(57)【要約】【課題】関節炎の新規マーカーを利用した、変形性関節炎やリウマチ等の関節炎の診断を行うことのできる関節炎診断剤および関節炎診断キットを提供すること。【解決手段】テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを認識する抗体を含有することを特徴とする関節炎診断剤およびテネイシンＣのフィブロネクチンＩＩＩ様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識するする第一の抗体を含む第一の試薬と、テネイシンＣのフィブロネクチンＩＩＩ様ドメインの選択的スプライシング部位よりＮアミノ末端側を認識する第二の抗体を含む第二の試薬とを含有することを特徴とする関節炎診断キット。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを認識する抗体を含有することを特徴とする関節炎診断剤。
【請求項２】
テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを認識する抗体が、次の抗体（ａ）または（ｂ）である請求項第１項記載の関節炎診断剤。
（ａ）テネイシンＣのフィブロネクチンＩＩＩ様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識する抗体
（ｂ）テネイシンＣのフィブロネクチンＩＩＩ様ドメインの選択的スプライシング部位よりＮアミノ末端側を認識する抗体
【請求項３】
抗体（ａ）が、テネイシンＣのフィブロネクチンＩＩＩ様ドメインの選択的スプライシング部位のＢＣＤドメインを認識する抗体である請求項２項記載の関節炎診断剤。
【請求項４】
抗体（ｂ）が、テネイシンＣの上皮成長因子様ドメインを認識する抗体である請求項２項記載の関節炎診断剤。
【請求項５】
テネイシンＣのフィブロネクチンＩＩＩ様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識するする第一の抗体を含む第一の試薬と、テネイシンＣのフィブロネクチンＩＩＩ様ドメインの選択的スプライシング部位よりＮアミノ末端側を認識する第二の抗体を含む第二の試薬とを含有することを特徴とする関節炎診断キット。
【請求項６】
第一の試薬が固相化された第一の抗体を含む試薬であり、第二の試薬が標識された第二の抗体を含む試薬である請求項第４項記載の関節炎診断キット。
【請求項７】
変形性関節炎と関節リウマチとを鑑別するものである請求項第５項または第６項項記載の関節炎診断キット。
【請求項８】
変形性関節炎の重篤度を判定するものである請求項第５項または第６項記載の関節炎診断キット。
【請求項９】
関節液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量を指標として変形関節炎と関節リウマチとを鑑別することを特徴とする関節炎診断方法。
【請求項１０】
関節液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量を指標として変形性関節炎の重篤度を判定することを特徴とする関節炎診断方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、関節炎の診断に利用することのできる関節炎診断剤および関節炎診断キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
関節炎は、一つまたは複数の関節の炎症であり、加齢と共に生じてくる可能性の高い疾患である。この関節炎には様々な種類があり、例えば変形性関節炎やリウマチ性関節炎等が知られている。変形性関節炎は老化による関節の変形であり、リウマチは関節の炎症を伴うことが知られている。しかしながら、これらは症状が似ているため、判別が難しいことが知られている。
【０００３】
従来、関節炎の診断にはリウマチ因子（抗ヒト免疫グロブリン抗体）の測定、抗核抗体の測定、関節液検査、関節Ｘ線検査等を行い、変形関節炎やリウマチ等の診断が行われている。また、赤沈（血沈）やＣ反応性タンパク質を測定することにより、関節リウマチの重篤度や症状の変化を知ることができる。しかしながら、上記検査では変形性関節炎については重篤度等の変化を知ることができない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明は、関節炎の新規マーカーを利用した、変形性関節炎やリウマチ等の関節炎の診断を行うことのできる関節炎診断剤および関節炎診断キットの提供を課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、関節炎と関連を有するマーカーについて、鋭意検索を行った結果、癌間質などの組織再構築部位に特異的に発現するテネイシンＣの高分子スプライシングバリアントと変形性関節炎と密接な関係があることを見出した。そしてこのテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量を、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを認識する抗体を利用した診断剤や診断キットで測定することにより、関節炎の診断等を行えることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち本発明は、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを認識する抗体を含有することを特徴とする関節炎診断剤を提供するものである。
