(57)【要約】【課題】ヘマトコッカス藻類からアスタキサンチンの濃縮物を超臨界抽出方法によって抽出する。【解決手段】ヘマットコッカス藻類からのアスタキサンチンの抽出方法において、細胞壁を破壊したヘマットコッカス藻類を、アスタキサンチンへの溶解度が超臨界流体に対する溶解度よりも大きな補助溶剤と混練して形成した成形体を抽出槽内に充填し、超臨界流体を供給してアスタキサンチンを抽出した後に、分離槽において減圧してアスタキサンチンを分離するアスタキサンチンの抽出方法。【選択図】　図１
2004041147.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘマットコッカス藻類からのアスタキサンチンの抽出方法において、細胞壁を破壊したヘマットコッカス藻類を、アスタキサンチンへの溶解度が超臨界流体に対する溶解度よりも大きな補助溶剤と混練して形成した成形体を抽出槽内に充填し、超臨界流体を供給してアスタキサンチンを抽出した後に、分離槽において減圧してアスタキサンチンを分離することを特徴とするアスタキサンチンの抽出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘマトコッカス藻類由来のアスタキサンチンの効率的な製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アスタキサンチンは赤色を呈するカロチノイド色素の一種で、自然界に広く分布している。例えば、マダイやサケ・マス等の魚類、あるいは甲殻類等は、その表皮、筋肉又は外殻等にアスタキサンチンを蓄積し、その為に表皮あるいは肉が美しい赤色もしくは桃色を呈するが、これらの生物は自らアスタキサンチンを生合成することはできない。
アスタキサンチンは天然物由来で、食材用色素、食品添加物として有用であると共に、これら魚介類を養殖する場合には、通常飼料にアスタキサンチンを添加し、着色、いわゆる色揚げが行われている（特開昭５４−７０９９５号公報、特開平７−６７５４６号公報）。また鶏卵の色調改善等を目的とした家禽用飼料等にも利用されている（特許第２５６１１９８号公報）。更に最近はアスタキサンチンの持つ強力な抗酸化作用が注目され、粧香品や医薬品、健康食品としての用途も検討されている（特開昭６３−８３０１７号公報、特開平２−４９０９１号公報）。
【０００３】
これらに用いられるアスタキサンチン源としては、化学合成品の他、アスタキサンチンを含有する、オキアミ、アミエビ、カニ類やファフィア酵母類等がある。市場では安全性の面から天然品の方がより好まれており、オキアミから色素を抽出精製する方法や、ファフィア酵母の培養法等が盛んに研究されている（特開平６−２００１７９号公報、特開平８−５０８８８５号公報）。
しかしながら、これら生物はアスタキサンチン含有量が低く、抽出や精製等にも技術的、経済的問題があり、現在のところ化学合成品が最も多く使用されているが、安全性の観点から、天然物由来のアスタキサンチンを使用したいとの要請が強い。
【０００４】
微細藻類のヘマトコッカスは、上述の生物に比べてアスタキサンチン含有量が顕著に高い為、天然物由来のアスタキサンチン源として近年特に注目されている。
ヘマトコッカス藻類から有機溶剤を用いてアスタキサンチンを抽出する場合、溶剤としてエタノール、アセトン、ヘキサンを用いるように規定されており、食品添加物として用いる場合には残留溶剤濃度も決められている（アセトンの場合３０μｇ／ｇ以下、ヘキサンの場合２５μｇ／ｇ以下）。しかし食品分野、医薬品分野では残留溶剤を問題視する機運が高まっており残留溶剤の少ない、もしくは残留溶剤の問題がない方法での製品化が待たれていた。
【０００５】
更に、有機溶剤を用いて抽出する方法においては、残留溶剤の問題だけではなく、ヘマトコッカス藻類培養液中の栄養源、化学薬品類、クロロフィル類、リン脂質類、ステロール類の混入は避けられないと言う大きな問題があり、ヘマトコッカス藻類由来のアスタキサンチンの利用を躊躇する傾向がある。
また、有機溶剤抽出法においてヘマトコッカス藻類を抽出する場合には、高濃度の製品が得られないのみではなく、一定濃度のアスタキサンチン抽出物しか得られないので、用途に応じた濃度の製品を得ることもできないという問題点があった。
【０００６】
そこで本発明者らは、アスタキサンチンの有機溶剤抽出法の欠点を改善する為、超臨界二酸化炭素抽出法で抽出する方法を検討したが、超臨界二酸化炭素のみを抽出溶剤として使用した場合、アスタキサンチンの流体への溶解度が低いため抽出効率が悪く、しかも抽出時間の経過と共に抽出速度が低下し、この結果、抽出時間が非常に長くなり実用的な抽出方法ということはできなかった。
