(57)【要約】【課題】炎症、血管や組織の新生、癌、腸管での潰瘍あるいは前立腺肥大症などの種々の疾患の発症及び発症の抑制等に関与する可能性を有する新規なＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）ポリペプチド、それらをコードするＤＮＡ、それらに対する抗体、それらを介するシグナル伝達を調節する物質を同定する方法、及びそれらを含む医薬組成物等を提供する。【解決手段】哺乳動物の成体の生理学的機能の調節において極めて重要な役割を担うＧＰＣＲに関し鋭意研究することにより、炎症、血管や組織の新生、癌、腸管での潰瘍あるいは前立腺肥大症などの種々の疾患に関与する可能性を有する新規なＧＰＣＲを見出した。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号９、配列番号２０、配列番号３１、配列番号４５、配列番号５４、配列番号７４、配列番号８９、配列番号１３７または配列番号１５３のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその一部をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
該ポリペプチドの一部が、該ポリペプチドの細胞外領域の全部またはその一部であることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号８、配列番号１９、配列番号３０、配列番号４４、配列番号５３、配列番号７３、配列番号８８、配列番号１３６の塩基番号３８乃至２５４８または配列番号１５２の塩基番号３８乃至１１６２のいずれかに記載される塩基配列またはその一部を含むＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号８、配列番号１９、配列番号３０、配列番号４４、配列番号５３、配列番号７３、配列番号８８、配列番号１３６の塩基番号３８乃至２５４８または配列番号１５２の塩基番号３８乃至１１６２のいずれかに記載される塩基配列を有するＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号９、配列番号２０、配列番号３１、配列番号４５、配列番号５４、配列番号７４、配列番号８９、配列番号１３７または配列番号１５３のいずれかに記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその一部。
【請求項６】
配列番号９、配列番号２０、配列番号３１、配列番号４５、配列番号５４、配列番号７４、配列番号８９、配列番号１３７または配列番号１５３のいずれかに記載されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその一部。
【請求項７】
該ポリペプチドの一部が、該ポリペプチドの細胞外領域の全部またはその一部であることを特徴とする請求項５に記載のポリペプチドの一部。
【請求項８】
配列番号９、配列番号２０、配列番号３１、配列番号４５、配列番号５４、配列番号７４、配列番号８９、配列番号１３７または配列番号１５３のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの細胞外領域及びヒト免疫グロブリンの重鎖の定常領域全部若しくは一部とからなる融合ポリペプチド。
【請求項９】
請求項４に記載のＤＮＡに相補的な塩基配列を有するＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１乃至請求項４のいずれかに記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の発現ベクターで形質転換された形質転換細胞。
【請求項１２】
請求項５乃至請求項７のいずれかに記載のポリペプチドまたはその一部に反応性を有する抗体。
【請求項１３】
該抗体が、ポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
該抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１２に記載の抗体。
【請求項１５】
請求項５乃至請求項７のいずれかに記載のポリペプチドまたはその一部に反応性を有するモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項１６】
請求項７に記載のポリペプチドの一部若しくは請求項８に記載の融合ポリペプチド及び薬学的に許容され得る担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１２乃至請求項１５のいずれかに記載の抗体若しくは該抗体の一部及び薬学的に許容され得る担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１５に記載のモノクローナル抗体またはその一部を産生する細胞。
【請求項１９】
該細胞が、モノクローナル抗体を産生する能力を有する非ヒト哺乳動物由来のＢ細胞と哺乳動物由来のミエローマ細胞とを融合して得られる融合細胞であることを特徴とする請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
該細胞が、該モノクローナル抗体の重鎖をコードするＤＮＡ若しくはその軽鎖をコードするＤＮＡのいずれか一方のＤＮＡ、または両方のＤＮＡが細胞内に導入されることにより形質転換された遺伝子組換え細胞であることを特徴とする請求項１８に記載の細胞。
【請求項２１】
下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含む配列番号９、配列番号２０、配列番号３１、配列番号４５、配列番号５４、配列番号７４、配列番号８９、配列番号１３７または配列番号１５３のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する物質を同定する方法：
（ａ）該ポリペプチド、該ポリペプチドを発現する細胞または該細胞の膜調製物に被験物質を接触させる工程；及び
（ｂ）工程（ａ）で被験物質を接触させた後に、該ポリペプチド、該ポリペプチドを発現する細胞または該細胞の膜調製物への該被験物質の結合を有無を検出する工程。
【請求項２２】
下記（ａ）乃至（ｃ）の工程を含む配列番号９、配列番号２０、配列番号３１、配列番号４５、配列番号５４、配列番号７４、配列番号８９、配列番号１３７または配列番号１５３のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを介した細胞内へのシグナル伝達を調節する活性を有する物質を同定する方法：
（ａ）該ポリペプチドを発現する細胞に被験物質を接触させる工程；
（ｂ）工程（ａ）で被験物質を接触させた後の該細胞のプロファイルを決定する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で決定されたプロファイルを、該ポリペプチドを発現する細胞に該被験物質を接触させなかった場合における該細胞のプロファイルと比較する工程。
【請求項２３】
該物質が、アゴニストまたはアンタゴニストであることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項２２に記載の方法により同定された物質。
【請求項２５】
請求項２３に記載の方法により同定されたアゴニストまたはアンタゴニスト。
【請求項２６】
請求項２３に記載の物質または請求項２４に記載のアゴニスト若しくはアンタゴニスト及び薬学的に許容され得る担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項２７】
下記（ａ）乃至（ｃ）のいずれかに記載の工程を含む配列番号９、配列番号２０、配列番号３１、配列番号４５、配列番号５４、配列番号７４、配列番号８９、配列番号１３７または配列番号１５３のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの産生の異常の被験者における有無を診断する方法：
（ａ）該被験者から取得した被験試料中における該ポリペプチドの量及び健常人から取得した被験試料中における該ポリペプチドの量を決定し両者を比較する工程；
（ｂ）該被験者から取得した被験試料中における該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの量及び健常人から取得した被験試料中における該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの量を決定し両者を比較する工程；または
（ｃ）該被験者から取得した被験試料中における該ポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列における変異の有無を決定する工程。
【請求項２８】
配列番号９、配列番号２０、配列番号３１、配列番号４５、配列番号５４、配列番号７４、配列番号８９、配列番号１３７または配列番号１５３のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡがその内在性ゲノムに組込まれており、該ポリペプチドを産生するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に係るポリペプチド若しくはその一部（例えば、その細胞外領域または当該細胞外領域とヒト免疫グロブリン重鎖の定常領域とからなる融合ポリペプチド）、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ若しくはその一部、該ＤＮＡを含む発現ベクター、該ベクターで形質転換された細胞、該ポリペプチド若しくはその一部に結合する抗体、該抗体を産生する細胞、前記のいずれかを含む医薬組成物、該ポリペプチドに結合する物質を同定する方法、該方法により同定された物質、該ポリペプチドを介するシグナル伝達を調節する活性を有する物質を同定する方法、該方法により同定された物質（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト等）、該ポリペプチドの産生異常の有無を診断する方法、及び該ポリペプチドを産生するトランスジェニック非ヒト哺乳動物等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞の表面で働く糖蛋白質である受容体は、細胞膜蛋白質の最も重要なカテゴリーの一つである。この受容体は、様々な細胞外からの刺激や情報（例えば、ホルモン、増殖因子、薬剤、匂い、光など）を生理的な応答に変換するために必須である。当該変換には、通常、細胞膜結合酵素の活性化や種々のセカンドメッセンジャーの産生を伴う。
このような受容体は、結合するリガンドの種類、作用発現の機構及び連係する代謝の様式などによりいくつかのグループに分類されている。
その一つは、Ｇ蛋白質共役型受容体（Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ；　ＧＰＣＲ）と総称される受容体である。
【０００３】
Ｇ蛋白質（ＧＴＰ結合蛋白質（ＧＴＰ（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ　５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の略称。）は、ＧＴＰが結合しているαサブユニットとβサブユニット及びγサブユニットからなるヘテロ三量体であり、細胞内シグナル伝達系の複雑なネットワークの中で細胞外からのシグナルを細胞内に伝達するトランスデューサーとしてまた該シグナルの伝達時間を制御する分子スイッチとして中心的な役割を担う。この三量体Ｇ蛋白質は、Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）により活性化される。
このＧ蛋白質は、４つのファミリー（Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｑ、Ｇ１２）に分類され、現在までに約２０種類のＧ蛋白質が同定されている（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００４】
即ち、Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）とは、このような細胞内シグナル伝達のキー分子であるＧ蛋白質と共役して細胞外からの刺激（シグナル）の細胞内への伝達を担う受容体である。
ＧＰＣＲは、ホルモン作用、神経伝達、循環調節、生体防御、感覚（視覚、嗅覚、味覚など）といった様々な情報伝達に関与し、推定２，０００種類以上のＧＰＣＲが少なくとも１６種類のＧα、５種類のＧβ及び１２種類のＧγからなるＧ蛋白質に共役し、１００種類以上のエフェクター群（例えば、アデニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼＣ、カリウムチャンネル、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼなど）の活性を制御する。
ＧＰＣＲの上述のような多様性の一方で、ＧＰＣＲの構造及び作用発現の分子メカニズムは保存されている。ＧＰＣＲは、細胞膜を７回または６回貫通する構造（７　ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　：　７ＴＭ）を有し、この高次構造を通じて細胞外から受容した刺激を変換し、細胞膜の内側に存するＧ蛋白質へ伝達しこれを活性化する（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００５】
ＧＰＣＲが受容する外的情報、即ち、リガンドは、極めて多種類であり、アミン、アミノ酸、ペプチド、蛋白質（例えば、ホルモンなど）、ヌクレオシド、ヌクレオチド、脂質、及びカルシウムイオン（Ｃａ２＋）、外的刺激（匂い、味、フェロモン）の成分物質など極めて多種類に及ぶ。
これまでに開発された薬剤の５０％以上は、ＧＰＣＲに対するアゴニストかアンタゴニストであり、ＧＰＣＲが生体の機能調節においてだけでなく、種々の疾患の治療のターゲットとして極めて重要であることを物語っている（例えば、非特許文献３参照。）。
【０００６】
【非特許文献１】
実験医学，　１９９６，　Ｖｏｌ．１４，　Ｎｏ．２，　Ｓｕｐｐｌ．，　ｐ．１３８−１４９
【非特許文献２】
現代医療，　２０００，　Ｖｏｌ．３２，　Ｎｏ．７，　ｐ．１５６１−１５６８
【非特許文献３】
蛋白質核酸酵素，　２００１，　Ｖｏｌ．４６，　Ｎｏ．１１，　ｐ．１７６４−１７７１
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
即ち、本発明は、生体の多種多様な機能維持及び防御において必須である細胞内シグナル伝達を担う新規なＧＰＣＲを同定するとともに、該ＧＰＣＲのリガンドや生物機能及び該ＧＰＣＲと疾患との関係を明らかにすることを目的とする。
さらに本発明は、該ＧＰＣＲの機能の機能を調節することにより該ＧＰＣＲが関与する疾患の治療または予防を可能とする方法及び手段、並びに該ＧＰＣＲの機能を調節し種々の疾患を治療または予防可能な薬剤を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヒトのＧＰＣＲに関して鋭意研究を重ねた結果、近年報告されたヒトゲノムの塩基配列の中に新たなＧＰＣＲをコードする遺伝子を見出し本発明を完成するに到った。
即ち、本発明は、下記（１）乃至（２８）に記載されるとおりの発明である。
（１）　配列番号９、配列番号２０、配列番号３１、配列番号４５、配列番号５４、配列番号７４、配列番号８９、配列番号１３７または配列番号１５３のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその一部をコードするＤＮＡ。
（２）　該ポリペプチドの一部が、該ポリペプチドの細胞外領域の全部またはその一部であることを特徴とする前記（１）に記載のＤＮＡ。
（３）　配列番号８、配列番号１９、配列番号３０、配列番号４４、配列番号５３、配列番号７３、配列番号８８、配列番号１３６の塩基番号３８乃至２５４８または配列番号１５２の塩基番号３８乃至１１６２のいずれかに記載される塩基配列またはその一部を含むＤＮＡ。
（４）　配列番号８、配列番号１９、配列番号３０、配列番号４４、配列番号５３、配列番号７３、配列番号８８、配列番号１３６の塩基番号３８乃至２５４８または配列番号１５２の塩基番号３８乃至１１６２のいずれかに記載される塩基配列を有するＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（５）　配列番号９、配列番号２０、配列番号３１、配列番号４５、配列番号５４、配列番号７４、配列番号８９、配列番号１３７または配列番号１５３のいずれかに記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその一部。
（６）　配列番号９、配列番号２０、配列番号３１、配列番号４５、配列番号５４、配列番号７４、配列番号８９、配列番号１３７または配列番号１５３のいずれかに記載されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその一部。
（７）　該ポリペプチドの一部が、該ポリペプチドの細胞外領域の全部またはその一部であることを特徴とする前記（５）に記載のポリペプチドの一部。
（８）　配列番号９、配列番号２０、配列番号３１、配列番号４５、配列番号５４、配列番号７４、配列番号８９、配列番号１３７または配列番号１５３のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの細胞外領域及びヒト免疫グロブリンの重鎖の定常領域全部若しくは一部とからなる融合ポリペプチド。
（９）　前記（４）に記載のＤＮＡに相補的な塩基配列を有するＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（１０）　前記（１）乃至前記（４）のいずれかに記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
（１１）　前記（１０）に記載の発現ベクターで形質転換された形質転換細胞。
（１２）　前記（５）乃至前記（７）のいずれかに記載のポリペプチドまたはその一部に反応性を有する抗体。
（１３）　該抗体が、ポリクローナル抗体であることを特徴とする前記（１２）に記載の抗体。
（１４）　該抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする前記（１２）に記載の抗体。
（１５）　前記（５）乃至前記（７）のいずれかに記載のポリペプチドまたはその一部に反応性を有するモノクローナル抗体またはその一部。
（１６）　前記（７）に記載のポリペプチドの一部若しくは前記（８）に記載の融合ポリペプチド及び薬学的に許容され得る担体を含んでなる医薬組成物。
（１７）　前記（１２）乃至前記（１５）のいずれかに記載の抗体若しくは該抗体の一部及び薬学的に許容され得る担体を含んでなる医薬組成物。
（１８）　前記（１５）に記載のモノクローナル抗体またはその一部を産生する細胞。（１９）　該細胞が、モノクローナル抗体を産生する能力を有する非ヒト哺乳動物由来のＢ細胞と哺乳動物由来のミエローマ細胞とを融合して得られる融合細胞であることを特徴とする前記（１８）に記載の細胞。
（２０）　該細胞が、該モノクローナル抗体の重鎖をコードするＤＮＡ若しくはその軽鎖をコードするＤＮＡのいずれか一方のＤＮＡ、または両方のＤＮＡが細胞内に導入されることにより形質転換された遺伝子組換え細胞であることを特徴とする前記（１８）に記載の細胞。
（２１）　下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含む配列番号９、配列番号２０、配列番号３１、配列番号４５、配列番号５４、配列番号７４、配列番号８９、配列番号１３７または配列番号１５３のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する物質を同定する方法：
（ａ）該ポリペプチド、該ポリペプチドを発現する細胞または該細胞の膜調製物に被験物質を接触させる工程；及び
（ｂ）工程（ａ）で被験物質を接触させた後に、該ポリペプチド、該ポリペプチドを発現する細胞または該細胞の膜調製物への該被験物質の結合を有無を検出する工程。
（２２）　下記（ａ）乃至（ｃ）の工程を含む配列番号９、配列番号２０、配列番号３１、配列番号４５、配列番号５４、配列番号７４、配列番号８９、配列番号１３７または配列番号１５３のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを介した細胞内へのシグナル伝達を調節する活性を有する物質を同定する方法：
（ａ）該ポリペプチドを発現する細胞に被験物質を接触させる工程；
（ｂ）工程（ａ）で被験物質を接触させた後の該細胞のプロファイルを決定する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で決定されたプロファイルを、該ポリペプチドを発現する細胞に該被験物質を接触させなかった場合における該細胞のプロファイルと比較する工程。
（２３）　該物質が、アゴニストまたはアンタゴニストであることを特徴とする前記（２２）に記載の方法。
（２４）　前記（２２）に記載の方法により同定された物質。
（２５）　前記（２３）に記載の方法により同定されたアゴニストまたはアンタゴニスト。
（２６）　前記（２３）に記載の物質または前記（２４）に記載のアゴニスト若しくはアンタゴニスト及び薬学的に許容され得る担体を含んでなる医薬組成物。
（２７）　下記（ａ）乃至（ｃ）のいずれかに記載の工程を含む配列番号９、配列番号２０、配列番号３１、配列番号４５、配列番号５４、配列番号７４、配列番号８９、配列番号１３７または配列番号１５３のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの産生の異常の被験者における有無を診断する方法：
（ａ）該被験者から取得した被験試料中における該ポリペプチドの量及び健常人から取得した被験試料中における該ポリペプチドの量を決定し両者を比較する工程；
（ｂ）該被験者から取得した被験試料中における該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの量及び健常人から取得した被験試料中における該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの量を決定し両者を比較する工程；または
（ｃ）該被験者から取得した被験試料中における該ポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列における変異の有無を決定する工程。
（２８）　配列番号９、配列番号２０、配列番号３１、配列番号４５、配列番号５４、配列番号７４、配列番号８９、配列番号１３７または配列番号１５３のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡがその内在性ゲノムに組込まれており、該ポリペプチドを産生するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【０００９】
本発明のＧＰＣＲは、それらをコードする遺伝子の発現（ｍＲＮＡの転写）の組織分布、並びに既知のＧＰＣＲとのアミノ酸配列相同性等の特徴から、例えば、炎症、癌、腸管疾患（潰瘍など）あるいは前立腺肥大症に限らず、種々の疾患の発症または抑制に関与していると考えられ、本発明のＧＰＣＲ及びそれをコードするＤＮＡは、そのような疾患治療のための医薬品開発のターゲットとなり得る。
即ち、本発明のＧＰＣＲポリペプチド若しくはその一部（例えば、その細胞外領域または当該細胞外領域とヒト免疫グロブリン重鎖の定常領域とからなる融合ポリペプチド）；該ポリペプチドをコードするＤＮＡ若しくはその一部；該ＤＮＡを含む発現ベクター；該ベクターで形質転換された細胞；該ポリペプチド若しくはその一部に結合する抗体（好ましくはモノクローナル抗体）及び該抗体を産生する細胞等は、（１）そのような種々の疾患の予防または治療のための医薬品物質（候補物質を含む）を同定するためのツールまたは試薬として、さらに（２）該ＧＰＣＲの遺伝子発現若しくはＧＰＣＲの産生の程度を指標とした該疾患の状態を診断するためのツールまたは試薬として極めて有用である。
【００１０】
当該ツール及び試薬を用いることにより、上述のような種々の疾患の発症の予防または治療が可能な物質（候補物質を含む）を選別、同定するための評価系及び方法を確立することが可能であり、さらにこの評価系及び方法を用いて選別、同定された物質は上記疾患の予防または治療のための医薬品として極めて有用である。
【００１１】
また、本発明のＧＰＣＲポリペプチドの一部（例えば、その細胞外領域または当該細胞外領域とヒト免疫グロブリン重鎖の定常領域とからなる融合ポリペプチド）は、蛋白質製剤の活性成分として；該ポリペプチドをコードするＤＮＡ若しくはその一部は、遺伝子治療用の活性成分若しくはアンチセンス医薬品の活性成分として；該ＤＮＡを含む発現ベクターは、遺伝子治療用の活性成分として；該ベクターで形質転換された細胞は、細胞治療用の活性成分として；該ポリペプチド若しくはその一部に結合する抗体（好ましくはモノクローナル抗体）は、抗体医薬品の活性成分としても極めて有用であり、これらの活性成分を含む医薬品により、上述のような種々の疾患の発症の予防または治療が可能となる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明で用いられる語句の意味、並びに物質の製造方法を明らかにすることにより、本発明を詳細に説明する。
本発明における「哺乳動物」とは、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、ウサギ、ラット、ハムスター、モルモット、及びマウスなどである。好ましくはヒト、サル、ラットまたはマウスであり、特に好ましくはヒト、ラットまたはマウスである。
本発明における「非ヒト哺乳動物」とは、ヒト以外の上記哺乳動物である。
【００１３】
本願明細書または図面においてアミノ酸を表記するために用いられるアルファベットの三文字あるいは一文字は、各々次に示すアミノ酸を意味する。
（Ｇｌｙ／Ｇ）グリシン、（Ａｌａ／Ａ）アラニン、（Ｖａｌ／Ｖ）バリン、（Ｌｅｕ／Ｌ）ロイシン、（Ｉｌｅ／Ｉ）イソロイシン、（Ｓｅｒ／Ｓ）セリン、（Ｔｈｒ／Ｔ）スレオニン、（Ａｓｐ／Ｄ）アスパラギン酸、（Ｇｌｕ／Ｅ）グルタミン酸、（Ａｓｎ／Ｎ）アスパラギン、（Ｇｌｕ／Ｑ）グルタミン、（Ｌｙｓ／Ｋ）リジン、（Ａｒｇ／Ｒ）アルギニン、（Ｃｙｓ／Ｃ）システイン、（Ｍｅｔ／Ｍ）メチオニン、（Ｐｈｅ／Ｆ）フェニルアラニン、（Ｔｙｒ／Ｙ）チロシン、（Ｔｒｐ／Ｗ）トリプトファン、（Ｈｉｓ／Ｈ）ヒスチジン、（Ｐｒｏ／Ｐ）プロリン。
【００１４】
本発明において「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、本発明のポリペプチド、特に好ましくは、配列番号９、２０、３１、４５、５４、７４、８９、１３７または１５３のいずれかに記載のアミノ酸配列中の複数個のアミノ酸、好ましくは１乃至１０個のアミノ酸、特に好ましくは１乃至５個のアミノ酸が置換、欠失及び／または修飾されているアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びに該アミノ酸配列に、複数個のアミノ酸、好ましくは１乃至１０個のアミノ酸、特に好ましくは１乃至５個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を意味する。
【００１５】
本発明における「ポリペプチド」及び「その一部」または「融合ポリペプチド」は、伝子組換え技術のほか、化学的合成法、細胞培養方法等のような当該技術的分野において知られる公知の方法あるいはその修飾方法を適宜用いることにより製造することができる。また、上述のようなアミノ酸の置換、欠失、または挿入は常法に従って行うことができる（実験医学別冊・「遺伝子工学ハンドブック」（１９９２）など）。
【００１６】
上述のような変異（１以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入、付加）を有するポリペプチドの製造方法としては、例えば、合成オリゴヌクレオチド指定突然変異導入法（ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ）法、亜硝酸あるいは亜硫酸処理によってランダムに点突然変異を導入する方法、Ｂａ１３１酵素等により欠失変異体を作製する方法、カセット変異法、リンカースキャニング法、ミスインコーポレーション法、ミスマッチプライマー法、ＤＮＡセグメント合成法などを挙げることができる。
【００１７】
合成オリゴヌクレオチド指定突然変異導入（ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ）法は、例えば下記のように行うことができる。アンバー変異をもつＭ１３ファージベクターに変異誘起を希望する領域をクローニングし、一本鎖ファージＤＮＡを調製する。アンバー変異をもたないＭ１３ベクターのＲＦＩＤＮＡを制限酵素処理により線状とし、上記の一本鎖ファージＤＮＡと混合して変性後、アニールさせ、「ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ　ＤＮＡ」を形成させる。これに変異を導入した合成オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡリガーゼの反応により閉環状２本鎖ＤＮＡとする。このＤＮＡをミスマッチ修飾能が欠損している大腸菌ｍｕｔＳ株にトランスフェクションし、増殖したファージをサプレッサー機能のない大腸菌に感染させ、アンバー変異を持たないファージだけを選択する。
【００１８】
また、亜硝酸による点突然変異を導入する方法は、例えば下記のような原理を利用する。ＤＮＡを亜硝酸処理すると塩基が脱アミノ化されて、アデニンはヒポキサンチンに、シトシンはウラシルに、グアニンはキサンチンになる。脱アミノ化されたＤＮＡを細胞に導入すると、ＤＮＡ複製時にヒポキサンチンはシトシンと、ウラシルはアデニンとキサンチンはチミンと塩基対を形成するため、「Ａ：Ｔ」が「Ｇ：Ｃ」へ、「Ｇ：Ｃ」が「Ａ：Ｔ」へと置換する。実際には亜硝酸処理した一本鎖ＤＮＡ一部を「ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ　ＤＮＡ」にハイブリダイズさせ、以下、合成オリゴヌクレオチド指定突然変異導入（ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ）法と同様に操作して変異株を分離すればよい。
【００１９】
