(57)【要約】【課題】新たな肥満細胞特異的シグナル分子を提供すること。【解決手段】Ｓｒｃ　ｋｉｎａｓｅ　ｆａｍｉｌｙタンパク質と相互作用するラット肥満細胞由来タンパク質ＳＫＡＰ５５およびそれをコードする遺伝子。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）の何れかに記載のタンパク質。
（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；又は、
（ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＳｒｃ　　ｋｉｎａｓｅ　ｆａｍｉｌｙタンパク質と相互作用するタンパク質；
【請求項２】
以下の（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）の何れかに記載の遺伝子。
（ｃ）請求項２に記載のタンパク質をコードする遺伝子；
（ｄ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子；又は
（ｅ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなり、かつＳｒｃ　ｋｉｎａｓｅ　ｆａｍｉｌｙタンパク質と相互作用するタンパク質をコードする遺伝子；又は
（ｆ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列から成り、かつＳｒｃ　　ｋｉｎａｓｅ　ｆａｍｉｌｙタンパク質と相互作用するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
被験物質の存在下、請求項１記載のタンパク質とＳｒｃ　ｋｉｎａｓｅ　ｆａｍｉｌｙタンパク質とを相互作用させることを含む、該相互作用を阻害する物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラットＳＫＡＰ５５およびそれをコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトＴ細胞においてシグナル伝達に関するアダプター分子としてＳＫＡＰ５５、ＳＬＡＰ１３０／Ｆｙｂなどが報告されている（非特許文献１、非特許文献２）
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２７２　　１６０７７−８０（１９７７）
【非特許文献２】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２７２　　１１６７４−７７（１９７７）
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新たな肥満細胞特異的シグナル分子を提供することを解決すべき課題とした。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、肥満細胞に発現したＦｃεＲＩ下流の特異的シグナル伝達機構を解明するため、ＰＣＲ法により新規遺伝子の探索を行った結果、新規なラットＳＫＡＰ５５遺伝子を同定することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００４】
すなわち、本発明によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）の何れかに記載のタンパク質が提供される。
（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；又は、
（ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＳｒｃ　　ｋｉｎａｓｅ　　ｆａｍｉｌｙタンパク質と相互作用するタンパク質；
本発明のさらに別の側面によれば、以下の（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）の何れかに記載の遺伝子が提供される。
（ｃ）上記の（ａ）又は（ｂ）に記載のタンパク質をコードする遺伝子；
（ｄ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子；又は
（ｅ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなり、かつＳｒｃ　　ｋｉｎａｓｅ　　ｆａｍｉｌｙタンパク質と相互作用するタンパク質をコードする遺伝子；又は、
（ｆ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列から成り、かつＳｒｃ　　ｋｉｎａｓｅ　　ｆａｍｉｌｙタンパク質と相互作用するタンパク質をコードする遺伝子。本発明のさらに別の側面によれば、被験物質の存在下、請求項１記載のタンパク質とＳｒｃ　　ｋｉｎａｓｅ　ｆａｍｉｌｙタンパク質とを相互作用させることを含む、該相互作用を阻害する物質のスクリーニング方法が提供される。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（１）ラットＳＫＡＰ５５タンパク質　　
本発明によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）の何れかに記載のラットＳＫＡＰ５５タンパク質が提供される。
（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；又は、
（ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＳｒｃ　　ｋｉｎａｓｅ　　ｆａｍｉｌｙタンパク質と相互作用するタンパク質；
【０００６】
本明細書で言う「アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【０００７】
蛋白質の構成要素となるアミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるものであるが、実質的に蛋白質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）、等が挙げられる。
【０００８】
従って、配列表の配列番号２に記載したラットＳＫＡＰ５５タンパク質のアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による変異蛋白質であっても、その変異がラットＳＫＡＰ５５タンパク質の３次元構造において保存性が高い変異であって、その変異蛋白質が、ラットＳＫＡＰ５５タンパク質と同様に、Ｓｒｃ　ｋｉｎａｓｅ　ｆａｍｉｌｙタンパク質と相互作用してその生理機能を発揮できる生理活性蛋白質であれば、これらは全て本発明の範囲内に属する。
