(57)【要約】【課題】    本発明は、医薬品等での応用が期待される新規なフッ素化アミノ糖ヌクレオチド及びその製造法を提供する。【解決手段】  本発明は、下記式（Ｉ）で表されるフッ素化アミノ糖ヌクレオチドに関するものである。2004168751.tif 000018（式中、Ａｃはアセチル基、Ｒ１〜Ｒ３は水酸基、フッ素原子または水素原子を示す。ただし、Ｒ１〜Ｒ３の少なくとも１つはフッ素原子である。）  また、本発明は、ヌクレオシド二リン酸−糖ピロホスホリラーゼを用いる酵素反応により上記式（Ｉ）で表されるフッ素化アミノ糖ヌクレオチドを合成することを特徴とする、フッ素化アミノ糖ヌクレオチドの製造法に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表されるフッ素化アミノ糖ヌクレオチド。
2004168751.tif 000016
（式中、Ａｃはアセチル基、Ｒ１〜Ｒ３は水酸基、フッ素原子または水素原子を示す。ただし、Ｒ１〜Ｒ３の少なくとも１つはフッ素原子である。）
【請求項２】
Ｒ２がフッ素原子である、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
ウリジン５’−（２−アセタミド−２，４−ジデオキシ−４−フロロ−α−Ｄ−グルコピラノシル）ジホスフェートである、請求項１記載の化合物。
【請求項４】
ウリジン５’−（２−アセタミド−２，４−ジデオキシ−４−フロロ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル）ジホスフェートである、請求項１記載の化合物。
【請求項５】
下記式（ＩＩ）化合物とウリジン５’−トリリン酸（ＵＴＰ）とを使用し、ヌクレオシド二リン酸−糖ピロホスホリラーゼを用いる酵素反応により請求項１記載のフッ素化アミノ糖ヌクレオチドを合成することを特徴とする、フッ素化アミノ糖ヌクレオチドの製造法。
2004168751.tif 000017
（式中、Ｒ４はリン酸エーテル基、リン酸エステル基、リン酸基、リン酸金属塩基、Ｒ１〜Ｒ３は水酸基、フッ素原子または水素原子を表す。ただし、Ｒ１〜Ｒ３の少なくとも１つはフッ素原子である。）
【請求項６】
ヌクレオシド二リン酸−糖ピロホスホリラーゼがＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼである、請求項５記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品等での応用が期待されるフッ素化アミノ糖ヌクレオチド及びその製造法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖は、タンパク質、核酸につぐ第３の生命の鎖であり、生体内において多種多様な構造で存在している。生体の調節に関わっている多くの因子の中で、生体の基本単位である細胞と細胞の間のコミュニケーションや細胞と外界からの侵入者あるいは細胞以外の生体成分とのコンタクトを交わす場合、細胞表面に発現している複合糖質と言われる分子群が重要な役割を果たしていることが広く知られている。
【０００３】
つまり、細胞の表面に髭状に伸びている多数の糖鎖は、アンテナのように外側に突き出し、ウイルス、細菌、または細胞外基質などの反応分子と接触し、相互反応する。この相互反応がきっかけとなり、様々な生体反応が引き起され、細胞の生理的あるいは病的な変化へと繋がっている。例えば、がん細胞はいくつかの段階を経て遠隔臓器に転移することが知られている。転移過程では糖鎖認識分子と糖鎖提示分子が転移のステップに強く関与していることが指摘されている。
【０００４】
このような現状により、天然型の構造を有する糖鎖や非天然型の新規な糖鎖を合成する試みが盛んに行われている。合成に際し、著しい多様性を持つ生理活性糖鎖はすべて単糖から構成されることから、糖鎖合成における基本ブロックである単糖の合成はとても重要なことであると認識されている。
【０００５】
複雑な糖鎖の合成に必要で、生体内のグリコシド結合の生成反応に深く関与しているものとしては、糖ヌクレオチドと呼ばれる活性化された糖の化合物（これを糖供与体と呼ぶ）と１００種類以上もある糖転移酵素である。この転移酵素の働きにより、糖が立体特異的、位置特異的に逐次結合して糖鎖が合成される。例えば、細胞が癌化する際、まず糖鎖の一部に異変が生じ、上記のグリコシド結合生成反応により、腫瘍マーカーへと糖鎖が伸長して行くと考えられている。
【０００６】
従って、細胞の運命を変えたい時には、この糖鎖の構造を何らかの手法で変えなければならない。つまり、細胞表面に発現される糖鎖を人為的に改変することにより、細胞の持つ本来の性質や機能を変えられることが期待されている。その基本は、糖供与体である糖ヌクレオチドの単糖構造を変えることである。
【０００７】
従来、生体内における非天然型の生理活性糖鎖の役割について、非常に多くの知見が得られ、糖鎖生物学、糖鎖工学といった研究分野から医薬品分野などへの幅広い応用が期待されるようになってきている。例えば、フッ素化糖ヌクレオチドについては、化学合成法を用いたフッ素化ガラクトース糖ヌクレオチド（Carbohydr. Res., 269, 273-294 (1995)）、フッ素化Ｎ−アセチルグルコサミン糖ヌクレオチド及びＮ−アセチルガラクトサミン糖ヌクレオチドの合成（Carbohydr. Res., 184, 77-85 (1988)）が報告されている。また、酵素合成法を用いたフッ素化糖ヌクレオチドの合成（Bioorg. Med. Chem., 5, 497-500 (1997)、ＵＳＰ５７７０４０７、Carbohydr. Res., 328, 473-480 (2000)）も報告されている。
【０００８】
【特許文献１】米国特許５７７０４０７号公報
【非特許文献１】Carbohydr. Res., 269, 273-294 (1995)
【非特許文献２】Carbohydr. Res., 184, 77-85 (1988)
【非特許文献３】Bioorg. Med. Chem., 5, 497-500 (1997)
【非特許文献４】Carbohydr. Res., 328, 473-480 (2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
生理活性糖鎖の不可欠な基本組成単位として、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＮ−アセチルガラクトサミンが良く知られている。そこで、本発明者らは、癌細胞の転移阻止などに応用可能な転移阻害剤を創製する目的で、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＮ−アセチルガラクトサミンの特定の水酸基部分に類似の性質を有し、かつ不活性なフッ素原子が導入されたミミティックストッパーとしての糖ヌクレオチドを考案した。このようなフッ素化アミノ糖ヌクレオチドは、転移酵素に認識され、阻害剤として有用であると考えられる。
【００１０】
特に、フッ素化アミノ糖ヌクレオチドを化学合成するのではなく、生体内環境での生物合成に近い酵素合成法で合成することにより、このような方法で合成されたフッ素化アミノ糖ヌクレオチドは転移酵素に認識され、通常の糖供与体と競合するため、糖鎖伸長が阻害され、このメカニズムにより、たとえば癌細胞の増殖を防ぐ阻害剤として充分な効果が期待できるものと考えられる。
【００１１】
しかしながら、従来、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＮ−アセチルガラクトサミンの特定の水酸基部分に、類似の性質を有し、かつ不活性なフッ素原子が導入された糖ヌクレオチドは、化学合成では一部の化合物が合成されているが、酵素を用いた合成の報告はなされていない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、ミミティックストッパーとしてのＮ−アセチルグルコサミン及びＮ−アセチルガラクトサミンの特定の水酸基部分に類似の性質を有し、かつ不活性なフッ素原子が導入された糖ヌクレオチドを創製すべく、鋭意検討を重ねた結果、立体選択的、位置選択的に非天然型フッ素化アミノ単糖ホスファートの化学合成に成功し、得られた非天然型フッ素化アミノ単糖ホスフェートとヌクレオチドを基質としてヌクレオシド５’−二リン酸−糖ピロホスホリラーゼを作用させることで、フッ素化アミノ糖ヌクレオチドの合成に初めて成功し、得られたフッ素化アミノ糖ヌクレオチドが転移酵素阻害剤として有用であることを確認し、本発明を完成させた。
【００１３】
したがって、本発明は、下記式（Ｉ）で表されるフッ素化アミノ糖ヌクレオチドに関するものである。
2004168751.tif 000002
（式中、Ａｃはアセチル基、Ｒ１〜Ｒ３は水酸基、フッ素原子または水素原子を示す。ただし、Ｒ１〜Ｒ３の少なくとも１つはフッ素原子である。）
【００１４】
また、本発明は、下記式（ＩＩ）化合物とウリジン５’−トリリン酸（ＵＴＰ）とを使用し、ヌクレオシド二リン酸−糖ピロホスホリラーゼを用いる酵素反応により上記式（Ｉ）で表されるフッ素化アミノ糖ヌクレオチドを合成することを特徴とする、フッ素化アミノ糖ヌクレオチドの製造法に関するものである。
2004168751.tif 000003
（式中、Ｒ４はリン酸エーテル基、リン酸エステル基、リン酸基、リン酸金属塩基、Ｒ１〜Ｒ３は水酸基、フッ素原子または水素原子を表す。ただし、Ｒ１〜Ｒ３の少なくとも１つはフッ素原子である。）
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＮ−アセチルガラクトサミンの特定の水酸基部分に、類似の性質を有し、かつ不活性なフッ素原子が導入された糖ヌクレオチドが初めて提供され、しかも化学合成するのではなく、生体内環境での生物合成に近い酵素合成法で合成したことにより、本発明のフッ素化アミノ糖ヌクレオチドは転移酵素に認識され、通常の糖供与体と競合するため、糖鎖伸長が阻害され、このメカニズムにより、たとえば癌細胞の増殖を防ぐ阻害剤として充分な効果が期待できるものと考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（１）本発明化合物
本発明化合物は、前記式（Ｉ）で表されるフッ素化アミノ糖ヌクレオチドである。式（Ｉ）中、Ａｃはアセチル基、Ｒ１〜Ｒ３は水酸基、フッ素原子または水素原子を示す。ただし、Ｒ１〜Ｒ３の少なくとも１つはフッ素原子である。
【００１７】
このような本発明化合物の中でも、Ｒ２がフッ素原子である化合物、具体的には、ウリジン５’−（２−アセタミド−２，４−ジデオキシ−４−フロロ−α−Ｄ−グルコピラノシル）ジホスフェートまたはウリジン５’−（２−アセタミド−２，４−ジデオキシ−４−フロロ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル）ジホスフェートが好適である。
【００１８】
本発明化合物は、塩、水和物または溶媒和物の形態であってもよい。そのような塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩またはリチウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩もしくはアンモニウム塩などの任意の塩が例示される。また、水和物または溶媒和物としては、本発明化合物またはその塩１分子に対し、０．１〜１０分子の水または溶媒が付着したものを例示することができる。さらに、本発明化合物には、互変異性体などの各種異性体も包含されうる。
【００１９】
