(57)【要約】　　　（修正有）【課題】食品級生物における海洋魚不凍ぺプチドの発現方法及び食品におけるその適用方法の提供。【解決手段】　例えば凍結後の製品の氷再結晶を防止又は抑制することにより例えば潜在的凍結損傷を最小限にするように氷晶成長プロセスを改変して特に再成長における氷の寸法及び形状特徴を変更して性質を改善する製品改善用製品添加剤としての、ＩＩＩ型ＡＦＰ　ＨＰＬＣ１２に実質的に対応するアミノ酸配列をもつポリペプチド又はタンパク質の使用であって、同量のニシナメタガレイＡＦＰで得られるよりも高い特異改変活性、特に不凍活性を得るように不凍ペプチドにそれ自体公知の方法で実施することを特徴とする前記使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　ＩＩＩ型ＡＦＰタンパク質ＨＰＬＣ１２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列をもつ実質的に純粋な単離組換え食品級ポリペプチド又はタンパク質。
【請求項２】
　ＩＩＩ型ＡＦＰタンパク質ＨＰＬＣ１２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列をもつポリペプチド又はタンパク質を含む食品であって、該食品は前記ポリペプチド又はタンパク質を前記形態又は量で天然に含む食用生物以外のものである、前記食品。
【請求項３】
　該ポリペプチド又はタンパク質が組換えポリペプチド又はタンパク質である請求項２に記載の食品。
【請求項４】
　該ポリペプチド又はタンパク質が食品級ポリペプチド又はタンパク質である請求項２又は３に記載の食品。
【請求項５】
　ＩＩＩ型ＡＦＰタンパク質ＨＰＬＣ１２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列をもつ組換えポリペプチド又はタンパク質を発現し得る酵母を含む食品であって、該食品は前記ポリペプチド又はタンパク質を前記形態又は量で天然に含む食用生物以外のものである、前記食品。
【請求項６】
　食品が冷凍用製品である請求項２〜５のいずれか一項に記載の食品。
【請求項７】
　食品がアイスクリームである請求項６に記載の食品。
【請求項８】
　食品が冷凍パン生地又は冷凍パン製品である請求項６に記載の食品。
【請求項９】
　ＩＩＩ型ＡＦＰタンパク質ＨＰＬＣ１２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列をもつポリペプチド又はタンパク質を添加した生物材料であって、該生物材料は前記ポリペプチド又はタンパク質を前記形態又は量で天然に含む食用生物以外のものである、前記生物材料。
【請求項１０】
　該ポリペプチド又はタンパク質が組換えポリペプチド又はタンパク質である、請求項９に記載の生物材料。
【請求項１１】
　ＩＩＩ型ＡＦＰタンパク質ＨＰＬＣ１２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列をもつ組換えポリペプチド又はタンパク質を発現し得る酵母を添加した生物材料。
【請求項１２】
　該生物材料が動物臓器もしくは組織または植物である、請求項９〜11のいずれか一項に記載の生物材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．序論
　極地魚類の血液は不凍ペプチド（又は、抗凍結ペプチドとも言う）の存在により凍結から保護されている。これらの不凍ペプチドはその構造により４種類に分類することができる（ＤａｖｉｅｓとＨｅｗ，１９９０）。Ｉ型ＡＦＰはアラニン含量が高く、トレオニンとアスパラギン残基が等間隔で分配されており、α螺旋構造をもつ。ＩＩ型ＡＦＰは特徴的な高い（８％）システイン含量をもつ。ＩＩＩ型ＡＦＰは小さい（約６４アミノ酸長）球状ペプチドである。最後のグループである不凍糖タンパク質は、特定二糖が結合した反復トリペプチドモチーフをもつ。これらの全ペプチドは共通して非束一性凝固点降下及び氷晶成長抑制性をもつ。これらの特徴は冷凍品の氷晶状態を改変するのに利用できると考えられる。魚類の血液からこれらのペプチドを精製するのは経済的に決して有効な方法とは思われないので、最新バイオテクノロジーを利用してＡＦＰを大量生産する方法が求められている。
【背景技術】
【０００２】
　微生物における不凍ペプチドの生産に関する初期研究は酵母と大腸菌におけるＩ型ＡＦＰの発現に集中していた（Ｗａｒｒｅｎら，１９９３，ＭｃＫｏｗｎら，１９９１）。大腸菌は毒素を生産する能力があるので、この細菌は一般に安全とみなす（ＧＲＡＳ）ことができず、食品産業用ＡＦＰの製造に使用するには問題がある。
【０００３】
　酵母株のうちにはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのようにＧＲＡＳ生物とみなされるものが知られており、大腸菌と異なり、増殖培地に異種タンパク質を分泌する能力をもち、産物の下流処理を助長する。従って、酵母は種々の異種タンパク質の生産用宿主生物として魅力的である（Ｒｏｍａｎｏｓら，１９９２）。
【０００４】
　酵母におけるＡＦＰ生産の最初の報告は、合成Ｉ型ＡＦＰと末端を欠失させたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓプロテインＡの融合物の細胞内蓄積に関するものであった（Ｗａｒｒｅｎら，１９９３）。このペプチドは有害な凍結作用から酵母を保護すると主張された。Ｉ型ＡＦＰ自体の細胞外生産については記載されていない。他の型のＡＦＰについては全く記載されていない。
【０００５】
　本研究室では、天然ニシナメタガレイ（Ｗｉｎｔｅｒ　Ｆｌｏｕｎｄｅｒ）Ｉ型ＡＦＰ（ＨＰＬＣ６）の合成遺伝子を含む発現ベクターをもつ酵母形質転換細胞が構築されており（Ｄｒｉｅｄｏｎｋｓら，１９９５）、これは現在放棄されている出願人のＰＣＴ出願第ＷＯ９４／０３６１７号に記載されている。これらの酵母による活性モノマーＡＦＰの分泌は立証できなかった。有意な氷再結晶抑制活性を得る唯一の方法は、内因性酵母プロテアーゼによる後期処理により活性モノマーを生成できるように設計されたＩ型ＡＦＰのマルチマーを発現させることであった（Ｄｒｉｅｄｏｎｋｓら，１９９５）。このアプローチは最終的に活性なＩ型ＡＦＰを生産できるが、部分的に処理された不均一形態のマルチマーＡＦＰの分泌を伴った。活性ペプチドをモノマーとして得るように後期処理するのは工業生産目的には許容できないとみなされた。労力と費用が増すだけでなく、食品適用認可を得るにも問題があった。これはまず第１に、活性モノマーを得るための薬品の使用に起因し、第２に非天然配列の発現に起因する。
【０００６】
　従って、食品級生物を使用して簡単で効果的に活性モノマーＡＦＰを発現及び分泌させ、食品製造に適用可能な工業的に許容可能な方法を提供することは不可能であると思われた。
【０００７】
　酵母でＩ型ＡＦＰを発現させることにより生じる問題を解決するために、本発明者らは酵母でオーシャンパウト（Ｏｃｅａｎ　Ｐｏｕｔ、ゲンゲ科の魚の一種）からのＩＩＩ型ＡＦＰを発現させようと試みた。ＩＩＩ型ＡＦＰは小さい球状タンパク質であり、この理由からα螺旋Ｉ型ＡＦＰよりも酵母で発現させるのに適しているのではないかと考えた。
【０００８】
　ＩＩＩ型ＡＦＰはオーシャンパウト（Ｍａｃｒｏｚｏａｒｃｅｓ　ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）やオオカミウオ等の極地魚類の血液中に存在する（ＤａｖｉｅｓとＨｅｗ，１９９０）。オーシャンパウトの血液を分画すると、ＩＩＩ型ＡＦＰの少なくとも１２種の異なる変種の存在が判明すると記載されている（図１、Ｈｅｗら，１９８４、ＤａｖｉｅｓとＨｅｗ，１９９０）。これらのペプチドは相同度が高く、少なくとも６０％のアミノ酸が一致し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発は、氷に結合するために必要な全種のオーシャンパウトＡＦＰに共通の１群の表面残基を立証している（Ｃｈａｏら，１９９４）。２３及び３６位のグルタミン酸（Ｇｌｕ）の負電荷はポリペプチドの熱安定性と熱ヒステリシス活性に関与すると思われる（Ｌｉら，１９９１）。これに続く３種の保存アミノ酸である１４位のアスパラギン（Ａｓｎ）、１８位のトレオニン（Ｔｈｒ）及び４４位のグルタミン（Ｇｌｎ）もＡＦＰ−ＩＩＩの氷結合活性に重要な残基であると思われる（Ｃｈａｏら，１９９４）。
【０００９】
　本発明者らはオーシャンパウトＩＩＩ型ＡＦＰのＨＰＬＣ−１変種を酵母で発現させることに成功したが、ＩＩＩ型ＡＦＰの十分活性なモノマーを分泌させることはできなかった。これでは上記問題を解決していないことは明白である。
【００１０】
　更に、本発明者らは酵母により生産されるＩＩＩ型ＡＦＰ　ＨＰＬＣ−１がオーシャンパウト血液から単離したＡＦＰ調製物と比較した場合に予想外に低い特異活性を示すことを確認した。この低い活性は恐らくペプチドの不適正な折り畳み又はＨＰＬＣ−１変種の固有の低い特異活性に起因すると考えられた。ニシナメタガレイにみられるものよりも高活性のＡＦＰを生産するためにこのような研究を続けても明らかに見込みがないと思われた。
【００１１】
