(57)【要約】【課題】本発明は、精製Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ空胞形成毒素およびＨ．ｐｙｌｏｒｉ感染に対する防御抗体の生成に本毒素を使用する方法を提供することを課題とする。本抗原に対する抗血清は、本毒素を検出するために使用され得る。項毒素抗体を検出する方法は、消化性潰瘍疾患、胃ガン、またはその他のＨ．　ｐｙｌｏｒｉ感染の臨床結果を発病させる患者の感受性を決定する。【解決手段】真核細胞の空胞形成を特異的に誘導し、かつウシ胎児血清タンパク質を含まないＨ．ｐｙｌｏｒｉ由来の精製抗原。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞の空胞形成を特異的に誘導し、かつウシ胎児血清タンパク質を含まないＨ．ｐｙｌｏｒｉ由来の精製抗原。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
発明の背景
本件は１９９２年２月２６日に出願した米国出願第８４１，６４４号の一部継続出願である。　発明の分野
本発明はＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉの空胞形成毒素と、消化性潰瘍および胃の悪性疾患への素因に関する診断用試験において毒素を使用する方法と、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染に対する免疫学的防御を提供するワクチンとして毒素を使用する方法とに関する。
【０００２】
【従来の技術】
背景技術の簡単な説明
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ　はヒトの胃の中に通常存在している湾曲したグラム陰性細菌であり、この生物は１度獲得すると数年間または数十年間存続する（Ｂｌａｓｅｒ，Ｍ．Ｊ．　（１９９０）　Ｊ．　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｄｉｓ．　１６１：６２６−６３３　）。多くの列挙される証拠より、Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉに感染するとほとんど全般的に慢性胃炎になることが示されている（Ｄｉｘｏｎ，Ｍ．Ｆ．　（１９９０）　Ｊ．　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．　ａｎｄ　Ｈｅｐａｔｏｌ．　６：１２５−１３０）。Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉに誘導される胃炎にかかっているほとんどの人は無症状のままであるが、この状態は消化性潰瘍および胃腺癌の両方を発病させる重要な危険因子である（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｌ．　（１９９１）　Ｎ．　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．　３２４：１０４３−１０４８、ならびにＮｏｍｕｒａ，　Ａ．，　Ｓｔｅｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｇ．Ｎ．，　Ｃｈｙｏｕ，　Ｐ．−Ｈ．，　Ｋａｔｏ，　Ｉ．，　Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ，　Ｇ．Ｉ，およびＢｌａｓｅｒ，　Ｍ．Ｊ．，　Ｎ．　Ｅｎｇ．　Ｊ．Ｍｅｄ．　１９９１；　３２５：１１３２−６）。
【０００３】
Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ感染の発生病理はまだよく分かっていない。生物による高レベルのウレアーゼ産生（Ｄｕｎｎ，Ｂ．Ｅ．，　Ｃａｍｐｂｅｌｌ，　Ｇ．Ｐ．，　Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ，　Ｇ．Ｉ．，およびＢｌａｓｅｒ，　Ｍ．Ｊ．　（１９９０）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２６５：９４６４−９４６９）は、胃感染の開始および維持に関して必須であると考えられる（Ｅａｔｏｎ，　Ｋ．Ａ．，　Ｍｏｒｇａｎ，　Ｄ．Ｒ．，Ｋｒａｋｏｗｋａ，　Ｓ．　（１９８９）　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．　５７：１１１９−１１２５）。他の潜在毒性の決定要因は、真核細胞の空胞形成を誘導する毒素である（Ｃｏｖｅｒ，Ｔ．Ｌ．，　Ｈａｌｔｅｒ，　Ｓ．Ａ．，　Ｂｌａｓｅｒ，　Ｍ．Ｊ．　（１９９２）　Ｈｕｍａｎ　Ｐａｔｈｏｌ．　２３：１００４−１０１０）。機能的に活性な毒素を、インビトロでＨ．ｐｙｌｏｒｉ単離物の５０〜６０％が産生する（Ｌｅｕｎｋ，　Ｒ．Ｄ．，　Ｊｏｈｎｓｏｎ，　Ｐ．Ｔ．，　Ｄａｖｉｄ，　Ｂ．Ｃ．，Ｋｒａｆｔ，Ｗ．Ｇ．，およびＭｏｒｇａｎ，　Ｄ．Ｒ．　（１９８８）　Ｊ．　Ｍｅｄ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　２６：９３−９９ならびにＣｏｖｅｒ，　Ｔ．Ｌ．，Ｄｏｏｌｅｙ，　Ｃ．Ｐ．，およびＢｌａｓｅｒ，　Ｍ．Ｊ．　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．；　５８：６０３−６１０（１９９０））。毒素活性を中和する抗体はＨ．ｐｙｌｏｒｉ感染者由来の血清中に存在し、そのことより空胞形成毒素活性はインビボで関連があることが示唆される（Ｌｅｕｎｋ，　Ｒ．Ｄ．，　Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｍ．Ａ．，　Ｍｏｒｇａｎ，　Ｄ．Ｒ．，　Ｌｏｗ，　Ｄ．Ｅ．，およびＳｉｍｏｒ，　Ａ．Ｅ．　（１９９０）Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８：１１８１−１１８４ならびにＣｏｖｅｒ，　Ｔ．Ｌ．，　Ｃａｏ．，　Ｐ．，およびＢｌａｓｅｒ，　Ｍ．Ｊ．　（１９９１）　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１００：Ａ５７０）。２つの研究で、毒素産生Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ感染の普及は、消化性潰瘍のＨ．　ｐｙｌｏｒｉ感染患者の間のほうが胃炎のみの感染患者の間より高いことが示唆された（Ｆｉｇｕｒａ，Ｎ．，　Ｇｕｇｌｉｅｌｍｅｔｔｉ，　Ｐ．，　Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ，　Ａ．，　Ｂａｒｂｅｒｉ，　Ａ．，　Ｃｕｓｉ，　Ｇ．，　Ｍｕｓｍａｎｎｏ，　Ｒ．，Ｒｕｓｓｉ，　Ｍ．，およびＱｕａｒａｎｔａ，　Ｓ．　（１９８９）　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　２７：２２５−２２６；Ｇｏｏｓｅｎｓ，　Ｈ．，　Ｖｌａｅｓ，　Ｌ．，　Ｌａｍｂｅｒｔ，　Ｊ．Ｐ．，　Ｇｌｕｐｃｚｙｎｓｋｉ，　Ｙ．，　Ｂｕｒｅｔｔｅ，　Ａ．，およびＢｕｔｚｌｅｒ，Ｊ．Ｐ．　（１９９１）Ｍｉｃｒｏｂ．　Ｅｃｏｌ．　Ｈｅａｌｔｈ　Ｄｉｓ．　４：１３０）。
【０００４】
以前の研究で、本発明者らは空胞形成毒素活性のあるブロス培養上清中には存在するが、毒素活性の欠落した上清中には存在しないかまたは濃度が低い、いくつかのＨ．　ｐｙｌｏｒｉタンパク質の同定を行った（Ｃｏｖｅｒ，Ｔ．Ｌ．，　Ｄｏｏｌｅｙ，　Ｃ．Ｐ．，およびＢｌａｓｅｒ，　Ｍ．Ｊ．　（１９９０）　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．　５８：６０３−６１０）。さらに、本発明者らは空胞形成毒素がＨ．ｐｙｌｏｒｉウレアーゼとは異なることを示した（Ｃｏｖｅｒ，　Ｔ．Ｌ．，　Ｐｕｒｙａｒ，　Ｗ．，　Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ，　Ｇ．Ｉ．，およびＢｌａｓｅｒ，Ｍ．Ｊ．　（１９９１）　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．　５９：１２６４−１２７０）。本出願で本発明者らはＨ．　ｐｙｌｏｒｉ由来の空胞形成毒素の精製および特徴付けについて述べている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、精製Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ空胞形成毒素およびＨ．ｐｙｌｏｒｉ感染に対する防御抗体の生成に本毒素を使用する方法を提供することを目的とする。本抗原に対する抗血清は、本毒素を検出するために使用され得る。項毒素抗体を検出する方法は、消化性潰瘍疾患、胃ガン、またはその他のＨ．ｐｙｌｏｒｉ感染の臨床結果を発病させる患者の感受性を決定する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
発明の要旨
空胞形成毒素活性を有する実質的に純粋な抗原組成物を提供することが、本発明の目的である。本抗原組成物は天然物または組換え産物のいずれかから精製され得る。
【０００７】
組換え空胞形成毒素またはそのフラグメントを提供するために発現され得る遺伝子を提供することが、本発明のさらなる目的である。上記遺伝子の部分的なＤＮＡ配列を配列番号１に提示する。
【０００８】
毒素に対する抗体に特異的に結合する精製抗原組成物を提供することが、本発明の目的である。
【０００９】
毒素産生Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ感染の存在についての臨床診断用試験を提供し、それによって消化性潰瘍疾患または胃の悪性疾患の危険のある患者を特定することが本発明の目的である。
【００１０】
Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ毒素に対する高レベルの特異抗体を誘導し、そしてヒトにおいてＨ．ｐｙｌｏｒｉ自然感染に対して保護するタンパク質ワクチンを提供することが本発明の目的である。
【００１１】
Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ毒素に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体、および毒素の検出におけるそれらの使用または治療目的での方法を提供することが本発明の他の目的である。
【００１２】
本明細書中で開示した抗原組成物、ワクチン、方法、抗血清または抗体、およびキットを提供することにより、これらおよび他の実施態様が達成される。
【００１３】
本発明の１つの実施態様では、空胞形成毒素活性を有する精製抗原組成物（これ以降ＣＢ抗原とする）は、Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉのブロス培養上清から抽出され、９７２，０００ダルトンより大きい分子量（非変性条件下でゲル濾過クロマトグラフィーによって決定した）、および変性したときに８７，０００±３００ダルトンの明確な分子量（還元条件下でのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＳＧＥ）で決定した）を有した。抗原は配列番号２に示されるアミノ末端配列、配列番号１５〜１７に示される中間アミノ酸配列を含有し得、そして加えて配列番号１に提示した核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含有し得る。ＣＢ抗原という用語は機能的に活性のある未変性の空胞形成毒素として定義される；それに対して、Ｍｒ＝８７，０００タンパク質はＣＢ抗原の機能的に不活性なサブユニットであり、変性条件下でのみ検出される。ＣＢ抗原という用語は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉから得られるか、あるいは合成または組換えによる生産で得られる完全体毒素（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）の抗原性のあるフラグメントを含有する。ＣＢ抗原またはそのフラグメントと実質的に相同性を有する抗原タンパク質もまた、本発明に従って使用され得る。さらに、ＣＢ抗原アナログもまた期待される。
【００１４】
ＣＢ抗原に対して産生された抗血清またはモノクローナル抗体は、毒素の存在に関する試験に使用され得る。試験サンプルをそのような抗血清に接触させ、次いで試験サンプルの成分に結合する抗体を検出する。そのような結合が予め決定しておいた陽性閾レベルを越えたところで、サンプルは毒素に対して陽性とする。
【００１５】
ＣＢ抗原は、無毒的な方法でヒトに投与したときに、Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ感染に対する感染防御免疫を誘導し得る。それ故に、抗原は将来的なＨ．　ｐｙｌｏｒｉ感染に対するワクチンとして、適切なアジュバントと組み合わせて使用され得る。
【００１６】
本発明の１つの局面では、ＣＢ抗原は抗毒素抗体の検出のための方法に使用される。精製した毒素を、抗毒素抗体を含むと疑われる体液のサンプルと接触させる。そのような接触に次いで、公知の方法が、抗原−抗体複合体形成量を決定するために使用される。複合体の形成が予め決定した陽性閾値を越えるときは、試験は抗毒素抗体の存在に対して陽性とする。
【００１７】
抗原−抗体複合体の形成を検出するために好ましい技術は酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、間接免疫蛍光アッセイ、ラテックス凝集、およびリポソーム−ベースアッセイを含むが、それらに限定されない。あるいは、ウエスタンブロット技術を用い得て、その場合バンドが目視判定で検出され、そして濃いバンドの実質的な出現が陽性の指標として得られ得る。陽性シグナル（すなわち、試験サンプルが毒素特異抗体を含むことを示す）と考えられる抗原／抗体複合体の量は、選んだ検出方法によるが、一般的に他の全てのパラメーター（サンプルの希釈、インキュベート時間、など）を一定にしておいて、陰性コントロール群由来のサンプルで観察された結果から、平均値プラス標準偏差の１区間より高い値として定義され得る。より高い特異性が望まれるいくつかの実施態様においては、平均値プラス２標準偏差または平均値プラス３標準偏差が利用され得る。陰性コントロール群は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染がないと知られている個体からなる。
【００１８】
本発明の１つの局面では、本発明の範囲内の抗原組成物を含み、そしてさらに上記組成物中の抗原に結合し得る試験サンプル中に、何らかのイムノグロブリンが存在することを検出する手段を含むキットが提供される。
