(57)【要約】【課題】 腫瘍細胞中のｎｅｕプロトオンコジーンまたはオンコジーンの増幅および過剰発現の検出方法を提供する。【解決手段】 哺乳類起源のｎｅｕプロトオンコジーンまたはオンコジーン中に存在するヌクレオチド配列と特異的に反応する核酸プローブを用いる。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトｎｅｕ遺伝子産物の細胞外ドメインに特異的な単離された抗体であって、免疫原としてヒトｎｅｕを発現する生存細胞を用いて生成される抗体であって、但し、ヒトｎｅｕ遺伝子産物の細胞外ドメインはハイブリドーマＢＤ５−２ｄ（ＡＴＣＣ　ＨＢ９６９８）により産生されるモノクローナル抗体により認識される、抗体。
【請求項２】
請求項１記載の抗体を抗腫瘍量含む、ｎｅｕ遺伝子産物を発現する腫瘍に苦しむ患者を治療するための医薬組成物。
【請求項３】
細胞上のｎｅｕ遺伝子産物の細胞発現レベルを検出するためのアッセイ法であって、
（ａ）請求項１記載の抗体をｎｅｕ遺伝子産物に結合させるのに適した条件下で細胞と請求項１記載の抗体を接触させ；そして
（ｂ）細胞に結合した抗体のレベルを測定することにより細胞上のｎｅｕ遺伝産物子の発現のレベルを決定する
ことよりなる、アッセイ法。
【請求項４】
生物学上の液体中のｎｅｕ遺伝子産物の過剰発現を検出するためのアッセイ法であって、
（ａ）請求項１記載の抗体をｎｅｕ遺伝子産物に結合させるのに適した条件下で生物学上の液体と請求項１記載の抗体を接触させ；そして
（ｂ）そうして結合した抗体のレベルを測定することにより生物学上の液体中のｎｅｕ遺伝子産物の発現の量を決定する
ことよりなる、アッセイ法。
【請求項５】
液体中のヒトｎｅｕ遺伝子産物に関する免疫アッセイ法であって、
　（ａ）（ｉ）請求項１記載の抗体；
　　　　（ii）標識されており且つｎｅｕ遺伝子産物の別の免疫原性領域に特異的な請求項１記載の二次抗体；及び
　　　（iii）ｎｅｕ遺伝子産物
の複合体を形成させ；そして
　（ｂ）工程（ａ）において形成された複合体に結合した標識のレベルを検出して、それにより液体中のヒトｎｅｕ遺伝子産物の量を測定すること
を含む、アッセイ法。
【請求項６】
ヒトｎｅｕ遺伝子産物の細胞外ドメインに特異的な単離された抗体であって、免疫原としてヒトｎｅｕを発現する生存細胞を用いて生成され、且つ、ハイブリドーマＢＤ５−２ｄ（ＡＴＣＣ　ＨＢ９６９８）により産生されるモノクローナル抗体ＢＤ５−２ｄである、抗体。
【請求項７】
生物学上の液体中のｎｅｕ遺伝子産物の過剰発現を検出するためのアッセイ法であって、
（ａ）生物学上の液体を、ハイブリドーマＢＤ５−２ｄ（ＡＴＣＣ　ＨＢ９６９８）により産生されるモノクローナル抗体ＢＤ５−２ｄに、抗体がｎｅｕ遺伝子産物に結合するのに適した条件下で接触させ；そして
（ｂ）そうして結合した抗体のレベルを測定することにより生物学上の液体中のｎｅｕ遺伝子産物の発現の量を決定する
ことよりなる、アッセイ法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ヒト発癌の誘導に於て、体細胞の変異が重要な原因となつていることを示唆する証拠が増加しつつある。これらの体細胞の変異は、それまで正常であつた細胞のゲノムに蓄積し、そのうちいくつかは悪性の増殖につながる表現型を示す。このような癌遺伝子の変異は、欠失、転座、増幅及び点ヌクレオチド変化など多くの異なるタイプのＤＮＡ構造変化を含み得る。点ヌクレオチド変化は点突然変異とも言われ、そのような変異を引きおこす変異原性の化学物質による発癌に、しばしば関与している。さらに、このような変異はＤＮＡ複製に於けるミスによつて、自発的にも生じ得る。
【０００２】
点突然変異はヒト腫瘍の１０−１５％の原因に直接関与していることが示されている。これらの腫瘍は、正常な細胞のプロトオンコジーンがその遺伝子内のいくつかの場所に生じた点突然変異によつて変化した、ｒａｓ遺伝子フアミリーの癌遺伝子を持つ。これらの突然変異は腫瘍細胞ゲノムの質的変化として示され、これによつて腫瘍細胞は正常細胞と区別され、又、腫瘍の遺伝的起源を診断する基礎となる。活性型癌遺伝子を生じさせた変異を同定することは、腫瘍発生の診断上及び予後の手がかりとなる。例えば、ｒａｓ癌遺伝子の１２番目のコドンには多くの変異が見つかつているが、これは通常あるべきグリシンが他の様々なアミノ酸残基に置換したことによる。これらのアミノ酸置換はそれぞれ等価ではない。ある置換（例えばバリン）は強いトランスフオーム活性をもつ一方、他の置換（例えばプロリン）は細胞の表現型にごく限られた影響を及ぼすのみである。このように、特定のヌクレオチド置換が腫瘍細胞のふるまいを強く決定付ける（例えば、増殖速度、侵襲性など）。以上のことから、変異癌遺伝子のＤＮＡプローブは臨床腫瘍学に於ける診断用試薬として裏付けがある。
【０００３】
このようなプローブは有用ではあるが、注目している遺伝子中の、点突然変異が生じ易い領域のみが同定されている。もしこのような領域が同定されなかつた場合、限られた大きさ（例えば１０−２０ヌクレオチド長）のヌクレオチドプローブを用いて、優に３０，０００塩基対又はそれ以上の長さをもつ遺伝子全体を検索するのは実際的ではない。例えば、もし全長３３，０００塩基対の遺伝子を１５ヌクレオチドのプローブで検索した場合、３０００−５０００の別個のプローブが必要である。
［発明が解決しようとする課題］
【０００４】
このように、変異癌遺伝子のＤＮＡプローブは診断上の手段としての素質を持つてはいるが、癌遺伝子機能活性化の原因に関係した別個の変異領域が同定されている場合を除いては、有効に用いることはできない。変異による活性化の領域が決定されていなければ、点突然変異に対するＤＮＡプローブの利用は非実用的である。
【０００５】
プロトオンコジーンの増幅及び（又は）過剰発現もヒト腫瘍の原因として示唆されている。プロトオンコジーンＣ−ｍｙｃ及びＮ−ｍｙｃはそれぞれ肺及び神経芽細胞での小細胞腫で増幅されている。Ｎ−ｍｙｃプロトオンコジーンは多くの第ＩＩ、第ＩＩＩ、及び第ＩＶ段階の腫瘍に於て３−３００倍に増幅していることが見い出された。Ｎ−ｍｙｃプロトオンコジーンの増幅は、その増幅の度合いとは必ずしも比例しない、遺伝子産物の発現増加を常に伴う。より重要なことに、一次的な、未処理の神経芽細胞中のＮ−ｍｙｃ遺伝子のコピー数は、段階にかかわらず、予後の要素として臨床上重要である。（シーガーら（Ｓｅｅｇｅｒｅｔ ａｌ．）、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．，１９８５；３１３：１１１１−６）ゲノム内での増幅と腫瘍の進行の早さの間には顕著な相関がある。このように、核酸ハイブリダイゼーシヨン技術を用いたプロトオンコジーンの増幅又はそのｍＲＮＡ発現の検出、或いは免疫学的手法を用いた癌遺伝子産物蛋白質の過剰発現の検出は予後のための重要な価値をもつことは明白である。
［課題を解決するための手段］
【０００６】
この発明は細胞ＤＮＡの評価に関連し、ｎｅｕ遺伝子の過剰発現又はプロトオンコジーンの活性化及び癌遺伝子への変化をもたらす遺伝子の損傷或いは増幅を含む変化が生じているかを決定するものである。活性化変異を含む領域のヌクレオチド配列に特異的な核酸プローブが記述され、その利用法として、ｎｅｕフアミリー癌遺伝子の存在を決定するのに用いられることが示される。さらに、ｎｅｕプロトオンコジーンｍＲＮＡ及び遺伝子産物の発現レベルの決定に用いることができる。ｎｅｕプロトオンコジーン又はｎｅｕ遺伝子産物をそれぞれ認識する核酸プローブ及びモノクローナル抗体と、それらの使用法が記述される。
【発明の実施の形態】
【０００７】
点ヌクレオチド変化又は点突然変異によつて癌遺伝子に変化した、増殖因子受容体類似の蛋白質をコードするラツトｎｅｕプロトオンコジーンが決定された。この点突然変異は当初、胎盤を通じて発癌性物質（例えばエチルニトロソウレア）を作用させたラツトの神経芽細胞に見られ、そのＤＮＡがコードするｐ１８５の膜貫通領域のアミノ酸配列に影響していることが見い出された。それは、正常蛋白質のバリンがグルタミン酸残基に置換されていた。
【０００８】
同様な点突然変異を検査するために用いた核酸プローブから、それぞれ別個に発生し、独立に腫瘍を生じさせた、さらに７つのｎｅｕ癌遺伝子の存在が推測されたが、７つすべてのｎｅｕ癌遺伝子に同じ活性化変異が存在することが証明された。これらの細胞では、同じアミノ酸置換（バリンからグルタミン酸への置換）が生じていた。さらに、ｎｅｕ遺伝子と相同な核酸を用いて分析を行つたところ、変異原のメチルニトロソウレアは神経系の腫瘍形成を誘導し、エチルニトロソウレアにより誘導された腫瘍と同じ位置でｎｅｕ遺伝子の活性化を起こしていることが証明された。
【０００９】
ヒトｎｅｕ遺伝子ホモログ（ｃ−ｅｒｂＢ２又はＨＥＲ２としても知られる）は同様な機構を通じて癌遺伝子化状態になると思われる。即ち、正常な細胞のＤＮＡ塩基配列（プロトオンコジーン）の点ヌクレオチドの変化が癌遺伝子の活性化をもたらす。ラツトとヒトのｎｅｕ遺伝子の塩基配列には違いがあるため、同じ変異（バリンからグルタミン酸へ）は１塩基の変化では生じない。このバリンからグルタミン酸への置換は２塩基の変化を必要とし、確率的には非常に起こりにくい。ヒトｎｅｕ遺伝子のこの位置で一塩基の変化によりグルタミン酸以外のアミノ酸へ置換を起こした時の影響は、知られてはいないが、あると期待される。一方、ｎｅｕプロトオンコジーンの癌遺伝子としての活性は、遺伝子の増幅又は他の要因によるｎｅｕプロトオンコジーンの過剰発現によつて活性化されるであろう。
【００１０】
自然に生ずるヒト腫瘍の多様なＤＮＡに於て活性化を引き起こす変化は、ヒトｎｅｕ遺伝子領域に特異的に反応し、かつラツトｎｅｕ癌遺伝子に於て活性化を起こす変異を含む領域に対応するよう構築された核酸プローブを使うことによつて同定され得る。ヒト腫瘍細胞に於てプロトオンコジーンからｎｅｕ癌遺伝子への変化の原因となる活性化点突然変異を同定することは、ヒト腫瘍ＤＮＡにｎｅｕ癌遺伝子活性化の原因となる点突然変異が存在するか否かを検査するのに有効な核酸ハイブリダイゼーシヨンプローブを作成する基礎となり得る。これらのハイブリダイゼーシヨンプローブは細胞内でｎｅｕプロトオンコジーンやｎｅｕ癌遺伝子が生じているのを検出したり、ヒト腫瘍試料での癌遺伝子活性化の概要を決定するのに用いることができる。このような核酸プローブが通常のヌクレオチドプローブ同様に記述され、それを用いて腫瘍細胞中にｎｅｕ癌遺伝子が存在するか否かを検出する方法が示される。さらに、ｎｅｕプロトオンコジーン又は癌遺伝子の増幅及び（或いは）過剰発現を検出するための核酸プローブも記述されている。ｎｅｕ癌遺伝子又はプロトオンコジーンの出現を検出するのに利用できる、ｎｅｕ癌遺伝子にコードされるｐ１８５蛋白質に特異的な抗体も記述されている。ヒト血清、血しよう又は尿、或いは正常な前腫瘍形成細胞又は腫瘍形成細胞のような生理溶液中でヒトｎｅｕ抗原を検出するための特別な"補捉"イミユノアツセイ法が記述されている。
【００１１】
ｎｅｕ癌遺伝子は最初、胎盤を通して発癌物質エチルニトロソウレアを作用させて誘導したラツト神経芽細胞腫から単離された。活性化はプロトオンコジーンのバリンからグルタミン酸残基に置換させる１つの点突然変異である。ｎｅｕ癌遺伝子のヒトホモログもクローニングされ、その癌遺伝子としての能力は、２つの隣接した点突然変異が必要ではあるが、活性化したラツトの遺伝子で見い出されたのと同じ変異を生ずることによつて活性化される。さらに、ヒトの遺伝子は変異による変化が全く無い場合でも、過剰発現により癌原性を示す。このことは、変異を生じていないラツトのｎｅｕ遺伝子がいかなるレベルで発現してもトランスフオーミング活性を示さないのとは著しく異なる。ヒトｎｅｕ遺伝子活性化の第３の機構は、トランケーシヨンによるものである。ヒトｎｅｕプロトオンコジーンのアミノ末端が欠失した場合、トランスフオーミング活性を示す。
【００１２】
ヒトの腫瘍形成に於けるプロトオンコジーンの関与は十分に証明されている。プロトオンコジーンが悪性過程に寄与する機構は多様である。これらの機構には、プロトオンコジーン本来の塩基配列の変化や発現の制御も含まれる。発現制御の変化は以前から存在していた遺伝子の発現増加や、遺伝子コピー数の増加（遺伝子増幅）によつて起こり得る。関与している癌遺伝子及びその活性化の様式を決定することは、診断、予後及び療法上重要な意味をもつ。最近、ヒト胸部癌に於てｎｅｕプロトオンコジーンが増幅していることが示された。３０％の胸部腫瘍で２倍から２０倍以上のｎｅｕが増幅されていた。増幅したｎｅｕの存在は全体的な生存期間と病状のぶり返しの時間を予知する重要な指標となる（スレイモンら（Ｓｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ１９８７；２３５：１７７−１８２）。
【００１３】
突然変異による活性化
今日ではｒａｓ遺伝子を除く細胞性遺伝子が点突然変異によつて癌遺伝子に変わり得ることが知られている。最近、増殖因子受容体類似の蛋白質をコードするラツトのｎｅｕプロトオンコジーンも１個のヌクレオチド変化により癌遺伝子に変化し得ることが示された。このように、ｎｅｕプロトオンコジーン（すなわち、正常な非腫瘍細胞の正常なゲノムに存在するヌクレオチド配列）は、１個のヌクレオチド置換から、変異による活性化を経て、対応する癌遺伝子（すなわち、細胞内での発現によつて正常細胞から腫瘍細胞へと変化させるようなヌクレオチド配列）となることが示された。この点突然変異は当初、胎盤を通じてエチルニトロソウレアを作用させることにより誘導されたラツト神経芽細胞腫で証明されたものであるが、個別にエチルニトロソウレアを作用させることにより独立して誘導された７個の別のｎｅｕオンコジーンでも生じていることが示された。点突然変異の検出は、活性化変異を含むことが初めに示された領域に特異的な核酸プローブの利用によつた。すべてのケースで、同じアミノ酸置換が起こつており、コードされるｐ１８５蛋白質の膜貫通部に通常存在するバリンがグルタミン酸残基に置換されていた。この発見は、ｎｅｕプロトオンコジーンの限られた数のサイトでのヌクレオチド置換の結果、活性型癌遺伝子を生ずることを示唆している。
