(57)【要約】【課題】安全かつ調製が容易で、新規なＰ−糖タンパク質の機能を阻害する作用を有する成分を含有する多剤耐性抑制剤を提供すること。【解決手段】ニガウリ植物及び／又はその処理物から水及び／又は有機溶媒を用いて抽出することにより得られるＰ−糖タンパク質を阻害する作用を有する物質を有効成分として含有する多剤耐性抑制剤。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニガウリ植物及び／又はその処理物から水及び／又は有機溶媒を用いて抽出することにより得られるＰ−糖タンパク質を阻害する作用を有する物質を有効成分として含有する多剤耐性抑制剤。
【請求項２】
前記有機溶媒が、メタノールである、請求項１に記載の多剤耐性抑制剤。
【請求項３】
前記請求項１又は２に記載の多剤耐性抑制剤を含有する医薬用組成物。
【請求項４】
前記請求項１又は２に記載の多剤耐性抑制剤を含有する食品用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｐ−糖タンパク質を阻害する作用を有する物質を有効成分として含有する多剤耐性抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌を克服することは人類共通の課題であり、そのために現在までに多くの制癌剤が開発されている。一方で、癌細胞が複数の制癌剤やその他の薬剤に対し耐性を有すること（多剤耐性）が、制癌剤による治療の大きな問題となっている。
【０００３】
癌細胞が多剤耐性を発現するメカニズムについては未だ不明な点も多いが、基本的には多剤耐性癌細胞の多くは、Ｐ−糖タンパク質を過剰に産生しており、このＰ−糖タンパク質が制癌剤の細胞外への輸送を担っていると考えられている。その結果、細胞内の抗癌剤の濃度低下がもたらされる。
【０００４】
Ｐ−糖タンパク質は基質特異性が低く、構造が類似しない多くの化合物と結合して薬物を細胞外へ輸送することから、一度癌細胞においてＰ−糖タンパク質が発現すると、多くの制癌剤に対しても耐性を有することになる。事実、アドリアマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、アクチノマイシン　Ｄ、コルヒチン等の構造的に異なる多くの制癌剤がＰ−糖タンパク質により細胞外に排出されることが知られている。従って、Ｐ−糖タンパク質の機能を阻害することが、多剤耐性の克服につながると考えられる。
【０００５】
このような多剤耐性を克服するために、Ｐ−糖タンパク質の機能を阻害する薬剤の開発が種々行われている。例えば、抗Ｐ−糖タンパク質モノクローナル抗体を用いてＰ−糖タンパク質の機能自体をブロックする方法（Ｊｐｎ．　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　８０，　６２７−６３１（１９８９）；　ＢＩＯ　ｍｅｄｉｃａ　６　（５），　４４２−４４５　（１９９１））が報告されている。
【０００６】
しかしながら、上記モノクローナル抗体を用いた方法においては、このような抗体は他の動物（例えばマウス）由来の抗体であるため、それ自体の抗原性が強く臨床への使用は必ずしも容易ではない。
【０００７】
また、ベラパミルなどのカルシウム拮抗薬、シクロスポリン　Ａ、ＦＫ５０６などの免疫抑制剤がＰ−糖タンパク質の機能を阻害することが報告されている。
【０００８】
しかし、これらを多剤耐性の克服を目的として投与した場合、それらの本来持つ作用であるカルシウム拮抗作用、免疫抑制作用が強力な副作用として現れる。例えば、ベラパミルなどのカルシウム拮抗薬は、血管拡張作用が強いので、低血圧などのショックを誘発することがある。
【０００９】
そのため、副作用の可能性の少ない新たな物質が求められていた。
【００１０】
一方、ニガウリについては、粉砕物あるいは抽出物が脂質代謝を改善するとの報告はあるが（特開２００１−２７８８０４）、多剤耐性抑制作用を有すること、さらにはＰ−糖タンパク質を抑制することについては全く知られていなかった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記観点からなされたものであり、安全かつ調製が容易で、新規なＰ−糖タンパク質の機能を阻害する作用を有する成分を含有する多剤耐性抑制剤を提供することを課題とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、ニガウリ植物及び／又はその処理物から水及び／又は有機溶媒を用いて抽出することにより得られる物質にＰ−糖タンパク質の機能を阻害する作用があることを見出し、本発明の完成に至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）ニガウリ植物及び／又はその処理物から水及び／又は有機溶媒を用いて抽出することにより得られるＰ−糖タンパク質を阻害する作用を有する物質を有効成分として含有する多剤耐性抑制剤。