また、本発明におけるポリペプチドには、該ポリペプチドの一部も包含される。ここで一部とは、本発明のＧＰＣＲの全長ポリペプチド（特に好ましくは、配列番号９、２０、３１、４５、５４、７４、８９、１３７または１５３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）のアミノ酸配列中の任意の部分配列を含むポリペプチドを意味する。
好ましくは、該ＧＰＣＲポリペプチドの（特に好ましくは配列番号９、２０、３１、４５、５４、７４、８９、１３７または１５３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）の細胞外領域若しくはその任意の一部を意味する。
該ＧＰＣＲポリペプチドの一部（配列番号９、２０、３１、４５、５４、７４、８９、１３７または１５３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの任意の一部）は、後述する当該技術的分野において知られる公知の方法あるいはその修飾方法に従って、遺伝子組換え技術または化学的合成法により製造することもできるし、また該ＧＰＣＲを発現する細胞（好ましくは組換え細胞）の細胞膜調製物をポリペプチド分解酵素等を用いて適切に処置することにより製造することができる。
【００２０】
本発明のＧＰＣＲが、細胞膜上でモノマ−（ｍｏｎｏｍｅｒ）分子、同一のアミノ酸配列を有するもう１本の鎖と会合してなるホモダイマ−（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）、異なるアミノ酸配列を有する他のもう１本の鎖と会合してなるヘテロダイマ−（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）、及びトリマー（ｔｒｉｍｅｒ）やテトラマー（ｔｅｔｒａｍｅｒ）などのオリゴマ−（ｏｒｉｇｏｍｅｒ）の形態を取る場合には、それらも本発明のＧＰＣＲに包含される。
本発明のＤＮＡは、前述の本発明のポリペプチドまたはその一部をコードするＤＮＡであって、本発明のポリペプチドをコードし得るいかなる塩基配列をも包含し、ゲノミックＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれをも包含する。また、該ＤＮＡは、同一のアミノ酸をコードするコドンであればどのようなコドンから構成されるＤＮＡをも含む。
また、本発明におけるＤＮＡは、哺乳動物のＧＰＣＲポリペプチドをコードするＤＮＡを包含し、好ましい態様としては、ヒト、マウスまたはラットのＧＰＣＲポリペプチドをコードするＤＮＡを挙げることができる。
【００２１】
本発明のＤＮＡは、好ましくは、配列番号９、２０、３１、４５、５４、７４、８９、１３７または１５３のいずれかに記載するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡであり、特に好ましくは、配列番号８、１９、３０、４４、５３、７３、８８、配列番号１３６の塩基番号３８乃至２５４８または配列番号１５２の塩基番号３８乃至１１６２のいずれかに記載の塩基配列を含むＤＮＡである。
本発明のＤＮＡには、配列番号９、２０、３１、４５、５４、７４、８９、１３７または１５３のいずれかに記載するアミノ酸配列中に複数個のアミノ酸、好ましくは１乃至１０個のアミノ酸、特に好ましくは１乃至５個のアミノ酸を置換、欠失及び／または修飾するか、若しくは該アミノ酸配列に複数個のアミノ酸、好ましくは１乃至１０個のアミノ酸、特に好ましくは１乃至５個のアミノ酸を挿入することによって得られる変異ポリペプチド若しくはその一部をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡに包含される。
さらに、本発明のＤＮＡには、上述のＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも包含される。
【００２２】
「ストリンジェントな条件下」としては、例えば、次のような条件を挙げることができる。
例えば、５０塩基以上のプローブを用い、０．９％ＮａＣｌ下でハ　イブリダイゼーションを行う場合には、、５０％の解離を生ずる温度（Ｔｍ）の目安を下記計算式から求め、ハイブリダイゼーションの温度を下記計算式のように設定することができる。
【００２３】
Ｔｍ＝８２．３℃＋０．４１×（Ｇ＋Ｃ）％−５００／ｎ−０．６１×（フォルムアミド）％
（ｎはプローブの塩基数を示す。）
温度＝Ｔｍ−２５℃
また、１００塩基以上のプローブ（Ｇ＋Ｃ＝４０〜５０％の場合）を用いる場合には、Ｔｍが下記（１）及び（２）のように変化することを目安する。
（１）１％ミスマッチ毎に、Ｔｍが約１℃下がる。
（２）フォルムアミド１％毎に、Ｔｍが０．６〜０．７℃下がる。
従って、完全相補鎖の組み合わせの場合の温度条件は下記のようにすることができる。
（Ａ）６５〜７５℃（フォルムアミド無添加）
（Ｂ）３５〜４５℃（５０％フォルムアミド存在下）
また、不完全相補鎖の組み合わせの場合の温度条件は下記のようにすることができる。
（Ａ）４５〜５５℃（フォルムアミド無添加）
（Ｂ）３５〜４２℃（３０％フォルムアミド存在下）
また、２３塩基以下のプローブを用いる場合の温度条件は、３７℃とすることもできるし、また下記計算式を目安とすることもできる。
温度＝２℃×（Ａ＋Ｔの数）＋４℃×（Ｃ＋Ｇの数）−５℃
【００２４】
上記ハイブリダイゼーションの標準的な条件（例えば、穏やかな条件、非常に厳格な条件など）は、既報の条件を参考に設定することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　６．３．１−６．３．６，　１９９９）。
穏やかなハイブリダイゼーションの条件としては、２×ＳＳＣ（ｓｏｄｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ／ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ）／３０℃の後、１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ／３０−５０℃での１回以上洗浄が挙げられる。
非常に厳格なハイブリダイゼーションの条件としては、６×ＳＳＣ（ｓｏｄｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ／ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ）／４５℃の後、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ／５０−６５℃での一回以上の洗浄が挙げられる。
【００２５】
本発明のＤＮＡは、いかなる方法で得られるものであってもよい。例えばｍＲＮＡから調製される相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡから調製されるＤＮＡ、化学合成によって得られるＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法で増幅させて得られるＤＮＡおよびこれらの方法を適当に組み合わせて構築されるＤＮＡをも全て包含するものである。
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、常法に従って本発明のポリペプチドのｍＲＮＡからｃＤＮＡをクローン化する方法、ゲノムＤＮＡを単離してスプライシング処理する方法、化学合成する方法等により取得することができる。
【００２６】
（１）例えば、本発明のポリペプチドのｍＲＮＡからｃＤＮＡをクローン化する方法としては、以下の方法が例示される。
まず、本発明のポリペプチドを発現・産生する前述のような組織あるいは細胞から該本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを調製する。ｍＲＮＡの調製は、例えばグアニジンチオシアネート法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１８，　ｐ．５２９４，　１９７９）、熱フェノール法もしくはＡＧＰＣ法等の公知の方法を用いて調製した全ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースやポリＵ−セファロース等によるアフィニティクロマトグラフィーにかけることによって行うことができる。
【００２７】
次いで得られたｍＲＮＡを鋳型として、例えば逆転写酵素を用いる等の公知の方法、例えばオカヤマらの方法（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，　Ｖｏｌ．２，　ｐ．１６１，　１９８２；　Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．，　Ｖｏｌ．３，　ｐ．２８０，　１９８３）やＨｏｆｆｍａｎらの方法（Ｇｅｎｅ，　Ｖｏｌ．２５，　ｐ．２６３，　１９８３）等によりｃＤＮＡ鎖を合成し、ｃＤＮＡの二本鎖ｃＤＮＡへの変換を行う。このｃＤＮＡをプラスミドベクター、ファージベクターまたはコスミドベクターに組み込み、大腸菌を形質転換して、あるいはインビトロパッケージング後、大腸菌に形質移入（トランスフェクト）することによりｃＤＮＡライブラリーを作製する。
【００２８】
ここで用いられるプラスミドベクターとしては、宿主内で複製保持されるものであれば特に制限されず、また用いられるファージベクターとしても宿主内で増殖できるものであれば良い。常法的に用いられるクローニング用ベクターとしてｐＵＣ１９、λｇｔ１０、λｇｔ１１等が例示される。ただし、後述の免疫学的スクリーニングに供する場合は、宿主内で本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を発現させうるプロモーターを有したベクターであることが好ましい。
【００２９】
プラスミドにｃＤＮＡを組み込む方法としては、例えばＭａｎｉａｔｉｓらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　ｓｅｃｏｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ｐ．１．５３，　１９８９）に記載の方法などが挙げられる。また、ファージベクターにｃＤＮＡを組み込む方法としては、Ｈｙｕｎｈらの方法（ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ，　Ｖｏｌ．１，　ｐ．４９，　１９８５）などが挙げられる。簡便には、市販のクローニングキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えプラスミドやファージベクターは、原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ：　ＨＢ１０１，　ＤＨ５αまたはＭＣ１０６１／Ｐ３等）等の適当な宿主に導入する。
【００３０】
プラスミドを宿主に導入する方法としては、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　ｓｅｃｏｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｖｏｌ．１．７４，　１９８９）に記載の塩化カルシウム法または塩化　カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、ファージベクターを宿主に導入する方法としてはファージＤＮＡをインビトロパッケージングした後、増殖させた宿主に導入する方法等が例示される。インビトロパッケージングは、市販のインビトロパッケージングキット（例えば、ストラタジーン製、アマシャム製等）を用いることによって簡便に行うことができる。
【００３１】
本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡの単離は、他の一般的なｃＤＮＡのスクリーニング法を用いることによっても行うことができる。
例えば、いずれかの方法により単離した本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ一部、あるいは別個に化学合成した本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドを３２Ｐでラベルしてプローブとなし、公知のコロニーハイブリダイゼーション法（Ｃｒｕｎｓｔｅｉｎら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃｉｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　Ｖｏｌ．７２，　ｐ．３９６１，　１９７５）またはプラークハイブリダイゼーション法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　ｓｅｃｏｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ　，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ｐ．２．１０８，　１９８９）により、市販または所望に応じ独自に調製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法が挙げられる。さらに、前記いずれかの方法で単離した本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ一部の塩基配列を基に一対のＰＣＲプライマーを作製し、全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として該プライマーを用いたＰＣＲにより本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡを増幅する方法を挙げることができる。
【００３２】
ｃＤＮＡを発現しうる発現ベクターを用いて作製したｃＤＮＡライブラリーを用いる場合には、本発明のポリペプチドに反応性を有する抗体を用いる抗原抗体反応を利用して、目的のクローンを選択することができる。大量にクローンを処理する場合には、ＰＣＲ法を利用したスクリーニング法を用いることが好ましい。
この様にして得られたＤＮＡの塩基配列はマキサム・ギルバート法（マキサム（Ｍａｘａｍら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．，　Ｖｏｌ．７４，　ｐ．５６０，　１９７７）あるいはファージＭ１３を用いたジデオキシヌクレオチド合成鎖停止の方法（Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．，　Ｖｏｌ．７４，　ｐ．５４６３−５４６７，　１９７７）によって決定することができる。市販のＤＮＡシークエンサーを用いると簡便に塩基配列を決定することが可能である。
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子は、その全部または一部を上記のようにして得られるクローンから制限酵素等により切り出すことにより取得できる。
【００３３】
（２）また、前述のような本発明のポリペプチドを発現する細胞に由来するゲノムＤＮＡから本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを単離することによる調製方法としては、例えば以下の方法が例示される。
該細胞を好ましくはＳＤＳまたはプロテナーゼＫ等を用いて溶解し、フェノールによる抽出を反復してＤＮＡの脱蛋白質を行う。ＲＮＡを好ましくはリボヌクレアーゼにより消化する。得られるＤＮＡを適当な制限酵素により部分消化し、得られるＤＮＡ一部を適当なファージまたはコスミドで増幅しライブラリーを作成する。そして目的の配列を有するクローンを、例えば放射性標識されたＤＮＡプローブを用いる方法等により検出し、該クローンから本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の全部または一部を制限酵素等により切り出し取得する。
【００３４】
例えば、ヒト由来ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを取得する場合には、さらにヒトゲノムＤＮＡ（染色体ＤＮＡ）が導入されたコスミドライブラリーを作製（「ラボマニュアルヒトゲノムマッピング」、堀雅明及び中村祐輔　編、丸善　出版）し、該コスミドライブラリーをスクリーニングすることにより、目的ポリペプチドのコーディング領域のＤＮＡを含む陽性クローンを得、該陽性クローンから切り出したコーディングＤＮＡをプローブとして用い、前述のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより調製することもできる。
【００３５】
また、本発明は上述の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡやゲノミックＤＮＡ）の任意の一部に関する。当該ｃＤＮＡやゲノミックＤＮＡの塩基配列の任意の部分塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ；　ＰＣＲ）におけるプライマーＤＮＡとして有用である。該プライマーＤＮＡの一対を用いたＰＣＲにより、本発明のポリペプチドをコードするゲノミックＤＮＡの任意の部分塩基配列を増幅することができる。
【００３６】
例えば、ある疾患が本発明のＧＰＣＲポリペプチドをコードするゲノミックＤＮＡ（特にエクソン）の塩基配列に変異あるいは欠失が原因であると推定される場合には、そのようなゲノムＤＮＡの変異または欠失の存否は、下記のようなＰＣＲにより解析することができる。
（１）本発明のＧＰＣＲをコードするゲノミックＤＮＡの任意の部分塩基配列に相補的な塩基配列を有する一対のプライマーＤＮＡを作製する。
（２）被験者の組織または細胞から取得した該ＧＰＣＲポリペプチドをコードするゲノミックＤＮＡを鋳型として、該一対のプライマーＤＮＡを用いて、該ゲノミックＤＮＡの目的の部分塩基配列を増幅する。
（３）ＰＣＲ産物の有無、及び該ＰＣＲ産物の塩基配列を解析し、該塩基配列と健常人由来の該ＧＰＣＲポリペプチドをコードするゲノミックＤＮＡ中の対応塩基配列とを比較することにより該ゲノミックＤＮＡ中の変異または欠失を同定する。
即ち、この方法は、例えば、種々の疾患と該ＧＰＣＲとの関連性を解明できるだけでなく、該ＧＰＣＲがある種の疾患の発症の原因である場合には、上記の方法により該疾患の診断が可能である。
【００３７】
本発明は、上述の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する組換えベクターに関する。本発明の組換えベクターとしては、原核細胞及び／または真核細胞の各種の宿主内で複製保持または自己増殖できるものであれば特に制限されず、プラスミドベクターおよびファージベクターが包含される。
【００３８】
当該組換えベクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用ベクター（プラスミドＤＮＡおよびバクテリアファージＤＮＡ）に本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを常法により連結することによって調製することができる。
用いられる組換え用ベクターとして具体的には、大腸菌由来のプラスミドとして例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１９など、酵母由来プラスミドとして例えばｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５など、枯草菌由来プラスミドとして例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４　などが例示される。また、ファージとしては、λファージなどのバクテリオファージが、さらにレトロウイルス、ワクシニヤウイルス、核多角体ウイルスなどの動物や昆虫のウイルス（ｐＶＬ１３９３など）が例示される。
【００３９】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを発現させ本発明のポリペプチドを生産させる目的においては、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を発現し、これら蛋白質を生産する機能を有するものであれば特に制限されない。例えば、ｐＭＡＬ　Ｃ２　、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　Ｖｏｌ．１８，　ｐ．５３２２，　１９９０等）あるいはｐＭＥ１８Ｓ（実験医学別冊「遺伝子工学ハンドブック」，　１９９２等）等を挙げることができる。
また、本発明のポリペプチドは他の別のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして製造することもできる。具体的な態様としては、後述する本発明のポリペプチドの細胞外領域とヒト免疫グロブリンの重鎖の定常領域の全部若しくは一部とからなる融合ポリペプチドが挙げられる。
【００４０】
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現ベクターは少なくともプロモーター−オペレーター領域、開始コドン、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、終止コドン、ターミネーター領域および複製可能単位から構成される。
宿主として酵母、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合、発現ベクターは少なくともプロモーター、開始コドン、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、終止コドンを含んでいることが好ましい。またシグナルペプチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、選択マーカー領域または複製可能単位などを含んでいてもよい。また、目的に応じて通常用いられる遺伝子増幅遺伝子（マーカー）を含んでいてもよい。
【００４１】
細菌中で本発明のポリペプチドを発現させるためのプロモーター−オペレーター領域は、プロモーター、オペレーター及びＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）　配列（例えば、ＡＡＧＧなど）を含むものである。例えば宿主がエシェリキア属菌の場合、好適にはＴｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモーターなどを含むものが例示される。酵母中で本発明のポリペプチドを発現させるためのプロモーターとしては、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターが挙げられ、宿主がバチルス属菌の場合は、ＳＬ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。また、宿主が哺乳動物細胞等の真核細胞である場合、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。好ましくは、ＳＶ４０、レトロウイルスである。しかし、特にこれらに限定されるものではない。また、発現にはエンハンサーの利用も効果的な方法である。
【００４２】
好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴＧ）が例示される。
終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡ）が例示される。
ターミネーター領域としては、通常用いられる天然または合成のターミネーターを用いることができる。
【００４３】
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡを言い、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたＤＮＡフラグメント）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ　ではプラスミドｐＢＲ３２２、もしくはその人工的修飾物（ｐＢＲ３２２を適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母では酵母２μプラスミド、もしくは酵母染色体ＤＮＡが、また哺乳動物細胞ではプラスミドｐＲＳＶｎｅｏ　ＡＴＣＣ　３７１９８、プラスミドｐＳＶ２ｄｈｆｒ　ＡＴＣＣ　３７１４５、プラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ　ＡＴＣＣ　３７２２４、プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏ　ＡＴＣＣ　３７１４９等があげられる。
【００４４】
エンハンサー配列、ポリアデニレーション部位およびスプライシング接合部位については、例えばそれぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシン等の抗生物質耐性遺伝子等が例示される。
【００４５】
遺伝子増幅遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、グルタミン酸合成酵素遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、オルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、アスパルラートトランスカルバミラーゼ遺伝子等を例示することができる。
本発明の発現ベクターは、少なくとも、上述のプロモーター、開始コドン、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他の制限酵素切断部位など）を用いることができる。
【００４６】
本発明の形質転換細胞は、上述の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより調製することができる。
本発明で用いられる宿主細胞としては、前記の発現ベクターに適合し、形質転換されうるものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞あるいは人工的に樹立された組換細胞など種々の細胞（例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞または昆虫細胞（好ましくは、Ｓｆ９）などが例示される。
【００４７】
好ましくは動物細胞または昆虫細胞であり、具体的には、マウス由来細胞（ＣＯＰ、Ｌ、Ｃ１２７、Ｓｐ２／０、ＮＳ−１またはＮＩＨ３Ｔ３等）、ラット由来細胞（ＰＣ１２，ＰＣ１２ｈ）、ハムスター由来細胞（ＢＨＫ及びＣＨＯ等）、サル由来細胞（ＣＯＳ１、ＣＯＳ３、ＣＯＳ７、ＣＶ１及びＶｅｌｏ等）、ヒト由来細胞（Ｈｅｌａ、２倍体線維芽細胞に由来する細胞、ミエローマ細胞およびＨｅｐＧ２等）、及び昆虫細胞（Ｓｆ９など）などが例示される。
【００４８】
発現ベクターの宿主細胞への導入（形質転換（形質移入））は従来公知の方法を用いて行うことができる。
例えば、動物細胞の場合は、例えばＧｒａｈａｍの方法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，　Ｖｏｌ．５２，　ｐ．４５６，１９７３）、昆虫細胞の場合は、例えばＳｕｍｍｅｒｓらの方法（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．，　Ｖｏｌ．３，　ｐ．２１５６−２１６５，　１９８３）によってそれぞれ形質転換することができる。
【００４９】
本発明のポリペプチドは、上記の如く調製される発現ベクターを含む形質転換細胞（以下、形質移入体を包含する意味で使用する。）を栄養培地で培養することによって製造することができる。
栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含でいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。
培養は当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨおよび培養時間は、本発明のポリペプチドが大量に生産されるように適宜選択される。
【００５０】
なお、下記に宿主細胞に応じて用いられる具体的な培地および培養条件を例示するが、何らこれらに限定されるものではない。
宿主が動物細胞の場合、培地として例えば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｖｏｌ．１２２，　ｐ．５０１，　１９５２）、　ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，　Ｖｏｌ．８，　ｐ．３９６，　１９５９）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊ．　Ａｍ．　Ｍｅｄ．　Ａｓｓｏｃ．，　Ｖｏｌ．１９９，　ｐ．５１９，　１９６７）、１９９培地（ｐｒｏｃ．　Ｓｏｃ．　Ｅｘｐ．　Ｂｉｏｌ．　Ｍｅｄ．，　Ｖｏｌ．７３，　ｐ．１，　１９５０）等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
宿主が昆虫細胞の場合、例えば胎児牛血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　Ｖｏｌ．８２，　ｐ．８４０４，　１９８５）等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５〜１００時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
【００５１】
宿主が細菌、放線菌、酵母、糸状菌である場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜８である培地である。
宿主がＥ．　ｃｏｌｉの場合、好ましい培地としてＬＢ培地、Ｍ９培地（Ｍｉｌｌｅｒら、　Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．　Ｇｅｎｅｔ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ｐ．４３１，　１９７２）等が例示される。かかる場合、培養は、必要により通気、撹拌しながら、通常１４〜４３℃、約３〜２４時間行うことができる。
宿主がＢａｃｉｌｌｕｓ属菌の場合、必要により通気、撹拌をしながら、通常３０〜４０℃、約１６〜９６時間行うことができる。
【００５２】
宿主が酵母である場合、培地として、例えばＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培（Ｂｏｓｔｉａｎ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　Ｖｏｌ．７７，　ｐ．４５０５，　１９８０）が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
