(57)【要約】【課題】免疫応答、特に抗腫瘍免疫応答を誘導しうる樹状細胞（ＤＣ）や、該ＤＣをヒトを含む動物に投与する免疫応答の誘導方法や、該免疫応答の誘導方法に用いられる免疫応答の誘導剤や免疫応答誘導用キットを提供すること。【解決手段】アポトーシスが誘導された腫瘍細胞（ＡＴＣ）を、トリニトロフェニルを用いてハプテン化し、該ハプテン化したＡＴＣに抗ハプテンＩｇＧ抗体を複合させ、得られるＡＴＣ−ハプテン−抗ハプテンＩｇＧ抗体複合体（ＡＴＣ−ＩＣ）をＤＣと共培養し、ＡＴＣ−ＩＣはＤＣ上に発現しているＦｃγＲを介してＤＣに効率よく取り込まれ、ＤＣの成熟を誘導する。このＡＴＣ−ＩＣを取り込んだＤＣでマウスを免疫すると、効果的にＣＴＬが活性化され、強い抗腫瘍免疫応答が惹起される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞をハプテン化し、該ハプテン化した細胞に抗ハプテン抗体を複合させ、得られる細胞−ハプテン−抗ハプテン抗体複合体を樹状細胞上に発現しているＦｃγレセプターを介して樹状細胞に取り込ませ、細胞−ハプテン−抗ハプテン抗体複合体を取り込んだ樹状細胞を投与することを特徴とする免疫応答の誘導方法。
【請求項２】
細胞が、アポトーシス細胞であることを特徴とする請求項１記載の免疫応答の誘導方法。
【請求項３】
アポトーシス細胞が、Ｘ線照射により細胞死が誘導されたアポトーシス細胞であることを特徴とする請求項２記載の免疫応答の誘導方法。
【請求項４】
細胞が、腫瘍細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の免疫応答の誘導方法。
【請求項５】
腫瘍細胞が、悪性黒色腫、胃癌、悪性脳腫瘍、肺癌、結腸癌、乳癌、腎臓癌又は前立腺癌に由来する細胞であることを特徴とする請求項４記載の免疫応答の誘導方法。
【請求項６】
ハプテンが、トリニトロフェニル又はジニトロフェニルであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の免疫応答の誘導方法。
【請求項７】
ハプテン化した細胞に抗ハプテン抗体を複合させて得られる細胞−ハプテン−抗ハプテン抗体複合体が、Ｆｃγレセプターを介して取り込まれていることを特徴とする免疫応答を誘導しうる樹状細胞。
【請求項８】
細胞が、アポトーシス細胞であることを特徴とする請求項７記載の免疫応答を誘導しうる樹状細胞。
【請求項９】
アポトーシス細胞が、Ｘ線照射により細胞死が誘導されたアポトーシス細胞であることを特徴とする請求項８記載の免疫応答を誘導しうる樹状細胞。
【請求項１０】
細胞が、腫瘍細胞であることを特徴とする請求項７〜９のいずれか記載の免疫応答を誘導しうる樹状細胞。
【請求項１１】
腫瘍細胞が、悪性黒色腫、胃癌、悪性脳腫瘍、肺癌、結腸癌、乳癌、腎臓癌又は前立腺癌に由来する細胞であることを特徴とする請求項１０記載の免疫応答を誘導しうる樹状細胞。
【請求項１２】
ハプテンが、トリニトロフェニル又はジニトロフェニルであることを特徴とする請求項７〜１１のいずれか記載の免疫応答を誘導しうる樹状細胞。
【請求項１３】
請求項７〜１２のいずれか記載の免疫応答を誘導しうる樹状細胞を含有することを特徴とする免疫応答の誘導剤。
【請求項１４】
さらに免疫アジュバントを含むことを特徴とする請求項１３記載の免疫応答の誘導剤。
【請求項１５】
細胞とハプテンと抗ハプテン抗体とを備え、ハプテン化した細胞に抗ハプテン抗体を複合させた細胞−ハプテン−抗ハプテン抗体複合体を形成することができ、該形成した細胞−ハプテン−抗ハプテン抗体複合体を樹状細胞上に発現しているＦｃγレセプターを介して樹状細胞に取り込ませることができることを特徴とする樹状細胞による免疫応答誘導用キット。
【請求項１６】
細胞が、アポトーシス細胞であることを特徴とする請求項１５記載の樹状細胞による免疫応答誘導用キット。
【請求項１７】
アポトーシス細胞が、Ｘ線照射により細胞死が誘導されたアポトーシス細胞であることを特徴とする請求項１６記載の樹状細胞による免疫応答誘導用キット。
【請求項１８】
細胞が、腫瘍細胞であることを特徴とする請求項１５〜１７のいずれか記載の樹状細胞による免疫応答誘導用キット。
【請求項１９】
腫瘍細胞が、悪性黒色腫、胃癌、悪性脳腫瘍、肺癌、結腸癌、乳癌、腎臓癌又は前立腺癌に由来する細胞であることを特徴とする請求項１８記載の樹状細胞による免疫応答誘導用キット。
【請求項２０】
ハプテンが、トリニトロフェニル又はジニトロフェニルであることを特徴とする請求項１５〜１９のいずれか記載の樹状細胞による免疫応答誘導用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞−ハプテン−抗ハプテン抗体複合体を、Ｆｃγレセプターを介して取り込んだ免疫応答、特に抗腫瘍免疫応答を誘導しうる樹状細胞や該樹状細胞を、ヒトを含む動物に投与する免疫応答の誘導方法や、該免疫応答の誘導方法に用いられる免疫応答の誘導剤や免疫応答誘導用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫グロブリン（Ｉｇ）は、魚類から哺乳類に至る全ての脊椎動物の体液中に存在し、リンパ系細胞によって産生され、物理化学的性質や免疫学的性質によって５つのクラス、すなわちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥに分類され、分子の基本構造は各クラス共通で、分子量５〜７万のＨ鎖と分子量２．３万のＬ鎖とから構成され、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥに対応してγ、μ、α、δ、ε鎖と呼ばれる構造のＨ鎖を有することが知られている。このＩｇ分子をパパインで分解して得られるヒンジ部からＣ末端までのＨ鎖２本がＳ−Ｓ結合で結ばれているものはＦｃフラグメントと呼ばれ、このＦｃフラグメントが結合する細胞表面上の受容体はＦｃレセプター（以下「ＦｃＲ」という）と呼ばれている。これらＦｃＲは、細胞内のシグナル伝達を導出して、リガンドである抗原−抗体複合体によって、クロスリンクすることで数多くのエフェクターの応答を誘発する造血細胞表面分子のファミリーを構成することが知られている。また、ＩｇのＦｃ領域に対して親和性をもち細胞表面上に存在しているＦｃＲは、抗体依存性細胞傷害反応、過敏性反応などの免疫応答に関与することが知られている。