　本発明者らは更に、オーシャンパウト血液からのＡＦＰを種々のＨＰＬＣフラクションに分画してその再結晶活性を分析し、ＨＰＬＣ−１以外のどのフラクションが本発明者らの所望の用途に潜在的に有用であるかを調べた。１２種のＩＩＩ型ＡＦＰフラクションのうちで試験濃度で再結晶抑制に活性な唯一のフラクションはＨＰＬＣ−１２であると思われた。従って、Ｉ型ＡＦＰ及びＩＩＩ型ＡＦＰのＨＰＬＣ−１に伴う組換え生産の問題を解決できるならば、ＨＰＬＣ−１２は有用であろうと判断した。
【００１２】
　その後、Ｉ型ＡＦＰとＩＩＩ型ＡＦＰの上記実験結果から全く予想外なことに、本発明者らは、ＩＩＩ型ＡＦＰ　ＨＰＬＣ−１２に決定されたアミノ酸配列をコードする核酸の酵母発現により、モノマーとして発現及び分泌され且つ活性の低下しない産物が得られることを発見した。こうして、組換えＤＮＡ技術を使用して純粋な活性ＡＦＰを製造する非常に適切な製造方法が入手可能になった。
【００１３】
　また、モノマー自体として酵母により分泌される組換えＨＰＬＣ−１２がオーシャンパウト血液から単離したＡＦＰの混合物の高い不凍ペプチド活性を示すことができることも実際に発見された。この不凍活性はニシナメタガレイＩ型ＡＦＰのほぼ２倍である。更に、産物はこのように他のＡＦＰよりも再結晶アッセイで高活性であり、所望の用途に著しく適している。
【００１４】
　天然に存在する種々のＩＩＩ型ＡＦＰのアミノ酸組成、配列及び核酸配列は既に知られている。ＤａｖｉｅｓとＨｅｗ（１９９０）はこれについて記載しており、ファージにおける魚のゲノムＤＮＡのｃＤＮＡクローンに基づいてオーシャンパウトに決定されたＨＰＬＣ−１，４，５〜７，９，１１及び１２の配列について１９８５年以降のＬｉらの論文と１９８８年以降のＨｅｗらの論文に言及している。Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｉｎ　１９９４においてＣｈａｏ，Ｈ．らは、ＩＩＩ型ＡＦＰ　ＨＰＬＣ−１２のイソ型を二次元ＮＭＲ試験のために大腸菌でどのように合成及び発現させるかを記載しており、不凍タンパク質における構造／機能関係の理解を助けると共に、氷結合のためのモチーフを定義している。次いで、核酸を突然変異させ、プロリン突然変異体である突然変異ＩＩＩ型ＡＦＰポリペプチドを製造している。非突然変異組換えＨＰＬＣ−１２の熱ヒステリシス値をオーシャンパウトから単離したＡＦＰ即ちＩＩＩ型ＡＦＰと比較している。活性プロフィルは標準誤差の範囲内で区別できないと記載されている。他のＡＦＰ型との比較は述べられていない。異常に高い熱ヒステリシス値は示されておらず、実際に値は全く与えられていない。再結晶性に及ぼす効果については全く記載されていない。本発明者らはここで熱ヒステリシス活性が再結晶性と無関係であることを指摘する。熱ヒステリシス値は結合強度の指標であり、再結晶アッセイのように不凍活性の尺度を与えるものではない。高いヒステリシス値を示すが、再結晶に効果がないか又はその逆のタンパク質の例は公知であり、相関の欠如を裏付けている。
【００１５】
　組換えＨＰＬＣ−１で得られる結果と、ＡＦＰに関する刊行物に開示されている内容を考慮すると、組換えＨＰＬＣ−１２の高いＡＦＰ活性は全く予想外であった。血液からのオーシャンパウトＩＩＩ型ＡＦＰのセファデックスカラム分画により得られるようなＩＩＩ型ＡＦＰフラクションの熱ヒステリシス値は、ニシナメタガレイＡＦＰ（Ｉ型）及びケムシカジカＡＦＰ（ＩＩ型）の値と共にＨｅｗら，１９８４の論文の表１に与えられている。これらの値は、組換えＤＮＡ技術を用いずに該当種の血液に由来するフラクションから得たものである。ＡＦＰ間の活性にはほんの僅かな差があり、ＱＡＥ−Ａが最高活性であると思われた。ＱＡＥ−ＡはＱＡＥセファデックスカラムで分離できた５種の異なる変種の１種であり、その後、ＨＰＬＣ−１２に由来することが示された。しかし、その差は非常に僅かで測定変動による偏差の範囲内であると記載されている。熱ヒステリシス値の差は同一論文中でＨｅｗら自身が明らかに無関係として退けている。同著者らは「オーシャンパウトＡＦＰの殆どは他の公知ＡＦＧＰ及びＡＦＰで検出されると同等の熱ヒステリシスを示した」と述べている。その後の文献では種々の型の熱ヒステリシス値又はＩ型とＩＩＩ型の比較は記載されていない。種々のフラクションの再結晶効果については全く教示又は示唆されていない。従って、単一のＩＩＩ型ＡＦＰがニシナメタガレイＡＦＰよりも著しく高い氷晶成長抑制特異活性を示すとは予想外であった。ＨＰＬＣ−１２がＩ型ＡＦＰペプチド又は他のＩＩＩ型ＡＦＰペプチドよりも著しく高い活性を示すことも開示又は示唆されていなかった。
【００１６】
　ＩＩＩ型ＨＰＬＣ−１２のＡＦＰ活性が高いかどうかを試験するために、本発明者らはＨＰＬＣにより血液からのオーシャンパウトＡＦＰ調製物を分画し、個々のペプチド成分が氷晶成長を抑制する能力を試験した。本発明者らはＨＰＬＣ−１２変種が最高の特異活性をもつことを確認した。他の成分は魚ＩＩＩ型ＡＦＰ１００ｍｇ／ｍｌに等価の濃度で検出可能な活性を示さなかった。
【００１７】
　こうして、本発明者らはＩ型ＡＦＰのほぼ２倍のＡＦＰ活性を示す純粋な食品級ポリペプチドの製造方法を見いだした。このポリペプチドはＩ型ＡＦＰとは対照的にモノマーとして分泌できるので、大規模生産に理想的であり、組換え技術により製造されるＩ型ＡＦＰよりも著しく少ない下流処理工程しか必要としない。更に、モノマーとしての発現は、オーシャンパウト血液中に天然に存在するペプチドとほぼ同一の製品を製造できることを意味する。このような製品は天然食品級生物であるオーシャンパウトに天然に存在するＡＦＰと非常によく似ているため、食品用に許容され易い。
【００１８】
　こうして本発明により、ニシナメタガレイＩ型ＡＦＰよりも内在的に高い特異活性をもつＨＰＬＣ−１２型の組換えＩＩＩ型ＡＦＰを安価で非常に容易に大量生産することが初めて可能になった。本発明によるＩＩＩ型不凍ペプチドは、特異再結晶抑制活性が高いため、アイスクリームや冷凍生地及び他の冷凍パン製品等の冷凍用食品で利用するのに最も有望な候補である。
【００１９】
　この方法では活性ポリペプチド、好ましくはモノマーとしての発現産物の分泌が食品製造工程で現場で行われるため、ＡＦＰ自体を加える必要がないという付加的利点もある。こうして発酵工程でＩＩＩ型ＡＦＰ　ＨＰＬＣ−１２に実質的に対応するポリペプチドを分泌することが可能な酵母を使用して発酵産物を製造することが可能になったため、食品製造工程でポリペプチドの精製やその後期添加等の付加段階を必要とせずに、ＩＩＩ型ＡＦＰ　ＨＰＬＣ−１２に実質的に対応するポリペプチドを現場で製造できるようになった。ＩＩＩ型ＡＦＰ　ＨＰＬＣ−１２に実質的に対応するポリペプチドを現場で発現できるため、良好な凍結性をもつ植物、果物もしくは野菜及びトランスジェニック動物又はその部分を開発することも今や可能である。
【００２０】
　本発明は、例えば凍結後の製品の氷再結晶を防止又は抑制することにより例えば潜在的凍結損傷を最小限にするように氷晶成長プロセスを改変して特に再成長における氷の寸法及び形状特徴を変更した改善製品の製造方法に関し、該方法は、非改善製品又は非改善製品の製造で通常使用される成分もしくは混合物に、ニシナメタガレイからのＩ型ＡＦＰよりも高いＡＦＰ活性を示すＩＩＩ型ＡＦＰ　ＨＰＬＣ−１２に実質的に対応するアミノ酸配列をもつポリペプチド又はタンパク質を、氷晶成長を改変するに十分な量で加えることを特徴とする。製品は食品でも生物材料でもよい。生物材料は例えば動物臓器もしくは組織又は植物材料であり得る。特に、組換えポリペプチドを加えることができる。ポリペプチドは食品級状態の最終製品を提供するように食品級状態であることが好ましい。本発明による方法は製品が食品であると好ましい。適切なポリペプチドの特定態様は実施例に例示するような酵母ＡＦＰである。改善された凍結性を示す改善製品の製造を目的とする本発明の製造方法は、明細書の他の項で説明する同様に本発明の範囲に含まれる新規ポリペプチド製造方法で得られるＡＦＰを加えると適切である。
【００２１】
　「ＩＩＩ型ＡＦＰ　ＨＰＬＣ−１２のアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列をもつポリペプチド又はタンパク質」なる用語は、オーシャンパウトから単離したＨＰＬＣ−１２のアミノ酸配列に等しいアミノ酸配列を意味し、更に、天然タンパク質と同一のＡＦＰ活性をもつポリペプチドをコードするものであれば公知アミノ酸配列と１又は２個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列も意味する。突然変異又は差異はポリペプチドの活性に不可欠であると知られているアミノ酸には存在すべきでない。従って、プロリン残基は欠失又は置換していないことが好ましい。アミノ酸配列に差異がある場合にはサイレント突然変異であることが好ましく、置換はポリペプチドのヒドロパシープロフィルを変えず、従って、ポリペプチド構造と活性をさほど変えないと予想される保存性置換であり、即ち疎水性側鎖をもつアミノ酸は疎水性側鎖をもつ別のアミノ酸のみで置換し、親水性側鎖をもつアミノ酸は親水性側鎖をもつ別のアミノ酸のみで置換することが好ましい。ＨＰＬＣ−１２とＨＰＬＣ−１のアミノ酸相同度は６０％未満である。６０％を越える、好ましくは７０％を越える、より好ましくは８０％を越える相同度を示すアミノ酸配列がＨＰＬＣ−１２に類似の性質を示すポリペプチドを表すと予想することができ、従って、ＨＰＬＣ−１２に実質的に対応するとみなされる。更に、前記アミノ酸配列によりコードされるポリペプチドは少なくともニシナメタガレイからのＩ型ＡＦＰのＡＦＰ活性、好ましくは少なくとも天然ＨＰＬＣ−１２のＡＦＰ活性を示すべきである。ＡＦＰ活性は定量しようとするポリペプチドの連続希釈液と、同量のＩ型ＡＦＰ及び／又はオーシャンパウト血液から得られるような天然ＨＰＬＣ−１２の希釈液を使用して再結晶アッセイで比較することにより定量できる。このような再結晶アッセイを実施及び評価することが可能な方法については実施例に例示する。上記特徴の全部又は多くを示すポリペプチドはＨＰＬＣ−１２に実質的に対応するとみなすことができる。
