(57)【要約】【課題】乳酸菌の培地組成を選択することにより、免疫賦活効果の高い乳酸菌を製造する方法、及び該方法によって得られた乳酸菌を有効性成分として含有する免疫賦活剤を提供する。【解決手段】コーンスティープリカーとカゼインの加水分解物とを含有する培地を用いて乳酸菌を培養することにより、免疫賦活効果の高い乳酸菌を得る。この乳酸菌を有効成分として含有させることにより、優れた効果を有する免疫賦活剤を提供する。この場合、前記培地のｐＨを６．５〜７．５に保持して培養を行なうことが好ましく、前記培地は、コーンスティープリカーを１〜１５質量％、カゼインの加水分解物を０．０１〜５質量％含有することが好ましい。また、前記乳酸菌が乳酸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）であることが好ましく、得られた乳酸菌は加熱処理することが好ましい。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌を、コーンスティープリカーとカゼインの加水分解物とを含有する培地を用いて培養することを特徴とする免疫賦活効果を有する乳酸菌の製造法。
【請求項２】
前記培地のｐＨを６．５〜７．５に保持して培養を行なう、請求項１に記載の免疫賦活効果を有する乳酸菌の製造法。
【請求項３】
前記培地は、コーンスティープリカーを１〜１５質量％、カゼインの加水分解物を０．０１〜５質量％含有するものである、請求項１又は２に記載の免疫賦活効果を有する乳酸菌の製造法。
【請求項４】
前記カゼインの加水分解物は、カゼインを２種類以上のプロテアーゼを用いて分解して得られるものである、請求項１〜３のいずれか一つに記載の免疫賦活効果を有する乳酸菌の製造法。
【請求項５】
前記プロテアーゼとして、アルカリ性プロテアーゼ及び中性プロテアーゼを用いる、請求項４に記載の免疫賦活効果を有する乳酸菌の製造法。
【請求項６】
前記乳酸菌が乳酸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）である、請求項１〜５のいずれか一つに記載の免疫賦活効果を有する乳酸菌の製造法。
【請求項７】
前記培養物から乳酸菌の菌体を採取し、加熱殺菌する請求項１〜６に記載の免疫賦活効果を有する乳酸菌の製造法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法で得られた乳酸菌を有効成分として含有することを特徴とする免疫賦活剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、経口摂取することにより、生体におけるサイトカインの産生量を高め、優れた免疫賦活効果が期待できる免疫賦活効果を有する乳酸菌の製造法及び免疫賦活剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
乳酸菌は、腸内フローラのバランスを改善して腸内腐敗産物の低減や糞便性状を改善する効果のほか、生体の免疫活性を向上させる効果（免疫賦活効果）を有することが知られている。一般に、乳酸菌による上記のような生理効果を得るためには、菌体を比較的大量に摂取する必要があると言われている。
【０００３】
一方、乳酸菌の培養には、様々な培地が用いられているが、通常、乳酸菌の生育を良好にするために、酵母エキス、ペプトン、肉エキス等を含む栄養分豊富な培地が用いられている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、乳酸菌の免疫賦活効果と培地組成との関係については、これまでに研究されたことがなく、乳酸菌の増殖特性だけに着眼して培地組成が選択されていたのが現状である。
【０００５】
また、栄養分の豊富な培地を用いれば、乳酸菌がより多く増殖することは容易に考えられるが、乳酸菌を工業的に大量に培養しようとした場合、上記のような栄養分豊富な培地を用いると、培地のコストが非常に高くなってしまうという問題があった。
