(57)【要約】【課題】本発明は、多数の生物のＤＮＡが混合した試料等、プライマー結合の競合が起こりうる環境でＰＣＲ増幅を経て得られたに情報に対して、「不明瞭なバンド」の有無を明らかにする事を可能とするポリヌクレオチド断片の再現方法、および、データの確認方法を提供する。また、「不明瞭なバンド」の有無を明らかにすることにより、生物識別を精度良く行う生物識別方法および生物識別の確認方法を提供することを課題とする。【解決手段】ＰＣＲ増幅後、増幅されたポリヌクレオチド断片の分類のための処理を行った試料を得る第一の工程と、第一の工程で得た試料の一部又は全部からポリヌクレオチドを抽出する第二の工程と、前記抽出されたポリヌクレオチド断片に対し、再度ＰＣＲ増幅をおこなう【選択図】　　　図１
2004041074.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＲ増幅後、増幅されたポリヌクレオチド断片の分類のための処理を行った試料を得る第一の工程と、第一の工程で得た試料の一部又は全部からポリヌクレオチドを抽出する第二の工程と、前記抽出されたポリヌクレオチド断片に対し、再度ＰＣＲ増幅をおこなう第三の工程を含むことを特徴とするポリヌクレオチド断片の再現方法。
【請求項２】
前記第二の工程におけるポリヌクレオチドの抽出は、第一の工程で得た分類のための処理後の試料を複数の区画に分け、各々の区画または一つの区画からおこなうことを特徴とする請求項１記載のポリヌクレオチド断片の再現方法。
【請求項３】
前記第一の工程は、照合対象試料に対して行うものであり、前記第二の工程におけるポリヌクレオチドを抽出する部位は、プライマー結合の競合が少ないまたは無い状態で識別対象生物のポリヌクレオチドに対してＰＣＲ増幅と分類のための処理を行った場合に、存在の有無を確認したいポリヌクレオチド断片が多く存在すると推定される部位の情報に基づいて決定されるものである事を特徴とする請求項１または２記載のポリヌクレオチド断片の再現方法。
【請求項４】
前記第一の工程で使用される分類のための処理は電気泳動法であり、前記第二の工程は、泳動処理後の試料の泳動基質の、全部または一部からポリヌクレオチドを抽出する工程を含み、前記第三の工程は、前記第２の工程で抽出されたポリヌクレオチド断片に対し再度ＰＣＲ増幅及び電気泳動処理を行うことにより、抽出を行った泳動基質の部位および当該部位よりも泳動開始部位から見て遠い部位に位置するポリヌクレオチド断片を増幅させる工程を含むことを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載のポリヌクレオチド断片の再現方法。
【請求項５】
ＰＣＲ増幅される対象はＤＮＡであり、前記第二の工程は、識別対象である一または複数の種類の生物のＤＮＡに対してＰＣＲ増幅および電気泳動法を適用し、ＤＮＡ断片のバンドが現れる部位を把握し、当該把握された部位に対応する第一工程を経た照合対象試料の泳動基質の区画より、ＤＮＡを抽出する工程を含むものであることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれかに記載のポリヌクレオチド断片の再現方法。
【請求項６】
前記第一の工程に用いられる電気泳動法はゲル電気泳動法であり、前記第二の工程におけるＤＮＡの抽出は、対応する位置のゲルを切り出してＤＮＡの抽出を行うものであることを特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載のポリヌクレオチド断片の再現方法。
【請求項７】
前記第二の工程でポリヌクレオチドを抽出する区画は、プライマー結合の競合が少ないまたは無い状態で、識別対象生物のポリヌクレオチドに対してＰＣＲ増幅及び電気泳動処理を行った場合にはポリヌクレオチドのバンドが識別され、かつ、照合対象試料に対してＰＣＲ増幅及び電気泳動処理を行った場合にはポリヌクレオチドのバンドが識別しにくいと想定される区画であることを特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載のポリヌクレオチド断片の再現方法。
【請求項８】
前記第二の工程でポリヌクレオチドを抽出する区画は、プライマー結合の競合が少ないまたは無い状態で、識別対象生物のポリヌクレオチドに対してＰＣＲ増幅及び電気泳動処理を行った場合にはポリヌクレオチドのバンドが識別され、かつ、同様の条件で照合対象試料に対してＰＣＲ増幅及び電気泳動処理を行った場合にはポリヌクレオチドのバンドが識別しにくい区画であることを特徴とする請求項７記載のポリヌクレオチド断片の再現方法。
【請求項９】
識別対象生物のＤＮＡに対し、ＰＣＲ増幅と電気泳動法を用いて得た電気泳動像を記憶する記憶手段を備え、前記記憶された電気泳動像と、照合対象試料に対してＰＣＲ増幅と電気泳動法とを行って得た電気泳動像と比較することにより生物を識別する方法において、照合対象試料に対してＰＣＲ増幅及び電気泳動法を行い、識別対象生物の泳動像に現れるＤＮＡ断片のバンドのうち、存在の有無を確認したいＤＮＡ断片またはＤＮＡ断片のセットが出現する部位に該当する照合対象の泳動基質からＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡに対して、再度のＰＣＲ増幅と電気泳動法を行う工程を含むことを特徴とする生物識別方法。
【請求項１０】
前記ＰＣＲ増幅はＳＳＣ−ＰＣＲ法により行われ、照合対象試料は、複数の生物のＤＮＡが存在していると予想されるものであることを特徴とする請求項９に記載の生物識別方法。
【請求項１１】
前記再度のＰＣＲ増幅を行うＤＮＡを抽出する区画は、照合対象試料に対してＰＣＲ増幅と電気泳動法を行った場合にはバンドが識別しにくい区画であり、かつ、識別対象生物のＤＮＡに対してＰＣＲ増幅と電気泳動法を行った場合にはバンドが識別可能な部位に対応する区画であることを特徴とする請求項９または請求項１０に記載の生物識別方法。
【請求項１２】
前記ＰＣＲ増幅は、複数の種類のプライマーを用いるＳＳＣ−ＰＣＲ法であることを特徴とする請求項９ないし請求項１１のいずれかに記載の生物識別方法。
【請求項１３】
前記生物識別方法は、微生物を対象とするものであることを特徴とする請求項９ないし請求項１２のいずれかに記載の生物識別方法。
【請求項１４】
請求項９ないし請求項１３のいずれかに記載の生物識別方法により得られる再度のＰＣＲ増幅と電気泳動法を行った後の泳動像と、照合対象試料に対してのＰＣＲ増幅と電気泳動法とを行って得た電気泳動像とを比較し、照合対象試料に対してのＰＣＲ増幅と電気泳動法とを行って得た電気泳動像では認識されないバンドが、再度のＰＣＲ増幅と電気泳動法を行った結果の電気泳動像において識別されるか否かにより、生物識別の結果を確認する生物識別の確認方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＰＣＲ増幅を利用した、ポリヌクレオチド断片の再現方法、生物識別方法、および生物識別の確認方法に関する。
【従来の技術】
環境汚染の把握や改善、食品の安全性の確認、特定の疾患との関連から、食品、土壌、ゴミ処理槽、呼吸器や消化器系等の体内、糞便等、多数の生物のＤＮＡが混在していると予想される試料からも、効率的に生物の存否や状態を識別することが求められている。これらの試料に含まれる生物には、ＤＮＡ解析が進んでいない物も多いため、事前に配列情報が必要な通常のＰＣＲ法を用いた検出は、困難であるという問題があった。また、同一の環境に生息している生物同士には遺伝的近縁性の高い種類のものも含まれることも予想され、各々のＤＮＡマーカーを得て、含まれる生物種を検出することが困難であるという問題があった。
これらの困難を解決するため、ＡＰ−ＰＣＲ法、ＲＡＰＤ法、ＲＬＧＳ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｌａｎｄｍａｒｋ　ｇｅｎｏｍｅ　ｓｃａｎｎｉｎｇ）、パルスフィールド電気泳動法あるいは出願人の先の出願であるＳＳＣ−ＰＣＲ法（特開平１１−３４１９８９）、等を用いた方法が考案されている。
ＡＰ−ＰＣＲ（ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ　ｐｒｉｍｅｄ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）法またはＲＡＰＤ法とは、単一のプライマーでゲノム中の一部または複数の部分を増幅する技術である。事前の塩基配列情報がない場合にも、単数または複数のＤＮＡ断片を増幅することができる。このような特徴から、ゲノムプロジェクトのあまり進んでいない生物のゲノム解析には、特に有効な手段と考えられている。具体的には、ＡＰ−ＰＣＲまたはＲＡＰＤ法は、ＰＣＲの反応時にプライマーのアニーリング温度を下げ、反応液中のマグネシウムイオン濃度をあげることにより、プライマーアニール時の配列特異性を下げる。すると単一のプライマー（以下ＡＰプライマーと呼ぶ）は、ミスマッチが入っている場合でも、ゲノムにアニールしやすくなり、それぞれの３´末端同士が向き合った場合には、増幅サイクルに入り、向き合った部分にはさまれたＤＮＡ断片がＰＣＲ産物として増幅される（以下ＲＡＰＤ断片）。ＤＮＡが２本鎖になっているの部分では、塩基対の塩基同士が互いの電荷を打ち消し合うため、電荷はリン酸の数により決定される。リン酸の数と核酸の分子量は、通常比例する。このため、ゲル電気泳動によってこれらのＰＣＲ産物をその鎖長で分離し、ＤＮＡフィンガープリントとして観察することができる。ＤＮＡフィンガープリントは、ミニサテライトの検出や多型の検出、シーケンス反応等に用いられている。また、分離したＤＮＡは、ゲルより抽出し、回収することが可能である。使用するゲルは、アガロースゲル、セファロース、ポリアクリルアミドゲル、セファデックスゲル、デンプン、またはこれらの混合物、等が一般的である。
