(57)【要約】【課題】細胞毒性を抑制する蛋白質および該蛋白質をコードする遺伝子の提供。【解決手段】ホメオボックスを含む蛋白質が細胞毒性を抑制する作用を示すことを見出した。ホメオボックス蛋白質であるヒトＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２は、アルツハイマー病を引き起こす変異アミロイド前駆蛋白質（ＡＰＰ）またはプレセニリンの変異体による細胞毒性を有意に抑制した。ホメオボックスドメインだけで、この細胞保護作用を発揮するのに十分であった。さらに、Ｇｔｘ／Ｎｋｘ６．２以外のホメオボックス含有蛋白質でも同様の細胞毒性に対する抑制活性が観察された。ホメオボックス含有蛋白質およびその遺伝子は、アルツハイマー病などの細胞毒性を伴う疾患に対する医薬として、また新たな医薬開発のためのツールとして有用である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホメオボックスを含む蛋白質または該蛋白質を発現するベクターを有効成分とする、細胞毒性の阻害剤。
【請求項２】
配列番号：４または１０に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質または該蛋白質と機能的に同等の蛋白質、あるいは該蛋白質または該蛋白質と機能的に同等の蛋白質を発現するベクターを有効成分とする、請求項１に記載の細胞毒性の阻害剤。
【請求項３】
ホメオボックスを含む蛋白質または該蛋白質を発現するベクター、ならびに薬学的に許容される担体を含む、細胞毒性を伴う疾患の治療または予防に用いられる医薬組成物。
【請求項４】
疾患がアルツハイマー病である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ホメオボックスを含む蛋白質を細胞に導入または発現させる工程を含む、細胞毒性を抑制する方法。
【請求項６】
細胞毒性がアルツハイマー病に伴う細胞毒性である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ホメオボックスを含む蛋白質の細胞毒性に対する抑制活性を検出する方法であって、
（ａ）該蛋白質の存在下、細胞において細胞毒性を誘導する工程、
（ｂ）該細胞の細胞毒性を検出する工程、
（ｃ）該蛋白質の非存在下または工程（ａ）に比べ低用量の存在下において検出される該細胞の細胞毒性と比べた時の工程（ｂ）で検出される細胞毒性の低下を、細胞毒性に対する該蛋白質の抑制活性と関連付ける工程、を含む方法。
【請求項８】
細胞毒性を、ＡＰＰ変異体またはＰＳ２変異体の発現により誘導する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ホメオボックスを含む蛋白質の細胞毒性に対する抑制活性に及ぼす被検化合物の効果を検出する方法であって、
（ａ）該被検化合物および該蛋白質の存在下、細胞において細胞毒性を誘導する工程、
（ｂ）該細胞の細胞毒性を検出する工程、
（ｃ）該被検化合物の非存在下または工程（ａ）に比べ低用量の存在下において検出される該細胞の細胞毒性と比べた時の工程（ｂ）で検出される細胞毒性の低下および上昇を、それぞれ細胞毒性に対する該蛋白質の抑制活性に及ぼす該被検化合物の促進および抑制効果と関連付ける工程、を含む方法。
【請求項１０】
ホメオボックスを含む蛋白質の細胞毒性に対する抑制活性を調節する化合物を選択する方法であって、
（ａ）該被検化合物および該蛋白質の存在下、細胞において細胞毒性を誘導する工程、
（ｂ）該細胞の細胞毒性を検出する工程、
（ｃ）該被検化合物の非存在下または工程（ａ）に比べ低用量の存在下において検出される該細胞の細胞毒性と比べ、工程（ｂ）で検出される細胞毒性を低下または上昇させる化合物を選択する工程を含む方法。
【請求項１１】
ホメオボックスを含む蛋白質の細胞毒性に対する抑制活性を調節する化合物を選択する方法であって、
（ａ）被検化合物および該蛋白質を接触させる工程、
（ｂ）該被検化合物および該蛋白質の結合を検出する工程、および
（ｃ）該蛋白質に結合する化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項１２】
ホメオボックスを含む蛋白質の細胞毒性に対する抑制活性を調節する化合物を選択する方法であって、
（ａ）被検化合物の存在下、該蛋白質をコードする遺伝子を内因的に保持する細胞における該遺伝子の発現を検出する工程、
（ｂ）該被検化合物の非存在下または工程（ａ）に比べ低用量の存在下において検出される該遺伝子の発現と比べ、工程（ａ）で検出される発現を上昇または低下させる化合物を選択する工程を含む方法。
【請求項１３】
請求項１０から１２のいずれかに記載の方法により選択されうる化合物を有効成分とする細胞毒性の阻害剤。
【請求項１４】
請求項１０から１２のいずれかに記載の方法により選択されうる化合物を投与する工程を含む、細胞毒性を抑制する方法。
【請求項１５】
細胞毒性がアルツハイマー病に伴う細胞毒性である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ホメオボックスを含む蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖の少なくとも１５ヌクレオチド以上を含むポリヌクレオチド、または該蛋白質に結合する抗体を含む、細胞毒性の抑制レベルの検査薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞毒性を抑制する蛋白質およびその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ　ｄｅｓｅａｓｅ；　ＡＤ）は最も注目されている神経変性疾患の１つであり、治癒できる治療法は未だ開発されていない。ＡＤの臨床症状の多くは進行性の神経細胞死で説明することができる。ＡＤにおいて神経細胞死が起こる機構を解明し、これを防ぐ方法を見つけることが、この疾患の有効な治療法を確立するために極めて重要である。早発性の家族性ＡＤ（ｆａｍｉｌｉａｌ　ＡＤ；　ＦＡＤ）を引き起こす既知の変異遺伝子にはアミロイド前駆蛋白質（ａｍｙｌｏｉｄ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ；　ＡＰＰ）の変異体、プレセニリン　（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ；　ＰＳ）　１の変異体、およびＰＳ２の変異体の３種類があり、それぞれが神経細胞毒性を引き起こすことが示されている（Ｙａｍａｔｓｕｊｉ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９６ａ）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７２：　１３４９−１３５２；　Ｗｏｌｏｚｉｎ，　Ｂ．ｅｔ　ａｌ．　（１９９６）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７４：　１７１０−１７１３；　Ｇｕｏ，　Ｑ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９７）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　１７：　４２１２−４２２２；　Ｗｅｉｈｌ，　Ｃ．Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　１９：　５３６０−５３６９；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００ａ）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５：　３４５４１−３４５５１；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）　Ｊ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｅｘｐ．　Ｔｈｅｒ．　３００：　７３６−７４５；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔａｌ．　（２００２）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．　８０：　４２６−４３７）。エクダイソン（ｅｃｄｙｓｏｎｅ；　ＥｃＤ）誘導系（Ｎｏ，　Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９６）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９３：　３３４６−３３５１）を用いた研究により、４つの異なるＦＡＤ変異体［Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰ、Ｋ５９５Ｎ／Ｍ５９６Ｌ−ＡＰＰ　（ＮＬ−ＡＰＰ）、Ｍ１４６Ｌ−ＰＳ１、Ｎ１４１Ｉ−ＰＳ２］が、発現依存的な様式で、異なる細胞毒性機構の異なる組み合わせを触発することが明らかとなった（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００ａ）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５：　３４５４１−３４５５１；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）　Ｊ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｅｘｐ．　Ｔｈｅｒ．　３００：　７３６−７４５；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．　８０：　４２６−４３７）。これらのＦＡＤ変異体はＡＤ症例全体の中の一角を引き起こすに過ぎないことを考えると、このような機構の複雑さは、根底にある機構だけに基づいて単一の抗ＡＤ細胞保護薬を同定することは困難であることを示唆している。
【０００３】
ところで、神経ホメオボックス遺伝子であるＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２は、出生後マウスの脳より単離された遺伝子（Ｋｏｍｕｒｏ，　Ｉ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９３）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１２：　１３８７−１４０１）であり、分化したオリゴデンドロサイトで発現し、髄鞘形成（ｍｙｅｌｉｎｉｚａｔｉｏｎ）に潜在的な役割を有している（Ａｗａｔｒａｍａｎｉ，　Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９７）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　１７：　６６５７−６６６８；　Ｓｉｍ，　Ｆ．Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００）　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　１００：　１３１−１３９）。Ｇｔｘ／Ｎｋｘ６．２は腹部脊髄の神経始原細胞にも発現しており、この始原細胞からＶ０神経が形成されるのを阻害する（Ｖａｌｌｓｔｅｄｔ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００１）　Ｎｅｕｒｏｎ　３１：　７４３−７５５）。ヒトＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２もクローニングされ染色体１０ｑ２６にマッピングされている。この領域は、種々の悪性脳腫瘍においてヘテロ接合性がしばしば失われている（Ｌｅｅ，　Ｓ．Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００１）　Ｍａｍｍ．　Ｇｅｎｏｍｅ　１２：１５７−１６２）。Ｇｔｘ／Ｎｋｘ６．２を欠失したマウスは、中枢神経系に外見上の変化は見られず正常に発生する（Ｃａｉ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００１）　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　２１：　４３９９−４４０３）。Ｇｔｘ／Ｎｋｘ６．２の機能に関する情報はこのように限られているが、ホメオボックス遺伝子は核転写に関する調節蛋白質をコードしており、それらの協調的な活性化は胚発生における時間的および空間的なパターン形成の基礎となっていることが受け入れられている。分化の分子制御は、組織特異的な遺伝子の発現を調節する、系列に限定された（ｌｉｎｅａｇｅ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）転写因子に依存している。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（ショウジョウバエ）の発生を支配する遺伝子の中には、ホメオティック遺伝子およびセグメンテーション遺伝子の逐次的な活性化が分節のアイデンティティ、極性、および数を制御している。Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ（Ａｎｔｐ）、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ（Ｅｎ）、および　Ｐａｉｒｅｄ（Ｐｒｄ）ファミリーを含むこれらの遺伝子の多くは、ホメオボックスと呼ばれる特徴的な約１８０　ｂｐの配列モチーフを含んでいる（ＭｃＧｉｎｎｉｓ，　Ｗ．　ａｎｄ　　Ｋｌｕｍｒａｕｆ，　Ｒ．　（１９９２）　Ｃｅｌｌ　６８：　２８３−３０２）。これらの遺伝子が配列特異的な転写因子として作用することに一致して、Ｇｔｘ／Ｎｋｘ６．２は最適な結合配列として　（Ａ／Ｔ）ＴＴＡＡＴＧＡ　に結合し、下流の遺伝子の転写を抑制する（Ａｗａｔｒａｍａｎｉ，　Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　Ｒｅｓ．　６１：　３７６−３８７）。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｙａｍａｔｓｕｊｉ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９６ａ）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７２：　１３４９−１３５２
【非特許文献２】
Ｗｏｌｏｚｉｎ，　Ｂ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９６）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７４：　１７１０−１７１３
【非特許文献３】
Ｇｕｏ，　Ｑ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９７）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　１７：　４２１２−４２２２
【非特許文献４】
Ｗｅｉｈｌ，　Ｃ．Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　１９：　５３６０−５３６９
【非特許文献５】
Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００ａ）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５：　３４５４１−３４５５１
【非特許文献６】
Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）　Ｊ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｅｘｐ．　Ｔｈｅｒ．　３００：　７３６−７４５
【非特許文献７】
Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．　８０：　４２６−４３７
【非特許文献８】
Ｎｏ，　Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９６）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９３：　３３４６−３３５１
【非特許文献９】
Ｋｏｍｕｒｏ，　Ｉ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９３）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１２：　１３８７−１４０１
【非特許文献１０】
Ａｗａｔｒａｍａｎｉ，　Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９７）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　１７：　６６５７−６６６８
【非特許文献１１】
Ｓｉｍ，　Ｆ．Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００）　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　１００：　１３１−１３９
【非特許文献１２】
Ｖａｌｌｓｔｅｄｔ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００１）　Ｎｅｕｒｏｎ　３１：　７４３−７５５
【非特許文献１３】
Ｌｅｅ，　Ｓ．Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００１）　Ｍａｍｍ．　Ｇｅｎｏｍｅ　１２：１５７−１６２
【非特許文献１４】
Ｃａｉ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００１）　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　２１：　４３９９−４４０３
【非特許文献１５】
ＭｃＧｉｎｎｉｓ，　Ｗ．　ａｎｄ　　Ｋｌｕｍｒａｕｆ，　Ｒ．　（１９９２）　Ｃｅｌｌ　６８：　２８３−３０２
【非特許文献１６】
Ａｗａｔｒａｍａｎｉ，　Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　Ｒｅｓ．　６１：　３７６−３８７
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、細胞毒性を抑制する蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子、およびそれらの利用を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、細胞毒性を抑制する抗ＡＤ剤開発への新たなアプローチとして、Ｄ’Ａｄａｍｉｏら（Ｄ’Ａｄａｍｉｏ，　Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９７）　Ｓｅｍｉｎ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　９：　１７−２３）により開発された”デストラップ”スクリーニングと呼ばれる新しいアプローチに独自の改変を加え、偏りのない機能スクリーニングにより、死んで行く細胞を生存させる分子を検索した。本発明者らは、ＡＤ患者脳の後頭葉から構築した発現ｃＤＮＡライブラリーを用いて、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰを誘導できる神経細胞（Ｎｉｉｋｕｒａ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍ．　２７４：　４４５−４５４）にこの方法を適用した。これにより本発明者は、ホメオドメインをコードする抗ＦＡＤ遺伝子を同定することに成功した。ＦＡＤ遺伝子による細胞毒性から神経細胞を保護する遺伝子として同定されたこのクローンは、神経のホメオボックス遺伝子であるヒトＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２遺伝子と同一であった。ヒトＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２は、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰによるカスパーゼ阻害剤感受性のアポトーシス性の細胞毒性を阻害するだけでなく、Ｌ６４８Ｐ−ＡＰＰ、ＮＬ−ＡＰＰ、Ａ６１７Ｇ−ＡＰＰ、およびＮ１４１Ｉ−ＰＳ２によるそれも阻害した。細胞保護活性に責任のあるＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２の領域としてそのホメオドメイン（Ｌｙｓ１４８　−　Ｈｉｓ２０７）（配列番号：４）が特定された。Ｇｔｘ／Ｎｋｘ６．２のホメオドメインを発現させた細胞では、ＡＰＰのＦＡＤ変異体による細胞死が、全長ヒトＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２を発現させた細胞と同程度に抑制されたことから、Ｇｔｘ／Ｎｋｘ６．２のホメオドメイン自体が、Ｇｔｘ／Ｎｋｘ６．２の抗ＦＡＤ遺伝子のアンタゴナイズ活性を担っていると考えられる。
【０００７】
ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２のホメオドメインで観察されたこの細胞保護機能が、ホメオドメイン一般に保存されているかを調べるため、ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２のホメオドメインと４６．７％のアミノ酸配列の同一性しかないホメオドメインを持つヒトＤｌｘ４を用いてアッセイを行った。その結果、ヒトＤｌｘ４はＶ６４２Ｉ−ＡＰＰに対してｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２と同様の細胞保護機能を持つことが明らかとなった。この事実は、このような細胞保護機能はホメオドメインに広く付随していることを示している。本発明により提供されるホメオボックスを含む蛋白質または該蛋白質をコードするベクターを含む細胞毒性抑制剤を用いれば、神経細胞などにおける細胞毒性を抑制することが可能となる。特に、本発明の細胞毒性抑制剤はＡＤに関連する細胞死を有意に抑制することから、ＡＤの予防または治療のための医薬としての利用が期待される。また患者におけるホメオボックス含有蛋白質の発現を検出することにより、患者の細胞毒性抑制状態をモニターすることも可能である。
【０００８】
