(57)【要約】【課題】実験動物の２以上の異なる部位点をマーカーで標識し上記部位点間の距離の変化を画像解析により評価することを特徴とする実験動物の自動化された行動解析法及びそのための装置の提供。【解決手段】本願発明は、より特に、ホルマリン試験におけるリッキングのための自動化された行動解析法及びそのための装置であり、前記実動物はラットであり、そして前記部位点は口と足の２点である。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
実験動物の自動化された行動解析法において、上記動物の２以上の異なる部位点をマーカーで標識し、上記部位点間の距離の変化を画像解析により評価することを特徴とする、前記行動解析法。
【請求項２】
前記行動解析の対象がホルマリン試験におけるリッキングであり、そして、前記部位点が口と足の２点である、請求項１に記載の解析法。
【請求項３】
前記口を標識するマーカーがピクリン酸を含む黄色マーカーであり、及び／又は、前記足を標識するマーカーが蛍光緑色テープである、請求項２に記載の解析法。
【請求項４】
前記実験動物が、マウス、ラット、ウサギ又はモルモットである、請求項１に記載の解析法。
【請求項５】
請求項１に記載の行動解析法であって、以下のステップ：
（１）前記実験動物を、２台のビデオカメラで上から及び下から同期して撮影して、上からの画像と下からの画像を得；
（２）上記マーカーが上記下からの画像のフレーム内に検出できない場合にのみ、上記下からの画像のフレームに代えて、上記下からの画像のフレームに対応する上記上からの画像のフレームを、用いて画像処理を実行し；そして
（３）前記マーカーで標識された２以上の部位点間の距離が所定値以内にあるフレームのみを抽出する；
を含む、前記行動解析法。
【請求項６】
請求項１に記載の行動解析法に使用する装置であって、
前記実験動物を入れるための透明ケージ、
前記実験動物を照明するための手段、
前記実験動物を上から撮影するためのビデオカメラと下から撮影するためのビデオカメラ、及び
上記上からの画像と下からの画像を同期させるための手段、
を含む、前記装置。
【請求項７】
前記照明手段が、ワット数１０の調光可能な７２０ルクスの蛍光灯である、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
請求項１に記載の行動解析法に使用する装置であって、
前記実験動物を上から撮影するためのビデオカメラと下から撮影するためのビデオカメラ、
上記上からの画像と下からの画像を同期させるための手段、
上記の同期して録画された画像を解析するための画像解析装置であって、以下のプログラム：
上記マーカーが上記下からの画像のフレーム内に検出できない場合にのみ、上記下からの画像のフレームに代えて、上記下からの画像のフレームに対応する上記上からの画像のフレームを、用いて画像処理を実行するプログラム；及び
前記マーカーで標識された２以上の部位点間の距離が所定値以内にあるフレームのみを抽出するプログラム；
を具備する画像解析装置；
を含む、前記行動解析法に使用する装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本願発明は、実験動物の２以上の異なる部位点をマーカーで標識し上記部位点間の距離の変化を画像解析により評価することを特徴とする実験動物の自動化された行動解析法及びそのための装置に関する。より特に、本願発明は、ホルマリン試験におけるリッキングのための自動化された行動解析法及びそのための装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床前薬理学は、全ての医薬の開発において不可欠である。鎮痛薬の場合には、その有効性に関する証拠は、主に実験動物の行動試験から評価されている。今日広く行われているｉｎ　ｖｉｖｏの鎮痛試験・スクリーニング法の大半は、マウス・ラットなどのげっ歯類を用いた行動薬理学的試験である。行動試験は、その実験動物に対する薬物の効果の重要な情報を与えるけれども、同時に多くの欠点をもつ。すなわち、行動試験は反射応答の評価のみに基づき、より複雑な応答を含む試験は実験者に大きな負担を要求し、そしてその結果の記録も実験者の主観に委ねられる。したがって、行動の分析を自動化することができれば、実験者の主観に左右されなくなり、かつ、行動試験をより容易に使用することができるようになり、侵害関連行動の客観的な解析・計測を提供することができる。
【０００３】