【０００７】
ヘマトコッカス藻類は、栄養細胞から休眠状態であるシスト細胞に形態変化した後に、多量のアスタキサンチンをシスト細胞中に蓄積するものであるが、シスト細胞は強固な細胞壁を持つため、アスタキサンチンを抽出するためには、物理的、化学的な細胞壁の破壊が必要である。細胞壁を破砕すると、ヘマトコッカス藻類は更に微粉化する。
この微粉末を抽出設備の抽出槽へ充填したり、取り出したりすることは非常に取り扱いが厄介であり作業性も悪い。その上、この微粉末をそのまま抽出槽内に充填すると、超臨界流体が充填層内において、いわゆるチャンネリング、ショートパス現象を引き起こす。その結果、超臨界流体との接触が不均一となりいわゆる抽出斑が起り、アスタキサンチンの回収率を低下せしめると言う問題点が有ることがわかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、超臨界流体を用いてヘマトコッカス藻類からアスタキサンチン濃縮物を得るに当たって、アスタキサンチンの抽出を効率的で短時間で行う方法を提供することを課題とするものである。
また、本発明は、超臨界流体を用いてヘマトコッカス藻類からアスタキサンチン濃縮物を得るに当たって、抽出槽の充填層内での超臨界流体が、チャンネリング、ショートパス現象と称するような不均一な流れとなり、均一な接触が行われないために生じるアスタキサンチンの抽出斑を防止し、アスタキサンチンの抽出効率および回収率を向上させる超臨界抽出方法を提供することを課題とするものである。
更に、本発明は、超臨界流体による抽出時に、抽出時間の経過と共に漸次低下してくる抽出速度を加速させ、アスタキサンチン回収率を向上させる抽出方法に関する。
また、本発明は、超臨界流体を用いてヘマトコッカス藻類から、残留溶剤、ヘマトコッカス藻類培養液中の栄養源、化学薬品類、クロロフィル類、リン脂質類、ステロール類等が混入しないアスタキサンチン濃縮物を得る方法に関する。
また、超臨界流体を用いてヘマトコッカス藻類からアスタキサンチン濃縮物を得る際に、用途に応じた任意の濃度のアスタキサンチン濃縮物を製造する方法を提供することを課題とするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の課題は、ヘマットコッカス藻類からのアスタキサンチンの抽出方法において、細胞壁を破壊したヘマットコッカス藻類を、アスタキサンチンへの溶解度が超臨界流体に対する溶解度よりも大きな補助溶剤と混練して形成した成形体を抽出槽内に充填し、超臨界流体を供給してアスタキサンチンを抽出した後に、分離槽において減圧してアスタキサンチンを分離するアスタキサンチンの抽出方法によって解決することができる。
超臨界流体が二酸化炭素である前記のアスタキサンチンの抽出方法である。
補助溶剤がグリセリン、水から選ばれる少なくとも１種である前記のアスタキサンチンの抽出方法である。
多孔質化剤として、炭素数８個ないし１２個の中鎖脂肪酸トリグリセリド、高級不飽和脂肪酸を添加する前記のアスタキサンチンの抽出方法である。
成形体が直径０．５〜３ｍｍ、長さ２〜３０ｍｍのペレット状、あるいは直径０．５〜３ｍｍの球状体である前記のアスタキサンチンの抽出方法である。
【００１０】
アスタキサンチンの回収率があらかじめ定めた値に達した後に、超臨界状態の二酸化炭素中にエタノールを混合して抽出を継続する前記のアスタキサンチンの抽出方法である。
抽出を連続的に行うとともに、抽出途中において濃度が異なる抽出物を分画する前記のアスタキサンチンの抽出方法である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明は、ヘマトコッカス藻類からアスタキサンチンを抽出分離する際に、細胞壁を破壊した微粒子を抽出槽内に充填して形成した充填層中に超臨界流体を供給して抽出分離操作を行った場合には、アスタキサンチンの抽出効率および回収率が向上しないのは、抽出槽内に形成される超臨界流体の流路が不均一なものとなり、いわゆる抽出斑が形成されることが主たる原因でありあることを見出した。そして、そのような問題点を解決する手段として、アスタキサンチンと抽出に使用する超臨界流体のそれぞれに対する溶解特性が異なる補助溶剤を用いてヘマトコッカス藻類の細胞壁を破壊した微粒子を混練して成形体を作製して抽出槽内に充填して、超臨界流体を供給することによって各成形体への超臨界流体の接触を均一化し、しかも成形体はアスタキサンチンに対する溶解特性が良好で、超臨界流体への溶解度が小さな物質を用いて成形されているので、超臨界流体による抽出工程中においても、超臨界流体に対して溶解度が小さな補助溶剤が急激に抽出されることはなく、成形体の崩壊等を起こすことなく安定した抽出を可能であることを見出したものである。
