(57)【要約】　　　（修正有）【課題】慢性の精神分裂病患者等における多飲水症と関連するオレキシン伝達機構の遺伝子多型を明らかにし、これらを検出することによって、被験者が多飲水症の素因を有するか否かを予測する方法を提供すること。【解決手段】被験者から得た生物学的試料を分析し、オレキシン１受容体遺伝子の多型であって、特定配列における一塩基多型、及び／又は前記一塩基多型と連鎖不平衡にある少なくとも１つの多型を決定する。本発明の好ましい実施形態において、前記オレキシン１受容体遺伝子の多型は、特定配列の１２２２番目の位置から前後に５００塩基以内の領域にある。【選択図】　　図１
2004041055.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から得た生物学的試料を分析し、オレキシン１受容体遺伝子の多型であって、配列番号１の１２２２番目の位置における一塩基多型、及び／又は前記一塩基多型と連鎖不平衡にある少なくとも１つの多型を決定することを特徴とする、前記被験者が多飲水症の素因を有するか否かを予測する方法。
【請求項２】
前記被験者が慢性精神分裂病患者であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オレキシン１受容体遺伝子が、配列番号１に示した塩基配列のヒトオレキシン１受容体ｃＤＮＡ、又はそのゲノムＤＮＡである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記オレキシン１受容体遺伝子の多型が、配列番号１の１２２２番目の位置から前後に５００塩基以内の領域にある請求項１〜３何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
被験者から得た生物学的試料を分析し、オレキシン１受容体遺伝子の多型であって、配列番号１に示した塩基配列の１２２２番目のアデニンがグアニンに置換された一塩基多型を検出することを特徴とする、前記被験者が多飲水症の素因を有することを予測する方法。
【請求項６】
配列番号１の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドからなり、前記少なくとも１０個の連続するヌクレオチドが配列番号１の１２２２番目の一塩基多型を含むポリヌクレオチド又はその相補的な配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記一塩基多型が、配列番号１の１２２２番目のアデニンがグアニンに置換された一塩基多型であることを特徴とする請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
ヒトオレキシン１受容体遺伝子と特異的にハイブリダイズし、該遺伝子の一部からなるＤＮＡ断片を増幅するＰＣＲプライマー対であって、増幅されたＤＮＡ断片が配列番号１に示す塩基配列の１２２２番目の塩基を含むことを特徴とするＰＣＲプライマー対。
【請求項９】
ヒトオレキシン１受容体遺伝子と特異的にハイブリダイズし、配列番号１に示す塩基配列の１２２２番目の位置におけるヒトオレキシン１受容体遺伝子の一塩基多型を検出することのできるオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項８に記載のＰＣＲプライマー対、及び／又は請求項９に記載のオリゴヌクレオチドを含む、多飲水症の診断用キット。
【請求項１１】
ヒトオレキシン１受容体に多型変異を有するポリペプチド、又はその断片であって、前記ヒトオレキシン１受容体が実質的に配列番号２に示すアミノ酸配列からなり、前記多型変異が、配列番号２に示したアミノ酸配列の４０８番目のアミノ酸がバリンであることを特徴とするポリペプチド又はその断片。
【請求項１２】
請求項１１に記載のポリペプチド又はその断片に特異的に結合する抗体。
【請求項１３】
請求項１１に記載のポリペプチド又はその断片を発現する形質転換細胞。
【請求項１４】
請求項１１に記載のポリペプチド若しくはその断片、又は請求項１３に記載の形質転換細胞を使用する、ヒトオレキシン１受容体の機能を調節する化合物のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、被験者が多飲水症（Ｐｏｌｙｄｉｐｓｉａ）の素因を有するか否かを予測する方法に関し、より詳しくは、オレキシン１受容体遺伝子の多型を決定することにより、慢性精神病患者、特に慢性精神分裂病患者が多飲水症の素因を有するか否かを予測する方法、及びその方法に使用するキット等に関する。更に、本発明は、多飲水症の素因を形成する変異体オレキシン１受容体ポリペプチド、それを発現する形質転換細胞、及びそれらを用いてオレキシン１受容体の機能を調節する化合物のスクリーニング方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
過度の水摂取行動を示す多飲水症（Ｐｏｌｙｄｉｐｓｉａ）は、精神分裂病患者の３〜１７％が罹患する難治性の合併症である（ＤｅＬｅｏｎ　Ｊ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｌ．　Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ　１９９４；３５：　４０８−４１９）。本疾患は、２つの関連する疾患である多尿症及び水中毒と結びついている。多尿症は１日に３Ｌ以上もの大量の尿を排出することが知られている（Ｓｌｅｅｐｅｒ，　Ｆ．　Ｈ．，　Ａｍ．　Ｊ．　Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，　１９３５；　９１：　１０１９−１０３１）。長い年月の間に、患者の腎臓は、過剰の水分の全てを排出することができなくなり、体内に留まった水分は、しばしば低ナトリウム血症（血清中のナトリウム濃度の低下）を引き起こす。突然の、そして重篤な低ナトリウム血症は、水中毒と呼ばれる神経学的、精神医学的な種々の症状の原因となる脳浮腫を引き起こし、死に至る場合もある。従って、精神分裂病の治療における多飲水症の問題は、神経遮断薬によって引き起こされる遅発性ジスキネシアや悪性症状と同等又はそれ以上に重要であり、医学的な管理を必要とする。このような重篤な結果に至るにもかかわらず、多飲水症に関する遺伝的な解析は少なく、わずかにアンジオテンシン変換酵素遺伝子の多型との関連性（Ｏｕｙａｎｇ，　Ｗ−Ｃ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｂｉｏｌｏｇｙ　２００１；　４４：　３１−３５）等が示唆されているのみである。
【０００３】
近年、ラットの脳室内にオレキシンペプチドを投与すると水の摂取量が増加し、この効果はアンジオテンシンＩＩよりも長期間に及ぶことが報告されている（Ｋｕｎｉｉ，　Ｋ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．，　１９９９，；　８４２：　２５６−２６１）。オレキシンは、ヒポクレチンとも呼ばれ、脳の外側視床下部領域、及びその周辺に特異的に局在する神経細胞に含まれる神経ペプチドである。ヒトでは１３１残基の前駆体ペプチド（プレプロオレキシン）から、翻訳後の修飾により２つの活性ペプチド（オレキシンＡとＢ）が生成される。オレキシンには共にＧタンパク質共役受容体である２つの受容体が存在し、オレキシン１受容体はオレキシンＡと選択的に結合し（オレキシンＡに対してオレキシンＢよりも１００倍高い親和性で結合する。）、オレキシン２受容体はオレキシンＡ、及びＢのそれぞれに対してほぼ同一の結合親和性を示す（Ｓａｋｕｒａｉ，　Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ，　１９９８；　９２：　５７３−５８５）。
