(57)【要約】【課題】本発明の目的は、プローブ担体に固定化した核酸プローブの状態、例えば、配置位置のイメージングやその量的分析を、より正確に行うことができるプローブ担体の分析方法を提供することにある。【解決手段】核酸プローブの固定化領域の多数が担体上にマトリクス状に配置された核酸プローブ担体を飛行時間型二次イオン質量分析法によって分析する際に、核酸プローブをハロゲン原子で標識し、ハロゲン原子を含むフラグメントイオンを検出して、核酸プローブの担体上での状態を分析する。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブの固定化領域の多数が担体上にマトリクス状に配置されたプローブ担体を飛行時間型二次イオン質量分析法によって分析する方法であって、
前記プローブがハロゲン原子で標識され、該ハロゲン原子のフラグメントイオンを検出して、前記プローブの状態を分析することを特徴とするプローブ担体の分析方法。
【請求項２】
前記プローブが規定の数のハロゲン原子を有する請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
一次イオンを、前記担体の分析対象領域の面積に対して相対的に小さな面積を有するスポットとして該分析対象領域全体に対して順次パルス照射して、該パルス照射によって発生する二次イオンを、それぞれのパルス照射ごとに飛行時間的に質量分析して画像化する請求項１または２に記載の分析方法。
【請求項４】
一次イオンのパルス照射を、非連続的パターンに基づいて行い、得られたそれぞれの質量分析の結果を、一次イオンのパルス照射の非連続的パターンに基づいて再構成して画像化する請求項３に記載の分析方法。
【請求項５】
非連続的パターンがランダムなパターンである請求項４に記載の分析方法。
【請求項６】
非連続的パターンが特定のプログラムされたパターンである請求項５に記載の分析方法。
【請求項７】
ハロゲン原子がフッ素、塩素、臭素及びヨウ素原子のいずれか１種である請求項１から５のいずれかに記載の分析方法。
【請求項８】
前記プローブが核酸プローブである請求項１〜７のいずれかに記載の分析方法。
【請求項９】
ハロゲン原子の既定の数が１から前記核酸プローブのヌクレオチド数までのいずれかである請求項８に記載の分析方法。
【請求項１０】
ハロゲン原子の既定の数が１から５個である請求項９に記載の分析方法。
【請求項１１】
前記核酸プローブが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）及びｃＲＮＡ（コンプリメンタリーＲＮＡ）の少なくとも１種である請求項１０に記載の分析方法。
【請求項１２】
ハロゲン原子がプローブのヌクレオチドの塩基に結合している請求項１０または１１に記載の分析方法。
【請求項１３】
前記ハロゲン原子が核酸プローブの、前記核酸プローブが前記標的核酸とハイブリッドを形成する際に、該ハイブリッド形成を阻害しない位置に結合している請求項１２に記載の分析方法。
【請求項１４】
前記ハロゲン原子がピリミジン塩基の５位またはプリン塩基の８位に結合している請求項１２の分析方法。
【請求項１５】
核酸プローブがＤＮＡ核酸プローブであり、ハロゲン原子の該ＤＮＡ核酸プローブへの導入が該ＤＮＡ核酸プローブをＤＮＡ自動合成装置で合成する際に、ハロゲン原子を結合した合成ユニットである２’‐デオキシリボヌクレオシド‐３’‐フォスフォロアミダイトを用いて行なわれる請求項１４に記載の分析方法。
【請求項１６】
前記ハロゲン原子を結合した合成ユニットが以下の構造式で示されるものである請求項１５に記載のＤＮＡチップの分析方法。
【化１】
2004037083.tif 000013
（上記各式において、Ｘはハロゲン原子を、ＤＭＴＯはジメトキシトリチル基を、ｉＰｒはイソプロピル基を、ＣＮＥｔは２‐シアノエチルを表す。）
【請求項１７】
前記核酸プローブがＲＮＡ核酸プローブであり、前記ハロゲン原子の該ＲＮＡ核酸プローブへの導入が、該ＲＮＡ核酸プローブをＲＮＡ自動合成装置で合成する際に、ハロゲン原子を結合した合成ユニットであるリボヌクレオシド‐３’‐フォスフォロアミダイトを用いて行なわれる請求項１４に記載の分析方法。
【請求項１８】
前記核酸プローブがＰＮＡ核酸プローブであり、前記ハロゲン原子の該ＰＮＡ核酸プローブへの導入が、該ＰＮＡ核酸プローブをＰＮＡ自動合成装置で合成する際に、ハロゲン原子を結合した合成ユニットである核酸塩基結合ペプチドアナログを用いて行なわれる請求項１４に記載の分析方法。
【請求項１９】
前記核酸プローブがｃＤＮＡ核酸プローブであり、前記ハロゲン原子の該ｃＤＮＡ核酸プローブへの導入が、該ｃＤＮＡ核酸プローブを逆転写酵素を用いて伸展合成する際に、ハロゲン原子を結合した２’‐デオキシリボヌクレオシド‐５’‐三リン酸を用いて行なわれる請求項１４に記載の分析方法。
【請求項２０】
前記核酸プローブがゲノムＤＮＡから誘導されたＤＮＡ核酸プローブであり、前記ハロゲン原子の該ＤＮＡ核酸プローブへの導入が、該ＤＮＡ核酸プローブをＤＮＡポリメレースによって伸展合成する際に、ハロゲン原子を結合した２’‐デオキシリボヌクレオシド‐５’‐三リン酸を用いて行われる請求項１４に記載の分析方法。
【請求項２１】
