(57)【要約】【課題】活性酸素を消去し皮膚中での過酸化脂質の生成を抑制し、皮膚細胞のヒアルロン酸産生能を促進させるとともに分解能を抑制し、さらには皮膚細胞のアクアポリン合成を促進することにより、皮膚に対する優れた保湿性、荒れ肌改善、老化防止および美白効果を有する活性酸素消去剤、ヒアルロン酸合成促進・分解抑制剤およびアクアポリン合成促進剤を提供する。【解決手段】ノウゼンハレン科植物より得られる抽出物を含有することを特徴とする活性酸素消去剤、ヒアルロン酸合成促進及び分解抑制剤並びにアクアポリン合成促進剤。【選択図】図１
2004168732.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ノウゼンハレン科植物より得られる抽出物を含有することを特徴とする活性酸素消去剤。
【請求項２】
ノウゼンハレン科植物より得られる抽出物を含有することを特徴とするヒアルロン酸合成促進剤。
【請求項３】
ノウゼンハレン科植物より得られる抽出物を含有することを特徴とするヒアルロン酸分解抑制剤。
【請求項４】
ノウゼンハレン科植物より得られる抽出物を含有することを特徴とするアクアポリン合成促進剤。
【請求項５】
ノウゼンハレン科植物がノウゼンハレン属であることを特徴とする請求項１記載の活性酸素消去剤。
【請求項６】
ノウゼンハレン科植物がノウゼンハレン（キンレンカ）であることを特徴とする請求項１記載の活性酸素消去剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、活性酸素消去剤、ヒアルロン酸合成促進剤、ヒアルロン酸分解抑制剤及びアクアポリン合成促進剤に関し、更に詳しくは、活性酸素を消去し皮膚中での過酸化脂質の生成を抑制し、皮膚細胞のヒアルロン酸産生能を促進させるとともに分解能を抑制し、さらには皮膚細胞のアクアポリン合成を促進することにより、皮膚に対する優れた保湿性、荒れ肌改善、老化防止および美白効果が期待される活性酸素消去剤、ヒアルロン酸合成促進剤及び分解抑制剤並びにアクアポリン合成促進剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
老化した皮膚では過酸化脂質が増大し、柔軟性、弾力性を失い、皮膚のしわが増大し、乾燥して滑らかさのない荒れ肌症状が認められる。これらの皮膚症状が現れる原因物質の一つとして、大気中の酸素が紫外線や酵素等の影響を受けて生成するいわゆる活性酸素が考えられている。このような活性酸素には、スーパーオキシド、ヒドロキシラジカル、一重項酸素、過酸化水素等がある。この活性酸素は脂肪酸を酸化し、過酸化物を生成させる。その上、生成した過酸化物と活性酸素は、生体に対してコラーゲン線維の架橋、ヒアルロン酸の断片化、ＤＮＡ螺旋の部分開裂、連鎖的ラジカルの発生による組織の損傷等の悪影響を及ぼし、その結果として、皮膚のしわや弾力消失、脱毛といった生体の老化を促進するといわれている。
【０００３】
一方、日焼けによる色黒、しみ、そばかす等の皮膚への色素沈着は、黒褐色無定型の色素であるメラニンの生成によって生じるものと考えられている。メラニンは、表皮基底層に存在するメラノサイトと呼ばれる色素細胞内のメラノソームにおいて、チロシナーゼによってチロシンからドーパ、ドーパからドーパキノンに変換された後、各種メラニン中間代謝産物を経て、酸化重合して生成される。紫外線により生成された活性酸素は、この系の酸化反応を活性化するため、メラニンが過剰に生成され、皮膚への色素沈着を促進するといわれている。
【０００４】
したがって、活性酸素を消去することは、皮膚の老化及び色素沈着を改善あるいは予防する点で皮膚にとって非常に重要なことであり、老化防止皮膚化粧料に求められる重要な要素である。
【０００５】
そのため、従来、生体内に発生した活性酸素を消去する作用のある物質の探索が広く行われてきた。この様な作用を有する物質として、従来用いられてきたものとしては、天然物由来のものでは、脂溶性のトコフェロール（ビタミンＥ）、水溶性のアスコルビン酸（ビタミンＣ）等が挙げられ、合成化合物では、ＢＨＴ（ブチルヒドロキシトルエン）、ＢＨＡ（ブチルヒドロキシアニソール）等が挙げられる。しかし、これらの物質は活性酸素消去作用が十分ではなく、合成化合物において、ＢＨＡは発癌性を有する疑いが一部持たれており、いずれも活性酸素消去剤としては実用的とは言い難かった。したがって、生体内に発生する活性酸素を消去する作用を十分に有し、安全性が高く、皮膚等への適用性の良好な活性酸素消去剤が強く望まれている。
【０００６】
皮膚の老化防止という側面では、皮膚中のヒアルロン産量を高めることも重要である。ヒアルロン酸は、細胞間隙への水分の保持、組織内にジェリー状のマトリックスを形成することに基づく細胞の保持、組織の潤滑性と柔軟性の保持、機械的障害などの外力への抵抗、および、細菌感染の防止など多くの機能を有している（例えば、非特許文献１）。
