(57)【要約】　　　（修正有）【課題】　特定のアミノ酸配列を有するヒトＴ１レセプター（Ｔ１Ｒ）様リガンドＩポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供すること。【解決手段】　特定のアミノ酸配列を有するか、またはＡＴＣＣ受託番号第９７６５６号に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる、全長Ｔ１Ｒ様リガンドＩポリペプチド、成熟Ｔ１Ｒ様リガンドＩポリペプチド、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ細胞外ドメイン、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ膜貫通ドメイン、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列、そのポリヌクレオチドのいずれか１つのヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列、からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含有する単離された核酸分子。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　以下からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含有する単離された核酸分子：
　（ａ）図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を有するか、またはＡＴＣＣ受託番号第９７６５６号に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる、全長Ｔ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
　（ｂ）図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を有するか、またはＡＴＣＣ受託番号第９７６５６号に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる、成熟Ｔ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
　（ｃ）図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を有するか、またはＡＴＣＣ受託番号第９７６５６号に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；
　（ｄ）図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を有するか、またはＡＴＣＣ受託番号第９７６５６号に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列；
　（ｅ）図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を有するか、またはＡＴＣＣ受託番号第９７６５６号に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列；
　（ｆ）　（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）のポリヌクレオチドのいずれか１つのヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　（発明の分野）
　本発明は、新規のＴ１レセプター（Ｔ１Ｒ）様リガンドＩタンパク質に関する。詳細には、Ｔ１Ｒ様リガンドＩタンパク質をコードする単離された核酸分子が提供される。Ｔ１Ｒ様リガンドＩポリペプチド、組換えベクターおよびこれらを発現するための宿主細胞もまた提供される。
【０００２】
　（関連分野）
　インターロイキン−１（ＩＬ−１）。インターロイキン−１（ＩＬ−１αおよびＩＬ−１β）は、ほとんど全ての細胞型に影響する「多機能性」サイトカインであり、そしてしばしば、他のサイトカインまたはメディエータ小分子と共同して影響する。（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，　Ｃ．Ａ．，　Ｂｌｏｏｄ　８７：２０９５−２１４７　（１９９６年３月１５日）。）Ｌ−１遺伝子ファミリーの３つのメンバー：ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、およびＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）が存在する。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βはアゴニストであり、ＩＬ−１Ｒａは特異的なレセプターアンタゴニストである。ＩＬ−１αおよびβは、リーダー配列を有さない前駆体として合成される。各前駆体の分子量は３１ｋＤである。ＩＬ−１αまたはＩＬ−１βの１７ｋＤの「成熟」形態へのプロセシングは、特異的な細胞性プロテアーゼを必要とする。対照的に、ＩＬ−１Ｒａは、シグナルペプチドを伴って進化し、そして細胞の外に容易に輸送され、そして分泌ＩＬ−１Ｒａ（ｓＩＬ−１Ｒａ）と呼ばれる。
【０００３】
　ＩＬ−１レセプターおよびリガンド。ＩＬ−１経路のレセプターおよびリガンドは十分に規定されている（総説については、Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，　Ｃ．Ａ．，　ＦＡＳＥＢ　Ｊ．　８：１３１４−１３２５　（１９９４）；　Ｓｉｍｓ，　Ｊ．Ｅ．ら、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１　ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ，　３巻、ＪＡＩ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｉｎｃ．，　Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，　ＣＴ　（１９９４），　１９７−２２２頁）。３つのリガンド、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、およびＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）は、３つの型のＩＬ−１レセプター、８０−ｋＤａ　Ｉ型ＩＬ−１レセプター（ＩＬ−１Ｒ１）（Ｓｉｍｓ，　Ｊ．Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：５８５−５８９　（１９８８）），　６８−ｋＤａ　ＩＩ型ＩＬ−１レセプター（ＩＬ−１ＲＩＩ）（ＭｃＭａｈａｎ，　Ｃ．Ｊ．ら、ＥＭＢＯ　Ｊ．　１０：２８２１−２８３２　（１９９１）、および可溶性形態のＩＩ型ＩＬ−１Ｒ（ｓＩＬ−１ＲＩＩ）を結合する（Ｃｏｌｏｔｔａ，　Ｆ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６１：４７２−４７５　（１９９３））。
【０００４】
　ＩＬ−１リガンドとレセプターとの間の相互作用は、損傷および感染へのＩＬ−１媒介宿主応答の刺激および調節に必須の役割を果たす。ＩＬ−１ＲＩを発現する細胞およびＩＬ−１αまたはＩＬ−１βで処理した細胞は、以下を含むいくつかの特定の方法で応答する：関連する転写因子、ＮＦ−κβの核局在化を刺激すること（総説については、Ｔｈａｎｏｓ，　Ｄ．＆　Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．　Ｃｅｌｌ　８０：５２９−５３２　（１９９６）を参照のこと）、上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）のスレオニン６６９残基（Ｔｈｒ−６６９）をリン酸化するマイトジェン活性化タンパク質キナーゼスーパーファミリーのタンパク質キナーゼの活性化（Ｇｕｙ，　Ｇ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２６７：１８４６−１８５２　（１９９２）；　Ｂｉｒｄ，　Ｔ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２６８：２２８６１−２２８７０　（１９９１）；　Ｂｉｒｄ，　Ｔ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．　２６９：３１８３６−３１８４４　（１９９４））、およびＩＬ−８遺伝子の転写の刺激（Ｍｕｋａｉｄａ，　Ｎ．ら、Ｊ．Ｂｏｌ．ｃｈｅｍ．　２６５：２１１２８−２１１３３　（１９９０））。
【０００５】
　ＩＬ−１ＲＩ様ファミリー。多様な系に由来する多くのタンパク質が、ＩＬ−１ＲＩの細胞質内ドメインに相同性を示す。この拡大したＩＬ−１ＲＩ様ファミリーは、哺乳動物タンパク質、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａタンパク質、および植物（タバコ）タンパク質を含む。（Ｇａｙ，　Ｎ．Ｊ．＆　Ｋｅｉｔｈ，　Ｆ．Ｊ．，　Ｎａｔｕｒｅ　３５１：３５５−３５６　（１９９１）；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｃ．ら、Ｃｅｌｌ　５２：２６９−２７９　（１９８８）；　Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，　Ｄ．Ｓ．ら、Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖ．　５：７９７−８０７　（１９９１）；　Ｅｄｏｎ，　Ｅ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１２０：８８５−８９９　（１９９４）；　Ｍｉｔｃｈａｎ，　Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ　２７１：５７７７−５７８２　（１９９６年３月８日））。
【０００６】
　哺乳動物ＩＬ−１ＲＩ様レセプターファミリーメンバーは、マウスタンパク質ＭｙＤ８８　（Ｌｏｒｄ，　Ｋ．Ａ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　５：１０９５−１０９７　（１９９０））およびヒト遺伝子、ｒｓｃ７８６（Ｎｏｍｕｒａ，　Ｎ．ら、ＤＮＡ　Ｒｅｓ．　１：２７−３５　（１９９４））を含む。別のマウスレセプターメンバー、Ｔ１／ＳＴ２は、ＢＡＬ／ｃ−３Ｔ３細胞において発現される新規の一次応答遺伝子として以前に特徴付けられた（Ｋｌｅｍｅｎｚ，　Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８６：５７０８−５７１２　（１９８９）；Ｔｏｍｉｎａｇａ，　Ｓ．，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　２５８：３０１−３０４　（１９８９）；　Ｔｏｍｉｎｇａ，　Ｓ．ら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　３１８：８３−８７　（１９９３））。膜貫通タンパク質ｍｕｌＬ−１Ｒ　ＡｃＰ（Ｇｒｅｅｎｆｅｄｅｒ，　Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２７０：１３７５７−１３７６５　（１９９５））は、Ｉ型およびＩＩ型ＩＬ−１Ｒの両方に相同性を有する。ＩＬ−１Ｒ　ＡｃＰは、ＩＬ−１ＲＩのＩＬ−１βに対する親和性を増強することが最近示されており、そしてＩＬ−１応答を媒介することに関与し得る。
【０００７】
　Ｔ１レセプター。ＩＬ−１レセプターファミリーのメンバーとしてのＴ１／ＳＴ２レセプター（以降、「Ｔ１レセプター」）（Ｂｅｒｇｅｒｓ，　Ｇ．ら、ＥＭＢＯ　Ｊ．　１３：１１７６　（１９９４））は、異なる種において種々のホモログを有する。ラットでは、それはＦｉｔ−１と呼ばれ、マウスＩＬ−１ＲＩおよびＩＩそれぞれに対して２６％〜２９％のアミノ酸相同性を共有するエストロゲン誘導性、ｃ−ｆｏｓ−依存性膜貫通タンパク質である。マウスでは、Ｆｉｔ−１タンパク質はＳＴ２と呼ばれ、ヒトではＴ１と呼ばれる。２つのＩＬ−１レセプターおよびＦｉｔ−１／ＳＴ２／Ｔ１遺伝子の機構は、それらが共通の祖先に由来することを示す（Ｓｉｍｓ，　Ｊ．Ｅ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　７：４８３　（１９９５））。Ｆｉｔ−１は、２つの形態で存在する：ＩＬ−１ＲＩおよびＦｉｔ−１Ｓのサイトゾルドメインに類似したサイトゾルドメインを有する膜形態（Ｆｉｔ−１Ｍ）、これは分泌され、そしてＦｉｔ−Ｍの細胞外ドメインからなる。
【０００８】
　多くの方法において、これらの２つの形態のＦｉｔ−１タンパク質は、膜結合および可溶性ＩＬ−１ＲＩの形態に類似する。ＩＬ−１ｓＲＩが細胞結合形態のタンパク質分解切断に由来することが示されている（Ｓｉｍｓ，　Ｊ．Ｅ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　７：４８３　（１９９５））。他方では、Ｆｉｔ−１遺伝子は、２つのプロモーターの制御下にある。これは、膜のレセプターまたは可溶性形態のレセプターのいずれかをコードする２つのイソ型を生じる。２つのＲＮＡ転写物は、遺伝子の３’末端のオルタナティブＲＮＡスプライシングから生じる。ＩＬ−１βは、Ｆｉｔ−１に弱く結合し、そしてシグナルを伝達しない（Ｒｅｉｋｅｒｓｔｏｒｇｅｒ，　Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２７０：１７６４５　（１９９５））が、サイトゾルＦｉｔ−１に融合された細胞外マウスＩＬ−１ＲＩからなるキメラレセプターはＩＬ−１シグナルを伝達する（Ｒｅｉｋｅｒｓｔｏｒｇｅｒ，　Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２７０：１７６４５　（１９９５））。Ｆｉｔ−１のサイトゾル部分は、ＩＬ−１ＲＩのＧＴＰａｓｅ様配列と整列化する（Ｈｏｐｐ，　Ｔ．Ｐ．，　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉ．　４：１８５１　（１９９５））（下記参照）。
【０００９】
　種々の疾患状態におけるＩＬ−１産生。増大したＩＬ−１産生は、種々のウイルス、細菌、真菌、および寄生体の感染；血管内凝固；高用量ＩＬ−２治療；固形腫瘍；白血病；アルツハイマー病；ＨＩＶ−１感染；自己免疫障害；外傷（外科）；血液透析；虚血性疾患（心筋梗塞）；　非感染性肝炎；喘息；ＵＶ照射；閉鎖性頭部損傷；膵炎；歯周病；対宿主性移植片病；移植片拒絶を有する患者、および激しい運動後の健康な被検体において報告されている。アルツハイマー病を有する患者における増大したＩＬ−１β産生とアミロイド前駆体タンパク質の放出における考えられるＩＬ−１の役割との関連が存在する（Ｖａｓｉｌａｋｏｓ，Ｊ．Ｐ．ら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　３５４：２８９　（１９９４））。しかし、ほとんどの条件において、ＩＬ−１は、産生の増大を示す唯一のサイトカインではなく、従って、任意の特定の疾患の病原に関連するようなＩＬ−１知見の特異性は欠損している。種々の疾患状態において、ＩＬ−１αではなくＩＬ−１βは、循環において検出される。
【００１０】
　治療におけるＩＬ−１。ＩＬ−１は、多くの重要な生物学的活性を発揮することが見出されているが、治療用量に近接した用量で毒性であることも見出されている。（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，　Ｃ．Ａ．，　Ｂｌｏｏｄ　８７：２０９５−２１４７　（１９９６年３月１５日））。一般に、ＩＬ−１のいずれかのイソ型の急性毒性は、皮下注射と比較して静脈注射後で大きかった。皮下注射は、有意な局所的疼痛、紅斑、および膨潤（Ｋｉｔａｍｕｒａ，　Ｔ．，＆　Ｔａｋａｋｕ，　Ｆ．，　Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．　７：１７０　（１９８９）；　Ｌａｕｇｈｌｉｎ，　Ｍ．Ｊ．，　Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．　６７：２６７　（１９９３））。１００ｎｇ／ｋｇ以上の用量でＩＬ−１を静脈に投与した患者は有意な低血圧を経験した。皮下に４〜３２ｎｇ／ｋｇのＩＬ−１βを与えた患者では、最も高い用量レベルで唯一低血圧の発症があっただけであった（Ｌａｕｇｈｌｉｎ，　Ｍ．Ｊ．，　Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．　６７：２６７　（１９９３））。
【００１１】
　正常な髄貯蔵を有する患者におけるＩＬ−１関連骨髄刺激とは対照的に、５日周用量（３０〜１００ｍｇ／ｋｇ）のＩＬ−１αで処置された再生不良性貧血を有する患者は、末梢血計数または骨髄細胞性において増大を有さなかった（Ｗａｌｓｈ，　Ｃ．Ｅ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ　８０：１０６　（１９９２））。ＩＬ−１は、好中球減少および血小板減少の最下点を元に戻すために、化学療法の種々の措置を受けた患者に投与される。
【００１２】
　自己の骨髄または幹細胞の０日〜１３日の４０ｎｇ／ｋｇのＩＬ−１αでの日周処置は、好中球減少のより早い回復を生じた（中央値、１２日；Ｐ＜０．００１）（Ｗｅｉｓｄｏｒｆ，　Ｄ．ら、Ｂｌｏｏｄ　８４：２０４４　（１９９４）。処置の１４日後、骨髄は、関係付けられた骨髄球前駆細胞で有意に富化された。同様の結果が、パージした骨髄またはパージしていない骨髄の移植のときに開始して５日間、５０ｎｇ／ｋｇ／ｄのＩＬ−１βを与えたＡＭＬを有する患者において報告された（Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ，　Ｊ．ら、Ｂｌｏｏｄ　８３：３４７３　（１９９４））。低容量のＩＬ−１αまたはＩＬ−１βのいずれかをヒトに注射することによって、印象的な発熱性および分子の低血圧誘導性特性が確認される。
【００１３】
　可溶性ＩＬ−１レセプターを用いる疾患の回復。マウスＩＬ−１ｓＲＩのマウスへの投与は、異所（ｈｅｔｅｒｏｔｏｐｉｃ　ｈｅａｒ）同種移植片の生存を増大し、そして同種移植間の細胞の過形成性リンパ節応答を減少した（Ｆａｎｓｌｏｗ，　Ｗ．Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４８：７３９（１９９０））。抗原誘導性関節炎のラットモデルにおいて、マウスＩＬ−１ｓＲＩの局所滴下は、関節膨張および組織破壊を減少した（Ｄｏｗｅｒ，　Ｓ．Ｋ．ら、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１：１１３　（１９９４））。これらのデータは、正常な対側関節に投与されたＩＬ−１ｓＲＩの総量が全身的に作用したことを示す。実験的な自己免疫脳炎のモデルにおいて、ＩＬ−１ｓＲＩは、この疾患の重篤度を減少した（Ｊａｃｏｂｓ，　Ｃ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１４６：２９８３　（１９９１））。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
　本発明は、以下からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含有する単離された核酸分子である：
　（ａ）図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を有するか、またはＡＴＣＣ受託番号第９７６５６号に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる、全長Ｔ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
　（ｂ）図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を有するか、またはＡＴＣＣ受託番号第９７６５６号に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる、成熟Ｔ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
　（ｃ）図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を有するか、またはＡＴＣＣ受託番号第９７６５６号に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；
　（ｄ）図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を有するか、またはＡＴＣＣ受託番号第９７６５６号に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列；
　（ｅ）図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を有するか、またはＡＴＣＣ受託番号第９７６５６号に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列；
　（ｆ）　（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）のポリヌクレオチドのいずれか１つのヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列。
【００１５】
　好適な実施形態においては、上記ポリヌクレオチドが、膜貫通ドメインの全てまたは一部が欠失されているＴ１Ｒ様リガンドＩポリペプチド細胞外ドメインおよび細胞内ドメインをコードする配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有する。
【００１６】
　本発明はまた、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）のヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子であって、ハイブリダイズするポリヌクレオチドが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、Ａ残基のみまたはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにはハイブリダイズしない、単離された核酸分子である。
【００１７】
　本発明はまた、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）のアミノ酸配列を有するＴ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子である。
【００１８】
　好適な実施形態においては、上記単離された核酸分子が、以下からなる群から選択されるＴ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドのエピトープ保有部分をコードする：図１（配列番号２）の約２０〜約５３のアミノ酸残基を含むポリペプチド；図１（配列番号２）の約８２〜約９８のアミノ酸残基を含むポリペプチド；図１（配列番号２）の約１０６〜約１３４のアミノ酸残基を含むポリペプチド；および約１５５〜約１８４のアミノ酸残基を含むポリペプチド。
【００１９】
　本発明はまた、上記の単離された核酸分子をベクターに挿入する工程を包含する、組換えベクターを作製する方法である。
【００２０】
　本発明はまた、上記の方法によって産生される、組換えベクターである。
【００２１】
　本発明はまた、上記の組換えベクターを宿主細胞を導入する工程を包含する、組換え宿主細胞を作製する方法である。
【００２２】
　本発明はまた、上記の方法によって産生される組換え宿主細胞である。
【００２３】
　本発明はまた、ポリペプチドを産生するための組換え方法であって、上記の宿主細胞を、ポリペプチドが発現されるような条件下で培養する工程、およびポリペプチドを回収する工程を包含する、方法である。
【００２４】
　本発明はまた、以下からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する単離されたＴ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドである：
　（ａ）図１（配列番号２）に示されるか、またはＡＴＣＣ受託番号第９７６５６号に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる全長Ｔ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドのアミノ酸配列；
　（ｂ）図１（配列番号２）に示されるか、またはＡＴＣＣ受託番号第９７６５６号に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる成熟Ｔ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドのアミノ酸配列；
　（ｃ）図１（配列番号２）に示されるか、またはＡＴＣＣ受託番号第９７６５６号に含まれるｃＤＮＡによってコードされるＴ１Ｒ様リガンドＩポリペプチド細胞外ドメインのアミノ酸配列；
　（ｄ）図１（配列番号２）に示されるか、またはＡＴＣＣ受託番号第９７６５６号に含まれるｃＤＮＡによってコードされるＴ１Ｒ様リガンドＩポリペプチド膜貫通ドメインのアミノ酸配列；
　（ｅ）図１（配列番号２）に示されるか、またはＡＴＣＣ受託番号第９７６５６号に含まれるｃＤＮＡによってコードされるＴ１Ｒ様リガンドＩポリペプチド細胞内ドメインのアミノ酸配列；
　（ｆ）図１（配列番号２）に示されるか、またはＡＴＣＣ受託番号第９７６５６号に含まれるｃＤＮＡによってコードされるＴ１Ｒ様リガンドＩポリペプチド細胞外ドメインおよび細胞内ドメインのアミノ酸配列であって、膜貫通ドメインの全てまたは一部が欠失されている、アミノ酸配列；および
　（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）のポリペプチドのいずれか１つのエピトープ保有部分のアミノ酸配列。
【００２５】
　本発明はまた、Ｔ１Ｒ様リガンドＩタンパク質のエピトープ保有部分を含む単離されたポリペプチドであって、部分が以下からなる群から選択される、単離されたポリペプチドである：図１（配列番号２）の約２０〜約５３のアミノ酸残基を含むポリペプチド；図１（配列番号２）の約８２〜約９８のアミノ酸残基を含むポリペプチド；図１（配列番号２）の約１０６〜約１３４のアミノ酸残基を含むポリペプチド；および約１５５〜約１８４のアミノ酸残基を含むポリペプチド。
【００２６】
　本発明はまた、上記のＴ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体である。
【００２７】
　本発明はまた、増大したレベルのＴ１Ｒ様リガンドＩ活性の必要性を有する個体を処置する方法であって、個体に上記の単離されたポリペプチドを含む組成物を投与する工程を含む、方法である。
【００２８】
