(57)【要約】【課題】１−リン酸化糖誘導体と核酸塩基誘導体からヌクレオシドホスホリラーゼの作用により汎用性の高いヌクレオシド誘導体の製造方法を提供し、さらに、同反応におけるヌクレオシドの転化率の向上方法を提供し、低コストで高純度のヌクレオシド誘導体の製造法を提供する。【解決手段】一般式（１）で表される2004041073.tif 000009１−リン酸化塘誘導体をヌクレオシドホスホリラーゼ、イオン交換樹脂存在下で反応させて一般式（２）で表される2004041073.tif 000010ヌクレオシド誘導体を製造する方法。【効果】ヌクレオシドホスホリラーゼまたは該酵素活性を有する微生物を用いた１−リン酸化糖誘導体と核酸塩基誘導体からのヌクレオシド誘導体の製造において、イオン交換樹脂を用いてヌクレオシド誘導体を高収率で回収できるばかりではなく、リン酸トラップ剤のコスト低減、また目的のリン酸塩製造に付すことの利点もある。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）［化１］
【化１】
2004041073.tif 000006
〔式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して水素原子、メチル基、保護されたヒドロキシメチル基または保護されたカルボキシル基を表し、Ｒ３はアシル基を表し、Ｘはハロゲン原子、アルコキシ基またはアルキルチオ基を表し、Ｗは酸素原子またはイオウ原子を表し、Ｚは酸素原子、イオウ原子または置換されてもよい炭素原子を表し、ｎは０または１を表し、ｐおよびｑは０から４の整数を表し、ｒは０または１を表す。（ただし、ｐ、ｑ、ｒ、ｎは、Ｚが酸素原子、イオウ原子の場合には、ｐ＋ｒ≦ｎ＋１、ｑ≦２×（ｎ＋１）−２×（ｐ＋ｒ）を、Ｚが炭素原子の場合はｐ＋ｒ≦ｎ＋２、ｑ≦２×（ｎ＋２）−２×（ｐ＋ｒ）を満たす。）〕で示される１−リン酸化糖誘導体をヌクレオシドホスホリラーゼ存在下、リン酸基と核酸塩基誘導体の交換反応により、一般式（２）［化２］
【化２】
2004041073.tif 000007
（式中、Ｂは、独立してそれぞれピリミジン、プリン、アザプリンおよびデアザプリンからなる群から選択された塩基を示し、それらはハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、水酸基、ヒドロキシアミノ基、アミノキシ基、アルコキシ基、メルカプト基、アルキルメルカプト基、アリール基、アリールオキシ基またはシアノ基によって置換されていてもよい。また、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒは請求項３記載の一般式（１）と同義である。）で示されるヌクレオシド誘導体を製造する方法において、イオン交換樹脂の存在下に該交換反応を行うことを特徴とする一般式（２）で示されるヌクレオシド誘導体の製造法。
【請求項２】
イオン交換樹脂が強塩基性アニオン交換樹脂、弱塩基性アニオン交換樹脂、中塩基性アニオン交換樹脂である請求項１記載の製造法。
【請求項３】
一般式（１）で示される１−リン酸化糖誘導体が式（３）［化３］
【化３】
2004041073.tif 000008
で示される１−リン酸化糖およびその塩であることを特徴とする請求項１記載の製造法。
【請求項４】
１−リン酸化塘誘導体と反応させる核酸塩基誘導体がアデニン、グアニン、シトシン、チミンである請求項１に記載のヌクレオシド誘導体の製造法。
【請求項５】
ヌクレオシドホスホリラーゼが、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１）、グアノシンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１５）、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２）、ウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．３）、チミジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．４）、デオキシウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２３）からなる群から選択される１種又は２種以上の酵素であることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載のヌクレオシドの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヌクレオシドホスホリラーゼを用いたヌクレオシド化合物の製造法に関する。各種のヌクレオシド及びそのアナログ化合物は、抗ウイルス医薬品、抗ガン医薬品やアンチセンス医薬品などの原料または原体として使用される。
【０００２】
【従来の技術】
ヌクレオシドホスホリラーゼはリン酸存在下でヌクレオシドのＮ−グリコシド結合を加リン酸分解できる酵素の総称であり、次式で表される反応を触媒する。
ヌクレオシド＋リン酸（塩）→塩基＋１−リン酸化糖誘導体
プリンヌクレオシドホスホリラーゼとピリミジンホスホリラーゼに大別される該酵素は、広く生物界に分布し、哺乳類、鳥類、魚類などの組織、酵母、細菌に存在する。この酵素反応は可逆的であり、逆反応を利用した各種ヌクレオシドの合成が以前より知られている。例えば、２´−デオキシリボース１−リン酸と核酸塩基（チミン、アデニンまたはグアニン）からチミジン（特開平０１−１０４１９０号）、２´−デオキシアデノシン（特開平１１−１３７２９０号）または２´−デオキシグアノシン（特開平１１−１３７２９０号）を製造する方法が開示されている。
【０００３】
