(57)【要約】【課題】本発明は、核を持たず、ミトコンドリア活性を示す、培養可能な細胞を製造する方法および該方法により得られる細胞を提供することを課題とする。【解決手段】核を持たず、ミトコンドリアＤＮＡを持つ細胞と、ミトコンドリアＤＮＡを持たないガン細胞由来培養細胞とを細胞融合し、得られたサイブリッド細胞を培養し、得られた培養細胞から浮遊細胞を回収することを特徴とする、核を持たず、ミトコンドリア活性を示す、培養可能な細胞を製造する方法および該方法により得られる細胞を提供する。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核を持たず、ミトコンドリアＤＮＡを持つ細胞と、ミトコンドリアＤＮＡを持たないガン細胞由来培養細胞とを細胞融合し、得られたサイブリッド細胞を培養し、得られた培養細胞から浮遊細胞を回収することを特徴とする、核を持たず、ミトコンドリア活性を示す、培養可能な細胞を製造する方法。
【請求項２】
核を持たず、ミトコンドリアＤＮＡを持つ細胞が、血小板である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ミトコンドリアＤＮＡを持たないガン細胞由来培養細胞が、Ｈｅｌａ　Ｒｈｏ０細胞である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法により得られる、核を持たず、ミトコンドリア活性を示す、培養可能な細胞。
【請求項５】
請求項４に記載の細胞に、被験薬剤を投与し、該細胞のミトコンドリア活性を指標として、ミトコンドリア関連疾患の治療薬剤をスクリーニングする方法。
【請求項６】
ミトコンドリア関連疾患が、ミトコンドリア病、アルツハイマー性痴呆又はパーキンソン症のうちのいずれかである請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核を持たず、ミトコンドリア活性を示す、培養が可能である新規な細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ミトコンドリアは固有のＤＮＡ（ミトコンドリアＤＮＡ：以下　「ｍｔＤＮＡ」ともいう）を持ち、独自の遺伝的発現システムを持つ。しかし、ｍｔＤＮＡには１３個のペプチドのみがコードされており、遺伝的発現システムに関する因子を含むほかのすべてのミトコンドリア蛋白質は核遺伝子にコードされている。従って、これまで、ミトコンドリアは、核なしでは維持できないと考えられてきた。従来、ミトコンドリアを肝臓、心筋、骨格筋、脳、血小板などから分離精製する技術が確立していた（非特許文献１〜３を参照）　。ミトコンドリア病、パーキンソン病、アルツハイマー病、Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ病を含む種々の疾患において、精製されたミトコンドリアを用いて、酵素活性などのミトコンドリア機能が評価されてきた（非特許文献３〜６を参照）。しかし、分離精製されたミトコンドリアは増殖能をもたず培養は不可能であった。
【０００３】
血小板は巨核球から分離し、ミトコンドリアを有するが核を有さない生体内にある特異的細胞である。しかし、血小板は増殖能を持たず生体内で数日間の寿命である。このため、ミトコンドリアの経時的変化を観察するのは不可能であった。
【０００４】
他方、Ｒｈｏ０細胞と表される、ｍｔＤＮＡを持たないヒト細胞株が単離されている（非特許文献７を参照）。Ｒｈｏ０細胞株を、変異ｍｔＤＮＡと融合し、サイトプラスミーを行うことにより、変異ｍｔＤＮＡを持った細胞（サイブリッド細胞）の培養が可能になった。Ｒｈｏ０細胞株と様々なミトコンドリア病の患者由来の除核細胞との融合により得られた細胞株はミトコンドリア疾患の解明に寄与している（非特許文献８〜１０を参照）。しかし、このようなサイブリッド細胞のミトコンドリアは常に核の影響下にあり、培養細胞に薬剤を投与した際のミトコンドリアの変化は核を介してのミトコンドリアへの間接作用による可能性があり、薬剤などのミトコンドリアへの直接作用を評価するのにはこのようなサイブリッド細胞では不十分であった。これらのことから、核がなくミトコンドリア活性を示すミトコンドリアが主体をなす細胞の培養が望まれていた。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｓｔｕｍｐｆ　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｍｅｄ　２１，　１８２−１８９，　１９７９．
【非特許文献２】
Ｈａｔａｆｉ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．　Ａ．Ｂ．Ｂ．　９４　１４８，　１９６４．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ＩＶ，　５１−５９，　１９７９．
【非特許文献３】
Ｈａａｓ　ＲＨ，　Ｋ　Ｎａｋａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．　Ａｎｎ　Ｎｅｕｒｏｌ　１９９５；３７：７１４−７２２．
【非特許文献４】
Ｓｈｏｆｆｎｅｒ　ＪＭ，　Ｂｒｏｗｎ　ＭＤ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　１７：１７１−１８４，１９９３．
【非特許文献５】
Ｇｒｕｎｅｗａｌｄ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．　Ａｎｎ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ａｃａｄｅｍｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　８９３：２０３−２１３，１９９９．
