、本発明のアラビノースの製造方法に使用するアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質としては、ＡＦＱ１が好ましい。
【００１８】
前記ＡＦＱ１およびＡＦＳ１の精製方法としては、特に限定されないが、例えば、以下のようにして精製できる。まず、本発明の菌であるペニシリウム クリソジェナム ３１Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３）の培養液を、前述した本発明のタンパク質の精製方法で行うように、硫安沈殿および透析を行い、同様のバッファーで溶解する。次に、その溶液をＲｅｓｏｕｒｃｅＱカラム（Amersham Bioscience社製）に充填し、６０ｍｌの同じバッファーで洗浄し、０〜０.２ＭのＮａＣｌ直線濃度勾配を加えた１２０ｍｌの前記バッファーによって、流速３ml/minで溶出する。
【００１９】
前記ＡＦＱ１およびＡＦＳ１のアラビノフラノシダーゼ活性は、例えば、ｐ-ニトロフェニル-α-Ｌ-アラビノフラノシドを基質として使用し、p-ニトロフェノールの遊離を検出すること等によって測定できる。その反応は、例えば、０.０２％ｐ-ニトロフェニル-α-Ｌ-アラビノフラノシドを含む１９０μｌの２０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５.０）に、適宜希釈した１０μｌの酵素溶液を加え、３７℃で１５分インキュベートして行う。１.８ｍｌの０.２Ｍ Ｎａ2ＣＯ3を加え前記反応を止めた後、遊離したｐ-ニトロフェノールを、例えば、分光光度法（４２０ｎｍ）でモニター等して検出する。
【００２０】
前記ＲｅｓｏｕｒｃｅＱカラムに結合するアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質がＡＦＱ１であり、結合しないアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質がＡＦＳ１である。以下、さらにＡＦＱ１およびＡＦＳ１の精製方法の形態の一例を説明する。前記ＡＦＱ１を含むＲｅｓｏｕｒｃｅＱカラムの溶出液画分は、２０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５.０）に対して透析した後、同様のバッファーで平衡化したＭｏｎｏＱカラム(Amersham Bioscience社製)に充填し、０〜０.２ＭのＮａＣｌ直線濃度勾配を加えた２０ｍｌの前記バッファーによって、流速１ｍｌ/minで溶出する。アラビノフラノシダーゼ活性がある画分を、３０％飽和の硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５.０）に対して透析した後、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｕｐｅｒｏｓｅカラム(Amersham Bioscience社製)に充填し、３０から０％飽和までの硫酸アンモニウムの直線濃度勾配を加えた２０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５.０）を用いて、流速０.５ｍｌ/minで溶出する。ＡＦＱ１を含む画分を遠心限外ろ過法（商品名Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ-ＭＣ,Nippon Millipore Ltd.製、１０ｋＤａカットオフ）によって濃縮し、最後に、その溶液を１００ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭの酢酸バッファー（pH 5.0)で平衡化したサイズ排除カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム(Amersham Bioscience社製）を使用して、ＡＦＱ１を精製する。また、前記ResourceQカラムに結合しなかったＡＦＳ１を含む画分は、直接、２０ｍＭの酢酸バッファー（pH 5.0)で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅＳ(Amersham Bioscience社製）に充填し、０〜０.２ＭのＮａＣｌ直線濃度勾配を加えた１２０ｍｌの前記バッファーによって、流速３ｍｌ/minで溶出する。前記ＡＦＳ１を含む溶出液画分を、２０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５.０）に対して透析し、濃縮した後、その溶液を１００ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５.０）で平衡化したサイズ排除カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムに充填し、ＡＦＳ１を精製する。ＡＦＱ１およびＡＦＳ１は、例えば、以上のようにして精製できる。
【００２１】
（本発明のタンパク質の部分アミノ酸配列）
本発明のタンパク質のＮ末端のアミノ酸配列は、例えば、エドマン分解による気相ペプチドシーケンサー等によって決定できる。また、内部の部分アミノ酸配列は、例えば、リジルエンドペプチターゼ等により切断された断片を分離し、例えば、前述のようなペプチドシーケンサー等によって、その断片のＮ末端からアミノ酸配列を決定できる。ただし、例えば、前述のようにペニシリウム クリソジェナム ３１Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３）から精製した本発明のタンパク質（以下、本発明の天然型のタンパク質）を、前記ペプチドシーケンサーによって配列決定する場合や、リジルエンドペプチターゼによって分解する場合、糖鎖を処理する必要がある。本発明の天然型のタンパク質は、エンドグリコシダーゼＨを作用させると、例えば、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによる分子量が４７から４２ｋＤａ減少するが、この事実が示すように、本発明の天然型のタンパク質は、糖タンパクだからである。前記糖鎖処理は、例えば、エンドグリコシダーゼＨ等ですることができる。
【００２２】
（本発明のタンパク質をコードする遺伝子配列の決定）
前述のようにして本発明のタンパク質のＮ末端および内部の部分アミノ酸配列が決定できると、その情報に基づいて、本発明の菌であるペニシリウム クリソジェナム ３１Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３）のゲノムから、コード領域配列（ＣＤＳ）を含む領域をクローニングできる。その方法は、特に限定されず、例えば、種々の市販クローニングキットを使用できる。そして、上記のようにクローニングしたゲノム配列の情報に基づき、開始コドンおよび終止コドンを含めたＣＤＳを想定し、プライマーを設定して、本発明の菌であるペニシリウム クリソジェナム ３１Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３）のｃＤＮＡライブラリーから、本発明のタンパク質のｃＤＮＡをクローニングできる。前記ｃＤＮＡライブラリーの作製方法としては、特に限定されず、例えば、種々の市販クローニングキット等により得ることができる。そして、前記ゲノム配列と、得られた前記ｃＤＮＡの塩基配列を比較することで、ＣＤＳを決定できる。
【００２３】
