(57)【要約】【課題】本発明は、ハイブリダイゼーション反応において高い再現性を得ることができる、固相担体に長い核酸プローブを安定に固定化した核酸固定化基板を提供すること。【解決手段】固相担体２と、該固相担体２に結合された複数のオリゴヌクレオチド分子３と、該複数のオリゴヌクレオチド分子３のうちの二以上と核酸プローブ４とが該核酸プローブ４上の二以上の領域においてハイブリダイズすることにより、該オリゴヌクレオチド分子３を介して固相担体２に固定化された核酸プローブとを含んでなる核酸固定化基板１を提供する。【選択図】　　　図１
2004041190.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相担体と、
該固相担体に結合された複数のオリゴヌクレオチド分子と、
該複数のオリゴヌクレオチド分子のうちの二以上が、ある核酸プローブ上の二以上の異なる領域においてハイブリダイズすることにより、該オリゴヌクレオチド分子を介して固相担体に固定化された核酸プローブと
を含んでなる核酸固定化基板。
【請求項２】
前記固相担体と前記オリゴヌクレオチド分子との結合が、共有結合である請求項１に記載の核酸固定化基板。
【請求項３】
前記固相担体と前記オリゴヌクレオチド分子との結合が、生物学的結合である請求項１に記載の核酸固定化基板。
【請求項４】
前記固相担体と前記オリゴヌクレオチド分子との結合が、リンカーを介した結合である請求項１に記載の核酸固定化基板。
【請求項５】
前記リンカーが樹枝状分子である請求項４に記載の核酸固定化基板。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチド分子には、前記核酸プローブ上の二以上の異なる領域の各々にハイブリダイズする配列を有する二以上の異なる種類がある請求項１〜５のいずれかに記載の核酸固定化基板。
【請求項７】
前記核酸プローブが、３，０００塩基〜１，０００，０００塩基の塩基長である請求項１〜６のいずれかに記載の核酸固定化基板。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチド分子の、前記核酸プローブ上の二以上の異なる領域の各々にハイブリダイズする部分の配列が、２０塩基〜１００塩基の塩基長である請求項１〜７のいずれかに記載の核酸固定化基板。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の核酸固定化基板とターゲットＤＮＡとを接触させるステップを含む核酸の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は核酸固定化基板に関する。本発明は、詳しくは、核酸検出におけるハイブリダイゼーション法に用いるための、担体上に核酸プローブを固定化した核酸固定化基板に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、核酸プローブを担体上に固定化して、ターゲットＤＮＡを含む試料をハイブリダイゼーション反応させるＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ、以下核酸固定化基板ともいう）が利用されている。このようなＤＮＡチップは、基礎医学研究だけでなく、臨床研究、創薬研究、疾病の診断や治療法の選択、予防医学への応用が広がるものとして期待されている。
【０００３】
非特許文献１及び非特許文献２には、ハイブリダイゼーション法に基づく核酸の検出において、ＤＮＡ断片等の核酸プローブと相補性を持つ核酸（以下、ターゲットＤＮＡという）を含む試料をニトロセルロース膜等の担体上に固定化して溶液中の核酸プローブを反応させる方法が開示されている。
【０００４】
非特許文献３には、ＤＮＡチップに用いられる核酸の担体上への固定化方法として、担体上で直接核酸プローブを合成する方法（オンチップ合成法）が開示されており、非特許文献４には、核酸の担体上への固定化方法として、あらかじめ調製した核酸プローブを担体上に固定化する方法（スポット法）が開示されている。
【０００５】
オンチップ合成法としては、半導体作製に利用されるフォトリソグラフィー技術と固相合成技術を組み合わせて、スライドガラスやシリコン基板上で核酸プローブを合成する方法が知られている。しかしながら、オンチップ合成法では基板上で核酸プローブを合成するための特殊な装置と試薬が必要であり、さらには、合成できる核酸プローブの長さも数１０塩基程度に限られるという問題がある。
【０００６】
スポット法としては、ＤＮＡチップ作製装置を用いてあらかじめ調製した核酸プローブを、ポリ−Ｌ−リジン等で表面処理を施した固相担体表面にスポットして静電結合させる方法が知られている。このような核酸プローブを静電結合させる方法では、長い核酸プローブを固定化することが可能であるが、ハイブリダイゼーション反応操作の結果、再現性が得られないという欠点がある。
【０００７】
また、非特許文献５には、アミノ基やアルデヒド基等の官能基を有するシランカップリング剤で表面処理を施した固相担体と官能基修飾を施した核酸プローブを、ＤＮＡチップ作製装置を用いてスポットした後に共有結合させる方法が開示されている。
【０００８】
表面処理を施した固相担体と官能基修飾を施した核酸プローブとを一点で共有結合させる方法では、核酸プローブを固相担体に比較的強固に結合させることができる。しかしながら、核酸プローブの調製には、官能基修飾を施したオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法により増幅するという煩雑な工程が必要である。さらには、このような調整法では、数千塩基といった長い核酸プローブを調製することが困難であるために、結果として長い核酸プローブを固定化することが困難となる。
【０００９】
【非特許文献１】
Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ　（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ）
【非特許文献２】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ．Ｅｄ．　（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ）
【非特許文献３】
Ｆｏｒｄｅｒ，　Ｓ．Ｐ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，　７６７−７７３　（１９９１）
【非特許文献４】
Ｓｃｈｅｎａ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２７０，　４６７−４７０　（１９９５）
【非特許文献５】
Ｇｅｏ，　Ｚ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　２２，　５４５６−５４６５　（１９９４）
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ターゲットＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応において高い再現性を得ることができる核酸固定化基板であって、固相担体に長い核酸プローブを安定に固定化した核酸固定化基板を提供することを目的とする。
【００１１】
【発明を解決するための手段】
