(57)【要約】【課題】被験物質中の標的物質であるダイオキシン類等の環境汚染物質に代表される低分子物質の、簡便かつ高感度の検出手段を提供すること。【解決手段】被験試料中の標的物質に結合し得る抗体を一部とする標識抗体と、被験試料の反応物を接触させるための、反応物接触部位が設けられている、被験試料中の標的物質を検出可能な、イムノクロマトグラフィーを用いた低分子物質検出用器具を用いて、上記低分子物質の検出を行うことにより、上記の課題を解決し得ることを見いだした。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験試料中の標的物質に結合し得る抗体を一部とする標識抗体と、被験試料の反応物を接触させるための、反応物接触部位が設けられている、被験試料中の標的物質を検出可能な、イムノクロマトグラフィーを用いた低分子物質検出用器具。
【請求項２】
下記の（１）および（２）が設けられている、請求項１記載の低分子物質検出用器具。
（１）：標的物質に結合していないフリーの標識抗体を捕捉することが可能な要素を結合状態で含む、未反応標識抗体捕捉部位。
（２）：標識抗体が結合した標的物質と接触すると視覚的な変化を生じる検出要素を含む、検出部位。
【請求項３】
検出部位における検出要素が、金属コロイド粒子またはラテックス粒子である、請求項１または２記載の低分子物質検出用器具。
【請求項４】
検出部位における検出要素が、結合状態で含まれる、請求項１〜３のいずれかに記載の低分子物質検出用器具。
【請求項５】
未反応標識抗体捕捉部位における、標的物質に結合していないフリーの標識抗体を捕捉することが可能な要素が、標的物質、または、標的物質の類似物質である、請求項１〜４のいずれかに記載の低分子物質検出用器具。
【請求項６】
未反応標識抗体捕捉部位、および、検出部位が、多孔性のクロマトグラフィー用メンブレンに固定化された担体を基材とする、請求項１〜５のいずれかに記載の低分子物質検出用器具。
【請求項７】
標的物質が、ダイオキシン類、および／または、ＰＣＢ類である、請求項１〜６のいずれかに記載の低分子物質検出用器具。
【請求項８】
反応物接触部位において接触させた、被験試料中の標的物質に結合し得る抗体を一部とする標識抗体と被験試料の反応物中の、標識抗体と標的物質の複合体、および／または、標的物質を結合していないフリーの標識抗体を検出することにより、被験試料中の標的物質の検出を行う、請求項１〜７のいずれかに記載の低分子検出用器具の使用方法。
【請求項９】
（１）請求項１〜８のいずれかに記載の低分子物質検出器具、および、（２）被験試料中の標的物質に結合し得る抗体を一部とする標識抗体を、構成要素として含む、低分子物質検出用セット。
【請求項１０】
被験試料中の標的物質に結合し得る抗体を一部とする標識抗体が、乾燥状態で保たれている、請求項９記載の低分子物質検出用セット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定物質の検出器具に関する発明である。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ダイオキシン類、ＰＣＢ類、その他の環境汚染物質による、環境汚染が深刻化し、人体および生体への影響が懸念されている。これまで、ダイオキシン類等の環境汚染物質の検出方法としては、ガス・クロマトグラフ質量分析法（ＧＣ−ＭＳ法）を中心とした分析法が用いられてきた。ＧＣ−ＭＳ法は、公定分析法として用いられており、その感度、精度共、非常に優れた方法であるが、特殊な装置を必要とするために、分析コストが高く、分析の手順自体も煩雑である等の問題点が認められる。
【０００３】
ダイオキシン類等の環境汚染物質を、一般的には、ＧＣ−ＭＳ法よりも簡便な、これらの化学物質に対する抗体を用いるＥＬＩＳＡ法により、検出を行うことは、上記の問題点の解決手段の一つとして認められている。
【０００４】
しかしながら、ＥＬＩＳＡ法には、定量性に優れ、高感度であるが、通常、サンプルの検出に、特殊な機器を必要とするか、必要としない場合であっても、検出するまでの時間が１時間以上かかる、等の欠点が認められる。これらの欠点を補うため、操作が簡単で、高感度であり、検出時間が短い、免疫クロマトグラフィーが注目されている。
【０００５】
免疫クロマトグラフィーにおいて最も広く利用されているＥＬＩＳＡ法の態様としては、被験物質である高分子物質（それ自身で抗原性を有する物質）の異なる部位に結合する２種類の抗体を利用したサンドイッチ法が挙げられる（特許文献１、２等）。このサンドイッチ法を利用した検出器具では、標的物質となっている高分子物質の濃度に比例した強度の着色を生じ、被験物質の検出が容易であることから、病院での臨床検査、家庭での妊娠検査等において、広く普及している。
【特許文献１】
特開平１０−６２４２０号公報
【特許文献２】
特開２００１−１２４７７１号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
被験物質が、ダイオキシン類やＰＣＢ類のように、低分子化合物である場合は、低分子化合物と抗体との分子量の差が著しいため、サンドイッチ法を適用することは困難である。このため、低分子化合物を免疫クロマトグラフィーで検出する際には、標的となる低分子化合物と、低分子化合物もしくは低分子化合物に対する類似化合物を、抗体に対する結合において競合させて、標的低分子化合物を検出する、競合法が適しているとも考えられる。
【０００７】
しかしながら、競合法を用いた場合は、低分子化合物の濃度に反比例した強度の着色を指標にせざるを得ないため、標的物質の濃度に比例した強度の着色を指標とするサンドイッチ法に比較し、被験物質の判定が煩雑となる。このため、競合法を用いた免疫クロマトグラフィーは、広く普及するに至っておらず、ダイオキシンやＰＣＢ等の低分子の環境汚染物質の検出に用いることも困難である。
【０００８】
このような課題を解決するために、
ａ）被験試料を接触させるための「被験試料適用部位」
ｂ）被験試料中の標的物質に結合し得る抗体を一部とする標識抗体を非結合状態で含む「標識抗体反応部位」
ｃ）標的物質に結合していないフリーの標識抗体を捕捉することが可能な要素を結合状態で含む「未反応標識抗体捕捉部位」
ｄ）標識抗体が結合した標的物質と接触すると視覚的な変化を生じる検出要素を含む「検出部位」
のａ）〜ｄ）が設けられた、低分子物質検出用器具を提供することは、非常に有益である、と考えられる。
【０００９】
しかしながら、このような低分子物質検出用器具においては、検出感度が期待するほどには上がりにくい、という問題点が生ずる傾向が認められる。
すなわち、このような低分子検出用器具では、
１）被験試料を、被験試料適用部位に接触させると、被験試料における溶媒と共に、標識抗体反応部位の標識抗体が、メンブレン上の未反応標識抗体捕捉部位に、一気に到達するため、標識抗体反応部位の標識抗体の量を十分とすると、未反応の標識抗体のすべてを、捕捉部位において捕捉することが困難となり、被験試料中に、標的物質が存在しない場合であっても、検出部位において、擬陽性反応が起こってしまう懸念が認められる。
【００１０】
２）標識抗体反応部位の標識抗体のメンブレンへのリリースを促進させるため、界面活性剤処理を行うと、本来起こるべき抗原抗体反応が阻害され、被験試料中に標的物質が存在しない場合であっても、未反応標識抗体のすべてが捕捉部位で捕捉されず、検出部位において擬陽性反応が起こってしまう懸念が認められる。
【００１１】
３）被験試料を被験試料適用部位に接触させる際に、被験試料における溶媒と共に、標識抗体反応部位の標識抗体が、一気にメンブレン上を移動するため、標識抗体と反応可能な被験試料中の標的物質は一部のみとなり、たとえ、被験試料の量を増やしても、検出感度の上昇にはつながり難い傾向が認められる。
等の問題点が生ずる傾向が認められる。
【００１２】
本発明は、このような低分子化合物検出用の免疫クロマトグラフィーが有する問題点を考慮しつつ、被験物質中の標的物質であるダイオキシン類等の環境汚染物質に代表される低分子物質の検出手段を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題の解決に向けて、鋭意検討を行った結果、被験試料を、直接に被験試料適用部位に接触させるのではなく、予め、被験試料と標識抗体を接触させて得られる反応物を、被験対象物として扱うことで、かかる課題を解決し得ることを見いだし、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は、被験試料中の標的物質に結合し得る抗体を一部とする標識抗体（本明細書において、標識抗体ともいう）と、被験試料の反応物を接触させるための、反応物接触部位が設けられている、被験試料中の標的物質を検出可能な、イムノクロマトグラフィーを用いた低分子物質検出用器具（以下、本検出用器具ともいう）、を提供する発明である。
