(57)【要約】【課題】新規蛋白質及びその製造法【解決手段】破骨細胞形成抑制因子（ＯＣＩＦ）に特異的に結合し、高い親和性を有する新規蛋白質。骨吸収促進因子存在下で培養した骨芽様細胞膜あるいは骨髄由来のストローマ細胞から細胞の膜画分を調製、界面活性剤で膜蛋白質を可溶化しＯＣＩＦ固定化アフニティカラムを用いて精製することによって得ることができる。この蛋白質を用い生理活性物質をスクリーニングしたあるいはこの蛋白質に対する抗体を得ることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の物理化学的性質及び生物活性を有する新規蛋白質。
ａ．　親和性：破骨細胞形成抑制因子（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ；ＯＣＩＦ）に特異的に結合し、高い親和性（細胞膜上での解離定数、Ｋｄ値が１０−９Ｍ以下）を有する。
ｂ．　分子量：非還元条件下におけるＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分子量測定で、約３０，０００−４０，０００　又は約４０，０００±４，０００　の分子量を示し、モノマータイプのＯＣＩＦとクロスリンクさせた場合の見かけ上の分子量は、約９０，０００−１１０，０００を示す。
ｃ．　生物活性：活性型ビタミンＤ３及び副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）　などの、骨吸収促進因子存在下でのマウス骨芽細胞様ストローマ細胞とマウス脾臓細胞共培養において、破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する活性を有する。
【請求項２】
骨吸収促進因子存在下で培養した骨芽様細胞株あるいは骨髄由来のストローマ細胞から細胞の膜画分を調製し、界面活性剤で膜蛋白質を可溶化し、ＯＣＩＦ固定化アフィニティカラムを用いて精製することを特徴とする、請求項１記載の蛋白質の製造方法。
【請求項３】
請求項１記載の蛋白質を用い、この蛋白質に特異的に結合し、その蛋白質の生物活性を阻害あるいは修飾する物質をスクリーニングする方法。
【請求項４】
請求項１記載の蛋白質を用い、この蛋白質に特異的に結合し、その蛋白質の生物活性を伝達する物質をスクリーニングする方法。
【請求項５】
請求項３又は４記載のスクリーニング方法により得られた物質を含有する医薬組成物。
【請求項６】
請求項１記載の蛋白質に対する抗体。
【請求項７】
配列表配列番号１記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
配列表配列番号２記載の塩基配列からなる　ＤＮＡ。
【請求項９】
配列表配列番号２記載の塩基配列の１又はそれ以上の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入されており、且つ破骨細胞抑制因子に特異的に結合し、その活性を抑制する性質を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項７又は９のいずれかに記載のＤＮＡと比較的温和な条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれかに記載のＤＮＡと７０％以上の相同性を有する　ＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項７〜１１のいずれかに記載のＤＮＡを遺伝子工学的に発現することにより得られる蛋白質。
【請求項１３】
破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する活性を有する請求項１２記載の蛋白質。
【請求項１４】
配列表配列番号１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質。
【請求項１５】
請求項７〜１１のいずれかに記載のＤＮＡを用いて遺伝子工学的に産生させることを特徴とする蛋白質の製造法。
【請求項１６】
請求項７〜１１のいずれかに記載の　ＤＮＡによりコードされる蛋白質の発現を調節する物質のスクリーニング方法。
【請求項１７】
請求項７〜１１のいずれかに記載の　ＤＮＡによりコードされる蛋白質に特異的に結合し、その生物活性を阻害又は修飾する物質のスクリーニング方法。
【請求項１８】
請求項７〜１１のいずれかに記載の　ＤＮＡによりコードされる蛋白質に特異的に結合し、その結合を通して該蛋白質の生物活性を伝達する物質のスクリーニング方法。
【請求項１９】
請求項１６〜１８のいずれかに記載のスクリーニング方法により得られた物質を含有する医薬組成物。
【請求項２０】
配列表配列番号１記載のアミノ酸配列の７６〜３１６　番目のアミノ酸配列を含む蛋白質又はその蛋白質の断片、類縁体、あるいは変異体をコードする　ＤＮＡ。
【請求項２１】
配列表配列番号１記載のアミノ酸配列の７２〜３１６　番目のアミノ酸配列を含む蛋白質又はその蛋白質の断片、類縁体、あるいは変異体をコードする　ＤＮＡ。
【請求項２２】
配列表配列番号１記載のアミノ酸配列を含む蛋白質又はその蛋白質の断片、類縁体、あるいは変異体をコードするＤＮＡ。
【請求項２３】
破骨細胞形成抑制因子ＯＣＩＦに特異的に結合し、その生物活性を抑制する作用を有する蛋白質をコードする、請求項２０〜２２のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項２４】
配列表配列番号２の塩基配列を有する、請求項２０〜２３のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項２５】
請求項２０〜２４のいずれかに記載の　ＤＮＡと比較的温和な条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項２６】
請求項２０〜２５のいずれかに記載の　ＤＮＡと７０％以上の相同性を有するＤＮＡ。
【請求項２７】
請求項２０〜２６のいずれかに記載の　ＤＮＡを遺伝子工学的に発現することにより得られるポリペプチドを含む蛋白質。
【請求項２８】
破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する活性を有することを特徴とする、請求項２７記載の蛋白質。
【請求項２９】
配列表配列番号１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質又はその蛋白質の断片、類縁体、あるいは変異体である、請求項２７又は２８に記載の蛋白質。
【請求項３０】
請求項２０〜２６のいずれかに記載の　ＤＮＡを用いて遺伝子工学的に生産させることを特徴とする蛋白質の製造方法。
【請求項３１】
請求項２０〜２６のいずれかに記載のＤＮＡによりコードされる蛋白質の発現を調節する物質のスクリーニング方法。
【請求項３２】
請求項２０〜２６のいずれかに記載のＤＮＡによりコードされる蛋白質に特異的に結合し、その生物活性を阻害又は修飾する物質のスクリーニング方法。
【請求項３３】
請求項２０〜２６のいずれかに記載の　ＤＮＡによりコードされる蛋白質に特異的に結合し、その結合を通して該蛋白質の生物活性を伝達する物質のスクリーニング方法。
【請求項３４】
請求項３１〜３３のいずれかに記載のスクリーニング方法により得られた物質を含有する医薬組成物。
【請求項３５】
配列表配列番号１１記載のアミノ酸配列を含む蛋白質又はその蛋白質の断片、類縁体、あるいは変異体をコードするＤＮＡ。
【請求項３６】
破骨細胞形成抑制因子ＯＣＩＦに特異的に結合し、その活性を抑制する活性を有する蛋白質をコードする、請求項３５に記載のＤＮＡ。
【請求項３７】
配列表配列番号１２記載の塩基配列を有する、請求項３５又は３６記載のＤＮＡ。
【請求項３８】
請求項３５〜３７のいずれかに記載のＤＮＡと比較的温和な条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項３９】
請求項３５〜３８のいずれかに記載の　ＤＮＡと７０％以上の相同性を有する　ＤＮＡ。
【請求項４０】
請求項３５〜３９のいずれかに記載の　ＤＮＡを遺伝子工学的に発現することにより得られるポリペプチドを含む蛋白質。
【請求項４１】
破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する活性を有する請求項４０記載の蛋白質。
【請求項４２】
配列表配列番号１１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質又はその蛋白質の断片、類縁体、あるいは変異体である、請求項４０又は４１に記載の蛋白質。
【請求項４３】
請求項３５〜３９のいずれかに記載の　ＤＮＡを用いて遺伝子工学的に生産させることを特徴とする蛋白質の製造方法。
【請求項４４】
請求項３５〜３９のいずれかに記載の　ＤＮＡによりコードされる蛋白質の発現を調節する物質のスクリーニング方法。
【請求項４５】
請求項３５〜３９のいずれかに記載の　ＤＮＡによりコードされる蛋白質に特異的に結合し、その生物活性を阻害又は修飾する物質のスクリーニング方法。
【請求項４６】
請求項３５〜３９のいずれかに記載の　ＤＮＡによりコードされる蛋白質に特異的に結合し、その結合を通して該蛋白質の生物活性を伝達する物質のスクリーニング方法。
【請求項４７】
請求項４４〜４６のいずれかに記載のスクリーニング方法により得られた物質を含有する医薬組成物。
【請求項４８】
破骨細胞形成抑制因子（ＯＣＩＦ）　に特異的に結合する膜結合蛋白質分子（ＯＢＭ）及び／又はその膜結合部位を欠損した可溶性ＯＢＭ（ｓＯＢＭ）　を認識する抗体。
【請求項４９】
マウスＯＢＭ　及び／又はマウスｓＯＢＭを認識することを特徴とする、請求項４８記載の抗体。
【請求項５０】
ヒトＯＢＭ　及び／又はヒトｓＯＢＭを認識することを特徴とする、請求項４８記載の抗体。
【請求項５１】
ポリクローナル抗体である、請求項４８記載の抗体。
【請求項５２】
モノクローナル抗体である、請求項４８記載の抗体。
【請求項５３】
ヒトＯＢＭ　及び／又はヒトｓＯＢＭ及び／又はマウスＯＢＭ　及び／又はマウスｓＯＢＭに　交差性を有する請求項５２記載のモノクローナル抗体。
【請求項５４】
次の性質を有する、請求項５２記載のモノクローナル抗体。
ａ）　分子量：約１５０，０００
ｂ）　サブクラス：ＩｇＧ１又はＩｇＧ２
ｃ）　ライトチェイン：κ鎖
【請求項５５】
マウス又はヒトのＯＢＭ　又はｓＯＢＭで動物を免疫し、その動物の血液を精製することを特徴とする、ポリクローナル抗体の製造方法。
【請求項５６】
請求項５３又は５２〜５４記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドー　マ。
【請求項５７】
受託番号　ＦＥＲＭ　ＢＰ−６２６４，　ＦＥＲＭ　ＢＰ−６２６５　又はＦＥＲＭ　ＢＰ−６２６６である、ハイブリドーマ。
【請求項５８】
請求項５６又は５７記載のハイブリドーマを培養し、培養液中にモノクローナル抗体を産生させ、これをその培養液から精製、回収することを特徴とする、モノクローナル抗体の製造方法。
【請求項５９】
請求項４８〜５４のいずれかに記載の抗体を用いることを特徴とする、ＯＢＭの測定方法。
【請求項６０】
請求項４８〜５４のいずれかに記載の抗体を用いることを特徴とする、ｓＯＢＭの測定方法。
【請求項６１】
請求項４８〜５４のいずれかに記載の抗体を固相抗体及び酵素標識抗体として用いることを特徴とする、ＯＢＭ又はｓＯＢＭの測定方法。
【請求項６２】
請求項４８〜５４のいずれかに記載の抗体を有効成分とする医薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、破骨細胞形成抑制因子（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ；以下、ＯＣＩＦということがある）に結合する新規な蛋白質（ＯＣＩＦ結合分子；以下ＯＢＭということがある）、及びその製造方法に関する。
また本発明は、該蛋白質をコードするＤＮＡ、このＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質、該蛋白質を遺伝子工学的に製造する方法、及び該蛋白質を含有する医薬組成物に関する。
さらに本発明は、該蛋白質びそのＤＮＡを用いた、該蛋白質の発現を調節する物質、該蛋白質の生物活性を阻害又は修飾する物質、あるいは該蛋白質と結合しその作用を伝達するレセプターのスクリーニング方法、これにより得られた物質、及び得られた物質を含有する医薬組成物に関する。
またさらに本発明は、該蛋白質に対する抗体、その製造方法、それを用いた該蛋白質の測定方法、及び抗体を含有する医薬に関する。
【０００２】
【従来技術】
骨代謝は、骨形成を担当する骨芽細胞と骨吸収を担当する破骨細胞の、総合された活性に依存している。骨代謝異常は、骨形成と骨吸収の均衡が崩れることにより発生すると考えられている。骨代謝の異常を伴う疾患としては、骨粗鬆症、高カルシウム血症、骨ページェット病、腎性骨異栄養症、慢性関節リューマチ、及び変形性関節炎などが知られている。これらの骨代謝異常疾患の代表として骨粗鬆症が挙げられる。この疾患は、破骨細胞による骨吸収が骨芽細胞による骨形成を上まわることにより発生する疾患であり、骨の石灰質と骨基質とが等しく減少することを特徴とする。この疾患の発生メカニズムについては未だ完全には解明されていないが、骨の疼痛が発生し、骨の脆弱化による骨折が起こる疾患である。高齢人口の増加に伴い、骨折による寝たきり老人の原因となり、この疾患は社会問題にもなっており、その治療薬の開発が急務となっている。このような骨代謝異常による骨量減少症は、骨形成の促進、骨吸収の抑制、あるいはこれらのバランスの改善により治療できることが期待される。即ち、骨形成は、骨形成を担当する骨芽細胞の増殖、分化、機能を促進すること、破骨細胞前駆細胞からの破骨細胞への分化、成熟を抑制すること、あるいは破骨細胞の骨吸収活性などの機能を抑制することにより促進されると期待される。このような活性を有するホルモン、低分子物質、あるいは生理活性蛋白質について、現在精力的な探索及び開発研究が進められている。
【０００３】
すでに、骨に関わる疾患の治療及び治療期間の短縮を図る医薬品として、カルシトニン製剤、活性型ビタミンＤ３製剤、エストラジオールを含有するホルモン製剤、イプリフラボン、ビタミンＫ２、ビスフォスフォネート系化合物などがあり、さらに、より副作用が少なく、有効性に優れた治療薬の開発を目指して活性型ビタミンＤ３誘導体、エストラジオール誘導体、第２世代または第３世代のビスフォスフォネート系化合物などの臨床試験が実施されている。
【０００４】
しかし、これらの薬剤を用いた治療法は、その効果並びに治療結果において必ずしも満足出来るものではなく、より安全かつ有効性の高い新しい治療薬の開発が期待されている。また、骨代謝疾患の治療に使用されている薬剤の中には、その副作用により治療可能な疾患が限定されているものもある。更に現在、骨粗鬆症などの骨代謝疾患の治療には、複数の薬剤を同時に使用する多剤併用療法が主流になってきている。このような観点から、従来の医薬品とは異なった作用メカニズムを持ち、しかもより有効性が高くかつ副作用の少ない医薬品の開発が期待されている。
【０００５】
前述したように、骨代謝を担当する細胞は骨芽細胞と破骨細胞である。これらの細胞は互いに密接に相互作用していることが知られており、この現象はカップリングと呼ばれている。即ち、破骨細胞の分化、成熟には骨芽細胞様ストローマ細胞が分泌するサイトカイン類、インターロイキン１（ＩＬ−１）、３（ＩＬ−３）、６（ＩＬ−６）、１１（ＩＬ−１１）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、インターフェロンガンマー（ＩＦＮ‐γ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ‐α）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ‐β）などが促進的又は抑制的に作用することが報告されている（非特許文献１；　非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。骨芽細胞様ストローマ細胞は、未熟な破骨細胞前駆細胞や破骨細胞との細胞間接着により、それぞれ破骨細胞の分化、成熟や成熟破骨細胞による骨吸収などの機能発現に重要な役割を演じていることが知られている。この細胞間接着による破骨細胞形成に関与する因子として、骨芽細胞様ストローマ細胞の膜上に発現される破骨細胞分化誘導因子（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ，　ＯＤＦ）（非特許文献５；非特許文献６）という分子が仮想されており、この仮説によれば破骨細胞の前駆細胞にＯＤＦのレセプターが存在している。
しかし、ＯＤＦ及びこのレセプターとも未だ精製及び同定されておらず、それらの性質、作用機作、及び構造に関する報告もない。このように、破骨細胞の分化、成熟のメカニズムは未だ十分に解明されておらず、このメカニズムの解明は基礎医学領域に多大な貢献をするだけでなく、新しい作用メカニズムに基づく新規な骨代謝異常症治療薬の開発にも貢献することが期待される。
【０００６】
本発明者らは、このような状況に鑑み鋭意探索を進めた結果、ヒト胎児肺線維芽細胞、ＩＭＲ−９０（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ１８６）の培養液中に破骨細胞形成抑制因子（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ，　ＯＣＩＦ）を見出した（特許文献１）。
さらに、本発明者らは、ＯＣＩＦのＤＮＡクローニング、動物細胞を用いた遺伝子組み換え型ＯＣＩＦの生産、遺伝子組み換え型ＯＣＩＦによるｉｎ　ｖｉｖｏ薬効（骨代謝改善効果）の確認などに成功した。ＯＣＩＦは、従来の医薬品よりも有効性が高くかつ副作用が少ない、骨代謝異常に関連する疾患の予防及び治療剤として期待されている。
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ９６／２６２１７号
【非特許文献１】Ｒａｉｓｚ：　Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ　ｏｆ　Ｂｏｎｅ　ａｎｄ　Ｍｉｎｅｒａｌ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，　２８７−３１１，　１９９２
【非特許文献２】Ｓｕｄａ　ｅｔ　ａｌ．：Ｐｒｉｎｃｅｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｂｏｎｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　８７−１０２，　１９９６
【非特許文献３】Ｓｕｄａ　ｅｔ　ａｌ．：　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ，　４，　２６６−２７０，　１９５５
【非特許文献４】Ｌａｃｅｙ　ｅｔ　ａｌ．：Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，　１８６，　２３６９−２３７６，　１９９５
【非特許文献５】Ｓｕｄａ　ｅｔ　ａｌ．：Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖ．１３，６６−８０，　１９９２
【非特許文献６】Ｓｕｄａ　ｅｔ　ａｌ．：Ｂｏｎｅ　１７，　８７Ｓ−９１Ｓ，　１９９５
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは破骨細胞形成抑制因子ＯＣＩＦを用い、その結合蛋白質の存在を鋭意探索した結果、ＯＣＩＦ結合蛋白質が活性型ビタミンＤ３や副甲状腺ホルモン（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅ，　ＰＴＨ）などの骨吸収促進因子の存在下で培養した骨芽細胞様ストローマ細胞上に特異的に発現することを見出した。さらに、このＯＣＩＦ結合蛋白質の性質及びその生理的機能を調べたところ、該蛋白質は未熟な破骨細胞前駆細胞からの破骨細胞への分化、成熟に関与する、いわゆる破骨細胞分化、成熟を支持又は促進する因子としての生物活性を有していることを見出し、本発明を成すに至った。さらに、本発明蛋白質につき研究を重ねた結果、この新規な膜蛋白質は骨芽細胞様ストローマ細胞と脾臓細胞との共培養系において、骨芽細胞様ストローマ細胞による未熟な破骨細胞前駆細胞からの破骨細胞への分化、成熟を担う重要な蛋白質であることを明らかにした。本発明における破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する因子としての蛋白質の同定及びその単離精製の成功により、本発明蛋白質を利用した、生体の骨代謝機構に基づいた新規な骨代謝異常症治療薬のスクリーニングを可能にした。
【０００９】
従って本発明は、破骨細胞形成抑制因子ＯＣＩＦに結合する新規な蛋白質（ＯＣＩＦ結合分子；ＯＢＭ）、及びその製造方法を提供することを課題とする。また本発明は、該蛋白質をコードするＤＮＡ、このＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質、該蛋白質を遺伝子工学的に製造する方法、及び該蛋白質を含有する医薬組成物を提供することを課題とする。また、該蛋白質を含有する骨代謝異常症予防及び／又は治療剤を提供することを課題とする。さらに本発明は、該蛋白質を及びそのＤＮＡを用いた、該蛋白質の発現を調節する物質、該蛋白質の生物活性を阻害又は修飾する物質、あるいは該蛋白質と結合しその作用を伝達するレセプターのスクリーニング方法、これにより得られた物質、及び得られた物質を含有する医薬組成物を提供することを課題とする。またさらに本発明は、該蛋白質に対する抗体、その製造方法、それを用いた該蛋白質の測定方法、及び抗体を含有する医薬を提供することを課題とする。
【００１０】
本発明蛋白質は、以下の物理化学的性質及び生物活性を示す。
即ち、
ａ．親和性：破骨細胞形成抑制因子（ｏｓｔｅｑｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ；　ＯＣＩＦ）に特異的に結合し、高い親和性（細胞膜上での解離定数、Ｋｄ値が１０−９Ｍ以下）を有する。
ｂ．分子量：非還元条件下におけるＳＤＳ―ポリアクリルアミド電気泳動による分子量測定で、約３０，０００−４０，０００の分子量を示し、又、モノマータイプのＯＣＩＦとクロスリンクさせた場合の見かけ上の分子量は、約９０，０００−１１０，０００を示す。
ｃ．生物活性：活性型ビタミンＤ３及び副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）などの、骨吸収促進因子の存在下でのマウス骨芽細胞様ストローマ細胞とマウス脾臓細胞共培養において、破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する活性を有する。
破骨細胞形成の代表的なインビトロ培養系として、活性型ビタミンＤ３あるいはＰＴＨ存在下でのマウス由来骨芽細胞様ストローマ細胞株・ＳＴ２とマウス脾臓細胞との共培養系がよく知られている。本発明蛋白質の発現細胞は活性型ビタミンＤ３存在あるいは非存在下でそれぞれ培養したマウス骨芽細胞様ストローマ細胞あるいはマウス脾臓細胞へのＯＣＩＦの結合性を試験することにより調べることができる。
【００１１】
本発明蛋白質は、活性型ビタミンＤ３やＰＴＨのような骨吸収促進因子の存在下で培養した骨芽細胞様ストローマ細胞上に特異的に誘導される蛋白質として特定される。又、活性型ビタミンＤ３存在下の上記共培養系にＯＣＩＦを添加することにより１から４０ｎｇ／ｍｌの範囲で用量依存的に破骨細胞の形成が阻害されること、活性型ビタミンＤ３存在下でＳＴ２細胞上に誘導される本発明蛋白質の発現の経時変化と破骨細胞形成の経時変化とがよく相関すること、又、ＳＴ２細胞に発現される本発明蛋白質の多寡とＳＴ２細胞による破骨細胞形成支持能の強弱が一致し、ＳＴ２細胞上の本発明蛋白質にＯＣＩＦが結合することにより破骨細胞形成が完全に抑制されることから、本発明蛋白質は破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する生物活性（作用）を有する蛋白質として特定される。
【００１２】
本発明蛋白質のＯＣＩＦに対する親和性は、ＯＣＩＦを標識し、その標識体の動物細胞膜表面への結合性を試験することによって評価することができる。ＯＣＩＦは、放射性同位元素による標識や蛍光標識などのような通常の蛋白質標識法を用いることによって標識することができる。例えば、ＯＣＩＦの放射性同位元素による標識としてはチロシン残基の１２５Ｉ標識が挙げられ、ヨードジェン法、クロラミンＴ法、及び酵素法などの標識法を利用することができる。このようにして得た標識ＯＣＩＦを用いた、ＯＣＩＦの動物細胞膜表面への結合性試験は常法に従い実施でき、又、結合性試験に用いる培地に標識ＯＣＩＦの１００倍から４００倍濃度未標識ＯＣＩＦを添加することにより、非特異的な結合量を測定することができる。ＯＣＩＦの特異的結合量は、標識ＯＣＩＦの総結合量から非特異的な結合量を差し引くことにより算出される。細胞膜上に発現された本発明蛋白質の親和性は標識ＯＣＩＦの添加量を変えて試験を行い、特異的結合量をＳｃａｔｃｈａｒｄ　ｐｌｏｔで解析することによって評価される。このようにして求められた、本発明蛋白質のＯＣＩＦに対する親和力は約１００−５００ｐＭであり、本発明蛋白質はこのように破骨細胞形成抑制因子ＯＣＩＦに高い親和性（細胞膜上での解離定数、Ｋｄ値が１０−９Ｍ以下）を有する蛋白質として特定される。ＯＢＭの分子量は、ゲル濾過クロマトグラフィーやＳＤＳ−ＰＡＧＥ等を用いて測定される。より正確に分子量を測定するためにはＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いるのが好ましく、ＯＢＭは還元条件下で約４０，０００　（４０，０００±４，０００）の分子量を有する蛋白質として特定される。
【００１３】
本発明蛋白質は、マウス骨芽細胞様ストローマ細胞株ＳＴ２、マウス前脂肪細胞株ＰＡ６、その他のヒト骨芽細胞様細胞株、あるいはヒト、マウス、ラットなどの哺乳動物から採取し濃縮した骨芽細胞様細胞などから得ることができる。又、これらの細胞に本発明蛋白質を発現させるために必要な誘導物質としては、活性型ビタミンＤ３（Ｃａｌｃｉｔｒｉｏｌ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、インターロイキン（ＩＬ）‐１、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、オンコスタチンＭ及び白血病細胞増殖抑制因子ＬＩＦ）などの骨吸収促進因子が挙げられる。又、これらの誘導物質の添加濃度としては、活性型ビタミンＤ３やＰＴＨでは、１０−８Ｍ、ＩＬ−１１やオンコスタチンＭではそれぞれ１０ｎｇ／ｍｌ及び１ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６では２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６と５００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６可溶性レセプターを用いるのが望ましい。好ましくは、マウス骨芽細胞様ストローマ細胞株ＳＴ２を用い、１０−８Ｍ活性型ビタミンＤ３、１０−７Ｍデキサメサゾン、及び１０％牛胎児血清を添加したα‐ＭＥＭ中で一週間以上培養してコンフルエントにした細胞を用いるとよい。このようにして培養した細胞はセルスクレイパーなどを用いて剥離させ、回収するとよい。又、回収した細胞は使用するまでの間‐８０℃で保存しておくことができる。
【００１４】
本発明蛋白質は、このようにして回収した細胞の膜画分から精製すると効率良く精製することができる。膜画分の調製は、細胞内器官の分画に利用される通常の方法に従って行うことかできる。膜画分の調製に使用する緩衝液には、好ましくは各種プロテアーゼ阻害剤を添加するとよい。添加するプロテアーゼ阻害剤としては、例えばＰＭＳＦ、ＡＰＭＳＦ、ＥＤＴＡ、０‐フェナントロリン、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、アプロチニン、大豆トリプシンインヒビターなどのセリンプロテアーゼ阻害剤、チオールプロテアーゼ阻害剤、及びメタロプロテアーゼ阻害剤などが挙げられる。細胞の破砕には、Ｄａｕｎｃｅホモジナイザー、ポリトロンホモジナイザー、超音波破砕装置なとを用いることが出来る。破砕した細胞は０．５Ｍシュクロースを加えた緩衝液に懸濁させ、６００×ｇで１０分間遠心分離することにより、細胞核と未破砕の細胞を沈殿画分として分離することかできる。遠心分離で得た上清を１５０，０００×ｇで９０分間遠心分離することにより、沈殿画分として膜画分を得ることかできる。このようにして得た膜画分を各種の界面活性剤で処理することにより、細胞膜に存在する本発明蛋白質を効率良く可溶化し、抽出することかできる。可溶化に用いる界面活性剤としては、細胞膜蛋白質の可溶化に一般的に使用されている各種界面活性剤、例えばＣＨＡＰＳ（３‐［（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）‐ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、Ｎｉｋｋｏｌ、ｎ‐オクチルグリコシドなどを用いることができる。好ましくは、０．５％ＣＨＡＰＳを添加して４℃で２時間攪拌し、本発明蛋白質を可溶化するのが良い。このようにして調製したサンプルを、１５０，０００×ｇで６０分間遠心分離し、その上清を可溶化膜画分として得ることかできる。
【００１５】
このようにして得られた可溶化膜画分からの本発明蛋白質の精製は、ＯＣＩＦを固定化したカラム、ゲル、樹脂などを用いて効率よく精製することかできる。固定化に使用するＯＣＩＦとしては、ＷＯ９６／２６２１７号公報記載の方法に従って、ヒト胎児肺線維芽細胞株ＩＭＲ−９０の培養液から単離したもの、あるいは遺伝子工学的手法により得られたもの（ｒＯＣＩＦ）を使用することができる。これらのｒＯＣＩＦは、ヒト、ラット、あるいはマウスのｃＤＮＡを常法に従って発現ベクターに組み込み、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞などの動物細胞あるいは昆虫細胞などで発現させ、精製することによって得ることができる。このようにして得られたＯＣＩＦは、分子量約６０ｋＤａ（モノマー型）と１２０ｋＤａ（ダイマー型）の分子量を示すが、固定化に用いるＯＣＩＦとしては、好ましくはダイマー型ＯＣＩＦを用いる。ＯＣＩＦを固定化するためのゲル、樹脂としてはＥＣＨセファロース４Ｂ、ＥＡＨセファロース４Ｂ、チオプロピルセファロース６Ｂ、ＣＮＢｒ‐活性化セファロース４Ｂ、活性化ＣＨセファロース４Ｂ、エポキシ活性化セファロース６Ｂ、活性化チオールセファロース４Ｂ（以上、ファルマシア社）、ＴＳＫｇｅｌ　ＡＦ‐エポキシトヨパール６５０、ＴＳＫｇｅｌ　ＡＦ‐アミノトヨパール６５０、ＴＳＫｇｅｌ　ＡＦ‐フォルミルトヨパール６５０、ＴＳＫｇｅｌ　ＡＦ‐カルボキシトヨパール６５０、ＴＳＫｇｅｌ　ＡＦ‐トレシルトヨパール６５０（以上、トーソー社）、アミノ−セルロファイン、カルボキシ−セルロファイン、ＦＭＰ活性化セルロファイン、フォルミル−セルロファイン（以上、生化学工業社）、アフィゲル１０，　アフィゲル１５，　アフィプレップ１０（以上、ＢｉｏＲａｄ社）などを用いることができる。又、ＯＣＩＦを固定化するためのカラムとしてはＨｉＴｒａｐ　ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄカラム（ファルマシア社）、ＴＳＫｇｅｌ　Ｔｒｅｓｙｌ−５ＰＷ（トーソー社）などを用いることができる。ＨｉＴｒａｐ　ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄカラム（１ｍｌ，ファルマシア社）を用いたＯＣＩＦの固定化法として、具体的には以下の方法を挙げることができる。即ち、ＯＣＩＦ　１３．０　ｍｇを含む０．２Ｍ　ＮａＨＣＯ３／０．５Ｍ　ＮａＣｌ（ｐＨ８．３）溶液１ｍｌをカラムに添加し、室温で３０分間カップリング反応させる。
【００１６】
次いで、０．５Ｍエタノールアミン／０．５Ｍ　ＮａＣｌ（ｐＨ８．３）と０．１Ｍ酢酸／０．５Ｍ　ＮａＣｌ（ｐＨ４．０）を流し、再度０．５Ｍエタノールアミン／０．５Ｍ　ＮａＣｌ（ｐＨ８．３）に置き換え、室温で１時間放置し、過剰な活性基を不活性化する。その後、０．５Ｍエタノールアミン／０．５Ｍ　ＮａＣｌ（ｐＨ８．３）と０．１Ｍ酢酸／０．５Ｍ　ＮａＣｌ（ｐＨ４．０）で２度洗浄し、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／１　Ｍ　ＮａＣｌ／０．１％ＣＨＡＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で置換することにより、ＯＣＩＦ固定化カラムを作製することができる。このようにして作製したＯＣＩＦ固定化カラムやＯＣＩＦ固定化ゲルあるいは樹脂などを用い、本発明蛋白質を効率よく精製することができる。本発明蛋白質の分解を抑制するために、精製に用いる緩衝液にも上記の各種プロテアーゼ阻害剤を添加するとよい。本発明蛋白質は、上記の可溶化膜画分をＯＣＩＦ固定化カラムに負荷する、あるいはＯＣＩＦ固定化ゲル、樹脂などと混ぜて攪拌することによって吸着させ、酸、各種蛋白質変性剤、カコジレートバッファーなどによってＯＣＩＦ固定化カラム、ゲル、あるいは樹脂などから溶出することができる。好ましくは、本発明蛋白質の変性を最小限に抑えるため、酸を用いて溶出し直ちに中和するとよい。溶出に用いる酸性緩衝液としては、例えば０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）、０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）、及び０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．０）などを用いることができる。
