(57)【要約】【課題】特定の細胞を体外循環により簡単、大量、安全に分離、回収できる材料を提供すること。【解決手段】リガンドと前記リガンドを固定化するための基材を含むリガンド固定化材料であって、基材に固定化されたリガンドを外部刺激により脱離でき、体外循環に用いられることを特徴とする体外循環用リガンド固定化材料。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンドと前記リガンドを固定化するための基材を含むリガンド固定化材料であって、基材に固定化されたリガンドを外部刺激により脱離でき、体外循環に用いられることを特徴とする体外循環用リガンド固定化材料。
【請求項２】
基材の形状が繊維状、中空糸膜状または平膜状であることを特徴とする請求項１に記載の体外循環用リガンド固定化材料。
【請求項３】
前記基材が多孔質であることを特徴とする請求項１又は２に記載の体外循環用リガンド固定化材料。
【請求項４】
前記基材がポリスルホン、セルロース、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリルからなる群より１つ以上選択される高分子化合物を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料。
【請求項５】
前記基材が親水性高分子を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料
【請求項６】
前記親水性高分子がポリビニルピロリドンであることを特徴とする請求項５に記載の体外循環用リガンド固定化材料。
【請求項７】
アミノ基を有することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料。
【請求項８】
前記アミノ基がポリエチレンイミン由来であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料。
【請求項９】
前記リガンドと前記基材とが化学結合を介して固定化されており、前記化学結合が前記外部刺激によって切断されることにより前記リガンドが脱離可能であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料。
【請求項１０】
前記外部刺激が還元剤による還元反応であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料。
【請求項１１】
前記リガンドが前記基材にジスルフィド結合を介して固定化されていることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料。
【請求項１２】
前記リガンドと前記基材とが架橋剤によって固定されており、前記架橋剤の両末端の官能基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、ピリジルジスルフィド基およびマレイミド基からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料。
【請求項１３】
該架橋剤がＮ−スクシンイミジル　３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネートであることを特徴とする請求項１２に記載の体外循環用リガンド固定化材料。
【請求項１４】
前記基材が表面にアミノ基を有し、前記アミノ基と前記リガンドが前記外部刺激により切断可能な架橋剤を利用して固定化されていることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料。
【請求項１５】
前記リガンドに２−ピリジル−ジスルフィド基が１モル以上１０モル以下で導入されていることを特徴とする請求項１４に記載の体外循環用リガンド固定化材料。
【請求項１６】
前記リガンドにメルカプト基が１モル以上１０モル以下で導入されていることを特徴とする請求項１４に記載の体外循環用リガンド固定化材料。
【請求項１７】
前記リガンドが抗体あるいはレセプターであることを特徴とする請求項１〜１６のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料を含み、細胞を分離するために用いられることを特徴とする体外循環用細胞分離カラム。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料を含み、血液浄化に用いられることを特徴とする体外循環用血液浄化カラム。
【請求項２０】
請求項１〜１７のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料を含み、細胞を分離可能な疾病治療用カラムであって、該疾患治療用カラムを用いて得られた細胞が癌、アレルギー、感染症、臓器移植、もしくは自己免疫疾患の治療又はワクチンとして用いられることを特徴とする疾病治療用カラム。
【請求項２１】
前記細胞が造血幹細胞であることを特徴とする請求項２０に記載の疾病治療用カラム。
【請求項２２】
前期細胞がＴ細胞であることを特徴とする請求項２０に記載の疾病治療用カラム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液中の病因物質や有用物質を除去回収、特に幹細胞やリンパ球系の細胞などの特定の細胞を分離回収するための、さらに該材料を再利用するための、外部刺激により基材に固定化したリガンドが脱離することを特徴とする体外循環用リガンド固定化材料に関するものであり、特にヒト血液および臍帯血中に存在する造血幹細胞、神経幹細胞、血管内皮前駆細胞、多能性幹細胞や樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞などの表面抗原とリガンドとの相互作用を利用することにより、治療に有用な特定の細胞を回収する材料として好適に用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
近年、リガンド、特に抗体を用いて、抗体と相互作用する細胞を選択的に分離する試みがなされている。かかる試みは、抗体を担体に固定化した材料を用い、ここに血液細胞などの細胞群を流すことにより、抗体と相互作用する特定の細胞だけを除去する技術が検討されている。
【０００３】
例えば、ＷＯ９７／０２７８７８においてはヒト表面抗原を認識する抗体を不織布に固定化し、特定の血球成分を除去することを試みている。しかし、このような技術では、抗体と相互作用する細胞が除去されるだけであり、それらの細胞を担体表面から回収し、さらに利用することは困難である。
【０００４】
