(57)【要約】【課題】診断および分析アッセイを実行するための装置を提供する。【解決手段】装置は、プラットフォームと、プラットフォームから延びる複数のピンとを含んでおり、ピンは、試薬保管容器に挿入できるように適合されると共に、それに付着したリガンドを有しており、リガンドは、標的試薬に接触して置かれるとそれと反応して複合体を形成し、複合体のリガンド部は、分析測定中に実質的にピンに付着したままになる。ピンには、反応をリアルタイムで監視・制御するためのセンサおよび／または送信器をさらに含めることができる。【選択図】　　　　図１
2004037453.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析測定を実行するためのプラットフォームアセンブリであって、
（ａ）プラットフォームと、
（ｂ）前記プラットフォームから延びる複数のピンとを備え、前記ピンは、試薬保管容器に挿入できるように適合されると共に、それに付着したリガンドを含んでおり、前記リガンドは、標的試薬に接触して置かれるとそれと反応して複合体を形成し、前記複合体の前記リガンド部は、分析測定中に実質的にピンに付着したままであることを特徴とするアセンブリ。
【請求項２】
前記ピンは、それに関連したリガンド付着促進材をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のアセンブリ。
【請求項３】
前記リガンドは、リガンド付着促進材を含む組成物を含むことを特徴とする請求項１に記載のアセンブリ。
【請求項４】
前記リガンドは、前記ピンに化学的に付着していることを特徴とする請求項１に記載のアセンブリ。
【請求項５】
前記リガンドは、前記ピンに吸着していることを特徴とする請求項１に記載のアセンブリ。
【請求項６】
前記リガンドは、同一または異なるピンに付着していることを特徴とする請求項１に記載のアセンブリ。
【請求項７】
前記リガンドは、タンパク質または核酸であることを特徴とする請求項１に記載のアセンブリ。
【請求項８】
前記リガンドは、ペプチドまたはポリペプチドであることを特徴とする請求項１に記載のアセンブリ。
【請求項９】
前記リガンドは、リポーター分子を含むことを特徴とする請求項１に記載のアセンブリ。
【請求項１０】
前記試薬保管容器は、マルチウェルプレートであることを特徴とする請求項１に記載のアセンブリ。
【請求項１１】
前記プラットフォーム上に位置決めされたコネクタプレートをさらに備える請求項１に記載のアセンブリであって、前記コネクタプレートは、（ｉ）ベースプレートと、（ｉｉ）前記ベースプレートによって支持されると共に、前記ピンに連結されており、前記ピンへの信号の送信および／または前記ピンからの信号の受信を容易にするための複数のコネクタとを含むことを特徴とするアセンブリ。
【請求項１２】
分析測定方法であって、
（ａ）プラットフォームと、試薬保管容器に挿入できるように適合された複数のピンとを備えるプラットフォームアセンブリを提供するステップと、
（ｂ）分析測定を実行するためのピンにリガンドを付着させるステップと、
（ｃ）前記付着させたリガンドを試薬保管容器内で標的試薬に接触させて複合体を形成するステップであって、前記複合体の前記リガンド部を分析測定中に実質的にピンに付着したままにするステップと、
（ｄ）前記分析測定と相関のある信号を測定するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
代謝産物またはイオンの濃度変化、ある種の遺伝子の転写の変化、酵素活性の変化、ｐＨの変化、細胞成長の変化、抗体結合、および、受容体とリガンドとの間の相互作用から成る群から選択される生物活性を決定するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記分析測定は、比色測定、蛍光測定または濃度測定から成る群から選択されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ピンをリガンド付着促進材で少なくとも部分的にコーティングするステップをさらに含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
リガンドに結合できるか、または、リガンドの活性を調節できる物質を同定するためのスクリーニング方法であって、
（ａ）プラットフォームと、試薬保管容器に挿入できるように適合された複数のピンとを備えるプラットフォームアセンブリを提供するステップと、
（ｂ）前記ピンにリガンドを付着させるステップと、
（ｃ）前記付着させたリガンドを、前記リガンドに結合できるか、または、前記リガンドの活性を調節できると推測される物質に曝露させて複合体を形成するステップであって、前記複合体の前記リガンド部をスクリーニングプロセス中に実質的にピンに付着したままにし、前記物質を前記試薬保管容器内に置くステップと、
（ｄ）前記物質が前記リガンドに結合するかどうか、または、前記リガンドの活性を調節するかどうかを判定するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
