(57)【要約】【課題】本発明は、ある物質が意図している作用効果に何らかの影響を及ぼす可能性がある別の物質について、その影響の度合いを測定する方法に関するものである。【解決手段】ある物質が意図している作用効果に何らかの影響を及ぼす可能性がある別の物質について、その影響の度合いを評価する方法であって、上記別の物質を作用させた後、生じた生成物を免疫化学的手法により、ある物質が意図している作用効果を測定することを特徴とする、測定方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある物質が意図している作用効果に何らかの影響を及ぼす可能性がある別の物質について、その影響の度合いを評価する方法であって、上記別の物質を作用させた後、生じた生成物を免疫化学的手法により、ある物質が意図している作用効果を測定することを特徴とする、測定方法。
【請求項２】
ある物質が意図している作用効果に及ぼす別の物質の影響に対して、さらに第３の物質が及ぼす影響の度合いを評価する方法であって、上記別の物質を作用させる際に、上記第３の物質を同時に共存させ、生じる生成物量の変化を免疫化学的手法により、ある物質が意図している作用効果を測定することを特徴とする、測定方法。
【請求項３】
薬物代謝酵素の活性を測定する方法であって、薬物代謝酵素を作用させた後、生じた生成物を免疫化学的手法により測定することを特徴とする薬物代謝酵素活性の測定方法。
【請求項４】
薬物代謝酵素活性を測定する際に、評価すべき化学物質を同時に共存させ、生じる生成物量の変化を免疫化学的手法により測定し、評価すべき化学物質の効果を評価することを特徴とする測定方法。
【請求項５】
免疫学的手法が、生成物を特異的に認識する抗体を利用することを特徴とする請求項１〜４の測定方法。
【請求項６】
生成物を特異的に認識する抗体を用いて、酵素免疫測定法、表面プラズモン共鳴法、微量示差熱測定法、水晶振動共鳴法から少なくとも一つの手法を利用することを特徴とする、請求項１〜５の測定方法。
【請求項７】
薬物代謝酵素が、ＣＹＰ１Ａ〜Ｂ・ＣＹＰ２Ａ〜２Ｍ・ＣＹＰ３Ａ１・ＣＹＰ４Ａ〜４Ｓ・ＣＹＰ５・ＣＹＰ６Ａ〜６Ｗ・ＣＹＰ７Ａ〜Ｂ・ＣＹＰ８・ＣＹＰ８Ｂ・ＣＹＰ９Ｂ・ＣＹＰ９Ｃ・ＣＹＰ９Ｆ・ＣＹＰ９Ｈ・ＣＹＰ１０・ＣＹＰ１１・ＣＹＰ１１Ａ〜Ｂ・ＣＹＰ１２〜１２Ｅ・ＣＹＰ１３Ａ・ＣＹＰ１７・ＣＹＰ１９・ＣＹＰ１９Ａ・ＣＹＰ１８Ａ・ＣＹＰ２１・ＣＹＰ２１Ａ・ＣＹＰ２４・ＣＹＰ２６・ＣＹＰ２６Ａ・ＣＹＰ２７Ａ〜２７ＢＢ・ＣＹＰ２８Ａ〜２８Ｄ・ＣＹＰ３６Ａ・ＣＹＰ３９・ＣＹＰ４４・ＣＹＰ４６・ＣＹＰ４９Ａ・ＣＹＰ５１・ＣＹＰ５２Ａ・ＣＹＰ５３Ａ・ＣＹＰ５５Ａ・ＣＹＰ５６・ＣＹＰ５７Ａ・ＣＹＰ５８・ＣＹＰ５９Ａ・ＣＹＰ６０Ａ〜６０Ｂ・ＣＹＰ６１・ＣＹＰ６２・ＣＹＰ６４・ＣＹＰ６５Ａ・ＣＹＰ６７・ＣＹＰ７１Ａ・ＣＹＰ７１Ｂ・ＣＹＰ７１Ｃ・ＣＹＰ７１Ｄ・ＣＹＰ７１Ｅ・ＣＹＰ７３Ａ・ＣＹＰ７４Ａ・ＣＹＰ７５Ａ・ＣＹＰ７６Ａ〜７６Ｃ・ＣＹＰ７７Ａ・ＣＹＰ７８Ａ・ＣＹＰ７９Ａ〜７９Ｂ・ＣＹＰ８０Ａ〜８０Ｅ・ＣＹＰ８２Ａ・ＣＹＰ８３Ａ〜８３Ｂ・ＣＹＰ８４Ａ・ＣＹＰ８５・ＣＹＰ８６Ａ・ＣＹＰ８８Ａ・ＣＹＰ８９Ａ・ＣＹＰ９０Ａ〜９０Ｃ・ＣＹＰ９１Ａ・ＣＹＰ９３Ａ〜９３Ｂ・ＣＹＰ９４Ａ・ＣＹＰ９７Ｂ・ＣＹＰ９８Ａ・ＣＹＰ９９Ａ・ＣＹＰ１０１・ＣＹＰ１０２Ａ・ＣＹＰ１０３・ＣＹＰ１０４・ＣＹＰ１０５Ａ〜１０５Ｅ・ＣＹＰ１０６・ＣＹＰ１０６Ａ・ＣＹＰ１０７Ａ〜１０７Ｊ・ＣＹＰ１０８・ＣＹＰ１０９・ＣＹＰ１１０・ＣＹＰ１１２・ＣＹＰ１１２Ａ・ＣＹＰ１１３Ａ・ＣＹＰ１１４・ＣＹＰ１１６〜１１７・ＣＹＰ１１７Ａ・ＣＹＰ１１９〜１２６・ＣＹＰ１２７Ａ・ＣＹＰ１２８〜１３２・ＣＹＰ１３３Ｂ・ＣＹＰ１３４・ＣＹＰ１３５Ａ・ＣＹＰ１３５Ｂ・ＣＹＰ１３６〜１４４・ＣＹＰ１５２Ａ・ＣＹＰ３０１Ａ・ＣＹＰ３０２Ａ・ＣＹＰ３０３Ａ・ＣＹＰ３０４Ａ・ＣＹＰ３０５Ａ・ＣＹＰ３０６Ａ・ＣＹＰ３０７Ａ・ＣＹＰ３０８Ａ・ＣＹＰ３０９Ａ・ＣＹＰ３１０Ａ・ＣＹＰ３１１Ａ・ＣＹＰ３１２Ａ・ＣＹＰ３１３Ａ〜３１３Ｂ・ＣＹＰ３１４Ａ・ＣＹＰ３１５Ａ・ＣＹＰ３１６Ａ・ＣＹＰ３１７Ａ・ＣＹＰ３１８Ａの遺伝子およびそのサブファミリー・亜型に相当する蛋白質、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの中から選ばれる１つまたは２以上の混合物であることを特徴とする請求項３〜６の測定方法。
【請求項８】
薬物代謝酵素が、ＣＹＰ１Ａ１・ＣＹＰ１Ａ２・ＣＹＰ１Ｂ１・ＣＹＰ２Ａ６・ＣＹＰ２Ｂ６・ＣＹＰ２Ｃ８・ＣＹＰ２Ｃ９１・ＣＹＰ２Ｃ９２・ＣＹＰ２Ｃ９３・ＣＹＰ２Ｃ１８・ＣＹＰ２Ｃ１９・ＣＹＰ２Ｄ６１・ＣＹＰ２Ｄ６１０・ＣＹＰ２Ｅ１・ＣＹＰ３Ａ４・ＣＹＰ３Ａ５・ＣＹＰ３Ａ７・ＣＹＰ４Ａ１１・ＣＹＰ４Ｆ２・ＣＹＰ４Ｆ３Ａ・ＣＹＰ１９の遺伝子に相当する酵素蛋白、１７β‐ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの中から選ばれる１つまたは２以上の混合物であることを特徴とする請求項３〜６の測定方法。
【請求項９】
薬物代謝酵素活性測定に使用する基質が、内在性のホルモン化合物であることを特徴とする請求項３〜８の測定方法。
【請求項１０】
薬物代謝酵素活性測定に使用する基質が、テストステロン・プロゲステロン・ジヒドロテストステロン、アンドロステンジオン、７−エトキシ−３−シアノクマリン、７−メトキシ−４−トリフルオロメチルクマリン、７−ベンジロキシ−４−トリフルオロメチルクマリン、ジベンジルフルオレセイン、７−エトキシ−４−トリフルオロメチルクマリン・カフェイン・アセタアミノフェン・７−ベンジルオキシキノリン・ブフラロール・ダプソン・デブリスキンサルフェイト・デキストロメトルファンハイドロブロミド・デイクロフェナック・ハロペリドール・６β‐ヒドロキシ−コルチゾール・１１α‐ヒドロキシテストステロン・メフェニトイン・メトキシレゾルフィン・３‐Ｏ‐メチルフルオレセイン・ミダゾラム・オメプラゾ−ル・タキソール・テエニル‐３Ｃ‐アルコール・トルブタミド・トラマドール・Ｒ‐（＋）‐ワルファリン・Ｓ‐（‐）‐ワルファリンである請求項３〜８の測定方法。
【請求項１１】
薬物代謝酵素反応の間あるいは薬物代謝酵素反応後、薬物代謝酵素が固定化されることを特徴とする、請求項３〜１１の方法。
【請求項１２】
薬物代謝酵素反応終了後、薬物代謝酵素とその他の反応組成物とが分離されることを特徴とする請求項３〜１１の方法。
【請求項１３】
薬物代謝酵素反応後、薬物代謝酵素の活性を抑制するために、加熱処理あるいは阻害剤を添加することを特徴とする請求項３〜１２の方法。
【請求項１４】
抗体が魚類・両性類・鳥類・爬虫類、哺乳類由来のポリクローナル抗体あるいは、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項５〜１３の方法。
【請求項１５】
薬物代謝酵素が貝類・軟体動物・魚類・両性類・鳥類・爬虫類・哺乳類由来であることを特徴とする請求項３〜１４の方法。
【請求項１６】
薬物代謝酵素が遺伝子組換えで生産されていることを特徴とする請求項３〜１５の方法。
【請求項１７】
抗体が固定化されていることを特徴とする請求項３〜１６の方法。
【請求項１８】
薬物代謝酵素反応に必要なＮＡＤＰＨを補完する再生系を薬物代謝酵素反応時に共存させることを特徴とする、請求項３〜１７の方法。
【請求項１９】
薬物代謝酵素反応に必要なＮＡＤＰＨを補完する再生系が、グルコース６リン酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素を含むことを特徴とする、請求項３〜１８の方法。
【請求項２０】
薬物代謝酵素反応の基質が、抗体による免疫反応に実質的に影響を及ぼさない濃度に調節されていることを特徴とする、請求項３〜１９の方法。
【請求項２１】
次に示す（１）〜（３）を含む試薬組成物であって、ある物質が意図している作用効果に何らかの影響を及ぼす可能性がある別の物質について、その影響の度合いを測定する為の試薬組成物。
（１）ある物質が意図している作用効果に何らかの影響を及ぼす可能性がある別の物質
（２）ある物質が、その物質が意図している作用効果に何らかの影響を及ぼす可能性がある別の物質によって作用を受け、生じた生成物を、特異的に認識する抗体
（３）（２）に記載の抗体を用いて、酵素免疫測定法、表面プラズモン共鳴法、微量示差熱測定法、水晶振動共鳴法のいずれか１つの方法による測定を可能にする試薬
【請求項２２】
特異抗体（生成物架橋結合蛋白質）固定化プレートあるいは特異抗体固定化（生成物架橋結合蛋白質）金薄膜チップ、特異抗体（生成物架橋結合蛋白質）固定化水晶振動子チップ、反応用緩衝液、特異抗体液、抗体試料希釈液、標準品、標識量を定量するための酵素基質液などから適宜選択される組成物を構成パーツとするキットであって、ある物質が意図している作用効果に何らかの影響を及ぼす可能性がある別の物質について、その影響の度合いを測定する為のキット。
