(57)【要約】【課題】　より安全である生成体細胞からの組換えレトロウイルス（レトロウイルスベクター粒子）及び正常よりも高い力価の生成を可能にする方法を提供すること。【解決手段】　パッケージングタンパク質及び目的の遺伝子生成物からなる群より選択される高レベルの主要因子を産生するパッケージング細胞を選択する方法であって、　（ａ）細胞中で主要因子を発現する主要遺伝子と、細胞中で選択可能タンパク質を発現する選択可能遺伝子とを含んで成るゲノムをパッケージング細胞に供給し、ここで、該選択可能遺伝子は、該主要遺伝子の下流に配置され、それによって、該主要遺伝子よりも低いレベルで発現され；　（ｂ）臨界レベルで選択可能タンパク質を発現する細胞の同定を可能にする選択因子に該パッケージング細胞を曝露し；　（ｃ）より高レベルの主要因子を発現するパッケージング細胞を検出することを含んで成る方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
パッケージングタンパク質及び目的の遺伝子生成物からなる群より選択される高レベルの主要因子を産生するパッケージング細胞を選択する方法であって、
　（ａ）細胞中で主要因子を発現する主要遺伝子と、細胞中で選択可能タンパク質を発現する選択可能遺伝子とを含んで成るゲノムをパッケージング細胞に供給し、ここで、該選択可能遺伝子は、該主要遺伝子の下流に配置され、それによって、該主要遺伝子よりも低いレベルで発現され；
　（ｂ）臨界レベルで選択可能タンパク質を発現する細胞の同定を可能にする選択因子に該パッケージング細胞を曝露し；
　（ｃ）より高レベルの主要因子を発現するパッケージング細胞を検出することを含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は一般にレトロウイルス、そしてより詳しくは、感受性標的細胞にベクター構造体を搬送することのできる組換えレトロウイルスに関する。これらのベクター構造体は典型的には標的細胞において所望のタンパク質を発現するようにデザインされており、このタンパク質には、数多くの手段における治療的作用を有することがあり、それ故、細胞の中へのタンパク質（又はＲＮＡ）の輸送を可能とする「薬剤」輸送系を構成するタンパク質が含まれる。酵素反応、細胞成分との結合性、免疫学的作用又はその他の生物学的作用に関するタンパク質（又はＲＮＡ）の特異性は、もしこのタンパク質又はＲＮＡ分子が細胞の中に輸送されうるなら、標的細胞に関連の特異的作用を及ぼすことを可能とする。かかる作用には遺伝的欠陥の修復、細胞プロセスをブロックするためのアンチセンスＲＮＡの生産、プロドラッグの酵素的潜在化、及び細胞免疫系の刺激、並びにタンパク質の細胞内生産に基づくその他のあらゆる治療が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
　レトロウイルスは複製し、そしてＤＮＡ中間体を介して宿主細胞のゲノムの中に組込まれることのできるＲＮＡウイルスである。このＤＮＡ中間体又はプロウイルスは、宿主の細胞ＤＮＡの中に安定に組込まれうる。宿主細胞の中へのそれらの組込まれる効率性に基づき、レトロウイルスは人遺伝子治療における利用にとって最も有望とされるベクターのうちの一つである。これらのベクターは、それらが疾患の遺伝的治療にとって最も有望である技術の一つであると考えられるようにするいくつかの特徴を有している。これには：（１）紹胞の中への遺伝子物質（ベクターゲノム）の効率的な侵入；（２）標的細胞の核への侵入に現実的に有効なプロセス；（３）比較的高いレベルの遺伝子発現；（４）標的細胞に及ぼす最小の病理学的作用；及び（５）特定の細胞サブタイプを標的にする能力が含まれ、これらはベクター−標的細胞結合のコントロール及び遺伝子発現の組織特異的コントロールを介する。例えば、対象の外来遺伝子を、正常のレトロウイルスＲＮＡと置き換えてレトロウイルスの中に組込むことができる。レトロウイルスがそのＲＮＡを細胞の中に注入すると、この外来遺伝子も細胞の中に導入され、そしてそれらがあたかもレトロウイルス自体であるかのように宿主の細胞ＤＮＡの中に組込まれうる。宿主内でのこの外来遺伝子の発現は宿主細胞による外来タンパク質の発現をもたらす。
【０００３】
