(57)【要約】【課題】新規な抗癌剤が要望されている。【解決手段】抗腫瘍活性を有し、下記構造を有する生理活性物質ＮＫ３３８８２Ｐ１を提供する。更に、該化合物又はそれらの薬理学上許容し得る塩及び医薬用添加剤とを含む抗癌剤を提供する。2004168680.tif 000008
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質をもつ生理活性物質ＮＫ３３８８２Ｐ１、又はその薬理学上許容される塩。
１）分子式：Ｃ１７Ｈ１５ＮＯ５
２）分子量：３１３（ＥＳＩ法により測定した［Ｍ＋Ｎａ］＋＝３３６及び［Ｍ＋Ｈ］＋＝３１４）
３）水素核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中、４００ＭＨｚで測定したスペクトルを図１に示す。
４）炭素核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中、１００ＭＨｚで測定したスペクトルを図２に示す。
５）溶解性：メタノール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ジメチルスルホキシドに易溶。水に難溶。
【請求項２】
式（Ｉ）で表される生理活性物質ＮＫ３３８８２Ｐ１、又はその薬理学上許容される塩。
【化１】
2004168680.tif 000007
【請求項３】
請求項１又は２に記載の生理活性物質ＮＫ３３８８２Ｐ１あるいはその薬理学上許容される塩、及び医薬用添加剤とを含む医薬。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の生理活性物質ＮＫ３３８８２Ｐ１あるいはその薬理学上許容される塩、及び医薬用添加剤とを含む抗癌剤。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の生理活性物質ＮＫ３３８８２Ｐ１あるいはその薬理学上許容される塩、及び医薬用添加剤とを含む乳癌治療剤。
【請求項６】
ストレプトマイセス属に属し、請求項１又は２に記載された生理活性物質ＮＫ３３８８２Ｐ１を生産する能力を有する微生物を、栄養培地にて培養し、培養物中に生理活性物質ＮＫ３３８８２Ｐ１を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする生理活性物質ＮＫ３３８８２Ｐ１の製造法。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の生理活性物質ＮＫ３３８８２Ｐ１を生産する能力を有する微生物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生理活性物質ＮＫ３３８８２Ｐ１、その製造法及びその用途に関する。本発明のＮＫ３３８８２Ｐ１は、細胞増殖抑制作用を示し、悪性腫瘍に対する治療薬として使用される抗癌物質として期待される。
【０００２】
【従来の技術】
従来、抗癌抗生物質としては、アドリアマイシン等のアントラサイクリン類、ブレオマイシン等のブレオマイシン類、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ネオカルチノスタチン等が知られていた。（非特許文献１）
【０００３】
【非特許文献１】
龍原  徹著、ポケット医薬品集  ２００１年版、白文社、平成１３年１月発行、１２４頁〜１３３頁、
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、これらは副作用の面や抗癌効果の面から満足すべきものではなく、抗癌作用を示す新規化合物が望まれていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、これらの課題を解決するために微生物の代謝産物について種々検索した結果、放線菌に属する一菌株が、哺乳動物の癌細胞に対する細胞増殖抑制作用を有する生理活性物質ＮＫ３３８８２Ｐ１を産生し、ＮＫ３３８８２Ｐ１及びその薬理学上許容される塩が癌細胞に対する細胞増殖抑制作用を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（７）に関する。
