(57)【要約】【課題】重金属による染色や蛍光物質の導入といった特別な前処理をせずとも有機物のイメージングが可能であって、しかも複数の化学種を含む物質についても、その化学種を同定し構造をイメージングすることが可能な、ナノメートルスケールという高分解能の観察手段を提供する。【解決手段】従来の近接場光学顕微鏡は、ナノメートルスケールでの観察は行えるものの、多くの物質、特に有機物が自家蛍光を発する深紫外線領域での観察が行えなかった。そこで深紫外線領域での観察を可能とするために、励起光および信号光が通過するすべての光学部品を純粋石英製または蛍石製とする。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起光および信号光が通過するすべての光学部品を石英製もしくは蛍石製として、深紫外領域までの観察を可能としたことを特徴とする深紫外線対応近接場光学顕微鏡。
【請求項２】
一または二以上の波長光源を有することを特徴とする請求項１に記載の深紫外線対応近接場光学顕微鏡。
【請求項３】
赤外から深紫外領域の範囲に属する所定の波長の近接場光を観察対象物近傍で発生させ
該近接場光で励起された物質から生じた蛍光を測定して、蛍光分析から化学種の同定を行う
ことを特徴とする、請求項１または２に記載の深紫外線対応近接場光学顕微鏡を使用した物質の同定方法。
【請求項４】
赤外から深紫外領域までの範囲に属する所定の波長の近接場光を観察対象物近傍で発生させ
該近接場光で励起された物質から生じた蛍光を測定して、蛍光波長の相違から化学種の相違を検出することにより、
一または二以上の化学種を含有する有機物または無機物である観察対象物表面の化学種分布をモニタ等の表示手段上に表示する
ことを特徴とする、請求項１または２に記載の深紫外線対応近接場光学顕微鏡を使用した有機物または無機物の直接イメージング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、光源として深紫外線の利用が可能な近接場光学顕微鏡に関する。
本発明の顕微鏡を使用することにより、従来は染色処理等をしなければ高解像度の観察が困難であった高分子化合物、生体試料などの有機物試料について、染色処理等をせずともナノスケールでのイメージングが可能となる。さらに、多波長の光源を使用することにより、試料中の様々な物質を同定することが可能となる。
【０００２】
【従来の技術】
現在、ナノメートルスケールの構造を観察する手段として、電子顕微鏡や原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）などが用いられている。また、化学、生物学、医学分野では、観察したい有機化合物、ＤＮＡ、タンパク質などの物質に各種蛍光色素や蛍光ラベル化剤、ＤＮＡ染色試薬、蛍光染料、あるいはＧｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）のような蛍光性タンパクを導入することにより、これらの物質の経時変化や動きなどを蛍光顕微鏡を用いて観察している。
特に近年は、光を用いながらその波長以下の空間分解能を達成できる近接場光学顕微鏡（ＳＮＯＭ）を用いて、ナノメートルスケールでの観察が盛んに行われている。特に有機物のように、電子顕微鏡を用いるには重金属処理を行わなければならないような物質について近接場光学顕微鏡を用いて観察を行うことが注目されている。
【０００３】
近接場光学顕微鏡とは、一端を尖鋭化させた光ファイバプローブを用いて、ファイバの先端に発生する近接場光を光源として試料を励起し、それにより発せられる蛍光を検出して試料の構造を観察する顕微鏡である。近接場光学顕微鏡によれば、光の回折限界であるλ／２（λ：光の波長）を超えて、１００ｎｍ以下のスケールで観察が可能であり、また、電子顕微鏡のように観察に真空雰囲気が要求されず、例えば水中でも観察が可能である。
【０００４】
【非特許文献１】
大津元一著「ナノ・フォトニクス」米田出版，　１９９９年１２月１日
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
電子顕微鏡によって有機物を観察する場合、コントラストを得るために、重金属による染色処理を行わなければならない。このような染色処理は手間がかかるばかりでなく、生体のようにそもそも染色処理が不可能なものもある。
また、ＡＦＭは原子・分子レベルの分解能を持つものの、観測しているのは試料表面の凹凸のみ、即ち物質の表面形状だけであるため、化学種を同定することができず、物質の具体的な構造解釈が困難である場合が多い。
【０００６】