【００２２】
　例えば凍結後の製品の氷再結晶を防止又は抑制することにより例えば潜在的凍結損傷を最小限にするように氷晶成長プロセスを改変して特に再成長における氷の寸法及び形状特徴を変更して性質を改善した改善製品の製造方法であって、非改善製品自体又は非改善製品を製造するために通常使用される成分もしくは混合物に、ＩＩＩ型ＡＦＰ　ＨＰＬＣ−１２のアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列をもつ食品級組換えポリペプチド又はタンパク質を発現させることが可能な宿主生物を加え、次いで、非改善製品を製造するために通常使用される段階以外に明細書の他の項に開示するような本発明によるポリペプチド製造方法を実施することにより、ＩＩＩ型ＡＦＰ　ＨＰＬＣ−１２をコードする核酸配列を製品又は成分もしくは混合物で発現させるような条件下に宿主生物を置くことを特徴とする方法も本発明の範囲に含まれる。製品は食品又は生物材料が適切であり得る。生物材料は例えば動物臓器もしくは組織又は植物材料であり得る。特に、組換えポリペプチドを加えることができる。ポリペプチドは食品級状態の最終製品を提供するように食品級状態であることが好ましい。改善する製品を食品とする方法が好ましい。本発明による方法に適切なポリペプチドの特定態様は、実施例に例示するような酵母ＡＦＰである。ＡＦＰポリペプチド又はタンパク質を製品の混合物もしくは成分又は製品自体に放出するために、製造工程中又は後に宿主生物を死滅又は損傷させてもよい。このような死滅又は損傷は当業者に公知の多数の方法で実施することができ、ポリペプチド又はタンパク質のＡＦＰ活性が低下するほど苛酷な条件下で方法を実施しないように注意する必要がある。あるいは、成分もしくは混合物又は食品自体にＡＦＰポリペプチド又はタンパク質を分泌することが可能な宿主生物を製造工程で使用してもよい。例えば、パン製品等の食品の製造工程ではパン酵母を宿主生物として利用できる。製造方法は焼く前又はその間に別の酵母即ちＩＩＩ型ＡＦＰ　ＨＰＬＣ−１２に実質的に対応するポリペプチド又はタンパク質を生地で発現及び分泌することが可能なＤＮＡ構築物を含む酵母を加える以外は通常通りに実施し、改善された凍結性をもつ生地又は焼き菓子製品を製造することができる。同様に、乳酸菌等の細菌を使用する方法も本発明の適切な態様を構成する。発酵を必要とするチーズ製造及びヨーグルト製造方法又は他の食品製造方法も本発明に含まれる型の方法である。
【００２３】
　本発明により製品を改善する製造方法は、ＩＩＩ型ＡＦＰ　ＨＰＬＣ−１２に実質的に対応するアミノ酸配列をもつ組換えポリペプチド又はタンパク質が発現又は分泌された後に、ＡＦＰポリペプチド又はタンパク質をモノマー産物として得るためにプロテアーゼ又は薬品の添加する必要なしに実施できるという利点がある。
【００２４】
　例えば凍結後の製品の氷再結晶を防止又は抑制することにより例えば潜在的凍結損傷を最小限にするように氷晶成長プロセスを改変して特に再成長における氷の寸法及び形状特徴を変更して性質を改善する製品改善用製品添加剤としての、上記に開示した態様のいずれかのＩＩＩ型ＡＦＰ　ＨＰＬＣ−１２に実質的に対応するアミノ酸配列をもつポリペプチド又はタンパク質の使用であって、ニシナメタガレイＡＦＰで得られるよりも高い特異不凍活性を得るようにＡＦＰにそれ自体公知の方法で実施することを特徴とする使用も本発明の範囲に含まれる。製品は食品が好ましい。製品は生物材料も適切である。タンパク質又はポリペプチドは組換えタンパク質又はポリペプチドであり得る。
【００２５】
　製品を改善するための方法又は使用の好適態様は、製品が冷凍用製品であるような方法又は使用である。食品ではアイスクリームが適切な例である。上述のように、生地又はパン製品も有用である。
【００２６】
　例えば凍結後の製品の氷再結晶を防止又は抑制することにより例えば潜在的凍結損傷を最小限にするように氷晶成長プロセスを改変して特に再成長における氷の寸法及び形状特徴を変更して性質を改善する食品改善用食品添加剤として、上記に開示した態様のいずれかのＩＩＩ型ＡＦＰ　ＨＰＬＣ−１２に実質的に対応するアミノ酸配列をもつ食品級組換えポリペプチド又はタンパク質を含む食品も本発明の範囲に含まれる。このような食品は、単にオーシャンパウトに天然に存在する形態及び数でオーシャンパウトＨＰＬＣ−１２のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列をもつポリペプチド又はタンパク質をコードする配列を含むオーシャンパウト等の天然食用生物を含まない。本発明による製品の適切な分類は非動物製品である。別の適切な分類は人造製品の分類である。植物製品も本発明による製品の適切な例である。本発明による食品は、上記態様のいずれかの製品改善方法又は使用により得られる。
【００２７】
　特に、例えば凍結後の製品の氷再結晶を防止又は抑制することにより例えば潜在的凍結損傷を最小限にするように氷晶成長プロセスを改変して特に再成長における氷の寸法及び形状特徴を変更して改善された耐凍結性をもつ食品級組換え宿主生物を含む食品であって、食品級宿主生物が上記に開示した態様のいずれかのＩＩＩ型ＡＦＰ　ＨＰＬＣ−１２に実質的に対応するアミノ酸配列をもつ食品級組換えポリペプチド又はタンパク質を含むか及び／又はこれに囲まれており、及び／又は凍結前にこのようなポリペプチド又はタンパク質を発現及び／又は分泌することが可能な食品も本発明の範囲に含まれる。
【００２８】
　このような組換え食品級宿主生物も本発明の保護範囲に含まれる。食品級組換え宿主生物は少なくとも１種のＡＦＰコーディング核酸配列を発現することが可能であり、前記核酸配列はＤＮＡ構築物に含まれ、前記ＤＮＡ構築物は天然宿主生物には存在せず、前記ＤＮＡ構築物は、
（ａ）宿主生物で活性な強力で場合により誘導性のプロモーターと、
（ｂ）下記（ｃ）のＡＦＰコーディング核酸配列の発現中に宿主生物により生産されるタンパク質を分泌することが可能な任意ＤＮＡシグナル配列中に存在していてもよいＡＴＧ開始コドン（その場合にはシグナル配列はＡＦＰコーディング核酸配列と同種でも異種でもよく、ＡＴＧ開始コドンと同一読み枠に配置される）と、
（ｃ）ＩＩＩ型ＡＦＰタンパク質ＨＰＬＣ−１２のアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列をコードし、ＡＴＧ開始コドンと同一読み枠に配置された少なくとも１種の核酸配列と、場合により、
（ｄ）ＡＦＰコーディング核酸配列の３’末端に結合した停止コドン
をこの順序で含む。
【００２９】
　このような組換え宿主生物の適切な態様はポリペプチド製造方法に関して以下に記載し、これらの生物自体も発明の範囲に含まれる。
【００３０】
　本発明は更に、氷晶の成長及び形状改変活性を示す組換えポリペプチド又はタンパク質、即ちニシナメタガレイＡＦＰの不凍活性よりも高い特異不凍活性を示す組換え不凍ペプチド（ＡＦＰ）の製造方法にも関し、該方法は、
１）天然宿主生物には存在せず且つ
（ａ）宿主生物で活性な強力で場合により誘導性のプロモーターと、
（ｂ）下記（ｃ）のＡＦＰコーディング核酸配列の発現中に宿主生物により生産されるタンパク質を分泌することが可能な任意ＤＮＡシグナル配列中に存在していてもよいＡＴＧ開始コドン（その場合にはシグナル配列はＡＦＰコーディング核酸配列と同種でも異種でもよく、ＡＴＧ開始コドンと同一読み枠に配置される）と、
（ｃ）ＩＩＩ型ＡＦＰタンパク質ＨＰＬＣ−１２のアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列をコードし、ＡＴＧ開始コドンと同一読み枠に配置された少なくとも１種の核酸配列と、場合により、
（ｄ）ＡＦＰコーディング核酸配列の３’末端に結合した停止コドン
をこの順序で含むＤＮＡ構築物に含まれる少なくとも１種のＡＦＰコーディング核酸配列の発現を生じるか又は誘導するような条件下で食品級宿主生物を培養することを特徴とする。
【００３１】
