(57)【要約】　　　（修正有）【課題】インフルエンザ菌Ｒｄの全ゲノム配列を提供する。【解決手段】特定の配列で示される配列；コンピューター読み出し媒体に保存されている配列情報、及びコンピューターに基づくシステム、及びその使用を容易にする方法；及び特定の配列に示す配列中の１７００を超えるタンパク質コード化フラグメントの提供。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載のインフルエンザ菌Ｒｄゲノムのヌクレオチド配列、そのフラグメント及びその使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は分子生物学の分野に関するものである。本発明はインフルエンザ菌（ヘモフィルスインフルエンザ）のヌクレオチド配列、そのフラグメントを含む組成物並びに産業的発酵及び製薬的開発における使用法を開示する。
【０００２】
【従来の技術】
自由に生存する細胞生物の完全なゲノム配列は未だ決定されていない。最初のミコバクテリウム配列は１９９６年までに完了し、一方大腸菌及びＳ．セレビシエは１９９８年前までに完了すると期待されている。これらはオーバラップコスミドクローンの無作為及び／又は指令配列決定によってなされている。ランダムショットガン方法によって１メガベース又はそれ以上のオーダーの配列を決定しようと試みた者はいなかった。
【０００３】
インフルエンザ菌は、唯一の天然宿主がヒトである小さい（概ね０．４×１ミクロン）非自動性、非胞子形成、胚芽陰性の細菌である。これは子供や成人の上部呼吸器粘膜に住みついており、そして殆どが子供で中耳炎や気道感染を生じさせる。最も重篤な合併症は髄膜炎であり、そしてこれは感染児の５０％までで神経病学的続発症をもたらす。免疫学的に異なる莢膜多糖抗原に基づいて、６種のインフルエンザ菌血清型（ａからｆ）が同定されている。型を決定できない多数の株も知られている。血清型ｂは大多数のヒト疾病の原因となる。
【０００４】
インフルエンザ菌生物学の医学的に重要な特徴における関心は、この生物のビルレンス特徴を決定する遺伝子に特に焦点が集まっている。莢膜多糖に寄与する多数の遺伝子のマップが作成されそして配列が決定された（非特許文献１参照）。幾つかの外層膜タンパク質（ＯＭＰ）遺伝子が同定されそして配列が決定された（非特許文献２参照）。外層膜のリポオリゴ糖（ＬＯＳ）成分及びその合成経路の遺伝子は集中的に研究されている（非特許文献３参照）。１９８４年以後ワクチンは利用可能であるが、外層膜成分の研究は、改良ワクチンに対する需要によって或る程度動機づけられている。最近、カタラーゼ遺伝子はビルレンス関連遺伝子の可能性があるとして特徴付けられそして配列が決定された（非特許文献４参照）。インフルエンザ菌ゲノムの解明はインフルエンザ菌がどのようにして侵襲性疾患を引き起こすのかそしてどのようにして感染と最も良く闘うのかの理解を高めるであろう。
【０００５】
インフルエンザ菌は非常に効率的な天然ＤＮＡ形質転換系を有しており、そしてこの系は非封入（Ｒ）、血清型ｄ株で集中的に研究されている（非特許文献５参照）。少なくとも１６の形質転換特異的遺伝子が同定されそして配列が決定されている。これらのうち、４つは調節遺伝子であり（非特許文献６及び非特許文献７参照）、少なくとも２つは組換え過程に関係しており（非特許文献８参照）、そして少なくとも７つは膜及び細胞周辺腔に向けられており（非特許文献９及び非特許文献１０参照）、そしてそこでこれら遺伝子は構造成分として又はＤＮＡ輸送機構のアッセンブリー内で機能するように思われる。インフルエンザ菌Ｒｄの形質転換は、配列特異的ＤＮＡ取り込み、コンピテント細胞当たり数個の二本鎖ＤＮＡ分子のトランスフォーマソムと呼ばれる膜小室中への迅速な取込み、ドナーＤＮＡの１本鎖の細胞質中への直線的トランスローケーション、並びに１本鎖置換メカニズムによる１本鎖と染色体の対合及び組換えを含む多数の興味ある特徴を示している。インフルエンザ菌Ｒｄ形質転換系はグラム陰性系の中で最も完全に研究された系であり、そしてグラム陽性系とは多数の態様で異なっている。
【０００６】
インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの大きさは制限消化物のパルスフィールドアガロースゲル電気泳動法によって概ね１．９Ｍｂであると決定されており、このゲノムは大腸菌の大きさの概ね４０％である（非特許文献１１参照）。インフルエンザ菌の制限マップは円形である（非特許文献１２及び非特許文献１３参照）。種々の遺伝子が制限消化ＤＮＡバンドのサザンハイブリッド形成プローブ法によって制限フラグメントにマッピングされている。このマップは無作為に配列決定されたフラグメントから得られた完全なゲノム配列のアッセンブリーを証明するのに価値があろう。ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）には現在約１００ｋｂの冗長のないインフルエンザ菌ＤＮＡ配列がある。約半分は血清型ｂからのものでありそして半分はＲｄからのものである
【０００７】
【非特許文献１】
クロル（Ｋｒｏｌｌ）等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　１９９１，　５（６）：　１５４９〜１５６０
【非特許文献２】
ラングフォード（Ｌａｎｇｆｏｒｄ）等、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９２，　１３８：　１５５〜１５９
【非特許文献３】
ワイザー（Ｗｅｉｓｅｒ）等、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，　１９９０，　１７２：　３３０４〜３３０９
【非特許文献４】
ビシュニ（Ｂｉｓｈｎｉ）等、印刷中
【非特許文献５】
カーン（Ｋａｈｎ）及びスミス（Ｓｍｉｔｈ）、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　１９８４，　８１：　８９〜１０３
【非特許文献６】
レッドフィールド（Ｒｅｄｆｉｅｌｄ）、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，　１９９１，　１７３：　５６１２〜５６１８
【非特許文献７】
チャンドラー（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ＵＳＡ，　１９９２，　８９：　１６２６〜１６３０
【非特許文献８】
バルーキ（Ｂａｒｏｕｋｉ）及びスミス（Ｓｍｉｔｈ）、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，　１９８５，　１６３（２）：　６２９〜６３４
【非特許文献９】
トーム（Ｔｏｍｂ）等、Ｇｅｎｅ，　１９９１，　１０４：１〜１０
【非特許文献１０】
トーム（Ｔｏｍｂ）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ＵＳＡ，　１９９２，　８９：　１０２５２〜１０２５６
【非特許文献１１】
リー（Ｌｅｅ）及びスミス（Ｓｍｉｔｈ）、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，　１９８８，１７０：　４４０２〜４４０５
【非特許文献１２】
リー（Ｌｅｅ）等、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，　１９８９，　１７１：　３０１６〜３０２４
【非特許文献１３】
レッドフィールド（Ｒｅｄｆｉｅｌｄ）及びリー（Ｌｅｅ）、「インフルエンザ菌Ｒｄ」、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｐｓ：　Ｌｏｃｕｓ　Ｍａｐｓ　ｏｆ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　Ｇｅｎｏｍｅｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、オブライエン（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，　Ｓ．Ｊ．）編集、２１１０〜２１１２頁
【０００８】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】
本発明はインフルエンザ菌Ｒｄゲノムの配列決定に基づいている。得られた一次ヌクレオチド配列は配列識別番号：１７５０で提供する。
本発明はインフルエンザ菌Ｒｄゲノムの得られたヌクレオチド配列又はその代表的なフラグメントを熟練技術者が容易に使用し、分析しそして解釈できる形態で提供する。１つの実施態様では、本発明は配列識別番号：１７５０で示されるヌクレオチド配列に相当する一次配列情報の連続列として提供される。
本発明は更に、配列識別番号：１７５０のヌクレオチド配列と少なくとも９９．９％同一のヌクレオチド配列を提供する。
【０００９】
配列識別番号：１７５０のヌクレオチド配列、その代表的なフラグメント又は配列識別番号：１７５０のヌクレオチド配列と少なくとも９９．９％同一のヌクレオチド配列はその使用を容易にする多様な媒体中で提供することができる。この実施態様の１つの適用では、本発明の配列はコンピューター読み出し媒体に記録される。このような媒体には、磁気保存媒体、例えばフロッピーディスク、ハードディスク保存媒体及び磁気テープ；　ＣＤ−ＲＯＭのような光学保存媒体；　ＲＡＭ及びＲＯＭのような電気保存媒体；　並びにこれらカテゴリーの合成物、例えば磁気／光学保存媒体が含まれるが、これらに限定されない。
本発明は更に、システム、特に、データ保存手段に保存され本明細書に記載された配列情報を有しているコンピューターに基づくシステムを提供する。このようなシステムはインフルエンザ菌Ｒｄゲノムの商業的に重要なフラグメントを同定するように設計されている。
【００１０】
本発明のもう１つの実施態様はインフルエンザ菌Ｒｄゲノムの単離フラグメントに向けれらている。本発明のインフルエンザ菌Ｒｄゲノムのフラグメントには、ペプチドをコードしているフラグメント（以下、読み取り枠（ＯＲＦ））、操作可能的に結合されたＯＲＦの発現を調節するフラグメント（以下、発現調節フラグメント（ＥＭＦ））、結合ＤＮＡフラグメントの細胞内取込みに介在するフラグメント（以下、取込み調節フラグメント（ＵＭＦ））、及び試料中のインフルエンザ菌Ｒｄの存在を診断するために使用できるフラグメント（以下、診断フラグメント（ＤＦ））が含まれるが、これらに限定されない。
【００１１】
インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの各ＯＲＦフラグメントは表１（ａ）及び２に開示し、そしてＯＲＦの５’に見られるＥＭＦはポリヌクレオチド試薬として膨大な数の方法で使用することができる。これらの配列は、試料中の特定の微生物の存在についての診断プローブ又は診断増幅プライマーとして、商業的に重要な医薬品を製造するために、そして遺伝子発現を選択的に制御するために使用することができる。
【００１２】
本発明には更に、本発明のインフルエンザ菌Ｒｄゲノムの１つ又はそれより多いフラグメントを含んでいる組換え構築物が含まれる。本発明の組換え構築物は、インフルエンザ菌Ｒｄのフラグメントが挿入されているベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターを含んでいる。
本発明は更に、本発明のインフルエンザ菌Ｒｄゲノムの単離フラグメントの任意の１つを含有する宿主細胞を提供する。これらの宿主細胞は哺乳動物細胞のような高等真核生物宿主、酵母細胞のような下等真核細胞であることができるか又は細菌細胞のような原核細胞であることができる。
【００１３】
本発明は更に、本発明のＯＲＦでコードされている単離タンパク質に向けられている。当該技術分野で知られている多様な方法を使用して本発明のタンパク質の任意の１つを取得することができる。最も簡単なレベルでは、商業的に入手できるペプチド合成器を使用してアミノ酸配列を合成することができる。代替的方法では、タンパク質は天然にタンパク質を産生する細菌細胞から精製される。最後に、本発明のタンパク質は所望のタンパク質を発現するように改変されている細胞から代替的に精製することができる。
【００１４】
本発明は更に、本発明のインフルエンザ菌Ｒｄゲノムのフラグメントの相同体及び本発明のＯＲＦによってコードされるタンパク質の相同体を取得する方法を提供する。詳細には、本明細書に開示されたヌクレオチド及びアミノ酸配列をプローブ又はプライマーとして使用しそしてＰＣＲクローニング法やコロニー／プラークハイブリッド形成法のような技術を使用することによって、当該技術分野の熟練者は相同体を取得することができる。
【００１５】
本発明は更に、本発明のタンパク質の１つと選択的に結合する抗体を提供する。このような抗体にはモノクローナル抗体とポリクローナル抗体の両方が含まれる。
本発明は更に、上記抗体を産生するハイブリドーマを提供する。ハイブリドーマは特異的なモノクローナル抗体を分泌し得る不死化細胞株である。
本発明は更に、本発明のＯＲＦの１つ又はその相同体を発現する細胞から誘導された試験試料の同定方法を提供する。このような方法は、試験試料を本発明の１つ若しくはそれより多い抗体又は本発明の１つ若しくはそれより多いＤＦと共に、試料がＯＲＦ又はこれから産生された生成物を含有しているかどうかを熟練者が測定できる条件下でインキュベートすることを含んでいる。
【００１６】
本発明のもう１つの実施態様では、上記アッセイを実施するために必要な試薬を含有しているキットを提供する。
詳細には、本発明は、（ａ）本発明の抗体の１つ又はＤＦの１つを含んでいる第１の容器；　及び（ｂ）１つ又はそれより多い次の試薬：　洗浄試薬、結合した抗体又はハイブリッド化したＤＦの存在を検出し得る試薬を含んでいる１つ又はそれより多い他の容器、を含んでいる１つ又はそれより多い容器を、近接して閉じ込めて受け入れる隔室キットを提供する。
【００１７】
本発明の単離タンパク質を使用して、本発明は更に、本発明のＯＲＦの１つによってコード化されるタンパク質と結合し得る物質を取得しそして同定する方法を提供する。詳細には、このような物質には抗体（上記した）、ペプチド、炭水化物、医薬品等が含まれる。このような方法は次の段階を含んでいる：
（ａ）物質を、本発明のＯＲＦの１つによってコードされる単離タンパク質と接触させること；　及び
（ｂ）上記物質が上記タンパク質と結合するかどうかを測定すること。
【００１８】
インフルエンザ菌の完全なゲノム配列は、この生物で研究している全ての研究室にとってそして多様な商業的目的で非常に価値があろう。インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの多数のフラグメントはジーンバンク又はタンパク質データベースの類似性検索によって直ちに同定され、そしてヘモフィルス属研究者にとって当面の価値があり、そしてタンパク質の製造又は遺伝子発現の制御にとって当面の商業的な価値があるであろう。特別の例はＰＨＡシンターゼに関するものである。ポリヒドロキシブチレートはインフルエンザ菌Ｒｄの膜に存在しておりそしてその量は形質転換に必要な能力レベルと相互関係があることが報告されている。このポリマーを合成するＰＨＡシンターゼは多数の細菌で同定されそして配列が決定されているが、それら細菌はどれもインフルエンザ菌と進化的に近くない。この遺伝子は、ハイブリッド形成プローブ又はＰＣＲ技術を使用してインフルエンザ菌から未だ単離しなければならない。しかし乍ら、本発明のゲノム配列は以下に記載する検索手段を使用することによってこの遺伝子の同定を可能にする。
【００１９】
細菌や他の小ゲノムの全ゲノム配列を解明する方法論や技術の発展によって染色体組織を分析する能力や理解が大いに高められておりそして高められるであろう。特に、配列が決定されたゲノムは、ゲノムＤＮＡの大きい断片内の遺伝子を同定し得ること、調節要素の構造、位置及び間隔、産業的適用の可能性を有する遺伝子を同定すること、並びに比較ゲノム及び分子系統発生学を行い得ることを含めて、染色体の構造及び機能を分析する手段を開発するモデルを提供するであろう。
【００２０】
本発明の図面の概要は以下のとおりである。
図１　−　インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの制限マップ。
図２　−　本発明のコンピューターに基づくシステムを実行するために使用できるコンピューターシステム１０２の組立て分解図。
図３　−　４６０ｂｐの平均配列長及び２５ｂｐの重複を有する２．５Ｍｂゲノム（三角）及び１．６Ｍｂゲノム（丸）についてのランダー・ウォーターマン（Ｌａｎｄｅｒ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）の予測と比較した、オートアッセンブラー（ＡｕｔｏＡｓｓｅｍｂｌｅｒ）（四角）で組み立てた概ね４０００個までのランダム配列フラグメントの実験的範囲の比較。
【００２１】
図４　−　インフルエンザ菌ゲノムを管理し、組み立て、編集しそして注釈をつけるために使用したデータフロー及びコンピュータープログラム。マッキントッシュ（Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ）とユニックス（Ｕｎｉｘ）の両プラットフォームを使用してＡＢ３７３配列データファイル（Ｋｅｒｌａｖａｇｅ等、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｔｗｅｎｔｙ−Ｓｉｘｔｈ　Ａｎｎｕａｌ　Ｈａｗａｉｉ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＩＥＥＥ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、ワシントンＤ．Ｃ．、５８５（１９９３年））を処理する。ファクチュラ（Ｆａｃｔｕｒａ）（ＡＢ）は配列ファイルの自動ベクター配列除去及び末端切り取り用に設計したマッキントッシュのプログラムである。プログラムｅｓｐはマッキントッシュプラットフォームで作動しそしてファクチュラによって配列ファイルから抽出された特徴データをユニックスに基づくインフルエンザ菌関連データベースに書き込む。組み立ては、ｓｔｐ、Ｘ−ウィンドウグラフィックインターフェース、及び使用者によって特定されるか又は標準的なＳＱＬ照会を使用してインフルエンザ菌データベースから配列を取り出すことができる制御プログラムを使用して特定の配列ファイルセット及びそれらの関連特徴を取り出すことによって達成される。
【００２２】
配列ファイルは、数千もの配列フラグメントを迅速且つ正確に組み立てるためにＴＩＧＲで設計された組み立て装置、ＴＩＧＲアッセンブラーを使用して組み立てられた。ＴＩＧＲエディター（Ｅｄｉｔｏｒ）はＴＩＧＲアッセンブラーアウトプットから得られる整列した配列ファイルを書き込みそして連続編集用にこの整列及び関連エレクトロフェログラムを表示することができるグラフィックインターフェースである。推定上のコード化領域の同定はジーンマーク（Ｇｅｎｅｍａｒｋ）（Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ及びＭｃＩｎｉｎｃｈ、Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ　Ｃｈｅｍ．　１７（２）：１２３（１９９３年））、即ち遺伝子の位置を予測するマーコフ（Ｍａｒｋｏｖ）及びベイズ（Ｂａｙｅｓ）のモデル化プログラムで実施し、そしてインフルエンザ菌配列データセットに向けた。ペプチド検索は、４０９６個のマイクロプロセッサーを有するマスパル（Ｍａｓｐａｒ）ＭＰ−２大規模パラレルコンピューターで実行されるｂｌａｚｅ（Ｂｒｕｔｌａｇ等、Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ　Ｃｈｅｍ．　１７：２０３（１９９３年））を使用してジーンマークで予測される各コード化領域の３つの読み取り枠に対して実施した。各読み取り枠から得られる結果をｍｂｌｚｔによって単一のアウトプットファイル中に組み合わせた。最適のタンパク質整列は潜在的なフレームシフト間に整列を延長させるプログラムｐｒａｚｅを使用して取得した。アウトプットは、インフルエンザ菌データベースと直接相互作用するオーダーメードのグラフィックビュープログラム、ｇｂｙｏｂを使用して調べた。これらの整列は潜在的なフレームシフトエラーを同定するために使用しそして更に編集するための目標とした。
【００２３】
図５　−　データベースとの適合を有する各予測コード化領域の位置並びにゲノムの選択された全体的特徴を示しているインフルエンザ菌Ｒｄ染色体の円形表示。外部円周：　特有のＮｏｔＩ制限部位（ヌクレオチド１と呼称される）、ＲｓｒＩＩ部位及びＳｍａＩ部位の位置。外部同心円：　遺伝子同定を行った各同定コード化領域の位置。各コード化領域の位置は図６〜４５の色コードによる役割に関してコード化されている。第２の同心円：　高いＧ／Ｃ含有量の領域（＞４２％、赤色；　＞４０％、青色）及び高いＡ／Ｔ含有量の領域（＞６６％、黒色；　＞６４％、緑色）。高いＧ／Ｃ含有量の領域は６個のリボソームオペロンとミュー様プロファージと特に関係がある。第３の同心円：　ラムダクローンによる範囲（青色）。３００個を超えるラムダクローンは各末端から配列決定して、ゲノムの構造全体を確認しそして６個のリボソームオペロンを同定した。第４の同心円：　６つのリボソームオペロン（緑色）、ｔＲＮＡ（黒色）及び曖昧なミュー様プロファージ（青色）の位置。第５の同心円：　単純な一列に並んだ繰返し。次の繰返しの位置が示されている：　ＣＴＧＧＣＴ、ＧＴＣＴ、ＡＴＴ、ＡＡＴＧＧＣ、ＴＩＧＡ、ＴＴＧＧ、ＴＴＴＡ、ＴＴＡＴＣ、ＴＧＡＣ、ＴＣＧＴＣ、ＡＡＣＣ、ＴＴＧＣ、ＣＡＡＴ、ＣＣＡＡ。推定上の複製起源は塩基６０３，０００付近で始まる外側で方向を指している矢印（緑色）によって示される。２つの潜在的終結配列は円の反対側の中間点付近で示されている（赤色）。
【００２４】
図６〜４５　−　インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。予測コード化領域を各鎖上に示す。ｒＲＮＡ及びｔＲＮＡ遺伝子はそれぞれ直線及び三角として示す。遺伝子は凡例に記載された役割カテゴリーによって色でコード化されている。遺伝子識別（ＧｅｎｅＩＤ）番号は表１（ａ）、１（ｂ）及び２の番号に対応する。可能な場合、３文字表記も提供する。
【００２５】
図４６　−　インフルエンザ菌ｂ型中に存在するふさ状へり遺伝子集団の８個の遺伝子を含有するインフルエンザ菌染色体の領域とインフルエンザ菌Ｒｄ中の同じ領域との比較。この領域では両生物共に　ｐｅｐＮ及びｐｕｒＥ遺伝子が側部に結合している。しかし乍ら、非感染性Ｒｄ株では、ふさ状へり遺伝子集団の８個の遺伝子が切り取られている。Ｒｄ株のこの領域には１７２ｂｐのスペーサー領域が位置しており、そしてｐｅｐＮ及びｐｕｒＥ遺伝子が側部に結合している。
【００２６】
図４７　−　５つの予測チャンネルタンパク質の疎水性分析。既知のペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋのリリース８７種）との相同性を示していない５つの予測コード化領域のアミノ酸配列であって、各アミノ酸配列はチャンネル形成タンパク質の特徴である複数の疎水性ドメインを示している。予測コード化領域の配列は、ジーンワークス（ＧｅｎｅＷｏｒｋｓ）ソフトウェアパッケージ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）を使用してカイト・ドーリトル（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）アルゴリズム（Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．１５７：１０５（１９８２年））（１１残基の範囲で）で分析した。
