(57)【要約】【課題】  フロー蛍光装置、並びに２光子励起及び／又は共焦光学セット・アップを用いる方法の提供。【解決手段】  本発明の光学セット・アップは、小さな蛍光生物粒子を計数するのに最適である。アクティブな共焦体積は回折制限され、結果としてフローチャンネルの体積よりかなり小さい。励起及び検出概念は、バックグラウンドシグナルの排除のために極めて有効であることが見い出された。レーザーを集中するため、及び蛍光を収集するための大きな開口数を有する対物レンズが用いられ、これは、フェムトリッターの容量にほぼ相当する回折制限体積に測定のアクティブな体積を制限する。この体積は通常のフローサイトメトリーの検出体積よりかなり小さい。【選択図】      図１
2004347608.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光粒子の励起が２光子励起で行われることを特徴とするフロー蛍光法。
【請求項２】
蛍光放出が単一光子を分解することができる１以上の平行な光子カウンターで検出されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記異なる光子カウンターが前記粒子を染色するために用いられる異なる蛍光染料に対応する異なる波長帯のために調整された適切なスペクトルフィルターを用いることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
その流れの中のバックグラウンドカウントと本当の蛍光粒子からのカウントとの間の識別が、時間領域における単一光子カウントの相関分析に基づくことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一に記載の方法。
【請求項５】
前記励起及び検出が共焦光学セット・アップで行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
回折制限焦点体積を供する２光子励起のための手段を含むことを特徴とするフロー蛍光装置。
【請求項７】
単一光子を分解することができる蛍光検出のための一又はいくつかの平行な光子カウンターを組み込むことを特徴とする請求項６に記載の装置。
【請求項８】
蛍光検出のために用いられるディテクターが粒子を染色するために用いられる異なる蛍光染料に対応する異なる波長帯のために調整された適切なスペクトルフィルターを用いることを特徴とする請求項７に記載の装置。
【請求項９】
蛍光検出のために用いられるディテクターが高量子効率で単一光子を分解することができるホトダイオードであることを特徴とする請求項７に記載の装置。
【請求項１０】
時間領域における１以上の平行な光子ディテクターからの単一光子カウントのバーストの分析を行う単一コリレーターを組み込むことを特徴とする請求項６に記載の装置。
【請求項１１】
相関時間及び相関しきい値を含む相関パラメータが不特定の光子カウントの最適な識別のために調節可能であることを特徴とする請求項10に記載の装置。
【請求項１２】
前記粒子の大きさの決定のための相関光子カウントの時間の長さの決定のための手段を含むことを特徴とする請求項10に記載の装置。
【請求項１３】
励起力が各々の特定の適用におけるサンプルからの最適な光子放出比率のために調節可能であることを特徴とする請求項６に記載の装置。
【請求項１４】
励起及び検出のための共焦光学セット・アップを含むことを特徴とする請求項６に記載の装置。
【請求項１５】
励起及び検出が共焦セット・アップで行われることを特徴とするフロー蛍光法。
【請求項１６】
蛍光放出が単一光子を分解することができる１以上の平行な光子カウンターで検出されることを特徴とする請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
異なる光子カウンターが、粒子を染色するために用いられる異なる蛍光染料に対応する異なる波長帯のために調整された適切なスペクトルフィルターを用いることを特徴とする請求項15に記載の方法。
【請求項１８】
バックグラウンドカウントとその流れ中の本当の蛍光粒子からのカウントとの間の識別が時間領域における単一光子カウントの相関分析に基づくことを特徴とする請求項15〜17のいずれか一に記載の方法。
【請求項１９】
励起及び検出のための共焦光学セット・アップを含むことを特徴とするフロー蛍光装置。
【請求項２０】
単一光子を分解することができる蛍光検出のための１又はいくつかの平行な光子カウンターを組み込むことを特徴とする請求項19に記載の装置。
【請求項２１】
蛍光検出のために用いられるディテクターが、前記粒子を染色するために用いられる異なる蛍光染料に対応する異なる波長帯のために調整された適切なスペクトルフィルターを用いることを特徴とする請求項20に記載の装置。
【請求項２２】
蛍光検出のために用いられるディテクターが、高い量子効率で単一光子を分解することができるホトダイオードであることを特徴とする請求項20に記載の装置。
【請求項２３】
時間領域における１又はいくつかの平行な光子ディテクターからの単一光子カウントのバーストの分析を行う単一のコリレーターを組み込むこと特徴とする請求項19に記載の装置。
