(57)【要約】【課題】安価且つ簡単な方法で正確に口腔内のストレプトコッカスソブリヌスの存在を確認することが可能なストレプトコッカスソブリヌス検査キットを提供する。【解決手段】ストレプトコッカスソブリヌスに適した液体培地と、ストレプトコッカスソブリヌスとのみ結合しうる抗体が担時された担体と、先の担体に担持されたものとは別のストレプトコッカスソブリヌスとのみ結合しうる抗体に識別物質を結合させた標識抗体を含む液体とから成るストレプトコッカスソブリヌス検査キット、又は、ストレプトコッカスソブリヌスに適した液体培地と、ストレプトコッカスソブリヌスとのみ結合しうる抗体及び先の抗体とは別のストレプトコッカスソブリヌスとのみ結合しうる抗体に識別物質を結合させた標識抗体が担持された担体とから成るストレプトコッカスソブリヌス検査キットとする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトコッカスソブリヌスに適した液体培地と、ストレプトコッカスソブリヌスとのみ結合しうる抗体が担時された担体と、先の担体に担持されたものとは別のストレプトコッカスソブリヌスとのみ結合しうる抗体に識別物質を結合させた標識抗体を含む液体とから成るストレプトコッカスソブリヌス検査キット。
【請求項２】
標識抗体を含む液体がストレプトコッカスソブリヌスに適した液体培地に予め含まれている請求項１に記載のストレプトコッカスソブリヌス検査キット。
【請求項３】
ストレプトコッカスソブリヌスに適した液体培地と、ストレプトコッカスソブリヌスとのみ結合しうる抗体及び先の抗体とは別のストレプトコッカスソブリヌスとのみ結合しうる抗体に識別物質を結合させた標識抗体が担持された担体とから成るストレプトコッカスソブリヌス検査キット。
【請求項４】
ストレプトコッカスソブリヌスに適した液体培地が、バシトラシン，グラミシジン，コリスチンから選ばれる少なくとも１種の抗生物質が含有されている、ブレインハートインフュージョン培地，コロンビアＣＮＡ５％ヒツジ血液培地，Ｄ−コッコセル培地，コロンビア５％ヒツジ血液培地，フェニルエタノール培地，アザイド血液培地，Ｍ１７培地，トリプトソーヤ培地，チオグリコール酸培地，羊血液培地，トリプケースソイ培地，ＬＴ１００培地，チョコレート培地から選ばれる少なくとも１種である請求項１から３の何れか１項に記載のストレプトコッカスソブリヌス検査キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は口腔内に存在する齲触原生細菌の中でも特にストレプトコッカスソブリヌスを選択してその存在を確認することが可能なストレプトコッカスソブリヌス検査キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
齲蝕は歯という人体で最も硬い組織が口腔内に常在するミュータンス連鎖球菌等の齲蝕原生細菌によって不可逆的に破壊される特異な細菌感染症である。ヒトの口腔内に於ける齲蝕原生細菌の存在と齲蝕の発生との間には密接な関係があることが知られており、ヒトの口腔内の齲蝕原生細菌の有無を簡便に検査できれば将来の罹患リスクや現状の罹患状況の把握ができ、極めて多くの人々に恩恵をもたらすことが可能である。従って、口腔内のミュータンス連鎖球菌の有無を判定する目的にも利用できるミュータンス連鎖球菌を選択的に培養する培地が提案されている（特許文献１参照。）。
【０００３】
ところで、ヒトの口腔内に常在して齲蝕を引き起こす齲蝕原性細菌とは、前述のように一般的にはミュータンス連鎖球菌を指す。このミュータンス連鎖球菌はストレプトコッカスミュータンスとストレプトコッカスソブリヌスの２種類の菌を意味している。実際にはストレプトコッカスソブリヌスを保有している人は１０人中１人か２人程度しかおらず、その数の割合もストレプトコッカスミュータンスと比較して少ない。
【０００４】