【０００９】
本発明のタンパク質と相互作用するＳｒｃ　ｋｉｎａｓｅ　ｆａｍｉｌｙタンパク質とは、タンパクチロシンキナーゼの１種であり、例えば、ｌｙｎ、ｌｃｋ、ｆｙｎ等を挙げることができる。
【００１０】
本明細書で言う「Ｓｒｃ　ｋｉｎａｓｅ　ｆａｍｉｌｙタンパク質と相互作用するタンパク質」とは、これらのタンパク質と相互作用して複合体を形成することができるタンパク質を意味する。このとき相互作用するＳｒｃ　ｋｉｎａｓｅ　ｆａｍｉｌｙタンパク質またはこれ以外のチロシンキナーゼにより本発明のタンパク質がリン酸化されている方が相互作用は生じやすい。
【００１１】
本発明のラットＳＫＡＰ５５タンパク質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、生体試料又は培養細胞などから単離した天然由来の蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。組み換え蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードする遺伝子を入手することが必要である。
【００１２】
例えば、本発明のタンパク質をコードする塩基配列に基づいてＰＣＲ用プライマーを設計し、該プライマーを使用するＰＣＲにより目的遺伝子を増幅後、ベクター中に増幅した遺伝子を組み込むことにより組み換え遺伝子を構築できる。このような組み換え遺伝子を好適な発現系に導入してタンパク質を発現させることにより、組み換えタンパク質を生成することができる。
【００１３】
上記のようにして生成した組み換えタンパク質は常法により単離精製することができる。例えば、組み換えタンパク質を発現させる際に、一定の標識物質を付加させた状態で発現させ、その後、この標識物質に対して親和性を有する物質を用いて発現させた組み換えタンパク質を精製することができる。例えば、組み換えタンパク質にヒスチジンのタグを付加させて発現させた場合には、組み換えタンパク質はＮｉ−ＮＴＡアガロースを用いてアフィニティ精製することができる。あるいは、組み換えタンパク質にＧＳＴを付加させて発現させた場合には、グルタチオンセファロースを用いてアフィニティ精製することができる。
【００１４】
目的タンパク質を発現させるための発現系（遺伝子をクローニングするための発現ベクターと、その宿主）は当業者に公知である。ＰＣＲなどにより調製した目的ＤＮＡを宿主細胞中で発現させるためには、まず、該ＤＮＡを発現ベクター中のプロモーターの下流に挿入し、次いでこの組み換え発現ベクターを、発現ベクターに適合した宿主細胞中に導入する。
【００１５】
細菌用の発現ベクターとしては、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ）、ｐＱＥ−３０（ＱＩＡＧＥＮ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｌｐｔＩＩ　ＳＫ＋、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＵＣ１８〔Ｇｅｎｅ，　３３，　１０３（１９８５）〕、ｐＵＣ１９〔Ｇｅｎｅ，　３３，　１０３（１９８５）〕、ｐＳＴＶ２８（宝酒造）、ｐＳＴＶ２９（宝酒造）、ｐＵＣ１１８（宝酒造）などが挙げられ、酵母用の発現ベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、Ｙｃｐ５Ｏ（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等が挙げられ、動物細胞用の発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ）、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが挙げられる。
【００１６】
細菌用の発現ベクターに用いることができるプロモーターとしては、例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐ　ｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐ　ｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーター等を挙げることができる。酵母用の発現ベクターに用いることができるプロモーターとしては、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等を挙げることができる。動物細胞用の発現ベクターに用いることができるプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【００１７】
宿主細胞としては、目的タンパク質を発現できるものであれば特に制限されず、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。より具体的には、エッシェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、ミクロバクテリウム属等に属する細菌、クルイベロミセス属、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属等に属する酵母、ナマルバ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞などの動物細胞、Ｓｆ９、Ｓｆ２１などの昆虫細胞等を挙げることができるが、本発明では、動物細胞を使用することが好ましい。
【００１８】
組換えベクターの宿主への導入方法は、例えば、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法、リポフェクション法などが挙げられ、宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。
【００１９】
（２）ラットＳＫＡＰ５５タンパク質をコードする遺伝子　　
さらに本発明によれば、以下の（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）の何れかに記載のラットＳＫＡＰ５５タンパク質をコードする遺伝子が提供される。