また本発明はＡＤ傷害に対する神経保護機構を理解するための分子的糸口を提供し、さらに発生において調節される機構とＡＤ機構の阻害との間の新たな結びつきを示唆するものである。これまでにそれらの間で幾つかの機能的関連が想定されており、それらはＮｏｔｃｈの活性化におけるＰＳ蛋白質の調節的役割（Ｗｏｎｇ，　Ｐ．Ｃ．　ｅｔａｌ．　（１９９７）　Ｎａｔｕｒｅ　３８７：　２８８−２９２；　Ｈａｎｄｌｅｒ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００）　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１２７：　２５９３−２６０６；　Ｓｅｌｋｏｅ，　Ｄ．Ｊ．　（２０００）　Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．　１０：　５０−５７）や、骨格および神経発生におけるＰＳ１（Ｓｈｅｎ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９７）　Ｃｅｌｌ　８９：　６２９−６３９；　Ｄｏｎｏｖｉｅｌ，　Ｄ．Ｂ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　１３：　２８０１−２８１０）の、そして肺発生におけるＰＳ２（Ｈｅｒｒｅｍａｎ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９６：１１８７２−１１８７７）の本質的な役割を示すジーンターゲティングの研究に基づいている。また、Ｈｏｎｇら（Ｈｏｎｇ，　Ｃ．Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　１９：　６３７−６４３）は、ＰＳ１のＦＡＤ関連変異体が神経前駆体の分化に役割を果たすことを報告している。また、マウスのホメオボックス遺伝子Ｈｏｘ３．１がＡＰＰ　ｍＲＮＡレベルをネガティブに調節することが報告されている（Ｖｉｏｌｅｔｔｅ，　Ｓ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９２）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８９：　３８０５−３８０９）。Ｈｏｘ３．１蛋白質はＡＰＰ　ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲに結合し、ＡＰＰの発現を抑制する。しかし、この機構は、ＡＰＰのＦＡＤ変異体による細胞死に対して観察されたｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２による抑制を説明しない。本発明は、ホメオドメイン含有蛋白質が、複数のＡＤ傷害に対してアンタゴニストとして作用することを初めて実証するものである。観察された抗ＡＰＰ活性を媒介するｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２結合蛋白質またはｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２調節遺伝子を、酵母２ハイブリッド系、ジーンアレイ系、ディファレンシャルディスプレイ、および他の適当なアプローチを用いて同定することにより、ＡＤ傷害の分子機構を解明し、ＡＤの治療法を開発することが可能と考えられる。
【０００９】
本発明は、細胞毒性を抑制する蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子、およびそれらの利用等に関し、より具体的には、
（１）ホメオボックスを含む蛋白質または該蛋白質を発現するベクターを有効成分とする、細胞毒性の阻害剤、
（２）配列番号：４または１０に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質または該蛋白質と機能的に同等の蛋白質、あるいは該蛋白質または該蛋白質と機能的に同等の蛋白質を発現するベクターを有効成分とする、（１）に記載の細胞毒性の阻害剤、
（３）ホメオボックスを含む蛋白質または該蛋白質を発現するベクター、ならびに薬学的に許容される担体を含む、細胞毒性を伴う疾患の治療または予防に用いられる医薬組成物、
（４）疾患がアルツハイマー病である、（３）に記載の医薬組成物、
（５）ホメオボックスを含む蛋白質を細胞に導入または発現させる工程を含む、細胞毒性を抑制する方法、
（６）細胞毒性がアルツハイマー病に伴う細胞毒性である、（５）に記載の方法、
（７）ホメオボックスを含む蛋白質の細胞毒性に対する抑制活性を検出する方法であって、
（ａ）該蛋白質の存在下、細胞において細胞毒性を誘導する工程、
（ｂ）該細胞の細胞毒性を検出する工程、
（ｃ）該蛋白質の非存在下または工程（ａ）に比べ低用量の存在下において検出される該細胞の細胞毒性と比べた時の工程（ｂ）で検出される細胞毒性の低下を、細胞毒性に対する該蛋白質の抑制活性と関連付ける工程、を含む方法、
（８）細胞毒性を、ＡＰＰ変異体またはＰＳ２変異体の発現により誘導する、（７）に記載の方法、
（９）ホメオボックスを含む蛋白質の細胞毒性に対する抑制活性に及ぼす被検化合物の効果を検出する方法であって、
（ａ）該被検化合物および該蛋白質の存在下、細胞において細胞毒性を誘導する工程、
（ｂ）該細胞の細胞毒性を検出する工程、
（ｃ）該被検化合物の非存在下または工程（ａ）に比べ低用量の存在下において検出される該細胞の細胞毒性と比べた時の工程（ｂ）で検出される細胞毒性の低下および上昇を、それぞれ細胞毒性に対する該蛋白質の抑制活性に及ぼす該被検化合物の促進および抑制効果と関連付ける工程、を含む方法、
（１０）ホメオボックスを含む蛋白質の細胞毒性に対する抑制活性を調節する化合物を選択する方法であって、
（ａ）該被検化合物および該蛋白質の存在下、細胞において細胞毒性を誘導する工程、
（ｂ）該細胞の細胞毒性を検出する工程、
（ｃ）該被検化合物の非存在下または工程（ａ）に比べ低用量の存在下において検出される該細胞の細胞毒性と比べ、工程（ｂ）で検出される細胞毒性を低下または上昇させる化合物を選択する工程を含む方法、
（１１）ホメオボックスを含む蛋白質の細胞毒性に対する抑制活性を調節する化合物を選択する方法であって、
（ａ）被検化合物および該蛋白質を接触させる工程、
（ｂ）該被検化合物および該蛋白質の結合を検出する工程、および
（ｃ）該蛋白質に結合する化合物を選択する工程、を含む方法、
（１２）ホメオボックスを含む蛋白質の細胞毒性に対する抑制活性を調節する化合物を選択する方法であって、
（ａ）被検化合物の存在下、該蛋白質をコードする遺伝子を内因的に保持する細胞における該遺伝子の発現を検出する工程、
（ｂ）該被検化合物の非存在下または工程（ａ）に比べ低用量の存在下において検出される該遺伝子の発現と比べ、工程（ａ）で検出される発現を上昇または低下させる化合物を選択する工程を含む方法、
（１３）（１０）から（１２）のいずれかに記載の方法により選択されうる化合物を有効成分とする細胞毒性の阻害剤、
（１４）（１０）から（１２）のいずれかに記載の方法により選択されうる化合物を投与する工程を含む、細胞毒性を抑制する方法、
（１５）細胞毒性がアルツハイマー病に伴う細胞毒性である、（１４）に記載の方法、
（１６）ホメオボックスを含む蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖の少なくとも１５ヌクレオチド以上を含むポリヌクレオチド、または該蛋白質に結合する抗体を含む、細胞毒性の抑制レベルの検査薬、に関する。なお、本明細書において引用された文献は、全て本明細書に組み込まれる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明は、ホメオボックスを含む蛋白質またはその蛋白質を発現するベクターを有効成分とする細胞毒性の阻害剤を提供する。本発明においてホメオボックスとは、ＤＮＡと相互作用する蛋白質の一群に共通する、３つのヘリックスを含む約６０アミノ酸の配列のモチーフを言う（Ｓｃｏｔｔ，　Ｍ．Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８９）　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ　９８９：　２５−４８；　ＭｃＧｉｎｎｉｓ，　Ｗ．　ａｎｄ　　Ｋｌｕｍｒａｕｆ，　Ｒ．　（１９９２）　Ｃｅｌｌ　６８：　２８３−３０２）。ＤＮＡ−ホメオドメイン複合体の結晶構造により、ホメオボックス蛋白質における３つのヘリックスの境界、ならびにＤＮＡ塩基およびＤＮＡ糖−リン酸バックボーンと相互作用する残基が明らかにされており、ホメオボックスドメインのＮ末端のアームと第３のヘリックスは、それぞれＤＮＡのマイナーグルーブ（副溝）およびメジャーグルーブ（主溝）の塩基と特異的に相互作用することが報告されている（Ｋｉｓｓｉｎｇｅｒ，　Ｃ．Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９０）　Ｃｅｌｌ　６３：　５７９−５９０；　Ｗｏｌｂｅｒｇｅｒ，　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９１）　Ｃｅｌｌ　６７：　５１７−５２８）。
【００１１】
ホメオボックスは、例えばＰｆａｍコンピュータプログラムを用いたｈｉｄｄｅｎ　Ｍａｒｋｏｖ　ｍｏｄｅｌ（ＨＭＭ）に基づく検索により検出することができる（Ｅ．Ｌ．Ｌ．　Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，ｅｔ　ａｌ．，　１９９７，　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　２８：４０５−４２０）。例えば本発明におけるホメオボックスには、天然の蛋白質の部分アミノ酸配列においてＰｆａｍコンピュータプログラムによりｇａｔｈｅｒｉｎｇ　ｃｕｔｏｆｆ（ＧＡ）値よりも高いスコアでホメオボックスが検出されるアミノ酸配列が含まれる。具体的には、例えばＰｆａｍ　７．１プログラム（Ａ．　Ｂａｔｅｍａｎｅｔ　ａｌ．，　２００２，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　３０：　２７６−２８０）において、アミノ酸配列をｑｕｅｒｙにして検索を行い、アライメントのＰｆａｍ＿ｌｓスコアがＧＡ値（５．９０）さらに好ましくはｔｒｕｓｔｅｄ　ｃｕｔｏｆｆ（ＴＣ）値（６．００）よりも高いスコアでホメオボックスが検出されることにより同定される。ＧＡよりも高いスコアで検出されるドメインのアノテーションは極めて高い信頼性を有する。アライメントは例えばｇｌｏｃａｌで行い、Ｐｆａｍ＿ｌｓのスコアを得る。Ｐｆａｍ＿ｌｓスコアは、例えば１２以上、より好ましくは２４以上、より好ましくは４８以上、より好ましくは６４以上でホメオボックスが検出されることが好ましい。このようにＰｆａｍでホメオボックスが検出された時のＥ　ｖａｌｕｅは通常１×１０−３未満であり、好ましくは１×１０−５未満であり、より好ましくは１×１０−７未満であり、より好ましくは１×１０−９未満であり、より好ましくは１×１０−１２未満である。Ｐｆａｍによる検索はウェブサイト（Ｓａｎｇｅｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　（ＵＫ），　Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ　（ＵＳＡ），　Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｔ　（Ｓｗｅｄｅｎ），　または　Ｉｎｓｔｉｔｕｔ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　ｄｅ　ｌａ　Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ　Ａｇｒｏｎｏｍｉｑｕｅ　（Ｆｒａｎｃｅ））上のサーバーを利用して実施することもできるし、ＦＴＰサイトからＰｆａｍデータベースをダウンロードしてローカルで検索を行うこともできる。
【００１２】
本発明においてホメオボックスを含む蛋白質は、好ましくはヒトＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２（ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２：　ＧｅｎＢａｎｋ　＃ＡＡＫ１３２５１）またはヒトＤＬＸ４（Ｑｕｉｎｎ，　Ｌ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９７）　Ｇｅｎｅ　１８７：　５５−６１；　Ｂｅｎｄｌｌ，　Ａ．　Ｊ．　ａｎｄ　Ａｂａｔｅ−Ｓｈｅｎ，　Ｃ．　（２０００）　Ｇｅｎｅ　２４７：　１７−３１；　ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　Ｎｏ．　Ｑ９２９８８）のホメオボックス（それぞれ配列番号：４または１０）含む蛋白質または該蛋白質と機能的に同等の蛋白質である。該機能的に同等な蛋白質は、ヒトＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２またはヒトＤＬＸ４のホメオボックスと機能的に同等なホメオボックスを含む。このようなホメオボックスは、好ましくはヒトＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２（ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２：　ＧｅｎＢａｎｋ　＃ＡＡＫ１３２５１）またはヒトＤＬＸ４（Ｑｕｉｎｎ，　Ｌ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９７）　Ｇｅｎｅ　１８７：　５５−６１；　Ｂｅｎｄｌｌ，　Ａ．　Ｊ．　ａｎｄ　Ａｂａｔｅ−Ｓｈｅｎ，　Ｃ．　（２０００）　Ｇｅｎｅ　２４７：１７−３１；　ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　Ｎｏ．　Ｑ９２９８８）のホメオボックス（それぞれ配列番号：４または１０）と３５％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは４５％以上、さらに好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる。特にヒトＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２またはヒトＤＬＸ４のホメオボックスのアミノ酸配列と８０％以上、例えば９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるホメオボックスは好ましい。このようなホメオボックスは、他のホメオボックス蛋白質に由来してもよいし、ヒトＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２またはヒトＤＬＸ４のホメオボックスのアミノ酸を置換、欠失、および／または挿入して生成することもできる。アミノ酸を置換する場合には、置換数は３９以内、好ましくは３６以内、より好ましくは３３以内、より好ましくは３０以内、より好ましくは２５以内、より好ましくは２０以内である。特に、ヒトＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２またはヒトＤＬＸ４のホメオボックスのアミノ酸の１５以内、例えば１０個以内を置換したアミノ酸配列からなるホメオボックスは好ましい。特に、ホメオボックス一般に保存されているアミノ酸を置換する場合には、後述する保存的置換を行うことが好ましい。
【００１３】
塩基配列またはアミノ酸配列の同一性は、例えば文献「Ａｌｔｓｃｈｕｌ，　Ｓ．　Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．，　１９９０，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　２１５：　４０３−４１０」に記載の方法に従って決定することができる。具体的には、塩基配列の同一性を決定するにはｂｌａｓｔｎプログラム、アミノ酸配列の同一性を決定するにはｂｌａｓｔｐプログラムを用い、例えばＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｈｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＢＬＡＳＴのウェブページにおいてＬｏｗ　ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙを含むフィルターは全てＯＦＦにして、デフォルトのパラメータを用いて検索を行う（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，　Ｓ．Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９３）　Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．　３：２６６−２７２；　Ｍａｄｄｅｎ，　Ｔ．Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９６）　Ｍｅｔｈ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　２６６：１３１−１４１；　Ａｌｔｓｃｈｕｌ，　Ｓ．Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９７）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２５：３３８９−３４０２；　Ｚｈａｎｇ，　Ｊ．　＆　Ｍａｄｄｅｎ，　Ｔ．Ｌ．　（１９９７）　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．　７：６４９−６５６）。パラメータの設定は、例えばｏｐｅｎ　ｇａｐのコストはヌクレオチドは５で蛋白質は１１、ｅｘｔｅｎｄ　ｇａｐのコストはヌクレオチドは２で蛋白質は１、ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍｉｓｍａｔｃｈのペナルティーは−３、ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍａｔｃｈの報酬は１、ｅｘｐｅｃｔ　ｖａｌｕｅは１０、ｗｏｒｄｓｉｚｅはヌクレオチドは１１で蛋白質は３、Ｄｒｏｐｏｆｆ　（Ｘ）　ｆｏｒ　ｂｌａｓｔ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ　ｉｎ　ｂｉｔｓはｂｌａｓｔｎでは２０で他のプログラムでは７、Ｘ　ｄｒｏｐｏｆｆ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｇａｐｐｅｄ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　（ｉｎ　ｂｉｔｓ）はｂｌａｓｔｎ以外では１５、ｆｉｎａｌ　Ｘ　ｄｒｏｐｏｆｆ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｇａｐｐｅｄ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　（ｉｎ　ｂｉｔｓ）はｂｌａｓｔｎでは５０で他のプログラムでは２５　にする。アミノ酸配列の比較においては、スコアのためのマトリックスとしてＢＬＯＳＵＭ６２を用いることができる。２つの配列の比較を行うｂｌａｓｔ２ｓｅｑｕｅｎｃｅｓプログラム（Ｔａｔｉａｎａ　Ａ　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ．　１７４：２４７−２５０）により、２配列のアライメントを作成し、配列の同一性を決定することができる。
【００１４】
図２Ｂにホメオボックスのアミノ酸配列のアライメントが示されている。ホメオボックスは特定の位置に保存されたアミノ酸残基を有している（Ｓｃｏｔｔ，　Ｍ．Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８９）　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ　９８９：　２５−４８）。本発明においてホメオボックスは、これらのコンセンサスのアミノ酸残基を保持することが好ましい。一例としては、例えば、６０残基のホメオボックスのアミノ酸配列において、２Ｋ／２Ｒ、５Ｒ、８Ｆ／８Ｙ、１２Ｑ、１６Ｌ、２０Ｆ、２５Ｙ、２６Ｌ、３１Ｒ、３４Ｌ／３４Ｉ、３５Ａ／３５Ｓ、３８Ｌ、４０Ｌ／４０Ｍ、４５Ｖ／４５Ｉ、４８Ｗ、４９Ｆ、５０Ｑ、５１Ｎ、５２Ｋ／５２Ｒ、５３Ｒ、５５Ｋ、および　５７Ｋ／５７Ｒ　が保存されているか、またはそれらが保存的に他のアミノ酸に置換されていることが好ましい（番号は　１〜６０番目までのホメオボックスのアミノ酸配列の位置を表す。スラッシュはそれらのどれかを表す）。ここで１〜６０の番号はアミノ酸の相対的な位置を示すためのもので、ホメオボックスは６０アミノ酸よりも少ないポリペプチドであってもよく、例えば５６アミノ酸以上、好ましくは５７アミノ酸以上、より好ましくは５８アミノ酸以上、より好ましくは５９アミノ酸以上を含むポリペプチドである。上記の保存アミノ酸を保持するホメオボックスは、［Ｋ／Ｒ］ＸＸＲＸＸ［Ｆ／Ｙ］ＸＸＸＱＸＸＸＬＸＸＸＦＸＸＸＸＹＬＸＸＸＸＲＸＸ［Ｌ／Ｉ］［Ａ／Ｓ］ＸＸＬＸ［Ｌ／Ｍ］ＸＸＸＸ［Ｖ／Ｉ］ＸＸＷＦＱＮ［Ｋ／Ｒ］ＲＸＫＸ［Ｋ／Ｒ］（Ｘは任意のアミノ酸、”［　］”の中はスラッシュで区切られて記載されたアミノ酸のいずれかを指す）のアミノ酸配列またはこれらの所望のアミノ酸が保存的に他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むポリペプチドと表すことができる。より好ましくは、２Ｋ／２Ｒ、５Ｒ、８Ｆ／８Ｙ、９Ｓ／９Ｔ、１２Ｑ、１６Ｌ、２０Ｆ、２５Ｙ、２６Ｌ、２７Ａ／２７Ｔ／２７Ｓ、３０Ｅ／３０Ｒ／３０Ｋ、３１Ｒ、３４Ｌ／３４Ｉ、３５Ａ／３５Ｓ、３８Ｌ、４０Ｌ／４０Ｍ、４４Ｑ、４５Ｖ／４５Ｉ、４６Ｋ／４６Ｒ、４７Ｖ／４７Ｉ／４７Ｔ、４８Ｗ、４９Ｆ、５０Ｑ、５１Ｎ、５２Ｋ／５２Ｒ、５３Ｒ、５５Ｋ、５７Ｋ／５７Ｒ、および　５８Ｋ　が保存されているか、またはそれらが保存的に他のアミノ酸に置換されていることが好ましい（スラッシュはそれらのどれかを表す）。このようなホメオボックスは、［Ｋ／Ｒ］ＸＸＲＸＸ［Ｆ／Ｙ］［Ｓ／Ｔ］ＸＸＱＸＸＸＬＸＸＸＦＸＸＸＸＹＬ［Ａ／Ｔ／Ｓ］ＸＸ［Ｅ／Ｒ／Ｋ］ＲＸＸ［Ｌ／Ｉ］［Ａ／Ｓ］ＸＸＬＸ［Ｌ／Ｍ］ＸＸＸＱ［Ｖ／Ｉ］［Ｋ／Ｒ］［Ｖ／Ｉ／Ｔ］ＷＦＱＮ［Ｋ／Ｒ］ＲＸＫＸ［Ｋ／Ｒ］Ｋ　（Ｘは任意のアミノ酸、”［　］”の中はスラッシュで区切られて記載されたアミノ酸のいずれかを指す）のアミノ酸配列またはこれらの所望のアミノ酸が保存的に他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むポリペプチドと表すことができる。
【００１５】
アミノ酸を置換する場合、性質の似たアミノ酸に置換すれば、もとの蛋白質の活性が維持されやすいと考えられる。このような置換を保存的置換という。アミノ酸の保存的置換は、当業者にはよく知られている。保存的置換に相当するアミノ酸のグループとしては、例えば、塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸　（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性アミノ酸　（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性アミノ酸　（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐アミノ酸　（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族アミノ酸　（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などが挙げられる。
【００１６】
天然のホメオボックス含有蛋白質は、例えば既知のホメオボックス含有蛋白質をコードする核酸をプローブまたはプライマーとしたハイブリダイゼーションまたはＰＣＲにより単離することができる。また、ホメオボックスにおいて保存されたアミノ酸領域を基にデジェネレートプライマーを設計し、これを用いてＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）等を行うことによりホメオボックスをコードするＤＮＡを増幅することができる。ホメオボックスをコードする核酸を単離するための材料は特に制限されない。好ましくは、高等真核生物のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡである。高等真核生物としては、例えば哺乳動物、特にマウス、ラット、サル、ヒトなどが挙げられる。
【００１７】
ホメオボックス含有蛋白質をコードする核酸をハイブリダイゼーションにより単離する場合は、例えば既知のホメオボックス含有蛋白質の全長またはホメオボックス部分をコードする核酸をプローブに、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。本発明においてホメオボックスには、天然のホメオボックス含有蛋白質をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡでもＲＮＡでもよい）とハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするホメオボックスが含まれる。既知のホメオボックス含有蛋白質としては、特にｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２またはｈＤＬＸ４が好適である。プローブとしては、例えばｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２またはｈＤＬＸ４のホメオボックスをコードするポリヌクレオチドを用いることができ、具体的には配列番号：３または９に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。ハイブリダイゼーションの条件は当業者であれば適宜調節することができるがストリンジェントな条件で行うことが好ましい。