【０００７】
また本発明は、テネイシンＣのフィブロネクチンＩＩＩ様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識するする第一の抗体を含む第一の試薬と、テネイシンＣのフィブロネクチンＩＩＩ様ドメインの選択的スプライシング部位よりＮアミノ末端側を認識する第二の抗体を含む第二の試薬とを含有することを特徴とする関節炎診断キットを提供するものである。
【０００８】
更に本発明は、関節液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量を指標として変形関節炎と関節リウマチとを鑑別することを特徴とする関節炎診断方法を提供するものである。
【０００９】
また更に本発明は、関節液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量を指標として変形性関節炎の重篤度を判定することを特徴とする関節炎診断方法を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の関節炎診断剤（以下、「本発明診断剤」という）は、関節炎の新規マーカーとしてテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを利用するものである。
【００１１】
このテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントは、テネイシンＣ（Ｔｅｎａｓｃｉｎ−Ｃ）中にあるフィブロネクチンＩＩＩ様ドメインがスプライシングされた結果生じるバリアントである。すなわち、テネイシンＣは、細胞外マトリックス糖タンパク質の１種であり、分子量約２５万以上のポリペプチドがＮ末端付近で３分子でコイル上に合わさり、更に、２つのジスルフィド結合によって６量体を形成している。各ポリペプチド鎖にはＮ末端側から、ＴＡドメイン、上皮増殖因子様ドメイン、フィブロネクチンＩＩＩ様ドメイン、フィブリノーゲン様ドメインが含まれている（Ｊｏｎｅｓ　Ｆ．Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，（２０００）Ｄｙｖ　Ｄｙｎ　２０８：２３５−２５９）。
【００１２】
このうち、フィブロネクチンＩＩＩ様ドメインは、基本的な８個の配列（１−８）が反復しており、その５番目と６番目との間に、９個のスプライシングされる反復配列（Ａ１−Ａ４、Ｂ、ＡＤ２、ＡＤ１、Ｃ、Ｄ）が選択的スプライシング部位として存在する。テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントは、この反復配列が７個（Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ｂ、Ｃ、Ｄ）挿入されるもの、７個がさまざまな組み合わせで挿入されるもの、または全く挿入されないものが大部分であろうとされている。このうち、癌などの病変組織では７個のドメインが入ったものが多く発現しており、後半の３つの反復（Ｂ、Ｃ、Ｄ）が癌間質に比較的特異的であると考えられる。他方、選択的スプライシング部位は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）で切断されやすい部位であることが知られており、この部位のエピトープを測定に使用することにより、分子構造の保たれたテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントのみを測定することができると考えられる。
【００１３】
本発明診断剤で用いる、上記した分子構造の保たれたテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを測定するための抗体は、上記のいずれかのテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントまたはこれから得られるペプチド断片等を抗原として使用し、抗体産生の常法に従って製造されるものであり、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを測定可能なものであれば特に制限されない。
【００１４】
上記抗体の製造において、抗原として用いられるテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントまたはこれから得られるペプチド断片等は、例えば、テネイシンＣを産生している組織もしくは培養細胞から抽出したもの、前記培養細胞の培養液中のテネイシンＣを濃縮・精製したもの、あるいはこれらのテネイシンＣをプロテアーゼ等の酵素もしくは化学的に断片化したものや、ヒトやマウスのテネイシンＣのアミノ酸配列や塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．：Ｘ５６１６０、Ｄ９０３４３）等から、認識させたい特定の部位をコードするｃＤＮＡに一致するポリヌクレオチドを作製し、これを常法によりベクターに組み込み、このベクターを用いて大腸菌等の宿主微生物、もしくは培養細胞を形質転換し、この大腸菌等の宿主微生物・培養細胞を培養して産生させたリコンビナントタンパク質や上記配列から特定の部位のアミノ酸配列に一致したポリペプチドを合成した後ニッケルカラム等で精製したもの等が挙げられる。
【００１５】
