(57)【要約】【課題】子宮内膜症及び子宮内膜癌の治療及び診断のための新規な手段の提供。【解決手段】本発明は、子宮内膜症及び子宮内膜癌の治療及び診断のために、及び不正出血の治療のために、ＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチド、プロキネチシン２ポリペプチド、ＥＧ−ＶＥＧＦ核酸及びプロキネチシン２核酸のエフェクタ、又は対応受容体を製薬的に使用することに関する。本発明はさらに、受容性を診断するために、ＥＧ−ＶＥＧＦ、プロキネチシン２又はＥＧ−ＶＥＧＦ／プロキネチシン２受容体の量を測定することに関する。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
子宮内膜の疾患を治療又は予防する医薬品を製造するための薬剤組成物の使用であって、該薬剤組成物が、有効成分として、ＥＧ−ＶＥＧＦ核酸、ＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチド、ＥＧ−ＶＥＧＦに対する抗体、ＥＧ−ＶＥＧＦ−アンチセンス核酸、プロキネチシン２核酸、プロキネチシン２ポリペプチド、プロキネチシン２に対する抗体、プロキネチシン２−アンチセンス核酸、ＥＧ−ＶＥＧＦ／プロキネチシン２受容体、ＥＧ−ＶＥＧＦ／プロキネチシン２受容体−アンチセンス核酸、及びＥＧ−ＶＥＧＦ／プロキネチシン２受容体に対する抗体から成る群から選択された物質を含有していることを特徴とする、薬剤組成物の使用。
【請求項２】
前記疾患が子宮内膜症である、請求項１に記載の薬剤組成物の使用。
【請求項３】
前記疾患が子宮内膜癌である、請求項１に記載の薬剤組成物の使用。
【請求項４】
前記疾患が機能不全性出血である、請求項１に記載の薬剤組成物の使用。
【請求項５】
子宮内膜症又は子宮内膜癌の診断のための、請求項１に記載の薬剤組成物の使用。
【請求項６】
前記有効成分がＥＧ−ＶＥＧＦ核酸又はプロキネチシン２核酸である、遺伝子治療のための薬剤として使用される、請求項１に記載の薬剤組成物の使用。
【請求項７】
子宮の受容性を検出するための、請求項１に記載の薬剤組成物の使用。
【請求項８】
子宮の受容性を検出する方法であって、ＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドの量及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ核酸の量を、請求項１に記載の組成物を用いて測定することを特徴とする、子宮受容性を検出する方法。
【請求項９】
ＥＧ−ＶＥＧＦ／プロキネチシン２−受容体アンタゴニストをトレースするための試験システムであって、下記の成分、すなわち：ＥＧ−ＶＥＧＦ／プロキネチシン２−受容体ＧＰＲ７３ａもしくはＧＰＲ７３ｂ、又はＧＰＲ７３ａのスプライス変異型を一時的もしくは安定的に発現させる細胞系と；前記受容体と結合するリガンドと；潜在的アンタゴニストを含有する物質データベースと、を互いに接触させ、アンタゴニストのトレースが、結合試験によって又は機能試験、例えばカルシウム放出量測定を介して行うことができることを特徴とする、試験システム。
【請求項１０】
子宮内膜症を治療する医薬品を製造するためのＥＧ−ＶＥＧＦ／プロキネチシン２−受容体アンタゴニストの使用であって、ＥＧ−ＶＥＧＦ／プロキネチシン２−受容体を発現させる細胞中の上述のＥＧ−ＶＥＧＦ／プロキネチシン２−受容体アンタゴニストが、活性化により、リガンドによって放出される細胞内カルシウムイオン濃度を最小５０％だけ阻害する、ＥＧ−ＶＥＧＦ／プロキネチシン２−受容体アンタゴニストの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＥＧ−ＶＥＧＦ−／プロキネチシン２−受容体アンタゴニスト、及び子宮内膜疾患、例えば子宮内膜症、子宮内膜癌及び機能不全性出血を治療するための薬剤として、前記ＥＧ−ＶＥＧＦ−／プロキネチシン２−受容体アンタゴニストを使用することに関する。
【０００２】
子宮内膜症は、生殖年齢の全ての女性のうちのほぼ２〜１０％が罹患する、最も一般的な婦人科系疾患の１つである（Ｇａｚｖａｎｉ及びＴｅｍｐｌｅｔｏｎ　２００２，　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　１２３，　２１７−２２６；　Ｓｍｉｔｈ　２００１，　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．　Ｍｅｔａｂ．　１２，１４７−１５１）。その原因は、主に腹腔内での子宮内膜組織の異所性埋没である。痛みやその他の多数の症状に加えて、多くの子宮内膜症患者は不妊である。不妊の理由はほとんど判っていない（Ｒｙａｎ　及び　Ｔａｙｌｏｒ　１９９７，　Ｏｂｓｔｅｔ．　Ｇｙｎｅｃｏｌ．　Ｓｕｒｖ．　５２，　３６５−３７１；　Ｈａｎｅｙ　１９９７，　Ｒｅｐｒｏｄ．　Ｍｅｄ．　Ｒｅｖ．　６，　１４５−１６１）。