　遺伝子治療のために開発されてきたほとんどのレトロウイルスはネズミのレトロウイルスである。簡単に述べると、これらのレトロウイルスは二つの型、即ち、宿主の細胞ＤＮＡの中に組込まれるプロウイルスとして、又は遊離ビリオンとして存在する。ビリオンは、レトロウイルスの構造及び酵素タンパク質（逆転写酵素を含む）、ウィルスゲノムの２つのＲＮＡコピー、並びにウイルスのエンベロープ糖タンパク質が埋まっている細胞の形質膜の部分を含むウイルスを形成する。このゲノムは４つの主要領域：長い末端反復（Ｌｏｎｇ　Ｔｅｒｍｉｎａｌ　Ｒｅｐｅａｔ：ＬＴＲ）、並びにｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を編制する。ＬＴＲはプロウイルスゲノムの両端に見い出せることができ、ＲＮＡゲノムの５’及び３’末端の構成成分であり、そして転写の開始及び終結にとって必須なシス作用因子を含む。３種の遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖは末端のＬＴＲの間に位置する。ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子はそれぞれ内部ウイルス構造及び酵素タンパク質をコードする。ｅｎｖ遺伝子はエンベロープ糖タンパク質をコードし、これはウイルスに感染性及び宿主域特異性を授ける。
【０００４】
　遺伝子治療のためにレトロウイルスを用いるうえでの重要な概念は「安全」なレトロウイルスの利用である。パッケージング細胞系はこの概念に合うように開発されている。簡単に述べると、この方法論は２つの成分、即ち、レトロウイルスベクターとパッケージング細胞の利用を採用する。レトロウイルスベクターは長い末端反復（ＬＴＲ）、転移させるべき外来ＤＮＡ及びパッケージング配列（φ）を含む。このレトロウイルスベクターはそれ自体によって再生することはなく、その理由は携造及びエンベレロープタンパク質をコードする遺伝子がこのベクターの中に含まれていないからである。このパッケージング細胞はｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖタンパク質をコードする遺伝子を含むが、しかしパッケージングシグナル「φ」は含まない。従って、パッケージング細胞はそれ自体によっては空のビリオン粒子しか形成できない。一般方法においては、レトロウイルスベクターをパッケージング細胞の中に導入し、これによって「生産細胞」を作り上げている。この生産細胞はレトロウイルスベクター（外来）のＤＮＡのみを含むビリオン粒子を製造し、従って治療的利用にとって安全なレトロウイルスであると従来から考えられている。
【０００５】
　この手法の現状の利用においていくつかの欠点がある。１つの問題は生産細胞系による「生存ウイルス」（即ち、コンピテント複製性レトロウイルス）の発生が含まれる。レトロウイルスで汚染された人の治療のための調製物は、人の治療における利用に適切でないと現状考えられている．例えば、イメージング及び治療のためのモノクローナル抗体のレトロウイルス汚染の排除のためにかなりの手段が取られている。生存ウイルスは、（１）ベクターゲノムとヘルパーゲノムが互いに組換えし合うとき；（２）ベクターゲノム又はヘルパーゲノムが生産細胞の中で相同性の未解明な内因性レトロウイルス因子と組換えしたとき；又は（３）未解明の内因性レトロウイルス因子が再活性化したとき（例えばマウス細胞における異種向性（ゼネトロピック）レトロウイルス）に常用の生産細胞の中にあることがある。
【０００６】
　他の問題はマウスを基礎とする生産細胞の、それらが所望のベクターをパッケージするのと近い効率で内因性レトロウイルス−ベクター様因子（これはｏｎｃ遺伝子配列を含むことができる）をパッケージする性質にある。かかる因子は、そのベクター様構造のため、所望のベクター配列の転移と匹敵する頻度にて標的処理細胞に伝達される。
【０００７】
　第３の問題は、（１）大量の細胞（例えば１０８−１０１０個）の処理；及び（２）商業的に有用な価格でのベクター粒子の製造、のために十分なベクター粒子を適切な濃度で作製する能力にある。最後に、人細胞への遺伝子の輸送に現状利用されている唯一の生産細胞は、名祖であるネズミレトロウイルスエンベロープ遺伝子に関して知られている両向性生産細胞であり、これはほとんどの人細胞におけるレセプターを有している。
【０００８】
　より安全なパッケージング細胞を作製するため、研究者は３’ＬＴＲ及び５’ＬＴＲの部分において更なる欠失を行った（非特許文献１を参照のこと）。かかる細胞を用いたとき、野生型ゲノムを形成するには２回の組換え現象が必要となる。にもかかわらず、いくつかの研究室の結果は、たとえ複数の突然変異が存在している場合でさえも、野生型ウイルスがいまだ残っていることがあることを示唆している（非特許文献２；非特許文献３を参照のこと）。
