(57)【要約】【課題】タンパク質を分子量による制限を受けずにミトコンドリアへ輸送することのできる手段を提供し、ミトコンドリアで合成されるタンパク質を自由に改変し、その機能を自由に改変することを可能とする。【解決手段】サブユニットの膜内での配向（トポロジー）に注目し、特定のサブユニット固有の輸送シグナルを用いることにより、所望のタンパク質をミトコンドリアに輸送することができることを見出した。このようなサブユニットは次の条件を満たす。１）核ＤＮＡにコードされたミトコンドリアの膜タンパク質のサブユニットである。２）ミトコンドリアの膜に存在するときに、このサブユニットのタンパク質のＮ末端、好ましくはＮ末端とＣ末端の両方、がミトコンドリアのマトリックス側に存在するサブユニットである。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定のタンパク質のＮ末端に輸送シグナルを結合させて、このタンパク質を細胞質からミトコンドリアへ輸送する方法であって、この輸送シグナルが、核ＤＮＡにコードされたミトコンドリアの膜タンパク質のサブユニットであって、そのサブユニットがミトコンドリアの膜に存在するときにそのＮ末端がミトコンドリアのマトリックス側に存在するサブユニットの輸送シグナルであることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記サブユニットがミトコンドリアの膜に存在するときにそのＮ末端とＣ末端の両方がミトコンドリアのマトリックス側に存在する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サブユニットが２以上の偶数回膜貫通型である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記特定のタンパク質の分子量が１０，０００〜６０，０００である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記特定のタンパク質がミトコンドリアＤＮＡにコードされるタンパク質である請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ミトコンドリアＤＮＡにコードされるタンパク質が、ミトコンドリアの膜タンパク質のサブユニットである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質が改変されたことを特徴とする請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の方法によりミトコンドリアへ輸送された前記タンパク質から前記輸送シグナルが切断除去され、切断の結果残ったタンパク質及びその他のサブユニットからミトコンドリア膜タンパク質が形成されることから成る、ミトコンドリア膜タンパク質の製法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法により、ミトコンドリアＤＮＡにコードされるタンパク質の機能を改変する方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法により製造されたミトコンドリア膜タンパク質を有するミトコンドリア。
【請求項１１】
請求項１０に記載のミトコンドリアから外膜が除去されたミトプラスト。
【請求項１２】
請求項１０に記載のミトコンドリアを含む細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、特定のタンパク質を細胞質からミトコンドリアへ輸送する方法に関し、より詳細には、ミトコンドリアＤＮＡにコードされるタンパク質を細胞質からミトコンドリアへ輸送し、ミトコンドリアＤＮＡにコードされるタンパク質の機能を改変する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞内のミトコンドリアは、炭水化物、脂質、タンパク質などがもつ化学エネルギーをＡＴＰの化学エネルギーに変換する役割を持ち、細胞の存続に不可欠であるが、ミトコンドリアにはＤＮＡがあり、２０種のアミノ酸に対応するｔＲＮＡ、そしてリボゾームＲＮＡの遺伝子情報をコードする。すなわちミトコンドリアは独自のタンパク質合成系をもつ。さらにミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）は上述したエネルギー変換反応（呼吸）を触媒する膜酵素の一部サブユニット遺伝子をコードする。
