(57)【要約】　　　（修正有）【課題】癌細胞が特異的かつ一般的に産生する抗原を特定し、その抗原の存在の有無又は存在量を指標として広く癌一般の診断を行なうことができる癌の診断方法を提供する。【解決手段】被験者から採取した検体における特定のアミノ酸配列からなる癌特異的抗原の存在の有無又は存在量を指標として、前記被験者における癌細胞の存在の有無を診断し、この際、前記癌特異的抗原の存在の有無又は存在量は、例えば、前記記載の特定のアミノ酸配列からなる癌特異的抗原に特異的に反応することを特徴とする抗体又はその断片を用いて検出又は定量する。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１記載のアミノ酸配列からなる癌特異的抗原に特異的に反応することを特徴とする抗体又はその断片。
【請求項２】
配列番号１記載のアミノ酸配列からなる癌特異的抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマ。
【請求項３】
請求項１記載の抗体又はその断片を有効成分として含有することを特徴とする癌特異的抗原の検出・定量剤。
【請求項４】
配列番号１記載のアミノ酸配列からなる癌特異的抗原をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを有効成分として含有することを特徴とする癌特異的抗原の検出・定量剤。
【請求項５】
請求項１記載の抗体又はその断片を含むことを特徴とする癌特異的抗原の検出・定量用キット。
【請求項６】
配列番号１記載のアミノ酸配列からなる癌特異的抗原をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むことを特徴とする癌特異的抗原の検出・定量用キット。
【請求項７】
被験者から採取した検体における配列番号１記載のアミノ酸配列からなる癌特異的抗原の存在の有無又は存在量を、請求項１記載の抗体若しくはその断片、請求項３若しくは４記載の検出・定量剤、又は請求項５若しくは６記載の検出・定量用キットを用いて検出又は定量することを特徴とする癌特異的抗原の検出・定量方法。
【請求項８】
被験者から採取した検体における配列番号１記載のアミノ酸配列からなる癌特異的抗原の存在の有無又は存在量を指標として、前記被験者における癌細胞の存在の有無を診断することを特徴とする癌の診断方法。
【請求項９】
前記癌特異的抗原の存在の有無又は存在量を、請求項７記載の検出・定量方法によって検出又は定量することを特徴とする請求項８記載の診断方法。
【請求項１０】
前記検体が、前記被験者の体液であることを特徴とする請求項８又は９記載の診断方法。
【請求項１１】
前記体液が、血液、血清、血漿、腹水、胸水、髄液、リンパ液又は唾液であることを特徴とする請求項１０記載の診断方法。
【請求項１２】
請求項１記載の抗体又はその断片を含むことを特徴とする癌の診断用キット。
【請求項１３】
配列番号１記載のアミノ酸配列からなる癌特異的抗原をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むことを特徴とする癌の診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、癌特異的抗原ＣＲＰ２に特異的に反応する抗体、癌特異的抗原ＣＲＰ２に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、癌特異的抗原ＣＲＰ２に特異的に反応する抗体又は癌特異的抗原ＣＲＰ２をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを利用した癌特異的抗原の検出・定量剤、検出・定量用キット及び検出・定量方法、並びに癌の診断方法及び診断用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体試料を用いたヒトの癌の診断は、一般的に、血液中に含まれる腫瘍マーカーの測定により行われる。このような腫瘍マーカーとしては、例えば、肝癌のマーカーであるαフェトプロテイン（ＡＦＰ）、大腸癌のマーカーである癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、膵癌マーカーであるＣＡ１９−９、前立腺癌のマーカーである前立腺特異抗原（ＰＳＡ）等が知られている。また、腫瘍マーカーを検出・定量する代表的な方法としては、それぞれの腫瘍マーカーに対して特異的に反応する抗体を用いた放射能免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、化学発光測定法（ＣＬＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）等が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、現在使用されている腫瘍マーカーは腫瘍特異性や臓器特異性を有する一方、腫瘍マーカーの存在しない臓器も存在するため、１種類の腫瘍マーカーを単独で用いて広く癌一般の診断を行うことは難しい。したがって、早期発見を含めた癌の１次スクリーニングを効率よく行うために、癌特異的であって癌一般に共通するマーカーの開発が切望されている。
【０００４】
そこで、本発明は、第一に、癌細胞が特異的かつ一般的に産生する抗原を特定し、その抗原に特異的に反応する抗体、及びその抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供することを目的とする。
また、本発明は、第二に、癌細胞が特異的かつ一般的に産生する抗原を特定し、その抗原を検出・定量できる癌特異的抗原の検出・定量剤、検出・定量用キット及び検出・定量方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、第三に、癌細胞が特異的かつ一般的に産生する抗原を特定し、その抗原の存在の有無又は存在量を指標として広く癌一般の診断を行うことができる癌の診断方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ＣＲＰ２遺伝子が胃癌の悪性化に関連することを見出し（実施例１参照）、ＣＲＰ２と癌との関連性を認識するに至った。そして、健常者及び各種癌患者の血清検体に含まれるＣＲＰ２濃度を、ＣＲＰ２に特異的に反応するモノクローナル抗体（実施例２及び３参照）を用いて測定した結果、各種癌患者におけるＣＲＰ２濃度が、癌の種類を問わず、健常者のＣＲＰ２濃度よりも顕著に高いレベルにあることを確認し（実施例４及び５参照）、このことから、ＣＲＰ２が癌細胞によって特異的かつ一般的に産生される抗原（タンパク質）であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、下記（１）〜（１３）に示す抗体又はその断片、ハイブリドーマ、癌特異的抗原の検出・定量剤、癌特異的抗原の検出・定量用キット、癌特異的抗原の検出・定量方法、癌の診断方法及び癌の診断用キットを提供する。
【０００７】
（１）配列番号１記載のアミノ酸配列からなる癌特異的抗原に特異的に反応することを特徴とする抗体又はその断片。
（２）配列番号１記載のアミノ酸配列からなる癌特異的抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマ。
（３）前記（１）記載の抗体又はその断片を有効成分として含有することを特徴とする癌特異的抗原の検出・定量剤。
