(57)【要約】　　　（修正有）【解決手段】ｆｌｇおよびｂｅｋと命名された２つのヒト遺伝子の全ｃＤＮＡクローン化を開示する。これらの遺伝子は、３つの免疫グロブリン様領域を有する細胞外ドメイン、単一の膜横断ドメイン、およびチロシンキナーゼドメインを含む細胞質蛋白質から構成される２つの類似するが別個の表面受容体をコードする。形質移入されたＮＩＨ３Ｔ３細胞中において、それぞれｆｌｇおよびｂｅｋについて１５０ｋＤａおよび１３５ｋＤａの蛋白質が生合成される。放射能ラベルした酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦまたはｋＦＧＦを用いた直接結合実験、天然生育因子を用いた結合の阻害および結合データの分析は、ｂｅｋおよびｆｌｇが、（２〜１５）×１０−１１　Ｍの解離定数でａＦＧＦ、ｂＦＧＦまたはｋＦＧＦと結合することを示した。【効果】ｆｌｇまたはｂｅｋまたはその生物学的に活性な断片を過剰発現する形質転換宿主細胞は薬物検索のために使用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された形態であって、プロテインキナーゼ活性を有する細胞質ドメイン、キナーゼ挿入物、膜横断ドメインおよび約３つの免疫グロブリン様反復部を有する細胞外ドメインを含む受容体蛋白質であって、前記受容体蛋白質が、図７のアミノ酸配列、又は図７のアミノ酸配列の対立遺伝子変異体を含むことを特徴とする受容体蛋白質。
【請求項２】
図７のアミノ酸配列を有するｆｌｇである請求項１記載の受容体蛋白質。
【請求項３】
受容体蛋白質をコードする単離されたＤＮＡ配列であって、前記蛋白質がプロテインキナーゼ活性を有する細胞質ドメイン、キナーゼ挿入物、膜横断ドメインおよび約３つの免疫グロブリン様反復部を有する細胞外ドメインを有し、且つ前記ＤＮＡ配列が図７のＤＮＡ配列、又は図７のＤＮＡ配列の対立遺伝子変異体を含むことを特徴とする単離されたＤＮＡ配列。
【請求項４】
ｆｌｇである蛋白質をコードする請求項３記載の単離されたＤＮＡ配列。
【請求項５】
図７のＤＮＡ配列がコードする蛋白質がｆｌｇである請求項４記載の単離されたＤＮＡ配列。
【請求項６】
プロモータに機能的に結合された、請求項３記載の単離されたＤＮＡ配列を含む発現ベクタ。
【請求項７】
請求項６記載の発現ベクタにより形質転換された組換え宿主。
【請求項８】
プロテインキナーゼ活性を有する細胞質ドメイン、キナーゼ挿入物、単一の膜横断ドメインおよび３つの免疫グロブリン様反復部を有する細胞外ドメインを含むヒト受容体蛋白質の細胞外ドメインまたはその断片の、所望しないヘパリン結合生育因子により媒介される細胞応答を阻害するのに有効な量と、薬学的に許容し得るキャリヤとを含む治療組成物であって、前記ヒト受容体蛋白質が図７のアミノ酸配列を含むことを特徴とする治療組成物。
【請求項９】
受容体蛋白質がｆｌｇである請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
プロテインキナーゼ活性を有する細胞質ドメイン、キナーゼ挿入物、単一の膜横断ドメインおよび３つの免疫グロブリン様反復部を有する細胞外ドメインを含むヒト受容体蛋白質の細胞外ドメインまたはその断片の、前記受容体蛋白質を担持するヒト細胞に対する日和見病原体の結合を阻害するのに有効な量と、薬学的に許容し得るキャリヤとを含む治療組成物であって、前記ヒト受容体蛋白質が図７のアミノ酸配列を含むことを特徴とする治療組成物。
【請求項１１】
前記受容体蛋白質がｆｌｇである請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
細胞受容体に対する繊維芽細胞生育因子の結合を阻害する薬物を検索する方法であって、
（ａ）繊維芽細胞生育因子の存在下に繊維芽細胞生育因子受容体を過剰発現し得る宿主細胞と共に薬物をインキュベートする工程、および
（ｂ）該薬物の、繊維芽細胞生育因子の結合を阻害する能力を測定する工程
を含み、前記受容体がｆｌｇであることを特徴とする薬物の検索方法。
【請求項１３】
繊維芽細胞生育因子受容体に対する日和見病原体の結合を阻害する薬物を検索する方法であって、
（ａ）前記病原体の存在下に繊維芽細胞生育因子受容体を過剰発現し得る宿主細胞と共に薬物をインキュベートする工程、および
（ｂ）該薬物の、病原体の結合を阻害する能力を測定する工程
を含み、前記受容体がｆｌｇであることを特徴とする薬物の検索方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
この発明は、独特の種類の繊維芽細胞生育因子受容体、これをコードする核酸および組換え系での生育因子受容体の発現に関する。またこの発明は、受容体の拮抗体として作用する候補薬物の検索に発現された受容体またはその断片を使用することに関する。
【０００２】
報告された研究開発
繊維芽細胞生育因子（ＦＧＦ）系統群は７つの関連するヘパリン結合蛋白質よりなり、これらには酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ）、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、ｉｎｔ−２、ｈｓｔ／ｋＦＧＦ、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６およびＫＧＦが包まれる。ＦＧＦ系統群の構成員は約３０〜５５％のアミノ酸配列の同一性、類似する遺伝子構造を共有し、形質移入された細胞中で過剰発現する場合に培養細胞を形質転換することができる。原型的なＦＧＦ、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦは、精製され、配列決定およびクローン化されるべき最初のものであった。これらは、間葉および神経外胚葉起源の多様な細胞に対する試験管内における分裂誘発因子である。生体内では、ＦＧＦは発生中のツメガエル胚子の中胚葉の形成を誘導することができ、有効な脈管形成活性を有する（ブルゲスとマシアグ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８；５７５−６０６（１９８９）による総説）。
【０００３】
ＦＧＦに対する細胞の応答は、固有のチロシンキナーゼ活性を有する特定の細胞表面受容体の結合および活性化により媒介される。受容体は蛋白質であり、しばしばグリコシル化されており、細胞膜の一体化された構成要素として働く。典型的には、受容体は、リガンドとして知られる物質と特定の相互作用をすることができる細胞表面に局在した細胞外ドメインを有する。繊維芽細胞生育因子はリガンドの例である。細胞外ドメインに対するリガンドの結合の結果、膜の細胞内表面に局在する受容体の第２の領域（すなわち細胞質ドメイン）が活性化され、他の細胞内分子との反応が可能となる。細胞質ドメインは触媒領域、すなわち酵素活性を有する領域からなる。ここに記載する繊維芽細胞生育因子受容体と特に関連するものとして、触媒ドメインは蛋白質チロシンキナーゼである。このキナーゼの基質には、受容体自体（すなわち自己リン酸化）またはホスホリパーゼＣ−γのような他の細胞内蛋白質がなることができる。ある種の受容体のキナーゼドメインは、１００までの殆ど親水性のアミノ酸残基の挿入により妨害され得る。
【０００４】
この挿入物は、ある種の細胞基質およびエフェクタ蛋白質との受容体相互作用を変調するよう作用し得る。細胞質ドメインは、ＣＯＯＨ末端尾部領域にて終止する。この配列は、公知のＲＴＲの中では最も分岐したものである。幾つかの自己リン酸化部位がこの領域にマップされており、この領域はキナーゼシグナル機能に対して負の制御を及ぼすことにより作用し得る。触媒領域は、近位膜ドメインにより膜から適切に離間する。現在までの証拠では、この領域は、異種刺激による受容体機能の変調、受容体変調導入として知られているプロセスに関与するとの考えが支持されている。細胞外および細胞質ドメインの結合は膜中を架橋する領域により、適切には膜横断ドメインとして知られている。リガンドの相互作用は、凝集または他の機構によるような構造変化を誘導することにより細胞質ドメインを活性化すると考えられている。よって、受容体は分子的変換器として作用し、細胞外の事態（リガンド結合）を細胞内応答（細胞質酵素活性）に翻訳するものである。
【０００５】
前記したように、受容体が結合する物質はリガンド（その対応受容体との関連においてのみ定義的に意味を持つ用語）として知られている。よって、「リガンド」という用語は、リガンドの存在についての情報を細胞内標的分子に受容体が運ぶという様式でその物質が受容体と結合または相互作用することができるという以外には、如何なる特定の分子の大きさ、構造的または組成的特徴をも意味しない。このような機能的な定義により、細胞外ドメインに結合し得るが受容体の活性化に影響を与え得ない物質は必然的に排除される。直接的に言えば、受容体に結合することのできる全ての物質はリガンドではないが、全てのリガンドは受容体に結合することができる。
前記したように、受容体は、リガンド相互作用に依存する検定し得る生物学的活性を有するものとして同定された。一般に、この活性は酵素的なものであり、細胞質ドメインに局在している。この発明に関連する１つの群の受容体は、固有の蛋白質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）活性を有する。
【０００６】
図１は、ＰＴＫ活性を担持する幾つかの公知の生育因子受容体の概略図である。
ＰＴＫ活性を有する生育因子受容体、または受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は類似する分子トポロジーを有する。全てのものが大きなグリコシル化された細胞外リガンド結合ドメイン、単一の疎水性膜横断領域、およびＰＴＫ触媒ドメインを含む細胞質ドメインを有している。その構造により、ＰＴＫは膜会合アロステリック酵素であると考えることができる。水溶性のアロステリック酵素と異なり、ＲＴＫのトポロジーは、リガンド結合ドメインとＰＴＫ活性とは細胞膜により分離されていることを示している。したがって、細胞外のリガンド結合による受容体の活性化は、膜のバリアを横切って細胞内ドメイン機能の活性化に翻訳されなければならない。
【０００７】
配列の類似性および独特の構造的特徴に基き、３つの受容体をサブクラスに分類することができる（図１）。４つのサブクラスに特徴的な構造的特徴は、単量体サブクラスＩ受容体の細胞外ドメインにおける２つのシステインに富む反復配列、サブクラスＩＩＲＴＫの類似するシステインに富む配列を有するジスルフィド結合ヘテロ四量体α２β２構造、およびサブクラスＩＩＩおよびＩＶＴＲＫの細胞外ドメインにおける５または３の免疫グロブリン様反復部をそれぞれ包含するものである。後者の２つのサブクラスのチロシンキナーゼドメインは、種々の長さの親水性挿入配列により中断される。ＲＴＫｃＤＮＡクローンが利用可能であることにより、ＲＴＫ系統群の構成員の作用機構の詳細な構造／機能解析を開始することが可能となった（ウルリッチとシュレシンガー、Ｃｅｌｌ　６１；２０３−２２１（１９９０）による総説）。
【０００８】