更に、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５０（１），ＰＰ．１２１〜１２６，（１９８６）では、イノシンをリン酸存在下で、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ由来のプリンヌクレオシドホスホリラーゼを用いた反応により、リボース１−リン酸とヒポキサンチンに分解した後、イオン交換樹脂で単離したリボース１−リン酸と１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミドより、同じくＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ由来のプリンヌクレオシドホスホリラーゼにより、抗ウイルス剤であるリバビリンを製造する技術が報告されている。
【０００４】
しかしながら、該酵素の逆反応を利用して、ペントース−１−リン酸またはその塩と核酸塩基よりヌクレオシド化合物を生成させる反応は平衡反応であるため、転化率が向上しないという技術的欠点を有していた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、１−リン酸化糖誘導体と核酸塩基誘導体からヌクレオシドホスホリラーゼの作用により汎用性の高いヌクレオシド誘導体の製造方法を提供することであり、さらに、同反応におけるヌクレオシドの転化率の向上方法を提供し、低コストで高純度のヌクレオシド誘導体の製造法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、課題を達成するべく鋭意検討を行い、１−リン酸化糖誘導体をヌクレオシドホスホリラーゼ存在下、リン酸基と核酸塩基誘導体の交換反応によりヌクレオシド誘導体を製造する方法において、塩基性アニオン交換樹脂等のイオン交換樹脂にリン酸塘誘導体を吸着させ、ヌクレオシドホスホリラーゼと核酸塩基誘導体を加えることにより、高い転化率でヌクレオシド誘導体が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］一般式（１）［化４］
【０００８】
【化４】
2004041073.tif 000002
【０００９】
〔式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して水素原子、メチル基、保護されたヒドロキシメチル基または保護されたカルボキシル基を表し、Ｒ３はアシル基を表し、Ｘはハロゲン原子、アルコキシ基またはアルキルチオ基を表し、Ｗは酸素原子またはイオウ原子を表し、Ｚは酸素原子、イオウ原子または置換されてもよい炭素原子を表し、ｍは１から３の整数を表し、ｎは０または１を表し、ｐおよびｑは０から４の整数を表し、ｒは０または１を表す。（ただし、ｐ、ｑ、ｒ、ｎは、Ｚが酸素原子、イオウ原子の場合には、ｐ＋＋ｒ≦ｎ＋１、ｑ≦２×（ｎ＋１）−２×（ｐ＋ｒ）を、Ｚが炭素原子の場合はｐ＋ｒ≦ｎ＋２、ｑ≦２×（ｎ＋２）−２×（ｐ＋ｒ）を満たす。）〕で示される１−リン酸化糖誘導体をヌクレオシドホスホリラーゼ存在下、リン酸基と核酸塩基誘導体の交換反応により、一般式（２）［化５］
【００１０】
【化５】
2004041073.tif 000003
【００１１】
（式中、Ｂは、独立してそれぞれピリミジン、プリン、アザプリンおよびデアザプリンからなる群から選択された塩基を示し、それらはハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、水酸基、ヒドロキシアミノ基、アミノキシ基、アルコキシ基、メルカプト基、アルキルメルカプト基、アリール基、アリールオキシ基またはシアノ基によって置換されていてもよい。また、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒは請求項３記載の一般式（１）と同義である。）で示されるヌクレオシド誘導体を製造する方法において、イオン交換樹脂の存在下に該交換反応を行うことを特徴とする一般式（２）で示されるヌクレオシド誘導体の製造法。
［２］　イオン交換樹脂が強塩基性アニオン交換樹脂、弱塩基性アニオン交換樹脂、中塩基性アニオン交換樹脂である請求項１記載の製造法。
［３］　一般式（１）で示される１−リン酸化糖誘導体が式（３）［化６］
【００１２】
【化６】
2004041073.tif 000004
【００１３】
で示される１−リン酸化糖およびその塩であることを特徴とする請求項１記載の製造法。
［４］　　１−リン酸化塘誘導体と反応させる核酸塩基誘導体がアデニン、グアニン、シトシン、チミンである請求項１に記載のヌクレオシド誘導体の製造方法、［５］　ヌクレオシドホスホリラーゼが、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１）、グアノシンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１５）、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２）、ウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．３）、チミジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．４）、デオキシウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２３）からなる群から選択される１種又は２種以上の酵素であることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載のヌクレオシドの製造法。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で用いられる１−リン酸化糖類としては、好ましくはフコース、ラムノース、ジギトキソース、オレアンドロース、キノボースのような６−デオキシ糖類、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロースのようなヘキソース類、リボース、アラビノース、キシロース、リキソースのようなペントース類、エリトロース、トレオースのようなテトロース類、グルコサミン、ダウノサミンのようなアミノ糖類、グルクロン酸、ガラクツロン酸のようなウロン酸類、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、ペンツロースのようなケトース類、２−デオキシリボースのようなデオキシ糖類といったＤ系列もしくはＬ系列よりなる天然型単糖由来の残基、ピラノース型あるいはフラノース型の非天然糖由来の残基、並びにそれらが有する水酸基および／またはアミノ基が保護もしくはアシル化された糖残基誘導体、またはそれらが有する水酸基がフッ素などのハロゲン原子で置換されたハロゲン化糖残基を有する天然型単糖由来もしくは非天然糖由来の残基のうち、１位水酸基がリン酸化された糖の誘導体を示す。