配列番号３に示す塩基配列が、本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一例である。また、本発明のタンパク質をコードする、ペニシリウム クリソジェナム ３１Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３）のゲノム上の配列；ＣＤＳ（配列番号５）は、２つのイントロン；イントロンＡおよびイントロンＢを含む。前記イントロンＡは、４９ｂｐ、前記イントロンＢは、５６ｂｐの長さであって、ともに、真菌の５’および３’スプライシング部位コンセンサス配列である、ＧＴＰｕＮＧＰｙＡＣおよびＰｙＧＣＴＡＡＣの配列を有する。さらに、前記イントロンＡおよびＢのそれぞれの内部にあるＣＡＣＴＡＡＣおよびＴＧＣＴＡＡＣという配列は、真菌のイントロン内部コンセンサス配列ＮＰｕＣＴＰｕＡＣおよびＰｙＧＣＴＹＡＡＣに、それぞれ一致する。
【００２４】
前記ＣＤＳ（配列番号５）は、３７８アミノ酸（配列番号１）からなるタンパク質をコードする１１３４ｂｐのＤＮＡ（配列番号３の１番〜１１３４番目）を含む。前記タンパク質は、計算上の分子量が、４１,６３６Ｄａであり、計算上の等電点は、５.１１である。また、３１番、６５番、１９４番および３０２番目に位置する４つのアスパラギン酸残基が、Ｎ−グリコシド結合の可能性がある部位として推定される。さらに、シグナルペプチド予測プログラム「ＳｉｇｎａｌＰ ver.1.1」(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)によると、配列番号１で表されるタンパク質は、１６番目と１７番目に位置するアラニンとトレオニンの間で切断されることが予測される。一方、前述のようにペプチドシーケンサーで決定したＮ末端アミノ酸配列は、配列番号１ので表されるタンパク質の２４番目のセリンから始まる。したがって、本発明のタンパク質が、例えば、配列番号１のアミノ酸配列からなる場合、成熟体としては、例えば、配列番号１における２４番目から３７８番目のアミノ酸配列からなるタンパク質があげられ、前駆体としては、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質があげられる。前記前駆体のみに含まれる、Ｎ末端の拡張した領域（例えば、配列番号１の１番〜２３番目）には、シグナルペプチドおよびプロ-ペプチドが含まれていることが予測される。
【００２５】
本発明のタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号１）と、既知の６つのアラビナン分解酵素のアミノ酸配列とを比較しても、いずれとも相同性は認められない。前記既知の酵素の遺伝子は、アスペルギラス属(Aspergillus niger)由来のabfA、abfB、abnA、および、枯草菌(Bacillus subtilis)由来のabfA、xsa、abnAである。また、シュードモナス菌(Pseudomonas fluorescens)由来のアラビナナーゼ活性を有するタンパク質は、エキソかつエンド様式でアラビノトリオースを遊離する活性があるが、この酵素のアミノ配列にも、本発明のタンパク質との相同性は見出せない。しかし、ＦＡＳＴＡプログラムによる相同性検索からは、本発明のタンパク質と高い相同性を示す２つの遺伝子が示される。１つ目は、アカパンカビ(Neurospora crassa)の保存性がある仮定上のタンパク質をコードする遺伝子（accession No. AL355929, protein_id CAB91342.2）であり、その推定アミノ酸配列は、例えば、配列番号１のアミノ酸配列と、３７２アミノ酸の重複部に対して、３９％の同一性を示す。２つ目は、放線菌(Streptomyces coelicolor)の推定上の２機能性タンパク質をコードする遺伝子（accession No. AL359779, protein_id CAB95280.1）であり、その推定アミノ酸配列は、例えば、配列番号１のアミノ酸配列と、３２２アミノ酸の重複部中、３０％の同一性を示す。
【００２６】
（組換えタンパク質の発現）
本発明のタンパク質に由来する本発明の組換えタンパク質は、例えば、大腸菌等で発現させることができる。前記組換えタンパク質を発現するベクターとしては、特に制限されず、適宜選択したベクターに、例えば、本発明のタンパク質の前記成熟体をコードする領域等の塩基配列をクローニングすればよい。本発明のの組換えタンパク質は、例えば、前記成熟体のアミノ配列のみからなっててもよいし、種々のタンパク質やペプチド等との融合タンパク質でもよい。前記融合させるタンパク質またはペプチドとしては、特に限定されないが、例えば、精製の手順の簡略化・低廉化や、安定性の向上・可溶化等を目的としたものがあげられ、具体的には、例えば、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ヒスチジンタグ、ＧＳＴタンパク質等があげられる。これらの中でも、吸収、精製、固定化等に使用するためのアミロース樹脂が他のアフィニティー樹脂より安価である点および大量発現時の可溶化効果が期待できる点より、ＭＢＰが好ましい。得られた本発明の組換えタンパク質のエキソアラビナナーゼ活性およびアラビノビオース転移活性は、例えば、前述のように、本発明のタンパク質に用いる方法と同様に確認することができる。
【００２７】
本発明の組換えタンパク質をコードするベクターおよびその宿主は、本発明のタンパク質の大量発現系として使用できる。例えば、大腸菌等の微生物を使用した大量発現およびその精製は、簡便に、また、安価で行えるため好ましい。本発明の組換えタンパク質の一例としては、例えば、配列番号４の塩基配列がコードするタンパク質（配列番号２）があげられる。同タンパク質のＮ末端の１番目から３９３番目のアミノ酸残基は、ＭＢＰに由来する部分であり、３９４番目から７４８番目のアミノ酸配列は、本発明の天然型のタンパク質に由来する部分である。
【００２８】
従って、本発明のタンパク質は、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質である。ここで、下記（ａ）のタンパク質と下記（ｃ）のタンパク質とのアミノ酸配列の相同性は、例えば、６０％以上であって、９０％以上が好ましく、より好ましくは、９５％以上、さらに好ましくは、９９％である。この場合、下記（ｃ）のタンパク質において、置換、付加、挿入もしくは欠失するアミノ酸残基の数は、例えば、１〜１５１個であって、１〜３７個が好ましく、より好ましくは、１〜１８個、さらに好ましくは、１〜４個である。また、下記（ｂ）のタンパク質と下記（ｃ）のタンパク質とのアミノ酸配列の相同性は、例えば、３０％以上であって、６０％以上が好ましく、より好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９９％である。この場合、下記（ｃ）のタンパク質において、置換、付加、挿入もしくは欠失するアミノ酸残基の数は、例えば、１〜５２３個であって、１〜２９９個が好ましく、より好ましくは、１〜７５個、さらに好ましくは、１〜７個である。なお、上述の通り、下記（ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）の前半の約半分は、組換えによる融合部分でありこの部分における相同性の低さは許容される。