【００５３】
本発明のポリペプチドは、上述のような形質転換細胞を培養し、該細胞から調製した細胞膜画分から製造することができる。
得られた細胞膜画分から蛋白質を精製並びに単離するために一般に用いられる常法に従って該本発明のポリペプチドを精製、単離する。
単離、精製方法としては、例えば塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
【００５４】
前述した本発明のＤＮＡには、配列番号８、１９、３０、４４、５３、７３、８８、配列番号１３６の塩基番号３８乃至２５４８または配列番号１５２の塩基番号３８乃至１１６２のいずれかに記載の塩基配列中の部分塩基配列を含むＤＮＡ若しくは該ＤＮＡの一部が化学修飾されているＤＮＡ、または該部分塩基配列に相補的な塩基配列を含むＤＮＡ若しくは該ＤＮＡの一部が化学修飾されているＤＮＡ等が包含される。
ここで、「部分塩基配列」とは、配列番号８、１９、３０、４４、５３、７３、８８、１３６または１５２のいずれかに記載の塩基配列中に含まれる任意の部位における任意の数の塩基からなる部分塩基配列を意味する。
【００５５】
当該ＤＮＡは、ＤＮＡハイブリダーゼーションまたはＲＮＡハイブリダイゼーションの操作におけるプローブとして有用である。当該ＤＮＡをプローブとして用いる目的においては、該部分塩基配列としては、連続した２０塩基以上の部分塩基配列が挙げられ、好ましくは、連続した５０塩基以上の部分塩基配列、さらに好ましくは連続した１００塩基以上の部分塩基配列、より好ましくは連続した２００塩基以上の部分塩基配列、特に好ましくは連続した３００塩基以上の部分塩基配列が挙げられる。
また、前述したとおり上記ＤＮＡは、ＰＣＲにおけるプライマーとしても有用である。該ＤＮＡをＰＣＲプライマーとして用いる目的においては、該部分塩基配列としては、連続した５乃至１００塩基の部分塩基配列が挙げられ、好ましくは、連続した５乃至７０塩基の部分塩基配列、さらに好ましくは連続した５乃至５０塩基の部分塩基配列、より好ましくは連続した５乃至３０塩基の部分塩基配列が挙げられる。
【００５６】
さらに、上記ＤＮＡは、アンチセンス医薬としても有用である。即ち、該ＤＮＡは、本発明のＧＰＣＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズすることにより、該ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写あるいは該ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を阻害することができる。
上記ＤＮＡをアンチセンス医薬として用いる目的においては、該部分塩基配列としては、連続した５乃至１００塩基の部分塩基配列が挙げられ、好ましくは、連続した５乃至７０塩基の部分塩基配列、さらに好ましくは連続した５乃至５０塩基の部分塩基配列、より好ましくは連続した５乃至３０塩基の部分塩基配列が挙げられる。
【００５７】
また、このＤＮＡをアンチセンス医薬として用いる場合には、該ＤＮＡが患者の体内に投与された場合の血中半減期の増大（安定性）、細胞内膜の透過性の増大、あるいは経口投与の場合の消化器官での分解耐性の増大若しくは吸収の増大などの目的のために、該ＤＮＡの塩基配列の一部に化学修飾を施すことが可能である。化学修飾としては、例えば、オリゴヌクレオチドの構造中のリン酸結合、リボース、核酸塩基、糖部位、３’及び／または５’末端等の化学修飾が挙げられる。
リン酸結合の修飾としては、１以上の該結合を、ホスホジエステル結合（Ｄ−オリゴ）、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合（Ｓ−オリゴ）、メチルホスホネート結合（ＭＰ−オリゴ）、ホスホロアミデート結合、非リン酸結合及びメチルホスホノチオエート結合のいずれかまたはそれらの組み合わせへの変更を挙げることができる。リボースの修飾としては、２’−フルオロリボースあるいは２’−Ｏ−メチルリボースへなどへの変更を挙げることができる。核酸塩基の修飾としては、５−プロピニルウラシルまたは２−アミノアデニンなどへの変更が挙げられる。
【００５８】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡまたはゲノミックＤＮＡ）を用いれば、例えば、本発明のヒトのＧＰＣＲを生体内に発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製することができる。
即ち、該ヒト由来のＤＮＡが、非ヒト哺乳動物（例えばマウス）の内在性遺伝子座上にインテグレート（ｉｎｔｅｇｒａｔｅ）されることにより、体内に該ＤＮＡによりコードされる本発明のヒトＧＰＣＲが発現される。このトランスジェニック非ヒト哺乳動物も本願の発明に属する。
該トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、トランスジェニック動物の製造において通常使用されるような常法（例えば、最新動物細胞実験マニュアル、ＬＩＣ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｈａｐ．７，　ｐ．３６１−４０８，　１９９０）に従って作製することができる。
【００５９】
具体的には、例えば、トランスジェニックマウスの場合には、正常マウス胚盤胞（ｂｌａｓｔｃｙｓｔ）のから取得した胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，　ＥＳ　Ｃｅｌｌ）を、本発明のヒトＧＰＣＲをコードする遺伝子及びマーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）が発現可能なように挿入された発現ベクターで形質転換する。該本発明のヒトＧＰＣＲをコードする遺伝子が内在性遺伝子上にインテグレートされたＥＳ細胞を、マーカー遺伝子の発現の有無に基づいて常法により選別する。次いで、選別したＥＳ細胞を、別の正常マウスから取得した受精卵（肺盤胞）にマイクロインジェクションする（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　Ｖｏｌ．７７，　Ｎｏ．１２，
ｐｐ．７３８０−７３８４，　１９８０；米国特許第４，８７３，１９１号公報）。
該胚盤胞を仮親としての別の正常マウスの子宮に移植する。そうして該仮親マウスから、ファウンダーマウス（子マウス）が生まれる。該ファウンダーマウスを正常マウスと交配させることによりヘテロトランスジェニックマウスを得る。該ヘテロ（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｃ）トランスジェニックマウス同士を交配することにより、メンデルの法則に従って、ホモ（ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｃ）トランスジェニックマウスが得られる。
【００６０】
また、本発明に包含されるマウスＧＰＣＲをコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて、いわゆるノックアウトマウスを作製することができる。
本発明におけるノックアウトマウスとは、本発明のマウスＧＰＣＲをコードする内在性遺伝子がノックアウト（不活性化）されたマウスであり、例えば相同組換えを応用したポジティブネガティブセレクション法（米国特許第５，４６４，７６４号公報、同５，４８７，９９２号公報、同５，６２７，０５９号公報　、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　Ｖｏｌ．８６，　８９３２−８９３５，　１９８９、Ｎａｔｕｒｅ，　Ｖｏｌ．３４２，　４３５−４３８，　１９８９など）を　用いて作製することができ、このようなノックアウトマウスも本発明の一態様である。
【００６１】
本発明における「抗体」とは、ポリクローナル抗体（抗血清）あるいはモノクローナル抗体を意味し、好ましくはモノクローナル抗体である。
具体的には、前述の本発明のポリペプチドまたはその一部（フラグメント）に反応性を有する抗体である。
本発明の「抗体」は、本発明のポリペプチドを高発現する形質転換体、その細胞膜調製物またはそれらから単離された組換えポリペプチド若しくはその一部（以下「抗原」）を、マウス、ラット、ハムスター、モルモットあるいはウサギ等の哺乳動物に免疫して得られる天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体及びヒト型抗体（ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ抗体）、並び　にヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造され得るヒト抗体も包含する。
またモノクローナル抗体の場合には、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有するモノクローナル抗体をも包含する。好ましくは、ＩｇＧまたはＩｇＭである。
【００６２】
本発明で言うポリクローナル抗体（抗血清）あるいはモノクローナル抗体は、既存の一般的な製造方法によって製造することができる。即ち、例えば、抗原を、必要に応じてフロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔ）とともに、哺乳　動物、好ましくは、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマあるいはウシ、より好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはウサギに免疫する。ポリクローナル抗体は、該免疫感作動物から得た血清から取得することができる。またモノクローナル抗体は、該免疫感作動物から得た該抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマ（融合細胞）を調製し、該ハイブリドーマをクローン化し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造される。
【００６３】
モノクローナル抗体は、具体的には下記のようにして製造することができる。即ち、抗原を、必要に応じてフロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔ）とともに、マウス、ラット、ハ　ムスター、モルモットあるいはウサギ、好ましくはマウス、ラットあるいはハムスター（ヒト抗体産生トランスジェニックマウスのような他の動物由来の抗体を産生するように作出されたトランスジェニック動物を含む）の皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に１乃至数回注射するかあるいは移植することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１乃至１４日毎に１乃至４回免疫を行って、最終免疫より約１乃至５日後に免疫感作された該哺乳動物から抗体産生細胞が取得される。
【００６４】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ（融合細胞）の調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法（Ｎａｔｕｒｅ，　Ｖｏｌ．２５６，　ｐ．４９５−４９７，　１９７５）及びそれに準じる修飾方法に従って行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作された哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラットまたはヒト由来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞との細胞融合させることにより調製される。
【００６５】
細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、例えばマウス由来ミエローマＰ３／Ｘ６３−ＡＧ８．６５３（６５３；ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ１５８０）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０、Ｓｐ２）、ＰＡＩ、Ｆ０ある　いはＢＷ５１４７、ラット由来ミエローマ２１０ＲＣＹ３−Ａｇ．２．３．、ヒト由来ミエローマＵ−２６６ＡＲ１、ＧＭ１５００−６ＴＧ−Ａ１−２、ＵＣ７２９−６、ＣＥＭ−ＡＧＲ、Ｄ１Ｒ１１あるいはＣＥＭ−Ｔ１５を使用することができる。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の前述のマウス免疫感作で用いた免疫抗原に対する反応性を、例えばＲＩＡやＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法によって測定することにより行なうことができる。
【００６６】
ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをインビトロ、またはマウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等、好ましくはマウスまたはラット、より好ましくはマウスの腹水中等でのインビボで行い、得られた培養上清、または哺乳動物の腹水から単離することにより行うことができる。
インビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
【００６７】
基本培地としては、例えば、Ｈａｍ’Ｆ１２培地、ＭＣＤＢ１５３培地あるいは低カルシウムＭＥＭ培地等の低カルシウム培地及びＭＣＤＢ１０４培地、ＭＥＭ培地、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＡＳＦ１０４培地あるいはＲＤ培地等の高カルシウム培地等が挙げられ、該基本培地は、目的に応じて、例えば血清、ホルモン、サイトカイン及び／または種々無機あるいは有機物質等を含有することができる。
モノクローナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あるいは腹水を、飽和硫酸アンモニウム、ユーグロブリン沈澱法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２等）、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインＡカラム等のアフィニティカラムクロマトグラフィーに供すること等により行うことができる。
【００６８】
また、当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし、トランスジェニック動物作製技術を用いて当該抗体コーディング遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれたトランスジェニックなウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタを作製し、当該トランスジェニック動物のミルク中から当該抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である（日系サイエンス、１９９７年４月号、第７８頁乃至８４頁）。
【００６９】
本発明における「キメラ抗体」は、遺伝子工学的に作製されるモノクローナル抗体であって、具体的には、例えば、その可変領域がマウスイムノグロブリン由来の可変領域であり、かつその定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴とするマウス／ヒトキメラモノクローナル抗体等のキメラモノクローナル抗体を意味する。
ヒトイムノグロブリン由来の定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ等のアイソタイプにより各々固有のアミノ酸配列を有するが、本発明における組換キメラモノクローナル抗体の定常領域はいずれのアイソタイプに属するヒトイムノグログリンの定常領域であってもよい。好ましくは、ヒトＩｇＧの定常領域である。
本発明におけるキメラモノクローナル抗体は、例えば以下のようにして製造することができる。しかしながら、そのような製造方法に限定されるものでないことは言うまでもない。
【００７０】
例えば、マウス／ヒトキメラモノクローナル抗体は、既報の方法を参照しながら作製することができる（実験医学（臨時増刊号），　Ｖｏｌ．１．６，　Ｎｏ．１０，　１９８８及び特公平３−７３２８０号公報等）。
即ち、マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから単離した該マウスモノクローナル抗体をコードするＤＮＡから取得した活性なＶＨ遺伝子（Ｈ鎖可変領域をコードする再配列されたＶＤＪ遺伝子）の下流に、ヒトイムノグロムリンをコードするＤＮＡから取得したＣＨ遺伝子（Ｈ鎖定常領域をコードするＣ遺伝子）を、また該ハイブリドーマから単離したマウスモノクローナル抗体をコードするＤＮＡから取得した活性なＶＬ遺伝子　（Ｌ鎖可変領域をコードする再配列されたＶＪ遺伝子）の下流にヒトイムノグロムリンをコードするＤＮＡから取得したＣＬ遺伝子（Ｌ鎖定常領域をコードするＣ遺伝子）を、各々発現可能なように配列して１つ又は別々の発現ベクターに挿入し、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、該形質転換細胞を培養することにより作製することができる。
【００７１】
具体的には、まず、マウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから常法によりＤＮＡを抽出後、該ＤＮＡを適切な制限酵素（例えばＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ等）を用いて消化し、電気泳動（例えば０．７％アガロースゲル使用）に付してサザンブロット法を行う。泳動したゲルを例えばエチジウムブロマイド等で染色し、写真撮影後、マーカーの位置を付し、ゲルを２回水洗し、０．２５Ｍ　ＨＣｌ溶液に１５分間浸す。次いで、０．４ＮのＮａＯＨ溶液に１０分間浸し、その間緩やかに振盪する。常法により、フィルターに移し、４時間後フィルターを回収して２×ＳＳＣで２回洗浄する。フィルターを十分乾燥した後、ベイキング（７５℃、３時間）を行う。ベイキング終了後に、該フィルターを０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液に入れ、６５℃で３０分間処理する。次いで、３×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液に浸す。得られたフィルターをプレハイブリダイゼーション液と共にビニール袋に入れ、６５℃で３〜４時間処理する。
【００７２】
次に、この中に３２Ｐ標識したプローブＤＮＡ及びハイブリダイゼーション液を入れ、６５℃で１２時間程度反応させる。ハイブリダイゼーション終了後、適切な塩濃度、反応温度および時間（例えば、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液、室温、１０分間）のもとで、フィルターを洗う。該フィルターをビニール袋に入れ、２×ＳＳＣを少量加え、密封し、オートラジオグラフィーを行う。
【００７３】
上記サザンブロット法により、マウスモノクローナル抗体のＨ鎖及びＬ鎖を各々コードする再配列されたＶＤＪ遺伝子及びＶＪ遺伝子を同定する。同定したＤＮＡ一部を含む領域をショ糖密度勾配遠心にて分画し、ファージベクター（例えば、Ｃｈａｒｏｎ　４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ　２８、λＥＭＢＬ３、λＥＭＢＬ４等）に組み込み、該ファージベクターで大腸菌（例えば、ＬＥ３９２、ＮＭ５３９等）　を形質転換し、ゲノムライブラリーを作製する。そのゲノムライブラリーを適当なプローブ（Ｈ鎖Ｊ遺伝子、Ｌ鎖（κ）Ｊ遺伝子等）を用いて、例えばベントンデイビス法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｖｏｌ．１９６，　ｐ．１８０−１８２，　１９７７）に従って、プラークハイブリダイゼーションを行い、再配列されたＶＤＪ遺伝子あるいはＶＪ遺伝子を各々含むポジティブクローンを得る。得られたクローンの制限酵素地図を作製し、塩基配列を決定し、目的とする再配列されたＶＨ（ＶＤＪ）遺伝子あるいはＶＬ（ＶＪ）遺伝子を含む遺伝子が得られていることを確認する。
【００７４】
一方、キメラ化に用いるヒトＣＨ遺伝子及びヒトＣＬ遺伝子を別に単離する。例えば、ヒトＩｇＧ１とのキメラ抗体を作製する場合には、ＣＨ遺伝子であるＣγ１遺伝子とＣＬ遺伝子であるＣκ遺伝子を単離する。これらの遺伝子はマウス免疫グロブリン遺伝子とヒト免疫グロブリン遺伝子の塩基配列の高い相同性を利用してヒトＣγ１遺伝子及びヒトＣκ遺伝子に相当するマウスＣγ１遺伝子及びマウスＣκ遺伝子をプローブとして用い、ヒトゲノムライブラリーから単離することによって得ることができる。
【００７５】
具体的には、例えば、クローンＩｇ１４６（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　Ｖｏｌ．７５，ｐ．４７０９−４７１３，　１９７８）からの３ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ一部とクローンＭＥＰ１０（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　Ｖｏｌ．７８，　ｐ．４７４−４７８，　１９８１）からの６．８ｋｂのＥｃｏＲＩ一部をプローブとして用い、ヒトのラムダＣｈａｒｏｎ　４Ａ　のＨａｅＩＩＩ−ＡｌｕＩゲノムライブラリー（Ｃｅｌｌ，　Ｖｏｌ．１５，　ｐ．１１５７−１１７４，　１９７８）中から、ヒトＣκ遺伝子を含み、エンハンサー領域を保持しているＤＮＡ一部を単離する。また、ヒトＣγ１遺伝子は、　例えばヒト胎児肝細胞ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動　で分画した後、５．９ｋｂのバンドをλ７８８に挿入し、前記のプローブを用いて単離する。
【００７６】
このようにして単離されたマウスＶＨ遺伝子とマウスＶＬ遺伝子、及びヒトＣＨ遺伝子とヒトＣＬ遺伝子を用いて、プロモーター領域及びエンハンサー領域など　を考慮しながらマウスＶＨ遺伝子の下流にヒトＣＨ遺伝子を、またマウスＶＬ遺伝子の下流にヒトＣＬ遺伝子を、適切な制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いて、例えばｐＳＶ２ｇｐｔあるいはｐＳＶ２ｎｅｏ等の発現ベクターに常法に従って組み込む。この際、マウスＶＨ遺伝子／ヒトＣＨ遺伝子とマウスＶＬ遺伝子／ヒトＣＬ遺伝子のキメラ遺伝子は、一つの発現ベクターに同時に配置されてもよいし、各々別個の発現ベクターに配置することもできる。
【００７７】
このようにして作製したキメラ遺伝子挿入発現ベクターを、例えばＰ３Ｘ６３・Ａｇ８・６５３細胞あるいはＳＰ２１０細胞といった、自らは抗体を産生していない骨髄腫細胞にプロトプラスト融合法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リン酸カルシウム法あるいは電気穿孔法等により導入する。形質転換細胞は、発現ベクターに導入された薬物耐性遺伝子に対応する薬物含有培地中での培養により選別し、目的とするキメラモノクローナル抗体産生細胞を取得する。
このようにして選別された抗体産生細胞の培養上清中から目的のキメラモノクローナル抗体を取得する。
【００７８】
本発明における「ヒト型抗体（ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ抗体）」は、遺伝子工学的に作製されるモノクローナル抗体であって、具体的には、例えば、その超可変領域の相補性決定領域の一部または全部がマウスモノクローナル抗体に由来する超可変領域の相補性決定領域であり、その可変領域の枠組領域がヒトイムノグロブリン由来の可変領域の枠組領域であり、かつその定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴とするヒト型モノクローナル抗体を意味する。
【００７９】
ここで、超可変領域の相補性決定領域とは、抗体の可変領域中の超可変領域に存在し、抗原と相補的に直接結合する部位である３つの領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｓｉｄｕｅ；ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を指し、また可変領域の枠組領域とは、該３つ相補性決定領域の前後に介在する比較的保存された４つの領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ；ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）を指す。
換言すれば、例えばマウスモノクローナル抗体の超可変領域の相補性決定領域の一部または全部以外の全ての領域が、ヒトイムノグロブリンの対応領域と置き代わったモノクローナル抗体を意味する。
ヒトイムノグロブリン由来の定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ等のアイソタイプにより各々固有のアミノ酸配列を有するが、本発明におけるヒト型モノクローナル抗体の定常領域はいずれのアイソタイプに属するヒトイムノグログリンの定常領域であってもよい。好ましくは、ヒトＩｇＧの定常領域である。また、ヒトイムノグロブリン由来の可変領域の枠組領域についても限定されるものではない。
【００８０】
本発明におけるヒト型モノクローナル抗体は、例えば以下のようにして製造することができる。しかしながら、そのような製造方法に限定されるものでないことは言うまでもない。
例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する組換ヒト型モノクローナル抗体は、特表平４−５０６４５８号公報及び特開昭６２−２９６８９０号公報等を参照して、遺伝子工学的に作製することができる。
即ち、マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから、少なくとも１つのマウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子と該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子に対応する少なくとも１つのマウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子を単離し、またヒトイムノグロブリン遺伝子から前記マウスＨ鎖ＣＤＲに対応するヒトＨ鎖ＣＤＲ以外の全領域をコードするヒトＨ鎖遺伝子と、前マウスＬ鎖ＣＤＲに対応するヒトＬ鎖ＣＤＲ以外の全領域をコードするヒトＬ鎖遺伝子を単離する。
【００８１】
単離した該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子と該ヒトＨ鎖遺伝子を発現可能なように適当な発現ベクターに導入し、同様に該マウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子と該ヒトＬ鎖遺伝子を発現可能なように適当なもう１つの発現ベクターに導入する。または、該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子／ヒトＨ鎖遺伝子とマウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子／ヒトＬ鎖遺伝子を同一の発現ベクターに発現可能なように導入することもできる。このようにして作製された発現ベクターで宿主細胞を形質転換することによりヒト型モノクローナル抗体産生形質転換細胞を得、該形質転換細胞を培養することにより培養上清中から目的のヒト型モノクローナル抗体を得る。
【００８２】
本発明における「ヒト抗体」とは、イムノグロブリンを構成するＨ鎖の可変領域及びＨ鎖の定常領域並びにＬ鎖の可変領域及びＬ鎖の定常領域を含む全ての領域がヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来するイムノグロブリンである。
ヒト抗体は、常法に従って、例えば、少なくともヒトイムノグロブリン遺伝子をマウス等のヒト以外の哺乳動物の遺伝子座中に組込むことにより作製されたトランスジェニック動物を、抗原で免疫感作することにより、前述したポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体の作製法と同様にして製造することができる。例えば、ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスは、既報（Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　Ｖｏｌ．１５，　ｐ．１４６−１５６，　１９９７；　Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　Ｖｏｌ．７，　ｐ．１３−２１，　１９９４；　表平４−５０４３６５号公報；国際出願公開ＷＯ９４／２５５８５号公報；日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９９５年；Ｎａｔｕｒｅ，　Ｖｏｌ．３６８，　ｐ．８５６−８５９，　１９９４；　及び特表平６−５００２３３号公報）に記載の方法に従って作製することができる。
【００８３】
本発明における「抗体の一部」とは、前述の本発明における抗体、好ましくはモノクローナル抗体の一部分の領域を意味し、具体的にはＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ（ｖａｒｉａｂｌｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ｓＦｖ、ｄｓＦｖ（ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ　ｓｔａｂｉｌｉｓｅｄ　Ｆｖ）あるいはｄＡｂ（ｓｉｎｇｌｅ　ｄｏｍａｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）である　（Ｅｘｐ．　Ｏｐｉｎ．　Ｔｈｅｒ．　Ｐａｔｅｎｔｓ，　Ｖｏｌ．６，　Ｎｏ．５，　ｐ．４４１−４５６，　１９９６）。
