(57)【要約】【課題】ＥＴ−ＮＡＮＢウィルス物質に由来するウィルスタンパク質及びそのフラグメントを含んで成る組成物、およびＥＴ−ＮＡＮＢゲノム配列、ならびにそれらの調製方法及びそれらの使用（診断及びワクチン生成、ＥＴ−ＮＡＮＢウィルスタンパク質の調製に及びウィルス検出のためのプローブ）。【解決手段】ＨＥＶゲノムの２番目のオープンリーディングフレームによってコードされるキャプシドタンパク質のＣ末端の４２アミノ酸を含むペプチドを、薬理学的に受容可能なキャリア中に含む、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）に対して個体を免疫する際に使用されるワクチン組成物。そのゲノムが、Ｅ．コリ株ＢＢ４に担持され、そしてＡＴＣＣ寄託番号第６７７１７号を有するプラスミドｐＴＺＫＦ１（ＥＴ１．１）に存在する１．３３ＫｂのＤＮＡ　ＥｃｏＲＩ挿入体のコード領域に相同である領域を含む腸内伝達された非一Ａ／非一Ｂウィルス肝炎物質に由来するタンパク質。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）に対して個体を免疫する際に使用されるワクチン組成物であって、該組成物は、該ＨＥＶゲノムの２番目のオープンリーディングフレームによってコードされるキャプシドタンパク質のＣ末端の４２アミノ酸を含むペプチドを、薬理学的に受容可能なキャリア中に含む、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、前記ペプチドが、（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列または（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む、組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物であって、前記ペプチドが、（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列または（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む、組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物であって、前記ペプチドが、キャリアタンパク質に結合されている、組成物。
【請求項５】
Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）感染を中和することができる抗体を含むワクチン組成物であって、該中和は、培養中の初代ヒト肝細胞のＨＥＶ感染を該組成物が阻止する能力によって示される、組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の組成物であって、（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列または（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むペプチドと免疫反応性である抗体を含む、組成物。
【請求項７】
請求項５に記載の組成物であって、（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列または（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むペプチドと免疫反応性である抗体を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
（関連出願へのクロスリファーレンス）
本出願は、１９８８年６月１７日に出願されたアメリカ特許第２０８，９９７号の一部継続出願である、１９８９年４月１１日に出願されたアメリカ特許第３３６，６７２号の一部継続出願である、１９８９年６月１６日に出願されたアメリカ特許第３６７，４８６号の一部継続出願である、１９８９年１０月１３日に出願されたアメリカ特許第４０２，９２１号の一部継続出願である、１９９０年４月５日に出願されたアメリカ特許第０７／５０５，８８８号の一部継続出願であり、これらのすべては本明細書に引用により組込まれる。
【０００２】
（序論）
（発明の分野）
本発明は、組換えタンパク質、遺伝子及び遺伝子プローブ、及びより詳しくは、腸内伝達された非−Ａ／非−Ｂ肝炎ウィルス物質に由来するようなタンパク質及びプローブ、前記タンパク質及びプローブを用いる診断方法及びワクチン用途、及び診断及び予防に特に有用である特異的エピトープ（及びこれらのエピトープを含むように人工的に生成されたタンパク質）をコードする遺伝子セグメントに関する。
【０００３】
【従来の技術】
（背景）
腸内伝達された非−Ａ／非−Ｂ肝炎ウィルス物質（ＥＴ−ＮＡＮＢ：またＨＥＶとしても言及される）は、アジア、アフリカ、ヨーロッパ、メキシコ及びインド亜大陸におけるいくつかの伝行病及び特発性病における肝炎の報告された原因である。感染は、通常、糞により汚染された水によるが、但しウィルスはまた、密接な物理的接触により広がる。ウィルスは、慢性的な感染を引き起こすように思えない。ＥＴ−ＮＡＮＢにおけるウィルス性病因は、プールされた糞分離物による志願者の感染により示されており；免疫電子顕微鏡（ＩＥＭ）研究は感染された個人からの糞における直径２７〜３４ｎｍのウィルス粒子を示した。そのウィルス粒子は、地理的に明確な領域からの感染された個人からの血清における抗体と反応し、これは、単一のウィルス物質又は単一のウィルスの種類が全世界に見られるＥＴ−ＮＡＮＢ肝炎の大部分の原因であることを示唆する。抗体反応は、腸内伝達されたＮＡＮＢウィルス（また、Ｃ型肝炎ウィルス又はＨＣＶとしても知られている）により感染された個人からの血清においては見られず、これは、２種のＮＡＮＢタイプの間での異なった特異性を示す。
【０００４】
血清学的差異の他に、それらの２種のタイプのＮＡＮＢ感染は、明確な臨床学的差異を示す。ＥＴ−ＮＡＮＢは、発熱及び関節痛にしばしば関連し、そして門戸炎症を伴い且つ、肝臓バイオプシー検体（Ａｒａｎｋａｌｌｅ）における関連する胆汁静止を伴う急性感染を特徴とする。症状は通常、６週間内に散らされる。対照的に、腸外伝達されたＮＡＮＢは、約５０％の場合において、慢性感染を生む。発熱及び関節痛はめったに見られず、そして炎症が優先的に実質的な分布を有する（Ｋｈｕｒｏｏ，１９８８）。ＥＴ−ＮＡＮβの経路は一般的に、健康な個人においては平凡であり、そして感染されたこれらの大部分は、ＨＣＶにより見られる慢性的な後遺症なしに回復する。しかしながら、この疾病の１つの特別な流行学的特徴は、妊婦に観察される著しく高い死亡率であり；これは１０〜２０％の程度であることが多くの研究から報告されている。この発見は、多くの流行学的研究において見出されているが、しかし現在、未解決のまま存続する。これがウィルス病原性に影響を及ぼしても、しなくても、ウィルス及び免疫抑制された（妊娠）宿主の相互作用の致死的な結果又は感染しやすい非栄養状態の集団の衰弱した出生前健康の影響が、明らかにされるべき残っている。
【０００５】
これらの２種のウィルス物質はまた、霊長類宿主の感受性に基づいて区別され得る。ＥＴ−ＮＡＮＢ（但し、非腸内伝達物質ではない）は、マカクザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ　ｍｏｎｋｅｙ）に伝達され得る。非腸内伝達された物質は、ＥＴ−ＮＡＮＢよりもチンパンヂーにより容易に伝達される（Ｂｒａｄｌｅｙ，１９８７）。
【０００６】
ＥＴ−ＮＡＮＢ肝炎に関連するウィルスゲノム配列を同定し、そしてクローン化するために、世界で多くの努力が行なわれて来た。ウィルス特異的ゲノム配列を必要とするこの努力の１つの目的は、ウィルス及びそのタンパク質生成物の性質を同定し、そして特徴づけることである。もう１つの目的は、抗体基礎の診断方法に及びワクチンのために使用され得る組換えウィルスタンパク質を生成することである。これらの努力にもかかわらず、ＥＴ−ＮＡＮＢ肝炎に関連するウィルス配列は、これまで都合良く同定されておらず、又はクローン化されてもおらず、又はいづれかウィルス特異的タンパク質も同定されても又は生成されてもいない。
関連文献
【０００７】
【表１】
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【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、ＥＴ−ＮＡＮＢの大めのウィルス物質に由来するウィルスタンパク質及びそのフラグメントを含んで成る組成物、その調製方法及びその使用を提供することを目的とする。本発明は、診断及びワクチン生成に特に有用であるウィルスタンパク質の多くの特定のフラグメント（及びその対応する遺伝子配列）を提供することもまた目的とする。本発明はまた、ＥＴ−ＮＡＮＢウィルスタンパク質の調製に及びウィルス検出のためのプローブとして使用されるＥＴ−ＮＡＮＢゲノム配列を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
項１．　そのゲノムが、Ｅ．コリ株ＢＢ４に担持され、そしてＡＴＣＣ寄託番号第６７７１７号を有するプラスミドｐＴＺＫＦ１（ＥＴ１．１）に存在する１．３３ＫｂのＤＮＡ　ＥｃｏＲＩ挿入体のコード領域に相同である領域を含む腸内伝達された非一Ａ／非一Ｂウィルス肝炎物質に由来するタンパク質。
【００１０】
項２．　上記１．３３ＫｂのＥｃｏＲＩ挿入体内の完全なコード領域によりコードされる第１項記載のタンパク質。
【００１１】
項３．　３．そのゲノムが、下記第１配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．２）：
【００１２】
【表２】
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又はそれに相補的な配列を有するＤＮＡ分子のコード領域に相同である領域を含む腸内伝達された非Ａ／非Ｂウィルス肝炎物質に由来する組換えタンパク質。
【００１３】
項４．　（ａ）腸内伝達された非Ａ／非Ｂ肝炎により感染された個人に存在する抗体と免疫反応性であり、そして（ｂ）そのゲノムが、Ｅ．コリ株ＢＢ４に担持され、そしてＡＴＣＣ寄託番号第６７７１７号を有するプラスミドｐＴＺＫＦ１（ＥＴ１．１）に存在する１．３３ＫｂのＤＮＡＥｃｏＲＩ挿入休に相同である領域を含むウィルス肝炎物質に由来するタンパク質。
【００１４】
項５．　上記１．３３ＫｂのＥｃｏＲＩ挿入体内のコード領域によりコードされる第４項記載の方法。
【００１５】
項６．　（ａ）腸内伝達された非Ａ／非Ｂ肝炎により感染された個人に存在する抗体と免疫反応性であり、そして（ｂ）遺伝子配列４０６．３−２又は４０６．４−２又はそのフラグメントによりコードされるタンパク質。
【００１６】
項７．　試験個人における腸内伝達された非Ａ／非Ｂ肝炎ウィルス物質による感染を検出するための方法であって：
（ａ）腸内伝達された非Ａ／非Ｂ肝炎により感染された個人に存在する抗体と免疫反応性であり、そして（ｂ）そのゲノムが、Ｅ．コリ株ＢＢ４に担持され、そしてＡＴＣＣ寄託番号第６７７１７号を有するプラスミドｐＴＺＫＦ１（ＥＴ１．１）に存在する１．３３ＫｂのＤＮＡ　ＥｃｏＲＩ挿入体に相同である領域を含むウィルス肝炎物質に由来するペプチド抗原を供給し、
そのような抗原と試験個人からの血清とを反応せしめ、そして
結合された抗体の存在について上記抗原を試験することを含んで成る方法。
【００１７】
項８．　上記血清抗体がＩｇＭ又はＩｇＧ抗体、又は、両者の混合物であり、上記供給された抗原が支持体に結合され、上記反応がそのような血清と支持体とを接触することを包含し、そして上記試験が上記支持体及び結合された血清抗体とリポーターラベルされた抗−ヒト抗体とを反応せしめることを包含する第７項記載の方法。
【００１８】
項９．　腸内伝達された非Ａ／非Ｂ肝炎感染の診断に役立つ血清抗体の存在を確かめるためのキットであって、
（ａ）腸内伝達された非Ａ／非Ｂ肝炎物質により感染された個人に存在する抗体と免疫反応性であり、そして（ｂ）そのゲノムが、Ｅ．コリ株ＢＢ４に担持され、そしてＡＴＣＣ寄託番号第６７７１７号を有するプラスミドｐＴＺＫＦ１（ＥＴ１．１）に存在する１．３３ＫｂのＤＮＡ　ＥｃｏＲＩ挿入体に相同である領域を含むウィルス肝炎物質に由来する表面結合組換えペプチド抗原を含む支持体、及びリポーターラベルされた抗一ヒト抗体を含んで成るキット。
【００１９】
項１０．　そのゲノムが、Ｅ．コリ株ＢＢ４に担持され、そしてＡＴＣＣ寄託番号第６７７１７号を有するプラスミドｐＴＺＫＦ１（ＥＴ１．１）に存在する１．３３ＫｂのＤＮＡＥｃｏＲＩ挿入体に相同である領域を含む腸内伝達された非−Ａ／非−Ｂウィルス肝炎物質に由来するＤＮＡフラグメント。
【００２０】
項１１．　上記１．３３ＫｂのＥｃｏＲＩ挿入体に由来する第１０項記載のフラグメント。
【００２１】
項１２．　遺伝子配列４０６．３−２又は４０６．４−２又はそのフラグメント（そのフラグメントは少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含んで成る）を含んで成るＤＮＡ分子。
【００２２】
項１３．　そのゲノムが、下記第１配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１）：
【００２３】
【表３】
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又はそれに相補的な配列内のＤＮＡフラグメントに相同である領域を含む腸内伝達された非Ａ／非Ｂウィルス肝炎物質に由来するＤＮＡフラグメント。
【００２４】
項１４．　容器又は別々の容器に、そのゲノムが、Ｅ．コリ株ＢＢ４に担持され、そしてＡＴＣＣ寄託番号第６７７１７号を有するプラスミドｐＴＺＫＦ１（ＥＴ１．１）に存在する１．３３ＫｂのＤＮＡ　ＥｃｏＲＩ挿入体に相同である領域を含む腸内伝達されたウィルス肝炎物質に由来するＤＮＡ複合フラグメントの対立鎖の非相同領に由来する一対の一本鎖プライマーを含んで成るキット。