上記課題を解決するため、本発明者らは、固相担体に固定化したオリゴヌクレオチド分子と核酸プローブとを二箇所以上で水素結合させることで、固相担体に長い核酸プローブであっても安定的に固定化させた核酸固定化基板を得ることが可能であることを見出した。また、好ましくは、上記核酸固定化基板において、固相担体へのオリゴヌクレオチド分子の固定化の際に、固相担体とオリゴヌクレオチド分子とを結合するリンカーを用いることで、さらに安定性が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、本発明は、固相担体と、該固相担体に結合された複数のオリゴヌクレオチド分子と、該複数のオリゴヌクレオチド分子のうちの二以上が、ある核酸プローブ上の二以上の異なる領域においてハイブリダイズすることにより、該オリゴヌクレオチド分子を介して固相担体に固定化された核酸プローブとを含んでなる核酸固定化基板を提供するものである。ここで、「ある核酸プローブ上の異なる二以上の領域」とは、一本の核酸プローブの一部を形成する領域であって、空間的に離れた二以上の領域をいう。また、本発明において用いられる「ハイブリダイズ」あるいは「ハイブリダイゼーション」という語は、相補性をもつ塩基対間での水素結合による相互作用を意味するものである。また、ここでいう複数のオリゴヌクレオチド分子は、同種または異種のものであってよい。
【００１３】
本発明によれば、前記固相担体とオリゴヌクレオチド分子との結合は、共有結合であってよく、あるいは、生物学的結合であってもよい。
【００１４】
また、本発明によれば、前記固相担体とオリゴヌクレオチド分子との結合は、固相担体とオリゴヌクレオチド分子との間にリンカーを介した結合であってもよい。リンカーは、その分子中に固相担体と結合する官能基とオリゴヌクレオチド分子に結合する官能基とを有し、核酸固定化基板を使用してターゲットＤＮＡを分析する条件において使用することができるものを用いることができる。好ましいリンカーとしては、樹枝状分子を用いることができる。
【００１５】
さらに、前記オリゴヌクレオチド分子には、前記核酸プローブ上の二以上の異なる領域の各々にハイブリダイズする配列を有する二以上の異なる種類がある上述の核酸固定化基板を提供する。
【００１６】
ここで用いられる「ハイブリダイズする配列」とは、オリゴヌクレオチド分子に含まれる配列であって、核酸プローブ上の二以上の異なる領域の各々に相補的な配列をいう。しかし、ここでいう相補的とは、オリゴヌクレオチド分子の全ての塩基が核酸プローブの一部と完全に相補的である必要はなく、オリゴヌクレオチド分子と核酸プローブがハイブリダイゼーションを形成するのに十分な程度に相補的であればよい。即ち、オリゴヌクレオチド分子の塩基長のうち、領域により異なるが、塩基数の５〜５０％程度が相補的であればよい。また、「相補的な配列を有する」とは、オリゴヌクレオチド分子の全てが相補的な配列であっても、オリゴヌクレオチド分子の一部に相補的な配列を含むものであってもよいことをいう。しかし、オリゴヌクレオチド分子が、固相担体と核酸プローブとの媒介として働くことを考えると、オリゴヌクレオチド分子の全てが前記核酸プローブ上の二以上の領域の各々に相補的な配列であることが好ましい。
【００１７】
本発明の核酸固定化基板においては、前記核酸プローブが、３，０００塩基〜１，０００，０００塩基の塩基長を有することが好ましい。
【００１８】
また、前記オリゴヌクレオチド分子の、前記核酸プローブ上の二以上の異なる領域の各々にハイブリダイズする部分の配列が、２０塩基〜１００塩基の塩基長であることが好ましい。
【００１９】
さらには、本発明は、前述の核酸固定化基板とターゲットＤＮＡとを接触させるステップを含む核酸の検出方法を提供するものである。
【００２０】
ターゲットＤＮＡとは、本発明の核酸固定化基板により検出するＤＮＡであって、本発明の核酸固定化基板に固定化された核酸プローブに相補的な配列を有するＤＮＡをいう。かかる検出方法はまた、核酸固定化基板とターゲットＤＮＡとを接触させるステップに加えて、接触させた核酸固定化基板とターゲットＤＮＡとをインキュベートするステップと、該インキュベートするステップにおいてハイブリダイゼーションにより該核酸固定化基板に固定化されたターゲットＤＮＡを定量化するステップを含むことができる。ターゲットＤＮＡの定量化は、ターゲットＤＮＡを蛍光標識し、蛍光量を定量することにより実施することが好ましい。
【００２１】
本発明に係る核酸固定化基板によれば、比較的長い核酸プローブを、固相担体に複数箇所で強固に結合することができる。このような核酸固定化基板を用いて試料中の核酸を解析する方法によれば、再現性の高いハイブリダイゼーション反応を行うことができ、精度の高い分析が可能となる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を、図面を用いてさらに詳細に説明する。以下の説明は本発明を限定するものではない。
【００２３】
本発明の第一の実施形態による核酸固定化基板の概念図を、図１に示す。図１に示す核酸固定化基板１は、固相担体２に複数のオリゴヌクレオチド分子３が共有結合あるいは生物学的結合５により結合されている。また、そのうち三つのオリゴヌクレオチド分子が、核酸プローブ４上の三つの領域において、核酸プローブ４と水素結合６により、各々ハイブリダイズしている。
【００２４】
ここで、固相担体２とオリゴヌクレオチド分子３との結合は、共有結合あるいは生物学的結合５による比較的強固な結合である。また、一つのオリゴヌクレオチド分子３あたり、固相担体２との間の結合５の数は、一つであってもよく、二以上であってもよい。図１においては、固相担体２とオリゴヌクレオチド分子３とのあいだに三つの結合５が形成されている実施形態を示したが、本発明はこのような特定の結合５の数に限定されるものではない。
【００２５】
オリゴヌクレオチド分子３と核酸プローブ４との結合は、相補的な塩基対による水素結合６である。従って、オリゴヌクレオチド分子３と核酸プローブ４とがハイブリダイゼーションを形成する部分は相補的な配列となっている。
【００２６】
本発明に係る核酸固定化基板１は、このように核酸プローブ４が、複数のオリゴヌクレオチド分子３を介して、複数の箇所で固相担体２に固定化されたものであるため、長い核酸プローブ４を安定に固相担体２に固定化することができる。
【００２７】
図１においては、核酸プローブ４とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド分子３が三つ用いられる場合につき記載したが、本発明はオリゴヌクレオチド分子３と核酸プローブ４とが三つの領域でハイブリダイゼーションを形成するものに限定されない。
次に、本発明の核酸固定化基板１を構成するそれぞれの要素につき、詳細に説明する。
【００２８】
［固相担体］
本発明に用いる固相担体２としては、オリゴヌクレオチド分子３を結合することが可能で、本発明に係る核酸固定化基板１を用いたターゲットＤＮＡの分析条件において使用することができるものを用いる。このような固相担体２の材質としては、一般的にはプラスチック、無機高分子、金属等が挙げられるが、特に制限されるものではない。
【００２９】
プラスチックとして具体的には、成形性に優れた熱硬化性、熱可塑性の樹脂であって、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、フェノール樹脂、エポキシ樹脂等が挙げられる。無機高分子として具体的にはガラス、水晶、カーボン、シリカゲル等が挙げられる。金属としては金、白金、銀、銅、鉄、アルミニウム等が挙げられる。
【００３０】
固相担体２の形状については、一般的には平板、フィルム、繊維、ビーズ等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、固相担体２の大きさは、本発明に係る核酸固定化基板１を用いたターゲットＤＮＡの分析の目的に応じて決定することができ、例えば、スライドガラス程度のものを用いることができるが、このような大きさに限定されるものではない。
【００３１】
固相担体２は、その表面に、オリゴヌクレオチド分子３を結合するための結合部位を有する。ここで、固相担体の表面とは、本発明に係る核酸固定化基板１を用いて、ターゲットＤＮＡとハイブリダイゼーションを行うとき、核酸プローブ４とターゲットＤＮＡとの相互作用が可能になる箇所をいい、具体的には、ターゲットＤＮＡを含む溶液を加えたときに、その溶液と接する個所をいう。
【００３２】
このような固相担体２のオリゴヌクレオチド分子３との結合部位としては、共有結合を形成し得る官能基を使用することができる。具体的には、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、エポキシ基等が挙げられるがこれらには限定されない。
