(57)【要約】【課題】基板上に結合された物質に対しても、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ分析を利用して、かかる物質の特定に利用可能な分子量の測定を可能とする方法を提供する。【解決手段】物質を基板上に結合する際、その接合部に、光によって切断される部分構造を設け、所定の光照射によって、かかる光によって切断される部分構造で選択的に切断することで、非固定状態とすることで、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ分析を利用可能とする。【解決手段】【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に固定化されている物質の質量データの取得方法であって、
前記物質の基板上への固定化に、光によって切断される部分構造を含む構造を用い、
基板上に固定化されている物質に対して、前記光によって切断される部分構造の切断を誘起する光を照射し、
該光照射によって前記部分構造が切断され、非固定状態とされた前記物質の質量スペクトルを分析することを特徴とする基板上に固定化されている物質の質量データの取得方法。
【請求項２】
前記質量スペクトルを分析する手段がマトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（Ｍａｔｒｉｘ　Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｌａｓｅｒ　Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、以下ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳと略す）法である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記光によって切断される部分構造の切断を誘起する光が、前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法の分析時に使用されるレーザー光であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法の分析時に使用されるレーザー光は、
波長３３７ｎｍの窒素レーザー光であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記基板上に固定化されている物質が、核酸であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
核酸が、ＤＮＡであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
核酸が、ＲＮＡであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
核酸が、ＰＮＡ（ペプチド核酸）であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項９】
光照射によって切断される部分構造として、
ニトロベンゼンを含む構造を選択することを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の化合物Ｉを用いて構築されていることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【化１】
2004037128.tif 000020
化合物Ｉ
【請求項１１】
前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の化合物ＩＩを用いて構築されていることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【化２】
2004037128.tif 000021
一般式ＩＩ
（式中、ｎ＝３、または、４、Ｘ＝Ｈ、または、ＳＯ３Ｎａである）
【請求項１２】
前記基板は、表面に１級アミノ基が形成されたガラス基板であり、
前記物質の末端にチオール（ＳＨ）基が結合されており、
該アミノ基と、該チオール基との結合が、前記化合物Ｉ、あるいは、一般式ＩＩで示される化合物を介して、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応、及び、チオール基とこれら化合物のブロムベンジル部位との反応によって行われていることを特徴とする請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ガラス基板への１級アミノ基の形成が、１級アミノ基を有するシランカップリング剤を用いて行われていることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記基板は、表面にスルファニル基が形成されたガラス基板であり、
前記物質の末端にアミノ基が結合されており、
該チオール基と、該アミノ基の結合が、化合物Ｉ、あるいは、一般式ＩＩで示される化合物を介して、チオール基とこれら化合物の部ブロムベンジル部位との反応、及び、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応によって行われていることを特徴とする請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ガラス基板へのチオール基の形成が、チオール基を有するシランカップリング剤を用いて行われていることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の一般式ＩＩＩで示される化合物を用いて構築されていることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【化３】
2004037128.tif 000022
化合物ＩＩＩ
（式中、ＤＭＴｒＯは、ジメトキシトリチルオキシ基、ＣＮＥｔは、２−シアノエチル基を表す。）
【請求項１７】
基板上に固定化されている物質の脱離、及び、イオン化を支援する物質（マトリクス物質）を、上記基板の、すくなくとも、質量分析を行う領域にコーティングする請求項２〜１６に記載の得方法。
【請求項１８】
マトリクス物質のコーティングの厚さが、基板上に固定化されている物質の脱離、及び、イオン化に必要にして十分である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
複数の生体関連物質が光によって切断される部分構造を含む構造によって基板上にマトリクス状に固定配置されたバイオチップの各マトリクスの生体関連物質の質量データの取得方法であって、
基板上に固定化されている各マトリクスの生体関連物質に対して、前記光によって切断される部分構造の切断を誘起する光を照射し、
該光照射によって前記部分構造が切断され、非固定状態とされた前記生体関連物質の質量スペクトルを分析することを特徴とするバイオチップの各マトリクスの生体関連物質の質量データの取得方法。
【請求項２０】
前記質量スペクトルを分析する手段がＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
ＭＳ法である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記光によって切断される部分構造の切断を誘起する光が、前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法の分析時に使用されるレーザー光であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法の分析時に使用されるレーザー光は、
波長３３７ｎｍの窒素レーザー光であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記基板上に固定化されている生体関連物質が、核酸であることを特徴とする請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
核酸が、ＤＮＡであることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
核酸が、ＲＮＡであることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
核酸が、ＰＮＡ（ペプチド核酸）であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