【００２７】
本発明はインフルエンザ菌Ｒｄゲノムの配列決定に基づいている。得られた一次ヌクレオチド配列は配列識別番号：１７５０で提供されている。本明細書で使用するとき、「一次配列」とはＩＵＰＡＣ命名法で表わされるヌクレオチド配列を言う。
配列識別番号：１７５０で提供される配列はインフルエンザ菌Ｒｄゲノム中に見られる特有のＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に関連して適応されている。熟練技術者は、この開始／停止点が便宜上選択されたものでありそして構造的意義を反映していないことを容易に認識するであろう。
【００２８】
本発明は配列識別番号：１７５０のヌクレオチド配列又はその代表的なフラグメントを、熟練技術者が容易に使用し、分析しそして解釈できる形態で提供する。１つの実施態様では、配列は配列識別番号：１７５０で提供されるヌクレオチド配列に対応する一次配列情報の連続列として提供される。
本明細書で使用するとき、「配列識別番号：１７５０で示されるヌクレオチド配列の代表的なフラグメント」とは、公に利用可能なデータベース内で現在示されていない配列識別番号：１７５０の任意の部分を言う。本発明の好ましい代表的なフラグメントはインフルエンザ菌読み取り枠、発現調節フラグメント、取込み調節フラグメント及び試料中のインフルエンザ菌Ｒｄの存在を診断するために使用できるフラグメントである。このような好ましい代表的なフラグメントの識別は表１（ａ）及び２に提供されるがこれらに限定されない。
【００２９】
配列識別番号：１７５０で提供されたヌクレオチド配列情報は、メガベースショットガン配列決定方法を使用してインフルエンザ菌Ｒｄゲノムの配列を決定することによって得られた。下記実施例で考察した正確さに関する３つのパラメーターを使用して、本発明者は配列識別番号：１７５０の配列が最大９９．９８％の正確さを有していると計算した。かくして、配列識別番号：１７５０で提供されたヌクレオチド配列は、必ずしも１００％完全ではないが、インフルエンザ菌Ｒｄゲノムのヌクレオチド配列を非常に正確に示すものである。
【００３０】
以下で詳細に検討するように、配列識別番号：１７５０並びに表１（ａ）及び２で提供された情報を定型的なクローニング及び配列決定方法と一緒に使用して、当該技術分野の通常の技倆を有する者は、非常に多様なインフルエンザ菌タンパク質をコードする読み取り枠（ＯＲＦ）を含む重要な全ての「代表的なフラグメント」をクローン化しそしてそれらの配列を決定することができるであろう。極く稀な場合に、これは配列識別番号：１７５０で開示されたヌクレオチド配列中に存在するヌクレオチド配列の誤謬を明らかにすることがある。それ故、本発明が一度利用可能になると（即ち、配列識別番号：１７５０並びに表１（ａ）及び２の情報が一度利用可能になると）、配列識別番号：１７５０中の配列決定の稀な誤謬の解決は正に当該技術分野の技倆の範囲内であろう。ヌクレオチド配列編集ソフトウエアは公に利用可能である。例えば、アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｙｔｅｍ）（ＡＢ）のオートアッセンブラー（商標）はヌクレオチド配列を視覚的に調べている間の補助物として使用することができる。
【００３１】
たとえ配列識別番号：１７５０の非常に稀な配列決定の誤謬が全て訂正されたとしても、得られるヌクレオチドは配列識別番号：１７５０のヌクレオチド配列と依然として少なくとも９９．９％同一であろう。
異なるインフルエンザ菌株から得られるゲノムのヌクレオチド配列は僅かに異なっている。しかし乍ら、全てのインフルエンザ菌株のゲノムのヌクレオチド配列は配列識別番号：１７５０で提供されたヌクレオチド配列と少なくとも９９．９％同一であろう。
【００３２】
かくして、本発明は更に、配列識別番号：１７５０のヌクレオチド配列と少なくとも９９．９％同一のヌクレオチド配列を熟練技術者が容易に使用し、分析しそして解釈できる形態で提供する。ヌクレオチド配列が配列識別番号：１７５０のヌクレオチド配列と少なくとも９９．９％同一であるかどうかを決定する方法は定型的でありそして熟練技術者にとって容易に利用可能である。例えば、周知のｆａｓｔａアルゴリズム（Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８５：２４４４（１９８８年）を使用してヌクレオチド配列の同一性パーセントを得ることができる。
【００３３】
コンピューター関連実施態様
配列識別番号：１７５０で提供されたヌクレオチド配列、その代表的なフラグメント又は配列識別番号：１７５０と少なくとも９９．９％同一のヌクレオチド配列はそれらの使用を容易にする多様な媒体中で「提供され」得るであろう。本明細書で使用するとき、提供されたとは、本発明のヌクレオチド配列、即ち、配列識別番号：１７５０で提供されたヌクレオチド配列、その代表的なフラグメント又は配列識別番号：１７５０と少なくとも９９．９％同一のヌクレオチド配列を含有する単離核酸分子以外の製造物を言う。このような製造物はインフルエンザ菌Ｒｄゲノム又はそのサブセット（例えば、インフルエンザ菌Ｒｄ読み取り枠（ＯＲＦ））を、インフルエンザ菌Ｒｄゲノム又は天然若しくは精製形態で存在している該ゲノムのサブセットを試験するために直接適用できない手段を使用して、熟練技術者がこの製造物を試験できるようになる形態で提供する。
【００３４】
この実施態様の１つの適用では、本発明のヌクレオチド配列をコンピューター読み出し媒体に記録することができる。本明細書で使用するとき、「コンピューター読み出し媒体」とはコンピューターが読み出しそして直接アクセスできる任意の媒体を言う。このような媒体には、フロッピーディスク、ハードディスク保存媒体及び磁気テープのような磁気保存媒体；　ＣＤ−ＲＯＭのような光学保存媒体；　ＲＡＭ及びＲＯＭのような電気保存媒体；　並びにこれらカテゴリーの合成物、例えば磁気／光学保存媒体が含まれるが、これらに限定されない。熟練技術者は、現在知られているコンピューター読み出し媒体をどのように使用して、本発明のヌクレオチド配列が記録されているコンピューター読み出し媒体を含んでいる製造物を創製するのかを容易に理解することができるであろう。
【００３５】
本明細書で使用するとき、「記録された」とはコンピューター読み出し媒体に情報を保存する過程を言う。熟練技術者は、現在知られているコンピューター読み出し媒体への情報記録方法を容易に採用して、本発明のヌクレオチド配列情報を含む製造物を作ることができるであろう。
【００３６】
本発明のヌクレオチド配列を記録しているコンピューター読み出し媒体を創作するために、熟練技術者は多様なデータ保存構造物を利用することができる。データ保存構造物の選択は一般的には、保存情報にアクセスするために選択される手段に基づいている。加えて、多様なデータプロセッサープログラム及びフォーマットを使用して本発明のヌクレオチド配列情報をコンピューター読み出し媒体に保存することができる。配列情報は、ワープロテキストファイル中に示すか、ワードパーフェクト（ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔ）やマイクロソフトワード（ＭｉｃｒｏＳｏｆｔ　Ｗｏｒｄ）のような市販で入手可能なソフトウエア中にフォーマットするか、又はＤＢ２、Ｓｙｂａｓｅ、Ｏｒａｃｌｅ等のようなデータベースアプリケーション中に保存されたＡＳＣＩＩファイルの形態で示すことができる。熟練技術者は、本発明のヌクレオチド配列情報が記録されているコンピューター読み出し媒体を得るために、任意の数のデータプロセッサー構築フォーマット（例えば、テキストファイル又はデータベース）を容易に適合させることができる。
【００３７】
配列識別番号：１７５０のヌクレオチド配列、その代表的なフラグメント、又は配列識別番号：１７５０と少なくとも９９．９％同一のヌクレオチド配列をコンピューター読み出し形態で提供することによって、熟練技術者は多様な目的で配列情報に定型的にアクセスすることができる。熟練技術者がコンピューター読み出し媒体中に提供された配列情報にアクセスすることができるコンピューターソフトウエアは公に入手可能である。以下の実施例は、ＳｙｂａｓｅシステムでＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　２１５：４０３〜４１０（１９９０年））及びＢＬＡＺＥ（Ｂｒｕｔｌａｇ等、Ｃｏｍｐ．　Ｃｈｅｍ．　１７：２０３〜２０７（１９９３年））検索アルゴリズムを実行するソフトウエアをどのように使用して、インフルエンザ菌Ｒｄゲノム内の読み取り枠（ＯＲＦ）を、他の生物から得られるその相同体又はタンパク質を含めて同定するのかを示している。このようなＯＲＦはインフルエンザ菌Ｒｄゲノム内のフラグメントをコードしているタンパク質であり、そして発酵反応及び商業的に有用な代謝物の製造に使用される酵素のような商業的に重要なタンパク質を製造するのに有用である。
【００３８】
本発明は更に、本明細書に記載された配列情報を含有しているシステム、特にコンピューターに基づくシステムを提供する。このようなシステムはインフルエンザ菌Ｒｄゲノムの商業的に重要なフラグメントを同定するように設計されている。
本明細書で使用するとき、「コンピューターに基づくシステム」は、本発明のヌクレオチド配列情報を分析するために使用されるハードウエア手段、ソフトウエア手段及びデータ保存手段を言う。本発明のコンピューターに基づくシステムの最小限のハードウエア手段は中心処理ユニット（ＣＰＵ）、インプット手段、アウトプット手段及びデータ保存手段を含んでいる。熟練技術者は、現在利用可能なコンピューターに基づくシステムのいずれも本発明で使用するのに適していることを容易に理解することができる。
【００３９】
上記したように、本発明のコンピューターに基づくシステムは本発明のヌクレオチド配列を保存しているデータ保存手段並びに必要なハードウエア手段及び検索手段を支持しそして実施するソフトウエア手段を含んでいる。本明細書で使用するとき、「データ保存手段」とは、本発明のヌクレオチド配列情報を保存できるメモリー、又は本発明のヌクレオチド配列情報を記録している製造物にアクセスできるメモリーアクセス手段を言う。
【００４０】
本明細書で使用するとき、「検索手段」とは、標的配列又は標的構造モチーフをデータ保存手段内に保存された配列情報と比較するために、コンピューターに基づくシステムで実行される１つ又はそれより多いプログラムを言う。検索手段は特定の標的配列又は標的モチーフに適合するインフルエンザ菌Ｒｄゲノムのフラグメント又は領域を同定するために使用される。多様な既知のアルゴリズムが公に開示されており、そして検索手段実行用の市販で入手可能な多様なソフトウエアが本発明のコンピューターに基づくシステムで使用されそして使用することができる。このようなソフトウエアの例はマックパターン（ＭａｃＰａｔｔｅｒｎ）（ＥＭＢＬ）、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸ（ＮＣＢＩＡ）であるが、これらに限定されない。熟練技術者は、相同性検索を実施するための利用可能なアルゴリズム又は実行用ソフトウエアパッケージのどれも本発明のコンピューターに基づくシステムで使用するために適応させ得ることを容易に認識することができる。
【００４１】
本明細書で使用するとき、「標的配列」は６個若しくはそれより多いヌクレオチド又は２個若しくはそれより多いアミノ酸の任意のＤＮＡ又はアミノ酸配列であることができる。熟練技術者は、標的配列が長ければ長いほど、標的配列がデータベース中にランダム発生として存在する可能性は少なくなることを容易に認識することができる。標的配列の最も好ましい配列の長さは約１０から１００個のアミノ酸又は約３０から３００個のヌクレオチド残基である。しかし乍ら、インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの商業的に重要なフラグメント、例えば遺伝子発現やタンパク質プロセシングに関与する配列フラグメントの検索はより短い長さのフラグメントであることが良く認識されている。
【００４２】
本明細書で使用するとき、「標的構造モチーフ」又は「標的モチーフ」とは、配列（単数又は複数）が標的モチーフの折りたたみによって形成される三次元配置に基づいて選択される合理的に選択された任意の配列又は配列の組合せを言う。多様な標的モチーフが当該技術分野で知られている。タンパク質標的モチーフには酵素活性部位及びシグナル配列が含まれるが、これらに限定されない。核酸標的モチーフにはプロモーター配列、ヘアピン構造体及び誘導可能な発現要素（タンパク質結合配列）が含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
インプット及びアウトプット手段用の多様な構造フォーマットを使用して、本発明のコンピューターに基づくシステムで情報をインプット又はアウトプットすることができる。アウトプット手段用の好ましいフォーマットは標的配列又は標的モチーフと種々の相同度を有するインフルエンザ菌Ｒｄゲノムのフラグメントをランクづける。このようにして示されたものは熟練技術者に種々の量の標的配列又は標的モチーフを含有する配列のランクづけを提供し、そして同定されたフラグメント中に含まれる相同度を同定する。
【００４４】
多様な比較手段を使用して標的配列又は標的モチーフをデータ保存手段と比較して、インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの配列フラグメントを同定することができる。本発明の実施例では、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＺＥアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　２１５：４０３〜４１０（１９９０年））を実行する実行用ソフトウエアを使用してインフルエンザ菌Ｒｄゲノム内の読み取り枠を同定した。熟練技術者は、公に入手可能な相同性検索プログラムがどれも本発明のコンピューターに基づくシステム用の検索手段として使用できることを容易に認識することができる。
【００４５】
この実施態様の１つの適用は図２で提供する。図２は、本発明を実行するために使用できるコンピューターシステム１０２の分解組立て図を提供する。コンピューターシステム１０２は母線１０４に連結されたプロセッサー１０６を含んでいる。母線には主メモリー１０８（好ましくはランダムアクセスメモリー、ＲＡＭとして実行される）及び多様な二次的保存デバイス１１０、例えばハードドライブ１１２及び取外し可能媒体保管デバイス１１４も連結されている。取外し可能媒体保管デバイス１１４は、例えばフロッピーディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、磁気テープドライブ等を表わすことができる。コントロール論理学及び／又はデータが記録されている取外し可能保存媒体１１６（例えば、フロッピーディスク、コンパクトディスク、磁気テープ等）は取外し可能媒体保管デバイス１１４中に挿入することができる。コンピューターシステム１０２は、取外し可能媒体保管デバイス１１４で一度挿入された取外し可能媒体保管デバイス１１４からコントロール論理学及び／又はデータを読み出すのに適するソフトウエアを含んでいる。
【００４６】
本発明のヌクレオチド配列は、主メモリー１０８、任意の二次的保存デバイス１１０及び／又は取外し可能保存媒体１１６に周知の方法で保存することができる。ゲノム配列にアクセスしそしてこれを処理するソフトウエア（例えば、検索ツール、比較ツール等）は実行中の主メモリーに存在している。
【００４７】
生化学的実施態様
本発明のもう１つの実施態様はインフルエンザ菌Ｒｄゲノムの単離フラグメントに向けられている。本発明のインフルエンザ菌Ｒｄゲノムのフラグメントには、ペプチドをコードしているフラグメント（以下、読み取り枠（ＯＲＦ））、操作可能的に結合されたＯＲＦの発現を調節するフラグメント（以下、発現調節フラグメント（ＥＭＦ））、結合ＤＮＡフラグメントの細胞内取込みに介在するフラグメント（以下、取込み調節フラグメント（ＵＭＦ））、及び試料中のインフルエンザ菌Ｒｄの存在を診断するために使用できるフラグメント（以下、診断フラグメント（ＤＦ））が含まれるが、これらに限定されない。
【００４８】
本明細書で使用するとき、「単離核酸分子」又は「インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの単離フラグメント」とは、精製手段に付されて、通常組成物に関連する化合物の数が組成物から減少している特異的なヌクレオチド配列を有する核酸分子を言う。多様な精製手段を使用して本発明の単離フラグメントを生成させることができる。これらには電荷、溶解度又は大きさに基づいて溶液の構成成分を分離する方法が含まれるが、これらに限定されない。
【００４９】
１つの実施態様では、インフルエンザ菌Ｒｄ　ＤＮＡを機械的に剪断して１５〜２０ｋｂの長さのフラグメントを作ることができる。次に、これらのフラグメントを使用して、以下の実施例で記載したようにしてラムダクローン中に上記フラグメントを挿入することによってインフルエンザ菌Ｒｄライブラリーを生じさせることができる。次いで、配列識別番号：１７５０で提供されるヌクレオチド配列情報を使用して、例えば、表１（ａ）で提供されるＯＲＦを側部に付けたプライマーを生成させることができる。次いで、ＰＣＲクローニング法を使用してラムダＤＮＡライブラリーからＯＲＦを単離することができる。ＰＣＲクローニング法は当該技術分野で周知である。かくして、配列識別番号：１７５０、表１（ａ）及び表２の利用可能性が与えられると、本発明の任意のＯＲＦ又は他の核酸フラグメントを単離することは定型的となろう。
【００５０】
本発明の単離核酸分子には一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ並びに一本鎖ＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用するとき、「読み取り枠」、ＯＲＦは終結コドンを有していないアミノ酸をコードする一連の３塩基連鎖を意味し、そしてタンパク質に翻訳可能な配列である。表１ａ、１ｂ及び２はインフルエンザ菌Ｒｄゲノム中のＯＲＦを識別している。特に、表１ａは、括弧内の生物（表１（ａ）の第４欄参照）から得られるタンパク質配列に適合する相同性に基づいて記載されたタンパク質をコードしているインフルエンザ菌ゲノム内のＯＲＦの位置を示している。
【００５１】
表１（ａ）の第１欄は特定のＯＲＦの「遺伝子識別」を提供している。この情報は２つの理由により有用である。第１に、図６〜４５で提供されるインフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップはこれらの遺伝子識別番号に従ってＯＲＦに言及している。第２に、表１（ｂ）は遺伝子識別番号を使用して、どのＯＲＦが公のデータベースでこれまでに提供されたかを示している。
【００５２】
表１（ａ）の第２及び第３欄は配列識別番号：１７５０で提供されたヌクレオチド配列中のＯＲＦの位置を示している。通常の技倆を有する者は、ＯＲＦがインフルエンザ菌ゲノム内で反対方向を向いていることがあることを認識するであろう。これは２及び３欄に示されている。
表１（ａ）の第５欄は、ＯＲＦによってコードされているタンパク質と第４欄の括弧内の生物から得られる対応するタンパク質との同一性パーセントを示している。
【００５３】
表１（ａ）の第６欄は、ＯＲＦによってコードされているタンパク質と第４欄の括弧内の生物から得られる対応するタンパク質との類似性パーセントを示している。２つのポリペプチド配列の同一性パーセント及び類似性パーセントの概念は当該技術分野で良く理解されている。例えば、３個のアミノ酸の位置（例えば、１、３及び５位）が異なっている１０個のアミノ酸の長さの２つのポリペプチドは７０％の同一性パーセントを有すると言われる。しかし乍ら、この同じ２つのポリペプチドは、例えば、５位のアミノ酸部分が、同一ではないが、「類似」している（即ち、同様な生化学的特徴を有している）場合、８０％の類似性パーセントを有すると考えられるであろう。
表１（ａ）の第７欄はアミノ酸相同性適合の長さを示している。
【００５４】
表２は、別の生物から得られる既知のタンパク質配列との「相同性適合」をもたらさなかったポリペプチド配列をコードしているインフルエンザ菌ＲｄゲノムのＯＲＦを提供している。相同性検索に使用したアルゴリズムと規準に関する詳細は以下の実施例で更に提供されている。
熟練技術者は、表１（ａ）、１（ｂ）及び２に示された以外のインフルエンザ菌Ｒｄゲノム内のＯＲＦ、例えば、本発明のコンピューターに基づくシステムを使用して確認可能なものに加えて、同定されたＯＲＦと重複しているか又はこれと反対側の鎖によってコードされているＯＲＦを容易に同定することができる。
本明細書で使用するとき、「発現調節フラグメント」、ＥＭＦは、操作可能的に結合したＯＲＦ又はＥＭＦの発現を調節する一連のヌクレオチド分子を意味する。
【００５５】
本明細書で使用するように、配列の発現がＥＭＦの存在によって変更するとき、配列は「操作可能的に結合した配列の発現を調節する」と言う。ＥＭＦにはプロモーター及びプロモーター調節配列（誘導要素）が含まれるが、これらに限定されない。ＥＭＦの１つのクラスは、特異的な調節因子又は生理学的事象に応答して操作可能的に結合したＯＲＦの発現を誘導するフラグメントである。ヘモフィルス属から得られる既知のＥＭＦの総説はトム（Ｔｏｍｂ）等（Ｇｅｎｅ　１０４：１〜１０（１９９１年））及びチャンドラー　エム．　エス．（Ｃｈａｎｄｌｅｒ，　Ｍ．Ｓ．）（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８９：１６２６〜１６３０（１９９２年））によって記載されている。
【００５６】
ＥＭＦ配列は、表１（ａ）、１（ｂ）及び２に提供されたＯＲＦへの近接性によってインフルエンザ菌Ｒｄゲノム内で同定することができる。表１（ａ）、１（ｂ）又は２のＯＲＦの任意の１つの５’で取った約１０から２００個までのヌクレオチドの長さの遺伝子間断片又は遺伝子間断片のフラグメントは、天然に結合したＯＲＦ配列で見られるものと類似した態様で、操作可能的に結合した３’ＯＲＦの発現を調節するであろう。本明細書で使用するとき、「遺伝子間断片」とは、本明細書で記載した２つのＯＲＦ間のヘモフィルス属ゲノムのフラグメントを言う。或いは、ＥＭＦは本発明のコンピューターに基づくシステムで標的配列又は標的モチーフとして既知のＥＭＦを使用して同定することができる。
【００５７】
ＥＭＦの存在及び活性はＥＭＦトラップベクターを使用して確認することができる。ＥＭＦトラップベクターはマーカー配列に対するクローニング部位５’を有している。マーカー配列は同定可能な表現型、例えば、抗生物質耐性又は補充栄養要求性因子をコードしており、そしてＥＭＦトラップベクターを適当な条件下で適当な宿主内に入れたとき上記表現型を同定又はアッセイすることができる。上記したように、ＥＭＦは操作可能的に結合したマーカー配列の発現を調節するであろう。種々のマーカー配列の更に詳細な考察は以下で提供する。
【００５８】
ＥＭＦであると考えられる配列を、ＥＭＦトラップベクター内のマーカー配列から上流の１つ又はそれより多い制限部位の３つの読み取り枠の全てでクローン化する。次いで、既知の方法を使用してこのベクターを適当な宿主内に形質転換し、そして形質転換した宿主の表現型を適当な条件下で試験する。上記したように、ＥＭＦは操作可能的に結合したマーカー配列の発現を調節する。
【００５９】
本明細書で使用するとき、「取込み調節フラグメント」、ＵＭＦは、結合ＤＮＡフラグメントの細胞内への取込みに介在する一連のヌクレオチド分子を意味する。ＵＭＦは上記したコンピューターに基づくシステムを用いて標的配列又は標的モチーフとして既知のＵＭＦを使用して容易に同定することができる。