【０００９】
　現在までに詳細されている数多くのヘルパー細胞系はネズミ、鳥類、ラット及びイヌ細胞の一定の宿主域に限定されている。最近のヘルパー細胞系は人細胞及び広域のその他の哺乳動物細胞に感染できる両向性レトロウイルスベクター系を用いて作製されているが（非特許文献４を参照のこと）、これにより開発された両向性パッケージン系にはウイルスＬＴＲの１又は複数の部分が残っており、従ってたとえ複数の突然変異が存在していたとしても、複製−コンピテントゲノムが生ずる可能性が残っている。複数の突然変異を有し、且つ感染性ウイルスを作製する傾向の低い両向性ベクター系は一般に不満足たる低い力価のレトロウイルス粒子を示す。
【００１０】
　より安全なパッケージング細胞系を作製するためのより最近になっての手法の一つは、一方がｇａｇ及びｐｏｌを含み、そして他方がｅｎｖを含む２つの別々のプラスミドに分割したヘルパーウイルスの相補部分の利用を含む（非特許文献５及び非特許文献６を参照のこと）。この二重プラスミド系の１つの利点は、複製コンピテントゲノムが生ずるのに３回の組換え現象が必要であることにある。にもかかわらず、これらの二重プラスミドベクターもレトロウイルスのＬＴＲの部分を含む欠点に悩まされ、従って感染性ウイルスを生産する能力が残っている。３’及び５’ＬＴＲ欠失の両方を含む細胞系が作られているが、しかしながらこれによっても有用に改善されておらず、その理由はそれらが比較的低い力価を提供するからである（非特許文献７）。
【００１１】
　本発明は従来のパッケージング細胞系の困難さを解決し、そして更に関連の利点を提供する。
【非特許文献１】ＭｉｌｌｅｒとＢｕｔｔｉｍｏｒｅ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５−２９０２
【非特許文献２】Ｂｏｓｓｅｌｍａｎら著，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１７９７−１８０６，１９８７
【非特許文献３】ＤａｎｏｓとＭｕｌｌｉｇａｎ著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８１：６４６０−６４６４，１９８８
【非特許文献４】Ｓｏｒｇｅら著，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１７２０−１７３７，１９８４
【非特許文献５】Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら著，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１１２０−１１２４
【非特許文献６】Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら著，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１６７：６００−６０６，１９８８
【非特許文献７】Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら著，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３２０９−３２１２，１９８９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
　従って、本発明は、より安全である生成体細胞からの組換えレトロウイルス（レトロウイルスベクター粒子）及び正常よりも高い力価の生成を可能にする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
　１つの局面において、本発明は、パッケージングタンパク質及び対象の遺伝子生成物から選択される高レベルの主要因子を生成するパッケージング細胞を選択する方法であって：
（ａ）そこで主要因子を発現する主要遺伝子を含んで成るゲノム、及び上記主要因子よりも低いレベルでそこで選択可能タンパク質を発現する選択可能遺伝子をパッケージング細胞に供給し（ここで上記主要遺伝子及び選択可能遺伝子の発現レベルは比例し）；
（ｂ）臨界レベルで選択可能タンパク質を発現するそれらの細胞の同定を可能にする選択因子に上記パッケージング細胞を暴露し；そして