また、特定の細胞を回収、利用する技術としては、フローサイトメトリーによる方法や最近では磁気ビーズ法などがあげられるが、いずれも少量の細胞を対象としており、さらに、細胞と標識抗体とを反応させた後、分離作業をするという非常に煩雑な操作が必要であり、特定の細胞を大量に回収する際は、時間、コストがかかることが問題であった。
【０００５】
また、リガンドを固定化したカラム担体を用いて目的物質を回収する技術として、プロテインＧセファロース、キレートカラム、グルタチオンカラムなどが知られており、これらの技術は固定化したリガンドが何らかの外部刺激で脱離できるような構造をもつことにより、一度リガンドに吸着した物質を、外部刺激によりリガンドと共に脱離、回収することができるものとなっている。しかし、これらの技術では、担体としてゲルや微粒子を使用しているため、細胞群など比較的大きな目的物質を対象とする場合、目的物質が空孔を通過する際に空孔を塞いでしまうため、目的物質の回収率が低かったり、あるいは、リガンドと目的物質の適切な相互作用ができないことが問題であった。さらに、これら従来の回収技術で血液から特定の細胞を回収する場合には、一度血液を体外に取り出した後に、血液を分離材料へ添加するという方法をとる必要があり、大気中の雑菌や微生物がコンタミする危険性がある。さらに、体外へ取り出せる血液量に限界があるため、処理できる血液量が少なく、回収できる細胞数が少なくなる傾向にある。そのため、血液を体外に取り出す前にＧ−ＣＳＦ等の医薬品により目的とする細胞数を上昇させるなどの方法が行われているが、これら医薬品による副作用が重大な問題となってくる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明では、上記従来技術の欠点を解消するものであり、特定の細胞を簡単、大量、安全に分離、回収できる材料を提供することを目的としてしている。
【０００７】
すなわち、本発明の材料では、外部刺激によりリガンドが脱離する構造を有することにより、リガンドにより捕捉した細胞を容易に回収することができる。
【０００８】
また、基材として体外循環に使用可能な素材を利用することにより、血液などの細胞群を一度に大量、安全に処理することができる。例えば素材として、透析膜をはじめとして種々の分離膜などに用いられているポリスルホン系の膜を、血液適合性を付与するためにポリビニルピロリドンなどの親水性高分子をブレンドして用いることにより、血液浄化用分離膜として使用できる。また、ポリスルホン系の材料は耐熱性に優れるため、蒸気滅菌などの処理が可能である。しかし、現在利用されているこのようなポリスルホン系の透析膜は表面に官能基がないためにリガンドを固定化するなどの化学修飾することは困難であったが、本発明を用いれば、リガンドの固定化が容易に行うことができる。
【０００９】
また、本発明の材料で大量に回収した特定の細胞を利用することにより、癌、アレルギー、感染症、臓器移植、もしくは自己免疫疾患の治療、又はワクチンに用いることができる。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明は下記構成を有する。
（１）リガンドと前記リガンドを固定化するための基材を含むリガンド固定化材料であって、基材に固定化されたリガンドを外部刺激により脱離でき、体外循環に用いられることを特徴とする体外循環用リガンド固定化材料。
（２）基材の形状が繊維状、中空糸膜状または平膜状であることを特徴とする（１）に記載の体外循環用リガンド固定化材料。
（３）前記基材が多孔質であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の体外循環用リガンド固定化材料。
（４）前記基材がポリスルホン、セルロース、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリルからなる群より１つ以上選択される高分子化合物を含むことを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料。
（５）前記基材が親水性高分子を含むことを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料
（６）前記親水性高分子がポリビニルピロリドンであることを特徴とする請求項５に記載の体外循環用リガンド固定化材料。
（７）アミノ基を有することを特徴とする（１）〜（６）のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料。
（８）前記アミノ基がポリエチレンイミン由来であることを特徴とする（１）〜（７）のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料。
（９）前記リガンドと前記基材とが化学結合を介して固定化されており、前記化学結合が前記外部刺激によって切断されることにより前記リガンドが脱離可能であることを特徴とする（１）〜（８）のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料。
（１０）前記外部刺激が還元剤による還元反応であることを特徴とする（１）〜（９）のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料。
（１１）前記リガンドが前記基材にジスルフィド結合を介して固定化されていることを特徴とする（１）〜（１０）のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料。
（１２）前記リガンドと前記基材とが架橋剤によって固定されており、前記架橋剤の両末端の官能基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、ピリジルジスルフィド基およびマレイミド基からなる群より選ばれることを特徴とする（１）〜（１１）のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料。
（１３）該架橋剤がＮ−スクシンイミジル　３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネートであることを特徴とする（１２）に記載の体外循環用リガンド固定化材料。
（１４）前記基材が表面にアミノ基を有し、前記アミノ基と前記リガンドが前記外部刺激により切断可能な架橋剤を利用して固定化されていることを特徴とする（１）〜（１１）のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料。
（１５）前記リガンドに２−ピリジル−ジスルフィド基が１モル以上１０モル以下で導入されていることを特徴とする（１４）に記載の体外循環用リガンド固定化材料。
（１６）前記リガンドにメルカプト基が１モル以上１０モル以下で導入されていることを特徴とする（１４）に記載の体外循環用リガンド固定化材料。
