(57)【要約】【課題】膜状有機物質が基板上にマトリクス状に配置された有機デバイス（バイオチップなど）中の有機膜組成を、飛行時間型二次イオン質量分析（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）法により、高い定量精度、また、再現性よく分析する方法の提供。【解決手段】被測定物と、その外部にある標準物質とについて、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置の測定条件を同一に設定して、それぞれ二次イオン質量スペクトルを測定し、前記標準物質において測定される二次イオン質量スペクトルに基づく、「質量数　対　二次イオン強度」の関係から検出器効率の補正を行う方法を採用すると、検出系の経時変化に伴う絶対的な感度変動の影響を排除でき、高い定量精度、と再現性を達成できる。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機デバイス上の有機物質からなる膜の組成を飛行時間型二次イオン質量分析法により分析する方法であって、
被測定物の有機物質からなる膜に関して、飛行時間型二次イオン質量分析法によりその組成を定量する際、
標準物質を、前記被測定物の外部に設け、
被測定物と、その外部にある標準物質とについて、飛行時間型二次イオン質量分析装置の測定条件を同一に設定して、それぞれ二次イオン質量スペクトルを測定し、
前記標準物質において測定される二次イオン質量スペクトルに基づく、「質量数　対　二次イオン強度」の関係から検出器効率の補正を行い、
その補正された検出器効率により、前記有機物質からなる膜の二次イオン質量スペクトルの各二次イオン強度測定値を規格化較正し、その規格化較正後の二次イオン強度により、前記有機物質からなる膜の組成を定量的に分析することを特徴とする有機膜の組成分析方法。
【請求項２】
被測定物の前記有機物質からなる膜は、該有機物質からなる単分子膜であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記有機デバイスは、前記有機物質からなる膜として、複数の生体関連物質が基板上にマトリクス状に配置されているバイオチップであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標準物質として、数平均分子量が１０００〜１００，００００の範囲にある高分子を選択することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記高分子は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリブテン、ポリアクリロニトリルからなる群より選択されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記検出器効率の補正工程は、
外部に設ける前記標準物質の二次イオン質量スペクトル中に出現する、二点若しくは三点以上の質量数に対応する二次イオンピーク強度を用いて、「質量数　対
二次イオン強度」の関係を示す検量線を作成し、
該検量線を用いて、該飛行時間型二次イオン質量分析装置の検出器による二次イオンの検出効率を補正する工程であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
有機デバイス上に存在している、前記有機物質かららなる膜は、
直径が１μｍ〜１ｍｍの範囲に選択される円状、若しくは、最も長い対角線の長さが１μｍ〜１ｍｍの範囲に選択される多角形状であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
被測定物と、その外部にある標準物質とについて測定を行う際、前記飛行時間型二次イオン質量分析装置の測定条件において、少なくとも、一次イオン電流または二次イオン引き出し電圧を同一条件に設定して、分析を行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、有機物質からなる膜が基板上にマトリクス状に配置されている、有機デバイス中の該有機膜の組成分析方法に関し、特には、飛行時間型二次イオン質量分析法（Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ　Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　Ｉｏｎ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、以下、ＴＯＦ−ＳＩＭＳと略す）を利用して、有機物質として、複数の生体関連物質が基板上にマトリクス状に配置されている、所謂、バイオチップ表面の各マトリクスの生体関連物質について組成分析を行う方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡチップ、プロテインチップ等、各種のプローブ分子を基板上にマトリクス状に配置したもの、所謂、バイオチップは、ゲノム解析、あるいは、遺伝子の発現解析などの目的に利用されるようななってきた。また、それらバイオチップを利用した解析の結果は、癌、遺伝病、生活習慣病、感染症等の診断、予後予想、治療方針の決定等に重要な指標を提供するものと期待されている。