【請求項２３】
非ステロイド性化学物質を評価対象とする請求項３〜２０の方法。
【請求項２４】
薬物代謝酵素反応の際の基質濃度が０．０５ｎＭ〜５００μＭであることを特徴とする請求項３〜２０の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ある物質が意図している作用効果に何らかの影響を及ぼす可能性がある別の物質について、その影響の度合いを測定する方法に関するものである。あるいは、薬物代謝酵素、特にサイトクロームＰ４５０（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ４５０）酵素ファミリー及びヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの活性測定に関するものであり、また化学物質等の薬物代謝酵素への阻害効果を評価するための方法に関するものである。また本発明はそれらの方法によって測定系を構築する際に使用する組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
薬物代謝酵素のうち、サイトクロームＰ４５０は生殖・性分化・成熟・成長・代謝・維持等に関わるホルモン量を調節する酵素であるとともに、また種々の薬物・毒物を代謝する酵素であり、生体内での解毒に関わる酵素である。サイトクロームＰ４５０に関する研究は膨大な量に及び、種々の薬物に対する作用性データが蓄積されており、近年さらにサイトクロームＰ４５０の一塩基置換体（ＳＮＰ）・亜型に関しても知見が得られており、現在も世界的な動きで研究が進められている。これによって各種起源のサイトクロームＰ４５０の発現機序・構造・機能・メカニズム・進化機構だけでなく、ヒトの人種間でＳＮＰｓの違い等も解明されつつある。他の薬物代謝酵素、すなわちヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、モノアミンオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼなどの酸化還元酵素、ＵＤＰ‐グルクロン酸転移酵素、ＵＤＰ‐スルフォン酸転移酵素、糖転移酵素、グルタチオンレダクターゼなどの抱合酵素も状況は同じであり、ドラッグデイスカバリーの加速化に応じた研究が進められており、薬物の代謝経路・動態・副作用のメカニズム・亜型・多型などが詳細に把握されつつある。
【０００３】
また薬物ではなく、近年では多くの汎用化学物質や非意図的生成物・汚染化学物質がＰ４５０酵素を介して影響を与えるケースがでている。生殖作用への影響として、本来遺伝的に雌である生物が雌化する例（サイトクロームＰ４５０アロマターゼ：ＣＹＰ１９：阻害）などが知られている。堀口ら（マル、エンバイロ、リサーチ　５０巻２２３−２２９頁（２０００年）：Ｍａｒ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｒｅｓ　Ｖｏｌ．　５０，　ｐｐ２２３−２２９（２０００））は貝類の例を報告している。人工化学物質による生命の性・生殖への影響はいわゆる内分泌撹乱物質問題として先世紀末より、緊急性のある課題として人類が直面しているものである。またＰ４５０アロマターゼが、乳癌・子宮癌等の癌にも密接に関与する場合がある。エストロゲン依存性の癌の進行過程に伴ってＰ４５０アロマターゼは発現し、近年では北脇らが、子宮内膜症・子宮腺筋腫・子宮筋腫などに伴ってアロマターゼが発現することを報告している（北脇ら　Ｂｉｏｌ．　Ｒｅｐｒｏｄ．　　５７巻　５１４−５１９頁（１９９７年）：Ｋｉｔａｗａｋｉ，　Ｊ．，ｅｔ．ａｌ．　Ｂｉｏｌ．　Ｒｅｐｒｏｄ．，　Ｖｏｌ．５７，５１４−５１９（１９９７））。彼らは健常者では子宮内膜にアロマターゼが認められないことを、アロマターゼ特異的抗体を用いた免疫染色法にて確認している。またＰ４５０アロマターゼの活性測定は、良性乳腺疾患・乳癌などの治療において、ホルモン感受性の有無の判断、治療方針の決定に有用であるとされている。さらにアロマターゼは胎盤・卵巣・セルトリ細胞・リーデッヒ細胞・脂肪組織・筋肉・毛髪の他、脳にもその存在が確認されており、脳の性分化・性行動にも関与する可能性が指摘されている。
【０００４】
非意図的生成物・汚染化学物質としての、タバコ紫煙中のベンズピレン類や種々の排ガス中の多環芳香族類等は、Ｐ４５０酵素類によって代謝されるものも多く、場合によっては生体内でより毒性の高い化学物質に変換される。代謝物のあるものは発癌プロモーターとなる場合もある。
【０００５】
ヒトのサイトクロームＰ４５０は、人種間あるいは個人間で、アミノ酸配列が異なるものが存在し（１塩基多型：ＳＮＰ等）、薬物に対して反応性が異なる場合がある。既に見出されたＳＮＰに関しては、米国国立衛生研究所のウエブサイト上等にデータベース化されたものを現在利用できる。ＳＮＰに関しては多くは塩基配列・アミノ酸配列上のデータであり、今後個々の薬物の反応性に関するデータが充実していくものと考えられる。また今後予め把握された個人のＰ４５０遺伝子群の情報に基づいて、テーラーメード治療・投薬がありうると考えられている。
【０００６】
サイトクロームＰ４５０の活性の阻害は、薬物副作用の生じる可能性を意味し、重要である。このため阻害効果の確認は、薬物の開発過程すなわち候補化合物の選別において、重要な意味を有している。また薬物が開発されマーケットに流通した後に、重大な相互作用が報告される場合もある。副作用のもたらす社会問題の回避、人的・経済的損失の回避のため、創薬開発においては、早い段階における候補化合物の相互作用の把握が必要であり、それが全体の開発の効率化・スピードアップに繋がる。このためかかせない薬物相互作用の前臨床試験として、薬品メーカーなどが薬物代謝酵素、特にサイトクロームＰ４５０の阻害スクリーニングを精力的に実施している。
【０００７】
サイトクロームＰ４５０はヒト以外にも広く、哺乳類・鳥類・爬虫類・両生類・魚類・貝類などの無脊椎動物・植物・カビ等の真核微生物にも広く分布し、根幹的な酵素の一つとして位置づけられている。このことはＰ４５０酵素に対して阻害能あるいは促進能を有する人工化学物質は、特定の生物のみだけでなく広い範囲の影響を及ぼす可能性が高いことを意味する。薬剤の効率的スクリーニングだけでなく、現在人類が大規模に使用している化学物質の影響を見なおすことが必要であるが、その試験法は種々の問題を有するため高効率な新しい方法が望まれている。
【０００８】
阻害試験法などに使用するために、サイトクロムＰ４５０は組換え技術等によって、昆虫細胞や哺乳動物細胞、酵母、大腸菌などを用いて生産されている（シグルら　ビー　ビー　アール　シー　２０１巻６９４−７００頁（１９９４年）：　Ｓｉｇｌｅ　Ｒ．Ｏ．ｅｔ．　ａｌ．，　Ｂ．　Ｂ．　Ｒ．　Ｃ．　Ｖｏｌ．　２０１，　ｐｐ２０１−７００（１９９４）　あるいは　クレスピら　アドブ　ファーマコル　４３巻１７１−８８頁（１９９７年）（Ｃｒｅｓｐｉ　ｅｔ．　ａｌ．，　Ａｄｖ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，　Ｖｏｌ．４３，　ｐｐ１７１−８８（１９９７））等）。これらの一部は既に商業的製品としても流通している（グエングリッチ　ネイチャー　レビュー　ドラッグ　デイスカバリー　１巻３５９−３６６頁（２００２年）：Ｅ．Ｐ．Ｇｕｅｎｇｅｒｉｃｈ，　Ｎａｔｕｒｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　Ｄｒｕｇ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｖｏｌ．　１，　ｐｐ３５９−３６６（２００２））。サイトクロームＰ４５０以外の薬物代謝酵素も、ヒト・微生物・植物など種々の給源のものが、抽出物・組換え生産されたものとして利用できる状況にある。
【０００９】