出願人は、ＡＰ−ＰＣＲまたはＲＡＰＤ法をさらに改良することにより、試料に複数の生物のＤＮＡが含まれている場合にも、複数の種類のＡＰプライマーを１度に、または順次に、または並列に用いて複数の生物から同時にＲＡＰＤ断片を得、さらに、これらの複合したフィンガープリントのバンドパターンと、各々の生物がもつフィンガープリントのパターンを比較することにより、生物群の識別を行うことを可能にした（特開平１１−３４１９８９参考）。
しかし、これまでのわれわれの実験によれば、ある一種類の生物のＤＮＡにたいしてＰＣＲ法またはＳＳＣ−ＰＣＲ法等を行った場合には得られるＰＣＲ産物の一部が、多種類の生物のＤＮＡを混合した試料やプライマー結合サイトが多数ある試料に対してＰＣＲ増幅をおこなった場合には、ＰＣＲ産物の中から明瞭に検出できない現象が見られた（以下、明瞭に検出できなくなるバンドを不明瞭なバンド、このような現象を不明瞭なバンド現象と呼ぶ）。
ＳＳＣ−ＰＣＲ法等をもちいた生物の識別方法は、電気泳動処理によりＲＡＰＤ産物を解析し、ある一種類の生物のＤＮＡにたいしてＳＳＣ−ＰＣＲ法等を行った場合には得られるＲＡＰＤ産物が、混合した試料のＤＮＡにたいしてＳＳＣ−ＰＣＲ法等を行った場合に得られるＰＣＲ産物に含まれるか否かで生物の存在の有無を決定するものであるから、上記のような再現性の低いＤＮＡ断片を含むことにより、ＳＳＣ−ＰＣＲ法により得られたデータは全体の信頼性が低くなるという問題があった。
また、上記のような問題は、ＳＳＣ−ＰＣＲを用いた場合にのみ起こるのではいと考えられる。すなわち、多数のプライマー結合サイトを持つポリヌクレオチドに対してＰＣＲ増幅を行う場合や、一度に複数種のプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行う場合等、プライマー結合の競合が起こる環境でのＰＣＲ増幅の結果では、ポリヌクレオチド断片の増幅しやすさの差によって、上記「不明瞭なバンド」現象が生じ得る。不明瞭なバンドは、生物の状態を識別するＲＡＰＤ法のフィンガープリントや、遺伝子発現量を解析する、ブロッティング等のデータ等の様々なデータの信頼性を低くしている可能性がある。
なお、本命明細書中では、ＰＣＲ増幅という言葉は、ポリメラーゼ連鎖反応を用いたＤＮＡ等のポリヌクレオチドの増幅方法を意味し、ＰＣＲ法、ＲＡＰＤ法（ＡＰ−ＰＣＲ法）、ＳＳＣ−ＰＣＲ法等で行う増幅をも含むものとする。
【発明が解決しようとする課題】
多数の生物のＤＮＡが混合した試料等、プライマー結合の競合が起こりうる環境でＰＣＲ増幅を経て得られたに情報に対して、「不明瞭なバンド」の有無を明らかにする事を可能とするポリヌクレオチド断片の再現方法、および、データの確認方法を提供する。また、「不明瞭なバンド」の有無を明らかにすることにより、生物識別を精度良く行う生物識別方法および生物識別の確認方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
請求項１は、ＰＣＲ増幅後、増幅されたポリヌクレオチド断片の分類のための処理を行った試料を得る第一の工程と、第一の工程で得た試料の一部又は全部からポリヌクレオチドを抽出する第二の工程と、前記抽出されたポリヌクレオチド断片に対し、再度ＰＣＲ増幅をおこなう第三の工程を含むことを特徴とするポリヌクレオチド断片の再現方法である。
ポリヌクレオチドを抽出する部位は、試料の泳動開始部位に近接する一部又は任意の一部や、全部である場合を含む。また、ポリヌクレオチド断片の分類のための処理には、ペーパーやカラムを用いたクロマトグラフィーや液体クロマトグラフィー、超遠心法、密度勾配遠心法、溶媒抽出法等を含む。また、当該再現方法には、「不明瞭なバンド」がもともと存在しない試料に対して行った場合等、結果的に「不明瞭なバンド」が再現しない場合を含む。また、分類されるポリヌクレオチド断片には、２本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ，高次構造をもつＲＮＡ、三次元構造を壊すために尿素やホルムアルデヒド処理を行なったＲＮＡ等を含む。請求項２は、前記第二の工程におけるポリヌクレオチドの抽出は、第一の工程で得た分類のための処理後の試料を複数の区画に分け、各々の区画または一つの区画からおこなうことを特徴とする請求項１記載のポリヌクレオチド断片の再現方法である。
請求項３は、前記第一の工程は、照合対象試料に対して行うものであり、前記第二の工程におけるポリヌクレオチドを抽出する部位は、プライマー結合の競合が少ないまたは無い状態で識別対象生物のポリヌクレオチドに対してＰＣＲ増幅と分類のための処理を行った場合に、存在の有無を確認したいポリヌクレオチド断片が多く存在すると推定される部位の情報に基づいて決定されるものである事を特徴とする請求項１または２記載のポリヌクレオチド断片の再現方法である。
存在の有無を確認したいポリヌクレオチド断片は、単数であっても複数であっても構わない。また、ポリヌクレオチド断片が多く存在するとの推定は、キャピラリー電気泳動等の結果からの推定や、コンピュータ上での処理や補正の手段を含んでなす推定を含む。
請求項４は、前記第一の工程で使用される分類のための処理は電気泳動法であり、前記第二の工程は、泳動処理後の試料の泳動基質の、全部または一部からポリヌクレオチドを抽出する工程を含み、前記第三の工程は、前記第２の工程で抽出されたポリヌクレオチド断片に対し再度ＰＣＲ増幅及び電気泳動処理を行うことにより、抽出を行った泳動基質の部位および当該部位よりも泳動開始部位から見て遠い部位に位置するポリヌクレオチド断片を増幅させる工程を含むことを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載のポリヌクレオチド断片の再現方法である。
電気泳動法には、キャピラリー電気泳動、パルスフィールド電気泳動、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法等、電界での動きを基にしたあらゆる分離方法を含む。
請求項５は、ＰＣＲ増幅される対象はＤＮＡであり、前記第二の工程は、識別対象である一または複数の種類の生物のＤＮＡに対してＰＣＲ増幅および電気泳動法を適用し、ＤＮＡ断片のバンドが現れる部位を把握し、当該把握された部位に対応する第一工程を経た照合対象試料の泳動基質の区画より、ＤＮＡを抽出する工程を含むものであることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれかに記載のポリヌクレオチド断片の再現方法である。
識別対象生物は、一種類の場合の他、例えば特定の場所に生息する複数の細菌を菌層としてとらえたい場合のように、複数の生物を群としてとらえる場合を含む。
請求項６は、前記第一の工程に用いられる電気泳動法はゲル電気泳動法であり、前記第二の工程におけるＤＮＡの抽出は、対応する位置のゲルを切り出してＤＮＡの抽出を行うものであることを特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載のポリヌクレオチド断片の再現方法である。
請求項７は、前記第二の工程でポリヌクレオチドを抽出する区画は、プライマー結合の競合が少ないまたは無い状態で、識別対象生物のポリヌクレオチドに対してＰＣＲ増幅及び電気泳動処理を行った場合にはポリヌクレオチドのバンドが識別され、かつ、照合対象試料に対してＰＣＲ増幅及び電気泳動処理を行った場合にはポリヌクレオチドのバンドが識別しにくいと想定される区画であることを特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載のポリヌクレオチド断片の再現方法である。
請求項８は、前記第二の工程でポリヌクレオチドを抽出する区画は、プライマー結合の競合が少ないまたは無い状態で、識別対象生物のポリヌクレオチドに対してＰＣＲ増幅及び電気泳動処理を行った場合にはポリヌクレオチドのバンドが識別され、かつ、同様の条件で照合対象試料に対してＰＣＲ増幅及び電気泳動処理を行った場合にはポリヌクレオチドのバンドが識別しにくい区画であることを特徴とする請求項７記載のポリヌクレオチド断片の再現方法である。