【請求項２４】
相関時間及び相関しきい値を含む相関パラメータが不特定の光子カウントの最適な識別のために調節可能であることを特徴とする請求項23に記載の装置。
【請求項２５】
前記粒子の大きさの決定のための相関光子カウントの時間の長さの決定のための手段を含むことを特徴とする請求項23に記載の装置。
【請求項２６】
励起力が、各々の特定の適用におけるサンプルからの最適な光子放出比率のために調節可能であることを特徴とする請求項19に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
フローサイトメーターは、日常的な診断並びに細胞及び他の粒子を分析及び分類するための調査研究に広く用いられる。細胞は液状懸濁液内にあり、この懸濁液は薄いキャピラリーキュベットを通してくみ上げられ、レーザービームがそのレーザービーム及び検出対物レンズに対して90°の角度でその流れに焦点が集められる。そのレーザービームは、キャピラリーの穴の外側の流れにも焦点を合わせることができる。サンプル懸濁液は、キャピラリーキュベットの軸の中心に沿って細胞を流す流体力学的焦点化法を用いてレーザービームの焦点内に維持される。フローサイトメーターは、現在、多くの記事に、例えばSalzman & al.in : Flow Cytometry and Sorting, Second Edition, M.R.Melamed, T.Lindmo, M.L Mendelsohn, Eds. Wiley & Sons, Inc., New York, 1990, pp.81-107 に報告されている。
【０００２】
細胞は、通常、１又はいくつかの蛍光染料又は蛍光生分子、例えば抗体で染色され、フローサイトメーターはレーザー励起のために放出された蛍光及び光散乱の測定のために用いられ、これらのパラメータはそれらの特徴、例えば蛍光染料により示される免疫化学的特徴に従って細胞を計数するために用いられる。散乱するシグナルは、通常、細胞の大きさを示す。フローサイトメーターは、細胞を分析するため、又は細胞の物理的分離（ソーティング）のために作られ得る。後者の場合、フローサイトメーターは、静電荷を有し、穴から出された細胞を含む液体ドロップレットを更なる分析のための異なるキュベットに送る静電偏向装置と組み合わせられる。
【０００３】
通常のフローサイトメーターにおける流速は10〜100 cm／ｓである。結果として、各々の細胞は約10〜100 マイクロ秒、レーザービームにより露光される。蛍光放出から生ずる光子バーストが光ディテクターにより検出され、細胞内の蛍光染料の量に直接比例する振幅を有する電気シグナルがディテクターから得られるだろう。
【０００４】
電子シグナルが分析され、記録されるだろう。そして通常、ヒストグラムは細胞の数対蛍光強度を示す結果となろう。
【０００５】
フローサイトメトリーの精度、感度及び信頼度は、非特異的蛍光、細胞の自己蛍光、光学構成部分の蛍光及び光ディテクターで発生するノイズを含む異なる因子により削減される。妨害の源はバリエーション及びランダムに起こるシグナルの原因となる。結果として、通常のフローサイトメーターは、通常の細胞の集団内の少量の特定の細胞を分析することができず、主な集団の１／1000未満を構成する細胞は検出され得ない。このような“まれな事象”の分析の例は、最小の残った病気の検出のための血液循環における癌細胞のためのスクリーニング、及び遺伝的異常の早期の検出のための母の血液循環における胎児赤芽球のスクリーニングを含む。他の例は、少量の小さな細胞、例えば培養なしで液体状血液中でのバクテリアの迅速な検出である。赤血球及びバクテリア細胞は小さく（１〜５μｍ）、それらは強い不特定の妨害なしに通常のフローサイトメーターで分析され得ない。先に言及されるヒト及びバクテリア細胞の信頼できる迅速な検出は、医学において大きな可能性を有する。
【０００６】
“まれな事象”又は小さな粒子の慣用の流動蛍光分析での検出は、バックグラウンド蛍光及び散乱により妨げられ、本当のシグナルから誤ったシグナルを識別することは極めて困難である。本発明は、生物流体におけるまれな事象又は小さな粒子の検出のための改良された装置及び方法に関する。本明細書に用いられる“粒子”という言葉は、哺乳動物細胞、血液細胞、バクテリア細胞、細胞オルガネラ及びウィルスを含むいずれかの生物粒子をいう。
発明の背景
本発明の背景は、小さな粒子、共焦光学顕微鏡、２光子励起、蛍光相関分光法及び単一分子検出の流重力蛍光分析を扱う多くの論文によりカバーされる。本発明の背景技術として、我々は、センシティブな流動蛍光分析に関する以下の論文を列記する。
２光子励起：
Denk, W., Strickler, J., and Webb, W.W.Two-photon laser microscopy. US pat 5034613, 1991.
Lytle, F.E., Dinkel, D.M., and Fisher, W.G.Trace-Level Quantitation Via Time-Resolved Two-Photon-Excited Fluorescence. Appl.Spectrosc. 47 (12)：2002, 1993.