（２）本発明化合物の製造法
このような本発明化合物は、下記式（ＩＩ）化合物とウリジン５’−トリリン酸（ＵＴＰ）とを使用し、ヌクレオシド二リン酸−糖ピロホスホリラーゼを用いる酵素反応により本発明のフッ素化アミノ糖ヌクレオチドを合成することができる。
2004168751.tif 000004
（式中、Ｒ４はリン酸エーテル基、リン酸エステル基、リン酸基、リン酸金属塩基、Ｒ１〜Ｒ３は水酸基、フッ素原子または水素原子を表す。ただし、Ｒ１〜Ｒ３の少なくとも１つはフッ素原子である。）
【００２０】
以下、下記式（ＩＩＩ）で表されるＲ２がフッ素原子である化合物を例に挙げ、本発明化合物の製造法を具体的に説明する。
2004168751.tif 000005
（式中、Ａｃはアセチル基を示す。）
【００２１】
＜第１工程＞
第１工程は、式（ＩＶ）化合物をベンズアルデヒドジメチルアセタールで４，６位の水酸基をブロックすることにより、式（Ｖ）化合物を得る工程である。
2004168751.tif 000006
2004168751.tif 000007
（式中、Ａｃはアセチル基、Ｐｈはフェニル基、Ａｌｌはアリル基を示す。）
【００２２】
上記の方法で出発物質として用いられた式（ＩＶ）で示される単糖のアノマー位の保護基を選択する原則は、単糖上の他の位置に使われている保護基（ベンジル基など）と区別できる脱保護反応条件を有するアリル基を選ぶことである。つまり、糖ヌクレオチドを構築する際に、アノマー位の保護基を選択的に脱保護し、１位でリン酸化を行うことは一つの手段として本発明方法で用いられる。
【００２３】
単糖のＤ−ガラクトースやＤ−グルコースのアノマー位を、酸性樹脂などの酸性触媒の存在下、位置選択的にアリル基で保護する反応は良く知られており（Carbohydr. Res., 331, 247(2001)）、生成物はアノマー位の混合物である場合が多い。また、Ｎ−アセチルガラクトサミンやＮ−アセチルグルコサミンのアノマー位をアリル化する場合は、ｐ−トルエンスルホン酸１水和物（ＰＴＳ）などを用いる方法が報告されており（Tetrahedron Lett., 43, 1477(2002)）、目的生成物と共に脱アセチルのものも同時に得られる。
【００２４】
Ｎ−アセチルグルコサミンのアノマー位をアリル化する場合は、ルイス酸三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体を用いた方法は報告されている（Carbohydr. Res., 37, 193(1974)）。しかし、Ｎ−アセチルガラクトサミンのアノマー位をアリル基で保護するときには、上記文献の反応条件をそのまま用いると、ほぼ壊れて望ましい生成物は得られないため、７０℃という反応の最適温度と２時間の反応条件を選定することで、Ｎ−アセチルガラクトサミンのアノマー位のアリル化反応を行うことで、高収率でアノマーの選択的作り分けができ、目的生成物のα体を収率よく合成することができる。
【００２５】
得られたα体とβ体の混合物から再結晶することにより、純粋なα体の式（ＩＶ）化合物を単離することができる。このように得られたα体単糖は結晶性が非常に優れており、出発物質として、高純度のものを多量かつ容易に調製可能である。
【００２６】
このような出発物質を用い、従来の方法にしたがって式（Ｖ）化合物を容易に調製できる。即ち、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどの不活性有機溶媒中、(±)−カンファ−１０−スルホン酸の存在下、常温で、ベンスアルデヒドジメチルアセタールと式（ＩＶ）化合物を反応させることにより式（Ｖ）化合物を導くことができる。
【００２７】
＜第２工程＞
第２工程は、前記式（Ｖ）化合物の３位にベンジル保護基を導入して式（ＶＩ）化合物を得、さらに酸性条件下で還元的な切り分け反応によって高位置選択的に式（ＶＩＩ）化合物を得る工程である。
2004168751.tif 000008
2004168751.tif 000009
（式中、Ａｃはアセチル基、Ｐｈはフェニル基、Ａｌｌはアリル基、Ｂｎはベンジル基を示す。）
【００２８】
式（ＶＩ）化合物の合成は従来の方法にしたがって容易に実施することができる。すなわち、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどの不活性有機溶媒中、酸化バリウムと水酸化バリウムの塩基の存在下、常温で、ベンジルブロミドと式（Ｖ）化合物を反応させることで、式（Ｖ）化合物の３位ベンジル化を行うことができる。
【００２９】
次に、式（ＶＩ）化合物の４，６位のベンジリデン基を高位置選択的に切り分け、式（ＶＩＩ）化合物を得る。ベンジリデン基の高位置選択的な切り分け方法としては、水素化シアノボランナトリウムを用いるベンジリデン基の切り分け反応が数多く知られていおり（Carbohyd. Res., 108, 97 (1982)；Carbohydr. Res., 329, 709 (2000)；Carbohydr. Res., 315, 251 (1999)など ）、このような従来の方法をそのまま適用することで、ほぼ１００％の位置選択性をもって、式（ＶＩＩ）化合物を得ることができる。得られた化合物の精製も常法により容易に行うことができる。
【００３０】
＜第３工程＞
第３工程は、前記式（ＶＩＩ）化合物をフッ素化反応により式（ＶＩＩＩ）化合物を得、１位のアリル基を脱保護して式（ＩＸ）化合物を得る工程である。
2004168751.tif 000010
2004168751.tif 000011
（式中、Ａｃはアセチル基、Ａｌｌはアリル基、Ｂｎはベンジル基を示す。）
【００３１】
Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコースの水酸基をフッ素原子で置換するフッ素化反応は極めて困難であることは、いくつかの文献に指摘されている（ J. Carbohydr. Chem., 2(3), 313(1983)； Carbohyd. Res., 95, 189(1981)； Carbohydr. Res., 32, 261(1974) など）。また、Ｎ−アセチルグルコサミンやＮ−アセチルガラクトサミンのフッ素化も既に検討されているが（ Carbohydr.  Res., 198, 205(1990) ；Carbohydr.  Res., 326, 250(2000)）、反応自身は進行しにくく、収率も著しく低い。
【００３２】
発明者らは、低温でかつ大過剰のフッ素化剤、ジエチルアミノサルファトリフルオリド（ＤＡＳＴ）を用いる方法で、Ｎ−アセチルグルコサミンの４位カーボンの立体中心反転に伴い、順調に目的のフッ素化Ｎ−アセチルグルコサミンへ導くことが可能なこと、及びフッ素化Ｎ−アセチルガラクトサミンの合成には、上記のＤＡＳＴ法でうまく行かなかったため、Ｎ−アセチルグルコサミンの４位水酸基をメシル化後、テトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）で処理することによって目的フッ素化Ｎ−アセチルガラクトサミンを高収率で導くことが可能であることを見出した。
【００３３】
したがって、第３工程においては、目的がフッ素化Ｎ−アセチルグルコサミン誘導体であるか、フッ素化Ｎ−アセチルガラクトサミン誘導体であるかによって反応条件が異なる。フッ素化Ｎ−アセチルグルコサミン誘導体を目的とする場合には、ジクロロメタン等の有機溶媒中、過剰量のジエチルアミノサルファトリフルオリド（ＤＡＳＴ）を用い、−３０℃〜室温で適宜反応させることにより、目的とする式（ＶＩＩＩ）化合物を得ることができる。また、フッ素化Ｎ−アセチルガラクトサミン誘導体を目的とする場合には、ピリジン、アセトニトリル等の有機溶媒中、当量以上のメシル化剤（メシルクロリド）を用い、−３０〜１０℃で適宜反応させることによりメシル化後、過剰量のテトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）を用い、１００℃前後で環流することで目的とする式（ＶＩＩＩ）化合物を得ることができる。
【００３４】
得られた式（ＶＩＩＩ）化合物の１位アリル基の脱保護基反応は、常法（ Carbohydr. Res., 328, 95 (2000)）にしたがって行うことができる。なお、得られた１位フリーの式（ＩＸ）化合物は、１：１のα、β体ではなく、６：１の比率でα体が圧倒的に多く得られる。これは２位に存在するＮ−アセチルアミノ基の微妙な関与ではないかと推測される。
【００３５】
＜第４工程＞
第４工程は、前記式（ＩＸ）化合物の１位をリン酸ジベンジルエーテルに誘導して式（Ｘ）化合物を得、さらに該化合物の１位リン酸エーテルを酸化して高立体的に式（ＸＩ）化合物を得る工程である。
2004168751.tif 000012
2004168751.tif 000013
（式中、Ａｃはアセチル基、Ｂｎはベンジル基を示す。）
【００３６】
式（Ｘ）及び（ＸＩ）化合物の合成は、公知の手法（J. Am. Chem. Soc., 115, 2260-2267 (1993)）を用いて行うことができる。すなわち、ジベンジルＮ，Ｎ−ジエチルホスホラミデート（ＤＤＰ）を用い、ジベンジルリン酸エーテル体である式（Ｘ）化合物（α、β体混合物）を合成し、さらに、テトラブチルヒドロペルオキシドにより、このジベンジルリン酸エーテル体を立体選択的に酸化することによって、望ましい１位リン酸ジベンジルエステルα体である式（ＸＩ）化合物を単一な生成物として得ることができる。
【００３７】
＜第５工程＞
第５工程は、前記式（ＸＩ）化合物のベンジル保護基を脱保護して式（ＸＩＩ）化合物を得、該化合物とウリジン５’−トリリン酸（ＵＴＰ）とをヌクレオシド二リン酸−糖ピロホスホリラーゼを用いる酵素反応により下記式（ＩＩＩ）で表されるフッ素化アミノ糖ヌクレオチドを得る工程である。
2004168751.tif 000014
2004168751.tif 000015
（式中、Ａｃはアセチル基、Ｂｎはベンジル基を示す。）
【００３８】
ベンジル基の脱保護は、水素添加反応などの従来公知方法条件にて行うことができる。
このようにして得られた式（ＸＩＩ）化合物とウリジン５’−トリリン酸を用い、ヌクレオシド二リン酸−糖ピロホスホリラーゼを用いてフッ素化アミノ糖ヌクレオチドである式（ＩＩＩ）化合物を合成する方法は、公知の方法にて行うことができる。
【００３９】
すなわち、反応に用いるヌクレオシド二リン酸−糖ピロホスホリラーゼとしては、式（ＸＩＩ）化合物を合成できるものであれば特に制限されるものではないが、特にＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼが使用に好ましい。また、ヌクレオシド二リン酸−糖ピロホスホリラーゼは特定の由来のものに限定されず、動物由来、植物由来、微生物由来など、すべての由来のものを使用することができるが、酵素調製の簡便性などの点から微生物由来のヌクレオシド二リン酸−糖ピロホスホリラーゼを使用するのが好ましい。また、使用するヌクレオシド二リン酸−糖ピロホスホリラーゼ遺伝子がクローン化されている場合には、そのクローン化されたヌクレオシド二リン酸−糖ピロホスホリラーゼ遺伝子を用いて常法により大腸菌などを宿主として大量生産させ、当該組換え菌より当該酵素を調製することも可能である。
【００４０】
このようなヌクレオシド二リン酸−糖ピロホスホリラーゼは、当該活性を有する限りどのような形態であってもよい。具体的には、微生物の菌体、該菌体の処理物または該処理物から得られる酵素調製物などが挙げられる。