【０００３】
ミトコンドリアＤＮＡを改変する方法として、これまで（Ａ）当該遺伝子を金属微粒子に塗布して、ミトコンドリアに撃ち込み遺伝子導入する方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，　２６４，　２６５−２７８　（１９９６）等）。（Ｂ）化学的にあるいは酵素を使ってｍｔＤＮＡを消失させた細胞株を樹立し、そこに新たなｍｔＤＮＡを導入する方法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　８５，　７２８８−７２９２　（１９８８）等）。（Ｃ）さらに当該遺伝子を核に取り込ませ、細胞質で発現されたタンパク質をミトコンドリアに輸送させミトコンドリアの機能を改変する方法（Ｃｅｌｌ，　４６，　８３７−８４４　（１９８６）等）がすでに知られている。また今回の技術に関連する膜タンパク質の輸送としては、４８個のアミノ酸残基からなる酵母のｍｔＤＮＡにコードされるＡＴＰ合成酵素のサブユニット８（Ｓ　ＶＩＩＩ）がミトコンドリアに輸送されミトコンドリアの機能回復に成功している（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８５，　２０９１−２０９５　（１９８８））。
【０００４】
本発明は、高等動物のｍｔＤＮＡにコードされたマルチ膜貫通タンパク質の機能を改変する方法を開発することを課題とする。ｍｔＤＮＡにコードされたタンパク質の機能改変に採用されてきた従来の方法では、（Ａ）の場合、撃ち込まれたＤＮＡが安定に保持される頻度が低く、また細胞内に数多くあるミトコンドリア全てに当該遺伝子が導入されることはない。したがって本方法はミトコンドリアの機能改変、すなわちミトコンドリア病治療技術としては不適切である。（Ｂ）の場合、遺伝子の改変方法としては原理的に正しい。しかしｍｔＤＮＡを欠失させた細胞株の樹立が必要であり、しかしＤＮＡが消失すると呼吸欠損になるため細胞の増殖が遅いなど問題が予想され、この場合も技術的に難しい。
【０００５】
一方（Ｃ）の方法であるが、ミトコンドリアのタンパク質合成系で使われる独自のコドンを細胞質型に変更させる操作が必要であるが、一連の操作は比較的容易で、短期間で達成可能で、しかもタンパク質の輸送は、全てのミトコンドリアに均等に起こると予想されミトコンドリアの機能改変技術としては望ましい。
これまで（Ｃ）の方法で、失われたミトコンドリアの機能を回復するために、その機能を担うｍｔＤＮＡにコードされる水溶性のタンパク質を輸送し、欠損した機能を部分的にではあるが回復することに成功したことが報告されている（Ｃｅｌｌ，　４６，　８３７−８４４　（１９８６））。
【０００６】
またｍｔＤＮＡにコードされた膜タンパク質の場合も、１回膜貫通型の酵母ＡＴＰ合成酵素のＳ　ＶＩＩＩを同様にミトコンドリアに輸送し機能発現に成功している。しかし８回膜貫通型のチトクロムｂ（呼吸系のｂｃ１複合体のサブユニット）、また１２回膜貫通型のチトクロム酸化酵素のサブユニットＩ（Ｓ　Ｉ）は、ミトコンドリアへの輸送は不可能と報告されている（Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２２８，　７６２−７７１（１９９５））。ここでは輸送シグナルとしてＡＴＰ合成酵素のサブユニット９の輸送シグナルを用いているが、このＴＰ合成酵素のサブユニット９はＮ及びＣ末端の両方がミトコンドリアの膜間空間側に存在している（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８６，　１７００　（１９９９）、上記サブユニット９はこの論文のサブユニットｃに相当する。）。高分子量のタンパク質を輸送することが出来なかった理由は、この輸送シグナルの選択にあったものと考えられる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように従来技術においては、８回膜貫通型のチトクロムｂや１２回膜貫通型のチトクロム酸化酵素のＳ　Ｉのような分子量の大きいタンパク質をミトコンドリアへ輸送することが出来ないため、このようなタンパク質が分子量による制限を受けずにミトコンドリアへ輸送することのできる技術が求められていた。このような技術が可能になれば、ミトコンドリアで合成されるタンパク質を自由に改変することが可能になり、その結果、ミトコンドリアの機能を自由に改変することが可能になり、更に、ミトコンドリアの特定の機能の欠陥を治療する手段をもたらすことができる。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