サイトクロムＰ４５０の一つであるアロマターゼ（ＣＹＰ１９）の測定法としては、シェンケルら（ジャーナル　ステロイド　バイオケム　３３巻１２５−１３１頁（１９８９年）：Ｓｃｈｅｎｋｅｌ　ｅｔ．　ａｌ．，　Ｊ．　Ｓｔｅｒｏｉｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，　Ｖｏｌ．３３，　ｐｐ１２５−１３１（１９８９））らの動物細胞を用いた方法、酵母細胞で発現させた酵素によるスクリーニング方法（ポンポンら　モレキュラー　エンドクリノロジー　３巻１４７７−１４８７頁（１９８９年）：　Ｐｏｎｐｏｎ　Ｄ．　ｅｔ．　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙＶｏｌ．　３，　ｐｐ１４７７−１４８７（１９８９））、組換え技術によりアロマターゼを発現する哺乳動物細胞を用いる方法（特表平４−５０２２６１）等の細胞を用いた方法がある。これらはインビトロ試験で実施しうるものであるが、細胞全体を使用するため、サイトクロムＰ４５０蛋白質と試験対象の化学物質の直接の反応性を評価するものではない。　アロマターゼ活性測定法として、アロマターゼ蛋白質そのものの活性を検出する方法としては、ラジオアイソトープラベルされた基質を使用する、トリチウム水遊離アッセイ法（ベリノら　ジャーナル　クリニ　エンドクリノロジー　メタボ　４４巻６９９頁（１９７７年）：　Ｂｅｌｌｉｎｏ，　Ｆ．　Ｌ．　ｅｔ．　ａｌ．，　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．　Ｍｅｔａｂ．，　Ｖｏｌ．　４４，　ｐｐ６９９（１９７７））やクレスピら（アナル　バイオケム　２４８巻１８８−１９０頁（１９７７）：Ｃｒｅｓｐｉ，　Ｃ．Ｌ．，　ｅｔ．　ａｌ．，　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　Ｖｏｌ．２４８，　ｐｐ１８８−１９０（１９９７））による、サイトクロムＰ４５０によって代謝された後、蛍光性を有する基質を使用する蛍光法がある。　さらに谷口ら（アナル　バイオケム　１８１巻１６７−１７１頁（１９８９年）：Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，　Ｈ．，　ｅｔ．　ａｌ．，　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　Ｖｏｌ．１８１，　ｐｐ１６７−１７１（１９８９））等の様に、酵素反応の生成物を、液体クロマトグラフィーにより分離し、検出・定量する方法などがある。
【００１０】
アロマターゼ以外の薬物代謝酵素、すなわち他種のサイトクロームＰ４５０及び１７β‐ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、モノアミン酸化酵素、ＵＤＰ‐グルクロン酸転移酵素なども上記アロマターゼの方法に準じた形でその測定・阻害効果の評価が実施されている。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
薬物代謝酵素活性を測定において、哺乳動物細胞、組換え酵母細胞、組換え昆虫細胞など細胞を用いた場合には、細胞が含む他の代謝酵素の影響を受けることが最も大きな障害となる。サイトクロムＰ４５０以外に多数の酵素が種類細胞内に存在しているが、試験対象の化学物質が、それらの酵素によって代謝される可能性は高い。また種々の化学物質の、細胞膜透過性は、動物細胞・酵母・大腸菌でそれぞれ異なるため、それぞれの細胞を用いて得た結果で差が認められるため、細胞を用いることによるバイアス込みの実験結果が得られることとなる。
【００１２】
トリチウム標識体などアイソトープを使用する方法においては、放射性化合物を取扱うための、特別の隔離空間・設備を必要とする他、アッセイ廃棄物も放射性化合物を含むため、特別の留意が必要であり、実験の操作性にも制限がある。
【００１３】
クレスピらによる方法はサイトクロムＰ４５０活性を測定する場合には、放射性化合物を使用することもなく、多くの問題を生じないが、サイトクロムＰ４５０阻害剤のスクリーニングにおいては、試験対象の化学物質の非常に多くが自ら蛍光を有するため、化学物質の阻害用量曲線を得る場合に、自己蛍光が測定の妨害となる。多くの化学物質が蛍光を有するためこの方法はスクリーニングとして限界を有する。
【００１４】
谷口らによる液体クロマトグラフィーによる方法は、放射性化合物を使用することもなく、阻害剤スクリーニングの場合においても、液体クロマトグラフィーにより分離分析のため、試験対象物質の自己蛍光の影響も、原理的にありえない。しかしながらクロマトグラフィーによる分析の前に、除蛋白操作・分離操作を必要とするため煩雑であり、さらに一度に多くのサンプルを分析することができないという難点を有する。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、放射性化合物を使用することなく、試験対象化学物質の自己蛍光の影響を受けることがなく、煩雑な操作を必要としない、ハイスループットに適した薬物代謝酵素（特にサイトクロームＰ４５０）活性の測定方法（特にサイトクロームＰ４５０）、及び薬物代謝酵素（特にサイトクロームＰ４５０）活性の阻害剤のスクリーニング方法につき鋭意努力検討した結果、それら薬物代謝酵素によって変換されて生じた生成物を、免疫化学的に測定することで諸問題が解決されることに想到し、本願発明を完成させるに至った。
【００１６】
すなわち本発明は、以下のような構成からなる。
［１］　ある物質が意図している作用効果に何らかの影響を及ぼす可能性がある別の物質について、その影響の度合いを評価する方法であって、上記別の物質を作用させた後、生じた生成物を免疫化学的手法により、ある物質が意図している作用効果を測定することを特徴とする、測定方法。
［２］　ある物質が意図している作用効果に及ぼす別の物質の影響に対して、さらに第３の物質が及ぼす影響の度合いを評価する方法であって、上記別の物質を作用させる際に、上記第３の物質を同時に共存させ、生じる生成物量の変化を免疫化学的手法により、ある物質が意図している作用効果を測定することを特徴とする、測定方法。
［３］　薬物代謝酵素の活性を測定する方法であって、薬物代謝酵素を作用させた後、生じた生成物を免疫化学的手法により測定することを特徴とする薬物代謝酵素活性の測定方法。
［４］　薬物代謝酵素活性を測定する際に、評価すべき化学物質を同時に共存させ、生じる生成物量の変化を免疫化学的手法により測定し、評価すべき化学物質の効果を評価することを特徴とする測定方法。
［５］　免疫学的手法が、生成物を特異的に認識する抗体を利用することを特徴とする［１］〜［４］の測定方法。
［６］　生成物を特異的に認識する抗体を用いて、酵素免疫測定法、表面プラズモン共鳴法、微量示差熱測定法、水晶振動共鳴法から少なくとも一つの手法を利用することを特徴とする、［１］〜［５］の測定方法。
［７］　薬物代謝酵素が、ＣＹＰ１Ａ〜Ｂ・ＣＹＰ２Ａ〜２Ｍ・ＣＹＰ３Ａ１・ＣＹＰ４Ａ〜４Ｓ・ＣＹＰ５・ＣＹＰ６Ａ〜６Ｗ・ＣＹＰ７Ａ〜Ｂ・ＣＹＰ８・ＣＹＰ８Ｂ・ＣＹＰ９Ｂ・ＣＹＰ９Ｃ・ＣＹＰ９Ｆ・ＣＹＰ９Ｈ・ＣＹＰ１０・ＣＹＰ１１・ＣＹＰ１１Ａ〜Ｂ・ＣＹＰ１２〜１２Ｅ・ＣＹＰ１３Ａ・ＣＹＰ１７・ＣＹＰ１９・ＣＹＰ１９Ａ・ＣＹＰ１８Ａ・ＣＹＰ２１・ＣＹＰ２１Ａ・ＣＹＰ２４・ＣＹＰ２６・ＣＹＰ２６Ａ・ＣＹＰ２７Ａ〜２７ＢＢ・ＣＹＰ２８Ａ〜２８Ｄ・ＣＹＰ３６Ａ・ＣＹＰ３９・ＣＹＰ４４・ＣＹＰ４６・ＣＹＰ４９Ａ・ＣＹＰ５１・ＣＹＰ５２Ａ・ＣＹＰ５３Ａ・ＣＹＰ５５Ａ・ＣＹＰ５６・ＣＹＰ５７Ａ・ＣＹＰ５８・ＣＹＰ５９Ａ・ＣＹＰ６０Ａ〜６０Ｂ・ＣＹＰ６１・ＣＹＰ６２・ＣＹＰ６４・ＣＹＰ６５Ａ・ＣＹＰ６７・ＣＹＰ７１Ａ・ＣＹＰ７１Ｂ・ＣＹＰ７１Ｃ・ＣＹＰ７１Ｄ・ＣＹＰ７１Ｅ・ＣＹＰ７３Ａ・ＣＹＰ７４Ａ・ＣＹＰ７５Ａ・ＣＹＰ７６Ａ〜７６Ｃ・ＣＹＰ７７Ａ・ＣＹＰ７８Ａ・ＣＹＰ７９Ａ〜７９Ｂ・ＣＹＰ８０Ａ〜８０Ｅ・ＣＹＰ８２Ａ・ＣＹＰ８３Ａ〜８３Ｂ・ＣＹＰ８４Ａ・ＣＹＰ８５・ＣＹＰ８６Ａ・ＣＹＰ８８Ａ・ＣＹＰ８９Ａ・ＣＹＰ９０Ａ〜９０Ｃ・ＣＹＰ９１Ａ・ＣＹＰ９３Ａ〜９３Ｂ・ＣＹＰ９４Ａ・ＣＹＰ９７Ｂ・ＣＹＰ９８Ａ・ＣＹＰ９９Ａ・ＣＹＰ１０１・ＣＹＰ１０２Ａ・ＣＹＰ１０３・ＣＹＰ１０４・ＣＹＰ１０５Ａ〜１０５Ｅ・ＣＹＰ１０６・ＣＹＰ１０６Ａ・ＣＹＰ１０７Ａ〜１０７Ｊ・ＣＹＰ１０８・ＣＹＰ１０９・ＣＹＰ１１０・ＣＹＰ１１２・ＣＹＰ１１２Ａ・ＣＹＰ１１３Ａ・ＣＹＰ１１４・ＣＹＰ１１６〜１１７・ＣＹＰ１１７Ａ・ＣＹＰ１１９〜１２６・ＣＹＰ１２７Ａ・ＣＹＰ１２８〜１３２・ＣＹＰ１３３Ｂ・ＣＹＰ１３４・ＣＹＰ１３５Ａ・ＣＹＰ１３５Ｂ・ＣＹＰ１３６〜１４４・ＣＹＰ１５２Ａ・ＣＹＰ３０１Ａ・ＣＹＰ３０２Ａ・ＣＹＰ３０３Ａ・ＣＹＰ３０４Ａ・ＣＹＰ３０５Ａ・ＣＹＰ３０６Ａ・ＣＹＰ３０７Ａ・ＣＹＰ３０８Ａ・ＣＹＰ３０９Ａ・ＣＹＰ３１０Ａ・ＣＹＰ３１１Ａ・ＣＹＰ３１２Ａ・ＣＹＰ３１３Ａ〜３１３Ｂ・ＣＹＰ３１４Ａ・ＣＹＰ３１５Ａ・ＣＹＰ３１６Ａ・ＣＹＰ３１７Ａ・ＣＹＰ３１８Ａの遺伝子およびそのサブファミリー・亜型に相当する蛋白質、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの中から選ばれる１つまたは２以上の混合物であることを特徴とする［３］〜［６］の測定方法。