Denk, W., Strickler, J.H., and Webb, W.W.Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248：73, 1990.
Sepanlak, M.J. and Yeung, E.S. Laser Two-photon Excited Fluorescence Detection for High Pressure Liquid Chromatography.
Anal.Chem. 49 (11)：1554-1556, 1977.
Wirth, M.J. and Fatunmbi, H.O. Very High Detectability in Two-Photon Spectroscopy. Anal.Chem. 62：973-976, 1990.
流動蛍光分析及びサイトメトリー：
Nguyen, D.C. and Keller, R.A. Ultrasensitive laser-induced fluorescence detection in hydrodynamically focused flows. Journal of the Optical Society of America B 4 (2) : 138, 1987.
共焦顕微鏡：
Mathies, R.A. and Peck, K. Laser excited confocal microscope fluorescence scanner and method. Eur.pat.appl. 91300246.5 (440 342 A3), 1991. G01N 21/64.
単一分子検出：
Dovichi, N.J., Martin, J.C., Jett, J.H., Trkula, M., and Keller, R.A. Laser-Induced Fluorescence of Flowing Samples as an Approach to Single-Molecule Detection in Liquids. Anal.Chem. 56 (3) : 348, 1984.
Lee, Y., Maus, R.G., Smith, B.W., and Winefordner, J.D. Laser-Induced Fluorescence Detection of a Single Molecule in a Capillary. Anal.Chem. 66 (23)：4142, 1994.
Mathies, R.A. High Sensitivity Fluorescent Single Particle and Single  Molecule Detection Apparatus and Method. PCT/US90/02702 (WO 90/14589), 1990. G01N 21/64.
Mathies, R.A. Peck, K., and Stryer, L. Optimization of High-Sensitivity Fluorescence Detection. Anal.Chem. 62 (17)：1786, 1990.
Peck, K., Stryer, L., Glazer, A.N., and Mathies, R.A. Single-molecule fluorescence detection : Autocorrelation criterion and experimental realization with phycoerythrin. Proc.Natl.
Acad.Sci. 86：4087, 1989.
Shera, E.B. Single  molecule tracking. Eu.Pat. 88909172.4 (EP 0 381 694 B1), 1988 G01N 21/64.
Shera, E.B. Seitzinger N.K., Davis, L.M., Keller, R.A., Soper, S.A., Detection of single fluorescent molecules, Chem Phys Letter 23 ：553-557, 1990.
蛍光相関分光法：
Dovichi, N.J., Martin, J.C., Jett, J.H., and Keller, R.A. Attogram Detection Limit for Aqueous Dye Samples by Laser-Induced Fluorescence. Science. 219：845, 1983.
Rigler, R. and Eigen, M. Method  and device for assessing the suitability of biopolymers. PCT/EP/00117 (WO 94/16313), 1994. G01N 21/64.
発明の目的
本発明の目的は、フローサイトメトリーのための改良された方法及び装置である。フローサイトメトリー分析の信頼度及び精度は、本発明で大きく改良され得る。特に、大量の異なる種類及び大きさの粒子を含む生物懸濁液中のまれな事象及び小さなサイズの粒子の分析が改良され得、通常のフローサイトメトリーに典型的な妨害が削減され得る。更に、本発明は、今日典型的に用いられる通常のフローサイトメトリーにおけるものより低い出力かつより安価な使用を許容する。
