(57)【要約】【課題】新規なアポトーシス誘導剤、及びアポトーシス誘導剤のスクリーニング方法の提供。【解決手段】例えばヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）の遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドなど、ＨＤＡＣ６を抑制する事によるアポトーシス誘導剤、及びこのアポトーシス誘導剤を含んで成る抗癌剤、本発明はまた、ＨＤＡＣ６を抑制するアポトーシス誘導物質のスクリーニング方法であり更に詳しくはアポトーシス誘導物質のスクリーニング方法であって、（１）　被験物質がヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）を抑制するか否かを、ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）の基質となり得るアセチル化物質の脱アセチル化又はヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）の発現の減少を指標として決定し、そして（２）　抑制する場合には更に、インビトロ及び／又はインビボで細胞にアポトーシスを引き起こすか否かを確認する、ことを含んでなる方法を提供する。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）を抑制する物質を含んでなる、アポトーシス誘導剤。
【請求項２】
前記ヒストンアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）を抑制する物質が、核酸またはペプチドである、請求項１に記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項３】
前記核酸が、ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイムである、請求項２に記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項４】
前記核酸がヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）のアンチセンスオリゴヌクレオチドである請求項２に記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項５】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）の遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧを含む配列に相補的か、またはその開始コドン前後の配列に相補的なヌクレオチド配列を有する、請求項４に記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項６】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＣＡＴＡＧＴＴＧＡＧ　ＧＡＧＧＣＴＴＧＧＣ（配列番号：３）、ＴＣＣＴＧＧＣＣＧＧ　ＴＴＧＡＧＧＴＣＡＴ（配列番号：４）、ＧＧＴＴＧＡＧＧＴＣＡＴＡＧＴＴＧＡＧＧ（配列番号：５）、ＣＣＣＴＧＣＣＧＣＧ　ＧＴＴＣＴＴＣＣＡＣ（配列番号：６）、又はＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴ　ＴＧＴＧＧＴＧＧＡＡ（配列番号：７）のヌクレオチド配列を有する、請求項５に記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項７】
前記アンチセンスヌクレオチドが、ＣＣＴＴＧＡＣＣＧＴ　ＧＧＴＧＣＡＣＡＴＣ（配列番号：１０）、ＧＴＧＧＴＧＣＡＣＡ　ＴＣＣＣＡＡＴＣＴＡ（配列番号：１１）、ＣＣＡＴＴＡＣＣＧＴ　ＧＧＴＧＧＡＣＡＴＣ（配列番号：１２）、ＧＴＧＧＴＧＧＡＣＡ　ＴＣＣＣＡＡＴＣＣＡ（配列番号：１３）、ＡＣＴＧＧＣＣＡＴＧ　ＴＣＡＧＧＡＴＴＧＧ（配列番号：１７）、又はＴＣＣＧＴＡＧＧＧＣ　ＡＴＧＣＣＣＡＣＴＧ（配列番号：１８）のヌクレオチド配列を有する、請求項４に記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のアポトーシス誘導剤を有効成分とする抗癌剤。
【請求項９】
ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）を抑制するアポトーシス誘導物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記アポトーシス誘導物質のスクリーニング方法が、
（１）　被験物質がヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）を抑制するか否かを、ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）の基質となり得るアセチル化物質の脱アセチル化又はヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）の発現の減少を指標として決定し、
（２）　抑制する場合には更に、インビトロ及び／又はインビボで細胞にアポトーシスを引き起こすか否かを確認する、
ことを含んでなる請求項９に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アポトーシス誘導剤及びそのスクリーニング方法に関する。このアポトーシス誘導剤は抗癌剤として有望である。
【０００２】
【従来の技術】
ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）は、遺伝子の発現制御に重要な働きをしていることが明らかになっている（Ｋｈｏｃｈｂｉｎ　Ｓ，　Ｖｅｒｄｅｌ　Ａ，　Ｌｅｍｅｒｃｉｅｒ　Ｃ，　Ｓｅｉｇｎｅｕｒｉｎ−Ｂｅｒｎｙ　Ｄ．　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｏｆ　ｈｉｓｔｏｎｅ　ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．　Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｇｅｎｅｔ　Ｄｅｖ．　２００１　Ａｐｒ；　１１（２）：　１６２−６）。ヒトのヒストンデアセチラ−ゼには多数のアイソザイムが存在し、クラスＩ（ＨＤＡＣアイソザイム１、２、３及び８）、クラスＩＩ（ＨＤＡＣアイソザイム４、５、６及び７）、並びにクラスＩＩＩ　（ＳＩＲＴアイソザイム１、２、３、４、５、６及び７）に分類される。この内、ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）は、他のアイソザイムが核に存在するのと異なり細胞質内に存在する。したがってヒストンを本来の基質としえない、トリコスタチンＡにより阻害される、構造がユニークである、などの点で他のアイソザイムと異なる性質を有する。
【０００３】
細胞分裂に重要な役割を果たす微小管は、その構成たんぱく質の一つとしてα−チューブリンを含んでおり、このタンパク質は、タキソールなどにより微小管が安定化されると、アセチル化を受けることが知られている（Ｐｉｐｅｒｎｏ，　Ｇ．，　ＬｅＤｉｚｅｔ，　Ｍ．　＆　Ｃｈａｎｇ，　Ｘ．−ｊ．　（１９８７）　Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ　α−ｔｕｂｕｌｉｎ　ｉｎ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ，　Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１０４，　２８９−３０２）。したがって、細胞質内にはα−チューブリンにアセチル基を付加する酵素（α−チューブリンアセチル化酵素）（α−チューブリンアセチラーゼ）とα−チューブリンに付加したアセチル基を除去する酵素（α−チューブリン脱アセチル化酵素）（α−チューブリンデアセチラーゼ）が存在すると考えられる。