【００３３】
このような官能基を固相担体２の表面に導入する方法の一つとしては、所望の官能基を有するシランカップリング剤によって固相担体２を処理することができる。カップリング剤の例としては、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−β−（アミノエチル）−β−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、あるいはγ−グリシドキシプロピルトリメトキシシランを用いることができる。結合部位となる官能基を固相担体２に導入する別の方法としては、プラズマ処理が挙げられる。このようなプラズマ処理により、固相担体２の表面に、水酸基等の官能基を導入することができる。プラズマ処理は、当業者には既知の装置を用いて行うことができる。
【００３４】
オリゴヌクレオチド分子３を結合するための部位として、他には、生物学的な特異的結合を形成する結合部位を用いることができる。このような生物学的結合の例としては、ビオチンとアビジンあるいはストレプトアビジンとの結合、抗原タンパク質と抗体タンパク質との結合等が挙げられるが、これらには限定されない。
【００３５】
これらの結合部位を、固相担体２の材料となるプラスチックや無機高分子上に導入する方法は当業者には既知であり、それらの方法により、固相担体２に所望の官能基あるいは生物学的結合部位を導入することができる。また、化学的処理あるいは生物学的処理を施し、結合部位が既に導入された固相担体２は、一般に市販されており、本発明に係る核酸固定化基板１においては、固相担体２としてこれらを利用することもできる。
【００３６】
［オリゴヌクレオチド分子］
オリゴヌクレオチド分子３は、固相担体２の表面の結合部位に共有結合的あるいは生物学的に結合されるとともに、核酸プローブ４上の複数の領域で、該核酸プローブ４の領域とのハイブリダイゼーションにより結合されて、固相担体２に核酸プローブ４を固定化するための媒介となるものである。
【００３７】
このようなオリゴヌクレオチド分子３としては、核酸プローブ４となるゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＥＳＴ（発現配列タグ）等の一部と相補的な配列とすることができる。従って、その配列は、核酸プローブの配列により決定される。
【００３８】
オリゴヌクレオチド分子３の長さは、通常、１０〜１０００塩基程度、好ましくは２０〜１００塩基程度が適当であるが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
本発明におけるオリゴヌクレオチド分子３は、固相担体２に結合されるため、固相担体２との結合部位を有する。このような結合部位としては、オリゴヌクレオチドを化学修飾することにより導入された官能基や、生物学的結合部位を用いることが好ましい。
【００４０】
結合部位はオリゴヌクレオチド分子３中に一か所だけ設けることもできるし、複数の結合部位を設けることもできる。また、オリゴヌクレオチド分子３中の結合部位が存在する位置については、オリゴヌクレオチド分子３の一方の末端あるいは両方の末端、さらにはそれに加えてオリゴヌクレオチド分子３の中間とすることが可能であって、核酸プローブ４とのハイブリダイズを阻害しない限りにおいて、結合部位の存在する位置には、特に制限はない。
【００４１】
結合部位となるオリゴヌクレオチド分子３に導入される官能基としては、前記固相担体に導入した結合部位との結合を形成し得るもの、例えばアミノ基、チオール基等を用いることが好ましい。
【００４２】
固相担体２に共有結合により結合をするための官能基、例えば、アミノ基を導入した場合には、これと共有結合を形成するアルデヒド基やエポキシ基をオリゴヌクレオチド分子３に導入することができる。さらには、固相担体２にカルボキシル基を導入した場合には、オリゴヌクレオチド分子３にアミノ基を導入することができる。この場合には、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）等の脱水縮合剤で処理することにより共有結合を形成することができる。その他には、固相担体２とオリゴヌクレオチド分子３との双方にアミノ基を導入しておけば、グルタルアルデヒドやｐ−フェニレンジイソチオシアネート（ＰＤＣ）等を架橋剤として用い、共有結合により固定化することができる。また、固相担体２にビオチンを導入した場合には、これと特異的結合を形成するアビジン（ストレプトアビジン）をオリゴヌクレオチド分子３に導入することができる。
【００４３】
このような結合部位による固相担体２とオリゴヌクレオチド分子３との結合は当業者には既知の化学的、生物学的方法により実施することができ、固相担体２の材質や、オリゴヌクレオチド分子３の長さ、性質との関係で、適宜決定することができる。
【００４４】
オリゴヌクレオチド分子３は、結合部位で固相担体２と結合する一方で、核酸プローブ４の一定領域とハイブリダイズする。オリゴヌクレオチド分子３は、核酸プローブ４のハイブリダイズする領域と相補的であることが好ましいが、ハイブリダイズすることが可能であれば１００％の相補性を有する必要はなく、相補的でない塩基を領域により異なるが、５〜５０％程度含んでいてもよい。
【００４５】
このようなオリゴヌクレオチド分子３のうちの少なくとも二以上が、該オリゴヌクレオチドの約１，０００倍〜１００，０００倍の長さを有する核酸プローブ４と、核酸プローブ４上の少なくとも二以上の異なる領域でハイブリダイゼーションを形成することにより、核酸プローブ４を、固相担体２に複数箇所で固定化する必要がある。従って、核酸プローブ４の複数の領域の各々に相補的な、複数の種類のオリゴヌクレオチド分子３を用いることが好ましい。
【００４６】
［核酸プローブ］
核酸プローブ４は、分析の対象となるターゲットＤＮＡに相補的なものを使用することができる。
【００４７】
核酸プローブ４の長さとしては、数百〜数千塩基、更には数十万塩基の核酸プローブを用いることができる。本発明においては、３，０００塩基〜１，０００，０００塩基の長さの核酸プローブ４を固相担体２に固定化することが好ましく、さらには、１０，０００塩基〜１，０００，０００塩基の長さの核酸プローブ４を固定化することが好ましい。
【００４８】
核酸プローブ４は、固相担体２に固定化された上記オリゴヌクレオチド分子３とハイブリダイズする少なくとも二以上の領域を有する。核酸プローブ４のオリゴヌクレオチド分子３とハイブリダイゼーションを形成する領域の長さは、１０〜１０００塩基程度、好ましくは２０〜１００塩基程度である。
【００４９】
核酸プローブ４がオリゴヌクレオチド分子３とハイブリダイゼーションを形成する領域の、核酸プローブ４上における位置は、例えば、核酸プローブ４の５’末端と３’末端の双方の位置とすることができる。さらに強固に固定化するためには、これらに加えて、核酸プローブ４の中間部分の位置に、オリゴヌクレオチド分子３とハイブリダイゼーションを形成する領域をさらに設けることが好ましい。
【００５０】
核酸プローブ４の調製には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＥＳＴ等を使用することが好ましく、一般的には組織や細胞サンプルから単離した調製物を使用することが好ましい。また、細菌人工染色体（ＢＡＣ）を利用したゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリー、任意のｃＤＮＡをクローン化したプラスミドを用いることもできる。さらにこれらを鋳型としてＰＣＲ法によって増幅した調製物を使用することもできる。
【００５１】
次に本発明に係る核酸固定化基板１を製造する方法につき説明する。
【００５２】
［１．固相担体とオリゴヌクレオチド分子との結合の形成］
