(57)【要約】【課題】光学活性３−ヒドロキシブタン酸系化合物を製造する方法を提供すること。【解決手段】光学活性３−ヒドロキシブタン酸系化合物の製造方法であって、（Ｉ）一般式（１）【化１】2004041070.tif 000048（式中、Ｘはシアノメチル基等を表し、Ｒは置換されていてもよい炭素数１から４の低級アルキル基を表す。）で示される３−オキソブタン酸エステルを不斉還元して一般式（２）【化２】2004041070.tif 000049（式中、ＸおよびＲは前記と同じ意味を表し、＊は不斉炭素を表す。）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する第一工程、（ＩＩ）前記第一工程後、前記光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル等を不斉水解する第二工程、及び（ＩＩＩ）前記第ニ工程後、反応液から不斉水解しない光学異性体、あるいは、反応液から不斉水解する光学異性体から生じた光学活性３−ヒドロキシブタン酸又はその誘導体を回収する第三工程を有することを特徴とする製造方法等が提供可能になった。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学活性３−ヒドロキシブタン酸系化合物の製造方法であって、
（Ｉ）一般式（１）
【化１】
2004041070.tif 000044
（式中、Ｘはシアノメチル基、置換されていてもよいベンジルオキシメチル基、置換されていてもよいアルコキシメチル基、置換されていてもよいアシルオキシメチル基又はヒドロキシメチル基、あるいは、ハロゲノメチル基を表し、Ｒは置換されていてもよい炭素数１から４の低級アルキル基を表す。）
で示される３−オキソブタン酸エステルを不斉還元して一般式（２）
【化２】
2004041070.tif 000045
（式中、ＸおよびＲは前記と同じ意味を表し、＊は不斉炭素を表す。）
で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する第一工程、
（ＩＩ）前記第一工程後、前記光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体を不斉水解する第二工程、及び
（ＩＩＩ）前記第ニ工程後、反応液から不斉水解しない光学異性体
、あるいは、反応液から不斉水解する光学異性体から生じた
光学活性３−ヒドロキシブタン酸又はその誘導体を回収する第三工程
を有することを特徴とする製造方法。
【請求項２】
第一工程における不斉還元のための反応が、触媒として一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力を有する還元酵素又は当該酵素を産生する微生物、あるいはそれらの処理物を、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルに作用させ、これを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性−３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する反応であることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力を有する還元酵素又は当該酵素を産生する微生物、あるいはそれらの処理物が、前記能力を人為的に付与されてなる形質転換体又はその死菌化細胞であることを特徴とする請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
形質転換体が、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力を有する還元酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含有するプラスミドが導入されてなる形質転換体であることを特徴とする請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
形質転換体が大腸菌であることを特徴とする請求項３又は４記載の製造方法。
【請求項６】
一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力が、下記のアミノ酸配列群の中から選ばれるアミノ酸配列を有する酵素が持つ能力であることを特徴とする請求項２記載の製造方法。
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、一般式（１）で示される−３−オキソブタン酸エステルを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性−３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２又は４で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２又は４で示される塩基配列からなるＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列を有し、かつ、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｅ）コリネバクテリウム属又はペニシリウム属に属する微生物由来の、一般式（１）で示される４−置換−３−オキソブタン酸エステルを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性４−置換−３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列
【請求項７】
一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力が、下記のアミノ酸配列群の中から選ばれるアミノ酸配列を有する酵素が持つ能力であることを特徴とする請求項２記載の製造方法。
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列を有し、かつ、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｅ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来の、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列
【請求項８】
一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力が、下記のアミノ酸配列群の中から選ばれるアミノ酸配列を有する酵素が持つ能力であることを特徴とする請求項２記載の製造方法。
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号３で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号４で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列
（ｄ）配列番号４で示される塩基配列からなるＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列を有し、かつ、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｅ）ペニシリウム属に属する微生物由来の、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列
【請求項９】
一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力が、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する酵素が持つ能力であることを特徴とする請求項２記載の製造方法。
【請求項１０】
一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力が、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する酵素が持つ能力であることを特徴とする請求項２記載の製造方法。
【請求項１１】
一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力が、配列番号２で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列を有する酵素が持つ能力であることを特徴とする請求項２記載の製造方法。
【請求項１２】
一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力が、配列番号４で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列を有する酵素が持つ能力であることを特徴とする請求項２記載の製造方法。
【請求項１３】
一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力を有する酵素又は当該酵素を産生する微生物、あるいはそれらの処理物の由来が、コリネバクテリウム属又はペニシリウム属に属する微生物であることを特徴とする請求項２記載の製造方法。
【請求項１４】
第一工程における不斉還元のための反応が、触媒として金属触媒を、水素雰囲気下において一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルに作用させ、これを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する反応であることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項１５】
金属触媒が、ルテニウム−光学活性ホスフィン錯体であることを特徴とする請求項１４記載の製造方法。
【請求項１６】
ルテニウム−光学活性ホスフィン錯体における光学活性ホスフィンが、（Ｒ）−ＢＩＮＡＰ又は（Ｓ）−ＢＩＮＡＰであることを特徴とする請求項１５記載の製造方法。
【請求項１７】
第二工程における不斉水解のための反応が、触媒として一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解酵素又は当該酵素を産生する微生物、あるいはそれらの処理物を、前記光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル又は前記誘導体に作用させ、これを不斉水解する反応であることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項１８】
（１）第一工程における不斉還元のための反応が、触媒として一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力を有する還元酵素又は当該酵素を産生する微生物、あるいはそれらの処理物を、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルに作用させ、これを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する反応であって、かつ、（２）第二工程における不斉水解のための反応が、触媒として一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解酵素又は当該酵素を産生する微生物、あるいはそれらの処理物を、前記光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル又は前記誘導体に作用させ、これを不斉水解する反応であることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項１９】
エステル加水分解酵素が、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体の（Ｓ）体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解酵素であることを特徴とする請求項１７記載の製造方法。
【請求項２０】
エステル加水分解酵素が、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体の（Ｒ）体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解酵素であることを特徴とする請求項１７記載の製造方法。
【請求項２１】
一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解酵素又は当該酵素を産生する微生物、あるいはそれらの処理物が、前記能力を人為的に付与されてなる形質転換体又はその死菌化細胞であることを特徴とする請求項１７記載の製造方法。
【請求項２２】
形質転換体が、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含有するプラスミドが導入されてなる形質転換体であることを特徴とする請求項２１記載の製造方法。
【請求項２３】
形質転換体が大腸菌であることを特徴とする請求項２１又は２２記載の製造方法。
【請求項２４】
一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力が、下記のアミノ酸配列群の中から選ばれるアミノ酸配列を有する酵素が持つ能力であることを特徴とする請求項２１記載の製造方法。
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号５、７，９で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号５、７，９で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号６、８，１０で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列
（ｄ）配列番号６、８，１０で示される塩基配列からなるＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列を有し、かつ、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｅ）クロモバクテリウム属、アルスロバクタ−属又はアスペルギルス属に属する微生物由来の、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有する酵素のアミノ酸配列
【請求項２５】
一般式（１）
【化３】
2004041070.tif 000046
（式中、Ｘはシアノメチル基、置換されていてもよいベンジルオキシメチル基、置換されていてもよいアルコキシメチル基、置換されていてもよいアシルオキシメチル基又はヒドロキシメチル基、あるいは、ハロゲノメチル基を表し、Ｒは置換されていてもよい炭素数１から４の低級アルキル基を表す。）
で示される３−オキソブタン酸エステルから光学活性３−ヒドロキシブタン酸系化合物を製造するための触媒としての、前記一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力を有する還元触媒と一般式（２）
【化４】
2004041070.tif 000047
（式中、ＸおよびＲは前記と同じ意味を表し、＊は不斉炭素を表す。）
で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解触媒との両触媒の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、３−ヒドロキシブタン酸系化合物の製造方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
３−位にヒドロキシ基を持つブタン酸誘導体は医薬中間体として有用である。例えば、特許第３２４１７２３号に記載されるように、抗高脂血症剤等の鍵中間体として重要性である。上記の誘導体を効率的に合成するには、光学純度の高い３−ヒドロキシブタン酸系化合物が極めて有用である。
このような光学純度の高い光学活性３−ヒドロキシブタン酸系化合物を製造する簡便な方法は知られていなかった。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
このような状況下、本発明者等は、光学活性３−ヒドロキシブタン酸系化合物の製造方法について鋭意検討した結果、３−オキソブタン酸エステルを原料とし、かつ、不斉還元反応及び不斉加水分解反応の両者反応を前記順序で組み合わせることにより、目的とする光学純度の高い光学活性３−ヒドロキシブタン酸系化合物を簡便に製造できることを見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．光学活性３−ヒドロキシブタン酸系化合物の製造方法であって、
（Ｉ）一般式（１）
【化５】
2004041070.tif 000002
（式中、Ｘはシアノメチル基、置換されていてもよいベンジルオキシメチル基、置換されていてもよいアルコキシメチル基、置換されていてもよいアシルオキシメチル基又はヒドロキシメチル基、あるいは、ハロゲノメチル基を表し、Ｒは置換されていてもよい炭素数１から４の低級アルキル基を表す。）
で示される３−オキソブタン酸エステルを不斉還元して一般式（２）
【化６】
2004041070.tif 000003
（式中、ＸおよびＲは前記と同じ意味を表し、＊は不斉炭素を表す。）
で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する第一工程、
（ＩＩ）前記第一工程後、前記光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体を不斉水解する第二工程、及び
（ＩＩＩ）前記第ニ工程後、反応液から不斉水解しない光学異性体、あるいは、反応液から不斉水解する光学異性体から生じた光学活性３−ヒドロキシブタン酸又はその誘導体を回収する第三工程
を有することを特徴とする製造方法；
２．第一工程における不斉還元のための反応が、触媒として一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力を有する還元酵素又は当該酵素を産生する微生物、あるいはそれらの処理物を、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルに作用させ、これを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性−３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する反応であることを特徴とする前項１記載の製造方法；
３．一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力を有する還元酵素又は当該酵素を産生する微生物、あるいはそれらの処理物が、前記能力を人為的に付与されてなる形質転換体又はその死菌化細胞であることを特徴とする前項２記載の製造方法；
４．形質転換体が、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力を有する還元酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含有するプラスミドが導入されてなる形質転換体であることを特徴とする前項３記載の製造方法；
５．形質転換体が大腸菌であることを特徴とする前項３又は４記載の製造方法；
６．一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力が、下記のアミノ酸配列群の中から選ばれるアミノ酸配列を有する酵素が持つ能力であることを特徴とする前項２記載の製造方法
