(57)【要約】【課題】ＴＮＦαの作用を中和することのできる蛋白質の提供【解決手段】最初のグリコシル化された形で分子量約４２０００ダルトンを有し、Ｎ−末端にアミノ酸配列；Ｘａａ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ［式中、Ｘａａは、水素原子、フェニルアラニン基（Ｐｈｅ）又はアミノ酸配列；Ａｌａ　Ｐｈｅ、Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅ、Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅ、Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅ、Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅ又はＬｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅを表す］を有する蛋白質、及びこの蛋白質の作用を強く低下させることなく、アミノ酸又はペプチドの好適な置換、欠失又は付加により又はグリコシド基を変化させることにより得られるムテインにより解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　ＳＤＳゲル電気泳動で測定する際に分子量約４２０００ダルトンを有し、かつＮ−末端にアミノ酸配列；
Ｘａａ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ
［式中、Ｘａａは、水素原子、フェニルアラニン基（Ｐｈｅ）又はアミノ酸配列；Ａｌａ　Ｐｈｅ、Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅ、Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅ、Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅ、Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅ又はＬｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅを表す］を有するＴＮＦα−抑制作用を有する蛋白質のＴＮＦα−抑制作用を強く低下させることなく、アミノ酸又はペプチドの好適な置換、欠失又は付加により又はグリコシド基を変化させることにより得られるムテイン。
【請求項２】
　ａ．オリジナルなグリコシル化形でＳＤＳゲル電気泳動で測定する際に約４２０００ダルトンの分子量を有し、
ｂ．特異的にＴＮＦαを結合し、
ｃ．トリプシンにより分解されず、かつ
ｄ．発熱患者の尿から又は卵巣ガン患者の腹水液から、逆浸透又は限外濾過、および次いでイオン交換クロマトグラフィーおよびＴＮＦ親和性カラム上での親和性クロマトグラフィーにより単離される；
Ｎ−末端にアミノ酸配列；
Ｘａａ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ
［式中、Ｘａａは、水素原子、フェニルアラニン基（Ｐｈｅ）又はアミノ酸配列；Ａｌａ　Ｐｈｅ、Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅ、Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅ、Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅ、Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅ又はＬｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅを表す］を有するＴＮＦα−抑制作用を有する蛋白質、及びこの蛋白質のＴＮＦα−抑制作用を強く低下させることなく、アミノ酸又はペプチドの好適な置換、欠失又は付加により又はグリコシド基を変化させることにより得られるムテイン。
【請求項３】
　脱グリコシル化された形の請求項１又は２記載の蛋白質。
【請求項４】
そのムテインがその蛋白質のＴＮＦα−抑制作用を強く低下させることなく、アミノ酸又はペプチドの付加により又はグリコシド基を変化させることにより得られる請求項１から３までのいずれか１項記載の蛋白質。
【請求項５】
　ムテインがＮ末端配列にアミノ酸配列；
Ｘａａ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ
［式中、Ｘａａは前記のものを表す］を有する、請求項４記載の蛋白質。
【請求項６】
ＳＤＳゲル電気泳動で測定する際に分子量約４２０００ダルトンを有し、Ｎ−末端にアミノ酸配列；