【０００３】
ＦｃＲには、体液中のＩｇＧのＦｃフラグメントに特異的に結合するＦｃγレセプター（以下「ＦｃγＲ」という）、ＩｇＥのＦｃフラグメントに特異的に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃフラグメントに特異的に結合するＦｃαＲ等の種類が知られている。これら免疫担当細胞のＦｃレセプターは細胞機能と重要な関係があり、大部分のリンパ球、Ｔ細胞リンパ球の一部、単核球、好中球、好塩基球、マクロファージ、肥満細胞（マスト細胞）及び血小板等に多く存在していることが知られている。また、これらのレセプターは抗体に依存したリンパ球機能に役割を果たすが、その固有の機能に関しては不明な点が多い。ＦｃγＲは遺伝子構造の類似性に基づいてタイプＩ（ＣＤ６４抗原）、タイプＩＩ（ＣＤ３２抗原）、タイプＩＩＩ（ＣＤ１６抗原）の３種に大きく分類される。ＦｃγＲＩは、分子量７２ｋＤａの糖タンパク質であり、ＩｇＧ単量体と高い親和性で結合し、単球とマクロファージに発現している。ＦｃγＲＩＩは、他のＦｃＲとは異なりＩｇＧ単量体に対して低親和性であり、免疫複合体となった多価ＩｇＧと結合し、単球、マクロファージ、多形核白血球（ＰＭＮ）、マスト細胞、血小板、いくつかのＴ細胞リンパ球及びいくつかのＢ細胞リンパ球を含む造血幹細胞に広く発現している。ＦｃγＲＩＩＩは、低親和性のＦｃγＲで、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、ＰＭＮ及びマスト細胞に発現することが、それぞれ知られている。また、ＦｃγＲＩＩには遺伝子配列が異なるＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃγＲＩＩＣの３種類の受容体が存在しており、いずれの染色体も１ｑ２３に位置していることも知られている。
【０００４】
上記免疫細胞群に発現するＦｃＲは、抗体依存性に様々な免疫・炎症反応を開始する分子である。ＦｃＲは、複数の細胞種に重複して発現するため、個々のＦｃＲの役割は、これらＦｃＲ分子群に対するノックアウトマウス（例えば、非特許文献１〜７参照。）の作出により初めて明らかとなり、いくつかのＦｃＲの生理的機能の理解が進んでいる。また本発明者らは、ＩｇＥの高親和性レセプターであるＦｃεＲＩに会合しているホモダイマー分子として単離同定されたＦｃＲγ鎖に対するノックアウトマウスを作製している（例えば、非特許文献２参照。）。そして、このＦｃＲγ鎖ノックアウトマウスは、少なくともＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃεＲＩの３種のＦｃＲの発現及び機能を失っていることも知られている。
【０００５】
他方、腫瘍免疫においては、Ｔ細胞が重要な仲介を果たすため、腫瘍に対するＴ細胞の強い反応を効率的に誘導することが、癌免疫療法の最終目標とされている。最近、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の同定、及び特に樹状細胞（ＤＣ）等の抗原提示細胞（ＡＰＣ）が、免疫応答の開始に際してきわめて重要な役割を果たし、腫瘍ワクチン接種に対する免疫療法上の新しい戦略として注目を集めている（例えば、非特許文献８〜１１参照。）。例えば、ＤＣを標的とする場合、メラノーマ細胞上で発現するメラノーマ抗原１（ＭＡＧＥ１）及びＴ細胞１が認識するメラノーマ抗原（ＭＡＲＴ１）などのＴＡＡが、メラノーマ特異的細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導するために使用されており、ＤＣワクチン接種の予備的研究において、特異的な抗腫瘍免疫を誘導することが知られている（例えば、非特許文献１２〜１４参照。）。
【０００６】
このように、ＴＡＡはＤＣとともに癌免疫療法の有望な手段と考えられており、近年では、ＤＣにＣＴＬに対して抗原エピトープを提示させるためのいくつかのアプローチが行われている。こうしたＤＣをパルスするための抗原の供給源としては、ＴＡＡ由来のクラスＩ拘束的合成ペプチド（例えば、非特許文献１２、１３参照。）、ウィルスベクター（例えば、非特許文献１５参照。）、腫瘍ＲＮＡ（例えば、非特許文献１６参照。）、アポトーシス腫瘍細胞（ＡＴＣ）のような全腫瘍抗原性内容物（ｗｈｏｌｅ　ｔｕｍｏｒ　ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ）等が知られている（例えば、非特許文献１７〜２０参照。）。これらの供給源の中でも、ＡＴＣをＤＣに取り込ませる方法が、あらかじめ抗原ペプチドの配列決定や患者のＨＬＡ分析をする必要がないことから好ましく、加えて、免疫を免れた変異体が発生する可能性や、ＣＤ４ヘルパーＴ細胞関連エピトープの欠失など、単独のＴＡＡを使用した場合に比べて有利であると考えられている。
【０００７】