【００１４】
メチルニトロソウレアにより誘導された、１０個の神経系腫瘍から調製したＤＮＡより生じたトランスフエクタントは活性型ｎｅｕ遺伝子を含み、トランスフオーミング活性をもつ遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドプローブに対するハイブリダイゼーシヨンの差から判断するとそれらはＤＮＡ中に同じ変化を持ち、エチルニトロソウレアによつて誘導された腫瘍に存在するのと同じ塩基配列の変化を持つと考えられた。このように、ｎｅｕ遺伝子と相似な核酸プローブはメチルニトロソウレアを作用させることによつて誘導された腫瘍中の活性型ｎｅｕ遺伝子の検出にも使用できることが示された。さらにこのことはどちらの変異原も同じ位置でｎｅｕ遺伝子を活性化し、活性化ｎｅｕ遺伝子はＢＤＩＸラツト（エチルニトロソウレアで誘導した腫瘍）及びＢｕｆｆａｌｏ ラツト（メチルニトロソウレアで誘導した腫瘍）の両方に生ずることが証明された。
【００１５】
ラツトｎｅｕ遺伝子に対応するヒト遺伝子が単離され、ｃ−ｅｒｂＢ２又はＨＥＲ２と呼ばれている。ヤマモト，Ｔ．ら（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ，３１９：２３０−２３４（１９８６）；コーセンス，Ｌ．ら（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１１３２−１１３９（１９８５）ラツト及びヒトのクローンのＤＮＡ塩基配列から、いずれもｎｅｕ遺伝子産物の１２６０アミノ酸の蛋白質が予想される。ここではヒトｎｅｕ癌遺伝子と呼ぶが、ラツトｎｅｕ遺伝子のヒトホモログの変異による活性化は同様な機構、即ちヒトｎｅｕ遺伝子内での１つのヌクレオチド置換又は点突然変異によつて生ずるらしい。１つのヌクレオチド置換は、ラツトｎｅｕ癌遺伝子に於て活性化変異を含むことが示された領域に対応するヒトｎｅｕプロトオンコジーンの領域で起きているということがかなり確実である。ｎｅｕ癌遺伝子に特有の領域又はそれに対応するｎｅｕプロトオンコジーンに特有な領域にそれぞれ特異的に反応する核酸プローブの利用により、多様な、自発的に生じたヒト腫瘍のＤＮＡに活性化をもたらす損傷が存在するか否かを決定することが可能である。つまり、ｎｅｕ癌遺伝子又はそれに対応するプロトオンコジーンのそれぞれに（しかし、両方にではなく）生じているヌクレオチド配列と反応（ハイブリダイズ）するハイブリダイゼーシヨンプローブを作成できる。そのようなプローブはヒト腫瘍ＤＮＡに於てｎｅｕ癌遺伝子を活性化する点突然変異を検査するのに用いることができる。例えば、臨床上対象としているヒト腫瘍のｎｅｕ癌遺伝子活性化を検出するのに、サザンブロツトハイブリダイゼーシヨン法で放射線標識した核酸プローブを用いることができる。
【００１６】
増幅／過剰発現ヒトｎｅｕプロトオンコジーンの増幅は、ヒトｎｅｕプロトオンコジーンの癌遺伝子としての性質を活性化するもう一つの機構であろう。ヒトｎｅｕプロトオンコジーンの増幅は、ｎｅｕ遺伝子のいずれの部分由来のハイブリダイゼーシヨンプローブを用いても検出できる。これらのプローブは癌遺伝子とプロトオンコジーンを区別する必要はない。このような手法は神経芽細胞腫中でのヒトＮ−ｍｙｃ遺伝子の増幅を検出するのに有効に利用されている。いくつかの種類の腫瘍で、ヒト癌遺伝子の増幅が見い出されている。最も良く報告されているのは、神経芽細胞腫に於けるＮ−ｍｙｃの増幅である。この遺伝子は多くの第ＩＩ、第ＩＩＩ及び第ＩＶ段階の腫瘍で３−３００倍の増幅が見い出された。さらに重要なことに、一次的な、未処理の神経芽細胞腫中のＮ−ｍｙｃコピー数は、段階とは無関係に予後の要素として臨床上重要である。（シーガーら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９８５；３１３：１１１１−６）ゲノムの増幅と腫瘍の進行の早さとの間には顕著な相関関係がある。遺伝子増幅を伴わないＮ−ｍｙｃ遺伝子の過剰発現も予後に同様な関係があることを示す証拠もある。癌遺伝子の増幅は、他の種々の腫瘍でも検出されている。その中には網膜芽細胞腫（Ｎ−ｍｙｃ）、急性前骨髄球白血病、結腸、胸部、肺及び胃の癌腫（ｃ−ｍｙｃ）がその他多くのものと同様に含まれる。
【００１７】
ｎｅｕ遺伝子の増幅及び／又は過剰発現の検出はホニユウ類細胞中の癌の存在を検査するのに利用できる。増幅や過剰発現はＤＮＡ、ＲＮＡ又は蛋白質レベルで測定できる。このような検査の１つの具体例は、テストされる細胞から調製した核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）について、ｎｅｕ遺伝子のヌクレオチド配列に相補的な、放射線標識した核酸プローブとを結合させることである。プローブは試料に存在する相補的塩基配列のｎｅｕ遺伝子とハイブリダイズする。このようなハイブリダイゼーシヨンの程度は、オートラジオグラフイーとその後の濃度計測定のような、良く知られた技術によつて測定される。対照と比較して高いレベルのハイブリダイゼーシヨンはｎｅｕ遺伝子の増幅を示唆し、腫瘍の原因として示唆されてきた。このように、ハイブリダイゼーシヨンのレベルは細胞中の癌の存在を暗示する。以下に示されるｎｅｕ遺伝子の１．６キロベースのＥｃｏＲＩ制限酵素断片は、ｎｅｕ遺伝子の他のどの部分とも同様に、ハイブリダイゼーシヨンプローブとして用いることができる。過剰発現の検出は、蛋白質レベルでも行われる。ｎｅｕ癌遺伝子にコードされるｐ１８５蛋白質はそれに対応するプロトオンコジーンにコードされる蛋白質とは異なり、このため、これらの蛋白質中の、変化した又は正常なアミノ酸配列に特異的なポリクローナル抗体やモノクローナル抗体などの血清学的試薬を開発することが可能である。これらの試薬は、変異や変化を起こした遺伝子産物を検出することにより、ｎｅｕ癌遺伝子が存在するか否かを高感度で検査するのに用いられ得る。血清学的試薬を用いて、免疫組織化学技術により細胞表面の、又、イミユノアツセイ技術により生理学溶液中のｎｅｕ遺伝子にコードされる蛋白質を検出できる。これらの検査には、前述のアミノ酸配列又はｎｅｕがコードする産物のアミノ酸配列の一部に特異的な抗体が用いられる。免疫ペルオキシダーゼ染色法のような免疫組織化学技術により、ヒト組織標本（例えば生検試料）のｎｅｕ遺伝子の発現を検査できる。或いは、免疫螢光法も用いられる。これらの検査では、ｎｅｕ遺伝子産物に特異的な抗体は、抗体がｎｅｕ遺伝子産物に結合するのに適当な条件下で、組織試料（細胞）と接触する。好ましい抗体はｎｅｕ遺伝子産物の細胞外ドメインに特異的なものである。細胞に対する結合の程度（標準的な免疫組織化学又は免疫螢光技術により決定できる）は、ｎｅｕ遺伝子産物の発現レベルを示唆する。
【００１８】
免疫学的検査法で、生理的溶液中でｎｅｕ遺伝子産物を検出できる。それらはコンペテイテイブアツセイや免疫学的計量法（放射免疫計量法又は酵素計量法）による検査を含む。生理的溶液（即ち、血液、唾液）はテストするべき検体から調製する。試料中の抗体とｎｅｕ遺伝子産物の複合体形成ができる条件下で、試料をｎｅｕ遺伝子産物に特異的な抗体と接触させる。複合体形成（抗体／抗原反応）の程度は試料中のｎｅｕ遺伝子産物の量を示唆する。抗体−抗原複合体の量は広く知られている方法によつて測定する。例えば、免疫計量法では、抗体／抗原複合体の定量に二次標識抗体が使われる。
【００１９】
血清や体液中のヒトｎｅｕ抗原を検出する免疫計量法検査は、正常な前腫瘍形成及び腫瘍形成細胞中のものと同様に、実施例７Ａから７Ｃに記述されている。"捕捉"免疫検査法は、実施例に詳細に記述されているように行い、概略的には、その方法に従つて行つたヒト生理溶液中のヒトｎｅｕ抗原を検出するための捕捉イミユノアツセイは次のようなものを含む。
ａ．モノクローナル又はポリクローナルの抗ｎｅｕ一次抗体で固相のインキユベーシヨン混合液を用意する。
ｂ．抗ｎｅｕ抗体が固相に結合するのに適した条件で混合液をインキユベーシヨンする。
ｃ．液体試科から固相を分離し、抗ｎｅｕ抗体を含まない固相上のサイトを排除（即ち、ブロツキング）する。
ｄ．抗ｎｅｕ抗体を含む免疫吸収剤とｎｅｕ抗原を含む、ヒト生理溶液のインキユベーシヨン混合液を用意する。
ｅ．溶液中のヒトｎｅｕ抗原が免疫吸収剤と結合するのに十分な時間、適当な条件でインキユベートする。
ｆ．液体試料から免疫吸収剤を分離する。
ｇ．免疫吸収剤を標識した抗ｎｅｕモノクローナル二次抗体とインキユベートし、ｈ．良く知られた技法を用いて免疫吸収剤に結合したラベルの量を検出する。
【００２０】
特に、ｎｅｕ抗原は実施例７に詳述される新しい捕捉イミユノアツセイにより検出できる。簡単に述べれば、生物標本からｎｅｕ抗原を捕捉する目的で、ポリスチレンプレートを抗ｎｅｕモノクローナル抗体又は抗ｎｅｕモノクローナル抗体の化合物でコートする。一度コートした後は、捕捉抗体と結合しないサイトは緩衝液のウシ血清アルブミンでブロツクされる。ｎｅｕ抗原を含む又は含む疑いのある試料をインキユベートし、ビオチン標識した抗ｎｅｕ抗体が加えられる。ビオチンを検出するため、ストレプトアビジンホースラデイツシユペルオキシダーゼ溶液を酵素の基質と共に加え、反応産物の光学密度を測定する。ｎｅｕ抗原の量は試料の光学密度を、予め測定しておいた標準ｎｅｕ抗原の量とその光学密度との関係と比較することにより決定する。この検査法により、三重の複合体が形成され、それらは、１）抗ｎｅｕ一次抗体 ２）ｎｅｕ遺伝子産物（"ｎｅｕ抗原"）及び ３）抗ｎｅｕ二次抗体から成る。この二次抗体は複合体形成前又は後で標識される。標識は良く知られたいずれかの方法で抗体に直接又は間接に付けられる。例えば、抗体とビオチンの複合体を形成させ得る。本発明のイミユノアツセイは一次抗体が抗ｎｅｕモノクローナル抗体でも、抗ｎｅｕモノクローナル抗体の混合物でも或いは抗ｎｅｕポリクローナル抗体でもｎｅｕ抗原を検出できる。
【００２１】
複合体はそれが固相に固定される以前に形成され得る。他の体系を用いれば、複合体は形成されると同時に固相に固定され得る。好ましい検査に於いては、ｎｅｕ遺伝子産物は、それを特異的に"捕捉"又は結合する免疫吸着剤に固定される。この免疫吸着剤はｎｅｕ遺伝子産物のあるイデイオトープに特異的な抗体の付着によつて形成される。このように、ほとんどの目的で、免疫吸着剤及び標識抗体の形成に２つの異なる抗ｎｅｕ抗体が用いられる。
【００２２】
捕捉アツセイはフオワード、リバース及び同時のモードで行える。ｎｅｕ遺伝子産物に対するフオワード捕捉アツセイでは、抗ｎｅｕ抗体は固相に付けられる。テストされる液体試科は免疫吸着剤とインキユベートされる。インキユベーシヨンは液体試料中のｎｅｕ遺伝子産物が、免疫吸着剤上に固定された抗ｎｅｕ抗体に結合するのに十分な時間行われる。この最初のインキユベーシヨンの後、固相の免疫吸着剤を試料から分離する。液体試料中に存在する可能性がある非結合抗原や非特異的結合蛋白質のような阻害物質を除去するため、免疫吸着剤を洗浄する。固定された抗体に結合した、ｎｅｕ抗原を含む免疫吸着剤は、続いて、標識抗ｎｅｕ抗体とインキユベートされ、固定化抗体−ｎｅｕ抗原−標識抗体の三重の複合体を形成する。インキユベーシヨンは標識抗ｎｅｕ抗体がｎｅｕ抗原に確実に結合する時間と条件で行われる。二度目のインキユベーシヨンの後、固相の免疫吸着剤から結合していない標識を除くため、もう一度洗浄する。固相の免疫吸着剤に結合した標識抗ｎｅｕ抗体を測定し、検出されたラベルの量は液体試料中に存在したｎｅｕ抗原の量の直接の測定結果を与える。
【００２３】
このサンドウイツチ型のイミユノアツセイはリバース及び同時のモードでも行うことができる。リバースモードでは、インキユベーシヨン混合液は検査される液体試料と可溶性の標識抗ｎｅｕ抗体から成る。混合液をインキユベートし、同じ或いは異なる抗体を持つ固相の免疫吸着剤に接触させる。さらにインキユベートした後、混合液から免疫吸着剤を分離し、液体試料中に存在したｎｅｕ抗原の量を示す、免疫吸着剤に結合したラベルを測定する。同時モードでは、インキユベーシヨン混合液は測定されるｎｅｕ抗原を含む液体試料と、標識抗ｎｅｕ抗体、及び固相の免疫吸着剤より成る。三重の複合体を形成させる適切なインキユベーシヨンの後、混合液から固相の免疫吸着剤を分離し、免疫吸着剤に結合したラベルを測定して液体試料中のｎｅｕ抗原の量のデータを得る。
【００２４】
腫瘍の治療ｎｅｕ
遺伝子産物に特異的な抗体は腫瘍の治療に用いることができる。治療としては、抗体は単独で受動免疫療法に、又は免疫毒の一成分として用いることができる。受動免疫療法では、腫瘍に対抗する量のモノクローナル抗体を生理学的に適切な媒体（例えば、通常の塩水）に入れて、ｎｅｕ遺伝子産物を発現する腫瘍に苦しむ患者に投与する（実施例８を見よ）。例えば、ｎｅｕ遺伝子産物の細胞外ドメインに特異的な抗体が腫瘍の治療に用いられる。免疫毒療法では、抗体は抗癌剤やサイトトキシンと結合させて免疫毒を作る。多様な医薬、細胞毒性をもつ試薬が共有結合又は非共有結合で抗体と結合できる。便利な治療用試薬の例としては、放射性化合物（例えばホウ素やレニウムの同位元素）、アルキル化剤や抗生物質のようなＤＮＡ結合試薬（例えばダウノマイシン、アドリアマイシン、クロラムブチル）、代謝阻害剤（例えば、メトトレキサート）、及び蛋白質合成阻害剤（例えば、ジフテリア毒素、毒性植物蛋白質）などを含む。 ここに記述した治療上の利用には、ｎｅｕ遺伝子産物に対する抗体はキメラ抗体として設計することもできる。キメラ抗体はヒト以外（例えばマウス）の可変領域（抗原結合領域）とヒト由来の不変領域をもつ。キメラ抗体はヒト由来の部分が優勢なため、ヒト体内で免疫原性は低く、ヒトへの外来蛋白質の投与に伴う諸問題を解消し得る。
この発明は、さらに以下の実施例で説明される。
【実施例】
【００２５】
実 施 例 １：ｎｅｕ ｃＤＮＡクローンとｎｅｕ遺伝子産物の単離
Ａ．ｎｅｕ遺伝子族