ここで、「Ｆ（ａｂ’）２」及び「Ｆａｂ’」とは、イムノグロブリン（モノ　クローナル抗体）を、蛋白分解酵素であるペプシンあるいはパパイン等で処理することにより製造され、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の前後で消化されて生成される抗体フラグメントを意味する。例えば、ＩｇＧをパパインで処理すると、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の上流で切断されてＶＬ（Ｌ鎖可変領域）とＣＬ（Ｌ鎖定常領域）からなるＬ鎖、及びＶＨ（Ｈ鎖可変領域）とＣＨγ１（Ｈ鎖定常領域中のγ１領域）とからなるＨ鎖フラグメントがＣ末端領域でジスルフィド結合により結合した相同な２つの抗体フラグメントを製造することができる。これら２つの相同な抗体フラグメントを各々Ｆａｂ’という。またＩｇＧをペプシンで処理すると、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の下流で切断されて前記２つのＦａｂ’がヒンジ領域でつながったものよりやや大きい抗体フラグメントを製造することができる。この抗体フラグメントをＦ（ａｂ’）２という。
【００８４】
本発明の「モノクローナル抗体を産生する細胞」とは、前述した本発明のモノクローナル抗体を産生する任意の細胞を意味する。
具体的には、下記が包含される。
（１）前述したとおりの、本発明のポリペプチド、その一部または該ポリペプチドを産生する細胞等で非ヒト哺乳動物を免疫して得られる本発明のポリペプチドまたはその一部に反応性を有するモノクローナル抗体を産生する該非ヒト哺乳動物由来のモノクローナル抗体産生Ｂ細胞。
（２）そのようにして得られた抗体産生Ｂ細胞を哺乳動物由来のミエローマ細胞と細胞融合して得られる前述のハイブリドーマ（融合細胞）。
（３）該モノクローナル抗体産生Ｂ細胞またはモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから単離される該モノクローナル抗体をコードする遺伝子（重鎖をコードする遺伝子若しくは軽鎖をコードする遺伝子のいずれか一方、または両方の遺伝子）により該Ｂ細胞及びハイブリドーマ以外の細胞を形質転換して得られるモノクローナル抗体産生形質転換細胞のいずれかを意味する。
ここで、前記（３）に記載のモノクローナル抗体産生形質転換細胞は、即ち、前記（１）のＢ細胞または（２）のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体の遺伝子組換え体を産生する遺伝子組換え細胞を意味する。この組換えモノクローナル抗体産生細胞は、前述したキメラモノクローナル抗体及びヒト型抗体の製造において使用される方法と同様にして製造することができる。
【００８５】
本発明の「医薬組成物」とは、前記で定義される本発明のポリペプチド若しくはその一部（特に好ましくは細胞外領域）、抗体、モノクローナル抗体若しくはその一部、融合ポリペプチド、ＤＮＡ（好ましくはアンチセンスＤＮＡ）、発現ベクターまたは形質転換細胞のいずれかと、薬学的に許容され得る担体とからなる医薬組成物である。
ここで「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の一つ以上を用いることにより、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、一つまたはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される外用液剤、腸溶内投与のための坐剤およびペッサリーなどが含まれる。
【００８６】
投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される活性成分（前記ポリペプチドや抗体など）の種類などにより異なるが、通常成人一人当たり、一回につき１０μｇから１０００ｍｇ　（あるいは１０μｇから５００ｍｇ）の範囲で投与することができる。しかしながら、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量より少ない量で十分な場合もあり、また上記の範囲を越える投与量が必要な場合もある。
【００８７】
とりわけ注射剤の場合には、例えば生理食塩水あるいは市販の注射用蒸留水等の非毒性の薬学的に許容され得る担体中に０．１μｇ抗体／ｍｌ担体〜１０ｍｇ抗体／ｍｌ担体の濃度となるように溶解または懸濁することにより製造することができる。このようにして製造された注射剤は、処置を必要とするヒト患者に対し、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、１μｇ〜１００ｍｇの割合で、好ましくは５０μｇ〜５０ｍｇ　の割合で、１日あたり１回〜数回投与することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射のような医療上適当な投与形態が例示できる。好ましくは静脈内注射である。
【００８８】
また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。
そのような注射剤の無菌化は、バクテリア保留フィルターを通す濾過滅菌、殺菌剤の配合または照射により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。
【００８９】
本発明の医薬組成物は、本発明のＧＰＣＲが関連している可能性を有する任意の疾患の予防並びに治療、並びに該疾患に伴う種々の他の病状を軽減するための医薬品として有用である。該疾患としては、例えば下記を挙げることができる。
炎症（腎炎、肝炎、肺炎、皮膚炎、膵炎など）、関節炎（慢性関節リウマチ、変形性関節炎など）、アレルギー（アトピー性皮膚炎、喘息など）、糖尿病、高血圧症、腸炎（炎症性大腸炎（ＩＢＤ）、潰瘍など）、動脈硬化症、高師血漿、中枢性疾患（痴呆症、アルツハイマー型疾患など）、肥満、、癌（脳内の癌、頚癌、舌癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、大腸癌、小腸や十二指腸の癌、前立腺癌、直腸癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌など）、皮膚疾患（強皮症、乾癬など）、組織線維症（肺線維症、肝臓の線維化、腎線維症など）、骨粗鬆症、免疫不全症候群、排尿障害、生殖機能障害など
【００９０】
本発明における「リガンド」とは、本発明のＧＰＣＲが受容する任意の物質を意味し、該ＧＰＣＲを発現している生体が本来有している内在性リガンド及び人工的に調製された人工的物質のいずれをも包含する。該リガンドとしては、該ＧＰＣＲに受容され該ＧＰＣＲを介した細胞内へのシグナル伝達を調節する活性を有する物質が好ましい。
本発明のＧＰＣＲのリガンドとしては、下記に例示されるような物質が潜在的な候補として包含される。
【００９１】
種々のペプチド（例えば、ｆＭＬＰペプチド、ｆｏｒｍｙｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅなど）、種々のサイトカイン（ＩＬ−６など）、種々の糖蛋白質、種々のホルモン（例えば、ＬＨ、ＴＳＨ、ＦＳＨ、ＧｎＲＨ、ＰＴＨなど）、種々のフェロモン（ＶＲ、ＧＤＶＮなど）、種々の脂質（例えばＬＰＡ（１−アシルＬＰＡ、２−アシルＬＰＡ、１−アルキルＬＰＡ、１−アルケニルＬＰＡ、環状フォスファチジン酸（ｃｙｃｌｉｃ　ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ　ａｃｉｄ；ｃＰＡ））など）、種々の神経伝達物質（ＧＡＢＡ−Ｂ、グルタミン酸など）、種々のアミン（カテコールアミンなど）、Ｃａ２＋、アミノ酸（例えば、グルタミン酸など）など。
公知のＧＰＣＲのリガンドとしては、下記が知られており、これらも本発明におけるリガンドに包含される。
【００９２】
アンギオテンシン、ボンベシン、カナビノイド、コレシストキニン、グルタミン、セロトニン、メラトニン、ニューロペプチドＹ、オピオイド、プリン、バソプレッシン、オキシトシン、ＰＡＣＡＰ、セクレチン、グルカゴン、カルシトニン、アドレノメジュリン、ソマトスタチン、ＧＨＲＨ、ＣＲＦ、ＡＣＴＨ、ＧＲＰ、ＰＴＨ、ＶＩＰ、ソマトスタチン、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ（Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ　ｇｅｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｅｐｔｉｄｅ）、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、プロスタグランジン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナリン、αおよびβ−ケモカイン（例えば、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ＰＦ４、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＭＣＰ−１、ＨＣ１４、ＭＣＰ−３、Ｉ−３０９、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＲＡＮＴＥＳなど）、エンドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パンクレアティックポリペプタイド、ガラニン、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、スフィンゴシン１−リン酸、コレステロール代謝関連物質（例えば、コール酸、リトコール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、グリココール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸、グリコケノデオキシコール酸、エピアンドロステロン、（＋）−４−アンドロステン−３，１７−ジオン、シスアンドロステン、１１β−ヒドロキシプロゲステロン、１７α−ヒドロキシプロゲステロン、１１−デオキシコルチコステロン、１１−デオキシコルチゾール、デヒドロイソアンドロステロン、３α−ヒドロシキシ−５α−プレグナン−２０−オン、４−プレグネン−２０α−オール−３−オン、５α−デヒドロテストステロン、テストステロン、プロゲステロン、及びそれらの塩など）。
【００９３】
本発明における「細胞のプロファイル」とは、本発明のＧＰＣＲに該ＧＰＣＲを介するシグナル伝達を調節する活性を有する物質（内在性リガンドや同定された人工的リガンド）が受容されることにより変化する細胞の表現型または細胞内での事象を意味する。
該細胞内での事象としては、具体的には、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化あるいはｐＨ低下などが挙げられる。特に好ましくは、細胞内Ｃａ２＋遊離または細胞内ｃＡＭＰ生成である。
該細胞の表現型としては、細胞の形態（形、大きさなど）、細胞の増殖、細胞からのサイトカイン等の生理活性物質に分泌、細胞表面マーカー分子の発現などが挙げられる。
【００９４】
本発明における「物質」、「被験物質」とは、自然界に存在する天然の物質あるいは人工的に調製される任意の物質を意味する。該物質には、前記で定義したＧＰＣＲの内在性リガンドが包含される。
本発明における該「物質」には、拮抗物質（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ及びｉｎｖｅｒｓｅ　ａｇｏｎｉｓｔを含む）及び作動物質（ｐａｒｔｉａｌ　ａｇｐｎｉｓｔ及びｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｇｏｎｉｓｔを含む）が包含さえる。
【００９５】
該拮抗物質とは、該ＧＰＣＲのリガンド（例えば、内在性リガンド）が該受容体に結合するのを競合的または非競合的に阻害する任意の物質を意味する。
該作動物質とは、該ＧＰＣＲの内在性リガンドと同様に該ＧＰＣＲに受容されることにより該ＧＰＣＲを介して細胞内にシグナルを伝達し、上述のような細胞のプロファイルに変化を生じさせる活性を有する物質を意味する。
【００９６】
該物質は、「ペプチド性物質」と「非ペプチド性物質」に大別することができる。
該「非ペプチド性物質」としては、任意の脂質、イオン、アミノ酸、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたは化学的に合成された任意の「化合物」を挙げることができる。
ここで、該「化合物」とは、分子量約１００乃至約１０００以下の化合物、好ましくは分子量約１００乃至約８００の化合物であり、より好ましくは分子量約１００乃至約６００の化合物を挙げることができる。
該「ペプチド性物質」としては、蛋白質、オリゴペプチド、抗体またはそれらいずれかの化学修飾体などを挙げることができる。
【００９７】
本発明には、本発明のＧＰＣＲ、具体的に配列番号９、２０、３１、４５、５４、７４、８９、１３７または１５３のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるＧＰＣＲに結合する物質を同定する方法が包含される。該方法は、具体的には、例えば、下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含む方法である。
（ａ）該ポリペプチド、該ポリペプチドを発現する細胞または該細胞の膜調製物に被験物質を接触させる工程；及び
（ｂ）工程（ａ）で被験物質を接触させた後に、該ポリペプチド、該ポリペプチドを発現する細胞または該細胞の膜調製物への該被験物質の結合を有無を検出する工程。
上記方法は、既報に記載の方法に従って実施することができる（国際出願公開ＷＯ０１／１４８８３、特開２００１−１２８６９５など）。
【００９８】
本発明には、本発明のＧＰＣＲ、具体的に配列番号９、２０、３１、４５、５４、７４、８９、１３７または１５３のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるＧＰＣＲに結合する物質または該ＧＰＣＲのリガンド（内在性リガンド及び人工的リガンド）を同定する方法が包含される。該方法は、具体的には、例えば、下記（ａ）乃至（ｃ）の工程を含む方法である。
（ａ）上記本発明のＧＰＣＲポリペプチドを発現する細胞に被験物質（上述のとおり）を接触させる工程；
（ｂ）工程（ａ）で被験物質を接触させた後の該細胞のプロファイル（上述のとおり）を決定する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で決定されたプロファイルを、該ポリペプチドを発現する細胞に該被験物質を接触させなかった場合における該細胞のプロファイルと比較する工程。
【００９９】
上記方法における細胞のプロファイルとしては、細胞内Ｃａ２＋遊離に伴う細胞内Ｃａ２＋濃度に変動または細胞内ｃＡＭＰ生成に伴う細胞内ｃＡＭＰ濃度の変動が好適な例としてあげられる。
該プロファイルの決定は、既報に記載の方法またはそれらの修飾方法により実施することができる（実験医学＜増刊＞；「バイオシグナル実験法」；Ｖｏｌ．１１，　Ｎｏ．３，　１９９３）。
上述のリガンド及び物質の選別、同定は、既報に記載の方法に従って実施することができる（国際出願公開ＷＯ０１／１４８８３、特開２００１−１２８６９５など）。
【０１００】
上述した本発明の方法には、所謂レポータージェーンアッセイ（ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｇｅｎｅ　ａｓｓａｙ）が包含される。
本発明に包含されるレポータージーンを用いてＧＰＣＲのリガンドを選別、同定する方法としては、例えば、特開２０００−３５４５００に記載される方法を挙げることができる。
レポータージーンを用いたアッセイの原理は概ね次のとおりである。
標的蛋白をコードする遺伝子とレポーター蛋白をコードする遺伝子を、該標的蛋白遺伝子のｍＲＮＡへの転写のシグナルに依存して該レポーターポリペプチドをコードする遺伝子のｍＲＮＡへの転写が起こるように挿入した発現ベクターで、遺伝子組換えポリペプチドの製造で一般的に使用される細胞を形質転換して遺伝子組換え細胞を作製する。得られた形質転換細胞に、被験物質（上述）を接触させる。該物質の作用に依存して発現される該標的蛋白のレベルを、該標的蛋白の発現と同時に発現される該レポーターポリペプチドが発する蛍光の量を測定することにより間接的に測定することにより、該化合物が、トランスポーター分子の発現に影響を与えるか否かを分析する方法（例えば、米国特許第５，４３６，１２８号及び米国特許第５，４０１，６２９号を参照できる）。
レポーターポリペプチドとしては、蛍若しくはウミシイタケなどに由来するルシフェラーゼ、またはクラゲ由来のＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）などが挙げられる。
【０１０１】
また、上記方法（アッセイ）を用いた化合物の選別、同定は、マニュアル作業でも可能であるが、機械（ロボット）を用いて自動で行う所謂ハイスループットスクリーニング（Ｈｉｇｈ　Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）（組織培養工学，　Ｖｏｌ．２３，　Ｎｏ．１３，　ｐ．５２１−５２４；米国特許第５，６７０，１１３号）を用いることによりより迅速、簡便に行うことができ、この態様も本発明の方法に包含される。
【０１０２】
本発明にはまた、配列番号９、配列番号２０、配列番号３１、配列番号４５、配列番号５４、配列番号７４、配列番号８９、配列番号１３７または配列番号１５３のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの産生の異常の被験者における有無を診断する方法が包含される。
この方法は、例えば、下記の工程を含むものである。
（ａ）該被験者から取得した被験試料中における該ポリペプチドの量及び健常人から取得した被験試料中における該ポリペプチドの量を決定し両者を比較する工程；
（ｂ）該被験者から取得した被験試料中における該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの量及び健常人から取得した被験試料中における該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの量を決定し両者を比較する工程；または
（ｃ）該被験者から取得した被験試料中における該ポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列における変異の有無を決定する工程。
これらの診断方法は、既報に記載の方法に従って実施することができる（国際出願公開ＷＯ０１／１４８８３、特開２００１−１２８６９５など）。
【０１０３】
以下、実施例を以て本発明をさらに詳細に説明するが、本発明が該実施例に記載される態様のみに限定されるものではないことは言うまでもない。
実施例１　新規ＧＰＣＲ１８６の同定及びそのｍＲＮＡ発現の組織分布の解析
＜１＞　新規ＧＰＣＲ１８６の同定及び調製
＜１−１＞　ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用フプライマーの設計及び調製
次の条件、（１）塩基長が２３乃至２８塩基であること、（２）ＧＣ含量が５０乃至６５％であること及び（３）プライマーのアニーリング温度（Ｔｍ）が７０℃以上であること、を満たすプライマー：１８６−Ｆ５（配列番号１）、１８６−Ｆ１（配列番号２）、１８６−Ｒ５（配列番号３）及び１８６−Ｒ３（配列番号４）を設計し合成した。
【０１０４】
＜１−２＞　鋳型ｃＤＮＡの合成
市販のキット（ＳＭＡＲＴ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を用いて、下記のとおり５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用ｃＤＮＡ及び３’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用ｃＤＮＡを調製した。
ヒト副腎由来のｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ（１μｇ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）、５’−ＣＤＳ（１０μＭ；１μｌ）及びＳＭＡＲＴ　ＩＩ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　（１０μＭ；１μｌ）の混合溶液（５μｌ；５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用ｃＤＮＡの調製の場合）、及びヒト視床由来のｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ（１μｇ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）及び３’−ＣＤＳ　（１０μＭ；１μｌ）の混合溶液（５μｌ；３’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲの場合）の各々を、７０℃で２分間変性させた後氷上で冷却した。
【０１０５】
次いで、各々の反応物に５倍濃縮した１ｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ　Ｂｕｆｆｅｒ（２μｌ）、ＤＴＴ（２０ｍＭ；１μｌ）、ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ（１０ｍＭ；１μｌ）及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ（１μｌ；ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ製）を加えよく混合した後、４２℃で９０分間インキュベートした。次いで、各々の反応溶液に、ＴＥ溶液（２５０μｌ）を加え、７２℃で７分間処理した。得られたｃＤＮＡの各々を以下の５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ及び３’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲの鋳型として使用した。
【０１０６】
＜１−３＞　５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ
５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用ｃＤＮＡ（１．５μｌ）、プライマー１８６−Ｒ５（１０μＭを１μｌ）、１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｍｉｘ（２．５μｌ）、１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（２．５μｌ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ；２μｌ）及び５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　Ｐｏｌ．Ｍｉｘ（０．５μｌ）を混合し反応溶液を調製した（最終容量：２５μｌ）。この溶液に対して、次の条件でＰＣＲを行った。
９４℃／１分；（９４℃／５秒及び７２℃／５分）×５回；（９４℃／５秒，７０℃／１０秒及び７２℃／５分）×５回；（９４℃／５秒，６８℃／１０秒及び７２℃／５分）×２５回；及び７２℃／１０分
【０１０７】
次いで、ＰＣＲ産物をＴＥ　Ｂｕｆｆｅｒで５０倍希釈した溶液（２．５μｌ）、プライマー１８６−Ｒ３（１０μＭ；１μｌ）、Ｎｅｓｔｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ；１μｌ）、１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ２　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（２．５μｌ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ；２μｌ）及び５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　Ｐｏｌ．　Ｍｉｘ（０．２μｌ）を混合し反応溶液を調製した（最終容量：２５μｌ）。この溶液に対して、次の条件でＰＣＲを行った。
９４℃／１分；（９４℃／５秒，６８℃／１０秒及び７２℃／５分）×２０回；及び７２℃／１０分
ＰＣＲ装置は、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９６００（ＡＢＩ社）を使用した。
【０１０８】
次いで、１％アガロースゲルを用いた電気泳動法により、ＰＣＲ産物を分離し、約１．３ｋ塩基長の増幅ＤＮＡのバンドを確認した。該ＤＮＡをゲルから切り出しＱＩＡＥＸ　ＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて精製し、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）のＴＡクローニングベクターへクローニングした。得られたクローンの塩基配列をＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで決定した（配列番号５）。
【０１０９】
＜１−４＞　３’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ
３’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用ｃＤＮＡ（１．５μｌ）、プライマー１８６−Ｆ５（１０μＭを１μｌ）、１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｍｉｘ（２．５μｌ）、１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（２．５μｌ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ；２μｌ）及び５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　Ｐｏｌ．Ｍｉｘ（０．５μｌ）を混合し反応溶液を調製した（最終容量：２５μｌ）。この溶液に対して、次の条件でＰＣＲを行った。
９４℃／１分；（９４℃／５秒及び７２℃／５分）×５回；（９４℃／５秒，７０℃／１０秒及び７２℃／５分）×５回；（９４℃／５秒，６８℃／１０秒及び７２℃／５分）×２５回；及び７２℃／１０分
【０１１０】
次いで、ＰＣＲ産物をＴＥ　Ｂｕｆｆｅｒで５０倍希釈した溶液（２．５μｌ）、プライマー１８６−Ｆ１（１０μＭ；１μｌ）、Ｎｅｓｔｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ；１μｌ）、１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ２　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（２．５μｌ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ；２μｌ）及び５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　Ｐｏｌ．　Ｍｉｘ（０．２μｌ）を混合し反応溶液を調製した（最終容量：２５μｌ）。この溶液に対して、次の条件でＰＣＲを行った。
９４℃／１分；（９４℃／５秒，６８℃／１０秒及び７２℃／５分）×２０回；及び７２℃／１０分
ＰＣＲ装置は、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９６００（ＡＢＩ社）を使用した。
次いで、１％アガロースゲルを用いた電気泳動法により、ＰＣＲ産物を分離し、約１．６ｋ塩基長の増幅ＤＮＡのバンドを確認した。該ＤＮＡをゲルから切り出しＱＩＡＥＸ　ＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて精製し、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）のＴＡクローニングベクターへクローニングした。得られたクローンの塩基配列をＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで決定した（配列番号６）。
【０１１１】
＜１−５＞　ＧＰＣＲ１８６の全長をコードする塩基配列及びそのアミノ酸配列の決定
上記ＰＣＲで同定した２つのＤＮＡの塩基配列（各々配列番号５及び配列番号６）の共通配列を解析し新規な蛋白質の全長のコーディング領域を含むＤＮＡ（配列番号７）を得た。当該ＤＮＡは、７３７アミノ酸からなる新規蛋白質をコードする塩基配列を含んでいた（＜塩基配列＞配列番号８；＜アミノ酸配列＞配列番号９）。
【０１１２】
＜１−６＞　ＧＰＣＲ１８６の構造的特徴の解析
前記で同定した新規蛋白質の全長アミノ酸配列について、総合遺伝子情報ツール（ｂｉｏＳＣＯＵＴ　１．５．２；ＬＩＯＮ社）を用いて、膜貫通領域の検索（ＰＨＤｈｔｍ；Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｖｏｌ．７，　ｐ．１７０４−１７１８，　１９９６）及びｂｌａｓｔ検索（ＢＬＡＳＴＰ　２．０．１１＜Ｊａｎ．　２０，
２０００＞；Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　Ｖｏｌ．２１５，　ｐ．４０３−４１０，　１９９０）を実施した。
その結果、この新規蛋白質は、７回膜貫通領域（配列番号９の４０２乃至４１９、４３７乃至４５４、４８２乃至４９９、５２２乃至５３９、５７４乃至５９２、６２５乃至６４２、及び６５６乃至６７３の領域）を有することが明らかとなったことから、同時にこの蛋白質が新規なＧＰＣＲであることが明らかとなった。この新規ＧＰＣＲをＧＰＣＲ１８６と命名した。
【０１１３】
また、既知蛋白質のアミノ酸配列とのホモロジー検索の結果、ＧＰＣＲ１８６（７乃至７３７番目までの領域）はマウスＧｒｅａｔ（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｆｆｅｃｔｉｎｇ　ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ　ｄｅｓｃｅｎｔ；ｔｒｅｍｂｌｎｅｗ／ＡＦ３４６５０１；１乃至７３６番目までの領域）と８２％の相同性を示した。また、このＧＰＣＲ１８６（１０３乃至７１３番目までの領域）は、ヒトＬＧＲ７（ｈｕｍａｎ　ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ　ｒｅｐｅａｔ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　７；ｔｒｅｍｂｌ／ＡＦ１９０５００；８乃至７２１番目までの領域）と５５％の相同性を示した。
