(57)【要約】【課題】核酸チップ上にマトリックス状に配置される核酸プローブに対して、その標的核酸がハイブリダイゼーションした状態とした上で、飛行時間型二次イオン質量分析法を用いて、核酸プローブと標的核酸とを同時に、明確に弁別して、高い感度で、定量的な分析、二次元的イメージングを簡便に行うことが可能な分析方法を提供する。【解決手段】プローブ核酸と標的核酸に関して、それぞれ別個の標識物質、例えば、ハロゲン原子で予め標識しておくことで、ハイブリッドを形成した後、プローブ核酸と、標的核酸を、標識している別個の標識物質に起因する二次イオンの測定を介して、個別にイメージングするとともに、量的分析する。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の核酸プローブが基板上にマトリクス状に配置された核酸チップの分析方法であって、
前記核酸プローブに対して、その標的核酸がハイブリダイゼーションしたハイブリッド体を構成した状態とした上で、核酸プローブと標的核酸とを同時に分析する際、
前記核酸プローブと前記標的核酸は、それぞれ既定の数の、異なる物質で予め標識し、
飛行時間型二次イオン質量分析法により、個々の標識物質を分析することを介して、標識された核酸プローブと、標識された標的核酸の分析を行うことを特徴とする核酸チップ上の核酸の分析方法。
【請求項２】
前記標識物質として、
核酸プローブ、および、標的核酸を構成する物質に由来する二次イオンと明確に区別される二次イオンを発生できる物質を選択することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該飛行時間型二次イオン質量分析法による分析は、
個々の標識物質の量的な分析であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
該飛行時間型二次イオン質量分析法による分析に際し、
一次イオンの照射は、前記核酸チップ表面の特定の面積を有する測定領域に対して、その測定領域の面積と比較して、相対的に小さな面積を有する照射スポットとして、順次パルス的に照射して、
該パルス的な一次イオン照射によって発生する二次イオンを、それぞれのパルス照射毎に飛行時間的に質量分析する測定法を選択することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記パルス的な一次イオン照射において、
照射スポット位置を、非連続的パターンに基づいて、順次移行させ、
それぞれのパルス照射毎に測定される、発生された二次イオンの質量分析の結果を、前記一次イオンの照射スポット位置パターンに基づいて、再構成して二次元的画像化を行うことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記非連続的パターンは、
ランダムなパターンであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記非連続的パターンは、
特定のプログラムされたパターンであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸プローブと前記標的核酸とをそれぞれ標識する、各標識物質の既定の数は、
核酸プローブ、ならびに、標的核酸の各一分子当たり、
少なくとも１以上で、各核酸を構成する塩基鎖長を超えない範囲に選択されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
各標識物質の既定の数は、
核酸プローブ、ならびに、標的核酸の各一分子当たり、１〜５個の範囲に選択されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸プローブと前記標的核酸とをそれぞれ標識する、各標識物質は、
互いに異なるハロゲン原子を選択することを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
各標識物質に選択される前記ハロゲン原子は、
フッ素、塩素、臭素、ヨウ素から選択される二種であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
各標識物質に選択される前記ハロゲン原子は、
前記核酸プローブならびに前記標的核酸を構成するヌクレオチドの塩基に結合されていることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸プローブならびに前記標的核酸を構成するヌクレオチドの塩基に結合されているハロゲン原子は、