【０００３】
現時点では子宮内膜症の治療に利用可能な原因療法はない。子宮内膜症の治療は、エストロゲン退縮のコンセプトに基づいて行われる。腹腔鏡検査又は開腹中に子宮内膜症病巣を除去又は破壊する侵襲的介入後、薬物療法が通常続いて行われる。この薬物療法はエストロゲン性減退を引き起こすことにより、残存してはいるがしかし検出不能な子宮内膜症病巣の増殖を少なくとも部分的に阻害する（Ｓｉｌｌｅｍ　１９９８，　Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ（登録商標）２３，　増補版１，１−２８）。使用される医薬品は、部分的にはこれらの男性ホルモン性により、多くの副作用を有し、突発的な出血、更年期障害、骨欠乏を引き起こす。薬物療法は子宮内膜症の初期治療に効果的であることが証明されてはいるものの、今までのところ、高い再発率の減少にまでは達していない。
【０００４】
子宮内膜癌は、西洋諸国において第４番目に一般的な形の癌である。診断段階を基準にして、５年後の生存率は２７％〜８８％である。主な原因はエストロゲンレベルの上昇であると見られる（Ａｋｈｍｅｄｋｈａｎｏｖ他、２００１，　Ａｎｎ．　Ｎ．　Ｙ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　９４３，　２９６−３１５）。エストロゲンレベルが上昇する結果、子宮内膜の細胞の増殖が増大し、このことはＤＮＡ複製のエラーと体細胞変異とを引き起こすおそれがあり、最終的には悪性腫瘍をもたらすおそれがある。他の腫瘍と同様に、脈管形成が、子宮内膜癌の臨床像において主要な役割を演じる。いくつかの研究において、脈管化の増大及び血管内皮成長因子ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）及びその受容体の過剰発現が注目されている（Ａｂｕｌａｆｉａ他，　１９９９，　Ｇｙｎｅｃｏｌ．　Ｏｎｃｏｌ．　７２，　２２０−２３１）。
【０００５】
現在、子宮内膜癌を治療するのには、いくつかの療法がある。抗エストロゲンは良好な結果を示すが、しかし、細胞成長防止剤又は放射線を伴う付加的な治療もしばしば実施しなければならない。
【０００６】
女性の約１０％は、子宮内膜の血管の変化に起因する、月経中の多量出血に定期的に苦しむ。このような女性の子宮内膜中には、内皮細胞の増殖率の上昇が検出された（Ｋｏｏｙ　１９９６，　Ｈｕｍ．　Ｒｅｐｒｏｄ．　１１，　１０６７−１０７２）。さらに、血管の構造的な相違、例えば、平滑筋細胞層の不完全な形成が観察された（Ａｂｂｅｒｔｏｎ他，　１９９９，　Ｈｕｍ．　Ｒｅｐｒｏｄ．　１４，　１０７２−１０７９）。月経中の血液損失は血管の収縮によって部分的に制御されるので、このことは、平滑筋の欠陥が出血に有意に関与することを示唆する。
【０００７】
手術介入（子宮切除）に加えて、薬物療法を行うこともできる。この場合、ステロイドホルモンも使用される。これに加えて、非ステロイド系抗炎症性物質が使用される。前記物質はきわめて効果的であるが、しかし多くの副作用を有するので、これらの物質は比較的短時間にわたってしか使用することができない（Ｉｒｖｉｎｅ及びＣａｍｅｒｏｎ　２０００，　Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ　Ｂｅｓｔ　Ｐｒａｃｔ　Ｒｅｓ　Ｃｌｉｎ　Ｏｂｓｔｅｔ　Ｇｙｎａｅｃｏｌ．　１３，１８９−２０２）。
子宮内膜の疾患を特異的に治療可能にする新しい治療法及び物質を見出すことが急務である。本発明は、新しい薬物療法の標的物質としてＥＧ−ＶＥＧＦ、プロキネチシン２及び対応受容体を使用する新しい治療法により、問題を解決する。
【０００８】
プロキネチシン１とも呼ばれるＥＧ−ＶＥＧＦ｛ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　ｇｌａｎｄ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（内分泌線由来の血管内皮成長因子）｝は、副腎のアドレナリン様皮質に由来する、内皮細胞に対して特異的な成長因子として既に記載されている。このＥＧ−ＶＥＧＦの発現は、卵巣、精巣、胎盤及び副腎において検出された（ＬｅＣｏｕｔｅｒ他，　２００１，　Ｎａｔｕｒｅ　４１２，　８７７−８８４）。さらに、消化管の平滑筋に対する収縮効果が検出された（Ｌｉ他，　２００１，　Ｍｏｌ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　５９，　６９２−６９８）。
【０００９】