［８］　薬物代謝酵素が、ＣＹＰ１Ａ１・ＣＹＰ１Ａ２・ＣＹＰ１Ｂ１・ＣＹＰ２Ａ６・ＣＹＰ２Ｂ６・ＣＹＰ２Ｃ８・ＣＹＰ２Ｃ９１・ＣＹＰ２Ｃ９２・ＣＹＰ２Ｃ９３・ＣＹＰ２Ｃ１８・ＣＹＰ２Ｃ１９・ＣＹＰ２Ｄ６１・ＣＹＰ２Ｄ６１０・ＣＹＰ２Ｅ１・ＣＹＰ３Ａ４・ＣＹＰ３Ａ５・ＣＹＰ３Ａ７・ＣＹＰ４Ａ１１・ＣＹＰ４Ｆ２・ＣＹＰ４Ｆ３Ａ・ＣＹＰ１９の遺伝子に相当する酵素蛋白、１７β‐ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの中から選ばれる１つまたは２以上の混合物であることを特徴とする［３］〜［６］の測定方法。
［９］　薬物代謝酵素活性測定に使用する基質が、内在性のホルモン化合物であることを特徴とする［３］〜［８］の測定方法。
［１０］　薬物代謝酵素活性測定に使用する基質が、テストステロン・プロゲステロン・ジヒドロテストステロン、アンドロステンジオン、７−エトキシ−３−シアノクマリン、７−メトキシ−４−トリフルオロメチルクマリン、７−ベンジロキシ−４−トリフルオロメチルクマリン、ジベンジルフルオレセイン、７−エトキシ−４−トリフルオロメチルクマリン・カフェイン・アセタアミノフェン・７−ベンジルオキシキノリン・ブフラロール・ダプソン・デブリスキンサルフェイト・デキストロメトルファンハイドロブロミド・デイクロフェナック・ハロペリドール・６β‐ヒドロキシ−コルチゾール・１１α‐ヒドロキシテストステロン・メフェニトイン・メトキシレゾルフィン・３‐Ｏ‐メチルフルオレセイン・ミダゾラム・オメプラゾ−ル・タキソール・テエニル‐３Ｃ‐アルコール・トルブタミド・トラマドール・Ｒ‐（＋）‐ワルファリン・Ｓ‐（‐）‐ワルファリンである［３］〜［８］の測定方法。
［１１］　薬物代謝酵素反応の間あるいは薬物代謝酵素反応後、薬物代謝酵素が固定化されることを特徴とする、［３］〜［１１］の方法。
［１２］　薬物代謝酵素反応終了後、薬物代謝酵素とその他の反応組成物とが分離されることを特徴とする［３］〜［１１］の方法。
［１３］　　薬物代謝酵素反応後、薬物代謝酵素の活性を抑制するために、加熱処理あるいは阻害剤を添加することを特徴とする［３］〜［１２］の方法。
［１４］　抗体が魚類・両性類・鳥類・爬虫類、哺乳類由来のポリクローナル抗体あるいは、モノクローナル抗体であることを特徴とする［５］〜［１３］の方法。
［１５］　薬物代謝酵素が貝類・軟体動物・魚類・両性類・鳥類・爬虫類・哺乳類由来であることを特徴とする［３］〜［１４］の方法。
［１６］　薬物代謝酵素が遺伝子組換えで生産されていることを特徴とする［３］〜［１５］の方法。
［１７］　抗体が固定化されていることを特徴とする［３］〜［１６］の方法。
［１８］　薬物代謝酵素反応に必要なＮＡＤＰＨを補完する再生系を薬物代謝酵素反応時に共存させることを特徴とする、［３］〜［１７］の方法。
［１９］　薬物代謝酵素反応に必要なＮＡＤＰＨを補完する再生系が、グルコース６リン酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素を含むことを特徴とする、［３］〜［１８］の方法。
［２０］　薬物代謝酵素反応の基質が、抗体による免疫反応に実質的に影響を及ぼさない濃度に調節されていることを特徴とする、［３］〜［１９］の方法。
［２１］　次に示す（１）〜（３）を含む試薬組成物であって、ある物質が意図している作用効果に何らかの影響を及ぼす可能性がある別の物質について、その影響の度合いを測定する為の試薬組成物。
（１）ある物質が意図している作用効果に何らかの影響を及ぼす可能性がある別の物質
（２）ある物質が、その物質が意図している作用効果に何らかの影響を及ぼす可能性がある別の物質によって作用を受け、生じた生成物を、特異的に認識する抗体
（３）（２）に記載の抗体を用いて、酵素免疫測定法、表面プラズモン共鳴法、微量示差熱測定法、水晶振動共鳴法のいずれか１つの方法による測定を可能にする試薬
［２２］　特異抗体（生成物架橋結合蛋白質）固定化プレートあるいは特異抗体固定化（生成物架橋結合蛋白質）金薄膜チップ、特異抗体（生成物架橋結合蛋白質）固定化水晶振動子チップ、反応用緩衝液、特異抗体液、抗体試料希釈液、標準品、標識量を定量するための酵素基質液などから適宜選択される組成物を構成パーツとするキットであって、ある物質が意図している作用効果に何らかの影響を及ぼす可能性がある別の物質について、その影響の度合いを測定する為のキット。
［２３］　非ステロイド性化学物質を評価対象とする［３］〜［２０］の方法。
［２４］　薬物代謝酵素反応の際の基質濃度が０．０５ｎＭ〜５００μＭであることを特徴とする［３］〜［２０］の方法。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明の薬物代謝酵素阻害剤のスクリーニングに使用する、薬物代謝酵素の給源としては、ヒト・ラット・マウスなどの哺乳類由来のもの、ニワトリなど鳥類由来のもの、ワニなどの爬虫類由来のもの、カエルなどの両性類由来のもの、マス・メダカなど魚類由来のもの、貝類・軟体動物等の無脊椎動物由来のもの、植物由来のもの、酵母・カビ等の真核微生物由来のものを使用することができる。また本発明での測定対象としての薬物代謝酵素は、例えば、ヒト・ラット・マウスなどの哺乳類、ニワトリなど鳥類、ワニなどの爬虫類、カエルなどの両性類、マス・メダカなど魚類、貝類等の無脊椎動物、植物、カビ・酵母等の真核微生物から採取したものなどに含まれる。
【００１８】
薬物代謝酵素としては、サイトクロームＰ４５０、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、モノアミンオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼなどの酸化還元酵素、ＵＤＰ‐グルクロン酸転移酵素、ＵＤＰ−スルフォン酸転移酵素、糖転移酵素、グルタチオンレダクターゼなどの抱合酵素あるいは加水分解酵素を本発明は対象とする。
【００１９】
本発明で対象とするＰ４５０の種類としては、特にサイトクロームＰ４５０が、ＣＹＰ１Ａ〜Ｂ・ＣＹＰ２Ａ〜２Ｍ・
ＣＹＰ３Ａ１・ＣＹＰ４Ａ〜４Ｓ・ＣＹＰ５・ＣＹＰ６Ａ〜６Ｗ・ＣＹＰ７Ａ〜Ｂ・ＣＹＰ８・ＣＹＰ８Ｂ・ＣＹＰ９Ｂ・ＣＹＰ９Ｃ・ＣＹＰ９Ｆ・ＣＹＰ９Ｈ・ＣＹＰ１０・ＣＹＰ１１・ＣＹＰ１１Ａ〜Ｂ・ＣＹＰ１２〜１２Ｅ・ＣＹＰ１３Ａ・ＣＹＰ１７・ＣＹＰ１９・ＣＹＰ１９Ａ・ＣＹＰ１８Ａ・ＣＹＰ２１・ＣＹＰ２１Ａ・ＣＹＰ２４・ＣＹＰ２６・ＣＹＰ２６Ａ・ＣＹＰ２７Ａ〜２７ＢＢ・ＣＹＰ２８Ａ〜２８Ｄ・ＣＹＰ３６Ａ・ＣＹＰ３９・ＣＹＰ４４・ＣＹＰ４６・ＣＹＰ４９Ａ・ＣＹＰ５１・ＣＹＰ５２Ａ・ＣＹＰ５３Ａ・ＣＹＰ５５Ａ・ＣＹＰ５６・ＣＹＰ５７Ａ・ＣＹＰ５８・ＣＹＰ５９Ａ・ＣＹＰ６０Ａ〜６０Ｂ・ＣＹＰ６１・ＣＹＰ６２・ＣＹＰ６４・ＣＹＰ６５Ａ・ＣＹＰ６７・ＣＹＰ７１Ａ・ＣＹＰ７１Ｂ・ＣＹＰ７１Ｃ・ＣＹＰ７１Ｄ・ＣＹＰ７１Ｅ・ＣＹＰ７３Ａ・ＣＹＰ７４Ａ・ＣＹＰ７５Ａ・ＣＹＰ７６Ａ〜７６Ｃ・ＣＹＰ７７Ａ・ＣＹＰ７８Ａ・ＣＹＰ７９Ａ〜７９Ｂ・ＣＹＰ８０Ａ〜８０Ｅ・ＣＹＰ８２Ａ・ＣＹＰ８３Ａ〜８３Ｂ・ＣＹＰ８４Ａ・ＣＹＰ８５・ＣＹＰ８６Ａ・ＣＹＰ８８Ａ・ＣＹＰ８９Ａ・ＣＹＰ９０Ａ〜９０Ｃ・ＣＹＰ９１Ａ・ＣＹＰ９３Ａ〜９３Ｂ・ＣＹＰ９４Ａ・ＣＹＰ９７Ｂ・ＣＹＰ９８Ａ・ＣＹＰ９９Ａ・ＣＹＰ１０１・ＣＹＰ１０２Ａ・ＣＹＰ１０３・ＣＹＰ１０４・ＣＹＰ１０５Ａ〜１０５Ｅ・ＣＹＰ１０６・ＣＹＰ１０６Ａ・ＣＹＰ１０７Ａ〜１０７Ｊ・ＣＹＰ１０８・ＣＹＰ１０９・ＣＹＰ１１０・ＣＹＰ１１２・ＣＹＰ１１２Ａ・ＣＹＰ１１３Ａ・ＣＹＰ１１４・ＣＹＰ１１６〜１１７・ＣＹＰ１１７Ａ・ＣＹＰ１１９〜１２６・ＣＹＰ１２７Ａ・ＣＹＰ１２８〜１３２・ＣＹＰ１３３Ｂ・ＣＹＰ１３４・ＣＹＰ１３５Ａ・ＣＹＰ１３５Ｂ・ＣＹＰ１３６〜１４４・ＣＹＰ１５２Ａ・ＣＹＰ３０１Ａ・ＣＹＰ３０２Ａ・ＣＹＰ３０３Ａ・ＣＹＰ３０４Ａ・ＣＹＰ３０５Ａ・ＣＹＰ３０６Ａ・ＣＹＰ３０７Ａ・ＣＹＰ３０８Ａ・ＣＹＰ３０９Ａ・ＣＹＰ３１０Ａ・ＣＹＰ３１１Ａ・ＣＹＰ３１２Ａ・ＣＹＰ３１３Ａ〜３１３Ｂ・ＣＹＰ３１４Ａ・ＣＹＰ３１５Ａ・ＣＹＰ３１６Ａ・ＣＹＰ３１７Ａ・ＣＹＰ３１８Ａの遺伝子およびそのサブファミリー・亜型に相当する酵素蛋白の中から選ばれる１つまたは２以上の混合物を使用することができ、さらに特に、ＣＹＰ１Ａ１・ＣＹＰ１Ａ２・ＣＹＰ１Ｂ１・ＣＹＰ２Ａ６・ＣＹＰ２Ｂ６・ＣＹＰ２Ｃ８・ＣＹＰ２Ｃ９１・ＣＹＰ２Ｃ９２・ＣＹＰ２Ｃ９３・ＣＹＰ２Ｃ１８・ＣＹＰ２Ｃ１９・ＣＹＰ２Ｄ６１・ＣＹＰ２Ｄ６１０・ＣＹＰ２Ｅ１・ＣＹＰ３Ａ４・ＣＹＰ３Ａ５・ＣＹＰ３Ａ７・ＣＹＰ４Ａ１１・ＣＹＰ４Ｆ２・ＣＹＰ４Ｆ３Ａ・ＣＹＰ１９の遺伝子に相当する酵素蛋白の中から選ばれる１つまたは２以上の混合物を使用することが好適である。
【００２０】
本発明で対象とする薬物代謝酵素の形態としては、純化され活性のある蛋白以外に、動物組織・植物組織・微生物から部分精製、粗精製あるいは未精製抽出物が使用可能である場合がある。
【００２１】