（１）下記の理化学的性質をもつ生理活性物質ＮＫ３３８８２Ｐ１、又はその薬理学上許容される塩。
１）分子式：Ｃ１７Ｈ１５ＮＯ５
２）分子量：３１３（ＥＳＩ法により測定した［Ｍ＋Ｎａ］＋＝３３６及び［Ｍ＋Ｈ］＋＝３１４）
３）水素核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中、４００ＭＨｚで測定したスペクトルを図１に示す。
４）炭素核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中、１００ＭＨｚで測定したスペクトルを図２に示す。
５）溶解性：メタノール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ジメチルスルホキシドに易溶。水に難溶。
（２）式（Ｉ）で表される生理活性物質ＮＫ３３８８２Ｐ１、又はその薬理学上許容される塩。
【０００７】
【化２】
2004168680.tif 000002
【０００８】
（３）上記（１）又は（２）に記載の生理活性物質ＮＫ３３８８２Ｐ１あるいはその薬理学上許容される塩、及び医薬用添加剤とを含む医薬。
（４）上記（１）又は（２）に記載の生理活性物質ＮＫ３３８８２Ｐ１あるいはその薬理学上許容される塩、及び医薬用添加剤とを含む抗癌剤。
（５）上記（１）又は（２）に記載の生理活性物質ＮＫ３３８８２Ｐ１あるいはその薬理学上許容される塩、及び医薬用添加剤とを含む乳癌治療剤。
（６）ストレプトマイセス属に属し、上記（１）又は（２）に記載された生理活性物質ＮＫ３３８８２Ｐ１を生産する能力を有する微生物を、栄養培地にて培養し、培養物中に生理活性物質ＮＫ３３８８２Ｐ１を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする生理活性物質ＮＫ３３８８２Ｐ１の製造法。
（７）上記（１）又は（２）に記載の生理活性物質ＮＫ３３８８２Ｐ１を生産する能力を有する微生物。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明において、生理活性物質ＮＫ３３８８２Ｐ１は、ストレプトマイセス属に属するその生産菌を培養し、該化合物を生成せしめ、この培養物より採取する事により得られる。
【００１０】
ＮＫ３３８８２Ｐ１は、上記の理化学的性質を有する。
又、ＮＫ３３８８２Ｐ１は下記の平面構造式（１）を有する。
【００１１】
【化３】
2004168680.tif 000003
【００１２】
ＮＫ３３８８２Ｐ１の生産菌の代表的なものとして、例えば土壌より分離したストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＮＡ  ３３８８２株が挙げられる。以下に、本菌株の菌学的性状を示す。
【００１３】
１．形態的性質
２７℃で２週間後に観察した結果、気菌糸は単純分岐し、その先端はらせん状で、輪生枝の形成は認められない。又、胞子嚢及び遊走子も認められない。胞子表面はとげ状で、胞子は楕円形で、大きさは０．５〜０．８×０．６〜１．２μｍである。又、１０個以上の連鎖をなして胞子が形成される。
【００１４】
２．各種培地における生育
各種培地上、２７℃、２週間後の生育状態を下記表１に示す。
2004168680.tif 000004
【００１５】
2004168680.tif 000005
【００１６】
2004168680.tif 000006
５．細胞壁中のジアミノピメリン酸
ＬＬ−ジアミノピメリン酸である。
【００１７】