【非特許文献６】
Ｍａｕｒｅｒ　Ｉ　ｅｔ　ａｌ．　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ａｇｉｎｇ　２１：４５５−６２，　２０００．
【非特許文献７】
ＧｕＭ　Ｃｏｏｐｅｒ　ＪＭ　ｅｔ　ａｌ．　Ａｎｎ　Ｎｅｕｒｏｌ　４４：１７７−１８６，　１９９８．
【非特許文献８】
Ｃｈｏｍｙｎ　Ａ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８９：４２２１−４２２５，　１９９２．
【非特許文献９】
Ｄｕｎｂａｒ　ＤＲ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｈｕｍ　Ｍｏｌ　Ｇｅｎｅｔ　５：１２３−１２９，　１９９６．
【非特許文献１０】
Ｃｈｏｍｙｎ　Ａ，　ｅｔ　ａｌ．　Ａｍ　Ｊ　Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅｔ　３４：９６６−９７４，　１９９４．
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、核を持たず、ミトコンドリア活性を示し、培養可能な細胞を製造する方法および該方法により得られる細胞を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、核を持たず、ミトコンドリアＤＮＡを持つ細胞と、ミトコンドリアＤＮＡを持たないガン細胞由来培養細胞とを細胞融合し、得られたサイブリッド細胞を培養し、得られた培養細胞から浮遊細胞を回収することにより、核を持たず、ミトコンドリア活性を示す、培養可能な細胞を得ることに成功し、発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明は上記のようにしてなされたものであり、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）　核を持たず、ミトコンドリアＤＮＡを持つ細胞と、ミトコンドリアＤＮＡを持たないガン細胞由来培養細胞とを細胞融合し、得られたサイブリッド細胞を培養し、得られた培養細胞から浮遊細胞を回収することを特徴とする、核を持たず、ミトコンドリア活性を示す、培養可能な細胞を製造する方法。
（２）　核を持たず、ミトコンドリアＤＮＡを持つ細胞が、血小板である（１）に記載の方法。
（３）　ミトコンドリアＤＮＡを持たないガン細胞由来培養細胞が、Ｈｅｌａ　Ｒｈｏ０細胞である（１）又は（２）に記載の方法。
（４）　（１）〜（３）のいずれかに記載の方法により得られる、核を持たず、ミトコンドリア活性を示す、培養可能な細胞。
（５）　（４）に記載の細胞に、被験薬剤を投与し、該細胞のミトコンドリア活性を指標として、ミトコンドリア関連疾患の治療薬剤をスクリーニングする方法。
（６）　ミトコンドリア関連疾患が、ミトコンドリア病、アルツハイマー性痴呆又はパーキンソン症のうちのいずれかである（５）に記載の方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明の細胞の製造方法
本発明の細胞の製造方法は、核を持たず、ミトコンドリアＤＮＡを持つ細胞と、ミトコンドリアＤＮＡを持たないガン細胞由来培養細胞とを細胞融合し、得られたサイブリッド細胞を培養し、得られた培養細胞から浮遊細胞を回収することを特徴とする、核を持たず、ミトコンドリア活性を示す、培養可能な細胞を製造する方法である。以下、核を持たず、ミトコンドリア活性を示す、培養可能な細胞を「ミトコンドリア細胞」ともいう。
本発明の方法に用いられる、核を持たず、ミトコンドリアＤＮＡを持つ細胞は、核及びミトコンドリアＤＮＡを持つ細胞から核を除核して用いてもよく、または、遺伝的に核を持たず、ミトコンドリアＤＮＡを持つ細胞を用いてもよいが、遺伝的に核を持たず、ミトコンドリアＤＮＡを持つ細胞を用いることが好ましい。このような細胞としては、例えば、血小板などが好ましく例示される。
核を持たず、ミトコンドリアＤＮＡを持つ細胞は、細胞中にミトコンドリアＤＮＡを持つ生物から取得することができる。このような生物としては、哺乳動物が好ましく、特にヒトが好ましい。
本発明の方法において、核を持たず、ミトコンドリアＤＮＡを持つ細胞として、事前にインフォームドコンセントを受けたミトコンドリア関連疾患を有する患者から取得された細胞を用いることにより、ミトコンドリア病変変異を有するミトコンドリア細胞を得ることができる。ミトコンドリア関連疾患としては、例えば、リー（Ｌｅｉｇｈ）症候群などのミトコンドリア病、アルツハイマー性疾患、およびパーキンソン症などが挙げられる。
【００１０】
本発明の方法に用いられる、ミトコンドリアＤＮＡを持たないガン細胞由来培養細胞としては、核を持ち、ミトコンドリアＤＮＡを持たない公知のＲｈｏ０細胞株が例示され、具体的には、Ｈｅｌａ　Ｒｈｏ０細胞株、繊維芽細胞Ｒｈｏ０細胞株及び骨肉腫細胞Ｒｈｏ０細胞株などが例示され、この中でＨｅｌａ　Ｒｈｏ０細胞株が好ましく例示される。なお、ガン細胞由来培養細胞は、生体中のガン組織由来の細胞を培養したものであってよく、また、生体中の正常組織由来の細胞をガン化して得られた樹立細胞株由来の細胞を培養したものであってもよい。
【００１１】
本発明の方法において、細胞融合は、サイブリッドを作製するための通常の細胞融合手法に従って行うことができる。
具体的には、例えば、細胞融合は、ミトコンドリアドナーである核を持たず、ミトコンドリアＤＮＡを持つ細胞に、ミトコンドリアＤＮＡを持たないガン細胞由来培養細胞を加え、エチレングリコール存在下などで細胞融合させる方法などにより行うことができる。