【０１１４】
＜２＞　ＧＰＣＲ１８６のｍＲＮＡ発現の組織分布
ＧＰＣＲ１８６のｍＲＮＡの各種組織での発現の程度を、常法に従ってＲＴ−ＰＣＲにより解析した。
＜２−１＞　ＲＴ−ＰＣＲ用プライマーの設計及び調製
ＧＰＣＲ１８６をコードする塩基配列（配列番号８）を基に、センスプライマー１８６−Ｆ３（配列番号１０）及びアンチセンスプライマー１８６−Ｒ３（配列番号１１）を設計し合成した。
【０１１５】
＜２−２＞　鋳型ｃＤＮＡの調製
市販のｃＤＮＡ合成キット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ製）を用いて、以下のようにしてヒトの各種組織（扁桃核、尾状核、小脳、脳梁、海馬、黒質、視床下核、視床、脳、網膜、脊髄、脳下垂体、唾液腺、乳腺、甲状腺、胸腺、気管、肺、心臓、肝臓、腎臓、副腎、膵臓、胃、小腸、骨格筋、胎盤、子宮、精巣、リンパ節、前立腺、脾臓）及び細胞株（ＨｅＬａ、ＨＬ−６０、Ｒａｊｉ、ＭＯＬＴ−４）の各々のｐｏｌｙ（Ａ）　ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ製）からｃＤＮＡを合成した。
【０１１６】
ｐｏｌｙ（Ａ）　ＲＮＡ（０．４μｇ；ＣＬＯＮＴＥＣＨ製）を、１０倍濃厚溶液の合成バッファー（２μｌ；　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２００ｍＭ；ｐＨ８．４）、ＫＣｌ（５００ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）及びＢＳＡ（１μｇ／μｌ））、ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ；４μｌ）、ＤＴＴ（０．１ｍＭ；２μｌ）、　デオキシヌクレオチド（各々１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ；１μｌ）、ｏｌｉｇｏ　ｄＴ（１２−１８）　ｐｒｉｍｅｒ（０．５μｇ／μｌ；１μｌ）及び逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＲＴ；５０ｕｎｉｔ／μｌ；１μｌ）からなる反応溶液（２０μｌ）中にて、４２℃、５０分間反応させｃＤＮＡを合成した。次いで、反応溶液に、Ｅ．Ｃｏｌｉ　ＲＮａｓｅ　Ｈ（２ｕｎｉｔ／μｌ；１μｌ）加えＲＮＡを分解した。
【０１１７】
＜２−３＞　ＲＴ−ＰＣＲ
上記のように調製したヒトｃＤＮＡ溶液の１５００倍希釈溶液（５μｌ）に、滅菌水（１２．３μｌ）、１０倍濃厚溶液のＰＣＲバッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１００ｍＭ；ｐＨ８．３）、ＫＣｌ（５００ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（１５ｍＭ；２．５μｌ；宝酒造製））、デオキシヌクレオチド（各種２．５ｍＭ；２．５μｌ；宝酒造製）、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（５ｕｎｉｔ／μｌ；０．２μｌ；宝酒造社製）、センスプライマー１８６−Ｆ３（１０μＭ；１．２５μｌ）及びアンチセンスプライマー１８６−Ｒ３（１０μＭ；１．２５μｌ）を加え反応溶液（２５μｌ）を調製した。
この溶液に対して、次の条件でＲＴ−ＰＣＲを行った。
９４℃／２分；（９４℃／３０秒，６０℃／３０秒及び７２℃／２分）×３５回；及び７２℃／１０分
ＰＣＲ装置はＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９６００（ＡＢＩ社）を使用した。
【０１１８】
ＰＣＲ産物を、常法に従って、２％アガロースゲルを用いた電気泳動法により分離した後、エチジウムブロマイドで染色した。
その結果、上記ＰＣＲによる遺伝子増幅は、視床、副腎、視床下核、骨格筋、精巣及び前立腺由来のｍＲＮＡから調製した鋳型ｃＤＮＡサンプルで認められた（図１）。また、当該遺伝子増幅の程度を指標に解析した場合、ＧＰＣＲ１８６のｍＲＮＡの発現の強さは、視床、副腎＞視床下核、骨格筋、精巣、前立腺の順であった。
【０１１９】
ＧＰＣＲ１８６がマウスＧｒｅａｔと高い相同性（アミノ酸配列同一性）を示し、該マウスＧｒｅａｔのｎｕｌｌ変異を有するマウスでは通常の精巣下降が起こらず不妊となること（精巣潜伏）が知られていること、及びＧＰＣＲ１８６のｍＲＮＡが視床や副腎で高発現することから、ＧＰＣＲ１８６は生殖機能の調節に関与する可能性が推察され、ＧＰＣＲ１８６の機能を調節することにより、例えば、生殖腺障害や痛覚過敏症などを治療できる可能性がある。
【０１２０】
実施例２　新規ＧＰＣＲ１８５の同定及びそのｍＲＮＡ発現の組織分布の解析
＜１＞　新規ＧＰＣＲ１８５の同定及び調製
＜１−１＞　ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用フプライマーの設計及び調製
次の条件、（１）塩基長が２３乃至２８塩基であること、（２）ＧＣ含量が５０乃至６５％であること及び（３）プライマーのアニーリング温度（Ｔｍ）が７０℃以上であること、を満たすプライマー：１８５−Ｆ４（配列番号１２）、１８５−Ｆ５（配列番号１３）、１８５−Ｒ５（配列番号１４）及び１８５−Ｒ７（配列番号１５）を設計し合成した。
【０１２１】
＜１−２＞　鋳型ｃＤＮＡの合成
市販のキット（ＳＭＡＲＴ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を用いて、下記のとおり５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用ｃＤＮＡ及び３’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用ｃＤＮＡを調製した。
ヒト小腸または前立腺由来のｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ（１μｇ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）、５’−ＣＤＳ（１０μＭ；１μｌ）及びＳＭＡＲＴ　ＩＩ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　（１０μＭ；１μｌ）の混合溶液（５μｌ；５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用ｃＤＮＡの調製の場合）、及びヒト小腸または前立腺由来のｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ（１μｇ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）及び３’−ＣＤＳ　（１０μＭ；１μｌ）の混合溶液（５μｌ；３’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲの場合）の各々を、７０℃で２分間変性させた後氷上で冷却した。
【０１２２】
次いで、各々の反応物に５倍濃縮した１ｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ　Ｂｕｆｆｅｒ（２μｌ）、ＤＴＴ（２０ｍＭ；１μｌ）、ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ（１０ｍＭ；１μｌ）及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ（１μｌ；ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ製）を加えよく混合した後、４２℃で９０分間インキュベートした。次いで、各々の反応溶液に、ＴＥ溶液（２５０μｌ）を加え、７２℃で７分間処理した。得られたｃＤＮＡの各々を以下の５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ及び３’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲの鋳型として使用した。
【０１２３】
＜１−３＞　５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ
５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用ｃＤＮＡ（１．５μｌ）、プライマー１８５−Ｒ５（１０μＭを１μｌ）、１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｍｉｘ（２．５μｌ）、１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（２．５μｌ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ；２μｌ）及び５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　Ｐｏｌ．Ｍｉｘ（０．５μｌ）を混合し反応溶液を調製した（最終容量：２５μｌ）。この溶液に対して、次の条件でＰＣＲを行った。
９４℃／１分；（９４℃／５秒及び７２℃／５分）×５回；（９４℃／５秒，７０℃／１０秒及び７２℃／５分）×５回；（９４℃／５秒，６８℃／１０秒及び７２℃／５分）×２５回；及び７２℃／１０分。
【０１２４】
次いで、ＰＣＲ産物をＴＥ　Ｂｕｆｆｅｒで５０倍希釈した溶液（２．５μｌ）、プライマー１８５−Ｒ７（１０μＭ；１μｌ）、Ｎｅｓｔｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ；１μｌ）、１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ２　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（２．５μｌ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ；２μｌ）及び５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　Ｐｏｌ．　Ｍｉｘ（０．２μｌ）を混合し反応溶液を調製した（最終容量：２５μｌ）。この溶液に対して、次の条件でＰＣＲを行った。
９４℃／１分；（９４℃／５秒，６８℃／１０秒及び７２℃／５分）×２０回；及び７２℃／１０分
ＰＣＲ装置は、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９６００（ＡＢＩ社）を使用した。
【０１２５】
次いで、１％アガロースゲルを用いた電気泳動法により、ＰＣＲ産物を分離し、約１．１ｋ（小腸由来）及び約１．０乃至１．３ｋ（前立腺由来）の塩基長の増幅ＤＮＡのバンドを確認した。該ＤＮＡをゲルから切り出しＱＩＡＥＸ　ＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて精製し、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）のＴＡクローニングベクターへクローニングした。得られたクローンの塩基配列をＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで決定した（配列番号１６）。
【０１２６】
＜１−４＞　３’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ
３’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用ｃＤＮＡ（小腸由来；１．５μｌ）、プライマー１８５−Ｆ４（１０μＭを１μｌ）、１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｍｉｘ（２．５μｌ）、１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（２．５μｌ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ；２μｌ）及び５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　Ｐｏｌ．Ｍｉｘ（０．５μｌ）を混合し反応溶液を調製した（最終容量：２５μｌ）。この溶液に対して、次の条件でＰＣＲを行った。
９４℃／１分；（９４℃／５秒及び７２℃／５分）×５回；（９４℃／５秒，７０℃／１０秒及び７２℃／５分）×５回；（９４℃／５秒，６８℃／１０秒及び７２℃／５分）×２５回；及び７２℃／１０分
【０１２７】
次いで、ＰＣＲ産物をＴＥ　Ｂｕｆｆｅｒで５０倍希釈した溶液（２．５μｌ）、プライマー１８５−Ｆ５（１０μＭ；１μｌ）、Ｎｅｓｔｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ；１μｌ）、１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ２　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（２．５μｌ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ；２μｌ）及び５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　Ｐｏｌ．　Ｍｉｘ（０．２μｌ）を混合し反応溶液を調製した（最終容量：２５μｌ）。この溶液に対して、次の条件でＰＣＲを行った。
９４℃／１分；（９４℃／５秒，６８℃／１０秒及び７２℃／５分）×２０回；及び７２℃／１０分
ＰＣＲ装置は、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９６００（ＡＢＩ社）を使用した。
次いで、１％アガロースゲルを用いた電気泳動法により、ＰＣＲ産物を分離し、約１．１ｋ塩基長の増幅ＤＮＡのバンドを確認した。該ＤＮＡをゲルから切り出しＱＩＡＥＸ　ＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて精製し、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）のＴＡクローニングベクターへクローニングした。得られたクローンの塩基配列をＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで決定した（配列番号１７）。
【０１２８】
＜１−５＞　ＧＰＣＲ１８５の全長をコードする塩基配列及びそのアミノ酸配列の決定
上記ＰＣＲで同定した２つのＤＮＡの塩基配列（各々配列番号１６及び配列番号１７）の共通配列を解析し新規な蛋白質の全長のコーディング領域を含むＤＮＡ（配列番号１８）を得た。当該ＤＮＡは、７３５アミノ酸からなる新規蛋白質をコードする塩基配列を含んでいた（＜塩基配列＞配列番号１９；＜アミノ酸配列＞配列番号２０）。
【０１２９】
＜１−６＞　ＧＰＣＲ１８５の構造的特徴の解析
前記で同定した新規蛋白質の全長アミノ酸配列について、総合遺伝子情報ツール（ｂｉｏＳＣＯＵＴ　１．５．２；ＬＩＯＮ社）を用いて、膜貫通領域の検索（ＰＨＤｈｔｍ；Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｖｏｌ．７，　ｐ．１７０４−１７１８，　１９９６）及びｂｌａｓｔ検索（ＢＬＡＳＴＰ　２．０．１１＜Ｊａｎ．　２０，
２０００＞；Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　Ｖｏｌ．２１５，　ｐ．４０３−４１０，　１９９０）を実施した。
その結果、この新規蛋白質は、７回膜貫通領域（配列番号２０の４０３乃至４２０、４３７乃至４５４、４６８乃至４８５、５０８乃至５２５、５５１乃至５７１、５９８乃至６１５、及び６２０乃至６３９の領域）を有することが明らかとなったことから、同時にこの蛋白質が新規なＧＰＣＲであることが明らかとなった。この新規ＧＰＣＲをＧＰＣＲ１８５と命名した。
【０１３０】
また、既知蛋白質のアミノ酸配列とのホモロジー検索の結果、ＧＰＣＲ１８５（１７１乃至７０４番目までの領域）はヒトＨＥ６　ｐｒｏｄｕｃｔ（ｔｒｅｍｂｌｅ／Ｘ８１８９２；３９７乃至９３２番目までの領域）と４６％の相同性を示した。
また、ｐｆａｍ検索から、ＧＰＣＲ１８５の３８乃至１０５番目の領域がホルモンレセプタードメインである可能性が示された。
【０１３１】
＜２＞　ＧＰＣＲ１８５のｍＲＮＡ発現の組織分布
ＧＰＣＲ１８５のｍＲＮＡの各種組織での発現の程度を、常法に従ってＲＴ−ＰＣＲにより解析した。
＜２−１＞　ＲＴ−ＰＣＲ用プライマーの設計及び調製
ＧＰＣＲ１８５をコードする塩基配列（配列番号１９）を基に、センスプライマー１８５−Ｆ３（配列番号２１）及びアンチセンスプライマー１８５−Ｒ４（配列番号２２）を設計し合成した。
【０１３２】
＜２−２＞　鋳型ｃＤＮＡの調製
市販のｃＤＮＡ合成キット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ製）を用いて、以下のようにしてヒトの各種組織（扁桃核、尾状核、小脳、脳梁、海馬、黒質、視床下核、視床、脳、網膜、脊髄、脳下垂体、唾液腺、乳腺、甲状腺、胸腺、気管、肺、心臓、肝臓、腎臓、副腎、膵臓、胃、小腸、骨格筋、胎盤、子宮、精巣、リンパ節、前立腺、脾臓）及び細胞株（ＨｅＬａ、ＨＬ−６０、Ｒａｊｉ、ＭＯＬＴ−４）の各々のｐｏｌｙ（Ａ）　ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ製）からｃＤＮＡを合成した。
【０１３３】
ｐｏｌｙ（Ａ）　ＲＮＡ（０．４μｇ；ＣＬＯＮＴＥＣＨ製）を、１０倍濃厚溶液の合成バッファー（２μｌ；　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２００ｍＭ；ｐＨ８．４）、ＫＣｌ（５００ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）及びＢＳＡ（１μｇ／μｌ））、ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ；４μｌ）、ＤＴＴ（０．１ｍＭ；２μｌ）、　デオキシヌクレオチド（各々１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ；１μｌ）、ｏｌｉｇｏ　ｄＴ（１２−１８）　ｐｒｉｍｅｒ（０．５μｇ／μｌ；１μｌ）及び逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＲＴ；５０ｕｎｉｔ／μｌ；１μｌ）からなる反応溶液（２０μｌ）中にて、４２℃、５０分間反応させｃＤＮＡを合成した。次いで、反応溶液に、Ｅ．Ｃｏｌｉ　ＲＮａｓｅ　Ｈ（２ｕｎｉｔ／μｌ；１μｌ）加えＲＮＡを分解した。
【０１３４】
＜２−３＞　ＲＴ−ＰＣＲ
上記のように調製したヒトｃＤＮＡ溶液の１５００倍希釈溶液（５μｌ）に、滅菌水（１２．３μｌ）、１０倍濃厚溶液のＰＣＲバッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１００ｍＭ；ｐＨ８．３）、ＫＣｌ（５００ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（１５ｍＭ；２．５μｌ；宝酒造製））、デオキシヌクレオチド（各種２．５ｍＭ；２．５μｌ；宝酒造製）、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（５ｕｎｉｔ／μｌ；０．２μｌ；宝酒造社製）、センスプライマー１８５−Ｆ３（１０μＭ；１．２５μｌ）及びアンチセンスプライマー１８５−Ｒ４（１０μＭ；１．２５μｌ）を加え反応溶液（２５μｌ）を調製した。
この溶液に対して、次の条件でＲＴ−ＰＣＲを行った。
９４℃／２分；（９４℃／３０秒，６０℃／３０秒及び７２℃／２分）×３５回；及び７２℃／１０分
ＰＣＲ装置はＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９６００（ＡＢＩ社）を使用した。
【０１３５】
ＰＣＲ産物を、常法に従って、２％アガロースゲルを用いた電気泳動法により分離した後、エチジウムブロマイドで染色した。
その結果、上記ＰＣＲによる遺伝子増幅は、小腸、前立腺、子宮、精巣、肝臓、副腎、脾臓、乳腺、甲状腺、網膜由来のｍＲＮＡから調製した鋳型ｃＤＮＡサンプルで認められた（図２）。
また、当該遺伝子増幅の程度を指標に解析した場合、ＧＰＣＲ１８５のｍＲＮＡの発現の強さは、小腸＞前立腺、子宮、精巣、肝臓、副腎＞脾臓、乳腺、甲状腺、網膜の順であった。
【０１３６】
ＧＰＣＲ１８５がそのＮ末端側にホルモン受容体に特異的なモチーフを有すること、及びそのｍＲＮＡが小腸や前立腺で高発現することから、ＧＰＣＲ１８５は、例えば腸管ホルモンの受容体として機能する可能性が推察され、ＧＰＣＲ１８５の機能を調節することにより、例えば腸管での潰瘍（十二指腸潰瘍など）が治療できる可能性がある。
【０１３７】
実施例３　新規ＧＰＣＲ１８８の同定及びそのｍＲＮＡ発現の組織分布の解析
＜１＞　新規ＧＰＣＲ１８８の同定及び調製
＜１−１＞　ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用フプライマーの設計及び調製
次の条件、（１）塩基長が２３乃至２８塩基であること、（２）ＧＣ含量が５０乃至６５％であること及び（３）プライマーのアニーリング温度（Ｔｍ）が７０℃以上であること、を満たすプライマー：１８８−Ｆ２（配列番号２３）、１８８−Ｆ６（配列番号２４）、１８８−Ｒ３（配列番号２５）及び１８８−Ｒ６（配列番号２６）を設計し合成した。
【０１３８】
＜１−２＞　鋳型ｃＤＮＡの合成
市販のキット（ＳＭＡＲＴ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を用いて、下記のとおり５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用ｃＤＮＡ及び３’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用ｃＤＮＡを調製した。
ヒト脳または前立腺由来のｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ（１μｇ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）、５’−ＣＤＳ（１０μＭ；１μｌ）及びＳＭＡＲＴ　ＩＩ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　（１０μＭ；１μｌ）の混合溶液（５μｌ；５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用ｃＤＮＡの調製の場合）、及びヒト脳または前立腺由来のｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ（１μｇ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）及び３’−ＣＤＳ　（１０μＭ；１μｌ）の混合溶液（５μｌ；３’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲの場合）の各々を、７０℃で２分間変性させた後氷上で冷却した。
【０１３９】
次いで、各々の反応物に５倍濃縮した１ｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ　Ｂｕｆｆｅｒ（２μｌ）、ＤＴＴ（２０ｍＭ；１μｌ）、ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ（１０ｍＭ；１μｌ）及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ（１μｌ；ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ製）を加えよく混合した後、４２℃で９０分間インキュベートした。次いで、各々の反応溶液に、ＴＥ溶液（２５０μｌ）を加え、７２℃で７分間処理した。得られたｃＤＮＡの各々を以下の５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ及び３’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲの鋳型として使用した。
【０１４０】
＜１−３＞　５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ
５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用ｃＤＮＡ（１．５μｌ）、プライマー１８８−Ｒ６（１０μＭを１μｌ）、１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｍｉｘ（２．５μｌ）、１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（２．５μｌ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ；２μｌ）及び５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　Ｐｏｌ．Ｍｉｘ（０．５μｌ）を混合し反応溶液を調製した（最終容量：２５μｌ）。この溶液に対して、次の条件でＰＣＲを行った。
９４℃／１分；（９４℃／５秒及び７２℃／５分）×５回；（９４℃／５秒，７０℃／１０秒及び７２℃／５分）×５回；（９４℃／５秒，６８℃／１０秒及び７２℃／５分）×２５回；及び７２℃／１０分
【０１４１】
次いで、ＰＣＲ産物をＴＥ　Ｂｕｆｆｅｒで５０倍希釈した溶液（２．５μｌ）、プライマー１８８−Ｒ３（１０μＭ；１μｌ）、Ｎｅｓｔｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ；１μｌ）、１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ２　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（２．５μｌ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ；２μｌ）及び５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　Ｐｏｌ．　Ｍｉｘ（０．２μｌ）を混合し反応溶液を調製した（最終容量：２５μｌ）。この溶液に対して、次の条件でＰＣＲを行った。
９４℃／１分；（９４℃／５秒，６８℃／１０秒及び７２℃／５分）×２０回；及び７２℃／１０分
ＰＣＲ装置は、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９６００（ＡＢＩ社）を使用した。
【０１４２】
次いで、１％アガロースゲルを用いた電気泳動法により、ＰＣＲ産物を分離し、約１．２ｋ（前立腺由来）及び約０．９ｋ（脳由来）の塩基長の増幅ＤＮＡのバンドを確認した。該ＤＮＡをゲルから切り出しＱＩＡＥＸ　ＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて精製し、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）のＴＡクローニングベクターへクローニングした。得られたクローンの塩基配列をＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで決定した（配列番号２７）。
【０１４３】
＜１−４＞　３’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ
３’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用ｃＤＮＡ（脳由来；１．５μｌ）、プライマー１８８−Ｆ６（１０μＭを１μｌ）、１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｍｉｘ（２．５μｌ）、１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（２．５μｌ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ；２μｌ）及び５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　Ｐｏｌ．Ｍｉｘ（０．５μｌ）を混合し反応溶液を調製した（最終容量：２５μｌ）。この溶液に対して、次の条件でＰＣＲを行った。
９４℃／１分；（９４℃／５秒及び７２℃／５分）×５回；（９４℃／５秒，７０℃／１０秒及び７２℃／５分）×５回；（９４℃／５秒，６８℃／１０秒及び７２℃／５分）×２５回；及び７２℃／１０分
【０１４４】
次いで、ＰＣＲ産物をＴＥ　Ｂｕｆｆｅｒで５０倍希釈した溶液（２．５μｌ）、プライマー１８８−Ｆ２（１０μＭ；１μｌ）、Ｎｅｓｔｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ；１μｌ）、１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ２　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（２．５μｌ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ；２μｌ）及び５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　Ｐｏｌ．　Ｍｉｘ（０．２μｌ）を混合し反応溶液を調製した（最終容量：２５μｌ）。この溶液に対して、次の条件でＰＣＲを行った。
９４℃／１分；（９４℃／５秒，６８℃／１０秒及び７２℃／５分）×２０回；及び７２℃／１０分
ＰＣＲ装置は、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９６００（ＡＢＩ社）を使用した。
次いで、１％アガロースゲルを用いた電気泳動法により、ＰＣＲ産物を分離し、約１．５ｋ塩基長の増幅ＤＮＡのバンドを確認した。該ＤＮＡをゲルから切り出しＱＩＡＥＸ　ＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて精製し、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）のＴＡクローニングベクターへクローニングした。得られたクローンの塩基配列をＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで決定した（配列番号２８）。