前記ピンをリガンド付着促進材で少なくとも部分的にコーティングするステップをさらに含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試薬保管容器に挿入するように適合された複数のピンを含む装置に関する。より詳細には、本発明は、試薬に接触して置かれるとそれと反応するリガンド（ｌｉｇａｎｄ）がピンに付着しており、ピンが信号のセンサおよび／または送信器を含み得る分析測定のための多ピン装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在の創薬方法は、所望の生物活性を有する化合物を同定するために、多数の化合物をスクリーニングするものである。生物活性の評価に使用されるアッセイ（検定：ａｓｓａｙ）には、受容体結合アッセイ、酵素アッセイ、または細胞間相互作用アッセイが含まれ、これらは、マイクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　ｐｌａｔｅ）内で５０から２５０マイクロリットルの反応体積で迅速に実行され、容易に自動化され得る。これらの試験システムを自動化・小型化することにより、試料処理能力の向上を図ることができる。
【０００３】
試料処理能力を増大させるために、分析試験システムの自動化の拡大に取り組んだグループもある。例えば、試験管、バイアル瓶、ウェルなどの保管容器から入れ物または表面に流体試料を移動するために、自動化システムが開発されてきた。この目的で、試験化合物を含む少ない体積の流体をマイクロタイタープレートのウェル内に移動させる多ピン装置を使用することが知られている。親水性の先端と疎水性の軸とが形成されるようにピンを処理して、試験化合物を含む流体試料が表面張力によって親水性の先端に物理的に拘束されるようにすることができる。ピンを動かしてアッセイプレートに近接させることによって、装置のピンからアッセイプレートのウェル内に流体が移動する。
【０００４】
また、複数の試薬試料を付着表面上に移動させるのに、試薬移動装置を使用することも知られている。この装置には、ピンの２次元配列が延びる移動表面を有する移動部材が含まれる。試薬は、ピンの外表面への粘着によってピンに付着して付着表面に移動させられ、そこで付着表面への粘着によって付着する。
【０００５】
前述の各システムは、マイクロタイターアッセイプレートなどのマルチウェルプレートのウェル内に流体試料を移動させるのに適している。しかしながら、これらのシステムのいずれも、マルチウェルアッセイプレートのウェル内で発生する検出可能な信号の送信器および／またはセンサとしてピンを使用するものではない。さらに、試験システムのいずれも、検出可能な信号の発生に関わるリガンドがその上に吸着または化学結合する堅固な支持体として、ピンの使用を開示するものではない。
【０００６】
近年では、蛍光標識した基質分子をマイクロタイタープレート用の蓋から延びる複数のプラスチックピンに物理的に付着させ得ることが判明している。プロテアーゼ活性についてアッセイを実行すべき試料は、プレートのウェル内に置かれる。基質でコーティングされたピンは、ウェル内の溶液に浸される。潜伏期間中に、試料中に存在するプロテアーゼが標識された基質を切断するので、基質がピンからウェル内の溶液に放出されることになる。潜伏期間の終わりに、ウェルからピンが取り除かれ、ピンから放出された蛍光基質がプレート読取り装置によって検出される。この方法の欠点は、プロテアーゼ酵素およびその阻害物質の検出および定量化が制限されていることにある。ピンは、基質をその場に固定（ａｎｃｈｏｒ）し、反応信号に干渉しないように未反応の基質を取り除くための固相として使用される。標的酵素は、ピン上の基質と反応するが、標的も、切断された基質も、反応後にピンと関連し続けることはない。このことは、この特定のシステムで可能なアッセイフォーマットの数を制限する。さらに、このシステムには、検出可能な生成物がウェル内の溶液中でしか測定できず、ピン自体の上では測定できないという制限がある。最後に、ピンは、反応を直接にリアルタイムで監視・制御するセンサおよび／または送信器を含むものとしては開示されていない。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　ｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　ｖｏｌｕｍｅ　２３０：　２８１−２８５　（１９８５）
【非特許文献２】
ＤＮＡ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，　Ｐａｒｔ　Ａ：　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｐｈｙｓｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＤＮＡ，Ｌｉｌｌｅｙ，　Ｄ．Ｍ．Ｊ．　ａｎｄ　Ｄａｈｌｂｅｒｇ，　Ｊ．Ｅ．　（Ｅｄｓ．），　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　ｖｏｌｕｍｅ　２１１，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｉｎｃ．，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９９２）
【非特許文献３】