（２）前記有機溶媒が、メタノールである、（１）に記載の多剤耐性抑制剤。
（３）（１）又は（２）に記載の多剤耐性抑制剤を含有する医薬用組成物。
（４）前記（１）又は（２）に記載の多剤耐性抑制剤を含有する食品用組成物。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明の多剤耐性抑制剤
本発明の多剤耐性抑制剤とは、薬剤（以下、「対象薬剤」ともいう）に対する耐性を抑制することができる薬剤をいい、言い換えると、対象薬剤の細胞外への排出を抑制することができる薬剤である。特に本発明では、具体的にＰ−糖タンパク質の機能を阻害することができる薬剤であると、多剤耐性抑制剤として使用することができる。
【００１５】
ここで、抑制の対象となる上記対象薬剤としては、シクロホスファミド、メルファランなどのアルキル化系抗がん剤、フルオロフラシルなどの代謝拮抗系抗がん剤、ダウノマイシン、マイトマイシンＣなどの抗がん性抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチンなどの植物由来アルカロイド抗がん剤などが挙げられる。
【００１６】
そして、本発明の多剤耐性抑制剤は、上記した対象薬剤のうち少なくとも１つに薬剤耐性抑制効果が認められるものである。
【００１７】
本発明の多剤耐性抑制剤は、ニガウリ植物及び／又はその処理物から水及び／又は有機溶媒を用いて抽出することにより得られるＰ−糖タンパク質を阻害する作用を有する物質を有効成分として含有する。
【００１８】
ニガウリ植物及び／又はその処理物から水及び／又は有機溶媒を用いて抽出することにより得られる物質には、以下の実施例から明らかなようにＰ−糖タンパク質を阻害する作用がある。そこでニガウリ植物及び／又はその処理物から水及び／又は有機溶媒を用いて抽出することにより得られる物質を有効成分として、効果を示すに有効な量含有する剤は、多剤耐性抑制剤として好適に使用することができる。
【００１９】
ここで、ニガウリ植物の処理物とは、ニガウリ植物を破砕、摩砕、乾燥、搾汁、濃縮等の処理を行ったものをいう。
【００２０】
有機溶媒として、例えばメタノール、ジメチルスルホキシド、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、ｉ−プロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、ｉ−ブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、ｔ−ブチルアルコール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミドなどの極性の高い有機溶媒が挙げられる。そして、これらの有機溶媒のうち１種又は２種以上を選択して使用することができる。中でも、特にメタノールが好ましく使用できる。
【００２１】
上記したニガウリ植物及び／又はその処理物から水及び／又は有機溶媒を用いてＰ−糖タンパク質を阻害する作用を有する物質を抽出する例を以下に例示するが、本発明はこの抽出例に限定されるものではない。
【００２２】
ニガウリ植物の凍結乾燥した粉末に有機溶媒（好ましくはメタノール）を加え振とう後、遠心分離にて上清と沈殿物に分離する。上清を減圧下濃縮後、凍結乾燥し、抽出物を得る。
【００２３】
このようにして得られた抽出物のＰ−糖タンパク質阻害作用の確認方法としては、後記実施例に示す評価方法を用いることができる。
【００２４】
上記多剤耐性抑制剤と、医薬用又は食品用として通常用いられている他の任意成分とを組み合わせれば、Ｐ−糖タンパク質を阻害することができる多剤耐性抑制用の医薬用組成物や食品用組成物を提供することができる。
＜２＞本発明の多剤耐性抑制剤を含有する医薬用組成物。
【００２５】
本発明の医薬用組成物は、上記の多剤耐性抑制剤を、常法にしたがって配合したものであり、Ｐ−糖タンパク質を阻害する作用が期待できるものであれば特に限定されるものではない。
【００２６】
本発明の医薬用組成物の剤型は、特に限定されないが、一般に製剤上許容される１または２種類以上の担体、賦形剤、統合剤、防腐剤、安定剤、香味剤等と共に混合して、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、水薬、ドリンク剤等の内服剤型とすることが好ましい。このような製剤化は、通常、医薬の製造に用いられる方法に従って製剤化することができる。
【００２７】
