(57)【要約】【課題】ベクターのセルフライゲーションや、複数の挿入断片がベクターに挿入されたクローンをなくし、一つのベクターに対し一つの遺伝子断片が確実に挿入された組み換えベクターを得る技術を提供する。【解決手段】遺伝子断片における各相補鎖の全長をそれぞれプライマーとするとともに、該遺伝子とハイブリダイズする相同な配列を有するベクターを鋳型として、ＰＣＲを行い組み換えベクターを得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子断片のクローニングまたは発現のために該遺伝子断片を含有する組み換えプラスミドを作成する方法であって、該遺伝子断片における各相補鎖の全長をそれぞれプライマーとするとともに、該遺伝子とハイブリダイズする相同な配列を有するプラスミドを鋳型として、ＰＣＲを行うことを特徴とする組み換えプラスミドの作成方法。
【請求項２】
請求項１の方法において、ＰＣＲを行った後、鋳型として使用したプラスミドを制限酵素ＤｐｎＩで切断除去する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の組み換えプラスミドの作成方法。
【請求項３】
請求項２の作成方法により得られる組み換えプラスミドであって、２本鎖ＤＮＡからなるとともに、２本鎖ＤＮＡの各ＤＮＡ鎖が、上記遺伝子断片部分と、上記相同配列部分を除くプラスミド部分とからなる線状のＤＮＡからなることを特徴とする組み換えプラスミド。
【請求項４】
宿主細胞への導入により該細胞内で修復により環状化されるものである請求項３に記載の組み換えプラスミド。
【請求項５】
複数の変異遺伝子断片を含有する試料を用いて、変異遺伝子断片を各々一つずつ含有する組み換えプラスミドを得る工程を含む変異遺伝子ライブラリを作成する方法であって、複数の変異遺伝子断片における相補鎖の全長をプライマーとするとともに、これら遺伝子断片にハイブリダイズする相同な配列を有するプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行うことを特徴とする、変異遺伝子ライブラリの作成方法。
【請求項６】
請求項５の方法により得られた変異遺伝子ライブラリ。
【請求項７】
請求項６の変異遺伝子ライブラリを翻訳または発現したものである変異タンパク質ライブラリ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な組み換えプラスミドの作成方法、該方法により得られた組み換えプラスミド、該組み換えプラスミドの作成法を応用した変異遺伝子ライブラリの作成方法、並びに該方法を使用して得た変異遺伝子ライブラリ及び変異タンパク質ライブラリに関する。
【０００２】
【従来の技術】
制限酵素とリガーゼの組み合わせによる遺伝子断片のベクターへのクローニングは確立された技術ではあるが、ベクターの自己環状化や、一つのベクターに対し複数の挿入断片が挿入されたクローンが出現することが問題となっていた。このことは、遺伝子一つ一つの機能をスクリーニングするための変異遺伝子ライブラリを作成する際に、とくに大きな問題となる。そのため、一つのベクターに対し一つの挿入断片を確実にクローニングするための方法が渇望されていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、上記従来技術の問題点に鑑み、ベクターの自己環状化や、一つのベクターに対し複数の挿入断片が挿入されたクローンをなくし、一つのベクターに対し一つの遺伝子断片が確実に挿入された組み換えベクターを得る技術を提供することにあり、さらに該技術を使用して有用な変異遺伝子ライブラリ、あるいは変異タンパク質ライブラリを提供しようとするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者は、上記従来技術の制限酵素とリガーゼによる組み換えベクターの作成法を採用する以上上記従来技術の問題点の解消は困難であり、従来技術とは全く異なるアプローチによる組み換えベクターの作成方法を提供するため、鋭意研究の結果、遺伝子断片における各相補鎖の全長をそれぞれプライマーとするとともに、該遺伝子とハイブリダイズする相同な配列を有するベクターを鋳型として、ＰＣＲを行い組み換えベクターを得る方法を創出し、本発明を完成するに至ったものである。
【０００５】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（５）に関するものである。