【０００４】
α−チューブリンのアセチル化が微小管の安定化に寄与することが知られている（Ｐｉｐｅｒｎｏ，　Ｇ．，　ＬｅＤｉｚｅｔ，　Ｍ．　＆　Ｃｈａｎｇ，　Ｘ．−ｊ．　（１９８７）　Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ　α−ｔｕｂｕｌｉｎ　ｉｎ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ，　Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１０４，　２８９−３０２）。しかしながら、ヒストンデアセチラ−ゼ６（ＨＤＡＣ６）は、α−チューブリンに対する脱アセチル化酵素であるが、ＨＤＡＣ６を阻害することにより、細胞にアポトーシスが惹起されることは知られていない。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　Ｄｅｖ．　２００１　Ａｐｒ；　１１（２）　：　１６２０１６６　Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，　１０４，　２８９−３０２
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、アポトーシスを惹起させることにより抗癌効果を生ずるアポトーシス誘導剤及び当該アポトーシス誘導剤を有効成分とする抗癌剤、並びにアポトーシス誘導剤のスクリーニング方法を提供しようとするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヒストンデアセチラ−ゼ（ＨＤＡＣ）の多数のアイソザイムの内、ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）のみが細胞質に存在し、その生来の基質がヒストンではありえないこと等に注目し、種々検討の結果、ＨＤＡＣ６がα−チューブリンのデアセチラーゼ酵素であることを確認した。更にＨＤＡＣ６を抑制してα−チューブリンのアセチル化を亢進させて微小管を安定化することにより、細胞にアポトーシスを惹起させることが出来ることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
したがって本発明は、ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）を抑制する物質を含んでなる、アポトーシス誘導剤を提供する。このヒストンアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）を抑制する物質としては、ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）自体を阻害する物質であってもよく、またヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）の生成（合成）を抑制する物質であってもよい。ヒストンデアセチラーゼ６の合成を抑制する物質の一例としては、核酸またはペプチドが挙げられ、この核酸としては、ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイムが挙げられる。
【０００９】
本発明はまた、ＨＤＡＣ６を抑制するアポトーシス誘導物質のスクリーニング方法であって、
（１）　被験物質がヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）を抑制するか否かを、ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）の基質となり得るアセチル化物質の脱アセチル化又はヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）の発現の減少を指標として決定し、
（２）　抑制する場合には更に、インビトロ及び／又はインビボで細胞にアポトーシスを引き起こすか否かを確認する、
ことを含んでなる方法を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明においては先ず、ＨＤＡＣ６がα−チューブリンの脱アセチル化酵素であることを確認した。このため、ＨＤＡＣ６をコードするｃＤＮＡを哺乳動物細胞用発現ベクターにクローニングし（実施例１）、この発現ベクターを宿主細胞に導入し、この細胞内でＨＤＡＣ６を過剰発現させ、α−チューブリンのアセチル化の程度を観察した。ＨＤＡＣ６がα−チューブリンの脱アセチル化酵素であれば、過剰発現したＨＤＡＣ６によってα−チューブリンのアセチル基が除去されるため細胞内のアセチル化されたα−チューブリンの量が減少するはずである。なお、ＨＤＡＣ６をコードするｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に示し、そしてそれによりコードされるアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
【００１１】
この結果、ＨＤＡＣ６を過剰発現させた場合アセチル化の程度が５０％程度減少したが、ＨＤＡＣ６を発現しないベクター（Ｈｉｓ６−ＨＤＡＣ６（ｆｕｌｌ）／ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＡＳ）及びベクターのみを細胞に導入した場合にはα−チューブリンのアセチル化の程度は減少しなかった。この結果、ＨＤＡＣ６がα−チューブリンの脱アセチル化酵素である事が証明された。
【００１２】
次に、ＨＤＡＣ６の細胞内での発現を低下させる方法を検討した。その一例として、ＨＤＡＣ６の遺伝子の発現を抑制する方法として、ＨＤＡＣ６のｍＲＮＡに対して相補的なホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）による発現抑制を試みた。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして、ＨＤＡＣ６の翻訳開始コドンＡＴＧを含む配列に相補的な３種類のオリゴヌクレオチド、すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチド１：ＣＡＴＡＧＴＴＧＡＧ　ＧＡＧＧＣＴＴＧＧＣ（配列番号：３）、アンチセンスオリゴヌクレオチド２：ＴＣＣＴＧＧＣＣＧＧ　ＴＴＧＡＧＧＴＣＡＴ（配列番号：４）及びアンチセンスオリゴヌクレオチド３：ＧＧＴＴＧＡＧＧＴＣ　ＡＴＡＧＴＴＧＡＧＧ（配列番号：５）、並びにＡＴＧの上流の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド４：ＣＣＣＴＧＣＣＧＣＧ　ＧＴＴＣＴＴＣＣＡＣ（配列番号：６）及びＡＴＧの下流の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド５：ＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴ　ＴＧＴＧＧＴＧＧＡＡ（配列番号：７）を用いた。
【００１３】
更に、ポリＡ付加シグナル配列（配列番号：１における塩基４０８２−４０８７）を含む上流側の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド６：ＴＴＴＡＴＴＡＣＡＴ　ＡＴＧＣＡＡＣＣＴＴ（配列番号：８）及びポリＡ付加シグナル配列を含む下流側の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド７：ＡＡＣＡＧＣＴＴＧＴ　ＡＣＴＴＴＡＴＴＡＣ（配列番号：９）、第一触媒領域（配列番号：１中における塩基３５２−１３０５）中の保存されたアスパラギン酸とヒスチジン残基（ＤＨ）に対応する配列を含む下流側の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド８：ＣＣＴＴＧＡＣＣＧＴ　ＧＧＴＧＣＡＣＡＴＣ（配列番号：１０）及び前記ＤＨに対応する配列を含む上流側の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド９：ＧＴＧＧＴＧＣＡＣＡ　ＴＣＣＣＡＡＴＣＴＡ（配列番号：１１）、並びに第二触媒領域（配列番号：１における塩基１５３７−２４７５）中の保存されたＤＨに対応する配列を含む下流側の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド１０：ＣＣＡＴＴＡＣＣＧＴ　ＧＧＴＧＧＡＣＡＴＣ（配列番号：１２）及び前記ＤＨに対応する配列を含む上流側の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド１１：ＧＴＧＧＴＧＧＡＣＡ　ＴＣＣＣＡＡＴＣＣＡ（配列番号：１３）を用いた。