周産期のＢＤＩＸラツトに、アルキル化剤であるエチルニトロソウレアを１回投与する事により神経外胚葉性腫瘍が高い効率で生起される。ラジユースキー，Ｍ．Ｆ．ら、Ｏｒｉｇｉｎｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー，７０９−７２６（１９７７）；ラジユースキー，Ｍ．Ｆ．，Ｒｅｃｅｎｔ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８４：６３−７６（１９８３）。妊娠１５日後に胎盤経由で変異処理を行うか、誕生後１０日間にわたつてエチルニトロソウレアを直接注射した動物の９５％は、投与量および株ごとの潜伏期を経た後、中枢および末梢神経系の腫瘍を誘起するだろう。これらの腫瘍由来のこれらの腫瘍および細胞系列は、広範な種類の神経細胞およびグリア細胞タイプの特徴を示す。シユバート，Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９４：２２４−２２７（１９７４）。この細胞タイプの、独立に由来した４つの腫瘍細胞系列から単離したＤＮＡはＮＩＨ３Ｔ３フオーカス形成アツセイにおいて検出され得る活性化されたガン遺伝子を含んでいる。このアツセイで検出されるガン遺伝子の大部分は、ｒａｓ遺伝子に密接に関連した３つのうちのひとつが、遺伝的に変化したものである事が示されている（バーマス，１９８４）。しかし、これらの神経／グリア芽腫由来の遺伝子はｒａｓ遺伝子に関連しておらず、ｎｅｕと呼ばれている。ｎｅｕは、はじめ、トランスフエクトした細胞表面に示される１８５０００Ｄａの腫瘍抗原ｐ１８５との結合より、特異な遺伝子である事が認められた。ｎｅｕは、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体をコードする。ｅａｒＢ遺伝子のＤＮＡ配列に関連しており、ＥＧＦ受容体に対する抗血清がｐ１８５といくらかの交差反応性を示す。しかし、詳細な分析により、ｎｅｕは、ｅａｒＢに対してごく限られた相同性しかもつておらず、この２つの遺伝子が異なる染色体上に位置する事が示されている。シエクター，Ａ．Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：９７６−９７８（１９８５）。したがつて、ｎｅｕ遺伝子は、ＥＧＦ受容体をコードする遺伝子に関連しているが、異なるものである。ｎｅｕガン遺伝子のｃＤＮＡクローンは、この遺伝子によりトランスフオームされた細胞系列から単離した。バーグマン，Ｃ．Ｉ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３１９：２２６−２３０（１９８６）。ヒトのこれと同じ遺伝子も単離されており、ｃ−ｅｒｂＢあるいはＨＥＲ２など、様々に呼ばれている。これらラツトおよびヒトクローンのＤＮＡ配列は、ｎｅｕ遺伝子のタンパク質産物が１２６０アミノ酸からなることを推定し、これは、ＥＧＦ受容体で推定されるアミノ酸配列に対し並列的であり、５０％同一である。ＥＧＦ受容体からの類推により、ｎｅｕ産物は、６５０アミノ酸のシステインが豊富な細胞外領域および、膜貫通ドメイン、チロシンキナーゼドメイン部分を含む５８０アミノ酸の細胞内領域からなる膜貫通タンパク質と考えられる。ｐ１８５タンパク質に関する生化学的研究はこの結論を支持している。ｐ１８５は、グリコシル化されており、無傷の細胞においても抗血清と反応する事ができ、これは、このタンパク質が細胞表面に局在する事に合致する。また、このタンパク質は、関連するチロシン特異的タンパク質リン��化活性を有している。しかし、ｐ１８５はＥＧＦを結合せず、そのため未同定の成長因子に対する受容体ではないかと考えられる。
Ｂ． ラツトｎｅｕ遺伝子の正常型およびトランスフオーム型アリルクローンの単離
ラツトｎｅｕ遺伝子の正常型およびトランスフオーム型アリルの、生物学的に活性のあるゲノムクローンが最近単離された。ハングＭ．−Ｃ，ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８３：２６１−２６４（１９８６）。これらのクローンの構造的比較からは、大幅な組換えが起きたという証拠は一切示されず、このことは、わずかな遺伝的改変がｎｅｕガン遺伝子の活性化の原因である事を示唆している。正常型アリルを含むトランスフオームされていない細胞および、変異型アリルを含むトランスフオームされた細胞系列において発現されたｐ１８５の 相対的 レベルが示され、これは、ｎｅｕの活性化の原因となる改変は、この遺伝子の発現の調節を失わせないことを示唆するものである。この結果はトランスフオームの原因がコードされているｐ１８５タンパク質内にあり、それはこの遺伝子のｃＤＮＡにおいて示されるであろう。
Ｃ． 正常型ｎｅｕ遺伝子のｃＤＮＡクローンとトランスフオーム型ｃＤＮＡクローンの比較
ｎｅｕ遺伝子の活性化の原因となる改変の効果を調べるために、すでに単離されていたトランスフオーム型ｃ ＤＮＡクローン、エチルニトロソウレアにより誘導された３種の異なる活性型ｎｅｕ遺伝子由来のＤＮＡ、およびｎｅｕ正常型アリルのｃＤＮＡクローンの比較が行われた。
正常型ｎｅｕ ｃＤＮＡクローンの単離
まず、正常型ｎｅｕ ｃＤＮＡクローンを単離することが必要とされた。そのために、細胞系列ＤＨＦＲ Ｇ８由来のＲＮＡを用いてｃＤＮＡを構築した。ハングＭ．−Ｃ，ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８３：２６１−２６４（１９８６）。ＤＨＦＲ細胞系列は、ラツトのＢＤＩＸ株由来の完全な正常型ｎｅｕ遺伝子を含むゲノムコスミドクローンを、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞にトランスフエクトすることにより作成された。これらの細胞は、トランスフエクトした遺伝子から高レベルのｎｅｕ遺伝子産物であるｐ１８５と高レベルのｎｅｕＲＮＡを発現する。ｃＤＮＡクローンはＳ１スナツプバツク法で、ターミナル・トランスフエラーゼを用いてｄＣＴＰによりテイリングし、ｄＧテイルをもつたｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ部位に挿入することにより作成された。ｎｅｕプローブと反応する３０個の組換え体プラスミドが単離された。これらのプラスミドクローンは、制限酵素地図により、活性型ｎｅｕガン遺伝子の全長ｃＤＮＡクローンと比較された。これらの正常型ｃＤＮＡクローンは、すでに同定されているトランスフオーム型ｃＤＮＡクローンと共通の配列をもつているが、どれもｎｅｕの全コード領域を含んではいなかつた。しかし、ｎｅｕの全コード領域を含むクローンは、ユニークなＮａｅＩ部位を共通にもつ、部分的に重複した２つのクローンをｉｎ ｖｉｔｒｏで組換えることにより構築された。これにより生じたクローンの５′末端について、ｎｅｕがコードするｐ１８５タンパク質に対する開始コドンの存在を調べるためにその配列を決定した。第１図に示されるように、この正常型ｎｅｕクローンをｐＳＶ２発現ベクターに挿入してｐＳＶ２ｎｅｕＮを作成した。マリガン，Ｒ．Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，２７７：１０８−１１４（１９７９）Ｂ１０４−１−１細胞系列由来のトランスフオーム型ｎｅｕｃＤＮＡクローンは、活性型ラツトｎｅｕ遺伝子の２次トランスフエクタントであるが、これをｐＳＶ２に挿入してｐＳＶ２ｎｅｕＴと呼ばれるプラスミドを構築した（第１図）。ｐＳＶ２ｎｅｕＴは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞あるいはＲａｔ１繊維芽細胞におけるフオーカス形成アツセイにおいて高い活性を示した。このアツセイは、トランスフエクシヨンによつて細胞に導入されたＤＮＡ分子が、単層で生育しているこれらの細胞をトランスフオームした状態に転換し、その子孫が、細胞単層上に形態的にトランスフオームした細胞の集塊あるいはフオーカスを形成せしむ能力を測定するものである。しかし、同様にｐＳＶ２ベクターに挿入された正常型ｎｅｕ ｃＤＮＡを同一の条件でＮＩＨ ３Ｔ３細胞にトランスフエクトした場合、フオーカスはいつさい観察されなかつた。
トランスフオーム型細胞および非トランスフオーム型細胞による、ｐ１８５産生の比較。
ｐＳＶ２ｎｅｕＮおよびｐＳＶ２ｎｅｕＴ プラスミドを含む細胞系列は、ｐＳＶ２ｎｅｏ（以下、ｎｅｏ−ｒマーカーと呼ぶ）とのコトランスフエクシヨンおよびＧ４１８の選択により単離された。サザン，Ｐ．Ｊ．とＰ．バーグ，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １：３２７−３４１（１９８２）。ｐＳＶ２ｎｅｕＴを発現している細胞系列は、形態的にトランスフオームし、レフラクタイルになる；ｐＳＶ２ｎｅｕＮを含む細胞系列は、形態的には偏平で非トランスフオーム型である。これらの細胞系列を32Ｐ正リン酸により代謝的に標識し、その細胞破砕液をラツトｎｅｕ遺伝子産物を特異的に沈澱させるモノクローナル抗体とともにインキユベーシヨンした。第２Ｂ図のレーンｃ，ｄおよびｉに示されているように、標識されたｐ１８５のレベルは、トランスフオーム型細胞と非トランスフオーム型細胞とで同等であつた。この結果は、ｎｅｕは発現の非調節化というよりはむしろ、コード領域における突然変異によつて活性化されることを示唆する初期の研究と合致するものである。ハングＭ．−Ｃ，ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８３：２６１−２６４（１９８６）。
【００２６】
実 施 例 ２： ｎｅｕ遺伝子の遺伝的解析
Ａ．ｎｅｕ遺伝子の活性化の原因となるＤＮＡ配列の同定
ｐＳＶ２ｎｅｕＴクローンのトランスフオーム活性を担う配列の同定は、このクローンと正常型アリルを担うｐＳＶ２ｎｅｕＮとの組換え体を用いることにより行われた。この組換え体は、クローン化された適当なＤＮＡ断片をライゲーシヨンする事によつて構築された。第１図は、活性化型変異を担うｎｅｕの領域を明らかにする一連のクローンの構造を示している。ここに示されるそれぞれの組換え体クローンの構造は、制限酵素地図によつて評価された。各例において、少なくとも２つの単離されたプラスミドに関して、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を形態的にトランスフオームする能力を試験した。全ての組換え体クローンは、ｎｅｏ−ｒマーカーとともにコトランスフエクシヨンされ、得られたＧ４１８耐性コロニーの形態が記録された。形態的にトランスフオームしていないコロニーは、獲得したｃＤＮＡクローンから、構造的に無傷のｐ１８５タンパク質を発現していることを確認するために試験された。クローンｐＳＶ２ｎｅｕＦおよびｐＳＶ２ｎｅｕＢは、 正常型クローンの残りの部分の配列に融合したトランスフオーム型クローンの、それぞれ、はじめの７１９と１８９９ヌクレオチドを含んでおり（第１図）、それらはｐ１８５の合成を指示することができるにもかかわらずトランスフオーム活性を示さなかつた。この遺伝子の５′末端からヌクレオチド２３８７まではトランスフオーム型ｎｅｕ配列を含み、それ以後は正常型ｎｅｕ配列を含むクローンｐＳＶ２ｎｅｕＨは、トランスフエクシヨンによりフオーカスを形成し、もとのｐＳＶ２ｎｅｕＴクローンによつて形成されるコロニーと区別できないトランスフオームしたコロニーを生ずる。ｐＳＶ２ｎｅｕＣもまた、トランスフオーム能をもつていた。これは正常型ｎｅｕ遺伝子のヌクレオチド２３３７からヌクレオチド３５３４までのＸｂａＩ断片を含み、これにより対応するトランスフオーム型ｃＤＮＡの部分が置換されている。この結果は、正常型ｃＤＮＡとトランスフオーム型ｃＤＮＡが、ヌクレオチド１８８９から２３３７の間の配列において異なつており、トランスフオーム型クローン中にこの配列が存在することがトランスフオーメーシヨンに必須であることを示している。この配列がトランスフオーメーシヨンの生起に充分であることを証明するために、相互的コンストラクトであるｐＳＶ２ｎｅｕＴＮとｐＳＶ２ｎｅｕＮＴ（第１図）が構築され、ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＲａｔ Ｉ繊維芽細胞へのトランスフエクシヨンによつて試験された。ｐＳＶ２ｎｅｕＴＮは、Ｎｄｅ ＩとＢｇｌＩにより規定される、正常型ｎｅｕクローン由来のヌクレオチド１８９９から２３８７を除いてはトランスフオーム型ｃＤＮＡ全長を含んでいる。ｐＳＶ２ｎｅｕＮＴは、トランスフオーム型クローン由来の配列により置換された、対応する４８８ヌクレオチドを除く全長の正常型ｎｅｕ ｃＤＮＡ配列を含んでいる。比較実験において、ｐＳＶ２ｎｅｕＮＴはもとのトランスフオーム型クローンであるｐＳＶ２ｎｅｕＴと同等の数のフオーカスを与え；ｐＳＶ２ｎｅｕＴＮ、ｐＳＶ２ｎｅｕＮ および偽トランスフエクシヨンでは、フオーカスはいつさい見られなかつた。この実験は、正常型とトランスフオーム型クローンの間の、基本的な遺伝的差異はこの���８８ヌクレオチドからなる断片に存在することを示している。第２図に示されているデータはこれらの結論を指示するものである。ｐｓＶ２ｎｅｕプラスミドと選択ｎｅｏ−ｒ遺伝子のコトランスフエクシヨンにより単離されたＧ４１８耐性細胞系列は、第２Ａ図に示されている。ｐＳＶ２ｎｅｕＴＮおよびｐＳＶ２ｎｅｕＮを含む系列は、形態的に偏平で、ｎｅｏ−ｒ遺伝子のみでトランスフエクシヨンした系列と区別することができない。それとは対照的に、ｐＳＶ２ｎｅｕＮＴおよびｐＳＶ２ｎｅｕＴを含む細胞は、非常にレフラクタイルで、形態的にお互い極めて類似している。これらの細胞系列は32Ｐ正リン酸により代謝的に標識し、その細胞破砕液を抗ｐ１８５モノクローナル抗体１６．４とともにインキユベーシヨンした。ドレビン，Ｊ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３１２：５４５−５４８（１９８４）。第２Ｂ図は、ｐＳＶ２ｎｅｕＮ（レーンｃとｄ）、ｐＳＶ２ｎｅｕＴ（レーンｉ）、ｐＳＶ２ｎｅｕＴＮ（レーンｅとｆ）およびｐＳＶ２ｎｅｕＮＴ（レーンｇとｈ）を含む典型的な細胞系列で発現しているｐ１８５のレベルを示している。正常型およびトランスフオーム型ｃＤＮＡが単離された細胞系列であるＤＨＦＲＧ８とＢ１０４−１−１細胞（レーンｂとｊ）由来の細胞破砕液についても分析を行つた。それぞれの細胞クローンは広範なｐ１８５レベルを示すが、正常型およびトランスフオーム型細胞両方においてｐ１８５発現が似た範囲にあることは明かである。ｎｅｏ−ｒマーカークローンのみでトランスフエクシヨンした系列において、ｐ１８５は全く見いだされない（レーンａ）。したがつて、これらの細胞における相違は、それらが発現しているｐ１８５の性質に関する。内在性の違いによると説明されねばならない。