【０００４】
このオレキシンの神経伝達障害は、慢性の睡眠疾患であるナルコレプシーの主たる病態生理であることが知られている（西野精治、吉田祥、分子精神医学Ｖｏｌ．１，　Ｎｏ．　５，　２００１，　４９−５７）。自然発症動物モデルとして発見されたナルコレプシー犬の遺伝解析の結果、オレキシン２受容体の変異により、リガンドであるオレキシンとの結合能が失われ、オレキシン神経伝達に生じた特異的な障害が、ナルコレプシーの原因であることが明らかとなった（Ｌｉｎ，　Ｌ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ，　１９９９；　９８：　３６５−３７６）。また、オレキシンニューロンが水分や食物の摂取行動を制御するための重要な解剖学的な領域である視床下部外側野領域に局在すること、及びドーパミンニューロンを含む中脳のモノアミン作動性細胞グループの全てに密度の高い興奮性の突起を伸ばしていることが知られている。しかしながら、精神分裂病の治療における多飲水症の原因とオレキシンとの関連性については、未だ如何なる証拠も見出されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、このような多飲水症と関連するオレキシン伝達機構の遺伝子多型を明らかにすることを目的とする。また、本発明は、多飲水症と関連する上記多型の検出方法を提供することを目的とする。更に、本発明は、このような多型変異を有するオレキシン伝達機構を用いて、食物や水分の摂取、エネルギー代謝、睡眠や覚醒などを統合的に調節するオレキシンによるシグナル伝達機構を解析し、これを調節する化合物を探索することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
オレキシンが水分の摂取行動のメディエーターとして生理的な役割を果たすと共に、ドーパミン作動性システムと関連しているという上記事実に基づいて、本発明者らはオレキシンによる神経伝達機構が、ドーパミンブロッカーの投与を受けた精神分裂病患者の過度の水分摂取と何らかの関係があると考えた。そして精神分裂病患者におけるオレキシン及びその受容体遺伝子について解析した結果、オレキシン１受容体における特定の多型が、多飲水症の素因と有意に関連していることを発見し、これに基づいて本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明の第１の視点において、被験者から得た生物学的試料を分析し、オレキシン１受容体遺伝子の多型であって、配列番号１の１２２２番目の位置における一塩基多型、及び／又は前記一塩基多型と連鎖不平衡にある少なくとも１つの多型を決定することを特徴とする、前記被験者が多飲水症の素因を有するか否かを予測する方法が提供される。慢性の精神分裂病患者は多飲水症を発症しやすいため、本発明の方法によりその素因を有するか否かを予測することが有用である。本発明の好ましい実施形態において、前記オレキシン１受容体遺伝子は、配列番号１に示した塩基配列のヒトオレキシン１受容体ｃＤＮＡ、又はそのゲノムＤＮＡである。更に好ましい実施形態において、前記オレキシン１受容体遺伝子の多型は、配列番号１の１２２２番目の位置から前後に５００塩基以内の領域にあることを特徴とする。本発明の１つの実施形態において、被験者から得た生物学的試料を分析し、オレキシン１受容体遺伝子の多型であって、配列番号１に示した塩基配列の１２２２番目のアデニンがグアニンに置換された一塩基多型を検出することを特徴とする、前記被験者が多飲水症の素因を有することを予測する方法が提供される。
【０００８】
本発明の他の視点において、配列番号１の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドからなり、前記少なくとも１０個の連続するヌクレオチドが配列番号１の１２２２番目の一塩基多型を含むポリヌクレオチド又はその相補的な配列からなるポリヌクレオチドが提供される。好ましい態様において、前記一塩基多型は、配列番号１の１２２２番目のアデニンがグアニンに置換された一塩基多型であることを特徴とする。
【０００９】
さらに異なる視点において、ヒトオレキシン１受容体遺伝子と特異的にハイブリダイズし、該遺伝子の一部からなるＤＮＡ断片を増幅するＰＣＲプライマー対であって、増幅されたＤＮＡ断片が配列番号１に示す塩基配列の１２２２番目の塩基を含むことを特徴とするＰＣＲプライマー対、及び／又はヒトオレキシン１受容体遺伝子と特異的にハイブリダイズし、配列番号１に示す塩基配列の１２２２番目の位置におけるヒトオレキシン１受容体遺伝子の一塩基多型を検出することのできるオリゴヌクレオチドが提供される。これらのプライマー対、及び／又はオリゴヌクレオチドは、多飲水症の素因を有するか否かを予測するために用いることができ、従って、１つの実施形態としてこれらを含む多飲水症の診断用キットが提供される。
【００１０】
さらに、なお異なる視点において、ヒトオレキシン１受容体に多型変異を有するポリペプチド、又はその断片であって、前記ヒトオレキシン１受容体が実質的に配列番号２に示すアミノ酸配列からなり、前記多型変異が配列番号２に示したアミノ酸配列の４０８番目のアミノ酸がバリンであることを特徴とするポリペプチド又はその断片、これらのポリペプチド又は断片に特異的に結合する抗体、及びこれらのポリペプチド又は断片を発現する形質転換細胞が提供される。
【００１１】
これらのポリペプチド又はその断片、抗体、及び／又は形質転換細胞は、オレキシン１受容体の機能を解析するために有用であり、従って、１つの実施形態としてこれらを用いたヒトオレキシン１受容体の機能を調節する化合物のスクリーニング方法が提供される。
【００１２】
【発明の実施の形態】
（定義）
本明細書において、以下の用語は特記しない限り次のように定義される。「オレキシン１受容体遺伝子」とは、哺乳動物のオレキシン１受容体をコードする核酸分子である。「核酸分子」には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及びｍＲＮＡ等を含み、二本鎖、又は一本鎖であり得る。一本鎖の場合はコード鎖（センス配列）、又は非コード鎖（アンチセンス配列）の何れであってもよい。好ましい実施形態において、哺乳動物とはヒトであり、ヒトオレキシン１受容体のゲノム遺伝子の構造が図１（ｂ）に、また、ヒトオレキシンｃＤＮＡの塩基配列が配列番号１に示される。図１（ｂ）に示したように、ヒトオレキシン１受容体ゲノム遺伝子は７個のエクソンからなり、４２５個のアミノ酸残基からなる受容体タンパク質をコードする遺伝子である。配列番号１の塩基配列は、オレキシン１受容体ｃＤＮＡを翻訳開始コドン（ＡＴＧ）のＡを１番目として表したものであって、本明細書におけるヌクレオチドの位置を指定するために用いられる。ヒトオレキシン１受容体遺伝子の塩基配列はすでに公知であり、例えば、完全なコード領域を含むｍＲＮＡの塩基配列はＧｅｎＢａｎｋにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＦ０４１２４３として登録されている。
【００１３】
