(57)【要約】【課題】  食品に添加しても風味を損なわず、細菌毒素を中和することができるクロストリジウム属細菌毒素中和剤を提供する。【解決手段】  クロストリジウム属細菌毒素中和剤は、ルチン、ニコチフロリン、ケンフェトリン、及び、フラボン骨格の５位及び７位に水酸基を有し、４'位の水酸基でラムノース骨格を有する糖鎖と配糖体を形成し、３位の水酸基でルチノース骨格を有する糖鎖と配糖体を形成するフラボノール配糖体からなる群より選択される少なくとも１成分を含有する。紅茶抽出物のテアルビジン分画を、メタノール／水溶媒を用いて逆相液体クロマトグラフィにより溶出分離してメタノール４０％及び／又はメタノール６０％のメタノール／水溶媒による溶出部を分取する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラボノール配糖体（Ａ）及びフラボノール配糖体（Ｂ）のうちの少なくとも１つを含有し、
前記フラボノール配糖体（Ａ）は、フラボン骨格の５位及び７位に水酸基を有し、３'位、４'位及び５'位の少なくとも１つに水酸基を有し、３位の水酸基でルチノース骨格を有する糖鎖と配糖体を形成するフラボノール配糖体であり、
前記フラボノール配糖体（Ｂ）は、フラボン骨格の５位及び７位に水酸基を有し、４'位の水酸基でラムノース骨格を有する糖鎖と配糖体を形成し、３位の水酸基でルチノース骨格を有する糖鎖と配糖体を形成するフラボノール配糖体である
ことを特徴とするクロストリジウム属細菌毒素中和剤。
【請求項２】
前記フラボノール配糖体（Ａ）は、ルチン、ニコチフロリン及びケンフェトリンからなる群より選択される少なくとも１成分であることを特徴とするクロストリジウム属細菌毒素中和剤。
【請求項３】
食品に添加して、クロストリジウム属細菌の毒素による中毒を予防するための請求項１又は２に記載のクロストリジウム属細菌毒素中和剤。
【請求項４】
前記クロストリジウム属細菌はボツリヌス菌である請求項１〜３のいずれかに記載のクロストリジウム属細菌毒素中和剤。
【請求項５】
前記クロストリジウム属細菌は破傷風菌である請求項１〜３のいずれかに記載のクロストリジウム属細菌毒素中和剤。
【請求項６】
紅茶抽出物のテアルビジン分画を、メタノール／水溶媒を用いて逆相液体クロマトグラフィーにより溶出分離してメタノール４０％及び／又はメタノール６０％のメタノール／水溶媒による溶出部を分取する工程を有するクロストリジウム属細菌毒素中和剤の製造方法。
【請求項７】
紅茶抽出物のテアルビジン分画をメタノール／水溶媒を用いて逆相液体クロマトグラフィーにより溶出分離して該テアルビジン分画を精製する工程を有するクロストリジウム属細菌毒素中和剤の製造方法。
【請求項８】
前記紅茶抽出物は、紅茶葉をアセトン水溶液で抽出した抽出液からアセトン及び水を除去することによって得られ、前記テアルビジン分画は、該紅茶抽出物の水分散液に、ｎ−ヘキサン、クロロホルム、酢酸エチル及びｎ−ブタノールによる分配抽出を順次行って得られるｎ−ブタノール抽出物である請求項６又は７に記載のクロストリジウム属細菌毒素中和剤の製造方法。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれかに記載の製造方法によって得られるクロストリジウム属細菌毒素中和剤。
【請求項１０】
下記式で表されるフラボノール配糖体（但し、式中、-glc-rhaはルチノシル基、-rhaは、ラムノシル基を示す）。
【化１】
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【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロストリジウム属細菌毒素中和剤及びその製造方法に関し、特に、風味に影響を与えることなく食品に添加でき、クロストリジウム属細菌毒素を中和し中毒を抑制するクロストリジウム属細菌毒素中和剤及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロストリジウム属ボツリヌス菌は、日本において過去に飯寿司（いずし）や辛子蓮根などから発生した集団食中毒、米国や欧州では生ハム、瓶詰め食品から発生した食中毒の原因菌として知られている。この食中毒はボツリヌス菌の感染症ではなく、菌が食品の中で産生した毒素を経口摂取することによる中毒症である。ボツリヌス菌によって産生されるボツリヌス神経毒素は、その高い致死率から、哺乳類に対して最も強力な神経毒素として知られている。この毒素は、血清学的に分類できる７種類（ＢｏＮＴ／Ａ〜Ｇ）に分けられ、毒素の作用発現過程は、次の３段階に分けられる。