請求項９は、識別対象生物のＤＮＡに対し、ＰＣＲ増幅と電気泳動法を用いて得た電気泳動像を記憶する記憶手段を備え、前記記憶された電気泳動像と、照合対象試料に対してＰＣＲ増幅と電気泳動法とを行って得た電気泳動像と比較することにより生物を識別する方法において、照合対象試料に対してＰＣＲ増幅及び電気泳動法を行い、識別対象生物の泳動像に現れるＤＮＡ断片のバンドのうち、存在の有無を確認したいＤＮＡ断片またはＤＮＡ断片のセットが出現する部位に該当する照合対象の泳動基質からＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡに対して、再度のＰＣＲ増幅と電気泳動法を行う工程を含むことを特徴とする生物識別方法である。
なお、本請求項には、存在の有無を確認したいＤＮＡ断片またはＤＮＡ断片のセットが出現する部位に該当する照合対象の泳動基質に、バンドが実際に出現している場合および出現していない場合の双方を含む。
請求項１０は、前記ＰＣＲ増幅はＳＳＣ−ＰＣＲ法により行われ、照合対象試料は、複数の生物のＤＮＡが存在していると予想されるものであることを特徴とする請求項９に記載の生物識別方法である。
請求項１１は、前記再度のＰＣＲ増幅を行うＤＮＡを抽出する区画は、照合対象試料に対してＰＣＲ増幅と電気泳動法を行った場合にはバンドが識別しにくい区画であり、かつ、識別対象生物のＤＮＡに対してＰＣＲ増幅と電気泳動法を行った場合にはバンドが識別可能な部位に対応する区画であることを特徴とする請求項９または請求項１０に記載の生物識別方法である。
請求項１２は、前記ＰＣＲ増幅は、複数の種類のプライマーを用いるＳＳＣ−ＰＣＲ法であることを特徴とする請求項９ないし請求項１１のいずれかに記載の生物識別方法である。
請求項１３は、前記生物識別方法は、微生物を対象とするものであることを特徴とする請求項９ないし請求項１２のいずれかに記載の生物識別方法。
請求項１４は、請求項９ないし請求項１３のいずれかに記載の生物識別方法により得られる再度のＰＣＲ増幅と電気泳動法を行った後の泳動像と、照合対象試料に対してのＰＣＲ増幅と電気泳動法とを行って得た電気泳動像とを比較し、照合対象試料に対してのＰＣＲ増幅と電気泳動法とを行って得た電気泳動像では認識されないバンドが、再度のＰＣＲ増幅と電気泳動法を行った結果の電気泳動像において識別されるか否かにより、生物識別の結果を確認する生物識別の確認方法である。
【発明の実施の形態】
まず、従来技術の問題点を解決するために、出願人が使用した現象について述べる。
例えば、２本鎖ＤＮＡ断片に対してゲル電気泳動を行なった場合には、電場内におかれた２本鎖ＤＮＡは陽極側に向って鎖長の短いものほど早く移動する。上記ＤＮＡ断片は各々の鎖長等によって泳動距離が定まることになり、フィンガープリント等の形で認識される。しかし、前記のようなフィンガープリントを例にとって解析してみると、バンドが出現する部位は、同種のＤＮＡ断片の多くが達する部位に過ぎず、実際には、固有の泳動距離まで泳動せず、より泳動開始位置に近い部位にも同種のＤＮＡ断片が、テールを引くように残される。この一方で、固有の泳動距離を越えて、より泳動開始位置から遠くに同種のＤＮＡ断片が存在する可能性はきわめて低い。このような現象は、ポリヌクレオチド等の物質を種類によって位置的に異なる部位に集合させるように分類する場合によく起こると考えられる。
不明瞭なバンド現象を生ずる原因の一つは、以下のようなものと考えられる。増幅されるＤＮＡ断片はその断片により、増幅しやすさが異なる。増幅しにくい種類のＤＮＡ断片は、プライマーの結合が競合により一部阻害される環境でＰＣＲ増幅が行われると、増幅するスピードが顕著に遅くなり不明瞭なバンドとなる。増幅しやすさの差を生む要因の一つは、プライマー結合サイトとプライマーの結合する強さの差であると考えられる。所定の塩基配列を有する鋳型ＤＮＡの適合位置にプライマーが強く結合して配置する場合は、ＤＮＡ断片の増幅効率が高いと考えられる。このようなプライマーにより増幅されたＤＮＡ断片は、電気泳動像において再現性の高い明瞭なバンドとして現れる。一方、プライマーと鋳型ＤＮＡの適合位置との結合が弱い場合、鋳型ＤＮＡの適合位置よりも結合が強い他の位置にプライマーが結合する。このように、ＤＮＡ断片の増幅反応においては競争的に反応が進行するため、プライマーと鋳型ＤＮＡとの結合が弱い場合にはＤＮＡ断片の増幅効率が低くなる。このような結合の弱いプライマーにより増幅されるＤＮＡ断片は、電気泳動像において再現性が低く不明瞭なバンドとして現れるというものである。
これらの現象の検討を踏まえ、本発明の実施例のプロセスについて説明する。図１左側に示すように、細菌Ａの試料、細菌Ｂの試料、細菌Ａと細菌Ｂの両方を含む試料、の３つから、それぞれＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ増幅を適用した後、電気泳動を行なって増幅されたＤＮＡ断片を分類した。細菌Ａの試料から得られたフィンガープリントには３本のバンドが認識された。細菌Ｂの試料から得られたフィンガープリントには２本のバンドが認識された。
この結果から推測すれば、細菌Ａと細菌Ｂの両方を含む試料には、ＡまたはＢの試料に見られる５本のバンド認識されることが予測される。しかし、実際には細菌Ａと細菌Ｂの両方を含む試料から得られたフィンガープリントには３本のバンドしか認識できなかった（図１左側の細菌Ａ＋Ｂのフィンガープリント像中、点線で示されているバンドは、出現が予測されたにもかかわらず識別されなかった２本のバンドを示す。
そこで出現を予測されたにもかかわらずバンドが認識されなかった区画のゲルを切り出して、この部位に含まれるＤＮＡ断片を抽出し、再度ＰＣＲ増幅を適用した後、同様の条件で電気泳動をおこなって増幅されたＤＮＡ断片を分類した。この結果、一度目のＰＣＲ増幅と電気泳動を経た段階では認識されなかった２本のバンドを含むフィンガープリントが認識された。認識されたバンドはいずれも、細菌Ａまたは細菌Ｂのフィンガープリントのどちらかに出現しているバンドであり、かつ、ＤＮＡを抽出した部位よりもプラス側の、泳動開始部位から遠い部位に出現するバンドである。すなわち、再度のＰＣＲ増幅により、一度目のＰＣＲ増幅適用時には、識別される程の量が増幅されなかった２種類のＤＮＡ断片についても、識別可能な量まで増幅されたことを意味している。
この現象は、不明瞭なバンドを形成するＲＡＰＤ断片も、一度目のＰＣＲ増幅時にプライマー結合の競合がある環境下でも比較的少量ではあっても増幅されており、当該増幅された断片についてはミスマッチが解消しているため、再度のＰＣＲ増幅時には増幅しやすい断片となっていると考えることにより説明することが可能となる。
さらに、これまでの実験から、一種類のＡＰプライマーで増幅されるＤＮＡ断片のバンド間で比較した場合には、蛍光強度の低いバンドのほうが不明瞭なバンドとなりやすい傾向があることが分かった。蛍光強度の低いバンドが出現する領域に対応する部位から、識別対象試料のＤＮＡを抽出する区画を設けることは一つの効果的な方法であると考えられる。また、照合対象試料に対して行った第一の工程後の結果と、選択した区画から抽出したポリヌクレオチドに対して行った第三の工程後の結果との比較を行った場合の他、第二工程で分けた区画同士の結果を比較した場合にも、「不明瞭なバンド」の有無を確認することが可能な場合がある。
なお、バンドの対比をおこないやすくするため、以下ＳＳＣ−ＰＣＲによるフィンガープリントについておこなった実証について記載するが、本方法はＳＳＣ−ＰＣＲ以外のＰＣＲ増幅を用いた試料についても実施可能である。
（実施例１）　実証例
▲１▼．１種類細菌ＤＮＡと２種類細菌混合ＤＮＡのＰＣＲについて
Ｖｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈｅｍｏｌｉｔｉｃｕｓとＹｅｒｓｉｎａ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａをｐｒｉｍｅｒ　Ｇ０２でＰＣＲした結果を図２に示す。実験は３回行った。図中ＡがＶｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈｅｍｏｌｉｔｉｃｕｓのＤＮＡ、ＢがＹｅｒｓｉｎａ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａのＤＮＡ、Ａ＋ＢがＶｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈｅｍｏｌｉｔｉｃｕｓ　とＹｅｒｓｉｎａ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａのＤＮＡを混合した試料をそれぞれテンプレートとしてＰＣＲした電気泳動プロファイルである。Ａでは約６５０ｂｐに蛍光強度が高いバンドが一本確認できた。また約９００ｂｐの位置には蛍光虚強度が低いバンドが見られるサンプルもあった。Ｂでは約１６００ｂｐ、１８００ｂｐの位置に２本バンドが見られ、９００ｂｐ付近に蛍光強度が弱いバンドが１本あるいは２本確認できた。２つのＤＮＡの混合物をテンプレートとしたＡ＋Ｂでは約６５０ｂｐの位置に蛍光強度が高いバンドが１本確認され、９００ｂｐに弱いバンドが見られるサンプルも有った。しかしＢでは明瞭に観察されたバンドを確認することはできなかった。