微生物の菌体の調製は、当該微生物が生育可能な培地を用い、常法により培養後、遠心分離等で集菌する方法で行うことができる。具体的に、バシラス属または大腸菌類に属する細菌を例に挙げ説明すれば、培地としてはブイヨン培地、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％食塩）または２ｘＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イーストエキストラクト、０．５％食塩）などを使用することができ、当該培地に種菌を接種後、約３０〜５０℃で約１０〜５０時間程度必要により撹拌しながら培養し、得られた培養液を遠心分離して微生物菌体を集菌することによりヌクレオシド二リン酸−糖ピロホスホリラーゼ活性を有する微生物菌体を調製することができる。
【００４１】
微生物の菌体処理物としては、上記微生物菌体を機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消火、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法に従って処理して得られる菌体の破壊物または菌体の細胞壁もしくは細胞膜の変性物が挙げられる。
【００４２】
酵素調製物としては、上記菌体処理物からヌクレオシド二リン酸−糖ピロホスホリラーゼ活性を有する画分を通常の酵素の精製手段、例えば塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理などを施して得られる粗酵素または精製酵素を使用することができる。
【００４３】
反応液に添加するウリジン５’−トリリン酸（ＵＴＰ）は、市販されているもの、あるいは公知の方法で調製したもの等を使用すればよい。使用濃度としては、約１〜２００ｍＭが好ましく、約１０〜１００ｍＭが特に好ましい。
【００４４】
本発明のフッ素化アミノ糖ヌクレオチドの合成反応は、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液等の各種緩衝液を用い、塩化マグネシウムの存在下、ヌクレオシド二リン酸−糖ピロホスホリラーゼを好ましくは約０．００１ユニット／ｍｌ以上、さらに好ましくは約０．０１ユニット／ｍｌ添加し、好ましくは約５０℃以下、より好ましくは約５〜５０℃で約１〜５０時間程度、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。
【００４５】
このようにして得られた糖ヌクレオチドは、糖ヌクレオチドの通常の単離精製手段（イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、塩析など）により単離精製することができる。
【実施例】
【００４６】
以下に、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。
【００４７】
実施例１
（１）アリルＮ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトサミニドの合成
５０ｍｌのナス型フラスコにＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（４４２ｍｇ、２ｍｍｏｌ）を入れてアリルアルコール８ｍｌを加えた。その中に、三ふっ化ほう素ジエチルエーテル錯体（０．２５ｍｌ、２ｍｍｏｌ）を滴下した。オイルバス７０℃で２時間反応させた。反応液をエバポーレーターで除去し、エタノール５ｍｌで薄めて０℃にてジイソプロピルエーテル５０ｍｌで生成物を落とした。エタノールで再結晶することによって純粋なアリルＮ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトサミニド（４１７ｍｇ、８０％）が得られた。
【００４８】
１Ｈ−ＮＭＲ  δ（ＤＭＳＯ）：７．５８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３９Ｈｚ）（ＮＨ−），５．９３〜５．８４（１Ｈ，ｍ）（−ＣＨ＝Ｃ），５．３０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．８３，１７．２４  Ｈｚ）（−Ｃ＝ＣＨ２），５．１４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．８３，１０．５３Ｈｚ）（−Ｃ＝ＣＨ２），４．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５１Ｈｚ）（Ｈ−１），４．１１〜４．０２（２Ｈ，ｍ）（Ｈ−２，−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ），３．９４〜３．８８（１Ｈ，ｍ）（−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ），３．７３（１Ｈ，ｂｒ，ｄ，Ｊ＝２．９０Ｈｚ）（Ｈ−４），３．６３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．９０，１０．９７Ｈｚ）（Ｈ−３），３．５９（１Ｈ，ｂｒ，ｄ，Ｊ＝５．６１Ｈｚ）（Ｈ−５），３．５３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．６１，１０．５３Ｈｚ）（Ｈ−６ａ），３．４９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．５６，１０．５３Ｈｚ）（Ｈ−６ｂ），３．３９（３Ｈ，ｂｒ，ｓ）（ＯＨ），１．８３（３Ｈ，ｓ）（ＣＯＣＨ３）
【００４９】
（２）アリルＮ−アセチル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−α−Ｄ−ガラクトサミニドの合成
原料アリルＮ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトサミニド（８４９ｍｇ、３．２５ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１１ｍｌに溶かし、（±）−カンファ−１０−スルホン酸（７６ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を入れて、氷−水バスで冷やしながら、ベンズアルデヒドジメチルアセタール（０．７ｍｌ、４．５５ｍｍｏｌ）を滴下した。室温で１２時間反応させた後、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを減圧で除去した。得られた黄色オイル状液体をクロロホルムメタノールの６：１混合溶媒に溶かした後、水１０ｍｌを入れてしばらく攪拌した。さらに、攪拌しながら１００ｍｌヘキサンをゆっくり入れた。白い固体が析出した。吸引濾過して、水とヘキサンで良く洗ってから、減圧乾燥した。生成物アリルＮ−アセチル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−α−Ｄ−ガラクトサミニド（８５２ｍｇ、７５％）が得られた。
【００５０】
１Ｈ−ＮＭＲ  δ（ＤＭＳＯ）：７．６９（１Ｈ  ｄ，Ｊ＝８．０６Ｈｚ）（ＮＨ−），７．５１〜７．４８（２Ｈ，ｍ）（Ｐｈ），７．４１〜７．３５（３Ｈ，ｍ）（Ｐｈ），５．９３〜５．８４（１Ｈ，ｍ）（−ＣＨ＝Ｃ），５．５９（１Ｈ，ｓ）（ＰｈＣＨ），５．３２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．７１，１７．３３Ｈｚ）（−Ｃ＝ＣＨ２），５．１６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．７１，１０．５０Ｈｚ）（−Ｃ＝ＣＨ２），４．８２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４２Ｈｚ）（Ｈ−１），４．６７（１Ｈ，ｂｒ，ｓ）（ＯＨ−３），４．１８（１Ｈ，ｂｒ，ｄ，Ｊ＝３．１７Ｈｚ）（Ｈ−４），４．１４〜３．９３（５Ｈ，ｍ）（３Ｈ−２，６ａ，６ｂ，−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ），３．８５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．１７，１１．２３Ｈｚ）（Ｈ−３），３．６４（１Ｈ，ｂｒ，ｓ）（Ｈ−５），１．８４（３Ｈ，ｓ）（ＣＯＣＨ３）
【００５１】
（３）アリルＮ−アセチル−３−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−α−Ｄ−ガラクトサミニドの合成
原料アリルＮ−アセチル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−α−Ｄ−ガラクトサミニド（２．１４ｇ、６．１４ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド４０ｍｌに溶かして酸化バリウム（１．８８ｇ、１２．３ｍｍｏｌ）と水酸化バリウム８水和物（１．９４ｇ、６．１４ｍｍｏｌ）を入れて、氷−水バスで冷やしながら、ベンジルブロミド（１．４６ｍｌ、１２．３ｍｍｏｌ）を滴下した。室温で１２時間反応させた後、セライト濾過を行った。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを減圧で除去した後、得られた白色固体をクロロホルムメタノールの６：１混合溶媒に溶かした。攪拌しながらヘキサンを入れた。白い固体が析出した。吸引濾過し、水とヘキサンで良く洗ってから、減圧乾燥した。生成物アリルＮ−アセチル−３−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−α−Ｄ−ガラクトサミニド（２．２９ｇ、８５％）が得られた。
【００５２】
１Ｈ−ＮＭＲ  δ（ＤＭＳＯ）：７．８６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５５Ｈｚ）（ＮＨ−），７．４５〜７．２３（１０Ｈ，ｍ）（２Ｐｈ），５．９６〜５．８６（１Ｈ，ｍ）（−ＣＨ＝Ｃ），５．６２（１Ｈ，ｓ）（ＰｈＣＨ），５．３５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．７１，１７．３３Ｈｚ）（−Ｃ＝ＣＨ２），５．１９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．７１，１０．５０Ｈｚ）（−Ｃ＝ＣＨ２），４．８２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．３６Ｈｚ）（Ｈ−１），４．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．６０Ｈｚ）（ＰｈＣＨ２），４．５３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．６０Ｈｚ）（ＰｈＣＨ２），４．４８（１Ｈ，ｂｒ，ｄ，Ｊ＝３．２０Ｈｚ）（Ｈ−４），４．２６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．３６，８．５５，１１．４４Ｈｚ）（Ｈ−２），４．１７〜４．１２（１Ｈ，ｍ）（−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ），４．０８（２Ｈ，ｂｒ，ｓ）（２Ｈ−６ａ，ｂ），４．０３〜３．９７（１Ｈ，ｍ）（−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ），３．８５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．２０，１１．４４Ｈｚ）（Ｈ−３），３．６７（１Ｈ，ｂｒ，ｓ）（Ｈ−５），１．８５（３Ｈ，ｓ）（ＣＯＣＨ３）
