(57)【要約】【課題】本発明は、ギ酸脱水素酵素に該改変方法を利用することにより、ＮＡＤＰを補酵素として利用しうる新規ギ酸脱水素酵素を提供する。また、ＮＡＤＰ依存型の酵素的還元系に当該酵素を共存させて補酵素を効率よく再生する方法をも提供するものである。【解決手段】ハロゲン化合物に耐性の高いチオバシラス属に属する微生物由来のギ酸脱水素酵素の補酵素依存性が変換されるように酵素自身を改変する方法、該方法を利用することにより得られた補酵素ＮＡＤＰに対する依存性が向上した変異型ギ酸脱水素酵素、ならびに当該酵素を用いた酵素的還元系におけるＮＡＤＰＨ再生方法を提供する。【選択図】　なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ギ酸脱水素酵素の補酵素依存型改変方法であって、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するギ酸脱水素酵素、あるいはこれと等価なギ酸脱水素酵素において、下記のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧの変異のうち少なくとも１つの部位特異的変異を行うことを特徴とする方法。
Ａ：配列番号１の２２１番目に対応するアミノ酸をセリンに置換する
Ｂ：配列番号１の１９８番目に対応するアミノ酸をグリシンに置換する
Ｃ：配列番号１の２２３番目に対応するアミノ酸をグリシンまたはアルギニンに置換する
Ｄ：配列番号１の２６０番目に対応するアミノ酸をアスパラギン酸、グルタミンまたはヒスチジンに置換する
Ｅ：配列番号１の３７９番目に対応するアミノ酸をアルギニン、チロシンまたはグリシンに置換する
Ｆ：配列番号１の３７９番目以降に対応するアミノ酸を欠失させる
Ｇ：配列番号１の３８２番目以降に対応するアミノ酸を欠失させる
【請求項２】
少なくとも、前記Ａの部位特異的変異を行う請求項１記載の補酵素依存型改変方法。
【請求項３】
前記Ａの部位特異的変異を行い、かつ、前記Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧの変異のうち少なくとも１つの部位特異的変異を行う請求項２記載の補酵素依存型改変方法。
【請求項４】
配列番号１の２２１番目に対応するアミノ酸をセリンに置換し、かつ配列番号１の２２３番目に対応するアミノ酸をグリシンまたはアルギニンに置換する請求項３記載の補酵素依存型改変方法。
【請求項５】
配列番号１の２２１番目に対応するアミノ酸をセリンに置換し、かつ配列番号１の２２３番目に対応するアミノ酸をグリシンまたはアルギニンに置換し、かつ配列番号１の３７９番目に対応するアミノ酸をアルギニンまたはグリシンに置換する請求項３記載の補酵素依存型改変方法。
【請求項６】
配列番号１の２２１番目に対応するアミノ酸をセリンに置換し、かつ配列番号１の２６０番目に対応するアミノ酸をアスパラギン、グルタミンまたはヒスチジンに置換する請求項３記載の補酵素依存型改変方法。
【請求項７】
配列番号１の２２１番目に対応するアミノ酸をセリンに置換し、かつ配列番号１の３７９番目に対応するアミノ酸をアルギニン、チロシンまたはグリシンに置換する請求項３記載の補酵素依存型改変方法。
【請求項８】
配列番号１の２２１番目に対応するアミノ酸をセリンに置換し、かつ配列番号１の３７９番目以降に対応するアミノ酸を欠失させる請求項３記載の補酵素依存型改変方法。
【請求項９】
配列番号１の２２１番目に対応するアミノ酸をセリンに置換し、かつ配列番号１の３８２番目以降に対応するアミノ酸を欠失させる請求項３記載の補酵素依存型改変方法。
【請求項１０】
チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物に由来するギ酸脱水素酵素を改変する請求項１〜９のいずれかに記載の補酵素依存型改変方法。
【請求項１１】
チオバシラス属に属する微生物がチオバシラス　エスピー（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＫＮＫ６５ＭＡ株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７６７１）である請求項９記載の補酵素依存型改変方法。
【請求項１２】
配列番号１に示したアミノ酸配列からなるギ酸脱水素酵素を改変する請求項１〜９のいずれかに記載の補酵素依存型改変方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の方法で補酵素依存型を改変して得られるギ酸脱水素酵素変異体。
【請求項１４】
酵素的還元反応系に、請求項１３記載のギ酸脱水素酵素変異体、当該酵素を生産する菌体、又は、菌体処理物を共存させて補酵素を再生する方法。
【請求項１５】
酵素的還元反応が、ハロケトン化合物の酵素的還元反応である請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、チオバシラス属に属する微生物由来のハロケトン化合物に対して高い耐性を有するギ酸脱水素酵素の特定アミノ酸を他のアミノ酸に置換、欠失、挿入することで補酵素依存型を改変する方法、その方法で補酵素依存型を改変したギ酸脱水素酵素変異体、および、ＮＡＤＰ依存型の酵素的還元系に当該酵素を共存させて補酵素を効率よく再生する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ギ酸脱水素酵素（酵素番号［ＥＣ１．２．１．２］）は、ギ酸と酸化型ニコチンアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ）より、二酸化炭素と還元型ニコチンアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨ）を生成する反応を触媒することから、ＮＡＤＨ依存型の酵素反応における補酵素再生に利用でき、この場合、安価なギ酸を利用できること、副産物が二酸化炭素であり系内に蓄積しないことなどの利点をもつ有用な酵素である。
