(57)【要約】【課題】免疫化学的方法により、簡便かつ正確にＤＮＡ鎖の５−メチルシトシンを測定する方法を提供する。【解決手段】５−メチルシトシンと特異的に結合する抗体を１本鎖ＤＮＡと接触させ、１価結合した抗体をＤＮＡ鎖から分離し、２価結合した抗体量を測定することによって、５−メチルシトシンの密集領域を特定する。【選択図】      図１
2004347508.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５−メチルシトシンと特異的に結合する抗体を１本鎖ＤＮＡと接触させ、ＤＮＡ鎖に結合した抗体量を測定することを特徴とするＤＮＡメチル化率の測定方法。
【請求項２】
１価結合した抗体をＤＮＡ鎖から分離し、２価結合した抗体量を測定することによって、５−メチルシトシンの密集領域を特定する請求項１の方法。
【請求項３】
１本鎖ＤＮＡの任意領域以外を２本鎖とし、１本鎖の領域についてＤＮＡメチル化率を測定する請求項１または２の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、ＤＮＡメチル化率の測定方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、癌細胞の悪性度の評価や、あるいは  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞の分化状態の評価等に有用なＤＮＡメチル化の測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
多細胞生物における細胞の分化や機能発現には、遺伝子情報が正しく発現されることが不可欠であるが、その発現制御には、転写調節因子のネットワークだけでなく、ＤＮＡのメチル化やクロマチン動態の変化といったエピジェネティック機構の関与が重要視されている。特に、ゲノムＤＮＡ中のシトシンのメチル化は、遺伝子発現を負に制御していることが知られている。また、ゲノム上でのメチル化のパターンの差異が、ゲノムインプリンティングやＸ染色体不活性化現象との関連を示すことや、さらには癌やＩＣＦ（ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，  ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｆａｃｉａｌ  ａｎｏｍａｌｉｅｓ）症候群、Ｒｅｔｔ症候群、脆弱Ｘ症候群などの疾患にも関係することが報告されている（例えば非特許文献１参照）。
【０００３】
ＤＮＡ鎖のメチルシトシンを測定する方法としては、メチル化感受性の制限酵素による切断片を比較する方法、ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ法、ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲ法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる方法等が知られている（非特許文献１参照）。また、特許文献１にはメチル化の対象となるＣＧ連続配列（ＣｐＧアイランド）を含むＤＮＡ鎖を特異的にＰＣＲ増幅する方法が、特許文献２にはメチルシトシンを含むＤＮＡ鎖に特異的にハイブリダイズする標識ＤＮＡ断片を用いる方法が開示されている。
【０００４】
【特許文献１】
特表平１１−５１１７７６号公報
【特許文献２】
特表２００２−５３５９９８号公報
【非特許文献１】
波平昌一  他  実験医学  ２０（７）：１−１９−１０２４，  ２００２
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
前記のとおり、ＤＮＡ鎖のメチル化は、癌をはじめとする様々な疾患の重要な指標であり、また遺伝子発現の制御に関係することから、例えば細胞の分化の程度を把握するための指標ともなり、これまでにその測定方法が様々に検討されている。
【０００６】
一方、例えば医療の現場においてＤＮＡメチル化を測定する場合には、迅速かつ正確に判定結果が得られることが求められている。しかしながら、このような観点からは従来の各方法は、必ずしも好ましい方法ではなかった。例えば、制限酵素を用いる方法の場合にはサザンブロッティング等による断片の比較手続が必須であり、ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ法や特許文献１の方法ではＰＣＲ法とその産物のＤＮＡ配列分析等の面倒な作業を必要とする。特に、従来の方法では、被験サンプルとしてのＤＮＡ鎖に対して必要な処理を不可欠とするため、判定結果を得るまでに多大な時間と労力を要するという問題点を有していた。
【０００７】