光照射によって切断される部分構造として、
ニトロベンゼンを含む構造を選択することを特徴とする請求１９〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の化合物Ｉを用いて構築されていることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【化４】
2004037128.tif 000023
化合物Ｉ
【請求項２９】
前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の化合物ＩＩを用いて構築されていることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【化５】
2004037128.tif 000024
一般式ＩＩ
（式中、ｎ＝３、または、４、Ｘ＝Ｈ、または、ＳＯ３Ｎａである）
【請求項３０】
前記基板は、表面に１級アミノ基が形成されたガラス基板であり、
前記生体関連物質の末端にチオール（ＳＨ）基が結合されており、
該アミノ基と、該チオール基との結合が、前記化合物Ｉ、あるいは、一般式ＩＩで示される化合物を介して、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応、及び、チオール基とこれら化合物のブロムベンジル部位との反応によって行われていることを特徴とする請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ガラス基板への１級アミノ基の形成が、１級アミノ基を有するシランカップリング剤を用いて行われていることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記基板は、表面にチオール基が形成されたガラス基板であり、
前記生体関連物質の末端にアミノ基が結合されており、
該チオール基と、該アミノ基の結合が、化合物Ｉ、あるいは、一般式ＩＩで示される化合物を介して、チオール基とこれら化合物の部ブロムベンジル部位との反応、及び、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応によって行われていることを特徴とする請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記ガラス基板へのチオール基の形成が、チオール基を有するシランカップリング剤を用いて行われていることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の一般式ＩＩＩで示される化合物を用いて構築されていることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【化６】
2004037128.tif 000025
化合物ＩＩＩ
（式中、ＤＭＴｒＯは、ジメトキシトリチルオキシ基、ＣＮＥｔは、２−シアノエチル基を表す。）
【請求項３５】
基板上に固定化されている生体関連物質の脱離、及び、イオン化を支援するマトリクス物質を、上記基板の、すくなくとも、質量分析を行う領域にコーティングする請求項１９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記マトリクス物質のコーティングの厚さが、基板上に固定化されている生体関連物質の脱離、及び、イオン化に必要にして十分である請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
複数の生体関連物質が基板上にマトリクス状に固定配置されたバイオチップであって、
各マトリクス上の生体関連物質が、光によって切断される部分構造によって固定されていることを特徴とするバイオチップ。
【請求項３８】
前記光によって切断される部分構造の切断を誘起する光が、レーザー光であることを特徴とする請求項３７に記載のバイオチップ。
【請求項３９】
前記レーザー光が、波長３３７ｎｍの窒素レーザー光であることを特徴とする請求項３８に記載のバイオチップ。
【請求項４０】
前記基板上に固定化されている生体関連物質が、核酸であることを特徴とする請求項３７〜３９のいずれか一項に記載のバイオチップ。
【請求項４１】
核酸が、ＤＮＡであることを特徴とする請求項４０に記載のバイオチップ。
【請求項４２】
核酸が、ＲＮＡであることを特徴とする請求項４１に記載のバイオチップ。
【請求項４３】
核酸が、ＰＮＡ（ペプチド核酸）であることを特徴とする請求項４２に記載のバイオチップ。
【請求項４４】
光照射によって切断される部分構造として、
ニトロベンゼンを含む構造を有することを特徴とする請求項３７〜４３のいずれか一項に記載のバイオチップ。
【請求項４５】
前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の化合物Ｉを用いて構築されていることを特徴とする請求項４４に記載のバイオチップ。
【化７】
2004037128.tif 000026
化合物Ｉ
【請求項４６】
前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の化合物ＩＩを用いて構築されていることを特徴とする請求項４４のバイオチップ。
【化８】
2004037128.tif 000027
一般式ＩＩ
（式中、ｎ＝３、または、４、Ｘ＝Ｈ、または、ＳＯ３Ｎａである）
【請求項４７】
前記基板は、表面に１級アミノ基が形成されたガラス基板であり、
前記生体関連物質の末端にチオール（ＳＨ）基が結合されており、
該アミノ基と、該チオール基との結合が、前記化合物Ｉ、あるいは、一般式ＩＩで示される化合物を介して、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応、及び、チオール基とこれら化合物のブロムベンジル部位との反応によって行われていることを特徴とする請求項４５または４６に記載のバイオチップ。
【請求項４８】
前記ガラス基板への１級アミノ基の形成が、１級アミノ基を有するシランカップリング剤を用いて行われていることを特徴とする請求項４７に記載のバイオチップ。
【請求項４９】
前記基板は、表面にチオール基が形成されたガラス基板であり、
前記生体関連物質の末端にアミノ基が結合されており、
該チオール基と、該アミノ基の結合が、化合物Ｉ、あるいは、一般式ＩＩで示される化合物を介して、チオール基とこれら化合物の部ブロムベンジル部位との反応、及び、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応によって行われていることを特徴とする請求項４５または４６に記載のバイオチップ。
【請求項５０】
前記ガラス基板へのチオール基の形成が、チオール基を有するシランカップリング剤を用いて行われていることを特徴とする請求項４９に記載のバイオチップ。
【請求項５１】
前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の一般式ＩＩＩで示される化合物を用いて構築されていることを特徴とする請求項４４に記載のバイオチップ。
【化９】
2004037128.tif 000028
化合物ＩＩＩ
（式中、ＤＭＴｒＯは、ジメトキシトリチルオキシ基、ＣＮＥｔは、２−シアノエチル基を表す。）
【請求項５２】
複数の生体関連物質が基板上にマトリクス状に固定配置されたバイオチップの各マトリクスの生体関連物質、及び、該生体関連物質と相互作用する物質の質量データの取得方法であって、
各マトリクス上の生体関連物質は、光によって切断される部分構造を含む構造によって前記基板に固定化されており、
バイオチップの各マトリクスの生体関連物質と相互作用する物質を該相互作用可能な条件におき、
基板上に固定化されている生体関連物質に対して、前記光によって切断される部分構造の切断を誘起する光を照射し、
該光照射によって前記部分構造が切断され、非固定状態とされた前記生体関連物質と、同時に非固定状態とされた該生体関連物質と相互作用した物質の質量スペクトルを分析することを特徴とするバイオチップの各マトリクスの生体関連物質、及び、該生体関連物質と相互作用する物質の質量データの取得方法。
【請求項５３】
質量スペクトルを分析する手段がＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法である請求項５２に記載の方法方法。
【請求項５４】