この発明は蛋白質チロシンキナーゼをコードするｆｍｓ様遺伝子（ｆｌｇ）の部分的ヒトｃＤＮＡクローンの発見に基づくものであるが、そのキナーゼドメインは、ＣＳＦ−１およびＰＤＧＦ受容体チロシンキナーゼのキナーゼ挿入物に類似する位置で中断されていたものである（ルタら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，３：９−１５（１９８８））。その後、ｆｌｇ特異的オリゴヌクレオチドプローブ（リーら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５：５７−６０（１９８９））を用い、更に抗ホスホチロシン抗体（パスカルとシンガー、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：５４４９−５４５３（１９８９）を用いてクローン化することによりチキンｆｌｇの全長のｃＤＮＡが単離された。ｆｌｇは次の４つの基準に基くＦＧＦ受容体である：１）固定化されたｂＦＧＦ上でのアフィニティクロマトグラフィによりチキン胚子から精製された受容体はチキンｆｌｇ遺伝子産物であり、２）ｆｌｇ抗ペプチド抗血清はＡ２０４横紋筋肉腫細胞における１３０および１５０ｋＤａの蛋白質に架橋結合した［１２５Ｉ］ａＦＧＦを免疫沈降させ、３）ｆｌｇ抗ペプチド抗血清はａＦＧＦまたはｂＦＧＦを用いる生細胞の処理によりチロシン上で特異的にリン酸化された類似する大きさの蛋白質を免疫沈降させ、４）ａＦＧＦ処理細胞溶解物に由来するｆｌｇ抗ペプチド抗血清により免疫沈降された１３０および１５０ｋＤａの蛋白質は試験管内でチロシンのリン酸化を受ける。
【０００９】
推定される第２のＦＧＦ受容体はマウス細菌性発現キナーゼ（ｂｅｋ）遺伝子産物であり、そのクローン一部が抗ホスホチロシン抗体を用いてマウス肝臓ｃＤＮＡ発現ライブラリーを検索することにより得られている（コーンブルスら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：５５４１−５５４４（１９８８））。部分的ｂｅｋクローンの演繹されたアミノ酸配列およびｆｌｇの対応する領域は８５％同一である。しかしながら、ｂｅｋがヒトｆｌｇ遺伝子のマウスの相同体を表しているのか、それとも他の密接に関連する遺伝子なのかは不明であった。この発明は、ヒトｂｅｋおよびｆｌｇの両者の全長のｃＤＮＡクローン、その完全な演繹されたアミノ酸配列を提供し、形質移入された細胞においてｂｅｋおよびｆｌｇの両者がａＦＧＦ、ｂＦＧＦおよびｋ−ＦＧＦと特異的かつ高い親和性で結合することを示すものである。
【００１０】
合理的に薬物を設計するため、受容体機能はますます試みる際の焦点となっている。受容体−リガンド結合、受容体活性化および／または受容体細胞内標的相互作用に影響を与える分子は全て治療のための潜在的な候補物質である。単離細胞または組織外植片により候補薬物を試験する従来の方法では大規模な検索には限界がある。標的受容体を含む組織サンプルまたは単離細胞は取得するのにコストがかかり、存在量は限られており、機能的に存続した状態で維持するのは困難である。更に、候補薬物を組織サンプルに信頼性よく再現性よく投与するのはしばしば困難である。組織培養した一次外植片を使用する検索検定は、組織サンプルを用いて可能な場合より大規模に行われる。しかしながら、生理的効果を検定するのはより困難であり、また検定は多数の原因、例えば培養媒体または培養条件により妨害を受け易い。最後に、天然の材料から単離された受容体を使用する検定は、受容体が天然性の変動を受け易く、適切な天然の供給元が常に利用可能とは限らないという欠点を有する。ここにおける目的は、大規模な検索の手順を修正できる形態で受容体を提供することである。
【００１１】
【発明の要旨】
この発明は、単離された形態であって、プロテインキナーゼ活性を有する細胞質ドメイン、キナーゼ挿入物、膜横断ドメインおよび３つの免疫グロブリン様反復部を有する細胞外ドメインからなる受容体蛋白質またはその断片、およびその生物学的に活性な等価物である。
この発明の他の観点は、受容体蛋白質またはその断片をコードする単離されたＤＮＡ配列であって、前記蛋白質がプロテインキナーゼ活性を有する細胞質ドメイン、キナーゼ挿入物、単一の膜横断ドメインおよび３つの免疫グロブリン様反復部を有する細胞外ドメインを有する単離されたＤＮＡ配列およびその生物学的等価物である。
この発明の他の観点は、受容体蛋白質をコードするｃＤＮＡからなるベクタ（前記蛋白質はプロテインキナーゼ活性を有する細胞質ドメイン、キナーゼ挿入物、単一の膜横断ドメインおよび３つの免疫グロブリン様反復部を有する細胞外ドメインを有する）である。
【００１２】
この発明の他の観点は、前記ベクタにより形質転換された宿主細胞である。
この発明の他の観点は、プロテインキナーゼ活性を有する細胞質ドメイン、キナーゼ挿入物、単一の膜横断ドメインおよび３つの免疫グロブリン様反復部を有する細胞外ドメインからなるヒト受容体蛋白質の細胞外ドメインまたはその断片（所望しないヘパリン結合生育因子により媒介される細胞応答を阻害するのに有効な量とする）および薬学的に許容し得るキャリヤからなる治療組成物である。この発明の他の観点は、プロテインキナーゼ活性を有する細胞質ドメイン、キナーゼ挿入物、単一の膜横断ドメインおよび３つの免疫グロブリン様反復部を有する細胞外ドメインからなるヒト受容体蛋白質の細胞外ドメインまたはその断片（前記受容体蛋白質を担持するヒト細胞に対する日和見病原体の結合を阻害するのに有効な量とする）および薬学的に許容し得るキャリヤからなる治療組成物である。
【００１３】
この発明の他の観点は、所望しないヘパリン結合生育因子により媒介される細胞応答を特徴とする疾患の患者を処置するに際し、有効量の請求の範囲第２５項記載の組成物をこの種の患者に投与することからなる処置方法である。
この発明の他の観点は、日和見病原体感染に罹患した患者を処置するに際し（前記病原体はヘパリン結合生育因子受容体に結合し得る）、有効量の請求の範囲第２９項記載の組成物をこの種の患者に投与することからなる処置方法である。この発明の他の観点は、細胞受容体に対する繊維芽細胞生育因子の結合を阻害する薬物を検索するに際し、
（ａ）繊維芽細胞生育因子の存在下に繊維芽細胞生育因子受容体を過剰発現し得る宿主細胞と共に薬物をインキュベートし、
（ｂ）繊維芽細胞生育因子の結合を阻害する薬物の能力を測定する
工程からなる薬物の検索方法である。
この発明の最後の観点は、繊維芽細胞生育因子受容体に対する日和見病原体の結合を阻害する薬物を検索するに際し、
（ａ）前記病原体の存在下に繊維芽細胞生育因子受容体を過剰発現し得る宿主細胞と共に薬物をインキュベートし、
（ｂ）病原体の結合を阻害する薬物の能力を測定する
工程からなる薬物の検索方法である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
ここで使用するように、以下の用語は以下の意味を有する。
ヌクレオチド−糖部分（ペントース）、リン酸および含窒素複素環塩基よりなるＤＮＡまたはＲＮＡの単量体単位。塩基はグリコシド炭素（ペントースの１′炭素）を介して糖部分に結合し、塩基と糖との組合せはヌクレオシドと呼ばれる。塩基はヌクレオシドを特徴付ける。４つのＤＮＡ塩基はアデニン（「Ａ」）、グアニン（「Ｇ」）、シトシン（「Ｃ」）およびチミン（「Ｔ」）である。４つのＲＮＡ塩基はＡ、Ｇ、Ｃおよびウラシル（「Ｕ」）である。
ＤＮＡ配列−隣接するペントースの３′および５′炭素の間のホスホジエステル結合により互いに連結されたヌクレオチドの線状列。異種ＤＮＡは、宿主のものとは通常はＤＮＡを交換しない起源から宿主生物に導入し得るＤＮＡであり、例えばイー・コリを形質転換するのに使用されるヒトＤＮＡがある。
コドン−ｍＲＮＡを介してアミノ酸、翻訳開始シグナルまたは翻訳終止シグナルをコードする３つのヌクレオチド（トリプレット）のＤＮＡ配列。例えば、ＤＮＡヌクレオチドトリプレットＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡおよびＣＴＧはアミノ酸ロイシン（「Ｌｅｕ」）をコードし、ＴＡＧ、ＴＡＡおよびＴＧＡは翻訳停止シグナルであり、ＡＴＧは翻訳開始シグナルである。
【００１５】
リーディングフレーム−アミノ酸配列へのｍＲＮＡの翻訳の際のコドンのグループ分け。翻訳に際しては適切なリーディングフレームが維持されなければならない。例えば、ＤＮＡ配列ＧＣＴＧＧＴＴＧＴＡＡＧは理論的には３つのリーディングフレームまたは相で発現され得て、そのそれぞれが異なるアミノ酸配列を与える：
2004041176.tif 000002
しかしながら、前記リーディングフレームの１つのみが正しい遺伝情報をコードしている。リボソームおよび福次的翻訳開始因子により翻訳開始シグナルが認識され、正しいリーディングフレームが固定される。
ポリペプチド−隣接する酸のα−アミノおよびカルボキシ基の間のペプチド結合により互いに連結されたアミノ酸の線状列。
ゲノム−細胞またはウイルスの全ＤＮＡ。これは就中、個々のポリペプチドをコードする構造遺伝子並びにオペレータ、プロモータおよびリボソーム結合および相互作用配列のような調節配列を包含し、シャイン・ダルガノ配列のような配列を包含する。
【００１６】
構造遺伝子−鋳型またはメッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）を介して特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸の配列をコードするＤＮＡ配列。構造遺伝子は、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）またはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）のようなその一次産物としてＲＮＡを有し得る。
転写−構造遺伝子からＲＮＡを生産するプロセス。
翻訳−ｍＲＮＡからポリペプチドを生産するプロセス。
発現−生成物を生成すべく構造遺伝が受けるプロセス。蛋白質生成物の場合、これは転写と翻訳との組合せである。
プラスミド−無傷の「レプリコン」からなる非染色体二本鎖ＤＮＡ配列であり、プラスミドは宿主細胞中で複製される。プラスミドが単細胞生物内に置かれた場合、プラスミドのＤＮＡに起因して、その生物の特徴は変化または形質転換される。例えば、テトラサイクリン耐性（ＴｅｔＲ　）の遺伝子を担持するプラスミドは、先にはテトラサイクリンに感受性であった細胞をこれに耐性のものに形質転換する。プラスミドによって形質転換された細胞を「形質転換体」と呼ぶ。
ファージまたはバクテリオファージ−細菌のウイルスであって、その多くは蛋白質エンベロープまたはコートに包被された（「カプシド」）ＤＮＡ配列よりなる。
【００１７】
クローン化運搬体−宿主細胞中で複製し得るプラスミド、ファージＤＮＡまたは他のＤＮＡ配列であって、例えば複製、コート蛋白質の生産のような必須の生物学的機能の欠損またはプロモータまたは結合部位のような発現制御領域の欠損を伴うことなく異種ＤＮＡの挿入につき決定し得る様式でこの種のＤＮＡ配列を切断し得る１または少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を特徴とし、例えばテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性のような形質転換された細胞の同定に使用するのに適切な選択的遺伝子マーカーを含む。クローン化運搬体はしばしばベクタと呼ばれる。
クローン化−非性的再生産またはＤＮＡ複製により１つのこの種の生物または配列から誘導される生物またはＤＮＡ配列の集団を得るプロセス。
レプリコン−特定の生物中での複製に必要なＤＮＡで、複製開始点を含む。
組換えＤＮＡ分子−末端−末端で接続され、幾つかの宿主細胞に感染する能力を有し、その中で維持され得る異なるゲノムに由来するＤＮＡの断片よりなる分子。
発現制御配列−遺伝子に機能的に連結された場合に構造遺伝子の発現を制御および調節するヌクレオチドの配列。これらにはｌａｃ系、ファージλの主オペレータおよびプロモータ領域、ウイルスコート蛋白質の制御領域および原核または真核細胞およびそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られている他の配列が包含される。
【００１８】
変異−生物の遺伝情報の遺伝し得る変化。
変異体−変異を有する生物。一般にその生物が属する種の標準対照株またはその生物の野生型集団と比較した場合に認識し得る表現型を発現する。