【０００３】
１）毒素タンパクの前シナプス神経終末細胞表面への結合
２）細胞内への移行
３）タンパク分解ドメインであるエンドペプチダーゼによる標的タンパクの分解
ボツリヌス中毒は、抗血清を投与する抗血清療法によって治療することができる。しかし、中毒に罹患する前に予防する方が望ましく、現在の中毒防止対策は、食品の加熱殺菌による細菌の発育・増殖の阻止である。
【０００４】
ところが、ボツリヌス中毒の発生が確認されている食品には、ハム類、真空パック食品、瓶詰め食品などの加工食品や飯寿司、鮒寿司などの「なれずし」等があり、このような食品においては、加熱殺菌によって十分な殺菌を確保するのは難しい場合もあるのが明らかであるため、神経毒素に対する中和物質の探索がなされている。
【０００５】
このような状況において、紅茶の抽出液中にボツリヌス神経毒素中和物質が含まれることが明らかになり、紅茶抽出液から粗分画によって分けられるテアルビジン分画に存在することが判明している（非特許文献１、２参照）。
【非特許文献１】Satoh E, Ishii T, Shimizu Y, Sawamura S and Nishimura M, "Black tea extract, thearubigin fraction, counteract the effects of botulinum neurotoxins in mice", Br J Pharmacol 132, 797-798(2001)
【非特許文献２】Satoh E, Ishii T, Shimizu Y, Sawamura S and Nishimura M, "The mechanism underlying the protective effect of the thearubigin fraction of black tea (Camellia sinensis) extract against the neuromuscular blocking action of botulinum neurotoxins", Pharmacol Toxicol 90, 199-202(2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
紅茶テアルビジンは、紅茶抽出液の褐色酸性色素画分の総称であり、毒素中和物質以外のものも多く含むが、食品に添加してボツリヌス神経毒素を中和するという点では有効である。
【０００７】
ところが、紅茶テアルビジン分画を生ハムなどに添加した場合、タンニンによるタンパクの収斂作用を生じ、官能試験において「まずい」、「渋い」、「苦い」といった呈味が示される。従って、紅茶テアルビジン分画中の毒素中和物質を特定し、食品の風味を損なわないように紅茶テアルビジン分画を精製する必要がある。
【０００８】
本発明は、食品に添加しても風味を損なわないクロストリジウム属細菌毒素中和剤及びその調製方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明の一態様によれば、クロストリジウム属細菌毒素中和剤は、フラボノール配糖体（Ａ）及びフラボノール配糖体（Ｂ）のうちの少なくとも１つを含有し、前記フラボノール配糖体（Ａ）は、フラボン骨格の５位及び７位に水酸基を有し、３'位、４'位及び５'位の少なくとも１つに水酸基を有し、３位の水酸基でルチノース骨格を有する糖鎖と配糖体を形成するフラボノール配糖体であり、前記フラボノール配糖体（Ｂ）は、フラボン骨格の５位及び７位に水酸基を有し、４'位の水酸基でラムノース骨格を有する糖鎖と配糖体を形成し、３位の水酸基でルチノース骨格を有する糖鎖と配糖体を形成するフラボノール配糖体であることを要旨とする。
【００１０】
上記フラボノール配糖体（Ａ）は、ルチン、ニコチフロリン及びケンフェトリンからなる群より選択される少なくとも１成分であることを要旨とする。
【００１１】