（ｃ）上記の（ａ）又は（ｂ）に記載のタンパク質をコードする遺伝子；
（ｄ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子；又は
（ｅ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなり、かつＳｒｃ　　ｋｉｎａｓｅ　　ｆａｍｉｌｙタンパク質と相互作用するタンパク質をコードする遺伝子；又は、
（ｆ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列から成り、かつＳｒｃ　　ｋｉｎａｓｅ　　ｆａｍｉｌｙタンパク質と相互作用するタンパク質をコードする遺伝子。
【００２０】
本明細書で言う「塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列」における「１もしくは数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から６０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個程度を意味する。
【００２１】
上記のＤＮＡ変異の程度としては、例えば、配列表の配列番号１に記載したラットＳＫＡＰ５５遺伝子の塩基配列と８０％以上の相同性を有するものが挙げられる。
【００２２】
本明細書で言う「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、通常の条件下（例えば　ＤＩＧ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製Ｃａｔ　Ｎｏ．１１７５０３３）でプローブをラベルした場合に、３２℃のＤＩＧ　Ｅａｓｙ　Ｈｙｂ溶液（ベーリンガー・マンハイム社製ＣａｔＮｏ．１６０３５５８）中でハイブリダイズさせ、５０℃の０．５×ＳＳＣ溶液（０．１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ　クエン酸ナトリウムである）でのサザンハイブリダイゼーションで、ラットＳＫＡＰ５５遺伝子にハイブリダイズする程度であればよい。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ，　２ｎｄ　Ｅｄ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　ＮＹ．，１９８９（以下、モレキュラークローニング第２版）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１〜３８，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２３】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００２４】
本発明の遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書の配列表の配列番号１及び２に記載した塩基配列およびアミノ酸配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて、ラット由来のｃＤＮＡライブラリーやゲノムＤＮＡライブラリーなどをスクリーニングすることにより本発明の遺伝子を単離することができる。また、ＰＣＲ法により本発明の遺伝子を取得することもできる。
【００２５】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなり、かつＳｒｃ　　ｋｉｎａｓｅ　　ｆａｍｉｌｙタンパク質と相互作用するタンパク質をコードする遺伝子（変異遺伝子）は、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することもできる。例えば、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡを利用し、これらＤＮＡに変異を導入することにより変異ＤＮＡを取得することができる。具体的には、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００２６】
上述の通り、配列表の配列番号１に記載したラットＳＫＡＰ５５遺伝子の塩基配列において、種々の人為的処理、例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断片の変異・欠失・連結等により、部分的にＤＮＡ配列が変化したものであっても、これらＤＮＡ変異体が、Ｓｒｃ　　ｋｉｎａｓｅ　ｆａｍｉｌｙタンパク質と相互作用するタンパク質をコードするＤＮＡであれば、本発明の範囲内のものである。
【００２７】
本明細書中上記した、配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、Ｓｒｃ　ｋｉｎａｓｅ　ｆａｍｉｌｙタンパク質と相互作用するタンパク質をコードする遺伝子は、上述した条件下で、一定のハイブリダイゼーション条件下でコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを行うことにより得ることができる。
【００２８】
（３）ＳＫＡＰ５５タンパク質とＳｒｃ　ｋｉｎａｓｅ　ｆａｍｉｌｙタンパク質との相互作用を阻害する物質のスクリーニング
ＳＫＡＰ５５タンパク質とＳｒｃ　ｋｉｎａｓｅ　ｆａｍｉｌｙタンパク質との相互作用を阻害する物質のスクリーニングは、被験物質の存在下において免疫沈降、ウエスタンブロットなどタンパク質複合体を検出するために通常使用される手法を用いて行うことができる。例えば、インビトロ又はインビボにおいて、Ｓｒｃ　ｋｉｎａｓｅ　ｆａｍｉｌｙタンパク質とＳＫＡＰ５５タンパク質とを一緒に接触させて相互作用させ、これらの何れかを認識する抗体を結合させたｐｒｏｔｅｉｎ−Ｇ　ａｇａｒｏｓｅなどの担体を用いて免疫沈降を行う。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ウエスタンブロッティングを行うことにより蛋白質の相互作用を確認することができる。
【００２９】
被験物質の非存在下における相互作用と比較し、被験物質の存在下において相互作用が低下した場合、当該被験物質をＳｒｃ　　ｋｉｎａｓｅ　　ｆａｍｉｌｙタンパク質及びＳＫＡＰ５５タンパク質の相互作用を阻害する物質の候補物質として選択することができる。本スクリーニングは、インビトロ又はインビボの何れでも行うことができる。
【００３０】