前記核酸プローブがｃＲＮＡ核酸プローブであり、前記ハロゲン原子の該ｃＲＮＡ核酸プローブへの導入が、該ｃＲＮＡ核酸プローブをＲＮＡポリメレースによって伸展合成する際に、ハロゲン原子を結合したリボヌクレオシド‐５’‐三リン酸を用いて行なわれる請求項１４の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、飛行時間型二次イオン質量分析法によって担体上にマトリクス状に固定化された核酸プローブの状態を分析する方法に関し、例えば多数の核酸プローブが固定化された担体表面上のマトリクスをイメージングしたり、マトリクスを構成する核酸プローブを量的に分析する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡチップ、ＲＮＡチップ等の核酸チップはゲノム解析、あるいは、遺伝子の発現解析などの目的に利用されるようななってきており、また、それらの解析の結果は、癌、遺伝病、生活習慣病、感染症等の診断、予後予想、治療方針の決定等に重要な指標を提供するものと期待されている。
【０００３】
核酸チップの作製方法にはいくつかの方法が知られている。ＤＮＡチップを例にとって説明すると、基板上にフォトリソグラフィーを用いてＤＮＡ核酸プローブを逐次的に合成していく方法（米国特許第５４０５７８３公報等）、あるいは、あらかじめ合成したＤＮＡ、または、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）を基板上に供給し結合する方法（米国特許第５６０１９８０公報、日本特許公開公報平１１‐１８７９００号公報、Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｖｏｌ．２７０，　４６７，　１９９５等）が代表的なＤＮＡチップの作製である。
【０００４】
一般的には、これらいずれかの方法によって核酸チップが作製されるが、これらの核酸チップを先に述べた用途に使用しようとする場合、解析の信頼性、すなわち、定量性、再現性を保証するためには各マトリクスに存在する核酸プローブ、すなわち、この場合では核酸の量、つまり、密度を知ることが重要である。また、実際にどのようなマトリクス形状（形状、サイズ、状態）で存在するかを知ること（イメージング）も、やはり、定量性、再現性の確保といった見地から重要である。さらに、特に後述するように、チップ作製のための基板に、マトリクスの位置を示すための物理的アドレスが存在しない場合に、例えば、インクジェット法によって核酸プローブ溶液を微小な液滴として供給するような手法でチップを作製すると、物理的アドレスがないので、検出の手段によっては、チップのどの部分を分析しているのかわからないという問題をかかえることになる。そのような場合は、採用している検出手段そのものによるマトリクス位置の顕影化が必要になる。
【０００５】
しかし、チップ上の核酸プローブは原理的に単分子膜レベルで存在するので、基本的に、これらの分析はきわめて高感度な表面解析技術が必要となる。
【０００６】
これらの高感度な表面解析技術としては、核酸プローブをアイソトープラベルする方法が知られてはいるが、手法が煩雑、危険、特殊な施設、装置が必要等の理由で一般的ではない場合が多い。
【０００７】
別の方法としては核酸プローブを蛍光標識する方法、または、核酸プローブと特異的に結合する物質に蛍光標識を施し、これと核酸プローブを結合させる方法、すなわち、蛍光ハイブリダイゼーション法が考えられるが、蛍光色素の安定性、クエンチング、蛍光色素の基板表面への非特異的吸着、また特異的結合（ハイブリダイゼーション）の定量性（安定性、再現性）等に問題がある場合があり、核酸プローブ自体の存在量を定量的に把握するには課題が残る。
【０００８】
他に、一般的な高感度表面分析手段としてはＦＴ−ＩＲ（フーリエ変換赤外分光）法を用いたＡＴＲ法、ＸＰＳ（Ｘ線光電子分光）法等があるが、いずれも核酸チップの核酸プローブの定量的分析、あるいは、イメージングには十分な感度を有しているとはいえない。特に、核酸チップの基板として一般的なガラスを用いる場合には、例えばＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）ではガラスに起因する吸収の影響、ＸＰＳではチャージアップの影響等があり、有効な分析手段とはいえない場合が多い。
【０００９】
また、別の高感度表面分析手段としては、レーザー共鳴イオン化法（ＲＩＳ：Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）によるＤＮＡの検出方法が米国特許第５８２１０６０公報に開示されている。これは試料表面から放出される注目元素のイオン化エネルギーに相当する波長のレーザービームを照射して当該元素をイオン化し検出するもので、試料表面から元素を放出させる手段としては、レーザービームを用いる方式、イオンを用いる方式が開示されているが、特定元素の検出しかできない場合があるという問題を持つ。
【００１０】
さらに他の高感度表面分析手段としては、動的二次イオン質量分析法（ｄｙｎａｍｉｃ−ＳＩＭＳ）があるが、この手法は二次イオンが生成する過程で有機化合物が小さいフラグメントイオン、または粒子にまで分解してしまうために質量スペクトルから得られる化学構造情報が乏しくなり、例えば、核酸関連物質のような有機物の分析には適していない。
【００１１】
これに対して、同じく二次イオン質量分析法の一手法として知られている、飛行時間型二次イオン質量分析（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）法は、固体試料の最表面にどのような原子または分子が存在するかを調べるための分析方法であり、以下の様な特長を持つ。すなわち、１０９ａｔｏｍｓ／ｃｍ２（最表面１原子層の１／１０５に相当する量）の極微量成分の検出能があること、有機物、無機物のどちらにも適用できること、表面に存在するすべての元素や化合物を測定できること、試料表面に存在する物質からの二次イオンのイメージングが可能なことである。
