(57)【要約】【課題】多数のＤＮＡ分子を、クローニングすることなく連結方向を規定しながら効率的に順次連結させることができる方法を提供する。【解決手段】ＤＮＡ分子の固相連結において、固相に固定化され、非回文配列を突出末端に有する固定化ＤＮＡ分子に対して、ＤＮＡ分子の両端に互いに相補的でない非回文配列を備えさせるようにする。このとき、このような連結ＤＮＡ分子の両端を、制限酵素を用いて創出するのにあたり、制限酵素の切断効率の変動などを回避して、適切な連結ＤＮＡ分子を得るようにする。これにより、正確な連結を確保する一方、不要な会合や連結が回避され、少量の連結ＤＮＡ分子で高い連結効率を得ることができる。【選択図】図１
2004041083.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖ＤＮＡ分子を合成する方法であって、
（ａ）非回文配列を含む突出末端を有する二本鎖ＤＮＡ分子が固定化された固相を準備する工程、
（ｂ）固定化された二本鎖ＤＮＡ分子から突出される前記非回文配列と相補的な第１の非回文配列を含む突出末端を連結しようとする端部に有し、固定化された二本鎖ＤＮＡ分子から突出される前記非回文配列と非相補的な第２の非回文配列を含む突出末端を他方の端部に有する連結すべき二本鎖ＤＮＡ分子を前記固相に供給し、固定化された二本鎖ＤＮＡ分子に連結すべき二本鎖ＤＮＡ分子を連結する工程、
（ｃ）前記固定化された二本鎖ＤＮＡ分子に対して未反応の二本鎖ＤＮＡ分子を反応
系から除去する工程、および
（ｄ）必要に応じて、工程（ｂ）および（ｃ）を繰り返す工程、を含む方法。
【請求項２】
前記連結二本鎖ＤＮＡ分子の両突出末端の第１及び第２の非回文配列は、それぞれ制限酵素による切断部位近傍の配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記制限酵素は、ＳｆｉＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｇｌＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＥａｒＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＰｆｉＭＩ、ＳｆａＮＩ、及びＶａｎ９１Ｉからなる群より選択される、１種あるいは２種以上である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
３以上の二本鎖ＤＮＡ分子を順次連結する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記（ｂ）工程に先だって、以下の工程：
（ｅ）切断面に第１の非回文配列を生じさせる制限酵素認識部位と第２の非回文配列を生じさせる制限酵素部位を有する二本鎖ＤＮＡ分子前駆体であって、これらの制限酵素部位は、同一あるいは異なる制限酵素による制限酵素認識部位であって、切断部位近傍の数個の塩基が相互に異なるように設定されている、二本鎖ＤＮＡ分子前駆体を、前記制限酵素で処理することにより、前記二本鎖ＤＮＡ分子を取得する工程を備える、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記制限酵素認識部位は、５’−ＧＧＣＣＮ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５ＧＧＣＣ−３’（ただし、Ｎ１〜Ｎ５は、それぞれ独立に、Ａ，Ｃ，Ｇ及びＴから選択される。）である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記（ｅ）工程で得られる前記二本鎖ＤＮＡ分子を精製する工程を備える、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記（ｂ）工程に先だって、以下の工程：
（ｆ）第１の非回文配列を切断面に生じさせる制限酵素認識部位を含み、その５’側に互いに親和性を有する一対の分子のうち一方の分子が連結された第１のプライマーと、前記第２の非回文配列を切断面に生じさせる制限酵素認識部位を含み、その５’側に前記一方の分子が連結された第２のプライマー、とを用いて増幅しようとする塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡ分子をＰＣＲ法により増幅する工程と、
（ｇ）増幅した断片を、前記第１の非回文配列と前記第２の非回文配列とを生じさせる同一あるいは異なる制限酵素で処理する工程と、
（ｈ）前記制限酵素処理物を前記他方の分子と接触させて、前記一対の分子の親和性により、前記一方の分子を５’側に維持する増幅断片を前記制限酵素処理物から分離して、前記第１の非回文配列と前記第２の非回文配列とを切断面に有する二本鎖ＤＮＡ分子を採取する工程、
とを有する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記第１の非回文配列を生じる制限酵素認識部位及び前記第１の非回文配列を生じる制限酵素認識部位は、いずれも、５’−ＧＧＣＣＮ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５ＧＧＣＣ−３’（ただし、Ｎ１〜Ｎ５は、それぞれ独立に、Ａ，Ｃ，Ｇ及びＴから選択される）である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の非回文配列を生じる制限酵素及び前記第２の非回文配列を生じる制限酵素はＳｆｉＩである、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記一対の分子は、ビオチン系化合物とアジピン系化合物であり、前記一方の分子がビオチン系化合物であり、前記他方の分子がアジピン系化合物である、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
特定の制限酵素切断面を有する二本鎖ＤＮＡ分子の製造方法であって、
少なくとも、目的とする第１の制限酵素切断面を生じさせる制限酵素認識部位を含み、その５’側に互いに親和性を有する一対の分子のうち一方の分子が連結された第１のプライマーを用いて、増幅しようとする塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡ分子を、ＰＣＲ法を用いて増幅する工程と、
増幅した断片を、前記第１の制限酵素切断面を生じさせる制限酵素で処理する工程と、
前記制限酵素処理物を前記他方の分子と接触させて、前記一対の分子の親和性により、前記一方の分子を５’側に維持する増幅断片を前記制限酵素処理物から分離して、目的とする第１の制限酵素切断面を有する二本鎖ＤＮＡ分子を採取する工程、
とを備える、方法。
【請求項１３】
特定の制限酵素切断面を有する二本鎖ＤＮＡ分子の製造方法であって、
目的とする第１の制限酵素切断面を生じさせる制限酵素認識部位を含み、その５’側に互いに親和性を有する一対の分子のうち一方の分子が連結された第１のプライマーと、目的とする第２の制限酵素切断面を生じさせる制限酵素認識部位を含み、その５’側に互いに親和性を有する一対の分子のうち一方の分子が連結された第２のプライマーを用いて、増幅しようとする塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡ分子を、ＰＣＲ法を用いて増幅する工程と、
増幅した断片を、前記第１の制限酵素切断面と前記第２の制限酵素切断面とを生じさせる同一あるいは異なる制限酵素で処理する工程と、