【００１９】
さらに、Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ感染に関する診断用試験は、被検者の核酸サンプルの増幅を導くプライマーに基づいて開発され得る。さらに詳細には、配列番号１に提示した核酸から選択した合成オリゴヌクレオチドは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの毒素を検出可能レベルにまで増幅するためのポリメラーゼチェイン反応で使用され得る。
【００２０】
本発明は、以下を提供する：
項１．真核細胞の空胞形成を特異的に誘導する抗原を含む、実質的に純粋な抗原組成物（ＣＢ抗原）。
項２．前記抗原が９７２，０００より大きい分子量で特徴付けられる、項１に記載の組成物。
項３．前記抗原が配列番号１に示されるアミノ末端配列と、配列番号１５、１６または１７に示されるアミノ酸配列からなる群より選択される中間アミノ酸配列とを含有する、項１に記載の組成物。
項４．前記抗原が、変性させたときに約８７，０００（還元条件下でドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定した）の分子量で特徴付けられる、項１に記載の組成物。
項５．前記抗原が、約６．１の等電点を有する、項４に記載の組成物。
項６．前記抗原が、ブロス培養上清中より５０００倍を越える高純度である、項１に記載の組成物。
項７．前記抗原が、配列番号１に提示したヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含有する、項１に記載の組成物。
項８．Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ空胞形成毒素をコードするＤＮＡ配列を含む、遺伝子またはそのフラグメント。
項９．以下の工程を包含するプロセスによって作られるＨ．　ｐｙｌｏｒｉ毒素に特異的に結合する抗体：変性または未変性のＣＢ抗原に対する抗血清を産生する工程。項１０．以下の工程を包含するプロセスによって作られるＨ．　ｐｙｌｏｒｉ毒素に特異的に結合する抗体：変性または未変性のＣＢ抗原に対するモノクローナル抗体を産生する工程。
項１１．以下の工程を包含するプロセスによって作られるＨ．　ｐｙｌｏｒｉ毒素に特異的に結合する抗体：項１に記載の抗原組成物に対する抗血清を産生する工程。
項１２．以下の工程を包含するプロセスによって作られるＨ．　ｐｙｌｏｒｉ毒素に特異的に結合する抗体：項１に記載の抗原組成物に対するモノクローナル抗体を産生する工程。
項１３．Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ感染に対するワクチンであって、該ワクチンが、薬学的に容認される担体を有する、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染に対する防御抗体の産生を誘導するのに効果的な量のＣＢ抗原を含む、ワクチン。
項１４．前記ＣＢ抗原が、９７２，０００より大きい分子量（未変性条件下でのゲル濾過クロマトグラフィーによって測定される）および変性したときに約８７，０００の分子量（還元条件下でのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動で決定される）および約６．１の等電点で特徴づけられる、項１３に記載のワクチン。
項１５．Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ感染を検出するための診断用検査キットであって、該検査キットが以下を包含する、キット：
（ａ）ＣＢ抗原を含む固定化抗原組成物；
（ｂ）該固定化抗原組成物に、試験されるヒトまたは動物から採取した体液を通過させるための手段；および、
（ｃ）該固定化抗原組成物に結合した該体液から免疫グロブリンを検出するための手段。
項１６．ヒトまたは動物由来のサンプル中のＨ．　ｐｙｌｏｒｉ毒素を検出するための診断用検査キットであって、該検査キットが以下を含む、キット：
（ａ）細胞空胞形成を誘導する毒素に特異的に結合する抗体；
（ｂ）該サンプルを該抗体に接触させるための手段；および
（ｃ）該抗体に結合した該体液由来の毒素を検出するための手段。
項１７．サンプルが体液、組織、Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ培養上清、または他のＨ．　ｐｙｌｏｒｉ調製物である、項１６に記載のキット。
項１８．サンプル中のＨ．ｐｙｌｏｒｉ毒素の核酸を検出するための診断用検査キットであって、該検査キットが以下を含む、キット：
（ａ）配列番号１に提示される核酸から選択される２つの一本鎖オリゴヌクレオチド；
（ｂ）ＰＣＲ反応を行うための手段；および
（ｃ）Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ毒素の核酸を検出するための手段。
項１９．Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ空胞形成毒素核酸の検出において有用である、配列番号２１および２２で提示されるＤＮＡ配列で表される合成オリゴヌクレオチド。
項２０．増幅を導くプライマーによってヒト被検体由来のサンプル中のＨ．　ｐｙｌｏｒｉ空胞形成毒素の核酸を検出する方法であって、ここで、該サンプルは項８に提示した群から選択される２つの１本鎖オリゴヌクレオチドからなる２重のプライマーで増幅されており、そして該増幅後、該増幅産物に１本鎖オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせ、そしてハイブリダイズした該プローブを検出する、方法。
項２１．ヒトまたは動物から採取した体液サンプル中の抗毒素抗体を検出する方法であって、以下の工程を包含する、方法：
（ａ）固相に結合した項１に記載の精製した組成物と該サンプルとを接触させる工程；
（ｂ）工程（ａ）の該接触物をインキュベートし、該抗体を該結合精製組成物に結合させる工程；および
（ｃ）該結合抗毒素抗体を検出する工程。
項２２．結合したサンプル中の真核細胞の空胞形成を誘導する毒素を検出する方法であって、以下の工程を包含する方法：
（ａ）ＣＢ抗原に対する抗体を該結合サンプルに接触させる、工程；
（ｂ）工程（ａ）の該接触物をインキュベートし、抗原抗体複合体を形成させる、工程；
（ｃ）該抗原抗体複合体を検出する工程。
項２３．前記サンプルが体液、Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ培養上清、または他のＨ．　ｐｙｌｏｒｉ調製物からなる群より選択される、項２０に記載の方法。
項２４．毒素産生Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ株によって患者において引き起こされる感染を検出する方法であって、以下の工程を包含する、方法：
（ａ）固相に結合した項１に記載の組成物を該患者由来の体液サンプルと接触させる工程；
（ｂ）工程（ａ）の該接触物をインキュベートし、該抗体を該結合組成物に結合させる、工程；
（ｃ）該結合抗毒素抗体を検出する工程；
（ｄ）検出された抗毒素抗体量を標準と比較し、毒素産生Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ株によって引き起こされる感染を検出する、工程。
項２５．患者中のに抗毒素抗体を検出し、そしてそれにより消化性潰瘍疾患、胃ガン、または他のＨ．　ｐｙｌｏｒｉ感染の臨床結果を発病させる患者の感受性を決定する方法であって、以下の工程を包含する、方法：
（ａ）固相に結合した項１に記載の組成物を該患者由来の体液サンプルに接触させる工程；
（ｂ）工程（ａ）の該接触物をインキュベートし、該抗体を該結合組成物に結合させる、工程；
（ｃ）該結合抗毒素抗体を検出する工程；
（ｄ）検出した抗毒素抗体量を標準と比較し、消化性潰瘍疾患、胃ガン、または他のＨ．　ｐｙｌｏｒｉ感染の臨床結果を発病させる患者の感受性を決定する、工程。項２６．ヒトを含む動物中でのＨ．　ｐｙｌｏｒｉに対する防御抗体の産生を誘導する方法であって、該方法はＨ．　ｐｙｌｏｒｉ感染に対する感染防御免疫が望ましい動物に、薬学的に容認される担体上の有効量のＣＢ抗原を含む有効量のワクチンを投与する工程を包含する、方法。
項２７．前記ワクチンが、経腸的に投与される、項２５に記載の方法。
項２８．前記ワクチンが、非経口的に投与される、項２５に記載の方法。
項２９．患者の真核細胞の空胞形成を誘導する毒素を中和するための治療法であって、以下の工程を包含する、方法：
（ａ）薬学的に容認される担体上の項９から１２に記載の組成物を該患者に投与する工程。
項３０．Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉの空胞形成毒素活性を阻害する方法であって、以下の工程を包含する、方法：
（ａ）適切な担体上の充分量の空胞ＡＴＰアーゼインヒピターを投与し、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ空胞形成毒素を阻害する工程；
項３１．前記空胞ＡＴＰアーゼインヒビターがｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎである、項２９に記載の方法。
項３２．配列番号１に提示されるＤＮＡ配列の全体または一部を発現させることによって、組換え空胞形成毒素またはそのフラグメントを産生する方法。
【００２１】
【発明の実施の形態】
発明の詳細な説明および最良の形態
本発明は、Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉの空胞形成毒素の等質性への最初の精製を示している。本毒素は硫酸アンモニウム沈澱、次いで疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、および陰イオン交換クロマトグラフィーによってブロス培養上清より単離された。実質的に純粋という用語は、ＣＢ抗原が他のＨ．ｐｙｌｏｒｉ産物に対して、Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉブロス培養上清中より高い濃度で抗原組成物中に存在することを意味する。
【００２２】
これらの手順により、非変性条件下で９７２，０００ダルトンを越える分子量を有する、精製された、機能的に活性な毒素（ＣＢ抗原）が回収された。本タンパク質の精製により毒素の比活性は５０００倍より大きく増加した。変性、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製毒素（ＣＢ抗原）の分析により、８７，０００ダルトンに移動する１本のバンドの存在が示された。ＥＬＩＳＡで、Ｍｒ＝８７，０００の変性タンパク質サブユニットに対する抗血清は、ｔｏｘ−　Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ上清よりもｔｏｘ＋　Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ上清と有意に高い割合で反応した。さらに、Ｍｒ＝８７，０００の変性タンパク質サブユニットに対する抗血清は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ　６０１９０の空胞形成毒素活性を、他のＨ．　ｐｙｌｏｒｉ株によって産生される毒素と同様に中和した。要するに、本データは空胞形成毒素活性におけるＣＢ抗原の役割を支持し、そして種々のＨ．ｐｙｌｏｒｉ株により産生される毒素は抗原的に関連があることを示す。
【００２３】
ウエスタンブロット分析は、Ｍｒ＝８７，０００の変性タンパク質サブユニットがｔｏｘ＋Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ培養上清の本発明者らの以前の分析において同定したバンド（原文でＭｒ＝８２，０００と報告）に関連があると考えられることを明らかにした（Ｃｏｖｅｒ，Ｔ．Ｌ．，　Ｄｏｏｌｅｙ，　Ｃ．Ｐ．，およびＢｌａｓｅｒ，　Ｍ．Ｊ．　（１９９０）　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．　５８：６０３−６１０）。本発明者らのｔｏｘ＋　Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ上清に関する以前の研究で、Ｍｒ＝１２８，０００のタンパク質もまた同定された。そのタンパク質は潰瘍疾患を伴わないＨ．ｐｙｌｏｒｉ感染者より、消化性潰瘍の患者由来の血清により多く認められた（Ｃｏｖｅｒ，　Ｔ．Ｌ．，　Ｄｏｏｌｅｙ，　Ｃ．Ｐ．，およびＢｌａｓｅｒ，Ｍ．Ｊ．　（１９９０）　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．　５８：６０３−６１０；Ｃｒａｂｔｒｅｅ，　Ｊ．Ｅ．，　Ｔａｙｌｏｒ，　Ｊ．Ｄ．，Ｗｙａｔｔ，　Ｊ．Ｉ．，　Ｈｅａｔｌｅｙ，　Ｒ．Ｖ．，　Ｓｈａｌｌｃｒｏｓｓ，　Ｔ．Ｍ．，　Ｔｏｍｐｋｉｎｓ，　Ｄ．Ｓ．，およびＲａｔｈｂｏｎｅ，　Ｂ．Ｊ．（１９９１）　Ｌａｎｃｅｔ　３３８：３３２−３３５）。最近の研究で、Ｍｒ＝１２８，０００のタンパク質は空胞形成毒素活性の発現に要求されず、Ｍｒ＝８７，０００のタンパク質サブユニットと免疫学的に交差反応しないことが示されている。
【００２４】
抗体含有の疑いのあるいずれものサンプルが、本明細書中に記載の方法に従って試験され得る。試験するサンプルは、好ましくは、血液、血清、尿、涙液、唾液などのような体液である。ヒトのサンプルに加えて、サンプルは、ヒトではない霊長類、馬、豚などのような哺乳類から採取され得る。記載の試験の感度によって、試験の前にサンプルを希釈し得る。希釈は、サンプル、試験する抗体、および抗原組成物の各々に適合した溶液を加えることによって行い得る。血清は、サンプルとして使用するとき、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．０〜７．４）（これ以後「ＰＢＳ」）、Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳ（これ以後「ＰＢＳ　Ｔ」）、チメロサールを含むＰＢＳ　Ｔ（これ以後「ＰＢＳＴＴ」）、ゼラチンを含むＰＢＳ　ＴＴ（これ以後「ＰＢＳ　ＴＴＧ」）、およびウシγグロブリンを含むＰＢＳ　ＴＴＧ（これ以後「ＰＢＳ　ＴＴＧＧ」）からなる群より選択される１つ以上の溶液で希釈され得る。希釈は、ＩｇＧ抗体について試験するとき、約１：１００から約１：１０００の比率程度であり得る。サンプルはＩｇＡおよびＩｇＭについても試験され得るが、ＩｇＧ試験が好ましい。
【００２５】
好ましい希釈剤および希釈率は、試験されるサンプルに従って異なり得る。例えば、尿は既にかなり希釈されていて、さらなる希釈は必要とされ得ない。しかし、他のアッセイでしばしば必要であるように尿を濃縮する必要がないことがある。試験の前に、好ましくは、尿のｐＨを、抗体機能にとって好ましいｐＨである約７．０と７．４との間に調整する。