【００１２】
得られたサイブリッド細胞の培養は、通常の細胞培養手段に従って行うことができる。
具体的には、例えば、サイブリッド細胞の培養は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）中で、３７℃で、８％　ＣＯ２を含む加湿混合気体中で培養を行うことができる。培養は７〜３０日間、好ましくは、１４〜３０日間行うことができる。
サイブリッド細胞は、始め接着形態を示して増殖し、続いて、増殖した細胞は接着細胞に重なるが、過増殖が進むにつれ、重なっている細胞が接着細胞から分離され、培養液中に浮遊する。本明細書における「浮遊細胞」とは、培養液中に浮遊するこれらの細胞を意味する。
浮遊細胞の回収は、培養液の上清を回収することなどにより行うことができる。
【００１３】
（２）本発明のミトコンドリア細胞
上記方法によって得られる、本発明のミトコンドリア細胞は、核を持たず、ミトコンドリア活性を示す、培養可能な細胞である。
本明細書において「核を持たない」とは、好ましくは核構造および核ＤＮＡを持たないことを意味する。さらに本明細書において「核を持たない」とは、細胞群中において５％以下、好ましくは３％以下の細胞が核を持つが、残りの細胞が核を持たないことを意味する。
核の有無は、例えば、ヘマトキシリン−エオシン染色などにより確認することができる。また、核、核ＤＮＡ及びミトコンドリア活性の有無は、例えば、核、核ＤＮＡ及びミトコンドリア膜電位をそれぞれ特異的に染色する蛍光色素により、各細胞構造を標識し、蛍光顕微鏡下で観察することなどにより確認することができる。各細胞構造の蛍光色素による標識および蛍光顕微鏡による検出は、通常の手法に従って行うことができる。核及び核ＤＮＡを標識する蛍光色素としては、例えばＳＹＴＯ　Ｇｒｅｅｎなどが挙げられる。ミトコンドリア膜電位を標識する蛍光色素としては、例えば、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ　Ｇｒｅｅｎなどが挙げられる。これらの蛍光色素は、例えば、モレキュラープローブ社などから販売されているものを用いることができる。
本明細書において、「ミトコンドリア活性を示す」とは、活性なミトコンドリア膜を標識するＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ　Ｇｒｅｅｎなどの色素で標識される構造を有することを意味する。
【００１４】
本発明のミトコンドリア細胞は、継続的な培養が可能である。培養は通常の細胞培養手段に従って行うことができる。本明細書において、「培養が可能」とは、通常のミトコンドリア細胞の培養に適した培地条件にて細胞を培養した場合に、３ヶ月以上、好ましくは６ヶ月以上、より好ましくは１年以上、培養細胞が増殖維持されることを意味する。
具体的には、例えば、本発明のミトコンドリア細胞の培養は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）中で、３７℃で、８％　ＣＯ２を含む加湿混合気体中で培養を行うことができる。
【００１５】
なお、本発明において用いられる組織からの細胞の調製、細胞の培養、ＰＣＲ、ＰＣＲプライマーの調製、ミトコンドリア及び核ＤＮＡの調製などの方法は、当業者によく知られている通常の遺伝子工学的手法に従って、行うことができる。
【００１６】
（３）本発明のスクリーニング方法
本発明のミトコンドリア細胞は、核を持たず、ミトコンドリア活性を示し、さらに培養が可能であるため、ミトコンドリア関連疾患の治療薬を開発するためのスクリーニング系として有用である。
具体的に、本発明のミトコンドリア細胞をミトコンドリア関連疾患治療薬のスクリーニング系として、例えば、次のように用いることができる。目的の疾患を有する患者由来の、核を持たず、ミトコンドリアＤＮＡを持つ細胞と、ミトコンドリアＤＮＡを持たないガン細胞由来培養細胞とのサイブリッドから得られた本発明のミトコンドリア細胞を被験細胞群及び対照細胞群にわけ、被験細胞群に試験する治療薬を投与し、その後、被験細胞群、及び、対照細胞群のミトコンドリア膜電位活性などを測定し、各群を比較し、治療薬の効果を検討し、ミトコンドリア関連疾患治療薬をスクリーニングすることができる。このような治療薬の例として、ミトコンドリア病、アルツハイマー性痴呆又はパーキンソン症の治療薬などが好ましく挙げられる。
【００１７】
本発明において、核を持たず、ミトコンドリア活性を示し、さらに培養が可能であるミトコンドリア細胞が開発された。これまで、活性なミトコンドリアを持ち、核を持たないこの種の細胞型については報告がない。
また、この結果は一回の異常な細胞培養によりなされたものではなく、ミトコンドリア細胞は病変変異を有する、あるいは有さないサイブリッドから繰り返し得られているということを強調する。
血小板は核を持たずに活性なミトコンドリアを持つので、親の親である血小板から、いくつかの性質がミトコンドリア細胞に伝えられているかもしれない。しかしながら、親の幹細胞の核ＤＮＡは、Ｈｅｌａ細胞から由来されているはずである。いくつかの信号がサイトゾル由来のＨｅｌａ核またはミトコンドリアを刺激するかもしれない。このミトコンドリア細胞は、核がどのように消失したか、信号は何か、どのようにミトコンドリアは維持されるかを調べるために非常に有用であろう。さらに、サイブリッドが核のバックグラウンドの影響を除外するものであったように、これらは変異ミトコンドリアの役割を調べるのに適用可能であり得る。
【００１８】
【実施例】
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は、その要旨をこえない限り、これらの実施例に限定されるものではない。
