(57)【要約】【課題】宿主生物系での組み換え蛋白質発現又は無細胞翻訳系での蛋白質発現では活性型蛋白質の発現が困難であった蛋白質であっても、効率的に蛋白質を発現することができ、かつ、容易に精製することができる蛋白質の製造方法を提供する。【解決手段】少なくとも、シングルリングを形成するシャペロニンをコードする遺伝子と目的蛋白質をコードする遺伝子とを転写・翻訳することによって、目的蛋白質とシングルリングシャペロニンとがペプチド結合を介して連結した融合蛋白質を発現させる工程を有する蛋白質の製造方法。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも、シングルリングを形成するシャペロニンをコードする遺伝子と目的蛋白質をコードする遺伝子とを転写・翻訳することによって、目的蛋白質とシングルリングシャペロニンとがペプチド結合を介して連結した融合蛋白質を発現させる工程を有することを特徴とする蛋白質の製造方法。
【請求項２】
融合蛋白質においては、シングルリングシャペロニンはシャペロニンのＮ回連結体（Ｎは１〜２０）であり、目的蛋白質は前記シャペロニンのＮ末端、Ｃ末端又はシャペロニン同士の間にペプチド結合を介して連結されていることを特徴とする請求項１記載の蛋白質の製造方法。
【請求項３】
融合蛋白質は、シングルリングシャペロニンと目的蛋白質の連結部に限定分解型プロテアーゼの切断配列を有するものであって、
更に、目的蛋白質を限定分解型プロテアーゼでシングルリングシャペロニンから切り出す工程を有することを特徴とする請求項１又は２記載の蛋白質の製造方法。
【請求項４】
融合蛋白質は、Ｎ末端及びＣ末端にそれぞれ異なる２種類のタグがペプチド結合を介して付加されているものであって、
更に、前記タグを用いて融合蛋白質を精製する工程を有することを特徴とする請求項１、２又は３記載の蛋白質の製造方法。
【請求項５】
請求項１、２、３又は４記載の蛋白質の製造方法により製造される蛋白質であって、シングルリングシャペロニンのリング構造の内部に、シングルリングシャペロニンとペプチド結合を介して封入されていることを特徴とする蛋白質。
【請求項６】
目的蛋白質は、Ｇ蛋白質共役型受容体又はチロシンカイネース型受容体であることを特徴とする請求項１、２、３又は４記載の蛋白質の製造方法。
【請求項７】
請求項１、２、３、４又は６記載の蛋白質の製造方法によって得られた融合蛋白質と目的蛋白質に対するリガンド物質との結合を解析することを特徴とする分子間相互作用解析法。
【請求項８】
融合蛋白質と目的蛋白質に対するリガンド物質との結合の解析は、前記融合蛋白質と前記目的蛋白質のリガンド物質とのいずれか一方をセンサーチップ上に固定化した後、他方を作用させることによって結合体を形成させ、作用前後の質量変化を表面プラズモン共鳴法により検出することにより行うことを特徴とする請求項７記載の分子間相互作用解析法。
【請求項９】
融合蛋白質と目的蛋白質に対するリガンド物質との結合の解析は、シンチライトをポリマーでコートしたビーズに前記融合蛋白質を固定化した後、ラジオアイソトープで標識した前記目的蛋白質のリガンド物質を作用させることによって結合体を形成させ、作用前後の励起光の変化をシンチレーションカウンターで検出するＳｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ　ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ　ａｓｓａｙにより行うことを特徴とする請求項７記載の分子間相互作用解析法。
【請求項１０】
請求項１、２、３、４又は６記載の蛋白質の製造方法によって得られた目的蛋白質に対して特異的に結合し得ることを特徴とするリガンド物質。
【請求項１１】
リガンド物質は、抗体であることを特徴とする請求項１０記載のリガンド物質。
【請求項１２】
リガンド物質は、ペプチドであることを特徴とする請求項１０記載のリガンド物質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、宿主生物系での組み換え蛋白質発現又は無細胞翻訳系での蛋白質発現では活性型蛋白質の発現が困難であった蛋白質であっても、効率的に蛋白質を発現することができ、かつ、容易に精製することができる蛋白質の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまでにバクテリア、酵母、昆虫、動植物細胞、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物等多くの宿主生物での組み換え蛋白質発現系が検討されてきた。なかでもバクテリアを宿主細胞とした組み換え蛋白質の製造方法は、その増殖速度の速さ等から医薬品原料の工業スケール生産の標準システムとなっている。
【０００３】
しかし、これらの従来の組み換え蛋白質発現系では、活性型蛋白質を大量に得ることが困難な場合が多くあった。例えば、目的蛋白質が宿主細胞に対して何らかの毒性を有する場合には、発現が抑制されて発現量が低下したり、細胞増殖量が低下したりする。また、目的蛋白質が可溶性蛋白質として発現する場合には、宿主のプロテアーゼによって分解されてしまい生産量が極めて少なくなることがあった。更に、目的蛋白質が発現しても折り畳みがうまくいかない場合には、可溶化が困難な封入体を形成してしまい、人工的に可溶化して再折り畳みを行っても最終的に得られる活性型蛋白質の量は極めて少なくなってしまうことがあった。
【０００４】
目的蛋白質が宿主細胞に対して何らかの毒性を有する場合の対策としては、例えば、発現誘導剤や温度によって目的蛋白質の発現を厳密に制御可能なベクターを用いた方法が検討されている。これは、目的蛋白質を発現していない状態で宿主細胞を定常期まで増殖させた後、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）等の発現誘導物質を添加したり、培養温度を変化させたりすることによって、菌体内で目的蛋白質を発現させる二段階培養法である。しかしながら、この方法では菌体増殖ステージにおいて、目的蛋白質の発現を完全に抑制することは困難であり、微量に目的蛋白質が発現することによって菌体増殖や発現量が低下することがあるという問題があった。