このストレプトコッカスソブリヌスがストレプトコッカスミュータンスと異なる点として、菌体にグルカンを微量加えると短時間で肉眼的にも明らかな凝集反応を起こすという特徴がある。このためストレプトコッカスソブリヌスは複数の酵素を産生することによりグルカンを生成して歯の平滑面に強固に付着する。従ってストレプトコッカスソブリヌスはストレプトコッカスミュータンスと比較して齲蝕原性が高いといえる。実際、ストレプトコッカスミュータンス単種に感染した口腔内と比較してストレプトコッカスミュータンス及びストレプトコッカスソブリヌスの２種類の菌から成るミュータンス連鎖球菌に感染した口腔内の方が齲蝕誘発性が高いことが知られている。これらのことから、被験者がストレプトコッカスソブリヌスを保有するか否かの判定を行うことは齲蝕リスクの判定に非常に重要である。
【０００５】
しかしながら、ストレプトコッカスミュータンスとストレプトコッカスソブリヌスを区別してその存在を判定することは非常に困難である。ストレプトコッカスソブリヌスの存在を確認するための方法の中で最も安価な方法は、培養して採取した菌を増殖させ判定する方法である。しかし、培養にはミュータンス連鎖球菌に一般的に利用されているＭＳＢ培地や前述したようなミュータンス連鎖球菌専用の培地を用いることになるため、ミュータンス連鎖球菌、即ちストレプトコッカスソブリヌスだけでなくストレプトコッカスミュータンスまでも増殖させてしまうことになりストレプトコッカスソブリヌスだけを増殖させその菌数から存在の判定を行うことは不可能であった。
【０００６】
また、簡便に利用できる方法として抗原抗体反応を利用した方法も数多く考案されている（例えば、特許文献２〜７参照。）。しかし、これらの抗原抗体反応を利用した方法は、ストレプトコッカスソブリヌスが単種又は他の菌と比較して多くの割合で存在している場合に限って有効となるものであり、ストレプトコッカスソブリヌスがストレプトコッカスミュータンスと同じか又は少ないレベルで存在している場合では正確なストレプトコッカスソブリヌスの存在の有無を判定することはできなかった。これは、ミュータンス連鎖球菌をサンプルとした場合では相対的に数の少ないストレプトコッカスソブリヌスでは判定に必要な感度が得られないこと、更に、感度を得るためにサンプルのミュータンス連鎖球菌全体を増やすと、抗原抗体反応を利用する方法に用いる多孔質膜中を毛細管現象によってサンプルが通過できなくなってしまい検査が不可能となってしまうからである。また、遺伝子レベルで両者を同定する手法もあるが、これには煩雑な操作と高価な機械と高度な技術を必要とするので一般的ではない。
【０００７】
特許文献１  特開２０００−２７９７５号公報
特許文献２  米国特許第５５９１６４５号公報
特許文献３  米国特許第４８５５２４０号公報
特許文献４  米国特許第４４３５５０４号公報
特許文献５  米国特許第４９８０２９８号公報
特許文献６  特開昭６１−１４５４５９号公報
特許文献７  特開平６−１６０３８８号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明は、口腔内に於けるストレプトコッカスソブリヌスの存在を安価且つ簡単な方法で正確に確認することが可能なストレプトコッカスソブリヌス検査キットを提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は前述の課題を解決するために鋭意検討した結果、特定の培地でストレプトコッカスソブリヌスを優先的に培養し、その後、培養されたストレプトコッカスソブリヌスを抗原抗体反応により検出する検査キットとすると前記課題の解決が可能であることを見いだし本発明を完成した。
【００１０】
【発明の実施の形態】