【００１９】
【実施例１】ｍｔＤＮＡを持たないＨｅｌａ細胞と、血小板との細胞融合によるサイブリッドおよび該サイブリッド由来の浮遊細胞の作製
ミトコンドリアゲノムＤＮＡの塩基番号９１７６（Ｔ９１７６Ｃ）における病変点突然変異の役割を調べるために、ｍｔＤＮＡを持たないＨｅｌａ細胞と、健常対照およびリー症候群の患者由来の血小板との融合によりサイブリッド細胞株を構築した。
（１）Ｒｈｏ０細胞培養
ｍｔＤＮＡを除去したヒトＨｅｌａ細胞株（ｍｔＤＮＡを持たないＲｈｏ０細胞）を、１０％ウシ胎児血清、５０　Ｕ／ｍｌペニシリン、５０　μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．２　ｍＭウリジン、２　ｍＭグルタミンおよび１　ｍＭピルビン酸ナトリウムを添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（ギブコＢＲＬ．　米国）中で、３７℃で、８　％　ＣＯ２を含む加湿混合気体中で培養した。
【００２０】
（２）血小板の精製
ミトコンドリアＡＴＰａｓｅ　６遺伝子のＴ９１７６Ｃ変異を有する血液サンプルを、リー症候群を示す２人の兄弟、および対照血液サンプルを、２人の健常ボランティアである４５才男性および３０才女性から得た。両ボランティアはこの研究に参加するためにインフォームドコンセントを受けた。兄弟は１８才の女性および１３才の男性であり、彼らの保護者はこの研究に彼らの細胞を使用することに同意した。これらの症例の臨床的詳細は以前に報告されている（Ｍａｋｉｎｏ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．　Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ　Ｄｉｓ　８：１４９−１５１，　１９９８　；　Ｎａｋａｎｏ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．　Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　１５：２１７，　１９９９　（ａｂｓｔｒａｃｔ）　（Ｊａｐａｎｅｓｅ））。血小板の単離は血液サンプルの取得後、２時間以内に、以前報告されたように行った（Ｓｈｕｌｔｓ　ＣＷ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ　５０：１９３−１９５，　１９９８）。簡単には、以下のようにして行った。２　ｍｌ容量の４．５％クエン酸を加えた２０　ｍｌの全血を得た。血液を室温で１０分間、２００　ｇで遠心し、上清の２／３中に血小板に富んだ血漿を生成させた。血小板に富んだ血漿を回収し、３０分間、３０００　ｇで再度遠心した。血小板を多く含む沈殿を洗浄し、その後回収した。
【００２１】
（３）血小板融合サイブリッド
血小板融合サイブリッドを、以前報告された方法に従って得た（Ｏｈｔａ　Ｓ．　細胞工学（Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　５（２）：１６０−１６５，　１９８６）。合計で５×１０７個のＲｈｏ０細胞を、０．０５　％トリプシン−ＥＤＴＡの添加後回収し、ハンクスバッファーに懸濁した。懸濁物を穏やかに血小板の沈殿に加え、１０分間、２００　ｇで遠心した。沈殿は血小板とＲｈｏ０細胞の混合物と考えられた。次に、０．２　ｍｌの０．１　％のエチレングリコール（ＤＭＳＯ）を、３０秒間２回加え、３０秒間室温で休ませた。その後、ウシ胎児血清を含まないＤ−ＭＥＭを４　ｍｌ添加し、ゆっくりと沈殿と混合させ、１０分間室温で放置した。混合したバッファーを、１０　％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤ−ＭＥＭ　４０　ｍｌ中にデカントした。細胞を９６ウェル中で培養した。血小板融合サイブリッドの単一クローンのコロニーを各ウェルで、バッファーを３日毎に交換し、培養した。単一クローンの血小板融合サイブリッド細胞株を構築した。
【００２２】
得られたサイブリッド細胞株（５個の対照および４１個のＴ９１７６Ｃ変異細胞株）を単離した。細胞株１はＴ９１７６Ｃ変異を有するリー症候群の患者の姉の方から得た。細胞株２はＴ９１７６Ｃ変異を有するリー症候群の患者の弟の方から得た。細胞株３は対照から得た。サイブリッドは始め接着形態を示して増殖し、続いて、増殖した細胞は接着細胞に重なった。過増殖が進むにつれ、重なっている細胞は接着細胞から分離され、培養液中に浮遊した。サイブリッド細胞株由来の浮遊細胞は回収され、１０％　ＦＢＳを添加した新鮮なＤ−ＭＥＭ培地中で、３７℃で、８％　ＣＯ２を含む加湿混合気体中で培養が続けられた。上記浮遊細胞は、連続的に約１ヶ月間加速度的に増殖を続け、同じ条件下で１年半増殖を続けた。
【００２３】
【実施例２】浮遊細胞のＤＮＡ解析
浮遊細胞が確かに、血小板とＲｈｏ０Ｈｅｌａ細胞を融合して得られたサイブリッド細胞由来であることを確認した。
（１）ＤＮＡ解析