Ｘａａ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ
［式中、Ｘａａは、水素原子、フェニルアラニン基（Ｐｈｅ）又はアミノ酸配列；Ａｌａ　Ｐｈｅ、Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅ、Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅ、Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅ、Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅ又はＬｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅを表す］を有するＴＮＦα−抑制作用を有する蛋白質を製造する方法において、発熱患者の尿又は卵巣ガン患者の腹水液の濃縮、および引き続くこのようにして得られた残分のイオン交換クロマトグラフィーおよび親和性クロマトグラフィーによる精製からなるＴＮＦα−抑制作用を有する蛋白質の製法。
【請求項７】
　得られたＴＮＦα−抑制作用を有する蛋白質を更に、ＴＮＦα−抑制作用を強く低下させることなく、アミノ酸又はペプチドの好適な置換、欠失又は付加により又はグリコシド基の変化により、変化させることからなる請求項６記載の製法。
【請求項８】
　請求項１から５までのいずれか１項記載の蛋白質を含有する、体液中のＴＮＦαの濃度が上昇している疾患を治療するための薬剤。
【請求項９】
　疾患がアレルギー、自己免疫病、リュウマチ性疾患、ショック肺、炎症性の骨疾病、血液凝固障害、又は移植後の合併症である請求項８記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、新規の蛋白質及びその製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
　ＴＮＦα(Tumor-Nekrose-Factor)は、生物学的活性において広いスペクトルを有する公知の蛋白質である。これは、種々の悪性及び非悪性の細胞種に影響を与え、敗血症ショック及び組織損傷並びに腎剥離、移植、ショック肺及び脳性マラリアでは、重要な役割を果たす（Lymphokines １９８７ Vol.１４；Pharmaceutical Res.５，１２９（１９８８）；Science ２３４，４７０（１９８６）；Nature ３３０，６６２（１９８７）；J．Exp.Med．1６６，１１３２（１９８７）；Science ２３７，１２１０（１９８７）；J.Exp．Med．１６６，１２８０（１９８７））。
【非特許文献１】Lymphokines １９８７ Vol.１４
【非特許文献２】Pharmaceutical Res.５，１２９（１９８８）
【非特許文献３】Science ２３４，４７０（１９８６）
【非特許文献４】Nature ３３０，６６２（１９８７）
【非特許文献５】J．Exp.Med．1６６，１１３２（１９８７）
【非特許文献６】Science ２３７，１２１０（１９８７）
【非特許文献７】J.Exp．Med．１６６，１２８０（１９８７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
　抗体を用いてＴＮＦαの作用を中和させることができることは、公知である（欧州特許第２６０６１０号明細書）。しかしながらこの抗体は、人特有の物質ではないので、人への使用の際に免疫反応を引き起こしうる。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
　ところで、人に起因し、ＴＮＦαの作用を中和することのできる蛋白質が発見された。
【０００５】
　本発明の目的は、分子量約４２０００ダルトン及びＮ−末端にアミノ酸配列；
Ｘａａ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ
［式中、Ｘは、水素原子、フェニルアラニン基（Ｐｈｅ）又はアミノ酸配列；Ａｌａ　Ｐｈｅ、Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅ、Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅ、Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅ、Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅ又はＬｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅを表す］を有する蛋白質及びそのムテイン(Muteine)である。