【００１４】
更に、ＨＤＡＣ６のｍＲＮＡの全領域を網羅するため、配列番号：１の塩基１−２０の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド１２：ＣＧＣＴＣＣＴＣＡＧ　ＧＧＧＡＣＴＧＣＣＣ（配列番号：１４）、塩基５０１−５２０の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド１３：ＡＣＡＴＣＡＧＣＴＣ　ＴＴＣＣＴＴＴＴＣＡ（配列番号：１５）、塩基１００１−１０２０の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド１４：ＣＣＡＡＧＧＣＡＣＡ　ＴＴＧＡＴＧＧＴＡＴ（配列番号：１６）、塩基１５０１−１５２０の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド１５：ＡＣＴＧＧＣＣＡＴＧ　ＴＣＡＧＧＡＴＴＧＧ（配列番号：１７）、
【００１５】
塩基２００１−２０２０の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド１６：ＴＣＣＧＴＡＧＧＧＣ　ＡＴＧＣＣＣＡＣＴＧ（配列番号：１８）、塩基２５０１−２５２０の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド１７：ＴＧＧＣＡＧＧＧＴＣ　ＡＧＣＡＧＧＧＧＴＧ（配列番号：１９）、塩基３００１−３０２０の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド１８：ＡＧＣＧＴＧＧＣＴＣ　ＣＣＣＣＡＡＣＡＧＣ（配列番号：２０）、塩基３５０１−３５２０の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド１９：ＡＡＴＴＣＴＣＴＴＧ　ＧＡＴＴＧＴＴＣＣＡ（配列番号：２１）及び塩基４００１−４０２０の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド２０：ＴＡＴＣＡＧＣＴＣＣ　ＣＴＣＴＴＧＧＧＧＣ（配列番号：２２）を用いた。
【００１６】
その結果、アンチセンスオリゴヌクレオチド１〜５、アンチセンスオリゴヌクレオチド８〜１１、並びにアンチセンスオリゴヌクレオチド１６に遺伝子の発現を抑制する効果、すなわちＨＤＡＣ６の産生の低下が認められた。また、ＨＤＡＣ６の産生の低下と共にα−チューブリンのアセチル化が亢進する事が確認された。
そこで、α−チューブリンのアセチル化を亢進する効果を有する事が確認されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを癌細胞に導入すると、細胞質中で微小管が安定化し、またアポトーシスが生じていることが観察された。ＨＤＡＣ阻害剤として知られているトリコスタチンＡも同様の結果をもたらすことが確認された。
【００１７】
以上の実験結果から、ＨＤＡＣ６を抑制する物質はアポトーシスを誘導し、抗癌剤として有用である事が合理的に推定される。従ってまた、ＨＤＡＣ６の活性を抑制する物質を、α−チューブリンの脱アセチル化及び／又はアセチル化を指標として選択することにより、アポトーシス誘導物質及び抗癌剤の検索を行う事が可能である。
ＨＤＡＣ６を抑制する物質には、酵素であるＨＤＡＣ６を阻害する酵素阻害剤と、ＨＤＡＣ６の生成（合成）を抑制する物質が考えられるので、それらを検索する方法としては、酵素としてのＨＤＡＣ６を阻害する酵素阻害剤を検索する方法と、ＨＤＡＣ６の発現、即ち生成（合成）を抑制する物質を検索する方法とがある。
【００１８】
ＨＤＡＣ６に対する酵素阻害剤の検索のためには、酵素であるＨＤＡＣ６と、その基質となり得るアセチル化物質と被験物質を反応せしめ、基質の脱アセチル化を指標とすれば良い。そして、被験物質が脱アセチル化を阻害する場合、その被験物質はアポトーシス誘導剤と推定される。ＨＤＡＣ６の基質となり得るアセチル化物質は、例えば、アセチル化α−チューブリン、アセチル化ヒストンまたはリジン残基をアセチル化した合成ペプチドなどを挙げる事ができる。脱アセチル化を検出する方法は検出が可能であれば特に限定されないが、アセチル化α−チューブリンを基質として用いる場合は、アセチル化α−チューブリンの減少及び／又は遊離される酢酸又は脱アセチル化α−チューブリンの増加等を測定すればよい。また、酵素阻害剤の検索の為に、ＨＤＡＣ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ、ＡＫ−５００（ＢＩＯＭＯＬ社）や、ＨＤＡＣ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（ＣｙｃＬｅｘ社）を使用する事もできる。
【００１９】
また、ＨＤＡＣ６の発現を抑制する物質を検索するには、ＨＤＡＣ６を発現している細胞、例えば動物細胞を、被検物質の存在下及び非存在下で培養し、被検物質の存在下で培養した細胞中のＨＤＡＣ６のタンパク量及び／またはｍＲＮＡ量が、被検物質の非存在下で培養した細胞中のＨＤＡＣ６のタンパク量及び／またはｍＲＮＡ量よりも減少している場合は、その被検物質はＨＤＡＣ６の発現抑制物質であり、従ってアポトーシス誘導剤であると推定すれば良い。
【００２０】
ＨＤＡＣ６のタンパク量はウエスタンブロット法等により、ｍＲＮＡの量はノーザンブロット法またはＲＴ−ＰＣＲ法等によって検出する事が出来る。また、細胞を被検物質の存在下及び非存在下で培養し、被検物質の存在下で培養した細胞中のアセチル化α−チューブリンとα−チューブリンとの比率とを比較し、被検物質の非存在下で培養した細胞中のアセチル化α−チューブリンの比率に比べて、被検物質の存在下で培養した細胞中のアセチル化α−チューブリンの比率が高い場合に、その被検物質はＨＤＡＣ６の発現抑制物質であり、従ってアポトーシス誘導剤であると推定することもできる。
【００２１】
上記の細胞としては、ＨＤＡＣ６を発現している細胞であれば特に限定されないが、動物細胞、特にヒトの培養細胞が好ましく、特に癌細胞が好ましく、例えば、ＨｅＬａ細胞、ＨＬ−６０細胞、Ａ５４９細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＬｏＶｏ細胞、ＳＷ４８０細胞、Ｃａｌｕ−１細胞などが挙げられ、特にＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＬｏＶｏ細胞、ＳＷ４８０細胞、Ｃａｌｕ−１細胞が好ましい。また、クローニングしたＨＤＡＣ６をコードするＤＮＡを人為的に導入してＨＤＡＣ６を過剰発現するように遺伝子操作した細胞を用いてもよい。
【００２２】
【実施例】
次に、実施例により、本発明を更に具体的に説明する。
実施例１．
全ＲＮＡの単離
ＨＤＡＣ６をコードするｃＤＮＡを、ＨＤＡＣ６のコード領域を３分割する事によりクローニングした。ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ）を１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０で培養し、５００Ｘｇ　５分間の遠心分離で回収した。回収した１　Ｘ　１０６個の細胞を１ｍｌのＴＲＩｚｏｌｅ　ｒｅｇｅｎｔ　（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）に溶解し、そこに２００μｌのクロロホルムを加え懸濁し、水層を回収した。回収した水層に５００μｌのイソプロピルアルコールを加えて混和し、１２０００Ｘｇにて１０分間遠心分離し、全ＲＮＡを沈殿させた。沈殿させた全ＲＮＡを７５％エタノールでリンスし、軽く風乾後５０μｌの水に溶解させた。２６０ｎｍの波長でＲＮＡ濃度を測定し、使用時まで−８０℃で保存した。
