(57)【要約】【課題】グルタチオンの類縁物質であるホモグルタチオンの安価で工業的に大量生産が可能な微生物の酵素を利用した製造方法を提供する。【解決手段】ホモグルタチオンの構成アミノ酸であるＬ−グルタミン酸、Ｌ−システインおよびβ―アラニンを、好ましくはアデノシン−５’−三リン酸存在下、γ―グルタミルシステインシンセターゼ活性とグルタチオンシンセターゼ活性を有するエッシェリヒア属のバクテリアまたはその処理物、好ましくは遺伝子組換え技術により両酵素活性を増大させた大腸菌またはその処理物、を使用し、反応させてホモグルタチオンを生成させる。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−システイン及びβ―アラニンを、γ―グルタミルシステインシンセターゼ及びグルタチオンシンセターゼ活性を有するエッシェリヒア属のバクテリア又はその処理物を用い反応させることを特徴とする、ホモグルタチオンの製造方法。
【請求項２】
反応系に、アデノシン−５’−三リン酸を存在させることを特徴とする、請求項１記載のホモグルタチオンの製造方法。
【請求項３】
反応系に、アデノシン−５’−三リン酸の再生系を共役させることを特徴とする、請求項２記載のホモグルタチオンの製造方法。
【請求項４】
アデノシン−５’−三リン酸の再生系が、アセテートキナーゼ反応系、カルバメートキナーゼ反応系あるいはバクテリア、酵母の解糖反応系であることを特徴とする、請求項３記載のホモグルタチオンの製造方法。
【請求項５】
エッシェリヒア属のバクテリアが、遺伝子組換え技術によりグルタチオンシンセターゼ活性を増大させた大腸菌であることを特徴とする、請求項１記載のホモグルタチオンの製造方法。
【請求項６】
エッシェリヒア属のバクテリアの処理物が、エッシェリヒア属のバクテリアの無細胞抽出液、有機溶媒あるいは界面活性剤処理した細胞の懸濁液、固定化された菌体又は酵素のいずれかであることを特徴とする、請求項１記載のホモグルタチオンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、解毒や抗酸化作用で有用なグルタチオンの類縁物質であるホモグルタチオンの酵素法による製造方法に関する。ホモグルタチオンは主に豆科植物に存在し、生化学用の試薬として有用であるのみならず、生体内でグルタチオンと同様に解毒作用や抗酸化作用を有する化合物である。
【０００２】
【従来の技術】
ホモグルタチオンの製造に関しては、豆科植物のササゲ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓａｕｒｅｕｓ）からの抽出、精製、あるいは保護基を付けた原料アミノ酸からの化学合成が報告されている（Ｃａｍｂｌｅ，Ｒら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（Ｃ）１９６８年１２１９−１２２４頁）。
しかしながら、豆科植物からの抽出は、ホモグルタチオンの含有量が少ないことより、操作が煩雑で、収率が低く、また大量の廃棄物が発生する。一方、化学合成による方法は各構成アミノ酸に保護基を付けて順次合成していく方法であるが、収率が低いうえに、触媒として鉛や水銀を含む有害な化合物を使用するので好ましくない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、かかる従来の方法の欠点を有しない、安全でかつ簡便で安価に、ホモグルタチオンを酵素的に製造する方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる課題を解決するために、鋭意研究の結果、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−システインおよびβ―アラニンに、グルタミルシステインシンセターゼおよびグルタチオンシンセターゼ活性を有する大腸菌又はその処理物を反応させたところ、ホモグルタチオンが生成することを見出し、本発明を完成するにいたった。
すなわち本発明は、
（１）Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−システイン及びβ―アラニンを、γ―グルタミルシステインシンセターゼ及びグルタチオンシンセターゼ活性を有するエッシェリヒア属のバクテリア又はその処理物を用い反応させることを特徴とする、ホモグルタチオンの製造方法、