【００２５】
項１５．　上記プラスミドにおけるＥｃｏＲＩ複合挿入体の対立鎖に由来する第１５項記載のキット。
【００２６】
項１６．　生物学的サンプルにおける腸内伝達された非Ａ／非Ｂ肝炎ウィルス物質を検出するための方法であって、上記サンプルに由来する複合ＤＮＡフラグメントの混合物を調製し、
上記複合フラグメントを変性し、
上記変性されたＤＮＡフラグメントに、
そのゲノムが、Ｅ．コリ株ＢＢ４に担持され、そしてＡＴＣＣ寄託番号第６７７１７号を有するプラスミドｐＴＺＫＦ１（ＥＴ１．１）に存在する１．３３ＫｂのＤＮＡ　ＥｃｏＲＩ挿入体に相同である領域を含む腸内伝達されたウィルス肝炎物質に由来するＤＮＡ複合フラグメントの対立鎖の非相同領に由来する一対の一本鎖プライマーを付加し、
腸内伝達された非Ａ／非Ｂ肝炎物質に由来するそのような複合ＤＮＡフラグメントの対立鎖の相同配列領域に上記プライマーをハイブリダイズし、
プライマー配列を含む新規ＤＮＡ複合体を形成するために、ＤＮＡヌクレオチドの存在下でＤＮＡポリマラーゼと上記プライムされたフラグメント鎖とを反応せしめ、そして
所望する程度の配列の増幅が達成されるまで、上記変性、付加、ハイブリダイゼーション及び反応段階をくり返すことを含んで成る方法。
【００２７】
項１７．　上記プライマーが、上記プラスミドにおけるＥｃｏＲＩ複合挿入体の対立鎖に由来する第１６項記載の方法。
【００２８】
項１８．　上記ウィルス物質により感染された培養細胞のサンプルにおけるウィルス物質の存在を検出するための第１６項記載の方法。
【００２９】
項１９．　腸内伝達された非Ａ／非Ｂ肝炎ウィルス物質に対する個人の免疫化のためのワクチンであって、薬理学的に許容できるアジュバントに、そのゲノムが、Ｅ．コリ株ＢＢ４に担持され、そしてＡＴＣＣ寄託番号第６７７１７号を有するプラスミドｐＴＺＫＦ１（ＥＴ１．１）に存在する１．３３ＫｂのＤＮＡ　ＥｃｏＲＩ挿入体に相同である領域を含む腸内伝達された非−Ａ／非−Ｂウィルス肝炎物質に由来する組換えタンパク質を含んで成るワクチン。
【００３０】
項２０．　上記タンパク質が、上記プラスミドにおけるＥｃｏＲＩ挿入体に由来する第１９項記載のワクチン。
【００３１】
項２１．　ＨＥＶに対する個人の免疫化のためのワクチンであって、薬理学的に許容できるアジュバントに、遺伝子配列４０６．３−２又は４０６．４−２又はそのフラグメントによりコードされたタンパク質を含んで成るワクチン。
【００３２】
項２２．　腸内伝達された非Ａ／非Ｂウィルス物質又はその物質により生成される核酸フラグメントを単離するための方法であって、上記物質の源として、腸内伝達された非Ａ／非Ｂ肝炎の活性感染を有するヒト又はマカクザルから得られた胆汁を利用することを含んで成る方法。
【００３３】
項２３．　上記胆汁が感染されたマカクザルから得られる第２２項記載の方法。
【００３４】
項２４．　そのゲノムが、Ｅ．コリ株ＢＢ４に担持され、そしてＡＴＣＣ寄託番号第６７７１７号を有するプラスミドｐＴＺＫＦ１（ＥＴ１．１）に存在する１．３３ＫｂのＤＮＡ　ＥｃｏＲＩ挿入体に相同である領域を含む腸内伝達された非−Ａ／非−Ｂウィルス肝炎物質に由来するタンパク質により免疫化されたヒトから得られたヒトポリクローナル抗−血清。
【００３５】
【発明の実施の形態】
（発明の要約）
ＥＴ−ＮＡＮＢの大めのウィルス物質に由来するウィルスタンパク質及びそのフラグメントを含んで成る組成物、その調製方法及びその使用が提供される。診断及びワクチン生成に特に有用であるウィルスタンパク質の多くの特定のフラグメント（及びその対応する遺伝子配列）がまた開示されている。ＥＴ−ＮＡＮＢウィルスタンパク質の調製方法は、ＥＴ−ＮＡＮＢゲノム配列の単離及び続く宿主細胞へのクローン化及び発現を包含する。得られた組換えウィルスタンパク質は、診断用物質及びワクチンとして使用される。ゲノム配列及びそのフラグメントは、ＥＴ−ＮＡＮＢウィルスタンパク質の調製に及びウィルス検出のためのプローブとして使用される。
【００３６】
（特定の態様の記載）
ＥＴ−ＮＡＮＢのためのウィルス物質に由来する一般的配列及びそのフラグメントを含んで成る新規の組成物、並びにそのゲノム配列を用いて生成された組換えウィルスタンパク質及びそれらの組成物を用いる方法が提供される。診断及びワクチン生成において特に有用である、ウィルスタンパク質上のエピトープが同定された。そのエピトープを含む小さなペプチドが、ＥＴ−ＮＡＮＢにより感染された多くの地域の患者により認識される。
【００３７】
ＨＥＶの分子クローニングは、２種のひじょうに異なったアプローチにより達成された。分子クローンの第１の好結果をもたらす同定は、感染された及び感染されていないマカクザルの胆汁からの非相同ｃＤＮＡへの推定上のＨＥＶ　ｃＤＮＡクローンの特異的ハイブリダイゼーションに基づかれた。両源からのｃＤＮＡは、感染された源のプローブに特異的にハィブリダイズしたクローンを同定するために３２Ｐにより高い比活性にラベルされた。ＨＥＶのＢｕｒｍａ単離物により感染されたマカクザルが、これらの第１の実験に使用された。この方法の感度は、全体のバックグラウンドに対する特異的配列の相対的量に直接的に関係する。対照の実験において、標的配列の特異的な同定は、１０００バックグラウンド配列当たり１特異的部分ほどにより得られることが見出された。多くのクローンは、感染された（Ｂｒｕｍａ単離物）及び対照の感染されていないマカクザルの胆汁から製造されたライブラリー及びプローブを用いてこの方法により同定された。この手段により精製された１６個のプラークのうち第１の広範囲に特徴づけられたクローンがＥＴ１．１として与えられた。
【００３８】
ＥＴ１．１はまず、感染された源のｃＤＮＡに由来し、そしてそれに対してユニークなものとして特徴づけられた。非相同性ｃＤＮＡが、配列非依存性単一第一増幅技法（ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｓｉｎｇｌｅ　ｐｒｅｍｉｅｒ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）（ＳＩＳＰＡ）を用いて、感染された及び感染されていない両源から増幅された。この技法は、１９８８年６月１７日に出願された同時継続出願第２０８，５１２号に記載されている。Ｂｕｒｍａ感染されたマカクザルの胆汁から製造されたｃＤＮＡの制限されたプールが、次に、プローブとして推定上のＨＥＶクローンを用いてクローニング又はハイブリダイゼーションの前、酵素的に増幅され得る。ＥＴ１．１は、感染源からの起源の胆汁ｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズした。ＨＥＶのゲノムに由来するようなこのクローンの追加の評価は、ＥＴ１．１配列の類似性により示され、そしてそれらの配列は、５種のＥＴ−ＮＡＮＢＨ流行病患者、たとえばソマリヤ、タシュケント、ボルネオ、メキシコ及びパキスタン人から集められた５種のヒト便サンプルから調製されたＳＩＳＰＡ　ｃＤＮＡに存在する。これらの分子流行学的研究は、世界のＥＴ−ＮＡＮＢＨの主要原因を表わすウィルスに由来するような単離された配列を確立した。
【００３９】
ＥＴ１．１のウィルス特異性は、クローンが感染されたマカクザルの肝臓から抽出されたＲＮＡに特異的にハイブリダイズする発現によりさらに確立された。ポリアデニル化されたＲＮＡのハイブリダイゼーション分析は、感染されていない肝臓に存在しないユニークな７．５Ｋｂのポリアデニル化された転写体を示した。この転写体の大きさは、それが十分な長さのウィルスゲノムを表わすことを示唆した。鎖特異的オリゴヌクレオチドがまた、ヒトの便から調製された半精製ビリオンから直接的に抽出されたウィルスゲノムＲＮＡをプローブするために使用された。鎖特異性は、ＥＴ１．１に同定されるＲＮＡ一指図されたＲＮＡポリマラーゼ（ＲＤＲＰ）の読み取り枠（ＯＲＦ）に基づかれた（下記参照のこと）。センス鎖を検出するプローブのみが、核酸にハイブリダイズした。これらの研究は、陽性センスの一本鎖ゲノムとしてＨＥＶを特徴づけた。肝臓から抽出されたＲＮＡに対する鎖特異的ハイブリダイゼーションはまた、大多数の細胞内転写物が陽性センスであることを確立した。ウィルス発現のための新規の機構がなければ、負の鎖が、検出できないけれども、センス鎖に比較して、１：１００以下の比で存在するであろう。
【００４０】
ＥＴ１．１は、感染されていないヒト、感染された及び感染されていないマカクザルに由来するゲノムＤＮＡ及びまた、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び種々のバクテリオファージ源からのゲノムＤＮＡを用いて、サザンプロットハイブリダイゼーション及びＰＣＲの両者により試験される場合、外因性であるとして示された。後者は、ｃＤＮＡ構成及び増幅の間に行なわれる種々の酵素的操作の間に導入される外因性配列によるつまらない汚染を妨げるために試験された。ＥＴ１．１クローンのヌクレオチド配列は、遺伝子銀行のデータベースにおけるいづれの登録物に対しても相同でないことがまた見出された。しかしながら、ＥＴ１．１クローンの翻訳された読み取り枠は、ＲＮＡ指図されたＲＮＡポリマラーゼと一致したコンセンサスアミノ酸残基と制限された相同性を示した。このコンセンサスアミノ酸モチーフは、すべての陽性鎖ＲＮＡウィルスの間で共通し、そして上記のように、ＨＣＶゲノムの３’末端で存在する。従って、１．３Ｋｂのクローンは、ウィルスゲノムの非構造部分に少なくとも一部由来することが予測された。　本発明により示されたＥＴ−ＮＡＮＢの種々の鎖のお互いへの関係のために、ＥＴ−ＮＡＮＢウィルス物質のゲノムは、Ｅ．コリ株ＢＢ４に担持され、そしてＡＴＣＣ寄託番号第６７７１７号を有するプラスミドｐＴＺＫＦ１（ＥＴ１．１）に存在する１．３３ＫｂのＤＮＡ　ＥｃｏＲＩ挿入体に対して相同である領域を含むものとして本明細書に定義される。両方向での全体の配列が、下記に示されるようにして同定された。両鎖の配列が、両鎖がタンパク質をコードすることができるので、供給された。しかしながら、片方向での配列は、既知のタンパク質への統計学的類似性のため及び前方配列が優先的にタンパク質コードしていることが知られているので、“前方”配列として命名された。この配列は、３種の可能な翻訳配列と共に、下記に示される。イソロイシンを有するヌクレオチド１４５で出発し、そして配列の末端に拡張する１本の長い読み取り枠が存在する。２種の他の読み取り枠が多くの停止コドンを有する。ヌクレオチド及びアミノ酸のための標準の略語が本明細書で使用される。
【００４１】
下記に与えられる遺伝子配列は、親出願に与えられる配列と実質的に同一である。本出願の配列は、５’末端で初めの３７個のヌクレオチド及び３’末端で最後の１３個のヌクレオチドの欠失において異なり、これらは、ウィルスに由来するよりもむしろ、クローニングのために使用されるリンカーに由来する。さらに、Ｇが、親出願に与えられる配列の位置２２７で欠除された。
【００４２】
次の遺伝子配列はＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１を有し；ヌクレオチド１で始まる読み取り枠における第１アミノ酸配列はＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．２を有し；ヌクレオチド２で始まる読み取り枠における第２アミノ酸配列はＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．３を有し；そしてヌクレオチド３で始まる読み取り枠における第３アミノ酸配列はＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．４を有する。
【００４３】
【表４】
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“逆配列”として本明細書で言及される相補的鎖が、上記に示される前方配列と同じ態様で下記に示される。前方配列に見出される長い読み取り枠よりも短いいくつかの読み取り枠が、この逆配列に見出され得る。逆方向における読み取り枠の相対的な短さのために、それらは、たぶん発現されない。
【００４４】
次の遺伝子配列は、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．５を有する。
【００４５】
【表５】
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病因物質における配列とこの配列との同一性は、ビルマで単離されたウィルス株に対応する配列を配置することによって確証された。ビルマ人からの単離物は、次の配列のヌクレオチドを含む（１つの鎖及び示される読み取り枠）。次の遺伝子配列は、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．６を有し；ＯＲＦ１に対応するタンパク質配列はＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．７を有し；ＯＲＦ２はＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．８を有し；そしてＯＲＦ３はＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．９を有する。
【００４６】
【表６】
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2004043470.tif 000036
2004043470.tif 000037
2004043470.tif 000038
2004043470.tif 000039
2004043470.tif 000040
2004043470.tif 000041