（ｃ）高レベルの主要因子を発現するそれらのパッケージング細胞を検出することを含んで成る方法を提供する。
【００１４】
　別の局面において、本発明は、組換えレトロウイルスの生成方法であって：
　ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖタンパク質を生成できる組換えウイルスにより感染された大細胞系から上記タンパク質を生成し；そして
　ウイルスベクターＲＮＡを担持する組換えレトロウイルスを生成するために、粒子アセンブリーのための欠失機能を補足するウイルスベクターＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リポソーム及び細胞抽出物と上記タンパク質とを接触せしめることを含んで成る方法を提供する。
【００１５】
　別の局面において、本発明は、組換えレトロウイルスの生成方法であって：
（ａ）別々に又は組合して、ｇａｇ／ｐｏｌ、ｅｎｖ及びレトロウイルスベクターゲノムをコードする組換えウイルスベクターを生成し；
（ｂ）高い力価のストックを生成し；そして
（ｃ）組換えレトロウイルスベクターを生成するために主要又は他の細胞を同時感染せしめることを含んで成る方法を提供する。
【００１６】
　別の局面において、本発明は、組換えレトロウイルスの生成方法であって、
（ａ）対象の遺伝子及び第１のレトロウイルス表現型のパッケージングシグナル；
（ｂ）パッケージングシグナルを欠く、上記第１のレトロウイルス表現型のｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子；
（ｃ）パッケージングシグナルを欠くハイブリッドｅｎｖ遺伝子（ここで上記第１のレトロウイルス表現型の細胞質セグメント及び上記第１のレトロウイルス表現型に対して外因性の結合セグメントを含んで成る）；を含んで成るゲノムを有する生成体細胞を増殖することを含んで成る方法を提供する。
【００１７】
　別の局面において、本発明は、組換えレトロウイルスの生成方法であって、
（ａ）対象の遺伝子及び第１のレトロウイルス表現型のパッケージングシグナル；
（ｂ）パッケージングシグナルを欠く、上記第１のレトロウイルス表現型のｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子；
（ｃ）生成体細胞の表面上で発現され、そして続いて、ベクター粒子の表面上に表わされるリガンドをコードする遺伝子を含んで成るゲノムを有する生成体細胞を増殖することを含んで成る方法を提供する。
【００１８】
　１つの実施形態において、上記リガンドはＣＤ４であり得る。
【００１９】
　別の局面において、本発明は、標的細胞に対象の遺伝子を選択的に担持できるレトロウイルスを調製するために有用なハイブリッドｅｎｖ遺伝子であって：
（ａ）第１のレトロウイルス表現型の細胞質セグメント；及び
（ｂ）上記第１のレトロウイルス表現型に対して外因性の結合セグメント（ここで上記結合セグメントは標的細胞に選択的に結合できる）；
をコードすることを特徴とする遺伝子を提供する。
【００２０】
　別の局面において、本発明は、標的細胞のゲノム上の予備選択された部位中にそのゲノムを組込むことができる組換えレトロウイルスの生成方法であって：
　カプシド及びエンベロープにベクターをパッケージングし、そして予備選択された部位中にレトロウイルスゲノムを組込むことができる変性形インテグラーゼをウイルス粒子に包含することを含んで成る方法を提供する。
【００２１】
　別の局面において、本発明は、組換えレトロウイルスの生成方法であって：
　ｇａｇ／ｐｏｌ−ｅｎｖウイルス構成体を含むトランスジェニック動物又は昆虫と、プロモーターを含むベクター構成体を含むトランスジェニック動物又は昆虫とを交配し；
　上記トランスジェニック動物又は昆虫の子孫を単離し；
　上記子孫から選択された細胞を単離し；
　適切な培地において上記細胞を増殖し；そして
　上記細胞から組換えレトロウイルスを単離することを含んで成る方法を提供する。
【００２２】
　別の局面において、本発明は、トランスジェニックパッケージング動物又は昆虫の生成方法であって：
　パッケージングのために必要な、いくらかの（但しすべてではない）ウイルスタンパク質をコードするベクター構成体を含むトランスジェニック動物又は昆虫と、上記必要なウイルスタンパク質の残りをコードするベクター構成体を含むトランスジェニック動物又は昆虫とを交配し；そして