　本発明はまた、減少したレベルのＴ１Ｒ様リガンドＩ活性の必要性を有する個体を処置する方法であって、個体に上記の単離された抗体を含む組成物を投与する工程を含む、方法である。
【００２９】
　本発明はまた、障害の診断の間に有用である方法であって：
　（ａ）個体の細胞または体液におけるＴ１Ｒ様リガンドＩ遺伝子発現レベルを測定する工程；
　（ｂ）個体のＴ１Ｒ様リガンドＩ遺伝子発現レベルと標準的なＴ１Ｒ様リガンドＩ遺伝子発現レベルとを比較し、それによって標準を上回るＴ１Ｒ様リガンドＩ遺伝子発現レベルにおける増大または減少が、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ関連障害の指標である、工程、
を包含する、方法である。
【００３０】
　（発明の要旨）
　本発明は、図１（配列番号２）のアミノ酸配列を有するヒトＴ１レセプター（Ｔ１Ｒ）様リガンドＩポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。Ｔ１Ｒ様リガンドＩは、Ｎ末端メチオニン、約２７アミノ酸残基のリーダー配列、約１５１残基の細胞外成熟ドメイン、約２３残基の潜在的な膜貫通ドメインおよび約１６アミノ酸残基の細胞内ドメイン、および約２５ｋＤａの推定分子量を含む、約２１７アミノ酸残基のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む。予想された成熟細胞外Ｔ１Ｒ様リガンドＩタンパク質の１５１アミノ酸配列を図１および配列番号２（残基２８〜１７８）に示す。
【００３１】
　別の局面において、本発明は、１９９６年７月１２日にＡＴＣＣ受託番号９７６５６として寄託されたクローンのｃＤＮＡによってコードされたアミノ酸配列を有するＴ１Ｒ様リガンドＩをコードする単離された核酸分子を提供する。好ましくは、核酸分子は、上記の寄託されたｃＤＮＡによってコードされる成熟ポリペプチドをコードする。
【００３２】
　本発明は、さらに、本明細書中に記載される核酸分子の核酸フラグメントに関する。寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子のフラグメントによって、本明細書中で考察されるような診断プローブおよびプライマーとして有用である少なくとも約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも約４０ｎｔの長さのフラグメントが意図される。もちろん、５０〜７３８ｎｔの長さのより大きなフラグメントもまた、寄託されたｃＤＮＡまたは図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列の（全てではなくとも）ほとんどに一致するフラグメントと同様に、本発明に従って有用である。少なくとも２０ｎｔの長さのフラグメントによって、例えば、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列からの２０以上の連続した塩基を含むフラグメントが意図される。遺伝子が寄託されており、そして図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列が提供されるので、このようなＤＮＡフラグメントを作製することは、当業者にとって日常的である。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。
【００３３】
　好ましい核酸フラグメントは、約２７アミノ酸残基（図１（配列番号２）の約１〜約２７のアミノ酸残基）のリーダー配列；約１５１残基の細胞外成熟ドメイン（図１（配列番号２）の約２８〜約１７８のアミノ酸残基）；約２３アミノ酸の膜貫通ドメイン（図１（配列番号２）の約１７９〜約２０１のアミノ酸残基）；約１６アミノ酸の細胞内ドメイン（図１（配列番号２）の約２０２〜約２１７のアミノ酸残基）；膜貫領域の全てまたは一部が欠失した細胞外および細胞内ドメインを含むペプチドをコードする核酸分子を含む。
【００３４】
　本発明のさらなる実施態様は、本明細書中に記載される核酸分子のいずれかのヌクレオチド配列に少なくとも９０％同一であり、そしてより好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子を含む。
【００３５】
　本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、組換えベクターを含む宿主細胞、および組換え技術によるＴ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドまたはそのフラグメントの産生に関する。
【００３６】
　本発明のポリペプチドは、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド、図１（配列番号２）のポリペプチド（詳細には、成熟ポリペプチド）、ならびに寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド、図１（配列番号２）のポリペプチド、またはそれらのフラグメントのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の類似性、より好ましくは少なくとも９５％の類似性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。本発明のさらなるポリペプチドは、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド、図１（配列番号２）のポリペプチド、またはそれらのフラグメントのアミノ酸配列に少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％または９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００３７】
　本発明による好ましいポリペプチドフラグメントは、成熟ポリペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン、または膜貫通ドメインの全てまたは一部を欠失した細胞外および細胞内ドメインを含むポリペプチドを含む。
【００３８】
　本発明のさらなる実施態様は、本明細書中に記載のＴ１Ｒ様リガンドＩのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはペプチドに関する。本発明のＩＬ−１様ポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも６〜３０または９〜５０のアミノ酸を有するこのようなポリペプチドの部分を含むが、本明細書中に記載される本発明のポリペプチドの全アミノ酸配列の長さまでの任意の長さ（全体を含む）のエピトープ保有部分ポリペプチドもまた含まれる。
【００３９】
　別の実施態様において、本発明は、本明細書中に記載されるアミノ酸配列を有するＴ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体を提供する。
【００４０】
　本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩの生物学的活性は、Ｔ１ＲリガンドおよびＩＬ−１の生物学的活性に類似すると考えられる。「正常な」Ｔ１Ｒ様リガンドＩ遺伝子発現レベル（すなわち、Ｔ１Ｒリガンド関連障害またはＩＬ−１関連障害を有さない個体由来の組織または体液における発現レベル）と比較して、有意により高いまたはより低いレベルのＴ１Ｒ様リガンドＩが、Ｔ１Ｒリガンド関連障害またはＩＬ−１関連障害を有する個体由来の組織または体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液、または髄液）において検出され得る。従って、本発明によるＴ１Ｒ様リガンドＩ遺伝子発現の発現を検出することは、診断マーカーである。
【００４１】
　さらなる実施態様において、本発明は、身体における増大または減少したレベルのＴ１Ｒ様リガンドＩ活性の必要性を有する個体を処置する方法に関する。この方法は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドまたはそのインヒビターを含む組成物をそのような個体に投与することを含む。
【００４２】
　本発明は、本明細書中に記載されるアミノ酸配列を有するＴ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドに特異的に結合する抗体を単離するための方法をさらに提供する。このような抗体は、上記のように、診断または治療に有用であり得る。
【００４３】
　（発明の詳細な説明）
　本発明は、図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列（クローン化されたｃＤＮＡを配列決定することによって決定した）を有するＴ１Ｒ様リガンドＩタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する。本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩタンパク質は、Ｔ１Ｒリガンド（図２）と配列相同性を共有する。
【００４４】
　図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列は、ＨＥＭＥＭ９０クローンを配列決定することによって得られた。これは、１９９６年７月１２日に、アメリカンタイプカルチャーコレクション，　１２３０１　Ｐａｒｋ　Ｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ，　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２に寄託され、そして受託番号第９７６５６号を与えられた。寄託されたクローンは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（−）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，　ＬａＪｏｌｌａ，　ＣＡ）中に含まれる。
【００４５】
　（核酸分子）
　他に示されない限り、本明細書中でＤＮＡ分子を配列決定することによって決定されたすべてのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡ配列決定機（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｉｎｃ．からのＭｏｄｅｌ　３７３）を用いて決定され、そして本明細書中で決定されるＤＮＡ分子によってコードされるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質のすべてのアミノ酸配列は、上記のように決定されるＤＮＡ配列の翻訳によって予想された。従って、この自動化アプローチによって決定された任意のＤＮＡ配列について当分野において公知のように、本明細書中で決定される任意のヌクレオチド配列はいくつかの誤りを含み得る。自動化によって決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されるＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して、代表的には少なくとも約９０％の同一、より代表的には少なくとも約９５％から少なくとも約９９．９９％の同一である。
【００４６】
　実際の配列は、当分野において周知の手動ＤＮＡ配列決定方法を含む他のアプローチによってより正確に決定され得る。当分野においてまた公知のように、実際の配列と比較した、決定されるヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳におけるフレームシフトを引き起こし、その結果、決定されるヌクレオチド配列によってコードされる予想されるアミノ酸配列は、挿入または欠失のような点にて始まる配列決定されるＤＮＡ分子によって実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なる。
【００４７】
　他に示されない限り、本明細書中に示される各「ヌクレオチド配列」は、デオキシリボヌクレオチド（Ａ，　Ｇ，　Ｃ，　およびＴと省略される）の配列として示される。しかし、核酸分子またはポリヌクレオチドの「核酸配列」によって、ＤＮＡ分子またはポリヌクレオチドにはデオキシリボヌクレオチドの配列が、そしてＲＮＡ分子またはポリヌクレオチドにはリボヌクレオチド（Ａ，　Ｇ，　Ｃ，　およびＵ）の対応する配列（ここで特定されるデオキシヌクレオチド配列における各チミジンデオキシヌクレオチド（Ｔ）は、リボヌクレオチドのウリジン（Ｕ）によって置き換えられる）が意図される。例えば、デオキシリボヌクレオチドの略語を用いて示される配列番号１の配列を有するＲＮＡ分子との言及は、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ，　ＧまたはＣが、対応するリボヌクレオチドＡ，　Ｇ，　またはＣによって置き換えられ、そして各デオキシヌクレオチドＴが、リボヌクレオチドＵによって置き換えられる配列を有するＲＮＡ分子を示すことが意図される。
【００４８】
　「単離された」核酸分子によって、天然の環境から取り出された核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が意図される。例えば、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のために単離されることが考慮される。単離されたＤＮＡ分子のさらなる例は、異種の宿主細胞において維持される組換えＤＮＡ分子、または溶液中の精製された（部分的または実質的）ＤＮＡ分子を含む。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロでのＲＮＡ転写物を含む。本発明に従って単離された核酸分子は、合成的に生成されるような分子をさらに含む。
【００４９】
　本明細書中で提供される情報（例えば、図１（配列番号１）中のヌクレオチド配列）を用いて、Ｔ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、標準的なクローニングおよびスクリーニング手順（例えば、開始物質としてｍＲＮＡを用いるクローニングｃＤＮＡのための手順）を用いて得られ得る。本発明の図のように、図１（配列番号１）において記載される核酸分子は、ヒト内皮組織由来のｃＤＮＡライブラリー中で発見された。さらに、遺伝子はまた、ヒト細胞の以下の型由来のｃＤＮＡライブラリーにおいて見出された：成人の心臓、ＴＮＦ誘導羊水細胞、軟骨肉腫、胎児の腎臓、胎児の心臓、海馬、ＪｕｒｋａｔＴ細胞、Ｊｕｒｋａｔ膜結合ポリソーム、微小血管内皮細胞、平滑筋、唾液腺、扁桃腺、胸腺、活性化Ｔ細胞、胎児の肝臓脾臓、および乳児の脳。
【００５０】
　Ｔ１Ｒ様リガンドＩｃＤＮＡは、開始コドンが図１（配列番号１）において示されるヌクレオチド配列の８８〜９０位である約２１７アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む；約２７アミノ酸残基の予想されるリーダー配列、および約２６ｋＤａの推定分子量。成熟したＴ１Ｒ様リガンドＩタンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸残基２８から残基２１７までを図１（配列番号２）中に示す。成熟したＴ１Ｒ様リガンドＩタンパク質は、３つの主要な構造的ドメインを有する。これらは、図１（配列番号２）中の約２８〜約１７８のアミノ酸残基由来の細胞外ドメイン；図１（配列番号２）中の約１７９〜約２０１のアミノ酸残基由来の膜貫通ドメイン；および図１（配列番号２）中の約２０２〜約２１７のアミノ酸残基由来の細胞内ドメイン。図１（配列番号２）中の本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩタンパク質は、Ｔ１Ｒリガンドに対して約３３％同一、そして約５２％類似であり、それは、ＧｅｎＢａｎｋに、受託番号第Ｕ４１８０４号として利用され得る。
【００５１】
　当業者が理解するように、上記の配列決定誤差の可能性、ならびに異なる公知のタンパク質におけるリーダーの切断部位の可変性に起因して、寄託されたｃＤＮＡによってコードされる実際のＴ１Ｒ様リガンドＩは、約２１７のアミノ酸を含むが、２００〜２２５の範囲のアミノ酸で任意の場所であり得る；そしてこのタンパク質の推定リーダー配列は、約２７アミノ酸であるが、約１５〜約４０の範囲のアミノ酸で任意の場所であり得る。さらに、例えば、図１（配列番号２）におけるＴ１Ｒ様リガンドＩタンパク質細胞外ドメイン、細胞内ドメイン、および膜貫通ドメインの正確な位置は、ドメインを定義するために使用される基準に依存してわずかに変化し得る（例えば、正確なアミノ酸の位置は、図１に示されるものと比較して約１〜約５の残基で異なり得る）。
【００５２】
　示されるように、本発明の核酸分子は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡ、およびクローニングによって得られるか、または合成的に生成されるゲノムＤＮＡを含む）なかに存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、またはそれは、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【００５３】
　本発明の単離された核酸分子は、図１（配列番号１）において示されるヌクレオチド配列の８８〜９０位で開始コドンを有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＤＮＡ分子を含み、そしてさらに、開始コドンが図１（配列番号１）中のヌクレオチド配列の８８〜９０位にあるＯＲＦのすべてまたは一部と実質的に異なる配列を含むが、遺伝コードの縮重に起因して、Ｔ１Ｒ様リガンドＩタンパク質またはそのフラグメントをなおコードするＤＮＡ分子を含む。当然のことながら、遺伝コードは当分野において周知である。従って、上記のような縮重した変異体を生成することは、当業者にとって日常的である。
【００５４】
　別の局面において、本発明は、１９９６年７月１２日にＡＴＣＣ寄託番号９７６５６として寄託されたプラスミド中に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有するＴ１Ｒ様リガンドＩタンパク質をコードする単離された核酸分子を提供する。好ましくは、核酸分子は、上記の寄託されたｃＤＮＡクローンによってコードされる成熟ポリペプチドをコードする。
【００５５】
　本発明は、さらに、図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列、もしくは上記の寄託されたクローン中に含まれるＴ１Ｒ様リガンドＩｃＤＮＡのヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子、または上記の配列の一つと相補的な配列を有する核酸分子を提供する。そのような単離された分子、特にＤＮＡ分子は、染色体とのインサイチュハイブリダイゼーションによって遺伝子マッピングするため、および例えばノーザンブロット分析によってヒト組織中のＴ１Ｒ様リガンドＩ遺伝子の発現を検出するためのプローブとして有用である。以下に詳細に記載されるように、特定の組織におけるＴ１Ｒ様リガンドＩ遺伝子発現の変化を検出することは、特定の障害を示し得る。
【００５６】
　本発明は、さらに、本明細書中で記載される単離した核酸分子のフラグメントに関する。寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列、または図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子のフラグメントによって、本明細書中で考察されるように、診断的プローブおよびプライマーとして有用である、長さが、少なくとも約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも約４０ｎｔが意図される。当然のことながら、長さがより大きなフラグメント５０〜１２００ｎｔもまた、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列、または図１（配列番号１）において示されるようなヌクレオチド配列のすべてではなくともほとんどに対応するフラグメントのように、本発明に従って有用である。例えば、長さが少なくとも２０ｎｔのフラグメントによって、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列、または図１（配列番号１）に示されるようなヌクレオチド配列からの２０以上の隣接した塩基を含むフラグメントが意図される。この遺伝子が寄託され、そして図１（配列番号１）において示されるヌクレオチド配列が提供されるので、そのようなＤＮＡフラグメントを生成することは、当業者にとって日常的である。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断、または超音波処理による剪断は、種々のサイズのフラグメントを生成するために容易に使用され得る。あるいは、そのようなフラグメントは、合成的に生成され得る。
【００５７】
　本発明の好ましい核酸フラグメントは、以下をコードする核酸分子を含む：Ｔ１Ｒ様リガンドＩ細胞外ドメインを含むポリペプチド（図１（配列番号１）中の約２８〜約１７８のアミノ酸残基）；Ｔ１Ｒ様リガンドＩ膜貫通ドメインを含むポリペプチド（図１（配列番号１）中の約１７９〜約２０１のアミノ酸残基）；およびＴ１Ｒ様リガンドＩ細胞内ドメインを含むポリペプチド（図１（配列番号２）中の約２０２〜約２１７のアミノ酸残基）；ならびに欠失した膜貫通ドメインの全てまたは一部を有するＴ１Ｒ様リガンドＩ細胞外および細胞内ドメインを有するポリペプチド。本発明のさらに好ましい核酸フラグメントは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩタンパク質のエピトープ保有部分をコードする核酸分子を含む。特に、図１（配列番号２）（これは、本発明者らがしており、Ｔ１Ｒ様リガンドＩタンパク質の抗原性領域である）中の以下のアミノ酸残基を含むポリペプチドをコードする単離した核酸分子が提供される：図１（配列番号２）中の約２０〜約５３のアミノ酸残基を含むポリペプチド；図１（配列番号２）中の約８２〜約９８のアミノ酸残基を含むポリペプチド；図１（配列番号２）中の約１０６〜約１３４のアミノ酸残基を含むポリペプチド；および約１５５〜約１８４のアミノ酸残基を含むポリペプチド。Ｔ１Ｒ様リガンドＩタンパク質の他のそのようなエピトープ保有部分を決定するための方法は、以下に詳細に記載される。
【００５８】
　別の局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、上記の本発明の核酸分子（例えば、ＡＴＣＣ寄託第９７６５６号中に含まれるｃＤＮＡクローン）中のポリヌクレオチドの一部にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離した核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」によって、括弧内を含む溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡ　）中４２℃での一晩のインキュベーション、続く約６５℃にて０．１×ＳＳＣにおいてフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０〜７０ｎｔにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。これらは、以上、および以下でより詳細に考察されるような診断用プローブおよびプライマーとして有用である。
【００５９】
　当然のことながら、参照のポリヌクレオチド（例えば、寄託されたｃＤＮＡクローン）のより大きな部分（例えば、長さが１００〜７５０ｎｔの部分）、または参照のポリヌクレオチドの完全長とまでもハイブリダイズするポリヌクレオチドはまた、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または図１（配列番号１）に示されるようなヌクレオチド配列のすべてではなくともほとんどに対応するポリヌクレオチドのように、本発明に従ったプローブとして有用である。例えば、「長さが少なくとも２０ｎｔ」のポリヌクレオチドの部分によって、参照のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（例えば、寄託されたｃＤＮＡ、または図１（配列番号１）に示されるようなヌクレオチド配列）からの２０以上の隣接したヌクレオチドが意図される。示されるように、そのような部分は、従来のＤＮＡハイブリダイゼーション技術に従ったプローブとして、または例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．ら編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　ＮＹ　（１９８９）に記載されるようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による標的配列の増幅のためのプライマーとしてのいずれかで診断的に有用である。
【００６０】
　Ｔ１Ｒ様リガンドＩｃＤＮＡクローンは寄託されており、そしてその決定されたヌクレオチド配列が図１（配列番号１）において提供されるので、Ｔ１Ｒ様リガンドＩｃＤＮＡ分子の一部にハイブリダイズするポリヌクレオチドを生成することは、当業者に日常的である。例えば、Ｔ１Ｒ様リガンドＩｃＤＮＡクローンの制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩｃＤＮＡ分子の一部にハイブリダイズするポリヌクレオチドである種々のサイズのＤＮＡ部分を生成するために容易に使用され得る。あるいは、本発明のハイブリダイズするポリヌクレオチドは、公知の技術に従って合成的に生成され得る。
【００６１】
　当然のことながら、ポリＡ配列（例えば、図１（配列番号１）に示されるＴ１Ｒ様リガンドＩｃＤＮＡの３’末端ポリ（Ａ）付加物）にのみ、またはＴ（またはＵ）の相補的な部分（ｓｔｒｅｔｃｈ）にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部にハイブリダイズするために使用される本発明のポリヌクレオチドに含まれない。なぜなら、そのようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）伸長またはその相補物を含む任意の核酸分子（例えば、実際上任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブリダイズする。
【００６２】