Ｓｔｕａｒｔ　ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ，　”Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ　（１９８４）
【非特許文献４】
Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　ｖｏｌｕｍｅ　２８９，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｉｎｃ．，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９９７）
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、ピンが分析方法の際に生成される検出可能な信号のセンサとして有用であって、さらにマルチウェルプレートの所与のウェル内の反応条件を変化させる信号を送信することもできる試験システムを提供することが有利であろう。このような送信は、例えば、電気的または熱的なものにすることができる。さらに、ピンがその上で反応を起こさせる堅固な支持体として作用する試験システムを提供することが有利であろう。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、プラットフォームとプラットフォームから延びる複数のピンとを含んだ分析測定を実行するためのプラットフォームアセンブリを提供するものであり、ピンは、試薬保管容器に挿入できるように適合されると共に、それに付着したリガンドを含んでおり、リガンドは、標的試薬に接触して置かれるとそれと反応して複合体を形成し、複合体のリガンド部は、分析測定中に実質的にピンに付着したままとなる。プラットフォームアセンブリのピンは、その上で反応を起こさせるのに特に有用である。ピンには、反応をリアルタイムで監視・制御する、信号のセンサおよび／または送信器を含めることができる。例えば、マルチウェルアッセイプレートのウェル内に存在する試薬と後に反応させるために、リガンドを吸着または化学結合形態でピン上に存在させることができる。したがって、ピンをセンサとして使用することによって、所与のピン上に形成された検出可能な信号を発する複合体を直接測定することができる。
【００１０】
本発明の他の態様は、プラットフォームと、試薬保管容器に挿入できるように適合された複数のピンとを含むプラットフォームアセンブリを提供するステップと、分析測定を実行するためのピンにリガンドを付着させるステップと、付着させたリガンドを試薬保管容器内で標的試薬に接触させて複合体を形成するステップであって、複合体のリガンド部を分析測定中に実質的にピンに付着したままにするステップと、分析測定と相関のある信号を測定するステップとを含む分析測定方法に関する。望まれる場合、信号の発生を容易にするために、標的試薬に加え、ピンを他の一連の試薬に接触させることができることに留意されたい。さらに、望まれる場合、この方法に洗浄またはインキュベートステップをさらに含めることができる。
【００１１】
さらに、本発明には、リガンドに結合できるか、または、リガンドの活性を調節できる物質を同定するためのスクリーニング方法も包含され、この方法は、プラットフォームと試薬保管容器に挿入できるように適合された複数のピンとを含むプラットフォームアセンブリを提供するステップと、ピンにリガンドを付着させるステップと、付着したリガンドを、リガンドに結合できるか、または、リガンドの活性を調節できると推測される物質に曝露させて複合体を形成するステップであって、複合体のリガンド部をスクリーニングプロセス中に実質的にピンに付着したままにするステップと、物質がリガンドに結合するかどうか、またはリガンドの活性を調節するかどうかを判定するステップとを含む。
【００１２】
本発明のプラットフォームアセンブリを形成する方法がさらに開示され、この方法は、その表面上に複数のピンを有するプラットフォーム材を提供するステップと、ピンにリガンドを付着させるステップとを含み、リガンドは、標的試薬に接触して置かれるとそれと反応して複合体を形成し、複合体のリガンド部は、分析測定中に実質的にピンに付着したままとされる。ピンは、リガンドをピンに直接に化学的または吸着的に付着させるのに適した材料から形成することができる。この方法には、ピンをリガンド付着促進材で少なくとも部分的にコーティングするステップをさらに含めることができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の主な目的は、通常マイクロタイタープレートを使用して実行される分析・診断方法を遂行するための条件を修正することにある。これは、分析・診断アッセイを実行するのに有用な本発明のプラットフォームアセンブリを用いて達成される。このようなアッセイには、これに限られるものではないが、未知の化合物に特定の生物活性についての試験を実行する薬物スクリーニングアッセイが含まれる。
【００１４】
分析測定を実行するためのプラットフォームアセンブリは、（ａ）プラットフォームと、（ｂ）プラットフォームから延びる複数のピンとを含み、ピンは、試薬保管容器に挿入できるように適合されると共に、それに付着したリガンドを含んでおり、リガンドは、標的試薬に接触して置かれるとそれと反応して複合体を形成し、複合体のリガンド部は、分析測定中に実質的にピンに付着したままとされる。
【００１５】