【０００３】
バイオチップの作製方法には、幾つかの手法が知られている。ＤＮＡチップを例にとって説明すると、フォトリソグラフィーを用いて、直接基板上にＤＮＡプローブを逐次的に合成していく方法（米国特許第５４０５７８３公報等）、あるいは、予め合成したＤＮＡ、または、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）を、基板上に供給し結合する方法（米国特許第５６０１９８０公報、特開平１１‐１８７９００号公報、Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｖｏｌ．２７０，　４６７，　１９９５等）が代表的なＤＮＡチップの作製法である。
【０００４】
一般的には、前記二種の方法によってバイオチップは作製されるが、作製されたバイオチップを先に述べた用途に使用しようとする場合、解析の信頼性、すなわち、定量性、再現性を保証するためには、各マトリクスに存在するプローブ、すなわち、プローブに利用する生体関連物質の量、つまり、密度を知ることが重要である。また、実際にどのようなマトリクス形状（形状、サイズ、状態）で存在するかを知ること（イメージング）も、やはり、定量性、再現性の確保といった見地から重要である。しかし、バイオチップ上のプローブは、原理的には単分子膜レベルとされており、基本的に、マトリクス位置の顕影化を含めた生体関連物質の分析には、きわめて高感度な表面解析技術が必要となる。
【０００５】
前記の要件を満足する高感度な表面解析技術の一つとして、プローブ自体にアイソトープラベルを施す方法が知られてはいるが、ラベル化の手法が煩雑であり、利用されるアイソトープラベル自体、被爆源となる危険性を有し、そのため、特殊な施設、装置が必要等の理由で、汎用性の観点で難点を有している。
【０００６】
別の方法として、プローブを蛍光標識する方法、または、プローブと特異的に結合する物質に蛍光標識を施し、これとプローブを結合させる方法、すなわち、ＤＮＡチップにおいては、蛍光ハイブリダイゼーション法が考えられる。しかしながら、標識に利用する蛍光色素の安定性、蛍光クエンチング、あるいは、蛍光色素の基板表面への非特異的吸着、さらには、特異的結合（ハイブリダイゼーション）の定量性（安定性、再現性）等、高い定量性を達成する上では、種々の問題が存在しており、プローブ自体の存在量を定量的に把握するには、なお課題が残る。
【０００７】
その他、一般的な検出対象に利用可能な高感度表面分析手段として、ＦＴ−ＩＲ（フーリエ変換赤外分光）法を用いたＡＴＲ法、ＸＰＳ（Ｘ線光電子分光）法等があるが、いずれも、生体関連物質である、バイオチップのプローブの定量的分析、あるいは、イメージングには十分な感度を有しているとはいえない。特に、バイオチップの作製用基板として、一般的なガラスを用いる場合には、例えば、ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）法では、基板のガラス自体に起因する吸収の影響、また、ＸＰＳ法では、ガラス自体は絶縁性材料であるため、チャージアップの影響等があり、有効な分析手段とはいえない。
【０００８】
さらに高感度表面分析手段として、飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）が知られている。
これに対して、同じく二次イオン質量分析法の一手法として知られている、飛行時間型二次イオン質量分析（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）法は、固体試料の最表面にどのような原子または分子が存在するかを調べるための分析方法であり、下記する特長を持つ。ｐｐｍオーダー、すなわち、１０９ａｔｏｍｓ／ｃｍ２（最表面１原子層の１／１０５に相当する量）の極微量成分の検出能があること、有機物、無機物のどちらにも適用できること、表面に存在するすべて成分の平面分布を測定可能なことなどの利点を有している。
【０００９】
以下に、この飛行時間型二次イオン質量分析法の原理を簡単に説明する。
【００１０】