【０００７】
皮膚のヒアルロン酸は、齢をとるにつれて減少し、その結果、小ジワやかさつきなどの老化をもたらすといわれている。このような老化した皮膚の改善剤として、コラーゲンやヒアルロン酸を配合した化粧料が数多く提案されているが、表面の保湿効果が改善されるだけであり、本質的に老化肌を改善するものではない。したがって、皮膚細胞のヒアルロン酸産性能を高め分解能を抑制することが皮膚老化の防止に有効である。
【０００８】
これまでに述べた皮膚の活性酸素消去やヒアルロン酸を高めることが皮膚に対して優れた効果を示すことに加え、最近の研究により皮膚細胞に存在するアクアポリンが重要な皮膚生理機能を担うことが明らかとなった。
【０００９】
アクアポリン（Ａｑｕａｐｏｒｉｎ：以下、ＡＱＰと略記する）は、水チャンネルとも呼ばれ、水を選択的に透過させる膜たんぱく質として知られている。これまでにヒトでは１１種類のＡＱＰ遺伝子（ＡＱＰ０〜ＡＱＰ１０）が発見され、このうちＡＱＰ３、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９は水だけでなくグリセロールや尿素など非イオン性小分子も透過させる。また、ヒト組織でのＡＱＰの発現分布をみると、ほとんどの臓器に複数のＡＱＰが存在していることが明らかとなっている。
【００１０】
表皮でのＡＱＰの発現については、本発明者らの最近の研究により、培養ヒトケラチノサイトおよびモデル皮膚表皮でのＡＱＰ３、ＡＱＰ５、ＡＱＰ９遺伝子の発現が報告されている。このうち培養ヒトケラチノサイトでのＡＱＰ３の発現は高浸透圧ストレスにより増加することから、ＡＱＰ３はケラチノサイトの水環境を制御する一つの重要な因子と考えられる（非特許文献２参照）。また、ＡＱＰ３遺伝子欠損マウスの皮膚では、角層水分量、皮膚粘弾性、バリアー回復の低下が認められ、ＡＱＰ３が皮膚物性ならびに皮膚生理機能に深く関与していることが示された（非特許文献３参照）。したがって、アクアポリンの産生促進は、皮膚の乾燥を抑え、はりを整え、バリアー機能を強化すると期待できる。しかしながら、アクアポリン合成促進作用を十分に有し、安全性が高く、皮膚等への適用性の良好なアクアポリン合成促進剤及び皮膚化粧料は知られていない。
【００１１】
【非特許文献１】
「ＢＩＯ  ＩＮＤＵＳＴＲＹ」８巻、１９９１年、３４６頁
【非特許文献２】
「Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ」１５２２巻、２００１年、８２−８８頁）
【非特許文献３】
「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」２９巻、１４３頁
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
斯かる状況下、本発明の目的は、活性酸素を消去し皮膚中での過酸化脂質の生成を抑制し、皮膚細胞のヒアルロン酸産生能を促進させるとともに分解能を抑制し、さらには皮膚細胞のアクアポリン合成を促進することにより、皮膚に対する優れた保湿性、荒れ肌改善、老化防止および美白効果を有する活性酸素消去剤、ヒアルロン酸合成促進・分解抑制剤およびアクアポリン合成促進剤を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は上記の事情に鑑み、鋭意研究した結果、ノウゼンハレン科植物より得られる抽出物が優れた活性酸素消去効果、ヒアルロン酸合成促進・分解抑制効果およびアクアポリン合成促進効果を有し、皮膚の乾燥、荒れ肌、老化および色素沈着を有効に改善あるいは予防することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、ノウゼンハレン科植物より得られる抽出物を含有することを特徴とする活性酸素消去剤、ヒアルロン酸合成促進及び分解抑制剤並びにアクアポリン合成促進剤にある。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳述する。
【００１６】
本発明に用いられるノウゼンハレン科植物は、ほふく性の茎をもつ多肉草本であり、原産地をメキシコからパタゴニア地方までの中央・南アフリカの限られた地域としている。観賞用として最も有名なのがノウゼンハレン（Ｔｒｏｐａｅｏｌｕｍ  ｍａｊｕｓ）であり、キンレンカ（金蓮花）とも呼ばれ花壇や鉢植えで栽培される。また、未熟な種子は酢漬けにされてケーパーの代わりに食されることもある。
【００１７】
本発明のノウゼンハレン科植物抽出物を得るための抽出溶媒としては、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール類、アセトン等のケトン類、酢酸エチル等のエステル類、ジエチルエーテル等のエーテル類、及びベンゼン等の芳香族化合物類の、一種又は二種以上の混合物から選択することができる。