　前記方法は場合により更に、それ自体公知の方法で更に処理することにより得られるＡＦＰコーディング核酸配列から発現される産物を採取する段階を含んでもよい。ＩＩＩ型ＡＦＰタンパク質ＨＰＬＣ−１２のアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列をコードする核酸配列の発現産物の分泌を得るために、ＤＮＡ構築物は更に、宿主の培養中に宿主による分泌を可能にする宿主生物のシグナル配列も含んでいてもよい。宿主生物は微生物が適切である。適切な食品級微生物は酵母等の真菌類と、乳酸菌等の細菌類である。酵母細胞Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓが適切な酵母宿主細胞の例である。どの酵母細胞が適切であるか、また、どの形質転換及び発現系を利用できるかは食品製造発酵方法の当業者により判断されよう（Ｒｏｍａｎｏｓら，ＣａｍｐｂｅｌｌとＤｕｆｆｕｓ）。乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍも適切な細菌宿主生物の例であり、乳製品に関連する細菌の組換えＤＮＡ研究に携わる当業者に公知の通り、多数の菌株が知られ、適切な形質転換及び発現系が存在する（Ｇａｓｓｏｎ，１９９３）。ＦＤＡには公衆に入手可能な食品級生物のリストがある。当業者は食品級とみなされる生物、即ちＧＲＡＳ（一般に安全と認められる）状態の生物を判断できる。特に、食品発酵及び乳製品製造に関連する生物が適切である。
【００３２】
　「ＩＩＩ型ＡＦＰタンパク質ＨＰＬＣ−１２のアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列をコードする１つの核酸配列」なる用語は、オーシャンパウトからの天然ＨＰＬＣ−１２のアミノ酸配列を厳密にコードする任意の核酸を意味する。このような核酸は遺伝コードの縮重、即ち異なる核酸コドンが同一アミノ酸をコードするという事実による差異があってもよい。更に、天然タンパク質と同一のＡＦＰ活性をもつポリペプチドをコードするものであれば、既知アミノ酸配列と１又は２個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列をコードする核酸配列も本発明の範囲に含まれる。突然変異又は差異はポリペプチドの活性に不可欠であると知られているアミノ酸には存在すべきでない。従って、プロリン残基は欠失又は置換していないことが好ましい。アミノ酸配列に変異がある場合にはサイレント突然変異であることが好ましく、置換はポリペプチドのヒドロパシープロフィルを変えず、従って、ポリペプチド構造と活性をさほど変えないと予想される保存性置換であり、即ち疎水性側鎖をもつアミノ酸は疎水性側鎖をもつ別のアミノ酸のみで置換し、親水性側鎖をもつアミノ酸は親水性側鎖をもつ別のアミノ酸のみで置換することが好ましい。ＨＰＬＣ−１２とＨＰＬＣ−１のアミノ酸相同度は６０％未満である。６０％を越える、好ましくは７０％を越える、より好ましくは８０％を越える相同度を示すアミノ酸配列がＨＰＬＣ−１２に類似の性質を示すポリペプチドを表すと予想することができ、従って、ＨＰＬＣ−１２に実質的に対応するとみなすことができる。従って、「実質的に対応」なる用語は、天然ＨＰＬＣ−１２のアミノ酸配列に６０％を上回る相同度を示すアミノ酸配列をコードする核酸配列を意味する。更に、前記アミノ酸配列によりコードされるポリペプチドは、少なくともニシナメタガレイからのＩ型ＡＦＰのＡＦＰ活性、好ましくは少なくとも天然ＨＰＬＣ−１２のＡＦＰ活性を示すべきである。ＡＦＰ活性は、定量しようとするポリペプチドの連続希釈液と、被験ポリペプチドと同一希釈液中のＩ型ＡＦＰ及び／又はオーシャンパウト血液から得られるような天然ＨＰＬＣ−１２を使用して再結晶アッセイで比較すること、即ち同一ｗ／ｖのポリペプチド又はタンパク質の比較により定量することができる。このような再結晶アッセイを実施及び評価することが可能な方法については実施例に例示する。上記特徴の全部又は多くを示すポリペプチドはＨＰＬＣ−１２に実質的に対応するとみなすことができる。
【００３３】
　本発明の好適態様では、ＤＮＡ構築物と宿主生物の培養条件は、ＩＩＩ型ＡＦＰタンパク質ＨＰＬＣ−１２のアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列をもつモノマーポリペプチドを分泌するように選択される。従って、ＤＮＡ構築物はＩＩＩ型ＡＦＰタンパク質ＨＰＬＣ−１２のアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列のダイマー又はマルチマーをタンデムに発現しないことが好ましい。ダイマー又はマルチマーが生産されると、付加的な下流処理段階が必要になったり、活性ポリペプチドを分泌できなくなったりする。従って、ＤＮＡ構築物はＩＩＩ型ＡＦＰタンパク質ＨＰＬＣ−１２のアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列をコードする核酸配列をモノマー形態で含むことが好ましい。当然のことながら、ＤＮＡ構築物はＩＩＩ型ＡＦＰタンパク質ＨＰＬＣ−１２のアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列をコードする核酸配列の多重コピーをモノマー形態でタンデムに含んでいてもよい。
【００３４】
　本発明の別の好ましい態様は、ＩＩＩ型ＡＦＰ　ＨＰＬＣ−１２に実質的に対応するアミノ酸配列をコードする核酸配列が該方法の宿主生物の好適コドンを含むＤＮＡ構築物を含む。これは、特に宿主生物で所定のコドンを避けることにより翻訳効率が増すという点で好ましい。原核生物、酵母及び植物で好ましいコドン使用はニシナメタガレイのコドン使用と異なる。例えばコドンＧＣＡ、ＧＣＧ及びＧＣＴの合計は大腸菌、Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＺ．ｍａｙｓでは公知遺伝子のアラニンコドンの６５％以上に相当するが、ニシナメタガレイ等の魚類のアラニンコドンでは２５％未満である。トレオニンコドンＡＣＡ、ＡＣＧ及びＡＣＴの場合も同様である（ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２６２６）。乳酸菌及び酵母で好ましいコドン使用はこれらの微生物群に関する文献から得られる。どのコドンが好ましいかは、これらの特定発現生物を用いる組換えＤＮＡ技術の当業者により判断されよう。
【００３５】
　宿主生物が酵母である場合には、ＤＮＡ構築物の好ましい態様はシグナル配列としてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのα接合因子(α−ｍａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ)のＤＮＡプレ配列を含む。別の態様では、プレ配列とＡＦＰコーディング核酸配列の間にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのα接合因子のプロ配列も含んでいてもよく、従って、プレ配列とプロ配列とＡＦＰコーディング核酸配列が同一読み枠に配置される。あるいは宿主生物が酵母である場合には、ＤＮＡ構築物の好適態様はＡＦＰをコードする核酸配列の前にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのインベルターゼシグナル配列を含む。
【００３６】
　宿主生物が酵母である場合には、ＤＮＡ構築物の好適態様はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの誘導的ＧＡＬ７プロモーター又は構成的ＧＡＰＤＨプロモーターを含む。他の宿主生物でＤＮＡ構築物に含まれる適切なプロモーターも周知である。
【００３７】
　利用可能な形質転換系又はその要素の例は、酵母についてはＣａｍｐｂｅｌｌとＤｕｆｆｕｓ、植物についてはＰＣＴ／ＵＳ９０／０６２６及びｖａｎ　ｄｅｎ　Ｅｌｚｅｎら（１９８５）、動物についてはＨａｎａｈａｎ（１９８８）の各文献に挙げられている。
【００３８】
　本発明以前にこのような高いＡＦＰ活性を示すＩＩＩ型ＡＦＰ　ＨＰＬＣ−１２に実質的に等価の実質的に単離精製された食品級組換えポリペプチド又はタンパク質は製造されていなかった。ニシナメタガレイよりも高いＡＦＰ活性を示すＩＩＩ型ＡＦＰ　ＨＰＬＣ−１２に実質的に等価の実質的に単離された食品級組換えポリペプチド又はタンパク質が製造されたのはこれが最初である。本発明は、例えば凍結後の製品の氷再結晶を防止又は抑制することにより例えば潜在的凍結損傷を最小限にするように氷晶成長プロセスを改変して特に再成長における氷の寸法及び形状特徴を変更して改善された性質を示す実質的に純粋な単離組換え食品級ポリペプチド又はタンパク質、即ち同量のニシナメタガレイＩ型ＡＦＰよりも高いＡＦＰ活性を示す組換え不凍ペプチド（ＡＦＰ）を含み、前記ポリペプチド又はタンパク質はＩＩＩ型ＡＦＰタンパク質ＨＰＬＣ−１２のアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列をもつ。このような組換えポリペプチド、特に氷晶成長抑制活性等の上記改変活性を示す組換えポリペプチド又はタンパク質、即ち本発明の上記態様のいずれかに記載の方法により製造され、ニシナメタガレイよりも高い特異不凍活性を示す組換え不凍ペプチド（ＡＦＰ）も本発明の範囲に含まれる。
２．材料と方法
２．１　菌株と増殖条件