この配列における塩基の合計数は７１９５個である。クローン化された配列に存在するポリ−Ａ末端は排除された。
【００４７】
他のＮＡＮＢ肝炎株から遺伝子材料を単離し、そして同定するための本明細書に記載される方法の能力が、メキシコで得られた単離物から遺伝子物質を同定することによって確証された。この単離物の配列は、上記ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１に示されるＥＴ１．１配列に約７５％同一であった。この配列は、下記セクションＩＩＢに示される条件を用いてのハイブリダイゼーションにより同定された。
【００４８】
ウィルスの単離へのこの種々のアプローチにおいて、ｃＤＮＡライブラリーは、ＴｅｌｉｘｆａｃにおけるＥＴ−ＮＡＮＢの発生から集められた半精製されたヒト便検体から直接的に製造された。ｃＤＮＡの回収及び代表的なライブラリーの構成は、配列非依存性単一第一増幅（ＳＩＳＰＡ）の適用により確かにされた。そのような増幅されたｃＤＮＡ集団からλｇｔ１１に構成されるｃＤＮＡライブラリーが、感染されたマカクザルからの肝臓断片に対する直接的な免疫螢光によりアッセイされる場合、“高い”力価の抗−ＨＥＶ抗体を有するように思われる血清によりスクリーンされた。４０６．３−２及び４０６．４−２として示される２種のｃＤＮＡクローンが、スクリーンされた合計６０，０００からこのアプローチにより同定された。これらのクローンの配列が続いて、元のＥＴ１．１クローンによるライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングにより単離されたクローンから得られたＨＥＶ（ビルマ）配列への相同比較によりウィルスゲノムの３’半分に位置していた。
【００４９】
感染されたマカクザル肝臓から抽出されたＲＮＡのノザンブロット上でのハイブリダイゼーションプローブとして使用される場合、これらの単離されたｃＤＮＡエピトープは、ＥＴ１．１プローブにより得られたノザンブロットに比較する場合、いく分異なった結果を付与した。ＥＴ１．１を用いて見出される単一の７．５Ｋｂの転写体の他に、３．２及び２．０Ｋｂの２種の追加の転写体が、ハイブリダイゼーションプローブとしてこれらのエピトープのいづれかを用いて同定された。これらのポリアデニル化された転写体が、プローブとして最３’末端エピトープクローン（４０６．３−２）を用いて同定され、そして従って、ゲノムの３’末端と共に同時末端としてこれらの転写体を確立した（下記参照のこと）。続いて、エピトープクローン（４０６．４−２）の１つは、特定の態様において、５種の異なった地理上の流行病から集められた抗血清と反応することが示された（ソマリア、ビルマ、メキシコ、タシュケント及びパキスタン）。４０６．３−２クローンは、これらの同じ５種の地域の流行病の４種の地域の流行病からの血清と反応した（Ｙａｒｂｏｕｇｈなど．，１９９０）。両クローンは、感染されたマクカザルからの後接種抗血清のみと反応した。後者の実験は、実験的に感染されたマカクザルにおける血清転換が単離された外因性クローン化配列に関係していることを確証した。
【００５０】
複合ｃＤＮＡ配列（メキシコ株のいくつかのクローンから得られた）が下記に示されている。
【００５１】
【表７】
2004043470.tif 000042
2004043470.tif 000043
2004043470.tif 000044
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上記配列は、ポリアデニル化されたクローンから得られた。３’ポリＡ“末端”は排除された。
【００５２】
上記配列は、このシリーズにおいて前の出願において同定された１６６１個のヌクレオチドから成る部分ｃＤＮＡ配列を含む。前で同定された部分配列が、一定の改正を伴って下記に示されている（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１１）。その改正は、前に報告された配列の初めの８０個の塩基の欠失；前者の位置１７４後にＧ、２７０の後にＣ及び２７９の後にＧＧＣＧの挿入；前者の位置７０９でＣのＴへの変化、７２２−７２３でＧＣのＣＧへの変化及び１６０６でＣのＧへの変化を包含し；前者の位置７６５でＴの欠失；及びリンカー配列の一部であるが、ウィルス起源のものではない、前者の配列の最後の１１個の塩基の欠失を包含する。
【００５３】
【表８】
2004043470.tif 000047
2004043470.tif 000048
ビルマ人及びメキシコ人菌株を比較する場合、７５．７％の同一性が、メキシコ人菌株のヌクレオチド１で始まる７１８９個のヌクレオチドオーバラップ及びビルマ人菌株のヌクレオチド２５で始まる７１８９個のヌクレオチドオーバラップで見出される。
【００５４】
同じ態様で、ＨＥＶの異なった菌株が、タシュケント、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｒ．で得られた単離体に同定された。タシュケント配列は下記に示される（ＳＥＱ　ＩＤ
Ｎｏ．１２）：
【００５５】
【表９】
2004043470.tif 000049
次の配列の比較に示されるように、タシュケント（Ｔａｓｈ．）配列は、より密接に関連する地理的な地域からの２種の菌株に予測されるように、メキシコ人菌株よりもビルマ人菌株により密接に類似する。比較において使用される数字システムは、ビルマ人菌株に基づかれている。前に示したように、ビルマ（ＢＵＲＭＡ）はＳＥＱＩＤＮｏ．６を有し；メキシコ（ＭＥＸＩＣＯ）はＳＥＱ　ＩＤＮｏ．１０を有し；そしてタシュケント（ＴＡｓＨＫＥＮＴ）はＳＥＱ　ＩＤＮｏ．１２を有する。配列間の線に存在する文字は、保存されたヌクレオチドを示す。
【００５６】
【表１０】
2004043470.tif 000050
2004043470.tif 000051
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実質的なコード領域である多くの読み取り枠が、上記に示されたＤＮＡ配列内に見出された。すでに示されたように、ＲＮＡ指図されたＲＮＡポリマラーゼ（ＲＤＲＰ）のためのコンセンサス残基が、ＨＥＶ（ビルマ）株クローンＥＴ１．１に同定された。クローンの隣接するオーバーラップ組がいったん蓄積された後、ＲＤＲＰを含む非構造要素並びにヘリカーゼドメインのためにコンセンサス残基として同定される要素が初めの大きな読み取り枠（ＯＲＦＩ）に位置することが明らかになった。ＯＲＦＩはゲノムの５’半分をカバーし、そして明らかな非コード配列の２７番目の塩基対の後、最初のコードされたｍｅｔで始まり、そして次に、停止コドンに達する前、５０７９塩基対まで拡張する。プラス１フレームにおいてＯＲＦ１停止コドンから下流の開始の３７ｂｐは、１９８０ｂｐまで拡張し、そしてポリＡ付加の点から上流の６８ｂｐで停止する第２の主要読み取り枠（ＯＲＦ２）である。第３前方ＯＲＦ（プラス２フレームにおける）はまた、ＨＥＶにより利用される。ＯＲＦ３はたった３７０ｂｐの長さであり、そしてメキシコＳＩＳＰＡ　ｃＤＮＡライブラリーからの免疫反応性ｃＤＮＡクローン４０６．４−２の同定がなければ、ウィルスにより利用されることは予測され得ないであろう（詳細な説明のためには下記を参照のこと）。このＯＲＦが発現される手段はまた十分に、明らかにされていないけれども、このエピトープは、ウィルスによるＯＲＦ３の利用を確証した。最初のｍｅｔが利用されると仮定する場合、ＯＲＦ３は、その５’末端で１ｂｐ，ＯＲＦ１と及びその３’末端で３２８ｂｐ，ＯＲＦ２とオーバーラップする。ＯＲＦ２は、広い反応性の４０６．３−２エピトープ及びまた、その最５’末端でシグナル配列を含む。このＯＲＦ２の初めの半分はまた、他のウィルスカプシドタンパク質に見られるｐＩ値に類似する高いｐＩ値（＞１０）を有する。これらのデータは、ＯＲＦ２がＨＥＶの優勢構造遺伝子であることを示唆する。
【００５７】
サブゲノム転写体の存在は、これらのＲＮＡがゲノムの５’末端からスプライシングすることによって生成されるかどうかを決定するために一組の実験を促進した。最５’末端を含む、そのゲノムからのサブゲノムプローブを用いての分析は、スプライスされた転写体のための証拠を提供しなかった。しかしながら、そのゲノムの領域は、そのサブゲノムメッセージの生成に使用されるＲＮＡ転写のためのたぶん内部開始部位として、Ｓｉｎｄｂｉｓに同定される２１ｂｐセグメントと高い程度の相同性を示すことが発見された。２１個のヌクレオチドのうち１６個（７６％）が同一である。
【００５８】
種々のＥＴ−ＮＡＮＢ発生から集められた血清により認識されるＨＥＶのエピトープ（すなわち一般的に認識される工ピトープ）をコードする２種のｃＤＮＡクローンが、単離され、そして特徴づけられた。クローンの１つが、種々の感染された個人からの８人のヒト血清と免疫反応し、そして他の１つのクローンは、試験された７人のヒト血清と免疫反応した。両クローンは、感染された動物からのマカクザル血清と特異的に免疫反応し、そして感染されなかった動物からの血清に対しては免疫反応を示さなかった。４０６．３−２及び４０６．４−２と命名された、これらの組換えファージにおけるｃＤＮＡの配列が測定された。ＨＥＶ読み取り枠は、ＨＥＶ感染の患者からの血清により特異的に認識されるエピトープをコードすることが示される。ｃＤＮＡ配列及びそれらがコードするポリペプチドが、下記に示される。
【００５９】
ＨＥＶのメキシコ人菌株に由来するエピトープ：
４０６．４−２配列（ヌクレオチド配列はＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１３を有し；アミノ酸配列はＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１４を有する）：
【００６０】
【表１１】
2004043470.tif 000063
４０６．３−２配列（ヌクレオチド配列はＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１５を有し；アミノ酸配列はＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１６を有する）：
【００６１】
【表１２】
2004043470.tif 000064
これらのエピトープの一般的な性質が、それらをコードするＤＮＡより示される相同性から明らかである。上記に示されるメキシコ人菌株からの配列をコードするエピトープが他の菌株、たとえば上記に示されるビルマ人菌株からのＤＮＡ配列と比較される場合、次の比較に示されるような類似性が明らかになる。
【００６２】
ＨＥＶメキシコ人及びビルマ人菌株からの４０６・４−２エピトープの比較：
【００６３】
【表１３】
2004043470.tif 000065
３３−アミノ酸オーバーラップにおける７３．５％の同一性が存在する。
【００６４】
ＨＥＶメキシコ人及びビルマ人菌株からの４０６．３−２エピトープの比較：
メキシコ人（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１９）
【００６５】
【表１４】
2004043470.tif 000066
ビルマ人（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．２０）
４２−アミノ酸オーバーラップにおいて９０．５％の同一性が存在する。
【００６６】
上記に与えられる個々の特定のＤＮＡ配列は、対応する相補的ＤＮＡ配列並びに示される主要配列及び前記相補的ＤＮＡ配列の両者に対応するＲＮＡ配列を示す。さらに、ペプチドをコードする読み取り枠が存在し、そして発現可能なペプチドが、アミノ酸配列がＥＴ１．１配列又は上記他の配列におけるように明確に示される場合と同じ態様で、アミノ酸配列を明確に示さないで、ヌクレオチド配列により表わされる。
【００６７】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
下記に定義される用語は、本明細書においては次の意味を有する：
１．“腸内伝達された非−Ａ／非−Ｂ肝炎ウィルス物質、ＥＴ−ＮＡＮＢ又はＨＥＶ”とは（ｉ）水系の感染性肝炎により引き起こされ、（ｉｉ）マカクザルにおいて伝達され得、（ｉｉｉ）血清学的にＡ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）及びＤ型肝炎ウィルスとは異なり、そして（ｉｖ）ＡＴＣＣ寄託番号第６７７１７号により同定されるＥ．コリ株ＢＢ４に担持されるプラスミドｐＴＺＫＦ１（ＥＴ１．１）における１．３３ＫｂのｃＤＮＡ挿入体に相同であるゲノム領域を包含するウィルス、ウィルス型又はウィルス種類を意味する。
【００６８】
２．２種の核酸フラグメントは、Ｍａｎｉａｔｉｓなど．，ｏｐ．ｃｉｔ．３２０〜３２３ページに記載されるハイブリダイゼーション条件下で、それらが他のものにハイブリダイズすることができる場合、“相同”である。しかしながら、次の洗浄条件：（２×ＳＣＣ，０．１％のＳＤＳ、室温で２度、それぞれ３０分間；次に２×ＳＣＣ、０．１％のＳＤＳ、５０℃で１度、３０分間；次に２×ＳＣＣ、室温で２度、それぞれ１０分間）を用いて、多くとも約２５〜３０％の塩基対ミスマッチを含む相同配列が同定され得る。より好ましくは、相同核酸鎖は１５〜２５％の塩基性対ミスマッチ、さらにより好ましくは５〜１５％の塩基対ミスマッチを含む。これらの相同性の程度は、当業界において良く知られているように、遺伝子ライブラリー（又は遺伝子材料の他の源）からのクローンの同定のためにより厳重な洗浄条件を用いることによって選択され得る。
【００６９】