【００１５】
また、本発明は、本検出用器具の使用方法（以下、本使用方法ともいう）と、本使用方法を行うための検出用セット（以下、本検出用セットともいう）を提供する発明である。
【００１６】
なお、本発明における被験試料は、低分子物質を含み得る試料であれば限定されず、特に、ダイオキシン類やＰＣＢ類等の環境関連低分子物質を含み得る試料が、好適な対象となる。例えば、大気、土壌、湖水や海水等の水試料等が挙げられる。被験試料には、その性質に応じて、様々の前処理、例えば、希釈処理、クリーン・アップ、濾過処理、濃縮処理等を行ったものも含めるものとする。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
第１図は、本検出用器具の一実施態様を示した図面（上面図）であり、第２図は、第１図の本検出器具１０を、実線Ｉ−Ｉ’に沿って横断して示した横断面図である。
【００１８】
本検出用器具１０において、反応物接触部位１、メンブレン５、および、吸収部位４は、各々、細長形状の薄膜６の上面に全部または一部が、接着している。また、未反応標識抗体捕捉部位２と検出部位３は、メンブレン５上に、各々、設けられている。
【００１９】
より詳細には、まず、薄膜６の一端に、反応物接触部位１の一端側が接着されている。これに対して、反応物接触部位１の他端側は、その一端が反応物接触部位１の薄膜６との接着部分（反応物接触部位１の一端側）と隣合って、その全面が薄膜６に接着されているメンブレン５の、一端側の上面に被さって、メンブレン５と接触している。薄膜６の他端側には、吸収部位４の一端側が接着されており、この吸収部位４の他端側は、メンブレン５の他端側の上面に被さって、メンブレン５と接触している。
【００２０】
未反応標識抗体捕捉部位２と検出部位３は、両者共、これらの部位を構成する化学成分を、メンブレン５に固定することにより、メンブレン５において設けられている。
【００２１】
本検出用器具１０は、被験試料を、そのまま、被験試料適用部位等に接触させるのではなく、予め、被験試料と標識抗体を接触させて得た反応物を、反応物接触部位１に接触させることを前提とする、イムノクロマトグラフィーを用いた検出用器具である。この点において、本検出用器具１０は、被験試料を、そのまま被験試料適用部位に接触させる、従来のイムノクロマトグラフィーを用いた検出用器具と異なっている。
【００２２】
このことにより、被験試料と標識抗体を十分に反応させることが可能になり、この反応を行った反応物を、本検出用器具１０に対して用いることにより、標識抗体が、一気に未反応標識抗体捕捉部位に到達するのを抑制することが可能となり、上述した擬陽性反応が抑制されて、検出感度が向上し、例えば、環境中における極微量の存在が問題となる低分子物質を、簡便、かつ、鋭敏に検出することが可能である。
【００２３】
本検出器具１０において、上記の反応物は、これを接触させる反応物接触部位１から吸収部位４に向けて、毛細管現象により移動して、被験試料中の低分子物質の検出が行われる（以下、本検出用器具の反応物接触部位側を「上流」、同吸収部位側を「下流」ともいう）。第１図および第２図において、上流から下流への反応物の移動方向は、矢印９により示される。
【００２４】
被験試料中に含まれ得る標的物質は、微量成分として生活環境に存在する低分子人工化学物質（以下、これらの物質を、「環境汚染物質」と総称することもある）である。環境汚染物質としては、特に、いわゆる「環境ホルモン」として、内分泌攪乱作用が疑われる物質が、好適な対象として挙げられる。具体的には、ダイオキシン類、ポリ塩化ビフェニール（ＰＣＢ）類、ポリ臭化ビフェニール（ＰＢＢ）類、ヘキサクロロベンゼン（ＨＣＢ）、ペンタクロロフェノール（ＰＣＰ）、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、アミトロール、アトラジン、アラクロール、ＣＡＴ（シマジン）、ヘキサクロロシクロヘキサン、エチルパラチオン、ＮＡＣ（カルバリル）、クロルデン、オキシクロルデン、ｔｒａｎｓ−ノナクロル、１，２−ジブロモ−３−　クロロプロパン、ＤＤＴ（ジクロロジフェニルトリクロロエタン）、ＤＤＥ（ジクロロジフェニルトリクロロエチレン）、ＤＤＤ（ジクロロジフェニルジクロロエタン）、ケルセン、アルドリン、エンドリン、ディルドリン、エンドスルファン（ベンゾエピン）、ヘプタクロル、ヘプタクロルエポキサイド、マラチオン、メソミル、メトキシクロル、マイレックス、ニトロフェン、トキサフェン、トリブチルスズ、トリフェニルスズ、トリフルラリン、アルキルフェノール（Ｃ５〜Ｃ９）ノニルフェノール、オクチルフェノール、ビスフェノールＡ、フタル酸ジ−２−　エチルヘキシル、フタル酸ブチルベンジル、フタル酸ジ−　ｎ−　ブチル、フタル酸ジシクロヘキシル、フタル酸ジエチル、ベンゾ（ａ）ピレン、２，４−ジクロロフェノール、アジピン酸ジ−２−　エチルヘキシル、ベンゾフェノン、４−ニトロトルエン、アルディカーブ、ベノミル、キーポン（クロルデコン）、マンゼブ（マンコゼブ）、マンネブ、メチラム、メトリブジン、シペルメトリン、エスフェンバレレート、フェンバレレート、ペルメトリン、ビンクロゾリン、ジネブ、ジラム、フタル酸ジペンチル、フタル酸ジヘキシル、フタル酸ジプロピル等が挙げられる。
【００２５】
上に列挙した環境汚染物質の中でも、最も典型的には、ダイオキシン類やＰＣＢ類が挙げられる。ダイオキシン類としては、例えば、ダイオキシン類特別措置法で指定されている２９種類のダイオキシン類を挙げることができる。すなわち、２，３，７，８−Ｔ４ＣＤＤ、１，２，３，７，８−Ｐ５ＣＤＤ、１，２，３，４，７，８−Ｈ６ＣＤＤ、１，２，３，６，７，８−Ｈ６ＣＤＤ、１，２，３，７，８，９−Ｈ６ＣＤＤ、１，２，３，４，６，７，８−Ｈ７ＣＤＤ、１，２，３，４，６，７，８，９−Ｏ８ＣＤＤ等のジベンゾダイオキシン類；３，４，４’，５−　Ｔ４ＣＢ、３，３’，４，４’−Ｔ４ＣＢ、３，３’，４，４’，５−Ｐ５ＣＢ、３，３’，４，４’，５，５’−　Ｈ６ＣＢ、２，３，３’，４，４’−Ｐ５ＣＢ、２，３，４，４’，５−　Ｐ５ＣＢ、２，３’，４，４’，５−Ｐ５ＣＢ、２’，３，４，４’，５−Ｐ５ＣＢ、２，３，３’，４，４’，５−Ｈ６ＣＢ、２，３，３’，４，４’，５’−　Ｈ６ＣＢ、２，３’，４，４’，５，５’−　Ｈ６ＣＢ、２，３，３’，４，４’，５，５’−　Ｈ７ＣＢ等のコプラナーＰＣＢ類；２，３，７，８−Ｔ４ＣＤＦ、１，２，３，７，８−Ｐ５ＣＤＦ、２，３，４，７，８−Ｐ５ＣＤＦ、１，２，３，４，７，８−Ｈ６ＣＤＦ、１，２，３，６，７，８−Ｈ６ＣＤＦ、１，２，３，７，８，９−Ｈ６ＣＤＦ、２，３，４，６，７，８−Ｈ６ＣＤＦ、１，２，３，４，６，７，８−Ｈ７ＣＤＦ、１，２，３，４，７，８，９−Ｈ７ＣＤＦ、１，２，３，４，６，７，８，９−Ｏ８ＣＤＦ等のジベンゾフラン類等が挙げられる。
【００２６】
ＰＣＢ類としては、例えば、２−Ｍｏｎｏｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、３−Ｍｏｎｏｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、４−Ｍｏｎｏｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ；
２，２’−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，３’−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，４’−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，５−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，６−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、３，３’−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、３，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、３，４’−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、３，５−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、４，４’−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　；
【００２７】