国際公開第０２／００７１１号パンフレット（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，　Ｉｎｃ）において、ＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドの核酸配列及び対応アミノ酸配列が開示されており、また、ホルモン産出組織（例えば卵巣）と関連する疾患の治療にこれらの配列を使用することが開示されている。ＥＧ−ＶＥＧＦ及びプロキネチシン２（Ｂｖ８とも呼ばれる）は、同じ群に属する：これらは６０％の同一性を有し、７５％だけ類似している。両蛋白質は、１０個のシステインラジカルを含む保存領域を有している　（Ｗｅｃｈｓｅｌｂｅｒｇｅｒ他，１９９９，　ＦＥＢＳＬｅｔｔ．　４６２，　１７７−１８１）。
【００１０】
プロキネチシン２の発現は、ほとんど専ら精巣内及び脳内で検出された（Ｗｅｃｈｓｅｌｂｅｒｇｅｒ他，１９９９，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　４６２，　１７７−１８１；　ＬｅＣｏｕｔｅｒ他，　２００３，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　１００，　２６８５−２６９０）。プロキネチシン２は、精巣内で脈管形成　（ＬｅＣｏｕｔｅｒ他、２００３，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　１００，　２６８５−２６９０）、消化管の平滑筋の収縮を促進し（Ｌｉ他，　２００１，　Ｍｏｌ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　５９，　６９２−６９８）、脳のキアスマ上核の日／夜サイクルを媒介する（Ｃｈｅｎｇ他，　２００２，　Ｎａｔｕｒｅ　４１７，　４０５−４１０）。子宮内膜におけるＥＧ−ＶＥＧＦ又はプロキネチシン２の意味は、詳細には考察されていない。子宮内膜疾患のＥＧ−ＶＥＧＦ又はプロキネチシン２の役割は、これまで知られていなかった。
【００１１】
本発明において、ＥＧ−ＶＥＧＦが子宮内膜において発現させられ、サイクルのいわゆる着床ウィンドウ（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｗｉｎｄｏｗ）において増加することを示すことができた（図５及び６）。半定量及び定量により、ヒトの子宮内膜に由来するｍＲＮＡが３つの臨床研究グループに関して比較された。これらの研究結果は、健康な女性において、グループｂ（着床ウィンドウ開放時）のＥＧ−ＶＥＧＦのｍＲＮＡが、グループａ（着床ウィンドウが開かれる前）の対照グループと比較して上昇する（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ）ことを示した。グループｃ（子宮内膜症患者）においても、ＥＧ−ＶＥＧＦのｍＲＮＡ量が上昇することが判った。
【００１２】
Ｇ−蛋白質にカップリングされた２つの関連受容体（ＧＰＲ７３ａ及びＧＰＲ７３ｂ）にＥＧ−ＶＥＧＦ又はプロキネチシン２を結合すると、受容体が活性化される。ＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチド及びプロキネチシン２ポリペプチドのこれらの生理的な結合相手は、最近になってようやく同定され、特徴づけされた（Ｌｉｎ他，　２００２，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７７，　１９２７６−１９２８０）。受容体により媒介される効果は、ＥＧ−ＶＥＧＦ及びプロキネチシン２の生物学的効果にとって重要である、ＥＧ−ＶＥＧＦ及びプロキネチシン２の生物学的効果は、病理学的な子宮内膜疾患にとって重要である。
【００１３】
本発明において、種々の子宮内膜症患者に由来する障害におけるＥＧ−ＶＥＧＦ、プロキネチシン２及びＥＧ−ＶＥＧＦ受容体ＧＰＲ７３ａの発現が、健康な組織におけるよりも有意に高いことを示すことができた（図７）。
さらに、ＧＰＲ７３ａの新しいヒト・スプライス変異型を同定することができた（図４）。この変異型のＲＮＡは付加的なエキソンを含有する。しかしこのエキソンはストップコドンを含有し、ひいては、短縮された蛋白質をもたらす。短縮された受容体は、第３の膜貫通ドメインまでしか進まず、したがって、信号伝達を媒介できないはずである。この受容体は、リガンドを除去する（ｓｃａｖｅｎｇｅ）か、又はヘテロ二量体に結合する、ＧＰＲ７３ａ又はＧＰＲ７３ｂの支配的−ネガティブな阻害物質であると云える。
【００１４】
一方では、成長因子ＥＧ−ＶＥＧＦ又はプロキネチシン２とＥＧ−ＶＥＧＦ受容体との結合を阻害し、又は、ＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチド又はプロキネチシン２ポリペプチドを直接的に阻害することにより、ＥＧ−ＶＥＧＦ又はプロキネチシン２の生物学的機能が抑制される。このような阻害作用により、上述の疾患を特異的に治療することが可能になる。本発明は、このような特異的治療のための薬剤を提供する。
【００１５】