Ｂ．正常型ｎｅｕアリルと活性型ｎｅｕ遺伝子を区別する変異の定義
トランスフオーム型ｎｅｕ ｃＤＮＡの コード領域の完全なＤＮＡ配列が決定されている。バーグマン，Ｃ．Ｉ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３１９：２２６−２３０（１９８６）。この２つのアリルを区別する厳密な変異を定義するために、ヌクレオチド１８９９から２３８７の間の領域のＤＮＡ配列が正常型ｎｅｕ ｃＤＮＡについて決定された。この配列とすでに決定されていたトランスフオーム型クローンの配列の間には、ただ１つの違いしか見つからなかつた。ヌクレオチド１０１２の位置に、発ガン遺伝子型クローンではＡが存在するが、一方、正常型はこの位置にＴをもつていた。この結果、コードされるｐ１８５の残基６４４に存在することが推定されるアミノ酸が影響を受ける；正常型タンパク質で見られるバリンが発ガン型では、グルタミン酸によつて置換されている。第３図は、正常型ｎｅｕ 遺伝子とトランスフオーム型ｎｅｕ遺伝子両方について、ヌクレオチド１９６８から２０７３のＤＮＡ配列および推定されるアミノ酸配列を示している。予想される変異は、ｎｅｕ遺伝子産物ｐ１８５で推定される膜貫通ドメイン内に帰属している。ｎｅｕの正常型およびトランスフオーム型アリルのゲノムクローンは、すでに単離されている。これらのクローンはｃＤＮＡにみられるヌクレオチドの相違を見るために独立に用いられた。このような共同研究からのデータは、ｃＤＮＡで観察される差異が、ｃＤＮＡクローニングにおいて生じたものである可能性を除外するために役だつている。この２つのアリルをゲノムからサブクローニングし、配列を決定することにより、同様なＴからＡへの置換がこれらのゲノムクローンにおいても存在することを確証した。これは、ＴからＡへの変換という変異がＢ１０４神経芽細胞腫瘍あるいは細胞系列を生成する際に、体細胞において生起することを示している。
【００２７】
実 施 例 ３：ｎｅｕガン遺伝子の活性化
Ａ．独立のｎｅｕガン遺伝子活性化の決定。
初期の結果は、６つの神経／グリア芽種細胞系列の内、４つから調製したＤＮＡがＮＩＨ ３Ｔ３フオーカス形成アツセイにおいて活性型のｎｅｕガン遺伝子を示すことを明らかにしていた。シー，Ｃ．ら：Ｎａｔｕｒｅ，２９０：２６１−２６４（１９８１）。これら６つの細胞系列はエチルニトロソウレアを用いて、ＢＤＩＸラツト胚を胎盤を介して変異源処埋することによつて得られたものである。これらの独立な活性型ｎｅｕ遺伝子は、それらが同じ活性型変異を含んでいるかで評価された。これらのｎｅｕ遺伝子を含むコランスフエクタント由来のＤＮＡについて、ｎｅｕ遺伝子のひとつあるいは他のアリルを優先的に認識する核酸プローブを用いてハイブリダイゼーシヨンを行つた。この方法は、ｒａｓ遺伝子の種々の活性型アリルを同定する際に用いられ、成功している。ボス，Ｊ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３１５：７２６−７３０（１９８５）；ザーブル，Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３１５：３８２−３８５（１９８５）。ｎｅｕ遺伝子の野生型あるいは変異型ｎｅｕいずれかの配列に対応する核酸が合成された。これらの２つの２０−ｍｅｒの配列が第４図に示されている。これらの２０−ｍｅｒを、次に、適当な制限酵素で切断したＤＮＡを含む、乾燥したアガロースゲルに対して厳しい条件（完全な２重鎖について計算されたＴｍよりも２℃低い温度）下でハイブリダイゼーシヨンさせた。野生型配列に対応する２０−ｍｅｒは、ｐＳＶ２ｎｅｕＴにハイブリダイゼーシヨンする場合に比べ、ｐＳＶ２ｎｅｕＮ に対し約１０倍強くハイブリダイゼーシヨンした。それとは対照的に、トランスフオーム型アリル由来の配列をもつ核酸は、同じ比率で優先的にｐＳＶ２ｎｅｕＴ とハイブリダイゼーシヨンした。ＤＮＡは、上述の４つの独立な活性型ｎｅｕガン遺伝子をもつたトランスフエクタントから単離され、ＨｉｎｄＩＩＩで切断した。それにより生じた断片を１％アガロースゲルで分離した。このアガロースゲルを、第４図で示される、上述のクローン化されたＤＮＡの分析で用いられたものと同一の条件下でインキユベーシヨンした。ＤＨＦＲ Ｇ８からのＤＮＡは、正常のゲノムｎｅｕ遺伝子をゲノムあたり約５０コピー含んでおり、対照として含まれている。第５Ａ図は、トランスフエクタントＤＮＡと野生型配列に対応する核酸とのハイブリダイゼーシヨンを示している。ＤＨＦＲ Ｇ８ ＤＮＡに強いシグナルが現れ、これは導入された正常型ｎｅｕ遺伝子のものである（レーンｂ）。ｎｅｕでトランスフオームしたトランスフエクタントＤＮＡ（レーンｃ−ｆ）および、トランスフエクシヨンしていないＮＩＴ ３Ｔ３細胞（レーンａ）を含むレーンに有意な弱いシグナルがみられた。第５Ｂ図は、変異配列を含む核酸をプローブとして、同じゲルについてハイブリダイゼーシヨンを行つた結果を示している。ＤＨＦＲ Ｇ８ ＤＮＡはこのプローブとわずかに弱く反応したが（レーンｂ）、ｎｅｕによりトランスフオームしたトランスフエクタントＤＮＡ（レーンｃからｆ）は、いずれもこのプローブにより強いシグナルを生じた。レーンｄに示されているトランスフエクタントＤＮＡは、トランスフオームに用いた遺伝子の３′末端が欠けているために、他のトランスフエクタントよりも小さいｎｅｕ−相同ＨｉｎｄＩＩＩ断片をもつている。野生型のプローブとトランスフエクタントとの反応性の低さは、同じプローブを用いたクローン化ｐＳＶ２ｎｅｕＴの分析の際に見られるシグナルと同程度であるため、（第４図のレーンｂとｄを、第５Ａ図および第５Ｂ図にあるレーンｃ−ｆと比較のこと）このプローブの交差反応性に起因するものであろう。ＤＮＡのロード量とトランスフエクタントのコピー数によるシグナル強度の違いを調節するために、５Ｂのゲルからプローブをはがし、ｎｅｕ遺伝子の異なる部分由来の核酸プローブを用いて再びハイブリダイゼーシヨンを行つた。トランスフエクタント細胞系列はトランスフエクシヨンの際の種々の増幅により、異なるコピー数のラツトｎｅｕ遺伝子を含んでいるかもしれない。このハイブリダイゼーシヨンの結果は第５Ｃ図に示されている。第５Ａ図、第５Ｂ図、第５Ｃ図において、それぞれ対応するレーンを比較すると、全てのｎｅｕガン遺伝子トランスフエクタントは、野生型プローブに比べ変異型プローブと強いハイブリダイゼーシヨンを示し、変異型プローブとそれらのハイブリダイゼーシヨンの程度は、種々のＤＮＡ中に存在するｎｅｕ遺伝子のコピー数と良い相関を見せることが判る。このデータは、調べられた活性型ｎｅｕ遺伝子は、全て同一のヌクレオチドの位置で改変をもつていることを強く示唆するにもかかわらず、全ての例において変異が同一のＴからＡへの転換を含んでいるのかは明かではなかつた。ＴからＧへの転換は、それにより野生型核酸とＡ／Ｇのミスマツチを生じ、変異型核酸とは比較的安定なＧ／Ｔミスマツチを生ずるために、おそらく同じハイブリダイゼーシヨンのパターンを与えるだろう。この可能性を調べるため、第４図に示される配列をもつた第３の２０−ｍｅｒを合成した。この核酸は、第５Ａ図で分析したゲルから初めに用いたプローブを除去した後に、このゲルとハイブリダイゼーシヨン条件下でインキユベーシヨンした。この核酸は、厳しい条件下ではトランスフエクタントＤＮＡと優先的にハイブリダイゼーシヨンしなかつた（第５Ｄ図）。したがつて、これらの活性型ｎｅｕ遺伝子それぞれにおける改変は、おそらく同じＴからＡへの転換であろう。点突然変異は腫瘍形成時に生じ、そのため、ラツトゲノムに最初から存在していた多型性、あるいはトランスフエクシヨン過程における活性化を反映しているわけではないこともまた確証された。ＤＮＡは、ＢＤＩＸラツト肝および、ＢＤＩＸラツトに由来し、トランスフエクシヨンアツセイにおいて活性型ｎｅｕ遺伝子を与える４種のラツト腫瘍細胞系列から単離された。２連でゲルを作成し、野生型核酸あるいは変異型核酸いずれかをプローブとして用いた（第６図）。ＢＤＩＸ肝ＤＮＡは野生型核酸と良く反応したが、変異型核酸とは反応しない（第６図、レーンａとｆ）。これとは対照的に、４つの腫瘍細胞系列は変異型核酸とのみ反応した（第６図、レーンｂ−ｅおよびｉ−ｌ）。このことは、ヌクレオチド２０１２でのＴからＡへの転換は、腫瘍あるいは腫瘍細胞系列の生成時に生起したことを示している。また、腫瘍細胞系列は、ｎｅｕ遺伝子の活性型アリルに関してヘミ接合あるいはホモ接合型のようである。正常型アリルの欠失が腫瘍形成時あるいは、腫瘍細胞系列の途上で起こるのかも知れない。正常型ｒａｓアリルの同じ様な欠失あるいは発現の低下はこれらのｒａｓ遺伝子の発ガン型を含むいくつかの腫瘍、および腫瘍細胞系列で観察されている。カボンらＮａｔｕｒｅ，３０４：５０７−５１３（１９８３）：ジエレロ，ＩらＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ ｔｈｅ ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：７８１０−７８１４（１９８５）。
【００２８】
ｎｅｕの多様な独立の活性化
見かけ上ランダムに作用する試薬により刺激することによる化学的発ガンは、それにより生じた腫瘍細胞中に特異的な遺伝的変化をしばしばもたらす。ｎｅｕは、分析されたトランスフオーム型ｎｅｕアリルの４種それぞれにおいて、同一のヌクレオチドの変化によつて活性化されているようである。これらのアリルはそれぞれ、アルキル化試薬であるエチルニトロソウレアを胎盤経由で与えることにより生じた、神経芽細胞腫あるいはグリア芽細胞腫から単離された。シユバート，Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，２４９：２２４−２２７（１９７４）。ｎｅｕは、関連したアルキル化試薬メチルニトロソウレアによつて生じた、４種の独立の神経系腫瘍においても同じ残基で活性化されている。メチルニトロソウレアによる、Ｂｕｆ／Ｎラツトにおける乳ガンの生起に関する、同じ様な広範な研究により、約１００例の独立に生起した腫瘍にはすべて、残基３５で同一のＧからＡへの転換によつて活性化されたＨ−ｒａｓ発ガン遺伝子が含まれていることが示されている。スクマー，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３０６：６５８−６６１（１９８３）；ザーブル，Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３１５：３８２−３８５（１９８５）。活性化の特異性に関するそのほかの例には、遺伝的に感受性のＳｅｎｃａｒマウスにおける、ジメチルベンザトラセンにより誘導された乳頭腫が活性型Ｈ−ｒａｓ遺伝子を有していることや、ガンマ線照射あるいはメチルニトロソウレアにより誘導される胸腺リンパ腫が、それぞれトランスフエクシヨン能をもつＫ−ｒａｓおよびＮ−ｒａｓを生ずるなどの例が含まれている。バルメイン，ＡとＩ．Ａ．プラグネル、Ｎａｔｕｒｅ，３０３：７２−７４（１９８３）；グレロ，Ｉ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：２０２−２０５（１９８４）。前者で検出されるＫ−ｒａｓ発ガン遺伝子は調べた４つの腫瘍のうち少なくとも３つにおいて同じ活性型変異を有しているようである。異なる条件下での、同じ変異誘起剤、つまりメチルニトロソウレアの投与が、乳腺腫瘍ではＨ−ｒａｓを特異的に活性化し、胸腺リンパ腫ではＮ−ｒａｓを、神経外胚葉腫ではｎｅｕを特異的に活性化する点は興味深い。グレロ，Ｉ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２５：１１５９−１１６２（１９８４）。これらの腫瘍をそれぞれ誘導する催奇剤は、はじめ、細胞のＤＮＡに広範な損傷を与えるはずである。しかし、最終的に検出される変異は極めて特異的である。明らかに、多段階のガン化過程において、強力な生物学的な圧力が、確立した腫瘍中で観察される遺伝的損傷を坦つた細胞の成長に選択的に働くはずである。細胞内の遺伝子のわずかな部分のみが生物学的に活性な発ガン遺伝子に転換され得るようである。これらの遺伝子のひとつでは、多くの可能な変異のいくつかのみがトランスフオーム活性をもつた発ガン遺伝子を生ずる。発ガン遺伝子を生ずる相対的にまれな変異は、まず腫瘍に対し選択的な優位性をもつていなくてはならないために、また後に、フオーカス形成アツセイにおいて検出され得るために濃縮されるのである。ひとつの腫瘍型における特異的な損傷が繰り返し現れることにより、可能な活性型変異の間で他の選択���も存在することが示唆される。活性型変異の性質は、催奇剤の化学的反応性によつて強い影響を受ける。例えば、胸腺腫を誘起するために用いられた異なる変異誘起剤は、生じた腫瘍において異なる遺伝子の活性化を引き起こす。同様に、ジメチルベンズアントラセンによつて誘起された乳ガンは、メチルニトロソウレアによつて誘起されたものとは異なる特異的な改変を含んでいる。前述の神経芽細胞腫を誘起する薬剤である、エチルニトロソウレアの反応性はＤＮＡに多数の異なる副次的障害を形成させる。シンガー，Ｂ．とＪ．Ｔ．カスマーレク、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５２：６５５−６９３（１９８２）。これらのうち、ＧからＡへの転移を起こす障害については、詳しい記載がなされている。ラジユースキー，Ｍ．Ｆ．，Ｒｅｃｅｎｔ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８４：６３−７６（１９８３）。 こういつた変異は、関連した催奇剤であるメチルニトロソウレアによつて誘起された乳ガンの、Ｈ−ｒａｓ発ガン遺伝子中の活性型障害として繰り返し見いだされている。ザーブル，Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３１５：３８２−３８５（１９８５）。しかし、ここで述べている変異はＴからＡへの転換であり、その生起は、これらのアルキル化剤の投与の後に形成される多くの別の損傷を含む、他の機構によつて説明されねばならない。この種の変異は先例がないわけではない：生殖系列の変異誘起処理後に単離された、他の２つのエチルニトロソウレアによつて生じた変異もまた、ＴからＡへの転換であることが示されている。ポツプ，Ｒ．Ａ．ら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０５：１５７−１６７（１９８３）；ルイス，Ｓ．Ｅ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：５８２９−５８３１（１９８５）。メチルニトロソウレアによつて誘導されたリンパ腫から単離したＮ−ｒａｓ発ガン遺伝子は、ＣからＡへの転換によつて活性化されていることが見いだされており、これは、アルキル化剤によつて誘起されるいくつかの異なる付随的障害が、変異を起こし得ることを示唆している。グレロ，Ｉ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：７８１０−７８１４（１９８５）。