ＵＭＦの存在及び活性は、ＵＭＦと考えられるものをマーカー配列に結合させて確認することができる。次に、得られた核酸分子を適当な条件下で適当な宿主とともにインキュベートし、そしてマーカー配列の取込みを測定する。上記したように、ＵＭＦは結合したマーカー配列の取込み頻度を高める。ヘモフィルス属におけるＤＮＡ取込みの総説はグッドガル　エス．　エイチ．（Ｇｏｏｄｇａｌｌ，　Ｓ．Ｈ．）等、Ｊ．　Ｂａｃｔ．　１７２：５９２４〜５９２８（１９９０年）によって提供されている。
【００６０】
本明細書で使用するとき、「診断フラグメント」、ＤＦはインフルエンザ菌配列と選択的にハイブリッドを形成する一連のヌクレオチド配列を意味する。ＤＦは、インフルエンザ菌Ｒｄゲノム内の特有の配列を同定することによってか又は、増幅若しくはハイブリッド形成選択性を測定する適当な診断フォーマットでＤＦ配列からなるプローブ若しくは増幅プライマーを発生させそして試験することによって容易に同定することができる。
【００６１】
本発明の範囲内に入る配列は本明細書に記載された特定の配列に限定されないで、それらの対立遺伝子や種異体も含んでいる。対立遺伝子及び種異体は配列識別番号：１７５０で提供される配列、その代表的なフラグメント又は配列識別番号：１７５０と少なくとも９９．９％同一のヌクレオチド配列を同じ種の別の単離物から得られる配列と比較することによって定型的に測定することができる。更に、コドン変動性を受け入れるために、本発明には本明細書で開示された特定のＯＲＦがコードするものと同一のアミノ酸配列をコードする核酸分子が含まれる。換言すれば、ＯＲＦのコード化領域において、１つのコドンを、同じアミノ酸をコードしているもう１つのコドンで置き換えることが明白に意図されている。
【００６２】
本明細書で開示された任意の特定の配列は、ＯＲＦのような特別のフラグメントを両方向（即ち、両鎖の配列）で配列を再度決定することによって誤謬を容易にスクリーニングすることができる。或いは、誤謬のスクリーニングは、プローブ又はプライマーとして問題のフラグメントの１部又は全てを使用して単離したインフルエンザ菌起源の対応するポリヌクレオチドの配列を決定することによって実施することができる。
【００６３】
表１（ａ）、１（ｂ）及び２に開示されたインフルエンザ菌Ｒｄゲノムの各ＯＲＦ並びにＯＲＦの５’に見られるＥＭＦはポリヌクレオチド試薬として多数の方法で使用することができる。これらの配列は、試料中のインフルエンザ菌ＲＤのような特定の微生物の存在を検出する診断プローブ又は診断増幅プライマーとして使用することができる。これは、インフルエンザ菌に対して非常に選択的な表２のフラグメント又はＯＲＦの場合に特に当てはまる。
【００６４】
加えて、広範囲に記載した本発明のフラグメントを使用して、三重らせん形成又はアンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡによって遺伝子発現を制御することができ、そしてこれら方法は共にポリヌクレオチド配列とＤＮＡ又はＲＮＡの結合に基づいている。これらの方法で使用するのに適するポリヌクレオチドは通常、２０から４０塩基の長さでありそして転写に係わる遺伝子領域（三重らせん　−　Ｌｅｅ等、Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　６：３０７３（１９７９年）；　Ｃｏｏｎｅｙ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：４５６（１９８８年）；　及びＤｅｒｖａｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１：１３６０（１９９１年）参照）又はｍＲＮＡ自体（アンチセンス　−　Ｏｋａｎｏ、Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．　５６：５６０（１９９１年）；　Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｓ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ、フロリダ州ボカレートン（１９８８年））に相補的であるように設計される。三重らせん形成はＤＮＡからＲＮＡの転写を最適に停止させ、一方アンチセンスＲＮＡハイブリッド形成はｍＲＮＡ分子のポリペプチドへの翻訳を遮断する。両技術共モデルシステムで有効であることが証明されている。本発明の配列に含まれている情報はアンチセンス又は三重らせんオリゴヌクレオチドを設計するために必要である。
【００６５】
本発明は更に、本発明のインフルエンザ菌Ｒｄゲノムの１つ又はそれより多いフラグメントを含む組換え構築物を提供する。本発明の組換え構築物はベクター、例えば、プラスミド又はウイルスベクターを含んでおり、そしてこの中にインフルエンザ菌Ｒｄが、前方向又は逆方向に挿入されている。本発明のＯＲＦの１つを含んでいるベクターの場合には、ベクターは更に、例えば、ＯＲＦに操作可能的に結合したプロモーターを含めて、調節配列を含んでいることができる。本発明のＥＭＦ及びＵＭＦを含むベクターでは、ベクターは更にＥＭＦ又はＵＭＦと操作可能的に結合したマーカー配列又は異種ＯＲＦを含んでいることができる。多数の適当なベクター及びプロモーターが当該技術分野の熟練者に知られており、そして本発明の組換え構築物を生成させるために商業的に入手することができる。次のベクターは例として提供する。細菌性：　ｐＢｓ、ファージスクリプト、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ、ｐＢｓ　ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；　ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。真核生物性：　ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴＩ、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；　ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
【００６６】
プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクター又は選択性マーカーを有する他のベクターを使用して所望の遺伝子から選択することができる。２つの適当なベクターはｐＫＫ２３２−８及びｐＣＭ７である。特別に名前を挙げられる細菌性プロモーターにはｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰＲ及びｔｒｃが含まれる。真核生物性プロモーターにはＣＭＶ最初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルスから得られるＬＴＲ並びにマウスメタロチオナイン−Ｉが含まれる。適当なベクターやプロモーターの選択は正に当該技術分野の通常の技倆レベルの範囲内である。
【００６７】
本発明は更に、本発明のインフルエンザ菌Ｒｄゲノムの単離フラグメントのいずれか１つを含有する宿主細胞を提供し、その際フラグメントは既知の形質転換方法を使用して宿主細胞中に導入されている。宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核生物宿主細胞、酵母細胞のような下等真核生物宿主細胞であることができるか、又は宿主細胞は細菌細胞のような原核細胞であることができる。宿主細胞中への組換え構築物の導入はリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ、デキストラン介在トランスフェクション又はトランスポーレーションによって実施することができる（Ｄａｖｉｓ，　Ｌ．等、Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６年））。
【００６８】
本発明のインフルエンザ菌Ｒｄゲノムのフラグメントの１つを含有する宿主細胞を慣用の態様で使用して、単離フラグメントでコードされている遺伝子産生物を生じさせることができ（ＯＲＦの場合）るか又はＥＭＦの制御下で異種タンパク質を産生させるために使用することができる。
本発明は更に、本発明の核酸フラグメントによって又は本発明の核酸フラグメントの縮重改変体によってコードされている単離ポリペプチドを提供する。「縮重改変体」によって、本発明の核酸フラグメント（例えば、ＯＲＦ）とヌクレオチド配列が異なっているが、遺伝暗号の縮重により同一のポリペプチド配列をコードしているヌクレオチドフラグメントが意図される。本発明の好ましい核酸フラグメントはタンパク質をコードしている表１（ａ）に示されたＯＲＦである。
【００６９】
当該技術分野で知られている多様な方法論を使用して本発明の単離ポリペプチド又はタンパク質のいずれか１つを取得することができる。最も簡単なレベルでは、市販で入手可能なペプチド合成器を使用してアミノ酸配列を合成することができる。これは、より大きいポリペプチドの小さいペプチドやフラグメントの製造で特に有用である。フラグメントは、例えば、天然のポリペプチドに対する抗体の産生で有用である。代替的方法では、ポリペプチド又はタンパク質はポリペプチド又はタンパク質を天然に産生する細菌細胞から精製される。当該技術分野の熟練者はポリペプチドやタンパク質を単離する既知の方法に容易に従って本発明の単離ポリペプチド又はタンパク質の１つを取得することができる。これらにはイムノクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びイムノアフィニティクロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されない。
【００７０】
本発明のポリペプチドやタンパク質は代替的に、所望のポリペプチド又はタンパク質を発現するように改変されている細胞から精製することができる。本明細書で使用するとき、細胞が通常は産生しないか又は細胞が通常はより低いレベルで産生するポリペプチド又はタンパク質を細胞が産生するように遺伝子操作でなされているとき、この細胞は所望のポリペプチド又はタンパクを発現するように改変されていると言う。当該技術分野の熟練者は、本発明のポリペプチド又はタンパク質の１つを産生する細胞を作るために、真核又は原核細胞中に組換え配列か又は合成配列のどちらかを導入しそして発現させる方法を容易に適合させることができる。
【００７１】
任意の宿主／ベクター系を使用して、本発明の１つ又はそれより多いＯＲＦを発現させることができる。これらには真核生物宿主、例えば、ＨｅＬａ細胞、Ｃｖ−１細胞、ＣＯＳ細胞及びＳｆ９細胞、並びに原核生物宿主、例えば大腸菌及び枯草菌が含まれるが、これらに限定されない。最も好ましい細胞は、通常は特定のポリペプチド若しくはタンパク質を発現しないか若しくはポリペプチド又はタンパク質を低い天然レベルで発現する細胞である。
【００７２】
本明細書で使用するとき、「組換え体」は、ポリペプチド又はタンパク質が組換え体（例えば、微生物又は哺乳動物）の発現系から誘導されることを意味する。「微生物」とは、細菌又は真菌（例えば、酵母）発現系で製造される組換えポリペプチド又はタンパク質を言う。生成物として、「組換え微生物」は、天然の内在性物質を本質的に含有せずそして関連する天然のグリコシル化を伴わないポリペプチド又はタンパク質を明示する。大部分の細菌培養物、例えば大腸菌内で発現されるポリペプチド又はタンパク質はグリコシル化修飾を有していない；　酵母内で発現されるポリペプチド又はタンパク質は哺乳動物細胞で発現されるものと異なるグリコシル化パターンを有している。
【００７３】
「ヌクレオチド配列」とはデオキシリボヌクレオチドのヘテロポリマーを言う。一般的に、本発明で提供されるポリペプチド及びタンパク質をコードするＤＮＡ断片は、微生物又はウイルスオペロンから誘導される調節要素を含んでいる組換え体転写ユニット中で発現され得る合成遺伝子を提供するために、インフルエンザ菌Ｒｄゲノムのフラグメントと短いオリゴヌクレオチドリンカーから、又は一連のオリゴヌクレオチドから組み立てられている。
【００７４】
「組換え発現媒体又はベクター」とは、ＤＮＡ（ＲＮＡ）配列からポリペプチドを発現させるためのプラスミド又はファージ又はウイルス又はベクターを言う。発現媒体は、（１）遺伝子発現で調節の役割を有している１つ又は複数の遺伝子要素、例えば、プロモーター又はエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写されそしてタンパク質に翻訳される構造又はコード化配列、及び（３）適当な転写開始及び終止配列のアッセンブリーを含む転写ユニットを含んでいることができる。酵母又は真核生物発現系で使用するように意図された構造ユニットは好ましくは、宿主細胞で翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含有している。或いは、組換えタンパク質がリーダー又は輸送配列なしで発現される場合、これはＮ末端メチオニン残基を含有することができる。この残基は最終生成物を提供するために発現された組換えタンパク質からその後開裂することができるか又はできない。
【００７５】
「組換え発現系」は、染色体ＤＮＡ内に安定的に組換え転写ユニットを組み込んでいるか又は組換え転写ユニットを染色体外に有している宿主細胞を意味する。細胞は原核又は真核細胞であることができる。本明細書で特定した組換え発現系は、発現されるＤＮＡ断片又は合成遺伝子に結合した調節要素の誘導に基づいて異種ポリペプチド又はタンパク質を発現する。
成熟タンパク質は、適当なプロモーターの制御下で哺乳動物細胞、酵母、細菌又は他の細胞内で発現することができる。細胞不含翻訳系を使用し、本発明のＤＮＡ構築物から誘導されるＲＮＡを使用してこのようなタンパク質を製造することもできる。原核生物及び真核生物宿主で使用するのに適するクローニング及び発現ベクターは、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）等、モレキュラークローニング：　実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク（１９８９年）（この開示は参照として本明細書に組み入れる）によって記載されている。
【００７６】
一般的に、組換え発現ベクターは宿主細胞の形質転換を可能にする複製起源及び選択マーカー、例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子及びＳ．セレビシエＴＲＰ１遺伝子並びに高度発現遺伝子から誘導され下流の構造配列の転写を指令するプロモーターを含有している。このようなプロモーターは、なかんずく、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、ａ因子、酸ホスファターゼ又は熱ショックタンパク質のような解糖酵素をコードしているオペロンから誘導することができる。異種構造配列は翻訳開始及び終止配列、そして好ましくは、細胞周辺腔又は細胞外媒体中へ翻訳タンパク質の分泌を指令し得るリーダー配列と共に適当な相で組み立てられる。任意に、異種配列は、所望の特徴、例えば発現された組換え産生物を安定化し又は精製を単純化するＮ末端同定ペプチドを含有する融合タンパク質をコードすることができる。
【００７７】
細菌で使用するのに有用な発現ベクターは、機能プロモーターを有する操作可能な読み取り相内で、適当な翻訳開始及び終止シグナルと一緒に所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を挿入することによって構築される。ベクターは、ベクターの維持を確保するために、そして所望の場合、宿主内での増幅を提供するために、１つ又はそれより多い表現型の選択マーカー及び複製起源を含んでいる。形質転換用の適当な原核生物宿主には大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌並びにシュードモナス、ストレプトミセス及びスタフィロコッカス属内の種々の種が含まれるが、他のものを選択対象として使用することもできる。
【００７８】
代表的な実施例として、細菌で使用するのに有用な発現ベクターは選択マーカー及び周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ　３７０１７）の遺伝子要素を含んでいる市販で入手可能なプラスミドから誘導される細菌性複製起源を含むことができるが、こ例に限定されない。このような市販のベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、スウェーデン国ウプサラ）及びＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ、米国ウィスコンシン州マディソン）が含まれる。これらのｐＢＲ３２２「バックボーン」切片は適当なプロモーター及び発現すべき構造配列と共に組合せられる。
【００７９】
適当な宿主株を形質転換しそして適当な細胞密度まで宿主株を増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な手段（例えば、温度シフト又は化学的誘導）によって活性化し、そして細胞を更なる期間培養する。細胞は典型的には遠心によって採集し、物理的又は化学的手段によって破壊し、そして得られた粗製抽出物は更に精製するために維持する。
【００８０】
種々の哺乳動物細胞培養系を使用して組換えタンパク質を発現することもできる。哺乳動物発現系の例には、グルズマン（Ｇｌｕｚｍａｎ）、セル（Ｃｅｌｌ）２３：１７５（１９８１年）によって記載されたサル腎臓線維芽細胞のＣＯＡ−７株並びに適合可能なベクターを発現し得る他の細胞株、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ及びＢＨＫ細胞株が含まれる。哺乳動物発現ベクターは複製起源、適当なプロモーター及びエンハンサー、そして更には必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、転写終止配列、並びに５’側部非転写配列を含んでいよう。ＳＶ４０ウイルスゲノムから誘導されるＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０起源、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス及びポリアデニル化部位を使用して必要な非転写遺伝子要素を提供することができる。
【００８１】
細菌培養物内で産生される組換えポリペプチド及びタンパク質は通常、１回又はそれより多い塩析、水性イオン交換又はサイズ排除クロマトグラフィー段階の前に細胞ペレットから初期抽出して単離される。成熟タンパク質の配置を完了させる際には、必要な場合、タンパク質の再生段階を使用することができる。最後に、最終精製段階用に高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用することができる。タンパク質の発現で使用された微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、超音波処理、機械的破壊又は細胞溶解の使用を含む任意の好都合な方法によって破壊することができる。
【００８２】
本発明は更に、本明細書に記載したものと実質的に同等な単離ポリペプチド、タンパク質及び核酸分子を含む。本明細書で使用するとき、実質的に同等とは、１つ又はそれより多い置換、欠失又は付加によって参照配列と異なっておりそしてその最終的な効果が参照配列と対象配列間で不利な機能的相違をもたらしていない核酸及びアミノ酸配列の両方、例えば、突然変異配列を言うことができる。本発明の目的では、同等な生物学的活性及び同等な発現特徴を有する配列は実質的に同等と考えられる。同等性決定の目的では、成熟配列の一部切断は無視すべきである。
【００８３】
本発明は更に、本発明のインフルエンザ菌Ｒｄゲノムのフラグメントの、インフルエンザ菌の他の株から得られる相同体及び本発明のＯＲＦによってコードされているタンパク質の相同体を取得する方法を提供する。本明細書で使用するとき、インフルエンザ菌の配列又はタンパク質が本発明のインフルエンザ菌Ｒｄゲノムのフラグメントの１つ又は本発明のＯＲＦの１つによってコードされているタンパク質と顕著な相同性を共有している場合、これは本発明のインフルエンザ菌Ｒｄゲノムのフラグメント又はＯＲＦの１つによってコードされているタンパク質の相同体として特定される。詳細には、本明細書で開示した配列をプローブ又はプライマーとして使用し、そしてＰＣＲクローニング法及びコロニー／プラークハイブリッド形成法のような技術を使用して、当該技術分野の熟練者は相同体を取得することができる。
【００８４】
本明細書で使用するとき、２つの核酸分子又はタンパク質は、これら２つが８５％を超える配列（アミノ酸又は核酸）相同性を有する領域を含有している場合、「顕著な相同性を共有する」と言う。
配列識別番号：１７５０で提供されたヌクレオチド配列又は配列識別番号：１７５０と少なくとも９９．９％同一のヌクレオチド配列から誘導される領域特異的プライマー又はプローブを使用して、ＤＮＡ合成及びＲＮＡ増幅をプライムし、そして既知の方法（Ｉｎｎｉｓ等、ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０年））を使用して相同体をコードするクローン化したＤＮＡを含有するコロニーを同定することができる。
【００８５】
配列識別番号：１７５０又は配列識別番号：１７５０と少なくとも９９．９％同一のヌクレオチド配列から誘導されるプライマーを使用するとき、当該技術分野の熟練者は、高い緊縮条件（例えば、５０〜６０℃でのアニーリング）を用いることによって、このプライマーと７５％以上相同な配列しか増幅されないことを認識しているであろう。より低い緊縮条件（例えば、３５〜３７℃でのアニーリング）を使用することによって、このプライマーと４０〜５０％以上相同な配列も増幅されるであろう。
【００８６】
コロニー／プラークのハイブリッド形成用に、配列識別番号：１７５０又は配列識別番号：１７５０と少なくとも９９．９％同一のヌクレオチド配列から誘導されるＤＮＡプローブを使用するとき、当該技術分野の熟練者は高い緊縮条件（例えば、５Ｘ　ＳＳＰＣ及び５０％ホルムアミド中５０〜６５℃でのハイブリッド形成並びに０．５Ｘ　ＳＳＰＣ中５０〜６５℃での洗浄）を使用することによって、このプローブと９０％以上相同な領域を有する配列を取得することができ、そしてより低い緊縮条件（例えば、５Ｘ　ＳＳＰＣ及び４０〜４５％ホルムアミドでのハイブリッド形成並びにＳＳＰＣ中４２℃での洗浄）を使用することによって、このプローブと３５〜４５％以上相同な領域を有する配列が取得されることを認識しているであろう。
【００８７】
生物がこのようなタンパク質を天然に発現するか又はこのようなタンパク質をコードしている遺伝子を含有している限り、本発明の相同体の供給源として任意の生物を使用することができる。相同体を単離するための最も好ましい生物は、インフルエンザ菌Ｒｄと密接に関係のある細菌である。
【００８８】
本発明の組成物の使用
表１（ａ）で提供された各ＯＲＦはリレイ　エム．（Ｒｉｌｅｙ，　Ｍ．）（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　５７（４）：８６２（１９９３年））から書きかえた１０２の生物学的役割カテゴリーの１つに割り当てた。これによって熟練技術者は同定された各コード化配列の用途を決定することができる。表１（ａ）は更に、各ＯＲＦによってコードされるペプチドのタイプの確認を提供している。その結果、当該技術分野の熟練者は本発明のポリペプチドを、推定上のポリペプチド同定のタイプと一致した商業的、治療的及び産業的目的に使用することができる。
【００８９】