したがって本発明は、薬剤組成物の使用であって、該薬剤組成物が、子宮内膜の疾患、特に子宮内膜症、子宮内膜癌又は機能不全性出血を治療又は予防する医薬品を製造するために、有効成分として、ＥＧ−ＶＥＧＦ核酸又はプロキネチシン２核酸と、ＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチド又はプロキネチシン２ポリペプチドと、ＥＧ−ＶＥＧＦに対する抗体又はプロキネチシン２に対する抗体と、ＥＧ−ＶＥＧＦ−アンチセンス核酸又はプロキネチシン２−アンチセンス核酸と、ＥＧ−ＶＥＧＦ／プロキネチシン２受容体と、ＥＧ−ＶＥＧＦ／プロキネチシン２受容体−アンチセンス核酸と、ＥＧ−ＶＥＧＦ／プロキネチシン２受容体に対する抗体とから成る群から選択された物質を含有している、薬剤組成物の使用に関する。
【００１６】
ＥＧ−ＶＥＧＦ核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡ、又はこれらの部分を含んでいる。ＤＮＡ配列及び蛋白質配列を図１に示す。ＥＧ−ＶＥＧＦ核酸は好ましくはＤＮＡである。
プロキネチシン２核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡ、又はこれらの部分を含んでいる。ＤＮＡ配列及び蛋白質配列は、寄託番号ＮＭ＿０２１９３５で遺伝子バンクのデータベースに記載されている。プロキネチシン２核酸は好ましくはＤＮＡである。
ＥＧ−ＶＥＧＦ／プロキネチシン２−受容体−核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡ、又はこれらの部分を含んでいる。ＤＮＡ配列及び蛋白質配列を図２及び３に示す。新しいスプライス変異型のＤＮＡ配列及び蛋白質配列を図４に示す。ＥＧ−ＶＥＧＦ／プロキネチシン２−受容体−核酸は好ましくはＤＮＡである。
【００１７】
ＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドは、配列全体として、またこれらの部分として定義づけされる。
プロキネチシン２ポリペプチドは、配列全体として、またこれらの部分として定義づけされる。
ＥＧ−ＶＥＧＦ−アンチセンス核酸は、ＥＧ−ＶＥＧＦのｍＲＮＡに対して相補的なＤＮＡ及び／又はＲＮＡである。ＥＧ−ＶＥＧＦ−アンチセンス核酸は、相補配列全体又は部分配列を含むことができる。
【００１８】
プロキネチシン２−アンチセンス核酸は、プロキネチシン２のｍＲＮＡに対して相補的なＤＮＡ及び／又はＲＮＡである。プロキネチシン２−アンチセンス核酸は、相補配列全体又は部分配列を含むことができる。
ＥＧ−ＶＥＧＦ／プロキネチシン２−受容体−アンチセンス核酸は、ＥＧ−ＶＥＧＦ／プロキネチシン２−受容体のｍＲＮＡに対して相補的なＤＮＡ及び／又はＲＮＡである。ＥＧ−ＶＥＧＦ／プロキネチシン２−受容体−アンチセンス核酸は、相補配列全体又は部分配列を含むことができる。
【００１９】
ＥＧ−ＶＥＧＦ、プロキネチシン２又はＥＧ−ＶＥＧＦ／プロキネチシン２−受容体に対する抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであってよい。この抗体は、ＥＧ−ＶＥＧＦ、プロキネチシン２又はＥＧ−ＶＥＧＦ／プロキネチシン２−受容体、又はこれらのフラグメントに対する抗体であってよい。このような抗体は、実験動物の免疫化による標準的な方法に従って得ることができる。
【００２０】
本発明の薬剤組成物は、一般的に使用される固形又は液状のビヒクル又は希釈剤、及び、一般的に使用される製薬的かつ技術的なアジュバントを用いて、当業者に良く知られている方法で、好適な容量と共に所望の投与タイプに応じて製造される。錠剤は例えば、有効成分を周知のアジュバント、例えば不活性希釈剤（例えばデキストロース、糖、ソルビトール、マンニトール、ポリビニルピロリドン）、分散剤（ｅｘｐｌｏｓｉｖｅｓ）（例えばコーンスターチ又はアルギン酸）、バインダ（例えば澱粉又はゼラチン）、滑剤（例えばカルボキシポリメチレン、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタレート又はポリビニルアセテート）と混合することにより得ることができる。有効成分を含有するカプセルは、例えば有効成分を不活性ビヒクル（例えばラクトース又はソルビトール）と混合し、ゼラチンカプセル内に封入することにより、製造することができる。
【００２１】
本発明による薬剤組成物は、好適な溶液、例えば一般的な生理食塩水中で使用することもできる。
非経口投与の場合、特に油性溶液、例えばごま油、ひまし油及び綿実油の溶液が好適である。溶解性を増大するために、可溶化剤、例えばベンジルベンゾエート又はベンジルアルコールを添加することができる。
本発明による薬剤組成物は、子宮内膜症及び子宮内膜癌を診断するのに使用することもできる。この場合、例えば、ＥＬＩＳＡ試験又は蛋白質チップによって、ＥＧ−ＶＥＧＦ又はプロキネチシン２の量が見極められる。ＥＧ−ＶＥＧＦ又はプロキネチシン２の発現量の上昇は、子宮内膜症又は子宮内膜癌の存在を示す。
【００２２】