（４）配列番号１記載のアミノ酸配列からなる癌特異的抗原をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを有効成分として含有することを特徴とする癌特異的抗原の検出・定量剤。
（５）前記（１）記載の抗体又はその断片を含むことを特徴とする癌特異的抗原の検出・定量用キット。
（６）配列番号１記載のアミノ酸配列からなる癌特異的抗原をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むことを特徴とする癌特異的抗原の検出・定量用キット。
【０００８】
（７）被験者から採取した検体における配列番号１記載のアミノ酸配列からなる癌特異的抗原の存在の有無又は存在量を、前記（１）記載の抗体若しくはその断片、前記（３）若しくは（４）記載の検出・定量剤、又は前記（５）若しくは（６）記載の検出・定量用キットを用いて検出又は定量することを特徴とする癌特異的抗原の検出・定量方法。
（８）被験者から採取した検体における配列番号１記載のアミノ酸配列からなる癌特異的抗原の存在の有無又は存在量を指標として、前記被験者における癌細胞の存在の有無を診断することを特徴とする癌の診断方法。
（９）前記癌特異的抗原の存在の有無又は存在量を、前記（７）記載の検出・定量方法によって検出又は定量することを特徴とする前記（８）記載の診断方法。（１０）前記検体が、前記被験者の体液であることを特徴とする前記（８）又は（９）記載の診断方法。
（１１）前記体液が、血液、血清、血漿、腹水、胸水、髄液、リンパ液又は唾液であることを特徴とする前記（１０）記載の診断方法。
（１２）前記（１）記載の抗体又はその断片を含むことを特徴とする癌の診断用キット。
（１３）配列番号１記載のアミノ酸配列からなる癌特異的抗原をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むことを特徴とする癌の診断用キット。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の抗体又はその断片は、配列番号１記載のアミノ酸配列からなる癌特異的抗原に特異的に反応することを特徴とする。
ここで、「配列番号１記載のアミノ酸配列からなる癌特異的抗原」とは、具体的には、ヒト由来のＣＲＰ２（ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２）を意味する。以下では、「配列番号１記載のアミノ酸配列からなる癌特異的抗原」を「癌特異的抗原ＣＲＰ２」という場合がある。なお、「癌特異的抗原ＣＲＰ２」には、癌特異的抗原である限り、配列番号１記載のアミノ酸配列からなるＣＲＰ２に加え、多型等によって生じ得る、配列番号１記載のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列（例えば、配列番号１記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列）からなるＣＲＰ２も含まれる。
【００１０】
ＣＲＰ２は、ＣＲＰ１及びＣＲＰ３とともにＣＲＰ（ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ　ｐｒｏｔｅｉｎ）ファミリーに属する公知のタンパク質であるが、癌細胞によって特異的かつ一般的に産生される抗原（タンパク質）であることが本発明者により初めて明らかにされた。ここで、「癌細胞によって特異的に産生される」とは、癌細胞によって産生されるが、正常細胞によって産生されないことを意味し、「癌細胞によって一般的に産生される」とは、癌の種類を問わず、各種癌細胞によって産生されることを意味する。
【００１１】
本発明の抗体には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれもが含まれ、その断片には、癌特異的抗原ＣＲＰ２に特異的に反応し得る限り、いかなる断片も含まれる。抗体の断片としては、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）等が挙げられる。
また、本発明の抗体又はその断片には、癌特異的抗原ＣＲＰ２に特異的に反応し得る限り、癌特異的抗原ＣＲＰ２のいかなる部分に反応する抗体又はその断片も含まれる。
【００１２】
本発明の抗体又はその断片は、癌特異的抗原ＣＲＰ２に特異的に反応する性質、すなわち、癌特異的抗原ＣＲＰ２（その断片を含む）には反応するが、ヒトから採取した検体（例えば、血液、血清、血漿、腹水、胸水、髄液、リンパ液、唾液等の体液）に含まれる癌特異的抗原ＣＲＰ２（その断片を含む）以外のタンパク質には反応しない性質を有する。但し、本発明の抗体又はその断片は、ヒト以外の哺乳動物由来のＣＲＰ２（その断片を含む）に反応する性質を有していてもよい。
【００１３】
本発明の抗体又はその断片は、例えば、下記（１）〜（３）のようにして取得することができる。
（１）免疫用抗原の調製
免疫用抗原としては、配列番号１記載のアミノ酸配列の一部又は全部からなるペプチド又はタンパク質を利用することができる。具体的には、（ｉ）ＣＲＰ２を発現しているヒト由来の癌細胞又は癌組織の破砕物又はその精製物、（ｉｉ）遺伝子組換え技術を用いて配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡ（ヒトＣＲＰ２遺伝子）の一部又は全部を大腸菌、昆虫細胞又は動物細胞等の宿主に導入して発現させた組換えタンパク質、（ｉｉｉ）配列番号１記載のアミノ酸配列に従ってその一部又は全部を化学合成したペプチド等を利用することができる。
【００１４】
また、免疫用抗原としては、配列番号１記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を利用することができる。このようなタンパク質としては、ヒト由来のＣＲＰ２に対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入したタンパク質の他、欠失、置換又は付加された状態で天然に存在するタンパク質、例えば、マウス、ラット等の哺乳動物由来のＣＲＰ２や、これらのＣＲＰ２に対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入したタンパク質等が挙げられる。ヒトを含む哺乳動物由来のＣＲＰ２に導入される変異の位置は特に限定されるものではないが、ＣＲＰ２の立体構造が保持される位置であることが好ましい。また、欠失、置換又は付加されるアミノ酸の個数は特に限定されるものではないが、ＣＲＰ２の立体構造が保持される個数であることが好ましく、その個数は好ましくは１又は数個、さらに好ましくは１〜３個である。
【００１５】
ヒト以外の哺乳動物由来のＣＲＰ２は、既にＣＲＰ２遺伝子が単離・同定されている場合にはそれを利用できるし、単離・同定されていない場合であっても、既に単離・同定されているＣＲＰ２遺伝子をプローブとして、目的のｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングすることによって取得することができる。また、ヒトを含む哺乳動物由来のＣＲＰ２への人為的変異は、例えば、部位特異的変異誘発法等の公知の方法によって導入することができる。
【００１６】
（２）ポリクローナル抗体の作製