（１）遺伝子断片のクローニングまたは発現のために該遺伝子断片を含有する組み換えプラスミドを作成する方法であって、該遺伝子断片における各相補鎖の全長をそれぞれプライマーとするとともに、該遺伝子とハイブリダイズする相同な配列を有するプラスミドを鋳型として、ＰＣＲを行うことを特徴とする組み換えプラスミドの作成方法。
（２）上記（１）の方法において、ＰＣＲを行った後、鋳型として使用したプラスミドを制限酵素ＤｐｎＩで切断除去する工程をさらに含むことを特徴とする上記（１）に記載の組み換えプラスミドの作成方法。
（３）上記（１）の作成方法により得られる組み換えプラスミドであって、２本鎖ＤＮＡからなるとともに、２本鎖ＤＮＡの各ＤＮＡ鎖が、上記遺伝子断片部分と、上記相同配列部分を除くプラスミド部分とからなる線状のＤＮＡからなることを特徴とする組み換えプラスミド。
（４）宿主細胞への導入により該細胞内で修復により環状化されるものである上記（３）に記載の組み換えプラスミド。
（５）複数の変異遺伝子断片を含有する試料を用いて、変異遺伝子断片を各々一つずつ含有する組み換えプラスミドを得る工程を含む変異遺伝子ライブラリを作成する方法であって、複数の変異遺伝子断片における相補鎖の全長をプライマーとするとともに、これら遺伝子断片にハイブリダイズする相同な配列を有するプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行うことを特徴とする、変異遺伝子ライブラリの作成方法。
（６）上記（５）の方法により得られた変異遺伝子ライブラリ。
（７）上記（６）の変異遺伝子ライブラリを翻訳または発現したものである　変異タンパク質ライブラリ。
【０００６】
以下、本発明の組み換えベクターの作成法について図１を参照しながらさらに詳細に説明する。
（１）　遺伝子断片の調製；本発明において組み換えプラスミドにおいて含有させる対象遺伝子断片は、化学合成したもの、各種遺伝子源から制限酵素等のヌクレアーゼを用いて切り出したもの（ａ’）、あるいはアッパープライマー、ロウワープライマーを用い、遺伝子あるいは該遺伝子を含むプラスミドを鋳型として、ＰＣＲにより複製増幅したもの（ａ）等が挙げられるが、これらに限らずいかなるものであってもよい。
【０００７】
また、上記ＰＣＲ法として変異ＰＣＲ法を使用する場合、得られるものは種々の変異遺伝子の集合体であり、これを用いて、本発明の組み換えプラスミドの作成方法を実施すれば、後記することから明らかなように、変異遺伝子ライブラリを作成できる。
【０００８】
（２）　ＰＣＲによる組換えプラスミド合成；本発明においては、上記各種方法により得た遺伝子断片の全長をＰＣＲのプライマーとする。すなわち、該遺伝子断片の各相補鎖全体をプライマーとし、該遺伝子とハイブリダイズする相同な配列を有するプラスミドを鋳型として、ＰＣＲを行う。
上記ＰＣＲにおいては、鋳型プラスミドを加熱してその相補鎖を解離させ、次いで、プライマーとなる該遺伝子断片の各相補鎖を反応系に加え、冷却して上記分離された鋳型プラスミドの各相補鎖にそれぞれ該遺伝子断片の各相補鎖をハイブリダイズさせる。この後ＤＮＡポリメラーゼとヌクレオチドを加え、各プライマーの下流側に、鋳型プラスミドを鋳型にしたＤＮＡ鎖を伸長させる。この操作を複数サイクル行い、上記各プライマーの下流側に鋳型プラスミドの上記相同配列部分を除いたプラスミドの配列が付加された線状ＤＮＡを複製増幅する。
【０００９】
（３）　鋳型プラスミド切断除去；この後、ＤｐｎＩ等により環状プラスミドである鋳型プラスミドを消化する。
これにより得られるものは、２本鎖ＤＮＡからなるとともに、２本鎖ＤＮＡの各ＤＮＡ鎖が、上記遺伝子断片部分と、上記相同配列部分を除くプラスミド部分とからなるニックの入った線状の組み換えプラスミドである。
【００１０】
なお、上記ＤｐｎＩはメチル化されたＤＮＡのみを特異的に切断するため、ｄａｍ＋の遺伝子型をもつエシェリシア　コリー内などで増幅されたプラスミドが基質となり、メチル化されていないヌクレオチドを用いて合成されたＰＣＲ産物などは切断を受けない。
このことにより、新たに合成されたニックの入ったプラスミドが形質転換能を有し、ＤｐｎＩで切断された鋳型プラスミドは形質転換能を有さなくなる。
（４）　形質転換；上記（３）の工程により得られた、線状の２本鎖ＤＮＡからなる組み換えプラスミドを宿主細胞に導入して該細胞の形質転換を行う。上記線状の組み換えプラスミドは、各相補のＤＮＡ鎖を基にその欠陥部分が修復され、環状プラスミドとなり、宿主細胞において複製され、該遺伝子断片のクローニングあるいはその発現が可能となる。