この出願の発明は以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、簡便かつ正確にＤＮＡメチル化の程度を測定する方法を提供することを課題としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決する発明として、５−メチルシトシンと特異的に結合する抗体を１本鎖ＤＮＡと接触させ、ＤＮＡ鎖に結合した抗体量を測定することを特徴とするＤＮＡメチル化率の測定方法を提供する。
【０００９】
またこの発明の方法においては、１価結合した抗体をＤＮＡ鎖から分離し、２価結合した抗体量を測定することによって、５−メチルシトシンの密集領域を特定することを好ましい態様の一つとしている。
【００１０】
さらにこの発明の方法においては、１本鎖ＤＮＡの任意領域以外を２本鎖とし、１本鎖の領域についてＤＮＡメチル化率を測定することを別の好ましい態様としている。
【００１１】
なお、この発明において「ＤＮＡ鎖」とは、プリンまたはピリミジンが糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）がホスホジエステル結合した分子を言い、特にゲノムＤＮＡ鎖を意味する。また、この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９；  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ，  １９９５等に記載されている。
【００１２】
以下、各発明について、実施形態を詳しく説明する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
この出願の発明は、前記のとおり、５−メチルシトシンと特異的に結合する抗体を１本鎖ＤＮＡと接触させ、ＤＮＡ鎖に結合した抗体量を測定し、この抗体量によってＤＮＡメチル化率を決定することを特徴としている。
【００１４】
５−メチルシトシンと特異的に結合する抗体（以下、「抗５−メチルシトシン抗体」と記載することがある）は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、５−メチルシトシンに結合することができる全体分子、およびＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片等であるが、特に、モノクローナル抗体の全体分子であることが好ましい。モノクローナル抗５−メチルシトシン抗体は、５−メチルシトシンを免疫原として、公知のモノクローナル抗体作製法（例えば、「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、１９９０年；  ”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ”  Ｊａｍｅｓ  Ｗ．  Ｇｏｄｉｎｇ，  ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９６）に従い作製することができる。また、５−メチルシトシンを特異的に認識するモノクローナル抗体は、文献（例えば、Ｒｅｙｎａｕｄ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ，  １９９２  Ｊａｎ  ３１；６１（３）：２５５−６２；  Ｍｉｚｕｇａｋｉ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｌ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ．  １９９６  Ｄｅｃ；１９（１２）：１５３７−４０；  Ｐｏｄｅｓｔａ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  １９９３  Ｊｕｎ；２５（６）：９２９−３３）等が知られており、これらを使用することもできる。
【００１５】
ＤＮＡ鎖に結合した（すなわち、ＤＮＡ鎖中の５−メチルシトシンに結合した）抗体量の測定は、例えば、抗５−メチルシトシン抗体を標識化し、この標識シグナル量を測定することによって行うことができる。また、抗体に結合する２次抗体（例えば抗ＩｇＧ抗体）を標識化し、ＤＮＡ鎖に結合した抗５−メチルシトシン抗体（１次抗体）に２次抗体を結合させ、その標識シグナルを測定する方法（いわゆる「サンドイッチ法」）によって行うこともできる。標識は、酵素、放射性同位体または蛍光色素を使用することができる。酵素は、ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ｎｕｍｂｅｒが大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常のＥＩＡに用いられる酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。