前述のように結合部位を設けた固相担体２に、結合部位を設けたオリゴヌクレオチド分子３を含む溶液を加えて、これらの結合に適した条件で反応をさせ、固相担体２とオリゴヌクレオチド分子３との結合を形成する。このとき、オリゴヌクレオチド分子３を含む溶液を、異なる二種類以上のオリゴヌクレオチド分子３を含むものとすることで、異なる二種類以上のオリゴヌクレオチド分子３を固相担体２に結合させることができる。
【００５３】
［２．オリゴヌクレオチド分子と核酸プローブとの結合の形成］
次に、固相担体２に結合されたオリゴヌクレオチド分子３に、さらに核酸プローブ４を固定化させる。核酸プローブ４は、前記の固相担体２に結合させたオリゴヌクレオチド分子３とのハイブリダイズによって固定化することができ、このようなハイブリダイズの形成は、核酸プローブ４が溶解している水溶液またはバッファーをオリゴヌクレオチド分子３が固定化された固相担体２上に滴下すればよく、一般に市販されているＤＮＡチップ作製装置等を本発明において使用することも可能である。
【００５４】
このようにして作製された本発明に係る核酸固定化基板１は、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイとも呼ばれ、核酸プローブ４がオリゴヌクレオチド分子３を介して固相担体２に強固に固定化されている。これにより、核酸プローブ４に相補性を持つ検出可能に標識したターゲットＤＮＡとハイブリダイズさせることで再現性のある良好な分析結果を得ることができる。
【００５５】
次に、本発明にかかる核酸固定化基板の第二の実施形態について説明する。本発明の第二の実施形態によれば、固相担体と、該固相担体に結合された複数のオリゴヌクレオチド分子と、該複数のオリゴヌクレオチド分子のうちの二以上が、ある核酸プローブ上の二以上の異なる領域においてハイブリダイズすることにより、該オリゴヌクレオチド分子を介して固相担体に固定化された核酸プローブとを含んでなる核酸固定化基板であって、前記固相担体と前記オリゴヌクレオチド分子との結合が、リンカーを介した結合である核酸固定化基板が提供される。
【００５６】
リンカーは、その分子中に、固相担体と結合する官能基とオリゴヌクレオチド分子に結合する官能基とを有し、核酸固定化基板を使用してターゲットＤＮＡを分析する条件において使用することができるものを用いることができる。特に、固相表面付近でのハイブリダイゼーション反応の立体障害を避けるという観点から、固相担体とオリゴヌクレオチドとの距離を離すことができる分子、または、固相担体へのオリゴヌクレオチドの強固な固定という観点から、固相担体とオリゴヌクレオチドとをより強固に結合できる分子、あるいは、それらの両方の性質を有する分子が、リンカーとして好ましく用いられる。分子量が比較的大きいリンカー分子を用いることが好ましいが、上記の性質を有するものであれば、その分子量は一定の範囲に限定されるものではない。またその構造についても、上記の性質を有するものであれば、特定の構造を有するものに限定されない。
【００５７】
また、オリゴヌクレオチドを付着させるためにはホモ双機能的、またはヘテロ双機能的性質を持つものがリンカーとしては好ましい。リンカーの種類、形状等には特に制限はない。ハイブリダイズする条件、それに伴う洗浄操作、さらに該標的核酸を除去する操作等において、固相担体およびオリゴヌクレオチドに対して、充分に強固な結合性を有していればよい。具体的には、通常の化学結合を利用したもの、タンパク質同士の相互作用に基づく結合、タンパク質と特定の分子との強い相互作用に基づく結合等を利用したもの等が挙げられる。リンカーとオリゴヌクレオチドを結合させて、次いでリンカーを固相担体に結合してもよいし、逆に先に固相担体とリンカーを結合させて、次いでリンカーとオリゴヌクレオチドとを結合させてもよい。
【００５８】
リンカーとしては、例えば、ホモ双機能的リンカーとしてはフェニレン１，４−ジイソチオシアネートが挙げられ、ヘテロ双機能的リンカーとしてはｍ−マレインイミドベンゾイルーＮ−ハイドロキシスルホースクシンイミドエステルが挙げられるが、上述のように、固相担体と結合することができ、かつ、オリゴヌクレオチド分子とを結合することができるものであれば、特定のリンカーには限定されない。
【００５９】
さらには、樹枝状分子を使用することが好ましい。固相担体表面の反応基の数を増加させることにより、固相表面上のオリゴヌクレオチドの密度を増加させるためである。樹枝状分子とは、少なくとも１つ以上の枝分かれを有する分子をいう。具体的には、樹枝状分子とは、Ｈａｗｋｅｒ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ　ａｌ；Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９０年，１０１０頁、Ｔｏｍａｌｉａ，Ｄ．Ａ．ｅｔ　ａｌ；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，２９巻，１３８頁（１９９０）、Ｈａｗｋｅｒ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ　ａｌ；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１２巻，７６３８頁（１９９０）、Ｆｒｅｃｈｅｔ，Ｊ．Ｍ．Ｊ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６３巻１７１０頁（１９９４）、あるいは柿本正明；化学，５０巻，６０８頁（１９９５）等の文献に詳述されている、デンドリマーに代表される概念である。好適な樹枝状分子には、デンドリマー、テクトデンドリマー、規則的デンドロン、デンドリグラフト、及び超分枝ポリマーを含む樹枝状構造を有するポリマーを含むが、これらには限定されない。
【００６０】
ここで、本実施の形態による核酸固定化基板に用いる固相担体は、第一の実施形態において説明したのと同様の素材、形状を有する部材を使用することができる。固相担体は、その表面に、リンカーと結合するための結合部位を有する。このような固相担体のリンカーとの結合部位としては、共有結合を形成し得る官能基を使用することができる。具体的には、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、エポキシ基等が挙げられるがこれらには限定されない。リンカーが有する官能基と反応しうるものであればよい。
【００６１】
このような官能基を固相担体の表面に導入する方法の一つとしては、所望の官能基を有するシランカップリング剤によって固相担体を処理することができる。カップリング剤の例としては、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−β−（アミノエチル）−β−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、あるいはγ−グリシドキシプロピルトリメトキシシランを用いることができる。結合部位となる官能基を固相担体に導入する別の方法としては、プラズマ処理が挙げられる。このようなプラズマ処理により、固相担体の表面に、水酸基等の官能基を導入することができる。プラズマ処理は、当業者には既知の装置を用いて行うことができる。
【００６２】
オリゴヌクレオチド分子は、リンカーに結合されるとともに、核酸プローブ上の複数の領域で、該核酸プローブの領域とのハイブリダイゼーションにより結合されるものである。したがって、本実施の形態において、オリゴヌクレオチド分子は、核酸プローブとのハイブリダイゼーションを損なうことなくリンカーと結合する部位を有するものであれば良い。このようなオリゴヌクレオチド分子としては、第一の実施形態で説明したのと同様のものを用いることができる
【００６３】
このようなオリゴヌクレオチド分子としては、核酸プローブとなるゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＥＳＴ（発現配列タグ）等の一部と相補的な配列とすることができる。従って、その配列は、核酸プローブの配列により決定される。オリゴヌクレオチド分子の長さは、通常、１０〜１０００塩基程度、好ましくは２０〜１００塩基程度が適当であるが、これらに限定されるものではない。