ゲノムＤＮＡを、対照およびＴ９１７６Ｃ変異を有する患者の血小板由来のサイブリッド、およびその誘導体であるミトコンドリア細胞から、通常の方法に従って抽出した。Ｔ９１７６Ｃ変異の検出を、以前に示された方法（Ｍａｋｉｎｏ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．　Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ　Ｄｉｓ　８：１４９−１５１，　１９９８　；　Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ　Ｄ　ｅｔ　ａｌ．　Ａｎｎ　Ｎｅｕｒｏｌ　３８（３）：４６８−７２，　１９９５　；　Ｃａｍｐｏｓ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ　４９：５９５−５９７，　１９９７）により、ポリメラーゼチェインリアクション制限多型（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）解析により行った。ｍｔＤＮＡ位置９０２５−９０４６（フォワード）ＧＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＣＡＴＧＣＡＣＣＴＡＡ（配列番号１）および断片の３’　末端から３　ｂｐの９１７９の位置にＴからＣへのミスマッチを含む９２０３−９１７７（リバース）ＧＴＧＴＴＧＴＣＧＴＧＣＡＧＧＴＡＧＡＧＧＣＴＴＣＣＴ（配列番号２）オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、変異を包含するｍｔＤＮＡの１７８塩基対（ｂｐ）断片を増幅した。ｍｔＤＮＡの塩基番号は、Ａｎｄｅｒｓｏｎ等の文献（Ａｎｄｅｒｓｏｎ　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ　２９０：４５７−４６５，　１９８１）に従って決定した。ＰＣＲは、９４℃、１分；６０℃、１分；７２℃、１分を３５サイクルの反応条件で行った。ＰＣＲ産物を１５　ＵのＳｃｒｆＩで２４時間、３７℃で消化し、３　％アガロースゲルを電気泳動させ、エチジウムブロマイドで染色した。変異ｍｔＤＮＡにおいて、ミスマッチ含有プライマーは、ｎｔ９１７６のＳｃｒｆＩの制限部位を導入する。したがって、ＳｃｒｆＩは野生型ｍｔＤＮＡを分断せず、１７８ｂｐの断片が残るのに対し、ＳｃｒｆＩは変異ｍｔＤＮＡを１５１ｂｐ及び２７ｂｐの２つの断片に分断する。
【００２４】
Ｔ９１７６Ｃ変異を検出するためのＰＣＲ−ＲＦＬＰ解析によれば、Ｔ９１７６Ｃ変異を有するサイブリッドに由来する浮遊細胞は、図１に示すように変異を有する。他方では、対照血小板融合サイブリッド由来の浮遊細胞は、塩基位置９１７６における野生型ｍｔＤＮＡを持つ（図１）。浮遊細胞およびそれらのもととなるサイブリッド細胞は、患者および対照の血小板由来のｍｔＤＮＡを持つことを確認した。
【００２５】
以下図１に示す結果の説明をする。
図１は、新規なミトコンドリア細胞におけるＴ９１７６Ｃ変異の制限断片長解析の結果を示す。野生型ｍｔＤＮＡが切断されず、１７８ｂｐであるのに対し、この変異が存在すると１７８ｂｐの増幅断片はＳｃｆＩで、１５１ｂｐと２７ｂｐに切断される（２７ｂｐの断片はここには示されない）。レーン１−１０は、Ｔ９１７６Ｃ変異を有する１５１ｂｐ断片を示すが、レーン１１はＴ９１７６Ｃ変異を有さない１７８ｂｐ断片を示す。レーン１−５は、Ｔ９１７６Ｃ変異を有するリー症候群患者の姉の血小板由来の細胞株１の標本を示す。レーン６−１０は、細胞番号１の弟の血小板由来の細胞株２の標本を示す。レーン１１は、細胞株３の標本を示す（対照）。レーンＭは、ｐｓｉ１７４／Ｈｉｎｄ　ＩＩＩのサイズマーカーである。
【００２６】
【実施例３】浮遊細胞の特徴
浮遊細胞の細胞内構造をヘマトキシリン−エオシン染色により確認した。
浮遊細胞は接着せず、しかしながらゆるく凝集した。顕微鏡下で、細胞表面は粗い膜構造を持っていた（図３−１ｂ）。ヘマトキシリン−エオシン染色されたサイトゾルは同種エオシン色を呈したが、驚くべきことにヘマトキシリン染色はされず、このことは核が存在しないことを示した（図２ａ）。これに対して、もとのサイブリット細胞は、ヘマトキシリンで染色される明らかな核構造を持っていた（図２ｂ）。この結果は、多くの浮遊細胞が核構造及び核ＤＮＡを持たないことを示した。
【００２７】
以下図２に示す結果の説明をする。
図２は、浮遊細胞の顕微鏡的特徴を示す。細胞株は株２である（ｍｔＤＮＡのＴ９１７６Ｃ変異を有するリー症候群患者の弟の血小板由来）。
（ａ）ミトコンドリア細胞は核を欠いている。細胞はヘマトキシリン−エオシンで染色した。倍率は２０×（明）。ヘマトキシリン−エオシン染色サイトゾルは同種エオシン色を呈したが、驚くべきことにヘマトキシリン染色は見られなかった。
（ｂ）陽性対照としての、ヘマトキシリン−エオシン染色で核を染色したもとのサイブリッド細胞。倍率は２０×（明）。
【００２８】
以下図３に示す結果の説明をする。
図３は、浮遊細胞及びもとのサイブリッドの共焦点顕微鏡解析の結果を示す。図３−１は、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ蛍光色素により判定されたミトコンドリア膜活性を含有する野生型浮遊細胞である（倍率６０×）。
（ａ）白い顆粒粒子が細胞中に分散していた。形と大きさはサイブリッドのミトコンドリアと同一であった。
（ｂ）透過顕微鏡検査における浮遊細胞は、膜状表面を示した。
【００２９】
【実施例４】ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ蛍光色素、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒおよびＭｉｔｏＧｒｅｅｎ二重染色、ならびに、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒおよびＳＹＴＯ　Ｇｒｅｅｎ二重染色を用いた共焦点測定
浮遊細胞の細胞内構造を共焦点蛍光顕微鏡を用いた蛍光色素染色により、さらに確認した。
（１）共焦点蛍光顕微鏡を用いたＭｉｔｏＴｒａｃｈｅｒ、ＭｉｔｏＴｒａｃｈｅｒ　ＧｒｅｅｎおよびＳＹＴＯ　Ｇｒｅｅｎ核酸染色