さらに、本発明は、遺伝子治療剤として薬剤組成物を使用することにより採用することができる。このことと関連して、ＥＧ−ＶＥＧＦ又はプロキネチシン２の効果は、遺伝子治療の利用によってブロックされる。この場合、ＥＧ−ＶＥＧＦ−アンチセンス配列又はプロキネチシン２−アンチセンス配列、又はＥＧ−ＶＥＧＦ／プロキネチシン２−受容体−アンチセンス配列を含有するベクターが構成され、適用される。その一例は、アデノウィルス、アデノウィルス関連ウィルス、単純ヘルペスウィルス又はＳＶ４０に由来するベクターである。
【００２３】
遺伝子治療は、既に記載されているように実施することができる（Ｇｏｍｅｚ−Ｎａｖａｒｒｏ他，　１９９９，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ，　３５，　８６７−８８５）。投与は局所的、すなわち直接的に子宮内に行うか、又は全身的に、すなわち血液循環を介して行うことができる。その結果として、子宮内膜におけるＥＧ−ＶＥＧＦ、プロキネチシン２又はＥＧ−ＶＥＧＦ／プロキネチシン２の受容体の発現がブロックされることになる。その結果、ＥＧ−ＶＥＧＦ又はプロキネチシン２の生物学的機能が阻害される。
【００２４】
遺伝子治療における別の用途は、ＧＰＲ７３ａ−スプライス変異型の配列を含有するベクターが構成され適用されることにある。その一例は、アデノウィルス、アデノウィルス関連ウィルス、単純ヘルペスウィルス又はＳＶ４０に由来するベクターである。遺伝子治療は、既に記載されているように実施することができる（Ｇｏｍｅｚ−Ｎａｖａｒｒｏ他，　１９９９，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ，　３５，　８６７−８８５）。投与は局所的、すなわち直接的に子宮内に行うか、又は全身的に、すなわち血液循環を介して行うことができる。その結果として、子宮内膜におけるＥＧ−ＶＥＧＦ／プロキネチシン２受容体ＧＰＲ７３ａ及び／又はＧＰＲ７３ｂの発現がブロックされることになる。その結果ＥＧ−ＶＥＧＦ又はプロキネチシン２によって誘発される信号伝達が早期に停止されることになる。
【００２５】
本発明はまた、子宮受容性の検出のために、本発明による薬剤組成物を使用することに関する。子宮受容性は、胚盤胞の着床の成功のための要件である。このような沈着は短時間、つまりいわゆる着床ウィンドウの期間にのみ実施され得る。この着床ウィンドウはヒトの場合、中間分泌期、従って排卵から７〜９日後に開かれる。本発明は、ＥＧ−ＶＥＧＦ発現量が着床ウィンドウ開放時に上昇する（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ）ことを示すので、体外受精によって受精された卵細胞の導入に適した時機を、ＥＧ−ＶＥＧＦ　ｍＲＮＡ又はＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドの量を測定することにより見極めることができる。この測定は、ノーザンブロット、ＰＣＲ又はチップ・ハイブリダイゼーション、又は免疫試験によって行われる。
【００２６】
さらに本発明は、子宮受容性を検出する方法であって、ＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドの量及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ核酸の量を、本発明による薬剤組成物を用いて見極める、子宮受容性を検出する方法に関する。先ず、女性から血液又は子宮内膜試料を採取し、次いで、ＥＧ−ＶＥＧＦ　ｍＲＮＡ又はＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドの量を見極める。
【００２７】
本発明は、ＥＧ−ＶＥＧＦ又はプロキネチシン２の効果に影響を与える物質を同定するために、本発明による薬剤組成物を使用することに関する。エフェクタは、ＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチド又はプロキネチシン２ポリペプチドに結合することにより、又は、生理学的結合相手との結合に関してＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチド又はプロキネチシン２ポリペプチドと競合することにより、ＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチド又はプロキネチシン２ポリペプチドの生物学的活性に影響を与える物質である。エフェクタは、好ましくは受容体スプライス変異型に結合し、ひいてはＧＰＲ７３ａ又はＧＰＲ７３ｂの機能を調節又は阻害する物質であってもよい。
【００２８】