【００１８】
本発明において蛋白質とは複数（２以上）のアミノ酸またはアミノ酸誘導体が結合したポリペプチドを指す。蛋白質にはペプチドイソステア（ｐｅｐｔｉｄｅ　ｉｓｏｓｔｅｒｅｓ）が含まれてもよい。蛋白質には、通常、ペプチド、オリゴペプチド、またはオリゴマーなどと呼ばれるような短い鎖も含まれる。また長い鎖のものも含む。蛋白質は、翻訳後修飾などにより天然に修飾されていてもよい。また人工的に修飾されていてもよい。修飾には、ペプチドのバックボーン、アミノ酸側鎖、アミノ末端、またはカルボキシル末端などの修飾が含まれる。また、蛋白質のポリペプチド鎖は分岐していてもよく、環状でもよい。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、［フラビン（ｆｌａｖｉｎ）、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、脂質、脂質誘導体、またはホスファチジルイノシトール］　等の共有結合、クロスリンク形成、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、ピログルタミン酸化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、リン酸化、ユビキチン化などが含まれるが、これらに制限されない。これらの修飾により、蛋白質の細胞保護作用や細胞内での安定性、分解速度などを調節することも可能と考えられる。
【００１９】
本発明において蛋白質は融合蛋白質であってもよい。融合蛋白質とは、天然において隣接していない少なくとも２つの蛋白質が連結した蛋白質であり、ペプチド合成により、または蛋白質のコード領域をフレームが一致するように連結させた核酸を発現させることにより製造することができる。本発明においてホメオボックスを含む蛋白質には、上記のホメオボックスと他の蛋白質との融合蛋白質が含まれる。他の蛋白質としてはタグのような数残基の短いペプチドから蛋白質のような長いポリペプチドまで任意のポリペプチドが挙げられる。具体的には、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグなどのペプチドタグ配列、ＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）、グルタチオン　Ｓ−トランスフェラーゼ　（ＧＳＴ）、β−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。例えばＨｉｓタグを付加した蛋白質は、ニッケルカラムにより精製することができる。また、例えばＧＳＴとの融合蛋白質は、グルタチオンカラムを用いて精製することができる。また、融合する他の蛋白質としては抗体断片（Ｆｃ断片）などが挙げられる。さらに、リーダー配列、分泌シグナル、プレ蛋白質またはプロ蛋白質の配列などが挙げられるが、それらに制限されない。
【００２０】
また、本発明において蛋白質には、その塩も含まれる。このような塩は酸または塩基から誘導される。具体的には、例えば無機酸との塩（例えば、塩酸塩、リン酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩など）、有機酸との塩（例えば、酢酸塩、乳酸塩、ギ酸塩、酪酸塩、グリコール酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩など）、あるいは塩基との塩（例えば、アンモニウム塩、ナトリウム塩やカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、有機塩基との塩、およびアルギニンやリジンなどのアミノ酸との塩）が挙げられる。
【００２１】
また本発明において蛋白質には、その誘導体が含まれる。ここで「誘導体」とは、蛋白質の官能基を既知の方法により修飾、付加、変異、置換、または削除などにより改変された形態を持つ分子を意味する。このような官能基の改変は、例えば、蛋白質に存在する官能基の保護、蛋白質の安定性または組織移行性の制御、あるいは蛋白質の活性の制御等を目的として行われうる。例えば蛋白質には、そのＮ末端、Ｃ末端、及び蛋白質を構成するアミノ酸の側鎖の官能基のいずれかが保護基等の他の置換基によって修飾されているものが含まれる。置換基としては、例えば各種のアルキル基、アシル基、アミド体、リン酸基、アミノ基、カルボキシル基、エステル基など挙げられるがこれらに制限されない。
また、本発明において蛋白質は、蛋白質同士を結合させたダイマーなどの重合体、分枝状分子、環化分子が含まれる。また、蛋白質は担体に結合していてもよい。例えば蛋白質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、あるいは他のポリマーなどと結合していてもよい。
【００２２】
本発明において蛋白質を構成するアミノ酸は、Ｌ体および／またはＤ体であることができる。Ｄ体のアミノ酸の使用は、ペプチダーゼによる分解を低下させるために有用である。また、アミノ酸は天然のアミノ酸に限定されず、非天然のアミノ酸でもよい。例えば、ホモセリン、β−ヒドロキシバリン、Ｏ−４−ヒドロキシフェニルチロシン、α−ｔ−ブチルグリシン、２−アミノ酪酸、α−シクロヘキシルグリシン、α−フェニルグリシンなどをあげることができる。また、蛋白質のペプチド結合は、適宜ペプチド結合以外の共有結合に置換することが考えられる。非ペプチド結合への置換により、ペプチダーゼによる感受性を下げ、薬効の持続性の向上や投与ルートの選択の幅を広げることができる。非ペプチド結合の例としては、イミノ結合、エステル結合、ヒドラジン結合、セミカルバジド結合、およびアゾ結合などが挙げられるが、これらに制限されない。
【００２３】
蛋白質は、該蛋白質をコードする核酸を発現するベクターを導入した宿主またはその培養上清から組み換え蛋白質として調製することができる。蛋白質は、公知の技術により実質的に純粋な蛋白質にまで精製することができる。蛋白質の精製には、例えば硫安沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過などの各種クロマトグラフィー、濾過、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせて分離、精製することができる。クロマトグラフィーとしては、ＨＰＬＣまたはＦＰＬＣ等を用いて行うこともできる。また、蛋白質に対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーなどを利用することもできる。アフィニティー精製に用いる抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。また、インビトロトランスレーションなどによりホメオボックスを含む蛋白質を調製することも可能である。
【００２４】
蛋白質は、公知のペプチド合成技術によって合成ポリペプチドとして製造することもできる（日本生化学会編，　新生化学実験講座　タンパク質ＶＩ，　ｐｐ．３−７４，　東京化学同人，　１９９２年）。ペプチドの合成法は、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。また、合成ＤＮＡの作製や部位特異的変異導入法などにより天然のホメオボックスをコードするＤＮＡに変異を導入し、これを宿主細胞で発現させて、任意のアミノ酸変異を有するホメオボックス含有蛋白質を調製することも可能である。また、このようなアミノ酸の変異は自然界においても生じ得る。本発明においてホメオボックス含有蛋白質は、このように人工的か自然に生じたものかを問わず、天然のホメオボックス含有蛋白質（例えばヒトＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２またはＤｌｘ４のホメオボックス）のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／もしくは付加などにより変異した蛋白質であってもよい。
【００２５】
例えば本発明においてホメオボックスは、天然の蛋白質に含まれる所望のホメオボックスのアミノ酸配列と例えば８０％以上、より好ましくは８３％以上、さらに好ましくは８６％以上、さらに好ましくは８８％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるホメオボックスが含まれる。このようなホメオボックスは、天然のホメオボックス蛋白質のアミノ酸を置換、欠失、および／または挿入して生成することができる。人為的にアミノ酸を置換する場合には、置換数は１２以内、好ましくは１０以内、より好ましくは８以内、より好ましくは７以内、より好ましくは６以内、より好ましくは３以内である。特に、ホメオボックス一般に保存されているアミノ酸を置換する場合には、上記した保存的置換を行うことが好ましい。
【００２６】
ホメオボックスを含む蛋白質のアミノ酸数は特に限定されず、天然のホメオボックス含有蛋白質のように長いポリペプチドであってもよく、あるいは約６０アミノ酸のホメオボックスからなる蛋白質であってもよい。ホメオボックスのみからなる蛋白質でも、長い蛋白質と同等の細胞毒性抑制活性を有することから、製剤化が容易な短い蛋白質からなるホメオボックス蛋白質を好適に用いることができる。本発明の細胞毒性抑制剤の蛋白質のアミノ酸数は、例えば３００アミノ酸以下、好ましくは２４０アミノ酸以下、より好ましくは２００アミノ酸以下、より好ましくは１５０アミノ酸以下、より好ましくは１２０アミノ酸以下、より好ましくは１００アミノ酸以下、例えば約６０アミノ酸である。
【００２７】
本発明において用いられるホメオボックスを含む蛋白質は、アポトーシス性の細胞毒性を阻害する活性を有する。アポトーシスとは、細胞自身が引き起こす細胞死であり、核の染色体凝集、核の断片化、および細胞質の凝縮の特徴を持つ。本発明の細胞毒性阻害剤は、アポトーシス性の細胞毒性を阻害するために有用である。アポトーシスの検出は、ＴＵＮＥＬ法、ＤＮＡラダー法、電子顕微鏡を用いた方法、あるいは核や細胞膜の特有の変化を検出する方法により行うことができる。最後者の例としては、アネキシンＶ測定法や、核の形態変化、またはカスパーゼ活性を測定する方法が挙げられる。
【００２８】
また本発明において用いられるホメオボックスを含む蛋白質は、特にカスパーゼ依存性の細胞毒性を阻害する活性を有する。カスパーゼは細胞のアポトーシスの実行に関与する蛋白質であり、複数のファミリーが知られている（Ｅ．Ｓ．　Ａｌｎｅｍｒｉ，　１９９７，　Ｊ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　６４：　３３−４２）。本発明においてカスパーゼ依存性の細胞毒性とは、これらのうちいずれかのカスパーゼが関与する細胞毒性を言う。カスパーゼが関与するかは、種々のカスパーゼ阻害剤を用いて決定することができる。すなわち本発明において、カスパーゼ阻害剤のいずれかに感受性の細胞毒性はカスパーゼ依存性である。カスパーゼ阻害剤としては、表２に示すようなテトラペプチドなどが知られており、また例えばカスパーゼ１ファミリーの阻害剤としてはＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｉｎｃ．）、カスパーゼ６阻害剤としてはＡｃ−ＶＥＩＤ−ＣＨＯ（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｉｎｃ．）、カスパーゼ６および８阻害剤としては、Ｚ−ＩＥＴＤ−ＣＨＯ　（ＭＢＬ社）などが挙げられる。また、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯはほとんど全てのカスパーゼを阻害し、特にカスパーゼ３ファミリーに最も高い親和性を有している。これら、またはその他のカスパーゼ阻害剤により細胞毒性が有意に阻害される場合、その細胞毒性はカスパーゼ依存性と判断される。これらの阻害剤の感受性試験は、本実施例または文献に従って実施することができる（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００ａ）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５：　３４５４１−３４５５１）。特に本発明におけるカスパーゼ依存性細胞毒性として、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯに感受性の細胞毒性が挙げられる。本発明の細胞毒性阻害剤は、このようなカスパーゼ依存性の細胞毒性を阻害するために有用である。また本発明の細胞毒性阻害剤は、好ましくはグルタチオンエチルエステル（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−ｅｔｈｙｌ−ｅｓｔｅｒ；　ＧＥＥ）に感受性の細胞毒性を阻害するために有用である。ＧＥＥ感受性試験は、文献に従って行うことができる（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００ａ）Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５：　３４５４１−３４５５１）。
【００２９】
また本発明の細胞毒性阻害剤は、特にアルツハイマー病（ＡＤ）における細胞毒性の阻害剤として有用である。家族性ＡＤの原因遺伝子として知られるＡＰＰおよびＰＳの変異体には、カスパーゼ感受性の細胞死を引き起こすものが多く知られている。ホメオボックスを含む蛋白質は、これらのＡＤに関連する細胞毒性を抑制するために有用である。カスパーゼ感受性の細胞死を誘導するＡＤ関連変異体としては、例えばＶ６４２Ｉ　ＡＰＰ、Ｌ６４８Ｐ−ＡＰＰ、ＮＬ−ＡＰＰ、Ａ６１７Ｇ−ＡＰＰ、およびＮ１４１Ｉ−ＰＳ２などが挙げられる。本発明の細胞毒性阻害剤は、これらの変異体により引き起こされるＡＤの予防および治療のために用いることができる。
【００３０】
また本発明は、ホメオボックスを含む蛋白質をコードするベクターを有効成分とする細胞毒性の阻害剤を提供する。ベクターは、宿主細胞に核酸を導入するものであれば特に制限はなく、該蛋白質をコードする核酸そのものであってもよく、あるいは該核酸がプラスミドやウイルスベクターに組み込まれたものであってもよい。核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。また核酸は、一本鎖および二本鎖が含まれる。これらはベクターの種類に従って異なりうる。一本鎖の場合、センス鎖であってもアンチセンス鎖であってもよい。例えばプラスミドベクターであれば、該蛋白質をコードするＤＮＡをプラスミドベクターに組み込んで作製することができる。ウイルスベクターであれば、該ウイルスベクターに該蛋白質をコードする核酸が組み込まれたベクターを構築する。該蛋白質をコードする核酸の由来は特に制限されず、合成核酸、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ　などに由来し得る。また、上記のホメオボックスを含む蛋白質をコードする限り、任意の縮重に基づく塩基配列を有する核酸が含まれる。また、ベクターは、該蛋白質コード領域以外にイントロン等の非翻訳領域を含んでいてもよく、また、５’および３’に非コード配列　（非転写配列、非翻訳配列、プロモーター、エンハンサー、サプレッサー、転写因子結合配列、スプライシング配列、ポリＡ付加配列、ＩＲＥＳ、ｍＲＮＡ安定化・不安定化配列等を含む）　を含んでもよい。また他の蛋白質をコードしていてもよい。上記ベクターを含む細胞毒性阻害剤は、特に細胞毒性を伴う疾患の遺伝子治療ベクターとして有用である。
【００３１】
また本発明は、上記のようなホメオボックスを含む蛋白質を細胞に投与または発現させる工程を含む、細胞毒性の抑制方法を提供する。また本発明は、細胞毒性の抑制におけるホメオボックスを含む蛋白質または該蛋白質を発現するベクターの使用に関する。例えば上記蛋白質または該蛋白質をコードするベクターを細胞内に注入またはトランスフェクションすることにより、該細胞の細胞毒性を抑制することができる。あるいは、細胞が内因的に持つホメオボックス含有蛋白質遺伝子の発現を上昇させることにより、細胞毒性を抑制してもよい。本発明の方法は、例えばヒトおよび非ヒト動物のインビボおよびインビトロ（エクスビボにおける生体外での適用を含む）における細胞毒性の阻害において好適に用いられる。本発明の細胞毒性の抑制方法は、特にアポトーシス性の細胞毒性を抑制するために利用することができる。また本発明の細胞毒性の抑制方法は、特にカスパーゼ依存性の細胞毒性を抑制するために利用することができる。インビボにおいては、例えば上記蛋白質を注射針またはカテーテル等を介して直接注入したり、あるいは該蛋白質を発現するベクターを生体に投与することができる。なお、本発明において細胞毒性の抑制は有意な抑制であればよく、完全な抑制も含まれる。
【００３２】
ホメオボックスを含む蛋白質、または該蛋白質をコードするベクターは、細胞毒性を抑制するための試薬および医薬として用いることができる。本発明は、細胞毒性を抑制するための、該蛋白質または該ベクターの試薬および医薬としての使用に関する。また本発明は、細胞毒性を抑制するための試薬または医薬の製造における、ホメオボックスを含む蛋白質の使用に関する。ホメオボックスを含む蛋白質、または該蛋白質をコードするベクターは、これら自体を試薬または医薬として用いる他、滅菌水、生理食塩水、緩衝剤、塩、安定剤、保存剤、界面活性剤、他の蛋白質（ＢＳＡなど）、トランスフェクション試薬（リポフェクション試薬を含む）等と適宜組み合わせてもよい。これらは混ぜ合わされて組成物となっていてもよく、使用時に混合されるまで分離されていてもよい。
【００３３】
本発明の細胞毒性阻害剤は、特に神経細胞の細胞毒性の抑制に有用である。このためには、本発明の阻害剤を神経細胞に導入する。本発明において神経細胞には、神経系細胞、神経系細胞に由来する細胞および神経前駆細胞等が含まれる。例えば、神経芽細胞腫、褐色細胞腫、奇形腫、神経系細胞を用いた融合細胞および胎児性胚細胞等は、本発明において神経細胞に含まれる。また、株化神経細胞ならびに初代または継代培養神経等が含まれる。代表的な株化神経細胞としては、Ｆ１１細胞、ＰＣ１２細胞（Ｌ．Ａ．　Ｇｒｅｅｎｅおよび　Ａ．Ｓ．　Ｔｉｓｃｈｌｅｒ，　１９７６，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７３：　２４２４−２４２８）、ＮＴＥＲＡ２細胞（Ｊ．　Ｓｋｏｗｒｏｎｓｋｉおよび　Ｍ．　Ｆ．　Ｓｉｎｇｅｒ，　１９８５，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８２：　６０５０−６０５４）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（Ｌ．　Ｏｄｅｌｓｔａｄ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８１，　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．，　２２４：　６９−８２）等が挙げられる。これらの細胞は、後述の本発明のスクリーニング等において好適に用いられる。また、本発明の細胞毒性阻害剤は、特にアポトーシスなどの細胞死を抑制するために有用である。本発明の細胞毒性阻害剤は、ホメオボックスを含む蛋白質または該蛋白質を発現するベクターを含む抗アポトーシス剤となる。また、本発明の細胞毒性阻害剤は、アルツハイマー病を含む神経細胞毒性を伴う疾患の予防または治療を行うための医薬として有用である。ホメオボックス含有蛋白質を細胞内に導入または細胞内で発現させることにより、細胞を細胞死から保護することができる。該蛋白質は、細胞死を伴う疾患に対する医薬組成物として有用である。該蛋白質は、特に神経変性を保護するために有用である。すなわち、該蛋白質は、神経変性を伴う疾患に対する医薬組成物となる。
【００３４】
ホメオボックス含有蛋白質を発現するベクターを医薬として用いて、遺伝子治療などを行うことが可能である。ベクターの投与方法は、例えば　ｉｎ　ｖｉｖｏ　で行われる。遺伝子治療に用いるためのベクター系としては、アデノウイルスベクター、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）ベクター、ヘルペスウイルスベクター（いずれも　Ｒｏｂｂｉｎｓ　ａｎｄ　Ｇｈｉｖｉｚｚａｎｉ，　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｔｈｅｒ．　８０：　３５−４７，　１９９８）、レトロウイルスベクター（Ｅｎｇｅｌ　ａｎｄ　Ｋｏｈｎ，　Ｆｒｏｎｔ．　Ｂｉｏｓｃｉ．　４：　ｅ２６−３３，　１９９９）、レンチウイルスベクター（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，　Ｋ．，　１９９９，　Ｊ．　Ｒｅｃｅｐｔ．　Ｓｉｇｎａｌ．　Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．　Ｒｅｓ．　１９：　６７３−６８６）などを用いることが考えられるが、これらに制限されない。
【００３５】
ホメオボックス含有蛋白質、または該蛋白質をコードする核酸が挿入されたベクターを利用して予防や治療を行う対象となる疾患としては、ホメオボックス含有蛋白質が疾患の治療に有効である限り、特に制限されない。予防および治療の対象として特に適した疾患としては、アポトーシスを伴う疾患が挙げられる。また、特にカスパーゼ依存性の細胞毒性を伴う疾患が挙げられる。また好適な対象疾患としては、例えば神経変性を伴う疾患、特にアルツハイマー病が挙げられる。これまでの研究からアルツハイマー病における細胞死には、ＡＰＰやプレセニリンのある種の活性化が関与していることが示唆されている（Ｉ．　Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，　Ａｄｖ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，　４１：　３３７−３６８；　Ｉ．　Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．　Ａｇｉｎｇ．，　１９：　Ｓ３３−Ｓ３８；　Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９，　Ｃｌｉｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　５５：　２１９−２２５）。このため、本発明の医薬組成物は、アルツハイマー病における神経毒性を保護する薬剤として用いられることが期待される。特に本発明の医薬組成物は、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰ、Ｌ６４８Ｐ−ＡＰＰ、ＮＬ−ＡＰＰ、Ａ６１７Ｇ−ＡＰＰ、およびＮ１４１Ｉ−ＰＳ２からなる群より選択される変異体により引き起こされるＡＤに対する医薬として有効である。また、本発明の医薬組成物を用いて、アルツハイマー病以外にも、例えば脳虚血による神経細胞の細胞死に起因する疾患を予防することも考えられる（Ｔ．　Ｋｉｒｉｎｏ，　１９８２，Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．，　２３９：　５７−６９）。その他、痴呆を伴うパーキンソン病（Ｍ．Ｈ．　Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２７６：　２０４５−２０４７）、びまん性レービー小体（Ｌｅｗｙ　ｂｏｄｉｅｓ）病（Ｍ．Ｇ．　Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９５：　６４６９−６４７３）、ダウン症に伴う痴呆なども、治療や予防の対象となり得る。また、ＡＰＰの類縁分子である　ＡＰＬＰ１　が、先天性ネフローゼ症候群の原因遺伝子といわれている（Ｌｅｎｋｋｅｒｉ，　Ｕ．　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８，　Ｈｕｍ．　Ｇｅｎｅｔ．　１０２：　１９２−１９６）ことから、ネフローゼ症候群などの腎疾患も治療や予防の対象となり得る。また、Ｇｔｘが分化したオリゴデンドロサイトに強発現している事実（Ｋｏｍｕｒｏ，　Ｉ．　ｅｔ　ａｌ．，　１９９３，　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１２：　１３８７−１４０１）を考慮すると、多発性硬化症などの脱髄性疾患も治療や予防の対象となり得る。