上記医薬用組成物の投与量としては、疾患の種類、症状、患者の年齢、体重等により異なるが、成人１日当たり、ニガウリ植物及び／又はその処理物から水及び／又は有機溶媒を用いて抽出することにより得られるＰ−糖タンパク質を阻害する作用を有する物質を５０ｍｇ〜１００００ｍｇ含む多剤耐性抑制剤を含有する医薬用組成物を、１回ないし数回に分けて投与するのが好ましい。
＜３＞本発明の多剤耐性抑制剤を含有する食品用組成物
本発明の食品用組成物は、上記の多剤耐性抑制剤を、常法にしたがって配合したものである。
【００２８】
本発明の食品用組成物としては、上記のＰ−糖タンパク質を阻害する作用が期待できるものであれば特に限定されるものではないが、種々の食品に、食品として通常用いられている任意成分とともに、食品原料に抽出物を所要量配合することができる。この抽出物を配合する際に特に留意することはなく、通常の製造方法により加工製造することにより、健康食品、機能性食品を製造することができる。
【００２９】
配合量は、食品の種類により異なるが、食品の味を損なわず、且つ十分なＰ−糖タンパク質を阻害する効果を得るためには、食品用組成物全量に対して、Ｐ−糖タンパク質を阻害する作用を有する物質を０．１〜２０重量％の割合で、より好ましくは０．５〜５重量％の割合で配合させるのが好ましい。
【００３０】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００３１】
【実施例１】＜試料抽出方法＞
試料の抽出方法は、以下のように行った。
【００３２】
市販のニガウリを洗浄後、種子部および両端を除去し、破砕後凍結乾燥して粉末化させた。
【００３３】
ニガウリの凍結乾燥物５ｇに４０％メタノール（５０ｍｌ）を加え、室温で２０分振とうした。その後、遠心分離（３，０００　ｒｐｍ×１５分）にて上清と沈殿物に分離し、上清を減圧下濃縮後に凍結乾燥し、２．３ｇの抽出物を得た。
【００３４】
【実施例２】＜Ｐ−糖タンパク質の阻害活性評価＞
Ｐ−糖タンパク質の阻害活性評価は、次に示すｉｎ　ｖｉｔｒｏの評価系において測定した。
＜評価１＞
上記試料抽出方法（４０％メタノールで抽出）により抽出したニガウリ抽出物を用いて、０．１から５．０ｍｇ／ｍｌの範囲で濃度を変えたニガウリ抽出物の試料を用意した。
【００３５】
Ｃａｃｏ−２細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　（Ｒｏｃｋｖｉｌｅ，　ＭＤ，　Ｕ．Ｓ．Ａ．）より入手し（ＡＴＣＣ　ＨＴＢ−３７）、１０％ウシ胎児血清、１％　非必須アミノ酸、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、１００ｕｎｉｔ／ｍｌ　ペニシリン　Ｇ、１００μｇ／ｍｌ　ストレプトマイシンを加えたダルベッコ変法イーグル培地で、３７℃、５％二酸化炭素／９５％空気雰囲気下で培養した。
【００３６】
Ｃａｃｏ−２細胞を２４穴プレートに１．４×１０５個ずつまき、３７℃で１４日間培養した。その後、培地を除去しリン酸緩衝食塩水で洗浄した。その後、ＨＢＳＳ（１３６．７ｍＭ　塩化ナトリウム、５．４ｍＭ　塩化カリウム、０．９５ｍＭ　塩化カルシウム二水和物、０．８１ｍＭ　硫酸マグネシウム七水和物、０．４４ｍＭ　リン酸二水素カリウム、０．３９ｍＭ　リン酸二ナトリウム十二水和物、２５ｍＭ　Ｄ−グルコース）に４ｍＭ　炭酸水素ナトリウム、１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓを加えｐＨ７．４に補正したもの（以下、「ｕｐｔａｋｅ　ｂｕｆｆｅｒ」ともいう）を７００μｌ添加し、１０分間平衡化を行った。
【００３７】
反応液（試料および４０ｎＭ（０．２μＣｉ／ｍｌ）［３Ｈ］−ダウノマイシン（Ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ）をｕｐｔａｋｅ　ｂｕｆｆｅｒに溶解したもの）を３００μｌ加え、２時間放置後、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を３００μｌ加えて細胞を可溶化した後に液体シンチレーションカウンター（ＡＬＯＫＡ）により、Ｃａｃｏ−２細胞に取り込まれた［３Ｈ］−ダウノマイシン量を測定した。
【００３８】
０．１から５．０ｍｇ／ｍｌの濃度の異なるニガウリ抽出物の試料を用いて上記方法に従って評価した結果を表１に示す。
【００３９】
表１から明らかなように、ニガウリ抽出物に濃度依存的な［３Ｈ］−ダウノマイシン取り込み作用が認められた。
【００４０】
【表１】
2004043401.tif 000002
＜評価２＞
上記試料抽出方法において、メタノールの濃度を変えて０％から１００％のメタノール水溶液で抽出したニガウリ抽出物の試料を用意した。