以上を要約すると、本菌株は細胞壁がＬＬ−ジアミノピメリン酸であり、又、メナキノンの種類は、主にＭＫ−９（Ｈ８）である。インタ−ナショナル・ストレプトマイセス属・プロジェクト（略称ＩＳＰ）の方法によれば、胞子形成菌糸の形態は、Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｓｐｉｒａｌｓに属し胞子表面はとげ状で、成熟した菌糸の色は灰色系統（Ｇｒａｙ  ｃｏｌｏｒ−ｓｅｒｉｅｓ）である。メラニン様色素を生産し、培地中に茶色味の可溶性色素を呈する。又、基生菌糸の色はうす黄からうす黄茶を呈する。炭素源としてはＬ−アラビノ−ス、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコ−ス、Ｄ−フラクトース、シュクロース、イノシトール、Ｌ−ラムノース、Ｄ−マンニトール、ラフィノースを利用する。
【００１８】
以上の性質をもとにア−ル・イ−・ブッファナン・アンド・エヌ・イ−・ギボンズ編、バ−ジ−ズ・マニュアル・オブ・デタミネ−ティブ・バクテリオロジ−（Ｂｅｒｇｅｙ‘ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版、１９７４年に従って検索を行った結果、上記ＮＡ  ３３８８２株はストレプトマイセス属に属することが判明した。よって、本菌をストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＮＡ３３８８２と命名した。
該菌株は、独立行政法人  産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８８２５として寄託されている。
【００１９】
本発明に用いるストレプトマイセス属に属する菌株は他のストレプトマイセス属の菌株と同様、変異させることが可能である。例えば、紫外線、エックス線、薬品等を用いる人工的な変異手段でも容易に変異しうる。このように得られたどの様な変異株であっても本発明である生理活性物質ＮＫ３３８８２Ｐ１の生産能を有するものは、全て本発明に使用する事ができる。
【００２０】
本発明によりＮＫ３３８８２Ｐ１を製造するには、まず前記菌株を放線菌が利用し得る栄養物を含有する培地で好気的に培養する。栄養源としては、従来から放線菌の培養に利用されている公知のものが使用でき、例えば炭素源としては、グルコース、グリセリン、ガラクトース、水飴、デキストリン、シュクロース、でんぷん、糖蜜、動・植物油等を使用できる。又、窒素源としては、大豆粉、小麦、小麦胚芽、コーンスティープ・リカー、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸ソーダ、尿素等を単独か又は組み合わせて用いることができる。その他、必要に応じ、ナトリウム、コバルト、塩素、硫酸、燐酸、及びその他のイオンを生成することのできる無機塩類を添加することは有効である。又、菌の生育を助け、生理活性物質ＮＫ３３８８２Ｐ１の生産を促進するような有機物及び無機物を適当に添加することができる。
【００２１】
培養法としては、液体培養法、特に深部攪拌培養法が適している。培養に適当な温度は１５℃〜３７℃であるが、多くの場合、２６℃〜３０℃付近で培養する。生理活性物質ＮＫ３３８８２Ｐ１の生産は、培地や培養条件により異なるが、振盪培養、タンク培養とも通常１〜１０日の間でその蓄積が最高に達する。培養物中の生理活性物質ＮＫ３３８８２Ｐ１の蓄積量が最高になった時に、培養を停止し、培養液から目的物質を単離する。
【００２２】
生理活性物質ＮＫ３３８８２Ｐ１の培養液からの採取にあたっては、その性状を利用した通常の分離手段を適宜組み合わせて精製することができる。すなわち、培養液を遠心分離あるいはろ過によりろ液と菌体部に分離し、ろ液からはそれを、ダイアイオンＨＰ−２０（三菱化成製）等に吸着させメタノ−ル等の低級アルコールやアセトン等により溶出するか、あるいは酢酸エチル又は１−ブタノ−ル等の有機溶媒で抽出することにより、一方の菌体部からはそれをメタノ−ル等の低級アルコールやアセトン等で抽出することによりＮＫ３３８８２Ｐ１の画分を得ることができる。