前記制限酵素処理物を前記他方の分子と接触させて、前記一対の分子の親和性により、前記一方の分子を５’側に維持する増幅断片を前記制限酵素処理物から分離して、目的とする第１の制限酵素切断面と第２の制限酵素切断面とを有する二本鎖ＤＮＡ分子を採取する工程、
とを備える、方法。
【請求項１４】
前記第１の制限酵素切断面と前記第２の制限酵素切断面とを生じさせる制限酵素認識部位は、いずれも、５’−ＧＧＣＣＮ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５ＧＧＣＣ−３’（ただし、Ｎ１〜Ｎ５は、それぞれ独立に、Ａ，Ｃ，Ｇ及びＴから選択される）である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記一対の分子は、ビオチン系化合物とアジピン系化合物であり、前記一方の分子がビオチン系化合物であり、前記他方の分子がアジピン系化合物である、請求項１２〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
二本鎖ＤＮＡ分子の精製方法であって、
目的とする第１の制限酵素切断面を生じさせる制限酵素認識部位を含み、その５’側に互いに親和性を有する一対の分子のうち一方の分子が連結された第１のプライマーと、目的とする第２の制限酵素切断面を生じさせる制限酵素認識部位を含み、その５’側に互いに親和性を有する一対の分子のうち一方の分子が連結された第２のプライマーを用いて、増幅しようとする塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡ分子を、ＰＣＲ法を用いて増幅する工程と、
増幅した断片を前記第１の制限酵素切断面と前記第２の制限酵素切断面とを生じさせる同一あるいは異なる制限酵素で処理する工程と、
前記制限酵素処理物を前記他方の分子と接触させて、前記一対の分子の親和性により、前記一方の分子を５’側に維持する増幅断片を前記制限酵素処理物から分離して、目的とする第１の制限酵素切断面と第２の制限酵素切断面とを有する二本鎖ＤＮＡ分子を採取する工程、
とを備える、方法。
【請求項１７】
前記一対の分子は、ビオチン系化合物とアジピン系化合物であり、前記一方の分子がビオチン系化合物であり、前記他方の分子がアジピン系化合物である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記アジピン系化合物は磁気ビーズに固定化されている、請求項１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、固相において二本鎖ＤＮＡ分子を順次連結する方法および順次連結された二本鎖ＤＮＡ分子を製造する方法、並びにこれら方法を利用して得られた二本鎖ＤＮＡ分子の利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物、動物、微生物などの生物の形質を強化したり、これら生物に新たな形質を付与しようとする場合に、一つの遺伝子をコードするＤＮＡ断片の導入のみでは、しばしば初期の目的を達成することができない。この場合、複数の遺伝子を連結して生物に導入することが有効である。また、生物の代謝系を抑制するために、代謝系に関与する遺伝子に対応するアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ断片を
生物に導入する場合においても、複数のＤＮＡ断片を連結して生物に導入することが有効である。そこで、バイオテクノロジー技術の一つとして、多数のＤＮＡ断片を連結する技術の開発が試みられている。
【０００３】
従来、多数のＤＮＡ断片を連結する場合には、通常、一つのＤＮＡ断片毎に、下記（ｉ）から（ｉｉｉ）のサイクルを繰り返し行なっていた。
（ｉ）ＤＮＡ断片の組換え反応を液相にて行う。
（ｉｉ）制限酵素を用いたＤＮＡ断片末端の消化により、ＤＮＡ断片に回文配列末端または平滑末端を生じさせて、ＤＮＡ断片間の連結を行なう。
（ｉｉｉ）大腸菌等に該連結したＤＮＡ断片をクローニングし、クローン株において目的のＤＮＡ断片が挿入されているか制限酵素処理により確認を行なう。
【０００４】
しかしながら、このような作業は煩雑であるばかりか多くの時間と労力を必要とし、また、このサイクルの間、連結したＤＮＡ断片を安定に保持することは難しかった。さらに、ＤＮＡ断片の連結部位に回文配列末端や平滑末端を用いた場合、ＤＮＡ断片の連結方向が一方向に特定されず、逆方向に連結された組換え体が得られるという問題が生じていた。
【０００５】
そこで、ＤＮＡ断片の連結方向を規制する手法の開発が試みられた。例えば、特開平９−９９７９号公報には、ＤＮＡ断片の連結方向を規制するために、ＤＮＡ断片に作用してその末端に非回文配列を生じさせる酵素であるＳｆｉＩの認識部位を持つプラスミドに、ＳｆｉＩ認識部位とそれ以外の酵素の認識部位を持つ断片を挿入し、一つのＳｆｉＩ認識部位を持つプラスミドを作製する方法が開示されている。
また、米国特許第５５９５８９５号公報には、ベクター内に２箇所ＳｆｉＩで切断される部位をアダプター等で挿入して一定方向でクローニングできるベクターを作成する方法が開示されている。このベクターはＳｆｉＩで切断することにより、両末端に非回文配列突出末端を生じる。このベクターに、例えばｃＤＮＡを一定方向でクローニングしたい場合、ＳｆｉＩ切断部位を持つアダプターをｃＤＮＡの両端に付加し、これをＳｆｉＩ処理し、同じくＳｆｉＩ処理したクローニングベクターとの間でライゲーション反応をさせる。
【０００６】
しかしながら、液相系であるこれらの方法を利用して多数のＤＮＡ断片を連絡させる場合には、連結方向を規制するために、連結断片の一方に２個所以上の制限酵素部位が求められる。また、一つのＤＮＡ断片の連結操作毎にクローニング操作が必要となり煩雑である点は、何ら改善されておらず、これら方法により多数のＤＮＡ断片を連結させるためには、多くの労力と時間を要する。さらに、これら公報には、２つのＤＮＡ断片間の連結しか開示されておらず、これら公報に記載の手法では多数のＤＮＡ断片をクローニングすることなく順次連結することはできない。
【０００７】
―方、固相系を利用したＤＮＡ断片の連結に関しては、特開平５−２６０９７２号公報に記載の手法が存在するが、該公報においても２つのＤＮＡ断片の連結しか開示されておらず、また、該公報に記載の手法では、回文配列を用いてＤＮＡ断片を連結させるため、連結方向が規制できないという問題点があった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、多数のＤＮＡ分子を、クローニングすることなく連結方向を規定しながら効率的に順次連結させることができる方法を提供することにある。また、本発明は、該方法を利用して、多数のＤＮＡ分子が連結されたＤＮＡ分子を製造することをも自的とする。さらに、本発明は、該方法を利用して得られたＤＮＡ分子の用途を提供することをも目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、固相系において非回文配列を利用してＤＮＡ分子を連結させることにより、ＤＮＡ分子のクローニングなしに、しかも、連結方向を規定しながらＤＮＡ分子を順次連結させることができることを見出した。また、本発明者らは、この連結反応をより一層規定どおり正確かつ効率的に行い得る手段を見出した。
なお、本発明において「回文配列」とは、その塩基配列が相補鎖の塩基配列と同一になる塩基配列を意味する。たとえば、「５’ＡＣＧＴ」はその相補鎖が「５’ＡＣＧＴ」であり、回文配列である。一方、本発明において、「非回文配列」とは、その塩基配列が相補鎖の塩基配列と同一にならない塩基配列を意味する。たとえば、「５’ＡＴＣＧ」は、その相補鎖が「５’ＣＧＡＴ」であり、両者は同一ではないため非回文配列である。また、塩基配列の塩基数が奇数の場合、塩基の種類（Ａ．Ｃ．Ｇ．Ｔ）に関わらず、当該塩基配列は非回文配列となる。