免疫用抗原を用いて、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等の哺乳動物を免疫する。免疫動物は、抗体を容易に作製できることからマウスを利用するのが好ましい。免疫の際には、抗体産生誘導する為に、フロイント完全アジュバント等の免疫助剤を用いてエマルジョン化した後、複数回の免疫することが好ましい。免疫助剤としては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）の他、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムゲル等を利用することができる。哺乳動物１匹当たりの抗原の投与量は、哺乳動物の種類に応じて適宜設定できるが、マウスの場合には通常１０〜１００μｇである。投与部位は、例えば、静脈内、皮下、腹腔内等である。免疫の間隔は、通常、数日から数週間間隔、好ましくは２〜４週間間隔で、合計３〜６回、好ましくは３〜４回免疫を行う。そして、最終免疫日から７〜１４日後に、ＣＲＰ２に対する抗体力価を測定し、抗体力価が上昇した後に採血し、抗血清を得る。抗体力価の測定は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）等により行うことができる。
【００１７】
抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して又はこれらを組み合わせて利用することができる。
【００１８】
（３）モノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体の作製の際にも、ポリクローナル抗体の場合と同様に免疫用抗原を用いて哺乳動物を免疫し、最終免疫日から３〜４日後に抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、胸腺細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞が一般的に利用される。
【００１９】
次いで、ハイブリドーマを得るために、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、ヒト、マウス等の哺乳動物由来の細胞であって一般に入手可能な株化細胞を利用することができる。利用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態では選択培地（例えばＨＡＴ培地）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞の具体例としては、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４等のマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
【００２０】
細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地等の動物細胞培養用培地中に、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを所定の割合（例えば２：１〜１０：１）で混合し、ポリエチレングリコール等の細胞融合促進剤の存在下で、又は電気パルス処理（例えばエレクトロポレーション）により融合反応を行う。
【００２１】
細胞融合処理後、選択培地を用いて培養し、目的とするハイブリドーマを選別する。次いで、増殖したハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法　（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）等によってスクリーニングすることができる。
【００２２】
ハイブリドーマのクローニングは、例えば、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法等により行うことができ、最終的にモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得する。
【００２３】
取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法等を利用することができる。細胞培養法においては、例えばハイブリドーマを１０〜２０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地等の動物細胞培養培地中、通常の培養条件（例えば３７℃，５％ＣＯ２濃度）で３〜７日間培養することにより、その培養上清からモノクローナル抗体を取得することができる。また、ハイブリドーマをマウス等の腹腔内に移植し、６〜１４日後に腹水を採取し、当該腹水からモノクローナル抗体を取得することもできる。
【００２４】
モノクローナル抗体の精製が必要とされる場合は、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して又はこれらを組み合わせて利用することができる。
【００２５】
本発明の癌特異的抗原の検出・定量剤は、本発明の抗体又はその断片、あるいは癌特異的抗原ＣＲＰ２をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを有効成分として含有することを特徴とする。ここで、「癌特異的抗原ＣＲＰ２をコードする核酸」にはＤＮＡ及びＲＮＡの両者が含まれ、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ等が含まれる。また、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドのいずれであってもよい。
【００２６】
本発明の検出・定量剤によって検出又は定量し得る癌特異的抗原には、ヒト由来のＣＲＰ２に加え、ヒト以外の哺乳動物由来のＣＲＰ２も含まれる。本発明の検出・定量剤は、本発明の抗体又はその断片、あるいは癌特異的抗原ＣＲＰ２をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドそれ自体であってもよいが、これらを常法により製剤化したものであってもよい。本発明の検出・定量剤は、癌特異的抗原ＣＲＰ２を検出・定量し得る限り、いかなる剤形に製剤化してもよい。
【００２７】
本発明の癌特異的抗原の検出・定量用キットは、本発明の抗体又はその断片、あるいは癌特異的抗原ＣＲＰ２をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。本発明の検出・定量用キットは、本発明の抗体又はその断片、あるいは癌特異的抗原ＣＲＰ２をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む限り、いかなる形態であってもよく、任意の試薬、器具等を含むことができる。
【００２８】
本発明の癌特異的抗原の検出・定量用キットが、癌特異的抗原ＣＲＰ２をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む場合には、ＰＣＲに必要な試薬（例えばＨ２Ｏ、バッファー、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰミックス、Ｔａｑポリメラーゼ等）、ＰＣＲ増幅断片の定量に必要な試薬（例えばＲＩ、蛍光色素等）、ＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ等の１種類又は２種類以上を含むことができる。また、本発明の癌特異的抗原の検出・定量用キットが、本発明の抗体又はその断片を含む場合には、本発明の抗体又はその断片を固定化するための固相担体（例えば、イムノプレート、ラテックス粒子等）、抗γ−グログリン抗体（二次抗体）、抗体（二次抗体を含む）又はその断片の標識（例えば、酵素、蛍光物質等）、各種試薬（例えば、酵素基質、緩衝液、希釈液等）等の１種類又は２種類以上を含むことができる。抗体又はその断片の標識としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、フロレッセンス、ウンベリフェロン等の蛍光物質等が挙げられる。