　示されるように、Ｔ１Ｒ様リガンドＩをコードする本発明の核酸分子は、以下を含むが、それらに限定されない：それ自体によって、成熟ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子；成熟したポリペプチドのコード配列およびさらなる配列（例えば、約２７のアミノ酸リーダー配列をコードする配列）（例えば、プレタンパク質配列またはプロタンパク質配列またはプレプロタンパク質配列）；成熟ポリペプチドのコード配列で、上記のさらなるコード配列を含むかまたは含まず、更なる非コード配列とともに集まっており、この配列はイントロンおよび非コード５’および３’配列（例えば、転写、ｍＲＮＡプロセシング（スプライシングおよびポリアデニル化シグナル（例えば、リボソーム結合およびｍＲＮＡの安定性）を含む）において役割を担う転写非翻訳配列）を含むがこれらに限定されない；さらなる機能性を提供するようなさらなるアミノ酸をコードするさらなるコード配列。従って、例えば、ポリペプチドをコードする配列は、マーカー配列（例えば、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列）に融合され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、マーカーアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，　Ｉｎｃ．）において提供されるタグ）であり、他の中では、それらの多くは公的および／または商業的に入手可能である。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８６：　８２１−８２４　（１９８９）において記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質由来のエピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドであり、それは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ　３７：　７６７　（１９８４）によって記載されている。他のそのような融合タンパク質は、ＮまたはＣ末端にてＦｃに融合されるＴ１Ｒ様リガンドＩタンパク質またはそのフラグメントを含む。
【００６３】
　本発明は、さらに、Ｔ１Ｒ様リガンドＩタンパク質の一部、アナログ、または誘導体をコードする本発明の核酸分子の変異体に関する。変異体は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の１つが意図される。天然に存在しない変異体は、例えば当分野で公知の変異誘発技術を用いて生成され得る。
【００６４】
　そのような変異体は、ヌクレオチド置換、欠失、または添加によって生成される変異体を含む。置換、欠失、または添加は、１つ以上のヌクレオチドを含み得る。変異体は、コードもしくは非コード領域、またはその両方において変化され得る。コード領域における変異は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を生成し得る。これらの中で特に好ましいものは、サイレント置換、添加、および欠失であり、これらは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩまたはその一部の特性および活性を変化しない。これらの点において特にまた好ましいものは、保存性置換である。
【００６５】
　本発明のさらなる実施態様は、（ａ）図１（配列番号２）に示される完全なアミノ酸配列（リーダーを含む）を有するか、もしくはＡＴＣＣ受託番号９７６５６に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる全長Ｔ１Ｒ様リガンドＩをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）図１（配列番号２）中のほぼ２８位からほぼ２１７位のアミノ酸配列を有するか、もしくはＡＴＣＣ受託番号９７６５６に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる成熟Ｔ１Ｒ様リガンドＩ（リーダー配列が除去された全長ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列；（ｃ）図１（配列番号２）中のほぼ２８位からほぼ１７８位のアミノ酸配列を有するか、もしくはＡＴＣＣ受託番号９７６５６に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるＴ１Ｒ様リガンドＩ細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）図１（配列番号２）中のほぼ１７９位からほぼ２０１位のアミノ酸配列を有するか、もしくはＡＴＣＣ受託番号９７６５６に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるＴ１Ｒ様リガンドＩ膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）　図１（配列番号２）中のほぼ２０２位からほぼ２１７位のアミノ酸配列を有するか、もしくはＡＴＣＣ受託番号９７６５６に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるＴ１Ｒ様リガンドＩ細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列；または（ｆ）　（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、もしくは（ｅ）のヌクレオチド配列のいずれかと相補的なヌクレオチド配列と、少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を有し、そしてより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を含む。
【００６６】
　Ｔ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば、９５％「同一」のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、ポリヌクレオチド配列が、Ｔ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでの点変異を含み得ることを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照配列と同一であることが意図される。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列における５％までのヌクレオチドが欠失され得るかもしくは別のヌクレオチドで置換され得るか、または参照配列において全ヌクレオチドの５％までの多数のヌクレオチドが、参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置でか、または参照配列内の残基間で個々に、または参照配列内の１以上の隣接した群でのいずれかで散在されて、これらの末端位置の間のどこかで生じ得る。
【００６７】
　実際には、任意の特定の核酸分子が、図１に示されるヌクレオチド配列または寄託されたｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかどうかは、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐａｃｋａｇｅ，　Ｖｅｒｓｉｏｎ　８　ｆｏｒ　Ｕｎｉｘ（登録商標），　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐａｒｋ，　５７５　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｄｒｉｖｅ，　Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷＩ　５３７１１）のような公知のコンピュータープログラムを用いて従来通りに決定され得る。ＢＥＳＴＦＩＴは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，　Ａｄｖ．　Ａｐｐｌ．　Ｍａｔｈ．　２：４８２−４８９　（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の相同性の最適のセグメントを見出す。ＢＥＳＴＦＩＴまたは任意の他の配列整列プログラムを使用して、特定の配列が、例えば本発明による参照配列に９５％同一であるか否かを決定する場合、パラメーターは、もちろん、同一性の割合が、参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算されるように、そして参照配列の総ヌクレオチド数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように、設定される。
【００６８】
　本出願は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩタンパク質活性を有するポリペプチドをコードするか否かに関係なく、上記の核酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸分子に関する。これは、特定の核酸分子がＴ１Ｒ様リガンドＩ活性を有するポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者は、核酸分子をどのようにして、例えば、ハイブリダイゼーションプローブ、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして使用するかをなお知るからである。Ｔ１Ｒ様リガンドＩ活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用としては、とりわけ（１）Ｔ１Ｒ様リガンドＩ遺伝子またはその対立遺伝子変異体をｃＤＮＡライブラリーから単離すること；（２）Ｖｅｒｍａら，　Ｈｕｍａｎ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：　ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８８）に記載の、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ遺伝子の正確な染色体位置を提供するための分裂中期染色体展開物に対するインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）；および、（３）特定の組織におけるＴ１Ｒ様リガンドＩ　ｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析、が挙げられる。
【００６９】
　しかし、実際に、Ｔ１Ｒ様リガンドＩタンパク質活性を有するポリペプチドをコードする上記の核酸配列に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有する核酸分子が好ましい。
【００７０】
　「Ｔ１Ｒ様リガンドＩタンパク質活性を有するポリペプチド」によって、特定の生物学的アッセイにおいて測定される場合、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩタンパク質の活性と類似する（しかし、必ずしも同一ではない）活性を示すポリペプチドが意図される。Ｔ１Ｒ様リガンドＩ活性は、公知のレセプター結合アッセイを用いてアッセイされ得る（Ｍｉｔｃｈａｍ，　Ｊ．Ｌ．ら，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２７１：５７７７−５７８３（１９９６）；　およびＧａｙｌｅ，　Ｍ．Ａ．ら，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２７１：５７８４−５７８９（１９９６））。これらのアッセイは、ＮＦ−κＢゲルシフトアッセイ、インビトロＴｈｒ−６６９キナーゼアッセイ、およびＩＬ−８プロモーター活性化アッセイを含む。
【００７１】
　これらのアッセイを実施するために、最初に、哺乳動物細胞を適切なレセプターに対するｃＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトする必要がある。例えば、Ｔ１／ＳＴ２レセプターに対するｃＤＮＡを含む発現ベクターが使用され得る。このｃＤＮＡは記載されるように得られ得る。（Ｋｌｅｍｅｎｚ　Ｒ．ら，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　８６：５７０８−５７１２　（１９８９）；　Ｔｏｍｉｎａｇａ，　Ｓ．，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　２５８：３０１−３０４；　Ｂｅｒｇｅｒｓ，　Ｇ．ら，　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１３：１１７６−１１８８））。あるいは、Ｔ１／ＳＴ２　ｃＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅され得る。適切な組織または細胞型（例えば、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞（Ｋｌｅｍｅｎｚ，　Ｒ．ら，　Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　８６：５７０８−５７１２　（１９８９））由来のｍＲＮＡから調製された市販のｃＤＮＡライブラリーが、テンプレートとして使用され得る。当業者に周知の任意のいくつかのトランスフェクション法を用いて、適切な細胞株（例えば、ＣＯＳ　７細胞）が、Ｔ１／ＳＴ２発現プラスミドでトランスフェクトされ得る。レセプターの発現は、ラジオイムノアッセイによって確認され得る（Ｍｉｔｃｈａｍ，Ｊ．Ｌ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２７１：　５７７７−５７８３　（１９９６）を参照のこと）。トランスフェクションの１〜３日後、コンフルエントなトランスフェクトＣＯＳ７細胞が、１〜１０ｎｇのＴ１Ｒ様リガンドＩタンパク質で１５分〜２時間刺激される。Ｔ１Ｒ様リガンドＩタンパク質による刺激の持続時間は、どのアッセイが使用されるかに依存して変動し、そして日常的な実験のみを用いて決定され得る。
【００７２】
　ＮＦ−κＢアッセイを実施するために、トランスフェクト細胞からの核抽出物が、刺激後、直ちに調製される（Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ，Ｊ．ら，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２６６：　１２，７２２−１２，７３３　（１９９１））。免疫グロブリンκ軽鎖由来のＮＦ−κＢエンハンサーエレメントを含む２本鎖合成オリゴヌクレオチドプローブ　（５’　ＴＧＡＣＡＧＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＡＧＡＧＧＡ　３’）が、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰでのリン酸化によって５’末端標識される。核抽出物（１０μｇ）が、室温で２０分間放射標識プローブとインキュベートされ、そしてタンパク質−ＤＮＡ複合体が０．５×ＴＢＥ、１０％ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動によって分離される。
【００７３】
　インビトロＴｈｒ−６６９キナーゼアッセイを実施するために、トランスフェクトされた細胞の細胞質抽出物が、刺激後直ちに調製される（Ｂｉｒｄ，Ｔ．Ａ．ら，　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　４：４２９−４４０　（１９９２））。１０μｌの細胞抽出物が、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ　７．４）、１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１５μＭ　ＡＴＰ、７５μＣｉ／ｍｌ　［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ、および７５０μＭ　基質ペプチド（ＥＧＦＲの残基６６３〜６７３）を含む２０μｌの反応混合液へ添加される。混合物がペプチドの代わりに蒸留水とともにインキュベートされる。３０℃で２０分間のインキュベーション後、反応はギ酸の添加によって終結される。反応物は遠心分離によって明澄化され、そして３０μｌの上清がホスホセルロース濾紙ディスク上にスポットされる。洗浄（７５ｍＭオルトリン酸で３回）および乾燥の後、ペプチドに取り込まれたカウントは、チェレンコフカウントをモニターすることによって測定される。結果は、刺激細胞において検出された活性と比較しての、非刺激細胞において検出されたＴｈｒ−６６９キナーゼ活性の割合として表される。
【００７４】
　ＩＬ−８プロモーター活性化アッセイを実施するために、ＣＯＳ７細胞（１２ウェル組織培養プレートにおいて１ウェルあたり１×１０５細胞）を、Ｔ１／ＳＴ２レセプター発現ベクターおよびｐＩＬ８ｐレポータープラスミドで同時トランスフェクトされる（Ｍｉｔｃｈａｍ，　Ｊ．Ｌ．ら，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２７１：５７７７−５７８３（１９９６））。トランスフェクションの１日後、培地が交換され、そして細胞は、１ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ−１αで刺激されるかまたは刺激されないかのいずれかである。刺激の１２〜１６時間後、細胞は、５％（ｗ／ｖ）無脂肪乾燥ミルク（５％ＭＢＭ）を含む結合培地で２回洗浄され、そして２ｍｌの５％ＭＢＭを用いて室温で３０分間ブロックされる。次いで、細胞は室温で６０〜９０分間、１μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−２Ｒα抗体（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，　ＭＮ）を含む５％ＭＢＭ　１．５ｍｌ／ウェルとともに、ゆっくり揺らしながらインキュベートされる。細胞は、５％ＭＢＭで１度洗浄され、そして１：１００希釈の１２５Ｉヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，　Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，　ＭＯ）を含む５％ＭＢＭ　１ｊｌ／ウェルとともに６０分間、室温でインキュベートされる。ウェルは、５％ＭＢＭで４回およびリン酸緩衝化生理食塩水で２回洗浄される。ウェルは、１ｍｌの０．５Ｍ　ＮａＯＨの添加によってはがされ、そして全カウントが測定される。結果は、２つの２連ウェルまたは３つの３連ウェルにわたって平均化された全ｃｐｍとして表される。
【００７５】
　従って、「Ｔ１Ｒ様リガンドＩタンパク質活性を有するポリペプチド」は、上記のアッセイにおいてＴ１Ｒ様リガンドＩタンパク質活性を示すポリペプチドを含む。
【００７６】
　もちろん、遺伝子コードの縮重のために、当業者は、上記の核酸配列に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有する多数の核酸分子が、「Ｔ１Ｒ様リガンドＩタンパク質活性を有する」ポリペプチドをコードすることを直ちに認識する。実際に、これらのヌクレオチド配列の縮重改変体の全ては同じポリペプチドをコードするので、これは上記の比較アッセイを実施することなしでさえ当業者に明らかである。縮重改変体でないそのような核酸分子について、合理的な数がまたＴ１Ｒ様リガンドＩ活性を有するポリペプチドをコードすることが、当分野でさらに認識される。これは、当業者が、タンパク質の機能により低い有意性で影響しそうであるか、または有意には影響しそうにないかのいずれかのアミノ酸置換（例えば、１つの脂肪族アミノ酸の第二の脂肪族アミノ酸への置換）を完全に知っているからである。
【００７７】
　例えば、どのように表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製するかに関するガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ，　Ｊ．Ｕ．ら，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に提供される。ここで著者らは、アミノ酸配列の変化に対する寛容を研究するための２つの主要なアプローチが存在することを示す。第一の方法は、進化のプロセスに依存し、ここで変異は、自然淘汰によって受容されるか拒絶されるかのいずれかである。第二のアプローチは、クローン化遺伝子の特定の位置でアミノ酸変化を導入するために遺伝子操作を、そして機能を維持する配列を同定するために選択またはスクリーニングを用いる。著者らが述べるように、これらの研究は、タンパク質が、アミノ酸置換に驚くほど寛容であることを明らかにしている。著者らは、どのアミノ酸の変化が、タンパク質の特定の位置で許容性でありそうであるかをさらに示している。例えば、大部分の埋没したアミノ酸残基は非極性側鎖を必要とし、一方表面の側鎖の特性は一般的にわずかしか保存されていない。他のこのような表現型的にサイレントな置換は、Ｂｏｗｉｅ，　Ｊ．Ｕ．ら，前出およびその中に引用される参考文献に記載される。
【００７８】
　ベクターおよび宿主細胞
　本発明はまた、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含むベクター、組換えベクターで遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術によるＴ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドまたはそのフラグメントの産生に関する。
【００７９】
　組換え構築物は、感染、形質導入、トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、エレクトロポレーション、および形質転換のような周知の技術を用いて宿主細胞に導入され得る。ベクターは、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製可能かまたは複製欠損であり得る。後者の場合、ウイルスの増殖は、一般的に、相補宿主細胞においてのみ生じる。
【００８０】
　ポリヌクレオチドは、宿主細胞における増殖のための選択マーカーを含むベクターに結合され得る。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物のような沈殿物中か、または荷電された脂質との複合体中で導入される。ベクターがウイルスである場合、ベクターは、適切なパッケージング細胞株を用いてインビトロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
【００８１】
　目的のポリヌクレオチドに対するシス作用性制御領域を含むベクターが好ましい。適切なトランス作用性因子は、宿主によって供給される得るか、相補ベクターによって供給され得るか、または宿主への導入の際にベクター自体によって供給され得る。
【００８２】
　この事に関する特定の好ましい実施態様において、ベクターは、誘導性および／または細胞型特異的であり得る特異的な発現を提供する。このようなベクターの中で特に好ましいベクターは、温度および栄養添加物のような操作することが容易である環境因子によって誘導性のベクターである。
【００８３】
　本発明において有用な発現ベクターとしては、染色体ベクター、エピソームベクター、およびウイルス由来ベクター（例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント、ウイルス（例えば、バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、トリポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、およびレトロウイルス）、ならびにそれらの組合せに由来するベクター（例えば、コスミドおよびファージミド）が挙げられる。
【００８４】
　ＤＮＡインサートは、適切なプロモーター（例えば、少し名を挙げると、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、およびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよび後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーター）に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。発現構築物は、さらに、転写開始、転写終結のための部位、および、転写領域中に翻訳のためのリボゾーム結合部位を含む。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、翻訳されるべきポリペプチドの始めに転写開始ＡＵＧを含み、そして終わりに適切に位置される終止コドンを含む。
【００８５】
　示されるように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、およびＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表的な例としては、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ　Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）；ならびに植物細胞が挙げられる。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で公知である。
【００８６】
　細菌における使用に好ましいベクターの中には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）が含まれる。好ましい真核生物ベクターの中には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およびｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉｃａから入手可能）がある。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。
【００８７】
　本発明における使用に適した公知の細菌プロモーターの中には、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３プロモーターおよびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、λＰＲプロモーターおよびλＰＬプロモーター、ならびにｔｒｐプロモーターが含まれる。適切な真核生物プロモーターとしては、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期ＳＶ４０プロモーターおよび後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）、ならびにメタロチオネインプロモーター（例えば、マウスメタロチオネインＩプロモーター）が挙げられる。
【００８８】
　宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によってもたらされ得る。このような方法は、Ｄａｖｉｓら，　Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）のような多くの標準的研究室マニュアルに記載されている。