このような同定によって、当該技術分野の熟練者はインフルエンザ菌ＯＲＦを、同定されている配列の既知のタイプと類似した態様で；　例えば、特定の蔗糖供給源を発酵させるために又は特定の代謝物を産生させるために使用することができる。（営利産業内で使用される酵素の総説については、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　第２版、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ　Ｐｕｂｌ．　Ｌｔｄ．、ニューヨーク（１９９１年）及びＢｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ、編集　Ｊ．　Ｔｒａｍｐｅｒ等、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、オランダ国アムステルダム（１９８５年）参照）。
【００９０】
１．生合成酵素
代謝の中間産生物の分解に関与する酵素、中心的な中間代謝に関与する酵素、呼吸に関与する酵素、発酵に関与する好気性及び嫌気性の両酵素、ＡＴＰプロトン駆動力変換に関与する酵素、広範囲の調節機能に関与する酵素、アミノ酸合成に関与する酵素、ヌクレオチド合成に関与する酵素、補因子及びビタミン合成に関与する酵素を含めて、中間的及び巨大分子代謝に係わる触媒反応、小分子の生合成、細胞過程及び他の機能の介在に関与するタンパク質をコードしている読み取り枠を産業的な生合成用に使用することができる。ヘモフィルス属に存在する種々の代謝経路は、絶対栄養要件に基づいて、並びに表１（ａ）で確認される種々の酵素の試験によって同定することができる。
【００９１】
中間代謝のカテゴリー内で同定され、表１（ａ）で確認されるＯＲＦによってコードされている多数のタンパク質は中間代謝物の分解並びに非巨大分子代謝に特に関与している。同定された酵素の幾つかにはアミラーゼ、グルコース、オキシダーゼ及びカタラーゼが含まれる。
タンパク質分解酵素は商業的に重要なもう１つのクラスの酵素である。タンパク質分解酵素は、亜麻及び他の植物繊維の加工を含む多数の産業的処理、果汁の抽出、清澄化及びペクチン除去、植物油の抽出並びに単細胞果実を得るために果実及び植物の柔軟化での用途が見い出されている。食品産業で使用されるタンパク質分解酵素の詳細な総説はロムボウツ（Ｒｏｍｂｏｕｔｓ）等（Ｓｙｍｂｉｏｓｉｓ　２１：７９（１９８６年））及びボラーゲン（Ｖｏｒａｇｅｎ）等（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ　ｉｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、編集　Ｊ．Ｒ．　Ｗｈｉｔａｋｅｒ等、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　Ｓｅｒｉｅｓ　３８９：９３（１９８９年））によって提供されている。
【００９２】
グルコース、ガラクトース、フルトース及びキシロースの代謝はヘモフィルス属の初期代謝の重要な部分である。これらの糖類の分解に関与する酵素は産業的な発酵で使用することができる。商業的な観点から重要な糖変換酵素の幾つかにはグルコースイソメラーゼのような糖イソメラーゼが含まれる。ケトグロン酸（ＫＧＡ）を産生するグルコースオキシダーゼのような他の代謝酵素に商業的な用途が見い出されている。ＫＧＡは、ライヒシュタイン（Ｒｅｉｃｈｓｔｅｉｎ）の方法（Ｋｒｕｅｇｅｒ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６（Ａ）、Ｒｈｉｎｅ，　Ｈ．Ｊ．編集、Ｖｅｒｌａｇ　Ｐｒｅｓｓ、ドイツ国バインハイム（１９８４年）参照）を使用するアスコルビン酸の商業的製造における中間体である。
【００９３】
グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）は市販で入手可能であり、そしてビールの酸素除去用に精製形態並びに固定形態で使用されている。ハルトマイヤー（Ｈａｒｔｍｅｉｒ）等、（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１：　２１（１９７９年）参照。最も重要なＧＯＤの適用はグルコン酸の産業的規模の発酵である。グルコン酸を使用する市場は洗剤、織物、皮革、写真、医薬品、食品、飼料及びコンクリート産業である（Ｂｉｇｅｌｉｓ、Ｇｅｎｅ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　Ｆｕｎｇｉ、Ｂｅｎｅｔｔ　Ｊ．Ｗ．等編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９８５年）、３５７頁参照）。産業的な適用に加えて、ＧＯＤは体液中のグルコースの定量測定用の医薬品、最近は澱粉及びセルロース加水分解物から得られるシロップを分析するバイオテクノロジーにおいて適用が見い出されている。オウス（Ｏｗｕｓｕ）等（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ．　Ａｃｔａ．　８７２：８３（１９８６年））参照。
【００９４】
世界で今日使用されている主要な甘味料はテンサイやサトウキビから得られる蔗糖である。産業的酵素の分野では、グルコースイソメラーゼ方法が今日の市場で最も大きい広がりを示している。最初、可溶性酵素が使用され、そしてその後固定酵素が開発された（Ｋｒｕｅｇｅｒ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｔｈｅ　Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｉｎａｕｅｒ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、マサチューセッツ州サンダーランド（１９９０年））。今日、固定酵素を使用してグルコースから製造される高フルクトースシロップの使用は断然大きい産業的事業である。これら酵素の産業的使用の総説はジョルゲンセン（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ）（Ｓｔａｒｃｈ　４０：３０７（１９８８年））によって提供されている。
【００９５】
プロテイナーゼ、例えばアルカリ性セリンプロテイナーゼは洗剤添加物として使用されるので、産業的分野で使用される最も大きい微生物酵素量の１つを表わしている。それらが産業的に重要であるため、産業的方法でのこれら酵素の使用に関する発表及び未発表情報が多数存在している。（Ｆａｕｌｔｍａｎ等、Ａｃｉｄ　Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｔａｎｇ，　Ｊ．編集、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９７７年）及びＧｏｄｆｒｅｙ等、Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｅｎｚｙｍｅｓ、ＭａｃＭｉｌｌａｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、英国サリー（１９８３年）及びＨｅｐｎｅｒ等、Ｒｅｐｏｒｔ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　ｂｙ　１９９０、Ｈｅｌ　Ｈｅｐｎｅｒ　＆　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、ロンドン（１９８６年）参照）。
【００９６】
本発明のもう１つのクラスの商業的に使用可能なタンパク質は表１で確認される微生物リパーゼである（Ｍａｃｒａｅ等、Ｐｈｉｌｏｓｏｐｈｉｃａｌ　Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｈｉｒａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｌｏｎｄｏｎ　３１０：２２７（１９８５年）及びＰｏｓｅｒｋｅ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｏｉｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　６１：１７５８（１９８４年）参照）。リパーゼは、容易に入手できるトリグリセリドのリパーゼ触媒相互エステル化を使用して中性グリセリドを製造する油脂産業で主として使用されている。リパーゼの適用には、洗浄方法中に織物から脂肪の除去を容易にする洗剤添加物としての使用が含まれる。
【００９７】
複雑な有機分子の合成で主要段階の触媒として酵素、そして特に微生物酵素を使用することは非常な速度で人気を得てきている。非常に重要な１つの分野はキラル中間体の製造である。キラル中間体の製造は広範囲の合成化学者、特に新薬、農薬、芳香剤及び風味剤の製造に関与している科学者にとって重要である。（Ｄａｖｉｅｓ　等、Ｒｅｃｅｎｔ　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｉｒａｌ　Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ　Ｕｓｉｎｇ　Ｅｎｚｙｍｅｓ、ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ、フロリダ州ボカレートン（１９９０年）参照）。酵素によって触媒される以下の反応は有機化学者にとって重要である：　カルボン酸エステル、リン酸エステル、アミド及びニトリルの加水分解、エステル化反応、トランス−エステル化反応、アミドの合成、アルカノン及びオキソアルカネートの還元、アルコールからカルボニル化合物への酸化、スルフィドからスルホキシドへの酸化、並びにアルドール反応のような炭素結合形成反応。バイオトランスフォーメーションや有機合成に対して本発明のＯＲＦの１つによってコードされている酵素の使用を考えるとき、単離酵素とは全く異なって、微生物使用の利点及び不利益をそれぞれ考慮することが時には必要となる。一方では全細胞系、又は他方では部分的に精製して単離された酵素を使用することの賛否両論がブッド（Ｂｕｄ）等（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｉｎ　Ｂｒｉｔａｉｎ（１９８７年）、１２７頁）によって詳細に記載されている。
【００９８】
アミノ酸の生合成及び代謝に関与する酵素、アミノトランスフェラーゼはアミノ酸の触媒的製造で有用である。微生物に基づく酵素系を使用する利点はアミノトランスフェラーゼ酵素が〓−アミノ酸だけの立体選択的合成を触媒しそして一般的に一様に高い触媒速度を有していることである。アミノ酸製造に対してアミノトランスフェラーゼを使用する説明はロゼル・デービッド（Ｒｏｓｅｌｌｅ−Ｄａｖｉｄ）（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１３６：４７９（１９８７年））によって提供されている。
【００９９】
本発明のＯＲＦによってコードされている有用なタンパク質のもう１つの有用なカテゴリーには核酸合成、修復及び組換えに関与する酵素が含まれる。商業的に重要な多様な酵素がこれまでにヘモフィルス種のメンバーから単離されている。これらには、Ｈｉｎｃ　ＩＩ、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ及びＨｉｎｆ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼが含まれる。表１（ａ）で、バイオテクノロジー産業で直接的な用途を有している制限酵素、リガーゼ、ギラーゼ及びメチラーゼのような広範な酵素列が確認される。
【０１００】
２．抗体の産生
本明細書に記載したように、本発明のタンパク質、並びにそれらの相同体は、現在他のタンパク質に対して適用されており当該技術分野で知られている多様な手順や方法で使用することができる。本発明のタンパク質は更に、タンパク質に選択的に結合する抗体を生成させるために使用することができる。このような抗体はモノクローナル抗体か又はポリクローナル抗体のいずれか、並びにこれら抗体のフラグメント及びヒト型化形態であることができる。
本発明は更に、本発明のタンパク質の１つに選択的に結合する抗体及びこれら抗体を産生するハイブリドーマを提供する。ハイブリドーマは、特異的なモノクローナル抗体を分泌し得る不死化細胞株である。
【０１０１】
一般的に、ポリクローナル及びモノクローナル抗体並びに所望の抗体を産生し得るハイブリドーマを作成する技術は当該技術分野で周知である（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，　Ａ．Ｍ．、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、オランダ国アムステルダム（１９８４年）；　Ｓｔ．　Ｇｒｏｔｈ等、Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　３５：１〜２１（１９８０年）；　Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５〜４９７（１９７５年））、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ等、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　４：７２（１９８３年）；　Ｃｏｌｅ等、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ　Ｒ．　Ｌｉｓｓ，　Ｉｎｃ．（１９８５年）、７７〜９６頁）。
【０１０２】
抗体を産生することが知られている動物（マウス、ウサギ等）を偽遺伝子ポリペプチドで免疫化することができる。免疫法は当該技術分野で周知である。このような方法には、ポリペプチドの皮下又は腹腔内注射が含まれる。当該技術分野の熟練者は、免疫法で使用される本発明のＯＲＦによってコードされているタンパク質の量は免疫化される動物、ペプチドの抗原性及び注射部位に基づいて変動することを認識しているであろう。
【０１０３】
免疫原として使用されるタンパク質は、タンパク質の抗原性を高めるために修正するか又はアジュバント中で投与することができる。タンパク質の抗原性を高める方法は当該技術分野で周知であり、そしてこれらには抗原と異種タンパク質（例えば、グロブリン又はβ−ガラクトシダーゼ）との結合又は免疫法中にアジュバントを含めることが含まれるが、これらに限定されない。
モノクローナル抗体に関しては、免疫化した動物から脾臓細胞を取り出し、ミエローマ細胞、例えばＳＰ２／０−Ａｇ１４ミエローマ細胞と融合させ、そしてモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞とすることができる。
【０１０４】
当該技術分野で周知の多数の方法のうちの任意の１つを使用して、所望の特徴を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定することができる。これらにはエリザアッセイ、ウエスタンブロット分析又はラジオイムノアッセイによるハイブリドーマのスクリーニングが含まれる（Ｌｕｔｚ等、Ｅｘｐ．　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．　１７５：１０９〜１２４（１９８８年））。
【０１０５】
所望の抗体を分泌するハイブリドーマをクローン化しそして当該技術分野で知られている方法を使用してクラス及びサブクラスを決定する（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，　Ａ．Ｍ．、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、オランダ国アムステルダム（１９８４年））。
１本鎖抗体を製造するために記載された方法（米国特許　４，９４６，７７８）を、本発明のタンパク質に対する１本鎖抗体を製造するように適合させることができる。
ポリクローナル抗体に関しては、抗体を含有する抗血清を免疫化した動物から単離し、そして上記した方法の１つを使用して所望の特異性を有する抗体の存在についてスクリーニングする。
【０１０６】
本発明は更に、上記した抗体を検出できるように標識された形態で提供する。抗体は放射性同位体、アフィニティ標識（例えば、ビオチン、アビジン等）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ又はローダミン等）、常磁性体原子等を使用して検出できるように標識することができる。このような標識化を達成する方法は当該技術分野で周知であり、例えば（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ，　Ｌ．Ａ．等、Ｊ．　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．　１８：３１５（１９７０年）；　Ｂａｙｅｒ，　Ｅ．Ａ．等、Ｍｅｔｈ．　Ｅｎｚｙｍ．　６２：３０８（１９７９年）；　Ｅｎｇｖａｌ，　Ｅ．等、Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１０９：１２９（１９７２年）；　Ｇｏｄｉｎｇ，　Ｊ．Ｗ．、Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｍｅｔｈ．　１３：２１５（１９７６年））を参照されたい。
本発明の標識抗体は、インフルエンザ菌Ｒｄゲノムのフラグメントが発現されている細胞又は組織を同定するためにインビトロ、インビボ及びインシトゥアッセイで使用することができる。
【０１０７】
本発明は更に、固形支持体に固定した上記抗体を提供する。このような固形支持体の例にはポリカーボネートのようなプラスチック、アガロースやセファロースのような複雑な炭水化物、ポリアクリルアミドのようなアクリル樹脂並びにラテックスビーズが含まれる。抗体をこのような固形支持体に結合する技術は当該技術分野で周知である（Ｗｅｉｒ，　Ｄ．Ｍ．等、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」第４版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、英国オックスフォード、１０章（１９８６年）；　Ｊａｃｏｂｙ，　Ｗ．Ｄ．等、Ｍｅｔｈ．　Ｅｎｚｙｍ．　３４　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９７４年））。本発明の固定抗体は、本発明のタンパク質のインビトロ、インビボ及びインシトゥアッセイ並びにイムノアフィニティ精製法で使用することができる。
【０１０８】
３．診断アッセイ及びキット
本発明は更に、本発明のＤＦ又は抗体の１つを使用して、試験試料中における本発明のＯＲＦの１つ又はその相同体の発現を同定する方法を提供する。
詳細には、このような方法は試験試料を１つ若しくはそれより多い抗体又は１つ若しくはそれより多い本発明のＤＦと共にインキュベートし、そしてＤＦ又は抗体と試験試料内の成分との結合をアッセイすることを含んでいる。
【０１０９】
ＤＦ又は抗体を試験試料と共にインキュベートする条件は変動する。インキュベーション条件はアッセイで使用される様式、使用される検出方法及びアッセイで使用されるＤＦ又は抗体のタイプや性質に依存する。当該技術分野の熟練者は、通常利用可能なハイブリッド形成、増幅又は免疫学的アッセイ様式の任意のものを、本発明のＤＦ又は抗体を使用するために容易に適合させ得ることを認識しているであろう。このようなアッセイの例はチャード　ティ．（Ｃｈａｒｄ，　Ｔ．）（Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ａｎｄ　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、オランダ国アムステルダム（１９８６年））；　バロック　ジー．　アール．（Ｂｕｌｌｏｃｋ，　Ｇ．Ｒ．）等（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、フロリダ州オーランド、１巻（１９８２年）、２巻（１９８３年）、３巻（１９８５年））；　ティーセン　ピー．（Ｔｉｊｓｓｅｎ，　Ｐ．）（Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、オランダ国アムステルダム（１９８５年））中に見ることができる。
【０１１０】
本発明の試験試料には細胞、細胞のタンパク質若しくは膜抽出物、又は生物学的液体、例えば痰、血液、血清、血漿若しくは尿が含まれる。上記した方法で使用される試験試料はアッセイ様式、検出方法の性質、及びアッセイすべき試料として使用される組織、細胞又は抽出物に基づいて変動する。細胞のタンパク質抽出物又は膜抽出物の調製方法は当該技術分野で周知であり、そして使用される系と適合し得る試料を得るために容易に適合させることができる。
【０１１１】
本発明のもう１つの実施態様では、本発明のアッセイを実施するのに必要な試薬を含有するキットが提供される。
詳細には、本発明は（ａ）本発明のＤＦ又は抗体の１つを含んでいる第１の容器；　及び（ｂ）１つ又はそれより多い次の試薬：　洗浄試薬、結合したＤＦ又は抗体の存在を検出し得る試薬を含んでいる１つ又はそれより多い他の容器、を含んでいる１つ又はそれより多い容器を、近接して閉じ込めて受け入れる隔室キットを提供する。
【０１１２】
詳細には、隔室キットには試薬が別々の容器に入れられている任意のキットが含まれる。このような容器には小さいガラス容器、プラスチック容器又はプラスチック片若しくは紙片が含まれる。このような容器によって、試料と試薬が互いに夾雑しないように試薬を１つの隔室からもう１つの隔室に効率的に輸送することができ、そして各容器の試薬又は溶液を１つの隔室からもう１つの隔室に定量的態様で添加することができる。このような容器には、試験試料を受け入れる容器、アッセイで使用される抗体を含有する容器、洗浄試薬（例えば、リン酸緩衝食塩液、トリス緩衝液等）を含有する容器及び結合した抗体又はＤＦを検出するために使用される試薬を含有する容器が含まれるであろう。
【０１１３】
検出試薬のタイプには、標識核酸プローブ、標識した第２の抗体、若しくは二者択一的に、第１の抗体が標識されている場合、酵素、又は標識抗体と反応し得る抗体結合試薬が含まれる。当該技術分野の熟練者は、本発明で開示されたＤＦ及び抗体が当該技術分野で周知の確立されたキット様式の１つに容易に組み込まれ得ることを容易に認識するであろう。
【０１１４】
４．結合物質のスクリーニングアッセイ
本発明の単離タンパク質を使用して、本発明は更に、本発明のＯＲＦの１つによってコードされているタンパク質又は本明細書で記載したヘモフィルス属ゲノムのフラグメントの１つと結合する物質を取得しそして同定する方法を提供する。
詳細には、上記方法は次の段階を含んでいる：
（ａ）　物質を、本発明のＯＲＦの１つによってコードされて
いる単離タンパク質又はヘモフィルス属ゲノムの単離フラグメントと接触させ；　そして
（ｂ）　上記物質が上記タンパク質又は上記フラグメントと結合するかどうかを測定する。
【０１１５】
上記アッセイでスクリーニングされる物質は、ペプチド、炭水化物、ビタミン誘導体又は他の医薬品であることができるが、これらに限定されない。これらの物質は無作為に選択しそしてスクリーニングすることができるか又はタンパク質モデル化技術を使用して合理的に選択若しくは設計することができる。
無作為スクリーニングでは、ペプチド、炭水化物、医薬品等のような物質が無作為に選択されそしてそれらが本発明のＯＲＦによってコードされているタンパク質と結合する能力についてアッセイされる。
【０１１６】