【０００６】
一方、コーンスターチを製造する際の副産物であるコーンスティープリカーを用いた培地（コーンスティープリカー培地）は、安価な培地としてよく知られているが、乳酸菌の免疫賦活効果との関係については何ら知られていなかった。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、乳酸菌の培地組成を選択することにより、免疫賦活効果の高い乳酸菌を製造する方法、及び該方法によって得られた乳酸菌を有効性成分として含有する免疫賦活剤を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記目的を達成するために鋭意研究した結果、カゼインの加水分解物を添加したコーンスティープリカー培地で乳酸菌を培養することにより、免疫賦活効果の高い乳酸菌が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明の免疫賦活効果を有する乳酸菌の製造法は、乳酸菌を、コーンスティープリカーとカゼインの加水分解物とを含有する培地を用いて培養することを特徴とする。
【００１０】
本発明によれば、カゼインの加水分解物を添加したコーンスティープリカー培地を用いて乳酸菌を培養することにより、免疫賦活効果の高い乳酸菌を安価に得ることができる。
【００１１】
本発明の乳酸菌の製造法においては、前記培地のｐＨを６．５〜７．５に保持して培養を行なうことが好ましい。これによって、ｐＨの低下に伴う乳酸菌の増殖性低下を防止し、生産性を高めることができる。
【００１２】
また、前記培地は、コーンスティープリカーを１〜１５質量％、カゼインの加水分解物を０．０１〜５質量％含有することが好ましい。これによって、免疫賦活効果がより高い乳酸菌を得ることができる。
【００１３】
更に、前記カゼインの加水分解物は、カゼインを２種類以上のプロテアーゼを用いて分解して得られるものであることが好ましい。この場合、前記プロテアーゼとして、アルカリ性プロテアーゼ及び中性プロテアーゼを用いることが好ましい。これによって、乳酸菌の栄養源として利用されやすいペプチドやアミノ酸を得ることができる。
【００１４】
更にまた、前記乳酸菌が乳酸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）であることが好ましい。加えて、前記培養物から乳酸菌の菌体を採取し、加熱殺菌することが好ましい。これによれば、免疫賦活効果のより高い乳酸菌を得ることができると共に、食品、医薬品の原料として用いる場合の安全性をより高めることができる。
【００１５】
本発明によれば、カゼインの加水分解物を添加したコーンスティープリカー培地を用いて乳酸菌を培養することにより、免疫賦活効果の高い乳酸菌を安価に得ることができる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
まず、本発明の乳酸菌の培養方法に用いられる培地について説明する。コーンスティープリカー（以下、ＣＳＬと略す。）は、コーンスターチの製造工程中、原料（トウモロコシ）の浸漬工程で得られる浸漬液を濃縮したものであり、トウモロコシ中から溶解するタンパク質、無機成分、アミノ酸等を含んでいる。ＣＳＬは培地成分として一般に用いられており、市販のものを用いることができる。
【００１７】
また、カゼインの加水分解物は、市販のものを用いてもよく、カゼインを酵素分解又は酸加水分解して調製してもよい。本発明においては、カゼインを２種類以上の酵素を用いて加水分解して調製したものを用いることが好ましい。このようにして得られるカゼインの加水分解物は、カゼインが適度に分解されて、乳酸菌の栄養源として利用されやすいペプチドやアミノ酸を多く含んでいる。