　プラスミドの増幅には大腸菌株ＪＭ１０９（ｅｎｄＡ１，ｒｅｃＡ１，ｓｙｒＡ９６，ｔｈｉ，ｈｓｄＲ１７，ｒｋ−，ｍｋ＋　ｒｅｌＡ１　ｓｕｐＥ４４，Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら，１９８５）を用いた。多重コピー組み込みプラスミドの形質転換にはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＳＵ５０（ＭＡＴａ，ｃｉｒ°，ｌｅｕ２，ｈｉｓ４，ｃａｎ１；　Ｖｅｒｂａｋｅｌ，１９９１）を用いた。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むルリア寒天プレートで大腸菌形質転換細胞を選択した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）。必須アミノ酸（ヒスチジン２０μｇ／ｍｌ、ウラシル２０μｇ／ｍｌ）を補充した選択ＹＮＢプレート（アミノ酸を含まない０．６７％　Ｄｉｆｃｏ酵母窒素ベース、２％グルコース、２％寒天）で酵母株を保存した。同一液体培地を予備培養に使用し、３０℃で４８時間培養し、ＧＡＬ７プロモーターを誘導するために５％ガラクトースを含むＹＰ培地（１％Ｄｉｆｃｏ酵母エキス、２％Ｄｉｆｃｏペプトン）で１：１０に希釈した。
【００３９】
　プラスミド
　ＡＦＰ−ＩＩＩを含むプラスミドの詳細については表１に示す。
【００４０】
　形質転換
　ＪＭ１０９の形質転換はＣｈｕｎｇら（１９８９）に従った。酵母株の形質転換は主にＢｅｃｋｅｒら（１９９１）により記載されているようにエレクトロポレーションにより実施した。形質転換細胞を選択ＹＮＢプレートで回収した。当業者は種々の形質転換方法を実施できることを理解し得る。どのような方法を使用するかは形質転換しようとする生物に依存し、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）やＣａｍｐｂｅｌｌとＤｕｆｆｕｓ（１９８８）等の種々の便覧に詳細に記載されている。
【００４１】
　分子生物学手順
　制限酵素とＤＮＡ修飾酵素は製造業者により推奨されているように適用した。
【００４２】
　オリゴヌクレオチドはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８０Ａ　ＤＮＡ合成器で合成し、標準手順により精製した。
【００４３】
　ＡＦＰ−ＩＩＩの精製
　オーシャンパウト（Ｍａｃｒｏｚｏａｒｃｅｓ　ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）からのＡＦＰ−ＩＩＩはニューファンドランド島の近海で捕獲した魚の血液から精製した。ＡＦＰ−ＩＩＩサンプルはＨｅｗら（１９８４）により記載されているように凝固した魚の血清の遠心分離により調製した。
【００４４】
　カチオン交換クロマトグラフィー
　カチオン交換クロマトグラフィーはＳＭＡＲＴシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）でＭｏｎｏ　Ｓカラム（ＨＲ５／５，Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）で実施した。サンプル緩衝液は１０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（Ｍｅｒｃｋ）ｐＨ６．０とし、溶離は０→０．５Ｍ　ＮａＣｌ（Ｍｅｒｃｋ）直線勾配を１００μｌ／分の流速で用いて実施した。μピークモニター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて２１４及び２８０ｎｍでペプチドを検出した。システム温度を１５℃に設定して一体型ＳＭＡＲＴシステムフラクションコレクターを使用して２１４ｎｍシグナルをモニターしながらフラクションを集めた。
【００４５】
　逆相高性能液体クロマトグラフィー
　ＳＭＡＲＴシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）でμＲＰＣ　Ｃ４／Ｃ１８　ＳＣ２．１／１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を実施した。Ｍｉｌｌｉ　Ｑ水中０．０６％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ，Ｍｅｒｃｋ）（溶媒Ａ）中でサンプルをカラムに加え、Ｍｉｌｌｉ　Ｑ水中８０％アセトニトリル（Ｍｅｒｃｋ）、０．０５４％ＴＦＡ（溶媒Ｂ）を使用して溶離した。使用した標準勾配は、１００μｌ／分の流速で０分１００％溶媒Ａ、５分１００％溶媒Ａ、１０分６５％溶媒Ａ、５０分４０％溶媒Ａ、５５分０％溶媒Ａ、５７．５分０％溶媒Ａ、５８分１００％溶媒Ａにプログラムした。μピークモニター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて２１４、２５６及び２８０ｎｍの３種の波長でペプチドを検出した。システム温度を２０℃に設定して一体型ＳＭＡＲＴシステムフラクションコレクターを使用して２１４ｎｍシグナルをモニターしながらピークを集めた。
【００４６】
　０分１００％溶媒Ａ、１０分６０％溶媒Ａ、３５分５５％溶媒Ａ、３６分４５％溶媒Ａ、４５分４５％溶媒Ａ、４６分０％溶媒Ａ、５０分０％溶媒Ａ、５０．１分１００％溶媒Ａ、６０分１００％溶媒Ａの修正勾配によりＡＦＰ−ＩＩＩイソ型１、２及び３を分離した。緩衝液と全ＳＭＡＲＴシステムの詳細は標準勾配で使用したものと同一である。
【００４７】
　ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
　製造業者のプロトコルに従って１６％ポリアクリルアミドＴｒｉｃｉｎｅゲル（Ｎｏｖｅｘ）をＸｃｅｌｌ電気泳動セル（Ｎｏｖｅｘ）用いて泳動させた。サンプル緩衝液はＮｏｖｅｘ製品であり、３．０ｍｌ　ＴＲＩＳ−ＨＣｌ　３．０Ｍ，２．４ｍｌグリセロール，０．８ｇ　ＳＤＳ，１．５ｍｌ　０．１％クーマシーブルーＧ，０．５ｍｌ　０．１％フェノールレッド及び５％β−メルカプトエタノールから構成されるものを蒸留水で最終容量１０ｍｌに調整し、ｐＨ＝８．４５とした。移動用緩衝液もＮｏｖｅｘ製品であり、合計１リットルの蒸留水中に１２．１ｇ　ＴＲＩＳ，１７．９ｇ　Ｔｒｉｃｉｎｅ及び１ｇ　ＳＤＳを含むものとし、ｐＨ値は約ｐＨ８．３とした。４０％エタノール（Ｍｅｒｃｋ）、１０％酢酸（Ｍｅｒｃｋ）及び５０％蒸留水の溶液に溶かした１０％クーマシーブリリアントブルーＲ２５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してゲルを着色し、この溶液をマイクロ波で４５秒間加熱した後、ゲルを回転震盪器で１５分間染色した。ゲルを１０％エタノール（Ｍｅｒｃｋ）、７．５％酢酸（Ｍｅｒｃｋ）及び８２．５％蒸留水の溶液で脱色した。分子量測定の場合には、ＭＡＲＫ１２予備染色マーカー（Ｎｏｖｅｘ）を用いた。
【００４８】
　ウェスタンブロッティング
　製造業者のプロトコルに従ってウェスタントランスファーブロットモジュール（Ｎｏｖｅｘ）でトランスブロットトランスファー培地（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してＮｏｖｅｘ　Ｔｒｉｃｉｎｅゲルをブロットした。ブロッティング後、膜を１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中５％脱脂粉乳でブロックした後、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０（ｐＨ７．４）及びオーシャンパント不凍ペプチドに対するモノクローナル抗血清中１％脱脂粉乳中でインキュベートした。Ｓ基の判定とＱ基の判定に用いる２種の異なる抗体を入手した（Ｍ．Ｍ　Ｇａｎｉ，Ｕｎｉｌｅｖｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃｏｌｗｏｒｔｈ　Ｈｏｕｓｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから寄贈）。温和に撹拌しながら室温で一晩インキュベートした。未吸着抗体をインキュベーション用緩衝液で洗浄して除去した（３×５分）。膜を二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、アルカリ性ホスファターゼ結合体、ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）と共に室温で２時間インキュベートした。ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して酵素を展開した。
【００４９】
　トリプシン消化
　トリプシン消化に備え、サンプルを０．１Ｍ　ＮＨ４ＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．３）に溶かした。トリプシン（ＴＰＣＫ処理、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を１：１００の酵素：基質比で加えた。３０分後にｐＨを調べ、同一量のトリプシンをもう一度加えた。３７℃で一晩インキュベーションを行った。ＴＦＡを加えて消化を停止し、ｐＨ値をｐＨ２にした。ＳＭＡＲＴシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でＲＰ−ＨＰＬＣによりペプチドを分離した。