上述の方法に加え、物質の採取に用いられる公知の方法、たとえば吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーよりのかき取り、高速液体クロマトグラフィー等を適宜組み合わせ、あるいは繰り返すことによってＮＫ３３８８２Ｐ１を純粋に単離することができる。
【００２３】
本発明において薬理学上許容される塩とは、通常とり得る塩であれば特に限定されないが、アルカリ金属塩が好ましく、具体的にはナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。
【００２４】
医薬品として使用する場合の製剤化及び投与方法は従来公知の種々の方法が適用できる。すなわち、投与方法としては例えば注射、経口又は直腸投与等が可能である。製剤形態としては、例えば注射剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、座剤又はカプセル剤等をとり得る。
【００２５】
製剤化の際にＮＫ３３８８２Ｐ１又はそれらの薬理学上許容される塩に悪影響を与えない限り、医薬用に用いられる種々の医薬用添加剤、すなわち、担体やその他の助剤、例えば安定剤、防腐剤、無痛化剤、乳化剤等が必要に応じて使用され得る。製剤において、ＮＫ３３８８２Ｐ１又はその薬理学上許容される塩の含量は製剤形態等により広範囲に変えることが可能であり、一般には０．０１〜１００％（重量）、好ましくは０．１〜７０％（重量）含有し、残りは通常医薬用に使用される添加剤からなる。
【００２６】
ＮＫ３３８８２Ｐ１あるいはその薬理学上許容される塩、及び医薬用添加剤とを含む医薬は、好ましくは抗癌剤として固型癌、例えば食道癌、胃癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、大腸癌、子宮癌等に使用される。特に好ましくは、乳癌治療剤として使用される。
ＮＫ３３８８２Ｐ１又はその薬理学上許容される塩の投与量は症状、投与方法等により異なるが、成人１人１日あたり０．０１〜８００ｍｇ程度である。
【００２７】
以下に試験例を挙げて、ＮＫ３３８８２Ｐ１の、哺乳動物の癌細胞に対する細胞増殖抑制作用について述べる。
【００２８】
試験例    細胞増殖抑制作用
１０％  ＧＦ２１（和光純薬社製）を添加したＤａｉｇｏ’ｓ  Ｔ培地を用いて、ヒト乳癌細胞Ｔ−４７Ｄを、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。この細胞を、９６穴プレートへ播種し、１日間培養した後、ＮＫ３３８８２Ｐ１を添加した。同時にβ−エストラジオールを添加し、６日間処理した。増殖度は、メチレンブルー法により評価した。そのＩＣ５０値は２．９μｇ／ｍｌだった。
【００２９】
試験例から明らかな様に、本発明のＮＫ３３８８２Ｐ１は、哺乳動物の癌細胞に細胞増殖抑制作用を示す。
【００３０】
【実施例】
以下に本発明の実施例を示すが、これは単なる一例示であって何等、本発明を限定するものではなく、種々の変法が可能である。
【００３１】
実施例１  ＮＫ３３８８２Ｐ１の醗酵法による生産
（１）発酵
種母作成用の培地として、グリセロール２．０％、グルコース１．０％、ペプトン０．５％、酵母エキス（日本製薬社製）０．５％、アジプロン（味の素社製）０．５％、燐酸水素二カリウム０．０５％、硫酸マグネシウム０．０５％、炭酸カルシウム０．２％、シリコン０．０１％から成る培地を用いた。なお、滅菌前の培地はｐＨ７．０に調整して使用した。
【００３２】
５００ｍｌ容三角フラスコに上記培地を１００ｍｌ分注し、１２０℃で２０分間滅菌し、これにストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＮＡ  ３３８８２の斜面培養の１〜２白金耳を接種し、２５℃、２００回転／分の回転式振盪機にて２日間培養し、これを種母とした。
【００３３】