【００８９】
　高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増大させ得る。エンハンサーは、所定の宿主細胞型におけるプロモーターの転写活性を増大するように働く、通常約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーの例としては、ＳＶ４０エンハンサー（これは、複製起点の後期側上の１００〜２７０ｂｐに位置される）、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【００９０】
　翻訳されたタンパク質の小胞体の管腔内へか、周辺質空間内へか、または細胞外環境内への分泌のために、適切な分泌シグナルが、発現されるポリペプチド中に組み込まれ得る。シグナルは、ポリペプチドに対して内因性であり得るか、またはそれらは異種シグナルであり得る。
【００９１】
　従って、ポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で発現され得、そして分泌シグナルだけでなく、付加的な異種の機能的領域も含み得る。例えば、付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間の、または続く操作および保存の間の、安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。また、ペプチド部分が、精製を容易にするためにポリペプチドへ付加され得る。そのような領域は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。とりわけ、分泌または排出を生じるため、安定性を改善するため、および精製を容易にするためのペプチド部分のポリペプチドへの付加は、当分野でよく知られており、そして日常的な技術である。好ましい融合タンパク質は、タンパク質の可溶化に有用な免疫グロブリン由来の異種領域を含む。例えば、ＥＰ　Ａ　０　４６４　５３３（また、カナダ対応出願２０４５８６９）は、別のヒトタンパク質またはその一部とともに免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質中のＦｃ部分は、治療および診断における使用に十分に有利であり、従って、例えば改善された薬物動態学的特性を生じる（ＥＰ　Ａ　０２３２　２６２）。一方、いくつかの使用について、融合タンパク質が、記載される有利な様式で、発現され、検出され、および精製された後にＦｃ部分が欠失され得ることが望ましい。これは、Ｆｃ部分が、治療および診断における使用の妨害であると判明する場合（例えば、融合タンパク質が免疫のための抗原として使用されるべき場合）である。薬物探索において、例えばｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための高処理能力スクリーニングアッセイの目的でＦｃ部分と融合されている。Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　Ｖｏｌ．８：５２−５８（１９９５）、およびＫ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら，　Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ．２７０，Ｎｏ．１６，　９４５９−９４７１頁（１９９５）を参照のこと。
【００９２】
　Ｔ１Ｒ様リガンドＩは、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。
【００９３】
　本発明のポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、本発明のポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
Ｔ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドおよびペプチド
　本発明はさらに、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列、もしくは図１（配列番号２）のアミノ酸配列を有する単離されたＴ１Ｒ様リガンドＩポリペプチド、または上記ポリペプチドの一部を含むペプチドもしくはポリペプチドを提供する。用語「ペプチド」および「オリゴペプチド」は、（通常認識されるように）同義語と考えられ、そして各用語は、文脈がペプチド結合によって結合された少なくとも２つのアミノ酸の鎖を示すことを必要とする場合、交換可能に使用され得る。用語「ポリペプチド」は、１０より多いアミノ酸残基を含む鎖に対して本明細書中で使用される。本明細書中の全てのオリゴペプチドおよびポリペプチドの式または配列は、左から右へ、そしてアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書かれる。
【００９４】
　「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質によって、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ，　Ｇｅｎｅ　６７：３１−４０　（１９８８）に記載の一段階法のような任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質がそうであるように、本発明の目的で単離されていると考えられる。
【００９５】
　Ｔ１Ｒ様リガンドＩのいくつかのアミノ酸配列が、このタンパク質の構造または機能に有意に影響することなく改変され得ることが、当分野で認識される。配列内のこのような差異が意図される場合、活性を決定するタンパク質の重要な領域が存在することを覚えておくべきである。一般的に、類似の機能を実行する残基が使用される場合、三次構造を形成する残基の置換が可能である。他の例において、残基の型は、変化がタンパク質の重要でない領域で生じる場合、全く重要でないかもしれない。
【００９６】
　従って、本発明は、さらに、実質的なＴ１Ｒ様リガンドＩ活性を示すか、または下記に考察されるタンパク質部分のようなＴ１Ｒ様リガンドＩの領域を含むＴ１Ｒ様リガンドＩの改変体を含む。このような変異体は、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性の残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む。小さな変化、またはこのような「中性」アミノ酸置換は、一般的にほとんど活性に影響しない。
【００９７】
　代表的に保存的置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【００９８】
　上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントでありそうか（すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか）に関するさらなるガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ，　Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｅｓｓａｇｅ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：　Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｏ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ　Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４７：１３０６−１３１０　（１９９０）に見出され得る。
【００９９】
　本発明のポリペプチドは、リーダー配列を含む寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドからリーダーを除いたポリペプチド（すなわち成熟タンパク質）、リーダーを含む図１（配列番号２）のポリペプチド、リーダーを除いた図１（配列番号２）のポリペプチド、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ細胞外ドメイン、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ膜貫通ドメイン、およびＴ１Ｒ様リガンドＩ細胞内ドメイン、ならび上記のポリペプチドと少なくとも９０％の類似性、より好ましくは少なくとも９５％の類似性、およびさらにより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の類似性を有するポリペプチドを含む。さらに本発明のポリペプチドは、本明細書中に記載のポリペプチドと、少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％または９５％同一、さらにより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチドを含み、そしてまた、少なくとも３０アミノ酸、およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を有するこのようなポリペプチドの部分を含む。
【０１００】
　２つのポリペプチドについての「％類似性」によって、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐａｃｋａｇｅ，　Ｖｅｒｓｉｏｎ　８　ｆｏｒ　Ｕｎｉｘ（登録商標），　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐａｒｋ，　５７５　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｄｒｉｖｅ，　Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷＩ　５３７１１）および類似性を決定するための省略時設定（ｄｅｆａｕｌｔ　ｓｅｔｔｉｎｇ）を用いて２つのポリペプチドのアミノ酸配列を比較することによって生じる類似性のスコアが意図される。ＢＥＳＴＦＩＴは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，　Ａｄｖ．　Ａｐｐｌ．　Ｍａｔｈ．　２：４８２−４８９　（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムを、２つの配列間の類似性の最適のセグメントを見出すために使用する。
【０１０１】
　Ｔ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドの参照アミノ酸配列に少なくとも、例えば、９５％「同一な」アミノ酸配列を有するポリペプチドにより、ポリペプチド配列がＴ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドの参照アミノ酸配列の各１００アミノ酸毎に５つまでのアミノ酸変化を含み得ることを除いて、ポリペプチドのアミノ酸配列は参照配列と同一であることが意図される。言い換えれば、参照アミノ酸配列に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列において５％までのアミノ酸残基が、欠失されるかもしくは別のアミノ酸で置換され得、または参照配列における５％までの総アミノ酸残基の多数のアミノ酸が参照配列に挿入され得る。これらの参照配列の改変は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位置もしくはカルボキシ末端位置で、または参照配列の残基間で個々に、もしくは参照配列内で１つ以上の近接したグループ内のいずれかで末端位置の間のどこかで、起こり得る。
【０１０２】
　実際には、任意の特定のポリペプチドが、例えば、図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列、または寄託されたｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかどうかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐａｃｋａｇｅ，　Ｖｅｒｓｉｏｎ　８　Ｕｎｉｘ（登録商標）版、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐａｒｋ，　５７５　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｄｒｉｖｅ，　Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷＩ　５３７１１）のような公知のコンピュータープログラムを使用して慣習的に決定され得る。特定の配列が、例えば、本発明の参照配列に９５％同一であるかどうかを決定するために、Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを使用する場合、当然、同一性の百分率が参照アミノ酸配列の全長にわたって計算され、そして参照配列内のアミノ酸残基の総数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるようなパラメーターが設定される。
【０１０３】
　下記に詳細に記載するように、本発明のポリペプチドは、下記のようにＴ１Ｒ様リガンドＩ発現を検出するための診断アッセイにおいて有用である、またはＴ１Ｒ様リガンドＩタンパク質機能を増強または阻害し得るアゴニストおよびアンタゴニストとして、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を惹起するために使用され得る。さらに、このようなポリペプチドは、本発明の候補アゴニストおよびアンタゴニストでもあるＴ１Ｒ様リガンドＩ結合タンパク質を「捕獲する」ための酵母ツーハイブリッドシステムにおいて使用され得る。酵母ツーハイブリッドシステムは、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ　３４０：２４５−２４６（１９８９）に記載されている。
【０１０４】
　別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を含む、ペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチドのエピトープ部分は、本発明のポリペプチドの免疫原性または抗原性エピロープである。「免疫原性エピトープ」は、タンパク質全体が免疫原である場合、抗体応答を誘発するタンパク質の一部として定義される。これらの免疫原性エピトープは、分子上の２、３の焦点に制限されると考えられている。一方では、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」と定義され得る。タンパク質の免疫原性エピトープの数は、一般には、抗原性エピトープの数よりも少ない。例えば、Ｇｅｙｓｅｎ，　Ｈ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８１：３９９８−４００２（１９８４）を参照のこと。
【０１０５】
　抗原性エピトープを保有するペプチドまたはポリペプチド（すなわち、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域を含む）の選択に関して、タンパク質配列の一部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応する抗血清を日常的に誘発し得ることが当分野で周知である。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１９：６６０−６６６（１９８３）を参照のこと。タンパク質−反応性血清を誘発し得るペプチドは、しばしばタンパク質の一次配列で頻繁に示され、そして単純な化学的法則のセットにより特徴付けられ得、そしてインタクトなタンパク質の免疫ドミナント領域（すなわち、免疫原性エピトープ）にも、アミノ末端またはカルボキシル末端にも、制限されない。極度に疎水性であるペプチドおよび６以下の残基のペプチドは、一般には、模倣タンパク質に結合する抗体の誘導に効果がなく；より長い、可溶性ペプチド、特にプロリン残基を含むペプチドは、通常は有効である。Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出、６６１。例えば、これらのガイドラインに従って設計された２０のペプチドのうち１８（インフルエンザウイルス赤血球凝集素ＨＡ１ポリペプチド鎖の配列の７５％を覆う８−３９残基を含む）は、　ＨＡ１タンパク質またはインタクトなウイルスと反応する抗体を誘導した；そしてＭｕＬＶポリメラーゼからの１２／１２ペプチドおよび狂犬病糖タンパク質からの１８／１８はそれぞれのタンパク質を沈澱する抗体を誘導した。
【０１０６】
　本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、それゆえ、本発明のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む抗体を惹起するのに有用である。従って、抗原エピトープ保有ペプチドで免疫化されたドナーからの脾臓細胞の融合により得られるハイブリドーマの大部分は、一般に天然のタンパク質と反応性がある抗体を分泌する。Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出、６６３。抗原性エピトープ保有ペプチドまたはポリペプチドにより惹起された抗体は、模倣タンパク質を検出するのに有用であり、そして異なるペプチドに対する抗体が、翻訳後プロセシングを受けるタンパク質前駆体の種々の領域の末路を追跡するために使用され得る。免疫沈降アッセイにおいて、短いペプチド（例えば、約９アミノ酸）でさえ、より長いペプチドに結合しそして置換し得ることが示されているので、ペプチドおよび抗ペプチド抗体は、模倣タンパク質についての種々の定性的または定量的アッセイ、例えば、競合的アッセイにおいて使用され得る。例えば、Ｗｉｌｓｏｎ，　Ｉ．Ａ．ら、Ｃｅｌｌ　３７：７６７−７７８（１９８４）７７７を参照のこと。本発明の抗ペプチド抗体もまた、模倣タンパク質の精製（例えば、当分野で周知の方法を使用して、吸着クロマトグラフィーにより）に有用である。
【０１０７】
　上記のガイドラインに従って設計された本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、好ましくは本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる少なくとも７、より好ましくは少なくとも９、そして最も好ましくは約１５〜約３０アミノ酸の間の配列を含む。しかし、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の約３０〜約５０アミノ酸または全体までの任意の長さおよび全体を含む、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列のより大部分を含むペプチドまたはポリペプチドもまた、本発明のエピトープ保有ペプチドまたはポリペプチドであると考えられ、そしてまた模倣タンパク質と反応する抗体を誘導するのに有用である。好ましくは、エピトープ保有ペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒中で実質的な溶解性を提供するように選択され（すなわち、その配列は、比較的親水性残基を含み、そして高度な疎水性配列は好ましくは回避される）；そしてプロリン残基を含む配列が特に好ましい。
【０１０８】
　Ｔ１Ｒ様リガンドＩ特異的抗体を産生するために使用され得る抗原性ポリペプチドの非限定的な例には、図１（配列番号２）における約２０〜約５３のアミノ酸残基を含むポリペプチド；図１（配列番号２）における約８２〜約９８のアミノ酸残基を含むポリペプチド；図１（配列番号２）における約１０６〜約１３４のアミノ酸残基を含むポリペプチド；および図１（配列番号２）における約１５５〜約１８４のアミノ酸残基を含むポリペプチドが挙げられる。
【０１０９】
　本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明の核酸分子を使用する組換え手段を含むペプチドまたはポリペプチドを作製するための任意の従来の手段により産生され得る。例えば、短いエピトープ保有アミノ酸配列は、組換え体産生および精製の間、ならびに抗ペプチド抗体を産生するための免疫化の間、キャリアとして作用するより大きなポリペプチドに融合され得る。エピトープ保有ペプチドはまた、化学合成の公知の方法を使用して合成され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、４週間未満で、調製されそして特徴付けられた（ＥＬＩＳＡ−タイプ結合研究により）ＨＡ１ポリペプチドのセグメントの単一のアミノ酸改変体を示す１０〜２０ｍｇの２４８の異なる１３残基ペプチドのような多数のペプチドの合成のための簡単な方法を記載している。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，　Ｒ．Ａ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８２：５１３１−５１３５　（１９８５）。この「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＰＳ）」プロセスは、さらにＨｏｕｇｈｔｅｎら（１９８６）の米国特許第４，６３１，２１１号に記載される。この手順において、種々のペプチドの固相合成のための個々の樹脂は、別々の溶媒透過性パケットに含まれ、固相法に関連する多くの同一の反復工程の最適な使用を可能にする。完全なマニュアル手順は、５００〜１０００以上の合成が同時に行われるのを可能にする。Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、前出、５１３４。
【０１１０】
　本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、当分野に周知の方法によって抗体を誘導するために使用される。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出；Ｃｈｏｗ，　Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅ，　Ｆ．　Ｊ．ら、Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｖｉｒｏｌ．　６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと。一般には、動物は遊離ペプチドで免疫化され得る；しかし、抗ペプチド抗体力価はペプチドを高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にカップリングすることにより追加免疫され得る。例えば、システインを含有するペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを使用してキャリアにカップリングされ得、一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリアにカップリングされ得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離またはキャリア−カップリングペプチドのいずれかで、例えば、約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびＦｒｅｕｎｄのアジュバントを含むエマルジョンの腹腔内および／または皮内注射により免疫化される。いくつかの追加免疫注射が、例えば、固体表面に吸着された遊離ペプチドを使用してＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る有用な力価の抗ペプチド抗体を提供するために、例えば、約２週間の間隔で必要とされ得る。免疫化動物からの血清における抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択により、例えば、当分野で周知の方法による固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出により増加され得る。
【０１１１】
　本発明の免疫原性エピトープ保有ペプチド、すなわち、全体のタンパク質が免疫原性である場合、抗体応答を惹起するタンパク質の部分は、当分野で公知の方法により同定される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）前出は、酵素−結合免疫吸着アッセイにおける反応に十分に純粋な何百というペプチドの固体支持体上の迅速な同時合成の手順を開示する。合成ペプチドの抗体との相互作用は、次いで、それらを支持体から除去することなく容易に検出される。この様式において、所望のタンパク質の免疫原性エピトープを保有するペプチドは、当業者により日常的に同定され得る。例えば、口蹄疫ウイルスのコートタンパク質における免疫学的に重要なエピトープは、タンパク質の２１３のアミノ酸配列全体を覆う全ての２０８の可能なヘキサペプチドの重複セットの合成による７アミノ酸の解明によりＧｅｙｓｅｎらによって位置付けされた。次いで、全ての２０アミノ酸が順にエピトープ内の各位置で置換されたペプチドの完全な置換セットが合成され、そして抗体との反応のための特異性を与える特定のアミノ酸が決定された。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドのペプチドアナログは、この方法により日常的に作成され得る。Ｇｅｙｓｅｎ（１９８７）の米国特許第４，７０８，７８１号は、所望のタンパク質の免疫原性エピトープを保有するペプチドを同定するこの方法をさらに記載している。
【０１１２】
　さらになお、　Ｇｅｙｓｅｎ（１９９０）の米国特許第５，１９４，３９２号は、目的の抗体の特定のパラトープ（抗原結合部位）に相補的であるエピトープの位相幾何学的等価物（すなわち、「ミモトープ」）であるモノマー（アミノ酸または他の化合物）の配列を検出または決定する一般的な方法を記載する。より一般的には、Ｇｅｙｓｅｎ（１９８９）の米国特許第４，４３３，０９２号は、目的の特定のレセプターのリガンド結合部位に相補的であるリガンドの位相等価であるモノマーの配列を検出または決定する方法を記載する。同様に、Ｐｅｒａｌｋｙｌａｔｅｄ　Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ　ＭｉｘｔｕｒｅｓにおけるＨｏｕｇｈｔｅｎ，　Ｒ．　Ａ．ら（１９９６）の米国特許第５，４８０，９７１号は、線状Ｃ１−Ｃ７−アルキル過アルキル化（ｐｅｒａｌｋｙｌａｔｅｄ）オリゴペプチドおよびセットおよびこのようなペプチドのライブラリー、ならびに目的のアクセプター分子に、優先的に結合する過アルキル化オリゴペプチドの配列を決定するためにこのようなオリゴペプチドセットおよびライブラリーを使用する方法を開示する。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドの非ペプチドアナログはまた、これらの方法により日常的に作成され得る。