ここでは、複合体は、２つまたはそれ以上の物質の組合せとして定義される。「実質的に付着」とは、複合体の形成後および分析測定中に、複合体のリガンド部すべてまたはほぼすべてがピンに付着したままであることを意味する。「分析測定中」とは、測定可能な信号を生成するのに十分な期間を意味する。
【００１６】
試薬保管容器には、試験管、バイアル瓶、トレー、またはウェルを含めることができる。好ましい一実施形態では、試薬保管容器は、マイクロタイタープレートなどのマルチウェルプレートのウェルに相当する。代わりに、マルチウェルプレートに、仮想的なウェルを含めることもできる。仮想的なウェルを含むマイクロタイター様のプレートは、比較的疎水性の領域内に比較的親水性の範囲を有するようにパターン設定される表面を有するので、試料が、より疎水性の高い領域の縁部によって、より親水性の高い範囲に表面張力で物理的に拘束される。それは、「仮想的なウェル」を形成する、疎水性領域内の親水性範囲の配置である。仮想的なウェルを含むマイクロタイター様プレートは、当該技術分野で公知である。
【００１７】
さて、図１を参照するに、プラットフォーム４とプラットフォーム４から延びる複数のピン６とを含む本発明によるプラットフォームアセンブリ２が示されており、ピンは、試薬保管容器８内に挿入できるように適合されると共に、それに付着したリガンド１０を含んでおり、リガンド１０は、標的試薬１２に接触して置かれるとそれと反応して複合体１３を形成する。複合体の液体部分は、分析測定中にピンに付着したままである。図１に示す特定の実施形態では、試薬保管容器は、マイクロタイタープレートのウェルに相当する。この例では、マイクロタイタープレート内の複数のウェルの空間的配置に近似した空間的配置でプラットフォーム上に形成することによって、ピンがマイクロタイタープレートのウェルへの挿入に適合されている。本発明によるプラットフォームアセンブリによって、ピン上に様々なリガンドを置くことが可能になることに留意されたい。さらに、マイクロタイタープレートのウェル内に様々な試薬を置くことも可能である。
【００１８】
前述のように、本発明のピンは、それに付着したリガンドを含む。一実施形態では、リガンドは、ピンの表面に直接に化学的に付着している。他の実施形態では、リガンドは、ピンの表面に直接に吸着している。本発明の意図において、リガンドは、表面張力だけではない手段によってピンに付着する。
【００１９】
ピンへの化学的または吸着的な付着に適したリガンドには、タンパク質または核酸が含まれる。核酸リガンドには、ＤＮＡおよびＲＮＡの天然型または化学合成型、ならびにそれらの修飾型または変異型を含めることができる。さらに、化学合成型のオリゴヌクレオチド、あるいはＤＮＡの天然型、修飾型、または変異型由来のオリゴヌクレオチドは、ピンへの付着に適したリガンドである。様々な形態の核酸の化学合成は、当該技術分野で公知の方法によって実行することができる（例えば、非特許文献１や、非特許文献２を参照のこと）。
【００２０】
前述のように、適切なリガンドには、タンパク質が含まれる。さらに、修飾型または変異型のタンパク質またはタンパク質断片をピンに結合させることができる。例えば、一実施形態では、リガンドは、ペプチドまたはポリペプチドである。ポリペプチドを合成するのに適した方法が開示されている（例えば、非特許文献３や、非特許文献４を参照のこと）。
【００２１】
リガンドは、ピンの表面に直接に付着させることができる。代替的な実施形態では、ピンには、さらにそれに関連したリガンド付着促進材が含まれる。例えば、ビオチンタグを含む特定のリガンドを付着させるために、ピンをアビジン溶液でコーティングまたは部分コーティングすることができる。このようなコーティングは、噴霧、浸漬、塗装などの手段によって実行することができる。さらにリガンドは、リガンド付着促進材を含む組成物中に存在させることができる。リガンドは、リンカー分子を介してピンの表面に付着させることができる。ピン上にアンカーされたリガンドが存在するので、洗浄ならびにその後の試薬保管容器内に配置された試薬との反応が容易になる。
【００２２】
試薬保管容器内の試薬は、酵素、抗体、抗原、受容体、蛍光染料などの染料、標識リガンドなどのリガンド、サイトカイン、活性化物質、阻害物質、緩衝液、細胞、およびこれらの組合せから選択することができる。
【００２３】
図２を参照するに、図２（ａ）〜（ｃ）に示す実施形態は、分析または診断アッセイの様々なステップ中の本発明によるプラットフォームアセンブリのピンの略図である。図示されたアッセイフォーマットは、ヘテロジニアス（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）アッセイフォーマットであり、これについては以下でさらに詳細に説明する。具体的には、図２（ａ）は、試験抗血清などの標的試薬１６を含む試薬保管容器（ウェル）８に挿入した後における抗原などのリガンド１４で事前にコーティングされたピン６を示している。所与のウェル内の各試薬は、生物活性をスクリーニングするための独特の試験物質に対応させることができる。図２（ｂ）は、リガンド１４と標的試薬１６が反応した後のピンを示している。望まれる場合、インキュベーションの際にリガンドと試薬とを反応させる。望まれる場合、その後ピンを洗浄して、図２（ｃ）に示すように他の試薬と接触させることができる。図２（ｃ）は、ピンの面上での信号の発生を容易にするために、ピン上の複合体１８を、標識された抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ）の抗体などの第２試薬２０とさらに反応させた後における図２（ｂ）のピンを示している。図のように、複合体１８のリガンド部（１４）は、分析方法中には実質的にピンに付着したままである。