【００５３】
（２）アリルＮ−アセチル−３，６−ジベンジル−α−Ｄ−ガラクトサミニドの合成
１００ｍｌフラスコに原料アリルＮ−アセチル−３−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−α−Ｄ−ガラクトサミニド（８７８ｍｇ、２ｍｍｏｌ）を入れて無水テトラヒドロピラン２４ｍｌで溶かした。乾燥したモレキュラシーブス４Å（１ｇ）と水素化シアノボランナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）（２ｇ、３２ｍｍｏｌ）を加えた。室温２０分攪拌した後、氷−水バスで冷やしながら、２．０Ｍ塩酸のエーテル溶液をｐＨが３になるように滴下した。室温で１時間を反応させた後、セライト濾過を行った。ジエチルエーテルで薄めて分液した。水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で良く洗った後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過、エバポーレーターで濃縮後、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝２５：１）により分取して目的物アリルＮ−アセチル−３，６−ジベンジル−α−Ｄ−ガラクトサミニド（５６４ｍｇ、６４％）を得た。
【００５４】
１Ｈ−ＮＭＲ  δ（ＤＭＳＯ）：７．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８５Ｈｚ）（ＮＨ−），７．３８〜７．２３（１０Ｈ，ｍ）（２Ｐｈ），５．９６〜５．８７（１Ｈ，ｍ）（−ＣＨ＝Ｃ），５．３０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．７１，１７．３３Ｈｚ）（−Ｃ＝ＣＨ２），５．１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．７１，１０．５０Ｈｚ）（−Ｃ＝ＣＨ２），４．７３（１Ｈ，ｂｒ，ｓ）（ＯＨ−４），４．７１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．６６Ｈｚ）（Ｈ−１），４．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．６０Ｈｚ）（ＰｈＣＨ２−３），４．５２（２Ｈ，ｂｒ，ｓ）（ＰｈＣＨ２−６），４．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．６０Ｈｚ）（ＰｈＣＨ２−３），４．２８（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．６６，８．８５，１１．２９Ｈｚ）（Ｈ−２），４．１３〜４．０７（１Ｈ，ｍ）（−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ），４．０２（１Ｈ，ｂｒ，ｓ）（Ｈ−４），３．９８〜３．９３（１Ｈ，ｍ）（−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ），３．８４（１Ｈ，ｂｒ，ｔ，Ｊ＝５．９５Ｈｚ）（Ｈ−５），３．６６〜３．６０（２Ｈ，ｍ）（Ｈ−３，６ａ），３．５５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．８７，１０．０７Ｈｚ）（Ｈ−６ｂ），１．８５（３Ｈ，ｓ）（ＣＯＣＨ３）
【００５５】
（５）アリルＮ−アセチル−３，６−ジベンジル−４−フロロ−α−Ｄ−グルコサミニドの合成
２５ｍｌフラスコにジエチルアミノサルファトリフルオリド（ＤＡＳＴ）（１．１ｍｌ、８．２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン１ｍｌに溶かして−２０℃に冷やした。原料アリルＮ−アセチル−３，６−ジベンジル−α−Ｄ−ガラクトサミニド（４５４ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を別の１０ｍｌフラスコに入れ、ジクロロメタン２ｍｌに溶かした。この原料の溶液をＤＡＳＴのフラスコに滴下した。−２０℃で３０分攪拌した後、室温で３時間反応させた。反応終了後、−１０℃に冷やしてエタノール１ｍｌを滴下した。しばらく攪拌した後、酢酸エチルで薄めて分液した。水、飽和食塩水で良く洗った後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過、エバポーレーターで濃縮後、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：酢酸エチル＝１２：１）により分取して目的物アリルＮ−アセチル−３，６−ジベンジル−４−フロロ−α−Ｄ−グルコサミニド（２０４ｍｇ、４４％）を得た。
【００５６】
１Ｈ−ＮＭＲ  δ（ＣＤＣｌ３）：７．３８〜７．２７（１０Ｈ，ｍ）（２Ｐｈ），５．９１〜５．８１（１Ｈ，ｍ）（−ＣＨ＝Ｃ），５．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２８Ｈｚ）（ＮＨ−），５．２５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．７１，１７．３３Ｈｚ）（−Ｃ＝ＣＨ２），５．２０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．７１，１０．５０Ｈｚ）（−Ｃ＝ＣＨ２），４．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．４５Ｈｚ）（ＰｈＣＨ２−３），４．８５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４２Ｈｚ）（Ｈ−１），４．６４（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝８．４２，９．８９，５０．７８Ｈｚ）（Ｈ−４），４．６６〜４．５５（３Ｈ，ｍ）（ＰｈＣＨ２−６，３），４．２８〜４．１４（２Ｈ，ｍ）（Ｈ−２，−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ），４．００〜３．８７（２Ｈ，ｍ）（Ｈ−５，−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ），３．７７〜３．６８（３Ｈ，ｍ）（Ｈ−３，６ａ，６ｂ），１．９０（３Ｈ，ｓ）（ＣＯＣＨ３）
【００５７】
（６）Ｎ−アセチル−３，６−ジベンジル−４−フロロ−Ｄ−グルコサミンの合成
原料アリルＮ−アセチル−３，６−ジベンジル−４−フロロ−α−Ｄ−グルコサミニド（２２１．５ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を９５％の酢酸水溶液２．５ｍｌに溶かして酢酸ナトリウム（４４３．３ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）と塩化パラジウム（２０５ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）を入れた。室温で２４時間反応させた後、セライト濾過を行った。酢酸エチルで薄めて分液した。水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で良く洗った後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過、エバポーレーターで濃縮後、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１）により分取して生成物Ｎ−アセチル−３，６−ジベンジル−４−フロロ−Ｄ−グルコサミン（１７６ｍｇ、８７％）を得た。
【００５８】
１Ｈ−ＮＭＲ  δ（ＣＤＣｌ３）（α体）：７．３６〜７．２６（１０Ｈ，ｍ）（２Ｐｈ），５．３７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７０Ｈｚ）（ＮＨ−），５．２０（１Ｈ，ｂｒ，ｔ，Ｊ＝３．３６Ｈｚ）（Ｈ−１），４．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．２１Ｈｚ）（ＰｈＣＨ２−３），４．６０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．３６Ｈｚ）（ＰｈＣＨ２−６），４．５７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．３６Ｈｚ）（ＰｈＣＨ２−６），４．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．２１Ｈｚ）（ＰｈＣＨ２−３），４．５０（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝８．３９，９．９２，５０．７８  Ｈｚ）（Ｈ−４），４．１５〜４．０３（２Ｈ，ｍ）（Ｈ−２，５），３．８４〜３．７５（１Ｈ，ｍ）（Ｈ−３），３．７１（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１０．８３，２．２９Ｈｚ）（Ｈ−６ａ），３．６５（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１．８３，５．６５，１０．８３Ｈｚ）（Ｈ−６ｂ），１．８６（３Ｈ，ｓ）（ＣＯＣＨ３），１．６０（１Ｈ，ｂｒ，ｓ）（ＯＨ−１）
【００５９】
（７）ジベンジル２−アセタミド−２，４−ジデオキシ−３，６−Ｏ−ジベンジル−４−フロロ−Ｄ−グルコピラノシルホスファートの合成
２５ｍｌフラスコに１，２，４―トリアゾール（２６４ｍｇ、３．８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン９ｍｌに溶かして、原料Ｎ−アセチル−３，６−ジベンジル−４−フロロ−Ｄ−グルコサミン（３８５ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）を入れた。還流しながらジベンジルＮ，Ｎ−ジエチルホスホラミデート（０．７ｍｌ、２．４ｍｍｏｌ）を滴下した。還流４５分後、室温まで冷やしてエーテルで薄めて分液した。飽和重曹水、水、飽和食塩水で良く洗った後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、エバポーレーターで濃縮する際に析出した固体を吸引濾過し、減圧乾燥することにより目的物ジベンジル２−アセタミド−２，４−ジデオキシ−３，６−Ｏ−ジベンジル−４−フロロ−Ｄ−グルコピラノシルホスファート（３３６ｍｇ、５４％）（α：β＝１：１）を得た。
【００６０】
１Ｈ−ＮＭＲ  δ（ＤＭＳＯ）：８．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７０Ｈｚ）（ＮＨ−β），８．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９３Ｈｚ）（ＮＨ−α），７．３６〜７．２４（２０Ｈ，ｍ）（−４Ｐｈ），５．４８（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝８．５４，３．２０Ｈｚ）（α−Ｈ−１），５．１５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．３９Ｈｚ）（β−Ｈ−１），１．８２（３Ｈ，ｓ）（α−ＣＯＣＨ３），１．７６（３Ｈ，ｓ）（β−ＣＯＣＨ３）