（１７）前記リガンドが抗体あるいはレセプターであることを特徴とする（１）〜（１６）のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料。
（１８）（１）〜（１７）のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料を含み、細胞を分離するために用いられることを特徴とする体外循環用細胞分離カラム。
（１９）（１）〜（１７）のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料を含み、血液浄化に用いられることを特徴とする体外循環用血液浄化カラム。
（２０）（１）〜（１７）のいずれかに記載の体外循環用リガンド固定化材料を含み、細胞を分離可能な疾病治療用カラムであって、該疾患治療用カラムを用いて得られた細胞が癌、アレルギー、感染症、臓器移植、もしくは自己免疫疾患の治療又はワクチンとして用いられることを特徴とする疾病治療用カラム。
（２１）前記細胞が造血幹細胞であることを特徴とする（２０）に記載の疾病治療用カラム。
（２２）前期細胞がＴ細胞であることを特徴とする（２０）に記載の疾病治療用カラム。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明においてリガンドを固定化する基材としては、血液などの細胞群を一度に大量に処理できる体外循環に使用可能な基材が好ましく、基材の形状としては平膜状、中空糸膜状、繊維状、粒子状、ゲル状など何でもよいが、閉鎖系で圧力損失を伴わず、細胞を傷つけず体外循環できる利点から平膜状、中空糸膜状、繊維状が望ましく、また、表面積を確保し、細胞とリガンドとの相互作用を大きくする点からこれらは多孔質であることがのぞましい。多孔質材料の場合は、製造条件を制御することにより孔の制御も可能である。
【００１２】
基材に使用される素材は、医療用に用いられている素材が好ましく、例えば、ポリ塩化ビニル、セルロース系ポリマー、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレンなどが挙げられる。この中でも特にポリスルホンは成形が容易で、成形したときの膜性能に優れているため、好適に用いられる。ポリスルホンとしては、主鎖に芳香環、スルフォニル基およびエーテル基をもつもので、例えば、次式（１）、（２）の化学式で示されるポリスルホンが好適に使用されるが、本発明ではこれらに限定されない。式中のｎは、例えば５０〜８０の如き整数である。
【００１３】
【化１】
2004041341.tif 000002
【００１４】
ポリスルホンの具体例としては、テイジンアモコ社製”ユーデル”（登録商標）ポリスルホンＰ−１７００、Ｐ−３５００、ＢＡＳＦ社製”ウルトラソン”（登録商標）Ｓ３０１０、Ｓ６０１０、住友化学製”ビクトレックス”（登録商標）、テイジンアモコ社製”レーデルＡ”（登録商標）、ＢＡＳＦ社製”ウルトラソンＥ”（登録商標）等のポリスルホンが挙げられる。又、本発明で用いられるポリスルホンは上記式（１）及び／又は（２）で表される繰り返し単位のみからなるポリマーが好適ではあるが、本発明の効果を妨げない範囲で他のモノマーと共重合していても良い。特に限定するものではないが、他の共重合モノマーは１０重量％以下であることが好ましい。
【００１５】
また、ポリスルホンなど疎水性の高分子を血液や細胞と接触するような用途で使用する際は、その接触面を親水化することが好ましい。親水化の方法としては、ポリビニルピロリドンやポリエチレングリコールなどのポリスルホン系高分子との相溶性に優れる親水性高分子を加工前のポリスルホン溶液に添加したり、血液や細胞との接触面を親水性の化合物でコーティングすることにより達成できる。これらのうちで血液適合性の観点からポリビニルピロリドンが好適に用いられる。使用するポリビニルピロリドンとしては、特に限定されないが、入手の容易さから、市販されている重量平均分子量１１０万、４．５万、２．９万、９０００、２９００のものが好適に用いられるが、もちろんそれ以外の分子量のものを使用してもかまわない。ポリビニルピロリドンの重量平均分子量は特に限定されるものではないが、２０００〜２００００００が好ましく、１００００〜１５０００００がより好ましい。なお、ここで記したポリビニルピロリドンの重量平均分子量は、材料に使用する原料段階での分子量である。作製された材料においては、放射線架橋などの手段によりポリビニルピロリドンの分子量は原料段階での分子量より大きなものとなっている場合もある。これらのポリビニルピロリドンは、ホモポリマーが好適であるが、本発明の効果を妨げない範囲で他のモノマーと共重合されたものであってもかまわない。ここで、他の共重合モノマーの量は特に限定するものではないが、１０重量％以下であることが好ましい。
【００１６】
ポリスルホン系材料に多孔質性を付与するには、あらかじめポリスルホン溶液にポリビニルピロリドンをブレンドさせることにより達成できる。
【００１７】
材料としてポリスルホン系中空糸膜を用いる場合、ポリスルホン系中空糸膜は例えば以下のようにして製造できるがこれに限定されない。
【００１８】
ポリスルホンとポリビニルピロリドン（重量比率２０：１〜１：５が好ましく、５：１〜１：１がより好ましい）を良溶媒（Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジオキサンなどが好ましい）および良溶媒の混合溶液に溶解させた原液（濃度は、１０〜３０重量％が好ましく、１５〜２５重量％がより好ましい）を二重環状口金から吐出する際に内側に注入液を流し、乾式部を走行させた後凝固浴へ導く。この際、乾式部の湿度が影響を与えるために、乾式部走行中に膜外表面からの水分補給によって、外表面近傍での相分離挙動を速め、孔径拡大し、結果として透析の際の透過・拡散抵抗を減らすことも可能である。ただし、相対湿度が高すぎると外表面での原液凝固が支配的になり、かえって孔径が小さくなり、結果として透析の際の透過・拡散抵抗を増大する傾向がある。そのため、相対湿度としては６０〜９０％が好適である。また、注入液組成としてはプロセス適性から原液に用いた溶媒を基本とする組成からなるものを用いることが好ましい。注入液濃度としては、例えばジメチルアセトアミドを用いたときは、４５〜８０重量％、さらには６０〜７５重量％の水溶液が好適に用いられる。
【００１９】
また、本発明において、基材にリガンドを固定化するためには基材表面に官能基を含有させる必要がある。官能基としてはアミノ基、カルボキシル基、硫酸基、水酸基、リン酸基、イソシアネート基、ニトロ基、アルデヒド基、ピリジルジスルフィド基などが挙げられるが、リガンドの固定化反応の容易さと水溶液で中での安定性からアミノ基が好適である。
【００２０】