【００３６】
本発明の医薬組成物は、有効成分自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化することも可能である。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、徐放剤などと適宜組み合わせて製剤化して投与することが考えられる。本発明の医薬組成物は、水溶液、錠剤、カプセル、トローチ、バッカル錠、エリキシル、懸濁液、シロップ、点鼻液、または吸入液などの形態であり得る。蛋白質や核酸の含有率は適宜決定すればよい。
【００３７】
患者への投与は、有効成分の性質に応じて、例えば経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、脊髄腔内、脳室内、または経口的に行われうるがそれらに限定されない。脳神経変性疾患の治療に用いる場合においては、本発明の医薬組成物は、静脈内、脊髄腔内、脳室内または硬膜内注射を含む任意の適当な経路で中枢神経系に導入するのが望ましい。投与量は、患者の年齢、体重、症状、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適宜適当な投与量を選択することが可能である。投与量、投与方法は、本発明の医薬組成物の有効成分の組織移行性、治療目的、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【００３８】
ホメオボックスを含む蛋白質の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では１回あたり約１０μｇから約１ｇ、好ましくは約１００μｇから約２００ｍｇ、より好ましくは約１．０から約５０ｍｇであると考えられる。ベクターの投与量も投与対象、対象臓器、症状、投与方法、ベクターの種類等により異なるが、ウイルスベクターであれば、レトロウイルスベクターの場合は例えば１０４〜１０９　プラーク形成単位（ＰＦＵ）、アデノウイルスベクターの場合は例えば１０７〜１０１３　ＰＵＦを投与することができる。
【００３９】
また、本発明は、上記のホメオボックスを含む蛋白質の細胞毒性に対する抑制活性を検出する方法であって、（ａ）ホメオボックスを含む蛋白質の存在下、細胞において細胞毒性を誘導する工程、（ｂ）該細胞の細胞毒性を検出する工程、および（ｃ）該蛋白質の非存在下または工程（ａ）に比べ低用量の存在下において検出される該細胞の細胞毒性と比べた時の工程（ｂ）で検出される細胞毒性の低下を、細胞毒性に対する該蛋白質の抑制活性と関連付ける工程、を含む方法を提供する。細胞毒性は、例えばＡＤ関連変異体の発現により誘導することができ、具体的にはＶ６４２Ｉ−ＡＰＰ、Ｌ６４８Ｐ−ＡＰＰ、ＮＬ−ＡＰＰ、および　Ａ６１７Ｇ−ＡＰＰ　等のＡＰＰ変異体、ならびにＮ１４１Ｉ−ＰＳ２などのＰＳ変異体を用いることができる。この方法を神経細胞に適用する場合には、神経細胞としては、例えば株化神経細胞（例えば　Ｆ１１　細胞）や初代神経培養（例えばラット脳皮質初代培養）等を用いることができる。上記の検出方法は、特にアポトーシスに対するホメオボックス含有蛋白質の抑制活性の検出に有用である。また当該検出方法は、カスパーゼ依存性の細胞毒性に対するホメオボックス蛋白質の抑制活性の検出に有用である。例えば、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰおよびＬ６４８Ｐ−ＡＰＰの低および高発現による神経細胞毒性、ならびにＮＬ−ＡＰＰ、Ａ６１７Ｇ−ＡＰＰ、およびＮ１４１Ｉ−ＰＳ２の低発現による神経細胞毒性は、カスパーゼ阻害剤感受性の細胞毒性を誘導し、これらによる細胞毒性は、ホメオドメインを含む蛋白質により有意に抑制される。細胞毒性の抑制活性は、実施例に記載された方法または他に記載の方法（例えば国際公開番号　ＷＯ００／１４２０４参照）に従って検出することができる。ホメオボックス含有蛋白質の存在下で検出された細胞毒性が、該ホメオボックス含有蛋白質の非存在下または工程（ａ）に比べ低用量の該蛋白質の存在下において検出される同じ細胞の細胞毒性に比べ低下すれば、この蛋白質は細胞毒性に対する抑制活性を有すると判断される。
【００４０】
具体的な方法を例示すれば、例えば　Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰまたはＬ６４８Ｐ−ＡＰＰなどのＦＡＤ遺伝子を発現するベクターを単独で、または活性を検出したいホメオボックス蛋白質を発現するベクターと共に神経細胞（例えばＦ１１細胞）にトランスフェクトし、一定時間（例えば７２時間）培養後、細胞死をトリパンブルー排除アッセイにより測定する。あるいは、ホメオボックス蛋白質を発現するベクターを予め細胞にトランスフェクトしておくか、または該蛋白質を予め調製しておき、この蛋白質の存在下または非存在下で細胞にＦＡＤ遺伝子をトランスフェクトして、細胞死を測定してもよい。ＦＡＤ遺伝子は、誘導性プロモーターを用いてコンディショナルに発現させることもできる。例えば実施例で用いられたエクダイソン（ＥｃＤ）誘導系を利用すれば、ＥｃＤの用量によりＦＡＤ遺伝子の発現量を制御することが可能であり、これによりＮＬ−ＡＰＰ、Ａ６１７Ｇ−ＡＰＰ、およびＮ１４１Ｉ−ＰＳ２等の発現の低誘導による細胞死を誘導することができる。このようにして誘導した細胞毒性に対する、ホメオボックス含有蛋白質の阻害効果を評価する。細胞死の測定はトリパンブルー排除アッセイ以外にも、形態変化、ＬＤＨ放出、またはアポトーシス（核の形態変化またはＤＮＡ断片化など）の測定によって行うことも可能である。
【００４１】
具体的な操作は、例えば本明細書に記載された方法に従って行うことができる。この方法は、様々な細胞における細胞毒性に対するホメオボックス蛋白質の抑制効果を定量するために用いられ得る。細胞としては特に制限はなく、細胞毒性を起し得るさまざまな細胞が用いられる。細胞死の誘導は、それぞれの細胞に応じて公知の細胞死誘導系を使用することができる。また、神経細胞を用いて、細胞毒性に影響を与え得るさまざまな刺激、環境変化、または遺伝子発現などの諸条件がホメオボックス含有蛋白質の細胞死抑制効果に及ぼす効果を検出するためにも用いられ得る。また、このような検出は、生物種や亜種、または個体間に存在し得る、細胞死におけるホメオボックス含有蛋白質に対する感受性の違いを検出するために用いられ得る。これにより、例えば民族、人種、または個人間（例えば変異や多型による感受性の違い等）などにおいて、ホメオボックス含有蛋白質の有効性を検討することができる。このような方法により、例えば臨床適用に向けた詳細な条件検討を行うことも可能である。
【００４２】
また、ホメオボックス含有蛋白質は、特に細胞毒性のカスパーゼ依存性成分を強く抑制する。上記の検出方法により細胞毒性の抑制を調べることにより、ホメオボックス含有蛋白質の細胞毒性抑制の特異性を解析したり、また細胞毒異性の抑制の定量結果に従って細胞毒性を分類することも可能と考えられる。実施例に記載したように、ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２はＡＰＰのＳｙｄｎｅｙ変異による細胞死を保護したが、Ｆｌｅｍｉｓｈ変異による細胞死は保護しなかった。このことから、ＦＡＤ変異遺伝子による神経細胞死は２つのグループに分類され得る。１つはホメオボックス含有蛋白質感受性のグループであり、他方はホメオボックス含有蛋白質抵抗性のグループである。ホメオボックス含有蛋白質による遺伝子治療が検討される場合においては、このような分類は重要になると思われる。本発明の検出方法に従ってＡＤの各種変異体のホメオボックス含有蛋白質感受性を定量することにより、ＡＤを分類することができる。
【００４３】
また、本発明は、ホメオボックス含有蛋白質による細胞毒性抑制に対する被検化合物の効果を検出する方法を提供する。この方法は、（ａ）該被検化合物およびホメオボックス含有蛋白質の存在下、細胞において細胞毒性を誘導する工程、（ｂ）該細胞の細胞毒性を検出する工程、および（ｃ）該被検化合物の非存在下または工程（ａ）に比べ低用量の存在下において検出される該細胞の細胞毒性と比べた時の工程（ｂ）で検出された細胞毒性の低下および上昇を、それぞれ細胞毒性に対する該蛋白質の抑制活性に及ぼす該被検化合物の促進および抑制効果と関連付ける工程、を含む方法である。この方法は、ホメオボックス含有蛋白質による細胞毒性の抑制効果を促進または抑制する化合物をアッセイするために有用である。ホメオボックス含有蛋白質は、染色体中の標的ＤＮＡへの結合を介して細胞毒性抑制効果を発揮する可能性が高い。この方法を用いれば、該蛋白質の標的ＤＮＡへの結合を阻害し得る候補化合物や、逆に促進し得る候補化合物の作用を検証することができる。また、この検出方法を用いて、ホメオボックス含有蛋白質による細胞毒性の抑制を調節（促進または抑制）する化合物をスクリーニングすることも可能である。この方法は、（ａ）被検化合物およびホメオボックス含有蛋白質の存在下、細胞において細胞毒性を誘導する工程、（ｂ）該細胞の細胞毒性を検出する工程、および該被検化合物の非存在下または工程（ａ）に比べ低用量の存在下において検出される該細胞の細胞毒性と比べ、工程（ｂ）で検出される細胞毒性を低下または上昇させる化合物を選択する工程を含む方法、を含む方法である。工程（ｃ）においては、必要に応じて任意の対照における場合と比較することができる。例えば、工程（ｃ）において、被検化合物非存在下において検出した場合に比べ、被検化合物存在下において細胞毒性を促進または抑制する化合物を選択することができる。細胞毒性を促進する化合物は、スクリーニングに用いたホメオボックス含有蛋白質による細胞毒性の抑制を阻害する化合物の候補となり、細胞毒性を抑制する化合物は、該ホメオボックス含有蛋白質による細胞毒性の抑制作用をさらに促進する化合物の候補となる。また、上記のスクリーニングにおいて、被検試料とは別の化合物における場合を対照とすることもできる。例えばホメオボックス含有蛋白質による細胞毒性の抑制を調節し得る別の化合物を用いて細胞毒性を検出し、工程（ｃ）において、この別の化合物の存在下における場合に比べ、被検化合物存在下において細胞毒性を促進または抑制する化合物を選択することもできる。このようなスクリーニングにおいては、ホメオボックス含有蛋白質による細胞毒性の抑制の調節能に関して、既存の化合物よりもさらに高い効果を有する化合物をスクリーニングすることができる。
【００４４】
スクリーニングに用いる被検化合物またはそれを含む試料としては、例えば、精製蛋白質（抗体を含む）、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成ペプチドのライブラリー、細胞抽出液、細胞培養上清、合成低分子化合物のライブラリー、土壌などの天然材料、放線菌ブロースなどの細菌放出物質を含む溶液などが挙げられるが、これらに制限されない。
【００４５】
細胞毒性の誘導およびホメオボックス含有蛋白質の導入または発現は、例えば実施例に従って行うことができる。被検化合物を細胞に適用するタイミングに特に制限はなく、ホメオボックス含有蛋白質を導入または発現させる前、後、または同時に適用することができる。また被検化合物の適用方法に制限はなく、培養細胞系であれば、例えば培地に添加される。また核酸であれば、例えば適当なベクターを介して細胞内に導入される。その他、任意の投与方法により、該試料を適用することができる。
【００４６】
上記の化合物の効果の検出方法またはスクリーニング方法により細胞毒性を低下させることが見出された化合物は、ホメオボックス含有蛋白質の細胞毒性抑制活性を促進する化合物の候補となり、アルツハイマー病を含む細胞毒性を伴う疾患の予防や治療への応用が考えられる。
【００４７】
また、細胞毒性を調節する化合物をスクリーニングするために、ホメオボックス含有蛋白質に結合する化合物をスクリーニングすることが考えられる。この方法は、（ａ）被検化合物およびホメオボックス含有蛋白質を接触させる工程、（ｂ）該被検化合物および該蛋白質の結合を検出する工程、および（ｃ）該蛋白質に結合する化合物を選択する工程、を含む方法である。ホメオボックス含有蛋白質に結合する化合物は、該蛋白質のアンタゴニストまたはアゴニストの候補となる。
【００４８】
スクリーニングに用いるホメオボックス含有蛋白質は特に制限されないが、脳神経疾患の治療薬のスクリーニング等においては脳神経で発現するホメオボックス含有蛋白質が好ましい。具体的には特にＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２が挙げられる。ホメオボックス含有蛋白質は、スクリーニングの手法に応じて、可溶性蛋白質として、また担体に結合させた形態としてスクリーニングに用いることができる。該蛋白質は標識されていてもよい。標識としては、放射性同位元素による標識、蛍光物質による標識、ビオチンやジゴキシゲニンによる標識、タグ配列の付加などが挙げられる。
【００４９】
スクリーニングに用いる被検試料としては、例えば、精製タンパク質（抗体を含む）、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成ペプチドのライブラリー、細胞抽出液、細胞培養上清、合成低分子化合物のライブラリー、土壌などの天然材料、放線菌ブロースなどの細菌放出物質を含む溶液などが挙げられるが、これらに制限されない。被検試料は、必要に応じて適宜標識して用いられる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識などが挙げられるが、これらに制限されない。
【００５０】
例えば、ホメオボックス含有蛋白質と結合する蛋白質をスクリーニングする場合は、ホメオボックス含有蛋白質を固定したアフィニティーカラムにそれと結合する蛋白質を発現していることが予想される組織または細胞の細胞抽出物をのせ、カラムに特異的に結合する蛋白質を精製することにより、ホメオボックス含有蛋白質に結合する蛋白質のスクリーニングを実施することが可能である。
【００５１】
さらに、ホメオボックス含有蛋白質と結合する蛋白質を発現していることが予想される組織若しくは細胞よりファージベクターを用いたｃＤＮＡライブラリーを作製し、アガロース上にプラークを形成させ、標識したホメオボックス含有蛋白質を用いてウエストウエスタンブロッテイング法によりスクリーニングしたり、ＧＡＬ４　ＤＮＡ結合領域などのＤＮＡ結合ペプチドおよびＧＡＬ４転写活性化領域などの転写活性化ペプチドを、それぞれホメオボックス含有蛋白質および被検蛋白質との融合蛋白質として発現させ、ＤＮＡ結合ペプチドの結合配列を有するプロモーターの下流に連結させたレポーター遺伝子の発現を通してホメオボックス含有蛋白質と被検蛋白質との結合を検出する「ｔｗｏハイブリッドシステム」等に従い実施することも可能である。被検試料としては、例えば脳皮質組織、神経細胞株、または神経芽細胞腫や奇形腫細胞などから調製することが好ましい。神経細胞株としては、例えば　Ｆ１１細胞、ＰＣ１２細胞（Ｌ．　Ａ．　Ｇｒｅｅｎｅ　および　Ａ．　Ｓ．　Ｔｉｓｃｈｌｅｒ，　１９７６，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７３：　２４２４−２４２８）、ＮＴＥＲＡ２細胞（Ｊ．　ＳｋｏｗｒｏｎｓｋｉおよびＭ．　Ｆ．　Ｓｉｎｇｅｒ，　１９８５，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８２：　６０５０−６０５４）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（Ｌ．　Ｏｄｅｌｓｔａｄ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８１，　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．，　２２４：　６９−８２）等が挙げられる。
【００５２】
また、ホメオボックス含有蛋白質に結合するポリヌクレオチドをスクリーニングする場合には、例えばサウスウェスタン法またはゲルシフト法などにより蛋白質とＤＮＡの結合を検出することができる。
【００５３】
また、固定化したホメオボックス含有蛋白質に、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーなどを作用させ、結合する分子をスクリーニングすることも考えられる。また、表面プラズモン共鳴現象を利用した結合の検出によるスクリーニングも可能である（例えば　ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ社製）など）。これらのスクリーニングは、コンビナトリアルケミストリー技術を用いたハイスループットスクリーニングにより行うことも可能である。
本発明のスクリーニングにより得られたホメオボックス含有蛋白質に結合する化合物は、ホメオボックス含有蛋白質の活性を調節する化合物の候補となり、アルツハイマー病を含む細胞毒性を伴う疾患の予防や治療への応用が考えられる。
【００５４】
また、ホメオボックスを含む蛋白質の細胞毒性の抑制活性を調節する化合物を選択する方法としては、（ａ）被検化合物の存在下、該蛋白質のＤＮＡへの結合を検出する工程、（ｂ）該被検化合物の非存在下または工程（ａ）に比べ低用量の存在下において検出される該蛋白質のＤＮＡへの結合と比べ、工程（ａ）における該結合を上昇または低下させる化合物を選択する工程を含む方法が挙げられる。ホメオボックス含有蛋白質とＤＮＡとの結合は、上記に記載した方法により検出することができる。ホメオボックス含有蛋白質のＤＮＡへの結合を抑制する化合物は、該蛋白質の細胞毒性の抑制活性を抑制する化合物の候補となり、逆に該蛋白質のＤＮＡへの結合を促進する化合物は、該細胞毒性の抑制活性を促進する化合物の候補となる。
【００５５】
また、ホメオボックス含有蛋白質遺伝子の発現を調節する化合物をスクリーニングすることにより、細胞毒性を調節する化合物のスクリーニングを行うことも可能である。例えば、ホメオボックス含有蛋白質遺伝子の発現を上昇させる化合物が得られれば、これにより該遺伝子の発現を上昇させ細胞毒性を抑制することができる。本発明は、細胞毒性を調節する化合物のスクリーニング方法であって、ホメオボックス含有蛋白質をコードする遺伝子の発現を上昇または低下させる化合物を選択することを特徴とする方法に関する。このスクリーニングは、具体的には、ホメオボックス含有蛋白質をコードする遺伝子またはその発現制御領域を利用して、細胞内、生体内、または　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　発現系等において該遺伝子の発現（転写または翻訳など）を調節しうる化合物を選択する工程を含む方法である。このスクリーニングにより単離し得る化合物は、細胞毒性の調節剤（促進剤または抑制剤）となり、アルツハイマー病を含む細胞毒性を伴う疾患の予防や治療へ用いられ得る。
【００５６】
上記のスクリーニング方法は、例えば（ａ）被検化合物の存在下、ホメオボックス含有蛋白質をコードする遺伝子を内因的に保持する細胞における該遺伝子の発現を検出する工程、（ｂ）該被検化合物の非存在下または工程（ａ）に比べ低用量の存在下において検出される該遺伝子の発現と比べ、工程（ａ）で検出される発現を上昇または低下させる化合物を選択する工程、を含む方法により実施することができる。ここで遺伝子の発現には、転写および翻訳が含まれる。
【００５７】
例えば、ホメオボックス含有蛋白質をコードする遺伝子が発現している細胞を被検試料と共に培養し、該遺伝子の発現をノーザン解析やＲＴ−ＰＣＲ法などのｍＲＮＡを検出する方法、あるいはウェスタンブロッティング、免疫沈降、ＥＬＩＳＡなどの蛋白質を検出する方法などにより検出し、被検試料を添加しない場合と比較して、該遺伝子の発現を促進または阻害する化合物を選択することにより、目的の化合物スクリーニングすることができる。スクリーニングに用いる細胞に特に制限はないが、ＡＤなどの脳神経疾患の治療薬のスクリーニングを目的とする場合には神経細胞が好適である。
【００５８】
また、ホメオボックス含有蛋白質をコードする遺伝子の発現制御領域の活性化または不活性化を指標とする方法によって、生体内または細胞内において該遺伝子の発現を調節しうる化合物をスクリーニングすることも考えられる。すなわち、上記のホメオボックス含有蛋白質をコードする遺伝子の発現を調節する化合物を選択することによる、ホメオボックスを含む蛋白質の細胞毒性の抑制活性を調節する化合物を選択する方法には、（ａ）被検化合物の存在下、該蛋白質をコードする遺伝子を内因的に保持する細胞における該遺伝子のプロモーターの活性を検出する工程、および（ｂ）該活性を上昇または低下させる化合物を選択する工程、を含む方法が含まれる。このスクリーニングは、例えば（ａ）ホメオボックス含有蛋白質をコードする遺伝子の内因的転写制御配列の下流に機能的に結合されたレポーター遺伝子を有するベクターが導入された細胞に、被検化合物を接触させる工程、（ｂ）該レポーター遺伝子の発現を検出する工程、および（ｃ）該被検化合物を該細胞に接触させない場合（対照）と比較して、該レポーター遺伝子の発現を調節（促進または阻害）する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法により実施することができる。
【００５９】
ここで「内因的転写制御配列」とは、ホメオボックス含有蛋白質をコードする遺伝子を天然に保持している細胞において、該遺伝子の転写を制御している配列のことを言う。このような配列は、プロモーター、エンハンサー、および／またはリプレッサーなどが含まれる。これら配列としては、例えば、ホメオボックス含有蛋白質をコードする遺伝子の上流領域のＤＮＡを用いることができる。例えば、該蛋白質をコードする遺伝子の転写開始点（または翻訳開始コドン）からその上流数ｋｂまでのＤＮＡ断片には、該遺伝子の内因的転写制御配列が含まれていると考えられる。この断片をレポーター遺伝子と連結することで、レポーター遺伝子の発現を、該蛋白質をコードする遺伝子の転写制御下に置くことが可能である。上流領域は適宜欠失または変異を導入して転写制御活性を測定し、転写制御に関与している配列を特定してその断片を用いることも可能である。現在、転写制御に関与する転写因子が結合する多くの転写制御配列が知られている。該蛋白質をコードする遺伝子の上流域から、これら既知の転写制御配列を同定することで、内因的転写制御配列を特定することも考えられる。通常、遺伝子の転写を制御している配列は、１つの遺伝子に複数存在しているが、本発明のスクリーニングにおいては、それらのいずれか、またはその組み合わせを用いることができる。内因的転写制御配列は、他のプロモーターとのキメラにしてもよい。キメラプロモーターは、転写制御の試験においてはよく用いられている。キメラプロモーターの作製に用いる他のプロモーターとしては、例えばＳＶ４０初期プロモーター由来の最小プロモーターなどが挙げられる。なお、「機能的に結合された」とは、該転写制御配列の活性化に応答して、その下流に結合されたレポーター遺伝子が発現しうるように、該転写制御配列とレポーター遺伝子が結合していることを指す。
【００６０】
具体的には、例えば、ホメオボックス含有蛋白質をコードする配列若しくはその一部をプローブとしたゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより、該蛋白質をコードする遺伝子の転写制御領域（プロモーター、エンハンサーなど）をクローニングし、これを適当なレポーター遺伝子（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子など）の上流に挿入した発現ベクターを作製し、これを哺乳動物細胞に導入する。次いで、被検試料を該細胞に接触させ、レポーター活性を検出し、被検試料を接触させない細胞におけるレポーター活性と比較して、レポーター活性を増加または減少させる化合物を選択することにより、細胞内において目的のホメオボックス蛋白質遺伝子の発現を調節しうる化合物をスクリーニングすることができる。このスクリーニングは遺伝子の発現をレポーター活性を指標として検出するため、上記したノーザン解析などの直接的な検出と比較して簡便である。
【００６１】
また、プロモーター配列を特定しなくても、例えばジーンターゲティングによりゲノム中のホメオボックス含有蛋白質をコードする遺伝子の蛋白質コード領域をレポーター遺伝子のそれと置換することにより、レポーター遺伝子をノックインした細胞または動物を用いてスクリーニングを行うことも可能である。このためには、置換したいレポーター遺伝子の前後に、相同組換えのためのゲノム配列を連結したジーンターゲティングベクターを細胞に導入し、相同組換えを起こした細胞を選択する。特定の遺伝子部位にレポーター遺伝子をノックインする技術は当業者に公知である。