　上記トランスジェニック動物又は昆虫の子孫を単離することを含んで成る方法を提供する。
【００２３】
　１つの実施形態において、上記方法は、高い力価の組換えレトロウイルスを生成できる主要細胞を生成するために、ベクター構成体を含むトランスジェニック動物又は昆虫と上記子孫とを交配する段階をさらに含み得る。
【００２４】
　別の実施形態において、上記方法は、高い力価の組換えレトロウイルスを生成できる主要細胞を生成するために、ベクター構成体を含む組換えレトロウイルスにより、上記子孫から外植された細胞を感染せしめる段階をさらに含み得る。
【００２５】
　別の局面において、本発明は、標準のマウス両向性パッケージング細胞系に比較して、ウイルスパッケージングタンパク質において少なくとも１０倍高く生成する非マウスパッケージング細胞系を提供する。
【００２６】
　１つの実施形態において、上記ウイルスパッケージングタンパク質は、ｇａｇ／ｐｏｌタンパク質であり得る。
【００２７】
　別の実施形態において、上記細胞系が両向性パッケージング細胞系であり得る。
【００２８】
　好ましい実施形態において、上記パッケージング細胞系は、ベクター構成体の導入に基づいて、標準のマウス両向性パッケージング細胞系に比較してベクター力価において少なくとも１０倍高く生成し得る。
【００２９】
　別の好ましい実施形態において、上記パッケージング細胞系は、ベクター構成体の導入に基づいて、ヒト細胞を感染できるベクター粒子を生成し得る。
【００３０】
　別の局面において、本発明は、ベクター構成体の導入に基づいて、複製コンピテントウイルスにより実質的に汚染されていないベクター粒子を生成できる異種向性パッケージング細胞系を提供する。
【００３１】
　１つの実施形態において、上記細胞系は、ＨＴ１０８０細胞が感染される場合、標準のマウス両向性パッケージング細胞系に比較して、少なくとも同じベクター力価を生成し得る。
【００３２】
　別の局面において、本発明は、多向性パッケージング細胞系を提供する。
【００３３】
　１つの実施形態において、上記細胞系は、ベクター構成体の導入に基づいて、複製コンピテントウイルスにより実質的に汚染されていないベクター粒子を生成し得る。
【００３４】
　別の実施形態において、上記パッケージング細胞系は、２９３細胞が感染される場合、ベクター構成体の導入に基づいて、標準のマウス両向性パッケージング細胞系に比較してベクター力価において少なくとも１０倍高く生成し得る。
【００３５】
　別の局面において、本発明は、パッケージング細胞系が、ベクター構成体の導入に基づいて、腎臓系統の細胞（但し、線維芽細胞、上皮、Ｔ細胞又は単球系統の細胞ではない）を感染できるベクター粒子を生成する多向性パッケージング細胞系を提供する。
【００３６】
　別の局面において、本発明は、ｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖのための遺伝子を別々のオペロン上に担持し（上記オペロンはレトロウイルスＬＴＲ配列を欠き）、そしてＮ２型ベクター構成体の導入に基づいて、少なくとも２０日間の培養継代の後、実質的にヘルパーウイルスを生成しない非マウスパッケージング細胞系を提供する。
【００３７】
　１つの実施形態において、上記細胞系は、両向性パッケージング細胞系であり得る。
【００３８】
　別の実施形態において、上記細胞系は、多向性パッケージング細胞系であり得る。
【００３９】
　別の実施形態において、上記細胞系は、異種向性パッケージング細胞系であり得る。
【００４０】
　別の局面において、本発明は、組換えレトロウイルスの生成方法であって：
ａ）レトロウイルスベクターシステムによりパッケージできる転写体を生成する内因性プロウイルスを実質的に有さない細胞系中にレトロウイルスベクターシステムからのパッケージング遺伝子を導入し；そして
ｂ）標準のマウス両向性パッケージング細胞系に比較して、ウイルスパッケージングタンパク質において少なくとも１０倍高く生成し、そしてベクター構成体の導入に基づいて、標準のマウス両向性パッケージング細胞系に比較して、ベクター力価において少なくとも１０倍高く生成する細胞について選択することを含んで成る方法を提供する。
【００４１】
　別の局面において、本発明は、組換えレトロウイルスの生成方法であって：
ａ）レトロウイルスベクターシステムによりパッケージできる転写体を生成する内因性プロウイルスを実質的に有さない細胞系中に、ヒト細胞を感染できるレトロウイルスベクターシステムからのパッケージング遺伝子を導入し；そして