上記したテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントまたはこれから得られるペプチド断片等を抗原として常法により、ウサギ、マウス等の動物に免役することができる。このように免疫した動物から脾細胞を調製し、脾細胞とマウスミエローマ細胞とを融合し、限界希釈法により目的とするクローンをクローニングすることができる。この抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、例えばポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で行うことができる。
【００１６】
なお、上記の動物の免疫において、リコンビナントタンパク質を抗原として用いる場合には、エピトープのはっきりとしたモノクローナル抗体を作製することが可能である。また、動物に免疫を行う際に、内在性のテネイシンＣの影響を除くために、テネイシンＣ遺伝子欠損マウスを使用することが好ましい。そのような遺伝子欠損マウスを用いることにより、種交差性の高いモノクローナル抗体を得ることが期待できる。更に、この際に融合細胞の選択は公知のＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）選択法を用いて行うことが好ましく、ミエローマ細胞としては、融合した細胞を選択する方法が確立されている、ＨＧＰＲＴ（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎ−ｇｕａｎｉｎ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）欠損株を用いることが好ましい。このＨＧＰＲＴ欠損株のミエローマ細胞は、代謝系の欠損のためにアミノプテリン非存在下では生存できないが、融合したハイブリドーマ細胞では、脾細胞よりＨＧＰＲＴが供給されるために、ＨＡＴ培地中で生存することができ、その結果非融合細胞と容易に分離することができる。更に、限界希釈法によりＨＡＴ培地中で増殖するものの抗体を産生しないクローンを除くことにより、クローニングを確立することができる。
【００１７】
以上によって得られるハイブリドーマ細胞の産生する抗体が、前記のように作製されたテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントまたはこれから得られるペプチド断片等とウエスタンブロット法等を用いることにより、目的とする適当な部位を認識しているかどうかを確認することが可能である。もしくは、プロテアーゼを用い酵素的にテネイシンＣの断片を作製し、反応するポリペプチドのアミノ酸解析を行い、認識する部位を決定することなども行われる。
【００１８】
具体的に本発明診断剤で用いる、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを測定することのできる抗体の好ましい例としては、次のような抗体を挙げることができる。
（ａ）テネイシンＣのフィブロネクチンＩＩＩ様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識する抗体
（ｂ）テネイシンＣのフィブロネクチンＩＩＩ様ドメインの選択的スプライシング部位よりＮアミノ末端側を認識する抗体
【００１９】
具体的に抗体（ａ）として、テネイシンＣのフィブロネクチンＩＩＩ様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識する抗体を作製する場合には、例えば、前記選択的スプライシング部位内のいずれかのドメイン、好ましくは選択的スプライシング部位内のＢＣＤドメインをコードするｃＤＮＡのポリヌクレオチドをＰＣＲ法により作製し、これをｐＱＥベクター等のベクターに組み込む。次いでこのベクターを大腸菌等の宿主微生物に導入し、この宿主微生物をＬＢ培地で培養してリコンビナントタンパク質を産生させる。次いで、このリコンビナントタンパク質を上記した方法により動物に免役し、この動物から得られた脾細胞とマウスミエローマ細胞を融合させハイブリドーマ細胞を作製する。このハイブリドーマ細胞の産生する抗体の認識部位を、上記免疫に用いたリコンビナントタンパク質を用いてクローニングする。最後に、このハイブリドーマ細胞を常法により培養することによって抗体（ａ）が得られる。
【００２０】
また、具体的に抗体（ｂ）として、テネイシンＣのフィブロネクチンＩＩＩ様ドメインの選択的スプライシング部位よりＮアミノ末端側を認識する抗体を作製する場合には、例えば、ヒト神経膠芽細胞腫培養細胞Ｕ−２５１ＭＧの培養液からゲルろ過カラムとイオン交換カラムを用いて精製されたヒトテネイシンＣを抗原として上記した方法により動物に免役し、この動物から得られた脾細胞と、マウスミエローマ細胞を融合させハイブリドーマ細胞を作製する。次いで、このハイブリドーマ細胞のうち、テネイシンＣのフィブロネクチンＩＩＩ様ドメインの選択的スプライシング部位よりＮアミノ末端側、すなわち、ＴＡドメイン、上皮増殖因子様ドメイン等、好ましくは上皮増殖因子様ドメインを認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、例えば前記ドメインのリコンビナントタンパク質やその断片等を用いてクローニングする。最後に、このハイブリドーマ細胞を培養することによって抗体（ｂ）が得られる。
【００２１】