【００１７】
このようにして精製した本発明蛋白質は、生物試料からの蛋白質の精製に汎用される通常の方法を用いて、本発明蛋白質の物理化学的性質を利用した各種の精製操作により更に精製することができる。本発明蛋白質溶液の濃縮には限外濾過、凍結乾燥及び塩析など、通常、蛋白質の精製過程で用いられる手法が挙げられる。
好ましくは、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ‐１０（ＢｉｏＲａｄ杜）などを用いた遠心による限外濾過を用いるのが良い。又、精製手段としては、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、調製用電気泳動などを用いた通常の蛋白質の精製に利用される各種の手法を組み合わせて用いることができる。より具体的には、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ　１２カラム（ファルマシア社）などを用いたゲル濾過クロマトグラフィーや逆相クロマトグラフィーを組み合わせて用いることにより、本発明蛋白質を純化することが可能である。又、精製過程中の本発明蛋白質の同定は、固定化ＯＣＩＦとの結合活性あるいはＯＣＩＦとの結合物を抗ＯＣＩＦ抗体による免疫沈降後、ＳＤＳ‐ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析することにより検出できる。
このようにして得られた本発明蛋白質は、その活性より骨代謝異常症、例えば大理石病などの治療剤としての医薬、あるいは研究・診断用試薬として有用である。
【００１８】
また本発明は、破骨細胞形成抑制因子ＯＣＩＦに結合する新規な蛋白質（ＯＣＩＦ結合分子；ＯＢＭ）をコードするＤＮＡ、そのＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質、それを用いてＯＣＩＦに特異的に結合する蛋白質を遺伝子工学的に製造する方法、及び該蛋白質を含有する骨代謝治療剤に関する。さらに本発明は、ＯＢＭの発現を調節する物質のスクリーニング方法、ＯＢＭと結合しその作用を阻害又は修飾する物質のスクリーニング方法、ＯＢＭと結合しＯＢＭの作用を伝達するレセプターのスクリーニング方法、これらのスクリーニングの結果得られた物質を含有する医薬組成物に関する。
【００１９】
本発明のＤＮＡによりコードされる新規蛋白質ＯＢＭは、以下の物理化学的性質及び生物活性を示す。
即ち、
ａ．破骨細胞形成抑制因子（ＯＣＩＦ）に特異的に結合する。
ｂ．還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定で、約４０，０００（±４，０００）の分子量を示す。又、モノマータイプのＯＣＩＦとクロスリンクさせた場合の見かけ上の分子量は約９０，０００−１１０，０００である。
ｃ．破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する活性を有する。
ものである。
【００２０】
本発明のＯＣＩＦ結合分子、ＯＢＭをコードするＤＮＡを同定し、ＯＢＭの性質を評価するためのプローブとして使用するヒト破骨細胞形成抑制因子（ＯＣＩＦ）は、ＷＯ９６／２６２１７号に従ってヒト胎児性線維芽細胞株ＩＭＲ−９０の培養液から単離することができる。ＯＢＭのＤＮＡの単離、同定には、遺伝子組換え型ヒトＯＣＩＦ、遺伝子組換え型マウスＯＣＩＦ、遺伝子組換え型ラットＯＣＩＦ等を用いることもできる。これらの遺伝子組換え型ＯＣＩＦはそれぞれのＤＮＡを常法に従って発現ベクターに組み込み、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞等の動物細胞あるいは昆虫細胞などで発現させ、精製することによって得ることができる。
【００２１】
目的の蛋白質をコードするｃＤＮＡを分離する（ｃＤＮＡクローニング）方法としては、その蛋白質の部分アミノ酸配列を決定しそれに対応する塩基配列をもとにハイブリダイゼーション法により目的のｃＤＮＡを単離する方法の他に、蛋白質のアミノ酸配列が不明であっても発現ベクター中にｃＤＮＡライプラリーを構築し、それらを細胞中に導入し、目的の蛋白質の発現の有無をスクリーニングすることにより、目的のｃＤＮＡを単離する方法（発現クローニング法）がある（Ｄ’Ａｎｄｒｅａ　ｅｔ　ａｌ．：　Ｃｅｌｌ　５７，　２７７−２８５，　１９８９；　Ｆｕｋｕｎａｇａ　ｅｔ　ａｌ．：　Ｃｅｌｌ　６１，　３４１−３５０，　１９９０）。
発現クローニング法では、宿主細胞として細菌、酵母、動物細胞などが目的に応じて使い分けられている。本発明のように動物細胞の膜表面に存在すると考えられる蛋白質をコードするｃＤＮＡをクローニングする際には、動物細胞を宿主とする場合が多い。又、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率の高い宿主が通常使用される。そのような特徴を持つ細胞のひとつが、本発明で用いたサル腎臓細胞ＣＯＳ−７細胞である。ＣＯＳ−７細胞ではＳＶ４０　ｌａｒｇｅ　Ｔ　ａｎｔｉｇｅｎが発現しているため、ＳＶ４０の複製開始点を持っプラスミドは細胞中で多コピーのエピソームとして存在するようになり、通常より高発現が期待できる。又、ＤＮＡを導入した時点から数日のうちに最高の発現レベルに到達するので迅速なスクリーニングに適している。この宿主細胞に高発現可能なプラスミドを組み合わせることによって、極めて高レベルの遺伝子発現が可能となる。プラスミド上で最も遺伝子の発現量に影響を与える因子はプロモーターであり、高発現用のプロモーターとしてＳＲαプロモーターやサイトメガロウィルス由来プロモーター等がよく使用される。
【００２２】
発現クローニングにより膜蛋白質のｃＤＮＡをクローニングしようとする際のスクリーニング法として、バインディング法（ｂｉｎｄｉｎｇ法）、パニング法（ｐａｎｎｉｎｇ法）、フィルムエマルジョン法などが考案されている。
本発明は、発現クローニング法とバインディング法を組み合わせることによって得たＯＣＩＦに特異的に結合する蛋白質（ＯＢＭ）をコードするＤＮＡ及び発現蛋白質、及びＤＮＡ又は発現蛋白質を用いた生理活性物質のスクリーニングに関する。本発明のＤＮＡがコードするＯＢＭは、ＯＣＩＦを標識し、その標識体の動物細胞膜表面への結合性を試験することによって検出することができる。ＯＣＩＦの標識法としては、放射性同位元素による標識や蛍光標識等、一般的な蛋白質の標識法を用いることができる。例えば、ＯＣＩＦの放射性同位元素による標識としてはチロシン残基の１２５Ｉ標識か挙げられ、具体的標識法としてヨードジェン法、クロラミンＴ法及び酵素法等がある。ＯＣＩＦの動物細胞膜表面への結合性はこのようにして得た標識ＯＣＩＦを用い、常法に従った方法で試験できる。又、結合性の試験に用いる培地に標識ＯＣＩＦの１００倍から４００倍濃度の未標識ＯＣＩＦを添加することにより、非特異的な結合量を測定できる。ＯＣＩＦの特異的結合量は、標識ＯＣＩＦの総結合量から非特異的な結合量を差し引くことにより算出される。
【００２３】
本発明者らは、破骨細胞の分化に関与する因子はＯＣＩＦと相互作用するとの仮定のもと、遺伝子組み換え型ＯＣＩＦを用い、ＯＣＩＦが結合する蛋白質を分離するため、マウス骨芽細胞様ストローマ細胞株ＳＴ２のｍＲＮＡから作製した発現ライブラリーを以下に述べる方法でスクリーニングした。ＳＴ２ｍＲＮＡをもとに合成したＤＮＡを動物細胞用発現ベクターに挿入し、それらをサル腎臓細胞ＣＯＳ−７細胞に遺伝子導入した。１２５Ｉ標識したＯＣＩＦをプローブとして用いてＣＯＳ−７細胞上に発現した目的の蛋白質をスクリーニングした。その結果、ＯＣＩＦと特異的に結合する蛋白質をコードするＤＮＡを分離するに至り、このＯＣＩＦ結合分子（ＯＣＩＦ結合分子；ＯＢＭ）をコードするＤＮＡの塩基配列を決定した。又、このＤＮＡにコードされるＯＢＭは細胞膜上でＯＣＩＦと強くしかも特異的に結合することを見出した。
【００２４】
本発明でいう比較的温和な条件でのＤＮＡハイブリダイゼーションとは、例えば常法に従いナイロンメンブレンにＤＮＡをトランスファーし固定化した後、ハイブリダイゼーション用バッファー中で放射線標識したプローブのＤＮＡと４０〜７０℃、２時間〜１晩程度ハイブリダイゼーションさせ、０．５×ＳＳＣ　（０．０７５Ｍ塩化ナトリウム及び０．００７５Ｍクエン酸ナトリウム）で４５℃１０分洗浄する条件を言う。具体的には、常法に従い、ナイロンメンブレンにハイボンドＮ（アマシャム杜）を用い、ＤＮＡをトランスファーし固定化した後、Ｒａｐｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（アマシャム社）中で３２Ｐ標識したプローブのＤＮＡと６５℃２時間ハイブリダイゼーションさせて、０．５×ＳＳＣ　（０．０７５Ｍ塩化ナトリウム及び０．００７５Ｍクエン酸ナトリウム）で４５℃１０分洗浄する条件を言う。
【００２５】
破骨細胞形成の代表的なインビトロ培養系として、活性型ビタミンＤ３あるいはＰＴＨの存在下でのマウス由来骨芽細胞様ストローマ細胞株、ＳＴ２とマウス脾臓細胞との共培養系がよく知られている。本発明のＯＢＭは活性型ビタミンＤ３やＰＴＨのような骨吸収促進因子の存在下で培養した骨芽細胞様ストローマ細胞上に特異的に誘導される蛋白質として特定される。更に、活性型ビタミンＤ３あるいはＰＴＨ非存在下でもマウス脾臓細胞の培養系に本発明のＤＮＡによりコードされる蛋白質を添加することによって破骨細胞の形成が促進されることから、本発明のＤＮＡによりコードされるＯＢＭは破骨細胞の分化、成熟に関与していると考えられる。
【００２６】
本発明のＤＮＡを発現ベクターに挿入してＯＢＭ発現プラスミドを作製し、これを各種の細胞又は菌株に導入して発現させることにより、組み換え型ＯＢＭを製造することができる。発現させる際の哺乳動物細胞の宿主としてＣＯＳ−７、ＣＨＯ、Ｎａｍａｌｗａなど、又は細菌の宿主として大腸菌などを、用いることができる。その際、ＤＮＡの全長を用いて膜結合型蛋白質として発現させる、あるいは膜結合部位をコードする部分を除去することにより分泌型、可溶化型としても発現させることができる。このようにして製造された組み換え型ＯＢＭは、通常用いられる蛋白精製法、例えばＯＣＩＦ固定化カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー一、イオン交換クロマトグラフィー、あるいはゲル濾過クロマトグラフィーなどを組み合わせることにより、効率よく精製することができる。このようにして得られた本発明蛋白質は、その活性より骨代謝異常症、例えば大理石病などの治療剤としての医薬、あるいは研究・診断用試薬として有用である。
【００２７】
本発明のＤＮＡにコードされる蛋白質ＯＢＭを利用して、（１）ＯＢＭの発現を調節する物質のスクリーニング、（２）ＯＢＭに特異的に結合し、ＯＢＭの生物活性を阻害、あるいは修飾する物質のスクリーニング、及び（３）破骨細胞前駆細胞に存在し、ＯＢＭの生物活性を伝達する蛋白質（ＯＢＭレセプター）のスクリーニング、更にはこのＯＢＭレセプターを利用したアンタゴニストやアゴニストの開発が可能である。上述のＯＢＭあるいはＯＢＭレセプターを用いたコンビナトリアルケミストリーにおいて、アンタゴニストあるいはアゴニストの探索に必要なペプチドライブラリーは具体的に以下の方法で作製することができる。その一つに、スプリット法がある（Ｌａｍ　ｅｔ　ａｌ．；　Ｎａｔｕｒｅ　３５４，　８２−８４，　１９９１）。この方法は、合成担体（ビーズ）にそれぞれのアミノ酸（ユニット）を結合させたものを各ユニットごと別々に合成する。この合成された担体を一度すべて混ぜ、次にユニットの数に等分し、次のユニットをまた各々結合させる。この操作をｎ回繰り返すことにより、担体にｎ個のユニットが結合したライブラリーが作製される。このように合成を行うと一つの担体群には、１種類の配列しか合成されないので、本発明の蛋白質を用いた上記のスクリーニング法で陽性を示した担体群を選びだし、そのアミノ酸配列を決定すれば、特異的に結合するペプチドを同定することができる。又、別の方法としてファージディスプレイ法を用いることもできる。この方法はランダムなペプチドをコードする合成遺伝子をファージで発現させるもので、上記合成ライブラリーに比べ、ライブラリー中の分子数を多くできるという利点があるものの、ファージが嫌う配列はライブラリーに存在し得ないことなどがあり、分子数当たりの多様性が低いという欠点がある。ファージディスプレイ法でも同様に、本発明の蛋白質を用いたスクリーニング系を利用し、それに特異的に結合するファージをパニングにより濃縮し、得られた特異的結合性を有するファージを大腸菌で増幅し、そのペプチドをコードする塩基配列を決定すればよい。更に、前記（２）及び（３）のスクリーニング系を使用し、ペプチドライブラリーからＯＢＭあるいはＯＢＭレセプターに特異的でかつ高親和性のペプチドをスクリーニングしたい場合、スクリーニング時にそれぞれＯＣＩＦやＯＢＭを共存させ、それぞれの濃度を上げながら、陽性を示した担体あるいはファージをスクリーニングすることにより、特異的かつ極めて高親和性のペプチドを得ることができる。例をあげれば、すでに造血ホルモンであるエリスロポエチン（ＥＰＯ）のレセプターを用い、多様性に富んだペプチドライブラリーからのＥＰＯ様活性を有する低分子ペプチドアゴニストのスクリーニング及びその立体構造解析、更にはその立体構造に基づいた有機合成展開によるＥＰＯ活性を有する低分子物質（アゴニスト）の創製に成功している（Ｎｉｃｈｏｌａｓ　ｅｔ　ａ１．：　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２７３，　４５８−４６３，　１９９６）。
【００２８】
また本発明者らは、破骨細胞形成抑制因子ＯＣＩＦを用い、その結合蛋白質が活性型ビタミンＤ３や副甲状腺ホルモン（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅ，　ＰＴＨ）などの骨吸収因子の存在下で培養した骨芽細胞様ストローマ細胞株、ＳＴ２の細胞上に特異的に発現することをすでに見出した。さらに、該蛋白質は未熟な破骨細胞前駆細胞からの破骨細胞への分化、成熟に関与する、いわゆる破骨細胞分化、成熟を支持又は促進する因子としての生物活性を有していることを見出し、該蛋白質を精製することによりその物理化学的諸性質及びその生物活性を明らかにした。本発明者らは、本発明のＤＮＡにより発現される遺伝子組み換え型蛋白質ＯＢＭと、すでに前記ＯＣＩＦと特異的に結合する精製天然型蛋白質との異同を明らかにすべく、物理化学的性質及び生物活性を比較した。その結果、両蛋白質とも▲１▼膜結合蛋白質であり、特異的にＯＣＩＦと結合し、▲２▼ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分子量は約４０，０００、▲３▼モノマータイプのＯＣＩＦとクロスリンキングさせた場合の見かけの分子量は約９０，０００−１１０，０００であり、物理化学的諸性質がよく一致していること、又、生物活性においても、両蛋白質は破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する活性を有していることから、両蛋白質は同一である可能性が示唆された。さらに、本発明ＤＮＡを用いて遺伝子工学的に発現させ、精製した蛋白質（遺伝子組み換え型ＯＢＭ）で作製したウサギ抗ＯＢＭポリクローナル抗体は、前記の方法で得られる精製天然型蛋白質に交差性を有し、ＯＢＭとＯＣＩＦとの特異的結合を阻害するのと同様に、前記の精製天然型蛋白質とＯＣＩＦとの結合を特異的に阻害した。これらの結果から、本発明のＤＮＡにより発現される遺伝子組み換え型蛋白質ＯＢＭは、前記ＯＣＩＦに特異的に結合する天然型蛋白質と同一であることが明らかである。
【００２９】
さらに本発明者らは、ＯＣＩＦに特異的に結合し、天然型あるいは遺伝子組み換え型マウスＯＢＭと同様にマウス脾臓細胞からの破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する活性を有するヒト由来ＯＣＩＦ結合蛋白分子（以下ヒトＯＢＭと称する）をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）を単離するため、前述のとおりマウスＯＢＭ　ｃＤＮＡから作製したプライマーを用い、ヒトリンパ節由来ｃＤＮＡを鋳型としてｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）を行い、得られたヒトＯＢＭｃ　ＤＮＡ断片をプローブとして上記ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。その結果、ＯＣＩＦと特異的に結合するヒト由来蛋白質をコードするｃＤＮＡを分離することに成功し、このヒト由来ＯＣＩＦ結合蛋白分子、即ちヒトＯＢＭをコードするｃＤＮＡの塩基配列を決定した。このｃＤＮＡにコードされるヒトＯＢＭは、マウスＯＢＭと同様に細胞膜上でＯＣＩＦと強く、しかも特異的に結合する特性を有し、またマウス脾臓細胞からの破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する生物活性を有することを見出した。
【００３０】
即ち、本発明は破骨細胞形成抑制因子ＯＣＩＦに結合する新規なヒト由来蛋白質であるヒトＯＢＭをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質、そのＤＮＡを用いてＯＣＩＦに特異的に結合する性質を有し、マウス脾臓細胞からの破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する活性を有する蛋白質を遺伝子工学的に製造する方法、及び該蛋白質を含有する骨代謝異常症治療剤の提供、更にヒトＯＢＭの発現を調節する物質のスクリーニング方法、ヒトＯＢＭと結合しその作用を阻害又は修飾する物質のスクリーニング方法、ヒトＯＢＭと結合しその作用を伝達するレセプターのスクリーニング方法及びこれらのスクリーニングの結果得られた物質を含有する医薬組成物を提供することを課題とする。
【００３１】
本発明は、ＯＣＩＦに特異的に結合する特性を有し、また破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する生物活性を有する新規なヒト蛋白質であるヒトＯＢＭをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質、そのＤＮＡを用いてＯＣＩＦに特異的に結合する特性を有し、また破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する生物活性を有する蛋白質を遺伝子工学的に製造する方法、及び該蛋白質を含有する骨代謝異常症治療剤に関する。更に、本発明はヒトＯＢＭの発現を調節する物質のスクリーニング方法、ヒトＯＢＭと結合しその作用を阻害又は修飾する物質のスクリーニング方法、ヒトＯＢＭと結合しＯＢＭの生物活性を伝達するレセプターのスクリーニング方法、及びこれらのスクリーニングの結果得られた物質を含有する医薬組成物、さらにヒト由来ＯＣＩＦ結合蛋白質に対する抗体及びその抗体を用いた骨代謝異常症の予防及び／又は治療薬に関する。
【００３２】
本発明のＤＮＡによりコードされる新規ヒト由来ＯＣＩＦ結合蛋白分子、即ちヒトＯＢＭは、以下の物理化学的性質及び生物活性を示す。
即ち、
ａ．破骨細胞形成抑制因子（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ，　ＯＣＩＦ）（ＷＯ９６／２６２１７号）に特異的に結合する。
ｂ．還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定で、約４０，０００（±５，０００）の分子量を示す。又、モノマータイプのＯＣＩＦとクロスリンクさせた場合の見かけ上の分子量は約９０，０００‐１１０，０００である。
ｃ．破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する生物活性を有する。
ものである。
【００３３】
本発明のヒトＯＢＭをコードするｃＤＮＡを分離同定するための、プローブとして使用するマウス由来ＯＣＩＦ結合蛋白質であるマウスＯＢＭ　ｃＤＮＡは、前述の方法に従って、マウス骨芽細胞様ストローマ細胞株、ＳＴ２のｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。又、ヒトＯＢＭｃ　ＤＮＡを発現することにより得られる蛋白質の特性及びその生物活性を評価するために必要なヒト破骨細胞形成抑制因子ＯＣＩＦは、ＷＯ９６／２６２１７号記載の方法に従って、ヒト線維芽細胞株ＩＭＲ−９０の培養液から単離、あるいはそのＤＮＡを用いて遺伝子工学的に製造することができる。ヒトＯＢＭの特性や生物活性の評価には、遺伝子組み換えヒトＯＣＩＦ、遺伝子組み換えマウスＯＣＩＦ、遺伝子組み換えラットＯＣＩＦ等を用いることもできる。これらの遺伝子組み換え型ＯＣＩＦは、それぞれのｃＤＮＡを常法に従って発現ベクターに組み込み、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞等の動物細胞あるいは昆虫細胞などで発現させ、精製することによって得ることができる。
【００３４】
目的の蛋白質をコードするヒト型のｃＤＮＡを単離する（ｃＤＮＡクローニング）方法としては、▲１▼その蛋白質を精製し、その部分アミノ酸配列を決定し、それに対応する塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして用い、ハイブリダイゼーション法により目的のｃＤＮＡを単離する方法、▲２▼目的の蛋白質のアミノ酸配列が不明であっても発現ベクター中にｃＤＮＡライブラリーを構築し、それらを細胞中に導入し、目的蛋白質の発現の有無をスクリーニングすることにより、目的のｃＤＮＡを単離する方法（発現クローニング法）、及び▲３▼ヒト由来の目的蛋白質と同じ特性及び生物活性を有するヒト以外の哺乳動物由来の蛋白質をコードする遺伝子、ｃＤＮＡがクローニングしようとするヒト由来の目的蛋白質のｃＤＮＡと高いホモロジーを有すると想定し、前者のｃＤＮＡをプローブとし、ヒト細胞あるいは組織から構築したｃＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーション法やｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　（ＰＣＲ）法により目的のヒト蛋白質をコードするｃＤＮＡを単離する方法がある。
【００３５】
ヒトＯＢＭ　ｃＤＮＡは、前記マウスＯＢＭ　ｃＤＮＡと高い相同性を有するとの想定のもと、ヒトＯＢＭ産生細胞あるいは組織は後者のｃＤＮＡをプローブとして、ノーザンハイブリダイゼーション法により調べることができる。ヒトＯＢＭ　ｃＤＮＡは、マウスＯＢＭ　ｃＤＮＡから作製したマウスＯＢＭプライマーを用い、上記のようにして同定したヒトＯＢＭ産生組織、例えばヒトリンパ節等から構築したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによりヒトＯＢＭ　ｃＤＮＡ断片を得て、このヒトＯＢＭｃ　ＤＮＡ断片をプローブとし、上記の様に同定したヒトＯＢＭ産生細胞あるいは組織のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。本発明は、このようにして得られたＯＣＩＦに特異的に結合する性質を有し、また破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する生物活性を有するヒト由来蛋白質、即ちヒトＯＢＭをコードするＤＮＡに関する。本発明のＤＮＡがコードするヒトＯＢＭは、膜貫通領域を有する膜結合型蛋白質をコードすることから、ＯＣＩＦを標識し、本発明のｃＤＮＡを発現した動物細胞表面へのＯＣＩＦ標識体の結合によって検出することができる。ＯＣＩＦの標識法としては、前述と同様、放射性同位元素による標識や蛍光標識等、一般的な蛋白質の標識法を用いることができる。
本発明のヒトＯＢＭ　ｃＤＮＡにより発現される蛋白質の分子量は、ゲル濾過クロマトグラフィーやＳＤＳ−ＰＡＧＥ等を用いて測定される。より正確に分子量を測定するためには、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いるのが好ましく、ヒトＯＢＭは、還元条件下で約４０，０００（４０，０００±５，０００）の分子量を有する蛋白質として特定される。
【００３６】
本発明でいう比較的温和な条件でのＤＮＡハイブリダイゼーションとは、例えば常法に従いナイロンメンブランにＤＮＡをトランスファーし、固定化した後、ハイブリダイゼーション用バッファー中で放射線標識したプローブのＤＮＡと４０−７０℃、２時間から一夜程度ハイブリダイゼーションさせ、０．５×ＳＳＣ（０．０７５Ｍ塩化ナトリウム及び０．００７５Ｍクエン酸ナトリウム）で４５℃、１０分間洗浄する条件を言う。より具体的には、常法に従い、ナイロンメンブランにハイボンドＮ（アマシャム社）を用い、ＤＮＡをトランスファーし、固定化した後、Ｒａｐｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（アマシャム社）中で３２Ｐ標識したプローブのＤＮＡと６５℃、２時間ハイブリダイゼーションさせて、上記の０．５ｘＳＳＣで４５℃、１０分間洗浄する条件を言う。
【００３７】
破骨細胞形成の代表的なインビトロ培養系として、活性型ビタミンＤ３あるいはＰＴＨの存在下でのマウス由来骨芽細胞様ストローマ細胞株、ＳＴ２とマウス脾臓細胞との共培養系がよく知られている。このインビトロ培養系での破骨細胞形成には、骨芽細胞様ストローマ細胞と脾臓細胞間の接着による相互作用及び活性型ビタミンＤ３やＰＴＨ等の骨吸収促進因子の存在が不可欠である。このインビトロ培養系において、骨吸収促進因子非存在下で、しかも破骨細胞形成支持能のないサル腎臓細胞株であるＣＯＳ細胞に本発明のｃＤＮＡを発現させた遺伝子組み換えＣＯＳ紬胞株は、骨芽細胞様ストローマ細胞株、ＳＴ２と同様に脾臓細胞からの破骨細胞形成支持能を獲得した。また本発明のｃＤＮＡは膜結合型蛋白質をコードすることから、この膜結合部位をコードする部分を除去することにより分泌型、可溶型として発現させることもできる。骨吸収促進因子非存在下の上記インビトロ培養系に、この分泌型ヒトＯＢＭを添加するだけで破骨細胞の形成が起こることも確認された。
これらの結果から、本発明のｃＤＮＡによりコードされるヒトＯＢＭは破骨細胞の分化、成熟に関与する因子として特定される。
【００３８】
本発明のｃＤＮＡを発現ベクタ一に挿入してヒトＯＢＭ発現プラスミドを作製し、これを各種の細胞または菌株に導入して発現させることにより、組み換え型ヒトＯＢＭを製造することができる。発現させる際の哺乳動物細胞の宿主としてＣＯＳ−７、ＣＨＯ、Ｎａｍａｌｗａ細胞などを、また細菌の宿主として大腸菌等を用いることができる。その際、ｃＤＮＡの全長を用いて膜結合型蛋白質として発現させることができるし、また膜結合部位をコードする部分を除去することにより分泌型、可溶化型としても発現させることができる。このようにして製造された組み換え型ヒトＯＢＭは、通常用いられる蛋白精製法、例えばＯＣＩＦ固定化カラムを用いたアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーやゲル濾過クロマトグラフィー等を組み合わせることにより効率良く精製できる。このようにして得られた本発明ヒトＯＢＭは、その活性より骨代謝異常症、例えば大理石病などの治療剤としての医薬、あるいは研究・診断用試薬として有用である。
【００３９】
本発明のｃＤＮＡにコードされる蛋白質、ヒトＯＢＭを利用することにより、▲１▼ヒトＯＢＭの発現を調節する物質のスクリーニング、▲２▼ヒトＯＢＭに特異的に結合し、その生物活性を阻害あるいは修飾する物質のスクリーニング、及び▲３▼ヒト破骨細胞前駆細胞に存在し、ヒトＯＢＭの生物活性を伝達するヒト蛋白質（ヒトＯＢＭレセプター）のスクリーニング、さらにはこのヒトＯＢＭレセプターを利用したアンタゴニストやアゴニストの開発が可能である。上述のヒトＯＢＭあるいはヒトＯＢＭレセプターを用いたコンビナトリアルケミストリーにおいて、アンタゴニストあるいはアゴニストの探索に必要なペプチドライブラリーはマウスＯＢＭを用いたスクリーニングの方法と同様の方法で作製することができ、マウスＯＢＭの代わりにヒトＯＢＭを用いて、ペプチドライブラリーを同様にスクリーニングすることにより、特異的かつ極めて高親和性のペプチドを得ることができる。
【００４０】
さらにまた、前述のようにＯＢＭは有用性の高い蛋白質であるが、この蛋白質の測定を行うにはＯＢＭを特異的に認識する抗体とその抗体を用いた酵素免疫測定法の構築が必須である。しかしながら、これまでにＯＢＭの測定に有用な抗体は得られていない。さらに、ＯＢＭあるいはｓＯＢＭの生物活性を中和する抗ＯＢＭ／ｓＯＢＭ抗体は、ＯＢＭあるいはｓＯＢＭの作用、即ち破骨細胞形成の促進作用を抑制することが想定され、骨代謝異常症の治療薬としての開発が期待されるが、このような抗体も未だ得られていない。
【００４１】
上述の状況に鑑み本発明者らは鋭意研究の結果、破骨細胞形成抑制因子（ＯＣＩＦ）に特異的に結合する膜結合蛋白質（ＯＣＩＦ結合分子；ＯＢＭ）及び膜結合部位を欠損した可溶性ＯＢＭ（ｓＯＢＭ）の両抗原を認識する抗体（抗ＯＢＭ／ｓＯＢＭ抗体）を見出すに至った。従って本発明は、破骨細胞形成抑制因子ＯＣＩＦに特異的に結合する膜結合蛋白質ＯＢＭ及び膜結合部位を欠損した可溶性ＯＢＭ（ｓＯＢＭ）の両抗原を認識する抗体（抗ＯＢＭ／ｓＯＢＭ抗体）、その製造方法、この抗体を用いたＯＢＭ及びｓＯＢＭの測定方法、さらにこの抗体を有効成分とする骨代謝異常症予防及び／又は治療剤を提供することを課題とする。
【００４２】
本発明は、破骨細胞形成抑制因子（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ；　ＯＣＩＦ）に特異的に結合する膜結合蛋白質（ＯＣＩＦ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ；　ＯＢＭ）及び膜結合部位を欠損した可溶性ＯＢＭ（ｓＯＢＭ）の両抗原を認識する抗体（抗ＯＢＭ／ｓＯＢＭ抗体）、その製造方法、この抗体を用いたＯＢＭ及びｓＯＢＭの測定方法、さらにこの抗体を有効成分とする医薬、特に骨代謝異常症予防及び／又は治療剤に関する。
本発明の抗体は、ＯＢＭ及びｓＯＢＭの生物活性である破骨細胞形成促進活性を中和する活性を有し、以下の性質を持つ抗体から構成される。
即ち、
ａ）マウスＯＢＭ及びマウスｓＯＢＭの両抗原を認識するポリクローナル抗体（抗マウスＯＢＭ／ｓＯＢＭポリクローナル抗体）
ｂ）ヒトＯＢＭ及びヒトｓＯＢＭの両抗原を認識するポリクローナル抗体（抗ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭポリクローナル抗体）
ｃ）マウスＯＢＭ及びマウスｓＯＢＭの両抗原を認識するモノクローナル抗体（抗マウスＯＢＭ／ｓＯＢＭモノクローナル抗体）
ｄ）ヒトＯＢＭ及びヒトｓＯＢＭの両抗原を認識するモノクローナル抗体（抗ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭモノクローナル抗体）
ｅ）マウスＯＢＭ及びマウスｓＯＢＭの両抗原に交差性を有する抗ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭモノクローナル抗体、から構成される。
【００４３】
マウスＯＢＭ及びマウスｓＯＢＭの両抗原を認識するポリクローナル抗体（以下抗マウスＯＢＭ／ｓＯＢＭポリクローナル抗体と称する）及びヒトＯＢＭ及びヒトｓＯＢＭの両抗原を認識するポリクローナル抗体（以下抗ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭポリクローナル抗体と称する）は、以下の手段によって得ることができる。免疫用抗原としての精製マウスＯＢＭは、前述の方法に従って得ることができる。即ち、マウス骨芽細胞様ストローマ細胞株ＳＴ−２を活性ビタミンＤ３処理し、その細胞膜上のＯＢＭをＯＣＩＦ固定化カラム及びゲル濾過クロマトグラフィーにより精製することにより、天然型マウスＯＢＭ（ｎａｔｉｖｅ　ＯＢＭ）を得ることができる。又、前述のマウスＯＢＭ　ｃＤＮＡ（配列表配列番号１５）又はヒトＯＢＭ　ｃＤＮＡ（配列表配列番号１２）を常法により発現ベクターに組み込み、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｎａｍａｌｗａ、ＣＯＳ−７細胞等の動物細胞、昆虫細胞、あるいは大腸菌などで発現させて、上記と同様の方法で精製することにより、遺伝子組み換えマウスＯＢＭ（配列表配列番号１）又はヒトＯＢＭ（配列表配列番号１１）を得ることができ、これを免疫用抗原として用いても良い。この時、膜結合蛋白質であるマウスＯＢＭあるいはヒトＯＢＭを大量かつ高度に精製するには、多大の労力を要する。一方、膜結合型蛋白質であるＯＢＭとその膜結合部位を欠損させて得られる可溶化蛋白質である可溶性ＯＢＭ（ｓＯＢＭ）とは、前述のように破骨細胞の分化、成熟促進活性において差異がないことが認められている。従って、マウスｓＯＢＭ及びヒトｓＯＢＭは発現及びその高度精製が比較的容易であることから、これら可溶化蛋白質であるｓＯＢＭを免疫用抗原として用いても良い。