【００６２】
また、細胞毒性を調節する遺伝子をスクリーニングするために、細胞内においてホメオボックス含有蛋白質が標的とする遺伝子をスクリーニングすることも考えられる。ホメオボックス含有蛋白質は核内の標的遺伝子の転写調節領域に結合することにより標的遺伝子の発現を制御すると考えられる。従って、該蛋白質が標的とする遺伝子が得られれば、該標的遺伝子を用いて細胞毒性を制御することが可能となる。このような方法は、（ａ）ホメオボックス含有蛋白質の存在下または非存在下で細胞の遺伝子発現を検出する工程、（ｂ）ホメオボックス含有蛋白質の存在下において、該蛋白質の非存在下に比べ発現が上昇または低下する遺伝子を選択する工程、を含む。具体的には、例えばホメオボックス含有蛋白質を発現させた細胞と発現させない対照細胞とでディファレンシャルディスプレイやサブトラクションなどの公知の方法により、発現が変化する遺伝子をスクリーニングすることができる。また、ＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップなどを用いて、より効率的にスクリーニングを行うことも可能である。
【００６３】
また、ある対象とする遺伝子の発現が、ホメオボックス含有蛋白質の発現により変化するかを調べることにより、細胞毒性を調節する遺伝子の評価を行うこともできる。すなわち本発明は、細胞毒性を調節する遺伝子を選択する方法であって、ホメオボックス含有蛋白質の存在下または非存在下で細胞の遺伝子発現を検出する工程、および該ホメオボックス含有蛋白質の存在下において発現が変化する遺伝子を選択する工程、を含む方法にも関する。ホメオボックス含有蛋白質により発現が変化する遺伝子群のより詳細な解析も可能である。このような方法は、転写産物（ｍＲＮＡ）や翻訳産物（蛋白質）の検出により行うことができる他、プロモーターの下流に連結させたレポーター遺伝子を用いたプロモーター解析により行うことも可能である。例えば蛋白質の検出は、ウェスタン解析やＥＬＩＳＡ、免疫沈降などの方法で行うことができる他、ペプチドチップやプロテインチップを用いた　ＨＴＳ（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）により実施することもできる。
【００６４】
スクリーニングにより選択される化合物を細胞毒性抑制のための医薬として用いる場合、その投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば１回あたり約１０μｇから約１ｇ、好ましくは約１００μｇから約２００ｍｇ、より好ましくは約１．０から約５０ｍｇであると考えられる。
【００６５】
また本発明は、ホメオボックスを含む蛋白質に結合する抗体、またはホメオボックスを含む蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖の少なくとも１５ヌクレオチド以上を含むポリヌクレオチドを含む、細胞毒性の抑制レベルの検査薬に関する。また本発明は、該ポリヌクレオチドまたは該抗体を用いた細胞毒性の抑制レベルの検査方法および細胞毒性の抑制レベルの検査における使用に関する。これらのポリヌクレオチドおよび抗体を用いて、ホメオボックスを含む蛋白質のレベルを検出したり、あるいはホメオボックスを含む蛋白質の構造変異または発現調節の異常を検出することにより、被検試料における細胞毒性を抑制するホメオボックス蛋白質が存在するかまたはその発現量を調べたり、あるいはホメオボックスを含む蛋白質を用いた治療において、投与されたホメオボックス蛋白質、ベクターから発現したホメオボックス蛋白質、または発現を誘導されたホメオボックス蛋白質をモニターすることが可能である。
【００６６】
上記の細胞毒性の抑制レベルの検査の１つの態様は、具体的には、（ａ）ホメオボックスを含む蛋白質に結合する抗体、またはホメオボックスを含む蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖の少なくとも１５ヌクレオチド以上を含むポリヌクレオチドを用いて、被検試料における該ホメオボックス含有蛋白質をコードする遺伝子の発現を検出する工程、（ｂ）対照試料における発現と比べ工程（ａ）で検出される発現が低下していることを、細胞毒性の抑制レベルの低下と、発現が上昇していることを細胞毒性の抑制レベルの上昇と関連付ける工程、を含む方法である。また細胞毒性の抑制レベルの検査の他の態様は、具体的には、（ａ）ホメオボックスを含む蛋白質に結合する抗体、またはホメオボックスを含む蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖の少なくとも１５ヌクレオチド以上を含むポリヌクレオチドを用いて、被検試料における該ホメオボックス含有蛋白質をコードする遺伝子の変異を検出する工程、（ｂ）変異の存在を細胞毒性の抑制レベルの低下と関連付ける工程、を含む方法である。
【００６７】
例えば、被検試料におけるホメオボックスを含む蛋白質量を、ウェスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡなどで検出する。あるいは該蛋白質をコードするｍＲＮＡの発現量をノーザンブロッティングまたはＲＴ−ＰＣＲ等により検出する。該蛋白質量またはｍＲＮＡ発現が対照試料（例えば正常試料、またはホメオボックス蛋白質を用いた治療時においては未治療部位の試料など）に比べ上昇している場合には、該被検試料は細胞毒性に対する耐性が上昇していることを示唆する。反対に対照試料に比べ低下している場合には、該被検試料は細胞毒性に対する耐性が低下していることを示唆する。また、該遺伝子または発現された蛋白質に変異を有していれば、その試料における細胞毒性に対する耐性（抑制レベル）が低下していると判断される。また、プロモーター変異により発現の低下する場合にも、細胞毒性に対する抑制レベルが低下すると判断される。このような検査は特にアポトーシス性の細胞毒性を伴う疾患の検査に有用である。またカスパーゼ依存性の細胞毒性の検査に有用である。そのような疾患としては、特にＡＤが挙げられる。
【００６８】
本発明において抗体には、ポリクーナル抗体およびモノクローナル抗体が含まれる。ポリクローナル抗体は、例えばホメオボックスを含む蛋白質またはその部分ペプチドを調製し、これを抗原にウサギ、ヤギ、ヒツジなどを免疫してポリクローナル抗体を作製する。抗原ペプチドは、適宜他の蛋白質、例えばキーホールリンペットヘモシアニンや血清アルブミンなどのキャリア蛋白質に結合させて免疫することができる。モノクローナル抗体は、免疫したマウスやラットの脾細胞を用い、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることにより作製することができる。抗体の作製は、公知の方法に従って行うことができる（Ｅｄ．　Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｄ　Ｌａｎｅ，　”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　１９８８）。
【００６９】
ポリクローナル抗体は血清から、モノクローナル抗体はハイブリドーマ培養上清またはハイブリドーマを接種した動物の腹水から、硫安分画、プロテインＧセファロースカラム、抗原を固定したアフィニティーカラムなどの一般的な生化学的手法で抗体を精製することができる。本発明の抗体は、ホメオボックス含有蛋白質に結合する限り、その抗体断片であってもよい。例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはそれらの修飾物が含まれる。また、ヒト型抗体もしくはヒト抗体なども含まれる。これにより調製された抗体は、例えば、ホメオボックス含有蛋白質の構造変異の検査や診断、該蛋白質の発現量の検出などに利用することが可能である。
【００７０】
また、上記ポリヌクレオチドにおいて「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（またはＡ：Ｕ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖核酸の一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば９５％以上）の塩基配列上の同一性を有すればよい。配列の同一性は、本明細書の記載に従って決定することができる。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。また、ＰＮＡなどであってもよい。このようなポリヌクレオチドは、ホメオボックス含有蛋白質をコードするＤＮＡやＲＮＡの検出や増幅に用いるプローブやプライマーとして用いることができる。
【００７１】
これらの抗体またはポリヌクレオチドを含む検査薬は、これら自体を直接用いる以外に、例えば滅菌水、生理食塩水、緩衝剤、塩、安定剤、保存剤、界面活性剤、他の蛋白質（ＢＳＡなど）等と適宜組み合わせてもよい。これらは混ぜ合わせて組成物としてもよく、使用時に混合されるまで分離されていてもよい。
【００７２】
また、上記の抗体およびポリヌクレオチドを用いて、細胞毒性を伴う疾患の検査、例えばアルツハイマー病の検査を行うことができる。ホメオボックス含有蛋白質は細胞毒性を抑制する活性を有する。従って、これらの蛋白質またはこれをコードする遺伝子の変異や多型、および発現異常は、疾患の発症や進行の原因となる可能性がある。このような検査は、例えば、（ａ）ホメオボックスを含む蛋白質に結合する抗体、またはホメオボックスを含む蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖の少なくとも１５ヌクレオチド以上を含むポリヌクレオチドを用いて、被検試料における該ホメオボックス含有蛋白質をコードする遺伝子の発現を検出する工程、（ｂ）対照試料における発現と比べ工程（ａ）で検出される発現が低下していることを、細胞毒性を伴う疾患の発症または進行の促進と、発現が上昇していることを該疾患の発症または進行の抑制と関連付ける工程、を含む方法である。また上記疾患の検査の他の態様は、具体的には、（ａ）ホメオボックスを含む蛋白質に結合する抗体、またはホメオボックスを含む蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖の少なくとも１５ヌクレオチド以上を含むポリヌクレオチドを用いて、被検試料における該ホメオボックス含有蛋白質をコードする遺伝子の変異を検出する工程、（ｂ）変異の存在を細胞毒性を伴う疾患の発症または進行の促進と関連付ける工程、を含む方法である。このような検査も、本発明の細胞毒性の抑制レベルの検査に含まれる。
【００７３】
上記疾患の検査には、疾患を発症している患者の検査のみならず、ホメオボックス含有蛋白質をコードする遺伝子の変異（構造的または発現量の変異）に起因して疾患を発症する可能性や、発症した場合の進行や重症度を予測するために行う、該蛋白質をコードする遺伝子またはそのアレルバリアントの発現量の検査、およびそれらの変異の検査も含まれる。すなわち、該遺伝子の発現の低下や変異、多型などにより、表面上は未だ症状を発現していない場合においても、疾患の発症の可能性や、その症状が重症化する危険性が上昇しているものと考えられる。疾患の検査は、例えばホメオボックス含有蛋白質をコードする遺伝またはそのアレルバリアントの検出を通して行われる。「遺伝子の検出」には、遺伝子の存在の検出、変異または多型（ＳＮＰなどを含む）の検出、および発現の検出などの遺伝子を基にする検出が含まれる。神経組織を含む組織内におけるＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２などのホメオボックス含有蛋白質遺伝子の変異や多型、または発現の低下の検査を、ＡＤを含む神経またはその他の臓器変性疾患の診断または予後判定に用いることができる可能性がある。例えば同じＡＤ患者でも、ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２に変異や多型を有していたり、または発現が低い患者は、その他の患者に比べ病気の進行が急速で、予後が不良である可能性が考えられる。検査方法としては、例えばホメオボックス含有蛋白質に対する抗体を用いたＲＩＡ法により、組織サンプル中の濃度を測定したり、生検材料を免疫組織染色法で検査することが考えられる。また、ウェスタンブロットにより分子量の変異を検査することも考えられる。また、例えば上記ポリヌクレオチドをプライマーにして患者のゲノムからホメオボックス含有蛋白質をコードする遺伝子を増幅して配列を解析し、その変異や多型を検査するゲノム診断を行うことが考えられる。また、該蛋白質をコードする遺伝子による遺伝子治療の際に、上記ポリヌクレオチドや抗体を用いて導入遺伝子の発現レベルをモニターすることも考えられる。このような検査も、本発明における疾患の検査に含まれる。
【００７４】
【実施例】
以下に実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら制限されるものではない。なお、以下の実施例に記載した全ての実験は独立のトランスフェクションにおいて少なくとも３回繰り返した。統計解析はスチューデントのｔ検定により実施し、ｐ＜０．０５　を有意とした。
［実施例１］　細胞および遺伝子
ｐｃＤＮＡプラスミド（Ｆｕｎｋ，　Ｃ．Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９０）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８７：　５６３８−５６４２）またはｐＩＮＤプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングされた　Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰ、ＮＬ−ＡＰＰ、Ａ６１７Ｇ−ＡＰＰ、Ｌ６４８Ｐ−ＡＰＰ、Ｍ１４６Ｌ−ＰＳ１、Ｎ１４１Ｉ−ＰＳ２　ｃＤＮＡは、以前記載されている（Ｙａｍａｔｓｕｊｉ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９６ａ）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７２：　１３４９−１３５２；　Ｙａｍａｔｓｕｊｉ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９６ｂ）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１５：　４９８−５０９；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００ａ）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５：　３４５４１−３４５５１；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００１ａ）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９８：　６３３６−６３４１；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００１ｂ）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　２８３：　４６０−４６８；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００１ｃ）Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　２１：　９２３５−９２４５）。ｐＥＦ−ＢＯＳプラスミド（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，　Ｓ．　ａｎｄ　Ｎａｇａｔａ，　Ｓ．　（１９９０）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１８，　５３２２）中のＧ８５Ｒ−ＳＯＤ１　ｃＤＮＡは以前記載されている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００１ａ）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９８：　６３３６−６３４１）。ラット胚初代神経およびマウス神経芽細胞腫のハイブリッド細胞であるＦ１１（Ｐｌａｔｉｋａ，　Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８５）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８２：３４９９−３５０３）は、１８％ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ；　ＦＢＳ，　Ｈｙｃｌｏｎｅ，　Ｌｏｇａｎ，　ＵＴ）および抗生物質を添加したＨａｍ’ｓ　Ｆ−１２（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，　ＭＤ）で増殖させた。ＥｃＤ受容体（ＥｃＤ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ；　ＥｃＲ）およびレチノイドＸ受容体（ｒｅｔｉｎｏｉｄ　Ｘ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ；　ＲＸＲ）の両方を安定に過剰発現する細胞である　Ｆ１１／ＥｃＲ　は、共発現ベクター　ｐＶｇＲＸＲ　およびゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）選択（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，　Ｃａｒｌｓｂａｄ，　ＣＡ）を用いて、以前の記載に従って樹立した（国際公開番号　ＷＯ００／１４２０４参照；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００ａ）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５：　３４５４１−３４５５１）。全長　Ｄｌｘ４　ｃＤＮＡ　は　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　から入手した。他の材料は商業的に入手した。
ベクターの導入により発現させたＡＰＰ、ＰＳ１、ＰＳ２、およびＳＯＤ１　のイムノブロット解析を以前記載のように行った（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００ａ）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５：　３４５４１−３４５５１；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００１ａ）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９８：　６３３６−６３４１；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００１ｂ）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．　２８３：　４６０−４６８；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００１ｃ）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　２１：　９２３５−９２４５；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）　Ｊ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｅｘｐ．　Ｔｈｅｒ．　３００：　７３６−７４５；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．　８０：　４２６−４３７）。
【００７５】
［実施例２］　トランスフェクションプロトコル
（Ｆ１１細胞）
ｐｃＤＮＡ、ｐＥＦ−ＢＯＳ、または　ｐＥＦ４／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プラスミドのＦ１１細胞への一過的トランスフェクションにおいては、Ｆ１１細胞を　６ウェルプレートに　７×１０４　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ　で撒種し、１８％　ＦＢＳ　を含む　Ｈａｍ’ｓ　Ｆ−１２で１２〜１６時間培養し、その後血清の非存在下で３時間プラスミドをトランスフェクトした（各ウェル　０．７５μｇ　ｐｃＤＮＡプラスミド、０．７５μｇ　ｐＥＦプラスミド、３μｌ　ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ、および　６μｌ　ＰＬＵＳ試薬；　ＧｉｂｃｏＢＲＬ）。続いて　１８％　ＦＢＳ　を含む　Ｈａｍ’ｓ　Ｆ−１２で２時間インキュベートした後、１０％　ＦＢＳ　を含む　Ｈａｍ’ｓ　Ｆ−１２で培養した。トランスフェクションの開始から４８時間後に、トリパンブルー排除により細胞死率を測定した（１．５μｇプロトコル）。幾つかの実験は、０．５μｇ　ｐｃＤＮＡ、０．５μｇ　ｐＥＦ４−ｈＧｔｘ、２μｌ　ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ、および　４μｌ　ＰＬＵＳ試薬により実施し、トランスフェクションから７２時間後に細胞死率を測定した（０．５μｇプロトコル）。複数の研究（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔａｌ．　（２０００ａ）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５：　３４５４１−３４５５１；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００１ａ）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９８：　６３３６−６３４１；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００１ｃ）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　２１：　９２３５−９２４５；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）　Ｊ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｅｘｐ．　Ｔｈｅｒ．　３００：　７３６−７４５；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．　８０：　４２６−４３７；　Ｓｕｄｏ，　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００１）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　２８２：　５４８−５５６）により、Ｆ１１細胞を用いた０．５μｇプロトコルは、Ｆ１１／ＥｃＲ細胞系の　１μｇ　ｐＩＮＤのトランスフェクションおよび　１０μＭ　ＥｃＤ処理におけるコード蛋白質の発現を模倣し、Ｆ１１細胞を用いた１．５μｇプロトコルは、Ｆ１１／ＥｃＲ細胞の　１μｇ　ｐＩＮＤのトランスフェクションおよび　４０μＭ　ＥｃＤ処理におけるコード蛋白質の発現を模倣することが示されている。
【００７６】
（Ｆ１１／ＥｃＲ細胞）