エフェクタは低分子物質であるか、又はペプチド又は蛋白質、例えば抗体であってよい。別のエフェクタとしては、空間的な構造に基づいて標的分子と特異的に結合可能であり、ひいてはリガンドとその受容体との相互作用を阻止可能なスピーゲルマー又はアプタマーのような核酸も可能である。このようなエフェクタを同定するために、ＥＧ−ＶＥＧＦ／プロキネチシン２受容体を発現させる細胞が、ＥＧ−ＶＥＧＦ又はプロキネチシン２で処理される。その結果、細胞内のカルシウムレベルが変化し、このカルシウムレベルが測定される。アンタゴニストは、カルシウム流入を阻止することができる物質である。
【００２９】
さらに、ヘテロ二量体化を選択的に引き起こし、ひいてはＥＧ−ＶＥＧＦ又はプロキネチシン２によって誘発される信号をブロックする物質を求めるために、受容体スプライス変異型をＧＰＲ７３ａ又はＧＰＲ７３ｂと一緒に共発現させることができる。ＥＧ−ＶＥＧＦ／プロキネチシン２アンタゴニストのスクリーニングのためのその他の検出システムを利用することもできる。
【００３０】
【実施例】
例１．半定量ＲＴ−ＰＣＲ分析による、子宮内膜試料中のＥＧ−ＶＥＧＦ−ＲＮＡ量の測定
１．　グループａ（ＬＨプラス２〜４日）：排卵が黄体化ホルモン（ＬＨ）の放出によって誘発されてから２〜４日後、子宮内膜は胚に対してまだ受容性を有していない。このグループは、卵管閉塞のため、又は男性の不妊のためにＩＶＦプログラムに参加していて、正常な子宮内膜を有している女性患者から成る。
【００３１】
２．　グループｂ（ＬＨプラス７〜９日）：この時点で、「着床ウィンドウ」が開き、子宮内膜は、胚盤胞の沈着に対して受容性を有する。「着床ウィンドウ」が開くことにより、胚の着床に本質的な役割を果たす蛋白質産物を有する遺伝子の発現又は阻害が予期される。
３．　グループｃ（ＬＨプラス７〜９日プラス子宮内膜症）：この時点で、健康な女性の場合には着床ウィンドウが開かれる。しかしこのグループの患者は未知の理由から不妊であり、子宮内膜症であった。
【００３２】
２つのグループ、ＬＨ＋２−４／妊娠可能（ａ）及びＬＨ＋７−９／妊娠可能（ｂ）に属する患者から、子宮内膜を取り出し、液体窒素中で急速凍結した。ここからＲＮｅａｓｙ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、総ＲＮＡを分離した。次いでＤＮアーゼ−Ｉ−消化（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を行った。５．７μｇの総ＲＮＡで始めて、次いで第１鎖合成をｓｔｒａｔａｇｅｎｅのＰｒｏＳＴＡＲ　Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ　ＲＴ−ＰＣＲキットで実施した。ＥＧ−ＶＥＧＦ量の半定量に際して、０．５μｌの第１鎖ＤＮＡ及び特異的プライマをＥＧ−ＶＥＧＦに対して使用した（５’−ＴＣＡＡＴＣＡＴＧＣＴＣＣＴＣＣＴＡＧＴＡＡＣＴＧＴＧ−３’及び５’−ＡＡＧＴＣＣＡＴＧＧＡＧＣＡＧＣＧＧＴＡＣ−３’）。
【００３３】
ＰＣＲ条件は、２分間、９４℃；２０秒間、９４℃；２０秒間、６５℃；４０秒間、７２℃（４０サイクル）；１０分間、７２℃であった。内部対照として、Ｓ９−ＲＮＡを増幅した（プライマ：５’−ＡＧＧＡＣＣＣＡＣＧＧＣＧＴＣＴＧＴＴＣＧ−３’及び５’−ＡＴＣＣＡＧＣＡＧＣＣＣＡＧＧＡＧＧＧＡＣ−３’）。ＰＣＲ条件は、２分間、９４℃；２０秒間、９４℃；２０秒間、６０℃；４０秒間、７２℃（２４サイクル）；１０分間、７２℃であった。反応後、増幅産物を２％アガロースゲル上に分離し、臭化エチジウムで染色した。バンド強度をＧｅｌＤｏｃ装置で測定した（図５）。
【００３４】
例２．リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ分析による、子宮内膜試料中のＥＧ−ＶＥＧＦ−ＲＮＡ量の測定
３つのグループ、ＬＨ＋２−４／妊娠可能（ａ）、ＬＨ＋７−９／妊娠可能（ｂ）及びＬＨ＋７−９／子宮内膜症（ｃ）に属する患者から、子宮内膜を取り出し、液体窒素中で急速凍結した。
液体窒素下で「乳鉢（ｍｏｒｔａｒｓ）」によって粉砕された組織から、ＴＲＩＺＯＬ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって、総ＲＮＡを分離した。５μｇの総ＲＮＡから始めて、先ずＤＮアーゼＩ−消化（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、次いで第１鎖合成を、ＲＴ−ＰＣＲのためのＳＵＰＥＲ−ＳＣＲＩＰＴ　ＩＩ第１鎖合成システム（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて実施した。
【００３５】