【００１８】
ノウゼンハレン科植物抽出物は、抽出溶媒溶液のままでも良いし、常法により乾固、濃縮して用いても良い。また、ろ過や、再抽出等を行っても良い。
【００１９】
本発明の活性酸素消去剤、ヒアルロン酸合成促進・分解抑制剤およびアクアポリン合成促進剤は、剤型的には例えば軟膏類、ローション類、乳液類、クリーム類、パック類、粉末類、顆粒類等の任意の剤型とすることができ、例えば使用形態として皮膚化粧料が挙げられる。皮膚化粧料の基剤としては、公知の外用基剤で良く、特に限定されない。そして適用する皮膚としては頭皮を含む人体上の皮膚全てに利用が期待できる。
【００２０】
本発明のノウゼンハレン科植物抽出物の活性酸素消去剤、ヒアルロン酸合成促進・分解抑制剤およびアクアポリン合成促進剤への配合量は、使用する系によって様々で、一概には言えないが、全量に対して、乾物換算で、０．００００１〜１０．０質量％（以下、特に断りなければ、％で記する）であると本発明の活性酸素消去効果、ヒアルロン酸合成促進・分解抑制効果、アクアポリン合成促進効果を得るために好ましく、しかも使用時の感触が良好で、また個々の剤型を安定に保つことができる。０．００００１％未満では、効果が十分に発揮されない場合があり、一方、１０．０％を超えて配合しても配合量に見合った効果が得られない場合がある。
【００２１】
本発明の活性酸素消去剤、ヒアルロン酸合成促進・分解抑制剤およびアクアポリン合成促進剤には、必要に応じて、通常、医薬品、医薬部外品、化粧料等の皮膚外用剤に配合されるタール系色素、酸化鉄等の着色顔料、パラベン、フェノキシエタノール等の防腐剤、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、環状シリコーン等のシリコーン油、パラフィン、ワセリン等の炭化水素類、オリーブスクワラン、米スクワラン、米胚芽油、ホホバ油、ヒマシ油、紅花油、オリーブ油、マカデミアナッツ油、ヒマワリ油等の植物油、ミツロウ、モクロウ、カルナバロウ等のロウ類、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸セチル、イソステアリン酸イソステアリル、ミリスチン酸イソプロピル等のエステル油、エタノール等の低級アルコール類、セタノール、ベヘニルアルコール、ステアリルアルコール、長鎖分岐脂肪族アルコール等の高級アルコール類、コレステロール、フィトステロール、分岐脂肪酸コレステロールエステル、マカデミアナッツ脂肪酸フィトステリルエステル等のステロール類及び誘導体、硬化油等の加工油類、
【００２２】
ステアリン酸、ミリスチン酸、イソステアリン酸、オレイン酸、イソ型長鎖脂肪酸、アンテイソ型長鎖脂肪酸等の高級脂肪酸、リモネン、水素添加ビサボロール等のテルペン類、トリカプリル・カプリン酸グリセリル、２−エチルヘキサン酸グリセリル、トリイソ型長鎖脂肪酸グリセリル、トリパルミチン酸グリセリル等のトリグリセリド、セチル硫酸ナトリウム、Ｎ−ステアロイル−Ｌ−グルタミン酸塩等の陰イオン界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン多価アルコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、多価アルコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、変性シリコン、蔗糖エステル等の非イオン界面活性剤、テトラアルキルアンモニウム塩等の陽イオン界面活性剤、ベタイン型、スルホベタイン型、スルホアミノ酸型等の両性界面活性剤、レシチン、リゾフォスファチジルコリン、セラミド、セレブロシド等の天然系界面活性剤、酸化チタン、酸化亜鉛等の顔料、ジブチルヒドロキシトルエン等の抗酸化剤、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、硫酸ナトリウム、メタ珪酸ナトリウム、塩化カルシウム等の無機塩類、クエン酸ナトリウム、酢酸カリウム、琥珀酸ナトリウム、アスパラギン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、ジクロロ酢酸、メバロン酸、グリチルリチン酸等の有機酸及びその塩、塩酸エタノールアミン、硝酸アンモニウム、塩酸アルギニン、ジイソプロピルアミン塩、尿素、デカルボキシカルノシン等の有機アミン類及びその塩、エデト酸等のキレート剤、キサンタンガム、カルボキシビニルポリマー、カラギーナン、ペクチン、アルキル変性カルボキシビニルポリマー、寒天等の増粘剤、水酸化カリウム、ジイソプロパノールアミン、トリエタノールアミン等の中和剤、ヒドロキシメトキシベンゾフェノンスルフォン酸塩等の紫外線吸収剤、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール、マルビトール、ジグリセリン、ラフィノース等の多価アルコール、各種アミノ酸、アスコルビン酸、ビオチン、トコフェロール等のビタミン類及びアスコルビン酸硫酸エステル塩、アスコルビン酸燐酸エステル塩、ニコチン酸トコフェロール等のビタミン誘導体等を本発明の目的を達成する範囲内で適宜配合することができる。