【００４４】
マウスｓＯＢＭ（配列表配列番号１６）及びヒトｓＯＢＭ（配列表配列番号１７）は、マウスｓＯＢＭ　ｃＤＮＡ（配列表配列番号１８）又はヒトｓＯＢＭ　ｃＤＮＡ（配列表配列番号１９）の５’上流側に他の分泌蛋白質由来の既知シグナル配列をコードする塩基配列を付加し、上記と同様に遺伝子工学的手法により発現ベクターに組み込み、各種動物細胞、昆虫細胞、あるいは大腸菌などを宿主として発現し、精製することにより、それぞれ得ることができる。このようにして得られた免疫用抗原を、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、必要に応じ同容量のフロイント完全アジュバントと混合し乳化後、動物に約１週間間隔で皮下投与し、数回免疫する。抗体価を測定し、最高の抗体価に達した時点でブースター投与し、投与１０日後に全採血を行う。得られた抗血清を硫酸アンモニウム分画沈澱し、グロブリン分画を陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製するか、あるいは抗血清をバインディングバッファー（Ｂｉｏｒａｄ社）で２倍希釈し、その希釈抗血清をプロテインＡ又はプロテインＧセファロースカラムクロマトグラフィーにより精製することにより、目的とする抗マウス又は抗ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭポリクローナル型抗体を得ることができる。
【００４５】
本発明のモノクローナル抗体は、以下の方法により得ることができる。即ち、モノクローナル抗体の作製に必要な免疫用抗原としては、ポリクローナル抗体の時と同様に天然型マウスＯＢＭ（ｎａｔｉｖｅ　ＯＢＭ）、遺伝子組み換えマウス型又はヒトＯＢＭ、遺伝子組み換えマウス型又はヒト型ｓＯＢＭを用いることができる。それぞれの抗原により哺乳動物を免疫するか、あるいはインビトロ法により免疫したリンパ球細胞を骨髄腫細胞株（ミエローマ）などと融合させ、常法によりハイブリドーマを作製する。このハイブリドーマ培養液について、高度に精製されたそれぞれの抗原を用いて、ソリッドフェーズＥＬＩＳＡによりそれぞれの抗原を認識する抗体生産ハイブリドーマを選択する。得られたハイブリドーマをクローニングし、樹立した安定な抗体産生ハイブリドーマをそれぞれ培養することにより、目的とする抗体が得られる。ハイブリドーマの作製に当たっては、哺乳動物を使用する場合、マウスやラットなどの小動物を使用するのが一般的である。免疫は、抗原を適当な溶媒、例えば生理食塩水などで適当な濃度に希釈し、この溶液を静脈内や腹腔内に投与し、これに必要に応じてフロイント完全アジュバントを併用投与し、動物に１〜２週間間隔で３〜４回程度投与する方法が一般的である。このようにして免疫された動物を最終免疫後３日目に解剖し、摘出した脾臓から得られた脾臓細胞を免疫細胞として使用する。免疫細胞と細胞融合するマウス由来のミエローマとしては、例えばｐ３／ｘ６３−Ａｇ８、ｐ３−Ｕ１、ＮＳ−１、ＭＰＣ−１１、ＳＰ−２／０、ＦＯ、Ｐ３ｘ６３　Ａｇ８．　６５３及びＳ１９４などが挙げられる。又、ラット由来の細胞としては、Ｒ−２１０などの細胞株が挙げられる。ヒト型の抗体を生産する場合には、ヒトＢリンパ球をインビトロで免疫し、ヒトミエローマ細胞やＥＢウイルスにより形質転換した細胞株と細胞融合させることにより、ヒト型の抗体を生産することができる。免疫された細胞とミエローマ細胞株との融合は公知の方法、例えばＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎらの方法（Ｋｏｅｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．：　Ｎａｔｕｒｅ　２５６，　４９５−４９７，　１９７５）が一般的に使用されるが、電気パルスを利用した電気パルス法などでも良い。免疫リンパ球とミエローマ細胞株は、通常行われている細胞数の比率に混合し、一般に使用される牛胎児血清（ＦＣＳ）不含細胞培養用培地にポリエチレングリコールを添加して融合処理を行い、ＦＣＳ添加ＨＡＴ選択培地で培養を行い融合細胞（ハイブリドーマ）を選別する。
【００４６】
次に、抗体を生産するハイブリドーマをＥＬＩＳＡ、プラーク法、オクタロニー法、凝集法など通常用いられる抗体の検出方法により選択し、安定なハイブリドーマを樹立する。このようにして樹立されたハイブリドーマは、通常の培養方法により継代培養可能であり、必要に応じて凍結保存できる。ハイプリドーマは常法により培養して、その培養液、または哺乳動物の腹腔内に移植することにより、腹水から抗体を回収することができる。培養液あるいは腹水中の抗体は、塩析法、イオン交換及びゲル濾過クロマトグラフィー、プロテインＡまたはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーなど通常用いられる方法により精製することができる。このような方法により、抗原としてｓＯＢＭを用いて得られたモノクローナル抗体のほとんど全ては、ｓＯＢＭだけでなくＯＢＭをも特異的に認識できる抗体（抗ＯＢＭ／ｓＯＢＭモノクローナル抗体と称する）である。これらの抗体は、ＯＢＭ及びｓＯＢＭのそれぞれの測定に利用することができる。これらの抗体は放射性アイソトープや酵素ラベルすることにより、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）やエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）として知られている測定系に用いることにより、ＯＢＭ量及びｓＯＢＭ量を測定することができる。これらの測定系を用いることにより、血液、尿などの生体試料中のｓＯＢＭ量を容易にかつ高感度で測定することができる。また、これらの抗体を用いることにより、組織や細胞表面に結合したＯＢＭ量をバインディングアッセイ等により容易にかつ高感度で測定することかできる。
【００４７】
得られた抗体をヒトに対する医薬として用いる場合、抗原性の問題からヒト型抗ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭ抗体を作製することが望ましい。ヒト型抗ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭ抗体の作製は、次に述べるような手法により得ることができる。即ち、▲１▼ヒト末梢血あるいは脾臓から採取したヒトリンパ球をｉｎ　ｖｉｔｒｏでＩＬ−４存在下、抗原であるヒトＯＢＭあるいはヒトｓＯＢＭで感作し、感作したヒトリンパ球をマウスとヒトとのヘテロハイブリドーマであるＫ６Ｈ６／Ｂ５（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１８２３）と細胞融合させることにより、目的の抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングする。得られた抗体産生ハイブリドーマが生産する抗体は、ヒト型抗ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭモノクローナル抗体である。これらの抗体の中からヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭの活性を中和する抗体を選別する。しかしながら、このようにヒトリンパ球をｉｎ　ｖｉｔｒｏで感作する方法では、一般的に抗原に対して高親和性の抗体を得るのは困難である。
【００４８】
従って、ヒトＯＢＭおよびｓＯＢＭに高親和性のモノクローナル抗体を得るには、上記のようにして得られた低親和性ヒト型抗ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭモノクローナル抗体を高親和化する必要がある。それには、上記のようにして得られ、中和抗体であるものの低親和性であるヒト型抗ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭモノクローナル抗体のＣＤＲ領域（特にＣＤＲ−３）にランダム変異を導入し、これをファージで発現させてヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭを固相化したプレートを用いてファージディスプレイ法により、抗原であるヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭに強力に結合するファージを選択し、そのファージを大腸菌で増やし、その塩基配列から高親和性を有するＣＤＲのアミノ酸配列を決定すればよい。このようにして得られたヒト型抗ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭモノクローナル抗体をコードする遺伝子を一般的に使用されている哺乳動物細胞用発現ベクターに組み込んで、発現させることによりヒト型抗ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭモノクローナル抗体が得られる。これらの中から、ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭの生物活性を中和し、かつ高親和性である目的のヒト型抗ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭモノクローナル抗体を選別することができる。また、▲２▼Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いて、本発明と同じように常法（Ｋｏｅｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ　２５６，　４９５４９７，　１９７５）によりマウス型抗ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭモノクローナル抗体を作製し、ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭの生物活性を中和し、かつ高親和性を有するモノクローナル抗体を選択する。この高親和性マウス型抗ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭモノクローナル抗体のＣＤＲ‐領域（ＣＤＲ−１，２および３）をヒトＩｇＧのＣＤＲ領域に移植するＣＤＲ−ｇｒａｆｔｉｎｇ（Ｗｉｎｔｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ：　Ｎａｔｕｒｅ　３４９，　２９３−２９９，　１９９１）の手法を駆使することによりヒト型化が可能である。上記に加え、さらに▲３▼ヒト末梢血リンパ球をＳｅｖｅｒｅ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｉｍｍｕｎｅ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　（ＳＣＩＤ）マウスに移植し、この移植されたＳＣＩＤマウスはヒト型抗体を生産する（Ｍｏｓｉｅｒ　Ｄ．Ｅ．ｅｔ　ａｌ．：　Ｎａｔｕｒｅ　３３５，　２５６−２５９，　１９８８；　Ｄｕｃｈｏｓａｌ　Ｍ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．：　Ｎａｔｕｒｅ　３５５，　２５８−２６２，　１９９２）ので、抗原としてヒトＯＢＭあるいはｓＯＢＭを抗原として感作し、スクリーニングすることにより、ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭに特異的なヒト型モノクローナル抗体を生産するリンパ球をそのマウスから採取することかできる。得られたリンパ球を前述のヒト型抗体の作製法▲１▼と同様に、マウスとヒトとのヘテロハイブリドーマであるＫ６Ｈ６／Ｂ５（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１８２３）と細胞融合させ、得られたハイブリドーマをスクリーニングすることにより、目的のヒト型モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。このようにして得られたハイブリドーマを培養することにより、目的のヒト型モノクローナル抗体を大量に製造でき、上述の方法と同様に精製することにより精製品を得ることができる。又、目的のヒト型モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからｃＤＮＡライブラリーを構築し、目的のヒト型モノクローナル抗体をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）をクローニングし、この遺伝子を遺伝子工学的手法により適当な発現ベクターに組み込み、各種動物細胞、昆虫細胞、あるいは大腸菌などを宿主として発現させることにより、遺伝子組み換えヒト型モノクローナル抗体を大量に製造することができる。
【００４９】
得られた培養液から上述と同様の方法により精製することにより、精製されたヒト型モノクローナル抗体を大量に得ることができる。
さらに、上述の方法で得られた抗ＯＢＭ／ｓＯＢＭモノクローナル抗体の中から、ＯＢＭ／ｓＯＢＭの生物活性を中和する抗体を得ることかできる。これらＯＢＭ／ｓＯＢＭの生物活性を中和する抗体は、生体内でのＯＢＭ／ｓＯＢＭの生物作用、即ち破骨細胞形成促進作用をブロックすることから、医薬として、特に骨代謝異常症の予防及び／又は治療剤として期待される。抗ＯＢＭ／ｓＯＢＭ抗体によるＯＢＭあるいはｓＯＢＭの生物活性の中和活性は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの破骨細胞形成系における破骨細胞形成の抑制活性で測定することができる。ｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイ系として、以下の３つの方法がある。即ち、破骨細胞形成（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）のｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養系として、▲１▼活性型ビタミンＤ３とデキサメサゾンの存在下、マウス骨芽細胞様ストローマ細胞株、ＳＴ２細胞とマウス脾臓細胞との共培養系、▲２▼サル腎臓細胞株、ＣＯＳ−７細胞上にＯＢＭを発現させ、ホルムアルデヒドにより固定化し、Ｍ−ＣＳＦ存在下、その細胞上でマウス脾臓細胞を培養する共培養系、▲３▼遺伝子組み換えｓＯＢＭ及びＭ−ＣＳＦ存在下でマウス脾臓細胞を培養する系などが挙げられる。これら培養系に種々の濃度で抗ＯＢＭ／ｓＯＢＭ抗体を添加し、破骨細胞形成に及ぼす影響を調べることにより、抗ＯＢＭ／ｓＯＢＭ抗体による破骨細胞形成抑制活性を測定することができる。又、ｉｎ　ｖｉｖｏでの実験動物を利用した骨吸収抑制活性により抗ＯＢＭ／ｓＯＢＭ抗体の破骨細胞形成抑制活性を評価することができる。即ち、破骨細胞形成が亢進している動物モデルとして、卵巣摘出モデルがある。この種の実験動物に抗ＯＢＭ／ｓＯＢＭ抗体を投与し、骨吸収抑制活性（骨密度の増強活性）を測定することにより、抗ＯＢＭ／ｓＯＢＭ抗体による破骨細胞形成抑制活性を測定することができる。
【００５０】
このようにして得られたＯＢＭ／ｓＯＢＭの生物活性を中和する抗体は、医薬として、特に骨代謝異常症の予防及び／又は治療を目的とした医薬組成物として、あるいはこのような疾患の免疫学的診断のための抗体として有用である。本発明抗体は、製剤化して経口的あるいは非経口的に投与することができる。本発明抗体を含む製剤は、ＯＢＭ及び／又はｓＯＢＭを認識する抗体を有効成分として含有する医薬組成物として、ヒトあるいは動物に対し安全に投与されるものである。医薬組成物の形態としては、点滴を含む注射剤、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤などが挙げられる。モノクローナル抗体は高分子蛋白質であることから、バイアル瓶などのガラス容器や注射筒などへの吸着が著しい上に不安定であり、種々の物理化学的因子、例えば熱、ｐＨおよび湿度等により容易に失活する。従って、安定な形で製剤化するために、安定化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、可溶化剤、界面活性剤などを添加する。
【００５１】
安定化剤としては、グリシン、アラニン等のアミノ酸類、デキストラン４０およびマンノース等の糖類、ソルビトール、マンニトール、キシリトール等の糖アルコール等が挙げられ、またこれらの二種以上を併用してもよい。これらの安定化剤の添加量は、抗体の重量に対して０．０１〜１００倍、特に０．１〜１０倍添加するのが好ましい。これら安定化剤を加えることにより、液状製剤あるいは凍結乾燥製剤の保存安定性を向上することができる。緩衝剤としては、例えばリン酸バッファー、クエン酸バッファー等が挙げられる。緩衝剤は、液状製剤あるいは凍結乾燥製剤の再溶解後の水溶液のｐＨを調整し、抗体の安定性、溶解性に寄与する。緩衝剤の添加量としては、例えば液状製剤あるいは凍結乾燥製剤を再溶解した後の水量に対し、１〜１０ｍＭとするのが好ましい。界面活性剤としては、好ましくはポリソルベート２０、プルロニックＦ−６８、ポリエチレングリコール等、特に好ましくはポリソルベート８０が挙げられ、またこれらの２種以上を併用してもよい。抗体のような高分子蛋白質は容器の材質であるガラスや樹脂などに吸着しやすい。従って、界面活性剤を添加することによって、液状製剤あるいは凍結乾燥製剤の再溶解後の抗体の、容器への吸着を防止することができる。界面活性剤の添加量としは、液状製剤あるいは凍結乾燥製剤の再溶解後の水重量に対し０．００１〜１．０％添加することが好ましい。以上のような安定化剤、緩衝剤、あるいは吸着防止剤を加えて本発明抗体の製剤を調製することができるが、特に医療用又は動物薬用注射剤として用いる場合は、浸透圧比として許容される浸透圧比は１〜２が好ましい。浸透圧比は、製剤化に際して塩化ナトリウムの増減により調製することができる。製剤中の抗体含量は、適用疾患、適用投与経路などに応じて適宜調整することができ、ヒトに対するヒト型化抗体の投与量は、抗体のヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭに対する親和性、即ちヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭに対する解離定数（Ｋｄ値）に依存し、親和性が高い（Ｋｄ値が低い）ほど、ヒトヘの投与量を少なく薬効を発現することができる。又、ヒト型抗体はヒト血中での半減期が約２０日間と長いことから、例えばヒトに対して投与する際には、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇを１〜３０日間に１回以上投与すれば良い。
【００５２】
【実施例】
以下の実施例により本発明をより詳紬に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
本発明蛋白質の製造
（１）ＳＴ２細胞の大量培養
マウス骨芽細胞様ストローマ細胞株ＳＴ２（ＲＩＫＥＮ　ＣＥＬＬ　ＢＡＮＫ，　ＲＣＢＯ２２４）は、１０％牛胎児血清を含むα‐ＭＥＭ培地を用いて培養した。付着細胞用２２５ｃｍ２Ｔフラスコでコンフルエントになるまで培養したＳＴ２細胞を、トリプシン処理してＴフラスコから剥がし洗浄した後、５枚の２２５ｃｍ２Ｔフラスコに移し、１０−８Ｍ活性型ビタミンＤ３（Ｃａｌｃｉｔｒｉｏｌ）、１０−７Ｍデキサメサゾン、及び１０％牛胎児血清を添加したα‐ＭＥＭ培地各々６０ｍｌを加えてＣＯ２インキュベーター中で７−１０日間培養した。培養したＳＴ２細胞はセルスクレイパーを用いて回収し、使用するまで‐８０℃で保存した。
【００５３】
（２）膜画分の調製と膜結合蛋白質の可溶化
２２５ｃｍ２のＴフラスコ８０枚を用いて培養した実施例１‐（１）記載のＳＴ２細胞（容量約１２ｍｌ）に、プロテアーゼ阻害剤（２ｍＭ　ＡＰＭＳＦＰ，　２ｍＭ　ＥＤＴＡ，　２ｍＭ　ｏ−ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ，　１ｍＭ　ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，　１μｇ／ｍｌ　ｐｅｐｓｔａｔｉｎ　Ａ及び１００　ｕｎｉｔｓ／ｍｌ　ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）を含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）を３倍容量（３６ｍｌ）加えた。ボルテックスミキサーを用いて３０秒間この細胞を激しく攪拌した後、氷中で１０分間放置した。
ホモジナイザー（ＤＯＵＮＣＥ　ＴＩＳＳＵＥ　ＧＲＩＮＤＥＲ，　Ａ　ｓｙｒｉｎｄｇｅ，　ＷＨＥＡＴＯＮ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を用い、細胞を破砕した。この細胞破砕液に、上記のプロテアーゼ阻害剤、０．５Ｍシュクロース、０．１Ｍ塩化カリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、及び２ｍＭ塩化カルシウムを加えた１０ｍＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）の等量（４８ｍｌ）を加え、攪拌した後、４℃、６００×ｇで１０分間遠心した。この遠心分離により、細胞核と未破砕の細胞を沈殿画分として分離した。遠心分離で得た上清を４℃、１５０，０００×ｇで９０分間遠心し、沈殿画分としてＳＴ２細胞の膜画分を得た。この膜画分に、上記のプロテアーゼ阻害剤、１５ｍＭ塩化ナトリウム、及び０．１Ｍシュクロースを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）８ｍｌを加えた後、２０％　ＣＨＡＰＳ　（３‐［（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）‐ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］‐１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ、Ｓｉｇｍａ社）２００μｌを加え、４℃で２時間攪拌した。この液を４℃、１５０，０００×ｇで６０分間遠心し、その上清を可溶化膜画分として得た。
【００５４】
【実施例２】
本発明蛋白質の精製
（１）ＯＣＩＦ固定化アフィニティーカラムの調製
ＨｉＴｒａｐ　ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄカラム（１ｍｌ，ファルマシア社）内のイソプロパノールを１ｍＭ塩酸で置換した後、ＷＯ９６／２６２１７号公報記載の方法で調製した遺伝子組み換え型ＯＣＩＦ　１３．０ｍｇを含む０．２Ｍ　ＮａＨＣＯ３／０．５ＭＮａＣｌ（ｐＨ　８．３）溶液１ｍｌをシリンジ（５ｍｌ，テルモ社）を用いカラムに添加した。室温で３０分間カップリング反応させた後、過剰な活性基を不活性化する為、０．５Ｍエタノールアミン／０．５Ｍ　ＮａＣｌ（ｐＨ　８．３）と０．１Ｍ酢酸／０．５Ｍ　ＮａＣｌ（ｐＨ　４．０）を３ｍｌずつ交互に３回流し、再度０．５Ｍエタノールアミン／０．５Ｍ　ＮａＣｌ（ｐＨ　８．３）に置き換え室温で１時間放置した。その後、０．５Ｍエタノールアミン／０．５Ｍ　ＮａＣｌ（ｐＨ　８．３）と０．ｌＭ　酢酸／０．５Ｍ　ＮａＣｌ（ｐＨ　４．０）で２度洗浄し、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／１Ｍ　ＮａＣｌ／０．１％ＣＨＡＰＳ緩衝液（ｐＨ　７．５）に置換した。
【００５５】
（２）ＯＣＩＦ固定化アフィニティーカラムによる本発明蛋白質の精製
ＯＣＩＦ結合蛋白質の精製は、特に断らない限り４℃で行った。前述のＯＣＩＦ固定化アフィニティーカラムを、実施例１‐（２）記載のプロテアーゼ阻害剤、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、及び０．５％　ＣＨＡＰＳを加えた１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ　７．２）で平衡化した。このカラムに、実施例１‐（２）項記載の可溶化膜画分約８ｍｌを流速０．０１ｍｌ／分で負荷した。このカラムに、上記のプロテアーゼ阻害剤、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、及び０．５％ＣＨＡＰＳを加えた１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ　７．２）を流速０．５ｍｌ／分で１００分間流してカラムを洗浄した。次に、プロテアーゼ阻害剤、０．２Ｍ塩化ナトリウム、及び０．５％ＣＨＡＰＳを加えた０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ　３．３）を流速０．１ｍｌ／分で５０分間流し、カラムに吸着した蛋白質を溶出した。同様に、プロテアーゼ阻害剤、０．２Ｍ塩化ナトリウム、及ひ０．５％ＣＨＡＰＳを加えた０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．０）を流速０．１ｍｌ／分で５０分間流し、カラムに吸着した蛋白質を溶出した。溶出液は０．５ｍｌ／フラクションにて分取した。分取した画分には、２Ｍトリス溶液を加え、直ちに中和した。各緩衝液で溶出したフラクション（溶出液量１．０−５．０ｍｌ）の各々をセントリコン−１０（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ‐１０，　Ａｍｉｃｏｎ，　ＵＳＡ）を用いて５０から１００μｌに濃縮した。濃縮した各フラクションの一部を分取し、それぞれにＯＣＩＦを添加後、ＯＣＩＦポリクローナル抗体で免疫沈殿させた。その沈殿画分をＳＤＳ化して後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけてＯＣＩＦに特異的な結合能を有する蛋白質のバンドが出現するフラクション（Ｆｒ．　Ｎｏ．３−１０）を本発明蛋白質画分とした。
【００５６】
（３）ゲル濾過による本発明蛋白質の精製
実施例２‐（２）記載の方法で精製し、濃縮したＯＣＩＦ結合蛋白質（０．ｌＭグリシン−塩酸緩衝液、ｐＨ　３．３及び０．ｌＭクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ　２．０溶出画分）を１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，　０．５Ｍ　ＮａＣｌ，　０．５％　ＣＨＡＰＳ（ｐＨ　７．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ　１２ＨＲ１０／３０カラム（ファルマシア杜、１．０ｘ３０ｃｍ）にかけ、平衡化緩衝液を移動相として用い流速０．５　ｍｌ／ｍｉｎで展開させ、０．５　ｍｌずつの画分を集めた。上記と同様にして本発明蛋白質画分（Ｆｒ．　Ｎｏ．　２７−３２）を同定し、各々のフラクションをＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０　（Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮した。
【００５７】
（４）逆相高速液体クロマトグラフィーによる精製
前述のゲル濾過で精製したＯＣＩＦ結合蛋白質を０．１％　トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ），３０％アセトニトリルで平衡化したＣ４カラム（２．１ｘ２５０ｍｍ、Ｖｙｄａｃ，　ＵＳＡ）に負荷した。最初の５０分間でアセトニトリル濃度を３０％から５５％に、次の１０分間でアセトニトリル濃度を８０％にする勾配、流速０．２ｍｌ／ｍｉｎで溶出を行い、溶出された蛋白質のピークを２１５ｎｍで検出した。溶出された各ピークの蛋白質を分取し本発明蛋白質のピークを同定することにより、高度に精製された本発明蛋白質を得た。
【００５８】
【実施例３】
精製された本発明蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
まず、活性型ビタミンＤ３存在下あるいは非存在下で培養したＳＴ２細胞から調製した膜可溶化画分を上記のようにＯＣＩＦ固定化アフィニティーカラムで精製し、その精製標品をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。図１（Ａ）に示したように、活性型ビタミンＤ３存在下で培養したＳＴ２細胞からの精製標品のみに、約３０，０００−４０，０００のメジャーな蛋白質バンドが検出され、ＯＣＩＦ固定化アフィニティーカラムにより、ＯＣＩＦに特異的に結合する蛋白質、即ち本発明蛋白質が選択的に濃縮、精製されることが明らかになった。しかしながら、本発明蛋白質以外にＯＣＩＦ固定化カラムの担体やスペサーなどに非特異的に結合した数種の蛋白質バンドが両精製サンプル中に共通して検出された。これらの本発明蛋白質以外の蛋白質を上記のようにゲル濾過及びＣ４逆相クロマトグラフィーで除去し、得られた高度精製本発明蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを図１（Ｂ）に示した。高度精製本発明蛋白質は電気泳動的に均一であり、その分子量は約３０，０００−４０，０００であった。
【００５９】
【実施例４】
ＯＣＩＦの骨芽細胞への結合試験
（１）　１２５Ｉ　標識ＯＣＩＦの調製
ＯＣＩＦはヨードジェン（Ｉｏｄｏｇｅｎ）法により１２５標識した。即ち、２．５ｍｇ／ｍｌ　Ｉｏｄｏｇｅｎ‐クロロホルム溶液２０μｌを１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移し、４０℃でクロロホルムを蒸発させて、ヨードジェンコートしたチューブを調製した。このチューブを０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（Ｎａ−Ｐｉ，ｐＨ　７．０）４００μｌで３回洗浄した後、０．５Ｍ　Ｎａ−Ｐｉ，　ｐＨ　７．０，　５μｌを加えた。このチューブにＮａ−１２５Ｉ溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、ＮＥＺ−０３３Ｈ２０）１．３μｌ（１８．５　ＭＢｑ）を加えた後、直ちに１ｍｇ／ｍｌ　ｒＯＣＩＦ溶液（モノマー型あるいはダイマー型）１０μｌを加え、ボルテックスミキサーで攪拌した後、室温で３０秒間放置した。この溶液を、予め１０ｍｇ／ｍｌヨウ化カリウム、０．５Ｍ　Ｎａ−Ｐｉ，　ｐＨ　７．０溶液８０μｌと５％牛血清アルブミンのリン酸塩緩衝生理食塩水５μｌを添加しておいたチューブに移し攪拌した。この溶液を０．２５％牛血清アルブミンのリン酸塩緩衝生理食塩水溶液で平衡化しておいたスピンカラム（１ｍｌ，　Ｇ−２５　ｆｉｎｅ，　ファルマシア社）に負荷し、２，０００ｒｐｍで５分間遠心した。カラムから溶出された画分に０．２５％牛血清アルブミンのリン酸塩緩衝生理食塩水溶液４００μｌを加え攪拌した後、２μｌを取り、その放射能をガンマーカウンターで測定した。このようにして調製した１２５Ｉ標識ＯＣＩＦ溶液の放射化学純度は１０％ＴＣＡにより沈殿する画分の放射能を測定することにより求めた。又、１２５Ｉ標識ＯＣＩＦ溶液のＯＣＩＦ生物活性は、ＷＯ９６／２６２１７号公報記載の方法に従い測定した。
又、１２５Ｉ標識ＯＣＩＦ濃度は以下のようにＥＬＩＳＡにより測定した。
【００６０】
（２）　１２５Ｉ標識ＯＣＩＦ濃度のＥＬＩＳＡによる測定
ＷＯ９６／２６２１７号公報記載の抗ＯＣＩＦウサギポリクローナル抗体を２μｇ／ｍｌになるように溶解させた５０ｍＭ　ＮａＨＣＯ３（ｐＨ　９．６）１００μｌずつを９６ウェルイムノプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭ、Ｎｕｎｃ社）の各ウェルに加えて４℃で一夜放置した。この液を吸い取った後、ブロックエース（雪印乳業）／リン酸塩緩衝生理食塩水溶液（２５／７５）３００μｌずつを各ウェルに加え、室温で２時間放置した。この液を吸い取った後、各ウェルを０．０１　％ポリソルベート８０を含むリン酸塩緩衝生理食塩水（Ｐ−ＰＢＳ）で３回洗浄し、次いで１２５Ｉ標識ＯＣＩＦサンプルあるいはＯＣＩＦ標準品を添加したブロックエース／リン酸塩緩衝生理食塩水溶液（２５／７５）３００μｌずつを各ウェルに加え、室温で２時間放置した。この液を吸い取った後、Ｐ−ＰＢＳ　２００μｌで各ウェルを６回洗浄した。パーオキシダーゼ標識したウサギ抗ＯＣＩＦポリクローナル抗体を含むブロックエース（雪印乳業）／リン酸塩緩衝生理食塩水溶液（２５／７５）１００μｌずつを各ウェルに加え、室温で２時間放置した。この液を吸い取った後、Ｐ−ＰＢＳ　２００μｌで各ウェルを６回洗浄した。ＴＭＢ溶液（ＴＭＢ　Ｓｏｌｕｂｌｅ　Ｒｅａｇｅｎｔ，　Ｈｉｇｈ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，　Ｓｃｙｔｅｋ社）１００μｌずつを各ウェルに加え、室温で２−３分放置した後、停止液（Ｓｔｏｐｐｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ，　Ｓｃｙｔｅｋ社）１００μｌずつを各ウェルに加えた。各ウェルの４９０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。ＯＣＩＦ標準品を用いて作製した検量線より、１２５Ｉ標識ＯＣＩＦの濃度を求めた。
