(57)【要約】【課題】タンパク質等の化学物質の二次元的な分離を，再現性が高く，迅速かつ簡便に，自動化や分離条件の変更も容易に行うこと。【解決手段】液体クロマトグラフィーによって分離された化学物質を，クロマトグラフィーのカラムに直列に接続された流路において，流れと垂直な方向に印加された電場により，流れと垂直な方向に分離することにより，流出時刻および位置の相違に基づいた二次元分離を行う。特に，電場を印加を微細な流路で行うことにより，タンパク質の分離に有効なｐＨ勾配の維持や電極間距離の低減による高速分離が期待できる。また，システム全体をマイクロチップ化することにより，接続部なスペースが少なく，液体クロマトグラフィーや電気的な分離の種々の手法が利用可能な汎用的な分離・分析装置が構築できる。【選択図】図２
2004157096.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体クロマトグラフィーによって分離され，クロマトグラフィーのカラムから溶出した化学物質を，クロマトグラフィーのカラムに直列に接続された流路において，流れと垂直な方向に印加された電場により，流れと垂直な方向に分離することにより，該流路からの流出時刻および位置の相違に基づいて該化学物質を分離・分析することを特徴とする物質の二次元分離機構及びその装置。
【請求項２】
請求項１において，電場を印加する流路中に，流れと垂直な方向にｐＨ勾配を形成させることにより，タンパク質等をその等電点の違いによって分離することを特徴とする二次元分離機構及びその装置。
【請求項３】
請求項１または請求項２のいずれか１項に記載の二次元分離機構及びその装置において，電場を印加する流路の幅と深さがマイクロメートルからミリメートルの大きさであり，流路内の流れが層流を保つことを特徴とする二次元分離機構及びその装置。
【請求項４】
請求項１，請求項２または請求項３のいずれか１項に記載の二次元分離機構及びその装置において，電場を印加する流路がマイクロチップに加工された流路である二次元分離機構及びその装置。
【請求項５】
請求項１，請求項２，請求項３または請求項４のいずれか１項に記載の二次元分離機構及びその装置において，クロマトグラフィーのカラムと電場を印加する流路が同一のマイクロチップ上に加工されている二次元分離機構及びその装置。
【請求項６】
請求項１，請求項２，請求項３，請求項４または請求項５のいずれか１項に記載の二次元分離機構及びその装置において，試料導入構造あるいは溶出液の組成を調整するための液体を混合するための構造が同一のマイクロチップ上に加工されている二次元分離機構及びその装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は，化学物質の二次元分離機構及びその装置に関する。
【従来の技術】
【０００２】
数千種類以上の性質の似通った化学物質の混合物を個別の物質に分離する場合，一回の電気泳動やクロマトグラフィーなどでは分離性能に限界があるため，しばしば，分離条件や分離原理の異なる二つの分離方法を組み合わせた二次元分離法が用いられる。
【０００３】
二次元分離法の中で良く知られているのは，タンパク質混合物の分離を目的とした方法で，ゲルプレートを用い，等電点電気泳動とＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を組み合わせた二次元電気泳動法である。この他にも，多段の液体クロマトグラフィーや，マイクロチップを利用したミセル導電クロマトグラフィーと電気泳動の組み合わせによる疑似二次元分離法なども知られている。
【０００４】
しかし，上記の方法は，装置が大掛かりになる，あるいは，煩雑な操作が必要で再現性が低い，あるいは，目的に応じた分離方法の変更が容易ではないなどの問題点がある。また，疑似的な二次元分離法は，性質の似通ったタンパク質の分離などには分離の解像度を十分に高くすることが難しいという問題点もある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は，従来の技術の有する上記のような種々の問題点に鑑みてなされたものであり，その目的とするところは，新規な原理を用いた化学物質の二次元分離機構及びその装置を提供することで，さらに，目的に応じた分離条件・分離原理の変更が比較的容易である，再現性が高く，迅速で，自動化も容易に行うことのできる，二次元分離機構及びその装置を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために，本発明では，液体クロマトグラフィーによる分離と，電場を利用した分離を直列に接続した二次元分離機構及びその装置を提案する。
【０００７】
図１には，本発明の原理を説明するための概念説明図が示されている。本発明のうち請求項１に記載の発明は，液体クロマトグラフィーにより分離され，液体クロマトグラフィーのカラムから溶出した物質を，クロマトグラフィーのカラムに直列に接続され，流れと垂直な方向に電場を印加した流路Ａに導入し，流れと垂直な方向に分離する，というものである。
