(57)【要約】【課題】複雑な解析を必要とせず、正確に遺伝子の配列を決定する方法を提供すること。【解決手段】該未知の塩基配列の予想される複数の塩基配列の各々に対して相補的な塩基配列を有する１番〜ｎ番（ｎ≧２）の複数種の一本鎖核酸プローブの各々が基体上に互いに隔離されるように配置されているプローブアレイを用意し、複数種の一本鎖核酸プローブ毎にその完全相補一本鎖核酸を反応させた際の蛍光量を測定して、所定の蛍光量の位置をポジティブとしたパターンを作成し、標的一本鎖で同様にして得られるパターンと一致するパターンに用いた完全相補一本鎖核酸の配列から標的一本鎖核酸の配列を特定する。【選択図】　　図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的一本鎖核酸の所定の部位の塩基配列を特定する方法であって、
（ａ）１番〜ｎ番（ｎ≧２）の複数種の一本鎖核酸プローブの各々が基板上に互いに隔離されるように配置されているプローブアレイを用意する工程；
（ｂ）該一本鎖核酸プローブの内の１つが有する塩基配列に対して完全相補的な塩基配列を有し、かつ蛍光標識が施された標識化一本鎖核酸を含む第１のサンプルと該プローブアレイとを互いに相補的な一本鎖核酸同士が二本鎖核酸を形成する条件下で反応させ、未反応の標識化一本鎖核酸を除去したのちに、該アレイから観察される蛍光強度を測定し、該プローブアレイ上の各々の１本鎖核酸プローブの位置とその蛍光特性との関係を示す第１のテンプレートパターンを得る工程；
（ｃ）他の一本鎖核酸プローブのそれぞれについて、該ステップ（ｂ）と同一の操作を行ない、該プローブアレイ上の各々の１本鎖核酸プローブの位置とその蛍光特性との関係を示す第２〜第ｎのテンプレートパターンを得る工程；
（ｄ）該プローブアレイと蛍光標識が施された前記標的一本鎖核酸を含む第２のサンプルとを該テンプレートパターンを得た条件と同じ条件下で反応させ、未反応の標識化一本鎖核酸を除去したのちに、該アレイから観察される蛍光強度を測定し、該プローブアレイ上の各々の１本鎖核酸プローブの位置とその蛍光特性との関係を示すサンプルパターンを得る工程；
（ｅ）該サンプルパターンを上記工程（ｂ）及び（ｃ）で得たｎ個のテンプレートパターンと対比し、該パターンと実質的に一致するテンプレートパターンがある場合に、そのテンプレートパターンの作成に用いた一本鎖核酸の塩基配列を該標的一本鎖核酸の所定の部位の塩基配列として特定する工程、を有することを特徴とする標的一本鎖核酸の所定の部位の塩基配列を特定する方法。
【請求項２】
前記テンプレートパターンおよび前記サンプルパターンは、蛍光像として得られる画像パターンである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２のサンプルは、異なる塩基配列を有する複数の標的一本鎖核酸を有し、前記（ｅ）工程において、前記複数の塩基配列を同時に判定する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該プローブアレイ上のプローブの長さが８ｍｅｒから３０ｍｅｒの長さである請求項１記載の方法。
【請求項５】
該プローブアレイ上のプローブの長さが１２ｍｅｒから２５ｍｅｒの長さである請求項４記載の方法。
【請求項６】
第１のテンプレートパターンを得るために１番目の塩基配列に対して完全相補的な塩基配列を有し、かつ蛍光標識を施された一本鎖核酸を含む第１のサンプル及び標的一本鎖核酸を含むサンプルとプローブアレイとを反応させる工程において、プローブアレイ基板をサンプルを含む溶液中で熱変性し、その後基板をサンプル溶液に浸したまま、二本鎖形成反応に適した温度に降下させてハイブリダイゼーションを行う工程を更に有する請求項１〜５のいずれかに記載の反応。
【請求項７】
プローブアレイ上のプローブの長さが１８ｍｅｒであり、熱変性を行う温度が７０℃以上であり、二本鎖形成反応を行う温度が４０℃以上であり、その時のサンプル溶液に１００ｍＭの食塩が含まれている請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＤＮＡ診断及び治療に使用されるＤＮＡチップを用いた核酸塩基配列を特定する方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
核酸等の物質の配列を決定し、或いはその配列をチェックする手法のひとつにＤＮＡアレイを利用する方法がある。ＵＳＰ５４４５９３４には、１インチ角に１０万個以上のオリゴヌクレオチドプローブを結合したＤＮＡアレイの開示がある。このようなＤＮＡアレイは、少量の検体で一度に多項目を検査できるという利点がある。このようなＤＮＡチップ上に、蛍光標識した検体を流すと、上記ＤＮＡチップ上のプローブと相補的な配列を有するＤＮＡ断片はプローブと結合し、その部分だけが蛍光により識別でき、ＤＮＡ試料中のＤＮＡ断片の配列を解明することができる。