Ｒ１又はＲ２で表される保護されたヒドロキシメチル基における保護基とは、加水素分解、加水分解、光分解のような化学的方法によって除去される保護基を指す。そのような基としては、ホルミル基、アシル基、シリル基、アルキル基、アラルキル基、カルボニル基があり、中でも好ましくは、ホルミル基、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、シリル基、アルコキシアルキル基、ハロゲン化アルキル基、アラルキル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基が挙げられる。
【００１５】
脂肪族アシル基としては、アルキルカルボニル基またはハロゲン置換された低級アルキルカルボニル基が挙げられる。
【００１６】
上記のアルキルカルボニル基の具体例として、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、バレリル基、イソバレリル基、オクタノイル基、ノニルカルボニル基、デシルカルボニル基、３−メチルノニルカルボニル基、８−メチルノニルカルボニル基、３−エチルオクチルカルボニル基、３，７−ジメチルオクチルカルボニル基、ウンデシルカルボニル基、ドデシルカルボニル基、トリデシルカルボニル基、テトラデシルカルボニル基、ペンタデシルカルボニル基、ヘキサデシルカルボニル基、１−メチルペンタデシルカルボニル基、１４−メチルペンタデシルカルボニル基、１３，１３−ジメチルテトラデシルカルボニル基、ヘプタデシルカルボニル基、１５−メチルヘキサデシルカルボニル基、オクタデシルカルボニル基などを例示することができる。
【００１７】
また、ハロゲン置換された低級アルキルカルボニル基の具体例として、クロロアセチル基、ジクロロアセチル基、トリクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基などを例示することができる。
【００１８】
芳香族アシル基としては、アリールカルボニル基、ハロゲン置換されたアリールカルボニル基、低級アルキル化アリールカルボニル基、低級アルコキシアリールカルボニル基、ニトロ化アリールカルボニル基、低級アルコキシカルボニル化アリールカルボニル基、アリール化アリールカルボニル基を挙げることができる。
【００１９】
上記のアリールカルボニル基の具体例として、ベンゾイル基、α−ナフトイル基、β−ナフトイル基などを例示することができる。
【００２０】
また、ハロゲン置換されたアリールカルボニル基の具体例として、２−フルオロベンゾイル基、３−フルオロベンゾイル基、４−フルオロベンゾイル基、２−クロロベンゾイル基、３−クロロベンゾイル基、４−クロロベンゾイル基、２−ブロモベンゾイル基、３−ブロモベンゾイル基、４−ブロモベンゾイル基、２，４−ジクロロベンゾイル基、２，６−ジクロロベンゾイル基、３，４−ジクロロベンゾイル基、３，５−ジクロロベンゾイル基などを例示することができる。
【００２１】
また、低級アルキル化アリールカルボニル基の具体例として、２−トルオイル基、３−トルオイル基、４−トルオイル基、２，４，６−トリメチルベンゾイル基などを例示することができる。
【００２２】
さらに、低級アルコキシアリールカルボニル基の具体例として、２−アニソイル基、３−アニソイル基、４−アニソイル基などを例示することができる。
【００２３】
ニトロ化アリールカルボニル基の具体例として、２−ニトロベンゾイル基、３−ニトロベンゾイル基、４−ニトロベンゾイル基、３，５−ジニトロベンゾイル基などを例示することができる。
【００２４】
さらに、低級アルコキシカルボニル化アリールカルボニル基の具体例として、２−（メトキシカルボニル）ベンゾイル基などを、アリール化アリールカルボニル基の具体例として、４−フェニルベンゾイル基などを例示することができる。
【００２５】
シリル基としては、低級アルキルシリル基、アリール基で置換された低級アルキルシリル基を挙げることができる。
【００２６】
低級アルキルシリル基の具体例として、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、メチルジイソプロピルシリル基、トリイソプロピルシリル基を例示することができる。
【００２７】
アリール基で置換された低級アルキルシリル基の具体例として、ジフェニルメチルシリル基、ジフェニルイソプロピルシリル基、フェニルジイソプロピルシリル基などを例示することができる。
【００２８】
アラルキル基としては、低級アルキル基で置換されたアラルキル基、低級アルコキシ基で置換されたアラルキル基、ニトロ基で置換されたアラルキル基、ハロゲン置換されたアラルキル基、シアノ基で置換されたアラルキル基を挙げることができる。
【００２９】
これらの具体的な基を例示すると、２−メチルベンジル基、３−メチルベンジル基、４−メチルベンジル基、２，４，６−トリメチルベンジル基、２−メトキシベンジル基、３−メトキシベンジル基、４−メトキシベンジル基、２−ニトロベンジル基、３−ニトロベンジル基、４−ニトロベンジル基、２−クロロベンジル基、３−クロロベンジル基、４−クロロベンジル基、２−ブロモベンジル基、３−ブロモベンジル基、４−ブロモベンジル基、２−シアノベンジル基、３−シアノベンジル基、４−シアノベンジル基などが挙げられる。
【００３０】
アラルキルオキシカルボニル基としては、低級アルキル基で置換されたアラルキルオキシカルボニル基、低級アルコキシ基で置換されたアラルキルオキシカルボニル基、ニトロ基で置換されたアラルキルオキシカルボニル基、ハロゲン置換されたアラルキルオキシカルボニル基、シアノ基で置換されたアラルキルオキシカルボニル基を挙げることができる。
