(57)【要約】【課題】優れた抗真菌活性を有し、特に、耐性菌を含む真菌に対して優れた抗真菌活性を有する化合物を提供する。【解決手段】下記式（Ｉ）で表される化合物等。【化１】2004168685.tif 000007【選択図】なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
【化１】
2004168685.tif 000006
【請求項２】
下記の物理化学的性状を有する化合物又はその塩。
１）物質の性状：白色粉末状物質
溶解性：ピリジン、メタノール、ＤＭＳＯに可溶、水、ノルマルヘキサンに不溶
３）分子式：Ｃ４１Ｈ７３Ｎ９Ｏ１５
４）分子量：９３１  （ＦＡＢマススペクトル法により測定）
５）高分解能二重収束質量分析計を用い、ＥＳＩマススペクトル法にて測定した精密質量：［Ｍ＋Ｈ］＋は次に示す通りである。
実測値：９３２．５３１６
計算値：９３２．５３０４
６）赤外吸収スペクトル：臭化カリウム  （ＫＢｒ）  錠剤法で測定した赤外吸収スペクトルは以下に示す極大吸収を示す。
３３１６，２９２５，１７４９，１６３２，１５３４，１０６８  ｃｍ−１
７）１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：重ピリジン中でピリジンの最も低磁場のシグナルを８．７４  ｐｐｍとして測定した、１Ｈ−核磁気共鳴スペクトルは、以下に示すとおりである。括弧中の水素の数はＨＳＱＣ法およびＤＥＰＴ法により観測されたものである。
０．８４  （３Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７  Ｈｚ），  ０．８８  （３Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ７  Ｈｚ），  １．０５−１．３３  （１８Ｈ，  ｍ），  １．５５（３Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ６．５  Ｈｚ），  １．５９  （３Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７  Ｈｚ），  １．８２  （１Ｈ，  ｍ），  ２．２８  （２Ｈ，  ｍ），  ２．４０  （１Ｈ，  ｍ），  ２．６７  （１Ｈ，  ｍ），  ２．８３  （２Ｈ，  ｍ），  ３．２８  （１Ｈ，  ｍ），  ３．３５  （１Ｈ，  ｍ），  ４．２２  （１Ｈ，  ｂｒ  ｄ，  Ｊ  ＝  １６．５  Ｈｚ），  ４．３０−４．５２  （８Ｈ，  ｍ），  ４．５９−４．６５  （２Ｈ，  ｍ），  ４．８６（１Ｈ，  ｍ），  ５．０３  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７  Ｈｚ），  ５．１６  （１Ｈ，  ｍ），  ５．２８  （３Ｈ，  ｍ），  ５．４７  （１Ｈ，  ｍ），  ５．６５  （１Ｈ，  ｍ），  ｐｐｍ
８）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル：重ピリジン中でピリジンの最も低磁場のシグナルを１５０．４  ｐｐｍとして測定した、１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトルは、以下に示すとおりである。
１４．８  （ｑ），  １５．３  （ｑ），  １８．２  （ｑ），  １８．２  （ｔ），  ２１．３  （ｑ），  ２３．４  （ｔ），  ２５．９  （ｔ），  ２７．７  （ｔ），  ３０．１  （ｔ），  ３０．３  （ｔ，炭素２個分として），  ３０．４  （ｔ），  ３０．５  （ｔ），  ３０．７（ｔ），３２．６  （ｔ），  ３３．０  （ｔ），  ３７．６  （ｄ），  ３８．９  （ｔ），  ４０．２  （ｔ），  ４２．９  （ｔ），  ５１．１  （ｄ），  ５３．７  （ｄ），  ５７．５  （ｄ），  ５７．８  （ｄ），  ６０．１  （ｄ），  ６０．５  （ｄ），  ６１．８  （ｔ），  ６３．０  （ｔ），  ６３．３  （ｔ），  ６３．７  （ｔ），  ６８．３  （ｄ），  ７６．８  （ｄ），  １７０．７  （ｓ），  １７１．６  （ｓ），  １７２．２  （ｓ），  １７２．４  （ｓ），  １７２．７  （ｓ），  １７３．３  （ｓ），  １７３．９  （ｓ），  １７４．２  （ｓ），  １７４．７  （ｓ）  ｐｐｍ
９）高速液体クロマトグラフィー：
カラム：カプセルパック  Ｃ１８  ＡＣＲ，  ４．６  Φ  ｘ  １５０  ｍｍ  （（株）資生堂社製）
溶媒：アセトニトリル／０．２  ％  トリエチルアミン燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）＝４０／６０
流速：１．０  ｍｌ／  分
検出：紫外部吸収  ２１０  ｎｍ
保持時間：６．０  分
【請求項３】
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属に属する請求項１または請求項２に記載の化合物の生産菌を培養し、その培養物より請求項１または請求項２に記載の化合物を採取することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の化合物の製造方法。
【請求項４】
トリコデルマ属に属する、請求項１または請求項２に記載の化合物の生産菌がトリコデルマ・ハマータム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｍａｔｕｍ  （Ｂｏｎｏｒｄ．）  Ｂａｉｎｉｅｒ）ＳＡＮＫ１８５０２株である請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