ｂ）ベクター構成体の導入に基づいて、標準のマウス両向性パッケージング細胞系の力価に少なくとも等しいベクター力価を生成し、そしてヒト細胞を感染できるベクター粒子を生成する細胞について選択することを含んで成る方法を提供する。
【００４２】
　別の局面において、本発明は、ＣＡ、２Ａ、ＤＡ、ＤＡ２、ＤＸ、Ｄ１７　ＸＥＮＯ、ＨＸ、ＨＴ１０８０　ＸＥＮＯ、ＨＰ及びＨＴ１０８０　ＰＯＬＹから成る群から選択された細胞系を提供する。
【００４３】
　別の局面において、本発明は、選択された細胞型を感染できるベクターの生成方法であって：
ａ）ウイルスが遺伝子的に変異誘発し、そして卓越して早く増殖する株が生成するまで、選択された細胞型の細胞においてウイルスを連続的に継代し；
ｂ）上記変異誘発され、そして早く増殖する株を単離し；
ｃ）上記変異誘発されたウイルスの選択的増殖を担当できる上記変異誘発された株の成分を同定し、そして単離し；
ｄ）連続した継代の前、上記ウイルスに基づかれる生成体細胞における対応する成分のための置換体として上記同定され、そして単離された成分を、挿入し、そして、
ｅ）上記ベクターを生成せしめるために上記生成体細胞を培養することを含んで成る方法を提供する。
【００４４】
【表１】
2004041234.tif 000002
【００４５】
【表２】
2004041234.tif 000003
【００４６】
【表３】
2004041234.tif 000004
【００４７】
【表４】
2004041234.tif 000005
【００４８】
【表５】
2004041234.tif 000006
【００４９】
【表６】
2004041234.tif 000007
【００５０】
【表７】
2004041234.tif 000008
【００５１】
【表８】
2004041234.tif 000009
【実施例】
【００５２】
【表９】
2004041234.tif 000010
【００５３】
【表１０】
2004041234.tif 000011
【００５４】
【表１１】
2004041234.tif 000012
【００５５】
【表１２】
2004041234.tif 000013
【００５６】
【表１３】
2004041234.tif 000014
【００５７】
【表１４】
2004041234.tif 000015
【００５８】
【表１５】
2004041234.tif 000016
【００５９】
【表１６】
2004041234.tif 000017
【００６０】
【表１７】
2004041234.tif 000018
【００６１】
【表１８】
2004041234.tif 000019
【００６２】
【表１９】
2004041234.tif 000020
【００６３】
【表２０】
2004041234.tif 000021
【００６４】
【表２１】
2004041234.tif 000022
【００６５】
【表２２】
2004041234.tif 000023
【００６６】
【表２３】
2004041234.tif 000024
【００６７】
【表２４】
2004041234.tif 000025
【００６８】
【表２５】
2004041234.tif 000026
【００６９】
【表２６】
2004041234.tif 000027
【００７０】
【表２７】
2004041234.tif 000028
【００７１】
【表２８】
2004041234.tif 000029
【００７２】
【表２９】
2004041234.tif 000030
【００７３】
【表３０】
2004041234.tif 000031
【００７４】
【表３１】
2004041234.tif 000032
【００７５】
【表３２】
2004041234.tif 000033
【００７６】
【表３３】
2004041234.tif 000034
【００７７】
【表３４】
2004041234.tif 000035
【００７８】
【表３５】
2004041234.tif 000036
【００７９】
【表３６】
2004041234.tif 000037
【００８０】
【表３７】
2004041234.tif 000038
【００８１】
【表３８】
2004041234.tif 000039
【００８２】
【表３９】
2004041234.tif 000040
【００８３】
【表４０】
2004041234.tif 000041
【００８４】
【表４１】