前記光によって切断される部分構造の切断を誘起する光が、前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法の分析時に使用されるレーザー光であることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法の分析時に使用されるレーザー光は、
波長３３７ｎｍの窒素レーザー光であることを特徴とする請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記基板上に固定化されている生体関連物質が、核酸であり、前記相互作用が該核酸と該核酸の一部の塩基配列と相補的な塩基配列をその一部に有する核酸とのハイブリダイゼーションであることを特徴とする請求項５２〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
核酸が、ＤＮＡであることを特徴とする請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
核酸が、ＲＮＡであることを特徴とする請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
核酸が、ＰＮＡ（ペプチド核酸）であることを特徴とする請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
光照射によって切断される部分構造として、
ニトロベンゼンを含む構造を選択することを特徴とする請求項５２〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の化合物Ｉを用いて構築されていることを特徴とする請求項６０に記載の方法。
【化１０】
2004037128.tif 000029
化合物Ｉ
【請求項６２】
前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の化合物ＩＩを用いて構築されていることを特徴とする請求項６０に記載の方法。
【化１１】
2004037128.tif 000030
一般式ＩＩ
（式中、ｎ＝３、または、４、Ｘ＝Ｈ、または、ＳＯ３Ｎａである）
【請求項６３】
前記基板は、表面に１級アミノ基が形成されたガラス基板であり、
前記生体関連物質の末端にチオール（ＳＨ）基が結合されており、
該アミノ基と、該チオール基との結合が、前記化合物Ｉ、あるいは、一般式ＩＩで示される化合物を介して、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応、及び、チオール基とこれら化合物のブロムベンジル部位との反応によって行われていることを特徴とする請求項６１または６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記ガラス基板への１級アミノ基の形成が、１級アミノ基を有するシランカップリング剤を用いて行われていることを特徴とする請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記基板は、表面にチオール基が形成されたガラス基板であり、
前記生体関連物質の末端にアミノ基が結合されており、
該チオール基と、該アミノ基の結合が、化合物Ｉ、あるいは、一般式ＩＩで示される化合物を介して、チオール基とこれら化合物の部ブロムベンジル部位との反応、及び、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応によって行われていることを特徴とする請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項６６】
前記ガラス基板へのチオール基の形成が、チオール基を有するシランカップリング剤を用いて行われていることを特徴とする請求項６６に記載の方法。
【請求項６７】
前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の一般式ＩＩＩで示される化合物を用いて構築されていることを特徴とする請求項６６に記載の方法。
【化１２】
2004037128.tif 000031
化合物ＩＩＩ
（式中、ＤＭＴｒＯは、ジメトキシトリチルオキシ基、ＣＮＥｔは、２−シアノエチル基を表す。）
【請求項６８】
基板上に固定化されている生体関連物質と、該生体関連物質と相互作用した物質の脱離、及び、イオン化を支援するマトリクス物質を、上記基板の、すくなくとも、質量分析を行う領域にコーティングする請求項５２〜６７いずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記マトリクス物質の厚さが、基板上に固定化されている生体関連物質と、該生体関連物質と相互作用した物質の脱離、及び、イオン化に必要にして十分である請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
生体関連物質が光によって切断される構造で固定されたバイオチップを、所定位置から分析可能な位置まで移動搬送する手段と、該分析可能な位置に於いて、該バイオチップの形状と、バイオチップ上の各マトリクスの配置情報に基づいて、指定した順に従って、各マトリクス上の物質を順次分析し、バイオチップを分析可能な位置から所定の位置まで移動搬送する手段を具備したことを特徴とするＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
【０００２】【０００３】
【発明の属する技術分野】
本発明は、基板上に固定化されている物質の解析方法に関し、より具体的には、複数の生体関連物質がマトリクス状に固定配置されている、所謂、バイオチップに対して、その生体関連物質に関して解析する方法、ならびに、生体関連物質の固定が該解析方法の適用に適する形態とされているバイオチップ、さらには、前記バイオチップ上に固定されている生体関連物質と相互作用する物質の解析方法に関する。
【０００４】
【従来の技術】
基板に特定の物質が固定化されてなるデバイス、なかでも、複数の生体関連物質がマトリクス状に固定は配置されている、ＤＮＡチップ、プロテインチップ等、各種のプローブ分子を基板上にマトリクス状に配置したもの、所謂、バイオチップは、ゲノム解析、あるいは、遺伝子の発現解析などの目的に利用されるようななってきた。また、それらバイオチップを利用した解析の結果は、癌、遺伝病、生活習慣病、感染症等の診断、予後予想、治療方針の決定等に重要な指標を提供するものと期待されている。
【０００５】
バイオチップの作製方法には、幾つかの手法が知られている。ＤＮＡチップを例にとって説明すると、フォトリソグラフィーを用いて、直接基板上にＤＮＡプローブを逐次的に合成していく方法（米国特許第５４０５７８３公報等）、あるいは、予め合成したＤＮＡ、または、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）を、基板上に供給し結合する方法（米国特許第５６０１９８０公報、特開平１１‐１８７９００号公報、Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｖｏｌ．２７０，　４６７，　１９９５等）が代表的なＤＮＡチップの作製法である。
【０００６】
一般的には、前記の方法のいずれかによってバイオチップが作製されるが、いずれの方法によって作製されるとしても、これらのバイオチップを先に述べた用途に使用しようとする場合、解析の信頼性を保証するためには各マトリクスに存在するプローブ、すなわち、この場合では生体関連物質が、所望する物質であることが極めて重要である。仮に、バイオチップの各マトリクスに存在する物質の極く一部であっても、所望の物質でない場合、その不純物がプローブ分子として機能する結果も混入することになり、解析の信頼性は根本的に失われるからである。
【０００７】
しかしながら、例えば、先に示したＤＮＡチップの作製方法をはじめとして、通常のバイオチップの作製方法では、所望としない物質が、特定の位置に固定配置される可能性が完全に排除されているとは、必ずしもいいきれないにもかかわらず、一旦基板上に固定配置された物質を特定する方法はこれまでほとんど知られていなかった。（なお、ここでいう固定とは、例えば、共有結合のように、基板上に強固に結合している状態をいい、単に吸着のような状態ではない。）