【０１４５】
＜１−５＞　ＧＰＣＲ１８８の全長をコードする塩基配列及びそのアミノ酸配列の決定
上記ＰＣＲで同定した２つのＤＮＡの塩基配列（各々配列番号２７及び配列番号２８）の共通配列を解析し新規な蛋白質の全長のコーディング領域を含むＤＮＡ（配列番号２９）を得た。当該ＤＮＡは、３８１アミノ酸からなる新規蛋白質をコードする塩基配列を含んでいた（＜塩基配列＞配列番号３０；＜アミノ酸配列＞配列番号３１）。
【０１４６】
＜１−６＞　ＧＰＣＲ１８８の構造的特徴の解析
前記で同定した新規蛋白質の全長アミノ酸配列について、総合遺伝子情報ツール（ｂｉｏＳＣＯＵＴ　１．５．２；ＬＩＯＮ社）を用いて、膜貫通領域の検索（ＰＨＤｈｔｍ；Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｖｏｌ．７，　ｐ．１７０４−１７１８，　１９９６）及びｂｌａｓｔ検索（ＢＬＡＳＴＰ　２．０．１１＜Ｊａｎ．　２０，
２０００＞；Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　Ｖｏｌ．２１５，　ｐ．４０３−４１０，　１９９０）を実施した。
その結果、この新規蛋白質は、７回膜貫通領域（配列番号３１の４９乃至７１、９０乃至１０７、１２４乃至１４１、１６７乃至１８４、２２５乃至２４２、２６２乃至２８２、及び２８８乃至３０７の領域）を有することが明らかとなったことから、同時にこの蛋白質が新規なＧＰＣＲであることが明らかとなった。この新規ＧＰＣＲをＧＰＣＲ１８８と命名した。
【０１４７】
また、既知蛋白質のアミノ酸配列とのホモロジー検索の結果、ＧＰＣＲ１８８（４２乃至３１２番目までの領域）はヒトＧＡＢＡ−Ｂレセプター（ｓｗｉｓｓ／Ｏ７５８９９；４７４乃至７４４番目までの領域）と３１％の相同性を示した。
【０１４８】
＜２＞　ＧＰＣＲ１８８のｍＲＮＡ発現の組織分布
ＧＰＣＲ１８８のｍＲＮＡの各種組織での発現の程度を、常法に従ってＲＴ−ＰＣＲにより解析した。
＜２−１＞　ＲＴ−ＰＣＲ用プライマーの設計及び調製
ＧＰＣＲ１８８をコードする塩基配列（配列番号３０）を基に、センスプライマー１８８−Ｆ４（配列番号３２）及びアンチセンスプライマー１８８−Ｒ４（配列番号３３）を設計し合成した。
【０１４９】
＜２−２＞　鋳型ｃＤＮＡの調製
市販のｃＤＮＡ合成キット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ製）を用いて、以下のようにしてヒトの各種組織（扁桃核、尾状核、小脳、脳梁、海馬、黒質、視床下核、視床、脳、網膜、脊髄、脳下垂体、唾液腺、乳腺、甲状腺、胸腺、気管、肺、心臓、肝臓、腎臓、副腎、膵臓、胃、小腸、骨格筋、胎盤、子宮、精巣、リンパ節、前立腺、脾臓）及び細胞株（ＨｅＬａ、ＨＬ−６０、Ｒａｊｉ、ＭＯＬＴ−４）の各々のｐｏｌｙ（Ａ）　ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ製）からｃＤＮＡを合成した。
【０１５０】
ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ（０．４μｇ；ＣＬＯＮＴＥＣＨ製）を、１０倍濃厚溶液の合成バッファー（２μｌ；　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２００ｍＭ；ｐＨ８．４）、ＫＣｌ（５００ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）及びＢＳＡ（１μｇ／μｌ））、ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ；４μｌ）、ＤＴＴ（０．１ｍＭ；２μｌ）、デオキシヌクレオチド（各々１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ；１μｌ）、ｏｌｉｇｏ　ｄＴ（１２−１８）　ｐｒｉｍｅｒ（０．５μｇ／μｌ；１μｌ）及び逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＲＴ；５０ｕｎｉｔ／μｌ；１μｌ）からなる反応溶液（２０μｌ）中にて、４２℃、５０分間反応させｃＤＮＡを合成した。次いで、反応溶液に、Ｅ．Ｃｏｌｉ　ＲＮａｓｅ　Ｈ（２ｕｎｉｔ／μｌ；１μｌ）加えＲＮＡを分解した。
【０１５１】
＜２−３＞　ＲＴ−ＰＣＲ
上記のように調製したヒトｃＤＮＡ溶液の１５００倍希釈溶液（５μｌ）に、滅菌水（１２．３μｌ）、１０倍濃厚溶液のＰＣＲバッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１００ｍＭ；ｐＨ８．３）、ＫＣｌ（５００ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（１５ｍＭ；２．５μｌ；宝酒造製））、デオキシヌクレオチド（各種２．５ｍＭ；２．５μｌ；宝酒造製）、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（５ｕｎｉｔ／μｌ；０．２μｌ；宝酒造社製）、センスプライマー１８８−Ｆ４（１０μＭ；１．２５μｌ）及びアンチセンスプライマー１８８−Ｒ４（１０μＭ；１．２５μｌ）を加え反応溶液（２５μｌ）を調製した。
この溶液に対して、次の条件でＲＴ−ＰＣＲを行った。
９４℃／２分；（９４℃／３０秒，６０℃／３０秒及び７２℃／２分）×３５回；及び７２℃／１０分
ＰＣＲ装置はＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９６００（ＡＢＩ社）を使用した。
【０１５２】
ＰＣＲ産物を、常法に従って、２％アガロースゲルを用いた電気泳動法により分離した後、エチジウムブロマイドで染色した。
その結果、上記ＰＣＲによる遺伝子増幅は、前立腺、Ｈｅｌａ細胞株、精巣、脳、視床下核、甲状腺、胸腺、気管、心臓、子宮、脾臓由来のｍＲＮＡから調製した鋳型ｃＤＮＡサンプルで認められた（図３）。
また、当該遺伝子増幅の程度を指標に解析した場合、ＧＰＣＲ１８８のｍＲＮＡの発現の強さは、前立腺、Ｈｅｌａ細胞株、精巣＞脳、視床下核、甲状腺、胸腺、気管、心臓、子宮、脾臓の順であった。
ＧＰＣＲ１８８がヒトＧＡＢＡ−Ｂ受容体と相同性（アミノ酸配列同一性）を有すること、そのｍＲＮＡが前立腺で高発現すること、また前立腺肥大症の患者ではＧＡＢＡ−Ｂ受容体遺伝子の発現の上昇が見られることから、ＧＰＣＲ１８８はＧＡＢＡ−Ｂ受容体と相互に作用することで前立腺の機能の調節に関与していることが推察され、ＧＰＣＲ１８８の機能を調節することで前立腺肥大症の治療が可能となる可能性がある。
【０１５３】
実施例４　新規ＧＰＣＲ１８７の同定及びそのｍＲＮＡ発現の組織分布の解析
＜１＞　新規ＧＰＣＲ１８７の同定及び調製
＜１−１＞　ヒトゲノム塩基配列からのＧＰＣＲ１８７をコードする塩基配列の抽出
ＯＲＦ（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ）を予測する既報のプログラム（ＧｅｎｅＳｃａｎ；　Ｊ．　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，　Ｖｏｌ．２６８，　ｐ．７８−９４，　１９９７）を用いて、米国ＮＩＨ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＨｅａｌｔｈ）に属するＮＬＭ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌｉｂｒａｒｙ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅの部署であるＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から発表されたヒトゲノム概要配列（Ｒｅｌｅａｓｅ　ａｓ　ｏｆ　Ａｐｒｉｌ　１９，　２００１）を解析することによりＯＲＦを含むｃＤＮＡ群を同定し、当該ｃＤＮＡ群を条件検索することにより新規蛋白質の全長（配列番号３５）をコードすると推察されるｃＤＮＡ（配列番号３４）を見出した。
【０１５４】
＜１−２＞　ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用フプライマーの設計及び調製
次の条件、（１）塩基長が２３乃至２８塩基であること、（２）ＧＣ含量が５０乃至６５％であること及び（３）プライマーのアニーリング温度（Ｔｍ）が７０℃以上であること、を満たすプライマー：１８７−Ｆ４（配列番号３６）及び１８７−Ｆ５（配列番号３７）を設計し合成した。
【０１５５】
＜１−３＞　鋳型ｃＤＮＡの合成
市販のキット（ＳＭＡＲＴ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を用いて、下記のとおり３’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用ｃＤＮＡを調製した。
ヒト腎臓由来のｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ（１μｇ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）及び３’−ＣＤＳ　（１０μＭ；１μｌ）の混合溶液（５μｌ）の各々を、７０℃で２分間変性させた後氷上で冷却した。
次いで、反応物に５倍濃縮した１ｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ　Ｂｕｆｆｅｒ（２μｌ）、ＤＴＴ（２０ｍＭ；１μｌ）、ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ（１０ｍＭ；１μｌ）及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ（１μｌ；ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ製）を加えよく混合した後、４２℃で９０分間インキュベートした。次いで、各々の反応溶液に、ＴＥ溶液（２５０μｌ）を加え、７２℃で７分間処理した。得られたｃＤＮＡを以下の３’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲの鋳型として使用した。
【０１５６】
＜１−４＞　　３’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ
３’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用ｃＤＮＡ（１．５μｌ）、プライマー１８７−Ｆ４（１０μＭを１μｌ）、１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｍｉｘ（２．５μｌ）、１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（２．５μｌ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ；２μｌ）及び５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　Ｐｏｌ．Ｍｉｘ（０．５μｌ）を混合し反応溶液を調製した（最終容量：２５μｌ）。この溶液に対して、次の条件でＰＣＲを行った。
９４℃／１分；（９４℃／５秒及び７２℃／５分）×５回；（９４℃／５秒，７０℃／１０秒及び７２℃／５分）×５回；（９４℃／５秒，６８℃／１０秒及び７２℃／５分）×２５回；及び７２℃／１０分。
【０１５７】
次いで、ＰＣＲ産物をＴＥ　Ｂｕｆｆｅｒで５０倍希釈した溶液（２．５μｌ）、プライマー１８７−Ｆ５（１０μＭ；１μｌ）、Ｎｅｓｔｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ；１μｌ）、１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ２　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（２．５μｌ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ；２μｌ）及び５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　Ｐｏｌ．　Ｍｉｘ（０．２μｌ）を混合し反応溶液を調製した（最終容量：２５μｌ）。この溶液に対して、次の条件でＰＣＲを行った。
９４℃／１分；（９４℃／５秒，６８℃／１０秒及び７２℃／５分）×２０回；及び７２℃／１０分
ＰＣＲ装置は、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９６００（ＡＢＩ社）を使用した。
次いで、１％アガロースゲルを用いた電気泳動法により、ＰＣＲ産物を分離し、約１．１ｋ塩基長の増幅ＤＮＡのバンドを確認した。該ＤＮＡをゲルから切り出しＱＩＡＥＸ　ＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて精製し、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）のＴＡクローニングベクターへクローニングした。得られたクローンの塩基配列をＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで決定した（配列番号３８）。
【０１５８】
＜１−５＞　Ｎ末端領域をコードする塩基配列の検証
前記＜１−１＞で見出した新規蛋白質（配列番号３５）のＮ末端領域をコードする塩基配列の正否をＲＴ−ＰＣＲによる検証した。
センスプライマー１８７−Ｆ７（配列番号３９）及びアンチセンスプライマー１８７−Ｒ４（配列番号４０）を設計、合成し、前記ヒト腎臓ｃＤＮＡを鋳型として同様にしてＲＴ−ＰＣＲを行った。その結果、約３７０塩基長のＤＮＡの増幅が認められた。このＤＮＡの塩基配列を決定したところ、プライマー配列を除き３３３塩基長のＤＮＡ（配列番号４１）であった。
一方、前記＜１−１＞で見出した新規蛋白質をコードする塩基配列（配列番号３４）を鋳型として上記プライマーを用いた場合に増幅されると推測される塩基長は２２９塩基（配列番号４２）であった。
上記の結果から、前記＜１−１＞で見出した新規蛋白質のＮ末端領域をコードする塩基配列は配列番号４１に記載の塩基配列が正しいものと判断した。
【０１５９】
＜１−６＞　ＧＰＣＲ１８７の全長をコードする塩基配列及びそのアミノ酸配列の決定
前記＜１−１＞で見出した新規蛋白質を全長をコードする塩基配列（配列番号３４）を、上記ＲＡＣＥ−ＰＣＲで同定したＤＮＡの塩基配列（配列番号３８）及び前記ＲＴ−ＰＣＲで同定したＤＮＡの塩基配列（配列番号４１）と置き換えることにより該新規蛋白質の全長の正しいコーディング領域を含むＤＮＡ（配列番号４３）を得た。当該ＤＮＡは、９９４アミノ酸からなる新規蛋白質をコードする塩基配列を含んでいた（＜塩基配列＞配列番号４４；＜アミノ酸配列＞配列番号４５）。
【０１６０】
＜１−７＞　ＧＰＣＲ１８７の構造的特徴の解析
前記で同定した新規蛋白質の全長アミノ酸配列について、総合遺伝子情報ツール（ｂｉｏＳＣＯＵＴ　１．５．２；ＬＩＯＮ社）を用いて、膜貫通領域の検索（ＰＨＤｈｔｍ；Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｖｏｌ．７，　ｐ．１７０４−１７１８，　１９９６）及びｂｌａｓｔ検索（ＢＬＡＳＴＰ　２．０．１１＜Ｊａｎ．　２０，
２０００＞；Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　Ｖｏｌ．２１５，　ｐ．４０３−４１０，　１９９０）を実施した。
その結果、この新規蛋白質は、６回膜貫通領域（配列番号４５の６９６乃至７１４、７６６乃至７８４、８０８乃至８２５、８５１乃至８６８、８９７乃至９１４及び９２４乃至９４１の領域）を有することが明らかとなった。
【０１６１】
また、既知蛋白質のアミノ酸配列とのホモロジー検索の結果、この新規蛋白質（６３７乃至９５８番目までの領域）はヒトＣＤ９７（ｓｗｉｓｓ／Ｐ４８９６０；４９５乃至８０２番目までの領域）と３２％の相同性を示した。また、この新規蛋白質（２３９乃至９６３番目までの領域）は、ヒトＬｅｃｔｏｍｅｄｉｎ−２（ｈｕｍａｎ　ＬＥＣ２；ｔｒｅｍｂｌ／ＡＦ３０７０７９；３７５乃至１１１７番目までの領域）と２３％の相同性を示した。
この新規蛋白質の膜貫通領域は６箇所しか予測されていないものの、このような既知分子との相同性から、この蛋白質は新規なＧＰＣＲであると考えられ、ＧＰＣＲ１８７と命名した。
【０１６２】
＜２＞　ＧＰＣＲ１８７のｍＲＮＡ発現の組織分布
ＧＰＣＲ１８７のｍＲＮＡの各種組織での発現の程度を、常法に従ってＲＴ−ＰＣＲにより解析した。
＜２−１＞　ＲＴ−ＰＣＲ用プライマーの設計及び調製
ＧＰＣＲ１８７をコードする塩基配列（配列番号４４）を基に、センスプライマー１８７−Ｆ２（配列番号４６）及びアンチセンスプライマー１８７−Ｒ２（配列番号４７）を設計し合成した。
【０１６３】
＜２−２＞　鋳型ｃＤＮＡの調製
市販のｃＤＮＡ合成キット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ製）を用いて、以下のようにしてヒトの各種組織（扁桃核、尾状核、小脳、脳梁、海馬、黒質、視床下核、視床、脳、網膜、脊髄、脳下垂体、唾液腺、乳腺、甲状腺、胸腺、気管、肺、心臓、肝臓、腎臓、副腎、膵臓、胃、小腸、骨格筋、胎盤、子宮、精巣、リンパ節、前立腺、脾臓）及び細胞株（ＨｅＬａ、ＨＬ−６０、Ｒａｊｉ、ＭＯＬＴ−４）の各々のｐｏｌｙ（Ａ）　ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ製）からｃＤＮＡを合成した。
【０１６４】
ｐｏｌｙ（Ａ）　ＲＮＡ（０．４μｇ；ＣＬＯＮＴＥＣＨ製）を、１０倍濃厚溶液の合成バッファー（２μｌ；　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２００ｍＭ；ｐＨ８．４）、ＫＣｌ（５００ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）及びＢＳＡ（１μｇ／μｌ））、ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ；４μｌ）、ＤＴＴ（０．１ｍＭ；２μｌ）、　デオキシヌクレオチド（各々１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ；１μｌ）、ｏｌｉｇｏ　ｄＴ（１２−１８）　ｐｒｉｍｅｒ（０．５μｇ／μｌ；１μｌ）及び逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＲＴ；５０ｕｎｉｔ／μｌ；１μｌ）からなる反応溶液（２０μｌ）中にて、４２℃、５０分間反応させｃＤＮＡを合成した。次いで、反応溶液に、Ｅ．Ｃｏｌｉ　ＲＮａｓｅ　Ｈ（２ｕｎｉｔ／μｌ；１μｌ）加えＲＮＡを分解した。
【０１６５】
＜２−３＞　ＲＴ−ＰＣＲ
上記のように調製したヒトｃＤＮＡ溶液の１５００倍希釈溶液（５μｌ）に、滅菌水（１２．３μｌ）、１０倍濃厚溶液のＰＣＲバッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１００ｍＭ；ｐＨ８．３）、ＫＣｌ（５００ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（１５ｍＭ；２．５μｌ；宝酒造製））、デオキシヌクレオチド（各種２．５ｍＭ；２．５μｌ；宝酒造製）、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（５ｕｎｉｔ／μｌ；０．２μｌ；宝酒造社製）、センスプライマー１８７−Ｆ２（１０μＭ；１．２５μｌ）及びアンチセンスプライマー１８７−Ｒ２（１０μＭ；１．２５μｌ）を加え反応溶液（２５μｌ）を調製した。
この溶液に対して、次の条件でＲＴ−ＰＣＲを行った。
９４℃／２分；（９４℃／３０秒，６０℃／３０秒及び７２℃／２分）×３５回；及び７２℃／１０分
ＰＣＲ装置はＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９６００（ＡＢＩ社）を使用した。
【０１６６】
ＰＣＲ産物を、常法に従って、２％アガロースゲルを用いた電気泳動法により分離した後、エチジウムブロマイドで染色した。
その結果、上記ＰＣＲによる遺伝子増幅は、腎臓、尾状核、小脳、脳梁、海馬、前立腺、及び脾臓由来のｍＲＮＡから調製した鋳型ｃＤＮＡサンプルで認められた（図４）。
また、当該遺伝子増幅の程度を指標に解析した場合、ＧＰＣＲ１８７のｍＲＮＡの発現の強さは、腎臓＞尾状核、小脳、脳梁、海馬、前立腺、脾臓の順であった。
【０１６７】
ＧＰＣＲ１８７が炎症反応で起こる白血球の血管内皮細胞への接着及び浸潤に関与するＣＤ９７に相同性を有することから、ＧＰＣＲ１８７は炎症反応の調節に関与する可能性が推察され、ＧＰＣＲ１８７の機能を調節することにより、例えば、種々の炎症を治療できる可能性がある。腎臓においてＧＰＣＲ１８７の遺伝子の高発現が見られることから、ＧＰＣＲ１８７の機能を調節することにより腎炎の治療が期待される。
【０１６８】
実施例５　新規ＧＰＣＲ１８９の同定及びそのｍＲＮＡ発現の組織分布の解析
＜１＞　新規ＧＰＣＲ１８９の同定及び調製
＜１−１＞　ヒトゲノム塩基配列からのＧＰＣＲ１８９をコードする塩基配列の抽出
ＯＲＦ（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ）を予測する既報のプログラム（ＧｅｎｅＳｃａｎ；　Ｊ．　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，　Ｖｏｌ．２６８，　ｐ．７８−９４，　１９９７）を用いて、米国ＮＩＨ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＨｅａｌｔｈ）に属するＮＬＭ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌｉｂｒａｒｙ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅの部署であるＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から発表されたヒトゲノム概要配列（Ｒｅｌｅａｓｅ　ａｓ　ｏｆ　Ａｐｒｉｌ　１９，　２００１）を解析することによりＯＲＦを含むｃＤＮＡ群を同定し、当該ｃＤＮＡ群を条件検索することにより新規蛋白質の全長（配列番号４８）をコードすると推察される塩基配列（配列番号４９）を見出した。
【０１６９】
＜１−２＞　ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用フプライマーの設計及び調製
次の条件、（１）塩基長が２３乃至２８塩基であること、（２）ＧＣ含量が５０乃至６５％であること及び（３）プライマーのアニーリング温度（Ｔｍ）が７０℃以上であること、を満たすプライマー：１８９−Ｒ３（配列番号５０）及び１８９−Ｒ４（配列番号５１）を設計し合成した。
【０１７０】
＜１−３＞　鋳型ｃＤＮＡの合成
市販のキット（ＳＭＡＲＴ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を用いて、下記のとおり５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用ｃＤＮＡを調製した。
ヒト脳由来のｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ（１μｇ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）、５’−ＣＤＳ　（１０μＭ；１μｌ）及びＳＭＡＲＴ　ＩＩ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（１０μＭ；１μｌ）の混合溶液（５μｌ）の各々を、７０℃で２分間変性させた後氷上で冷却した。
次いで、反応物に５倍濃縮した１ｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ　Ｂｕｆｆｅｒ（２μｌ）、ＤＴＴ（２０ｍＭ；１μｌ）、ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ（１０ｍＭ；１μｌ）及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ（１μｌ；ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ製）を加えよく混合した後、４２℃で９０分間インキュベートした。次いで、各々の反応溶液に、ＴＥ溶液（２５０μｌ）を加え、７２℃で７分間処理した。得られたｃＤＮＡを以下の５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲの鋳型として使用した。
【０１７１】
＜１−４＞　　５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ
５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用ｃＤＮＡ（１．５μｌ）、プライマー１８９−Ｒ４（１０μＭを１μｌ）、１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｍｉｘ（２．５μｌ）、１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（２．５μｌ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ；２μｌ）及び５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　Ｐｏｌ．Ｍｉｘ（０．５μｌ）を混合し反応溶液を調製した（最終容量：２５μｌ）。この溶液に対して、次の条件でＰＣＲを行った。
９４℃／１分；（９４℃／５秒及び７２℃／５分）×５回；（９４℃／５秒，７０℃／１０秒及び７２℃／５分）×５回；（９４℃／５秒，６８℃／１０秒及び７２℃／５分）×２５回；及び７２℃／１０分
【０１７２】
次いで、ＰＣＲ産物をＴＥ　Ｂｕｆｆｅｒで５０倍希釈した溶液（２．５μｌ）、プライマー１８９−Ｒ３（１０μＭ；１μｌ）、Ｎｅｓｔｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ；１μｌ）、１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ２　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（２．５μｌ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ；２μｌ）及び５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　Ｐｏｌ．　Ｍｉｘ（０．２μｌ）を混合し反応溶液を調製した（最終容量：２５μｌ）。この溶液に対して、次の条件でＰＣＲを行った。
９４℃／１分；（９４℃／５秒，６８℃／１０秒及び７２℃／５分）×２０回；及び７２℃／１０分
ＰＣＲ装置は、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９６００（ＡＢＩ社）を使用した。
次いで、１％アガロースゲルを用いた電気泳動法により、ＰＣＲ産物を分離し、約１．０ｋ塩基長の増幅ＤＮＡのバンドを確認した。該ＤＮＡをゲルから切り出しＱＩＡＥＸ　ＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて精製し、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）のＴＡクローニングベクターへクローニングした。得られたクローンの塩基配列をＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで決定した（配列番号５２）。
【０１７３】
＜１−５＞　ＧＰＣＲ１８９の全長をコードする塩基配列及びそのアミノ酸配列の決定
前記＜１−１＞で見出した新規蛋白質を全長をコードする塩基配列（配列番号４９）と上記ＲＡＣＥ−ＰＣＲで同定したＤＮＡの塩基配列（配列番号５２）との共通配列から目的の蛋白質の全長をコードするＤＮＡ（＜塩基配列＞配列番号５３；　＜アミノ酸配列＞配列番号５４）を得た。
一方、上記ＲＡＣＥ−ＰＣＲで得たＤＮＡ配列（配列番号５２）の５’末端は該蛋白質のＮ末端メチオニンをコードする開始コドンまで伸びていなかったため、該蛋白質のＮ末端領域をコードする塩基配列の正否を次のＲＴ−ＰＣＲにより検証した。
該開始コドンを挟む位置でセンスプライマー１８９−Ｆ７（配列番号５５）及びアンチセンスプライマー（配列番号５６）を設計、合成した。これらのプライマーを用いて、前記のヒト脳由来ｃＤＮＡを鋳型として常法に従ってＲＴ−ＰＣＲを行った。
その結果、上記で同定したＤＮＡの塩基配列（配列番号５３）を元に期待されるとおりの塩基長のＤＮＡが増幅されたことから、当該ＤＮＡ（配列番号５３）は目的の新規蛋白質の全長をコードする正しい塩基配列であることが確認された。
このＤＮＡ（配列番号５３）は、８３６アミノ酸からなる新規蛋白質をコードする塩基配列を含んでいた（＜塩基配列＞配列番号５３；＜アミノ酸配列＞配列番号５４）。
【０１７４】
＜１−６＞　ＧＰＣＲ１８９の構造的特徴の解析
前記で同定した新規蛋白質の全長アミノ酸配列について、総合遺伝子情報ツール（ｂｉｏＳＣＯＵＴ　１．５．２；ＬＩＯＮ社）を用いて、膜貫通領域の検索（ＰＨＤｈｔｍ；Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｖｏｌ．７，　ｐ．１７０４−１７１８，　１９９６）及びｂｌａｓｔ検索（ＢＬＡＳＴＰ　２．０．１１＜Ｊａｎ．　２０，
２０００＞；Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　Ｖｏｌ．２１５，　ｐ．４０３−４１０，　１９９０）を実施した。
その結果、この新規蛋白質は、７回膜貫通領域（配列番号５４の２７８乃至２９６、３１５乃至３３２、３４３乃至３６１、３９２乃至４０９、４３４乃至４５３、５１２乃至５２９及び５４４乃至５６１の領域）を有することが明らかとなった。
【０１７５】
また、既知蛋白質のアミノ酸配列とのホモロジー検索の結果、この新規蛋白質（１乃至８３６番目までの領域）はＧＰＣＲであるＴＥＭ５（Ｔｕｍｏｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｍａｒｋｅｒ　５　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ；ｔｒｅｍｂｌｎｅｗ／ＡＦ３７８７５５；４８０乃至１３３１番目までの領域）と３７％の相同性を示した。