【００２３】
ＨＤＡＣ６をコードするｃＤＮＡのクローニング
単離したＨＬ−６０細胞の全ＲＮＡを用い、逆転写反応を行なった。反応には、ＧｉｂｃｏＢＲＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩを使用し、ＴａＫａＲａ　ＲＮＡ　ＰＣＲ　Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１に含まれているＲａｎｄｏｍ　９　ｍｅｒｓをプライマーとして０．５μｇ用い、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩに添付されているマニュアル通りに操作を行い、全ｃＤＮＡを得てＰＣＲの鋳型とした。
【００２４】
2004043446.tif 000002
【００２５】
ＰＣＲは、上記の全ｃＤＮＡを鋳型として、上記のプライマー対を用い、ポリメラーゼとしてＬＡ　Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用いて、９４℃にて１分間、５５℃にて３０秒間、および７２℃にて２分間の温度にて３０サイクルを行った。こうして増幅された各ｃＤＮＡをクローニングベクターｐＴ７ｂｌｕｅ　Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングして、それぞれ、ＨＤＡＣ６　ＨＥＡＤ／ｐＴ７ｂｌｕｅ、ＨＤＡＣ６　ＭＩＤ／ｐＴ７ｂｌｕｅ、及びＨＤＡＣ６　ＴＡＩＬ／ｐＴ７ｂｌｕｅを得、配列決定した。
【００２６】
前記ＨＤＡＣ６　ＨＥＡＤ／ｐＴ７ｂｌｕｅのＸｂａＩ／ＮｄｅＩ部位に、Ｈｉｓ６リンカー：ＣＴＡＧＡＴＧＣＣＧ　ＣＧＧＧＧＴＴＣＴＣ　ＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡ　ＴＣＡＴＣＡ（配列番号：２９）及びＴＡＴＧＡＴＧＡＴＧ　ＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡ　ＧＡＡＣＣＣＣＧＣＧ　ＧＣＡＴ（配列番号：３０）を、それぞれＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化後アニールして挿入し、構築したベクターをＸｂａＩ及びＤｒａＩＩＩ　により消化してＨｉｓ６付きＨＥＡＤ（Ｘｂａ／ＤｒａＩＩＩ）断片を得た。このＨｉｓ６付きＨＥＡＤ（Ｘｂａ／ＤｒａＩＩＩ）断片及び前記ＨＤＡＣ６ＭＩＤ／ｐＴ７ｂｌｕｅをＤｒａＩＩＩ　及びＢｐｕ１１０２Ｉで消化して得られたＭＩＤ（ＤｒａＩＩＩ／Ｂｐｕ１１０２Ｉ）断片を前記ＨＤＡＣ６　ＴＡＩＬ／ｐＴ７ｂｌｕｅをＸｂａＩ及びＤｒａＩＩＩ　で消化したものに挿入し、全長ＨＤＡＣ６（Ｎ−末端Ｈｉｓ６融合）／ｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｈｉｓ６−ＨＤＡＣ６（ｆｕｌｌ）／ｐＴ７ｂｌｕｅと称する）を構築した。
【００２７】
前記Ｈｉｓ６−ＨＤＡＣ６（ｆｕｌｌ）／ｐＴ７ｂｌｕｅをＳａｃＩで消化してＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化後ＸｂａＩで消化し、この断片をベクターｐＶＬ１３９２のＸｂａＩ／ＳｍａＩ部位と連結し、トランスファーベクターＨｉｓ６−ＨＤＡＣ６（ｆｕｌｌ）／ｐＶＬ１３９２を作成した。以上の工程を図１２及び１３に記載する。
次に、このトランスファーベクターを、常法に従って、ＴＮＭ−ＦＨ培地で培養したＳｆ−９細胞にトランスフェクトした。即ち、４μｇの前記トランスファーベクターＨｉｓ６−ＨＤＡＣ６（ｆｕｌｌ）／ｐＶＬ１３９２、０．５μｇのＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ線状化ＡｃＭＮＰＶ　ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び２０μＬのＩｎｓｅｃｔｉｎＰｌｕｓリポゾ−ムを、１ｍＬのＧｒａｃｅ昆虫培地中で、２×１０６個のＳｆ−９細胞と共にキットのマニュアル通りにインキュベートした。７日間の培養の後、培養上清を取り、プラーク精製を行い、単一プラークからウイルスを増幅して、高タイターウイルスストックとした。
【００２８】
実施例２．　組換えＨＤＡＣ６タンパク質の生成
実施例１で増幅したウイルス約１０８ｐｆｕ／ｍＬを１／１００希釈し、１０６細胞／ｍＬのＳｆ−９細胞３００ｍＬにＭＯＩ＝１で感染させ、２７℃にて７２時間、７０ｒｐｍで撹拌培養した。培養後、５００Ｘｇにて５分間の遠心分離により細胞を回収し、−８０℃で保存した。この細胞をプロテアーゼ阻害剤（１ｍＭ　ＰＭＳＦ，２μＭ　ロイペプチン，２μＭ　ぺプスタチン，２００ｎＭ　アプロチニン）を含む６ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５），３００ｍＭ　ＮａＣｌ，２０ｍＭ　イミダゾール）に懸濁し、テフロンホモジナイザーにより２０ストロークで破砕し、破砕物を２００００Ｘｇ、４℃にて３０分間遠心分離して透明な細胞破砕液を得た。この得られた細胞破砕液に、緩衝液Ａで平衡化した１ｍＬの吸着樹脂Ｎｉ−ＮＴＡ　Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（Ｑｉａｇｅｎ）を加え、４℃にて１〜２時間吸着させた。
【００２９】
前記吸着樹脂含有液を２０００Ｘｇで５分間、４℃にて遠心分離して上清を除去し、回収した吸着樹脂を１０ｍＬの緩衝液Ａに再懸濁し、２０００Ｘｇで５分間、４℃にて遠心分離し、上清を除去した。この操作を３回反復した。この洗浄した樹脂を緩衝液Ａに懸濁し、カラム（Ｅｃｏｎｏ　ｃｏｌｕｍｎ，　ＢＩＯ−ＲＡＤ）に詰め、２０ｍＬの緩衝液Ａで洗浄した。このカラムを緩衝液Ｂ（５０ｍＭ　リン酸ナトリウム（ｐＨ７．５），３００ｍＭ　ＮａＣｌ，３００ｍＭ　イミダゾール）により溶出処理し、溶出液画分を１ｍＬづつ集め、透析緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，２ｍＭ　ＥＤＴＡ）に対して透析した。透析液のタンパク質を、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）により定量した後、−８０℃にて保存した。
【００３０】
上記のようにして精製したＨＤＡＣ６タンパク質の脱アセチル化活性を、ＨＤＡＣ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　Ａｓｓａｙ／Ｄｒｕｇ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｋｉｔ（ＢＩＯＭＯＬ）により測定した。また、ＨＤＡＣ６の阻害剤であるトリコスタチンＡを１μＭ測定系に加えた場合についても測定を行い、図１に示す結果を得た。即ち、測定試料の脱アセチル化活性はトリコスタチンＡにより完全に阻害され、遺伝子組換えにより調製したＨＤＡＣ６が本来の脱アセチル化活性を有することが確認された。
【００３１】
実施例３．　ＨＤＡＣ６強制発現用ベクターの構築及びＨＤＡＣ６の強制発現によるα−チューブリンの脱アセチル化の促進
実施例１で構築したＨｉｓ６−ＨＤＡＣ６（ｆｕｌｌ）／ｐＴ７ｂｌｕｅをＳａｃＩで消化してＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端後、ＸｂａＩで消化し、この断片をＥｃｏＲＶ及びＸｂａＩで消化したｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、Ｈｉｓ６−ＨＤＡＣ６（ｆｕｌｌ）／ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＡＳを得た。構築したベクターは、発現用のプロモーターに対してＨＤＡＣ６ｃＤＮＡが逆向きに挿入されている為、該ベクターを、ＰｍｅＩで消化後、ＰｍｅＩを不活性化してそのままｐｃＤＮＡ３．１（＋）とＨＤＡＣ６断片を結合し、発現用のプロモーターに対してＨＤＡＣ６ｃＤＮＡが正方向に挿入された、ＨＤＡＣ６の強制発現用ベクター、Ｈｉｓ６−ＨＤＡＣ６（ｆｕｌｌ）／ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＳＥを得た。以上の工程を図１４に記載する。