【０００５】
目的蛋白質が宿主のプロテアーゼによって分解されてしまう場合の対策としては、例えば、ｌｏｎ、ｏｍｐＴのようなプロテアーゼ構造遺伝子の一部を欠損させた大腸菌を宿主として用いる方法が考案されている。しかしながら、大腸菌において現在判明しているプロテアーゼは３０種類以上あるため、一部の構造遺伝子を欠損させただけではプロテアーゼ分解の影響を回避することは困難であり、また、宿主のプロテアーゼを全て欠損させてしまうと他の弊害が起こるため、根本的な解決法とはなっていない。
【０００６】
目的蛋白質が封入体を形成する場合の対策としては、目的蛋白質をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）やチオレドキシン−マルトース結合蛋白質等との融合蛋白質として発現させる方法；大腸菌が宿主である場合には、ペリプラズム内に目的蛋白質を発現させる方法等が考案されている。しかしながら、これらの方法でも、封入体の形成を高効率で解消するのは困難であった。
また、蛋白質の折り畳み反応を支援する蛋白質群である分子シャペロンと共発現させ、可溶性画分への発現量を増大させる方法も考案されている。しかしながら、活性型蛋白質の量は飛躍的には増加しないのが現状であった。
【０００７】
これに対して、目的蛋白質をヒートショックプロテインの１種であるシャペロニンとの融合蛋白質としてシャペロニンの立体構造内部に納めることにより、目的蛋白質の宿主への毒性発現、封入体形成、プロテアーゼによる分解の問題を解消し、目的蛋白質を可溶性蛋白質として大量に発現させる方法が提案されている。この方法によれば、用いる宿主や目的蛋白質ごとに発現条件を試行錯誤で検討する必要もなく、大量の目的蛋白質を得ることができる。
【０００８】
しかしながら、この方法では得られた融合蛋白質から目的蛋白質を回収する際に２層のリング構造を形成しているシャペロニンを開環する必要があるため、目的蛋白質の精製作業が煩雑になるという問題があった。また、シャペロニンと目的蛋白質との融合蛋白質は極めて巨大であるため、宿主細胞由来のプロテアーゼによる分解を受けたり、宿主との相同組換えが起こったりするため、均一な融合蛋白質を得ることは非常に困難であった。更に、シャペロニンと目的蛋白質との融合蛋白質を結晶構造解析やドラッグデリバリーシステム等に適用する時は、高純度に精製された融合蛋白質が求められるが、宿主細胞系においてシャペロニン融合蛋白質を発現させた時、シャペロニン構造体に宿主由来のシャペロニンが含まれたり、分解を受けたシャペロニンが再構成して複合体を形成し目的蛋白質が設計どおりに格納されていなかったりする場合があった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記現状に鑑み、宿主生物系での組み換え蛋白質発現又は無細胞翻訳系での蛋白質発現では活性型蛋白質の発現が困難であった蛋白質であっても、効率的に蛋白質を発現することができ、かつ、容易に精製することができる蛋白質の製造方法を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、少なくとも、シングルリングを形成するシャペロニンをコードする遺伝子と目的蛋白質をコードする遺伝子とを転写・翻訳することによって、目的蛋白質とシングルリングシャペロニンとがペプチド結合を介して連結した融合蛋白質を発現させる工程を有する蛋白質の製造方法である。
以下に本発明を詳述する。
【００１１】
本発明の蛋白質の製造方法では、目的蛋白質とシングルリングシャペロニンとの融合蛋白質を発現させる。
上記シャペロニンとは、細胞に熱ショック等のストレスを与えることにより誘導される分子シャペロンと呼ばれる蛋白質群のなかで、分子量が約６０ｋＤａのもののことであり、バクテリア、古細菌、及び真核生物の全ての生物に存在し、蛋白質の折り畳み支援や変性防御の機能を有するものである。
【００１２】
上記シャペロニンは、グループ１型とグループ２型とに大別される。バクテリアや真核生物のオルガネラに存在するシャペロニンはグループ１型に分類され、いずれも１４量体のホモオリゴマーで、コシャペロニンと称される分子量約１０ｋＤａの蛋白質の環状７量体を補因子とする。一方、グループ２型シャペロニンは、真核生物の細胞質や古細菌にみられるが、それらの構造や機能に関しては不明な点が多く残されており、グループ１型のコシャペロニンに相当する蛋白質も現在のところ見つかっていない。
【００１３】
通常、シャペロニンは１４〜１８個のサブユニットからなる２層のリング構造を形成し、それぞれのリングの内部に空洞（キャビティ）を有している。シャペロニンはこのキャビティ内部に、ポリペプチドや変性蛋白質を一時的に格納し、蛋白質の折り畳み構造形成を助ける機能をもつ。
【００１４】
現在考えられているシャペロニンによる蛋白質の折り畳みの機構では、上下のリングの協同的な作用が重要な役割を担っていると考えられている。例えば、大腸菌由来のシャペロニンＧｒｏＥＬとコシャペロニンＧｒｏＥＳの場合を例にとると、まず、片側のリングに蛋白質が結合し、次に、ＡＴＰが同じ側のリング（シスリング）に結合すると、コシャペロニンＧｒｏＥＳがシスリングに結合し、シャペロニンＧｒｏＥＬの構造変化が起こりＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳ複合体の内部に内径８０Å、高さ８０Åの巨大な空洞でき、内容積はＧｒｏＥＳ結合前の約２倍となる。このＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳ複合体の構造内部に変性ポリペプチドが閉じ込められ、親水的な空洞内部においてポリペプチドは折り畳みを開始する。
【００１５】
折り畳みの過程において、ＡＴＰは徐々にＡＤＰへ加水分解される。シスリングで折り畳まれた蛋白質はコシャペロニンＧｒｏＥＳの解離によってキャビティより放出されるが、そのためには、トランスリングでのＡＴＰの加水分解が必要となる。つまり、蛋白質の折り畳みの進行とは完全に独立した形で、トランスリング内部に結合したＡＴＰがＡＤＰへと加水分解されることによってコシャペロニンＧｒｏＥＳがシスリングより解離する。