以上のようにして得られるテネイシンＣのフィブロネクチンＩＩＩ様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識する抗体（ａ）（クローン名：１９Ｃ４ＭＳ）とテネイシンＣの選択的スプライシング部位のＮ末端側を認識する抗体（クローン名：４Ｆ１０ＴＴ）を産生するハイブリドーマ細胞をそれぞれＦＥＲＭ　Ｐ−１９０６４およびＦＥＲＭ　Ｐ−１９０６３として、平成１４年１０月１０日付で独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６　日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託した。
【００２２】
具体的に寄託したハイブリドーマ細胞１９Ｃ４ＭＳは、テネイシンＣのフィブロネクチンＩＩＩ様ドメインの選択的スプライシング部位のＢＣＤドメインを認識する抗体を産生するものであり、ハイブリドーマ細胞４Ｆ１０ＴＴはテネイシンＣの上皮成長因子様ドメインを認識する抗体を産生するものである。
【００２３】
上記の様にして得られるハイブリドーマ細胞を公知の方法により培養して、精製することにより、本発明診断剤で用いられるモノクローナル抗体を得ることができる。ハイブリドーマ細胞の培養は、培地中で培養することにより行うことが好ましい。また、マウス腹腔内にハイブリドーマ細胞を注射し、腹水からモノクローナル抗体を採取することもできる。このようにして得られたモノクローナル抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過法、硫安塩析法等の常法により精製することができる。
【００２４】
また、これらの抗体は必要により標識することができる。この標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下「ＨＲＰ」と言う）、アルカリフォスファターゼ等の酵素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍光物質、３２Ｐ、１２５Ｉ等の放射性物質、化学発光物質などが挙げられる。
【００２５】
かくして得られる抗体（ａ）および抗体（ｂ）を含有する本発明診断剤は、下記の免疫学的測定方法に用いることができる。
【００２６】
具体的な免疫学的測定方法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｇｖａｌｌ，　Ｅ，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ，　７０，　４１９−４３９（１９８０））、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）等の、一般の免疫化学的測定法において使用されている種々の方法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプランニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５日）が挙げられる。そして、これらの方法は種々の観点から適宜選択することができるが、感度、簡便性等の点からはＥＬＩＳＡ法が好ましい。
【００２７】
より具体的な、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントの測定について、ＥＬＩＳＡ法の一つであるサンドイッチ法を例にとってその手順を説明すれば次の通りである。すなわち、まず、工程（Ａ）として、本発明の抗体（ａ）を担体に固相化し、次いで、工程（Ｂ）として、抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関係な、例えばタンパク質により、ブロッキングする。更に、工程（Ｃ）として、これに各種濃度のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを含む検体を加え、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアント−抗体複合体を生成させた後、工程（Ｄ）として、標識した抗体（ｂ）を加え、固相化抗原−抗体複合体と結合させ、最後に工程（Ｅ）として、標識量を測定することにより、予め作成した検量線から検体中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントの量を決定することができる。
【００２８】
まず、工程（Ａ）において、抗体を固相化するために用いられる担体としては、特別な制限はなく、免疫化学的測定法において常用されるものをいずれも使用することができる。例えば、ポリスチレン製の９６穴マイクロタイタープレートあるいは、アミノ基結合型のマイクロタイタープレートが挙げられる。また、抗体を固相化させるには、例えば、抗体を含む緩衝液を担体上に加え、インキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例えば１０ｍＭのＰＢＳを挙げることができる。緩衝液中の抗体の濃度は広い範囲から選択できるが、通常０．０１〜１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは０．１〜２０μｇ／ｍｌが適している。また、担体として９６ウェルのマイクロタイタープレートを使用する場合には、３００μｌ／ウェル以下で２０〜１５０μｌ／ウェル程度が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特に制限はないが、通常４℃程度で一晩のインキュベーションが適している。
【００２９】