スクリーニングに供される被験物質の種類は特に限定されず、任意の物質を使用することができる。被験物質は、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、あるいは化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよい。被験物質は、好ましくは低分子化合物であり、低分子化合物の化合物ライブラリーが好ましい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
【００３１】
このようなＳｒｃ　ｋｉｎａｓｅ　ｆａｍｉｌｙタンパク質及びＳＫＡＰ５５タンパク質の相互作用を阻害する物質は、肥満細胞における情報伝達が関与する疾患、例えば、アレルギー疾患などの治療または予防剤等の医薬の候補物質として有用である。
【００３２】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００３３】
実施例１　ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を用いた肥満細胞特異的新規遺伝子の同定
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞（Ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）より購入可能）５　ｘ　１０５個をＰＢＳで洗浄した後、ＴＲＩＺＯＬ　（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）　１　ｍＬで可溶化した。クロロホルムを０．２　ｍＬ加えて軽く振倒した後、１０，０００　ｘ　ｇで１０分間遠心分離し、水相を分取した。
イソプロパノールを０．５　ｍＬ加えてＲＮＡを析出させた後、１０，０００　ｘ　ｇで１０分間遠心分離を行った。上清を除去した後、沈殿７５　％エタノールで洗浄してｔｏｔａｌ　ＲＮＡを得、適当量のＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ　（Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，　Ｏｓａｋａ，　Ｊａｐａｎ）
に溶解した。ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　２　μｇにＡｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｇｒａｄｅ　Ｄｎａｓｅ　Ｉ　（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ，　Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を１　Ｕ添加し、２５℃で１５分間インキュベートした。最終濃度１　ｍＭとなるようにＥＤＴＡを添加し、７０℃で１５分間インキュベートした。
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍを用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。ｃＤＮＡ　０．１　μｇをテンプレートとし、ＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ　（ＴａＫａＲａ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，　Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）にてＰＣＲ反応を行った。
プライマーの配列は、ＳＫＡＰ５５検出用として
ｆｏｒｗａｒｄ：　５’−ｇＣＴｇｇＡＴＣＣＣＡＴｇＣＡｇｇＣＴｇＴＣｇＣＣＣＴＣＣＣｇｇＡｇｇＡｇＡＴ−３’（配列番号３）
ｒｅｖｅｒｓｅ：　５’−ＣＣＣｇＡＡＴＴＣＴＣＡＴＣＴＴＣＣＴＴＣＣＡＴＴＴＣＡＡＡｇｇＣｇｇＴ−３’（配列番号４）
を用い、最終濃度０．５μＭで行った。反応液中について１．５　％アガロースゲルで電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（５０μｇ／ｍＬ）で染色した。結果を図１に示した。
さらにこのｃＤＮＡ断片をｐＣＭＶ−ｔａｇ２　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，　ＣＡ）の　ＢａｍＨＩと　ＸｈｏＩの制限サイトに、Ｆｌａｇ　ｅｐｉｔｏｐｅを有する融合蛋白質が翻訳されるフレームでサブクローニングし、ｐＣＭＶ−ｔａｇ２　／ＳＫＡＰ５５を得た。その後、シークエンスによりＯｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅの塩基配列を決定した（配列番号１）。
アミノ酸配列を既に報告されているヒトＳＫＡＰ５５のアミノ酸配列と比較したところ、アミノ酸配列で７９．６％の相同性を有しており、ヒトＳＫＡＰ５５と同じくＰＨドメイン、ＳＨ３ドメインの存在を確認した。
【００３４】
実施例２
アフリカミドリザル腎（ＳＶ４０形質転換）細胞ＣＯＳ−７（理研バンク）を１０％　（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１００　ｕｎｉｔｓ／ｍｌ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、　１００　μｇ／ｍｌ　ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ　を含むＤＭＥＭ培地を用い、５％ＣＯ２、３７℃条件下、１０ｃｍシャーレ（１×１０６ｃｅｌｌｓ）で一晩培養し、プラスミド：　ｐＭＥ／Ｌｙｎ　（０．２μｇ）　及びｐＣＭＶ−ｔａｇ２　／ＳＫＡＰ５５（０．５μｇ）をＥｆｆｅｃｔｅｎｅ　ｒｅａｇｅｎｔにて導入した。導入２日後に回収した　ＣＯＳ−７（１×１０８ｃｅｌｌｓ）ｌｙｓａｔｅを過剰量のＧＳＴ結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ｂｅａｄｓ（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ，　ＣＡ）を添加し遠心し、遠心上清Ａを得た。