【０００３】
ギ酸脱水素酵素は、高等植物、メタノール資化性酵母、細菌等において広くその存在が知られている。しかし、一般的にギ酸脱水素酵素はＮＡＤを補酵素として利用するため、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下ＮＡＤＰＨ）依存型の酵素反応において補酵素再生に利用することは出来ない。
【０００４】
酸化型ニコチンアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰ）を補酵素とするギ酸脱水素酵素（酵素番号［ＥＣ１．２．２．１］）も存在し、例えばクロストリジウム・パスツーリアナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）由来の酵素（　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　ｖｏｌ．１５９，　３７５，　１９８４）、クロストリジウム・サーモアセティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ）由来の酵素（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　ｖｏｌ．２５９，　１８２６，１９８３）などが知られているが、いずれの酵素も金属要求性で酸素に不安定であり、工業的な使用は困難である。
【０００５】
また、ＮＡＤＰを補酵素としたときの活性を向上させたＮＡＤＰ依存型ギ酸脱水素酵素が、シュードモナス・スピーシーズ　１０１（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．　１０１：　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ＸＩＩ，　Ｄｅｕ　Ｖｉｌｌｅ，　Ｆｒａｎｃｅ）、キャンディダ・メチリカ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｍｅｔｈｙｌｉｃａ：　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｌｅｔｔ．，　ｖｏｌ．２３，　２８３，　２００１）由来の酵素に部位特異的変異を加えることにより開発されているが、シュードモナス属、キャンディダ属由来のギ酸脱水素酵素は、ハロケトン化合物により失活しやすい傾向があり、ハロケトン化合物を医薬品等の中間体として有用なハロアルコール等に変換するような酵素反応に対しては、効率よく補酵素再生を行うことはできない。
【０００６】
一方、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来のギ酸脱水素酵素はハロケトン化合物に対して耐性が高く、かつ比活性も高いことなどから、従来のギ酸脱水素酵素に対しては失活をもたらすようなハロケトン化合物の酵素的還元系においても、補酵素を効率よく再生できるが、ＮＡＤＰ依存型酵素への改変は報告されていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記のようなギ酸脱水素酵素の問題点、即ち、ハロケトン化合物をＮＡＤＰＨを補酵素とする還元酵素によって還元する酵素反応系には使用することが出来ない問題を解決すべく、ハロケトン化合物に対し高い耐性を有する工業的に利用可能な優れた性質をあわせもつＮＡＤＰ依存型ギ酸脱水素酵素および、その酵素を生み出す改変方法を提供するものである。さらに、酵素的な還元反応において当該酵素を利用してＮＡＤＰＨを効率良く再生することができ、また、通常の酵素に対しては酵素失活をもたらすハロケトン化合物などの酵素的還元系にも適用しうる方法を提供するものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題に鑑み、補酵素分子との結合エネルギー計算値を参考に、ギ酸脱水素酵素に部位特異的変異を加えた結果、ＮＡＤＰを補酵素としたときの活性を上げることに成功した。さらに、ハロケトン化合物に耐性の当該酵素を用いることで、ハロケトン化合物の酵素的還元系においてもＮＡＤＰＨの再生を効率的に行うことが可能となり、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、ギ酸脱水素酵素の補酵素依存性を変換させるための酵素改変方法ならびに改変されたギ酸脱水素酵素変異体である。また本発明は、酵素的還元反応系に当該酵素を用いて補酵素を再生する方法であり、ハロケトン化合物の還元反応にも適用しうる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明において、天然型ギ酸脱水素酵素及びギ酸脱水素酵素変異体の活性は、ギ酸ナトリウム５００ｍＭ、ＮＡＤもしくはＮＡＤＰ　５ｍＭを含む０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７）中で、３０℃でのＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨの生成にともなう３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行う。