【００２６】
サンプルの希釈が要求されない一方、Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ特異抗体の非存在下で有意な抗原／抗体複合体が形成される可能性は、希釈することで減少すると考えられる。希釈範囲は、陽性シグナルと考えられる抗原／抗体複合体のレベル閾に合わせることを考慮にいれるべきである。
【００２７】
本開示により、寄託されたＨ．　ｐｙｌｏｒｉ株由来の精製毒素（ＣＢ抗原）を得るための簡易な方法が提供される一方、この抗原は多くのＨ．　ｐｙｌｏｒｉ株に共通であることが強調される。寄託された株および本明細書の記載により、本抗原の簡易な単離方法が提供される一方、本発明は抗原が得られる原料または方法（例えば組換え生産による）に関わらず、抗原の利用を広く包含することが強調される。
【００２８】
試験サンプルを本発明に従って抗原化合物に接触させる前に、この抗原組成物を従来の技術を用いて固定するのが好ましい（しかし必要ではない）。１つの選択的な実施態様では、以下にさらに詳しく記載したようなリポソーム−ベースアッセイが使用され得る。従来の固定については、例えばポリスチレンプレートを、本発明に従って作製した抗原懸濁液とインキュベートし得る。あるいは、例えば電気泳動ゲル上にタンパク質バンドとして単離された抗原を、既知の方法でニトロセルロースシートに移し得る。Ｔｏｗｂｉｎら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ’ｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　７６：４３５０−５４　（１９７９）；　Ｂｕｒｎｅｔｔｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１１２：９５−２０３　（１９８１）参照。当該分野において、抗原を実質的に不活性な基質に結合させる多数の他の技術が知られている。
【００２９】
本発明に従って結合させた抗原を、好ましくは、Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉに対する抗体の存在について試験するサンプルを含む希釈液と接触させる。本抗原およびサンプルを、好ましくは、少なくとも５分間から１５分間インキュベートする。インキュベーションはヒトの体温またはその付近（約３７℃）で行うと、少ない時間で済む。他の温度でのインキュベーション（例えば４℃）もまた適切だが、一般的に追加のインキュベーション時間が必要である。３７℃での好ましいインキュベーション時間は、約５分間から約９０分間である。迅速アッセイもまた室温で行われ得る。次いで、結合抗原をすすぎ、いずれもの非結合抗体（つまり抗原に対して特異的ではない抗体）をも除く。好ましくは、すすぎはＰＢＳＴ、ＰＢＳ　ＴＴ、またはトリス／Ｔｗｅｅｎ／塩化ナトリウム／アザイドのような緩衝液で行う。多数回のすすぎが好ましい。
【００３０】
インキュベーションの間、Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ特異抗体は固相抗原に結合し、抗原／抗体複合体を作る。全ての非結合抗体は、実質的にすすぎ手順の間に除かれる。本発明の抗原は高特異性のため、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに特異的でない抗体は実質的にすすぎで除かれる。もちろん、もし試験サンプルがＨ．　ｐｙｌｏｒｉ特異抗体を含まなかったら、固相抗原は実質的にヒト抗体を結合せず、そして抗原／抗体複合体に対する次の試験では、そのような複合体の実質的な存在は示されない。他方で、もし試験サンプルにＨ．ｐｙｌｏｒｉ特異抗体が豊富にあったら、これらの抗体は固相抗原に結合し、次で検出される多量の抗原／抗体複合体を形成する。
【００３１】
抗原／抗体複合体の検出は、幅広い種類の既知の方法によって行われ得る。好ましい方法には、酵素免疫アッセイ、ラテックス凝集、ウエスタンブロット技術、または間接免疫蛍光アッセイが含まれるが、それらに限定されない。
【００３２】
一般的に、固相抗原に複合したＨ．　ｐｙｌｏｒｉ特異抗体は、標識、または他の方法で検出可能な、試験される免疫グロブリンに特異的である第２抗体と接触させることによって検出される。例えば、もし試験サンプルがヒト血清ならば、検出可能な第２抗体は、ヒト免疫グロブリンに特異的である。標識した第２抗体はどのヒト抗体（好ましくはＩｇＧまたはＩｇＡ型、最も好ましくはＩｇＧ）に対しても特異的であり得る。急性セロコンバージョンが疑われるとき、ＩｇＭに特異的な標識第２抗体を使用するＩｇＭ試験が適当であり得る。第２抗体は、好ましくは固相抗原と約２０℃から約３７℃の温度において、約５分間から約２時間、好ましくは３０分間から６０分間、インキュベートする。それから、全ての非結合標識抗体を除くために、抗原を緩衝液で洗浄する（好ましくは多くの回数）。洗浄により、抗原上に存在する免疫グロブリンに結合した抗体以外の、実質的に全ての標識抗体が除かれる。もちろん、実質的には、この時点で存在するヒト免疫グロブリンのみがＨ．ｐｙｌｏｒｉに特異的な抗体である。このため、Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ特異抗体の存在は、標識第２抗体の存在または非存在を決定することによって、間接的に測定され得る。
【００３３】
標識を検出するためには、多くの既知の技術があり、これは使用した標識の型で異なる。例えば、フルオレセイン標識抗体は、フルオレセインの特定波長で発光された光を走査することにより、検出され得る。あるいは、酵素標識は、適切な基質とのインキュベーションおよび酵素活性、好ましくは色調変化になる活性、の検出によって検出される。そのような活性は、目視判定により決定され得るか、または適切な波長にセットした分光光度計によって機械的に読みとられ得る。
【００３４】
あるいは、酵素標識が、西洋ワサビペルオキシダーゼであり得、そして基質が、Ｈ２Ｏ２と、酵素の存在下で生成され、４１４ｎｍにセットした分光光度計で検出可能な化合物である２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）とであり得る。
【００３５】
ウエスタンブロッティングにおいて、陽性シグナルは、酵素が第２抗体とコンジュゲートするときに検出され得る。適切な基質とインキュベートすると、本プロセスによって分析される抗原バンド前後に酵素により色素産物が生成される。反応するバンドの存在は、目視判定で検出され得る。間接免疫蛍光アッセイ法において、フルオレセイン標識第２抗体はフルオレセイン励起検出器または目視判定で検出され得る。
【００３６】
リポソーム−ベースアッセイは表面にＨ．　ｐｙｌｏｒｉ抗原が発現されるリポソーム内にフルオレセイン、酵素、または基質の存在を含み得る。これらのリポソームを、試験する希釈体液サンプルとインキュベートし、そして充分に洗浄する。表面に抗原／抗体複合体を形成する免疫グロブリンを有するいかなるリポソームもが、リポソームを含むポリスチレンチューブの内壁上に、第２抗体（試験する免疫グロブリンに特異的である）を付着させることによって認識され得る。表面に抗体を結合させたリポソームは、チューブ壁に固定され、そして非固定リポソームは洗浄除去される。リポソームは、例えば界面活性剤または補体で細胞溶解され得、そして内部に存在していた酵素または基質が遊離し、チューブ内で溶液中の相補的な基質（または酵素）と反応する。酵素活性（好ましくは色調変化反応）は、目視判定または分光光度計の色調測定により検出され得た。予め決定した陽性閾を越える酵素活性により、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ特異抗体の存在が示される。
【００３７】
本発明に従った抗体検出の感度および特異性は、限定した集団のヒトから得られる血清を使用して決定した。ＥＬＩＳＡにより、精製毒素（ＣＢ抗原）に対するＩｇＧ抗体が、Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ感染者由来の血清中で同定された。およそ５０％のＨ．ｐｙｌｏｒｉ感染者由来の血清によって提示されたＥＬＩＳＡの光学濃度値は、非感染者由来の血清によって提示された範囲を越えていた。このことは、およそ５０％のＨ．ｐｙｌｏｒｉ感染者が毒素を産生するＨ．　ｐｙｌｏｒｉ株に感染していることを示唆する。同様に、およそ５０％のＨ．ｐｙｌｏｒｉ株がインビトロで毒素を産生する（Ｌｅｕｎｋ，　Ｒ．Ｄ．，　Ｊｏｈｎｓｏｎ，　Ｐ．Ｔ．，　Ｄａｖｉｄ，　Ｂ．Ｃ．，　Ｋｒａｆｔ，Ｗ．Ｇ．，およびＭｏｒｇａｎ，　Ｄ．Ｒ．　（１９８８）　Ｊ．　Ｍｅｄ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　２６：９３−９９；Ｃｏｖｅｒ，　Ｔ．Ｌ．，Ｄｏｏｌｅｙ，　Ｃ．Ｐ．，およびＢｌａｓｅｒ，　Ｍ．Ｊ．　（１９９０）　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．　５８：６０３−６１０）。
【００３８】
この出願では、結果を平均±ＳＥＭで表す。光学濃度値は独立変数に関するステューデントの両側ｔ検定を用いて比較した。
【００３９】
さらに、体液または組織を含有する試料中の核酸の検出は、核酸の存在量が少量であるため、あるいは試料中に異なった原料由来のＤＮＡまたはＲＮＡを含有する他の干渉物質が存在するために困難であり得る。これらの限界は、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）技術と呼ばれる分析方法を採用することにより、克服され得る。この技術によって、特異ＤＮＡ配列の選択的富化が、標的配列の指数関数的増幅により達成され得る。Ｍｕｌｌｉｓら，Ｍｅｔ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１５５，　３３５（１９８７）。Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ毒素を検出するための方法は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ毒素を産生する核酸のサンプルを検出可能なレベルにまで増幅するために、配列番号１に提示されるＤＮＡ配列から選択されるオリゴヌクレオチドの増幅を導くプライマーの使用により提供される。
【００４０】
ＰＣＲ増幅を促進するために、ペアのオリゴヌクレオチドプライマーが、米国特許第４，６８３，２０２号（本明細書中で参考として援用されている）に記載のように採用され得る。このプライマーは標的ＤＮＡに隣接する配列にハイブリダイズするように設計する。インビトロ増幅に続いて、増幅した標的配列を、ハイブリダイズプローブを用いて検出する。例えば、この分析手順は、Ｏｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８，２９５−９７　（１９８８）に記載されるように、ＨＩＶ−１の直接検出のために使用されてきた。増幅サイクルは、Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，　４８７−９１　（１９８８）によって記載されるように、９５℃までのインキュベーションで熱安定であるポリメラーゼを使用することによって促進される。
【００４１】
本発明のある実施態様では、合成オリゴヌクレオチド配列をプライマーとして使用した。これらの配列は、周知の化学的方法で調製され得、そして市販のＤＮＡ合成機もまた使用され得る。例えば、必要とされる配列は、Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　ｌｅｔｔｅｒｓ，　２２：１８５９−６２　（１９８１）に記載の合成方法で調製され得る。固相支持体上でのオリゴヌクレオチドの合成のための他の方法は、米国特許第４，４５８，０６６号に記載されている。自動ＤＮＡ合成装置はＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社が発売しているＤＮＡ合成機のようなものが用いられ得る。
【００４２】
さらに詳細には、プローブ配列のオリゴヌクレオチド配列は、ヌクレオチドが以下に示される標準略語文字で表される：Ａはアデノシン、Ｔはチミジン、Ｇはグアノシン、Ｃはシトシン、およびＮは不明。これらの鎖は、標準の５’プライムから３’プライム方向に表記されている。変性プライマー中に用いられる略語は表３に示す。
【００４３】
【実施例】
実施例１
毒素の精製
以前に記載した毒素産生株のＨ．　ｐｙｌｏｒｉ　６０１９０（ＡＴＣＣ　４９５０３）を、毒素精製のための原料として用いた。Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ６０１９０を、５％ＣＯ２を含む包囲環境中で、０．５％活性炭（未処理、粒径８〜２０メッシュ、Ｓｉｇｍａ）を含むＢｒｕｃｅｌｌａブロス中で３７℃で４８時間培養した（Ｃｏｖｅｒ，Ｔ．Ｌ．，　Ｐｕｒｙｅａｒ，　Ｗ．，　Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ，　Ｇ．Ｉ．，およびＢｌａｓｅｒ，　Ｍ．Ｊ．　（１９９１）　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．５９：１２６４−１２７０）。培養物を１０，０００ｇで２０分間遠心分離し、そして上清に存在するタンパク質を硫酸アンモニウムの５０％飽和溶液で沈澱させた。１０，０００ｇで１５分間遠心分離した後、ペレットを６０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）に再懸濁した。
【００４４】
疎水性相互作用クロマトグラフィーを、６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび０．５Ｍ　硫酸アンモニウム（ｐＨ７．７）を含む緩衝液を用いて、ＰＨＥＮＹＬＳＵＰＥＲＯＳＥＨＲ　５／５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ．，　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，　ＮＪ）で行い、そしてタンパク質を６０ｍＭＴｒｉｓ　ＨＣｌ（ｐＨ７．７）で溶出した。サイズ排除クロマトグラフィーを、６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび０．１Ｍ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．７）を含む緩衝液を用いて、０．１２ｍｌ／分の流速でＳＵＰＥＲＯＳＥ　１２　ＨＲ　１６／５０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で行った。陰イオン交換クロマトグラフィーを２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．７）中で、ＭＯＮＯ−ＱＨＲ　５／５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で行った。タンパク質は２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ中で１０ｍｌにわたって０．３Ｍから０．６ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配をかけて溶出した。カラム溶出物を、２８０ｎｍのＵＶ吸光度に対してモニターした。