このような構造的特徴から、この新規蛋白質は新規なＧＰＣＲであると考えられ、ＧＰＣＲ１８９と命名した。
【０１７６】
＜２＞　ＧＰＣＲ１８９のｍＲＮＡ発現の組織分布
ＧＰＣＲ１８９のｍＲＮＡの各種組織での発現の程度を、常法に従ってＲＴ−ＰＣＲにより解析した。
＜２−１＞　ＲＴ−ＰＣＲ用プライマーの設計及び調製
ＧＰＣＲ１８９をコードする塩基配列（配列番号５３）を基に、センスプライマー１８９−Ｆ１（配列番号５７）及びアンチセンスプライマー１８９−Ｒ１（配列番号５８）を設計し合成した。
【０１７７】
＜２−２＞　鋳型ｃＤＮＡの調製
市販のｃＤＮＡ合成キット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ製）を用いて、以下のようにしてヒトの各種組織（扁桃核、尾状核、小脳、脳梁、海馬、黒質、視床下核、視床、脳、網膜、脊髄、脳下垂体、唾液腺、乳腺、甲状腺、胸腺、気管、肺、心臓、肝臓、腎臓、副腎、膵臓、胃、小腸、骨格筋、胎盤、子宮、精巣、リンパ節、前立腺、脾臓）及び細胞株（ＨｅＬａ、ＨＬ−６０、Ｒａｊｉ、ＭＯＬＴ−４）の各々のｐｏｌｙ（Ａ）　ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ製）からｃＤＮＡを合成した。
【０１７８】
ｐｏｌｙ（Ａ）　ＲＮＡ（０．４μｇ；ＣＬＯＮＴＥＣＨ製）を、１０倍濃厚溶液の合成バッファー（２μｌ；　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２００ｍＭ；ｐＨ８．４）、ＫＣｌ（５００ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）及びＢＳＡ（１μｇ／μｌ））、ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ；４μｌ）、ＤＴＴ（０．１ｍＭ；２μｌ）、　デオキシヌクレオチド（各々１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ；１μｌ）、ｏｌｉｇｏ　ｄＴ（１２−１８）　ｐｒｉｍｅｒ（０．５μｇ／μｌ；１μｌ）及び逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＲＴ；５０ｕｎｉｔ／μｌ；１μｌ）からなる反応溶液（２０μｌ）中にて、４２℃、５０分間反応させｃＤＮＡを合成した。次いで、反応溶液に、Ｅ．Ｃｏｌｉ　ＲＮａｓｅ　Ｈ（２ｕｎｉｔ／μｌ；１μｌ）加えＲＮＡを分解した。
【０１７９】
＜２−３＞　ＲＴ−ＰＣＲ
上記のように調製したヒトｃＤＮＡ溶液の１５００倍希釈溶液（５μｌ）に、滅菌水（１２．３μｌ）、１０倍濃厚溶液のＰＣＲバッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１００ｍＭ；ｐＨ８．３）、ＫＣｌ（５００ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（１５ｍＭ；２．５μｌ；宝酒造製））、デオキシヌクレオチド（各種２．５ｍＭ；２．５μｌ；宝酒造製）、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（５ｕｎｉｔ／μｌ；０．２μｌ；宝酒造社製）、センスプライマー１８９−Ｆ１（１０μＭ；１．２５μｌ）及びアンチセンスプライマー１８９−Ｒ１（１０μＭ；１．２５μｌ）を加え反応溶液（２５μｌ）を調製した。
この溶液に対して、次の条件でＲＴ−ＰＣＲを行った。
９４℃／２分；（９４℃／３０秒，６０℃／３０秒及び７２℃／２分）×３５回；及び７２℃／１０分
ＰＣＲ装置はＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９６００（ＡＢＩ社）を使用した。
【０１８０】
ＰＣＲ産物を、常法に従って、２％アガロースゲルを用いた電気泳動法により分離した後、エチジウムブロマイドで染色した。
その結果、上記ＰＣＲによる遺伝子増幅は、ほぼ全ての組織及び被験細胞株で認められた（図５）。
また、当該遺伝子増幅の程度を指標に解析した場合、ＧＰＣＲ１８９のｍＲＮＡの発現の強さは、甲状腺＞扁桃核、脳梁、海馬、黒質、視床下核、視床、脳、網膜、脊髄、脳下垂体、乳腺、前立腺＞尾状核、小脳、唾液腺、胸腺、肝臓、副腎、小腸、胎盤、Ｈｅｌａ細胞株、ＨＬ−６０細胞株、脾臓＞気管、肺、心臓、腎臓、膵臓、胃、骨格筋、子宮、精巣、リンパ節、ＭＯＬＴ−４細胞株の順であった。
【０１８１】
ＧＰＣＲ１８９が癌細胞の増殖時に起こる血管新生に関与するマーカー分子ＴＥＭ５に相同性を有することから、ＧＰＣＲ１８９は癌細胞の増殖及び転移の調節に関与する可能性が推察され、ＧＰＣＲ１８９の機能を調節することにより、例えば、癌細胞の増殖及び転移を治療できる可能性がある。
【０１８２】
＜３＞　ＧＰＣＲ１８９　ｃＤＮＡのクローニング
＜３−１＞　ＰＣＲ用プライマーの設計
上記で得たＧＰＣＲ１８９全長をコードする塩基配列（配列番号５３）を、常法に従って塩基長が約５００乃至９００ｂｐの５つの断片に分断化した。断片化した各々の塩基配列をＰＣＲにより増幅させるため各々の断片に対して以下のプライマーセットを設計、合成した。なお、各プライマーの鋳型ＤＮＡとの重複領域は２５ｂｐ以上とした。
イ）１次ＰＣＲ用プライマー
第１断片：
１８９＿Ｆｒ．１＿ＰＣＲ＿Ｆ１（配列番号９０）及び１８９＿Ｆｒ．１＿ＰＣＲ＿Ｒ１（配列番号９１）
第２断片：
１８９＿Ｆｒ．２＿ＰＣＲ＿Ｆ１（配列番号９２）及び１８９＿Ｆｒ．２＿ＰＣＲ＿Ｒ１（配列番号９３）
第３断片：
１８９＿Ｆｒ．３＿ＰＣＲ＿Ｆ１（配列番号９４）及び１８９＿Ｆｒ．３＿ＰＣＲ＿Ｒ１（配列番号９５）
第４断片：
１８９＿Ｆｒ．４＿ＰＣＲ＿Ｆ１（配列番号９６）及び１８９＿Ｆｒ．４＿ＰＣＲ＿Ｒ１（配列番号９７）
第５断片：
１８９＿Ｆｒ．５＿ＰＣＲ＿Ｆ１（配列番号９８）及び１８９＿Ｆｒ．５＿ＰＣＲ＿Ｒ１（配列番号９９）
【０１８３】
ロ）２次ＰＣＲ用プライマー
第１断片：
１８９＿Ｆｒ．１＿ＰＣＲ＿Ｆ２（配列番号１００）及び１８９＿Ｆｒ．１＿ＰＣＲ＿Ｒ２（配列番号１０１）
第２断片：
１８９＿Ｆｒ．２＿ＰＣＲ＿Ｆ２（配列番号１０２）及び１８９＿Ｆｒ．２＿ＰＣＲ＿Ｒ２（配列番号１０３）
第３断片：
１８９＿Ｆｒ．３＿ＰＣＲ＿Ｆ２（配列番号１０４）及び１８９＿Ｆｒ．３＿ＰＣＲ＿Ｒ２（配列番号１０５）
第４断片
１８９＿Ｆｒ．４＿ＰＣＲ＿Ｆ２（配列番号１０６）及び１８９＿Ｆｒ．４＿ＰＣＲ＿Ｒ２（配列番号１０７）
第５断片：
１８９＿Ｆｒ．５＿ＰＣＲ＿Ｆ２（配列番号１０８）及び１８９＿Ｆｒ．５＿ＰＣＲ＿Ｒ２（配列番号１０９）
さらに、塩基配列決定用ＰＣＲプライマー（シークエンスプライマー）として、ＧＰＣＲ１８９全長をコードする塩基配列（配列番号５３）の２００乃至３５０ｂｐ毎に１２種類のセンスプライマー（１８９＿ＳＥＱ＿Ｆ１乃至１８９＿ＳＥＱ＿Ｆ１２；）配列番号１１０乃至１２１）及び１２種類のアンチセンスプライマー（１８９＿ＳＥＱ＿Ｒ１乃至１８９＿ＳＥＱ＿Ｒ１２；配列番号１２２乃至１３３）を設計、合成した。
【０１８４】
＜３−２＞　鋳型ｃＤＮＡの調製
ヒト精巣由来のｈｕｍａｎ　ｐｏｌｙ（Ａ）　ＲＮＡ　（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）、Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＲＮＡ　ＰＣＲ　ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用い該キットに添付の実験操作説明書の従いｃＤＮＡを以下のようにして合成した。
ｐｏｌｙ（Ａ）　ＲＮＡ　０．０１μｇを、２倍濃厚溶液のＢｃａバッファー（２μｌ）、ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ；０．８μｌ）、デオキシヌクレオチド混合液（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ；各々１０ｍＭ；）０．２μｌ）、ＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／μｌ；０．１μｌ）、Ｂｃａ　ＰＬＵＳ　ＲＴａｓｅ（４２Ｕ／μｌ；０．２μｌ）及びＲａｎｄｏｍ　９ｍｅｒ（５０μＭ；０．２μｌ）からなる反応液（４μｌ）中に、６５℃で１分間、３０℃で１分間、３０乃至６５℃で１５分間、６５℃で３０分間、９８℃で５分間及び５℃で５分間反応させた。
【０１８５】
＜３−３＞　１次ＰＣＲ
上記で調製したヒトｃＤＮＡ溶液（４μｌ）、滅菌水（５．５μｌ）、１０倍濃厚溶液のＰｙｒｏｂｅｓｔ　ＰＣＲバッファー（２μｌ）、デオキシヌクレオチド混合液（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ；各々１０ｍＭ；０．４μｌ）、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡポリメラーゼ（５ｕ／μｌ；０．１μｌ）、第１断片用のセンスプライマー１８９＿Ｆｒ．１＿ＰＣＲ＿Ｆ１（４μｌ；５μＭ；配列番号９０）及びアンチセンスプライマー１８９＿Ｆｒ．１＿ＰＣＲ＿Ｒ１（４μｌ；５μＭ；配列番号９１）を加え、２０μｌの反応液を調製した。
この溶液に対して、以下の条件でＰＣＲを行った。
９４℃　３０秒、（９４℃　３０秒→７２−５６℃　３０秒（−１℃／サイクル）→７２℃　２分）×１７回、（９４℃　３０秒→５５℃　３０秒→７２℃　２分）×１３回及び７２℃　３分
ＰＣＲ装置はＴａＫａＲａ　Ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ　ＳＰ、ＴａＫａＲａ　Ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ　ＧＰ（ＴａＫａＲａ社）を使用した。１％アガロースゲルを用いた電気泳動法により、第１断片の１次ＰＣＲ産物を得たことを確認した。
上記と同じ条件によるＰＣＲにより、＜３−１＞で調製した第２、第３、第４、第５断片増幅用のプライマーセットを用いて、第２、第３、第４、第５断片の１次ＰＣＲ産物を得た。
【０１８６】
＜３−４＞　２次ＰＣＲ
上記で調整した第１断片の１次ＰＣＲ反応液の１００倍希釈液（５μｌ）、滅菌水（１５．７５μｌ）、１０倍濃厚溶液のＰｙｒｏｂｅｓｔ　ＰＣＲバッファーＩＩ（４μｌ）、デオキシヌクレオチド混合液（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ；各々２．５ｍＭ；４μｌ）、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡポリメラーゼ（５ｕ／μｌ；０．２５μｌ）、第１断片用の２次ＰＣＲ用センスプライマー１８９＿Ｆｒ．１＿ＰＣＲ＿Ｆ２（１０μｌ；５μＭ；配列番号１００）及びアンチセンスプライマー１８９＿Ｆｒ．１＿ＰＣＲ＿Ｒ２（１０μｌ；５μＭ；配列番号１０１）を加え、５０μｌの反応液を調製した。
この溶液に対して、以下の条件でＰＣＲを行った。
９４℃　３０秒、（９４℃　３０秒→７２−５６℃　３０秒（−１℃／サイクル）→７２℃　２分）×１７回、（９４℃　３０秒→５５℃　３０秒→７２℃　２分）×１３回、及び７２℃　３分
ＰＣＲ装置はＴａＫａＲａ　Ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ　ＳＰ、ＴａＫａＲａ　Ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ　ＧＰ（ＴａＫａＲａ社）を使用した。１％アガロースゲルを用いた電気泳動法により第１断片の２次ＰＣＲ産物を得たことを確認した。増幅ＤＮＡをＱＩＡＧＥＮ　ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて分離精製し、１０ｎｇ／μｌになるように調整した。
上記と同じ条件によるＰＣＲにより、＜３−１＞で調製した第２、第３、第４、第５断片用の２次ＰＣＲプライマーセットを用いて、第２、第３、第４、第５断片の２次ＰＣＲ産物を得た。
【０１８７】
＜３−５＞　３次ＰＣＲ（遺伝子全長の増幅）
上記で調製した第１乃至第５のＤＮＡ断片の２次ＰＣＲ産物の精製品の混合液（各々１０ｎｇ／μｌ；２．５μｌ）、滅菌水（１８．２５μｌ）、１０倍濃厚溶液のＰｙｒｏｂｅｓｔ　ＰＣＲバッファーＩＩ（５μｌ）、デオキシヌクレオチド混合液（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ；各々２．５ｍＭ；４μｌ）、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡポリメラーゼ（５ｕ／μｌ；０．２５μｌ）、センスプライマー１８９＿ＰＣＲ＿Ｆ２（１０μｌ；５μＭ；配列番号１３４）の及びアンチセンスプライマー１８９＿ＰＣＲ＿Ｒ２（１０μｌ；５μＭ；配列番号１３５）を加え、５０μｌの反応液を調製した。
この溶液に対して、以下の条件でＰＣＲを行った。
９４℃　３０秒、（９４℃　３０秒→７２−５６℃　３０秒（−１℃／サイクル）→７２℃　２分）×１７回、（９４℃　３０秒→５５℃　３０秒→７２℃　２分）×１３回及び７２℃　３分
ＰＣＲ装置はＴａＫａＲａ　Ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ　ＳＰ、ＴａＫａＲａ　Ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ　ＧＰ（ＴａＫａＲａ社）を使用した。１％アガロースゲルを用いた電気泳動法によりＰＣＲ産物を確認し、ＱＩＡＧＥＮ　ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて分離精製した。
【０１８８】
＜３−６＞　クローニング
上記で精製したＰＣＲ産物の末端をＴ４　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｋｉｎａｓｅ（ＴａＫａＲａ社）を用いてリン酸化し、ＴａＫａＲａ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２（ＴａＫａＲａ社）を用いてｐＥＮＴＲ１Ａ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）へブラントエンドライゲーションを行い挿入した。これを大腸菌ＤＨ５α株へ導入した。得られた複数のクローンのうちの３クローンからマルチスクリーンプレート（ミリポア社）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。
【０１８９】
＜３−７＞　塩基配列の決定
上記で精製したプラスミドＤＮＡを鋳型とし、＜３−１＞で調製したシークエンスプライマー２４種類と上記の３次ＰＣＲ用プライマー２種類を用いて配列解析を行った。
配列決定は、ＤＹＥｎａｍｉｃ　ＥＴ　ｄｙｅ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｋｉｔ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を使用しＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法により行った。シークエンス反応物はＭａｇｎｅｔｉｃ　Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｂｅａｄｓ（Ｓｅｒａｄｙｎ社）を使用して精製し、ＭｅｇａＢａｃｅ１０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて電気泳動を行った。
【０１９０】
クローニングされたＧＰＣＲ１８９の全長をコードするｃＤＮＡの塩基配列（配列番号１３６）を、＜１−５＞で決定した同じくＧＰＣＲ１８９の全長をコードするｃＤＮＡの塩基配列（配列番号５３）と比較したところ、配列番号５３における１２２６番目の塩基Ｇ及び１２２９番目の塩基Ｇが、配列番号１３６においてはともにＣ（塩基番号１２６３及び１２６６）であった。この差異は、単離した３クローンにおいて一致したことから、ＰＣＲ反応による増幅ミスではないと判断した。この塩基の差異により配列番号５３の塩基配列から翻訳されるアミノ酸配列（配列番号４０）の４０９番目のグリシン（Ｇｌｙ）及び４１０番目のグリシン（Ｇｌｙ）が、配列番号１３６の塩基配列から翻訳されるアミノ酸配列（配列番号１２３）においては共にアラニン（Ａｌａ）であった。
このような数個の塩基配列の差異から、２つの遺伝子配列の少なくともいずれか一方が１塩基多型（ＳＮＰ）のような変異遺伝子配列である可能性が示唆される。
【０１９１】
実施例６　新規ＧＰＣＲ２２３の同定及びそのｍＲＮＡ発現の組織分布の解析
＜１＞　ＧＰＣＲ２２３の一部の同定及びｍＲＮＡ発現の組織分布の解析
＜１−１＞　ヒトゲノム塩基配列からのＧＰＣＲ２２３をコードする塩基配列の抽出
ＯＲＦ（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ）を予測する既報のプログラム（ＧｅｎｅＳｃａｎ；　Ｊ．　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，　Ｖｏｌ．２６８，　ｐ．７８−９４，　１９９７）を用いて、米国ＮＩＨ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＨｅａｌｔｈ）に属するＮＬＭ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌｉｂｒａｒｙ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅの部署であるＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から発表されたヒトゲノム概要配列（Ｒｅｌｅａｓｅ　ａｓ　ｏｆ　Ａｐｒｉｌ　１９，　２００１）を解析することによりＯＲＦを含むｃＤＮＡ群を同定し、当該ｃＤＮＡ群を条件検索することにより新規蛋白質の一部（配列番号６０及び配列番号６２）をコードすると推察される塩基配列（配列番号５９及び配列番号６１）を見出した。
【０１９２】
＜１−２＞　ＲＴ−ＰＣＲ用プライマーの設計及び合成
前記で同定した塩基配列（配列番号５９及び配列番号６１）の各々を基に、センスプライマー２２３−Ｆ１（配列番号６３）及びアンチセンスプライマー２２３−Ｒ１（配列番号６４）を設計、合成した。
【０１９３】
＜１−３＞　鋳型ｃＤＮＡの調製
市販のｃＤＮＡ合成キット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ製）を用いて、以下のようにしてヒトの各種組織（扁桃核、尾状核、小脳、脳梁、海馬、黒質、視床下核、視床、脳、網膜、脊髄、脳下垂体、唾液腺、乳腺、甲状腺、胸腺、気管、肺、心臓、肝臓、腎臓、副腎、膵臓、胃、小腸、骨格筋、胎盤、子宮、精巣、リンパ節、前立腺、脾臓）及び細胞株（ＨｅＬａ、ＨＬ−６０、Ｒａｊｉ、ＭＯＬＴ−４）の各々のｐｏｌｙ（Ａ）　ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ製）からｃＤＮＡを合成した。
【０１９４】
ｐｏｌｙ（Ａ）　ＲＮＡ（０．４μｇ；ＣＬＯＮＴＥＣＨ製）を、１０倍濃厚溶液の合成バッファー（２μｌ；　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２００ｍＭ；ｐＨ８．４）、ＫＣｌ（５００ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）及びＢＳＡ（１μｇ／μｌ））、ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ；４μｌ）、ＤＴＴ（０．１ｍＭ；２μｌ）、デオキシヌクレオチド（各々１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ；１μｌ）、ｏｌｉｇｏ　ｄＴ（１２−１８）　ｐｒｉｍｅｒ（０．５μｇ／μｌ；１μｌ）及び逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＲＴ；５０ｕｎｉｔ／μｌ；１μｌ）からなる反応溶液（２０μｌ）中にて、４２℃、５０分間反応させｃＤＮＡを合成した。次いで、反応溶液に、Ｅ．Ｃｏｌｉ　ＲＮａｓｅ　Ｈ（２ｕｎｉｔ／μｌ；１μｌ）加えＲＮＡを分解した。
【０１９５】
＜１−４＞　ＲＴ−ＰＣＲ
上記のように調製したヒトｃＤＮＡ溶液の１５００倍希釈溶液（５μｌ）に、滅菌水（１２．３μｌ）、１０倍濃厚溶液のＰＣＲバッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１００ｍＭ；ｐＨ８．３）、ＫＣｌ（５００ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（１５ｍＭ；２．５μｌ；宝酒造製））、デオキシヌクレオチド（各種２．５ｍＭ；２．５μｌ；宝酒造製）、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（５ｕｎｉｔ／μｌ；０．２μｌ；宝酒造社製）、センスプライマー２２３−Ｆ１（１０μＭ；１．２５μｌ）及びアンチセンスプライマー２２３−Ｒ１（１０μＭ；１．２５μｌ）を加え反応溶液（２５μｌ）を調製した。
この溶液に対して、次の条件でＲＴ−ＰＣＲを行った。
９４℃／２分；（９４℃／３０秒，６０℃／３０秒及び７２℃／２分）×３５回；及び７２℃／１０分
ＰＣＲ装置はＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９６００（ＡＢＩ社）を使用した。
【０１９６】
ＰＣＲ産物を、常法に従って、２％アガロースゲルを用いた電気泳動法により分離した後、エチジウムブロマイドで染色した。
その結果、約５００ｂの増幅遺伝子産物が網膜、心臓及び精巣の組織で認められた（図６）。
また、当該遺伝子増幅の程度を指標に解析した場合、ＧＰＣＲ２２３のｍＲＮＡの発現の強さは、精巣＞心臓＞＞網膜の順であった。
【０１９７】
＜１−５＞　塩基配列決定
前記のＰＣＲ増幅遺伝子産物をＭｉｃｒｏＳｐｉｎ　Ｓ２００　ＨＲ　Ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いて精製した後、プライマー２２３−Ｆ１（配列番号６３）及びプライマー２２３−Ｒ１（配列番号６４）を用いて、市販の塩基配列決定用キット（ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　Ｂｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ；　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）と反応させた。次いで、市販のＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３１００　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｅｒ；ＡＢＩ製）を用いて塩基配列を決定した（配列番号６５）。
【０１９８】
＜２＞　ＧＰＣＲ２２３の全長の同定
＜２−１＞　ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用プライマーの設計及び調製
次の条件、（１）塩基長が２３乃至２８塩基であること、（２）ＧＣ含量が５０乃至６５％であること及び（３）プライマーのアニーリング温度（Ｔｍ）が７０℃以上であること、を満たすプライマー：２２３−Ｒ４（配列番号６６）、２２３−Ｒ５（配列番号６７）、２２３−Ｆ１（配列番号６８）及び２２３−Ｆ３（配列番号６９）を設計し合成した。
【０１９９】
＜２−２＞　鋳型ｃＤＮＡの合成
市販のキット（ＳＭＡＲＴ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を用いて、下記のとおり５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用ｃＤＮＡ及び３’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用ｃＤＮＡを調製した。５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用ｃＤＮＡの調製には、ヒト骨格筋由来のｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡを、また３’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用ｃＤＮＡの調製にはヒト精巣由来ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡを用いた。
ヒト骨格筋由来のｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ（１μｇ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）、５’−ＣＤＳ　（１０μＭ；１μｌ）及びＳＭＡＲＴ　ＩＩ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（１０μＭ；１μｌ）の混合溶液（５μｌ）を、７０℃で２分間変性させた後氷上で冷却した。同様に、ヒト精巣由来のｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ（１μｇ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）及び３’−ＣＤＳ　（１０μＭ；１μｌ）の混合溶液（５μｌ）を、７０℃で２分間変性させた後氷上で冷却した。
次いで、各々の反応物に５倍濃縮した１ｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ　Ｂｕｆｆｅｒ（２μｌ）、ＤＴＴ（２０ｍＭ；１μｌ）、ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ（１０ｍＭ；１μｌ）及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ（１μｌ；ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ製）を加えよく混合した後、４２℃で９０分間インキュベートした。次いで、各々の反応溶液に、ＴＥ溶液（２５０μｌ）を加え、７２℃で７分間処理した。得られたｃＤＮＡを以下の５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲの鋳型として使用した。
【０２００】
＜２−３＞　　３’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ
３’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用ｃＤＮＡ（１．５μｌ）、プライマー２２３−Ｆ１（配列番号６８；１０μＭを１μｌ）、１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｍｉｘ（２．５μｌ）、１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（２．５μｌ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ；２μｌ）及び５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　Ｐｏｌ．Ｍｉｘ（０．５μｌ）を混合し反応溶液を調製した（最終容量：２５μｌ）。この溶液に対して、次の条件でＰＣＲを行った。
９４℃／１分；（９４℃／５秒及び７２℃／５分）×５回；（９４℃／５秒，７０℃／１０秒及び７２℃／５分）×５回；（９４℃／５秒，６８℃／１０秒及び７２℃／５分）×２５回；及び７２℃／１０分
【０２０１】
次いで、ＰＣＲ産物をＴＥ　Ｂｕｆｆｅｒで５０倍希釈した溶液（２．５μｌ）、プライマー２２３−Ｆ３（配列番号６９；１０μＭ；１μｌ）、Ｎｅｓｔｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ；１μｌ）、１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（２．５μｌ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ；２μｌ）及び５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ２　Ｐｏｌ．　Ｍｉｘ（０．２μｌ）を混合し反応溶液を調製した（最終容量：２５μｌ）。この溶液に対して、次の条件でＰＣＲを行った。
９４℃／１分；（９４℃／５秒，６８℃／１０秒及び７２℃／５分）×２０回；及び７２℃／１０分
ＰＣＲ装置は、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９６００（ＡＢＩ社）を使用した。
次いで、１％アガロースゲルを用いた電気泳動法により、ＰＣＲ産物を分離し、約０．４ｋ塩基長の増幅ＤＮＡのバンドを確認した。該ＤＮＡをゲルから切り出しＱＩＡＥＸ　ＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて精製し、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）のＴＡクローニングベクターへクローニングした。得られたクローンの塩基配列をＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで決定した（配列番号７０）。
【０２０２】
＜２−４＞　　５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ
５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用ｃＤＮＡ（１．５μｌ）、プライマー２２３−Ｒ４（配列番号６６；１０μＭを１μｌ）、１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｍｉｘ（２．５μｌ）、１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（２．５μｌ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ；２μｌ）及び５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　Ｐｏｌ．Ｍｉｘ（０．５μｌ）を混合し反応溶液を調製した（最終容量：２５μｌ）。この溶液に対して、次の条件でＰＣＲを行った。
９４℃／１分；（９４℃／５秒及び７２℃／５分）×５回；（９４℃／５秒，７０℃／１０秒及び７２℃／５分）×５回；（９４℃／５秒，６８℃／１０秒及び７２℃／５分）×２５回；及び７２℃／１０分
【０２０３】