即ち本発明の一つは、ストレプトコッカスソブリヌスに適した液体培地と、ストレプトコッカスソブリヌスとのみ結合しうる抗体が担時された担体と、先の担体に担持されたものとは別のストレプトコッカスソブリヌスとのみ結合しうる抗体に識別物質を結合させた標識抗体を含む液体とから成るストレプトコッカスソブリヌス検査キットであり、このとき、標識抗体を含む液体がストレプトコッカスソブリヌスに適した液体培地に予め含まれていても良い。もう一つの発明としては、ストレプトコッカスソブリヌスに適した液体培地と、ストレプトコッカスソブリヌスとのみ結合しうる抗体及び先の抗体とは別のストレプトコッカスソブリヌスとのみ結合しうる抗体に識別物質を結合させた標識抗体が担持された担体とから成るストレプトコッカスソブリヌス検査キットである。また何れの発明に於いても、ストレプトコッカスソブリヌスに適した液体培地がバシトラシン，グラミシジン，コリスチンから選ばれる少なくとも１種の抗生物質が含有されている、ブレインハートインフュージョン培地，コロンビアＣＮＡ５％ヒツジ血液培地，Ｄ−コッコセル培地，コロンビア５％ヒツジ血液培地，フェニルエタノール培地，アザイド血液培地，Ｍ１７培地，トリプトソーヤ培地，チオグリコール酸培地，羊血液培地，トリプケースソイ培地，ＬＴ１００培地，チョコレート培地から選ばれる少なくとも１種であると好ましいことも見いだしたのである。
【００１１】
本発明に係るストレプトコッカスソブリヌス検査キットに用いるストレプトコッカスソブリヌスに適した液体培地は、ストレプトコッカスソブリヌスを他の菌は勿論、ストレプトコッカスミュータンスに対しても優先的に培養することが可能である培地を示す。具体的には、バシトラシン，グラミシジン，コリスチンから選ばれる少なくとも１種の抗生物質が含有されている、ブレインハートインフュージョン培地，コロンビアＣＮＡ５％ヒツジ血液培地，Ｄ−コッコセル培地，コロンビア５％ヒツジ血液培地，フェニルエタノール培地，アザイド血液培地，Ｍ１７培地，トリプトソーヤ培地，チオグリコール酸培地，羊血液培地，トリプケースソイ培地，ＬＴ１００培地，チョコレート培地から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。なお、バシトラシン，グラミシジン，コリスチンから選ばれる少なくとも１種の抗生物質が含有されているミティスサリバリウス変法培地や一般的なＭＳＢ培地等ではストレプトコッカスミュータンスに対しても優先的に培養することはできない。
【００１２】
本発明に係るストレプトコッカスソブリヌス検査キットに用いられる液体培地に含有されている抗生物質は、その種類によって液体培地に対する好適な含有量が異なる。バシトラシンの場合は、液体培地１Ｌに対して５０〜１０００ユニットが好ましく、５０ユニット未満だと液体培地に夾雑物が多量に増殖してしまう傾向があり、これは検査の精度を低下させたり多孔質膜の目詰まりを起こす原因となる。また、１０００ユニットを超える量を配合するとストレプトコッカスソブリヌス自体の増殖に悪影響を及ぼす虞があり、より好ましくは１００〜５００ユニットである。グラミシジンの場合は液体培地１Ｌに対して０．１〜１０ｍｇ含有されていることが好ましく、その理由はバシトラシンに準じ、より好ましいのは０．５〜４ｍｇである。コリスチンの場合は液体培地１Ｌに対して１〜１００ｍｇ含有されていることが好ましく、その理由はバシトラシンに準じ、より好ましいのは２〜２０ｍｇである。
【００１３】
前記ストレプトコッカスソブリヌスに適した液体培地により培養されたストレプトコッカスソブリヌスを、抗原抗体反応を利用した方法により検出する。抗原抗体反応を用いた検出方法としては従来の方法に準じた方法が制限無く利用でき、具体的にはストレプトコッカスソブリヌスとのみ結合しうる抗体が担時された担体と、先の担体に担持された抗体とは別のストレプトコッカスソブリヌスとのみ結合しうる抗体に識別物質を結合させた標識抗体を含む液体とを用いたり、ストレプトコッカスソブリヌスに適した液体培地と、ストレプトコッカスソブリヌスとのみ結合しうる抗体及び先の抗体とは別のストレプトコッカスソブリヌスとのみ結合しうる抗体に識別物質を結合させた標識抗体が担持された担体を用いる。
【００１４】