【０００３】
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｂｙ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＳＢＨ）法は、このようなＤＮＡアレイを利用し塩基配列を調べる方法で、ＵＳＰ５２０２２３１にその詳細が記載されている。ＳＢＨ法では、ある長さについて可能なオリゴヌクレオチドの全配列を基板上に並べ、検体ＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応によって形成される完全に相補的なハイブリッド体を検出するもので、完全に相補的なハイブリッド体のセットを得れば、そのセットはある配列について１塩基ずつずれた配列の集合になるはずであり、それらを解析することにより判定を行うものである。
【０００４】
原理的には、検体ＤＮＡ中に、ある特定の配列があるかどうかを調べるためには、その配列と相補的な配列をプローブとしてハイブリダイゼーション反応を行って結合の有無を調べることとなる。しかし、実際には、１種類のプローブでハイブリッドの有無を調べ、それを基にひとつの検査項目として判定することは非常に難しい。なぜなら、完全に相補的なハイブリッド体を比べると、ハイブリッド体由来の蛍光はそれぞれの配列により強度が異なる。特に、塩基配列中のＧＣ含量はハイブリッド体の安定性に大きな影響を与える。しかも、完全に相補的ではなく１塩基のミスマッチを含む配列でも、ハイブリッド体を形成し、蛍光を発する。そのハイブリッド体は、同じ配列間で比較すると、完全マッチのものより安定性が低く蛍光は弱くなるが、完全に相補的な他のハイブリッド体よりも蛍光強度が高いということはよく見られる現象である。また、１塩基ミスマッチとはいっても、ハイブリッド体のどの位置にミスマッチを含むかによってその安定性は大きく変化する。末端にミスマッチを含む場合には、比較的安定なハイブリッド体が得られるが、ハイブリッド体の真ん中に含む場合には相補鎖の連続部分が分割されるために不安定になる。このように、ハイブリッド体の安定性に関してはいろいろな要因が絡み合い、完全に相補的か否かを判定する蛍光強度の絶対値（基準値）というのが得られないのが現状である。また、１塩基ミスマッチを完全に排除し、完全マッチからのみの蛍光を検出しうる条件というものも得られていないといえる。
【０００５】
配列によるハイブリッド体の安定性の違いを解消するための工夫として、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　Ｖｏｌ．８２，　ｐｐ１５８５−１５８８　（１９８５）にはｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅを用いる方法が記載されている。しかし、上記問題点を完全に解消するには至っていない。
【０００６】
そこで、完全マッチか否かを判定する方法として、Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｖｏｌ．２７４　ｐ６１０−６１４，　１９９６には１５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドのプローブ配列の真ん中に１塩基ミスマッチを配した配列を用意し、完全マッチと１塩基ミスマッチとのハイブリッド由来の蛍光強度を比較し、完全マッチの方が強度が強いときにポジティブと判定するような方法が記載されている。
【０００７】
さらに、ＵＳＰ５７３３７２９には上記方法に加えてより正確な判定を行うための方法として、コンピューターを用いて、得られたハイブリッド体の蛍光強度の比較から検体の塩基配列を知るための方法が開示されている。
【０００８】
これらの方法では、調べたい位置の核酸塩基部分をプローブの真ん中に設定し、その位置に必ず４種類のヌクレオチドセットを用意すること、及びそのようなプローブのセットを１塩基ずつずれた配列について用意することが必要とされる。そして上述のような１５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを用い、真ん中に１塩基ミスマッチを有する他の３種類のプローブとの比較を行って完全マッチか否かを判定するという方法で、それぞれの安定性を、理論的に或いは経験的に評価し、より精度を得ることができるとされている。また、調べたい領域の塩基の長さがＬであれば、プローブ数は４×Ｌ（５塩基であれば２０種）になる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