また、ＡＴＣを取り込んだＤＣが動物モデルの免疫に使用され、予防的かつ防御的な抗腫瘍免疫をインビボで誘導することが知られている（例えば、非特許文献２１〜２３参照。）。しかし、最近は、ＡＴＣによる抗腫瘍免疫の活性化が少々不充分であり、おそらくこれはＤＣの成熟化を誘導できないことが原因であろうと指摘する報告が数多くなされている（例えば、非特許文献２４、２５参照。）。さらに、ＡＴＣを取り込んだＤＣが、抗腫瘍免疫を誘導するために原炎症性サイトカインなどの外部成熟シグナルをさらに必要とすることを示唆する報告（例えば、非特許文献文献２６、２７参照。）も見受けられる。
【０００８】
ＤＣ上のＦｃγＲを介して取り込まれたＩｇＧ−複合抗原（免疫複合体、ＩＣ）は、ＭＨＣクラスＩ経路を通じて効率的にＣＴＬに提示されることが報告されている（例えば、非特許文献２８〜３２参照。）。また、ＦｃγＲを介して取り込みを行ったＤＣによる抗原提示は、可溶性抗原の食作用の１００倍に増加する可能性があると示唆されており、また、ＩＣ自体がＤＣの成熟を効率的に誘導することも示されている（例えば、非特許文献２８参照。）。可溶性抗原と同様に、リポソーム内の抗原についても、ＤＣ上のＦｃγＲを標的とする場合には、ＭＨＣクラスＩ拘束的抗原提示能が増大することも知られている（例えば、非特許文献３３参照。）。これらの結果から、ＤＣ上のＦｃγＲを腫瘍由来抗原の標的とすると、抗腫瘍免疫はインビボで増大する場合があるとされている。
【０００９】
また、生理的な条件下で細胞自らが積極的に惹起するようにプログラムされた細胞死、すなわちアポトーシスは、免疫系において老化した細胞や病態細胞など、生体にとって好ましくない細胞を排除するために生体に備わった機構であることが知られている。このアポトーシスは細胞サイズの急速な縮小と細胞核の変化を特徴とし、アポトーシス細胞は通常アポトーシス小体となり、最終的にはマクロファージ等の食細胞により貪食される。すなわち、まず細胞が縮小して隣接細胞から離れ、核のＤＮＡとタンパク質との複合体であるクロマチンが核膜周辺に凝縮し、核の濃縮が生じると共に細胞表面の微絨毛が消失して平滑化し、大小の突起が出現し、やがてそれらがくびれてちぎれ、膜に包まれた大小の球状のアポトーシス小体に断片化し、これらの小体がマクロファージや隣接する食細胞により貪食除去されることはよく知られている。その他、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）等のハプテンで修飾された癌細胞から得られる腫瘍細胞抽出物でＴ細胞リンパ球を刺激することも知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【００１０】
【特許文献１】
特表平１１−５０７６３３号公報
【非特許文献１】
Ｃｅｌｌ　７５，　９６９−９７６，　１９９３
【非特許文献２】
Ｃｅｌｌ　７６，　５１９−５２９，　１９９４
【非特許文献３】
Ｎａｔｕｒｅ　３７９，　３４６−３４９，　１９９６
【非特許文献４】
Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　５，　１８１−１８８，　１９９６
【非特許文献５】
Ｎａｔｕｒｅ　３６９，　７５３−７５６，　１９９４
【非特許文献６】
Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１５２，３３７８−３３９０，　１９９４
【非特許文献７】
Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９１，　６８３５−６８３９，　１９９４
【非特許文献８】
Ｎａｔ．　Ｍｅｄ．　７，　７６１，　２００１
【非特許文献９】
Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１９，　６６７３−６６７９，　２００１
【非特許文献１０】
Ｎａｔｕｒｅ　３９２，　２４５，　１９９８
【非特許文献１１】
Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１８，　７６７，　２０００
【非特許文献１２】
Ｎａｔ．　Ｍｅｄ．　４，　３２８，　１９９８
【非特許文献１３】
Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　６１，　６４５１，　２００１
【非特許文献１４】
Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１８，　２４５，　２０００
【非特許文献１５】
Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　５７，　２８６５，　１９９７
【非特許文献１６】
Ｎａｔ．　Ｍｅｄ．　６，　１０１１，　２０００
【非特許文献１７】
Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．　１９２，　１５３５，　２０００
【非特許文献１８】
Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　６０，　６４４１，　２０００
【非特許文献１９】
Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１６１，　４４６７，　１９９８
【非特許文献２０】
Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　６０，　３５４２，　２０００
【非特許文献２１】
Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　５９，　３３２９，　１９９９
【非特許文献２２】
Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１６３，　１３０，　１９９９
【非特許文献２３】
Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　６１，　２３８６，　２００１
【非特許文献２４】
Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．　１９１，　４２３，　２０００
【非特許文献２５】
Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．　１９１，　４１１，　２０００
【非特許文献２６】
Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　６０，　４４４６，　２０００
【非特許文献２７】
Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　１０８，　９５７，　２００１
【非特許文献２８】
Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．　１８９，　３７１，　１９９９
【非特許文献２９】
Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．　１９５，　Ｆ１，　２００２
【非特許文献３０】
Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．　１９５，　１２５，　２００２
【非特許文献３１】
Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　６１，　１９７，　２００１
【非特許文献３２】
Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１９，　２７５，　２００１
【非特許文献３３】
Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　３０，　８４８，　２０００
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、免疫応答、特に抗腫瘍免疫応答を誘導しうるＤＣや、該ＤＣを、ヒトを含む動物に投与する免疫応答の誘導方法や、該免疫応答の誘導方法に用いられる免疫応答の誘導剤や免疫応答誘導用キットを提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、アポトーシスが誘導された腫瘍細胞（ＡＴＣ）をハプテン化し、該ハプテン化したＡＴＣに抗ハプテン抗体を複合させ、得られるＡＴＣ−ハプテン−抗ハプテン抗体複合体（ＡＴＣ−ＩＣ）をＤＣと共培養したところ、ＡＴＣ−ＩＣはＤＣ上に発現しているＦｃγＲを介してＤＣに効率よく取り込まれ、ＤＣの成熟を誘導することや、ＡＴＣ−ＩＣを取り込んだＤＣでマウスを免疫したところ、効果的にＣＴＬが活性化され、強い抗腫瘍免疫応答が惹起されることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち本発明は、細胞をハプテン化し、該ハプテン化した細胞に抗ハプテン抗体を複合させ、得られる細胞−ハプテン−抗ハプテン抗体複合体を樹状細胞上に発現しているＦｃγレセプターを介して樹状細胞に取り込ませ、細胞−ハプテン−抗ハプテン抗体複合体を取り込んだ樹状細胞を投与することを特徴とする免疫応答の誘導方法（請求項１）や、細胞が、アポトーシス細胞であることを特徴とする請求項１記載の免疫応答の誘導方法（請求項２）や、アポトーシス細胞が、Ｘ線照射により細胞死が誘導されたアポトーシス細胞であることを特徴とする請求項２記載の免疫応答の誘導方法（請求項３）や、細胞が、腫瘍細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の免疫応答の誘導方法（請求項４）や、腫瘍細胞が、悪性黒色腫、胃癌、悪性脳腫瘍、肺癌、結腸癌、乳癌、腎臓癌又は前立腺癌に由来する細胞であることを特徴とする請求項４記載の免疫応答の誘導方法（請求項５）や、ハプテンが、トリニトロフェニル又はジニトロフェニルであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の免疫応答の誘導方法（請求項６）に関する。
【００１４】
また本発明は、ハプテン化した細胞に抗ハプテン抗体を複合させて得られる細胞−ハプテン−抗ハプテン抗体複合体が、Ｆｃγレセプターを介して取り込まれていることを特徴とする免疫応答を誘導しうる樹状細胞（請求項７）や、細胞が、アポトーシス細胞であることを特徴とする請求項７記載の免疫応答を誘導しうる樹状細胞（請求項８）や、アポトーシス細胞が、Ｘ線照射により細胞死が誘導されたアポトーシス細胞であることを特徴とする請求項８記載の免疫応答を誘導しうる樹状細胞（請求項９）や、細胞が、腫瘍細胞であることを特徴とする請求項７〜９のいずれか記載の免疫応答を誘導しうる樹状細胞（請求項１０）や、腫瘍細胞が、悪性黒色腫、胃癌、悪性脳腫瘍、肺癌、結腸癌、乳癌、腎臓癌又は前立腺癌に由来する細胞であることを特徴とする請求項１０記載の免疫応答を誘導しうる樹状細胞（請求項１１）や、ハプテンが、トリニトロフェニル又はジニトロフェニルであることを特徴とする請求項７〜１１のいずれか記載の免疫応答を誘導しうる樹状細胞（請求項１２）に関する。
【００１５】