次いで、ＰＣＲ産物をＴＥ　Ｂｕｆｆｅｒで５０倍希釈した溶液（２．５μｌ）、プライマー２２３−Ｒ５（配列番号６７；１０μＭ；１μｌ）、Ｎｅｓｔｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ；１μｌ）、１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（２．５μｌ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ；２μｌ）及び５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ２　Ｐｏｌ．　Ｍｉｘ（０．２μｌ）を混合し反応溶液を調製した（最終容量：２５μｌ）。この溶液に対して、次の条件でＰＣＲを行った。
９４℃／１分；（９４℃／５秒，６８℃／１０秒及び７２℃／５分）×２０回；及び７２℃／１０分
ＰＣＲ装置は、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９６００（ＡＢＩ社）を使用した。
次いで、１％アガロースゲルを用いた電気泳動法により、ＰＣＲ産物を分離し、約０．６ｋ塩基長の増幅ＤＮＡのバンドを確認した。該ＤＮＡをゲルから切り出しＱＩＡＥＸ　ＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて精製し、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）のＴＡクローニングベクターへクローニングした。得られたクローンの塩基配列をＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで決定した（配列番号７１）。
【０２０４】
＜２−５＞　ＧＰＣＲ２２３の全長をコードする塩基配列及びそのアミノ酸配列の決定
前記＜１−５＞、＜２−３＞及び＜２−４＞で見出した新規蛋白質の一部を各々コードする塩基配列（配列番号６５、配列番号７０及び配列番号７１）との共通配列から目的の蛋白質ＧＰＣＲ２２３の全長をコードするＤＮＡ（＜塩基配列＞配列番号７３；＜アミノ酸配列＞配列番号７４）を含む塩基配列（配列番号７２）を得た。
【０２０５】
＜２−６＞　ＧＰＣＲ２２３の構造的特徴の解析
前記で同定した新規蛋白質の全長アミノ酸配列について、総合遺伝子情報ツール（ｂｉｏＳＣＯＵＴ　１．５．２；ＬＩＯＮ社）を用いて、膜貫通領域の検索（ＰＨＤｈｔｍ；Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｖｏｌ．７，　ｐ．１７０４−１７１８，　１９９６）及びｂｌａｓｔ検索（ＢＬＡＳＴＰ　２．０．１１＜Ｊａｎ．　２０，
２０００＞；Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　Ｖｏｌ．２１５，　ｐ．４０３−４１０，　１９９０）を実施した。
その結果、この新規蛋白質は、７回膜貫通領域（配列番号７４の５５乃至７８、９４乃至１１７、１３４乃至１５１、１７３乃至１９１、２２２乃至２４２、２７８乃至２９５及び３１０乃至３２８の領域）を有することが明らかとなった。
【０２０６】
また、既知蛋白質のアミノ酸配列とのホモロジー検索の結果、この新規蛋白質の４２乃至３３５番目までの領域及び５４乃至３３５番目までの領域が各々、既知ＧＰＣＲであるヒトＶｉｓｕａｌ　ｐｉｇｍｅｎｔ−ｌｉｋｅ受容体ｐｅｒｏｐｓｉｎ（ｓｗｉｓｓ／Ｏ１４７１８；１６乃至３０１番目までの領域）と３０％の相同性（アミノ酸配列同一性）を、またヒトＯｐｓｉｎ−４（Ｍｅｌａｎｏｐｓｉｎ）（ｓｗｉｓｓ／Ｑ９ＵＨＭ６；　６９乃至３５７番目までの領域）と３０％の相同性（アミノ酸配列同一性）を有していた。
このような構造的特徴から、この新規蛋白質は新規なＧＰＣＲであると考えられ、ＧＰＣＲ２２３と命名した。
ＧＰＣＲ２２３の遺伝子発現が、精巣、心臓及び網膜に特異的に認められることから、ＧＰＣＲ２２３の機能を調節することにより、例えば、性機能関連障害あるいは心臓疾患を治療できる可能性がある。
【０２０７】
実施例７　新規ＧＰＣＲ２２２の同定及びそのｍＲＮＡ発現の組織分布の解析
＜１＞　ＧＰＣＲ２２２の一部の同定及びｍＲＮＡ発現の組織分布の解析
＜１−１＞　ヒトゲノム塩基配列からのＧＰＣＲ２２２をコードする塩基配列の抽出
ＯＲＦ（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ）を予測する既報のプログラム（ＧｅｎｅＳｃａｎ；　Ｊ．　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，　Ｖｏｌ．２６８，　ｐ．７８−９４，　１９９７）を用いて、米国ＮＩＨ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＨｅａｌｔｈ）に属するＮＬＭ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌｉｂｒａｒｙ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅの部署であるＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から発表されたヒトゲノム概要配列（Ｒｅｌｅａｓｅ　ａｓ　ｏｆ　Ａｐｒｉｌ　１９，　２００１）を解析することによりＯＲＦを含むｃＤＮＡ群を同定し、当該ｃＤＮＡ群を条件検索することにより新規蛋白質の一部（配列番号７６）をコードすると推察される塩基配列（配列番号７５）を見出した。
【０２０８】
＜１−２＞　ＲＴ−ＰＣＲ用プライマーの設計及び合成
前記で同定した塩基配列（配列番号７６）の各々を基に、センスプライマー２２２−Ｆ１０（配列番号７７）、２２２−Ｆ６（配列番号７９）、２２２−Ｆ８（配列番号８０）及び２２２−Ｆ９（配列番号８３）、並びにアンチセンスプライマー２２２−Ｒ８（配列番号７８）、２２２−Ｒ１２（配列番号８１）、２２２−Ｒ４（配列番号８２）及び２２２−Ｒ９（配列番号８４）を設計、合成した。
【０２０９】
＜１−３＞　鋳型ｃＤＮＡの調製
市販のｃＤＮＡ合成キット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ製）を用いて、以下のようにしてヒトの各種組織（扁桃核、尾状核、小脳、脳梁、海馬、黒質、視床下核、視床、脳、網膜、脊髄、脳下垂体、唾液腺、乳腺、甲状腺、胸腺、気管、肺、心臓、肝臓、腎臓、副腎、膵臓、胃、小腸、骨格筋、胎盤、子宮、精巣、リンパ節、前立腺、脾臓）及び細胞株（ＨｅＬａ、ＨＬ−６０、Ｒａｊｉ、ＭＯＬＴ−４）の各々のｐｏｌｙ（Ａ）　ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ製）からｃＤＮＡを合成した。
【０２１０】
ｐｏｌｙ（Ａ）　ＲＮＡ（０．４μｇ；ＣＬＯＮＴＥＣＨ製）を、１０倍濃厚溶液の合成バッファー（２μｌ；Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２００ｍＭ；ｐＨ８．４）、ＫＣｌ（５００ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）及びＢＳＡ（１μｇ／μｌ））、ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ；４μｌ）、ＤＴＴ（０．１ｍＭ；２μｌ）、デオキシヌクレオチド（各々１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ；１μｌ）、ｏｌｉｇｏ　ｄＴ（１２−１８）　ｐｒｉｍｅｒ（０．５μｇ／μｌ；１μｌ）及び逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＲＴ；５０ｕｎｉｔ／μｌ；１μｌ）からなる反応溶液（２０μｌ）中にて、４２℃、５０分間反応させｃＤＮＡを合成した。次いで、反応溶液に、Ｅ．Ｃｏｌｉ　ＲＮａｓｅ　Ｈ（２ｕｎｉｔ／μｌ；１μｌ）加えＲＮＡを分解した。
【０２１１】
＜１−４＞　ＲＴ−ＰＣＲ
上記のように調製したヒトｃＤＮＡ溶液の１５００倍希釈溶液（５μｌ）に、滅菌水（１２．３μｌ）、１０倍濃厚溶液のＰＣＲバッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１００ｍＭ；ｐＨ８．３）、ＫＣｌ（５００ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（１５ｍＭ；２．５μｌ；宝酒造製））、デオキシヌクレオチド（各種２．５ｍＭ；２．５μｌ；宝酒造製）、Ｅｘ　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（５ｕｎｉｔ／μｌ；０．２μｌ；宝酒造社製）、センスプライマー２２２−Ｆ１０（配列番号７７；１０μＭ；１．２５μｌ）及び２２２−Ｆ９（配列番号８３；１０μＭ；１．２５μｌ）のいずれか一方、及びアンチセンスプライマー２２２−Ｒ８（配列番号７８；　１０μＭ；１．２５μｌ）及び２２２−Ｒ９（配列番号８４；１０μＭ；１．２５μｌ）のいずれか一方を加え反応溶液（２５μｌ）を調製した。
この溶液に対して、次の条件でＲＴ−ＰＣＲを行った。
９４℃／２分；（９４℃／３０秒，６０℃／３０秒及び７２℃／２分）×３５回；及び７２℃／１０分
ＰＣＲ装置はＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９６００（ＡＢＩ社）を使用した。
【０２１２】
ＰＣＲ産物を、常法に従って、２％アガロースゲルを用いた電気泳動法により分離した後、エチジウムブロマイドで染色した。
一方、センスプライマー２２２−Ｆ１０（配列番号７７）とアンチセンスプライマー２２２−Ｒ８（配列番号７８）によるＰＣＲでの増幅遺伝子産物については、さらの内側の塩基配列をアニールする一対のプライマーを用いてｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行った。
ＴＥ　ｂｕｆｆｅｒで５０倍に希釈した該ＰＣＲ産物の溶液（５μｌ）、センスプライマー２２２−Ｆ６（配列番号７９；１０μＭ）及び２２２−Ｆ８（配列番号８０；１０μＭ）のいずれか一方、アンチセンスプライマー２２２−Ｒ１２（配列番号８１；１０μＭ）及び２２２−Ｒ４（配列番号８２；１０μＭ）のいずれか一方、１０倍希釈したＰＣＲ緩衝液（２．５μｌ）、１０ｍＭのｄＮＴＰ（２．５μｌ）及びｒＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（０．１μｌ）を混合しＰＣＲ用反応溶液（最終容量：２５μｌ）を調製した。
【０２１３】
その結果、プライマー２２２−Ｆ９（配列番号８３）及び２２２−Ｒ９（配列番号８４）によるＰＣＲでは、約３８０ｂの増幅遺伝子産物が各種の組織で認められた。
また、当該遺伝子増幅の程度を指標に解析した場合、ＧＰＣＲ２２２のｍＲＮＡの発現の強さは、甲状腺、脾臓＞前立腺、リンパ節＞小脳、脳梁、海馬、黒質、視床下核、唾液腺、胸腺、子宮、精巣の順であった（図７）。
一方、プライマー２２２−Ｆ６（配列番号７９）及び２２２−Ｒ１２（配列番号８１）の一対、またはプライマー２２２−Ｆ８（配列番号８０）及び２２２−Ｒ４（配列番号８２）の一対を用いたＰＣＲでは、扁桃、脳梁、視床下核、脊髄、甲状腺、膵臓、子宮、前立腺及び脾臓で明確な遺伝子増幅バンドが認められたが、組織によって選択的スプライシングを起こってることが推測された。
【０２１４】
＜１−５＞　塩基配列決定
視床下核及び子宮由来のｃＤＮＡを鋳型としてプライマー２２２−Ｆ６（配列番号７９）及び２２２−Ｒ１２（配列番号８１）の一対またはプライマー２２２−Ｆ８（配列番号８０）及び２２２−Ｒ４（配列番号８２）の一対を用いたＰＣＲにより増幅された遺伝子産物の各々を、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ　Ｓ２００　ＨＲ　Ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いて精製した後、プライマー２２２−Ｆ６（配列番号７９）及び２２２−Ｒ１２（配列番号８１）の一対またはプライマー２２２−Ｆ８（配列番号８０）及び２２２−Ｒ４（配列番号８２）の一対を用いて、市販の塩基配列決定用キット（ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　Ｂｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ；　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）と反応させた。次いで、市販のＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３１００　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｅｒ；ＡＢＩ製）を用いて塩基配列を決定した（配列番号８５及び配列番号８６）。
【０２１５】
＜２＞　ＧＰＣＲ２２２の全長の同定
＜２−１＞　ＧＰＣＲ２２２の全長をコードする塩基配列及びそのアミノ酸配列の決定
前記＜１−１＞で同定した新規蛋白質の一部（配列番号７６）をコードすると推察される塩基配列（配列番号７５）において、前記ＰＣＲプライマー２２２−Ｒ４（配列番号８２）の塩基配列に対応する部分より上流の塩基配列を、前記で得た２つのＰＣＲ産物の塩基配列（配列番号８５及び配列番号８６）に置き換えることにより３７４個のアミノ酸からなる目的の新規蛋白質の全長をコードするＯＲＦ（アミノ酸配列：配列番号８９；　塩基配列：配列番号８８）を含む塩基配列（配列番号８７）を得た。
【０２１６】
＜２−２＞　ＧＰＣＲ２２２の構造的特徴の解析
前記で同定した新規蛋白質の全長アミノ酸配列について、総合遺伝子情報ツール（ｂｉｏＳＣＯＵＴ　１．５．２；ＬＩＯＮ社）を用いて、膜貫通領域の検索（ＰＨＤｈｔｍ；Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｖｏｌ．７，　ｐ．１７０４−１７１８，　１９９６）及びｂｌａｓｔ検索（ＢＬＡＳＴＰ　２．０．１１＜Ｊａｎ．　２０，
２０００＞；Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　Ｖｏｌ．２１５，　ｐ．４０３−４１０，　１９９０）を実施した。
その結果、この新規蛋白質は、７回膜貫通領域（配列番号８９の７１乃至９１、１０６乃至１２８、１４７乃至１６６、１８９乃至２０６、２２６乃至２４６、２７３乃至２９１及び３０８乃至３２６の領域）を有することが明らかとなった。
【０２１７】
また、既知蛋白質のアミノ酸配列とのホモロジー検索の結果、この新規蛋白質の６９乃至３４９番目までの領域及び６７乃至３６２番目までの領域が各々、既知ＧＰＣＲであるヒトＢ１ブラジキニン受容体（ｓｗｉｓｓ／Ｐ４６６６３；３９乃至３３１番目までの領域）と２３％の相同性（アミノ酸配列同一性）を、またヒトソマトスタチンＩＶ型受容体（ｓｗｉｓｓｎｅｗ／Ｐ３１３９１；　４５乃至３４４番目までの領域）と２５％の相同性（アミノ酸配列同一性）を有していた。
このような構造的特徴から、この新規蛋白質は新規なＧＰＣＲであると考えられ、ＧＰＣＲ２２２と命名した。
ＧＰＣＲ２２２の遺伝子発現が視床下核及び子宮に特異的であることから、本遺伝子は、当該器官の機能の調節に関与するものと考えられる。視床下核が存する視床下部は、多種多様な機能の調節に関与しており、視床下部における障害は、消化、吸収、代謝、循環、食欲及び性機能などに重大な影響をもたらすことが知られている。とりわけ、視床下核の障害としては、ルイス体症候群が知られている。従って、ＧＰＣＲ２２２の機能を調節することにより、消化、吸収、代謝、循環、食欲及び性機能に関連する種々の疾患を治療できる可能性がある。
【０２１８】
＜３−１＞　ＰＣＲ用プライマーの調製
ＧＰＣＲ２２２の全長をコードするｃＤＮＡをＰＣＲで増幅させるために下記のプライマーセットを設計、合成した。
１次ＰＣＲ用プライマー：
２２２＿ＰＣＲ＿Ｆ１（配列番号１３８）及び２２２＿ＰＣＲ＿Ｒ１（配列番号１３９）
２次ＰＣＲ用プライマー：
２２２＿ＰＣＲ＿Ｆ２（配列番号１４０）及び２２２＿ＰＣＲ＿Ｒ２（配列番号１４１）
さらに、塩基配列決定用ＰＣＲプライマー（シークエンスプライマー）として、ＧＰＣＲ２２２全長をコードする塩基配列（配列番号８８）の２００乃至３５０ｂｐ毎に５種類のセンスプライマー２２２＿ＳＥＱ＿Ｆ１（配列番号１４２）、２２２＿ＳＥＱ＿Ｆ２（配列番号１４３）、２２２＿ＳＥＱ＿Ｆ３（配列番号１４４）、２２２＿ＳＥＱ＿Ｆ４（配列番号１４５）及び２２２＿ＳＥＱ＿Ｆ５（配列番号１４６）、並びに５種類のアンチセンスプライマー２２２＿ＳＥＱ＿Ｒ１（配列番号１４７）、２２２＿ＳＥＱ＿Ｒ２（配列番号１４８）、２２２＿ＳＥＱ＿Ｒ３（配列番号１４９）、２２２＿ＳＥＱ＿Ｒ４（配列番号１５０）及び２２２＿ＳＥＱ＿Ｒ５（配列番号１５１）を設計、合成した。
【０２１９】
＜３−２＞　鋳型ｃＤＮＡの調製
常法に従ってヒト子宮由来のｈｕｍａｎ　ｐｏｌｙ（Ａ）　ＲＮＡ　（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）、Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＲＮＡ　ＰＣＲ　ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。ｐｏｌｙ（Ａ）　ＲＮＡ（０．０１μｇ）を、２倍濃厚溶液のＢｃａバッファー（２μｌ）、ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ；０．８μｌ）、デオキシヌクレオチド混合液（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ；各々１０ｍＭ；０．２μｌ）、ＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／μｌ；０．１μｌ）、Ｂｃａ　ＰＬＵＳ　ＲＴａｓｅ（４２Ｕ／μｌ；０．２μｌ）及びＲａｎｄｏｍ　９ｍｅｒ（５０μＭ；０．２μｌ）からなる反応液（４μｌ）中にて、６５℃で１分間、３０℃で１分間、３０乃至６５℃で１５分間、６５℃で３０分間、９８℃で５分間及び５℃で５分間反応させた。
【０２２０】
＜３−３＞　１次ＰＣＲ
上記で調製したヒトｃＤＮＡ溶液（４μｌ）、滅菌水（５．５μｌ）、１０倍濃厚溶液のＰｙｒｏｂｅｓｔ　ＰＣＲバッファー（２μｌ）、デオキシヌクレオチド混合液（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ；各々１０ｍＭ；０．４　μｌ）、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡポリメラーゼ（５ｕ／μｌ；０．１μｌ）、センスプライマー２２２＿ＰＣＲ＿Ｆ１（配列番号１３８）及びアンチセンスプライマー２２２＿ＰＣＲ＿Ｒ１（配列番号１３９）をそれぞれ４μｌ（５μＭ）加え、２０μｌの反応液を調製した。
この溶液に対して、以下の条件でＰＣＲを行った。
９４℃　３０秒、（９４℃　３０秒→７２−５６℃　３０秒（−１℃／サイクル）→７２℃　２分）×１７回、（９４℃　３０秒→５５℃　３０秒→７２℃　２分）×１３回及び７２℃　３分
ＰＣＲ装置はＴａＫａＲａ　Ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ　ＳＰ、ＴａＫａＲａ　Ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ　ＧＰ（ＴａＫａＲａ社）使用した。１％アガロースゲルを用いた電気泳動法により、ＰＣＲ産物を確認した。
【０２２１】
＜３−４＞　２次ＰＣＲ
上記で調製した１次ＰＣＲ反応液の１００倍希釈液（５μｌ）、滅菌水（１５．７５μｌ）、１０倍濃厚溶液のＰｙｒｏｂｅｓｔ　ＰＣＲバッファーＩＩ（４μｌ）、デオキシヌクレオチド混合液（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ；各々２．５ｍＭ；４μｌ）、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡポリメラーゼ（５ｕ／μｌ；０．２５μｌ）、センスプライマー２２２＿ＰＣＲ＿Ｆ２（１０μｌ；５μＭ；配列番号１４０）及びアンチセンスプライマー２２２＿ＰＣＲ＿Ｒ２（１０μｌ；５μＭ；配列番号１４１）を加え、５０μｌの反応液を調製した。この溶液に対して、以下の条件でＰＣＲを行った。
９４℃　３０秒、（９４℃　３０秒→７２−５６℃　３０秒（−１℃／サイクル）→７２℃　２分）×１７回、（９４℃　３０秒→５５℃　３０秒→７２℃　２分）×１３回及び７２℃　３分
ＰＣＲ装置はＴａＫａＲａ　Ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ　ＳＰ、ＴａＫａＲａ　Ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ　ＧＰ（ＴａＫａＲａ社）を使用した。１％アガロースゲルを用いた電気泳動法により、ＰＣＲ産物を確認し、ＱＩＡＧＥＮ　ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて分離精製した。
【０２２２】
＜３−５＞　塩基配列の決定（ダイレクトシークエンス）
上記で精製したＰＣＲ産物を鋳型とし、＜３−１＞で調製したシークエンスプライマー１０種類と２次ＰＣＲ用プライマー２種類を用いて塩基配列解析を行った。配列決定は、ＤＹＥｎａｍｉｃ　ＥＴ　ｄｙｅ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｋｉｔ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を使用しＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法で行った。シークエンス反応物はＭａｇｎｅｔｉｃ　Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｂｅａｄｓ（Ｓｅｒａｄｙｎ社）を使用して精製し、ＭｅｇａＢａｃｅ１０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて電気泳動を行った。
得られたＧＰＣＲ２２２の全長をコードするｃＤＮＡの塩基配列（配列番号１５２）を、先に決定した同じくＧＰＣＲ２２２の全長をコードするｃＤＮＡの塩基配列（配列番号８８）と比較したところ、配列番号８８の９３６番目の塩基Ｔが、配列番号１５２においてはＣ（塩基番号９７３番目）であった。ダイレクトシークエンシングの結果であることからこの差異はＰＣＲ反応による増幅ミスではないと判断した。
【０２２３】
＜３−６＞　クローニング
上記で精製したＰＣＲ産物の末端をＴ４　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｋｉｎａｓｅ（ＴａＫａＲａ社）を用いてリン酸化し、ＴａＫａＲａ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２（ＴａＫａＲａ社）を用いてｐＥＮＴＲ１Ａ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）へブラントエンドライゲーションを行い挿入した。これを大腸菌ＤＨ５α株へ導入した。得られたクローンからマルチスクリーンプレート（ミリポア社）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。
【０２２４】
＜３−７＞　塩基配列の決定
上記で精製したプラスミドＤＮＡを鋳型とし、＜３−１＞で調製したシークエンスプライマー１０種類と２次ＰＣＲ用プライマー２種類を用いて配列解析を行った。配列決定はＤＹＥｎａｍｉｃ　ＥＴ　ｄｙｅ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｋｉｔ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を使用しＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法で行った。シークエンス反応物はＭａｇｎｅｔｉｃ　Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｂｅａｄｓ（Ｓｅｒａｄｙｎ社）を使用して精製し、ＭｅｇａＢａｃｅ１０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて電気泳動を行った。
クローニングされたＧＰＣＲ２２２の全長をコードするｃＤＮＡの塩基配列（配列番号１５２）は、上記＜３−５＞でのダイレクトシークエンスにより得た塩基配列と同じく、配列番号８８の塩基配列と比べ１塩基の差異が認められた一方、該１塩基の差異によるアミノ酸配列の変更はない。
このような数個の塩基配列の差異から、２つの遺伝子配列の少なくともいずれか一方が１塩基多型（ＳＮＰ）のような変異遺伝子配列である可能性が示唆される。
【０２２５】
【発明の効果】
本発明の蛋白質は、生体の生理学的機能を正常な維持並びに種々の病的状態の回避、排除のための生体機能の調節において極めて重要な役割を果たす、ホルモン、ホルモン様物質、神経伝達物質及び脂質などの多様な生体内リガンドの受容体となるＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）である。
本発明のＧＰＣＲは、それらをコードする遺伝子の発現（ｍＲＮＡの転写）の組織分布、並びに既知のＧＰＣＲとのアミノ酸配列相同性等の特徴から、例えば、炎症、癌、腸管疾患（潰瘍など）あるいは前立腺肥大症に限らず、種々の疾患の発症または抑制に関与していると考えられ、本発明のＧＰＣＲ及びそれをコードするＤＮＡは、そのような疾患治療のための医薬品開発のターゲットとなり得る。
【０２２６】
即ち、本発明のＧＰＣＲポリペプチド若しくはその一部（例えば、その細胞外領域または当該細胞外領域とヒト免疫グロブリン重鎖の定常領域とからなる融合ポリペプチド）；該ポリペプチドをコードするＤＮＡ若しくはその一部；該ＤＮＡを含む発現ベクター；該ベクターで形質転換された細胞；該ポリペプチド若しくはその一部に結合する抗体（好ましくはモノクローナル抗体）及び該抗体を産生する細胞等は、（１）そのような種々の疾患の予防または治療のための医薬品物質（候補物質を含む）を同定するためのツールまたは試薬として、さらに（２）該ＧＰＣＲの遺伝子発現若しくはＧＰＣＲの産生の程度を指標とした該疾患の状態を診断するためのツールまたは試薬として極めて有用である。
【０２２７】
当該ツール及び試薬を用いることにより、上述のような種々の疾患の発症の予防または治療が可能な物質（候補物質を含む）を選別、同定するための評価系及び方法を確立することが可能であり、さらにこの評価系及び方法を用いて選別、同定された物質は上記疾患の予防または治療のための医薬品として極めて有用である。
【０２２８】
また、本発明のＧＰＣＲポリペプチドの一部（例えば、その細胞外領域または当該細胞外領域とヒト免疫グロブリン重鎖の定常領域とからなる融合ポリペプチド）は、蛋白質製剤の活性成分として；該ポリペプチドをコードするＤＮＡ若しくはその一部は、遺伝子治療用の活性成分若しくはアンチセンス医薬品の活性成分として；該ＤＮＡを含む発現ベクターは、遺伝子治療用の活性成分として；該ベクターで形質転換された細胞は、細胞治療用の活性成分として；該ポリペプチド若しくはその一部に結合する抗体（好ましくはモノクローナル抗体）は、抗体医薬品の活性成分としても極めて有用であり、これらの活性成分を含む医薬品により、上述のような種々の疾患の発症の予防または治療が可能となる。
【０２２９】
【配列表】
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【０２３０】
「配列表フリーテキスト」
配列番号：３４
他の情報：人工配列についての記載：ヒト蛋白質の全長をコードする仮想ｃＤＮＡ。
配列番号：３５
他の情報：人工配列についての記載：ヒト蛋白質の全長をコードする仮想ｃＤＮＡ。
配列番号：４２
他の情報：人工配列についての記載：仮想ｃＤＮＡ。
配列番号：４８
他の情報：人工配列についての記載：ヒト蛋白質の全長をコードする仮想ｃＤＮＡ。
配列番号：４９
他の情報：人工配列についての記載：ヒト蛋白質の全長をコードする仮想ｃＤＮＡ。
配列番号：５９
他の情報：人工配列についての記載：仮想ｃＤＮＡ。
配列番号：６１
他の情報：人工配列についての記載：仮想ｃＤＮＡ。
配列番号：７５
他の情報：人工配列についての記載：仮想ｃＤＮＡ。
【０２３１】
【図面の簡単な説明】
【図１】各種ヒト組織及び細胞株でのＧＰＣＲ１８６のｍＲＮＡの発現の強さを相対的に示す図。
図の＋＋、＋、±及び−なる記号は各々下記を意味する。
＋＋　：　強く発現。
＋　　：　中程度に発現。
±　　：　弱く発現。
−　　：　発現なし。
【図２】各種ヒト組織及び細胞株でのＧＰＣＲ１８５のｍＲＮＡの発現の強さを相対的に示す図。
図の＋＋、＋、±及び−なる記号は各々下記を意味する。
＋＋　：　強く発現。
＋　　：　中程度に発現。
±　　：　弱く発現。
−　　：　発現なし。
【図３】各種ヒト組織及び細胞株でのＧＰＣＲ１８８のｍＲＮＡの発現の強さを相対的に示す図。
図の＋＋、＋、±及び−なる記号は各々下記を意味する。
＋＋　：　強く発現。
＋　　：　中程度に発現。
±　　：　弱く発現。
−　　：　発現なし。
【図４】各種ヒト組織及び細胞株でのＧＰＣＲ１８７のｍＲＮＡの発現の強さを相対的に示す図。
図の＋＋、＋、±及び−なる記号は各々下記を意味する。
＋＋　：　強く発現。
＋　　：　中程度に発現。
±　　：　弱く発現。
−　　：　発現なし。
【図５】各種ヒト組織及び細胞株でのＧＰＣＲ１８９のｍＲＮＡの発現の強さを相対的に示す図。
図の＋＋、＋、±及び−なる記号は各々下記を意味する。
＋＋　：　強く発現。
＋　　：　中程度に発現。
±　　：　弱く発現。
−　　：　発現なし。
【図６】各種ヒト組織及び細胞株でのＧＰＣＲ２２３のｍＲＮＡの発現の強さを相対的に示す図。
図の＋＋、＋、±及び−なる記号は各々下記を意味する。
＋＋　：　強く発現。
＋　　：　中程度に発現。
±　　：　弱く発現。
−　　：　発現なし。
【図７】各種ヒト組織及び細胞株でのＧＰＣＲ２２２のｍＲＮＡの発現の強さを相対的に示す図。
図の＋＋、＋、±及び−なる記号は各々下記を意味する。
＋＋　：　強く発現。
＋　　：　中程度に発現。
±　　：　弱く発現。
−　　：　発現なし。
【図１】
2004041172.tif 000155
【図２】
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【図３】
2004041172.tif 000157
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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