「対立遺伝子」（ａｌｌｅｌｅ）とは、特定の遺伝形質に関する２つ或はそれ以上の遺伝子の択一的な型の一つ一つの遺伝子型のことをいう。被験者が２つの同一の対立遺伝子を持つ場合には「ホモ接合性」（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）と呼ばれ、２つの異なる対立遺伝子を持つ場合には「ヘテロ接合性」（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ）と呼ばれる。また、「遺伝子型」（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）とは、着目する遺伝子座の対立遺伝子の組合せをいう。対立遺伝子型及び遺伝子型の統計的解析には、例えば、モンテカルロ法（ＣＬＵＭＰプログラム、Ｓｈａｍ　Ｐ．Ｃ．　＆　Ｃｕｒｔｉｓ　Ｐ．　Ａｎｎ．　Ｈｕｍ．　Ｇｅｎｅｔ．　５９，　９７−１０５　（１９９５）参照）を用いて行うことができ、ＣＬＵＭＰプログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｌｉｎｋａｇｅ．ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ／．から入手できる。
【００１４】
「多型」（Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）とは、遺伝子やポリペプチド又はその一部において２以上の型が存在することをいう。少なくとも２つの異なる型、即ち、異なる塩基配列を有する遺伝子断片を「遺伝子の多型部位」という。多型部位は一塩基対の場合も、或は一定の長さの塩基対の場合もある。１個の塩基が他の塩基に置き換わっているものを一塩基多型（以下「ＳＮＰ」又は「ＳＮＰｓ」という場合がある。）といい、ＳＮＰはヒトゲノムにおいては数百塩基対から１０００塩基対に１ヶ所の割合で存在すると推測されている。また、この他に２塩基から数十塩基を１単位とする配列が繰返し存在する部位において、その繰返し回数が個人間で異なるものも存在し、ＶＮＴＲ（ｖａｒｉａｂｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｔａｎｄｅｍ　ｒｅｐｅａｔｓ）やマイクロサテライト多型と呼ばれている。ＳＮＰはその存在する位置によって機能が異なり、ポリペプチドの翻訳領域に存在してアミノ酸配列の置換や欠失を引き起こし、遺伝子の機能に影響を与えるものや、プロモーターやイントロン等の発現調節領域に存在して遺伝子発現量に影響を与えるもの、あるいは他の領域に存在して遺伝子発現への影響はほとんど無いもの等がある。
【００１５】
「生物学的試料」とは、生物に由来するポリヌクレオチドを含有する試料であって、種々の組織や細胞から採取される、生きている、若しくは死滅した、又は考古学的な試料をも含む。具体的には体液（血液、尿、唾液等）、皮膚、毛根、粘膜、内臓、胎盤、臍帯血等である。
【００１６】
「ポリヌクレオチド」とは、一般に、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドのいずれかである。それらは非修飾ＲＮＡ又はＤＮＡ、あるいは修飾ＲＮＡ又はＤＮＡであってもよく、例えばＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、未プロセッシングＲＮＡおよびそれらの断片などが挙げられる。ポリヌクレオチドの長さは特に限定されないが、一般的には約１０塩基以上をいう。一方、ポリヌクレオチドよりも比較的短いものを「オリゴヌクレオチド」という場合もあり、「オリゴヌクレオチド」の長さは、一般的には、約５０塩基以下である。
【００１７】
「ポリペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合で連結されたものであり、比較的短鎖のペプチド又はオリゴペプチドと呼ばれるものからタンパク質と呼ばれる長鎖のものまでを含む。ポリペプチドには、遺伝的にコードされている２０種類のアミノ酸以外のアミノ酸が含まれていてもよい。また、修飾されたアミノ酸を含むことがあり得る。これらの修飾アミノ酸は生体内において、例えば、翻訳後のプロセッシングにおいて、或は、当業者に公知の化学修飾法によって生成される。これらの修飾は、ペプチド結合の主鎖、アミノ酸側鎖、アミノ末端、又はカルボキシル末端において起こり得、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、ビオチン化、脂質や脂質誘導体との共有結合、架橋結合の生成、ジスルフィド結合、糖鎖の付加、ＧＰＩアンカーの付加、リン酸化及びプレニル化等を含む。
【００１８】
（多飲水症の素因を有するか否かを予測する方法）
本発明の１つの実施形態において、被験者から得た生物学的試料を分析し、オレキシン１受容体遺伝子の多型を決定することを特徴とする、前記被験者が多飲水症の素因を有するか否かを予測する方法が提供される。前記オレキシン１受容体遺伝子の多型は、一塩基、又は二塩基以上の欠失、置換、又は付加であり得る。これらの変異によって、翻訳産物にアミノ酸置換、フレームシフト、又は終始コドンが挿入されることがあり、オレキシン１受容体の機能に大きな、又は少なくとも部分的な変化を起こしうるからである。あるいは、これらの変異は、オレキシン１受容体の機能や構造に影響を与えない変異でもあり得る。例えば、遺伝子のスプライシング部位に関連する変異はｍＲＮＡの安定性を損なったり、遺伝子の転写や翻訳効率に影響を与えたりすることがあり得る。また、上記オレキシン１受容体遺伝子の多型は、遺伝子型、又は少なくとも一方の対立遺伝子型であり、遺伝子型の場合はホモ接合型、又はヘテロ接合型の何れでもよい。特定の対立遺伝子に関する連鎖不平衡解析によっても上記オレキシン受容体１遺伝子の多型を決定することができる。「連鎖不平衡」とは、２つの対立遺伝子がそれぞれ独立に遺伝する場合よりも大きな頻度で互いに連鎖して遺伝することをいう。ＳＮＰｓマーカーは、日本人を含むアジア人とヨーロッパ人では平均２２ｋｂ以内で連鎖不平衡が保たれている。また、アフリカ人では平均１１ｋｂ以内で連鎖不平衡が保たれていることが報告されている（Ｇａｂｒｉｅｌ　ＳＢ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２９６：２２２５−２２２９，　２００２）。
【００１９】
さらに、このような連鎖不平衡を示す一群の対立遺伝子のことをハプロタイプと称する。オレキシン受容体１遺伝子座において複数のＳＮＰｓがある場合、その多型の組み合わせは個人によって異なる。この組み合わせがいわゆるハプロタイプマーカーであり、個人の多様性を表している。このようなハプロタイプマーカーを利用して被験者の遺伝情報と多飲水症に対する素因を関連付けることができる。本発明の１つの実施形態において、２つの遺伝子座の連鎖不平衡及びハプロタイプ頻度の推定はＡｒｌｅｑｕｉｎソフトウエア（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ等）を用いて行うことができ、ｈｔｔｐ：／／ａｎｔｈｒｏｐｏｌｏｇｉｅ．ｕｎｉｇｅ．ｃｈ／ａｒｌｅｑｕｉｎ／ｍｅｔｈｏｄｓ．ｈｔｍｌから入手することができる。
【００２０】