発明の詳細な記載
フローサイトメトリーに一般に用いられる蛍光染料は、励起光の高い吸収及び蛍光放出の高い量子収率を供する。しかしながら、検出の感度は、照射光散乱、光学部分のバックグラウンド蛍光及びサンプル媒体の自己蛍光により実質的に限定される。通常のフローサイトメーターにおいて、光子ディテクターは、全細胞からの蛍光放出の極めて効果的な収集のために最適化され、その照射は、比較的長い焦点距離で焦点レンズで行われる。この典型的な光学セット・アップは、比較的低い量子効率が蛍光放出の波長に強く依存し、 0.5％〜５％で種々である一般的に用いられる光電子増倍管のために十分に強いシグナル強度を供する。この理由のため、高感度のフローサイトメトリーは、強力かつ高価なアルゴン−イオンレーザーをしばしば要求する。
【０００７】
通常のフローサイトメトリーと本発明との間の本質的な差は、励起及び検出の焦点体積に関する。通常のフローサイトメトリーにおいては、異なる粒子の照射の分散が最小となるように全体のフローチャンネルを横切る同様の照射を仮定するために長い焦点距離のレンズを用いて励起が行われる。同様に、ディテクターは、高開口数の対物レンズでフローチャンネルに焦点を合わせられ、ディテクターの前の比較的大きな開口は、効率的な光収集を最適化するために用いられる。
【０００８】
本発明の装置は、共焦光学セット・アップ及び／又は２光子励起の使用に基づく。これらのシステムの両方は、励起及び検出のための高開口数の対物レンズを用いる。励起の焦点体積は、回折制限され、結果としてフローチャンネルの容量より極めて小さい。
【０００９】
本発明の光学的セット・アップは、小さな蛍光粒子を計数するために最適である。先に言及される励起及び検出概念は、通常のフローサイトメトリーにおいて困難な小さな粒子の計数を行うバックグラウンドシグナルの排除に極めて効果的であることが発見された。レーザーを焦点を合わせるため、及び蛍光を収集するための大きな開口数を有する対物レンズを用いて、その光学的セット・アップの両方は、測定のアクティブな体積を１フェムトリットルより少い体積にほぼ相当する回折制限体積に制限する。この体積は、通常のフローサイトメトリーの検出体積よりかなり小さい。これらの方法の両方、及び関連する光学系は、アクティブな回折制限焦点体積の外から発するバックグラウンド散乱及び蛍光の全ての波について極めて効果的に区別する。結果として、シグナル対ノイズ比は大きく改良される。
【００１０】
本発明の更なる特徴はシグナル分析に関する。通常のフローサイトメトリーにおいて、光電子増倍管がアナログモードにおいて用いられる。即ち、光電子増倍管から得られたパルスの振幅はその粒子の照射時間の間に検出される光子の全体である。パルス振幅は、蛍光の最大の強度に比例する。パルス高分析は、バックグラウンドが原因であるシグナルの識別のため、そして関心の粒子により形成されるこれらのシグナルを選択するために通常用いられる。本発明において、シグナル分析はパルス高分析を基にしないが、時間領域におけるシグナル光子の出来事の単一光子計数及び自動相関分析に基づく。
【００１１】
単一の光子の出来事の相関分析は、高い計数効率を有する単一光子カウンターを要求する。現在、アバランシェダイオード単一光子カウンターの導入は、本発明の実施形態で可能である。アバランシェ光子カウンターは、広範囲の可視光及び近赤外(NIR) 光に基づく光放出のために極めて高い量子効率（80％まで）を有し、フローサイトメトリーに用いられるなら、それらは極めてより低い励起強度での光電子増倍管に適合するシグナル比に貢献する。これは、より安価なレーザーの使用を許容する。本発明の装置に用いられるアバランシェ光子カウンターは、粒子の照射時間の間に典型的に10ns長の分離したパルスのバーストを形成する。これらのパルスは、時間領域において自動相関され、相関関数が特定の粒子とバックグラウンド蛍光及びノイズを含む他の不特定のシグナルとの間の識別のために用いられる。
【００１２】
共焦原理を有する本発明の説明
図１は、本発明の方法に必要とされる測定システムの機能的図の例である。それは共焦原理と共に理解される。装置の機能を以下に示す。レーザー（１）は蛍光の励起のめたに用いられ、それはレンズ（２ａ）及び高開口数対物レンズ（２ｂ）を通してフローキュベット（４）の内側の流体力学的に集中されたサンプルの流れ（３）に焦点を合わせられる。サンプルからの蛍光シグナルは、二色鏡（５）及びピンホール（６）によりディテクター（７）に向けられる。ディテクター（７）は、シグナル分析装置（８）に接続され、そのシグナルアナライザーはシグナルを数値形態にし、その結果はハードウェアーも制御するコンピューター（９）内で処理される。
【００１３】
共焦セット・アップの原理を図１を引用して以下に記載する。最初に、点様光源（１）の、対物レンズ（２ｂ）の焦点面（３）へのイメージングが記載される。回折のために、点様光源は焦点面内において、光学系に特徴的である強度分布を形成する。その強度分布は３次元で決定される点像強度分布関数と呼ばれる。標準化された点像強度分布関数は点様光源から照射された光子が焦点領域（３）上にいかに分布するかの確率Ｓ１；即ち、光子がサンプル容量の異なる部分に吸収される確率を規定する。