【００１０】
本発明の方法の原理は以下の如くである。図１に本発明方法の原理の概略を示して説明する。すなわち、まず、突出末端が非回文配列Ａである二本鎖ＤＮＡ分子が固相に固定された状態を得る。図１に例示する形態では、この固定化ＤＮＡ分子はすでに連結しようとするＤＮＡ配列として遺伝子１を含んでいる。
なお、以下の説明において、固相に固定化されたＤＮＡ分子を本明細書において固定化ＤＮＡ分子というものとする。また、二本鎖ＤＮＡ分子は、特に一本鎖であることを記載しない限りは、二本鎖ＤＮＡ分子を意味するものとする。
【００１１】
次いで、この反応系に、固定化ＤＮＡ分子に対して、連結しようとするＤＮＡ分子（以下、このＤＮＡ分子を連結ＤＮＡ分子というものとする。）を、供給する。
連結ＤＮＡ分子は、前記固定化ＤＮＡ分子の前記非回文配列Ａに相補的な非回文配列Ａｃを正しく連結されるべき端部に有している。なお、例示される形態においては、遺伝子２のＤＮＡ配列を含んでいる。
また、この連結ＤＮＡ分子は連結されるべきでない端部に、非回文配列Ｂを有している。ここで非回文配列Ｂは、少なくとも前記非回文配列Ａと相補的でない非回文配列を意味している。
【００１２】
次いで、好ましくはリガーゼ反応により、固定化ＤＮＡ分子と連結ＤＮＡ分子とを結合する。
連結ＤＮＡ分子が上記構成を有することにより、連結ＤＮＡ分子は、前記非回文配列Ａと非回文配列Ａｃとの相補性に基づくハイブリダイズにより、正しい方向ですなわち、予め設定された順序で固定化ＤＮＡ分子に連結され、求めていない方向での連結が回避される。連結されるべきでない他方の端部には、非回文配列Ａと相補的でない非回文配列Ｂを有しているため、この他方の端部が固定化ＤＮＡ分子に連結されることはない。
【００１３】
次いで、未反応のＤＮＡ分子を洗浄により除去する。連結ＤＮＡ分子の数に応じて、反応系へのＤＮＡ分子の添加、リガーゼ反応、洗浄のサイクルを繰り返す。連結されたＤＮＡ分子を得る場合には、さらに、制限酵素処理などにより固相からＤＮＡ分子を分離する。
このようにして、連結ＤＮＡ分子が連結されて固相上に新たに構築された固定化ＤＮＡ分子の自由端には、非回文配列Ｂが備えられている。したがって、正しく連結されるべき端部に非回文配列Ｂに相補的な非回文配列Ｂｃを有する第２の連結ＤＮＡ分子を供給することにより、逐次連結を正確に実施することができる。
【００１４】
従来の液相系でのＤＮＡ分子の連結法においては、反応系から未反応のＤＮＡ分子を除去することができず、ＤＮＡ分子の連結効率が低下し　また、多くのＤＮＡ分子を連結する場合、相補する連結部を有するＤＮＡ分子同士の会合が困難であった。
このため多数のＤＮＡ分子を連結させる場合に、ＤＮＡ分子のクローニングを必要とした。本発明の方法では、ＤＮＡ分子の連結に固相系を利用することにより、液相系のようなクローニングなしで多数のＤＮＡ分子を順次連結させることができ、しかも連結ＤＮＡ分子の突出末端に非回文配列を用いていることにより、連結ＤＮＡ分子の連結方向を規制することもできる。このため本発明の方法によれば複数のＤＮＡ分子を順次連結させる効率を飛躍的に向上させることが可能となった。
【００１５】
なお、上記連結ＤＮＡ分子において、前記非回文配列Ｂが、非回文配列Ａと相補的でないことに加え、前記非回文配列Ａとも相補的でないことが好ましい。すなわち、連結ＤＮＡ分子の非回文配列Ａｃと非回文配列Ｂとが相補的でないことが好ましい。連結ＤＮＡ分子の両端部が互いに相補的でない場合、反応系中の連結ＤＮＡ分子同士の会合や連結が回避される。すなわち、反応系において未結合状態にある連結ＤＮＡ分子同士の連結が回避されている他、固定化ＤＮＡ分子に既に結合した連結ＤＮＡ分子に対する連結ＤＮＡ分子の結合も回避されている。したがって、一つの連結工程において、誤って逐次的な連結が生じることも回避されている。
したがって、このような構成を備える連結ＤＮＡ分子を用いることにより、規定どおりの順序での連結を確実に実現できるとともに、不要なハイブリダイズや結合が効率的に排除されて、より高い連結効率を得ることができる。
【００１６】
したがって、本発明によれば、以下の手段が提供される。
（１）二本鎖ＤＮＡ分子を合成する方法であって、
（ａ）非回文配列を含む突出末端を有する二本鎖ＤＮＡ分子が固定化された固相を準備する工程、
（ｂ）固定化された二本鎖ＤＮＡ分子から突出される前記非回文配列と相補的な第１の非回文配列を含む突出末端を連結しようとする端部に有し、固定化された二本鎖ＤＮＡ分子から突出される前記非回文配列と非相補的な第２の非回文配列を含む突出末端を他方の端部に有する連結すべき二本鎖ＤＮＡ分子を前記固相に供給し、固定化された二本鎖ＤＮＡ分子に連結すべき二本鎖ＤＮＡ分子を連結する工程、
（ｃ）前記固定化された二本鎖ＤＮＡ分子に対して未反応の二本鎖ＤＮＡ分子を反応
系から除去する工程、および
（ｄ）必要に応じて、工程（ｂ）および（ｃ）を繰り返す工程、を含む方法。
（２）前記連結二本鎖ＤＮＡ分子の両突出末端の第１及び第２の非回文配列は、それぞれ制限酵素による切断部位近傍の配列である、（１）に記載の方法。
（３）前記制限酵素は、ＳｆｉＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｇｌＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＥａｒＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＰｆｉＭＩ、ＳｆａＮＩ、及びＶａｎ９１Ｉからなる群より選択される、１種あるいは２種以上である、（２）に記載の方法。
（４）３以上の二本鎖ＤＮＡ分子を順次連結する、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
【００１７】
一方、このような互いに非相補的な非回文配列を両端部に備える連結ＤＮＡ分子を用いて逐次連結を実行するにあたっては、以下の特徴を有する制限酵素、（１）切断面に非回文配列を生じさせる、（２）切断部位近傍の数個の塩基を任意に選択できる、（３）連結しようとする目的の塩基配列中において切断部位を有していないかあるいはほとんどない制限酵素を用いることが好ましい。少なくとも（１）及び（２）の条件を備える制限酵素によれば、切断部位近傍の塩基部位の選択により、互いに非相補的な非回文配列を容易に形成できる。また、両末端を同一の制限酵素の認識部位における塩基の任意的選択により互いに非相補的な非回文配列を得ることがさらに好ましい。さらに、（３）を備える制限酵素を用いれば、容易に連結ＤＮＡ分子を調製できる。
このような制限酵素としては、ＳｆｉＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｇｌＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＥａｒＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＰｆｉＭＩ、ＳｆａＮＩ、及びＶａｎ９１Ｉを挙げることができるが、好ましくは、ＳｆｉＩである。ＳｆｉＩは、５’−ＧＧＣＣＮ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５ＧＧＣＣ−３’（Ｎ１〜Ｎ５は、それぞれ独立に、Ａ，Ｃ，Ｇ及びＴから選択される）を認識部位とし、中央の３塩基Ｎ２Ｎ３Ｎ４が３末端側に突出した形でＤＮＡ分子を切断する制限酵素である。