【００４５】
ＨｅＬａ細胞を、以前に記載したように、９６−ウエルプレート中で、１０％のウシ胎児血清を含むＥａｇｌｅの修正最小必須培地（ＭＥＭ−ＦＢＳ）で培養した（Ｃｏｖｅｒ，Ｔ．Ｌ．，　Ｄｏｏｌｅｙ，　Ｃ．Ｐ．，およびＢｌａｓｅｒ，　Ｍ．Ｊ．（１９９０）　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．　５８：６０３−６１０）。毒素調製物をＭＥＭ−ＦＢＳで系列希釈し、そして９６−ウエルプレート中で、１０μｌ分注量を接着細胞および培養液９０μｌと３７℃で１８時間インキュベートした。その後、以前に記載したように、細胞の空胞形成をニュートラルレッド取り込みアッセイを用いて分光光度計で定量した（Ｃｏｖｅｒ，Ｔ．Ｌ．，　Ｐｕｒｙｅａｒ，　Ｗ．，　Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ，　Ｇ．Ｉ．，およびＢｌａｓｅｒ，　Ｍ．Ｊ．　（１９９１）　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．５９：１２６４−１２７０）。サンプル中の毒素活性の力価は、培養液のみで提示される光学濃度の３ＳＤ以上の光学濃度が提示されるサンプルの最大希釈率として定義した。サンプルの特異活性は、毒素の逆数力価のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）に対する比率で定義した。比活性を決定するために、ＭＥＭ−ＦＢＳに塩化アンモニウム（１０ｍＭ）を加えた。これは毒素活性を増強することを以前に示した濃度（Ｃｏｖｅｒ，Ｔ．Ｌ．，　Ｐｕｒｙｅａｒ，　Ｗ．，　Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ，　Ｇ．Ｉ．，およびＢｌａｓｅｒ，　Ｍ．Ｊ．　（１９９１）　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．５９：１２６４−１２７０）であり、Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ感染したヒトの胃液中のアンモニウムイオンの濃度に近い（Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｂ．Ｊ．およびＬａｎｇｔｏｎ，　Ｓ．Ｒ．　（１９８６）　Ｌａｎｃｅｔ　ｉ：９６５−９６６）。
【００４６】
タンパク質濃度は、サンプルの濃度によって、ＱＵＡＮＴＩＧＯＬＤ試薬（ＤｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄＢｉｏｔｅｃｈ，　Ｎｅｗｔｏｎ　Ｃｅｎｔｒｅ，　ＭＡ）またはＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キット（Ｐｉｅｒｃｅ，　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，　Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）のいずれかを使用して測定し、標準としてアルブミンを使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＡｍｅｓによって記載された（Ａｍｅｓ，Ｇ．Ｆ．−Ｌ　（１９７４）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２４９：６３４−６４４）ような、修正Ｌａｅｍｍｌｉゲル系で行い、そしてタンパク質をＯａｋｌｅｙらの銀染色を用いてゲルで分析した（Ｏａｋｌｅｙ，Ｂ．Ｒ．，　Ｋｉｒｃｈ，　Ｄ．Ｒ．，およびＭｏｒｒｉｓ，　Ｎ．Ｒ．　（１９８０）　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１０５：３６１−３６３）。分子量標準は、ウサギ筋肉ホスホリラーゼｂ（９７，４００）、ウシ血清アルブミン（６６，２００）、ニワトリ卵白オボアルブミン（４５，０００）、ウシ炭酸脱水酵素（３１，０００）、および大豆トリプシンインヒビター（２１，５００）（Ｂｉｏｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，　ＣＡ）。
【００４７】
Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉの空胞形成毒素の精製は、ブロス培養上清中に存在するタンパク質の硫酸アンモニウム沈澱を含み、続いて上記のように、疎水性相互作用、ゲル濾過、陰イオン交換の一連のクロマトグラフィーを行った。変性条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色で、Ｍｒ＝８７，０００±３００のタンパク質サブユニットの等質性までの精製が示された（図２）。表１にまとめたように、精製プロセスの各段階の比活性の分析で、毒素（ＣＢ抗原）は未濃縮ブロス培養上清から５０００倍および硫酸アンモニウム沈澱物から２５倍を越える精製度であった。このように、他のＨ．ｐｙｌｏｒｉ産物に比較して、Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉブロス培養上清中より高濃度で存在する実質的に純粋な調製物が得られた。精製毒素の回収率は、培養上清１リットルあたり８μｇで、これは原未濃縮上清中で存在する毒素活性の５％より少ない量に相当する。
【００４８】
上記精製方法に加えて、実質的に純粋な毒素は、ＳＵＰＥＲＯＳＥ　１２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムの代わりにＳＵＰＥＲＯＳＥ６（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを用いることによって生成され得る。同様に、精製方法におけるその他の修正も、当業者により採用され得る。例えば、ＰＭＳＦ、ＤＴＴ、ＥＤＴＡ、および１０％グリセロールのようなタンパク質変性を阻害するための添加物が包含され得る。
【００４９】
【表１】
2004043469.tif 000002
実施例２
ＣＢタンパク質の特徴付け
疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーにより部分的に精製した後、毒素調製物を変性条件下の７％アクリルアミドゲル上で電気泳動した。Ｍｒ＝８７，０００バンドを切り出し、ゲルから溶出し、そしてＯ．７Ｍ炭酸水素アンモニウムを加えた。次いで溶液をＰＨＥＮＹＬＳＵＰＥＲＯＳＥＨＲ　５／５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に流し、蒸留水で溶出した。アミノ末端アミノ酸配列決定を既に記載されているようにして行い（Ｐｅｉ，　Ｚ．，Ｅｌｌｉｓｏｎ，　Ｒ．Ｔ．，　ＩＨ，　Ｌｅｗｉｓ，　Ｒ．Ｖ．，　およびＢｌａｓｅｒ，　Ｍ．Ｊ．　（１９８８）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．２６３：６４１６−６４２０）、そしてＮａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースで既知のタンパク質との潜在的な相同について検索した。アミノ酸組成分析を、Ｊｏｎｅｓ（Ｊｏｎｅｓ，　Ｂ．Ｎ．　（１９８１）　Ｊ．　Ｌｉｑ．　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．　４：５６５：５８６）の記載のようにして行った。
【００５０】
精製したＭｒ＝８７，０００の変性タンパク質サブユニットのアミノ酸組成は以下のようであった（モル％で示す）：Ａｓｘ１４．８，　Ｇｌｘ　９．６，　Ｓｅｒ　９．３，　Ｈｉｓ　１．５，　Ｇｌｙ　１３．０，　Ｔｈｒ　６．７，　Ａｒｇ　３．５，　Ａｌａ　８．１，　Ｔｙｒ　３．８，Ｍｅｔ　２．３，　Ｖａ１　６．７，　Ｐｈｅ　４．６，　Ｉｌｅ　６．７，　Ｌｅｕ　９．３　（Ｌｙｓ，　Ｔｒｐ，　Ｐｒｏ，　およびＣｙｓは未決定）。２回の測定に基づき２３個のＮ末端アミノ酸の配列は、表２に示すようである（配列番号２）。Ｎ末端配列は疎水性アミノ酸に富み、非荷電性であり、そして推定される等電点が５．８３である。Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ構造予測は、この部分の配列が１００％伸長構造（ｅｘｔｅｎｄｅｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に関連していることを示す。
【００５１】
ＭＦ＝８７，０００タンパク質サブユニットおよび他の既知のタンパク質のＮ末端配列間の比較では、強い相同性はないことが示された。しかし、Ｍｒ＝８７，０００タンパク質サブユニットのＮ末端配列と多数の他の既知のタンパク質の中間配列との間には、部分的な相同性があった。これらの既知のタンパク質の多くは、輸送過程に関わっていた（表２）（Ｓａｌｋｏｆｆ，Ｌ．，　Ｂｕｔｌｅｒ，　Ａ．，　Ｓｃａｖａｒｄａ，　Ｎ．，　およびＷｅｉ，　Ａ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１５：８５６９−７２；Ｒｏｇａｒｔ，Ｒ．Ｂ．，　Ｃｒｉｂｂｓ，　Ｌ．Ｌ．，　Ｍｕｇｌｉａ，　Ｌ．Ｋ．，　Ｋｅｐｈａｒｔ，　Ｄ，Ｄ．，　およびＫａｉｓｅｒ，　Ｍ．Ｗ．　（１９８９）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８６：８１７０−７４；Ｔａｋｅｙａｓｕ，　Ｋ．，　Ｔａｍｋｕｎ，　Ｍ．Ｍ．，　Ｒｅｎａｕｄ，　ＫＪ．，　およびＦａｍｂｒｏｕｇｈ，Ｄ．Ｍ．　（１９８８）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６３：４３４７−５４；Ｈｅｓｓｅ，　Ｊ．Ｅ．，　Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋ，　Ｌ．，　Ａｌｔｅｎｄｏｒｆ，Ｋ．，　Ｒｅｉｃｉｎ，　Ａ，Ｓ．，　Ｄｏｒｕｓ，　Ｅ．，　およびＥｐｓｔｅｉｎ，　Ｗ．（１９８４）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ８１：４７４６−５０；Ｍａｎｄｅ１，　Ｍ．，　Ｍｏｒｉｙａｍａ，　Ｙ，，　Ｈｕｌｍｅｓ，　Ｊ，Ｄ，，　Ｐａｎ，　Ｙ−Ｃ．　Ｅ．　Ｎｅｌｓｏｎ，　Ｈ．，　およびＮｅｌｓｏｎ，Ｎ．　（１９８８）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８５：５５２１−２４；Ｈｉｌｅｓ，　Ｉ．Ｄ．，　Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，　Ｍ．Ｐ．，Ｊａｍｉｅｓｏｎ，　Ｄ．Ｊ．，　およびＨｉｇｇｉｎｓ，　Ｃ．Ｆ．（１９８７）　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏ１．　１９５：１２５−４２；およびＳｚｋｕｔｎｉｃｋａ，Ｋ．，　Ｔｓｃｈｏｐｐ，　Ｊ．Ｆ．，　Ａｎｄｒｅｗｓ，　Ｌ．，　およびＣｒｉｌｌｏ，　Ｖ．Ｐ．　（１９８９）　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１７１：４４８６−９３；Ｈａｗｋｉｎｓ，Ａ．Ｒ．，　Ｌａｍｂ，　Ｈ．Ｋ．，　Ｓｍｉｔｈ，　Ｍ．，　Ｋｅｙｔｅ，　Ｊ．Ｗ．，　およびＲｏｂｅｒｔｓ，　Ｃ．Ｆ．　（１９８８）　Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．　２１４：２２４−２３１；Ｇｏｌｄｒｉｃｋ，　Ｄ．，　Ｙｕ，　Ｇ．−Ｑ．，　Ｊｉａｎｇ，　Ｓ．Ｑ．，およびＨｏｎｇ，　Ｊ．−Ｓ．　（１９９８）Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１７０：３４２１−３４２６）。水治療法プロット分析（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ　ｐｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｅｓ）に基づくと、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ　Ｍｒ＝８７，０００タンパク質サブユニットに相同な配列は、しばしば疎水性の膜に広がっているセグメントであった。表２に挙げたタンパク質に加えて、ブタ由来のカルシウムチャンネル放出タンパク質（Ｈａｒｂｉｔｚ，Ｉ．，　Ｃｈｏｗｄｈａｒｙ，　Ｂ．，　Ｔｈｏｍｓｅｎ，　Ｐ．Ｄ．，　Ｄａｖｉｅｓ，　Ｗ．，　Ｋａｕｆｍａｎｎ，　Ｗ．，　Ｋｒａｎ，　Ｓ．，Ｇｕｓｔａｖｓｓｏｎ，　Ｉ．，　Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，　Ｋ．，　およびＨａｕｇｅ，　Ｊ．Ｇ．　（１９９０）　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　８：２４３−２４８）、ラット由来のカイニン酸ゲートイオンチャンネル前駆体（Ｈｏｌｌｍａｎｎ，Ｍ．，　Ｏ’Ｓｈｅａ−Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，　Ａ，　Ｒｏｇｅｒｓ，　Ｓ．Ｗ．，　およびＨｅｉｎｅｍａｎｎ，　Ｓ．（１９８９）　Ｎａｔｕｒｅ　３４２：６４３−８）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の一般アミノ酸（ａｍｉｎｏ　ａｉｄ）パーミアーゼ（Ｊａｕｎｉｚｕｘ，　Ｊ．−Ｃ．，　およびＧｒｅｎｓｏｎ，　Ｍ．（１９９０）Ｅｕｒ．Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１９０：３９−４４）、Ｓ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のアルギニンパーミアーゼ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ，　Ｗ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６０：１１８３１−７）、Ｅ．　ｃｏｌｉ由来のラクトースパーミアーゼ（Ｄ．Ｅ．，　Ｇｒｏｎｅｂｏｒｎ，　Ｂ．，　およびＭｕｌｌｅｒ−Ｈｉｌｌ，Ｂ．（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ　２８３：５４１−５４５）、およびＥ．　ｃｏｌｉ由来のマンノースパーミアーゼＥＩＩ−Ｐ　ＭＡＮセグメント（Ｅｒｎｉ，Ｂ．，　Ｚａｎｏｌａｒｉ，　Ｂ．，　およびＫｏｃｈｅｒ，　Ｈ．Ｐ．（１９８７）Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６２：５２３８−４７）と部分的な相同性があった。Ｍｒ＝８７，０００タンパク質サブユニットのＮ末端と、複数のファミリーのイオンチャンネルおよび輸送タンパク質の異なる領域との間の部分相同性は、この関係が注目に値することを示唆している。