【００１２】
以下、この方法の原理を簡単に説明する。高真空中で、高速のイオンビーム（一次イオン）を固体試料表面に照射すると、スパッタリング現象によって表面の構成成分が真空中に放出される。このとき発生する正または負の電荷を帯びたイオン（二次イオン）を電場によって一方向に収束し、一定距離だけ離れた位置で検出する。スパッタの際には、試料表面の組成に応じて様々な質量をもった二次イオンが発生するが、軽いイオンほど早く、反対に重いイオンほど遅い速度で飛行するため、二次イオンが発生してから検出されるまでの時間（飛行時間）を測定することで、発生した二次イオンの質量を分析することができる。
【００１３】
従来のｄｙｎａｍｉｃ−ＳＩＭＳでは、すでに述べたように、イオン化の際に有機化合物が小さいフラグメントイオンまたは粒子にまで分解してしまうため、質量スペクトルから得られる化学構造情報が乏しいのに対し、ＴＯＦ−ＳＩＭＳでは一次イオン照射量が著しく少ないため、有機化合物は化学構造を保った状態でイオン化され、質量スペクトルから有機化合物の構造を知ることができる。固体試料表面の最も外側で発生した二次イオンのみが、真空中へ放出されるので、試料の最表面　（深さ数Å程度）の情報を得ることができる。
【００１４】
ＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置には大きく分けてセクター型とリフレクトロン型のふたつのタイプがある。これらの方法の違いのひとつは被分析試料を固定するホルダの電気的な接地方法である。セクター型では装置の機構上、上記ホルダに数ｋＶの正または負の電圧を印加することで二次イオンを質量分析計に導いているのに対し、リフレクトロン型ではホルダは接地され、二次イオン引き出し電極に数ｋＶから数１０ｋＶの正または負の電圧を印加することで二次イオンを質量分析計に導いている。
【００１５】
ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法では正の一次イオンが多用されるが、一次イオンの極性にかかわらず正の二次イオンと負の二次イオンが発生する。また、一次イオンの極性にかかわらず、一般的な測定条件では一次イオンの照射により二次電子が発生し、この二次電子の発生量が一次イオン量に比べて多量であるために、結果として被分析試料の表面は正に帯電し易く、この帯電電荷が過剰になると（いわゆるチャージアップ状態）測定に支障をきたすことになる。その際、装置構成を考えると、セクター型装置を用いて絶縁物の負の二次イオンを測定する場合に最も大きく正に帯電し得るといえる（発生した二次電子がすべて、上記の正電圧を印加した二次イオン引き出し電極に向かってしまうため）。
【００１６】
上記の正帯電を中和するため、セクター型、リフレクトロン型の両タイプとも帯電中和用のパルス型電子銃を装備することが多い。この電子銃による具体的な帯電中和方法とは、一次イオン（サブ〜数ｎｓｅｃパルス）照射、正または負の二次イオンの飛行時間計測の後、次の一次イオンパルスを照射するまでの間に、上記パルス型電子銃からの電子線を被分析試料に一定時間照射する、というものである。なお、上記電子線を被分析試料に照射する間は、セクタ型ーにおける試料ホルダへの電圧印加、および、リフレクトロン型における二次イオン引き出し電極への電圧印加はともに停止され、接地される。
【００１７】
この方法により、上記の正帯電は緩和され（若しくは解消し）、絶縁物の分析が可能となることが多いが、上記の説明と同様、セクター型装置を使った絶縁物の測定で、負の二次イオンを測定する場合が最も大きく正に帯電し易いため、帯電中和のマージンはこの場合が最も狭い。いずれにしても、チャージアップを回避するには、試料ホルダが電気的に接地されているリフレクトロン型の装置を使う方が、セクター型装置を使うよりも（一般的には）有利である。特に被分析試料の導電率が低い場合（抵抗率が高い、もしくは、誘電率が高いと言い換えることができる）、例えば、ガラス等の場合にはリルレクトロン型の方が測定に適しているといえる。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
さて、リフレクトロン型であれ、セクター型であれ、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法はきわめて感度の高い分析方法であるために、チャージアップの影響が少ない、例えば、金基板上に単分子膜レベルで形成されたオリゴヌクレオチドを分析することが可能である（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　１２ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　Ｉｏｎ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ　９５１，　１９９９）。上記文献には、基板に固定化されたＤＮＡ、および、ＰＮＡのＴＯＦ−ＳＩＭＳ法による分析結果が記載されており、それによれば、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法によって検出されるフラグメントイオンとして、ＤＮＡ核酸プローブの場合にはリン酸バックボーン由来のＰＯ２ー、とＰＯ３ーイオン、塩基由来の（チミン−Ｈ）ーイオンが、また、ＰＮＡ核酸プローブの場合には、やはり（チミン−Ｈ）ーイオンがあげられている。これらのほかに検出され得るフラグメントイオンがあったとしても、それらは、基本的にＤＮＡ、ＰＮＡの基本構造由来のものとならざるを得ない。