相対定量化のために転写物を増幅するのに際して、０．１２５μｌの第１鎖ＤＮＡを使用した。特異的プライマ対（ＥＧ−ＶＥＧＦ：５’−ＣＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡＡＡＣＧＣＡＡＧＣＡ−３’及び５’−ＣＧＧＧＡＡＣＣＴＧＧＡＧＣＡＣＡＧ−３’；カルシトニン：５’−ＣＡＡＣＴＴＴＧＴＧＣＣＣＡＣＣＡＡＴＧＴ−３’及び５’−ＧＡＧＴＣＡＴＴＣＡＧＣＴＧＣＴＣＡＧＧＣ−３’；白血病抑制因子（ＬＩＦ）：５’−ＣＴＡＧＴＴＣＣＣＣＡＣＣＴＣＡＡＴＣＣＣ−３’及び５’−ＡＡＧＧＣＣＡＴＧＴＧＣＴＴＴＴＣＡＧＴＧ−３’）及びＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用することにより、下記のＰＣＲ条件下で増幅を行った：１０分間、９５℃；１５秒間、９５℃；１分間、６０℃　（４０サイクル）。
【００３６】
内部対照として、サイトクロムオキシダーゼのサブユニット１Ａに関してＲＮＡを増幅した（プライマ：５’−ＣＧＴＣＡＣＡＧＣＣＣＡＴＧＣＡＴＴＴＧ−３’及び５’−ＧＧＴＴＡＧＧＴＣＴＡＣＧＧＡＧＧＣＴＣ−３’）。ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　７７００配列検出器（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によってオンラインで、増幅産物の増大に関して、蛍光発光を尺度として測定を行った。増幅産物の純度を融解曲線をプロットすることにより検査した（図６）。
【００３７】
例３．女性患者の傷害における、ＥＧ−ＶＥＧＦ、プロキネチシン２及びＥＧ−ＶＥＧＦ受容体（ＧＰＲ７３ａ）のＲＮＡ量の測定
組織を取り出したあと、この組織を液体窒素中で急速凍結した。液体窒素下で「乳鉢（ｍｏｒｔａｒｓ）」によって粉砕された組織から、ＴＲＩＺＯＬ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって、総ＲＮＡを分離した。オリゴ−ｄＴセルロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用することにより、バッチ法において、ポリＡ＋−ＲＮＡを濃縮した。１００−４００ｎｇのポリＡ＋−ＲＮＡから始めて、第１鎖合成を、ＲＴ−ＰＣＲのためのＳＵＰＥＲ−ＳＣＲＩＰＴ　ＩＩ第１鎖合成システム（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて実施した。
【００３８】
相対定量化のために転写物を増幅するのに際して、０．２５μｌの第１鎖ＤＮＡを使用した。特異的プライマ対（ＥＧ−ＶＥＧＦ：５’−ＣＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡＡＡＣＧＣＡＡＧＣＡ−３’及び５’−ＣＧＧＧＡＡＣＣＴＧＧＡＧＣＡＣＡＧ−３’；ＥＧ−ＶＥＧＦ受容体ＧＰＲ７３ａ：５’−ＡＴＴＧＡＣＡＧＧＴＡＴＣＴＧＧＣＴＡＴＴＧＴＣＣ−３’及び５’−ＣＣＡＡＧＧＣＡＡＴＣＡＧＧＣＣＡＧＴ−３’）；対応するＴａｑＭａｎ試料（ＥＧ−ＶＥＧＦ：５’−ＴＥＴ−ＡＣＡＣＣＴＧＴＣＣＴＴＧＣＴＴＧＣＣＣＡＡＣＣ−ＴＡＭＲＡ−３’）；ＥＧ−ＶＥＧＦ受容体ＧＰＲ７３ａ：５’−ＦＡＭ−ＣＴＧＡＧＡＣＣＡＣＧＧＡＴＧＡＡＧＴＧＣＣＡＡＡＣＡ−ＴＡＭＲＡ−３’）及びＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用することにより、下記のＰＣＲ条件下でマルチプレックスＰＣＲとして増幅を行った：２分間、５０℃；１０分間、９５℃；１５秒間、９５℃；１分間、６２℃（４０サイクル）。
【００３９】
内部対照として、シクロフィリンに関してＲＮＡを増幅した（プライマ：５’−ＧＡＡＧＴＴＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＡＧＡ−３’及び５’−ＧＣＣＴＡＡＡＧＴＴＣＴＣＧＧＣＣＧＴ−３’；試料：５’−ＶＩＣ−ＣＧＡＧＣＴＣＴＴＴＧＣＡＧＡＣＧＴＴＧＴＧＣＣＴ−ＴＡＭＲＡ−３’）。ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　７７００配列検出器（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によってオンラインで、増幅産物の増大に関して、蛍光発光を尺度として測定を行った。
【００４０】
プロキネチシン２−ＲＮＡの相対定量化のために、ポリＡ＋−ＲＮＡから始めて、０．５μｌの第１鎖ＤＮＡを使用した。特異的プライマ対（５’−ＣＴＣＣＴＧＴＣＡＴＧＧＣＡＣＧＧＡＡ−３’及び５’−ＡＧＣＣＣＡＡＣＡＧＣＡＧＡＧＣＴＧＡＡ−３’）及びＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）を使用することにより、下記のＰＣＲ条件下で増幅を行った：２分間、５０℃；１０分間、９５℃；１５秒間、９５℃；１分間、６０℃（４０サイクル）。内部対照として、ＲＮＡをシクロフィリンに関して増幅した（図７）。
【００４１】
例４．ＥＧ−ＶＥＧＦ／プロキネチシン２受容体の受容体アンタゴニストをトレースする試験システム