【００３１】
これらの具体例として、２−メチルベンジルオキシカルボニル基、３−メチルベンジルオキシカルボニル基、４−メチルベンジルオキシカルボニル基、２，４，６−トリメチルベンジルオキシカルボニル基、２−メトキシベンジルオキシカルボニル基、３−メトキシベンジルオキシカルボニル基、４−メトキシベンジルオキシカルボニル基、２−ニトロベンジルオキシカルボニル基、３−ニトロベンジルオキシカルボニル基、４−ニトロベンジルオキシカルボニル基、２−クロロベンジルオキシカルボニル基、３−クロロベンジルオキシカルボニル基、４−クロロベンジルオキシカルボニル基、２−ブロモベンジルオキシカルボニル基、３−ブロモベンジルオキシカルボニル基、４−ブロモベンジルオキシカルボニル基、２−シアノベンジルオキシカルボニル基、３−シアノベンジルオキシカルボニル基、４−シアノベンジルオキシカルボニル基などを挙げることができる。
【００３２】
アルコキシカルボニル基としては、低級アルコキシカルボニル基、ハロゲン置換されたアルコキシカルボニル化合物、アルキルシリル基で置換されたアルコキシカルボニル基を挙げることができる。
【００３３】
低級アルコキシカルボニル基の具体例として、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、ｓｅｃ−ブトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基などを例示することができる。
【００３４】
ハロゲン置換されたアルコキシカルボニル基の具体例として、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基を、低級アルキルシリル基で置換されたアルコキシカルボニル基の具体例として、２−トリメチルシリルエトキシカルボニル基などを例示することができる。
【００３５】
アルキル基としては、メトキシメチル基、エトキシメチル基、２−メトキシエチル基、２−メトキシエトキシメチル基のようなアルコキシアルキル基、２，２，２−トリクロロエチル基のようなハロゲン化アルキル基、ベンジル基、α−ナフチルメチル基、β−ナフチルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基のようなアリール基で置換された低級アルキル基が挙げられる。
【００３６】
これらの中で、好ましくは、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、アラルキル基であり、さらに好ましくは、４−トルオイル基、４−クロロベンゾイル基、またはベンジル基である。
【００３７】
Ｒ１およびＲ２で表される保護されたカルボキシル基における保護基とは、加水素分解、加水分解、光分解のような化学的方法によって除去される保護基を指す。そのような基としては、好ましくは、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基のような低級アルキル基、２−（トリメチルシリル）エチル基、２−（トリエチルシリル）エチル基のようなシリル化された低級アルキル基あるいは前述のアラルキル基、アルコキシアルキル基などを挙げることができる。さらに好ましくは、メチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、またはベンジル基である。
【００３８】
Ｘで示すハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子を示す。
Ｘで表されるアルコキシ基、アルキルチオ基としては、例えば、前述の低級アルキル基、アラルキル基、アルコキシアルキル基を有するアルコキシ基、アルキルチオ基を挙げることができる。さらに好ましくは、メトキシ基、メトキシエトキシ基、メチルチオ基である。
【００３９】
Ｚで表される置換されてよい炭素原子とは、一般式で表した置換基が１つないし２つ置換した炭素原子を表し、置換していない場合には、水素原子で置換されている炭素原子を指す。
【００４０】
Ｒ３で表されるアシル基としては、例えば、前述の脂肪族アシル基、芳香族アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、さらに、メタンスルホニル基、トリフルオロメタンスルホニル基のような低級アルカンスルホニル基、ベンゼンスルホニル基、ｐ−トルエンスルホニル基のようなアリールスルホニル基を挙げることができる。好ましくは、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、低級アルカンスルホニル基であり、具体的には、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ベンゾイル基、メタンスルホニル基である。
【００４１】
本発明に用いられる核酸塩基誘導体とはＤＮＡやＲＮＡの化合構造形式要素となっている窒素原子を含む複素環式化合物であり、ピリミジン、プリン、あるいは塩基アナログからなる群から選択された天然または非天然型の核酸塩基を示し、それら塩基はハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、水酸基、ヒドロキシアミノ基、アミノオキシ基、アルコキシ基、メルカプト基、アルキルメルカプト基、アリール基、アリールオキシ基またはシアノ基によって置換されていてもよい。
【００４２】