【００１２】
本明細書において、アミノ酸、ペプチド、タンパク質は下記に示すＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会で採用された略語を用いて表される。また、ペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列は、左端から右端にかけてＮ末端からＣ末端となるように表される。またＮ末端が１番となるように表され、配列番号１のタンパク質ではＡｌａが１番となる。
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン、Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン、
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸、Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸、
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン、Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン、
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン、Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン、
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン、Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン、
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン、Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン、
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン、Ｑ＝Ｇｌｕ＝グルタミン、
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン、Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン、
Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン、Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン、
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン、Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン。
【００１３】
本発明により作製されるギ酸脱水素酵素変異体を記述するに際して、参照を容易にするため、例えば、位置２２１におけるアスパラギン酸のセリンへの置換はＡｓｐ２２１Ｓｅｒ、またはＤ２２１Ｓと示される。多重変異については、スラッシュ記号（“／”）により分けることで表記する。例えば、Ｄ２２１Ｓ／Ｈ２２３Ｇとは、位置２２１のアスパラギン酸をセリンへ、かつ、位置２２３のヒスチジンをアスパラギン酸へ置換することを示す。
【００１４】
本明細書において酵素の「変異体」とは、もとの酵素のアミノ酸配列のアミノ酸が少なくとも１つ以上の置換、挿入もしくは欠失されたアミノ酸配列を有し、ＮＡＤＰを補酵素としてギ酸脱水素酵素活性を有する改変された酵素をいう。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸の挿入とは、もとのペプチドに１つ以上のアミノ酸を挿入することをいう。
【００１５】
配列番号１に示すアミノ酸配列を有するギ酸脱水素酵素と等価なギ酸脱水素酵素とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつハロケトン化合物に対して耐性を有するギ酸脱水素酵素を指す。
【００１６】
ハロケトン化合物とは、カルボニル基と隣接する炭素原子上にハロゲン原子を有する化合物を指し、特に制限されないが、例えば、４−クロロアセト酢酸エチル、４−ブロモアセト酢酸エチル、４−ヨードアセト酢酸エチル、４−クロロアセト酢酸メチル、２−クロロアセト酢酸エチル、２−クロロ−１−（３−ピリジニル）−エタノン、［（１Ｓ）−３−クロロ−２−オキソ−１−（フェニルメチル）プロピル］−カルバミン酸−１，１−ジメチルエチルエステル、２−クロロアセトフェノン、２，３’−ジクロロアセトフェノン、クロロアセトン、１−（ベンゾイルオキシ）−３−クロロ−２−プロパノン、１−クロロ−３−ヒドロキシ−２−プロパノン等を挙げることができる。
【００１７】
ハロケトン化合物に対して耐性を有するとは、粗酵素液を１０ｍＭの４−クロロアセト酢酸エチルの存在下、３０℃で５時間インキュベーションした後の残活性が２５％以上であることをいう。
【００１８】