３．２種のアミノ酸配列又は２種のヌクレオチド配列（２種のヌクレオチド配列間で相同性の他の定義において）は、それらが変異ギャップマトリックス及び．６又はそれ以上のギャップペナルティーを有するプログラムＡＬＩＧＮを用いて、５以上（標準偏差単位において）の整合評点を有する場合、相同（この用語は好ましくは本明細書で使用される）であると思われる。Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．０．，Ａｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（１９７２）第５巻、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，１０１〜１１０ページ及びＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ２，１〜１０を参照のこと。２種の配列（又はその一部、好ましくは少なくとも長さ３０個のアミノ酸）は、より好ましくは、それらのアミノ酸が、上記のＡＬＩＧＮプログラムを用いて最適に整合される場合、５０％以上又は５０％、同一である場合、相同である。
【００７０】
４．ＤＮＡフラグメントは、それがウィルス物質のゲノムの領域と同じ又は実質的に同じ塩基対配列を有する場合、ＥＴ−ＮＡＮＢウィルス物質に“由来”する。
【００７１】
５．タンパク質は、それがＥＴ−ＮＡＮＢウィルス物質に由来するＤＮＡ又はＲＮＡフラグメントの読み取り枠によりコードされる場合、ＥＴ−ＮＡＮＢウィルス物質に“由来”する。
【００７２】
（ＩＩ．クローン化されたＥＴ−ＮＡＮＢフラグメントの獲得）
本発明の１つの観点によれば、ウィルス特異的ＤＮＡクローンは、（ａ）既知のＥＴ−ＮＡＮＢ感染を有するマカクザルの胆汁からＲＮＡを単離し、（ｂ）フラグメントライブラリーを形成するためにｃＤＮＡフラグメントをクローン化し、そして（ｃ）感染された及び感染されていない胆汁源から放射性ラベルされたｃＤＮＡへ特異的なハブリダイゼーションにより前記ライブラリーをスクリーンすることによって生成され得る。
【００７３】
（Ａ．ｃＤＮＡフラグメント混合物）
マカクザルにおけるＥＴ−ＮＡＮＢ感染が、２７〜３４ｎｍ（平均３２ｎｍの直径）のＥＴ−ＮＡＮＢ粒子に対して陽性のヒト患者の便からの１０％（ｗ／ｖ）懸濁液により前記動物に静脈内接種することによって、開始される。感染された動物は、肝炎感染を示す高レベルのアラニンアミノトランスフェラーゼについてモニターされる。ＥＴ−ＮＡＮＢ感染は、公開された方法（Ｇｒａｖｅｌｌｅ）に従って、ウィルス様粒子（ＶＬＰｓ）への血清陽性抗体の免疫特異的結合により確証される。手短に言及すれば、感染後３〜４週目でその感染された動物から取られた便（又は胆汁）検体が１：１０にリン酸緩衝溶液により希釈され、そして１０番目の懸濁液が低速度の遠心分離及び１．２および０．４５ミクロンのフィルターを通しての連続的な濾過により透明にされる。その材料は、３０％スクロースクッション（Ｂｒａｓｄｌｅｙ）を通してのペレット化によりさらに精製され得る。得られるＶＬＰｓの調製物は、既知のＥＴ−ＮＡＮＢ感染のヒト患者からの希釈された血清と共に混合される。一晩のインキュベーションの後、その混合物は一晩遠心分離され、免疫凝集体にペレット化され、そしてそれらは染色され、そしてＶＬＰｓに結合する抗体について電子顕微鏡により試験される。
【００７４】
ＥＴ−ＮＡＮＢ感染はまた、ＶＬＰ一陽性血清への血清転換により確証され得る。感染された動物の血清は、感染されたヒト患者の便検体から単離された２７〜３４ｎｍのＶＬＰｓと共に上記のようにして混合され、そしてＶＬＰｓに結合する抗体について免疫電子顕微鏡により試験される。
【００７５】
胆汁は、ＥＴ−ＮＡＮＢ陽性動物から、胆管にカニューレ挿入し、そして胆汁流体を集ることによって又は検死の間、胆管から排出することによって集められ得る。全ＲＮＡが、例１Ａに概略されているようにして、熱いフェノール抽出により胆汁から抽出される。そのＲＮＡフラグメントは、例１Ａにまた言及されているようにして、ランダムプライミングにより、対応する二本鎖ｃＤＮＡフラグメントを合成するために使用される。そのｃＤＮＡフラグメントは、所望する大きさの種類のフラグメント、たとえば５００〜４，０００塩基対のフラグメントを得るためにゲル電気泳動又は密度傾斜遠心分離により分別され得る。
【００７６】
ウィルス材料の他の源、たとえば便サンプルから得られたＶＬＰｓ（例４に記載されるようにして）がｃＤＮＡ画分を生成するために使用され得るが、胆汁源が好ましい。本発明の１つの観点によれば、ＥＴ−ＮＡＮＢ感染されたサルからの胆汁は、免疫電子顕微鏡により明らかなように、便サンプルから得られた材料のよりも多くの数の損なわれていないウィルス粒子を示すことが見出された。ＥＴ−ＮＡＮＢウィルスタンパク質はゲノム材料、又は損なわれていないウィルスの源として使用するために、ＥＴ−ＮＡＮＢ感染されたヒト又は短尾ザルから得られた胆汁は、本発明の一部を形成する。
【００７７】
（Ｂ．ｃＤＮＡライブラリー及びスクリーニング）
上記からのｃＤＮＡフラグメントは、ｃＤＮＡライブラリーを形成するために適切なクローニングベクター中にクローン化される。これは、適切な末端リンカー、たとえばＥｃｏＲＩ配列を有するブラント末端化フラグメントを供給し、そしてクローニングベクターの適切な挿入部位、たとえばユニークＥｃｏＲＩ部位中に前記フラグメントを挿入することによって行なわれ得る。初期クローニングの後、所望によりライブラリーが再クローン化され、フラグメント挿入体を含むベクターの％が高められる。例１Ｂに記載されるライブラリー構成が例示的である。ｃＤＮＡフラグメントは、フラント末端化され、ＥｃｏＲＩ末端を備え付けられ、そしてλファージベクターｇｔ１０のＥｃｏＲＩ部位中に挿入される。５％以下のフラグメント挿入体を示すライブラリーファージが単離され、そしてそのフラグメント挿入体がλｇｔ１０中に再クローン化され、９５％以上の挿入体含有ファージが生成される。
【００７８】
ｃＤＮＡライブラリーが、感染された及び感染されていない源に由来するｃＤＮＡプローブヘの特異的なハブリダイゼーションによりＥＴ−ＮＡＮＢに対して特異的な配列についてスクリーンされる。感染された及び感染されていない胆汁源又は便ウィルス単離体からのｃＤＮＡフラグメントは、上記のようにして調製され得る。そのフラグメントの放射性ラベル化は、従来の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，１０９ページ）に従って、ランダムラベル化、ニックトランスレーション又は末端ラベリングにより行なわれる。上記からのｃＤＮＡライブラリーは、例２に記載されるようにして、二重ニトロセルロースフィルターへの移行及び感染された源及び感染されていない源（対照）の放射性ラベルされたプローブによるハブリダイゼーションによりスクリーンされる。２５〜３０％の好ましい限界の塩基対ミスマッチでハイブリダイズする配列を回収するために、クローンは、それらがＭａｎｉａｔｉｓなど．，ｏｐ．ｃｉｔ．，３２０〜３２３ページに記載される条件下でハブプリダイズする場合、但し次の洗浄条件（２×ＳＣＣ，０．１％のＳＤＣ、室温、２度、それぞれ３０分間；次に２×ＳＣＣ，０．１％のＳＤＳ，ＳＶｕＣ、１度、３０分間；次に２×ＳＣＣ、室温、２度、それぞれ１０分間）を用いて選択され得る。これらの条件は、プローブとしてＥＴ１．１配列を用いて上記メキシコ人単離物の同定を可能にした。感染された源のプローブに対する選択的なハブリダイゼーションを示すプラークが、好ましくは上記のように低いプレート密度で再プレートされ、そして再スクリーンされ、ＥＴ−ＮＡＮＢ配列に対して特異的である単一のクローンが単離される。例２に示されるように、感染された源のプローブに特異的にハブリダイズする１６個のクローンが、これらの方法により同定された。λｇｔ１０１．１として命名されたクローンの１つは、１．３３Ｋｂのフラグメント挿入体を含んだ。
【００７９】
（Ｃ．ＥＴ−ＮＡＮＢ配列）
パートＢからのＥＴ−ＮＡＮＢフラグメントのクローン化された領域の塩基体配列が、標準の配列決定方法により決定される。例３に記載される１つの例示的な方法においては、選択されたクローニングベクターからのフラグメント挿入体が切断され、ゲル電気泳動により単離され、そして挿入部位のいづれかの側上での塩基対配列が知られているクローニングベクター中に挿入される。例３で使用される特定のベクターは、第１図の左側に示されるｐＴＺＫＦ１ベクターである。ｇｔ１０１．１ファージからのＥＴ−ＮＡＮＢフラグメントが、ｐＴＺＫＦ１プラスミドのユニークＥｃｏＲＩ部位で挿入された。所望する挿入体を担持する組換え体が、例３に記載されているようにして、単離された１．３３Ｋｂのフラグメントとのハブリダイゼーションにより同定された。ｐＴＺＫＦ１（ＥＴ１．１）として同定される１つの選択されたプラスミドは、ＥｃｏＲＩによるベクター消化の後、予測される１．３３Ｋｂのウラグメントを付与した。ｐＴＺＫＦ１（ＥＴ１．１）により感染されたＥ．コリ株ＢＢ４は、ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤに寄託され、そしてＡＴＣＣ寄託番号第６７７１７号により同定される。
【００８０】
ｐＴＺＫＦ１（ＥＴ１．１）プラスミドは、第１図の底部に例示される。フラグメント挿入体は、それぞれＡ及びＣで示される５’及び３’末端領域、及びＢで示される中間領域を有する。これらの領域の配列は、標準のジデオキシ配列決定により決定され、そしてこのシリーズの初期出願に示された。３種の短い配列（Ａ，Ｂ及びＣ）は、同じ挿入体鎖からである。例３に見出されるであろうように、Ｂ一領域配列は実際に、反対鎖から決定され、その結果、上記Ｂ領域配列は、配列決定された鎖における配列の相補体を示す。この部分の配列の塩基数はおおよそである。
【００８１】
本発明者の実験室における後での研究は、上記に示される十分な配列を同定した。この完全な配列のフラグメントは、制限エンドヌψレアーゼを用いて容易に調製され得る。前方及び逆配列の両者のコンピューター分析は、多くの切断部位を同定した。
【００８２】
（ＩＩＩ．ＥＴ−ＮＡＮＢフラグメント）
もう１つの観点によれば、本発明は、ＥＴ−ＮＡＮＢゲノム配列又はそれらに由来するｃＤＮＡフラグメントとハイブリダイズするＥＴ−ＮＡＮＢ特異的フラグメント又はプローブを包含する。そのフラグメントは、セクションＩＩに記載されるような十分な長さのｃＤＮＡフラグメントを含み、又はクローン化されたｃＤＮＡフラグメント内の短い配列領域に由来することができる。短いフラグメントは、セクションＩＶに示されるように、所望する大きさのフラグメントを生成する条件下で十分な長さのフラグメントを酵素により消化することによって調製され得る。他方、そのフラグメントは、ｃＤＮＡフラグメントに由来する配列を用いて、オリゴヌクレオチド合成法により生成され得る。選択された配列のオリゴヌクレオチドを生成するための方法が利用できる。フラグメントは通常、プローブとして使用される場合、少なくとも１２個の長さのヌクレオチド、好ましくは少なくとも１４，２０，３０又は５０個の長さのヌクレオチドである。プローブは、十分な長さ又は５００以下、好ましくは３００又は２００以下の長さのヌクレオチドである。
【００８３】
与えられたＥＴ−ＮＡＮＢフラグメントが実際、ＥＴ−ＮＡＮＢウィルス物質に由来することを確証するために、そのフラグメントは、感染された源からのｃＤＮＡと選択的にハイブリダイズすることが示され得る。例示目的によれば、ＰＴＺＫＦ１（ＥＴ１．１）プラスミドにおける１．３３ＫｂのフラグメントがＥＴ−ＮＡＮＢ起源であることを確かめるために、そのフラグメントが、ｐＴＺＫＦ１（ＥＴ１．１）プラスミドから切断され、精製され、そしてランダムラベリングにより放射性ラベルされた。その放射性ラベルされたフラグメントは、感染された及び感染されていない源からの分別されたｃＤＮＡとハブリダイズされ、そのプローブが感染された源のｃＤＮＡとのみ反応することが確証された。この方法は、例４に例示され、ここでｐＴＺＫＦ１（ＥＴ１．１）プラスミドからの上記放射性ラベルされた１．３３Ｋｂのフラグメントが感染された及び感染されていない源から調製されたｃＤＮＡへの結合について試験された。感染された源は、（１）既知のＥＴ−ＮＡＮＢ感染のビルマ人からのヒト患者からの便サンプルに由来するウィルスの株により感染された短尾ザルからの胆汁及び（２）メキシコ人からのヒトＥＴ−ＮＡＮＢ患者の便サンプルに由来するウィルス物質である。個々のフラグメント混合物におけるｃＤＮＡがまず、例４に記載されるリンカー／プライマー増幅法により増幅された。フラグメント分離は、アガロースゲル上で、次にサザンプロット及び次に分別されたｃＤＮＡに放射性ラベルされた１．３３Ｋｂのフラグメントを結合するハブリダイゼーションにより行なわれた。感染源からのｃＤＮＡを含むレーンは、予測されるように（リンカー／プライマー増幅法により増幅されたｃＤＮＡは、広範囲の大きさを有することが予測されるであろう）、結合されたプローブのスミアバンドを示した。非感染源からの増幅されたｃＤＮＡに結合するプローブは観察されなかった。その結果は、１．３３ＫｂプローブがＥＴ−ＮＡＮＢ感染に関係するｃＤＮＡフラグメントに対して特異的であることを示す。プローブとしてＥＴ１．１を用いてのこの同じタイプの研究は、タシェケント、ソマリア、ボルネオ及びパキスタンから集められたＥＴ−ＮＡＮＢサンプルヘのハブリダイゼーションを示した。第２に、プローブが種々の大陸（アジア、アフリカ及び北米）に由来するＥＴ−ＮＡＮＢ関連配列に対して特異的である事実は、クローンされたＥＴ−ＮＡＮＢビルマ配列（ＥＴ１．１）が、ＥＴ−ＮＡＮＢ肝炎の感染の原因である通常のＥＴ−ＮＡＮＢウィルス又はウィルス種類に由来することを示す。
【００８４】
関連する確認研究において、ヒト又は短尾ザルのゲノムＤＮＡ（感染された又は感染されていない）から調製された分別されたゲノムフラグメントに結合するプローブが試験された。プローブ結合は、いづれのゲノム画分にも観察されず、これは、ＥＴ−ＮＡＮＢフラグメントが内因性ヒト又はサルゲノムフラグメントでないことを示し、そしてさらに、ＨＥＶがＲＮＡウィルスであることを示す。
【００８５】