核酸プローブ、ならびに、標的核酸それぞれと、相補的な塩基配列を有する核酸とのハイブリッド形成の阻害を誘起しない、ヌクレオチド塩基上の位置に結合されていることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
各標識物質に選択される前記ハロゲン原子は、
ピリミジン塩基の５位、あるいは、プリン塩基の８位のいずれかに結合されていることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸プローブまたは前記標的核酸は、少なくとも、合成ＤＮＡ鎖部分を有し、
各標識物質に選択される前記ハロゲン原子の導入は、前記合成ＤＮＡ鎖部分になされ、
該合成ＤＮＡ鎖部分をＤＮＡ自動合成装置で合成する際、使用される複数種の核酸塩基用合成ユニットの少なくとも一つに、該ハロゲン原子が前記核酸塩基上の修飾部位に結合した２’−デオキシリボヌクレオシド−３’−フォスフォロアミダイト型合成ユニットを選択することで、該ハロゲン原子の導入がなされていることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ハロゲン原子が核酸塩基上の修飾部位に結合した２’−デオキシリボヌクレオシド−３’−フォスフォロアミダイト型合成ユニットは、下記の４種の構造式のいずれかで示される合成ユニットの群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【化１】
2004037123.tif 000010
（式中、Ｘは、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、
ＤＭＴＯは、ジメトキシトリチル基、
ｉＰｒは、イソプロピル基、
ＣＮＥｔは、２−シアノエチル基を、それぞれ表す。）
【請求項１７】
前記核酸プローブまたは前記標的核酸は、少なくとも、合成ＲＮＡ鎖部分を有し、
各標識物質に選択される前記ハロゲン原子の導入は、前記合成ＲＮＡ鎖部分になされ、
該合成ＲＮＡ鎖部分をＲＮＡ自動合成装置で合成する際、
使用される複数種の核酸塩基用合成ユニットの少なくとも一つに、該ハロゲン原子が前記核酸塩基上の修飾部位に結合したリボヌクレオシド−３’−フォスフォロアミダイト型合成ユニットを選択することで、該ハロゲン原子の導入がなされていることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸プローブまたは前記標的核酸は、少なくとも、合成ＰＮＡ鎖部分を有し、
各標識物質に選択される前記ハロゲン原子の導入は、前記合成ＰＮＡ鎖部分になされ、
該合成ＰＮＡ鎖部分をＰＮＡ自動合成装置で合成する際、
使用される複数種の核酸塩基用合成ユニットの少なくとも一つに、該ハロゲン原子が前記核酸塩基上の修飾部位に結合した核酸塩基結合ペプチドアナログ型合成ユニットを選択することで、該ハロゲン原子の導入がなされていることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸プローブまたは前記標的核酸は、ＲＮＡを鋳型として調製されるｃＤＮＡであり、
各標識物質に選択される前記ハロゲン原子の導入は、鋳型のＲＮＡに基づき、ＤＮＡプライマーを用いて、逆転写酵素による伸展合成される該ｃＤＮＡの塩基鎖部になされ、
該逆転写酵素による伸展合成の際、
使用される複数種の核酸塩基の三リン酸ユニットの少なくとも一つに、該ハロゲン原子が前記核酸塩基上の修飾部位に結合した２’−デオキシリボヌクレオシド−５’−三リン酸ユニットを選択することで、該ハロゲン原子の導入がなされていることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸プローブまたは前記標的核酸は、ゲノムＤＮＡを鋳型として誘導調製されるＤＮＡ断片であり、
各標識物質に選択される前記ハロゲン原子の導入は、鋳型のゲノムＤＮＡに基づき、ＤＮＡプライマーを用いて、ＤＮＡポリメレースによる伸展合成される該ＤＮＡ断片の塩基鎖部になされ、
該ＤＮＡポリメレースによる伸展合成の際、
使用される複数種の核酸塩基の三リン酸ユニットの少なくとも一つに、該ハロゲン原子が前記核酸塩基上の修飾部位に結合した２’−デオキシリボヌクレオシド−５’−三リン酸ユニットを選択することで、該ハロゲン原子の導入がなされていることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸プローブまたは前記標的核酸は、ゲノムＤＮＡを鋳型として誘導調製されるｃＲＮＡであり、