ここで使用する、ｂｅｋおよびｆｌｇは、無細胞培養系により生産される繊維芽細胞生育因子受容体またはその断片を示し、天然のｂｅｋおよびｆｌｇのように試験管内で細胞生育、分化および応答に影響を与える能力を有する生物活性形態のものである。
ｂｅｋおよびｆｌｇの異なる対立形質が天然に存在し得る。これらの変種は、同一の生物学的機能の蛋白質をコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列における相異を特徴とし得る。単一または多数のアミノ酸置換、欠失、付加または変更を有する相似体を作製することができる。天然のｂｅｋおよびｆｌｇのいずれかの生物学的に活性な特性を保持するｂｅｋおよびｆｌｇの誘導体に帰着する代替的なｍＲＮＡスプライシング形態を含むこの種の全ての対立形質変種、修飾体および相似体はこの発明の範囲内に包含される。
【００１９】
ここで使用する１および３文字のアミノ酸省略形は次の意味を有する：
Ａ　Ａｌａ　アラニン
Ｃ　Ｃｙｓ　システイン
Ｄ　Ａｓｐ　アスパラギン酸
Ｅ　Ｇｌｕ　グルタミン酸
Ｆ　Ｐｈｅ　フェニルアラニン
Ｇ　Ｇｌｙ　グリシン
Ｈ　Ｈｉｓ　ヒスチジン
Ｉ　Ｉｌｅ　イソロイシン
Ｋ　Ｌｙｓ　リジン
Ｌ　Ｌｅｕ　ロイシン
Ｍ　Ｍｅｔ　メチオニン
Ｎ　Ａｓｎ　アスパラギン
Ｐ　Ｐｒｏ　プロリン
Ｑ　Ｇｌｎ　グルタミン
Ｒ　Ａｒｇ　アルギニン
Ｓ　Ｓｅｒ　セリン
Ｔ　Ｔｈｒ　スレオニン
Ｖ　Ｖａｌ　バリン
Ｗ　Ｔｒｐ　トリプトファン
Ｙ　Ｔｙｒ　チロシン
Ｂ　Ａｓｘ　ＡｓｐまたはＡｓｎ、区別しない
Ｚ　Ｇｌｘ　ＧｌｕまたはＧｌｎ、区別しない
Ｘ　Ｘ　　　未決定または不定型のアミノ酸
【００２０】
説明を容易にするため、この発明は３つの別々ではあるが関連する態様を有するものとして示すことができる。第１の態様は、ヒトｆｌｇおよびｂｅｋ受容体蛋白質をコードする全長ｃＤＮＡのクローン化および同定に関する。第２の態様は組換え宿主細胞中でのヒトｆｌｇおよびｂｅｋ遺伝子産物の発現を構成するものであり、第３の態様は就中受容体分析および薬物検索のための組換えにより誘導した産物の使用を構成するものである。
【００２１】
ヒトｆｌｇおよびｂｅｋのクローン化
一般に組換えＤＮＡ技術は公知であり（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、（アカデミック・プレス、ニューヨーク、第６５および６８巻（１９７９）；１００および１０１（１９８３））を参照することができる）、この中に引用された参考文献がある。最も普通に使用される組換えＤＮＡ方法論を具体化する広範な技術的議論は、マニアティスら、「分子クローン化」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリイ（１９８２）および「分子生物学の現代の手順」、第ＩおよびＩＩ巻、アウスベルら編、グリーン・パブリシング・アソシ・アンド・ウイレイ・インターサイエンス（１９８７）に認めることができる。種々のポリペプチドをコードする遺伝子は、組換えＤＮＡ運搬体、例えば細菌またはウイルスベクタ中にポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を組込み、適切な宿主を形質転換することによりクローン化することができる。この宿主は典型的にはエシェリキア・コリ（イー・コリ）株であるが、所望の産物に応じて真核宿主を利用することができる。組換えベクタを組込むクローンを単離し、生育させ、所望のポリペプチドを大規模に生産するのに使用することができる。
【００２２】
幾つかの研究者のグループがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の混合物を真核細胞から単離し、一連の酵素反応を用いてこのｍＲＮＡ混合物に相補的な二本鎖ＤＮＡコピーを合成している（ウェワーら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：７１３７−７１４１（１９８６））。第１の反応において、逆転写酵素とも呼ばれるＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼによりｍＲＮＡは一本鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転写される。逆転写酵素は５′−３′の方向にＤＮＡを合成し、前駆体としてデオキシリボヌクレオチド５′−トリリン酸を利用し、鋳型およびプライマー鎖の両者を必要とするが、その内後者は遊離の３−ヒドロキシ末端を有さなければならない。ｍＲＮＡ鋳型の部分的または完全なコピーいずれの場合でも、逆転写酵素生成物はしばしばその３′末端において短い部分的に二本鎖のヘアピン（「ループ」）を有する。第２の反応において、これらの「ヘアピンループ」はＤＮＡポリメラーゼに対するプライマーとして利用され得る。予備形成されたＤＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼの作用に際して鋳型およびプライマーの両者として必要である。ＤＮＡポリメラーゼは遊離の水酸基を有するＤＮＡ鎖の存在を必要とし、これに新しいヌクレオチドが付加して５′−３′方向に鎖を延長する。このような一連の逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼ反応の生成物は一端になおループを有する。ループの頂部または二本鎖ＤＮＡの「折畳み点」はこのように生じるものであり、実質的に一本鎖の断片である。第３の反応において、一本鎖特異的ヌクレアーゼＳ１を用いてこの一本鎖断片を開裂させ、「平滑末端」デュープレックスＤＮＡ断片を生成する。この一般的な方法は全ゆるｍＲＮＡ混合物に適用することができ、ブエルら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：２４８３（１９７８）に記載されている。
【００２３】
この結果得られた二本鎖ｃＤＮＡ混合物（ｄｓ−ｃＤＮＡ）を、多数の公知の技術のいずれかにより、少なくとも部分的には使用する特定の運搬体に応じてクローン化運搬体に挿入する。多様な挿入方法が、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８：１６−１８（１９８０）およびそこに引用された参考文献に相当詳細に論じられている。
一旦ＤＮＡ断片を挿入したならば、クローン化運搬体を使用して適切な宿主を形質転換する。このようなクローン化運搬体は通常は宿主に対して抗生物質耐性特性を与えるものである。この種の宿主は一般に原核細胞である。この時点では、少数の形質転換または形質移入された宿主のみが所望のｃＤＮＡを含有する。全ての形質転換または形質移入宿主の総計により遺伝子「ライブラリー」が構成される。この方法により作成された全ｄｓ−ｃＤＮＡライブラリーにより、出発材料として使用したｍＲＮＡ混合物中に存在するコード情報の代表的サンプルが与えられる。
【００２４】
適切なオリゴヌクレオチド配列が利用可能であるならば、これを使用して以下の様式で意図するクローンを同定することができる。個々の形質転換または形質移入細胞をニトロセルロースろ紙上でコロニーとして生育させる。これらのコロニーを溶解させる。放出されるＤＮＡは加熱することによりろ紙上に強固に結合する。その後、意図する構造遺伝子に相補的なラベルしたオリゴヌクレオチドプローブと共にろ紙をインキュベートする。プローブは相補的なｃＤＮＡとハイブリダイズし、オートラジオグラフィによって同定される。対応するクローンを特徴付けし、所望の蛋白質の構造情報の全てを含む１つまたは組合せたクローンの同定を図る。意図する蛋白質をコードする核酸配列を単離し、発現ベクタに再挿入する。発現ベクタにより、クローン化された遺伝子は、ｄｓ−ｃＤＮＡの効率的な発現（転写および翻訳）を可能とする特定の原核または真核制御要素の調節制御下に置かれる。よって、この一般的な技術は、少なくとも一部のアミノ酸またはＤＮＡ配列が公知であり、これについてオリゴヌクレオチドプローブが利用可能であるような蛋白質に対してのみ適用することができる。一般にはマニアティスら、前記文献を参照することができる。
【００２５】
更に最近では、意図するコードされた蛋白質に特異的な抗体を用いて細菌コロニーまたはファージプラークをプローブすることにより特定のクローンを同定する方法が開発された。蛋白質産物の獲得が必要であるため、この方法は「発現ベクタ」クローン化運搬体と共にのみ使用することができる。蛋白質の発現を制御する調節遺伝子配列に隣接して構造遺伝子をベクタに挿入する。化学的方法または宿主細胞もしくはベクタにより与えられる機能により細胞を溶解し、特定の抗体および酵素免疫検定のような検出系によって蛋白質を検出する。この例には、ヤングとデービス、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：１１９４−１１９８（１９８３）およびヤングとデービス、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２：７７８（１９８３）により記載されたλｇｔ１１系がある。
【００２６】
前記したように、ヒトｆｌｇの部分的ｃＤＮＡクローンは本発明者の先の研究から公知であった。元のヒトｆｌｇ部分的ｃＤＮＡクローンＣ５１並びに幾つかの付加的な独立した単離物のその後のヌクレオチド配列分析により、全ての部分的クローンは、開裂した天然に存在するＥｃｏＲＩ部位に対応する同一の５′配列を有することが明らかとなった。これは、ｃＤＮＡライブラリーの構築に際して、このＥｃｏＲＩ部位はＥｃｏＲＩによる開裂の前にＥｃｏＲＩメチラーゼにより保護されていなかったことを示唆する。したがってこれは、ｆｌｇｃＤＮＡの５′末端は独立にクローン化された重複していないＥｃｏＲＩ断片に存する理由によると考えられる。固定ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（ローら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：２１７−２２０（１９８０））を使用してこのことを確認し、内部ＥｃｏＲＩ部位の上流のｆｌｇヌクレオチド配列の更なる１７０塩基対（ｂｐ）を取得した。λｇｔ１１アーム特異的オリゴヌクレオチドプライマーと共にこの新しい配列においてプライマーを使用するＰＣＲ反応の第２段階により、同じＨＵＶＥＣｃＤＮＡライブラリーに由来する５′ｆｌｇクローンの挿入物を増幅した。ＰＣＲにより生成する配列変異が時として起こるため、この第２のＰＣＲ生成物を放射能ラベルし、λｇｔ１１にてＨＵＶＥＣｃＤＮＡライブラリーを再検索するプローブとして使用した。内部ＥｃｏＲＩ部位から５′非翻訳領域に延在する１つの７００ｂｐクローンが得られた。ヒトｆｌｇの完全な演繹されたアミノ酸配列を図２ａに示す。
【００２７】
部分的マウスｂｅｋおよびヒトｆｌｇｃＤＮＡクローンの公表された配列（コーンブルスら、１９８８前記、ルタら、１９８８前記）は高度に相同性であり、キナーゼ挿入物（５０％同一性）およびＣＯＯＨ末端にのみ認められる顕著な相違を有している。多少の配列の相異は種の相違に帰し得るが、より大きくはヒトのキナーゼ挿入物およびネズミのＰＤＧＦ受容体（Ｂ型）は８５％同一であり（ヤーデンら、Ｎａｔｕｒｅ，３２３：２２６−２３２（１９８６）、クラエソン−ウェイシュら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：３４７６−３４８６（１９８８））、ｂｅｋはｆｌｇより実際は異なる遺伝子産物であることを示唆していることが銘記された。ｂｅｋをクローン化すべく、λｇｔ１１におけるヒト脳幹ｃＤＮＡライブラリーを、マウスｂｅｋのＣＯＯＨ末端１１コドンに対応する放射能ラベルした３３塩基オリゴヌクレオチドを用いて検索した（コーンブルスら、１９８８前記）。これは、公表されたｂｅｋおよびｆｌｇ配列の間の非同一性の最長の鎖に対応する。３２のクローンを同定したが、３．２ｋｂｃＤＮＡ挿入物を含有するその内の１つのｂｅｋ５を配列決定した。演繹されたアミノ酸配列により、これはｆｌｇに極めて類似するが区別され、また翻訳開始ＡＴＧを含む約２５ｂｐのシグナルペプチド配列を欠失することが明確に確定された。ｂｅｋ５の５′領域に対応する７５０ｂｐｃＤＮＡ断片を用いて脳幹ライブラリーを再検索することにより重複するクローンが得られた。ヒトｂｅｋの完全な演繹されたアミノ酸配列を図２ａに示す。ｆｌｇおよびｂｅｋクローン化の詳しい詳細は実施例Ｉに示す。