【００２３】
【実施例】
以下、本発明による活性酸素消去効果、ヒアルロン酸合成促進・分解抑制効果およびアクアポリン合成促進効果を明らかにするための実施例等を示す。尚、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２４】
試料：ノウゼンハレン抽出物
ノウゼンハレン抽出物は、ノウゼンハレン抽出物凍結乾燥品（試料１；丸善製薬社製）、ノウゼンハレン５０％エタノール抽出溶液（試料２；丸善製薬社製）を用いた。
【００２５】
・活性酸素消去効果試験（実施例１）
活性酸素を消去する効果を測定する方法は各種あるが、今回は活性酸素の一つであるスーパーオキシド（Ｏ２−）の消去効果を測定した。方法は以下に示す通りである。すなわち、キサンチン−キサンチンオキシダーゼ系により活性酸素の一つであるスーパーオキシド（Ｏ２−）を発生させ、試料溶液によるその消去率を求めた。スーパーオキシド（Ｏ２−）はニトロブルーテトラゾリウムと反応させて、ジホルマザンとし、５６０ｎｍの吸光度により測定した（ＮＢＴ法）。
【００２６】
５０ｍｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．２）２．４ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ／Ｌキサンチン０．１ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ／Ｌエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム０．１ｍＬ、０．１５％牛血清アルブミン０．１ｍＬ、及び０．７５ｍｍｏｌ／Ｌニトロブルーテトラゾリウム０．１ｍＬを含む発色試液２．９ｍＬに対し、試料溶液０．１ｍＬを加え、２５℃で恒温にし、キサンチンオキシダーゼ（０．５単位／ｍＬ）を含む酵素液０．１ｍＬを加えて攪拌した後、２５℃にて２０分間放置した。６．０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化第二銅を含む反応停止液０．１ｍＬを加えて分光光度計にて５６０ｎｍの吸光度を測定し、その値をＳとした。試薬ブランクは発色試液２．９ｍＬ及び試料溶液０．１ｍＬを取り、２５℃で恒温にし、酵素液の代りにリン酸緩衝液０．１ｍＬを加えて、以下同様にして分光光度計にて５６０ｎｍの吸光度を測定し、その値をＳ’とした。コントロールは、発色試液２．９ｍＬ及び試料溶液の代りにそれぞれの希釈溶液０．１ｍＬを用い、以下同様にして分光光度計にて５６０ｎｍの吸光度を測定し、その値をＣとした。コントロールの試薬ブランクは発色試液２．９ｍＬ及び試料溶液の代りにそれぞれの希釈溶液０．１ｍＬを用い、酵素液の代りに炭酸ナトリウム緩衝液０．１ｍＬを加えて、以下同様にして分光光度計にて５６０ｎｍの吸光度を測定し、その値をＣ’とした。各試料溶液濃度におけるスーパーオキシド消去率を下記式により計算し、片対数グラフの横軸に試料溶液濃度（対数）、縦軸にスーパーオキシド消去率をとり、このグラフからスーパーオキシド５０％消去濃度（ＩＣ５０）を求めた。尚、Ｓ、Ｓ’、Ｃ、Ｃ’は３回測定し、それぞれの平均値を用いた。
［式］
スーパーオキシド消去率（％）＝１００×［１−（Ｓ−Ｓ’）／（Ｃ−Ｃ’）］
【００２７】
得られた結果を下記に示す。
2004168732.tif 000003
【００２８】
2004168732.tif 000004
【００２９】
上記より明らかなように、本発明に係るノウゼンハレン科植物抽出物は極めて低濃度でスーパーオキシドを消去することが認められた。
【００３０】
ヒアルロン酸合成促進・分解抑制効果を明らかにするための実施例を示す。
（１）ヒアルロン酸合成促進効果（実施例２）
・ＭＥＭ培地の調製法
Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  （大日本製薬社製、１０−１０１）  １０．６ｇにそれぞれ終濃度として、１％（Ｖ／Ｖ）Ｎｏｎ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ（大日本製薬社製、１６−８１０）、１ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウム（大日本製薬社製、１６−８２０）、１．２％（Ｗ／Ｖ）炭酸水素ナトリウム、蒸留水を加えて１Ｌとした後、炭酸ガスを吹き込んでｐＨを約７にした（以下、ＭＥＭ培地と略記する）。
【００３１】
・ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の非働化
ＦＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を５６℃で３０分間加熱処理した。
【００３２】
・プロナーゼ溶液
２００μｇ／ｍＬプロナーゼ（カルビオケム−ベーリング・コーポレイション社製、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ由来）、０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムおよび０．０２％アジ化ナトリウム含有０．５ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）。
【００３３】
・細胞培養
正常ヒト線維芽細胞株〔デトロイト５５１株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １１０）〕を０．６×１０５個／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種し、１０％（Ｖ／Ｖ）の非働化ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて９５％（Ｖ／Ｖ）空気−５％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガスの雰囲気下、３７℃で３日間静置培養し、さらに無血清ＭＥＭ培地にて１日間培養した。次いで、試料を添加した培地にて３日間培養後、培養上清を回収し上清中のヒアルロン酸量を求めた。
【００３４】
・ヒアルロン酸産生量の測定
培養上清０．６３ｍＬにプロナーゼ溶液０．０７ｍＬを加え、３７℃で１８時間静置した後、１００℃で１０分間加熱処理し、プロナーゼを失活させた。次に、反応液０．０１ｍＬからヒアルロン酸プレート「中外」（中外診断科学社製）を用い、添付説明書に従いヒアルロン酸量を測定した。尚、試料添加は各群ｎ＝３で試験を行い、結果はそれぞれの平均値を用いた。
【００３５】
得られた結果を下記に示す。
2004168732.tif 000005
【００３６】
2004168732.tif 000006
【００３７】
上記より明らかなように、本発明に係るノウゼンハレン科植物抽出物は極めて低濃度でヒアルロン酸合成促進効果を有することが認められた。
【００３８】
（２）ヒアルロン酸分解抑制効果（実施例３）
・細胞添加用高分子トリチウムヒアルロン酸の調製方法
正常ヒト線維芽細胞株〔デトロイト５５１株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １１０）〕の細胞数を１０％（Ｖ／Ｖ）の非働化ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて２×１０５個／ｍＬに調整し、２２５ｃｍ２のフラスコに５０ｍＬ入れ、３日間培養しコンフルエント状態にした。その後ヒアルロン酸の前駆体であるトリチウムグルコサミン（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．社製）を培養系に添加し（１０μＣｉ／ｍＬ）、さらに３日間培養したのち、培養液からトリチウムラベルされたヒアルロン酸をＵｎｄｅｒｈｉｌｌらの方法（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，８２巻，４７５頁，１９７９年）によって精製し、さらにゲルろ過カラムにより分子量１００万以上の高分子トリチウムヒアルロン酸（比放射活性，０．１μＣｉ／μｇ）を調製した。これを細胞培養系への添加用高分子トリチウムヒアルロン酸とした。
【００３９】
・正常ヒト線維芽細胞への高分子トリチウムヒアルロン酸の添加培養
正常ヒト線維芽細胞株〔デトロイト５５１株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １１０）〕の細胞数を１０％（Ｖ／Ｖ）の非働化ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて１．５×１０５個／ｍＬに調整し、１２穴プレート（ファルコン社製）に０．８ｍＬずつ播種し、９５％（Ｖ／Ｖ）空気−５％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガスの雰囲気下、３７℃で３日間静置培養し、さらに、ＭＥＭ培地のみに培地交換し、１日間培養した。その後、高分子トリチウムヒアルロン酸を含む（１μＣｉ／ｍＬ；３７ＭＢｑ／ｍＬ，１０μｇ／ｍＬ）ＭＥＭ培地を調製し、培地交換をし、３日間培養を行った。
【００４０】
・細胞による高分子トリチウムヒアルロン酸の分解評価
