(57)【要約】【目的】アガロースゲルを用いることにより，タンパクを分子サイズにより分離する。【構成】濃縮ゲルをつけ，あるいは添加物により，高分離能を有したアガロースゲルを用い，タンパク質を分子サイズにより分離する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アガロースに他の多糖類及び／又は水溶性ポリマーを添加して得られる電気泳動用ゲル
【請求項２】
濃縮ゲル部と分離ゲル部の組み合わせよりなる請求項１に記載の電気泳動用ゲル。
【請求項３】
ゲル組成に濃度勾配を施すことを特徴とする請求項１，２に記載の電気泳動用ゲル。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は，アガロースゲルを用いて血清や尿，その他の蛋白含有生体材料を電気泳動し，臨床検査などのライフサイエンス分野で利用するアガロースゲルに関する。
【０００２】
【従来の技術】
最初，ポリアクリルアミドゲルを支持体とした電気泳動法でタンパク質を分離したのはＲａｙｍｏｎｄとＷｅｉｎｔｒａｕｂによってである（Ｓｃｉｅｎｃｅ　１３０；　７１１，　１９５９）。彼らは重合したアクリルアミドゲルを用い，血清タンパク質の分画を試み，この人工ポリマーが従来の支持体に比べ大きな利点をもつことを見出した。また，Ｓｈａｐｉｒｏらは，界面活性剤であるＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム，ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｐｈａｔｅ）の存在下においてタンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動を行う際に，タンパク質の分子量とゲル中における移動度によい相関があることを明らかにした（Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ　２８；　８１５−２０，　１９６７）。その後，電気泳動に用いる緩衝液系が改良され，連続緩衝液系としてはＳｈａｐｉｒｏら，Ｗｅｒｂｅｒら（Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２４４；　４４０６−１２，　１９６９），Ｆａｉｒｂａｎｋｓら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１０；　２６０６−１７，　１９７１）の系が用いられることが多く，一方，不連続緩衝液系としては，Ｏｒｎｓｔｅｉｎ−Ｄａｖｉｓの系（Ａｎｎ　Ｎ　Ｙ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　１２１；　４０４−２７，　１９６９），ならびにＬａｅｍｍｌｉの系（Ｎａｔｕｒｅ　２２７；　６８０−８５，　１９７０）が多用されている。連続系は電極液およびサンプル，ゲルの全てにおいて，同じｐＨの緩衝液を用いる方法である。この方法では，単一の組成から成るゲルの上に，サンプルを直接アプライし，通電する。このため，ゲル作成が簡便であるが分離能は不連続系に比べると低い。
【０００３】
一方，不連続系はそれぞれ異なるｐＨの緩衝液，サンプル，濃縮ゲル（ｓｔａｃｋｉｎｇ　ｇｅｌ），分離ゲル（ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ　ｇｅｌ）を用いる方法である。現在，タンパク質の分離にはＬａｅｍｍｌｉの方法が最も多用されている。
ポリアクリルアミドは未重合であると，一過性の神経毒となり危険である。また，ポリアクリルアミドゲルを自製するのは手間がかかるのが問題である。また，泳動時間が，１．５時間以上かかることも添える。
【０００４】