【００１２】
更に、抽出工程においてアスタキサンチンの抽出が進行し、抽出率が低下した段階において、超臨界流体に対してエタノールを添加して抽出速度を向上させるものである。
また、超臨界流体によって抽出されたアスタキサンチンには、有機溶剤によって抽出した場合に混入が避けられなかった、リン脂質、タンパク質、クロロフィル、ステロール等が抽出されることはなく、各種用途で使用可能なアスタキサンチンが得られるということを見出したものである。
【００１３】
本発明で用いられるヘマトコッカス藻類は、ヘマトコッカス属に属し、アスタキサンチンを生産する藻体に広く適用することができるものであり、天然物、あるいは有機物を炭素源として培養されたもののいずれでも良い。
培養によって取得する例を挙げると、培養液中のヘマトコッカス藻類の増殖および濃度向上のための工程を経た後に、細胞質のアスタキサンチンへの転換および蓄積の工程が行われる。この工程は細胞の成長を抑制するようなストレスが加わる環境下、例えば太陽光、温度、ｐＨ、酸素分圧等の条件を制御することによって行われる。この現象は、緑色の流動性のある細胞質から不活性なシストへの形態的・生化学的な転換を伴って起きている。これら影響因子を制御することによって、アスタキサンチンを１．０〜８％の濃度で蓄積させることができる。
本発明では、アスタキサンチン含有のヘマトコッカス藻類から、シスト化した細胞の細胞壁を予め物理的、化学的に破壊して微細な粒子状体とした後に、超臨界流体によって抽出することを特徴とするものである。
【００１４】
本発明における超臨界流体とは、臨界温度および臨界圧力を超過した状態の流体であって、二酸化炭素では温度３１．６℃以上、圧力７．３８ＭＰａ以上、プロパンでは９６．７℃以上、４．２６ＭＰａ以上、エチレンでは９．９℃以上、５．１５ＭＰａ以上の状態にあるものを言う。これらの流体は、液体に近い密度と気体に近い大きな拡散定数を有していることを特徴としており、超臨界流体には、温度および圧力が臨界温度、臨界圧力を超過した状態の流体のみに限らず、温度、圧力の両者が臨界点の近傍にあるもの、いずれか一方が臨界条件を超え、他方は臨界点の近傍にあるものなどの、いわゆる亜臨界状態の流体も含むものである。
【００１５】
これらのなかでも、二酸化炭素は、不燃性であるとともに食品添加剤としても使用されている物質であり、とくにアスタキサンチンを補助食品、食品添加物として用いる場合には好適である。
【００１６】
以下に超臨界流体として超臨界二酸化炭素を使用した例について説明する。
本発明は、抽出槽内において超臨界二酸化炭素と接触させて抽出する際に、細胞壁を破壊したヘマットコッカス藻類を、アスタキサンチンへの溶解度が超臨界流体に対する溶解度よりも大きな補助溶剤と混練して形成した成形体を抽出槽内に充填することを特徴している。
【００１７】
そのような補助溶剤としては、グリセリン、水を挙げることができる。これらは、アスタキサンチンへの溶解度が大きいが、超臨界状態の二酸化炭素に対しては、それぞれの蒸気圧程度の量が溶解するのみである。
特に、グリセリン、あるいはグリセリンと水との混合物を併用することが好ましい。グリセリンを水と混合した場合には、混合物の粘度はグリセリンの粘度に比べて低下してヘマトコッカス藻類との分散がより進むものと考えられる。
【００１８】
補助溶剤を細胞壁を破壊したヘマットコッカス藻類に添加し、補助溶剤を添加、浸透させて混練物を、ペレット状、球状等の形状に成形した後に、成形体を抽出槽内に充填して超臨界流体を供給すると、抽出槽内は成形体によって充填されているので、超臨界流体の均質な流れが形成される。しかも、補助溶剤はアスタキサンチンには溶解するのでアスタキサンチンの抽出速度を促進する作用を果たす。
一方、水、グリセンリン等の補助溶剤は、それぞれの蒸気圧程度の量が超臨界二酸化炭素に伴われて除去されるので、抽出の経過に伴って成形体から徐々に抽出されることとなり、成形体の形状を維持しながら成形体の多孔質化を進めることができる。
【００１９】
更に、成形体の形状を維持した状態で多孔質化を促進するために、多孔質化剤として、炭素数が８個ないし１２個の中鎖脂肪酸トリグリセリド、菜種油、コーン油、オリーブ油等の高級不飽和脂肪酸を添加することができ、これらの複数種を混合して用いてもよい。