【００１４】
対応する点像強度分布関数Ｓ２も、ディテクター（７）の前のピンホール（６）に達する焦点から放出される光子の空間的分布のために決定され得る。焦点の付近におけるこの標準化関数の値は、異なる点から放出され、ピンホール（６）にぶつかる光子の確率を規定する。
【００１５】
本発明の方法及び装置に適用されている共焦光学系において、光源（１）及びピンホール（６）は、同じ焦点（３）に焦点が合わせられる。点様光源（１）により放出された光子がサンプル中での蛍光放出を引きおこし、その放出された光子がピンホール（６）に当たる確率は、照射及び検出強度分布の標準化積Ｓ１×Ｓ２により示される。これにより得られた確率分布は３次元であり、特に軸の方向における慣用的光学構成物により形成されるものより明らかに制限される。共焦システムにおいて測定されるべき流体容量は慣用的光学システム内のものよりかなり小さい。大きな開口数（N.A.＞0.5)及び共焦システムを有する対物レンズを用いる場合、アクティブな流体容量は通常の流動蛍光分析の光学系により供されるものの10分の１未満に削減される。
【００１６】
２光子励起を有する本発明の説明
共焦光学系は、全てのバックグラウンド散乱、及びアクティブな回折制限焦点容量の外側から発する蛍光を極めて効率的に識別する。結果として、シグナル対ノイズ比は大きく改善される。しかしながら、生物粒子の分析において、共焦システムは回折制限焦点体積内の粒子それ自体からの光散乱を除去しない。この問題を解決するために、本発明は２光子励起の方法を用いる。
【００１７】
通常のフローサイトメトリーにおいて、そして先に記載される共焦概念においては、蛍光ラベルは単一光子で励起され、これは励起光ビームの波長において蛍光ラベルの発色団が光を吸収することを意味する。２光子励起は、他の概念より、散乱及び自己蛍光により引きおこされるバックグラウンドの更により効率的な削減を供する、強い光源を焦点を合わせることにより、単位体積当り、そして単位時間当りの光子の密度が２つの光子が同じ発色団内に吸収されるのに十分に高くなる時に２光子励起が可能である。この場合において、吸収されたエネルギーは２つの光子のエネルギーの総計である。確率の概念に従うと、発色団における単一光子の吸収は独立した出来事であり、いくつかの光子の吸収は一連の単一から独立な出来事である。単一光子の吸収の確率は、励起されるエネルギー状態が飽和されていない限り線形関数として記載され得る。２つの光子の吸収は第２の種類の非線形的過程である。２光子励起において、発色団は、両光子が同時に吸収された場合にのみ励起され、それはおおよそフェムトセカンド (10-15 秒）内である。２つの光子の吸収の確率は、単一の光子の吸収の確率分布の積に等しい。これにより、２つの光子により引きおこされる蛍光放出の強度は照射の光子強度に関する二次プロセスである。
【００１８】
本発明の光学系の特性が点様光源に対するシステムの応答と共に先に記載されている。点様光源は、回折のため、光学系に特徴的な焦点面に強度分布を形成する（点像強度分布関数）。標準化した場合、この点像強度分布関数は、光源からの光子が焦点領域に達する確率分布である。２光子励起において、励起の確率分布は２つの光子の強度分布の標準化した積に等しい。これにより得られた確率分布３次元であり、特に軸方向において単一光子励起についてのものより明らかに制限される。これにより、２光子励起において、焦点の明らかに制限された３次元の近隣において形成された蛍光のみが励起される。
【００１９】
発色団が２光子励起され、励起が焦点の３次元的近隣に制限される場合、焦点の近隣の外側の光学構成物からの散乱は、通常の励起と比較するなら著しく削減される。更に、２光子励起はサンプルの周囲において、及び光学構成物において、焦点の外側のバックグラウンド蛍光を削減する。励起光ビームは可能な限り小さな点に焦点を合わせなければならないので、２光子励起は本発明に従う方法における状況でもある少ないサンプル容量及び構造の観察に最も適する。
【００２０】
２光子励起の先に言及される利点は、可視光又は近赤外(NIR）光が紫外又は青色領域における励起のために用いられ得るという事実に基づく。同様に、可視領域における励起は、 NIR光より達成され得る。光源の波長は発光団の放射波長よりかなり長いので、光源の波長における散乱及び可能な自己蛍光は、それらがディテクターに達することを防ぐための低通過フィルター（少くとも10オーダーの減衰）を用いて効果的に減衰され得る。
【００２１】
２光子励起を形成するための一般的な方法は、超短レーザーパルスを用いることである。短いパルスの間、２光子励起のために十分な高エネルギー密度を達成することが可能であるが、平均エネルギーは低く維持される。２光子励起が連続波レーザー照射でも観察され得ることも観察され得た（ドイツ特許出願P 44 14 0940,9-42)。
【００２２】
我々の実験において、我々は、極めて高いシグナル対バックグラウンド比及び優れた感度が２光子励起及び短寿命の蛍光ラベルで達成され得ることを観察した。２光子励起のための適切な蛍光ラベルは、例えばクマリン、ロダミン誘導体及びフィコピリプロテインである。