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、一般式（１）で示される−３−オキソブタン酸エステルを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性−３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２又は４で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２又は４で示される塩基配列からなるＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列を有し、かつ、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｅ）コリネバクテリウム属又はペニシリウム属に属する微生物由来の、一般式（１）で示される４−置換−３−オキソブタン酸エステルを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性４−置換−３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列
７．一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力が、下記のアミノ酸配列群の中から選ばれるアミノ酸配列を有する酵素が持つ能力であることを特徴とする前項２記載の製造方法
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列を有し、かつ、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｅ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来の、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列
８．一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力が、下記のアミノ酸配列群の中から選ばれるアミノ酸配列を有する酵素が持つ能力であることを特徴とする前項２記載の製造方法
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号３で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号４で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列
（ｄ）配列番号４で示される塩基配列からなるＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列を有し、かつ、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｅ）ペニシリウム属に属する微生物由来の、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列
９．一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力が、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する酵素が持つ能力であることを特徴とする前項２記載の製造方法；
１０．一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力が、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する酵素が持つ能力であることを特徴とする前項２記載の製造方法；
１１．一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力が、配列番号２で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列を有する酵素が持つ能力であることを特徴とする前項２記載の製造方法；
１２．一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力が、配列番号４で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列を有する酵素が持つ能力であることを特徴とする前項２記載の製造方法；
１３．一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力を有する酵素又は当該酵素を産生する微生物、あるいはそれらの処理物の由来が、コリネバクテリウム属又はペニシリウム属に属する微生物であることを特徴とする前項２記載の製造方法；
１４．第一工程における不斉還元のための反応が、触媒として金属触媒を、水素雰囲気下において一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルに作用させ、これを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する反応であることを特徴とする前項１記載の製造方法；
１５．金属触媒が、ルテニウム−光学活性ホスフィン錯体であることを特徴とする前項１４記載の製造方法；
１６．ルテニウム−光学活性ホスフィン錯体における光学活性ホスフィンが、（Ｒ）−ＢＩＮＡＰ又は（Ｓ）−ＢＩＮＡＰであることを特徴とする前項１５記載の製造方法；
１７．第二工程における不斉水解のための反応が、触媒として一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解酵素又は当該酵素を産生する微生物、あるいはそれらの処理物を、前記光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル又は前記誘導体に作用させ、これを不斉水解する反応であることを特徴とする前項１記載の製造方法；
１８．（１）第一工程における不斉還元のための反応が、触媒として一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力を有する還元酵素又は当該酵素を産生する微生物、あるいはそれらの処理物を、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルに作用させ、これを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する反応であって、かつ、（２）第二工程における不斉水解のための反応が、触媒として一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解酵素又は当該酵素を産生する微生物、あるいはそれらの処理物を、前記光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル又は前記誘導体に作用させ、これを不斉水解する反応であることを特徴とする前項１記載の製造方法；
１９．エステル加水分解酵素が、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体の（Ｓ）体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解酵素であることを特徴とする前項１７記載の製造方法；
２０．エステル加水分解酵素が、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体の（Ｒ）体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解酵素であることを特徴とする前項１７記載の製造方法；
２１．一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解酵素又は当該酵素を産生する微生物、あるいはそれらの処理物が、前記能力を人為的に付与されてなる形質転換体又はその死菌化細胞であることを特徴とする前項１７記載の製造方法；
２２．形質転換体が、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含有するプラスミドが導入されてなる形質転換体であることを特徴とする前項２１記載の製造方法；
２３．形質転換体が大腸菌であることを特徴とする前項２１又は２２記載の製造方法；
２４．一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力が、下記のアミノ酸配列群の中から選ばれるアミノ酸配列を有する酵素が持つ能力であることを特徴とする前項２１記載の製造方法
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号５、７，９で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号５、７，９で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号６、８，１０で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列
（ｄ）配列番号６、８，１０で示される塩基配列からなるＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列を有し、かつ、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｅ）クロモバクテリウム属、アルスロバクタ−属又はアスペルギルス属に属する微生物由来の、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有する酵素のアミノ酸配列
２５．一般式（１）
【化７】
2004041070.tif 000004
（式中、Ｘはシアノメチル基、置換されていてもよいベンジルオキシメチル基、置換されていてもよいアルコキシメチル基、置換されていてもよいアシルオキシメチル基又はヒドロキシメチル基、あるいは、ハロゲノメチル基を表し、Ｒは置換されていてもよい炭素数１から４の低級アルキル基を表す。）
で示される３−オキソブタン酸エステルから光学活性３−ヒドロキシブタン酸系化合物を製造するための触媒としての、前記一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力を有する還元触媒と一般式（２）
【化８】
2004041070.tif 000005
（式中、ＸおよびＲは前記と同じ意味を表し、＊は不斉炭素を表す。）
で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解触媒との両触媒の使用；
等を提供するものである。
【０００４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明製造方法では、不斉還元反応（即ち、第一工程）及び不斉加水分解反応（即ち、第二工程）の両者反応を前記順序で組み合わせて用いることが重要である。
【０００５】
まず、本発明製造方法の第一工程について説明する。
当該工程において用いられる原料である、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルは、例えば、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（１９９５）１０１４等に記載されるように、４−ベンジルオキシ−３−オキソブタン酸エステルは４−クロロ−３−オキソブタン酸エステルに水素化ナトリウム存在下、ベンジルアルコールを反応させることにより得ることができる。また例えば、４−アセチルオキシ−３−オキソブタン酸エステルは４−ブロモ−３−オキソブタン酸メチルに酢酸カリウムを反応させることにより得ることができる。これらの方法に限定されるわけではなく、他の方法により得られたものでも使用することができる。
【０００６】
一般式（１）におけるＲで示される置換されてもよい炭素数１〜４の低級アルキル基としては、具体的には、メチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、等が例示される。
一般式（１）におけるＸで示される置換基のうち、置換されていてもよいベンジルオキシメチル基としては、例えば、４−メチルベンジルオキシメチル、３−クロルベンジルオキシメチル、４−シアノベンジルオキシメチル、３−ニトロベンジルオキシメチル等が例示され、置換されていてもよいアルコキシメチル基としては、例えば、クロロメチルオキシメチル、メチルオキシエチルオキシメチル等が例示され、置換されていてもよいアシルオキシメチル基としては、クロロアセチルオキシメチル、トリフルオロアセチルオキシメチル基等が例示され、またハロゲノメチル基としては、例えば、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロルメチル、ジクロルメチル、トリクロルメチル、ブロモメチル、ジブロモメチル等が例示される。
【０００７】
一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルとして、具体的には、４−ベンジルオキシ−３−オキソブタン酸メチル、４−ベンジルオキシ−３−オキソブタン酸エチル、４−ベンジルオキシ−３−オキソブタン酸ｎ−プロピル、４−ベンジルオキシ−３−オキソブタン酸イソプロピル４−ベンジルオキシ−３−オキソブタン酸ｎ−ブチル、４−ベンジルオキシ−３−オキソブタン酸イソブチル、４−ベンジルオキシ−３−オキソブタン酸ｓｅｃ−ブチル、４−ベンジルオキシ−３−オキソブタン酸ｔ−ブチル、４−アセチルオキシ−３−オキソブタン酸メチル、４−アセチルオキシ−３−オキソブタン酸エチル、４−アセチルオキシ−３−オキソブタン酸ｎ−プロピル、４−アセチルオキシ−３−オキソブタン酸イソプロピル、４−アセチルオキシ−３−オキソブタン酸ｎ−ブチル、４−アセチルオキシ−３−オキソブタン酸イソブチル、４−アセチルオキシ−３−オキソブタン酸ｓｅｃ−ブチル、４−アセチルオキシ−３−オキソブタン酸ｔ−ブチル、４−シアノ−３−オキソブタン酸メチル、４−シアノ−３−オキソブタン酸エチル、４−シアノ−３−オキソブタン酸プロピル、４−シアノ−３−オキソブタン酸イソプロピル、４−シアノ−３−オキソブタン酸ｎ−ブチル、４−シアノ−３−オキソブタン酸ｓｅｃ−ブチル、４−シアノ−３−オキソブタン酸イソブチル、４−シアノ−３−オキソブタン酸ｔ−ブチル、４−ブロモ−３−オキソブタン酸メチル、４−ブロモ−３−オキソブタン酸エチル、４−ブロモ−３−オキソブタン酸プロピル、４−ブロモ−３−オキソブタン酸イソプロピル、４−ブロモ−３−オキソブタン酸ｎ−ブチル、４−ブロモ−３−オキソブタン酸ｓｅｃ−ブチル、４−ブロモ−３−オキソブタン酸イソブチル、４−ブロモ−３−オキソブタン酸ｔ−ブチル、４−クロロ−３−オキソブタン酸メチル、４−クロロ−３−オキソブタン酸エチル、４−クロロ−３−オキソブタン酸プロピル、４−クロロ−３−オキソブタン酸イソプロピル、４−クロロ−３−オキソブタン酸ｎ−ブチル、４−クロロ−３−オキソブタン酸ｓｅｃ−ブチル、４−クロロ−３−オキソブタン酸イソブチル、４−クロロ−３−オキソブタン酸ｔ−ブチル、４，４，４−トリフルオロ−３−オキソブタン酸メチル、４，４，４−トリフルオロ−３−オキソブタン酸エチル、４，４，４−トリフルオロ−３−オキソブタン酸プロピル、４，４，４−トリフルオロ−３−オキソブタン酸一プロピル、４，４，４−トリフルオロ−３−オキソブタン酸ｎ−ブチル、４，４，４−トリフルオロ−３−オキソブタン酸ｓｅｃ−ブチル、４，４，４−トリフルオロ−３−オキソブタン酸イソブチル、４，４，４−トリフルオロ−３−オキソブタン酸ｔ−ブチル等が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【０００８】
当該工程において用いられる触媒としては、例えば、（１）一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力を有する還元酵素又は当該酵素を産生する微生物、あるいはそれらの処理物（第一の本発明製造方法に対応している。）、（２）金属触媒（第二の本発明製造方法に対応している。）等をあげることができる。
第一の本発明製造方法における触媒としての酵素は、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力を有する酵素である（以下、本還元酵素と記すこともある。）。このような酵素は、市販品酵素であってもよく、また本還元酵素を産生する微生物等から通常の生化学的な手法や遺伝子工学的な手法等を利用して調製することもできる。例えば、本還元酵素を産生する微生物が形質転換体である場合には、当該形質転換体としては、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力を有する還元酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含有するプラスミドが少なくとも導入されてなる形質転換体（以下、本形質転換体と記すこともある。）等をあげることができる。また、本還元酵素を産生する微生物が非形質転換体（即ち、前記能力が人為的に付与されていないにも係わらず、予め当該能力を有する微生物）である場合には、当該非形質転換体としては、後述の実施例のように、市販の微生物又は土壌などから前記能力を指標にしてスクリーニングすることにより単離された微生物等があげられる。このような微生物の例としては、コリネバクテリウム属やペニシリウム属に属する微生物等をあげることができる。
【０００９】
「一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力」の具体的な例としては、例えば、下記のアミノ酸配列群の中から選ばれるアミノ酸配列を有する酵素が持つ能力をあげることができる。
＜アミノ酸配列群＞
（ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ａ２）配列番号３で示されるアミノ酸配列
（ｂ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｂ２）配列番号３で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｃ１）配列番号２で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列
（ｃ２）配列番号４で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列
（ｄ１）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列を有し、かつ、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｄ２）配列番号４で示される塩基配列からなるＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列を有し、かつ、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｅ１）コリネバクテリウム属に属する微生物由来の、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｅ２）ペニシリウム属に属する微生物由来の、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列
【００１０】
本形質転換体を作製する際に用いられる、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する能力を有する酵素（即ち、本還元酵素）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（以下、本還元酵素遺伝子と記すこともある。）は、（１）天然に存在する遺伝子の中からクローニングされたものであってもよいし、（２）天然に存在する遺伝子であっても、このクローニングされた遺伝子の塩基配列において、その一部の塩基の欠失、置換又は付加が人為的に導入されてなる遺伝子（即ち、天然に存在する遺伝子を変異処理（部分変異導入法、突然変異処理等）を行ったもの）であってもよいし、（３）人為的に合成されたものであってもよい。