高真空中において、高速のイオンビーム（一次イオン）を固体試料表面に照射すると、スパッタリング現象によって表面の構成成分が真空中に放出される。この過程で発生する正または負の電荷を帯びたイオン（二次イオン）を、電場によって一方向に収束し、一定距離だけ離れた位置で検出する。スパッタの際には、試料表面の組成に応じて、様々な質量をもった二次イオンが発生するが、一定の電界中では、質量の軽いイオンほど早く、反対に重いイオンほど遅い速度で飛行する。そのため、二次イオンが発生してから、検出器に到達するまでの時間（飛行時間）を測定することで、発生した二次イオンの質量を分析することができる。
【００１１】
一方、従来のダイナミック二次イオン質量分析法（Ｄｙｎａｍｉｃ　ＳＩＭＳ）法では、イオン化の際、有機化合物は小さいフラグメントイオンまたは粒子にまで分解してしまうため、質量スペクトルから得られる化学構造情報、例えば、質量範囲は限定されるのに対し、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法では、一次イオン照射量が著しく少ないため、有機化合物は化学構造を保った状態でイオン化され、幅の広い質量範囲で測定される質量スペクトルから有機化合物の構造をより直接的に知ることができる。加えて、固体試料表面の最も外側で発生した二次イオンのみが、真空中へ放出されるので、試料の最表面　（深さ数Å程度）の情報を、選択的に得ることができる。また、イオンを検出する方法は、電子や光を検出する方法と比べて感度がよいため、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法では、表面に存在するｐｐｍオーダーの微量成分を検出することができる。さらに、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法では、一次イオンビームを走査することによって、試料表面のイオン像（マッピング）を測定することもできる。
【００１２】
ＴＯＦ−ＳＩＭＳを用いたＤＮＡの測定例の報告としては、Ｊ．Ｃ．Ｆｅｌｄｎｅｒらによる、ＰＮＡに対するＤＮＡのハイブリダイゼーションの評価（ＳＩＭＳ　ＸＩＩＩ国際会議予稿集、２００１年１１月１１日〜１６日、奈良）などがある。
【００１３】
さらには、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法を用いた定量分析の試みとしては、異なる濃度の標準溶液を清浄なシリコン基板上に塗布、乾燥後、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法で基板表面を測定し、二次イオンピーク強度から検量線を作成した上で、被分析試料の二次イオンピーク強度と比較する方法（Ｃ．Ｍ．　Ｊｏｈｎ　ｅｔ　ａｌ．，　ＳＩＭＳ　ＶＩＩＩ，　ｐ６５７，　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，　１９９２）や、シリコン基板上に微量金属元素をスピンコートした全反射蛍光Ｘ線分析用の標準試料を用いて、定量の基準とする方法（Ｐ．　Ｌａｚｚｅｒｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｕｒｆａｃｅ　ａｎｄ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ，　Ｖｏｌ．　２９，　７９８　（２０００））などが知られている。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来のＴＯＦ−ＳＩＭＳ法による定量分析には、以下のような改善の余地があった。
【００１５】
まず、一般的な問題点として、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置の一次イオン電流、二次イオン引き出し電圧などの測定条件を一定に設定した際、検出器の劣化やフライトチューブ内の二次イオンの透過率低下など、検出系の経時変化に起因する感度変動を補正することはできない。また、装置によっては、上記検出系の経時変化に伴う感度変動に関して、自動的に、または半自動的に補正する機能を具えた装置もあるものの、その補正は必ずしも完全なものではなく、高い信頼性には欠けている。従って、濃度が既知の標準試料を用いて、感度校正を行った上で、定量分析を行うのが一般的である。
【００１６】
しかしながら、標準試料を用いた感度校正を利用する、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法による定量分析にも、次のような問題点があった。
【００１７】