２，２’，３−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，４−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，５−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，６−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，３，３’−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，３，４−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３，４’−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，３，５−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３，６−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３’，４−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，３’，５−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，３’，６−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，４，４’−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，４，５−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，４，６−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，４’，５−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，４’，６−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２’，３，４−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２’，３，５−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、３，３’，４−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、３，３’，５−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、３，４，４’−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、３，４，５−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、３，４’，５−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ；
【００２８】
２，２’，３，３’−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，４−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，４’−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，５−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，５’−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，６−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，６’−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，４，４’−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，４，５−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，４，５’−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，４，６−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，４，６’−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，５，５’−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，５，６’−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，６，６’−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３，３’，４−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，３，３’，４’−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３，３’，５−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，３，３’，５’−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３，３’，６−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，３，４，４’−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，３，４，５−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３，４，６−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３，４’，５−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，３，４’，６−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，３，５，６−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３’，４，４’−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３’，４，５−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，３’，４，５’−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３’，４，６−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，３’，４’，５−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３’，４’，６−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３’，５’，６−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，４，４’，５−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，４，４’，６−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２’，３，４，５−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、３，３’，４，４’−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、３，３’，４，５−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、３，３’，４，５’−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、３，４，４’，５−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ；
【００２９】
２，２’，３，３’，４−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，３’，５−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，３’，６−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，４，４’−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，４，５−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，４，５’−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，４，６−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，４，６’−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，４’，５−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，４’，６−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，５，５’−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，５，６−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，５，６’−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，５’，６−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，６，６’−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３’，４，５−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３’，４，６−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，４，４’，５−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，４，４’，６−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，４，５，５’−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，４，５，６’−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，４，５’，６−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，４，６，６’−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３，３’，４，４’−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３，３’，４，５−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，３，３’，４’，５−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３，３’，４，５’−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３，３’，４，６−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，３，３’，４’，６−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３，３’，５，５’−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３，３’，５，６−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，３，３’，５’，６−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３，４，４’，５−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，３，４，４’，６−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，３，４，５，６−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３，４’，５，６−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，３’，４，４’，５−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３’，４，４’，６−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３’，４，５，５’−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３’，４，５’，６−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２’，３，３’，４，５−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２’，３，４，４’，５−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２’，３，４，５，５’−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２’，３，４，５，６’−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、３，３’，４，４’，５−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、３，３’，４，５，５’−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　；
【００３０】
２，２’，３，３’，４，４’−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，３’，４，５−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，３’，４，５’−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，３’，４，６−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，３’，４，６’−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，３’，５，５’−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，３’，５，６−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，３’，５，６’−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，３’，６，６’−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，４’，４，５−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，４，４’，５’−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，４，４’，６−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，４，４’，６’−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，４，４，５’−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，４，５，６−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，４，５，６’−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，４，５’，６−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，４，６，６’−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，４’，５，５’−