本発明で好適な薬物代謝酵素とその反応に使用する基質及び、特異的抗体の組合せとしては、例えば　ヒトＣＹＰ１９とテストステロン及び抗テストステロン抗体、ヒトＣＹＰ１９とアンドロステンジオン及び抗エストロン抗体、ヒトＣＹＰ３Ａとプロゲステロン及び抗６β‐ヒドロキシプロゲステロン、ヒトＣＹＰ２１Ａとプロゲステロン及び抗１１‐デオキシコルチコステロン抗体、ヒトＣＹＰ１Ａ２と（Ｒ）‐ワルファリン及び抗ヒドロキシワルファリン抗体、（ヒトＣＹＰ２Ｃ８又はヒトＣＹＰ２Ｃ９又はヒトＣＹＰ２Ｃ１９）とジベンジルフルオレセインと抗フルオレセイン抗体、ヒト１７β‐ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ等の組合せがある。これらに薬物代謝酵素の生物種間においてあるいはヒトの１塩基多型による種別によって、薬物代謝酵素の基質特異性の差異を考慮に入れる必要が生じる場合があるであろう。
【００２２】
本発明における免疫化学的測定方法としては、薬物代謝酵素によって変換された生成物を特異的な抗体を利用した、酵素免疫測定法、表面プラズモン共鳴法、微量示差熱測定法、水晶振動共鳴法などを選択することができる。酵素免疫測定法として、生成物をハプテンとして酵素と結合させた、酵素標識体と固相化された生成物特異的抗体とを組み合わせた競合法か、生成物を牛血清アルブミン等と架橋結合させたものを固相化し、酵素標識された生成物特異的抗体を組合せた競合法を使用することができる。またこれらの方法を適宜変更して応用することが可能である。これらの酵素免疫測定競合法においては、薬物代謝酵素によって変換されて生じた生成物が多いほど、最終的に検出する酵素標識体は少なくなり、結果として得られるシグナルは小さくなる。表面プラズモン共鳴法を利用する場合は、使用する金薄膜表面に、生成物特異的抗体または生成物を牛血清アルブミン等と架橋結合したものを、固定化して使用することができる。微量示差熱測定法の場合は、生成物と抗体との反応時に生じる微量熱量を直接測定することができる。水晶振動共鳴法の場合は水晶振動子上に生成物特異的抗体または生成物を牛血清アルブミン等と架橋結合したものを、固定化して使用することができる。
【００２３】
本発明の免疫化学的測定において使用する抗体とは、免疫グロブリンの各クラス、すなわちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤのことを言い、各抗体は魚類・両性類・爬虫類・哺乳類のものを使用することができる。また抗体はこれら各種動物の生体液から得られたポリクローナルなものであっても、ハイブリドーマより産生されたモノクローナルものでも、遺伝子工学的に製造されたものであってもよい。さらには抗体は全体の分子であっても、結合部分の活性を保持しえれば、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ，ｓｃＦｖあるいはミニボデイなどいかなる形態のフラグメントであってもよい。それらの抗体は生成物に対して、測定時において薬物代謝酵素による生成物に対して十分に高い特異性を有することが必要である。多数の化学物質と交差反応性を有する抗体を用いる場合も、本発明は包含するが、その場合薬物代謝酵素の阻害活性の評価対象化学物質の種類は限定される可能性が高いであろう。
【００２４】
本発明の免疫化学的測定において使用する抗体は、酵素免疫測定法、表面プラズモン共鳴法、水晶振動共鳴法の場合、不溶性担体に固定化して使用しても良いし、固定化せず溶液状態で使用しても良い。微量示差熱測定法での抗体の使用は、固定化する必要性はない。酵素免疫測定法、表面プラズモン共鳴法、水晶振動共鳴法で、抗体を不溶性担体に固定化することなく、溶液状態で使用する場合は、生成物を架橋結合した蛋白質（生成物‐ＢＳＡコンジュゲート等）を不溶性担体に固定化することが必要となる。
【００２５】
本発明でいう競合法とは、特異的抗体の結合対象である生成物Ａの標識体（Ａ−Ｌ）を、Ａ特異的抗体（Ｉｇ）が固定化された担体上で、薬物代謝酵素によって生成された（Ａ）と（Ａ−Ｌ）の競合反応を行なわせた後、遊離の（Ａ−Ｌ）もしくは固相に結合した（Ａ−Ｌ）の標識（Ｌ）の量を計測する、測定系のことをいう。図１に標識として酵素（ペルオキシダーゼ）を用いた競合法測定系の例を示す。あるいは図２の様に、シグナルを生じない蛋白質（Ｂ）とＡを架橋結合した複合体（Ａ−Ｂ）を固定化した担体を用いて、標識抗体（Ｉｇ−Ｌ）と薬物代謝酵素によって生成された（Ａ）を競合反応させる系も可能である。この場合遊離の（Ｉｇ−Ｌ）もしくは担体と結合した（Ｉｇ−Ｌ）の標識（Ｌ）の量を計測する。特異的抗体を固相化したものと酵素標識生成物を用いた測定系において得られる、薬物代謝酵素阻害のドーズレスポンスカーブ（用量曲線）を図３に模式的に示す。
【００２６】
本発明において表面プラズモン共鳴法、水晶振動共鳴法を用いた場合の測定原理を図４および図１２に示す。これらの方法の場合、特異的抗体を金薄膜表面あるいは水晶振動子上に固定化するか、シグナルを生じない蛋白質（Ｂ）とＡを架橋結合した複合体（Ａ−Ｂ）を金薄膜表面あるいは水晶振動子上に固定化するかいずれかである。
【００２７】
本発明における生成物特異抗体あるいは生成物−蛋白質架橋複合体を固定化するための不溶性担体としては、ポリスチレン・ナイロン・ポリカーボネートなどプラスチック、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、デキストラン、セファロース、ニトロセルロース、ガラス、濾紙などが使用可能である。各担体には各種の官能基（ヒドラジド基、アルキルアミノ基、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基など）が導入されていてもよい。担体の形状としては、マイクロタイタープレート、膜、シート、チップ、ビーズなど操作性のよいものを使用することができる。各不溶性担体の吸着可能力・結合能力はあらかじめ確認できている方が好ましいが、それらの情報は必ずしも必須ではない。本発明では、固相担体作製時に、共有結合によるカップリングも実施可能である。カップリング試薬としては、グルタルアルデヒド、カルボジイミドなどが用いられる。
【００２８】
本発明における抗体固相あるいは生成物−蛋白質架橋複合体を固定化する際に使用する吸着液のベース緩衝液としては、１０ｍＭ　りん酸緩衝液（１５０ｍＭＮａＣｌ含有：ｐＨ７．２）、５０ｍＭ　炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ含有：ｐＨ８．５）など、一般的に用いられているものを、抗体あるいは生成物−蛋白質架橋複合体の安定性が保持されるｐＨ範囲内（ｐＨ３．０〜１０．０：好ましくはｐＨ５．０〜９．０）で使用することができる。塩の種類、緩衝液の濃度は示した例に限定されるものではなく、適宜変更することができ、抗体固相あるいは生成物−蛋白質架橋複合体の種類によっては、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２、あるいは微量の重金属塩等を０．０１ｍＭ〜３００ｍＭの範囲で添加することが可能である。吸着・結合反応後、牛血清アルブミンやカゼイン・ゼラチンなどを、非特異的反応防止の為にブロッキング剤として０．０１％〜１０％（Ｗ／Ｖ）の範囲で使用することができる。このブロック剤のベース緩衝液としては吸着液に使用したりん酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液の他に、マレイン酸、乳酸などの有機酸緩衝液を１０ｍＭ〜３００ｍＭの範囲で使用することができる。ｐＨは測定系に関連するレセプター（抗体を含む）の安定化に最もふさわしい範囲を選択できるが、一般的にはｐＨ５．０〜ｐＨ８．５で使用することが多い。また固定化後の安定化のためにサッカロース・グルコース・デキストランなどの糖類を安定化剤として０．０１％〜２０％（Ｗ／Ｖ）の範囲で適宜添加することができる。
【００２９】
測定系に関与する抗体あるいは生成物−蛋白質架橋複合体を固定化させる時の濃度としては、０．１ｐｇ（ピコグラム）／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの範囲を使用することができる。より好ましくは１０ｐｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌを、さらに好ましくは０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌを選択することができる。
【００３０】
吸着・結合時に必要な時間としては、５分〜７２時間が選択可能であるが、より好ましくは１時間〜３６時間が選択できる。　インキュベートする温度としては、１℃〜４５℃が選択可能であるが、より好ましくは２℃〜３７℃が選択できる。