フラグメントにおけるＥＴ−ＮＡＮＢ特異的配列のもう１つの確認は、フラグメントにおけるフード領域からＥＴ−ＮＡＮＢタンパク質を発現する能力及びＥＴ−ＮＡＮＢの発生の間、集められた血清とそれらのタンパク質の特異的血清反応性を示す能力である。下記セクションＩＶは、そのフラグメントを用いてのタンパク質発現方法を論じる。
【００８６】
ＥＴ−ＮＡＮＢ特異的フラグメントの１つの重要な使用は、追加の配列情報を含む、ＥＴ−ＮＡＮＢ由来のｃＤＮＡを同定するためである。新しく同定されたｃＤＮＡは、全体のウィルスゲノムが同定され、そして配列決定されるまで、追加の相互作用を可能にする新しいフラグメントプローブを生成する。追加のＥＴ−ＮＡＮＢライブラリークローンを同定し、そしてそこから新しいプローブを生成するための方法は一般的に、セクションＩＩに記載されるクローニング及び選択方法に従う。
【００８７】
フラグメント（及び上記配列に基づいて調製されたオリゴヌクレオチド）はまた、患者サンプルにおけるＥＴ−ＮＡＮＢウィルスゲノム材料を検出するポリマラーゼ鎖反応方法のためのプライマーとしても有用である。この診断方法は、大記セクションＶに記載されるであろう。
【００８８】
４０６．３−２及び４０６．４−２として本明細書において同定される、メキシコ人菌株に由来する２種の特定の遺伝子配列（免疫原性エピトープをコードする）が同定された。これは、個人及びＨＥＶにより感染された実験用動物からの血清と免疫学的に特異的に反応するエピトープをコードするクローンを単離することによって行なわれた。単離された配列と遺伝子配列の遺伝子銀行における配列との比較は、これらのウィルス配列が新規であることを示す。これらの配列はユニークであるので、それらは、ＨＥＶの存在を同定し、そしてＨＡＶ，ＨＢＶ及びＨＣＶ株と肝炎のこの株とを区別するために使用され得る。その配列はまた、サンプルにおけるウィルスの存在を油断するためのオリゴヌクレオチドプローブの企画のためにも有用である。それらは、それら自体、イムノアッセイに使用されるポリペプチドの合成のために使用され得る。特定の４０６．３−２及び４０６．４−２配列は、発現又は複製を容易にするために他の遺伝子材料、たとえばベクター中に導入され得る。それらはまた、関連するウィルス株、たとえばビルマ人菌株によりコードされる類似する抗原性領域を同定するためにも使用され得る（上記に示されるように）。
【００８９】
（ＩＶ．ＥＴ−ＮＡＮＢタンパク質）
上記に示されるように、ＥＴ−ＮＡＮＢタンパク質は、ＥＴ−ＮＡＮＢフラグメントに読み取り枠コード領域を発現することによって調製され得る。１つの好ましいアプローチにおいて、タンパク質発現のために使用されるＥＴ−ＮＡＮＢフラグメントは、所望する大きさのフラグメント及び好ましくは、約１００〜約３００個の塩基対の間の大きさのランダムフラグメントを生成するために処理されているクローン化されたｃＤＮＡに由来する。例５は、ＤＮＡ消化によるそのようなフラグメントの調製を記載する。約３０〜約１００個のアミノ酸の間のペプチド抗原を得ることが所望されるので、消化フラグメントは好ましくは、たとえば約１００〜３００塩基対サイズ範囲でそれらを選択するために、ゲル電気泳動によりサイズ分別される。他方、ＨＥＶ含有源（たとえば胆汁又は便）から直接的に構成されるｃＤＮＡライブラリーは、適切な発現ベクター中にクローンされる場合、直接的にスクリーンされ得る（下記参照のこと）。
【００９０】
たとえば、４０６．３−２及び４０６．４−２配列（及びそのペプチドフラグメント）により発現されるＥＴ−ＮＡＮＢタンパク質が特に、好ましい。なぜならば、これらのタンパク質は、種々の異なったヒト血清と免疫反応することが示されているからであり、それによって、それらの表面上でのＨＥＶに対して特異的な１又は複数のエピトープの存在を示す。これらのクローンは、ｇｔ１１ライブラリーの直接的なスクリーニングにより同定された。
【００９１】
（Ａ．発現ベクター）
ＥＴ−ＮＡＮＢフラグメントを、適切な発現ベクター中に挿入する。１つの典型的な発現ベクターは、λｇｔ１１であり、これはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の翻訳停止コドンの上流に５３塩基対のユニークＥｃｏＲＩ挿入部位を含む。従って、その挿入された配列は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子のＮ一末端部分、非相同ペプチド及びβ−ガラクトシダーゼペプチドのＣ−末端領域（このＣ−末端部分は、非相同ペプチドコード配列が翻訳終止コドンを含まない場合に発現される）を含むβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質として発現されるであろう。このベクターはまた、許容できる温度、たとえば３２℃でウィルス溶原を引き起し、そして高温、たとえば３７℃でウィルス溶菌を導く感温性リプレッサー（ｃ１８５７）を生成する。このベクターの利点は、（１）ひじょうに有効的な組換え体の生成、（２）許容性であるが、しかし非許容性ではない温度で、宿主細胞増殖に基づいて溶原他された宿主細胞を選択する能力、及び（３）高レベルの組換え融合タンパク質生成を包含する。さらに、非相同挿入体を含むファージは、不活性β−ガラクトシダーゼ酵素を生成するので挿入体を有するファージは、β−ガラクトシダーゼ着色基質反応により容易に同定され得る。
【００９２】
発現ベクター中への挿入のためには、ウィルス消化フラグメントが、必要な場合、従来の方法に従って、選択された制限部位リンカーを含むように変性され得る。例１は、λｇｔ１１中への消化フラグメントをクローニングするための方法を例示し、この方法は、前記フラグメントをブラント末端化し、ＥｃｏＲＩリンカーにより連結し、そしてＥｃｏＲＩにより切断されたλｇｔ１１中にそのフラグメントを導入する段階を包含する。得られるウィルスゲノムライブラリーは、比較的大きな（代表的な）ライブラリーが生成されたことを確証するために調べられ得る。これは、λｇｔ１１ベクターの場合、適切な細菌宿主を感染せしめ、その細菌をプレート化し、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性の損失についてプラークを試験することによって行なわれ得る。例１に記載される方法を用いて、約５０％のプラークが酵素活性の損失を示した。
【００９３】
（Ｂ．ペプチド抗原の発現）
上記で形成されたウィルスゲノムライブラリーが、ＥＴ−ＮＡＮＢ血清陽性個人からの抗血清と免疫反応性であるペプチド抗原（融合タンパク質として発現される）の生成のためにスクリーンされる。好ましいスクリーニング方法において、ファージライブラリーベクターにより感染された宿主細胞が上記のようにしてプレート化され、そしてそのプレートが二人目セルロースフィルターによりプロットされ、そのフィルター上に細胞により生成される組換えタンパク質抗原がトランスファーされる。次に、そのフィルターが、ＥＴ−ＮＡＮＢ抗血清と反応せしめられ、未結合抗体を除去するために洗浄され、そして抗−ＥＴ−ＮＡＮＢ抗体を通して、サンドイッチ態様でフィルターに結合されるようになる、レポーターラベルされた抗一ヒト抗体と反応せしめられる。
【００９４】
対象の組換え抗原のそれらの生成により同定される典型的なファージプラークは、抗体反応性融合タンパク質の生成のために比較的低い密度で再試験される。免疫反応性組換え抗原を生成したいくつかの組換えファージクローンが、その方法で同定された。
【００９５】
選択された発現ベクターは、組換えタンパク質精製のために、大規模生成で使用され得る。大規模生成は、（ａ）選択されたλｇｔ１１組換え体により適切な宿主、たとえばＥ．コリを溶原化し、（ｂ）高レベルの非相同ペプチドを生成する条件下でその形質導入された細菌を培養し、そして（ｃ）溶解された細胞から組換え抗原を精製するために、種々の報告された方法の１つを用いて行なわれる。
【００９６】
上記λｇｔ１１クローニングベクターを包含する１つの好ましい方法においては、高い産生体のＥ．コリ宿主、ＢＮＮ１０３が、選択されたライブラリーファージにより感染せしめられ、そして２つのプレート上でレプリカ培養される。１つのプレートが３２℃で増殖せしめられ、ここでウィルス溶原が生じ、そして他のプレートが４２℃で増殖せしめられ、ここで感染性ファージが溶菌段階で存在し、そして従って細胞増殖を妨げる。従って、低い温度（但し高い温度ではない）で増殖する細胞は、都合良く溶原化されることが仮定される。
【００９７】
次に、溶原化された宿主細胞が、ウィルス挿入体を含む融合タンパク質の高い産生を好む液体培養条件下で増殖せしめられ、そして所望する融合タンパクを開放するために急速な凍結により溶菌される。
【００９８】
（Ｃ．ペプチドの精製）
組換えペプチドは、分画沈殿法、分子ふるいクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動、ゲル電気泳動及びアフィニティークロマトグラフィーを包含する標準のタンパク質精製方法により精製され得る。融合されたタンパク質、たとえば上記のようにして調製されたβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の場合、使用されるタンパク質単離技法は、天然タンパク質の単離に使用される技法から適合され得る。従って、可溶性β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の単離のためには、タンパク質は、単純なアフィニティークロマトグラフィーにより、たとえば表面結合抗−β−ガラクトシダーゼ抗体を有する固体支持体上に細胞溶菌材料を通すことによって容易に単離され得る。
【００９９】
（Ｄ．ウイルスタンパク質）
本発明のＥＴ−ＮＡＮＢタンパク質はまた、ＥＴ−ＮＡＮＢウィルス物質から直接的に由来する。上記のように、感染された個人からの便又は肝臓サンプルから単離されたＶＬＰｓ又はタンパク質は、ウィルスタンパク質材料の１つの適切な源である。便サンプルから単離されたＶＬＰｓは、タンパク質分解の前、アフィニティークロマトグラフィーによりさらに精製され得る（下記参照のこと）。ウィルス物質はまた、細胞培養物において増殖せしめられ、そしてこれは便利且つ実質的に濃縮されたウィルスタンパク質源を供給する。１９８６年４月１日に出願されたアメリカ特許第８４６，７５７号は、細胞培養物にＮＡＮＢ感染を支持する不滅化されたトリオマ（ｔｒｉｏｍａ）肝臓細胞を記載する。そのトリオマ細胞系は、ヒト染色体安定性のために選択されたマウス／ヒト融合パートナーとヒト肝臓細胞とを融合することによって調製される。所望するＮＡＮＢウィルス物質を含む細胞は、抗−ＥＴ−ＮＡＮＢヒト抗体を用いて、免疫螢光法により同定され得る。
【０１００】
ウィルス物質は、音波処理、高−又は低−塩条件又は界面活性剤の使用を包含する従来の方法により、タンパク質単離の前、破壊される。
【０１０１】
ＥＴ−ＮＡＮＢウィルスタンパク質の精製は、適切な固体支持体に標準の方法に従って結合された精製、抗−ＥＴ−ＮＡＮＢ抗体を用いて、アフィニティークロマトグラフィーにより実施され得る。抗体自体は、アフィニティークロマトグラフィーにより精製され得、ここで上記のような免疫反応性組換えＥＴ−ＮＡＮＢタンパク質が、免疫血清源から抗−ＥＴ−ＮＡＮＢ抗体の単離のために固体支持体に結合されている。結合された抗体は、標準方法により支持体から開放される。
【０１０２】
他方、抗−ＥＴ−ＮＡＮＢ抗体は、組換えＥＴ−ＮＡＮＢタンパク質によりマウス又は他の動物を免疫化することによって調製されたモノクローナル抗体（Ｍａｂ）又は抗血清であり得る。Ｍａｂ産生のためには、リンパ球がその動物から単離され、そして適切な融合パートナーにより不滅化され、そして組換えタンパク質免原と反応する好結果をもたらす融合タンパク質が選択される。これ、らは、天然ＥＴ−ＮＡＮＢ抗原を得るために、上記アフィニティー精製方法に使用され得る。
【０１０３】
（Ｖ．利用性）
ＥＴ−ＮＡＮＢは、ヒトに対するその効果のため主として興味あるものであるが、細近のデータは、このウィルスがまた、他の動物、特に哺乳類を感染することができることを示している。従って、利用性の本明細書での論議は、ヒト及び家畜使用、特に商業的な家畜使用、たとえば豚、牛、羊、馬及び他の家畜の診断及び処置に適用される。
【０１０４】
（Ａ．診断方法）
本発明の粒子及び抗原並びに遺伝子材料は、診断アッセイに使用され得る。ＥＴ−ＮＡＮＢ肝炎の存在を検出するための方法は、ＥＴ−ＮＡＮＢ肝炎ウィルスに関係する分析物の存在のために生物学的サンプル、たとえば血液サンプル、便サンプル又は肝臓バイオプシー検体を分析することを含んで成る。
【０１０５】
分析物は、少なくとも約１６個のヌクレオチド、通常３０〜２００個のヌクレオチド、実質的には上記に示される配列の完全な配列（ｃＤＮＡ配列）を含んで成るプローブとハイブリダイズするヌクレオチド配列であり得る。分析物はＲＮＡ又はｃＤＮＡであり得る。分析物は典型的には、この分類が支配されるＥＴ−ＮＡＮＢ又は粒子であると思われるウィルス粒子である。ウィルス粒子は、上記“前方”及び“逆”配列の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドの配列に少なくとも約７０％相同の、通常、配列内の少なくとも約６０個の連続するヌクレオチドに少なくとも約８０％相同の配列を含んで成るＲＮＡウィルスゲノムを有するものとして、さらに特徴づけられ、そして完全な長さの配列に実質的に相同の配列を含むことができる。分析物を検出するためには、分析物がプローブにハイブリダイズする場合、そのプローブは検出可能なラベルを含むことができる。本明細書に記載される４０６．３−２及び４０６．４−２クローンに由来する連続ヌクレオチドの配列がプローブとして使用するために特に好ましい。なぜならば、これらのクローンは、ＨＥＶのために特に診断に役立つように思えるからである。
【０１０６】
分析物はまた、ＥＴ−ＮＡＮＢウィルス粒子上に抗原、たとえば細胞表面抗原を認識する抗体を含むことができる。分析物はまた、ＥＴ−ＮＡＮＢウィルス抗原でもあり得る。分析物が抗体又は抗原である場合、それぞれラベルされた抗原又は抗体のいづれかが、免疫学的複合体を形成するために分析物に結合するために使用され得、これは次に、ラベルにより検出され得る。