ミトコンドリアで合成されるタンパク質のうち、ミトコンドリアＤＮＡにコードされるものは一部であり、その他は核ＤＮＡにコードされる。この核ＤＮＡにコードされれたタンパク質は、ミトコンドリアの脂質二重層の外膜と内膜を通過するために、固有の輸送シグナル（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｓｉｇｎａｌ、Ｓｏｒｔｉｎｇ　ｓｉｇｎａｌともいう。）を連結して、ミトコンドリアに輸送される。輸送後、輸送シグナルは切り離される。
【０００９】
本発明者らは、サブユニットの膜内での配向（トポロジー）に注目し、特定のサブユニット固有の輸送シグナルを用いることにより、所望のタンパク質をミトコンドリアに輸送することができることを見出し、本発明を完成させた。
このようなサブユニットは次の条件を満たすものである。１）核ＤＮＡにコードされたミトコンドリアの膜タンパク質のサブユニットである。従って、このサブユニットは細胞質で発現し、ミトコンドリアへ輸送される。２）このサブユニットがミトコンドリアへ輸送され、ミトコンドリアの膜に存在するときに、このサブユニットのタンパク質のＮ末端、好ましくはＮ末端とＣ末端の両方、がミトコンドリアのマトリックス側に存在するサブユニットである。このようなサブユニットとして、２以上の偶数回膜貫通型が適当であると考えられる。このようなサブユニットに固有の輸送シグナルを用いることにより、上記課題を解決することができた。
【００１０】
即ち、本発明は、特定のタンパク質のＮ末端に輸送シグナルを結合させて、このタンパク質を細胞質からミトコンドリアへ輸送する方法であって、この輸送シグナルが、核ＤＮＡにコードされたミトコンドリアの膜タンパク質のサブユニットであって、そのサブユニットがミトコンドリアの膜に存在するときにそのＮ末端、好ましくはＮ末端とＣ末端の両方、がミトコンドリアのマトリックス側に存在するサブユニットの輸送シグナルであることを特徴とする方法である。
【００１１】
このようにして膜タンパク質のサブユニットをミトコンドリアへ輸送してミトコンドリア膜タンパク質を製造することができるので、本発明はまた、このようにして製造されたミトコンドリア膜タンパク質を有するミトコンドリアであり、このミトコンドリアから外膜が除去されたミトプラストであり、更に、このミトコンドリアを含む細胞である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明においては、まずタンパク質のＮ末端に特定の輸送シグナルを結合させる。このような結合方法に特に制限はないが、タンパク質をコードする遺伝子に輸送シグナルをコードする塩基配列を、該タンパク質のＮ末端に相当する端に結合するように、連結して核ＤＮＡに導入すれば、細胞質でタンパク質のＮ末端に輸送シグナルを結合した融合タンパク質を発現させることができる。この場合に、ミトコンドリアと核では遺伝コードに異なるものがあるため、ミトコンドリア遺伝子を核で同じタンパク質をもたらすよう適宜遺伝コードを改変する必要がある。
【００１３】
また本発明の輸送の対象となるタンパク質は、いかなるタンパク質でもよいが、ミトコンドリアＤＮＡにコードされるタンパク質に適用できることが本発明の特徴の一つである。
このようなタンパク質として、本発明で採用した輸送シグナルを本来有しているサブユニットと配向が同じ、即ち、サブユニットがミトコンドリアの膜に存在するときにそのＮ末端とＣ末端の両方がミトコンドリアのマトリックス側に存在するようなサブユニットが最も好ましい。このようなタンパク質として、チトクロムｂやチトクロム酸化酵素のＳ　Ｉのようなミトコンドリアの膜タンパク質のサブユニットが挙げられる。