ｐＩＮＤ　プラスミドの一過的トランスフェクションにおいては、Ｆ１１／ＥｃＲ細胞を　６ウェルプレートに　７×１０４　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ　で撒種し、１８％　ＦＢＳ　を含む　Ｈａｍ’ｓ　Ｆ−１２で１２〜１６時間培養し、その後　ＥｃＤ誘導性ｐＩＮＤプラスミドを血清の非存在下で３時間トランスフェクトした（１μｇ　ｐＩＮＤ、１μｇ　ｐＥＦ４−ｈＧｔｘ、４μｌ　ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ、および　８μｌ　ＰＬＵＳ試薬）（ｐＩＮＤプロトコル）。続いて以前の記載（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００ａ）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５：　３４５４１−３４５５１；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）　Ｊ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｅｘｐ．　Ｔｈｅｒ．　３００：　７３６−７４５；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．　８０：　４２６−４３７）通り、１８％　ＦＢＳ　を含む　Ｈａｍ’ｓ　Ｆ−１２で１６時間インキュベートした後、１０％　ＦＢＳ　を含む　Ｈａｍ’ｓ　Ｆ−１２で２時間培養し、その後ＥｃＤ（Ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ；　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃａｔ．　＃Ｈ１０１−０１）を培地に添加した。
【００７７】
［実施例３］　細胞毒性および生存アッセイ
細胞毒性はトリパンブルー排除アッセイにより、以前の記載に従ってアッセイした（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００ａ）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５：　３４５４１−３４５５１；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００ｂ）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　２０：　８４０１−８４０９；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００１ａ）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９８：　６３３６−６３４１；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．（２００１ｂ）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　２８３：　４６０−４６８；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００１ｃ）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　２１：　９２３５−９２４５；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）　Ｊ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｅｘｐ．　Ｔｈｅｒ．　３００：　７３６−７４５；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．　８０：　４２６−４３７）。具体的には、細胞を血清不含の培地に穏やかにピペッティングして細胞を懸濁し、２００μｌの細胞懸濁液に　０．４％　トリパンブルー溶液（Ｓｉｇｍａ，　Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，　ＭＯ）を５０μｌ室温で混合した（トリパンブルーの最終濃度は　０．０８％）。トリパンブルー溶液を混合後、３分以内に染色された細胞を計数した。細胞死率は全細胞中のトリパンブルー染色細胞の割合として決定した。従って、測定される細胞死率は、実験終了時における接着細胞および浮遊細胞の両者を含めた全細胞中の死細胞の集団を表す。細胞生存率アッセイ（Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ−８，　Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，　Ｏｓａｋａ，　Ｊａｐａｎ）はＷＳＴ−８［２−（２−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（２，４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，　ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ；　２−（２−，メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジサルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，　一ナトリウム塩］を用いて、以前に記載したように行った（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００ｂ）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　２０：　８４０１−８４０９）。Ｆ１１系において、トリパンブルー排除アッセイにより測定した細胞死率はＷＳＴ−８アッセイにより測定した細胞生存率とよく逆相関していることが実証されている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００ｂ）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　２０：　８４０１−８４０９）。
【００７８】
［実施例４］　疾患ベースのデストラップスクリーニング
ＥｃＤ処理により誘導的にＶ６４２Ｉ−ＡＰＰを過剰発現するＦ１１／ＥｃＲ／Ｖ６４２Ｉ細胞が以前記載されている（Ｎｉｉｋｕｒａ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍ．　２７４：　４４５−４５４）。この細胞では、ＥｃＤ処理により細胞の大部分で２〜３日以内に細胞死が起こる（国際公開番号　ＷＯ００／１４２０４；　Ｎｉｉｋｕｒａ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍ．　２７４：　４４５−４５４）。これらの細胞を用いて、本発明者らはデストラップスクリーニングに独自の改変を加え、疾患ベースのデストラップスクリーニングと名付けたスクリーニングを行った（国際公開番号　ＷＯ０１／２１７８６参照）。Ｖｉｔｏら（Ｖｉｔｏ，　Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９７）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７２：　２８３１５−２８３２０）のもともとのスクリーニングでは、正常組織のｃＤＮＡライブラリーをＪｕｒｋａｔ細胞にトランスフェクトし、Ｔ細胞受容体抗体により細胞を殺し、生き残った細胞からライブラリーの断片が回収された。これに対して、本発明者らのアプローチでは、剖検により診断されたＡＤ患者脳の後頭葉から構築した発現ｃＤＮＡライブラリーを用いたことに特徴がある。ＡＤ患者脳の後頭葉は疾患経過の間、インタクトに保たれることから、本発明者らはＡＤ患者脳の後頭葉では神経保護遺伝子が発現しているはずだと考えた。まず、剖検で診断されたＡＤ患者の後頭葉から　ｐＥＦ−ＢＯＳ　中に構築した哺乳類発現ｃＤＮＡライブラリー（国際公開番号　ＷＯ０１／２１７８６；ＡＤ−１ライブラリーと名付けた）をＦ１１／ＥｃＲ／Ｖ６４２Ｉ細胞にトランスフェクトし、細胞をＥｃＤで７２時間処理し、生き残った細胞からプラスミドを回収した。この手順を３回繰り返し、ランダムに多数の異なるクローンのプラスミドを単離した。ランダムに選択したクローンのドットブロットハイブリダイゼーションを利用して、これらを複数の独立なグループに分類した。これにより、１つの遺伝子ＤＴ２３６を同定した。
【００７９】
［実施例５］　ＤＴ２３６はＶ６４２Ｉ−ＡＰＰによる神経細胞毒性を阻害する活性を有する
Ｆ１１神経ハイブリッド細胞の単純な一過的トランスフェクション系（Ｙａｍａｔｓｕｊｉ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９６ａ）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７２：　１３４９−１３５２）を用いて、本発明者らはＶ６４２Ｉ−ＡＰＰによる細胞毒性に対するＤＴ２３６のアンタゴナイズ活性を確認した（表１）。ｐｃＤＮＡに挿入されたＶ６４２Ｉ−ＡＰＰ　ｃＤＮＡをＦ１１細胞にトランスフェクトすると、５０〜６０％の細胞が７２時間までに細胞死を起こした。ここで用いた条件では、トランスフェクション効率は一定して６５〜７０％であるので（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００ａ）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５：　３４５４１−３４５５１）、このＦＡＤ遺伝子を発現するほとんどの細胞がトランスフェクションの開始から７２時間後には死んでいたことになる。ｐｃＤＮＡ中のＶ６４２Ｉ−ＡＰＰ　ｃＤＮＡとｐＥＦ−ＢＯＳ中のＤＴ２３６とをＦ１１細胞にトランスフェクトすると細胞毒性は有意に阻害され、ＣＭＶプロモーターで駆動されるＶ６４２Ｉ−ＡＰＰの発現は阻害されなかった（データ省略）ことから、スクリーニングから予想されたように、ＤＴ２３６はＶ６４２Ｉ−ＡＰＰによる神経細胞死を阻害することが示された。
【００８０】
ＤＴ２３６は、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰによる細胞毒性を、同じ条件におけるｗｔＡＰＰの細胞毒性と同程度のレベルにまで抑制することは注目される（表１）。空プラスミドのトランスフェクションによる細胞死率は１５〜２０％であり、これはリポフェクション後のＦ１１細胞のベーサルな細胞死率と同等であった。本発明者らが実証したように（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００ａ）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５：　３４５４１−３４５５１）、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰ特異的な細胞毒性の機構はｗｔＡＰＰに付随する細胞毒性の機構とは異なっている［Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰは抗酸化剤であるグルタチオン−エチル−エステル（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−ｅｔｈｙｌ−ｅｓｔｅｒ；　ＧＥＥ）にも、カスパーゼ阻害剤であるＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ　（ＤＥＶＤ）　にも感受性があるが、ｗｔＡＰＰはどちらにも抵抗性がある］。従って、ＤＴ２３６がＶ６４２Ｉ−ＡＰＰの細胞毒性をｗｔＡＰＰの細胞毒性のレベルにまで阻害したことは、ＤＴ２３６はＶ６４２Ｉ−ＡＰＰ特異的な細胞毒性を特異的に抑制したことを示唆している。同じ条件下で、それぞれ　ＮＬ−ＡＰＰ、Ｍ１４６Ｌ−ＰＳ１、および　Ｎ１４１Ｉ−ＰＳ２　のトランスフェクションはＤＴ２３６のコトランスフェクションの有りまたは無しにおいて５０〜６０％の細胞毒性であったことから、他のＦＡＤ遺伝子による細胞毒性はＤＴ２３６により抑制されなかったことを示している。
【００８１】
表２はＶ６４２Ｉ−ＡＰＰによる細胞毒性が、ＤＥＶＤに加え、Ａｃ−ＬＥＨＤ−ＣＨＯ　および　Ａｃ−ＤＱＴＤ−ＣＨＯ　に感受性があったことを示しており、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰの細胞毒性にはカスパーゼ−３／７　および　−９　が関与し得ることを示唆している。対照的に、ＮＬ−ＡＰＰ、Ｍ１４６Ｌ−ＰＳ１、またはＮ１４１Ｉ−ＰＳ２　による細胞毒性は　ＤＥＶＤ、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ、Ａｃ−ＬＥＨＤ−ＣＨＯ、Ａｃ−ＶＥＩＤ−ＣＨＯ、または　Ａｃ−ＤＱＴＤ−ＣＨＯ　のいずれにも抵抗性があった。これらのデータはＤＴ２３６はＶ６４２Ｉ−ＡＰＰにより誘導されるような、ＤＥＶＤ感受性のアポトーシス性の細胞毒性（Ｙａｍａｔｓｕｊｉ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９６ａ）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７２：　１３４９−１３５２；　Ｙａｍａｔｓｕｊｉ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９６ｂ）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１５：　４９８−５０９；　Ｎｉｉｋｕｒａ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍ．　２７４：　４４５−４５４；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００ａ）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５：　３４５４１−３４５５１）を選択的に抑制することが示唆している。このことは、ｐＩＮＤ系を用いた本発明者らの最近の報告で、ＮＬ−ＡＰＰ、Ｍ１４６Ｌ−ＰＳ１、またはＮ１４１Ｉ−ＰＳ２　の高発現がＤＥＶＤ抵抗性の細胞死を引き起こすということとも一致している（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００ａ）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５：　３４５４１−３４５５１；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）　Ｊ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｅｘｐ．　Ｔｈｅｒ．　３００：　７３６−７４５；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．　８０：　４２６−４３７）。
【００８２】
【表１】ＤＴ２３６の効果
2004137207.tif 000002
ｗｔＡＰＰ、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰ、ＮＬ−ＡＰＰ、Ｍ１４６Ｌ−ＰＳ１、またはＮ１４１Ｉ−ＰＳ２　ｃＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ中）と共にまたはなしで、ｐＥＦ−ＢＯＳまたはＤＴ２３６（ｐＥＦ−ＢＯＳ中）をＦ１１細胞にトランスフェクトし、細胞死率をトリパンブルー排除アッセイにより測定した。＊　ｐＥＦ−ＢＯＳの代わりにｐＥＦ４／Ｈｉｓベクターをコトランスフェクトした結果を示す。＊＊　ｐ＜０．０１，　ｐＥＦ−ＢＯＳを用いた時のＶ６４２Ｉ−ＡＰＰによる細胞毒性に対して。
【００８３】
【表２】テトラペプチド阻害剤の存在下におけるＡＰＰのＦＡＤ変異体の細胞毒性
2004137207.tif 000003
１００μＭの各テトラペプチドの存在下、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰ　ｃＤＮＡまたはＮＬ−ＡＰＰ　ｃＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ中）をＦ１１細胞に７２時間トランスフェクトし、細胞死率をトリパンブルー排除アッセイにより測定した。値は３つの独立したトランスフェクション実験における平均±Ｓ．Ｄ．を示す。数はＶ６４２Ｉ−ＡＰＰ　ｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞の細胞死率のパーセンテージを示す。１００％はＶ６４２Ｉ−ＡＰＰをトランスフェクトした細胞の特異的な細胞死率を示し、これらの実験においては４６．０±１．９％であった。＊　Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰのみ（上レーン）またはＮＬ−ＡＰＰのみ（下レーン）による細胞毒性との差が統計的に有意（ｐ＜０．０５）となる、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰのみ（上レーン）またはＮＬ−ＡＰＰのみ（下レーン）の値の８０％より小さい値にマークを付けた。
【００８４】
［実施例６］　ＤＴ２３６はヒトＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２である
クローニングしたＤＴ２３６　ｃＤＮＡ断片は自動シークエンサーを用いてシークエンシングを行った（ＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ３１０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ，　Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，　ＣＡ）。得られた配列を用いたＤＮＡホモロジーの解析はＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｈｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を用いて行った。
ＤＴ２３６　ｃＤＮＡの配列は２７７アミノ酸からなるポリペプチドをコードするＯＲＦを持っていた。このＯＲＦの配列はヒトＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２（ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２：　ＧｅｎＢａｎｋ　＃ＡＡＫ１３２５１）と同一であることが判明し、マウスＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２（ｍＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２：　ＧｅｎＢａｎｋ　＃Ｌ０８０７４）とも極めて高いホモロジーを示した。ヒトおよびマウスＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２を比較すると、ヌクレオチドレベルでの同一性は８８．６％であり、アミノ酸レベルでは９７．５％であった。ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２のホメオドメインはＮｋｘ６．１（Ｉｎｏｕｅ，　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９７）　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　４０：　３６７−３７０）のそれと有意なホモロジーを示した。Ｄｌｘ４のＤＮＡ結合部位（Ｑｕｉｎｎ，　Ｌ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９７）　Ｇｅｎｅ　１８７：　５５−６１；　Ｂｅｎｄｌｌ，　Ａ．　Ｊ．　ａｎｄ　Ａｂａｔｅ−Ｓｈｅｎ，　Ｃ．　（２０００）　Ｇｅｎｅ　２４７：　１７−３１）は、ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２のＤＮＡ結合部位とほとんど同一であった。ｈＧｔｘのホメオボックスとＤｌｘ４またはＮｋｘ６．１のホメオドメインとの同一性は、それぞれ４６．７％および９５．０％であった。しかしながら、図２Ｂ　に示したように、ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２のホメオドメインは、大半のホメオドメインの配列とは限られたホモロジー（３０〜５０％の同一性）しか示さなかった（例えば、ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２のホメオドメインとＡｎｔｐまたはＥｎとの同一性はそれぞれ４３．３％または３８．３％であった）。ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２のＮ末端およびＣ末端領域は、実質的にｍＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２のそれらの同一であったが、他のどの既知のホメオボックス含有蛋白質とも違っていた。ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２のＮ末端領域は非常にＧｌｙおよびＰｒｏに富んでおり、残基３６〜９４では２８．８％がＧｌｙであり、残基９５〜１４７では２０．８％がＰｒｏである（図１）。ＧｌｙおよびＰｒｏに富むＮ末端ドメインは転写調節、またはｉｎ　ｖｉｖｏにおけるＤＮＡ標的部位の効率的な選択に必要な他の蛋白質との相互作用のどちらかに機能し得る。ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２のＣ末端領域は荷電アミノ酸に富んでいた。残基２０８〜２７７では、１７．１％の残基が塩基性であり、２１．４％が酸性であった。
【００８５】
図２Ｂに示したように、ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２のＣ末端部分は幾つかの調節蛋白質のヘリックス−ターン−ヘリックスＤＮＡ結合ドメインと構造的な類似性を示し、このホメオドメインのＮ末端のアームと第３のヘリックスは、それぞれＤＮＡのマイナーグルーブ（副溝）およびメジャーグルーブ（主溝）の塩基と特異的に相互作用する（Ｓｃｏｔｔ，　Ｍ．Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８９）　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ　９８９：　２５−４８；　Ｋｉｓｓｉｎｇｅｒ，　Ｃ．Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９０）　Ｃｅｌｌ　６３：　５７９−５９０；　Ｗｏｌｂｅｒｇｅｒ，　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９１）　Ｃｅｌｌ　６７：　５１７−５２８）。この情報から、ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２はホメオボックス蛋白質としてのみならず他のタイプのＤＮＡ結合蛋白質としても機能し、核転写因子として働いていることが示唆される。
【００８６】
［実施例７］　ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２はＡＰＰのＶ６４２Ｉ変異体およびＮＬ変異体による細胞毒性を阻害する
ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２のＯＲＦをｐＥＦ４のポリクローニング部位に挿入してｐＥＦ４−ｈＧｔｘを構築した。本発明者らは、ｐｃＤＮＡ中のＶ６４２Ｉ−ＡＰＰまたはＮＬ−ＡＰＰのどちらかにより引き起こされるＦ１１細胞の細胞死に対するｐＥＦ４−ｈＧｔｘの効果を　１．５μｇプロトコルを用いて調べた（図３Ａ）。ＤＴ２３６の場合と同様に、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰによる細胞毒性はｐＥＦ４−ｈＧｔｘにより有意に抑制された。空のｐＥＦ４／Ｈｉｓをコトランスフェクションした場合と比べ、ｐＥＦ４−ｈＧｔｘのコトランスフェクションはＶ６４２Ｉ−ＡＰＰの発現にはほとんど影響しなかった（データ省略）。これに対し、ｐＥＦ４−ｈＧｔｘのトランスフェクションはＮＬ−ＡＰＰによる細胞毒性（図３Ａ）またはその発現（データ省略）に対して一見すると効果を持たなかった。ここで用いた１．５μｇプロトコルでは、ｐｃＤＮＡ中のＦＡＤ遺伝子　１．５μｇをｐＥＦ４−ｈＧｔｘまたはｐＥＦ４／Ｈｉｓと共にＦ１１細胞にトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後に細胞死率を測定した。ｐＩＮＤ系では、ｐＩＮＤ中のＦＡＤ遺伝子　１μｇをｐＥＦ４−ｈＧｔｘまたはｐＥＦ４／Ｈｉｓと共にＦ１１／ＥｃＲ細胞にトランスフェクトし、ＥｃＤで処理し、トランスフェクションの７２時間後に細胞死率を測定した。この１．５μｇのトランスフェクションプロトコルは、ｐＩＮＤ系においてＦＡＤ遺伝子をコードする１μｇのｐＩＮＤプラスミドのトランスフェクションおよび４０μＭ　ＥｃＤ処理による細胞毒性を模倣していることが、複数の研究により示されている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００ａ）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５：　３４５４１−３４５５１，　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００１ａ）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９８：　６３３６−６３４１；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００１ｂ）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　２８３：　４６０−４６８；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００１ｃ）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　２１：　９２３５−９２４５；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）　Ｊ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｅｘｐ．　Ｔｈｅｒ．　３００：　７３６−７４５；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．　８０：　４２６−４３７）。
【００８７】
このｐＩＮＤ系を用いることで、ＮＬ−ＡＰＰの高発現（内因性ＡＰＰの３倍より大）ではＤＥＶＤ抵抗性の非アポトーシス性の細胞毒性が起こり、ＮＬ−ＡＰＰの低発現（内因性ＡＰＰの３倍以下）によるＤＥＶＤ感受性のアポトーシス性の細胞毒性とは違いがあるが、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰでは低発現から高発現までＤＥＶＤ感受性のアポトーシス性の細胞毒性のみが起こることが見出されている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００ａ）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５：　３４５４１−３４５５１）。ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２がＶ６４２Ｉ−ＡＰＰによるＤＥＶＤ感受性の細胞毒性を阻害したことから、ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２はＮＬ−ＡＰＰの低発現によるアポトーシス性の細胞毒性もまた阻害することができる可能性があった。
【００８８】
そこで本発明者らは、低発現および高発現による細胞毒性を良好に解析することができるｐＩＮＤ系を用いて、ＮＬ−ＡＰＰの細胞毒性に対するｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２発現の効果を調べた。この系では、ｐＥＦ４／ＨｉｓまたはｐＥＦ４−ｈＧｔｘのコトランスフェクションの条件下、ＥｃＤ誘導性のｐＩＮＤプラスド中のＮＬ−ＡＰＰ　ｃＤＮＡをＦ１１／ＥｃＲ細胞にトランスフェクトし、様々な濃度のＥｃＤで処理した。ＥｃＤ処理はプラスミドのトランスフェクションからほぼ１日を経た後に行ったため、トランスフェクションの効率はＥｃＤ処理によっては影響されなかった。Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００ａ）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５：　３４５４１−３４５５１；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）　Ｊ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｅｘｐ．　Ｔｈｅｒ．　３００：　７３６−７４５；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．　８０：　４２６−４３７）は、ｐＩＮＤ中のｃＤＮＡが、コードする蛋白質をＥｃＤ依存的な様式で発現すること、そして野生型（ｗｔ）ＡＰＰは処理するＥｃＤ用量と直線的な関係で発現すること、さらにＤＥＶＤまたはＧＥＥの存在下でもＶ６４２Ｉ−ＡＰＰまたはＮＬ−ＡＰＰはｗｔＡＰＰで観察されるのとほとんど同一のＥｃＤ依存性で発現されることを実証している。ｐＩＮＤ−ｗｔＡＰＰ　ｃＤＮＡをトランスフェクトしたＦ１１／ＥｃＲ細胞では、以前の記載（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００ａ）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５：　３４５４１−３４５５１）のように、１０および４０μＭのＥｃＤはそれぞれ内因性ＡＰＰの発現の約１．５倍および約６倍でトランスフェクトしたｗｔＡＰＰを発現させた。ＤＥＶＤ非存在下ではＶ６４２Ｉ−ＡＰＰまたはＮＬ−ＡＰＰの発現は１０μＭ　ＥｃＤで飽和に達し、１０μＭ　ＥｃＤより高い用量ではその発現は１０μＭ　ＥｃＤで観察された発現レベルに留まった。発現プロフィールのこの特徴は、以前の詳細な記載（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００ａ）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５：　３４５４１−３４５５１）の通り、変異ＡＰＰにより誘導されるＤＥＶＤ−カスパーゼの活性化およびＤＥＶＤ−カスパーゼにより誘導される発現したＡＰＰホロ蛋白質のプロテオリシス（Ｖｉｔｏ，　Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９７）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７２：　２８３１５−２８３２０）を含むフィードバックループに起因していた。ＥｃＤの担体はエタノールだが、エタノールはＡＰＰ蛋白質を誘導しなかった。従って、ＥｃＤ処理で観察された効果は発現されたＡＰＰ蛋白質に起因したものであった。本実施例において本発明者らは、誘導性ＡＰＰおよびＰＳ１およびＰＳ２構築物についての本発明者らの以前の研究（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００ａ）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５：３４５４１−３４５５１；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）　Ｊ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｅｘｐ．　Ｔｈｅｒ．　３００：　７���６−７４５；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．　８０：　４２６−４３７）と同様、１０μＭ　ＥｃＤでもたらされる発現は低発現、４０μＭ　ＥｃＤでもたらされる発現は高発現と定義した。以前記載（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００ａ）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５：　３４５４１−３４５５１）したように、ＤＥＶＤはｐＩＮＤプロモーター活性を阻害しなかった。
【００８９】
このｐＩＮＤ系において、１０μＭ　ＥｃＤでもたらされるＮＬ−ＡＰＰの細胞毒性は、ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２の共発現によりほぼ完全に抑制された（図３Ｂ）。これとは明らかに対照的に、４０μＭ　ＥｃＤでもたらされるＮＬ−ＡＰＰの細胞毒性は、ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２により影響されなかった。１００μＭ　ｚＶＡＤ−ｆｍｋの存在下におけるＮＬ−ＡＰＰの細胞毒性の曲線は、ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２の共発現下での曲線と実質的に重なっていた（図３Ｂ）。これらのデータは、ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２はｚＶＡＤ−ｆｍｋの効果と同様の効果を発揮し、ＮＬ−ＡＰＰによるアポトーシス性の細胞毒性を阻害することを示している。
【００９０】
また本発明者らは、低発現または高発現によるＶ６４２Ｉ−ＡＰＰの細胞毒性を、ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２が阻害するか、そしてどのように阻害するかを調べた（図３Ｃ）。上記のデータから期待されるように、ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２の共発現は１０μＭおよび４０μＭのＥｃＤによりもたらされるＶ６４２Ｉ−ＡＰＰの細胞毒性を阻害した。ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２の共発現下でのＶ６４２Ｉ−ＡＰＰの細胞毒性の曲線は、１００μＭ　ｚＶＡＤ−ｆｍｋ存在下での曲線と実質的に同一となった。これらのデータは、ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２はＶ６４２Ｉ−ＡＰＰによるアポトーシス性の細胞毒性を抑制したことを示しており、これは、ＡＰＰのＦＡＤ変異体により誘導される細胞毒性のアポトーシス性の成分をｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２が共通して抑制するという考えと一致している。
【００９１】
［実施例８］　ＡＰＰのＡ６１７Ｇ変異体およびＬ６４８Ｐ変異体による細胞毒性に対するｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２の効果
Ａ６１７Ｇ−ＡＰＰはＦｌｅｍｉｓｈ変異体として、Ｌ６４８Ｐ−ＡＰＰはＳｙｄｎｅｙ変異体として知られている。Ａ６１７Ｇ−ＡＰＰを持つ患者は、大脳性アミロイド血管障害（ｃｅｒｅｂｒａｌ　ａｍｙｌｏｉｄ　ａｎｇｉｏｐａｔｈｙ）および典型的なＡＤ型の進行性神経変性の複合病状を被り、大型で密なコアを持つ実質の老人斑および血管における広範なアミロイド沈着の両者を伴う（Ｈｅｎｄｒｉｋｓ，　Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９２）　Ｎａｔ．　Ｇｅｎｅｔ．　１：　２１８−２２１）。Ｓｙｄｎｅｙ変異はオーストラリアの早発型ＦＡＤ家族において同定された（Ｋｗｏｋ，　Ｂ．Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００）　Ａｎｎ．　Ｎｅｕｒｏｌ．　４７：　２４９−２５３）。Ｌ６４８Ｐ−ＡＰＰは神経細胞のアポトーシス性細胞死を引き起こすことが示されており（Ｋｗｏｋ，　Ｂ．Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００）　Ａｎｎ．　Ｎｅｕｒｏｌ．　４７：　２４９−２５３；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００１ｃ）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　２１：　９２３５−９２４５）、Ａ６１７Ｇ−ＡＰＰもまた神経細胞死を誘導する（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００１ｃ）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　２１：　９２３５−９２４５）。１．５μｇプロトコルを用いて、本発明者らはＡ６１７Ｇ−ＡＰＰによる細胞毒性およびＬ６４８Ｐ−ＡＰＰによる細胞毒性に対するｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２の効果を調べた。図４Ａは、いずれのＦＡＤ変異体ＡＰＰのトランスフェクションも、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰおよびＮＬ−ＡＰＰと同じくらいの効率で神経細胞死を引き起こすことを示している。ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２の共発現は、Ｌ６４８Ｐ−ＡＰＰによる細胞毒性をｗｔＡＰＰによる細胞毒性のレベルまたはｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２共発現下でのＶ６４２Ｉ−ＡＰＰによる細胞毒性のレベルにまで阻害した。これに対し、ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２の共発現はＡ６１７Ｇ−ＡＰＰによる細胞毒性を阻害しなかった。これらのデータは、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰおよびＮＬ−ＡＰＰの場合（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００ａ）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５：　３４５４１−３４５５１）と同様に、これら２つのＦＡＤ変異体が異なる機構を通して神経毒性を発揮することを示唆している。
【００９２】
ＮＬ−ＡＰＰの低発現（Ｆ１１細胞における　０．５μｇ　ｃＤＮＡのトランスフェクション、およびトランスフェクションの７２時間後の細胞毒性の測定、あるいはＦ１１／ＥｃＲ細胞における１μｇのｐＩＮＤがコードするＮＬ−ＡＰＰ　ｃＤＮＡのトランスフェクション、および１０μＭ　ＥｃＤ処理の７２時間後の細胞毒性の測定）はＤＥＶＤ感受性かつｈＧｔｘ感受性の細胞毒性を発揮するが、ＮＬ−ＡＰＰの高発現（１．５μｇのｐｃＤＮＡがコードするＮＬ−ＡＰＰ　ｃＤＮＡのトランスフェクション、およびトランスフェクションの４８時間後の細胞毒性の測定、あるいは１μｇのｐＩＮＤがコードするＮＬ−ＡＰＰ　ｃＤＮＡのトランスフェクション、および４０μＭ　ＥｃＤ処理の７２時間後の細胞毒性の測定）はＤＥＶＤ抵抗性かつｈＧｔｘ抵抗性の細胞毒性を付加的に発揮することに注意が必要である。従って本発明者らは、Ａ６１７Ｇ−ＡＰＰまたはＬ６４８Ｐ−ＡＰＰの低発現による細胞毒性はｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２により阻害される可能性があると考えた。そこで、０．５μｇプロトコルを用いてこの可能性を調べた。このプロトコルでのＡ６１７Ｇ−ＡＰＰまたはＬ６４８Ｐ−ＡＰＰの発現は、実質的に内因性ＡＰＰの発現と同等であり（データ省略）、細胞死率アッセイおよび細胞生存率アッセイの両方で測定した結果、細胞毒性もＶ６４２Ｉ−ＡＰＰを同様に発現させた場合のそれと同じくらいであった（図４Ｂ）。ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２のコトランスフェクションは、Ａ６１７Ｇ−ＡＰＰまたはＬ６４８Ｐ−ＡＰＰによる細胞毒性を完全に阻害したが、空のｐＥＦ４／Ｈｉｓプラスミドでは効果はなかった。またｐＥＦ４／ＨｉｓのコトランスフェクションでのＡ６１７Ｇ−ＡＰＰまたはＬ６４８Ｐ−ＡＰＰの発現と比べ、ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２のコトランスフェクションはそれらの発現に影響しなかった（データ省略）。このように、ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２はＡ６１７Ｇ−ＡＰＰまたはＬ６４８Ｐ−ＡＰＰの低発現による細胞毒性を抑制した。
【００９３】
［実施例９］　Ｍ１４６Ｌ−ＰＳ１、Ｎ１４１Ｉ−ＰＳ２、またはＧ８５Ｒ−ＳＯＤ１による細胞毒性に対するｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２の効果
次に、ＦＡＤを引き起こす他の変異体であるＭ１４６Ｌ−ＰＳ１またはＮ１４１Ｉ−ＰＳ２の高発現による細胞毒性に対するｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２の効果を１．５μｇプロトコルを用いて調べた。これらのＦＡＤ変異体は両者とも、Ｆ１１神経ハイブリッドを含む様々な細胞系において神経細胞死を引き起こしたりまたは増強することが示されている（Ｗｏｌｏｚｉｎ，Ｂ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９６）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７４：　１７１０−１７１３；　Ｇｕｏ，　Ｑ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９６）　Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ　８：　３７９−３８３；　Ｇｕｏ，　Ｑ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９７）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　１７：　４２１２−４２２２；　Ｇｕｏ，　Ｑ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９ａ）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　Ｒｅｓ．　５６：　４５７−４７０；　Ｇｕｏ，　Ｑ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９ｂ）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９６：　４１２５−４１３０；　Ｇｕｏ，　Ｑ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９ｃ）　Ｎａｔ．　Ｍｅｄ．　５：　１０１−１０６；　Ｃｚｅｃｈ，　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９８）　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　８７：　３２５−３３６；　Ｗｅｉｈｌ，　Ｃ．Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　１９：　５３６０−５３６９；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００１ａ）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９８：　６３３６−６３４１；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）Ｊ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｅｘｐ．　Ｔｈｅｒ．　３００：　７３６−７４５；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．　８０：　４２６−４３７）。報告の通り、Ｍ１４６Ｌ−ＰＳ１またはＮ１４１Ｉ−ＰＳ２のトランスフェクションはＶ６４２Ｉ−ＡＰＰおよびＮＬ−ＡＰＰと同じ位強い細胞毒性を引き起こした（図５）。ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２の共発現はＭ１４６Ｌ−ＰＳ１またはＮ１４１Ｉ−ＰＳ２による細胞毒性を阻害しなかった。従って、ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２はＭ１４６Ｌ−ＰＳ１またはＮ１４１Ｉ−ＰＳ２の高発現による細胞毒性に対しては阻害効果を持たなかった。
【００９４】
次に、Ｍ１４６Ｌ−ＰＳ１またはＮ１４１Ｉ−ＰＳ２の低発現による細胞毒性をｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２が阻害するかをｐＩＮＤ−Ｆ１１／ＥｃＲ系を用いて調べた。図５Ｂに示したように、ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２の共発現はＭ１４６Ｌ−ＰＳ１の低発現または高発現のどちらによる細胞毒性に対しても阻害効果を持たなかった。これに対して、ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２共発現はＮ１４１Ｉ−ＰＳ２の低発現による細胞毒性を完全に阻害した。空のｐＥＦ４／Ｈｉｓプラスミドではこの阻害は見られず、またｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２の共発現はＮ１４１Ｉ−ＰＳ２の高発現による細胞毒性を阻害しなかった。Ｍ１４６Ｌ−ＰＳ１またはＮ１４１Ｉ−ＰＳ２の高発現による細胞毒性に対してｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２が効果を持たなかったことは、Ｆ１１細胞を用いた単純なトランスフェクションデータと一致していた（上記参照）。Ｎ１４１Ｉ−ＰＳ２の低発現はＤＥＶＤ感受性のアポトーシス性細胞毒性を誘導するが、Ｎ１４１Ｉ−ＰＳ２の高発現はＤＥＶＤ抵抗性の非アポトーシス性の細胞毒性を付加的に誘導すること、そしてＭ１４６Ｌ−ＰＳ１はそれだけで低発現から高発現までＤＥＶＤ抵抗性の非アポトーシス性の細胞毒性を誘導することが報告されている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）　Ｊ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｅｘｐ．　Ｔｈｅｒ．　３００：　７３６−７４５；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．　８０：　４２６−４３７）。これらの結果は、ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２はＦＡＤ遺伝子により共通して誘導されるＤＥＶＤ感受性のアポトーシス性の細胞毒性を選択的に阻害するという考えと一致している。
【００９５】