【００１８】
そこで、本発明によれば、以下の手段が提供される。
（５）前記（ｂ）工程に先だって、以下の工程：
（ｅ）切断面に第１の非回文配列を生じさせる制限酵素認識部位と第２の非回文配列を生じさせる制限酵素部位を有する二本鎖ＤＮＡ分子前駆体であって、これらの制限酵素部位は、同一あるいは異なる制限酵素による制限酵素認識部位であって、切断部位近傍の数個の塩基が相互に異なるように設定されている、二本鎖ＤＮＡ分子前駆体を、前記制限酵素で処理することにより、前記二本鎖ＤＮＡ分子を取得する工程を備える、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記制限酵素認識部位は、５’−ＧＧＣＣＮ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５ＧＧＣＣ−３’（ただし、Ｎ１〜Ｎ５は、それぞれ独立に、Ａ，Ｃ，Ｇ及びＴから選択される。）である、（５）記載の方法。
【００１９】
さらに、本発明者らが、検討を進めた結果、固定化ＤＮＡ分子に対して供給する連結ＤＮＡ分子の両末端にそれぞれ適切な非回文配列を有さない場合、連結工程の効率が著しく低下することを見出した。特に、３以上の連結ＤＮＡ分子を連結する場合において、連結効率の低下が顕著であることがわかった。
すなわち、いずれか片方の端部にしか非回文配列を有さない場合には、所期の連結が実現されないか、あるいはされたとしても、次なる連結ＤＮＡ分子の結合が不可能である。また、双方の端部において非回文配列を有さない場合には、全く連結反応しない。特に、上記のとおり、Ｓｆｉ　Ｉ等の制限酵素認識部位を用いて、中央側塩基を異ならせて非相補的な非回文配列を有する二本鎖ＤＮＡ分子を調製する場合、塩基の相違により切断効率が変動することがある。この場合には、目的とする連結二本鎖ＤＮＡ分子を常に十分な濃度で得ることは困難であることがわかった。
そこで、本発明者らは、目的とする連結二本鎖ＤＮＡ分子のみを固相に供給することにより、高度に多重に連結ＤＮＡ分子を初めて得ることができ、これにより、上記した問題点が解決できることを見出し、さらなる発明を完成した。
したがって、本発明は、以下のさらなる手段を提供する。
【００２０】
（７）前記（ｅ）工程で得られる前記二本鎖ＤＮＡ分子を精製する工程を備える、（５）又は（６）に記載の方法。
（８）前記（ｂ）工程に先だって、以下の工程：
（ｆ）第１の非回文配列を切断面に生じさせる制限酵素認識部位を含み、その５’側に互いに親和性を有する一対の分子のうち一方の分子が連結された第１のプライマーと、前記第２の非回文配列を切断面に生じさせる制限酵素認識部位を含み、その５’側に前記一方の分子が連結された第２のプライマー、とを用いて増幅しようとする塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡ分子をＰＣＲ法により増幅する工程と、
（ｇ）増幅した断片を、前記第１の非回文配列と前記第２の非回文配列とを生じさせる同一あるいは異なる制限酵素で処理する工程と、
（ｈ）前記制限酵素処理物を前記他方の分子と接触させて、前記一対の分子の親和性により、前記一方の分子を５’側に維持する増幅断片を前記制限酵素処理物から分離して、前記第１の非回文配列と前記第２の非回文配列とを切断面に有する二本鎖ＤＮＡ分子を採取する工程、
とを有する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
（９）前記第１の非回文配列を生じる制限酵素認識部位及び前記第１の非回文配列を生じる制限酵素認識部位は、いずれも、５’−ＧＧＣＣＮ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５ＧＧＣＣ−３’（ただし、Ｎ１〜Ｎ５は、それぞれ独立に、Ａ，Ｃ，Ｇ及びＴから選択される）である、（８）記載の方法。
（１０）前記第１の非回文配列を生じる制限酵素及び前記第２の非回文配列を生じる制限酵素はＳｆｉＩである、（８）記載の方法。
（１１）前記一対の分子は、ビオチン系化合物とアジピン系化合物であり、前記一方の分子がビオチン系化合物であり、前記他方の分子がアジピン系化合物である、（８）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）特定の制限酵素切断面を有する二本鎖ＤＮＡ分子の製造方法であって、
少なくとも、目的とする第１の制限酵素切断面を生じさせる制限酵素認識部位を含み、その５’側に互いに親和性を有する一対の分子のうち一方の分子が連結された第１のプライマーを用いて、増幅しようとする塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡ分子を、ＰＣＲ法を用いて増幅する工程と、
増幅した断片を、前記第１の制限酵素切断面を生じさせる制限酵素で処理する工程と、
前記制限酵素処理物を前記他方の分子と接触させて、前記一対の分子の親和性により、前記一方の分子を５’側に維持する増幅断片を前記制限酵素処理物から分離して、目的とする第１の制限酵素切断面を有する二本鎖ＤＮＡ分子を採取する工程、
とを備える、方法。
（１３）特定の制限酵素切断面を有する二本鎖ＤＮＡ分子の製造方法であって、
目的とする第１の制限酵素切断面を生じさせる制限酵素認識部位を含み、その５’側に互いに親和性を有する一対の分子のうち一方の分子が連結された第１のプライマーと、目的とする第２の制限酵素切断面を生じさせる制限酵素認識部位を含み、その５’側に互いに親和性を有する一対の分子のうち一方の分子が連結された第２のプライマーを用いて、増幅しようとする塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡ分子を、ＰＣＲ法を用いて増幅する工程と、
増幅した断片を、前記第１の制限酵素切断面と前記第２の制限酵素切断面とを生じさせる同一あるいは異なる制限酵素で処理する工程と、
前記制限酵素処理物を前記他方の分子と接触させて、前記一対の分子の親和性により、前記一方の分子を５’側に維持する増幅断片を前記制限酵素処理物から分離して、目的とする第１の制限酵素切断面と第２の制限酵素切断面とを有する二本鎖ＤＮＡ分子を採取する工程、
とを備える、方法。
（１４）前記第１の制限酵素切断面と前記第２の制限酵素切断面とを生じさせる制限酵素認識部位は、いずれも、５’−ＧＧＣＣＮ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５ＧＧＣＣ−３’（ただし、Ｎ１〜Ｎ５は、それぞれ独立に、Ａ，Ｃ，Ｇ及びＴから選択される）である、（１３）記載の方法。
（１５）前記一対の分子は、ビオチン系化合物とアジピン系化合物であり、前記一方の分子がビオチン系化合物であり、前記他方の分子がアジピン系化合物である、（１２）〜（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）二本鎖ＤＮＡ分子の精製方法であって、
目的とする第１の制限酵素切断面を生じさせる制限酵素認識部位を含み、その５’側に互いに親和性を有する一対の分子のうち一方の分子が連結された第１のプライマーと、目的とする第２の制限酵素切断面を生じさせる制限酵素認識部位を含み、その５’側に互いに親和性を有する一対の分子のうち一方の分子が連結された第２のプライマーを用いて、増幅しようとする塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡ分子を、ＰＣＲ法を用いて増幅する工程と、