これらのなかでも、炭素数８個ないし１２個の中鎖脂肪酸トリグリセリドは、炭素鎖が長いものに比べて粘性が小さいので、ヘマトコッカス藻類を成形する際には、混練、および成形がし易いので好ましい。
【００２０】
補助溶剤、多孔質化剤は、超臨界二酸化炭素は、抽出の進行に伴って成形体の多孔質化を促進し、超臨界二酸化炭素は成形体の内部へも拡散して成形体の内部からも効率良く抽出が進行することとなる。
【００２１】
また、補助溶剤は、その添加量が多くなると超臨界二酸化炭素の成形体内部への拡散を阻害し、超臨界流体に溶解性のある補助溶剤およびヘマトコッカス藻類中の脂質が抽出された後、粒子形状は維持するものの多孔質化が充分に起こらないという問題点が生じる。したがって、補助溶剤は、成形体全体の２０質量％以下が好ましい。
また、多孔質化剤として添加する炭素数が８ないし１２個の中鎖脂肪酸トリグリセリド、菜種油、コーン油、オリーブ油等の混合量が多くなると、超臨界流体に伴ってアスタキサンチンとともに抽出されるために、相対的にアスタキサンチンの濃度が低下するので、高濃度品を抽出する場合には、それらの使用量を少なくすることが必要である。
【００２２】
また、成形体の形状は、直径０．５ｍｍないし３ｍｍに造粒することが好ましく、直径１〜２ｍｍのものがアスタキサンチンの回収率が大きくなるので好ましい。また、成形体は、球状、楕円体状、円柱状のいずれでも良い。
【００２３】
また、超臨界二酸化炭素による抽出が進行すると、成形体中の脂質の含有量が抽出の進行に伴って減少するために、抽出速度が低下することは避けられなかった。これは、溶剤に比べて溶質の割合が減少し、アスタキサンチンの抽出速度が減少することに起因するものであって、アスタキサンチンの抽出率が３０〜５０％に達した付近からアスタキサンチンの抽出速度曲線の勾配が緩やかになってくる。
【００２４】
このような問題は、抽出率が３０〜５０％に達した後に、超臨界二酸化炭素中にエタノールをヘマトコッカス藻類に対し質量比で５〜１５％添加することにより、アスタキサンチンの超臨界二酸化炭素への溶解度を高め、抽出を加速させることができるので抽出時間を大幅に短縮できる。
一方、抽出初期から超臨界二酸化炭素にエタノールを加えた場合においては、当初の抽出速度は大きいが、アスタキサンチンの抽出率が３０〜５０％に達すると抽出速度が徐々に低下し、全体の抽出時間はエタノールを添加しない場合と同等である。
【００２５】
このように抽出経過時間の途中からエタノールを添加することによって抽出時間が大幅に短縮することが可能であるのは、ヘマトコッカス藻類中の脂質が超臨界二酸化炭素によって抽出され、成形体が多孔質化し、そこに抽出加速剤であるエタノールが拡散浸透し易くなるためであって、抽出の初期に添加するよりも、抽出が進行してから添加することによって、添加の効果が顕著となるものと考えられる。
【００２６】
また、超臨界流体を用いたヘマトコッカス藻類からのアスタキサンチンの抽出方法においては、抽出時間の経過と共にアスタキサンチン濃縮物の濃度が向上するという他の抽出方法ではみられない特徴を有している。これは、抽出初期においては、ヘマトコッカス藻類中の炭素数８ないし２０の脂質留分が優先的に抽出され、アスタキサンチンの濃度は質量１％以下と非常に希薄である。しかし抽出時間の経過と共にこれら脂質留分は減少し、アスタキサンチンの濃度が向上する。
したがって、任意の抽出経過時間におけるアスタキサンチン濃縮物を取り出すことによって、用途に応じた濃度のアスタキサンチン濃縮物を製造することが可能であり、濃度の異なる成分を分画することができる。このような分画方法を用いることによって、濃度０．５〜６０質量％の任意の濃度のアスタキサンチンを製造することができる。
更に、得られた高濃度のアスタキサンチンを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等によって更に高濃度に濃縮しても良い。
【００２７】
また、超臨界二酸化炭素による抽出物には、リン脂質類、タンパク質類、クロロフィル類、ステロール類、ヘマトコッカス藻類の培養に使用される栄養源等も含まれていないので、抽出物は食品色素、食品添加物、健康食品、化粧品、香料、医薬品、飼料などとして安全性が高いものである。
【００２８】
【実施例】
以下に、実施例、比較例により本発明を説明する。
2004041147.tif 000003
ヘマトコッカス藻類９５重量部に、グリセリン５重量部を添加し、混合機（品川製造所製）で十分混練した後、湿式押し出し造粒機（ダルトン社製）で２０ｒｐｍにて粒径１ｍｍに造粒した。この結果１ｍｍφ、長さ５ｍｍのペレット状に造粒することができた。