【００２３】
２光子励起の方法を用いることにおいて、光子ディテクターからのレーザーパルス及びパルスの同期条件も光子ディテクターから熱ノイズを除去するために用いられ得る。この場合、熱ノイズは意味がなくなる。２光子励起の使用は、特にサンプル中で蛋白質及び他の高分子により引きおこされる散乱及びバックグラウンドノイズがかなり低くなるため、いずれの単一光子励起法と比較しても有利である。レーザーの波長において蛍光が発生せず、また低通過フィルターがレーザーの波長を効果的にブロックするので、レーザービームにより引きおこされる散乱がディテクターに達し得ない。
【００２４】
２光子励起はパルスレーザーで最もよく行われ得る。短い検出及び自動相関時間は極めて高い繰返し周波数を有するパルスレーザーを要求する。今日、この適用に適したレーザーは10nJのパルスエネルギーを有し、 76MHzのパルス周波数を有し、調節可能な 700〜900nm の波長を有するチタン−サファイアフェムトセカンドレーザーである。この適用に適したより安価なパルスレーザーが、近い将来利用できるようになるだろう。この種の開発の例は、モードロック300MHzパルスダイオードレーザー (Laser Ionics Inc., Orlando, Florida, USA) 、λ＝825nm 、パルスエネルギー0.03nJ、パルス幅１〜20psである。他の例は、新しく、また市販されていないが、 80MHzパルスレート、30fsパルス幅、 0.5nJパルスエネルギー及び調節可能 820〜900nm 波長を有するダイオードポンプCrLi−Sapphireレーザーである。
【００２５】
２光子励起は、共焦セット・アップのものより少し大きいが３次元に明らかに規定される回折制限焦点体積を供し得る。低分解能は単に２光子励起のためのより長い励起波長を用いる結果である。しかしながら、２光子励起のための光学系は共焦セット・アップとも組み合わせられ得る。適切なディテクターピンホールを選択することにより、焦点体積のサイズを最適化することが可能である。
【００２６】
シグナル分析
ディテクターからの単一光子バーストの持続時間は、流速、アクティブな焦点体積の寸法及び粒子の大きさによる。焦点体積及びその形状は、共焦光学構成物又は２光子励起の点像強度分布関数により規定される。図１におけるディテクター（７）からのシグナルは、例えば10ナノ秒の持続時間でのバイナリーデジタルシグナルに移される単一光子パルスからなる。図２は、時間スケール（Ａ), (Ｂ）及び（Ｃ）におけるディテクターから得られたパルスの例を示す。１ｍ／ｓの流速での１μｍ径の粒子は後でレーザービームの励起下での遷移時間として言及される時間ｔm ＝１μｓとどまる。ラベルの励起のために用いられるレーザービームの強度は焦点（３）において励起状態をほとんど飽和させることができるほど高い。蛍光ラベルの減衰時間が時間間隔ｔm ＝１マイクロ秒内で１ナノ秒のみであるなら、それは強力なレーザーの励起下で励起され 103倍まで緩和される。ディテクターより観察される光子の数はラベルの量子効率、光学構成物（２ａ，２ｂ，４，５及び６）の収集効率及び損失並びに光子ディテクター（７）の量子効率による、実際、10-2の検出効率は、80％量子効率を有するアバランシェダイオード光子カウンターを用いる場合に得られ得る。遷移時間ｔm 内で、ディテクター（７）は１つの粒子から生ずる蛍光放出の１又は多くの光子を検出することができる。光子は、遷移時間ｔm 内で確率的光子バーストとして現れる（図２、セクション１）。これらのバーストに加えて、多くの他の確率的シグナルも検出され得る（図２、セクション２）。それらは、サンプル中の遊離分子により引きおこされるバックグラウンドから、散乱から、そして熱ノイズから生ずる。
【００２７】
分析されるべきサンプルの各々の種類から光子バーストの間に検出されるべき単一光子の最適な周波数のためにレーザー強度を調節することが有用である。レーザー強度が高すぎると、光子の速度がディテクターの計数速度を超え、時間領域における計数のポアソン分布はひずめられ、結果として自動相関分析での本当のシグナルとノイズとの間の識別が最適でない。励起強度は、各々の特定の適用におけるサンプルからの最適な光子放出速度のための調節可能なパラメータである。
【００２８】
アバランシェダイオード光子カウンターは、10-3の確率で自発性の後のパルスを発生し得る。３カウント以上のしきい値でシグナルを自動相関することは、後のパルスにより引きおこされるバックグラウンドを除去するが、これは検出効率を犠牲にして行われる。２つの分離した光子カウンターのために放出ビームを50％／50％ビームスプリッターで２つの部分に分け、交差コリレーターを用いることにより、後のパルスを除去して２倍短い相関時間を作り、粒子の計数速度を増加させることが可能である。増加した光学的的損失は増加したレーザー出力で補われ得る。
【００２９】
粒子からのバックグラウンドカウントと本当のカウントとの間の識別力は、粒子の特異的染色のための２以上の異なる染料を用いることにより更に増強され得る。そのシステムは、各々２以上の蛍光ディテクターを組み込むことができ、蛍光検出のために用いられるディテクターは、適切なスペクトルフィルターを用いて、前記異なる染料に対応する異なる波長のバンドに向けられる。