【００５０】
　Ｎ末端アミノ酸配列分析
　製造業者のプロトコルに従ってＬＦ　３０００タンパク質シーケンサー（Ｂｅｃｋｍａｎ）でＮ末端アミノ酸配列分析を行った。自動ＲＰ−ＨＰＬＣシステムであるシステムＧｏｌｄ（Ｂｅｃｋｍａｎ）でアミノ酸のＰＴＨ誘導体を分析した。
【００５１】
　アミノ酸分析によるタンパク質定量
　１％フェノールを含む６Ｍ　ＨＣｌ中でＡＦＰ−ＩＩＩサンプルを１１０℃で減圧下に２４時間加水分解した後、乾燥した。分析は製造業者のプロトコルを使用してアルファプラスシリーズ２アミノ酸分析器（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）で実施した。
【００５２】
　再結晶アッセイ
　ＡＦＰ−ＩＩＩ活性を試験しようとするサンプルをスクロース粉末と混合し、３０容量％スクロース溶液とした。この溶液の一部を顕微鏡スライドに載せ、蒸発しないようにカバースリップを被せてＬｉｎｋａｍ　ＴＨＭＳ冷却段に置き、冷却段をＬｉｎｋａｍ　ＣＳ　１９６冷却システムに接続してＬｉｎｋａｍ　ＴＭＳ　９１コントローラーにより制御した。この溶液を−４０℃まで急冷（δ９９℃／分）した後、−６℃まで加熱した。−６℃で３０分間インキュベートする間に氷晶の成長を顕微鏡試験した。
【００５３】
　ＨＰＬＣ精製ペプチドのアッセイに備え、精製ＡＦＰ−ＩＩＩイソ型を含むＲＰ−ＨＰＬＣカラムからのサンプルをＭｉｌｌｉ　Ｑ水で１回再水和段階後にＳｐｅｅｄ　Ｖａｃ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｓａｖａｎｔ）で２回乾燥した。２度目の乾燥段階後にサンプルをＭｉｌｌｉ　Ｑ水１００μｌに可溶化し、ｐＨを調べ、ＲＰ−ＨＰＬＣ緩衝系からの全ＴＦＡが除去されていることを確認した。サンプルをλ＝２１４ｎｍで０．７００の吸光度値まで希釈し、約０．１μｇ／ｍｌの魚ＡＦＰ−ＩＩＩ溶液と等価にした。サンプルが等量のＡＦＰ−ＩＩＩを含んでいることを確かめるために、アミノ酸分析により事後確認した。精製サンプルＡＦＰ−ＩＩＩイソ型を使用した場合には、Ｎ末端アミノ酸配列分析によりその純度を調べた。
【００５４】
　補給バッチ発酵（Ｆｅｄ　ｂａｔｃｈ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）
　接種手順：適当な形質転換細胞を２５ｍｌの最小培地で３０℃で３００ｒｐｍで一晩培養した。次に、２％グルコースを含むＹＰ５００ｍｌを入れた１０００ｍｌ容震盪フラスコに培養物を移し、３０℃で３００ｒｐｍで一晩培養した。この培養物を補給バッチ実験の接種材料として使用した。
【００５５】
　以下のバッチ培地を使用した。１１０ｇグルコース・１Ｈ２Ｏに脱イオン水を加えて５００ｇとした。２５ｇ　Ｔｒｕｓｏｙ，５０ｇ酵母エキス（Ｏｈｌｙ），１０．５ｇ　Ｋ２ＨＰＯ４，５ｍｌ　１０００×Ｅｇｌｉビタミン溶液，５０ｍｌ　１００×Ｅｇｌｉトレーサー金属（Ｅｇｌｉ，１９８０），０．２５ｇ　Ｌ−ヒスチジン・ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ），３ｇ　ＭｇＳＯ４，２ｇ消泡剤に脱イオン水を加えて４５００ｇとした。グルコース溶液は熱滅菌し、ビタミン溶液は別個に濾過滅菌した。他の全成分は発酵槽で熱滅菌した。温度は３０℃に調節し、ｐＨは５．０の値に調節した。発酵槽に材料を接種し、空気流速２リットル／分及び撹拌機速度６００ｒｐｍで細胞を培養した。１８時間後に補給相を開始した。
【００５６】
　以下の補給培地を使用した。グルコース・１Ｈ２Ｏ　１１００ｇに脱イオン水を加えて１７５０ｇとした。６２．５ｇ酵母エキス（Ｏｈｌｙ），３０ｇ　Ｋ２ＨＰＯ４，５ｍｌ　１０００×Ｅｇｌｉビタミン溶液，５０ｍｌ　１００×Ｅｇｌｉトレーサー金属（Ｅｇｌｉ，１９８０），６．２５ｇ　Ｌ−ヒスチジン・ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ），６．２５ｇ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，２ｇ消泡剤に脱イオン水を加えて８５０ｇとした。
【００５７】
　Ｋｅｕｌｅｒｓ（１９９３）により記載されているようなソフトウェアツールにより補給ポンプを１．０５の一定ＲＱ値（生成ＣＯ２モルと消費Ｏ２モルの比）に調節した。３７時間後に培養物を回収した。
【実施例１】
【００５８】
ＩＩＩ型ＡＦＰをコードする合成遺伝子の構築
　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で発現するように最適化されたＨＰＬＣ Ｉ 抗凍結ペプチドをコードするヌクレオチド配列を以下のように構築した：主として、優先的に用いられるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅコドン中に発現した成熟ＡＦＰのＤＮＡ配列を含む１２個からなる１セットのオリゴヌクレオチド（ｉｎｖａｆｐ１、ｉｎｖａｆｐ２、ｉｎｖａｆｐ３、ｉｎｖａｆｐ４、ｉｎｖａｆｐ５、ｉｎｖａｆｐ６、ｉｎｖａｆｐ７、ｉｎｖａｆｐ８、ｉｎｖａｆｐ９、ｉｎｖａｆｐ１０、ｉｎｖａｆｐ１１及びｉｎｖａｆｐ１２）を合成した。該合成遺伝子は、ＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより産生された付着端に対して適合性の５′一本鎖領域を含むように設計した（図２）。
【００５９】
　合成ＡＦＰ遺伝子アセンブリーを得るために、各５０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドを１２μｌの水に溶解し、９５℃で２分間インキュベートし、そのまま氷上に置いた。この変性ステップの後、オリゴヌクレオチドを、２．５ｍＭのＡＴＰ、５ｍＭのＤＴＴ及び約１０Ｕのポリヌクレオチドキナーゼを含む最終容量２０μｌ中３７℃で４０分間リン酸化し、次いで９５℃で２分間変性させて、氷上に置いた。各１０μｌのリン酸化オリゴヌクレオチドをそれらに最も相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチドと混合して二重鎖を形成させた。９５℃で２分間インキュベートして変性させた後、各二重鎖をゆっくり３０℃に冷却した。再度、全部で６種の二重鎖混合物各１０μｌをプールし、５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、８ｍＭのＭｇＣｌ２、８ｍＭのＤＴＴ、４０μｇ／ｍｌのゼラチン及び１０ＵのＤＮＡリガーゼを含む最終容量１００μｌ中２０℃で２時間インキュベートした。次いで、連結混合物を沈降させ、３０μｌのＴＥ緩衝液に再溶解した。混合物１５μｌを２％アガロースゲル上に置き、ゲルから予測サイズ（約２２４塩基対）のＤＮＡバンドを切り出し、最後に、供給業者により推奨されたＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ手順に従って精製した。
【００６０】
　次いで、得られたＤＮＡフラグメントをＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ線状化ベクターｐＴＺ１９Ｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に連結し、標準的手順に従ってＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ １０９に形質転換した。わずかに変更を加えたアルカリ溶解微小分離法（ａｌｋａｌｉｎｅ−ｌｙｓｉｓ　ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ）に従って数個の形質転換体のプラスミドＤＮＡを単離し、数種の酵素を用いて制限分析により分析した。そのようなプラスミドの１つに含まれていた挿入体の配列を、二本鎖プラスミドのサンガージデオキシ配列決定法（Ｓａｎｇｅｒら，１９７７）により確認した。合成ＡＦＰ−ＩＩＩカセットのコード領域を含むこの中間体構築物をｐＵＲ７７００と称した（図３）。
【実施例２】
【００６１】
　ＡＦＰ−ＩＩＩ ＨＰＬＣ−１をコードする合成遺伝子を含む酵母発現ベクターの構築
　ｐＵＲ７７００によって運ばれる合成ＡＦＰ−ＩＩＩ遺伝子は、酵母中でこのペプチドを発現させるのに必要な情報を全く含んでいない。この遺伝子を発現・分泌させるためには、ＡＦＰ−ＩＩＩ遺伝子と適当な分泌シグナル配列との翻訳融合体を含む構築物を作って、これらの融合体の配列を酵母遺伝子プロモーターの制御下に置かなければならない。
【００６２】