【００３１】
本発明で不溶性担体に抗体または生成物−蛋白質架橋複合体を吸着させた後、適宜１０ｍＭ　りん酸緩衝液（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ含むｐＨ７．２）などの洗浄液で洗浄することができる。洗浄剤にはツイーン２０やトリトンＸ−１００など、温和な非イオン界面活性剤等などを適宜加えることもできる。
【００３２】
薬物代謝酵素活性測定に使用する基質としては、例えばＣＹＰ１９に対しては、テストステロン、ジヒドロテストステロン、アンドロステンジオン、７−エトキシ−３−シアノクマリン、７−メトキシ−４−トリフルオロメチルクマリン、７−ベンジロキシ−４−トリフルオロメチルクマリン、ジベンジルフルオレセイン、７−エトキシ−４−トリフルオロメチルクマリン　等を使用することができる。ＣＹＰ１Ａ２に対しては、アミノフィリン、アミトリプチリン、ベタキソロール、カフェイン、クロミプラミン、クロザピン、クロルプロマジン、フルボキサミン、ハロペリドール、イミプラミン、メトクロプラミド、オランザピン、オンダンセトロン、プロプラノロール、タクリン、テオフィリン、チオリダジン、トリフルオペラジン、ヴェラパミル、（Ｒ）‐ワルファリン　等を使用することができる。ＣＹＰ２Ｃ９に対しては、アミトリプチリン、セリヴァスタチン、デイコフェナック、フルオクセチン、フラバスタチン、イブプロフェン、ロザルタン、ネプロケセン、トルブタミド、トルセミデ、（Ｓ）‐ワルファリン等を使用することができる。ＣＹＰ２Ｃ１９に対しては、アミトリプチリン、シタロプラム、クロミプラミン、ジアゼパム、フルニトラゼパム、イミプラミン、ランソプラゾル、オメプラゾル等を使用することができる。ＣＹＰ２Ｄ６に対しては、アミノプチリン、ベタキソロール、クロミプラミン、クロザピン、コデイン、デシプラミン、デキストロメソルファン、ドネパジル、フレサイアナイド、フルオクセチン、ハロペリドル、イミプラミン、メサドン、メトクロパラミド、メトプロロール、メキシリチン、ノルトリプチリン、オランザピン、オンダンセトロン、オルフェナドリン、パラケシチン、ピンドロール、プロパフェノン、プロプラノール、リスペルドン、セルトラリン、チオリダジン、チモロロール、トラゾドン、ヴェンラフィキサン等を使用することができる。ＣＹＰ２Ｅ１に対しては、アセタミノフェン、カフェイン、クロルゾクサゾン、デキストロメソルファン、エタノール、テオフィリン、ヴェンラファキシン等を使用することができる。ＣＹＰ３Ａに対しては、アラプラゾラム、アミオダロン、アミトリプチリン、アステミゾール、ブデソニデ、ブプロピン、ブスピロン、カフェイン、カルバマゼピン、セリバスタチン、シサプライド、クラリソマイシン、クロミプラミン、クロナゼパム、コデイン、シクロスポリン、デキサメタゾン、デキストロメソファン、ジヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、ジアゼパム、ジルチアゼム、ジソピラミド、ドネペジル、ドキシサイクリン、エリスロマイシン、エストラジオール、エチニルエストラジオール、フェロデピン、フルオクセチン、イミプラミン、ランソプラゾール、リドカイン、ロラタダイン、ロバスタチン、ミダゾラム、ネファゾドン、ニカルデイピン、ニフェデピン、ニソルデイン、ノルエティンドロン、オメプラゾル、オンダセルトン、オルフェナドリン、パロキセチン、プロゲステロン、プロパフェノン、クエテイアピン、キニジン、リファムピン、セルトライン、ジブトラミン、ジルデナフィル、シムバスタチン、タクロリムス、タモキシフェン、テルフェナミド、テストステロン、テオフィリン、トラゾドン、トリアゾラム、ヴェンラファキシン、ベラパミル、ヴィンブラスチン、（Ｒ）‐ワルファリン、ゾルピデム等を使用することができる。１７βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼに対しては、エストロン等を使用することができる。これらの基質の多くは内在性のホルモンかあるいは薬物として使用されているものであり、これらを本発明の薬物代謝酵素阻害剤の評価に使用する場合は、薬物代謝酵素に対する阻害効果に加えてさらに、薬物‐薬物相互作用の効果も含んだ評価となる。
【００３３】
薬物代謝酵素活性測定に使用する抗体としては、上述の基質が代謝された生成物を特異的に認識する抗体であれば、使用に制限はないが、例えば抗テストステロン抗体、抗エストロン抗体、抗６β‐ヒドロキシプロゲステロン抗体、　抗１１‐デオキシコルチコステロン、抗ヒドロキシワルファリン抗体、抗フルオレセイン抗体　等を使用することができる。　基質との交差反応性が低く、代謝生成物に対する感度が高い、実用的なモノクローナル抗体の使用が好適である。
【００３４】
薬物代謝酵素活性阻害効果を評価する際に、反応後、薬物代謝酵素反応時、薬物代謝酵素は固定化されていても良い。また薬物代謝酵素反応後、不溶性担体に固定化された薬物代謝酵素特異的抗体により補足・固定化し、反応系外に除去しても良い。また予め薬物代謝酵素をビオチン化しておき、薬物代謝酵素反応後、不溶性担体に固定化されたストレプトアビジンにて反応系外に除去しても良い。あるいは薬物代謝酵素活性阻害効果を評価する際に、反応後、薬物代謝酵素の活性を抑制するために、加熱処理をすることができる。あるいは反応後、既知の薬物代謝酵素の阻害剤を添加することができる。
【００３５】
薬物代謝酵素、特にサイトクロームＰ４５０反応に必要なニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）（以下ＮＡＤＰＨとも記載）を補完する再生系としては、ＮＡＤＰＨを産生することができる酵素系であれば限定されることはないが、薬物代謝酵素反応及び薬物代謝酵素反応後の免疫反応に影響を与えないことが望ましい。この様な酵素系として、グルコース６リン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）（以下ＮＡＤＰ＋とも記載）とグルコース６リン酸脱水素酵素の組合せ、イソクエン酸、ＮＡＤＰ＋とイソクエン酸脱水素酵素の組合せ等がある。
【００３６】
薬物代謝酵素反応の基質は、極めて多量に存在する場合、薬物代謝酵素反応後の免疫化学反応に影響を与える場合がある。このため実質的に影響が出ないレベルにまで、基質の量を調節することが好ましい。具体例として、サイトクロームＰ４５０　ＣＹＰ１９の場合、基質としてテストステロンを、特異抗体として抗１７βエストラジオール抗体、標識体として１７β‐エストラジオール標識ペルオキシダーゼを選択した場合、抗１７βエストラジオール抗体の特異性が非常に高く、テストステロンに対する交差反応性が極めて低い場合においても、一般に薬物代謝酵素の反応として使用する際の基質濃度（１ｍＭ〜１００ｍＭ）では、特異的抗体にとって量的に極めて過剰であり、抗１７β−エストラジオール抗体と１７β−エストラジオールの免疫反応に影響を及ぼす場合がある。この場合基質濃度としてテストステロン濃度を減じることで、実質的に免疫反応に影響が出ないようにすることができる。他のアンドロジェン基質も、生成物特異的抗体の性能にもよるが、サイトクロームＰ４５０反応時の基質濃度が０．０５ｎＭ〜５００μＭであることが好ましい場合がある。あるいはサイトクロームＰ４５０　ＣＹＰ２Ｃ１９の場合、基質としてジベンジルフルオレセインを、特異抗体として抗フルオレセイン抗体、標識体としフルオレセインイソシアネート標識ペルオキシダーゼを選択した場合、抗フルオレセイン抗体の特異性が非常に高く、ジベンジルフルオレセインに対する交差反応性が極めて低い場合においても、酵素の反応として使用する際の基質濃度（１ｍＭ〜１００ｍＭ）では、特異的抗体にとって量的に極めて過剰であり、抗フルオレセイン抗体とフルオレセインとの免疫反応に影響を及ぼす場合がある。この場合基質濃度としてジベンジルフルオレセイン濃度を減じることで、実質的に免疫反応に影響が出ないようにすることができる。抗体の性能にもよるが、サイトクロームＰ４５０　２Ｃ１９反応時の基質濃度が０．０５ｎＭ〜５００μＭであることが好ましい場合がある。
【００３７】
薬物代謝酵素、特にサイトクロームＰ４５０反応のもう一つの電子伝達体としてのＮＡＤＰＨを使用する場合は、ＮＡＤＰＨとして直接反応系に、一般に使用される０．１ｍＭ〜１０．０ｍＭの範囲で添加することが可能である。あるいはＮＡＤＰ＋として添加し、上述の再生系の組合せを添加しても良い。グルコース６リン酸、ＮＡＤＰ＋、グルコース６リン酸脱水素酵素の組合せの場合、それぞれ　０．２ｍＭ〜２０ｍＭ、０．１ｍＭ〜５．０ｍＭ、０．１ユニット／ｍｌ〜２０ユニット／ｍｌの範囲で使用可能である。より好ましくはそれぞれ　０．５ｍＭ〜１０ｍＭ、０．５ｍＭ〜３．０ｍＭ、０．５ユニット／ｍｌ〜１０ユニット／ｍｌの範囲で使用可能である。なおグルコース６リン酸、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＰＨはナトリウム塩、カリウム塩等の形で使用することができ、酵素類は高純度精製品・部分精製品・硫安懸濁品等を使用することができる。
