(57)【要約】【課題】微生物由来の新規なラッカーゼ作用を有する酵素、その製造方法等を提供する。【解決手段】微生物由来ラッカーゼ（ポリフェノールオキシダーゼ）であって、次の性質；（１）基質特異性：２，２’−アジノービス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、グアヤコール、４−ヒドロキシインドール、２，６−ジメトキシフェノール、カテコール、ピロガロール、シリングアルダジンを基質とした酸化反応を触媒する、（２）至適ｐＨ；６．５−７．５、（３）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が７０，０００−８０，０００ダルトン、を有する酵素、その製造方法、該酵素を産生する微生物、及びフェノール性化合物、芳香族アミン化合物の分解方法。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物由来のラッカーゼ（ポリフェノールオキシダーゼ）作用を有する酵素であって、次の性質；（１）基質特異性：２，２’−アジノービス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、グアヤコール、４−ヒドロキシインドール、２，６−ジメトキシフェノール、カテコール、ピロガロール、シリングアルダジンを基質とした酸化反応を触媒する、（２）至適ｐＨ；６．５−７．５、（３）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が７０，０００−８０，０００ダルトン、を有することを特徴とする酵素。
【請求項２】
次の性質；（１）至適温度：４０−４５℃、（２）等電点：３．５−４．０、を有する、請求項１記載の酵素。
【請求項３】
カエトロマイアセエ（Ｃｈａｅｔｒｏｍｉａｃｅａｅ）科に系統上含まれる不完全菌類に属する微生物が産生する酵素である、請求項１記載の酵素。
【請求項４】
微生物が、カエトロマイアセエ（Ｃｈａｅｔｒｏｍｉａｃｅａｅ）科に系統上含まれる不完全菌類Ｉ−４株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７４３）である、請求項３記載の酵素。
【請求項５】
カエトロマイアセエ（Ｃｈａｅｔｒｏｍｉａｃｅａｅ）科に系統上含まれる不完全菌類に属し、請求項１記載のラッカーゼ産生能を有する微生物を培養し、該酵素を産生せしめ、これを採取することを特徴とするラッカーゼの製造方法。
【請求項６】
微生物が、カエトロマイアセエ（Ｃｈａｅｔｒｏｍｉａｃｅａｅ）科に系統上含まれる不完全菌類Ｉ−４株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７４３）である、請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
請求項１に記載のラッカーゼを産生するカエトロマイアセエ（Ｃｈａｅｔｒｏｍｉａｃｅａｅ）科に系統上含まれる不完全菌類Ｉ−４株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７４３）。
【請求項８】
請求項１に記載のラッカーゼを用いた、フェノール性化合物、及び／又は芳香族アミン化合物を基質とする酵素反応法により、これらの化合物を分解する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物由来の新規なラッカーゼ作用を有する酵素（ラッカーゼと記載する）及びカエトロマイアセエ（Ｃｈａｅｔｒｏｍｉａｃｅａｅ）科に系統上属する微生物から新規なラッカーゼを製造する方法に関するものであり、更に詳しくは、新規なラッカーゼを産生するＣｈａｅｔｒｏｍｉａｃｅａｅ（科）に系統上属する微生物の産生する新規な酵素ラッカーゼ、その製造方法、及びその用途等に関するものである。
【０００２】
本発明では、このラッカーゼ、あるいはこのラッカーゼを産生するＣｈａｅｔｒｏｍｉａｃｅａｅ（科）に系統上属する微生物を用いることにより、種々のフェノール性化合物、芳香族アミン化合物を基質とした酵素反応を促進することが可能であり、この触媒能力は、種々の化学反応に応用可能である。それゆえに、本発明は、例えば、製紙・パルプ産業におけるリグニン分解、化学産業でのフェノール樹脂、人工漆塗料、接着剤などの製造や有機化合物の合成、染毛剤やパーマ液などの化粧品製造、廃水処理分野での環境ホルモンを含んだ汚染物質の分解など、多方面への幅広い応用が期待できるものとして有用である。
【０００３】
【従来の技術】