このように、蛋白質の折り畳みに関与するシャペロニンの構造変化は、ＡＴＰの結合や加水分解のシグナルが、シャペロニンリングの会合面を通じてお互いのリングに協同的に起こっていると考えられている。
【００１６】
近年、種々の細胞由来のシャペロニン複合体の立体構造がＸ線結晶構造解析によって詳細に明らかにされつつある。それによれば、隣接するサブユニット間及びリング間の相互作用によるシャペロニン複合体の構成は、アミノ酸間の疎水的相互作用及び静電相互作用によっている。また、シャペロニンのＮ末端及びＣ末端はともにキャビティ側に位置し、フレキシビリティの高い構造となっており、特に大腸菌由来シャペロニンＧｒｏＥＬでは、Ｃ末端の少なくとも２３アミノ酸はフレキシビリティの高い構造を示すことがわかっている。
【００１７】
バクテリア、古細菌由来のシャペロニンは、遺伝子組換え手法に大腸菌細胞質可溶性画分に容易に大量生産させることが可能である。更に、精製した発現産物を電子顕微鏡観察することによって、様々のシャペロニンが大腸菌でも自己集合し、１４〜１８量体からなる２層リング構造のシャペロニン複合体を形成できることがわかっている。
【００１８】
近年、遺伝子工学的にアミノ酸変異を導入することにより、上述のような２層のリング構造を形成せず、シングルリングを形成するようなシャペロニンも得られるようになってきた。
これらのシングルリングを形成するシャペロニンも、大腸菌の可溶性画分に大量発現することができ、ゲル濾過や電子顕微鏡及び画像解析等によって発現産物の大部分がシングルリングを構成していることが確認されている。
【００１９】
かかるシングルリングでも蛋白質を収容できるキャビティが充分に形成されることが確認されており、蛋白質をキャビティ内に収容して折り畳みを行うことができる。シングルリングシャペロニンは２層のリング構造のシャペロニンに比べてその開環が容易であるという利点を有する。シャペロニンがそのリング構造への自己集合能が維持されていれば、シングルリング構成のため以外の様々なアミノ酸変異体も使用可能であることから、シャペロニンの各サブユニットの会合力が弱められた変異体を用いれば、格納された目的蛋白質の回収はより容易となる。また、シングルリングシャペロニンはダブルリングシャペロニンに比べて、構造の揺らぎが大きいため、シャペロニンリング内に格納された目的蛋白質のフォールディングが進行しやすくなり、目的蛋白質を活性型で発現させることが容易となる。
また、後述するようにシングルリングを形成するシャペロニンを用いた融合蛋白質のＮ末端及びＣ末端にそれぞれ異なる２種類のタグがペプチド結合を介して付加されるように設計すれば、従来の２層のリング構造を形成する場合に比較して、飛躍的に融合蛋白質の精製が容易になる。
更に、後述するように融合複合体から目的蛋白質を切り出す場合においても、シングルリングを形成するシャペロニンを用いた融合蛋白質では切り出しに用いる限定分解型プロテアーゼがシャペロニン−目的蛋白質の連結部分に直接作用できることから、切り出し操作も簡略化できるという利点もある。
【００２０】
本発明の蛋白質の製造方法は、シングルリングを構成するシャペロニンと目的蛋白質を融合蛋白質とし、目的蛋白質をシングルリングシャペロニンのキャビティ内部に収納された状態で発現させることによって、目的蛋白質の宿主への毒性、プロテアーゼによる分解、封入体の形成の問題を解消し、可溶性蛋白質として大量発現させると同時に、融合蛋白質の精製や目的蛋白質の精製を簡略化して、目的蛋白質の大量発現及び高純度精製を可能とするものである。
【００２１】
すなわち、目的蛋白質が宿主生物にとって重要な自然機構を阻害する性質を有するものであっても、シングルリングシャペロニンのキャビティ内部に収納されることにより生体内環境から仕切られているため阻害作用を発現することもない。また、宿主のプロテアーゼによる消化も受けにくくなる。また、強力なプロモーターによって発現が誘導された時に見られるように、蛋白質の折り畳み中間体同士が多数会合することなく個々にシングルリングシャペロニンのキャビティ内部に固定されるため、宿主生物を用いた発現及び無細胞翻訳系に見られる封入体形成も抑えられる。更に、シャペロニンは宿主生物の細胞質又は体液等の可溶性画分へ発現するため、シングルリングシャペロニンのキャビティ内部に格納された蛋白質が膜結合性又は膜貫通性の蛋白質であっても膜へ移行し宿主生物の膜構造を破壊することもなく、宿主生物に対する毒性は発現しない。また、いかなる蛋白質も同一のシングルリングシャペロニンに格納されているため、同一条件で融合蛋白質としての発現及び精製が可能である。
更に、本来シャペロニン複合体は単に外部環境から仕切られたスペースを提供するだけでなく、蛋白質折り畳み機能を有するため、目的蛋白質の折り畳みも正常に行われ、かつ構造が安定することも期待できる。
【００２２】
本発明の蛋白質の製造方法において用いられるシャペロニンとしては、シングルリングを形成するものであれば、バクテリア、古細菌及び真核生物いずれの由来のものでも使用可能である。
真核生物のミトコンドリア由来のシャペロニン６０は通常シングルリングとして精製されるため、特別の遺伝子操作なしで用いることができる（Ｖｉｉｔａｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２６７，６９５−６９８）。
【００２３】
また、人為的にシングルリングを形成させる手段としては様々な方法が提案されており、いずれの手段を用いてもかまわない。最も一般的に用いられている方法は、リング間の疎水的相互作用や塩橋に寄与するアミノ酸に変異を導入することによって、リング間相互作用を抑制する方法である。例えば、大腸菌由来のシャペロニンＧｒｏＥＬの場合、結晶構造解析より赤道ドメインの４つの荷電アミノ酸（Ｒ４５２、Ｅ４６１、Ｓ４６３、Ｖ４６４）がリング間の結合に強く寄与していていることが分かっているため、４５２番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、４６１、４６３、４６４番目のアミノ酸残基をアラニンに置換することにより、リング間相互作用が軽減し、シングルリングを構成する（Ｗｅｉｓｓｍａｎ