一方，アガロースゲルでは，縦型で，ＳＤＳを含む緩衝液を用いて蛋白を分子量で分離することが一般的に行われている。Ｗｕらは（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　２４；　６７６−８，　１９９８），ＳＤＳ−アガロースゲル電気泳動を縦型で行っており，濃縮ゲルにはｐＨ６．８のトリス−塩酸緩衝液を，また，分離ゲルにはｐＨ８．６のトリス−ホウ酸緩衝液を使用している。更に，７％濃度のアガロースを分離ゲルとして使用しており，ゲル作製に使用する道具類，例えば，ゲル作製プレートやゲル注入シリンジ等の温度コントロールが必要となり，かつ，サンプルコームを挿入し取り出す際の操作性が煩雑である。また，Ｓｌａｕｇｈｔｅｒらは（Ａｒｃｈ　Ｐａｔｈｏｌ　Ｌａｂ　Ｍｅｄ　１１９；　１４８−５２，　１９９５），ＳＤＳ−アガロースゲル電気泳動を水平型で行っており，濃縮ゲルにはｐＨ　６．７のトリス−塩酸緩衝液を，また，分離ゲルにはｐＨ　９のトリス−グリシン緩衝液を使用している。分離アガロース濃度は１．５％であり，更に，陰極端にサンプルアプライ用ゲルとして，同アガロースの１．２％濃度のものをｐＨ　８．４５のトリス−グリシン緩衝液で調整したゲルも使用しており，計３分画からなる水平型アガロースゲルを提案している。この方法では，重合して高分子となった血液中のフォンウィルブランド因子を分離し，ウエスタンブロッティングで検出している。彼らの方法では，低分子の蛋白は観察が困難である。
【０００５】
以上のようにアガロースを用いて蛋白を分子量で分けるという手法の報告はいくつかあるが，未だに一般的でないのは，ポリアクリルアミドゲルと比べてアガロースは毒性はないが，ゲル作製おいてはポリアクリルアミドゲル作製とほとんど変わらないくらいの煩雑さがあるということが挙げられる。また，低分子ＤＮＡ用のアガロースも市販されており，それを蛋白用アガロースゲルに応用しているが，このようなアガロースは，様々な加工を施されていると考えられ，そのためゲルの最現性が難しいのではないかと考えられる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は，蛋白の分子量による分離性はポリアクリルアミドゲルより広範囲の分子量の分離や，特定範囲の分子量の分離が良く，また毒性もなくかつ，電気泳動により分離する際の操作性，取扱性，保存性の優れた新規なアガロースゲルに関する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この出題の発明では，上記の問題点を持つポリアクリルアミドゲルに替わる，タンパク分離用ゲルとして，毒性がなくかつ分離能に優れ，また，Ｍｕｐｉｄゲルメーカー（アドバンス社）を用いることにより，簡易に短時間で作製可能なアガロースゲルを実現した。また，アガロースにデキストランなどの多糖類やポリビニルアルコールなどの水溶性ポリマーを添加混合し，物理的及び化学的にアガロースゲルの網目構造を変えることにより蛋白分子量分離性を著しく上げることができた。更に分離ゲル領域に対し濃度勾配をつけることにより，蛋白の広範囲の分子量分離性を得ることができた。このゲルをＭｕｐｉｄゲルメーカー（アドバンス社）を用いると，簡便，容易に均一な高分離性を持った水平型アガロースゲルを作製しかつ，プレキャストゲルとして完成することが出来た。
【０００８】
【作用】
濃縮ゲル，分離ゲルについて
濃縮ゲルはおおよそ１％，分離ゲルはおおよそ５％が好ましい。用いるアガロースは例えばアガロースＳ（和光純薬工業株式会社製）等の低硫酸含量（０．１％以下），低電気浸透度（０．１以下）のアガロースゲルとする。ゲル作製および泳動に用いる緩衝液は例えばｐＨ　８．３のトリス−グリシン緩衝液とする。分離ゲルを５％とすると約１４Ｋ〜２２０Ｋの範囲のタンパクが分離可能である。濃縮ゲルは１％程度だとタンパク量が約５μｇでも泳動緩衝液中へのロスの影響が小さい。また，濃縮ゲル領域での泳動の際は低電圧，分離ゲル領域では高電圧をかける。例えば、濃縮ゲル領域では５０Ｖ（約５Ｖ／ｃｍ）、分離ゲル領域では１００Ｖ（約１０Ｖ／ｃｍ）とする。
【０００９】
ゲルに添加する多糖類について
アガロースは海藻中に存在する多糖類で，テングサ科，オゴノリ科，イギス科，ノリ科，オバクサ科，サイシ科などの海藻中により精製したものである。本発明はこれらの海藻中多糖類に対し，海藻以外の多糖類として豆類に存在する多糖類，樹液に存在する多糖類，および果実や穀類に存在する多糖類，微生物の産生する多糖類を添加混合しアガロースゲルの網目構造を微細構造に変えたり，化学構造を変えることにより蛋白の分子量分離性を著しく向上することができた。これらの添加する化学構造としてあげると，ムコ多糖，例えば酸性ムコ多糖として，ウロン酸，硫酸，リン酸などの残基を含むもので，コンドロイチン，ヘパリン，コンドロイチン硫酸，キチンなどがある。また，糖脂質として例えば，セレブロシド硫酸，ガングリオシドなどがある。その他の多糖としてグルコースのみよりなる多糖，例えばアミロース，デキストランなどがある。又，ガラクトースのみより成るガラクタン，マンノースのみより成るマンナン，フルクトースのみより成るフルクタン，アラビノースのみより成るアラビナン，キシロースのみより成るキシランなどがある。これら多糖のアガロースゲルに混入する比率は，　例えば０．０１　から１重量％で、好ましくは０．０５　から０．５　重量％が示される。