リグニン分解酵素の一つであるラッカーゼは、ポリフェノールオキシダーゼ又はウルシオールオキシダーゼとも呼ばれ、微生物、菌類、植物などに広く存在し、酸素の存在下で、フェノール性化合物、芳香族アミン化合物などの酸化反応を触媒することが知られている。ラッカーゼの産業応用の代表例としては、製紙産業におけるパルプのリグニン分解があげられる。木材腐朽菌のリグニン分解酵素系が、環境汚染物質の分解に有効であり、その中で、ラッカーゼが重要な役割を果たしていることが示唆され、廃水の無毒化などにラッカーゼが利用されている。先行技術文献としては、Ｎ．　Ｄｕｒａｎ，　Ｅ．　Ｅｓｐｏｓｉｔｏ，　Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ａｎｄ　ｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｋｅ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ｉｎ　ｗａｓｔｅ　ｗａｔｅｒ　ａｎｄ　ｓｏｉｌ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：　ａ　ｒｅｖｉｅｗ，　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｃａｔａｌｙｓｉｓ　Ｂ：　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　２８　（２０００）　８３−９９　があげられる。
【０００４】
最近は、難分解性で、少量で、生物の内分泌系を攪乱する作用を有する内分泌攪乱物質（環境ホルモン）による環境汚染が問題となっている。今日までに、環境中に放出されてきた化学物質の多くが、ホルモン様作用により動物の生理・生殖機能に影響を与えることが明らかになってきた。このような環境ホルモンであることが疑われているプラスチックや界面活性剤の原材料であるビスフェノールＡ、ノニルフェノールは、大量に消費・廃棄されているため、浸出水、下水、工業排水、河川水、湖沼水、池の水、水道水、地下水等の環境中に広く拡散して存在している。低濃度で広範囲に拡散した難分解性の環境ホルモンを、従来の物理・化学的処理で処理することは多大なエネルギーを費やすことになり、その効率はきわめて悪い。一方、酵素や微生物を用いた生物処理は、穏和な反応であるが、省エネルギー的な分解が可能である。そのために、当技術分野においては環境ホルモンの分解に適したラッカーゼの探索が強く要請されていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術の諸問題を確実に解決することが可能な新規なラッカーゼ生産菌の探索とその応用技術の開発を目標として鋭意研究を行った結果、愛知県の土壌より分離したＣｈａｅｔｒｏｍｉａｃｅａｅ（科）に系統上含まれる不完全菌類Ｉ−４株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７４３）の産生するラッカーゼが、環境ホルモンであることが疑われているプラスチックや界面活性剤の原材料であるビスフェノールＡ、４−オクチルフェノール、ノニルフェノール、２、４−ジクロロフェノール、４−ニトロトルエン、アジピン酸ジ−２−エチルヘキシルなどを、効率よく分解することを見出し、更に研究を重ねて、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、微生物由来の新規な酵素ラッカーゼ、その製造方法、該酵素を産生する微生物、及び該酵素による新規反応方法を提供することを目的とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）微生物由来のラッカーゼ（ポリフェノールオキシダーゼ）作用を有する酵素であって、次の性質；（ａ）基質特異性：２，２’−アジノービス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、グアヤコール、４−ヒドロキシインドール、２，６−ジメトキシフェノール、カテコール、ピロガロール、シリングアルダジンを基質とした酸化反応を触媒する、（ｂ）至適ｐＨ；６．５−７．５、（ｃ）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が７０，０００−８０，０００ダルトン、を有することを特徴とする酵素。
（２）次の性質；（ａ）至適温度：４０−４５℃、（ｂ）等電点：３．５−４．０、を有する、前記（１）記載の酵素。
（３）カエトロマイアセエ（Ｃｈａｅｔｒｏｍｉａｃｅａｅ）科に系統上含まれる不完全菌類に属する微生物が産生する酵素である、前記（１）記載の酵素。
（４）微生物が、カエトロマイアセエ（Ｃｈａｅｔｒｏｍｉａｃｅａｅ）科に系統上含まれる不完全菌類Ｉ−４株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７４３）である、前記（３）記載の酵素。