【００２９】
実 施 例 ４：核酸プローブを用いたｎｅｕ発ガン遺伝子の検出
Ａ．ｎｅｕ遺伝子に相同な核酸プローブを用いたバツフアロー・ラツト由来の腫瘍ＤＮＡに関する検討
スクマーとバーバシツド（米国国立ガン研究所、ベセスダ）は、活性型ｎｅｕ遺伝子を含む１０種のメチルニトロソウレアによつて誘起された述経系腫瘍を単離した。これらの腫瘍ＤＮＡから得られたトランスフエクタントは、これらのｎｅｕ遺伝子中の変異が、すでに記載のある腫瘍で見つかるものと同じであるか決定するために検定された。これは以下のようにして行われた；１０種の独立な活性型ｎｅｕ遺伝子を含む１４のトランスフエクタントが第７図に示されている（トラツク１−１４）。ゲルを２連で作成し、上述の核酸プローブにより検索した。すなわち、それらは、正常型（第７図、上）あるいはトランスフオーム型遺伝子に相当する核酸（第７図、下）により検索された。ＮＩＨ ＤＮＡ（トラツクＮ）、ＤＨＦＲＧ８ ＤＮＡ（トラツクＧ）（高コピーの正常型ｎｅｕ遺伝子）、Ｂ１０４−１−１ ＤＮＡ （トラツクＢ）（高コピーのトランスフオーム型ｎｅｕ遺伝子）および、活性型ｎｅｕ遺伝子を含まない２つのバツフアロー・ラツト腫瘍（トラツクｃ１とｃ２）が対照として含まれていた。トランスフエクシヨンされたｎｅｕ遺伝子は全て、上述のトランスフオーム型ｎｅｕｃＤＮＡクローンが取られた細胞系列である、Ｂ１０４−１−１ ＤＮＡ と同じ改変をもつていた。トランスフオーム型遺伝子に対応した核酸に対するハイブリダイゼーシヨンの違いに基づいて、トランスフエクシヨンしたｎｅｕ遺伝子は、Ｂ１０４−１−１ ｎｅｕ遺伝子と同じ配列の変化を有していると推定される。これらの結果は、この核酸によつて検出される活性型ｎｅｕ遺伝子に関する、１０種の独立な事例を与えるものであり；第２の変異誘起剤であるメチルニトロソウレアが、エチルニトロソウレアと同様な機作でこの位置においてｎｅｕ遺伝子を活性化に導いたことを示し；活性型ｎｅｕ遺伝子がＢＤＩＸラツトと同様に、バツフアロー・ラツトにおいても生じることを示している。
【００３０】
Ｂ．オリゴヌクレオチドによる変異導入
オリゴヌクレオチドによる変異導入は、通常アミノ酸の第６６４番目に見いだされるバリン残基をグルタミン残基に置換するために用いられた。この変異ｎｅｕ遺伝子を発現ベクターに挿入し、受容細胞にトランスフエクシヨンあるいは感染させると、生じた安定な細胞系列は１００％ガン化した。（それとは対照的に、アミノ酸第６６４番目にバリン残基を含むタンパク質をコードする正常型ｎｅｕ遺伝子（ガン原遺伝子）でトランスフオームした受容細胞は、０．１％がガン化しただけである。）したがつて、グルタミン酸と同様に、第６６４番目のグルタミンもまたトランスフオーム型ｎｅｕ遺伝子を生じ、グルタミンを認識する核酸プローブで検出される変異は、トランスフオーム型変異であることが予想される。第６６４番目におけるアスパラギン酸への置換は、ガン化していない細胞へトランスフエクシヨンあるいは感染することにより、受容細胞の２−３％にガン化した形質を生ずる。これは、ガン化を生起するためには、その変異と共に、過剰発現を伴わねばならないような弱いトランスフオーム型のｎｅｕ遺伝子アリルを表していると考えられる。
【００３１】
Ｃ．ヒトｎｅｕ遺伝子における活性型変異の同定
すでに記載された実験と同様に、この点に関する議論は、ラツトｎｅｕ発ガン遺伝子の活性化の原因となる点突然変異に関連しているが、ヒト腫瘍細胞ＤＮＡにある、それに相当するヒトｎｅｕ遺伝子における活性型変異の同定と、ｎｅｕ発ガン遺伝子（あるいは、それに相当するガン原遺伝子）の存在の検出に同様な研究法を用いることは可能である。例えば、ラツトｎｅｕ発ガン遺伝子の活性化の原因である点突然変異を含むことが示されている領域に相当する、ヒトｎｅｕ遺伝子の領域と特異的に反応する核酸プローブを構築することが可能である。構築可能なプローブの例としては、ｎｅｕ発ガン遺伝子とそのガン原遺伝子の間で異なる、１ヌクレオチドに基づいたものであり、この１ヌクレオチドの改変は、ｎｅｕガン原遺伝子を活性型発ガン遺伝子に転換する原因である。これらのプローブは、どのような長さのものも可能であるが、一般に１５から２０ヌクレオチド長であり、ラツトｎｅｕ発ガン遺伝子について上述されたように、腫瘍細胞ゲノムを分析し、ｎｅｕ発ガン遺伝子中に損傷（変異）があるかを決定し、またその正確な配置を決定するために用いることができる。
【００３２】
Ｄ．ｎｅｕ発ガン遺伝子の存在の検出ｎｅｕ
ガン原遺伝子からｎｅｕ発ガン遺伝子への変異を引き起こすガン化を検出するためのアツセイは、ガン原遺伝子あるいは発ガン遺伝子中に存在し、他のものには存在しない（あるいは転写される）ヌクレオチド配列に対し特異的な、標識された核酸を用いることからなるものである。ヒト細胞におけるガン化のアツセイは、検定する細胞からＤＮＡを単離し、このＤＮＡを、発ガンあるいはガン原遺伝子のＤＮＡ配列のいずれかに特異的な、標識したポリヌクレオチドプローブと接触させ、その後、どちらのプローブがＤＮＡにハイブリダイゼーシヨンしたかを決定することによつて行うことができる。放射性同位体により標識すると、これらのプローブは、例えば点突然変異の生起などについて、腫瘍細胞ＤＮＡを検定するためのサザンブロツト法に用いることができる。このタイプのアツセイは、ヒト腫瘍ＤＮＡ中で活性化されている発ガン遺伝子の性質を決定するための診断法として、臨床的に用いることができる。このアツセイ法は、ｎｅｕ族遺伝子の１ヌクレオチドの改変を検出することができ、アツセイされる腫瘍細胞に関して極めて決定的な情報を供給することができるため、非常に特異的なものとなるだろう。これらのプローブを用いるための試薬は、キツトに収めることが可能である。したがつて、キツトは、プローブに加え１種以上の緩衝液、プローブの標識試薬および、サザンあるいは他のブロツトに用いる試薬などを含むだろう。発ガン遺伝子によりコードされる産物から、ガン原遺伝子によつてコードされる産物タンパク質のアミノ酸配列へ変化するために、特異的な血清試薬によつてもそれぞれを検出することが可能である。この血清試薬は、タンパク質のこの部位において、正常型のｎｅｕガン原遺伝子に特定されるアミノ酸配列に特異的なものか、あるいはタンパク質のこの部位において、改変された発ガン遺伝子を特定するアミノ酸配列に特異的なものを用いることができる。改変されていないタンパク質の領域と反応し、その結果、コードされたタンパク質の正常型あるいは異常型と反応できるような、他の血清学的試薬も用いることができる。クローニング技術を用いることにより、ガン原遺伝子の正常な部位、あるいは発ガン遺伝子の改変された部位によつてコードされる、有意な量のタンパク質を単離することができる。このような部分的タンパク質は、通常の抗体生産法によつて抗体を生産するために用いることができる。したがつて、ポリクローナル抗体を生産するために、このようなタンパク質が、ウサギあるいはラツトなどの宿主を免疫するために用いられ、このタンパク質に対する抗体は宿主から得られる血清から回収されるだろう。別の用法としては、ハイブリドーマ細胞を形成する典型的な細胞融合法により、単離された遺伝子部分によつて産生されるタンパク質に対する抗体を生産する細胞を用いることによつて、モノクローナル抗体を生産することができる。基本的には、これらの技術は、抗体産生細胞を不死性を有するミエローマ細胞などと融合し、不死性と求められる抗体（この場合、単離された遺伝子部分によつてコードされる、正常型あるいは改変型タンパク質部分に対する抗体）を産生することのできる融合雑種細胞を与えることを含んでいる。この雑種細胞は、次に抗体産生を促す条件下で培養され、その後、抗体は細胞培養液から回収される。モノクローナル抗体産生のためのこのような技術は、文献に詳しく記載されている。参照するものとしては、例えば、ヒラリー・コプロウスキーらによつて提出された、米国特許第４，１７２，１２４号明細書および第４，１９６，２６５号明細書などがあり、これから得られた点については参考文献に加えられている。
【００３３】
実 施 例 ５：ヒトｎｅｕ遺伝子のクローニング
ヒトｎｅｕ遺伝子は、高レベルのｎｅｕＲＮＡを発現している２つの頸部ガン細胞系列（ＳＷ１７１０、ＭＥ１８０）のｐｏｌｙ Ａ＋ ＲＮＡ由来のラムダｇｔ１１ ｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた。ラツトｎｅｕチロシンキナーゼドメインの１３００ｂｐ Ｐｓｔ Ｉ断片を、ＳＷ１７１０ｃＤＮＡライブラリーを検索するためにプローブとして用いた。２つの組換え体プラークが、制限酵素部位の分析と部分的な配列決定により、ヒトｎｅｕとして同定された。組換え体配列は、ヌクレオチド８４９から始まり、ｎｅｕタンパク質のはじめの２２５から１２５５アミノ酸全てをコードしている。ヒトｎｅｕ遺伝子の、この欠けた領域は、ＳＷ１７１０ ｎｅｕ ｃＤＮＡクローンの５′Ｅｃｏ ＲＩ断片をプローブとして用いて、ＭＥ１８０ ｃＤＮＡライブラリーから単離された。この２つのクローンの、サブクローニングされた領域とヒトｎｅｕ遺伝子の全長の構成を表した図は、第８図に示されている。
【００３４】
Ａ． ｎｅｕ発現ベクターの構築
ｎｅｕをコードする全配列を、発現ベクターｐＬＪ（ロバートら、１９８５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５６：４０４−４１３）および、ｐＭａｘ（無条件でバーナード・マシユー−プレボツトから譲り受けた、第９図に示されている）にクローニングした。これらのベクターはどちらも、ｎｅｕ遺伝子をモロニー・ミユーリン・白血病ウイルスプロモーターおよびエンハンサー（ＬＴＲ）による転写調節下に置いている。ｐＬＪベクターでは、ＳＶ４０プロモーターからｎｅｏRも発現されている。
【００３５】
Ｂ．膜貫通領域の点突然変異の構築
オリゴによる変異の導入は、アマシヤム社のサイトーデイレクテツド・ミユータゲネシス・キツトを用い、以下のオリゴヌクレオチドを用いて、キツトの指示にしたがつて行い、ＣＴＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＧＣＡＴＴＣＴＧこの中で、下線を施したヌクレオチドは正常型ヒトｎｅｕアリルと異なるものである。点突然変異の存在は、デイフアレンシヤル・ハイブリダイゼーシヨンおよび、プロメガ社の２重鎖配列決定キツトを用い、キツトの指示にしたがつて配列を分析することによつて決定された。
【００３６】
Ｃ．短縮されたｎｅｕアリルの構築
ｐＭαｘベクターは、第９図に示されるように、ポリリンカーに唯一の切断部位を有するＮｃｏ Ｉにより切断し、クレノーにより末端を埋めて平滑末端とした。ＣＡＴＧＣＡＴＣＧＡＴＣ の配列をもつ１２塩基対のＳｐｈ Ｉリンカー（Ｎ．Ｅ．Ｂ＃１１１５）をこの部位に挿入し、ポリリンカー中に唯一のＰｐｈＩ部位を導入した。この特定のリンカーは、３つの読み枠全てに翻訳開始シグナル（ＡＴＧ）を与えるために選ばれた。これによつて生じたベクターは、ｐＭａｘ−Ｓｐｈとして第９図に示されている。ｐＭａｘ−Ｓｐｈは、Ｓｐｈ−Ｉ部位とＸｈｏ Ｉ部位（いずれもポリリンカー内）で切断された。遺伝子のまさに５′の膜貫通領域から、３′末端のｎｅｕ ｃＤＮＡを含む、２２２５塩基対のＳｐｈ Ｉ／ＳａｌＩ断片が、ヒトｎｅｕ ｃＤＮＡ全体を含むプラスミド（第９図ではｐＡｂＴ５６５として示されている）から単離された。制限酵素によつて切断されたベクターおよび単離された断片は、ライゲーシヨンされ、バクテリア株ＨＢ１０１にトランスフオーメーシヨンされた。これにより生じたプラスミドは第９図に示されており、ｐＭαｘデルタｎｅｕあるいはｐＡｂＴ５０１１と呼ばれている。
【００３７】
Ｄ．細胞のトランスフエクシヨン
ｎｅｕを発現するベクターは、通常のリン酸カルシウム法によつてＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフエクシヨンされた。簡単に述べると、第１日目は、細胞を１０ｃｍの組織培養皿当たり、５×１０5プレーテイングする。２日目は、細胞に再び栄養を与え、４時間後にＤＮＡの沈澱を加え、細胞を６時間インキユベーシヨンし、再度栄養を与える。後日、細胞をＧ４１８を含む培地に分配し、１０−１４時間インキユベーシヨンする。ＮＩＨ３Ｔ３ＤＮＡをキヤリアーとして用い、ｐＳＶ−２ ｎｅｏ を選択マーカーとして用いた。
【００３８】
Ｅ．ＲＮＡの単離
細胞の全ＲＮＡは、グアニジウム・イソチオシアネート／ＣｓＣｌ法により単離された。培養中の細胞からＲＮＡを単離する際には、溶解緩衝液（４Ｍグアニジウム・イソチオシアネート、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ザルコシル、０．１Ｍ ＢＭＥ）を組織培養皿に直接加えた。凍結組織を開始材料とするときは、組織を溶解緩衝液中で、組織ホモジナイザー（バイオスペツク・プロダクツ ＩＮＣ．）によつて直接ホモジナイズした。次に、細胞溶解液を１８ゲージの注射針に通し、ＳＷ５０．１ベツクマン・ポリアロマー・チユーブに作成した１．２ｍｌの５．７Ｍ ＣｓＣｌ、０．１Ｍ ＥＤＴＡ溶液上に重層した。これを、３５，０００ｒｐｍで最低１２時間遠心する。つぎに、ＲＮＡペレツトを１％ＳＤＳを含むＴＥに再溶解する。