各標識物質に選択される前記ハロゲン原子の導入は、鋳型のゲノムＤＮＡに基づき、プライマーを用いて、ＲＮＡポリメレースによる伸展合成される該ｃＲＮの塩基鎖部になされ、
該ＲＮＡポリメレースによる伸展合成の際、
使用される複数種の核酸塩基の三リン酸ユニットの少なくとも一つに、該ハロゲン原子が前記核酸塩基上の修飾部位に結合したリボヌクレオシド−５’−三リン酸ユニットを選択することで、該ハロゲン原子の導入がなされていることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸プローブと前記標的核酸とをそれぞれ標識する、各標識物質の少なくとも一つは、
金属、または、金属化合物のいずれかから選択されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項２３】
前記金属、または、金属化合物中の金属元素は、
Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ａｌ、Ｔａ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｚｎ、Ｓｎ、Ｒｕ、Ｒｈからなる群から選択されることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記金属化合物は、有機金属錯体であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記有機金属錯体は、
Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ａｌ、Ｔａ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｚｎ、Ｓｎ、Ｒｕ、Ｒｈからなる群から選択される金属元素を含む錯体であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数の核酸プローブが基板上にマトリクス状に配置した、言謂、核酸チップを用いた標的核酸の検出、分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡチップ、ＲＮＡチップ等、各種の核酸プローブ分子を基板上にマトリクス状に配置したもの、所謂、核酸チップは、ゲノム解析、あるいは、遺伝子の発現解析などの目的に利用されるようななってきた。また、それら核酸チップを利用した解析の結果は、癌、遺伝病、生活習慣病、感染症等の診断、予後予想、治療方針の決定等に重要な指標を提供するものと期待されている。
【０００３】
核酸チップの作製方法には、幾つかの手法が知られている。ＤＮＡチップを例にとって説明すると、フォトリソグラフィーを用いて、直接基板上にＤＮＡプローブを逐次的に合成していく方法（米国特許第５４０５７８３公報等）、あるいは、予め合成したＤＮＡ、または、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）を、基板上に供給し結合する方法（米国特許第５６０１９８０公報、特開平１１‐１８７９００号公報、Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｖｏｌ．２７０，　４６７，　１９９５等）が代表的なＤＮＡチップの作製法である。
【０００４】
一般的には、前記二種の方法によって核酸チップは作製され、このチップ上に固定されている核酸プローブと、検出を目的とする核酸分子、所謂、標的核酸を含有する検体溶液とをハイブリダイゼーション条件においた後、核酸チップ上のプローブ核酸と標的核酸のハイブリッド体形成の有無を何らかの手段によって検出することによって、所望の標的核酸の検出、分析が達成される。
【０００５】
その際、解析の信頼性、すなわち、定量性、再現性を保証するためには、核酸チップの各マトリクスに存在するハイブリッドの量、つまり、密度を知ることが重要である。加えて、ハイブリダイゼーションの際に、標的核酸溶液（検体）に溶解している標的核酸の存在量、すなわち、濃度を知るためには、ハイブリダイゼーションに先立ち、マトリクス中のプローブ核酸の量、すなわち、同様に密度を知ることが、また、重要である。すなわち、仮に、標的核酸の溶解濃度が高く、ハイブリダイゼーションが十分起こり得るとしても、マトリクス中のプローブ核酸の密度が低い場合には、ハイブリッド量はプローブ核酸の密度に依る制限を受ける。その際には、見掛け上、標的核酸の溶解濃度は、実際の値と比較して、少なく見積もられる可能性がある。すなわち、マトリクス中の核酸プローブ密度と、ハイブリッド量の双方を、確度よく把握することが、実際の検体に含有される、標的核酸の濃度を正確に知る際に必要となる。