放射性同位体としては、１２５Ｉや３Ｈ等の通常のＲＩＡで用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルオレッセンスイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。また、このような標識シグナルの測定は、標識として酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。放射生同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。また、蛍光色素を用いる場合には、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。
【００１６】
この発明の方法は、液相系で行うこともでき、固相系で行うこともできるが、安定した測定値を得るためには、固相系で行うことが好ましい。すなわち、被験試料であるＤＮＡ鎖を固相に固定化し、この固定化ＤＮＡ鎖に抗５−メチルシトシン抗体を反応させる。ＤＮＡ鎖（特にゲノムＤＮＡ）を固相に固定化するには、例えば、固相に２本鎖リンカーＤＮＡを固定化し、このリンカーの端部と一致させて制限酵素切断した２本鎖ゲノムＤＮＡをリガーゼを用いて連結させる方法等を採用することができる。リンカーＤＮＡを固相に固定化するには、リンカーＤＮＡの一端を公知の方法によりビオチン化し、これをアビジンコートした固相に固定化することによって行うことができる。あるいは、官能基を導入したリンカーＤＮＡを合成し、表面処理した固相担体表面にリンカーＤＮＡを点着し、共有結合させる方法（例えば、Ｌａｍｔｕｒｅ，  Ｊ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：２１２１−２１２５，  １９９４；  Ｇｕｏ，  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：５４５６−５４６５，  １９９４）を採用することもできる。さらに、以上の方法により固定化した２本鎖ＤＮＡは、例えば塩酸溶液等によって変性処理することによって１本鎖ＤＮＡとすることができる。
【００１７】
この発明の方法は、また、１価結合した抗５−メチルシトシン抗体をＤＮＡ鎖から分離し、２価結合した抗体量を測定することによって、５−メチルシトシンの密集領域を特定することを好ましい態様の一つとしている。すなわち、抗体（ＩｇＧ）分子は、１本のＦｃ部分と２本のＦａｂ部分とからなっており、対象のエピトーブに対してＦａｂ部分の先端が結合する。従って、図１に示したように、ＤＮＡ鎖の５−メチルシトシンが１個の場合には、抗５−メチルシトシン抗体の１本のＦａｂ部分が結合し（１価結合：図１Ｂ）、一方、適当な距離に２個の５−メチルシトシンが存在する場合には、２本のＦａｂがそれぞれの５−メチルシトシンに結合する（２価結合：図１Ａ）。抗体の２価結合は、１価結合に比べて約１０３（Ｍ−１）倍も強い親和性を持つことが知られているため、１価結合した抗体を除去し、２価結合した抗体を測定することによって、５−メチルシトシンが密集する領域を高精度で検出することができる。
【００１８】
ここで抗体分子とＤＮＡ分子の分子サイズについて論ずる。ＩｇＧ分子構造はおよそアルファベットのＴに似た構造を呈しており、２つのＦａｂの両端間、すなわち２つの抗原結合部位の距離はおよそ１４．２ｎｍであることが明らかとなっている（Ｓａｒｍａ  Ｖ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，  ｖｏｌ．２４６，ｐｐ３７５３−３７５９，  １９７１）。また、ＷａｔｓｏｎとＣｒｉｃｋが提唱したＤＮＡの２重らせん構造のＢ型ＤＮＡでは、１塩基対ごとに０．３４ｎｍの間隔で並び、ＤＮＡのらせんが１回転する間隔であるピッチは３．４ｎｍである。これから換算すると、ＩｇＧ分子に存在する２カ所の抗原結合部位の約１４ｎｍは、塩基数に換算すると約４２塩基の距離に相当する。従って、抗５−メチルシトシン抗体は、同一ＤＮＡ上に存在する異なる２つの５−メチルシトシン間の距離がおよそ４０塩基以内に存在すれば、ＤＮＡに対して２価結合することができる。
【００１９】
後記実施例４、５に示したように、１本鎖ＤＮＡ中の５−メチルシトシン含有率が例えばおよそ４．４％に上った場合には、抗５−メチルシトシン抗体は複数個の５−メチルシトシンを含む１本鎖ＤＮＡに２価結合できるようになり、それは、同一１本鎖ＤＮＡ上の異なる２つの５−メチルシトシン分子間の平均距離が約１４ｎｍ以下になると推察される。
【００２０】