基材にアミノ基を含有させる方法としては、あらかじめ成形のための溶液にアミノ基を有する物質をブレンドしておいてから成形する方法や、成形した材料にアミノ基を含有する物質を含む溶液に浸漬または付着させ、放射線照射により固定化する方法、材料に活性基を導入しておき、アミノ基含有物質を固定化する方法などが用いられる。活性基はクロロメチル基、クロロアセトアミドメチル基などが利用される。
【００２１】
基材にアミノ基を含有させる場合は、材料全体にアミノ基を含有させてもよいし、血液や細胞の接触する部分だけにアミノ基を含有させてもよい。中空糸膜の内表面を用いる場合は、アミノ基含有高分子量物質を内側からろ過し、充填することにより内表面にアミノ基を集積させることができる。
【００２２】
基材にアミノ基を含有させる際に使用するアミノ基を有する物質としては、ポリマーであっても低分子であってもよい。低分子の場合は、アンモニア、テトラエチレンペンタミン、デンドリマー、アグマチンなどが用いられる。ポリマーの場合は、ポリアルキレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリリジン、アジリジン（エチレンイミン）化合物を有するポリマー、ポリエチレンイミン誘導体、キトサン、グリシンエステル化ポリエチレングリコール、ヒドラジド化ポリエチレングリコール、ω−ヒドロキシ−α−アミンポリエチレングリコール、ω−アミノ−α−カルボキシルポリエチレングリコールおよびそれらに置換基の導入されたもの、およびこれらを構成するモノマー単位からなる共重合体などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２３】
これらアミノ基を有するポリマーの中でも毒性の低さ、入手のしやすさ、取り扱いのしやすさなどから、分岐状のポリエチレンイミンが特に好適に用いられる。ポリエチレンイミンは、分子量６００以上の直鎖状、分岐状のものが好ましく用いられ、また、ポリエチレンイミンの誘導体としては、ポリエチレンイミンをアルキル化、カルボキシル化、フェニル化、リン酸化、スルホン化、メルカプト化、ピリジルジスルフィド化など、所望の割合で誘導体化したものが挙げられる。
【００２４】
また、上記の成形した材料にアミノ基を含有する物質を含む溶液に浸漬または付着させ、放射線照射により固定化する方法をとる際の放射線処理としては、湿潤状態でγ線・電子線などを照射すればよい。ここでいう湿潤状態とは、材料を乾燥させない状態のことを言う。その程度は特に限定されるものではないが、通常、材料が１重量％以上の水分を含んでいることが好ましい。
【００２５】
放射線の吸収線量は湿潤状態で１０〜５０ｋＧｙ程度が好ましく、２０ｋＧｙを超える線量を照射した場合は、滅菌処理を同時に行うことも可能である。この際、吸収線量は線量測定ラベルをモジュールの表面に貼り付けるなどして測定することができる。得られたアミノ基含有材料を医療用途に用いる場合は、リガンド固定化操作を無菌下で行うことが望ましい。
【００２６】
以上に説明した材料を用いて、基材にアミノ基を含有させるには、例えば、ポリスルホン／ポリビニルピロリドンブレンド基材を十分水洗した後、１ｗｔ％のポリエチレンイミン水溶液に浸漬して、２５ｋＧｙにてγ線照射して基材にアミノ基を含有させる方法、あるいは、ポリスチレン基材をＮ−メチロール−α−クロロアセトアミド、ニトロベンゼン、硫酸、パラホルムアルデヒドの混合液で反応させ、クロロアミドメチル化架橋ポリスチレン基材を得て、さらに、ポリエチレンイミンをトリエチルアミン、ジメチルスルフォキシドの混合溶液に溶解し、この溶液にクロロアミドメチル化架橋基材を加えて攪拌、洗浄して、ポリスチレン基材へアミノ基を導入することもできるが、これらの方法に限定されない。
【００２７】
本発明においては、材料に固定化したリガンドが外部刺激により脱離できる特徴をもつことにより、基材上のリガンドにより捕捉した物質を容易に回収することができる。このような外部刺激としては、光、熱、ｐＨ、塩濃度、化学反応などがあげられるが、リガンドの安定性などから化学反応により化学結合を切断してリガンドが脱離される材料が好ましく、化学的な結合が切断される反応として、加水分解反応、酸化反応、還元反応などがあげられるが、水中での安定性や細胞のバイアビリティー維持が必要であることから還元反応が好ましい。特に、ジスルフィド結合を還元剤による還元反応により切断させる反応は、タンパク質のリフォールディングなど生体内で良く行われる反応であり、リガンドを脱離する反応として好適であるため、基材にジスルフィド結合を介してリガンドを固定化することが望ましい。ここで使用する還元剤としてジチオスレイトール、メルカプトエタノール、システイン、還元型グルタチオンなどがあげられる。
【００２８】
基材にジスルフィド結合を介してリガンドを固定化する方法としては、リガンドがタンパク質である場合は、タンパク質自身もジスルフィド結合を有することもあるので、リガンドを直接材料に固定しても良いが、通常、メルカプト基同士の酸化反応、あるいはジスルフィド交換反応を利用してジスルフィド結合を形成させる方法をとる。ジスルフィド交換反応を利用する方法としては、ピリジルジスルフィド基とメルカプト基の交換反応を用いるのが反応性の点から好ましく、ピリジルジスルフィド基やメルカプト基を基材およびリガンドに導入して結合させる。この際、通常架橋剤を利用する。
【００２９】
上記のようなジスルフィド結合を介した固定化に利用できるような架橋剤としては、基材表面の官能基同士あるいはリガンド同士の結合を防ぐため二種類の違った官能基と反応する活性化基をもつ架橋剤を使用することが好ましく、活性化基として、アミノ基と反応するＮ−ヒドロキシスクシンイミド基、イミドエステル基、ニトロアリールハライド基、メルカプト基と反応するマレイミド基、ピリジルジスルフィド基、チオフタルイミド基、活性化ハロゲン基、光化学反応により架橋するフェニルアジド基、ジアゾカルベン基、などを持つような架橋剤を利用することができる。なかでも、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基とピリジルジスルフィド基を持つような架橋剤を利用することにより、上記で作製したようなアミノの基を有する基材や抗体などのアミノ基を有するリガンドにピリジルジスルフィド基を導入できる。また、このピリジルジスルフィド基を還元剤により還元することによりメルカプト基に変換できる。このような架橋剤として、Ｎ−スクシンイミジル　３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート、スクシンイミジル６−［３’（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエートや水溶性のスルフォスクシンイミジル６−［３’（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエートなどが挙げられる。水に不溶性の架橋剤を用いる場合は、ジメチルスルホキシドやメタノールなどの可溶性の有機溶媒に溶解後、水系の反応液に添加することにより利用できるが、材料に反応させる際は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基とピリジルジスルフィド基を持つような架橋剤はポリスルホン系材料に吸着しやすいため、メタノール、エチレンオキシド、グリセリンなどの架橋剤を溶解し、ポリスルホン系材料を溶解しない有機溶媒で洗浄することが望ましい。