増幅した断片を前記第１の制限酵素切断面と前記第２の制限酵素切断面とを生じさせる同一あるいは異なる制限酵素で処理する工程と、
前記制限酵素処理物を前記他方の分子と接触させて、前記一対の分子の親和性により、前記一方の分子を５’側に維持する増幅断片を前記制限酵素処理物から分離して、目的とする第１の制限酵素切断面と第２の制限酵素切断面とを有する二本鎖ＤＮＡ分子を採取する工程、
とを備える、方法。
（１７）前記一対の分子は、ビオチン系化合物とアジピン系化合物であり、前記一方の分子がビオチン系化合物であり、前記他方の分子がアジピン系化合物である、（１６）に記載の方法。
（１８）前記アジピン系化合物は磁気ビーズに固定化されている、（１７）記載の方法。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＤＮＡ分子を順次連結する新規な方法を提供する。
本発明の方法においては、まず、突出末端が非回文配列であるＤＮＡ分子を固相に結合して固定化する（工程（ａ））。連結工程が逐次的行われて、延長化される固定化ＤＮＡ分子を図３に示す。
【００２２】
ＤＮＡ分子の末端を非回文配列にする手法としては、例えば、制限酵素処理が挙げられる。制限酵素としては、消化後の二本鎖ＤＮＡ分子の突出末端を非回文配列するものであれば特に制限はない。このような制限酵素としては、例えば、ＳｆｉＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｇｌＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＥａｒＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＰｆｉＭＩ、ＳｆａＮＩ、Ｖａｎ９１Ｉなどが挙げられるがこれらに限定されない。また、二本鎖ＤＮＡ分子の末端を非回文配列にする他の手法としては、末端に非回文配列を有するアダプターを二本鎖ＤＮＡ分子の末端に付加する方法が挙げられる。また、図２に示すように、所望部位を有するベクターに対して当該部位を含めるように非回文配列を生じさせる制限酵素認識部位を有するプライマーでＰＣＲを実施し、その産物を当該制限酵素処理することによっても得ることができる。なお、制限酵素部位は、ベクター中に備えられていてもよい。
二本鎖ＤＮＡ分子の末端を非回文配列にするさらなる手法としては、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理を利用する方法が挙げられる。この手法においては、Ｔ４ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ作用により二本鎖ＤＮＡ断片の末端から最初のＡ塩基またはＧ塩基の直前まで塩基が削られ、非回文配列突出末端が形成される（宝酒造社のＬＩＣ　ｖｅｃｔｏｒ　ｋｉｔｓ参照）。
【００２３】
固定相へＤＮＡ分子を結合させる方法としては、互いに親和性を有する２つの分子を利用する方法が挙げられる。このような分子の一方を固相に結合させ、他の一方を二本鎖ＤＮＡ分子に結合させれば、これら分子相互の親和性を利用して固相と二本鎖ＤＮＡ分子を結合させることができる。このように互いに親和性を有する分子としては、例えば、アビジン−ビオチン系を好適に用いることができるが、これに限定されない。いわゆるビタミンや細胞表面物質等と各種タンパク質との間の各種結合を用いることができる。このような親和性を示す一定のタンパク質は各種結合性タンパクとして知られている。親和性を有するアジピン系化合物とビオチン系化合物は入手可能な各種形態のものを適宜選択して用いることができる。
また、抗原−抗体反応も用いることができる。抗原抗体反応としては、ジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン抗体とを用いることができる。この場合、ＤＮＡ分子にジゴキシゲニンを結合し、抗ジゴキシゲニン抗体を固相に結合する。
【００２４】
固相への二本鎖ＤＮＡ分子の連結においては、二本鎖ＤＮＡの末端をアミノ化し、固相（例えば、ポリスチレンプレートやシランコートされたガラスなど）にアミド結合させる方法を用いることも可能である。
【００２５】
本発明の方法においては、次いで、ＤＮＡ分子が固定化された固相に対して、両側の突出末端が非回文配列である連結ＤＮＡ分子を供給し、固定化ＤＮＡ分子の端部に、連結する（工程（ｂ））。
連結ＤＮＡ分子は、既に固定化された二本鎖ＤＮＡ分子から突出される前記非回文配列（以下、固定化非回文配列ということもある。）と相補的な第１の非回文配列を含む突出末端を連結しようとする端部に有し、固定化非回文配列と非相補的な第２の非回文配列を含む突出末端を他方の端部に有している。図３の最上段右側には、両端が異なる非回文配列を有する第１の連結ＤＮＡ分子が示されている。
このような連結ＤＮＡ分子は、目的とする配列を有する断片の両端に上記各配列を有するアダプターを付加することにより、あるいはさらに制限酵素などによる修飾を施すことによっても得ることができるが、ＰＣＲ法によって得ることができる。非回文配列を持つ核酸断片の作成は、例えば以下のような方法で作成可能である。ＳｆｉＩ，ＢｓｔＸＩ等の切断面に非回文配列を生じさせる制限酵素部位を設けたプライマーでＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物をこれらの制限酵素で処理することにより、かかるＤＮＡ分子を得ることができる。
あるいは、ＳｆｉＩ，ＢｓｔＸＩ等の切断部位を２箇所持つようにドナープラスミドを作成し、その間に目的とする断片をクローニング後、設けたＳｆｉＩ，ＢｓｔＸＩ等の部位で切断して得ることもできる。
【００２６】
このような連結ＤＮＡ分子において、第１の非回文配列と第２の非回文配列とが互いに相補的でないようにするには、異なる非回文配列を生じさせる異なる制限酵素を用いて、両端に異なる非回文配列を生じさせることもできる。好ましくは、非回文配列を生じさせる制限酵素であって、切断部位近傍の数個の塩基を任意に設定できる同一の制限酵素を一つの連結ＤＮＡ分子に対して用い、その制限酵素認識部位の切断部位近傍塩基の任意設定性を利用する。このような制限酵素としては、既に先に例示した酵素、すなわち、ＳｆｉＩを始めとする計１８種の制限酵素を挙げることができる。制限酵素認識部位において、任意設定する塩基を異ならせることにより、相補的でない非回文配列を一つの制限酵素による処理で創出できる。
なお、全ての連結ＤＮＡ分子に同一の制限酵素を用いることもできるし、複数の制限酵素を用いることもできるし、さらには、異なる連結ＤＮＡ分子毎に異なる制限酵素を用いることもできる。同一の制限酵素を用いれば、操作性や効率の点において有利である。
【００２７】
具体的には、切断面に第１の非回文配列を生じさせる制限酵素認識部位と第２の非回文配列を生じさせる制限酵素認識部位を有するＤＮＡ分子前駆体を作製し、これらの制限酵素部位は、切断部位近傍の数個の塩基が相互に異なるように設定しておく。このＤＮＡ分子前駆体を、同一あるいは異なる制限酵素で処理することにより、目的とする連結ＤＮＡ分子を得ることができる。
【００２８】
このような制限酵素の切断部位近傍における塩基の任意設定によれば、一つのあるいはわずかな種類の特定の制限酵素（特にレアカッタータイプ）を用いて、互いに相補的でない非回文配列を両端に有する連結ＤＮＡ分子を多数容易に得ることができる。したがって、このような非回文配列の創出は、逐次的連結ないし多重的連結において非常に有用である。
【００２９】