この原理を利用して、抗５−メチルシトシン抗体をｎａｎｏ−ｓｃａｌｅ−ｒｏｄ、すなわちおよそ１４ｎｍを測定する「ナノものさし」として利用することができる。具体的には、同一１本鎖ＤＮＡ分子上の異なる２つの５−メチルシトシン分子間の距離を測る場合、抗体（ＩｇＧ）が１価結合しかできない場合には５−メチルシトシン分子間の距離はおよそ１４ｎｍ以上で、２価結合できる場合には１４ｎｍ以内の距離にあると言える。これを利用して、ＤＮＡ中の５−メチルシトシン含有率を求めることが可能である。
【００２１】
なお、１価結合抗体を除去するには、例えば、アルカリ性または酸性の緩衝液、高塩濃度の緩衝液を作用させる方法、抗原（５−メチルシトシン）の過剰量を共存させて拮抗させる方法、あるいは溶液温度を上昇させる方法等を採用することができる。またこの発明の方法においては、抗５−メチルシトシン抗体を反応させ、１価結合および２価結合のそれぞれの抗体をＤＮＡ鎖に結合させた後、上記の方法によって１価結合抗体を除去（解離）させてもよく、あるいは、上記の緩衝液等を用いて、２価結合の抗体だけをＤＮＡ鎖に結合させるようにしてもよい。
【００２２】
さらにこの発明の方法においては、１本鎖ＤＮＡの任意領域以外を２本鎖とし、１本鎖の領域についてＤＮＡメチル化率を測定することを別の好ましい態様としている（図３参照）。この方法は、特にＤＮＡのメチル化が重要な意味をもつ領域（例えば遺伝子の発現制御領域等）のみを対象として５−メチルシトシンの存在量やその密度を測定する場合に特に好ましい。測定対象領域以外を２本鎖とするには、２本鎖とする領域のＤＮＡ配列に対して相補的な１本鎖オリゴヌクレオチド断片をアニールさせる方法等を採用することができる。
【００２３】
以下、実施例を示してこの出願の発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００２４】
【実施例】
実施例１：抗体の作成
５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ−ＫＬＨ（ＫＬＨ＝キーホールリンペットヘモシアニン）コンジュゲート（１００ｍｇ）をＦＣＡ（フロイント・コンプリート・アジュバント）と共にマウス足掌に投与し、９日目にリンパ節を取り、マウスミエローマ細胞（ＳＰ２／０）と融合させた。得られた融合細胞を９６穴培養プレート３枚に撒き、常法に従ってＨＡＴ培地を用いたハイブリドーマの選択的育成を行った。培養開始から約１０日から２週間後に、育成してきたハイブリドーマの培養上精について抗体活性をスクリーニングした。具体的には、抗原［５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅをＢＳＡ（牛血清アルブミン）に結合させた５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ−ＢＳＡコンジュゲート］を１０ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに溶解し、これを９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートにコーティングし、その後、ＢＳＡで常法に従ってブロッキングした後、これに前記ハイブリドーマの培養上清を反応させ、抗体反応陽性を呈したハイブリドーマを取得した。さらに、ｃｙｔｉｄｉｎｅをＢＳＡに結合させたｃｙｔｉｄｉｎｅ−ＢＳＡコンジュゲートに対する抗体反応性も同様に測定し、ｃｙｔｉｄｉｎｅ−ＢＳＡに対して交差性の見られない、あるいは低い抗体を産生するハイブリドーマを選択し、最終的にこのハイブリドーマから常法に従い、抗５−メチルシトシン抗体を得た。
実施例２：抗体の特異性の検討（１）
実施例１で作製した抗５−メチルシトシン抗体の反応特異性を調べるため、以下の実験を行った。
【００２５】
マウスｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｋｉｎａｓｅ（ＧｅｎＢａｎｋ／Ｍ９５４０８）のｃＤＮＡ塩基配列のうち、１９６６番目から２１９０番目の塩基にあたる２２５塩基のＤＮＡ断片（図３、配列番号１）をＰＣＲ法により増幅した。この時、ＰＣＲ用センス鎖プライマーは、５’位をビオチン化したオリゴＤＮＡを使用した。鋳型ＤＮＡにはマウス脳ｃＤＮＡを用い、以下の条件でＰＣＲを行った。
【００２６】
なお、ＰＣＲ産物である２本鎖ＤＮＡのセンス鎖には５０塩基のシトシン塩基が存在するが、ＰＣＲプライマー部分を除く４６塩基のうちの２０塩基のシトシンがランダムに５−メチルシトシンに置換されるように（図３参照）、ＰＣＲ反応溶液中に５−ｍｅｔｈｙｌ−２’−ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ−５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  （５ｍ−ｄＣＴＰ）を混入させた。具体的には、下記のデオキシヌクレオチド・ストックＡ液とストックＢ液を２６対２０の比率で混合した溶液を用いてＰＣＲ反応を行った。