例えば、高感度な表面分析技術として知られる、飛行時間型二次イオン質量分析（Ｔｉｍｅ　ｏｆ　Ｆｌｉｇｈｔ　ｔｙｐｅ　Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　Ｉｏｎ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ　以下ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）を用いると、例えば、金基板上に単分子膜レベルで形成されたオリゴヌクレオチドを分析することが可能である（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　１２ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　Ｉｏｎ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ　９５１，　１９９９）。しかし、検出される二次イオンは、固定配置された物質が分断化された、例えば、Ｐ−、ＰＯ−、ＰＯ２−、またはＰＯ３−等のフラグメントイオンであり、これらの断片的な情報からは、元の物質がどのようなオリゴヌクレオチド、すなわち、この場合には、どのような塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであるかを知ることはできない。別のフラグメントイオンとしては、（アデニン−Ｈ）−、（チミン−Ｈ）−、（グアニン−Ｈ）−、（シトシン−Ｈ）−、（ウラシル−Ｈ）−等の塩基のフラグメントイオンも検出されるが、組成、例えば、全体の塩基配列を確実に特定できるほどの定量性、厳密性は、ＴＯＦ−ＳＩＭＳにはない。
【０００８】
他の高感度な表面分析方法としては、Ｘ線電子分光法（Ｘ−ｒａｙ　Ｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：以下ＸＰＳ）があるが、この方法によって得られる情報も原子の組成、もしくは、原子間の結合状態に関するものであり、物質全体に関する情報を得ることはできず、感度的にも、例えば、単分子膜レベルの核酸を分析するためには十分とはいえない。
【０００９】
一方、基板上に、例えば吸着している物質の分析に関していえば、近年、マトリクス援助レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析（Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｌａｓｅｒ　Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：以下ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ）法が、物質の分子量を高感度に分析可能な方法として注目されている。
【００１０】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法とは、マトリクスとよばれる、特定の波長の光を吸収する物質と、被検物質を混合して、分析用の、例えば、ステンレス基板上に置き（吸着）、ここにマトリクスが吸収する光を照射して、マトリクスから被検物質へのエネルギー移動により、被検物質を、脱着、イオン化させる。この脱着イオンを、飛行時間的に質量分析するのがＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法の基本原理である。前述のＴＯＦ−ＳＩＭＳ法では、一次イオン照射で発生するフラグメントイオンを分析するが、このＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法においては、フラグメント化していない物質そのものに関しても、その質量を分析することが可能である。従って、例えば、対象が核酸であれば、塩基配列自体を分析することはできないものの、塩基配列に関する極めて重要なデーターを得ることができることになる。少なくとも、フラグメント化していない核酸について測定される質量が、意図した値と異なれば、その核酸は所望の塩基配列を有するものではないことは、瞭然である。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法では、測定対象の物質を断片化せず、そのまま脱着させる原理を有するので、基板上に、例えば、共有結合によって固定された物質は、そのままでは、脱着イオン化を行うことができず、従って分析できない。すなわち、上述のバイオチップにおいて、各マトリクスに固定配置された物質は、そのままでは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法による分析が適用できないことになる。
【００１２】
このようなＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法の持つ課題を解決する手段として、例えば、核酸チップを用いて遺伝子多形を分析する際に、プローブ核酸の特定の位置に、酸性で分解可能な結合を配し、マトリクスと共に酸性物質を混入させることにより、分析時に、プローブ核酸を切断、イオン化することにより、プローブ核酸を分析する方法が示されている（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　Ｖｏｌ．　２９，　Ｎｏ．　１８，　３８６４，　２００１）。この方法によれば、基板に共有結合で固定化されている核酸の分析も可能ではあるが、この方法には、上記文献にも記述があるように、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）は酸性条件でデピュリネーションを起こして、プリン塩基の場所で切断されてしまうので、酸性条件を強くできないため、上記意図した特定の場所での切断効率が悪く、その分、分析の感度が低いという問題点、逆にいえば、感度を上げようとして、酸性条件を強くすると、核酸が上記特定の位置以外の場所で切断されてしまうという問題点がある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記従来技術の持つ課題を検討した結果、以下の発明を為すに至った。
【００１４】
すなわち、本発明にかかる基板上に固定化されている物質の解析方法は、
基板上に固定化されている物質を解析する方法であって、
前記物質の基板上への固定化に、光によって切断される部分構造を含む構造を選択し、
基板上に固定化されている物質に対して、前記光によって切断される部分構造の切断を誘起する光を照射し、
該光照射によって前記部分構造が切断され、非固定状態とされた前記物質の質量スペクトルを分析する質量データの取得方法である。質量スペクトルの分析方法としてはマトリクス援助レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析（Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｌａｓｅｒ　Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：以下ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ）法を用いることが好ましい。その際、前記光によって切断される部分構造の切断を誘起する光が、前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ法の分析時に使用されるレーザー光であることが好ましい。また、前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法の分析時に使用されるレーザー光は、波長３３７ｎｍの窒素レーザー光であることができる。例えば、前記基板上に固定化されている物質が、核酸であることが好ましい。その核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）のいずれでもよい。
【００１５】
光照射によって切断される部分構造として、ニトロベンゼンを含む構造を選択することが好ましい。前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の化合物Ｉを用いて構築されていることができる。
【００１６】
【化１３】
2004037128.tif 000002
【００１７】
化合物Ｉ
また、前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の化合物ＩＩを用いて構築されていることもできる。
【００１８】
【化１４】
2004037128.tif 000003
【００１９】
一般式ＩＩ
（式中、ｎ＝３、または、４、Ｘ＝Ｈ、または、ＳＯ３Ｎａである）
加えて、その際、前記基板は、表面に１級アミノ基が形成されたガラス基板であり、