既に述べたように、このような制限酵素、たとえば、ＳｆｉＩにおいては、任意設定された塩基の種類によって切断効率が変動することが報告されている（Ｎｕｃｌｅｉｃ．　Ａｃｉｄｓ．　Ｒｅｓ．　２００１　Ａｐｒ．　１；２９：１４７６−８３）。したがって、このように両端に相補的でない非回文配列を創出するような制限酵素処理によって、両端とも消化された連結ＤＮＡ分子を確実にあるいは安定的に得るには、制限酵素処理産物から目的とする連結ＤＮＡ分子を精製することが好ましい。
精製法としては、特に限定しないが、たとえば、以下のようなＰＣＲプライマーを用いる方法を挙げることができる。すなわち、第１の非回文配列を切断面に生じさせる制限酵素認識部位を含み、その５’側に互いに親和性を有する一対の分子のうち一方の分子が連結された第１のプライマーと、前記第２の非回文配列を切断面に生じさせる制限酵素認識部位を含み、その５’側に前記一方の分子が連結された第２のプライマー、とを用いる。なお、ここで、互いに親和性を有する一対の分子としては、既に述べた（ａ）工程において、固相にＤＮＡ分子を結合させるのに用いる一対の分子を利用できる。すなわち、アビジン−ビオチン系に代表される各種結合性タンパク質や、ジゴキシゲニン−抗ジゴキシゲニン抗体に代表される各種抗原−抗抗原抗体を好適に用いることができるが、これに限定されないで、適宜選択して用いることができる。好ましくは、アビジン−ビオチン系である。この場合、プライマーに対しビオチン系分子を結合させておくことが好ましい。
【００３０】
これらのプライマーにより得られたＰＣＲ産物（増幅断片）は、両端に前記一方の分子を有している。このＰＣＲ産物を制限酵素処理することで、制限酵素が作用して消化されたのであれば、前記一方の分子は増幅断片から分離する。完全に消化された場合には、増幅断片は前記一方の分子を全く有さなくなる。
このような制限酵素処理後、処理物を前記一対の分子の親和性を用いて、前記一方の分子を維持する増幅断片を分離する。分離は、たとえば、前記他方の分子をビーズなどの適当な固相に結合させておき、消化不完全な増幅断片を前記親和性により固相側に分配し、完全消化物（目的とする連結ＤＮＡ分子）を液相側に分配し、これにより目的とする連結ＤＮＡ分子を分離採取する。固相を磁気ビーズとすることにより、磁気によって固相と液相との分離を容易に達成することができる。
以上説明したように、相補的でない非回文配列を有する連結ＤＮＡ分子を調製するのに用いる制限酵素認識部位は、５’−ＧＧＣＣＮ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５ＧＧＣＣ−３’（ただし、Ｎ１〜Ｎ５は、それぞれ独立に、Ａ，Ｃ，Ｇ及びＴから選択される）であり、制限酵素ＳｆｉＩのものである。
【００３１】
こうして得られた目的とする連結ＤＮＡ分子を連結工程に供給することにより、予め設定したとおりの連結方向が確保されるのに加え、不要な会合や連結が回避されて、当該連結工程を確実に達成することができる。同時に、次段の連結工程における高連結効率も確保される。高い連結効率が達成されることにより、さらに多くの連結ＤＮＡ分子を連結させることができるようになる。
また、本方法によれば、少量の連結ＤＮＡ分子の負荷によっても、確実に固定化ＤＮＡ分子に連結できるようになる。この結果、固相上には、有効な（正しく連結された）固定化ＤＮＡ分子を確実に存在させることができる。このため、固相における固定化ＤＮＡ分子の存在密度を低減させることができるようになり、これにより、より多重的な連結を容易に実施できるようになる。
【００３２】
特に、本発明において逐次的に連結ＤＮＡ分子を供給して連結工程を実施する場合、各工程における連結効率を高めることは、最終目的物を得ることに対して相乗的に作用する。
また、当該精製により、目的とする連結ＤＮＡ分子を高い純度で得ることができるのであれば、固定化ＤＮＡ分子に対して、逐次的でなく２種類以上の連結ＤＮＡ分子を供給して多重的な連結工程を実施することもできる。
【００３３】
なお、上記した、連結ＤＮＡ分子の精製方法は、特定の制限酵素切断面（非回文配列には限定しないで回文配列の場合も含む）を有するＤＮＡ分子の製造方法（精製方法）として本発明の一形態を構成できる。すなわち、このＤＮＡ分子の精製方法は、特に本発明の固相連結による合成方法以外の通常のクローニングなどに用いるのに好ましいＤＮＡ分子の製造（精製）方法を提供することができ、また、これによって得られるＤＮＡ分子を提供することができる。
すなわち、一方の端部にのみ特定の制限酵素切断面を有するＤＮＡ分子を製造（精製）は、目的とする配列を切断面に生じさせる制限酵素認識部位を含み、その５’側に互いに親和性を有する一対の分子のうち一方の分子が連結された第１のプライマーを少なくとも用いて目的とするＤＮＡ配列に対してＰＣＲを実施することにより得られたＰＣＲ産物に対して、上記前記一対の分子の親和性による分離工程を行うことにより、実現することができる。
【００３４】
また、各端部に第１及び第２の制限酵素切断面を有するＤＮＡ分子を製造する場合には、第１の配列を切断面に生じさせる制限酵素認識部位を含み、その５’側に互いに親和性を有する一対の分子のうち一方の分子が連結された第１のプライマーと、第１のプライマーと同様の形態で第２の配列を切断面に生じさせる制限酵素認識部位と前記一方の分子とが連結された第２のプライマーとを用いて目的とするＤＮＡ配列に対してＰＣＲを実施する。次いで、得られたＰＣＲ産物を、上記前記一対の分子の親和性による分離工程を行うことができる。
本発明は、このようなＤＮＡ分子の製造方法によって得られたＤＮＡ分子も包含する。このようなＤＮＡ分子は一般のクローニングや連結にも有用である。
【００３５】
なお、固相に対して、前記連結ＤＮＡ分子前駆体を供給して、ｉｎ　ｓｉｔｕで、すなわち、固相上で制限酵素分解し連結ＤＮＡ分子を調製することもできる。ただし、この場合、既に連結されるのに用いられたのと異なる制限酵素認識部位によって前記前駆体を調製しておく必要がある。
【００３６】
固定化ＤＮＡ分子に対する連結ＤＮＡ分子の連結は、リガーゼ反応を利用して行なうことができる。リガーゼ反応に用いる酵素としては、ＤＮＡ分子同士を連結させることができるものであれば特に制限はなく、例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを好適に用いることができる。Ｅ．ｃｏｌｉリガーゼや耐熱性酵素であるＴａｇやＰｆｕのリガーゼを用いることも可能である。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを利用したリガーゼ反応は、通常、緩衝液としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を用い、Ｍｇ，ＤＴＴ，ＡＴＰの存在下で行う。さらに、ＰＥＧを添加することにより反応効率を高めることもできる。反応は、通常、１６℃程度で２時間以上行なうリガーゼ反応の試薬としては、市販品（例えば、宝酒造社のＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ）を用いることも可能である。二本鎖ＤＮＡ分子同士の連結においては、リガーゼ以外にも、例えば、リコンビナーゼ（ｌｉｆｅｔｅｃｈ社）やＴＯＰＯイソメラーゼＩ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を利用することもできる。
【００３７】
本発明の方法においては、次いで、固相に結合された二本鎮ＤＮＡ分子に対して未反応の二本鎖ＤＮＡ分子を反応系から除去する（工程（ｃ））。