或いは、物質は合理的に選択又は設計することができる。本明細書で使用するとき、物質が特別のタンパク質の配置に基づいて選択されるとき、この物質は「合理的に選択又は設計する」と言う。例えば、当該技術分野の熟練者は現在利用可能な方法を、特異的なペプチド配列と結合し得るペプチド、医薬品等を生成するように容易に適合させて、合理的に設計された抗ペプチドペプチド（例えば、Ｈｕｒｂｙ等、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，　ＩｎＳｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，　Ａ　Ｕｓｅｒ’ｓ　Ｇｕｉｄｅ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、ニューヨーク（１９９２年）、２８９〜３０７頁、及びＫａｓｐｃｚａｋ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２８：９２３０〜９２３８（１９８９年）参照）又は医薬品等を生成させることができる。
【０１１７】
上記に加えて、広範に記載した本発明の物質の１つのクラスを使用して、本発明のＯＲＦ又はＥＭＦの１つと結合させて遺伝子発現を制御することができる。上記したように、このような物質は無作為にスクリーニングするか又は合理的に設計／選択することができる。ＯＲＦ又はＥＭＦを標的化することによって、熟練技術者は、発現制御に関して同一のＥＭＦに依存している単一のＯＲＦか又は複数のＯＲＦのどちらかの発現を調節する配列特異的又は要素特異的物質を設計することができる。
【０１１８】
ＤＮＡ結合物質の１つのクラスは、ＤＮＡ又はＲＮＡと結合することによってハイブリッドを形成するか又は三重らせん形態を形成する塩基残基を含有している物質である。このような物質は古典的なホスホジエステル、リボ核酸バックボーンに基づいていることができるか又は塩基結合能力を有する多様なスルフヒドリル若しくはポリマー誘導体であることができる。
【０１１９】
これらの方法で使用するのに適する物質は通常２０から４０塩基を有しており、そして転写に関与する遺伝子領域（三重らせん　−　Ｌｅｅ等、Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　６：３０７３（１９７９年）；　Ｃｏｏｎｅｙ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：４５６（１９８８年）；　及びＤｅｒｖａｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１：１３６０（１９９１年）参照）又はｍＲＮＡ自体（アンチセンス　−　Ｏｋａｎｏ、Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．　５６：５６０（１９９１年）；　Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｓ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ、フロリダ州ボカレートン（１９８８年））に相補的であるように設計される。三重らせん形成はＤＮＡからＲＮＡの転写を停止させ、一方アンチセンスＲＮＡハイブリッド形成はｍＲＮＡ分子のポリペプチドへの翻訳を遮断する。両技術共モデルシステムで有効であることが証明されている。本発明の配列に含まれている情報はアンチセンス又は三重らせんオリゴヌクレオチド及び他のＤＮＡ結合物質を設計するために必要である。
【０１２０】
本発明のＯＲＦの１つによってコードされているタンパク質と結合する物質は、ＯＲＦによってコードされているタンパク質の活性を調節することによって細菌感染を制御させる際に、診断薬として使用することができる。本発明のＯＲＦの１つによってコードされているタンパク質と結合する物質を既知の技術を使用して処方して、ヘモフィルス属の増殖及び感染の制御で使用する医薬品組成物を製造することができる。
【０１２１】
５．ワクチン及び医薬品組成物
本発明は更に、インフルエンザ菌又は別の関連生物の増殖をインビボ又はインビトロで調節するために使用できる医薬品を提供する。本明細書で使用するとき、「医薬品」は、医薬品組成物を提供するために既知の技術を使用して処方できる組成物として定義される。本明細書で使用するとき、「本発明の医薬品」とは、本発明のＯＲＦによってコードされているタンパク質から誘導されるか又は本明細書で記載したアッセイを使用して同定される物質である医薬品を言う。
【０１２２】
本明細書で使用するとき、医薬品が問題の生物の増殖速度、分裂速度又は生存性を減少させるとき、その医薬品は「ヘモフィルス種又は関連生物の増殖をインビボ又はインビトロで調節する」と言われる。本発明の医薬品の使用を実施するには作用の基礎になっているメカニズムを理解する必要はないが、本発明の医薬品は多数の態様で生物の増殖を調節することができる。医薬品のなかには重要なタンパク質と結合し、その結果タンパク質の生物学的活性を遮断することによって増殖を調節するものもあり、一方他の医薬品は生物の外部表面の成分と結合して付着を遮断するか又は生物が多数の天然の免疫系と一層作用し易いようにすることがある。或いは、医薬品は本発明のＯＲＦの１つによってコードされているタンパク質を含みそしてワクチンとして役立つことができる。外層膜成分、例えばＬＰＳに基づくワクチンの開発及び使用は当該技術分野で周知である。
【０１２３】
本明細書で使用するとき、「関連生物」とは、本発明の医薬品の１つによって増殖を調節し得る任意の生物を言う。一般的には、このような生物はワクチンとして使用される医薬品又はタンパク質の標的であるタンパク質の相同体を含有する。このようなものとして、関連生物は細菌である必要はなく、真菌又はウイルス病原体であることができる。
【０１２４】
本発明の医薬品及び医薬品組成物は慣用の態様で、例えば経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内又は皮内経路で投与することができる。医薬品組成物は、特定の適応症の治療及び／又は予防に有効である量で投与される。一般的に、医薬品組成物は少なくとも約１０μｇ／体重ｋｇの量で投与され、そして殆どの場合、１日当たり約８ｍｇ／体重ｋｇを超えない量で投与される。殆どの場合、投与量は、投与経路、症状等を考慮に入れて、１日当たり約１０μｇ／体重ｋｇから約１ｍｇ／体重ｋｇまでである。
【０１２５】
本発明の物質は天然形態で使用することができるか又は修飾して化学的誘導体を形成させることができる。本明細書で使用するとき、分子が通常は分子の１部ではない追加的な化学的部分を有しているとき、この分子は別の分子の「化学的誘導体」であると言われる。このような部分は分子の溶解度、吸収、生物学的半減期等を改善することができる。これらの部分は代替的に、分子の毒性を減少させ、分子の望ましくない副作用を消失させるか又は弱化させる等の可能性がある。このような効果を媒介し得る部分はレミントンのファーマシューチカルサイエンス（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（１９８０年）に開示されている。
【０１２６】
例えば、機能的誘導体の免疫学的特徴、例えば一定の抗体に対する親和性の変化は競合タイプのイムノアッセイによって測定される。免疫調節活性の変化は適当なアッセイによって測定される。酸化還元若しくは熱安定性、生物学的半減期、疎水性、タンパク質分解を受け易いこと又は担体と凝集するか若しくは多量体に凝集する傾向のようなタンパク質特性の修正は通常の技倆を有する技術者に良く知られている方法でアッセイされる。
【０１２７】
本発明の医薬品の治療効果は任意の適当な手段（即ち、吸入、静脈内、筋肉内、皮下、腸又は非経口）によって医薬品を患者に提供することによって得ることができる。生物の増殖を制御すべき血液又は組織内で有効な濃度を達成するように、本発明の医薬品を投与することが好ましい。
有効な血液濃度を達成するために好ましい方法は注射によって医薬品を投与することである。投与は連続注入又は単回若しくは多数回注射によることができる。
【０１２８】
患者に本発明の医薬品の１つを提供する際には、投与する医薬品の投与量は、患者の年齢、体重、身長、性、一般的な医学的状態、以前の医学的履歴等のような要素に従って変動するであろう。一般的には、より少ないか又はより多い投与量を投与することができるが、約１ｐｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）の範囲内の医薬品投与量を受容者に提供することが望ましい。治療的に有効な投与量は、本発明の医薬品又は他の医薬品の組合せ物を使用して少なくすることができる。
【０１２９】
本発明で使用するとき、（１）各化合物の生理学的効果か又は（２）各化合物の血清濃度のどちらかを同時に測定することができるとき、２つ若しくはそれより多い化合物又は医薬品は互いに「組み合わせて」投与されると言われる。本発明の組成物は、他の医薬品の投与と同時に、投与前に又は投与後に投与することができる。
本発明の医薬品は標的生物の増殖速度（上記で特定したような）を低下させるのに十分な量で受容被験者に提供することを意図している。
【０１３０】
本発明の医薬品（単数又は複数）の投与は「予防的」か又は「治療的」のどちらかを目的とすることができる。予防的に提供するときには、医薬品（単数又は複数）は生物増殖を示す何らかの症状に先立って提供される。医薬品（単数又は複数）の予防的投与はその後の感染開始率の防止、弱化又は低下に役立つ。治療的に提供するときには、医薬品（単数又は複数）は感染の徴候の開始時（又は直後）に提供する。化合物（単数又は複数）の治療的投与は感染の病理学的症状の弱化及び回復速度の上昇に役立つ。
【０１３１】
本発明の医薬品は製薬的に許容できる形態でそして治療的に有効な濃度で哺乳動物に投与される。組成物は、受容患者がその投与に耐えることができる場合、「製薬的に許容可能」であると言う。このような医薬品は、投与される量が生理学的に有意である場合、「治療的に有効な量」で投与されると言う。医薬品の存在によって受容患者の生理学における検出可能な変化が生じる場合、医薬品は生理学的に有意である。
【０１３２】
本発明の医薬品は製薬的に有用な組成物を調製する既知の方法に従って処方することができ、そしてその方法によってこれらの材料又はそれらの機能的誘導体は製薬的に許容可能な担体媒体と混合して組み合わせられる。他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含めて、適当な媒体及びそれらの処方は例えば、レミントンのファーマシューチカルサイエンシズ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（第１６版、Ｏｓｏｌ，　Ａ．、編集、Ｍａｃｋ、ペンシルベニア州イーストン（１９８０年））に記載されている。有効な投与に適する製薬的に許容可能な組成物を形成するために、このような組成物は有効量の１つ又はそれより多い本発明の医薬品を適量の担体媒体と一緒に含有するであろう。
【０１３３】
追加的な製薬方法を使用して作用持続を制御することができる。放出制御製剤は本発明の１つ又はそれより多い医薬品をコンプレックス化するか又は吸収するためにポリマーを使用して達成することができる。送達の制御は適当な巨大分子（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又は硫酸プロタミン）及び巨大分子の濃度並びに放出を制御するために導入する方法を選択することによって実施することができる。放出制御製剤による作用持続を制御するもう１つの考えられる方法は本発明の医薬品を、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）又はエチレンビニルアセテートコポリマーのようなポリマー材料の粒子中に導入することである。或いは、これらの医薬品をポリマー粒子中に導入する代わりに、これらの材料を、例えばコアセルベーション技術又は界面ポリマー化によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル内に、又はコロイド医薬品送達系、例えばリポソーム、アルブミン微小球体、微小エマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル又はマクロエマルジョン中に閉じ込めことができる。このような技術はレミントンのファーマシューチカルサイエンシズ（１９８０年）中に記載されている。
【０１３４】
本発明は更に、本発明の製薬組成物の１つ又はそれより多い成分を充填した１つ又はそれより多い容器を含む製薬パック又はキットを提供する。このような容器（単数又は複数）に関係があるのは、医薬品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府当局によって規定された形態の通知であり、そしてこの通知はヒトに投与するために製造、使用又は販売の当局による承認を反映している。加えて、本発明の医薬品は他の治療用化合物と一緒にして使用することができる。
【０１３５】
６．メガベースＤＮＡ配列決定に対するショットガン方法
本発明は更に、無作為ショットガン方法を使用して１メガベースより大きい配列の配列を決定できることを最初に示すものである。以下の実施例で詳細に記載されたこの方法によって、配列決定プロトコールを開始する前の重複するか又は連続したサブクローンを単離しそして順序づける前段階費用が削除された。
以下の実施例では本発明の或る種の特徴を一層詳細に記載するが、これらによって限定されるものではない。
【０１３６】
【実施例】
実施例
実験計画及び方法
１．ショットガン配列決定戦略
全ゲノムの配列決定に対するショットガン方法の戦略全体は表３に概略して示す。ショットガン配列決定の理論は、ポワソン分布の等式ｐｘ＝ｍｘｅ−ｍ／ｘ！（式中、ｘは事象発生数であり、ｍは平均発生数であり、そしてｐｘ　は、一定量の無作為配列が生じた後に与えられた塩基が配列を決定されない確率である）のランダー（Ｌａｎｄｅｒ）及びウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）（Ｌａｎｄｅｒ及びＷａｔｅｒｍａｎ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　２：２３１（１９８８年））の適用に従っている。Ｌがゲノムの長さであり、ｎが配列決定されたクローン挿入末端の数であり、そしてｗが配列決定読み取りの長さである場合には、ｍ＝ｎｗ／Ｌであり、そしてクローンが一定の塩基に先行するｗ個の塩基のいずれでも生じない確率、即ち塩基が配列決定されない確率はｐ０＝ｅ−ｍである。ｍの単位として折りたたみ範囲を使用すると、１．８Ｍｂの配列を無作為に発生させた後に、ｍ＝１であり、１Ｘ範囲を表わすことが分かる。この場合には、ｐ０＝ｅ−１＝０．３７であるので、概ね３７％が配列決定されていない。例えば５Ｘ範囲（挿入末端と平均配列読み取り長さがともに４６０ｂｐのものから概ね９５００個のクローンの配列が決定される）からｐ０＝ｅ−５＝０．００６７又は０．６７％の配列未決定が得られる。全体の］ギャップ長はＬｅ−ｍであり、平均ギャップサイズはＬ／ｎである。５Ｘ範囲は１２８のギャップを残し、平均約１００ｂｐの大きさである。この処理はランダー及びウォーターマン（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　２：２３１（１９８８年））と本質的に同じである。表４は、４６０ｂｐの平均フラグメントサイズを有する１．９Ｍｂゲノムでの範囲を示す。
【０１３７】
２．無作為ライブラリー構築
実際の配列決定中に上記した無作為モデルを概算するためには、クローン化ゲノムフラグメントのほぼ理想的なモデルが必要である。次のライブラリー構築方法はこれを達成するために開発した。
Ｈ．インフルエンザＲｄ　ＫＷ２０　ＤＮＡはフェノール抽出によって調製した。６００μｇのＤＮＡ、３００ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ　Ｎａ−ＥＤＴＡ、３０％グリセリンを含有する混合物（３．３ｍｌ）は、３ｍｍプローブを使用して１分間０℃に設定した最低エネルギーで超音波処理した（Ｂｒａｎｓｏｎ　Ｍｏｄｅｌ　４５０　Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）。ＤＮＡをエタノール沈殿させ、そしてＴＥ緩衝液５００μｌに再度溶解した。ブラント末端を作るために、１００μｌ分別物を、５単位のＢＡＬ３１ヌクレアーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）を有するＢＡＬ３１緩衝液２００μｌ中３０℃で１０分間消化した。ＤＮＡをフェノール抽出し、エタノール沈殿し、ＴＥ緩衝液１００μｌに再度溶解し、１．０％低融解アガロースゲル上で電気泳動にかけ、そして１．６〜２．０ｋｂの大きさのフラクションを切り取り、フェノール抽出し、そしてＴＥ緩衝液２０μｌに再度溶解した。２段階結合方法を使用して、＞９９％が１本鎖挿入物である９７％の挿入物を有するプラスミドライブラリーが得られた。最初の結合混合物（５０μｌ）はＤＮＡフラグメント２μｇ、ＳｍａＩ／ＢＡＰ　ｐＵＣ１８　ＤＮＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）２μｇ及びＴ４リガーゼ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）１０単位を含有しており、そしてインキュベーションは１４°で４時間であった。
【０１３８】
フェノール抽出及びエタノール沈殿後、ＤＮＡはＴＥ緩衝液２０μｌに溶解し、そして１．０％の低融解アガロースゲル上で電気泳動にかけた。大きさによって挿入物（ｉ）、ベクター（ｖ）、ｖ＋ｉ、ｖ＋２ｉ、ｖ＋３ｉ、．．．として同定された、臭化エチジウム染色線形バンドの梯子状のものを３６０ｎｍＵＶ光線で視覚化し、そしてｖ＋ｉＤＮＡを切り取り、そしてＴＥ　２０μｌ中に回収した。ｖ＋ｉＤＮＡは、ｖ＋ｉ線形物、４個の各ｄＮＴＰ　５００μＭ及びＴ４　ポリメラーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）９単位を含有する反応混合物（５０μｌ）中推奨される緩衝条件下３７℃で５分間Ｔ４　ポリメラーゼ処理してブラント末端とした。フェノール抽出及びエタノール沈殿後に、回復したｖ＋ｉ線形物をＴＥ　２０μｌに溶解した。円形物にするための最終の結合はｖ＋ｉ線形物５μｌ及びＴ４リガーゼ５単位を含有する反応物５０μｌ中１４°で一夜実施した。７０°で１０分後、反応混合物を−２０°で貯蔵した。
【０１３９】
この２段階方法によって、二重挿入キメラ（＜１％）又は遊離ベクター（＜３％）から最小限の夾雑を有する一重挿入プラスミド組換え体の分子的に無作為収集物が得られた。無作為さからの逸脱がクローニング中に最も生起しそうに思われるので、組換え及び制限機能を全て欠いている大腸菌宿主細胞（Ａ．　Ｇｒｅｅｎｅｒ、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　３（１）：５（１９９０年））を使用して、制限による再配列、欠失及びクローンの損失を防止した。形質転換細胞を抗生物質拡散プレートに直接まいて、最も迅速に増殖する細胞の増加及び選択を可能にする通常のブイヨン回復相を回避した。播種は次のようにして行った：
【０１４０】
エピキュリアン　コリ　ＳＵＲＥ　ＩＩスーパーコンピーテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ２００１５２）の分別物１００μｌを氷上で解凍し、そして氷上の冷却ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）２０５９管に移した。１．４Ｍのβ−メルカプトエタノールの分別物１．７μｌを細胞分別物に加えて２５ｍＭの最終濃度にした。細胞を氷上で１０分間インキュベートした。最終結合物の分別物１μｌを細胞に添加し、そして氷上で３０分間インキュベートした。細胞を４２°で３０秒間パルス加熱し、そして氷上に２分間戻した。任意の一定の形質転換細胞の優先的増殖を最小限にするために、液体培養物中の生育期間はこのプロトコールから除いた。その代わりに、形質転換体を、ＳＯＢ寒天（１．５％　ＳＯＢ寒天：　トリプトン２０ｇ、酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ　０．５ｇ、１．５％Ｄｉｆｃｏ　Ａｇａｒ／Ｌ）の底部層５ｍｌを含有する栄養に富むＳＯＢプレート上に直接まいた。底部層５ｍｌに０．４ｍｌのアンピシリン（５０ｍｇ／ｍｌ）／ＳＯＢ寒天１００ｍｌを補充する。ＳＯＢ寒天の上部層１５ｍｌにＸ−Ｇａｌ（２％）１ｍｌ、ＭｇＣｌ２（１Ｍ）１ｍｌ及びＭｇＳＯ４／ＳＯＢ寒天１００ｍｌの１ｍｌを補充する。上部層１５ｍｌを播種する直前に注いだ。我々の力価は概ね１００個のコロニー／形質転換分別物１０μｌであった。
【０１４１】
コロニーは全て大きさに関係なく鋳型製造用に採取した。ライブラリーからは「有毒」ＤＮＡ又は有害遺伝子産生物によって失われるクローンしか欠失せず、ギャップ数は予想されたより僅かしか増加しないであろう。
Ｈ．インフルエンザライブラリーの品質を評価するために、Ｍ１３−２１プライマーを使用して概ね４０００個の鋳型から配列データを取得した。１３００、１８００、２５００、３２００及び３８００個の配列フラグメントを取得した後に、無作為配列フラグメントを、オートアッセンブラー（登録商標）ソフトウエア（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（ＡＢ）のＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ部門）を使用して組み立て、そして組み立てられた特有の塩基対の数を決定した。上記した式に基づいて、２．５Ｘ１０６及び１．９Ｘ１０６ｂｐのゲノムについて４６０ｂｐの平均読み取り長さで得られた配列フラグメント数の関数として、配列決定されていない塩基対の数の理想的なプロットを決定した（図３）。３８００個までの配列フラグメントのアッセンブリーから得られた実際のデータを使用してアッセンブリーの進展をプロットし、そして理想的なプロットで提供されているデータと比較する（図３）。図３は、実際のアッセンブリーデータが理想的なプロットから本質的には逸脱していなかったことを示しており、我々が二重挿入物キメラによる夾雑が最小限度でありそしてベクターを有していない理想的な無作為ライブラリーと近似して構築していたことを示している。
【０１４２】
３．無作為ＤＮＡ配列決定