上記のミスマッチを利用する方法は同じ配列の同じ位置の１塩基ミスマッチとの比較を行うことで判定が比較的容易である点、及びプローブ数が少なくて良い（ＳＢＨでは同様な解析に１０２４種のプローブが必要）点において優れた方法ではあるが、同じ領域に２塩基ミスマッチがある場合、或いは、塩基の欠損、挿入がある場合には正確な情報が得られないという重大な欠点がある。
【００１０】
一方、ＳＢＨ法は、上記問題点を解決し、原理的にはどのような変異にも対応可能な方法ではあるが、その判定はかなり難しい。それは、ある配列の完全マッチよりも別の配列の１塩基ミスマッチの方が強度が強いことや、１塩基ミスマッチとはいっても、配列中のどの位置にミスマッチがあるかによって、そのハイブリッド体の安定性が大きく異なることによる。その結果、完全マッチ、１塩基ミスマッチ、２塩基ミスマッチ（連続、不連続）は蛍光強度から単純に判断することはできず、理論的な予測、各種配列との比較、経験的なパラメーターの蓄積といった複雑な解析を必要とする。
【００１１】
さらに、ひとつひとつのプローブに関してそのハイブリッド体の強度を計測し、その値を解析して遺伝子配列を決定、判定するためには、アレイを読みとる検出装置の他に大がかりなコンピューター装置を必要とし、ＤＮＡアレイを利用した簡便な遺伝子診断を行う上で大きな障害となる。
【００１２】
このような問題点に鑑み、本発明では、複雑な解析を必要とせず、正確に遺伝子の配列を決定する方法を提供する。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
上述のように、ハイブリッド体の強度は種々の要因によって支配されており、１５ｍｅｒから２０ｍｅｒ程度の長さのプローブを用いた場合に、１塩基ミスマッチを有するハイブリッド体の蛍光強度を完全に除くことは事実上困難である。それに対し、２塩基ミスマッチを有する配列は、２塩基ミスマッチの位置、連続、不連続にかかわらず、ハイブリッド体の形成を抑制する条件を得ることが比較的容易である。
【００１４】
本発明は、このような発見に基づいてなされたものであって、完全マッチ配列のスポットに加えて、所定のミスマッチ数、例えば１塩基ミスマッチの配列を有するハイブリッド体のスポットも、ポジティブと見なす点にひとつの特徴を有する。
【００１５】
つまり、本発明の一実施態様にかかる標的一本鎖核酸の、所定の部位の、未知の塩基配列を特定する方法は、
（ａ）該未知の塩基配列の予想される複数の塩基配列の各々に対して相補的な塩基配列を有する１番〜ｎ番（ｎ≧２）の複数種の一本鎖核酸プローブの各々が基体上に互いに隔離されるように配置されているプローブアレイを用意する工程；
（ｂ）該一本鎖核酸プローブの内の１つが有する塩基配列に対して完全相補的な塩基配列を有し、かつ蛍光標識が施された標識化一本鎖核酸を含む第１のサンプルと該プローブアレイとを互いに相補的な一本鎖核酸同士が二本鎖核酸を形成する条件下で反応させ、未反応の標識化一本鎖核酸を除去したのちに、該アレイから観察される蛍光強度を該プローブアレイ上の各々の一本鎖核酸プローブについて測定し、該プローブアレイ上の各々の１本鎖核酸プローブの位置とその蛍光特性との関係を示す第１のテンプレートパターンを得る工程；
（ｃ）他の全ての一本鎖核酸プローブのそれぞれについて、該ステップ（ｂ）と同一の操作を行ない、該プローブアレイ上の１本鎖核酸プローブが各々の塩基配列に対して完全相補的な一本鎖核酸と二本鎖核酸を形成したときの該プローブアレイ上の各々の１本鎖核酸プローブの位置とその蛍光特性との関係を示す第２〜第ｎのテンプレートパターンを得る工程；
（ｄ）該プローブアレイと該標的一本鎖核酸を含む第２のサンプルとを該テンプレートパターンを得た条件と同じ条件の下で反応させ、次いで蛍光の有無及び強度を該プローブアレイ上の各々の塩基配列の一本鎖核酸プローブについて測定し、該プローブアレイ上の各々の１本鎖核酸プローブの位置とその蛍光特性との関係を示すサンプルパターンを得る工程；
（ｅ）該サンプルパターンを上記工程（ｂ）及び（ｃ）で得たｎ個のテンプレートパターンと対比し、該パターンと実質的に一致するテンプレートパターンがある場合に、そのテンプレートパターンの作成に用いた一本鎖核酸の塩基配列を該標的一本鎖核酸の、未知の塩基配列として特定する工程、
を有することを特徴とするものである。
【００１６】
また、本発明の他の実施態様は、例えば１塩基ミスマッチと２塩基ミスマッチハイブリッド体の蛍光強度との間にしきい値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を設け、ポジティブとネガティブに区別する点にひとつの特徴を有する。係る他の実施態様は、標的一本鎖核酸の所定の部位の、未知の塩基配列を特定する方法であって、