ＭｉｔｏＴｒａｃｈｅｒ　ＣＴＸ−Ｒｏｓプローブ（以後、ＭｉｔｏＴｒａｃｈｅｒという）（モレキュラープローブ、オレゴン）は、Ｘ−ロザミン由来の脂肪親和性のカチオン色素であり、ミトコンドリア膜活性を測定する際、細胞固定の間もよく維持される、ミトコンドリア選択的染色を表す。ＭｉｔｏＴｒａｃｈｅｒ　Ｇｒｅｅｎ（モレキュラープローブ、オレゴン）も、ミトコンドリア膜活性を増強することなく、ミトコンドリア選択的である（Ｌｉｇｏｎ　ＬＡ　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ　Ｃｏｍｐ　Ｎｅｕｒｏｌ　４２７：３４０−３５０，　２０００　；　Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ　４５：１０５３−１０５７，　１９９７）。ＳＹＴＯ　Ｇｒｅｅｎ（Ｓｙｔｏ　１６）（モレキュラープローブ、オレゴン）は、生細胞中でも核酸染色される蛍光色素である（Ｆｒｅｙ　Ｔ．　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　２１：２６５−２７４）。２０　ｎＭのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ、２０　ｎＭのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒおよび１００　ｎＭのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ　Ｇｒｅｅｎ、１００　ｎＭのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ　Ｇｒｅｅｎおよび１　μＭのＳＹＴＯ　Ｇｒｅｅｎをそれぞれ加えたサンプルを１５分間放置した。ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒによる単染色、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒおよびＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ　Ｇｒｅｅｎによる二重染色、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒおよびＳＹＴＯ　Ｇｒｅｅｎによる二重染色の切片スキャンを、コンピューター補助共焦点蛍光顕微鏡（ＦｌｕｏＶｉｅｗ　ＦＶ３００、オリンパス、東京）を用いて細胞内構造解析のために得た。
【００３０】
ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ　ＣＴＸ−Ｒｏｓ（以下、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒという）は、ミトコンドリア特異的なミトコンドリア膜電位を表す。浮遊細胞をＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒで染色し、共焦点顕微鏡で観察した結果、図３−１ａに示すように、細胞内に顆粒粒子が分散していた。形や大きさは、サイブリッドのミトコンドリアと同一であった（図３−２ｃ，ｇ）。ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ　Ｇｒｅｅｎ色素はミトコンドリアの膜活性に関わらず、特異的にミトコンドリアを標識する。共焦点蛍光顕微鏡を用いたＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒおよびＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ　Ｇｒｅｅｎ二重標識は、野生型浮遊細胞および変異型浮遊細胞の両者のＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（図３−２ａ，ｅ）およびＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ　Ｇｒｅｅｎ（図３−２ｂ，ｆ）による陽性染色を表した。野生型サイブリッドおよび変異型サイブリッド両者におけるミトコンドリアは、核を取り囲んで顆粒状にＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（図３−２ｃ，ｇ）およびＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ　Ｇｒｅｅｎ（図３−２ｄ，ｈ）により染色された。蛍光色素ＳＹＴＯ　Ｇｒｅｅｎは、生細胞中へ膜を浸透して核の核酸を染色する。浮遊細胞およびサイブリッドをＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒおよびＳＹＴＯ　Ｇｒｅｅｎ色素の二重色素を用いて共焦点蛍光顕微鏡を用いて標識した結果（図３−３）、野生型浮遊細胞および変異型浮遊細胞のどちらもＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒで陽性染色されたが（図３−３ｄ，ｉ）、ＳＹＴＯ　Ｇｒｅｅｎでの陰性染色は陰性であった（図３−３ｂ，ｇ）。一方では、野生型および変異型においてもとのサイブリッドは、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（図３−３ｄ、ｉ）およびＳＹＴＯ　Ｇｒｅｅｎ色素（図３−３ｅ，ｊ）で陽性染色された。
これらの結果は、浮遊細胞の多くはミトコンドリア膜活性を示し、しかし、核構造および核ＤＮＡを欠いていることを強く示唆する。したがって、これらの浮遊細胞をミトコンドリア細胞と名付けた。
【００３１】
以下図３に示す結果の説明をする。