このような方法は、核ＤＮＡにコードされるタンパク質、特に膜タンパク質にも適用することができる。
また、本発明の方法には、分子量による制限を受けるものではないので、分子量が１０，０００〜６０，０００のように大きいタンパク質に適用できるのも本発明の特徴の一つである。
【００１４】
上記のように、ミトコンドリアへ輸送されたタンパク質に結合していた輸送シグナルは切断除去され、この切断の結果残ったタンパク質はそのままミトコンドリア内で機能してもよいし、またこのタンパク質が、例えば、ミトコンドリア膜タンパク質のサブユニットの一つであるならば、このタンパク質とその他のサブユニットからミトコンドリア膜タンパク質が形成される。
この方法により、ミトコンドリアのタンパク質の機能を改変することができるし、またこのようなタンパク質に欠陥がある場合には正常のものに直すこともできる。
【００１５】
【発明の効果】
本発明の方法は、ミトコンドリアＤＮＡにコードされたマルチ膜貫通タンパク質に依存した様々な機能を人為的に改変させることを可能にする。１２回膜貫通型のチトクロム酸化酵素のＳ　Ｉで成功したことは、これまでミトコンドリアへの輸送不可能と言われていた８回膜貫通型のチトクロムｂについても、このタンパク質が前者のタンパク質と膜内での配向が同じであるので、今回の方法で機能変換が可能である。両タンパク質ともミトコンドリアの呼吸で中心的な役割を担っており、したがってタンパク質の変異によって惹起される重篤な遺伝子疾患の治療が可能になる。また本方法は遺伝病の治療のみならずミトコンドリアの膜タンパク質の機能、機能と構造との関連を研究する際にも有効な方法である。また、核ＤＮＡにコードされる膜タンパク質を新たにミトコンドリアに輸送させ、ミトコンドリアに新規機能を付与させることも可能となる。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
本実施例で対象としたチトクロム酸化酵素は、ミトコンドリアに由来する３つのサブユニット（Ｓ　Ｉ−ＩＩＩ）と核にコードされ細胞質からミトコンドリアに輸送される１０個のサブユニット（Ｓ　ＩＶ−ＸＩＩＩ）からなる。Ｓ　Ｉは本酵素の活性中心を担うもっとも重要なサブユニットである。本実施例では、このＳ　Ｉをミトコンドリアに輸送し機能発現を達成させるため、膜内での配向（トポロジー）が同じであって、Ｎ末端とＣ末端がマトリックス側にあるＳ　ＩＶ（２回膜貫通型）に注目して、そのＮ−末端に結合していたミトコンドリア輸送シグナル（配列番号６）をＳ　ＩのＮ末端に融合させ細胞質からミトコンドリアに輸送させた。
またヒトの遺伝子治療を考慮してヒト培養細胞を選択した。このＳ　ＩＶのミトコンドリア輸送シグナルを利用して細胞質からミトコンドリアへタンパク質が輸送されたことはない。但し、酵母のチトクロム酸化酵素のＳ　ＩＶの輸送シグナルを使った報告（Ｔｈｅ　ＥＭＢＯ　Ｊ．　４，　２０６１−２０６８，　１９８５）があるが、酵母のＳ　ＩＶはほ乳類チトクロム酸化酵素のＳ　Ｖに対応し、膜貫通部分はなく、また輸送シグナルは異なっている。
【００１７】
本実施例では、野生型ウシチトクロム酸化酵素のＳ　Ｉと、Ｓ　ＩのＮ末端から５１番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させた二つの遺伝子をそれぞれヒトのＨｅＬａ細胞の染色体に組み込んだ。ミトコンドリアに輸送させたＳ　Ｉを検知するためＳ　ＩのＣ末端にヒスチジンタグ（ヒスチジンが６つ連続したアミノ酸配列）を付け加えた。機能の検討には、Ｓ　Ｉ遺伝子が染色体に組み込まれた培養細胞を増殖させ、そこからミトコンドリアを調製して、ミトコンドリアのチトクロムｃ酸化活性と水素イオン能動輸送活性を測定した。
【００１８】
Ｓ　Ｉ遺伝子のクローニング