請求項１または請求項２に記載の化合物又はその薬理上許容される塩を有効成分として含有する医薬。
【請求項６】
請求項１または請求項２に記載の化合物又はその薬理上許容される塩を有効成分として含有する真菌感染症の予防薬又は治療薬。
【請求項７】
トリコデルマ  ハマータム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｍａｔｕｍ  （Ｂｏｎｏｒｄ．）  Ｂａｉｎｉｅｒ）ＳＡＮＫ１８５０２株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、優れた抗真菌活性を有する化合物若しくはその塩、該化合物の製造法、該化合物を有効成分として含有する医薬（特に抗真菌剤）、又は、該化合物を生産する新規微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、抗真菌剤として、アムフォテリシンＢ、フルシトシン、アゾール系薬剤等が臨床上用いられている。しかし、これらの薬剤は、毒性が強く使用が難しいことや耐性菌が出現する等の問題がある。また、真菌類のうちアスペルギルス属に対して有効な抗真菌剤はほとんど見出されておらず、いまだ臨床上使用されているものはない。
【０００３】
これらの問題を解決すべく、微生物が生産する化合物の中から抗真菌活性を有する化合物を見出す研究が行われている。例えば、耐性菌に対して抗真菌活性を有する化合物として、オーレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属が生産するオーレオバシジン（ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ）類（例えば、非特許文献１参照。）が報告されているが、該化合物はアスペルギルス属に対する効果が十分ではなく、現在、上記問題を解決する薬剤は臨床上用いられるに至っていない。
【０００４】
今後、癌等の重篤な基礎疾患を有する患者や、免疫不全をきたす患者の増加が懸念されており、これらの患者の増加に伴い薬剤耐性菌やアスペルギルス属に感染した患者が増加することが予想されることから、これらの真菌に対しより有効な抗真菌剤が渇望されていた。
【０００５】
【非特許文献１】
「新規抗真菌抗生物質オーレオバシジン」，ジャーナルオブアンチバイオティックス，１９９１年，第４４巻，ｐ．９１９−９２４（“ＡＵＲＥＯＢＡＳＩＤＩＮＳ，  ＮＥＷ  ＡＮＴＩＦＵＮＧＡＬ  ＡＮＴＩＢＩＯＴＩＣＳ”，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，１９９１，４４，  ｐ．９１９−９２４）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、微生物の培養液中から新規化合物を見出し、かかる新規化合物の製造法、該化合物を生産する新規微生物およびその培養法を確立し、この化合物の薬理活性について永年に亘り鋭意研究を行った結果、この化合物が優れた抗真菌活性を有し、特に、現在問題となりつつある、耐性菌を含む真菌に対して優れた抗真菌活性を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
また、本発明の化合物は、より優れた抗真菌活性を有する誘導体を合成する際の出発原料とすることも可能である。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
（１）  下記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩、
【０００９】
【化２】
2004168685.tif 000002
【００１０】
（２）  下記の物理化学的性状を有する化合物又はその塩、
１）物質の性状：白色粉末状物質
溶解性：ピリジン、メタノール、ＤＭＳＯに可溶、水、ノルマルヘキサンに不溶
３）分子式：Ｃ４１Ｈ７３Ｎ９Ｏ１５
４）分子量：９３１  （ＦＡＢマススペクトル法により測定）
５）高分解能二重収束質量分析計を用い、ＥＳＩマススペクトル法にて測定した精密質量：［Ｍ＋Ｈ］＋は次に示す通りである。
実測値：９３２．５３１６
計算値：９３２．５３０４
６）赤外吸収スペクトル：臭化カリウム  （ＫＢｒ）  錠剤法で測定した赤外吸収スペクトルは以下に示す極大吸収を示す。
３３１６，２９２５，１７４９，１６３２，１５３４，１０６８  ｃｍ−１
７）１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：重ピリジン中でピリジンの最も低磁場のシグナルを８．７４  ｐｐｍとして測定した、１Ｈ−核磁気共鳴スペクトルは、以下に示すとおりである。括弧中の水素の数はＨＳＱＣ法およびＤＥＰＴ法により観測されたものである。０．８４  （３Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７  Ｈｚ），  ０．８８  （３Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ７  Ｈｚ），  １．０５−１．３３  （１８Ｈ，  ｍ），  １．５５（３Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ６．５  Ｈｚ），  １．５９  （３Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７  Ｈｚ），  １．８２  （１Ｈ，  ｍ），  ２．２８  （２Ｈ，  ｍ），  ２．４０  （１Ｈ，  ｍ），  ２．６７  （１Ｈ，  ｍ），  ２．８３  （２Ｈ，  ｍ），  ３．２８  （１Ｈ，  ｍ），  ３．３５  （１Ｈ，  ｍ），  ４．２２  （１Ｈ，  ｂｒ  ｄ，  Ｊ  ＝  １６．５  Ｈｚ），  ４．３０−４．５２  （８Ｈ，  ｍ），  ４．５９−４．６５  （２Ｈ，  ｍ），  ４．８６（１Ｈ，  ｍ），  ５．０３  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７  Ｈｚ），  ５．１６  （１Ｈ，  ｍ），  ５．２８  （３Ｈ，  ｍ），  ５．４７  （１Ｈ，  ｍ），  ５．６５  （１Ｈ，  ｍ），  ｐｐｍ