図３は、浮遊細胞及びもとのサイブリッドの共焦点顕微鏡解析の結果を示す。図３−２。サイブリッドのミトコンドリアがそうであるように、野生型および変異型の浮遊細胞はミトコンドリア選択性色素特異的なミトコンドリア膜を有した（倍率１００×）。
（ａ，ｅ）両野生型浮遊細胞（ａ）および変異型浮遊細胞（ｅ）は、ミトコンドリア膜活性に特異的なＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒにより標識された顆粒状の染色を示した。
（ｂ，ｆ）両野生型浮遊細胞（ｂ）および変異型浮遊細胞（ｆ）は、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ
Ｇｒｅｅｎにより標識された顆粒状の染色を示した。
（ｃ，ｄ，ｇ，ｈ）野生型サイブリッドのミトコンドリアは、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ　色素（ｃ）およびＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ　Ｇｒｅｅｎ（ｄ）標識された、核を取り囲む顆粒状染色を示した。変異型サイブリッドのミトコンドリアもまた、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ　色素（ｇ）およびＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ　Ｇｒｅｅｎ（ｈ）標識された、核を取り囲む顆粒状染色を示した。
【００３２】
図３−３。野生型浮遊細胞および変異型の浮遊細胞はＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒおよびＳＹＴＯ　Ｇｒｅｅｎ色素標識核構造および核ＤＮＡを欠く（倍率１００×）。
（ａ，ｆ）野生型浮遊細胞（ａ）および変異型（ｆ）は、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒにより標識された顆粒状の染色を示した。
（ｂ，ｇ）野生型浮遊細胞（ｂ）および変異型（ｇ）は、ＳＹＴＯ　Ｇｒｅｅｎ標識陰性を示した。
（ｃ，ｈ）透過顕微鏡検査は、野生型（ｃ）および変異型（ｈ）浮遊細胞における粗い膜状表面を示した。
（ｄ，ｉ）野生型サイブリッド（ｄ）および変異型サイブリッド（ｉ）は、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ色素により標識された核を取り囲む顆粒状の染色を示した。
（ｅ，ｊ）野生型（ｅ）および変異型（ｊ）における核。野生型サイブリッドはＳＹＴＯ　Ｇｒｅｅｎ標識で染色された。
【００３３】
【実施例５】ＳＹＴＯ　Ｇｒｅｅｎ　およびＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒを用いたミトコンドリア細胞のフローサイトメトリー
ミトコンドリア細胞集団における核およびミトコンドリアの存在を調べるため、二色フローサイトメトリーを行った。
ミトコンドリア細胞に１００　ｎＭのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒおよび１　μＭのＳＹＴＯ　Ｇｒｅｅｎを添加した後、サンプルを１５分間放置した。サンプルをフローサイトメーター（Ｅｐｉｃｓ　Ｅｌｉｔｅ　ＥＳＰ、ベックマンコールター、米国）で試験した。２色における他のスペクトラムバンドから誘導された擬陽性を無視することについては、ＭｉｔｏｒａｃｋｅｒおよびＳＹＴＯ　Ｇｒｅｅｎの単一標識である陰性対照で確認した。ミトコンドリア細胞またはサイブリッドの全細胞のカウントは、４０００−８０００周辺であった。
【００３４】
ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒおよびＳＹＴＯ　Ｇｒｅｅｎで二重染色した、健常対照及びＴ９１７６Ｃ変異を有するサイブリッドおよび各サイブリッド由来のミトコンドリア細胞のフローサイトメトリーの結果を図４−１に示した。フローサイトメトリーの結果を、ＳＹＴＯ　Ｇｒｅｅｎ　およびＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒの陽性または陰性により、４つの領域に分割した。Ｔ９１７６Ｃ変異型ミトコンドリア細胞の９７．６％および野生型ミトコンドリア細胞の９９．６％がＳＹＴＯ　Ｇｒｅｅｎ陰性領域に存在した。他方では、Ｔ９１７６Ｃ変異型サイブリッドの９２．４％および野生型サイブリッドの９７．３％がＳＹＴＯ　Ｇｒｅｅｎ　およびＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ陽性領域に存在した。これらの結果は、主なミトコンドリア細胞は核を欠いているが、数％未満の細胞のみが核および核ＤＮＡを維持していることを示唆する。
【００３５】
ミトコンドリア膜活性は、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒにより、ミトコンドリア細胞およびサイブリッドにおいてＴ９１７６Ｃ　ｍｔＤＮＡ変異株および野生型ｍｔＤＮＡ株間で比較した（図４−２）。Ｔ９１７６Ｃ変異ｍｔＤＮＡを有するミトコンドリア細胞は、野生型ｍｔＤＮＡを持つものよりもミトコンドリア活性がより少なかった。ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒの強度は変異型ミトコンドリア細胞において、１７．４±２０．４（標準±標準偏差）であり、野生型において３７．８±３０．９であった。結果は、サイブリッドにおけるＴ９１７６Ｃ　ｍｔＤＮＡ変異株および野生型ｍｔＤＮＡ株間の違いに相当した。変異サイブリッドにおいて強度は４３．５±７９．９であり、野生型において１０１．６±７１．７であった。Ｔ９１７６Ｃ変異ｍｔＤＮＡを有するサイブリッドも、野生型ｍｔＤＮＡのものに対して、活性の少ないミトコンドリアを持つ。この結果は、Ｔ９１７６Ｃ　ｍｔＤＮＡ変異は、ミトコンドリア膜活性の減少に、核の存在に関係なく、影響することを示唆する。