【００１８】
カゼインの酵素分解は、例えば以下のようにして行なうことが好ましい。すなわち、カゼインを水に懸濁した後、ｐＨを９〜１０に調整し、アルカリ性プロテアーゼを基質に対して０．０５〜５質量％添加して、酵素の至適温度（４０〜７０℃）で０．５〜５時間反応させた後、反応液のｐＨを６．５〜７．５に調整し、中性プロテアーゼを基質に対して０．０５〜５質量％添加して、酵素の至適温度（３５〜５０℃）で０．５〜２４時間反応させればよい。
【００１９】
上記アルカリ性プロテアーゼとしては、食品製造に使用可能な酵素や酵素製剤であれば特に制限なく用いることができ、例えば、商品名「アロアーゼＸＡ−１０」（ヤクルト薬品工業製）、商品名「オリエンターゼ２２ＢＦ」（阪急バイオインダストリー製）、商品名「アルカラーゼ」（ノボインダストリー製）、商品名「サモアーゼ」（大和化成製）等を用いることができる。
【００２０】
また、上記中性プロテアーゼとしては、食品製造に使用可能な酵素や酵素製剤であれば特に制限なく用いることができ、例えば、商品名「パンチターゼＨＰ」、商品名「パンチターゼＡＰ」、商品名「パンチターゼＮＰ−２」（いずれもヤクルト薬品工業製）、商品名「オリエンターゼＯＮＳ」（阪急バイオインダストリー製）、商品名「ニュートラーゼ」（ノボインダストリー製）等を用いることができる。
【００２１】
本発明においては、ＣＳＬを１〜１５質量％、カゼインの加水分解物を０．０１〜５質量％含有する培地を用いることが好ましく、ＣＳＬを５〜１０質量％、カゼインの加水分解物を０．２〜０．５質量％含有する培地を用いることがより好ましい。ＣＳＬ及びカゼイン加水分解物の含有量が少な過ぎると、乳酸菌の良好な生育が期待できず、また、十分な免疫賦活効果、すなわち、ＩＬ−１２産生誘導能を有する乳酸菌を得ることができない。一方、ＣＳＬ及びカゼイン加水分解物の含有量が多過ぎると、乳酸菌を集菌する際、培地成分由来の沈殿物が混入するため、純粋な菌体を得ることができない場合がある。
【００２２】
また、上記基本的成分の他に、必要に応じて、乳糖、ブドウ糖、デキストリン等の糖源、リン酸塩等の無機成分、大豆蛋白質（その加水分解物も含む）等を添加してもよい。上記成分の中でも、乳糖を１〜１０質量％、リン酸塩を０．１〜１質量％添加することが好ましい。なお、酵母エキス、ペプトン、肉エキス等も必要に応じて添加してもよいが、コストが高くなるため好ましくない。
【００２３】
本発明で用いられる培地は、上記各成分を用いて常法にしたがって調製することができ、例えば、水（好ましくは蒸留水又はイオン交換水）に所定量のＣＳＬ及びカゼインの加水分解物を添加し、必要に応じて上記の他の成分を更に加えて均一に溶解した後、ｐＨを６．５〜７．０に調整して公知の方法（例えばオートクレーブ等）により滅菌すればよい。
【００２４】
本発明の培養方法は、上記のようにして調製した培地を用いて常法にしたがって乳酸菌の培養を行なえばよく、例えば、上記培地に乳酸菌の前培養液（もしくは寒天培地で培養した乳酸菌のコロニー）を接種し、好気性、微好気性又は嫌気性の条件下で、３０〜４５℃、１２〜７２時間培養すればよい。なお、培養中に、乳酸菌の代謝産物（例えば乳酸等）により培地のｐＨが低下するため、適宜培地のｐＨを測定し、アルカリ水溶液（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム等の水溶液）を添加して、培地のｐＨを６．５〜７．５（より好ましくはｐＨ６．８〜７．２）に保持しながら培養を行なうことが好ましい。このように培地のｐＨを中性付近に保持して培養を行なうことにより、乳酸菌の生育を良好にすることができ、菌体収量を向上させることができる。
【００２５】