例えば、Ｊｏｈｎらが報告した、異なる濃度の標準溶液を清浄なシリコン基板上に塗布、乾燥後、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法で前記標準試料を測定し、二次イオンピーク強度から検量線を得た上で、被分析試料の二次イオンピーク強度と比較する方法では、定量精度を向上させるためには、該標準溶液を毎回調製する必要があり、作業上の煩雑さがあるという問題点があった。つまり、上記シリコン基板上の標準試料も、一度作製した後、時間とともにハイドロカーボン等（コンタミネーション）が堆積したり、標準物質自体が化学変化したりするため、同一の標準試料を継続して使用することは、高い信頼性を達成する際、問題を有している。また、Ｐ．　Ｌａｚｚｅｒｉらが報告した、シリコン基板上に微量金属元素をスピンコートした全反射蛍光Ｘ線分析用の標準試料を利用して、検量線の作成、感度校正に用いる方法においても、標準試料を長期間保存する間に、同様に表面汚染や酸化などを生じることがあり、高い信頼性を達成する際、問題を有している。さらには、通常、該全反射蛍光Ｘ線分析用の標準試料は導電性があり、導電性の標準試料に対するＴＯＦ−ＳＩＭＳ測定条件と、導電性に乏しい有機膜に対する測定条件とは、一般に異なる（例えば、帯電中和用の使用の有無など）。従って、この測定条件の差異に起因して、場合によっては、定量誤差が生じてしまうという問題点もあった。
【００１８】
本発明は、前記の課題を解決するもので、本発明の目的は、膜状の有機物質が基板上にマトリクス状に配置されている有機デバイス（バイオチップなど）中の該有機膜の組成を、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法により、高い定量精度、また、再現性よく分析する方法を提供することにある。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記の課題を解決すべく鋭意研究を進めたところ、検出系の経時変化に伴う感度変動を考慮に入れ、高い定量精度、また、再現性よくＴＯＦ−ＳＩＭＳ法による分析を行う上では、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置において、「質量数対　二次イオン強度」の関係で示される、検出器系の検出効率の二次イオン質量依存性を、その都度較正することが有効であることを見出した。その検出器効率の補正手段として、被測定物と、その外部にある標準物質とについて、飛行時間型二次イオン質量分析装置の測定条件を同一に設定して、それぞれ二次イオン質量スペクトルを測定し、前記標準物質において測定される二次イオン質量スペクトルに基づく、「質量数　対　二次イオン強度」の関係から検出器効率の補正を行う方法を採用すると、検出系の経時変化に伴う絶対的な感度変動の影響を排除でき、高い定量精度、と再現性を達成できることを確認し、これらの知見に基づき、本発明者らは、本発明を完成するに至った。
【００２０】
すなわち、本発明にかかる有機膜の組成分析方法は、
有機デバイス上の有機物質からなる膜の組成を飛行時間型二次イオン質量分析法により分析する方法であって、
被測定物の有機物質からなる膜に関して、飛行時間型二次イオン質量分析法によりその組成を定量する際、
標準物質を、前記被測定物の外部に設け、
被測定物と、その外部にある標準物質とについて、飛行時間型二次イオン質量分析装置の測定条件を同一に設定して、それぞれ二次イオン質量スペクトルを測定し、
前記標準物質において測定される二次イオン質量スペクトルに基づく、「質量数　対　二次イオン強度」の関係から検出器効率の補正を行い、
その補正された検出器効率により、前記有機物質からなる膜の二次イオン質量スペクトルの各二次イオン強度測定値を規格化較正し、その規格化較正後の二次イオン強度により、前記有機物質からなる膜の組成を定量的に分析することを特徴とする有機膜の組成分析方法である。
【００２１】
この本発明の方法は、被測定物の前記有機物質からなる膜は、該有機物質からなる単分子膜である際に好適に利用できる。さらに、前記有機デバイスは、例えば、前記有機物質からなる膜として、複数の生体関連物質が基板上にマトリクス状に配置されているバイオチップである場合、本発明の方法はより好ましいものとなる。
【００２２】
一方、本発明の方法においては、前記標準物質として、数平均分子量が１０００〜１００，００００の範囲にある高分子を選択することが好ましい。その際、前記高分子は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリブテン、ポリアクリロニトリルからなる群より選択することがより好ましい。
【００２３】
本発明の方法において、前記検出器効率の補正工程は、