生産培養の培地として、グルコース１．０％、ガラクトース１．０％、デキストリン２．０％、コーン・スティープ・リカー１．０％、ファーマメディア１．０％、硫酸マグネシウム０．０５％、炭酸カルシウム０．２％、硫酸鉄０．０００１１％、硫酸銅０．０００６４％、塩化マンガン０．０００１５％、硫酸亜鉛０．０００７９％、塩化コバルト０．０００１％から成る培地を用いた。なお、滅菌前の培地はｐＨ７．０に調整して使用した。
【００３４】
上記培地１００ｍｌを含む３００本の５００ｍｌ容三角フラスコに、接種量が１％となるように接種し、５日間培養を行った。培養は同一条件下で３回行った。培養終了後、培養液に塩酸を加えｐＨ２に調整した後、遠心分離し上清液を各々３０リットル（計９０リットル）を得た。
【００３５】
（２）精製
この各々の遠心上清液を等量の酢酸エチルで抽出した。得られた酢酸エチル層を濃縮乾固しＮＫ３３８８２Ｐ１を含む画分をそれぞれ２３．２ｇ、１８．５ｇ、１７．５ｇ得た。
【００３６】
まず初めの培養で得られたＮＫ３３８８２Ｐ１を含む濃縮乾固物２３．２ｇをヘキサン−アセトン（１０：１）の混合溶媒に溶解後、あらかじめ同混合溶媒で充填したシリカゲルカラム（シリカゲル６０、メルク社製）１２００ｍｌ（φ４．７×５０ｃｍ）のカラムにかけ、同混合溶媒を３．３リットル、２：１の混合溶媒を３リットル流した後、１：１の混合溶媒３リットルで溶出、分画した。溶出した分画のうち、ＮＫ３３８８２Ｐ１を多く含む画分を濃縮乾固し、ＮＫ３３８８２Ｐ１を多く含む画分２６２０ｍｇを得た。
【００３７】
同様に２回めと３回めの培養で得られたＮＫ３３８８２Ｐ１を含む濃縮乾固物を合わせた３６ｇをヘキサン−アセトン（１０：１）の混合溶媒に溶解後、あらかじめ同混合溶媒で充填したシリカゲルカラム（シリカゲル６０、メルク社製）１６００ｍｌ（φ６．４×５０ｃｍ）のカラムにかけ、同混合溶媒を４．４リットル、２：１の混合溶媒を４リットル流した後、１：１の混合溶媒４リットルで溶出、分画した。溶出した分画のうち、ＮＫ３３８８２Ｐ１を多く含む画分を濃縮乾固し、ＮＫ３３８８２Ｐ１を多く含む画分３７７０ｍｇを得た。
【００３８】
次いでＮＫ３３８８２Ｐ１を多く含む画分２６２０ｍｇ、３７７０ｍｇをそれぞれ同一条件の中圧カラムクロマトマトグラフィーで精製した。即ち逆相カラムのＰＥＧＡＳＩＬ  ＰＲＥＰ  ＯＤＳ−５０１５−１２Ａ（φ３４×１５０ｍｍ、センシュー科学社製）を用い、２０％アセトニトリル水溶液１．５リットルで溶出した後、２０％アセトニトリル水溶液から８０％アセトニトリル水溶液でリニアグラジエント勾配をかけ、２．０リットル溶出した。溶出した分画のうちＮＫ３３８８２Ｐ１を多く含む画分を濃縮乾固し、それぞれ２３ｍｇ、４４ｍｇを得た。
【００３９】
更にＮＫ３３８８２Ｐ１を多く含む画分２３ｍｇと４４ｍｇをあわせた６７ｍｇを逆相高速液体クロマトグラフィーにて精製した。即ち、逆相カラムのＰＥＧＡＳＩＬ  ＯＤＳ（φ１０×２５０ｍｍ、センシュー科学社製）を用い、流速７ｍｌ／分、３０％アセトニトリル水溶液で６０分間溶出した。ＮＫ３３８８２Ｐ１は、保持時間１４分から１５分に溶出された。溶出した分画のうち、ＮＫ３３８８２Ｐ１を多く含む画分をアセトニトリル留去後、同量の酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル層を濃縮乾固し、純粋なＮＫ３３８８２Ｐ１（３．３ｍｇ）を得た。
【発明の効果】
本発明により、細胞増殖抑制作用を示す新規な生理活性物質ＮＫ３３８８２Ｐ１又はその薬理学上許容される塩が提供された。これらは、悪性腫瘍に対する治療薬等として利用できる。
【００４０】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＮＫ３３８８２Ｐ１の重クロロホルム中で測定した４００ＭＨｚ水素核磁気共鳴スペクトルを示す。
【図２】ＮＫ３３８８２Ｐ１の重クロロホルム中で測定した１００ＭＨｚ炭素核磁気共鳴スペクトルを示す。
【図１】
2004168680.tif 000009
【図２】
2004168680.tif 000010