（ａ）配列番号１または配列番号１の２４番目から３７８番目に示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載のアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入若しくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であって、エキソアラビナナーゼ活性を有するタンパク質、またはさらにアラビノビオース転移活性を有するタンパク質。
【００２９】
さらに、本発明の遺伝子は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子であり、本発明のポリヌクレオチドは、下記（ｄ）から（ｈ）のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。ここで、下記（ｅ）の塩基配列と下記（ｇ）の塩基配列との相同性は、例えば、５０％以上であって、８０％以上が好ましく、より好ましくは、９５％以上、さらに好ましくは、９９％以上である。この場合、下記（ｇ）の塩基配列において、置換、付加、挿入もしくは欠失する塩基の数は、例えば、１〜５６７個であって、１〜２２６個が好ましく、より好ましくは１〜５７個、さらに好ましくは１〜１１個である。また、下記（ｆ）の塩基配列と下記（ｇ）の塩基配列との相同性は、例えば、２５％以上であって、７５％以上が好ましく、より好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９９％以上である。この場合、下記（ｇ）の塩基配列において、置換、付加、挿入もしくは欠失する塩基の数は、例えば、１〜１６８５個であって、１〜５６１個が好ましく、より好ましくは１〜２２５個、さらに好ましくは１〜２２個である。なお、上述の通り、下記（ｆ）の塩基配列の前半の約半分は、組換えによる融合部分でありこの部分における相同性の低さは許容される。
（ｄ）上記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質をコードする塩基配列。
（ｅ）配列番号３または配列番号３の７０番目から１１３４番目に記載の塩基配列。
（ｆ）配列番号４に記載の塩基配列。
（ｇ）（ｅ）または（ｆ）に記載の塩基配列において、１個以上の塩基が、置換、付加、挿入若しくは欠失した塩基配列であって、エキソアラビナナーゼ活性を有するタンパク質、またはさらにアラビノビオース転移活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（ｈ）（ｄ）から（ｇ）のいずれかに記載の塩基配列の相補配列。
【００３０】
（農産廃棄物からのアラビノビオース製造）
本発明のタンパク質を用いれば、例えば、農産廃棄物等に含まれるアラビノース含有多糖から、アラビノビオースを製造することができる。前記製造に使用するエキソアラビナナーゼ活性を有するタンパク質としては、簡便かつ安価で製造できる等の点より、本発明の組換えタンパク質を使用することが好ましい。前記農産廃棄物としては、例えば、オレンジファイバー、みかんジュース粕、アップルファイバー、りんごジュース粕、ビートファイバー、ビートパルプ、シュガービートパルプ、落花生粕、米ぬか、とうもろこし粕、大豆粕、あずき粕等があげられる。これらの中で、アラビオビノース製造の材料として好ましいのは、シュガービートパルプ、りんごジュース粕、大豆粕であって、より好ましくは、シュガービートパルプである。農産廃棄物からのアラビノビオースの製造方法は、例えば、農産廃棄物からアラビノース含有多糖を抽出する工程、前記多糖を酵素処理する工程、前記酵素反応溶液からアラビノビオースを分離する工程等を含む。
【００３１】
前記農産廃棄物からのアラビノース含有多糖の抽出は、例えば、前記廃棄物をアルカリ条件下で加熱処理することで行うことができる。また、アラビノース含有多糖の酵素処理は、例えば、大豆のアラビナン等のように、アラビナンに側鎖がついていない場合は、直接本発明のタンパク質を作用させて、アラビノビオースを遊離させることができる。一方、例えば、シュガービート（甜菜）のアラビナン等のように、アラビナンに側鎖がついている場合には、本発明のタンパク質を作用させる前に、例えば、アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質（枝切酵素）等で処理して脱分枝し、さらに、遊離したアラビノースを除くため、例えば、限外ろ過等をする必要がある。こうして得られた脱分枝アラビナンに本発明のタンパク質を作用させてると、アラビノビオースを遊離させることができる。そして、このような酵素反応溶液からアラビノビオースを分離する工程としては、例えば、限外ろ過法によって、アラビノビオースと未反応物を分離する方法等があげられ、前記アラビノビオースを含む画分を、さらに、例えば、脱塩処理等することにより、精製アラビノビオースを得ることができる。
【００３２】
ビフィズス菌選択増殖活性を有するオリゴ糖としては、例えば、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、キシロオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖等があげられるが、アラビノビオースにも、前記活性が認められる可能性は非常に高い。したがって、本発明の製造方法により製造されるアラビノビオースは、例えば、食品や試薬として利用できる。さらに、アラビノビオースは、高価であるため、その他の生理機能が研究されていないが、本発明によりアラビノビオースが安価になれば、例えば、これらの基礎・開発研究の発展にも貢献できる。
【００３３】
（糖質付加物質の製造）
本発明のタンパク質が有するアラビノビオース転移活性を利用すれば、例えば、新規物質を含むアラビノビオース付加物質の製造方法を提供することができる。例えば、キシリトールにアラビノビオースを転移させた場合には、一種のアラビノキシランが得られる。アラビノキシランには、免疫賦活活性や抗がん作用があることが確認されているが、現状では低分子アラビノキシランを得ることが難しく、詳細な機能解析も進んでいない。このように、本発明のタンパク質を用いたアラビノビオース付加物質の製造方法は、例えば、化学物質、薬剤、食品等を修飾することにより、その効能、作用、副作用等を付加したり制御できる可能性がある。
【実施例】
【００３４】
以下に、本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００３５】
（本発明のタンパク質の精製）
前述した「本発明のタンパク質の精製方法」に従って、本発明の菌であるペニシリウム クリソジェナム ３１Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３）から、本発明のタンパク質を精製した。各精製段階の結果を下記表２にまとめる。
【００３６】
（表２）
精製ステップ      タンパク質      活性      比活性      精製     収率
(ｍｇ)        (Ｕ)     (Ｕ/ｍｇ)    (倍)    （％）
培養ろ液          ４７３.０    ２２８.０    ０.４８    １      １００
硫酸アンモニウム  １９９.０    ２１１.０    １.０６    ２.２  ９２.５
DEAE-Toyopearl      ３１.７      １８.９    ０.６０    １.３    ８.３
Phenyl Superose       ２.６        ５.２    ２.００    ４.２    ２.３