【０００６】
また、実際にどのようなマトリクス形状（形状、サイズ、状態）で存在するかを知ること（イメージング）も、やはり、定量性、再現性の確保といった見地から重要である。さらに、後述するように、チップ作製に利用される基板に、マトリクスの位置を明示するための物理的アドレスを設けていない場合、例えば、インクジェット法によってプローブ溶液を微小な液滴として供給するような手法でバイオチップを作製した際、物理的アドレスがないため、検出の手段によっては、バイオチップ上のどのプローブ部分を分析しているか、判断に迷うという問題をかかえることにもなる。その場合、採用している検出手段そのものが、マトリクス位置の顕影化を可能とするものであることが必要となる。
【０００７】
しかし、バイオチップ上のプローブは、原理的には単分子膜レベルとされており、基本的に、マトリクス位置の顕影化を含めた生体関連物質の分析には、きわめて高感度な表面解析技術が必要となる。
【０００８】
前記の要件を満足する高感度な表面解析技術の一つとして、プローブ自体にアイソトープラベルを施す方法が知られてはいるが、ラベル化の手法が煩雑であり、利用されるアイソトープラベル自体、被爆源となる危険性を有し、そのため、特殊な施設、装置が必要等の理由で、汎用性の観点で難点を有している。
【０００９】
別の方法として、プローブを蛍光標識する方法、または、プローブと特異的に結合する物質に蛍光標識を施し、これとプローブを結合させる方法、すなわち、ＤＮＡチップにおいては、蛍光ハイブリダイゼーション法が考えられる。しかしながら、標識に利用する蛍光色素の安定性、蛍光クエンチング、あるいは、蛍光色素の基板表面への非特異的吸着、さらには、特異的結合（ハイブリダイゼーション）の定量性（安定性、再現性）等、高い定量性を達成する上では、種々の問題が存在しており、プローブ自体の存在量を定量的に把握するには、なお課題が残る。
【００１０】
その他、一般的な検出対象に利用可能な高感度表面分析手段として、ＦＴ−ＩＲ（フーリエ変換赤外分光）法を用いたＡＴＲ法、ＸＰＳ（Ｘ線光電子分光）法等があるが、いずれも、生体関連物質である、核酸チップの核酸プローブ自体の定量的分析、核酸チップ上に形成されているハイブリッド体の定量的分析、あるいは、イメージングには十分な感度を有しているとはいえない。特に、核酸チップの作製用基板として、一般的なガラスを用いる場合には、例えば、ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）法では、基板のガラス自体に起因する吸収の影響、また、ＸＰＳ法では、ガラス自体は絶縁性材料であるため、チャージアップの影響等があり、有効な分析手段とはいえない。
【００１１】
さらに、他の高感度表面分析手段としては、動的二次イオン質量分析法（ｄｙｎａｍｉｃ−ＳＩＭＳ）があるが、この手法では、二次イオンを生成する過程で、有機化合物を小さいフラグメントイオン、または粒子にまで分解している。そのため、質量スペクトルから得られる化学構造情報は多くなく、例えば、構成する塩基は共通した四種しかない核酸関連物質のような有機物の分析には、得られる情報は不十分であり、汎用的に利用するには適していない。
【００１２】
これに対して、同じく二次イオン質量分析法の一手法として知られている、飛行時間型二次イオン質量分析（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）法は、固体試料の最表面にどのような原子または分子が存在するかを調べるための分析方法であり、下記する特長を持つ。すなわち、１０９ａｔｏｍｓ／ｃｍ２（最表面１原子層の１／１０５に相当する量）の極微量成分の検出能があること、有機物、無機物のどちらにも適用できること、表面に存在するすべての元素や化合物を測定できること、試料表面に存在する物質からの二次イオンのイメージングが可能なことである。
【００１３】
以下に、この飛行時間型二次イオン質量分析法の原理を簡単に説明する。
【００１４】
高真空中において、高速のイオンビーム（一次イオン）を固体試料表面に照射すると、スパッタリング現象によって表面の構成成分が真空中に放出される。この過程で発生する正または負の電荷を帯びたイオン（二次イオン）を、電場によって一方向に収束し、一定距離だけ離れた位置で検出する。スパッタの際には、試料表面の組成に応じて、様々な質量をもった二次イオンが発生するが、一定の電界中では、質量の軽いイオンほど早く、反対に重いイオンほど遅い速度で飛行する。そのため、二次イオンが発生してから、検出器に到達するまでの時間（飛行時間）を測定することで、発生した二次イオンの質量を分析することができる。