【００６１】
　（３）ＯＣＩＦの骨芽細胞あるいは脾臓細胞への結合試験
マウス骨芽細胞様ストローマ細胞株ＳＴ２あるいは脾臓細胞をそれぞれ４×１０４　ｃｅｌｌ／ｍｌ及び２ｘ１０６　ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度になるように、１０−８Ｍ活性型ビタミンＤ３（Ｃａｌｃｉｔｒｉｏｌ）及び１０−７Ｍデキサメサゾン添加あるいは無添加の１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むα‐ＭＥＭ培地に懸濁させ、この培地１ｍｌずつを２４ウェルマイクロプレートに播種した。細胞をＣＯ２インキュベーター中で４日間培養しα‐ＭＥＭ培地で洗浄した後、上記の１２５Ｉ標識ＯＣＩＦ（モノマー型又はダイマー型）２０ｎｇ／ｍｌを加えた結合試験用培地（０．２％牛血清アルブミン、２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ緩衝液、０．２％　ＮａＮ３を加えたα‐ＭＥＭ培地）２００μｌを各ウェルに加えた。又、別のウェルには、８μｇ／ｍｌ　ｒＯＣＩＦ（４００倍濃度）を更に添加した結合試験用培地を２００μｇ／ｍｌ加え、非特異的吸着量測定に供した。ＣＯ２インキュベーター中で１時間培養した後、１　ｍｌのリン酸塩緩衝生理食塩水　１　ｍｌで３回洗浄した。この際、脾臓細胞は浮遊細胞であるため、２４ウェルプレートを遠心分離しながら、各ウェルの細胞を洗浄した。洗浄後、０．１Ｎ　ＮａＯＨ溶液５００μｌを各ウェルに加え、室温に１０分間放置することにより細胞を溶解させ、細胞に結合したＲＩ量をガンマーカウンターで測定した。
１２５Ｉ標識ＯＣＩＦは、培養した脾臓細胞には結合せず、図２に示したように、活性型ビタミンＤ３で培養した骨芽細胞様ストローマ細胞にのみ特異的に結合した。
このことから、本発明蛋白質は活性型ビタミンＤ３とデキサメサゾンにより骨芽細胞様ストローマ細胞上に誘導される膜結合蛋白質であることが明らかになった。
【００６２】
【実施例５】
本発明蛋白質の生物活性
（１）骨芽細胞様ストローマ細胞の破骨細胞形成支持能
骨芽細胞の破骨細胞形成支持能は、形成される破骨細胞の酒石酸耐性酸性フォスファターゼ活性（ＴＲＡＰ活性）を測定することによって評価した。即ち、ｄｄｙマウス（８−１２週齢）の脾臓細胞（２×１０５　ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌ）とマウス骨芽細胞様ストローマ細胞ＳＴ２（５×１０３　ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌ）を１０−８Ｍ活性型ビタミンＤ３、１０−７Ｍデキサメサゾン、及ひ１０％牛胎仔血清を加えたα‐ＭＥＭ培地に懸濁させ、９６ウェルプレートに播種した。ＣＯ２インキュベーター中で１週間培養した後、各ウェルをリン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄し、更に１００μｌのエタノール／アセトン（１：１）を加えて、室温で１分間固定した。固定後、５．ｍＭ　ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅと１０ｍＭ酒石酸ナトリウムを含む５０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ　４．５、１００μｌを各ウェルに加え、室温で１５分間反応させた。反応後、０．１Ｎ　ＮａＯＨ溶液を各ウェルに添加し、４０５　ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。ＲＩＫＥＮ　ＣＥＬＬ　ＢＡＮＫから購入した後の継代数約１０代のＳＴ２細胞と継代数約４０代のＳＴ２細胞の破骨細胞形成支持能を試験した結果を図３に示す。この結果から、継代数の多いＳＴ２細胞は破骨細胞形成支持能が高いことか明らかになった。
【００６３】
　（２）活性型ビタミンＤ３及びデキサメサゾン存在下での培養における骨芽細胞様ストローマ細胞膜上の本発明蛋白質発現の経時変化と共培養系における破骨細胞形成の経時変化
実施例４‐（３）と同様に、骨芽細胞様ストローマ細胞株ＳＴ２を活性型ビタミンＤ３及びデキサメサゾン存在下で７日間培養した。ＯＣＩＦ結合試験は、実験例４‐（１）に記載した１２５Ｉ標識ＯＣＩＦ（モノマータイプ）を用いて行った。非特異的結合は４００倍濃度の非標識ＯＣＩＦを用いて１２５Ｉ標識ＯＣＩＦのＳＴ２細胞への結合を競合させることにより測定した。その結果、活性型ビタミンＤ３とデキサメサゾンにより、培養日数の経過と共に１２５Ｉ標識ＯＣＩＦの特異的結合量が上昇した。即ち、図４及び図５に示したように本発明蛋白質は活性型ビタミンＤ３によりＳＴ２細胞の表面に培養日数と共に発現し、その発現は培養４日目に最大に達した。一方、マウス脾臓細胞とＳＴ２細胞の共培養を活性型ビタミンＤ３存在下で行うことにより、破骨細胞様の細胞が形成される。破骨細胞のマーカー酵素であるＴＲＡＰ陽性の単核前破骨細胞様細胞は培養３、４日目には形成され、さらに分化、成熟したＴＲＡＰ陽性の多核細胞は培養５、６日目に形成される。本発明蛋白質の発現の経時変化と破骨細胞形成のそれとは良く相関していることが明らかになった。
【００６４】
　（３）共培養期間において、種々の培養期間のみＯＣＩＦ処理した場合の破骨細胞形成抑制効果
本発明蛋白質が破骨細胞形成に関与する因子であることを更に明確にするために、前述の実施例５‐（２）における６日間の共培養期間において、種々の培養期間（各２日間、但し５日目のみ１日間）の細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのＯＣＩＦで処理した。
その結果、図６に示したように、ＳＴ２細胞上に最も本発明蛋白質が発現される培養４８−９６時間目でのＯＣＩＦ処理が最も効果的に破骨細胞の形成を抑制した。即ち、ＯＣＩＦは本発明蛋白質を介してＳＴ２細胞に結合することにより、破骨細胞形成を抑制することが明らかになった。
以上の結果から、本発明蛋白質は活性型ビタミンＤ３とデキサメサゾンにより骨芽細胞様ストローマ細胞膜上に誘導され、破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する因子としての生物活性（作用）を有することが明らかになった。
【００６５】
【実施例６】
１２５Ｉ標識ＯＣＩＦと本発明蛋白質とのクロスリンキング試験
本発明蛋白質の存在をさらに確認するため、１２５Ｉ標識ＯＣＩＦと本発明蛋白質とのクロスリンキングを行った。実施例４‐（３）と同様にマウス骨芽細胞様細胞株ＳＴ２を活性型ビタミンＤ３及びデキサメサゾン存在下及び非存在下で４日間培養した。細胞をリン酸塩緩衝生理食塩水１ｍｌで洗浄した後、上記の１２５Ｉ標識ＯＣＩＦ（モノマー型）２５ｎｇ／ｍｌ、又はＷＯ９６／２６２１７号公報にある配列表配列番号７６記載の蛋白質を動物細胞で発現させ上記の方法で標識することにより得られた１２５Ｉ標識ＯＣＩＦ‐ＣＤＤｌ　４０ｎｇ／ｍｌを加えた結合試験用培地（０．２％　牛血清アルブミン、２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ緩衝液、０．２％　ＮａＮ３、及び１００μｇ／ｍｌヘパリンを加えたα‐ＭＥＭ培地）２００μｌを添加した。又、別のウェルには、４００倍濃度のＯＣＩＦを更に添加した結合試験用培地を添加し、非特異的吸着試験に供した。ＣＯ２インキュベーター中で１時間培養した後、１００μｇ／ｍｌヘパリンを加えたリン酸塩緩衝生理食塩水１ｍｌで３回洗浄した。これらのウェルに１００μｇ／ｍｌのクロスリンキング剤、ＤＳＳ（Ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｓｕｂｅｒａｔｅ、Ｐｉｅｒｃｅ社）を溶解させたリン酸塩緩衝生理食塩水５００μｌを加え、０℃で１０分間反応させた。これらのウェルの細胞を０℃に冷却したリン酸塩緩衝生理食塩水１ｍｌで２回洗った後、１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、２ｍＭ　ＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、１０μＭ　ｐｅｐｓｔａｔｉｎ、１０μＭ　ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１０μＭ　ａｎｔｉｐａｉｎ、及び２ｍＭ　ＥＤＴＡを加えた２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ緩衝液１００μｌを各ウェルに加え室温に３０分間放置して細胞を溶解させた。これらのサンプル１５μｌを常法により非還元条件下でＳＤＳ化した後、ＳＤＳ‐ポリアクリルアミド電気泳動用ゲル（４−２０％ポリアクリルアミドグラジェント、第一化学社）を用いて泳動させた。泳動後、ゲルを乾燥させ、ＢｉｏＭａｘ　ＭＳフィルム（Ｋｏｄａｋ社）とＢｉｏＭａｘ　ＭＳ増感スクリーン（Ｋｏｄａｋ社）を用いて‐８０℃で２４時間感光させた。感光させたフィルムを常法により現像した。
１２５Ｉ標識ＯＣＩＦ（モノマー型、６０ｋＤａ）を用いた場合には分子量約９０，０００−１０，０００のクロスリンクされた蛋白質が検出された。又、１２５Ｉ標識ＯＣＩＦ−ＣＤＤｌ（３１ｋＤａ）を用いた場合、図７に示すように約７０−８０ｋＤａ（平均７８ｋＤａ）のクロスリンクされた蛋白質が検出された。
【００６６】
【実施例７】
ＳＴ細胞上に発現する本発明蛋白質のＳｃａｔｃｈａｒｄ　Ｐｌｏｔによる解析
上記の１２５Ｉ標識ＯＣＩＦ（モノマー型）を１，０００ｐＭになるように加えた結合試験用培地（０．２％　牛血清アルブミン、２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ緩衝液、０．２％　ＮａＮ３を加えたα‐ＭＥＭ培地）を調製し、結合試験用培地を用い、１／２希釈倍率で段階的に希釈した。又、非特異的な結合を求めるため、これらの溶液に更に４００倍濃度の未標識モノマー型ＯＣＩＦを添加した溶液を調製した。調製したこれらの溶液２００μｌを１０−８Ｍ活性型ビタミンＤ３（Ｃａｌｃｉｔｒｉｏｌ）と１０−７Ｍデキサメサゾン存在下で４日間培養した上記のＳＴ２細胞（約１０継代目）のウェルに加え、実施例４‐（３）と同様の方法で１２５Ｉ標識ＯＣＩＦの結合を試験した。得られた結果を常法に従ってＳｃａｔｃｈａｒｄ　Ｐｌｏｔし、ＯＣＩＦとＯＣＩＦ結合蛋白質の解離定数とＳＴ２細胞当たりのＯＣＩＦ結合蛋白質の個数（サイト数）を求めた。その結果、ＯＣＩＦと本発明蛋白質の解離定数は２８０ｐＭ、ＳＴ２細胞当たりのＯＣＩＦ結合蛋白質のサイト数は約３３，０００個／細胞であった。又、実施例５‐（１）で記載したように、約４０継代培養したＳＴ２細胞は破骨細胞形成支持能が１０継代培養したＳＴ２細胞よりも高かったことから、前者のＳＴ２細胞上に発現した本発明蛋白質のサイト数を測定したところ、サイト数が５８，０００個／細胞であり、明らかに１０継代培養したＳＴ２細胞よりも多く、本発明蛋白質の発現量の多寡がＳＴ２細胞による破骨細胞形成支持能の強弱に繋がっていることが明らかになった。このことは、本発明蛋白質は破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する因子であることを示す。
【００６７】
【実施例８】
ＯＢＭｃＤＮＡのクローニング
（１）マウスＳＴ２細胞からのＲＮＡの抽出
マウス骨芽細胞様ストローマ細胞株ＳＴ２（ＲＩＫＥＮ　ＣＥＬＬ　ＢＡＮＫ，　ＲＣＢＯ２２４）は、１０％　牛胎児血清を含むα‐ＭＥＭ培地（ギブコＢＲＬ杜）を用いて培養した。付着細胞用２２５ｃｍ２Ｔ‐フラスコでコンフルエントになるまで培養したＳＴ２細胞を、トリプシン処理してＴ‐フラスコから剥がし洗浄した後、５枚の２２５ｃｍ２Ｔ‐フラスコに移し、１０−８Ｍ活性化ビタミンＤ３（Ｃａｌｃｉｔｒｉｏｌ、和光純薬杜）、ｌＯ−７Ｍデキサメサゾン、及び１０％牛胎児血清を添加したα−ＭＥＭ培地を各々６０ｍｌずつ加えてＣＯ２インキュベーター中で５日間培養した。培養したＳＴ２細胞からＩＳＯＧＥＮ（和光純薬社）を用いて総ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡ約６００μｇからＯｌｉｇｏ（ｄＴ）‐ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラム（５’‐３’Ｐｒｉｍｅ社）を用いてポリＡ＋ＲＮＡを調製した。約８μｇのポリＡ＋ＲＮＡを得た。
【００６８】
（２）発現ライブラリーの構築
実施例８−（１）で得られたポリＡ＋ＲＮＡ　２μｇからＧｒｅａｔ　Ｌｅｎｇｔｈｓ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用い、その説明書に従い二本鎖ｃＤＮＡを合成した。即ち、ポリ＋ＲＮＡ　２μｇとＯｌｉｇｏ（ｄＴ）２５（ｄＮ）プライマーを混合し蒸留水を加え最終容量を６．２５μｌとし、７０℃で３分保温後、氷中で２分冷却した。この溶液に蒸留水２．２μｌ、５Ｘ　Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ　ｂｕｆｆｅｒ　２．５μｌ、１００ｍＭ　ＤＴＴ　（ジチオスレイトール）０．２５μｌ、ＰＲＩＭＥ　ＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　（１Ｕ／ｍｌ）　（５’‐３’Ｐｒｉｍｅ社）　０．５μｌ、５倍希釈した［α‐３２Ｐ］　ｄＣＴＰ（アマシャム杜、３０００　Ｃｉ／ｍｍｏｌ、２μＣｉ／μｌ）　０．５μｌ、ｄＮＴＰ（各２０ｍＭ）　０．６５μｌ、ＭＭＬＶ　（ＲＮａｓｅＨ‐）逆転写酵素１．２５μｌ（２５０ユニット）を加え、４２℃で９０分保温した。さらに、蒸留水を６２．２５μｌ、５Ｘ　ｓｅｃｏｎｄ−ｓｔｒａｎｄ　ｂｕｆｆｅｒ　２０μｌ、ｄＮＴＰ　（各２０ｍＭ）　０．７５μｌ、Ｓｅｃｏｎｄ−ｓｔｒａｎｄ　ｅｎｚｙｍｅ　ｃｏｃｋｔａｉｌ　５μｌを添加し、１６℃で２時間保温した。この反応液にＴ４ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　７．５ユニットを加え、１６℃でさらに３０分保温後０．２Ｍ　ＥＤＴＡ　５μｌ添加して反応を停止し、フェノール・クロロフォルム処理後、エタノール沈殿を行った。この二本鎖ｃＤＮＡの末端にＥｃｏＲＩ−Ｓａｌ　Ｉ−ＮｏｔＩリンカー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を付加し末端をリン酸化した。サイズフラクショネーション用カラムにより５００ｂｐ以上のｃＤＮＡを分離し、エタノール沈殿を行った。沈殿したＤＮＡを水に溶解し、あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社）切断及びＣＩＡＰ（ウシ小腸アルカリフォスファターゼ、宝酒造社）処理して調製したｐｃＤＬ−ＳＲ　α２９６　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｖｏｌ．８，　ｐｐ４６６−４７２、１９８８）に挿入した。
【００６９】
（３）　ＯＣＩＦとの結合を指標とした発現ライブラリーのスクリーニング
実施例８−（２）で得られたＤＮＡを用い大腸菌、ＸＬ２　ＢｌｕｅＭＲＦ’（東洋紡社）を形質転換し、１ウェルあたり約１００コロニーとなるように細胞培養用２４ウェルプラスティックプレートに調製したＬカーベニシリン寒天培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキス、１％ＮａＣｌ、６０μｇ／ｍｌカーベニシリン、１．５％寒天）上に増殖させた。各ウェル中の形質転換株を３ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ　Ｂｒｏｔｈアンピシリン培地（１．２％トリプトン、２．４％イーストエキス、０．４％グリセロール、０．０１７Ｍ　ＫＨ２ＰＯ４、０．０７２Ｍ　Ｋ２ＨＰＯ４，　１００μｇ／ｍｌアンピシリン）に懸濁し、３７℃で一晩振盪培養した。遠心により集菌しＱＩＡｗｅｌｌ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。２６０ｎｍにおける吸光度によりＤＮＡ含量を測定し、エタノール沈殿により濃縮し、２００ｎｇ／μｌとなるように蒸留水に溶解した。この様にしてそれぞれ約１００個のコロニーから由来するＤＮＡプールを５００プール調製し、ＣＯＳ−７細胞（ＲＩＫＥＮ　ＣＥＬＬ　ＢＡＮＫ，ＲＣＢＯ５３９）へのトランスフェクションに用いた。ＣＯＳ−７細胞を２４ウェルプレートに８×１０４細胞／ウェルとなるように播種し、１０％　牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いて、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて一晩培養した。翌日、培地を除いた後、無血清ＤＭＥＭ培地で細胞を洗浄した。トランスフェクション用試薬リポフェクトアミン（ギブコＢＲＬ社）添付のプロトコールに従い、予めＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地　（ギブコＢＲＬ　社）を用いて希釈しておいた前記プラスミドＤＮＡとリポフェクトアミン（ギブコＢＲＬ　社）を混合し、１５分後この混合液を各ウェルの細胞に加えた。用いたＤＮＡ及びリポフェクタミンの量はそれぞれ１μｇ及び４μｌとした。５時間後、培地を除去し、１ｍｌの１０％　牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（ギブコ社）を添加し、ＣＯ２　インキュベーター中（５％ＣＯ２）、３７℃で２−３日培養した。上記の様にトランスフェクトし２−３日培養したＣＯＳ−７　細胞を無血清ＤＭＥＭ培地で洗浄した後、１２５Ｉ標識したＯＣＩＦ　２０ｎｇ／ｍｌを加えた結合試験用培地（０．２％牛血清アルブミン、２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ緩衝液、０．１ｍｇ／ｍｌ　ｈｅｐａｒｉｎ及び０．０２％　ＮａＮ３を加えた無血清ＤＭＥＭ培地）　２００μｌを各ウェルに加えた。ＣＯ２　インキュベーター中（５％　ＣＯ２）で３７℃　１時間培養した後、細胞を０．１ｍｇ／ｍｌ　ｈｅｐａｒｉｎを含むリン酸塩緩衝生理食塩水５００μｌで２回洗浄した。洗浄後、０．１Ｎ　ＮａＯＨ溶液　５００μｌを各ウェルに加え、室温に１０分間放置することにより細胞を溶解させ、各ウェル中の１２５Ｉの量をガンマーカウンター（パッカード社）で測定した。計５００　プールをスクリーニングすることにより、ＯＣＩＦと特異的に結合する蛋白質をコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡプール１っを分離した。さらに本発明のｃＤＮＡを含むＤＮＡプールを細分化し、前記と同様のトランスフェクションとスクリーニング操作を繰り返すことにより、ＯＣＩＦと結合する蛋白質をコードするｃＤＮＡを単離した。このｃＤＮＡを含むプラスミドをｐＯＢＭ２９１と名付けた。このプラスミドを含む大腸菌は、ｐＯＢＭ２９１として通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人産業技術総合研究所　微生物寄託センター）に受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−５９５３として平成９年５月２３日に寄託されている。ＯＣＩＦの１２５Ｉ標識ならびにＥＬＩＳＡによる１２５Ｉ標識ＯＣＩＦの定量法を以下に示す。ＯＣＩＦはヨードジェン（Ｉｏｄｏｇｅｎ）法により１２５Ｉ標識した。２．５　ｍｇ／ｍｌ　Ｉｏｄｏｇｅｎ−クロロホルム溶液２０μｌを１．５　ｍｌエッペンドルフチューブに移し、４０℃でクロロホルムを蒸発させて、ヨードジェンコートしたチューブを調製した。このチューブを０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（Ｎａ−Ｐｉ，　ｐＨ　７．０）４００μｌで３回洗浄した後、０．５　Ｍ　Ｎａ−Ｐｉ，　ｐＨ　７．０，　５μｌを加えた。このチューブにＮａ−１２５Ｉ溶液　（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、ＮＥＺ−０３３Ｈ２０）１．３μｌ（１８．５　ＭＢｑ）を加えた後、直ちに１ｍｇ／ｍｌＯＣＩＦ溶液（モノマー型あるいはダイマー型）　１０μｌを加え、ボルテクスミキサーで攪拌した後、室温で３０秒間放置した。この溶液を、予め１０ｍｇ／ｍｌ沃化カリウム、０．５Ｍ　Ｎａ−Ｐｉ，　ｐＨ７．０溶液８０μｌと　５％　牛血清アルブミンを含むリン酸塩緩衝生理食塩水（ＢＳＡ−ＰＢＳ）５μｌ　を添加しておいたチューブに移し攪拌した。この溶液をＢＳＡ−ＰＢＳで平衝化しておいたスピンカラム（１ｍｌ，　Ｇ−２５　ｆｉｎｅ，　ファルマシア社）に負荷し、２，０００ｒｐｍで５分間遠心した。カラムから溶出された画分にＢＳＡ−ＰＢＳを４００μｌ加え撹拌した後、２μｌを取り、その放射能をガンマーカウンターで測定した。このようにして調製した　１２５Ｉ標識ＯＣＩＦ溶液の放射化学純度は　１０％　ＴＣＡにより沈殿する画分の放射能を測定することにより求めた。また、１２５Ｉ標識ＯＣＩＦ溶液のＯＣＩＦ生物活性は、ＷＯ９６／２６２１７号公報記載の方法に従い測定した。また、１２５Ｉ標識ＯＣＩＦ濃度は、以下のようにＥＬＩＳＡにより測定した。即ち、ＷＯ９６／２６２１７号公報記載のウサギ抗ＯＣＩＦポリクローナル抗体を２μｇ／ｍｌになるように溶解させた５０ｍＭ　ＮａＨＣＯ３，　ｐＨ　９．６を１００　μｌずつ９６ウェルイムノプレート（Ｎｕｎｃ，ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭ）の各ウェルに加えて４℃で一夜放置した。この液を吸い取った後、ブロックエース（雪印乳業）とリン酸塩緩衝生理食塩の混合水溶液　（混合比２５：７５）（Ｂ−ＰＢＳ）を２００μｌずつ各ウェルに加え、室温で２時間放置した。この液を吸い取った後、各ウェルを０．０１％Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ　８０を含むリン酸塩緩衝生理食塩水　（Ｐ−ＰＢＳ）で３回洗浄し、次いで１２５Ｉ標識ＯＣＩＦサンプルあるいはＯＣＩＦ標準品を添加した　Ｂ−ＰＢＳを１００μｌずつ各ウェルに加え、室温で２時間放置した。この液を吸い取った後、Ｐ−ＰＢＳ２００μｌで各ウェルを６回洗浄した。パーオキシダーゼ標識したウサギ抗ＯＣＩＦポリクローナル抗体をＢ−ＰＢＳで希釈した溶液を１００μｌずつ各ウェルに加え、室温で２時間放置した。この液を吸い取った後、Ｐ−ＰＢＳ２００μｌ���各ウェルを６回洗浄した。ＴＭＢ　溶液　（ＴＭＢ　Ｓｏｌｕｂｌｅ　Ｒｅａｇｅｎｔ，　Ｈｉｇｈ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，　Ｓｃｙｔｅｋ社）を１００μｌずつ各ウェルに加え、室温で２−３分放置した後、停止液（Ｓｔｏｐｐｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ，　Ｓｃｙｔｅｋ社）を１００μｌずつ各ウェルに加えた。各ウェルの４５０　ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。ＯＣＩＦ標準品を用いて作製した検量線より１２５Ｉ標識ＯＣＩＦの濃度を求めた。
【００７０】
（４）　ＯＢＭの全アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列の決定
実施例８−（３）で得られたＯＢＭｃＤＮＡの塩基配列を、タックダイデオキシターミネーターサイクルシークエンシングキット（パーキンエルマー社）を用いて決定した。即ち、ｐＯＢＭ２９１を鋳型とし、直接挿入断片の塩基配列を決定した。また、ｐＯＢＭ２９１を制限酵素ＥｃｏＲＩ　で切断し得られた約１．０ｋｂ　ならびに約０．７ｋｂ　の断片をプラスミドｐＵＣ１９（宝酒造社）のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、それらの断片の塩基配列も決定した。用いたプライマーは、ｐｃＤＬ−ＳＲα２９６　の挿入断片　ＤＮＡの塩基配列を決定するためのプライマーＳＲＲ２、プラスミドｐＵＣ１９　の挿入断片　ＤＮＡの塩基配列を決定するためのプライマーｍｌ３ＰｒｉｍｅｒＭ３、ｍｌ３ＰｒｉｍｅｒＲＶ（ともに宝酒造社）及びＯＢＭｃＤＮＡの塩基配列に基づいて設計された合成プライマーＯＢＭ＃８である。これらプライマーの配列を配列表配列番号３〜６に示す。
また、決定されたＯＢＭｃＤＮＡの塩基配列を配列番号２に、その配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号１にそれぞれ示す。
【００７１】
〔実施例９〕
本発明ｃＤＮＡにコードされる蛋白質の発現
プラスミドｐＯＢＭ２９１　を６ウェルプレートの各ウェル中でＣＯＳ−７細胞にリポフェクトアミンを用いトランスフェクションし、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中で２日間培養した。５％透析牛胎児血清を添加した、システイン・メチオニン不含ＤＭＥＭ　（大日本製薬社）　に培地交換し（８００μｌ／ｗｅｌｌ）　１５分培養した後、Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｍｉｘ　（ＮＥＮ社、１０ｍＣｉ／ｍｌ）を１４μｌ添加した。４時間培養後、１０％　牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を　２００μｌ加え１時間培養した。細胞をＰＢＳで２回洗浄後、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％　ｂｏｖｉｎｅ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ、１０μｇ／ｍｌ　ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、０．２　ＴＩＵ／ｍｌ　ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１ｍＭ　ＰＭＳＦを含むＴＳＡバッファー　（０．１４Ｍ　ＮａＣｌ、０．０２５％　ＮａＮ３を含む　１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ　８．０））を０．５ｍｌ加え、氷上１時間静置した。ピペッティングにより細胞を破砕した後、４℃で３０００Ｘｇ　１０分間遠心分離し上清を得た。この上清１００μｌに２００μｌの希釈バッファー　（０．１　％　ＴｒｉｔｃｍＸ−１００、０．１％　ｂｏｖｉｎｅ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ、１０μｇ／ｍｌ　ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、０．２ＴＩＵ／ｍｌ　ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１ｍＭ　ＰＭＳＦを含むＴＳＡバッファー）を加え、ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（５０μｌ）とともに４℃で１時間振とうさせた後、４℃で１５００Ｘｇ　にて１分間遠心分離し上清を回収することにより、ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに非特異的に吸着する分画を除いた。この上清にＯＣＩＦ（１μｇ）を加え、４℃で１時間振とうさせながらＯＢＭとＯＣＩＦを結合させた後、抗ＯＣＩＦポリクローナル抗体　（５０μｇ）を加えて４℃で１時間振とうした。これにｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（１０μｌ）を加えさらに４℃で１時間振とうした。４℃で１５００Ｘｇ　にて１分間遠心分離し沈澱画分を回収した。４℃、１５００Ｘ　ｇ　で１分間の遠心分離による沈澱の洗浄を、希釈バッファーで２回、ｂｏｖｉｎｅ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎを含まない希釈バッファーで２回、ＴＳＡバッファーで１回、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　６．５）で１回行った。洗浄後、沈澱に１０　％βメルカプトエタノールを含むＳＤＳ　バッファー（０．１２５　ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、４％ドデシル硫酸ナトリウム、２０％　グリセロール、０．００２％ブロモフェノールブルー、ｐＨ　６．８）を加え、１００℃で５分加熱後　ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％ポリアクリルアミドゲル、第一化学社）を行った。常法によりゲルを固定した後、Ａｍｐｌｉｆｙ（アマシャム社）により、アイソトープのシグナルを増強した後、Ｂｉｏ　Ｍａｘ　ＭＲフィルム　（ＫＯＤＡＫ社）　を用いて−８０℃で感光させた。結果を図８に示す。
本発明ｃＤＮＡにコードされる蛋白質の分子量は約４０，０００であることが示された。
【００７２】
〔実施例１０〕
本発明ｃＤＮＡにコードされる蛋白質とＯＣＩＦとの結合
プラスミドｐＯＢＭ２９１　を２４ウェルプレートの各ウェル中でＣＯＳ細胞にリポフェクトアミンを用いてトランスフェクトし、その細胞を２−３日培養したのち無血清ＤＭＥＭ培地で洗浄し、これに１２５Ｉ標識したＯＣＩＦ　２０ｎｇ／ｍｌを加えた結合試験用培地　（０．２％牛血清アルブミン、２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ緩衝液、０．１ｍｇ／ｍｌ　ｈｅｐａｒｉｎ、０．２％　ＮａＮ３を加えた無血清ＤＭＥＭ培地）２００　μｌ　を加えた。また別のウェルには、１２５Ｉ標識したＯＣＩＦ　２０ｎｇ／ｍｌに加えて８μｇ／ｍｌの非標識ＯＣＩＦを更に添加した結合試験用培地を２００μｌ加えて実験を行った。ＣＯ２　インキュベーター中（５％　ＣＯ２）で３７℃にて１時間培養した後、細胞を０．１ｍｇ／ｍｌのｈｅｐａｒｉｎを含むリン酸緩衝生理食塩水５００μｌで２回洗浄した。洗浄後、０．１Ｎ　ＮａＯＨ溶液５００μｌを各ウェルに加え、室温に１０分間放置することにより細胞を溶解させ、ウェル中の１２５Ｉの量をガンマーカウンターで測定した。その結果、図９に示したようにプラスミドｐＯＢＭ２９１　をトランスフェクトした細胞にのみ１２５Ｉ標識したＯＣＩＦが結合することが確認された。また、その結合は、４００倍濃度のＯＣＩＦを添加することで著しく阻害されることが確認された。以上の結果から、プラスミドｐＯＢＭ２９１上のｃＤＮＡにコードされる蛋白質、ＯＢＭは、ＣＯＳ−７細胞表面でＯＣＩＦと特異的に結合することが明らかとなった。
【００７３】
〔実施例１１〕
１２５Ｉ標識したＯＣＩＦと本発明ｃＤＮＡにコードされる蛋白質とのクロスリンキング
試験
本発明ｃＤＮＡにコードされる蛋白質の性質をさらに詳しく解析するため、１２５Ｉ標識したモノマー型ＯＣＩＦと本発明ｃＤＮＡにコードされる蛋白質とのクロスリンキングを行った。実施例８−（３）に記載の方法に従ってプラスミドｐＯＢＭ２９１をＣＯＳ−７　細胞にトランスフェクトした後、上記の　１２５Ｉ標識したＯＣＩＦ　（２５ｎｇ／ｍｌ）　を加えた結合試験用培地２００μｌ　を添加した。また、別のウェルには、１２５Ｉ標識したＯＣＩＦに加え４００　倍濃度の非標識ＯＣＩＦをさらに添加した結合試験用培地を加えた。ＣＯ２インキュベーター中（５％　ＣＯ２）で３７℃　１時間培養した後、細胞を０．１ｍｇ／ｍｌ　ｈｅｐａｒｉｎを含むリン酸塩緩衝生理食塩水５００　μｌで２回洗浄した。この細胞に１００μｇ／ｍｌのクロスリンキング剤、ＤＳＳ　（Ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｓｕｂｅｒａｔｅ，　Ｐｉｅｒｃｅ社）　を溶解させたリン酸塩緩衝生理食塩水　５００μｌ　を加え、０℃で１０　分間反応させた。これらのウェルの細胞を０　℃に冷却したリン酸緩衝生理食塩水　１ｍｌ　で２回洗った後、この細胞に１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（和光純薬社）、２ｍＭ　ＰＭＳＦ　（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ、シグマ社）、１０μＭ　ｐｅｐｓｔａｔｉｎ　（和光純薬社）、１０μＭ　ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ（和光純薬社）、１０μＭ　ａｎｔｉｐａｉｎ　（和光純薬杜）、及び２ｍＭ　ＥＤＴＡ　（和光純薬社）を含む　２０　ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ緩衝液　１００μｌ　を加え、室温に３０分間放置して細胞を溶解させた。これらのサンプル１５μｌを常法により還元条件下でＳＤＳ化した後、ＳＤＳ−電気泳動用ゲル（４−２０％　ポリアクリルアミドグラジエント、第一化学社）を用いて泳動した。泳動後、ゲルを乾燥させ、ＢｉｏＭａｘ　ＭＳフィルム（Ｋｏｄａｋ社）　とＢｉｏＭａｘＭＳ　増感スクリーン　（Ｋｏｄａｋ社）を用いて−８０℃で２４時間感光させた。感光させたフィルムを常法により現像した。この結果、１２５Ｉ標識モノマー型ＯＣＩＦと本発明ｃＤＮＡによりコードされる蛋白質をクロスリンクさせることにより、図１０に示すように分子量約９０，０００−１１０，０００のバンドが検出された。