【００５２】
【表２】
2004043469.tif 000003
非変性毒素（ＣＢ抗原）の分子量の測定を、６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよびＯ．１ＭＮａＣｌ（ｐＨ７．７）を含有する緩衝液を用いて、ＳＵＰＥＲＯＳＥ　６　ＨＲ　１０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で行った。標準物質（Ｓｉｇｍａ，　Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，　ＭＯ）は、サケ精子ＤＮＡ（ボイド容量）、ブルーデキストラン（２，０００，０００）、ウシチログロブリン（６６９，０００）、ウマ脾臓アポフリチン（４４３，０００）、サツマイモ由来β−アミラーゼ（２００，０００）、ウシ血清アルブミン（６６，０００）、およびウシ赤血球由来カルボニックアンヒドラーゼ（２９，０００）を含む。この分析に用いられた毒素調製物は、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーにより部分精製を行い、次いでＳＵＰＥＲＯＳＥ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）６ＨＲ　１０／３０カラムにかけた。空胞形成毒素活性（細胞培養で検出されるような）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出されたＭｒ＝８７，０００バンドはいくつかの画分に存在し、９７２，０００よりも大きなＭｒを有する各画分は凝集によるものと考えられる。凝集が精製に用いられる処理から生じるかどうかを決定するために、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ　６０１９０由来の濃縮していないブロス培養上清を同じカラムを通して継代培養し、Ｍｒ＝８７，０００タンパク質サブユニットに対する抗血清との反応性について、画分をＥＬＩＳＡで分析した。１００，０００よりも大きい推定分子量のタンパク質を含む複数の画分が抗血清により認識され、Ｍｒ＝８７，０００タンパク質サブユニットの凝集が未処理の上清においても生じていることが示された。
【００５３】
精製毒素のｐＩを等電点電気泳動により測定した。等電点電気泳動は、５Ｍ尿素および２．５％アンフォライト（ｐＨ範囲３．５〜９．５）を含む５％アクリルアミドゲル（ＬＫＢ，Ｂｒｏｍｍａ，　Ｓｗｅｄｅｎ）用いるＲｅｓｏｌｖｅ　Ａｌｐｈａ水平電気泳動ユニット（Ｉｓｏｌａｂ，　Ｉｎｃ．，　Ａｋｒｏｎ，　ＯＨ）で行った。標準物質（Ｓｉｇｍａ）は、トリプシンインヒビター（４．６）、β−ラクトグロブリンＡ（５．１３）、ウシ炭酸脱水酵素ＩＩ（Ｂ）（５．９）、およびヒト炭酸脱水酵素Ｂ（６．６）であった。精製されたＨ．ｐｙｌｏｒｉのＭｒ＝８７，０００の変性タンパク質サブユニットおよび等電点電気泳動標準物質を、１時間エレクトロプロッティングすることによりニトロセルロース紙上に移した。標準物質は、クマシーブルーでの染色により分析し、そしてＨ．ｐｙｌｏｒｉタンパク質は、以下に記載の方法を用い、特異抗血清でのイムノブロッティングにより分析した。非変性毒素は１％アガロースゲル（Ｉｓｏｌａｂ，Ａｋｒｏｎ，　Ｏｈｉｏ）で移動しなかった。おそらくそのサイズが大きいことによる。従って、Ｍｒ＝８７，０００タンパク質サブユニットを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルフラグメントから溶出し、５Ｍ尿素を含む５％アクリルアミドゲルで等電点電気泳動し、ｐＩは約６．１を示した。
【００５４】
実施例３
毒素をコードするＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅および毒素遺伝子のクローニング
中間アミノ酸配列を決定するために、Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ　６０１９０由来ＣＢ抗原を、Ｃｏｖｅｒら、「Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ由来空胞形成毒素の精製および特徴付け」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２６７：１０５７０−５７５（１９９２）の記載のようにカラムクロマトグラフィーにより精製した。クロマトグラフィーについては実施例１を参照のこと。
【００５５】
精製した８７ｋＤａバンドをＰＶＤＦ紙に固定化し、切り出した。アミドブラック染色し切り出したタンパク質バンドをＭｉｌｌｉ−Ｑ水で１回洗浄し、０．５ｍｌの２００μＭ　ＮａＯＨ／２０％アセトニトリルで１分間脱色し、次いでＭｉｌｌｉ−Ｑ水で１回洗浄した。残っている非特異的タンパク質結合部位を０．５ｍｌの０．２％ＰＶＰ−４０／メタノール（ｗ／ｖ）で室温で３０分間、次いで０．５ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水を加えてブロックした。サンプルを１ｍ１のＭｉｌｌｉ−Ｑ水で６〜１０回洗浄して過剰のＰＶＰ−４０を除去し、約１×１−ｍｍ平方に裁断し、同じＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに戻した。５０マイクロリットルの１％ＲＴＸ−１００／１０％アセトニトリル／１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）をストリップに加え、次いで５μｌのＡｒｇ−Ｃプロテアーゼを加えた。最良の結果は、５０μｌ未満の体積の消化緩衝液で得られた。消化は、３７℃で２４時間行った。消化緩衝液中に０．００１％より多いＳＤＳを使用する実験では、ヘプタン／イソアミルアルコール（４：１、ｖ／ｖ）での抽出をＨＰＬＣ分析の前に行った。Ｆｒａｎｋ，Ｒ．Ｗ．，　およびＢｏｓｓｅｒｈｏｆｆ，　Ａ．（１９８８）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｗｉｔｔｍａｎｎ−Ｌｉｅｂｏｌｄ，　Ｂ．，　編），　ＰＰ２７３−２７９，　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ，　Ｂｅｒｌｉｎ　Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ。消化後、サンプルを５分間超音波処理にかけ、次いで１７００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして上清をＨＰＬＣ注入バイアル（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）に移した。引続き５０μｌの消化緩衝液（１Ｘ）および５０μｌの１．１％ＴＦＡ（２Ｘ）での洗浄を、超音波処理および遠心分離にかけて上記のようにして行った。すべての上清を全部で２００μｌになるようプールした。サンプルをすぐにＨＰＬＣで分析しない場合は、２μｌの１％ＤＦＰ／エタノール（ｖ／ｖ）をプールした上清に加えて消化を停止させ、バイアルを−２０℃で保存した。
【００５６】
ペプチドの単離は、二溶媒デリバリーシステム、ダイオード線検出器、容量可変インジェクター、およびオートサンプラーを備えた１０９０Ｍ　ＨＰＬＣ　（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，　Ａｖｏｎｄａｌｅ，　ＰＡ）で行った。フローセルからの放出を、死容量（ｄｅａｄｖｏｌｕｍｅ）が９μｌであるキャピラリーによりフラクションコレクターに直接連結した。データは、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ　７９９９５ＡＣｈｅｍ−Ｓｔａｔｉｏｎソフトウェアを用いて集めた。ペプチドを注入（２００μ１）し、Ｖｙｄａｃ　Ｃ１８カラム（２．１Ｘ２５０ｍｍ）で、流速１５０μｌ／分で、室温で分離した。クロマトグラフィー条件は、Ｓｔｏｎｅらの記載のようにした。Ｓｔｏｎｅ，Ｋ．Ｌ，，　ＬｏＰｒｅｓｔｉ，　Ｍ．Ｂ．，　Ｗｉｌｌｉａｍｓ，　Ｎ．Ｄ．，　Ｃｒａｗｆｏｒｄ，　Ｊ．Ｗ．，　ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ，　Ｒ．，　およびＷｉｌｌｉａｍｓ，Ｋ．Ｒ．（１９８９）　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｈｕｇｌｉ，　Ｔ．Ｅ，，編），　３７７−３９０頁，　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。簡単に述べると、濃度勾配は、１．６〜２９．６％Ｂ（０〜６３分）、２９．６〜６０％Ｂ（６３〜９５分）、６０〜８０％Ｂ（９５〜１０５分）であり、そして用いた緩衝液は、Ａ＝０．１％ＴＦＡ／Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水およびＢ緩衝液＝０．０８％ＴＦＡ／アセトニトリルであった。次いでカラムを、８０％Ｂで１２分間、１５０μｌ／分で洗浄し、１．６％Ｂで５０分間、３００μ１／分で再び平衡化した。ペプチド溶出を２２０ナノメーターでモニターした。画分を０．５分ごとに集め（７５μ１／画分）、配列分析を行うまで−２０℃で保存した。次いで、中間ペプチドのミクロ配列決定をＦｅｒｎａｎｄｅｚ（Ａｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１９９２：２０１１：２５５−２６４）に記載のようにして行った。
【００５７】
３つのペプチドのミクロ配列決定により、以下のアミノ酸配列が得られた（括弧は不明瞭な残基を示す）；
（Ｌ）ＧＱＦＮＧＮ（Ｓ）ＦＴ（Ｓ）ＹＫＤＸＡＤ
配列番号１５
（Ｎ）ＩＫＮＶＥＩＴＲ
配列番号１６
（Ｔ）ＲＶ／ＩＤＦＮＡＫＮＩＬＩＤＮＦＬＥＩＮＮＲ
配列番号１７
この情報を用いて、配列番号２のアミノ酸残基番号２から８、および配列番号１７に既に示されている中間ペプチドのアミノ酸残基番号１３から２０に相当する、変性オリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
５’ＴＴＹＴＴＹＡＣＮＡＣＮＧＴＮＡＴＨＡＴ　３’
配列番号１８
５’ＧＡＹＡＡＹＴＴＹＹＴＮＧＡＲＡＴＨＡＡＹＡＡ　３’
（センス）
配列番号１９
３’ＣＴＲＴＴＲＡＡＲＲＡＮＣＴＹＴＡＤＴＴＲＴＴ　５’
（アンチセンス）
配列番号２０
【００５８】
【表３】
2004043469.tif 000004
変性プライマー中に用いられている記号を表３に示す。
【００５９】
変性オリゴヌクレオチドプライマーは、ＤＮＡシンセサイザーで標準ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｄｉｔｅ）化学を用いて合成した。これらの変性オワゴヌクレオチド（配列番号１８および２０）をポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーとして用いた。このプライマーは、毒素遺伝子の介在配列を増幅するように設計した。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ　６０１９０細胞を蒸留水中に血液寒天プレートから採取し、１００℃で５サイクルボイルし、遠心分離にかけてデブリを除去した。この上清を、ＰＣＲのＤＮＡテンプレートとして用いた。
【００６０】
ＰＣＲは、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　ＤＮＡ熱サイクラーを用いて、製造者の指示に従って行った。ＰＣＲは、温度９４℃で１．５分間、３７℃で２分間、および７２℃で２分間のサイクルで５サイクル、次いで、温度９４℃で１．５分間、４１℃で２分間、および７２℃で２分間のサイクルで４５サイクル行った。増幅したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分析し、有力なバンドが０．５ｋｂに移動したことが分かった。
【００６１】
０．５ｋｂの増幅されたＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから切り出し、精製し、そしてｐＴ７ｂｌｕｅＴ−ベクターキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いてＮＯＶＡＢＬＵＥ（Ｎｏｖａｇｅｎ）細胞にクローニングした。プラスミドＤＮＡを形質転換体から精製し、そしてＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで消化することにより、０．５ｋｂ挿入断片の存在を確認した。λＺＡＰベクタープライマーを用いる挿入断片のジデオキシヌクレオチド配列決定は、標準法により行った。Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　７１：１３４２−４６　（１９７７）、およびＭａｎｉａｔｉｓ，ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　ＮＹ，　１９８９。増幅産物の核酸配列を配列番号１に示す（５’から３’方向、２４から４９５塩基）。この配列の部分は、配列番号２、１５、および１７のアミノ酸配列を正確にコードしていたので、毒素遺伝子の一部が首尾よくクローニングされたことが分かる。詳細には、配列番号１５は、配列番号１の４００から４５０塩基によりコードされていた。
【００６２】