【００６１】
（８）ジベンジル２−アセタミド−２，４−ジデオキシ−３，６−Ｏ−ジベンジル−４−フロロ−α−Ｄ−グルコピラノシルホスフェートの合成
２５ｍｌフラスコに、原料ジベンジル２−アセタミド−２，４−ジデオキシ−３，６−Ｏ−ジベンジル−４−フロロ−Ｄ−グルコピラノシルホスファート（６０ｍｇ、０．０９３ｍｍｏｌ）とＴＨＦ２．５ｍｌを入れた。−１０℃に冷やし、テトラブチルヒドロペルオキシド（ＴＢＨＰ）（０．１ｍｌ、０．４６ｍｍｏｌ）を滴下した。−１０℃に１時間半反応した後、エーテルで薄めて分液した。飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液、飽和重曹水、飽和食塩水で良く洗った後、硫酸ナトリウムで乾燥させた。濾過し、エバポーレーターで濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１）により分取して生成物ジベンジル２−アセタミド−２，４−ジデオキシ−３，６−Ｏ−ジベンジル−４−フロロ−α−Ｄ−グルコピラノシルホスフェート（３５ｍｇ、５７％）（α体だけ）を得た。同時に２０％のＮ−アセチル−３，６−ジベンジル−４−フロロ−Ｄ−グルコサミンを回収した。
【００６２】
１Ｈ−ＮＭＲ  δ（ＤＭＳＯ）：８．２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．７８Ｈｚ）（ＮＨ−），７．３９〜７．２６（２０Ｈ，ｍ）（−４Ｐｈ），５．５８（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝６．５６，３．２０Ｈｚ）（Ｈ−１），５．１３〜５．０６（４Ｈ，ｍ）（−２ＣＨ２Ｐｈ），４．７３（２Ｈ，ｂｒ，ｓ）（−ＣＨ２Ｐｈ−６），４．６２（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝８．７０，９．９２，５０．９６Ｈｚ）（Ｈ−４），４．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．０６Ｈｚ）（−ＣＨ２Ｐｈ−４），４．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．０６Ｈｚ）（−ＣＨ２Ｐｈ−４），４．１５〜３．８７（３Ｈ，ｍ）（Ｈ−２，３，５），３．６６〜３．５５（２Ｈ，ｍ）（２Ｈ−６），１．８１（３Ｈ，ｓ）（ＣＯＣＨ３）
【００６３】
（９）２−アセタミド−２，４−ジデオキシ−４−フロロ−α−Ｄ−グルコピラノシルリン酸２ナトリウム塩の合成
１０ｍｌフラスコに、原料ジベンジル２−アセタミド−２，４−ジデオキシ−３，６−Ｏ−ジベンジル−４−フロロ−Ｄ−グルコピラノシルホスフェート（３５ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ）、エタノール１．６ｍｌと１０％炭酸水素ナトリウム水溶液１ｍｌを入れた。攪拌しながら５％パラジウムーカーボン２５ｍｇを加えた。室温にて２３時間反応させた後、触媒を濾過することにより除いて濾液を濃縮した。ゲル（Ｇ−１０）濾過の精製法で目的とする酵素反応中間体２−アセタミド−２，４−ジデオキシ−４−フロロ−α−Ｄ−グルコピラノシルリン酸２ナトリウム塩（１５ｍｇ、８２％）を得た。
【００６４】
１Ｈ−ＮＭＲ  δ（Ｄ２Ｏ）：５．３５（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝７．６３，３．２０Ｈｚ）  （Ｈ−１），４．４２（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝８．７０，９．９２，５０．９６Ｈｚ）（Ｈ−４），４．０３〜４．１４（２Ｈ，ｍ）（Ｈ−２，３），３．９６（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝９．９２，１．９８Ｈｚ）（Ｈ−５），３．８７（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１２．６６，１．９８Ｈｚ）（Ｈ−６），３．７８（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１．９８，４．２７，１２．６６Ｈｚ）（Ｈ−６），２．０５（３Ｈ，ｓ）（ＣＯＣＨ３）
【００６５】
（１０）ジナトリウムウリジン５’−（２−アセタミド−２，４−ジデオキシ−４−フロロ−α−Ｄ−グルコピラノシル）ジホスフェートの酵素合成
＜酵素の調製＞
大腸菌ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ遺伝子の発現プラスミド  ｐＴｒｃ−ｇｌｍＵは、文献（Okuyama, K., et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 386-392 (2000)）に記載の方法で作製した。このプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、形質転換体ＪＭ１０９［ｐＴｒｃ−ｇｌｍＵ］を得た。ＪＭ１０９［ｐＴｒｃ−ｇｌｍＵ］は、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌ含む２ｘＹＴ培地に植菌し、３７℃で振とう培養した。菌体濃度が、５ｘ１０８個／ｍｌとなった時点でＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭとなるように添加して、さらに２０時間培養を続けた。菌体は、遠心分離により回収したのち、標準緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ塩化マグネシウム）に懸濁し、超音波処理により破砕した。遠心分離により菌体残さを除き、上清を回収後、イオン交換クロマトグラフィー（ワットマン社製ＤＥ５２）およびゲル濾過クロマトグラフィー（ファルマシア社製セファデックスＧ−２００）によりＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼを精製し、２４０ｕｎｉｔｓ／ｍｌの酵素液を得た。
＜酵素活性アッセイ＞
０．２ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＵＤＰ−ＧｌｕＮＡｃ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３ｍＭのＮａ−ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅと０．０５〜０．２μｌの酵素液を３７℃で５分間反応させた後、３分間の煮沸により反応停止させた。ＵＴＰの生成量をＨＰＬＣにより定量し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＵＴＰを生成する活性を１ｕｎｉｔとした。
【００６６】
＜酵素合成＞
２．４ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＵＴＰ−３Ｎａ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１ｍｌのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ（２．４ｕｎｉｔｓ）と４．２ｍｇの原料２−アセタミド−２，４−ジデオキシ−４−フロロ−α−Ｄ−グルコピラノシルリン酸２ナトリウム塩を含む反応液を３７℃で１時間反応させた。得られた液の組成は１．３７ｍＭのＵＤＰ−４−Ｆ−ＧｌｃＮＡｃ、３．１６ｍＭのＵＴＰ、０．２０ｍＭのＵＤＰ、０．０３ｍＭのＵＭＰと０．０１ｍＭのＵｒａであった。反応液を煮沸した後、次の精製工程に移すまでの間、冷凍保存した。この冷凍液を室温まで温めた後、セルロースアセテートフィルタを通してＨＰＬＣ（ＩｎｅｒｔｓｉｌＯＤＳ−３）分取を行い、さらにゲル濾過（セファデックスＧ−１０）で脱塩処理を行い、非天然型のジナトリウム  ウリジン５’−（２−アセタミド−２，４−ジデオキシ−４−フロロ−α−Ｄ−グルコピラノシル）ジホスフェート（ＵＤＰ−４−Ｆ−ＧｌｃＮＡｃ・２Ｎａ）を単離した。
【００６７】
１Ｈ−ＮＭＲ  δ（Ｄ２Ｏ）：７．６０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１４Ｈｚ）（Ｕｒｉｄｉｎｅ−Ｈ−６），５．６７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１４Ｈｚ）（Ｕｒｉｄｉｎｅ−Ｈ−５），５．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．００Ｈｚ）（ｒｉｂ−Ｈ'−１），５．２１（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝７．３３，３．２８Ｈｚ）（Ｈ−１），４．１８（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝７．７８，９．９６，５０．５８Ｈｚ）（Ｈ−４），４．０６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．００Ｈｚ）（ｒｉｂ−Ｈ'−２），４．０１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．００Ｈｚ）（ｒｉｂ−Ｈ'−３），４．００〜３．９７（１Ｈ，  ｍ）（ｒｉｂ−Ｈ'−４），３．９４（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝２．２７，４．７７，１１．７０Ｈｚ）（ｒｉｂ−Ｈ'−５），３．８６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝４．０７，５．３３，１１．７０Ｈｚ）（ｒｉｂ−Ｈ'−５），３．８２〜３．７３（３Ｈ，ｍ）（Ｈ−５，３，２），３．５８〜３．４７（２Ｈ，ｍ）（２Ｈ−６），１．７８（３Ｈ，ｓ）（ＣＯＣＨ３）
【００６８】
実施例２
（１）アリルＮ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニドの合成
１Ｌのナス型フラスコにＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（２２．１ｇ、１００ｍｍｏｌ）を入れてアリルアルコール４００ｍｌを加えた。その中に、三ふっ化ほう素ジエチルエーテル錯体（２ｍｌ、０．２ｍｍｏｌ）を滴下した。１３０℃で２時間還流させた後、室温まで冷ます。反応液をエバポーレーターで除去し、エタノール２００ｍｌで薄めて０℃にてジイソプロピルエーテル１．５Ｌで生成物を落とした。エタノールで再結晶することによって純粋なアリルＮ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニド（２３ｇ、８８％）が得られた。
【００６９】