上記クロストリジウム属細菌毒素中和剤は、食品に添加することにより、クロストリジウム属細菌の毒素による中毒を予防する。
【００１２】
また、本発明の一態様によれば、クロストリジウム属細菌毒素中和剤の製造方法は、紅茶抽出物のテアルビジン分画を、メタノール／水溶媒を用いて逆相液体クロマトグラフィーにより溶出分離してメタノール４０％及び／又はメタノール６０％のメタノール／水溶媒による溶出部を分取する工程を有することを要旨とする。
【００１３】
本発明の他の態様によれば、クロストリジウム属細菌毒素中和剤の製造方法は、紅茶抽出物のテアルビジン分画をメタノール／水溶媒を用いて逆相液体クロマトグラフィーにより溶出分離して該テアルビジン分画を精製する工程を有することを要旨とする。
【００１４】
又、本発明の一態様によれば、下記式で表されるフラボノール配糖体（但し、式中、-glc-rhaはルチノシル基、-rhaは、ラムノシル基を示す）が提供され、クロストリジウム属細菌毒素中和剤の有効成分として使用される。
【化１】
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【発明の効果】
【００１５】
以上説明したように、本発明によれば、食品に添加しても風味を損なう苦みなどの呈味を示さず、好適にボツリヌス細菌毒等を中和することができるクロストリジウム属細菌毒中和剤が提供されるので、食品の安全性の向上に大きく貢献するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
紅茶テアルビジン分画は、紅茶葉の水又は熱水による抽出物からのアルコール抽出物であり、褐色酸性色素画分の総称である。分取を具体的に記載すると、紅茶葉の熱水抽出液から、カフェイン分画（クロロホルム抽出物）、カテキン及びテアフラビン分画（酢酸エチル抽出物）を抽出除去した後に、ｎ−ブタノールによって抽出した抽出物で、紅茶タンニンに属する。紅茶抽出物に含まれる主なフラボノイドは酢酸エチル抽出物に、アルカロイドの多くはクロロホルム抽出物に含まれ、アミノ酸は水相に含まれる。テアルビジン分画による細菌毒素中和作用は、神経毒素の細胞表面への結合阻害である。
【００１７】
細菌毒素の中和物質を同定するために、本願発明者らは、テアルビジン分画の精製を検討したところ、逆相ＨＰＬＣカラムを用いて、メタノール−水系溶媒（メタノール０％、２０％、４０％、６０％、８０％及び１００％）でテアルビジン分画を溶出分離することによって、さらに毒素中和活性の高い部分に精製できることを確認している。また、分離した溶出部から１５種の成分について単離でき、これらの成分のボツリヌス菌毒素中和活性の測定結果によると、メタノール６０％溶出部から得られる５成分のうちの溶出順が１番目、２番目、３番目及び４番面の成分に高い活性が見られる。この４つの成分は、ＮＭＲスペクトルから各々の分子構造が判明し、１番目の成分はクエルセチン（quercetin）配糖体の１つであるルチン（rutin: quercetin-3-O-glc-(6-1)-rha、下記式（１）の化合物）、２番目の成分は、ケンペロール−３−（ルチノシド）−４’−ラムノシド（下記式（２）の化合物）、３番目の成分はケンフェトリン（kaempfetrin: kaempferol-3-O-glc-(6-1)-rha-(3-1)-glc、下記式（３）の化合物）、４番目の成分はニコチフロリン（nicotiflorin: kaempferol-3-O-glc-(6-1)-rha、下記式（４）の化合物）であり、２番目、３番目及び４番目の成分はケンペロール配糖体である。これら４成分は、タンニンのような苦みや風味を損なうような呈味は示さず、また、これらが含まれるメタノール６０％溶出部についても風味を損なうような呈味は示さないので、このようにテアルビジン分画の精製によって得られる精製物は、食品の風味を損なうことなく細菌毒素中和作用を食品に付与することができる。また、これら４成分と比べて細菌毒素中和作用がさほど高くない成分も存在し、これらはいずれもフラボノール配糖体であり、フラボン骨格の５位及び７位に水酸基を有し、３'位、４'位及び５'位の少なくとも１つに水酸基を有し、３位の水酸基において、ルチノース（つまり、グルコース−ラムノース）骨格を有する糖鎖と配糖体を形成している。これらには、例えばミリセチン配糖体等が含まれていると考えられるが、単離による確定はなされていない。