前記物質の末端にスルファニル（ＳＨ）基が結合されており、
該アミノ基と、該スルファニル基との結合が、前記化合物Ｉ、あるいは、一般式ＩＩで示される化合物を介して、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応、及び、スルファニル基とこれら化合物のブロムベンジル部位との反応によって行われていることが好ましい。なお、前記ガラス基板への１級アミノ基の形成が、１級アミノ基を有するシランカップリング剤を用いて行われていることが好ましい。
【００２０】
あるいは、前記基板は、表面にスルファニル基が形成されたガラス基板であり、
前記物質の末端にアミノ基が結合されており、
該スルファニル基と、該アミノ基の結合が、化合物Ｉ、あるいは、一般式ＩＩで示される化合物を介して、スルファニル基とこれら化合物の部ブロムベンジル部位との反応、及び、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応によって行われていることもできる。その時、前記ガラス基板へのスルファニル基の形成が、スルファニル基を有するシランカップリング剤を用いて行われていることが好ましい。
【００２１】
さらには、前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の一般式ＩＩＩで示される化合物を用いて構築されていることもよい。
【００２２】
【化１５】
2004037128.tif 000004
【００２３】
化合物ＩＩＩ
（式中、ＤＭＴｒＯは、ジメトキシトリチルオキシ基、ＣＮＥｔは、２−シアノエチル基を表す。）
加えて、本発明にかかるバイオチップの解析方法は、
複数の生体関連物質が基板上にマトリクス状に固定配置されたバイオチップの解析法であって、
各マトリクス上への生体関連物質の固定化に、光によって切断される部分構造を含む構造を選択し、
基板上に固定化されている生体関連物質に対して、前記光によって切断される部分構造の切断を誘起する光を照射し、
該光照射によって前記部分構造が切断され、非固定状態とされた前記生体関連物質を、マトリクス援助レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析法によって分析することを特徴とするバイオチップの解析方法である。その際、前記光によって切断される部分構造の切断を誘起する光が、前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法の分析時に使用されるレーザー光であることが好ましい。また、前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法の分析時に使用されるレーザー光は、波長３３７ｎｍの窒素レーザー光であることができる。例えば、前記基板上に固定化されている生体関連物質が、核酸であることが好ましい。その核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）のいずれでもよい。
【００２４】
光照射によって切断される部分構造として、ニトロベンゼンを含む構造を選択することが好ましい。前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の化合物Ｉを用いて構築されていることができる。
【００２５】
【化１６】
2004037128.tif 000005
【００２６】
化合物Ｉ
また、前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の化合物ＩＩを用いて構築されていることもできる。
【００２７】
【化１７】
2004037128.tif 000006
【００２８】
一般式ＩＩ
（式中、ｎ＝３、または、４、Ｘ＝Ｈ、または、ＳＯ３Ｎａである）
加えて、その際、前記基板は、表面に１級アミノ基が形成されたガラス基板であり、
前記物質の末端にスルファニル（ＳＨ）基が結合されており、
該アミノ基と、該スルファニル基との結合が、前記化合物Ｉ、あるいは、一般式ＩＩで示される化合物を介して、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応、及び、スルファニル基とこれら化合物のブロムベンジル部位との反応によって行われていることが好ましい。なお、前記ガラス基板への１級アミノ基の形成が、１級アミノ基を有するシランカップリング剤を用いて行われていることが好ましい。
【００２９】
あるいは、前記基板は、表面にスルファニル基が形成されたガラス基板であり、
前記物質の末端にアミノ基が結合されており、
該スルファニル基と、該アミノ基の結合が、化合物Ｉ、あるいは、一般式ＩＩで示される化合物を介して、スルファニル基とこれら化合物の部ブロムベンジル部位との反応、及び、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応によって行われていることもできる。その時、前記ガラス基板へのスルファニル基の形成が、スルファニル基を有するシランカップリング剤を用いて行われていることが好ましい。
【００３０】
さらには、前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の一般式ＩＩＩで示される化合物を用いて構築されていることもよい。
【００３１】
【化１８】
2004037128.tif 000007
【００３２】
化合物ＩＩＩ
（式中、ＤＭＴｒＯは、ジメトキシトリチルオキシ基、ＣＮＥｔは、２−シアノエチル基を表す。）
一方、本発明のバイオチップは、複数の生体関連物質が基板上にマトリクス状に固定配置されたバイオチップであって、
各マトリクス上への生体関連物質の固定化に、光によって切断される部分構造を含む構造が選択されていることを特徴とするバイオチップである。前記光によって切断される部分構造の切断を誘起する光が、レーザー光である、その際、前記レーザー光が、波長３３７ｎｍの窒素レーザー光であることが好ましい。例えば、前記基板上に固定化されている生体関連物質が、核酸であることが好ましい。その核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）のいずれでもよい。
【００３３】
光照射によって切断される部分構造として、ニトロベンゼンを含む構造を選択することが好ましい。前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の化合物Ｉを用いて構築されていることができる。
【００３４】
【化１９】
2004037128.tif 000008
【００３５】
化合物Ｉ
また、前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の化合物ＩＩを用いて構築されていることもできる。
【００３６】
【化２０】
2004037128.tif 000009
【００３７】
一般式ＩＩ
（式中、ｎ＝３、または、４、Ｘ＝Ｈ、または、ＳＯ３Ｎａである）
加えて、その際、前記基板は、表面に１級アミノ基が形成されたガラス基板であり、
前記物質の末端にスルファニル（ＳＨ）基が結合されており、
該アミノ基と、該スルファニル基との結合が、前記化合物Ｉ、あるいは、一般式ＩＩで示される化合物を介して、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応、及び、スルファニル基とこれら化合物のブロムベンジル部位との反応によって行われていることが好ましい。なお、前記ガラス基板への１級アミノ基の形成が、１級アミノ基を有するシランカップリング剤を用いて行われていることが好ましい。
【００３８】
あるいは、前記基板は、表面にスルファニル基が形成されたガラス基板であり、
前記物質の末端にアミノ基が結合されており、
該スルファニル基と、該アミノ基の結合が、化合物Ｉ、あるいは、一般式ＩＩで示される化合物を介して、スルファニル基とこれら化合物の部ブロムベンジル部位との反応、及び、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応によって行われていることもできる。その時、前記ガラス基板へのスルファニル基の形成が、スルファニル基を有するシランカップリング剤を用いて行われていることが好ましい。
【００３９】
さらには、前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の一般式ＩＩＩで示される化合物を用いて構築されていることもよい。
【００４０】
【化２１】
2004037128.tif 000010