【００２８】
ｆｌｇおよびｂｅｋは類似するがなお別個の遺伝子産物であり（図２ｂ）、受容体結合チロシンキナーゼのＰＤＧＦ／ＣＳＦ−１／ｃ−ｋｉｔ系統群により共有される構造的特徴を有する（ウルリッチとシュレシンガー、１９９０前記）。これらのコード配列は２１アミノ酸の疎水性シグナルペプチド配列、３５６（ｂｅｋ）および３５５（ｆｌｇ）アミノ酸の細胞外ドメイン、２１アミノ酸の膜横断ドメイン、および４２３（ｂｅｋ）および４２５（ｆｌｇ）アミノ酸の細胞質ドメインよりなる。ｆｌｇおよびｂｅｋの細胞外ドメインは類似する大きさおよび位置の３つの「免疫グロブリン様」（Ｉｇ）ドメインを含むものである。興味あることに、第１のＩｇドメイン内および周囲のアミノ酸配列同一性は、第２および第３のＩｇドメイン（７４％）内および周囲に認められるものより極めて小さい（４３％）。ｆｌｇおよびｂｅｋの細胞外ドメインには８つの潜在的なＮ−結合グリコシル化部位が同一の位置に局在する。ｆｌｇはアミノ酸１８５に付加的なＮ−結合グリコシル化部位を含む。リーら（１９８９）は、８つの隣接する酸性アミノ酸によりチキンｆｌｇの細胞外ドメイン内に１つの領域を銘記した。この「酸性ボックス」はヒトｆｌｇおよびヒトｂｅｋにも存在し、それぞれ８および５の酸性残基よりなる。ｂｅｋおよびｆｌｇの細胞質ドメインは、１４のアミノ酸挿入により分割される保存された触媒性キナーゼドメインが後続する長い近位膜領域よりなる。キナーゼドメインには相離するカルボキシ末端尾部が続く。ｂｅｋおよびｆｌｇの全体的同一性は７１％であり、その最も高い同一性（８８％）の領域はキナーゼドメインである。
【００２９】
種々の細胞系統におけるｆｌｇおよびｂｅｋｍＲＮＡ発現を、これらの非相同３′非翻訳領域の部分に対応するｂｅｋおよびｆｌｇのｃＤＮＡプローブを用いてノーザンブロットにより決定した。Ａ２０４横紋筋肉腫細胞では約４．３および４．２ｋｂの２つのｆｌｇ転写物が認められるが、ｂｅｋｍＲＮＡは検出し得ない（図３）。ＨＵＶＥＣおよびヒトテトラカルシノーマＮＴＥＲＡ２細胞は、それぞれ４．２および４．３ｋｂのｆｌｇ転写物を独特に発現する。別個の４．３および４．２ｋｇのｆｌｇ転写物の意義は現在は知られていない。これらは、図２ａと図２ｂとを比較すると、細胞外ドメインのアミノ末端システインループを欠失した単離されたｆｌｇクローンに関連する可能性がある。４．４ｋｂのｂｅｋ転写物はテトラカルシノーマ細胞系統にのみ認められる。他の研究者により、ｂｅｋｍＲＮＡは成体マウス肝臓、肺、脳および腎臓では発現されるが、心臓および脾臓には存在しないことが示されている（コーンブルスら、１９８８前記）。チキンｆｌｇ蛋白質は胚子の腸、脳、砂嚢、心臓、骨格筋および繊維芽細胞に認められるが、成体チキンでは脳にのみ認められる（パスカレとシンガー、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：５４４９−５４５３（１９８９））。考え併せると、これらの結果はｂｅｋおよびｆｌｇが協調的に発現されていないことを示している。
【００３０】
組換え細胞中でのｆｌｇおよびｂｅｋの発現
ｆｌｇおよびｂｅｋのｄｓ−ｃＤＮＡは、多くの公知の技術のいずれかにより発現ベクタに挿入することができる。一般に、マニアティスら（１９８２）前記およびアウスベルら（１９８７）前記に方法を認めることができる。一般に、少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼによりベクタを線状化し、これにより少なくとも２つの平滑または付着末端を生成するものとする。ベクタ挿入部位にｄｓ−ｃＤＮＡを連結または接続する。
【００３１】
実質的な細胞壁物質を含む原核または他の細胞を用いる場合、発現ベクタを用いる形質転換の最も普通の方法は、コーエン・アール・エヌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９：２１１０（１９７２）により記載された塩化カルシウム前処理である。細胞壁バリアを有さない細胞を宿主細胞として使用する場合は、グラハムとファン・デル・イービー、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６（１９７３）により記載されたリン酸カルシウム沈殿法により感染を行う。核注入、ウイルス感染、エレクトロポーレーションまたはプロトプラスト融合のようなＤＮＡを細胞に導入する他の方法を成功裡に使用することができる。その後細胞を選択培地上で培養し、発現ベクタがコードする蛋白質を生産する。「発現ベクタ」は含有するＤＮＡ配列を転写および翻訳し得るベクタを指し、その場合この種の配列はこれらの発現に影響を与え得る他の調節配列に結合している。これらの発現ベクタは、宿主生物または系内でエピソーム、バクテリオファージまたは染色体ＤＮＡの一体化部分として複製し得るものでなければならない。発現ベクタの１つの形態は、通常は細菌中に生息し複製するバクテリオファージ、ウイルスである。この目的のために特に望ましいファージは、ヤングとデービス、前記により記載されたλｇｔ１０およびλｇｔ１１ファージである。λｇｔ１１は、挿入されたＤＮＡにより特定されるポリペプチドを生産し得る一般的な組換えＤＮＡ発現ベクタである。
【００３２】
分解を最小のものとするため、ラクトースの合成アナログ（ＩＰＴＧ）を用いる誘発に際して、外来蛋白質またはその一部を原核蛋白質β−ガラクトシダーゼに融合させて合成する。蛋白質分解経路を欠損する宿主細胞を使用することにより、誘発されたλｇｔ１１クローンにより生産される新規蛋白質の生存期間を増加させることもできる。λｇｔ１１クローン内での外来ＤＮＡの適切な発現は、β−ガラクトシダーゼプロモータおよび翻訳開始コドンに対する挿入されたＤＮＡの方向性およびリーディングフレームに依存し得る。
組換えＤＮＡ技術に有用な発現ベクタの他の形態はプラスミド、環状で組込まれていない（染色体外）二本鎖ＤＮＡである。同等の機能を与える全ゆる他の形態の発現ベクタがこの発明の目的における使用に適切である。ここに開示する組換えベクタおよび方法論は、広範な範囲の原核および真核生物を包含する宿主細胞における使用に適切である。原核細胞は、ＤＮＡ配列のクローン化およびベクタの構築に好適である。例えば、イー・コリＫ１２株ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ第３３９６９４号）が特に有用である。勿論、他の微生物株を使用することができる。宿主細胞または系と和合性の種から誘導された複製および制御配列を含むベクタをこれらの宿主との関連において使用する。ベクタは通常は複製開始点を担持すると共に形質転換された細胞にて表現型選択を与え得る特徴を有する。例えば、イー・コリはベクタｐＢＲ３２２を使用して形質転換することができ、これはアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含む（ボリバーら、Ｇｅｎｅ，２：９５（１９７７））。
【００３３】
これらの抗生物質耐性遺伝子は形質転換された細胞を同定する手段を与える。発現ベクタは、意図する遺伝子の発現に使用することのできる制御要素を含むことができる。イー・コリ中で外来ＤＮＡ配列の発現に使用される通常の原核制御要素には、イー・コリのβ−ガラクトシダーゼおよびトリプトファン（ｔｒｐ）オペロンから誘導されるプロモータおよび制御配列並びにバクテリオファージλのｐＲおよびｐＬプロモータが包含される。これらの要素の組合せも使用された（例えば、ｔｒｐプロモータとラクトースオペレータとの融合体であるＴＡＣ）。他のプロモータも発見され利用され、それらのヌクレオチド配列に関する詳細が公表され、当業者であればこれらを機能的に組合せて活用することができる。原核生物に加えて、真核微生物、例えば酵母培養物も使用することができる。サッカロミセス・セレビシア、または通常のパン酵母は真核微生物の中で最も普通に使用されるが、他の多数の株が通常は利用可能である。酵母中での外来ＤＮＡ配列の発現に適切な酵母プロモータには、３−ホスホグリセレートキナーゼまたは他の解糖系酵素のプロモータが包含される。適切な発現ベクタは終止シグナルを含有し得て、これはクローン化された遺伝子のｍＲＮＡ転写物のポリアデニル化および終止を与える。酵母和合性プロモータ、複製開始点および適切な終止配列を含む全ゆるベクタがｂｅｋまたはｆｌｇの発現に適切である。
【００３４】
多細胞生物から誘導された細胞系統も宿主として使用することができる。原則的に、この種の全ゆる細胞培養が実施可能であり、脊椎動物または無脊椎動物起源の由来を問わない。しかしながら、脊椎動物細胞が最も興味あるものであり、培養した脊椎動物細胞の増殖（組織培養）は近年では日常的な手順となっている。この種の有用な宿主の例には、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、マウスＣ１２７または３Ｔ３、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７およびＭＤＣＫ細胞系統がある。マウス３Ｔ３およびＣＨＯ細胞が特に好適である。この種の細胞の発現ベクタは、通常は複製開始点、発現される遺伝子の前に位置するプロモータ、ＲＮＡスプライス部位（必要に応じて）および転写終止配列を含む。
哺乳動物細胞で使用するため、発現ベクタ上の制御機能（プロモータおよびエンハンサ）がしばしばウイルス材料によって与えられる。例えば、普通に使用されるプロモータは、ポリオーマ、アデノウイルス２および最も多くの場合シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）から誘導される。ネズミのメタロチオネイン遺伝子のプロモータ（パウラキスとハーマー、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：３９７−４０１（１９８３））のような真核プロモータも使用することができる。更に、この種の制御配列が宿主の系と和合性の場合、所望の遺伝子配列と天然に会合したプロモータまたは制御配列を利用することが可能であり、しばしば望ましい。転写の効率を上げるため、真核エンハンサ配列も構成に加えることができる。これらの配列は、種々の動物細胞またはマウスサルコーマウイルスのような腫瘍性レトロウイルスから得ることができる。
【００３５】
複製開始点は異種の起源、例えばＳＶ４０または他のウイルス供給源から与えられるものを含むベクタの構築により与えられ得るか、宿主細胞染色体複製機構により与えられる。ベクタが宿主細胞染色体に組込まれる場合、後者が十分である場合が多い。
宿主細胞はｂｅｋまたはｆｌｇを産生することができ、これらは多様な化学的組成とすることができる。最初のアミノ酸としてメチオニンを有する蛋白質を生産する。構造遺伝子の起源に天然に存在するＡＴＧ開始コドンにより、または構造遺伝子の断片の前に操作することにより、このメチオニンが存在するものとする。蛋白質を細胞内または細胞外で切断することができ、蛋白質のアミノ末端に天然に認められるアミノ酸を生成する。蛋白質はそれ自身または異種のシグナルペプチドと共に生産することができ、シグナルペプチドは細胞内外の環境下で特異的に切断することができる。最後に、ｂｅｋまたはｆｌｇは、余分のポリペプチドを何ら切断除去する必要性なく成熟形態で直接発現により生産することができる。