化学、生物学、医学分野で広く用いられている蛍光顕微鏡は、光を用いるため高感度であり、かつ、常温、常圧、空気中という通常雰囲気下で、特定の部位を手軽に観察できるという利点があるが、蛍光観察には蛍光色素の導入が必須とされており、各種蛍光ラベル化剤、ＤＮＡ染色試薬、蛍光染料、あるいはＧＦＰのような蛍光性タンパクの導入が必須の要件である。
このように、蛍光顕微鏡による観察には、蛍光物質の導入作業が必要であって試料を直接観察することができない、もしくは、蛍光物質の導入のため試料の再利用が困難である等の問題点がある。
【０００７】
また、従来の近接場光学顕微鏡は可視領域までしか対応しておらず、通常の有機化合物の特徴的な吸収がある深紫外線を使用することができない。これは、従来の光学顕微鏡では可視光が光源として用いられ、紫外線、特に３４０ｎｍ以下の深紫外線は用いられず、顕微鏡自体も４００ｎｍ以下の紫外光を透過しないような材質の光学部品が用いられているためである。このため、試料は４００ｎｍ以上の可視光線で発色する蛍光色素により染色して観察する必要があり、染色が不可能なものは観察ができないという問題がある。
【０００８】
本発明はこのような課題を解決するために成されたものであり、その目的とするところは、有機物または無機物の化学種の同定および直接イメージングが可能である深紫外線対応近接場光学顕微鏡を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために成された本発明に係る深紫外線対応近接場光学顕微鏡は、励起光および信号光が通過するすべての光学部品を石英製もしくは蛍石製としたことを特徴とする。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明においては、光の回折限界を超えるナノスケールの解像度を達成できる顕微鏡である近接場光学顕微鏡（ＳＮＯＭ）技術を基盤とし、深紫外線領域までの波長の光源を使用できるようにすることによって、多くの物質が深紫外線に対して自家蛍光を発するという性質を利用した直接イメージングを行う。なお、直接イメージングとは、重金属で染色せず、また、蛍光物質を導入することなく物質のイメージ観察を行うことを意味する。
【００１１】
ＳＮＯＭは、一般には市販の光ファイバプローブを用いて、これに可視光を通すことによりファイバ先端に発生する近接場光により試料を励起し、その結果、試料から発せられる蛍光を画像として観察する。しかし、通常のファイバは４００ｎｍ以下の紫外光を伝播せず、また、測定系の対物レンズも一般の顕微鏡では４００ｎｍ以下の光は透過せず、紫外用対物レンズでも３４０ｎｍ以下の光は透過しないので、特に３４０ｎｍ以下の深紫外線はこれまで光学顕微鏡に用いられてこなかった。従って、試料は主に可視光線で発色する蛍光色素により染色して観察されていた。
【００１２】
本発明においては、純粋石英製または蛍石製の光ファイバを用いて作製したプローブを使用することにより、３４０ｎｍから２００ｎｍの深紫外光を透過させ、さらに検出測定系の対物レンズも純粋石英または蛍石製として紫外線対応にすることにより、波長２．５μｍの近赤外領域から２００ｎｍの深紫外線領域にわたる全波長の入射光に対応できるようにした。深紫外線を受けると、きわめて広い範囲の物質が自家蛍光を発するため、本発明のＳＮＯＭによれば従来よりも広範囲の物質の観察が可能となる。
【００１３】
高分解能観察に現在広く用いられている電子顕微鏡では、真空チャンバで観察が行われ、また、有機物を観察する場合はコントラストを得るために、重金属をコーティングしてイメージングを行っている。しかし本発明の方法によれば、有機物の無染色イメージングが可能となる。また、従来の蛍光顕微鏡では、その空間分解能が光の波長程度の５００ｎｍであるのに対し、本発明の近接場光学顕微鏡はそれよりも一桁高い数十ｎｍの分解能が得られ、より高次元の構造観察を行うことができる。
【００１４】
例えば、近年、化学、生物学、医学分野において、分子レベルの構造と材料機能・生体機能の関連がより深く探求されるようになり、それに伴い、ナノメートルからサブミクロンレベルの構造観察が要求されている。本発明の近接場光学顕微鏡によれば、芳香環を有する汎用高分子、生体関連分子（ＤＮＡ、タンパクなど）や無機材料においても、特に色素で染色することなく、簡便にそれらの蛍光像を得ることができるようになる。このため色素を試料に導入するための複雑な前処理や色素染色による試料形態の変化という問題が避けられる。また、多波長での観察を行うことにより、複数の化学種を含む物質の分光イメージングも可能になるなど、幅広い画像をナノスケールの高解像度で得られる。このように、本発明を利用すれば、形態構造観察のみならず、物質の種類を分光的に判別することも可能となる。