【００１９】
上述のように、核酸チップを用いての標的物質の定量的な検出を行おうとした場合、チップ上の核酸プローブ量の量的な把握が極めて重要となるが、チップに搭載されている各マトリクスの核酸は、場合により、鎖長、塩基配列がそれぞれに異なることとなるため、上述のように核酸に本来的に固有であるフラグメントイオンのみしか検出できない場合、チップ上の核酸プローブ量の更に正確な量的把握は困難となる場合が生じる。また、ＤＮＡ核酸プローブ、ＲＮＡ核酸プローブの場合には、ＰＯ２ー、ＰＯ３ーイオンは、イオン化効率も比較的高く、全てのヌクレオチドに結合しているので、検出自体は比較的容易ではあるが、ＰＮＡ核酸プローブの場合を含めて核酸プローブに４種の塩基がランダムに含まれている場合には、塩基のフラグメントイオンを検出しようとすると、数的に不利であり、また、イオン化効率もそれほど高くないので、検出自体も比較的困難となる場合が多い。
【００２０】
すなわち、従来技術にはない、更に改善された検出効率と定量的な検出が可能なフラグメントイオンを供出可能な核酸プローブの標識方法が望まれていた。
【００２１】
このようなフラグメントイオンの供出方法として、特開昭６１‐１１６６５号公報には電気泳動法、液体クロマトグラフィー法、高速ゲルろ過法により分子量分離した核酸断片に、Ｓ、Ｂｒ、Ｉ、等の非金属元素、または、Ａｇ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｏｓ、Ｈｇ等の金属元素を導入して、これらの元素を原子吸光分析法、プラズマ発行分析法、または、質量分析法によって同定する手段を設けた核酸塩基検出装置に関する記載があるが、質量分析装置に関する具体的な記載、また、特にハロゲン原子の核酸への導入方法に関しての記載はない。
【００２２】
一方、チップ上の核酸プローブの量的把握を別の観点からみると、実際に核酸プローブ領域として形成されているマトリクスそのものを分析する必要がある。特開平１１−１８７９００号公報にひとつの例として記載されているＤＮＡチップの作製方法を用いて、あらかじめ合成されたＤＮＡ核酸プローブの溶液をインクジェット法で基板表面へ吐出、結合せしめる場合、上述したように、基板上でマトリクス（吐出されたＤＮＡが結合されたスポット）の位置を知る手段がない場合があり、そのような場合にはＴＯＦ−ＳＩＭＳ法によって、スポットをイメージングして、イメージングされたスポットにおけるフラグメントイオンの分析が為されることが望ましい。しかしながら、上記、特開平１１−１８７９００号公報にはそのような記載がなく、また、特開昭６１‐１１６６５号公報には上述のように、質量分析法には言及があるが、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法による核酸チップのイメージング方法と、核酸チップ上の核酸の量的分析に関しては全く記載されていない。
【００２３】
さて、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法により核酸チップのイメージングと、核酸チップ上の核酸の量的分析を行おうとした際、スポットのサイズ、あるいは、検出の効率等を勘案すると、イメージングされるエリアの面積は、例えば、３００μｍ×３００μｍ以上が望ましいが、ＤＮＡチップの作製のための基板として、よく用いられるガラス等の比較的抵抗率の高い基板を用いて、３００μｍ×３００μｍの範囲を、一次イオンビーム直径を必要な解像度を得るための５μｍで、テレビの受像機のように一定の方向にビームを順次スキャン（ラスタースキャン）し、画像を得ようとすると、チャージアップの影響が大きく、良好な画像を得ることができないことになる。
【００２４】
本発明の目的は、プローブ担体に固定化したプローブの状態、例えば、配置位置のイメージングやその量的分析を、より正確に行うことができるプローブ担体の分析方法を提供することにある。
【００２５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記、ＴＯＦ−ＳＩＭＳを用いて、比較的抵抗率の高い担体上に形成されたプローブの固定化領域を含む比較的面積の大きな部分のイメージングと、プローブの量的把握を行う際の課題を検討して結果、以下の発明を為すに至った。
【００２６】
すなわち、本発明のプローブ担体の分析方法は、プローブの固定化領域の多数が担体上にマトリクス状に配置されたプローブ担体を飛行時間型二次イオン質量分析法によって分析する方法であって、前記プローブがハロゲン原子で標識され、該ハロゲン原子のフラグメントイオンを検出して、前記プローブの状態を分析することを特徴とするプローブ担体の分析方法である。
【００２７】
本発明によれば、プローブ担体に固定化したプローブの状態、例えば、配置位置のイメージングやその量的分析を、より正確に行うことができる。
【００２８】
【発明の実施の形態】