Mono Q                ０.６        ２.５    ４.１７    ８.７    １.１  
前記のように精製した本発明のタンパク質のｐＨに対する安定性を調べた。本発明のタンパク質（７５μｇ/ｍｌ）を、さまざまなｐＨに設定したバッファー中、３０℃で１６時間インキュベートした後に、その酵素活性を、前述の標準アラビナナーゼアッセイ法により測定した。ｐＨ１〜２のバッファーとして、ＨＣｌ−ＫＣｌバッファーを、ｐＨ３〜５のバッファーとして、酢酸バッファーを、ｐＨ６〜８のバッファーとして、リン酸バッファーを、ｐＨ９〜１１のバッファーとして、Ｎａ2ＣＯ3-ＮａＨＣＯ3バッファーを、それぞれ１００ｍＭの濃度で使用した。その結果、ｐＨ３〜８のバッファーでインキュベートされたエキソアラビナナーゼが、インキュベート前の活性の８０％以上を維持した。また、２０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５.０）中、１時間のプレインキュベーション後でも、３０℃〜５０℃の範囲では、本発明のタンパク質は、エキソアラビナナーゼ活性を維持できた。
【００３７】
また、本発明のタンパク質の基質特異性を調べた。まず、本発明のタンパク質のアラビノシダーゼ活性を調べるために、前記のようにして得られた本発明のタンパク質５μｌ（１０ｍＵ）と、０.２％のｐ-ニトロフェニル-α-Ｌ-アラビノフラノシドまたはｐ-ニトロフェニル-α-Ｌ-アラビノピラノシド（ともにSigma社製）１９５μｌとを、２０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５.０）中、３７℃で一晩インキュベートした。０.２ＭのＮａ2ＣＯ3を反応溶液に加えた後に、遊離したｐ-ニトロフェノールを、分光光度法（４２０ｎｍ）でモニターした。その結果を下記表３に示す。次に、α-１,５-Ｌ-アラビノフラノビオース、トリオース（ともに、Megazyme社製）およびその他の多糖に対する分解活性を調べるために、本発明のタンパク質４ｍＵを、０.２％の前記の基質をそれぞれ含む２００μｌの２０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５.０）中、３７℃で１時間インキュベートした。前記反応産物を、前述した高性能陰イオン交換クロマトグラフィーにより検出した。反応溶液中に遊離したアラビノビオースの量を下記表３に示す。
【００３８】
（表３）
基質                         遊離した糖の量(μｇ/ｍｌ)
ｐ-ニトロフェニル-α-Ｌ-アラビノフラノシド                    ０
ｐ-ニトロフェニル-α-Ｌ-アラビノピラノシド                    ０
シュガービート脱分枝アラビナン                            ４５５
シュガービートアラビナン                                    ４２
大豆アラビノガラクタン                                      ５７
ラーチウッドアラビノガラクタン                                ０
α-１,５-Ｌ-アラビノフラノビオース                            ０
α-１,５-Ｌ-アラビノフラノトリオース                      ２５２    
表３に示すように、本発明のタンパク質は、脱分枝アラビナンおよびα-１,５-Ｌ-アラビノフラノトリオースから、多くのアラビノビオースを遊離させた。また、シュガービートアラビナン（Megazyme社製）および大豆アラビノガラクタン（大豆熱水抽出物）に対しても、いくらかの活性があった。しかし、本発明のタンパク質は、ラーチウッドアラビノガラクタン（Sigma社製）、ｐ-ニトロフェニル-α-Ｌ-アラビノフラノシド、ｐ-ニトロフェニル-α-Ｌ-アラビノピラノシドおよびα-１,５-Ｌ-アラビノフラノビオースを基質としなかった。
【００３９】
（本発明のタンパク質の部分アミノ酸配列）
本発明の天然型のタンパク質のＮ末端のアミノ酸配列を決定する前に、この酵素に結合している糖質を取り除いた。まず、前記酵素を、エンドグリコシダーゼＨ（Roche Diagnostics社製）とともに２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５.０）中、３７℃で２０時間インキュベートした。次に、１０％ゲルを使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Laemmli法）により、脱グリコシル化された本発明のタンパク質を分離し、ＰＶＤＦ膜に電気的に転写し、ペプチドシーケンサー（Shimadzu Corp.製商品名ＰＳＱ−１）によりＮ末端アミノ酸配列を決定した。その配列は、配列番号６であって、配列番号１に記載のアミノ酸配列の２４番目から４８番目に該当した。
【００４０】
内部配列を決定するために、まず、ポリアクリルアミドゲル中の前記脱グリコシル化した本発明のタンパク質を、リジルエンドペプチダーゼ（Wako Pure Chemical Industries Ltd.製）で消化し、逆相ＨＰＬＣを使用して、２つのペプチド断片Ｆ７３およびＦ８４を分離した。次に、前述と同様にして、それぞれのペプチドのＮ末端配列を決定した。前記Ｆ７３およびＦ８４の配列は、それぞれ、配列番号７および８であって、配列番号１に記載のアミノ酸配列２１１番目から２３０番目および８６番目から１００番目にそれぞれ該当した。
【００４１】
（本発明のタンパク質をコードする遺伝子配列の決定）
前述のように決定した、本発明の天然型のタンパク質およびＦ７３ペプチドのＮ末端アミノ酸配列をもとに、本発明の天然型のタンパク質のＮ末端領域のプライマーＮｔｅｒＦおよびＮｔｅｒＦ２（配列番号９および１０）、ならびに、Ｆ７３領域のプライマー７３Ｒおよび７３Ｒ２（配列番号１１および１２）を設計した。１回目のＰＣＲは、NterF/73Rのプライマーセットを用いて、本発明の菌であるペニシリウム クリソジェナム ３１Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３）のゲノムＤＮＡを鋳型として行い、２回目のＰＣＲは、NterF2/73R2のプライマーセットを用いて、前記ＰＣＲ産物を鋳型に行った。前記２回のＰＣＲで得られた約０.６ｋｂｐの産物（ＮＴ−１とする）は、本発明の天然型のタンパク質のＮ末端とＦ７３と間の領域をコードするゲノム配列である。このＮＴ−１領域を、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen社製）にクローニングし、塩基配列を決定した。塩基配列決定は、商品名DYEnamic ET Terminator Cycleシーケンスキット（Amersham Pharmacia社製）と、ＤＮＡシーケンサー商品名モデル３７３ストレッチ（Appllied Biosystems社製）を用いて行った。
【００４２】