置換基としてのハロゲン原子としては、塩素、フッ素、ヨウ素、臭素が例示される。アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基などの炭素数１〜７のアルキル基が例示される。ハロアルキル基としては、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、ブロモメチル、ブロモエチルなどの炭素数１〜７のアルキルを有するハロアルキル基が例示される。アルケニル基としては、ビニル、アリルなどの炭素数２〜７のアルケニル基が例示される。ハロアルケニル基としては、ブロモビニル、クロロビニルなどの炭素数２〜７のアルケニルを有するハロアルケニル基が例示される。アルキニル基としては、エチニル、プロピニルなどの炭素数２〜７のアルキニル基が例示される。アルキルアミノ基としては、メチルアミノ、エチルアミノなどの炭素数１〜７のアルキルを有するアルキルアミノ基が例示される。アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシなどの炭素数１〜７のアルコキシ基が例示される。アルキルメルカプト基としては、メチルメルカプト、エチルメルカプトなどの炭素数１〜７のアルキルを有するアルキルメルカプト基が例示される。アリール基としては、フェニル基；メチルフェニル、エチルフェニルなどの炭素数１〜５のアルキルを有するアルキルフェニル基；メトキシフェニル、エトキシフェニルなどの炭素数１〜５のアルコキシを有するアルコキシフェニル基；ジメチルアミノフェニル、ジエチルアミノフェニルなどの炭素数１〜５のアルキルアミノを有するアルキルアミノフェニル基；クロロフェニル、ブロモフェニルなどのハロゲノフェニル基などが例示される。
【００４３】
ピリミジンを具体的に例示すれば、シトシン、ウラシル、５−フルオロシトシン、５−フルオロウラシル、５−クロロシトシン、５−クロロウラシル、５−ブロモシトシン、５−ブロモウラシル、５−ヨ−ドシトシン、５−ヨ−ドウラシル、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル（チミン）、５−エチルシトシン、５−エチルウラシル、５−フルオロメチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−トリフルオロシトシン、５−トリフルオロウラシル、５−ビニルウラシル、５−ブロモビニルウラシル、５−クロロビニルウラシル、５−エチニルシトシン、５−エチニルウラシル、５−プロピニルウラシル、ピリミジン−２−オン、４−ヒドロキシアミノピリミジン−２−オン、４−アミノオキシピリミジン−２−オン、４−メトキシピリミジン−２−オン、４−アセトキシピリミジン−２−オン、４−フルオロピリミジン−２−オン、５−フルオロピリミジン−２−オンなどが挙げられる。
【００４４】
プリンを具体的に例示すれば、プリン、６−アミノプリン（アデニン）、６−ヒドロキシプリン、６−フルオロプリン、６−クロロプリン、６−メチルアミノプリン、６−ジメチルアミノプリン、６−トリフルオロメチルアミノプリン、６−ベンゾイルアミノプリン、６−アセチルアミノプリン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−アミノオキシプリン、６−メトキシプリン、６−アセトキシプリン、６−ベンゾイルオキシプリン、６−メチルプリン、６−エチルプリン、６−トリフルオロメチルプリン、６−フェニルプリン、６−メルカプトプリン、６−メチルメルカプトプリン、６−アミノプリン−１−オキシド、６−ヒドロキシプリン−１−オキシド、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン（グアニン）、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２−アミノ−６−ヨ−ドプリン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−メルカプトプリン、２−アミノ−６−メチルメルカプトプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシアミノプリン、２−アミノ−６−メトキシプリン、２−アミノ−６−ベンゾイルオキシプリン、２−アミノ−６−アセトキシプリン、２−アミノ−６−メチルプリン、２−アミノ−６−サイクロプロピルアミノメチルプリン、２−アミノ−６−フェニルプリン、２−アミノ−８−ブロモプリン、６−シアノプリン、６−アミノ−２−クロロプリン（２−クロロアデニン）、６−アミノ−２−フルオロプリン（２−フルオロアデニン）などが挙げられる。
【００４５】
塩基アナログを具体的に例示すれば、６−アミノ−３−デアザプリン、６−アミノ−８−アザプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシ−８−アザプリン、６−アミノ−７−デアザプリン、６−アミノ−１−デアザプリン、６−アミノ−２−アザプリンなどが挙げられる。
【００４６】
本発明におけるヌクレオシドホスホリラーゼとは、リン酸存在下でヌクレオシド化合物のＮ−グリコシド結合を分解する酵素の総称であり、本発明においては逆反応を利用することができる。反応に使用する酵素は、相当するペントース−１−リン酸と核酸塩基から目的とするヌクレオシド化合物を生成しうる活性を有していればいかなる種類及び起源のものでもかまわない。該酵素はプリン型とピリミジン型に大別されが、公知なものとしては例えば、プリン型としてプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１）、グアノシンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１５）、ピリミジン型としてピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２）、ウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．３）、チミジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．４）、デオキシウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２３）などが挙げられる。
【００４７】