【０００６】
　ムテインとは、プロテイン鎖中のアミノ酸又はペプチドの好適な交換、欠失又は添加により得られ、これらの処置により新規の蛋白質の作用が著しく弱められることはない蛋白質である。ムテインは、グリコシド基の変形によっても得ることができる。
【０００７】
　ここに記載の新規蛋白質は酸性特性を有し、その等電点は、ｐＨ２〜５である。これは、特異的にＴＮＦαと結合し、トリプシンによる消化は、困難であるか又は不可能である。
【０００８】
　新規蛋白質は、例えば熱のある、即ち体温が約３８℃以上の患者の尿から単離することができる。このために尿を先ず濃縮し、これは、例えば逆浸透又は限外濾過により行うことができる。このようにして得られた透析残分を、引き続いてイオン交換−及び親和性クロマトグラフィーにより精製する。
【０００９】
　この蛋白質は、卵巣癌の患者の人間の腹水液からも得られる。
【００１０】
　蛋白質の精製は公知法、例えば親和性−又はイオン交換クロマトグラフィーにより行うことができる。
【００１１】
　そうして得られた蛋白質は、アミノ酸配列中のＮ−末端で不均一である。アミノ酸は７個まで欠けていて良い。そのような不均一性は、身体特有の蛋白質の場合には異例ではなく、例えばγ−インターフェロンの場合にも現われる。
【００１２】
　エンドグリコシダーゼを用いての処理により、この蛋白質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動でのその走行特性を変え、このことは、糖基の離脱に起因する。
【００１３】
　前記蛋白質は、尿及び腹水液中に１〜１００μｇ／ｌの濃度で存在する。この蛋白質を、薬学上の目的のために大量に提供するために、公知の遺伝子工学的方法(Maniatis,T.et al:Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.,1982参照)を利用した。この目的のためには、先ず新規蛋白質に関する遺伝情報を確認し、相応する核酸を単離すべきである。そのために、純粋蛋白質をジチオトレイトールで還元し、ついで遊離のＳＨ−基の誘導化のためにヨードアセトアミドを添加し、引き続きそうして処理された蛋白質をブロムシアン、続いてトリプシンを用いて小さいペプチドに開裂させる。ペプチドの分離は、逆相クロマトグラフィーにより行う。この精製されたペプチドのうちの１個のＮ−末端シークエンシングは、配列：Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓを示した。更にこの蛋白質は、次の３個の他のペプチド配列を有する：Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ、Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ及びＰｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｘａｂ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ（ここでＸａｂは、おそらくグリコシル化されている、未知のアミノ酸である）。
【００１４】
　存在するペプチド配列は、相応するオリゴヌクレオチドの合成により、人間のゲノムからの又は相応するｃ−ＤＮＡ−バンク（Bank）からの遺伝子の明白な同定を、配列特異的なフィルターハイブリッド形成により可能とする。
【００１５】
　次いでそうして得られた蛋白質に関する遺伝情報は、表現のために、公知法により種々の宿主細胞、例えば真核細胞、酵母、枯草菌又は大腸菌中にもたらされ、かつそのようにして蛋白質を得ることができる。その際、真核細胞中にグリコシル化された形の蛋白質が生じる。
【００１６】
　アミノ酸又はペプチドの交換、欠失又は添加により新規蛋白質から誘導されるムテインは、有利に遺伝子工学的方法により製造される。
【００１７】
　新規蛋白質は、良好なＴＮＦα−抑制作用を示し、従って体液中のＴＮＦα濃度が高まる疾病、例えば敗血症ショックの治療のために使用することができる。更にこれらは、次の疾病に使用できる：アレルギー、自己免疫病、リュウマチ性疾患、ショック肺、炎症性の骨疾病、血液凝固障害、火傷並びに移植後の合併症。
【実施例】
【００１８】
　例１
　ＴＮＦα−抑制作用の測定
　ＴＮＦαの生物学的活性をマウス細胞系Ｌ９２９(J.Biol.Chem.２６０，２３４５（１９８５））及び人間細胞系ＭＣＦ７の溶解(Lyse)により測定した。ＴＮＦα抑制作用の測定の実験の際に、ＴＮＦαの濃度を、細胞の少なくとも５０％が溶解するように選択した。
【００１９】