得られたペレットを、図１で示す超臨界抽出装置の抽出槽に充填して抽出を行った。
【００２９】
超臨界抽出装置１は、抽出槽２を有し、二酸化炭素貯槽３から、二酸化炭素は第１熱交換器４を介して供給された二酸化炭素を圧縮機５において圧縮の後、第２熱交換器６において所定の温度として抽出槽２に供給される。抽出槽２において成分を抽出した後に減圧弁７および第３熱交換器８を介して、分離槽９に供給されて所定の圧力において分離されて分離槽下部の抽出物分離弁１０によって抽出物が分離される。
また、分離槽９から回収された二酸化炭素は、第４熱交換器１１によって冷却されて二酸化炭素貯槽３に貯蔵される。
【００３０】
また、抽出槽への超臨界二酸化炭素の管路には、エタノール貯槽１２からエタノール加圧ポンプ１３に結合したエタノール供給弁１４が結合されてエタノールが供給される。
【００３１】
図１に示す、超臨界抽出装置によって、抽出圧力３５．ＭＰａ、抽出温度４０℃、二酸化炭素流量６０ｎｌ／ｈｒで超臨界二酸化炭素を供給して抽出を行った。生成したアスタキサンチンの量を、吸光光度計によって測定した。
抽出時間とアスタキサンチンの回収率を図２に示す。また、抽出時間６時間におけるアスタキサンチンの回収率は６４．９％であった。抽出槽を開放し、充填した粒子を観察した結果、充填した粒子はほぼ均一に抽出されていた。また粒子を破砕し粒子内部を観察した結果、均一に抽出されていた。
【００３２】
比較例１
補助溶媒を用いて成形体を作製しない点を除き、実施例１と同様に抽出槽内にヘマトコッカス藻類を充填し、実施例１と同様の抽出条件で抽出を行った。
抽出時間とアスタキサンチンの回収率を図２に示す。抽出時間６時間におけるアスタキサンチンの回収率は２４．７％であった。また、抽出槽を開放したところ、充填した粉末は均一には抽出されていなかった。
【００３３】
比較例２
成形をしなかった点を除き、実施例１と等しい量のグリセリンを補助溶剤として加え、混合機で混合したものを抽出槽に充填して、実施例１と同様の抽出条件で抽出を行った。
抽出時間とアスタキサンチンの回収率を図２に示す。抽出時間６時間におけるアスタキサンチンの回収率は４０．１％であった。また、抽出槽を開放して内部の状態を観察したところ、抽出は均一には行われておらず、また塊状となっていた部分の内部は抽出されていなかった。
【００３４】
実施例２
ヘマトコッカス藻類９５重量部に対して、グリセリン５重量部を添加して実施例１と同様の条件で成形した成形体を球形整粒機（ダルトン社製マルメライザー）により、直径０．５〜２ｍｍ、粒度分布の極大値１．２ｍｍの球形とした。得られた成形体を抽出槽に充填して、実施例１と同様の抽出条件で抽出を行った。抽出時間とアスタキサンチンの回収率を図３に示す。抽出時間６時間におけるアスタキサンチンの回収率は６３．１％であった。また、抽出槽を開放して内部の状態を観察したところ抽出は均一には行われており、成形体内部の観察でも均一に抽出されていたことが確認できた。
【００３５】
実施例３
ヘマトコッカス藻類９５重量部に対して、グリセリン５重量部を添加して実施例１と同様の条件で湿式押し出し造粒機（ダルトン社製）で２０ｒｐｍにて粒径２ｍｍに造粒して、直径２ｍｍ、長さ５ｍｍのペレット状に造粒した点を除き、成形体を抽出槽内に充填して実施例１と同様の抽出条件で抽出を行った。
抽出時間とアスタキサンチンの回収率を図３に示す。抽出時間６時間におけるアスタキサンチンの回収率は５８．０％であった。また、抽出槽を開放して内部の状態を観察したところ抽出は均一には行われており、成形体内部の観察でも均一に抽出されていたことが確認できた。
【００３６】
実施例４
ヘマトコッカス藻類９５重量部に対して、グリセリン５重量部を添加して実施例１と同様の条件で湿式押し出し造粒機（ダルトン社製）で２０ｒｐｍにて粒径０．５ｍｍに造粒して、直径０．５ｍｍ、長さ５ｍｍのペレット状に造粒した点を除き、成形体を抽出槽内に充填して実施例１と同様の抽出条件で抽出を行った。
抽出時間とアスタキサンチンの回収率を図３に示す。抽出時間６時間におけるアスタキサンチンの回収率は４８．６％であった。また、抽出槽を開放して内部の状態を観察したところ一部に抽出が不均一な部分が見られた。
【００３７】
実施例５
ヘマトコッカス藻類９５重量部に対して、グリセリン５重量部を添加して実施例１と同様の条件で湿式押し出し造粒機によって２０ｒｐｍにて粒径３ｍｍに造粒して、直径３ｍｍ、長さ５ｍｍのペレット状に造粒した点を除き、成形体を抽出槽内に充填して実施例１と同様の抽出条件で抽出を行った。