【化２】
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【００１８】
細菌毒素中和活性の試験では、メタノール４０％溶出部も活性を示し、これも風味を損なうような呈味は示さないので、この分画も細菌毒素中和剤として食品に用いることができる。メタノール４０％溶出部及び６０％溶出部を併せて分取したものは細菌毒素中和剤として十分な活性を有し、食品添加物としても風味を損なわない。故に、製造効率の観点からは、メタノール４０％溶出部及び６０％溶出部を合わせて分取することは好ましい。従って、求められる活性に応じて分取する部分を調整し、より高い活性の細菌毒素中和剤を製造する場合は、メタノール６０％溶出部のみを分取し、更に高い活性が必要な場合には、上記４成分（１）〜（４）を分取すればよい。
【００１９】
より効率よく細菌毒素中和剤を製造するために、紅茶葉からの抽出を、水又は熱水に代えて、８０％アセトン水溶液によって行うことが有効である。アセトン水溶液による抽出では、水による抽出に比べて、より多くの成分を紅茶から抽出でき、得られる紅茶抽出物の水分散液からクロロホルム及び酢酸エチルによる分配抽出を経てｎ−ブタノール抽出により得られるテアルビジン分画も、水抽出物の場合と同じように、メタノール−水系溶媒で逆相ＨＰＬＣカラムより良好に分離される。濃度が異なるアセトン水溶液は、８０％アセトン水溶液に比べて紅茶から抽出できる成分量が低下するが、水での抽出よりは多く抽出できる。更に、テアルビジン分画の調製において、クロロホルム抽出の前にｎ−ヘキサン抽出を行うことにより、抽出物からテアルビジン分画を分取する精度が向上する。
【００２０】
紅茶抽出物のテアルビジン分画は、ボツリヌス菌と同じクロストリジウム属に属する破傷風菌の神経毒素に対しても抗毒素活性を有し、上記４成分（クエルセチン配糖体及びケンペロール配糖体）も、クロストリジウム属細菌類に共通する神経毒素の中和剤として有効である。
【００２１】
近年、ボツリヌス神経毒素は、眼瞼痙攣や顔面痙攣などの各種痙攣性麻痺症に対する外科的治療の代替療法として用いられている。従って、本発明の細菌毒素中和剤は、上記痙攣性麻痺症の治療薬における毒力の制御用剤としても利用することができる。この場合、テアルビジン分画から上記４成分にまで分離精製したものが最適であり、毒素中和活性の制御には、生体に影響を与えない希釈剤を用いればよい。
【実施例】
【００２２】
紅茶５００ｇに、８０％アセトン水溶液３Ｌを加えて室温下で１２時間行う抽出を２回行った。固液分離により得られた２つの抽出液を一緒にして減圧濃縮し、更に凍結乾燥して紅茶粗抽出物３３０ｇを得た。得られた粗抽出物を蒸留水１．５Ｌに懸濁し、ｎ−ヘキサン６Ｌ、クロロホルム６Ｌ、酢酸エチル６Ｌ及びｎ−ブタノール６Ｌを用いて順次分配抽出を行って、各有機溶媒相を回収して濃縮・凍結乾燥して、ｎ−ヘキサン可溶部１９．４ｇ、クロロホルム可溶部５０．６ｇ、酢酸エチル可溶部９５ｇ及びｎ−ブタノール可溶部（テアルビジン分画）６０．３ｇを得た。水可溶部は６４．５ｇであった。
【００２３】
各溶媒可溶部の細菌毒素中和活性を下記に示す測定方法に従って調べたところ、ｎ−ブタノール可能部に高い活性が認められた。
【００２４】
メタノール−水系の溶媒（メタノール０％、２０％、４０％、６０％、８０％及び１００％）を用いて、上記ｎ−ブタノール可能部を逆相系ＨＰＬＣカラム（Shiseido CapcellPak、内径５ｃｍ、長さ１０ｃｍ）を用いて溶出分離し、各溶出部に含まれる成分量は、水溶出部２．５ｇ、２０％メタノール溶出部１４．１ｇ、４０％溶出部２２ｇ、６０％溶出部４．１ｇ、８０％溶出部３．０ｇ及び１００メタノール％溶出部１．２ｇであった。各溶出部の毒素中和活性（グラフでは神経痙攣の発生率で表示）を調べたところ、図１のグラフのような結果が得られ、４０％メタノール溶出部（収量２２ｇ）及び６０％メタノール溶出部（収量４．１ｇ）に強い細菌毒素中和活性が見出された（グラフ中のＣＮＴはコントロールを示す）。これらの溶出部を各々３０％エタノール−０．