２種類以上の細菌ＤＮＡを混合すると、単体では見られたバンドが消失することがあることがわかった。この現象はＶｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈｅｍｏｌｉｔｉｃｕｓとＹｅｒｓｉｎａ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａに特異的ではなく、他の細菌の組合せでも見られる一般な現象である。
▲２▼．ゲルから抽出したＤＮＡを鋳型としたＰＣＲについて
３組の混合ＤＮＡについて図３に示した。上段はＶｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈｅｍｏｌｉｔｉｃｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎａ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａとｐｒｉｍｅｒ　Ｇ０２、中段はＶｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈｅｍｏｌｉｔｉｃｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｒａ　ｏｘｙｔｏｃａとｐｒｉｍｅｒ　Ｂ４７、下段はＫｌｅｂｓｉｅｒａ　ｏｘｙｔｏｃａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓとｐｒｉｍｅｒ　Ｇ２２の組合せでＰＣＲした結果である。各段の左には１種類の細菌ＤＮＡをテンプレートとしたサンプルと２種の細菌ＤＮＡを混合したＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲ結果を示している。混合ＤＮＡのレーンに示した正方形はゲルの切出し位置を示す。各々の組で４箇所から抽出した。
各々の位置を切り出しＤＮＡ抽出したサンプルをテンプレートとしてＰＣＲした結果を各段の右図に示した。この図中の正方形に数字は、ゲル切出し位置に対応する。４箇所のレーンの右に隣接するレーンは４箇所から抽出したＤＮＡを等量混合したサンプルをＰＣＲした結果である。
図中の１／１０、１／１００、１／１０００は抽出したＤＮＡをテンプレートとした時の希釈倍率を示す。
これらの実験からわかったことをＶｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈｅｍｏｌｉｔｉｃｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎａ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａとｐｒｉｍｅｒ　Ｇ０２を使った例で示す。
切出し位置「１」から抽出したＤＮＡを使うとＡあるいはＢで現れたバンドを再現できた。これは、この部分にＡ，Ｂで現れた全てのバンドが含まれていることを示す。
切出し位置「３」から抽出したＤＮＡを使うとＡで見られた６５０ｂｐのバンドは再現できたがＢで見られた１７００ｂｐ近辺のバンドは再現されなかった。これは、切り出し部分より陽極側のバンドは含まれるが、陰極側のバンドは存在しないことを示している。
２種の細菌ＤＮＡを混合して消えたＢの１７００ｂｐ付近のバンドは、この位置より陰極側を切り出すことで再現できた。その他２組の例でも同様のことが言える。
以上の結果より、ＤＮＡの混合で消えたバンドは消えた部分よりも陰極側のゲルから抽出したＤＮＡを再度ＰＣＲすることにより再現できると結論できる。
▲３▼．なお、本実験は以下の条件のもとでおこなった。
１．使用細菌
Ｖｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈｅｍｏｌｉｔｉｃｕｓ（３）
Ｙｅｒｓｉｎａ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ（４）
Ｋｌｅｂｓｉｅｒａ　ｏｘｙｔｏｃａ（６）
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ（１２）
２．ＰＣＲ機器
ＧｅｎｅＡＭＰ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：商標）
３．ＰＣＲ反応溶液（２０ｕＬ）
１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
５０ｍＭ　ＫＣｌ
１．５ｍＭ　Ｍｇ２＋
２００ｕＭ　ｄＮＴＰｍｉｘ（ｅａｃｈ）
４．ポリメラーゼ
ＴａＫａＲａ　Ｔａｑ：０．０２５Ｕ／μＬ
５．テンプレート
１種類細菌ＤＮＡの試料：１０ｐｇ／μＬ（ｅａｃｈ）
２種類細菌ＤＮＡの混合試料：１０ｐｇ／μＬ（ｅａｃｈ）
６．プライマー
３種類のプライマーを用いた。
・　ｐｒｉｍｅｒ　Ｇ０２（５’−ＴＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡ−３’）　（配列番号１）
・　ｐｒｉｍｅｒ　Ｂ４７（５’−ＧＣＣＧＣＣＡＧＡＧＧＡ−３’）　（配列番号２）
・　ｐｒｉｍｅｒ　Ｇ２２（５’−ＡＧＧＧＣＣＡＴＧＡＴＡ−３’）　（配列番号３）
2004041074.tif 000003
８．１回目の電気泳動後のゲルからのＰＣＲ産物の抽出
Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＱＩＡＧＥＮ：商標）キット
９．ＤＮＡ抽出について
各細菌を新鮮培地にて培養しＳＤＳ等の薬剤による溶菌、酵素とフェノールによる蛋白除去を経てエタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。ＤＮＡを数回洗い乾燥後ＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）に溶解した。
１０．ＰＣＲと電気泳動について
１種類細菌ＤＮＡ試料
抽出したＤＮＡを純水を用いて希釈し、上記条件でＰＣＲをおこなった。その後、アガロースゲルを用いて１００Ｖで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色を経てＵＶ励起による蛍光をデジタルカメラで撮影した。この画像を電子データとして保存した。
１１．２種細菌ＤＮＡ混合試料
抽出した各ＤＮＡを純水を用いて希釈後、混合し上記条件でＰＣＲをおこなった。その後の処理は１種類細菌ＤＮＡ試料の場合と同様である。
１２．再度のＰＣＲについて
ＰＣＲ産物の抽出とＰＣＲ（図１参照）
電気泳動後のゲルの目的とする位置をカッターで切出しＧｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍキットを用いてＰＣＲ産物の抽出とクリーンアップを行った。その後、これまでと同様の条件でＰＣＲを行い、電気泳動とエチジウムブロマイドによる染色後写真撮影し、画像を電子ファイルとして保存した。
（実施例２）　本件発明を、データの確認方法として用いる場合
例えば、第一の工程で作成される試料は、ＰＣＲ増幅を含む工程により得られた電気泳動像の既存データの状態を再現した試料であり、前記第二の工程は、第一工程で作成した試料の泳動基質を複数の区画に分け、各々または一つの区画からポリヌクレオチドを抽出するものであり、前記抽出されたポリヌクレオチドに対して前記第三の工程を行うことで得られた電気泳動像のバンドと、既存データの電気泳動像のうち、第二の工程でポリヌクレオチドの抽出を行なった部位に対応する部位および当該部位よりも泳動開始部位からみて遠い部位に位置するバンドとを比較し、バンドの欠損を確認する第４の工程と、を含むような構成とすれば、データの確認方法としても使用できる。これまでに蓄積されているフィンガープリントのデータや、複数の染色体からなる生物のＲＡＰＤ法データ、ＲＮＡ発現量のデータ等、ＰＣＲ増幅の工程を含むデータの信頼性等を確認することが可能となる。
【発明の効果】
「不明瞭なバンド」の有無の確認を行なうことが可能となり、ポリヌクレオチド断片の再現、データの確認、精度の良い生物識別および生物識別の確認が可能となる。
【配列表】
2004041074.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【図１】不明瞭なバンドの再現方法のプロセスを示す図
【図２】１種類の細菌のＤＮＡと２種類の細菌のＤＮＡを混合したものについてＰＣＲを行なった結果の比較
【図３】ゲルから抽出したＤＮＡを鋳型としたＰＣＲの結果
【図１】
2004041074.tif 000005
【図２】
2004041074.tif 000006
【図３】
2004041074.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成15年3月20日(2003.3.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【特許請求の範囲】