【００６４】
オリゴヌクレオチド分子をリンカーに結合するための結合部位としては、オリゴヌクレオチドを化学修飾することにより導入された官能基を用いることが好ましい。結合部位はオリゴヌクレオチド分子中に一か所だけ設けることもできるし、複数の結合部位を設けることもできる。また、オリゴヌクレオチド分子中の結合部位が存在する位置については、オリゴヌクレオチド分子の一方の末端あるいは両方の末端、さらにはそれに加えてオリゴヌクレオチド分子の中間とすることが可能であって、核酸プローブとのハイブリダイズを阻害しない限りにおいて、結合部位の存在する位置には、特に制限はない。
【００６５】
結合部位となるオリゴヌクレオチド分子に導入される官能基としては、リンカーの結合部位との結合を形成し得るもの、例えばアミノ基、チオール基等を用いることができる。リンカーに共有結合性の官能基、例えば、アミノ基が存在する場合には、これと共有結合を形成するアルデヒド基やエポキシ基をオリゴヌクレオチド分子に導入することができる。さらには、リンカーにカルボキシル基が存在する場合には、オリゴヌクレオチド分子にアミノ基を導入することができる。この場合には、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）等の脱水縮合剤で処理することにより共有結合を形成することができる。その他には、アミノ基を有するリンカーを用いる場合にオリゴヌクレオチド分子にもアミノ基を導入しておけば、グルタルアルデヒドやｐ−フェニレンジイソチオシアネート（ＰＤＣ）等を架橋剤として用い、共有結合によりリンカーにオリゴヌクレオチド分子を固定化することができる。
【００６６】
このようなオリゴヌクレオチド分子のうちの少なくとも二以上が、該オリゴヌクレオチドの約１，０００倍〜１００，０００倍の長さを有する一つの核酸プローブと、核酸プローブ上の少なくとも二以上の異なる領域でハイブリダイゼーションを形成することにより、一つの核酸プローブを、固相担体に複数箇所で固定化する必要がある。従って、一つの核酸プローブの複数の領域の各々に相補的な、複数の種類のオリゴヌクレオチド分子を用いることが好ましい。
【００６７】
核酸プローブは、第一の実施形態と同様に、分析の対象となるターゲットＤＮＡに相補的なものを使用することができる。核酸プローブの長さとしては、数百〜数千塩基、更には数十万塩基の核酸プローブを用いることができる。本発明においては、３，０００塩基〜１，０００，０００塩基の長さの核酸プローブを固相担体に固定化することが好ましく、さらには、１０，０００塩基〜１，０００，０００塩基の長さの核酸プローブを固定化することが好ましい。核酸プローブは、固相担体にリンカーを介して固定化された上記オリゴヌクレオチド分子とハイブリダイズする少なくとも二以上の領域を有する。核酸プローブのオリゴヌクレオチド分子とハイブリダイゼーションを形成する領域の長さは、１０〜１０００塩基程度、好ましくは２０〜１００塩基程度である。核酸プローブがオリゴヌクレオチド分子とハイブリダイゼーションを形成する領域の、核酸プローブ上における位置は、例えば、核酸プローブの５’末端と３’末端の双方の位置とすることができる。さらに強固に固定化するためには、これらに加えて、核酸プローブの中間部分の位置に、オリゴヌクレオチド分子とハイブリダイゼーションを形成する領域をさらに設けることが好ましい。核酸プローブの調製は、第一の実施形態と同様に実施することができる。
【００６８】
次に、第二の実施形態のうち、特に好ましい形態である、リンカーとして樹枝状分子を用いた核酸固定化基板について、図面を参照して説明する。図２は、本発明に係る樹枝状分子をリンカーとして用いた場合の核酸固定化基板の概念図である。図２に示す核酸固定化基板１ａは、固相担体２に図示しない複数の樹枝状分子のリンカー７が共有結合により結合されている。そのうち１つの樹枝状分子のリンカー７に対し、複数のオリゴヌクレオチド分子３が共有結合５により結合されている。さらに、これらのオリゴヌクレオチド分子３は、核酸プローブ４上の二つの異なる領域において、核酸プローブ４と水素結合６により、各々ハイブリダイズしている。
【００６９】
本実施形態による核酸固定化基板１ａにおいては、一つの核酸プローブ４とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド分子３が二つ用いられ、リンカー７を介して固相担体２に固定される場合について図面に記載したが、本発明はオリゴヌクレオチド分子３、リンカー７及び核酸プローブ４が所定数の領域でハイブリダイゼーションを形成するものには限定されない。
【００７０】
リンカー７として好ましく用いられる、樹枝状分子（ｂｒａｎｃｈｅｄ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）とは、複数の末端反応性基を有する密な分枝構造を有するポリマー分子またはオリゴマー分子を意味する。樹枝状分子は、数層もしくは数世代の繰り返し単位を含む。このような樹枝状分子は、２以上の反応性基を有するモノマー単位、又は少なくとも三つの反応性基を有する少なくとも１つのモノマー単位の組み合わせを反応させることにより製造される。
【００７１】
本発明において、用いることのできる好適な樹枝状分子は、デンドリマー、テクトデンドリマー、規則的デンドロン、デンドリグラフト、及び超分枝ポリマーを含む既知の樹枝状構造を有するものを含む。
【００７２】
デンドリマーとは、３つ以上の官能基を有するコア分子を合成の中心として、マイケル型付加と縮合反応を繰り返すことにより得られるポリマーまたはオリゴマーをいう。繰り返し単位は世代もしくは分枝とよばれ、ある世代はその前の世代の末端部分に結合する。こうして、前の世代の末端部分の官能基に対する分枝度は制限され、分枝度は通常２又は３である。直鎖繰り返し単位のみを含んでいる理想的な直鎖ポリマーと異なり、理想的なデンドリマーは分枝繰り返し単位のみを含んでいるものであるが、本実施形態において用いることのできるデンドリマーは、分枝繰り返し単位のみを含んでいるものには限定されない。
【００７３】
用いることのできるデンドリマーは、１つの原子もしくは原子群であってよい通常のコアから広がる複数のデンドロンからなるものを含む。各デンドロンは通常末端表面基、２以上の分枝官能基を有する内部分枝連結、及び隣接する分枝連結と共有結合する二価コネクターからなる。また、好ましいデンドリマーは、繰り返し単位の主鎖の構造が、アミドアミンであり、世代が４世代以上であるが、このような構造を有するデンドリマー以外を排除するものではない。
【００７４】
コア−シェル型テクトデンドリマーとは、互いには反応性を示さない１番目の種類の末端官能基を複数有するコア用樹枝状重合体分子と、互いには反応性を示さないが前記１番目の種類の末端官能基には反応性を示す２番目の種類の末端官能基を複数有する複数のシェル用樹枝状重合体分子、すなわち、複数の樹枝状シェルポリマー分子（その各々はコアーポリマー分子の表面に化学結合している）に囲まれた１つの樹枝状コアーポリマーを含む組成物である。このようなコア−シェル型テクトデンドリマーについては、特表２００２−５３７４２６号公報に詳述されている。
【００７５】
一方、超分枝ポリマー（ｈｙｐｅｒｂｒａｎｃｈｅｄ　ｐｏｌｙｍｅｒ）はクシ型分枝を繰り返すことにより合成されるポリマー分子またはオリゴマー分子である。前の世代のオリゴマー分枝に、さらにオリゴマーを分枝することにより、超分枝ポリマーでは１つの世代から次の世代に対して、分枝度は制限されず、分枝度を高くするもしくは変化させることが可能である。超分枝ポリマーは、デンドロン及びデンドリマーの規則的な構造と比較して非理想的な不規則な分枝のレベルが高い樹枝状分子を意味する。具体的には、超分枝ポリマーは比較的多数の不規則な分枝を含み、各々の繰り返し単位が分枝連結を含むものではない。従って、超分枝ポリマーは直鎖及び分枝繰り返し単位の混合物を含んでいてもよい。
【００７６】