１％酢酸を溶離液として逆相系ＨＰＬＣカラム（同上）で分離したところ、４０％メタノール溶出部からは９種類、６０％メタノール溶出部からは５種類の成分が単離され、６０％メタノール溶出部の１番目、２番目、３番目及び４番目に溶出する成分について、ＮＭＲ測定装置（α−４００、日本電子（株）社製）によりＮＭＲスペクトルを測定したところ、表１及び表２のようなデータを得た。これに基づいて構造決定を行って、１番面の成分は式（１）のルチン、２番目の成分は式（２）の化合物、３番目の成分は式（３）のケンフェトリン、４番目の成分は式（４）のニコチフロリンと同定された。これらの成分について、各々、毒素中和活性の測定を行った。その結果、図２に示すように、各成分に高い細菌毒素中和活性が認められた。図２は、６０％メタノール溶出部の１番目（60-1）、２番目（60-2）、３番目（60ー3）及び４番目（60-4）の各溶出成分についての神経筋収縮性、つまり、コントロールにおいて自律収縮が中毒によって５０％に減少した時点で維持されている自律収縮能力を示す。他の４０％メタノール溶出部中の成分については、収量不足などにより構造決定が困難であった。
【表１】
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【表２】
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【００２５】
上記１番目、２番目、３番目及び４番目の成分及びテアルビジン分画について、下記の官能試験を行ったところ、テアルビジン分画の場合は、全員（１３名）が「まずい」又は「苦い」のいずれかを感じたのに対し、１番目、２番目、３番目及び４番目の成分の場合は、「まずい」又は「苦い」と感じたのは３名であった。尚、コントロールでは、「旨味」が１２名、「塩味」が６名であった。
【００２６】
［細菌毒素中和活性の測定］
生後４周令のｄｄＹ系の両性マウスに飼料及び飲料水を自由に摂取させて群飼し、３〜８ヶ月令のマウスの横隔膜神経筋標本を、ラットにおけるBuelbringの方法に準じて作製した。摘出した筋は、筋繊維の方向に沿って約１ｃｍの幅で横隔膜神経の入力部を中央に残して切り出し、単収縮測定用の標本とした。
【００２７】
ボツリヌスＡ型神経毒素（１５μｇ／１５μＬ、和光純薬工業（株）製）とボツリヌス菌毒素中和活性測定用のサンプル溶液（サンプル濃度が１．５μｇ／２０μＬの生理食塩水溶液）とを混合し、Krebs-Ringer液中に添加した。コントロールとしてはサンプル溶液に代えて生理食塩水を用いた。尚、添加後の毒素濃度は１．５ｎＭとなるようにした。この液中に、マウスから摘出した単収縮測定用の標本を投入して、標本の運動神経終末部に反復してガラス製微小電極を刺入し、横隔膜神経幹の電気刺激に対する終末電位の発現を指標として、中和活性を図１のように評価した。図２における神経筋収縮性は、上記標本を各サンプル溶液に同時に加え、中毒によって次第に減少する神経筋収縮を測定し、コントロールの収縮が添加前の５０％に減少した時点での各サンプル溶液における神経筋収縮の値を評価した。
【００２８】
［官能試験］
ボツリヌス菌毒素中和活性測定用のサンプルを４０ｇ／Ｌの割合で含む滅菌生理食塩水溶液を作製した。この際、溶解を促進するために超音波処理を２０分間施した。この溶液中に生ハムを５００ｇ／Ｌの割合で入れ、１週間冷蔵庫（４℃）内で浸漬した後に水切りして、官能試験用試料とした。コントロール試料として、紅茶抽出物を含まない滅菌生理食塩水溶液に浸漬したハムを用意した。
【００２９】
被験者として１３名を設定し、予備試験として各被験者にサッカロース、食塩、クエン酸、キニーネを用いて味覚感度試験を実施した後、被験者の目をアイマスクで覆って試料を口に入れ、１分間咀嚼した後に感じた味覚を調べた。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】メタノール−水を用いた紅茶テアルビジン分画のＨＰＬＣ溶出分離による各溶出部における神経痙攣発生率を示すグラフである。
【図２】６０％メタノール溶出部から得られる各溶出成分の神経筋収縮性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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