【００３０】
高開口数の対物レンズ及びできる限り大きい放出角の使用は、記載される方法に有利である。検出開口は二重であり、これにより各々の放出された光子はディテクターに達する可能性を２倍有し、Ｎ光子の自動相関での検出確率の増加はＮ2 である。これは、１以上のディテクターにおいて放出された光子を収集するために同じ焦点に焦点を合わせられた２以上の対物レンズを用いることによっても達成され得る。例えば各々に対して反対側の２つの対物レンズ及び２つのディテクターを用いることは、２の因子による検出の確率を増加させる。
【００３１】
単一光子カウントの相関分析は、自動相関分析及び相互相関分析の両方を含み得る。自動相関分析は各々のディテクターからの光子カウント間の時間間隔の記録に基づく。２又はいくつかの独立した光子ディテクターのための相関分析の適用は相互相関と呼ばれる。粒子の遷移時間の間の１又はいくつかのディテクターにより検出された本当の粒子からの放出された光子は、時間領域内で及び次の相関パラメータ：相関時間、ディテクター当りのカウントの最小の数における相関しきい値、独立したディテクターからの一致したカウントの条件のために規定された一致したしきい値内で相関関係があり得る。これらの相関パラメータは、不特定の光子カウントの最適な識別のために調節できる。
【００３２】
流れの方向におけるアクティブな焦点体積の寸法は極めて小さいので、相関したカウントについての情報は、各々の粒子の遷移時間の持続時間の決定のために、結果として粒子の適切な大きさの決定のためにも用いられ得る。小さな生物粒子の研究において、この方法は、同じ懸濁液中の大きな粒子のため不特定の蛍光シグナルを識別するために役立つ。
【００３３】
単一光子バーストのための相関分析を行う装置は、各々のディテクターからの単一光子カウントの予めセットした数が予めセットした時間内に達するなら、出力シグナルを与える電子論理回路であり得る。その回路はより複雑な相関関数も行うことができ、又はその回路は与えられたシグナルプロセッサー内に、もしくは慣用のコンピューター上にロードされた特別のコンピューターソフトウェアにより置き換えられ得る。
【００３４】
通常のフローサイトメトリー分析は、通常、いくつかのパラメータの測定を同時に組み合わせる。ほとんど共通なのは蛍光と光の散乱との組合せである。散乱シグナルは粒子の大きさを測定するために用いられる。サイトグラムは、各々の粒子についての蛍光強度対散乱強度の分布を示す。
【００３５】
本発明の方法は、通常のフローサイトメーターに典型的な同様の原理下での散乱シグナルの測定を許容する。しかしながら、本方法の適用において特に関心である小さな粒子は極めて弱い散乱シグナルを供し、そのシグナルは粒子の大きさについて限定された情報を与える。サイズ測定のために２つの代わりの方法を提案する。
【００３６】
第１の代わりの方法は、粒子からの単一光子バーストの時間分布分析に基づく。大きな粒子（10μｍ）の場合、粒子の小さな部分のみが共焦において、又は２光子励起セット・アップにおいて回折制限焦点により励起される。結果として、これらの大きな粒子は小さな粒子よりかなり長い時間、励起下のままであり、自動相関カウントのバーストは更に長い。バーストの長さの分析は、小さい粒子と大きい粒子とのステムとの間を識別する方法を提供する。
【００３７】
サイズ決定のための他の方法は、動いている個々の粒子により散乱された光の強度の角度依存性、即ち光散乱パターンの測定を意味する“Flying Light Scattering Indicatpix"(以後"FLSI") と呼ばれる方法を用いることに基づく (V.P.Maltsev, "Estimation of morphological Characteristics of single particles from light scattering data in flow cytometry," Russian Chemical Bulletin 43, 1115-1124 (1994))。FLSI方法は、流れの軸方向であるレーザービームにより照射された領域内で動いている粒子から10°〜 120°の極角及び０°〜 180°の方位角において散乱した光の強度の測定を供する特別の光学スキャンシステムを用いる。粒子の大きさはミー散乱理論に基づき記録されたパターンから計算される。この方法は通常の光の散乱測定よりかなり優れたシグナル対ノイズ比、並びに 0.5〜７μｍの間の粒子の大きさの正確な測定をを供し、この方法は、通常の光の散乱法より、小さな粒子の大きさを測定するためにかなり有用である。
【００３８】
共焦セット・アップの実施形態及びその性能の例
図１に示されるような光学セット・アップ及びその性能をテストした。光源（１）は、 532nm波長において 300μＷビームを作り出す周波数二重 10mW CWNd：YAG レーザーである。照射光を、 0.5の開口数を有する顕微鏡対物レンズ（２ｂ）を通してサンプル（３）に焦点を合わせた。サンプル（３）、を単純な液体操作システムと共に位置調節可能キャピラリーチューブ（４）を通して送った。放出された蛍光を二色鏡（５）及びピンホール／開口（６）により照射光から分離し、アバランシェ光子カウンター（７）により検出した（EG & G Optoelectronics, Canada, Type SPCM-141-AQ) 。