８）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル：重ピリジン中でピリジンの最も低磁場のシグナルを１５０．３５  ｐｐｍとして測定した、１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトルは、以下に示すとおりである。
１４．８  （ｑ），  １５．３  （ｑ），  １８．２  （ｑ），  １８．２  （ｔ），  ２１．３  （ｑ），  ２３．４  （ｔ），  ２５．９  （ｔ），  ２７．７  （ｔ），  ３０．１  （ｔ），  ３０．３  （ｔ，炭素２個分として），  ３０．４  （ｔ），  ３０．５  （ｔ），  ３０．７（ｔ），３２．６  （ｔ），  ３３．０  （ｔ），  ３７．６  （ｄ），  ３８．９  （ｔ），  ４０．２  （ｔ），  ４２．９  （ｔ），  ５１．１  （ｄ），  ５３．７  （ｄ），  ５７．５  （ｄ），  ５７．８  （ｄ），  ６０．１  （ｄ），  ６０．５  （ｄ），  ６１．８  （ｔ），  ６３．０  （ｔ），  ６３．３  （ｔ），  ６３．７  （ｔ），  ６８．３  （ｄ），  ７６．８  （ｄ），  １７０．７  （ｓ），  １７１．６  （ｓ），  １７２．２  （ｓ），  １７２．４  （ｓ），  １７２．７  （ｓ），  １７３．３  （ｓ），  １７３．９  （ｓ），  １７４．２  （ｓ），  １７４．７  （ｓ）  ｐｐｍ
９）高速液体クロマトグラフィー：
カラム：カプセルパック  Ｃ１８  ＡＣＲ，  ４．６  Φ  ｘ  １５０  ｍｍ  （（株）資生堂社製）
溶媒：アセトニトリル／０．２  ％  トリエチルアミン燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）＝４０／６０
流速：１．０  ｍｌ／  分
検出：紫外部吸収  ２１０  ｎｍ
保持時間：６．０  分
（３）  トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属に属する（１）または（２）に記載の化合物の生産菌を培養し、その培養物より（１）または（２）に記載の化合物を採取することを特徴とする（１）または（２）に記載の化合物の製造方法、
（４）  トリコデルマ属に属する、（１）または（２）に記載の化合物の生産菌がトリコデルマ・ハマータム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｍａｔｕｍ  （Ｂｏｎｏｒｄ．）  Ｂａｉｎｉｅｒ）ＳＡＮＫ１８５０２株である（３）に記載の製造方法、
（５）  （１）または（２）に記載の化合物又はその薬理上許容される塩を有効成分として含有する医薬、
（６）  （１）または（２）に記載の化合物又はその薬理上許容される塩を有効成分として含有する真菌感染症の予防薬又は治療薬、
（７）  トリコデルマ  ハマータム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｍａｔｕｍ  （Ｂｏｎｏｒｄ．）  Ｂａｉｎｉｅｒ）ＳＡＮＫ１８５０２株に関する。
【００１１】
以下、本明細書において、上記（１）または（２）に記載の化合物をＦ−２０９１６Ａという。
【００１２】
本発明のＦ−２０９１６Ａは、和歌山県おいて採集された土壌から分離したトリコデルマ  ハマータム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｍａｔｕｍ  （Ｂｏｎｏｒｄ．）  Ｂａｉｎｉｅｒ）ＳＡＮＫ１８５０２株（以下、単に「ＳＡＮＫ１８５０２株」と称する。）の培養液中に生産される。
【００１３】
本発明の化合物は、いくつかの不斉炭素原子を有するため、種々の光学異性体が存在する。式（Ｉ）において、これらの異性体はすべて単一の式で示されているが、本発明はラセミ化合物を含むこれらの異性体、およびこれらの異性体の混合物をもすべて含む。これらの異性体は、立体特異的合成法により、または光学活性化合物を原料化合物とした合成により、製造することができ、または、異性体の混合物として製造した後、所望の異性体をクロマトグラフィー等を用いて常法により単離することにより製造することもできる。
【００１４】
本発明の化合物は、アミノ基等を有するため、酸を用いて当業者に周知の方法により塩にすることができる。本発明はこれらの塩も包含する。本発明の化合物の塩を医薬として使用する場合、医学的に使用され、薬理学的に許容されるものであれば特に限定はなく、また、医薬以外の用途に用いる場合、例えば中間体として用いる場合には、該用途に用いることのできるものであれば特に限定されない。
【００１５】