（ａ）該未知の塩基配列の予想される複数の塩基配列の各々に対して相補的な塩基配列を有する１番〜ｎ番（ｎ≧２）の複数種の一本鎖核酸プローブの各々が基体上に互いに隔離されるように配置されているプローブアレイを用意する工程；
（ｂ）該一本鎖核酸プローブの内の１番目の塩基配列に対して完全相補的な塩基配列を有し、かつ標識が施された一本鎖核酸を含む第１のサンプルと該プローブアレイとを互いに相補的な一本鎖核酸同士が二本鎖核酸を形成する条件下で反応させ、観察される蛍光を該プローブアレイ上の各々の塩基配列の一本鎖核酸プローブについて測定し、該プローブアレイ上の各々の１本鎖核酸プローブの位置とその蛍光特性との関係を示すテンプレートパターンＩを得る工程；
（ｃ）得られた第１のテンプレートパターンを解析し、各位置のプローブとミスマッチ塩基対数（ｉ）を有する二本鎖核酸の蛍光量の平均値（Ｆｉ）を算出する工程；
（ｄ）ミスマッチのない完全相補的な二本鎖核酸の蛍光量（Ｆ０）と、１塩基ミスマッチを有する二本鎖核酸の蛍光量の平均値（Ｆ１）との差（Ｆ１，０）を求め、さらに、（ｉ＋１）塩基ミスマッチを有する二本鎖核酸の蛍光量（Ｆｉ＋１）とｉ塩基ミスマッチの蛍光量（Ｆｉ）の差（Ｆｉ＋１，ｉ）を求め、Ｆｉ，　ｉ＋１　＜＜　Ｆｉ−１，　ｉとなるようなｉを設定する工程；
（ｅ）第２番目のプローブの塩基配列に対して、ミスマッチ塩基対の数がｉ以下になる塩基配列を有する一本鎖核酸プローブの基体上の位置をポジティブとし、ｉ＋１以上のミスマッチを有する塩基配列のプローブの基体上の位置をネガティブとし、ポジティブの位置が形成するテンプレートパターンＩＩを得る工程；
（ｆ）（ｅ）と同一の操作を他のすべての一本鎖核酸プローブについて行い、ミスマッチ塩基対の数がｉ以下になる塩基配列を有する一本鎖核酸プローブの基体上の位置が形成するテンプレートパターンＩＩＩ〜ｎを得る工程；
（ｇ）該プローブアレイと該標的一本鎖核酸を含むサンプルとを該第１のテンプレートパターンを得た条件と同じ条件の下で反応させ、蛍光の有無及び強度を該プローブアレイ上の各々の塩基配列の一本鎖核酸プローブについて測定し、該プローブアレイ上の各々の１本鎖核酸プローブの位置とその蛍光特性との関係を示すパターンを得る工程；
（ｈ）該パターンを上記工程（ｂ）（ｅ）及び（ｆ）で得たｎ個のテンプレートパターンと対比し、該パターンと実質的に一致するテンプレートパターンがある場合に、そのテンプレートパターンに対応する一本鎖核酸の塩基配列を該標的一本鎖核酸の、未知の塩基配列として特定する工程、
を有することを特徴とするものである。
【００１７】
そしてこのような態様を採用することで、上記ポジティブと区別されたスポットが基板上で形成するパターンを画像として得、それを予想パターンと比較することによりその配列を解析することができ、未知の遺伝子配列を容易に特定することができる。
【００１８】
また、本発明においては、さらにこのような１塩基ミスマッチと２塩基ミスマッチを完全に区別するためのハイブリダイゼーション反応条件を提示する。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下本発明について具体的に説明する。
（蛍光像による判定）
本発明の一実施態様では、ミスマッチを起こす可能性のある核酸塩基が近接して存在する場合に特に有効である。ここでは、癌抑制遺伝子ｐ５３の２３８番目、２３９番目のアミノ酸配列に対応する塩基配列を含む５’ＧＡＴＧＧＧＮＣＴＣＮＮＧＴＴＣＡＴ３’を例として説明する。上記例は、発明の概要を説明するためのひとつの形態であり、いかなる形態のアレイにおいても、本発明は画像として処理するという点では同様な概念を提示しており、何らアレイの形態、プローブの配置を限定するものではない。また、当然のことながら、ＳＢＨ法も本発明の解析対象である。
【００２０】
上記例において、Ｎで記した各塩基部分を４種の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）に置き換えたプローブの完全セットを用意した場合、つまり、３カ所（連続している必要はない）の塩基について調べる場合には、４３＝６４種の、５カ所の場合には４５＝１０２４種のプローブが基板上に並ぶ。
【００２１】
６４種のプローブを用いた場合の配置例を図１に示す。
【００２２】