【００３８】
免疫化学的測定として酵素免疫測定法を用いる場合、標識用酵素として、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、リゾチーム等、一般の酵素免疫測定法に使用されているものを制限なく利用できる。また適宜それら選択した酵素に応じて、テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）、ｏ−フェニレンジアミン、２，２−アジノジ−（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム（ＡＢＴＳ）、ｐ−ニトロフェニルリン酸、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド等の各種酵素に対応した基質が使用できる。
【００３９】
薬物代謝酵素反応及び免疫化学的反応においては、評価対象とする化学物質の溶解性を高めるため、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等の有機溶媒を含むことができる。それらの有機溶媒はサイトクロームＰ４５０反応及び免疫化学反応に影響しない範囲か、影響を無視できる範囲で使用することができる。サイトクロームＰ４５０の種類によって異なるが、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドは、およそ０．１〜２０％、好ましくは０．２％〜１０％、より好ましくは　０．２％〜５％で使用することができる。
【００４０】
本発明でいう測定用キットとは、上述の生成物を特異的に認識する抗体を用いて、酵素免疫測定法、表面プラズモン共鳴法、微量示差熱測定法、水晶振動共鳴法などによる測定を可能にする各種の試薬群（固相化された担体を含む）のことである。具体的には特異抗体（生成物架橋結合蛋白質）固定化プレートあるいは特異抗体固定化（生成物架橋結合蛋白質）金薄膜チップ、特異抗体（生成物架橋結合蛋白質）固定化水晶振動子チップ、反応用緩衝液、特異抗体液、抗体試料希釈液、標準品、標識量を定量するための酵素基質液などから適宜選択される組成物を組合せたセットをいう。
【００４１】
本発明でいう非ステロイド性化学物質とは、いわゆるステロイド骨格を有しない、アミノグルテチミド、ナフトフラボンなどをいう。ステロイド骨格を有する化学物質のうちあるものは、薬物代謝酵素、特にサイトクロームＰ４５０等の生成物質と構造的に類似するため、生成物特異的抗体に対して若干交差反応性を有する場合がある。これらの場合得られる阻害効果は、低く見積られ、偽陰性の結果を生じる可能性がある。こうした化学物質を評価する場合、特に薬物代謝酵素のみを除いた測定系にて評価した結果と照らし合わせて、化学物質の阻害効果を論じなければならない。しかしながらサイトクロームＰ４５０阻害剤のうち、薬剤として開発されるものは、種々の理由からステロイド骨格を有しないものもあり、本発明は特に非ステロイド性サイトクロームＰ４５０阻害剤のスクリーニングとしても有用である。また内分泌撹乱物質として問題になっている物質の多くは芳香環を有するが、非ステロイド性のものが多く、本発明は特に内分泌撹乱物質のスクリーニングとしても有用である。
【実施例】
本発明の実施における望ましい態様を実施例として以下に述べる。
【００４２】
［実施例１］
（抗エストラジオール抗体固定化プレートの作製）
エストラジオールの３位の位置を利用して架橋された蛋白質を抗原として得た、精製抗エストラジオール抗体を、１μｇ／ｍｌとなるように５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に希釈し（抗体吸着液）、コーニングコースター社製のマクロタイタープレート（９６ウエルタイプ：材質はポリスチレン）に１ウエルあたり１００μＬづつ分注した。分注後プレート表面をシールし、４℃にて終夜静置した。翌日抗体吸着液を除去し、１ウエルあたり１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．２；１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む）　２００μＬにて３回洗浄した。洗浄後１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．２；１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む：りん酸緩衝液１）をベースとし、０．２％カゼイン、１０％サッカロースを含むブロッキング溶液　２００μＬを１ウエルづつ満たした。ブロッキング液を満たした後プレートを４℃にて終夜静置し、翌日ブロッキング液除去後１６時間の真空乾燥を実施した。真空乾燥したプレートは減圧化にて保管袋に密封し、以下の測定に供するまで４℃にて保存した。
（サイトクロムＰ４５０の測定）
ジェンテスト（ＧＥＮＴＥＳＴ）社製の組換えヒトサイトクロームＰ４５０　ＣＹＰ１９を、１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．２　；０．１％ＢＳＡを含む：りん酸緩衝液２）にて希釈し、各濃度系列を作製した。この各濃度系列　２５μＬと、りん酸緩衝液２をベースとした、グリセロール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下Ｇ６ＰＤＨとも記載）（０．５ユニット／ｍｌ）、ＭｇＣｌ２　４．１３ｍＭ、ＮＡＤＰ・２Ｎａ　１．６３ｍＭ、Ｇ６Ｐ・Ｎａ　４．１３ｍＭ、テストステロン６２．５μＭの反応混合液　１００μＬ　及び　りん酸緩衝液２　２５μＬをポリプロピレン製アッセイプレート（９６ウエル）中にて混合し、３７℃にて２０分間反応させた。ヒトサイトクロームＰ４５０　ＣＹＰ１９はテストステロンを１７β‐エストラジオールに変換するものである。この反応液を５０μＬとり、１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．２　；０．１％ＢＳＡを含む：りん酸緩衝液３）をベースとしたペルオキシダーゼ標識エストラジオール（Ｅ２−ＨＲＰ）５０μＬと、抗エストラジオール抗体固定化プレート上にて混合し、４℃にて１時間反応させた。反応後ツイン２０　０．１％を含むりん酸緩衝液１　２００μＬにてプレートを３回洗浄後、テトラメチルベンチジンを含む酵素反応溶液１００μＬを加え、３７℃にて２０分間インキュベートした。この後１Ｎ　硫酸１００μＬにて酵素反応をとめ、４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーにて測光し、データ処理を実施した。ヒトアロマターゼの各濃度系列と得られる吸光度の関係を図５に示す。アロマターゼの濃度と吸光度は非常に高い相関性をもっており、本実施例の方法により吸光度のデータより試料中のヒトサイトクロームＰ４５０　ＣＹＰ１９活性が測定できることが示されている。
【００４３】
［実施例２］
（化学物質のヒトサイトクロームＰ４５０　ＣＹＰ１９への阻害効果の評価　▲１▼）
ジェンテスト（ＧＥＮＴＥＳＴ）社製の組換えヒトサイトクロームＰ４５０　ＣＹＰ１９を、りん酸緩衝液２にて約１６００倍希釈し、このヒトサイトクロームＰ４５０　ＣＹＰ１９溶液　２５μＬと、りん酸緩衝液２をベースとした、Ｇ６ＰＤＨ（０．５ユニット／ｍｌ）、ＭｇＣｌ２　４．１３ｍＭ、ＮＡＤＰ・２Ｎａ　１．６３ｍＭ、Ｇ６Ｐ・Ｎａ　４．１３ｍＭ、テストステロン６２．５μＭの反応混合液　１００μＬ　及び　りん酸緩衝液２をベースとした２５μＬのαナフトフラボン０μＭ〜３．２μＭ（終濃度）溶液を、ポリプロピレン製アッセイプレート（９６ウエル）中にて混合し、３７℃にて２０分間反応させた。この反応液を５０μＬとり、以後実施例１と同様の操作を実施し、各αナフトフラボン溶液濃度と４５０ｎｍでの吸光度の関係を求めた。図６にその対応関係を示す。αナフトフラボンの量の増加に伴って、サイトクロームＰ４５０　ＣＹＰ１９の阻害が強くなり、生成するエストラジオール量が少なくなり、酵素免疫測定法でのシグナル量が増加していることが判る。
【００４４】
［実施例３］
（化学物質のサイトクロームＰ４５０　ＣＹＰ１９への阻害効果の評価　▲２▼）
実施例２のαナフトフラボンにかえて、０〜９μＭ（終濃度）のアミノグルテチミド溶液を用いて同様の操作を実施し、各アミノグルテチミド溶液濃度と４５０ｎｍでの吸光度の関係を求めた。図７にその対応関係を示す。アミノグルテチミドの量の増加に伴って、実施例２同様にサイトクロームＰ４５０　ＣＹＰ１９の阻害が強くなり、生成するエストラジオール量が少なくなり、酵素免疫測定法でのシグナル量が増加していることが判る。