抽出時間とアスタキサンチンの回収率を図３に示す。抽出時間６時間におけるアスタキサンチンの回収率は４４．７％であった。また、抽出槽を開放して内部の状態を観察したところ抽出は均一に行われていたが、成形体を破砕して観察したところ、成形体内部には一部に抽出が不均一な個所があった。
【００３８】
実施例６
ヘマトコッカス藻類９０重量部に対して、グリセリンを５重量部および中鎖脂肪酸トリグリセリド（花王製　ココナードＲＫ）５重量部を添加して成形した点を除き、成形体を抽出槽内に充填して実施例１と同様の抽出条件で抽出を行った。
抽出時間とアスタキサンチンの回収率を図４に示す。抽出時間６時間におけるアスタキサンチンの回収率は６６．８％であった。また、抽出槽を開放し、充填した成形体を観察した結果、充填した成形体はほぼ均一に抽出されていた。また成形体を破砕し成形体内部を観察した結果、均一に抽出されていた。
【００３９】
実施例７
ヘマトコッカス藻類９５重量部に対して、水５重量部を添加して成形した点を除き、成形体を抽出槽内に充填して実施例１と同様の抽出条件で抽出を行った。抽出時間とアスタキサンチンの回収率を図４に示す。抽出時間６時間におけるアスタキサンチンの回収率は５６．４％であった。また、抽出槽を開放し、充填した成形体を観察した結果、成形体はほぼ完全な形状を維持しており、成形体内部から抽出は均一に進行していた。
またグリセリンのみを添加した実施例１と比べると、抽出率において若干劣るものの、成形体の形成用の補助溶剤としては十分なものであった。
【００４０】
実施例８
ヘマトコッカス藻類９０重量部に、グリセリンおよび水をそれぞれ５．０重量部を添加して成形した点を除き、成形体を抽出槽内に充填して実施例１と同様の抽出条件で抽出を行った。
抽出時間とアスタキサンチンの回収率を図６に示す。抽出時間６時間におけるアスタキサンチンの回収率は７２．３％であった。更に、９時間抽出すると、アスタキサンチンの回収率は９２．０％であった。このとき抽出物のアスタキサンチン平均濃度は１０．９質量％であった。
抽出終了後、抽出槽内でのヘマトコッカス藻類と超臨界二酸化炭素との接触状況をアスタキサンチンの赤色色素の抽出状況から目視して調べたところ、赤色色素はむらなく抽出されていた。更に成形体は多孔質化し、内部まで均一に抽出されていた。
【００４１】
また、実施例１のように補助溶剤としてグリセリンを単独で使用した場合は、グリセリンの粘度が高いので、ヘマトコッカス藻類の微粉末と均一混合させることに困難を伴うが、グリセリンに水を添加すると粘度が低下するために、均一な混合が容易となる。
その結果、グリセリンおよび水を併用する方が、よりいっそう抽出速度が向上する。
また、抽出の経過時間と、アスタキサンチン濃縮物中のアスタキサンチン濃度を測定し、その結果を図５に示す。抽出開始から０．５時間における濃度は０．８１質量％であったが、抽出時間の経過と共に濃度が上昇し、６時間では４５．５質量％、９時間では５４．３質量％に達した。
【００４２】
比較例３
ヘマトコッカス藻類９０重量部に対して、中鎖脂肪酸トリグリセリド（花王製ココナードＲＫ）１０重量部を添加した点を除き、実施例１と同様にして、粒径１ｍｍ、長さ５ｍｍのペレット状の成形体を得た。
得られた成形体を実施例１と同様の条件で抽出を行った。抽出時間６時間におけるアスタキサンチンの回収率は４２．７％であった。抽出時間とアスタキサンチンの回収率を図４に示す。抽出槽を開放したところ、成形体は完全に微紛化し、抽出が均一に行われていなかった。
【００４３】
比較例４
実施例１に用いたヘマトコッカス藻類のみを補助溶剤を用いることなく、実施例１で用いた押し出し造粒機で、ダイス径１ｍｍ、回転数１０ｒｐｍにて造粒を試みたが、ヘマトコッカス藻類の微粒子は圧密化するものの成形体を形成するに至らなかった。そこで３回同じ操作を繰り返し、１ｍｍ以下の圧密化した成型物および未成型の微粉末を含む抽出原料を得た。
これを抽出槽に充填し、実施例１に記載の条件と同様の条件で、抽出を行ったが、６時間後においてもアスタキサンチン回収率が３３．３％程度であった。
また、抽出時間とアスタキサンチンの回収率を図４に示す。
【００４４】
実施例９
ヘマトコッカス藻類８５重量部に対して、グリセリン１０重量部、水５重量部を添加して成形した点を除き、成形体を抽出槽内に充填して実施例１と同様の抽出条件で抽出を行った。
抽出時間とアスタキサンチンの回収率を図６に示す。抽出時間６時間で、アスタキサンチンの回収率は６９．６％であり、１０時間抽出すると、アスタキサンチンの回収率は８１．５％であった。このとき抽出物のアスタキサンチン平均濃度は９．３質量％であった。