【００４１】
化合物ＩＩＩ
（式中、ＤＭＴｒＯは、ジメトキシトリチルオキシ基、ＣＮＥｔは、２−シアノエチル基を表す。）
対応して、本発明にかかるバイオチップの解析方法は、
複数の生体関連物質が基板上にマトリクス状に固定配置されたバイオチップの解析法であって、
バイオチップの各マトリクスの生体関連物質と相互作用する物質を該相互作用可能な条件におき、
各マトリクス上への生体関連物質の固定化に、光によって切断される部分構造を含む構造を選択し、
基板上に固定化されている生体関連物質に対して、前記光によって切断される部分構造の切断を誘起する光を照射し、
該光照射によって前記部分構造が切断され、非固定状態とされた前記生体関連物質と、該生体関連物質と相互作用した物質とを、同時に、
マトリクス援助レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析法によって分析することを特徴とするバイオチップの解析方法である。その際、前記光によって切断される部分構造の切断を誘起する光が、前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法の分析時に使用されるレーザー光であることが好ましい。なお、前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法の分析時に使用されるレーザー光は、波長３３７ｎｍの窒素レーザー光であることができる。例えば、前記基板上に固定化されている生体関連物質が、核酸であることが好ましい。その核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）のいずれでもよい。
【００４２】
光照射によって切断される部分構造として、ニトロベンゼンを含む構造を選択することが好ましい。前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の化合物Ｉを用いて構築されていることができる。
【００４３】
【化２２】
2004037128.tif 000011
【００４４】
化合物Ｉ
また、前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の化合物ＩＩを用いて構築されていることもできる。
【００４５】
【化２３】
2004037128.tif 000012
【００４６】
一般式ＩＩ
（式中、ｎ＝３、または、４、Ｘ＝Ｈ、または、ＳＯ３Ｎａである）
加えて、その際、前記基板は、表面に１級アミノ基が形成されたガラス基板であり、
前記物質の末端にスルファニル（ＳＨ）基が結合されており、
該アミノ基と、該スルファニル基との結合が、前記化合物Ｉ、あるいは、一般式ＩＩで示される化合物を介して、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応、及び、スルファニル基とこれら化合物のブロムベンジル部位との反応によって行われていることが好ましい。なお、前記ガラス基板への１級アミノ基の形成が、１級アミノ基を有するシランカップリング剤を用いて行われていることが好ましい。
【００４７】
あるいは、前記基板は、表面にスルファニル基が形成されたガラス基板であり、
前記物質の末端にアミノ基が結合されており、
該スルファニル基と、該アミノ基の結合が、化合物Ｉ、あるいは、一般式ＩＩで示される化合物を介して、スルファニル基とこれら化合物の部ブロムベンジル部位との反応、及び、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応によって行われていることもできる。その時、前記ガラス基板へのスルファニル基の形成が、スルファニル基を有するシランカップリング剤を用いて行われていることが好ましい。
【００４８】
さらには、前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の一般式ＩＩＩで示される化合物を用いて構築されていることもよい。
【００４９】
【化２４】
2004037128.tif 000013
【００５０】
化合物ＩＩＩ
（式中、ＤＭＴｒＯは、ジメトキシトリチルオキシ基、ＣＮＥｔは、２−シアノエチル基を表す。）
【００５１】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明をより詳しく説明する。
【００５２】
すなわち、本発明は、光によって切断される部分構造を含む構造で基板上に固定化されている物質に、該切断される部分構造が切断される光を照射し、該光照射によって切断された上記物質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法によって分析することを特長とする。この際、基板は、複数の生体関連物質がマトリクス状に固定配置された、いわゆる、バイオチップであることが本発明の主眼目であるが、無論、本発明はバイオチップに限定されるものではない。
【００５３】
また、本発明は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法を用いて、生体関連物質を分析可能とするべく、光によって切断される部分構造を含む構造で基板上に複数の生体関連物質が固定配置されているバイオチップそのものを包含する。
【００５４】
さらに、本発明は、上記、光によって切断される部分構造を含む構造で基板上に複数の生体関連物質が固定配置されているバイオチップと該生体関連物質と相互作用可能な物質を、該相互作用可能な条件においた後、該生体関連物質と、該生体関連物質と相互作用可能な物質を同時にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法によって解析することをもって更なる特長とする。この場合、相互作用とは、核酸におけるハイブリッド形成、抗体と抗原の作用、レセプターとリガンドとの作用等を指す。
【００５５】
本発明では分析時に照射される光が上記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法の分析時に使用されるレーザー光、すなわち、一般的には波長３３７ｎｍの窒素レーザー光であれば、分析時にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ装置内で、レーザー照射による切断と、脱着／イオン化が同時に起きるので望ましい形態といえる。本法で用いられる他のレーザーの例としては、Ｎｄ：ＹＡＧレーザーの波長５３２ｎｍ第二次高調波をあげることができる。従来例として酸性で分断される結合を利用する際の問題点として、核酸がデピュリネーションにより切断される点をあげたが、核酸は紫外線（２５０〜２７０ｎｍ）を吸収して、場合によって、チミン二量体を形成して、所望の相互作用を生起しないことがあるが、上記のレーザーの波長範囲では、そのような障碍がなく望ましいといえる。
【００５６】
本発明が対象とする基板に固定化されている物質は特に限定されるものではないが、基板が、いわゆる、バイオチップであれば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ等の核酸、もしくは、核酸アナログを本発明の範疇とすることができる。
【００５７】
また、本発明の、光によって切断される部分構造がに関していえば、これも、限定されることはないが、一般的に光開裂を起こす構造として知られる、ニトロベンゼン含む構造を例としてあげることができる。ニトロベンゼンを含む構造は、一般的に３５０〜４００ｎｍの光によって開裂することが知られているので、上記の窒素レーザーを光源として好適に用いることができる。
【００５８】
ニトロベンゼンを含む構造は下記の化合物Ｉ、もしくは、一般式ＩＩで示される化合物を用いて構築することが可能である。
【００５９】
【化２５】
2004037128.tif 000014
【００６０】
化合物Ｉ
【００６１】
【化２６】
2004037128.tif 000015
【００６２】
一般式ＩＩ
（式中、ｎ＝３、または、４、Ｘ＝Ｈ、または、ＳＯ３Ｎａである）
その際、基板に所望の物質を固定する方法としては、基板として、表面に１級アミノ基が形成されたガラス基板を用いて、物質の一端にスルファニル（ＳＨ）基が結合されており、該アミノ基と、該スルファニル基の結合が、化合物Ｉ、あるいは、一般式ＩＩで示される化合物を介して、すなわち、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応、及び、スルファニル基とこれら化合物のブロムベンジル部位との反応によって行われる方法を採用することができる。この場合、ガラス基板への１級アミノ基の形成が、１級アミノ基を有するシランカップリング剤を用いて行うことができる。