さらに本発明は、請求項７〜１２のいずれか記載の免疫応答を誘導しうる樹状細胞を含有することを特徴とする免疫応答の誘導剤（請求項１３）や、さらに免疫アジュバントを含むことを特徴とする請求項１３記載の免疫応答の誘導剤（請求項１４）や、細胞とハプテンと抗ハプテン抗体とを備え、ハプテン化した細胞に抗ハプテン抗体を複合させた細胞−ハプテン−抗ハプテン抗体複合体を形成することができ、該形成した細胞−ハプテン−抗ハプテン抗体複合体を樹状細胞上に発現しているＦｃγレセプターを介して樹状細胞に取り込ませることができることを特徴とする樹状細胞による免疫応答誘導用キット（請求項１５）や、細胞が、アポトーシス細胞であることを特徴とする請求項１５記載の樹状細胞による免疫応答誘導用キット（請求項１６）や、アポトーシス細胞が、Ｘ線照射により細胞死が誘導されたアポトーシス細胞であることを特徴とする請求項１６記載の樹状細胞による免疫応答誘導用キット（請求項１７）や、細胞が、腫瘍細胞であることを特徴とする請求項１５〜１７のいずれか記載の樹状細胞による免疫応答誘導用キット（請求項１８）や、腫瘍細胞が、悪性黒色腫、胃癌、悪性脳腫瘍、肺癌、結腸癌、乳癌、腎臓癌又は前立腺癌に由来する細胞であることを特徴とする請求項１８記載の樹状細胞による免疫応答誘導用キット（請求項１９）や、ハプテンが、トリニトロフェニル又はジニトロフェニルであることを特徴とする請求項１５〜１９のいずれか記載の樹状細胞による免疫応答誘導用キット（請求項２０）に関する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明の免疫応答の誘導方法としては、細胞をハプテン化し、該ハプテン化した細胞に抗ハプテン抗体を複合させ、得られる細胞−ハプテン−抗ハプテン抗体複合体をＤＣ上に発現しているＦｃγＲを介してＤＣに取り込ませ、細胞−ハプテン−抗ハプテン抗体複合体を取り込んだＤＣをマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ヒツジ、サル、ヒト等の動物に投与する方法であれば特に制限されるものではなく、本発明のＤＣとしては、ハプテン化した細胞に抗ハプテン抗体を複合させて得られる細胞−ハプテン−抗ハプテン抗体複合体が、ＦｃγＲを介して取り込まれている免疫応答を誘導しうるＤＣであれば特に制限されるものではなく、本発明の免疫応答の誘導剤としては、ハプテン化した細胞に抗ハプテン抗体を複合させて得られる細胞−ハプテン−抗ハプテン抗体複合体が、ＦｃγＲを介して取り込まれている免疫応答を誘導しうるＤＣを含有するものであれば特に制限されるものではなく、本発明のＤＣによる免疫応答誘導用キットとしては、細胞とハプテンと抗ハプテン抗体とを備え、ハプテン化した細胞に抗ハプテン抗体を複合させた細胞−ハプテン−抗ハプテン抗体複合体を形成することができ、該形成した細胞−ハプテン−抗ハプテン抗体複合体をＤＣ上に発現しているＦｃγレセプターを介してＤＣに取り込ませることができるものであれば特に制限されるものではなく、上記免疫応答には、抗体依存性細胞傷害反応、過敏性反応などを例示することができる。
【００１７】
上記ハプテン化する細胞としては、免疫応答を誘導しうるＤＣを得ることができる細胞であれば特に制限されるものではなく、動物細胞、植物細胞、微生物細胞等その種類は特に制限されないが、悪性黒色腫、胃癌、悪性脳腫瘍、肺癌、結腸癌、乳癌、腎臓癌、前立腺癌等の腫瘍細胞が、免疫応答を誘導しうるＤＣを効率的に得ることができる点で好ましく、また、アポトーシスが誘導された細胞（アポトーシス細胞）、ネクローシスが誘導されれた細胞、正常細胞、ウイルス感染細胞等細胞の形態も特に制限されないが、免疫応答を誘導しうるＤＣを効率的に得ることができる点でアポトーシス細胞が好ましく、中でも、ＡＴＣが強い免疫応答を誘導しうるＤＣを効率的に得ることができる点で特に好ましい。
【００１８】
腫瘍細胞等の細胞に、アポトーシスを誘導する方法としては、公知のアポトーシス誘導方法であればどのような方法でもよく、Ｘ線、γ線、紫外線等の放射線を腫瘍細胞等に照射する方法や、ＴＮＦ−α、Ｆａｓリガンド、グルココルチコイド、レチノイン酸、ｂａｘ等のアポトーシス誘導剤を使用する方法を例示することができるが、細胞の種類・形態を問わず、簡便かつ効率的に細胞死を誘導することができる点でＸ線照射によりアポトーシス細胞を調製することが好ましい。
【００１９】
上記細胞をハプテン化するハプテンとしては、トリニトロフェニル（ＴＮＰ）、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）、Ｎ−ヨ−ドアセチル−Ｎ’−（５スルホニック１−ナフチル）エチレンジアミン等を例示することができる。また、細胞をハプテン化する方法としては、滅菌した緩衝液に懸濁したＴＮＰ、ＤＮＰ、ＴＮＢＳ等のハプテンを所定の細胞と１０〜６０分間反応させてから滅菌生理食塩水で洗浄することにより、細胞にＴＮＰ、ＤＮＰ、ＴＮＢＳ等のハプテンを結合させることができる。このようにハプテン化した細胞に抗ハプテン抗体を作用させると、細胞−ハプテン−抗ハプテン抗体複合体を得ることができる。抗ハプテン抗体、好ましくは抗ハプテンＩｇＧ抗体は、各種市販品や公知の方法で作製したものを用いることができる。
【００２０】
本発明に用いられるＤＣとしては、単球由来のＤＣ、ＣＤ３４陽性造血前駆細胞由来のＤＣ、末梢血単核球から比重遠心法により得られるＤＣを多く含む分画などを好適に例示することができるが、比較的簡便に大量のＤＣが得られるという理由から、単球由来のＤＣを有利に用いることができる。そして、これらＤＣと、前記細胞−ハプテン−抗ハプテン抗体複合体を、インビトロで共培養することにより、ＤＣ上に発現しているＦｃγＲを介して細胞−ハプテン−抗ハプテン抗体複合体を効率よくＤＣに取り込むことができる。また、この細胞−ハプテン−抗ハプテン抗体複合体を取り込んだＤＣは成熟化が増進しており、このＤＣを動物体内に投与すると、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩを介して、ＡＴＣ等の細胞由来の抗原を提示し、効率的にＣＴＬを活性化し、強い抗腫瘍免疫応答を惹起することができる。成熟ＤＣは、未成熟ＤＣに比べて、ＣＤ８６やＭＨＣクラスＩと行ったいわゆる副刺激といわれる分子を十分に発現しており、免疫応答の効率的な誘導の点でより好ましい。