前記ＮＴ−１領域の塩基配列を決定した後、このＮＴ−１領域内に、２つのプライマー；ＸＣ１Ｒ、ＸＣ２Ｒ（配列番号１３，１４）、および、それらの相補配列プライマー；ＸＣ１Ｆ、ＸＣ２Ｆ（配列番号１５，１６）を設定した。これらのプライマーと、カセットライゲーションを利用したＰＣＲ（ＣＬＭ-ＰＣＲ）用のプライマーＣ；１およびＣ２（Takara Bio Inc.製）とを組合せ、商品名TaKaRa LA Taq（Takara Bio Inc.製）ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＣＬＭ−ＰＣＲを行い、前記ＮＴ−１領域周辺のゲノム配列を決定した。まず、前記ＮＴ-１の５’側の領域の塩基配列は、以下のように決定した。本発明の菌であるペニシリウム クリソジェナム ３１Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３）のゲノムＤＮＡを制限酵素PstIで処理し、PstIカセット（Takara Bio Inc.製）をライゲーションしたものを鋳型に使用し、１回目のプライマーセットとしてC1/XC2R、２回目のプライマーセットとしてC2/XC1Rを使用し、ＰＣＲを行った。その結果増幅された約１.２ｋｂの断片を、前述のように、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターにクローニングし、塩基配列を決定した。決定されたＮＴ−１の５’領域には、本発明のタンパク質の推定ＡＴＧ開始コドンを含んでいた。次に、前記ＮＴ-１の３’側の領域の塩基配列は、以下のように決定した。制限酵素HindIIIで処理され、HindIIIカセット（Takara Bio Inc.製）がライゲーションされた前記菌のゲノムＤＮＡを鋳型に使用し、１回目のプライマーセットとしてC1/XC1F、２回目のプライマーセットとしてC2/XC2Fを使用し、ＰＣＲを行った。その結果増幅された約１.２ｋｂの断片を、前述のように、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターにクローニングし、塩基配列を決定した。決定されたＮＴ−１の３’領域には、本発明のタンパク質の推定ＴＡＡ終止コドンを含んでいた。以上の結果から、本発明のタンパク質をコードする領域を含む１,６９５ｋｂのゲノム配列が得られた。
【００４３】
前記ゲノムからクローニングされた配列において、開始ＡＴＧコドンは、３０５番目のヌクレオチド（ｎｔ３０５）に位置し、終止ＴＡＡコドンは、ｎｔ１,５４４に位置することが推定され、５’上流非コード領域には、ｎｔ２４０にＴＡＴＡＡボックスが推定され、ＣＡＡＴボックスが、ｎｔ６２、ｎｔ１５７およびｎｔ２６２に存在した。このゲノム配列から推測される本発明のタンパク質のコード領域（ＣＤＳ）を確かめるため、本発明のタンパク質のｃＤＮＡ配列を決定した。前記ゲノム配列から推定されるＡＴＧ開始コドンおよびＴＡＡ終止コドンを含むように、１組のプライマーＡｂｎｘＢおよびＡｂｎｘ３Ｒ（配列番号１７および１８）を作製し、これらのプライマーと、前記ｃＤＮＡライブラリーとを使用しＰＣＲを行い、約１.１ｋｂの増幅された断片を得た。前記ｃＤＮＡライブラリーは、以下のようにして得た。まず、全ＲＮＡを得るために、プレ培養した本発明の菌であるペニシリウム クリソジェナム ３１Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３）を、２％シュガービートパルプを１％シュガービートエキストラクト（シュガービートパルプアルカリ抽出物）に変更した以外は上記表１に記載の組成と同様の液体培地１００ｍｌに接種し、２００ｍｌ三角フラスコ中、３０℃で１３日、静置培養した。培養後、菌糸体を遠心分離法により回収し、液体窒素で処理し、乳鉢で粉状化した。その菌糸体１５０ｍｇから、RNeasy Mini Kit（Qiagen社製）を使用して、全ＲＮＡを回収した。次に、前記全ＲＮＡをＤＮase（ＲＴ級、Wako社製）を用いて３７℃で３０分間処理し、この全ＲＮＡと、ランダムヘキサマープライマーと、逆転写酵素（商品名SuperScriptII、Invitorogen）とを使用して、前記菌のｃＤＮＡライブラリーを得た。
【００４４】
前記ｃＤＮＡライブラリーから増幅された１.１ｋｂの断片を、前述のように、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターにクローニングし、塩基配列を決定し、本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一つ（配列番号１）を得た。また、この配列から、本発明の菌におけるゲノム配列上のコード領域（ＣＤＳ、配列番号５、１,２４２ｂｐ）を確認した。
【００４５】
（本発明の組換えタンパク質の発現）
本発明の組換えタンパク質を得るために、２つのプライマー；ＰｍａｌＦおよびＰｍａｌＲを設計し（配列番号１９および２０）、本発明のタンパク質のｃＤＮＡを鋳型に使用し、ＰＣＲを行った。増幅された断片を、ｐＭＡＬ-ｃ２Ｘ（New England BioLabs社製）のBamHI-HindIII部位にクローニングし、ｍａｌＥ遺伝子の下流にアラビナナーゼの遺伝子が挿入されたプラスミドｐＭＡＬ−ＡＸを得た。前記プラスミドは、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合した本発明のタンパク質（アミノ酸配列番号２）をコードする（塩基配列番号４）。
【００４６】
前記組換えタンパク質を発現するために、前記ｐＭＡＬ−ＡＸで、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、アンピシリンを含む１ＬのＬＢ培地で培養した。この培養細胞の無細胞抽出物から、アミロース樹脂カラム（New England BioLabs社製）を使用して、本発明の組換えタンパク質を精製した。まず、前記カラムを、２０ｍＭ Tris-HCl(ｐＨ ７.４)、２００ｍＭ NaClおよび１ｍＭ EDTAからなるバッファーで平衡化し、次に、前記抽出物を前記バッファーに溶解し、そして、その溶液中のタンパク質を前記カラムに結合させ、その結合したタンパク質を、１０ｍＭのマルトースを含む前記バッファーで溶出した。その結果、前記１Ｌの培養液から、７５ｍｇのＭＢＰ融合タンパク質を回収した。
【００４７】
ＭＢＰと融合した本発明のタンパク質の温度およびｐＨへの活性依存性、ならびに、温度に対する安定性は、本発明の天然型のタンパク質と同様であった。安定性を維持するｐＨ領域は、本発明の天然型のタンパク質がｐＨ３〜８であるのに対して、本発明のＭＢＰ融合タンパク質はｐＨ４〜９と、アルカリ性方法へ移動していた。しかし、本発明のＭＢＰ融合タンパク質は、本発明の天然型のタンパク質と同様に、エキソアラビナナーゼ活性と、アラビノビオース転移活性とを有していた。
【００４８】
（アラビノビオースの製造）
シュガービートパルプ（甜菜糖の搾り粕）から、アラビノビオースを製造した。まず、前記パルプを、０.１Ｍ ＮａＯＨ中、１００℃で１時間処理し、その抽出液に、エタノールを加え、多糖が含まれる画分を回収した。次に、ペニシリウム クリソジェナム ３１Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３）由来のアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質（ＡＦＱ１またはＡＦＳ１）を前記多糖に作用させ、糖鎖として結合している分枝アラビノースを遊離させた。その結果、１ｇの前記多糖から、約０.６ｇの直鎖型アラビナンが得られた。そして、このアラビナンに、本発明の組換えタンパク質を作用させ、アラビノビオースを遊離させた。ビオースとしての収率は、約７０％であった。
【００４９】
（アラビノビオースの転移-Ａ）