【０００８】
したがって，本発明のうち請求項１に記載の発明によれば，導入された化学物質の混合物は，一次元目のクロマトグラフィーによって分離されることにより個々に異なる時間で溶出し，二次元目で電気によって分離されることにより流れと垂直な方向に異なる位置で流出する。このことにより，時間と位置による二次元な分離を行うことができる。
【０００９】
なお，分離された物質の検出あるいは回収の場所は，図１に示すように，流路Ａの出口もしくはその近傍にあり，流れと垂直な線上に選ぶことできる。分析の方法としては，光学的検出，電気化学的検出，マススペクトロメトリー等を用いることができる。
【００１０】
また，この方法においては，クロマトグラフィー及び電気による分離に関して，いくつかの異なる原理を自由に選択することができる。クロマトグラフィーの例としては，ゲル濾過クロマトグラフィー，イオン交換クロマトグラフィー，疎水クロマトグラフィー，アフィニティークロマトグラフィー，逆相クロマトグラフィー等を用いることができ，電気泳動の例としては，ゲル電気泳動，等電点電気泳動，ミセル導電クロマトグラフィー等を用いることができる。
【００１１】
また，本発明のうち請求項２に記載の発明は，流路Ａにおいて緩衝液等により流れと垂直な方向にｐＨの勾配を持たせたものである。
【００１２】
したがって，本発明のうち請求項２に記載の発明によれば，印加する電圧によって物質はその等電点に等しいｐＨの地点に移動するため，流路Ａにおいて等電点電気泳動を行うことが可能になる。この方法は，タンパク質の分離・分析おいて，特に有用である。
【００１３】
また，本発明のうち請求項３に記載の発明は，二次元目の電気による分離法をマイクロメートルからミリメートルのスケールで行うものである。
【００１４】
したがって，本発明のうち請求項３に記載の発明によれば，微少なスケールの効果により流路Ａにおける流れを安定的に層流に保つことができるため，二次元目に作成されたｐＨ勾配が安定に保持され，分離性能を向上させることができる。また，移動距離を短縮することができるため，僅かな電圧によっても迅速な分離が可能となる。
【００１５】
また，本発明のうち請求項４に記載の発明は，図１における流路Ａとして，マイクロチップ上に加工することによって作成したマイクロチャネルを用いる方法である。
【００１６】
したがって，本発明のうち請求項４に記載の発明によれば，流路Ａの幅，深さ，長さ，また印加電圧，滞留時間を正確にコントロールすることが可能となり，また，本発明のうち請求項３に記載の発明を容易に実現することが可能となる。
【００１７】
また，本発明のうち請求項５に記載の発明は，流路Ａと，クロマトグラフィーのカラムを同一のマイクロチップ上に加工する，というものである。
【００１８】
したがって，本発明のうち請求項５に記載の発明によれば，二次元分離機構のための装置を，正確に，かつ容易に作成することが可能となり，また，クロマトグラフィーと電気による分離法の間のデッドスペースを小さくすることが可能となるため，より性能の高い二次元分離を行うことが可能となる。
【００１９】
また，本発明のうち請求項６に記載の発明は，本発明のうち請求項５に記載の，クロマトグラフィーのカラムと流路Ａのみならず，試料導入構造あるいは溶出液の組成を調整するための液体を混合するための構造を同一のマイクロチップに加工する，というものである。
【００２０】
したがって，本発明のうち請求項６に記載の発明によれば，二次元分離に必要な装置を全て同一のマイクロチップに加工することで，操作の統合が可能となり，再現性の良い分離方法が可能となる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下，添付の図面に基づいて，本発明による化学物質の二次元分離機構の実施の形態を詳細に説明するものとする。
【００２２】
図２（ａ）（ｂ）には，本発明による二次元分離機構の実施の形態を備えたマイクロチップが示されており，図２（ａ）は図２（ｂ）におけるＡ矢視図であり，図２（ｂ）は図２（ａ）におけるＢ−Ｂ線による断面図である。
【００２３】
このマイクロチップ１０は，イオン交換クロマトグラフィーと等電点電気泳動による二次元分離を行うためのマイクロチップであり，例えば，ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）などの高分子（ポリマー）材料によって形成された，２枚の平板状の基板１１と１２により形成されている。
【００２４】
そして，基板１１の下面１１ａと基板１２の上面１２ａには，それぞれ深さの異なるマイクロチャネルが形成されており，その深さは例えば，それぞれ１０μｍ，１５０μｍ程度である。
【００２５】
ポート１３，１４は，それぞれ異なるイオン濃度をもつ緩衝液の入口であり，それぞれの流量を変化させ，マイクロミキサー１５を通過させることにより，クロマトグラフィーにおける溶離液のイオン濃度に勾配を持たせることが可能になる。
【００２６】