一方、Ｔａｋｅｍｏｔｏらの方法（Ｉｎｔ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｎｏｖ　；８（１１）：１６９９−７０５（１９９６））によりｐＧＥＸ−４Ｔ／ＧＳＴ−ＬｙｎＳＨ２、　ＧＳＴ−ＦｙｎＳＨ２及びＧＳＴ−ＬｃｋＳＨ２からＬｙｎ、Ｆｙｎ及びＬｃｋのＳＨ２ドメインとＧＳＴを融合させたタンパクを精製した。
ＬｃｋＳＨ２（配列番号５）、　ＦｙｎＳＨ２（配列番号６）　ＬｙｎＳＨ２（配列番号７）
遠心上清Ａを、ＧＳＴ−ＬｙｎＳＨ２、ＧＳＴ−Ｆｙｎ　ＳＨ２またはＧＳＴ−ＬｃｋＳＨ２が結合したｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｈｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，　Ｕｐｐｓａｌａ，　Ｓｗｅｄｅｎ）と４℃　ｏｖｅｒｎｉｇｈｔインキュベートした。
ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ｂｅａｄｓ　に１０倍量の０．５％　Ｎｏｎｉｄｅｎｔ　Ｐ−４０　ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ　（１％　Ｎｏｎｉｄｅｎｔ　Ｐ−４０，　１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ，　２　ｍＭ　ＥＤＴＡ，　５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ　８．０）　１０ｍＭ　ＮａＦ，　２　ｍＭ　Ｎａ３ＶＯ４，　１ｍＭ　ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌ　ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１０μｇ／ｍｌ　ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）　２０　ｍＬを添加し軽く振盪した後、５，０００　ｘ　ｇで２分間遠心分離することによりビーズを洗浄した。さらに３回洗浄を繰り返した後、クエン酸緩衝液（ｐＨ：４．０）を　１００　μＬ添加し溶出した。
各溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥのサンプルとした。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、セミドライブロッティングシステム（Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ　Ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｅｒ）を用い、２　ｍＡ／ｃｍ２で９０分間通電することにより、蛋白質をＰＶＤＦメンブランに転写した。メンブランをＢｌｏｃｋ　Ａｃｅ（Ｄａｉｎｉｈｏｎｓｅｉｙａｋｕ，　Ｏｓａｋａ，　Ｊａｐａｎ）に浸し、４℃で一晩ブロッキングを行った。ＴＴＢＳ　（２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ８．０），　３００　ｍＭＮａＣｌ，０．０５　％　Ｔｗｅｅｎ　２０）で５回洗浄した後、１０　％　Ｂｌｏｃｋ　Ａｃｅを含むＴＴＢＳで希釈した１次抗体に浸し、室温にて２時間振倒した。ＴＴＢＳで５回洗浄した後、１０　％　Ｂｌｏｃｋ　Ａｃｅを含むＴＴＢＳで希釈したｈｏｒｓｅ　ｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ結合２次抗体に浸し、室温にて１時間振倒した。ＴＴＢＳで５回洗浄した後、ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　（ＥＣＬ）　ｓｙｓｔｅｍ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　ＵＫ　Ｌｉｍｉｔｅｄ，　Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，　Ｅｎｇｌａｎｄ）　で発光させ、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ　ＥＣＬ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　ＵＫ　ｌｉｍｉｔｅｄ，　Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，　Ｅｎｇｌａｎｄ）に感光させた。
【００３５】
その結果、ＧＳＴ−　Ｌｙｎ−ＳＨ２、ＧＳＴ−　Ｆｙｎ−ＳＨ２及びＧＳＴ−　Ｌｃｋ−ＳＨ２いずれにおいてもＳＫＡＰ５５が沈降されていた（図２）。
なお、抗ＦｌａｇはＵｐｓｔａｔｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（Ｌａｋｅ　Ｐｌａｃｉｄ，　ＮＹ）から、抗ＧＳＴ抗体はＳａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ，　ＣＡ）から入手し、ｐＭＥ／Ｌｙｎは西住先生（東京大学医科学研究所制癌研究部）より供与頂いた。
【００３６】
【発明の効果】
本発明により、新規なラットＳＫＡＰ５５遺伝子および当該遺伝子がコードするタンパク質並びに当該タンパク質とＳｒｃ　ｋｉｎａｓｅ　ｆａｍｉｌｙタンパク質との相互作用を解析するスクリーニング系を提供することが可能になった。このような物質は、医薬等として有用である。
【００３７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、末梢血から誘導培養したラット肥満細胞におけるＳＫＡＰ５５の遺伝子発現を示す。ＰＣＲ試料について１．５％アガロースゲルで電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色した。
【図２】
図２は、ＣＯＳ−７細胞にｐＭＥ／Ｌｙｎ（Ｌｙｎ）、ｐＣＭＶ−ｔａｇ２　／ＳＫＡＰ５５（ＦＬＡＧ−ＳＫＡＰ５５）をトランスフェクトし、そのｔｏｔａｌ　ｃｅｌｌ　ｌｙｓａｔｅにＧＳＴ又はＧＳＴ−ＬｙｎＳＨ２を結合させたｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ｂｅａｄｓを添加し、ｐｕｌｌ　ｄｏｗｎを行った結果を示す。
【図１】
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【図２】
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