また、工程（Ｂ）のブロッキングは、抗体を固相化した担体において、後に添加する検体中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントが抗原抗体反応とは無関係に吸着される部分が存在する場合があるので、それを防ぐ目的で行う。ブロッキング剤としては、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液を使用できる。あるいは、ブロックエース（Ｂｌｏｃｋ−Ａｃｅ：大日本製薬製（コードＮｏ．ＵＫ−２５Ｂ））等の市販のブロッキング剤を使用することもできる。具体的には、限定されるわけではないが、例えば抗原を固相化した部分に、ブロックエースを適量加え、約４℃で、一晩のインキュベーションをした後、緩衝液で洗浄することにより行われる。
【００３０】
次いで工程（Ｃ）において、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを含む検体を固相化抗体と接触させ、固相化抗体でテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを捕捉し、固相化抗体−テネイシンＣ高分子スプライシングバリアント複合体を生成させる。反応は限定されるわけではないが、３７℃程度で約１時間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応のタンパク質等を除去させることが好ましい。この反応に用いる緩衝液としては、１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．２）および０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０の組成のものが好ましい。
【００３１】
更に工程（Ｄ）において、固相化抗体に捕捉されたテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントの別のエピトープを認識する、標識抗体を加え、固相化抗体−テネイシンＣ高分子スプライシングバリアント−標識抗体複合体を形成させる。この反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応のタンパク質等を除去させることが好ましい。この反応に用いる緩衝液としては、前記したものが使用される。この工程（Ｄ）において使用される標識抗体の量は、担体に結合した固相化抗体に対して約５０００〜１００００倍、好ましくは最終吸光度が１．０〜１．５となるように希釈した標識抗体を反応させるのが望ましい。希釈には緩衝液を用いることができ、反応は限定されるわけではないが、約４℃で約３０分間行い、反応後、緩衝液で洗浄することが好ましい。以上の反応により、担体に抗体−テネイシンＣ高分子スプライシングバリアント−標識抗体複合体を結合することができる。
【００３２】
最後に工程（Ｅ）において、固相化抗体−テネイシンＣ高分子スプライシングバリアント−標識抗体複合体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を測定することによって検量線からテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントの量を算出することができる。
【００３３】
標識抗体の標識物として、酵素であるペルオキシダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素と３，３’，５，５’−テトラメチルベンジン（以下「ＴＭＢ」という）を含む発色基質溶液を使用することができる。発色反応は、限定されるわけではないが、発色基質溶液を加え約２５℃で約２０分間反応させた後、２Ｎの硫酸を加えて酵素反応を停止させことにより行うことができる。ＴＭＢを使用する場合、発色は４５０ｎｍの吸光度により測定する。一方、標識物として、酵素であるアルカリホスファターゼを使用する場合には、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法が適している。なお、既知の濃度のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを添加した反応液の吸光度により予め作成しておいた検量線を用いて、検体中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントの濃度を算出できる。
【００３４】
本発明診断剤を用いて上記のような測定を行うためには、テネイシンＣのフィブロネクチンＩＩＩ様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識する抗体（抗体（ａ））を含む第一の試薬と、テネイシンＣのフィブロネクチンＩＩＩ様ドメインの選択的スプライシング部位よりＮアミノ末端側を認識する抗体（抗体（ｂ））を含む第二の試薬とを含有させた関節炎診断キット（以下、「本発明キット」という）を利用すればよい。
【００３５】
より好ましい本発明キットの例としては、本発明の抗体（ａ）を担体上に固相化し、本発明の抗体（ｂ）を上記した標識物質で標識化したキットを利用することが好ましい。
【００３６】
上記のように作製された本発明キットは、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを定量できるものである。これを用いて関節液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを定量すれば、関節炎が変形性関節炎であるか、リウマチ性関節炎であるかの診断に使用することができる。