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，４’，５，６−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，４’，５，６’−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，４’，５’，６−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，４’，６，６’−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，５，５’，６−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，５，６，６’−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，４，４’，５，５’−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，４，４’，５，６’−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，４，４’，６，６’−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３，３’，４，４’，５−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，３，３’，４，４’，５’−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３，３’，４，４’，６−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，３，３’，４，５，５’−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，３，３’，４，５，６−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３，３’，４，５’，６−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，３，３’，４’，５，５’−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３，３’，４’，５，６−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，３，３’，４’，５’，６−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３，３’，５，５’，６−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，３，４，４’，５，６−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３’，４，４’，５，５’−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３’，４，４’，５’，６−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、３，３’，４，４’，５，５’−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　；
【００３１】
２，２’，３，３’，４，４’，５−Ｈｅｐｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，３’，４，４’，６−Ｈｅｐｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，３’，４，５，５’−Ｈｅｐｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，３’，４，５，６−Ｈｅｐｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，３’，４，５，６’−Ｈｅｐｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，３’，４，５’，６−Ｈｅｐｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，３’，４，６，６’−Ｈｅｐｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，３’，４’，５，６’−Ｈｅｐｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，３’，５，５’，６−Ｈｅｐｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，３’，５，５，６’−Ｈｅｐｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，４，４’，５，５’−Ｈｅｐｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，４，４’，５，６−Ｈｅｐｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，４，４’，５，６’−Ｈｅｐｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，４，４’，５’，６−Ｈｅｐｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，４，４’，６，６’−Ｈｅｐｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，４，５，５’，６−Ｈｅｐｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，４，５，６，６’−Ｈｅｐｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，４’，５，５’，６−Ｈｅｐｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，４’，５，６，６’−Ｈｅｐｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３’，４，４’，５，５’−Ｈｅｐｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３’，４，４’，５，６−Ｈｅｐｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３’，４，４’，５’，６−Ｈｅｐｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３’，４，５，５’，６−Ｈｅｐｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３’，４’，５，５’，６−Ｈｅｐｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　；
【００３２】
２，２’，３，３’，４，４’，５，５’−Ｏｃｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，３’，４，４’，５，６−Ｏｃｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，３’，４，４’，５’，６−Ｏｃｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，３’，４，４’，６，６’−Ｏｃｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，３’，４，５，５’，６−Ｏｃｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，３’，４，５，６，６’−Ｏｃｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，３’，４，５’，６，６’−Ｏｃｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，３’，４’，５，５’，６−Ｏｃｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，３’，５，５’，６，６’−Ｏｃｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，４，４’，５，５’，６−Ｏｃｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，２’，３，４，４’，５，６，６’−Ｏｃｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　、２，３，３’，４，４’，５，５’，６−Ｏｃｔａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ　；