そのような塩としては、例えば、酢酸塩、臭化物塩、塩化物塩、塩酸塩、臭酸塩、ヨウ化物塩、硫酸塩、リン酸塩、ニリン酸塩のような無機塩；およびクエン酸塩、マレイン酸塩、パモ酸塩、酒石酸塩のような有機酸塩等を挙げることができる。好適には、薬理学的に許容される塩であり、より好適には、塩酸塩、パモ酸塩である。
【００１６】
また、本発明の化合物およびその塩は、大気中に放置したり、水又は有機溶媒と混和することによって水又は溶媒と結合し、水和物又は溶媒和物を形成する場合があるが、これらの水和物及び溶媒和物も「薬理上許容される塩」として本発明に含まれる。
【００１７】
更に、本発明は、生体内において代謝されることによりＦ−２０９１６Ａに変換される化合物、いわゆるプロドラッグもすべて含むものである。
【００１８】
【発明の実施の形態】
（１）生産菌
本発明Ｆ−２０９１６Ａの製造方法において用いられる、トリコデルマ  （Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）  属に属する菌株としては、例えばトリコデルマ  ハマータム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｍａｔｕｍ  （Ｂｏｎｏｒｄ．）  Ｂａｉｎｉｅｒ）ＳＡＮＫ１８５０２株（以下、単に「ＳＡＮＫ１８５０２株」と称する）をあげることができる。ＳＡＮＫ１８５０２株は、２００１年２月和歌山県で採集した土壌より分離された。
【００１９】
本菌の菌学的性状を観察するため、次の各培地上で培養を行った。使用した各培地の組成を以下に記載する。
【００２０】
【表１】
＜２％ＭＡ培地（２％麦芽エキス寒天培地）＞
麦芽エキス                                    ２０ｇ
寒天                                          ２０ｇ
蒸留水                                    １０００ｍｌ
＜ＣＭＡ培地（コーンミール寒天（Ｃｏｒｎ  Ｍｅａｌ  Ａｇａｒ）培地）＞
コーンミールアカ゛ール（日水製薬（株）製）    １７ｇ
寒天                                            ５ｇ
蒸留水                                    １０００ｍｌ
＜ＷＳＨ培地＞
オートミール                                  １０ｇ
硫酸マグネシウム七水和物                        １ｇ
リン酸二水素カリウム                            １ｇ
硝酸ナトリウム                                  １ｇ
寒天                                          ２０ｇ
蒸留水                                    １０００ｍｌ。
【００２１】
色調の表示はコーネラップ、ワンスチャー，「メチューン・ハンドブック・オブ・カラー」，第３版，ロンドン，エアメチューン，１９７８年（Ｋｏｒｎｅｒｕｐ  Ａ，  Ｗａｎｓｃｈｅｒ  ＪＨ  “Ｍｅｔｈｕｅｎ  ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｃｏｌｏｕｒ”  ３ｒｄ．  ｅｄｉｔｉｏｎ．  Ｅｒｙｅ  Ｍｅｔｈｕｅｎ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  （１９７８））に従った。ＳＡＮＫ１８５０２株の各平板培地上での生育は次の通りである。
【００２２】
２％ＭＡ培地上での成長は、２０℃、４日の培養で直径６０乃至６２ｍｍである。コロニーは平坦で薄く、気菌糸は少ない。コロニー表面は白色である。培養を継続すると多数のプステル（ｐｕｓｔｕｌｅｓ）が同心円状にまたはコロニー縁辺部に形成される。プステルは直径６  ｍｍ以下、半球形、表面はビロード状、初め白色でしだいにディープグリーン（２５Ｅ８）となる。浸出液および匂いはない。裏面は無色である。
【００２３】
ＣＭＡ培地上での成長は、２０℃、４日の培養で直径５６ｍｍである。コロニーは平坦で薄く、気菌糸は少ない。コロニー表面は白色である。浸出液および匂いはない。裏面は無色である。
【００２４】
ＷＳＨ培地上での成長は、２０℃、４日の培養で直径６４乃至６６ｍｍである。コロニーは平坦で薄く、気菌糸は少ない。コロニー表面は白色である。浸出液および匂いはない。裏面は無色である。
【００２５】
ＳＡＮＫ１８５０２株の微小形態は次の通りである。
分生子柄は平滑で薄壁、無色で幅６  μｍ以下、下部では規則的に分枝し、分枝はほぼ直角に分かれる。分生子柄主軸の先端部は不稔、不規則に分枝し、波状乃至かぎ状、不稔部分は長さ１２０  μｍ以下である。フィアライドは４乃至５×２．５乃至３．５  μｍ、つぼ形、多くは４乃至６個輪生する。分生子は３乃至４．５×２．５乃至３μｍ、楕円形で平滑、薄壁で薄い緑色。厚膜胞子は直径５乃至１２μｍ、菌糸末端部または菌糸に介在して形成され、亜球形乃至楕円形、平滑で壁は厚さ１  μｍ以下、無色である。
【００２６】