【００３７】
本発明キットを用いて関節炎の診断を行うには、まず、本発明キットにより、被験者から採取した関節腔液を試料として用い、この中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを定量する。そして、このテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量により、変形性関節炎と関節リウマチとを鑑別する。関節液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量の高低で関節リウマチと変形性関節炎が鑑別でき、また特に変形性関節炎については、関節液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量の測定で、レントゲン分類の重症度と相関が見られることにより判定することができる。
【００３８】
また、上記のようにして測定されたテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量により変形性関節炎の重篤度を判定することができる。具体的には、変形性関節炎の関節液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量の増量により、骨破壊の重症度が判定できる。
【００３９】
【実施例】
以下に実施例により本発明を説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
【００４０】
実　施　例　１
テネイシンＣのフィブロネクチンＩＩＩ様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識する抗体の作製：
（１）免疫原の調製
テネイシンＣのアミノ酸配列や塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．：Ｘ５６１６０）から、フィブロネクチンＩＩＩ様ドメインの選択的スプライシング部位のＢＣＤドメイン（以下、単に「ＢＣＤドメイン」という）をコードするｃＤＮＡであるポリヌクレオチド（配列番号１）を常法により作製し、これをｐＱＥ−３１ベクター（キアゲン製）に組換え、大腸菌のコンピテントセル（ＪＭ−１０９）に導入した。この大腸菌を培養し、イソプロピル−β−Ｄ（−）チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加した後一晩培養し、ｐＱＥ−３１ベクターに組込んだｃＤＮＡのリコンビナントタンパク質（配列番号２）を生成させた。大腸菌の細胞膜を破壊することによりリコンビナントタンパク質を抽出した後、Ｈｉｓ　ｔｒａｐカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）で精製した。
【００４１】
（２）モノクローナル抗体の作製
テネイシンＣの遺伝子欠失マウスは三重大学医学部付属動物実験施設で継体飼育されている、ＢＡＬＢ／Ｃに戻し交配されたものを用いた。上記（１）で作製したＢＣＤ部分のリコンビナントタンパク質の１００μｇとコンプリートアジュバントとを等量混合してエマルジョンを作製し、これをマウスに２週間の間隔で２回免疫した。更に、細胞融合３日前にマウスの尾静脈内に１００μｇのリコンビナントタンパク質を注射した。免疫したマウスから脾臓を摘出し、これから脾細胞懸濁液を調整し、脾細胞とマウスミエローマ細胞（Ｓｐ２／０）を５：１で混合し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液中で細胞融合を行い、ハイブリドーマ細胞を得た。
【００４２】
その後、ハイブリドーマ細胞を含むＰＥＧ溶液からＰＥＧを除去し、残ったハイブリドーマ細胞をＢｒｉｃｌｏｎｅ（Ｂｉｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ製）５％と２０％ＦＣＳを添加したＩＭＤＭに再浮遊し、９６穴マイクロプレートに１×１０５個／穴の濃度でまきこみ、ＣＯ２濃度７％、３７℃で培養を行った。４日後ＨＡＴ培地を添加し、７〜１０日後に精製ヒトテネイシンＣを抗原としてプレートに吸着させ、培養液を反応させ、さらに希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧを反応させることにより、抗体産生を確認した。クローンはＨＴ培地を用いてさらに選択培養し、限界希釈法によってクローニングを２回繰り返した。
【００４３】
（３）抗体の精製
ハイブリドーマ細胞を無血清培地のＧＩＴ培地（和光純薬）で細胞の８０％が死滅するまで抗体を産生させた。遠心（１，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）により細胞を取り除いた後、硫酸アンモニウム５０％飽和状態にして４℃で一晩静置し、沈殿を遠心（１，０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ）して回収した。この沈殿を２倍に希釈したｂｉｎｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＡＭＡＰＳ　ＩＩｋｉｔ製）に溶解させた後、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ａｍｅｒｓｈａｍ製）にＩｇＧを吸着させた。その後、ＰＢＳ透析を一晩行って抗体を精製した。