ポート１６はクロマトグラフィー担体とサンプルの入口であり，ここから導入された担体は，フリット構造１８において，その深さが担体の直径よりも小さいために堰き止められ，クロマトグラフィーのカラム１７に長さ数ｍｍ程度充填される。なお，クロマトグラフィー担体としては，例えばファルマシア社製ＳＯＵＲＣＥＴＭ３０Ｑアニオン交換ビーズなどを用いることができる。
【００２７】
ポート１９，２０，２１，２２はそれぞれ異なるｐＨをもつ緩衝液の入口であり，二次元目の等電点電気泳動のための流路２３内に，流れと垂直な方向にｐＨ勾配を持たせることができる。
【００２８】
なお，流路２３のサイズは，例えば幅１０００μｍ，深さ１５０μｍ，長さ１５ｍｍであり，この中での滞留時間を約４５秒程度にした場合，流れは乱れることなく安定に層流を保つため，ｐＨ勾配は乱れることなく維持される。
【００２９】
２４，２５は電極であり，例えば，幅０．５ｍｍ，長さ１．５ｍｍのＰｄ板などを用いることができる。
【００３０】
２６，２７のポートは，外部電源と電極を結ぶためのポートであり，導電性カーボンペーストなどを充填することができる。
【００３１】
２８は観察する位置を線状に示したものであり，この線上において，光学的検出などを行うことができる。
【００３２】
ポート２９は，マイクロチップに導入された緩衝液やサンプル溶液などの出口である。
【００３３】
以上の構成において，上記したマイクロチップ１０を用いた二次元分離機構について，タンパク質の分離を例に取って説明する。
【００３４】
まず，あらかじめタンパク質の吸着を防ぐために，酸素プラズマによる処理を施し，引き続いて，クロマトグラフィーのカラム１７に，クロマトグラフィーの担体を導入しておく。
【００３５】
次に，ポート１３，１４から，イオン濃度が異なり，ｐＨが同じ緩衝液をそれぞれ一定の流量になるように導入し，同時に，ポート１９，２０，２１，２２からｐＨが異なる液体をそれぞれ一定の流量になるように導入する。この時，電極２４を正極，電極２５を負極とする場合には，導入する緩衝液のｐＨは，低い順に，２０＜１９＜１３＝１４＜２１＜２２である。
【００３６】
次に，サンプル溶液をポート１６から導入し，タンパク質をクロマトグラフィーのカラム１７中の担体に吸着させる。なお，ポート１６は，サンプル導入時以外には，緩衝液が漏れ出ることを防ぐために閉鎖する。
【００３７】
ポート１３，１４から導入する緩衝液の流量の比率を，段階的に変化させることで，クロマトグラフィーのカラム１７における緩衝液のイオン濃度を変化させると共に，電極２４，２５の間に電圧を印加する。
【００３８】
検出ポイント２８付近を経時的に顕微鏡とＣＣＤカメラなどを用いて観察することで，一次元目をクロマトグラフィーでの溶出時間，二次元目を検出ポイント２８に沿った位置としたタンパク質の二次元分離を検出する。
【００３９】
実際に，上記の二次元分離機構において，蛍光標識されたタンパク質ＢＳＡとＩｇＧを，数分程度で，二次元的に分離することに成功している。
【００４０】
【発明の効果】
本発明は，以上説明したような機構に基づいているため，目的に応じた分離方法の選択が可能であるという優れた効果を奏する。
【００４１】
また，本発明は，以上説明したような機構に基づいているため，再現性の向上，分析時間の短縮，操作の簡便化などの優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の原理を説明するための概念説明図である。
【図２】本発明による二次元分離機構の実施の形態を備えたマイクロチップを示し，図２（ａ）は図２（ｂ）におけるＡ矢視図であり，図２（ｂ）は図２（ａ）におけるＢ−Ｂ線による断面図である。
【符号の説明】
１０                  マイクロチップ
１１                  基板
１１ａ                基板１１下面
１２                  基板
１２ａ                基板１２上面
１３                  ポート
１４                  ポート
１５                  ミキサー
１６                  ポート
１７                  カラム
１８                  フリット構造
１９                  ポート
２０                  ポート
２１                  ポート
２２                  ポート
２３                  流路
２４                  電極
２５                  電極
２６                  ポート
２７                  ポート
２８                  検出ポイント
２９                  ポート
【図１】
2004157096.tif 000003
【図２】
2004157096.tif 000004