外部に設ける前記標準物質の二次イオン質量スペクトル中に出現する、二点若しくは三点以上の質量数に対応する二次イオンピーク強度を用いて、「質量数　対
二次イオン強度」の関係を示す検量線を作成し、
該検量線を用いて、該飛行時間型二次イオン質量分析装置の検出器による二次イオンの検出効率を補正する工程であることがより好ましい。
【００２４】
本発明の方法を利用する際、有機デバイス上に存在している、前記有機物質かららなる膜は、
直径が１μｍ〜１ｍｍの範囲に選択される円状、若しくは、最も長い対角線の長さが１μｍ〜１ｍｍの範囲に選択される多角形状であることができる。
【００２５】
なお、被測定物と、その外部にある標準物質とについて測定を行う際、前記飛行時間型二次イオン質量分析装置の測定条件において、少なくとも、一次イオン電流または二次イオン引き出し電圧を同一条件に設定して、分析を行うことが好ましい。
【００２６】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明をより詳細に説明する。
【００２７】
従来の標準試料を用いた感度校正を利用する、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法による定量分析では、標準試料として、基材の表面に形成されている、面密度が一定の被膜層を利用しているが、本発明の方法では、組成に変動がない標準物質を検出器効率の補正に利用している。すなわち、本発明の方法は、有機膜の組成分析方法であり、使用するＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置に関して、同時に検出器効率の補正を行った上で、かかる被測定物の有機物質について、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法を利用して、発生する二次イオン種の質量数と、前記の効率補正により規格化、較正を施した、その二次イオン強度比に基づき、対象とする有機物質の組成を決定する方法である。
【００２８】
具体的には、膜状の有機物質が基板上にマトリクス状に配置された有機デバイスに関して、その有機膜をＴＯＦ−ＳＩＭＳにより分析する際、そのＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置の測定条件、少なくとも、発生する二次イオン量と、検出系に導かれる二次イオンの比率を制御する条件である、一次イオン電流、二次イオン引き出し電圧などの測定条件を同一に設定して、有機膜と、外部に設ける標準物質とに関して、それぞれ二次イオン質量スペクトルを測定する。この外部標準物質は、既知の組成を有する物質であり、発生する二次イオン種に関して、その質量数と二次イオン量は、同じ測定条件下では、変動しないものとなる。従って、この標準物質の二次イオン質量スペクトルに基づき、実際に検出器で検出される二次イオン強度を、その質量数に対して、プロットすると、「質量数　対　二次イオン強度」の関係として、その時点における使用した装置の検出器効率を示す検量線が得られる。
【００２９】
同時期に、同じ測定条件下で、同一のＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置において、測定された有機デバイス中の膜状の有機物質に対する二次イオン質量スペクトル上でも、前記外部標準物質により作成される、装置の検出器効率を示す検量線と同じ「質量数　対　二次イオン強度」関係が成り立つ。そのため、この「質量数　対　二次イオン強度」の関係から検出器効率の補正を行った上で、有機膜のＴＯＦ−ＳＩＭＳ測定結果に対して、特定の質量数に対応する二次イオンピーク強度の規格化、較正を施すことで、検出系の経時変化に伴う絶対的な感度変動の影響を排除でき、高い定量精度と再現性で、該有機膜の組成を分析することが可能となる。
【００３０】
特に、本発明の組成分析方法は、上記有機膜が、有機物質からなる単分子膜であり、その基板自体は、導電性を示さないガラス基板などを使用している有機デバイスへの応用に適している。例えば、基板上にマトリクス状に配置された有機デバイスが、複数の生体関連物質が基板上にマトリクス状に配置された、所謂、バイオチップである場合、組成分析に利用される二次イオンは、特定の質量数範囲に存在しており、それに適合する外部標準物質を容易に選択することができる。
【００３１】