他の好適な樹枝状分子は、結合したデンドリマー、例えば２以上の樹枝状分子がその反応性末端基を介して（直接、又はα，ω−テレケリック直鎖オリゴマー／ポリマーもしくは他の二官能性もしくは多官能性分子を介して）互いに共有結合している架橋した樹枝状分子及び／又は樹枝状分子クラスター、樹枝状分子鎖、樹枝状分子ネットワーク（例えば架橋した樹枝状分子）、及びコアーシェルテクトデンドリマー（すなわち、複数の樹枝状シェルポリマー分子（その各々はコアーポリマー分子の表面に化学結合している）に囲まれた１つの樹枝状コアーポリマーを含む組成物）のさまざまな組み合わせを含む。
【００７７】
上述のような、デンドリマー、デンドロン、超分枝ポリマー、スター分枝ポリマー、密スター分枝ポリマー及び超クシ型分枝ポリマーの製造方法及び特性は当該分野において知られており、文献に詳細に記載されている。例えば、密スター分枝ポリマーについては、特開平６−９３０９７号公報に記載されており、デンドリマー、デンドロンについては、特表平９−５１０４８９号公報に記載されている。
【００７８】
用いることのできる樹枝状分子の具体例には、３世代以上のポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、ポリアミドアミンデンドリグラフト及びポリアミドアミン超分枝ポリマー、３世代以上のポリ（ベンジルエーテル）デンドリマー、ポリ（ベンジルエーテル）デンドリグラフト及びポリ（ベンジルエーテル）超分枝ポリマー、３世代以上のポリエステルデンドリマー及びポリエステル超分枝ポリマー、３世代以上のポリ（プロピレンイミン）（ＰＰＩ）デンドリマー、ポリ（プロピレンイミン）デンドリグラフト及びポリ（プロピレンイミン）超分枝ポリマー、３世代以上のオルガノシリコン含有デンドリマー、オルガノシリコン含有デンドリグラフト及びオルガノシリコン含有超分枝ポリマー、３世代以上のポリスチレン樹枝状ポリマー等を含むが、これらには限定されない。
【００７９】
通常、あらゆる樹枝状分子、すなわち分枝上に分枝を有するポリマー分子およびオリゴマー分子を本発明に用いることができ、当業者であれば、コスト、入手性、溶解性、及び末端反応基の反応性及び密度に応じて選択することができる。また、一つの固相担体に異なる二種以上の樹枝状分子を結合させて用いてもよい。
【００８０】
本実施の形態による核酸固定化基板１ａの製造に用いられる樹枝状分子に存在していてよい末端官能基には、ヒドロキシ、メルカプト、カルボキシ、エステル、アルコキシ、アリル、ビニル、アミノ、ハロ、ウレア、オキシラニル、アジリジニル、オキサゾリニル、イミダゾリニル、スルホナト、ホスホナト、ヒドロシリル、イソシアナト、イソチオシアナート等を含むが、これらには限定されない。樹枝状分子に固相担体およびオリゴヌクレオチド分子を結合させるために、様々な既知の化学物質がこれら及び他の表面官能基に使用可能である。
【００８１】
固相担体２と樹枝状分子のリンカー７との結合、および樹枝状分子のリンカー７とオリゴヌクレオチド分子３との結合は、いずれも、上述の官能基を使用して形成される共有結合とすることができる。このとき、固相担体２に設けられた結合部位とリンカーの官能基との結合でリンカー７は固相担体２に結合され、オリゴヌクレオチド分子３に設けられた官能基とリンカー７の別の官能基とが結合される。このとき、樹枝状分子の末端官能基が固相担体２に設けられた結合部位と結合してもよく、樹枝状分子の側鎖官能基が固相担体２に設けられた結合部位と結合してもよい。また、樹枝状分子の末端官能基がオリゴヌクレオチド分子３に設けられた官能基と結合してもよく、樹枝状分子の側鎖官能基がオリゴヌクレオチド分子３に設けられた官能基と結合してもよい。
【００８２】
固相担体２とリンカー７との結合、およびリンカー７とオリゴヌクレオチド分子３との結合は、生物学的結合によることもできる。生物学的結合は、生物学的に特異的な結合、例えば、ビオチンとアビジンあるいはストレプトアビジンとの結合、抗原タンパク質と抗体タンパク質との結合等を使用して形成することができる。この場合、固相担体２、リンカー７、オリゴヌクレオチド分子３のそれぞれに生物学的結合部位を既知の方法で導入し、結合を形成させることができる。
【００８３】
［１．固相担体とリンカーとの結合の形成］
結合部位を設けた固相担体２に、結合部位となる官能基を有するリンカー７を含む溶液を加えて、固相担体２の結合部位とリンカー７の官能基の結合に適した条件で反応をさせ、固相担体２とリンカー７との結合を形成する。このとき、リンカーを含む溶液を、異なる二種類以上のリンカーを含むものとすることで、異なる二種類以上のリンカー７を固相担体２に結合させることができる。
【００８４】
［２．リンカーとオリゴヌクレオチド分子との結合の形成］
次に、固相担体２に結合させたリンカー７とオリゴヌクレオチド分子３とを結合させる。このときの結合の種類としては、前述のような共有結合や、生物学的結合が挙げられ、これらの種類によって、結合させるための操作は異なるが、いずれの方法も当業者であれば、通常の技術を用いて実施することができる。これにより、オリゴヌクレオチド分子３を固定化した固相担体２を得る。
【００８５】
［３．オリゴヌクレオチド分子と核酸プローブとの結合の形成］
次に、固相担体２にリンカー７を介して結合されたオリゴヌクレオチド分子３に、さらに核酸プローブ４を固定化させる。核酸プローブ４は、前記の固相担体２に結合させたオリゴヌクレオチド分子３とのハイブリダイズによって固定化することができ、このようなハイブリダイズの形成は、核酸プローブ４が溶解している水溶液またはバッファーをオリゴヌクレオチド分子３が固定化された固相担体２上に滴下すればよく、一般に市販されているＤＮＡチップ作製装置等を本発明において使用することも可能である。
【００８６】
このようにして作製された本発明に係る核酸固定化基板１ａは、核酸プローブ４がオリゴヌクレオチド分子３、リンカー７を介して固相担体２に強固に固定化されている。これにより、核酸プローブ４に相補性を持つ検出可能に標識したターゲットＤＮＡとハイブリダイズさせることで再現性のある良好な分析結果を得ることができる。
【００８７】
本実施の形態による樹枝状分子をリンカー７に用いて固相担体２とオリゴヌクレオチド分子３とを結合させ、オリゴヌクレオチド分子３に核酸プローブ４を結合させた核酸固定基板１ａは、高い安定性で核酸プローブ４を結合させることができる点で特に有利である。
【００８８】
次に、本発明に係る核酸固定化基板１または１ａを用いて核酸を検出する方法につき、説明する。本発明は、前述の核酸固定化基板１または１ａとターゲットＤＮＡとを接触させるステップを含む核酸を検出する方法を提供するものである。第一の実施形態として説明した核酸固定化基板１も、第二の実施形態として説明した核酸固定化基板１ａも、核酸を検出する方法においては、同じように使用することができるため、第一の実施形態として説明した核酸固定化基板１を用いて核酸を検出する方法について以下に説明する。
【００８９】
ターゲットＤＮＡは、本発明の核酸固定化基板１により検出する所望のＤＮＡとすることができる。本発明の核酸固定化基板１に固定化された核酸プローブ４は、このような検出の対象とする所望のターゲットＤＮＡに相補的な配列を有するように決定される。
【００９０】
かかる検出方法はまた、核酸固定化基板１とターゲットＤＮＡとを接触させるステップに加えて、接触させた核酸固定化基板１とターゲットＤＮＡとをインキュベートするステップと、該インキュベートするステップにおいてハイブリダイゼーションより該核酸固定化基板１に固定化されたターゲットＤＮＡを定量化するステップを含む。
【００９１】
ターゲットＤＮＡの定量化は、ターゲットＤＮＡを蛍光標識し、蛍光量を定量することにより実施することが好ましい。その他にも、ラジオアイソトープ、酵素、色素、化学発光物質等による標識方法により、ターゲットＤＮＡを定量化することができる。
【００９２】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例により本発明は限定されるものではない。
【００９３】
［実施例１］
［１．エポキシ基導入スライドガラスの作製］