ホルマリン試験は、ラットにおいて最初に記載され（Ｄｕｂｕｉｓｓｏｎ　Ｄ．　Ｄｅｎｎｉｓ　ＳＧ．　Ｔｈｅ　ｆｏｒｍａｌｉｎ　ｔｅｓｔ：　ａ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｎａｌｇｅｓｉｃ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｍｏｒｐｈｉｎｅ，　ｍｅｐｅｒｉｄｉｎｅ　ａｎｄ　ｂｒａｉｎ　ｓｔｅｍ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｒａｔｓ　ａｎｄ　ｃａｔｓ．　Ｐａｉｎ　１９７７；　４：　１６１−７４参照）、マウス、ウサギ、及びモルモットを含む様々な種において使用されている。ホルマリン試験はホルマリン注射に伴う痛み関連行動、例えば、かばうこと（フェーバリング；ｆａｖｏｕｒｉｎｇ）、ひっつかむこと（クラッチング；ｃｌｕｔｃｈｉｎｇ）、手足や頭を上げること（エレベーティング；ｇｅｌｅｖａｔｉｎｇ）、体を振ること（シェーキング；ｓｈａｋｉｎｇ）、たじろぐこと（フリンチング；ｆｌｉｎｃｈｉｎｇ）、舌でなめること（リッキング；ｌｉｃｋｉｎｇ）、又はかむこと（バイティング；ｂｉｔｉｎｇ）を評価する試験であり、典型的な痛み（特に炎症性疼痛）の評価方法として、世界的に広く認められている。典型的な試験方法は、１群６〜８匹としてマウス又はラットに薬物処理した後、ホルマリン溶液を各個体に次々に足底皮下投与してアクリル箱に移し、ビデオカメラのスイッチをＯＮにして無人状態で撮像を行う。動物の行動としては、投与直後約５分間は急性痛（第１期）が起こり、そして１５分後より４５分位までに炎症性疼痛（第２期）が続く。計測時間は１時間が一般的で、無人状態で１時間計測した後に戻ってきて実験を終了する。かくして実験そのものは１日で終了する。ところが、その後のデータ処理は、例えば、リッキング試験の場合には、これを再生しながらホルマリンを注射した足を舐める時間（リッキング時間）を、ストップウォッチを用いて手作業で計測する必要があり、非常に手間や時間がかかる。例えば、１つの化合物のＥＤ５０値を得るために１化合物３投与量＋対照、１群６匹、観測時間を１匹あたり１時間とすると、再生そのものに６×４×１＝２４時間を費やすことになる（これは最も簡単な例で実際にはもっと時間がかかる場合が多い）。これを１人の実験者が行うとして約１週間が費やされる。また動物の姿勢によっては、例えばホルマリンが注射された足を隠してしまう場合など、その足を舐めているかどうかはっきりしない場合がある。この対策としてミラーを後部又は下部に置くという措置もとってはいるが、それでも判定基準がある程度実験者の主観に依存する面がある。
【０００４】
一方、近年、ホルマリン試験を自動化するシステムが報告されるようになってきた。Ｊｅｔｔ　Ｍ．Ｆ．らは、ポリカーボネート製観察管内にラットを入れ、ラットのホルマリン試験において生じる複雑な動き（行動）を動力学的に測定してコンピュータを用いて解析する方法を記載した（Ｊｅｔｔ　ＭＦ，　Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ　Ｓ．　Ｔｈｅ　ｆｏｒｍａｌｉｎ　ｔｅｓｔ　ｉｎ　ｒａｔ：　ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　ａｕｔｏｍａｔｅｄ　ｓｙｓｔｅｍ．　Ｐａｉｎ　１９９６；　６４：　１９−２５参照）。
【０００５】
Ｊｏｕｒｄａｎ　Ｄ．らは、フランス国リヨンのＶｉｅｗ　Ｐｏｉｎｔ社製のＶＩＤＥＯＴＲＡＣＫ（商標）システムを用いて、ラットの痛み関連行動（グルーミング（ｇｒｏｏｍｉｎｇ）、リッキング、バイティング）と非特異的行動とのを判別するように、ラットの合計移動（ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎ；ラット重心の座標上の位置の変化）に検出閾値を設定して上記痛み関連行動のみを自動的に抽出する方法を報告した（Ｊｏｕｒｄａｎ　Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　４３　（２）：　１０３−１１０　（２００１），　Ｄ．　Ｊｏｕｒｄａｎ　ｅｔ　ａｌ．．　Ｐａｉｎ　７１　（１９７７）　２６５−２７０，　及びＪｏｕｒｄａｎＤ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｔｏｘｉｃｏｌ　４２　（１９９９）　１６３−１７０参照）。
【０００６】
また、Ｇｉｍｅｎｅｚ−Ｌｌｏｒｔ　Ｌ．らは、神経毒によるラットの運動活性の系統的な解析及び行動反応の分類をコンピュータにより行う方法であって、ラットの行動をビデオで撮影し、Ｖｉｅｗ　Ｐｏｉｎｔ社製Ｖｉｄｅｏｔｒａｃｋ　５１２（商標）で画像を解析する方法を報告したが、測定項目は、運動の時間、平均速度等である（Ｇｉｍｅｎｅｚ−Ｌｌｏｒｔ　Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．，　ＮｅｕｒｏＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙ　１９　（３）：　３７１−３８０，　１９９８参照）。