この工程においては、固定化されたＤＮＡ分子を未反応の二本鎖ＤＮＡ分子を含む反応液から分離し、次いで、固相に結合された二本鎖ＤＮＡ分子に対し、緩衝液を添加すればよい。例えば、固相に磁気ビーズを用いた場合、リガーゼ反応後、磁石の磁力を利用してこのビーズを収集し、未反応の二本鎖ＤＮＡを含む上清を除去し、緩衝液（例えば、Ｔ．Ｅ．緩衝液等）を添加し、磁石を磁気ビーズから遠ざけ磁気ビーズを磁力から解放し、これを緩衝液に軽く懸濁すればよい。必要に応じて、上清の除去と緩街液の添加を繰り返す。
【００３８】
本発明においては、連結させたいＤＮＡ分子の数に応じて、上記工程（ｂ）および（ｃ）を繰り返すことができる（工程（ｄ））。これにより多数のＤＮＡ分子を順次連結させることができる。
【００３９】
本発明のＤＮＡ断片の連結方法を利用して順次連結された二本鎖ＤＮＡ分子を得る場合には、さらに、固相に結合したＤＮＡ分子を固相から分離する（工程（ｅ））。
固相からのＤＮＡ分子の分離は、制限酵素処理により行なうことができる。例えば、固相として磁気ビーズを用いた場合には、まず、磁気ビーズにＤＮＡを固定化したまま制限酵素処理を行う。これにより、磁気ビーズからＤＮＡが溶液中に分離する。制限酵素処理後、磁石の磁力を利用して磁気ビーズを収集し、その上清を回収する。目的のＤＮＡ分子は上清中に存在するため、これにより目的のＤＮＡ分子を得ることができる。
【００４０】
ＤＮＡ分子と固相との結合にアビジン−ビオチン系を用いた場合には、当該ＤＮＡ分子と固相とを分離するために、ＤＮＡ分子に付加するビオチン分子の特性を利用することができる。固相に結合したＤＮＡ分子における、スペーサーとビオチン分子との結合には、通常、ＤＴＴ等の還元剤で断裂するＳ−Ｓ結合もしくはある波長の光を照射することにより断裂する分子を利用する。これにより、ＤＮＡ分子の連結終了後、還元剤処理または光照射によって、最終目的のＤＮＡ分子と固相とを分離することができる。本発明方法によって得られるＤＮＡ分子は、本発明の一部を構成する。
【００４１】
上記本発明の方法の工程は、すべて手作業で行なうことも可能であるが、それを実施するための装置を利用して、上記工程の全部もしくは一部を自動化することも可能である。本発明には、上記本発明の方法を実施するための装置が含まれる。
【００４２】
本発明の方法により得られた二本鎖ＤＮＡ分子は、「カセット方式」に他のベクターなどに導入することができる。ＹＡＣなどの長大なＤＮＡ分子をクローニングできるベクターに導入するのに有用である。したがって、長大な人工的ＤＮＡ構築物を容易に構築できるようになる。また、そのようなＤＮＡ構築物を保持する形質転換体も効率的に構築できるようになる。
また、このＤＮＡ分子は、それが由来する複数のＤＮＡ分子がコードするポリペプチドが融合された融合ポリペプチドの製造に利用することができる。したがって、本発明方法によって得られたＤＮＡ分子によリコードされるポリペプチドは、本発明に包含される。
融合ポリペプチドの製造においては、例えば、本発明の方法により得られた二本鎖ＤＮＡ分子を、さらに、ＧＳＴやＨｉｓ−ｔａｇをコードするＤＮＡ分子と融合し、組換えポリペプチドを発現させることにより、ＧＳＴやＨｉｓ−ｔａｇに結合するリガンドを担体としたアフィニティーカラムを用いて当該組換えポリペプチドを容易に精製することができる。本発明の方法により得られた二本鎖ＤＮＡ分子とＧＳＴやＨｉｓ−ｔａｇをコードするＤＮＡ分子との融合においては、Ｈｉｓ−ｔａｇが挿入されたＰＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）ＧＳＴとの融合用ベクターｐＧＥＸ（ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いることができる。二本鎖ＤＮＡ分子が挿入された上記ベクターを導入する宿主としては、大腸菌などを用いることができる。したがって、本発明方法によって得られたＤＮＡ分子を用いて得られた形質転換体を培養し、該形質転換体またはその培養上清から発現させたポリペプチドを回収する工程を含む、ポリペプチドの生産方法は、本発明の一態様である。
【００４３】
また緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）やルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）を、ＤＮＡ分子に対し融合させるための遺伝子として用いることにより、微生物、植物、動物における融合ポリペプチドのレポーター系を構築することも可能である。このレポーター系に用いるベクターとしては、ＧＦＰをレポーターとする場合にはｐＱＢＩ２５（ＴＡＫＡＲＡ）やｐＱＢＩ６３（ＴＡＫＡＲＡ）等を、ルシフェラーゼをレポーターとする場合にはではｐＧＬベクター（ｐｒｏｍｅｇａ）等を用いることができる。ベタターを導入する宿主としては、例えば、動物細胞や大腸菌などが好適である。植物細胞を宿主とする場合には、ベクターとして、例えば、ｐＢＩ１０１．２を好適に用いることができる。
【００４４】
また、本発明の方法により得られた二本鎖ＤＮＡ分子は、トランスジェニック生物の作製への応用が可能である。各植物、動物、微生物などの生物の形質を強化したり、これら生物に新たな形質を付与しようとする場合に、一つの遺伝子をコードするＤＮＡ断片の導入のみでは、しばしば初期の目的を達成することができない。この場合、複数の遺伝子を連結して生物に導入することが有効である。また、生物の代謝系を抑制するために、代謝系に関与する遺伝子に対応するアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ断片を生物に導入する場合においても、複数のＤＮＡ断片を連結して生物に導入することが有効である。本発明の方法によれば、一連の遺伝子群を効率的に多重連結することができ、これを各植物、動物、微生物などの生物に導入して、効果的にこれら生物の形質を改変することができる。
【００４５】
トランスジェニック植物の作製においては、例えば、まず、カルスを誘導し、その後、カルスにアグロバクテリウム法やパーティクルガン法等を用い目的の遺伝子を含むベクターを導入し、次いで、ベクター内に挿入されている薬剤耐性遺伝子の作用（例えば、カナマイシンやハイグロマイシンに対する耐性）を指標としてベクターが導入された株を選択する。その後、ホルモンを添加し、カルスを分化させ再生体を取得する。ここで一回の再生体を獲得するのに最低およそ２ヶ月は必要であり、多くの遺伝子を導入するため繰り返し上記の方法を行うと多大な時間が必要となる。そこで、本発明の方法を利用して多重に連結された遺伝子を用いることにより、多くの遺伝子が挿入されたトランスジェニック植物を短期間で作製することが可能となる。
【００４６】
トランスジエニック動物を作成する場合には、通常、受精卵の核内へ目的の遺伝子を線状ＤＮＡの形で導入する。この場合も、本発明の方法により多重に連結された遺伝子を用いることにより、多くの遺伝子が挿入したトランスジェニック動物を短期間で作成することが可能となる。
【００４７】
また、生物に新たな形質を付与する目的以外に、例えば、生物内で様々な物質を生産させる目的で、本発明の方法により製造された多重連結遺伝子を用いることもできる。
【００４８】
従って、本発明には、上記した融合ポリペプチドやトランスジェニック生物の製造あるいは生体内での物質生産などのために用いる、本発明の方法により得られた二本鎖ＤＮＡ分子が挿入されたベクター、および該二本鎖ＤＮＡ分子または該ベクターを保持する形質転換体が含まれる。さらに、本発明には、該形質転換体を利用した組換えポリペプチドの製造方法および該方法により得ることができる組換えポリペプチドが含まれる。