【００３９】
Ｆ．ハイブリダイゼーシヨンプローブ
細胞外ドメインの一部と、膜貫通ドメインおよびチロシン・キナーゼドメインのわずかな部分を含む１．６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、第１０図に示されるように、プロメガ社のｐＧＥＭデユアル・トランスクリプシヨン・ベクターにサブクローニングした。ハイブリダイゼーシヨンに用いるための標識したＲＮＡ転写物は、プロメガ社の指示にしたがつて作成した。
【００４０】
Ｇ．ＲＮＡスロツト・ブロツト分析
ＲＮＡ試料は、６×ＳＳＣ、７．４％ホルムアミドにより１μｇ／ｍｌに希釈され、６５℃で１５分間加熱し、その後氷上に置かれた。スロツト・ブロツトは、ＳＳＳスロツト・ブロツト装置と、制作社の指示にしたがつて供給されているプレカツトＢＡ ８５ニトロセルロース・シートを用いて行われた。フイルターは、あらかじめ水、次に１０×ＳＳＣで浸潤させ、２００μｌの容量において、２００ｎｇ／スロツトから開始して、２倍希釈系列としてＲＮＡを加えた。スロツトを次に２００μｌの１０×ＳＳＣで洗い、フイルターを真空オーブン中、８０℃で２時間加熱した。次に、このフイルターを１０×ＳＳＣで浸潤させ、ハイブリダイゼーシヨン緩衝液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム、２５０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルト）中で２時間プレハイブリダイゼーシヨンを行つた。次に、ハイブリダイゼーシヨン溶液をヒトｎｅｕに特異的な、１−２×１０6ｃｍｐ／ｍｌの、変性させた32Ｐ標識ＲＮＡプローブを含む新しい溶液と交換した。このフイルターを次に、６５℃で一晩インキユベーシヨンした。翌朝、このフイルターを、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、８０℃、２０分間、３回洗つた。
【００４１】
Ｈ．ヒトｎｅｕアリルのクローニングとトランスフオーム活性試験
高レベルのｎｅｕＲＮＡを発現する頸部ガン細胞系列から作成された２つのｃＤＮＡライブラリーは、ラツトｎｅｕｃＤＮＡのチロシン・キナーゼドメイン由来のプローブによりスクリーニングされた。制限酵素地図および、部分的な配列データと発表されたデータとの比較から、このスクリーニングから単離された、もともとのクローンから構築された、本来のヒトｎｅｕクローンの同一性が確証された。このヒトｎｅｕｃＤＮＡは、つぎにＬＴＲにより発現されるベクターに移された。このヒトｎｅｕコンストラクトによりトランスフエクシヨンされた細胞は、ヒト乳ガン細胞系列ＳＫＢＲ−３によつて発現されたヒトの本来のｎｅｕと区別できない、１８５，０００Ｄａのタンパク質を発現した。この正常型ヒトｎｅｕクローン（第１０図に示されるｐＭａｘ ｎｅｕ）をＮＩＨ ３Ｔ３細胞にトランスフエクシヨンすると、それらはガン化した。これは、ラツトｎｅｕ遺伝子について記載されたデータと完全に対照的なものである。ラツトでは、発現レベルにかかわらず、正常型ラツトｎｅｕアリルはトランスフオーム活性をもたなかつた。これより低いレベルでｎｅｕを発現する、他の発現ベクターにおける正常型ヒトｎｅｕ遺伝子の発現は、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞にガン化を引き起こさなかつた。しかし、もし、ヒトｎｅｕ遺伝子が、ラツトにおいてグルタミン酸に転換されたバリンと相同なアミノ酸に変異を生じたなら、この遺伝子はどの発現ベクターにおいても細胞をガン化するだろう。短縮したヒトｎｅｕアリルをどちらかの発現ベクターにより発現すると、これもまたＮＩＨ ３Ｔ３細胞をガン化する。これらの結果は、デイ・フイオリら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７；２３７：１７８−１８２によつて報告されたものと一致する。要約すると、正常型ｎｅｕに関してはより高い発現レベルが必要とされるが、正常型および変異型ヒトｎｅｕアリルはいずれも、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞をガン化することができる。
【００４２】
Ｉ．ヒト細胞系列および乳ガンにおけるｎｅｕＲＮＡレベルの分析
細胞の全ＲＮＡは、グアニジウム・イソチオシアネート法により、種々のヒト細胞系列および乳ガンから単離された。次に、ＲＮＡをヒトｎｅｕに特異的なプローブ、すなわち、細胞外ドメインの一部、膜貫通ドメインおよびチロシン・キナーゼドメインの一部を含む１．６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を用いたスロツト・ブロツト分析にかけた。また、全てのＲＮＡ試料は、フイルター上にあるＲＮＡ量を補正するために、アルフア・チユーブリンを用いてハイブリダイゼーシヨンした。ヒト乳細胞系列ＨＢＬ１００（ＡＴＣＣ ＨＴＢ １２４）は、対照として用いられ、全ての結果は、ＨＢＬ１００との相対的なレベルを表している。Ｅ．ガフニー、Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．，２２９：５６３−５６８（１９８２）。ｎｅｕの発現レベルは、ＨＢＬ１００のレベルの１から６４倍まで変動した。これらの結果は第１表に示されている。
【００４３】
【表１】
2004043486.tif 000002
ＨＢＬ−１００は、授乳期の母親の母乳由来の上皮細胞系列である。ＭＥ１８０は、頸部ガン細胞系列である。ＳＷ１７１０は、頸部ガン細胞系列である。ＭＫＮ−７は、腸ガン細胞系列である。ＳＫ−ＢＲ−３は、胸部の腺腫である。Ａ−４３１は、上皮性ガン細胞系列である。ＢＴ−４８３は、胸部の輸送管腫である。１８−３−７は、ｎｅｕでトランスフエクシヨンしたＮＩＨ３Ｔ３細胞である。この結果は、すでに発表されている結果（クラウスら、ＥＭＢＯ，１９８７；６：６０５−６１０）と同様であつた。われわれはまた、ヒトの一連の初期乳ガンにおけるｎｅｕのＲＮＡレベルも分析した。われわれは再び、第２表に示されるように、対照の１から１２８倍の範囲にわたる広範なｎｅｕの発現レベルを見いだした。
【００４４】
【表２】
2004043486.tif 000003
ハイブリダイゼーシヨンの結果は、32Ｐ ｎｅｕプローブを用いたドツト・ブロツトハイブリダイゼーションにおける、全細胞ＲＮＡの連続的希釈を用いて決定した。数値は、チユーブリンプローブを用いたハイブリダイゼーシヨンにより、全ＲＮＡ量に対して補正を施した。レベルは、正常な乳細胞系列ＨＢＬ−１００を１倍とした相対値である。上述のように、レベルはＨＢＬ−１００に対する相対値で表され、チユーブリンの発現に関して補正されている。
【００４５】
実 施 例 ６．：ｎｅｕ特異的モノクローナル抗体の作製
Ａ．ハイブリドーマの作製
後に記すハイブリドーマは、ｎｅｕ癌遺伝子にコードされた全長のタンパク質を発現している生細胞（後に記す１８−３−７細胞系統）を用いてマウスを免疫処理することにより得られた。このことはモノクローナル抗体産生に関して、他のアプローチとは重要な違いである。生細胞により提示された全長タンパク質を免疫原として用いることで、そのタンパク質の細胞質外ドメインの全体に及ぶ特異性をもつモノクローナル抗体を収集することができるのである。このことは、もとのタンパク質から、限られた数のエピトープしか、提示できず、それ故に限られた特異性の免疫反応を上げるという、ペプチドの免疫原や、原核生物のシステムにより作られた短いポリペプチドを用いるのとは反対のものである。更にタンパク質の抗原を本来の状態で提示することにより、その免疫システムは、後にその抗体を診断あるいは治療上の応用に用いる時に見られるであろうものと非常によく似た抗原とも反応してくれることだろう。
【００４６】
Ｂ．１８−３−７細胞の作製
１８−３−７細胞は、ヒト乳癌細胞系統のＳＫＢＲ−３と同じかそれ以上の水準で、全長の通常のヒトｎｅｕを発現しているトランスフエクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞系統である。ヒトｎｅｕ遺伝子はネズミ白血病ウイルスＬＴＲ（プロモーター及びエンハンサー）によつて発現している。この細胞系統は形質転換されたＮＩＨ３Ｔ３細胞の全ての特徴を示す。それは、軟寒天でも成長し、ヌード・マウス（ｎｕｄｅ ｍｏｕｓｅ）で腫瘍を形成するし、変わつた形態学的特徴も示す。この細胞系統を、抗ｎｅｕ特異的モノクローナル抗体の単離のための免疫原として用いた。ｐＬＪレトロウイルスのベクター（ｐＬＪ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ　ｖｅｃｔｏｒ）を改変して、ポリオーマ（Ｐｏｌｙｏｍａ）の初期領城を取り除くことで、ｐＬＪ ベクターの内因的な形質転換活性を排除した。改変したベクターの構成を図１１に示す。改変は、ｐＬＪをＡｐａＩで制限酵素処理して、６３００塩基対の断片を分離して、それをＴ4リガーゼ（Ｔ4 ｌｉｇａｓｅ）で再び環状にすることでなされた。その結果できたプラスミド（ｐデルタＬＪ＝ｐΔＬＪもしくはＡｂＴ５００９；図１１参照）を唯一のＢａｍＨＩ サイトで分解し、クレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）でフイル・イン（ｆｉｌｌｉｎ）して、ヒトｎｅｕタンパク質のコーデイング領域全体をもつＮｃｏ Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩをフイル・インした断片とライゲーシヨンさせた。その結果できたプラスミド（ｐΔＬＪｎｅｕもしくはｐＡｂＴ５７７；図１１参照）をカルシウムリン酸−沈澱法によりＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフエクトした。トランスフエクトされた細胞をＧ４１８（ｐΔＬＪはＳＶ４０でプロモートされるネオマイシン耐性遺伝子（ＳＶ４０ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｎｅｏR）を持つている）で選択した。そのコロン−をＲＮＡドツトブロツト（ＲＮＡ ｄｏｔｂｌｏｔｓ）によりｎｅｕ発現性に対し、スクリーニングにかけた。１８−３−７はスクリーニングしたおよそ５０のうちで最も高い発現細胞の１つであつた。
【００４７】
Ｃ．マウスの免疫処理
一匹あたり、１．４×１０6のＮＩＨ３Ｔ３生細胞を用いて、雌バルブ・シーマウス（Ｂａｌｂ／ｃ ｍｏｕｓｅ）の成体２匹を腹膜組織内で（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ＝Ｉ．Ｐ．）免疫処理した。これに続き、すぐにシクロホスフアミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）水溶液（３０ｍｇ／ｋｇＨ2Ｏ）をＩ．Ｐ．に注射した。シクロホスフアミド処理は最初の注射から２４、４８時間後にくり返された。免疫処理後１４日目に、１．５×１０6の１８−３−７生細胞をマウスにＩ．Ｐ．で注射した。更に１４日間休ませた後、再び、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、シクロホスフアミドそして１８−３−７細胞の注射という一連の操作をくり返した。２回目の１８−３−７細胞の注射後４日後にその動物は犠牲にされ、その脾臓が、最初の融合用に採られた。これとはまた別に、４匹の雌バルブ・シーマウスと４匹の雌のＣＢ６（Ｂａｌｂ／ｃ×Ｃ５７ＢＬ／６）マウスを用いて初めのラウンドは一匹あたり１．８×１０6のＮＩＢ３Ｔ３細胞、４．８×１０6の１８−３−７細胞を２回目では８．５×１０6のＮＩＨ３Ｔ３細胞、２．７×１０6の１８−３−７細胞を免疫処理に用いて、全く同じ実験を行なつた。
【００４８】
Ｄ．ハイブリドーマの方法論
ハイブリドーマは、免疫処理されたマウスからの細胞をＳＰ２／０骨髄腫細胞（ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌ）とをポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ＝ＰＥＧ）法に従つて融合させることにより作られた。脾臓を免疫処理したマウスから無菌的に採取して、脾臓を無血清培地（ＤＭＥ）で培養することにより、脾臓細胞の単一細胞懸濁液（ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）を得た。脾臓細胞とＳＰ２／０細胞（対数相（ｌｏｇｐｈａｓｅ）培養液より採取）を、脾臓細胞：骨髄腫細胞＝５：１の比でまぜあわせた。それを２００×ｇで４℃にて１０分間遠心して上清を吸引により取り除いた。チユーブの底を軽くたたくことで、細胞のペレツトを緩めた後、１ｍｌの滅菌した３７℃の１０％ ＰＥＧ／ＤＭＥ 溶液を一滴ずつ加えた。１．５分以上の間隔で、ＰＥＧを加えながら、チユーブを穏やかに振つた（ｓｗｉｒｌ）。更に３７℃の無血清ＤＭＥ１０ｍｌを一滴ずつ加えて、その後、更に２０ｍｌの培地を加えた。それから懸濁液を２００×ｇで室温下１０分間遠心した。培地を吸引により、細胞のペレツトから取り除き、２０％の胎児ウシ血清、０．２ｍＭヒポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ）、０．４μＭアミノプテリン（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ）、０．０３２ｍＭチミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）の存在下で腹膜のマクロフアージを含む（２×１０4細胞／ｍｌ）培地（ＨＡＴ培地）を用いて、細胞のペレツトを再び懸濁した。（腹膜のマクロフアージは、融合して用いられる細胞に従つて、Ｂａｌｂ／ｃまたはＣＢ６の免疫処理をしていないマウスから得た。注射してすぐに無血清培地を安楽死させた動物の腹膜へ移すことで、こうした細胞が得られた。）融合後の細胞を（腹膜マクロフアージを含めないで）最終細胞濃度で５×１０5細胞／ｍｌに再び懸濁した。この細胞混合液の１ｍｌを２４ウエル・プレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）の各ウエル（ｗｅｌｌ）に分配した。