【請求項１】ＰＣＲ増幅後、増幅されたポリヌクレオチド断片の分類のための処理を行った試料を得る第一の工程と、第一の工程で得た試料の一部又は全部からポリヌクレオチドを抽出する第二の工程と、前記抽出されたポリヌクレオチド断片に対し、再度ＰＣＲ増幅をおこなう第三の工程を含むことを特徴とするポリヌクレオチド断片の再現方法。
【請求項２】前記第二の工程におけるポリヌクレオチドの抽出は、第一の工程で得た分類のための処理後の試料を複数の区画に分け、各々の区画または一つの区画からおこなうことを特徴とする請求項１記載のポリヌクレオチド断片の再現方法。
【請求項３】前記第一の工程は、照合対象試料に対して行うものであり、前記第二の工程におけるポリヌクレオチドを抽出する部位は、プライマー結合の競合が少ないまたは無い状態で識別対象生物のポリヌクレオチドに対してＰＣＲ増幅と分類のための処理を行った場合に、存在の有無を確認したいポリヌクレオチド断片が多く存在すると推定される部位の情報に基づいて決定されるものである事を特徴とする請求項１または２記載のポリヌクレオチド断片の再現方法。
【請求項４】前記第一の工程で使用される分類のための処理は電気泳動法であり、前記第二の工程は、泳動処理後の試料の泳動基質の、全部または一部からポリヌクレオチドを抽出する工程を含み、前記第三の工程は、前記第２の工程で抽出されたポリヌクレオチド断片に対し再度ＰＣＲ増幅及び電気泳動処理を行うことにより、抽出を行った泳動基質の部位および当該部位よりも泳動開始部位から見て遠い部位に位置するポリヌクレオチド断片を増幅させる工程を含むことを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載のポリヌクレオチド断片の再現方法。
【請求項５】ＰＣＲ増幅される対象はＤＮＡであり、前記第二の工程は、識別対象である一または複数の種類の生物のＤＮＡに対してＰＣＲ増幅および電気泳動法を適用し、ＤＮＡ断片のバンドが現れる部位を把握し、当該把握された部位に対応する第一工程を経た照合対象試料の泳動基質の区画より、ＤＮＡを抽出する工程を含むものであることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれかに記載のポリヌクレオチド断片の再現方法。
【請求項６】前記第一の工程に用いられる電気泳動法はゲル電気泳動法であり、前記第二の工程におけるＤＮＡの抽出は、対応する位置のゲルを切り出してＤＮＡの抽出を行うものであることを特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載のポリヌクレオチド断片の再現方法。
【請求項７】前記第二の工程でポリヌクレオチドを抽出する区画は、プライマー結合の競合が少ないまたは無い状態で、識別対象生物のポリヌクレオチドに対してＰＣＲ増幅及び電気泳動処理を行った場合にはポリヌクレオチドのバンドが識別され、かつ、照合対象試料に対してＰＣＲ増幅及び電気泳動処理を行った場合にはポリヌクレオチドのバンドが識別しにくいと想定される区画であることを特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載のポリヌクレオチド断片の再現方法。
【請求項８】前記第二の工程でポリヌクレオチドを抽出する区画は、プライマー結合の競合が少ないまたは無い状態で、識別対象生物のポリヌクレオチドに対してＰＣＲ増幅及び電気泳動処理を行った場合にはポリヌクレオチドのバンドが識別され、かつ、同様の条件で照合対象試料に対してＰＣＲ増幅及び電気泳動処理を行った場合にはポリヌクレオチドのバンドが識別しにくい区画であることを特徴とする請求項７記載のポリヌクレオチド断片の再現方法。
【請求項９】識別対象生物のＤＮＡに対し、ＰＣＲ増幅と電気泳動法を用いて得た電気泳動像を記憶する記憶手段を備え、前記記憶された電気泳動像と、照合対象試料に対してＰＣＲ増幅と電気泳動法とを行って得た電気泳動像と比較することにより生物を識別する方法において、照合対象試料に対してＰＣＲ増幅及び電気泳動法を行い、識別対象生物の泳動像に現れるＤＮＡ断片のバンドのうち、存在の有無を確認したいＤＮＡ断片またはＤＮＡ断片のセットが出現する部位に該当する照合対象の泳動基質からＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡに対して、再度のＰＣＲ増幅と電気泳動法を行う工程を含むことを特徴とする生物識別方法。
【請求項１０】前記ＰＣＲ増幅はＳＳＣ−ＰＣＲ法により行われ、照合対象試料は、複数の生物のＤＮＡが存在していると予想されるものであることを特徴とする請求項９に記載の生物識別方法。
【請求項１１】前記再度のＰＣＲ増幅を行うＤＮＡを抽出する区画は、照合対象試料に対してＰＣＲ増幅と電気泳動法を行った場合にはバンドが識別しにくい区画であり、かつ、識別対象生物のＤＮＡに対してＰＣＲ増幅と電気泳動法を行った場合にはバンドが識別可能な部位に対応する区画であることを特徴とする請求項９または請求項１０に記載の生物識別方法。
【請求項１２】前記ＰＣＲ増幅は、複数の種類のプライマーを用いるＳＳＣ−ＰＣＲ法であることを特徴とする請求項９ないし請求項１１のいずれかに記載の生物識別方法。
【請求項１３】前記生物識別方法は、微生物を対象とするものであることを特徴とする請求項９ないし請求項１２のいずれかに記載の生物識別方法。
【請求項１４】請求項９ないし請求項１３のいずれかに記載の生物識別方法により得られる再度のＰＣＲ増幅と電気泳動法を行った後の泳動像と、照合対象試料に対してのＰＣＲ増幅と電気泳動法とを行って得た電気泳動像とを比較し、照合対象試料に対してのＰＣＲ増幅と電気泳動法とを行って得た電気泳動像では認識されないバンドが、再度のＰＣＲ増幅と電気泳動法を行った結果の電気泳動像において識別されるか否かにより、生物識別の結果を確認する生物識別の確認方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＰＣＲ増幅を利用した、ポリヌクレオチド断片の再現方法、生物識別方法、および生物識別の確認方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
環境汚染の把握や改善、食品の安全性の確認、特定の疾患との関連から、食品、土壌、ゴミ処理槽、呼吸器や消化器系等の体内、糞便等、多数の生物のＤＮＡが混在していると予想される試料からも、効率的に生物の存否や状態を識別することが求められている。これらの試料に含まれる生物には、ＤＮＡ解析が進んでいない物も多いため、事前に配列情報が必要な通常のＰＣＲ法を用いた検出は、困難であるという問題があった。また、同一の環境に生息している生物同士には遺伝的近縁性の高い種類のものも含まれることも予想され、各々のＤＮＡマーカーを得て、含まれる生物種を検出することが困難であるという問題があった。
【０００３】
これらの困難を解決するため、ＡＰ−ＰＣＲ法、ＲＡＰＤ法、ＲＬＧＳ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｌａｎｄｍａｒｋ　ｇｅｎｏｍｅ　ｓｃａｎｎｉｎｇ）、パルスフィールド電気泳動法あるいは出願人の先の出願であるＳＳＣ−ＰＣＲ法（特開平１１−３４１９８９）、等を用いた方法が考案されている。
【０００４】
ＡＰ−ＰＣＲ（ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ　ｐｒｉｍｅｄ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）法またはＲＡＰＤ法とは、単一のプライマーでゲノム中の一部または複数の部分を増幅する技術である。事前の塩基配列情報がない場合にも、単数または複数のＤＮＡ断片を増幅することができる。このような特徴から、ゲノムプロジェクトのあまり進んでいない生物のゲノム解析には、特に有効な手段と考えられている。具体的には、ＡＰ−ＰＣＲまたはＲＡＰＤ法は、ＰＣＲの反応時にプライマーのアニーリング温度を下げ、反応液中のマグネシウムイオン濃度をあげることにより、プライマーアニール時の配列特異性を下げる。すると単一のプライマー（以下ＡＰプライマーと呼ぶ）は、ミスマッチが入っている場合でも、ゲノムにアニールしやすくなり、それぞれの３´末端同士が向き合った場合には、増幅サイクルに入り、向き合った部分にはさまれたＤＮＡ断片がＰＣＲ産物として増幅される（以下ＲＡＰＤ断片）。ＤＮＡが２本鎖になっているの部分では、塩基対の塩基同士が互いの電荷を打ち消し合うため、電荷はリン酸の数により決定される。リン酸の数と核酸の分子量は、通常比例する。このため、ゲル電気泳動によってこれらのＰＣＲ産物をその鎖長で分離し、ＤＮＡフィンガープリントとして観察することができる。ＤＮＡフィンガープリントは、ミニサテライトの検出や多型の検出、シーケンス反応等に用いられている。また、分離したＤＮＡは、ゲルより抽出し、回収することが可能である。使用するゲルは、アガロースゲル、セファロース、ポリアクリルアミドゲル、セファデックスゲル、デンプン、またはこれらの混合物、等が一般的である。