本発明においては、担体上に固定化されたプローブの状態、例えば配置位置やその量の分析が、プローブに標識したハロゲン原子に基づくイオンフラグメントを飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）での検出により行われる。すなわち、ＴＯＦ−ＳＩＭＳを用いてプローブ担体のイメージングと分析を行うにあたり、プローブ担体上のプローブを好ましくは既定の数のハロゲン原子で標識し、ハロゲン原子のフラグメントイオンをＴＯＦ−ＳＩＭＳ法によって検出、分析する。ハロゲン原子はイオン化効率が比較的高いので、そのフラグメントイオンを用いての検出の感度の向上が期待できるとともに、一次イオン強度を低減することによりチャージアップの影響も、その分排除でき、後述する方法と合わせて、抵抗率の高い基板上での大面積のイメージングが可能となる。
【００２９】
また、既定の数のハロゲン原子で標識することにより、上述した核酸固有のフラグメントイオンのみを検出する場合の問題点を解決し、より定量性の高い分析が可能となる。
【００３０】
担体上に固定されるプローブは、特定の標的物質に対して特異的に結合可能なものであって、原理的には核酸のみならず、ハロゲン原子によって標識可能な物質、例えば、抗原、抗体、酵素等のタンパク質、また酵素と特異的に結合する基質等にも本発明の方法を応用することができる。担体上に支持されるプローブの一例としては、標的核酸とハイブリダイゼーション可能な塩基配列よりなるオリゴヌクレオチドの一部に必要に応じてリンカーを介して担体との結合部を有するもので、担体との結合部において担体表面に連結された構造を有するものを挙げることができる。なお、このような構成の場合における担体と結合部のオリゴヌクレオチドの分子内での位置は、所望とするハイブリダイゼーション反応を損なわない範囲内において特に限定されない。
【００３１】
本発明におけるプローブ担体は、プローブを固定化した独立領域、例えばドット状スポットの多数を所定の間隔をおいてマトリクス状に配置したもので、この形態には、プローブ・アレイ、マイクロチップ、核酸チップなどが含まれる。
【００３２】
一方、プローブは担体表面に結合可能な構造を有しており、担体上へのプローブの固定がこの結合可能な構造を介して行われていることが望ましい。その際、プローブが有する担体表面に結合可能な構造は、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、水酸基、酸ハライド化物（ハロホルミル基；−ＣＯＸ）、ハライド化物（−Ｘ）、アジリジン、マレイミド基、スクシイミド基、イソチオシアネート基、スルフォニルクロリド基（−ＳＯ２Ｃｌ）、アルデヒド基（ホルミル基；−ＣＨＯ）、ヒドラジン及びヨウ化アセトアミドなどの有機官能基の少なくとも１種を導入する処理により形成されたものであることが好ましい。また、プローブ側の担体への結合に必要な構造に応じて、担体の表面に必要とされる処理、例えばチオール基用のマレイミド基、アミノ基用のエポキシ基、アルデヒド基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基などを担体表面に形成する処理を施すことで共有結合によるプローブの固定が可能となる。なお、プローブは安定性を考えると、基板表面に共有結合によって結合されていることが望ましい。
【００３３】
本発明で用いるプローブが核酸からなる場合は、その種類は特に限定されるものではないが、後述のハロゲン原子による標識方法を勘案するとＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）、ｃＲＮＡ（コンプリメンタリーＲＮＡ）のいずれかであることが望ましく、これらの少なくとも１種からなる核酸プローブを担体に固定化することができる。
【００３４】
本発明ではプローブ担体のイメージング方法として、一次イオンを、該プローブ担体表面の特定の面積を有する部分（分析対象領域）に対して、該面積に対して相対的に小さな面積を有するスポットとしてパルス的に順次照射して、該パルス照射によって発生する二次イオンを、それぞれのパルス照射ごとに飛行時間的に質量分析する方法を用いるが、その際、チャージアップの影響を排除する方法として、一次イオンのパルス照射を、非連続的パターンに基づいて行い、得られたそれぞれの質量分析の結果を、一次パルス非連続的照射のパターンに基づいて再構成して画像化することが極めて有効で望ましい形態である。
【００３５】
その場合、非連続的パターンとして、ランダムなパターン、あるいは、特定のプログラムに従った非連続的なパターンを例としてあげることができる。
【００３６】
図２に、照射における連続的パターン（１）と非連続パターン（２）の例を示す。この場合、例えば、矩形のエリアを５×５個のスポットで一次イオンパルスを照射するとすると、図２の（１）のように、ひとつのスポットから隣接するスポットに順次全てのスポットを照射するパターンが連続的パターンであり、ひとつのスポットを照射し、次ぎに、すくなくとも隣接しないスポットを順次、全てのスポットを照射する図（２）パターンが非連続的パターンである。
【００３７】
非連続的パターンを乱数に基づいてランダムに形成することも場合によっては可能であるが、その場合には隣接したスポットを連続して照射する可能性もあるので、そのような場合にはあらかじめ、望ましい特定のプログラムにしたがった非連続パターンを形成しておけば良い。望ましいパターンとしては、上述のように、隣接したスポットを連続して照射しない、あるいは、隣接した行、列に存在するスポットを連続して照射しないなどのアルゴリズムが適宜採用できる。