抽出終了後、抽出槽内での超臨界二酸化炭素とヘマトコッカス藻類の接触状況をアスタキサンチンの赤色色素の抽出状況から目視で調べたところ、赤色色素はむらなく抽出されていたが、粒子内部に抽出むらがわずかにあった。
【００４５】
比較例５
ヘマトコッカス藻類７５重量部に対して、グリセリン２０重量部、水５重量部を添加した点を除き、実施例１と同様の条件で湿式押し出し造粒機（ダルトン社製）で造粒して、粒径１ｍｍ、長さ５ｍｍのペレット状に成形した。得られた成形体を、充填層に充填して実施例１と同様の条件で抽出した。
抽出時間とアスタキサンチンの回収率を図６に示す。抽出時間６時間で、アスタキサンチンの回収率は５４．７％、１０時間抽出すると、アスタキサンチンの回収率は６８．８％であった。このとき抽出物のアスタキサンチン平均濃度は７．１質量％であった。
【００４６】
抽出終了後、抽出槽内の超臨界二酸化炭素とヘマトコッカス藻類の接触状況をアスタキサンチンの赤色色素の抽出状況から目視して調べたところ、赤色色素はむらなく抽出されていたが、成形体の多孔質化が不充分であり、成形体内部にはむらがあった。
【００４７】
実施例１０
ヘマトコッカス藻類９０重量部に対して、水５重量部、菜種油５重量部を添加した点を除き、実施例１と同様の成形体を調製した。
得られた成形体を抽出槽に充填して実施例１と同様の条件で抽出した。
抽出時間とアスタキサンチンの回収率を図７に示す。抽出時間６時間で、アスタキサンチンの回収率は６２．６％、１０時間で８０．２％であった。このとき抽出物のアスタキサンチン平均濃度は５．７質量％であった。
【００４８】
実施例１１
ヘマトコッカス藻類９０重量部に対して、グリセリン５重量部、菜種油５重量部を添加した点を除き、実施例１と同様の成形体を調製した。
得られた成形体を抽出槽に充填して実施例１と同様の条件で抽出した。
抽出時間とアスタキサンチンの回収率を図７に示す。抽出時間６時間で、アスタキサンチンの回収率は６７．３％、１２時間で９２．１％であった。このとき抽出物のアスタキサンチン平均濃度は８．６８質量％であり、菜種油を添加した場合には、中鎖トリグリセリドを添加した場合と同様の効果が得られる。
【００４９】
実施例１２
ヘマトコッカス藻類８５重量部に対して、グリセリン５重量部、水５重量部、菜種油５重量部を添加した点を除き、実施例１と同様の成形体を調製した。
得られた成形体を抽出槽に充填して実施例１と同様の条件で抽出した。
抽出時間とアスタキサンチンの回収率を図７に示す。抽出時間６時間で、アスタキサンチンの回収率は７５．９％、９時間で９２．７％であった。このとき抽出物のアスタキサンチン平均濃度は８．９質量％であった。
抽出終了後、抽出槽内の超臨界二酸化炭素とヘマトコッカス藻類の接触状況をアスタキサンチンの赤色色素の抽出状況から目視して調べたところ、赤色色素はむらなく抽出されていた。
【００５０】
また、抽出の経過時間とアスタキサンチン濃縮物中のアスタキサンチン濃度を測定して、その結果を図５に示す。抽出開始から０．５時間における濃度は０．４３質量％であったが、抽出時間の経過と共に濃度が上昇し、６時間後においては４２．０質量％、９時間後においては５１．８質量％に達した。この時のアスタキサンチン回収率は９２．７質量％、アスタキサンチン濃縮物合計量の平均濃度は７．９質量％であった。
したがって、実施例８の結果も同様に示しているように、超臨界流体を用いてヘマトコッカス藻類からアスタキサンチン濃縮物を超臨界抽出法で抽出する場合、抽出時間の経過と共にアスタキサンチン濃縮物の濃度が向上するので、所望の抽出経過時間帯におけるアスタキサンチン濃縮物を採取することによって、アスタキサンチンを濃度に応じて分画することが可能となり、アスタキサンチン濃度０．５〜６０質量％の濃縮物を製造することができる。
【００５１】
実施例１３
ヘマトコッカス藻類９０重量部に対して、グリセリン５重量部、水５重量部を添加した点を除き、実施例１と同様の成形体を調製した。
得られた成形体を、抽出槽内に充填して実施例１と同様の条件で抽出を行った。２時間の抽出後に、アスタキサンチン回収率が４０．１％に達した後、ヘマトコッカス藻類の充填量に対し重量比で１／１０のエタノールを超臨界二酸化炭素中に添加して更に抽出を続けた。
抽出時間とアスタキサンチンの回収率を図８に示す。
【００５２】
抽出時間６時間でアスタキサンチンの回収率は９３．４％であり、エタノールを添加しないものに比べて、回収率を高めることができた。また、このとき抽出物のアスタキサンチン平均濃度は１１．２質量％であった。
【００５３】
実施例１４