【０１１３】
　「ポリペプチドおよびペプチド」のこの節に引用される各文書の全体の開示は、ここで参考として本明細書中に援用される。
【０１１４】
　当業者が理解するように、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドおよび上記のそのエピトープ保有フラグメントは、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメインの一部と結合し得、キメラペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は、精製を促進し、そしてインビボで増加した半減期を示す。これは、例えば、ヒトＣＤ４−ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示されている（ＥＰＡ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３３１：８４−８６（１９８８））。ＩｇＧ部分によるジスルフィド結合ダイマー構造を有する融合タンパク質はまた、他の分子の結合および中和において、モノマーＴ１Ｒ様リガンドＩタンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２７０：３９５８−３９６４（１９９５））。
【０１１５】
　（Ｔ１Ｒ様リガンドＩ関連障害診断）
　Ｔ１Ｒ様リガンドＩ関連障害について、「標準」Ｔ１Ｒ様リガンドＩ遺伝子発現レベル（すなわち、障害を有さない個体からの組織または体液におけるＴ１Ｒ様リガンドＩ遺伝子発現レベル）と比較して、実質的に変化した（増加または減少した）レベルのＴ１Ｒ様リガンドＩ遺伝子発現が、このような障害を有する個体から採取された組織または他の細胞または体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液、また脊髄液）において検出され得ると考えられる。従って、本発明は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ関連障害の診断の間に有用な診断方法を提供する。これは個体からの組織または他の細胞または体液におけるＴ１Ｒ様リガンドＩをコードする遺伝子の発現レベルを測定すること、および測定した遺伝子発現レベルと標準Ｔ１Ｒ様リガンドＩ遺伝子発現レベルとを比較することを含む。それにより、標準と比較された遺伝子発現レベルにおける増加または減少は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ関連障害の指標である。
【０１１６】
　Ｔ１Ｒ様リガンドＩ関連障害には、白血病、リンパ腫、動脈硬化症、自己免疫疾患、炎症性疾患、アルツハイマー病、眼の疾患、アポトーシス、子宮内増殖遅延、子癇前症、天疱瘡、および乾癬が挙げられることが考えられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
　個体により、哺乳動物個体、好ましくはヒトが意図される。「Ｔ１Ｒ様リガンドＩをコードする遺伝子の発現レベルを測定すること」により、第一の生物学的サンプルにおいて直接的（例えば、絶対的なタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを測定または評価することにより）または相対的（例えば、第二の生物学的サンプルにおけるＴ１Ｒ様リガンドＩタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルと比較することにより）のいずれかで、Ｔ１Ｒ様リガンドＩタンパク質のレベルまたはＴ１Ｒ様リガンドＩタンパク質をコードするｍＲＮＡレベルの定性的測定もしくは定量的測定または評価が意図される。好ましくは、第一の生物学的サンプルにおけるＴ１Ｒ様リガンドＩタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルが測定または評価され、そして標準Ｔ１Ｒ様リガンドＩタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルと比較される。標準は、障害を有さない個体から得られた第二の生物学的サンプルから得られるか、または障害を有さない個体の集団からの平均レベルにより決定され得る。当分野において評価されるように、一旦標準Ｔ１Ｒ様リガンドＩタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルが公知になると、それは比較のための標準として繰り返して使用され得る。
【０１１８】
　「生物学的サンプル」によって、個体、体液、細胞株、組織培養物、またはＴ１Ｒ様リガンドＩタンパク質もしくはｍＲＮＡを含む他の供給源から得られる任意の生物学的サンプルが意図される。示されるように、生物学的サンプルは、分泌された成熟Ｔ１Ｒ様リガンドＩを含む体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液、および随液）あるいはＴ１Ｒ様リガンドＩタンパク質を発現することが見出された組織供給源を含む。哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は当分野で周知である。生物学的サンプルがｍＲＮＡを含む場合、組織生検が好ましい供給源である。
【０１１９】
　全細胞ＲＮＡが、任意の適切な技術（例えば、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ，　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１６２：１５６−１５９　（１９８７）に記載されている一工程のグアニジン−チオシアネート−フェノール−クロロホルム法）を使用して生物学的サンプルから単離され得る。次いで、Ｔ１Ｒ様リガンドＩをコードするｍＲＮＡのレベルが、任意の適切な方法を用いてアッセイされる。これらは、ノーザンブロット分析、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＬＣＲ）を含む。
【０１２０】
　ノーザンブロット分析は、Ｈａｒａｄａら、Ｃｅｌｌ　６３：３０３−３１２　（１９９０）に記載されているように行われ得る。簡潔には、全ＲＮＡが上記のように生物学的サンプルから調製される。ノーザンブロットのためには、ＲＮＡは適切な緩衝液（例えば、グリオキサール／ジメチルスルホキシド／リン酸ナトリウム緩衝液）中で変性され、アガロースゲル電気泳動に供され、そしてニトロセルロースフィルターに転写される。ＲＮＡがＵＶリンカーによってフィルターに結合された後、フィルターは、ホルムアミド、ＳＳＣ、デンハルト溶液、変性させたサケ精子、ＳＤＳ、およびリン酸ナトリウム緩衝液を含有する溶液中で予備ハイブリダイゼーションされる。任意の適切な方法（例えば、３２ＰマルチプライムＤＮＡ標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））に従って標識されたＴ１Ｒ様リガンドＩ　ｃＤＮＡが、プローブとして使用される。一晩のハイブリダイゼーション後、フィルターは洗浄され、そしてＸ線フィルムに曝される。本発明に従うプローブとしての使用のためのｃＤＮＡは、上記の節に記載されており、そして少なくとも１５ｂｐの長さが好ましい。
【０１２１】
　Ｓ１マッピングは、Ｆｕｊｉｔａら、Ｃｅｌｌ　４９：３５７−３６７　（１９８７）に記載されているように行われ得る。Ｓ１マッピングでの使用のためのプローブＤＮＡを調製するために、上記のｃＤＮＡのセンス鎖がテンプレートとして使用され、標識されたアンチセンスＤＮＡが合成される。次いで、アンチセンスＤＮＡが、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して消化され、所望の長さのさらなるＤＮＡプローブが生成され得る。このようなアンチセンスプローブは、標的ｍＲＮＡ（すなわち、Ｔ１Ｒ様リガンドＩをコードするｍＲＮＡ）に対応する保護されたバンドを可視化するために有用である。ノーザンブロット分析が、上記のように行われ得る。
【０１２２】
　好ましくは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩをコードするｍＲＮＡのレベルは、Ｍａｋｉｎｏら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　２：２９５−３０１　（１９９０）　に記載されるようなＲＴ−ＰＣＲ法を使用してアッセイされる。この方法によれば、ポリアクリルアミドゲルバンド中の「アンプリコン」の放射活性は、標的ｍＲＮＡの初期濃度に直線的に相関する。簡潔には、この方法は、ＲＴプライマーおよび適切な緩衝液を含む反応混合物中の生物学的サンプルから単離された全ＲＮＡを添加する工程を包含する。プライマーのアニーリングのためのインキュベーション後、混合物はＲＴ緩衝液、ｄＮＴＰ、ＤＴＴ、ＲＮａｓｅインヒビター、および逆転写酵素を補充され得る。ＲＮＡの逆転写を達成するためのインキュベーション後、次いで、ＲＴ産物は標識されたプライマーを使用するＰＣＲに供される。あるいは、プライマーを標識するよりもむしろ、標識されたｄＮＴＰがＰＣＲ反応混合物中に含まれ得る。ＰＣＲ増幅は、従来技術に従ってＤＮＡサーマルサイクラー中で行われ得る。増幅を達成するための適切な数のラウンド後、ＰＣＲ反応混合物はポリアクリルアミドゲル上で電気泳動される。ゲルの乾燥後、適切なバンド（Ｔ１Ｒ様リガンドＩをコードするｍＲＮＡに対応する）の放射活性は、画像解析機を使用して定量される。ＲＴおよびＰＣＲ反応の成分および条件、試薬およびゲル濃度、ならびに標識方法は、当分野で周知である。ＲＴ−ＰＣＲ法の変形は当業者に明らかである。
【０１２３】
　逆転写された標的のｍＲＮＡを増幅する任意のオリゴヌクレオチドプライマーのセットが使用され得、そして上記の節で記載されるように設計され得る。
【０１２４】
　生物学的サンプル中のＴ１Ｒ様リガンドＩレベルのアッセイは、任意の当分野で公知の方法を使用して行われ得る。抗体に基づく技術が、生物学的サンプル中のＴ１Ｒ様リガンドＩレベルをアッセイするために好ましい。例えば、組織中でのＴ１Ｒ様リガンドＩの発現は、伝統的な免疫組織学的方法で研究され得る。これらの場合、特異的認識は一次抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）によって提供されるが、二次検出系は、蛍光、酵素、または他の結合された二次抗体を利用し得る。結果として、病理学試験のための組織切片の免疫組織学的染色が得られる。組織はまた、ウェスタンブロットまたはドット／スロットアッセイ（Ｊａｌｋａｎｅｎ，　Ｍ．ら、Ｊ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１０１：９７６−９８５　（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ，　Ｍら、Ｊ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１０５：３０８７−３０９６　（１９８７））のためのＴ１Ｒ様リガンドＩの遊離のために、例えば、尿素および中性の界面活性剤を用いて抽出され得る。陽イオン性固相の使用に基づくこの技術において、Ｔ１Ｒ様リガンドＩの定量は、単離されたＴ１Ｒ様リガンドＩを標準として使用して達成され得る。この技術はまた、体液にも適用され得る。これらのサンプルに関して、Ｔ１Ｒ様リガンドＩのモル濃度は、血清、血漿、尿、滑液、随液などのような異なる体液について、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ含量の標準値の設定を補助する。次いで、Ｔ１Ｒ様リガンドＩの量の正常値は、健常な個体に由来する値を使用して設定され得、これは、試験被検体から得られる値と比較され得る。
【０１２５】
　Ｔ１Ｒ様リガンドＩレベルを検出するために有用な他の抗体に基づく方法は、イムノアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））を含む。例えば、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ特異的モノクローナル抗体は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩを検出および定量するための、免疫吸着剤としておよび酵素標識プローブとしての両方に使用され得る。サンプル中に存在するＴ１Ｒ様リガンドＩの量は、直線回帰コンピューターアルゴリズムを使用して、標準的な調製物中に存在する量との比較によって算出され得る。腫瘍抗原を検出するためのこのようなＥＬＩＳＡは、Ｉａｃｏｂｅｌｌｉら、Ｂｒｅａｓｔ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　１１：１９−３０　（１９８８）　に記載されている。別のＥＬＩＳＡアッセイにおいては、２つの異なる特異的なモノクローナル抗体が、体液中のＴ１Ｒ様リガンドＩを検出するために使用され得る。このアッセイにおいて、一方の抗体が免疫吸着剤として使用され、そして他方が酵素標識プローブとして使用される。
【０１２６】
　上記の技術は、本質的に、「一工程」または「二工程」アッセイとして行われ得る。「一工程」アッセイは、固定化抗体とＴ１Ｒ様リガンドＩとを接触させる工程を包含し、そして洗浄する工程、標識された抗体と混合物とを接触させる工程は含まない。「二工程」アッセイは、洗浄する工程、その後、標識された抗体と混合物とを接触させる工程を包含する。他の従来の方法もまた、適切に使用され得る。通常、支持体上にアッセイ系の１つの成分を固定することが所望され、それによって系の他の成分は、その成分との接触およびサンプルからの容易な除去を生じることが可能となる。
【０１２７】
　適切な酵素標識は、例えば、基質との反応による過酸化水素の生成を触媒するオキシダーゼ群由来のものを含む。グルコースオキシダーゼは、それが良好な安定性を有し、そしてその基質（グルコース）が容易に入手できるために、特に好ましい。オキシダーゼ標識の活性は、酵素−標識抗体／基質反応によって形成される過酸化水素の濃度を測定することによってアッセイされ得る。酵素に加えて、他の適切な標識として、放射性同位元素（例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９ｍＴｃ））、ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）ならびにビオチンが挙げられる。
【０１２８】
　個体から得られる生物学的サンプル中のＴ１Ｒ様リガンドＩレベルをアッセイすることに加えて、Ｔ１Ｒ様リガンドＩはまた、画像解析によってインビボで検出され得る。Ｔ１Ｒ様リガンドＩのインビボでの画像解析のための抗体標識またはマーカーとして、Ｘ線撮影法、ＮＭＲ、またはＥＳＲによって検出可能なものが挙げられる。Ｘ線撮影法については、適切な標識として、検出可能な放射線を放射するが、被検体に対して明らかには有害ではない、バリウムまたはセシウムのような放射性同位元素が挙げられる。ＮＭＲおよびＥＳＲのための適切なマーカーとして、関連のハイブリドーマの栄養分の標識によって抗体中に取り込まれ得る、重水素のような検出可能な特徴的な回転を有するものが挙げられる。
【０１２９】
　放射性同位元素（例えば、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ）、放射性不透過体（ｒａｄｉｏ−ｏｐａｑｕｅ）基質、または核磁気共鳴によって検出可能な物質のような適切な検出可能な画像解析部分で標識されている、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ−特異的抗体または抗体フラグメントが、障害について試験される哺乳動物中に（例えば、非経口的、皮下、または静脈内）導入される。被検体の大きさおよび使用される画像解析システムによって、診断用の画像を生じるために必要とされる画像解析部分の量が決定されることが、当分野で理解される。放射性同位元素部分の場合、ヒト被検体については、注射される放射活性の量は、通常約５〜２０ミリキュリーの範囲の９９ｍＴｃである。次いで、標識抗体または抗体フラグメントは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩを含む細胞の位置に優先的に蓄積する。インビボでの腫瘍画像解析は、Ｓ．Ｗ．　Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｅｒ　Ｉｍａｇｉｎｇ　第１３章：Ｔｈｅ　Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ，　Ｂｕｒｃｈｉｅｌ，　Ｓ．Ｗ．およびＲｈｏｄｅｓ，　Ｂ．Ａ．編、Ｍａｓｓｏｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｉｎｃ．　（１９８２））に記載されている。
【０１３０】
　本発明での使用のためのＴ１Ｒ様リガンドＩ特異的抗体は、完全なＴ１Ｒ様リガンドＩまたはその抗原性ポリペプチドフラグメントに対して惹起され得る。これは、アルブミンのようなキャリアタンパク質と共に、またはそれが充分に長い（少なくとも約２５アミノ酸）場合はキャリアを伴わずに、動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に対して提示され得る。
【０１３１】
　本明細書中で使用される場合、用語「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩに特異的に結合し得る完全な分子および抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのような）を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは完全な抗体のＦｃ部分を欠いており、循環によってさらに迅速に除去され、そして完全な抗体の非特異的組織結合をほとんど有し得ない（Ｗａｈｌら、Ｊ．　Ｎｕｃｌ．　Ｍｅｄ．　２４：３１６−３２５　（１９８３））。従って、これらのフラグメントが好ましい。
【０１３２】
　本発明の抗体は、任意の種々の方法によって調製され得る。例えば、Ｔ１Ｒ様リガンドＩまたはその抗原性フラグメントを発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導するために動物に投与され得る。好ましい方法において、Ｔ１Ｒ様リガンドＩタンパク質の調製物は、それが天然の混入物を実質的に含まないように、上記のように調製され、そして精製される。次いで、このような調製物は、より大きな特異的活性のポリクローナル抗血清を産生するために動物に導入される。
【０１３３】
　最も好ましい方法において、本発明の抗体はモノクローナル抗体（またはそのＴ１Ｒ様リガンドＩ結合フラグメント）である。このようなモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｌｉｇａｎ，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９９０−１９９６）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　Ｎ．Ｙ．（１９８８），　第６〜９章，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ａｕｓｕｂｅｌ、前出、第１１章、その全体が本明細書中に参考として援用される））を用いて調製され得る。一般に、このような手順は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ抗原で、またはより好ましくはＴ１Ｒ様リガンドＩ発現細胞で動物（好ましくは、マウス）を免疫する工程を包含する。適切な細胞は、抗Ｔ１Ｒ様リガンドＩ抗体に結合するそれらの能力によって認識され得る。このような細胞は、任意の適切な組織培養培地中で培養され得る；しかし、１０％ウシ胎児血清（約５６℃で不活化した）を補充し、約１０μｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＥａｒｌｅ改変イーグル培地中で細胞を培養することが好ましい。このようなマウスの脾細胞が抽出され、そして適切な骨髄腫細胞株と融合される。任意の適切な骨髄腫細胞株が、本発明に従って使用され得る；しかし、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，　Ｍａｒｙｌａｎｄ，　ＵＳＡ）から入手可能な親骨髄腫細胞株（ＳＰ２Ｏ）を使用することが好ましい。融合後、得られたハイブリドーマ細胞はＨＡＴ培地中で選択的に維持され、次いでＷａｎｄｓら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　８０：２２５−２３２　（１９８１）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出、第７章に記載されているような限界希釈によってクローニングされる。次いで、このような選択によって得られたハイブリドーマ細胞は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ抗原に結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイされる。
【０１３４】
　あるいは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ抗原に結合し得るさらなる抗体が、抗イディオタイプ抗体の使用を通じて二工程手順で産生され得る。このような方法は、抗体がそれ自体が抗原であるという事実を使用し、従って、二次抗体に結合する抗体を得ることが可能である。この方法に従って、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ特異的抗体は、動物（好ましくは、マウス）を免疫するために使用される。次いで、このような動物の脾細胞はハイブリドーマ細胞を産生するために使用され、そしてハイブリドーマ細胞は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ−特異的抗体に結合する能力がＴ１Ｒ様リガンドＩ−抗原によってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗体は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ−特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そしてさらなるＴ１Ｒ様リガンドＩ−特異的抗体の形成を誘導するために動物を免疫するために使用され得る。
【０１３５】
　ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２および本発明の抗体の他のフラグメントが本明細書中で開示される方法に従って使用され得ることが明らかである。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生じる）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生じる）のような酵素を使用するタンパク質分解による切断によって産生される。あるいは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ−結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用または合成化学によって産生され得る。
【０１３６】
　ヒトにおける診断のために、インビボでのイメージングを用いて、上昇したレベルのＴ１Ｒ様リガンドＩを検出する場合、「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用することが好ましくあり得る。このような抗体は、上記のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞由来の遺伝構築物を用いて生成され得る。キメラ抗体を生成するための方法は、当分野で公知である。総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９：１２０２　（１９８５）；　Ｏｉら，　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　４：２１４　（１９８６）；　Ｃａｂｉｌｌｙら，　米国特許第４，８１６，５６７号；　Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら，　ＥＰ　１７１４９６；　Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，　ＥＰ　１７３４９４；　Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，　ＷＯ　８６０１５３３；　Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，　ＷＯ　８７０２６７１；　Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら，　Ｎａｔｕｒｅ　３１２：６４３　（１９８４）；　Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，　Ｎａｔｕｒｅ　３１４：２６８　（１９８５）を参照のこと。
【０１３７】
　本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩ特異的抗体にさらに適切な標識は、以下に提供される。適切な酵素標識の例は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、Δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼを含む。
【０１３８】
　適切な放射性同位体標識の例は、３Ｈ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、５７Ｔｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、１５２Ｅｕ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、２１７Ｃｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄなどを含む。１１１Ｉｎは、インビボでのイメージングが用いられる場合に好ましい同位体である。なぜなら、これは、１２５Ｉまたは１３１Ｉで標識したモノクローナル抗体の肝臓による脱ハロゲン化の問題を回避するからである。さらに、この放射性核種（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）は、イメージングのためにより好ましいγ放出エネルギーを有する（Ｐｅｒｋｉｎｓら，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｎｕｃｌ．　Ｍｅｄ．　１０：２９６−３０１　（１９８５）；　Ｃａｒａｓｑｕｉｌｌｏら，　Ｊ．　Ｎｕｃｌ．　Ｍｅｄ．　２８：２８１−２８７　（１９８７））。例えば、１−（Ｐ−イソチオシアネートベンジル）−ＤＰＴＡを用いてモノクローナル抗体にカップリングした１１１Ｉｎは、非腫瘍性組織（特に肝臓）における取り込みをほとんど示さなかった。それゆえ、腫瘍局在化の特異性を増強する（Ｅｓｔｅｂａｎら，　Ｊ．　Ｎｕｃｌ．　Ｍｅｄ．　２８：８６１−８７０　（１９８７））。