【００１１】
ここで、前記（ｂ）、（ｂ１）又は（ｂ２）にある「アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」や前記（ｄ）、（ｄ１）又は（ｄ２）にある「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列」には、例えば、配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列を有する酵素が細胞内で受けるプロセシング、該酵素が由来する生物の種差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、人為的なアミノ酸の変異等が含まれる。
前記（ｂ）、（ｂ１）又は（ｂ２）にある「（アミノ酸が）欠失、置換若しくは付加（された）」（以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。）を人為的に行う場合の手法としては、例えば、配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このＤＮＡを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１２，９４４１−９４５６（１９８４））、変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法等が挙げられる。
前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも１残基、具体的には１若しくは数個、又はそれ以上である。かかる改変の数は、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する能力を見出すことのできる範囲であればよい。
また前記欠失、置換若しくは付加のうち、特にアミノ酸の置換に係る改変が好ましい。当該置換は、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸への置換がより好ましい。このような置換としては、例えば、▲１▼グリシン、アラニン；▲２▼バリン、イソロイシン、ロイシン；▲３▼アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；▲４▼セリン、スレオニン；▲５▼リジン、アルギニン；▲６▼フェニルアラニン、チロシンのグループ内での置換が挙げられる。
【００１２】
本発明において「（アミノ酸が）欠失、置換若しくは付加（された）」には、例えば、２つの蛋白質間のアミノ酸配列に関する高い配列同一性（具体的には、８０％以上の配列同一性、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性）が存在している必要がある。また「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」には２つのＤＮＡ間の塩基配列に関する配列同一性（具体的には、８０％以上の配列同一性、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性）が存在している必要がある。
ここで「配列同一性」とは、２つのＤＮＡ又は２つの蛋白質間の配列の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡ又は蛋白質は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ　ＮＴＩを用いて、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．，２２（２２）：４６７３−４６８０（１９９４）を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはＶｅｃｔｏｒ　ＮＴＩ、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐにおいて、一般的に利用可能である。
前記（ｄ）、（ｄ１）又は（ｄ２）にある「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．，　Ｆｒｉｓｃｈ　Ｅ．　Ｆ．，　Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド　スプリング　ハーバー　ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｐｒｅｓｓ）に記載される方法や、「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、１９８９年、農村文化社発行）に記載されているサザンハイブリダイゼーション法等の通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ（９００ｍＭ　ＮａＣｌ、９０ｍＭ　クエン酸三ナトリウムを含む溶液。尚ここでは、ＮａＣｌ１７５．３ｇ、クエン酸三ナトリウム８８．２ｇを含む溶液を水８００ｍｌで溶解し、１０Ｎ　ＮａＣｌでｐＨを調製した後、全量を１０００　ｍｌとした溶液を２０×ＳＳＣとする。）中で６５℃にてハイブリッドを形成させた後、２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｎ．　Ｙ．　（１９８９），　６．３．１−６．３．６）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、２×ＳＳＣで５０℃の条件（低ストリンジェンシーな条件）から０．１×ＳＳＣで６５℃までの条件（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
【００１３】
本還元酵素遺伝子は、例えば、下記のような調製方法に準じて調製すればよい。
コリネバクテリウム・シュードジフテリティカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｅｒｉｔｉｃｕｍ）等のコリネバクテリウム属に属する微生物等から通常の遺伝子工学的手法に準じて染色体ＤＮＡを調製し、調製された染色体ＤＮＡを鋳型として、かつ適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅して本還元酵素遺伝子を調製する。
ここでコリネバクテリウム・シュードジフテリティカム由来の染色体ＤＮＡを鋳型として、かつ配列番号１７に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１８に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いてＰＣＲを行う場合には、配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡを増幅して本還元酵素遺伝子を調製することになる。
当該ＰＣＲの条件としては、例えば、４種類のｄＮＴＰを各々２０μＭ、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを各々１５ｐｍｏｌ、Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１．３Ｕ及び鋳型となるｃＤＮＡライブラリーを混合した反応液を９７℃（２分間）に加熱した後、９７℃（０．２５分間）−５０℃（０．５分間）−７２℃（１．５分間）のサイクルを１０回、次いで９７℃（０．２５分間）−５５℃−（０．５分間）−７２℃（２．５分間）のサイクルを２０回行い、さらに７２℃で７分間保持する条件が挙げられる。
尚、当該ＰＣＲに用いるプライマーの５’末端側には、制限酵素認識配列等を付加していてもよい。
上記のようにして増幅されたＤＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．，　Ｆｒｉｓｃｈ　Ｅ．　Ｆ．，　Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．著「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．　ＩＳＢＮＯ−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして組換ベクターを得ることができる。用いられるベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＵＣ１１９（宝酒造社製）、ｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　（東洋紡社製）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等が挙げられる。このようにしてベクターに組み込んだ形態で本還元酵素遺伝子を調製すれば、後の遺伝子工学的手法における使用において便利である。
【００１４】
また、ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｉｔｒｉｎｕｍ）等のペニシリウム属に属する微生物等から通常の遺伝子工学的手法（例えば、「新　細胞工学実験プロトコール」（東京大学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、１９９３年）に記載された方法）に準じてｃＤＮＡライブラリーを調製し、調製されたｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、かつ適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号３で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号４で示される塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅して本還元酵素遺伝子を調製する。
ここでペニシリウム・シトリナム由来のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、かつ配列番号１１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いてＰＣＲを行う場合には、配列番号４で示される塩基配列からなるＤＮＡを増幅して本還元酵素遺伝子を調製することになる。
当該ＰＣＲの条件としては、例えば、４種類のｄＮＴＰを各々２０μＭ、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを各々１５ｐｍｏｌ、Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１．３Ｕ及び鋳型となるｃＤＮＡライブラリーを混合した反応液を９７℃（２分間）に加熱した後、９７℃（０．２５分間）−５０℃（０．５分間）−７２℃（１．５分間）のサイクルを１０回、次いで９７℃（０．２５分間）−５５℃−（０．５分間）−７２℃（２．５分間）のサイクルを２０回行い、さらに７２℃で７分間保持する条件が挙げられる。
尚、当該ＰＣＲに用いるプライマーの５’末端側には、制限酵素認識配列等を付加していてもよい。
上記のようにして増幅されたＤＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．，　Ｆｒｉｓｃｈ　Ｅ．　Ｆ．，　Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．著「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．　ＩＳＢＮＯ−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして組換ベクターを得ることができる。用いられるベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＵＣ１１９（宝酒造社製）、ｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　（東洋紡社製）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等が挙げられる。このようにしてベクターに組み込んだ形態で本還元酵素遺伝子を調製すれば、後の遺伝子工学的手法における使用において便利である。
【００１５】
本形質転換体を調製する方法としては、例えば、本還元酵素遺伝子及び宿主細胞で機能可能なプロモーターが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡのような、本還元酵素遺伝子が宿主細胞中で発現できるような組換プラスミド（例えば、プロモーター、ターミネーター等の発現制御に関わる領域を本還元酵素遺伝子に連結して組換プラスミドを構築したり、ラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させるような組換プラスミド）を作製し、これを宿主細胞に導入することにより作製する方法等があげられる。さらに、本還元酵素遺伝子を宿主細胞の染色体中に導入する方法も利用することができる。
上記の組換プラスミドとしては、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖できるものであって、宿主細胞からの単離・精製が容易であり、宿主細胞中で機能可能なプロモーターを有し、検出可能なマーカーを持つ発現ベクターに、本還元酵素をコードする遺伝子が機能可能な形で導入されたものを好ましく挙げることができる。尚、発現ベクターとしては、各種のものが市販されている。
ここで、「機能可能な形で」とは、上記の組換プラスミドを宿主細胞に導入することにより宿主細胞を形質転換させた際に、本還元酵素遺伝子が、プロモーターの制御下に発現するようにプロモーターと結合された状態にあることを意味する。プロモーターとしては、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター、大腸菌のトリプトファンオペロンのプロモーター、又は、ｔａｃプロモーターもしくはｔｒｃプロモーター等の大腸菌内で機能可能な合成プロモーター等をあげることができる。またコリネバクテリウム・シュードジフテリティカム、ペニシリウム・シトリナム、バシラス・メガテリウムにおいて本還元酵素遺伝子の発現を制御しているプロモーターを利用してもよい。
また発現ベクターとしては、選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子等）を含むベクターを用いると、当該ベクターが導入された形質転換体を当該選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして容易に選択することができる。
さらなる高発現を導くことが必要な場合には、本還元酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の上流にリボゾーム結合領域を連結してもよい。用いられるリボゾーム結合領域としては、Ｇｕａｒｅｎｔｅ　Ｌ．ら（Ｃｅｌｌ　２０，　ｐ５４３）や谷口ら（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，　ｐ２０２，　講談社）による報告に記載されたものを挙げることができる。
宿主細胞としては、原核生物（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属）もしくは真核生物（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属）である微生物細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞等を挙げることができる。例えば、本形質転換体の大量調製が容易になるという観点では、大腸菌等を好ましく挙げることができる。
本還元酵素が宿主細胞中で発現できるようなプラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、用いられる宿主細胞に応じて通常使われる導入方法であればよく、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．　ＩＳＢＮＯ−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載される塩化カルシウム法や、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ：Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ　／Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｐｕｌｓｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍ」　Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　（１９９３）等に記載されるエレクトロポレーション法等をあげることができる。
宿主細胞において本還元酵素遺伝子が宿主細胞中で発現できるようなプラスミドが導入された形質転換体を選抜するには、前記の如く、例えば、ベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の表現型を指標にして選抜すればよい。
プラスミドが導入された宿主細胞（即ち、形質転換体）が本還元酵素遺伝子を保有していることは、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ等に記載される通常の方法に準じて、制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ウエスタンハイブリダイゼーション等を行うことにより、確認することができる。
【００１６】
本形質転換体の培養は、微生物培養、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞の培養に使用される通常の方法によって行うことができる。例えば大腸菌の場合、適当な炭素源、窒素源およびビタミン等の微量栄養物を適宜含む培地中で培養を行う。培養方法としては、固体培養、試験管振盪式培養、往復式振盪培養、ジャーファーメンター（Ｊａｒ　Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）培養、タンク培養等の液体培養のいずれの方法でもよく、好ましくは、通気撹拌培養法等の液体培養を挙げることができる。
培養温度は、本形質転換体が生育可能な範囲で適宜変更できるが、通常約１０〜５０℃、好ましくは約２０〜４０℃である。
培地のｐＨは約６〜８の範囲が好ましい。
培養時間は、培養条件によって異なるが通常約１日〜約５日が好ましい。
本形質転換体を培養するための培地としては、例えば、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される炭素源や窒素源、有機塩や無機塩等を適宜含む各種の培地を用いることができる。
炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、シュークロース等の糖類、グリセロール等の糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸、動物油、植物油及び糖蜜が挙げられる。これらの炭素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー（Ｃｏｒｎ　Ｓｔｅｅｐ　Ｌｉｑｕｏｒ）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、アミノ酸類、硝酸ナトリウム等の無機酸のアンモニウム塩、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩及び尿素が挙げられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は多くの場合には炭素源としても使用することができる。これらの窒素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
有機塩や無機塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びリン酸塩を挙げることができる。具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素一カリウム及びリン酸水素二カリウムが挙げられる。これらの有機塩及び／又は無機塩の培地への添加量は培養液に対して通常０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）程度である。
さらに、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター及びｌａｃプロモーター等のアロラクトースで誘導されるタイプのプロモーターと、本還元酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子とが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡが導入されてなる形質転換体の場合には、本還元酵素の生産を誘導するための誘導剤として、例えば、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ　ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を培地中に少量加えることもできる。
【００１７】
本形質転換体の取得は、例えば、前記の培養により得られた培養物を遠心分離等により形質転換体を沈殿物として回収すればよい。必要に応じて、回収前に当該形質転換体を、例えば、１００ｍＭリン酸１カリウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ６．５）等の緩衝液等を用いて洗浄してもよい。
【００１８】
第一の本発明製造方法において、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力を有する酵素を産生する微生物の、本発明製造方法の反応に用いる形態には、例えば、（１）培養液をそのまま用いる形態、（２）培養液の遠心分離等により菌体を集め、当該菌体を緩衝液若しくは水で洗浄することにより得られた湿菌体を用いる形態、等の培養により得られた微生物の菌体をそのまま用いる形態が含まれる。この場合には、その使用量は、例えば、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルに対して通常０．０１から２００重量倍程度、好ましくは０．１〜５０重量倍程度である。また、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力を有する酵素あるいは当該酵素又は当該酵素を産生する微生物の処理物の、本発明製造方法の反応に用いる形態には、例えば、培養液の遠心分離等により菌体を集め、当該菌体を緩衝液若しくは水で洗浄した湿菌体を、（１）有機溶媒（アセトン、エタノール等）処理することにより得られたものを用いる形態や（２）凍結乾燥処理することにより得られたものを用いる形態や（３）アルカリ処理することにより得られたものを用いる形態や（４）菌体を物理的に又は酵素的に破砕することにより得られたものを用いる形態、さらには、これらのものを公知の方法により固定化処理することにより得られたものを用いる形態も含まれる。この場合には、その使用量は、例えば、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルに対して通常０．００１から２重量倍程度、好ましくは０．０２〜０．５重量倍程度である。
【００１９】
第一の本発明製造方法において用いられる一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力を有する酵素又は当該酵素を産生する微生物、あるいはそれらの処理物のうち、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力を人為的に付与されてなる形質転換体又はその死菌化細胞が好ましく使用される。
【００２０】
本形質転換体から、その死菌化細胞を下記の方法により調製することもできる。
死菌化処理方法としては、例えば、物理的殺菌法（加熱、乾燥、冷凍、光線、超音波、濾過、通電）や、化学薬品を用いる殺菌法（アルカリ、酸、ハロゲン、酸化剤、硫黄、ホウ素、砒素、金属、アルコール、フェノール、アミン、サルファイド、エーテル、アルデヒド、カルボニル基、シアン及び抗生物質）をあげることができる。尚、これらの殺菌法のうちできるだけ本還元酵素の酵素活性を失活させず、かつ反応系への残留、汚染などの影響が少ない処理方法を各種の反応条件に応じて適宜選択することがよい。
【００２１】
このようにして調製された形質転換体又はその死菌化細胞は、例えば、凍結乾燥細胞、有機溶媒処理細胞、乾燥細胞等の形態、あるいは、固定化された形態（固定化物）で利用してもよい。
【００２２】
固定化物を得る方法としては、例えば、担体結合法（シリカゲルやセラミック等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等に本形質転換体又はその死菌化細胞を吸着させる方法）及び包括法（ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）、アルギン酸ゲル、寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に本形質転換体又はその死菌化細胞を閉じ込める方法）が挙げられる。
【００２３】
続いて、第一の本発明製造方法の第一工程における不斉還元反応について説明する。
第一の本発明製造方法の第一工程において一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルを不斉還元して一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルに変換する反応は、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力を有する酵素又は当該酵素を産生する微生物、あるいはそれらの処理物を作用させることによって達成される。
当該反応は、通常、水の存在下で行われる。水は緩衝液の形態であってもよく、この場合に用いられる緩衝剤としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の酢酸のアルカリ金属塩が挙げられる。
尚、緩衝液を溶媒として用いる場合、その量は一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステル１重量部に対して、通常、１〜３００重量倍、好ましくは５〜１００重量倍である。
当該反応に際しては、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルを反応系内に連続又は逐次加えてもよい。
【００２４】
反応温度としては、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルの３位にあるカルボニル基を不斉還元する能力を有する酵素（即ち、本還元酵素）又は当該酵素を産生する微生物、あるいはそれらの処理物に含まれた本還元酵素の安定性、反応速度の点から０〜７０℃程度をあげることができ、好ましくは約１０〜４０℃があげられる。
反応ｐＨとしては、反応が進行する範囲内で適宜変化させることができるが、例えば、５〜８をあげることができる。
【００２５】
反応は、水の他に有機溶媒の共存下に行うこともできる。この場合の有機溶媒としては、例えば、テトラヒドロフラン、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類、キ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル等のエステル類、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、イソオクタン、デカン等の炭化水素類、ｔ−ブタノール、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール等のアルコール類、ジメチルスルホキサイドなどのスルホキサイド類、アセトン等のカルボニル基類、アセトニトリル等のニトリル類及びこれらの混合物が挙げられる。
反応に使用する有機溶媒の量は、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルに対して、通常、１００重量倍以下であり、好ましくは７０重量倍以下である。
【００２６】
反応は、例えば、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨのような補酵素を加えて通常行うことがよい。
反応に用いられる補酵素の量は、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルに対して、通常、０．５重量倍以下、好ましくは０．１重量倍以下である。
【００２７】
さらに本還元酵素が依存する補酵素を再生するための共役系反応を組み合わせて用いることにより、当該補酵素の使用量を大幅に削減することができる。当該補酵素を再生する能力を有する酵素としては、例えば、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素又は有機脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素等）等が挙げられる。具体的には、グルコース脱水素酵素を精製酵素として用いる場合には、その使用量は、基質に対して通常、０．１〜１０重量％である。また、グルコースの使用量は、基質に対して通常、０．１〜１０モル当量である。
また、上記のような補酵素を再生する能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子と本還元酵素遺伝子とを同時に宿主細胞に導入してなる形質転換体を用いて不斉還元反応及び上記の共役系反応の両者を行うこともできる。
反応はさらに、必要に応じて、グルコース、シュークロース、フルクトース等の糖類、エタノール等のアルコール類、界面活性剤等を加えて行うこともできる。
【００２８】
不斉還元反応の終点は、例えば、反応液中の原料化合物の存在量を液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー等により追跡することにより決定することができる。反応時間の範囲としては、通常、５分間〜１０日間、好ましくは３０分間〜４日間、より好ましくは０．５時間から１０時間の範囲をあげることができる。
【００２９】
当該反応終了後は、触媒として酵素や微生物等を使用して化合物を製造する方法において通常用いられる化合物の回収方法により目的物を採取すればよい。例えば、まず反応液をヘキサン、ヘプタン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒で抽出する。必要に応じて反応液を濾過したり、又は遠心分離等の処理により不溶物を除去した後に前記抽出操作を行なえばよい。次に抽出された有機層を乾燥した後、濃縮物として目的物を回収することができる。目的物は、必要によりカラムクロマトグラフィー等によりさらに精製することができる。
また、上記の不斉還元反応が終了した後、生成した一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルを単離することなく、続く不斉加水分解反応に用いることもできる。
【００３０】
第ニの本発明製造方法の第一工程における不斉還元反応で用いられる金属触媒としては、例えば、ルテニウム−光学活性ホスフィン錯体、光学活性酒石酸−ラネーニッケル錯体等をあげることができる。さらに、ルテニウム−光学活性ホスフィン錯体における光学活性ホスフィンとしては、（Ｒ）−ＢＩＮＡＰ又は（Ｓ）−ＢＩＮＡＰ等があげられる。
【００３１】
第ニの本発明製造方法の第一工程における不斉還元反応における水素雰囲気下としては、例えば、水素カス圧５〜１００ｋｇ／ｃｍ２（０．５〜１０ＭＰａ）のような水素ガス加圧下等をあげることができる。
【００３２】
当該反応は、通常、有機溶媒の存在下で行われる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のプロトン性溶媒単独、あるいはこれらとテトラヒドロフラン、塩化メチレン、トルエン等の混合溶媒をあげることができる。尚、有機溶媒を用いる場合、その量は一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステル１重量部に対して、通常、０．１〜１００重量倍、好ましくは１〜１０重量倍である。
当該反応に際しては、一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステルを反応系内に連続又は逐次加えてもよい。
【００３３】
反応温度としては、通常、３０〜１５０℃程度、好ましくは約５０〜１２０℃があげられる。
【００３４】
反応の終点は、例えば、反応液中の原料化合物の存在量を液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー等により追跡することにより決定することができる。反応時間の範囲としては、通常、５分間〜２０時間、好ましくは３０分間〜１０時間の範囲をあげることができる。
【００３５】
反応終了後は、通常用いられる化合物の回収方法により目的物を採取すればよい。例えば、まず反応液をヘキサン、ヘプタン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒で抽出する。次に抽出された有機層を乾燥した後、濃縮物として目的物を回収することができる。目的物は、必要によりカラムクロマトグラフィー、蒸留等によりさらに精製することができる。
また、上記の不斉還元反応が終了した後、生成した一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルを単離することなく、続く不斉加水分解反応に用いることもできる。
【００３６】
次に、本発明製造方法の第ニ工程について説明する。
当該工程において用いられる原料である、前記光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体は、前記の本発明製造方法の第一工程で生成される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま公知の合成方法に基づいた付加的な工程を経ることにより誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルの誘導体である。付加的な工程としては、例えば、一般式（１）におけるＸで示される置換基がハロゲノメチル基である場合、当該置換基に対するシアノ化反応、アシルオキシ化反応、アルキルオキシ化反応等をあげることができる。このような反応は、一段階での反応でもよいし、多段階での反応であってもよい。上記の光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルの誘導体として、具体的には、例えば、４−シアノ−３−ヒドロキシ−ブタン酸エステル、４−アセトキシ−３−ヒドロキシブタン酸エステル、４−ベンジルオキシ−３−ヒドロキシブタン酸エステル等があげられる。
【００３７】
当該工程において用いられる触媒としては、例えば、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解酵素又は当該酵素を産生する微生物、あるいはそれらの処理物等をあげることができる。
【００３８】
本発明製造方法の第ニ工程で用いられるエステル加水分解酵素は、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解酵素である（以下、本加水分解酵素と記すこともある。）。本加水分解酵素のうち、例えば、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体の（Ｒ）体又は（Ｓ）体のいずれかのエステル結合部位を優先的に水解する能力を有するエステル加水分解酵素等を好ましいものとしてあげることができる。
【００３９】
本加水分解酵素は、市販品酵素であってもよく、また本加水分解酵素を産生する微生物等から通常の生化学的な手法や遺伝子工学的な手法（例えば、特開２００１−４６０８号公報、特開平７−１６３３６４、特開平５−５６７８７、特開２００１−４６０８４号公報、Ｇｅｎｅ　９６　１２５−１２８　１９９０、特開２０００−７８９８８号公報、特開平７−２１３２８０号公報に記載されている。）等を利用して調製することができる。例えば、本加水分解酵素を産生する微生物が形質転換体である場合には、当該形質転換体としては、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含有するプラスミドが少なくとも導入されてなる形質転換体（以下、本形質転換体２と記すこともある。）等をあげることができる。また、本加水分解酵素を産生する微生物が非形質転換体（即ち、前記能力が人為的に付与されていないにも係わらず、予め当該能力を有する微生物）である場合には、当該非形質転換体としては、後述の実施例のように、市販の微生物又は土壌などから前記能力を指標にしてスクリーニングすることにより単離された微生物等があげられる。このような微生物の例としては、アルスロバクターＳＣ−６−９８−２８　（ＦＥＲＭ　ＢＰ−３６５８）株が属するアルスロバクター属、アスペルギルス・フラバス　ＡＴＣＣ−１１４９２株が属するようなアスペルギルス属、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６７０３）株が属するようなクロモバクテリウム属、キラザイムＬ−２やキラザイムＬ−５（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）の起源微生物が属するようなキャンデイダ属等に属する微生物等をあげることができる。
【００４０】
「一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解酵素」の具体的な例としては、例えば、下記のアミノ酸配列群の中から選ばれるアミノ酸配列を有する酵素が持つ能力をあげることができる。
＜アミノ酸配列群＞
（ａ１）配列番号５で示されるアミノ酸配列
（ａ２）配列番号７で示されるアミノ酸配列
（ａ３）配列番号９で示されるアミノ酸配列
（ｂ１）配列番号５で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解酵素のアミノ酸配列
（ｂ２）配列番号７で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解酵素のアミノ酸配列
（ｂ３）配列番号９で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解酵素のアミノ酸配列
（ｃ１）配列番号６で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列