１重量％のγ−グリシドキシプロピルトリエトキシシランを含むメタノール溶液２００ｍｌにスライドガラスを浸漬し、１００℃で５分間加熱処理した。加熱処理終了後、スライドガラスを取り出し、室温で乾燥させ、固相担体２として用いるエポキシ基導入スライドガラスを得た。
【００９４】
［２．エポキシ基導入スライドガラスへのオリゴヌクレオチド分子の固定化］
後述する核酸プローブ４であるβ−アクチンｃＤＮＡ（１１０４塩基）の５’末端側と相補的な、長さ２２塩基の３’末端アミノ化標識オリゴヌクレオチド、およびβ−アクチンｃＤＮＡの３’末端側と相補的な、長さ２２塩基の５’末端アミノ化標識オリゴヌクレオチドの０．１モルの混合溶液を滴下し、カバーガラスで保護した後、湿潤箱中にて４℃で２０時間インキュベートした。次にスライドガラスを取り出し、蒸留水で洗浄した後に室温で乾燥させ、オリゴヌクレオチド分子固定化スライドガラスを得た。
【００９５】
［３．オリゴヌクレオチド分子固定化スライドガラスへの核酸プローブの固定化］
核酸プローブの固定化量を測定するために、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ（アマシャムバイオサイエンス社）で標識したβ−アクチンｃＤＮＡ（１１０４塩基）を、１μｇ／μｌになるように３ｘＳＳＣ（標準食塩クエン酸緩衝液）溶液に溶解し、核酸プローブ溶液とした。次に、ＧＴＭＡＳＳ　Ｓｔａｍｐｉｎｇ２０００（日本レーザ電子社）を用いて、上記（２）で得たオリゴヌクレオチド分子固定化スライドガラスの所定の位置に前記核酸プローブ溶液をスポットした。次いで、湿潤箱中で５０℃にて２０時間インキュベートし、スライドガラスに固定化されたオリゴヌクレオチド分子にハイブリダイゼーションによって核酸プローブを固定化させた。次にスライドガラスを取り出し、洗浄（２ｘＳＳＣ：５０℃、５分間、２回）して核酸プローブを固定化したオリゴヌクレオチド分子固定化スライドガラスを得た。
【００９６】
［４．固定化された核酸プローブ量の測定］
固定化された核酸プローブ４量の測定はＣｙ３標識した蛍光量を定量することによって行った。蛍光量の検出にはＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ａ（インターメディカル社）を用いた。その結果、蛍光強度は１７６１６であった。この値は従来の方法により核酸プローブ４を固定化した下記の比較例に比べて極めて高く、固定化されたオリゴヌクレオチド分子３と核酸プローブ４がハイブリダイゼーションによって強固に固定化されていることを示している。
【００９７】
［比較例１］
従来技術による核酸固定基板を作製した。
［１．ポリ−Ｌ−リジンコートスライドガラスへの核酸プローブの固定化］
核酸プローブの固定化量を測定するため、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ（アマシャムファルマシアバイオテク社）で標識したβ−アクチンｃＤＮＡ（１１０４塩基）を１μｇ／μｌになるように３ｘＳＳＣ溶液に溶解し、核酸プローブ溶液とした。次に、ＧＴＭＡＳＳ　Ｓｔａｍｐｉｎｇ２０００（日本レーザ電子社）を用いて、ポリ−Ｌ−リジンコートスライドガラスの所定の位置に前記核酸プローブ溶液をスポットした。これを湿潤箱中で室温にて２時間反応させた後、減圧乾燥機で８０℃にて２時間乾燥させた。次にブロッキング溶液（無水コハク酸１ｇ、ｎ−メチル−ピロリドン１００ｍｌ、０．２モルホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．０）１００ｍｌ）に室温で１０分間浸漬した後に蒸留水で洗浄して核酸プローブを固定化したポリ−Ｌ−リジンコートスライドガラスを得た。
【００９８】
［２．固定化された核酸プローブ量の測定］
固定化された核酸プローブの量の測定は、Ｃｙ３標識した蛍光量を定量することによって行った。蛍光量の検出にはＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ａ（インターメディカル社）を用いた。その結果、蛍光強度は２００５であった。この値は本発明の核酸固定化基板を用いた実施例１に比べて低く、従来の方法により製造された核酸固定化基板は強固に核酸プローブが固定化されていないことを示している。
【００９９】
［実施例２　ターゲットＤＮＡの検出］
［１．核酸固定化基板の作製］
Ｃｙ３標識されていない核酸プローブを用いる以外は実施例１と同様にして、核酸プローブが固定化されたスライドガラスを得た。
【０１００】
［２．ターゲットＤＮＡの検出］
ターゲットＤＮＡとして、Ｃｙ５−ｄＵＴＰ（アマシャムバイオサイエンス社）で標識したＨｅＬａ細胞由来ｃＤＮＡをハイブリダイゼーション溶液（６ｘＳＳＣ、０．２重量％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、５ｘデンハルト溶液、０．１ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ）５μｌに溶解したものを、上記（１）で得た本発明にかかる核酸固定化基板に滴下し、カバーガラスで保護した後、湿潤箱中にて６５℃で２０時間インキュベートした。次いでＤＮＡチップを洗浄（２ｘＳＳＣ、０．１重量％のＳＤＳ：室温、５分間、０．２ｘＳＳＣ、０．１重量％のＳＤＳ：４０℃、５分間、２ｘＳＳＣ：室温、５分間）した後、ＤＮＡチップ上の蛍光量の定量を行った。蛍光量の検出にはＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ａ（インターメディカル社）を用いた。その結果、蛍光強度は６５１１であった。
【０１０１】
［実施例３］
［１．長鎖核酸プローブ固定化のためのエポキシ基導入スライドガラスへのオリゴヌクレオチド分子固定化］
実施例１と同様にエポキシ基導入スライドガラスを作製し、これに、核酸プローブであるＢＡＣクローンＲＰ１１−３２９Ｊ７由来のヒトゲノムＤＮＡ（７３０２９塩基）の５’末端側と相補的な、長さ５０塩基の３’末端アミノ化標識オリゴヌクレオチド、および３’末端側と相補的な、長さ５０塩基の５’末端アミノ化標識オリゴヌクレオチドの、０．１モルの混合溶液を滴下し、カバーガラスで保護した後、湿潤箱中にて４℃で２０時間インキュベートした。次にスライドガラスを取り出し、蒸留水で洗浄した後に室温で乾燥させ、オリゴヌクレオチド分子固定化スライドガラスを得た。
【０１０２】
［２．オリゴヌクレオチド分子固定化スライドガラスへの核酸プローブの固定化］
固定化量を測定するためＣｙ３−ｄＵＴＰ（アマシャムバイオサイエンス社）で標識したヒトゲノムＤＮＡ（７３０２９塩基）を１μｇ／μｌになるように３ｘＳＳＣ（標準食塩クエン酸緩衝液）溶液に溶解し核酸プローブ溶液とした。次に、ＧＴＭＡＳＳ　Ｓｔａｍｐｉｎｇ２０００（日本レーザ電子社）を用いて、上記（１）で得たオリゴヌクレオチド分子固定化スライドガラスの所定の位置に前記核酸プローブ溶液をスポットした。次いで、湿潤箱中で５０℃にて２０時間インキュベートし、スライドガラスに固定化されたオリゴヌクレオチド分子に、核酸プローブをハイブリダイゼーションによって固定化させた。次にスライドガラスを取り出し、洗浄（２ｘＳＳＣ：５０℃、５分間、２回）して核酸プローブを固定化したオリゴヌクレオチド分子固定化スライドガラスを得た。
【０１０３】
［３．固定化された核酸プローブ量の測定］
固定化された核酸プローブ量の測定はＣｙ３標識した蛍光量を定量することによって行った。蛍光量の検出にはＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ａ（インターメディカル社製）を用いた。その結果、蛍光強度は１０３００であった。この値は、従来の方法により核酸プローブを固定した下記の比較例に比べて極めて高く、固定化されたオリゴヌクレオチド分子と核酸プローブがハイブリダイゼーションによって強固に固定化されていることを示している。
【０１０４】
［実施例４］
［１．長鎖核酸プローブ固定化のためのエポキシ基導入スライドガラスへのデンドリマー構造体リンカーの導入］