【００２４】
さらに、本発明のプラットフォームアセンブリを用いて、試料分離ステップが必要ないホモジニアス（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）アッセイを実行できることが企図されている。このようなホモジニアスアッセイは、エネルギー移動および蛍光消光によるＤＮＡ検出に使用されることが多い。この蛍光的手法は、戦略的な、ＤＮＡプローブ上への蛍光標識の位置決めと、第２プローブ上への第２標識の位置決めとによるものである。２つのプローブを同一のピンに付着させることができる。２つのプローブは、互いに一定の距離をあけてすぐ下流にある標的にハイブリダイズ（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）する。２つのプローブが試薬保管容器内の標的分子に同時にハイブリダイズするときに、一方または両方の標識に検出可能な変化が生じる。これらのホモジニアスアッセイでは、一般に蛍光標識および消光標識が使用される。隣接するか、または、密接に連結した標的にハイブリダイズするときに２つのタグが適切な距離だけ離れている場合、蛍光標識と消光標識との間でエネルギーが移動でき、それが検出可能な信号の変化を引き起こす。試薬保管容器内の標的ＤＮＡの存在は、消光標識によって発光が消光されることによる蛍光からの発光の減少として検出することができる。エネルギー移動および蛍光消光アッセイの主な利点は、アッセイが単純なことである。これらの手法では、検出が単一ステップで実行され、試薬移動ステップが必要ないので、アッセイが迅速なものになる。ただし、ホモジニアスアッセイは、一般に、ヘテロジニアスアッセイよりも感度が低く、多くの分析・診断アッセイに必要とされる検出レベルに欠けることがある。
【００２５】
このような理由から、本発明に包含される分析測定方法およびスクリーニング方法にヘテロジニアスアッセイが含まれることは、十分に本発明の企図される範囲内にある。この例では、検出可能な生成物を得るための必要に応じて、ピンに付着したリガンドを多数の洗浄およびインキュベーションステップを伴って一連の試薬に接触させる必要がある。
【００２６】
任意の数のヘテロジニアスアッセイのフォーマットが可能であることが理解されよう。例えば、ある間接的な標識スキームでは、試薬保管容器内に配置された検体にジゴキシゲニンなどの小分子を組み込むことができる。ピンに結合したリガンドと検体を反応させた後、検体中のジゴキシゲニンに特異的に結合する酵素共役（例えば、アルカリホスファターゼに共役した抗ジゴキシゲニン）を用いて、標識の存在を明らかにすることができる。したがって、初めに検体を含む試薬保管容器にピンを浸漬させた後、試薬トレー内の緩衝溶液への浸漬などによってピンを洗浄し、次いで、酵素共役を含む試薬保管容器内に浸漬させる。検体は、酵素用の化学発光基質を用いて可視化することができる。
【００２７】
他のアッセイフォーマットでは、ピンに付着したリガンドは、タンパク質抗原である。リガンドを付着させた後、ピン上の非特異的部位をブロッキングすることができる。次いで、ピンをマイクロタイタープレートのウェルに浸漬させることによって、マイクロタイタープレートの別個のウェル内に配置された抗体試験化合物をタンパク質抗原に接触させる。適切な洗浄溶液に浸漬させることによってピンをさらに洗浄した後、リポーター分子（ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）で標識された抗抗体化合物にピンを接触させることができる。さらに洗浄した後で、ピンの固相に結合した、リポーター分子を含む免疫複合体を検出することができる。図２に示す特定の実施形態では、測定可能な生成物がピン上に形成される。
【００２８】
代替的な実施形態では、測定可能な生成物を試薬保管容器内に形成することができる。例えば、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）とほぼ同様のアッセイフォーマットでは、初めにタンパク質抗原をピンに付着させる。ピンを洗浄後、マイクロタイタープレートのウェル内の抗体試験化合物を抗原と反応させる。さらに洗浄後、抗体を検出できるリガンド分子を加える。リガンド分子は、ペルオキシダーゼなどの酵素と共有結合する。遊離リガンドを洗い流した後、クロマジェン（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）を加えることによって、ピンに結合した酵素連結リガンドを可視化する。クロマジェンは、ピンに結合せず、酵素連結リガンドの酵素部分の作用を受けると有色の最終生成物を生成する試薬保管容器内に配置された無色の基質である。試験抗体化合物のタンパク質抗原との反応性の存在、ならびに試験抗体の量は、例えばマイクロタイタープレートの光学密度スキャニングで有色の最終生成物の量を評価することによって測定することができる。