【００２９】
本発明の癌特異的抗原の検出・定量方法は、被験者から採取した検体における癌特異的抗原ＣＲＰ２の存在の有無又は存在量を、本発明の抗体若しくはその断片、本発明の検出・定量剤又は本発明の検出・定量用キットを用いて検出又は定量することを特徴とする。
【００３０】
本発明の抗体又はその断片は、癌特異的抗原ＣＲＰ２に特異的に反応し、ヒトから採取された検体に含まれる癌特異的抗原ＣＲＰ２以外のタンパク質とは反応しない性質を有するので、本発明の抗体又はその断片の癌特異的抗原ＣＲＰ２に対する特異的反応性を利用することにより、被験者から採取された検体における癌特異的抗原ＣＲＰ２の存在の有無又は存在量を検出又は定量することができる。
【００３１】
また、癌特異的抗原ＣＲＰ２をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをプローブ又はプライマーとして利用することにより、癌特異的抗原ＣＲＰ２をコードする核酸の存在の有無又は存在量を検出又は定量することができ、これに基づいて癌特異的抗原ＣＲＰ２の存在の有無又は存在量を検出又は定量することができる。
【００３２】
本発明の抗体又はその断片を利用して癌特異的抗原ＣＲＰ２の存在の有無又は存在量を検出・定量する場合、本発明の抗体又はその断片の癌特異的抗原ＣＲＰ２に対する特異的反応性を利用するものである限り、その態様は特に限定されるものではなく、例えば、放射能免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、化学発光測定法（ＣＬＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）等を利用することができる。具体的な検出・定量方法としては、例えば、（ｉ）ラジオアイソトープ等で標識した癌特異的抗原ＣＲＰ２と一定量の抗体とを反応させる際に、検体中の癌特異的抗原ＣＲＰ２がその結合を阻害する程度によって、検体中の癌特異的抗原ＣＲＰ２を検出・定量する競合法、（ｉｉ）物理吸着や化学結合等により抗体を結合させた固相担体（例えば、イムノプレート、ラテックス粒子等）を用いて検体中の癌特異的抗原ＣＲＰ２を捕捉した後、捕捉された癌特異的抗原ＣＲＰ２を、固相担体に固定化した抗体とは癌特異的抗原ＣＲＰ２の異なる抗原決定基を認識する標識化抗体（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、フロレッセンス、ウンベリフェロン等の蛍光物質等で標識した抗体）で検出・定量するサンドイッチ法、（ｉｉｉ）固定化した赤血球やラテックス粒子等の固相担体に抗体を固定化し、検体中のＣＲＰ２を介して起こるそれらの粒子の凝集度により検出・定量する凝集法等が挙げられる。
【００３３】
また、癌特異的抗原ＣＲＰ２をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを利用して癌特異的抗原ＣＲＰ２の存在の有無又は存在量を検出・定量する場合、公知の遺伝子解析技術、例えば、ハイブリダイゼーション技術（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法等）、遺伝子増幅技術（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ等）等を利用することができる。
【００３４】
ハイブリダイゼーション技術を利用する際には、癌特異的抗原ＣＲＰ２をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをプローブとして利用することができ、遺伝子増幅技術を利用する際には、当該オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをプライマーとして利用することができる。
【００３５】
癌特異的抗原ＣＲＰ２をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの塩基配列は、ＣＲＰ２遺伝子の塩基配列に基づいて設計することができる。ヒトのＣＲＰ２遺伝子の塩基配列を配列番号２に示す。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、例えば、癌特異的抗原ＣＲＰ２をコードする核酸のＣＤＳ領域にハイブリダイズし得るように、ＣＤＳ領域の５’末端側又は３’末端側の領域にハイブリダイズし得るように、あるいは、ＣＤＳ領域からその５’末端側又は３’末端側の領域にわたる領域にハイブリダイズし得るように設計される。プライマーの５’末端側には制限酵素認識配列、タグ等を付加することができる。また、プローブ及びプローブには、蛍光色素、ラジオアイソトープ等の標識を付加することができる。
【００３６】
癌特異的抗原ＣＲＰ２をコードする核酸の存在量の具体的測定方法について、ＲＴ−ＰＣＲを利用する場合を例にして説明する。被験者から採取した検体から全ＲＮＡを抽出し、抽出した全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した後、合成したｃＤＮＡを鋳型とし、癌特異的抗原ＣＲＰ２をコードするｃＤＮＡにハイブリダイズし得るプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅断片を定量することによって、癌特異的抗原ＣＲＰ２をコードするｍＲＮＡの存在量を測定することができる。この際、ＰＣＲは、ＰＣＲ増幅断片生成量が初期鋳型ｃＤＮＡ量を反映するような条件（例えば、ＰＣＲ増幅断片が指数関数的に増加するＰＣＲサイクル数）で行う。
【００３７】
ＰＣＲ増幅断片の定量方法は特に限定されるものではなく、ＰＣＲ増幅断片の定量には、例えば、ラジオアイソトープ（ＲＩ）を用いた定量方法、蛍光色素を用いた定量方法等を利用することができる。
【００３８】
ＲＩを用いた定量方法としては、例えば、（ｉ）　反応液にＲＩ標識したヌクレオチド（例えば３２Ｐ標識されたｄＣＴＰ等）を基質として加えておき、ＰＣＲ増幅断片に取り込ませてＰＣＲ増幅断片をＲＩ標識し、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動等で分離した後、放射活性を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法、（ｉｉ）　ＲＩ標識したプライマーを用いることによりＰＣＲ増幅断片をＲＩ標識し、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動等で分離した後、放射活性を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法、（ｉｉｉ）　ＰＣＲ増幅断片を電気泳動した後、メンブランにブロッティングし、ＲＩ標識したプローブをハイブリダイズさせ、放射活性を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法等が挙げられる。放射活性は、例えば、液体シンチレーションカウンター、Ｘ線フィルム、イメージングプレート等を用いて測定することができる。
【００３９】