【０００５】
出願人は、ＡＰ−ＰＣＲまたはＲＡＰＤ法をさらに改良することにより、試料に複数の生物のＤＮＡが含まれている場合にも、複数の種類のＡＰプライマーを１度に、または順次に、または並列に用いて複数の生物から同時にＲＡＰＤ断片を得、さらに、これらの複合したフィンガープリントのバンドパターンと、各々の生物がもつフィンガープリントのパターンを比較することにより、生物群の識別を行うことを可能にした（特開平１１−３４１９８９参考）。
【０００６】
しかし、これまでのわれわれの実験によれば、ある一種類の生物のＤＮＡにたいしてＰＣＲ法またはＳＳＣ−ＰＣＲ法等を行った場合には得られるＰＣＲ産物の一部が、多種類の生物のＤＮＡを混合した試料やプライマー結合サイトが多数ある試料に対してＰＣＲ増幅をおこなった場合には、ＰＣＲ産物の中から明瞭に検出できない現象が見られた（以下、明瞭に検出できなくなるバンドを不明瞭なバンド、このような現象を不明瞭なバンド現象と呼ぶ）。
【０００７】
ＳＳＣ−ＰＣＲ法等をもちいた生物の識別方法は、電気泳動処理によりＲＡＰＤ産物を解析し、ある一種類の生物のＤＮＡにたいしてＳＳＣ−ＰＣＲ法等を行った場合には得られるＲＡＰＤ産物が、混合した試料のＤＮＡにたいしてＳＳＣ−ＰＣＲ法等を行った場合に得られるＰＣＲ産物に含まれるか否かで生物の存在の有無を決定するものであるから、上記のような再現性の低いＤＮＡ断片を含むことにより、ＳＳＣ−ＰＣＲ法により得られたデータは全体の信頼性が低くなるという問題があった。
【０００８】
また、上記のような問題は、ＳＳＣ−ＰＣＲを用いた場合にのみ起こるのではいと考えられる。すなわち、多数のプライマー結合サイトを持つポリヌクレオチドに対してＰＣＲ増幅を行う場合や、一度に複数種のプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行う場合等、プライマー結合の競合が起こる環境でのＰＣＲ増幅の結果では、ポリヌクレオチド断片の増幅しやすさの差によって、上記「不明瞭なバンド」現象が生じ得る。不明瞭なバンドは、生物の状態を識別するＲＡＰＤ法のフィンガープリントや、遺伝子発現量を解析する、ブロッティング等のデータ等の様々なデータの信頼性を低くしている可能性がある。
【０００９】
なお、本命明細書中では、ＰＣＲ増幅という言葉は、ポリメラーゼ連鎖反応を用いたＤＮＡ等のポリヌクレオチドの増幅方法を意味し、ＰＣＲ法、ＲＡＰＤ法（ＡＰ−ＰＣＲ法）、ＳＳＣ−ＰＣＲ法等で行う増幅をも含むものとする。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
多数の生物のＤＮＡが混合した試料等、プライマー結合の競合が起こりうる環境でＰＣＲ増幅を経て得られたに情報に対して、「不明瞭なバンド」の有無を明らかにする事を可能とするポリヌクレオチド断片の再現方法、および、データの確認方法を提供する。また、「不明瞭なバンド」の有無を明らかにすることにより、生物識別を精度良く行う生物識別方法および生物識別の確認方法を提供する。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
請求項１は、ＰＣＲ増幅後、増幅されたポリヌクレオチド断片の分類のための処理を行った試料を得る第一の工程と、第一の工程で得た試料の一部又は全部からポリヌクレオチドを抽出する第二の工程と、前記抽出されたポリヌクレオチド断片に対し、再度ＰＣＲ増幅をおこなう第三の工程を含むことを特徴とするポリヌクレオチド断片の再現方法である。
【００１２】
ポリヌクレオチドを抽出する部位は、試料の泳動開始部位に近接する一部又は任意の一部や、全部である場合を含む。また、ポリヌクレオチド断片の分類のための処理には、ペーパーやカラムを用いたクロマトグラフィーや液体クロマトグラフィー、超遠心法、密度勾配遠心法、溶媒抽出法等を含む。また、当該再現方法には、「不明瞭なバンド」がもともと存在しない試料に対して行った場合等、結果的に「不明瞭なバンド」が再現しない場合を含む。また、分類されるポリヌクレオチド断片には、２本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ，高次構造をもつＲＮＡ、三次元構造を壊すために尿素やホルムアルデヒド処理を行なったＲＮＡ等を含む。
【００１３】
請求項２は、前記第二の工程におけるポリヌクレオチドの抽出は、第一の工程で得た分類のための処理後の試料を複数の区画に分け、各々の区画または一つの区画からおこなうことを特徴とする請求項１記載のポリヌクレオチド断片の再現方法である。
【００１４】
請求項３は、前記第一の工程は、照合対象試料に対して行うものであり、前記第二の工程におけるポリヌクレオチドを抽出する部位は、プライマー結合の競合が少ないまたは無い状態で識別対象生物のポリヌクレオチドに対してＰＣＲ増幅と分類のための処理を行った場合に、存在の有無を確認したいポリヌクレオチド断片が多く存在すると推定される部位の情報に基づいて決定されるものである事を特徴とする請求項１または２記載のポリヌクレオチド断片の再現方法である。
【００１５】
存在の有無を確認したいポリヌクレオチド断片は、単数であっても複数であっても構わない。また、ポリヌクレオチド断片が多く存在するとの推定は、キャピラリー電気泳動等の結果からの推定や、コンピュータ上での処理や補正の手段を含んでなす推定を含む。
【００１６】
請求項４は、前記第一の工程で使用される分類のための処理は電気泳動法であり、前記第二の工程は、泳動処理後の試料の泳動基質の、全部または一部からポリヌクレオチドを抽出する工程を含み、前記第三の工程は、前記第２の工程で抽出されたポリヌクレオチド断片に対し再度ＰＣＲ増幅及び電気泳動処理を行うことにより、抽出を行った泳動基質の部位および当該部位よりも泳動開始部位から見て遠い部位に位置するポリヌクレオチド断片を増幅させる工程を含むことを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載のポリヌクレオチド断片の再現方法である。
【００１７】
電気泳動法には、キャピラリー電気泳動、パルスフィールド電気泳動、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法等、電界での動きを基にしたあらゆる分離方法を含む。
【００１８】
請求項５は、ＰＣＲ増幅される対象はＤＮＡであり、前記第二の工程は、識別対象である一または複数の種類の生物のＤＮＡに対してＰＣＲ増幅および電気泳動法を適用し、ＤＮＡ断片のバンドが現れる部位を把握し、当該把握された部位に対応する第一工程を経た照合対象試料の泳動基質の区画より、ＤＮＡを抽出する工程を含むものであることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれかに記載のポリヌクレオチド断片の再現方法である。
【００１９】
識別対象生物は、一種類の場合の他、例えば特定の場所に生息する複数の細菌を菌層としてとらえたい場合のように、複数の生物を群としてとらえる場合を含む。
【００２０】
請求項６は、前記第一の工程に用いられる電気泳動法はゲル電気泳動法であり、前記第二の工程におけるＤＮＡの抽出は、対応する位置のゲルを切り出してＤＮＡの抽出を行うものであることを特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載のポリヌクレオチド断片の再現方法である。
【００２１】
請求項７は、前記第二の工程でポリヌクレオチドを抽出する区画は、プライマー結合の競合が少ないまたは無い状態で、識別対象生物のポリヌクレオチドに対してＰＣＲ増幅及び電気泳動処理を行った場合にはポリヌクレオチドのバンドが識別され、かつ、照合対象試料に対してＰＣＲ増幅及び電気泳動処理を行った場合にはポリヌクレオチドのバンドが識別しにくいと想定される区画であることを特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載のポリヌクレオチド断片の再現方法である。
【００２２】
請求項８は、前記第二の工程でポリヌクレオチドを抽出する区画は、プライマー結合の競合が少ないまたは無い状態で、識別対象生物のポリヌクレオチドに対してＰＣＲ増幅及び電気泳動処理を行った場合にはポリヌクレオチドのバンドが識別され、かつ、同様の条件で照合対象試料に対してＰＣＲ増幅及び電気泳動処理を行った場合にはポリヌクレオチドのバンドが識別しにくい区画であることを特徴とする請求項７記載のポリヌクレオチド断片の再現方法である。
【００２３】