【００１５】
一方、ｄｙｎａｍｉｃ−ＳＩＭＳ法では、既に述べたように、イオン化の際、有機化合物は小さいフラグメントイオンまたは粒子にまで分解してしまうため、質量スペクトルから得られる化学構造情報、例えば、質量範囲は限定されるのに対し、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法では、一次イオン照射量が著しく少ないため、有機化合物は化学構造を保った状態でイオン化され、幅の広い質量範囲で測定される質量スペクトルから有機化合物の構造をより直接的に知ることができる。加えて、固体試料表面の最も外側で発生した二次イオンのみが、真空中へ放出されるので、試料の最表面（深さ数Å程度）の情報を、選択的に得ることができる。
【００１６】
前記測定原理を採用するＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置には、大きく分けて、セクター型とリフレクトロン型のふたつのタイプがある。この二方式間の違いの一つは、被分析試料を固定するホルダの電気的な接地方法である。セクター型では、装置の機構上、固定ホルダに数ｋＶの正または負の電圧を印加することで、発生した二次イオンを質量分析計に導いているのに対し、リフレクトロン型では、固定ホルダは接地し、二次イオン引き出し電極に数ｋＶから数１０ｋＶの正または負の電圧を印加することで、二次イオンを質量分析計に導いている。
【００１７】
ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法では、正の一次イオンが多用されるが、一次イオンの極性にかかわらず正の二次イオンと負の二次イオンが発生する。また、一次イオンの極性に依らず、一般的な測定条件では、一次イオンの照射により二次電子が発生し、二次電子の発生量は一次イオン量に比べて多量であるために、結果として、被分析試料の表面は正に帯電し易く、この帯電電荷が過剰（所謂、チャージアップ状態）になると、定量的な測定に支障をきたすことになる。このチャージアップに関して、装置構成を考えると、セクター型装置を用いて、絶縁物の負の二次イオンを測定する場合に、最も大きく正に帯電し得るといえる（発生した二次電子がすべて、上記の正電圧を印加した二次イオン引き出し電極に向かってしまうため）。
【００１８】
上記チャージアップの正帯電を中和するため、セクター型、リフレクトロン型の両タイプとも、帯電中和用のパルス型電子銃を装備することが多い。このパルス型電子銃による、具体的な帯電中和方法は、一次イオン（サブ〜数ｎｓｅｃパルス）照射、正または負の二次イオンの飛行時間計測を行った後、次の一次イオンパルスを照射するまでの間に、上記パルス型電子銃からの電子線を被分析試料に一定時間照射する工程を設けるものである。なお、パルス型電子線から電子線を被分析試料に照射する間は、セクター型においては、試料ホルダへの電圧印加、また、リフレクトロン型においては、二次イオン引き出し電極への電圧印加はともに停止され、それぞれ接地される。
【００１９】
この帯電中和方法により、チャージアップした正帯電は緩和され（若しくは解消し）、絶縁物の分析が可能となることが多い。なお、セクター型装置を使った絶縁物の測定で、負の二次イオンを測定する場合に、最も大きく正に帯電し易いため、帯電中和のマージンは、この測定形態が最も狭い。いずれにしても、チャージアップを回避するには、常時、試料ホルダが電気的に接地されているリフレクトロン型装置を使う方が、セクター型装置を使うよりも（一般的には）有利である。特に、被分析試料の導電率が低い場合（抵抗率が高い、もしくは、誘電率が高いと言い換えることができる）、例えば、ガラス等の場合には、リフレクトロン型装置の方が、定量的な測定に適しているといえる。
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】