蛍光色素を用いた定量方法としては、（ｉ）　二本鎖ＤＮＡにインターカレートする蛍光色素（例えば、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）、ＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎＩ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ等）を用いてＰＣＲ増幅断片を染色し、励起光の照射によって発せられる蛍光強度を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法、（ｉｉ）　蛍光色素で標識したプライマーを用いることによりＰＣＲ増幅断片を蛍光色素で標識し、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動等で分離した後、蛍光強度を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法等が挙げられる。蛍光強度は、例えば、ＣＣＤカメラ、蛍光スキャナー、分光蛍光光度計等を用いて測定することができる。
【００４０】
本発明の癌の診断方法は、被験者から採取した検体における癌特異的抗原ＣＲＰ２の存在の有無又は存在量を指標として、被験者における癌細胞の存在の有無を診断することを特徴とする。癌特異的抗原ＣＲＰ２は、癌細胞によって特異的かつ一般的に産生される抗原（タンパク質）であるので、被験者から採取した検体における癌特異的抗原ＣＲＰ２の存在の有無又は存在量を指標とすることにより、被験者における癌細胞の存在の有無を診断することができる。
【００４１】
本発明の診断方法においては、被験者から採取した検体に癌特異的抗原ＣＲＰ２が存在している場合又は健常者から採取した検体よりも癌特異的抗原ＣＲＰ２の存在量が多い場合には、被験者のいずれかの部位に癌細胞が存在していると診断することができる。本発明の診断方法の好ましい実施形態においては、健常者群から採取した検体における癌特異的抗原ＣＲＰ２量を測定し、その値の分布から正常範囲を設定する。そして、被験者から採取した検体における癌特異的抗原ＣＲＰ２量を定量し、その値が正常範囲以上になった場合には、被験者に癌細胞が存在すると診断する。癌細胞が存在すると診断された被験者は、必要に応じて、公知の方法により更に詳しい検査を行い、癌細胞の発生部位を特定する。
【００４２】
本発明の診断方法において、癌特異的抗原ＣＲＰ２の存在の有無又は存在量の検出・定量方法は特に限定されるものではないが、本発明の検出・定量方法を利用することが好ましい。
本発明の診断方法において、被験者から採取する検体は、被験者のいずれの細胞又は組織であってもよいが、被験者から比較的採取しやすいことから体液を利用することが好ましい。体液としては、血液、血清、血漿、腹水、胸水、髄液、リンパ液、唾液等が挙げられ、これらのうち特に血清が好ましい。
【００４３】
本発明の診断方法は、広く癌一般についてその癌細胞の存在の有無を診断することができるので、早期発見を含めた癌の１次スクリーニングを効率よく行うことができる。本発明の診断方法により診断できる癌の種類は特に限定されるものではなく、例えば、甲状腺癌、乳癌、胃癌、食道癌、口腔癌、大腸癌、直腸癌、肛門癌、膵臓癌、肺癌、腎癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌、外陰癌、皮膚癌、メラノーマ、中枢又は末梢神経腫瘍（髄膜腫、神経膠腫瘍、聴神経腫瘍、神経線維肉腫を含む脳・脊髄・末梢神経腫瘍）、歯肉癌、咽頭癌、顎癌（上顎癌を含む；扁平上皮癌）、縦隔腫瘍（胸腺癌を含む）、肝癌、胆管癌、胆嚢癌、腎盂腫瘍、尿管癌、睾丸腫瘍、前立腺癌、絨毛性腫瘍、卵管癌、膣癌、肉腫、白血病、赤白血病、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫及び癌肉腫（子宮癌肉腫を含む）が挙げられ、単一の癌のみならず複数の癌が併発したものも含まれる。
【００４４】
本発明の癌の診断用キットは、被験者から採取した検体における癌特異的抗原ＣＲＰ２の存在の有無又は存在量を検出・定量するための試薬として、本発明の抗体又はその断片、あるいは癌特異的抗原ＣＲＰ２をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む。
【００４５】
本発明の癌の診断用キットは、本発明の抗体又はその断片、あるいは癌特異的抗原ＣＲＰ２をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む限り、いかなる形態であってもよく、本発明の検出・定量用キットにおいて例示したような任意の試薬、器具等を含むことができる。
【００４６】
【実施例】
〔実施例１〕胃癌の悪性化に関連する遺伝子の同定
胃癌の悪性化に関連する遺伝子を同定するために、胃癌細胞株ＯＣＵＭ−２Ｍと、その亜株でヌードマウスの実験系で腹膜播種能を獲得したＯＣＵＭ−２ＭＤ３（Ｙａｓｈｉｒｏ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，　１４，　４３−５４，　１９９６）との間で、ＤＮＡチップによる網羅的遺伝子発現解析を行った。この際、ＤＮＡチップとして合成オリゴヌクレオチドアレイ（Ｈｕ３５Ｋａｒｒａｙ，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用い、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ　ＧｅｎｅＣｈｉｐ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｍａｎｕａｌに従って実験を行った。
【００４７】
具体的には、Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン）により細胞株からＲＮＡを抽出し、ＯｌｉｇｏｄＴカラムを用いてｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを精製した。１μｇのｍＲＮＡから、Ｔ７（ｄＴ）２４プライマーとＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｃｈｏｉｓｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）を用いて二重鎖ｃＤＮＡを合成し、フェノールクロロホルム抽出により精製した。次いで、ビオチン標識されたｃＲＮＡをＢｉｏＡｒｒａｙ　Ｈｉｇｈ　Ｙｉｅｌｄ　ＲＮＡ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎにより合成した。ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した後、アルカリ処理により５０〜２００塩基に断片化してＤＮＡチップと４５℃で１６時間ハイブリダイゼーションさせた。洗浄後、ストレプトアビジンフィコエリスリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）で染色してビオチン化抗ストレプトアビジン抗体（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でシグナルを増強した。ＨＰ　ＧｅｎｅＡｒｒａｙ　Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｈｅｗｌｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）でスキャンして画像を取り込み、ＤＮＡチップ上の全てのプローブのシグナル強度が１００になるようにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ　ＧｅｎｅＣｈｉｐ　Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて標準化を行った。約３５，０００個の遺伝子が搭載されているＨｕ３５Ｋａｒｒａｙに関して、ＲＴ−ＰＣＲによって結果の検証を行った。ＣＲＰ２遺伝子については、ＧｅｎｅＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ　ＡＡ１３３６６６のプローブでシグナルが検出され、シグナル強度は、ＯＣＵＭ−２Ｍでは１５９であったが、ＯＣＵＭ−２ＭＤ３では３９７１であり、ＯＣＵＭ−２ＭＤ３ではＣＲＰ２遺伝子の発現が亢進していた。