なお、被測定物が、バイオチップのように、導電性を示さないものである際には、外部標準物質にも、導電性を示さない物質を選択することが望ましく、加えて、前記の特定の質量数範囲に、かかる標準物質に由来する特徴的な二次イオン種を発生するものが利用できる。その観点から、外部標準物質として、１０００から１００万の数平均分子量範囲にある高分子を好適に利用することができる。利用可能な高分子としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリブテン、ポリアクリロニトリルなどが挙げられる。これらのポリマーは、標準物質に由来する特徴的な二次イオン種として、その構成ユニット数の差異に起因する、所定の質量数差を示す、一連の分鎖状の二次イオン種を発生する。従って、前記の高分子を標準物質に採用することで、「質量数　対　二次イオン強度」の関係から検出器効率の補正を行う際、より確度の高い補正を行うことが可能となる。
【００３２】
すなわち、上記検出器効率の補正は、外部標準物質の二次イオン質量スペクトルにおける二点若しくは三点以上の質量数に対応する二次イオンピーク強度から検量線を求め、この検量線を用いた補正とすることが好ましいが、その際に、利用可能な、二点若しくは三点以上の質量数に対応する二次イオンピークを、前記の高分子を標準物質に採用すること簡便に得られる。
【００３３】
本発明の組成分析方法は、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法を利用するため、一次イオンビームをスキャンすることで、ある程度の面積内のイメージングを行うことも可能となる。その際、本発明の組成分析方法は、被測定物である有機膜の形状や大きさに関しては、直径が１μｍ〜１ｍｍの範囲にある円状、若しくは、最も長い対角線の長さが１μｍ〜１ｍｍの範囲にある多角形状である際にも、その領域全体の分析に、高い定量性で適用することが可能である。
【００３４】
なお、本発明の方法によって分析される生体関連物質は、特に限定されるものではなく、どのような物質であってもかまわないが、本発明者らの検討では、核酸、蛋白質であれば好適に分析し得る。核酸の例としては、オリゴデオキシヌクレオチド、ポリデオキシヌクレオチド、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）等のＤＮＡ、または、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等のＲＮＡ、または骨格がペプチドで構成されるＰＮＡ（ペプチド核酸）で代表される核酸アナログが挙げられる。蛋白質の例としては、オリゴペプチド、ポリペプチド、酵素、抗体等を例として挙げることができる。
【００３５】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。なお、これら実施例は本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるものの、本発明はかかる形態に限定されるものではない。
【００３６】
（実施例１）
核酸プローブアレイの作製
特開２００１−０６６３０５号公報に開示した方法で、ガラス基板を利用する核酸プローブアレイを作製した。
【００３７】
（１）基板洗浄
１インチ角のガラス板をラックに入れ、超音波洗浄用洗剤に一晩浸した。さらに、洗剤中で２０分間超音波洗浄を行い、その後、水洗により洗剤を除去した。加えて、蒸留水ですすいだ後、蒸留水の入った容器中でさらに超音波処理を２０分間行った。次に、予め８０℃に加温した１Ｎ水酸化ナトリウム溶液中にガラス板を１０分間浸した。引き続き水洗、蒸留水洗浄を行って、プローブアレイ用の洗浄済ガラス基板を用意した。
【００３８】
（２）表面処理
アミノ基を結合したシラン化合物（Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン）を含むシランカップリング剤（商品名：ＫＢＭ６０３；信越化学工業（株）社製）の１ｗｔ％水溶液を室温下で２時間攪拌し、上記シラン化合物の分子内のメトキシ基を加水分解した。次いで、この溶液に、（１）で得た洗浄済ガラス基板を室温（２５℃）で２０分間浸した後、引き上げて、窒素ガスをガラス基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に、このガラス基板を、１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークして、シランカップリング処理を完結させ、基板表面にアミノ基を導入した。
【００３９】