６４種プローブアレイを４分割した左上の領域には、最初のＮがＡであるプローブ（プローブ番号１〜１６）が配置され、左下にはＧであるようなプローブ（プローブ番号１７〜３２）が配置される。同様に、右上はＣ（プローブ番号３３〜４８）、右下はＴ（プローブ番号４９〜６４）となる。各領域の中で、２番目のＮがＡであるようなプローブは左から数えて１列目、Ｇは２列目、Ｃは３列目、そしてＴは４列目に位置する。また、３番目のＮがＡであるようなプローブは上から数えて１行目、Ｇであるような配列は２行目、同様にＣが３行目、Ｔが４行目に配置される。その結果、例えば、５’ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＡＡＧＴＴＣＡＴ３’といった配列は最も左上のスポットに対応する。また、正常な遺伝子に相当する配列である５’ＡＴＧＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＣＡＴＣ３’は、右から３列目、上から３行目の位置にあるプローブＤＮＡ５’ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＡＴ３’とハイブリッドを形成することが期待される。
【００２３】
以下、１塩基ミスマッチをポジティブスポットとして扱う場合について説明する。この場合に、完全マッチ配列が４２番のプローブ（正常遺伝子）であるとすると、ポジティブと判断される１塩基ミスマッチ配列は、塗りつぶされた９カ所となり、完全マッチと合わせて図２に示されるようなパターンを形成することが予想される。
【００２４】
これに対し、標的核酸の特定すべき配列に対する変異配列では例えば図３に示すようなパターンの変化が見られる。
【００２５】
本発明では、このような完全マッチと１塩基ミスマッチからなる予想される蛍光パターン像を予めコンピュータ等の記憶装置に入力しておき、所定の方法で得られる蛍光像との比較により判定を行う。この時、それぞれのポジティブスポットの蛍光強度の詳細な定量データは必要ない。単にあるしきい値に対するポジティブ、ネガティブの判定のみで良く、簡便かつコンピュータ等を使用した自動化された判定が可能となる。
【００２６】
（しきい値の設定）
１８ｍｅｒ程度のプローブを用いる場合には、そのしきい値を通常１塩基ミスマッチの蛍光強度と２塩基ミスマッチによる蛍光強度との間に設定するのが好ましい。蛍光強度はそれぞれの配列組成、反応条件により異なるが、最も高い蛍光強度（通常は完全マッチのもの）の５０％から２５％の値、より好適には３０％から２０％をしきい値として設定すると良い。プローブ長が短い場合には、しきい値はさらに低くなる。
【００２７】
３塩基ミスマッチを含むものは最大値の１割以下の蛍光量であり、完全に区別できる。
【００２８】
しきい値を最大蛍光量の１／４に設定した場合、完全マッチ配列及び１塩基ミスマッチ配列を４，２塩基ミスマッチ配列を１、３塩基ミスマッチ配列を０として蛍光強度の分布を予想すると図４のようになる。
【００２９】
より具体的な判定方法について上記例について説明する。
【００３０】
ハイブリダイゼーション反応が極めて選択的に進行した場合には、強い蛍光は１点（完全マッチ）に集中する。次に感度を徐々に上げると、上記配置例では図３から予想されるように、１塩基ミスマッチは完全マッチを中心に縦横のライン状に並ぶはずである。しかし、実際の蛍光像は必ずしも強いスポットを中心に縦横それぞれ３個ずつライン状に並ぶとは限らない。１塩基ミスマッチ間の安定性の違いにより、６個がすべて同じ程度の強度を有するとは限らないため、検出されないスポットもあるが、少なくともこれらのライン状にいくつかスポットが見えるはずである。その時、残る３個の１塩基ミスマッチも予想される位置に強度の濃淡はあるものの検出できる。
【００３１】
また時には、完全マッチと１塩基ミスマッチが同程度の蛍光強度を与え、最初から完全マッチと１塩基ミスマッチとの１０スポットからなる予想される像に近い画像が得られる。
【００３２】
２塩基ミスマッチは、時としてしきい値を越える場合があるが、そのような場合でも、予想パターンからのずれとして容易に判別できる。
【００３３】
このように予想パターンと実際に得られる蛍光像との比較により判定する本発明の方法は、検体遺伝子中の変異の有無を容易に判定でき、さらにどの塩基（複数でも可）が何に変異しているか変異の内容を同時に判定が可能であるという特徴を持つ。
【００３４】
また、６４種のプローブによるハイブリダイゼーション反応の結果を、パターンで評価するという考えは、１スポットのみで判断する場合に比べ、より確実な判断という点で有利である。６４種のＤＮＡプローブとのハイブリッドは、それぞれの配列により熱安定性が異なるため、必ずしも完全マッチの場合が圧倒的に安定で強い蛍光を発するという保証はない。また、基板上のゴミやハイブリダイゼーション反応時のアーティファクトといったことが原因で、どれが最強のスポットで完全マッチのスポットであるか判断できないことも多い。その点パターンでの判定は、多少の蛍光量のばらつきがあってもそれを補える。