【００４８】
また、５’−　ｔｇｇａａｔｃｃｔｃｔｔｃｇｇａｃｃｃａａｇ　−３’及び５’−　ａｃａａｇｇｃｔｃａａｃａｇｃａｇｇｔｇａｇ　−３’をプライマーとして９４℃で３０秒、６３℃で３０秒、７２℃で６０秒の反応を２５サイクルさせた通常のＰＣＲを行ったところ、ＯＣＵＭ−２ＭとＯＣＵＭ−２ＭＤ３との間でＣＲＰ２遺伝子の発現量に差があることが確認された。さらに、後述の実施例２及び３で作製したモノクローナル抗体（Ｈ１３２７）を一次抗体（５０００倍希釈）とした通常のウエスタンブロット法により、ＯＣＵＭ−２ＭとＯＣＵＭ−２ＭＤ３との間でＣＲＰ２の発現量に差があることがタンパク質レベルでも確認された。
以上の結果から、ＣＲＰ２遺伝子が胃癌の悪性化に関連することが判明した。
【００４９】
〔実施例２〕ＣＲＰ２抗原の調製
（ａ）ＤＮＡ構築物の作製
ヒト由来のＣＲＰ２（ＵｎｉＧｅｎｅ　Ｃｌｕｓｔｅｒ　Ｈｓ．７０３２７）のアミノ酸配列及びヒト由来のＣＲＰ２をコードするＤＮＡの塩基配列は、ＧｅｎｅＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ　Ｄ４２１２３を参考にした（配列番号１，２）。コーディング領域全長を増幅するために、それぞれＢａｍＨＩとＸｈｏＩの制限酵素サイトを付加した下記のプライマーＧＣ１１０４、ＧＣ１１０５をデザインした。
ＧＣ１１０４：ＣＧＧＧＡＴＣＣ−ＡＴＧＧＣＣＴＣＣＡＡＡＴＧＣＣＣＣＡＡＧＴＧＣ
ＧＣ１１０５：ＣＧＣＴＣＧＡＧ−ＧＧＧＣＴＧＧＡＣＣＴＴＧＣＣＴＴＣＧＧＧＧ
【００５０】
胃癌細胞株ＯＣＵＭ−２ＭＤ３のＲＮＡを逆転写して合成したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った。得られたＰＣＲ産物をカラム精製により回収し、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターにライゲーションを行い、大腸菌（ＸＬＩ−ｂｌｕｅ）に形質転換を行った。ＬＢプレート（アンピシリン入り）上に得られた白色コロニーを数個ピックアップしてＬＢ（アンピシリン入り）溶液中、３７℃で一晩培養し、ミニプレップ法によりプラスミドを回収した。塩基配列をＤｙｅ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを用いたｄｉｄｅｏｘｉ法により決定し、Ｄ４２１２３と配列が同一のクローンを選択した。ＢａｍＨＩとＸｈｏＩとで二重消化を行い、得られたＢａｍＨＩ−ＣＲＰ２−ＸｈｏＩ断片をゲル精製して発現ベクターのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩサイトにライゲーションにより組み込んで大腸菌発現用（ｐＥＴ４１−ＣＲＰ２）、動物細胞発現用（ｐｃＤＮＡ４−ＣＲＰ２）のＤＮＡ構築物を作製した。
【００５１】
（ｂ）ＣＲＰ２抗原の発現と精製
大腸菌の培養はすべて３７℃で行った。形質転換によってＢＬ２１Ｃｏｄｏｎ−ｐｌｕｓ（ＤＥ３）にｐＥＴ４１−ＣＲＰ２を導入し、アンピシリン入りＬＢプレート上で１６時間培養を行った。このようにしてクローン化された大腸菌を５ｍＬのアンピシリン入りＬＢ培地に移し、１６時間培養した。この培養液を５００ｍＬのアンピシリン入り２×ＹＴ溶液（１Ｌ当たりトリプトン１６ｇ、酵母抽出液１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、５Ｎ塩化ナトリウム溶液０．２ｍＬ）に入れ、６００ｎｍにおける光学密度が０．６になった時点で、終濃度が１ｍＭになるようにタンパク質発現誘導剤ｉｓｏｐｒｏｒｙｌ−１−ｔｈｉｏ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を加え、さらに３時間培養した。集菌は６０００ｒｐｍ、１０分間の遠心で行った。
【００５２】
沈殿に対し、１０ｍＬの溶菌バッファー（５０ｍＭ　塩化ナトリウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ　８．０）を加え、さらに超音波破砕を行い、タンパク質を抽出した。界面活性剤トリトンＸ−１００を終濃度１％となるように加えた後、１００００ｒｐｍで４５分遠心を行い、上清を回収した。この上清を以下のタンパク質精製に用いた。
【００５３】
上清に対し、０．５ｍＬのグルタチオンセファロース（アマシャムバイオサイエンス社）を加え、３０分間、転倒混和を行い、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質であるＧＳＴ−ＣＲＰ２をセファロースに結合させた。２０００ｒｐｍで１０分間遠心を行い、セファロースを沈殿させた後、上清を破棄した。セファロースにリン酸バッファーを１０ｍＬ加え、遠心することでセファロースの洗浄を行った。洗浄は２回行った。ＧＳＴ−ＣＲＰ２のセファロースからの溶出は、セファロースに溶出バッファー（５０ｍＭグルタチオン、２００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ　８．０）を加えることで行った。溶出されたＧＳＴ−ＣＰＲ２はＰＤ−１０カラム（アマシャムバイオサイエンス社）を通し、リン酸バッファーに置換させた。
【００５４】
精製蛋白の半分はトロンビンによりＧＳＴを切断し、ＣＲＰ２とした。ＧＳＴ−ＣＲＰ２とＣＲＰ２の両方をマウスに免疫するための抗原として用いた。ｐｃＤＮＡ４−ＣＲＰ２をＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）によるトランスフェクションで動物細胞（ＣＯＳ７細胞）に一過性に発現させ、４８時間後に細胞をＲＩＰＡバッファーで溶解し、全細胞融解液を回収してｐｃＤＮＡ４のｔａｇであるＸｐｒｅｓｓに対する抗体でウエスタンブロットを行い、発現を確認した。この全細胞融解液は得られたモノクローナル抗体スクリーニング用の抗原として用いた。
【００５５】
〔実施例３〕抗ＣＲＰ２モノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体の作製は、Ｏｉらの方法（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｈｙｂｒｉｄｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ：Ｏｉ，　Ｖ．　Ｔ．，　ａｎｄ　Ｌ．　Ａ．　Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ、１９８０．及びＩｎ　Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｂ．　Ｂ．　Ｍｉｓｈｅｌ　ａｎｄ　Ｓ．　Ｍ．　Ｓｈｉｉｇｉ、Ｆｒｅｅｍａｎ　Ｃｏ．，　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，　ＣＡ、　３５１−５７２）に準じて行った。