請求項９は、識別対象生物のＤＮＡに対し、ＰＣＲ増幅と電気泳動法を用いて得た電気泳動像を記憶する記憶手段を備え、前記記憶された電気泳動像と、照合対象試料に対してＰＣＲ増幅と電気泳動法とを行って得た電気泳動像と比較することにより生物を識別する方法において、照合対象試料に対してＰＣＲ増幅及び電気泳動法を行い、識別対象生物の泳動像に現れるＤＮＡ断片のバンドのうち、存在の有無を確認したいＤＮＡ断片またはＤＮＡ断片のセットが出現する部位に該当する照合対象の泳動基質からＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡに対して、再度のＰＣＲ増幅と電気泳動法を行う工程を含むことを特徴とする生物識別方法である。
なお、本請求項には、存在の有無を確認したいＤＮＡ断片またはＤＮＡ断片のセットが出現する部位に該当する照合対象の泳動基質に、バンドが実際に出現している場合および出現していない場合の双方を含む。
請求項１０は、前記ＰＣＲ増幅はＳＳＣ−ＰＣＲ法により行われ、照合対象試料は、複数の生物のＤＮＡが存在していると予想されるものであることを特徴とする請求項９に記載の生物識別方法である。
請求項１１は、前記再度のＰＣＲ増幅を行うＤＮＡを抽出する区画は、照合対象試料に対してＰＣＲ増幅と電気泳動法を行った場合にはバンドが識別しにくい区画であり、かつ、識別対象生物のＤＮＡに対してＰＣＲ増幅と電気泳動法を行った場合にはバンドが識別可能な部位に対応する区画であることを特徴とする請求項９または請求項１０に記載の生物識別方法である。
【００２４】
請求項１２は、前記ＰＣＲ増幅は、複数の種類のプライマーを用いるＳＳＣ−ＰＣＲ法であることを特徴とする請求項９ないし請求項１１のいずれかに記載の生物識別方法である。
【００２５】
請求項１３は、前記生物識別方法は、微生物を対象とするものであることを特徴とする請求項９ないし請求項１２のいずれかに記載の生物識別方法。
【００２６】
請求項１４は、請求項９ないし請求項１３のいずれかに記載の生物識別方法により得られる再度のＰＣＲ増幅と電気泳動法を行った後の泳動像と、照合対象試料に対してのＰＣＲ増幅と電気泳動法とを行って得た電気泳動像とを比較し、照合対象試料に対してのＰＣＲ増幅と電気泳動法とを行って得た電気泳動像では認識されないバンドが、再度のＰＣＲ増幅と電気泳動法を行った結果の電気泳動像において識別されるか否かにより、生物識別の結果を確認する生物識別の確認方法である。
【００２７】
【発明の実施の形態】
まず、従来技術の問題点を解決するために、出願人が使用した現象について述べる。
【００２８】
例えば、２本鎖ＤＮＡ断片に対してゲル電気泳動を行なった場合には、電場内におかれた２本鎖ＤＮＡは陽極側に向って鎖長の短いものほど早く移動する。上記ＤＮＡ断片は各々の鎖長等によって泳動距離が定まることになり、フィンガープリント等の形で認識される。しかし、前記のようなフィンガープリントを例にとって解析してみると、バンドが出現する部位は、同種のＤＮＡ断片の多くが達する部位に過ぎず、実際には、固有の泳動距離まで泳動せず、より泳動開始位置に近い部位にも同種のＤＮＡ断片が、テールを引くように残される。この一方で、固有の泳動距離を越えて、より泳動開始位置から遠くに同種のＤＮＡ断片が存在する可能性はきわめて低い。このような現象は、ポリヌクレオチド等の物質を種類によって位置的に異なる部位に集合させるように分類する場合によく起こると考えられる。
【００２９】
不明瞭なバンド現象を生ずる原因の一つは、以下のようなものと考えられる。増幅されるＤＮＡ断片はその断片により、増幅しやすさが異なる。増幅しにくい種類のＤＮＡ断片は、プライマーの結合が競合により一部阻害される環境でＰＣＲ増幅が行われると、増幅するスピードが顕著に遅くなり不明瞭なバンドとなる。増幅しやすさの差を生む要因の一つは、プライマー結合サイトとプライマーの結合する強さの差であると考えられる。所定の塩基配列を有する鋳型ＤＮＡの適合位置にプライマーが強く結合して配置する場合は、ＤＮＡ断片の増幅効率が高いと考えられる。このようなプライマーにより増幅されたＤＮＡ断片は、電気泳動像において再現性の高い明瞭なバンドとして現れる。一方、プライマーと鋳型ＤＮＡの適合位置との結合が弱い場合、鋳型ＤＮＡの適合位置よりも結合が強い他の位置にプライマーが結合する。このように、ＤＮＡ断片の増幅反応においては競争的に反応が進行するため、プライマーと鋳型ＤＮＡとの結合が弱い場合にはＤＮＡ断片の増幅効率が低くなる。このような結合の弱いプライマーにより増幅されるＤＮＡ断片は、電気泳動像において再現性が低く不明瞭なバンドとして現れるというものである。
【００３０】
これらの現象の検討を踏まえ、本発明の実施例のプロセスについて説明する。図１左側に示すように、細菌Ａの試料、細菌Ｂの試料、細菌Ａと細菌Ｂの両方を含む試料、の３つから、それぞれＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ増幅を適用した後、電気泳動を行なって増幅されたＤＮＡ断片を分類した。細菌Ａの試料から得られたフィンガープリントには３本のバンドが認識された。細菌Ｂの試料から得られたフィンガープリントには２本のバンドが認識された。
【００３１】
この結果から推測すれば、細菌Ａと細菌Ｂの両方を含む試料には、ＡまたはＢの試料に見られる５本のバンド認識されることが予測される。しかし、実際には細菌Ａと細菌Ｂの両方を含む試料から得られたフィンガープリントには３本のバンドしか認識できなかった（図１左側の細菌Ａ＋Ｂのフィンガープリント像中、点線で示されているバンドは、出現が予測されたにもかかわらず識別されなかった２本のバンドを示す。
【００３２】
そこで出現を予測されたにもかかわらずバンドが認識されなかった区画のゲルを切り出して、この部位に含まれるＤＮＡ断片を抽出し、再度ＰＣＲ増幅を適用した後、同様の条件で電気泳動をおこなって増幅されたＤＮＡ断片を分類した。この結果、一度目のＰＣＲ増幅と電気泳動を経た段階では認識されなかった２本のバンドを含むフィンガープリントが認識された。認識されたバンドはいずれも、細菌Ａまたは細菌Ｂのフィンガープリントのどちらかに出現しているバンドであり、かつ、ＤＮＡを抽出した部位よりもプラス側の、泳動開始部位から遠い部位に出現するバンドである。すなわち、再度のＰＣＲ増幅により、一度目のＰＣＲ増幅適用時には、識別される程の量が増幅されなかった２種類のＤＮＡ断片についても、識別可能な量まで増幅されたことを意味している。
【００３３】
この現象は、不明瞭なバンドを形成するＲＡＰＤ断片も、一度目のＰＣＲ増幅時にプライマー結合の競合がある環境下でも比較的少量ではあっても増幅されており、当該増幅された断片についてはミスマッチが解消しているため、再度のＰＣＲ増幅時には増幅しやすい断片となっていると考えることにより説明することが可能となる。
【００３４】
さらに、これまでの実験から、一種類のＡＰプライマーで増幅されるＤＮＡ断片のバンド間で比較した場合には、蛍光強度の低いバンドのほうが不明瞭なバンドとなりやすい傾向があることが分かった。蛍光強度の低いバンドが出現する領域に対応する部位から、識別対象試料のＤＮＡを抽出する区画を設けることは一つの効果的な方法であると考えられる。また、照合対象試料に対して行った第一の工程後の結果と、選択した区画から抽出したポリヌクレオチドに対して行った第三の工程後の結果との比較を行った場合の他、第二工程で分けた区画同士の結果を比較した場合にも、「不明瞭なバンド」の有無を確認することが可能な場合がある。
【００３５】
なお、バンドの対比をおこないやすくするため、以下ＳＳＣ−ＰＣＲによるフィンガープリントについておこなった実証について記載するが、本方法はＳＳＣ−ＰＣＲ以外のＰＣＲ増幅を用いた試料についても実施可能である。
【００３６】
（実施例１）　実証例
▲１▼．１種類細菌ＤＮＡと２種類細菌混合ＤＮＡのＰＣＲについて
Ｖｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈｅｍｏｌｉｔｉｃｕｓとＹｅｒｓｉｎａ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａをｐｒｉｍｅｒ　Ｇ０２でＰＣＲした結果を図２に示す。実験は３回行った。図中ＡがＶｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈｅｍｏｌｉｔｉｃｕｓのＤＮＡ、ＢがＹｅｒｓｉｎａ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａのＤＮＡ、Ａ＋ＢがＶｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈｅｍｏｌｉｔｉｃｕｓ　とＹｅｒｓｉｎａ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａのＤＮＡを混合した試料をそれぞれテンプレートとしてＰＣＲした電気泳動プロファイルである。Ａでは約６５０ｂｐに蛍光強度が高いバンドが一本確認できた。また約９００ｂｐの位置には蛍光虚強度が低いバンドが見られるサンプルもあった。Ｂでは約１６００ｂｐ、１８００ｂｐの位置に２本バンドが見られ、９００ｂｐ付近に蛍光強度が弱いバンドが１本あるいは２本確認できた。２つのＤＮＡの混合物をテンプレートとしたＡ＋Ｂでは約６５０ｂｐの位置に蛍光強度が高いバンドが１本確認され、９００ｂｐに弱いバンドが見られるサンプルも有った。しかしＢでは明瞭に観察されたバンドを確認することはできなかった。