【００４９】
Ｅ．エライザ（ＥＬＩＳＡ）の手順と予備のスクリーニング
融合操作後、成長したハイブリドーマについて、１８−３−７細胞の細胞ライセート（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）上でエライザアツセイにより、抗ｎｅｕ抗体の分泌に対するスクリーニングを先ず行なつた。新しく採取した１８−３−７細胞を低張性の溶解緩衝液（１０ｍＭトリス、１０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）存在下で培養することにより、ライセートを調製し、その後トライトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を最終濃度１％になるように加えた。ＮＩＨ３Ｔ３細胞のライセートを負のコントロールとして用いるため、同様に調製した。マイクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ）（ヌンク，イムノプレートＩＩ；Ｎｕｎｃ，Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ ＩＩ）を、総タンパク質濃度５００μｇ／ｍｌなるライセート５０μｌを用いて室温で夜通しコートした。結合していない抗原を吸引して取り除いた後抗原でコートしたマイクロタイターウエル中のハイブリドーマの生コロニーから得た培養液の上清５０μｌをまずインキユベートすることから、エライザを行なつた。３７℃で３時間保温した後、洗浄緩衝液（０．５％ツイーン２０；Ｔｗｅｅｎ２０、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．６）で３回洗いそれから、ホースラデイツシユ ペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）で標識したヤギ抗マウスイムノグロブリン（Ｉｇ）Ｇ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭ（ＨＲＰ−ＧＡＭ−ＧＡＭ）５０μｌ と共に３７℃で１時間保温した。ウエルを洗浄緩衝液で再度、３回洗つて、更にテトラメチルベンジヂン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ＝ＴＭＢ）溶液を５０μｌ加えることでアツセイを展開した。この溶液は、ジメチルサルフオキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ＝ＤＭＳＯ）１ｍｌにＴＭＢ１０ｍｇを溶かし、その内１００μｌ をＴＭＢ緩衝液（０．１Ｍ酢酸ナトリウム；クエン酸でｐＨ６．０にしたもの）５ｍｌに、３％過酸化水素１０μｌと共に加えることで調製された。発色を５分間行ない、次いで２Ｎ硫酸（Ｈ2ＳＯ4）５０μｌを加えることで酵素反応を止めた。その結果現れた黄呈色の光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ　ｄｅｎｓｉｔｙ＝ＯＤ）をマイクロタイタープレートリーダー（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）で４５０ｎｍにて読んだ。ＮＩＨ３Ｔ３細胞でコートされたウエル上でよりも、１８−３−７細胞でコートされたウエル上の方が、黄発色が強いことで示されるように、正反応は培養液上清中に、ｎｅｕ癌遺伝子産物を認識する抗体があることを表していた。
【００５０】
Ｆ．ハイブリドーマのサブクローニング
最初のスクリーニングで正の結果を得たハイブリドーマを、限界希釈により広げてクローン化して、細胞及びその抗体を確実にモノクローナルなものとした。生後６週の免疫処理していないマウスから胸腺細胞を得て、ＨＡＴ培地で２×１０4細胞／ｍｌの濃度になるよう単一細胞懸濁液を作ることでフイーダー細胞群（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を最初に調製した。ｎｅｕ遺伝子産物に対する抗体の有無での試験で正とされたハイブリドーマのコロニーを、胸腺細胞を含んだ培地に５ハイブリドーマ細胞／ｍｌの濃度になるように希釈した。それから、この液２００ｕｌを、９６ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに分けた。一度コロニーを成長させてから、その上清を再び、ｎｅｕ癌遺伝子産物の有無に関して試験した。先に記したエライザアツセイで試験して、その結果が正であれば、そのコロニーを再度限界希釈してクローン化した。初めの融合について上記の方法で得られたハイブリドーマは、モノクローナル抗体を分泌しており、ＢＤ５−２ｄ、ＴＡ１−１ｃ、ＲＣ１−１ｃ、ＮＡ３−６ａ、ＯＤ３−１０ｊと名付けられている。２回目の融合についても、ハイブリドーマが得られ、ＰＢ−３、ＲＣ６−２、ＮＢ３、ＩＤ５、ＩＢ３−４と名のついた抗体を分泌している。
【００５１】
Ｇ．抗体のアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）及びサブクラス（ｓｕｂｃｌａｓｓ）の決定
ハイブリドーマによつて生産される抗体のアイソタイプ及び軽鎖のクラスを決定するため、また、ＩｇＧサブクラスを決定するため、エライザ・アツセイを行なつた。この目的のため、ボエリンガー マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｈｅｉｍ）（インデイアナポリス；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ＝ＩＮ）より、 必要な免疫試薬全てが入つているキツトを調達した。クローン化したハイブリドーマのコロニーから得た組織培養液の上清を、先に記した様に、１８−３−７細胞のライセート上で保温した。この後、種々のマウスイムノグロブリンアイソタイプ、軽鎖クラス、ＩｇＧサブクラスに特異的な種々のヤギ抗血清と共に保温してから、２次抗体としてのホースデイツシユペルオキシダーゼで標識したブタ抗ヤギＩｇＧと共に保温した。メーカーの教えにより、ＡＢＴＳ（２，２′−アジノ−ビス−〔３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸〕；２，２′−ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ−〔３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｏｉｄ〕）を用いてアツセイを展開して、その結果生じた緑呈色のＯＤを４０５ｎｍで読んだ。この方法を用いることで、最初の融合からのモノクローナル抗体のうち、３つ（ＢＤ５−２ｄ、ＲＣ１−４ｃ、ＴＡ１−１ｃ）が、ＩｇＧ1／カツパ（ｋａｐｐａ）抗体であり、ＮＡ３−６ａ、ＯＤ３−１０ｊはＩｇＭ／カツパ抗体であることが決定された。また、２回目の融合で得られたＲＣ６−２、ＮＢ３、ＩＤ５、ＩＢ３−４のモノクローナル抗体は、ＩｇＧ1／カツパであり、抗体ＰＢ３はＩｇＧ2a／ラムダ（ｌａｍｂｄａ）である。
【００５２】
Ｈ．放射免疫沈降反応
ｎｅｕ癌遺伝子産物の予想される分子量である１８５ｋｄの分子量のタンパク質を抗体が認識するか否かを決めるために、各モノクローナル抗体を用いて、放射性標識された１８−３−７細胞の免疫沈降を行なつた。１０ｃｍペトリ皿（ｐｅｔｒｉ ｄｉｓｈ）内の１８−３−７細胞（もしくはＮＩＨ３Ｔ３細胞）のほとんど混じ合つている単層を、５００μＣｉの35Ｓで標識したシステインを含む培地で、夜通し、培養した。翌朝、細胞を採取し、プロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦ及び、大豆トリプソン阻害剤の入つた洗浄性緩衝液（ＩＰ緩衝液：１％トライトンＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１０ｍＭトリス、０．６５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．２）中で溶解させた。およそ、１μＣｉの標識細胞標本を各ハイブリドーマ由来の培養液上清５００μｌと共に４℃で夜通しインキユベートした。この間に、精製したウサギ抗マウスＩｇＧ（キルケガード及びペリー ラボ；Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｓ）５０μｇ をＩＰ緩衝液中のプロテイン Ａ−セフアロース（ＰｒｏｔｅｉｎＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（フアルマシア；Ｐｈａｒｍａｃｉａ ）１：１のスラリー（ｓｌｕｒｒｙ）５０μｌと４℃で夜通し混ぜた。過剰のウサギ抗体をＩＰ緩衝液でプロテイン Ａ−セフアロースを１回洗うことで取り除き、それから、標識細胞と、モノクローナル抗体を含んだ培養混合液に、そのスラリーを加えた。この混合液を４℃で夜通し反応させた。プロテイン Ａ−セフアロースを遠心してペレツトにし、ＩＰ緩衝液で４回洗い、次いでＴＢＳ（１０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．２）で１回洗つてからペレツトを乾かした。ＳＤＳゲル用の試料用緩衝液（１０ｍＭ トリス、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％ ２−メルカプトエタノール；２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、０．０４％ ブロモフエノール ブルー；ｂｒｏｍ　ｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅ）５０μｌに各ペレツトを再び懸濁した。４．５％アクリルアミド重層用ゲル及び７％分離用ゲルを用いて、各試料の半分をＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ　ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ）にかけた。ゲルを乾かし、オートラジオグラフイーにかけた。全てのモノクローナル抗体はＮＩＨ３Ｔ３細胞には見られない。１８−３−７細胞中の約１８５ｋｄ の分子量を持つタンパク質を認識することが、免疫沈降反応の結果から示された。このことは、標準タンパク質マーカーにより示される様に１８５ｋｄ の分子量を持つタンパク質がゲル内で移動する距離に相当するバンドが、オートラジオグラフで存在したことにより決定された。同様の実験が、ＳＫＢＲ−３細胞（ヒト肺癌）及びＡ４３１細胞（ヒトの類表皮性癌）を用いてなされた。ＳＫＢＲ−３細胞は他の研究者たちにより、ヒトｎｅｕ癌遺伝子産物を高水準で発現していることが示されていたが、上に記したモノクローナル抗体を用いた免疫沈降反応では、これを確かなものとする結果を得た。観察されたバンドは、１８−３−７標識細胞から、沈降されたバンドと等しい距離だけ移動していた。一方、Ａ４３１細胞系統は、ヒト表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を非常に高い水準で発現していることで知られているが、ＥＧＦＲは１７０ｋｄのタンパク質で、ヒトｎｅｕ癌遺伝子産物と、タンパク質のチロシンキナーゼドメインで、重要な相同性を持つている。これは、もし抗体が、チロシンキナーゼ領域を認識していれば、ｎｅｕ遺伝子産物と交差反応を起こすかもしれないタンパク質なのである。しかしながら、上記のモノクローナル抗体を用いたＡ４３１細胞の免疫沈降反応は、１８５ｋｄの所も１７０ｋｄの所も反応性を示さなかつた。ヒトＥＧＦＲに特異的な、コントロールの抗体は予想通り、Ａ４３１細胞のタンパク質とうまく反応して、観察されたバンドは、１７０ｋｄの分子量に相当した。１８−３−７細胞に対して生じたモノクローナル抗体を用いるとＡ４３１との反応性が見られなかつたことから、抗体はヒトｎｅｕ癌遺伝子産物に特異的であり、ヒト表皮成長因子受容体とは交差反応しないということが、結論づけられた。
【００５３】
実 施 例 ７：生物学的試料におけるｐ１８５ ｎｅｕ抗原の検出
今までの実施例は、血清、血漿、尿といつたヒトの体液あるいは前新生細胞、新生細胞におけるヒトｎｅｕ抗原（約１８５０００ダルトンの分子量；ｐ１８５と呼ぶ）の検出を説明している。
【００５４】
Ａ．キヤプチヤーイムノアツセイ
多様な生物標本からｎｅｕ抗原を奪取（キヤプチヤー）する目的で、ポリスチレンプレート（コスター社、ケンブリツジ、ＭＡ）を１マイクログラム（μｇ）の抗ｎｅｕモノクローナル抗体（Ｍａｂ）、複数の抗ｎｅｕモノクローナル抗体の混合物、またはポリクローナル抗ｎｅｕ抗体のいずれかでコートした。Ｍａｂは炭酸緩衝液（ｐＨ＝９．６）で希釈し、マイクロタイタープレートの各ウエルに１００ｕｌを加えた。次に、プレートを３７℃で一晩インキユベートした。インキユベート後、プレートを０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。続いて抗ｎｅｕ抗体でコートされていないマイクロタイタープレートのウエル部分をブロツクするために、２．５％のＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を加えてプレートをインキユベートした。プレートを３７℃で１時間インキユベートし、再度ＰＢＳ／０．１％ ＢＳＡで３回洗浄した。プレートを使用しない場合には使用時まで４℃で保存した。ｎｅｕ抗原の評価を行う標本は、正常細胞、前腫瘍細胞、腫瘍細胞、または血清、血漿、あるいは尿などの体液である。標本からｎｅｕ抗原を奪取するために、標本をマイクロタイタープレートのウエル上にコートされた抗ｎｅｕＭａｂとインキユベートした。標本を２５℃で一晩インキユベートした。一晩のインキユベーシヨン後、プレートをＰＢＳ／０．１％ ＢＳＡで６回洗浄して過剰の生物標本を除去した。ビオチンで標識した別の抗ｎｅｕ Ｍａｂを各ウエルに加え、３７℃で１時間インキユベートした。プレートをＰＢＳ／０．１％ ＢＳＡで６回洗浄した。ビオチン標識した抗ｎｅｕＭａｂを検出するために、１：４０００に希釈したストレプトアビジンホースラデイツシユ−ペルオキシダーゼ溶液を加えて３７℃で１時間インキユベートした。プレートをＰＢＳ／０．０１％ＢＳＡで６回洗浄した。反応を完了させるために、基質であるＯＰＤを加えて３７℃で１５分インキユベートした。反応は硫酸で停止させ、ヌンク（Ｎｕｎｃ）プレート読み取り機を用いて波長４９０ｎｍでの吸光度を決定した。