本発明者らはまた、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｌａｔｅｒａｌ　ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；　ＡＬＳ）関連変異体スーパーオキシドジスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓｅ；　ＳＯＤ）１による細胞毒性に対するｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２の効果を調べた。ＳＯＤ１のＡＬＳ関連変異体は、Ｆ１１神経ハイブリッドを含む神経細胞培養において細胞死を引き起こすことが示されている（Ｒａｂｉｚａｄｅｈ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９５）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９２：３０２４−３０２８；　Ｂｒｕｉｊｎ，　Ｌ．Ｉ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９７）　Ｎｅｕｒｏｎ　１８：　３２７−３３８；　Ｇｈａｄｇｅ，　Ｇ．Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９７）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　１７：　８７５６−８７６６；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００１ａ）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９８：　６３３６−６３４１）。図５Ａに示したように、ＡＬＳ関連変異体ＳＯＤ１の１つであるＧ８５Ｒ−ＳＯＤ１の発現はＡＰＰ変異体およびＰＳ変異体と同じくらい強い細胞毒性を引き起こした。ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２の共発現は、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰまたはＬ６４８Ｐ−ＡＰＰによる細胞毒性を有意に阻害した条件下においても、Ｇ８５Ｒ−ＳＯＤ１による細胞毒性を阻害しなかった。
【００９６】
［実施例１０］　細胞保護作用は、ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２のホメオドメインに局在している
観察された細胞保護作用に責任のあるｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２の領域を特定するため、ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２の複数の欠失変異体を構築した（ｈＧｔｘＮＴ、ｈＧｔｘＣＴ、ｈＧｔｘΔＰ、および　ｈＧｔｘＨ）（図６Ａ）。ｈＧｔｘＮＴは最Ｎ末端ドメイン（残基１〜３５）およびＧｌｙリッチドメイン（残基３６〜９４）からなる。また、ｈＧｔｘＣＴはＰｒｏリッチドメイン（残基９５〜１４７）、ホメオドメイン（残基１４８〜２０７）、および極性（アミノ酸）リッチドメイン（残基２０８〜２７７）からなる。そして、ｈＧｔｘΔＰは残基１〜２０７からなり、極性リッチドメインを欠失するだけのｈＧｔｘである。
【００９７】
ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２のサブクローニングおよび欠失変異体の構築は、以下のようにして行った。まず、タグが付加されたｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２オープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ；　ＯＲＦ）ｃＤＮＡを構築するため、ＤＴ２３６をＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで切断した。このＥｃｏＲＩ部位は翻訳開始コドンＡＴＧから３９ヌクレオチド上流にあり、ＸｂａＩ部位はＤＴ２３６　ＯＲＦの下流のｐＥＦ−ＢＯＳベクター内に存在する。ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２の全ＯＲＦをｐＥＦ４／Ｈｉｓにサブクローニングし（ｐＥＦ４−ｈＧｔｘ）、その後配列が正しいことを確認した。ｐＥＦ４−ｈＧｔｘＮＴ、およびｐＥＦ４−ｈＧｔｘＣＴ　を構築するため、ＤＴ２３６を切断し、残基部位　１〜９９［ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２の５’非翻訳上流領域（ＵＴＲ）を含む］、および　１００〜２８０（ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２の３’−ＵＴＲを含む）の２断片を得て、各断片をｐＥＦ４／Ｈｉｓにサブクローニングした。ｐＥＦ４−ｈＧｔｘΔＰを構築するため、まず次のプライマーを用いてＰＣＲを行った（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，　ＣＡ　の　Ｐｆｕ　ｔｕｒｂｏ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　を用いた）。センスプライマーはＥｃｏＲＩ部位およびｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２の開始コドンの上流３９ヌクレオチドを含む　５’−ＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧＡＴＧＧＧＡＧ−３’（配列番号：１３）、ｈＧｔｘΔＰ用のアンチセンスプライマーは　５’−ＴＴＴＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＴＧＣＣＧＣＴＴＧＣＧＣＣＡＣＴＴＧ−３’（配列番号：１４）である。ｐＥＦ４−ｈＧｔｘＨ用のセンスプライマーは　５’−ＴＴＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＡＧＣＡＣＴＣＧＣＧＣＣＣＧＡＣＣＴＴＣ−３’（配列番号：１５）で、アンチセンスプライマーはｈＧｔｘΔＰ用のアンチセンスプライマーと同じものを用いた。各増幅断片は　ｐＥＦ４／Ｈｉｓ　のＥｃｏＲＩ部位およびＸｂａＩ部位にサブクローニングした。欠失変異体の配列は正しいことを確認し、各変異体の発現は抗（Ｈｉｓ）６　抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ，　ＣＡ）で検出した。
【００９８】
１．５μｇプロトコルを用いて、これらの欠失変異体のそれぞれをｐｃＤＮＡ−Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰと共にＦ１１細胞にトランスフェクトし、細胞死が阻害されるかを測定した。ｈＧｔｘＣＴおよびｈＧｔｘΔＰは、全長ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２と同じくらい有意にＶ６４２Ｉ−ＡＰＰによる細胞毒性を阻害したが、ｈＧｔｘＮＴは全く阻害しなかった。ｈＧｔｘＣＴ、ｈＧｔｘΔＰ、およびｈＧｔｘＮＴは、ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２と同様に発現した（図６Ｂ）。従って、ホメオドメインおよび／またはＰｒｏリッチドメインはｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２の細胞保護作用に責任があると考えられた。そこで、本発明者らはｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２のホメオドメイン（残基１４８〜２０７）であるｈＧｔｘＨの効果を調べた。ｈＧｔｘＨは、全長ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２と同じくらい有意にＶ６４２Ｉ−ＡＰＰによる細胞毒性を阻害した。全長ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２、ｈＧｔｘＣＴ、ｈＧｔｘΔＰ、ｈＧｔｘＮＴ、またはｈＧｔｘＨをコトランスフェクトした細胞におけるＶ６４２Ｉ−ＡＰＰの発現は、ｐＥＦ４／Ｈｉｓベクターをコトランスフェクトした細胞におけるＶ６４２Ｉ−ＡＰＰの発現と比べて有意な阻害はなかった（データ省略）。従って、ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２の細胞保護機能はそのホメオドメインに局在していた。
【００９９】
Ｌ６４８Ｐ−ＡＰＰに対するｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２の細胞保護作用にも同じことが当てはまった。ｈＧｔｘＣＴ、ｈＧｔｘΔＰ、およびｈＧｔｘＨは、全長ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２と同じくらい有意にＬ６４８Ｐ−ＡＰＰによる細胞毒性を阻害した。従って、ＡＰＰのＦＡＤ変異体に対するｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２の細胞保護作用は、共通してそのホメオドメインに局在することが示された。
【０１００】
本発明者らは、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰによる細胞毒性を他のホメオドメイン含有蛋白質が阻害するかを調べた。この目的のため、本発明者らはＤｌｘ４の効果を調べた。ＤＬＸ４のホメオドメインはｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２のそれと４６．７％のホモロジーしか有していないことから、もしＤｌｘ４がＶ６４２Ｉ−ＡＰＰによる細胞毒性を阻害するなら、ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２のホメオドメインの細胞保護作用は他のホメオドメイン含有蛋白質と共通すると考えられる図６Ｅに示したように、ヒトＤｌｘ４全長の共発現は、ｈＧｔｘＨおよび全長ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２と同じくらい有意にＶ６４２Ｉ−ＡＰＰによる細胞毒性を阻害した。Ｈｉｓタグ抗体を用いたイムノブロット解析により、Ｄｌｘ４はｈＧｔｘＨと同程度に発現していることが判明した（図６Ｂ）。ＣＭＶプロモーターにより駆動されるＶ６４２Ｉ−ＡＰＰの発現はｈＧｔｘＨのコトランスフェクションとＤｌｘ４のコトランスフェクションで同じであった（データ省略）。従って、ホメオドメイン（ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎｓ）は、ＦＡＤ変異体ＡＰＰに対して細胞保護作用を発揮することができる。
【０１０１】
【発明の効果】
ホメオボックス含有蛋白質は、アポトーシス性の細胞毒性を抑制する活性を有し、特にアルツハイマー病に関連する神経変性をアンタゴナイズする。従って該蛋白質は、アルツハイマーに関連する神経細胞毒性の機構解明に有用であると同時に、臨床応用の観点からも極めて有用である。ホメオボックス含有蛋白質およびその遺伝子、ならびに該蛋白質を利用したスクリーニングにより得られる化合物は、アルツハイマー病に関連する神経細胞毒性を予防する医薬として、また新たなアルツハイマー病治療薬開発のためのシード化合物として有用である。
【０１０２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２の塩基配列およびアミノ酸配列を示す図である。導出されるアミノ酸配列は塩基配列の下に示した。大きい鉤型のボックスはホメオドメインを示す。ホメオドメインの前の領域に見出されるプロリン残基およびグリシン残基は、それぞれ実線および破線で示した。ホメオドメインの後の領域は酸性アミノ酸（ボックスで示す）および塩基性アミノ酸（黒線で示す）に富んでいる。詳細は実施例参照のこと。
【図２】ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２　ｃＤＮＡおよび蛋白質の構造的特徴を示す図である。
Ａ：　ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２　ｃＤＮＡの模式図。白いボックスはオープンリーディングフレームを、黒い線は非翻訳領域を示す。
Ｂ：　ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２ホメオドメインと他の既知のホメオボックス含有遺伝子産物との比較。ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２のホメオドメインの配列を様々な既知のホメオボックス配列と比較している。ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２と同一のアミノ酸はダッシュ（−）で示し、ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２との同一性のパーセンテージを右に示した。コンセンサスは既知のホメオボックスに由来する（Ｓｃｏｔｔ，　Ｍ．Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８９）　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ　９８９：　２５−４８）。上部のシンボルは、ＥｎおよびＭＡＴａ２のＤＮＡ−ホメオドメイン複合体の結晶構造（Ｋｉｓｓｉｎｇｅｒ，　Ｃ．Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９０）　Ｃｅｌｌ　６３：　５７９−５９０；　Ｗｏｌｂｅｒｇｅｒ，　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９１）　Ｃｅｌｌ　６７：　５１７−５２８）に基づくＤＮＡ塩基（黒い円）およびＤＮＡ糖−リン酸バックボーン（白い円）との予想される相互作用部位を表す。３つのヘリックスの境界も、報告されているホメオドメインの結晶構造に基づく。
【図３】Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰまたはＮＬ−ＡＰＰによる神経細胞死に対するｐＥＦ４−ｈＧｔｘの効果を示す図である。
Ａ：　１．５μｇプロトコルでのＶ６４２Ｉ−ＡＰＰ　ｃＤＮＡまたはＮＬ−ＡＰＰ　ｃＤＮＡのトランスフェクションによるＦ１１細胞死に対するｐＥＦ４−ｈＧｔｘの効果。ｐＥＦ４−ｈＧｔｘ（図中ｈＧｔｘ）または空のｐＥＦ４／Ｈｉｓ（図中ｐＥＦ／Ｈｉｓ）と共に、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰまたはＮＬ−ＡＰＰ（各ｐｃＤＮＡ中）のどちらかの存在下またはその非存在下（ｐｃＤＮＡ）でＦ１１細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後にトリパンブルー排除アッセイにより細胞死率を測定した。本実施例において図中の”Ｎｏ　Ｔ”はトランスフェクションを行わなかった場合を示す。本実施例の値はすべて、少なくとも３つの独立した実験における平均±Ｓ．Ｄ．を示す。
Ｂ，　Ｃ：　ｐＩＮＤ系においてＥｃＤにより誘導されるＶ６４２Ｉ−ＡＰＰ（Ｂ）またはＮＬ−ＡＰＰ（Ｃ）の発現によるＦ１１／ＥｃＲ細胞死に対するｐＥＦ４−ｈＧｔｘの効果。ｐＩＮＤがコードするＶ６４２Ｉ−ＡＰＰまたはＮＬ−ＡＰＰを、ｐＥＦ４−ｈＧｔｘまたは空のｐＥＦ４／Ｈｉｓと共にＦ１１／ＥｃＲ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトからほぼ１日後、細胞をＥｃＤの濃度を増加させてまたはＥｃＤなしで処理した。トランスフェクションはＥｃＤ処理の開始のほぼ１日前に行ったので、ＥｃＤ処理はトランスフェクション効率に影響し得なかった。本実施例の全ての実験において、以前の記載（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００ａ）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５：　３４５４１−３４５５１）のように、トランスフェクション効率は一定して６５〜７０％であった。ｐＩＮＤはＥｃＤ誘導性プラスミドである。ＥｃＤ処理の７２時間後に、トリパンブルー排除により細胞死率を測定した。トランスフェクションなし、または空のｐＩＮＤと空のｐＥＦ４／Ｈｉｓのトランスフェクションによるネガティブコントロールにおける細胞死率（３回の独立した実験における平均±Ｓ．Ｄ．で示す）は、それぞれ、Ｂに示した実験においてはＥｃＤ非存在下で８．１±１．７％、４０μＭ　ＥｃＤ存在下で８．１±２．５％、またはＥｃＤ非存在下で９．１±１．０％、４０μＭ　ＥｃＤ存在下で１０．５±０．９％であり、Ｃに示した実験においてはＥｃＤ非存在下で８．５±１．２％、４０μＭ　ＥｃＤ存在下で８．１±０．３％、またはＥｃＤ非存在下で８．７±０．３％、４０μＭ　ＥｃＤ存在下で９．３±１．０％であった。
【図４】Ａ６１７Ｇ−ＡＰＰまたはＬ６４８Ｐ−ＡＰＰによる神経細胞毒性に対するｐＥＦ４−ｈＧｔｘの効果を示す図である。
Ａ：　１．５μｇプロトコルにおけるＡ６１７Ｇ−ＡＰＰまたはＬ６４８Ｐ−ＡＰＰによる神経細胞毒性に対するｐＥＦ４−ｈＧｔｘの効果。Ｆ１１細胞に空のｐｃＤＮＡ（図中ｐｃＤＮＡ）またはｐｃＤＮＡがコードするＶ６４２Ｉ−ＡＰＰ、Ａ６１７Ｇ−ＡＰＰ、またはＬ６４８Ｐ−ＡＰＰのいずれかを、ｐＥＦ４−ｈＧｔｘ（図中ｈＧｔｘ）または空のｐＥＦ４／Ｈｉｓ（図中ｐＥＦ）と共にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に細胞死率を測定した。”＊”　はスチューデントのｔ検定により有意差があることを示す。”ｎ．ｓ．”　は有意差なしを示す。
挿入図：ｐｃＤＮＡ中のｗｔＡＰＰ　ｃＤＮＡを低用量（０．５μｇ）または高用量（１．０μｇ）でトランスフェクトしたＦ１１細胞における、２２Ｃ１１抗体（抗ＡＰＰ抗体）によるＡＰＰのイムノブロッティング。左から右のレーンの順に、トランスフェクションなし、ｐｃＤＮＡトランスフェクション、０．５μｇ　ＡＰＰ　ｃＤＮＡトランスフェクション、または１．０μｇＡＰＰ　ｃＤＮＡトランスフェクションを行った。トランスフェクションの７２時間後に、細胞のライセート（２０μｇ／レーン）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、続いて　２．５μｇ／ｍｌ　の２２Ｃ１１を用いてイムノブロット解析を行った。１．５μｇ　ＡＰＰ　ｃＤＮＡｓ（ｗｔＡＰＰおよびＡＰＰ変異体）のＦ１１細胞へのトランスフェクションは、４８時間後に５０％前後の細胞死率をもたらした。これは、１μｇの各ＡＰＰ　ｃＤＮＡｓをトランスフェクトした際、７２時間後に得られる５０％前後の細胞死率と同等の効果である。
Ｂ：　０．５μｇプロトコルにおけるＶ６４２Ｉ−ＡＰＰ、Ｌ６４８Ｐ−ＡＰＰ、ＮＬ−ＡＰＰ、またはＡ６１７Ｇ−ＡＰＰによる神経細胞毒性に対するｐＥＦ４−ｈＧｔｘの効果。Ｆ１１細胞にｐＥＦ４−ｈＧｔｘ（図中ｈＧｔｘ）または空のｐＥＦ４／Ｈｉｓ（図中ｐＥＦ／Ｈｉｓ）をトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に細胞死率および生存率を、それぞれトリパンブルー排除（左パネル）およびＷＳＴ−８アッセイ（右パネル）により測定した。ネガティブコントロールとして、ｐｃＤＮＡのみ（図中ｖｅｃ）またはｐｃＤＮＡ中のｗｔＡＰＰ　ｃＤＮＡ（図中ｗｔＡＰＰ）のトランスフェクションを並行して行った。”＊”　はスチューデントのｔ検定により有意差があることを示す。”ｎ．ｓ．”　は有意差なしを示す。
【図５】Ｍ１４６Ｌ−ＰＳ１またはＮ１４１Ｉ−ＰＳ２による神経細胞死に対するｐＥＦ４−ｈＧｔｘの効果を示す図である。
Ａ：　１．５μｇプロトコルにおけるＭ１４６Ｌ−ＰＳ１　ｃＤＮＡ　またはＮ１４１Ｉ−ＰＳ２　ｃＤＮＡにより誘導されるＦ１１細胞死に対するｐＥＦ４−ｈＧｔｘの効果。ｐＥＦ４−ｈＧｔｘ（図中ｈＧｔｘ）または空のｐＥＦ４／Ｈｉｓベクター（図中ｐＥＦ）と共に、Ｍ１４６Ｌ−ＰＳ１、Ｎ１４１Ｉ−ＰＳ２、またはＧ８５Ｒ−ＳＯＤ１（Ｍ１４６Ｌ−ＰＳ１およびＮ１４１Ｉ−ＰＳ２はｐｃＤＮＡ中、Ｇ８５Ｒ−ＳＯＤ１はｐＥＦ−ＢＯＳ中）の存在下またはその非存在下（図中ｐＥＦ／Ｈｉｓ）でＦ１１細胞にトランスフェクトした。細胞死率はトリパンブルー排除アッセイにより測定した。
Ｂ，　Ｃ：　ｐＩＮＤ系におけるＭ１４６Ｌ−ＰＳ１（Ｂ）またはＮ１４１Ｉ−ＰＳ２（Ｃ）のＥｃＤ誘導発現によるＦ１１／ＥｃＲ細胞死に対するｐＥＦ４−ｈＧｔｘの効果。Ｆ１１／ＥｃＲ細胞に、ｐＩＮＤがコードするＭ１４６Ｌ−ＰＳ１またはＮ１４１Ｉ−ＰＳ２を、ｐＥＦ４−ｈＧｔｘまたは空のｐＥＦ４／Ｈｉｓベクターと共にトランスフェクトした。トランスフェクションからほぼ１日後、細胞をＥｃＤの濃度を増加させてまたはＥｃＤなしで処理した。ＥｃＤ処理はトランスフェクション効率に影響しなかった。ＥｃＤ処理の７２時間後に、トリパンブルー排除により細胞死率を測定した。トランスフェクションなし、または空のｐＩＮＤと空のｐＥＦ４／Ｈｉｓベクターのトランスフェクションによるネガティブコントロールにおける細胞死率は、図３のそれらと同様であった。
【図６】ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２の欠失変異体のアンタゴニスティックな機能を示す図である。
Ａ：　ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２の欠失変異体の模式図。これらの構築物は全てｐＥＦ４／Ｈｉｓ中に構築した。ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２のドメインを以下に示す。Ｎ末端ドメイン（Ｍｅｔ１〜Ｇｌｎ３５）、グリシンリッチドメイン（Ｇｌｙ３６〜Ｇｌｙ９４）、プロリンリッチドメイン（Ｐｒｏ９５〜Ｌｙｓ１４７）、ホメオドメイン（Ｌｙｓ１４８〜Ｈｉｓ２０７）、および極性リッチドメイン（Ａｌａ２０８〜Ｌｅｕ２７７）。
Ｂ：　発現されたｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２およびその欠失変異体のイムノブロット解析。ｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２またはその欠失変異体をトランスフェクトしたＦ１１細胞のライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、抗（Ｈｉｓ）６抗体を用いてイムノブロット解析を行った（レーン１：　トランスフェクションなし；　レーン２：　ｐＥＦベクターのトランスフェクション；　レーン３：　ｐＥＦ−ｈＧｔｘ；　レーン４：　ｐＥＦ−ｈＧｔｘＮＴ；　レーン５：　ｐＥＦ−ｈＧｔｘＣＴ；　レーン６：　ｐＥＦ−ｈＧｔｘΔＰ；　レーン７：　ｐＥＦ−ｈＧｔｘＨ；　レーン８：　Ｄｌｘ４）。
Ｃ：　Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰまたはＬ６４８Ｐ−ＡＰＰによる神経細胞毒性に対するｈＧｔｘ／Ｎｋｘ６．２の欠失変異体の効果。１．５μｇプロトコルを用い、空ベクター（図中ｐｃＤＮＡ）またはｐｃＤＮＡがコードするＶ６４２Ｉ−ＡＰＰまたはＬ６４８Ｐ−ＡＰＰを、ｐＥＦ４／Ｈｉｓベクター（図中ｐＥＦ）またはいずれかのｈＧｔｘ構築物（ｐＥＦ４−ｈＧｔｘ、ｐＥＦ４−ｈＧｔｘＮＴ、ｐＥＦ４−ｈＧｔｘＣＴ、ｐＥＦ４−ｈＧｔｘΔＰ）と共にＦ１１細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後に細胞死率を測定した。
Ｄ：　Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰまたはＬ６４８Ｐ−ＡＰＰによる神経細胞毒性に対するｐＥＦ−ｈＧｔｘＨの効果。Ｃと同じ条件下で、空ベクター（図中ｐｃＤＮＡ）またはｐｃＤＮＡがコードするＶ６４２Ｉ−ＡＰＰまたはＬ６４８Ｐ−ＡＰＰを、空のｐＥＦ４／Ｈｉｓベクター（図中ｐＥＦ）あるいはｐＥＦ４−ｈＧｔｘまたはｐＥＦ４−ｈＧｔｘＨのいずれかと共にＦ１１細胞にトランスフェクトした。細胞死率を同様にして測定した。
Ｅ：　Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰによる神経細胞毒性に対するＤｌｘ４の効果。Ｃと同じ条件下で、空ベクター（図中ｐｃＤＮＡ）またはｐｃＤＮＡがコードするＶ６４２Ｉ−ＡＰＰを、空のｐＥＦ４／Ｈｉｓベクター（図中ｐＥＦ）、ｐＥＦ４−ｈＧｔｘＨ、またはＤｌｘ４のいずれかと共にＦ１１細胞にトランスフェクトした。細胞死率を同様にして測定した。Ｃ〜Ｄにおいて、”＊”　はＶ６４２Ｉ−ＡＰＰとｐＥＦ４／Ｈｉｓによる細胞毒性に比べ細胞毒性が有意に低いことを示し、”＊＊”　はＶ６４２Ｉ−ＡＰＰとｐＥＦ４／Ｈｉｓによる細胞毒性に比べ細胞毒性に有意差がないことを示す。”・”　はＶ６４２Ｉ−ＡＰＰとｐＥＦ４／Ｈｉｓによる細胞毒性を示し、ｐｃＤＮＡとｐＥＦ４／Ｈｉｓによる細胞毒性に比べ有意に増悪している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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