本発明の組換えタンパク質を使用して、前記直鎖型アラビナンからアラビノビオースを遊離させるとともに、グリセロールに転移させた。５μｇの本発明の組換えタンパク質を、２５％グリセロール、１％アラビナンを含む０．４ｍｌの２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５.０）中、３７℃で２時間インキュベートした。その後、前記反応溶液中の物質を、高性能ＨＰＬＣ陰イオン交換クロマトグラフィーで分離し、アラビノビオースがグリセロールに転移した物質（アラビノビオグリセロール）を得た。その結果の図２に示す。図２中、ピーク１は、グリセロールのピークであり、ピーク３は、アラビノビオースのピークであり、ピーク２が、アラビノビオースがグリセロールに転移した転移産物のピークである。
【００５０】
（アラビノビオースの転移-Ｂ）
次に、アラビノビオースの受容物質（アクセプター）としてさまざまなアルコールや糖を用いて、本発明の組換えタンパク質のアラビノビオース転移能を比較した。反応液組成は、蒸留水で透析した１０μｌの２％直鎖型アラビナン、２μｌ(０．５６μｇ)の本発明の組換えタンパク質（０．２８ｍｇ/ｍｌ）、１０μｌの５０％アクセプター、および、０.４μｌの１Ｍ酢酸バッファー(ｐＨ５．０)であり、各組成の最終濃度を、アラビナン；１％、アクセプター；２５％、酢酸バッファー；２０ｍＭとした。また、反応条件は、３７℃、３０分間であり、５分間のボイルによる酵素の失活で反応を終了させた。反応終了後、９８０μｌのmilliQ水で５０倍希釈し、そのうち１０μｌを高性能陰イオン交換クロマトグラフィー(ＨＰＡＥＣ）を用いた分析に使用した。その結果の検出パターンの一例を図３に示す。図３は、アクセプターとしてグリセロールを使用した場合の結果の一例である。同図において、ピーク４、５および６を含む検出パターンを示し、ピーク４は、ＲＴ（保持時間）５.６分の主要転移産物を示し、ピーク５は、ＲＴ６.２分のマイナー転移産物を示し、ピーク６は、アラビノビオースを示す。生成されたアラビノビオース、主要転移産物、マイナー転移産物の生成量をクロマトグラフィーの検出パターンの面積に基づき比較した結果を下記表４に示す。
【００５１】
（表４）
アクセプター        アラビノビオース  主要転移産物  マイナー転移産物
メタノール                125              25              -
エタノール                113               6              -
2-メトキシエタノール       67              40              -
1-プロパノール             18               3              -
1,2-プロパンジオール       96              56              5
1,3-プロパンジオール       64              83              -
2-メチル-1-プロパノール    53               7              -
1-ブタノール               43               6              -
2-ブタノール               53               -              -
1,2-ブタンジオール         47              44              6
1,3-ブタンジオール          7              60              3
1,4-ブタンジオール         72              18              -
2,3-ブタンジオール        119              10              -
3-メチル-1-ブタノール      81              10              -
1-ペンタノール             85               4              -
1,5-ペンタジオール         47              15              -
グリセロール               70             182             17
ソルビトール              160             104              -
キシリトール              139             141              4
アラビノース              126              33             30
フルクトース              163              57             20
ガラクトース              141              26             24
グルコース                118              49             25
ラムノース                141              29              -
キシロース                105              31              6
無し                      214               -              -      
上記表４に示すとおり、本発明の組換えタンパク質は、グリセロールに最も高いアラビノビオースの転移能を示した。また、糖類のアクセプターの中では、糖アルコールに転移させやすいことが示された。糖類は、数個のヒドロキシル基を有するため、主要転移産物の他にも、マイナー転移産物が生成された。一価アルコールのアクセプターでは、メタノールに最も転移させやすかった。また、１位のヒドロキシル基に転移しやすく、一価よりも多価アルコールへの転移能が高い傾向が見られた。
【００５２】
次に、上記表４に示すとおり本発明の組換えタンパク質が最も高いアラビノビオース転移能を示したアクセプターであるグリセロールを用いて、さまざまな条件で転移反応を行った。具体的には、（１）温度条件、（２）ｐＨ条件、（３）アクセプター（グリセロール）濃度条件、（４）時間条件をそれぞれ変化させて、転移反応を行った。
【００５３】
（アラビノビオースの転移-Ｃ）
反応条件を２０〜５０℃の温度で１０分間にした他は、前記（アラビノビオースの転移-Ｂ）と同様にしてグリセロールに対する転移反応とその生成物の分析を行った。その結果を図４に示す。図４は、クロマトグラフィーの検出パターンの面積に基づく転移産物量および転移効率（アラビノビオースに対する転移産物の生成量比）を示す。図４に示すとおり、転移産物の生成量は、４０〜５０℃で最も高いことが示された。一方で、同温度では、アラビノビオースの生成量も高くなることが示された。
【００５４】
（アラビノビオースの転移-Ｄ）
反応液組成中の０.４μｌの１Ｍ酢酸バッファー(ｐＨ５．０)に替えて１μｌの１Ｍバッファー（ｐＨ２．７〜７．０）を使用して（最終濃度５０ｍＭ）、反応条件を４０℃、１０分間とした他は、前記（アラビノビオースの転移-Ｂ）と同様にしてグリセロールに対する転移反応とその生成物の分析を行った。その結果を図５に示す。図５は、クロマトグラフィーの検出パターンの面積に基づく転移産物量および転移効率を示す。図５に示すとおり、転移産物の生成量は、ｐＨ３〜５で最も高いことが示された。