【００３６】
以下図４に示す結果の説明をする。
図４は、ＳＹＴＯ　Ｇｒｅｅｎ及びＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ色素染色ミトコンドリア細胞およびもとのサイブリッドにおけるフローサイトメトリーの結果を示す。
（ａ）ミトコンドリア変異型細胞。（ｂ）ミトコンドリア野生型細胞。（ｃ）変異型サイブリッド。（ｄ）野生型サイブリッド。
図４−１。ミトコンドリア細胞は、ミトコンドリア膜活性を保持していたが、核または核ＤＮＡの多くを欠いていた。領域をＳＹＴＯ　Ｇｒｅｅｎ　およびＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒの陽性、陰性により４つの部分に分けた。陽性または陰性の標準は陰性対照およびサイブリッドの単一染色にしたがって決定した。Ｔ９１７６Ｃ変異型ミトコンドリア細胞（ａ）の９７．６％および野生型ミトコンドリア細胞（ｂ）の９９．６％は、各図の第１および３領域からなるＳＹＴＯ　Ｇｒｅｅｎ陰性領域に存在した。一方、Ｔ９１７６Ｃ変異型サイブリッドの９２．４％（ｃ）および野生型サイブリッド（ｄ）の９７．３％は、第２領域と表される両ＳＹＴＯ　Ｇｒｅｅｎ　およびＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ陽性領域に存在した。
図４−２。Ｔ９１７６Ｃ変異型ｍｔＤＮＡを持つミトコンドリア細胞は、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒにより評価されたように、野生型およびサイブリッドよりも活性の少ないミトコンドリア膜を表した。
（ａ）左の白抜き曲線が変異型ミトコンドリア細胞の強度である。右の黒塗り曲線が野生型のものである。
（ｂ）左の白抜き曲線が変異型サイブリッドの強度である。右の黒塗り曲線が野生型のものである。
【００３７】
【実施例６】ミトコンドリア細胞の増殖試験
ミトコンドリア細胞の増殖を検討した。
（１）フローサイトメーターを用いたミトコンドリア細胞のソーティング
サンプルとしてＴ９１７６Ｃ　ｍｔＤＮＡ変異型と野生型のそれぞれのミトコンドリア細胞を用いた。対象として野生型ｍｔＤＮＡサイブリッドを用いた。生細胞の核酸に特異的なＳｙｔｏ　Ｇｒｅｅｎ　（Ｓｙｔｏ　１６）（モレキュラープローブ、オレゴン）をサンプルに１μＭ添加し１５分間放置して蛍光染色し、フローサイトメーター（Ｅｐｉｃｓ　ＡＬＴＲＡ（商標）　ＨｙｐｅｒＳｏｒｔ（商標）、ベックマンコールター、米国）を用いてソーティングした。ミトコンドリア細胞のもととなったサイブリッド細胞の核染色の蛍光強度を基準に同等の蛍光強度を持つものを核ＤＮＡ量含有群、それ以下のものを核ＤＮＡ非含有群として、変異型と野生型のミトコンドリア細胞についてソーティングを行った。
【００３８】
（２）細胞数の計測
ソーティングしたミトコンドリア細胞は新鮮な１０％　ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ　１６４０培地中で８％　ＣＯ２を含有する加湿混合気体中で３７℃で培養した。対象のサイブリッドをＳｙｔｏ　Ｇｒｅｅｎへの暴露の後、ＲＰＭＩの変わりにＤＭＥＭ培地を用いる以外は上記と同様の条件で培養した。核ＤＮＡ量含有群と核ＤＮＡ非含有群とを経時的に（２週間毎）トリパンブルー染色を用いた色素排除試験により細胞数を計測した。
試験の結果、核ＤＮＡ量含有群と同様、核ＤＮＡ非含有群も増殖した（図５−１、２）。しかし、核ＤＮＡ量含有群の増殖速度が核ＤＮＡ非含有群より速かった（図５−１）。本研究で、ミトコンドリア細胞は細胞群中において核ＤＮＡ量が非常に少ない状態で増殖可能であること、すなわち、核なしで増殖可能なことが示唆された。
【００３９】
以下に図５に示す結果の説明をする。
図５はミトコンドリア細胞の増殖試験の結果を示す。＃３（＋）は野生型ミトコンドリア細胞の核ＤＮＡ量含有群、＃３（−）は核非含有群を示す。＃２（＋）はＴ９１７６Ｃ変異型ミトコンドリア細胞の核ＤＮＡ量含有群、＃２（−）は核非含有群を示す。各群の細胞数は経時的にトリパンブルー染色で計測した。
【００４０】
【発明の効果】
本発明により、核を持たず、ミトコンドリア活性を示す、培養可能な細胞を製造する方法および該方法により得られる細胞が提供される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】新規なミトコンドリア細胞におけるＴ９１７６Ｃ変異の制限断片長解析の結果を示す図（写真）である。
【図２】浮遊細胞の顕微鏡的特徴を示す図（写真）である。
【図３】浮遊細胞及びもとのサイブリッドの共焦点顕微鏡解析の結果を示す図（写真）である。
【図４】ＳＹＴＯ　Ｇｒｅｅｎ及びＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ色素染色ミトコンドリア細胞およびもとのサイブリッドにおけるフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図５】ミトコンドリア細胞の増殖試験の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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