【００３５】
（プローブ長）
本発明に用いられるプローブ長は８ｍｅｒから３０ｍｅｒ程度、より好ましくは、１２ｍｅｒから２５ｍｅｒである。８ｍｅｒ以下では１塩基ミスマッチを有するハイブリッド体の安定性は低く、完全マッチ由来の蛍光量の方が優位である。また、３０ｍｅｒより長いプローブでは２塩基ミスマッチ体の蛍光が、場合によっては（例えば、両末端にミスマッチ箇所が存在する場合）１塩基ミスマッチよりも強くなる。
【００３６】
（ハイブリダイゼーション反応条件）
上記良好なしきい値を与えるハイブリダイゼーション反応の条件としては、基板全体を検体溶液中に浸したまま加熱し、基板上のＤＮＡプローブと検体ＤＮＡの双方を同時に熱変性し、その後徐々に冷却してやや高めの温度でハイブリダイゼーション反応を行う。反応時の塩濃度は１００ｍＭ以下が望ましい。
【００３７】
熱変性を行うための温度としては、６０℃以上、好ましくは８０℃以上が適当である。熱変性のための温度の設定は、ＤＮＡアレイ基板自体の安定性、検体の長さ、濃度、標識化合物の種類に依存して決められる。例えば、樹脂を塗布しその樹脂とＤＮＡとを反応させて結合したような基板では、高温にすることにより、樹脂層が破壊されることがある。それに対し、シランカップリング剤を作製過程で用いた基板は、熱に対し比較的安定であり、さらに高温にすることができる。検体ＤＮＡが一本鎖の場合には、７０℃以上で分子内二本鎖構造はほぼ解消されると考えられるが、二本鎖の場合或いは検体ＤＮＡが長い一本鎖ＤＮＡの場合には、さらに温度を上げたり、ホルムアミド等の変性剤を加えて一本鎖への解離を促進する必要がある。熱変性に要する時間は１０分以上、好ましくは３０分程度が良い。
【００３８】
ハイブリダイゼーション反応の条件は、プローブ長、配列、検体の種類を考慮し、常法に従い温度や塩濃度を変えることによって行われる。本発明のような、極めて類似した配列を区別して認識するための条件として好適に用いられるのは、食塩１００ｍＭを含む溶液中、４５℃で３時間以上である。しかし、反応時間は検体濃度により大きな影響を受け、上記反応条件に限らない。高濃度の検体ならば３時間以内で充分判定が可能であり、また、検体溶液が希薄であれば、１０時間以上の反応時間が必要である。ホルムアミドを加える場合には食塩濃度を高める必要がある。
（ＤＮＡアレイ基板の製法）
本ハイブリダイゼーション反応を良好に進めうるＤＮＡアレイの作製方法として、以下にその例を示す。しかし、本発明の趣旨は、基板上のハイブリダイゼーションパターンを評価し、検体の塩基配列を決めるための簡便な方法を示すことであり、基本的に、基板の作製方法にはこだわらない。
【００３９】
ＤＮＡアレイでは、ＤＮＡプローブを基板表面にある官能基との反応により共有結合により固定する。該官能基とＤＮＡとの結合様式として、例えば、ガラス表面のマレイミド基とＤＮＡ末端のＳＨ基との結合反応を行わせる方法について示す。
【００４０】
マレイミド基の導入方法としては、まず、ガラス基板にアミノシランカップリング剤を反応させ、次にそのアミノ基とＥＭＣＳ試薬（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：Ｄｏｊｉｎ社製）との反応によりマレイミド基を導入する。ＤＮＡへのＳＨ基の導入は、ＤＮＡ自動合成機上５’−Ｔｈｉｏｌ−ＭｏｄｉｆｉｅｒＣ６（Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いる事により行うことができる。
【００４１】
該ＤＮＡ溶液をインクジェット法により基板上にスポットを形成させ、該ＤＮＡ基板上のマレイミド基とＤＮＡ末端のＳＨ基との反応により、プローブＤＮＡを固定化する。
【００４２】
インクジェット法によるマレイミド基を有するガラス基板への吐出に適したＤＮＡ溶液としては、グリセリン、尿素、チオジグリコール又はエチレングリコール、アセチレノールＥＨ（川村ファインケミカル社製）、イソプロピルアルコールを含む溶液が好ましい。特にグリセリン７．５％、尿素７．５％、チオジグリコール７．５％、アセチレノールＥＨ１％（いずれも質量％）を含む溶液が好ましい。
【００４３】
ＤＮＡが結合したアレイ基板は、２％ウシ血清アルブミン水溶液中に２時間浸し、ブロッキング反応を行った後、ハイブリダイゼーション反応に用いられる。
【００４４】
【実施例】
以下に実施例により、より詳細に説明する。
（実施例１：パターン認識　Ｉ）
１．プローブの設計