　ＴＮＦα結合蛋白質を有する上澄を、１：２ステップ(Schritt)で、微量滴定プレート中で希釈した。この溶液（０．０５ｍｌ）に人間−もしくはマウス−ＴＮＦα（１２０ｐｇ／ｍｌ）各々０．０５ｍｌを添加した。引き続いてアクチノマイシンＤ　２μｇ／ｍｌを含有する媒体０．１ｍｌ中のＬ９２９−細胞　５００００の添加を行った。ふ化器中で３７℃で２０〜２４時間のインキュベーションの後に、細胞を固定し、クリスタルヴァイオレットで着色した。ＴＮＦα−結合蛋白質の不在下で、ＴＮＦα及びＬＴ（リンフォトキシン）は、細胞を溶かした。これらは着色の間にすすぎ落した。ＴＮＦα−結合蛋白質を有する上澄の保護効果は、残存する完全な細胞の着色性により示された。
【００２０】
　細胞毒性作用の抑制は、人間−ＴＮＦαにたいしても、少々弱いが人間−ＬＴにたいしてもみられるが、マウス−ＴＮＦαではみられなかった。
【００２１】
　例２
　尿からの蛋白質単離
　熱（≧３８℃）のある患者から集めた尿４０ｌを、透析残分流の容量が２．５ｌに濃縮されるまで、ヘモフロウ　Ｆ６０瀘筒(Hemoflow（Ｒ） F60 Patrone；Fa.Fresenius)を通して濾過させた。
【００２２】
　引き続いてこの透析残分に、洗浄のために２０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）各々２．５ｌを４回添加し、かつ濾過を各々出発容量の２．５ｌになるまで続けた。
【００２３】
　そうして得られた一連の蛋白質、茶色に着色された透析残分を、ファルマツィア社のＳ−セファロース(S-Sepharose（Ｒ）；Fa.Pharmacia:カラム：φ＝５ｃｍ、ｌ＝１７ｃｍ)を介してクロマトグラフィーにかけた。カラムは、装入の前に、２０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５（＝緩衝液Ｉ）１０カラム容量（ＳＶ）で平衡させ、透析残分を装入した。緩衝液Ｉ　３ＳＶで後洗浄し、２０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５（＝緩衝液II）３ＳＶで溶出させると、有価生成物が得られた。
【００２４】
　更に精製するために、このフラクションを、緩衝液III（２０ｍＭ燐酸ナトリウム、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２）１０ＳＶで平衡させたＴＮＦ−親和性カラム（例４、φ＝１．５ｃｍ、ｌ＝１０ｃｍ）上に注いだ。装入後に緩衝液III　３ＳＶで後洗浄し、カラムでの溶出によるＴＮＦ−結合蛋白質フラクションを、０．５８％酢酸及び１４０ｍＭＮａＣｌからなる緩衝液IV４０ｍｌで洗浄した。
【００２５】
　純粋蛋白質の単離のために、ＴＮＦ−親和性カラムの溶出液をモノ　Ｑ−カラム　ＨＲ５／５(MONO Q-Saeule HR5/5；Fa.Pharmacia)で分離した。そのために先ず溶出液を０．１ｎＮａＯＨでｐＨ１２．０に調節した。
【００２６】
　カラムを２０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ１２．０（緩衝液Ｖ）１１ＳＶで平衡させた。ｐＨを調整したＴＮＦ−親和性カラム溶出液１０ｍｌを装入し、緩衝液Ｖ　４．４ＳＶで洗浄した。引き続き２０ｍＭ燐酸ナトリウム、ｐＨ７．５で溶出させた。
【００２７】
　不純物を更に除去するために、０．１ＮＨＣｌでｐＨ２．０に調節された２０ｍＭ酢酸緩衝液（緩衝液VI）　７ＳＶでモノ　Ｑ−カラムを洗浄した。
【００２８】
　その後、カラムを２０ｍＭ酢酸５〜６ＳＶ、２０ｍＭＮＨ４Ｃｌ−緩衝液、ｐＨ２．０（０．１ｎＨＣｌで調整、緩衝液VII）で更に溶出させた。１〜２ＳＶにより不純物を含有する２８０ｎｍでＵＶ−活性なバンド(Band)を溶出させ、更に１〜２ＳＶにより新規蛋白質を溶出させた。純粋蛋白質の更なる量は、１００ｍＭＮａＣｌに調整された緩衝液VII１〜２ＳＶの後溶出により達成されうる。
【００２９】
　蛋白質は、そうしてゲル電気泳動の純度＞９０％で得られた。尿１ｌから蛋白質約１〜１０μｇを得ることができる。
【００３０】
　例３
　人間の腹水液からの蛋白質単離
　卵巣癌の患者の穿刺液として得られる、少し混濁した稀液性の腹水液２．５ｌを３０００ｇで３０分間遠心分離機にかけた。上澄を１０％燐酸でｐＨ７．２に調整し、グルタルジアルデヒドで架橋されたＴＮＦ−セファロース(Sepharose（Ｒ）)−カラム（φ＝１．５ｃｍ、ｌ＝３ｃｍ；例４参照）上に添加した。このカラムを緩衝液III５０ｍｌで平衡させ、かつ装入後、緩衝液III１５０ｍｌで後洗浄した。ＴＮＦ−結合蛋白質を緩衝液IV３０ｍｌで溶出させた。
【００３１】
　更に精製するために、溶出液を１０％ＨＣｌでｐＨ３．０に調整し、２０ｍＭ酢酸（ｐＨ３．０）で平衡させたクロマトグラフィーカラム(Mono S HR 5/5,Fa.Pharmacia)上に注いだ。装入後、２０ｍＭ酢酸（ｐＨ３．０）１０ｍｌで後洗浄し、引き続いてＴＮＦ−結合蛋白質を２０ｍＭ酢酸（ｐＨ３．０）６部及び５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）４部からなる緩衝液混合物４ｍｌを用いる溶出により溶出させた。溶出液のｐＨ値を制御し、場合によってはｐＨ６．５に後調整した。