（ｃ２）配列番号８で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列
（ｃ３）配列番号１０で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列
（ｄ１）配列番号６で示される塩基配列からなるＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列を有し、かつ、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解酵素のアミノ酸配列
（ｄ２）配列番号８で示される塩基配列からなるＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列を有し、かつ、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解酵素のアミノ酸配列
（ｄ３）配列番号１０で示される塩基配列からなるＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列を有し、かつ、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解酵素のアミノ酸配列
（ｅ１）クロモバクテリウム属に属する微生物由来の、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解酵素のアミノ酸配列
（ｅ２）アルスロバクター属に属する微生物由来の、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解酵素のアミノ酸配列
（ｅ３）アスペルギルス属に属する微生物由来の、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解酵素のアミノ酸配列
【００４１】
本形質転換体２を作製する際に用いられる、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解酵素（即ち、本加水分解酵素）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（以下、本加水分解酵素遺伝子と記すこともある。）は、（１）天然に存在する遺伝子の中からクローニングされたものであってもよいし、（２）天然に存在する遺伝子であっても、このクローニングされた遺伝子の塩基配列において、その一部の塩基の欠失、置換又は付加が人為的に導入されてなる遺伝子（即ち、天然に存在する遺伝子を変異処理（部分変異導入法、突然変異処理等）を行ったものであってもよいし、（３）人為的に合成されたものであってもよい。
【００４２】
ここで、前記（ｂ）、（ｂ１）、（ｂ２）又は（ｂ３）にある「アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」や前記（ｄ）、（ｄ１）、（ｄ２）又は（ｄ３）にある「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列」には、例えば、配列番号５、７又は９で示されるアミノ酸配列を有する酵素が細胞内で受けるプロセシング、該酵素が由来する生物の種差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、人為的なアミノ酸の変異等が含まれる。
前記（ｂ）、（ｂ１）、（ｂ２）又は（ｂ３）にある「（アミノ酸が）欠失、置換若しくは付加（された）」（以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。）を人為的に行う場合の手法としては、例えば、配列番号５、７又は９で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このＤＮＡを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１２，９４４１−９４５６（１９８４））、変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法等が挙げられる。
前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも１残基、具体的には１若しくは数個、又はそれ以上である。かかる改変の数は、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を見出すことのできる範囲であればよい。
また前記欠失、置換若しくは付加のうち、特にアミノ酸の置換に係る改変が好ましい。当該置換は、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸への置換がより好ましい。このような置換としては、例えば、▲１▼グリシン、アラニン；▲２▼バリン、イソロイシン、ロイシン；▲３▼アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；▲４▼セリン、スレオニン；▲５▼リジン、アルギニン；▲６▼フェニルアラニン、チロシンのグループ内での置換が挙げられる。
【００４３】
本発明において「（アミノ酸が）欠失、置換若しくは付加（された）」には、例えば、２つの蛋白質間のアミノ酸配列に関する高い配列同一性（具体的には、８０％以上の配列同一性、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性）が存在している必要がある。また「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」には２つのＤＮＡ間の塩基配列に関する配列同一性（具体的には、８０％以上の配列同一性、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性）が存在している必要がある。
ここで「配列同一性」とは、２つのＤＮＡ又は２つの蛋白質間の配列の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡ又は蛋白質は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ　ＮＴＩを用いて、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．，２２（２２）：４６７３−４６８０（１９９４）を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはＶｅｃｔｏｒ　ＮＴＩ、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐにおいて、一般的に利用可能である。
前記（ｄ）又は（ｄ１）にある「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．，　Ｆｒｉｓｃｈ　Ｅ．　Ｆ．，　Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド　スプリング　ハーバー　ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｐｒｅｓｓ）に記載される方法や、「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、１９８９年、農村文化社発行）に記載されているサザンハイブリダイゼーション法等の通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ（９００ｍＭ　ＮａＣｌ、９０ｍＭ　クエン酸三ナトリウムを含む溶液。尚ここでは、ＮａＣｌ１７５．３ｇ、クエン酸三ナトリウム８８．２ｇを含む溶液を水８００ｍｌで溶解し、１０Ｎ　ＮａＣｌでｐＨを調製した後、全量を１０００　ｍｌとした溶液を２０×ＳＳＣとする。）中で６５℃にてハイブリッドを形成させた後、２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｎ．　Ｙ．　（１９８９），　６．３．１−６．３．６）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、２×ＳＳＣで５０℃の条件（低ストリンジェンシーな条件）から０．１×ＳＳＣで６５℃までの条件（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
【００４４】
本加水分解酵素遺伝子は、前述の還元酵素遺伝子調製方法同様に行なえばよい。例えば、下記のような調製方法に準じて調製すればよい。
アルスロバクターグロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ　ＩＦＯ１２９５８）等のアルスロバクター属に属する微生物等から通常の遺伝子工学的手法（例えば、「新　細胞工学実験プロトコール」（東京大学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、１９９３年）に記載された方法）に準じてｃＤＮＡライブラリーを調製し、調製されたｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、かつ適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、本加水分解酵素遺伝子を調製する。
【００４５】
本形質転換体２を調製する方法としては、例えば、本加水分解酵素遺伝子及び宿主細胞で機能可能なプロモーターが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡのような、本加水分解酵素遺伝子が宿主細胞中で発現できるような組換プラスミド（例えば、プロモーター、ターミネーター等の発現制御に関わる領域を本加水分解酵素遺伝子に連結して組換プラスミドを構築したり、ラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させるような組換プラスミド）を作製し、これを宿主細胞に導入することにより作製する方法等があげられる。さらに、本加水分解酵素遺伝子を宿主細胞の染色体中に導入する方法も利用することができる。
上記の組換プラスミドとしては、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖できるものであって、宿主細胞からの単離・精製が容易であり、宿主細胞中で機能可能なプロモーターを有し、検出可能なマーカーを持つ発現ベクターに、本加水分解酵素をコードする遺伝子が機能可能な形で導入されたものを好ましく挙げることができる。尚、発現ベクターとしては、各種のものが市販されている。
ここで、「機能可能な形で」とは、上記の組換プラスミドを宿主細胞に導入することにより宿主細胞を形質転換させた際に、本加水分解酵素遺伝子が、プロモーターの制御下に発現するようにプロモーターと結合された状態にあることを意味する。プロモーターとしては、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター、大腸菌のトリプトファンオペロンのプロモーター、又は、ｔａｃプロモーターもしくはｔｒｃプロモーター等の大腸菌内で機能可能な合成プロモーター等をあげることができる。またコリネバクテリウム・シュードジフテリティカム、ペニシリウム・シトリナム、バシラス・メガテリウムにおいて本加水分解酵素遺伝子の発現を制御しているプロモーターを利用してもよい。
また発現ベクターとしては、選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子等）を含むベクターを用いると、当該ベクターが導入された形質転換体を当該選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして容易に選択することができる。
さらなる高発現を導くことが必要な場合には、本加水分解酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の上流にリボゾーム結合領域を連結してもよい。用いられるリボゾーム結合領域としては、Ｇｕａｒｅｎｔｅ　Ｌ．ら（Ｃｅｌｌ　２０，　ｐ５４３）や谷口ら（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，　ｐ２０２，　講談社）による報告に記載されたものを挙げることができる。
宿主細胞としては、原核生物（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属）もしくは真核生物（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属）である微生物細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞等を挙げることができる。例えば、本形質転換体２の大量調製が容易になるという観点では、大腸菌等を好ましく挙げることができる。
本加水分解酵素が宿主細胞中で発現できるようなプラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、用いられる宿主細胞に応じて通常使われる導入方法であればよく、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．　ＩＳＢＮＯ−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載される塩化カルシウム法や、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ：Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ　／Ｅ．ｃｏｌｉＰｕｌｓｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍ」　Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　（１９９３）等に記載されるエレクトロポレーション法等をあげることができる。
宿主細胞において本加水分解酵素遺伝子が宿主細胞中で発現できるようなプラスミドが導入された形質転換体を選抜するには、前記の如く、例えば、ベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の表現型を指標にして選抜すればよい。
プラスミドが導入された宿主細胞（即ち、形質転換体）が本加水分解酵素遺伝子を保有していることは、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ等に記載される通常の方法に準じて、制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ウエスタンハイブリダイゼーション等を行うことにより、確認することができる。
【００４６】
本形質転換体２の培養は、微生物培養、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞の培養に使用される通常の方法によって行うことができる。例えば大腸菌の場合、適当な炭素源、窒素源およびビタミン等の微量栄養物を適宜含む培地中で培養を行う。培養方法としては、固体培養、試験管振盪式培養、往復式振盪培養、ジャーファーメンター（Ｊａｒ　Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）培養、タンク培養等の液体培養のいずれの方法でもよく、好ましくは、通気撹拌培養法等の液体培養を挙げることができる。
培養温度は、本形質転換体２が生育可能な範囲で適宜変更できるが、通常約１０〜５０℃、好ましくは約２０〜４０℃である。
培地のｐＨは約６〜８の範囲が好ましい。
培養時間は、培養条件によって異なるが通常約１日〜約５日が好ましい。
本形質転換体２を培養するための培地としては、例えば、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される炭素源や窒素源、有機塩や無機塩等を適宜含む各種の培地を用いることができる。
炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、シュークロース等の糖類、グリセロール等の糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸、動物油、植物油及び糖蜜が挙げられる。これらの炭素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー（Ｃｏｒｎ　Ｓｔｅｅｐ　Ｌｉｑｕｏｒ）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、アミノ酸類、硝酸ナトリウム等の無機酸のアンモニウム塩、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩及び尿素が挙げられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は多くの場合には炭素源としても使用することができる。これらの窒素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
有機塩や無機塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びリン酸塩を挙げることができる。具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素一カリウム及びリン酸水素二カリウムが挙げられる。これらの有機塩及び／又は無機塩の培地への添加量は培養液に対して通常０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）程度である。
さらに、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター及びｌａｃプロモーター等のアロラクトースで誘導されるタイプのプロモーターと、本加水分解酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子とが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡが導入されてなる形質転換体の場合には、本加水分解酵素の生産を誘導するための誘導剤として、例えば、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ　ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を培地中に少量加えることもできる。
【００４７】
本形質転換体２の取得は、例えば、前記の培養により得られた培養物を遠心分離等により形質転換体を沈殿物として回収すればよい。必要に応じて、回収前に当該形質転換体を、例えば、１００ｍＭリン酸１カリウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ６．５）等の緩衝液等を用いて洗浄してもよい。
【００４８】
本発明製造方法の第二工程では、触媒として、例えば、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解酵素を産生する微生物が使用されるが、その用いられる形態には、（１）培養液をそのまま用いる形態、（２）培養液の遠心分離等により菌体を集め、当該菌体を緩衝液若しくは水で洗浄することにより得られた湿菌体を用いる形態、等の培養により得られた微生物の菌体をそのまま用いる形態が含まれる。この場合には、その使用量は、例えば、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体に対して、通常、０．０１〜２００重量倍程度、好ましくは０．１〜５０重量倍程度である。