尚、上述した範囲に限らず、当該多糖類は、アガロースゲルの種類に応じ，又，多糖の性質により適宜選ぶことができる。
【００１０】
ゲルに添加する水溶性ポリマーについて
上述した多糖体であるアガロースに水溶性ポリマーを適宜加えることによりアガロースゲルの網目構造を微細構造に変えたり，化学構造を変えることにより蛋白の分子量分離性を著しく向上することができた。これらの添加する化学構造としてあげると，天然ポリマーとしてでんぷん質，例えば，コーンスターチや小麦でんぷん，かんしょでんぷん，ばれいしょでんぷん，タピオカでんぷんがある。又，植物粘質物ではアラビアゴム，トロロアオイ，トラガントゴム，タンパク質ではゼラチン，カゼイン，にかわ，コラーゲンである。更に，半合成品として，セルロース系ではビスコース，メチルセルロース，エチルセルロース，ヒドロキシエチルセルロース，カルボキシメチルセルロースがあり，でんぷん系として，可溶性でんぷん，カルボキシメチルデンプン，ジアルデヒドデンプンがある。さらに，合成品としては，ポリビニルアルコール，ポリアクリル酸ナトリウム，ポリエチレンオキシドがある。これら水溶性ポリマーのアガロースゲルに混入する比率は，　例えば０．０１から１重量％で、好ましくは０．０５　から０．５　重量％が示される。
尚、上述した範囲に限らず、当該水溶性ポリマーは、アガロースゲルの種類に応じ，又，多糖の性質により適宜選ぶことができる。
【００１１】
濃度勾配（グラジエント）アガロースゲルについて
温度コントロールできる容器に，１％および５％に調整したアガロース液をそれぞれ別々に入れ，それらアガロース液を適宜混ぜ合わせることにより，作製するゲルの陰極末端から陽極末端へと濃度が１〜５％の勾配をつける。アガロースに各種添加剤を加えることで，アガロースを高濃度に調製しても粘度が抑えられ，グラジエントゲルの作製が容易となった。濃度勾配をつけたゲルにより，広範囲にわたる分離能を実現できる。
【００１２】
【実施例】
組成の一例を以下に示す。（書ける範囲で調整して下さい）
組成例１
アガロースＳ　　　　　　　　　　　　４　　重量％
（λ−カラギーナン　　　　　　　　０．１　　重量％）
２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−　１９０ｍＭ　ｇｌｙｃｉｎｅ　ｂｕｆｆｅｒ　（０．０２％　ＳＤＳ，　０．０３％ＬＤＳ含む，ｐＨ　８．３）を使用。
【００１３】
組成例２
アガロースＳ　　　　　　　　　　　　　４　重量％
（ポリビニルアルコール１０００　　　　０．５　重量％）
２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−　１９０ｍＭ　ｇｌｙｃｉｎｅ　ｂｕｆｆｅｒ　（０．０２％　ＳＤＳ，　０．０３％ＬＤＳ含む，ｐＨ　８．３）を使用。
【００１４】
実験例１に基づき，濃縮ゲル領域の長さにおける泳動パターンの違いを図１に示す。
電圧は，濃縮ゲル領域では５０Ｖ，分離ゲル領域では１００Ｖとした。濃縮ゲル領域の長さは，ゲル孔から５ｍｍ，１０ｍｍ，１５ｍｍとした。濃縮ゲル領域の長さの違いにおける泳動パターンの差はさほど見られないが，本ゲルサイズは５×６ｃｍと小さいので，タンパク分画範囲を考えると，濃縮ゲル領域の長さがゲル孔から５ｍｍで十分であると考えられた。
【００１５】
実験例２に基づき，かける電圧を１００Ｖで一定にした場合と，濃縮ゲルでは５０Ｖ，分離ゲルでは１００Ｖと変えた場合の泳動パターンの違いを示す。濃縮ゲルの長さはゲル孔から５ｍｍである。１００Ｖの定電圧の泳動パターンは電圧を変えたときのパターンと比べて，かなりブロードであった。これは，タンパクの泳動速度が速かったために，濃縮ゲルの長さが５ｍｍでは十分濃縮されず，移動度の差がついたまま泳動されたと考えられる。
【００１６】