培養終了後、培養液を回収し、１００℃で５分間加熱処理を行った後、培地１ｍＬをセファロースＣＬ−２Ｂカラム（内径１ｃｍ，長さ６０ｃｍ）にアプライし以下の条件でゲルろ過を行った。流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、分画：４ｍＬ／１Ｆｒａｃｔｉｏｎ、分画総数：２５、更に分子量１０万以下のヒアルロン酸が溶出するフラクション１０〜２５の１６本を集め、［３Ｈ］放射活性を測定し分解したヒアルロン酸の量を求めた。分解抑制率は以下の式を用いて算出した。
分解抑制率＝（試料無添加時の放射活性−試料添加時の放射活性）×１００
／試料無添加時の放射活性
【００４１】
得られた結果を下記に示す。尚、試料添加は各群ｎ＝３で試験を行い、結果はそれぞれの平均値を用いた。
2004168732.tif 000007
【００４２】
2004168732.tif 000008
【００４３】
上記より明らかなように、本発明に係るノウゼンハレン科植物抽出物は極めて低濃度でヒアルロン酸分解抑制効果を有することが認められた。
【００４４】
アクアポリン合成促進効果を明らかにするための実施例等を示す（比較例１、実施例４〜６）。
・培養表皮細胞
ヒト正常表皮角化細胞は市販品（Ｅｐｉｄｅｒｃｅｌｌ／新生児包皮：クラボウ社製）を用いた。
【００４５】
・表皮細胞培養用培地
ＭＣＤＢ１５３ＨＡＡ（和光純薬社より購入）をベースとし、ハイドロコーチゾン（０．５μｍｏｌ／Ｌ）、エタノールアミン（０．１ｍｍｏｌ／Ｌ）、ホスホエタノールアミン（０．１ｍｍｏｌ／Ｌ）、インシュリン（５μｇ／ｍＬ）、及びＥＧＦ（上皮細胞成長因子：１０ｎｇ／ｍＬ）を加えたＫ−ＧＭ培地を調製した。培養には、これにＢＰＥ（牛脳下垂体抽出液、クラボウ社より購入）を培地１ｍＬ当たり４μＬ添加し、表皮細胞培養用培地とした。
【００４６】
・試料添加と表皮細胞抽出物の調製
正常ヒト表皮細胞の細胞数を表皮細胞培養用培地にて２．０×１０４個／ｍＬに調整し、２４穴プレート（ファルコン製）に１．０ｍＬずつ播種した。培養は、９５％（Ｖ／Ｖ）空気−５％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガスの雰囲気下３７℃で行い、培養５日目に試料を添加し、さらに１日間培養した。培養後、培地を除き２５０μＬの抽出バッファー（１００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ９．０、１％  ＳＤＳ、９ｍｏｌ／Ｌ尿素）を添加し細胞を溶解させ、さらに５００μＬの水を加え、これを細胞抽出液とした。
【００４７】
・ウェスタンブロッティング
・ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動；
細胞抽出液８μＬ、４倍濃縮ＳＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（インビトロジェン社）４μＬ、１０倍濃縮  Ｓａｍｐｌｅ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ（インビトロジェン社）  １．６μＬ、水  ２．４μＬを混合し、７０℃１０分加熱後、電気泳動に供した。電気泳動は４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ（インビトロジェン社）を用い、ＮｕＰＡＧＥ  ＧｅｌＳｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）の添付説明書に従った。
【００４８】
・タンパク質のＰＶＤＦ膜への転写；
転写は、Ｘｃｅｌｌ  ＩＩ  Ｂｌｏｔ  Ｍｏｄｕｌｅ（インビトロジェン社）を使用し、添付説明書に従った。ＰＶＤＦ膜は  Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（ミリポア社）を使用した。
【００４９】
・免疫学的検出；
転写後のＰＶＤＦ膜は、ブロッキング試薬（５％濃度にスキムミルクを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳに溶解した試薬）に室温で３０分浸した後、ブロッキング試薬で３０００倍に希釈したヒトアクアポリン−３抗体と４℃で２４ｈｒ反応させた。なお、ヒトアクアポリン−３抗体は、ヒトアクアポリン−３アミノ酸配列のＣ末端側ペプチドを合成し、これを免疫したウサギの血清より作製し、希釈倍率は適切な検出シグナルを得るために事前に設定した。次に、ＰＶＤＦ膜を０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ中で振盪洗浄し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで２０００倍に希釈した抗ウサギＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ社製）と室温で４５分反応させた。最後に、ＰＶＤＦ膜を０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ中で振盪洗浄後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用い添付説明書に従いシグナルを検出した。結果を図１に示す。尚、Ｔｗｅｅｎ−２０は、Ｕｎｉｑｅｍａ  Ａｍｅｒｉｃａｓ社商品名である。