癌抑制遺伝子であるｐ５３遺伝子の２４８番目、２４９番目のアミノ酸配列に対応する塩基配列ＣＧＧＡＧＧの中での変異の中で頻度が高いのは、１番目のＣがＴに、２番目のＡがＧに、そして２４９番目のアミノ酸３番目のＧがＴに変異している場合であることが知られている。そこで、この３カ所の塩基配列に着目して６４種のプローブを設計した。
【００４５】
つまり、プローブ全長を１８ｍｅｒとし、その真ん中にこの変異を含む６塩基を位置させ、その前後を共通配列で挟んだ構造で、５’ＡＴＧＡＡＣＮＮＧＡＧＮＣＣＣＡＴＣ３’である。ここで、Ｎと表した部分が４種の核酸塩基であるＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔに対応する。プローブＤＮＡは、検出したい配列（上記配列）と相補的な配列であるので、実際には、５’ＧＡＴＧＧＧＮＣＴＣＮＮＧＴＴＣＡＴ３’となる。
【００４６】
図１には６４種ＤＮＡプローブのＤＮＡアレイ上での配置図を示した。各配列（配列番号：１〜６４）を具体的に表１に示す。
【００４７】
【表１】
2004041198.tif 000003
正常な遺伝子に相当する配列である５’ＡＴＧＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＣＡＴＣ３’は、右から３列目、上から３行目の位置にある４２番のプローブＤＮＡ５’ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＡＴ３’とハイブリッドを形成することが期待される。
【００４８】
６４種の実験でも、完全マッチ以外に１塩基ミスマッチのハイブリッド体からの蛍光が予想される。完全マッチと１塩基ミスマッチとからなる予想される蛍光パターンを図２に示す。
【００４９】
２．マレイミド基導入基板の作製
（基板洗浄）
１インチ角のガラス板をラックに入れ、超音波洗浄用洗剤に一晩浸した。その後、洗剤中で２０分間超音波洗浄を行い、その後、水洗により洗剤を除去した。蒸留水ですすいだ後、蒸留水のはいった容器中でさらに超音波処理を２０分間行った。次に、あらかじめ加温してあった１Ｎ水酸化ナトリウム溶液に１０分間浸した。引き続き水洗、蒸留水洗浄を行った。
【００５０】
（表面処理）
１％シランカップリング剤水溶液（信越化学工業社製、商品名ＫＢＭ６０３）に室温で２０分浸し、その後、窒素ガスを両面に吹き付けて、水分を飛ばし、乾燥させた。１２０℃に加熱したオーブンで１時間ベークしシランカップリング処理を完結させた。続いて、ＥＭＣＳ（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：Ｄｏｊｉｎ社製）を２．７ｍｇ秤量し、ＤＭＳＯ／エタノールの１：１溶液に溶解した（最終濃度　０．３ｍｇ／ｍｌ）。シランカップリング剤処理を行ったガラス基板をこのＥＭＣＳ溶液に２時間浸し、シランカップリング剤のアミノ基とＥＭＣＳ溶液のカルボキシル基を反応させた。この状態でガラス表面にはＥＭＣＳ由来のマレイミド基が表面に存在することになる。ＥＭＣＳ溶液と反応させたガラス板は蒸留水で洗浄後、窒素ガスで乾燥させ、ＤＮＡとの結合反応に用いられる。
３．ＤＮＡの基板への結合反応
（６４種ＤＮＡプローブの合成）
５’末端にＳＨ基（チオール基）を有する上記６４種のプローブＤＮＡは、（株）ベックスに依頼し合成した。
（ＤＮＡプローブの吐出）
上記６４種のＤＮＡそれぞれ用いて以下の吐出操作を行なった。各ＤＮＡを水に溶解し、ＳＧクリア（グリセリン７．５％、尿素７．５％、チオジグリコール７．５％、アセチレノールＥＨ１％を含む水溶液）を用いて最終濃度８μＭになるよう希釈した。少量のサンプルが吐出できるように改造したＢＪプリンター用ヘッドＢＣ６２（キヤノン社製）のノズルにこのＤＮＡの溶液を１００μｌ充填した。各ヘッドあたり６種のＤＮＡが吐出できるようにして２つヘッドを用い、一度に１２種のＤＮＡを吐出し、ヘッドを６回交換して、６４種のＤＮＡのそれぞれのスポットが独立して形成されるように吐出させた。
【００５１】
各プローブを、スポット径が７０μｍ、ピッチが２００μｍとなるように設定し、８×８のマトリクス状に６４種を並べてスポッティングした。その後、３０分加湿チャンバー中に放置し、プローブＤＮＡを基板に結合させる反応を行った。
・ハイブリダイゼーション反応
（ブロッキング反応）
反応終了後、１ＭＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液にて基板を洗い、ガラス表面のＤＮＡ溶液を完全に洗い流した。その後、２％ウシ血清アルブミン水溶液中に浸し、２時間放置し、ブロッキング反応を行った。
（モデル検体ＤＮＡの合成）
ｐ５３遺伝子の正常な配列を持ち、プローブＤＮＡと同じ領域で同じ長さの標識ＤＮＡＮｏ．１を作製した。配列は下に示す通りで、５’末端にはローダミンを結合してある。