以下、変異体を生成するためのタンパク質のアミノ酸変異について説明する。本発明は、ギ酸脱水素酵素のあらかじめ選択された部位の単数または複数のアミノ酸残基を置換、挿入もしくは欠失、またはそれらを組み合わせることにより、補酵素分子の結合エネルギーの大きさを制御して補酵素依存性を変換することを特徴とする。
【００１９】
アミノ酸変異候補の設計は、該酵素または該酵素と相同性を有するアミノ酸配列または核酸配列について統計的解析を行う方法、あるいは該酵素または該酵素変異体の立体構造について計算化学的解析を行う方法等を用いる。より具体的には、アミノ酸変異に伴うＮＡＤＰの酵素結合能とＮＡＤの酵素結合能の差、およびアミノ酸変異に伴う変異酵素の物理化学的安定性の変化を指標として、アミノ酸変異候補を設計する。
【００２０】
本発明の補酵素依存型改変法に供するギ酸脱水素酵素としては、ハロケトン化合物に対して高い耐性を有するものが好ましく、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるギ酸脱水素酵素、または、当該ギ酸脱水素酵素と等価なギ酸脱水素酵素が挙げられ、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物由来のギ酸脱水素酵素が好ましく、より好ましくは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を持つチオバシラス　エスピー（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＫＮＫ６５ＭＡ株由来のギ酸脱水素酵素である。
【００２１】
チオバシラス　エスピー　ＫＮＫ６５ＭＡ株由来のギ酸脱水素酵素をコードする遺伝子は、当該遺伝子をｐＵＣ１９に組み込んだ組換えベクターによって形質転換された大腸菌、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＦＴ００１）、あるいは、当該遺伝子をｐＵＣＮＴに組み込んだ組換えベクターによって形質転換された大腸菌、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＦＴ００２）（特願２００１−３１２０４３）から、常法に従って容易に取得することができ、本発明の改変法に供することができる。
【００２２】
上記のチオバシラス　エスピー（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＫＮＫ６５ＭＡ株、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＦＴ００１）株、及びＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＦＴ００２）株は、発明者らが分離、取得した菌株であり、チオバシラス　エスピー（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＫＮＫ６５ＭＡ株は、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７６７１として、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＦＴ００１）株は受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７６７２として、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＦＴ００２）株は受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７６７３株として、平成１３年７月１９日に独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託されている。
【００２３】
アミノ酸の置換などを実施する方法は、化学合成、または遺伝子工学を利用する技術においてアミノ酸をコードするＤＮＡ配列のコドンを変化させることを含むが、これに限定されない。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＭｕｔａｎＲ−Ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍ　；　宝酒造社製（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　ｖｏｌ．１２，　６３，　１９９９）、ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＴＭ　；　Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製、Ｔ７−ＧＥＮ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｋｉｔ　；　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）の使用、あるいはＰＣＲ法の利用が挙げられる。
【００２４】
具体的には、もとのアミノ酸をコードする塩基を、他のアミノ酸をコードする塩基に置換したオリゴヌクレオチドおよび、ＭｕｔａｎＲ−Ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍ（宝酒造社製）を用い、ＭｕｔａｎＲ−Ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍのプロトコールに従い、目的の変異タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡを作製する。