【００３２】
１０ｃｍのディッシュ中１０％ＦＣＳ，１×非必須アミノ酸を含むＭＥＭ培地にＨｅＬａ細胞を播種し、ＨＤＡＣ６をヒスチジン融合タンパク質として発現する様に構築された５μｇのＨｉｓ６−ＨＤＡＣ６（ｆｕｌｌ）／ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＳＥと、５μｇのｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クローンテック）とを、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用いて同時形質転換した。又、Ｈｉｓ６−ＨＤＡＣ６（ｆｕｌｌ）／ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＡＳ及びｐｃＤＮＡ３．１（＋）を用い、同様の操作を行なった。４８時間後、トリプシンにより細胞を剥離して回収し、ＦＡＣＳ　ｃａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｃｅｎｃｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）陽性細胞のみを分別回収した。
【００３３】
回収した細胞を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液（ブロムフェノールブルー不含）により細胞溶解し、タンパク質を定量した後、２．５μｇ／レーンのタンパク質の量で細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離後、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗−アセチル化α−チューブリン抗体（ｃｌｏｎｅ　６−１１Ｂ−１，Ｓｉｇｍａ）、抗−α−チューブリン抗体（ｃｌｏｎｅ　ＤＭ１Ａ，Ｓｉｇｍａ）又は抗−ＲＧＳ　Ｈｉｓ抗体（ＱＩＡＧＥＮ）によりイムノブロットした。
図２に示す通り、ＨＤＡＣ６を発現しないベクター（Ｈｉｓ６−ＨＤＡＣ６（ｆｕｌｌ）／ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＡＳ及びｐｃＤＮＡ３．１（＋）を導入した細胞ではα−チューブリンのアセチル化の度合いに変化がないのに対して、ＨＤＡＣ６を強制発現させた細胞ではα−チューブリンのアセチル化の度合いが減少しており、ＨＤＡＣ６がα−チューブリンの脱アセチル化を担っていることが示唆された。
【００３４】
実施例４．　　ホスホロチオエート・アンチセンスオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）を用いたＨＤＡＣ６タンパク質の発現抑制とそれによるα−チューブリンアセチル化の亢進
ＨＤＡＣ６遺伝子のｍＲＮＡ配列（ｇｅｎｅ　ｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ　００６０４４）を基に、２０種類のアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号：３〜２２）及び対照オリゴヌクレオチド：ＣＣＴＣＴＴＡＣＣＴ　ＣＡＧＴＴＡＣＡＡＴ（配列番号：３１）（ヘモグロビン異常症サラセミアにおける赤血球βグロビンｐｒｅ−ｍＲＮＡ中の７０５番目の部位のスプライシング異常により生じた配列に由来し、健常細胞ではこのオリゴヌクレオチドは特異的標的部位や生物学的活性を有しない）をデザインし、ホスホロチオエート・アンチセンスオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）を合成した（サワディーテクノロジー）。
【００３５】
合成されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを滅菌水に溶解し、ＯｌｉｇｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、添付のプロトコールを用いてＨｅＬａ細胞に導入した。１．５×１０５のＨｅＬａ細胞は６ウエルプレートに播種し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの最終濃度は２００ｎＭとし、ＯｌｉｇｏｆｅｃｔＡＮＩＮＥは３μＬ／ウエルで使用した。
導入して４８時間後、細胞をトリプシンで剥離して回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液（ＢＰＢ不含）で細胞溶解し、タンパク質を定量した後、２５μｇ／レーンの細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗−アセチル化α−チューブリン抗体（ｃｌｏｎｅ　６−１１Ｂ−１，Ｓｉｇｍａ）、抗−α−チューブリン抗体（ｃｌｏｎｅ　ＤＭ１Ａ，Ｓｉｇｍａ）又は抗−ＨＤＡＣ６抗体（Ｈ−３００、サンタクルーズ）によりイムノブロットした。
【００３６】
図３に示す通り、試験した２０種類のアンチセンスオリゴヌクレオチドの内、約半数がＨＤＡＣ６の発現量の低下をもたらし、ある種のアンチセンスオリゴヌクレオチドがＨＤＡＣ６の発現を抑制することが確認された。対照オリゴは、予想通り、ＨＤＡＣ６タンパク質の発現低下を惹起する活性を有しなかった。
また、ＨＤＡＣ６タンパク質の発現量の低下に応じて、α−チューブリンのアセチル化が亢進していた。このことから、ＨＤＡＣ６タンパク質によりα−チューブリンの脱アセチル化が行われることが示唆された。
【００３７】
上記のアンチセンス活性を生じさせたアンチセンスオリゴヌクレオチドの内、本訳開始コドンＡＴＧ近傍のアンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．４（配列番号：６）、Ｎｏ．５（配列番号：７）及びネガティブコントロールとしてＮｏ．６（配列番号：８）、並びにコード領域の中間に位置し、最も強いアンチセンス活性を惹起するアンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．１６（配列番号：１８）につき、トランスフェクション後の細胞回収までの培養時間を変えて（２４時間後、３０時間後、３６時間後及び４８時間後）上記と同様の実験を行った。
図４に示す通り、アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．４、５及び１６は、何れの時間においてもα−チューブリンのアセチル化が亢進していることが確認された。このため、今後の実験においては、これら３種のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した。
【００３８】
実施例５．　ＨＤＡＣ６タンパク質の発現低下による微小管構造の変化
ＨｅＬａ細胞を、Ｌａｂ−ＴｅｋＩＩ　Ｃｈａｍｂｅｒｅｄ　Ｃｏｖｅｒｇｌａｓｓ（Ｎｕｎｃ）上に播種し、
（１）微小管重合剤である１μＭ　Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（Ｓｉｇｍａ）による１６時間の処理、
（２）ＨＤＡＣ阻害剤である１μＭ　トリコスタチンＡ（和光）による１６時間の処理、又は
（３）ＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．４を最終濃度２００ｎＭで、ＯｌｉｇｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥにより導入して２４時間培養を行った。
【００３９】