実験例３に基づき，ゲル作製に用いる緩衝液の違いによる泳動パターンを図３に示す。蒸留水で作製したゲルでは，血清タンパクの分離が悪く，また，低分子量マーカーの１４．４Ｋ〜２０．１Ｋのバンドの分離が不良であった。また，トリス−グリシン緩衝液中の界面活性剤を除いた液で作製したゲルでの分離は，比較的良好であったが，低分子量マーカーの１４．４Ｋ〜２０．１Ｋのバンドの分離が悪かった。トリス−塩酸緩衝液で作製したゲルでは，シャープなバンドが得られたが，各レーンにおける泳動速度が違ったために，歪んだ泳動像が得られた。これは，このゲルにおける温度分布の不均一性が原因であると考えられる。トリス−グリシン緩衝液（０．０２５％ＳＤＳおよび０．０２５％ＬＤＳ含む）で作製したゲルにおけるタンパクの分離が最も優れていた。
【００１７】
実験例１
本実験例では濃縮ゲル領域の長さの違いにおける泳動パターンの差を示す。
本ゲルはｐＨ　８．３のトリス−グリシン緩衝液（０．０２５％ＳＤＳおよび０．０２５％ＬＤＳ含む）を用い，濃縮ゲル領域にはアガロースＳ（和光純薬工業株式会社）を１％にしたものを，分離ゲル領域では５％にしたものを使用した。Ｍｕｐｉｄゲルメーカーの５×６ｃｍサイズのゲルトレーを用いた。濃縮ゲル領域の長さは図１の左から５ｍｍ（ａ），１０ｍｍ　（ｂ），１５ｍｍ　（ｃ）である。用いたサンプルは，　左から１０倍希釈した血清，１０倍希釈した血清　，低分子量マーカー（アマシャムバイオサイエンス社），低分子量マーカー（アマシャムバイオサイエンス社），高分子量マーカー（アマシャムバイオサイエンス社），ワイドレンジマーカー（シグマ社）である。濃縮ゲル領域では５０Ｖの電圧を，分離ゲル領域では１００Ｖの電圧をかけた。泳動後，ゲルをトリクロロ酢酸−スルホサリチル酸溶液で３０分固定し，その後，４０℃で温風乾燥し，ＣＢＢ染色（クイックＣＢＢ；和光純薬工業株式会社）を４０℃，１時間行った。
【００１８】
実験例２
本実験例では，定電圧で泳動した場合と，濃縮ゲル領域と分離ゲル領域で電圧を変えた場合の比較を示す。濃縮ゲル領域の長さは，ゲル孔から５ｍｍである。
図２（ａ）は濃縮ゲル領域では５０Ｖ，分離ゲル領域では１００Ｖと電圧を変えた場合，図２（ｂ）は，１００Ｖの定電圧の場合を示す。ゲルの組成およびサンプルおよび泳動後の操作は実験例１同様である。
【００１９】
実験例３
本実験例では，ゲル作製の際の用いる緩衝液の違いによる泳動パターンの差を示す。図３（ｄ）は、トリス−グリシン緩衝液（０．０２％ＳＤＳおよび０．０３％ＬＤＳ含む）ゲル，図３（ｃ）は、トリス−グリシン緩衝液（界面活性剤を含まない）ゲル，図３（ｂ）は、蒸留水で作製したゲル，図３（ａ）は、トリス−塩酸緩衝液で作製したゲルを示す。前３者で使用したサンプルは実験例１同様である。トリス−塩酸緩衝液で使用したサンプルは，左から，低分子量マーカー（アマシャムバイオサイエンス社），ＢＳＡ（和光純薬工業株式会社），トランスフェリン（シグマ社），ＩｇＧ（シグマ社），ワイドレンジマーカー（シグマ社）である。濃縮ゲル領域の長さはゲル孔から５ｍｍで，濃縮ゲル領域では５０Ｖ，分離ゲル領域では１００Ｖの電圧をかけた。泳動後の操作は実験例１〜２同様である。
【００２０】
実験例４
本実験例では，水溶性ポリマーを添加した際の泳動パターンを示す。アガロースＳ（和光純薬工業株式会社）を４％濃度になるようにｐＨ　８．３のトリス−グリシン緩衝液に溶解し，更にポリビニルアルコールを０．５％になるように添加し，この溶液を沸騰温浴中でゾル化させ，Ｍｕｐｉｄゲルメーカーの５×６ｃｍのゲルトレーに均一に流延させた。図４は左側から２倍希釈した高蛋白尿，１０倍希釈した血清の泳動パターンを示す。１００Ｖの電圧をかけた。泳動後の操作は実験例１〜３同様である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例について濃縮ゲルの長さの違いにおける泳動像を写真で示し説明した図
【図２】本発明の実施例についてゲルを使用する際にかける電圧を変えた際の泳動像を写真で示し説明した図
【図３】本発明の実施例についてゲルを作製する際に使用する緩衝液を変えた場合の泳動像を写真で示し説明した図
【図４】の実施例についてポリビニルアルコールを添加したアガロースゲルを使用した場合の泳動像を写真で示し説明した図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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