【００２５】
作製された改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡは、プラスミドと連結された状態で得られる。このプラスミドを用いて、ベクターに挿入した変異型ギ酸脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片部分の塩基配列を解析し、目的のアミノ酸をコードする塩基配列であることを確認する。
【００２６】
このようにして取得した変異型ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換えプラスミドを用いることにより、宿主微生物を形質転換し形質転換体を得ることができる。
【００２７】
宿主、ベクターとしては、「組換えＤＮＡ実験指針」（科学技術庁研究開発局ライフサイエンス課編：平成８年３月２２日改定）に記載の宿主―ベクター系を用いることができる。例えば、宿主としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、シュウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属またはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物を用いることができ、ベクターは上記の宿主内で自律複製できる微生物由来のプラスミド、ファージまたはその誘導体が使用できる。なかでも、宿主微生物としてエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、ベクターとして当該微生物中で自律複製できるベクターを用いるのが好ましい。
【００２８】
一例として、上記のようにして取得したＤＮＡをｐＫＦ１９ｋベクターに組み込んだ組換えプラスミドｐＫＦＦＴｍ（図１参照。なお、図中のＦＤＨｍ遺伝子とは、本発明のギ酸脱水素酵素変異体の遺伝子を表す。）あるいはｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３参照）に組み込んだ組換えプラスミドｐＮＴＦＴｍ（図２参照。なお、図中のＦＤＨｍ遺伝子とは、本発明のギ酸脱水素酵素変異体の遺伝子を表す。）を用いて、エシェリヒア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＭＶ１１８４やエシェリヒア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１を形質転換し、形質転換体エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＭＶ１１８４（ｐＫＦＦＴｍ）あるいはエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ｐＮＴＦＴｍ）を得ることができる。なお、ｐＫＦＦＴｍまたはｐＮＴＦＴｍは本発明で作製した変異型プラスミドの総称であり、本発明で作製した変異型プラスミドは、ｐＫＦＦＴｍ１、ｐＫＦＦＴｍ２もしくはｐＮＴＦＴｍ１、ｐＮＴＦＴｍ２などと命名した。例えば、ｐＮＴＦＴｍ１はＡ１９８Ｇ／Ｄ２２１Ｓの置換を含むギ酸脱水素酵素をｐＵＣＮＴベクターに組み込んだプラスミドである。
【００２９】
また、酵素の生産量を上昇させるために強力な構造プロモーターをもつように改質したベクターを使用することもできる。
【００３０】
なお、本発明で用いた組換えＤＮＡ技術は当該分野において周知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）に記載されている。
【００３１】
以上のようにして得られた形質転換体を通常の培地を用いて培養を行うことにより、本発明のギ酸脱水素酵素変異体を生産することができる。培養に使用する培地としては、炭素源、窒素源および無機塩類などの栄養素を含む通常の培地でよい。これに、ビタミン、アミノ酸などの有機微量栄養素を添加すると、好ましい結果が得られる場合が多い。
【００３２】
炭素源としては、グルコースやシュークロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、アルコール類などが適宜使用される。窒素源としては、アンモニウム塩、アンモニア水、アンモニアガス、尿素、酵母エキス、ペプトン、コーンス・ティープ・リカーなどが用いられる。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、鉄塩、硫酸塩、塩素などが用いられる。
【００３３】
培養は温度範囲２５℃から４０℃で行えるが、２５℃から３７℃が特に好ましい。また、ｐＨは４から８で培養できるが５から７．５が好ましい。また、回分式、連続式のいずれの培養方法でもよい。
【００３４】
必要に応じてメタノール、ギ酸、イソプロピル−１−チオ−β―Ｄ−ガラクトサイド（ＩＰＴＧ）、ラクトースなどの添加などの酵素誘導のための処理を行うこともできる。
【００３５】
以上のようにして創製、生産された本発明のギ酸脱水素酵素変異体は、ＮＡＤＰＨを補酵素とする酵素的還元系に共存させて補酵素ＮＡＤＰＨを効率良く再生することができる。さらに、本発明の変異型ギ酸脱水素酵素は、ハロケトン化合物に耐性を有するため、従来のギ酸脱水素酵素に対しては酵素失活をもたらすハロケトン化合物などの酵素的還元系にも、当該酵素を共存させて効率良くＮＡＤＰＨを再生することができる。