本発明におけるヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する微生物とは、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１）、グアノシンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１５）、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２）、ウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．３）、チミジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．４）、デオキシウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２３）からなる群から選択される一種類以上のヌクレオシドホスホリラーゼを発現している微生物であれば特に限定はされない。
【００４８】
このような微生物の具体例としては、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｂｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クルイヘラ（Ｋｌｕｙｖｅｒｅ）属、ミコバクテリウム（Ｍｉｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ヘモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属、ミコプラナ（Ｍｉｃｏｐｌａｎａ）属、プロタミノバクター（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、好熱性のバチルス属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ザルチナ（Ｓａｒｔｉｎａ）属、プラノコッカス（Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、エシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、クルチア（Ｋｕｒｔｈｉａ）属、ロドコッッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、エアロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アースロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属またはシュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属に含まれる微生物株を好適な例として挙げることができる。
【００４９】
近年の分子生物学および遺伝子工学の進歩により、上述の微生物株のヌクレオシドホスホリラーゼの分子生物学的な性質やアミノ酸配列等を解析することにより、該蛋白質の遺伝子を該微生物株より取得し、該遺伝子および発現に必要な制御領域が挿入された組換えプラスミドを構築し、これを任意の宿主に導入し、該蛋白質を発現させた遺伝子組換え菌を作出することが可能となり、かつ、比較的容易にもなった。かかる技術水準に鑑み、このようなヌクレオシドホスホリラーゼの遺伝子を任意の宿主に導入した遺伝子組換え菌も本発明のヌクレオシドホスホリラーゼを発現している微生物に包含されるものとする。
【００５０】
本発明におけるヌクレオシドホスホリラーゼまたは、該酵素活性を有する微生物としては市販の酵素、該酵素活性を有する微生物菌体、及び菌体処理物またはそれらの固定化物などが使用できる。菌体処理物とは、例えばアセトン乾燥菌体や機械的破壊、超音波破砕、凍結融解処理、加圧減圧処理、浸透圧処理、自己消化、細胞壁分解処理、界面活性剤処理などにより調製した菌体破砕物などであり、また、必要に応じて硫安沈殿やアセトン沈殿、カラムクロマトグラフィーにより精製を重ねたものを用いても良い。
【００５１】
原料である１−リン酸化糖誘導体はＳｉｇｍａ社、Ａｌｄｒｉｃｈ社などの試薬メーカーから購入するか、または
１）１−臭素化糖とリン酸銀塩とを縮合する方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１２１，Ｐ４６５（１９３７）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．７８，Ｐ８１１（１９５６）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．７９，Ｐ５０５７（１９５７））、
２）１−ハロゲン化糖とジベンジルリン酸のトリエチルアミン塩とを縮合する方法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．７７，Ｐ３４２３（１９５５）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．８０，Ｐ１９９４（１９５８）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１０６，Ｐ７８５１（１９８４）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５９，Ｐ６９０（１９９４））、
３）１−アセチル化糖を正リン酸と加熱縮合する方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７，Ｐ１１０７（１９６２）、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．３，Ｐ１１７（１９６６）、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．３，Ｐ４６３（１９６７）、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５０，Ｐ５７４（１９７２））、
４）１位をイミデート化して活性化した後にジベンジルリン酸と縮合する方法（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．６１，Ｐ１８１（１９７８）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．２３，Ｐ４０５（１９８２））、