【００５０】
試料無添加群（比較例１）と比べ、ノウゼンハレン抽出物凍結乾燥品０．００１％（実施例４）、０．０１％添加群（実施例５）、ノウゼンハレン５０％エタノール抽出溶液０．１％添加群（実施例６）では顕著な検出シグナル強度の増加が認められた。これより明らかなように、本発明に係るノウゼンハレン科植物抽出物は極めて低濃度でアクアポリン合成促進効果を有することが認められた。
【００５１】
以下、本発明の活性酸素消去剤、ヒアルロン酸合成促進・分解抑制剤、およびアクアポリン合成促進剤の処方例を示す。
【００５２】
処方例１〜３（スキンクリーム）
試料１又は２の活性酸素消去剤、ヒアルロン酸合成促進・分解抑制剤、およびアクアポリン合成促進剤を表１の組成でそれぞれを配合しスキンクリームを調製した（処方例１〜３）。
【００５３】
（１）組成
【表１】
2004168732.tif 000009
【００５４】
（２）調製法
（Ａ）成分および（Ｂ）成分を各々８０℃に加熱溶解した後混合して、攪拌しつつ冷却し、３０℃まで冷却して、スキンクリームを調製した。
【００５５】
処方例４〜６（ローション）
試料１又は２の活性酸素消去剤、ヒアルロン酸合成促進・分解抑制剤、およびアクアポリン合成促進剤を表２の組成で配合し、ローションを調製した（処方例４〜６）。
【００５６】
（１）組成
【表２】
2004168732.tif 000010
【００５７】
（２）調製法
各成分をそれぞれ混合溶解し、攪拌して、ローションを調製した。
【００５８】
処方例７〜９（ジェル）
試料１又は２の活性酸素消去剤、ヒアルロン酸合成促進・分解抑制剤、およびアクアポリン合成促進剤を表３の組成でそれぞれを配合しジェルを調製した（処方例７〜９）。
【００５９】
（１）組成
【表３】
2004168732.tif 000011
【００６０】
（２）調製法
（Ａ）成分および（Ｂ）成分を各々６０℃に加熱溶解した後混合して、攪拌しつつ冷却し、３０℃まで冷却して、ジェルを調製した。
【００６１】
処方例１０〜１２（ジェル）
試料１又は２の活性酸素消去剤、ヒアルロン酸合成促進・分解抑制剤、およびアクアポリン合成促進剤を表４の組成でそれぞれを配合しジェルを調製した（処方例１０〜１２）。
【００６２】
（１）組成
【表４】
2004168732.tif 000012
【００６３】
（２）調製法
（Ａ）成分および（Ｂ）成分を各々６０℃に加熱溶解した後混合して、攪拌しつつ冷却し、３０℃まで冷却して、ジェルを調製した。
【００６４】
処方例１３〜１５（親油クリーム）
試料１又は２の活性酸素消去剤、ヒアルロン酸合成促進・分解抑制剤、およびアクアポリン合成促進剤を表５の組成で配合し、親油クリームを調製した（処方例１３〜１５）。
【００６５】
（１）組成
【表５】
2004168732.tif 000013
【００６６】
（２）調製法
Ａ）成分および（Ｂ）成分を各々６０℃に加熱溶解した後混合して、攪拌しつつ冷却し、３０℃まで冷却して、親油クリームを調製した。
【００６７】
処方例１６〜１８（サンスクリーン）
試料１又は２の活性酸素消去剤、ヒアルロン酸合成促進・分解抑制剤、およびアクアポリン合成促進剤を表６の組成でそれぞれを配合しサンスクリーンを調製した（処方例１６〜１８）。
【００６８】
（１）組成
【表６】
2004168732.tif 000014
【００６９】
（２）調製法
（Ａ）成分および（Ｂ）成分を各々８０℃に加熱溶解した後混合して、攪拌しつつ冷却し、３０℃まで冷却して、サンスクリーンを調製した。
【００７０】
処方例１９〜２１（入浴剤）
試料１又は２の活性酸素消去剤、ヒアルロン酸合成促進・分解抑制剤、およびアクアポリン合成促進剤を表７の組成でそれぞれを配合し入浴剤を調製した（処方例１９〜２１）。
【００７１】
（１）組成
【表７】
2004168732.tif 000015
【００７２】
（２）調製法
（Ａ）成分および（Ｂ）成分を各々６０℃に加熱溶解した後混合して、攪拌しつつ冷却し、３０℃まで冷却して、入浴剤を調製した。
【００７３】
次に、効果を示すための試験例を示す。
【００７４】
下記記載の組成のスキンローション及び入浴剤を、それぞれの調製法に従い調製した。
【００７５】
試験例１〜３及び比較例２：スキンローション
配合成分                                            配合量（％）