本発明の培養方法において用いられる乳酸菌としては、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌａｃｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等が好ましく挙げられるが、より強い免疫賦活効果を有するＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ（ＡＴＣＣ　１９４３３、ＡＴＣＣ　１４５０８、ＡＴＣＣ　２３６５５、ＩＦＯ　１６８０３等）が特に好ましい。
【００２６】
本発明においては、乳酸菌の培養終了後、得られた培養物から乳酸菌の菌体を例えばろ過、遠心分離等の方法によって採取し、この菌体を加熱殺菌することが好ましい。これによって、食品や医薬品の原料として、より安全性の高い乳酸菌を提供することができ、しかも加熱殺菌により死菌体としても、免疫賦活効果が低下することはない。なお、殺菌した菌体は、乾燥、粉末化して食品や医薬品の原料として製品化することが好ましい。
【００２７】
本発明の免疫賦活剤は、上記乳酸菌を有効成分として含有するものである。このような免疫賦活剤は、上記乳酸菌に、必要により、賦形剤、甘味料、酸味料、ビタミン類、ミネラル類等を添加し、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、ペースト状又は液状の飲料として調製することができる。
【００２８】
本発明の免疫賦活剤の有効摂取量は、上記乳酸菌体換算で成人１日当り１ｍｇ〜１０ｇであり、より好ましくは５０〜５００ｍｇである。
【００２９】
また、本発明の免疫賦活剤は、例えば、飲料、ゼリー、キャンディー、ガム、レトルト食品、インスタント食品等に添加して摂取することもできる。この場合、上記乳酸菌を１日当たり１〜１０００ｍｇ、より好ましくは１０〜５００ｍｇ摂取できるように上記各食品中に添加することが好ましい。
【００３０】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
【００３１】
実施例
カゼイン２００ｇを水２Ｌに懸濁し、苛性ソーダでｐＨ１０に調整した後、サモアーゼ（商品名、大成化成製）を１．０ｇ添加して、７０℃で４時間反応させた。その後、塩酸で反応液のｐＨを７．０に調整した後、パンチターゼＮＰ−２（商品名、ヤクルト薬品工業製）を１．０ｇ添加して、５０℃で４時間反応させた。得られた反応液を加熱処理して酵素を失活させて、カゼイン加水分解液を得た。
【００３２】
２０質量％ＣＳＬ溶液０．２５Ｌに対し、上記カゼイン加水分解液を０〜０．７５Ｌ（カゼイン加水分解物０〜７５ｇ）加え、更に全量が１Ｌとなるようにイオン交換水を添加して、ｐＨ７．０に調整した後、オートクレーブ滅菌してカゼインの加水分解物の濃度の異なる培地をそれぞれ調製した。
【００３３】
各培地に、乳酸菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ　ＡＴＣＣ　１９４３３）の前培養液を適量添加し、ｐＨスタットを用いて、培養液のｐＨを７．０±０．１に苛性ソーダで調整しながら３７℃で２４時間培養を行なった。
【００３４】
培養終了後、培養液を遠心して菌体を回収して水洗した後、水に懸濁し、８０〜１１５℃、３０分〜３秒間加熱処理し、凍結乾燥して加熱処理菌体を得た。
【００３５】
そして、得られた各乳酸菌の加熱処理菌体を用いて、以下の方法により免疫賦活効果の測定を行なった。なお、免疫賦活効果は、ＩＬ−１２の産生誘導能を指標にした。
【００３６】
（１）マクロファージの調製
４〜８週齢のＩＣＲ系マウス（雄）の腹腔内に、１ｇ／１００ｍＬ濃度のグリセリン溶液を０．４ｍＬ／マウス注射して１晩飼育した後、頚椎脱臼によりマウスを屠殺し、腹腔内に冷却したＰＢＳを５ｍＬ／マウス注射して腹部をよくもんだ後、腹腔内液（約４ｍＬ）を注射器で取り出し、シリコンコートしたスピッツ管に入れて冷却遠心機で１２００ｒｐｍ、５分間遠心した。
【００３７】