品質の高い二本鎖ＤＮＡプラスミド鋳型（１９，６８７）は、アドバンスト　ジェネチック　テクノロジー　コーポレーション（メリーランド州ガイザーズバーグ）と共同して開発した「沸騰ビーズ」法を使用して製造した（Ａｄａｍｓ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２：１６５１（１９９１年）；　Ａｄａｍｓ等、Ｎａｔｕｒｅ　３５５：６３２（１９９２年））。プラスミドの調製は、細菌増殖から最終ＤＮＡ精製までの全てのＤＮＡ調製段階を９６ウエル様式で実施した。鋳型濃度はヘキストダイ（Ｈｏｅｃｈｓｔ　Ｄｙｅ）及びミリポアサイトフルオル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ）を使用して測定した。ＤＮＡ濃度は調整しなかったが、可能な場合、低産生鋳型を同定しそして配列は決定しなかった。鋳型は２つのＨ．インフルエンザラムダゲノムライブラリーからも調製した。増幅ライブラリーはベクターラムダＧＥＭ−１２（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で構築し、そして非増幅ライブラリーはラムダＤＡＳＨ　ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中で構築した。特に非増幅ラムダライブラリーについては、Ｈ．インフルエンザＲｄ　ＫＷ２０　ＤＮＡ（＞１００ｋｂ）を、ＤＮＡ５０μｇ、１ＸＳａｕ３ＡＩ緩衝液、Ｓａｕ３ＡＩ　２０単位を含有する反応混合物（２００μｌ）中２３°で６分間部分的に消化した。消化したＤＮＡはフェノール抽出し、そして０．５％の低融解寒天ゲル上で２Ｖ／ｃｍで７時間電気泳動にかけた。１５から２５ｋｂのまでのフラグメントを切り取り、そして６μｌの最終容量で回収した。フラグメント１μｌは、推奨される結合反応でＤＡＳＨＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）１μｌと一緒に使用した。ギガパック（Ｇｉｇａｐａｃｋ）ＩＩ　ＸＬパッケージングエキストラクト（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、＃２２７７１１）による推奨プロトコール後のパッケージング反応当たり結合混合物１μｌを使用した。ファージは、パッケージング混合物から増幅しないで直接まいた（推奨されるＳＭ緩衝液５００μｌによる希釈及びクロロホルム処理後）。収量は約２．５×１０３　ｐｆｕ／μｌであった。増幅ライブラリーは、ラムダＧＥＭ−１２ベクターを使用したことを除いて、上記と本質的に同じようにして作成した。パッケージング後、約３．５×１０４　ｐｆｕを制限ＮＭ５３９宿主にまいた。溶解物をＳＭ緩衝液２ｍｌ中に採取し、そして７％ジメチルスルホキシド中で凍結して保存した。このファージ力価は概ね１×１０９ｐｆｕ／ｍｌであった。
【０１４３】
液体溶解物（１０ｍｌ）は、無作為に選択したプラークから調製し、そして鋳型は陰イオン交換樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）上で調製した。配列決定反応は、Ｍ１３前向き（Ｍ１３−２１）及びＭ１３逆向き（Ｍ１３ＲＰ１）プライマー（Ａｄａｍｓ等、Ｎａｔｕｒｅ　３６８：４７４（１９９４年））用のアプライド　バイオシステムズ　ＰＲＩＳＭ　レディ　リアクションダイ　プライマー　サイクル　シークェンシング　キット（Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ＤｙｅＰｒｉｍｅｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔｓ）を用いてＡＢ触媒ラブステーション（ＬａｂＳｔａｔｉｏｎ）を使用してプラスミド鋳型上で実施した。染料ダーミネーター配列決定反応は、アプライド　バイオシステムズ　レディ　リアクション　ダイ　ターミネーター　サイクル　シークェンシング　キットを使用してパーキン−エルマー　９６００サーモサイクラーでラムダ鋳型で実施した。Ｔ７及びＳＰ６プライマーを使用してラムダＧＥＭ−１２ライブラリーから得られる挿入物末端の配列を決定し、そしてＴ７及びＴ３プライマーを使用してラムダＤＡＳＨ　ＩＩライブラリーから得られる挿入物の末端の配列を決定した。ＡＢ３７３　ＤＮＡシークエンサーを１日当たり平均１４個使用して３ヵ月間配列決定反応（２８，６４３）を８人で実施した。配列決定反応は全て、ＡＢ　３７３のストレッチ修飾を使用し、そして主として３４ｃｍのウエル対読み取り距離を使用して分析した。全体の配列決定成功率はＭ１３−２１配列に対しては８４％、Ｍ１３ＲＰ１配列に対しては８３％、そして染料ターミネーター反応に対しては６５％であった。平均使用可能読み取り長さはＭ１３−２１配列については４８５ｂｐであり、Ｍ１３ＲＰ１配列については４４４ｂｐであり、そして染料ターミネーター反応については３７５ｂｐであった。表５は本発明の高い処理量の配列決定相を要約するものである。
【０１４４】
リチャード（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）等（Ｒｉｃｈａｒｄｓ等、Ａｕｔｏｍａｔｅｄ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ａｎｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｍ．Ｄ．　Ａｄａｍｓ、Ｃ．　Ｆｉｅｌｄｓ、Ｊ．Ｃ．　Ｖｅｎｔｅｒ、編集（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、ロンドン、１９９４年）、２８章）は、ラムダ及びコスミドクローンのショットガンアッセンブリープロジェクトで連続物整列を促進する配列決定鋳型の両末端から得られる配列を使用すること価値を記載している。我々は、Ｍ１３−２１（前向き）プライマーと比較してＭ１３ＲＰ１（逆向き）で実施した配列決定反応でのより短い読み取り長さに対する両末端配列決定の望ましさ（鋳型総数の減少による費用減少を含めて）を比較衡量した。概ね鋳型の半分が両末端から配列決定された。合計で、９，２９７のＭ１３ＲＰ１配列決定反応を実施した。無作為逆向き配列決定反応は成功した前向き配列決定反応に基づいて実施された。幾つかのＭ１３ＲＰ１配列は半方向づけ態様で得られた：　連続物の末端で外方向を指しているＭ１３−２１配列は特に連続物を整列させる努力でＭ１３ＲＰ１配列決定用に選択した。半方向づけ戦略は有効であり、そしてクローンに基づく整列はアッセンブリーとギャップ閉じの統合部分を形成した（以下参照）。
【０１４５】
４．自動サイクル配列決定用プロトコール
配列決定は８つのＡＢＩカタリスト（Ｃａｔａｌｙｓｔ）ロボット及び１４のＡＢ　３７３　自動ＤＮＡシークエンサーを使用することからなっていた。カタリストロボットは、ＤＮＡの配列決定反応用に特別に開発された公に入手できる精巧なピペット化及び温度制御ロボットである。このカタリストは予め分別した鋳型と、デオキシヌクレオチド及びジデオキシヌクレオチド、Ｔａｑ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、蛍光標識配列決定プライマー及び反応緩衝液からなる反応混合物を組み合わせている。反応混合物と鋳型はアルミニウムの９６ウエル熱サイクルプレートのウエル内で一緒に組み合わせた。変性、プライマーと鋳型のアニーリング及びＤＮＡ合成の伸長を含む直線的増幅（例えば、１プライマー合成）の３０回連続サイクル段階を実施した。熱循環プレート上のゴムガスケット付き加熱蓋は蒸発を防止し、油を上塗りする必要はなかった。
【０１４６】
２つの配列決定プロトコールを使用した：　染料標識プライマーと染料標識ジデオキシチェインターミネーター。ショットガン配列決定法は４つのターミネーターヌクレオチドの各々について１つずつの、４つの染料標識配列決定プライマーの使用に係わるものである。各染料−プライマーは異なる蛍光染料で標識されており、４つの個々の反応を電気泳動、検出及び塩基呼出しのために３７３ＤＮＡシークエンサーの１つのレーン中に組み合わせることができる。ＡＢは現在、予め混合した反応混合物を、配列決定に必要な全ての非鋳型試薬を含有するバルクパッケージで供給している。プラスミド鋳型によって一般的にはより長い使用可能な配列が得られるが、配列決定はプラスミドと、厳密性が概ね同等の染料−プライマーと染料−ターミネーターの両方を有するＰＣＲ発生鋳型の両方を用いて実施することができる。
【０１４７】
合計９６０個の試料について、３７３　シークエンサー当たり３２の反応を毎日行った。電気泳動は製造者のプロトコールに従って夜間に実施し、そしてデータを１２時間集めた。電気泳動及び蛍光検出後に、ＡＢ　３７３は自動レーントラッキング及び塩基呼出しを実施する。レーントラッキングは視覚的に確認された。各配列のエレクトロフェログラム（又は蛍光レーントレース）は視覚的に点検しそして品質について評価した。低品質配列を追跡して取り出し、そしてその配列自体をソフトウエアによってＳｙｂａｓｅデータベースに入れた（８ｍｍテープに毎日保管した）。リーディングベクターポリリンカー配列はソフトウエアプログラムで自動的に取り除いた。標準ＡＢＩ３７３から編集した平均配列長さは４００ｂｐ位であり、そしてこれは大部分、配列決定反応用に使用した鋳型の品質に依存していた。ＡＢＩ３７３シークエンサーは全てストレッチライナーズ（Ｓｔｒｅｔｃｈ　Ｌｉｎｅｒｓ）に変換し、そしてこれによって蛍光検出前により長い電気泳動通路が提供され、その結果使用可能な塩基の平均数は５００〜６００ｂｐに増加した。
【０１４８】
情報科学
１．データ管理
大規模配列決定研究室（ｌａｂ）用の多数の情報管理システムが開発されている（Ｋｅｒｌａｖａｇｅ等、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｔｗｅｎｔｙ−Ｓｉｘｔｈ　Ａｎｎｕａｌ　Ｈａｗａｉｉ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＩＥＥＥ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、ワシントンＤ．Ｃ．、５８５（１９９３年））。配列データを集めそして組み立てるために使用されるこのシステムはＳｙｂａｓｅ関連データ管理システムを使用して開発され、そしてできるだけデータの流れを自動化して使用者のエラーを減少させるように設計された。データベースは、鋳型調製からゲノムの最終分析までの全操作中に集められた全ての情報を保存しそして相互に関連させている。ＡＢ３７３シークエンサーの生アウトプットはマッキントッシュプラットフォームに基づいており、そして選択されたデータ管理システムはユニックスプラットフォームに基づいていたので、生データ並びに分析結果を最小限の使用者の努力でデータベース中に継ぎ目なく流すようにできる多様な多数の使用者、依頼者のサーバーアプリケーションを設計しそして実行することが必要であった。大きい配列の組み立てや管理に使用するソフトウエアプログラムの説明は図４に提供する。
【０１４９】
２．組み立て
組み立てエンジン（ＴＩＧＲ　Ａｓｓｅｎｂｌｅｒ）は数千の配列フラグメントを迅速且つ正確に組み立てるために開発された。ＡＢ　オートアッセンブラー（商標）を、ＴＩＧＲアセンブラーの整列配列ファイルアウトプットと関連したデータ編集の目的でエレクトロフェログラムにグラフィックインターフェースを提供するように修正した（そしてＴＩＧＲ　Ｅｄｉｔｏｒと呼ばれる）。ＴＩＧＲエディター（Ｅｄｉｔｏｒ）はマッキントッシュプラットフォームのエレクトロフェログラムファイルとユニックスプラットフォームのインフルエンザ菌データベース中の配列データ間の同時性を維持している。
【０１５０】
ＴＩＧＲアセンブラーはゲノムのフラグメントを同時に集めそして組み立てる。１０４個より多いフラグメントを組み立てるのに必要な速度を得るために、アルゴリズムによって１０ｂｐのオリゴヌクレオチド配列の寄せ集め表を作って配列フラグメント重複表を作成した。各フラグメントの可能性のある重複数は、どのフラグメントが反復要素中に入ると思われるのかを決定する。単一の種配列フラグメントで開始して、ＴＩＧＲアセンブラーはオリゴヌクレオチド含有量に基づいて最良の適合フラグメントを加えるように試みることによって最新連続物を伸長する。最新連続物及び候補フラグメントは、最適のギャップ整列を提供するスミス・ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズム（Ｗａｔｅｒｍａｎ，　Ｍ．Ｓ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１６４：７６５（１９８８年））の修正版を使用して整列される。最新連続物は適合の品質に関する厳密な規準が満たされている場合にだけフラグメントによって伸長される。適合規準には最小限の重複の長さ、最大限の非適合末端の長さ及び最小限の適合割合が含まれる。これらの規準は、最小限範囲の領域ではアルゴリズムによって自動的に低下し、そして考えられる反復要素を有する領域内では上昇する。各フラグメントの可能性のある重複数は、どのフラグメントが反復要素中に入ると思われるのかを決定する。反復要素と潜在的にキメラであるフラグメントの境界を表わすフラグメントはしばしば、整列末端の部分的不適合に基づいて拒絶され、そして最新連続物から除かれる。ＴＩＧＲアセンブラーは各鋳型の両末端からの配列決定と一緒にクローンの大きさの情報を利用するように設計されている。これによって、同一の鋳型の２つの末端から得られる配列フラグメントが連続物内で互いに向き合っておりそして一定の塩基対整列（与えられたライブラリーに関して、既知のクローンの大きさ範囲に基づいて各クローンで特定可能な）内に位置しているという制約が強制される。インフルエンザ菌の２４，３０４個の配列フラグメントの組み立てには、５１２ＭｂのＲＡＭを有するＳＰＡＲＣｅｎｔｅｒ　２０００の１つのプロセッサーを使用して、３０時間のＣＰＵ時間が必要であった。この方法で概ね２１０個の連続物が得られた。ＴＩＧＲアセンブラーの厳密度が高いため、ｇｒａｓｔａ（修正されたｆａｓｔａ（Ｐｅｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　８５：２４４４（１９８８年）））を使用して全ての連続物を互いに検索した。このようにして、１４０個の連続物中にセットされたデータの要約を可能にする重複を更に検出した。連続物内の各フラグメントの位置及びコンセンサス配列自体に関する広範な情報をインフルエンザ菌関連データベースに入れた。
【０１５１】
３．組み立てられた連続物の整列
組み立て後、１４０個の連続物の相対的な位置は知られていなかった。これらの連続物はａｓｍ　ａｌｉｇｎによって整列させた。ａｓｍ　ａｌｉｇｎは互いに隣接する連続物を同定しそして整列させるために多数の関係を使用する。このアルゴリズムを使用して、１４０個の連続物を４２の群に入れ、合計して４２の物理的ギャップ（この領域の鋳型ＤＮＡがない）と９８の配列ギャップ（ギャップを埋めるために鋳型が利用できる）となった。
【０１５２】
物理的ギャップによって分離された連続物を整列させそしてギャップを埋める
物理的ギャップで分離された連続物を整列させるために４つの統合戦略を開発した。オリゴヌクレオチドプライマーを設計しそして各連続物群の末端から合成した。それ故、これらのプライマーは以下に概略する１つ又はそれより多い戦略で使用するためにを使用することができた：
１．　上記オリゴヌクレオチドの７２のサブセットについて固有の「フィンガープリント」を発生させるためにサザン分析を行った。この方法は、隣接連続物の末端と相同の標識オリゴヌクレオチドが共通のＤＮＡ制限フラグメントとハイブリッドを形成し、そしてその結果類似するか若しくは同一のハイブリッド形成パターン又は「フィンガープリント」を共有するという仮定に基づいていた。オリゴヌクレオチドは５０ｐｍｏｌの各２０量体及び２５０ｍＣｉの［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ並びにＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して標識した。標識したオリゴヌクレオチドは、セファデックスＧ−２５スーパーファイン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して精製し、そして１つの頻繁に使用されるカッター（ＡｓｅＩ）と５つの頻繁には使用されないカッター（ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＸｂａＩ及びＰｖｕＩＩ）で消化したインフルエンザ菌Ｒｄ染色体ＤＮＡのサザンハイブリッド分析で各々１０７ｃｐｍのオリゴヌクレオチドを使用した。各消化物から得られるＤＮＡを０．７％アガロースゲルで分画し、そしてニトランプラス（Ｎｙｔｒａｎ　Ｐｌｕｓ）ナイロン膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　Ｓｃｈｕｅｌｌ）に移した。ハイブリッド形成は４０°で１６時間実施した。非特異的シグナルを除去するために、各ブロットを室温で、緊縮度条件を０．１ＸＳＳＣ＋０．５％ＳＤＳにまで高め乍ら連続洗浄した。ブロットをホスホルイメージャー（ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ）カセット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ）に数時間暴露し、そしてハイブリッド形成パターンを視覚的に比較した。
このようにして同定された隣接連続物を特異的ＰＣＲ反応の標的とした。
【０１５３】
２．　ペプチド結合はペプチドデータベースに対してｂｌａｓｔｘ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　２１５：４０３（１９９０年））を使用して各連続物端の検索を行った。２つの連続物の末端が適当な方法で同じデータベース配列に適合していた場合には、これら２つの連続物は違いに隣接していると暫定的に考えた。
【０１５４】
３．　インフルエンザ菌ゲノムＤＮＡから構築された２つのラムダライブラリーは、連続物群の末端から設計したオリゴヌクレオチドで探索した（Ｋｉｒｋｎｅｓｓ等、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　１０：９８５（１９９１年））。次に、陽性プラークを使用して鋳型を作成し、そしてラムダクローン挿入物の各末端から配列を決定した。これらの配列フラグメントは全ての連続物のデータベースに対してｇｒａｓｔａを使用して検索した。同じラムダクローンの反対末端から得られる配列に適合する２つの連続物を整列させた。次いで、このラムダクローンによって隣接連続物間の配列ギャップを埋めるための鋳型が提供された。ラムダクローンは反復構造を解読するのに特に価値がある。
【０１５５】
４．　他の方法によって見い出された連続物の整列を確認しそして整列していない連続物の順番を確立するために、標準的で且つ範囲の長い（ＸＬ）ＰＣＲ反応を次のようにして実施した。
標準的なＰＣＲは次のようにして実施した。各反応は混合物３７μｌ；　Ｈ２Ｏ　１６．５μｌ、２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２　３μｌ、ｄＮＴＰミックス（１．２５ｍＭの各ｄＮＴＰ）８μｌ、１０Ｘ　ＰＣＲコア緩衝液ＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）４．５μｌ、インフルエンザ菌Ｒｄ　ＫＷ２０ゲノムＤＮＡ　２５ｎｇを含んでいた。適当な２つのプライマー（４μｌ、３．２ｐｍｏｌｅ／μｌ）を各反応に加えた。ホットスタートは９５°で５分間、続いて７５°で維持して実施した。維持している間に、Ｈ２Ｏ　４．３μｌ、１０Ｘ　ＰＣＲコア緩衝液ＩＩ　０．５μｌ中のアンプリタク（Ａｍｐｌｉｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）０．３μｌを各反応に加えた。ＰＣＲプロフィールは、９４°／４５秒の変性；　５５°／１分のアニーリング；　７２°／３分の伸長の２５回サイクルであった。反応は全て、パーキンエルマー　ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲシステム９６００で９６ウエル様式で実施した。
【０１５６】
長い範囲のＰＣＲ（ＸＬ　ＰＣＲ）は次のようにして実施した：　各反応は混合物３５．２μｌ；　Ｈ２Ｏ　１２．０μｌ、２５ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）２　２．２μｌ、ｄＮＴＰミックス（２００μＭの最終濃度）４μｌ、３．３Ｘ　ＰＣＲ緩衝液　１２．０μｌ、インフルエンザ菌Ｒｄ　ＫＷ２０ゲノムＤＮＡ　２５ｎｇを含んでいた。適当な２つのプライマー（５μｌ、３．２ｐｍｏｌｅ／μｌ）を各反応に加えた。ホットスタートは９４°で１分間で実施した。各反応に、３．３Ｘ　ＰＣＲ緩衝液ＩＩ　２．８μｌ中２．０μｌのｒＴｔｈポリメラーゼ（４Ｕ／反応）を加えた。ＰＣＲプロフィールは、９４°／１５秒の変性；　６２°／８分のアニーリング及び伸長の１８回のサイクル、続いて９４°／１５秒の変性；　６２°／８分（１サイクル当たり１５秒増加）のアニーリング及び伸長の１２回のサイクル；　７２°／１０分の最終伸長であった。反応は全て、パーキンエルマーＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲシステム９６００で９６ウエル様式で実施した。
【０１５７】
ＰＣＲ反応は本質的に物理的ギャップ末端の組合せ毎に実施したが、互いに隣接する連続物を整列させそしてギャップを完全に埋めるために必要なコンビナトリーＰＣＲ反応数を減少させるためには、サザンフィンガープリント法、データベース適合化及び大きい挿入物クローン探索のような技術が特に価値があった。これらの戦略をより大規模に将来のゲノムプロジェクトに使用しても完全にゲノムを埋める全体的な有効性が高められるであろう。これらの各技術によって整列させられそして埋められる物理的ギャップの数は表５に要約する。
【０１５８】
１５〜２０ｋｂのクローン末端から得られる配列情報はギャップを埋め、反復構造を解明し、そして全体的なゲノム組立ての一般的な情報を提供するのに特に適している。我々はまた、インフルエンザ菌ゲノムのフラグメントのなかには大腸菌の高コピープラスミド中でクローン化できないものがあることにも関心があった。我々は、溶解性ラムダクローンがこれら断片のＤＮＡを提供すると考えた。増幅したラムダライブラリー、作成された鋳型及び各末端から得られた配列情報から概ね１００個の無作為プラークを集めた。これらの配列を連続物に対して検索し（ｇｒａｓｔａ）、そしてデータベースでそれらの適当な連続物と結合し、そしてその結果ゲノムアセンブリーの正確さを更に支持するのに寄与するラムダクローンの足場が提供された（図５）。連続構造の確認に加えて、ラムダクローンは２３の物理的ギャップを埋めた。ゲノムの概ね７８％がラムダクローンによってカバーされた。
【０１５９】
ラムダクローンは反復構造の解明にも有用であった。ゲノム中で同定された反復構造は、６個のリボソームＲＮＡオペロン及び長さ５，３４０ｂｐの１個の反復（２コピー）を除いて、無作為挿入物ライブラリーから得られる単一クローンで埋めることができるほど十分に小さかった。オリゴヌクレオチドプローブは各反復の初めの特有の側部から設計しそしてラムダライブラリーとハイッブリッドを形成させた。各側部について陽性プラークを同定しそして各クローンの末端から得られる配列フラグメントを使用してゲノム内の反復を正しく方向づけた。
【０１６０】
インフルエンザ菌の６個のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）オペロン（１６Ｓサブユニット−２３Ｓサブユニット−５Ｓサブユニット）を識別できそして組み立てることができるかどうかが、かなりの数の反復領域を有していると思われる複雑なゲノムの配列を決定しそして組み立てるための我々の全体的な戦略の試験であった。高度の配列類似性及び６個のオペロンの長さによって、基礎になっている全ての配列を識別不能な２，３の連続物に集める組み立て方法が得られた。配列内でのオペロンの正しい配置を決定するために、それぞれについて１対の特有の側部配列が必要であった。左（１６Ｓ　ｒＲＮＡ）末端には特有の側部配列は全く見ることができなかった。この領域はリボソームプロモーターを有しており、そして高コピー数ｐＵＣ１８プラスミド中でクローン化できないように思われた。しかし乍ら、特有の配列は右（５Ｓ）末端で確認することができた。オリゴヌクレオチドプライマーはこれらの６個の側部領域から設計しそして２つのラムダライブラリーを提案するために使用した。６個の各ｒＲＮＡオペロンについて、ｒＲＮＡオペロンを完全に埋めそして１６Ｓ及び５Ｓ末端に特有の側部配列を有する少なくとも１個の陽性プラークが確認された。これらのプラークは、特有の配列を得る鋳型を６個のｒＲＮＡオペロンの各々に提供した。
【０１６１】