【００３０】
上記のような架橋剤などを利用して基材にピリジルジスルフィド基が導入される場合には、例えば下記反応式（３）のような反応を用いて固定化できる。リガンドの方に上記のような架橋剤を利用してピリジルジスルフィド基を導入、還元してメルカプト基を導入する、あるいは、リガンドが抗体である場合には、抗体をペプシンで消化してメルカプト基を生成させ、これらリガンドのメルカプト基と基材上のピリジルジスルフィド基のジスルフィド交換反応によりジスルフィド結合を介してリガンドを基材に固定化する。ここで、リガンドにピリジルジスルフィド基を導入して還元する際には、リガンドが抗体である場合、抗体自体の還元による失活を防ぐために酢酸緩衝液中などで還元することにより抗体自身の還元を抑えることができる。
【００３１】
【化２】
2004041341.tif 000003
【００３２】
また、上記のような架橋剤などを利用して基材にメルカプト基が導入されている場合、例えば下記反応式（４）のような反応を用いて固定化できる。リガンドに上記のような架橋剤ピリジルジスルフィド基を導入したもの使用し、リガンドのピリジルジスルフィド基と基材上のメルカプト基のジスルフィド交換反応によりジスルフィド結合を介してリガンドを基材に固定化することができる。
【００３３】
【化３】
2004041341.tif 000004
【００３４】
基材へ導入されるピリジルジスルフィド基あるいはメルカプト基の密度は高い方が望ましいが、反応に用いる架橋剤の濃度や反応時間により制御することができるので、適宜選ぶことができる。
【００３５】
リガンドへのピリジルジスルフィド基の導入率はリガンド１モル当たり１モル以上であることが必要であるが、導入率を上げるためにピリジルジスルフィド化剤の仕込量を上げるとリガンドがタンパク質の場合は失活したり、凝集したりするおそれがある。望ましくは仕込量はリガンド１モルあたり１０モル以下が望ましい。
【００３６】
基材にリガンドを固定化する際のリガンドの濃度は、固定化密度を上げるためには高い方が望ましいが、コスト面から考えて、１ｍｇ／ｍｌ以上が望ましい。０．５ｍｇ／ｍｌ以下の場合は固定化されるリガンドの量が少なくなり、機能が低下する恐れがある。
【００３７】
以上の示したようなような反応を利用してリガンドを基材にジスルフィド結合を介して固定化させる方法の例を以下に示すが、固定化の方法はこれらに限定されない。
【００３８】
例えば、アミノ基を含有するポリスルホン基材を架橋剤としてＮ−スクシンイミジル　３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（以下ＳＰＤＰ）を溶解したジメチルスルホキシド溶液に浸漬し反応させた後、ジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液で還元し、メルカプト基を有するポリスルホン平膜を得る。さらに、ヒト免疫グロブリンＧにＳＰＤＰを溶解したジメチルスルホキシド溶液を抗体１モルに対して１０モル添加し、室温で３０分反応させて、免疫グロブリンＧにピリジルジスルフィド基を導入した後、精製する。メルカプト基を有するポリスルホン平膜にピリジルジスルフィド基を導入したヒト免疫グロブリンＧを反応させ、ヒト免疫グロブリンＧをポリスルホン平膜にジスルフィド結合を介して固定化した材料を作製する。この材料を還元剤としてジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液に浸漬して、ジスルフィド結合を還元することによりヒト免疫グロブリンＧを脱離させることができる。
【００３９】
本発明で使用するリガンドは、細胞や病因物質などのターゲット物質と相互作用をもつものであれば、合成品でも天然物でもよいが、特異性の点から抗体およびレセプターを好ましく用いることができる。用いる抗体としては、例えば、抗ＣＤ１ａ抗体、抗ＣＤ１ｂ抗体、抗ＣＤ１ｃ抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ１０抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤｗ１２抗体、抗ＣＤ１３抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１５抗体、抗ＣＤ１６ａ抗体、抗ＣＤ１６ｂ抗体、抗ＣＤ１８抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ２４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ２６抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ３２抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４２ａ抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体、抗ＣＤ４９ｄ抗体、抗ＣＤ５０抗体、抗ＣＤ５４抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ５７抗体、抗ＣＤ５８抗体、抗ＣＤ６１抗体、抗ＣＤ６２Ｌ抗体、抗ＣＤ６２Ｐ抗体、抗ＣＤ６６抗体、抗ＣＤ６９抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８１抗体、抗ＣＤ８６抗体、抗ＣＤ９５抗体、抗ＣＤ１０２抗体、抗ＣＤ１０５抗体、抗ＣＤ１０６抗体、抗ＣＤ１０９抗体、抗ＣＤｗ１１９抗体、抗ＣＤ１２０ａ抗体、抗ＣＤ１２０ｂ抗体、抗ＣＤ１２１ａ抗体、抗ＣＤｗ１２１ｂ抗体、抗ＣＤ１２２抗体、抗ＣＤ１２３抗体、抗ＣＤ１２６抗体、抗ＣＤｗ１２８ａ抗体、抗ＣＤ１３０抗体、抗ＣＤｗ１３１抗体、抗ＣＤ１３２抗体、抗ＣＤ１３４抗体、抗ＣＤ１０５抗体、抗ＣＤ１３８抗体、ＣＤ１５２抗体、抗ＣＤ１５４抗体、抗ＣＤ１９９抗体、抗低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）抗体、抗酸化ＬＤＬ抗体、抗β２ミクログロブリン抗体、抗ＣＣＲ１抗体、抗ＣＣＲ２抗体、抗ＣＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ４抗体、抗ＣＣＲ５抗体、抗ＣＣＲ７抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体、抗ＣＸＣＲ５抗体、抗ＣＸＣＲ１抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。