（５）カエトロマイアセエ（Ｃｈａｅｔｒｏｍｉａｃｅａｅ）科に系統上含まれる不完全菌類に属し、前記（１）記載のラッカーゼ産生能を有する微生物を培養し、該酵素を産生せしめ、これを採取することを特徴とするラッカーゼの製造方法。
（６）微生物が、カエトロマイアセエ（Ｃｈａｅｔｒｏｍｉａｃｅａｅ）科に系統上含まれる不完全菌類Ｉ−４株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７４３）である、前記（５）記載の製造方法。
（７）前記（１）に記載のラッカーゼを産生するカエトロマイアセエ（Ｃｈａｅｔｒｏｍｉａｃｅａｅ）科に系統上含まれる不完全菌類Ｉ−４株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７４３）。
（８）前記（１）に記載のラッカーゼを用いた、フェノール性化合物、及び／又は芳香族アミン化合物を基質とする酵素反応法により、これらの化合物を分解する方法。
【０００７】
【発明の実施の形態】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、微生物由来のラッカーゼ（ポリフェノールオキシダーゼ）作用を有する酵素であって、次の性質；（ａ）基質特異性：２，２’−アジノービス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、グアヤコール、４−ヒドロキシインドール、２，６−ジメトキシフェノール、カテコール、ピロガロール、シリングアルダジンを基質とした酸化反応を触媒する、（ｂ）至適ｐＨ；６．５−７．５、（ｃ）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が７０，０００−８０，０００ダルトン、を有することを特徴とするものであり、カエトロマイアセエ（Ｃｈａｅｔｒｏｍｉａｃｅａｅ）科に系統上含まれる不完全菌類に属する微生物が産生する酵素であることを特徴とするものである。
【０００８】
本発明に係るＩ−４株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７４３）を、ポテトデキストロース寒天、オートミール寒天及び麦芽寒天の各プレートに接種し、２５℃で４週間の培養を行い、コロニーの巨視的特徴の観察を肉眼及び実体顕微鏡にて行ったところ、以下のような特徴を示した。すなわち、すべての寒天プレート上において、菌糸は、フェルトから綿毛状となり、表面色調はｗｈｉｔｅ−ｏｒａｎｇｅ
ｇｒｅｙを呈した。また、裏面色調は培養初期から黒色味を帯び、培養１週間後には、すべてのプレートでｂｒｏｗｎｉｓｈ　ｇｒｅｙを示した。培養開始１週間後あたりから鎖状となった分生子を形成した。
【０００９】
上記微生物について、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの２８ＳｒＤＮＡ遺伝子の６５−６４５に相当する部分の塩基配列を決定し、上記形態観察の結果と併せて、帰属分類群の推定を行ったところ、本発明に係るＩ−４株は、Ｃｈａｅｔｒｏｍｉａｃｅａｅ科に系統上含まれる不完全菌類であることが推定された。
【００１０】
次に、本菌から、本発明のラッカーゼ作用を有する酵素を生産するための条件について説明する。低温保存されたポテトデキストロース寒天上のコロニーの一部を、誘導剤、硫酸銅、抗生物質を添加した液体培地で３０℃、１−２日間振とう培養する。この前培養液を、新鮮培地に１０％添加し、更に、７日間振とう培養する。ラッカーゼは、菌体外に分泌生産され、培養液中に蓄積される。従って、培養後、菌体等の不溶物を遠心分離、濾紙又は濾布などによる濾過等により除去し、本ラッカーゼを含む培養液（粗酵素液）を回収する。
【００１１】
本発明のラッカーゼを分離精製するには、得られた粗酵素液から、濃縮、硫安分画（塩析）、透析、各種クロマトグラフィー、ゲル濾過などの一般的に用いられる酵素の精製方法及び手段を用いて精製することにより、該ラッカーゼは精製され得る。本発明において、酵素の精製方法及び手段は、特に制限されない。
【００１２】
本発明では、ラッカーゼ、あるいはこのラッカーゼを産生するＣｈａｅｔｒｏｍｉａｃｅａｅ（科）に系統上属する微生物を用いることにより、種々のフェノール性化合物、芳香族アミン化合物を基質とした酵素反応を促進することが可能であり、この触媒能力は、種々の化学反応に応用可能である。該酵素は、例えば、製紙・パルプ産業におけるリグニン分解、化学産業でのフェノール樹脂、人工漆塗料、接着剤などの製造や有機化合物の合成、染毛剤やパーマ液などの化粧品製造、廃水処理分野での環境ホルモンを含んだ汚染物質の分解など、多方面への幅広い応用が期待できる。