【００３２】
　この溶出液を燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０（緩衝液VIII）で平衡させたクロマトグラフィーカラムモノ　Ｑ　ＨＲ　５／５上に注いだ。各々緩衝液VIII　６ｍｌ及び２０ｍＭ酢酸、５ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ２．２　６ｍｌで洗浄後に、２０ｍＭ酢酸、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ２．０（緩衝液IX）６ｍｌを用いて蛋白質をカラムから溶出させた。
【００３３】
　この溶出液の同定により、これが、（Ｎ−末端配列の不均一を除き）例２により得られた蛋白質と同じものであることが判明した。
【００３４】
　例４
　ＴＮＦ−親和性カラムの製造
　ａ）ＢｒＣＮ−セファロースでのＴＮＦのカップリング
　ＢｒＣＮ−セファロース（BrCN-Sepharose（Ｒ）；Fa.Pharmacia)７．５ｇを水３０ｍｌ中に懸濁させた。膨潤時間３０分後にＢｒＣＮ−セファロース（BrCN-Sepharose（Ｒ）)−ゲル懸濁液を先ず１ｍＭＨＣｌ−溶液５００ｍｌで、次いで０．１ＭＮａＨＣＯ３、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ８．３で洗浄した。
【００３５】
　緩衝液（０．１ＭＮａＨＣＯ３、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ８．３）４１ｍｌ中に溶かされたＴＮＦ１３６ｍｇを、このゲル懸濁液に添加した。反応バッチを室温で２時間振り混ぜ、かつＴＮＦ−セファロース（TNF-Sepharose（Ｒ）)を３０００Ｕ／分で遠心分離した。ゲル物質を緩衝液４０ｍｌで洗浄した。
【００３６】
　上澄の蛋白質測定からカップリング収率＞９０％が得られた。
【００３７】
　ＢｒＣＮ−セファロース（BrCN-Sepharose（Ｒ）)の過剰の活性基のブロッキングのために、ゲル懸濁液に緩衝液（０．１ＭＮａＨＣＯ３、０．５ＭＮａＣｌ、１Ｍエタノールアミン、ｐＨ８．３）４０ｍｌを添加し、引き続いて室温で１時間振り混ぜ、次いでエタノールアミンを緩衝液（０．１ＭＮａＨＣＯ３、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ８．３）３×４０ｍｌを用いて洗い流した。
【００３８】
　ｂ）グルタルジアルデヒドを用いるＴＮＦ−セファロース（TNF-Sepharose（Ｒ）)の架橋
　ａ）により製造されたＴＮＦ−セファロース（TNF-Sepharose（Ｒ）)ゲル懸濁液２０ｍｌを緩衝液（２０ｍＭ燐酸ナトリウム、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０）２５ｍｌで２度洗浄した。この懸濁液を同じ緩衝液４０ｍｌ中に入れ、２５％グルタルジアルデヒド溶液１．６ｍｌを添加した。室温で１時間振り混ぜた後に、懸濁液を遠心分離させ、緩衝液（２０ｍＭ燐酸ナトリウム、１４０ｍＭＮａＣｌ、１Ｍエタノールアミン、ｐＨ８．０）２５ｍｌを添加した。再び１時間振り混ぜ、引き続いてＴＮＦ−セファロース（TNF-Sepharose（Ｒ）)懸濁液をクロマトグラフィーカラム（φ＝１．５ｃｍ、ｌ＝１０ｃｍ）中に充填した。
【００３９】
　このカラムは、緩衝液（２０ｍＭ燐酸ナトリウム、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２）１００ｍｌ及び０．５８％酢酸＋１４０ｍＭＮａＣｌ　５０ｍｌで洗浄後に親和性クロマトグラフィーのために使用可能であった。
【００４０】
　例５
　蛋白質の同定
　ａ）分子量及び純度
　分子量及び純度の測定のために、例２もしくは３により得られた蛋白質２μｇに、還元性及び非還元性条件下で、１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を施した(Nature 227,680(1970))。公知の一連の標準蛋白質との比較により、両方の方法による新規蛋白質が、クマシーブルーでの着色後に、分子量約４２０００ダルトンの均一なバンドであることが判明した。
【００４１】
　他のバンドを認識することはできなかった。従ってこの蛋白質の純度は、≧９０％でありうる。
【００４２】
　この蛋白質は、明白な青−紫に着色されたバンドとして確認される。
【００４３】
　ｂ）Ｎ−末端シークエンシング
　例２により得られた蛋白質１０μｇ（≒２５０ｐＭｏｌ）を気相シーケンサーを用いてＮ−末端で数回シークエンシングした。