また、レセプターとしては例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＲ５等のサイトカインレセプターやＦｃγ，Ｆｃε等のイムノグロブリンレセプター、ＲＡＧＥ，ＬＤＬレセプター等のスカベンジャ−レセプター等，Ｔ細胞レセプターや主要組織適合性抗原等の細胞認識レセプター等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの抗体やレセプターは単独で固定化しても良いし、複数の抗体やレセプターを組み合わせても良い。抗体は、アフィニティーの高さからモノクローナル抗体が好ましい。
【００４０】
これら抗体やレセプターは目的によって種々選定することができ、血液中の有用物質や病因物質を特異的に除去、回収する場合は細胞、無機物、タンパク質、ＤＮＡ、脂質、糖、ウィルスなどがターゲットとして挙げられる。例えば、抗ＣＤ２抗体を用いればＴ細胞およびＮＫ細胞を分離でき、抗ＣＤ３抗体を用いればＴ細胞をを分離でき、抗ＣＤ４抗体を用いればヘルパーＴ細胞を分離でき、抗ＣＤ８抗体を用いればサイトトキシックＴ細胞を分離でき、抗ＣＤ１１ａを用いれば白血球を分離でき、抗ＣＤ１１ｂを用いれば単球を分離でき、抗ＣＤ１４抗体を用いれば単球やマクロファージを分離でき、抗ＣＤ１５抗体を用いれば顆粒球やミエロイド細胞を分離でき、抗ＣＤ１６細胞を用いれば好中球あるいは休止期ＮＫ細胞を分離でき、抗ＣＤ１９抗体を用いればＢ細胞を分離でき、抗ＣＤ２２抗体を用いればＢ細胞を分離でき、抗ＣＤ２７抗体を用いればナイーブＢ細胞やメモリーＢ細胞を分離でき、抗ＣＤ３０抗体を用いれば活性化Ｂ細胞および活性化Ｔ細胞を分離でき、抗ＣＤ３３細胞を用いれば単球、顆粒球およびミエロイド細胞を分離でき、抗ＣＤ３４抗体を用いれば造血幹細胞を分離でき、抗ＣＤ４５抗体を用いれば白血球を分離でき、抗ＣＤ５６抗体を用いればＮＫ細胞を分離でき、抗ＣＤ６１抗体を用いれば巨核球及びその前駆細胞を分離でき、抗ＣＤ６６抗体を用いれば顆粒球を分離でき、抗ＣＤ６９抗体を用いれば活性化Ｔ細胞や活性化Ｂ細胞やＮＫ細胞を分離でき、抗ＣＤ７１抗体を用いれば赤芽球や活性化されたリンパ芽球を分離でき、抗ＣＤ１０５抗体を用いれば内皮細胞を分離できる。
【００４１】
本発明の材料を利用すれば、上記で示したようなターゲットとなる有用物質や病因物質をリガンドにより捕捉でき、さらに、外部刺激によりリガンドを基材から離脱させることにより、捕捉した有用物質や病因物質を回収する事が可能である。また、ターゲット物質を捕捉あるいは回収する際に使用する溶媒として、様々なｐＨ値のリン酸、酢酸、クエン酸などの緩衝液をもちいることができ、さらに緩衝液の中にウシ血清アルブミンや抗体などのタンパク質あるいはカチオン性、アニオン性などのポリマーなどを含有していても良い。
【００４２】
さらに素材として多孔質を用いる場合は、透析やろ過機能を付与することができ、血液浄化、細胞分離用途のみならず、バイオリアクターなどの細胞培養用材料としても用いることができる。
【００４３】
細胞を回収する際は全血と作用させてもよいし、血漿分画や単核球分画などにした後、作用させてもよい。
【００４４】
また、本発明の材料をカラムとして利用する場合、特に中空糸膜を用いる場合、例えば以下のようにしてカラムを製造することができるが特に限定されるものではない。まず、中空糸膜を必要な長さに切断し、必要本数を束ねた後、筒状ケースに入れる。その後両端に仮のキャップをし、中空糸膜両端部にポッティング剤を入れる。このとき遠心機でモジュールを回転させながらポッティング剤を入れる方法は、ポッティング剤が均一に充填されるために好ましい方法である。ポッティング剤が固化した後、中空糸膜の両端が開口するように両端部を切断し、中空糸膜モジュールを得ることができる。
【００４５】
以上のような方法で、回収した有用物質、病因物質を分析に用いることが可能である。また、細胞の場合はそれを培養し、分析や治療などに利用できる。例えば、リガンドとして抗ＣＤ４抗体を使用し、このリガンドをジスルフィド結合を介して基材に固定化した本発明の材料に血液を通してＣＤ４陽性のＴ細胞を捕捉し、ジチオスレイトールなどの還元剤でリガンドを脱離することにより、捕捉した細胞を大量に回収し、この細胞に様々な刺激を加えて活性化させ体内に戻すことにより、癌、アレルギー、感染症、臓器移植、あるいは自己免疫疾患の治療やワクチンとしてもちいることができる。
【００４６】
また、例えば、リガンドとして抗ＣＤ３４抗体を使用し、このリガンドをジスルフィド結合を介して基材に固定化した本発明の材料に臍帯血を通して、造血幹細胞を捕捉し、ジチオスレイトールなどの還元剤でリガンドを脱離することにより、造血幹細胞を大量に回収し、回収した造血幹細胞を培養して輸血医療に用いたり、様々な組織幹細胞に分化させることにより、肝疾患や神経疾患、血管傷害などの細胞療法に用いることができる。
【００４７】
また、外部刺激によりジスルフィド結合を解離してリガンドを脱離した後の材料は、表面にメルカプト基を有するので、再びピリジルジスルフィドを有するリガンドを固定化し、再利用することもできる。
【００４８】
【実施例】
１．メルカプト基をもつ平膜の作製
ポリスルホン（テイジンアモコ社製”ユーデル”（登録商標）Ｐ−３５００）１８重量部、ポリビニルピロリドン（ＢＡＳＦ社製”Ｋ３０”（登録商標））９重量部をＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド７２重量部、水１重量部に加え、９０℃、１４時間加熱溶解した。この溶液を０．１ｍｍスペーサー付きのガラス板に塗布し、ドクターブレードにて溶液を引き延ばしたものを水中にいれて、凝固させ、ポリスルホン／ポリビニルピロリドンブレンドからなる平膜状の材料を作製した。
【００４９】
上記、ポリスルホン／ポリビニルピロリドンブレンド材料を十分水洗した後、１ｗｔ％のポリエチレンイミン（分子量１万、和光純薬製）水溶液に浸漬して、２５ｋＧｙにてγ線照射した。放射線処理した支持体は、十分水洗した。
【００５０】
上記のアミノ基を含有するポリスルホン平膜をＮａＣｌを０．１５ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にＮ−スクシンイミジル　３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ピアース社製、以下ＳＰＤＰ）を２０ｍＭに溶解したジメチルスルホキシド溶液を最終ＳＰＤＰ濃度が１．２ｍＭとなるように添加した溶液に２．５時間浸漬した（室温）。反応させた平膜をメタノールで洗浄した後、水洗した材料を２５ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液で還元し、表面にメルカプト基をもつポリスルホン平膜を得た。