【００１１】
以上説明したように、本発明においては、組み換えプラスミドの作成において、遺伝子断片をプラスミドに制限酵素及びリガーゼを用いて挿入する手法ではなく、いわば、該遺伝子断片をプライマーとして、プラスミド部分を合成するものであって、このような組み換えプラスミドの作成法によれば、ベクターの自己環状化や、一つのベクターに対し複数の挿入断片が挿入されたクローンが出現しないことは容易に理解されることである。
【００１２】
また、従来、環状プラスミドを鋳型とし、ＰＣＲ法により全プラスミド配列を合成する方法もあるが、この方法で使用するプライマーは、たかだか２５−４０塩基対程度の長さの化学合成オリゴヌクレオチドであり、通常数千塩基対程度からなるプラスミド全体のうちの、ごくわずかな塩基の部位特異的な置換を目的としたものである。これに対して、本発明は、組み換え対象遺伝子の各相補鎖の全長をプライマーとするものであって、例えば数百塩基対以上の長さの遺伝子断片をプライマーとするものである。そしてこのような全長遺伝子断片をプライマーとして用いて、これら全長遺伝子断片部分の配列を含むプラスミド全体を合成して組み換えプラスミドを作成しようとするものであり、このような試みは従来なされておらず、本発明は全く新しい着想に基づくものである。
さらに、本発明の組み換えプラスミドの作成法は変異遺伝子ライブラリの形成において極めて有効である。
【００１３】
本発明において変異遺伝子ライブラリを作成するには、上記したように、まず組み換え対象となる遺伝子断片を変異ＰＣＲ法により作成するが、この際得られるものは種々の変異遺伝子の集合体であり、これをそのままプライマーとして用いる。一方、鋳型プラスミドとしては、上記集合体の各変異遺伝子と相同性があり、上記各変異遺伝子とハイブリダイズ可能な遺伝子部分を有するプラスミドを使用してＰＣＲ法を行う。ＰＣＲにおいては、集合体の各変異遺伝子断片を構成する各相補鎖は、鋳型となる相同遺伝子部分の各相補鎖とハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼにより、その下流側に鋳型プラスミドの相同遺伝子部分を除く配列に対応するＤＮＡ鎖を伸長し、ニックの入った線状の組み換えプラスミドが合成される。この操作を複数サイクル繰り返し、該線状の組み換えプラスミドを複製増幅する。このＰＣＲ法により複製増幅されて得られるものは、一つのプラスミドに対し変異遺伝子を一つのみ含み、プラスミド部分の配列を共通にする組み換えプラスミドの集合体である。
【００１４】
次いで、この組み換えプラスミドにより大腸菌等の宿主細胞を形質転換して、培地に培養し、生じたコロニー毎に釣菌し、各培地に分けて培養することにより各変異遺伝子をクローニングし、変異遺伝子ライブラリとする。
また、この遺伝子ライブラリの遺伝子を大腸菌等の宿主細胞内で翻訳あるいは発現させることにより、変異タンパク質ライブラリとすることもできる。
【００１５】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
なお、以下の実施例においては、クローニングの対象となる挿入遺伝子断片として、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の遺伝子を用い（Ｓｃｈｏｌｚ　Ｏ，　Ｔｈｉｅｌ　Ａ，　Ｈｉｌｌｅｎ　Ｗ，　Ｎｉｅｄｅｒｗｅｉｓ　Ｍ．　２０００．　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ａｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ．　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６７（６）：１５６５−１５７０）、ＰＣＲの鋳型にはＧＦＰ遺伝子が挿入されたプラスミド（アンピシリン耐性遺伝子を含む）を用いた。
【実施例１】
（１）　鋳型プラスミドの調製