本菌の以上のような菌学的性状は、ビセット等，「アリヴィジョンオブザジーナストリコデルマ．  ＩＩＩ．  セクションパキバシディウム  カナディアンジャーナルオブボタニー」，カナディアンジャーナルオブバトニー，１９９１年，第６９巻，ｐ．２３７３−２４１７（Ｂｉｓｓｅｔｔ  Ｊ，  “Ａ  ｒｅｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｕｓ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ．  ＩＩＩ．  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｐａｃｈｙｂａｓｉｄｉｕｍ”，  Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ，  ６９，  ｐ．２３７３−２４１７  （１９９１））やガムス、ビセット等，「モルホロジーアンドアイデンティフィケーションオブトリコデルマ」，キュビセック、ハルマン編集、「トリコデルマアンドグリオクラディウム」，第１巻，テイラーアンドフランシスジャーナル，１９９８年，ｐ．３−３４（Ｇａｍｓ  Ｗ，  Ｂｉｓｓｅｔｔ  Ｊ，  Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ．  Ｉｎ：Ｋｕｂｉｃｅｋ  ＣＰ，  Ｈａｒｍａｎ  ＧＥ  （ｅｄｓ）  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｎｄ  Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ．  Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  １，  ｐ．３−３４  （１９９８））に記載されているトリコデルマ  ハマータム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｍａｔｕｍ  （Ｂｏｎｏｒｄ．）  Ｂａｉｎｉｅｒ）と一致した。よって本菌株を、トリコデルマ  ハマータムと同定した。
【００２７】
なお、ＳＡＮＫ１８５０２株は、トリコデルマ  ハマータム  ＳＡＮＫ１８５０２株として、平成１４年１１月１日付けで日本国茨城県つくば市東１−１−１の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託され、受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２３０を付与された。
【００２８】
周知の通り、真菌類は自然界において、又は人工的な操作（例えば、紫外線照射、放射線照射、化学薬品処理等）により、変異を起こしやすく、本発明のＳＡＮＫ１８５０２株もその点は同じである。本発明にいうＳＡＮＫ１８５０２株はその全ての変異株を包含する。
【００２９】
また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組み換え、形質導入、形質転換等によりえられたものも包含される。即ち、Ｆ−２０９１６Ａを生産するＳＡＮＫ１８５０２株、それらの変異株およびそれらと明確に区別されない菌株は全てＳＡＮＫ１８５０２株に包含される。
【００３０】
（２）培養法及び精製法
本発明のＦ−２０９１６Ａを得るため、これらの微生物の培養は一般に他の発酵生成物を生産するために用いられる培地と同様の培地を用いて行なわれる。このような培地は、微生物が資化出来る炭素源、窒素源および無機塩を含有する。
【００３１】
炭素源としては、例えば、グルコース、フラクトース、マルトース、シュークロース、マンニトール、グリセリン、デキストリン、オート麦、ライ麦、トウモロコシデンプン、ジャガイモ、トウモロコシ粉、大豆油、綿実油、糖蜜、クエン酸、酒石酸等をあげることができる。これらの炭素源は単独または組み合わせて用いることができる。
【００３２】
培地に加える炭素源の量は、培地中の他の成分により異なるが、通常、培地量の１乃至１０重量％である。
【００３３】
窒素源としては、例えば、大豆粉、フスマ、落下生粉、綿実紛、カゼイン加水分解物、ファーマミン、コーンスチープリカー、ペプトン、肉エキス、イースト、イーストエキス、マルトエキス、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等をあげることができる。これらの炭素源は単独または組み合わせて用いることができる。
【００３４】
培地に加える窒素源の量は、培地中の他の成分により異なるが、通常、０．２乃至６重量％である。
【００３５】
炭素源および窒素源は、一般に組み合わせて用いるが、純粋な形態である必要はなく、微量の生育因子、ビタミンおよび無機栄養を含むより純度の低いものを用いてもよい。
【００３６】
無機塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、アンモニウム、カルシウム、リン酸、硫酸、塩酸、炭酸等のイオンを生じる塩類をあげることができる。
【００３７】
また、菌の資化しうるビタミンＢ１、ビオチンのようなビタミン類、チアミンのような菌体増殖促進物質等も必要に応じて添加してもよい。
【００３８】
更に、マンガン、モリブデン、その他の金属塩を必要に応じて添加してもよい。
【００３９】
栄養培地がかなり泡立つ場合など、必要に応じて、シリコンオイル、ポリアルキレングリコールエーテル、植物油、動物油、界面活性剤のような消泡剤を培地に添加してもよい。特に、液体培養に際しては、これらの消泡剤を添加することが好適である。
【００４０】
培地のｐＨは、培地の成分、生育温度等により異なるが、通常発酵生成物を生産するために用いられるｐＨであればよく、好適には、４．０乃至６．５の範囲である。
【００４１】
菌の生育温度は、培地の成分、ｐＨ等により異なるが、通常、１０℃乃至３３℃であり、２０℃から３０℃の範囲が生育に良好である。Ｆ−２０９１６Ａの生産には、２０℃から２７℃が好適である。
【００４２】
培養方法としては、特に制限はなく、微生物一般に用いられる培養法であればよく、固形培地を用いた培養法、攪拌培養法、振とう培養法、通気培養法等を使用することができる。好適には、好気的な液体培養法である攪拌培養法、振とう培養法、又は通気培養法であり、更に好適には、振とう培養法である。なお、工業的には、通気攪拌培養法が好適である。