【００３３】
２，２’，３，３’，４，４’，５，５’，６−Ｎｏｎａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，３’，４，４’，５，６，６’−Ｎｏｎａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２’，３，３’，４，５，５’，６，６’−Ｎｏｎａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ；Ｄｅｃａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ等が挙げられる。
【００３４】
なお、上述したような、本検出用器具において用いるべき、ダイオキシン類やＰＣＢ類に対する抗体を調製する場合の指針は、被験試料におけるダイオキシン類やＰＣＢ類の毒性を推定する場合と、これらの環境汚染物質の総量を推定する場合とでは、標的物質として好適な異性体が異なる。例えば、被験試料のダイオキシン類による毒性を推定する場合は、被験物質中のダイオキシン類の全毒性に占める割合が高い、１，２，３，７，８−Ｐ５ＣＣＤ、２，３，４，７，８−Ｐ５ＣＤＦ、または、３，３’，４，４’，５−Ｐ５ＣＢＤＤ等を標的物質とするのが好適である。また、被験試料におけるダイオキシン類の総量を推定する場合には、ダイオキシン類として被験試料中に含まれる濃度が高い傾向が強い、１，２，３，４，６，７，８，９−Ｏ８ＣＤＤ、１，２，３，４，６，７，８，９−Ｏ５ＣＤＦ、または、２，３’，４，４’，５−Ｐ５ＣＢ等を標的物質とすることが好適である。
【００３５】
本発明においては、標識抗体と被験試料は、本検出用器具とは別個に反応させる故に、標識抗体は、本検出用器具の必須ではないが、本検出用器具を用いて、低分子物質を検出するには必須である。
【００３６】
すなわち、本発明は、反応物接触部位において接触させた、被験試料中の標的物質に結合し得る標識抗体と被験試料の反応物中の、標識抗体と標的物質の複合体、および／または、標的物質を結合していないフリーの標識抗体を検出することにより、被験試料中の標的物質の検出を行う、本検出用器具の使用方法（本使用方法）を提供する発明である。
【００３７】
また、本使用方法を行うための、本検出用器具および標識抗体を、構成要素として含む低分子物質検出用セット（本検出用セット）を提供する発明である。
好適には、本検出用セットの一要素として用いられ得る、標識抗体の一部として用いることが可能な抗体、すなわち、被験試料中の標的物質に結合し得る抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、検出の対象とする環境汚染物質等の低分子物質を選んで、これを免疫抗原（必要に応じて、目的とする環境汚染物質をターゲットとしたハプテンをキャリアタンパクと結合させたものとすることも可能である）として、常法により製造して用いることができる。
【００３８】
すなわち、上記抗体がポリクローナル抗体の場合には、目的とするダイオキシン類やＰＣＢ類等を免疫抗原として免疫した動物に由来する免疫血清から製造することが可能であり、同じくモノクローナル抗体の場合には、ポリクローナル抗体と同様の方法で、免疫した動物の免疫細胞と動物の骨髄腫細胞とのハイブリドーマを作出し、これにより目的とするダイオキシン類やＰＣＢ類等を認識する抗体を産生するクローンを選択し、このクローンを培養することにより製造することができる。
【００３９】
免疫される動物も特に限定されるものではなく、マウス，ラット等を広く用いることができるが、モノクローナル抗体を製造する場合には、細胞融合に用いる骨髄腫細胞との適合性を考慮して選択することが望ましい。
【００４０】
免疫は一般的方法により、例えば上記免疫抗原を免疫の対象とする動物に静脈内，皮内，皮下，腹腔内注射等で投与することにより行うことができる。
より具体的には、上記免疫抗原を所望により通常のアジュバントと併用して、免疫の対象とする動物に２〜４週間毎に上記手段により数回投与し、ポリクローナル抗体製造のための免疫血清又はモノクローナル抗体製造のための免疫細胞、例えば免疫後の脾臓細胞を得ることができる。
【００４１】
モノクローナル抗体を製造する場合、この免疫細胞と細胞融合する他方の親細胞としての骨髄腫細胞としては、既に公知のもの、例えばＳＰ２／０−Ａｇ１４，Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１，ＭＰＣ１１−４５，６．ＴＧ１．７（以上、マウス由来）；２１０．ＲＣＹ．Ａｇ１．２．３（ラット由来）；ＳＫＯ−００７，ＧＭ１５００６ＴＧ−Ａ１２（以上、ヒト由来）等を用いることができる。
【００４２】
上記免疫細胞とこの骨髄腫細胞との細胞融合は、通常公知の方法、例えばケーラーとミルシュタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５））等に準じて行うことができる。
【００４３】
より具体的には、この細胞融合は、通常公知の融合促進剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ），センダイウイルス（ＨＶＪ）等の存在下において、融合効率を向上させるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を必要に応じて添加した通常の培養培地中で行い、ハイブリドーマを調製する。
【００４４】
所望のハイブリドーマの分離は、通常の選別用培地、例えばＨＡＴ（ヒポキサンチン，アミノプテリン及びチミジン）培地で培養することにより行うことができる。すなわち、この選別用培地において目的とするハイブリドーマ以外の細胞が死滅するのに十分な時間をかけて培養することによりハイブリドーマの分離を行うことができる。このようにして得られるハイブリドーマは、通常の限界希釈法により目的とするモノクローナル抗体の検索及び単一クローン化に供することができる。
【００４５】
目的とするモノクローナル抗体産生株の検索は、例えばＥＬＩＳＡ法，プラーク法，スポット法，凝集反応法，オクタロニー法，ＲＩＡ法等の一般的な検索法に従い行うことができる。
【００４６】
このようにして得られる環境汚染物質を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培地で継代培養することが可能であり、さらに液体窒素中で長時間保存することもできる。
【００４７】
このハイブリドーマからの目的とするモノクローナル抗体の採取は、ハイブリドーマを常法に従って培養して、その培養上清として得る方法や、ハイブリドーマを、このハイブリドーマに対して適合性が認められる動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法等を用いることができる。
【００４８】
このようにして得られるポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、更に塩析，ゲル濾過法，アフィニティクロマトグラフィー等の通常の手段により精製することができる。
【００４９】
標識抗体の標識としては、例えば、金コロイド粒子等の金属コロイド粒子、ラテックス粒子、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の発色機能を有する酵素等を用いることができる。すなわち、これらの標識と抗体を、常法により結合させて、標識抗体として用いることができる。
【００５０】
標識抗体は、乾燥状態で保たれていることが好適であり、例えば、安定化剤として、各種の糖、界面活性剤、グリセロール等の多価アルコール等と共存させ、熱、真空または凍結等の手段により乾燥を行い、乾燥状態となった標識抗体７を、例えば、密閉状態とすることが可能な容器８中において、好適には、乾燥剤を用いて、乾燥状態を保ちつつ保存することが好適である（第３図：本検出用器具１０と標識抗体７を封入した容器８のセットが、本検出用セットの典型的な態様である）。
【００５１】
本検出用器具１０、または、これを構成要素として含む本検出用セットを用いて、本検出方法により、被験試料中の標的物質の検出を試みる場合、被験試料中に標的物質が存在する場合には、反応物中に存在する、標識抗体と標的物質が結合した標識複合体とフリーの標識抗体が、共に、下流に向けて移動する。これに対して、標的物質が被験試料中に存在しない場合には、反応物中にも標識複合体は存在せず、フリーの標識抗体のみが下流に向けて移動する。