なお、米国特許第５５９５８９５号公報、特願２００１−３４１９８６に記載の内容は、全て引用により本明細書中に取り込まれるものとする。
【００４９】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００５０】
以下の実施例においては、シロイヌナズナのゲノム配列から５断片を選択し、これらの断片を逐次連結し、最後にベクターの連結を行った。また、実施例の概要を図４及び図５に示す。
（実施例１）固定化用ＤＮＡ分子の調製
ｐＵＣ１９にＩ−ＳｃｅＩを導入したベクターからＩ−ＳｃｅＩを含む部分について、配列番号１及び２に記載される配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを実施し、増幅断片を得た。一方にビオチン化したプライマー、他方に、ＳｆｉＩ認識配列をもつプライマーを用いた。ＰＣＲ実行後、ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて精製後、一晩制限酵素処理し、再度ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔにより精製した。
【００５１】
（実施例２）連結ＤＮＡ分子のビオチン化
シロイヌナズナゲノムライブラリーＫ２１Ｈ１のゲノム配列から約５００ｂｐの断片を適当に５断片選択した。これらの第１〜第５の断片をそれぞれＰＣＲ法によってこれらを増幅した。ＰＣＲにおいて使用したプライマーは、ＳｆｉＩ認識配列を有し、その５’側にビオチン修飾をした。なお、第１〜第５の断片を得るのにそれぞれ用いたプライマーの配列（各２種、計１０種）をそれぞれ配列番号３〜１２に示す。本例におけるＰＣＲの概略を図５の上段に示す。
ＰＣＲ実行後、ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔを用いて精製後、一晩制限酵素（ＳｆｉＩ）処理し、再度ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔにより精製した。
なお、ビオチン修飾していないプライマーを用いる以外は、上記と同様に操作して各対照例の連結ＤＮＡ分子を調製した。
【００５２】
（実施例３）ベクターＤＮＡ分子の調製
ｐＡＣＹＣ１８４の複製起点及びクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む領域を配列番号１３及び１４に示すプライマーを用いて増幅した。ＰＣＲ実行後、ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔを用いて精製後、ＳｆｉＩで一晩制限酵素処理し、再度ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔにより精製した。
【００５３】
（実施例４）連結ＤＮＡ分子の精製
実施例２において得られた各連結ＤＮＡ分子の濃度を測定し、各ＤＮＡ分子２μｇとストレプトアジピン化した３００μｌの磁気ビーズをエッペンドルフ管内で混合し、回転しつつ１時間結合させた。結合後磁気ビーズにより上清を回収し、ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔを用いてＤＮＡ溶解液を滅菌水に置換した。精製の過程の概略を図５の下段に示す。
【００５４】
（実施例５）固相上でのＤＮＡ分子の連続連結
まず、固定化ＤＮＡ分子の固定化には、Ｄｙｎａｌ社のＭ−２８０　ｋｉｌｏ−ｂａｓｅ　ｂｉｎｄｅｒ　ｋｉｔを使用した。ストレプトアビジン化ビーズ３０μｌをエッペンドルフチューブに入れ、磁気によりビーズを収集後６０μｌの結合溶液にて洗浄後、再度３０μｌの同緩衝液に懸濁した。その後固定化ＤＮＡ分子を２μｇを添加し、良く混合し、室温にて３時間放置した。
【００５５】
固定化ＤＮＡ分子を固定化後、４０μｌ洗浄溶液にて２回洗浄し、２００μｌのＴ．Ｅ．緩衝液で２洗浄を行った。次に、実施例４で精製した第１の連結ＤＮＡ分子を６００ｎｇ添加し、ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ｖｅｒ．２（宝酒造）のＩ酵素液を５０μｌ添加した。１６℃で２時間反応を行い約３０分毎に懸濁を行った。その後２００μｌのＴ．Ｅ．緩衝液で２回洗浄した。
実施例４で精製した第２〜第５の連結ＤＮＡ分子についても同様にして連結工程を実施した。最後に、ベクターＤＮＡ分子２．４μｇを用いて、ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ｖｅｒ．２（宝酒造）のＩ酵素液を５０μｌ添加した。１６℃で２時間反応を行い約３０分毎に懸濁を行った。その後２００μｌのＴ．Ｅ．緩衝液で２回洗浄した。
ベクターＤＮＡ分子連結後、Ｉ−ＳｃｅＩ処理によりビーズから遊離した後エタノール沈殿して、２００μＬの系でＥ．ｃｏｌｉ　ｌｉｇａｓｅによる自己閉環を行った。その後、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、クロラムフェニコールを添加したＬ培地に塗布した。
なお、連結ＤＮＡ分子として、実施例２で調製し、実施例４で精製した連結ＤＮＡ分子に替えて対照例の連結ＤＮＡ分子を使用する以外は、この実施例と同様に操作して、連結工程を実施し、以後同様に操作して、形質転換し、クロラムフェニコール添加Ｌ培地に塗布した。
【００５６】
（実施例６）連結効率の比較
得られたコロニーからプラスミドを回収し、制限酵素パターンを電気泳動により確認することにより、初期の目的としたＤＮＡ分子の合成を有無を確認した。
精製した連結ＤＮＡ分子と精製していない対照例の連結ＤＮＡ分子とを用いて比較したところ、精製していない連結ＤＮＡ分子の場合には、１０サンプル中目的とするＤＮＡ分子の存在を全く確認することができなかったのに対し、精製した連結ＤＮＡ分子の場合には、１０サンプル中２個において所期のＤＮＡ分子の合成を確認することができた。
以上のことから、本発明によれば、連結ＤＮＡ分子を精製した結果、各連結工程における連結効率が向上し、結果として、対照例では全く得られなかった所期のＤＮＡ分子が、実施例では１０サンプル中２サンプルという高い確率で所期のＤＮＡ分子が得られるようになったと考えられる。
【００５７】
【発明の効果】
本発明により、多数のＤＮＡ断片を、クローニングすることなく連結方向を規定しながら順次連結させることが可能となった。これにより多数のＤＮＡ断片（例えば、３以上のＤＮＡ断片）の連結を簡便に行なうことができ、しかも、そのための時間と労力の負担が顕著に軽減された。本発明の方法は、例えば、生物の形質転換のための多数の遺伝子の連結、ベクターの構築における複数のＤＮＡ断片の連結、変異遺伝子の構築などへの応用において有効である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の多重遺伝子連結技術の概念を示す図である。
【図２】固定化ＤＮＡ分子の調製過程の一例を示す図である。
【図３】固定化ＤＮＡ分子に対して、連結工程が逐次的行われて、固定化ＤＮＡ分子が延長化される過程の一例を示す図である。
【図４】実施例において得ようとする連結ＤＮＡ分子の連結計画の概要を示す図である。
【図５】実施例における連結ＤＮＡ分子の調製と精製の概要を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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