【００３８】
ハロゲン原子の標識の数に関しては特に限定されず、標識の位置、標識方法も、それが可能であり、後のプローブと標的物質との結合体の形成（核酸であればハイブリッド形成（ハイブリダイゼーション））を阻害しければ、いかような方法も可能であるが、実際には、ひとつのプローブ分子に対し一個所の標識が現実的である。その意味では、ハロゲン原子の既定の数は、核酸の場合は１から核酸プローブのヌクレオチド数までのいずれかであることが望ましく、核酸が合成オリゴヌクレオチドの場合には、標識の手間、コスト、また、ハロゲン原子のイオン化効率の高さ等を勘案して１から５個であれば、さらに望ましいといえる。また、ＰＣＲ法のように酵素伸長反応を用いて標識の導入を図ろうとする場合、標識が蛍光色素のように比較的大きな場合には立体障害等により標識導入数に限りがあるが、標識がハロゲン原子であれば、例えば、１種類の塩基（例えばアデニン）を全て標識することが可能であるので、標識数を定量的に把握できるとともに、感度、標識導入方法の点からも望ましいといえる。
【００３９】
ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素原子を挙げることができ、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法ではフッ素、塩素、臭素、ヨウ素原子の各フラグメントイオンが検出可能である。これらの４種のハロゲン原子は、例えば以下に記載される方法によりプローブに導入可能である。
【００４０】
プローブ担体の各マトリクスのプローブを、それぞれ別のハロゲン原子によって標識しても良い。
【００４１】
ハロゲン原子のプローブへの導入方法についても、特に限定されないが、よく知られている例としては、ハロゲン原子を核酸プローブのヌクレオチドの塩基に結合させる方法をあげることができ、本発明でも、この方法を好適に用いることができる。その際、ハロゲン原子が核酸プローブの、該核酸プローブが標的核酸とハイブリッドを形成する際に、該ハイブリッド形成を阻害しない位置に結合していることが望ましい。そのような位置は、ピリミジン塩基の５位、プリン塩基の８位である。ただし、核酸プローブの全てのヌクレオチド塩基のハロゲン原子がこの位置に結合していることは必ずしも必須ではない。
【００４２】
ハロゲン原子の核酸プローブへのより具体的な方法としては、核酸プローブがＤＮＡ核酸プローブの場合、ＤＮＡ核酸プローブをＤＮＡ自動合成装置で合成する際に、ハロゲン原子を結合した合成ユニット、すなわち、以下に構造式で示す２’‐デオキシリボヌクレオシド‐３’‐フォスフォロアミダイトを用いる方法を例としてあげることができる。
【００４３】
【化２】
2004037083.tif 000002
【００４４】
（上記各式において、Ｘはハロゲン原子を、ＤＭＴＯはジメトキシトリチル基を、ｉＰｒはイソプロピル基を、ＣＮＥｔは２‐シアノエチルを表す。）
また、核酸プローブがＲＮＡ核酸プローブの場合には、ＲＮＡ核酸プローブをＲＮＡ自動合成装置で合成する際に、ハロゲン原子を結合した合成ユニット、すなわち、リボヌクレオシド‐３’‐フォスフォロアミダイトを用いればよく、そのような合成ユニットの例として、以下に構造式の化合物をあげることができる。
【００４５】
【化３】
2004037083.tif 000003
【００４６】
（上記各式において、Ｘはハロゲン原子を、ＤＭＴＯはジメトキシトリチル基を、ｉＰｒはイソプロピル基を、ＣＮＥｔは２‐シアノエチルを、Ｍｅはメチル基を、ＴＢＤＭＳはｔ−ブチルジメトキシシリル基を表す。）
さらに、核酸プローブがＰＮＡ核酸プローブの場合では、ＰＮＡ核酸プローブをＰＮＡ自動合成装置で合成する際に、ハロゲン原子を結合した合成ユニット、すなわち、核酸塩基結合ペプチドアナログを用いれば好適である。
【００４７】
また、核酸プローブがｃＤＮＡ核酸プローブの場合には、ｃＤＮＡ核酸プローブを逆転写酵素によって伸展合成する際に、ハロゲン原子を結合した２’‐デオキシリボヌクレオシド‐５’‐三リン酸を用いる方法がハロゲン原子導入法の例としてあげることができる。
【００４８】
核酸プローブがゲノムＤＮＡから誘導されたＤＮＡ核酸プローブの場合には、ハロゲン原子の該ＤＮＡ核酸プローブへの導入が該ＤＮＡ核酸プローブをＤＮＡポリメレースによって伸展合成する際に、ハロゲン原子を結合した２’‐デオキシリボヌクレオシド‐５’‐三リン酸を用いる方法を例としてあげることができ、核酸プローブがｃＲＮＡ核酸プローブの場合には、ハロゲン原子の該ｃＲＮＡ核酸プローブへの導入が該ｃＲＮＡ核酸プローブをＲＮＡポリメレースによって伸展合成する際に、ハロゲン原子を結合したリボヌクレオシド‐５’‐三リン酸を用いて行うことができる。
【００４９】
上記の各伸展反応にはＰＣＲ反応、またはＲＴ‐ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）反応を用いることも可能である。
【００５０】
【実施例】
以下に実施例をあげて本発明を具体的に説明する。
実施例１　（核酸プローブチップの作製）
特開平１１−１８７９００号公報に記載の方法に準じて核酸プローブチップを作製した。
（１）基板洗浄