【００３６】
例えば、本発明で得られた変異型ギ酸脱水素酵素を補酵素再生に用いた４−クロロアセト酢酸エチルなどのハロケトンの酵素的還元反応は以下のように行うことができる。
【００３７】
反応は、水中もしくは水に溶解しにくい有機溶媒、たとえば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサンなどの有機溶媒中、もしくは、水性媒体との２層系などの適当な溶媒中で行い得る。このような溶媒中に基質であるハロケトン、補酵素ＮＡＤＰ、ハロケトン化合物を還元しうる酵素またはその触媒活性を持つ微生物やその処理物等、およびギ酸脱水素活性を有する本酵素または該形質転換微生物ＨＢ１０１（ｐＮＴＦＴｍ）の培養物やその処理物等を添加し、ギ酸でｐＨ調整下撹拌することにより行い得る。ハロケトンを還元しうる微生物としては、たとえば４−クロロアセト酢酸エチルを還元しうる組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１）（ＷＯ９８／３５０２５）などを用いることができる。反応は、１０℃〜７０℃、ｐＨ４〜１０で行う。また、基質の仕込み濃度は０．１％〜９０％（ｗ／ｖ）であるが、基質を連続的に添加しうる。反応は、バッチ法または連続方式で行い得る。本発明の反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。
【００３８】
ここで、微生物の処理物とは、例えば、粗抽出液、培養菌体凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、またはそれらの菌体の磨砕物等を意味する。更にそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化されて用いられ得る。固定化は当業者に周知の方法（例えば、架橋法、物理的吸着法、包括法など）で行い得る。
【００３９】
生成物としては、４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルはガスクロマトグラフィーで定量され得る。ＰＥＧ−２０Ｍ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ　ＷＡＷ　ＤＭＣＳ　１０％　８０／１００ｍｅｓｈ（ジーエルサイエンス社製）を充填したガラスカラム（ＩＤ３ｍｍ×１ｍ）を用い、１５０℃でクロマトグラフィーを行い、検出はＦＩＤにより行い得る。また、ケトン等を基質として、適当な還元酵素と共に上記と同様な方法で反応を行うことにより、アルデヒド、アミン、アルコール、アミノ酸等を得ることもできる。
【００４０】
以上のように、４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルをはじめとするアルコールやアミン、アルデヒド、アミノ酸等を酵素的に製造するためのＮＡＤＰ型の還元反応において、本酵素を利用することにより、高価な補酵素の使用量を大幅に減少させ、補酵素を効率よく再生できる方法が提供される。
【００４１】
以下に本発明の具体的な実施例を示すが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００４２】
【実施例】
（実施例１）ＮＡＤＰ依存型ギ酸脱水素酵素変異体の設計
天然型のギ酸脱水素酵素のアミノ酸残基を、ＮＡＤＰ結合に適したアミノ酸残基に置換して、ギ酸脱水素酵素の補酵素依存性を変換するためのアミノ酸置換の候補は、ＡＭＢＥＲ分子力場（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を用いた計算化学的解析により算出した。計算では、ＮＡＤＰに対する結合エネルギーとＮＡＤに対する結合エネルギーの差、およびアミノ酸置換に伴う酵素の（熱）安定性の指標である変性自由エネルギーを指標にアミノ酸変異候補を算出した。
【００４３】
また、ＮＡＤＰの２’−リン酸部分がタンパク質に衝突する可能性が予測されたため、ニコチンアミド結合部分の近傍にあるＣ末端部分を欠失させた変異も候補に挙げた。
【００４４】
設計したアミノ酸変異候補のうち、ＮＡＤＰに対する結合が強くなると推定された置換は、Ａ１９８Ｇ、Ｄ２２１Ａ、Ｄ２２１Ｓ、Ｈ２２３Ｇ、Ｈ２２３Ｒ、Ｅ２６０Ｎ、Ｅ２６０Ｑ、Ｅ２６０Ｈ、Ｈ３７９Ｒ、Ｈ３７９ＹおよびＨ３７９Ｇなどである。
【００４５】
また、欠失の候補としては、３７９番目以降のアミノ酸を欠失させた３７９ｄｅｌ、および３８２番目以降のアミノ酸を欠失させた３８２ｄｅｌを候補に挙げた。
【００４６】
次に、これらの変異を組み合わせ、よりＮＡＤＰに対する活性が高くなると計算されるものとして、Ａ１９８Ｇ／Ｄ２２１Ｓ変異体（ＦＴｍ１）、Ｄ２２１Ｓ／Ｈ２２３Ｇ変異体（ＦＴｍ２）、Ｄ２２１Ｓ／Ｈ２２３Ｒ変異体（ＦＴｍ３）、Ｄ２２１Ｓ／Ｅ２６０Ｎ変異体（ＦＴｍ４）、Ｄ２２１Ｓ／Ｅ２６０Ｑ変異体（ＦＴｍ５）、Ｄ２２１Ｓ／Ｅ２６０Ｈ変異体（ＦＴｍ６）、Ｄ２２１Ｓ／Ｈ３７９Ｒ変異体（ＦＴｍ７）、Ｄ２２１Ｓ／Ｈ３７９Ｙ変異体（ＦＴｍ８）、Ｄ２２１Ｓ／Ｈ３７９Ｇ変異体（ＦＴｍ９）、Ｄ２２１Ｓ／Ｈ２２３Ｇ／Ｈ３７９Ｒ変異体（ＦＴｍ１０）、Ｄ２２１Ｓ／Ｈ２２３Ｒ／Ｈ３７９Ｇ変異体（ＦＴｍ１１）、Ｄ２２１Ｓ／３７９ｄｅｌ変異体（ＦＴｍ１２）、Ｄ２２１Ｓ／３８２ｄｅｌ変異体（ＦＴｍ１３）を設計した。