本発明の好ましい態様として、図１（ｂ）には、本発明者らによって見出されたオレキシン１受容体ゲノム遺伝子におけるＳＮＰｓの例が示される。図１（ｂ）のＲ１−２は、２１０番目のシトシンがチミンに置換されたＳＮＰであり、Ｒ１−７は１２２２番目のアデニンがグアニンに置換されたＳＮＰである。このオレキシン１受容体の１２２２番目の位置は、ヒトナルコレプシーと関連する緩和な（ｂｅｎｉｇｎ）ＳＮＰであることが報告されているが（Ｐｅｙｒｏｎ，　Ｃ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔ．　Ｍｅｄ．，　２０００；　６：　９９１−９９７）、多飲水症との関係については本発明者らによって初めて明らかにされるものである。あるいは、図１（ｂ）に示した特定のＳＮＰの近傍、例えば、Ｒ１−７の上流又は下流の数千〜数万塩基以内、好ましくは約５００塩基以内、最も好ましくは約１００塩基以内の領域にあり、前記ＳＮＰと連鎖する少なくとも１つの多型を決定することによっても多飲水症の素因の有無を予測することができる。
【００２１】
多飲水症と関連するこのような少なくとも１つの多型を同定するためには、一般的には症例対照法（ｃａｓｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｔｕｄｙ）を用いることができる。症例対照法は、多飲水症の症状を示す被験者集団と、対照正常集団における上記オレキシン１受容体遺伝子の多型を決定し、その分布状態を統計的に解析する方法である。被験者集団の遺伝的特性（母集団の大きさ、均一性、地域的特性等）に応じて、特定の多型を同定することができる。
【００２２】
上記オレキシン１受容体遺伝子の多型を決定する方法としては、以下のような種々の公知技術を用いて、（１）少なくとも多型部位を含む対立遺伝子の一部の塩基配列の決定、（２）多型部位に特異的にハイブリダイズするプローブ（アレル特異的プローブ）による検出、（３）多型部位を含む遺伝子断片の分子量の測定等の方法により行うことができる。例えば、ダイレクト・シークエンシング法等によりゲノムＤＮＡから直接ＳＮＰを検出することができる。一方、特定のゲノムＤＮＡ領域を増幅した後、上記（１）〜（３）の検出手段を用いることもできる。ＤＮＡを増幅するための種々の方法は当業者に公知であり、例えば、所望のＤＮＡ断片をクローン化したり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、連結酵素連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増殖方法（ＳＤＡ；Ｗａｌｋｅｒ　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　８９，　３９２−３９６　（１９９２））、転写反応に基づいた増殖方法（　Ｋｗｏｈ　Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　８６，　１１７３−１１７７　（１９８９））、自己持続複製反応（Ｇｕａｔｅｌｌｉ　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　８７，　１８７４−１８７８　（１９９０））、Ｑ−βレプリカーゼシステム（Ｌｉｚａｒｄｉ　Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６，　１１９７−１２０２　（１９８８））、核酸配列に基づいた増殖反応（ＮＡＳＢＡ；Ｌｅｗｉｓ　Ｒ．　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｎｅｗｓ　１２，　１　（１９９２））、修復連鎖反応（ＲＣＫ）等により行うことができるがこれらに限定されない。
【００２３】
増殖反応産物は、種々の方法によりＳＮＰを決定することができ、例えば、塩基配列の決定、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法等による分子量の測定、及び制限酵素断片長の解析（ＲＦＬＰ）等が含まれる。一本鎖立体配置多型（ＳＳＣＰ）による検出技術もまた、アクリルアミドゲル等に基づく分離方法であるが、非変性条件下で行われる。好適なキャピラリー電気泳動によって行うこともできる。この技術は、種々のＤＮＡ断片をそれらの立体配置（コンフォメーション）に従って識別し得る（Ｏｒｉｔａ　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　８６，　（１９８９），　Ｃｏｔｔｏｎ　Ｍｕｔａｔ．　Ｒｅｓ．　２８５，　１２５−１４４　（１９９３），　Ｈａｙａｓｈｉ　Ｇｅｎｅｔ．　Ａｎａｌ．　Ｔｅｃｈ．　Ａｐｐｌ．　９，　７３−７９　（１９９２））。
【００２４】
ＴａｑＭａｎ法（商標）と呼ばれる方法は、アレル特異的なオリゴヌクレオチドと鋳型とのハイブリダイゼーション、及びＰＣＲ法を同時に行い、蛍光エネルギー移動現象を用いてＳＮＰを検出する方法である（Ｌｉｖａｋ　ｅｔ　ａｌ．，　ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　４：３５７−３６２，　１９９５、及び米国特許第５５２８８４８号参照）。蛍光色素と消光物質により標識したアレル特異的プローブを標的部位にハイブリダイズさせて、この部位を含む領域を増幅するように設計したプライマーでＰＣＲを行うと、プライマーからの伸長反応が進むと同時にＴａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によりハイブリダイズしたプローブが切断される。蛍光色素が消光物質と離れると蛍光が生じ、また、ＰＣＲ反応により鋳型が増幅するため蛍光強度は指数関数的に増強する。２種類のアレルに特異的なプローブを異なる蛍光色素で標識しておけば、１回のアッセイでホモ接合体とヘテロ接合体とを区別することができる。
【００２５】
ＤＮＡの増幅を伴なわない種々の方法が開発されている。例えば、インベーダー法（商標）は２種類のオリゴヌクレオチド（インベーダープローブとアレルプローブ）を用い、これらのプローブが鋳型ＤＮＡと形成する特異的な構造を認識して切断する特殊な酵素反応に基づいており、例えば、米国特許第５８４６７１７号、第５６１４４０２号、第５７１９０２８号、第５５４１３１１号及び第５８４３６６９号等に記載されている。この方法は目的とする塩基配列を２種類の異なるプローブで認識する。第１のプローブは一般的にインベーダープローブと呼ばれ、目的塩基配列の第１の部位に実質的に相補的である。第２のプローブはアレルプローブと呼ばれ、その３’末端側は目的塩基配列の第２の部位と実質的に相補的であるが、５’末端側には鋳型と非相補的で一本鎖を形成するテール又はフラップと呼ばれる配列を含む。これらのプローブが鋳型の隣接する領域にハイブリダイズすると、ＳＮＰ部位にインベーダープローブの３’末端が侵入し、この構造がＣｌｅａｖａｓｅにより切断されてフラップが遊離する。遊離したフラップはあらかじめ標識しておくことにより定量することができる。好ましくは、遊離したフラップを定量するために蛍光色素とクエンチャーで標識された第３のＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）プローブ（フラップと相補的な配列、及び自己相補的な配列を含む）を用いることができる。遊離したフラップはＦＲＥＴプローブと結合して特異的な構造を形成し、ＣｌｅａｖａｓｅによりＦＲＥＴプローブの蛍光色素部分が切断されて蛍光が発生する。フラップ−ＦＲＥＴプローブを２組用意し、異なる蛍光色素で標識することにより、１回のアッセイで各ホモ接合体とヘテロ接合体とを区別することができる。