【００５２】
上述したように、本検出用器具１０においては、メンブレン５（毛細管現象により、液相の移動が可能な素材、例えば、多孔性のクロマトメンブレン、ニトロセルロースメンブレン等が好適である。特に、多孔性のクロマトメンブレンは、多孔性故、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の蛋白質や、金コロイド粒子等の金属コロイド粒子、ラテックス粒子等の標識がメンブレン中を容易に移動可能であり、好適である。）上に、未反応標識抗体捕捉部位２と検出部位３が、上流から下流に向けて設けられている。
【００５３】
毛細管現象により、上流から移動してきた、標識複合体および／またはフリーの標識抗体は、まず、未反応標識抗体捕捉部位２に接触する。未反応標識抗体捕捉部位には、文字通り、未反応のフリーの標識抗体のみを捕捉することができる機能が付与されている。かかる機能の態様としては、標識抗体の一部を構成する標的物質に対する抗体が反応して結合することが可能な物質、具体的には、標的物質そのもの、または、このような結合反応が認められる標的物質の類似物質を挙げることができる。未反応標識抗体捕捉部位２では、これらの標的物質等が、液相の移動に伴って、移動することのないよう、結合状態であることが必要である。標的物質は、低分子物質であるため、所望の結合状態とするためには、例えば、ＢＳＡ等のキャリア蛋白に、標的物質等を結合させ、この蛋白結合させた標的物質等を、蛋白固定の常法により、未反応標識抗体捕捉部位２に、結合状態で定着させることが好適である。
【００５４】
このように、未反応標識抗体捕捉部位２には、未反応のフリーの標識抗体のみを捕捉することができる機能が備わっており、被験試料中に標的物質が存在する場合には、上流より移動してきた標識複合体およびフリーの標識抗体のうち、フリーの標識抗体のみが捕捉され、標識複合体のみが、下流に移動する。また、被験試料中に標的物質が存在しない場合には、移動するのは、フリーの標識抗体のみである。よって、標識抗体の、ほとんど全てが、未反応標識抗体捕捉部位２において捕捉され、下流に移動するほとんどが、標識抗体を含まない液相となる。
【００５５】
次いで、未反応標識抗体捕捉部位２を通過した液相は、その下流に設けられている、検出部位３に接触する。検出部位３では、標識抗体において用いた標識を顕在化させる、標識顕在化機能が備わっている。かかる標識顕在化機能は、用いた標識に対応する顕在化機能である。顕在化機能としては、例えば、標識複合体が、当初から目視可能な標識（例えば、金コロイド粒子等）である場合には、標識複合体を凝縮した形態で捕捉可能な検出要素、例えば、用いた環境汚染物質に特異的な抗体に対して特異的な抗体、すなわち、抗イムノグロブリンを用いることが好適である。この抗イムノグロブリン抗体は、用いた環境汚染物質に特異的な抗体のパラトープ（抗原結合部位）以外の箇所に対して結合する抗体（例えば、抗Ｆｃ抗体等）を用いることが好適である。
【００５６】
このような、抗イムノグロブリン抗体を、検出要素として、稠密的に検出部位３において固定化することにより、液相と共に移動してきた標識を濃縮・顕在化することが可能となる。
【００５７】
また、例えば、用いた標識が、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の発色機能を有する酵素のように、検出部位３において、酵素基質の接触による発色等を行うことが必要な場合には、検出部位３における検出要素は、単に、抗イムノグロブリン抗体ではなく、用いた標識を顕在化させる試薬等が結合した態様であることが好適である。このような場合に、検出要素として、単に、発色機能を有する上記酵素等を用いる場合は、後で、改めて発色反応等を行わなければならず、取扱いが煩雑になってしまう。
【００５８】
なお、いずれの例においても、抗イムノグロブリン抗体等の検出要素は、毛細管現象により、液相と共に検出部位３から移動しない、結合状態で含まれることが、標識を顕在化させる上で好適である。この結合状態の態様は、結果として、検出要素が、液相の移動と共に、検出部位３から移動しない状態が提供されれば特に限定されず、例えば、検出要素として、検出対象となる環境汚染物質に特異的な抗体のパラトープ以外の箇所に対して結合する抗体である場合は、その抗体の溶液を、検出部位３に該当する部分に滴下することにより、所望する結合状態が提供される。
【００５９】
また、吸収部位４は、毛細管現象により、上流から下流に移動してきた液相を、最終的に吸収する部位である。この吸収部位４は、本検出器具においては、選択的要素であるが、被験試料を、さらに容易にメンブレンを移動させるために、設けることが好適である。
【００６０】
以上、記載したように、本検出器具１０においては、被験試料中に標的物質が含まれている場合には、標的物質は、容器８中において、低分子化合物である標的物質と特異的に反応する標識抗体７と、標識複合体を形成する。かかる標識複合体は、反応物接触部位１に接触した後、さらにメンブレン５上を移動するが、未反応標識抗体捕捉部位２では捕捉されず、検出部位３に達する。検出部位３では、標識複合体を顕在化する物質が固定化されているため、標識複合体は、検出部位３で濃縮され、目視可能なバンドとして検出される。
【００６１】
一方、被験試料中に、標的物質が含まれていない場合は、標識抗体反応部位２で、上記の標識複合体は形成されず、フリーの標識抗体が、液相と共に移動する。このフリーの標識抗体の、ほとんど全てが、未反応標識抗体捕捉部位２で捕捉され、検出部位３には、標識抗体は、ほとんどが到達せず、その結果、標識抗体のバンドは検出部位３においては、ほとんど検出されない。
【００６２】
このように、本検出用器具１０、または、これを要素として含む本検出用セットによって、本使用方法を行うことにより、環境汚染物質等を、ポジティブな指標により検出することが可能であり、かつ、上述したように、従来のこのような方式のイムノクロマトグラフィーを用いた検出用器具において認められがちであった、過剰のフリーの標識抗体等による擬陽性反応を抑制することが可能となる。
【００６３】
なお、この本検出用器具１０は、本発明の一実施態様であり、本発明の範囲内において、他の態様をとることが可能である。例えば、メンブレン上に、反応物（標識複合体）が捕捉されるラインのみを、結合状態で含み、このラインで捕捉されない標識抗体を検出することにより、標的物質をネガティッブな指標により検出する、イムノクロマトグラフィー等にも利用可能である。
【００６４】
【実施例】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。
１．Ｃｏ−ＰＣＢ＃１１８モノクローナル抗体作製のための免疫抗原の調製
Ｃｏ−ＰＣＢ＃１１８をターゲットとした低分子化合物、６−［３，２’，４’，５’−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ−４−ｙｌ］ｏｘｙ］　ｈｅｘａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ　（低分子化合物１１８）は、既に報告されている、Ｙａ−Ｗｅｎ　Ｃｈｉｕ　ら（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，６７，３８２９）　における、６−［（３，３’，４’−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ−４−ｙｌ）ｏｘｙ］　ｈｅｘａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ　の合成法に若干の改善を加え、合成を行った。
【００６５】
得られた低分子化合物は、Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅを用いたＮＨＳ　エステル法（Ｐ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ　ａｎｄ　Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｍｏｃｋ，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９２，２，８５）により、カブトガニへモシアニン（ＫＬＨ）と結合させ、Ｃｏ−ＰＣＢ＃１１８モノクローナル抗体作製のための抗原として利用した。
【００６６】
２．Ｃｏ−ＰＣＢ＃１１８モノクローナル抗体作製