ヘマトコッカス藻類９０重量部に対して、グリセリン５重量部、水５重量部を添加した点を除き、実施例１と同様の成形体を調製した。
得られた成形体を抽出槽内に充填して、ヘマトコッカス藻類に対して１／１０の重量比のエタノールを超臨界二酸化炭素に加えた点を除いて実施例１と同様の抽出条件で抽出を行った。
抽出時間とアスタキサンチンの回収率を図８に示す。
【００５４】
抽出時間６時間でアスタキサンチンの回収率は７４．４％であり、エタノールを添加しないものに比べて、初期の回収率は大きいものの、９時間後の回収率はエタノールを加えないものと大差はなかった。一方、実施例１２に示すように抽出率が４０％に達した後にエタノールを添加した場合に比べ有意な差が見られた。また、このとき抽出物のアスタキサンチン平均濃度は１１．０質量％であった。
【００５５】
以上のように、抽出加速剤としてエタノールを添加することによって抽出速度を加速することができるが、エタノールを抽出の初期段階で添加するよりも、アスタキサンチンの回収を進めた段階で行うことが好ましく、アスタキサンチンの回収率の曲線の勾配が緩やかになる回収率３０〜５０％の時点で添加する方が好ましい。
【００５６】
実施例１５
実施例８で得られたアスタキサンチン平均濃度１０．９質量％を有するアスタキサンチン濃縮物を分析した結果、表１の結果が得られた。
【００５７】
比較例６
実施例１の試料のヘマトコッカス藻類５６．３ｇを５００ｍｌのアセトン／ヘキサン（１：１容量比）で撹拌しながら４時間抽出した後、濾過した。この濾液をロータリーエバポレーターにて溶剤を留去した後、窒素通気により完全に溶剤を除去し１６．４ｇの抽出物を得た。
アスタキサンチン回収率６０．８％、濃度８．４２質量％の抽出物であった。
得られた抽出物の分析結果を表１に示す。
【００５８】
各成分の分析は以下の方法によって行った。
・脂質：酸分解法
・総カロチノイド：吸光光度法
・アスタキサンチン：総カロチノイド量から黄色色素量を除いて求めた。
・水分：カールフィッシャー法
・タンパク質：ケルダール法
・灰分：直接灰化法
・乾燥減量：常圧加熱乾燥法、測定条件：１０５℃、１時間
・炭水化物：試料から水分、タンパク質、脂質、灰分を除いた残部を炭水化物とした。
・ステロール類：高速液体クロマトグラフ法
・総グリセリン：ガスクロマトグラフ法
・リン脂質：基準油脂分析試験法（日本油化学会編）に準拠
・総クロロフィル：吸光光度法
【００５９】
【表１】
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【００６０】
【発明の効果】
二酸化炭素を抽出溶剤とした超臨界抽出方法を用いたヘマットコッカス藻類からアスタキサンチンの抽出方法において、ヘマトコッカス藻類に、超臨界流体への溶解度よりもアスタキサンチンへの溶解度が大きな補助溶剤を添加して混練して形成した成形体を抽出槽内に充填し、超臨界流体によって抽出したので、抽出槽内において超臨界流体の流れが均一なものとするとともに、成形体の内部を抽出に伴って多孔化した状態で成形体の形状を維持することができるので、均一な抽出が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の一実施例の超臨界抽出装置を説明する図である。
【図２】図２は、成形体を用いた場合と用いない場合のアスタキサンチンの回収率の関係を説明する図である。
【図３】図３は、成形体の径、および形状とアスタキサンチンの回収率の関係を説明する図である。
【図４】図４は、補助溶剤の種類とアスタキサンチンの回収率の関係を説明する図である。
【図５】図５は、抽出の経過時間と、アスタキサンチン濃縮物中のアスタキサンチン濃度の関係を説明する図である。
【図６】図６は、成形体の形成時に加える補助溶剤の種類とアスタキサンチンの回収率を説明する図である。
【図７】図７は、補助溶剤の添加量とアスタキサンチンの回収率を説明する図である。
【図８】図８は、エタノールの添加時点とアスタキサンチンの回収率を説明する図である。
【符号の説明】
１…超臨界抽出装置、２…抽出槽、３…二酸化炭素貯槽、４…第１熱交換器、５…圧縮機、６…第２熱交換器、７…減圧弁、８…第３熱交換器、９…分離槽、１０…抽出物分離弁、１１…第４熱交換器、１２…エタノール貯槽、１３…エタノール加圧ポンプ、１４…エタノール供給弁
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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