【００１３】
本発明のラッカーゼを、環境ホルモンの分解に用いる場合は、該ラッカーゼを遊離あるいは固定化酵素の形態で汚染物質を含んだ廃水等の被処理物に、所定温度、及び時間で反応槽中で接触させることにより、あるいは環境ホルモン吸着性に優れた吸着剤を被処理物と接触させ、吸着濃縮した後に、遊離のラッカーゼと反応させ、無毒化することにより、実施することができる。環境ホルモンは、一般的にきわめて低濃度で存在するために、酵素反応には、反応速度を高めるために濃縮等により反応液中濃度を高めておく必要がある。尚、本発明に係るＩ−４株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、平成１４年２月２８日に、微生物の表示Ｉ−４、受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７４３として寄託されている。
【００１４】
【実施例】
次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１
本実施例では、Ｉ−４株を用いて、ラッカーゼ生産への培養液組成の影響を調べた。その結果、ラッカーゼ生産には、カフェイン酸、硫酸銅、及びクロラムフェニコールを添加したポテトデキストロース培地（ＰＤＢ）が適していた。ＬＢ培地（ＬＢ）、Ｍａｌｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ培地（ＭＥＡ）、Ｐｅｐｔｏｎｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｍｅｄｉｕｍ培地（ＰＹＧＭ）、Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　Ｓｕｃｒｏｓｅ培地（ＹＥＳ）などの他の液体培地では、ラッカーゼ生産性は低かった。これらの５種類の培地でのラッカーゼ生産の経時的変化を図１に示す。
【００１５】
次に、ラッカーゼ生産への誘導剤の影響を調べた。その結果、誘導剤であるカフェイン酸濃度は１ｍＭ前後が最適であり、その他には、グアヤコール（５ｍＭ）、キシリジン（０．０２ｍＭ）、ベラトリルアルコール（２０ｍＭ）がほぼ同様な誘導効果を有し、硫酸銅の濃度は３０−９０μＭが最適であった。これらの薬剤のラッカーゼ生産性への影響を表１に示す。
【００１６】
【表１】
2004041124.tif 000002
【００１７】
実施例２
本実施例では、ラッカーゼを精製し、精製ラッカーゼを調製した。Ｉ−４株を、カフェイン酸（１ｍＭ）、硫酸銅（３０μＭ）、クロラムフェニコール（０．０１％）を添加したポテトデキストロース培地で３０℃、７日間振とう培養した培養液　（約２．４Ｌ）を、濾紙で濾過し、回収した濾液を粗酵素液とした。粗酵素液に、硫酸アンモニウムを濃度８０％になるように添加し、１時間室温放置した。塩析効果によって生成した沈殿を遠心分離により回収し、２０ｍＭ１−メチルピペラジン（ｐＨ４．５）に溶解した。遠心操作により不溶物を除去した上清を２０ｍＭ１−メチルピペラジン（ｐＨ４．５）で平衡化した陰イオンクロマトグラフィーカラムに供試し、塩化ナトリウムの０−１Ｍ直線濃度勾配により吸着したラッカーゼを、カラムから溶出させた。その溶出パターンを図２に示す。
【００１８】
活性画分をまとめ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を透析外液として一晩透析を行い、精製ラッカーゼとした。必要に応じて、精製ラッカーゼは、限外ろ過膜で濃縮した。
【００１９】
ラッカーゼ活性は、酵素溶液０．１ｍと２０μＭシリングアルダジンを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２．９ｍｌからなる反応溶液を３０℃で１０分間反応させ、５３０ｎｍでの吸光度変化から酵素活性（Ｕ／ｍｌ）を算出した。１Ｕは、１分間当たり１μｍｏｌｅの生成物を生成する酵素量と定義した。上記の各精製工程における総タンパク量、総活性、比活性、精製度、及び収率を表２に示す。
【００２０】
【表２】
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【００２１】
実施例３
本実施例では、ラッカーゼの至適ｐＨ及び至適温度を調べた。至適ｐＨの測定には、５０ｍＭの酢酸、２−（Ｎ−モルホリノ）　エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、リン酸、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）のＮａ塩溶液を、至適温度は５０ｍＭリン酸Ｎａ塩溶液を反応液として用いた。その結果を図３に示す。ラッカーゼの至適ｐＨは７．０（図３−Ａ）、至適温度は４２℃となった（図３−Ｂ）。