【００４４】
実　施　例　２
テネイシンＣの上皮成長因子様ドメインを認識する抗体の作製：
（１）免疫原の調製
精製ヒトテネイシンＣは、オークヒル（Ａｕｋｈｉｌ　Ｉ．ｅｔ　ａｌ．（１９９０）　Ｍａｔｒｉｘ　１０：９８−１１１）の方法に従い、ヒト神経膠細胞株Ｕ２５１の細胞株から５０％硫酸アンモニウム飽和による塩析とＳｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ５００カラム、モノＱカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ製）を用いて精製した。
【００４５】
（２）モノクローナル抗体の作製および精製
テネイシンＣの遺伝子欠失マウスは三重大学医学部付属動物実験施設で継体飼育されている、ＢＡＬＢ／Ｃに戻し交配されたものを用いた。上記（１）で精製した精製ヒトテネイシンＣをマウスに免疫し、実施例１と同様の方法で、ハイブリドーマ細胞を得た。実施例１と同様の方法で、クローンのスクリーニングを行い、陽性クローンを培養し、培養上清から得られる抗体を精製した。
【００４６】
実　施　例　３
ウエスタンブロット法による抗体の認識部位の解析：
実施例１および実施例２で作製した抗体の認識部位をウエスタンブロット法により解析した。
【００４７】
（１）テネイシンＣの上皮増殖因子様ドメインのリコンビナントタンパク質の作製
マウステネイシンＣ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．：Ｄ９０３４３）の上皮増殖因子様ドメインのｃＤＮＡ配列（配列番号３）から、上皮増殖因子様ドメインの両端にプライマーを設計し、マウステネイシンＣのｃＤＮＡからＰＣＲにより、遺伝子を増幅し、ｐＳｅｃベクターに同部の遺伝子を組み込んだ。これを用いて、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を形質転換し、テネイシンＣの上皮増殖因子ドメインのリコンビナントタンパク質（配列番号４）を発現させた。培養上清に分泌されたリコンビナントタンパク質をＨｉｓ　ｔｒａｐカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）で精製した。
【００４８】
（２）ウエスタンブロット法による抗体の認識部位の解析
ポリアクリルアミド　ゲル　エレクトロフォレイシス（Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）　ＭＵＬＴＩＧＥＬ２／１５（第一化学薬品製）上で、レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）の方法を用いて電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）を行った。電気泳動されたタンパク質は、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製）へ電気的に転写した。メンブレンは０．５％スキムミルク添加５０ｍＭ　トリス−緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）でブロッキングし、０．１％スキムミルク添加ＴＢＳで１，０００倍に希釈した実施例１および実施例２で作製したモノクローナル抗体と一晩反応させ、０．１％スキムミルク溶液で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ−ｃｈａｉｎ：Ｂｉｏｒａｄ製）で５００倍に希釈して２次抗体として反応させ、洗浄後ＤＡＢ／Ｈ２Ｏ２溶液で発色させた。
【００４９】
ウエスタンブロットの結果を図１に示す。実施例２で作製したモノクローナル抗体（クローン名：４Ｆ１０ＴＴ）は幅広いバンドを認識し、特に、選択的スプライシング部位の挿入がないテネイシンＣと考えられる２１０ｋＤａ付近（図１のＬ）および７つのフィブロネクチンＩＩＩ様の反復が挿入されたバリアントであると考えられる３００ｋＤａ付近（図１のＨ）に濃いバンドが見られた。この結果より、実施例２で作製したモノクローナル抗体は、ヒトテネイシンＣを認識するとともに、上皮増殖因子様ドメインと反応し、同ドメインを認識することを確認した。
【００５０】
一方、実施例１で作製したモノクローナル抗体（クローン名：１９Ｃ４ＭＳ）は３００ｋＤａ付近に濃いバンドがあるものの、２１０ｋＤａ付近のバンドは見られなかった。従って、このモノクローナル抗体は低分子のバリアントを認識せず高分子量のバンドのみを認識すると推測されたため、実施例１で作製したＢＣＤドメインのリコンビナントタンパク質を用いて同様にウエスタンブロットを行った。その結果を図２に示す。図２において、ＢＣＤドメインのリコンビナントタンパク質を示す３７ｋＤａ付近に濃いバンドが認められた。従って、実施例１で作製したモノクローナル抗体はＢＣＤドメイン、すなわち、テネイシンＣのフィブロネクチンＩＩＩ様ドメインの選択的スプライシング部位内において正常ではスプライシングされる反復を含む、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを認識することを確認した。
【００５１】
従って、実施例１で作製したモノクローナル抗体（１９Ｃ４ＭＳ）と実施例２で作製したモノクローナル抗体（４Ｆ１０ＴＴ）とを組合わせることにより、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを測定することができると判断された。