組換え宿主細胞とは、組換えＤＮＡ技術を使用して構成したベクタにより形質転換された細胞を指す。ここに定義するように、ｂｅｋまたはｆｌｇはこの形質転換の結果として生産される。この種の細胞により生産されたｂｅｋまたはｆｌｇまたはこれらの断片を「組換えｂｅｋまたはｆｌｇ」と言う。
ｆｌｇおよびｂｅｋの発現の詳細は実施例ＩＩに示す。
【００３６】
ｆｌｇおよびｂｅｋ過剰生産細胞系統の応用
ここに提供する過剰発現ｂｅｋおよびｆｌｇ細胞系統は、リガンド／レセプション相互作用の検討並びに合理的に設計された薬物の検索プログラムに有用である。治療のための潜在的な部位には、限定されるものではないが、受容体／リガンド結合、シグナル導入、受容体／標的相互作用が包含される。
よって、薬物は競合的阻害または他の機構により天然のリガンド結合を阻害する能力について試験することができる。また、ｂｅｋおよびｆｌｇ過剰生産細胞を免疫源の供給源として使用してモノクローナル抗体のような抗体を生産することができ、これもリガンド結合または受容体凝集に影響を与えるその能力について試験することができる。この系は、キナーゼ／標的相互作用に影響を与える薬物を評価するのにも使用することができる。チルホスチンとして知られるこれらの薬物はその作用部位として受容体キナーゼドメインによる細胞標的のリン酸化を有し、受容体自体の自己リン酸化を含む。リガンド結合とキナーゼ活性とは別のドメインに存するため、全受容体配列を発現させて前記特定した活性に対する薬物の効果の評価を図ることが必要である。よって、この発明はｆｌｇおよびｂｅｋの生物学的に活性な断片の発現を企図する。例えば、ｂｅｋの最初の３７７アミノ酸またはｆｌｇの最初の３７６アミノ酸（すなわち細胞外プラス膜横断ドメイン）またはｂｅｋのＣＯＯＨ末端４２３アミノ酸またはｆｌｇの４２５アミノ酸をコードするｃＤＮＡのクローン化および発現の生成物を有用に用いてそれぞれリガンドおよびチルホスチンを評価することができる。実施例ＩＩＩはこれらの応用の幾つかを示すものである。
【００３７】
更に他の態様では、細胞外ドメイン単独またはそのサブドメインは、その標的細胞に感染する手段として内性ｂｅｋまたはｆｌｇを使用するヘルペスシンプレックスタイプＩまたは他の病原体のような日和見病原体による感染の阻害剤として有用たり得る。細胞へのＨＳＶ−１の侵入は、過剰発現したｆｌｇをその表面に有する細胞系統では劇的に増加することが報告されている（アール・ジェイ・カナーら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：１４１０−１４１３（１９９０））。よって、過剰発現細胞系統を使用して受容体断片自体のような候補薬物の存在下または非存在下に低減したウイルス結合（直接検定）を測定するかまたは媒体からの低減した感染性またはウイルスの低減によって阻害剤薬物を検索することができる。
この発明は、２つの繊維芽細胞生育因子受容体に対する完全なヒトｃＤＮＡ配列を提供するものである。ヒトプロテインキナーゼ末端ｆｌｇの部分的ｃＤＮＡ配列は公知であり（ルタら、前記（１９８８））、マウスプロテインキナーゼｂｅｋの部分的配列（コーンブルスら、前記（１９８８））についても同様であったが、これらの遺伝子のヒト形態の完全な配列は利用可能ではなかった。完全な配列がない場合、機能的リガンド結合部位の度合およびｆｌｇおよびｂｅｋの相同性の程度は適切に評価できなかった。ここで開示するように、ｆｌｇおよびｂｅｋはａＦＧＦ、ｂＦＧＦおよびｋ−ＦＧＦに対して高い親和性を有する類似するが別個の遺伝子産物である。ｂｅｋおよびｆｌｇ遺伝子は異なる染色体上に局在し、種々の細胞系統および組織中で異なったものとして発現される。
【００３８】
ｆｌｇおよびｂｅｋは、分割チロシンキナーゼドメインおよび複数の免疫グロブリン様ドメインよりなる細胞外領域を含むＰＤＧＦおよびＣＳＦ−１受容体チロシンキナーゼにより共有される構造的特徴を示す。しかしながら、ＦＧＦ受容体は次の幾つかの点でＰＤＧＦおよびＣＳＦ−１受容体とは構造的に別個である：１）ＦＧＦ受容体の細胞外ドメインは３つの免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインよりなるのに対し、ＰＤＧＦおよびＣＳＦ−１受容体のものは５つのＩｇドメインよりなる。この点についてはＦＧＦ受容体はＩＬ−１受容体に類似しており、その細胞外領域は３つのＩｇドメインよりなる（シムスら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：５３５−５８９（１９８８））、２）ＦＧＦ受容体の近位膜領域、８７（ｆｌｇ）および８９（ｂｅｋ）アミノ酸はＰＤＧＦおよびＣＳＦ−１受容体のもの（それぞれ４９および５１アミノ酸）より顕著に長い、３）ＦＧＦ受容体のキナーゼ挿入物ドメインは僅か１４のアミノ酸よりなるのに対し、ＰＤＧＦおよびＣＳＦ−１受容体キナーゼ挿入物は遥かに長い（それぞれ１０４および７０アミノ酸）（ハンクスら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：４２−５２（１９８８））。ＰＤＧＦ受容体のキナーゼドメインにおけるコンセンサスチロシン残基および潜在的な自己リン酸化部位は両者のＦＧＦ受容体で保存されている（ｆｌｇ残基６５４、ｂｅｋ残基６５７）。生物学的に別個の種々のリガンドに対する受容体の中に共通の構成が存在することは、構造および／または機能の理由について、強い進化の強制を受けたという議論を支持する（ウルリッチとシーシンガー、Ｃｅｌｌ，６０：２０３−２２１（１９９０））。
【００３９】
ｆｌｇまたはｂｅｋのコード配列を含む哺乳動物発現ベクタにより感染したＮＩＨ３Ｔ３細胞は、それぞれみかけの分子量１５０，０００および１３５，０００を有する糖蛋白質の合成を指向する。ツニカマイシンの存在下に合成された場合、主要なｆｌｇ蛋白質の分子量は１１０ｋＤａであるのに対し、ｂｅｋのものは９０ｋＤａである。９０および１１０ｋＤａの２つのｆｌｇ蛋白質が、ツニカマイシン処理した代謝的にラベルしたヒト横紋筋肉腫細胞の免疫沈降物に先に認められた（ルタら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８７２２−８７２６（１９８９））。蛋白質分解に関与する機構を完全に規定するのは不可能であるが、横紋筋肉腫細胞における９０および１１０ｋＤａのｆｌｇ蛋白質は真の一次翻訳産物を表している可能性がある。レイドら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１５９６−１６００（１９９０））は２つの別個のネズミｆｌｇｃＤＮＡの単離を最近報告したが、その１つは明らかにここに開示するヒトｆｌｇｃＤＮＡの相同体であり、第２の短いｃＤＮＡは代替的スプライシングにより第１のＩｇ様ドメインをコードする領域を欠失するものである。ここに開示する全長のクローンに加えて、ＨＵＶＥＣおよびヒト脳ｃＤＮＡライブラリーに由来する切断形態のｆｌｇおよびｂｅｋをコードすると考えられる他のｃＤＮＡクローンを回収することができる。第１のＩｇ様ドメインを欠損するが他はそのままであるｆｌｇの変種が単離された。他のｃＤＮＡ変種には、単一の配列のみ、単一の「Ｉｇ様」ドメインおよび停止コドンをコードするｂｅｋの切断された種類および２つの「Ｉｇ様」ドメインをコードするｆｌｇの変種が包含される。これらの２つのクローンはｂｅｋまたはｆｌｇの分泌された形態を代表し得る。これらのクローンのヌクレオチド配列と３つの「Ｉｇ様」ドメインを有する受容体をコードするｆｌｇおよびｂｅｋｃＤＮＡとの比較により、これらは代替的なスプライシングによりｆｌｇおよびｂｅｋの構造遺伝子から誘導されたことが示唆される。したがって、横紋筋肉腫細胞の溶解物から免疫沈降したｆｌｇの低分子量種は代替的なスプライシングにより生成したｆｌｇの真の形態を表す可能性がある。興味あることに、Ａ２０４横紋筋肉腫細胞は代替的なスプライス形態を表し得る２つの異なるｆｌｇｍＲＮＡを発現するのに対し、ＮＴＥＲＡ−２および内皮細胞は相異して代替的なｆｌｇｍＲＮＡを発現すると思われる。
【００４０】
発明の実施に有用な株の寄託
以下の株の生物学的に純粋な培養物の寄託をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１２３０１パーキロー・ドライブ、ロックビル、メリーランドにより行い、成功裡の生存性試験の後、後記する受託番号が与えられ、必要な手数料を支払った。前記培養物の入手は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．１４および３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２２により資格を与えられた長官により決定された者に対して特許出願の係属中は利用可能となる。公衆に対する前記培養物の利用可能性の全ゆる制限は、出願に基づく特許の発行に際して取消し得ないものとして除去され、前記培養物は、サンプルの調製に対する最も最近の申請後少なくとも５年の期間、またいずれの場合でも寄託の日付から少なくとも３０年の期間は永久的に利用可能に維持される。培養物が利用不可能となるか、または不注意により破壊された場合、同一の分類的記述になる生存する培養物と取り換えられる。
株／プラスミド　　　　　　　　　ＡＴＣＣＮｏ．　　寄託日付
イー・コリ／ｐＧＣ３７
イー・コリ／ｐｆｌｇＦＬ２４
保存を容易とするため、本発明のベクタは形質転換された細菌宿主の形態で寄託されたことを銘記すべきである。しかしながら、受容株につき細菌細胞を培養し、ベクタを回収し、これを使用してここに記載するようにマウス３Ｔ３細胞のような他の宿主細胞を形質転換することは通常の知識の問題である。
本発明の例示として以下の実施例を示す。本発明はこれらの実施例にのみ限定されるものではない。
【００４１】
実施例Ｉ
この実施例は全長のｆｌｇおよびｂｅｋｃＤＮＡのクローン化を示す。前記したように、レトロウイルス形質転換遺伝子産物に基くプローブ（詳細はルタら、１９８８前記を参照することができる）を用いてヒト内皮ｍＲＮＡから誘導したｃＤＮＡライブラリーを検索することにより部分的クローンが単離された。特に、Ｖ−ｆｍｓオンコ遺伝子（ＣＳＦ−１チロシンキナーゼ受容体の活性化された形態）をプローブとして用いて低いストリンジェント性の下で１０６のプラークを検索した。１５の陽性のλｇｔ１１クローンが検出され、５つをプラーク精製して更に分析した。１つのクローン、Ｃ５１がｆｍｓ様遺伝子（ｆｌｇ）と称された。以下に記載するように、欠失する５′断片をＰＣＲと従来のクローン化技術との組合せにより修復した。
ＰＣＲ増幅およびオリゴヌクレオチドプライマー
１００ｐｍｏｌのそれぞれのオリゴヌクレオチドプライマー、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ２　、０．０１％ゼラチン、０．２ｍＭのそれぞれのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ、１０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ８．３（２５℃で）および２．５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキン−エルマ・シータス）を用いて０．１ｍｌの最終容積としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（サイキら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０−１３５４（１９８５））を実施した。銘記しない限り、９４℃で１．５分間、６０℃で１．５分間および７２℃で４分間のサイクル時間により全ての反応を３０サイクル行った。