上記方法により作製、精製したＣｏ−ＰＣＢ＃１１８低分子化合物−ＫＬＨコンジュゲートを、ｂａｌｂ／ｃマウスにＲｉｂｉ　Ａｄｊｕｖａｎｔ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｏｒｉｘａ社製）とともに、２週間おきに最大８回の免疫を行い、尾静脈に追加免疫を行った後、通常法により、脾臓中の抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行った。得られたハイプリドーマは、培養上清をＣｏ−ＰＣＢ＃１１８低分子化合物蛋白コンジュゲートを固相化したプレートを用いてスクリーニングを行い、Ｃｏ−ＰＣＢ＃１１８に特異的に反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択した。
【００６７】
本実験に使用する抗体は、得られたハイブリドーマをプリスタン処理したマウス腹腔に投与し、通常法により腹水を採取後、陰イオン交換クロマトグラフィーで精製したものを利用した。
【００６８】
３．クロマトメンブレンの未反応標識体反応部位に固相化するための低分子化合物−蛋白質コンジュゲート調製
上記方法１において合成した低分子化合物１１８を、上記方法１と同様の手法でウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と結合させ、透析により精製を行った後、クロマトメンブレンの未反応標識抗体捕捉部位に固定化するための低分子化合物−蛋白質コンジュゲートとして利用した。
【００６９】
４．クロマトメンブレンの調整
ハイフロープラスメンブレン：ＨＦ９０（２５ｍｍ×３０ｃｍ、ミリポア社）の下端から５ｍｍの位置に未反応標識抗体捕捉部位として、上記方法３にて合成した低分子化合物１１８・ＢＳＡコンジュゲートを塗布し、また、下端から１５ｍｍの位置に検出部位として、抗マウスＩｇＧウサギ抗体（Ｚｙｍｅｄ）を塗布した。これら溶液は、ＸＹＺハンドリングシステム（ＢｉｏＤｏｔ社）を用いてライン状に塗布した。塗布後、メンブレンは室温で１晩放置により乾燥させ、クロマトメンブレンとして用いた。
【００７０】
５．金コロイド粒子標識抗Ｃｏ−ＰＣＢモノクローナル抗体の作製
金コロイド粒子（平均粒子径約４０ｎｍ、　ＢＢＩｎｔｅｒｅｎｅｔｉｏｎａｌ）への、上記方法２．で得た、抗Ｃｏ−ＰＣＢモノクローナル抗体の結合は、ＢＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌのプロトコールに従い行った。得られた金コロイド標識抗Ｃｏ−ＰＣＢモノクローナル抗体溶液は、ＯＤ５２０の値が５〜６になるよう調整し、使用まで冷蔵保存を行った。
【００７１】
６．コンジュゲートパッド装着タイプの検出器具の組み立て
グラスファイバー製のコンジュゲートパッド（１０ｍｍ×３０ｃｍ、ミリポア社製）に、上記方法により得られた金コロイド標識抗体液（最終濃度：１６％）を浸し、真空乾燥機で十分乾燥させたものを金コロイドパッドとして使用した。また、コットンパッド（２０ｍｍ×３０ｃｍ、ミリポア社製）を、２％サッカロース、１％ＢＳＡおよび１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＰＢＳ溶液に浸し、真空乾燥機で十分乾燥させたものを、サンプルパッドとして使用した。これらのパッドおよび上記方法４．において作成したクロマトメンブレンを、ラミネートカード（ミリポア社製）に装着し、さらに、吸収パッド（１７ｍｍ×３０ｃｍ、ミリポア社製）を装着後、ギロチン型カッター（ＢｉｏＤｏｔ社製）を用いて、ラミネートカードを、幅５ｍｍに切断し、免疫クロマトグラフィー装置として用いた。
【００７２】
７．本検出方法（本検出用セット）において用いる標識抗体と検出用器具の作製
プラスチック製の１．５ｍｌエッペンチューブ中に、上記方法５．により得られた金コロイド標識抗体液（最終濃度：１％）およびサッカロース液（最終濃度：３％）の１００μｌ混合液を入れ、真空乾燥機で十分乾燥させたものを、乾燥標識抗体として使用した。また、反応物接触部位として、グラスファイバーフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）および上記方法４．において作製したクロマトメンブレンを、ラミネートカード（ミリポア社製）に装着し、さらに、吸収パッド（１７ｍｍ×３０ｃｍ、ミリポア社製）を装着後、ギロチン型カッター（ＢｉｏＤｏｔ社製）を用いて、ラミネートカードを、幅５ｍｍに切断し、免疫クロマトグラフィー装置として用いた。
【００７３】
８．コンジュゲートパッド装着タイプの検出用器具を利用したＣｏ−ＰＣＢ＃１１８の検出
Ｃｏ−ＰＣＢ＃１１８を、２０％ＤＭＳＯ含有ＴＢＳ溶液で、２００ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、２ｐｐｍ、０．２ｐｐｍ、０．０２ｐｐｍに希釈した。これらの希釈Ｃｏ−ＰＣＢ＃１１８、１５０μＬをサンプルとして、被験試料適用部位に滴下し、一定時間後（第１表参照）に検出部位の着色度合いを目視により判定した。その結果を、第１表に示す。
【００７４】
【表１】
2004138550.tif 000003
【００７５】
９．本検出用器具を用いたＣｏ−ＰＣＢ＃１１８の検出
Ｃｏ−ＰＣＢ＃１１８を、２０％ＤＭＳＯ含有ＴＢＳ溶液で、２００ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、２ｐｐｍ、０．２ｐｐｍ、０．０２ｐｐｍに希釈した。これらの希釈Ｃｏ−ＰＣＢ＃１１８、１５０μＬを、上記方法７．で得た、乾燥標識抗体と十分に混合後、同じく、上記方法７．で得た本検出用器具の反応物接触部位に滴下し、一定時間後（第２表参照）に、検出部位の着色度合いを目視により判定した。その結果を、第２表に示す。
【００７６】
【表２】
2004138550.tif 000004
【００７７】
１０．結果
コンジュゲートパッド装着タイプの検出用器具を利用した場合、Ｃｏ−ＰＣＢ＃１１８測定サンプル滴下２０分間における目視判定により、２ｐｐｍ以上が陽性と判定されたのに対して、本検出用器具において、本使用方法を行った場合は、０．２ｐｐｍ以上が陽性となり、従来品であるコンジュゲートパッド装着タイプの検出用器具に比べ、検出感度が１０倍以上向上したことが確認された。
【００７８】
１１．Ｃｏ−ＰＣＢ＃１１８の半定量
なお、本検出用器具においても、従来品であるコンジュゲートパッド装着タイプの検出用器具においても、検出部位の着色度合いと、未反応標識抗体捕捉部位の着色度合いを指標にして、標的物質であるＣｏ−ＰＣＢ＃１１８の半定量（標的物質の存在オーダーを明らかにすることを示す）が可能であった。すなわち、まず、コンジュゲートパッド装着タイプの検出用器具において、第１表の検出部位の着色度合いに、未反応標識抗体捕捉部位の着色度合いを加味すると、第３表に示す結果が得られた。
【００７９】
【表３】
2004138550.tif 000005
【００８０】
この結果により、本例のコンジュゲートパッド装着タイプの検出用器具において、１）未反応標識抗体捕捉部位の着色が弱いまたは確認できない状態で、検出部位の着色が強い場合は、Ｃｏ−ＰＣＢ１１８濃度が、２０ｐｐｍ以上であり、２）未反応標識抗体捕捉部位および検出部位の着色が、両者とも認められる場合は、Ｃｏ−ＰＣＢ１１８濃度が、２〜２０ｐｐｍであり、３）未反応標識抗体捕捉部位の着色が強く、検出部位の着色が確認できない場合には、Ｃｏ−ＰＣＢ１１８濃度が、２ｐｐｍ以下であることがわかる。
【００８１】
次に、本検出用器具において、第２表の検出部位の着色度合いに、未反応標識抗体捕捉部位の着色度合いを加味すると、第４表に示す結果が得られた。
【００８２】
【表４】
2004138550.tif 000006
【００８３】
この結果より、１）未反応標識抗体補足部位の着色が、非常に弱い、または、確認できない状態で、検出部位の着色が強い場合には、Ｃｏ−ＰＣＢ１１８濃度が、２０ｐｐｍ以上であり、２）未反応標識抗体補足部位の着色が弱く、検出部位の着色が強い場合は、２〜２０ｐｐｍ、３）未反応標識抗体補足部位の着色が強く、検出部位の着色が弱い場合は、０．２〜２ｐｐｍ、４）未反応標識抗体補足部位の着色が強く、検出部位の着色が確認できない場合は、Ｃｏ−ＰＣＢ１１８濃度が、０．２ｐｐｍ以下であることがわかる。
【００８４】
【発明の効果】
本発明により、疑似陽性反応等が抑制されて、簡便であり、かつ、一層鋭敏な、被験物質中の標的物質であるダイオキシン類等の環境汚染物質に代表される低分子物質の検出手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本検出器具の一実施態様を示した図面（上面図）である。
【図２】本検出器具の一実施態様を示した図面（横断面図）である。
【図３】本検出用セットの構成要素として用いられ得る、標識抗体を封入した容器を表した図面である。
【図１】
2004138550.tif 000007
【図２】
2004138550.tif 000008
【図３】
2004138550.tif 000009