【０００７】
Ｖｏｒｈｅｅｓ　Ｃ．Ｖ．らは、妊娠ラット催奇性物質を投与し、生まれたラットの運動活性を観察方法であって、ビデオで撮影した動物の体（白）と背景（黒）のコントラストをコンピュータで解析して動物の運動活性の指標とする方法を報告した（Ｖｏｒｈｅｅｓ　Ｃ．Ｖ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ，　Ｖｏｌ．　１４，　ｐｐ．４３−４９，　１９９２参照）。
【０００８】
また最近では、Ｙａｋｓｈ　Ｔ．Ｌ．らは、金属バンドをラットの後肢に装着し、その動きに伴う電磁場の変化を検出することにより、ホルマリン試験におけるフリンチング行動を自動測定するシステムを報告した（Ｙａｋｓｈ　Ｔ．Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．，　ＪＡｐｐｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　９０：　２３８６−２４０２，　２００１参照）。
【０００９】
特許文献としては、特開平８−３２９５９（平成８年２月２日公開）が、実験動物の頭部にカラーマークを付け、記憶試験、迷路学習における行動軌跡を解析する方法を開示しているが、ホルマリン試験を目的とするものではない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
以上、これまで、ホルマリン試験を自動化するシステムが開発されてきたが、ホルマリン試験におけるリッキング行動のみを直接的に抽出し自動化するシステムは未だ報告されていない。また、実験動物の行動を画像解析するシステムが開発されてきたが、各実験動物当たり１点のみを追跡するものだけが開示されている。したがって、実験動物の行動解析において、リッキングを含む行動を個別に解析することにより、実験者の負担を軽減して効率を高め、得られるデータをより客観的なものとするための自動化システムを開発する必要性が未だ存在する。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
そこで、本願発明者らは、上記課題を解決すべく、特にホルマリン試験におけるリッキング行動を自動測定出来ないものか検討を重ねた結果、２点間抽出法のコンセプトを想到した。以下に説明するように、本願発明に係る解析方法においては、ラットの口と足の２点にあるマーカーを検出することにより、リッキング行動を直接的に検出することが可能である。
【００１２】
本願発明の１の態様においては、実験動物の自動化された行動解析法において、上記動物の２以上の異なる部位点をマーカーで標識し、上記部位点間の距離の変化を画像解析により評価することを特徴とする、前記行動解析法が提供される。前記行動解析の対象はホルマリン試験におけるリッキングであることができ、そして前記部位点は口と足の２点であることができる。好ましくは、前記口を標識するマーカーはピクリン酸を含む黄色マーカーであり、及び／又は、前記足を標識するマーカーは蛍光緑色テープであることができる。
【００１３】
前記実験動物は、マウス、ラット、ウサギ又はモルモット、あるいはネコであることができるが、これらの動物に限定されるものではない。
【００１４】
本願発明の他の態様においては、前記行動解析法であって、以下のステップ：（１）前記実験動物を、２台のビデオカメラで上から及び下から同期して撮影して、上からの画像と下からの画像を得；
（２）上記マーカーが上記下からの画像のフレーム内に検出できない場合にのみ、上記下からの画像のフレームに代えて、上記下からの画像のフレームに対応する上記上からの画像のフレームを、用いて画像処理を実行し；そして
（３）前記マーカーで標識された２以上の部位点間の距離が所定値以内にあるフレームのみを抽出する；
を含む、前記行動解析法が提供される。
【００１５】
本願発明のさらに他の態様においては、前記行動解析法に使用する装置であって、
前記実験動物を入れるための透明ケージ、
前記実験動物を照明するための手段、
前記実験動物を上から撮影するためのビデオカメラと下から撮影するためのビデオカメラ、及び
上記上からの画像と下からの画像を同期させるための手段、
を含む、前記装置が提供される。前記照明手段が、ワット数１０の調光可能な７２０ルクスの蛍光灯であることができる。
【００１６】