【００５２】
実　施　例　４
サンドイッチＥＬＩＳＡ系の構築：
サンドイッチＥＬＩＳＡ法の構築は以下のように作製した。実施例１で作製したテネイシンＣのフィブロネクチンＩＩＩ様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識するモノクローナル抗体（１９Ｃ４ＭＳ）の１０μｇ／ｍｌの濃度調整液を１０μｌずつ９６ｗｅｌｌＥＬＩＳＡ用プレートに加えた。４℃で一晩反応させた後、１０％ＢＳＡ／ＰＢＳ／ＮａＮ３溶液にてブロッキングを行い、この状態をサンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートとした。実施例２で作製したテネイシンＣの選択的スプライシング部位のＮ末端側を認識する第二のモノクローナル抗体（４Ｆ１０ＴＴ）とＨＲＰとの結合抗体を標識抗体とした。これらのサンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートと標識抗体の組合せでサンドイッチＥＬＩＳＡ系を作製した。標準テネイシンＣは実施例２（１）で作製した精製ヒトテネイシンＣを用い、既知のタンパク質量から得られる吸光度とタンパク質濃度の標準曲線をあらかじめ求め、実際のサンプル測定で得られる吸光度よりそのタンパク質量を測定した。
【００５３】
実　施　例　５
ＥＬＩＳＡ法による変形性関節炎患者および関節リウマチ患者の関節液中
のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量の測定：
テネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量の測定は以下のように行った。サンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートに被験者から採取した関節腔液サンプルを含む溶液を１００μｌ加え、３７℃で一時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで４回洗浄、標識抗体を１００μｌ加え、４℃で３０分反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで６回洗浄し、ＴＭＢ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ　ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）溶液を１００μｌ加え、室温、遮光下３０分放置した。１Ｎ硫酸で反応を止め、吸光度４５０ｎｍで測定した。測定した吸光度は前項に示したように標準タンパク質曲線よりテネイシンＣ濃度を求めた。上記の方法により、リウマチ患者関節腔液（１１例）、変形性関節症患者関節腔液（３９例）について測定したテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量を表１に示す。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
表１より、関節液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量は、変形関節炎（ＯＡ）と関節リウマチ（ＲＡ）ではＲＡに有意（ｐ＝０．０１）な上昇が見られた。また、特にＯＡでは関節の破壊の程度を示す関節レントゲン分類で、ＩＩＩ度とＩＶ度の症例比較で、有意にＩＶ度が高かった。この結果により、関節液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量の高低でＲＡとＯＡが鑑別でき、また特にＯＡについてはレントゲン分類の重症度と相関が見られ、関節液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量の測定により、骨破壊の程度が推測できる。
【００５６】
【発明の効果】
本発明によれば、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントが関節炎のマーカーとして利用できることが明らかとなった。また、特に、変形性関節炎の重篤度とテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量との関係も明らかとなった。
【００５７】
従って、関節液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを測定することにより、関節炎の鑑別や変形関節炎の重篤度の判定が可能となる。
【００５８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１および実施例２で作製したモノクローナル抗体のウエスタンブロットによる反応性を示す図面である（ＣＢＢはクマシーブリリアント青染色を示し、ｈＴＮＣは精製ヒトテネイシンＣを示し、ｒＥＧＦはマウスのＥＧＦリコンビナントタンパク質を示す）。
【図２】実施例１で作製したモノクローナル抗体のウエスタンブロットによるエピトープ解析を示す図面である（６ｘＨｉｓは６ｘＨｉｓｔｉｄｉｎ部位に対する抗体を示す）。
以　　上
【図１】
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【図２】
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