【００４３】
小規模な培養においては、２０乃至２７℃（好適には、２３℃）で数日間、振とう培養を行なうのが好適である。培養は三角フラスコ中で、１または２段階の種の発育工程により開始させる。種の発育段階の培地には、炭素源、窒素源、微量の生育因子、無機塩類および微量金属類を併用できる。種フラスコは定温インキュベーター中で２０乃至２７℃（好適には２３℃）、２乃至７日間（好適には４日間）振とうするか、又は充分に成育するまで振とうする。成育した種は、第二の種培地又は生産培地に接種するために用いられる。中間の発育工程を用いる場合には、本質的に同様の方法で成育させ、生産培地に接種するためにそれを部分的にあるいは全てを用いる。接種したフラスコを一定温度で数日間振とうし、本培養を行なう。
【００４４】
大量培養の場合には、攪拌および通気装置を付けた適当なジャーファーメンター又はタンクで行なうのが好ましい。この方法によれば栄養培地をジャーファーメンター又はタンクの中で作成できる。栄養培地を１２１℃まで加熱して必要時間滅菌し、冷却後、滅菌培地にあらかじめ成長させてあった種を接種する。培養は２０乃至２７度（好適には２３℃）で通気攪拌して行なう。この方法は、多量の化合物を得るのに適している。
【００４５】
培養の経過に伴って生産されるＦ−２０９１６Ａの量の経時変化は、高速液体クロマトグラフィーを用いて測定することができる。通常は、１００乃至２４０時間の培養でＦ−２０９１６Ａの生産量は最高値に達する。
【００４６】
培養終了後、培養液中の液体部分および菌体内に存在するＦ−２０９１６Ａは、培養終了液の全て、あるいは菌体、その他の固形部分を珪藻土をろ過助剤とするろ過操作又は遠心分離によって分別し、得られたろ液又は上清および菌体中から、その物理化学的性状を利用し抽出精製することができる。例えば、ろ液又は上清中に存在するＦ−２０９１６Ａは、水と混和しない有機溶剤、例えば、クロロホルム、塩化エチレン、塩化メチレン、酢酸エチル、ブタノール等を組み合わせることにより抽出精製することができる。あるいは吸着剤として、例えば活性炭又は吸着用樹脂であるアンバーライトＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４（登録商標、ローム・アンド・ハース社製）等や、ダイアイオンＨＰ−１０、ＨＰ−２０、ＣＨＰ−２０Ｐ、ＨＰ−５０、セパビーズＳＰ−２０７（登録商標、三菱化学（株）社製）等が使用される。Ｆ−２０９１６Ａを含む液を上記のごとき吸着剤の層を通過させて不純物を吸着させて取り除くか、又はＦ−２０９１６Ａを吸着させた後、メタノール水、アセトン水、ブタノ−ル水等を用いて溶出させることにより得られる。
【００４７】
また菌体内に存在するＦ−２０９１６Ａは、５０乃至９０％の含水アセトン又は含水メタノールにより抽出し有機溶剤を除去した後、ろ液と同様な抽出精製操作を行なうことにより得られる。
【００４８】
培養終了液の全てを用いる場合には、培養終了後に適当量、好ましくは終濃度５０％になる様にアセトン又はメタノールを添加し、Ｆ−２０９１６Ａを抽出することができる。抽出終了後、珪藻土をろ過助剤とするろ過操作を行い、得られた抽出液をろ液と同様な抽出精製操作を行なうことにより以降の精製に用いることができる。
【００４９】
このようにして得られたＦ−２０９１６Ａは、更にシリカゲル、マグネシウム−シリカゲル系のフロリジルのような担体を用いた吸着カラム又は薄層クロマトグラフィー、ＴＳＫゲルトヨパールＨＷ−４０Ｆ（登録商標、トーソー（株）社製）、セファデックスＬＨ−２０（登録商標、アマシャム  バイオサイエンス社製）等を用いた分配カラムクロマトグラフィーあるいはコスモシール１４０Ｃ１８（登録商標、ナカライテスク社製）等を用いた逆層カラムクロマトグラフィーを用いて粗精製できる。
【００５０】
またこのようにして粗精製されたＦ−２０９１６Ａは、更に逆層カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー、例えばカプセルパックＣ１８ＵＧ１２０（登録商標、資生堂社製）、カプセルパックＣ１８ＡＣＲ（登録商標、資生堂社製）、デベロシルＣ３０ＵＧ−３（登録商標、野村化学（株）社製）、等のカラムを用いて精製することができる。
【００５１】
以上の単離、精製の手段を単独又は適宜組み合わせ、又は反復して用いることによりＦ−２０９１６Ａを単離精製することができる。
【００５２】
本発明のＦ−２０９１６Ａ又はその塩は抗真菌作用を有し、真菌感染症の予防薬又は治療薬として使用することができる。
【００５３】
本発明のＦ−２０９１６Ａ又はその塩を真菌感染症の予防薬又は治療薬として用いる場合、種々の形態で投与される。その投与形態としては特に限定はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等に応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、およびカプセル剤の場合には経口投与される。また注射剤の場合には、単独、もしくはブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液との混合、あるいはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等と混和してエマルジョンとして静脈内投与され、さらには必要に応じて単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与される。坐剤の場合には直腸内投与される。