ｅｔ　ａｌ．，１９９５，Ｃｅｌｌ，８３，５７７−５８７）。
この４アミノ酸変異を導入した大腸菌由来のシングルリングＧｒｏＥＬでは、トランスリングが存在していないため、ＡＴＰ結合後のシスリングに結合したコシャペロニンＧｒｏＥＳが解離しないでシングルリングＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳ複合体の構造が維持されることが知られている（Ｗｅｉｓｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５，Ｃｅｌｌ，８３，５７７−５８７）。したがって、コシャペロニンＧｒｏＥＳも共発現できる系を構築すれば、コシャペロニンＧｒｏＥＳ結合によってリング内キャビティが拡大した状態が維持され、さらに、キャビティ内部が非常に親水的な環境となっているため、目的蛋白質の折り畳みにより適した雰囲気が得られる。また、目的蛋白質精製のためにコシャペロニンＧｒｏＥＳを解離したい場合は、適度な塩濃度の緩衝液で透析するか、コールドショックを与えることによってシングルリングＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳ複合体の遊離が可能である。
【００２４】
更に、様々な組み合わせのキメラシャペロニンを作製することによって、シャペロニンとしての機能を保持した状態のシングルリングシャペロニンが得られる。例えば、大腸菌由来のシャペロニンＧｒｏＥＬと根粒菌由来のシャペロニンとを用いてキメラシャペロニンを作製することによって、シングルリングシャペロニンを作製することができる（Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，２８２，７８９−８００）。
【００２５】
上記シャペロニン複合体の構造は由来生物によって若干相違する。例えば、バクテリア由来のシャペロニンリングのシャペロニンサブユニットの構成数は７個であり、古細菌由来のシャペロニンリングでは８〜９個、真核生物由来のシャペロニンリングでは８個である。
本発明では、使用するシャペロニンの由来により、シャペロニンと抗体重鎖又は抗体軽鎖の数の比を選択することが好ましい。シャペロニン：抗体重鎖又はシャペロニン：抗体軽鎖の比としては、１：１〜１２：１が可能であるが、好ましくは１：１〜９：１である。９：１よりもシャペロニンの数の比が大きくなると、発現する抗体重鎖又は抗体軽鎖の実質的な生産量が少なくなるとともに、シャペロニンによるリング構造の形成も困難となることがある。
すなわち、融合蛋白質においては、シャペロニンはそのＮ回連結体（Ｎは１〜２０）となるように設計することが好ましい。
【００２６】
具体的には、シャペロニンサブユニットの構成数が７個であるバクテリア由来のシャペロニンを用いる場合には、シャペロニン複合体の構造形成のしやすさからシャペロニン：抗体重鎖又はシャペロニン：抗体軽鎖の数の比は、１：１又は７：１であることが好ましく、シャペロニンサブユニットの構成数が８個である古細菌由来のシャペロニンを用いる場合には、シャペロニン複合体の構造形成のしやすさからシャペロニン：抗体重鎖又はシャペロニン：抗体軽鎖の比は、１：１、２：１、４：１又は８：１であることが好ましい。
ただし、目的蛋白質の形状や分子量によっては上記以外の数比であってもかまわない。
【００２７】
本発明の蛋白質の製造方法においては、目的蛋白質はまずシャペロニンとの融合蛋白質として得られる。
上記融合蛋白質におけるシャペロニンと目的蛋白質の連結パターンとしては、目的蛋白質がシングルリングシャペロニンのキャビティ内に確実に納まるように、目的蛋白質はシャペロニンのＮ末端、Ｃ末端又はシャペロニン同士の間にペプチド結合を介して連結されていることが好ましい。また、目的蛋白質の宿主に対する毒性が極めて高い又は宿主のプロテアーゼによる消化を極めて受けやすい場合には、目的蛋白質は、複数のシャペロニン連結間に連結されることがより好ましい。
本発明の蛋白質の製造方法により製造される蛋白質であって、シングルリングシャペロニンのリング構造の内部に、シングルリングシャペロニンとペプチド結合を介して封入されている蛋白質もまた、本発明の１つである。
【００２８】
通常、シャペロニン複合体の蛋白質折り畳み反応は、基質蛋白質（シングルポリペプチドとして）と１：１で起こるため、シャペロニンによる折り畳み機能を発現させるには、シングルリングシャペロニンに１個の目的蛋白質が格納されるよう融合蛋白質を設計することが好ましい。ただし、目的蛋白質の分子量によっては２分子以上格納させても正常に折り畳まれる場合がある。
【００２９】
本発明の蛋白質の製造方法において、シングルリングを形成するシャペロニンをコードする遺伝子と目的蛋白質をコードする遺伝子とを転写・翻訳することによって、目的蛋白質とシングルリングシャペロニンとがペプチド結合を介して連結した融合蛋白質を合成する方法としては特に限定されないが、シングルリングを形成するシャペロニンをコードする遺伝子及び目的蛋白質をコードする遺伝子をプラスミドに組込み、このプラスミドをベクターとして宿主に導入する方法が好適である。
【００３０】
ただし、一般的に、大腸菌等では発現プラスミドは１０ｋｂ以上の大きさになるとコピー数が減少し、結果的に蛋白質（Ａ）の発現量が低下することがある。例えば、シャペロニンが８つ連結した融合蛋白質を１つのプラスミドで生産しようとすると、発現プラスミドは１５ｋｂｐ以上にもなり、効率的な発現ができないことがある。
したがって、プラスミドを導入するにあたっては、シングルリングを形成するシャペロニンをコードする遺伝子と目的蛋白質をコードする遺伝子の大きさ；得ようとする融合蛋白質におけるシャペロニンと目的蛋白質との数比等を考慮することが必要となる。
【００３１】
具体的には、例えば、同一のシャペロニン融合蛋白質を発現させる同一遺伝子を異なる複製領域、及び薬剤耐性遺伝子を有する２種類のベクターに導入し、これら２種類のベクターで２種の薬剤の存在下で大腸菌等に形質転換、発現させることで、高発現をもたらすことが可能である。
【００３２】