また、例えば、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解酵素あるいは当該酵素又は当該酵素を産生する微生物の処理物も使用されるが、その用いられる形態には、培養液の遠心分離等により菌体を集め、当該菌体を緩衝液若しくは水で洗浄した湿菌体を、（１）有機溶媒（アセトン、エタノール等）処理することにより得られたものを用いる形態や（２）凍結乾燥処理することにより得られたものを用いる形態や（３）アルカリ処理することにより得られたものを用いる形態や（４）菌体を物理的に又は酵素的に破砕することにより得られたものを用いる形態、さらには、これらのものを公知の方法により固定化処理することにより得られたものを用いる形態も含まれる。この場合には、その使用量は、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル又はその誘導体に対して、通常、０．００１〜２重量倍程度、好ましくは０．０２〜０．５重量倍程度である。
【００４９】
一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解酵素又は当該酵素を産生する微生物、あるいはそれらの処理物のうち、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解酵素を人為的に付与されてなる形質転換体又はその死菌化細胞が好ましく使用される。
【００５０】
本形質転換体２から、その死菌化細胞を下記の方法により調製することもできる。
死菌化処理方法としては、例えば、物理的殺菌法（加熱、乾燥、冷凍、光線、超音波、濾過、通電）や、化学薬品を用いる殺菌法（アルカリ、酸、ハロゲン、酸化剤、硫黄、ホウ素、砒素、金属、アルコール、フェノール、アミン、サルファイド、エーテル、アルデヒド、カルボニル基、シアン及び抗生物質）をあげることができる。尚、これらの殺菌法のうちできるだけ本加水分解酵素の酵素活性を失活させず、かつ反応系への残留、汚染などの影響が少ない処理方法を各種の反応条件に応じて適宜選択することがよい。
【００５１】
このようにして調製された形質転換体又はその死菌化細胞は、例えば、凍結乾燥細胞、有機溶媒処理細胞、乾燥細胞等の形態、あるいは、固定化された形態（固定化物）で利用してもよい。
【００５２】
固定化物を得る方法としては、例えば、担体結合法（シリカゲルやセラミック等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等に本形質転換体２又はその死菌化細胞を吸着させる方法）及び包括法（ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）、アルギン酸ゲル、寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に本形質転換体２又はその死菌化細胞を閉じ込める方法）が挙げられる。
【００５３】
続いて、本発明製造方法の第二工程における不斉加水分解反応について説明する。
当該工程において一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体を不斉水解する反応は、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、当該エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体のエステル結合部位を不斉水解する能力を有するエステル加水分解酵素又は当該酵素を産生する微生物、あるいはそれらの処理物を作用させることによって達成される。
当該反応は、通常、水の存在下で行われる。水は緩衝液の形態であってもよく、この場合に用いられる緩衝剤としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の酢酸のアルカリ金属塩が挙げられる。
尚、緩衝液を溶媒として用いる場合、その量は一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル又はその誘導体１重量部に対して、通常、１〜３００重量倍、好ましくは５〜１００重量倍である。
当該反応に際しては、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル又はその誘導体を反応系内に連続又は逐次加えてもよい。
【００５４】
反応温度としては、本形質転換体２又はその死菌化細胞に含まれた本加水分解酵素の安定性、反応速度の点から０〜７０℃程度をあげることができ、好ましくは約１０〜４０℃があげられる。
反応ｐＨとしては、反応が進行する範囲内で適宜変化させることができるが、例えば、５〜８をあげることができる。
【００５５】
反応は、水の他に有機溶媒の共存下に行うこともできる。この場合の有機溶媒としては、例えば、テトラヒドロフラン、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類、キ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル等のエステル類、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、イソオクタン、デカン等の炭化水素類、ｔ−ブタノール、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール等のアルコール類、ジメチルスルホキサイドなどのスルホキサイド類、アセトン等のカルボニル基類、アセトニトリル等のニトリル類及びこれらの混合物が挙げられる。
反応に使用する有機溶媒の量は、一般式（２）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル又はその誘導体に対して、通常、１００重量倍以下であり、好ましくは７０重量倍以下である。
【００５６】
反応の終点は、例えば、反応液中の原料化合物の存在量を液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー等により追跡することにより決定することができる。反応時間の範囲としては、通常、５分間〜１０日間、好ましくは３０分間〜４日間の範囲をあげることができる。
【００５７】
次に、本発明製造方法の第三工程について説明する。
当該工程において反応液から光学活性３−ヒドロキシブタン酸系化合物
［（Ｉ）不斉水解しない光学異性体、即ち、
（Ｉ−ａ）一般式（３）
【化９】
2004041070.tif 000006
（式中、Ｘはシアノメチル基、置換されていてもよいベンジルオキシメチル基、置換されていてもよいアルコキシメチル基、置換されていてもよいアシルオキシメチル基又はヒドロキシメチル基、Ｒは置換されていてもよい炭素数１から４の低級アルキル基を表す。）
で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、又は、
（Ｉ−ｂ）当該エステルが有する不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体、
あるいは、
（ＩＩ）反応液から不斉水解する光学異性体から生じた一般式（４）
【化１０】
2004041070.tif 000007
（式中、Ｘはシアノメチル基、置換されていてもよいベンジルオキシメチル基、置換されていてもよいアルコキシメチル基、置換されていてもよいアシルオキシメチル基又はヒドロキシメチル基を表す。）
で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸又はその誘導体、即ち、
（ＩＩ−ａ）反応液から不斉水解する光学異性体である光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルから生じた一般式（４）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸、又は、
（ＩＩ−ｂ）反応液から不斉水解する光学異性体である光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルが有する不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル誘導体から生じた一般式（４）で示される光学活性３−ヒドロキシブタン酸誘導体］
を回収するには、反応終了後に、触媒として酵素や微生物等を使用して化合物を製造する方法において通常用いられる化合物の回収方法に準じて目的物を採取すればよい。例えば、まず反応液をヘキサン、ヘプタン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒で抽出する。必要に応じて反応液を濾過したり、又は遠心分離等の処理により不溶物を除去した後に前記抽出操作を行なえばよい。次に抽出された有機層を乾燥した後、濃縮物として目的物を回収することができる。目的物は、必要によりカラムクロマトグラフィー等により
さらに精製することができる。
【００５８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。
【００５９】
実施例１　（本発明製造方法の例（その１））
（１−１）本発明製造方法の第一工程（不斉還元反応）；
０．１Ｍリン酸バッファ−（ｐＨ６．５）　１５ｍｌにグルコース　２．３ｇ、ＮＡＤＰ＋　０．７ｍｇ、４−ベンジルオキシ−３−オキソブタン酸メチル　０．５２ｇを仕込んだところへ、実施例６で得られたＨＢ１０１（ｐＴｒｃＲＳｂＧ１２）の微生物培養液５．１ｇを添加した。反応中は、３０℃で攪拌しながら、反応混合物のｐＨを１５％炭酸ナトリウム水溶液で６．５に調整した。２０時間後、この反応混合物を、酢酸エチルで抽出、遠心分離することにより有機層を分離した。さらに減圧下で分離された有機層の溶媒を留去することにより、４−ベンジルオキシ−３−ヒドロキシブタン酸メチル　０．５０ｇ（光学純度９４％ｅｅ、４−ベンジルオキシ−３−オキソブタン酸メチルに対する収率９４％）を得た。
【００６０】
（１−２）本発明製造方法の第ニ工程（不斉加水分解反応）及び第三工程（回収）；
０．１Ｍリン酸バッファ−（ｐＨ６．５）　２００ｍＬに、実施例７で得られたＪＭ１０５（ｐＣＣ１６０Ａ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ）の微生物培養液１０ｍＬを加えたところへ、上記（１−１）で得られた４−ベンジルオキシ−３−ヒドロキシブタン酸メチル０．５ｇ及びメタノール６ｍｌを添加した。反応中は、２０℃で撹拌しながら、反応混合物のｐＨを１５％炭酸ナトリウム水溶液で６．５に調整した。２４時間後、この反応混合物を酢酸エチル２００ｍＬで抽出、遠心分離することにより有機層分離した。さらに減圧下で分離された有機層の溶媒を留去することにより、（Ｓ）−４−ベンジルオキシ−３−ヒドロキシブタン酸メチル　０．４１ｇ（光学純度９８％ｅｅ）を得た。
光学純度分析条件：
カラム：キラルセルＯＢ−Ｈ（ダイセル化学）
移動層：ヘキサン／イソプロパノール／トリフルオロ酢酸＝２７００／３００／３
検出器：ＵＶ　２２０ｎｍ
溶出時間：３７．０分、３８．８分
尚、当該工程において用いられた原料である４−ベンジルオキシ−３−オキソブタン酸メチルの調製は、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９９５）１０１４に記載される方法に準じた。また光学異性体の分析については、別途調製した４−ベンジルオキシ−３−ヒドロキシブタン酸メチルのラセミ体との比較により行なった。
【００６１】
実施例２　（本発明製造方法の第一工程（不斉還元反応））
０．１Ｍリン酸バッファ−（ｐＨ６．５）　１５ｍｌにグルコース　０．７５ｇ、ＮＡＤＰ＋　０．７ｍｇ、４−ブロモ−３−オキソブタン酸メチル　０．３０ｇ、酢酸ブチル１５ｍＬを仕込んだところへ、実施例６で得られたＨＢ１０１（ｐＴｒｃＲＳｂＧ１２）の微生物培養液　２ｇを添加した。反応中は、３０℃で攪拌しながら、反応混合物のｐＨを１５％炭酸ナトリウム水溶液で６．５に調整した。２４時間後、この反応混合物を、酢酸エチルで抽出、遠心分離することにより有機層を分離した。さらに減圧下で分離された有機層の溶媒を留去することにより、４−ブロモ−３−ヒドロキシブタン酸メチル　０．２７ｇ（光学純度９７％ｅｅ、４−ブロモ−３−オキソブタン酸メチルに対する収率９０％）を得た。
４−ブロモ−３−ヒドロキシブタン酸メチルの光学純度分析
カラム：γ−ＴＡ（０．２５ｍｍφ×３０ｍ、０．１２５μｍ）
カラム温度：１１０゜Ｃ（２０分）−（５℃／分）−１８０℃（１分）
キャリア−流量　：Ｈｅ１．０ｍＬ／分
注入口　　：２５０℃
検出器　　：２５０℃　　スフ゜リット比　：１／５０
溶出時間：　１７．６、１８．１分
【００６２】
実施例３　（本発明製造方法（その２）
（３−１）　本発明製造方法の第一工程（不斉還元反応）；
窒素置換をおこなった１Ｌオートクレーブに４−クロロアセト酢酸エチル４０ｇ、エタノール１５０ｍＬを仕込んだところへ、窒素雰囲気下Ｒｕ２Ｃｌ４（（＋）−ＢＩＮＡＰ）２（Ｃ２Ｈ５）３Ｎ　０．５ｇを加えて密閉し、内温を１００℃した。水素をオートクレーブ内に導入し内圧　約　１　Ｍｐａで４時間攪拌を続けた。反応マスを室温に戻した後、反応液を濃縮、さらに減圧蒸留し（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸エチルを３０ｇを得た。（ＧＣ分析による光学純度９２％ｅｅ）。
４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸エチルの光学純度分析
カラム：γ−ＴＡ（０．２５ｍｍφ×３０ｍ、０．１２５μｍ）
カラム温度：１１０゜Ｃ（２０分）−（５℃／分）−１８０℃（１分）
キャリア−流量　：Ｈｅ１．０ｍＬ／分
注入口　　：２５０℃
検出器　　：２５０℃　　スフ゜リット比　：１／５０
溶出時間：　１３．５分、１４．１分
【００６３】
（３−２）本発明製造方法の付加的な工程、第ニ工程（不斉加水分解反応）及び第三工程（回収）；
（３−２−ａ）本発明製造方法の付加的な工程（第一工程により得られる光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま公知の合成方法に基づいた付加的な工程を経ることにより誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルの誘導体に関する製造方法）；
上記（３−１）で得られた（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸エチル（光学純度９２％ｅｅ）２８ｇを５分間かけて滴下し、さらに室温で１０分間攪拌した。その後、反応混合物を氷冷し、シアン化ナトリウム８．７ｇを加え、続いて内温２５〜３３℃で４．５時間攪拌した。反応混合物に濃塩酸を加え、反応混合物のｐＨを１未満とした後、酢酸エチルで５回抽出した。有機層を合わせて減圧下で溶媒を留去することにより、残渣を得た。得られた残渣を酢酸エチル２００ｍＬに溶解した後、これを無水硫酸マグネシウムで乾燥し、次いで濾過することにより、（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸の溶液を得た。この溶液に氷冷下で、トリエチルアミン２０ｇ及び硫酸ジエチル２７ｇを滴下し、室温まで自然昇温させながら攪拌した。さらに５５〜６３℃で４０分間攪拌した後、氷冷し、反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍｌ）を加えた。有機層を分液し、水層を酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせて飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、次いで濃縮した。濃縮物を減圧蒸留することにより、（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸エチル１４ｇ（純度９５％；光学純度９４％ｅｅ）を得た。
【００６４】
（３−２−ｂ）第ニ工程（不斉加水分解反応）及び第三工程（回収）；
０．１Ｍリン酸バッファ−（ｐＨ６．５）　２００ｍＬ、実施例８で得られたＪＭ１０５（ＳＣ−６−９８−２８）の微生物培養液１０ｍＬを加えたところへ、上記（３−２−ａ）で得られた（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸エチル　０．５ｇ及びメタノール６ｍｌを添加した。反応中は、２０℃で撹拌しながら、反応混合物のｐＨを１５％炭酸ナトリウム水溶液で６．５に調整した。２４時間後、この反応混合物を濾過し、得られた濾液を酢酸エチルで抽出、遠心分離することにより有機層分離した。さらに減圧下で分離された有機層の溶媒を留去することにより、（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸エチル　０．４１ｇ（光学純度９７％ｅｅ）を得た。
光学純度分析条件
カラム：キラルセルＯＤ（ダイセル化学）
移動層：ヘキサン／イソプロパノール＝４／１
検出器：ＵＶ　２３０ｎｍ
溶出時間：１１．５分、１２．５分
尚、光学異性体の分析については、４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸エチルのラセミ体から別途調製した４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸エチルとの比較により行なった。
【００６５】
実施例４　（本発明製造方法の例（その３））
（４−１）本発明製造方法の第一工程（不斉還元反応）；
あらかじめ窒素置換した１００ｍｌオートクレーブに、４−クロロ−３−オキソブタン酸エチル約０．３ｍｏｌとｔ−ブチルアルコール１２０ｍｌを加え、ここにＲｕ２Ｃｌ４［（Ｒ）−ＢＩＮＡＰ］２Ｅｔ３Ｎ　１５０μＭの塩化メチレン２ｍｌ溶液を加え、水素圧１０〜１５ｋｇ／ｃｍ２、反応温度１００℃で２時間攪拌して水素化を行なう。溶媒を留去して残渣を減圧蒸留することにより、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸エチルを得る。
【００６６】
（４−２）本発明製造方法の付加的な工程（第一工程により得られる光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルからその不斉炭素の絶対立体配置を保持したまま公知の合成方法に基づいた付加的な工程を経ることにより誘導された光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステルの誘導体に関する製造方法；
水５０ｇに塩化カルシウム２３ｇ及び水酸化カルシウム８．４ｇを加え、室温で２０分間攪拌した。ここに上記（４−１）で得られる（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸エチル２８ｇを５分間かけて滴下し、さらに室温で１０分間攪拌する。その後、反応混合物を氷冷し、シアン化ナトリウム８．７ｇを加え、続いて内温２５〜３３℃で４．５時間攪拌する。反応混合物に濃塩酸を加え、反応混合物のｐＨを１未満とした後、酢酸エチルで５回抽出する。有機層を合わせて減圧下で溶媒を留去することにより、残渣を得る。得られる残渣を酢酸エチル２００ｍＬに溶解した後、これを無水硫酸マグネシウムで乾燥し、次いで濾過することにより、（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸の溶液を得る。この溶液に氷冷下で、トリエチルアミン２０ｇ及び硫酸ジエチル２７ｇを滴下し、室温まで自然昇温させながら攪拌する。さらに５５〜６３℃で４０分間攪拌した後、氷冷し、反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍｌ）を加える。有機層を分液し、水層を酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせて飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、次いで濃縮する。濃縮物を減圧蒸留することにより、（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸エチルを得る。
【００６７】
（４−３）第ニ工程（不斉加水分解反応）及び第三工程（回収）；
０．１Ｍリン酸バッファ−（ｐＨ６．５）　２００ｍＬ、実施例８で得られたＪＭ１０５（ＳＣ−６−９８−２８）の微生物培養液１０ｍＬを加えたところへ、上記（４−２）で得られる（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸エチル　０．５ｇ及びメタノール６ｍｌを添加する。反応中は、２０℃で撹拌しながら、反応混合物のｐＨを１５％炭酸ナトリウム水溶液で６．５に調整する。２４時間後、この反応混合物を濾過し、得られる濾液を酢酸エチルで抽出、遠心分離することにより有機層分離する。さらに減圧下で分離された有機層の溶媒を留去することにより、（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸エチルを得る。
光学純度分析条件
カラム：キラルセルＯＤ（ダイセル化学）
移動層：ヘキサン／イソプロパノール＝４／１
検出器：ＵＶ　２３０ｎｍ
溶出時間：１１．５分、１２．５分
尚、光学異性体の分析については、４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸エチルのラセミ体から別途調製した４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸エチルとの比較により行う。
【００６８】
実施例５　（本還元酵素を産生する微生物の処理物の調製）
５００ｍｌの坂口フラスコに滅菌済み培地（１Ｌの水にポテト抽出物２００ｇ及びデキストロース２０ｇを加えたもの）１００ｍｌを入れ、ここに市販のペニシリウムシトリナムＩＦＯ４６３１株（財団法人　発酵研究所（ｗｗｗ．ｉｆｏ．ｏｒ．ｊｐ）から入手可能）の菌体を植菌した。これを３０℃で好気条件下、４８時間振盪培養した。その後、培養液を遠心分離（８０００ｘｇ、１０分）して菌体を集め、集められた菌体を生理的食塩水５ｍｌに懸濁した。この菌体懸濁液に冷やしたアセトン３００ｍｌを加え、濾過した。回収された菌体を真空乾燥することにより、ペニシリウムシトリナムＩＦＯ４６３１のアセトン乾燥処理菌体１０ｇを得た。
【００６９】
実施例６　（本形質転換体の調製（その１））
（６−１）本還元酵素遺伝子の調製
（６−１−ａ）ｃＤＮＡライブラリーの調製
５００ｍｌフラスコに培地（水にポテト・デキストロース・ブロース（ベクトン・ディッキンソン社製）を２４ｇ／Ｌの割合で溶解したもの）１００ｍｌを入れ、１２１℃で１５分間滅菌した。ここに同組成の培地中で培養（３０℃、４８時間、振盪培養）したペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｉｔｒｉｎｕｍ）ＩＦＯ４６３１株（財団法人　発酵研究所（ｗｗｗ．ｉｆｏ．ｏｒ．ｊｐ）から入手可能）の培養液０．５ｍｌを加え、３０℃で好気条件下、７２時間振盪培養した。その後、培養液を遠心分離（８０００ｘｇ、１０分）して菌体を集め、集められた菌体を２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）５０ｍｌで３回洗浄することにより、約１．０ｇの洗浄菌体を得た。
得られた洗浄菌体を用いて、チオシアン酸グアニジンフェノールクロロホルム法で全ＲＮＡを調製した。調製された全ＲＮＡから、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（ｄＴ）３０−Ｓｕｐｅｒ（宝酒造社製）を用いてｐｏｌｙ（Ａ）を有するＲＮＡを得た。
ｃＤＮＡライブラリーの作製は、Ｇｕｂｌｅｒ　ａｎｄ　Ｈｏｆｆｍａｎ法に基づいて実施した。まず、上記のようにして得られたｐｏｌｙ（Ａ）を有するＲＮＡ、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１８−リンカープライマー（（含ＸｈｏＩサイト）宝酒造社製）、ＲＡＶ−２　Ｒｔａｓｅ及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ　Ｒｔａｓｅを用いて一本鎖ｃＤＮＡを調製した。調製された一本鎖ｃＤＮＡ（を含む前記反応液）にＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｅ．　ｃｏｌｉ　Ｒｎａｓｅ／Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ　Ｍｉｘｔｕｒｅ及びＴ４　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加えることにより、二本鎖ｃＤＮＡの合成及び当該二本鎖ｃＤＮＡの平滑末端化処理を行った。
このようにして得られた二本鎖ｃＤＮＡとＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩアダプター（宝酒造社製）とのライゲーションを行った。ライゲーション後に得られたＤＮＡを、以下の順で、リン酸化処理、ＸｈｏＩでの切断処理、スピンカラム（宝酒造社製）を用いる低分子量ＤＮＡの除去処理、λＺａｐＩＩ（ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ切断）とのライゲーションした後、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｋｉｔ　（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いてパッケージングすることにより、ｃＤＮＡライブラリー（以下、ｃＤＮＡライブラリー（Ａ）と記すこともある。）を調製した。
【００７０】
（６−１−ｂ）本還元酵素遺伝子を含有するプラスミドの調製（プラスミドｐＴｒｃＲＰｃの構築）
配列番号１３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１４で示されるオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、上記（６−１−ａ）で調製されたｃＤＮＡライブラリーを鋳型にして下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。（ロシュ・ダイアグノスティック社製のＥｘｐａｎｄ　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍを使用）
【００７１】
［反応液組成］
ｃＤＮＡライブラリー原液　　　　　　　１μｌ
ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ−ｍｉｘ）　　　　　　　　　０．４μｌ
プライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）　　　　　　各０．７５μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（ｗｉｔｈ　ＭｇＣｌ２）　　　　　　　５μｌ
ｅｎｚ．ｅｘｐａｎｄＨｉＦｉ　（３．５ｘ１０３Ｕ／ｍｌ）　　０．３７５μｌ
超純水　　　　　　　　　　　　　　４１．７２５μｌ
【００７２】
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をＰＥＲＫＩＮ　ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９７℃（２分間）に加熱した後、９７℃（０．２５分間）−５５℃（０．５分間）−７２℃（１．５分間）のサイクルを１０回、次いで９７℃（０．２５分間）−５５℃（０．５分間）−７２℃（２．５分間）のサイクルを２０回行い、さらに７２℃で７分間保持した。
【００７３】
ＰＣＲ反応液を精製して得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片に２種類の制限酵素（ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ）を加えることにより、当該ＤＮＡ断片を２重消化させた。次いで得られたＤＮＡ断片を精製した。
一方、ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を２種類の制限酵素（ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ）を加えることにより、当該ベクターを２重消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製した。
このようにして精製して得られた２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。得られたライゲーション液でＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αを形質転換した。
得られた形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ　（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて本還元酵素遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐＴｒｃＲＰｃと記すこともある。）を取り出した。
次に、取り出されたプラスミドｐＴｒｃＲＰｃを鋳型として、Ｄｙｅ　ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（パーキンエルマー製）を用いたシークエンス反応を行った後、得られたＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシーケンサー３７３Ａ（パーキンエルマー製）で解析した。その結果を配列番号１に示した。
【００７４】
（６−２）グルコース脱水素酵素遺伝子の調製
（６−２−ａ）染色体ＤＮＡ（Ｂ）の調製
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ　ＩＦＯ１２１０８株（財団法人　発酵研究所（ｗｗｗ．ｉｆｏ．ｏｒ．ｊｐ）から入手可能）からＱｉａｇｅｎ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　Ｔｉｐ　（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、それに付属するマニュアルに記載される方法に従って染色体ＤＮＡ（以下、染色体ＤＮＡ（Ｂ）と記すこともある。）を精製した。
【００７５】
（６−２−ｂ）グルコース脱水素酵素遺伝子を含むプラスミドの調製
Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ．２６４，　Ｎｏ．１１，　６３８１−６３８５（１９８９）に記載されたＢａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ　ＩＷＧ３由来のグルコース脱水素酵素のアミノ酸配列に基づいて配列番号１５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーとを合成した。
配列番号４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーとをプライマーに用い、前記（６−２−ａ）で精製された染色体ＤＮＡ（Ｂ）を鋳型にして（６−１−ｂ）に記載させる反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。（ロシュ・ダイアグノスティック社製のＥｘｐａｎｄ　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍを使用）
ＰＣＲ反応液を精製して得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＴＯＰＯＴＭＴＡ　ｃｌｏｎｉｎｇキットを用いてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターの既存「ＰＣＲ　Ｐｒｏｄｕｃｔ挿入サイト」にライゲーションした。得られたライゲーション液でＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αを形質転換した。
得られた形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ　（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてグルコース脱水素酵素遺伝子を含むプラスミド（以下、このプラスミドをプラスミドｐＳＤＧＤＨ１２と記すこともある。）を取り出した。
次に、取り出されたプラスミドｐＳＤＧＤＨ１２を鋳型として、Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（パーキンエルマー製）を用いたシークエンス反応を行った後、得られたＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシーケンサー３７３Ａ（パーキンエルマー製）で解析した。その結果を配列番号１９に示した。
【００７６】
（６−２−ｃ）還元酵素遺伝子及びグルコース脱水素酵素遺伝子を含むプラスミドの調製
プラスミドｐＳＤＧＤＨ１２に２種類の制限酵素（ＢａｍＨＩとＸｂａＩ）を加えることにより、当該プラスミドを２重消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドｐＴｒｃＲＰｃに２種類の制限酵素（ＢａｍＨＩとＸｂａＩ）を加えることにより、当該プラスミドを２重消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製した。
このようにして精製して得られた２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。得られたライゲーション液でＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αを形質転換した。
得られた形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ　（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて還元酵素遺伝子およびグルコース脱水素酵素遺伝子を含むプラスミド（以下、このプラスミドをｐＴｒｃＲＳｂＧ１２と記すこともある。）を取り出した。
【００７７】
（６−２−ｄ）還元酵素遺伝子及びグルコース脱水素酵素遺伝子を含む形質転換体の調製
ｐＴｒｃＲＳｂＧ１２プラスミドを用いてＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１を形質転換した。得られた形質転換体を５００ｍｌ容三角フラスコにＬＢ培地１００ｍｌを入れて滅菌した後、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌになるように加えたところに、接種し、３０℃で１８時間回転振とう培養した。次に３Ｌ容の小型培養槽（丸菱バイオエンジ社製、ＭＤＬ型）に滅菌した液体培地（水１Ｌにグリセロ−ル１５ｇ、酵母エキス２５ｇ及びリン酸一カリウム０．４ｇ、硫酸マグネシウム２ｇ硫酸第一鉄０．１ｇを溶解し、ｐＨ７．０とする。）１５００ｍｌを仕込み、そこへ上記の三角フラスコで培養した培養液１５ｍｌを接種した。３０℃で通気攪拌培養を始め、対数増殖期中期（培養１０〜１５時間）にＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を終濃度１ｍＭになるように添加した後、滅菌した培地を流加し、さらに培養を継続、計４０時間培養することにより、還元酵素遺伝子およびグルコース脱水素酵素遺伝子を含む形質転換体の培養液（この培養液をＨＢ１０１（ｐＴｒｃＲＳｂＧ１２）の培養液と記すこともある。）を得た。
【００７８】
実施例７　（本加水分解酵素を産生する微生物の調製（その１））
クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼ遺伝子組換え体微生物［ＪＭ１０５（ｐＣＣ１６０Ａ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ）］は、特開平７−２１３２８０号公報等に記載される方法に準じて作成した。即ち、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１４００９）由来のエステラーゼ遺伝子に部位特異的変異を導入した遺伝子を含むプラスミドｐＣＣ１６０Ａ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍを作成し、大腸菌ＪＭ１０５株に導入することにより組換え微生物を構築した。
以下にプラスミドｐＣＣ１６０Ａ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍの構築方法を示す。
【００７９】
（７−１）プラスミドｐＣＣ１６０Ａの調製
まず、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１由来の野生型エステラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＣＣ１０１を特開平７−２１３２８０号公報に記載された実施例１〜５にある方法に準じて作成した。同公報に記載された実施例７にある方法に準じて、プラスミドｐＣＣ１０１（０．５μｇ）を鋳型ＤＮＡとし、同公報に記載された実施例６にある方法に準じて作成した変異プライマ−ＭＹ−１（１００ｐｍｏｌ：特開平７−２１３２８０号公報に配列番号２７として記載されている。）および変異プライマー１６０Ａ（１００ｐｍｏｌ：特開平７−２１３２８０号公報に配列番号１１として記載されている。）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｒｅａｇｅｎｔ　キット（宝酒造株式会社製）によりＤＮＡ断片を増幅した。得られたＰＣＲ産物（２７０ｂｐＤＮＡ断片）をＳＵＰＲＥＣ−０２カラム（宝酒造株式会社製）を使用して精製した。
続いて、同様に、プラスミドｐＣＣ１０１（０．５μｇ）を鋳型ＤＮＡとし、変異プライマーＲＶ−Ｃ（５０ｐｍｏｌ：特開平７−２１３２８０号公報に配列番号２６として記載されている。）および先に精製した２７０ｂｐＤＮＡ断片（５０ｐｍｏｌ）をプライマーとしてＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｒｅａｇｅｎｔキット（宝酒造株式会社製）によりＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＣｅｌＩＩＩおよびＣｌａＩで消化し、サンプルを４％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ３：１Ａｇａｒｏｓｅ（宝酒造株式会社製）で電気泳動後、約２４０ｂｐのＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＤＮＡ精製キット（Ｂｉｏ１０１、Ｉｎｃ製）を用いて精製した。
一方、プラスミドｐＣＣ１０１（３μｇ）を制限酵素ＣｅｌＩＩＩおよびＣｌａＩで消化後、アルカリフォスファターゼ処理を行った。ついでこのＤＮＡ断片（４．２ｋｂｐ）と先に調製して得られた変異の導入された約２４０ｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて連結し、通常の方法に従って大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。