【００２９】
望ましい一実施形態では、ピンには、分析測定と相関のある信号のセンサを含めることができる。例えば、ピンに光ファイバセンサを含めることができる。ピン上で生成物が形成されるときに何らかの形態の光が放出される場合、外部計器源への光信号の送信に光ファイバセンサを役立たせることができる。これにより、検出可能な生成物形成のリアルタイム監視が提供される。
【００３０】
本発明の他の実施形態では、ピンは、リガンドと所与の試薬との間の反応を容易にする信号の送信器を含む。送信される信号には、例えば、熱、冷却、電気、光、磁気、およびこれらのいずれかの組合せを含めることができる。信号をピンに送信する能力により、ピンに付着したリガンドと、それが接触している次の試薬との間の反応を制御する手段が提供される。さらに、送信された所与の信号をアセンブリのプラットフォームから延びるすべてのピンについて同一のものにできること、あるいは、送信された信号をピンによって異なるものにできることは、十分に本発明で企図される範囲にある。送信される信号が熱または電気の場合には、ピンは、これだけに限られるものではないが、金属などの導電性材料を含むことが望ましい。
【００３１】
ピンには、さらに、プラスチック、セラミック、ガラス、石英、磁器およびゲルマニウムから選択される材料を含めることができる。材料は、純粋な形態で、あるいは、混合物、合金、またはブレンドとして使用することができる。ピンと、そこからピンが延びているプラットフォームの両方を透明にすることができる。この例では、ピンおよび／プラットフォームを、顕微鏡、カメラ支援、レーザ支援試験などのすべての視覚試験に適した石英、ガラス、プラスチック、ゲルマニウム、シリコンなどの透明材料製にすることができることが望まれる。
【００３２】
透明なプラスチックには、ポリスチレン、スチレン／アクリロニトリル、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリエステル、シリコン、ポリエチレン／アクリレート、ポリラクチドまたはセルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースブチレート、およびこれらのいずれかの混合物が含まれる。近赤外線を使用して反応を検出または誘発することが必要な用途には、シリコンまたはゲルマニウム支持体が非常に適していることに留意されたい。
【００３３】
本発明のプラットフォームアセンブリは、一般に、比色測定、蛍光測定、または濃度測定に関するものなど、マイクロタイタープレートで現在実施されているすべての分析・診断方法に適している。例えば、光散乱、混濁、蛍光、ルミネセンス（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）、ラマン散乱、放射能、アイソトープ標識、ｐＨシフトまたはイオンシフト、ならびに波長依存光吸収を、単独でまたは組み合わせて、使用し、測定することができる。ただし、測定される他の特性もさらに本発明に企図される。
【００３４】
前述のように、ピンが分析測定と相関のある信号のセンサを含む場合、ピンの面上で起こる反応を直接にリアルタイムで監視することができる。この目的で、本発明の一実施形態では、プラットフォームアセンブリが、プラットフォーム上に位置決めされたコネクタプレートをさらに含み、コネクタプレートは、（ｉ）ベースプレートと、（ｉｉ）ベースプレートによって支持されると共に、ピンに連結されており、ピンへの信号の送信および／またはピンからの信号の受信を容易にするための複数のコネクタとを含む。例えば、ピン上または試薬保管容器内で生成された信号を直接記録するために、電気リード線をコネクタから外部計器源まで導くことができる。
【００３５】
図３を参照するに、本発明によるプラットフォームアセンブリ２が、ベースプレート２２と、ベースプレート２２によって支持され、ピン６に連結された複数のコネクタ２４とを含む特定の実施形態で示されている。電気リード線２６は、反応を直接にリアルタイムで監視・制御するために、コネクタ２４と外部計器源とを接触させる。ピン６は、生成される信号のセンサおよび／またはピンへの信号の送信器を含むことができる。送信される信号は、例えば反応を急速に進ませて検出可能な信号を生成する熱であってもよい。さらに、広く用いられている検出方法の多くが励起光と発光とを分離する光学フィルタを使用する全蛍光測定によるものであるので、送信された信号は、特定の蛍光標識の励起に適した波長の光に対応し、ピンを通して受信された信号は、標識から放出された光に対応することが、本発明の企図される範囲内にある。
【００３６】
図３の特定の実施形態に示すように、ピン６には同一のリガンド２８が付着している。あるいは、アセンブリのピンに結合する１つまたはそれ以上のリガンドを異なるものにすることもできる。図３のマルチウェルプレート（ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ）の各ウェルには、試験化合物がリガンド２８に結合する能力などの生物活性を試験する独特の試験化合物を含めることができる。
【００３７】