【００２２】
実施例４
本実施例では、精製ラッカーゼの純度、分子量を調べた。精製ラッカーゼの純度検定、分子量推定はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１０％ゲル）（図４−Ａ）により、等電点は等電点電気泳動（ｐＨ３−７）（図４−Ｂ）により求めた。泳動後ゲルはクマシーブリリアントブルーＲ−２５０染色した。それらの結果を図４に示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量推定から、ラッカーゼは約７０，０００−８０，０００ダルトンのタンパク質であることが判った。等電点電気泳動の結果では、１本のメジャーバンド（ｐＩ＝３．５）と低いｐＩに向かって濃度が薄くなる近接した４本のマイナーバンドがみられた。
【００２３】
実施例５
本実施例では、まず、ラッカーゼの基質特異性を調べた。ラッカーゼ溶液０．１ｍｌと５ｍＭ基質を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２．９ｍｌからなる反応溶液を３０℃で１０分間反応させ、各吸収波長での吸光度変化から酵素活性（Ｕ／ｍｌ）を算出した。１Ｕは、１分間当たり１μｍｏｌｅの生成物を生成する酵素量と定義した。その結果を表３に示す。表３に示されるように、ラッカーゼは、ＡＢＴＳ、グアヤコール、４−ヒドロキシインドール、２、６−ジメトキシフェノール、カテコール、ピロガロール、シリングアルダジンに対する活性が高かった。
【００２４】
【表３】
2004041124.tif 000004
【００２５】
次に、ラッカーゼの環境ホルモン分解能を調べた。１ｍＭ１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、硫酸銅（０．２ｍＭ）存在下でラッカーゼ（１３．６Ｕ／ｍｌ）と内分泌攪乱物質（２ｍＭ）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）中で４０℃、１時間反応させた。反応後、酢酸エチルにて反応生成物を抽出し、薄層クロマトグラフィーにより反応の進行を調べた。その結果を表４に示す。表４に示されるように、環境ホルモンであることが疑われているプラスチックの原材料であるビスフェノールＡ、界面活性剤の原材料である４−オクチルフェノール及びノニルフェノール、プラスチックの可塑剤であるアジピン酸ジ−２−エチルヘキシル、製造過程中の物質である２、４−ジクロロフェノール、４−ニトロトルエン、などがラッカーゼによって効率よく分解されることが見出された。
【００２６】
【表４】
2004041124.tif 000005
【００２７】
【発明の効果】
本発明は、新規な酵素ラッカーゼ、その製造方法及び該酵素を産生する微生物に係るものであり、本発明により、以下のような効果が奏される。
（１）種々のフェノール性化合物、芳香族アミン化合物を基質とした酵素反応に利用可能であるばかりでなく、環境ホルモンであることが疑われている工業用原材料のビスフェノールＡ、４−オクチルフェノール、ノニルフェノール、アジピン酸ジ−２−エチルヘキシル、２、４−ジクロロフェノール、４−ニトロトルエンなどの分解に対しても、本発明は、有力な手段を提供するものである。
（２）環境ホルモンによって汚染されている水、土壌、大気、食品、あるいは生物などを、遊離あるいは固定化したラッカーゼ、あるいはラッカーゼ生産菌を用いて処理することによって、環境ホルモンの効率的酸化分解が可能であり、環境浄化に有用である。
（３）環境中に汚染が広がった内分泌攪乱物質、例えば、土壌汚染などを物理・化学的処理するのは経済的にコスト高となるが、本発明のラッカーゼ、ラッカーゼ生産菌による生物的処理は、広範囲汚染に対して、従来の物理・化学的処理よりも安価で、高効率な処理が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｉ−４株のラッカーゼ生産への培養液組成の影響を示す。
【図２】Ｉ−４株のラッカーゼの陰イオン交換カラムによる精製パターンを示す。
【図３】ｐＨ５．５〜８．５の範囲で本ラッカーゼ活性を測定した場合の相対活性（Ａ）、２５〜５０℃の範囲で本ラッカーゼ活性を測定した場合の相対活性（Ｂ）を示す。
【図４】本ラッカーゼのポリアクリルアミドゲル電気泳動による泳動パターン（Ａ）、本ラッカーゼの等電点電気泳動（ｐＨ３−７）による泳動パターン（Ｂ）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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