１Ｈ−ＮＭＲ  δ（ＤＭＳＯ）：７．７３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３４Ｈｚ）（ＮＨ−），５．９１〜５．８２（１Ｈ，ｍ）（−ＣＨ＝Ｃ），５．３０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．７１，１７．３２Ｈｚ）（−Ｃ＝ＣＨ２），５．１３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．７１，１０．３７Ｈｚ）（−Ｃ＝ＣＨ２），４．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０９Ｈｚ）（ＯＨ−３），４．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．５４Ｈｚ）（ＯＨ−４），４．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７４Ｈｚ）（Ｈ−１），４．４９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０９Ｈｚ）（ＯＨ−６），４．０７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．２４，１３．６８Ｈｚ）（−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ−），３．９０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．４１，１３．６８Ｈｚ）（−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ−），３．６８〜３．６０（２Ｈ，ｍ）（Ｈ−２，４），３．５１〜３．４３（２Ｈ，ｍ）（Ｈ−６），３．３８〜３．３４（１Ｈ，ｍ）（Ｈ−５），３．１２（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝６．０９，９．７３Ｈｚ）（Ｈ−３），１．８２（３Ｈ，ｓ）（ＣＯＣＨ３）
【００７０】
（２）アリルＮ−アセチル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−α−Ｄ−グルコサミニドの合成
原料アリルＮ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニド（１０．４ｇ、４０ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１３０ｍｌに溶かし、（±）−カンファ−１０−スルホン酸（９２９ｍｇ、４ｍｍｏｌ）を入れて、氷−水バスで冷やしながら、ベンズアルデヒドジメチルアセタール（７．８ｍｌ、５２ｍｍｏｌ）を滴下した。室温で１２時間反応させた後、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを減圧で除去した。得られた黄色オイル状液体をクロロホルムメタノールの６：１混合溶媒に溶かした後、水４００ｍｌを入れてしばらく攪拌した。さらに、攪拌しながら２Ｌヘキサンをゆっくり入れた。白い固体が析出した。吸引濾過して、水とヘキサンで良く洗ってから、減圧乾燥した。生成物アリルＮ−アセチル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−α−Ｄ−グルコサミニド（１１．３ｇ、８１％）が得られた。
【００７１】
１Ｈ−ＮＭＲ  δ（ＤＭＳＯ）：７．９１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３４Ｈｚ）（ＮＨ−），７．４６〜７．３６（５Ｈ，ｍ）（Ｐｈ），５．９４〜５．８４（１Ｈ，ｍ）（−ＣＨ＝Ｃ），５．６１（１Ｈ，ｓ）（ＰｈＣＨ），５．３３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．７１，１７．３２Ｈｚ）（−Ｃ＝ＣＨ２），５．１７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．７１，１０．３７Ｈｚ）（−Ｃ＝ＣＨ２），５．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０９Ｈｚ）（ＯＨ−３），４．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７４Ｈｚ）（Ｈ−１），４．１７〜４．１１（２Ｈ，ｍ）（Ｈ−６，−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ），３．９５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．４１，１３．６８Ｈｚ）（−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ），３．８４（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．７４，８．３４，１０．２５Ｈｚ）（Ｈ−２），３．７５〜３．６１（３Ｈ，ｍ）（Ｈ−３，５，６），３．４８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．７３Ｈｚ）（Ｈ−４），１．８４（３Ｈ，ｓ）（ＣＯＣＨ３）
【００７２】
（３）アリルＮ−アセチル−３−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−α−Ｄ−グルコサミニドの合成
原料アリルＮ−アセチル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−α−Ｄ−グルコサミニド（１．７４ｇ、５ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド３６ｍｌに溶かして酸化バリウム（１．５３ｇ、１０ｍｍｏｌ）と水酸化バリウム８水和物（１．５８ｇ、５ｍｍｏｌ）を入れて、氷−水バスで冷やしながら、ベンジルブロミド（１．２ｍｌ、１０ｍｍｏｌ）を滴下した。室温で１２時間反応させた後、セライト濾過を行った。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを減圧で除去した後、得られた白色固体をクロロホルムメタノールの６：１混合溶媒に溶かした。攪拌しながらヘキサンを入れた。白い固体が析出した。吸引濾過し、水とヘキサンで良く洗ってから、減圧乾燥した。生成物アリルＮ−アセチル−３−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−α−Ｄ−グルコサミニド（１．６６ｇ、７６％）が得られた。
【００７３】
１Ｈ−ＮＭＲ  δ（ＣＤＣｌ３）：７．５２〜７．２８（１０Ｈ，ｍ）（２Ｐｈ），５．９１〜５．８１（１Ｈ，ｍ）（−ＣＨ＝Ｃ），５．６０（１Ｈ，ｓ）（ＰｈＣＨ），５．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１６Ｈｚ）（ＮＨ−），５．２８〜５．１９（２Ｈ，ｍ）（−Ｃ＝ＣＨ２），４．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．３６Ｈｚ）（ＰｈＣＨ２），４．８６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．６６Ｈｚ）（Ｈ−１），４．６４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．３６Ｈｚ）（ＰｈＣＨ２），４．３２〜４．２６（２Ｈ，ｍ）（Ｈ−２，６），４．１５（１Ｈ，ｄｄｔ，Ｊ＝５．３４，１２．９７，１．３８Ｈｚ）（−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ），３．９６（１Ｈ，ｄｄｔ，Ｊ＝６．２６，１２．９７，１．２２Ｈｚ）（−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ），３．８９〜３．７１（４Ｈ，ｍ）（Ｈ−３，４，５，６），１．９１（３Ｈ，ｓ）（ＣＯＣＨ３）
【００７４】
（４）アリルＮ−アセチル−３，６−ジベンジル−α−Ｄ−グルコサミニドの合成
１００ｍｌフラスコに原料アリルＮ−アセチル−３−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−α−Ｄ−グルコサミニド（８７８ｍｇ、２ｍｍｏｌ）を入れて無水テトラヒドロピラン２４ｍｌで溶かした。乾燥したモレキュラシーブス４Å（１ｇ）と水素化シアノボランナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）（２ｇ、３２ｍｍｏｌ）を加えた。室温２０分攪拌した後、氷−水バスで冷やしながら、２．０Ｍ塩酸のエーテル溶液をｐＨが３になるように滴下した。室温で１時間を反応させた後、セライト濾過を行った。ジエチルエーテルで薄めて分液した。水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で良く洗った後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過、エバポーレーターで濃縮後、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝２５：１）により分取して目的物アリルＮ−アセチル−３，６−ジベンジル−α−Ｄ−グルコサミニド（６１１ｍｇ、６９％）を得た。
【００７５】
１Ｈ−ＮＭＲ  δ（ＣＤＣｌ３）：７．３７〜７．２８（１０Ｈ，ｍ）（２Ｐｈ），５．９２〜５．８３（１Ｈ，ｍ）（−ＣＨ＝Ｃ），５．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２８Ｈｚ）（ＮＨ−），５．２８〜５．１８（２Ｈ，ｍ）（−Ｃ＝ＣＨ），４．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．６６Ｈｚ）（Ｈ−１），４．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．９６Ｈｚ）（ＰｈＣＨ２−），４．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．９６Ｈｚ）（ＰｈＣＨ２−），４．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．９６Ｈｚ）（ＰｈＣＨ２−），４．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．９６Ｈｚ）（ＰｈＣＨ２−），４．２９〜４．１４（２Ｈ，ｍ）（Ｈ−２，−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ），３．９８〜３．９３  （１Ｈ，ｍ）（−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ），３．７９〜３．５８（５Ｈ，ｍ）（Ｈ−３，４，５，６，６），２．７０（１Ｈ，ｂｒ，ｓ）（４−ＯＨ），１．９１（３Ｈ，ｓ）（ＣＯＣＨ３）
【００７６】
（５）アリルＮ−アセチル−３，６−ジベンジル−４−メシル−α−Ｄ−グルコサミニドの合成
２５ｍｌフラスコに原料アリルＮ−アセチル−３，６−ジベンジル−α−Ｄ−グルコサミニド（６１１ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）をピリジン５．５ｍｌで溶かした。−１３℃に冷やしながらメシルクロリド（０．３２ｍｌ、４．２ｍｍｏｌ）をフラスコに滴下した。−１３℃で１０分攪拌した後、０℃にで４時間を反応させた。反応終了後、酢酸エチルで薄めて分液した。１Ｎ塩酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で良く洗った後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過、エバポーレーターで濃縮後、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：酢酸エチル＝４０：１）により分取して目的物アリルＮ−アセチル−３，６−ジベンジル−４−メシル−α−Ｄ−グルコサミニド（６６２ｍｇ、９２％）を得た。