【００５１】
２．抗体へのＳＰＤＰの導入
ＮａＣｌを０．１５ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に精製ヒト免疫グロブリンＧ（シグマ社製）を５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、さらに、ＳＰＤＰを２０ｍＭとなるように溶解したジメチルスルホキシド溶液を抗体１モルに対して１０モル添加し、室温で３０分反応させた後、ＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）で高分子量分画を精製した。合成したＳＰＤＰ−ＩｇＧ複合体の一部を２５ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液で還元反応を行い、反応により生成するピリジン−２−チオンの吸収（３４３ｎｍ）を測定することにより、ＳＰＤＰ基の導入量を測定したところ、免疫グロブリンＧ１モルあたりのＳＰＤＰ導入量は４．２モルであった。
【００５２】
抗体の濃度はＨＰＬＣで測定した（溶離液：０．５Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ４．５、カラム：東ソー製Ｇ３０００ＳＸＷＬ、装置：東ソー製ＨＰＬＣシステム、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ）。
【００５３】
３．実施例１
１．で作製した平膜１ｃｍ２を２．で得られたＳＰＤＰ化抗体を１ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液１ｍｌに室温で４．５時間浸漬した後、ＮａＣｌを０．１５ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄することにより、抗体をポリスルホン平膜にジスルフィド結合を介して固定化した体外循環用リガンド固定化材料（実施例１）を作製した。
【００５４】
ここで得られた抗体固定化平膜１ｃｍ２を外部刺激として２５ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液に浸漬して、ジスルフィド結合を還元することにより抗体を２０μｇ脱離させることができた。
【００５５】
また、還元後のポリスルホン平膜１ｃｍ２を再度、ＳＰＤＰ化抗体を１ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液１ｍｌに室温で４．５時間浸漬することにより、再度抗体をポリスルホン平膜にジスルフィド結合を介して固定化することができた。
【００５６】
４．メルカプト基をもつ中空糸膜の作製
ポリスルホン（テイジンアモコ社製”ユーデル”（登録商標）Ｐ−３５００）１８部、ポリビニルピロリドン（ＢＡＳＦ社製”Ｋ３０”（登録商標））９部をＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド７２部、水１部に加え、９０℃、１４時間加熱溶解した。この製膜原液を外径０．３ｍｍ、内径０．２ｍｍのオリフィス型二重円筒型口金より吐出し芯液としてジメチルアセトアミド５８部、水４２部からなる溶液を吐出させ、乾式長３５０ｍｍを通過した後、水１００％の凝固浴に導き中空糸膜を得た。
【００５７】
中空糸膜を１００００本束ね、中空糸膜中空部を閉塞しないようにポリウレタン系ポッティング剤で両末端をモジュールケースに固定し、モジュールを作製した後、ポリエチレンイミン（分子量１００万、ＢＡＳＦ社製）０．１重量％を含む水溶液を中空糸膜内側から外側にかけてろ過をかけることにより、ポリエチレンイミンを中空糸膜内表面に集積して充填した後、２５ｋＧｙでγ線照射した。中空糸膜を水洗した後、ＮａＣｌを０．１５ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にＳＰＤＰを２０ｍＭに溶解したジメチルスルホキシド溶液を最終ＳＰＤＰ濃度が１．２ｍＭとなるように添加した溶液を中空糸膜内部に室温で１時間灌流し、中空糸膜内表面をＳＰＤＰ化した後、膜をメタノールで洗浄し、さらに水洗した膜を２５ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液で還元し、内表面にメルカプト基をもつポリスルホン中空糸膜を得た。
【００５８】
５．実施例２
４．で得られたモジュールを解体して中空糸膜を取り出し、中空糸膜を３６本束ね、中空糸膜中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で両末端をモジュールケースに固定し、ミニモジュールを作製した。該ミニモジュールの直径は約７ｍｍ、長さは約１０ｃｍである。ミニモジュール内部に２．で得られたＳＰＤＰ化抗体を０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液１．５ｍｌを室温で２０時間灌流し洗浄することにより、抗体をポリスルホン中空糸膜内表面にジスルフィド結合を介して固定化し、体外循環用リガンド固定化材料を用いたカラム（実施例２）を得た。
【００５９】
ここでで得られた抗体固定化中空糸膜内部に外部刺激として２５ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液を灌流して、ジスルフィド結合を還元することにより抗体を１５μｇ脱離させることができた。
【００６０】
６．実施例３
４．で得られたモジュールを解体して中空糸膜を取り出し、中空糸膜を３６本束ね、中空糸膜中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で両末端をモジュールケースに固定し、ミニモジュールを作製した。該ミニモジュールの直径は約７ｍｍ、長さは約１０ｃｍである。ミニモジュール内部に抗体として２．と同様の方法で抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体（イムノテック社）を使用しで得られたＳＰＤＰ化抗体を０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液１．５ｍｌを室温で２０時間灌流し洗浄することにより、抗体をポリスルホン中空糸膜内表面にジスルフィド結合を介して固定化し、体外循環可能なリガンド固定化材料を用いたカラム（実施例３）を得た。
【００６１】