【００７４】
〔実施例１２〕
ノーザンブロットによる解析
付着細胞用２５ｃｍ２Ｔ　フラスコでコンフルエントになるまで培養したＳＴ２細胞を、トリプシン処理してＴ　フラスコから剥がし洗浄した後、１枚の２２５ｃｍ２Ｔ　フラスコに播種し、１０−８Ｍ　活性化ビタミンＤ３、１０−７Ｍ　デキサメサゾン、及び１０％牛胎児血清を添加したα−ＭＥＭ培地各々６０ｍｌを加えてＣＯ２インキュベーター中で４日間培養した。培養したＳＴ２細胞からＩＳＯＧＥＮ　（和光純薬社）　を用いて総　ＲＮＡを抽出した。また、活性化ビタミンＤ３とデキサメサゾン非存在下で培養したＳＴ２細胞からも上記の方法で総ＲＮＡを抽出した。各総ＲＮＡ　２０　μｇ　（４．５μｌ）にそれぞれ２．０μｌの５Ｘ　ゲル泳動緩衝液（０．２Ｍ　モルホリノプロパンスルホン酸、ｐＨ　７．０、５０ｍＭ　酢酸ナトリウム、５ｍＭ　ＥＤＴＡ）、３．５　μｌのホルムアルデヒド及び１０．０μｌのホルムアミドを加え５５℃で１５分保温後、電気泳動に供した。電気泳動用のゲルは１．０％アガロース、２．２Ｍ脱イオン化ホルムアルデヒド、４０ｍＭ　モルホリノプロパンスルホン酸　ｐＨ　７．０、１０ｍＭ　酢酸ナトリウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡの組成で調製した。
また、電気泳動は４０　ｍＭ　モルホリノプロパンスルホン酸、ｐＨ　７．０、１０ｍＭ　酢酸ナトリウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡの緩衝液中で行った。電気泳動後、ＲＮＡをナイロンメンブレンにトランスファーした。ｐＯＢＭ２９１を制限酵素ＥｃｏＲＩ　で切断して得られた、約１．０ｋｂ　の　ＤＮＡ断片を、メガプライム　ＤＮＡラベリングキット　（アマシャム社）及びα−３２Ｐ−ｄＣＴＰ（アマシャム社）　を用いて標識したものをプローブとしてハイブリダイゼーションを行った。その結果、図１１に示すように、ＳＴ２細胞では活性化ビタミンＤ３とデキサメサゾンの存在下で培養した場合に、本発明ｃＤＮＡにコードされる蛋白質　（ＯＢＭ）の遺伝子発現が強く誘導されていることが明らかとなった。
【００７５】
〔実施例１３〕
本発明ｃＤＮＡにコードされる蛋白質の破骨細胞形成支持能
実施例８−（３）に記載の方法でＣＯＳ細胞にｐＯＢＭ２９１　をトランスフェクトした。３日後トリプシナイズした細胞をリン酸塩緩衝生理食塩水で一回遠心洗浄したのち、１％パラフォルムアルデヒドを含むＰＢＳ　に細胞をサスペンドしながら室温で５分間固定し、ＰＢＳにて６回遠心洗浄した。１０−８Ｍ　活性化ビタミンＤ３、１０−７Ｍ　デキサメサゾン、１０％　牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地にて調製した１×１０６個／ｍｌ　のマウス脾臓細胞及び４×１０４個／ｍｌ　のＳＴ２　細胞を２４ウェルプレートにそれぞれ　７００μｌ、３５０μｌ添加したのちＴＣインサート　（Ｎｕｎｃ社）を各ウェルにセットした。上記培地にて段階希釈した固定化ＣＯＳ細胞（３５０μｌ）及びＯＣＩＦ（５０μｌ）をＴＣインサート中に添加して３７℃で６日間培養した。この結果、ＯＣＩＦによる破骨細胞形成阻害活性が、本発明ｃＤＮＡにコードされる蛋白質により抑制されることが明らかとなった。
【００７６】
〔実施例１４〕
分泌型ＯＢＭ　の発現
（１）　分泌型ＯＢＭ発現プラスミドの構築
ＯＢＭ　ＨＦ　（配列表配列番号７）とＯＢＭ　ＸＲ　（配列表配列番号８）をプライマー、ｐＯＢＭ２９１を鋳型としＰＣＲ反応を行った。この生成物を、アガロースゲル電気泳動で精製した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩで切断し、さらにアガロースゲル電気泳動で精製した。この精製断片（０．６ｋｂ）を、ｐＳｅｃ　ＴａｇＡ（インビトローゲン社）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＶ　断片　（５．２ｋｂ）と、ＯＢＭ　ｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ／ＰｍａＣＩ断片　（０．３２ｋｂ）とともにライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造社）　を用いてライゲーションを行い、その反応生成物を用いて大腸菌　ＤＨ５αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性株より、アルカリＳＤＳ　法によりプラスミドを精製し、制限酵素で切断することによりｐＳｅｃＴａｇＡ　に０．６Ｋｂ　と０．３２ｋｂの断片が挿入されたプラスミドを選び出した。
さらにこのプラスミドにつきダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳキット（パーキン‐エルマー社）を用いてシークエンスを行い、このプラスミドが分泌型ＯＢＭをコードする配列　（塩基配列：配列表配列番号２の３３８〜１３５５番、アミノ酸配列：配列表配列番号１の７２〜３１６番）を持っていることを確認した。このプラスミドを制限酵素ＮｈｅＩ、ＸｈｏＩで切断した後、分泌型ＯＢＭ　ｃＤＮＡに相当する断片（１．０ｋｂ）をアガロースゲル電気泳動で回収した。この断片をライゲーションキットを用いて発現ベクターｐＣＥＰ４（インビトローゲン社）のＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ断片（１０．４ｋｂ）に挿入し、その反応生成物を用いて大腸菌ＤＨ５　αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性株より、アルカリＳＤＳ法によりプラスミドを精製し、制限酵素で切断して解析することにより、目的の構造を持った分泌型ＯＢＭ発現プラスミド（ｐＣＥＰ　ｓＯＢＭ）を持つ大腸菌株を選び出した。ｐＣＥＰ　ｓＯＢＭを持つ大腸菌株を培養し、キアフィルタープラスミドミディキット（キアゲン社）を用いてｐＣＥＰ　ｓＯＢＭを精製した。
【００７７】
（２）分泌型ＯＢＭの発現
２９３−ＥＢＮＡ細胞を１０％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ　（ＩＭＤＭ−１０％ＦＣＳ）に懸濁し、コラーゲンコートした２４ウェルプレート（住友べ一クライト社）に２ｘ１０５　個／２ｍｌ／ウェルになるように播種し、一晩培養した。この細胞に１μｇのｐＣＥＰ　ｓＯＢＭ　又はｐＣＥＰ４をリポフェクトアミン（ギブコ社）４μｌを用いて形質導入し、０．５ｍｌ　の無血清ＩＭＤＭ又はＩＭＤＭ−１０　％ＦＣＳ　中でさらに２日間培養し、その培養上清を回収した。分泌型ＯＢＭの培養上清中での発現は、以下のようにして確認した。培養上清に最終濃度０．１Ｍになるよう炭酸水素ナトリウムを加えた後、培養液を９６ウェルプレートに添加し、４℃で一晩放置し、培養上清中のＯＢＭを９６ウェルプレートに固相化した。このプレートをＰＢＳ　で４倍希釈したブロックエース　（雪印乳業社）　溶液　（Ｂ−ＰＢＳ）で室温に２時間放置しブロッキングした後、Ｂ−ＰＢＳで希釈した３−１００ｎｇ／ｍｌのＯＣＩＦを各ウェルに１００μｌずつ加え３７℃で２時間放置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０　を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）でプレートを洗浄した後、Ｂ−ＰＢＳ　で希釈した　ＷＯ９６／２６２１７号記載のパーオキシダーゼ標識ウサギ抗ＯＣＩＦポリクローナル抗体を各ウェルに１００μｌずつ添加し、３７℃で２時間放置した。ＰＢＳ−Ｔで各ウェルを６回洗浄した後、ＴＭＢ溶液（ＴＭＢ　Ｓｏｌｕｂｌｅ　Ｒｅａｇｅｎｔ，　Ｈｉｇｈ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，　Ｓｃｙｔｅｋ社）を１００μｌずつ各ウェルに加え、室温で約１０分放置した後、停止液（Ｓｔｏｐｐｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ，　Ｓｃｙｔｅｋ社）　を１００μｌずつ各ウェルに加えた。各ウェルの　４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。結果を図１２に示す。ｐＣＥＰ　ｓＯＢＭを形質導入した細胞の培養上清を固相化したプレートでは、添加したＯＣＩＦの濃度に依存して４５０ｎｍの吸収が増加したが、ベクターｐＣＥＰ４を形質導入した細胞の培養上清を固定化した場合は吸収の増加はみられなかった。又、固定化に用いる培養上清の割合を５−９０％の範囲で種々に変化させ、一定濃度のＯＣＩＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加した際の実験の結果を図１３に示す。ｐＣＥＰ　ｓＯＢＭを形質導入した細胞の培養上清を固相化したプレートでは、培養上清の割合が高くなるほど４５０ｎｍの吸収が増加したが、ベクターｐＣＥＰ４を形質導入した細胞の培養上清を固定化したプレートでは、吸収の増加は見られなかった。以上の結果より、分泌型ＯＢＭが、ｐＣＥＰ　ｓＯＢＭを形質導入した細胞の培養上清中に生産されていることが確認された。
【００７８】
〔実施例１５〕
チオレドキシン‐ＯＢＭ　融合蛋白質　（Ｔｒｘ−ＯＢＭ）の発現
（１）チオレドキシン‐ＯＢＭ　融合蛋白質　（Ｔｒｘ−ＯＢＭ）発現ベクターの構築
１０μｌの１０Ｘ　ＥｘＴａｑバッファー（宝酒造社）、８　μｌ　の１０ｍＭｄＮＴＰ　（宝酒造社）、７７．５μｌ　の滅菌蒸留水、２μｌ　のｐＯＢＭ２９１　水溶液（１０ｎｇ／μｌ）、１μｌのプライマーＯＢＭ３（１００ｐｍｏｌ／μｌ、配列表配列番号９）、１μｌのプライマーＯＢＭＳａｌＲ２（１００ｐｍｏｌ／μｌ、配列表配列番号１０）、０．５μｌのＥｘＴａｑ　（５ｕ／μｌ）　（宝酒造社）を混合しマイクロ遠心管中でＰＣＲ反応を行った。９５℃５分、５０℃１秒、５５℃１分、７４℃１秒、７２℃５分の反応後、９６℃１分、５０℃１秒、５５℃１分、７４℃１秒、７２℃３分の反応を２５サイクル行った。１％アガロースゲル電気泳動により、反応液全量から約７５０ｂｐのＤＮＡ　断片をＱＩＡＥＸＩＩ　ｇｅｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。精製したＤＮＡ　断片全量を制限酵素ＳａＩＩ，　ＥｃｏＲＩ（宝酒造杜）で切断した後、１．５％アガロースゲル電気泳動を行い約１６０ｂｐ　のＤＮＡ断片　（断片１）を精製し２０μｌの滅菌蒸留水に溶解した。同様に、４μｇ　のｐＯＢＭ２９１を制限酵素ＢａｍＨＩ，　ＥｃｏＲＩ（宝酒造社）で切断し得られた約５８０ｂｐ　のＤＮＡ断片　（断片２）、及び２μｇのｐＴｒＸＦｕｓ　（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵素ＢａｍＨＩ，ＳａｌＩ（宝酒造社）で切断し得られた約３．６ｋｂのＤＮＡ断片（断片３）をそれぞれ精製し、それぞれを２０μｌの滅菌蒸留水に溶解した。ＤＮＡ断片の精製にはＱＩＡＥＸＩＩ　ｇｅｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔを用いた。
断片１、断片２、断片３をＤＮＡｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ｖｅｒ．２　（宝酒造社）　を用い、１６℃で２時間３０分保温することにより結合させた。ライゲーション反応液を用い大腸菌ＧＩ７２４　株（インビトローゲン社）をＴｈｉｏＦｕｓｉｏｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　（インビトロ一ゲン社）添付のＩｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｍａｎｕａｌに記載の方法で形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換株の中から、制限酵素切断により得られるＤＮＡ断片地図の解析並びにＤＮＡ　配列の決定により、ＯＢＭｃＤＮＡ　断片（塩基配列：配列表配列番号２の３５０〜１１１１、アミノ酸配列：配列表配列番号１の７６〜３１６）がチオレドキシン遺伝子に同じ読み枠で結合しているプラスミドを持つ菌株を選び出した。得られた菌株をＧＩ７２４／ｐＴｒｘＯＢＭ２５と名付けた。
【００７９】
（２）大腸菌でのＯＢＭの発現
ＧＩ７２４／ｐＴｒｘＯＢＭ２５株及びｐＴｒｘＦｕｓ　を持つＧＩ７２４株　（ＧＩ７２４／ｐＴｒｘＦｕｓ）それぞれを２ｍｌのＲＭＧ−Ａｍｐ　培地（０．６　％Ｎａ２ＨＰＯ４，　０．３　％ＫＨ２ＰＯ４，　０．０５　％ＮａＣｌ，　０．１　％　ＮＨ４Ｃｌ　１．２％カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社）、１％グリセロール、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１００　μｇ／ｍｌアンピシリン　（Ｓｉｇｍａ社）　ｐＨ７．４）で３０℃で６時間振とう培養した。菌液０．５ｍｌ　を５０ｍｌのＩｎｄｕｃｔｉｏｎ培地（０．６％　Ｎａ２ＨＰＯ４、０．３　％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ＮａＣｌ、０．１％　ＮＨ４Ｃｌ、０．２％カザミノ酸、０．５％グルコース、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、ｐＨ　７．４）に添加し、３０℃で振とう培養した。ＯＤ６００ｎｍでの値が約０．５になった時点で最終濃度が０．１ｍｇ／ｍｌになるようにＬ−トリプトファンを添加し、さらに３０℃での振とう培養を６時間継続した。菌液を３０００×ｇで遠心し菌体を集め、１２．５ｍｌのＰＢＳ　（１０ｍＭ　リン酸バッファー、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に懸濁した。懸濁液を超音波発生装置　（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ社）にかけ菌体を破砕し、７０００×ｇ　で３０分遠心して上清を集め可溶性蛋白質画分とした。この可溶性蛋白質画分液１０μｌずつを還元条件下でのＳＤＳ　ポリアクリルアミド（１０％）電気泳動に供した。この結果、ＧＩ７２４／ｐＴｒｘＯＢＭ２５の可溶性蛋白質画分液にはＧＩ７２４／ｐＴｒｘＦｕｓ　の可溶性蛋白質画分液には見られない分子量約４０ｋＤａのバンドが検出された（図１４）。よって、チオレドキシンとＯＢＭの融合蛋白質（Ｔｒｘ−ＯＢＭ）が大腸菌中で発現していることが確認された。
【００８０】
（３）Ｔｒｘ−ＯＢＭのＯＣＩＦとの結合能
発現させたＴｒｘ−ＯＢＭ　がＯＣＩＦと結合することを以下の実験により確認した。即ち、９６ウェルイムノプレート（Ｎｕｎｃ社）の各ウェルに１０ｍＭ炭酸水素ナトリウム水溶液で５０００倍に希釈した抗チオレドキシン抗体（インビトローゲン社）　を１００μｌずつ添加し４℃で一晩放置した。各ウェル中の液を捨てた後、ブロックエース（雪印乳業社）をＰＢＳ　で２倍希釈した溶液　（ＢＡ−ＰＢＳ）を各ウェルに２００μｌずつ添加し室温で１時間放置した。液を捨てた後、各ウェルにＢＡ−ＰＢＳで段階希釈した上記ＧＩ７２４／ｐＴｒｘＯＢＭ２５　由来及びＧＩ７２４／ｐＴｒｘＦｕｓ　由来可溶性蛋白質画分液を１００μｌずつ添加し室温で２時間放置した。ＰＢＳ−Ｔ　で各ウェルを３回洗浄した後、ＢＡ−ＰＢＳで希釈したＯＣＩＦ　（１００ｎｇ／ｍｌ）を各ウェルに１００μｌずつ添加し室温で２時間放置した。ＰＢＳ−Ｔで各ウェルを３回洗浄した後、ＢＡ−ＰＢＳで２０００倍希釈したＷＯ９６／２６２１７号記載のパーオキシダーゼ標識ウサギ抗ＯＣＩＦポリクローナル抗体を各ウェルに１００μｌずつ添加し、２時間室温で放置した。ＰＢＳ−Ｔで各ウェルを６回洗浄した後、ＴＭＢ溶液（ＴＭＢ　Ｓｏｌｕｂｌｅ　Ｒｅａｇｅｎｔ，　Ｈｉｇｈ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，　Ｓｃｙｔｅｋ社）を１００μｌずつ各ウェルに加え、室温で約１０分放置した後、停止液（Ｓｔｏｐｐｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ，　Ｓｃｙｔｅｋ社）を１００μｌずつ各ウェルに加えた。各ウェルの　４５０ｎｍ　における吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。結果を図１５に示す。ＧＩ７２４／ｐＴｒｘＦｕｓ由来可溶性蛋白質画分液を添加したものでは添加しなかったものと比べて吸光度に差は認められなかったが、ＧＩ７２４／ｐＴｒｘＯＢＭ２５　由来可溶性蛋白質画分液を添加したものでは、その添加濃度の増加に依存して吸光度が上昇した。又、添加する可溶性画分液の希釈割合を一定（１％）にし、ＢＡ−ＰＢＳで段階希釈したＯＣＩＦ（０−１００ｎｇ／ｍｌ）を添加した場合の実験結果を図１６に示す。ＧＩ７２４／ｐＴｒｘＦｕｓ　由来可溶性蛋白質画分液を用いたものではＯＣＩＦ濃度に係わりなく吸光度は低いままであったが、ＧＩ７２４／ｐＴｒｘＯＢＭ２５由来可溶性蛋白質画分液を用いたものでは添加したＯＣＩＦ濃度に依存して吸光度が上昇した。この結果より、ＧＩ７２４／ｐＴｒｘＯＢＭ２５　で生産されるＴｒｘ−ＯＢＭは、ＯＣＩＦと結合する能力があることが確認された。
【００８１】
（４）Ｔｒｘ−ＯＢＭを生産する大腸菌の大量培養
ＧＩ７２４／ｐＴｒｘＯＢＭ２５　をＲＭＧ−Ａｍｐ　寒天培地　（０．６％Ｎａ２ＨＰＯ４、０．３％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ＮａＣｌ、０．１％ＮＨ４Ｃｌ、２％カザミノ酸、１％グリセロール、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１．５％寒天、ｐＨ７．４）　に白金耳で塗まつし、３０℃で一晩培養した。菌を１０ｍｌのＩｎｄｕｃｔｉｏｎ培地に懸濁し、５ｍｌずつを５００ｍｌのＩｎｄｕｃｔｉｏｎ培地のはいった２Ｌ用三角フラスコ計２本に添加し、３０℃で振とう培養した。ＯＤ６００ｎｍでの値が約０．５　になった時点で最終濃度が０．１ｍｇ／ｍｌになるようにＬ−トリプトファンを添加し、さらに３０℃で振とう培養を６時間継続した。菌液を３０００×ｇで２０分間遠心分離して菌体を集め、菌体を１６０ｍｌ　のＰＢＳに懸濁した。懸濁液を超音波発生装置　（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ　社）にかけ菌体を破砕し、７０００×ｇで３０分間遠心して上清を集め可溶性蛋白質画分とした。
【００８２】
（５）ＯＣＩＦ固定化アフィニティーカラムの調製
ＴＳＫｇｅｌ　ＡＦ−トレシルトヨパール６５０（東ソー社）　２ｇとＷＯ９６／２６２１７号に記載の方法で調製した遺伝子組み換え型ＯＣＩＦ　３５．０　ｍｇを含む１．０　Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）　４０ｍｌとを混合し４℃で一晩ゆっくり振とうしカップリング反応を行った。過剰な活性基を不活性化する為、遠心分離により上清を除去した後、４０ｍｌの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液　（ｐＨ７．５）を沈殿した担体に加え、室温で１時間おだやかに振とうした。０．０１％　Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ　８０　と０．２Ｍ　ＮａＣｌを含む０．１Ｍ　グリシン‐塩酸緩衝液　（ｐＨ３．３）　及び０．０１％　Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ　８０　と０．２Ｍ　ＮａＣｌを含む０．１　Ｍ　クエン酸ナトリウム緩衝液　（ｐＨ２．０）を通液しカラムを洗浄した後、０．０１％　Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ　８０　を含む１０ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ　７．４）で２度洗浄し、平衡化した。
【００８３】
（６）　ＯＣＩＦ固定化アフィニティーカラムによるＴｒｘ−ＯＢＭの精製
Ｔｒｘ−ＯＢＭ　の精製は、特に断らない限り４℃で行った。上記のＯＣＩＦ固定化アフィニティー担体（１０ｍｌ）と上記実施例１５−（４）記載の可溶性蛋白質画分液　（１２０ｍｌ）とを混合後、５０ｍｌ遠心管（４本）中で、ローターを用いて４℃で一晩おだやかに振とうした。この混合液中の担体をエコノカラム（バイオラッド社、内径１．５ｃｍ　長さ１５ｃｍ）に充填した。０．０１％Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ　８０　を含むＰＢＳ　３００ｍｌ、０．０１％　Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ　８０　と２Ｍ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍｌ、及び０．０１％　Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ　８０　と０．２Ｍ　ＮａＣｌを含む０．１　Ｍ　グリシン‐塩酸緩衝液（ｐＨ３．３）　１００ｍｌ　を順次通液してカラムを洗浄した。次に、０．０１％Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ　８０　と０．２Ｍ　ＮａＣｌを含む０．１　Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液　（ｐＨ２．０）　を通液し、カラムに吸着した蛋白質を溶出した。溶出液は５ｍｌずつ分取した。分取した画分には、１０％容量の２Ｍトリス溶液（ｐＨ８．０）を加え、直ちに中和した。溶出液各画分中のＴｒｘ−ＯＢＭの有無を上記実施例１５−（３）記載の方法（ＯＣＩＦとの結合能）により調べた。
Ｔｒｘ−ＯＢＭを含む画分を集めさらに精製した。
【００８４】
（７）ゲル濾過によるＴｒｘ−ＯＢＭの精製
上記実施例１５−（６）のＴｒｘ−ＯＢＭフラクション約２５ｍｌを、Ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ１０　及びＣｅｎｔｒｉｃｏｎ　１０　（ａｍｉｃｏｎ杜）を用いて、約０．５ｍｌに遠心濃縮した。このサンプルを、予め０．０１　％Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ　８０　を含むＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ　１２　ＨＲ　１Ｏ／３０　カラム　（１．０ｘ　３０ｃｍ、ファルマシア社）　にかけた。分離には、０．０１％　　Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ　　８０　を含む　ＰＢＳを移動相として用い、流速　０．２５ｍｌ／ｍｉｎで展開した。カラムからの溶出液は０．２５　ｍｌずつ分取した。分取した画分のＴｒｘ−ＯＢＭは、実施例１５−（３）記載の方法及びＰｈａｓｔ　Ｓｙｓｔｅｍ　（ファルマシア社）を用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（１０−１５％ポリアクリルアミドゲル、ファルマシア社）と銀染色で検出した。純化されたＴｒｘ−ＯＢＭを含むフラクション（Ｆｒ．２０−２３）を集め、Ｔｒｘ−ＯＢＭの蛋白質濃度を測定した。蛋白質濃度の測定は、ウシ血清アルブミンを標準品として用いＤＣ−ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ　（バイオラッド社）で行った。
【００８５】
〔実施例１６〕
ＯＢＭの破骨細胞形成誘導活性
ｐＯＢＭ２９１及びｐｃＤＬ−ＳＲα２９６　をリポフェクトアミン（ギブコ社）を用いてＣＯＳ−７細胞にそれぞれトランスフェクトした。それぞれの細胞を１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで１日培養後トリプシン処理し、カバーグラス（１５ｍｍ　丸形、マツナミ社）を敷いた２４ウェルプレートに１ウェルあたり５×１０４個の細胞を播種し、さらに２日間培養した。培養プレートをＰＢＳで１回洗浄したのち、１％パラフォルムアルデヒドを含むＰＢＳを加えて室温で８分間インキュベートし細胞を固定した。細胞を固定したプレートをＰＢＳにて６回洗浄したのち、１０−８Ｍ　活性型ビタミンＤ３、１０−７Ｍデキサメサゾン、１０％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭにて１Ｘ１０６個／ｍｌに懸濁したマウス脾臓細胞を１ウェルあたり７００　μｌ添加した。各ウェル上にＭｉｌｌｉｃｅｌｌ　ＰＣＦ（ミリポア社）をセットし、上記培地にて４ｘ１０４個／ｍｌに懸濁したＳＴ２細胞をＭｉｌｌｉｃｅｌｌ　ＰＣＦ中に　７００μｌ　添加し３７℃、６日間培養した。培養終了後、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ　ＰＣＦを取り除き、プレートをＰＢＳ　で１回洗浄後、アセトン‐エタノール溶液（５０：５０）で１分間細胞を固定した後、ＬＥＵＫＯＣＹＴＥ　ＡＣＩＤ　ＰＨＯＳＰＨＡＴＡＳＥキット　（シグマ社）を用いて破骨細胞特異的マーカーである酒石酸耐性酸性フォスファターゼ活性（ＴＲＡＰ活性）を示す細胞のみを染色した。顕微鏡観察の結果、ｐｃＤＬ−ＳＲα２９６をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を固定したウェル中にはＴＲＡＰ活性を示す細胞は全く検出されなかったのに対し、ｐＯＢＭ２９１　をトランスフェクトした細胞を固定したウェル中には４５±１８個（平均±標準偏差、ｎ＝３）のＴＲＡＰ陽性細胞が観察された。又、これらのＴＲＡＰ陽性細胞に、カルシトニンが結合することも確認された。これより、ＯＢＭには破骨細胞形成を誘導する活性があることが明らかとなった。
【００８６】
〔実施例１７〕
Ｔｒｘ−ＯＢＭ及び分泌型ＯＢＭによる破骨細胞形成誘導活性
マウス脾臓細胞を１０−８Ｍ活性型ビタミンＤ３、１０−７Ｍ　デキサメサゾン、１０％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭに２×１０６個／ｍｌになるように懸濁し、この懸濁液を２４ウェルプレートに１ウェルあたり３５０　μｌ添加した。精製したＴｒｘ−ＯＢＭを上記培地で希釈した溶液（４０ｎｇ／ｍｌ）、ｐＣＥＰ　ｓＯＢＭ　又はｐＣＥＰ４　を形質導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞をＩＭＤＭ−１０　％ＦＣＳ　で培養した培養上清を上記培地にて１０倍希釈した溶液、又は上記培地のみをそれぞれ３５０μｌ　上記のウェルに添加した後、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ　ＰＣＦ（ミリポア社）を各ウェルにセットし、上記培地にて懸濁した４　×１０４個／ｍｌ　のＳＴ２細胞をＭｉｌｌｉｃｅｌｌ　ＰＣＦ　に６００μｌ　添加した。６日間培養した後、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ　ＰＣＦを取り除き、プレートをＰＢＳで一回洗浄後、アセトン‐エタノール溶液（５０：５０）で１分間細胞を固定したのち、ＬＥＵＫＯＣＹＴＥ　ＡＣＩＤ　ＰＨＯＳＰＨＡＴＡＳＥキット　（シグマ社）を用いて酒石酸耐性酸性フォスファターゼ活性　（ＴＲＡＰ活性）を示す細胞のみを染色した。顕微鏡観察の結果、Ｔｒｘ−ＯＢＭを添加しなかったウェル中にはＴＲＡＰ活性を示す細胞は全く検出されなかったのに対し、Ｔｒｘ−ＯＢＭを添加したウェルには１０６±　２１個（平均±標準偏差、ｎ＝３）のＴＲＡＰ陽性細胞が観察された。同様にｐＣＥＰ４で形質導入された２９３−ＥＢＮＡの培養上清を添加したウェル中にはＴＲＡＰ活性を示す細胞は全く検出されなかったのに対し、ｐＣＥＰ　ｓＯＢＭ　で形質導入された２９３−ＥＢＮＡの培養上清を添加したウェルには１２０±３１個（平均±標準偏差、ｎ＝３）のＴＲＡＰ陽性細胞が観察された。又、これらのＴＲＡＰ陽性細胞に、カルシトニンが結合することも確認された。これより、Ｔｒｘ−ＯＢＭ及び分泌型ＯＢＭには、破骨細胞形成を誘導する活性があることが明らかとなった。
【００８７】
〔実施例１８〕
本発明のｃＤＮＡにより発現される蛋白質ＯＢＭと本発明の天然型のＯＣＩＦ結合蛋白質との同一性
（１）ウサギ抗ＯＢＭポリクローナル抗体の作製
雄性日本白色ウサギ　（体重２．５−３．０　ｋｇ、北山ラベス社より入手）３羽に、実施例１４−（６）及び（７）記載の方法により得られた精製ＯＢＭ（チオレドキシン−ＯＢＭ融合蛋白質）　２００　μｇ／ｍｌをフロイント完全アジュバント　（ＤＩＦＣＯ社）と等量混合してエマルジョンとしたものを、１回１ｍｌずつ皮下免疫した。免疫は１週間間隔で合計６回行い、最終免疫後１０日目に全採血を行った。分離した血清から抗体を以下の様に精製した。即ち、ＰＢＳで２倍希釈した抗血清に最終濃度が４０％　（ｗ／ｖ　％）となるように硫酸アンモニウムを添加して４℃で１時間放置後、８０００　ｘ　ｇで２０分間遠心分離を行い、沈殿を得た。沈殿を少量のＰＢＳに溶解し、ＰＢＳ　に対して４℃で透析した後、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　カラム　（ファルマシア社製）　に負荷した。ＰＢＳ　で洗浄後、０．１　Ｍ　グリシン‐塩酸緩衝液（ｐＨ　３．０）　で吸着した免疫グロブリンＧを溶出し、直ちに１．５Ｍトリス‐塩酸緩衝液　（ｐＨ　８．７）　で中性ｐＨとした。溶出蛋白質画分をＰＢＳ　に対して透析後、２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、その濃度を決定した（Ｅ１％１３．５）。西洋ワサビパーオキシダーゼ標識した抗　ＯＢＭ抗体は、マレイミド活性化パーオキシダーゼキット（ピアス社）を用いて作製した。即ち、１ｍｇの精製抗体に８０μｇのＮ−スクシンイミド−Ｓ−アセチルチオ酢酸を添加し、室温で３０分間反応させた。これに５ｍｇのヒドロキシルアミンを添加して脱アセチル化した後、修飾された抗体をポリアクリルアミド脱塩カラムにて分画した。蛋白質画分を１ｍｇのマレイミド活性化パーオキシダーゼと混合し、室温で１時間反応させ酵素標識抗体を得た。
【００８８】
（２）ウサギ抗ＯＢＭポリクローナル抗体による本発明のｃＤＮＡにより発現される蛋白質（ＯＢＭ）あるいは本発明の天然型の蛋白質とＯＣＩＦとの特異的結合能の阻害
実施例１５‐（６）及び（７）記載の方法で得られた精製ＯＢＭ（チオレドキシン−ＯＢＭ融合蛋白質）及び実施例２−（４）の天然型精製ＯＣＩＦ結合蛋白質をそれぞれ０．１　Ｍ　炭酸水素ナトリウムに２　μｇ／ｍｌとなるように溶解し、それぞれの溶液１００μｌずつを９６ウェルイムノプレート（Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに加え、４℃で一夜放置した。各ウェルに５０％濃度のブロックエースを２００　μｌ　ずつ加え、室温で１時間放置した。各ウェルを０．１　％ポリソルベート２０を含むＰＢＳ（Ｐ２０−ＰＢＳ）で３回洗浄した後、Ｐ２０−ＰＢＳで希釈した２５％濃度のブロックエースにウサギ抗ＯＢＭ抗体を２００　μｇ／ｍｌとなるように溶解し、その抗体溶液あるいは抗体を含まない２５％濃度のブロックエース溶液を１００μｌずつ各ウェルに添加し、３７℃、１時間インキュベートした。各ウェルをＰ２０−ＰＢＳで３回洗浄した後、実施例８−（３）記載の１２５Ｉ標識したＯＣＩＦ２０ｎｇ／ｍｌを加えた結合試験溶液（０．２％牛血清アルブミン、２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、０．１ｍｇ／ｍｌヘパリンを加えたＰ２０−ＰＢＳ）を１００μｌずつ各ウェルに添加した。又、別のウェルには、１２５Ｉ標識したＯＣＩＦ　２０ｎｇ／ｍｌに加えて８μｇ／ｍｌの非標識ＯＣＩＦを含む結合試験溶液を１００　μｌ　加えて実験を行った。そのイムノプレートを３７℃、１時間インキュベートした後、各ウェルをＰ２０−ＰＢＳで６回洗浄した。各ウェル中の１２５Ｉの量をガンマーカウンターで測定した。結果を図１７に示す。図に示したように、本発明ｃＤＮＡにより発現され、精製して得られるＯＢＭ及び本発明の天然型のＯＣＩＦに特異的に結合する蛋白質は、ウサギ抗ＯＢＭポリクローナル抗体で処理することによって、１２５Ｉ標識したＯＣＩＦとの結合は全く起こらなかった。一方、抗体処理しなかった両蛋白質には、１２５Ｉ標識ＯＣＩＦが結合することが確認された。又、それらの結合は４００倍濃度の非標識ＯＣＩＦ（８μｇ／ｍｌ）を添加することにより顕著に阻害されることから、両蛋白質のＯＣＩＦへの結合は特異的結合であることが明らかになった。以上の結果から、ウサギ抗ＯＢＭポリクローナル抗体は、本発明ｃＤＮＡにより発現される蛋白質であるＯＢＭ及び本発明の天然型のＯＣＩＦ結合蛋白質を共に認識し、両蛋白質とＯＣＩＦとの特異的結合を阻害することが明らかになった。