また、同一宿主内で共存・複製可能な２種の異なるプラスミドに、融合蛋白質を発現させる遺伝子と、シャペロニンのみをコードする遺伝子とを組込み、これらのプラスミドを同一の宿主に導入する方法が好ましい。
この方法によれば、シャペロニン複合体の構造を制御することができる。例えば、シャペロニンと目的蛋白質の数比が４：１である融合蛋白質をコードする遺伝子を組込んだベクターと、１個又は２〜４個連結したシャペロニンのみをコードする遺伝子を組込んだベクターとを導入して共発現させることにより、シャペロニンと目的蛋白質の数比が８：１のシャペロニンリングを形成することが可能である。この方法は、プラスミドの巨大化を防止し、プラスミドコピー数の減少を防止することにより、発現量が低下するのを防ぐことができる。
【００３３】
上記宿主としては特に限定ないが、例えば、バクテリア、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体、植物個体又は昆虫個体等が好適である。なかでも、培養コストが安価であり、培養日数が短く、培養操作が簡便な点から、バクテリア又は酵母でより好適である。
また、バクテリア、真核生物抽出液等を用いた無細胞翻訳系（例えば、Ｓｐｉｒｉｎ，　Ａ．Ｓ．，　１９９１，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　１１，　２６５６−２６６４：　Ｆａｌｃｏｎｅ，　Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．，　１９９１，　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１１，　２６５６−２６６４）でも、融合蛋白質を可溶性蛋白質として発現させることが可能である。
【００３４】
本発明の蛋白質製造方法で発現される蛋白質複合体は、分子量が６５〜６００ｋＤａと巨大であるため、転写されたｍＲＮＡの特定のリボヌクレアーゼによる分解、翻訳された融合蛋白質のプロテアーゼによる分解と、２段階の切断を受ける可能性がある。かかる場合には、例えば、ｍＲＮＡの分解に関与するリボヌクレアーゼをコードするＲＮａｓｅＥ遺伝子を欠損させた宿主を用いることでｍＲＮＡの分解は抑制可能である。また、翻訳後のプロテーゼによる分解を抑制するためには、１５〜２５℃の低温で発現させたり、ｌｏｎ、ｏｍｐＴ等のプロテアーゼの構造遺伝子を欠損させた大腸菌を宿主として用いることが好ましい。
【００３５】
また、本発明の蛋白質の製造方法では、ベクターとして用いるプラスミドにシャペロニン又はコシャペロニンの繰返し配列が含まれるため、プラスミドが不安定となったり、特に宿主細胞とシャペロニン又はコシャペロニンの由来生物が同じであるときにはプラスミドＤＮＡとゲノムＤＮＡの相同組換えが起こったりする可能性がある。しかし、宿主として大腸菌を用いる場合は、遺伝子の相同組換えに関する遺伝子であるＲｅｃＡを欠損させた宿主を用いることで、プラスミドの安定性を向上させ、相同組換えを抑制することができる。
【００３６】
プラスミドを導入した宿主内で融合蛋白質を発現させる方法としては特に限定されず、公知の方法を用いることができ、例えば、予めプラスミドにコードされていた薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を含有する培地中で宿主を培養する方法等が挙げられる。また、２種のプラスミドを用いる場合において、２種のプラスミドにコードされる薬剤耐性遺伝子がそれぞれ異なっている場合には、この２種類の薬剤の存在下で宿主を培養することにより、効率よく、融合蛋白質を発現させることができる。
【００３７】
このようにして融合蛋白質を発現させた後、細胞を回収し破砕し、上清を回収して、精製を行う。
融合蛋白質は分子量が約８４０〜９６０ＫＤａの巨大蛋白質であるため、４０％飽和程度の硫安塩析によって沈殿させることができる。塩析により沈殿した融合蛋白質を回収した後、適当な緩衝液に溶解し、疎水クロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィーによって融合蛋白質の存在するフラクションを回収する。これらを限外ろ過によって濃縮した後、濃縮液を５〜５０ｍＭ程度の塩化マグネシウム及び５０〜３００ｍＭ程度の塩化ナトリウム又は塩化カリウムが含有された緩衝液を展開液としてゲルろ過を行い、排除限界直後のピークを回収することによって融合蛋白質を精製することができる。
融合蛋白質のリング構造が不安定な場合は、精製の過程でマグネシウム及びＡＴＰを存在させておくことで、リング構造である融合蛋白質を効率的に回収することが可能である。
【００３８】
更に高度な精製が必要な場合にあっては、予め融合蛋白質のＮ末端及びＣ末端にそれぞれ異なる２種類のタグがペプチド結合を介して付加されるように融合蛋白質を設計しておくことが好ましい。例えば、融合蛋白質のＮ末端に６〜１０個のヒスチジンが並んだヒスチジンタグを連結し、さらに、Ｃ末端にＡｓｐＴｙｒＬｙｓＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓの８アミノ酸からなるＦＬＡＧタグを連結した場合、精製のファーストステップとしてニッケル等の金属キレートカラムを用いれば、Ｎ末端にヒスチジンタグの付加されていない蛋白質は除去され、更にセカンドステップとして抗ＦＬＡＧ抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィーによってＣ末端側にＦＬＡＧタッグの付加蛋白質は除去される。したがって、Ｎ末端及びＣ末端にそれぞれヒスチジンタッグ及びＦＬＡＧタッグが付加された完全な融合蛋白質のみが精製されることになる。
従来のダブルリングシャペロニンでは、例えば、上側のリングにヒスチジンタッグが残り、下側のリングにＦＬＡＧタッグが残ったシャペロニン構造体等は、ニッケルカラムを用いたクロマトグラフィー及びＦＬＡＧに対するアフィニティクロマトグラフィーでも回収されるため、精製蛋白質に設計と異なった融合蛋白質が含まれることになっていた。かかる点も、シングルリングを形成するシャペロニンを用いる利点の１つである。