【００４７】
（実施例２）変異型（ＮＡＤＰ依存型）ギ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換えプラスミドの作成と遺伝子の解析
チオバシラス　エスピー（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＫＮＫ６５ＭＡ株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７６７１）に由来する天然型のギ酸脱水素酵素をコードする配列番号１５のヌクレオチド配列を、ｐＫＦ１９ｋベクターのＮｄｅＩ、ＰｓｔＩサイトにサブクローニングしたプラスミドｐＫＦＦＴを鋳型にして、各種変異体を作製した。
【００４８】
もとのアミノ酸をコードする塩基を、目的とする他のアミノ酸をコードする塩基に置換したオリゴヌクレオチドをプライマーにし、ｐＫＦＦＴを鋳型にして、変異導入用キットＭｕｔａｎＲ−Ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍ（宝酒造社製）を用い、ＭｕｔａｎＲ−Ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍのプロトコールに従って目的の変異タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡを作製した。
【００４９】
例えば、配列番号２に示すプライマーとＭｕｔａｎＲ−Ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍ（宝酒造社製）を用い、ＭｕｔａｎＲ−Ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍのプロトコールに従って、ｐＫＦＦＴに変異を加え、配列番号１記載のタンパク質の２２１番目のアスパラギン酸がセリンに改変された改変タンパク質（Ｄ２２１Ｓ）の遺伝情報を有するＤＮＡを作製した。このＤ２２１Ｓの遺伝情報を有するＤＮＡを保持するプラスミドｐＫＦＦＴｍ−２２１Ｓを基に、配列番号３に示すプライマーとＭｕｔａｎＲ−Ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍ（宝酒造社製）を用いて、さらに変異を加え、配列番号１記載の１９８番目のアラニンがグリシンに改変され、かつ２２１番目のアスパラギン酸がセリンに改変された改変タンパク質（Ａ１９８Ｇ／Ｄ２２１Ｓ）の遺伝情報を有するＤＮＡを作製した。このＡ１９８Ｇ／Ｄ２２１Ｓの遺伝情報を有するＤＮＡを保持するプラスミドをｐＫＦＦＴｍ１と命名した。
【００５０】
同様に、配列番号４〜１１のプライマーを用いて、実施例１で設計した変異が導入された変異型ギ酸脱水素酵素遺伝子を保持するプラスミドも同様に作製し、それぞれｐＫＦＦＴｍ２〜ｐＫＦＦＴｍ９と命名した。
【００５１】
また、同様の方法で、配列番号９のプライマーを用い、ｐＫＦＦＴｍ４を鋳型にしてＤ２２１Ｓ／Ｈ２２３Ｇ／Ｈ３７９Ｒの３つの変異を導入してｐＫＦＦＴｍ１０を作製した。さらに、配列番号１１のプライマーを用い、ｐＫＦＦＴｍ５を鋳型にしてＤ２２１Ｓ／Ｈ２２３Ｒ／Ｈ３７９Ｇの３つの変異を導入してｐＫＦＦＴｍ１１を作製した。
【００５２】
なお、本明細書中では、ｐＫＦＦＴｍ１〜ｐＫＦＦＴｍ１１までのプラスミドの総称をｐＫＦＦＴｍとしている。（図１参照。なお、図中のＦＤＨｍ遺伝子とは、本発明の変異型ギ酸脱水素酵素遺伝子を表す。）
導入したアミノ酸の変異は、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３１０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥＲＫＩＮ　ＥＬＭＥＲ社製）を用いて塩基配列を確認した。
【００５３】
（実施例３）　ギ酸脱水素酵素遺伝子を大量発現する組換えプラスミドの作製
実施例２で得られたプラスミドｐＫＦＦＴｍをＮｄｅＩおよびＰｓｔＩで消化後、同酵素で切断したベクタープラスミド（ＷＯ９４／０３６１３参照）とＤＮＡリガーゼを用いて結合することで、変異型ギ酸脱水素酵素遺伝子を多く発現できるように設計されたｐＮＴＦＴｍ１〜ｐＮＴＦＴｍ１１を取得した。
【００５４】
また、Ｄ２２１Ｓ／３７９ｄｅｌおよびＤ２２１Ｓ／３８２ｄｅｌの欠失変異を導入したプラスミドは、ＮｄｅＩサイトが付加されている配列番号１２のプライマーおよびＰｓｔＩサイトが付加されている配列番号１３または配列番号１４のプライマーを用いて、ｐＫＦＦＴｍ−２２１Ｓを鋳型にしてＰＣＲを行い、Ｃ末端アミノ酸が欠失し、かつＤ２２１Ｓ変異が導入されている遺伝情報を有するＤＮＡ配列を得た。このＤＮＡをＮｄｅＩおよびＰｓｔＩで消化後、同酵素で切断したベクタープラスミド（ＷＯ９４／０３６１３参照）とＤＮＡリガーゼを用いて結合することで、変異型ギ酸脱水素酵素遺伝子を多く発現できるように設計されたｐＮＴＦＴｍ１２およびｐＮＴＦＴｍ１３を取得した。
【００５５】
なお、本明細書中では、ｐＮＴＦＴｍ１〜ｐＮＴＦＴｍ１３までのプラスミドの総称をｐＮＴＦＴｍとしている。（図２参照。なお、図中のＦＤＨｍ遺伝子とは、本発明の変異型ギ酸脱水素酵素遺伝子を表す。）
【００５６】
（実施例４）変異型ギ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを用いた形質転換体の作成