　新鮮なウシ心臓の筋肉からミトコンドリアを調製し、常法によってミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を得た。ウシ心筋のｍｔＤＮＡは、すでに遺伝子配列が決定されているので（Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　１５６，　６８３−７１７　（１９８２））、その配列を利用して、配列番号２及び３に示す合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ法によってＳ　Ｉ遺伝子（図１、配列番号１）のみを増幅させて当該遺伝子をクローン化し、プラスミドｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトに挿入した（図２（Ａ））。このプラスミドをｐＳＩｍと名付けた。なお、配列番号２の合成ＤＮＡの４〜９番目の塩基は制限酵素Ｓａｃ　Ｉ、配列番号３の合成ＤＮＡの４〜９番目の塩基はＰｓｔ　Ｉのそれぞれ切断部位である。増幅されたサブユニットＩ遺伝子は両端に上記の制限酵素切断部位をもつため、切断し得られたＳａｃ　Ｉ−Ｐｓｔ　Ｉ　ＤＮＡ断片を上記のプラスミッドに挿入した。
【００１９】
塩基の改変
　なお、ミトコンドリア遺伝子でＴＧＡとＡＴＡは、それぞれトリプトファンとメチオニンをコードするが、核にそのまま組み込まれると、それらは翻訳停止とイソロイシンに対応するので、Ｓ　Ｉ遺伝子（図１）上の上記配列をそれぞれ細胞質でトリプトファンとメチオニンに翻訳されるようにＴＧＧとＡＴＧに改変した。改変は通常の部位特異的変異方法を用いた。改変した遺伝子を担うプラスミッドをｐＳＩと名付けた。
また５１番目のアスパラギン酸をアスパラギンになるようにｐＳＩの塩基を改変した。塩基の配列とその改変はＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで確認した。
【００２０】
塩基配列ヒスチジンタグの付加と発現ベクターの調製
　上記プラスミッドｐＳＩをＰＣＲの鋳型として、配列番号４の合成ＤＮＡとＴａｋａｒａ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社のｐＵＣ用の逆プライマー（配列番号５）を使用して、ヒスチジンタグをＣ末端にもつＳ　Ｉ遺伝子を増幅させた（図２（Ｂ）上）。配列番号４で示す上記プライマーの３〜８番目の塩基は、制限酵素ＢｇｌＩＩ切断部位、１２〜２９番目の塩基は、ヒスチジンタグをコードする配列と相補的な部分をそれぞれ示す。得られたＳ　Ｉ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＳａｃ　Ｉ−Ｂｇｌ　ＩＩで切断後（図２（Ｂ）中）、ｐＵＣ１８のＳａｃ　ＩとＢａｍ　ＨＩ部位に挿入し（切断された後の突出部位がＢｇｌ　ＩＩのそれと相補的なので結合が可能）、プラスミッドｐＳＩ−ｈｔを得た（図２（Ｂ）下）。
【００２１】
輸送シグナルの付加
　輸送シグナルとなるアミノ酸配列（配列番号６）を以下の方法でＳ　Ｉ遺伝子に結合させた。
２つのオリゴヌクレオチド（配列番号７及び８、配列番号７の３〜８番目はＳａｃ　Ｉ、配列番号８の２〜７番目はＳｐｌ　Ｉ切断部位を示し、配列番号７の３５〜５５番目と配列番号８の２０〜４０番目は相補的配列を示す。）を合成し、これらの相補的配列で２つのＤＮＡを結合させＰＣＲ法で完全な２本鎖ＤＮＡを調製した。
続いて、Ｓａｃ　Ｉで切断し、他端は平滑末端のままｐＵＣ１９のＳａｃ　ＩとＳｍａ　Ｉ部位（Ｓｍａ　Ｉ切断で平滑末端を生じる）に挿入した（図２（Ｃ）上）。ここからＥｃｏ　ＲＩ−Ｓｐｌ　Ｉ　ＤＮＡ断片を切り出した（図２（Ｃ）上の矢印）。
一方ｐＳＩ−ｈｔのＳ　Ｉ遺伝子をＳｐｌ　Ｉ部位をもつ配列番号９のプライマーとＴａｋａｒａ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社のｐＵＣ用ユニバーサルプライマー（配列番号１０）で増幅し（図２（Ｃ）中）、得られたＤＮＡ断片をＳｐｌ　ＩとＰｓｔ　Ｉで切断して（図２（Ｃ）中の矢印）、上記のＥｃｏ　Ｉ−ＳｐＩ　Ｉ　ＤＮＡ断片と併せてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳに挿入し、プラスミッドｐＢ／ＳＩＷを得た（図２（Ｃ）下）。
【００２２】
発現ベクターの調製
　プラスミッドｐＢ／ＳＩＷからＨｉｎｄ　ＩＩＩとＮｏｔ　ＩでＳ　Ｉ遺伝子を切り出し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のプラスミッドｐＲｃ／ＣＭＶに挿入し、発現ベクターｐＳＩｗｔ（野生型）を得た。
５１番目のアミノ酸をアスパラギンに変異させたサブユニットＩ（変異Ｓ　Ｉ）も上と同様に処理してｐＳＩ５１ｎを得た。