【００２１】
本発明の免疫応答、特に抗腫瘍免疫応答を誘導しうるＤＣは、効率的にＣＴＬを活性化し、強い免疫応答を惹起することができることから、本発明の免疫応答の誘導方法、免疫応答の誘導剤、免疫応答誘導用キットに有利に用いることができ、本発明の免疫応答、特に抗腫瘍免疫応答の誘導方法は、養子免疫療法等に応用して癌の治療等において有用であり、本発明の免疫応答、特に抗腫瘍免疫応答の誘導剤は、好ましくは免疫アジュバントとして抗腫瘍治療剤用等のＣＴＬ活性に優れたＤＣワクチンとして有用であり、本発明の免疫応答、特に抗腫瘍免疫応答誘導用キットは、ＤＣワクチンを簡易に作製する上で有用である。例えば、ウイルスが持っている抗原をＤＣに負荷することで、ウイルスに対する免疫応答を誘導することができる。
【００２２】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
Ａ．材料と方法
（マウス）
すべての実験は６〜１０週齢の雄及び雌マウスを用いて行った。Ｆｃ受容体共通γサブユニット（ＦｃγＲ）（Ｃｅｌｌ　７６，　５１９，　１９９４）とＩＩＢ型ＦｃγＲ（ＦｃγＲＩＩＢ）（Ｎａｔｕｒｅ　３７９，　３４６，　１９９６）の二重欠損マウス（ＦｃγＲｎｕｌｌ）は、Ｊ．Ｖ．　Ｒａｖｅｔｃｈ博士（ニューヨーク州ニューヨーク、ロックフェラー大学）より提供された。環境が制御された特殊な無菌施設である東北大学加齢医学研究所の動物用施設（日本国、仙台）にて上記マウスを飼育した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、日本チャールス・リバー株式会社より入手した。
【００２３】
（抗体及びフローサイトメトリー分析）
マウス抗トリニトロフェノール（ＴＮＰ）ＩｇＧ１抗体を、文献（Ｃｅｌｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１４５，　２９９，　１９９２）記載のように、ＤＥＡＥ−セルロース（Ｍｅｒｃｋ社製）上でのイオン交換クロマトグラフィー及び蛋白質Ｇカラムを用いたアフィニティ分離により、ハイブリドーマの腹水から精製した。また、免疫染色のため、次のモノクローナル抗体を使用した。ＦＩＴＣ、ＰＥ、又はビオチンで標識した、抗ＣＤ１１ｃ（ＨＬ３）抗体、抗ＣＤ８６（ＧＬ１）抗体、抗Ｉ−Ａｂ（Ｍ５／１１４．１５．２）抗体は、ＢＤ　ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製である。トリカラー標識ストレプトアビジン（Ｃａｌｔａｇ社製）及びＣｙ３標識ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ社製）を、ビオチン抗体の染色に使用した。ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体は、Ｚｙｍｅｄ社より入手した。標準的な技法にしたがって細胞表面を染色し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ　ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ社製）を用いたＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（日本ベクトン・ディッキンソン社製）で、フローサイトメトリー分析を行った。
【００２４】
（アポトーシス細胞死の誘導及びＩｇＧによるオプソニング）
遺伝子改変によりＯＶＡ遺伝子を発現するようにしたマウスＥＬ４胸腺腫細胞株（Ｅ．Ｇ７細胞、ＡＴＣＣ）を使用して、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導した。細胞にＸ線（１００Ｇｙ）を照射した後、３７℃、５％のＣＯ２で、無血清培地にて２７時間インキュベーションした。細胞のアポトーシスを誘導した後、細胞表面にＴＮＰを結合させた。すなわち、１０ｍｌのＰＢＳ液にあらかじめ５０ｍｇのＮａＨＣＯ３を入れて中性にした溶液に、１０ｍｇのＴＮＰを混合した液を、上記アポトーシスを起こした細胞にまぶして１５分間反応させることによりハプテン化を行い、細胞表面にＴＮＰを結合させた。ＡＴＣ−ＩＣの調製のため、マウス抗ＴＮＰＩｇＧ１抗体（１μｇ／１０５個）を用いて、かかる細胞をさらにオプソナイズした。ＡＴＣのオプソニングは、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体でＡＴＣ−ＩＣを染色することにより確認した。アポトーシス検出キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、細胞死を確認した。
【００２５】
（骨髄由来ＤＣの作製及びＤＣによる取込み）
文献（Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．　１７６，　１６９３，　１９９２）記載の通りに、マウスから骨髄細胞を得た。赤血球とリンパ球を除去した後、２０ｎｇ／ｍｌのマウスリコンビナントＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏ　Ｔｅｃｈ社製）の存在下で、骨髄細胞を１×１０６個／ｍｌで培養した。培養４日目に、培地をＧＭ−ＣＳＦ含有培地に交換した。ＡＴＣ／ＡＴＣ−ＩＣを取り込ませるため、培養６日目の細胞をＡＴＣあるいはＡＴＣ−ＩＣのいずれかと５：１の比率で共培養した。共培養開始３時間後、細胞を回収し、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣをＭＡＣＳ　ｓｏｒｔｉｎｇ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）で精製し、さらに２４時間培養した。その後、フローサイトメトリー分析あるいは動物へのワクチン接種のためにＤＣを回収した。