実施例３で得られたプラスミドｐＮＴＦＴｍ１〜ｐＮＴＦＴｍ１３をそれぞれエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株のコンピテントセルと混合することで形質転換を行い、表１に示す寒天培地にプレーティングして、変異型ギ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ｐＮＴＦＴｍ）をコロニーとして取得した。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
得られた形質転換体のコロニーを、表２に示す液体培地１０ｍｌに植菌後、３７℃で２０時間、振とうして好気的に培養した。
【００５９】
【表２】
2004041062.tif 000003
【００６０】
得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７）に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離により菌体由来の不溶物を除去して、形質転換体のＦＤＨ酵素液を取得した。得られた酵素液０．１ｍｌを、１Ｍギ酸Ｎａ（０．１Ｍリン酸バッファー中でｐＨ７）　１．５ｍｌ、０．１Ｍ　ＮＡＤＰ　０．１５ｍｌ、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７）１．２５ｍｌと混合して，３０℃で３４０ｎｍの吸光度変化をみたところ、ＮＡＤＰＨの生成による吸光度の増加が認められ、形質転換体にＮＤＡＰ依存型のギ酸脱水素酵素活性があることが確認された。補酵素としてＮＡＤを用いた場合、およびＮＡＤＰを用いた場合のそれぞれの活性を表３に示す。
【００６１】
【表３】
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【００６２】
（実施例５）４−クロロアセト酢酸エチルの酵素的還元系に、ＦＤＨ遺伝子を導入した組換え大腸菌を共存させて補酵素を再生する方法
実施例３で得たＨＢ１０１（ｐＮＴＦＴｍ１）を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した６０ｍｌの表４に示す培地に接種し、３７℃で９時間振とう培養した培養液を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した１００ｍｌの表２に示す液体培地に１％植菌して、３７℃で４６時間振とう培養した。培養液を遠心により１０倍濃縮し、超音波破砕してＮＡＤＰ依存型ＦＤＨ酵素液を取得した。また、４−ハロアセト酢酸エステルを還元する酵素として組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１）（ＷＯ９８／３５０２５）を５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した１００ｍｌの表２に示す培地に接種し、３７℃で２３時間振とう培養後の１０倍濃縮菌体を調製して、それを破砕した。ＮＡＤＰ依存型ＦＤＨ酵素液７．５ｍｌに、ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１）破砕液１．２ｍｌ、ＮＡＤＰ２５ｍｇ、蟻酸ナトリウム１ｇ、４−クロロアセトン酢酸エチル６ｇを添加し、イオン交換水２１．３ｍｌ、酢酸ブチル３０ｍｌを加えて総量６０ｍｌに調製した。５Ｍの蟻酸水溶液でｐＨ６．５に調製しつつ３０℃で撹拌しながら、４．５時間反応を行った。反応終了後、反応液を酢酸ブチルで抽出し、抽出物の分析を行ったところ、当該酵素であるＫＮＫ６５ＭＡ株由来のＦＤＨを利用して補酵素を再生したものは、転換率１００％で４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルが生成していた。
【００６３】
４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの定量はガスクロマトグラフィーで行った。ＰＥＧ−２０Ｍ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ　ＷＡＷ　ＤＭＣＳ　１０％　８０／１００ｍｅｓｈ（ジーエルサイエンス社製）を充填したガラスカラム（ＩＤ３ｍｍ×１ｍ）を用い、１５０℃でクロマトグラフィーを行い、検出はＦＩＤにより行った。
【００６４】
【発明の効果】
本発明では、ハロケトン耐性が高いギ酸脱水素酵素に、部位特異的変異を導入して補酵素依存性を改変する方法、およびハロケトンへの高い耐性を有する工業的に利用可能な優れた性質を持つＮＡＤＰ依存型ギ酸脱水素酵素が提供される。さらに、ハロケトン等のＮＡＤＰ依存性酵素的還元系に当該酵素を共存させて補酵素を効率的に再生する方法が提供される。
【００６５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＮＡＤＰ依存型ギ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換えプラスミドｐＫＦＦＴｍの図。
【図２】本発明のＮＡＤＰ依存型ギ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換えプラスミドｐＮＴＦＴｍの図。
【図１】
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【図２】
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