（２）反応系に、アデノシン−５’−三リン酸を存在させることを特徴とする、上記（１）記載のホモグルタチオンの製造方法、
（３）反応系に、アデノシン−５’−三リン酸の再生系を共役させることを特徴とする、上記（２）記載のホモグルタチオンの製造方法、
（４）アデノシン−５’−三リン酸の再生系が、アセテートキナーゼ反応系、カルバメートキナーゼ反応系あるいはバクテリア、酵母の解糖反応系であることを特徴とする、上記（３）記載のホモグルタチオンの製造方法、
（５）エッシェリヒア属のバクテリアが、遺伝子組換え技術によりグルタチオンシンセターゼ活性を増大させた大腸菌であることを特徴とする、上記（１）記載のホモグルタチオンの製造方法、
（６）エッシェリヒア属のバクテリアの処理物が、エッシェリヒア属のバクテリアの無細胞抽出液、有機溶媒あるいは界面活性剤処理した細胞の懸濁液、固定化された菌体又は酵素のいずれかであることを特徴とする、上記（１）記載のホモグルタチオンの製造方法、
を提供するものである。
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で用いられるバクテリアは、γ―グルタミルシステインシンセターゼ及びグルタチオンシンセターゼ活性を有するエッシュリヒア属のバクテリアであればいずれでもよいが、特に、遺伝子組換え手法でグルタチオンシンセターゼ活性を増強した大腸菌が好ましい。かかる大腸菌としては、特公平１−５８９５１号公報に記載のエシェリヒア・コリ微工研菌寄第７４７１が、また、グルタチオンシンセターゼ並びにγ−グルタミルシステインシンセターゼを共に増強した大腸菌としては、特公平１−５８９５１号公報に記載のエシェリヒア・コリ微工研菌寄第７４２０、エシェリヒア・コリ微工研菌寄第７４２１を挙げることができる。
これらバクテリアの培養は、特定の方法を用いることは必要とせず、通常の方法で培養すればよい。
【０００６】
反応は、培養により得られた菌体、あるいはその処理物が用いられる。処理物としては、菌体の有機溶媒あるいは界面活性剤処理物、無細胞抽出液、あるいは固定化された菌体又は酵素等を例示することができる。これらの中では、基質、特にアデノシン−５’−三リン酸の透過性をよくするためにトルエンのような有機溶媒あるいは界面活性剤による処理物、あるいは固定化された菌体又は酵素が好ましい。
固定化された菌体又は酵素は、例えばポリアクリルアミドゲル、アルギン酸カルシウム、カラギーナン等の高分子の担体に包括固定化し、ヘキサメチレンジアミンとグルタルアルデヒドによって架橋処理を行うことによって得られる。菌体の場合は、トルエンのような有機溶媒で更に処理すると高活性で耐久性に富む固定化菌体が得られる。この固定化菌体はカラムに充填し、固定化菌体カラムとして、ホモグルタチオンの連続生産に好適に用いられる。
【０００７】
ホモグルタチオンの酵素合成は、Ｌ−グルタミン酸とＬ−システインのγ―グルタミルシステインシンセターゼによるγ―グルタミルシステインの生成と、生成したγ―グルタミルシステインとβ―アラニンのグルタチオンシンセターゼによるホモグルタチオンの生成の２段階からなり、それぞれアデノシン−５’−三リン酸を必要とする。従って、反応系にアデノシンー５‘−三リン酸を添加することが望ましい。
アデノシン−５’−三リン酸は、それ自体を添加することもできるが、安価にホモグルタチオンを生産するために、アデノシン−５’−三リン酸の再生系を組み合わせることができる。組み合わせる再生系としては、アセトキナーゼ反応系、カルバメートキナーゼ反応系あるいはバクテリア、酵母の解糖反応系等を例示することができ、中でも大腸菌自体で活性の強いアセテートキナーゼ系が好ましい。
アデノシン−５’−三リン酸再生系を共役させる場合、例えば、アセトキナーゼ反応系を利用する場合、反応に必要なアデノシン−５’−三リン酸の添加量は必要モル数の１／１０〜１／１００とし、そのかわりに安価なアセチルリン酸を必要モル数添加することで反応を好適に進行させることができる。
【０００８】
ホモグルタチオン生成反応は、菌体あるいは菌体処理物を、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−システイン、β―アラニン、マグネシウムイオン、アデノシン−５’−三リン酸（及びアセチルリン酸）を含むｐＨ６〜９の反応液で、２０〜４０℃、数時間接触させることによって行うことができる。反応液の好ましい実施様態の例は、Ｌ−グルタミン酸５〜２００ｍＭ、Ｌ−システイン５〜５０ｍＭ、β―アラニン５〜２００ｍＭ、マグネシウムイオン１〜３０ｍＭ、アデノシン−５’−三リン酸０．５〜１０ｍＭ、アセチルリン酸５〜８０ｍＭ、リン酸カリウム緩衝液でｐＨは中性付近、反応温度は３７℃付近である。