【００５５】
（アラビノビオースの転移-Ｅ）
反応液組成中の１０μｌの５０％アクセプターに替えて０〜１００％のグリセロールを使用し、酢酸バッファーのｐＨを４．０とし、反応条件を４０℃、１０分間とした他は、前記（アラビノビオースの転移-Ｂ）と同様にしてグリセロールに対する転移反応とその生成物の分析を行った。その結果を図６に示す。図６は、クロマトグラフィーの検出パターンの面積に基づく転移産物量および転移効率を示す。図６に示すとおり、グリセロールの濃度が高いと、転移効率は増加するが、転移産物量は減少した。また、グリセロール濃度が２０％で、転移産物量が最も多くなった。
【００５６】
（アラビノビオースの転移-Ｆ）
反応液組成を、１００μｌの蒸留水で透析した２％直鎖型アラビナン、２０μｌ(０．５６μｇ)の本発明の組換えタンパク質（０．２８ｍｇ/ｍｌ）、１００μｌの４０％アクセプター、および、４μｌの１Ｍ酢酸バッファー(ｐＨ４．０)とし、各組成の最終濃度を、アラビナン；１％、アクセプター；２０％、酢酸バッファー（ｐＨ４．０）；２０ｍＭとして、反応温度４０℃で、１０、３０分、１、２、４、６、８、１０時間の反応を行い、その生成物の分析を（アラビノビオースの転移-Ｂ）と同様にして行った。その結果を図７に示す。図７は、クロマトグラフィーの検出パターンの面積に基づく転移産物量および転移効率を示す。図７に示すとおり、反応時間１時間で、転移産物量が最大となった。また、転移効率（転移産物/アラビノビオース）が、時間とともに減少するから、反応時間の経過にともない転移産物の最分解が起きたことがわかる。
【００５７】
（アラビノビオグリセロールの大量分取）
本発明の組換えタンパク質を用いて、アラビノビオースをグリセロールに転移させ、その転移産物（アラビノビオグリセロール）を分離回収した。トータル５６ｍｌの反応液組成を、蒸留水で透析した２５ｍｌの２％直鎖型アラビナン、５ｍｌの本発明の組換えタンパク質（０．２８ｍｇ/ｍｌ）、２５ｍｌの４０％グリセロール、および、１ｍｌの１Ｍ酢酸バッファー(ｐＨ４．０)とし、最終濃度を、アラビナン；１％、アクセプター（グリセロール）；２０％、酢酸バッファー（ｐＨ４．０）；２０ｍＭとした。この反応液を、４０℃、１時間で反応させ、５分間のボイルによる酵素の失活で反応を終了させた。反応後の溶液は、減圧濃縮で３２ｍｌとした後、２８８ｍｌのアセトニトリルを添加・混合し、９０％アセトニトリル溶液とした。遠心分離により生じた沈殿を取り除いた後、その上澄みを、９０％アセトニトリルで平衡化したＮＨ２ Ｓｅｐ-Ｐａｋ  ｖaｃ ２０ｃｃ（Waters社製）に通し、３００ｍｌの９０％アセトニトリルで溶出を行い、溶出液を５０ｍｌずつに分画した。未吸着画分では、ビオースと転移産物ともに、ほとんど検出できなく、０〜１００ｍｌの画分では、転移産物が主に溶出され、１００〜３００ｍｌの画分では、アラビノビオースが主に溶出された。この転移産物の画分には、グリセロールが混在したため、さらに、以下の分離回収操作を行った。前記転移産物画分（１００ｍｌ）を減圧濃縮して２０ｍｌとし、これに３８０ｍｌのアセトニトリルを混合して９５％アセトニトリル溶液とした。この９５％アセトニトリル溶液を、９５％アセトニトリルで平衡化したＮＨ２ Ｓｅｐ-Ｐａｋ  ｖaｃ ２０ｃｃ（Waters社製）に通し、１００ｍｌの９５％アセトニトリルおよび４００ｍｌの９０％アセトニトリルを用いてこの順で溶出を行い、溶出液を５０ｍｌずつに分画した。未吸着画分（４００ｍｌ）では、グリセリロールのみが溶出され、転移産物は、０〜２００ｍｌの分画で溶出された。この分画の転移産物には、２種類の転移産物（主要転移産物とマイナー転移産物）が含まれていたので、さらに、以下の分離回収操作を行った。前記転移産物画分（４００ｍｌ）を減圧濃縮して３ｍｌとし、これに２７％のアセトニトリルを混合して９０％アセトニトリル溶液とした。これを、９０％アセトニトリルで平衡化した２個つなげたＮＨ２ Ｓｅｐ-Ｐａｋ  ｖaｃ ２０ｃｃ（Waters社製）に通し、９０％アセトニトリルで１０ｍｌずつ溶出した。未吸着画分を含め最初の２３画分では転移産物は検出されなかった。２４〜３５画分には、図３におけるピーク５の第二次産物が主に含まれ、３６〜５０画分には、図３におけるピーク４の主要転移産物が主に含まれた。それぞれの画分について同様の操作を３回ずつ行って精製し、最終的に、主要転移産物（純度９６％）を８．４ｍｇ、マイナー転移産物（純度４４％）を１．８ｍｇを得た。
（アラビノース製造における共同作用）
アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質ＡＦＱ１およびＡＦＳ１を、前述した精製方法に従って、本発明の菌であるペニシリウム クリソジェナム ３１Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３）から精製した。その結果を表５に示す。
【００５８】
（表５）
精製ステップ      タンパク質    活性      比活性      精製     収率
(ｍｇ)        (Ｕ)     (Ｕ/ｍｇ)    (倍)    （％）
培養ろ液          １９５.７    ６７.２    ０.３４    １       １００
硫酸アンモニウム  １２５.１    ５１.５    ０.４１    １.２    ７６.６
（ＡＦＱ１）
ResourceQ           １９.８      ９.２    ０.４６    １.４    １３.７
Mono Q                ８.６      ７.９    ０.９２    ２.７    １１.８
Phenyl Superose       １.６      ４.２    ２.６３    ７.７      ６.３
Superdex 75           ０.５      ２.９    ５.８０  １７.０      ４.３
（ＡＦＳ１）
ResourceQ           ５１.１    ３６.６    ０.７２    ２.１    ５４.５
ResourceS             ３.４    ２９.０    ８.５３  ２５.１    ４３.２
Superdex 75           １.２    １６.２  １３.５０  ３９.７    ２４.１  
ＡＦＱ１およびＡＦＳ１の分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーによれば、それぞれ、７１ｋＤａおよび４６ｋＤａであり、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによれば、それぞれ、７９ｋＤａおよび５２ｋＤａの単一バンドであった。したがって、これらは単量体であると示唆される。また、ＡＦＱ１は、エンドグリコシダーゼＨによって７９ｋＤａから７５ｋＤａへの分子量の減少がみられ、糖タンパクであることが示唆された。ＡＦＳ１については、ＳＤＳ-ＰＡＧＥでは、反応前後の分子量変化は観察されなかった。ＡＦＱ１およびＡＦＳ１のＮ末端アミノ酸配列を、本発明のタンパク質と同様に決定したところ、それぞれ、配列番号２１および２２に示す配列であった。ＡＦＱ１およびＡＦＳ１は、５０℃で最大の酵素活性を示し、ｐＨ５.０、５０℃で１時間インキュベーションしても、当初の８０％以上の活性を示し、また、６０℃のプレインキュベーションにより完全失活した。３７℃における酵素活性は、ＡＦＱ１は、ｐＨ４.０〜６.５で良好で、ＡＦＳ１は、ｐＨ３.３〜５.０で良好であり、３０℃、１６時間のインキュベーション後に当初の８０％以上の活性を示したのは、ＡＦＱ１は、ｐＨ４.０〜８.０であり、ＡＦＳ１は、ｐＨ３.０〜７.０であった。金属への感受性を、Ａｇ+、Ｂａ2+、Ｃａ2+、Ｃｄ2+、Ｃｏ2+、Ｃｕ2+、Ｆｅ3+、Ｈｇ2+、Ｋ+、Ｍｇ2+、Ｍｎ2+、Ｎａ+、Ｎｉ2+およびＺｎ2+からなる１３カチオンについて調べた結果、両者とも、Ａｇ+、Ｃｄ2+、Ｃｕ2+およびＨｇ2+の添加により、活性阻害を受けた。ｐＨ５.０、３７℃におけるｐ-ニトロフェニル-α-Ｌ-アラビノフラノシドに対する速度論パラメータを調べたところ、ＫｍおよびＫｃａｔは、ＡＦＱ１が、０.８６ｍＭおよび０.８６x１０3/minであり、ＡＦＳ１が、１.３２ｍＭおよび３.５６x１０3/minであった。