【００２６】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法は、プライマーの蛍光標識を必要とせず、短時間で大量のサンプルを処理することができる方法である。ＳＮＰ部位に隣接するプライマーを作製し、ＰＣＲ増幅させたサンプルＤＮＡを鋳型として、ｄｄＮＴＰを用いて１塩基分だけプライマー伸長反応を行う。伸長反応生成物の質量分析により、付加したｄｄＮＴＰを識別する。
【００２７】
ＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ　ｃｉｒｃｌｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法は、環状の一本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡポリメラーゼがその上を移動しながら長い相補鎖ＤＮＡを合成していくＤＮＡ増幅手段をＳＮＰタイピングに応用したものである。ＳＮＰ（アレル）の識別をＲＣＡ法による増幅の有無で行う。すなわち、ゲノムＤＮＡとアニールし、環状になりうる一本鎖プローブ（パドロックプローブ）をゲノムＤＮＡにハイブリダイズさせて連鎖反応を行う。プローブの端を識別したいＳＮＰの部位としておけば、その部位がマッチしていれば連結され環状となってＲＣＡによる増幅が起こるが、ミスマッチであれば連結されず環状とならないためＲＣＡ増幅は起こらない。この２種類の増幅反応を識別することによってＳＮＰを決定することができる（Ｌｉｚａｒｄｉ，　Ｐ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔ．　Ｇｅｎｅｔ．　１９，　２２５　（１９９８））。
【００２８】
多型部位を含む種々のオリゴヌクレオチドプローブをマイクロアレイ上に配置したＤＮＡチップを用いて、ＰＣＲ増幅させた蛍光標識ｃＤＮＡやｃＲＮＡとハイブリダイゼーションするＤＮＡチップ法は、多くのＳＮＰｓを迅速に検出する手段として有用である。オリゴヌクレオチドを光リソグラフィー技術によりアレイ上で合成して１チップ上に数千から数十万個のプローブを配置させたもの（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製、米国特許第５４２４１８６号、同第５７４４１０１号、及び同第６０４０１３８号等参照）やあらかじめ調製したｃＤＮＡやオリゴヌクレオチドをピン又はインクジェット方式によりガラス上に固定化する方法等が知られている（米国特許第６０４０１３８号参照）。
【００２９】
（ポリヌクレオチド、プライマー対、及び多飲水症の診断用キット）
本発明の他の実施形態において、オレキシン１受容体遺伝子の多型を含むポリヌクレオチド、上記多型を含むＤＮＡ断片を増幅するためのプライマー対、上記多型を検出するためのオリゴヌクレオチド、及びこれらを含む多飲水症の診断用キットが提供される。これらのポリヌクレオチドは、天然物であっても、合成物であっても良い。例えば、ｃＤＮＡやゲノムＤＮＡを組換えＤＮＡ技術を用いて宿主細胞内で複製して製造することができる。あるいは、試験管内で合成して製造しても良い。合成方法としてはＰＣＲ等によりＤＮＡを増幅することも、化学的に合成することもできる。また、当業者であれば、公知の方法を用いて配列番号１のオレキシン１受容体遺伝子中に部位特異的に変異を導入し、本形態のポリヌクレオチドを調製することが可能である。当業者に公知の部位特異的変異を導入する方法としては、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，　Ｔ．　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　１５４，　３６７−３８２　（１９８７））、ダブルプライマー法（Ｚｏｌｌｅｒ，　Ｍ．　Ｊ．　ａｎｄ　Ｓｍｉｔｈ，　Ｍ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　１５４，　３２９−３５０　（１９８７））、カセット変異法（Ｗｅｌｌｓ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ　３４，　３１５−２３　（１９８５））、メガプライマー法（Ｓａｒｋａｒ，　Ｇ．　ａｎｄ　Ｓｏｍｍｅｒ，　Ｓ．　Ｓ．，　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　８，　４０４−４０７　（１９９０））が挙げられる。
【００３０】
これらのポリヌクレオチドは、本発明に係る遺伝子多型を検出するために用いることができる。また、アンチセンスＤＮＡとして発現を抑制するために用いることもできる。
【００３１】
他の一つの実施形態において、オレキシン１受容体遺伝子と特異的にハイブリダイズし、前記遺伝子の一部からなるＤＮＡ断片を増幅するＰＣＲプライマー対であって、増幅されたＤＮＡ断片が、配列番号１に示す塩基配列の１２２２番目の塩基を含むことを特徴とするＰＣＲプライマー対が提供される。本形態のプライマー対は、オレキシン１受容体遺伝子の上記多型部位の上流及び下流の特定の領域の各鎖と実質的に相補的になるように設計される。これらの各プライマーは、２５〜２５００塩基対離れた領域においてハイブリダイズすることができるが、増幅産物の塩基配列の決定又は分子量の解析を容易にするため、増幅産物の大きさが１００〜６００塩基対であることが好ましい。これらのオリゴヌクレオチドプライマーの長さは１０〜３０塩基の範囲内であれば良いが、好ましくは１８〜２５塩基のものを、更に好ましくは配列番号３〜１６に示したそれぞれ２２〜２４塩基のオリゴヌクレオチドプライマーを用いることができる。これらのプライマーは増幅されたＤＮＡ断片の検出を容易にするために標識することができる。標識としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光色素、ストレプトアビジン、アビジン、磁気ビーズ、抗原及び抗体等が用いられる。
【００３２】
さらに別の実施形態において、オレキシン１受容体遺伝子と特異的にハイブリダイズし、配列番号１に示す塩基配列の１２２２番目の位置におけるオレキシン１受容体遺伝子の多型を検出することのできるオリゴヌクレオチドが提供される。検出方法には種々の方法があるが、例えば、インベーダー法による検出を行う場合は、ＳＮＰ部位から鋳型の３’側に相補的に結合するように設計されたインベーダープローブとＳＮＰ部位から鋳型の５’側に相補的な配列を含み、その５’側に鋳型の配列とは無関係な配列（フラップ）を有するアレルプローブとが提供される。ＳＮＰ部位の配列であるインベーダープローブの３’末端は任意の塩基でよい。
【００３３】
ＴａｑＭａｎプローブは、ＳＮＰ部位を含み、鋳型と相補的な約２０塩基程度の長さのオリゴヌクレオチドである。５’末端はＦＡＭやＶＩＣ等の蛍光色素により、また、３’末端はクエンチャー（消光物質）により標識される。
【００３４】
ＲＣＡ法に用いるパドロックプローブは、両端がゲノム上のＳＮＰ周辺約２０塩基ずつからなり、その２つをバックボーンと呼ばれる特異的な配列が連結する。
【００３５】
好ましくは上記検出は、ゲノムＤＮＡを直接又は、増幅されたＤＮＡ断片を用いて塩基配列を決定することにより行う。塩基配列決定用のシークエンスプライマーとしては、ＳＮＰ部位の上流又は下流の適当な部位と実質的に相補的になるように設計される。これらのシークエンスプライマーの長さは１０〜３０塩基の範囲内であれば良いが、好ましくは１８〜２５塩基のものを用いることができる。これらのオリゴヌクレオチドは当業者において公知の種々の方法で化学合成される。また、検出を容易にするために標識されたものであっても良い。標識方法としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、磁性微粒子、抗原及び抗体等を用いることができる。