【００６３】
【化２７】
2004037128.tif 000016
【００６４】
上記の方法で、構築された基板に結合する核酸の構造の一例を、上の化学式（左）に示す。また、光照射によって切断された構造の例を、同じく、上の化学式（右）に示す（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｖｏｌ．　２６　Ｎｏ．　５，　１９９２）。例示するように、切断された後の核酸の切断された部位の構造は、切断される前の構造と同じであることがわかる。すなわち、開裂後のＤＮＡは結合前の状態に戻ることなり、質量も結合前と同じである。
【００６５】
特開平１１−１８７９００号公報には、１級アミノ基が形成された基板に、スルファニル基を有する核酸との結合に、下記の化学式ＩＶで示す、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシイミドを用いる例の記載があるが、本発明では、この化合物を、化合物Ｉ、あるいは、一般式ＩＩで示される化合物に替えるだけで、脱着と、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法による分析が可能となる。
【００６６】
【化２８】
2004037128.tif 000017
【００６７】
化合物ＩＶ
また、基板を作製する他の方法としては、基板として、表面にスルファニル基が形成されたガラス基板を用いて、物質の一端にアミノ基が結合されており、該スルファニル基と、該アミノ基の結合が、化合物Ｉ、あるいは、一般式ＩＩで示される化合物を介して、すなわち、スルファニル基とこれら化合物の部ブロムベンジル部位との反応、及び、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応によって行われる方法を例としてあげることができる。この際は、ガラス基板へのスルファニル基の形成が、スルファニル基を有するシランカップリング剤を用いることができる。
【００６８】
ニトロベンゼンを含む構造は、下記の化合物ＩＩＩで構築することも可能であるが、この方法は、特に核酸を基板に結合する際に有効で、プローブ核酸を核酸自動合成機で合成する際に、例えば、核酸の３’末端、または、５’末端に基板に結合させるべき官能基を有するユニットを導入する直前に、化合物ＩＩＩにより、光開裂が可能な構造を導入することができる。この場合、基板に結合させるべき官能基としては、アミノ基、スルファニル基を例としてあげることができ、そのような官能基を核酸自動合成機中で導入する試薬は、例えば、グレンリサーチ社から販売されているので、それらを適宜利用すればよい。また、基板側の処理は、既述のシランカップリング剤を利用した方法を、この場合でも採用可能である。
【００６９】
【化２９】
2004037128.tif 000018
【００７０】
化合物ＩＩＩ
（式中、ＤＭＴｒＯは、ジメトキシトリチルオキシ基、ＣＮＥｔは、２−シアノエチル基を表す。）
さて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法では、先に述べたように測定したい物質（被検物質）を脱離、及び、イオン化させるためにマトリクスという物質を被検物質と共存させるが、その方法としてよく行われる方法は、マトリクスの飽和溶液に被検物質を適当な濃度で溶解し、この共存溶液の、例えば、数μｌを、適宜アドレスが施されたステンレスプレートに滴下、乾燥させ、マトリクスの結晶内に被検物質が適当な濃度で共存している状態とする。この場合、マトリクスの結晶状態、三次元形態、被検物質の濃度によっては、スペクトルが得られなかったり、得られたとしても、Ｓ／Ｎ比、精度が良好でない場合がある。また、マトリクスの結晶の表面に微小ではあれ、凹凸、傾斜がある場合には、マトリクス中に被検物資が存在するために、場合によっては飛行時間に影響を与える結果、マススペクトルのマス精度に悪影響を与えることがある。
【００７１】
本発明では、被検物質は平滑な基板に固定化されているので、飛行時間に影響を与えるおそれは比較的小さい。また、被検物質に対するマトリクス物質の供給も、場合により、基板に対してマトリクスを薄膜状にコーティングすることにより、均一に行うことができ、また、マトリクスの結晶状態も良好となるために、良好なマス精度を得ることが可能となる。上記、マトリクス物質のコーティングは、ディッピング、スピンコーティング法等を適宜利用することができる。また、コーティングの厚さに関しては、厚すぎるとマトリクス物質の層内部に被検物質が埋め込まれた状態となるために、被検物質の基板表面からの切断、脱離、イオン化が良好に行われない場合があり、また、薄すぎると被検物質がマトリクスから顔を出した状態となり、やはり、基板表面からの切断、脱離、イオン化が良好に行われない場合があるので、被検物質の切断、脱離、イオン化に必要、且つ、十分な厚さにする必要がある。この場合、上記、被検物質の切断、脱離、イオン化に必要、且つ、十分なマトリクス物質のコーティングの厚さは、被検物質が存在する基板からの高さと同程度から千倍程度が好適であるが、もちろん、この厚さに限定されるものではない。
【００７２】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。
【００７３】
（実施例１）
ｄＴ４０プローブによる核酸結合基板の作製と、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法による分析
特開平１１−１８７９００号公報に記載の方法に準じて、核酸プローブプが一様に結合した基板を作製した。前記公開公報に記載の方法と異なる点は、核酸プライマーの固定に利用する二官能性架橋剤を、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシイミド（化合物ＩＶ）から、一般式ＩＩで示される化合物のひとつである下記化合物Ｖ、すなわち、スクシイミジル６−（４−ブロモメチル−３−ニトロベンゾイル）アミノヘキサノエートに変更したことと、基板上に、マトリクス状ではなく、一様に核酸プローブを結合させている点である。
【００７４】
【化３０】
2004037128.tif 000019
【００７５】
化合物Ｖ
（１）基板洗浄
２５．４ｍｍ×２５．４ｍｍ×１ｍｍの合成石英基板をラックに入れ、純水で１０％に稀釈した超音波洗浄用洗剤（ブランソン：ＧＰＩＩＩ）に一晩浸した。その
後、洗剤中で２０分間超音波洗浄を行い、その後、水洗により洗剤を除去した。純水ですすいだ後、純水の入った容器中でさらに超音波処理を２０分間行った。次に、予め８０℃に加温した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に基板を１０分間浸した。引き続き水洗、純水洗浄を行って、洗浄済基板をそのまま次の表面処理工程に供した。
【００７６】
（２）表面処理
アミノ基を結合したシランカップリング剤、Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン　ＫＢＭ６０３（信越化学工業）の１ｗｔ％水溶液を室温下で２時間攪拌し、上記シラン化合物の分子内のメトキシ基を加水分解した。次いで、この溶液に（１）で得た洗浄済基板を室温で１時間浸漬した後、純水で洗浄し、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に基板を１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークして最終的に基板表面にアミノ基を導入した。
【００７７】
次いで、化合物Ｖ（同仁化学研究所）５ｍｇを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／エタノールの１：１（容量比）混合溶媒に濃度が０．５ｍｇ／ｍｌとなる様に溶解した。シランカップリング処理を行った石英基板を、この化合物Ｖの溶液に室温で２時間浸漬して、シランカップリング処理によって基板表面に担持されているアミノ基と化合物Ｖのスクシイミド基を反応させた。この段階で基板表面に化合物Ｖ由来のブロモエチル基が存在することになる。化合物Ｖの溶液から引き上げた基板は、ＤＭＳＯ／エタノール混合溶媒、及びエタノールで順次洗浄した後、窒素ガスを吹き付けて乾燥させた。
（３）プローブＤＮＡの合成