【００５９】
合成ｐ-ニトロフェニルグリコシド（α-Ｌ-アラビノフラノシド、α-Ｌ-アラビノピラノシドおよびβ-Ｄ-キシロピラノシド）に対する活性については、ＡＦＱ１は、ｐ-ニトロフェニル-α-Ｌ-アラビノフラノシド以外への活性は示さなかった。一方、ＡＦＳ１は、ｐ-ニトロフェニル-α-Ｌ-アラビノフラノシド以外にもｐ-ニトロフェニル-α-Ｌ-アラビノピラノシドおよびｐ-ニトロフェニル-β-Ｄ-キシロピラノシドに対して活性を示し、その活性比は、１６０/１であった。また、本発明のタンパク質の場合と同様にして、さまざまな多糖に対する基質特異性を調べた。その結果を下記表６に示す。
【００６０】
（表６）                              遊離した還元糖量(μｇ/ｍｌ)   
ＡＦＱ１         ＡＦＳ１      
基質              ０.５ｈ    ６ｈ    ０.５ｈ    ６ｈ  
シュガービートＬアラビナン        １２０    ２９４   ２１３    ３９９
シュガービート脱分枝アラビナン        ３      ３６       ６      ６１
小麦アラビノキシラン                ６２      ９２       ２      ４６
大豆アラビノガラクタン                ５      ２１     ５１      ８５
ラーチウッドアラビノガラクタン        ２        ２       ４        ５  
上記表５に示すように、ＡＦＱ１およびＳ１ともに、脱分子アラビナンよりもＬアラビナンへの活性が大きいことから、これらのアラビノフラノシダーゼは、直鎖状α-１,５-Ｌ-アラビナンに結合した１,２-または１,３-結合型側鎖アラビノフラノース残基を好むことがわかった。ＡＦＱ１は、小麦アラビノキシランをより分解し、ＡＦＳ１は、大豆アラビノガラクタンをより分解した。また、ＨＰＬＣ解析の結果、遊離した糖は、アラビノースだけであった。また、ＡＦＱ１およびＳ１は、ともに、α-１,５-Ｌ-アラビノフラノトリオースおよびビオースを分解した。ＡＦＱ１は、完全に前記２基質をともに完全に分解したが、ＡＦＳ１は、反応溶液中のアラビノース濃度の上昇によって、活性が弱められ、同じ時間内では、完全に分解することができなかった。
【００６１】
前記２つのタンパク質と、本発明のタンパク質との共同作用を利用して、アラビノースを製造した。それぞれ４.５μｇのＡＦＱ１、ＡＦＳ１および本発明のタンパク質の少なくとも１つを含む溶液３０μｌと、３％Ｌアラビナンを含む９０μｌの２０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５.０）との混合液を３７℃でインキュベートし、所定時間反応させた後、ＨＰＬＣでアラビノースの定量を行った。その結果を下記表７に示す。
（表７）                遊離したアラビノースの濃度(mg/ml)             
時間(h)    Ｑ１    Ｓ１    Ｘ     Q1/X      S1/X     Q1/S1   Q1/S1/X   
０         ０      ０    ０         ０       ０       ０        ０
４      ６.８   ６.４    ０    １１.８    ６.８    ８.３   １３.４
８      ７.９   ７.５    ０    １５.４    ９.６    ９.７   １６.４
２２      ９.７   ９.０    ０    １７.１  １４.９  １２.０   １７.２  
Ｑ１：ＡＦＱ１，Ｓ１：ＡＦＳ１，Ｘ：本発明のタンパク質
上記表７が示すように、本発明のタンパク質のみでは、２２時間インキュベーションしてもアラビノースを遊離することができなかったが、ＡＦＱ１またはＡＦＳ１と共に作用すると、それぞれ単独での活性の和よりも大きな活性が得られた。特に、ＡＦＱ１とエキソアラビナナーゼの組合せでは、４時間のインキュベーションした時点で、ＡＦＳ１との組合せよりも早く、アラビノース生産における共同作用効果が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
以上のように、本発明のタンパク質は、例えば、付加価値の高いアラビノビオースの簡便かつ安価な製造、新規化合物を含むアラビノビオース付加物質の製造、および効率のよいアラビノースの製造に有用であり、さらに、植物由来廃棄物の資源化にも有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、本発明のタンパク質のエキソアラビナナーゼ活性を示す図である。
【図２】図２は、本発明のタンパク質によりアラビノビオースが転移された物質の検出パターンの一例を示す図である。
【図３】図３は、本発明のタンパク質によりアラビノビオースが転移された物質の検出パターンのその他の例を示す図である。
【図４】図４は、アラビノビオース転移物質量およびその転移効率と反応温度との関係の一例を示す図である。
【図５】図５は、アラビノビオース転移物質量およびその転移効率と反応液ｐＨとの関係の一例を示す図である。
【図６】図６は、アラビノビオース転移物質量およびその転移効率とアクセプター濃度との関係の一例を示す図である。
【図７】図７は、アラビノビオース転移物質量およびその転移効率と反応時間との関係の一例を示す図である。
【符号の説明】
【００６４】
１：グリセロールのピーク。
２：アラビノビオース転移産物のピーク。
３：アラビノビオースのピーク。
４：主要転移産物のピーク。
５：マイナー転移産物のピーク。
６：アラビノビオースのピーク。
【配列表フリーテキスト】
【００６５】
配列番号９    ＰＣＲ用プライマーNterF
配列番号１０  ＰＣＲ用プライマーNterF2
配列番号１１  ＰＣＲ用プライマー73R
配列番号１２  ＰＣＲ用プライマー73R2
配列番号１３  ＰＣＲ用プライマーXC1R
配列番号１４  ＰＣＲ用プライマーXC2R
配列番号１５  ＰＣＲ用プライマーXC1R
配列番号１６  ＰＣＲ用プライマーXC2R
配列番号１７  ＰＣＲ用プライマーAbnxB
配列番号１８  ＰＣＲ用プライマーAbnx3R
配列番号１９  ＰＣＲ用プライマーPmalF
配列番号２０  ＰＣＲ用プライマーPmalR
【図１】
2004229660.tif 000003
【図２】
2004229660.tif 000004
【図３】
2004229660.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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