２５．４ｍｍ×２５．４ｍｍ×１ｍｍの合成石英基板をラックに入れ、純水で１０％に稀釈した超音波洗浄用洗剤（ブランソン：ＧＰＩＩＩ）に一晩浸した。その後、洗剤中で２０分間超音波洗浄を行い、その後、水洗により洗剤を除去した。純水ですすいだ後、純水の入った容器中でさらに超音波処理を２０分間行った。次に、予め８０℃に加温した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に基板を１０分間浸した。引き続き水洗、純水洗浄を行って、そのまま次工程に供した。
（２）表面処理
アミノ基を結合したシランカップリング剤、Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン　ＫＢＭ６０３（信越化学工業）の１ｗｔ％水溶液を室温下で２時間攪拌し、上記シラン化合物の分子内のメトキシ基を加水分解した。次いでこの溶液に上記（１）で得た基板を室温で１時間浸漬した後、純水で洗浄し、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に基板を１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークして最終的に基板表面にアミノ基を導入した。
【００５１】
次いでＮ−マレイミドカプロイロキシスクシンイミド（同仁化学研究所：以下ＥＭＣＳ）２．７ｍｇを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／エタノールの１：１溶液に濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなる様に溶解した。シランカップリング処理を行った石英基板をこのＥＭＣＳ溶液に室温で２時間浸漬して、シランカップリング処理によって基板表面に担持されているアミノ基とＥＭＣＳ溶液のスクシイミド基を反応させた。この段階で基板表面にはＥＭＣＳ由来のマレイミド基が存在することになる。ＥＭＣＳ溶液から引き上げた基板はＤＭＳＯ及びエタノールの混合溶媒及びエタノールで順次洗浄した後、窒素ガスを吹き付けて乾燥させた。
【００５２】
（３）核酸プローブＤＮＡの合成
ＤＮＡ合成業者（ベックス）に依頼して配列番号：１から３の一本鎖核酸を合成した。塩基Ｔは通常の２’‐デオキシチミジンを示し、また、ＵＢｒは５‐ブロモ‐２’‐デオキシウリジンであり、合成時に以下に示すフォスフォロアミダイト体（グレンリサーチ社）を用いて導入した。
【００５３】
【化４】
2004037083.tif 000004
【００５４】
なお、３’末端のＵ（Ｂｒ）は下記に示す、Ｕ（Ｂｒ）結合ＣＰＧカラム（グレンリサーチ）を用いて導入した。臭素を導入したウラシルの５位はハイブリダイゼーションを阻害しないことが知られている。
【００５５】
【化５】
2004037083.tif 000005
【００５６】
またこれらのＤＮＡの５’末端には合成時にチオールモディファイア（グレンリサーチ社）を用いる事によってチオール（ＳＨ）基を導入した。なお、脱保護、ＤＮＡの回収は定法により行い、また、精製にはＨＰＬＣを用いた。合成から精製までの一連の工程はすべて合成業者に依頼して行った。
2004037083.tif 000006
（４）サーマルジェットプリンターによるＤＮＡ吐出、および基板への結合
上記配列番号：１から３の一本鎖ＤＮＡを８μＭの濃度でグリセリン７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、及び、アセチレンアルコール（商品名：アセチレノールＥＨ；川研ファインケミカル（株）社製）１ｗｔ％を含む溶液にそれぞれ溶解した。サーマルジェット法の一種であるバブルジェット法を用いたバブルジェットプリンターＢＪＦ−８５０（キヤノン）用のプリンターヘッドＢＣ−５０（キヤノン）を数１００μｌの溶液を吐出可能とするべく改造し、このヘッドを上記石英基板上へ吐出可能となるよう改造した吐出描画機に搭載した。このヘッドの改造タンク部に上記ＤＮＡ溶液を数各ＤＮＡに関して１００μｌ注入し、吐出描画機にＥＭＣＳ処理基板３枚を装着して、ここに３種ＤＮＡの溶液を各１枚ｎ基板にスポッティングした。なお、スポッティング時の吐出量は４ｐｌ／ｄｒｏｐｌｅｔで、スポッティングの範囲は基板の中央部に１０ｍｍ×１０ｍｍの範囲に２００ｄｐｉすなわち１２７μｍのピッチで吐出した。この条件ではスポッティングされたドットの直径は約５０μｍであった。
【００５７】
スポッティング終了後、基板を３０分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス板表面のマレイミド基と核酸プローブ末端のチオール基とを反応させた。次いで、基板を純水で洗浄し、純水中で保存した。ＤＮＡ結合基板（ＤＮＡチップ）はＴＯＦ−ＳＩＭＳによる分析直前に窒素ガスを吹き付けて乾燥し、真空デシケーター中でさらに乾燥した。
【００５８】
実施例２（ＴＯＦ−ＳＩＭＳによるイメージング、分析）
（１）実施例１で作製したＤＮＡチップのイメージング、および、分析をＩＯＮ　ＴＯＦ社製ＴＯＦ−ＳＩＭＳ　ＩＶを用いて行った。以下に装置条件をまとめた。
＜一次イオン＞
一次イオン：２５ｋＶ　Ｇａ＋、ランダムスキャンモード
一次イオンのパルス周波数：２．５ｋＨｚ（４００μｓｅｃ　／　ｓｈｏｔ）
一次イオンパルス幅：１ｎｓ
一次イオンビーム直径：５μｍ
＜二次イオン＞一次イオンの照射パターンについて再構成しイメージング
二次イオン検出モード：ｎｅｇａｔｉｖｅ
測定領域：３００μｍ×３００μｍ
二次イオンｉｍａｇｅのｐｉｘｅｌ数：１２８×１２８
積算回数：２５６
（２）結果