【００４４】
　Ｎ−末端配列分析は、同類の副配列の出現に基づき、Ｎ−末端アミノ酸配列の不均一性を示唆した。次の主配列を確認した：
　配列１ａ
　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ。
その他に、気相シークエンシングではＮ−末端でアミノ酸６個が延長された
　配列２ａ
　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ
及びＮ−末端でアミノ酸１個が減少された
　配列３ａ
　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕが確認された。
【００４５】
　同様に例３の蛋白質中では次の主配列が確認された：
　配列１ｂ
　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ（約１０％）
　配列２ｂ
　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ（約４５％）
　配列３ｂ
　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ（約４５％）。
【００４６】
　ｄ）トリプシンでの処理
　新規蛋白質２０μｇをｐＨ８．５で次のように処理した：
１．０．１ＭＮａＨＣＯ３−緩衝液ｐＨ８．５中に溶かしたトリプシン０．５μｇの添加；３７℃で１６時間のインキュベーション
２．０．１％ＳＤＳ−０．１ＭＮａＨＣＯ３−緩衝液ｐＨ８．５中に溶かしたトリプシン０．５μｇの添加；ＳＤＳ−含有率０．１％まで溶液を調整；３７℃で１６時間のインキュベーション。
【００４７】
　このように処理された蛋白質を、１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で、出発蛋白質と比較して分析した。蛋白質の減成は、確認できなかった。
【００４８】
　例６
　脱グリコシル化
　例２により得られたモノＱ−溶出液（≒０．１ｍｇ／蛋白質ｍｌ）０．１ｍｌを１ＭＮａＯＨでｐＨ７．２に調整した。引き続いてグリコペプチダーゼ　Ｆ(Fa.Boehringer Mannheim)１０単位を添加した。３７℃で６時間のインキュベーション後に、更に酵素１０単位を添加した。更に反応時間１６時間後にバッチ５０μｌを凍結乾燥させ、１５％ＳＤＳ−ゲル中で未処理の蛋白質と比較して分析した。酵素で処理された蛋白質は、未処理の試料と比較すると、約３ｋＤ小さい分子量を示した。更にバッチ２５μｌを、例１に記載のように、ＴＮＦα抑制作用に関して検査した。ＴＮＦα抑制作用は、糖分の脱離後にも完全に保持されていた。
【００４９】
　例７
　抗体製造
　例２及び３で単離された蛋白質を、ポリクロナール抗体の製造のためにイエウサギに注射した。抗体の反応性及び特異性をＥＬＩＳＡを用いて検査した。そのためにＥＬＩＳＡ−プレート(ELISA-Platte；Fa.Costar)を、抑制剤−もしくは対照蛋白質１μｇ／０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）　ｍｌの溶液で被覆し、非特異性結合を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで飽和させ、かつ種々の希釈血清と共にインキュベートした。結合された抗体の検査をビオチニル化された抗−ウサギ−ＩｇＧ及びストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ並びにＴＭＢ−基質を用いて行った。個々のインキュベーションの間に各々０．０５％トゥイーン(（Ｒ）Tween)−２０／ＰＢＳで３回洗浄した。２ＭＨ２ＳＯ４を用いる停止の後に、４５０ｎｍにおける光学密度を測定した。
【００５０】
　例８
　体液中の蛋白質検出
　種々の体液中のＴＮＦα結合蛋白質の検出のために、サンドイッチ−ＥＬＩＳＡ(sandwich-ELISA)を使用した。そのためにＥＬＩＳＡ−プレート(ELISA-Platte；Fa.Costar)をＴＮＦ（５μｇ／０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液　ｐＨ９．６　ｍｌ）で被覆した。１％ＢＳＡ／ＰＢＳで飽和させた後、検査すべき試料、例えばリウマチ患者の髄液と共にインキュベートした。検出を、例７に記載の抗−抑制剤−抗体及びビオチニル化された抗−ウサギ−ＩｇＧ／ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ／ＴＭＢ−基質を用いて行った。個々のインキュベーションの間に各々０．０５％トゥイーン(（Ｒ）Tween)−２０／ＰＢＳで３回洗浄した。２ＭＨ２ＳＯ４の添加後に、４５０ｎｍにおける吸光を測定した。