【０１３９】
　適切な非放射性同位体標識の例は、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｔｒ、および５６Ｆｅを含む。
【０１４０】
　適切な蛍光標識の例は、１５２Ｅｕ標識、フルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、ｏ−フタルアルデヒド（ｏ−ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）標識、およびフルオレサミン標識を含む。
【０１４１】
　適切な毒素標識の例は、ジフテリア毒素、リシン、およびコレラ毒素を含む。
【０１４２】
　化学発光標識の例は、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、およびエクオリン標識を含む。
【０１４３】
　核磁気共鳴コントラスト剤の例は、Ｇｄ、Ｍｎ、およびＦｅのような重金属原子核を含む。
【０１４４】
　上記の標識を抗体に結合するための代表的な技術は、Ｋｅｎｎｅｄｙら（Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｉｍ．　Ａｃｔａ　７０：１−３１　（１９７６））およびＳｃｈｕｒｓら（Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｉｍ．　Ａｃｔａ　８１：１−４０　（１９７７））により提供される。後者において言及されるカップリング技術は、グルタルアルデヒド方法、過ヨウ素酸方法、ジマレイミド方法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル方法であり、これらの方法は全て本明細書中に参考として援用される。
【０１４５】
　（染色体アッセイ）
　本発明の核酸分子はまた、染色体の同定に有用である。配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてその位置にハイブリダイズし得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要性がある。現在、実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標識化試薬はほとんど染色体位置の標識に利用可能でない。本発明によるＤＮＡの染色体へのマッピングは、これらの配列と、疾患に関連する遺伝子との相関付けにおいて重要な第１工程である。
【０１４６】
　この点における特定の好ましい実施態様において、本明細書中に開示されるｃＤＮＡは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ遺伝子のゲノムＤＮＡをクローニングするために使用される。これは、種々の周知の技術および一般に市販されているライブラリーを使用して達成され得る。次いで、ゲノムＤＮＡは、この目的のための周知の技術を使用してインサイチュ染色体マッピングのために使用される。代表的には、染色体マッピングの日常的な手順に従う、いくつかの試行錯誤が、良好なインサイチュハイブリダイゼーションシグナルを与えるゲノムプローブを同定するために必要であり得る。
【０１４７】
　いくつかの場合において、さらに、配列は、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製することにより染色体にマップされ得る。遺伝子の３’非翻訳領域のコンピューター解析が、ゲノムＤＮＡ内で１より多いエキソンにまたがらず、従って増幅プロセスを複雑化しないプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むそれらのハイブリッドのみが増幅部分を生じる。
【０１４８】
　体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に特定のＤＮＡを割り当てるための迅速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを本発明と共に使用して、特定の染色体由来の部分のパネルまたは類似の様式での大きなゲノムクローンのプールを用いて、準位置決定（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）が達成され得る。染色体にマップするために同様に使用され得る他のマッピングストラテジーは、インサイチュハイブリダイゼーション、標識してフロー選別した（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体を用いるプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる予備選択を含む。
【０１４９】
　ｃＤＮＡクローンの中期染色体スプレッド（ｓｐｒｅａｄ）への蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（「ＦＩＳＨ」）は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得る。この技術は、５０ｂｐまたは６０ｂｐほどの短いｃＤＮＡ由来のプローブを用いて使用され得る。この技術の総説については、Ｖｅｒｍａら，　Ｈｕｍａｎ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：　Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８８）を参照のこと。
【０１５０】
　一旦配列が正確な染色体位置にマップされると、配列の染色体上での物理的な位置を遺伝地図のデータと相関させ得る。このようなデータは、例えば、Ｖ．　ＭｃＫｕｓｉｃｋ，　Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ　Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ　ｉｎ　Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ　Ｈｏｐｋｉｎｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｗｅｌｃｈ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで入手可能である）において見出される。次いで、同じ染色体領域にマップされた遺伝子と疾患との間の関係が、連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。
【０１５１】
　次に、罹患個体と非罹患個体との間のｃＤＮＡ配列またはゲノム配列における相違を決定する必要がある。変異がいくつかまたは全ての罹患個体に観察されるが、いずれの正常な個体にも観察されない場合、この変異は疾患の原因因子であるようである。
【０１５２】
　物理的マッピング技術および遺伝的マッピング技術の現在の解像度では、疾患に関連する染色体領域に正確に位置決めされたｃＤＮＡは、５０と５００との間の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガベースのマッピング解像度、および２０ｋｂあたり１遺伝子と仮定する）。
【０１５３】
　（Ｔ１Ｒ様リガンドＩ障害の処置）
　本発明者らにより、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドが、インターロイキン−１（ＩＬ−１）およびＴ１Ｒリガンドと生物学的活性を共有すると考えられる。従って、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ（特に成熟形態）は、治療的効果を生じるために細胞、組織、または個体の身体に外因的に添加され得る。特に、Ｔ１Ｒ様リガンドＩタンパク質活性の標準的なレベルにおける減少により生じた障害は、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドの有効量を投与することにより処置され得る。好ましくは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩタンパク質活性を増加させるのに有効な量の本発明の単離されたＴ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドを含む薬学的組成物が投与される。このような治療が有効であるようである障害が上記でおよび下記で議論される。
【０１５４】
　当業者は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドの有効量が、このようなポリペプチドの投与が示される各々の条件について経験的に決定され得ることを認識する。Ｔ１Ｒ様リガンドＩ活性を有するポリペプチドは、薬学的組成物中で、１つ以上の薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、および／または賦形剤と組み合わせて投与され得る。ヒト患者に投与される場合、本発明の薬学的組成物の総日使用量が、音医療判断の範囲内で担当医により決定されることが理解される。任意の特定の患者についての特定の治療有効用量レベルは、達成されるべき応答の型および程度；（もしあれば）用いられる特定の組成および他の薬剤；患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別、および常食；投与の時間、投与経路、および組成物の排泄速度；処置の持続期間；特定の組成物と組み合わせるか、または同時に用いられる薬物（例えば、化学療法剤）；ならびに医療の分野で周知の同様の要素を含む種々の要素に依存する。
【０１５５】
　治療に用いられるＴ１Ｒ様リガンドＩ組成物はまた、個々の患者の臨床状態（特にＴ１Ｒ様リガンドＩ単独での処置の副作用）、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ組成物の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および実施者に公知の他の要素を考慮して、良好な医療行為と一致した様式で処方および投薬される。従って、本明細書中の目的のためのＴ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドの「有効量」は、このような考慮によって決定される。
【０１５６】
　一般的提案として、１用量あたりで非経口投与されるＴ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドの総薬学的有効量は、患者の体重あたり、約０．０１ｎｇ／ｋｇ／日〜１０μｇ／ｋｇ／日の範囲であるが、上記のように、これは治療的自由裁量に供される。より好ましくは、この用量は、少なくとも１．０ｎｇ／ｋｇ／日、そして最も好ましくはヒトについてホルモンで、約１．０〜１００ｎｇ／ｋｇ／日である。連続的に与えられる場合、Ｔ１Ｒ様リガンドＩは、代表的には、約０．０１ｎｇ／ｋｇ／時間〜約１００ｎｇ／ｋｇ／時間の用量速度で、１日あたり１〜４回の注射、または例えば、ミニポンプを用いる連続的皮下注入のいずれかにより投与される。静脈内バック溶液もまた用いられ得る。
【０１５７】
　免疫系に影響を与えるためのＴ１Ｒ様リガンドＩポリペプチド処置の経過は、特定の最小日数（マウスの場合７日間）より長く持続される場合、最適であるようである。変化を観察するために必要とされる処置の長さ、および処置後に応答が起きるまでの間隔は、所望される効果に従って変化するようである。
【０１５８】
　Ｔ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドはまた、持続放出系により適切に投与される。持続放出組成物の適切な例は、造形品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態の半透過性ポリマーマトリックスを含む。持続放出マトリックスは、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ　５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｕ．　Ｓｉｄｍａｎら，　Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ　２２：５４７−５５６　（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｒ．　Ｌａｎｇｅｒら，　Ｊ．　Ｂｉｏｍｅｄ　Ｍａｔｅｒ．　Ｒｅｓ．　１５：１６７−２７７　（１９８１）およびＲ．　Ｌａｎｇｅｒ，　Ｃｈｅｍ．　Ｔｅｃｈ．　１２：９８−１０５　（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｒ．　Ｌａｎｇｅｒら，　同書）、またはポリ−Ｄ−（−）３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ　１３３，９８８）を含む。持続放出Ｔ１Ｒ様リガンドＩ組成物はまた、リポソームに封入されたＴ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドを含む。Ｔ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドを含むリポソームは、それ自体が公知の方法により調製される：ＤＥ　３，２１８，１２１；　Ｅｐｓｔｅｉｎら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８２：３６８８−３６９２　（１９８５）；　Ｈｗａｎｇら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　７７：４０３０−４０３４　（１９８０）；　ＥＰ　５２，３２２；　ＥＰ　３６，６７６；　ＥＰ　８８，０４６；　ＥＰ　１４３，９４９；　ＥＰ　１４２，６４１；　日本国特許出願第８３−１１８００８号；　米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号；　ならびにＥＰ　１０２，３２４。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００オングストローム）単層型のものであり、ここで脂質含量は約３０ｍｏｌ．％コレステロールより高く、選択される比率は、最適なＴ１Ｒ様リガンドＩ治療のために調整される。
【０１５９】
　非経口投与のために、１つの実施態様では、Ｔ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドは、一般的に、所望の程度の純度で単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液、または乳濁液）のこのポリペプチドを、薬学的に受容可能なキャリア（すなわち、用いられる投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、処方物の他の成分と適合性であるキャリア）と混合することにより処方される。例えば、処方物は、好ましくは、酸化剤、およびポリペプチドに対して有害であることが公知である他の化合物を含まない。
【０１６０】
　一般的に、処方物は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドを、液体キャリアまたは微細に分割された固体キャリアまたはその両方と均一にかつ直接接触させることにより調製される。次いで、必要な場合、産物は、所望の処方物に成形される。好ましくは、キャリアは、非経口キャリア、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビヒクルの例は、水、生理食塩水、リンゲル溶液、およびデキストロース溶液を含む。固定油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルはまた、本明細書中で、ならびにリポソームで有用である。
【０１６１】
　キャリアは、等張性および化学的安定性を増強する物質のような、微量の添加剤を適切に含む。このような物質は、用いられる投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、そしてリン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、および他の有機酸またはそれらの塩のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニンのようなアミノ酸；セルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート化剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；ならびに／あるいはポリソルベート、ポロオキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）またはＰＥＧのような非イオン性界面活性剤を含む。
【０１６２】
　Ｔ１Ｒ様リガンドＩは、代表的に、このようなビヒクルに、約０．００１ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８のｐＨで処方される。上述の賦形剤、キャリア、または安定化剤の特定のものの使用が、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ塩の処方物をもたらすことが理解される。
【０１６３】
　治療的投与のために用いられるべきＴ１Ｒ様リガンドＩは、無菌でなければならない。無菌は、無菌の濾過メンブレン（例えば、０．２ミクロンメンブレン）を通しての濾過により容易に達成される。治療的Ｔ１Ｒ様リガンドＩ組成物は、一般的に、無菌の出入り口を有する容器（例えば、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針が貫通し得るストッパーを有するバイアル）に入れられる。
【０１６４】
　Ｔ１Ｒ様リガンドＩは、通常、単位用量または多回用量の容器（例えば、シールされたアンプルまたはバイアル）において、水溶液または再構成のための凍結乾燥処方物として保存される。凍結乾燥処方物の１例として、１０ｍｌバイアルが、無菌濾過された１％（ｗ／ｖ）水性Ｔ１Ｒ様リガンドＩ溶液５ｍｌで満たされ、そして得られた混合物は凍結乾燥される。注入溶液は、凍結乾燥されたＴ１Ｒ様リガンドＩを、静菌性の注射用蒸留水を用いて再構成することにより調製される。
【０１６５】
　例えば、満足できる結果は、１回または分割された用量で、１日あたり１〜４回投与される、０．０５〜５０００ｎｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．１〜１０００ｎｇ／ｋｇ／日、より好ましくは１０〜１００ｎｇ／ｋｇ／日のオーダーの投薬量における、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ活性を有するポリペプチドの経口投与により得られる。例えば、ｉ．ｖ．点滴または注入による非経口投与では、０．０１〜５００ｎｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．０５〜１００ｎｇ／ｋｇ／日、そしてより好ましくは０．１〜５０ｎｇ／ｋｇ／日のオーダーの投薬量が用いられ得る。従って、患者に対して適切な日投薬量は、２．５ｎｇ〜２５０μｇ（経口）、好ましくは５ｎｇ〜５０μｇ（経口）、より好ましくは５０ｎｇ〜１２．５μｇ（経口）のオーダーであるか、または０．５ｎｇ〜２５μｇ（静注）、好ましくは２．５ｎｇ〜５００μｇ（静注）、そしてより好ましくは５ｎｇ〜２．５μｇ（静注）のオーダーである。
【０１６６】
　（Ｔ１Ｒ様リガンドＩ抗体治療）
　本発明により、上昇したレベルのＴ１Ｒ様リガンドＩタンパク質活性により生じる障害は、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドのアンタゴニストの有効量を投与することにより処置され得る。それゆえ、Ｔ１Ｒ様リガンドＩレセプターへの結合についてインタクトなタンパク質と競合する可溶性のＴ１Ｒ様リガンドＩタンパク質（例えば、細胞外ドメイン）と同様に、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドを結合する抗体（好ましくはモノクローナル）または抗体フラグメントは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ関連障害の処置において有用である。このような抗体および／または可溶性Ｔ１Ｒ様リガンドＩタンパク質は、好ましくは薬学的に受容可能な組成物において提供される。
【０１６７】
　本発明の薬学的組成物は、例えば、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、または頬の経路により投与され得る。あるいは、または同時に、投与は、経口であり得る。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康状態、および体重、（もしあれば）同時処置の種類、処置の頻度、ならびに所望される効果の性質に依存する。
【０１６８】
　本発明の範囲内の組成物は、抗体、フラグメント、または誘導体が、その意図される目的を達成するために有効な量で含まれる全ての組成物を含む。個々の必要性は異なるが、各成分の有効量の最適な範囲の決定は、当分野の技量の範囲内である。有効用量は、個々のキメラ抗体またはモノクローナル抗体、結合した治療剤（下記を参照のこと）の存在および性質、患者およびその臨床状態の関数であり、そして約１０ｎｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重で変化し得る。好ましい投薬量は、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重を含む。
【０１６９】
　イメージングのための検出可能に標識された形態、または治療のための遊離もしくは結合した形態のような、非経口投与のためのＴ１Ｒ様リガンドＩ抗体またはフラグメントの調製物は、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液、および乳濁液を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えばオリーブ油）、および注入可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）である。水性キャリアは、生理食塩水および緩衝化媒体を含む、水、アルコール／水溶液、乳濁液、または懸濁液、塩化ナトリウム溶液を含む非経口ビヒクル、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル、または固定油を含む。静脈内ビヒクルは、流体補充物および栄養補充物（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）（例えば、リンゲルデキストロースに基づく補充物）などを含む。保存剤および他の添加剤はまた、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスなどのように存在し得る。一般的に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　第１６版，　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．，　Ｅａｓｔｏｎ，　ＰＡ，　１９８０を参照のこと。
【０１７０】
　本明細書中に記載される抗体は、他のモノクローナル抗体またはキメラ抗体と、あるいは抗体と相互作用するエフェクター細胞の数もしくは活性を増加させるのに役立つ、リンホカインまたは造血性増殖因子などと組み合わせて有利に利用され得る。
【０１７１】
　（Ｔ１Ｒ様リガンドＩの予想される多面的な生物学的効果）
　本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩポリペプチドは、下記の表１に示される多くの効果を含む多面的な生物学的効果を有すると予想される。同様の生物学的効果は、ＩＬ−１について、特に、膵臓内分泌組織（Ｍａｎｄｒｕｐ−Ｐｏｕｌｓｅｎ，　Ｔ．ら，　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　５：１８５　（１９９３））、甲状腺（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，　Ａ．Ｋ．，　Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ　１６：１４１　（１９９３））、視床下部−下垂体−副腎軸（Ｆａｎｔｕｚｚｉ，　Ｇ．，およびＧｈｅｚｚｉ，　Ｐ．，　Ｍｅｄｉａｔｏｒ　Ｉｎｆｌａｍｍ．　２：２６３　（１９９３）；　Ｒｉｖｉｅｒ，　Ｃ．，　Ａｎｎ．　ＮＹ　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　６９７：９７　（１９９３）；　Ｒｉｖｉｅｒ，　Ｃ．，およびＲｉｖｅｓｔ，　Ｓ．，　Ｃｉｂａ．　Ｆｏｕｎｄ．　Ｓｙｍｐ．　１７２：２０４　（１９９３））、発熱（Ｃｏｃｅａｎｉ，　Ｆ．，「Ｆｅｖｅｒ：　Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ａｎｄ　Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ」，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　ＮＹ，　Ｒａｖｅｎ　（１９９１）　５９頁）、骨代謝（Ｔａｋａｋｉｓ，　Ｄ．Ｎ．，　Ｊ．　Ｐｅｒｉｄｏｎｔｏｌ　６４：４１６　（１９９３））、慢性関節リウマチの病因における軟骨の破壊（Ａｒｅｎｄ，　Ｗ．Ｐ．，　およびＤａｙｅｒ，　Ｊ．Ｍ．，　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ　３３：３０５　（１９９０）；　Ｋｒａｎｅ，　Ｓ．Ｍ．ら，　Ａｎｎ．　ＮＹ　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　５８０：３４０　（１９９０））、子宮着床（Ｌｅｗｉｓ，　Ｍ．Ｐ．ら，　Ｐｌａｃｅｎｔａ　１５：１３　（１９９４））、および赤身体質量の損失（Ｒｏｕｂｅｎｏｆｆ，　Ｒ．ら，　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　９３：２３７９　（１９９４））に関連したものについて示されている。
【０１７２】
【表１】
2004041212.tif 000002