【００５４】
これらの各種製剤は、常法に従って主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解剤、矯味矯臭剤、コーティング剤等既知の医薬製剤分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。
【００５５】
錠剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、珪酸等の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第四級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、澱粉等の保湿剤、澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状珪酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等が例示できる。更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多重錠とすることができる。
【００５６】
丸剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えばブドウ糖、乳糖、澱粉、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤、ラミナラン、カンテン等の崩壊剤が例示できる。
【００５７】
坐剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセライド等を挙げることができる。
【００５８】
注射剤として調製される場合には、液剤および懸濁剤は殺菌され、且つ血液と等張であるのが好ましく、これら液剤、乳剤および懸濁剤の形態に形成するに際しては、希釈剤としてこの分野において慣用されているものを全て使用でき、例えば水、エチルアルコール、プロピレングリコール、エポキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を挙げることができる。尚、この場合、等張性の溶液を調製するに充分な量の食塩、ブドウ糖又はグリセリンを医薬製剤中に含有せしめてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。
【００５９】
更に必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有せしめてもよい。
【００６０】
上記医薬製剤中に含まれる有効成分化合物の量は、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、通常、全組成物中１乃至７０重量％、好ましくは１乃至３０重量％含まれる量とするのが適当である。
【００６１】
その投与量は症状、年齢、体重、投与方法および剤形等によって異なるが通常は成人に対して１日、上限として２０００ｍｇ（好ましくは２００ｍｇ、更に好ましくは２０ｍｇ）であり、下限として０．００１ｍｇ（好ましくは０．０１ｍｇ、更に好ましくは０．１ｍｇ）を投与することができる。
【００６２】
【実施例】
次に、実施例をあげて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）  Ｆ−２０９１６Ａの培養
ＳＡＮＫ１８５０２株のスラントより約１ｃｍ角の菌子片を切り取り生理食塩水約２ｍｌに懸濁した。ガラスポッターを用いてホモジナイズし、全量を滅菌（１２１℃、３０分間）した後述の組成からなる前培養培地８０  ｍｌを含む５００ｍｌ容三角フラスコに接種した。同様の操作を行い、３本の種培養フラスコを用意した。２３℃で２１０ｒｐｍ（７  ｃｍの回転半径）のロータリー振とう培養機中で４日間培養した。このようにして得られた培養液を、同じ組成の培地８０ｍｌを含む５００ｍｌ容三角フラスコ５０本に５  ％  接種し、２３℃で２１０ｒｐｍ（７  ｃｍの回転半径）のロータリー振とう培養機中で７日間培養した。
【００６３】
【表２】前培養培地の培地組成
―――――――――――――――――――――――――――――――――
グリセリン                                      ３０ｇ
グルコース                                      ３０ｇ
可溶性澱粉                                      ２０ｇ
大豆粉                                          １０ｇ
ゼラチン                                      ２．５ｇ
イーストエキス（Ｄｉｆｃｏ）                  ２．５ｇ
ＮＨ４ＮＯ３                                  ２．５ｇ
寒天                                              ３ｇ
消泡剤＊                                  ０．０５ｍｌ
水道水                                    １０００ｍｌ
―――――――――――――――――――――――――――――――――
滅菌前  ｐＨ  ６．５
＊  ニッサン・ディスフォームＣＢ−４４２（登録商標、日本油脂（株）社製）
【００６４】
【表３】本培養培地の培地組成
―――――――――――――――――――――――――――――――――