2004041234.tif 000042
【００８５】
【表４２】
2004041234.tif 000043
【００８６】
【表４３】
2004041234.tif 000044
【００８７】
【表４４】
2004041234.tif 000045
【００８８】
【表４５】
2004041234.tif 000046
【００８９】
【表４６】
2004041234.tif 000047
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１Ａ】図１Ａは哺乳動物細胞においてレトロウイルスタンパク質を発現するようにデザインされた４種のプラスミドを示す。ｐＳＶｇｐ及びｐＲＳＶｅｎｖは選択マーカーによって共トランスフェクトされており、そしてｐＳＶｇｐ−ＤＨＦＲ及びｐＲＳＶｅｎｖ−ｐｈｌｅｏは、ウイルスタンパク質コード領域の下流に位置する選択マーカーを有する等価のプラスミドである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、１．ＭＬＶコアタンパク質（ｐＳＣＶ１０）；２−４．ＭＬＶ両向性ｅｎｖ（ｐＣＭＶｅｎｖ　ＡｍＤｒａ，ｐＣＭＶｅｎｖ　ＡｎＮｈｅ，ｐＭＬＰｅｎｖ　ＡｍＳｐｈ）；５．ＭＬＶ異種向性ｅｎｖ（ｐＣＭＶｘｅｎｏ）；６．ＭＬＶ　ＭＣＦｅｎｖ（ｐＣＭＶ　ＭＣＦ）；７．レトロウイルスベクターとしてのＭＬＶ両向性ｅｎｖ（ｐＬＡＲＮＬ）、の発現をもたらすベクターを示している。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ヘルパーウイルスの存在下においてレトロウイルスベクターを作製する細胞系の固有能力を評価するスクリーニング手順の結果を示す（実施例２Ｂ）。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ウェスタンプロットによる、ｐＳＣＶ１０が導入された細胞のクローンの選別、及びｐＡ３１７と比較したこれらのクローンのｇａｇ生産についての評価の結果を示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、ＤＡ、ＣＡ、２Ａ及びＰＡ３１７由来の細胞リゼートにおける両向性ｅｎｖのレベルを比較したウェスタンブロット実験の結果を示す。
【図１Ｆ】図１Ｆは、ＣＦ　ｇａｇ／ｐｏｌの一過性トランスフェクション体、並びに永久発現性系ＸＦ７、Ｘ６、Ｘ１０及びＰ３１７（ａｍｐｈｏ　ｅｎｖ）由来の細胞リゼートにおける異種向性ｅｎｖのレベルを比較したウェスタンブロット実験の結果を示す。
【図１Ｇ】図１ＧはＨＴ１０８０に由来するクローンｐＡ３１７（両向性ｅｎｖ）及びＨＸ（異種向性ｅｎｖ）におけるＭＣＦ（多向性）ｅｎｖのレベルを比較したウェスタンブロット実験の結果を示す。
【図２】図２は、部位特異的突然変異誘発後のＨＩＶｅｎｖ及びＭｏＭＬＶの融合体の３つの部位を示す。トランスメンブラン領域の細胞外縁での連結をＡとして示し、そしてＢ及びＣはトランスメンブラン領域及び細胞質縁のそれぞれの中央での連結の位置を示す。数字はヌクレオチドの数に関する（ＲＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ、第ＩＩ巻、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、１９８５）。ＳＴ、ＳＲ、ＳＥは、ｔａｔ　ｒｅｖ及びｅｎｖの起点であり、そしてＴＴ、ＴＲ及びＴＥは対応の終結部位である。
【図３】図３は、外来性プロモーター／エンハンサーによる５’ＬＴＲにおけるＵ３の置換を示し、これはＳａｃＩ、ＢｓｓｈＩＩ又はこの領域におけるその他の部位にて融合されることができる。
【図４】図４は、ウイルスタンパク質又はベクターＲＮＡを発現する遺伝子導入マウスを交配する代表的な方法を例示する。
【図１Ａ】
2004041234.tif 000048
【図１Ｂ】
2004041234.tif 000049
【図１Ｃ】
2004041234.tif 000050
【図１Ｄ】
2004041234.tif 000051
【図１Ｅ】
2004041234.tif 000052
【図１Ｆ】
2004041234.tif 000053
【図１Ｇ】
2004041234.tif 000054
【図２】
2004041234.tif 000055
【図３】
2004041234.tif 000056
【図４】
2004041234.tif 000057