図１に実施例１で作製したＤＮＡチップをＴＯＦ−ＳＩＭＳ　ＩＶ型装置で上記条件に基づき分析し、得られたデータから臭素イオンについてイメージングを行った結果を示す。図１（１−１）及び（１−２）は配列番号：１、図１（１−３）及び（１−４）は配列番号：２、図１（１−５）及び（１−６）は配列番号：３に関するイメージで、図１の（１−１）、（１−３）及び（１−５）は７９Ｂｒーイオン、図１（１‐２）、（１−４）及び（１−６）は８１Ｂｒーイオンにそれぞれ由来するものである。
【００５９】
【表１】
2004037083.tif 000007
【００６０】
表１は図１から各１個のスポットのカウント数を示したものである。図１、および、表１からＤＮＡチップ上の臭素標識ＤＮＡのスポットの標識物質である臭素によるイメージングと、相対的にではあるが、定量的な把握が可能であることがわかる。
【００６１】
実施例３　（ゲノム由来の臭素標識ＤＮＡチップのイメージング、分析）
（１）ゲノム由来の臭素標識ＤＮＡチップの作製
Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ．　１８，　４３８，　２０００にはヒト口腔扁平上皮癌のふたつのセルライン、ＨＳＣ４とＨＳＣ５のゲノムＤＮＡのエキソン７の変異を検出するためのオリゴヌクレオチドチップの作製と、このチップを用いての、上記エキソンから誘導された蛍光標識ＤＮＡの検出に関して記載されている。
【００６２】
本実施例では上記方法に準じて、標識を蛍光から臭素に替えてＤＮＡを合成し、さらに、このＤＮＡを用いて、Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｖｏｌ．２７０，　４６７，　１９９５の方法（同文献はｃＤＮＡチップの作製）に準じてＤＮＡチップを作製した。
【００６３】
以下に具体的な手順について述べる。
▲１▼ゲノム由来の臭素標識ＤＮＡの合成
2004037083.tif 000008
【００６４】
【化６】
2004037083.tif 000009
【００６５】
まず、配列番号：３、４のＰＣＲプライマー（ＨＳＣ４、ＨＳＣ５に共通：ベックスに合成依頼）を用いて、ＨＳＣ４のゲノムからエキソン７の部分をＰＣＲ反応で合成した。すなわち、２０ｎｇのゲノムＤＮＡと各０．４μＭのセンス、アンチセンスプライマーを含む５０μｌのＰＣＲミクスチャーを９４℃（３０ｓｅｃ）、６０℃（４５ｓｅｃ）のサイクルを４０回繰り返してＰＣＲ増幅を行った。得られる鎖長は１７１ヌクレオチドと設計されている。
【００６６】
次に、上記増幅産物の一部を鋳型として、０．２μＭのセンスプライマー（配列番号：４）と、上図に構造を示した臭素標識ヌクレオチドの一種である、５‐ブロモ‐２’‐デオキシウリジン三リン酸（シグマ・アルドリッチ・ジャパン）を１０μＭで用いてｓｓＰＣＲ（一本鎖ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲサイクルは９６℃（３０ｓｅｃ）、５０℃（３０ｓｅｃ）、６０℃（４ｍｉｎ）、２５サイクルである。なお、得られた臭素標識一本鎖ＤＮＡはゲルろ過によって精製した。
▲２▼ＤＮＡチップの作製
ＥＭＣＳ処理した基板の替わりに、ポリリジンを塗布したスライドグラス（シグマ・アルドリッチ・ジャパン）を基板として、実施例１と同様な方法によりバブルジェット法を用いて、上記臭素標識一本鎖ＤＮＡを吐出してＤＮＡチップを作製した。ＤＮＡ溶液を吐出した基板を保湿容器に２時間放置した後、純水で洗浄後、窒素ガスで純水を吹き付けて乾燥し、さらに、１００℃で１時間加熱乾燥し、ＴＯＦ−ＳＩＭＳによる分析まで真空デシケーター中で保存した。
▲３▼ＴＯＦ−ＳＩＭＳによるイメージング、分析
実施例３と同様な条件で▲２▼のＤＮＡチップのＴＯＦ−ＳＩＭＳでのイメージング、および、分析を行った。数値データのみを表２に示した。
【００６７】
【表２】
2004037083.tif 000010
【００６８】
表２からゲノムから誘導し、かつ、臭素ラベルをほどこしたＤＮＡ核酸プローブからなるＤＮＡチップのＴＯＦ−ＳＩＭＳによる量的把握が可能であることがわかる。
【００６９】
なお、本実施例とほぼ同様の方法によりｍＲＮＡから誘導したｃＤＮＡのハロゲン原子による標識とＴＯＦ−ＳＩＭＳによるイメージング、および、量的分析も可能である。
【００７０】
【発明の効果】
本発明により、飛行時間型二次イオン質量分析法を用いて、プローブ担体上のハロゲン標識核酸プローブのハロゲン原子を分析することにより、核酸プローブのイメージングを行うと同時に、量的把握が可能となった。
【００７１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２のイメージング結果を示す図であり、（１−１）は配列番号：１、７９Ｂｒーイオンでの結果を、（１−２）は配列番号：１、８１Ｂｒーイオンでの結果を、（１−３）は配列番号：２、７９Ｂｒーイオンでの結果を、（１−４）は配列番号：２、８１Ｂｒーイオンでの結果を、（１−５）配列番号：３、７９Ｂｒーイオンでの結果を、（１−６）は配列番号：４、８１Ｂｒーイオンでの結果をそれぞれ示す。
【図２】イメージング用の一次イオン照射におけるスポットの連続照射（１）と非連続照射（２）について説明するための図であり、（２）における番号はスポットの照射順を示す。
【図１】
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【図２】
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