本発明のアセンブリのピン上で実行できる分析方法には、これらに限られるものではないが、抗体の抗原への結合、酵素による基質分子の特異的な切断、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、受容体とリガンドの間の相互作用、異なるまたは同一のタイプの細胞間の相互作用、例えば酵素アッセイ、ウイルス滴定アッセイなどの滴定アッセイ、赤血球または血小板の集合（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）、ラテックスビーズによる凝集（ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ）アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫吸着アッセイ）、または放射線免疫検定アッセイ（ＲＩＡ）が含まれる。
【００３８】
前述のように、本発明は、プラットフォームと試薬保管容器に挿入できるように適合された複数のピンとを含むプラットフォームアセンブリを提供するステップと、分析測定を実行するためのピンにリガンドを付着させるステップと、付着させたリガンドを試薬保管容器内で標的試薬に接触させて複合体を形成するステップであって、複合体のリガンド部が分析測定中に実質的にピンに付着したままであるステップと、分析測定と相関のある信号を測定するステップとを含む分析測定方法を提供する。試薬保管容器がマルチウェルプレートの場合、各ウェルに、ピンに付着したリガンドと反応するか、またはリガンドとの反応に関係する独特の試薬を含められることは理解されよう。さらに前述のように、各ピンに同一または異なるリガンドを結合させることができる。
【００３９】
一実施形態において、本発明によって提供される分析測定方法は、代謝産物またはイオンの増加／減少、ある種の遺伝子の転写の変化、酵素活性の変化、ｐＨの変化、細胞成長の変化、抗体結合、および、受容体とリガンドとの間の相互作用から成る群から選択される生物活性を決定するステップをさらに含むことができる。分析測定は、比色測定、蛍光測定、または濃度測定とすることができる。
【００４０】
蛍光検出などの光学検出方法は、一般に、励起および画像化ステップを用いる。励起および画像化ステップは、それぞれ、ピンを通じて、あるいはマルチウェルプレートの上部または底部を通じて実行することができる。
【００４１】
本発明は、本発明のプラットフォームアセンブリを用いるハイスループットスクリーニング（ｈｉｇｈ　ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）方法を提供する。さらに、ハイスループットではないスクリーニング方法も提供する。これらのスクリーニング方法は、特定のリガンドに結合できるか、または、特定のリガンドの活性を調節できる物質を同定する手段を含み、プラットフォームと、試薬保管容器に挿入できるように適合された複数のピンとを含むプラットフォームアセンブリを提供するステップと、ピンにリガンドを付着させるステップと、付着させたリガンドを、リガンドに結合できるか、または、リガンドの活性を調節できると推測される物質に曝露させて複合体を形成するステップであって、複合体のリガンド部がスクリーニングプロセス中に実質的にピンに付着したままであるステップと、その物質がリガンドに結合するかどうか、またはリガンドの活性を調節するかどうかを判定するステップとを含む。一実施形態では、このスクリーニング方法は、ピンをリガンド付着促進材で少なくとも部分的にコーティングするステップをさらに含む。
【００４２】
本発明のプラットフォームアセンブリは、多数の方法によって作製することができる。これらの方法は、一般に、（ａ）その表面上に複数のピンを有するプラットフォーム材を提供するステップと、（ｂ）ピンにリガンドを付着させるステップとを含み、リガンドは、標的試薬に接触して置かれるとそれと反応して複合体を形成し、複合体のリガンド部は、分析測定中に実質的にピンに付着したままとされる。さらに、この方法には、ピンをリガンド付着促進材で少なくとも部分的にコーティングするステップをさらに含めることができる。好ましい実施形態では、プラットフォーム材は、プラスチック、金属、セラミック、ガラス、石英、磁器、ゲルマニウム、およびこれらの組合せから選択される。ピンは、同様の材料から形成することができる。１つまたはそれ以上のピンを、配列中の他のピンと異なる材料で形成できることに留意されたい。
【００４３】
特定の実施形態では、予備成形された複数のピンがプラットフォーム材の表面に付着している。例えば、予備成形ピンを、これらに限られるものではないが、エポキシ樹脂プレート、金属プレート、プラスチックシート、他の成形平面基質などの担体に挿入することができる。ピンは、特に、滑り嵌め（ｓｌｉｐ　ｆｉｔ）で、または滑り嵌めでない方式で挿入することができる。滑り嵌めとは、ピンを整列させるのに十分に密接であるが、力を加えるとピンを滑らせることができるものである。滑り嵌めを用いるときには、ピンが担体から落下しないように、ピンの一端で拡大させることによってピンを担体内で保持することが好ましい。滑り嵌めを用いると、望むなら、ピンを使い捨て方式で使用することができる。さらに滑り嵌めによって、ピンの長さを、マイクロタイタープレートのウェルなどの試薬保管容器によって画成される表面に対して調整することができる。
【００４４】