【００３６】
他の実施形態において、多飲水症の診断用キットが提供される。このキットには、上記オレキシン１受容体遺伝子の多型を含むＤＮＡ断片を増幅するためのプライマー対、及び上記多型を検出するためのオリゴヌクレオチドの何れか又は両方が含まれる。被験試料からまず目的ＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを用いて遺伝子多型を決定することができる。一方、ＤＮＡの増幅反応を行わずに、ゲノムＤＮＡから直接多型を決定することも可能である。このような方法としてはダイレクトシークエンシング法又はインベーダー法等が挙げられる。キットには、任意に選択されるものとして、ＤＮＡの抽出試薬、精製試薬、ＰＣＲのための試薬、例えば１０倍濃縮緩衝液や耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）等を含むことができる。
【００３７】
（ポリペプチド）
本発明の他の実施形態において、ヒトオレキシン１受容体に多型変異を有するポリペプチド、又はその断片であって、前記ヒトオレキシン１受容体が実質的に配列番号２に示すアミノ酸配列からなり、前記多型変異が配列番号２に示したアミノ酸配列の４０８番目のアミノ酸がバリンであることを特徴とするポリペプチド又はその断片が提供される。ポリペプチド断片は少なくとも１０個の連続するアミノ酸配列からなり、好ましくは２０個以上の連続するアミノ酸配列であり、より好ましくは３０個以上のアミノ酸配列の長さを有する。これらのポリペプチド又はその断片は、上記多型変異を有するポリペプチドに対する抗体を作製するために有用である。
【００３８】
これらの多型変異を有するポリペプチドは、化学合成法により製造することができる他、天然のポリペプチド、又は遺伝子組み換え技術を利用した組換えポリペプチドとして調製したものをも含む。好ましい態様において、組換えポリペプチドは、本形態のヒト変異型オレキシン１受容体ポリペプチドをコードするＤＮＡで形質転換した細胞を培養することにより調製することが可能である。
【００３９】
オレキシン１受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体（Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＧＰＣＲ）スーパーファミリーに属する１つの受容体タンパク質である。ＧＰＣＲは、αヘリックスによる膜貫通部位を７ヶ所もっているので７回膜貫通型受容体とも呼ばれ、ペプチド性ホルモンや神経伝達物質等のリガンドと結合し、これらの情報を細胞内のＧタンパク質やｃＡＭＰなどのセカンドメッセンジャーに伝達することが知られている。同じくＧタンパク質共役型受容体であるオレキシン２受容体は、ナルコレプシー犬で遺伝子変異が発見され、変異の結果生じた不完全な受容体が正しい膜局在を維持できずオレキシン２受容体の機能が失われた結果オレキシン神経伝達に障害が生ずることが報告されている。これらの知見より、本発明において見出されたオレキシン１受容体遺伝子の多型変異が、オレキシン受容体の構造、及び／又は機能に何らかの影響を与えることによって、オレキシンの神経伝達作用を介して多飲水症を引き起こす可能性が示唆される。ヒトオレキシン１受容体の４０８番目のイソロイシンがバリンに置換された変異が、該受容体の機能にどのような影響を与えるかは明らかではないが、一般的なＧＰＣＲの構造から４０８番目のバリン残基は細胞内ドメインに存在し、細胞内のエフェクタータンパク質との相互作用に関与することが推測される。従って、本形態のヒトオレキシン１受容体に多型変異を有するポリペプチド、又はその断片は、エフェクタータンパク質との相互作用を介したオレキシンシグナル伝達の分子レベルでの機構と、水分の摂取行動との関連性を解析するために極めて有用であり、ヒトオレキシン１受容体の機能を調節する化合物のスクリーニング等に使用することができる。
【００４０】
（抗体）
また、本発明の一つの実施形態において、本発明に係る多型性を有する変異体オレキシン１受容体ポリペプチドに特異的に結合する抗体が提供される。本形態の抗体は、当業者に公知の方法（例えば、「新生化学実験講座１，タンパク質Ｉ，３８９−４０６，東京化学同人」参照）により調製することが可能である。ポリクローナル抗体の調製は、例えば、以下の如く行う。ウサギ、モルモット、マウス、ニワトリなどの免疫動物に適量の本発明の変異体オレキシン１受容体ポリペプチドもしくはその部分ペプチドを投与する。投与は、抗体産生を促進するアジュバント（ＦＩＡやＦＣＡ）と共に行ってもよい。投与は、通常、数週間ごとに行う。免疫を複数回行うことにより、抗体価を上昇させることができる。最終免疫後、免疫動物から採血を行うことにより抗血清が得られる。この抗血清に対し、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーによる分画、プロテインＡや固定化抗原を用いたアフィニティー精製を行うことにより、ポリクローナル抗体を調製することができる。一方、モノクローナル抗体の調製は、例えば、以下の如く行う。本発明の変異体オレキシン１受容体ポリペプチドもしくはその部分ペプチドを、上記と同様に免疫動物に免疫し、最終免疫後、この免疫動物から脾臓またはリンパ節を採取する。この脾臓またはリンパ節に含まれる抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコールなどを用いて融合し、ハイブリドーマを調製する。目的のハイブリドーマをスクリーニングし、これを培養し、その培養上清からモノクローナル抗体を調製することができる。モノクローナル抗体の精製は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーによる分画、プロテインＡや固定化抗原を用いたアフィニティー精製により行うことができる。これにより調製された抗体は、本発明の変異体オレキシン１受容体ポリペプチドのアフィニティー精製のために用いられる他、本発明の変異体オレキシン１受容体ポリペプチドの発現量の検出などに利用することが可能である。また、該抗体により、脳細胞における変異体オレキシン１受容体の発現を検出し、多飲水症の診断を行うこともできる。
【００４１】
（形質転換細胞及びそれを用いるヒトオレキシン１受容体の機能を調節する化合物のスクリーニング方法）