【００８９】
〔実施例１９〕
ヒトＯＢＭｃＤＮＡのクローニング
（１）マウスＯＢＭプライマーの調製
ヒトＯＢＭｃＤＮＡのスクリーニングには、上記の実施例の方法に従い調製したマウスＯＢＭプライマー、ＯＢＭ＃３　及びＯＢＭ＃８　を用いた。それぞれの配列を配列表配列番号９及び６に示す。
【００９０】
（２）ＰＣＲによるヒトＯＢＭｃＤＮＡ断片の取得
ヒトリンパ節由来ｃＤＮＡライブラリーとしてＨｕｍａｎ　Ｌｙｍｐｈ　Ｎｏｄｅ　Ｍａｒａｔｈｏｎ　ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（クロンテック社）を鋳型として、上記（１）で調製したマウスＯＢＭｃＤＮＡ　プライマーを用いて、ＰＣＲを行いヒトＯＢＭｃＤＮＡ断片を取得した。
以下に用いたＰＣＲの条件を示す。
１０×ＥＸ　Ｔａｑ　バッファー（宝酒造社）　　　２　　μｌ
２．５　ｍＭ　ｄＮＴＰ　　　　　　　　　　　　　１．６　μｌ
ｃＤＮＡ溶液　　　　　　　　　　　　　　　１　　μｌ
ＥＸ　Ｔａｑ　（宝酒造社）　　　　　　　　　　０．２　μｌ
蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　１４．８　μｌ
４０μＭプライマーＯＢＭ＃３　　　　　　　　　０．２　μｌ
４０μＭプライマーＯＢＭ＃８　　　　　　　　　０．２　μｌ
上記溶液をマイクロフュージチューブ中で混合後、以下の条件でＰＣＲを行った。９５℃で２分間前処理し、９５℃３０秒、５７℃３０秒及び７２℃２分３０秒間の３段階の反応を４０回繰り返した後、７２℃で５分間保温した。反応液の一部をアガロース電気泳動に供したところ、上記マウスＯＢＭｃＤＮＡプライマーで増幅される約６９０ｂｐのＤＮＡ断片が検出された。
【００９１】
（３）ＰＣＲにより増幅されたヒトＯＢＭｃＤＮＡ断片の精製と塩基配列の決定
実施例１９−（２）で得られたヒトＯＢＭｃＤＮＡ断片をアガロース電気泳動により分離し、さらにＱＩＡＥＸゲルエクストラクションキット（キアゲン社）を用いて精製した。この精製されたヒトＯＢＭｃＤＮＡ断片を鋳型として、再度上記マウスＯＢＭｃＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲを行い、このヒトＯＢＭｃＤＮＡ　断片を大量に調製し、同様にＱＩＡＥＸゲルエクストラクションキットにより精製した。精製されたヒトＯＢＭｃＤＮＡ断片の塩基配列を、ＯＢＭ＃３及び　ＯＢＭ＃８　（配列表９及び６）をプライマーとして、タックダイデオキシターミネーターサイクルシークエンシングＦＳキット（Ｔａｑ　Ｄｙｅ　Ｄｅｏｘｙ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　ｋｉｔ；パーキンエルマー社）を用いて決定した。このヒトＯＢＭｃＤＮＡ　断片の塩基配列は、マウスＯＢＭｃＤＮＡの相当する領域と比較した結果、８０．７％の相同性を示した。
【００９２】
（４）　約６９０　ｂｐのヒトＯＢＭｃＤＮＡ　断片をプローブとしたハイブリダイゼーション法による全長ヒトＯＢＭｃＤＮＡ　のスクリーニング
実施例１９−（３）で精製された約６９０　ｂｐのヒトＯＢＭｃＤＮＡ断片をメガプライム　ＤＮＡラベリングキット（アマシャム社）を用いて［α３２Ｐ］　ｄＣＴＰ　で標識し、全長のヒトＯＢＭｃＤＮＡをスクリーニングした。スクリーニングの対象としては、Ｈｕｍａｎ　Ｌｙｍｐｈ　Ｎｏｄｅ　５’−ＳＴＲＥＴＣＨ　ＰＬＵＳ　ｃＤＮＡ　ライブラリー　（クロンテック社、ＵＳＡ）を用いた。同社のプロトコールに従い、組み換えファージを３７℃で１５分間大腸菌Ｃ６００　Ｈｆｌに感染させた後、その大腸菌を４５℃に加温したＬＢ寒天培地　（１％トリプトン、０．５％イーストエキス、１％　ＮａＣｌ、０．７　％寒天）に添加し、１．５％寒天を含むＬＢ寒天培地プレート上に流し込んだ。３７℃で一夜培養後、プラークの生じたプレート上にハイボンドＮ（アマシャム社）を約３分間密着させた。このフィルターを常法に従いアルカリ変性処理した後、中和し、２×ＳＳＣ溶液に浸した後、ＵＶクロスリンク（ストラタジーン社）　によりＤＮＡをフィルターに固定した。得られたフィルターをＲａｐｉｄ−ｈｙｂ　バッファー　（アマシャム社）に浸漬し、６５℃で１５分間前処理した後、熱変性した上記ヒトＯＢＭｃＤＮＡ断片（約６９０ｂｐ、５×１０５　ｃｐｍ／ｍｌ）を添加した上記バッファーに移し替え、６５℃で一夜ハイブリダイゼーションさせた。反応後、フィルターをそれぞれ０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ及び０．１×ＳＳＣで順次１回ずつ６５℃で１５分間洗浄した。得られたいくつかの陽性クローンをさらに２回スクリーニングを繰り返すことにより純化した。それらの中から、約２．２ｋｂのインサートを持つクローンを選択し、以下の実験に用いた。この純化したファージをλｈＯＢＭと名付けた。純化したλｈＯＢＭからＱＩＡＧＥＮ　Ｌａｍｂｄａキット（キアゲン社）のプロトコールに従い、約１０μｇのＤＮＡを得た。このＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩで消化した後、アガロース電気泳動により約２．２ｋｂのｈＯＢＭインサートｃＤＮＡを分離した。ＱＩＡＥＸゲルエクストラクションキット（キアゲン社）を用いて精製したこのＤＮＡ断片を、あらかじめ制限酵素ＳａｌＩで切断し、脱リン酸化しておいたプラスミドｐＵＣ１９（ＭＢＩ社）にＤＮＡ　ライゲーションキット　ｖｅｒ．２（宝酒造社）を用いて挿入した。得られたＤＮＡ断片を含むｐＵＣ１９　で大腸菌ＤＨ　５α　（ギブコＢＲＬ杜）を形質転換させた。得られた形質転換株はｐＵＣ１９ｈＯＢＭ　と名付け、これを増殖させ、約２．２ｋｂのヒトＯＢＭｃＤＮＡ　が挿入されたプラスミドを常法により精製した。
【００９３】
（５）ヒトＯＢＭの全アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列の決定
実施例１９−（４）で得られたヒトＯＢＭｃＤＮＡの塩基配列を、タックダイデオキシターミネーターサイクルシークエンシングＦＳキット（パーキンエルマー社）を用いて決定した。即ち、ｐＵＣ１９ｈＯＢＭ　を鋳型とし、挿入断片の塩基配列を決定した。プライマーとして、ｐＵＣ１９　の挿入断片　ＤＮＡの塩基配列を決定するためのプライマー、ｍｌ３ＰｒｉｍｅｒＭ３及びｍｌ３　ＰｒｉｍｅｒＲＶ　（ともに宝酒造社）、及びヒトＯＢＭｃＤＮＡ　断片（約６９０ｂｐ）の塩基配列に基づいて設計した合成プライマーヒト　ＯＢＭ＃８を用いた。用いたプライマー、ｍｌ３ＰｒｉｍｅｒＭ３及びｍｌ３ＰｒｉｍｅｒＲＶ　の配列を、それぞれ配列表配列番号４及び５に示す。これにより決定された、ヒトＯＢＭｃＤＮＡ　の塩基配列から推定されるヒトＯＢＭのアミノ酸配列を配列表配列番号１１、又、ヒトＯＢＭｃＤＮＡの塩基配列を配列表配列番号１２にそれぞれ示す。
得られたヒトＯＢＭｃＤＮＡ　を含むプラスミド、ｐＵＣ１９ｈＯＢＭで形質転換した大腸菌は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人産業技術総合研究所微生物寄託センター）に受託番号　ＦＥＲＭ　ＢＰ−６０５８として平成９年８月１３日に寄託されている。
【００９４】
〔実施例２０〕
ＯＣＩＦの１２５Ｉ標識ならびにＥＬＩＳＡ　による１２５Ｉ標識ＯＣＩＦの定量
ＯＣＩＦはヨードジェン（Ｉｏｄｏｇｅｎ）法により１２５Ｉ標識した。２．５ｍｇ／ｍｌ　Ｉｏｄｏｇｅｎ−クロロホルム溶液２０μｌを１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移し、４０℃でクロロホルムを蒸発させて、ヨードジェンコートしたチューブを調製した。このチューブを０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（Ｎａ−Ｐｉ，ｐＨ７．０）４００μｌで３回洗浄した後、５μｌの０．５Ｍ　Ｎａ−Ｐｉ，　ｐＨ　７．０を加えた。このチューブにＮａ−１２５Ｉ溶液（アマシャム社、ＮＥＺ−０３３Ｈ）　１．３　μｌ　（１８．５ＭＢｑ）を加えた後、直ちに１ｍｇ／ｍｌ　ＯＣＩＦ溶液（モノマー型あるいはダイマー型）１０μｌを加え、ボルテックスミキサーで攪拌した後、室温で３０秒間放置した。この溶液を、予め１０　ｍｇ／ｍｌ沃化カリウムを含む０．５ＭＮａ−Ｐｉ（ｐＨ７．０）溶液８０μｌと５％牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＢＳＡ−ＰＢＳ）５μｌを添加しておいたチューブに移し撹伴した。この溶液をＢＳＡ−ＰＢＳ　で平衡化したスピンカラム（１ｍｌ，　Ｇ−２５　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　ｆｉｎｅ，　ファルマシア社）に負荷し、２，０００ｒｐｍで５分間遠心した。カラムから溶出された画分にＢＳＡ−ＰＢＳを４００μｌ加え攪拌した後、２μｌを取り、その放射能をガンマーカウンターで測定した。このようにして調製した１２５Ｉ標識ＯＣＩＦ溶液の放射化学純度は１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）により沈殿する画分の放射能を測定することにより求めた。
１２５Ｉ標識ＯＣＩＦのＯＣＩＦ生物活性は、ＷＯ９６／２６２１７号記載の方法に従い測定した。又、１２５Ｉ標識ＯＣＩＦ濃度は、以下のようにＥＬＩＳＡ　により測定した。即ち、ＷＯ９６／２６２１７号公報記載のウサギ抗ＯＣＩＦポリクローナル抗体を２μｇ／ｍｌになるように溶解した５０ｍＭＮａＨＣＯ３，　ｐＨ　９．６を１００　μｌずつ９６ウェルイムノプレート（Ｎｕｎｃ社、ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭ）の各ウェルに加えて、４℃一夜放置した。この溶液を捨てた後、ブロックエース（雪印乳業社）とリン酸塩緩衝生理食塩水との混合水溶液（混合比２５：７５）（Ｂ−ＰＢＳ）を２００　μｌずつ各ウェルに加え、室温で２時間放置した。この液を捨てた後、各ウェルを０．０１％　Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ　８０　を含むリン酸塩緩衝生理食塩水（Ｐ−ＰＢＳ）で３回洗浄し、次いで１２５Ｉ標識ＯＣＩＦサンプルあるいはＯＣＩＦ標準品を添加したＢ−ＰＢＳを　１００μｌずつ各ウェルに加え、室温で２時間放置した。この液を捨てた後、Ｐ−ＰＢＳ２００　μｌで各ウェルを６回洗浄した。パーオキシダーゼ標識したウサギ抗ＯＣＩＦポリクローナル抗体をＢ−ＰＢＳ　で希釈した溶液を１００μｌずつ各ウェルに加え、室温で２時間放置した。この溶液を捨てた後、Ｐ−ＰＢＳ２００μｌで各ウェルを６回洗浄した。ＴＭＢ　溶液（ＴＭＢ　Ｓｏｌｕｂｌｅ　Ｒｅａｇｅｎｔ，　Ｈｉｇｈ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，　Ｓｃｙｔｅｋ社）を１００μｌずつ各ウェルに加え、室温で２〜３分間放置した後、停止液（Ｓｔｏｐｐｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ，　Ｓｃｙｔｅｋ社）を１００μｌずつ各ウェルに加えた。各ウェルの４５０　ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。ＯＣＩＦ標準品を用いて作成した検量線より１２５Ｉ標識ＯＣＩＦの濃度を求めた。
【００９５】
〔実施例２１〕
本発明ｃＤＮＡにコードされる蛋白質の発現
（１）動物細胞用ｈＯＢＭ発現ベクターの構築
ｐＵＣｈＯＢＭ　を制限酵素ＳａｌＩで切断し、約２．２　ｋｂのＤＮＡ断片を１％アガロース電気泳動により精製し、ＤＮＡブランティングキット（宝酒造社）により末端を平滑化した（平滑化　ｈＯＢＭｃＤＮＡ　断片）。発現プラスミドｐｃＤＬ−ＳＲα２９６　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｖｏｌ　８，　ｐｐ４６６−４７２（１９８８））を制限酵素ＥｃｏＲＩ　で切断し、ブランティングキットにより末端を平滑化したものと、平滑化したｈＯＢＭｃＤＮＡ　断片とをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２により結合させた。ライゲーション反応液を用い大腸菌ＤＨαを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換株から、制限酵素切断により得られるＤＮＡ断片地図の解析並びにＤＮＡ配列の決定により、ＳＲαプロモーターによる転写方向に対してｈＯＢＭｃＤＮＡ　の転写方向が順向きに挿入されているプラスミド、ｐｈＯＢＭを持つ菌株を選びだし、ＤＨ５α／ｐｈＯＢＭと名付けた。
【００９６】
（２）ＣＯＳ−７細胞でのヒトＯＢＭの発現
大腸菌、ＤＨ５　α／ｐｈＯＢＭを培養し、キアフィルタープラスミドミディキット（キアゲン社）を用い、プラスミドｐｈＯＢＭを精製した。ｐｈＯＢＭを６ウェルプレートの各ウェル中でＣＯＳ−７細胞にリポフェクトアミンを用いてトランスフェクションし、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ中で２日間培養した。５％透析牛胎児血清を添加した、システイン・メチオニン不含ＤＭＥＭ（大日本製薬社）に培地交換し（８８μｌ／ｗｅｌｌ）１５分間培養した後、ＥｘｐｒｅｓｓＰｒｏｔｅｉｎ　Ｌａｂｅｌｎｇ　Ｍｉｘ　（ＮＥＮ社、１０　ｍＣｉ／ｍｌ）を１４μｌ添加した。４時間培養後、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭを２００　μｌ　加え１時間培養した。細胞をＰＢＳで２回洗浄後、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％牛ヘモグロビン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）、０．２　ＴＩＵ／ｍｌアプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）及び１ｍＭ　ＰＭＳＦ　を含むＴＳＡ　バッファー（０．１４Ｍ　ＮａＣｌ、０．０２５％　ＮａＮ３を含む１０ｍＭトリス‐塩酸、ｐＨ　８．０）を０．５ｍｌ加え、氷上で１時間静置した。ピペッティングにより細胞を破砕した後、４℃、３，０００×ｇ、１０分間遠心し上清を得た。この上清１００μｌ　に２００　μｌの希釈バッファー（０．１％　ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１％牛ヘモグロビン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、０．２ＴＩＵ／ｍｌアプロチニン及び１ｍＭ　ＰＭＳＦ　を含むＴＳＡ　バッファー）を加え、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　（５０μｌ）とともに４℃で１時間振盪させた後、４℃、１，５００×ｇで１分間遠心分離し上清を回収することにより：　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　に非特異的に吸着する蛋白質を除去した。この上清にＯＣＩＦ　（１μｇ）を加え、４℃で１時間振盪させながらヒトＯＢＭとＯＣＩＦを結合させた後、ウサギ抗ＯＣＩＦポリクローナル抗体（５０μｇ）を加えて４℃で１時間振盪した。この溶液にＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　（１０μｌ）を加え、更に４℃で１時間振盪した。４℃、１，５００×ｇで１分間遠心分離し沈殿画分を回収した。４℃、１，５００×ｇ　で１分間遠心分離して得られた沈殿を希釈バッファーで２回、牛ヘモグロビンを含まない希釈バッファーで２回、ＴＳＡバッファーで１回、５０ｍＭトリス‐塩酸（ｐＨ　６．５）で１回、それぞれ洗浄後、沈殿に１０％　βメルカプトエタノールを含むＳＤＳ　バッファー（０．１２５Ｍ　トリス‐塩酸、４％ドデシル硫酸ナトリウム、２０％グリセロール、０．００２％ブロモフェノールブルー、ｐＨ６．８）　を加え、１００℃で５分間加熱後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ　（１２．５％ポリアクリルアミドゲル、第一化学社）　にかけた。常法によりゲルを固定、乾燥させ、Ａｍｐｌｉｆｙ（アマシャム社）により、アイソトープのシグナルを増強した後、Ｂｉｏ　Ｍａｘ　ＭＲフィルム（コダック社）を用いて‐８０℃で感光させた。結果を図１８に示す。この結果、本発明のｃＤＮＡにコードされる蛋白質の分子量は、約４０，０００であることが明らかとなった。
【００９７】
〔実施例２２〕
本発明ｃＤＮＡにコードされる蛋白質とＯＣＩＦとの結合
実施例２１−（２）と同様に精製されたｐｈＯＢＭ　を２４ウェルプレートの各ウェル中でＣＯＳ−７細胞にリポフェクトアミンを用いてトランスフェクトし、その細胞を２〜３日間培養した後、無血清ＤＭＥＭで洗浄し、これに１２５Ｉ標識したＯＣＩＦ　２０　ｎｇ／ｍｌを加えた結合試験培地　（０．２％牛血清アルブミン、２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ緩衝液、０．１ｍｇ／ｍｌヘパリン、０．２％　ＮａＮ３　を加えた無血清ＤＭＥＭ）２００μｌを加えた。また別のウェルには、１２５Ｉ標識したＯＣＩＦ　２０　ｎｇ／ｍｌに加えて更に８μｇ／ｍｌの非標識ＯＣＩＦを添加した結合試験培地を２００　μｌ加えて実験を行った。ＣＯ２　インキュベーター中（５％　ＣＯ２）、３７℃で１時間培養した後、細胞を０．１ｍｇ／ｍｌのヘパリンを含むリン酸塩緩衝生理食塩水５００μｌで２回洗浄した。洗浄後、０．１ＮＮａＯＨ　溶液　５００μｌを各ウェルに加え、室温に１０分間放置することにより細胞を溶解させ、ウェル中の１２５Ｉの量をガンマーカウンターで測定した。この結果、図１９に示したように、ｐｈＯＢＭをトランスフェクトした細胞にのみ１２５Ｉ標識したＯＣＩＦが結合することが確認された。又、その結合は４００　倍濃度の非標識　ＯＣＩＦ　（８μｇ／ｍｌ）を添加することにより、顕著に阻害されることが確認された。以上の結果から、ｐｈＯＢＭ上のｃＤＮＡにコードされる蛋白質ヒトＯＢＭは、ＣＯＳ−７　細胞表面でＯＣＩＦに特異的に結合することが明らかとなった。
【００９８】
〔実施例２３〕
１２５Ｉ標識したＯＣＩＦと本発明ｃＤＮＡにコードされる蛋白質とのクロスリンキング試験
本発明ｃＤＮＡにコードされる蛋白質の性質を更に詳しく解析するため、１２５Ｉ標識したモノマー型ＯＣＩＦと本発明ｃＤＮＡにコードされる蛋白質とのクロスリンキングを行った。即ち、実施例２１−（１）及び（２）に記載した方法に従って、それぞれ発現ベクターをｐｈＯＢＭを構築し、ＣＯＳ−７　細胞にトランスフェクトした後、上記の１２５Ｉ標識したＯＣＩＦ　（２５ｎｇ／ｍｌ）を加えた結合試験用培地を２００　μｌずつ各ウェルに添加した。又、別のウェルには、１２５Ｉ標識したＯＣＩＦに加え４００　倍濃度の非標識ＯＣＩＦを更に添加した結合試験用培地を加えた。ＣＯ２インキュベーター中（５％　ＣＯ２）、３７℃で１時間培養した後、細胞を０．１ｍｇ／ｍｌ　のヘパリンを含むリン酸塩緩衝生理食塩水５００μｌ　で２回洗浄した。この細胞に１００μｇ／ｍｌのクロスリンキング剤、ＤＳＳ　（Ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｓｕｂｅｒａｔｅ，　Ｐｉｅｒｃｅ社）　を溶解させたリン酸塩緩衝生理食塩水　５００μｌを加え、０℃で１０分間反応させた。これらのウェルの細胞を０℃に冷却したリン酸塩緩衝生理食塩水１ｍｌで２回洗浄した後、この細胞に１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（和光純薬社）、２　ｍＭ　ＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ、シグマ社）、１０μＭ　ペプスタチン　（和光純薬社）、１０μＭロイペプチン　（和光純薬社）、１０μＭ　アンチパイン　（ａｎｔｉｐａｉｎ，　和光純薬社）及び２　ｍＭ　ＥＤＴＡ　（和光純薬社）を含む２０　ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　緩衝液１００μｌを加え、室温に３０分間放置して細胞を溶解させた。これらのサンプル１５　μｌを常法により還元条件下でＳＤＳ化した後、ＳＤＳ−電気泳動用ゲル（４−２０％ポリアクリルアミドグラジエント、第一化学社）を用いて泳動した。泳動後、ゲルを乾燥させ、ＢｉｏＭＡＸ　ＭＳ　フィルム（コダック社）とＢｉｏＭａｘ　ＭＳ　増感スクリーン（コダック社）を用いて‐８０℃で２４時間感光させた。感光させたフィルムを常法により現像した。この結果、１２５Ｉ標識モノマー型ＯＣＩＦと本発明ｃＤＮＡによりコードされる蛋白質をクロスリンクさせることにより、図２０に示すように、分子量約９０，０００‐１１０，０００の蛋白質バンドが検出された。
【００９９】
〔実施例２４〕
分泌型ヒトＯＢＭ　の発現
（１）　分泌型ヒトＯＢＭ　発現プラスミドの構築
ヒトＯＢＭ　ＳＦ　（配列表配列番号１３）　とマウスＯＢＭ　＃８（配列表配列番号６）をプライマー、ｐＵＣ１９ｈＯＢＭ　を鋳型としてＰＣＲ　反応を行った。この生成物をアガロースゲル電気泳動で精製した後、制限酵素ＳＰｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、さらにアガロースゲル電気泳動で精製して、０．２７ｋｂの断片を得た。ヒトＯＢＭ　ｃＤＮＡを制限酵素ＤｒａＩで部分消化し、一ヶ所切断された断片をアガロース電気泳動で精製し、その精製断片をさらに制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断した。０．５３ｋｂのＤｒａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をアガロース電気泳動で精製し、この精製断片と上記のＰＣＲ生成物のＳｐｌＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ　断片（０．２７　ｋｂ）をｐＳｅｃ　Ｔａｇ　Ａ（インビトローゲン社）のＳＰｌＩ／ＥｃｏＲＶ　断片（５．２　ｋｂ）と共にライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造社）を用いてライゲーションを行い、その反応生成物を用いて大腸菌ＤＨ５　αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性株より、アルカリＳＤＳ　法によりプラスミドを精製し、制限酵素で切断することによって、ｐＳｅｃ　Ｔａｇ　Ａ　に０．２７　ｋｂと０．５３　ｋｂの断片が挿入されたプラスミドを選び出した。さらに、このプラスミドをタックダイデオキシターミネーターサイクルシークエンシングＦＳキット（パーキンエルマー社）を用いてシークエンスを行い、このプラスミドが分泌型ヒトＯＢＭをコードする配列を持っていることを確認した。
このプラスミドを制限酵素ＮｈｅＩ、ＸｈｏＩで切断した後、分泌型ヒトＯＢＭ　ｃＤＮＡに相当する断片（０．８ｋｂ）をアガロースゲル電気泳動で回収した。この断片をライゲーションキットを用いて発現ベクターｐＣＥＰ４（インビトローゲン社）のＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ断片（１０．４ｋｂ）に挿入し、その反応生成物を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性株より、アルカリＳＤＳ法によりプラスミドを精製し、制限酵素で切断することにより、目的の構造を持った分泌型ヒトＯＢＭ発現プラスミド（ｐＣＥＰｓｈＯＢＭ）を持つ大腸菌株を選択した。ｐＣＥＰｓｈＯＢＭを持つ大腸菌株を培養し、キアフィルタープラスミドミディキット（キアゲン社）を用いてｐＣＥＰｓｈＯＢＭを精製した。
【０１００】
（２）　分泌型ＯＢＭの発現
２９３−ＥＢＮＡ細胞を１０％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ　（ＩＭＤＭ−１０％　ＦＣＳ）　に懸濁し、コラーゲンコートした２４ウェルプレート（住友べ一クライト社）に２×１０５細胞／２ｍｌ／ウェルになるように播種し、一夜培養した。この細胞に１μｇ　のｐＣＥＰｓｈＯＢＭ　及びｐＣＥＰ４　のそれぞれをリポフェクトアミン（ギブコ社）　４μｌを用いて形質導入し、０．５ｍｌの無血清ＩＭＤＭまたはＩＭＤＭ−１０　％　ＦＣＳ中で更に２日間培養し、その培養上清を回収した。分泌型ヒトＯＢＭの培養上清中での発現は、以下のようにして確認した。即ち、培養上清に最終濃度が０．１Ｍになるように炭酸水素ナトリウムを加えて４℃で一夜放置し、培養上清中のヒトＯＢＭを９６ウェルプレートに固相化した。このプレートをＰＢＳで４倍希釈したブロックエース（雪印乳業社）　溶液（Ｂ−ＰＢＳ）で室温に２時間放置しブロッキングした後、Ｂ−ＰＢＳで希釈した３−１００　ｎｇ／ｍｌのＯＣＩＦを加えて３７℃で２時間放置した。０．０５％Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ　２０　を含むＰＢＳ　（Ｐ−ＰＢＳ）でプレートを洗浄した後、Ｂ−ＰＢＳで希釈したＷＯ９６／２６２１７号記載のパーオキシダーゼ標識抗ＯＣＩＦ抗体を各ウェルに１００μｌずつ添加し、３７℃で２時間放置した。Ｐ−ＰＢＳで各ウェルを６回洗浄した後、ＴＭＢ溶液（ＴＭＢ　Ｓｏｌｕｂｌｅ　Ｒｅａｇｅｎｔ，　Ｈｉｇｈ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，　Ｓｃｙｔｅｋ社）を１００μｌずつ各ウェルに加え、室温で約１０分間放置した後、停止液（Ｓｔｏｐｐｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ．　Ｓｃｙｔｅｋ杜）を１００μｌずつ各ウェルに加えた。各ウェルの４５０　ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。結果を図２１に示す。ｐＣＥＰｓｈＯＢＭを形質導入した細胞の培養上清を固相化したプレートでは、添加したＯＣＩＦの濃度に依存して４５０ｎｍの吸光度が増加した。一方、ベクターのみのｐＣＥＰ４を形質導入した細胞の培養上清を固相化した場合には、その吸光度の増加は見られなかった。又、固相化に用いる培養上清量の割合を５〜９０％の範囲で種々変化させ、一定濃度のＯＣＩＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加した際の結果を図２２に示す。ｐＣＥＰｓｈＯＢＭ　を形質導入した細胞の培養上清を固相化したプレートでは、添加する培養上清量の増加につれて４５０ｎｍにおける吸光度が増加したが、ベクターｐＣＥＰ４を形質導入した細胞の培養上清を固相化したプレートでは、吸光度の増加は見られなかった。これらの結果により、分泌型ヒトＯＢＭ　がｐＣＥＰｓｈＯＢＭ　を形質導入した細胞の培養上清中に発現していることが確認された。
【０１０１】
〔実施例２５〕
チオレドキシン−ヒトＯＢＭ融合蛋白質（Ｔｒｘ−ｈＯＢＭ）の発現
（１）チオレドキシン−ヒトＯＢＭ融合蛋白質（Ｔｒｘ−ｈＯＢＭ）発現ベクターの構築
１０μｌの１０×ＥｘＴａｑバッファ−（宝酒造社）、８μｌの　１０ｍＭ　ｄＮＴＰ　（宝酒造社）、７７．５μｌの滅菌蒸留水、２μｌのｐＵＣ１９ｈＯＢＭ　水溶液　（１０ｎｇ／μｌ）、１μｌのプライマーマウスＯＢＭ　＃３　（配列表配列番号９）（１００ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのプライマーｈＯＢＭ　ＳａｌＲ２　（配列表配列番号１４）（１００ｐｍｏｌ／μｌ）、０．５　μｌのＥｘＴａｑ　（５ｕ／μｌ）（宝酒造社）を混合しマイクロ遠心管中でＰＣＲ反応を行った。９５℃５分、５０℃１秒、５５℃１分、７４℃１秒、７２℃５分の反応後、９６℃１分、５０℃１秒、５５℃１分、７４℃１秒、７２℃３分の反応を２５サイクル行った。反応液全量から約７５０ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡ断片（全量）を制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造社）及びＢｓｐＨＩ（ニューイングランドバイラブズ杜）で切断した後、１％アガロース電気泳動を行い、約３２０ｂｐのＤＮＡ断片（断片１）を精製し２０μｌの滅菌蒸留水に溶解した。同様に、実施例１９−（３）記載のｐＵＣ１９ｈＯＢＭ４μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ，　ＢｓｐＨＩ（宝酒造社）で切断して得られた約４５０ｂｐのＤＮＡ断片（断片２）、及び２μｇのｐＴｒｘＦｕｓ（インビトロジェン社）を制限酵素ＢａｍＨＩ，　ＳａｌＩ（宝酒造社）で切断して得られた約３．６　ｋｂのＤＮＡ断片（断片３）をそれぞれ精製し、それぞれを２０μｌの滅菌蒸留水に溶解した。ＤＮＡ断片の精製にはＱＩＡＥＸＩＩ　ｇｅｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔを用いた。断片１、断片２、及び断片３をＤＮＡ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ｖｅｒ．２　（宝酒造社）を用い、１６℃で２時間３０分保温することにより結合させた。ライゲーション反応液を用い大腸菌ＧＩ７２４株（インビトロジェン社）をＴｈｉｏＦｕｓｉｏｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）添付のＩｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｍａｎｕａｌに記載の方法で形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換株の中から、制限酵素切断により得られるＤＮＡ断片地図の解析並びにＤＮＡ配列の決定により、ｈＯＢＭ　ｃＤＮＡ断片がチオレドキシン遺伝子に同じ読み枠で結合しているプラスミドを持っ菌株を選択した。得られた菌株をＧＩ７２４／ｐＴｒｘｈＯＢＭと名付けた。
【０１０２】
（２）大腸菌でのＴｒｘ−ｈＯＢＭの発現
ＧＩ７２４／ｐＴｒｘｈＯＢＭ株及びｐＴｒｘＦｕｓ　を持つＧＩ７２４株（ＧＩ７２４／ｐＴｒｘＦｕｓ）をそれぞれ２ｍｌのＲＭＧ‐Ａｍｐ培地（０．６％　Ｎａ２ＨＰＯ４、０．３％　ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％　ＮａＣｌ、０．１％　ＮＨ４Ｃｌ、２％　カザミノ酸、１％　グリセロール、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１００　μｇ／ｍｌアンピシリン、ｐＨ　７．４）　中、３７℃で６時間振盪培養した。菌液　０．５ｍｌ　を５０ｍｌ　のＩｎｄｕｃｔｉｏｎ培地（０．６％　Ｎａ２ＨＰＯ４、０．３％　ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％　ＮａＣｌ、０．１％　ＮＨ４Ｃｌ、０．２％カザミノ酸、０．５％グルコース、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、ｐＨ７．４）に添加し、３０℃で振盪培養した。ＯＤ６００ｎｍ　における値が約０．５になった時点で、最終濃度が０．１ｍｇ／ｍｌになるようにレトリプトファンを添加し、更に３０℃で６時間振盪培養した。菌液を３，０００×ｇで遠心し菌体を集め、１２．５　ｍｌ　のＰＢＳ　に懸濁した。懸濁液を超音波発生装置（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ社）にかけ菌体を破砕し、７，０００　×ｇで３０分間遠心して上清を集めて可溶性蛋白質画分とした。これらの画分溶液１０μｌずつを還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ポリアクリルアミド）に供した。この結果、図２３に示すように、ＧＩ７２４／ｐＴｒｘＯＢＭ　の可溶性蛋白質画分には、ＧＩ７２４／ｐＴｒｘＦｕｓ　の可溶性蛋白質画分には見られない分子量約４０，０００の蛋白質のバンドが検出された。以上の結果から、チオレドキシンとヒトＯＢＭの融合蛋白質（Ｔｒｘ−ｈＯＢＭ）　が大腸菌中で発現していることが確認された。
【０１０３】
（３）　Ｔｒｘ−ｈＯＢＭ　のＯＣＩＦとの結合能　