【０１０７】
典型的には、分析物、たとえば表面抗原及び又は完全な粒子を検出するための方法は、イムノアッセイに基づかれている。イムノアッセイは、ＥＴ−ＮＡＮＢ肝炎ウィルスによる感染から発生した、宿主における抗体の存在を決定するために又はウィルス粒子又は抗原の存在を直接的に決定するアッセイにより行なわれ得る。そのような技法は、良く知られており、そして本明細書には詳細に記載されていない。例は、非均質及び均質イムノアッセイ技法の両者を包含する。両技法は、ウィルス粒子又はその抗原と対応する特異的抗体との間での免疫学的複合体の形成に基づかれている。ウィルス抗原のための非均質アッセイは典型的には、固体表面に結合される特定のモノクローナル又はポリクローナル抗体を使用する、サンドイッチアッセイがますます一般的になっている。固相の存在なしに溶液中で行なわれる物質アッセイはまた、たとえば酵素一抗原接合体への遊離抗体の結合により引き起こされる酵素活性の着異を決定することによって使用され得る。多くの適切なアッセイが、アメリカ特許第３，８１７，８３７号、第４，００６，３６０号及び第３，９９６，３４５号に開示されている。
【０１０８】
ＥＴ−ＮＡＮＢウィルスにより誘発される抗体の存在についてアッセイする場合、本発明のウィルス及び抗原は、ＩｇＧ又はＩｇＭ抗体のいづれかを検出するための特異的結合物質として使用され得る。ＩｇＭ抗体は典型的には、感染の間に出現する第１抗体であるので、ＩｇＧ合成がまだ開示されていない場合、宿主の血流に存在するＩｇＭとＩｇＧ抗体との特異的な区別が、医者又は他の検査者のその感染が最近であるか又は回後期であるかの決定を可能にするであろう。本明細書に記載される４０６．３−２及び４０６．４−２クローン及びそのペプチドフラグメントにより発現されるタンパク質が特に、抗体を検出するための特異的結合物質として使用するために好ましい。なぜならば、それらは多くの異なったヒトＨＥＶ血清と反応性であることが示されているからである。さらに、それらは急性及び回復期の血清の両者と反応性である。
【０１０９】
１つの診断形態においては、試験血清が、表面結合ＥＴ−ＮＡＮＢタンパク質抗原を有する固相試薬と反応せしめられる。試薬に抗−ＥＴ−ＮＡＮＢ抗体が結合し、そして洗浄により非結合血清成分を除去した後、試薬が、固体支持体上での結合された抗−ＥＴ−ＮＡＮＢ抗体の量に比例して試薬にリポーターを結合するためにリポーターによりラベルされた抗−ヒト抗体と反応せしめられる。その試薬が再び、非結合ラベル化抗体を除去するために洗浄され、そしてその試薬に関係するリポーターの量が決定される。典型的には、リポーターは、適切な螢光又は比色支持体の存在下で固相をインキュベートすることによって検出される酵素である。
【０１１０】
上記アッセイにおける固体表面試薬は、固体支持体材料、たとえばポリマービーズ、ディプスティック又はフィルター材料にタンパク質材料を結合するために既知の技法により調製される。これらの結合方法は一般的に、支持体へのタンパク質の非特異的吸着、又は典型的には遊離アミン基を通して、固体支持体上の化学的に反応性の基、たとえば活性カルボキシル、ヒドロキシル又はアルデヒド基へのタンパク質の共有結合を包含する。
【０１１１】
均質アッセイとして知られている第２の診断形態においては、固体支持体に結合する抗体は、培地中で直接的に検出され得る反応培地におけるいくらかの変化を生成する。これまで考案された均質アッセイの既知一般的なタイプは、（ａ）スピンラベルされたリポーター、〔ここで抗原に結合する抗体は、報告された移動性の変化により検出される（スピン分裂ピークの広拡化）〕、（ｂ）螢光リポーター（ここで結合は螢光効率の変化により検出される）、（ｃ）酵素リポーター（ここで抗体結合は、酵素／基質の相互作用をもたらす）及び（ｄ）リボソーム結合リポーター（ここで結合はリボソーム溶解及びカプセル封入されたリポーターの開放を導く）を包含する。本発明のタンパク質抗原へのこれらの方法の適合は、均質アッセイ試薬を調製するための従来の方法に従う。
【０１１２】
個々の上記アッセイにおいて、アッセイ方法は、試験個人からの血清とタンパク質抗原とを反応せしめ、そして結合された抗体の存在について抗原を試験することを包含する。その試験は、試験される抗体、すなわちＩｇＭ（急性相）又はＩｇＧ（回復相）にラベルされた抗一ヒト抗体を結合せしめ、そして第１の方法におけるように、固体支持体に結合されるリポーターの量を測定することを包含し、又は第２方法におけるように、均質アッセイ試薬上に結合する抗体の効果を観察することを包含することができる。
【０１１３】
上記アッセイ方法を実施するためのアッセイシステム又はキットもまた、本発明の一部を形成する。キットは一般的に、（ａ）腸内伝達された非Ａ／非Ｂウィルス物質により感染された個人に存在する抗体と免疫反応性であり、そして（ｂ）ゲノムがＥ．コリ株ＢＢ４に担持され、そしてＡＴＣＣ寄託番号第６７７１７号を有するプラスミドｐＴＺＫＦ１（ＥＴ１．１）に存在する１．３３ＫｂのＤＮＡ　ＥｃｏＲＩ挿入体に相同である領域を含むウィルス肝炎物質に由来する表面結合組換えタンパク質抗原を有する支持体を含む。キットにおけるリポーターラベルされた抗一ヒト抗体は、表面結合された抗−ＥＴ−ＮＡＮＢ抗体を検出するために使用される。
【０１１４】
（Ｂ．ウィルスゲノム診断への適用）
本発明の遺伝子材料は、天然において生じる感染に存在する遺伝子材料のためのプローブとして多くのアッセイでそれ自体使用され得る。ハイブリダイゼーションアッセイによる後での分析のための標的核酸の増幅のための１つの方法は、ポリマラーゼ鎖反応又はＰＣＲ技法として知られている。ＰＣＲ技法は、お互い離れて配置され、そして上記に示される遺伝子配列に基づかれているオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、疑わしい病理学的サンプルにおける本発明のウィルス粒子を検出することに適用され得る。プライマーは、二本鎖ＤＮＡ分子の対立する鎖に相補的であり、そして典型的には、約５０〜４５０ｎｔ又はそれ以上（通常２０００ｎｔよりも多くない）で分離される。この方法は、プライマー空間に基づいての予測される長さのＤＮＡフラグメントを得るために、特異的オリゴヌクレオチドプライマーの調製、及び標的ＤＮＡの変性、プライマー結合及びＤＮＡポリマラーゼによる拡張の反復されたサイクルを必要とする。１つのプライマーから生成される拡張生成物は、他のプライマーのための追加の標的配列として作用する。標的配列の増幅の程度は、行なわれるサイクルの数により調節され、そして単純な式２ｎ（ここでｎはサイクルの数である）により理論的に計算される。サイクル当たりの平均効率が約６５％〜８５％の範囲である場合、２５回のサイクルが、標的配列の０．３〜４．８ミリオン個のコピーを生成する。ＰＣＲ技法は、多くの出版物、たとえばＳａｉｋｉなど．，Ｓｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：１３５０〜１３５４；Ｓａｉｋｉなど．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２４：１６３〜１６６；及びＳｃｈａｒｆなど．，Ｓｉｅｎｃｅ（１９８６）２３３：１０７６〜１０７８に記載される。また、アメリカ特許第４，６８３，１９４号；第４，６８３，１９５号；及び第４，６８３，２０２号も参照のこと。
【０１１５】
本発明は、ＥＴ−ＮＡＮＢフラグメントの選択的増幅に基づいてのＥＴ−ＮＡＮＢウィルス物質の検出のための特定の診断方法を包含する。この方法は、そのゲノムが、Ｅ．コリ株ＢＢ４に担持され、そしてＡＴＣＣ寄託番号第６７７１７号を有するプラスミドｐＴＺＫＦ１（ＥＴ１．１）に存在する１．３３ＫｂのＤＮＡＥｃｏＲＩ挿入体に相同である領域を含む腸内伝達されたウィルス肝炎物質に由来する、ＤＮＡ複合フラグメントの対立鎖の非相同領域に由来する一対の一本鎖プライマーを使用する。本発明の１つの観点を形成するこれらの“プライマーフラグメンドは、上記セクション皿に記載されるようなＥＴ−ＮＡＮＢフラグメントから調製される。この方法は、上記に示されるように、アメリカ特許第４，６８３，２０２号に開示されるような選択された核酸配列を増幅するための方法に従う。
【０１１６】
（Ｃ．ペプチドワクチン）
本発明のいづれかの抗原が、ワクチンの調製に使用され得る。ワクチンの調製のための好ましい出発材料は、胆汁から単離された粒状抗原である。抗原は好ましくは、上記のような損なわれていない粒子として初めに回収される。しかしながら、他の源又は非粒子組換え抗原から単離された粒子から適切なワクチンを調製することもまた可能である。非粒子抗原が使用される場合（典型的には可溶性の抗原）、ウィルスエンベロープ又はウィルスカプシドに由来するタンパク質が、ワクチンの調製に使用するために好ましい。これらのタンパク質は、また上記のようにして、アフィニティークロマトグラフィーにより精製され得る。
【０１１７】
精製されたタンパク質がそれ自体、免疫原でない場合、それは、タンパク質を免疫原性にするためにキャリヤーに結合され得る。キャリヤーは、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペット（アオガイ）ヘモシアニン及び同様のものを包含する。ヒトタンパク質を実質的に含まないように抗原を精製することが所望されるが、但し必要ではない。しかしながら、タンパク質、ウィルス及びヒト起源のものでない他の物質を含まない抗原が、栄養培地、細胞系、組織又はウィルスが培養され又は得られる病理学的流体により又はそれらの汚染により導入され得ることがさらに重要である。
【０１１８】
ワクチン化は従来の態様で行なわれ得る。たとえば、抗原は、ウィルス粒子又はタンパク質であろうと、適切な希釈剤、たとえば水、塩溶液、緩衝溶液、完全又は不完全アジュバント及び同様のもので使用され得る。免疫原は、抗体誘発のための標準の技法を用いて、たとえば不活性化された又は弱毒化されたウィルス粒子又は抗原を含む生理学的に適合する滅菌された溶液の皮下投与により投与される。免疫応答生成量のウィルス粒子が典型的には、ワクチン注入当たり、１ｍｌ又はそれ以下の量で投与される。
【０１１９】
ワクチン組成物の特定の例は、薬理学的に許容できるアジュバントに、このゲノムが、Ｅ．コリ株ＢＢ４に担持され、そしてＡＴＣＣ寄託番号第６７７１７号を有するプラスミドｐＴＺＫＦ１（ＥＴ１．１）に存在する１．３３ＫｂのＤＮＡのＥｃｏＲＩ挿入体に相同である領域を含む腸内伝達された非Ａ／非Ｂウィルス肝炎物質に由来する組換えタンパク質又はタンパク質混合物を含む。ワクチンは、有意な力価の抗−ＥＴ−ＮＡＮＢ抗体が血清に検出されるまで、定期的な間隔で投与される。ワクチンは、ＥＴ−ＮＡＮＢ感染に対して保護するように意図されている。
【０１２０】
本明細書に記載された４０６．３−２及び４０６．４−２クローンにより発現されたタンパク質及びその同等物（発現されたタンパク質のフラグメントを含む）を用いて調製されたワクチンである。これらのクローンは、種々のヒトＨＥＶ−陽性血清と反応性であることがすでに示されているので、種々のＨＥＶ株に対する保護へのそれらの利用性が示される。
【０１２１】
（Ｄ．予防性及び治療性）
抗体及び抗血清抗体は、抗ウィルス剤として直接的に使用され得る。ワクチンとして使用する他に、組成物は、ＥＴ−ＮＡＮＢウィルス粒子に対する抗体を調製するためにも使用され得る。抗体を調製するためには、宿主動物は、ウィルス粒子を用いて免疫化され、又は適切な場合、ウィルス粒子由来の非粒子抗原がワクチンのために上記のようにしてキャリヤーに結合される。宿主血清又は血漿が、ウィルス粒子と反応性の抗体を含んで成る組成物を供給するために適切な間隔に従って集められる。γグロブリン画分又はＩｇＧ抗体は、たとえば飽和硫酸アンモニウム又はＤＥＡＥ　Ｓｅｐｈａｄｅｘの使用により、又は当業界において知られている他の技法により得られる。抗体は、他の抗ウィルス剤、たとえば薬物と関係する多くの副作用を実質的に含まない。
【０１２２】
抗体組成物は、実質的に逆の免疫システム応答を最少にすることによって宿主システムとより一層適合するように製造され得る。これは、外来性種の抗体のＦＣ部分のすべて又は一部を除去することによって、又は宿主動物と同じ種の抗体を用いて、たとえばヒト／ヒトハイブリドーマからの抗体の使用により達成される。
【０１２３】
抗体はまたは、抗体−ウィルス複合体がマクロファージにより認識されるので、免疫応答を増強する手段としても使用され得る。抗体は、抗体の他の治療的投与のために使用される量に類似する量で投与され得る。たとえば、プールされたγグロブリンが、細胞中へのウィルスの侵入を防ぐために、他のウィルス疾患、たとえば狂犬病、風疹及びＢ型肝炎の初期インキュベーションの間、０．０２〜０．１ｍｌ／体重１ｂで投与される。従って、ＥＴ−ＮＡＮＢウィルス粒子と反応する抗体は、免疫応答及び／又は抗ウィルス剤の有効性を増強するために、ＥＴ−ＮＡＮＢウィルスにより感染された宿主に単独で又は他の抗ウィルス剤と一緒に、受動的に投与され得る。
【０１２４】
他方、抗−ＥＴ−ＮＡＮＢ一ウィルス抗体は、免疫原として抗−イジオタイプの抗体を投与することによって誘発され得る。便利には、上記のようにして調製された精製抗−ＥＴ−ＮＡＮＢ一ウィルス抗体調製物が、宿主動物に抗−イジオタイプの抗体を誘発するために使用される。組成物は、適切な希釈で宿主動物に投与される。投与の後、通常反復された投与の後、宿主は抗−イジオタイプの抗体を生成する。Ｆｃ領域への免疫原性応答を排除するために、宿主動物と同じ種により誘発された抗体が使用され得、又は投与された抗体のＦｃ領域が除去され得る。宿主動物における抗−イジオタイプの抗体の誘発の後、血清又は血漿が、抗体組成物を供給するために除去される。組成物は、抗−ＥＴ−ＮＡＮＢウィルス抗体のために上記のようにして、又はアフィニティーマトリックスに結合される抗一ＥＴ−ＮＡＮＢ−ウィルス抗体を用いてのアフィニティークロマトグラフィーにより精製され得る。生成される抗−イジオタイプの抗体は、純粋なＥＴ−ＮＡＮＢ抗原に配座的に類似し、そしてＥＴ−ＮＡＮＢ粒子抗原よりもむしろＥＴ−ＮＡＮＢワクチンを調製するために使用され得る。