【００５６】
（ａ）マウスへの免疫
ＢＡＬＢ／ｃ系の雌性７週令のマウス１匹に、ＧＳＴ−ＣＲＰ２とＣＲＰ２の混合物１００μｇ（重量比で１：１）を含む生理食塩水溶液１５０μＬとフロイント完全アジュバント１５０μＬを混合して調製したエマルジョンを腹腔内に投与して初回免疫を行った。マウス２匹に免疫をした。初回免疫の２６日後、　ＧＳＴ−ＣＲＰ２とＣＲＰ２の混合物１００μｇを含む生理食塩水溶液２００μＬを１匹のマウスの腹腔内に投与して追加免疫を行った。マウス２匹に投与した。
【００５７】
（ｂ）細胞融合
ミエローマ細胞としてＰ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１、大日本製薬）、基本培地にはＲＰＭＩ１６４０を用い、グルタミンの濃度を３ｍＭとし、１ｍＭピルビン酸ナトリウムを添加した。また、抗生物質としてペニシリンＧとストレプトマイシンを添加した。
【００５８】
追加免疫の３日後、２匹の免疫マウスを断頭し瀉血したあと、脾臓を摘出して基本培地に浸し脾臓細胞の浮遊液を調製した。１０００×ｇ、室温で５分間遠心分離して上清を除き、赤血球溶解液（０．１６Ｍ−ＮＨ４Ｃｌ，　１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）を加えて細胞を浮遊させ混入した赤血球を溶血させた。さらに２回の遠心分離によって細胞を洗浄し、脾臓細胞の浮遊液を得た。その細胞数は７．６×１０７であった。一方、ＮＳ−１細胞を１０％の牛胎児血清（ＦＣＳ）を添加した基本培地で対数増殖期の状態に培養し、細胞を遠心分離により集め、基本培地を用いて２回洗浄した。
【００５９】
７．６×１０７の脾臓細胞に１／１０量のＮＳ−１細胞（７．６×１０６）を加えて混合し、１４５０×ｇで１０分間遠心分離した。上清を充分に除いた後、沈査の細胞へ５０％−ＰＥＧ溶液（ポリエチレングリコール１５００、Ｓｉｇｍａ社製）３００μＬを１分間かけて充分に混合しながら加えた。さらに１分間混合し続けたあと６００μＬの基本培地を２分間かけて混合しながら徐々に加えた。最後に２ｍＬの基本培地を３分間かけて混合しながら加えた。この間の操作は３７℃で行った。
【００６０】
この融合反応を終えた細胞浮遊液を１４５０×ｇで１０分間遠心分離し、その上清を除き増殖培地（２０％−ＦＣＳ添加の基本培地）を加えて細胞を浮遊させ１５ｍＬとした。この浮遊液に胸腺細胞（免疫をしていないＢＡＬＢ／ｃマウスから調製したもの）を５×１０６／ｍＬ加えたものを、９６穴プレートに１穴当たり１００μＬずつ入れた。７％−ＣＯ２、湿度１００％、３７℃の条件で培養を行った。
【００６１】
（ｃ）ＨＡＴ選択
培養１日後にＨＡＴ培地（２０％　ＦＣＳ添加の基本培地にヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを添加したもの）を各穴へ１００μＬずつ添加した。２日後培養液の上清を１００μＬずつ吸引除去し、ＨＡＴ培地を１００μＬずつ加えた。５日、７日後に同様にこのＨＡＴ培地の交換を行って融合細胞（ハイブリドーマ）のみ増殖させた。
【００６２】
（ｄ）スクリーニング
９日後に培養上清を採取し、ＣＲＰ２に対する抗体の有無を酵素免疫測定法（ＥＩＡ）で調べた。この１次スクリーニングではＧＳＴ−ＣＲＰ２とＣＲＰ２の２種類の抗原を固相したイムノプレートに培養上清を加えて反応させたあと、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を加え抗原に結合したマウスの抗体に反応させた。最後に発色液を加え、吸光度を測定した。
【００６３】
高い測定値を示した４０穴の細胞を２４穴プレートへ移してＨＴ培地（２０％−ＦＣＳ添加の基本培地にヒポキサンチン、チミジンを添加したもの）を用いて培養をした。３日後、その培養上清を採取しＥＩＡで２次スクリーニングを行い、ＧＳＴ−ＣＲＰ２とＣＲＰ２に強く反応するものを１６穴選んだ。
【００６４】
（ｅ）クローニング
選んだ１６穴の細胞はＨＴ培地を用い限界希釈法でクローニングを行った。その７日後培養上清を採取し、２次スクリーニングと同じく、抗原との反応性をＥＩＡで調べ、１１クローンを確立した。増殖培地を用いてこれらの融合細胞を増殖させ、２５０ｍＬのフラスコでの培養で集めた細胞を細胞の凍結とマウス腹腔への細胞移植に用いた。
【００６５】
（ｆ）ウエスタンブロッティング
クローニング後に得られた培養上清を用い、大腸菌およびＣＯＳ７細胞で発現したＣＲＰ２との反応をウエスタンブロッティングで調べた。いずれの培養上清中の抗体もＣＲＰ２と反応することを認めた。
【００６６】
（ｇ）マウス腹水の採取
ハイブリドーマの移植の３日以上前に、あらかじめプリスタンをＢＡＬＢ／ｃ系マウスに０．５ｍｉずつ腹腔内へ投与した。融合細胞の培養液約５０ｍＬを遠心分離し、沈査の細胞を生理食塩水で浮遊させた後、再度遠心分離して洗浄し、約１０７個の細胞をマウス１匹の腹腔内へ移植した。７〜１０日後に貯留したマウス腹水を２〜５ｍＬ採取し、遠心分離によりプリスタンと細胞を除いた。
【００６７】
（ｈ）抗体の精製
マウス腹水を生理食塩水で３倍に希釈し、硫酸アンモニウムの飽和水溶液を等量加えて抗体蛋白を塩析した。遠心分離後、上清を充分に取り除いて生理食塩水で沈殿物を溶解し、生理食塩水に対して透析を行った。
【００６８】
〔実施例４〕エンザイムイムノアッセイによるヒト検体中のＣＲＰ２抗原の検出
硫酸アンモニウムによる塩析で精製したＨｙｂ−Ａ１３２７Ｂ及びＨｙｂ−Ａ１３１１Ａをそれぞれ固相化用抗体及びペルオキシダーゼ標識用抗体として使用した。固相化用の支持体は９６ウエルのイムノプレートを用い、Ｈｙｂ−Ａ１３２７Ｂをリン酸緩衝生理食塩水中に５μｇ／ｍＬの濃度で溶解し、１ウエル当たり５０μＬを分注し、一夜２〜８℃で放置後、４０％ブロックエース（大日本製薬ＵＫ−Ｂ２５）を含むリン酸緩衝生理食塩水でブロッキングした。ペルオキシダーゼ標識抗体は、Ｎａｋａｎｅらの方法（Ｎａｋａｎｅ，　Ｐ．　Ｋ．，　ａｎｄ　Ａ．　Ｋａｗａｏｉ，　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｌａｂｅｌｅｄ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　：　ａ　ｎｅｗ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｊ．　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．　２２，　１０８４，　１９７４）に従い、過ヨウ素酸法によって抗体蛋白にＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を結合させた。すなわち、０．５ｍｇのＨＲＰを過ヨウ素酸で酸化したのち、ｐＨ　４の１ｍＭ酢酸緩衝液で透析を行い、酸化されたＨＲＰと１ｍｇの抗体蛋白を　ｐＨ　９〜９．５の１０ｍＭ炭酸緩衝溶液中で反応させた。ＮａＢＨ４で還元したあと、１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水に対して透析を行い、１０％子牛血清及び１％のマウス腹水を含むトリス緩衝生理食塩水を用いて、抗体換算で１．５μｇ／ｍＬに希釈した。ペルオキシダーゼの検出の基質としてＴＭＢ試薬（サイテックＴＭ４９００４１）及び基質反応の停止剤としてＴＭＢ停止剤（サイテックＴＳＢ９９９）を用いた。検体中に含まれるＣＲＰ２の濃度を測定する際のスタンダードとしては、前記のＧＳＴとの融合タンパク質を、１０％子牛血清を含むトリス緩衝生理食塩水で希釈して用いた。