【００３９】
予め決定された濃度における特定のロダミン−Ｂ標識抗体で染色した大腸菌バクテリアを含むテストサンプルで単一光子励起共焦蛍光モードにおいてセット・アップをテストした。バクテリアから検出された単一光子バーストは６カウントの平均期待値で時間領域内にポアソン分布していた。光学構成物からのバックグラウンド蛍光及び散乱並びにディテクターの熱ノイズは 200ｃ／ｓの比率でランダムな単一カウントとして発生した。１マイクロ秒自動相関時間内に３カウントのしきい値でシグナルを自動相関することにより、 100秒当り１カウント未満の機械のバックグラウンドで90％計算効率となった。
【００４０】
本発明の方法及び装置は、通常のパルス高分析のかわりに単一光子バーストの相関分析を用いることに基づく。相関分析の使用は、回折制限焦点体積を供することにより、及び極めて高い量子効率を有するアバランシェ光子カウンターにより可能となる。本発明の装置に適用される回折制限焦点体積は、通常のフローサイトメトリーにおけるものより実質的に小さい。大きく改善されたセンシティビティー及びシグナル対ノイズ比は、焦点体積の外側の蛍光又は散乱物が通常のフローサイトメトリーの場合におけるものとしてディテクターにシグナルを送らない。これは、サンプル流における遊離染料分子からのシグナルがカウントされるべき粒子からのシグナルと一致しないことを意味する。同様に、光学構成物のバックグラウンド蛍光は、これらの光子の源の点が共焦でなく、又は２光子励起でないのでディテクターに達し得ない。
【００４１】
通常のフローサイトメトリーに典型的なキュベット及び流体工学システムが、この適用のために粗すぎる１オーダーの大きさであることが明らかであり、小さな寸法の特別の液体操作システム及びキュベットがそのシステムの信頼できる機能に必要であり得る。近年のミクロ機械法は、この目的のためのガラス、シリコン又はプラスチックの微小構造を許容する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明の方法のために必要とされる測定システムの機能図である。
【図２】ディテクターから得られたシグナルの例を示す。
【図１】
2004347608.tif 000003
【図２】
2004347608.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月20日(2004.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起及び検出が共焦セット・アップで行われることを特徴とするフロー蛍光法。
【請求項２】
蛍光放出が単一光子を分解することができる１以上の平行な光子カウンターで検出されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
異なる光子カウンターが、粒子を染色するために用いられる異なる蛍光染料に対応する異なる波長帯のために調整された適切なスペクトルフィルターを用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
バックグラウンドカウントとその流れ中の本当の蛍光粒子からのカウントとの間の識別が時間領域における単一光子カウントの相関分析に基づくことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一に記載の方法。
【請求項５】
励起及び検出のための共焦光学セット・アップを含むことを特徴とするフロー蛍光装置。
【請求項６】
単一光子を分解することができる蛍光検出のための１又はいくつかの平行な光子カウンターを組み込むことを特徴とする請求項５に記載の装置。
【請求項７】
蛍光検出のために用いられるディテクターが、前記粒子を染色するために用いられる異なる蛍光染料に対応する異なる波長帯のために調整された適切なスペクトルフィルターを用いることを特徴とする請求項６に記載の装置。
【請求項８】
蛍光検出のために用いられるディテクターが、高い量子効率で単一光子を分解することができるホトダイオードであることを特徴とする請求項６に記載の装置。
【請求項９】
時間領域における１又はいくつかの平行な光子ディテクターからの単一光子カウントのバーストの分析を行う単一のコリレーターを組み込むこと特徴とする請求項５に記載の装置。
【請求項１０】
相関時間及び相関しきい値を含む相関パラメータが不特定の光子カウントの最適な識別のために調節可能であることを特徴とする請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記粒子の大きさの決定のための相関光子カウントの時間の長さの決定のための手段を含むことを特徴とする請求項９に記載の装置。
【請求項１２】
励起力が、各々の特定の適用におけるサンプルからの最適な光子放出比率のために調節可能であることを特徴とする請求項５に記載の装置。