【０１２５】
患者に抗−ＥＴ−ＮＡＮＢウィルス抗体を誘発する手段として使用される場合、抗体を注入する態様は、ワクチン化目的のためには、アジュバントを含む又は含まない生理学的に適切な希釈での有効濃度で、筋肉内、腹腔内、皮下的投与である。１又は複数の追加免疫注入が所望される。抗−ＥＴ−ＮＡＮＢウィルス抗体の誘発の抗−イジオタイプ方法は、抗−ＥＴ−ＮＡＮＢ一ウィルス抗体の受動的投与により引き起こされる問題、たとえば逆の免疫応答、及び精製された血液成分の投与、たとえばまだ発見されていないウィルスによる感染に関係する問題を緩和することができる。
【０１２６】
本発明のＥＴ−ＮＡＮＢ誘導タンパク質はまた、前−又は後−暴露予防のために企画された抗血清の生成に使用するためにも向けられる。ＥＴ−ＮＡＮＢタンパク質又はタンパク質の混合物が、適切なアジュバントと共に配合され、そしてヒト抗血清を生成するために既知方法に従って、ヒト候補体への注入により投与される。注入されたタンパク質に対する抗体応答は、上記セクションＨＡに記載するようにして、抗−ＥＴ−ＮＡＮＢ血清抗体の存在を検出するために、免疫化の後、数週間の間、定期的な血清サンプリングによりモニターされる。
【０１２７】
免疫化された個人からの抗血清が、感染にかかる危険性がある個人のために前−暴露予防処置として投与され得る。抗血清はまた、後−暴露予防のためにＢ型肝炎ウィルスに対する高力価の抗血清の使用に類似する、個人の後一暴露の処置においても有用である。
【０１２８】
（Ｅ．モノクローナノレ抗体）
ＥＴ−ＮＡＮＢウィルス粒子及びタンパク質に対する抗体及び抗−イジオタイプ抗体のイン　ビボ使用及び診断使用の両者に関しては、モノクローナル抗体を使用することが好ましい。モノクローナル抗−ウィルス粒子抗体又は抗−イジオタイプ抗体は、次の通りにして生成され得る。免疫化された動物からの脾臓又はリンパ球が除かれ、そして当業者に知られている方法によりハイブリドーマを調製するために不滅化され又は使用される。ヒト−ヒトハイブリドーマを生成するためには、ヒトリンパ球供与体が選択される。ＥＴ−ＮＡＮＢウィルスにより感染されることが知られている供与体（ここで感染は血液中における抗一ウィルス抗体の存在により又はウィルス培養により示されている）が、適切なリンパ球供与体として作用する。リンパ球は、末梢血液サンプルから単離され得、又は供与体が脾摘出にゆだねられる場合、脾臓細胞が、使用され得る。エプスタインーバールウィルス（ＥＢＶ）がヒトリンパ球を不滅化するために使用され得、又はヒト融合パートナーがヒト−ヒトハイブリドーマを生成するために使用され得る。ペプチドによる一次インビトロ免疫化がまた、ヒトモノクローナル抗体の生成に使用され得る。
【０１２９】
不滅化された細胞により分泌される抗体は、所望する特異体の抗体を分泌するクローンを決定するためにスクリーンされる。モノクローナル抗−ウィルス粒子抗体に関しては、その抗体はＥＴ−ＮＡＮＢウィルス粒子に結合すべきである。モノクローナル抗−イジオタイプ抗体に関しては、その抗体は、抗一ウィルス粒子抗体に結合すべきである。所望する特異性の抗体を生成する細胞が選択される。　次の例は本発明の種々の観点を例示するものであって、本発明の範囲を制限するものではない。
【０１３０】
【実施例】
（材料）
次の例に使用される材料は次の通りである：
酵素：ＤＮＡｓｅＩ及びアルカリホスファターゼを、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｐｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ＢＭＢ，Ｉｎｄｉａｎａｐ・ｌｉｓ，ＩＮ）から得、；ＥｃｏＲＩ，ＥｃｏＲＩメチラーゼ、ＤＮＡリガーセ、及びＤＮＡポリマラーゼ１をＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ，Ｂｅｖｅｒｌｙ　ＭＡ）から得；そしてＲＮａｓｅＡをＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）から得た。
【０１３１】
他の試薬：ＥｃｏＲＩリンカーをＮＥＢから得；そしてニトロブルーライラゾリウム（ＮＢＴ），Ｓ−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ），Ｓ−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘｇａｌ）及びイソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）をＳｉｇｍａから得た。
【０１３２】
ｃＤＮＡ合成キット及びランダムプライミングラベリングキットは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ１（ＢＨＢ，Ｉｎｄｉａ−ｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から入手できる。
【０１３３】
（例１）
（ｃＤＮＡライブラリーの調製）
（Ａ．ＥＴ−ＮＡＮＢウィルスの源）
２匹のマカクザル（ｃｙｎｏｓ）に、既知のＥＮ−ＮＡＮＢ患者からの免疫血清への便における２７〜３４ｎｍのウィルス様粒子（ＶＬＰｓ）の結合により明らかなように、その便がＥＴ−ＮＡＮＢに対して陽性であるビルマ人患者から単離されたＥＴ−ＮＡＮＢウィルス株により感染された第２継代ｃｙｎｏ（ｃｙｎｏキラク）から得られた便プールの１０％懸濁液を静脈内注射した。動物は、接種の後２４〜３６日間、高レベルのアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）を増殖し、そしてそれは、感染の前−急性相でその胆汁に２７〜３７ｎｍのＶＬＰｓを排泄した。
【０１３４】
個々の感染された動物の胆管にカニューレを挿入し、そして約１〜３ｃｃの胆汁を毎日集めた。ＲＮＡを、標準のＲＮＡ単離方法を用いて、熱いイフェノール抽出液により１つの胆汁検体（ｃｙｎｏ　＃２１）から抽出した。二本鎖ｃＤＮＡを、Ｂｏｅｈ−ｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から得られたｃＤＮＡ合成キットを用いて、第一鎖生成のためのランダムプライマーにより、単離されたＲＮＡから形成した。
【０１３５】
（Ｂ．複合フラグメントのクローニング）
複合ｃＤＮＡフラグメントを、標準条件（Ｍａｎｉａｔｅｓ，１１８ページ）下でＴ４ＤＮＡポリマラーゼによりブラント末端化し、次にフェノール／クロロホルムにより抽出し、そしてエタノールにより沈殿せしめた。そのブラント末端化された材料を、標準条件（Ｍａｎｉａｔｉｓ，３６９〜３９６ページ）下でＥｃｏＲＩリンカーにより連結し、そしてＥｃｏＲＩにより消化し、過多のリンカー末端を除いた。連結されていないリンカーを、連続してのイソプロパノール沈殿により除いた。
【０１３６】
λｇｔ１０ファージベクター（Ｈｕｙｎｈ）を、Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から得た。このクローニングベクターは、そのファージＣＩリプレッサー遺伝子にユニークＥｃｏＲＩクローニング部位を有する。上記からのｃＤＮＡフラグメントを、０．５〜１．０μｇのＥｃｏＲＩ−切断ｇｔ１０，０．５〜３μ１の上記複合フラグメント、０．５μ１の１０Ｘ連結緩衝液、０．５μ１のりガーゼ（２００単位）及び蒸留水５μ１までを混合することによって、ＥｃｏＲＩ部位中に導入した。その混合物を、１４℃で一晩インキュベートし、続く標準の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，２５０〜２６８ページ）に従って、インビトロパッケージングした。
【０１３７】
パッケージされたファージを、Ｅ．コリｈｆｌ株、たとえばＨＧ４１５株を感染せしめるために使用した。他方、Ｐｒｏ−ｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手できるＥ．コリ株Ｃ６００ｈｆｌを使用できる。ＥｃｏＲＩ一末端化フラグメントの挿入により得られた組換えプラークの％は、２０個のランダムプラークの分析により５％以下であった。
【０１３８】
得られるｃＤＮＡライブラリーをプレートし、そしてファージを、溶出緩衝液の添加によりその選択プレートから溶離した。ファージからのＤＮＡ抽出の後、そのＤＮＡをＥｃｏＲＩにより消化し、非相同性挿入体集団を開放し、そしてそのＤＮＡフラグメントを、アガロース上で分別し、ファージフラグメントを除いた。５００〜４，０００個の塩基対の挿入体を単離し、そして上記のようにしてλｇｔ１０中に再クローン化し、そしてパッケージされたファージを用いて、Ｅ．コリ株ＨＧ４１５を感染せしめた。好結果をもたらす組換え体の％は、９５％以上であった。ファージライブラリーを、合計８個のプレート上に、約５，０００個のプラーク／プレートでＥ．コリ株ＨＧ４１５に対してプレートした。
【０１３９】
（例２）
（ＥＴ−ＮＡＮＢクローン化フラグメントの選択）
（Ａ．ｃＤＮＡプローブ）
感染されていない及びＥＴ−ＮＡＮＢ感染されたマカクザルからの複合ｃＤＮＡフラグメントも、例１におけるようにして調製した。ｃＤＮＡフラグメントを、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から得られたランダムプライミングラベリングキットを用いて、ランダムプライミングにより放射性ラベル化した。
【０１４０】
例からのプレート化されたｃＤＮＡライブラリーを、２つのニトロセルロースフィルターのそれぞれに移し、そしてファージＤＮＡを、標準方法（Ｍａｎｉａｔｅｓ，３２０〜３２３ページ）に従って、ベーキングすることによってフィルター上に固定した。複数のフィルターを、感染された源又は上記からの対照ｃＤＮＡプローブのいづれかによりハイブリダイズした。そのフィルターのオートラジオグラフを試験し、感染された源のみからの放射性ラベルされたｃＤＮＡによりハイブリダイズされる、すなわち感染されていない源からのｃＤＮＡプローブとハイブリダイズしなかったライブラリークローンを同定した。試験された合計約４０，０００個のクローンのうち１６個のそのようなクローンを、この減法選択法により同定した。
【０１４１】
１６個のクローンの個々を取り出し、そして寒天プレート上に低濃度で再プレートした。個々のプレート上のクローンを、２つのニトロセルロースａｇ複合リフトに移し、そして上記のように感染された及び感染されていない源からの放射性ラベルされたｃＤＮＡプローブヘのハイブリダイゼーションについて試験した。感染された源のプローブに対して選択的な結合を示す（すなわち、感染された源のプローブと結合し、そして感染されていない源のプローブと実質的に結合しない）クローンを選択した。感染された源からのプローブに選択的に結合されるクローンの１つを、追加の研究のために単離した。選択されたベクターを、第１図に示されるλｇｔ１０−１．１として同定した。
【０１４２】
（例３）
（ＥＴ−ＮＡＮＢ配列）
例２からのクローンλｇｔ１０−１．１を、ＥｃｏＲＩにより消化し、ゲル電気泳動によりベクターフラグメントから分離される非相同挿入体を開放した。フラグメントの電気泳動移動性は、１．３３Ｋｂのフラグメントに一致した。ＥｃｏＲＩ末端を含むこのフラグメントを、ｐＴＺＫＦ１ベクターのＥｃｏＲＩ部位中に挿入し、この構成及び性質は、１９８７年１１月２５日に出願されたアメリカ特許第１２５，６５０号“Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ　ａｎｄ　Ｍｅｇｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｒａｒｅ　Ｃｌｏｎｅ　Ｉｄｅｎ−ｔｉｆｉｃａｔｉｏ”に記載されている。手短に言及すれば、及び第１図に示されるように、このプラスミドは、Ｔ７ポリマラーゼプロモーター部位に隣接するユニークＥｃｏＲＩ部位及び複製のファージ起点を含む。ＥｃｏＲＩ部位の個々の側にすぐ隣接する配列は知られている。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ　Ｊｕｌｌａ，ＣＡ）から得られたＥ．コリＢＢ４細菌を、プラスミドにより形質転換した。
【０１４３】
放射性ラベルされたＥＴ−ＮＡＮＢプローブを、例２におけるλｇｔ１０−１．１から１．３３Ｋｂの挿入体を切断し、そのフラグメントをゲル電気泳動により分離し、そして上記のようにしてランダムにラベルすることによって分離した。上記ｐＴＺＫＦ１によりトランスフェクトされ、そして所望するＥＴ−ＮＡＮＢ挿入体を含む細菌を、例２に概略された方法に従って、レプリカリフト及び放射性ラベルされたＥＴ−ＮＡＮＢプローブによるハィブリダイゼーションにより選択した。
【０１４４】
好結果をもたらす組換え体を含む１つの細菌コロニーを、１．３３Ｋｂの挿入体の部分を配列決定するために使用した。ｐＴＺＫＦ１（ＥＴ１．１）と命名されたこの単離体を、ＡＴＣＣに寄託し、そしてＡＴＣＣ寄託番号第６７７１７号を得た。標準のジデオキシ配列決定方法、及びＥｃｏＲＩ部位を端に有する配列のためのプライマーを用いて、挿入体の５’末端及び３’末端領域からの約２００〜２５０個の塩基対配列を得た。この配列は、セクションＩＩに与えられる。同じ技法による後での配列決定は、上記に与えられる、両方向に十分な配列を付与した。
【０１４５】
（例４）
（ＥＴ−ＮＡＮＢ配列の検出）