【００３７】
２種類以上の細菌ＤＮＡを混合すると、単体では見られたバンドが消失することがあることがわかった。この現象はＶｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈｅｍｏｌｉｔｉｃｕｓとＹｅｒｓｉｎａ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａに特異的ではなく、他の細菌の組合せでも見られる一般な現象である。
【００３８】
▲２▼．ゲルから抽出したＤＮＡを鋳型としたＰＣＲについて
３組の混合ＤＮＡについて図３に示した。上段はＶｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈｅｍｏｌｉｔｉｃｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎａ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａとｐｒｉｍｅｒ　Ｇ０２、中段はＶｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈｅｍｏｌｉｔｉｃｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｒａ　ｏｘｙｔｏｃａとｐｒｉｍｅｒ　Ｂ４７、下段はＫｌｅｂｓｉｅｒａ　ｏｘｙｔｏｃａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓとｐｒｉｍｅｒ　Ｇ２２の組合せでＰＣＲした結果である。各段の左には１種類の細菌ＤＮＡをテンプレートとしたサンプルと２種の細菌ＤＮＡを混合したＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲ結果を示している。混合ＤＮＡのレーンに示した正方形はゲルの切出し位置を示す。各々の組で４箇所から抽出した。
【００３９】
各々の位置を切り出しＤＮＡ抽出したサンプルをテンプレートとしてＰＣＲした結果を各段の右図に示した。この図中の正方形に数字は、ゲル切出し位置に対応する。４箇所のレーンの右に隣接するレーンは４箇所から抽出したＤＮＡを等量混合したサンプルをＰＣＲした結果である。
【００４０】
図中の１／１０、１／１００、１／１０００は抽出したＤＮＡをテンプレートとした時の希釈倍率を示す。
【００４１】
これらの実験からわかったことをＶｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈｅｍｏｌｉｔｉｃｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎａ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａとｐｒｉｍｅｒ　Ｇ０２を使った例で示す。
【００４２】
切出し位置「１」から抽出したＤＮＡを使うとＡあるいはＢで現れたバンドを再現できた。これは、この部分にＡ，Ｂで現れた全てのバンドが含まれていることを示す。
【００４３】
切出し位置「３」から抽出したＤＮＡを使うとＡで見られた６５０ｂｐのバンドは再現できたがＢで見られた１７００ｂｐ近辺のバンドは再現されなかった。これは、切り出し部分より陽極側のバンドは含まれるが、陰極側のバンドは存在しないことを示している。
【００４４】
２種の細菌ＤＮＡを混合して消えたＢの１７００ｂｐ付近のバンドは、この位置より陰極側を切り出すことで再現できた。その他２組の例でも同様のことが言える。
【００４５】
以上の結果より、ＤＮＡの混合で消えたバンドは消えた部分よりも陰極側のゲルから抽出したＤＮＡを再度ＰＣＲすることにより再現できると結論できる。
【００４６】
▲３▼．なお、本実験は以下の条件のもとでおこなった。
【００４７】
１．使用細菌
Ｖｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈｅｍｏｌｉｔｉｃｕｓ（３）
Ｙｅｒｓｉｎａ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ（４）
Ｋｌｅｂｓｉｅｒａ　ｏｘｙｔｏｃａ（６）
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ（１２）
２．ＰＣＲ機器
ＧｅｎｅＡＭＰ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：商標）
３．ＰＣＲ反応溶液（２０ｕＬ）
１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
５０ｍＭ　ＫＣｌ
１．５ｍＭ　Ｍｇ２＋
２００ｕＭ　ｄＮＴＰｍｉｘ（ｅａｃｈ）
４．ポリメラーゼ
ＴａＫａＲａ　Ｔａｑ：０．０２５Ｕ／μＬ
５．テンプレート
１種類細菌ＤＮＡの試料：１０ｐｇ／μＬ（ｅａｃｈ）
２種類細菌ＤＮＡの混合試料：１０ｐｇ／μＬ（ｅａｃｈ）
６．プライマー
３種類のプライマーを用いた。
【００４８】
・　ｐｒｉｍｅｒ　Ｇ０２（５’−ＴＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡ−３’）　（配列番号１）
・　ｐｒｉｍｅｒ　Ｂ４７（５’−ＧＣＣＧＣＣＡＧＡＧＧＡ−３’）　（配列番号２）
・　ｐｒｉｍｅｒ　Ｇ２２（５’−ＡＧＧＧＣＣＡＴＧＡＴＡ−３’）　（配列番号３）
７．ＰＣＲサイクル
９４℃／１ｍｉｎ
（１）９４℃／３０ｓｅｃ
（２）４５℃／６０ｓｅｃ
（１）（２）は３０ｃｖｃｌｅ
７２℃／９０ｓｅｃ
７２℃／７ｍｉｎ
８．１回目の電気泳動後のゲルからのＰＣＲ産物の抽出
Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＱＩＡＧＥＮ：商標）キット
９．ＤＮＡ抽出について
各細菌を新鮮培地にて培養しＳＤＳ等の薬剤による溶菌、酵素とフェノールによる蛋白除去を経てエタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。ＤＮＡを数回洗い乾燥後ＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）に溶解した。
【００４９】
１０．ＰＣＲと電気泳動について
１種類細菌ＤＮＡ試料
抽出したＤＮＡを純水を用いて希釈し、上記条件でＰＣＲをおこなった。その後、アガロースゲルを用いて１００Ｖで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色を経てＵＶ励起による蛍光をデジタルカメラで撮影した。この画像を電子データとして保存した。
【００５０】
１１．２種細菌ＤＮＡ混合試料
抽出した各ＤＮＡを純水を用いて希釈後、混合し上記条件でＰＣＲをおこなった。その後の処理は１種類細菌ＤＮＡ試料の場合と同様である。
【００５１】
１２．再度のＰＣＲについて
ＰＣＲ産物の抽出とＰＣＲ（図１参照）
電気泳動後のゲルの目的とする位置をカッターで切出しＧｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍキットを用いてＰＣＲ産物の抽出とクリーンアップを行った。その後、これまでと同様の条件でＰＣＲを行い、電気泳動とエチジウムブロマイドによる染色後写真撮影し、画像を電子ファイルとして保存した。
【００５２】
（実施例２）　本件発明を、データの確認方法として用いる場合
例えば、第一の工程で作成される試料は、ＰＣＲ増幅を含む工程により得られた電気泳動像の既存データの状態を再現した試料であり、前記第二の工程は、第一工程で作成した試料の泳動基質を複数の区画に分け、各々または一つの区画からポリヌクレオチドを抽出するものであり、前記抽出されたポリヌクレオチドに対して前記第三の工程を行うことで得られた電気泳動像のバンドと、既存データの電気泳動像のうち、第二の工程でポリヌクレオチドの抽出を行なった部位に対応する部位および当該部位よりも泳動開始部位からみて遠い部位に位置するバンドとを比較し、バンドの欠損を確認する第４の工程と、を含むような構成とすれば、データの確認方法としても使用できる。これまでに蓄積されているフィンガープリントのデータや、複数の染色体からなる生物のＲＡＰＤ法データ、ＲＮＡ発現量のデータ等、ＰＣＲ増幅の工程を含むデータの信頼性等を確認することが可能となる。
【００５３】
【発明の効果】
「不明瞭なバンド」の有無の確認を行なうことが可能となり、ポリヌクレオチド断片の再現、データの確認、精度の良い生物識別および生物識別の確認が可能となる。
【００５４】
【配列表】
2004041074.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【図１】不明瞭なバンドの再現方法のプロセスを示す図。
【図２】１種類の細菌のＤＮＡと２種類の細菌のＤＮＡを混合したものについてＰＣＲを行なった結果の比較
【図３】ゲルから抽出したＤＮＡを鋳型としたＰＣＲの結果