完全な毒素遺伝子をクローニングするために、Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ　６０１９０由来の染色体ＤＮＡを超音波処理により剪断し、得られたフラグメントを０．７％アガロースゲル上で電気泳動した。２〜１０ｋｂの大きさの範囲のフラグメントを切り出し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し平滑末端を得、ホスホリル化ＥｃｏＲＩオクタマーリンカー（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）に連結した。ＤＮＡをＥｃｏＲＩ切断し、λＺＡＰベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＩアームに連結した。連結混合物をＧｉｇａｐａｃｋＩＩパッケージングミックス（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に加え、ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞で滴定した。上記の毒素遺伝子のクローン化０．５ｋｂフラグメントをランダムヘキサマーを用いるプライマー伸長により放射標識し、ゲノムライブラリーをスクリーニングするのに用いた。８つの反応性クローンから組換えファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）を切り出し、ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。これらのクローンに由来するプラスミドＤＮＡは、１．２ｋｂ、１．１ｋｂ、または２．２ｋｂのＤＮＡ挿入断片であることを示した。このような大きさの挿入断片を含む３つの代表的なクローンを、それぞれさらなる研究に用いた（ｐ１Ａ１、ｐ３Ａ１、およびｐ３Ｃ）。これらの組換えプラスミドの制限エンドヌクレアーゼ処理により、ｐ１Ａ１とｐ３Ａ１との間には重複がないことが示された。
【００６３】
ｐ１Ａ１およびｐ３Ａ１の部分配列を、順方向および逆方向ベクタープライマーの両方を用いて決定した。毒素のＮ末端アミノ酸配列に相当するＤＮＡ配列はｐ３Ａ１中で同定され、配列番号１５および１７に示される中間アミノ酸配列に相当する配列はｐｌＡ１中で同定された。ｐ３Ａ１の１．１ｋｂ挿入断片は、配列番号１の１から１７７塩基に相当する配列、および約０．９ｋｂの上流配列を含んでいた。ｐ１Ａ１の１．２ｋｂ挿入断片は、配列番号１に示された配列の１７８から１４１２塩基に相当する配列を含んでいた。
【００６４】
Ｅ．　Ｃｏｌｉでの組換え毒素の発現
クローン３Ａ１は、毒素遺伝子の１７７塩基（Ｎ末端アミノ配列を含む）、リーダー配列、有望なプロモーター、および約０．８ｋｂの上流配列を含んでいた。クローン１Ａ１は、１．２ｋｂの中間毒素遺伝子（配列１７７−１４１２）を含んでおり、そして３Ａ１の下流末端にあるＥｃｏＲ１部位に隣接している。毒素を組換え発現させる１つのアプローチは、プライマーとして配列番号１の１から２０塩基および１３９２から１４１２塩基を用いて、毒素遺伝子の１４１２塩基対フラグメントをＰＣＲ増幅することである。次いで、この配列をＥ．ｃｏｌｉ　ＸＬ１ＢｌｕｅのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングし得、組換え毒素を発現させ得る。あるいは、３Ａ１および１Ａ１のＤＮＡ挿入断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドから切り出し得、ゲル精製し得る。挿入３Ａ１を中間制限部位でカットし、３Ａ１のフラグメントをゲル精製する。毒素遺伝子の所望の部位（プロモーター、リーダー配列、および１から１７７塩基）を含む３Ａ１のフラグメントを挿入断片１Ａ１に連結し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングし得る。両場合ともに、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔによる組換え毒素の生産は、ＩＰＴＧにより誘導され得る。組換え毒素がｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔで発現されない場合は、融合タンパク質の生産を含む改変発現ベクター（例えば、ｐＧＥＸ２Ｔ）が用いられ得る。
【００６５】
本実施例で議論されるように、約５５％の毒素遺伝子がクローニングされ、配列決定された；しかし、毒素遺伝子の残りの部分の配列をクローニングおよび配列決定するために、既知の配列の下流部分をプローブとして用い、λＺＡＰＩＩライブラリーを再スクリーニングし得る。次いで、完全な遺伝子をコードする配列の構築を上記の方法と類似の方法を用いて行い、そして完全組換え毒素をＥ．ｃｏｌｉで発現させ得る。
【００６６】
実施例４
ポリメラーゼチェイン反応またはプローブハイブリダイゼーションによるＨ．ｐｙｌｏｒｉ毒素遺伝子の検出
Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ感染の診断用試験はサンプルの増幅に関するプライマーに基づいて開発され得る。より詳細には、配列番号１に示したヌクレオチドから選択される合成オリゴヌクレオチドを、ポリメラーゼチェイン反応において用い、検出可能なレベルにまでＨ．ｐｙｌｏｒｉ毒素を増幅し得る。この検査では、非変性プライマー配列をＰＣＲに用いる。これらの非変性プライマー配列は、配列番号１に示される核酸から選択される。より詳細には、それらは以下を含み得る：
５’ＴＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＣＧＴＧＡＴＣＡＴ　３’　配列番号２１
３’ＣＴＡＴＴＡＡＡＡＡＡＴＣＴＴＴＡＧＴＴＡＴＴ　５’　配列番号２２
これらのプライマーを用いることにより、実施例３に示したようにして、０．５ｋｂの増幅産物を生成する。あるいは、臨床サンプルを、放射標識した配列番号１またはその一部分とハイブリダイズすることにより、毒素遺伝子を検出し得る。
【００６７】
実施例５
ＣＢ抗原の検出および中和における毒素に対する特異抗血清の使用
Ｍｒ＝８７，０００タンパク質サブユニットに対する抗血清は、雌シロニュージーランドウサギにおいて産生させた。これは、既に記載されたレジメに従って行った（Ｃｏｖｅｒ，Ｔ．Ｌ．，　Ｄｏｏｌｅｙ，　Ｃ．Ｐ．，　およびＢｌａｓｅｒ，　Ｍ．Ｊ．　（１９９０）　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．　５８：６０３−６１０）。まず、ウサギを、Ｍｒ＝８７，０００の変性タンパク質サブユニットを含むクマシーブルー染色アクリルアミドゲルフラグメントで免疫した。続けて、そのウサギを、非染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから蒸留水で溶出し、上記のように疎水性相互作用クロマトグラフィーにより濃縮したＭｒ＝８７，０００の変性タンパク質サブユニットで免疫した。
【００６８】
免疫前血清および免疫血清をウエスタンプロット分析により評価した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ培養上清中のタンパク質を、１アンペアで１時間のエレクトロプロッティングによりニトロセルロース紙上に移した。ニトロセルロース紙ストリップを血清とインキュベートし、洗浄し、アルカリホスファターゼ結合抗ヒトＩｇＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，　ＩＮ）または抗ウサギＩｇＧ（Ｔａｇｏ，　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，　ＣＡ）とインキュベートし、そしてＢｌａｋｅら（Ｂｌａｋｅ、Ｍ．Ｓ．，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，　Ｋ．Ｈ．，　Ｒｕｓｓｅｌ−Ｊｏｎｅｓ，　Ｇ．Ｉ．，　およびＧｏｔｓｃｈｌｉｃｈ，　Ｅ．Ｃ．（１９８４）Ａｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３６：１７５−１７９）の記載のようにして呈色（ｄｅｖｅｌｏｐ）した。精製されたＭｒ＝８７，０００タンパク質サブユニットに対して産生された抗血清は、Ｍｒ＝８７，０００タンパク質バンドを認識し、他のＨ．ｐｙｌｏｒｉ成分は認識しなかった（図３）。
【００６９】
免疫前ウサギ血清および免疫ウサギ血清はまた、ＥＬＩＳＡにより評価した。ＥＬＩＳＡは、マイクロタイターウエル当り１５ｎｇの精製ＣＢ抗原で行い、方法は既に記載されている通りであった（Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ，Ｇ．Ｉ．，　Ｄｗｏｒｋｉｎ，　Ｂ．Ｍ．，　Ｃｈｏｄｏｓ，　Ｊ．Ｅ．，　およびＢｌａｓｅｒ，　Ｍ．Ｊ．（１９８８）Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１０９：４６５−４７１　本明細書中に参考として援用されている）。ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧ（Ｔａｇｏ）または抗ウサギＩｇＧ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）をコンジュゲートとして用いた。ウサギ血清の力価を、０．２より大きい光学濃度を生じる最高希釈の逆数として定義した。この方法を用いると、抗血清の力価は１：５１２，０００であり、一方免疫前血清の力価は１：２ＯＯ未満であった。
【００７０】
空胞形成毒性活性の中和。　中和アッセイに用いる毒素調製物を、既に記載のようにして、Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ　６０１９０を４８時間、５％ウシ胎児血清を含むＢｒｕｃｅｌｌａブロスにおいて培養し、培養物を遠心し、そして限外濾過により上清を濃縮することにより調製した（Ｃｏｖｅｒ，Ｔ．Ｌ．，　Ｐｕｒｙｅａｒ，　Ｗ．，　Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ，　Ｇ．Ｉ．，　およびＢｌａｓｅｒ，　Ｍ．Ｊ．　（１９９１）　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．５９：１２６４−１２７０）。血清を５６℃で３０分間加熱し、組織培養液中で希釈し、そして等量の濃縮Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ上清と１時間インキュベートした。これは既に記載されているようにして行った（Ｃｏｖｅｒ，Ｔ．Ｌ．，　Ｃａｏ，　Ｐ．，　Ｍｕｒｔｈｙ　Ｕ．Ｋ．，　Ｓｉｐｐｌｅ，　Ｍ．Ｓ．，　およびＢｌａｓｅｒ，　Ｍ．Ｊ．（１９９２）　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．　９０：９１３−９１８）。空胞形成毒素活性における血清の中和効果は、ニュートラルレッド取り込みアッセイ（ｎｅｕｔｒａｌ　ｒｅｄ　ｕｐｔａｋｅａｓｓａｙ）を用いて定量した（Ｃｏｖｅｒ，　Ｔ．Ｌ．，　Ｐｕｒｙｅａｒ，　Ｗ．，　Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ，　Ｇ．Ｉ．，　およびＢｌａｓｅｒ，　Ｍ．Ｊ．（１９９１）　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．　５９：１２６４−１２７０）。用いたアッセイ条件下では、抗血清は、１：６４希釈でＨ．　ｐｙｌｏｒｉ６０１９０由来の上清の空胞形成毒素活性を完全に中和したが、一方免疫前血清は中和活性を有していなかった（図４）。抗血清はまた、２つの他の毒素産生Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ株に由来の培養上清に存在する毒素活性をも完全に中和し、種々のＨ．　ｐｙｌｏｒｉ単離株により産生される空胞形成毒素は抗原的に関連があることが示された。
【００７１】
【表４】
2004043469.tif 000005
Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ培養上清における空胞形成毒素の検出。
【００７２】
次の実験は、空胞形成毒素活性とＨ．　ｐｙｌｏｒｉ培養上清中のＣＢ抗原の存在との間に関係があるかどうかを決定することを目的とした。濃縮Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ培養上清の採取物から、８つのｔｏｘ＋株および８つのｔｏｘ−株の上清を選択した（Ｃｏｖｅｒ，Ｔ．Ｌ．，　Ｄｏｏｌｅｙ，　Ｃ．Ｐ．，　およびＢｌａｓｅｒ，　Ｍ．Ｊ．（１９９０）　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．　５８：６０３−６１０）。
【００７３】
これらのＨ．　ｐｙｌｏｒｉ株（表４）を５％ウシ胎児血清を含むＢｒｕｃｅｌｌａブロスにおいて培養し、培養上清を、既に記載のようにして、限外濾過により濃縮した（Ｃｏｖｅｒ，Ｔ．Ｌ．，　Ｄｏｏｌｅｙ，　Ｃ．Ｐ．，　およびＢｌａｓｅｒ，　Ｍ．Ｊ．（１９９０）　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．　５８：６０３−６１０）。
【００７４】
空胞形成毒素活性を定量するために、これらの上清の各希釈物を、ニュートラルレッドアッセイを用いて検査した（Ｃｏｖｅｒ，　Ｔ．Ｌ．，　Ｐｕｒｙｅａｒ，　Ｗ．，　Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ，Ｇ．Ｉ．，　およびＢｌａｓｅｒ，　Ｍ．Ｊ．　（１９９１）Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．　５９＝１２６４−１２７０）。１：２０よりも希釈した場合に、各ｔｏｘ＋上清は、培養液のみより２倍より大きい、細胞による純ニュートラルレッド取り込みを誘導したが、一方各ｔｏｘ−上清は、１：１０に希釈したときに有意なニュートラルレッド取り込みを誘導しなかった。ＣＢ抗原を検出するために、１６種の上清を、Ｍｒ＝８７，０００タンパク質サブユニットに対する抗血清の１：１０，０００希釈を用いてＥＬＩＳＡにより検査した（図５）。ｔｏｘ＋株由来の上清は、ｔｏｘ−株由来の上清よりも有意の高い光学濃度値を生じた（０．６１４±０．１０５に対し０．０４６±０．００９、ｐ＜０．０００１）。ウエスタンプロット研究により、各ｔｏｘ＋上清中のＭｒ＝８７，０００バンドの存在を確認し、これが変性条件下でのＣＢ抗原の形態であることが示された。これらの２つのグループの上清の間で重複がないことは、ＣＢ抗原が、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ上清中での空胞形成毒素活性を媒介する主要な置換体であることを示している。
【００７５】
実施例６
Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ感染ヒト由来の体液中の抗毒素抗体の検出