また、本発明の他の一つの実施形態において、本発明に係る多型性を有する変異体オレキシン１受容体ポリペプチドを発現する形質転換細胞が提供される。「形質転換細胞」とは組換えベクターにより宿主細胞に外来ＤＮＡが組み込まれた細胞であり、宿主細胞は原核細胞であっても真核細胞であっても良く、例えば細菌、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。好ましくは、前記宿主細胞は、神経細胞、グリア細胞、ミクログリア細胞、上皮細胞、腫瘍細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞又はアフリカツメガエルの卵母細胞を含む。或いは、細胞の代わりに細胞抽出液又は無細胞タンパク質翻訳系を用いることもできる。具体的には次のような方法で組換えベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を得ることができる。大腸菌の形質転換は、Ｈａｎａｈａｎ法（Ｈａｎａｈａｎ，　Ｄ．，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．１６６，　５５７−５８０　（１９８３））、電気穿孔法（Ｄｏｗｅｒ，　Ｗ．　Ｊ．　ｅｔ　ｌａ．，　Ｎｕｃｌ．，　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．　１６，　６１２７−６１４５　（１９８８））などで行う。酵母の形質転換は、例えば、スフェロプラスト法（Ｂｅａｃｈ，　Ｄ．　ａｎｄ　Ｎｕｒｓｅ，　Ｐ．，　Ｎａｔｕｒｅ　２９０，　１４０　（１９８１））、酢酸リチウム法（Ｏｋａｚａｋｉ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１８．，　６４８５−６４８９　（１９９０））などにより行われる。昆虫細胞の形質転換は、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６，　４７−５５　（１９８０））などに記載の方法に従って行うことができる。哺乳動物細胞への組換えＤＮＡの導入は、リン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ，　Ｆ．　Ｌ．　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｒＥｂ，　Ａ．　Ｊ．，　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２，　４５６−４６７　（１９７３））、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｓｕｓｓｍａｎ，　Ｄ．　Ｊ．　ａｎｄ　Ｍｉｌｍａｎ，　Ｇ．，　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　４，　１６４１−１６４３　（１９８４））、リポフェクション法（Ｆｅｌｇｎｅｒ，　Ｐ．　Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８４，　７４１３−７４１７　（１９８７））、電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．，　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１，　８４１−８４５　（１９８２））などで行われる。このようにして作製された形質転換細胞は、ヒトオレキシン１受容体の機能を調節する化合物のスクリーニング等に使用することができる。
【００４２】
好ましい実施形態において、上記宿主細胞は、脳の神経細胞を用いることができる。脳内において、オレキシン神経細胞は視床下部外側部に限局して存在するが、モノアミン・アセチルコリン等の神経核やその受容部位等に密に投射しており、精神分裂病の治療薬であるドーパミンブロッカーの作用に何らかの影響を与えていることが示唆される。また、オレキシンはｉｎ　ｖｉｔｒｏの系で、ドーパミン、セロトニン、ヒスタミン神経細胞も興奮させることが報告されている。従って、１つの実施形態として、変異体オレキシン１受容体ポリペプチドを発現する形質転換神経細胞を培養し、オレキシン存在下において該形質転換神経細胞と試験化合物とを接触させ、オレキシンの神経伝達作用を検出することによって、ヒトオレキシン１受容体の機能を調節する化合物をスクリーニングする方法が提供される。上記オレキシン神経伝達作用の検出は、上記形質転換神経細胞の興奮電位や、細胞内カルシウムレベルを測定することによって行うことができる。このような方法でスクリーニングされた化合物は、変異体オレキシン１受容体の機能を調節して多飲水症状を改善する可能性がある。さらに、睡眠覚醒の調節や節食調節等の生理的機構を統合的に制御しているオレキシンシステムに作用する新規な薬剤が得られる可能性もある。
【００４３】
従って、本発明は更に前記スクリーニング方法によって提供された化合物と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。本発明の一態様では、前記担体は、塩溶液（例えば、食塩）、生理食塩水、アルコール、グリセリール、エタノール、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、でん粉、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、パラフィン、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等、及びそれらの組み合わせである。前記医薬組成物は、更に、補助剤、例えば、潤滑剤、保存料、安定化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、緩衝材、色素、香料等を含むことができる。
【００４４】
（診断方法及び治療方法）
本発明はまた、被験者から得た生物学的試料を分析し、上記オレキシン１受容体遺伝子の多型を含むポリヌクレオチド又は上記ヒトオレキシン１受容体に多型変異を有するポリペプチドが存在するか否かを決定することを特徴とする多飲水症の診断方法を提供する。多飲水症の病態生理は複雑であり、発症には多くの因子が関与していると考えられるため、確定診断に基づいて個々の被験者に適切な治療方針を立てることが極めて困難である。本形態の診断方法によりオレキシン１受容体に特定の多型を検出することができれば、オレキシンの神経伝達機構の障害がその原因になることが予想されるため、例えば、オレキシン１受容体のアンタゴニスト（例えば、ＳＢ−３３４８６７等、Ｒｏｄｇｅｒｓ，　ＲＪ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　２００１，　１３：　１４４４−１４５２参照）を投与する治療方法等が選択され得る。精神分裂病の患者にとって多飲水症の素因があるか否かを診断することは、特に有用であり、抗精神分裂病薬によるこの重篤な副作用を回避するために、例えば、クロザピン等の比較的多飲水症を起こしにくい治療薬を処方するなどの治療方法の改善を行うことができる。従って、被験者から得た生物学的試料を分析し、上記オレキシン１受容体遺伝子の多型を含むポリヌクレオチド又は上記ヒトオレキシン１受容体に多型変異を有するポリペプチドが存在するか否かを決定し、抗精神分裂病薬を投与することを特徴とする精神分裂病の治療方法が提供される。
【００４５】
【実施例】
本発明は以下の実施例においてより具体的に説明される。実施例は発明をより明確に理解するためのものであって、如何なる意味においても本発明を限定するものではない。
【００４６】
［実施例１］ヒトオレキシン遺伝子、オレキシン１受容体遺伝子、及びオレキシン２受容体遺伝子におけるＳＮＰの同定