また、固定化菌を充填したカラムで連続的にホモグルタチオンを生産する場合は、カラムを２０〜４０℃（好適には３７℃）に保温し、上記原料液を空間速度（Ｓ．Ｖ）０．１〜２．０（好適には０．５）で通塔することによって目的が達せられる。
【０００９】
生成したホモグルタチオンの単離、精製は、必要に応じて菌体等を除去後、反応液を吸着樹脂やイオン交換樹脂を用いる等の常法により行うことができる。
【００１０】
本発明の特徴は、γ−グルタミルシステインシンセターゼ及びグルタチオンシンセターゼの二酵素によりアミノ酸から酵素的にホモグルタチオンを製造する点にある。ホモグルタチオンは豆科植物の生体内では、γ―グルタミルシステインシとβ―アラニンから、グルタチオンシンセターゼとは別のホモグルタチオンシンセターゼで生合成されており、グルタチオンシンセターゼでホモグルタチオンが生合成されるという報告はない。本発明者等は、遺伝子組換え手法でグルタチオンシンセターゼ活性を増強した大腸菌の処理物を用い種々の反応を検討していたところ、驚くべきことに、グルタチオンの生合成の時の約６割の程度でホモグルタチオンが生成することを見いだしたものである。
【００１１】
【実施例】
以下実施例をもって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１
１．　微生物の培養
グルコース２％、ペプトン１％、酵母エキス１．５％、硫酸マグネシウム０．２％、ならびにリン酸一カリウム０．５％を含みｐＨ７．０に調整した培地１５Ｌを３０Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、加熱滅菌した。これに予めブイヨン培地にて前培養したエシェリヒア・コリＨＢ１０１を接種し、３７℃で２４時間好気条件下で培養した。この様にして得られた培養液を６０００ｒｐｍで遠心分離し、湿重量５００ｇの菌体を得た。
２．　トルエン処理菌体の調製
得られた湿菌体２４０ｇを生理食塩水で洗浄後、ｐＨ７．０の５ｍＭトリス塩酸溶液に０．５ｍＭとなる様にシステインを加えた緩衝液６００ｍｌに懸濁した。この懸濁液にトルエンを７８ｍｌ添加し、３０℃で激しく撹拌した。２時間撹拌後、遠心分離によりトルエン処理菌体２００ｇを得た。
３．　ホモグルタチオン生成反応
表１に示す組成の反応液１００ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、３７℃に保ちつつマグネチックスターラーで１００ｒｐｍにて撹拌し、７時間反応を行った。反応液を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、０．５ｍＭ（０．１６ｍｇ／ｍｌ）のホモグルタチオンが生成していた。なお、反応液にアセチルリン酸を添加しなかった場合、ホモグルタチオンの生成量は０．１ｍＭであった。
【００１２】
【表１】
2004041146.tif 000002
【００１３】
実施例２
実施例１と同じ組成の培地に加熱滅菌後２０μｇ／ｍｌとなる様にクロラムフェニコールを添加した培地でエシェリヒア・コリ微工研菌寄第７４２１を実施例１と同様に培養して、湿重量４２０ｇの菌体を得た。得られた菌体を実施例１と同様に処理してトルエン処理菌体２００ｇを得た。
得られたトルエン処理菌体を用いて実施例１と同様に表１に示した反応組成の反応液１Ｌで７時間反応を行った結果、高速液体クロマトグラフィーで、１０ｍＭ（３．２ｍｇ／ｍｌ）のホモグルタチオンが生成した。
得られた反応液１Ｌを分画分子量６０００の限外濾過膜で濾過した後、硫酸でｐＨ２．０に調整して、吸着樹脂セパビーズＳＰ２０７（三菱化学工業製）１Ｌを充填したカラムに通塔しホモグルタチオンを吸着させた。そのカラムを水洗後、１０％メタノールで溶出し、溶出したホモグルタチオン画分をイオン交換樹脂ダイヤイオンＷＡ３０Ｓ（三菱化学工業製）６０ｍｌを充填したカラムに通塔しホモグルタチオンを吸着させた。そのカラムを水洗後、２％の酢酸で溶出し、ホモグルタチオン画分を集めた。
ホモグルタチオン画分を減圧濃縮して生成した白色の結晶状のものを濾取して減圧乾燥を行ったところ、１．２ｇのホモグルタチオンを得た。