Ｎ末端及びＣ末端に付加されるタグとしては詳述のヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ以外でもよく、他のタグとしては、例えば、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｓタグ等が挙げられる。
【００３９】
なお、目的蛋白質の回収のみが目的である場合は、融合蛋白質は必ずしも均一に精製する必要はなく、粗精製サンプルにＥＤＴＡ処理を施した後、プロテアーゼを作用させ、目的蛋白質に応じた精製操作を施せば良い。目的蛋白質にメチオニンが存在しない場合は、シャペロニンと目的蛋白質の間にメチオニンを存在させることによって、ＣＮＢｒによって切断可能なので、融合蛋白質をＥＤＴＡ処理及び透析するという操作は必要ない。
【００４０】
シャペロニンが耐熱性のものである場合には、宿主細胞を破砕した上澄みを６０〜８０℃で熱処理することにより、大部分の宿主由来蛋白質は沈殿するので、融合蛋白質の精製をより簡略化することができる。目的蛋白質が熱に対して不安定な場合でも、シャペロニンの空洞内部に保持されているので、変性することはない。
【００４１】
このようにして精製した融合蛋白質の形態は透過型電子顕微鏡によって観察可能である。目的蛋白質がシャペロニンリングに格納されている場合、外径１４〜１６ｎｍ程度のシャペロニン特有のリング構造が観察される。
【００４２】
次いで、精製した融合蛋白質から目的蛋白質を切り出す。
シャペロニンのサブユニット間の会合は、マグネシウムイオン及びＡＴＰによって安定化されている。従って得られた融合蛋白質から目的蛋白質のみを分離する場合には、上記のようにして回収した画分をエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で処理した後、マグネシウム及びＡＴＰが入っていない緩衝液に対して透析を行いマグネシウム及びＡＴＰを取り除く。これによってシャペロニンサブユニット間の相互作用は解除され立体構造は壊れ、目的蛋白質が露出する。
予め、シングルリングシャペロニンと目的蛋白質との連結部が限定分解型プロテアーゼの切断配列を有するように融合蛋白質を設計しておけば、透析内液にトロンビン等の限定分解型プロテアーゼを作用させることにより極めて容易に目的蛋白質を切り出すことができるので好ましい。
なお、本発明においてはシングルリングシャペロンを用いているため、シャペロニン赤道ドメインより限定分解型プロテアーゼがシャペロニン−目的蛋白質の連結部分に作用することができるためＥＤＴＡ処理及びマグネシウム−ＡＴＰフリーの緩衝液による透析処理を簡略化することもできる。
【００４３】
目的蛋白質が膜結合性又は膜貫通性蛋白質である場合には、目的蛋白質とシャペロニンの切断によって不溶化することもあるが、不溶化物のみを遠心分離によって回収した後、疎水性アルキル鎖がオクチル（Ｃ８）からドデシル（Ｃ１２）あたりの長さである非イオン性界面活性剤等を用いると、ミセルの直径がほぼ生体膜の相応し、可溶化しやすい。上記非イオン性界面活性剤としては、例えば、β−オクチルグルコシド、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、Ｔｗｅｅｎ２０等が挙げられる。
【００４４】
本発明の蛋白質の製造方法の対象となる目的蛋白質としては特に限定されないが、例えば、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス、ＨＩＶ、インフルエンザ等の病原性ウィルスゲノムにコードされる蛋白質（外被蛋白質、コア蛋白質、プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼ等）；ｓｃＦＶ（単鎖抗体）、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２　及び完全抗体型である治療・診断用抗体；７回膜貫通型受容体（Ｇ蛋白質共役型受容体）、チロシンカイネース型受容体、核内ホルモン受容体、血小板増殖因子、血液幹細胞成長因子、肝細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子、神経成長・栄養因子、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子等の成長因子に属するもの、腫瘍壊死因子、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージ・コロニー刺激因子、アルブミン、ヒト成長ホルモン等に属するもの等が挙げられる。その他にも、ヒト、マウス等高等動物由来の疾病関連遺伝子産物の全てが本発明の蛋白質の製造方法の目的蛋白質となり得る。また、化学プロセス食品加工、その他の産業分野に有効な酵素、蛋白質も本発明の蛋白質の製造方法の対象である。
【００４５】
本発明の蛋白質の製造方法によれば、従来の方法では目的蛋白質が宿主細胞に対して何らかの毒性を有していたり、宿主のプロテアーゼによって分解されてしまったり、可溶化が困難な封入体を形成してしまったりすることにより大量発現が困難であった蛋白質であってもシャペロニンとの融合蛋白質として容易に大量に発現させることができ、更に、融合蛋白質から容易に目的蛋白質を分離することができる。
【００４６】
また、本発明における目的蛋白質がＧＰＣＲ等の膜貫通型受容体や核内ホルモン受容体等の受容体である場合、受容体に対するリガンド物質や受容体に特異的に結合する抗体等と受容体との相互作用を、本発明における融合蛋白質を用いて解析することが可能である。解析方法としては特に限定されず、例えば、表面プラズモン共鳴法や、Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ　ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ　ａｓｓａｙ法等が挙げられる。
【００４７】