さて、リフレクトロン型であれ、セクター型であれ、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法は、極めて感度の高い分析方法であるため、チャージアップの影響が少ない被分析試料、例えば、導電性に優れた金基板上に単分子膜レベルで形成されたオリゴヌクレオチドを分析することが可能である（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　１２ｔｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　Ｉｏｎ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ　９５１，　１９９９）。該文献には、基板上に固定化されたＤＮＡ、および、ＰＮＡのＴＯＦ−ＳＩＭＳ法による分析結果が報告されており、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法によって検出されるフラグメントイオンとして、ＤＮＡプローブの場合には、リン酸バックボーン由来のＰＯ２−とＰＯ３−イオン、塩基由来の（チミン−Ｈ）−イオン、また、ＰＮＡプローブの場合には、やはり（チミン−Ｈ）−イオンを、検出した事例が挙げられている。
【００２１】
しかしながら、上述のＴＯＦ−ＳＩＭＳ法を検出手段として、一般的に用いられている方法であるＤＮＡチップを用いて、標的ＤＮＡを検出することにより、所望の遺伝子情報を得ようとすると、
（１）ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法は表面近傍のごく薄い層のみが検出されること、
（２）プローブＤＮＡと標的ＤＮＡから生起するフラグメントイオン種が同一である、という二つの理由により、標的ＤＮＡとのハイブリッド体の有無を特異的に検出することが困難であるという問題を生ずることになる。
【００２２】
この課題は、例えば、ＤＮＡチップの場合、プローブ形成後と、ハイブリッド形成後に、それぞれ、チップを分析すれば、ハイブリッド形成に付随して、検出されるフラグメントイオンの増強を把握することにより、ある程度は解決できる可能性がある。但し、本質的に検出されるフラグメントイオンが同一であるため、量的な分析における曖昧さを完全に克服することはできない。加えて、分析を二度にわたって実施しなければならないという操作上の手間、さらに、一旦プローブチップを分析環境（超高真空）下におくことに伴い、ハイブリダイゼーションによる標的ＤＮＡの検出に先立ち、核酸プローブにダメージを与える可能性があり、この二つの問題が、新たに生起することになる。
【００２３】
上述する問題を回避する手段の一つとして、プローブとして、ＰＮＡ（ペプチド核酸）を固相に結合して、標的核酸とハイブリッド体を形成させる方法がある（Ｊ．　Ｃ．　Ｆｅｌｄｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ：ＳＩＭＳ　ＸＩＩＩ国際会議；　２００１年１１月１１日〜１６日、奈良）。この方法を採用すると、プローブに利用するペプチド核酸は、塩基部分はＤＮＡと同じではあるが、リン酸バックボーンを持たないので、標的核酸のリン酸バックボーンに由来するフラグメントイオンを検出することで、ＰＮＡプローブと標的核酸とのハイブリッド形成の確認を行うことが可能となる。
【００２４】
しかしながら、ＤＮＡと比較して、ペプチド核酸自体、作製に要する費用は高いため、ペプチド核酸をプローブとしたチップを利用して、遺伝子情報の取得に要するコストは高いものとなり、実用的な観点では、大きな難点となる。また、各プローブ、および、各標的物資の分子量、鎖長等は必ずしも同じではなく、前記のリン酸バックボーンに由来するフラグメントイオン、ペプチド鎖バックボーンに由来するフラグメントイオンの相違のみを利用する手法では、定量性の観点でも、本質的な課題を残すことになる。
【００２５】
従って、プローブと標的核酸とのハイブリッド体を形成した状態でも、その検出効率が優れ、同時に定量的な検出が可能なフラグメントイオンを供出可能なプローブ核酸の標識方法が望まれていた。
【００２６】
検出効率が優れたフラグメントイオンの供出方法に関連して、特開昭６１−１１６６５号公報には、電気泳動法、液体クロマトグラフィー法、高速ゲルろ過法により分子量分離した核酸断片に、Ｓ、Ｂｒ、Ｉ、等の非金属元素、または、Ａｇ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｏｓ、Ｈｇ等の金属元素を導入して、これらの元素を原子吸光分析法、プラズマ発光分析法、または、質量分析法によって同定する手段を設けた核酸塩基検出装置に関する記載がなされている。但し、前記の手法を実施する際に利用される、質量分析装置に関する具体的な記載、さらには、特に、ハロゲン原子の核酸への導入方法に関する記載は含まれていない。