そして、上清及び壁面の赤血球を除去した後、冷ＰＢＳを加えてピペッティングし、８００ｒｐｍ、５分間遠心分離して上清及び壁面の赤血球を除去した。この操作をさらに１回繰り返して、最後に１％ＦＣＳ加ＥＴ−ＲＰＭＩ１６４０　Ｍｅｄｉｕｍｕ（インビトロジィエン社製、以下同じ）を１ｍＬ／マウス加えて細胞を懸濁した。この細胞懸濁液５０μＬにチェルク染色液５０μＬを加えて混合し、赤血球計算板にて生細胞数を数えた。そして、計算した生細胞数に基いて、細胞懸濁液に１％ＦＣＳ加ＥＴ−ＲＰＭＩ１６４０　Ｍｅｄｉｕｍｕを加えて細胞数が１×１０６／ｍＬとなるように調整してマクロファージ液を得た。
【００３８】
そして、９６穴平底プレートに、上記マクロファージ液を２００μＬ／穴ずつ入れ、１．５〜５時間ＣＯ２インキュベーターで培養した。
【００３９】
試薬
ＰＢＳ：ＮａＣｌ　８０ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ　２９ｇ、ＫＣｌ　２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４　２ｇを蒸留水に溶解して１Ｌとし、オートクレーブで滅菌する。
【００４０】
ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ　Ｃａｌｆ　Ｓｅｒｕｍ）：冷凍保存してあるＦＣＳを５６℃ウォーターバスバスに４０分間入れ非働化して、氷冷した後、７０μｍセルストレーナーに通し、滅菌容器に入れて冷蔵保存する。
【００４１】
ＥＴ−ＲＰＭＩ１６４０　Ｍｅｄｉｕｍｕ：ＲＰＭＩ１６４０　３１．２ｇ、ＮａＨＣＯ３　３．７５ｇ、ペニシリンＧ−Ｋ（商品名、万有製薬製、１００万単位）　０．１８ｇ、カナマイシン０．１８ｇを、注射用水３Ｌに溶解して、ＣＯ２ガスを吹き込んだ後、０．４５μｍのフィルターで濾過する。
【００４２】
チュルク染色液：０．０１％ゲンチアナバイオレット水溶液：酢酸：水＝１：１：９８で混合し、冷蔵保存する。
【００４３】
（２）菌体分散液の調製
各加熱処理菌体を１ｍｇ／ｍＬとなるように５％ＦＣＳ加ＥＴ−ＲＰＭＩ１６４０　Ｍｅｄｉｕｍｕで調製した後、超音波処理を行い、菌体を分散させて菌体分散液を得た。この菌体分散液を５％ＦＣＳ加ＥＴ−ＲＰＭＩ１６４０　Ｍｅｄｉｕｍｕで１００倍に希釈し、９６穴Ｕ型プレートに２５０μＬ／穴入れ、ＣＯ２インキュベーターで１時間保温した。
【００４４】
（３）ＩＬ−１２の誘導
上記（１）のプレインキュベートした９６穴平底プレートから上清を除去して、３７℃に保温したＰＢＳで２回洗浄した後、上記（２）のプレインキュベートした菌体分散液を２００μＬ加えてＣＯ２インキュベーターで正確に２時間培養してＩＬ−１２を誘導した。
【００４５】
ＩＬ−１２の測定は、マウスＩＬ−１２測定キット（商品名「Ｃｙｔｏｃｒｅｅｎ」、ＢＩＯ　ＳＯＵＲＣＥＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ社製）を用いて行なった。その結果を表１に示す。
【００４６】
【表１】
2004041099.tif 000002
【００４７】
表１から、カゼイン加水分解物を含まないＣＳＬ培地で培養して得られた乳酸菌に比べて、カゼイン加水分解物を含むＣＳＬ培地で培養して得られた乳酸菌は、ＩＬ−１２産生誘導能が非常に高いことが分かる。
【００４８】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、カゼインの加水分解物を添加したＣＳＬ培地を用いて乳酸菌を培養することにより、優れた免疫賦活効果を有する乳酸菌を得ることができる。また、該培地は、非常に安価に調製できるので、乳酸菌の培養コストを低くすることができる。更に、こうして得られた乳酸菌を有効成分として含有させることにより、安全性が高く、優れた免疫賦活効果を有する免疫賦活剤を提供することができる。