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
（アルコール相）
９５％エチルアルコール                              １５．０
ポリオキシエチレン（６０モル）硬化ヒマシ油            ２．０
パラオキシ安息香酸メチル                              ０．０５
香料                                                  適  量
試料（表８記載）                                    表８記載の量
（水相）
グリセリン                                            ５．０
クエン酸ナトリウム                                    適  量
イオン交換水                                          残  余
（合計）                                          １００．０
【００７６】
2004168732.tif 000016
【００７７】
・スキンローションの調製法
水相、アルコール相を各々均一に溶解し、そして水相とアルコール相とを混合攪拌分散し可溶化を行い、次いで容器に充填する。使用時には内容物を均一に振盪分散して使用する。
【００７８】
上記で調製したスキンローションを用いて使用試験を行い、皮膚老化防止効果及び美白効果を調べた。試験方法は下記に示す通りである。
【００７９】
・試験方法
８０名の女性被験者の顔面を左右に分け、一方に上記の試験例１〜３、他方に比較例２のスキンローションを毎日２回以上塗布してもらい、２ヵ月後比較例２を基準として下記の判定基準により各評価項目について評点を出してもらい、評点の合計値により評価した。被験者を１群２０名にわけて３群とし、試験例１〜３の各スキンローションについて試験を行った。その結果を表９に示す。
【００８０】
2004168732.tif 000017
【００８１】
［表９］
評価項目        試験例１  試験例２  試験例３
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
肌荒れ防止        ２５      ２０      ４１
肌のつや          ２７      ２１      ４３
肌のはり          ３１      ２８      ４５
肌の明るさ        ２９      ２２      ３９
しわ改善          ２４      １９      ３７
【００８２】
表９より明らかなように、本発明に係るノウゼンハレン抽出物凍結乾燥品を有効成分として含有するスキンローションは、肌荒れを防止し、肌のつや、はり、明るさを保ち、しわを改善する効果に優れ、皮膚老化防止用及び美白用の皮膚化粧料として用いることができることが明らかとなった。
【００８３】
試験例４：入浴剤
配合成分                                        配合量（％）
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
硫酸ナトリウム                                    ８５．０
香料及び界面活性剤                                  適  量
有機色素                                            適  量
ノウゼンハレン抽出物凍結乾燥品                    １０．０
炭酸水素ナトリウム                                  残  量
（合計）                                        １００．０
【００８４】
・入浴剤の調製法
各成分を混合し入浴剤を調製した。尚、この入浴剤は使用時に約３０００倍に希釈される。
【００８５】
上記入浴剤を被験者２０名に三週間毎日の入浴時に使用させた。結果、肌荒れ防止、肌のつや、はり、明るさの保持、しわの改善において効果が認められた。尚、本発明に係るスキンローション及び入浴剤による発赤や乾燥等の異常は認められなかった。
【００８６】
【発明の効果】
以上説明したように、皮膚の保湿性改善、肌荒れ防止、老化防止に有効な活性酸素消去剤、ヒアルロン酸合成促進・分解抑制剤及びアクアポリン合成促進剤を提供できることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト正常表皮角化細胞におけるノウゼンハレン抽出物のアクアポリン合成促進効果を示す図である。
【図１】
2004168732.tif 000018