組み立てた円形ゲノムの全体的構造の更なる配置は、酵素ＡｐａＩ、ＳｍａＩ及びＲｓｒＩＩについて組み立てた配列に基づくコンピューター発生制限マップをレッドフィールド（Ｒｅｄｆｉｅｌｄ）及びリー（Ｌｅｅ）（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｐｓ：　ｌｏｃｕｓ　ｍａｐｓ　ｏｆ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｇｅｎｏｍｅｓ、Ｓ．Ｊ．　Ｏ’Ｂｒｉｅｎ編集、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州ニューヨーク、１９９０年、２１１０）の予測物理的マップと比較することによって得られた。配列から誘導されたマップの制限フラグメントは物理的マップから得られたものと大きさ及び相対的順序が一致していた（図５）。
【０１６２】
編集
ＡＢオートアッセンブラー（登録商標）及びファーストデータファインダー（Ｆａｓｔ　Ｄａｔａ　ＦｉｎｄｅｒＴＭ）ハードウエアを使用して連続物の重複１０ｋｂ断片を組み立てることによって視覚的に編集した。オートアッセンブラー（登録商標）は編集用にエレクトロフェログラムデータにグラフィックインターフェースを提供する。エレクトロフェログラムデータを使用して各位置に最も可能性のある塩基を割り当てた。相違点を解決できなかったか又は明確な割り当てを行えなかった場合、自動塩基呼出しは変更しなかった。個々の配列の変更はエレクトロフェログラムファイルに書き込みそして複製プロトコール（ｃｒａｓｈ）を使用してインフルエンザ菌データベースとエレクトロフェログラムファイル間の配列データの同時性（同一性？）を維持した。編集後、注釈を付ける前にＴＩＧＲアセンブラーヲ用いて連続物を再度組み立てた。
【０１６３】
ゲノムに注釈を付ける途中に確認された潜在的フレームシフトはデータベースのレポートとして省いた。これらのレポートには、整列ソフトウエア（ｐｒａｚｅ）が逸失又は挿入塩基の最も可能性のある市であると予測する連続物の組合せ及びフレームシフトを含む配列整列の表示が含まれる。明らかなフレームシフトは、更に編集する必要があると思われる配列の領域を示すために使用した。フレームシフトは、明白なエレクトロフェログラムデータがフレームシフトと一致しない場合にも訂正しなかった。フレームシフトの編集はＴＩＧＲエディター（Ｅｄｉｔｏｒ）を用いて実施した。
ｒＲＮＡ及び他の反復領域はＴＩＧＲアセンブラーによる円形ゲノムの完全な組み立てを妨げた。ゲノムの最終的な組み立ては、短い重複に基づいて複数の連続物を一緒に継ぎ合わせるｃｏｍｂ　ａｓｍを使用して達成された。
【０１６４】
ゲノム配列の正確さ
インフルエンザ菌ゲノム配列の正確さは、これまでに同定されたインフルエンザ菌配列が非常に少なくそしてこれら配列の大部分が他の種のものであるため、定量することが困難である。しかし乍ら、データに適用することができる３つの正確さパラメーターが存在している。第１は、データベースの類似性に基づいて、予測されるインフルエンザ菌遺伝子の明白なフレームシフトの数は１４８である。これらの明白なフレームシフトの幾つかはは、特に、４９の明白なフレームシフトが他の生物から得られる仮定のタンパク質に対する適合に基づいているということを考慮すると、我々の配列中にあるというよりはむしろデータベース配列中にあると思われる。第２に、ゲノム中にはＮとして曖昧なままの塩基が１８８個がある（１／９，７３５ｂｐ）。これら２つのタイプの「知られている」エラーを組み合わせると、我々は９９．９８％の最大配列正確度を計算することができる。平均範囲は６．５Ｘであり、そしてゲノムの１％は１倍の範囲である。
【０１６５】
遺伝子の同定
インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの全てのコード化領域を予測しそして遺伝子、ｔＲＮＡ及びｒＲＮＡ並びにＤＮＡ配列の他の特徴（例えば、反復、調節部位、複製、起源部位、ヌクレオチド組成）を同定する試みを行った。容易に明白は配列特徴の幾つかの説明以下に提供する。
インフルエンザ菌Ｒｄゲノムは１，８３０，１２１ｂｐの円形染色体である。全体的なＧ／Ｃヌクレオチドの含有量は概ね３８％（Ａ＝３１％、Ｃ＝１９％、Ｇ＝１９％、Ｔ＝３１％、ＩＵＢ＝０．０３５％）である。ゲノムのＧ／Ｃ含有量は全体的な構造特徴を探すために幾つかの長さのウインドウで調べた。５，０００ｂｐのウインドウでは、Ｇ／Ｃの含有量は、７ラージＧ／Ｃに富む領域及びＡ／Ｔに富む領域を除いて比較的均等である（図５）。Ｇ／Ｃに富む領域は６個のｒＲＮＡオペロン及び不可解なミュー様プロファージの位置に対応する。バクテリオファージミューによってコードされるタンパク質と類似性を有する幾つかのタンパク質の遺伝子はゲノムの概ね１．５６〜１．５９Ｍｂｐの位置に位置している。ゲノムのこの領域はインフルエンザ菌の平均より顕著に高いＧ／Ｃ含有量を有している（ゲノムの残りの領域の約３８％と比較して約５０％のＧ／Ｃ）。Ａ／Ｔに富む領域の原因又は重要性については有意性は未だ確認されていない。
【０１６６】
大腸菌の最小複製起源（ｏｒｉＣ）は、１つの末端のＧＡＴＣコア配列を含有する１３塩基対の反復の３個のコピー及び他の末端のＴＩＡＴコア配列を含有する９塩基対の反復の４個のコピーによって特定される２４５ｂｐ領域である。ＧＡＴＣ部位はメチル化標的及び制御複製であり、一方ＴＩＡＴ部位はＤｎａＡの結合部位を提供し、複製プロセスの最初の段階である（Ｇｅｎｅｓ　Ｖ，Ｂ．　Ｌｅｗｉｎ編集（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９４年）、１８〜１９章）。限界がこれらの同じコア配列によって特定されている概ね２８１ｂｐの配列（６０２，４８３〜６０２，７６４）はインフルエンザ菌Ｒｄで複製起源を特定しているように思われる。これらのコーディネートはリボソームオペロンの組合せｒｒｎＦ、ｒｒｎＥ、ｒｒｎＤとｒｒｎＡ、ｒｒｎＢ、ｒｒｎＣ間に存在する。リボソームオペロンのこれら２つの群は反対方向に転写されそして起源の置換がそれらの転写の極性と一致する。大腸菌複製の終結は、２つの複製フォークが出会う中間点の一方の側の約１００ｂｐに配置された２つの２３ｂｐ終止配列によって示される。大腸菌の終止配列と１０ｂｐコア配列を共有する２つの潜在的終止配列はインフルエンザ菌ではコーディネート１，３７５，９４９〜１，３７５，９５８及び１，５５８，７５９〜１，５５８，７６８で同定された。これら２つの組のコーディネートは、提案されたインフルエンザ菌の複製起源の１８０°反対の点から概ね１００ｋｂをカバーする。
【０１６７】
６個のｒＲＮＡオペロンが同定された。各ｒＲＮＡオペロンは３つのｒＲＮＡサブユニット及び種々のスペーサー領域を次の順序で含有している：　１６Ｓサブユニット　−　スペーサー領域　−　２３Ｓサブユニット　−　５Ｓサブユニット。これらのサブユニットの長さはそれぞれ１５３９ｂｐ、２６５３ｂｐ及び１１６ｂｐである。これら３つのリボソームサブユニットのＧ／Ｃ含有量（５０％）はゲノムより全体として多い。スペーサー領域のＧ／Ｃ含有量（３８％）はゲノムの残りと一致する。３つのｒＲＮＡサブユニットのヌクレオチド配列は６つのリボソームオペロンの全てで１００％同一である。ｒＲＮＡオペロンは、１６Ｓ配列と２３Ｓ配列間のスペーサー領域に基づいて２つのクラスに分類することができる。２つのスペーサー領域のうちより短いものは長さが４７８ｂｐであり（ｒｒｎＢ、ｒｒｎＥ及びｒｒｎＦ）そしてｔＲＮＡ　Ｇｌｕの遺伝子を含んでいる。より長いスペーサーは長さが７２３ｂｐであり（ｒｒｎＡ、ｒｒｎＣ及びｒｒｎＤ）そしてｔＲＮＡ　Ｉｌｅ及びｔＲＮＡ　Ａｌａの遺伝子を含んでいる。これら２つのスペーサー領域の組も３つのオペロンの各群で１００％同一である。ｔＲＮＡ遺伝子はまた、２つのｔＲＮＡオペロンの１６Ｓ及び５Ｓ末端にも存在している。ｔＲＮＡ　Ａｒｇ、ｔＲＮＡ　Ｈｉｓ及びｔＲＮＡ　Ｐｒｏの遺伝子はｒｒｎＥの１６Ｓ末端に位置しており、一方ｔＲＮＡ　Ｔｒｐ及びｔＲＮＡ　Ａｓｐの遺伝子はｒｒｎＡの５Ｓ末端に位置している。
【０１６８】
インフルエンザ菌のゲノムの予測されたコード化領域は最初、ジーンバンクの１２２個のインフルエンザ菌コード化配列から誘導されるコドン頻度マトリックスを使用してプログラムジーンマーク（Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ及びＭｃＩｎｉｎｃｈ、Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ　Ｃｈｅｍ．　１７（２）：１２３（１９９３年））でコード化能を評価して特定した。予測されたコード領域配列（プラス３００ｂｐの側部配列）は、注釈を付けるために特に作られた非冗長細菌タンパク質（ＮＲＢＰ）のデータベースの検索で使用された。ＤＮＡコード化領域は全てジーンバンクから引き出し（リリース８５）、そして同一種から得られた配列を互いに検索した。＞１００個のヌクレオチドの領域に亘って＞９７％の類似性を有する配列を組み合わせた。更に、配列を翻訳させ、そしてスイスプロット（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）の全ての配列（リリース３０）とのタンパク質比較で使用した。同じ種に属しそして３３個のアミノ酸に亘って＞９８％の類似性を有する配列を組み合わせた。ＮＲＢＰは１，０９９の異なる種から得られた２３，７５１個のジーンバンク配列と１１，１８３個のスイスプロット配列から引き出された２１，４４５個の配列から構成されている。
【０１６９】
合計１，７４９の構成予測コード化領域が同定された。インフルエンザ菌の予測コード化領域の検索は、ＮＲＢＰを検索するために３つの付加鎖（ストランド）読み取り枠内の疑問ＤＮＡ配列を翻訳し、疑問配列に適合するタンパク質配列を同定し、そしてｐｒａｚｅを使用してタンパク質−タンパク質の適合を整列させるアルゴリズム、即ち修正スミス・ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）（Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　８５：２４４４（１９８８））アルゴリズムを使用して実施した。ＤＮＡ配列内の挿入又は欠失によってフレームシフトエラーが生じた場合には、整列アルゴリズムは最大類似性の領域で開始し、そして３００ｂｐの側部領域を使用して別のフレームで同じデータベース適合に整列を伸長した。フレームシフトエラーを含んでいることが知られている領域はデータベースで省きそして修正の可能性について評価した。同定されなかった予測コード化領域及び残りの遺伝子間配列はスイス・プロット、ＰＩＲ及びジーンバンクから入手できる全てのペプチド配列のデータセットを検索した。オペロン構造の同定は転写プロモーター及び終結部位の実験的測定によって促進されるであろう。
【０１７０】
推定して同定した各インフルエンザ菌遺伝子は、リレイ（Ｒｉｌｅｙ）（Ｒｉｌｅｙ，　Ｍ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　５７（４）：８６２（１９９３年））から適合させた１０２の生物学的役割カテゴリーの１つに割り当てた。割り当ては、予測コード化領域のタンパク質配列をリレイデータベース中のスイス・プロット配列と関連させて実施した。１，７４９の予測コード化領域のうち７２４は役割を割り当てられていない。これらのうち、３８４についてはデータベース適合が見い出されず、一方３４０はデータベースの「仮定上のタンパク質」に適合した。役割割り当ては予測コード領域の１，０２５で行われた。予測コード化領域の編集、それらの特有の識別物、３文字遺伝子識別記号、同一性パーセント、類似性パーセント及びアミノ酸適合長さは表１（ａ）に示す。
【０１７１】
インフルエンザ菌Ｒｄの注釈を付けた完全なゲノムマップは図６〜４５に示す。このマップは各予測コード化領域をインフルエンザ菌染色体上に置き、その転写方向を示し、そして色はその役割割り当てを暗号化している。役割割り当ては図５にも示す。
インフルエンザ菌Ｒｄの遺伝子及び遺伝子染色体機構を調査すると代謝過程の説明が可能になる。インフルエンザ菌は自由な生存生物として生き残るために、実験室で増殖するための栄養要求及び、特にその病原性やビルレンス（菌力）に関連するような他の生物と異なるようになる特徴を必要とする。ゲノムは生命にとって必須であることが知られている或るクラスの遺伝子の完全な補体を有していると期待されるであろう。例えば、インフルエンザ菌データベースの潜在的相同体と大腸菌リボソームの発表されたタンパク質配列は一対一で対応している。同様に、表１（ａ）に示されるように、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは各アミノ酸についてゲノム内に存在している。最後に、ｔＲＮＡ遺伝子の位置をゲノム上にマップした。代表的な２０種のアミノ酸を含めて５４の同定されたｔＲＮＡ遺伝子がある。
【０１７２】
自由な生存生物として生き残るためにインフルエンザ菌は発酵及び／又は電子輸送によってエネルギーをＡＴＰの形態で生じさせなければならない。偶発的嫌気性生物として、インフルエンザ菌Ｒｄはグルコース、フルクトース、ガラクトース、リボース、キシロース及びフコースを発酵することが知られている（Ｄｏｒｏｃｉｃｚ等、Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１７５：７１４２（１９９３年））。表１（ａ）で確認される遺伝子は、ホスホエノールピルビン酸−ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）及び非ＰＴＳメカニズムによるこれら糖類の取込みに輸送系を利用できることを示している。ＰＴＳ系の共通のホスフェート担体酵素Ｉ及びＨｐｒ（ｐｔｓＩ及びｐｔｓＨ）を特定する遺伝子並びにグルコース特異性ｃｒｒ遺伝子が同定された。ｐｔｓＩ、ｐｔｓＨ及びｃｒｒ遺伝子はｐｔｓオペロンを構成する。しかし乍ら、我々は膜結合グルコース特異的酵素ＩＩを同定していない。後者の酵素はＰＴＳ系でのグルコース輸送に必要である。フルクトースの完全なＰＴＳ系が同定された。
【０１７３】
完全な解糖系及び発酵最終生成物の産生をコードする遺伝子が同定された。増殖利用嫌気性呼吸メカニズムは、硝酸塩、亜硝酸塩及びジメチルスルホキシドのような無機電子受容体を使用して機能的電子輸送系をコードしている遺伝子を同定することによって見い出された。トリカルボン酸（ＴＣＡ）回路の３つの酵素をコードしている遺伝子はゲノムにはないように思われる。クエン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ及びアコルドターゼ（ａｃｏｒｄｔａｓｅ？アコニット酸ヒドラターゼのことか）は予測コード化領域を検索するか又は大腸菌酵素を翻訳における全ゲノムに対するペプチド照会として使用しても見い出されなかった。これは、特定された培養培地で要求される非常に高いグルタミン酸塩値（１ｇ／Ｌ）の説明を提供している（Ｋｌｅｉｎ及びＬｕｇｉｎｂｕｈｌ、Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　１１３：４０９（１９７９年）。グルタミン酸塩は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼによってアルファ−ケトグルタレートに変換することによってＴＣＡ回路に向けることができる。完全なＴＣＡ回路がない場合、グルタミン酸塩は多分、ＴＣＡ回路から分岐するプリカーサーを使用することによってアミノ酸の生合成の炭素源として役立つ。機能的な電子輸送系は、最終電子受容体として酸素を使用してＡＴＰの産生に利用することができる。
【０１７４】
これまでに答えられなかった病原性及びビルレンスに関する問題は、癒着及びリポオリゴ糖発生遺伝子のような或るクラスの遺伝子を試験することによって取り扱うことができる。モキソン（Ｍｏｘｏｎ）及び共同研究者（Ｗｅｉｓｅｒ等、Ｃｅｌｌ　５９：６５７（１９８７年））は、これらのビルレンス関連遺伝子が縦に並んだ四量体反復を含んでおり、そしてこの反復は複製中に１つ又はそれより多い反復単位の頻繁な付加及び欠失を受け、その結果この遺伝子の読み取り枠が変更されそしてそれによってその発現が変更されているという証拠を得ている。今や、完全なゲノム配列を使用して、このような縦に並んだ全ての配列区域の位置を決め（図５）そしてこのような潜在的ビルレンス遺伝子の相変動におけるそれらの役割を決定することを開始することが可能である。
【０１７５】
インフルエンザ菌Ｒｄは非常に効率的な天然のＤＮＡ形質転換系を有している（Ｋａｈｎ及びＳｍｉｔｈ、Ｊ．　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｂｉｏｌ．　１３８：１５５（１９８４年））。特有のＤＮＡ取込み配列部位、ゲノム内の多数のコピー中に存在している５’ＡＡＧＴＧＣＧＧＴは効率的なＤＮＡ取込みに必要であることが示されている。今や、これらの全ての部位の位置を決めそしてそれらの分布を完全に記載することが可能である。形質転換に関係のある１５の遺伝子は既に記載されており、そして配列が決定されている（Ｒｅｄｆｉｅｌｄ，　Ｒ．、Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１７３：５６１２（１９９１年）；　Ｃｈａｎｄｌｅｒ，　Ｍ．、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　８９：１６１６（１９９２年）；　Ｂａｒｏｕｋｉ及びＳｍｉｔｈ、Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１６３（２）：　６２９（１９８５年）；　Ｔｏｍｂ等、Ｇｅｎｅ　１０４：１（１９９１年）；　Ｔｏｍｂ，　Ｊ．、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　８９：１０２５２（１９９２年））。６つの遺伝子、ｃｏｍＡからｃｏｍＦは、プロモーターの上流で１つのらせんターンの周囲の２２ｂｐのパリンドローム受容能調節要素（ＣＲＥ）によって明白に（？）制御されているオペロンを含んでいる。ｒｅｃ−２形質転換遺伝子もこの要素によって制御されている。今や、ゲノム内のＣＲＥの追加的コピーの位置を決定しそしてＣＲＥ制御下の潜在的形質転換遺伝子を発見することが可能である。更に、他の広範囲の調節要素を今や容易に発見することが可能であり、これはこれまでは可能でなかった。
【０１７６】
細菌における１つの良好に記載された遺伝子調節系は、或る種の環境シグナルを検出するセンサー分子とセンサーの活性化形態でリン酸化されている調節分子から構成された「２成分」系である。調節タンパク質は一般的には、センサーによって活性化されたとき特定の遺伝子組を開始又は停止させる転写因子である（総説については、Ａｌｂｒｉｇｈｔ等、Ａｎｎ．　Ｒｅｖ．　Ｇｅｎｅｔ．　２３：３１１（１９８９年）；　Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ及びＫｏｆｏｉｄ、Ａｎｎ．　Ｒｅｖ．　Ｇｅｎｅｔ．　２６：７１（１９９２年）参照）。大腸菌は４０のセンサー−調節対を有していると考えられている（Ａｌｂｒｉｇｈｔ等、Ａｎｎ．　Ｒｅｖ．　Ｇｅｎｅｔ．　２３：３１１（１９８９年）；　Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ及びＫｏｆｏｉｄ、Ａｎｎ．　Ｒｅｖ．　Ｇｅｎｅｔ．　２６：７１（１９９２年））。インフルエンザ菌ゲノムはｔｂｌａｓｔｎ及びｔｆａｓｔａを使用して、代表的なタンパク質を用いてセンサーと調節タンパク質の各科から検索した。４つのセンサー及び５つの調節タンパク質が同定され、他の種から得られるタンパク質と類似していた（表６）。ＣｐｘＲを除いて、各調節タンパク質用の対応するセンサーがあるように思われる。大腸菌から得られるＣｐｘＡタンパク質で検索することによって、表６に示された４つのセンサーのうち３つが同定されたが、追加的な顕著な適合は見られなかった。配列類似性のレベルがｔｆａｓｔａで検出できないほど十分に低い可能性がある。ＮｔｒＣのクラスの調節タンパク質を代表するものは全く見られなかった。このクラスのタンパク質はＲＮＡポリメラーゼのシグマ５４サブユニットと直接相互作用し、そしてこれはインフルエンザ菌には存在していない。調節タンパク質はすべてＯｍｐＲサブクラスに入る（Ａｌｂｒｉｇｈｔ等、Ａｎｎ．　Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．　２３：３１１（１９８９年）；　Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ及びＫｏｆｏｉｄ、Ａｎｎ．　Ｒｅｖ．　Ｇｅｎｅｔ．　２６：７１（１９９２年））。インフルエンザ菌のｐｈｏＢＲ及びｂａｓＲＳ遺伝子は互いに隣接しており、そして多分オペロンを形成する。ｎａｒ及びａｒｃ遺伝子は互いに隣接して位置していない。
【０１７７】
完全なゲノム配列によって答えることができる最も興味のある問題は、どの遺伝子又は経路を欠いているかに関するものである。非病原性のインフルエンザＲｄ株は病原性の血清型ｂ株と顕著に異なっている。これら２つの株間の差異の多くは感染性に影響を与える因子であるように思われる。例えば、細菌と宿主細胞との接着に関与する繊毛のある遺伝子集団（ｖａｎＨａｍ等、Ｍｏｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　１３：６７３（１９９４年））を形成する８つの遺伝子はＲｄ株には存在していないことが今や示されている。インフルエンザ菌タイプｂ株では繊毛のある集団が側部に付いているｐｅｐＮ及びｐｕｒＥ遺伝子はＲｄ株では互いに隣接しており（図４６）、繊毛のある集団（ｄｕｓｔｅｒ→ｃｌｕｓｔｅｒ）全体が切り取られていることを示唆している。より広いレベルでは、大腸菌から得られるタンパク質コード化遺伝子の冗長でない組、即ちウィスコンシン大学のジーンバンクのゲノムプロジェクト（Ｇｅｎｏｍｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔ）連続物：　ジーンバンク受理　Ｄ１０４８３、Ｌ１０３２８、Ｕ００００６、Ｕ０００３９、Ｕ１４００３及びＵ１１８９９７から得られる１，２１６個の予測タンパク質配列（Ｙｕｒａ等、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２０：３３０５（１９９２年）；　Ｂｕｒｌａｎｄ等、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　１６：５５１（１９９３年））を利用して、我々は大腸菌のどのタンパク質がインフルエンザ菌に存在していないかを決定した。適合の最小閾は、弱い適合であっても陽性として得点し、そしてそれによってインフルエンザ菌にはいない大腸菌の遺伝子の最小見積もりを与えた。ｔｂｌａｓｔｎを使用して、大腸菌のタンパク質の各々を完全ゲノムに対して検索した。＞１００のｂｌａｓｔ得点は適合と考えた。合計６２７種の大腸菌タンパク質がインフルエンザ菌ゲノムの少なくとも１つの領域で適合し、そして５８９種のタンパク質は適合しなかった。５８９種の非適合タンパク質を調べそして大腸菌の仮定上のタンパク質を不釣り合いに多数含有していることが分かった。同定された大腸菌タンパク質６８パーセントがインフルエンザ菌の配列によって適合され、一方仮定上のタンパク質の３８％しか適合しなかった。タンパク質は、他のどの既知のタンパク質とも適合しないことに基づいて仮定上のタンパク質として注釈を付ける（Ｙｕｒａ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２０：３３９５（１９９２年）；　Ｂｕｒｌａｎｄ等、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　１６：　５５１（１９９３年））。適合しないタンパク質のなかで仮定上のタンパク質が過剰に提示されることについて少なくとも２つの可能性のある説明を提供することができる：　仮定上のタンパク質は実際には翻訳されない（少なくとも注釈を付けたフレームでは）かんたはこれらは大腸菌特異的タンパク質であり、最も密接に関連した種、例えばネズミチフス菌を除いて如何なる種にも見られないように思われる。