その後、Ｌａｂ−ＴｅｋＩＩ　Ｃｈａｍｂｅｒｅｄ　Ｃｏｖｅｒｇｌａｓｓを０．１Ｍ　ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．９）洗浄し、０．５％グルタルアルデヒド／０．１　Ｍ　ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．９）で１０分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、０．５％　Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００／ＰＢＳで５分間づつ３回透過性付与（ｐｅｒｍｅａｌｉｚｅ）し、ＰＢＳで３回洗浄し、２．５ｍｇ／ｍＬ　硼水素化ナトリウム／５０％エタノールで１０分間づつ３回処理し、ＰＢＳで３回洗浄し、１０％　正常ヤギ血清／ＰＢＳでブロッキングし、１次抗体である（ａ）抗−アセチル化α−チューブリン抗体（ｃｌｏｎｅ　６−１１Ｂ−１，Ｓｉｇｍａ）又は（ｂ）抗−α−チューブリン抗体（ｃｌｏｎｅ　ＤＭ　１Ａ，Ｓｉｇｍａ）／ＰＢＳと１時間反応させ、０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０／ＰＢＳで３回洗浄し、２次抗体であるＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８接合抗−マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ）／ＰＢＳと３０分間反応せしめ、そして０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０／ＰＢＳで３回洗浄した後、共焦点レーザー顕微鏡（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ）で観察した。
【００４０】
その結果を図５に示す。未処理対象細胞と比較して、微小管重合促進剤であるＰａｃｌｉｔａｘｅｌで処理した細胞では、抗−α−チューブリン抗体で染色した場合、核周辺に強く重合した微小管が観察された。抗−アセチル化α−チューブリン抗体で染色した場合、中心体から強く重合した微小管が観察された。
ＨＤＡＣ６の活性を阻害するトリコスタチンＡ又はＨＤＡＣ６の生成を抑制するＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドにより処理した細胞では、微小管重合促進剤であるＰａｃｌｉｔａｘｅｌ処理とは異なり、細胞質全体に重合した微小管像が観察された。これらの、α−チューブリンの脱アセチル化を阻害した細胞では、微小管重合促進剤であるＰａｃｌｉｔａｘｅｌで処理した場合とは異なる作用機序により、細胞質全体で微小管の安定性が上昇したと考えられる。
【００４１】
実施例６．　ＨＤＡＣ６タンパク質に発現低下によるアポトーシスの誘導
１０％ＦＣＳ，１×非必須アミノ酸を含むＭＥＭ培地を入れた６ウエルプレートにＨｅＬａ細胞（１．５×１０５／ｗｅｌｌ）を播種し、最終濃度２００ｎＭのＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．４、５、６及び１６、並びに対照オリゴヌクレオチドを、３μＬ／ウエルのＯｌｉｇｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥにより導入し、２４時間、３０時間、３６時間又は４８時間処理し、細胞をトリプシン処理により剥離して回収し、アポトーシスを検出できるＡｎｎｅｘｉｎ　Ｖ−ＰＥ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により、添付のプロトコールに従って染色し、ＦＡＣＳ　ｃａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて解析した。
【００４２】
即ち、回収した細胞をＰＢＳで洗浄し、１００μＬの結合緩衝液（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に懸濁させ、この細胞懸濁液に５μＬのＡｎｎｅｘｉｎ　Ｖ−ＰＥを加え、１５分間インキュベートし、結合緩衝液を加えて合計５００μＬにした。これを、ＦＡＣＳ解析にかけた。結果を図６に示す。Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ陽性の細胞の割合は、ＨＤＡＣ６タンパク質の発現量の減少に応じて増加している。Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖはアポトーシスの初期段階で細胞膜のホスファチジルセリンが細胞外に露出する際に結合するとされている。従って、ＨＤＡＣ６の機能を阻害することにより、細胞にアポトーシスを生じさせたと考えられる。
【００４３】
実施例７．　ＨＤＡＣ６タンパク質に発現低下によるミトコンドリア膜電位の脱分極の誘導
１０％ＦＣＳ，１×非必須アミノ酸を含むＭＥＭ培地を入れた６ウエルプレートにＨｅＬａ細胞（１．５×１０５／ｗｅｌｌ）を播種し、最終濃度２００ｎＭのＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．４、５、及び１６、並びに対照オリゴヌクレオチドを、３μＬ／ウエルのＯｌｉｇｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥにより導入し、２４時間、３６時間又は４８時間処理し、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｓｅｎｓｏｒ　ＪＣ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）を最終濃度１０μｇ／ｍＬと成るように加え、３７℃にて１０分間更に培養した。１０分後、細胞をトリプシン処理により剥離して回収し、ＦＡＣＳ　ｃａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて解析した。
【００４４】
Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｓｅｎｓｏｒ　ＪＣ−１を培地に添加すると、正常な細胞では速やかにミトコンドリア内に取り込まれ、赤色蛍光（〜５９０ｎｍ；ＦＬ−２）を示すが、ミトコンドリアの膜電位が脱分極している細胞では、ミトコンドリアに取り込まれずに細胞質に存在し、緑色蛍光（〜５２５ｎｍ；ＦＬ−１）を示す。従って、ミトコンドリアの膜電位が脱分極した細胞を検出するために、緑色蛍光陽性の細胞の割合をグラフ化し、アポトーシスの指標とした。
【００４５】
結果を図７に示す。図３の結果から、ＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドはＮｏ．１６、４及び５の順で、ＨＤＡＣ６タンパク質の発現量を低下させる活性が高いと推測できる。図６の結果から、ミトコンドリア膜電位が脱分極を起こしている細胞の割合は、ＨＤＡＣ６タンパク質の発現量の低下に比例して起こっており、ＨＤＡＣ６の機能を阻害すれば、細胞内のα−チューブリンのアセチル化が亢進し、更にミトコンドリアの膜電位の脱分極を引き起こすことからアポトーシスを引き起こしていると考えられる。
【００４６】
実施例８．　アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドＮｏ．１６（配列番号：１８）を用いたＨＤＡＣ６タンパク質の発現抑制とそれによるα−チューブリンアセチル化の亢進
オリゴヌクレオチドＮｏ．１６（配列番号：１８）（この実施例においてＨＤＡＣ６　ＡＳＯと称する）と対照オリゴヌクレオチドＣＣＴＣＴＴＡＣＣＴ　ＣＡＧＴＴＡＣＡＡＴ（配列番号：３１）（実施例４を参照のこと）を用いて、ＨｅｐＧ２細胞（Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ＳＷ４８０細胞（Ｃｏｌｏｎ　ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ＬｏＶｏ細胞（Ｃｏｌｏｎ　ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）又はＣａｌｕ−１（Ｌｕｎｇ　ｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）における、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる、ＨＤＡＣ６タンパク質の発現抑制とそれによるα−チューブリンアセチル化の亢進を試験した。