用いたアッセイ：膵臓内分泌組織（Ｍａｎｄｒｕｐ−Ｐｏｕｌｓｅｎ，　Ｔ．ら，　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　５：１８５　（１９９３））、甲状腺（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，　Ａ．Ｋ．，　Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ　１６：１４１　（１９９３））、視床下部−下垂体−副腎軸（Ｆａｎｔｕｚｚｉ，　Ｇ．およびＧｈｅｚｚｉ，　Ｐ．，　Ｍｅｄｉａｔｏｒ　Ｉｎｆｌａｍｍ．　２：２６３　（１９９３）；　Ｒｉｖｉｅｒ，　Ｃ．，　Ａｎｎ．　ＮＹ　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　６９７：９７　（１９９３）；　Ｒｉｖｉｅｒ，　Ｃ．，　およびＲｉｖｅｓｔ，　Ｓ．，　Ｃｉｂａ．　Ｆｏｕｎｄ．　Ｓｙｍｐ．　１７２：２０４　（１９９３））、発熱（Ｃｏｃｅａｎｉ，　Ｆ．，　「Ｆｅｖｅｒ：　Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ａｎｄ　Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ」，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　ＮＹ，　Ｒａｖｅｎ　（１９９１）　５９頁）、骨代謝（Ｔａｔａｋｉｓ，　Ｄ．Ｎ．，　Ｊ．　Ｐｅｒｉｄｏｎｔｏｌ　６４：４１６　（１９９３））、慢性関節リウマチの病因における軟骨の破壊（Ａｒｅｎｄ，　Ｗ．Ｐ．およびＤａｙｅｒ，　Ｊ．Ｍ．，　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ　３３：３０５　（１９９０）；　Ｋｒａｎｅ，　Ｓ．Ｍ．ら，　Ａｎｎ．　ＮＹ　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　５８０：３４０　（１９９０））、子宮着床（Ｌｅｗｉｓ，　Ｍ．Ｐ．ら，　Ｐｌａｃｅｎｔａ　１５：１３　（１９９４））および赤身体質量の損失（Ｒｏｕｂｅｎｏｆｆ，　Ｒ．ら，　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　９３：２３７９　（１９９４））。
【０１７３】
　本発明を一般的に記載してきたが、本発明は、例示のために提供され、そして限定することを意図しない以下の実施例を参照することにより、さらに容易に理解される。
【発明の効果】
【０１７４】
図１（配列番号２）のアミノ酸配列を有するヒトＴ１レセプター（Ｔ１Ｒ）様リガンドＩポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子が提供される。
【実施例】
【０１７５】
　（実施例１：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＴ１Ｒ様リガンドＩの発現および精製）
　寄託されたｃＤＮＡクローンにおいて成熟Ｔ１Ｒ様リガンドＩをコードするＤＮＡ配列を、Ｔ１Ｒ様リガンドＩのアミノ酸末端配列および遺伝子に対してベクター配列３’に特異的なＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。クローニングを容易にするための制限部位を含むさらなるヌクレオチドを、それぞれ５’および３’の配列に添加した。
【０１７６】
　当業者は、完全長成熟Ｔ１Ｒ様リガンドＩタンパク質（約２８〜約２１７アミノ酸）が、適切な５’および３’オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し得ることを理解する。
【０１７７】
　寄託されたクローンにおける完全長Ｔ１Ｒ様リガンドＩの細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ配列を、遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。５’オリゴヌクレオチドプライマーは、配列５’　ＣＧＣ　ＣＣＡ　ＴＧＧ　ＡＧＣ　ＴＣＡ　ＣＣＴ　ＴＣＧ　ＡＧＣ　ＴＧ　３’（配列番号４）を有し、これは下線を付したＮｃｏＩ制限部位を含み、続いて図１（配列番号１）の配列をコードするＴ１Ｒ様リガンドＩタンパク質の１７ヌクレオチド（ヌクレオチド１７０〜１８６）は、シグナルペプチドの直後で開始する。
【０１７８】
　３’プライマーは、配列５’　ＣＧＣ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＴＣＡ　ＴＣＧ　ＧＣＴ　ＡＴＴ　ＡＡＧ　ＧＴＣ　ＴＴＣ　３’（配列番号５）を有し、これはＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含み、続いて図１（配列番号１）の配列をコードするＴ１Ｒ様リガンドＩのヌクレオチド６０４〜６２１に相補的でありそして逆方向である停止コドンおよび１８ヌクレオチドを含む。
【０１７９】
　制限部位は、細菌発現ベクターｐＱＥ６０の制限酵素部位に対して都合良く、これらの実施例においてＭ１５／ｒｅｐ４宿主細胞における細菌発現のために使用した（Ｑｉａｇｅｎ，　Ｉｎｃ．　Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，　ＣＡ，　９１３１１）。ｐＱＥ６０は、アンピシリン抗生物質耐性（「Ａｍｐｒ」）をコードし、細菌の複製起点（「ｏｒｉ」）、ＩＰＴＧ誘導プロモーター、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、６−Ｈｉｓタグ、および制限酵素部位を含む。
【０１８０】
　増幅されたＴ１Ｒ様リガンドＩＤＮＡおよびベクターｐＱＥ６０の両方をＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次いで消化されたＤＮＡを一緒に連結する。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＤＮＡの制限されたｐＱＥ６０ベクターへの挿入は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩコード領域を、ベクターのＩＰＴＧ誘導プロモーターの下流に、かつこれに作動可能に連結するように、そしてＴ１Ｒ様リガンドＩの翻訳のために適切に位置される開始ＡＵＧにインフレームに配置する。
【０１８１】
　連結混合物を、標準的な手順を用いて、コンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換した。このような手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版；Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　Ｎ．Ｙ．　（１９８９）に記載されている。複数のコピーのプラスミドｐＲＥＰ４（これは、ｌａｃリプレッサーを発現し、そしてカナマイシン耐性（Ｋａｎｒ）を付与する）を含有するＥ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４を本明細書に記載の例示的な実施例を行うにあたって使用する。この株（これは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩを発現するために適切である多くの株の内の唯一である）は、Ｑｉａｇｅｎから市販されている。
【０１８２】
　形質転換体を、アンピシリンおよびカナマイシンの存在下でＬＢプレート上で増殖するそれらの能力により同定する。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、そしてクローン化ＤＮＡの同定を制限分析により確認する。
【０１８３】
　所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）とカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）との両方を補充したＬＢ培地における液体培養で一晩（「Ｏ／Ｎ」）増殖した。
【０１８４】
　Ｏ／Ｎ培養物を用いて約１：１００〜１：２５０の希釈で大規模培養に接種した。細胞を、０．４と０．６との間の６００ｎｍでの吸光度（「ＯＤ６００」）にまで増殖させる。次いで、イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を加えて１ｍＭの最終濃度にし、ｌａｃＩリプレッサーを不活性化することにより、ｌａｃリプレッサー感受性プロモーターからの転写を誘導する。細胞をさらに３〜４時間引き続きインキュベートする。次いで、標準的方法によって細胞を遠心分離により採集し、そして破壊する。日常的な回収技術を用いて破壊した細胞から封入体を精製し、そしてタンパク質を封入体から８Ｍ尿素中へ可溶化する。可溶化したタンパク質を含む８Ｍ尿素溶液を、２×リン酸緩衝化生理食塩水（「ＰＢＳ」）中でＰＤ−１０カラムを通し、それによって尿素を除去し、緩衝液を交換し、そしてタンパク質を再び折り畳む。タンパク質をクロマトグラフィーのさらなる工程によって精製してエンドトキシンを除去する。次いで、濾過滅菌した。濾過滅菌したタンパク質調製物を、９５μ／ｍｌの濃度の２×ＰＢＳ中で保存する。
【０１８５】
　ポリアクリルアミドゲル電気泳動の標準的な方法による調製物の分析は、調製物が、約１８ｋＤａの推定分子量を有する約９５％のモノマーＴ１Ｒ様リガンドＩを含むことを明らかにした。
【０１８６】
　（実施例２：バキュロウイルス発現系におけるＴ１Ｒ様リガンドＩのクローニングおよび発現）
　寄託されたクローンにおける完全長Ｔ１Ｒ様リガンドＩをコードするｃＤＮＡ配列を、この遺伝子の５’配列および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する：
　５’プライマーは、配列５’　ＣＧＣ　ＧＧＡ　ＴＣＣ　ＧＣＣ　ＡＴＣ　ＡＴＧ　ＧＧＣ　ＡＧＣ　ＡＣＴ　ＧＴＣ　ＣＣＧ　３’（配列番号６）を有し、下線を付したＢａｍＨＩ制限酵素部位を含み、続いて図１の配列（配列番号１）をコードするＴ１Ｒ様リガンドＩの１８ヌクレオチド（ヌクレオチド８８〜１０５）を含む。以下に記載のように発現ベクターに挿入した、Ｔ１Ｒ様リガンドＩをコードする増幅したフラグメントの５’末端は、有効なシグナルペプチドを提供する。真核生物細胞における翻訳の開始に有効なシグナルは、Ｋｏｚａｋ，　Ｍ．，　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．　１９６：９４７−９５０（１９８７）によって記載されるように、構築物のベクター部分に適切に配置される。
【０１８７】
　３’プライマーは、配列５’　ＣＧＣ　ＧＧＴ　ＡＣＣ　ＴＣＡ　ＣＴＧ　ＣＴＣ　ＣＡＧ　ＣＣＴ　ＧＧＧ　ＧＣ　３’（配列番号７）を有し、これは下線を付したＡｓｐ７１８制限部位を含み、続いて図１に示す配列をコードするＴ１Ｒ様リガンドＩのヌクレオチド６０４〜６２１（配列番号１）に相補的でありそして逆である停止コドンおよび１８ヌクレオチドを含む。
【０１８８】
　寄託されたクローンにおける完全長Ｔ１Ｒ様リガンドＩの細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ配列を、この遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する：
　５’プライマーは、配列５’　ＣＧＣ　ＧＧＡ　ＴＣＣ　ＧＣＣ　ＡＴＣ　ＡＴＧ　ＧＧＣ　ＡＧＣ　ＡＣＴ　ＧＴＣ　ＣＣＧ　３’（配列番号６）を有し、下線を付したＢａｍＨＩ制限酵素部位を含み、続いて図１の配列（配列番号１）をコードするＴ１Ｒ様リガンドＩの１８ヌクレオチド（ヌクレオチド８８〜１０５）を含む。以下に記載のように発現ベクターに挿入した、Ｔ１Ｒ様リガンドＩをコードする増幅したフラグメントの５’末端は、有効なシグナルペプチドを提供する。真核生物細胞における翻訳の開始に有効なシグナルは、Ｋｏｚａｋ，　Ｍ．，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　１９６：９４７−９５０（１９８７）によって記載されるように、構築物のベクター部分に適切に配置される。
【０１８９】
　３’プライマーは、配列５’　ＣＧＣ　ＧＧＴ　ＡＣＣ　ＴＣＡ　ＴＣＧ　ＧＣＴ　ＡＴＴ　ＡＡＧ　ＧＴＣ　ＴＴＣ　３’（配列番号８）を有し、これは下線を付したＡｓｐ７１８制限部位を含み、続いて図１に示す配列をコードするＴ１Ｒ様リガンドＩのヌクレオチド６０４〜６２１（配列番号１）に相補的でありそして逆である停止コドンおよび１８ヌクレオチドを含む。
【０１９０】
　増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」　ＢＩＯ　１０１　Ｉｎｃ．，　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，　Ｃａ．）を用いて、１％アガロースゲルより単離する。次いで、このフラグメントをＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、そして１％アガロースゲルで再び精製する。このフラグメントを、本明細書中でＦ２と命名する。
【０１９１】
　ベクターｐＡ２を用いて、Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，　Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｓｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ．　１５５５（１９８７）に記載の標準的な方法を用いて、完全長Ｔ１Ｒ様リガンドＩおよびＴ１Ｒ様リガンドＩの細胞外ドメインをバキュロウイルス発現系において発現する。
【０１９２】
　ベクターｐＡ２を用いて、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ完全長およびＴ１Ｒ様リガンドＩの細胞外ドメインをバキュロウイルス発現系において、Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，　Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｓｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ．　１５５５（１９８７）に記載の標準的な方法を用いて発現する。ｐＡ２ベクターは、シグナルペプチドコード領域を含まない。従って、Ｔ１Ｒ様リガンドＩシグナルペプチドは、（図１のヌクレオチド８８〜１６８（配列番号１））；図１のアミノ酸１〜２７（配列番号２）に依存する。
【０１９３】
　Ｔ１Ｒ様リガンドＩシグナルペプチドが、Ｔ１Ｒ様リガンドＩタンパク質の有効な発現を生じない場合、ｐＡ２ベクターのかわりにｐＡ２−ＧＰベクターを使用し得る。ＡｃＭＮＰＶ　ｇｐ６７のシグナルペプチド（Ｎ末端メチオニンを含む）は、ＢａｍＨＩ部位のちょうど上流に位置する。当業者は、ｐＡ２−ＧＰ発現ベクターを使用する場合、使用される５’オリゴヌクレオチドは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩシグナルペプチドをコードする配列を含むはずではないことを理解する。かわりに、５’オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド１６９で開始するはずである。
【０１９４】
　ｐＡ２およびｐＡ２−ＧＰの両方の発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、それに続く都合のいい制限部位を含む。ＡｃＭＮＰＶ　ｇｐ６７のシグナルペプチド（Ｎ末端メチオニンを含む）は、ＢａｍＨＩ部位のちょうど上流に位置する。シミアンウイルス４０（「ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。組換えウイルスの容易な選択のために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβガラクトシダーゼ遺伝子をポリヘドリンプロモーターと同方向に挿入し、そしてポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルが続く。ポリヘドリン配列を、野生型ウイルスＤＮＡとの細胞媒介性相同組換えのためにウイルス配列によって両側に隣接させ、クローン化ポリヌクレオチドを発現する生存可能なウイルスを生成する。
【０１９５】
　当業者が容易に理解するように、構築が転写、翻訳、輸送などのために適切に位置したシグナル（例えば、必要ならばインフレームでのＡＵＧおよびシグナルペプチド）を提供する、多くの他のバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１、およびｐＡｃＩＭ１）が、ｐＡ２またはｐＡ２−ＧＰの代わりに用いられ得る。このようなベクターは、とりわけ、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，　１７０：３１−３９に記載される。
【０１９６】
　当分野で公知の日常的な手順を用いて、プラスミドを制限酵素ＸｂａＩで消化し、次いでウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化する。次いで、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ　１０１　Ｉｎｃ．，　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，　Ｃａ）を用いてＤＮＡを１％アガロースゲルから単離する。このベクターＤＮＡを、本明細書中で「Ｖ２」と命名する。
【０１９７】
　フラグメントＦ２および脱リン酸化プラスミドＶ２を、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼでともに連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１細胞を連結混合物で形質転換し、そして培養プレート上に播く。ＸｂａＩを用いて個々のコロニーからのＤＮＡを消化し、次いでゲル電気泳動によって消化産物を分析することによって、ヒトＴ１Ｒ様リガンドＩ遺伝子を有するプラスミドを含む細菌を同定する。クローン化フラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定により確認する。このプラスミドを、本明細書中でｐＢａｃＴ１Ｒ−ｌｉｋｅ　ｌｉｇａｎｄ　Ｉと命名する。
【０１９８】
　５μｇのプラスミドｐＢａｃＴ１Ｒ−ｌｉｋｅ　ｌｉｇａｎｄ　Ｉを、Ｆｅｌｇｎｅｒら　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８４：７４１３−７４１７　（１９８７）によって記載されるリポフェクション法を用いて、１．０μｇの市販の線状化バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭ　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　ＤＮＡ」，　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）とともに同時トランスフェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭウイルスＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＢａｃＴ１Ｒ−ｌｉｋｅ　ｌｉｇａｎｄ　Ｉを、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．，　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，　ＭＤ）を含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合する。その後、１０μｌのリポフェクチンおよび９０μｌのグレース培地を添加し、混合し、そして室温にて１５分間インキュベートする。次いで、そのトランスフェクション混合物を、無血清グレース培地１ｍｌを有する３５ｍｍ組織培養プレート内に播種されたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１７１１）に滴下する。プレートを、新たに添加した溶液を混合するために、前後に振盪する。次いでプレートを、２７℃で５時間インキュベートする。５時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして１０％ウシ胎児血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加する。プレートをインキュベーターに戻し、そして２７℃で４日間培養を続ける。
【０１９９】
　４日後、上清を回収し、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（上記で引用）に記載されるようにプラークアッセイを行う。青く染色されたプラークを産生するｇａｌ発現クローンの容易な同定および単離を可能にするために、「Ｂｌｕｅ　Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．，　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を有するアガロースゲルを用いる。（このタイプの「プラークアッセイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、で配布される昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学の使用者ガイド（９〜１０頁）においても見い出され得る）。
【０２００】
　連続希釈の４日後、ウイルスを細胞に添加する。適切なインキュベーションの後、青く染色されたプラークをエッペンドルフピペットのチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、２００μｌのグレース培地を含むエッペンドルフチューブ中に再懸濁する。寒天を、短時間の遠心分離により除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を、３５ｍｍディッシュに播種されたＳｆ９細胞に感染するために用いる。４日後、これらの培養ディッシュの上清を回収し、次いでそれらを４℃で保存する。適切に挿入されたｈＥＳＳＢ　Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩを含むクローンを、この制限マッピングおよび配列決定を含むＤＮＡ分析によって同定する。これを、本明細書中でＶ−Ｔ１Ｒ−ｌｉｋｅ　ｌｉｇａｎｄ　Ｉと命名する。
【０２０１】
　Ｓｆ９細胞を、１０％熱不活化ＦＢＳを補充したグレース培地中で増殖する。細胞を、約２（約１〜約３）の感染多重度（「ＭＯＩ」）で組換えバキュロウイルスＶ−Ｔ１Ｒ−ｌｉｋｅ　ｌｉｇａｎｄ　Ｉで感染させる。６時間後、その培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたＳＦ９００　ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．，　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇから入手可能）に置き換える。４２時間後、５μＣｉの３５Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの３５Ｓ−システイン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を添加する。細胞をさらに１６時間インキュベートし、次いで細胞を遠心分離により収集し、溶解し、そして標識されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより可視化する。
【０２０２】
　（実施例３：哺乳動物細胞におけるクローニングおよび発現）
　哺乳動物細胞における、Ｔ１Ｒ様リガンドＩタンパク質遺伝子配列の一過的発現に使用されるベクターのほとんどは、ＳＶ４０複製起点を有するはずである。このことは、ウイルスＤＮＡ合成の開始に必要なＴ抗原を発現する細胞（例えば、ＣＯＳ細胞）において、高コピー数のベクターの複製を可能にする。任意の他の哺乳動物細胞株もまた、この目的に利用し得る。
【０２０３】
　代表的な哺乳動物発現ベクターは、プロモーターエレメント（ｍＲＮＡの転写の開始を媒介する）、タンパク質コード配列、ならびに転写の終結および転写物のポリアデニル化に必要なシグナルを含む。さらなるエレメントとしては、エンハンサー、ドナーによって隣接するＫｏｚａｋ配列および介在配列、ならびにＲＮＡスプライシングのためのアクセプター部位が挙げられる。非常に有効な転写を、ＳＶ４０由来の初期および後期プロモーター、レトロウイルス由来の長末端反復（ＬＴＲ）（例えば、ＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ）ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターで達成し得る。しかし、細胞シグナルもまた使用され得る（例えば、ヒトアクチンプロモーター）。本発明の実施における使用に適切な発現ベクターとしては、例えば、ｐＳＶＬおよびｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，　Ｕｐｐｓａｌａ，　Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ　３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ　３７１４６）、ならびにｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ　６７１０９）のようなベクターが挙げられる。使用し得る哺乳動物宿主細胞としては、ヒトＨｅｌａ、２８３、Ｈ９およびＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７およびＣＶ１、アフリカミドリザル細胞、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞、ならびにチャイニーズハムスター卵巣細胞が挙げられる。
【０２０４】
　あるいは、遺伝子は、染色体に取り込まれるその遺伝子を含む安定な細胞株において発現され得る。選択マーカー（例えば、ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン、ハイグロマイシン）どの同時トランスフェクションは、トランスフェクト細胞の同定および単離を可能にする。
【０２０５】
　トランスフェクトされた遺伝子はまた、増幅されて大量のコードされるタンパク質を発現し得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）は、目的の遺伝子の数百または数千ものコピーを有する細胞株を開発するのに有用なマーカーである。別の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ．　２２７：２７７−２７９（１９９１）；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１０：１６９−１７５（１９９２））。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地において増殖させ、そして最も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は染色体に取り込まれる増幅遺伝子（単数または複数）を含む。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、タンパク質の産生にしばしば使用される。