【００４５】
［実施例４］
（化学物質の１７β‐ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼへの阻害効果の評価）
実施例２のサイトクロームＣＹＰ１９に変えて、東洋紡績社製シュードモナス由来の１７β‐ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼと、基質のテストステロンに変えて、エストロンを、さらに実施例２のαナフトフラボンにかえて、０〜２０μＭ（終濃度）のゲニステイン溶液を用いて同様の操作を実施し、各溶液濃度と４５０ｎｍでの吸光度の関係を求めた。ここで１７β‐ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼは、エストロンを１７β‐エストラジオールに変換するものである。図８にその対応関係を示す。アミノグルテチミドの量の増加に伴って、実施例２同様に１７β‐ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの阻害が強くなり、生成するエストラジオール量が少なくなり、酵素免疫測定法でのシグナル量が増加していることが判る。
【００４６】
［実施例５］
（抗フルオレセイン抗体固定化プレートの作製）
フルオレセインのＸ位の位置を利用して架橋された蛋白質を抗原として得た、精製抗フルオレセイン抗体を、１μｇ／ｍｌとなるように５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に希釈し（抗体吸着液）、コーニングコースター社製のマクロタイタープレート（９６ウエルタイプ：材質はポリスチレン）に１ウエルあたり１００μＬづつ分注した。分注後プレート表面をシールし、４℃にて終夜静置した。翌日抗体吸着液を除去し、１ウエルあたり１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．２；１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む）　２００μＬにて３回洗浄した。洗浄後１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．２；１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む：りん酸緩衝液１）をベースとし、０．２％カゼイン、１０％サッカロースを含むブロッキング溶液　２００μＬを１ウエルづつ満たした。ブロッキング液を満たした後プレートを４℃にて終夜静置し、翌日ブロッキング液除去後１６時間の真空乾燥を実施した。真空乾燥したプレートは減圧化にて保管袋に密封し、以下の測定に供するまで４℃にて保存した。
（ヒトサイトクロムＰ４５０　ＣＹＰ２Ｃ１９　の測定）
ジェンテスト（ＧＥＮＴＥＳＴ）社製の組換えヒトサイトクロームＰ４５０　ＣＹＰ２Ｃ１９　を、１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．２　；０．１％ＢＳＡを含む：りん酸緩衝液２）にて希釈し、各濃度系列を作製した。この各濃度系列２５μＬと、りん酸緩衝液２をベースとした、Ｇ６ＰＤＨ（０．５ユニット／ｍｌ）、ＭｇＣｌ２　４．１３ｍＭ、ＮＡＤＰ・２Ｎａ　１．６３ｍＭ、Ｇ６Ｐ・Ｎａ　４．１３ｍＭ、ジェンテスト社製ジベンジルフルオレセイン　６２．５μＭの反応混合液　１００μＬ　及び　りん酸緩衝液２　２５μＬをポリプロピレン製アッセイプレート（９６ウエル）中にて混合し、３７℃にて２０分間反応させた。この反応液を５０μＬとり、１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．２　；０．１％ＢＳＡを含む：りん酸緩衝液３）をベースとしたシグマ社より入手したペルオキシダーゼ標識フルオレセン（Ｅ２−ＨＲＰ）５０μＬと、コスモバイオ社より入手した抗フルオレセイン抗体固定化プレート上にて混合し、４℃にて１時間反応させた。反応後ツイン２０　０．１％を含むりん酸緩衝液１　２００μＬにてプレートを３回洗浄後、テトラメチルベンチジンを含む酵素反応溶液１００μＬを加え、３７℃にて２０分間インキュベートした。この後１Ｎ　硫酸１００μＬにて酵素反応をとめ、４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーにて測光し、データ処理を実施した。ヒトサイトクロームＰ４５０　ＣＹＰ２Ｃ１９の各濃度系列と得られる吸光度の関係を図９に示す。ヒトサイトクロームＰ４５０　ＣＹＰ２Ｃ１９の濃度と吸光度は非常に高い相関性をもっており、本実施例の方法により吸光度のデータより試料中のヒトサイトクロームＰ４５０　ＣＹＰ２Ｃ１９活性が測定できることが示されている。
【００４７】
［実施例６］
（化学物質のヒトサイトクロームＰ４５０　ＣＹＰ２Ｃ１９への阻害効果の評価　▲１▼）
ジェンテスト（ＧＥＮＴＥＳＴ）社製の組換えヒトサイトクロームＰ４５０　ＣＹＰ２Ｃ１９を、りん酸緩衝液２にて約　２０００倍希釈し、このヒトサイトクロームＰ４５０　ＣＹＰ２Ｃ１９溶液　２５μＬと、りん酸緩衝液２をベースとした、Ｇ６ＰＤＨ（０．５ユニット／ｍｌ）、ＭｇＣｌ２　４．１３ｍＭ、ＮＡＤＰ・２Ｎａ　１．６３ｍＭ、Ｇ６Ｐ・Ｎａ　４．１３ｍＭ、ジベンジルフルオレセイン　３０μＭの反応混合液　１００μＬ　及び　りん酸緩衝液２をベースとした２５μＬのシグマ社製ケトコナゾール　０μＭ〜１２μＭ（終濃度）溶液を、ポリプロピレン製アッセイプレート（９６ウエル）中にて混合し、３７℃にて２０分間反応させた。この反応液を５０μＬとり、以後実施例１と同様の操作を実施し、各ケトコナゾール溶液濃度と４５０ｎｍでの吸光度の関係を求めた。図１０にその対応関係を示す。ケトコナゾールの量の増加に伴って、ヒトサイトクロームＰ４５０　ＣＹＰ２Ｃ１９の阻害が強くなり、生成するフルオレセイン量が少なくなり、酵素免疫測定法でのシグナル量が増加していることが判る。
【００４８】
［実施例７］
（化学物質のヒトサイトクロームＰ４５０　ＣＹＰ２Ｃ１９への阻害効果の評価
▲２▼）
実施例２のケトコナゾールにかえて、０〜２μＭ（終濃度）のチクロピダイン溶液を用いて同様の操作を実施し、各チクロビダイン溶液濃度と４５０ｎｍでの吸光度の関係を求めた。図１１にその対応関係を示す。チクロビダインの量の増加に伴って、実施例２同様にヒトサイトクロームＰ４５０　ＣＹＰ２Ｃ１９の阻害が強くなり、生成するフルオレセイン量が少なくなり、酵素免疫測定法でのシグナル量が増加していることが判る。
【００４９】
【発明の効果】
本発明により、放射性化合物を用いることなく、簡便・迅速に効率よくアロマターゼ活性を測定することができる。また本発明により、放射性化学物質を用いることなく、簡便・迅速にかつ効率的に多数の化学物質の薬剤代謝酵素阻害活性の評価を実施することができる。本発明はこれらの簡便・迅速性より、特に薬物代謝酵素を標的とする薬剤および撹乱化学物質の評価に好適である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で包含する競合法（抗体を固定化）の酵素免疫測定法での測定原理を模式的に示す。
【図２】本発明で包含する競合法（生成物−蛋白質架橋複合体）の酵素免疫測定法での測定原理を模式的に示す。
【図３】本発明で阻害剤をスクリーニングする際に得られるドーズレスポンスカーブのモデルを模式的に示す。
【図４】本発明で包含する表面プラズモン共鳴法、水晶振動法での測定原理（生成物特異的抗体を固定化する場合）を模式的に示す。
【図５】実施例１での、ヒトサイトクロームＰ４５０　ＣＹＰ１９の　各濃度系列と得られる吸光度の関係を示す。
【図６】実施例２での、各αナフトフラボン溶液濃度と４５０ｎｍでの吸光度の関係をを示す。
【図７】実施例３での、各アミノグルテチミド溶液濃度と４５０ｎｍでの吸光度の関係を示す。
【図８】実施例４での、各ゲニステイン溶液濃度と４５０ｎｍでの吸光度の関係を示す。
【図９】実施例５での、ヒトサイトクロームＰ４５０　ＣＹＰ２Ｃ１９　の各濃度系列と得られる吸光度の関係を示す。
【図１０】実施例６での、各ケトコナゾール溶液濃度と４５０ｎｍでの吸光度の関係をを示す。
【図１１】実施例７での、各チクロピダイン溶液濃度と４５０ｎｍでの吸光度の関係を示す。
【図１２】本発明で包含する表面プラズモン共鳴法、水晶振動法での測定原理（生成物−蛋白質を固定化する場合）を模式的に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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