得られた実施例３のカラムにヒト末梢血（ヘパリン含有）をＡＸＩＳ　ＳＨＩＥＬＤ社製”リンフォプレップ”（登録商標）で処理して単核球成分を分離し、単核球成分１．０×１０７個をリン酸緩衝液１．５ｍｌに懸濁し、該懸濁を実施例３のカラムに室温で１時間灌流させた。環流前のＣＤ４陽性細胞数は６×１０６個であったのに対し、処理後は６×１０５個であった。また処理後のモジュールをリン酸緩衝液を１時間灌流させて洗浄した後、２５ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液を１．５ｍｌで１時間灌流させて得た細胞は５×１０６個であり、ＣＤ４陽性の割合は９割以上であった。以上のＣＤ４陽性細胞の分析はフローサイトメーターにより行った。
【００６２】
７．　メルカプト基導入ポリスチレン繊維の作成
５０重量比の海成分（４６重量比のポリスチレンと４重量比のポリプロピレンの混合物）と５０重量比の島成分（ポリプロピレン）とからなる海島型複合繊維（厚さ：２．６デニール、島の数１６）を、３５ｇのＮ−メチロール−α−クロロアセトアミド、２３２．５ｇのニトロベンゼン、２３２．５ｇの９８％硫酸、０．５ｇのパラホルムアルデヒドの混合液を１０℃で２時間反応させた。繊維をニトロベンゼンで洗浄し、メタノールで反応を停止させた。これによりクロロアミドメチル化架橋ポリスチレン繊維（以下ＡＭＰＳｔ繊維と略す）を得た。得られたＡＭＰＳｔ繊維をさらに編地とした（以下ＡＭＰＳｔ編地１と略す）。
【００６３】
ポリエチレンイミン（分子量１万、和光純薬製）０．５７ｇを、トリエチルアミン０．９５ｇ、ジメチルスルフォキシド４８．５ｇに溶解し、この溶液に１．０２ｇのＡＭＰＳｔ編地１（クロロ含量２．６ｍｍｏｌ相当）を加え攪拌した。反応は３０℃で３時間行った。その後ジメチルスルフォキシド、メタノール、純水で洗浄した。得られたものをＡＭＰＳｔ編地２とする。
【００６４】
アミノ基を含有するＡＭＰＳｔ編地２をＮａＣｌを０．１５ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にＮ−スクシンイミジル　３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ピアース社製、以下ＳＰＤＰ）を２７ｍＭに溶解したジメチルスルホキシド溶液に０．５時間浸漬した（室温）。反応させたＡＭＰＳｔ編地をリン酸緩衝液洗浄した後、洗浄した材料を１００ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液で還元し、表面にメルカプト基をもつをＡＭＰＳｔ編地を得た。得られたものをＡＭＰＳｔ編地３とする。
【００６５】
８．実施例４
７．で得たＡＭＰＳｔ編地３を２．で作製したＳＰＤＰ化抗体を含むリン酸緩衝液に室温で１８時間浸漬し、抗体をＡＭＰＳｔ編地にジスルフィド結合を介して固定化し、体外循環可能なリガンド固定化材料（実施例４）を得た。
【００６６】
実施例４を外部刺激として５０ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝化生理食塩水に浸漬して、ジスルフィド結合を還元することにより抗体を脱離させることができた。抗体脱離量は実施例４１ｇ当たり１０．９μｇ／ｇであった。
【００６７】
また、還元後の実施例４を再度、ＳＰＤＰ化抗体を１ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝化生理食塩水に室温で１８時間浸漬することにより、再度抗体を実施例４の材料にジスルフィド結合を介して固定化することができた。
【００６８】
９．実施例５
７．で作製したＡＭＰＳｔ編地３を２．の方法で抗ウサギＣＤ４抗体（ファーミンジェン社製）を使用して得られたＳＰＤＰ化抗体を含むリン酸緩衝液に室温で１８時間浸漬し、該抗体をＡＭＰＳｔ編地３にジスルフィド結合を介して固定化した。得られたＡＭＰＳｔ編地５ｇをカラムに充填し、体外循環可能なリガンド固定化材料を用いたカラム（実施例５）を得た。充填後、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む生理食塩水で滅菌した後、ウサギに対して体外循環を行った。
【００６９】
ペントバルビタールの静脈内投与による麻酔下でウサギの手術及び体外循環を行った。右足の大腿動静脈を剥離しカテーテルを挿入し、動脈より流速１ｍｌ／ｍｉｎで血液をポンプで引き出し、カラムを通過させた後に静脈より返血した。抗凝固剤としてヘパリンを使用し、生理食塩水の輸液を３ｍｌ／ｍｉｎの速度で行った。
【００７０】
２時間の体外循環処理の後に回路内の血液をウサギに全て返血した。返血時には生理食塩水を置換液として回路に充填した。返血後にカラムを回路から外し、無菌的に脱離液を含む５ｍｌ注射筒へ接続し、脱離液（１％メルカプトエタノールを含むリン酸緩衝化生理食塩水）により処理することで細胞を回収した。フローサイトメーターにより回収液中のＣＤ４陽性細胞の数を測定した。
【００７１】
また、抗ＣＤ４抗体を固定化していない材料を充填したカラム（比較例１）により同様の実験を行った。その結果、表１に示すように実施例５のみＣＤ４陽性細胞がウサギ血液中より分離できることが確認された。
【００７２】
また、ウサギは実験中に異常は観察されず、また、実験終了後１４日間観察したが異常なく生存し、カラムの安全性も確認された。
【００７３】
【表１】
2004041341.tif 000005
【００７４】
【発明の効果】
本発明の材料では、外部刺激によりリガンドが脱離する構造を有することにより、リガンドにより捕捉した細胞を容易に回収することができる。
【００７５】
また、基材として体外循環に使用可能な素材を利用することにより、血液などの細胞群を一度に大量、安全に処理することができる。例えば素材として、透析膜をはじめとして種々の分離膜などに用いられているポリスルホン系の膜を、血液適合性を付与するためにポリビニルピロリドンなどの親水性高分子をブレンドして用いることにより、血液浄化用分離膜として使用できる。また、ポリスルホン系の材料は耐熱性に優れるため、蒸気滅菌などの処理が可能である。しかし、現在利用されているこのようなポリスルホン系の透析膜は表面に官能基がないためにリガンドを固定化するなどの化学修飾することは困難であったが、本発明を用いれば、リガンドの固定化が容易に行うことができる。
【００７６】
また、本発明の材料で大量に回収した特定の細胞を利用することにより、癌、アレルギー、感染症、臓器移植、もしくは自己免疫疾患の治療又はワクチンとして用いることができる。
【００７７】
さらに、本発明により、血液中の病因物質を特異的に除去し、病因物質を回収でき、分析することが可能でそれが、細胞の場合はそれを培養し、分析や治療などに利用でき、抗体離脱後の材料は再利用することもできる材料を提供することができる。