感染されていない及びＥＴ−ＮＡＮＢ感染されたマカクザルの胆汁からのｃＤＮＡフラグメント混合物を、上記のようにして調製した。ヒト便サンプルから得られたｃＤＮＡフラグメントを、次のようにして調製した。ＥＴ−ＮＡＮＢ発生の結果としてＥＴ−ＮＡＮＢにより感染されたものとして診断されたメキシコ人から得られた１０％便懸濁液３０ｍｌ、及び健康な感染されていない個人からの便の類似する体積を、３０％スクロース密度グラジエントクッション上に積層し、そして１５℃で、ＳＷ２７ローターで６時間、２５，０００ｘｇで遠心分離した。感染源の便からのペレット化された材料は、感染された便サンプルにＥＴ−ＮＡＮＢ感染の特徴を示す２７〜３４ｎｍのＶＬＰ粒子を含んだ。ＲＮＡを、感染された及び感染されていないサンプルの両者におけるスクロースーグラジエントペレットから単離し、そしてその単離されたＲＮＡを用いて、例２記載されるように、ｃＤＮＡフラグメントを生成した。
【０１４６】
感染された及び感染されていない胆汁源からの、及び感染された及び感染されていないヒト便源からのｃＤＮＡフラグメント混合物を、１９８８年６月１７日に出願されたアメリカ特許第０７／２０８，５１２号“ＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｓｕｂｓｔｒｃｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”に記載される新規のリンガ／プライマー複製方法によりそれぞれ増幅した。手短に言及すれば、個々のサンプルにおけるフラグメントを、ＤＮＡＰｏｌ．１によりブラント末端化し、次にフェノール／クロロホルムにより抽出し、そしてエタノールにより沈殿せしめた。そのブラント末端化された材料を、次の配列（上部又は５’配列はＳＥＱＩＤＮｏ．２１を有し；低部又は３’配列はＳＥＱＩＤＮｏ．２２を有する）：
【０１４７】
【表１５】
2004043470.tif 000067
を有するリンカーにより連結した。
【０１４８】
その複合フラグメントを、ＮｒｕＩにより消化し、リンカーのダイマーを除去し、配列５’一ＧＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＧ−３’を有するプライマーと共に混合し、そして次に、変性し、そして室温に冷却し、一本鎖ＤＮＡ／プライマー複合体を形成した。この複合体を、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｏｃｕｓ（Ｔａｑ）ポリマラーゼ及びすべての４種のデオキシヌクレオチドの添加により複数フラグメントを形成するために複製せしめた。連続的な鎖変性、鎖／プライマー複合体の形成及び複製を包含する複製工程を、２５回くり返した。
【０１４９】
増幅されたｃＤＮＡ配列を、２％アガロースマトリックスを用いて、アガロースゲル電気泳動により分別した。アガロースゲルからのＤＮＡフラグメントのニトロセルロース紙への移行の後、そのフィルターを、（ｉ）上記からのｐＴＺＫＦ１（ＥＴ１．１）プラスミドをＥｃｏＲＩにより処理し、（ｉｉ）開放された１．３３ＫｂのＥＴ−ＮＡＮＢフラグメントを単離し、そして（ｉｉｉ）単離されたフラグメントをランダムにラベルすることによって調製されたランダムラベル化３２Ｐプローブにハイブリダイズした。プローブハイブリダイゼーションを、従来のサザンプロット方法により行なった（Ｍａｎｉａｔｉｓ，３８２〜３８９ページ）。第２図は、感染された（Ｉ）及び感染されていない（Ｎ）胆汁源（２Ａ）からの及び感染された（Ｉ）及び感染されていない（Ｎ）ヒト便源（２Ｂ）からのｃＤＮＡにより得られたハイブリダイゼーションパターンを示す。そこで見られるように、ＥＴ−ＮＡＮＢプローブは感染された源の両者から得られたフラグメントとハイブリダイズが、しかし感染されていない源のいづれかから得られた配列に対して非相同性であり、従って、誘導された配列の特異性を確証した。
【０１５０】
ヒト及びマカクザルＤＮＡの両者からのゲノムＤＮＡフラグメントを有する放射性ラベルされた１．３３Ｋｂのフラグメントのサザンブロットをまた調製した。ゲノムフラグメント混合物のいづれかへのプローブハイブリダイゼーションは観察されず、ＥＴ−ＮＡＮＢ配列がヒト又はマカクザルのゲノムのいづれかに対して外来性であることを確証した。
【０１５１】
（例５）
（ＥＴ−ＮＡＮＢタンパク質の発現）
（Ａ．ＥＴ−ＮＡＮＢコード配列の調製）
例２からのｐＴＺＫＦ１（ＥＴ１．１）プラスミドを、ＥｃｏＲＩにより消化し、ゲル電気泳動によりその線状化されたプラスミドから精製された１．３３ＫｂのＥＴ−ＮＡＮＢ挿入体を開放した。その精製されたフラグメントを、約１ｍｇ／ｍｌの濃度に標準の消化緩衝液（０．５ＭのトリスＨＣｌ，ｐＨ７．５；１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ；１０ｍＭのＭＮＣ１２）により懸濁し、そして室温で約５分間、ＤＮＡｓｅＩにより消化した。これらの反応条件を、従来の検定研究から決定し、ここで優先的に１００〜３００個の塩基対フラグメントを生成するのに必要とされるインキュベーション時間を決定した。その材料を、フェノール／クロロホルムにより抽出し、その後、エタノールにより沈殿せしめた。
【０１５２】
消化物混合物におけるフラグメントをブラント末端化し、そして例１におけるようにＥｃｏＲＩリンカーにより連結した。得られたフラグメントを、Ｐｈｉｘ１７４／ＨａｅＩＩ及びλ／Ｈｉｎｄ皿サイズマーカーを用いて、１．２％アガロースゲル上での電気泳動（５〜１０ｖ／ｃｍ）により分析した。１００〜３００ｂｐの画分をＮＡ４５ストリップ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　Ｓｃｈｕｅ１１）上に溶出し、次にこれを、溶出溶液（１ＭのＮａＣｌ，５０ｍＭのアルギニン、ｐＨ９．０）を有する１．５ｍｌの微小管中に置き、そして６７℃で３０〜６０分間インキュベートした。溶離されたＤＮＡをフェノール／クロロホルムにより抽出し、そして次に２体積のエタノールにより沈殿せしめた。そのペレットを、２０μ１のＴＥ（０．０１ＭのトリスＨＣｌ，ｐＨ７．５；０．０１ＭのＥＤＮＡ）中に再懸濁した。
【０１５３】
（Ｂ．発現ベクターによるクローニング）
λｇｔ１１ファージベクター（Ｈｕｙｎｈ）を、Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から得た。このクローニングベクターは、β−ガラクトシダーゼ翻訳終結コドンから上流に５３個の塩基対のユニークＥｃｏＲＩクローニング部位を有する。コード配列（例５）から直接的に又はｃＤＮＡの増幅の後（例４）、供給される上記からのゲノムフラグメントを、０．５〜１．０μｇのＥｃｏＲＩ−切断ｇｔ１１，０．３〜３μ１の上記サイズ分けされたフラグメント、０．５μ１の１０Ｘ連結緩衝液（上記）、０．５μ１のりガーゼ（２００単位）及び５μ１までの蒸留水を混合することによってＥｃｏＲＩ部位中に導入した。その混合物を、１４℃で一晩インキュベートし、次に、標準の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，２５６〜２６８ページ）に従って、インビトロパッケージングした。
【０１５４】
そのパッケージされたファージを用いて、Ｄｒ．ＫｅｖｉｎＭｏｕｒｅ，ＤＮＡＸ（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）から得られたＥ．コリ株ＫＭ３９２を感染せしめた。他方、ＡＴＣＣから入手できるＥ．コリ株Ｙ１０９０（ＡＴＣＣ　＃３７１９７）を使用することもできる。感染された細菌をプレートし、そしてその得られたコロニーを、標準のＸ−ｇａｌ基質プラークアッセイ方法（Ｈａｎｉａｔｉｓ）を用いて、いｘ−ｇａＩの存在下でβ−ガラクトシダーゼ活性−（透明なプラーク）の損失について調べた。約５０％のファージプラークが、β−ガラクトシダーゼ酵素活性（組換え体）の損失を示した。
【０１５５】
（Ｃ．ＥＴ−ＮＡＮＢ組換えタンパク質のためのスクリーニング）
ＥＴ−ＮＡＮＢ回復期の抗血清を、メキシコ、ボルネオ、パキスタン、ソマリア及びビルマでのＥＴ−ＮＡＮＢ発生の間に感染された患者から得た。その血清は、ＥＴ−ＮＡＮＢ肝炎を有する何人かの他の患者のそれぞれからの便サンプルにおけるＶＬＰｓと免疫反応性であった。
【０１５６】
上記からのファージ源約１０４ｐｆｕにより感染されたＥ．コリＫＭ３９２細胞のローンを、１５０ｍｍのプレート上に調製し、そして３７℃で５〜８時間、逆にしながらインキュベートした。そのローンを、ニトロセルロースミートにより被覆し、プラークからの発現されたＥＴ−ＮＡＮＢ組換えタンパク質のその紙への移行を引き起こした。そのプレート及びフィルターを、対応するプレート及びフィルター位置を調和するために索引をつけた。
【０１５７】
フィルターを、ＴＢＳＴ緩衝液（１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０；１５０ｍＭのＨＣｌ；０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）により２度洗浄し、ＴＢＳＴにより再び洗浄し、そして抗血清（ＡＩＢで１：５０に希釈された、１２〜１５ｍ１／プレート）の添加の後、一晩インキュベートした。そのシートをＴＢＳＴにより２度洗浄し、そして次に、抗血清により認識される抗原を含むフィルター部位でラベルされた抗体を結合するために、酵素ラベルされた抗−ヒト抗体と接触せしめた。最後の洗浄の後、フィルターを、アルカリホスファターゼ緩衝液（１００ｍＭのトリス、ｐＨ９．５；１００ｍＭのＮａＣｌ；５ｍＭのＭｇＣ１２）５ｍｌ中で１６μ１のＢＣＩＰ（４℃で維持されている５０ｍｇ／ｍｌの原液）と共に混合された、３３μ１のＮＢＴ（４℃で維持されている５０ｍｇ／ｍｌの原液）を含む基質培地中で進行せしめた。抗血清により認識される場合、紫色が、抗原生成の点で現われた。
【０１５８】
（Ｄ．スクリーニングプレート）
前段階で決定された抗原生成領域を、８２ｍｍのプレート上に約１００〜２００ｐｆｕで再プレートした。ＮＢＴ−ＢＣＩＰ進行を通での５〜８時間のインキュベーションにより始まる上記段階を、ＥＴ−ＮＡＮＢ抗体と反応することができる抗原を分泌するファージをプラーク精製するためにくり返した。同定されたプラークを取り出し、としてファージ緩衝液により溶出した（Ｍａｎｉａｔｉｓ，４４３ページ）。
【０１５９】
（Ｅ．エピトープの同定）
例２からの元のｐＴＺＫＦ１（ＥＴ１．１）プラスミドに由来する一連のサブクローンを、上記と同じ技法を用いて単離した。それらの５個のサブクローンの個々は、Ｃで示される抗−ＥＴ抗血清のプールと免疫反応性であった。サブクローンは、前記で示された“逆”配列からの短い配列を含んだ。サブクローンにおける配列の開始及び最後の点（完全な“逆”配列に対して）を、下記表に同定する。
【０１６０】
【表１６】
2004043470.tif 000068
上記表に同定される遺伝子配列のすべては、エピトープのためのコード配列を含むべきであるので、エピトープのためのコード配列は、ヌクレオチド５９４（５’末端）と６４３（３’末端）との間の領域に存在することは明らかである。従って、この比較的短い配列に同等の及びそれに相補的な遺伝子配列は、このコード領域を用いて生成されるペプチドである場合、本発明の特に好ましい観点である。
【０１６１】
全く異なるエピトープを同定する第２の一連のクローンを、メキシコ人の血清のみから単離した。
【０１６２】
【表１７】
2004043470.tif 000069
このエピトープのためのコードシステムは、ヌクレオチド２（Ｓ末端）と１０１（３末端）との間に存在する。従って、この短い配列に関係する遺伝子配列は、このコード領域を用いて生成されるペプチドである場合、好ましい。
【０１６３】
ＨＥＶに対して特異的なエピトープを含むポリペプチドを調製することに使用するための２つの特に好ましいサブクローンは、４０６．３−２及び４０６．４−２クローン（これらの配列は上記に示される）である。これらの配列を、メキシコ人の便に由来する増幅されたｃＤＮＡライブラリーから単離した。このセクションに記載される技法を用いて、これらのクローンにより発現されるポリペプチドを、世界じゅうの源から得られた多くの種々のヒトＨＥＶ−陽性血清に対する免疫反応性について試験した。下記第３表に示されるように、８種の血清は４０６．４−２により発現されるポリペプチドと免疫反応し、そして６種の血清は、４０６．３−２クローンにより発現されるポリペプチドと免疫反応した。
【０１６４】
比較するために、表はまた、上記第１表に同定されるＹ２クローンと種々のヒト血清との反応性を示す。たった１種の血清が、このクローンにより発現されるポリペプチドと反応した。免疫反応性は、ｇｔ１１ベクターの正常な発現生成物のために見出されなかった。
【０１６５】
【表１８】
2004043470.tif 000070
本発明は特定の態様で記載されて来たが、特許請求の範囲内で修飾及び変更を行なうことができる。
【０１６６】
【発明の効果】
本発明により、ＥＴ−ＮＡＮＢの大めのウィルス物質に由来するウィルスタンパク質及びそのフラグメントを含んで成る組成物、その調製方法及びその使用が提供される。本発明により、診断及びワクチン生成に特に有用であるウィルスタンパク質の多くの特定のフラグメント（及びその対応する遺伝子配列）が提供される。本発明により、ＥＴ−ＮＡＮＢウィルスタンパク質の調製に及びウィルス検出のためのプローブとして使用されるＥＴ−ＮＡＮＢゲノム配列が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、クローン化されたＥＴ−ＮＡＮＢフラグメントの獲得及び配列決定に使用されるベクターの構成及び操作を示す。
【図２】図２Ａ−２Ｂは、サザンブロットを示し、ここで放射性ラベルされたＥＴ−ＮＡＮＢプローブが、感染された（Ｉ）及び感染されていない（Ｎ）胆汁源（２Ａ）、及び感染された（Ｉ）及び感染されていない（Ｎ）便サンプル源（２Ｂ）から単離されたＲＮＡから調製された増幅ｃＤＮＡフラグメントによりハイブリダイズされた。
【図１】
2004043470.tif 000071
【図２】
2004043470.tif 000072