【０１７８】
合計３８４の予測コード化領域はジーンバンクリリース８７の６フレーム翻訳とあまり類似性を示さなかった。これらの同定されていないコード化領域はｆａｓｔａを用いて互いに比較した。幾つかの新規な遺伝子群が同定された。例えば、データベースと適合しない２つの予測コード化領域（ＨＩ０５９１、ＨＩ０８５２）はそれらのほぼ完全な長さ（それぞれ、１３９及び１４３個のアミノ酸残基）で７５％の同一性を共有している。これら領域は互いに類似しているが現在のデータベースで得られるどのタンパク質とも適合しないことは、それらが新規な細胞機能を表わし得ることを示唆している。
【０１７９】
同定されなかったコード化領域には、顕著なアミノ酸同一性がない場合であってもレセプターのメンバーと輸送遺伝子群間にしばしば保持される潜在的膜−スパニングドメインのパターンを示している水治療法を含めて他のタイプの分析を当てはめることができる。膜結合チャンネンルタンパク質に特徴的である周期的パターンを有する潜在的トランスメンブレインドメインを示している同定されなかった予測コード化領域の５つの例を図４７に示す。このような情報を使用して、これら遺伝子の標的とされた欠失又は突然変異によって影響を受ける細胞機能の特異的な特徴に焦点を合わせることができる。
【０１８０】
インフルエンザ菌生物学の医学的に重要な特徴における興味はこの生物のビルレンス特徴を決定する遺伝子に特に集中している。細菌、カタラーゼ遺伝子の特徴が決定され、そして可能性のあるビルレンス関連遺伝子として配列が決定された（Ｂｉｓｈａｉ等、Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１７６：２９１４（１９９４年））。莢膜多糖類の原因である多数の遺伝子がマップされそして配列が決定された（Ｋｒｏｌｌ等、Ｍｏｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　５（６）：１５４９（１９９１年））。幾つかの外層膜タンパク質遺伝子が同定されそして配列が決定された（Ｌａｎｇｆｏｒｄ等、Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　１３８：１５５（１９９２年））。外層膜のリポオリゴ糖成分及びその合成経路の遺伝子は集中的に研究されている（Ｗｅｉｓｅｒ等、Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　　１７３：３３０４（１９９０年））。ワクチンは利用可能であるが、外層膜成分の研究はワクチンを改良する必要性によって幾分動機付けられている。
【０１８１】
データの入手可能性
インフルエンザ菌ゲノム配列は受理番号Ｌ４２０２３でゲノム配列データベース（Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ＤａｔａＢａｓｅ）（ＧＳＤＢ）に入れられている。同定された開始及び停止コドンを有する各予測コード化領域のヌクレオチド配列及びペプチド翻訳もＧＳＤＢによって受理されている。
【０１８２】
インフルエンザ菌タンパク質に対する抗体の産生
実質的に純粋なタンパク質又はポリペプチドは、トランスフェクションされるか又は形質転換された細胞から当該技術で既知の方法のいずれか１つを使用して単離される。タンパク質はまた、組換え原核生物発現系、例えば大腸菌内で産生させることができるか又は化学的に合成することができる。最終調製物中のタンパク質の濃度は、例えば、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）フィルターデバイスで濃縮して２，３マイクログラム／ｍｌのレベルに調整される。次に、このタンパク質に対するモノクローナル又はポリクローナル抗体を次のようにして調製することができる：
【０１８３】
ハイブリドーマ融合によるモノクローナル抗体の産生
記載したようにして同定しそして単離したペプチドのいずれかのエピトープに対するモノクローナル抗体は、コーラー　ジー（Ｋｏｈｌｅｒ，　Ｇ．）及びミルスタイン　シー（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　Ｃ．）（Ｎａｔｕｒｅ　２５：４９５（１９７５年））の古典的な方法又はその修正方法に従ってネズミハイブリドーマから調製することができる。簡単に言えば、マウスを、２，３週間に亘って２，３マイクログラムの選択したタンパク質で繰り返し接種する。次いで、マウスを屠殺し、そして脾臓の抗体産生細胞を単離する。脾臓細胞をポリエチレングリコールによってマウスミエローマ細胞と融合させ、そして過剰の融合していない細胞は、アミノプテリン含む選択培地（ＨＡＴ培地）で系を増殖させて破壊する。成功裏に融合した細胞を希釈し、希釈分別物を微量滴定ウエルに入れ、そこで培養物の増殖を継続する。抗体産生クローンは、エングバール　イー（Ｅｎｇｖａｌｌ，　Ｅ．）（Ｍｅｔｈ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　７０：４１９（１９８０年））によって最初に記載されたエリザ法及びその修正方法のような免疫アッセイ方法によってウエルの上清液中の抗体を検出して同定する。選択した陽性クローンを拡張しそしてそれらのモノクローナル抗体産生物を使用するために採集することができる。モノクローナル抗体の詳細な産生方法はデービス　エル（Ｄａｖｉｓ　Ｌ．）等（Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ニューヨーク、２１−２章（１９８９年））で記載されている。
【０１８４】
免疫法によるポリクローナル抗体産生
単一タンパク質の異種エピトープを含有するポリクローナル抗血清は、修正しないか又は免疫原性を高めるために修正することができる上記の発現タンパク質で適当な動物に免疫を与えることによって製造することができる。効果的なポリクローナル抗体産生は高原と宿主種の両方に関連した多数の因子によって影響をうける。例えば、小分子は他の分子より免疫原になりにくい傾向があり、そして担体やアジュバントの使用を必要とすることがある。更に、宿主動物は接種部位や投与量に応答して変動し、不適切又は過剰の抗原投与量では低力価の抗血清が得られる。多数の皮内部位に投与した少量（ｎｇレベル）の抗原は最も信頼性があるように思われる。ウサギに対する効果的な免疫法プロトコールはバイツカイチス　ジェイ（Ｖａｉｔｕｋａｉｔｉｓ，　Ｊ．）等（Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｍｅｔａｂ．　３３：９８８〜９９１（１９７８年））に見ることができる。
【０１８５】
規則的な間隔でブースター注射を与え、そして半定量法、例えば既知の濃度の抗原に対する寒天中の二重免疫拡散法によって測定するとき、抗血清の抗体力価が下降し始めたとき、抗血清を採集することができる。例えば、オウチターロニー　オー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ，　Ｏ）等（Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｅｒ　Ｄ．編集、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（１９７３年）中の１９章）参照。抗体の高原濃度は通常０．１〜０．２ｍｇ／血清ｍｌ（約１２μＭ）の範囲内である。抗原に対する抗血清の親和性は、例えば、フィッシャー　ディ（Ｆｉｓｈｅｒ　Ｄ．）（Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２版、Ｒｏｓｅ及びＦｒｉｅｄｍａｎ編集、Ａｍｅｒ．　Ｓｏｃ．　Ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、ワシントンＤ．Ｃ．（１９８０年）中の４２章）が記載したようにして、競合結合曲線を作成して測定する。
【０１８６】
どちらかのプロトコールに従って調製した抗体製剤は、生物学的試料中の抗原を有する物質の濃度を測定する定量的イムノアッセイで有用である；　それらはまた、生物学的試料中の抗原の存在を同定するために半定量的に又は定性的にも使用される。
【０１８７】
ＰＣＲプライマーの作成及びＤＮＡの増幅
表１（ａ）及び２に開示されたようなインフルエンザ菌Ｒｄゲノムの種々のフラグメントを、多様な用途用のＰＣＲプライマーを作成するために本発明に従って使用することができる。ＰＣＲプライマーは好ましくは少なくとも１５塩基、そして更に好ましくは少なくとも１８塩基の長さであることができる。プライマー配列を選択するとき、プライマー対は、融点が概ね同一であるように、概ね同一のＧ／Ｃ比率を有することが好ましい。この実施例のＰＣＲプライマー及び増幅ＤＮＡには以下の実施例での用途がある。
【０１８８】
ＯＲＦに対応するＤＮＡ配列からの遺伝子発現
表１（ａ）又は２で提供されるインフルエンザ菌Ｒｄゲノムのフラグメントは、慣用の技術を使用して発現ベクター中に導入される。（クローン化した配列を、哺乳動物、酵母、昆虫又は細菌発現系でのタンパク質翻訳を指令する発現ベクター中に移す技術は当該技術分野で周知である。）　市販で入手できるベクター及び発現系は、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（カリフォルニア州ラジョラ）、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（ウィスコンシン州マジソン）及びインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（カリフォルニア州サンディエゴ）を含む多様な供給者から入手することができる。所望の場合、発現を高めそして適当なタンパク質の折りたたみを促進するために、ハットフィールド（Ｈａｔｆｉｅｌｄ）等の米国特許第５，０８２，７６７号（これは参照として本明細書に組み入れる）で説明されているようにして、配列のコドン関連及びコドン対合を特定の発現生物用に最適化することができる。
【０１８９】
以下は、ヘモフィルス属のゲノムフラグメントのクローン化ＯＲＦからポリペプチド（単数又は複数）を発生させる１つの例示的方法として提供する。このＯＲＦは細菌起源であるためポリＡ配列を欠いているので、この配列は、例えば、ポリＡ配列を添加し、ＢｇｌＩ及びＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ酵素を使用し、そして真核生物発現系で使用するための哺乳動物ベクターｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に導入してｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からスプライシングして構築することができる。ｐＴＸ１はＬＴＲ及びモロニーマウス白血病ウイルスから得られるｇａｇ遺伝子の１部を含有している。構築物中のＬＴＲの位置によって安定なトランスフェクションが可能になる。ベクターは単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター及び選択性ネオマイシン遺伝子を含んでいる。ヘモフィルス属のＤＮＡは、ヘモフィルス属のＤＮＡと相補的であるオリゴヌクレオチドプライマーを使用して細菌ベクターからＰＣＲによって取得し、そして５’プライマー中に導入されたＰｓｔＩ用及び対応するヘモフィルス属ＤＮＡ３’プライマーの５’末端のＢｇｌＩＩ用の制限エンドヌクレアーゼ配列を有しており、ヘモフィルス属のＤＮＡが確実にポリＡ配列と共に後に続くように注意して配置されている。生じたＰＣＲ反応から得られた精製フラグメントをＰｓｔＩで消化し、エキソヌクレアーゼでブラント末端とし、ＢｇｌＩＩで消化し、精製しそしてｐＴＸ１と結合し、今やポリＡ及び消化されたＢｇｌＩＩを含有している。
【０１９０】
結合した産生物は、産生物明細書に概略した条件下でリポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｉｎｃ．、ニューヨーク州グランドアイランド）を使用してマウスＮＩＨ　３Ｔ３細胞中にトランスフェクションする。陽性のトランスフェクション産物は、トランスフェクションした細胞を６００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州セントルイス）中で増殖させた後に選択する。タンパク質は好ましくは上清液中に放出される。しかし乍ら、タンパク質が膜結合ドメインを有している場合、タンパク質は細胞内に保持されるか又は発現が細胞表面に限定される。
【０１９１】
トランスフェクション産物を精製しそして配置しなければならないので、予測ヘモフィルス属ＤＮＡ配列から合成された合成１５量体ペプチドをマウスに注射して、ヘモフィルス属ＤＮＡによってコードされているポリペプチドに対する抗体を発生させる。
抗体産生ができない場合、ヘモフィルスＤＮＡ配列を真核発現ベクター中に追加的に導入し、そして例えば、β−グロビンとのキメラとして発現させる。β−グロビンに対する抗体はキメラを精製するために使用される。次に、β−グロビン遺伝子とヘモフィルスＤＮＡ間で処理された対応するプロテアーゼ開裂部位を使用して、翻訳後に２つのポリペプチドフラグメントを互いに分離する。β−グロビンキメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃｓ）を発生する１つの有用な発現ベクターはｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）である。このベクターはウサギβ−グロビンをコードしている。ウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンＩＩは発現された転写物のスプライシングを促進し、そしてこの構築物中に導入されたポリアデニル化シグナルは発現値を高める。記載したこれらの技術は分子生物学の分野の熟練者には周知である。標準的な方法はデービス（Ｄａｖｉｓ）（既出か）等のような方法教科書で発表されており、そしてストラタジーン、ライフテクノロジーインク（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｉｎｃ．）又はプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の技術支援代理人から多数の方法を入手することができる。ポリペプチドは、インビトロ　エクスプレス　トランスレーション　キット（ＥｘｐｒｅｓｓＴＭ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のようなインビトロ翻訳系を使用してどちらかの構築物から追加的に産生させることができる。
【０１９２】
本発明は明確さ及び理解を目的として幾らか詳細に記載したが、当該技術分野の熟練者は、様式や詳細における種々の変更が本発明の真の範囲から逸脱することなくなされ得ることを理解するであろう。
上記で言及した特許、特許出願及び刊行物はすべて参照として本明細書に組み入れる。
【０１９３】
【表１】
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【０１９４】
【表２】
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【０１９５】
【表３】
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【０１９６】
【表４】
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【０１９７】
【表５】
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【０１９８】
【表６】
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【０１９９】
【表７】
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【０２００】
【表８】
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【０２０１】
【表９】
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【０２０２】
【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表５９】
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【表６４】
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【０２５７】
【表６５】
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【０２５８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの制限マップ。
【図２】本発明のコンピューターに基づくシステムを実行するために使用できるコンピューターシステム１０２の組立て分解図。
【図３】４６０ｂｐの平均配列長及び２５ｂｐの重複を有する２．５Ｍｂゲノム（三角）及び１．６Ｍｂゲノム（丸）についてのランダー・ウォーターマン（Ｌａｎｄｅｒ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）の予測と比較した、オートアッセンブラー（ＡｕｔｏＡｓｓｅｍｂｌｅｒ）（四角）で組み立てた概ね４０００個までのランダム配列フラグメントの実験的範囲の比較。
【図４】インフルエンザ菌ゲノムを管理し、組み立て、編集しそして注釈をつけるために使用したデータフロー及びコンピュータープログラム。
【図５】データベースとの適合を有する各予測コード化領域の位置並びにゲノムの選択された全体的特徴を示しているインフルエンザ菌Ｒｄ染色体の円形表示。
【図６】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図７】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図８】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図９】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図１０】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図１１】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図１２】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図１３】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図１４】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図１５】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図１６】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図１７】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図１８】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図１９】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図２０】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図２１】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図２２】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図２３】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図２４】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図２５】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図２６】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図２７】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図２８】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図２９】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図３０】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図３１】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図３２】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図３３】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図３４】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図３５】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図３６】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図３７】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図３８】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図３９】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図４０】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図４１】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図４２】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図４３】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図４４】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図４５】インフルエンザ菌Ｒｄゲノムの完全なマップ。
【図４６】インフルエンザ菌ｂ型中に存在するふさ状へり遺伝子集団の８個の遺伝子を含有するインフルエンザ菌染色体の領域とインフルエンザ菌Ｒｄ中の同じ領域との比較。
【図４７】５つの予測チャンネルタンパク質の疎水性分析。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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