【００７７】
１Ｈ−ＮＭＲ  δ（ＣＤＣｌ３）：７．３８〜７．２７（１０Ｈ，ｍ）（２Ｐｈ），５．９２〜５．８４（１Ｈ，ｍ）（−ＣＨ＝Ｃ），５．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６１Ｈｚ）（ＮＨ−），５．３０〜５．２１（２Ｈ，ｍ）（−Ｃ＝ＣＨ２），４．８５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．６６Ｈｚ）（Ｈ−１），４．７６〜４．６９（３Ｈ，ｍ）（Ｈ−４，ＰｈＣＨ２−），４．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．７５Ｈｚ（ＰｈＣＨ２−），４．５６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．９０Ｈｚ）（ＰｈＣＨ２−），４．４４（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．６６，９．６１，１０．５３Ｈｚ）（Ｈ−２），４．１９（１Ｈ，ｄｄｔ，Ｊ＝５．３４，１２．９７，１．３８Ｈｚ）（−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ），４．０２〜３．９３（２Ｈ，ｍ）（Ｈ−５，−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ），３．８６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．３１，１０．５３Ｈｚ）（Ｈ−３），３．８１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．２９，１０．９７Ｈｚ）（Ｈ−６），３．７２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．０４，１０．９７Ｈｚ）（Ｈ−６），２．８６（３Ｈ，ｓ）（ＳＯ２ＣＨ３），１．８９（３Ｈ，ｓ）（ＣＯＣＨ３）
【００７８】
（６）アリルＮ−アセチル−３，６−ジベンジル−４−フロロ−α−Ｄ−ガラクトサミニドの合成
５０ｍｌフラスコに原料アリルＮ−アセチル−３，６−ジベンジル−４−メシル−α−Ｄ−グルコサミニド（３５４ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）をアセト二トリル８ｍｌで溶かした。和光純薬製のテトラブチルアンモニウムフルオリド３水和物（２．６ｇ、８．２ｍｍｏｌ）を加えた。１００℃で還流６０時間後、室温まで冷まし、アセト二トリルをエバポーレーターで減圧除いた後、２００ｍｌの酢酸エチルで薄めて分液した。水、飽和食塩水で良く洗った後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過、エバポーレーターで濃縮する。析出した固体を吸引濾過し、水、ヘキサンで良く洗った後、オイルポンプで減圧乾燥した。２１３ｍｇ（７１％）の生成物アリルＮ−アセチル−３，６−ジベンジル−４−フロロ−α−Ｄ−ガラクトサミニドが得られた。
【００７９】
１Ｈ−ＮＭＲ  δ（ＣＤＣｌ３）：７．３９〜７．２８（１０Ｈ，ｍ）（２Ｐｈ），５．８９〜５．８０（１Ｈ，ｍ）（−ＣＨ＝Ｃ），５．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．００Ｈｚ）（ＮＨ−），５．２４〜５．１６（２Ｈ，ｍ）（−Ｃ＝ＣＨ２），４．９５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．２９，５０．３５Ｈｚ）（Ｈ−４），４．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．６６Ｈｚ）（Ｈ−１），４．７７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．２１Ｈｚ）（ＰｈＣＨ２−），４．６１〜４．５３（３Ｈ，ｍ）（ＰｈＣＨ２−，Ｈ−２），４．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．２１Ｈｚ）（ＰｈＣＨ２−），４．１４（１Ｈ，ｄｄｔ，Ｊ＝５．３４，１２．９７，１．３８Ｈｚ）（−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ），３．９９〜３．８６（２Ｈ，ｍ）（Ｈ−５，−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ），３．７３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．４８，９．３１Ｈｚ）（Ｈ−６），３．６３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．３７，９．３１Ｈｚ）（Ｈ−６），３．６１（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝２．２９，１０．９９，２７．９０Ｈｚ）（Ｈ−３），１．９４（３Ｈ，ｓ）（ＣＯＣＨ３）
【００８０】
（７）Ｎ−アセチル−３，６−ジベンジル−４−フロロ−Ｄ−ガラクトサミンの合成
原料アリルＮ−アセチル−３，６−ジベンジル−４−フロロ−α−Ｄ−ガラクトサミニド（８８．６ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を９０％の酢酸水溶液２ｍｌに溶かして酢酸ナトリウム（６５．６ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）と塩化パラジウム（７１ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を入れた。室温で１３時間反応させた後、セライト濾過を行った。酢酸エチルで薄めて分液した。水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で良く洗った後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過、エバポーレーターで濃縮した後、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１０：１）により分取して生成物Ｎ−アセチル−３，６−ジベンジル−４−フロロ−Ｄ−ガラクトサミン（α：β＝６：１）（５１ｍｇ、６３％）を得た。
【００８１】
１Ｈ−ＮＭＲ  δ（ＤＭＳＯ）（α）：７．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８５Ｈｚ）（ＮＨ−），７．３８〜７．２５（１０Ｈ，ｍ）（２Ｐｈ），６．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．６６Ｈｚ）（ＯＨ−１），５．００（１Ｈ，ｂｒ，ｔ，Ｊ＝３．６６Ｈｚ）（Ｈ−１），４．９９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．１４，５１．２７Ｈｚ）（Ｈ−４），４．６７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．６０Ｈｚ）（ＰｈＣＨ２−３），４．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．６０Ｈｚ）（ＰｈＣＨ２−３），４．５２（２Ｈ，ｂｒ，ｓ）（ＰｈＣＨ２−６），４．２０〜４．０９（２Ｈ，ｍ）（Ｈ−２，５），３．７９（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝２．１４，１１．２９，２８．８４Ｈｚ）（Ｈ−３），３．６３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．９５，９．７７Ｈｚ）（Ｈ−６ａ），３．５２（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝０．９２，６．８７，９．７７Ｈｚ）（Ｈ−６ｂ），１．８５（３Ｈ，ｓ）（ＣＯＣＨ３）
【００８２】
（８）ジベンジル２−アセタミド−２，４−ジデオキシ−３，６−Ｏ−ジベンジル−４−フロロ−Ｄ−ガラクトピラノシルホスファートの合成
２５ｍｌフラスコに１，２，４―トリアゾール（１１８．６ｍｇ、１．７２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン７ｍｌに溶かして、原料Ｎ−アセチル−３，６−ジベンジル−４−フロロ−Ｄ−ガラクトサミン（１７３ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を入れた。還流しながらジベンジルＮ，Ｎ−ジエチルホスホラミデート（０．３ｍｌ、１．１ｍｍｏｌ）を滴下した。還流４５分後、室温まで冷やしてエーテルで薄めて分液した。飽和重曹水、水、飽和食塩水で良く洗った後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、エバポーレーターで濃縮する際に析出した固体を吸引濾過し、減圧乾燥することにより目的物ジベンジル２−アセタミド−２，４−ジデオキシ−３，６−Ｏ−ジベンジル−４−フロロ−Ｄ−ガラクトピラノシルホスファート（１９４ｍｇ、７０％）（α：β＝１：１．５）を得た。
【００８３】
１Ｈ−ＮＭＲ  δ（ＤＭＳＯ）：８．００（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．００Ｈｚ）（ＮＨ−β），７．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９１Ｈｚ）（ＮＨ−α），７．３９〜７．２７（２０Ｈ，ｍ）（−４Ｐｈ），５．５５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．３６，８．５５Ｈｚ）（α−Ｈ−１），５．１１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．０９Ｈｚ）（β−Ｈ−１），５．１０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．１４，５０．９６Ｈｚ）（α−Ｈ−４），４．２５〜４．１３（２Ｈ，ｍ）（α−Ｈ−２，５），３．８１（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１．８３，１１．２９，２９．３０Ｈｚ）（β−Ｈ−３），３．５２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．８７，９．９２Ｈｚ）（α−Ｈ−６），１．８１（３Ｈ，ｓ）（α−ＣＯＣＨ３），１．７６（３Ｈ，ｓ）（β−ＣＯＣＨ３）
【００８４】
（９）ジベンジル２−アセタミド−２，４−ジデオキシ−３，６−Ｏ−ジベンジル−４−フロロ−α−Ｄ−ガラクトピラノシルホスフェートの合成