【００２３】
培養細胞への組み込み
　上記２種のプラスミッド（ＳＩｗｔ、ｐＳＩ５１ｎ）をそれぞれＨｅＬａ細胞にＱｉａｇｅｎのＥｆｆｅｃｔｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔを用いて感染させ、１０％のｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ培地で培養し、つづいて抗生物質であるｇｅｎｅｔｉｃｉｎ存在下で増殖するコロニーを選択した。
【００２４】
ミトコンドリアの調製と活性測定
　これら２種の培養細胞を、それぞれｇｅｎｅｔｉｃｉｎを含む上記培地で培養し、シャーレ内で細胞が１００％コンフルエントになると培養を止め、細胞を集めた。得られた細胞を０．２Ｍ　ショ糖と０．５ｍＭ　ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）緩衝液中でポッター型硝子攪拌装置（フッ素樹脂ペッスル）を用いて細胞を破壊し、常法によりミトコンドリアを得た。さらに常法通りにミトコンドリアを低張液で処理して０．２Ｍ　ショ糖と０．０２％牛血清アルブミンを含む１ｍＭ　ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．０）に懸濁してミトコンドリアの外膜が破壊されたミトプラストを調製した。野生型のＳ　Ｉを発現させた細胞から得たミトプラストを「ＷＴ」、変異Ｓ　Ｉのミトプラストを「Ｄ５１Ｎ」で表す。
【００２５】
ウエスタンブロット法によるサブユニットＩの検出
　上記のように調製したミトプラストを０．１％ＳＤＳに溶かし常法によってＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動を行い、ＰＶＤＦ膜に転写したのちヒスチジンタグ抗体と反応させた。その結果を図３に示す。図３（２）はＷＴのもの、図３（３）はＤ５１Ｎのものを示す。両者とも、精製ウシチトクロムｃ酸化酵素のＳ　Ｉと同じ移動度のところにタンパク質の存在を認めた。
一方、Ｓ　Ｉ遺伝子をもたないプラスミッドｐＲｃ／ＣＭＶを組み込ませたＨｅＬａ細胞（ｍｏｃｋ細胞）から調製したミトプラストには、上記のタンパク質は認められなかった（図３（１））。
【００２６】
チトクロムｃ酸化活性の測定
　還元型ウマチトクロムｃを調製して上記ミトプラストと２５℃で反応させた。還元型チトクロムｃは５５０ｎｍに鋭い吸収示すが、酸化され酸化型になると、その吸収は消失する（図４）。そこで還元型チトクロムｃの酸化活性を５５０ｎｍの波長で追跡した。
反応液（６６０μｌ）は以下の通り。１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．０）の緩衝液で、５０ｍＭ　ＫＣｌ，０．２Ｍ　ショ糖，４０ｎｍｏｌ／ｍｇ　Ｎエチルマレイミド、０．２ｎｍｏｌ／ｍｇ　アンチマイシンＡ、４５ｐｍｏｌ／ｍｇ　バリノマイシン、２．０μＭ　ロテノン、１１．３ｎｍｏｌ／ｍｌ　オリゴマイシン、と１．０μＭミクソチアゾールを含む。ミトプラストは約５０μｇを加えた。
【００２７】
反応は８．４ｎｍｏｌの還元型チトクロムｃを添加して始めた。チトクロムｃによりチトクロムｃ酸化酵素に電子が送り込まれると、チトクロムｃは酸化型となり、５５０ｎｍの吸収が減少する。その様子を図５に示す。
野生型Ｓ　Ｉ（ＷＴ）を発現している細胞から調製したミトプラストはシアンによって阻害される速やかなチトクロムｃ酸化活性を示し（図５左）、活性はｍｏｃｋ細胞から得たミトプラストとほぼ同じであった。
一方、変異Ｓ　Ｉ（Ｄ５１Ｎ：５１番目のアミノ酸をアスパラギンに変異させたサブユニットＩ）を発現しているミトプラストも速やかなチトクロムｃ酸化活性を示した（図５右）。比活性で比較すると、むしろ野生型のＳ　Ｉを含むミトプラストより３０％程高かったが、ほぼ同じと考えられる。
【００２８】
水素イオン能動輸送活性の測定
　また上記と同様の２種のミトプラストについて水素イオンの能動輸送活性を測定した。水素イオンの能動輸送活性は、上と同じ反応液の条件だが、緩衝液の濃度は０．５ｍＭに下げた。反応液中の水素イオン濃度の変化はベックマン社のｐＨメーターモデルφ６６０と同社の複合電極（ＢＥＣＫＭＡＮ、５１１０８２）を使った。測定は還元型チトクロムｃの添加によって起こる反応液の水素イオン濃度変化を追跡した。その結果を図６に示す。下方ほど水素イオン濃度は高い。