【００６９】
検体としては、癌患者より採取した血清７０例及び一般供血者の血清６９例を対象とした。
上記の抗体固相化プレートの各ウエルに、１０％子牛血清及び１％のマウス腹水を含むトリス緩衝生理食塩水を５０μＬ分注し、被検血清及びスタンダードを２５μＬ分注した後、室温で２時間インキューベーションした。０．０５％ツイーン２０を含むリン酸緩衝生理食塩水２００μＬで洗浄した後、各ウエルに５０μＬのペルオキシダーゼ標識抗体を分注し、室温で１時間インキューベーションした。０．０５％ツイーン２０を含むリン酸緩衝生理食塩水２００μＬで３回洗浄した後、各ウエルに５０μＬの検出用基質分注し、室温で３０分インキューベーションした。更に、５０μＬの基質反応停止剤を加え、ＥＩＡプレートリーダー（コロナ電子　ＭＴＰ−１２０）により、６３０ｎｍの波長の対照として４５０ｎｍの波長の吸収を測定した。スタンダード各濃度の吸収値から回帰により（図１）、各検体の濃度を求めた。結果を図２に示す。
【００７０】
健常者血清検体６９例のＣＲＰ２濃度測定値の平均が１８．１ｎｇ／ｍＬ、標準偏差が４．６ｎｇ／ｍＬ、平均＋３標準偏差が１８．１ｎｇ／ｍＬであったことから、カットオフ値を１９ｎｇ／ｍＬとした。この時の健常者血清群及び癌患者血清群の陽性率は、それぞれ４．３％及び４１．４％であった。両者を合わせた時の特異性は６８．３％（９５／１３９）、また診断率は９０．６％（２９／３２）であった。
ここで、「両者を合わせた時の特異性」は、健常者血清群と癌患者血清群の合計検体数に対する、健常者血清群で陰性となった検体数と癌患者血清群で陽性となった検体数の和の比率である。また、「診断率」は、陽性と判別された場合にその被験者が癌である確率であり、本実験においては、３２例が陽性と判別されるが、そのうち３例は健常者血清群であるので、診断率は９０．６％（２９／３２）となる。
【００７１】
〔実施例５〕蛍光イムノアッセイによるヒト検体中のＣＲＰ２抗原の検出
エンザイムイムノアッセイと同様に、固相化用抗体と及び標識用抗体としてＨｙｂ−Ａ１３２７Ｂ及びＨｙｂ−Ａ１３１１Ａを使用した。固相化用の支持体として蛍光ビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ　Ｃｏｏｐ．　Ｌ１００−ｃ１３８−０１）を用い、１−エチル−３−ジメチノアミノプロピルカルボジイミド（Ｐｉｅｒｃｅ　２２９６０）及びスルホ−Ｎ−ハイドロキシサクシンイミドを各５ｍｇ／ｍＬ含むＭＥＳ緩衝液（０．１モル、ｐＨ　５．５）中に１×１０７個／ｍＬとなるように懸濁し、室温で２０分間反応させた後、遠心分離（１０，０００×ｇ、２分間）により回収し、活性化ビーズとした。この活性化ビーズを、５０μｇ／ｍＬのＨｙｂ−Ａ１３２７Ｂを含むＭＥＳ緩衝液中に５×１０６個／ｍＬとなるように懸濁して、室温で２時間反応させた。反応後の蛍光ビーズは、遠心分離により０．０５％ツイーン２０を含むリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、１％の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水中に５×１０４個／ｍＬとなるように分散させ固相化抗体とした。一方、Ｈｙｂ−Ａ１３１１Ａは、炭酸緩衝液（０．１モル、ｐＨ　８．０）に５００μｇ／ｍＬとなるよう溶解し、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ　２１３３５）を最終濃度が１００μｇ／ｍＬとなるように加え、室温で２時間反応させて、ＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　１７−０８５１−０１）及び溶出液として１％の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水を用いて未反応のビオチンを除去し、溶出液にて５μｇ／ｍＬの抗体濃度となるように希釈して標識抗体とした。ビオチン標識抗体の検出には、蛍光物質であるＲ−フィコエリスリンで標識したストレプトアビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ　Ｓ−８６６）を用い、１％の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水中に３μｇ／ｍＬとなるように希釈して使用した。
【００７２】
検体中に含まれるＣＲＰ２の濃度を測定する際のスタンダードとしては、前記同様、ＧＳＴとの融合タンパク質を、１％の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水で希釈して用いた。
検体としては、癌患者より採取した血清５８例及び一般供血者の血清２９例を対象とした。
【００７３】
９６ウエルフィルター付きプレート（Ｎｕｌｇｅ　Ｎｕｎｃ　２５６０６５）のウエルに５０μＬの蛍光ビーズ及びスタンダード又は検体２５μＬを入れ、室温で２時間攪拌後、アスピレーターを用いて吸引ろ過した。次に、各ウエルに０．０５％のツイーン２０を含むリン酸緩衝生理食塩水１００μＬを入れ吸引ろ過したのち、ビオチン標識抗体５０μＬを加え、室温で１時間攪拌後、前記同様に各ウエルを洗浄した。最後に、Ｒ−フィコエリスリン標識ストレプトアビジンを５０μＬ加え、室温で１５分間攪拌後に吸引ろ過し、１％の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水を各ウエルに２００μＬ加え、懸濁し蛍光測定用のサンプルとした。各ウエルのビーズ上の蛍光強度は、ルミネックス１００（Ｌｕｍｉｎｅｘ　Ｃｏｏｐ．　００００１５）を用いて、各ウエル当たり１００個の蛍光ビーズに対してＲ−フィコエリスリン由来の蛍光強度を測定し、中央値をそのデータとした。
【００７４】
スタンダード各濃度の蛍光強度から回帰により（図３）、各検体の濃度を求めた。結果を図４に示す。
健常者血清検体２９例のＣＲＰ２濃度測定値の平均が２．２ｎｇ／ｍＬ、標準偏差が１．３ｎｇ／ｍＬ、平均＋３標準偏差が６．１ｎｇ／ｍＬであったことから、カットオフ値を６．２ｎｇ／ｍＬとした。この時の健常者血清群及び癌患者血清群の陽性率は、それぞれ０％及び３６．２％であった。両者を合わせた時の特異性は５７．５％（５０／８７）、また診断率は１００％（２１／２１）であった。
【００７５】
【発明の効果】
本発明により、癌細胞が特異的かつ一般的に産生する抗原に特異的に反応する抗体、当該抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、当該抗原を検出・定量できる癌特異的抗原の検出・定量剤、検出・定量用キット及び検出・定量方法、並びに当該抗原の存在の有無又は存在量を指標として広く癌一般の診断を行うことができる癌の診断方法が提供される。
【００７６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＣＲＰ２濃度（ｎｇ／ｍＬ）と吸光度（４５０ｎｍ）との関係を示す図である。
【図２】癌患者血清検体（ｎ＝５８）及び健常者血清検体（ｎ＝２９）におけるＣＲＰ２濃度（ｎｇ／ｍＬ）の測定結果を示す図である。
【図３】ＣＲＰ２濃度（ｎｇ／ｍＬ）と蛍光強度（ｍｅｄｉａｎ）との関係を示す図である。
【図４】癌患者血清検体（ｎ＝７０）及び健常者血清検体（ｎ＝６９）におけるＣＲＰ２濃度（ｎｇ／ｍＬ）の測定結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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