上記表面プラズモン共鳴法では、上記融合蛋白質と上記目的蛋白質のリガンド物質とのいずれか一方をセンサーチップ上に固定化した後、他方を作用させることによって結合体を形成させ、作用前後の質量変化を検出し、上記Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ　ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ　ａｓｓａｙ法では、シンチライトをポリマーでコートしたビーズに上記融合蛋白質を固定化した後、ラジオアイソトープで標識した上記目的蛋白質のリガンド物質を作用させることによって結合体を形成させ、作用前後の励起光の変化をシンチレーションカウンターで検出することによる。
【００４８】
本発明の蛋白質の製造方法によって得られた目的蛋白質に対して特異的に結合し得るリガンド物質もまた、本発明の１つである。上記リガンド物質としては、例えば、抗体やペプチド等が挙げられる。
【００４９】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００５０】
実施例１
（シングルリングＧｒｏＥＬ融合ＨＢｓ抗原の発現）
大腸菌Ｋ１２株ゲノムを鋳型とするＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）法によって、大腸菌シャペロニンＧｒｏＥＬ遺伝子をクローニングした。得られたＧｒｏＥＬ遺伝子を制限酵素ＤｒａＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化し、更にＧｒｏＥＬの４５２番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、４６１、４６３、４６４番目のアミノ酸残基をアラニンに置換した合成ＤＮＡを挿入することによってシングルリングを形成するシャペロニンをコードする遺伝子ＳＲ１を得た。
【００５１】
ｐＴｒｃ９９Ａ発現ベクター（アマシャムファルマシア社製）を用いて、得られたＳＲ１が一方向に１、２、３、４、５、６又は７回連結した遺伝子断片が挿入された発現ベクターｐＴｒｃ（ＳＲ１）ｎ（ｎは１〜７）を構築した。
発現ベクターｐＴｒｃ（ＳＲ１）ｎを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入しカルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む２ＸＹ．Ｔ．培地（バクトトリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ）で２３℃、１１０ｒｐｍで２４時間回転培養し、シャペロニン連結体を発現させた。
培養終了後、回収した菌体を超音波で破砕し、遠心分離で上清を回収後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ並びにクマシーブリリアントブルー染色によって分析した結果、（ＳＲ１）ｎ　が可溶性画分に大量発現していることが確認できた。また、得られた（ＳＲ１）７の上清をＮＡＴＩＶＥ−ＰＡＧＥで分析した結果、シングルリングとして存在していることが確認できた。
【００５２】
Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓ）遺伝子をＰＣＲ法によって５’末端にＮｈｅＩサイトを、３’末端にＸｈｏＩサイトを設け、ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩ処理が施されたｐＴｒｃ（ＳＲ１）７に導入し、ＳＲ１の７量体とＨＢｓ（Ｎ末端に６残基のヒスチジンが導入される）の融合蛋白質を合成する発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓ（ＳＲ１）７・ＨＢｓを構築した。
得られたベクターをＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した後、カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む２ＸＹ．Ｔ．培地で２３℃、１１０ｒｐｍで２４時間回転培養し、融合蛋白質の発現を行った。
【００５３】
大腸菌破砕物の可溶性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離後、クマシーブリリアントブルー染色によって分析した結果、ＳＲ１−ＨＢｓ抗原融合蛋白質に相当するサイズのバンドが検出された。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ブロッティングメンブランに転写し、抗ＨＢｓ抗原ポリクローナル抗体を用いてウエスターンブロッティングを行った結果、ＳＲ１の７量体のみを発現させた大腸菌抽出液では陰性であったが、融合蛋白質の場合のみ、そのサイズ相当（約４４０ＫＤａ）の陽性バンドが検出された。このことからＨＢｓ抗原がＳＲ１の７量体との融合蛋白質として大腸菌可溶性画分に発現することがわかった。ＨＢｓ抗原単独での発現実験では、大腸菌の可溶性画分にも沈殿画分にも同様のウエスターンブロッティングで陰性であった。本実施例の発現法によって大腸菌培養液１Ｌ当たり約７０ｍｇのＨＢｓが可溶性画分に発現していた。
【００５４】
実施例２
（両端タッグの付加されたシングルリングＧｒｏＥＬ融合ＨＢｓ抗原の精製）
実施例１で作製した発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓ（ＳＲ１）７・ＨＢｓをもとに、Ｃ末端にＦＬＡＧタグをコードする遺伝子が挿入された発現ベクターｐＨ（ＳＲ１）７・ＨＢＦを構築した。
【００５５】
得られた発現ベクターｐＨ（ＳＲ１）７・ＨＢＦを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換し、実施例１と同条件で発現を行った。超音波による菌体破砕後、上清を遠心分離によって回収し、ニッケルキレートセファロースカラムにアプライした。１ｍＭイミダゾールを含有する５０ｍＭ　Ｎａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で充分に洗浄後、１００ｍＭイミダゾールを含有する同緩衝液でニッケルキレートセファロースに吸着した画分を溶出した。溶出画分を１０ｍＭＣａＣｌ２及び１００ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で透析を行った後、抗ＦＬＡＧ抗体（シグマ社製）を用いたアフィニティクロマトグラフィーを行った。カラム洗浄後１ｍＭＥＤＴＡを含む溶液で吸着蛋白質を溶出した。