被験者として、多飲水行動がなく、血清Ｎａ＋濃度の正常な、少なくとも過去２年間入院中の１６７人の慢性精神分裂病患者を集めた。これらの精神分裂病患者は、ＤＳＭ−ＩＶの基準によって診断された８３人の男性（平均年齢４８．９±１１．７才、平均病歴２４．８±１２．９年）と８４人の女性（平均年齢４６．６±１４．０才、平均病歴２２．２±１３．１年）から構成された。多飲水症の患者としては、定常的に水を過剰摂取する行動が病院の職員によって観察され、過去２年間の定期検査において少なくとも１回は低ナトリウム血症（≦１３０ｍＥｑ／Ｌ）を示した精神分裂病の入院患者が集められた。これらの被験者は何れも糖尿病、又は水−イオンバランスに影響を与えるような全身性の疾患に罹患していることなく、ナトリウムの恒常性を妨げるような炭酸リチウム、抗けいれん薬、又は利尿薬による治療を受けていなかった。そのうえ、何れの精神分裂病患者も多飲水症を回復させる可能性のあるクロザピンやオランザピンの投与を受けていなかった。これらの医薬品は、現時点において日本では承認されていないからである。これらの多飲水症−低ナトリウム血症の精神分裂病患者は、５５人の男性（平均年齢４８．８±１１．６才、平均病歴２６．２±１１．４年）と２４人の女性（平均年齢４９．０±１０．６才、平均病歴２５．９±９．３年）から構成された。対照正常人は、９０人の男性（平均年齢４６．１±８．５才）と８４人の女性（平均年齢４４．６±１２．３才）から構成された。本実施例で調べた全ての被験者は、集団の層別化を最小限にするために日本民族を起源とした。本研究は理研倫理委員会の承認を受けたものであり、全ての関係者から書面によるインフォームドコンセントを得た。
【００４７】
無作為に選択した３０人の多飲水症患者のゲノムＤＮＡについて塩基配列を決定することにより、オレキシン遺伝子（ＨＣＲＴ）（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＦ１１８８８５）、オレキシン１受容体遺伝子（ＨＣＲＴＲ１）（ＡＦ２０２０７８−２０２０８４）、及びオレキシン２受容体遺伝子（ＨＣＲＴＲ２）（ＡＦ２０２０８５−２０２０９１）の多型を検索した。なお、塩基配列の決定は、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片を用いて行った。具体的には、オレキシン１受容体の塩基配列は、表１に示した７種類のプライマー対（配列番号３〜１６）を用いて、それぞれのエクソンを含むＤＮＡ断片を増幅した。なお、プライマーの５’端の位置はそれぞれのエクソンの上流又は下流に設定し、エクソン７については終止コドンの下流９７ｂｐに設定した。また、増幅反応に用いた試薬はＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（アプライドバイオシステム社製）である。
【００４８】
【表１】
2004041055.tif 000003
【００４９】
それぞれの遺伝子のすべてのエクソン、５’上流配列、及び隣接するイントロンの塩基配列を決定し、全部で６ヶ所の変異部位を見出した。これらの変異部位は、図１に示したように、オレキシン遺伝子（ＨＣＲＴ）のイントロンの５’側から数えて１６番目のチミンがシトシンに置換された変異（ＩＶＳ１＋１６Ｔ＞Ｃ）と、エクソン２の３’末端から２３ｂｐ下流のグアニンがチミンに置換された変異（Ｇ＞Ｔ）；オレキシン１受容体遺伝子（ＨＣＲＴＲ１）の２１０番目のシトシンがチミンに置換された変異（２１０Ｃ＞Ｔ）と１２２２番目のアデニンがグアニンに置換された変異（１２２２Ａ＞Ｇ（Ｉｌｅ４０８Ｖａｌ））；及びオレキシン２受容体遺伝子（ＨＣＲＴＲ２）のイントロン１の３’側から数えて２６番目のアデニンがシトシンに置換された変異（ＩＶＳ１−２６Ａ＞Ｃ）と、９２２番目のグアニンがアデニンに置換された変異（９２２Ｇ＞Ａ（Ｖａｌ３０８Ｉｌｅ））であった。これらの中で、オレキシン遺伝子（ＨＣＲＴ）の２つの多型とオレキシン１受容体遺伝子（ＨＣＲＴＲ１）の２１０Ｃ＞Ｔは、それぞれ１つのヘテロ接合体のみが見出されただけと頻度が小さく、生物学的な有意性が明確ではなかったため、残りの３ヶ所の多型部位について、全ての多飲水症の患者、非多飲水症の患者及び対照正常人の塩基配列を決定した。
【００５０】
［実施例２］ヒトオレキシン受容体遺伝子のＳＮＰｓと多飲水症との症例対照法による統計的解析
実施例１で決定した３ヶ所のＳＮＰ部位の塩基配列について、被験者数の分布とその統計的解析結果を表２に示した。遺伝子型のｐ値はＣＬＵＭＰプログラムを用いて計算した。対立遺伝子型のｐ値はχ二乗分布より求めた。オレキシン１受容体遺伝子の１２２２Ａ＞Ｇ（Ｉｌｅ４０８Ｖａｌ）の遺伝子型分布は、対照正常人と多飲水症患者との間で有意に異なっていた（ＣＬＵＭＰプログラムによるｐ値＝０．０１３８）（少なくとも１つのＶａｌ４０８に対するオッズ比は２．０６、［９５％信頼区間は１．２１−３．５１］；ｐ値＝０．００７８）。多飲水症の精神分裂病患者と非多飲水症の精神分裂病患者とを比較するとその差はより顕著であった（ｐ値＝０．０００５）（オッズ比２．７４、［９５％信頼区間は１．５９−４．７２］；ｐ値＝０．０００２）。ヘテロ接合体の分布が有意に異なることから、オレキシン１受容体の４０８番目のバリン（Ｖａｌ４０８）は多飲水症を引き起こすために優性に作用するように思われた。多飲水症の試料は女性より男性のほうが２倍以上あったが、Ｖａｌ４０８対立遺伝子の頻度はほとんど同じであり（男性３１％、女性３０％）、他の試料群でも差はなかった（両性間の頻度の差は１％以下であった）。従って、試料間での被験者数の性差が結果に与える影響はないと考えられる。しかしながら、多飲水症患者が男性に多いことの理由は不明である。対立遺伝子型の分布については、多飲水症を示す精神分裂病患者のＶａｌ４０８は対照正常人と比較して頻度が高く（ｐ値＝０．０５５０）、また、精神分裂病患者の非多飲水症患者と比較すると顕著に頻度が高かった（オッズ比１．８３、［９５％信頼区間は１．１９−２．８０］；ｐ値＝０．００５９）。オレキシン１受容体のＶａｌ４０８は、遺伝子型及び対立遺伝子型の何れにおいても精神分裂病全体（多飲水症と非多飲水症の両方を含む）との関連性はなかった。その他のＳＮＰｓは、多飲水症及び精神分裂病の何れとも関連性がなかった（表２参照）。これらの結果は、オレキシン１受容体のＶａｌ４０８が、精神分裂病自身とは関連性なく、精神分裂病患者における多飲水症の素因を形成することが強く示唆された。さらに重要なことに、これらのデータは遺伝子と環境（薬剤）との相互作用、又は環境因子によって引き起こされた出来事の遺伝的な基礎を意味することである。ここで、環境、或いは環境因子というのは、Ｖａｌ４０８キャリヤーの多飲水症発症の危険性が、全ての精神分裂病患者に投与されている従来の抗精神薬治療と関連するであろう。
【００５１】
【表２】
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【００５２】
【発明の効果】
本発明の方法を用いることより、被験者が多飲水症の素因を有するか否かを分子遺伝学的な根拠に基づいて予測することができる。特に、精神分裂病の患者にとっては、重篤な副作用である多飲水症の素因を有するか否かを診断することは、治療方法の選択等が可能となり副作用の防止に極めて有用である。さらに本発明の多型変異を有するオレキシン１受容体ポリペプチド、又はこれを発現する形質転換細胞等は、オレキシンの神経伝達作用と多飲水症との関連性を解明し、オレキシン１受容体の機能を調節するような薬剤の開発に有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
ヒトオレキシンリガンド（ａ）、ヒトオレキシン１受容体（ｂ）、及びヒトオレキシン２受容体（ｃ）の各ゲノム遺伝子の構造とこれらの遺伝子におけるＳＮＰｓを模式的に表した図である。
【図１】
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