【００２７】
一方、チップ上の核酸ハイブリッド体の量的把握を別の観点からみると、実際に核酸プローブ領域として形成されているマトリクス自体の存在位置を、分析により決定する必要もある。例えば、特開平１１−１８７９００号公報に記載されているＤＮＡチップの作製方法、すなわち、予め合成されたＤＮＡプローブの溶液をインクジェット法で基板表面へ吐出、結合させる方法を採用する際、基板として、作製されているマトリクス（吐出されたＤＮＡが結合されたスポット）の位置を示す位置マーカーを設けていない汎用の基板を利用する場合がある。そのような位置マーカーを設けていない基板を利用する場合には、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法によって、ＤＮＡプローブのスポット位置をイメージングしつつ、同時に、イメージングされたスポットにおけるフラグメントイオンの分析を行うことが望ましい。しかしながら、上記特開平１１−１８７９００号公報には、ＤＮＡプローブのスポット位置をイメージングすることの必要性を想起させる記載はなく、また、特開昭６１−１１６６５号公報には、核酸分子に標識した元素を利用する質量分析法には言及しているが、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法に応用して、チップ上でのハイブリッド体のイメージング方法と標的核酸の量的分析に関しては全く記載されていない。
【００２８】
さて、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法により核酸チップのイメージングと、核酸チップ上の核酸（ハイブリッド体を含む））の量的分析を行おうとした際、スポットのサイズ、あるいは、検出効率等を勘案すると、イメージングされるエリアの面積は、例えば、３００μｍ×３００μｍ以上が望ましいが、ＤＮＡチップの作製に利用する基板として、汎用されるガラス等の比較的抵抗率の高い基板を用いる際、３００μｍ×３００μｍの範囲を、一次イオンビーム直径を必要な解像度を得るため、一次イオンビームの照射スポットを５μｍとし、テレビ受像機の走査線のように、一定の方向にビームを順次スキャン（ラスタースキャン）し、二次元的画像を得ようとすると、チャージアップの影響が大きく、良好な画像を得ることができないことになる。
【００２９】
本発明は前記の課題を解決するものであり、本発明の目的は、複数の核酸プローブが基板上にマトリクス状に配置された核酸チップ、特には、比較的抵抗率の高い基板を利用する核酸チップにおいて、核酸プローブに対して、その標的核酸がハイブリダイゼーションしたハイブリッド体を構成した状態とした上で、核酸プローブと標的核酸とを同時にＴＯＦ−ＳＩＭＳ法を用いて分析する際、核酸プローブと標的核酸とを明確に弁別して、量的把握を行うことが可能で、さらには、核酸チップ上の比較的面積の大きな部分について、核酸プローブと標的核酸のハイブリッドの二次元的イメージングを簡便に行うことが可能な分析方法を提供することにある。
【００３０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記の課題を解決すべく鋭意検討を進めたところ、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法を用いて、核酸プローブに対して、その標的核酸がハイブリダイゼーションしたハイブリッド体を構成した状態とした上で、核酸プローブと標的核酸とを同時に分析する際、核酸プローブと標的核酸に、それぞれ異なる物質を用い、一分子当たり、それぞれ既定の数の標識を予め施し、この個々の標識物質に関して、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法を用いて分析することで、比較的抵抗率の高い基板上に核酸プローブが固定された核酸チップ上、比較的面積の大きな部分に対しても、核酸プローブと標的核酸のハイブリッド形成のイメージングと、個々の量的把握を同時に行うことが可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００３１】
すなわち、本発明にかかる核酸チップ上の核酸の分析方法は、
複数の核酸プローブが基板上にマトリクス状に配置された核酸チップの分析方法であって、
前記核酸プローブに対して、その標的核酸がハイブリダイゼーションしたハイブリッド体を構成した状態とした上で、核酸プローブと標的核酸とを同時に分析する際、