【００４１】
上記方法に従って、０％から１００％のメタノール水溶液で抽出したニガウリ抽出物、２ｍｇ／ｍｌの濃度の試料を用いて評価を行った。
【００４２】
その結果、表２に示すように、各抽出物とも強い［３Ｈ］−ダウノマイシン取り込み作用が認められた。
【００４３】
【表２】
2004043401.tif 000003
＜評価３＞
上記試料抽出方法（４０％メタノールで抽出）により抽出した２ｍｇ／ｍｌの濃度のニガウリ抽出物の試料を用いた。
【００４４】
Ｃａｃｏ−２細胞の培養は、上記の方法に準じて行った。
【００４５】
Ｃａｃｏ−２細胞を１２穴透過性プレートに１×１０５ずつまき、３７℃で１４日間培養した。その後、ｕｐｔａｋｅ　ｂｕｆｆｅｒで洗浄後、ｕｐｔａｋｅ　ｂｕｆｆｅｒを５００μｌ添加し、３０分間平衡化を行った。
【００４６】
反応液（２ｍｇ／ｍｌの試料および１００ｎＭ（０．５　μＣｉ／ｍｌ）の［３Ｈ］−ダウノマイシンをｕｐｔａｋｅ　ｂｕｆｆｅｒに溶解したもの）を細胞の先端側（Ａｐｉｃａｌ側）に添加し、一定時間（１５、３０、６０、９０、１２０分）後に細胞の基底側（Ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ側）の溶液を５０μｌ回収し、クリアゾル３ｍｌに溶解後、液体シンチレーションカウンター（ＡＬＯＫＡ）により、細胞の基底側へ透過した［３Ｈ］−ダウノマイシン量を測定した。
【００４７】
上記試料抽出方法（４０％メタノールで抽出）により抽出した２ｍｇ／ｍｌの濃度のニガウリ抽出物の試料を用いて上記方法に従い各時間経過後に評価した結果を表３に示す。
【００４８】
その結果、表３に示すように、ニガウリ抽出物に［３Ｈ］−ダウノマイシンの細胞の先端側から細胞の基底側への透過を促進させる作用が認められた。
【００４９】
【表３】
2004043401.tif 000004
＜評価４＞
上記試料抽出方法（４０％メタノールで抽出）により抽出した２ｍｇ／ｍｌの濃度のニガウリ抽出物の試料を用いた。
【００５０】
２ｍｇ／ｍｌの試料をｕｐｔａｋｅ　ｂｕｆｆｅｒに溶解したものを細胞の先端側に、１００ｎＭ（０．５　μＣｉ／ｍｌ）の［３Ｈ］−ダウノマイシンをｕｐｔａｋｅ　ｂｕｆｆｅｒに溶解したものを細胞の基底側に添加した他は、上記した評価３の方法に準じて行った。
【００５１】
試料と［３Ｈ］−ダウノマイシンを上記のようにそれぞれ細胞の先端側と細胞の基底側に添加し、一定時間（１５、３０、６０、９０、１２０分）後に細胞の先端側の溶液を５０μｌ回収し、クリアゾル３ｍｌに溶解後、液体シンチレーションカウンター（ＡＬＯＫＡ）により、細胞の先端側へ透過した［３Ｈ］−ダウノマイシン量を測定した。
【００５２】
上記試料抽出方法（４０％メタノールで抽出）により抽出した２ｍｇ／ｍｌの濃度のニガウリ抽出物の試料を用いて上記方法に従い各時間経過後に評価した結果を表４に示す。
【００５３】
その結果、表４に示すように、ニガウリ抽出物に［３Ｈ］−ダウノマイシンの細胞の基底側から細胞の先端側への透過を抑制させる作用が認められた。
【００５４】
【表４】
2004043401.tif 000005
評価３と評価４において、腸管上皮細胞であるＣａｃｏ−２細胞は培養液中で上下規則正しく配列しており、ここで、Ｃａｃｏ−２細胞の先端側（Ａｐｉｃａｌ側）は、生体内での腸管内腔側に相当し、Ｃａｃｏ−２細胞の基底側（Ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ側）は、生体内の腸管壁の内部側に相当する。栄養成分や薬物は、細胞の先端側（Ａｐｉｃａｌ側）から取り込まれる。
【００５５】
上記の評価３と評価４の実験では、ニガウリ抽出物の添加により、細胞の先端側から細胞の基底側への薬剤の取り込みが維持されること、細胞の基底側から細胞の先端側への薬剤の排出が抑制されることが明らかとなった。
【００５６】
これにより、薬剤を投与すると、腸管上皮細胞上のＰ−糖タンパク質の働きにより薬剤は腸管内腔側に戻されるが、ニガウリ抽出物を添加することにより、Ｐ−糖タンパク質の働きが阻害され（多剤耐性が改善され）、投与された薬剤の腸管内腔側への移行が抑制されたといえる。
【００５７】
以上、上記評価実験から明らかなように、ニガウリ植物及び／又はその処理物から得られる抽出物にＰ−糖タンパク質を阻害する作用が認められた。よって、ニガウリ植物及び／又はその処理物から水及び／又は有機溶媒を用いて抽出することにより得られる物質を有効成分として含有する剤は、多剤耐性抑制剤として好適に使用することができる。
【００５８】
【発明の効果】
本発明により、安全かつ調製が容易で、新規なＰ−糖タンパク質の機能を阻害する作用を有する成分を含有する多剤耐性抑制剤を提供することができた。