グリセリン                                      ３０  ｇ
グルコース                                      ３０  ｇ
可溶性澱粉                                      ２０  ｇ
大豆粉                                          １０  ｇ
ゼラチン                                      ２．５  ｇ
イーストエキス（Ｄｉｆｃｏ）                  ２．５  ｇ
ＮＨ４ＮＯ３                                    ２．５  ｇ
消泡剤＊                                    ０．０５  ｍｌ
水道水                                      １０００  ｍｌ
―――――――――――――――――――――――――――――――――
滅菌前ｐＨ  ６．５
＊  ニッサン・ディスフォームＣＢ−４４２（登録商標、日本油脂（株）社製）（実施例２）  Ｆ−２０９１６Ａの精製
以降の精製においては、活性画分を以下の高速液体クロマトグラフィー  （ＨＰＬＣ）  でモニターした。
カラム：カプセルパック  Ｃ１８  ＡＣＲ，  ４．６  Φ  ｘ  １５０  ｍｍ  （（株）資生堂社製）
溶媒：アセトニトリル／０．２  ％  トリエチルアミン燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）＝４０／６０
流速：１．０  ｍｌ／  分
検出：紫外部吸収  ２１０  ｎｍ
保持時間：６．０  分。
【００６５】
実施例１で得られた培養液  （５  Ｌ）  を遠心し、菌体と培養上清を分離した。菌体に  ５０％  アセトン溶液  １  Ｌ  を加え、  ３  時間室温にて抽出した。抽出液中のアセトンを減圧留去した後培養上清と合わせ、以降の精製に用いた。得られた水溶液５  Ｌ  のうち４  Ｌを、水で平衡化した  ４００  ｍｌ  の  ＨＰ−２０  カラムに付し、  １．５  Ｌの水および１．５  Ｌの５０％  メタノール水で洗浄後、  １．８  Ｌの  メタノールで溶出した。溶出液中のメタノールを減圧留去し、黄色粉末  １．３  ｇ  を得た。このうち  ３５０  ｍｇを、メタノール  （５０  ｍｌ）  に溶解し、０．０２  ％  トリフルオロ酢酸含有  ３０  ％  アセトニトリル水で平衡化した  １８０  ｍｌ  の  コスモシールオープンカラムに付した。このカラムを  ８００  ｍｌ  の  ０．０２  ％  トリフルオロ酢酸含有  ３０  ％  アセトニトリル水で洗浄後、  １  Ｌ  の  ０．０２  ％  トリフルオロ酢酸含有  ４０  ％  アセトニトリル水で溶出した。溶出液のアセトニトリルを減圧留去した後凍結乾燥し、黄色油状物質６３．５  ｍｇ  を得た。
【００６６】
このうち  ２０  ｍｇ  を１０  ｍｌ  のジメチルスルフォキシド溶液に溶解し、以下のように精製した。すなわち試料溶液  ０．５  ｍｌ  を  １０  ｍＭ  ギ酸アンモニウム含有  ４０％  アセトニトリル水で平衡化したＨＰＬＣカラム  （Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０  ＵＧ−３，  ２０  Φ  ｘ  １００  ｍｍ，（株）野村化学社製）  にチャージし、同じ溶媒で  １０  ｍｌ／分の流速で展開した。
【００６７】
２１０  ｎｍ  の紫外部吸収を検出し、１３  分から１５  分を分取して、分取液  ２０  ｍｌ  を得た。残りの試料についても同様に分取を行い、分取液  ４００  ｍｌ  を得た。分取液のアセトニトリルを減圧留去した後凍結乾燥し、４．６  ｍｇ  の  Ｆ−２０９１６Ａ  を得た。
（試験例１）抗真菌活性の測定
抗真菌活性（最小発育阻止濃度）は次の方法に従って測定した。即ち、０．１６５ＭのＭＯＰＳバッファー（ｐＨ  ７．０）（３−［Ｎ−モルフォリノ］プロパンスルホン酸：シグマ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて９６穴マイクロタイタープレートによるブロス希釈法で測定した（山口英世ら，「日本医真菌学会標準化委員会報告（１９９２−１９９４年）」ジャーナルオブメディカルマイコロジー，１９９５年，第３６巻，ｐ．６１−８６参照（Ｈｉｄｅｏ  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ，“Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ    １９９２−１９９４”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，  ３６，  ｐ．６１−８６，（１９９５））。
結果を以下の表３に示す。
【００６８】
【表４】
2004168685.tif 000003
表３に示したように、Ｆ−２０９１６Ａは試験したすべての真菌に対して顕著な抗真菌活性を示した。
（製剤例１）  経口用カプセル剤
【００６９】
【表５】
2004168685.tif 000004
上記処方の粉末を混合し、３０メッシュのふるいを通した後、この粉末をゼラチンカプセルに入れ、カプセル剤とする。
【００７０】
【発明の効果】
本発明の新規化合物Ｆ−２０９１６Ａ又はその塩は優れた抗真菌作用を示し、各種真菌感染症の予防又は治療薬として有用である。
【００７１】
【配列表】
2004168685.tif 000005