今までの研究により、全てのＨ．　ｐｙｌｏｒｉ感染者に由来するわけではないが、いく人かのＨ．　ｐｙｌｏｒｉ感染者に由来する血清は、毒素中和抗体を含んでいることが実証されている（Ｌｅｕｎｋ，Ｒ．Ｄ．，　Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，　Ｍ．Ａ．，　Ｍｏｒｇａｎ．　Ｄ．Ｒ．，　Ｌｏｗ，　Ｄ．Ｅ．，およびＳｉｍｏｒ，　Ａ．Ｅ．（１９９０）　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．　２８：１１８１−１１８４；Ｃｏｖｅｒ，　Ｔ．Ｌ．，　Ｃａｏ，　Ｐ．，　Ｍｕｒｔｈｙ　Ｕ．Ｋ．，　Ｓｉｐｐｌｅ，　Ｍ．Ｓ．，　およびＢｌａｓｅｒ，Ｍ．Ｊ．（１９９２）　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　９０：９１３−９１８）。そこで、本発明者らは、Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ感染者および非感染者由来の血清中にある、精製ＣＢ抗原タンパク質に対する抗体の普及率を測定することを試みた。
【００７６】
ヒト血清を、以前にｔｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ａｎｄ　ｔｈｅＶｅｔｅｒａｎｓ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ，　Ｓｙｒａｃｕｓｅ，　ＮＹで胃十二指腸内視鏡検査をうけた、症状のある患者から選択された４０人の患者から得た。これらの患者の胃生検標本の分析および血清学的評価に基づくと、２０人はＨ．ｐｙｌｏｒｉに感染しており、２０人は非感染であった。これらの患者の特徴およびこれらの血清の毒素中和活性は既に記載されている（Ｃｏｖｅｒ，Ｔ．Ｌ．，　Ｃａｏ，　Ｐ．，　Ｍｕｒｔｈｙ　Ｕ．Ｋ．，　Ｓｉｐｐｌｅ，　Ｍ．Ｓ．，　およびＢｌａｓｅｒ，　Ｍ．Ｊ．（１９９２）　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．　９０：９１３−９１８）。これらの４０の血清を、ＥＬＩＳＡにおいて精製ＣＢ抗原とのＩｇＧ反応性について試験した（図６）。
【００７７】
ＥＬＩＳＡは、マイクロタイターウエル当り１５ｎｇの精製ＣＢ抗原で行い、方法は、既に記載の通りであった（Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ，Ｇ．Ｉ．，　Ｄｗｏｒｋｉｎ，　Ｂ．Ｍ．，　Ｃｈｏｄｏｓ，　Ｊ．Ｅ．，　およびＢｌａｓｅｒ，　Ｍ．Ｊ．　（１９８８）　Ａｎｎ．　Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１０９：４６５−４７１　本明細書中に参考として援用されている）。ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧ（Ｔａｇｏ）または抗ウサギＩｇＧ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）をコンジュゲートとして用いた。Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ感染者由来の血清によるＣＢ抗原の平均の認識度は、非感染者由来の血清によるよりも顕著に強かった（ｐ＝０．０００９）。およそ半分のＨ．ｐｙｌｏｒｉ感染者に由来の血清は、非感染者と重複した光学濃度値を生じたが、一方他のＨ．　ｐｙｌｏｒｉ感染者に由来の血清は、重複しない光学濃度値を生じた。このことは、２つの集団が存在し得ることを示唆し、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ株の５０％〜６０％がインビトロで毒素産生性であるという観察結果と一致する。本発明者らは、次いで、ＥＬＩＳＡによるＣＢ抗原の認識と、細胞培養アッセイ（Ｃｏｖｅｒ，Ｔ．Ｌ．，　Ｃａｏ，　Ｐ．，　Ｍｕｒｔｈｙ　Ｕ．Ｋ，，　Ｓｉｐｐｌｅ，　Ｍ．Ｓ．，　およびＢｌａｓｅｒ，　Ｍ．Ｊ．（１９９２）　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．　９０：９１３−９１８）において既に測定された毒素中和活性との間に関係があるかどうかを決定した。Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ感染者由来の血清について、ＣＢ抗原のＥＬＩＳＡ認識は、毒素中和活性と有意に関連していた（ｐ＝０．０１９、ｒ＝０．５１８、直線回帰分析による）。対して、非感染者由来の血清については、これらの変数は有意に関連していなかった（ｐ＝０．９７３、ｒ＝０．００８）。
【００７８】
実施例７
ヒトを含む哺乳類への投与のための経口ワクチンの調製
本発明者らは、Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ感染に対するワクチンの開発におけるＣＢタンパク質の使用の可能な適用を考慮した。ワクチン調製物における胃酸およびタンパク質分解酵素の効果を制限するには、全体のＣＢタンパク質またはそれらの一部分が腸被覆ゼラチンカプセル中にパッケージされ得るか、または炭酸水素ナトリウムと共に投与され得る（Ｂｌａｃｋら、「炭酸水素ナトリウムと共にまたは腸被覆カプセル中で投与されたＴｙ２１ａ弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉの免疫原性」、Ｄｅｖ．　Ｂｉｏｌ．　Ｓｔａｎｄ．　５３：０，　１９８３）。このワクチンにおいて用いられる抗原が組換えにより生産され得ることは注目すべきことである。成人の投与量は、好ましくは、本発明の抗原の５．０〜５０．０ｍｇである。
【００７９】
ＣＢタンパク質の胃腸の免疫系への送達を高めるために、タンパク質［またはタンパク質のフラグメント］を化学結合させずに、２３０μｍの大きさの５〜１０個の経口摂取される生分解性ミクロスフェアに取り込み得る（Ｅｌｄｒｉｄｇｅら、「生分解性ミクロスフェア：経口免疫のためのワクチン送達システム」Ｃｕｒｒ．　Ｔｏｐ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１４６：５９，　１９８９）。ミクロスフェアは、グリコール酸および乳酸のコポリマーで構成される。これらは加水分解により元の成分に分解される。コポリマー内でのグリコール酸と乳酸との比を調整することにより、加水分解速度は数時間から数カ月まで変動する。従って、速効性および遅効性のミクロスフェアの両方が作製され得る。速効性および遅効性のミクロスフェアの混合物の使用は、１回の経口免疫で、一次および二次免疫応答の両方を誘導させるために用いられる。
【００８０】
実施例８
ヒトを含む哺乳類への投与のための非経口ワクチンの調製
胃腸の病原体に対しては経口投与ワクチンが好ましいと思われるが、他のいくつかの感染因子に対しては非経口ワクチンが効果を示す。細菌Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉの成分（腸チフスの原因である）は精製され、非経口投与ワクチンとして使用されている。この成分、Ｖｉ莢膜多糖、はかなり有効である（ＫｌｕｇｍａｎＫＰ，ら、「腸チフスに対するＶｉ莢膜多糖ワクチンの防御活性」Ｌａｎｃｅｔ　１９８７；１２：１６５−６９）。ポリオのソークワクチンを非経口的に投与すると、ポリオウイルスヘの感染にはほとんどまたは全く効果がないが、ポリオの疾患を予防する。非経口ワクチンはまた、限定的ではあるが、コレラの予防にも有効である。
【００８１】
Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉに対して、非経口ワクチンはＣＢタンパク質またはそれらのフラグメントを含み得た。トキソイド調製物もまたジフテリアまたは破傷風トキソイドの用途に類似して調製され得た。タンパク質またはそのフラグメントは、アジュバントと共に、または適切な緩衝液中で単独で投与され得た。アジュバントは、限定はされないが、ムラミルジペプチド、コンカナバリンＡ、ＤＥＡＥデキストラン、脂質多価陽イオン、または炭水化物（例えばヘキサデカン）を包含する。
【００８２】
Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉワクチンは、ヒトに対し、１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中１．０ｍｇ（０．５〜５．０ｍｇ範囲）の抗原（ＣＢタンパク質）として供与され得る。適切な抗原であれば、１回のみの投与が必要とされ得るが、アジュバントを加えたまたは加えない複数投与は考慮され得る。
【００８３】
実施例９
Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ毒素に対する抗体の検出およびＨ．　ｐｙｌｏｒｉの検出のための検査キットいくつかの異なる検出法を用いて抗体を検出するために、特定の検査キットが構成される。抗体検出のための１つの検査キットは、複数のウエル、ＣＢタンパク質またはその抗原性フラグメントで使用する前にコーティングされたプレート、ならびにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧおよび０．００５％過酸化水素を含むマッキルベン緩衝液中のＡＢＴＳからなる変色指示薬からなる酵素検出のためのＥＬＩＳＡ材料を含む区画された容器（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｅｄｅｎｃｌｏｓｕｒｅ）で構成される。アッセイにおいて用いられる抗原は組換えにより生産され得ることは注目すべきことである。もちろん、他の酵素および呈色剤もまた用いられ得る。例えば、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧは、ジエタノールアミンおよび塩化マグネシウム緩衝液中でｐ−ニトロフェニルホスフェートと組み合わせて用いられ得る。
【００８４】
ウエスタンプロット法を用いる抗体検出のための第２の検査キットは、容器、カバー、ニトロセルロースシート、および、ドデシル硫酸ナトリウムが存在しているポリアクリルアミドスラブゲル、界面活性剤、ｐＨ調整剤、乾燥脱脂乳、および過酸化水素を加えたＴｒｉｓ中のＤＡＢからなる変色指示薬を含む酵素検出のための材料で構成される。このウエスタンプロット分析キットはまた、ペルオキシダーゼ標識ヤギまたはウサギ抗ヒト免疫グロブリン、およびＣＢタンパク質またはその抗原性フラグメントの原料を含む。
【００８５】
間接免疫蛍光アッセイを用いる抗体検出のための別のＨ．　ｐｙｌｏｒｉ特異検査キットは、抗原としてＣＢタンパク質またはその抗原性フラグメントを加えた区画された容器、ヒト試験血清、リン酸緩衝生理食塩水、およびフルオレセイン結合ヤギ抗ヒトＩｇＧを含み得る。
【００８６】
最後に、抗体検出のための別のＨ．　ｐｙｌｏｒｉ特異検査キットは、リボソームを用い、容器、ヒト試験血清、蛍光マーカー（または酵素または基質）充填リボソーム（表面に抗原を有する）、および界面活性剤を含む。このアッセイでは、この容器は、ヤギ抗ヒトＩｇＧを有する予めコーティングされたチューブまたはウエルであり得る。
【００８７】
Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ特異検査キットは、いくつかの異なる検出法を用いてＨ．ｐｙｌｏｒｉ毒素を検出するために構成される。Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ毒素検出のための１つのキットは、複数のウエル、試験されるサンプルでコーティングされたプレート、ＣＢタンパク質またはその抗原性フラグメントに対する過免疫抗血清（またはモノクローナル抗体）、抗ウサギ免疫グロブリン、および本実施例で上述されているような適切なＥＬＩＳＡ材料を含む区画された容器を含む。
【００８８】
ウエスタンプロット法を用いるＨ．　ｐｙｌｏｒｉ毒素検出のための第２の検査キットは、容器、カバー、ニトロセルロースシート、および、ドデシル硫酸ナトリウムが存在しているポリアクリルアミドスラブゲル、界面活性剤、ｐＨ調整剤、乾燥脱脂乳、および過酸化水素を加えたＴｒｉｓ中のＤＡＢからなる変色指示薬を含む酵素検出のための材料で構成される。このウエスタンプロット分析キットはまた、ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン、およびＣＢタンパク質またはその抗原性フラグメントに対する過免疫抗血清の原料を含む。
【００８９】
ラテックス凝集アッセイを用いるＨ．　ｐｙｌｏｒｉ毒素検出のための別の特異検査キットは、区画された容器、ラテックスビーズにコンジュゲートしたＣＢタンパク質またはその抗原性フラグメントに対する過免疫血清、およびリン酸緩衝生理食塩水または水を含み得る。
【００９０】
実施例１０
ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ　Ａ１によるＨ．　ｐｙｌｏｒｉ空胞形成毒素活性の阻害
Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ空胞形成毒素に応答して形成する細胞空胞は酸性のｐＨである（ＣｏｖｅｒＴＬ、Ｈａｌｔｅｒ　ＳＡ，　ＭＪ　Ｂｌａｓｅｒ，　１９９２，「Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉブロス培養上清により誘導されたＨｅＬａ細胞空胞の特徴付け」ＨｕｍａｎＰａｔｈｏｌｏｇｙ　２３：１００４−１０１０）。真核細胞の区分（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）内のｐＨ濃度勾配の維持は、典型的には空胞型プロトン輸送ＡＴＰアーゼの活性に依存している（ＭｅｌｌｍａｎＩ，　Ｆｕｃｈｓ　Ｒ，　およびＡ　Ｈｅｌｅｎｉｕｓ．　１９８６．「エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス経路の酸性化」Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　５５：６６３−７００）。本発明者らは、真核細胞の空胞ＡＴＰアーゼがＨ．　ｐｙｌｏｒｉ毒素に誘導された空胞の形成および維持に重要であり得るという仮説をたてた。そこで、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ毒素誘導細胞空胞形成における空胞ＡＴＰアーゼインヒビターの効果を試験した。
【００９１】
イオン輸送ＡＴＰアーゼの９つの種々のインヒビター（ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ　Ａ１、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、７−クロロ−４−ニトロベンズ２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤクロライド）、Ｎ，Ｎ’ジシクロヘキシルカルボジイミドペンタクロロフェノール複合体（ＤＣＣＤ）、硝酸ナトリウム、ウワバイン、ジゴキシン、オルトバナジン酸ナトリウム、オメプラゾール、およびオリゴマイシン（Ｏｌｉｇｏｍｙｃｉｎ））の存在下で、ＨｅＬａ細胞をＨ．ｐｙｌｏｒｉ毒素とインキュベートした。