本願発明のさらに他の態様においては、前記行動解析法に使用する装置であって、前記行動解析法に使用する装置であって、
前記実験動物を上から撮影するためのビデオカメラと下から撮影するためのビデオカメラ、
上記上からの画像と下からの画像を同期させるための手段、
上記の同期して録画された画像を解析するための画像解析装置であって、以下のプログラム：
上記マーカーが上記下からの画像のフレーム内に検出できない場合にのみ、上記下からの画像のフレームに代えて、上記下からの画像のフレームに対応する上記上からの画像のフレームを、用いて画像処理を実行するプログラム；及び
前記マーカーで標識された２以上の部位点間の距離が所定値以内にあるフレームのみを抽出するプログラム；
を具備する画像解析装置；
を含む、前記行動解析法に使用する装置が提供される。
【００１７】
以下、図面を参照しながら、本願発明に係る解析法の原理を説明する。
【００１８】
図１に示すように動物の口と足の２点にマーカーを付け、ホルマリン試験をデジタルビデオ（ＤＶ）撮像下で実施する。実験終了後ビデオを再生しＤＶ端子（ｉＬｉｎｋｓ（商標））を介してパソコン（ＰＣ）にＡＶＩ形式（商標）の動画ファイルで格納する。この動画中の２点の色を専用ソフトウェア上で認識させ、これらの距離がある一定の値に近づいた場合をリッキングとみなし、そのフレーム数（１フレーム＝１／３０秒）をもとにリッキング時間の時系列情報を得る。このような原理に基づき、ハードウェアとソフトウェアの両面から開発を進め、完成したのが本願発明に係る自動化行動解析システム（ＡＢＳＳ（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ　Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ　Ｓｃｏｒｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ）ともいう）である。本システムを用いてホルマリン試験を自動解析する方法は、従来の動物実験法と色認識に基づく画像解析技術を融合させ、かつ、１の動物の異なる部位点間の距離を自動計測するため直接的にリッキング行動のみをとらえることができるという点で、従来技術のホルマリン試験自動解析方法と、相違する。
【００１９】
本願明細書中に使用するとき、用語「リッキング」とは、ホルマリン試験において、ホルマリンが注射された足（四肢のいずれか）を舐める行動をいい、本願発明に係る自動化行動解析法においては、口と足が実質的に接触している限り、バイティングをも包含する。
【００２０】
本願明細書中に使用するとき、用語「２点間抽出法」とは、１の実験動物の２以上の異なる部位点間の距離を、画像解析により抽出する方法をいう。
【００２１】
本願明細書中に使用するとき、用語「画像解析」とは、ビデオカメラ等で撮影された画像を解析することをいう。
【００２２】
本願明細書中に使用するとき、用語「自動化された」とは、上記画像解析において、コンピュータ等を使用することをいう。
【００２３】
以下、本願発明に係る自動化行動解析システムを使用して得られたデータと、従来のヒトの手を介してストップウォッチを使用して（マニュアルで）得られたデータとを比較し、本願発明に係る自動化行動解析システムの性能・効果を評価した。
【００２４】
【実施例】
材料と実験方法：
１．動物
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット４週齢、体重６０−１００ｇ（日本ＳＬＣ（株）、静岡）を８匹用いた。
【００２５】
２．使用した薬物
ホルムアルデヒド液（ＷＡＫＯ一級、和光純薬（株）、大阪）、成分：３７％ホルムアルデヒド＋８％メタノール
生理食塩液（大塚製薬（株）、東京）
動物マーキング用黄色色素：ピクリン酸の９９％エタノール飽和溶液：エタノール１２ｍＬ当たりピクリン酸約１ｇを溶解したもの（中部科学資材（株）、愛知）
３．本願発明に係る装置の１例：図２を参照のこと。
【００２６】
フレーム等含め全体（イトーキ（株）、愛知）
デジタルビデオ（ＤＶ）カメラ上下２台（Ｃａｎｏｎ　ＩＸＹＤＶ２、キャノン販売（株）、愛知）
動物専用アクリル製飼育ケージ（ケアリー（株）、大阪）
照明器具（蛍光灯１０Ｗ×４本、松下電器（株）、大阪）
リモコンセンサ（自作、大量生産はサンアドバンス（株）、愛知）
４．画像解析装置の１例
ビデオウォークマン（ソニー（株）、東京）
解析専用パソコン（デルコンピューター（株）、川崎）
５．画像解析用ソフトウェア
キャプチャー用ソフトＥｚＤＶ（カノープス（株）、神戸）
画像解析ソフトムービーアナライザーＭＣＩｐｌａｙ（サンアドバンス（株）、愛知）
ＡＢＳＳ解析ソフトおよび出力ソフト（サンアドバンス（株）、愛知）
６．その他