ＰＣＲ用プライマー：
センスプライマー：５’−Ｂｉｏｔｉｎ−ＣＧＴＧＡＡＧＣＣＴＴＴＴＣＡＡＧＧＡＧ−３’（配列番号２）
アンチセンスプライマー：５’−ＴＣＣＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＧＴＴＣＴＴＣ−３’（配列番号３）
使用酵素：
Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ロッシュ・ダイアグノスティクス社製）
デオキシヌクレオチド：
ストックＡ液（０．５ｍＭ  ｄＡＴＰ，  ０．５ｍＭ  ｄＴＴＰ，  ０．５ｍＭ  ｄＧＴＰ，  ０．５ｍＭ  ｄＣＴＰ）
ストックＢ液（０．５ｍＭ  ｄＡＴＰ，  ０．５ｍＭ  ｄＴＴＰ，  ０．５ｍＭ  ｄＧＴＰ，  ０．５ｍＭ  ５ｍ−ｄＣＴＰ）
上記デオキシヌクレオチド・ストック溶液は、ＰＣＲ反応液５０μｌ中に、Ａ液とＢ液の合計が５μｌになるように添加した。それぞれの割合は作製するＰＣＲ産物にどれだけの割合で５−メチルシトシンを取り込ませるかによって任意に設定できる。
反応条件：
（１）９４．５，  ２ｍｉｎ  ｘ  １サイクル
（２）［９４．５，  ３０ｓｅｃ／５８℃，  ３０ｓｅｃ／７２℃，  ４０ｓｅｃ  ］  ｘ  ２８サイクル
（３）７２℃，  ８ｍｉｎ  ｘ  １サイクル
ＰＣＲ反応はサーマルサイクラーＭＰ（宝酒造社）を用いて行った。
【００２７】
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ産物から常法に従ってＤＮＡを精製し、アビジンコートした９６穴マイクロタイタープレートに固定化した。次いで、この２本鎖ＤＮＡを、５０ｍＭ塩酸で２分間処理して１本鎖化した。この処理後にウェルをＰＢＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡで数回洗浄して、アビジンに捕獲された１本鎖ＤＮＡのみをウェルに固定化した。
【００２８】
この固定化した１本鎖ＤＮＡに対して、実施例１で作製した抗５−メチルシトシン抗体（１次抗体）と、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（２次抗体）を用いて、常法に従いＥＬＩＳＡを行った。ただし、マイクロタイタープレートの通常の洗浄は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０  を含む緩衝液で行い、基質にはパラニトロフェニルリン酸（シグマ社，Ｎ−１８９１）を用い、基質と反応させてから一定時間後に４０５ｎｍの吸光度を測定した。
【００２９】
ウェル上に固定化した１本鎖ＤＮＡ中に含まれる５−メチルシトシン含量を任意に変え、その時の抗５−メチルシトシン抗体の反応性を検討した。そのＥＬＩＳＡ測定結果を図４に示す。
【００３０】
図４に示したとおり、抗５−メチルシトシン抗体はウェル上に固定化したＤＮＡ中の５−メチルシトシン含量が増加するに従い、抗体結合性が増加した。塩酸処理により１本鎖化せずに２本鎖のままウェル上に固定化した場合、その２本鎖ＤＮＡは合計で約４３個の５−メチルシトシンを含む２本鎖ＤＮＡとなるが、この２本鎖ＤＮＡに抗５−メチルシトシン抗体は結合しなかった。すなわち、抗５−メチルシトシン抗体は、５−メチルシトシンを含む２本鎖ＤＮＡには結合せず、５−メチルシトシンを含む１本鎖ＤＮＡにのみ特異的に結合することが確認された。
実施例３：抗体の特異性の検討（２）
２０個の５−メチルシトシンをランダムに有するＤＮＡ鎖を対象とし、抗５−メチルシトシン抗体（１次抗体）の反応後、異なる濃度のＮａＣｌを含むウェル洗浄緩衝液で１０分間処理することを除き、実施例２と同様の方法によりＥＬＩＳＡを実施した。また、１次抗体反応後に０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む通常のウェル洗浄に使用する緩衝液［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０］で１０分間処理したものを比較対照（１００％）とした。
【００３１】
結果は図５に示したとおりである。ＮａＣｌの濃度に依存して、抗５−メチルシトシン抗体のメチルシトシンへの結合が阻害されるが、０．５から１ＭのＮａＣｌ処理（１０分）でも抗原抗体結合がある程度保持される事が確認された。
実施例４：抗体の特異性の検討（３）