ＤＮＡ合成業者（ベックス）に依頼して、配列番号１の一本鎖核酸（ｄＴの４０量体）を合成した。なお、配列番号１の一本鎖ＤＮＡの５’末端には、合成時にチオールモディファイア（グレンリサーチ）を用いることによって、スルファニル（ＳＨ）基を導入した。なお、脱保護、ＤＮＡの回収は定法により行い、また、精製にはＨＰＬＣを用いた。合成から精製までの一連の工程は、全て合成業者に依頼して行った。また、配列番号１の核酸の分子量計算値は、１２３０２．１７Ｄａである。
配列番号：１
５’　ＨＳ−（ＣＨ２）６−Ｏ−ＰＯ２−Ｏ−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　３’
（４）ＤＮＡの基板への結合
（３）に記載の配列番号１の一本鎖ＤＮＡを、８μＭの濃度で、グリセリン７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、アセチレンアルコール（商品名：アセチレノールＥＨ；川研ファインケミカル（株）社製）１ｗｔ％を含む溶液に溶解した。
【００７８】
次に、上記ＤＮＡ溶液２５μｌを、（２）で表面処理したガラス基板にのせ、１８ｍｍ×１８ｍｍのカバーガラスで覆い、ガラス板表面のブロモエチル基と核酸プローブ末端のスルファニル基とを室温で反応させた。３０分後、基板を純水で洗浄し、純水中で保存した。
【００７９】
（５）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法による分析
（４）で作製した核酸チップに窒素ガスを吹き付けて水を除去した後、イオン交換樹脂ＡＧ　５０Ｗ−Ｘ８（ＢＩＯ−ＲＡＤ）の適当量を１００μｌに分散して、該チップ表面の分析対象部分を含む領域にのせ、５分間、室温に放置して脱塩処理を行った。
【００８０】
次いで、純水で洗浄して、イオン交換樹脂を除去し、窒素ガスで水を除去し、真空デシケーターで乾燥した。この乾燥済核酸チップについて、以下の条件でＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法による分析を行った。なお、分析時、基板はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ分析用のステンレスプレート（日本ブルカー・ダルトニクス）に、ステンレスピンとステンレス製の基板押さえを用いて固定した。
装置名：ａｕｔｏｆｌｅｘ　Ｒｅｆｌｅｃｔｒｏｎ（日本ブルカー・ダルトニクス）
レーザー：窒素レーザー
加速電圧：２０ＫＶ
測定モード：リニアモード
イオン化：ポジティブ
内部標準：オリゴヌクレオチド；６１１７、９１９１Ｄａ
仕様マトリクス：３−ヒドロキシ−２−プロピオン酸（３−ＨＰＡ）
（６）分析結果
分子量１２３００．７６Ｄａにメインのピークが観測された。理論分子量１２３０２．１７Ｄａとの差は、用いた内部標準と実際に分析したＤＮＡの分子量差が大きかったためと考えられる。本実施例の結果より、本発明の方法により、基板上に共有結合で結合している物質の分析に対しても、前記結合部を光によって切断される部分構造を含む構造に選択することで、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法による分析を応用可能であることがわかる。
（比較例１）
化合物ＩＶによるＤＮＡの結合と、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法による分析の試み
実施例１において、基板との固定に用いた化合物Ｖに代えて、光によって切断される部分構造を構成できない、化合物ＩＶを用いる以外は、全く実施例１と同じ手順、条件により、ＤＮＡ結合基板を作製した。このＤＮＡ結合基板に対して、実施例１と全く同じ測定条件を設定し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法による分析を試みたが、明らかなピークは観察されなかった。
（実施例２）
ＤＮＡチップの作製、とＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法による分析
（１）ＤＮＡチップの作製
基板として、スライドグラス上に黒色テフロン樹脂のウェル（直径２ｍｍ）が３０個形成されたテフロンプリント・スライドグラス（ＥＲ−２１２：フナコシ薬品）を用い、実施例１の洗浄前に、ＵＶ−オゾン処理を施した後に、実施例１の洗浄、および、表面処理を行った。
配列番号：２
５’　ＨＳ−（ＣＨ２）６−Ｏ−ＰＯ２−Ｏ−ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡ　３’
次に、配列番号２のＤＮＡを実施例１と同様に溶解し、上記表面処理を施したスライドグラスのウェルに４μｌずつ供給し、保湿チャンバー中に室温下３０分間放置し、ＤＮＡと基板を反応させた。次いで、純水で洗浄し、純水中に保存した。なお、配列２の核酸の分子量計算値は５６６１．８４である。
（２）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法による分析
各ウェルに対するイオン交換樹脂分散液の供給を４μｌとする以外は、実施例１と同様の方法により、（１）で作製したＤＮＡチップを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳにより分析した。なお、分析はウェルの内部にレーザーのスポットを照射して行った。また、使用した内部標準核酸は３６４５Ｄａと６１１７Ｄａである。
（３）分析結果
分子量５６６２．０５Ｄａにメインのピークが観測された。本実施例の結果より、本発明の方法により、基板上にＤＮＡプローブを結合させる際、前記結合部を光によって切断される部分構造を含む構造に選択することで、ＤＮＡチップ上に結合されたＤＮＡプローブの分析が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法により可能となることがわかる。
（実施例３）
ＤＮＡチップ上でのハイブリダイゼーションと、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法による分析
（１）ハイブリダイゼーション
配列番号：３
５’　ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ　３’
実施例２で作製したＤＮＡチップのプローブ核酸の塩基配列（配列番号：２）に相補的な上記配列番号：３のＤＮＡを合成した。このＤＮＡを、５０ｐＭの濃度で１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）に溶解した。次に、実施例２で作製したＤＮＡチップのウェルに、このＤＮＡ溶液を５μｌ供給し、カバーガラスで覆いをした後、保湿チャンバー内で４５℃で１５時間ハイブリダイゼーションを行った。次に、ＤＮＡチップを冷純水で３０秒間洗浄し、窒素ガスで純水を除去して後、真空デシケーター中で乾燥した。なお、配列番号：３の核酸の分子量計算値は５５３２．０７Ｄａである。
（２）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳによる分析
脱塩処理を行わない以外は、実施例２と全く同様の方法により、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法により分析を行った。
（３）分析結果
分子量５６６２．０５Ｄａと５５３２．５７Ｄａにふたつのピークが観察された。これらは、それぞれ、ＤＮＡチップ上に結合された配列番号：２のＤＮＡプローブと、該プローブとハイブリッドを形成した配列番号：３のＤＮＡによるものと考えられた。
【００８１】
本実施例の結果より、本発明の方法により、基板上にＤＮＡプローブを結合させる際、前記結合部を光によって切断される部分構造を含む構造に選択することで、ＤＮＡチップ上に結合されたＤＮＡプローブと、該ＤＮＡプローブとハイブリッドを形成した標的ＤＮＡの双方ともに、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ法による分析を適用することが可能となることがわかる。
【００８２】
【発明の効果】
本発明により、基板上に結合された物質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳによる分析が可能となった。また、同様に、核酸チップ上に結合された核酸プローブ、ならびに、該核酸プローブとハイブリッドを形成した標的核酸のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳによる分析が可能となった。