５）１位をタリウムやリチウムアルコラートとして活性化した後にジベンジルリン酸クロリドで処理する方法（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．９４，Ｐ１６５（１９８１）、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．２３，Ｐ４０５（１９８２））、
６）ヌクレオシドホスホリラーゼの作用によりヌクレオシドの加リン酸分解反応を行って、１−リン酸化糖誘導体を製造する方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１８４、Ｐ４３７、１９５０）等を利用して得ることが出来る。
本発明で使用するイオン交換樹脂とは交換基に４級アミンを有する強塩基性アニオン交換樹脂、３級アミンを有する弱塩基性アニオン交換樹脂、脂肪族アミンを有する中塩基性アニオン交換樹脂である。具体的には強塩基性アニオン交換樹脂としてＭＰ５００（レバチッド）、Ｓ６３２８Ａ（レバチッド）、弱塩基性アニオン交換樹脂としてＭＰ６２（レバチッド）、中塩基アニオン交換樹脂としてはＶＰＯＣ１０６５（レバチッド）等が挙げられる。
【００５２】
１−リン酸化糖誘導体と核酸塩基誘導体の反応は、通常、溶媒の存在下に行われる。使用される溶媒としては、反応を阻害しなければ特に限定はないが、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール等の水性溶媒、ヘキサン、ヘプタンのような脂肪族炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン、アニソールのような芳香族炭化水素類、メチレンクロリド、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼンのようなハロゲン化炭化水素類、ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ｎ−ブチル、炭酸ジエチルエステルのようなエステル類、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン、ジグリムのようなエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリル、イソブチロニトリルのようなニトリル類、ホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ−メチルピロリジノン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−イミダゾリジノンのようなアミド類、アセトン、２−ブタノン、メチルイソプロピルケトン、メチルイソブチルケトンのようなケトン類、ジメチルホルムアミドが挙げられ、それらから選択される１種ないし２種以上からなる混合溶媒を挙げることができる。好適には水、メタノールである。
塩基性アニオン交換樹脂を用いる反応法としては、樹脂塔内等での循環法、反応槽内等での攪拌法などが挙げられるが特に限定はない。
反応において交換樹脂、１−リン酸化塘誘導体、核酸塩基誘導体、酵素液の添加方法としては一括添加、分割添加、連続添加等の方法があるが特に限定はない。交換樹脂量としては特に限定はないが、通常は１−リン酸化糖類に対して０．１から１０．０当量の交換容量、好適には１．０から３．０当量の交換容量の範囲で行なわれる
溶媒の量としては特に制限はないが、通常は交換樹脂量に対して０．１から１０倍量である。好適には０．５から３．０倍量である。
【００５３】
反応温度は、特に限定はなく、通常、０℃から８０℃、好適には２０℃から７０℃の範囲で行われる。
【００５４】
反応時間は、出発原料、試薬および溶媒の種類、反応温度によって異なるが、通常、１分間から７８時間、好適には０．５時間から２４時間で達成される。
【００５５】
本反応における１−リン酸化糖誘導体と核酸塩基誘導体との比率は特に限定はないが、通常、核酸塩基誘導体の使用量は１−リン酸化糖誘導体に対し０．３から３等量、好適には０．６から２等量である。
【００５６】
このように反応して製造したヌクレオシド化合物は、濾過、活性炭による吸脱着処理、濃縮、晶析、溶解などの常法を適用することにより単離することができる。
【００５７】
【実施例】
以下に実施例により、本発明を更に詳細に示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５８】
生成したヌクレオシド化合物はすべて高速液体クロマトグラフィーにより定量した。分析条件は以下による。
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＯＤＳ−Ａ５１４　３００×６．０ｍｍＩ．Ｄ．
（ＹＭＣ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ）
カラム温度：４０℃
ポンプ流速：１ｍｌ／ｍｉｎ．
検出波長：ＵＶ２５４ｎｍ、
溶離液：２０ｍＭのリン酸ニ水素カリウム水溶液（２０００ｍｌ）にアセトニトリル４０ｍｌを加え混合、脱気する。
内標準物質：ｐ−アミノ安息香酸
【００５９】
参考例１　酵素液の調製
エシェリヒア・コリＫ−１２／ＸＬ−１０株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を５０ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で一夜培養した後集菌し、リゾチーム１ｍｇ／ｍｌを含む溶菌液で溶菌した。溶菌液をフェノール処理した後、通常の方法によりエタノール沈殿によりＤＮＡを沈殿させた。生じたＤＮＡの沈殿は、ガラス棒に巻き付けて回収した後、洗浄し、ＰＣＲに用いた。
【００６０】