全てのオリゴヌクレオチドプライマーは、周知の標準的なシアノエチルホスホルアミデート化学を使用してアプライド・バイオシステムズ３８０ＡＤＮＡ合成装置により合成した。
オリゴヌクレオチドは以下の配列を有する：
【００４２】
2004041176.tif 000003
【００４３】
５′ｆｌｇクローンの単離
内部ＥｃｏＲＩ部位のｆｌｇｃＤＮＡ５′（ｐＣ５１の５′末端、ルタら、１９８８、前記）は、固定ＰＣＲ（ローら、１９８９前記）によりプイイマーＦｌｇ−１を使用し５０μｇヒト内皮細胞全ＲＮＡから第１の鎖ｃＤＮＡ合成を特異的にプライムして得た。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによる第１の鎖のｄＧ尾部形成の後、プライマーＦｌｇ−２、ＡＮおよび１０ｐｍｏｌＡＮｐｏｌｙＣによるＰＣＲ増幅（３０サイクル）を９４℃で１．５分間、５０℃で２分間および７２℃で４分間のサイクル時間で行った。Ｃ５１配列を５′方向に１７０ｂｐ延長した単一のＰＣＲ生成物が得られた。新たな配列を使用して２つのオリゴヌクレオチドを設計し、これらをλｇｔ１１アーム特異的オリゴヌクレオチドと共に使用してＰＣＲにより内皮細胞ライブラリーに含まれる５′ｆｌｇクローンを増幅した。第２のＰＣＲ反応は、２×１０６　ファージおよびオリゴヌクレオチドＦｌｇ−ＰＥ−１６５ｎｏｎおよびＧＴ１１−Ｒ１を用いて行った。第３の反応では、オリゴヌクレオチドプライマーＦｌｇ−ＰＥ−１４ｎｏｎおよびＧＴ１１−Ｒ３について鋳型として５μｌの先の反応物を使用した。第３の反応に由来する５６０ｂｐ生成物をＴ４ＤＮＡポリメラーゼとインキュベートすることにより平滑末端とし、ｐＧｅｍ−１（ストラタジーン）およびＭ１３ｍｐ１９のＳｍａＩ部位にクローン化して配列決定した。ｐＧｅｍ−１中の５′ｆｌｇＰＣＲ生成物を切出し、ランダムヘキサマープライミングにより放射能ラベルし（フェインバーグとボゲイステイン、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３７：２６６（１９８４））、ＨＵＶＥＣｃＤＮＡライブラリーを再検索するのに使用して潜在的なＰＣＲにより生成された人為現象のないｃＤＮＡクローンの取得を図った。２×１０６　の検索した組換えファージ中で唯１つのクローンを検出した。このクローンのｃＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列分析により、その配列はＰＣＲにより生成した生成物と同一であり、これは部分的ｆｌｇクローンｐＣ５１により共有されるＥｃｏＲＩ部位で終止することが明らかとなった。このｃＤＮＡを、翻訳開始ＡＴＧの５０ｂｐ５′を切断するＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩにより消化し、６５０ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ断片を同様に開裂したｐＧｅｍ−１にクローン化した。ｐＣ５１に由来する３′ＥｃｏＲＩｆｌｇ挿入物を５′ｆｌｇクローンのＥｃｏＲＩ部位にクローン化することにより全長のｆｌｇｃＤＮＡを構築した。全長のｃＤＮＡをＳｍａＩ／ＡｐａＩにより切出し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端とし、ｐＭＪ３０のＥｃｏＲＶ部位にクローン化した。ｐＭＪ３０は、ｐ２６７のａＦＧＦ挿入につきＥｃｏＲＶクローン化部位を含むリンカの置換により誘導される（ジェイら、ＥＭＢＯ．Ｊ．７：９６３−９６９（１９８８））。
【００４４】
重複するヒトｂｅｋｃＤＮＡクローンの単離
部分的ネズミｂｅｋコード配列（コーンブルスら、１９８８前記）の３′末端に相補的なアンチセンス３３塩基オリゴヌクレオチド（３′ｍｂｅｋ）を用いてλｇｔ１１中の１日保存ヒト脳幹ｃＤＮＡライブラリー（カムホルツら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：４９６２−４９６６（１９８８））を検索した。１．５×１０６　の組換えプラークの検索から３２の陽性ｃＤＮＡクローンが単離され、最長のクローン、λｂｅｋ５を更なる分析のために選択した。λｂｅｋ５をＥｃｏＲＩにより消化し、５′２．２ｋｂおよび３′１．０ｋｂＥｃｏＲＩ断片を更なる操作のためにＭ１３ｍｐ１９およびｐＧｅｍ−１ベクタ中に別々にサブクローン化した。
λｂｅｋ５に由来する５′基部７５０ｂｐ断片を用いて２回目に脳幹ライブラリーを検索することによりヒトｂｅｋの５′末端についてのｃＤＮＡクローンを単離した。ニックトランスレーションにより断片を放射能ラベルし、１．５×１０６プラークの検索に使用した。５４のハイブリダイズするプラークが検出され、１つ、λｂｅｋ７８が元のｃＤＮＡクローンと重複し、５′方向に更に２１８ｂｐ延長したものであった。
【００４５】
ＲＮＡ単離およびノーザン分析
Ａ２０４（ヒト横紋筋肉腫）、Ｕ５６３（ヒトグリア芽細胞腫）およびＮＴＥＲＡ−２ｃｌ．Ｄ１（ヒトテトラカルシノーマ）細胞を１０％ウシ胎児血清によるＤＭＥＭ中で生育させた。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、１０％ウシ胎児血清、１０Ｕ／ｍｌヘパリン（アップジョン）および５ｎｇ／ｍｌ組換えａＦＧＦを含有する培地１９９中で生育させた。グアニジンＨＣｌ（ワンら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１０７：７５−８６（１９８５））によりＮＴＥＲＡ２ｃｌ．Ｄ１細胞から、またグアニジンイソチオシアネート（チルグウィンら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８：５２９４−８９（１９７９））によりＨＵＶＥＣおよびＵ５６３細胞から全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡはその２６０ｎｍの光学的吸収により定量した。４μｇの全ＲＮＡを含有するサンプルをホルムアルデヒドを含有する１．２５％アガロースゲルにより分画し、ニトロセルロースに移した後、主として前記したように（シード、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ中、セトロウら編、第４巻第９１〜１０２頁、プレナム・プレス・ニューヨーク、１９８２）ランダムヘキサマープライミング（フェインバーグとボーゲルシュタイン、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３７：２５６（１９８４））により生成したプローブを使用してプローブした。ｆｌｇプローブは３′非コード領域内に完全に含まれる５５０ｂｐＡｐａＩ／ＥｃｏＲＩ断片とした。ｂｅｋプローブは３′非コード領域内に完全に含まれる８５０ｂｐＴｔｈ１１１Ｉ／ＥｃｏＲＩ断片とした。
【００４６】
実施例ＩＩ
この実施例は、哺乳動物発現ベクタにおける全長のｆｌｇおよびｂｅｋの発現を示すものである。
先の実施例に記載したように、ＳｍａＩ／ＡｐａＩを用いて全長のｆｌｇクローンを切出し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端とし、発現プラスミドｐＭＪ３０のＥｃｏＲＶ部位にクローン化した。ｐＭＪ３０は、ｐ２６７におけるａＦＧＦ挿入物のリンカ置換により誘導されたものである（ジャイら、ＥＭＢＯＪ．７：９６３−９６９（１９８８））。よって、全長のｆｌｇ配列を含むｐＭＪ３０をｐｆｌｇＦＬ２４とする。
オリゴヌクレオチドプライマーＢｅｋ４ＡおよびＢｅｋ１Ｂを用いてλＢｅｋ７８に由来する２７６ｂｐ断片を増幅することにより哺乳動物発現のためのヒトｂｅｋｃＤＮＡを調製した。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｃｌＩによる消化の後、重複の領域にて独特のＢｃｌＩ部位でλｂｅｋ５の２．２ｋｂサブクローンに５′２２２ｂｐ断片を接続した。ＰＣＲ増幅断片により、推定されるイニシエータＡＴＧコドンの直ぐ上流に制限部位および好適な翻訳開始配列を加えた。３′１．０ｋｂＥｃｏＲＩｂｅｋｃＤＮＡ断片を続いて挿入した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞への導入のため、全ヒトｂｅｋコード領域を含む２．５ｋｂ断片をｐＭＪ３０にサブクローン化した。全てのクローンのヌクレオチド配列を連鎖停止により両者の鎖について決定した（サンガーら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，５１：６６０−６７２（１９７７））。よって、全長のｂｅｋ配列を含むｐＭＪ３０をｐＧＣ３７とする。
【００４７】
１０％ウシ血清を用いてダルベッコ修飾イーグルズ培地（ＤＭＥＭ）中にてＮＩＨ３Ｔ３細胞を生育させた。ｆｌｇｃＤＮＡまたはｂｅｋｃＤＮＡの全コード配列を含む２０μｇの発現ベクタと１μｇｐＳＶ２ｎｅｏ，または１μｇｐＳＶ２ｎｅｏのリン酸カルシウム共沈殿によりＮＩＨ３Ｔ３細胞を感染させた。ｐＳＶ２ｎｅｏは単に選択マーカーを与えるのみであり、全ゆる同等の共感染系を用いることができることを銘記すべきである。個々のクローンを５００μｇ／ｍｌゲネチシン（ギブコ）中で選択し、２００μｇ／ｍｌゲネチシンを含有する培地中で維持した。
ＳＶ４０プロモータおよびサイトメガロウイルスエンハンサの直ぐ下流にて哺乳動物発現ベクタ中にｂｅｋおよびｆｌｇに対するｃＤＮＡのコード領域を別々に挿入した。ｐＳＶ２ｎｅｏ（サザンとバーグ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：３２７−３４１（１９８２））およびｂｅｋまたはｆｌｇ発現ベクタの１：２０混合物を用いてＮＩＨ３Ｔ３細胞を共感染し、５００μｇ／ｍｌゲネチシン（ギブコ）の存在下の生育により感染体を選択した。［１２５Ｉ］ａＦＧＦを架橋結合することによりＦＧＦ受容体の過剰発現についてそれぞれの約５０クローンを検索した。ｐＳＶ２ｎｅｏ単独により感染したＮＩＨ３Ｔ３細胞を対照とした。ａＦＧＦの増加した結合を示すｂｅｋおよびｆｌｇ感染細胞の両者のクローンをこの方法で同定し、ｂｅｋおよびｆｌｇは共にａＦＧＦ受容体であることを示した。１つのｂｅｋ感染クローン、Ｎｂｅｋ８および１つのｆｌｇ感染クローンＮｆｌｇ２６を、ａＦＧＦ受容体のその増加した発現に基く更なる分析のために選択した。
【００４８】
［３５Ｓ］メチオニンによりＮｂｅｋ８及びＮｆｌｇ２６細胞を代謝的にラベルし、細胞抽出物を調製し、ｂｅｋおよびｆｌｇ特異的抗ペプチド抗血清を免疫沈降させることにより、ｆｌｇおよびｂｅｋ発現ベクタの翻訳生成物を分析した。ｆｌｇ（Ｆｌｇ−１）のＣＯＯＨ末端１５アミノ酸またはｂｅｋ（Ｂｅｋ−１）のＣＯＯＨ末端１７アミノ酸に対応するペプチドを合成し、架橋結合剤１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを使用してスカシ貝ヘモシアニンに結合させた。完全フロインドアジュバント中で乳化したこれらの試薬を用いてその後ウサギを免疫化してポリクローナル抗血清ＡｎｔｉＦｌｇ−１およびＡｎｔｉＢｅｋ−１を生成した。
【００４９】