２５ｍｌフラスコに、原料ジベンジル２−アセタミド−２，４−ジデオキシ−３，６−Ｏ−ジベンジル−４−フロロ−Ｄ−ガラクトピラノシルホスファート（３２ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）とＴＨＦ１．５ｍｌを入れた。−１０℃に冷やし、テトラブチルヒドロペルオキシド（ＴＢＨＰ）（０．０５ｍｌ、０．２５ｍｍｏｌ）を滴下した。−１０℃に１時間半反応した後、エーテルで薄めて分液した。飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液、飽和重曹水、飽和食塩水で良く洗った後、硫酸ナトリウムで乾燥させた。濾過し、エバポーレーターで濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１）により分取して生成物ジベンジル２−アセタミド−２，４−ジデオキシ−３，６−Ｏ−ジベンジル−４−フロロ−α−Ｄ−ガラクトピラノシルホスフェート（１８ｍｇ）、５４％）（α体だけ）を得た。同時に２０％のＮ−アセチル−３，６−ジベンジル−４−フロロ−Ｄ−ガラクトサミンを回収した。
【００８５】
１Ｈ−ＮＭＲ  δ（ＤＭＳＯ）：８．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．７８Ｈｚ）（ＮＨ−），７．３８〜７．２６（２０Ｈ，ｍ）（−４Ｐｈ），５．６６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．３６，６．１０Ｈｚ）（Ｈ−１），５．２０〜５．０３（５Ｈ，ｍ）（Ｈ−４，−２ＣＨ２Ｐｈ−４，６），４．７４〜４．５４（４Ｈ，ｍ）（−２ＣＨ２Ｐｈ−Ｐ），４．２９〜４．１８（２Ｈ，ｍ）（Ｈ−２，５），３．９４（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝２．２９，１１．６０，２７．９２Ｈｚ）（Ｈ−３），３．６３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．１０，９．９２Ｈｚ）（Ｈ−６），３．５２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．７１，９．９２Ｈｚ）（Ｈ−６），１．８１（３Ｈ，ｓ）（ＣＯＣＨ３）
【００８６】
（１０）２−アセタミド−２，４−ジデオキシ−４−フロロ−α−Ｄ−ガラクトピラノシルリン酸２ナトリウム塩の合成
１０ｍｌフラスコに、原料ジベンジル２−アセタミド−２，４−ジデオキシ−３，６−Ｏ−ジベンジル−４−フロロ−α−Ｄ−ガラクトピラノシルホスフェート（６６．３ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）、エタノール３ｍｌと１０％炭酸水素ナトリウム水溶液２ｍｌを入れた。攪拌しながら５％パラジウムーカーボン５０ｍｇを加えた。室温にて２３時間反応させた後に、触媒を濾過することにより除いて濾液を濃縮した。ゲル（Ｇ−１０）濾過の精製法で目的とする酵素反応中間体２−アセタミド−２，４−ジデオキシ−４−フロロ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル  リン酸２ナトリウム塩（２９．８ｍｇ、８７％）を得た。
【００８７】
１Ｈ−ＮＭＲ  δ（Ｄ２Ｏ）：５．４０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．２１，７．４８Ｈｚ）（Ｈ−１），４．９２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．２９，５０．８１Ｈｚ）（Ｈ−４），４．３１〜４．２０（２Ｈ，ｍ）（Ｈ−２，５），４．０４（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝２．２９，１０．９９，２９．７５Ｈｚ）（Ｈ−３），３．８０〜３．７５（２Ｈ，ｍ）（２Ｈ−６），２．０５（３Ｈ，ｓ）（ＣＯＣＨ３）
【００８８】
（１１）ジナトリウムウリジン５’−（２−アセタミド−２，４−ジデオキシ−４−フロロ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル）ジホスフェートの酵素合成
１０ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＵＴＰ−３Ｎａ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、実施例１の（１０）で調製された０．２５ｍｌのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ（６０ｕｎｉｔｓ）と１８ｍｇの原料２−アセタミド−２，４−ジデオキシ−４−フロロ−α−Ｄ−グルコピラノシルリン酸２ナトリウム塩を含む反応液を３７℃で２時間反応させた。得られた液の組成は１．１３ｍＭのＵＤＰ−４−Ｆ−ＧａｌＮＡｃ、３．４６ｍＭのＵＴＰ、０．３０ｍＭのＵＤＰ、０．０２ｍＭのＵＭＰであった。反応液を煮沸した後次の精製工程に移るまで冷凍保存した。この冷凍液を室温まで温めた後、セルロースアセテートフィルタを通してＨＰＬＣ（ＩｎｅｒｔｓｉｌＯＤＳ−３）分取を行い、さらにゲル濾過（セファデックスＧ−１０）で脱塩を行い、非天然型のジナトリウムウリジン５’−（２−アセタミド−２，４−ジデオキシ−４−フロロ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル）ジホスフェート（ＵＤＰ−４−Ｆ−ＧａｌＮＡｃ・２Ｎａ）を単離した。
【００８９】
１Ｈ−ＮＭＲ  δ（Ｄ２Ｏ）：７．７２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１３Ｈｚ）（Ｕｒｉｄｉｎｅ−ＮＨ−Ｈ），５．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．１３Ｈｚ）（ＵＤＰ−Ｈ'−１），５．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１３Ｈｚ）（Ｕｒｉｄｉｎｅ−ＣＯ−Ｈ），５．３９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．３２，７．２１Ｈｚ）（Ｈ−１），４．１８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．１３Ｈｚ）（ＵＤＰ−Ｈ'−２），４．１４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．１３Ｈｚ）（ＵＤＰ−Ｈ'−３），４．１０〜４．０２（４Ｈ，ｍ）（Ｈ−２，５，Ｈ'−４，５），３．９７（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．６１，５．４９，１１．５１Ｈｚ）（Ｈ'−５），３．８９（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝２．４８，１０．９６，２９．５５Ｈｚ）（Ｈ−３），３．６３〜３．６０（２Ｈ，ｍ）（２Ｈ−６），１．８８（３Ｈ，ｓ）（ＣＯＣＨ３）
【００９０】
試験例１
ＵＤＰ−４−Ｆ−ＧｌｃＮＡｃのβ１，３−ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼを用いた受容体への転移実験を以下の要領で実施した。
＜試験材料＞
転移酵素としてはブタの血清から部分精製したβ１，３−ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼを用いた（矢賀部ら：日本農芸化学会大会要旨、５０５頁（１９９２））。糖鎖受容体としては市販のＬＮｎＴ−ＰＡ化糖鎖（ＰＡ−Ｓｕｇａｒ  Ｃｈａｉｎ  ０４１：宝酒造社製）を用いた。また、糖供与体は天然型ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと上記実施例で合成したＵＤＰ−４−Ｆ−ＧｌｃＮＡｃである。基準参考物質としては市販のｐａｒａ−ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｈｅｘａｏｓｅ（シグマ社製）を用いた。
【００９１】
＜実験方法＞
上記ｐａｒａ−ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｈｅｘａｏｓｅをＧａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅで切り、末端にはＧｌｃＮＡｃβ１，３−Ｇａｌβ１，４−の構造になっているスタンダードを調製し、部分精製したβ１，３−ＧｌｃＮＡｃ−トタンスフェラーゼによる受容体への転移反応後の生成物がＨＰＬＣで同じ時間で溶出されるのを確認した。
転移反応は、１ｍＭ  ＡＴＰ、０．５％  ＢＳＡ、０．１ｍＭ  ＰＡ−ＬＮｎＴ、１ｍＭ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ  ｏｒ  １ｍＭ  ＵＤＰ−４−Ｆ−ＧｌｃＮＡｃ、２．５μｌ  ｐａｒｔｉａｌ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  β１，３−ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼ（３．３２ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌ）及び１５ｍＭ ＭｎＣＩ２、を含有する１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）反応温度は３７℃で、反応時間は１８時間或いは２４時間である。
【００９２】
＜実験結果＞
天然型ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを用いて実験を行ったところ、転移されたＧｌｃＮＡｃを含む糖鎖ＧｌｃＮＡｃβ１，３−Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，３−Ｇａｌβ１，４−Ｇｌｃ−ＰＡをＨＰＬＣ上にはっきりと確認できた。一方、本発明の非天然型ＵＤＰ−４−Ｆ−ＧｌｃＮＡｃを用いることにより、予想した４−Ｆ−ＧｌｃＮＡｃを含む糖鎖糖鎖４−Ｆ−ＧｌｃＮＡｃβ１，３−Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，３−Ｇａｌβ１，４−Ｇｌｃ−ＰＡを確認できなかった。
以上の結果から、β１，３−ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼに対してＵＤＰ−４−Ｆ−ＧｌｃＮＡｃは基質になっていないことがはっきり分かった。
【００９３】
さらに、ＵＤＰ−４−Ｆ−ＧｌｃＮＡｃのβ１，３−ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼに対する阻害活性について検討した。すなわち、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ１ｍＭ存在下、ＵＤＰ−４−Ｆ−ＧｌｃＮＡｃを0〜２ｍＭまで変化させ、上記転移反応を行った。その結果、図１に示すように、１ｍＭＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの基質に対するＵＤＰ−４−Ｆ−ＧｌｃＮＡｃの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は、１．５ｍMであることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、阻害実験の結果を示したものである。なお、横軸は活性残存率（％）を示す。
【図１】
2004168751.tif 000019