　適当な分泌シグナル配列は、酵母により効率的に分泌されたタンパク質をコードする種々の遺伝子、例えば、ＳＵＣ２がコードするインベルターゼ又はＭＦα１及びＭＦα２がコードするα接合因子から選択することができる。インベルターゼシグナル配列との適当な融合体を得るために、インベルターゼシグナル配列、ＧＡＬ７プロモーターの一部及び適当な制限酵素部位を含むＰＣＲフラグメントを作製して、インベルターゼシグナル配列と合成ＡＦＰ−ＩＩＩ遺伝子とを確実にフレームが合うように融合させた。
【００６３】
　このフラグメントを得るために、以下の配列を用いてＰＣＲプライマー、ｉｎｖａｆｐ１４を設計した：
【００６４】
【化１】
2004043484.tif 000002
　このプライマーをＰＣＲ反応の３′プライマーとして用い、ＧＡＬ７プロモーター中に認められた配列とハイブリダイズさせる５′プライマーＰＧ７ ０５ ＡＦ（Ｖｅｒｂａｋｅｌ，１９９１）と組み合わせた。鋳型としてｐＵＲ２７７８プラスミドＤＮＡ（図４，ｖａｎ Ｇｏｒｃｏｍら，１９９１）を用いて反応させ、約２４３ｂｐのフラグメントを作製した。このフラグメントをアガロースゲルから溶離し、製造業者の指示に従ってＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ手順に従って精製した。次いで、精製されたフラグメントをＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化し、得られた約８８ｂｐのフラグメントをプラスミドｐＴＺ１９Ｒの適切な部位に連結した。連結混合物を形質転換してＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に導入し、１つの形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して、クローン化挿入体の同一性を確認した。このプラスミドをｐＵＲ７７０１と称した（図５）。
【００６５】
　インベルターゼシグナル配列と合成ＡＦＰ−ＩＩＩ遺伝子とのフレーム内融合体を得るために、ｐＵＲ７７００をＮｈｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、約１９６ｂｐのフラグメントを単離し、ｐＵＲ７７０１をＮｈｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化して形成した約２９１１ｂｐのフラグメントと連結した。得られたプラスミドをｐＵＲ７７０２と称した（図６）。
【００６６】
　同様な方法で、３′プライマーとしてプライマーＭＦαＡＦＰＩＩＩ：
【００６７】
【化２】
2004043484.tif 000003
を用いて、α接合因子プレプロシグナル配列を含むＰＣＲフラグメントを作製した。
【００６８】
　プライマーとしてＭＦαＡＦＰＩＩＩ及びＰＧ７ ０５ ＡＦを用い、ｐＵＲ２６６０（ＷＯ９４／０３６１７号）ＤＮＡ鋳型から、ＧＡＬ７プロモーターの一部とプレプロα接合因子コード配列の全てを含むＰＣＲフラグメントを作製した。ｐＵＲ２６６０は、ＧＡＬ７プロモーター制御下のプレプロα接合因子配列を含んでいる。得られた約４６２ｂｐのフラグメントを上述のように精製し、ＳａｃＩ及びＮｈｅＩで消化した。そのようにして得られた約２９２ｂｐのフラグメントを、ＳａｃＩ及びＮｈｅＩでｐＵＲ７７０２を消化して得られた約３０２５ｂｐのフラグメントに連結した。連結して得られた数種のＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９形質転換体由来のプラスミドＤＮＡの配列を決定して、正しいフラグメントがクローン化されていることを確認した。これらのプラスミドのうちの１種をｐＵＲ７７０３と称した（図７）。
【００６９】
　酵母中でＡＦＰ−ＩＩＩカセットを発現し得るプラスミドを構築するために、合成遺伝子−シグナル配列融合体を以下のように種々の酵母発現ベクターに導入した：
　標準法を用い、それぞれインベルターゼ及びα接合因子とＡＦＰ−ＩＩＩとの融合体を保有する、ｐＵＲ７７０２の約２７８ｂｐのＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとｐＵＲ７７０３の約４８８ｂｐのＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとを別々に、ＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した酵母発現ベクターにクローン化した。これらの発現ベクターはどちらもＳ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ ＧＡＬ７プロモーターを保有しているので、遺伝子をＳａｃＩ部位に挿入すると、ＧＡＬ７に誘導されて、挿入された遺伝子が形質転換され得る。
【００７０】
　ｐＵＲ７７０４（図８）は、ｐＵＲ７７０２由来のインベルターゼシグナル配列ＡＦＰ−ＩＩＩカセットを多重コピーリボソームＤＮＡ組込みベクターｐＵＲ２７７８に挿入して作製し、ｐＵＲ７７０６（図９）は、ＳａｃＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に挿入されたｐＵＲ７７０３由来のα接合因子ＡＦＰ−ＩＩＩカセットを含むｐＵＲ２７７８である。
【実施例３】
【００７１】
　Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＡＦＰ−ＩＩＩの発現
　プラスミドｐＵＲ７７０４及びｐＵＲ７７０６を、酵母ｒＤＮＡ領域に組み込むためにＨｐａＩで消化して線状化し、次いで電気泳動により別々にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＳＵ５０に導入した。形質転換体は、ロイシンの不在下に増殖する該形質転換体の能力に基づいて選択される。クローン化ＡＦＰ−ＩＩＩ遺伝子を発現させるために、先ず、ｐＵＲ７７０４又はｐＵＲ７７０６を保有する形質転換体を液体最少培地中３０℃で４０時間増殖させ、次いで、新たに調製した誘導培地（酵母エキス１％、Ｄｉｆｃｏペプトン２％、ガラクトース５％）に１：１０稀釈し、３０℃でさらに４８時間インキュベートした。その後、培養上清試料を氷の結晶の成長を阻害する該試料の能力についてテストした。
【００７２】
　−６℃で３０分間のインキュベーションを通して氷の結晶の成長を顕微鏡で調べた。合成ＡＦＰ−ＩＩＩ遺伝子を保有する酵母由来の上清試料は、形質転換されていない酵母又は発現ベクターは有するが合成ＡＦＰ−ＩＩＩ遺伝子を欠失する酵母の上清から調製した類似の対照試料に比べると氷の結晶の成長に対する阻害作用を有することが明らかに証明できた。しかし、該酵母により産生された物質の再結晶阻害活性は、等量の魚ＡＦＰ標本の該活性より有意に低かった。
【００７３】
　産生された抗凍結ペプチドをさらに分析するために、ｐＵＲ７７０４及びｐＵＲ７７０６形質転換体の誘導培養物由来の試料１０ｍｌを４０００ｒｐｍで５分間遠心し、細胞及び上清を収集し、−２０℃で保存した。変性ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いてタンパク質を分離し、抗ＡＦＰ特異的モノクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティングによりＡＦＰを検出した。
【００７４】
　ｐＵＲ７７０４及びｐＵＲ７７０６を保有する酵母形質転換体由来の上清試料中に６．５ｋＤの見かけ分子量を有するバンドが存在するということは、これらの形質転換体がＡＦＰ−ＩＩＩを産生し得ることを明らかに示している。該ペプチドを逆相ＨＰＬＣにかけて精製し、Ｎ末端配列を決定した。この配列は、ＨＰＬＣ−１ペプチドが酵母により正しくプロセシング且つ分泌されたことを示していた。
【実施例４】
【００７５】
　最も活性なオーシャンパウト抗凍結ペプチドサブタイプの同定
　２段階手順を用いてＡＦＰ−ＩＩＩ由来のイソ型を精製した。先ず、試料を陽イオン交換Ｍｏｎｏ Ｓカラムに装入し、記載勾配を用いて溶離した。溶離パターンを図１０に示す。該カラムから１つの非遅延（ｎｏｎ−ｒｅｔａｒｄｅｄ）ピーク（Ｑピーク）と４つの溶離ピーク（Ｓ１〜Ｓ４）を単離した。Ｓ１は、これらの条件下でのＭｏｎｏ Ｓ陽イオン交換カラムに対する結合能が最も低いタンパク質を表し、Ｓ４は、該カラムに対する結合能が最も高いタンパク質を含む。ピークを収集し、記載勾配を用いるＲＰ−ＨＰＬＣカラムに装入した。全物質からのクロマトグラムを図１１に示す。ピークはＡＦＰ−ＩＩＩのイソ型であり、特定条件を用いたこのカラム上での挙動に従って１から１２までの番号が付されている。ＡＦＰ−ＩＩＩのイソ型は全て２５〜４５分の間に溶離する。Ｑ及びＳ１〜Ｓ４分画のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを図１２〜図１６に示す。分画はそれぞれ異なるＡＦＰ−ＩＩＩイソ型を生成するが、どのＡＦＰイソ型がどのピークに含まれていたかを表２に要約する。Ｍｏｎｏ Ｓカラム及びＲＰ−ＨＰＬＣカラムから収集した分画をマウス抗ＡＦＰ−ＩＩＩ抗血清を用いてテストしたが、Ｓ１からＳ４までの全てのイソ型はＳ型抗血清に対して陽性の反応を示し、Ｑグループからのイソ型１２はＱ型抗血清に対して陽性の反応を示した。５種のイソ型からＮ末端アミノ酸配列を決定した（表３）。ＡＦＰ−ＩＩＩＨＰＬＣ７のピークは魚リゾチームで汚染されていたが、同定された他のアミノ酸配列はＡＦＰ−ＩＩＩイソ型の既知配列と関連付けることができた。等量の精製タンパク質を抗凍結活性についてテストした。