１０ｃｍ組織培養皿（ファルコン）中で生育させた９０％融合の細胞をメチオニンを含有しないＤＭＥにより洗浄し、１０％ウシ血清および１００μＣｉ／ｍｌ［３５Ｓ］メチオニン（アマシャム）を含むメチオニンを含有しないＤＭＥ中で６時間インキュベートした。その後ＰＢＳ（ギブコ）により細胞を３回洗浄し、０５ｍｌの溶解緩衝液（２０ｍＭヘペス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセリン、１％トリトンＸ−１００、１．５ｍＭＭｇＣｌ２　、１ｍＭＥＤＴＡ、１μｇ／ｍｌアプロチニン、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド）に掻き取り、氷上で１５分間インキュベートした。エッペンドルフ遠心機により４℃で１５分間溶解物を遠心分離した。サンプル当り３ｍｇのプロテインＡ−セファロースを膨潤させ、２０ｍＭヘペス、ｐＨ７．５により洗浄し、その後対応するウサギ抗ペプチド抗血清（ＡｎｔｉＦｌｇ−１およびＡｎｔｉＢｅｋ−１）を用いて室温で３０分間混合し、その後ＨＮＴＧ緩衝液（２０ｍＭヘペス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、０１％トリトンＸ−１００、１０％グリセリン）により３回洗浄を行った。プロテインＡ−セファロース／抗体複合体をその後それぞれ清澄化した細胞溶解物と６０分間ＨＮＴＧ緩衝液中にて４℃でインキュベートし、５０ｍＭヘペス、ｐＨ８．０、５００ｍＭＮａＣｌ、０．２％トリトンＸ−１００および５ｍＭＥＧＴＡにより２回、５０ｍＭヘペス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００、５ｍＭＥＧＴＡおよび０．１％ＳＤＳにより２回、最後に１０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ８および０１％トリトンＸ−１００により２回洗浄した。ラエムリサンプル緩衝液（ラエムリ、Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０−６８５（１９７０））を洗浄した免疫沈降物に添加し、これをその後４分間煮沸し、ＳＤＳ−（７％）ポリアクリルアミドゲル上で分離した。コダックＸ−Ｏｍａｔフィルム（イーストマン・コダック社、ロチェスター、ＮＹ）により乾燥したゲルのオートラジオグラムを作製した。
【００５０】
免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後オートラジオグラフィ（図４）を行った。ｆｌｇ抗ペプチド抗血清によりｆｌｇ感染細胞から１５０ｋＤａのバンドが特異的に免疫沈降した（レーン３）のに対し、ｂｅｋ抗ペプチド抗血清はｂｅｋ感染細胞から１３５ｋＤａ（レーン７）のバンドを特異的に免疫沈降させた。対応する抗原性ペプチドの存在下における免疫沈降は、ｆｌｇおよびｂｅｋ特異的蛋白質の沈降を完全に排除する。ｆｌｇおよびｂｅｋの演繹されたアミノ酸配列は、それぞれ８９，４３７および８９，７５０ダルトンの成熟コア蛋白質を予測させ、細胞外ドメインの潜在的な部位でのグリコシル化はより高い分子量形態に帰着すると考えられる。グリコシル化を遮断するためのツニカマイシンによるＮＦｌｇ２６およびＢｅｋ８細胞の処理は、低減された分子量のｂｅｋおよびｆｌｇ生成物を結果的に与え、これらの予測されたコア蛋白質の大きさと一層一貫している（レーン４および８）。結果はｂｅｋおよびｆｌｇの両者が糖蛋白質であることを示す。ｂｅｋと比較して大きいｆｌｇの大きさは潜在的なＮ−結合グリコシル化部位（それぞれで９対８）の数と一貫性があるが、ツニカマイシン処理細胞から単離されたｆｌｇ生成物は、そのアミノ酸配列から予測されるより遅く移動する。この遅い移動の理由は知られていないが、恐らく組換えｆｌｇの構造によるものではない。というのは、ＮＦｌｇ２６およびＡ２０４横紋筋肉腫細胞に由来するｆｌｇは、ツニカマイシン処理の前後共同一のみかけの分子量を有するからである。
【００５１】
対照細胞に由来する免疫沈降物からはｂｅｋまたはｆｌｇ蛋白質は検出されなかった（レーン１、２、５および６）。先の実験では、ＦＧＦ架橋結合ｆｌｇ蛋白質はＮＩＨ３Ｔ３２．２細胞から免疫沈降したが（ルタら、１９８９前記）、これは明らかに内性ｆｌｇを発現している。対照実験でｆｌｇを検出できなかったのは、ｂｅｋおよびｆｌｇ過剰発現細胞系統を使用したにも拘らず主として分析した細胞が少数でありオートラジオグラフ露出時間が短かったことによるものである。
内性繊維芽細胞生育因子受容体の基礎レベルは細胞型の如何によって変動し得る。３Ｔ３細胞はこの種の受容体を約５〜１０，０００含有するが、３Ｔ３２．２細胞のような幾つかの３Ｔ３サブクローンは細胞当り３０，０００までの受容体を含有し得る。ここで使用するように「過剰発現」細胞という用語は、約５０，０００受容体以上を有する細胞を指す。前記開示したプラスミドによる３Ｔ３細胞の最初の感染は約５０，０００受容体／細胞を有する細胞を生成する。しかしながら、培養中に時間と共に３００，０００以上の受容体／細胞を発現するクローンを選択することができる。ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞を感染させてメソトレキセート選択により増幅すると、これらは細胞当り百万以上の受容体を生産することが期待される。
【００５２】
実施例ＩＩＩ
放射能ヨウ素化およびＦＧＦの結合
先に記載されたように精製したウシ誘導ａＦＧＦ（ブルゲスら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：１１３８９−１１３９２（１９８５））、ヒト組換えｂＦＧＦ（モスカテリ博士の好意による贈与）およびヒト組換えｋＦＧＦ（クラウジオ・バシリコ博士の好意による贈与）を、エンザイモビーズ（バイオラド）の手順を使用して放射能ヨウ素化した。それぞれの非ラベル競合体を使用するラジオアイソトープ希釈により放射能ヨウ素化したリガンドの比活性を決定した。非ラベルのリガンドの濃度はアミノ酸分析（ジェイら、１９８７前記）により決定した。［１２５Ｉ］ａＦＧＦの異なる調製物の比活性は１３０，０００〜７６０，０００ｃｐｍ／ｎｇの間で変動し、［１２５Ｉ］ｂＦＧＦについての比活性は５０，０００〜５００，０００ｃｐｍ／ｎｇの間であった。［１２５Ｉ］ｋＦＧＦの比活性は５０，０００〜２００，０００ｃｐｍ／ｎｇの間で変動した。
【００５３】
結合検定は次のように行った：
１×１０５　細胞／穴を有するフィブロネクチン被覆２４穴皿を氷上に載置し、冷却した結合緩衝液（ＤＭＥＭ、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、５Ｕ／ｍｌヘパリン、５０ｍＭヘペス、ｐＨ７．４）を用いて穴を２回リンスした。１ｍｌの氷冷結合緩衝液を用いて２０分間皿を氷上でインキュベートした後、ヘパリンを有さない冷却結合緩衝液中での［１２５Ｉ］ＦＧＦの一連の希釈により４℃で２時間とした。同一の一連の希釈物を使用するが１００倍モル過剰の非放射能ラベルａＦＧＦの存在下として非特異的結合を行った。インキュベートの後、細胞を氷上に載置し、ヘパリンを除いた氷冷結合緩衝液により２回リンスした後、０．３ＮＮａＯＨ、３７℃に１５分間溶解させた。［１２５Ｉ］ｂＦＧＦを使用する場合、細胞をインキュベート後に氷上に載置し、ＰＢＳにより３回、２０ｍＭヘペス、ｐＨ７．５中の１ｍｌ２ＭＮａＣｌにより２回および２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０中の１ｍｌ２ＭＮａＣｌにより２回洗浄した。酸性２ＭＮａＣｌ洗浄により放出された放射能は、高い親和性部位に対する特異的な結合を示す（モスカテリ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１３１：１２３−１３０（１９８７））。
【００５４】
無傷細胞に対する［１２５Ｉ］酸性ＦＧＦ、［１２５Ｉ］塩基性ＦＧＦおよび［１２５Ｉ］ｋＦＧＦの共有結合による架橋結合
ヒトフィブロネクチンで被覆した６０ｍｍの組織培養皿中でＮＦｌｇ２６、ＮＢｅｋ８およびＮＮｅｏ４細胞を生育させた。融合に際し、結合緩衝液（０．２％ＢＳＡおよび２０ｍＭヘペス、ｐＨ７．５を含有するＤＭＥＭ）により細胞を２回洗浄し、２５ｎｇ／ｍｌの［１２５Ｉ］ａＦＧＦ、［１２５Ｉ］ｂＦＧＦまたは［１２５Ｉ］ｋＦＧＦを含有する結合緩衝液を用いて４℃で９０分間インキュベートした。結合緩衝液で１回およびＰＢＳで１回洗浄した後、架橋結合剤として０．３ｍＭジスクシニミジルスベレート（ピエルセ）（ＤＭＳＯ中の３０ｍＭ保存溶液として調製）を含有するＰＢＳを用いて４℃で２０分間細胞を更にインキュベートした。その後１０ｍＭヘペス、ｐＨ７．５、２００ｍＭグリシン、２ｍＭＥＤＴＡにより１回、ＰＢＳにより１回細胞を洗浄し、その後ＰＢＳ中で掻き取り、エッペンドルフ遠心機による遠心分離により集めた。１００μｌの溶解緩衝液（２０ｍＭヘペス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、１０％グリセリン、１．５ｍＭＭｇＣｌ２　、１ｍＭＥＤＴＡ、１μｇ／ｍｌアプロチニン、１μｇ／ｍｌロイペプチンおよび１ｍＭＰＭＳＦ）中で細胞ペレットを溶解し、氷上で１５分間インキュベートし、エッペンドルフ遠心機により４℃で１５分間遠心分離した。略同容積のそれぞれのサンプルの上澄をラエムリサンプル緩衝液（ラエムリ、Ｎａｔｕｒｅ，２２７：６８０−６８５（１９７０））と混合し、４分間煮沸し、ＳＤＳ−７％ポリアクリルアミドゲル上で分画した。ゲルをクーマシー・ブリリアント・ブルーにより染色し、全てのサンプルが略同量の蛋白質を含有することを確認した。コダックＸ−Ｏｍａｔフィルムにより乾燥したゲルのオートラジオグラムを作製した。
【００５５】
［１２５Ｉ］ａＦＧＦを用いる親和性架橋結合によりｂｅｋおよびｆｌｇの過剰発現につきクローンを検索することができることは、ｂｅｋおよびｆｌｇの両者は高い親和力でａＦＧＦに結合することを示唆する。ｂｅｋおよびｆｌｇ過剰発現細胞に対する［１２５Ｉ］ａＦＧＦ、［１２５Ｉ］ｂＦＧＦおよび［１２５Ｉ］ｋＦＧＦの結合を並列で分析した。［１２５Ｉ］ａＦＧＦ、［１２５Ｉ］ｂＦＧＦまたは［１２５Ｉ］ｋＦＧＦを用いる細胞のインキュベートの後、受容体−ＦＧＦ複合体をジスクシニミジルスベレートと共有結合により架橋結合させ、可溶化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィ（図５）に供した。１６５ｋＤａの単一のバンドは、ｆｌｇ過剰発現細胞系統中でａＦＧＦおよびｂＦＧＦの両者に架橋結合した（レーン２および５）。同様に、１５０ｋＤａの単一のバンドは、ｂｅｋ過剰発現細胞系統中でａＦＧＦおよびｂＦＧＦの両者に架橋結合した（レーン３および６）。リガンドの分子量（約１５ｋＤａ）を差引いた後、ｆｌｇおよびｂｅｋ過剰発現細胞系統における架橋結合バンドの大きさ（それぞれ１５０および１３５ｋＤａ）は免疫沈降したｆｌｇおよびｂｅｋ蛋白質（図４）の大きさに正に対応する。ａＦＧＦまたはｂＦＧＦを架橋結合したもの（図５ａ）の場合と比較して［１２５Ｉ］ｋＦＧＦを架橋結合（図５ｂ）した場合のバンドの大きさがみかけ上僅かに大きいのは、ｋＦＧＦ（２２Ｋｄ）対ａＦＧＦまたはｂＦＧＦ（１６Ｋｄ）の大きさの差によるものである。対照細胞では架橋結合した生成物は認められなかったがこれは再度過剰発現細胞系統を用いて得られたシグナルの強度により与えられたオートラジオグラフ露呈時間が短かったことに帰するものである。
【００５６】
酸性、塩基性およびｋ−繊維芽細胞生育因子により放射能ラベルされたｆｌｇおよびｂｅｋの平衡結合分析