【００４７】
合成された前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを、を滅菌水に溶解し、ＯｌｉｇｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、添付のプロトコールを用いて上記の細胞に導入した。細胞は、ＨｅｐＧ２細胞　５×１０５細胞／ウエル、ＳＷ４８０細胞　４×１０５細胞／ウエル、ＬｏＶｏ細胞　４×１０５細胞／ウエル、又はＣａｌｕ−１細胞　２×１０５細胞／ウエルの濃度で６ウエルプレートに播種し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの最終濃度は２００ｎＭとし、ＯｌｉｇｏｆｅｃｔＡＮＩＮＥは３μＬ／ウエルで使用した。全ての細胞は、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）＋１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）中で培養した。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入して４８時間後、細胞をトリプシンで剥離して回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液（ＢＰＢ不含）で細胞溶解し、タンパク質を定量した後、２０μｇ／レーンの細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗−アセチル化α−チューブリン抗体（ｃｌｏｎｅ　６−ＩＩＢ−１，Ｓｉｇｍａ）、抗−α−チューブリン抗体（ｃｌｏｎｅ　ＤＭ１Ａ，Ｓｉｇｍａ）又は抗−ＨＤＡＣ６抗体（Ｈ−３００、サンタクルーズ）によりイムノブロットした。
【００４８】
図８に示す通り、試験したアンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．１６（ＨＤＡＣ６　ＡＳＯ）は、実験に用いた全ての細胞においてＨＤＡＣ６の発現量の低下をもたらすことが確認された。対照アンチセンスオリゴヌクレオチドは、予想通り、ＨＤＡＣ６タンパク質の発現低下を惹起する活性を有しなかった。このことから、ＨＤＡＣ６タンパク質によりα−チューブリンの脱アセチル化が行われることが確認された。
【００４９】
実施例９．　アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．１６によるＨＤＡＣ６タンパク質の発現低下に起因するミトコンドリア膜電位の脱分極の誘導
ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）＋１０％ＦＣＳを入れた６ウエルプレートに、ＨｅｐＧ２細胞　５×１０５細胞／ウエル、ＳＷ４８０細胞　４×１０５細胞／ウエル、ＬｏＶｏ細胞　４×１０５細胞／ウエル、又はＣａｌｕ−１細胞　２×１０５細胞／ウエルを播種し、最終濃度２００ｎＭのＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．１６、又は対照オリゴヌクレオチドを、３μＬ／ウエルのＯｌｉｇｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥにより導入し、４８時間インキュベートした。パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）処理対照については、細胞を１μＭのパクリタキセルと共に２４時間インキュベートした。インキュベーションの後、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓｅｎｓｏｒ　ＪＣ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）を最終濃度１０μｇ／ｍＬと成るように加え、３７℃にて１０分間更にインキュベートした。１０分後、細胞をトリプシン処理により剥離して回収し、ＦＡＣＳ　ｃａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて解析した。
【００５０】
結果を図９に示す。図８の結果から、ＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．１６は、ＨＤＡＣ６タンパク質の発現量を低下させる活性を有すると推測できる。図９の結果から、ＨＤＡＣ６の機能を阻害すれば、細胞内のα−チューブリンのアセチル化が亢進し、更にミトコンドリアの膜電位の脱分極を引き起こすことからアポトーシスを引き起こしていると考えられる。
【００５１】
実施例１０．　アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．１６により誘導されるアポトーシスによる細胞数の減少
ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）＋１０％ＦＣＳを入れた６ウエルプレートに、ＨｅｐＧ２細胞　５×１０５細胞／ウエル、ＳＷ４８０細胞　４×１０５細胞／ウエル、ＬｏＶｏ細胞　４×１０５細胞／ウエル、又はＣａｌｕ−１細胞　２×１０５細胞／ウエルを播種し、最終濃度２００ｎＭのＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．１６、又は対照オリゴヌクレオチドを、３μＬ／ウエルのＯｌｉｇｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥにより導入し、４８時間インキュベートした。パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）処理対照については、細胞を１μＭのパクリタキセルと共に２４時間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を回収し、血球計算板により細胞数を測定した。
【００５２】
結果を図１０に示す。図１０の結果から、ＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．１６は、ＨＤＡＣ６タンパク質の発現量を低下させる活性を有し、細胞死を誘導することが推測できる。
実施例８〜１０の結果から、ＨｅＬａ細胞以外の癌細胞においても、ＨＤＡＣ６の生成を抑制することにより、ＪＣ−１染色で緑色蛍光陽性細胞が検出されること、及び細胞数の減少が観察されることから、ミトコンドリアを介するアポトーシスによる細胞死が誘導されることが示唆された。
【００５３】
実施例１１．　アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．１６によるＨＤＡＣ６タンパク質の発現低下に起因する微小管構造の変化
ＨｅＬａ細胞を、Ｌａｂ−ＴｅｋＩＩ　Ｃｈａｍｂｅｒｅｄ　Ｃｏｖｅｒｇｌａｓｓ（Ｎｕｎｃ）上に播種し、
（１）微小管重合剤である１μＭ　Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（Ｓｉｇｍａ）により１６時間の処理し、
（２）ＨＤＡＣ阻害剤である１μＭ　トリコスタチンＡ（和光）により１６時間の処理し、又は
（３）ＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．１６を最終濃度２００ｎＭで、ＯｌｉｇｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥにより導入して２４時間培養を行った。
コルセミド（Ｃｏｌｃｅｍｉｄ；コルヒチンの誘導体）を、エタノールに溶解して培地に添加し、最終濃度１μＭとし、１５分間（前処理無しでは微小管がほぼ消失する時間）処理した。
【００５４】