ストレプトコッカスソブリヌスとのみ結合しうる抗体が担時された担体としてはストレプトコッカスソブリヌスを含む液体培地が浸透可能な多孔質膜等の液体吸収性材料であれば特に限定されないが、具体的には原料として、例えば濾紙，吸い取り紙，紙タオル等の紙質の材料が好ましい。その他にも脱脂綿，石英ウール，ガラスウール，ウール，絹，綿，麻，アクリル，レーヨン，ナイロン，ニトロセルロース，酢酸セルロース，再生セルロース等の繊維からなる布や不織布が適している。また、デキストラン，ムタン，レバン，セルロースパウダーを管に詰めたものや固形に成形したもの等も使用可能であり、最も好ましいのは紙質の材料やニトロセルロースの膜状の担体である。ストレプトコッカスソブリヌスとのみ結合しうる抗体が担時された担体の形状としては、液体培地の移動が確認しやすい形状であれば特に限定されないが、厚さ０．２〜２ｍｍ，幅２〜２０ｍｍ，長さ５〜２００ｍｍ程度の短冊状や方形であったり、直径２〜１００ｍｍ程度の円形であることが好ましい。
【００１５】
本発明に係るストレプトコッカスソブリヌス検査キットに用いる担体に担持されたものとは別のストレプトコッカスソブリヌスとのみ結合しうる抗体に識別物質を結合させた標識抗体を含む液体は、担体に担時されている抗体とは別のストレプトコッカスソブリヌスとのみ結合しうる抗体に標識物質として一般的にラテックス粒子や金コロイド粒子といったものを結合させた標識抗体を含む液である。この標識抗体を含む液体は抗体が破壊されることなく担体へ含まれることが可能な液体であれば特に限定されないが、一般的な培養液であることが好ましい。
【００１６】
本発明に係るストレプトコッカスソブリヌス検査キットは、ストレプトコッカスソブリヌスに適した液体培地にてストレプトコッカスソブリヌスを選択的に培養した後は従来と同様の抗原抗体反応を用いてストレプトコッカスソブリヌスの存在を判定する。即ち、被験者の唾液を採取しストレプトコッカスソブリヌスに適した液体培地にてストレプトコッカスソブリヌスを選択的に培養し、培養後の培養液に、担体に担持されたものとは別のストレプトコッカスソブリヌスとのみ結合しうる抗体に識別物質を結合させた標識抗体を含む液体を適量混合してから先のストレプトコッカスソブリヌスとのみ結合しうる抗体が例えば帯状に担時されている例えば短冊状の担体の一端に滴下等により接触させる。標識物質としては一般的にラテックス粒子や金コロイド粒子といったものが利用される。
【００１７】
培養液中で標識抗体がストレプトコッカスソブリヌスに結合してストレプトコッカスソブリヌスが標識され、この標識されたストレプトコッカスソブリヌスが担体中を毛細管現象により移動してストレプトコッカスソブリヌスとのみ結合しうる抗体が担時されている場所でこの抗体に捕捉され可視シグナルとして（この場合では帯状に）検出されるのである。
【００１８】
本発明に係るストレプトコッカスソブリヌス検査キットに於いては、標識抗体を含む液体がストレプトコッカスソブリヌスに適した液体培地に予め含まれていると検査の度に標識抗体を含む液体を培養後のストレプトコッカスソブリヌスに適した液体培地に混合する必要がないので好ましい。
【００１９】
また、ストレプトコッカスソブリヌスに適した液体培地と、ストレプトコッカスソブリヌスとのみ結合しうる抗体及び先の抗体とは別のストレプトコッカスソブリヌスとのみ結合しうる抗体に識別物質を結合させた標識抗体が担持された担体とから成るストレプトコッカスソブリヌス検査キットを用いる場合には、被験者の唾液を採取してストレプトコッカスソブリヌスに適した液体培地にてストレプトコッカスソブリヌスを選択的に培養し、培養後の培養液をストレプトコッカスソブリヌスとのみ結合しうる抗体が例えば帯状に担時されており、且つ先の抗体とは別のストレプトコッカスソブリヌスとのみ結合しうる抗体に識別物質を結合させた標識抗体が担持された例えば短冊状の担体の一端に滴下等により接触させる。
【００２０】
この場合、標識抗体を担体に予め担時させる場所は、担体に担時されているストレプトコッカスソブリヌスとのみ結合しうる抗体の存在する場所を除く、更に液体培地が担体を通過する場所である必要がある。また、標識抗体を予め含ませる場所が培養後のストレプトコッカスソブリヌスに適した液体培地が接触される箇所と同じ場所であると確実且つ速やかに標識抗体により標識されるために好ましい。