【００５６】
溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果、４４０ｋＤａ付近にバンドが確認できた。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ブロッティングメンブランに転写し、抗ＨＢｓ抗原ポリクローナル抗体を用いてウエスターンブロッティングを行った結果、そのサイズ相当（約４４０ＫＤａ）の陽性バンドが検出された。また、Ｈｉｓタッグ及びＦＬＡＧタッグにより精製したサンプルを、ゲルろ過及びＮＡＴＩＶＥ−ＰＡＧＥにより分析したところ、発現した融合蛋白質がシングルリングとして存在していることが確認できた。
【００５７】
一方、比較実験として、シングルリングを構成しない野生型のシャペロニンＧｒｏＥＬとＨＢｓ抗原の融合蛋白質（Ｎ末端にヒスチジンタグを付加）の発現ベクターｐＴｒｃＨ（ＧｒｏＥＬ）７ＨＢｓを同条件で発現させた。
細胞破砕後の上清をニッケルカラムにアプライし吸着画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析したところ、シャペロニン構造体の分解物であると考えられる６０、１２０、２４０ｋＤａ付近の大きなバンドが認められた。抗ＧｒｏＥＬモノクローナル抗体を用いてウエスターンブロッティングを行った結果、サイズ相当部分に陽性バンドが検出された。
【００５８】
実施例３
（シングルリングＧｒｏＥＬ融合ＧＰＣＲの発現）
ヒト由来の膜蛋白質である５種のＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）である、セロトニン受容体（ＨＴ１ａＲ）遺伝子、エンドセリンＡ受容体（ＥＴＡＲ）遺伝子、エンドセリンＢ受容体（ＥＴＢＲ）遺伝子、Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　Ｐｅｐｔｉｄｅ１受容体（ＶＩＰ１Ｒ）遺伝子、及び、ＣＤ９７遺伝子に、ＰＣＲによって５’末端にＮｈｅＩサイトを、３’末端にＸｈｏＩサイトを設け、実施例１と同様にＮｈｅＩ及びＸｈｏＩ処理が施されたｐＴｒｃ（ＳＲＩ）７に導入し、更に、実施例２と同様にＣ末端にＦＬＡＧタッグを付加した発現ベクターｐＴｒｃ（ＳＲ１）７ＨＴ１ａＲＦ、ｐＴｒｃ（ＳＲ１）７ＥＴＡＲＦ、ｐＴｒｃ（ＳＲ１）７ＴＣＦＥＴＢＲＦ、ｐＴｒｃ（ＳＲ１）７ＶＩＰ１ＲＦ、及び、ｐＴｒｃ（ＳＲ１）７ＣＤ９７Ｆを作製した。得られた発現ベクターで大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）株を形質転換し、実施例１と同条件で発現を行った。超音波による菌体破砕後、上清を遠心分離によって回収し、抗ＦＬＡＧ抗体固定化ビーズ（シグマ社製）を用いて免疫沈降反応を行った。５種全てのＧＰＣＲについて、いずれも融合蛋白質として４７０ｋＤａ付近にバンドが確認でき、またそれら全てが、抗ＦＬＡＧ抗体に対して結合した。このことから、これら５種のＧＰＣＲの全てが大腸菌可溶性画分に発現することが確認できた。
【００５９】
実施例４
（表面プラズモン共鳴法によるＳＲ１七量体及びエンドセリンＡ受容体の融合蛋白質とエンドセリン−１との結合状態の解析）
金薄膜を蒸着し、その金薄膜上にリンカー層を介して結合したデキストランにカルボキシルメチル基が導入されたセンサーチップ（ビアコア社製、センサーチップＣＭ５）にエンドセリン−１（ペプチド研究所、Ｈ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−ＯＨ）を、センサーチップ上のカルボキシル基とエンドセリン−１のアミノ基とを共有結合させることにより、センサーチップ上に固定した。得られたセンサーチップを、表面プラズモン共鳴解析装置（ビアコア社製、ＢＩＡＣＯＲＥ　Ｘ）にセットし、サンプルとして実施例３で得られた１００μｇのシングルリングＧｒｏＥＬ七量体融合エンドセリンＡ受容体溶液をフローセルに流した。この、エンドセリン−１とエンドセリンＡ受容体との結合・解離に伴う質量変化をリアルタイムで測定し、エンドセリン−１とエンドセリンＡ受容体との特異的結合を検出した。また、対照として、エンドセリンＡ受容体を融合していないシングルリングＧｒｏＥＬ七量体、シングルリング化を行っていないダブルリング構造のＧｒｏＥＬ七量体融合エンドセリンＡ受容体、及び、シングルリング化を行っていないダブルリング構造のＧｒｏＥＬ七量体も同様にフローセルに流し、エンドセリン−１との結合・解離に伴う質量変化を測定した。結果、図１に示すようにエンドセリン−１とシングルリングＧｒｏＥＬ七量体融合エンドセリンＡ受容体と間の相互作用が確認でき、また、エンドセリン−１とシングルリングＧｒｏＥＬ七量体との間に相互作用を認めることができなかったことから、エンドセリン−１とシングルリングＧｒｏＥＬ七量体融合エンドセリンＡ受容体中のエンドセリンＡ受容体が特異的に結合したことがわかった。一方、ダブルリング構造のＧｒｏＥＬ七量体融合エンドセリンＡ受容体、ダブルリング構造のＧｒｏＥＬ七量体は、エンドセリン−１との相互作用を認めることができなかったことから、ＧｒｏＥＬのシングルリング化がエンドセリンＡ受容体のリガンド結合活性には有効であることが確認できた。
【００６０】
【発明の効果】
本発明によれば、宿主生物系での組み換え蛋白質発現又は無細胞翻訳系での蛋白質発現では活性型蛋白質の発現が困難であった蛋白質であっても、効率的に蛋白質を発現することができ、かつ、容易に精製することができる蛋白質の製造方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】エンドセリン−１固定化センサーチップを用いたエンドセリン−１と（ＳＲ１）７ＥＴＡＲ及び（ＳＲ１）７間における相互作用の測定結果を示す図である。
【図１】
2004043447.tif 000002