その後、Ｌａｂ−ＴｅｋＩＩ　Ｃｈａｍｂｅｒｅｄ　Ｃｏｖｅｒｇｌａｓｓを０．１Ｍ　ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．９）で洗浄し、０．５％グルタルアルデヒド／０．１Ｍ　ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．９）で１０分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、０．５％　Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００／ＰＢＳで５分間づつ３回透過性付与（ｐｅｒｍｅａｌｉｚｅ）し、ＰＢＳで３回洗浄し、２．５ｍｇ／ｍＬ　硼水素化ナトリウム／５０％エタノールで１０分間づつ３回処理し、ＰＢＳで３回洗浄し、１０％　正常ヤギ血清／ＰＢＳでブロッキングし、１次抗体であるラット抗−α−チューブリンモノクローナル抗体（ＭＡＢ１８６４；ＣＨＥＭＩＣＯＮ）／ＰＢＳと１時間反応させ、０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０／ＰＢＳで３回洗浄し、２次抗体であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ　４８８接合抗−ラットＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ）／ＰＢＳと３０分間反応せしめ、そして０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０　／ＰＢＳで３回洗浄した後、共焦点レーザー顕微鏡（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ）で観察した。
【００５５】
その結果を図１１に示す。前処理をしないでコルセミド処理をした細胞では微小管が消失したのに対し、微小管重合促進剤であるパクリタキセル、ＨＤＡＣ６を阻害するトリコスタチンＡ、又はＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した細胞では、重合した微小管が残っている像が観察された。これは、ＨＤＡＣ６の阻害又は抑制によりα−チューブリンのアセチル化が亢進し、微小管が安定化されたことによると考えられる。
【００５６】
【産業上の利用可能性】
本発明により、ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）の抑制によってα−チューブリンのアセチル化が亢進し、その結果アポトーシスが誘導される事が見出され、ＨＤＡＣ６を抑制する物質は抗癌剤として有望である事が示された。従って本発明は、抗癌剤として有望なアポトーシス誘導剤を提供する。本発明は更に、抗癌剤として有望なアポトーシス誘導剤のスクリーニング方法を提供する。
【００５７】
【配列表】
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【００５８】
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【００５９】
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【００６０】
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【００６１】
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【００７０】
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【００８０】
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【００８１】
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【００８３】
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【００８４】
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【００８５】
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【００８８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明において製造された組換えＨＤＡＣ６が脱アセチル化活性を有し、その活性がトリコスタチンＡにより阻害されることを示すグラフである。
【図２】図２は、ＨＤＡＣ６がアセチル化α−チューブリンを脱アセチル化することを示すウエスタンブロットの図であり、図面代用写真である。
【図３】図３は、試験したＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドの内、幾つかがＨＤＡＣ６の発現を抑制し、α−チューブリンのアセチル化を亢進させることを示すウエスタンブロットの図であり、図面代用写真である。
【図４】図４は、ＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．４、５、６及び１６並びに陰性対照オリゴヌクレオチドにつき、処理時間を変えて、ＨＤＡＣ６の生成抑制及びα−チューブリンのアセチル化を亢進させる事を示すウエスタンブロットの図であり、図面代用写真である。
【図５】図５は、本発明のＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．４での処理により、ＨｅＬａ細胞の細胞質中に微小管が重合したことを示す顕微鏡写真であり、図面代用写真である。
【図６】図６は、本発明のＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．４、５及び１６が、Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ陽性により判定した場合、ＨｅＬａ細胞においてアポトーシスを誘導することを示すグラフである。
【図７】図７は、本発明のＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．４、５及び１６が、ＪＣ−１染色により判定した場合、ＨｅＬａ細胞においてミトコンドリアにおける脱分極を誘導することを示すグラフである。
【図８】図８は、本発明のＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．１６での処理により、各種ヒト癌細胞中でＨＤＡＣ６の生成が抑制され、α−チューブリンのアセチル化が亢進することを示すウエスタンブロット図である。
【図９】図９は、ＪＣ−１染色により判定した場合、本発明のＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．１６が、各種ヒト癌細胞において、ミトコンドリアにおける脱分極を誘導することを示すグラフである。
【図１０】図１０は、本発明のＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドが、各種ヒト癌細胞において細胞死を誘導することを示すグラフである。
【図１１】図１１は、本発明のＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．１６は、微小管を安定化させ、コルセミドによる微小管の消失を阻害することを示す写真である。
【図１２】図１２は、ＨＤＡＣ６全長ｃＤＮＡのクローニング及びバキュロウイルス用Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｖｅｃｔｏｒの構築を示す。
【図１３】図１３は図１２の続きである。
【図１４】図１４は、ＨＡＤＣ６の動物細胞発現用ベクターの構築を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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