他の方法では、プラットフォーム材の表面にピンを機械加工する方法、プラットフォーム材の表面にピンをレーザ切断する方法、およびプラットフォーム材からピンを成型する方法のうちの１つによって、複数のピンを形成することができる。プラスチック、ガラス、金属などの適切なプラットフォーム材からの成型は、従来の巨視的な方法によって、あるいは、Ｘ線、リソグラフィ、電着、成型など微細機械加工で使用される標準微細加工方法によって達成することができる。
【００４５】
さらに、本発明によるプラットフォームアセンブリを形成する他の方法には、コンピュータ数値制御機械を使用するプラスチックのフライス削り（ｍｉｌｌｉｎｇ）、溶融材料の開放金型への鋳造、射出成形、および低融点の比較的軟質な金属の冷間鍛造を含めることができる。冷間鍛造では、非常に重い金型と急激に衝突させて、冷間鍛造する金属に強い圧力をかける。さらに、プラットフォームおよびピンが、金属または他の導電性材料から形成されるのであれば、本発明によるプラットフォームアセンブリを形成する好ましい方法は、放電機械加工方法であり、金属プレートなどのプレートから金属を取り除いて、そこから延びる複数のピンを形成する。
【００４６】
ここで、本発明によるプラットフォームアセンブリを使用して分析・診断アッセイを実行する特定の利点に関し、ピンが、反応のリアルタイムでの直接的な監視および制御を可能にすることに留意されたい。本発明によって提供されるプラットフォームアセンブリを使用するアッセイは、リガンドをウェル表面に付着させる典型的なアッセイフォーマットよりも汎用性の高いものになる。例えば、複数のピンは、様々なリガンドの配列を表現することができる。さらに、試薬保管容器がマイクロタイターのようなプレートのウェルに対応する特定の実施形態では、ウェルの空間配列内の各試薬を、流体の液体部分の性質が異なるか、または、液体に溶解している化合物の性質が異なる、あるいは、その両方が異なる流体にすることができる。最後に、プラットフォームから延びるピンの空間配列中の各ピンを使用して、独自の信号を送信かつ／または受信することができる。これらの要因すべてを組み合わせると、試験できる化合物の数、評価できる生物活性のタイプおよび数ならびに反応の制御および監視の点で汎用性が与えられる。
【００４７】
また、現在用いられている典型的なマイクロタイターアッセイフォーマットは、反応時間が試薬の適正な混合によって決まる拡散律速プロセスである。対照的に、本発明のプラットフォームアセンブリのピンを試薬保管容器内に浸漬させるときには、リガンドと、それに結合できる他の化合物とが、試薬保管容器内の所与の試薬との反応にすぐに利用可能である。
【００４８】
さらに、ピンを使用すると、使用する試薬の体積をより小さいものにすることができる。これは、いくつかの理由から望ましい。例えば、希少な生物・化学材料を節約することができる。この目的で、試薬精製に関する要件が少ないので、アッセイを速いペースで進展させることができる。さらに、試験化合物を節約すると、所与の試験化合物に、１つより多くのアッセイを実行することができる。このことにより、所与の試験物質の生物活性の、１つより多くの側面の評価が可能になる。最後に、ピンの表面上で反応を起こさせることによって、ピンの表面上の検体の濃度を高めて反応感度を高めることができ、それが信号強度を増加させることになることに留意されたい。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のプラットフォームアセンブリの略図であって、プラットフォームから延びるピンが、標的試薬を含むマルチウェルプレートに挿入できるように適合され、それに共有結合または吸着手段によって直接付着したリガンドを含み、リガンドが標的試薬に結合している状態を示す図である。
【図２】分析方法の様々なステップにて本発明のプラットフォームアセンブリのピンを示す略図であり、（ａ）は、試験抗体などの試験物質が入っているウェルに挿入した後における抗原などのリガンドで事前にコーティングされたピンを示す図であり、（ｂ）は、抗原と試験抗体の反応後の（ａ）のピンを示す図であり、（ｃ）は、標識された抗イディオタイプ抗体とさらに反応して、ピンの表面上に検出可能な生成物が生成された後の（ｂ）のピンを示す図である。
【図３】本発明の一実施形態を示す図であって、プラットフォームアセンブリが、プラットフォーム上に位置決めされたコネクタプレートをさらに含み、コネクタプレートが、ベースプレートと、ピンに連結されたピンへの信号の送信および／またはピンからの信号の受信を容易にするための複数のコネクタとを含んでおり、電気リード線が、コネクタに接触しており、ピン上またはマイクロタイタープレートのウェル内で起こる反応をリアルタイムで監視・制御するために、これらを外部計器源まで導くことができ、各ウェルには、ピンに付着したリガンドに結合する能力などの生物活性をスクリーニングする独特の試験物質を含めることができることを示す図である。
【符号の説明】
２　プラットフォームアセンブリ
４　プラットフォーム
６　ピン
８　試薬保管容器
１０、１４、２８　リガンド
１２、１６　標的試薬
１３、１８　複合体
２０　第２試薬
２２　ベースプレート
２４　コネクタ
２６　電気リード線
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【外国語明細書】
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