発現させたＴｒｘ−ｈＯＢＭがＯＣＩＦと結合することを、以下の実験により確認した。即ち、９６ウェルイムノプレート（Ｎｕｎｃ社）の各ウェルに１０ｍＭ　炭酸水素ナトリウム水溶液で５０００倍に希釈した抗チオレドキシン抗体（インビトロジェン社）を１００μｌ　ずつ添加し４℃で一夜放置した。各ウェル中の液を捨てた後、ブロックエース（雪印乳業社）をＰＢＳで２倍希釈した溶液　（ＢＡ−ＰＢＳ）　を各ウェルに２００　μｌずつ添加し室温で１時間放置した。液を捨てた後、各ウェルをＰ−ＰＢＳで３回洗浄した。各ウェルにＢＡ−ＰＢＳで段階希釈した上記ＧＩ７２４／ｐＴｒｘｈＯＢＭ　由来及び　ＧＩ７２４／ｐＴｒｘＦｕｓ　由来可溶性蛋白質画分溶液を　１００μｌ　ずつ添加し室温で２時間放置した。Ｐ−ＰＢＳで各ウェルを３回洗浄した後、ＢＡ−ＰＢＳで希釈したＯＣＩＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）を各ウェルに１００μずつ添加し室温に２時間放置した。Ｐ−ＰＢＳで各ウェルを３回洗浄した後、ＢＡ−ＰＢＳで２０００倍に希釈したＷＯ９６／２６２１７号記載のパーオキシダーゼ標識した抗ＯＣＩＦ抗体を各ウェルに１００μｌずつ添加し、室温で２時間放置した。Ｐ−ＰＢＳ　で各ウェルを６回洗浄した後、ＴＭＢ　溶液を　１００μｌずつ各ウェルに加え、室温で約１０分間放置した後、停止液（Ｓｔｏｐｐｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ）を　１００μｌずつ各ウェルに加えた。各ウェルの４５０　ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。結果を図２４に示す。　ＧＩ７２４／ｐＴｒｘＦｕｓ由来可溶性蛋白質画分溶液を添加したもの、添加しなかったものの間で吸光度には差異は見られなかったが、ＧＩ７２４／ｐＴｒｘｈＯＢＭ　由来可溶性蛋白質画分溶液を添加したものでは、その添加濃度が増加するにつれて吸光度が上昇した。又、添加する可溶性蛋白質画分溶液の希釈割合を一定（１％濃度）にし、ＢＡ−ＰＢＳで段階希釈したＯＣＩＦ（０−１００ｎｇ／ｍｌ）を添加した場合の実験結果を図２５に示す。　ＧＩ７２４／ｐＴｒｘＦｕｓ　由来可溶性蛋白質画分溶液を用いたものでは、ＯＣＩＦの濃度に係わりなく吸光度は低値であったが、ＧＩ７２４／ｐＴｒｘｈＯＢＭに由来可溶性蛋白質画分溶液を添加したものでは、ＯＣＩＦ濃度が増加するにつれて吸光度が増加した。これらの結果から、ＧＩ７２４／ｐＴｒｘｈＯＢＭで生産されるＴｒｘ−ｈＯＢＭには、ＯＣＩＦと結合する能力があることが確認された。
【０１０４】
（４）Ｔｒｘ−ｈＯＢＭを生産する大腸菌の大量培養　
ＧＩ７２４／ｐＴｒｘｈＯＢＭをＲＭＧ−Ａｍｐ　寒天培地（０．６％Ｎａ２ＨＰＯ４、０．３％　ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％　ＮａＣｌ、０．１％　ＮＨ４Ｃｌ、２％　カザミノ酸、１．５％　寒天、ｐＨ　７．４）に白金耳で塗抹し、３０℃で一夜培養した。菌体を１０ｍｌ　のＩｎｄｕｃｔｉｏｎ培地に懸濁し、５ｍｌずつを５００　ｍｌのＩｎｄｕｃｔｉｏｎ　培地の入った２　ｌ用三角フラスコ計２本に添加し、３０℃で振盪培養した。ＯＤ６００ｎｍ　での吸光度が約０．５になった時点で最終濃度が０．１　ｍｇ／ｍｌとなるようにＬ‐トリプトファンを添加し、更に３０℃で６時間振盪培養した。菌液を３，０００×ｇで２０分間遠心分離して菌体を集め、菌体を１６０　ｍｌのＰＢＳ　に懸濁した。懸濁液を超音波発生装置（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ社）にかけ菌体を破砕し、７，０００×ｇ　で３０分間遠心分離して上清を集め可溶性蛋白質画分とした。
【０１０５】
（５）　ＯＣＩＦ固定化アフィニティーカラムの調製
ＴＳＫｇｅｌ　ＡＦ−トレシルトヨパール６５０　（東ソー社）　２ｇと、ＷＯ９６／２６２１７号公報記載の方法で調製した遺伝子組み換え型ＯＣＩＦ３５．０　ｍｇを含む１．０Ｍリン酸カリウム緩衝液　（ｐＨ　７．５）　４０ｍｌとを混合し、４℃で一夜緩やかに振盪することによりカップリング反応を行った。過剰な活性基を不活性化するため、遠心分離により上清を除去した後、４０ｍｌの０．１Ｍトリス‐塩酸緩衝液　（ｐＨ　７．５）を沈殿した担体に加え、室温で１時間穏やかに振盪した。０．０１％　Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ　８０　と０．２Ｍ　ＮａＣｌ　を含む０．１Ｍグリシン‐塩酸緩衝液　（ｐＨ　３．３）　及び０．０１％　Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ　８０　と０．２Ｍ　ＮａＣｌを含む０．１Ｍ　クエン酸ナトリウム緩衝液　（ｐＨ　２．０）を通液しカラムを洗浄した後、０．０１％Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ　８０　を含む１０　ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液　（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、カラムを平衡化した。
【０１０６】
（６）　ＯＣＩＦ固定化アフィニティーカラムによるＴｒｘ−ｈＯＢＭの精製
Ｔｒｘ−ｈＯＢＭの精製は、特に断らない限り４℃で行った。上記のＯＣＩＦ固定化アフィニティー担体（１０ｍｌ）　と上記実施例２５−（４）記載の可溶性蛋白質画分溶液　（１２０ｍｌ）とを混合後、５０ｍｌ遠心管　（４本）中で、ローテーターを用いて４℃で一夜穏やかに振盪した。この混合液中の担体をエコノカラム（内径１．５ｃｍ×長さ１５ｃｍ、バイオラッド社）に充填した。０．０１％　Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ　８０　を含むＰＢＳ　３００ｍｌ、０．０１％　Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ　８０　及び２．０ＭＮａＣｌを含む１０　ｍＭ　リン酸緩衝液　（ｐＨ　７．０）　１００ｍｌ、０．０１％　Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ　８０　及び０．２Ｍ　ＮａＣｌを含む０．１Ｍ　グリシン‐塩酸緩衝液（ｐＨ　３．３）　１００ｍｌを順次通液してカラムを洗浄した。次に、０．０１％　Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ　８０　及び０．２Ｍ　ＮａＣｌを含む０．１　Ｍ　クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ　２．０）を通液し、カラムに吸着した蛋白質を溶出した。溶出液は５ｍｌずつ分取した。分取した画分には、１０％容量の２Ｍトリス溶液　（ｐＨ　８．０）　を加えて直ちに中和した。溶出液各画分中のＴｒｘ−ｈＯＢＭの有無を、実施例２５−（３）記載の方法により調べた。又、Ｔｒｘ−ｈＯＢＭを含む画分を集め、更に精製を進めた。
【０１０７】
（７）ゲル濾過によるＴｒｘ−ｈＯＢＭの精製
上記実施例２５−（６）記載のＴｒｘ−ｈＯＢＭフラクション約２５ｍｌをＣｅｎｔｒｉｐｌｕｓ１０及びＣｅｎｔｒｉｃｏｎ　１０　（Ａｍｉｃｏｎ社）を用いて、約０．５ｍｌに遠心濃縮した。この濃縮サンプルを予め０．０１％　Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ　８０　を含むＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ１２　ＨＲ　１０／３０カラム（１．０×３０ｃｍ、ファルマシア社）に負荷した。移動相として０．０１％　Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ　８０　を含むＰＢＳを用い、流速０．２５ｍｌ／ｍｉｎでカラムを展開した。カラムからの溶出液は０．２５ｍｌずつ分取した。分取した画分のＴｒｘ−ｈＯＢＭは、実施例２５−（３）記載の方法及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出した。純化されたＴｒｘ−ｈＯＢＭを含むフラクションを集め、Ｔｒｘ−ｈＯＢＭの蛋白質濃度を測定した。蛋白質濃度は牛血清アルブミンを標準品として用い、ＤＣ−ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（バイオラッド社）で測定した。
【０１０８】
〔実施例２６〕
ｈＯＢＭの破骨細胞形成誘導活性
ｐｈＯＢＭ及びｐｃＤＬ−ＳＲα２９６をリポフェクトアミン（ギブコ社）を用いてＣＯＳ−７細胞にそれぞれトランスフェクトした。それぞれの細胞を１０％　ＦＣＳを含むＤＭＥＭで１日間培養後トリプシン処理し、カバーグラス（１ｍｍ丸形、マツナミ社）を敷いた２４ウェルプレートに１ウェル当たり５×１０４個の細胞を播種し、さらに２日間培養した。培養プレートをＰＢＳで１回洗浄した後、１％パラフォルムアルデヒドを含むＰＢＳを加えて室温で８分間インキュベートし細胞をカバーグラス上に固定化した。細胞を固定化したプレートをＰＢＳで６回洗浄した後、１０−８Ｍ活性化ビタミンＤ３、１０−７Ｍデキサメサゾン、１０％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭにて１×１０６個／ｍｌになるように懸濁したマウス脾臓細胞を１ウェル当たり７００μｌずつ添加した。各ウェル上にＭｉｌｌｉｃｅｌｌ　ＰＣＦ（ミリポア社）をセットし、上記培地にて４×１０４個／ｍｌに懸濁したＳＴ２細胞をＭｉｌｌｉｃｅｌｌ　ＰＣＦ中に７００μｌずつ添加し、３７℃で６日間培養した。培養終了後、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ　ＰＣＦを取り除き、プレートをＰＢＳで１回洗浄後、アセトン−エタノール溶液（５０：５０）で１分間細胞を固定した後、ＬＥＵＫＯＣＹＴＥ　ＡＣＩＤ　ＰＨＯＳＰＨＡＴＡＳＥキット（シグマ社）を用いて破骨細胞特異的マーカーである酒石酸耐性酸性フォスファターゼ活性（ＴＲＡＰ活性）を示す細胞のみを染色した。顕微鏡観察の結果、ヒトＯＢＭ　ｃＤＮＡを含まないベクターのみのｐｃＤＬ−ＳＲα２９６をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を固定化したウェル中にはＴＲＡＰ活性を示す細胞は全く検出されなかったのに対し、ｐｈＯＢＭをトランスフェクトした細胞を固定化したウェル中には６５±１８個（ｎ＝３、平均値±標準偏差）のＴＲＡＰ陽性細胞が観察された。又、これらのＴＲＡＰ陽性細胞は１２５Ｉ　−標識サケカルシトニン（アマシャム社）と特異的結合を示したことから、カルシトニンレセプターを発現していることが確認された。これらの結果から、本発明ｃＤＮＡによりコードされる蛋白質であるヒトＯＢＭは破骨細胞形成を誘導する活性があることが明らかとなった。
【０１０９】
〔実施例２７〕
Ｔｒｘ−ｈＯＢＭ及び分泌型ヒトＯＢＭによる破骨細胞形成誘導活性
マウス脾臓細胞を１０−８Ｍ活性型ビタミンＤ３、１０−７Ｍデキサメサゾン、１０％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭに２×１０６個／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレートに１ウェルあたり３５０μｌ添加した。精製したＴｒｘ−ｈＯＢＭを上記培地で希釈した溶液（４０ｎｇ／ｍｌ）、ｐＣＥＰｓｈＯＢＭまたはｐＣＥＰ４を形質導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞をＩＭＤＭ−１０％ＦＢＳで培養した培養上清を上記培地にて１０倍希釈した溶液または上記培地のみをそれぞれ３５０μｌ添加した後、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ　ＰＣＦ（ミリポア社）を各ウェルにセットし、上記培地にて懸濁した４×１０４個／ｍｌのＳＴ２細胞をＭｉｌｌｉｃｅｌｌ　ＰＣＦに６００μｌ添加した。６日間培養した後、ＭｉｌｌｉｃｅｌｌＰＣＦを取り除き、プレートをＰＢＳで１回洗浄後、アセトン−エタノール溶液（５０：５０）で１分間細胞を固定した後、ＬＥＵＫＯＣＹＴＥ　ＡＣＩＤ　ＰＨＯＳＰＨＡＴＡＳＥキット（シグマ社）を用いて酒石酸耐性酸性フォスファターゼ活性（ＴＲＡＰ活性）を示す細胞のみを染色した。顕微鏡観察の結果、Ｔｒｘ−ｈＯＢＭを添加しなかったウェル中にはＴＲＡＰ活性を示す細胞は全く検出されなかったのに対し、Ｔｒｘ−ｈＯＢＭを添加したウェルには１１５±１９個（ｎ＝３、平均値±標準偏差）のＴＲＡＰ陽性細胞が観察された。同様に、ｐＣＥＰ４で形質導入された２９３−ＥＢＮＡの培養上清を添加したウェル中にはＴＲＡＰ活性を示す細胞は全く検出されなかったのに対し、ｐＣＥＰｓｈＯＢＭで形質導入された２９３−ＥＢＮＡの培養上清を添加したウェルには１２５±２３個（ｎ＝３、平均値±標準偏差）のＴＲＡＰ陽性細胞が観察された。又、これらＴＲＡＰ陽性細胞は１２５Ｉ標識したサケカルシトニン（アマシャム社）と特異的結合を示しことから、カルシトニンレセプターを発現していることが確認された。これらの結果から、Ｔｒｘ−ｈＯＢＭ及び分泌型ＯＢＭには、破骨細胞形成を誘導する活性があることが明らかとなった。
【０１１０】
〔実施例２８〕
ポリクローナル抗体の作製
免疫抗原として用いるマウスｓＯＢＭ又はヒトｓＯＢＭは、前記の方法に従って得た。即ち、マウスｓＯＢＭ　ｃＤＮＡ　（マウスＯＢＭのＮ末端から７２番目までのアミノ酸を欠損させた膜結合部位を持たないマウスｓＯＢＭ（配列表配列番号１６）をコードするｃＤＮＡ、配列表配列番号１８）又はヒトＯＢＭ　ｃＤＮＡ（ヒトＯＢＭのＮ末端から７１番目までのアミノ酸を欠損させた膜結合部位を持たないヒトｓＯＢＭ（配列表配列番号１７）をコードするｃＤＮＡ、配列表配列番号１９）を、イムノグロブリンのκ−チェーンのシグナルペプチドをコードする塩基配列を含む発現ベクターｐＳｅｃＴａｇＡ（インビトローゲン社）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＶ断片（５．２ｋｂ）と、ＯＢＭｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ／ＰｍａＣＩ断片（０．３２ｋｂ）とともにライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造社）を用いてライゲーションを行い、その反応生成物を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性株からアルカリＳＤＳ法によりプラスミドを精製し、制限酵素で切断することによりｐＳｅｃ　ＴａｇＡに０．６Ｋｂと０．３２　Ｋｂの断片が挿入されたプラスミドを選び出した。このプラスミドをダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳキット（パーキン−エルマー社）を用いてシークエンスを確認した結果、このプラスミドがマウス又はヒトｓＯＢＭをコードする配列を有することを確認した。このプラスミドを制限酵素ＮｈｅＩ、ＸｈｏＩで切断した後、分泌型ＯＢＭ　ｃＤＮＡに相当する断片（１．０ｋｂ）をアガロースゲル電気泳動で回収した。この断片をライゲーションキットを用いて発現ベクターｐＣＥＰ４（インビトローゲン社）のＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ断片（１０．４ｋｂ）に挿入し、その反応生成物を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性株からアルカリＳＤＳ法によりプラスミドを精製し、制限酵素で切断して解析することにより、目的の構造を持った分泌型ＯＢＭ発現プラスミド（ｐＣＥＰ　ｓＯＢＭ）を持つ大腸菌株を選び出した。ｐＣＥＰｓＯＢＭを持つ大腸菌株を培養し、キアフィルタープラスミドミディキット（キアゲン社）を用いてｐＣＥＰ　ｓＯＢＭを精製した。次に、２９３−ＥＢＮＡ細胞を１０％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ（ＩＭＤＭ−１０％ＦＣＳ）に懸濁し、コラーゲンコートした２４ウェルプレート（住友べ一クライト社）に２×１０５個／２ｍｌ／ウェルになるように播種し、一夜培養した。この細胞に１μｇのｐＣＥＰ　ｓＯＢＭ又はｐＣＥＰ４をリポフェタミン（ギブコ社）４μｌを用いて形質導入し、０．５ｍｌの無血清ＩＭＤＭ又はＩＭＤＭ−１０％ＦＣＳ中でさらに２日間培養し、その培養上清を回収した。遺伝子組み換えマウス可溶性ＯＢＭ（ｍｓＯＢＭ）あるいはヒト可溶性ＯＢＭ（ｈｓＯＢＭ）の高生産細胞株を以下のようにスクリーニングした。ｍｓＯＢＭあるいはｈｓＯＢＭを含むと見られる培養上清に最終濃度が０．１Ｍになるように炭酸水素ナトリウムを添加後、それぞれの培養上清を１００μｌずつ９６ウェルイムノプレート（Ｎｕｎｃ社）の各ウェルに添加し、４℃で一夜放置して培養上清中のｍｓＯＢＭあるいはｈｓＯＢＭを各ウェルに固相化した。このプレートの各ウェルにＰＢＳで���倍希釈したブロックエース（雪印乳業社）溶液（Ｂ−ＰＢＳ）を２００μｌ加え、室温で２時間放置した。０．１％ｐｏｌｙｓｐｒｂａｔｅ２０を含むＰＢＳ（Ｐ−ＰＢＳ）で３回洗浄後、Ｂ−ＰＢＳで段階的に希釈した遺伝子組み換えＯＣＩＦ（ｒＯＣＩＦ）溶液（３〜１００ｎｇ／ｍｌ）を１００μｌずつ各ウェルに添加し、３７℃で２時間放置した。そのプレートをＰＢＳで３回洗浄した後、Ｂ−ＰＢＳで希釈したパーオキシダーゼ標識抗ＯＣＩＦポリクローナル抗体（ＷＯ９６／２６２１７号）を１００μｌずつ各ウェルに添加し、３７℃で２時間放置した。Ｐ−ＰＢＳで各ウェルを６回洗浄後、ＴＭＢ溶液（ＴＭＢ　Ｓｏｌｕｂｌｅ　Ａｇｅｎｔ，　Ｈｉｇｈｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，　Ｓｃｙｔｅｋ社）を１００μｌずつ各ウェルに加え、室温で約１０分間放置した後、停止液（Ｓｔｏｐｐｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ，　Ｓｃｙｔｅｋ社）を１００μｌずっ各ウェルに加えた。各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。ｍｓＯＢＭあるいはｈｓＯＢＭの生産細胞株の培養上清を固相化したプレートでは、ＯＣＩＦの添加濃度に比例して、吸光度が顕著に増加した。ｍｓＯＢＭあるいはｈｓＯＢＭの生産細胞株について、その吸光度の増加の割合の高い生産株を、それぞれ高生産株として選択した。このように選択されたｍｓＯＢＭあるいはｈｓＯＢＭ高生産２９３−ＥＢＮＡ細胞をそれぞれ５％ＦＣＳを含有するＩＭＤＭを培地として用い、Ｔ−フラスコ（Ｔ−２２５）を２５枚用いて大量培養した。コンフルエントに達した後、新鮮な培地をＴ−２２５フラスコ１枚当たり１００ｍｌずつ加え、３〜４日間培養して、培養上清を回収した。この操作を４回繰り返して、ｍｓＯＢＭあるいはｈｓＯＢＭを含む培養上清をそれぞれ１０リットル得た。実施例２５−（６）及び（７）記載の方法に従いｒＯＣＩＦ固定化カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーにより精製することにより、これら培養上清からＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動的に均一（分子量３２ｋＤａ）な精製ｍｓＯＢＭ及びｈｓＯＢＭをそれぞれ約１０ｍｇ及び１２ｍｇ得た。このようにして得られた精製標品を、それぞれ免疫抗原として用いた。得られた各抗原を、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に２００μｇ／ｍｌになるように溶解し、等容量のフロイント完全アジュバントと混合し乳化後、日本白色ウサギ各３羽に約１週間間隔で１ｍｌを皮下投与し免疫した。抗体価を測定し、抗体価が最高に到達した時点で、ブースター投与し、投与１０日後に全採血した。抗血清をプロテインＡセファロースクロマトグラフィー用バインディングバッファー（ＢｉｏＲａｄ社）で２倍希釈し、同バッファーで平衡化したプロテインＡカラムに負荷した。同バッファーでカラムを充分洗浄後、カラムに吸着した抗ｓＯＢＭ抗体をエルーションバッファー（ＢｉｏＲａｄ社）あるいは０．１Ｍグリシン−ＨＣｌバッファー、ｐＨ２．９−３．０で溶出した。抗体溶出液を直ちに中和する目的で、１．０ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０を少量含む試験管を用いて溶出溶液を分画した。抗体溶出液をＰＢＳに対して４℃、一夜透析した。抗体溶液の蛋白量をウシＩｇＧをスタン���ードとしてＬｏｗｒｙ法により測定した。このようにして、本発明のポリクローナル抗体を含む精製イムノグロブリン（ＩｇＧ）が、ウサギ抗血清１ｍｌ当たり約１０ｍｇ得られた。
【０１１１】
〔実施例２９〕
ポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡによるＯＢＭ及びｓＯＢＭの測定
実施例２８で得られたウサギ抗ヒトｓＯＢＭポリクローナル抗体を、固相抗体及び酵素標識抗体としたサンドイッチＥＬＩＳＡを構築した。酵素標識は、石川らの方法（Ｉｓｈｉｋａｗａ　ｅｔ　ａｌ：Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏ　ａｓｓａｙ，　Ｖｏｌ．４，　２０９−３２７，　１９８３）に従いパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識した。実施例２８で得られた抗ヒトｓＯＢＭポリクローナル抗体を２μｇ／ｍｌとなるように０．１Ｍ　ＮａＨＣＯ３溶液に溶解し、９６−ウェルイムノプレート（Ｎｕｎｃ社）の各ウェルに１００μｌずつ添加、室温で一夜放置した。次いで、各ウェルに２００μｌずつ５０％ブロックエース（雪印乳業社）を加え、室温で１時間放置し、各ウェルを０．１％ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ２０を含むＰＢＳ（洗浄バッファー）で３回洗浄した。
実施例２６の方法と同様にヒトＯＢＭを発現し実施例２の方法で精製することにより得られた精製ヒトＯＢＭ、及び実施例２８で得られた精製ヒトｓＯＢＭをそれぞれ一次反応用バッファー（４０％ブロックエース、０．１％ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ２０を含む０．２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．２）で段階希釈した溶液を、１００μｌずつ各ウェルに加えた。室温で２時間放置後、各ウェルを上記洗浄バッファーで３回洗浄した。
二次反応用バッファー（２５％ブロックエース、０．１％ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ２０を含む０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．２）で１０００倍希釈したＰＯＤ標識抗ヒトｓＯＢＭポリクローナル抗体を１００μｌずつ各ウェルに加え、室温で２時間放置した後、各ウェルを３回洗浄バッファーで洗浄した。各ウェルに酵素基質溶液（ＴＭＢ，　ＳｃｙＴｅｋ社）を１００μｌずつ添加し、室温で１０分間放置後、反応停止液（Ｓｔｏｐｐｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔ，　ＳｃｙＴｅｋ社）を１００μｌずつ各ウェルに加えて酵素反応を停止させた。各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて測定した。結果を図２６に示す。ウサギ抗ヒトｓＯＢＭポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡは、ヒトｓＯＢＭ（分子量約３２ｋＤａ）及びヒトＯＢＭ（分子量約４０ｋＤａ）をほぼ等しく認識し、それぞれの測定感度は約１２．５ｘ１０−３ｐｍｏｌ／ｍｌ（ヒトＯＢＭで約５００ｐｇ／ｍｌ、ヒトｓＯＢＭで約４００ｐｇ／ｍｌ）であった。実施例２８で得られたウサギ抗マウスｓＯＢＭポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡによるマウスｓＯＢＭ及びマウスＯＢＭの測定は上記と同様に実施でき、それぞれの測定感度も同程度で極めて微量のマウスｓＯＢＭあるいはマウスＯＢＭを測定できることが明らかとなった。
以上のように、実施例２８で得られた本発明抗ヒトｓＯＢＭポリクローナル抗体は、ヒトｓＯＢＭ及びヒトＯＢＭの両抗原を等しく認識することから、抗ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭポリクローナル抗体と名付けた。又、実施例２８で得られた抗マウスｓＯＢＭポリクローナル抗体は、同様にマウスｓＯＢＭ及びマウス０ＢＭの両抗原を等しく認識することから、抗マウスＯＢＭ／ｓＯＢＭポリクローナル抗体と名付けた。
【０１１２】
〔実施例３０〕
モノクローナル抗体の作製
免疫用抗原には、実施例２８で得られた精製ヒトｓＯＢＭを用いた。精製ヒトｓＯＢＭを１０μｇ／ｍｌになるように生理食塩水に溶解した。このようにして調製したヒトｓＯＢＭ溶液に、同容量のフロイント完全アジュバントを加え良く乳化した後、それぞれの抗原をＢａｌｂ／ｃマウスー匹当たり腹腔内に２００μｌずつ１週間間隔で３回投与し、マウスを免疫した。次に、ヒトｓＯＢＭを５μｇ／ｍｌ含む生理食塩水に同容量のフロイント不完全アジュバントを添加し、充分乳化したものを上記Ｂａｌｂ／ｃマウスー匹あたり２００μｌずつ、１週間間隔で４回追加免疫した。４回目の追加免疫の１週間後、ブースターとしてヒトｓＯＢＭを１０μｇ／ｍｌ含む生理食塩水をＢａｌｂ／ｃマウス１匹当たり１００μｌずつ静脈内に投与した。最終免疫後３日目に脾臓を摘出、脾臓細胞を分離し、マウスミエローマ細胞　Ｐ３ｘ６３−ＡＧ８．６５３とを公知の方法（Ｋｏｅｈｌｅｒ，Ｇ．　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，　Ｃ．，　Ｎａｔｕｒｅ，２５６，　４９５（１９７５））に従い細胞融合した。融合終了後、細胞懸濁液をヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミヂンを含むＨＡＴ培地中で１０日間培養した。ミエローマ細胞が死滅し、ハイブリドーマが出現した後、ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたＨＴ培地に培地交換し、培養を継続した。
【０１１３】
〔実施例３１〕
ハイブリドーマの選択及びクローニング
実施例３０の細胞融合及び培養を開始して１０日後にハイブリドーマの出現を認めたので、下記に記載した改良ソリッドフェーズＥＬＩＳＡにより、ヒトｓＯＢＭを認識する高親和性抗体及びその抗体を産生するハイブリドーマの選択を行った。又、ヒトｓＯＢＭとマウスｓＯＢＭの両方を認識する抗ＯＢＭモノクローナル抗体を選択するために、ソリッドフェーズＥＬＩＳＡ用抗原として、ヒトｓＯＢＭ以外に実施例２７で得られたマウスｓＯＢＭも使用した。ヒトｓＯＢＭ及びマウスｓＯＢＭをそれぞれ５μｇ／ｍｌになるように０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液に溶解し、それぞれの抗原溶液を５０μｌずつ９６−ウェルイムノプレート（Ｎｕｎｃ社）の各ウェルに加え、４℃で一夜静置しそれぞれの抗原を固相化した。各ウェル中の抗原溶液を捨て、各ウェルに５０％ブロックエース（雪印乳業社）を２００μｌずつ加え、室温で１時間放置してブロッキングした。各ウェルを０．１％ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ２０を含むリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−Ｐ）で洗浄し、各ウェルに４０μｌの牛血清（ハイクローン社）を加えた。次いで、各ウェルに１０μｌのハイブリドーマ培養上清を加え、８０％血清濃度下、室温で２時間反応させた。８０％血清存在下でのソリッドフェーズＥＬＩＳＡの目的は、高濃度の蛋白質及び血清由来の免疫反応妨害物質等の存在中でも微量のヒトｓＯＢＭあるいはマウスｓＯＢＭと結合できる抗体、即ちヒトｓＯＢＭあるいはマウスｓＯＢＭに対して高親和性の抗体生産ハイブリドーマを選択するためである。室温で２時間反応後、プレートをＰＢＳ−Ｐで洗浄し、２５％ブロックエースを含む生理食塩水で５０００分の１に希釈したパーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（ＫＰＬ社）を各ウェルに５０μｌ加え、室温で２時間反応させた。プレートをＰＢＳ−Ｐで３回洗浄した後、各ウェルに５０μｌの酵素基質溶液（ＴＭＢ，　ＳｃｙＴｅｋ社）を加え、室温で５分間反応させた。次いで、反応停止液（ｓｔｏｐｐｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔ，　ＳｃｙＴｅｋ社）５０μｌを加えて酵素反応を停止させた。各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（イムノリーダーＮＪ２０００、日本インターメッド社）を用いて測定し、ヒトｓＯＢＭあるいはマウスｓＯＢＭを認識する抗体生産ハイブリドーマを選択した。特に高い吸光度（ＯＤ４５０ｎｍ）を示すそれぞれの抗体生産ハイブリドーマを選択し、それらを限界希釈法により３〜５回クローニングを繰り返すことにより、安定な抗体生産ハイブリドーマを樹立した。得られた抗体生産株の中から、さらに抗体の生産性が高いハイブリドーマ株を選別した。
【０１１４】
〔実施例３２〕
モノクローナル抗体の生産及び精製
実施例３１で得られた抗体、即ち高親和性でヒトｓＯＢＭを認識する抗体生産ハィブリドーマ及びマウスｓＯＢＭにも交差性を有する抗体を産生するハイブリドーマをそれぞれ培養し、マウスー匹当たりそれぞれのハイブリドーマを１×１０６細胞ずつ、約１週間前にプリスタン（アルドリッチケミカル社）を投与しておいたＢａｌｂ／ｃ系マウスの腹腔内に移植した。約２〜３週間後、蓄積した腹水を採取し、本発明のヒトｓＯＢＭあるいはヒトｓＯＢＭ及びマウスｓＯＢＭを認識するモノクローナル抗体を含む腹水を得た。実施例２８に記載したプロテインＡカラムによる抗ＯＢＭ／ｓＯＢＭポリクローナル抗体の精製法に準じて、プロテインＡカラム（ファルマシア社）クロマトグラフィーにより腹水から精製モノクローナル抗体を得た。
【０１１５】
〔実施例３３〕
モノクローナル抗体の抗原特異性
ヒトｓＯＢＭを特異的に認識するモノクローナル抗体並びにヒトｓＯＢＭ及びマウスｓＯＢＭにも交差性を有するモノクローナル抗体について、ヒトｓＯＢＭ、膜結合部位を有するｉｎｔａｃｔなヒトＯＢＭ、マウスｓＯＢＭ、及び膜結合部位を有するｉｎｔａｃｔなマウスＯＢＭを抗原とした時の抗原特異性について調べた。３０数種類のモノクローナル抗体を得たが、それらのうち代表的なモノクローナル抗体にっいての結果を第１表に示す。この結果、ヒトｓＯＢＭを特異的に認識する抗ヒトｓＯＢＭモノクローナル抗体のほとんど全ては膜結合部位を有するｉｎｔａｃｔなヒトＯＢＭも認識するが、マウスｓＯＢＭ及び膜結合部位を有するｉｎｔａｃｔなマウスＯＢＭは認識しないことが明らかとなった。一方、ヒトｓＯＢＭ及びマウスｓＯＢＭも認識するモノクローナル抗体も得られたが、その数は極めて少なく、これらの抗体はヒトＯＢＭ並びにマウスＯＢＭにも交差性を有していることがわかった。これらの結果は、ヒトＯＢＭとマウスＯＢＭには共通した抗原認識部位、即ちエピトープが存在していることを示すものである。ヒトｓＯＢＭを免疫抗原として作製した抗ヒトｓＯＢＭモノクローナル抗体は、膜結合型のｉｎｔａｃｔな蛋白質であるヒトＯＢＭも等しく認識することから、抗ヒトｓＯＢＭモノクローナル抗体を抗ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭモノクローナル抗体と名付けた。
【０１１６】
【表１】
2004041195.tif 000002
【０１１７】
〔実施例３４〕
モノクローナル抗体のクラス及びサブクラスの検定
本発明のモノクローナル抗体のクラス及びサブクラスを、イムノグロブリンクラス及びサブクラス分析キット（アマシャム社）を用いて検定した。検定は、キットに指示されているプロトコールに従い実施した。代表的なモノクローナル抗体についての結果を表２に示す。抗ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭモノクローナル抗体の大多数はＩｇＧ１であり、その他ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂも存在していた。又、いずれの抗体もライトチェーンはκ鎖であった。
【０１１８】
【表２】
2004041195.tif 000003
【０１１９】
〔実施例３５〕
モノクローナル抗体の解離定数（Ｋｄ値）の測定
公知の方法（Ｂｅｔｒａｎｄ　Ｆｒｉｇｕｅｔ　ｅｔ　ａｌ．：Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　７７，３０５−３１９，１９８６）に従い、モノクローナル抗体の解離定数を測定した。即ち、実施例３２で得られた精製抗体を５ｎｇ／ｍｌに４０％ブロックエース、０．１％　ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ２０を含む０．４Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．４（１次バッファー）で希釈し、これに実施例２８で得られた精製ヒト可溶性ＯＢＭ（ｈｓＯＢＭ）を６．２５ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌになるように１次バッファーで希釈したものを等容量混ぜ、４℃で１５時間静置することによりｈｓＯＢＭとモノクローナル抗体を結合させた。１５時間後、ｈｓＯＢＭと未結合の抗体をｈｓＯＢＭ（１０μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェル）を固相化したソリッドフェーズＥＬＩＳＡにて測定することにより、モノクローナル抗体のｈｓＯＢＭに対する解離定数を算定した。又、ｈｓＯＢＭに対するモノクローナル抗体でありながら、マウス可溶性ＯＢＭ（ｍｓＯＢＭ）にも交差する抗体のｍｓＯＢＭに対する親和性についても、上記のｈｓＯＢＭの代わりにｍｓＯＢＭを使用することにより同様に測定した。特に、各抗原に高い親和性を示し、酵素免疫測定法やその他バインディングアッセイ等に有用な抗体についての結果を第３表に示す。