得られたホモグルタチオンの高速液体クロマトグラフィー分析での純度は９５％であった。
また、得られたホモグルタチオンを加水分解して、ほぼ等モルのＬ−グルタミン酸、Ｌ−システインおよびβ―アラニンが生ずることをアミノ酸アナライザーにて確認した。
【００１４】
実験例
表２に記載の各種微生物を、実施例１と同じ培地組成の培地１Ｌを５Ｌ三角フラスコに入れて、３０℃で２４時間振トウ培養した。培養終了後、各々の培養液より遠心分離で菌体を集めた。各湿菌体１ｇにつきトルエン処理、ならびに超音波破砕を行った。トルエン処理は実施例１と同様にして、超音波破砕は湿菌体１ｇを４ｍｌのｐＨ７．０の５ｍＭトリス塩酸溶液に０．５ｍＭとなる様にシステインを加えた緩衝液に懸濁して、冷却しながら４分間行い、遠心分離して酵素液を得た。
それぞれの菌体処理液を用いて、実施例１と同様に表１に示した反応液５０ｍｌで７時間反応を行い、生成しているホモグルタチオン量を高速液体クロマトグラフィーで測定した。結果を表２に示す。なお、超音波破砕で得た酵素液の添加量は各々２ｍｌとした。
【００１５】
【表２】
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【００１６】
実施例３
実施例２で得たエシェリヒア・コリ微工研菌寄第７４２１の湿菌体２０ｇを生理食塩水で洗浄後、生理食塩水２０ｍｌに懸濁し、４０℃に保った。１．２４ｇのκ―カラギーナンを６０ｍｌの生理食塩水に溶解し、４０℃に昇温し、上記菌体懸濁液を添加混合した。この混合液を０．３Ｍ塩化カリウム水溶液中に滴下して球状の固定化菌体を得た。この固定化菌体を２％の塩化カリウム、０．０８Ｍのヘキサメチレンジアミン及び１％のグルタルアルデヒドを含む０．３３Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）４００ｍｌに移し、５℃で１時間緩やかに撹拌して硬化処理を行い、生理食塩水で洗浄後、トルエン１０％、Ｌ−システイン０．５ｍＭを含む５ｍＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）２００ｍｌに入れて、２５℃で１時間撹拌した。
このようにして得たトルエン処理した固定化菌体８０ｇを生理食塩水で洗浄後、ジャケット付きのカラム（φ２．７ｃｍ×１４ｃｍ）に充填し、ジャケットに温水を通して３７℃に保ち、表１に示した組成の原料液（但し、表１中のトルエン処理菌体を除く）を毎時４０ｍｌの流速で通塔させた。
この操作を５日間連続して行い、通過液中に生成しているホモグルタチオンを実施例２と同様の方法で単離した。その結果、５日間の連続生産で合計１．１ｇのホモグルタチオンを得た。
得られたホモグルタチオンの純度は高速液体クロマトグラフィー分析で９６％であった。又、取得したホモグルタチオンは実施例２と同様の方法で同定した。
【００１７】
【発明の効果】
本発明は、従来知られていない、微生物あるいは酵素法によるホモグルタチオンの製造方法であり、安価に工業的に大量生産が可能な微生物を使用する製造方法を提供するものである。
本発明においてＬ−グルタミン酸、Ｌ−システインおよびβ―アラニンにγ―グルタミルシステインシンセターゼとグルタチオンシンセターゼの二酵素を同時に作用させ、γ―グルタミルシステインシンセターゼはＬ−グルタミン酸とＬ−システインを結合させ、グルタチオンシンセターゼはその結合物にβ―アラニンを結合させてホモグルタチオンを生成させる。これらの反応は同一系内で併行して行われ、お互いに反応を阻害せずかえって全体としての反応の進行が促進される。工程が少ない分、高収率が達成される。遺伝子組換え技術で両酵素の活性を増大させた菌を使用すると実生産で回収が可能なホモグルタチオンの生成が認められる。
また、大腸菌で元々活性の高いアセテートキナーゼによるアデノシン−５’−三リン酸再生系等を利用することによって、安価なアセチルリン酸を供給するだけで、アデノシン−５’−三リン酸が反応に消費された時に生じるアデノシン−５’−二リン酸がアデノシン−５’−三リン酸に再生され、高価なアデノシンー５‘−三リン酸をエネルギー源として大量に添加し消費することなくホモグルタチオンが酵素的に合成される。
さらに、菌体固定化物等を充填したカラムを利用した場合、ホモグルタチオンの連続生産が可能であり、菌体の取扱い回数が少なくて済み、工業的に有利である。