【００２６】
（食作用及びＤＣの成熟）
ＡＴＣの取り込みのため、ＡＴＣ又はＡＴＣ−ＩＣをＰＫＨ２（Ｚｙｎａｘｉｓ社製）で緑に染色し、ＤＣと腫瘍細胞の比率を５：１として、ＤＣと共培養した。３時間後、細胞を回収し、抗ＣＤ１１ｃ−ビオチン／トリカラー抗体で染色した。ＤＣによるＡＴＣ／ＡＴＣ−ＩＣの取り込みは、ＰＫＨ２とトリカラーの両方に陽性を示した細胞として、フローサイトメトリー分析で確認した。同じ実験を、４℃で又はＦｃγＲｎｕｌｌＤＣ上で行った。また、ＡＴＣ又はＡＴＣ−ＩＣを取り込んだＤＣの成熟度を評価するため、ＡＴＣ／ＡＴＣ−ＩＣでＤＣを３時間パルスし、ＣＤ１１ｃ＋細胞をＭＡＣＳで選別した。さらに２４時間共培養した後、細胞をＣＤ８６及びＭＨＣクラスＩＩ（Ｉ−Ａｂ）で染色し、フローサイトメトリーで分析した。共焦点顕微鏡で分析するため、ＰＫＨ２標識ＡＴＣを取り込んだＤＣを、ＣＤ１１ｃ−ビオチン／Ｃｙ３で染色し、スライドに乗せた。共焦点レーザー顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社製）を用いて、取り込みを確認した。
【００２７】
（免疫組織化学的分析）
ＤＣ免疫後２０日目以降にマウスの凍結脾臓切片を調製し、ＦＩＴＣ標識ＧＬ７を用いて４℃で１８時間インキュベーションした。洗浄後、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）にスライドを乗せて調べた。
【００２８】
（細胞障害性アッセイ）
マウスを３匹ずつのグループに分け、ＡＴＣ又はＡＴＣ−ＩＣを取り込んだＤＣ（１×１０６／２００μｌのＰＢＳ／マウス）を尾静脈から注入した。ワクチン接種の１〜２週間後、マウスを処分し、Ｔ濃縮細胞をその脾臓から調製した。照射済（１００Ｇｙ）Ｅ．Ｇ７細胞とともに、エフェクター−スティミュレーターの比率を１０：１として、脾臓細胞をインビトロで５日間インキュベーションした。再刺激後、標的Ｅ．Ｇ７細胞を１００μｌＣｉ／ｍｌのＮａ２５１ＣｒＯ４で１時間標識し、刺激済脾臓細胞とともに３７℃で４時間インキュベーションした。オートウェルガンマシステム（Ａｌｏｋａ社製）を用いてＣＴＬ活性を測定した。
【００２９】
（インビボでの抗腫瘍防御作用）
マウスを１２匹ずつのグループに分け、ＡＴＣ又はＡＴＣ−ＩＣでパルスしたＤＣ（５×１０５／１００μｌのＰＢＳ／マウス）、若しくはＰＢＳのみを左後足に皮下注射し、１週間後に同様の免疫操作をもう一度行った。最後のワクチン接種から７日後、マウスの同じ部位に、１×１０５個のＥ．Ｇ７細胞を含む１００μｌのＰＢＳを皮下注射した。直径５ｍｍ未満の腫瘍を非腫瘍サイズ（ｔｕｍｏｒ−ｆｒｅｅ　ｓｉｚｅ）と決め、８０日以上に渡って記録した。
【００３０】
Ｂ．結果
（ＡＴＣ−ＩＣはＤＣにより効率的に取り込まれ、ＤＣの成熟を誘導する）
ＩｇＧとの複合体となったＡＴＣ（ＡＴＣ−ＩＣ）に対するＤＣの食作用の効率を測定した。ＡＴＣの供給源としての胸腺腫Ｅ．Ｇ７細胞にＸ線を１時間照射した後、無血清培地にて３７℃で２７時間インキュベーションした。アネキシンＶ結合及びプロピジウムアイオダイド染色によるフローサイトメトリーにより、約９０％の細胞にアポトーシスが誘導されたことを確認した（図１）。次いで、ＴＮＰを細胞表面に結合させてＥ．Ｇ７細胞をオプソナイズし、その後、抗ＴＮＰマウスＩｇＧ１抗体を添加した。アポトーシスを起こしたＥ．Ｇ７細胞のオプソニングを、フローサイトメトリーでＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体を検出することにより確認した（図２）。なお、抗ＴＮＰマウスＩｇＧ１抗体無添加の場合をコントロールとした。
【００３１】
次に、ＤＣがアポトーシス細胞の効率的な取り込みに関与しているとの報告（例えば、非特許文献２３参照。）があることから、オプソニングがＤＣによるアポトーシス細胞の取り込みを増大させられるかどうかを調べてみた。ＤＣとＡＴＣ又はＡＴＣ−ＩＣとを５：１の比率で、３７℃又は４℃のいずれかで３時間共培養した。取り込みを視覚化するため、フローサイトメトリー分析で食作用アッセイを行った。ＤＣとＡＴＣをそれぞれ別個にレッドＣＤ１１ｃ−ビオチン／トリカラー又はグリーンＰＫＨ２のいずれかで標識し、ＤＣ（レッド）によるＡＴＣ（グリーン）の取り込みを二重陽性細胞のパーセンテージで表示した（図３）。なお、ＤＣによるＡＴＣの取り込みは、右上の四分区間におけるダブルポジティブ細胞（ｄｏｕｂｌｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｌｓ）の割合として求めた。共培養の開始から３時間で、早くもＤＣが効率的にＡＴＣを取り込むことが確認された（３４％がダブルポジティブ）。さらに、共培養の開始３時間後には７５％のＤＣがＡＴＣ−ＩＣを取り込んでいるが、これは非オプソニング細胞を取り込む場合と比較して２倍以上高い数字であり、ＡＴＣよりもＡＴＣ−ＩＣをより効率的に取り込んでいることがわかる（図３、３７℃）。コントロールとして、取り込まれた細胞を表面結合細胞と区別するため、ＤＣの取り込みを阻害して４℃で共培養を行った（図３、４℃）。また、フローサイトメトリー分析で示された取り込みをさらに確認するため、共焦点顕微鏡による分析を行った（図４、参考写真１参照）。ＩｇＧ１アイソタイプの免疫複合体は、ＦｃγＲを介してＤＣに取り込まれていることがわかった。
【００３２】