【００５５】
Ｂ．キヤプチヤーアツセイを用いた細胞および腫瘍抽出液由来のｎｅｕの検出
生体物質における本アツセイの有用性を評価するために、幾つかのキヤプチヤーイムノアツセイを行つた。第１２図は、１次抗体にＴＡ−１、２次抗体にビオチン化ＮＡ−３を用いたキヤプチヤーイムノアツセイの結果を示している。細胞抽出液は幾つかのヒト細胞系から調製した。ｎｅｕＲＮＡレベルは、これらの細胞系の幾つか（ＳＫ−ＢＲ−３、ＺＲ−７５−１、ＭＣＦ−７）に関して報告されている。本アツセイで検出されるｎｅｕ抗原の相対的レベルは、報告されているＲＮＡデータと一致する。ｎｅｕ抗原のレベルが既知の細胞系を用いたこれらのアツセイおよび他の幾つかのアツセイ（ここには示していない）の結果から、本アツセイは細胞抽出液中のｎｅｕ抗原の相対レベルを決定するために使用可能であることが示唆される。ｎｅｕ抗原の発現の違いを第１２図に示されている腫瘍細胞系の分類に使用できることも、この結果は示唆している。本アツセイが腫瘍抽出液中のｎｅｕ抗原を検出できるかどうかを決定するために、ヌードマウス中でｎｅｕを発現している腫瘍細胞（Ｘ−３−５）またはｎｅｕを発現していない腫瘍細胞（３Ｔ３−ｒａｓ）を増殖させた。この二つのＮＩＨ３Ｔ３由来細胞系は、Ｘ−３−５が発現されているヒトｎｅｕ遺伝子を含むことを除いてはアイソジエニツクである。第１３図は、ＮＢ−３を１次抗体とし、ビオチン化されたＴＡ−１を検出用抗体として用いたキヤプチヤーイムノアツセイの結果を示している。ｎｅｕ抗原はＸ−３−５腫瘍抽出液で検出されたが、３Ｔ３ ｒａｓ腫瘍抽出液では検出されず、本アツセイは腫瘍抽出液中のヒトｎｅｕ抗原を特異的に検出できることを示唆する。何人かの研究者が、多くのヒト乳癌で高レベルで発現されていることを示した。ヒト乳癌中でｎｅｕが検出され得るかどうかを決定するために、１個体から２つの試料を調製した。抽出液を１人の患者のヒト乳癌（２７４７−０１−０５０）および正常胸組織（２７４７−０１−０５０）から調製した。本アツセイにおいて、ＴＡ−１を１次抗体として、ビオチン化したＢＤ−５を検出用抗体として使用した。第１４図はｎｅｕが腫瘍では検出されるが、正常胸組織では検出されないことを示す。これらのアツセイから、ｎｅｕキヤプチヤーイムノアツセイは細胞または腫瘍抽出液からヒトｎｅｕ特異的に検出できることが示された。これらのデータはまた、試料間の相対的なｎｅｕレベルもこのアツセイで決定できることを示唆している。
【００５６】
Ｃ．血漿および血清中のｎｅｕの検出
これらの実施例は、マウスおよびヒトの有する腫瘍由来の血清および血漿中のｎｅｕ抗原の検出を例示するものである。ｎｅｕ抗原がヒト血清または血漿中で特異的に認識されるかどうかを決定するために、幾つかのコントロール実験を行つた。ｎｅｕ抗原がヒト血清または血漿中で特異的に検出され得るかどうかを決定するために、幾つかのコントロール実験を行つた。これらには、ｎｅｕを高レベルで発現する細胞系の培養液上清、および腫瘍を有するヌードマウスの血清中のｎｅｕ抗原の検出が含まれる。第１５図は、ＮＢ−３を１次抗体、ビオチン化したＴＡ−１を検出抗体として用いて細胞系の培養液上清のｎｅｕのキヤプチヤーイムノアツセイの結果を示している。この結果から、ｎｅｕを高レベルで発現するマウス細胞系（１８−３−７）あるいはヒト細胞系（ＳＫ−ＢＲ−３）の上清にはｎｅｕ抗原が検出されたが、ｎｅｕを発現していない細胞系である３Ｔ３−ｒａｓ、あるいは培地のみには検出されないことが示された。これらの細胞系のうち２つ（１８−３−７および３Ｔ３−ｒａｓ）はヌードマウス中で腫瘍として増殖可能である。これらの細胞系をヌードマウスに皮下注射して生じた腫瘍を有するマウスを継代し、ＴＡ−１を１次抗体、ビオチン化したＢＤ−５を検出抗体として用いるキヤプチヤーイムノアツセイによつてその血清中のｎｅｕ抗原の存在を解析した。本アツセイの結果を第１６図に示す。細胞や腫瘍抽出液、および培養液上清のみと同様に、腫瘍を持つヌードマウスの血清中にｎｅｕが存在することがこのアツセイで示された。正常なヌードマウスの血清および、ｎｅｕを発現しない腫瘍を持つヌードマウスの血清は、ｎｅｕ抗原の存在は認められなかつた。これらの実験から、ｎｅｕ抗原はｎｅｕ抗原を発現する腫瘍を持つヌードマウスの血清中で検出されることが示唆される。ｎｅｕ抗原はｎｅｕを発現するヒト細胞系（ＳＫ−ＢＲ−３）およびヌードマウスの腫瘍を引き起こす細胞系の上清で検出される。ｎｅｕを高レベルで発現する腫瘍の患者はｎｅｕ抗原を含む血清を持つであろうという仮説を確かめるために、一連のアツセイをおこなつた。一つのアツセイ群では、抗ｎｅｕ Ｍａｂ ＴＡ−１をキヤプチヤー抗体として、ビオチンで標識したＢＤ−５を検出抗体として用いた。分析試料としては、正常なヒト血漿および２人の乳癌患者からの血漿を用いた。この結果から、正常な血漿および患者ＡＪＡＣからの血漿は、本アツセイでは実質的に反応しなかつたが、患者ＰＳＵＬからの血漿は本アツセイで顕著な反応性を示し、ｐ１８５抗原は乳癌患者ＰＳＵＬの血清中に存在することが示唆された（第１７図）。この実験をＭａｂ ＮＢ−３をキヤプチヤー抗体（固相支持体に固定された物）、ビオチンで標識したＭａｂ ＴＡ−１を検出抗体として、多数の患者に関して反復して行つた。このアツセイを用いて、３７の独立な血漿試料がｎｅｕ特異的モノクローナル抗体との反応性に関して評価された。これらの標本は、正常な人からの１２の血漿試料、良性胸部疾患患者からの６血漿試料、乳癌患者からの１９血漿試料が含まれた。第１８図は３グループの平均値（ｎｅｕユニツト）を示している。正常および良性の場合は１００−１１０の平均値を有し、１９の乳癌患者��約２００のｎｅｕ平均値を持つていた。表３は各試料に関して得られた個々のデータを示している。乳癌患者の幾つかのｎｅｕ値は、アツセイの上限を越えており、表３では"５００＋"として示してある。これらの場合、試料をさらに２倍に希釈し、アツセイを繰り返した。結果は括弧で示してある。
【００５７】
【表３】
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【００５８】
実 施 例 ８：軟寒天中のｎｅｕでトランスフオームされた細胞のＴＡ−１阻害
本実施例は抗ｎｅｕモノクローナル抗体がトランスフオームされた細胞に細胞安定化効果がある可能性があることについて示すものである。ヒトｎｅｕ遺伝子をトランスフエクトされ、ｎｅｕを高レベルで発現しているマウス繊維芽細胞（ＮＩＨ ３Ｔ３）は軟寒天中でコロニーを形成する。この性質はｎｅｕタンパク質の量およびそれの持つチロシンキナーゼ活性と直接関連する。ヒトｎｅｕタンパク質の細胞外部分を認識するモノクローナル抗体（Ｍａｂ）は、これらのタンパク質を細胞表面上でクラスター化し、パツチを作らせ、続いて細胞中に内在化させて、それによつてチロシンキナーゼ活性を減少させると考えられる。我々は、Ｍａｂ ＴＡ−１を軟寒天中で増殖しているｎｅｕでトランスフオームしたＮＩＨ ３Ｔ３細胞系（１７−３−１−３）に加えることにより、濃度に依存してこの細胞系で形成されるコロニー数が減少することを示した。特に、ここで用いた最高濃度のＴＡ−１（１５０μｇ／ｍｌ）では、形成されるはずのコロニー数の５％以下しか形成されなかつた（未処理のコントロール群では１５０のコロニーが形成されたのに対し、７コロニー）。ＴＡ−１と同じマウスサブタイプ（いずれもＩｇＧ1）に適合する非特異的なＭａｂは１５０μｇ／ｍｌでも形成されるコロニーの数には影響がなかつた。軟寒天中でコロニーを形成しない細胞は依然として生育可能であることから、この増殖阻害効果は細胞毒性のものではなく、細胞安定化するものだと考えられる。この結果から、ヒトｎｅｕタンパク質を過剰発現する腫瘍細胞にたいする抗体による毒性治療が示唆される。
【００５９】
寄託
抗体産生細胞系ＢＤ−５−２ｄは、米国メリーランド州ロツクビルのアメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨンに寄託されている。ＡＴＣＣ番号はＨＢ９６９８である。
【００６０】
同等のもの
本分野の技術者には理解されるように、通常の実験技術を用いて、ここで特に述べた本発明の個々の態様と同等の多くのものが可能である。このような同等物は以下の請求の範囲に含まれることが意図されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は指示されているｎｅｕ遺伝子ｃＤＮＡをｐＳＶ２発現ベクターに挿入して構築したｐＳＶ２ ｎｅｕの概略図である。
【図２】図２にはｐＳＶ２ｎｅｕを含む細胞株に特有な電気泳動ゲルのパターンが示される。
【図３】図３は正常なラツトｎｅｕ遺伝子及び形質転換したラツトｎｅｕ遺伝子の１９６８から２０７３のヌクレオチド及び予想されるアミノ酸の配列を示す。
【図４】図４はａ）野生型（正常）、ｂ）正常ｎｅｕ遺伝子の変異ｎｅｕ遺伝子、ｃ）ＤＨＦＲ Ｇ８から調製したＤＮＡ、ｄ）ＴからＧへのトランスバージヨンが存在する変異ｎｅｕ遺伝子の修飾型の塩基配列に対応する核酸プローブのヌクレオチド配列を示す。
【図５】図５はｎｅｕトランスフエクタントから調製したＤＮＡに核酸プローブをハイブリダイゼーシヨンさせた後の電気泳動ゲルのパターンを示す。
【図６】図６は腫瘍細胞株及び正常なＢＤＩＸ ＤＮＡにオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイゼーシヨンさせた後の電気泳動ゲルのパターンを示す。
【図７】図７は１０個の独立した活性化ｎｅｕ遺伝子を含む１４のトランスフエクタントを正常遺伝子（プロトオンコジーン）に対応するオリゴヌクレオチド（上）又はトランスフオーム能をもつ遺伝子（癌遺伝子）に対応するオリゴヌクレオチド（下）で探査した後の電気泳動ゲルのパターンを示す。
【図８】図８は２種類の頸部癌腫細胞株（ＭＥ１８０及びＳＷ１７１０）のｃＤＮＡから構築した全長のｎｅｕｃＤＮＡクローンの概略図である。
【図９】図９は２つのヒトｎｅｕベクター、指示されたｎｅｕ遺伝子ｃＤＮＡをそれぞれｐＭａｘ発現ベクター及びｐＭａｘ−Ｓｐｈ発現ベクターに挿入して構築したｐＭａｘｎｅｕ及びｐＭａｘ ｄｅｌｔａ ｎｅｕの概略図である。
【図１０】図１０は指示されているｎｅｕ遺伝子の部分をｐＧＥＭ発現ベクターに挿入して作成したハイブリダイゼーシヨンプローブの概略図である。
【図１１】図１１は指示されているｎｅｕ遺伝子ｃＤＮＡをｐＬＪｄｅｌｔａ発現ベクターに挿入して作成したプラスミドベクターｐＬＪ ｄｅｌｔａ ｎｅｕの概略図である。
【図１２】図１２は捕捉ＥＬＩＳＡシステムを使つて、多様なヒト胸部腫瘍細胞株からのライセートについてｎｅｕ抗原の存在を検査した捕捉イミユノアツセイの結果を示す。抗ｎｅｕモノクローナル抗体（ＴＡ−１）がｐ１８５ｎｅｕ抗原の捕捉に、検出試薬としてビオチン標識した抗ｎｅｕモノクローナル抗体ＮＡ−３が用いられた。
【図１３】図１３はｎｅｕを発現しているヌードマウスの腫瘍のライセート（Ｘ−３−５）及びｎｅｕ陰性の腫瘍のライセート（３Ｔ３／ｒａｓ）、ｐ１８５ｎｅｕ抗原特異的な抗ｎｅｕモノクローナル抗体（ＮＢ−３）を比較した結果（腫瘍ライセートのマイクログラム対光学密度）を示す。
【図１４】図１４は正常なヒト胸部組織片（２７４７−０１−０５０）又は胸部腫瘍（２４２７−０１−０５０）から細胞のライセートを調製し、捕捉システムを用いてｎｅｕ抗原の存在を検査した結果を示す。アツセイは捕捉用試薬として抗ｎｅｕモノクローナル抗体ＴＡ−１を、ビオチン標識検出試薬としてモノクローナル抗体ＢＤ−５を用いて行つた。
【図１５】図１５は１８−３−７細胞（ヒトｎｅｕ遺伝子でトランスフオームし、細胞表面にｐ１８５蛋白質を発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞）、３Ｔ３ ｒａｓ細胞（ｒａｓ遺伝子でトランスフオームし、細胞表面にヒトｐ１８５蛋白質を発現していないＮＩＨ３Ｔ３細胞）及びＳＫ−ＢＲ−３ヒト胸部腫瘍細胞の培養上澄と１０％ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ培地の分析結果を示す。捕捉イミユノアツセイでは、捕捉用試薬として抗ｎｅｕモノクローナル抗体ＮＢ−３を、検出試薬としてビオチン標識したＴＡ−１を用いた。
【図１６】図１６は正常なマウスの血清（Ｔ１４４）、ｐ１８５蛋白質を発現している腫瘍をもつマウスの血清（１８−３−７マウス）及びｐ１８５蛋白質を発現していない腫瘍をもつマウスの血清（３Ｔ３（ｒａｓ））について、捕捉抗体として抗ｎｅｕモノクローナル抗体ＴＡ−１を、検出試薬としてビオチン標識した抗ｎｅｕモノクローナル抗体ＢＤ−５を用いて捕捉イミユノアツセイを行つた結果を示す。
【図１７】図１７は捕捉試薬として抗ｎｅｕモノクローナル抗体ＴＡ−１を、検出試薬としてビオチン標識したＢＤ−５を用いて捕捉イミユノアツセイを行つた結果を示す。検査を行つた試料は正常なヒト体液及び二人の胸部腫瘍患者から調製した体液を含む。
【図１８】図１８は三例のヒト患者から調製したｎｅｕ癌遺伝子値の平均（ｎｅｕの単位）を図示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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