次いで、Ｎ−マレイミドカプロイロキシスクシンイミド（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ；Ｄｏｊｉｎ社製）（以降、ＥＭＣＳと略す）を２．７ｍｇ秤量し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／エタノールの１：１（容量比）混合溶媒に、最終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなる様に溶解して、ＥＭＣＳ溶液を用意した。前記のシランカップリング処理を行ったガラス基板を、ＥＭＣＳ溶液に室温で２時間浸して、シランカップリング処理によってガラス基板表面に担持されているアミノ基と、ＥＭＣＳ溶液のカルボキシ基を反応させた。この反応により、ガラス基板表面には、ＥＭＣＳ由来のマレイミド基が表面に存在することになる。ＥＭＣＳ溶液から引き上げたガラス基板を、上記のＤＭＳＯ／エタノールの混合溶媒及びエタノールで順次洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。
【００４０】
（３）プローブＤＮＡの合成
ＤＮＡ自動合成機を用いて、配列番号１の一本鎖核酸を合成した。なお、配列番号１の一本鎖ＤＮＡの５’末端に、ＤＮＡ自動合成機による合成時に、チオールモディファイア（Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（グレンリサーチ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ）社製）を用いて、スルファニル（ＳＨ）基を導入した。続いて、通常の脱保護を行い、ＤＮＡを回収し、高速液体クロマトグラフィーにて精製し、以下の実験でプローブＤＮＡとして用いた。
配列番号：１
５’　ＨＳ−（ＣＨ２）６−Ｏ−ＰＯ２−Ｏ−ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡ　３’
（４）ＢＪプリンターによるＤＮＡ吐出、および基板への結合
配列番号１の一本鎖ＤＮＡを、最終濃度が約４００ｍｇ／ｍｌになるようにＴＥ溶液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）／１ｍＭ　ＥＤＴＡ水溶液）に溶解し、一本鎖ＤＮＡ溶液を調製した（なお、ＤＮＡ濃度は、吸収強度から算出した）。
【００４１】
一方、グリセリン７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、及びアセチレンアルコール（商品名：アセチレノールＥＨ；川研ファインケミカル（株）社製）１ｗｔ％を含む水溶液を用意し、前記ＤＮＡ溶液に加え、一本鎖ＤＮＡの最終濃度が８μＭとなるように調整した。この液体の表面張力は３０〜５０ｄｙｎｅ／ｃｍの範囲内であり、また、粘度は１．８ｃｐｓ（Ｅ型粘度計：東京計器（株）社製）であった。この液体を、バブルジェットプリンター（商品名：ＢＪＣ６２０；キヤノン（株）社製）用インクタンクに充填し、バブルジェットヘッドに装着した。なお、利用するバブルジェットプリンター（商品名：ＢＪＣ６２０；キヤノン（株）社製）は、平板上への印刷が可能な様に改造を施したものである。また、このバブルジェットプリンターは、３６０×７２０ｄｐｉの解像度で印字可能である。
【００４２】
次いで、このプリンターに、（２）で表面処理したガラス基板を装着し、核酸プローブを含む液体を、ガラス基板表面にスポッティングした。その際、バブルジェットヘッドの液体吐出面と、液体付着面であるガラス基板表面との距離は、１．２〜１．５ｍｍであった。また、マトリックス状のスポッティングは、３６０ｄｐｉの方向には、１回のスポッティング後、２回の空吐出を行い、７２０ｄｐｉの方向には、１回のスポッティング後、５回の空吐出を行う様に、スポッティング条件を設定した。スポッティング終了後、ガラス基板を３０分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基と、核酸プローブ５’末端のスルファニル基とを反応させた。なお、上記プリンターによる１吐出動作当たりのＤＮＡプローブ溶液吐出量は、約２４ｐｌであった。
【００４３】
なお、上記アセチレンアルコールは、下記一般式（Ｉ）で示される。
【００４４】
【化１】
2004037120.tif 000002
【００４５】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、アルキル基を表わし、ｍおよびｎはそれぞれ０もしくは正の整数を表わし、ｍ＝０かつｎ＝０、もしくは、１≦ｍ＋ｎ≦３０であって、ｍ＋ｎ＝１の場合は、ｍまたはｎは０である。）
（５）ブロッキング反応
マレイミド基とスルファニル基との反応終了後、ガラス基板を１Ｍ　ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液で洗浄し、ガラス基板表面のＤＮＡを含む液体を完全に洗い流した。次いで、ガラス基板を、２％ウシ血清アルブミン水溶液中に浸して２時間放置し、表面のブロッキング反応を行った。
【００４６】
（実施例２）
外部標準物質のＴＯＦ−ＳＩＭＳ測定と、検量線の作成