ＥＧ−ＶＥＧＦ／プロキネチシン２受容体ＧＰＲ７３ａ、ＧＰＲ７３ｂ又はＧＰＲ７３ａのスプライス変異型を一時的又は安定的に発現させる細胞系（例えばＣＨＯ又はＨＥＫ）を確立する。リガンドを付加した後、物質データベースをチェックして、リガンド結合を置換する物質を見出す（結合アッセイ）。あるいは、機能アッセイを実施する。例えばエクオリンに基づくルミネセンス・アッセイにより、リガンドによって引き起こされるカルシウム放出量を測定する。この場合、細胞中でエクオリンに対応する発現プラスミドが同時貫通（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｉｘ）される。エクオリンは、放出されたカルシウムによって結合され、その結果、発光を増大させる。受容体アンタゴニストによるこのような活性の阻害作用は、試験のための測定変数として使用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ヒトＥＧ−ＶＥＧＦのＤＮＡ及び蛋白質の配列を示す。
【図２】図２は、ヒトＥＧ−ＶＥＧＦ／プロキネチシン２受容体ＧＰＲ７３ａ（２ａ）のＤＮＡ及び蛋白質の配列を示す。
【図３】図３は、ヒトＥＧ−ＶＥＧＦ／プロキネチシン２受容体ＧＰＲ７３ｂ（２ｂ）のＤＮＡ及び蛋白質の配列を示す。
【図４】図４は、ヒトＥＧ−ＶＥＧＦ／プロキネチシン２受容体の新しいスプライス変異型ＧＰＲ７３ａ（２ｃ）のＤＮＡ及び蛋白質の配列を示す。
【図５】図５は、ＲＴ−ＰＣＲ法によって検出される、子宮内膜中のＥＧ−ＶＥＧＦからのＲＮＡの発現を示す。グループａ（ＬＨ＋２−４）と比較して、グループｂ（ＬＨ＋７−９／妊娠可能）におけるヒトＥＧ−ＶＥＧＦ遺伝子が増加する（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ）ことが明らかである。ＥＧ−ＶＥＧＦに対して特異的な「プライマ」を使用した。内部対照として、アンチセンスＳ９を増幅した。ＰＣＲ増幅後、産物をアガロースゲル上に分離し、臭化エチジウムで染色した。バンド強度を量化した。グループａは、着床ウィンドウ開放前のグループであり、グループｂは、健康な女性における、着床ウィンドウ開放時のグループであり、ＬＨは黄体形成ホルモンであり、２〜４又は７〜９は期間（日）である。
【図６】図６は、ＴａｑＭａｎ法により検出される、子宮内膜中のＥＧ−ＶＥＧＦからのＲＮＡの発現量を示す。グループａ（ＬＨ＋２−４）と比較して、グループｂ（ＬＨ＋７−９／妊娠可能）及びグループｃ（ＬＨ＋７−９／子宮内膜症）におけるヒトＥＧ−ＶＥＧＦ遺伝子が増加する（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ）ことが明らかである。ＥＧ−ＶＥＧＦに対して特異的な「プライマ」を使用した。さらに、着床ウィンドウ開放時点で周知のように増加する（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ）２種の遺伝子、ＬＩＦ及びカルシトニンｍＲＮＡの量を測定した。ＰＣＲ産物の量をＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎで染色することにより測定した。ｍＲＮＡの全量をアクチンｍＲＮＡの量に合わせた。グループａは、着床ウィンドウ開放前のグループであり、グループｂは、健康な女性における、着床ウィンドウ開放時のグループであり、グループｃは、子宮内膜症患者における、着床ウィンドウ開放時のグループであり、ＬＨは黄体形成ホルモンであり、２〜４又は７〜９は期間（日）である。
【図７】図７は、子宮内膜症に罹った患者に由来し、ＴａｑＭａｎ法により検出された障害におけるＥＧ−ＶＥＧＦ及びＥＧ−ＶＥＧＦ受容体ＧＰＲ７３ａ（ここではＥＧ−ＶＥＧＦ　Ｒ１と呼ぶ）のＲＮＡの発現量を示す。相対的なｍＲＮＡ発現量をシクロフィリン−ｍＲＮＡの量に合わせた。女性患者＃ＤＦ３１ｈ１，　ＤＦ３３ｈ１及びＤＦ２６ｈ１において、組織は健康な対照患者の正常位置発生組織　（白いバー）であり、子宮内膜症患者ＡＶ１０３，　ＡＶ１０４，　ＦＣ１０８及びＤＦ５１の試料は、子宮内膜（正常位置、ｈ１；グレイのバー）又は異所性の障害（ｅ１又はｅ３；黒のバー）に由来する。健康な組織と比較して、種々異なる障害においてＧＰＲ７３ａ（ＥＧ−ＶＥＧＦ　Ｒ１）に対応するヒト遺伝子が増大する（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ）ことが明らかである。ＧＰＲ７３ａ（ＥＧ−ＶＥＧＦ　Ｒ１）に対して特異的な「プライマ」を使用した。対照として、精巣及び子宮内膜におけるＧＰＲ７３ａ　（ＥＧ−ＶＥＧＦ　Ｒ１）−ＲＮＡの量を測定した。ＰＣＲ産物の量をＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎで染色することにより測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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