９６穴マイクロタイタープレートに固定化する１本鎖ＤＮＡあたりに含まれる５−メチルシトシン含量を変化させた場合の、ＮａＣｌ処理に対する感受性を測定した。すなわち、１次抗体結合後、０．５Ｎ  ＮａＣｌを含むウェル洗浄緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）／０．５Ｍ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）でウェルを１０分間処理することを除き、実施例３と同様に実施した。
【００３２】
結果は図６に示したとおりである。なお、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）／０．５Ｍ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を用いた処理の代わりに、通常のウェル洗浄緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で同様に１０分間処理したものを比較対照とした。
【００３３】
図６にも示したとおり、抗５−メチルシトシン抗体は、９６穴マイクロタイタープレートのウェルに固定化してある１本鎖ＤＮＡ（２２５塩基）中に平均４個の５−メチルシトシンが含まれる場合には、０．５Ｍ  ＮａＣｌ処理で抗原抗体反応は解離しやすいが、ウェル上に固定化された１本鎖ＤＮＡ（２２５塩基）中に平均１０個の５−メチルシトシンが存在すると、抗原に対する抗体の結合性は安定化し、０．５Ｍ  ＮａＣｌ洗浄に対する抵抗性が急に増加することが確認された。
実施例５：抗体の特異性の検討（４）
実施例１で作成した抗５−メチルシトシン抗体はマウスＩｇＧ２ａ、κ鎖の抗体であるが、この抗体のＦａｂフラグメントを作製し、ＦａｂフラグメントとＩｇＧ全体分子のＮａＣｌ処理に対する結合抵抗性を比較検討した。ＥＬＩＳＡプロトコールは実施例４に従った。
【００３４】
結果は図７に示したとおりである。一般的に、抗原との結合部位を２カ所持つＩｇＧ分子と、結合部位が１カ所のＦａｂフラグメントとでは、抗原と抗体のアフィニティー（平衡定数：Ｍ−１）はおよそ１０００倍の開きがあり、抗原と２価結合できるＩｇＧ分子の方がより強い親和性を持つ。図７から明らかなように、抗５−メチルシトシン抗体のＩｇＧ分子は、このＩｇＧから派生したＦａｂ分子より高塩濃度（ＮａＣｌ）処理に対する抵抗性が強い。すなわち、同じＮａＣｌ濃度で比較すると、ＦａｂフラグメントはＩｇＧ分子より抗原から早く解離することが確認された。
【００３５】
以上の結果は、実施例４の結果と併せて、以下のとおり考察される。実施例４では、１本鎖ＤＮＡ中の５−メチルシトシン含有率がおよそ１．８％の場合には高濃度のＮａＣｌ（ここでは０．５ＭのＮａＣｌ）による処理で、抗原抗体反応の大部分が解離するが、１本鎖ＤＮＡ中の５−メチルシトシン含有率がおよそ４．４％に上った場合には高濃度のＮａＣｌ処理によっても、抗原抗体結合を維持するＩｇＧ分子の割合が急に増加した。
【００３６】
これはすなわち、実施例５のＦａｂフラグメントを用いた試験結果からも明らかなように、１本鎖ＤＮＡ中の５−メチルシトシン含有率がＤＮＡ分子の特定領域内に置いて約１．８％から約４．４％に移行することによって、抗５−メチルシトシン抗体（ＩｇＧ分子）が１価結合から２価結合に移行することを意味している。言い換えれば、抗原（５−メチルシトシン）が一定密度以上存在することによって、抗５−メチルシトシン抗体１分子（ＩｇＧ）が同一ＤＮＡ分子上に存在する複数個の５−メチルシトシン塩基に２価結合できるようになることを意味している。
実施例６：特定領域の５−メチルシトシン含量の測定例
抗５−メチルシトシン抗体は２本鎖ＤＮＡと反応しないことを利用し、２本鎖ＤＮＡ中の特定の領域を限定的に１本鎖化し、この１本鎖を測定対象領域として５−メチルシトシン含量を測定した。
【００３７】
実施例２の方法に従い、図３（配列番号１）に塩基配列を示した２本鎖ＤＮＡのセンス鎖ＤＮＡ中に２０塩基の５−メチルシトシンを含むようにＰＣＲ法で２本鎖ＤＮＡを合成した。なお、ＰＣＲプライマーは、実施例２と同一とした。
【００３８】
次に、変性用緩衝液［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．１）／５０ｍＭ  ＫＣｌ／１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２］に２本鎖ＤＮＡ約５００ｎｇと、５０ｐｍｏｌｅの合成オリゴＤＮＡ（図８の３種類：それぞれ配列番号４、５、６）を加えて全量５０μｌとし、これをＰＣＲ用チューブ（２００μｌ容量）に入れ、ＰＣＲ用サーマルサイクラーにセットした。この反応液を９８℃、２分間の変性処理後、直ちに６５℃、３０分の処理を行い、ＤＮＡの再会合を誘導した。これにより、２本鎖ＤＮＡの一部の領域が、加えた合成オリゴＤＮＡインサートの妨害より、限定した領域において１本鎖化した状態で安定する。