外部標準物質として、数平均分子量が約１００００の棒状のポリエチレンをスライスし、その切断面を分析面とした。ＴＯＦ−ＳＩＭＳスペクトルの測定には、ＩＯＮ−ＴＯＦ製のＴＯＦ−ＳＩＭＳ　ＩＶ型装置を使用した。その測定条件は、一次イオン：Ｇａ＋、一次イオン加速エネルギー：２５ｋｅＶ、トータルドーズ量：１×１０１１ｉｏｎｓ／ｃｍ２とした。これ以外の測定条件は、前記装置における標準的な条件を採用した。
【００４７】
図１に、スライス直後の試料で得られたＴＯＦ−ＳＩＭＳスペクトルを模式的に示し、また、図２に、同じ試料を、１月経過後に同条件で測定したＴＯＦ−ＳＩＭＳスペクトルを模式的に示す。
【００４８】
その測定結果を利用して、ＤＮＡの核酸塩基の親イオンに相当する二次イオンピークが出現する質量数範囲、すなわち、質量数が２００〜３００の範囲について、エチレンユニット数に相違を有する、一連の主要ピークに対する二次イオン強度を用いて、検量線を作成した。
【００４９】
（実施例３）
核酸プローブアレイのＴＯＦ−ＳＩＭＳ測定と、ハイブリダイゼーションによる評価
実施例１で作製した核酸プローブアレイ表面のスポッティング部について、実施例２に記載する測定条件でＴＯＦ−ＳＩＭＳスペクトルを測定した。１月後に、同じ条件で、再度ＴＯＦ−ＳＩＭＳスペクトルを測定した。
【００５０】
これらのスペクトルについて、それぞれ、対応する検量線に基づき、二次イオン強度を規格化し、核酸骨格に起因するＰＯ２−等の二次イオン強度を比較した。その結果、１月間をおいて測定を行った、両スペクトルの対応する規格化済み二次イオン強度の相違は、±１０％以内であった。
【００５１】
同じ核酸プローブアレイ試料について、特開２００１−０６６３０５号公報に開示したハイブリダイゼーション後の蛍光強度を測定し、その後、１月間をおいて再度測定し、両者の結果を比較したところ、測定される蛍光強度の相違は、±１５％以内であった。
【００５２】
（比較例１）
実施例３に記載するＴＯＦ−ＳＩＭＳスペクトルに関して、検量線による二次イオン強度の規格化を行わず、測定された二次イオン強度を直接比較した場合、両者の強度相違は、±１０％以上、但し、±２０％以内でバラツキを示していた。
【００５３】
（実施例４）
実施例３と同様に測定したＴＯＦ−ＳＩＭＳスペクトルに関して、検量線による二次イオン強度の規格化を行った後、核酸骨格に起因するＰＯ２−と、核酸塩基に起因する二次イオンの強度比を算出した。その後、１月間をおいて再度測定し、同じく、検量線による二次イオン強度の規格化を行った後、強度比を算出した。両測定における前記強度比を比較すると、その相違は、±２０％以内であった。
【００５４】
（比較例２）
実施例４に記載するＴＯＦ−ＳＩＭＳスペクトルに関して、検量線による二次イオン強度の規格化を行わず、測定された二次イオン強度から直接強度比を算定した。その後、１月間をおいて再度測定し、同様に、測定された二次イオン強度から直接強度比を算定した。両測定における前記強度比を比較すると、その相違は、±３０％以上、但し、±４０％以内でバラツキを示していた。
【００５５】
【発明の効果】
本発明の有機物質の組成分析方法においては、その組成分析に利用する有機物質のＴＯＦ−ＳＩＭＳスペクトルにおいて、対応する二次イオン種に適合する、質量数毎に感度補正する手段として、組成に変動がない標準物質を検出器効率の補正に利用している。すなわち、本発明の方法は、使用するＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置に関して、同時に標準物質を利用して検出器効率の補正を行った上で、かかる被測定物の有機物質について、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法を利用して、発生する二次イオン種の質量数と、前記の効率補正により規格化、較正を施した、その二次イオン強度比に基づき、対象とする有機物質の組成を決定する方法であるため、測定装置の検出系の経時的な検出器効率の変化による影響を排除して、高い定量性を達成できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】標準物質として利用される、ポリエチレンの切断直後の断面に対して測定される、ＴＯＦ−ＳＩＭＳスペクトルの一例を模式的に示す図である。
【図２】図１に示すスペクトルの測定後、１月の経過後、同一の測定条件でポリエチレン断面を再測定した際のＴＯＦ−ＳＩＭＳスペクトルの一例を模式的に示し、測定装置の検出系の経時的な検出器効率の変化に起因する、「質量数　対　二次イオン強度」の関係の変化を説明する図である。
【図１】
2004037120.tif 000003
【図２】
2004037120.tif 000004