【００７６】
　再結晶阻害活性アッセイで証明されたように、ＡＦＰ−ＩＩＩのＨＰＬＣ−１２イソ型のみが有意な抗凍結活性を示した。この知見を確認するために、ＨＰＬＣ−１２イソ型の存在下及び不在下にオーシャンパウト（Ｏｃｅａｎ　Ｐｏｕｔ）ＡＦＰ−ＩＩＩイソ型を再構成した。再結晶アッセイにより証明されたように、完全に再構成されたペプチド標本は粗魚標本の活性を保持していたが、ＨＰＬＣ−１２イソ型を欠失する標本は抗凍結活性が著しく減少していた。
【００７７】
　イソ型１２のトリプシン消化を用い、このイソ型の全アミノ酸配列を決定した。該配列は、文献記載（Ｄａｖｉｅｓ及びＣｈｏｗ，１９９０）の配列と同一であることが判明した。
【実施例５】
【００７８】
　ＩＩＩ型ＡＦＰのＨＰＬＣ−１２変異体をコードする合成遺伝子の構築
　以下のように、インベルターゼシグナル配列に結合し且つＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中での発現に最適化されたコドンを含むＨＰＬＣ−１２抗凍結ペプチドをコードするヌクレオチド配列を構築した：主として、優先的に用いられるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅコドン中に発現した成熟ＡＦＰのＤＮＡ配列を含む１５個からなる１セットのオリゴヌクレオチド（ＨＰＬＣ１２．１、ＨＰＬＣ１２．２、ＨＰＬＣ１２．３、ＨＰＬＣ１２．４、ＨＰＬＣ１２．５、ＨＰＬＣ１２．６、ＨＰＬＣ１２．７、ＨＰＬＣ１２．８、ＨＰＬＣ１２．９、ＨＰＬＣ１２．１０、ＨＰＬＣ１２．１１、ＨＰＬＣ１２．１２、ＨＰＬＣ１２．１３、ＨＰＬＣ１２．１４及びＨＰＬＣ１２．１５）を合成した。該合成遺伝子は、ＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより産生された付着端に対して適合性の一本鎖領域を含むように設計した（図１７）
【００７９】
　合成ＨＰＬＣ−１２遺伝子アセンブリーを得るために、各５０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドを１２μｌの水に溶解し、９５℃で２分間インキュベートし、そのまま氷上に置いた。この変性ステップの後、オリゴヌクレオチドを、２．５ｍＭのＡＴＰ、５ｍＭのＤＴＴ及び約１０Ｕのポリヌクレオチドキナーゼを含む最終容量２０μｌ中３７℃で４０分間リン酸化し、次いで、９５℃で２分間変性させ、氷上に置いた。各１０μｌのリン酸化オリゴヌクレオチドをそれらと最も相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチドと混合して二重鎖を形成した。９５℃で２分間インキュベートして変性させた後、各二重鎖をゆっくり３０℃に冷却した。再度、全二重鎖混合物１０μｌをプールし、５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、８ｍＭのＭｇＣｌ２、８ｍＭのＤＴＴ、４０μｇ／ｍｌのゼラチン及び１０ＵのＤＮＡリガーゼを含む最終容量１００μｌ中２０℃で２時間インキュベートした。次いで、連結混合物を沈降させ、３０μｌのＴＥ緩衝液に再溶解した。混合物１５μｌを２％アガロースゲル上に置き、ゲルから予測サイズ（約２９１塩基対）のＤＮＡバンドを切り出し、最後に、供給業者により推奨されたＧｅｎｅ ＣｌｅａｎＩＩ手順に従って精製した。
【００８０】
　このフラグメントを、ＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化して、多重コピー組込みベクターｐＵＲ２７７８由来のベクターフラグメントに連結した。該挿入体の配列を確認し、得られたプラスミドをｐＵＲ７７１８と称した（図１８）。
【００８１】
　プラスミドｐＵＲ７７１８を、酵母ｒＤＮＡ領域に組み込むためにＨｐａＩで消化して線状化し、次いで電気泳動によりＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＳＵ５０に導入した。得られた形質転換体を、ロイシンの不在下に増殖するそれらの能力に基づいて選択した。
【００８２】
　クローン化ＨＰＬＣ−１２遺伝子を発現させるために、先ず、ｐＵＲ７７１８を保有する形質転換体を液体最少培地中３０℃で４０時間増殖させ、次いで、新たに調製した誘導培地（酵母エキス１％、Ｄｉｆｃｏペプトン２％、ガラクトース５％）に１：１０稀釈し、３０℃でさらに４８時間インキュベートした。次いで、培養上清試料を、氷の結晶の成長を阻害するそれらの能力についてテストした。
【００８３】
　結果（再結晶アッセイ）は、培養上清が高レベルの抗凍結活性を有することを明らかに示している。これらの結果をＨＰＬＣ−１変異体の酵母発現で得られた結果と比べて見ると、最低レベルのＨＰＬＣ−１２抗凍結活性しか生成しなかった形質転換体由来の上清でも、最高のＨＰＬＣ−１形質転換体由来のものより優れていることが示された。
【００８４】
　ｐＵＲ７７１８を保有するＳＵ５０形質転換体を用いて補給バッチ発酵（ｆｅｄ　ｂａｔｃｈ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を行った。供給段階の後、１Ｌ容バケツを用いるＪｏｕａｎ ＬＲ ５．２２遠心機中４６５０ｒｐｍ（７２００ｇ）で３０分間遠心して細胞を収集した。氷再結晶阻害テストにかけて上清の抗凍結活性をテストした。非稀釈上清は結晶の成長を明らかに阻害したが、これは、培養上清中に高レベルの活性抗凍結ペプチドが存在することを示している。
【００８５】
　この発酵体の上清をウエスタンブロットにかけると、ＡＦＰＩＩＩ−ＨＰＬＣ１２物質が分泌されたことが示された。酵母により産生されたＨＰＬＣ１２の見かけ分子量は、魚により産生されたＨＰＬＣ１２のものと等しかった。酵母により産生されたペプチドを精製し、アミノ酸配列を決定すると、該物質がオーシャンパウトにより産生されたＨＰＬＣ１２ペプチドと区別がつかないことが確認された
【００８６】
【表１】
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【００８７】
【表２】
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【００８８】
【表３】
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【００８９】
【表４】
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【００９０】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】ＩＩＩ型ＡＦＰのイソ型。ボックスで囲まれた領域は同一領域を表し、四角で囲んだ（ｓｈａｄｅｄ）アミノ酸はペプチドの抗凍結特性に関して重要であると認められたものである。
【図２】ＡＦＰ−ＩＩＩ型ＨＰＬＣ１をコードする合成遺伝子。
【図３】合成ＡＦＰ−ＩＩＩ遺伝子を保有するプラスミド、ｐＵＲ７７００の構築を概略的に示す図。
【図４】酵母発現ベクターｐＵＲ２７７８の制限マップ。
【図５】インベルターゼシグナル配列を保有するプラスミド、ｐＵＲ７７０１の構築を概略的に示す図。
【図６】フレームが合うようにインベルターゼシグナル配列に結合させた合成ＡＦＰ−ＩＩＩ遺伝子を保有するプラスミド、ｐＵＲ７７０２の構築を概略的に示す図。
【図７】フレームが合うように接合因子プレプロ分泌シグナル配列と融合させた合成ＡＦＰ−ＩＩＩ遺伝子を保有するプラスミド、ｐＵＲ７７０３の構築を概略的に示す図。
【図８】フレームが合うようにインベルターゼシグナル配列に結合させた合成ＡＦＰ−ＩＩＩ遺伝子を保有する多重コピーｒＤＮＡ組込みベクター、ｐＵＲ７７０４の構築を概略的に示す図。
【図９】フレームが合うようにプレプロ接合因子シグナル配列に結合させた合成ＡＦＰ−ＩＩＩ遺伝子を保有する多重コピーｒＤＮＡ組込みベクター、ｐＵＲ７７０６の構築を概略的に示す図。
【図１０】Ｍｏｎｏ Ｓカラムからのオーシャンパウト抗凍結ペプチドの溶離パターン。
【図１１】逆相ＨＰＬＣで分離した抗凍結ペプチドのクロマトグラム。
【図１２】逆相ＨＰＬＣで分離したＭｏｎｏ Ｓ Ｓ１抗凍結ペプチドのクロマトグラム。
【図１３】逆相ＨＰＬＣで分離したＭｏｎｏ Ｓ Ｓ２抗凍結ペプチドのクロマトグラム。
【図１４】逆相ＨＰＬＣで分離したＭｏｎｏ Ｓ Ｓ３抗凍結ペプチドのクロマトグラム。
【図１５】逆相ＨＰＬＣで分離したＭｏｎｏ Ｓ Ｓ４抗凍結ペプチドのクロマトグラム。
【図１６】逆相ＨＰＬＣで分離したＭｏｎｏ Ｓ Ｓ１抗凍結ペプチドのクロマトグラム。
【図１７】ＩＩＩ型ＡＦＰ ＨＰＬＣ１２インベルターゼシグナル配列融合タンパク質をコードする合成遺伝子。
【図１８】プラスミドｐＵＲ７７１８の概略図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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