【００２９】
還元型チトクロムｃの添加後、野生型のＳ　Ｉを発現しているミトプラスト（ＷＴ）では、顕著な反応液の酸性化が起こった（図６（Ａ）、ａで示す領域）。しかし時間経過とともに反応液はアルカリ化した。これは還元型チトクロムｃが酸化されると、同時に酸素は水に還元され水素イオンがミトプラスト内で消費された結果である。ミトプラストの膜は水素イオンを通し難いが完全ではないので非酵素的に水素イオンが膜を通過する。これはｂａｃｋｆｌｏｗとしてよく知られた現象である。反応開始後の酸性化（図６（Ａ）、ａで示す領域）は、本酵素による水素イオンの能動輸送の結果であり、膜が水素イオン通しにくいために過渡的に観察される。
しかし、反応開始前に脱共役剤（ｐ−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｏｘｙ　ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｃｙａｎｉｄｅ　ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｏｎｅ）を１０μｇ加えて、水素イオンが膜の中を自由に出入りできるようにすると、最初の酸性化は消失した（図６（Ｂ））。
【００３０】
変異酵素（Ｄ５１Ｎ）の場合は、還元型チトクロムｃの添加によって起こる酸性化が起こらなかった（図６（Ｃ））。これは水素イオンの能動輸送が顕著に減少した、あるいは消失したことを示す。
この結果は、変異によって培養細胞のチトクロムｃ酸化活性はほとんど影響を受けなかったものの、もう一方の機能である水素イオン能動輸送活性が顕著に低下したことを示す。この実験事実は、細胞質からミトコンドリアに輸送されたウシＳ　Ｉによってミトコンドリアの機能改変が実現したことを示す。
【００３１】
【配列表】
2004041067.tif 000002
2004041067.tif 000003
2004041067.tif 000004
2004041067.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】ウシ心臓の筋肉から調製したミトコンドリアのＳ　Ｉ遺伝子を示す図である。ＴＧＡ（一重下線）とＡＴＡ（二重下線）は、それぞれＴＧＧとＡＴＧに改変した。
【図２】Ｃ端にヒスチジンタグ及びＮ端に輸送シグナルを結合させたウシチトクロムｃ酸化酵素のサブユニットＩの発現ベクターを作製する過程を示す図である。
【図３】精製ウシチトクロムｃ酸化酵素のＳ　Ｉと同じ移動度におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。（１）は、Ｓ　Ｉ遺伝子をもたないプラスミッドｐＲｃ／ＣＭＶを組み込ませたＨｅＬａ細胞（ｍｏｃｋ細胞）から調製したミトプラストのもの、（２）はプラスミッド（ＳＩｗｔ）を感染させたＨｅｌａ細胞から得たミトプラスト（ＷＴ）のもの、（３）はプラスミッド（ｐＳＩ５１ｎ）を感染させたＨｅｌａ細胞から得たミトプラスト（Ｄ５１Ｎ）のものを示す。
【図４】ウマチトクロムｃの吸収スペクトルを示す図である。還元型チトクロムｃは５５０ｎｍに鋭い吸収示すが、酸化型ではそれが消失する。
【図５】チトクロムｃ酸化活性を示す図である。縦軸は５５０ｎｍの吸光度を示し、減少（下方）は酸化が起こっていることを示す。横軸は時間を示す。傾きが急なほど活性が強いことを示す。白抜き矢印は還元型チトクロムｃの添加を示す。左（ＷＴ）は、野生型Ｓ　Ｉを発現している細胞から調製したミトプラスト、右（Ｄ５１Ｎ）は、変異Ｓ　Ｉ（５１番目のアミノ酸をアスパラギンに変異させたサブユニットＩ）を発現しているミトプラストのものを示す。
【図６】水素イオンの能動輸送活性を示す図である。縦軸は、水素イオン濃度を示し、下方ほど水素イオン濃度は高い。横軸は時間を示す。白抜き矢印は還元型チトクロムｃの添加を示す。（Ａ）はＷＴのもの、（Ｂ）はＷＴに脱共役剤を加えたもの、（Ｃ）はＤ５１Ｎのものを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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