ＧＦＰ＋遺伝子以外のベクター部分は、Ｄａｔｅら（Ｄａｔｅ　Ｔ，　Ｔａｎｉｈａｒａ　Ｋ，　Ｎｕｍｕｒａ　Ｎ．　１９９０．　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｃ−Ｍｙｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｈａｔ　ｉｓ　ｉｎｉｔｉａｔｅｄ　ａｔ　ａ　ｎｏｎ−ＡＵＧ　ｃｏｄｏｎ　ｉｎ　ｅｘｏｎ　１．　Ｇｅｎｅ　９０（１）：１４１−１４４）により作成されたｐＴＤ−ｔａｃをもとに、該プラスミドの有する唯一のＮｃｏＩ認識部位（ＣＣＡＴＧＧ）をＮｄｅＩ認識部位（ＣＡＴＡＴＧ）に変換したプラスミドｐＴＤ−ｔａｃＮｄを作成した。次に、ＧＦＰ＋遺伝子の該ベクターへのクローニングは、以下のように行われた。即ち、２つのプライマー、５’−ＧＧＣＡＴＡＴＧＡＧＴＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＴＴＴ−３’（配列表の配列番号１）及び５’−ＧＧＴＡＡＴＧＧＴＡＧＣＧＡＣＣＧＧＣＧ−３’（同配列番号２）を用いて、クロンテック社製のＧＦＰｕｖをコードするプラスミドｐＧＦＰｕｖよりＧＦＰ遺伝子領域を定法に従いＰＣＲ法により増幅した。次に、増幅断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、先に同様の制限酵素により切断しておいたｐＴＤ−ｔａｃＮｄとを定法に従いライゲーションにより連結した。こうして得られたＧＦＰｕｖを発現する組み換えプラスミドに対し、ストラタジーン社製ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキットにより部位指定突然変異を行い、６４番目及び６５番目の位置のアミノ酸置換を行った。即ち、２つのプライマー、５’−ＣＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＣＡＣＴＡＣＴＴＴＡＡＣＴＴＡＴＧＧＴＧＴＴＣＡＡＴＧＣＴＴＴＴＣＣ−３’（同配列番号３）及び
５’−ＧＧＡＡＡＡＧＣＡＴＴＧＡＡＣＡＣＣＡＴＡＡＧＴＴＡＡＡＧＴＡＧＴＧＡＣＡＡＧＴＧＴＴＧＧ−３’（同配列番号４）を用い、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキットのマニュアルに従い実験を行った。こうして得られたＧＦＰ＋遺伝子部分の塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列表の配列番号５及び６に示す。本プラスミドは、イソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトピラノシドによる誘導により、蛍光をもった活性なＧＦＰ蛋白質を発現させる。
上記ＧＦＰ遺伝子が挿入されたプラスミドは、エシェリシア　コリーＪＭ１０９（ｄａｍ＋）内で増幅し、キアゲン社製のプラスミド精製キットを用いて精製した。
このＧＦＰ遺伝子が挿入されたプラスミドは以下の工程において本発明の鋳型プラスミドとして用いられる。このプラスミドの塩基配列を配列表に配列番号７として示す。
【００１６】
（２）　クローニングする断片の調製
ＧＦＰ遺伝子を変異ＰＣＲ法により増幅し、プライマーとなるＤＮＡ断片を調製した。変異ＰＣＲは定法に従い行った。反応溶液（総量５０μｌ）は、１０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ　８．３）、５０ｍＭ　塩化カリウム、７ｍＭ　塩化マグネシウム、０．４ｍＭ　塩化マンガン、０．０１％ゲラチン、０．２ｍＭ　ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ　ｄＧＴＰ、１ｍＭ　ｄＣＴＰ、１ｍＭ　ｄＴＴＰ、各２５ｐｍｏｌ　プライマー、５０ｎｇの上記（１）で得た鋳型プラスミド、１．２５ユニット　Ｔａｑ２０００　ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）を含む。用いたＰＣＲプライマー（５’−ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ−３’（同輩列番号８）及び５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣ−３’（同配列番号９）は、ベクターの配列の一部であり、ＧＦＰ遺伝子の全体を増幅するように設計されている。本溶液を９５℃　１分間の保温後、９４℃　３０秒、５５℃　３０秒、７２℃　３０秒の温度サイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃で５分間保温した。鋳型ＤＮＡは以下のＰＣＲによるプラスミド合成反応においても用いられるため、得られたＰＣＲ産物とともにキアゲン社製のＤＮＡ精製キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ；登録商標）により同時に精製し、６０μｌの水で溶出した。