ＰＣＲ用のプライマーには、エシェリヒア・コリの既知のｄｅｏＤ遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＥ０００５０８（コード領域は塩基番号１１５３１−１２２５０）に基づいて設計した配列番号１及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（北海道システム・サイエンス株式会社）に委託して合成した）を用いた。これらのプライマーの５’末端付近及び３’末端付近には、それぞれＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識配列を有する。
【００６１】
制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化した前記大腸菌染色体ＤＮＡ　６ｎｇ／μｌ及びプライマー各３μＭを含む０．１ｍｌのＰＣＲ反応液を用いて、変性：９６℃、１分間、アニーリング：５５℃、１分間、伸長反応：７４℃、１分間からなる反応サイクルを、３０サイクルの条件でＰＣＲを行なった。
【００６２】
上記反応産物及びプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造（株））を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ライゲーション・ハイ（東洋紡（株））を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリＤＨ５αを形質転換した。形質転換株を、アンピシリン（Ａｍ）５０μｇ／ｍｌ及びＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含むＬＢ寒天培地で培養し、Ａｍ耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を得た。
【００６３】
このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出し、目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを、ｐＵＣ−ＰＮＰ７３と命名した。こうして得られた形質転換体を、エシェリヒア・コリ　ＭＴ−１０９０５と名づけた。
エシェリヒア・コリ　ＭＴ−１０９０５株をＡｍ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍＬで３７℃・１晩振とう培養した。得られた培養液を１３０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、菌体を集めた。菌体を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍＬに懸濁し、超音波により破砕したものを酵素源として用いた。
【００６４】
実施例１
２´−デオキシグアノシンの合成（１）
純水２０ｇに強塩基性アニオン交換樹脂（ＭＰ５００　レバチッド：交換容量１．１ｅｑ／Ｌ）２０ｍｌ（総交換容量　２４ｍｍｏｌ）と２−デオキシリボース１−リン酸ジ（アンモニウム）塩（４．９６ｇ、２０ｍｍｏｌ）を加え、室温下、３０分間攪拌した。３０分後、参考例１で調製された酵素液（０．５ｍｌ）とグアニン（２．８７ｇ、１９ｍｍｏｌ）加え、攪拌下、５０℃で１０時間反応した。１０時間後に反応液をＨＰＬＣで分析した結果、所望の２´−デオキシグアノシンを反応収率８３％で得た。
【００６５】
実施例２
２´−デオキシアデノシンの合成
純水２０ｇに強塩基性アニオン交換樹脂（ＭＰ５００　レバチッド：交換容量１．１ｅｑ／Ｌ）２０ｍｌ（総交換容量　２４ｍｍｏｌ）と２−デオキシリボース１−リン酸ジ（アンモニウム）塩（４．９６ｇ、２０ｍｍｏｌ）を加え、室温下、３０分間攪拌した。３０分後、参考例１で調製された酵素液（０．５ｍｌ）とアデニン（２．５７ｇ、１９ｍｍｏｌ）加え、攪拌下、５０℃で１０時間反応した。１０時間後に反応マスをＨＰＬＣにて分析した結果、所望の２´−デオキシグアノシンを反応収率８６％で得た。
【００６６】
実施例３
２´−デオキシシチジンの合成
純水２０ｇに強塩基性アニオン交換樹脂（ＭＰ５００　レバチッド：交換容量１．１ｅｑ／Ｌ）２０ｍｌ（総交換容量　２４ｍｍｏｌ）と２−デオキシリボース１−リン酸ジ（アンモニウム）塩（４．９６ｇ、２０ｍｍｏｌ）を加え、室温下、３０分間攪拌した。３０分後、参考例１で調製された酵素液（０．５ｍｌ）とシトシン（２．１１ｇ、１９ｍｍｏｌ）加え、攪拌下、５０℃で１０時間反応した。１０時間後に反応マスをＨＰＬＣにて分析した結果、所望の２´−デオキシシチジンを反応収率８０％で得た。
【００６７】
参考例２
２−デオキシリボース１−リン酸ジ（アンモニウム）塩の合成
２−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩（１ｇ、２．４２ｍｍｏｌ、ＳＩＧＭＡ製）をメタノール（１０ｇ）に懸濁し、アンモニアガス（０．６２ｇ、３６．５ｍｍｏｌ）を吹き込み、５０℃で２時間攪拌する。得られた反応マスを３０℃でろ過後、メタノール（５ｇ）で２回洗浄、乾燥し、所望の２´−デオキシリボース１−リン酸ジ（アンモニウム）塩（０．５７ｇ）を収率９５％で得た。
１Ｈ　ＮＭＲ　（Ｄ２Ｏ，　２７０　ＭＨｚ）　ｄ　５．５６　（ｓ，　１　Ｈ），　４．０３　（ｍ，　２　Ｈ），　３．５２　（ｄｄ，　Ｊ　＝　３．３，１２．２　Ｈｚ，　１　Ｈ），　３．４１　（ｄｄ，　Ｊ　＝　５．３，　１２．２　Ｈｚ，　１　Ｈ），　２．１７　（ｍ，　１　Ｈ）　，　１．８７　（ｄ，　Ｊ　＝　１３．９　Ｈｚ，　１　Ｈ）、　ＭＳ　（ＡＰＣＩ）　ｍ／ｚ　２１３　（Ｍ−Ｈ）
【００６８】
【発明の効果】
本発明によれば、ヌクレオシドホスホリラーゼまたは該酵素活性を有する微生物を用いた１−リン酸化糖誘導体と核酸塩基誘導体からのヌクレオシド誘導体の製造において、イオン交換樹脂を用いて反応することによりことにより、従来技術では達成されなかった反応収率の向上が達成される。更に、イオン交換樹脂を用いた反応ではリン酸トラップ剤としては無期限に使用が可能であり、リン酸の回収方法も簡便である。また目的のリン酸塩として回収も可能である。工業的見地から本発明は大きなコストダウンに繋がり、その意義は大きい。
【００６９】
2004041073.tif 000005