酸性および塩基性ＦＧＦを放射能ヨウ素化し、前記したようにヘパリン−セファロースにより精製した。ヨウ素化されたリガンドを用いる過剰発現細胞系統の飽和結合分析によりａＦＧＦおよびｂＦＧＦに対するｂｅｋおよびｆｌｇの解離定数を確定した。ｂｅｋおよびｆｌｇに対するａＦＧＦおよびｂＦＧＦの両者の結合は特異的であり、飽和し得るものであった（図６ｂ及び図６ｄ）。更に、飽和における［１２５Ｉ］ａＦＧＦおよび［１２５Ｉ］ｂＦＧＦの結合は１００倍モル過剰のａＦＧＦまたはｂＦＧＦの存在下で完全に排除され、それぞれのリガンドは同一の部位に対する結合につき互いに効果的に競合することが示された。典型的な実験（図６ａ及び図６ｃ）についての結合データのスキャッチャード分析（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０−６７２（１９４９））により、ｆｌｇ過剰発現細胞は、それぞれａＦＧＦおよびｂＦＧＦにつき２４ｐＭおよび４７ｐＭの親和力を有する細胞当り約５５，０００の受容体を担持することが示される。同様に、ｂｅｋ過剰発現細胞は、それぞれａＦＧＦおよびｂＦＧＦにつき４７ｐＭおよび８２ｐＭの親和力を有する細胞当り約６４，０００の受容体を担持する。ｋＦＧＦは、それぞれ３２０および８０ｐＭの親和力によりｆｌｇおよびｂｅｋに結合する（図６ｅ〜図６ｈ）。また、ｋＦＧＦはｂＦＧＦと類似する親和力でｂｅｋに結合するが、ｂＦＧＦの４倍の親和力でｆｌｇに結合する。更なる実験からのデータにより、ｆｌｇに対して２０〜８０ｐＭの範囲およびｂｅｋに対して４０〜１００ｐＭの範囲のａＦＧＦのみかけのＫｄが与えられる。ｆｌｇ（５０〜１５０ｐＭ）およびｂｅｋ（８０〜１５０ｐＭ）に対するｂＦＧＦのＫｄの類似する変動が認められるが、全ゆる単一の実験の範囲内ではｂＦＧＦはａＦＧＦと比較するとｆｌｇまたはｂｅｋに対する約２倍低い親和力を常に示す。値の変動は、恐らくヨウ素化リガンドの異なる調製物の比活性および生物学的完全性の決定に起因すると考えられる。いずれにしろ、ｂｅｋおよびｆｌｇは類似する高い親和力でａＦＧＦに結合し、ａＦＧＦより約２倍低い親和力でｂＦＧＦに結合することをデータは明らかに示している。これらの結論は、［１２５Ｉ］ａＦＧＦおよび［１２５Ｉ］ｂＦＧＦを用いてｆｌｇおよびｂｅｋ過剰発現細胞に対する結合について増加する量の非放射活性ａＦＧＦまたはｂＦＧＦを競合させた競合（アイソトープ希釈）実験により支持される。
【００５７】
薬物検索
生物学的に活性な形質転換細胞は、そのコグナント（ｃｏｇｎａｎｔ）受容体に対するＦＧＦの結合を阻害する際のその有効性につき化合物を検索するのに使用することができる。潜在的な阻害剤の非存在下にリガンド／受容体相互作用のパラメータを確立したならば、評価されるべき化合物、添加したラベルしたＦＧＦを含有する試験サンプルを用いて細胞を予備インキュベートし、存在する場合はＦＧＦ結合の低減を測定することは日常的な仕事に過ぎない。
他の検定が可能である。例えば、ＦＧＦ結合を直接測定するより寧ろ、ＦＧＦの効果（すなわち細胞内の事態）を検定することができる。この種の事態の１つは、受容体自体またはホスホリパーゼＣ−γのような他の細胞内標的の蛋白質リン酸化である。リン酸化された蛋白質の出現は、この種の蛋白質と抗ホスホチロシン抗体との反応性により測定することができる。
【００５８】
この発明は薬物評価のための有用な細胞系統に関するものであり、用いるいずれかの特定の検定に関するものではない。先に記載したように、有用な検索系を提供するために全受容体分子を発現する必要はない。例えば、第１のＩｇドメインおよび「酸性ボックス」を欠失した細胞外ドメインでもＦＧＦリガンドと結合することはなお可能であることが突き止められた。前記したように、細胞質ドメインを発現している宿主細胞を、候補トリホスチンの試験のためのプロテインキナーゼの簡便な供給源として使用することができる。細胞質ドメインのみを含むプラスミドにより形質転換されたイー・コリはこの目的のために有用であることが示された。この発明により提供されるｆｌｇおよびｂｅｋの無傷の配列が与えられたならば、ＰＣＲ技術または固相ペプチド合成により種々のドメインの断片を作製し、リガンドまたはリン酸化された蛋白質に対して結合するその能力についてこれを評価することは通常の技術であることは勿論である。
潜在的な治療剤には、限定されるものではないが、小さな有機分子、受容体断片自体または細胞外ドメインに対するリガンドの結合を阻害するかまたはプロテインキナーゼ活性を与える抗体が包含される。
【００５９】
阻害的活性を有する化合物は、所望しないＦＧＦ媒介細胞応答を特徴とする疾患状態の処置のための治療剤として潜在的に有用である。この種の応答を特徴とするものとして示された疾患状態には、ガン、特にある種の形態の胸部ガン、乾癬、関節炎、アテローム硬化症および良性前立腺肥大が包含される。
この発明の治療剤は単独または薬学的に許容し得るキャリヤと組合せて投与することができ、その割合は化合物の溶解性および化学的性状、選択した投与の経路および標準的な薬学的慣行により決定される。例えば、これらはデンプン、ミルクシュガー、ある種の粘土等のような他のもの（ｅｘｃｅｐｉｅｎｔｓ）を含有する錠剤またはカプセルの形態で経口的に投与することができる。糖およびコーンシロップ、香料および色素と活性成分とを混合した後十分に脱水して固体形態へのプレスを適切なものとするトローチまたはロゼンジの形態でこれらを舌下錠により投与することができる。着色および香料剤を含有し得る溶液の形態でこれらを経口的に投与することができ、また非経口的に、すなわち筋肉内、静脈内または皮下投与によりこれらを注射することができる。非経口的投与のためには、他の溶質、例えば溶液を等張とするのに十分な塩類またはグルコースを含有する殺菌溶液の形態でこれらを使用することができる。
医師は最も適切な本治療剤の投与量を決定し得るが、これは投与の形態および選択する特定の化合物により変動し得て、更に処置を行う特定の患者によって変動し得る。一般にその化合物の最適投与量より実質的に少ない少量の投薬を用いて最初の処置を行うことが意図され、その状況で最適効果が達成されるまで少量の増加分ずつ投薬を増加させる。組成物を経口的に投与した場合は、非経口的に与える少量の量と同じ効果を与えるには活性薬剤がより大量に必要となることが一般に認められよう。
【図面の簡単な説明】
【図１】受容体チロシンキナーゼサブクラスの概略図を示す。
【図２ａ】ヒトｆｌｇおよびｂｅｋのアミノ酸配列および構造的類似を示す。
ｃＤＮＡクローンから演繹されたものとしてヒトｆｌｇおよびｂｅｋのアミノ酸配列を示す。ｆｌｇのものと異なるｂｅｋ配列における残基のみを示す。上実線は推定されたシグナルペプチドおよび膜横断配列を強調する一方、上点線はキナーゼ挿入領域を強調するものである。Ｉｇ様ドメインを特定する保存されたシステイン残基上に黒丸を付ける。潜在的なＡｓｎ結合グリコシル化部位の上に下向き三角を付ける。開いた角型括弧は「酸性ボックス」を囲むものであり、対向する矢印はチロシンキナーゼドメインを画定するものである。
【図２ｂ】ヒトｂｅｋおよびｆｌｇ蛋白質の異なる領域の間のアミノ酸の同一性の程度を示す。黒塗りのブロック棒は分割した細胞質キナーゼドメインを示し、ループは細胞外Ｉｇ様ドメインを示す。核酸配列はＥＭＢＬデータライブラリーに提
出されている。受託番号Ｘ５２８３２およびＸ５２８３３がヒトｂｅｋおよびｆｌｇのｃＤＮＡに対してそれぞれ与えられた。
【図３ａ】ｆｌｇのｍＲＮＡ発現を明示するノーザンブロットを示すものである。種々の細胞系統に由来する４μｇの全ＲＮＡを、ｆｌｇ発現についてのノーザン分析に供した。この結果得られたブロットのオートラジオグラムの図である。ＲＮＡは次の細胞系統に由来する：Ａ２０４横紋筋肉腫（レーン１）、Ｕ５６３グリア芽細胞腫（レーン２）、ＨＵＶＥＣ（レーン３）、ＮＴＥＲＡ−２テラトカルシノーマ（レーン４）。
【図３ｂ】ｂｅｋのｍＲＮＡ発現を明示するノーザンブロットを示すものである。種々の細胞系統に由来する４μｇの全ＲＮＡを、ｂｅｋ発現についてのノーザン分析に供した。この結果得られたブロットのオートラジオグラムの図である。ＲＮＡは次の細胞系統に由来する：Ａ２０４横紋筋肉腫（レーン１）、Ｕ５６３グリア芽細胞腫（レーン２）、ＨＵＶＥＣ（レーン３）、ＮＴＥＲＡ−２テラトカルシノーマ（レーン４）。
【図４】［３５Ｓ］メチオニンを用いたｆｌｇおよびｂｅｋ過剰発現細胞系統の代謝的ラベルを示す。
実施例ＩＩで説明するようにツニカマイシンの存在下（レーン２、４、６、８）または非存在下（レーン１、３、５、７）で［３５Ｓ］メチオニンを用いてＮＦｌｇ２６、ＮＢｅｋ８およびＮＮｅｏ４対照細胞をラベルした。細胞溶解物を抗ｆｌｇ−１（レーン１〜４）または抗ｂｅｋ−１（レーン５〜８）を用いて免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィに供した。この結果得られたオートラジオグラムの図を示す。溶解物は次のものに由来する：Ｎｅｏ４対照細胞（レーン１、２、５、６）、Ｆｌｇ２６細胞（レーン３、４）、Ｂｅｋ８細胞（レーン７、８）。分子量標準の位置を示す。対応する抗原性ペプチドの存在下での免疫沈降により、ｆｌｇおよびｂｅｋ特異的蛋白質の沈降が完全に排除される（データは示していない）。
【図５ａ】ｆｌｇ及びｂｅｋ過剰発現細胞に対する［１２５Ｉ］ＦＧＦの架橋結合を示す。実施例ＩＩＩで説明するように、［１２５５Ｉ］ａＦＧＦ（レーン１〜３）および［１２５５Ｉ］ｂＦＧＦ（レーン４〜６）をＮＦｌｇ２６（レーン３、６）、ＮＢｅｋ８（レーン３、６）およびＮＮｅｏ４（レーン１、４）細胞のモノレイヤに対して共有結合により架橋結合した。その後細胞を溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ゲルをＸ線フィルムに露出した。この結果得られたオートラジオグラムの図を示す。
【図５ｂ】ｆｌｇ及びｂｅｋ過剰発現細胞に対する［１２５Ｉ］ＦＧＦの架橋結合を示す。［１２５Ｉ］ａＦＧＦ（レーン１〜３）および［１２５Ｉ］ｋＦＧＦ（レーン４〜６）をＮＮｅｏ４（レーン１、４）、ＮＦｌｇ２６（レーン２、５）およびＮＢｅｋ１３（レーン３、６）のモノレイヤに対して共有結合により架橋結合し、図５ａと同様に分析した。
【図６ａ】ｆｌｇ過剰発現細胞系統に対するａＦＧＦ（■−■）およびｂＦＧＦ（●…●）結合のスキャッチャード分析結果を示す図面である。
【図６ｂ】ｆｌｇ２６（パネルＡ）細胞に対する［１２５Ｉ］ａＦＧＦ（■−■）および［１２５Ｉ］ｂＦＧＦ（●…●）の飽和結合分析結果を示す図面である。
１００倍モル過剰のいずれかのリガンド存在下におけるバックグラウンドのカウントは、それぞれの点において常に合計ｃｐｍの１０％未満だった。スキャッチャード分析におけるスケールは、それぞれのパネルで同一である。
【図６ｃ】ｂｅｋ過剰発現細胞系統に対するａＦＧＦ（■−■）およびｂＦＧＦ（●…●）結合のスキャッチャード分析結果を示す図面である。
【図６ｄ】ｂｅｋ８（パネルＢ）細胞に対する［１２５Ｉ］ａＦＧＦ（■−■）および［１２５Ｉ］ｂＦＧＦ（●…●）の飽和結合分析結果を示す図面である。
１００倍モル過剰のいずれかのリガンド存在下におけるバックグラウンドのカウントは、それぞれの点において常に合計ｃｐｍの１０％未満だった。スキャッチャード分析におけるスケールは、それぞれのパネルで同一である。
【図６ｅ】ｆｌｇ２６（パネルＡ）に対する［１２５Ｉ］ｋＦＧＦ結合のスキャッチャード分析結果を示す図面である。
【図６ｆ】ｆｌｇ２６（パネルＡ）に対する［１２５Ｉ］ｋＦＧＦの飽和結合分析結果を示す図面である。
【図６ｇ】ｂｅｋ１３（パネルＢ）に対する［１２５Ｉ］ｋＦＧＦ結合のスキャッチャード分析結果を示す図面である。
【図６ｈ】ｂｅｋ１３（パネルＢ）に対する［１２５Ｉ］ｋＦＧＦの飽和結合分析結果を示す図面である。
【図７】図７ａ〜図７ｅはｆｌｇの全ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
【図８】図８ａ〜図８ｅはｂｅｋの全ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図６ｆ】
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【図６ｇ】
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【図６ｈ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図７ｅ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図８ｅ】
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