エポキシ基導入スライドガラスに、市販されている試薬の原液である１０重量％のポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーを含むメタノール溶液（市販品名：Ｓｔａｒｂｕｒｓｔ（商標）　（ＰＡＭＡＭ）　Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ，　１０　ｗｔ．　％　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｉｎ　ＭｅＯＨ　（Ｇ４）（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製））１００μｌを塗布し、３７℃で２時間インキュベートした。次に、スライドガラスをメタノールにて洗浄した後に室温で乾燥させ、デンドリマー構造体リンカー導入スライドガラスを得た。
【０１０５】
［２．デンドリマー構造体リンカー導入スライドガラスの活性化］
０．１ＭのＤＣＣ（１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド）を含むＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）溶液１００μｌをデンドリマー構造体リンカー導入スライドガラスに塗布し、３７℃で１２時間インキュベートした。次にスライドガラスを取りだし、ＤＭＦで洗浄し、室温で乾燥させ、活性化デンドリマー構造体リンカー導入スライドガラスを得た。
【０１０６】
［３．活性化デンドリマー構造体リンカー導入スライドガラスへのオリゴヌクレオチド分子の固定化］
核酸プローブであるＢＡＣクローンＲＰ１１‐３２９Ｊ７由来のヒトゲノムＤＮＡ（７３２０２９塩基）の５’末端側と相補的な、長さ５０塩基の３’末端アミノ化標識オリゴヌクレオチド、および３’末端側と相補的な、長さ５０塩基の５’末端アミノ化標識オリゴヌクレオチドの、０．１モルの混合溶液を滴下し、カバーガラスで保護した後、湿潤箱中にて４℃で２０時間インキュベートした。次に、スライドガラスを取り出し、蒸留水で洗浄した後に室温で乾燥させ、オリゴヌクレオチド分子固定化スライドガラスを得た。
【０１０７】
［４．オリゴヌクレオチド分子固定化スライドガラスへの核酸プローブの固定化］
核酸プローブの固定化量を測定するために、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ（アマシャムファルマシアバイオテク社）で標識したヒトゲノムＤＮＡ（７３０２９塩基）を１μｇ／μｌになるように３×ＳＳＣ溶液に溶解し、核酸プローブ溶液とした。次に、ＧＴＭＡＳＳ　Ｓｔａｍｐｉｎｇ　２０００（日本レーザ電子社）を用いて、オリゴヌクレオチド分子固定化スライドガラスの所定の位置に前記核酸プローブ溶液をスポットした。これを湿潤箱中で３７℃にて２０時間インキュベートし、スライドガラスに固定化されたオリゴヌクレオチド分子に、核酸プローブをハイブリダイゼーションによって固定化させた。次にスライドガラスを取り出し、洗浄（２×ＳＳＣ：５０℃、５分間、２回）して核酸プローブを固定化したオリゴヌクレオチド分子固定化スライドガラスを得た。
【０１０８】
［５．固定化された核酸プローブ量の測定］
固定化された核酸プローブ量の測定はＣｙ３標識した蛍光量を定量することによって行った。蛍光量の検出にはＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ａ（インターメヂィカル社製）を用いた。その結果、蛍光強度は１２４２４であった。この値は、従来の方法により核酸プローブを固定した下記の比較例に比べて極めて高く、固定化されたオリゴヌクレオチド分子と核酸プローブがハイブリダイゼーションによって強固に固定化されている事を示している。
【０１０９】
［比較例２］
［１．ポリ−Ｌ−リジンコートスライドガラスへの長鎖核酸プローブの固定化］固定化量を測定するため、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）で標識したヒトゲノムＤＮＡ（７３０２９塩基長）を１μｇ／μｌになるように３ｘＳＳＣ溶液に溶解し、核酸プローブ溶液とした。次に、ＧＴＭＡＳＳ　Ｓｔａｍｐｉｎｇ２０００（日本レーザ電子社）を用いて、ポリ−Ｌ−リジンコートスライドガラスの所定の位置に前記核酸プローブ溶液をスポットした。これを湿潤箱中で室温にて２時間反応させた後、減圧乾燥機で８０℃にて２時間乾燥させた。次にブロッキング溶液（無水コハク酸１ｇ、ｎ−メチル−ピロリドン１００ｍｌ、０．２モルのホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．０）１００ｍｌ）に室温で１０分間浸漬した後に蒸留水で洗浄して核酸プローブを固定化したポリ−Ｌ−リジンコートスライドガラスを得た。
【０１１０】
［２．固定化された核酸プローブ量の測定］
固定化された核酸プローブ量の測定は、Ｃｙ３標識した蛍光量を定量することによって行った。蛍光量の検出にはＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ａ（インターメディカル社製）を用いた。その結果、蛍光強度は３０６２であった。この値は実施例３に比べて低く、核酸プローブが強固には固定化されていないことを示している。
【０１１１】
［実施例５　ターゲットＤＮＡの検出］
［１．核酸固定化基板の作製］
Ｃｙ３標識されていない核酸プローブを用いる以外は実施例３と同様にして核酸プローブが固定化されたスライドガラスを得た。
【０１１２】
［２．ターゲットＤＮＡの検出］
ターゲットＤＮＡとして、Ｃｙ５−ｄＵＴＰ（アマシャムバイオサイエンス社製）で標識したＨｅＬａ細胞由来ゲノムＤＮＡをハイブリダイゼーション溶液（６ｘＳＳＣ、０．２重量％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、５ｘデンハルト溶液、０．１ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ）５μｌに溶解したものを、上記（１）で得た核酸固定化基板に滴下し、カバーガラスで保護した後、湿潤箱中にて６５℃で２０時間インキュベートした。次いでＤＮＡチップを洗浄（２ｘＳＳＣ、０．１重量％のＳＤＳ：室温、５分間、０．２ｘＳＳＣ、０．１重量％のＳＤＳ：４０℃、５分間、２ｘＳＳＣ：室温、５分間）した後、ＤＮＡチップ上の蛍光量の定量を行った。蛍光量の検出にはＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ａ（インターメヂィカル社製）を用いた。その結果、核酸固定化基板の蛍光強度は７０２０であった。一方、デンドリマー構造体をリンカーに用いて製造した実施例４の核酸固定基板を使用して、同様にＣｙ５−ｄＵＴＰで標識したターゲットＤＮＡを検出する実験を行った結果、蛍光強度は１０５９９であった。
【０１１３】
【発明の効果】
本発明に係る核酸固定化基板によれば、比較的長い核酸プローブを、固相担体に複数箇所で強固に安定的に結合することができる。特に、固相担体とオリゴヌクレオチドとを結合するリンカーとして樹枝状分子類を使用することで、核酸プローブをさらに強固に固相担体に結合した核酸固定化基板を得ることができる。このような核酸固定化基板を用いて試料中の核酸を分析する方法によれば、再現性の高いハイブリダイゼーション反応を行うことができ、精度の高い分析が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の核酸固定基板を概念的に示す図である。
【図２】本発明のデンドリマー構造体をリンカーに用いた核酸固定化基板を概念的に示す図である。
【符号の説明】
１　核酸固定基板
１ａ　リンカーを結合に用いた核酸固定化基板
２　固相担体
３　オリゴヌクレオチド分子
４　核酸プローブ
５　共有結合あるいは生物学的結合
６　水素結合
７　リンカー
【図１】
2004041190.tif 000003
【図２】
2004041190.tif 000004