このようにして得られた形質転換体から定法に従いプラスミドｐＣＣ１６０Ａを調製した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの変異が導入されていることを確認した。
【００８０】
（７−２）プラスミドｐＣＣ１８９Ｙの調製
ｐＣＣ１６０Ａの調製の場合に用いられた変異プライマー１６０Ａを特開平７−２１３２８０号公報に記載された実施例６にある方法に準じて作成した変異プライマー１８９Ｙ（特開平７−２１３２８０号公報に配列番号２４として示されている。）に変更して、その他はプラスミドｐＣＣ１６０Ａの調製の場合と同様にして、プラスミドｐＣＣ１８９Ｙを調製した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの変異が導入されていることを確認した。
【００８１】
（７−３）プラスミドｐＣＣ３６３ｔｅｒｍの調製
プラスミドｐＣＣ１０１（０．５μｇ）を鋳型ＤＮＡとし、変異プライマーＭＹ−２（１００ｐｍｏｌ：特開平７−２１３２８０号公報に配列番号３０として示されている。）および変異プライマーＡ３６３ｔｅｒｍ（１００ｐｍｏｌ：特開平７−２１３２８０号公報に配列番号２８として示されている。）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｒｅａｇｅｎｔ　キット（宝酒造株式会社製）によりＤＮＡ断片を増幅した。得られたＰＣＲ産物（１５０ｂｐ断片）をＳＵＰＲＥＣ−０２カラム（宝酒造株式会社製）を使用して精製した。
続いて、同様にプラスミドｐＣＣ１０１（０．５μｇ）を鋳型ＤＮＡとし、変異プライマーＲＶ−Ｄ（５０ｐｍｏｌ：特開平７−２１３２８０号公報に配列番号２９として示されている。）および先に精製した１５０ｂｐＤＮＡ断片（５０ｐｍｏｌ）をプライマーとしてＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｒｅａｇｅｎｔキット（宝酒造株式会社製）によりＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｔＰＩおよびＸｂａＩで消化し、サンプルを４％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ３：１Ａｇａｒｏｓｅ（宝酒造社株式会社製）で電気泳動し、約２８０ｂｐのＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＤＮＡ精製キット（Ｂｉｏ１０１、Ｉｎｃ製）を用いて精製した。一方、ｐＣＣ１０１（３μｇ）をＢｓｔＰＩおよびＸｂａＩで消化し、アルカリフォスファターゼ処理を行った。ついでこの４．２ｋｂｐのＤＮＡ断片と先に調製して得られた変異の導入された２８０ｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて連結し、通常の方法に従って大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。得られた形質転換体から定法に従ってプラスミドｐＣＣ３６３ｔｅｒｍを調製した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの変異が導入されていることを確認した。
【００８２】
（７−４）多重変異型エステラーゼ生産プラスミドの構築
上記（７−１）で得られた変異体プラスミドｐＣＣ１６０Ａ（１０μｇ）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＦｓｐＩで消化して得た０．　６ｋｂｐのＤＮＡ断片、上記（７−２）で得られた変異体プラスミドｐＣＣ１８９Ｙ（１０μｇ）をＦｓｐＩおよびＢｓｔＰＩで消化して得た０．４ｋｂｐの断片および上記（７−３）で得られたプラスミドｐＣＣ３６３ｔｅｒｍ（３μｇ）を制限酵素ＢｓｔＰＩおよびＥｃｏＲＩで消化して得た３．　４ｋｂｐのＤＮＡ断片の３種をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて連結し、通常の方法に従って大腸菌ＪＭ１０５株に形質転換し、多重変異型エステラーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＣＣ１６０Ａ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍを含有する形質転換体微生物を得た。
【００８３】
（７−５）形質転換体微生物の培養
５００ｍｌ容三角フラスコに液体培地（水１Ｌにグリセロ−ル５ｇ、酵母エキス６ｇ及びリン酸一カリウム９ｇ、リン酸二カリウム４ｇを溶解し、ｐＨ７．０とする。）１００ｍｌを入れて滅菌した後、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌになるように加え、上述の方法で作成したクロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラ−ゼ遺伝子組換え微生物の斜面培養から１白金耳接種し、３０℃で２４時間回転振とう培養した。次に３Ｌ容の小型培養槽（丸菱バイオエンジ社製、ＭＤＬ型）に滅菌した液体培地（水１Ｌにグリセロ−ル１５ｇ、酵母エキス２５ｇ及びリン酸一カリウム０．４ｇ、硫酸マグネシウム２ｇ硫酸第一鉄０．１ｇを溶解し、ｐＨ７．０とする。）１５００ｍｌを仕込み、そこへ上記の三角フラスコで培養した培養液１５ｍｌを接種した。３０℃で通気攪拌培養を始め、対数増殖期中期（培養１０〜１５時間）にＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を終濃度１ｍＭになるように添加した後、滅菌した培地を流加し、さらに培養を継続、計４０時間培養することにより、微生物培養液（この培養液をＪＭ１０５（ｐＣＣ１６０Ａ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ）の培養液と記すこともある。）を得た。
【００８４】
実施例８　（本加水分解酵素を産生する微生物の調製（その２））
アルスロバクターＳＣ−６−９８−２８株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１８５１）由来のエステラーゼ遺伝子組換え体微生物［ＪＭ１０５（ＳＣ−６−９８−２８）］は、特開平５−５６７８７号公報記載の方法に準じて作成した。
即ち、特開平５−５６７８７号公報に記載される実施例にある方法に準じてアルスロバクターＳＣ−６−９８−２８株由来のエステラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＡＧＥ−１を調製した。これを制限酵素ＮｓｐＶ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化することによりエステラーゼの翻訳領域を切り出し、エステラーゼ遺伝子の開始コドンＧＴＧをＡＴＧに変換するために合成したＤＮＡ断片および、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｌａｃプロモータを有する発現ベクターｐＵＣ１１８（宝酒造株式会社製）とライゲーションを行った。この様にして、ｌａｃプロモーターの下流にアルスロバクターＳＣ−６−９８−２８株由来のエステラーゼ遺伝子を有する大腸菌用発現プラスミドを作成した後、定法に従い大腸菌ＪＭ１０５株に導入することにより組換え体微生物を構築した。
アルスロバクタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＳＣ−６−９８−２８株由来のエステラ−ゼ遺伝子組換え微生物を、実施例７（７−５）に記載される方法と同様にして培養し、微生物培養液（この培養液をＪＭ１０５（ＳＣ−６−９８−２８）の培養液と記すこともある。）を得た。
【００８５】
実施例９　（本形質転換体の調製（その２））
（９−１）本還元酵素遺伝子の調製
配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡを含有するプラスミドｐＫＡＲを以下のようにして調製した。
まず、Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９９）５２：３８６−３９２等に記載される公知のプラスミドｐＵＡＲ（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８１２７）から、配列番号２で示されるＤＮＡを含むＤＮＡ断片を、ＰｓｔＩ及びＳｍａＩを用いて切り出した。切り出されたＤＮＡ断片を、ＰｓｔＩ／ＳｍａＩ処理したｐＫＫ２２３−３ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）のＴａｃプロモーターの下流に挿入した。このようにしてプラスミドｐＫＡＲを構築した。
【００８６】
（９−２）本還元酵素を産生する形質転換体の調製
構築されたプラスミドｐＫＡＲを用いてＥ．　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株を形質転換した。
次に、フラスコに液体培地（水１０００ｍｌにトリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ及び塩化ナトリウム５ｇを溶解した。この溶液に１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨを７．０に調整した。）１００ｍｌを入れ、滅菌した後、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌ、ＺｎＣｌ２を０．０１％（ｗ／ｖ）、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ　ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を０．４ｍＭになるように加えた。このようにして調製された培地に、上記で得られた形質転換体（Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＡＲ株）が前記組成の液体培地で予め培養された培養液０．３ｍｌを接種し、これを３０℃で１４時間振盪培養した。
培養後、得られた培養液を遠心分離（１５０００×ｇ、１５分、４℃）することにより、菌体を回収した。回収された菌体を、５０ｍＭリン酸１カリウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ７．０）３０ｍｌに懸濁し、この懸濁液を遠心分離（１５０００×ｇ、１５分、４℃）することにより、本還元酵素を産生する形質転換体である洗浄菌体を得た。
【００８７】
実施例１０　（本形質転換体の調製（その３））
（１０−１）染色体ＤＮＡの調製
フラスコに液体培地（水１０００ｍｌにトリプトン５ｇ、酵母エキス２．５ｇ、塩化ナトリウム４ｇ、ゼラチン２．５ｇ、酢酸ナトリウム１．５ｇ及びスレオニン２．４ｇを溶解する。この溶液に１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨを７．０に調整する。）１００ｍｌを入れ、滅菌する。このようにして調製された培地に、特開平１０−９４３９９等に記載される公知のコリネバクテリウム・シュードジフテリティカム亜種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｅｒｉｔｉｃｕｍ）ＳＴ−１０株（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１３１５０）が前記組成の液体培地で予め培養された培養液０．３ｍｌを接種し、これを３０℃で１０時間振盪培養する。
培養後、得られた培養液を遠心分離（１５０００×ｇ、１５分、４℃）することにより、菌体を回収する。回収された菌体を、５０ｍＭリン酸１カリウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ７．０）３０ｍｌに懸濁し、この懸濁液を遠心分離（１５０００×ｇ、１５分、４℃）することにより、洗浄菌体を得る。
このようにして得られる洗浄菌体を用いて、Ｊ．Ｃ．Ｗａｎｇらの方法（Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　（１９９９）５２：３８６−３９２）によって染色体ＤＮＡを調製する。
【００８８】
（１０−２）本還元酵素遺伝子を含有するプラスミドの調製（プラスミドｐＴｒｃＰＡＲの構築）
配列番号１７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに、前記（２−１）で調製される染色体ＤＮＡを鋳型にして下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行う。（ロシュ・ダイアグノスティック社製のＥｘｐａｎｄ　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍを使用）
【００８９】
［反応液組成］
染色体ＤＮＡ　　　　　　　　　　　１μｌ
ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ−ｍｉｘ）　　　　　　　　　０．４μｌ
プライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）　　　　　　各０．７５μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（ｗｉｔｈ　ＭｇＣｌ２）　　　　　　　５μｌ
ｅｎｚ．ｅｘｐａｎｄＨｉＦｉ　（３．５ｘ１０３Ｕ／ｍｌ）　　０．３７５μｌ
超純水　　　　　　　　　　　　　　４１．７２５μｌ
【００９０】
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をＰＥＲＫＩＮ　ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９７℃（２分間）に加熱した後、９７℃（０．２５分間）−５５℃（０．５分間）−７２℃（１．５分間）のサイクルを１０回、次いで９７℃（０．２５分間）−５５℃（０．５分間）−７２℃（２．５分間）のサイクルを２０回行い、さらに７２℃で７分間保持する。
【００９１】
ＰＣＲ反応液を精製して得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片に２種類の制限酵素（ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ）を加えることにより、当該ＤＮＡ断片を２重消化する。次いで得られるＤＮＡ断片を精製する。
一方、ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を２種類の制限酵素（ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ）を加えることにより、当該ベクターを２重消化する。次いで得られるＤＮＡ断片を精製する。
このようにして精製して得られる２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼでライゲーションする。得られるライゲーション液でＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αを形質転換する。
得られる形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ　（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて本還元酵素遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐＴｒｃＰＡＲと記すこともある。）を取り出す。
【００９２】
実施例１１　（本還元酵素を産生する微生物の取得方法）
（１１−１）洗浄菌体の調製
市販の微生物又は土壌などから単離した微生物を滅菌ＬＢ培地（１０ｍｌ）に接種した後、これを振盪培養する（３０℃、１８時間）。培養後、培養液を遠心分離・洗浄することにより、洗浄菌体を回収する。
（１１−２）スクリーニング
１００ｍＭリン酸１カリウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ６．５）２０ｍｌに、上記（１１−１）で調製された洗浄菌体１ｇ、ＮＡＤＰ＋１２ｍｇ、ＮＡＤ＋１２ｍｇ及びグルコース２．５ｇを加える。この混合物に、さらに一般式（１）で示される３−オキソブタン酸エステル２４０ｍｇを加えた後、当該混合物のｐＨを１５％炭酸ナトリウム水溶液で６．５に調製する。このようにして得られる混合物（反応液）を３０℃で４時間攪拌することにより反応を行う。反応終了後、反応液に酢酸エチル２５ｍｌを注加攪拌し、次いで遠心分離することにより有機層及び水層を別々に回収する。回収される水層に再度酢酸エチル２５ｍｌを加えて同様な操作を行う。このようにして得られる有機層を合一濃縮した後、これをクロロホルム３０ｍｌに溶解し、無水Ｎａ２ＳＯ４を用いて乾燥する。乾燥後、クロロホルムを留去することにより残渣を得る。得られる残渣に、３−ヒドロキシブタン酸エステルが含まれていることを液体クロマトグラフィー又はガスクロマトグラフィーにて定性及び／定量分析により確認する。
【００９３】
実施例１２　（本加水分解酵素を産生する微生物の取得方法）
（１２−１）洗浄菌体の調製
市販の微生物又は土壌などから単離した微生物を滅菌ＬＢ培地（１０ｍｌ）に接種した後、これを振盪培養する（３０℃、１８時間）。培養後、培養液を遠心分離・洗浄することにより、洗浄菌体を回収する。
（１２−２）スクリーニング
１００ｍＭリン酸１カリウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ７．０）２０ｍｌに、上記（１２−１）で調製された洗浄菌体１ｇを加える。この混合物に、さらに一般式（２）で示される３−ヒドロキシブタン酸エステル２４０ｍｇを加え、３０℃で１０時間攪拌することにより反応を行う。反応終了後、反応液に酢酸エチル２５ｍｌを注加攪拌し、次いで遠心分離することにより有機層及び水層を別々に回収する。回収される水層に再度酢酸エチル２５ｍｌを加えて同様な操作を行う。このようにして得られる有機層を合一濃縮した後、これをクロロホルム３０ｍｌに溶解し、無水Ｎａ２ＳＯ４を用いて乾燥する。乾燥後、クロロホルムを留去することにより残渣を得る。得られる残渣に、３−ヒドロキシブタン酸エステルが含まれていることを液体クロマトグラフィー又はガスクロマトグラフィーにて定性及び／定量分析により確認する。
【００９４】
【発明の効果】
本発明により、光学活性３−ヒドロキシブタン酸系化合物を簡便に製造することができる。
［配列表フリーテキスト］
配列番号１１
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号１２
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号１３
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号１４
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号１５
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号１６
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号１７
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号１８
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
【００９５】
【配列表】
2004041070.tif 000008
2004041070.tif 000009
2004041070.tif 000010
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