【００９２】
より詳細には、Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ６０１９０（空胞形成毒素を産生する非常に特徴付けられた株である）を、５％ウシ胎児血清を加えたＢｒｕｃｅｌｌａブロス中で、５％ＣＯ２環境で３７℃で４８時間培養した。培養物を遠心分離にかけた後、上清を超遠心分離により３０倍に濃縮し、０．２ミクロンのフィルターに通した。上清は組織培養アッセイで試験する前に−７０．０℃で保存した。精製毒素は、ゲル濾過クロマトグラフィーをＳＵＰＥＲＯＳＥ１２ＨＲ　１０／５０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の代わりにＳＵＰＥＲＯＳＥ　６ＨＲ　１０／５０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で行ったこと以外は、既に記載のようにして、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ　６０１９０から調製した。
【００９３】
ＨｅＬａ細胞を、１０％ウシ胎児血清および２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）を含むアール（Ｅａｒｌｅ’ｓ）塩を加えたイーグル修正最小必須培地で、５％ＣＯ２環境下で培養した。精製Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ毒素を包含する実験において、培地を１０ｍＭ塩化アンモニウムで補足し、活性を強めた。細胞をＡＴＰアーゼインヒビターと予め１時間インキュベートさせた後、濃縮した培養上清または精製したＨ．ｐｙｌｏｒｉ　６０１９０由来毒素を加え、細胞を３７℃でさらに１８時間インキュベートした。空胞形成は、倒立光学顕微鏡（２００×倍率）により視覚的に評価し、またはニュートラルレッド取り込みアッセイを用いて定量した。（Ｃｏｖｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ，　５９：１２６４−１２７０（１９９１））。顕微鏡アッセイでは、Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ空胞形成毒素活性の阻害を、細胞の１０％未満に空胞が認められるストリンジェント基準により定義した。
【００９４】
おもに空胞型ＡＴＰアーゼのインヒビターは、Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ毒素に反応して空胞の形成を阻害し、そして毒素により誘導される空胞形成をくつがえした。試験した空胞ＡＴＰアーゼインヒビターのうちｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎＡ１が毒素で誘導される空胞形成の最も有効なインヒビターであった（最小阻害濃度＝２５ｎＭ）。他の空胞ＡＴＰアーゼインヒビター（Ｎ−エチルマレイミド、７−クロロ−４−ニトロベンズ‐２−オキサ−１，３−ジアゾール、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、および硝酸ナトリウムを含む）は、より高い濃度で空胞形成毒素活性を阻害した。それに対して、Ｆ１Ｆ０型またはＰ型ＡＴＰアーゼインヒビターは毒素活性を阻害しなかった。（表５を参照のこと）。
【００９５】
【表５】
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要約すると、空胞型ＡＴＰアーゼのインヒビター（ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ　Ａ１で例示される）は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ空胞形成毒素により誘導される細胞傷害のインヒビターであり、Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ関連胃十二指腸疾患の治療において有用な治療薬であり得る。
【００９６】
本発明は特定のおよび好ましい実施態様に関連しておもに記載されているが、本発明の範囲から逸脱しない改変を行い得ることが理解される。以下の請求の範囲は、一般には本発明の原則に従い、そして本発明の属する分野において既知のまたは慣例の実施内にあるような、または当業者に明らかであるような本発明の開示からの変更を包含する、本発明のすべての変形、使用、または適用をカバーすることが意図されている。
【００９７】
本発明は、精製Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ空胞形成毒素およびＨ．ｐｙｌｏｒｉ感染に対する防御抗体の生成に本毒素を使用する方法を提供することを課題とする。本抗原に対する抗血清は、本毒素を検出するために使用され得る。項毒素抗体を検出する方法は、消化性潰瘍疾患、胃ガン、またはその他のＨ．ｐｙｌｏｒｉ感染の臨床結果を発病させる患者の感受性を決定する。
【００９８】
【発明の効果】
従って、本発明は、精製Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ空胞形成毒素およびＨ．　ｐｙｌｏｒｉ感染に対する防御抗体の生成に本毒素を使用する方法を提供することを目的とする。
【００９９】
【配列表】
【０１００】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】図１はＨ．　ｐｙｌｏｒｉ空胞形成毒素のカラムクロマトグラフィーを示す。カラムの溶出物は２８０ナノメーターの吸光度（実線）に対してモニターした。そして塩濃度は点線で示す。画分の空胞形成毒素活性はニュートラルレッドアッセイを用いてアッセイし、純光学濃度（ｎｅｔｏｐｔｉｃａｌ　ｄｅｎｓｉｔｙ）（黒丸）として表わす。Ａ）硫酸アンモニウム沈澱させた上清中のタンパク質のＰＨＥＮＹＬＳＵＰＥＲＯＳＥ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）クロマトグラフィー。初期の画分（１ｍｌ〜１５ｍｌ容量）の緩衝液中の硫酸アンモニウム（０．５Ｍ）の存在が、これらの画分によって誘導されるニュートラルレッドの取り込みに貢献した（Ｃｏｖｅｒ，Ｔ．Ｌ．，　Ｐｕｒｙｅａｒ，　Ｗ．，　Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ，　Ｇ．Ｉ．，　Ｂｌａｓｅｒ，　Ｍ．Ｊ．（１９９１）　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．５９：１２６４−７０）。Ｂ）Ａからの溶出ピークをＳＵＰＥＲＯＳＥ　１２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに添加し、そして毒素活性をボイド容量で検出した。Ｃ）ＳＵＰＥＲＯＳＥ１２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムから溶出した毒素活性を有する画分をＭＯＮＯ　Ｑ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに添加し、そして毒素活性をＮａＣｌの直線濃度勾配をかけて溶出した。
【図１Ｂ】図１はＨ．　ｐｙｌｏｒｉ空胞形成毒素のカラムクロマトグラフィーを示す。カラムの溶出物は２８０ナノメーターの吸光度（実線）に対してモニターした。そして塩濃度は点線で示す。画分の空胞形成毒素活性はニュートラルレッドアッセイを用いてアッセイし、純光学濃度（ｎｅｔｏｐｔｉｃａｌ　ｄｅｎｓｉｔｙ）（黒丸）として表わす。Ａ）硫酸アンモニウム沈澱させた上清中のタンパク質のＰＨＥＮＹＬＳＵＰＥＲＯＳＥ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）クロマトグラフィー。初期の画分（１ｍｌ〜１５ｍｌ容量）の緩衝液中の硫酸アンモニウム（０．５Ｍ）の存在が、これらの画分によって誘導されるニュートラルレッドの取り込みに貢献した（Ｃｏｖｅｒ，Ｔ．Ｌ．，　Ｐｕｒｙｅａｒ，　Ｗ．，　Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ，　Ｇ．Ｉ．，　Ｂｌａｓｅｒ，　Ｍ．Ｊ．（１９９１）　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．５９：１２６４−７０）。Ｂ）Ａからの溶出ピークをＳＵＰＥＲＯＳＥ　１２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに添加し、そして毒素活性をボイド容量で検出した。Ｃ）ＳＵＰＥＲＯＳＥ１２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムから溶出した毒素活性を有する画分をＭＯＮＯ　Ｑ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに添加し、そして毒素活性をＮａＣｌの直線濃度勾配をかけて溶出した。
【図１Ｃ】図１はＨ．　ｐｙｌｏｒｉ空胞形成毒素のカラムクロマトグラフィーを示す。カラムの溶出物は２８０ナノメーターの吸光度（実線）に対してモニターした。そして塩濃度は点線で示す。画分の空胞形成毒素活性はニュートラルレッドアッセイを用いてアッセイし、純光学濃度（ｎｅｔｏｐｔｉｃａｌ　ｄｅｎｓｉｔｙ）（黒丸）として表わす。Ａ）硫酸アンモニウム沈澱させた上清中のタンパク質のＰＨＥＮＹＬＳＵＰＥＲＯＳＥ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）クロマトグラフィー。初期の画分（１ｍｌ〜１５ｍｌ容量）の緩衝液中の硫酸アンモニウム（０．５Ｍ）の存在が、これらの画分によって誘導されるニュートラルレッドの取り込みに貢献した（Ｃｏｖｅｒ，Ｔ．Ｌ．，　Ｐｕｒｙｅａｒ，　Ｗ．，　Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ，　Ｇ．Ｉ．，　Ｂｌａｓｅｒ，　Ｍ．Ｊ．（１９９１）　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．５９：１２６４−７０）。Ｂ）Ａからの溶出ピークをＳＵＰＥＲＯＳＥ　１２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに添加し、そして毒素活性をボイド容量で検出した。Ｃ）ＳＵＰＥＲＯＳＥ１２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムから溶出した毒素活性を有する画分をＭＯＮＯ　Ｑ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに添加し、そして毒素活性をＮａＣｌの直線濃度勾配をかけて溶出した。
【図２】図２はＨ．　ｐｙｌｏｒｉ毒素（ＣＢ抗原）の変性、還元条件下でのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１２％アクリルアミド）を示す。レーンは：ａ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ　６０１９０のブロス培養上清から、硫酸アンモニウムの５０％飽和溶液で沈澱させたタンパク質；ｂ、疎水性相互作用クロマトグラフィーで部分的に精製した毒素；ｃ、ゲル濾過クロマトグラフィーで部分的に精製した毒素；ｄ、陰イオン交換クロマトグラフィーをかけた後、変性、還元条件下でＭｒ＝８７，０００のバンドとして視覚化された精製ＣＢ抗原。クロマトグラフィー条件はテキストに記載されている通りであった。既知の分子量（キロダルトン）のマーカータンパク質の移動度は左に示す。
【図３】図３は免疫ウサギ血清によるＭｒ＝８７，０００のタンパク質バンドのウエスタンブロットの認識を示している。硫酸アンモニウム５０％飽和溶液により、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ　６０１９０のブロス培養物から沈澱させたタンパク質を１０％アクリルアミドゲルで電気泳動し、ニトロセルロース紙に移し、ウサギ血清の１：１０，０００希釈液とインキュベートし、抗原を分析した。レーンａ、免疫前血清。レーンｂ、精製したＭｒ＝８７，０００の変性Ｈ．ｐｙｌｏｒｉタンパク質サブユニットに対して作製した抗血清。この抗血清ではＭｒ＝８７，０００のバンドのみ認識した。
【図４】図４は精製したＭｒ＝８７，０００の変性タンパク質サブユニットに対して産生された抗血清によるＨ．ｐｙｌｏｒｉの空胞形成毒素活性の中和を示す。免疫前血清、および精製したＭｒ＝８７，０００のＨ．　ｐｙｌｏｒｉタンパク質サブユニットに対して産生された抗血清を毒素中和活性について試験した。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ　６０１９０由来の粗濃縮ブロス培養上清によって誘導されたニュートラルレッドの取り込みを、点線で示す。１：６４希釈で、抗血清は完全に毒素活性を中和したが、免疫前血清は毒素活性を中和しなかった。
【図５】図５はＨ．　ｐｙｌｏｒｉ上清中の空胞形成毒素の検出を示す。８つのｔｏｘ＋　Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ株および８つのｔｏｘ−株由来の濃縮培養上清を炭酸緩衝液で１：１００に希釈し、Ｍｒ＝８７，０００の変性タンパク質サブユニットに対する抗血清（１：１０，０００希釈）との反応性についてＥＬＩＳＡで試験した。ｔｏｘ＋上清はｔｏｘ−上清よりかなり高い光学濃度値を示した（０．６１４±０．１１に対し０．０４６±０．０１、Ｐ＜０．０００１）。
【図６】図６はヒト血清による精製Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ毒素（ＣＢ抗原）の血清学的な認識を示す。２０人のＨ．　ｐｙｌｏｒｉ感染者および２０人の未感染者由来の血清を１：１００に希釈し、精製ＣＢ抗原（１５ｎｇ／マイクロタイターウエル）とのＩｇＧ反応性についてＥＬＩＳＡで試験した。Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ感染患者由来の血清は未感染者由来の血清より有意に高く精製毒素を認識した（平均光学濃度はそれぞれ０．４２４±０．０６および０．１８２±０．０２、ｐ＝０．０００９）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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