【０２０６】
　発現ベクターｐＣ１およびｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター（ＬＴＲ）（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｕｇｙ，　４３８−４４７０（１９８５年３月））およびＣＭＶ−エンハンサーのフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ　４１：５２１−５３０（１９８５））を含む。複数のクローニング部位（例えば、制限酵素切断部位ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８）は、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。ベクターはさらに、ラットプレプロインシュリン遺伝子の３’イントロン、ポリアデニル化、および終結シグナルを含む。
【０２０７】
　（実施例３（ａ）：ＣＯＳ細胞におけるクローニングおよび発現）
　発現プラスミドを、Ｔ１Ｒ様リガンドＩをコードするｃＤＮＡを発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，　Ｉｎｃ．から入手し得る）内へクローニングすることによって作製する。
【０２０８】
　発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐは以下：（Ｄｏｗｅｒ，　Ｃｏｌｏｔｔａ，　Ｆ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｔｏｄａｙ　１５：５６２（１９９４））Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の原核生物細胞における増殖に効果的なＥ．ｃｏｌｉ複製起点；（Ｇｒｅｅｎｆｅｄｅｒ，　Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７０：１３７５７（１９９５））プラスミド含有原核生物細胞の選択のためのアンピシリン耐性遺伝子；（Ｐｏｌａｎ，　Ｍ．Ｌ．ら、Ａｍ．　Ｊ．　Ｏｂｓｔｅｔ．　Ｇｙｎｅｃｏｌ．　１７０：１０００（１９９４））真核生物細胞における増殖のためのＳＶ４０複製起点；（Ｃａｒｉｎｃｉ，　Ｍｏｒａ，　Ｍ．ら、Ｐｒｏｇ．　Ｃｌｉｎ．　Ｂｉｏｌ．　Ｒｅｓ．　３４９：２０５（１９９０））ＣＭＶプロモーター、ポリリンカー、ＳＶ４０イントロン；および、ｃＤＮＡが、都合良くＣＭＶプロモーターの発現制御下におかれ、そしてポリリンカーにおける制限部位によってＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結し得るように配列されたポリアデニル化シグナルを含む。
【０２０９】
　完全Ｔ１Ｒ様リガンドＩ前駆体をコードするＤＮＡフラグメントおよびその３’末端にインフレームで融合しＨＡタグを、ベクターのポリリンカー領域にクローン化し、その結果組み換えタンパク質発現をＣＭＶプロモーターによって導かれる。ＨＡタグは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ　３７：７６７（１９８４）によって記載されるインフルエンザ血液凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する。標的タンパク質へのＨＡタグの融合は、ＨＡエピトープを認識する抗体を用いる組換えタンパク質の簡単な検出を可能にする。
【０２１０】
　プラスミド構築ストラテジーは以下のようである。
【０２１１】
　寄託されたクローンのＴ１Ｒ様リガンドＩ　ｃＤＮＡを、上記のＥ．ｃｏｌｉにおけるＴ１Ｒ様リガンドＩの発現のための発現ベクターの構築についてと同様に、都合の良い制限部位を含むプライマーを用いて増幅する。発現されたＴ１Ｒ様リガンドＩの検出、精製、および特徴づけを容易にするために、１つのプライマーは、上記のように血液凝集素タグ（「ＨＡタグ」）を含む。
【０２１２】
　当業者は、完全長Ｔ１Ｒ様リガンドＩタンパク質（約１〜約２１７アミノ酸）を、適切な５’および３’オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＣＯＳ細胞において発現し得ることを理解する。
【０２１３】
　寄託されたクローンにおける完全長Ｔ１Ｒ様リガンドＩの細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ配列を、遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。
【０２１４】
　５’プライマーは、配列５’　ＣＧＣ　ＧＧＡ　ＴＣＣ　ＧＣＣ　ＡＴＣ　ＡＴＧ　ＧＧＣ　ＡＧＣ　ＡＣＴ　ＧＴＣ　ＣＣＧ　３’（配列番号６）を有し、これは下線を付したＢａｍＨＩ部位および配列番号１のヌクレオチド８８−１０５に対応する１８ヌクレオチドを有する。
【０２１５】
　３’プライマーは、下線を付したＸｂａＩ部位、停止コドン、ヘマグルチニンＨＡタグを形成した後の９コドン、および１８ｂＰの３’コード配列を含み、以下の配列を含む：
　配列番号１の逆相補体の６０４〜６２１として、５’　ＣＧＣ　ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＴＣＡ　ＡＧＣ　ＧＴＡ　ＧＴＣ　ＴＧＧ　ＧＡＣ　ＧＴＣ　ＧＴＡ　ＴＧＧ　ＧＴＡ　ＴＣＧ　ＧＣＴ　ＡＴＴ　ＡＡＧ　ＧＴＣ　ＴＴＣ　３’（配列番号９）。
【０２１６】
　ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントおよびベクターｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐをＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、次いで連結する。連結混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＳＵＲＥへ形質転換し（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，　１１０９９　Ｎｏｒｔｈ　Ｔｏｒｒｅｙ　Ｐｉｎｅｓ　Ｒｏａｄ，　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，　ＣＡ　９２０３７より入手可能）、そして形質転換培養物を、次いでインキュベートしてアンピシリン耐性コロニーの増殖を可能にするアンピシリン培地プレートへプレーティングする。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ　−コードフラグメントの存在について制限分析およびゲルサイズ画分によって試験する。
【０２１７】
　組換えＴ１Ｒ様リガンドＩの発現のために、ＣＯＳ細胞を、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８９）に記載のＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮを用いて、上記のように発現ベクターでトランスフェクトする。細胞をベクターによるｈｕＸＡＧ−１の発現のための条件下でインキュベートする。
【０２１８】
　Ｔ１Ｒ様リガンドＩ　ＨＡ融合タンパク質の発現を、例えば、Ｈａｒｌｏｗら，　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版；　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載の方法を用いて放射標識化および免疫沈降法によって検出する。この目的を達するため、トランスフェクションの２日後に、細胞を、３５Ｓ−システインを含む培地中で８時間インキュベートすることによって標識する。細胞および培地を回収し、そして細胞を洗浄し、そしてＷｉｌｓｏｎら（上記に引用された）に記載されるように界面活性剤含有ＲＩＰＡ緩衝液：１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１％　ＮＰ−４０、０．１％　ＳＤＳ、１％　ＮＰ−４０、０．５％　ＤＯＣ、５０ｍＭ　ＴＲＩＳ、ｐＨ　７．５で溶解する。タンパク質を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体を用いて細胞溶解物および培養培地から沈降する。次いで、沈降されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびオートラジオグラフィーによって分析する。期待されるサイズの発現産物が細胞溶解物において観察され、これはネガティブコントロールにおいては観察されない。
【０２１９】
　（実施例３（ｂ）：ＣＨＯ細胞におけるクローニングおよび発現）
　ベクターｐＣ４を、Ｔ１Ｒ様リガンドＩタンパク質の発現のために使用する。プラスミドｐＣ４は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体である。このプラスミドは、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下で、マウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。これらのプラスミドでトランスフェクトされるジヒドロ葉酸活性を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞または他の細胞は、化学治療剤メトトレキサートを補充した選択培地（αマイナスＭＥＭ、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で細胞を増殖させることによって選択され得る。メトトレキサート（ＭＴＸ）に耐性である細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子の増幅は、よく考証されている（例えば、Ａｌｔ，　Ｆ．Ｗ．，　Ｋｅｌｌｅｍｓ，　Ｒ．Ｍ．，　Ｂｅｒｔｉｎｏ，　Ｊ．Ｒ．およびＳｃｈｉｍｋｅ，　Ｒ．Ｔ．，　１９７８，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２５３：１３５７−１３７０、Ｈａｍｌｉｎ，　Ｊ．Ｌ．およびＭａ，　Ｃ．１９９０，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　１０９７：１０７−１４３、Ｐａｇｅ，　Ｍ．Ｊ．およびＳｙｄｅｎｈａｍ，　Ｍ．Ａ．１９９１，　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　第９巻：６４−６８を参照のこと）。漸増濃度のＭＴＸにおける細胞増殖は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果として、標的酵素ＤＨＦＲを過剰産生することによって薬物への耐性を生じる。第二の遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子に連結される場合、通常、同時増幅され、そして過剰発現される。遺伝子の１，０００を越えるコピーを有する細胞株を開発することは最先端である。続いて、メトトレキサートが取り除かれる場合、細胞株は、染色体（単数または複数）に取り込まれる増幅遺伝子を含む。
【０２２０】
　プラスミドｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルス（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌｏｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ．，　１９８５年３月　４３８−４４７０）の長末端反復（ＬＴＲ）の目的の強力なプロモーターの遺伝子、およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ　４１：５２１−５３０，１９８５）の最初期遺伝子のエンハンサーから単離されたフラグメントの遺伝子の発現を含む。プロモーターの下流は、続く遺伝子の取り込みを可能にするＢａｍＨＩ、ＰｖｕＩＩおよびＮｒｕＩの単一の制限酵素切断部位である。これらのクローニング部位の後ろに、プラスミドは、３つ全てのリーディングフレーム中の転写ストップコドン、続いてラットプレプロインシュリン遺伝子の３’イントロンおよびポリアデニル化部位を含む。他の高効率プロモーターもまた、発現のために使用し得る（例えば、ヒトβアクチンプロモーター、ＳＶ４０初期もしくは後期プロモーター、または他のレトロウイルス（例えば、ＨＩＶおよびＨＴＬＶＩ）からの長末端反復）。ｍＲＮＡのポリアデニル化のために、他のシグナル（例えば、ヒト成長ホルモンまたはグロビン遺伝子由来）も同様に使用し得る。
【０２２１】
　染色体に挿入された目的の遺伝子を有する安定な細胞株もまた、選択マーカー（例えば、ｇｐｔ、Ｇ４１８、またはハイグロマイシン）での同時トランスフェクトに基づいて選択し得る。開始における２つ以上の選択マーカー（例えば、Ｇ４１８およびメトトレキサート）を使用することが有用である。
【０２２２】
　プラスミドｐＣ４を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、次いでウシ小腸ホスファターゼを用いて、当分野で公知の手順によって脱リン酸化する。次いで、ベクターを、１％アガロースゲルから単離する。
【０２２３】
　Ｔ１Ｒ様リガンドＩタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、Ｔ１Ｒ様リガンドＩタンパク質のアミノ末端配列および遺伝子のベクター配列３’に特異的なＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。クローニングを容易にするための制限部位を含むさらなるヌクレオチドを、それぞれ５’および３’配列に付加する。
【０２２４】
　全長Ｔ１Ｒ様リガンドＩをコードするｃＤＮＡ配列を、遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。５’プライマーは、配列５’　ＣＧＣ　ＧＧＡ　ＴＣＣ　ＧＣＣ　ＡＴＣ　ＡＴＧ　ＧＧＣ　ＡＧＣ　ＡＣＴ　ＧＴＣ　ＣＣＧ　３’（配列番号６）を有し、これは、下線を付したＢａｍＨＩ制限酵素部位、続いて図１（配列番号１）のＴ１Ｒ様リガンドＩの配列の１８ヌクレオチド（ヌクレオチド８８〜１０５）を含む。発現ベクター（以下に記載）に挿入した、ヒトＴ１Ｒ様リガンドＩをコードする増幅したフラグメントの５’末端は、有効なシグナルペプチドを提供する。真核生物細胞における翻訳開始のために十分なシグナル（Ｋｏｚａｋ，　Ｍ．，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　１９６：９４７−９５０（１９８７）によって記載される）を、構築物のベクター部分に適切に配置する。
【０２２５】
　３’プライマーは、配列５’　ＧＣＧ　ＧＧＴ　ＡＣＣ　ＴＣＡ　ＣＴＧ　ＣＴＣ　ＣＡＧ　ＣＣＴ　ＧＧＧ　ＧＣ　３’（配列番号９）を有し、これは、下線を付したＡｓｐ７１８制限、続いて停止コドンおよび図１（配列番号１）のＴ１Ｒ様リガンドＩコード配列のヌクレオチド７７１〜７８７と逆ならびに相補的な１７ヌクレオチドを含む。制限部位は、ＣＨＯ発現ベクターＰＣ４における制限酵素部位に都合がよい。
【０２２６】
　全長Ｔ１Ｒ様リガンドＩの細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ配列を、遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。
【０２２７】
　５’プライマーは、配列５’　ＣＧＣ　ＧＧＡ　ＴＣＣ　ＧＣＣ　ＡＴＣ　ＡＴＧ　ＧＧＣ　ＡＧＣ　ＡＣＴ　ＧＴＣ　ＣＣＧ　３’（配列番号６）を有し、これは、下線を付したＢａｍＨＩ制限酵素部位、および図１のＴ１Ｒ様リガンドＩの配列の１８ヌクレオチド（ヌクレオチド８８〜１０５）（配列番号１）を含む。発現ベクター（以下に記載）に挿入した、Ｔ１Ｒ様リガンドＩをコードする増幅したフラグメントの５’末端は、有効なシグナルペプチドを提供する。真核生物細胞における翻訳開始のために有効なシグナル（Ｋｏｚａｋ，　Ｍ．，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　１９６：９４７−９５０（１９８７）によって記載される）を、構築物のベクター部分に適切に配置する。
【０２２８】
　３’プライマーは、配列５’　ＣＧＣ　ＧＧＴ　ＡＣＣ　ＴＣＡ　ＴＣＧ　ＧＣＴ　ＡＴＴ　ＡＡＧ　ＧＴＣ　ＴＴＣ　３’（配列番号８）を有し、これは、下線を付したＡｓｐ７１８制限、続いて停止コドンおよび図１（配列番号１）のＴ１Ｒ様リガンドＩコード配列のヌクレオチド６０４〜６２１と逆および相補的な１８ヌクレオチドを含む。
【０２２９】
　増幅したＴ１Ｒ様リガンドＩ　ＤＮＡを、ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で消化する。ベクターｐＣ４をＢａｍＨＩで消化し、次いで消化したＤＮＡをともに連結する。次いで、単離されたフラグメントおよび脱リン酸化ベクターをＴ４　ＤＮＡリガーゼで連結する。Ｔ１Ｒ様リガンドＩタンパク質ＤＮＡのＢａｍＨＩで制限されたベクターへの挿入は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩタンパク質コード領域をベクターのプロモーターの下流に配置し、そしてベクターのプロモーターに作動可能に連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１細胞を形質転換し、そして制限酵素ＢａｍＨＩを用いて正しい配向に挿入されたプラスミドｐＣ４を含む細菌を同定する。連結混合物を、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：　Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載されるような標準的な手順を用いて、コンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換する。形質転換培養物を、アンピシリン培地プレートにプレーティングし、次いでインキュベートして、アンピシリン耐性コロニーの増殖を可能にする。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、そしてＴ１Ｒ様リガンドＩコードフラグメントの配列について、制限分析およびゲル測定することによって試験する。挿入した遺伝子の配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認する。
【０２３０】
　（ＣＨＯ−ＤＨＦＲ細胞のトランスフェクション）
　活性なＤＨＦＲ酵素を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トランスフェクションのために使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ４を、リポフェクチン（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）を用いて、０．５μｇのプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏとともに同時トランスフェクトする。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは優性選択マーカー（Ｇ４１８を含む一群の抗生物質への耐性を与える酵素をコードするＴｎ５由来の遺伝子ｎｅｏ）を含む。細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、細胞をトリプシン処理し、ハイブリドーマクローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種し、そして約１０〜１４日培養する。その後、単一のクローンをトリプシン処理し、次いで異なる濃度のメトトレキサート（２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ）を用いて、６ウェルペトリ皿または１０ｍｌフラスコに播種する。次いで、最高濃度のメトトレキサートで増殖するクローンを、さらに高濃度のメトトレキサート（５００ｎＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ）含む新たな６ウェルプレートに移す。同じ手順を、クローンが１００μＭの濃度で増殖するまで繰り返す。
【０２３１】
　所望の遺伝子産物の発現を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析によって分析する。Ｔ１Ｒ様リガンドＩ融合タンパク質の発現を、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版；Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載の方法を用いて、放射性標識および免疫沈降によって検出する。この目的のために、トランスフェクションの２日後、細胞を、３５Ｓ−システインを含む培地中で８時間のインキュベーションによって標識する。細胞および培地を回収し、そして細胞を洗浄し、そしてＷｉｌｓｏｎら（前出）によって記載されるように、界面活性剤含有ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、０．５％ＤＯＣ、５０ｍＭ　ＴＲＩＳ（ｐＨ７．５））で溶解させる。タンパク質を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体を用いて、細胞溶解物および細胞培地から沈殿させる。次いで、沈殿したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびオートラジオグラフィーによって分析する。予想したサイズの発現産物を細胞溶解物において見いだし、これはネガティブコントロールにおいては見いだされない。
【０２３２】
　（実施例４：Ｔ１Ｒ様リガンドＩ遺伝子発現の組織分布）
　ノーザンブロット分析を行って、とりわけＳａｍｂｒｏｏｋら（上記に引用される）によって記載される方法を用いて、ヒト組織におけるＴ１Ｒ様リガンドＩ遺伝子の発現レベルの試験を行った。本発明の完全Ｔ１Ｒ様リガンドＩヌクレオチド配列（配列番号１）を含むｃＤＮＡプローブ（配列番号１）を、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅＴＭＤＮＡ標識系（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、製造業者の説明書に従って、３２Ｐで標識した。標識後、プローブを、ＣＨＲＯＭＡ　ＳＰＩＮ−１００ＴＭカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　Ｉｎｃ．）を用いて、製造業者のプロトコル番号ＰＴ１２００−１に従って、精製した。次いで、精製した標識化プローブを使用して、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ遺伝子の発現について、種々のヒト組織を試験した。
【０２３３】
　種々のヒト組織（Ｈ）およびヒト免疫系組織（ＩＭ）を含む多組織ノーザン（ＭＴＮ）ブロットをＣｌｏｎｔｅｃｈから入手し、そしてＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂＴＭ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、製造業者のプロトコル番号ＰＴ１１９０−１に従って、標識化プローブで試験する。ハイブリダイゼーションおよび洗浄に続いて、ブロットを取り付け、そして−７０℃にて一晩フィルムに暴露し、そして標準的な手順に従ってフィルムを現像した。約２．０ｋｂのＴ１Ｒ様リガンドＩシグナルを、膵臓、リンパ腺、胸腺、骨髄、胎児肝臓、および末梢性白血球からのｍＲＮＡを含むレーンにおいて検出した。非免疫組織からのｍＲＮＡを含むレーンではシグナルは検出されなかった。
【０２３４】
　約２．０ｋｂのＴ１Ｒ様リガンドＩシグナルを、膵臓、リンパ腺、胸腺、骨髄、胎児肝臓、および末梢性白血球からのｍＲＮＡを含むレーンにおいて検出した。非免疫組織からのｍＲＮＡを含むレーンではシグナルは検出されなかった。
【０２３５】
　本発明が、前述の説明および実施例に詳細に記載される以外に実施され得ることは明白である。
【０２３６】
　本発明の多数の改変および変異が、上記の教示に照らして可能であり、それゆえ添付の請求項の範囲内である。
【０２３７】
　本明細書中に参考として援用される全ての刊行物の開示の全体が、本明細書で参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０２３８】
【図１Ａ】図１は、ＡＴＣＣ受託番号９７６５６に含まれるｃＤＮＡクローンを配列決定することによって決定されたＴ１Ｒ様リガンドＩタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。約１〜約２７のアミノ酸は、シグナルペプチドを示し（第１の下線を付した配列）；約２８〜約１７８のアミノ酸は細胞外ドメインを示し（第１と第２の下線を付した配列の間の配列）；約１７９〜約２０１のアミノ酸は膜貫通ドメインを示し（第２の下線を付した配列）；および約２０１〜約２１７のアミノ酸は細胞内ドメインを示す（残りの配列）。
【図１Ｂ】図１は、ＡＴＣＣ受託番号９７６５６に含まれるｃＤＮＡクローンを配列決定することによって決定されたＴ１Ｒ様リガンドＩタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。約１〜約２７のアミノ酸は、シグナルペプチドを示し（第１の下線を付した配列）；約２８〜約１７８のアミノ酸は細胞外ドメインを示し（第１と第２の下線を付した配列の間の配列）；約１７９〜約２０１のアミノ酸は膜貫通ドメインを示し（第２の下線を付した配列）；および約２０１〜約２１７のアミノ酸は細胞内ドメインを示す（残りの配列）。
【図２】図２は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩのアミノ酸配列とＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ４１８０４（配列番号３）のタンパク質配列との間の類似性の領域を示し、全体で３３％同一性を示す。
【図３】図３は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩアミノ酸配列の分析を提供する。α、β、ターンおよびコイル領域；親水性および疎水性領域；両親媒性領域；可動性領域；抗原性指数ならびに表面確率が示される。
【０２３９】
　（配列表）
【０２４０】
【表２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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