【００２１】
【実施例】
＜ストレプトコッカスソブリヌスに適した液体培地＞
表１に示すように、ブレインハートインフュージョンの液体培地１Ｌに対して抗生物質を添加し液体培地とした。
【００２２】
＜担体＞
プラスティックフィルムで裏打ちをしたニトロセルロースメンブレン（商品名：ＳＸＨＦ，日本ミリポア社製）を担体として用いた。この膜を５ｍｍ×４０ｍｍの長方形に切り出し、ストレプトコッカスソブリヌスとのみ結合しうる抗体を１％ウシ血清アルブミン含有５０ｍｍｏｌリン酸緩衝液に１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように希釈し、この抗体希釈液を切り出したニトロセルロースメンブレンの中央部、長手方向と直角にマイクロピペットで凡そ１μＬ／ｃｍとなるように塗布した。この膜の一方の端に１５ｍｍ四方の濾紙を密着するようにクリップで固定し吸水体とした。また、実施例７、８及び比較例２に用いた担体は、吸水体と反対側の端（液体培地を滴下する側の端）に標識抗体の保持体として５ｍｍ×２０ｍｍのポリプロピレン製マトリクス（商品名：クイックリリース  コンジュゲートパッド，日本ミリポア社製）をクリップで固定し、標識抗体である金コロイド標識した抗ストレプトコッカスソブリヌスモノクローナル抗体（Ｏ．Ｄ．１．０  ５２０ｎｍ）を含む液体を３０μＬ滴下した。この器具を３７℃で２時間乾燥し、使用直前までデシケーター中に保管し担体を得た。
【００２３】
＜標識抗体＞
識別物質として粒径４０ｎｍの金コロイドを、担体に担時された抗体とは別の抗体に結合させ標識した。金コロイドは市販品（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｂｉｏｃｅｌｌ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）のものを使用し、ウシ血清アルブミン（商品名：ＢＳＡ、ＳＩＧＭＡ社製）１％、非イオン性界面活性剤（商品名：Ｔｗｅｅｎ２０，ＳＩＧＭＡ社製）１％を添加したＰＢＳで抗体濃度０．１μｇ／ｍＬとなるように希釈した。
【００２４】
＜実施例１〜８＞
被験者３名から唾液を採取し、各唾液０．０５ｍＬを表１に記載の実施例毎の培養液１ｍＬに添加し３７℃にて１晩培養した。実施例１〜８及び比較例１、２に各液体培地０．１ｍＬに対して界面活性剤（商品名  ＴｒｉｔｏｎＸ１００，ＳＩＧＭＡ社製）を１重量％添加した。実施例１〜３及び比較例１には各培養液０．１ｍＬに金コロイド標識した抗ストレプトコッカスソブリヌスモノクローナル抗体（Ｏ．Ｄ．１．０  ５２０ｎｍ）を２０μＬ添加した。なお、実施例４〜６は表１に記載してあるように予め液体培地に金コロイド標識した抗ストレプトコッカスソブリヌスモノクローナル抗体（Ｏ．Ｄ．１．０  ５２０ｎｍ）を含む液体を添加した。また、実施例７，８及び比較例２は前述のように標識抗体を予め担体の端部に含ませてある。
【００２５】
各実施例の液体培地１００μｌを担体の吸水体に滴下し、担体中央部の捕捉抗体を結合させた箇所に帯状の発色が見られるかを確認し、発色が確認された場合を○，見られなかった場合を×とした。結果を表１に纏めて示す。
【００２６】
＜ストレプトコッカスソブリヌスの保有の確認＞
被験者３名の唾液から遺伝子を抽出し、ＰＣＲ（遺伝子増幅技術）にてストレプトコッカスソブリヌスの保有の有無を調べた結果、被験者１と３はストレプトコッカスソブリヌスを保有しており、被験者２はストレプトコッカスソブリヌスを保有していないことが確認された。
【００２７】
表１
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【００２８】
【発明の効果】
以上、詳述したように本発明に係るストレプトコッカスソブリヌス検査キットは、従来困難であったストレプトコッカスソブリヌスの口腔内での存在の有無を安価且つ簡単な方法で正確に検査することが可能なストレプトコッカスソブリヌス検査キットであり、口腔衛生に貢献するところ非常に大なるものである。