【００１５】
【発明の効果】
本発明の顕微鏡では、利用できる光源波長を深紫外線領域へと拡大することにより、多くの物質が自家蛍光を発する深紫外線領域での観察を可能とし、その領域での観察により、試料に対して染色を施すことなく、広範な化学種の同定およびその空間分布を高分解能でイメージングできる。また、染色工程を経ずに観察できることから、従来の手法よりも試料調整が容易である。特に、生体試料のように染色が不可能で、従来は高分解能観察を行うことが困難であった試料もイメージとして観測ができるという利点を有する。
【００１６】
【実施例】
本発明の顕微鏡を図１に示す。本発明の顕微鏡は、光源となるレーザ１０、カプラー１１、先端に１００ｎｍ以下の開口を有するプローブ１４を備えた光ファイバ１２、試料１３からの信号光を集光する対物レンズ１５、検出部１７に導く光ファイバ１６、分光を行う検出部１７、観察を行うモニタ１８を備える。プローブは純粋石英製または蛍石製のコアを有する光ファイバから作製されており、プローブを尖鋭化することで励起光を波長以下の大きさまで絞り込む。試料１３からの信号光は溶融石英もしくは蛍石製光学素子で検出部１７へと導かれる。
本装置では、励起光及び信号光が透過するすべての光学部品を石英製または蛍石製とすることで、波長２００ｎｍの深紫外光から２．５μｍの近赤外光までの広範な波長帯を利用可能としている。光源は所定の波長光を発するレーザ光源を複数用意して観察対象に応じて適宜選択して使用してもよいが、複数の化学種を含む観察対象の分光イメージングを可能にするために、連続的に多波長での測定を行うことができる波長可変レーザが好ましい。
【００１７】
本発明のＳＮＯＭを使用し、ＹＡＧレーザーを光源として、２６６ｎｍの波長光を光ファイバに導入し石英基板上に載置したポリスチレン膜およびポリメタクリル酸メチル膜の観察を行った。ポリスチレンは２６６ｎｍの光を吸収するため、蛍光を発して膜形状が観察されるが、ポリメタクリル酸メチルは２６６ｎｍの光を吸収しないため、蛍光は生じず、膜形状は観察されないと推測された。
膜形状を観察するために、それぞれの膜の一部に傷を付けた後、傷部分の観察を行った。その結果を図２から図７に示す。図２および図５は膜の高低差から特定されたポリスチレン膜およびポリメタクリル酸メチル膜の表面形状像であって、図３および図６は近接場光によって励起された物質より発せられた蛍光の強度分布を表した紫外蛍光像である。
膜の高低差から膜の表面形状を観察する方法においては、ポリスチレン膜およびポリメタクリル酸メチル膜のいずれも膜形状が観察できた（図２，図５）。しかし近接場光によって励起された物質より発せられた蛍光の強度分布を表した紫外蛍光像から膜の表面形状を観察する方法においては、当初の推測通り、ポリスチレン膜ではその蛍光像から膜形状が観察されたが（図３）、ポリメタクリル酸メチル膜では、蛍光が検出されず、全く膜形状が観察できなかった（図６）。
なお、図４および図７はそれぞれ図２，３のＩＶ−ＩＶ断面および図５，６のＶＩＩ−ＶＩＩ断面におけるプローブの水平方向の位置とポリスチレンまたはポリメタクリル酸メチルの膜の高さおよび蛍光強度との関係を示したグラフである。
【００１８】
このように、物質の種類によって光の吸収波長は異なるため、多波長で測定を行うことにより、広範な物質を同定することが可能である。また、例えば、スチレンとメタクリル酸メチルのブロックポリマー膜においても、膜におけるスチレンやメタクリル酸メチルの繰り返し部分を特定し、それをイメージングするというように、従来の電子顕微鏡等による観察では困難であったことも本発明により可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】近接場光学顕微鏡の概略図
【図２】膜の一部に傷をつけたポリスチレン膜の表面形状像
【図３】膜の一部に傷をつけたポリスチレン膜の紫外蛍光像
【図４】図２，３のＩＶ−ＩＶ断面におけるプローブの水平方向の位置とポリスチレン膜の高さおよび蛍光強度との関係図
【図５】膜の一部に傷をつけたポリメタクリル酸メチル膜の表面形状像
【図６】膜の一部に傷をつけたポリメタクリル酸メチル膜の紫外蛍光像
【図７】図５，６のＶＩＩ−ＶＩＩ断面におけるプローブの水平方向の位置とポリメタクリル酸メチル膜の高さおよび蛍光強度との関係図
【符号の説明】
１０…レーザ
１２、１６…光ファイバ
１３…試料
１４…プローブ
１７…検出器
１８…モニタ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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