ラット用スポンジゴム製ネックレス（自作）
蛍光緑色テープ（カシオ計算機（株）、東京）
実験方法：
１．ホルマリン試験
非絶食状態のＳＤラットを、専用飼育室より取り出し、予め自作のネックレスを首に巻いた後、黄色マーカー（ピクリン酸エタノール飽和溶液）を口から鼻周囲にかけて塗布し、そして約１時間乾燥させた。次いで上記ネックレスを外し、右足に蛍光緑色テープ（直径７．５　ｍｍ、幅４．５　ｍｍ）を巻き、ＡＢＳＳ装置内のケージ内に照明点灯状態で入れ、そして３０分間で適応させた。その後、２％ホルマリン溶液（上記ホルムアルデヒド液を１００％ホルマリンとし、その２％を生理食塩液にて溶解したもの）の５０μＬをテープを巻いた側のラット右足底に皮下注射（ｉｎｔｒａｐｌａｎｔａｒ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）し、そしてその後６０分間ビデオカメラで行動を撮像した。以上の操作を、ラット５匹について行った。こうして得られたデータに関して、以下に述べるように、本願発明に係る自動化行動解析法により得られたデータを従来技術のマニュアル解析法により得られたデータと比較した。
【００２７】
２．自動化行動解析法
動物のリッキング行動は下からの画像で大半は捉えることができるが、時としてマーカーの付いた足を上に向けるために下から捉えられない場合も起こる。そこで、図３に示すように、上下からの撮像を行い、リッキング行動を出来る限り網羅出来るようにした。そして、下からマーカーが見えないフレームはエラーとみなし、上からの画像は下の画像処理でエラーとなったフレームのみ処理を行うというアルゴリズムでプログラムを設計した。これにより、同一フレームが上下同時に処理され２重処理するのを回避することができ、上下の有効解析フレームを単純に足し合わせたものを処理すれはよいことになる。また、そのための条件として、上のカメラと下のカメラで、録画開始時刻を一致させ、以降の録画を全て同期させる必要がある。そのための工夫として、赤外線ＬＥＤをカメラ近傍に配置しこれをケーブルでリモコンに接続したものを自作した。これにより、リモコンのスイッチをＯＮにすれば上下のカメラが同時に作動し、同期をとる事が出来る。かくして実験終了後録画されたデジタルビデオテープは図３に示すフローにしたがって上下共にビデオウォークマンで再生しながら、同時にキャプチャー専用ソフトウェアＥｚＤＶでキャプチャーを行い、ＡＶＩ形式の動画ファイルでパソコン格納した。このＡＶＩファイルを画像解析ソフトムービーアナライザーＭＣＩｐｌａｙで開き、口の黄色マーカーと足の蛍光緑色テープの色を、生データの画像よりスクロールし認識させた。次いで各色について許容誤差（指定色の近傍色の認識可能な範囲：口を１０、足を１０）及び解析するフレーム間隔を入力（１フレーム間隔）した後処理を行うことにより、有効解析フレーム情報を含むファイル（ＡＢＷファイル）として出力した。次いでＡＢＳＳ解析ソフトを用いて予め化合物名、用量、動物番号等を入力し、２点間距離の設定（設定した距離以内に２点が存在する場合にリッキングとして判定する：５０ドットに設定）を行った後、先のＡＢＷファイルを開くことによりリッキングとして判定されたフレームのリストが３０秒間隔で表示された。これを、ＡＢＳＳ出力ソフトを用い、加算時間（５分）を設定し出力することにより、リッキング時間を５分間隔で加算した時系列情報を得た。
【００２８】
３．マニュアル解析法
実験終了後録画されたデジタルビデオテープのうち下から撮像したものについてのみ再生し、ラットのリッキング時間をストップウォッチで計測した。リッキング時間のみ（口と足を舐めずに単に接触させているだけの状態は計測しない）をホルマリン投与後５分間隔で６０分迄計測した。
結果：
図４に示すように、本願発明に係る自動化行動解析法とマニュアル解析法のいずれの場合においても、急性痛に相当する第１期のピークが最初の５分に、また炎症性疼痛に相当する第２期のピークが２０分前後に認められ、ほぼ一致する結果を得ることができた。したがって、本願発明に係る自動化行動解析法は、従来技術のマニュアル解析法に代替しうることが証明された。
【図面の簡単な説明】
【図１】本願発明に係る自動化行動解析法の基本コンセプトである２点間抽出法の原理を示す概略図。
【図２】本願発明に係る自動化行動解析装置の概略図。
【図３】本願発明に係る自動化行動解析法のフロー図。
【図４】本願発明に係る自動化行動解析法と従来技術のマニュアル計測法とによるリッキング時間の比較図。
【図１】
2004086885.tif 000002
【図２】
2004086885.tif 000003
【図３】
2004086885.tif 000004
【図４】
2004086885.tif 000005