【０１２０】
【表３】
2004041195.tif 000004
この結果、ヒト可溶性ＯＢＭ（ｈｓＯＢＭ）に特異的な抗体であるＨ−ＯＢｍｌ及びＨ−ＯＢＭ４は解離定数（Ｋｄ）が１０−１１Ｍオーダーで、ｈｓＯＢＭに極めて高い親和性を有していることが明らかになった。一方、ｈｓＯＢＭ及びマウス可溶性ＯＢＭ（ｍｓＯＢＭ）の両方を認識する抗体、Ｈ−ＯＢＭ９のＫｄ値は、ｍｓＯＢＭに対しては１０−８オーダーであり、ｈｓＯＢＭに対しては１０−９Ｍオーダーであった。又、表１に記載の両抗原を認識する他の抗体、Ｈ−ＯＢｍｌ３の両抗原に対する解離定数は、Ｈ−ＯＢＭ９と差異はなく、両抗体はサブクラスも一致していることから、同じエピトープを認識する同一抗体である可能性が示唆された。
【０１２１】
〔実施例３６〕
抗ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによるヒトＯＢＭ及びｓＯＢＭの測定方法
実施例３５で得られた２種類の高親和性モノクローナル抗体、Ｈ−ＯＢｍｌ及びＨ−ＯＢＭ４をそれぞれ固相抗体と酵素標識抗体として、サンドイッチＥＬＩＳＡを構築した。
抗体の標識は、マレイミド活性化パーオキシダーゼキット（ピアス社）を用いて行った。Ｈ−ＯＢｍｌ抗体を１０μｇ／ｍｌになるよう０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液に溶解し、１００μｌずつ９６−ウェルイムノプレート（Ｎｕｎｃ社）の各ウェルに加え、４℃で一夜静置し固相化した。各ウェルの溶液を捨て、５０％濃度のブロックエース３００μｌを加え、室温で２時間静置しブロッキングした。ブロッキング後、プレートを０．１％ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ２０を含むリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−Ｐ）で洗浄した。ヒト可溶性ｓＯＢＭ及びヒトＯＢＭをそれぞれ４０％ブロックエース（雪印乳業社）及び０．１％ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ２０（和光純薬社）を含む０．４ＭＴｒｉｓ−ＨＣ（ｐＨ７．４）（１次反応バッファー）に溶解、希釈し、種々の濃度の被験溶液を調製した。種々の濃度に調製したそれぞれの被験溶液を１００μｌずつ各ウェルに加え、室温で２時間反応させた。２時間後、プレートをＰＢＳ−Ｐで洗浄し、２５％ブロックエース及び０．１％ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ２０を含む０．２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）（２次反応バッファー）で希釈したＰＯＤ標識Ｈ−ＯＢＭ４抗体を各ウェルに１００μｌ加え、室温で２時間反応させた。
プレートをＰＢＳ−Ｐで洗浄した後、各ウェルに１００μｌの酵素基質溶液（ＴＭＢ，ＳｃｙＴｅｋ社）を加えて発色させた後、反応停止液（ｓｔｏｐｐｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔ，　ＳｃｙＴｅｋ社）を１００μｌずつ各ウェルに加えて酵素反応を停止した。各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて測定した。結果を図２７に示す。
この結果、実施例３５で得られた２種類の高親和性抗ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭモノクローナル抗体、Ｈ−ＯＢｍｌ及びＨ−ＯＢＭ４を用いて構築したサンドイッチＥＬＩＳＡは、ヒトＯＢＭ及びヒトｓＯＢＭを等しく認識し、その測定感度は約１．２５−２．５×１０−３ｐｍｏｌ／ｍｌ（分子量約４０ｋＤａのヒトＯＢＭでは約５０−１００ｐｇ／ｍｌ、分子量約３２ｋＤａのヒトｓＯＢＭでは約４０−８０ｐｇ／ｍｌ）で極めて微量のヒトＯＢＭ及びヒトｓＯＢＭを測定できることが明らかとなった。尚、これら２種類の抗ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭモノクローナル抗体、Ｈ−ＯＢｍｌ及びＨ−ＯＢＭ４を生産するハイブリドーマをＨ−ＯＢｍｌ及びＨ−ＯＢＭ４と命名し、またマウスＯＢＭ及びマウスｓＯＢＭも認識し、破骨細胞形成抑制活性を発揮する抗ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭモノクローナル抗体、Ｈ−ＯＢＭ９を生産するハイブリドーマをＨ−ＯＢＭ９と命名した。これらのハイブリドーマは、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人産業技術総合研究所　微生物寄託センター）に受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６２６４　（Ｈ−ＯＢｍｌ）、ＦＥＲＭ　ＢＰ−６２６５　（Ｈ−ＯＢＭ４）、及びＦＥＲＭ　ＢＰ−６２６６　（Ｈ−ＯＢＭ９）として、平成９年１１月５日にそれぞれ寄託されている。
【０１２２】
〔実施例３７〕
マウスＯＢＭ及びマウスｓＯＢＭを認識する抗ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭモノクローナル抗体を用いたマウスＯＢＭ及びマウスｓＯＢＭの測定
実施例３３及び３５で得られたマウスＯＢＭ及びマウスｓＯＢＭも認識する抗ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭモノクローナル抗体、Ｈ−ＯＢＭ９を固相抗体とし、実施例２８で得られた抗マウスＯＢＭ／ｓＯＢＭポリクローナル抗体を酵素標識抗体とするサンドイッチＥＬＩＳＡを構築した。
マウスＯＢＭ及びマウスｓＯＢＭをそれぞれ実施例３５と同様に一次反応用バッファーで段階的に希釈し、実施例３６と同様の方法によりマウスＯＢＭ及びマウスｓＯＢＭを測定した。結果を図２８に示す。この結果、本発明のマウスＯＢＭ及びマウスｓＯＢＭも認識する本発明の抗ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭモノクローナル抗体、Ｈ−ＯＢＭ９を使用することにより、マウスＯＢＭ及びマウスｓＯＢＭを同様に測定できることが確認された。実施例３５の結果に示すように、この抗ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭモノクローナル抗体、Ｈ−ＯＢＭ９はマウスｓＯＢＭに対する解離定数が高い、即ちマウスｓＯＢＭに対する親和性が比較的低いことから、本ＥＬＩＳＡによるマウスＯＢＭ（分子量約４０ｋＤａ）及びマウスｓＯＢＭ（分子量約３２ｋＤａ）の測定感度は、約２５×１０−３ｐｍｏｌ／ｍｌ　（マウスＯＢＭでは約１ｎｇ／ｍｌ、マウスｓＯＢＭでは約０．８ｎｇ／ｍｌ）程度であった。
【０１２３】
〔実施例３８〕
抗ＯＢＭ／ｓＯＢＭ抗体による破骨細胞形成抑制活性試験
マウス脾細胞とＳＴ２細胞（マウス骨髄由来間質細胞）とのｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅでｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ−ｌｉｋｅ　ｃｅｌｌ（ＯＣＬ）が誘導されることが知られている（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，　１２５，　１８０５−１８１３（１９８９））。そこで、ＯＢＭ／ｓＯＢＭ抗体をこのｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅに添加した時、ＯＣＬ誘導を抑制するか否かを検討した。このｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ系においてはマウスＯＢＭが発現しているので、実施例に使用する抗体はマウスＯＢＭを認識するウサギ抗マウスＯＢＭ／ｓＯＢＭポリクローナル抗体、及びヒトＯＢＭ及びマウスＯＢＭの両抗原を認識するヒト抗ＯＢＭ／ｓＯＢＭモノクローナル抗体、Ｈ−ＯＢＭ９を用いた。１０％ＦＣＳを含むαＭＥＭにて段階希釈したそれぞれのＯＢＭ抗体を２４ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（ヌンク社）に７００μｌ／ｗｅｌｌ、上記培地にて懸濁した雄マウス脾細胞（２×１０６／ｍｌ）を３５０μｌ／ｗｅｌｌ添加した。次いでトリプシナイズしたＳＴ２細胞を４×１０−８Ｍ　ＶｉｔａｍｉｎＤ３及び４×１０−７ＭＤｅｘａｍｅｔｈａｚｏｎｅを含む上記培地に懸濁し（８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）３５０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で６日間培養した。培養プレートをＰＢＳにて１回洗浄したのち、５０％エタノール、５０％アセトンの混合液にて室温で１分間固定した。プレートを風乾した後、ＬＥＵＫＯＣＹＴＥ　ＡＣＩＤ　ＰＨＯＳＰＨＡＴＡＳＥキット（シグマ社）のプロトコールに従い基質液を５００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で５５分間反応させた。この反応により破骨細胞特異的マーカーである酒石酸耐性酸性フォスファターゼ活性（ＴＲＡＰ活性）を示す細胞のみが染色される。プレートを蒸留水で１回洗浄した後風乾してＴＲＡＰ陽性細胞数をカウントした。結果を表４に示す。この結果、ウサギ抗マウスＯＢＭ／ｓＯＢＭポリクローナル抗体及びマウスＯＢＭを認識する抗ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭモノクローナル抗体、Ｈ−ＯＢＭ９とも抗体濃度に依存してＯＣＬ誘導を阻害することがわかった。
これらの抗体は、破骨細胞形成因子、ＯＣＩＦ／ＯＰＧと同様に破骨細胞形成抑制活性を有し、骨代謝異常症治療薬として有望であることが明らかになった。
【０１２４】
【表４】
2004041195.tif 000005
【０１２５】
〔実施例３９〕
Ｔｒｘ−ＯＢＭのヒト破骨細胞形成誘導活性
成人健常者より静脈採取した全血から、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（ｓｉｇｍａ社）を用い、添付のプロトコールに従いｄｅｎｓｉｔｙ　ｇｒａｄｉｅｎｔ法によって単核細胞を調製した。この単核細胞を１０−７Ｍデキサメサゾン、２００ｎｇ／ｍｌマクロファージコロニー刺激因子（ミドリ十字杜）、１０％牛胎児血清及び実施例１５で得られた。精製されたＴｒｘ−ＯＢＭ（０−１００ｎｇ／ｍｌ）を含むα−ＭＥＭに１．３×１０６／ｍｌになるように懸濁し、この懸濁液を４８ウェルプレートに１ウェルあたり３００μｌ添加し３日間３７℃で培養した。培養液を上記培地で交換後、さらに４日間３７℃で培養した。培養した細胞を実施例５に示した方法で酒石酸耐性酸性フォスファターゼ活性（ＴＲＡＰ活性）を示す細胞を選択的に染色し、染色された多核細胞の数を顕微鏡観察により測定した。結果を図２９に示す。この結果、Ｔｒｘ−ＯＢＭを添加しなかったウェル中にはＴＲＡＰ活性を示す細胞はほとんど検出されなかったのに対し、Ｔｒｘ−ＯＢＭを添加すると濃度依存的にＴＲＡＰ陽性多核細胞が出現した。又、これらのＴＲＡＰ陽性多核細胞は破骨細胞のマーカーであるビトロネクチンレセプターも陽性であった。さらに、同様の培養を４８ウェルプレートに静置した象牙質切片上で行うと、Ｔｒｘ−ＯＢＭ存在下でのみ象牙質切片上に吸収窩が形成された。これより、Ｔｒｘ−ＯＢＭにはヒト破骨細胞形成を誘導する活性があることが明らかとなった。
【０１２６】
〔実施例４０〕
抗ＯＢＭ／ｓＯＢＭ抗体による骨吸収抑制活性
妊娠１５日目のｄｄＹマウス（日本ＳＬＣ社）に［４５Ｃａ］−ＣａＣｌ２溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を１匹あたり２５μＣｉ皮下注射し、胎仔の骨を４５Ｃａでラベルした。翌日、マウスを屠殺し開腹して、子宮から胎仔を取り出した。胎仔より前肢を摘出して、皮膚及び筋肉を剥がし長管骨を摘出し、さらに軟骨を除去して長管骨の骨幹部のみにした。骨幹部は２４穴プレートに入れた０．５ｍｌの培養液（０．２％牛血清アルブミン（ｓｉｇｍａ社）を含むＢＧＪｂ　ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社））に１本ずつ浮かべ、３７℃，　５％　ＣＯ２存在下で２４時間培養した。前培養終了後、各種骨吸収因子（ビタミンＤ３、プロスタグランジンＥ２、副甲状腺ホルモン、インターロイキン１α）、及び正常ウサギＩｇＧ（１００μｇ／ｍｌ；対照として）又は実施例２８で得られたウサギ抗ＯＢＭ／ｓＯＢＭポリクローナル抗体を含む新しい培養液（０．５ｍｌ）に長管骨を移し、さらに７２時間培養した。培養終了後、長管骨は０．５ｍｌの５％トリクロロ酢酸水溶液（和光純薬社）に入れ、室温で３時間以上処理して脱灰した。培養液及びトリクロロ酢酸抽出液（共に０．５ｍｌ）にシンチレーター（ＡＱＵＡＳＯＬ−２、ＰＡＣＫＡＲＤ社）５ｍｌを加え、４５Ｃａの放射活性を測定し、骨吸収により培養液中に遊離した４５Ｃａの割合を算出した。結果を図３０〜図３３にそれぞれ示す。この結果、ビタミンＤ３　（１０−８Ｍ）は骨吸収活性を上昇させたが、ウサギ抗ＯＢＭ／ｓＯＢＭポリクローナル抗体を加えることにより、濃度依存的にビタミンＤ３による骨吸収を抑制し、１００μｇ／ｍｌの濃度において完全に抑制した（図３０）。又、プロスタグランジンＥ２　（１０−６Ｍ）あるいは副甲状腺ホルモン（１００ｎｇ／ｍｌ）は骨吸収活性を上昇させたが、ウサギ抗ＯＢＭ／ｓＯＢＭポリクローナル抗体の添加（ｌ００μｇ／ｍｌ）により、プロスタグランジンＥ２及び副甲状腺ホルモンによる骨吸収をほぼ完全に抑制した（図３１及び図３２）。一方、陽性対照として用いた正常ウサギＩｇＧ（１００μｇ／ｍｌ）は、プロスタグランジンＥ２及び副甲状腺ホルモンによる骨吸収に対して影響しなかった。又、インターロイキン１α（１０ｎｇ／ｍｌ）によっても骨吸収が引き起こされたが、ウサギ抗ＯＢＭ／ｓＯＢＭポリクローナル抗体（１００μｇ／ｍｌ）により有意に抑制された（図２３）。これらの結果より、本発明抗体は骨吸収抑制物質として優れていることが明らかとなった。マウス抗ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭ抗体であるＨ−ＯＢＭ９についても同様の実験を行った結果、ウサギ抗ＯＢＭ／ｓＯＢＭポリクローナル抗体とほぼ同等の骨吸収抑制活性があることが確認された。
【０１２７】
産業上の利用の可能性
本発明により、破骨細胞形成抑制因子（Ｏｓｔｅｏｃ１ａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ；ＯＣＩＦ）に結合する新規な蛋白質、その製造方法、この蛋白質を用いて該蛋白質の発現を調節する物質のスクリーニング方法、該蛋白質の作用を阻害又は修飾する物質のスクリーニング方法、該蛋白質と結合してその作用を伝達するレセプターのスクリーニング方法、及びこれらのスクリーニング方法により得られた物質を含有する医薬組成物、該蛋白質に対する抗体、及びその抗体を用いた骨代謝異常治療剤が提供される。
また、本発明により、破骨細胞形成抑制因子ＯＣＩＦに結合する新規な蛋白質（ＯＣＩＦ結合分子）をコードするＤＮＡ、そのＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質、そのＤＮＡを用いてＯＣＩＦに特異的に結合する蛋白質を遺伝子工学的に製造する方法、及び該蛋白質を含有する骨代謝治療剤が提供される。更に、ＯＣＩＦ結合分子の発現を調節するスクリーニング方法、ＯＣＩＦ結合分子と結合しその作用を阻害又は修飾する物質のスクリーニング方法、ＯＣＩＦ結合分子と結合しその作用を伝達するレセプターのスクリーニング方法、これらのスクリーニングの結果得られた物質を含有する医薬組成物が提供される。
さらに、破骨細胞形成抑制因子ＯＣＩＦに結合する新規なヒト蛋白質（ヒト由来ＯＣＩＦ結合分子、ヒトＯＢＭ）をコードするＤＮＡ、そのＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質、そのＤＮＡを用いてＯＣＩＦに特異的に結合する性質を有し、破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する生物活性を有する蛋白質を遺伝子工学的に製造する方法、及び該蛋白質を含有する骨代謝異常症治療剤が提供される。ＯＣＩＦ結合分子の発現を調節する物質のスクリーニング方法、ＯＣＩＦ結合分子と結合し、その作用を阻害又は修飾する物質のスクリーニング方法、ＯＣＩＦ結合分子と結合し、その生物作用を伝達するレセプターのスクリーニング方法、及びこれらのスクリーニングの結果得られた物質を含有する医薬組成物、さらにヒト由来ＯＣＩＦ結合蛋白質に対する抗体及びその抗体を用いた骨代謝異常症の予防及び／又は治療薬が提供される。
またさらに、本発明により、ＯＣＩＦに特異的に結合する膜結合分子（ＯＣＩＦ　ｂｉｎｄｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌｅ；ＯＢＭ）蛋白質及び膜結合部位を欠損した可溶性ＯＢＭ（ｓＯＢＭ）の両抗原を認識する抗体（抗ＯＢＭ／ｓＯＢＭ抗体）、その製造方法、この抗体を用いたＯＢＭ及びｓＯＢＭの測定方法、さらにこの抗体を有効成分とする骨代謝異常症予防及び／又は治療剤が提供される。
本発明により得られた蛋白質あるいは抗体は、医薬あるいは研究又は試験用試薬として有用である。
【０１２８】
【配列表フリーテキスト】
配列番号３：ＰＣＲプライマー　ＳＲＲ２
配列番号４：ＰＣＲプライマー　ｍｌ３ＰｒｉｍｅｒＭ３
配列番号５：ＰＣＲプライマー　ｍｌ３ＰｒｉｍｅｒＲＶ
配列番号６：ＰＣＲプライマー　ＯＢＭ＃８
配列番号７：ＰＣＲプライマー　ＯＢＭ　ＨＦ
配列番号８：ＰＣＲプライマー　ＯＢＭ　ＸＲ
配列番号９：ＰＣＲプライマー　ＯＢＭ　＃３
配列番号１０：ＰＣＲプライマー　ＯＢＭ　ＳａｌＲ２
配列番号１３：ＰＣＲプライマー　ヒトＯＢＭ　ＳＦ
配列番号１４：ＰＣＲプライマー　ヒトＯＢＭ　ＳａｌＲ２
【配列表】
2004041195.tif 000006
2004041195.tif 000007
2004041195.tif 000008
2004041195.tif 000009
2004041195.tif 000010
2004041195.tif 000011
2004041195.tif 000012
2004041195.tif 000013
2004041195.tif 000014
2004041195.tif 000015
2004041195.tif 000016
2004041195.tif 000017
2004041195.tif 000018
2004041195.tif 000019
2004041195.tif 000020
2004041195.tif 000021
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明実施例３のマウスＯＢＭ蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
〔符号の説明〕
（Ａ）：レーン１：分子量マーカー
レーン２：活性型ビタミンＤ３とデキサメサゾン存在下で培養したＳＴ２細胞からの部分精製標品（Ｇｌｙ−ＨＣｌ（ｐＨ２．０）溶出画分）
レーン３：活性型ビタミンＤ３とデキサメサゾン非存在下で培養したＳＴ２細胞からの部分精製標品（Ｇｌｙ−ＨＣｌ（ｐＨ２．０）溶出画分）
（Ｂ）：レーン１：分子量マーカー
レーン２：逆相高速液体クロマトグラフィーで精製した本発明マウスＯＢＭ蛋白質（実施例３）
【図２】実施例４の１２５Ｉで標識したＯＣＩＦの骨芽細胞様ストローマ細胞ＳＴ２への結合試験の結果を示す。
【図３】実施例５（１）の継代数の違う骨芽細胞様ストローマ細胞ＳＴ２による破骨細胞形成支持能を示す。
〔符号の説明〕
１：継代数約１０代のＳＴ２細胞の破骨細胞形成支持能
２：継代数約４０代のＳＴ２細胞の破骨細胞形成支持能
【図４】実施例５（２）の活性型ビタミンＤ３及びデキサメサゾン存在下での培養における骨芽細胞様ストロ一マ細胞膜上の本発明蛋白質発現の経時変化を示す。
【図５】実施例５（２）の共培養系における破骨細胞形成の経時変化を示す。
【図６】実施例５（３）の共培養期間において、種々の培養期間のみＯＣＩＦ処理した場合の破骨細胞形成抑制効果を示す。
【図７】実施例６の１２５１標識ＯＣＩＦと本発明蛋白質とのクロスリンキング試験の結果を示す。
〔符号の説明〕
レーン１：１２５Ｉ標識ＯＣＩＦ−ＣＤＤｌ
レーン２：１２５Ｉ標識ＯＣＩＦ−ＣＤＤｌとＳＴ２細胞をクロスリンクさせたもの
レーン３：４００倍濃度の未標識ＯＣＩＦを添加してクロスリンクさせたもの
【図８】実施例９における、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
〔符号の説明〕
レーン１：ｐＯＢＭ２９１をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の蛋白質を、ＯＣＩＦ無添加で免疫沈降させたもの
レーン２：　ｐＯＢＭ２９１をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の蛋白質を、ＯＣＩＦを添加して免疫沈降させたもの
【図９】実施例１０における、１２５Ｉで標識したＯＣＩＦの、ｐＯＢＭ２９１をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞への結合試験の結果を示す。
〔符号の説明〕
レーン１及び２：１２５Ｉで標識したＯＣＩＦの、ｐＯＢＭ２９１をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞への結合量
レーン３及び４：１２５Ｉで標識したＯＣＩＦの、ｐＯＢＭ２９１をトランスフェクしたＣＯＳ−７細胞への結合量（４００倍濃度の未標識ＯＣＩＦ添加時）
【図１０】実施例１１における、１２５Ｉで標識したＯＣＩＦを用いたクロスリンク試験の結果を示す。
〔符号の説明〕
レーン１：１２５Ｉ標識ＯＣＩＦ
レーン２：１２５Ｉ標識ＯＣＩＦと、ｐＯＢＭ２９１をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞をクロスリンクさせたもの
レーン３：４００倍濃度の未標識ＯＣＩＦ存在下て、１２５Ｉ標識ＯＣＩＦと、ｐＯＢＭ２９１をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞をクロスリンクさせたもの
【図１１】実施例１２における、ノーザンブロットの結果を示す。
〔符号の説明〕
レーン１：ビタミンＤ及びデキサメサゾン無添加で培養したＳＴ２細胞由来ＲＮＡ
レーン２：ビタミンＤ及びデキサメサゾンを添加し培養したＳＴ２細胞由来ＲＮＡ
【図１２】実施例１３‐（２）における、ＯＣＩＦ濃度を変えた時の培養上清中蛋白質のＯＣＩＦ結合能を示す。
〔符号の説明〕
○：ｐＣＥＰ４
●：ｐＣＥＰ　ｓＯＢＭ
【図１３】実施例１３‐（２）における、培養上清の割合を変えた時の培養上清中蛋白質のＯＣＩＦ結合能を示す。
〔符号の説明〕
○：ｐＣＥＰ４
●：ｐＣＥＰ　ｓＯＢＭ
【図１４】実施例１４−（２）における、大腸菌で発現させたチオレドキシンとマウスＯＢＭの融合蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
〔符号の説明〕
レーン１：分子量マーカー
レーン２：ＧＩ７２４／ｐＴｒｘＦｕｓ由来可溶性蛋白質画分
レーン３：ＧＩ７２４／ｐＴｒｘＯＢＭ２５由来可溶性蛋白質画分
【図１５】実施例１４‐（３）における、可溶性蛋白質画分の割合を変えた時の０ＣＩＦ結合能を示す。
〔符号の説明〕
□：ＧＩ７２４／ｐＴｒｘＦｕｓ
○：ＧＩ７２４／ｐＴｒｘＯＢＭ２５
【図１６】実施例１４‐（３）における、ＯＣＩＦ濃度を変えた時の可溶性蛋白質画分（１％）のＯＣＩＦ結合能を示す。
〔符号の説明〕
□：ＧＩ７２４／ｐＴｒｘＦｕｓ
○：ＧＩ７２４／ｐＴｒｘＯＢＭ２５
【図１７】本発明のマウスＯＢＭ　ｃＤＮＡにより発現され精製して得られる蛋白質マウスＯＢＭ、及び天然型の精製ＯＣＩＦ結合蛋白質とＯＣＩＦとの特異的結合能の、ウサギ抗マウスＯＢＭ抗体による阻害結果を示す。
〔符号の説明〕
１：抗体で処理したｃＤＮＡにより発現され精製して得られる蛋白質、ＯＢＭ＋１２５Ｉ−ＯＣＩＦ
２：抗体で処理した天然型の蛋白質＋１２５Ｉ‐ＯＣＩＦ
３：抗体未処理のｃＤＮＡにより発現されて得られる蛋白質、マウスＯＢＭ＋１２５Ｉ‐ＯＣＩＦ
４：抗体未処理の天然型の蛋白質＋１２５Ｉ‐ＯＣＩＦ
５：３＋非標識ＯＣＩＦ（１２５Ｉ−ＯＣＩＦの４００倍量）
６：４＋非標識ＯＣＩＦ（１２５Ｉ−ＯＣＩＦの４００倍量）
【図１８】本発明のｃＤＮＡにより発現される蛋白質、ヒトＯＢＭのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
〔符号の説明〕
レーン１：分子量マーカー
レーン２：本発明のｃＤＮＡを含む発現ベクター、ｐｈＯＢＭをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の蛋白質をＯＣＩＦ無添加でウサギ抗ＯＣＩＦポリクローナル抗体で免疫沈降させたもの
レーン３：本発明ｃＤＮＡを含む発現ベクター、ｐｈＯＢＭをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の蛋白質をＯＣＩＦ添加でウサギ抗ＯＣＩＦポリクローナル抗体で免疫沈降させたもの
【図１９】本発明ｃＤＮＡを含む発現ベクター、ｐｈＯＢＭをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞へのＯＣＩＦの結合試験の結果を示す。
〔符号の説明〕
レーン１：ｐｈＯＢＭをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞に１２５Ｉ　−ＯＣＩＦを添加したもの
レーン２：ｐｈＯＢＭをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞に１２５Ｉ　−ＯＣＩＦを添加し、さらに４００倍量の非標識ＯＣＩＦを加えたもの
【図２０】本発明ｃＤＮＡでコードされる蛋白質、ヒトＯＢＭと１２５Ｉ　−ＯＣＩＦ（モノマー型）とのクロスリンキング試験の結果を示す。
〔符号の説明〕
レーン１：　１２５Ｉ−ＯＣＩＦ
レーン２：　１２５Ｉ‐ＯＣＩＦとｐｈＯＢＭをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞膜上の蛋白質とをクロスリンクさせたもの
レーン３：４００倍濃度の非標識ＯＣＩＦ存在下で、１２５Ｉ　−ＯＣＩＦとｐｈＯＢＭをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞膜上の蛋白質とをクロスリンクさせたもの
【図２１】実施例２３‐（２）における、ＯＣＩＦ濃度を変えた時の培養液上清中蛋白質（分泌型ｈＯＢＭ）のＯＣＩＦ結合能を示す。
〔符号の説明〕
○：分泌型ヒトＯＢＭをコードするｃＤＮＡを含まないベクターのみのｐＣＥＰ４をトランスフェクトした２９３−ＥＢＮＡ細胞の培養液
●：分泌型ヒトＯＢＭをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターのｐＣＥＰｓｈＯＢＭをトランスフェクした２９３−ＥＢＮＡ細胞の培養液
【図２２】実施例２３‐（２）における、ＯＣＩＦ濃度を一定にし、添加する培養液量を変えた時の培養液上清中蛋白質（分泌型ヒトＯＢＭ）のＯＣＩＦ結合能を示す。
〔符号の説明〕
○：分泌型ヒトＯＢＭをコードするｃＤＮＡを含まないベクターのみのｐＣＥＰ４をトランスフェクトした２９３−ＥＢＮＡ細胞の培養液
●：分泌型ヒトＯＢＭをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターのｐＣＥＰｓｈＯＢＭをトランスフェクトした２９３−ＥＢＮＡ細胞の培養液
【図２３】大腸菌で発現させたチオレドキシンとヒトＯＢＭの融合蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
〔符号の説明〕
レーン１：分子量マーカー
レーン２：大腸菌ＧＩ７２４／ｐＴｒｘＦｕｓ由来可溶性蛋白質画分
レーン３：大腸菌ＧＩ７２４／ｐＴｒｘｈＯＢＭ由来可溶性蛋白質画分
【図２４】実施例２４‐（３）における、チオレドトキシンとヒトＯＢＭの融合蛋白質を含む大腸菌由来可溶性蛋白質画分の添加割合を変えた時の融合蛋白質と、ＯＣＩＦとの結合能を示す。
〔符号の説明〕
○：大腸菌ＧＩ７２４／ｐＴｒｘＦｕｓ由来可溶性蛋白質画分
●：大腸菌ＧＩ７２４／ｐＴｒｘｓｈＯＢＭ由来可溶性蛋白質画分
【図２５】実施例２４‐（３）における、ＯＣＩＦ濃度を変えた時の大腸菌由来可溶性蛋白質画分中のチオレドトキシンとヒトＯＢＭの融合蛋白質と、ＯＣＩＦとの結合能を示す。
〔符号の説明〕
○：大腸菌ＧＩ７２４／ｐＴｒｘＦｕｓ由来可溶性蛋白質画分
●：大腸菌ＧＩ７２４／ｐＴｒｘｓｈＯＢＭ由来可溶性蛋白質画分
【図２６】本発明のウサギ抗ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによる、ヒトＯＢＭ及びｓＯＢＭの測定結果を示す。
〔符号の説明〕
口：ヒトＯＢＭ
●：ヒトｓＯＢＭ
【図２７】本発明の抗ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによる、ヒトＯＢＭ及びｓＯＢＭの測定結果を示す。
〔符号の説明〕
□：ヒトＯＢＭ
●：ヒトｓＯＢＭ
【図２８】本発明のマウスＯＢＭ及びｓＯＢＭにも交差性を有する抗ヒトＯＢＭ／ｓＯＢＭモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによる、マウスＯＢＭ及びｓＯＢＭの測定結果を示す。
〔符号の説明〕
□：マウスＯＢＭ
●：マウスｓＯＢＭ
【図２９】チオレドトキシンとマウスＯＢＭの融合蛋白質によるヒト破骨細胞様細胞形成の促進活性を示す。
【図３０】ビタミンＤ３刺激による骨吸収活性の、抗ＯＢＭ／ｓＯＢＭ抗体による抑制を示す。
【図３１】プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）刺激による骨吸収活性の、抗ＯＢＭ／ｓＯＢＭ抗体による抑制を示す。
【図３２】副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）刺激による骨吸収活性の、抗ＯＢＭ／ｓＯＢＭ抗体による抑制を示す。
【図３３】インターロイキン１α（１Ｌ−１）刺激による骨吸収活性の、抗ＯＢＭ／ｓＯＢＭ抗体による抑制を示す。
【図１】
2004041195.tif 000022
【図２】
2004041195.tif 000023
【図３】
2004041195.tif 000024
【図４】
2004041195.tif 000025
【図５】
2004041195.tif 000026
【図６】
2004041195.tif 000027
【図７】
2004041195.tif 000028
【図８】
2004041195.tif 000029
【図９】
2004041195.tif 000030
【図１０】
2004041195.tif 000031
【図１１】
2004041195.tif 000032
【図１２】
2004041195.tif 000033
【図１３】
2004041195.tif 000034
【図１４】
2004041195.tif 000035
【図１５】
2004041195.tif 000036
【図１６】
2004041195.tif 000037
【図１７】
2004041195.tif 000038
【図１８】
2004041195.tif 000039
【図１９】
2004041195.tif 000040
【図２０】
2004041195.tif 000041
【図２１】
2004041195.tif 000042
【図２２】
2004041195.tif 000043
【図２３】
2004041195.tif 000044
【図２４】
2004041195.tif 000045
【図２５】
2004041195.tif 000046
【図２６】
2004041195.tif 000047
【図２７】
2004041195.tif 000048
【図２８】
2004041195.tif 000049
【図２９】
2004041195.tif 000050
【図３０】
2004041195.tif 000051
【図３１】
2004041195.tif 000052
【図３２】
2004041195.tif 000053
【図３３】
2004041195.tif 000054