次に、ＦｃγＲｎｕｌｌマウスのＤＣを用いて、ＤＣが効率的にＡＴＣ−ＩＣを取り込むかどうかをフローサイトメトリーで分析した。ＦｃγＲｎｕｌｌマウス由来のＤＣが取り込んだ細胞の数は、ＡＴＣとＡＴＣ−ＩＣの間で差異はなく（図５）、ＤＣによる効率的なＡＴＣ−ＩＣの取り込みが、ＦｃγＲ依存性であることを示している。また、ＤＣの成熟においてアップレギュレートする表面分子の発現に対するＡＴＣの作用を調べた。ＤＣをＡＴＣのみでパルスした場合、ＣＤ８６及びＭＨＣクラスＩＩ（Ｉ−Ａｂ）などの表面分子の発現レベルは、パルスを行わなかったＤＣの場合と同程度であった。しかし、ＤＣをＡＴＣ−ＩＣでパルスした場合には、ＡＴＣの場合及びパルスを行わなかったＤＣの場合と比較して、表面分子の発現レベルが高かった（図６）。なお、平均蛍光強濃度を図６の表に示す。これらの結果は、ＤＣがＡＴＣ−ＩＣでパルスされた場合も、ＤＣの成熟度が効率的に高まることを示している。
【００３３】
（ＡＴＣ−ＩＣを取り込んだＤＣは効率的にＣＴＬを活性化し、強い抗腫瘍免疫応答を惹起する）
ＦｃγＲを介してＡＴＣ−ＩＣを取り込んだＤＣが、効率的に腫瘍特異的ＣＴＬをインビボで活性化できるかを調べるため、ＡＴＣ又はＡＴＣ−ＩＣのいずれかを取り込んだＤＣをＢ６マウスに静脈注射して免疫した。免疫後、脾臓細胞を回収し、Ｅ．Ｇ７を標的とした標準５１Ｃｒ放出アッセイを行い、腫瘍特異的ＣＴＬの産生について評価した。ＡＴＣでパルスしたＤＣを用いて免疫したマウスの脾臓細胞は、ある程度のＥ．Ｇ７細胞を死亡させた（図７、○）。しかし、ＡＴＣ−ＩＣでパルスしたＤＣを用いて免疫したマウスの場合、ＡＴＣでパルスした場合と比較して、Ｅ．Ｇ７細胞はより効果的に死亡していた（図７、●）。ＡＴＣ−ＩＣの場合は、ＡＴＣの場合よりも細胞傷害活性がかなり強く、ＡＴＣの場合と比較して、インビボにおいて腫瘍特異的ＣＴＬを効果的に活性化することがわかる。次に、ＡＴＣ又はＡＴＣ−ＩＣでパルスしたＦｃγＲｎｕＩＩマウス由来のＤＣで免疫したマウスのＣＴＬ活性を、同様にして標準５１Ｃｒ放出アッセイにより調べた（図８）。ＡＴＣ−ＩＣでパルスしたＦｃγＲｎｕＩＩマウス由来のＤＣを用いて免疫したマウスにおける細胞傷害活性（図８、●）とＡＴＣでパルスしたＦｃγＲｎｕＩＩマウス由来のＤＣを用いて免疫したマウスにおける細胞傷害活性（図８、○）はほとんど変わらなかった。これらの結果は、ＡＴＣ−ＩＣによる強い細胞傷害活性は、ＤＣ上のＦｃγＲに依存していることを示している。
【００３４】
ＤＣワクチンの供給源としてのＡＴＣ−ＩＣの効力を調べるために、ＡＴＣ又はＡＴＣ−ＩＣでパルスしたＤＣでマウスを２度免疫した。２度目の免疫から７日後、これらのマウスにＥ．Ｇ７腫瘍細胞を移植した。図９にあるように、ＡＴＣ−ＩＣでパルスしたＤＣを用いて免疫したマウス（図９、●）の５０％は、８０日以上無腫瘍状態のままであったが、ＡＴＣのみでパルスしたＤＣを用いて処置したマウス（図９、○）は、接種されたＥ．Ｇ７細胞に対する有意な防御作用を示さなかった。なお、ＤＣに代えてＰＢＳを使用したコントロールでは３０日以内にすべてのマウスに腫瘍が現れた（図９、▼）。これらの結果を考え合わせると、ＡＴＣ−ＩＣはＡＴＣと比較してかなり効率的な抗腫瘍応答を、インビボにおいて誘導することがわかる。
【００３５】
【発明の効果】
本発明によると、抗腫瘍治療剤等のＣＴＬ活性に優れたＤＣワクチンや、養子免疫療法等に応用して癌の治療等が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｘ線照射により胸腺腫Ｅ．Ｇ７細胞にアポトーシスが誘導されたことを示す、フローサイトメトリーの結果（アネキシンＶ結合陽性／プロピジウムアイオダイド染色陰性）を示す図である。
【図２】抗ＴＮＰマウスＩｇＧ１抗体を用いたオプソニングを、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体を検出することにより確認したフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図３】ＤＣによるＡＴＣ又はＡＴＣ−ＩＣの取込み量を示すフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図４】ＤＣによるＡＴＣ又はＡＴＣ−ＩＣの取込みを示す共焦点顕微鏡写真を示す図である。
【図５】ＦｃγＲｎｕＩＩマウス由来のＤＣによるＡＴＣ又はＡＴＣ−ＩＣの取込み量を示すフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図６】ＤＣをＡＴＣ又はＡＴＣ−ＩＣでパルスしたときの表面分子ＣＤ８６及びＭＨＣクラスＩＩ（Ｉ−Ａｂ）の発現レベルを示す図である。
【図７】ＡＴＣ又はＡＴＣ−ＩＣでパルスしたＤＣで免疫したマウスのＣＴＬ活性を標準５１Ｃｒ放出アッセイで調べた結果を示す図である。
【図８】ＡＴＣ又はＡＴＣ−ＩＣでパルスしたＦｃγＲｎｕＩＩマウス由来のＤＣで免疫したマウスのＣＴＬ活性を標準５１Ｃｒ放出アッセイで調べた結果を示す図である。
【図９】ＡＴＣ又はＡＴＣ−ＩＣでパルスしたＤＣで２度免疫したマウスにＥ．Ｇ７腫瘍細胞を接種し、腫瘍のないマウスの割合の経時変化を示す図である。
【図１】
2004137221.tif 000002
【図２】
2004137221.tif 000003
【図３】
2004137221.tif 000004
【図４】
2004137221.tif 000005
【図５】
2004137221.tif 000006
【図６】
2004137221.tif 000007
【図７】
2004137221.tif 000008
【図８】
2004137221.tif 000009
【図９】
2004137221.tif 000010