【００５２】
Ｎｏ．１：５’Ｒｈｏ−ＡＴＧＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＣＡＴＣ３’
（ハイブリダイゼーション反応条件）
ＤＮＡアレイ基板の入ったハイブリダイゼーション反応用の袋に１００ｍＭ　ＮａＣｌを含む１０ｎＭモデル検体ＤＮＡ溶液を２ｍｌ入れ、最初に８０℃で１０分加熱後、インキュベーターの温度を４５℃に下げ、そのまま１５時間反応させた。
５．検出
（方法）
検出は、蛍光顕微鏡（ニコン社製）に画像解析処理装置ＡＲＧＵＳ（浜松ホトニクス社製）を接続して行った。
（結果）
モデル系である１８ｍｅｒの標識ＤＮＡ　Ｎｏ．１とのハイブリダイゼーション反応の結果得られた蛍光量を、図４に示す。蛍光量の最大値は完全に相補的である４２番のプローブである。その蛍光量を最大値（１００％）として、その２０％にしきい値を設け、それ以上のところを黒く塗りつぶしてある。
【００５３】
Ｎｏ１０，２６，５８の部分のスポットも蛍光をもち、予想パターン図２と良く一致していることがわかる。更にしきい値を下げることにより、予想パターンと一致する。つまり、上記３スポットに加え、完全マッチを中心に１塩基ミスマッチ配列の部分が縦横のラインに並ぶ。
【００５４】
（実施例２：パターン認識ＩＩ）
実施例と同様に６４種のプローブからなるＤＮＡアレイ基板を作製し、モデル検体としてＮｏ．２の配列を持つローダミン標識ＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応を行った。Ｎｏ．２の配列は図１のＮｏ．４６プローブと相補的である。
【００５５】
Ｎｏ．２：５’Ｒｈｏ−ＡＴＧＡＡＣＣＡＧＡＧＧＣＣＣＡＴＣ３’
ハイブリダイゼーション反応条件も実施例１と同様である。
【００５６】
実施例１と同様、予想されるパターンを求めたのが、図５である。それに対し、得られた結果を図６に示す。しきい値を最大値の１０％に設定してハイブリダイゼーション反応の結果を黒ぬりで示す。予想との対応がよい。
【００５７】
（実施例３：パターン認識　ＩＩＩ）
実施例２と同じモデル検体ＤＮＡを用いて実施例２と同様な実験を行った。但し、ハイブリダイゼーション反応に用いる検体ＤＮＡ濃度を５ｎＭとし、４０℃で一晩反応させた。得られた結果を図７に示す。
【００５８】
しきい値を５０％にすると、１塩基ミスマッチの３４及び６２番のプローブの位置（斜線部）に蛍光が現れ、さらに３０％にまでしきい値を下げると、予想パターンに合う結果となる。この場合、ＮＯ．６と２２の２塩基ミスマッチも検出されるが、１塩基ミスマッチが構成するパターンからのずれとして、２塩基ミスマッチであることが判別でき、完全マッチのスポットが４６番であることが判定可能である。
【００５９】
【発明の効果】
このように、単にハイブリッドの有無のみで判定する従来の方法に比べ、本発明の方法はさらに１塩基ミスマッチの蛍光量を考慮に入れることにより精度の良い検出が可能となった。
【００６０】
ＤＮＡプローブとのハイブリッドは、それぞれの配列により熱安定性が異なるため、必ずしも完全マッチの場合が圧倒的に安定で強い蛍光を発するという保証はない。パターンでの判定は、１スポットのみで判断する場合に比べ、より確実な判断という点で有利である。
【００６１】
基板上のゴミやハイブリダイゼーション反応時のアーティファクトといったことが原因で、どれが最強のスポットで完全マッチのスポットであるか判断できないことも多い。その点、本発明におけるパターンでの判定は、多少の蛍光量のばらつきがあってもそれを補えることが可能となる。
【００６２】
従って、本発明によって、遺伝子の変異を、簡便かつ効率的にスクリーニングできる検査方法を提供することができる。
【００６３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】６４種のプローブを用いた場合の配置例を示す。
【図２】標的核酸の配列に対して基板上のポジティブと判断される領域の配置のパターンを示す図である。
【図３】標的核酸に対する変異配列において基板上でポジティブと判断される領域の配置のパターンを示す図である。
【図４】実施例１で得られた蛍光量のパターンを示す図である。
【図５】実施例２において予想されるパターンを示す図である。
【図６】実施例２で得られた蛍光量のしきい値１０％でのパターンを示す図である。
【図７】実施例３で得られた蛍光量のパターンを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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