【００１７】
（３）　組換えプラスミドのＰＣＲ合成
上記（２）で得たＤＮＡをプライマーに、（１）で得た変異前の遺伝子を含むプラスミドを鋳型とし、ＰＣＲを行うことにより、環状プラスミドのＰＣＲ合成を行った。反応溶液（総量５０μｌ）は、２０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ　８．８）、１０ｍＭ　塩化カリウム、１０ｍＭ　硫酸アンモニウム、２ｍＭ　硫酸マグネシウム、各０．２ｍＭ　デオキシリボヌクレオチド混合物、０．１％　トリトンＸ−１００、０．１ｍｇ／ｍｌ　牛血清アルブミン、（１）で得られたＰＣＲ産物及び鋳型プラスミド　４０μｌ、１．２５ユニット　ＰｆｕＴｕｒｂｏ　ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）を含む。本溶液を６８℃にて５分間の保温後、９５℃にて５分間保温し、さらに９５℃　３０秒、５５℃　３０秒、６８℃　６分の温度サイクルを１８回繰り返した。最初の６８℃にて５分間の保温は、（２）で得られたＴａｑポリメラーゼによるＰＣＲ増幅断片の３’末端にアデニンが付加されているため、３’→５’ヌクレアーゼ活性をもったＰｆｕポリメラーゼによりこれを除去するためである。
【００１８】
（４）　合成プラスミド溶液のＤｐｎＩ処理
上記（３）で合成されたプラスミドに対し、制限酵素ＤｐｎＩ（ＮＥＢ社製）を２０ユニット加え、３７℃で１時間保温し、鋳型として用いたプラスミドＤＮＡの切断除去を行った。
【００１９】
【実施例２】
（１）　ライブラリの調製
【実施例１】（４）で調製された合成プラスミドを含む溶液を、エシェリシアコリーＪＭ１０９のコンピテントセル（東洋紡社製）に導入し、形質転換体を寒天プレート上にコロニーを形成させた。形質転換体を爪楊枝で１１５２個突き、１００μｇ／ｌのアンピシリン、０．１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを含む１ｍｌのＬＢ培地の入った９６穴深型マイクロプレートに植菌した。
【００２０】
（２）　ライブラリの蛍光スクリーニング
マイクロプレートを３７℃で１６時間振とう培養した。一部（１００μｌ）の培養液を分取し、ＧＦＰの発する蛍光（励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長５０９ｎｍ）を指標にスクリーニングを行った。結果を図２に示す（蛍光強度の強いものから順に並べてある）。
（３）　ライブラリの制限酵素チェック
（２）で得られたライブラリスクリーニングの結果より、蛍光を発しないクローンを２４個無作為に拾い、制限酵素チェックを行った。その結果、いずれのクローンにおいてもベクターに一つずつのＧＦＰ遺伝子が挿入されており、クローニング操作自体は正しく行われていることが確認された。
【００２１】
（４）　変異体ＧＦＰの変異部位の決定
上記（２）におけるスクリーニングにより蛍光強度の強かったクローンのうち１つを単離し、ＧＦＰコード部位の塩基配列を決定した。その結果、４９６番目の塩基がＡからＣに変わり、これに応じ前者においては１６６番目のアミノ酸がリジンからグルタミンへ変わっていた。
【００２２】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明によれば、自己環状化されたベクターや複数の断片が一つのベクターに組み込まれるといった、従来法にみられる制限酵素とライゲーションの組み合わせにより起こるクローニング・エラーを生じることがなく、一つのベクターに対し一つの遺伝子断片のみ含む組み換えベクターを得ることができ、これにより遺伝子を確実、正確にクローニングすることが可能となる。こうしてクローニング・エラーを排除することは、変異遺伝子ライブラリあるいはこれを翻訳ないしは発現させた変異タンパク質ライブラリを作成する際にとりわけ有益である。
【００２３】
【配列表】
2004041036.tif 000002
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の組み換えプラスミドの作成工程の概要を示す図である。
【図２】ＧＦＰ蛋白質の変異ライブラリの蛍光スクリーニングの結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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