すなわち合成オリゴＤＮＡインサートが２本鎖ＤＮＡにサンドイッチされた状態で安定化する。得られたＰＣＲ産物を、アビジンコートした９６穴マイクロタイタープレートの基質上に、オリゴインサートがサンドイッチされた状態のまま固定化した。ここでは前記のＰＣＲチューブ内の全反応溶液５０μｌのうち、５μｌを９６穴マイクロタイタープレートの１ウェルに加えて固定化した。これより以降の操作は、前記の実施例４と同様のＥＬＩＳＡプロトコールに従って行った。ただし、２次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を用い、基質としてはテトラメチルベンチジン（ＳＩＧＭＡ社  ｃａｔ♯  Ｔ−０４４０）を用い、室温において３０分間の発色反応後、基質１００μｌに対して０．３Ｍ硫酸を２０μｌ加えて反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００３９】
結果は図９に示したとおりである。被験対象である２本鎖ＤＮＡ（２２５ｂｐ）にはセンス鎖あたり約２０塩基の５−メチルシトシンを含有している。２本鎖ＤＮＡの端部に近い領域にハイブリダイズするオリゴインサート＃１を使用した場合に最も吸光度が高く、オリゴインサートのハイブリダイズする領域が２本鎖ＤＮＡの中央領域に入るにつれて吸光度が低くなっていく。使用したオリゴインサートは全て３０ｍｅｒである。従ってこのとき、オリゴインサート＃１、＃２および＃３が２本鎖ＤＮＡに結合した場合には、それぞれ３塩基、６塩基および１１塩基のシトシンが１本鎖として露出することになり、このうちのおよそ５０％の割合のシトシンが５−メチルシトシンに置き換わっている。２本鎖ＤＮＡから露出するシトシン数が少ないオリゴインサート＃１の吸光度の方が高く、露出するシトシン数がより多いオリゴインサート＃２、＃３では吸光度が低くなっている。すなわちこれは、２本鎖ＤＮＡ上のオリゴインサートがハイブリダイズする位置は２本鎖ＤＮＡの末端部分の方が安定し、中央部分に行くに従って２本鎖ＤＮＡから排除され易いことを意味している。これを解消する方法としては、ＤＮＡ同士の結合より強固に結合する１本鎖ＲＮＡか、あるいは同じくＤＮＡ同士の結合より強固に結合するペプチド核酸（ＤＮＡやＲＮＡとは異なりリン酸結合ではなくペプチド結合で骨格を形成しているオリゴＤＮＡ。ＰＮＡと略す。）を用いることにより、標的２本鎖の中央部分であっても効率よく、かつ限局的に１本鎖化を行うことができる。これらに限らず、ＤＮＡ同士の結合より強く、なおかつＤＮＡとハイブリダイズする物質であれば、前記のオリゴインサートの場合と同様の結果が得られる。
【００４０】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、ＤＮＡ鎖の５−メチルシトシンを簡便かつ正確に測定することが可能となり、例えば癌の悪性度の診断等に新たな手段が提供される。
【００４１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】（Ａ）は、５−メチルシトシンを含む１本鎖ＤＮＡに対する抗５−メチルシトシン抗体の２価結合を示し、（Ｂ）は１価結合を示す。
【図２】部分的に１本鎖としたＤＮＡ鎖の５−メチルシトシンに対する抗５−メチルシトシン抗体の結合状態を示す。
【図３】実施例で使用したＤＮＡ鎖の塩基配列である。四角で囲ったシトシンが任意の割合でランダムに５−メチルシトシンに置換する。
【図４】ＤＮＡ鎖に含まれる５−メチルシトシンの個数と、抗５−メチルシトシン抗体の結合の程度の関係を示したグラフである。
【図５】１次抗体（５−メチルシトシン抗体）反応後にＮａＣｌ処理した場合の、ＮａＣｌ濃度と抗５−メチルシトシン抗体の結合の程度の関係を示したグラフである。
【図６】１次抗体（５−メチルシトシン抗体）反応後に０．１５Ｍまたは０．５ＭのＮａＣｌで処理した場合の、ＤＮＡ鎖に含まれる５−メチルシトシンの個数と、抗５−メチルシトシン抗体の結合の程度の関係を示したグラフである。
【図７】各濃度のＮａＣｌで処理した場合の、５−メチルシトシン抗体（ＩｇＧ分子）とそのＦａｂ分子の５−メチルシトシン結合状態を示したグラフである。
【図８】実施例で１本鎖ＤＮＡ領域を形成するために使用した合成オリゴＤＮＡインサート＃１〜３の塩基配列と、これらのインサートがハイブリダイズするＤＮＡ鎖の塩基配列である。インサートのハイブリダイズ領域を枠で示した。
【図９】合成オリゴＤＮＡインサート＃１〜３をハイブリダイズした２本鎖ＤＮＡに対する抗５−メチルシトシン抗体の結合の程度を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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