前記核酸プローブと前記標的核酸は、それぞれ既定の数の、異なる物質で予め標識し、
飛行時間型二次イオン質量分析法により、個々の標識物質を分析することを介して、標識された核酸プローブと、標識された標的核酸の分析を行うことを特徴とする核酸チップ上の核酸の分析方法である。その際、前記標識物質は、
核酸プローブ、および、標的核酸を構成する物質ではないことが好ましい。より具体的には、前記標識物質として、
核酸プローブ、および、標的核酸を構成する物質に由来する二次イオンと明確に区別される二次イオンを発生できる物質を選択することが好ましい。
【００３２】
また、本発明の方法では、該飛行時間型二次イオン質量分析法による分析は、個々の標識物質の量的な分析である形態とすることができる。また、該飛行時間型二次イオン質量分析法による分析に際し、
一次イオンの照射は、前記核酸チップ表面の特定の面積を有する測定領域に対して、その測定領域の面積と比較して、相対的に小さな面積を有する照射スポットとして、順次パルス的に照射して、
該パルス的な一次イオン照射によって発生する二次イオンを、それぞれのパルス照射毎に飛行時間的に質量分析する測定法を選択することが可能である。その際、前記パルス的な一次イオン照射において、
照射スポット位置を、非連続的パターンに基づいて、順次移行させ、
それぞれのパルス照射毎に測定される、発生された二次イオンの質量分析の結果を、前記一次イオンの照射スポット位置パターンに基づいて、再構成して二次元的画像化を行うこともできる。なお、前記非連続的パターンは、
ランダムなパターンであることが好ましい。あるいは、前記非連続的パターンは、
特定のプログラムされたパターンであることも好ましい。
【００３３】
本発明の方法においては、前記核酸プローブと前記標的核酸とをそれぞれ標識する、各標識物質の既定の数は、標識物質、標識方法に応じて適宜選択されるものである。核酸プローブと標的核酸のハイブリッド形成を阻害しない範囲に、各標識物質の既定の数を選択することが望ましい。ハイブリッド形成を阻害しない形態の標識物質、標識方法を利用できる際には、
核酸プローブ、ならびに、標的核酸の各一分子当たり、
少なくとも１以上で、各核酸を構成する塩基鎖長を超えない範囲に選択することができる。なかでも、これら核酸が合成オリゴヌクレオチドである際には、各標識物質の既定の数は、
核酸プローブ、ならびに、標的核酸の各一分子当たり、１〜５個の範囲に選択されることが望ましい。
【００３４】
本発明の方法においては、前記核酸プローブと前記標的核酸とをそれぞれ標識する、各標識物質は、
互いに異なるハロゲン原子を選択することができる。この場合、各標識物質に選択される前記ハロゲン原子は、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素から選択される二種である。例えば、各標識物質に選択される前記ハロゲン原子は、
前記核酸プローブならびに前記標的核酸を構成するヌクレオチドの塩基に結合されている形態とすることが好ましい。その際、前記核酸プローブならびに前記標的核酸を構成するヌクレオチドの塩基に結合されているハロゲン原子は、
核酸プローブ、ならびに、標的核酸それぞれと、相補的な塩基配列を有する核酸とのハイブリッド形成の阻害を誘起しない、ヌクレオチド塩基上の位置に結合されていることがより好ましい。そのためには、各標識物質に選択される前記ハロゲン原子は、
ピリミジン塩基の５位、あるいは、プリン塩基の８位のいずれかに結合されていることがさらに好ましい。
【００３５】
例えば、前記核酸プローブまたは前記標的核酸は、少なくとも、合成ＤＮＡ鎖部分を有し、
各標識物質に選択される前記ハロゲン原子の導入は、前記合成ＤＮＡ鎖部分になされ、
該合成ＤＮＡ鎖部分をＤＮＡ自動合成装置で合成する際、使用される複数種の核酸塩基用合成ユニットの少なくとも一つに、該ハロゲン原子が前記核酸塩基上の修飾部位に結合した２’−デオキシリボヌクレオシド−３’−フォスフォロアミダイト型合成ユニットを選択することで、該ハロゲン原子の導入がなされている形態を選択することができる。その際、前記ハロゲン原子が核酸塩基上の修飾部位に結合した２’−デオキシリボヌクレオシド−３’−フォスフォロアミダイト型合成ユニットは、下記の４種の構造式のいずれかで示される合成ユニットの群から選択されることが好ましい。
【００３６】
【化２】
2004037123.tif 000002
【００３７】
（式中、Ｘは、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、
ＤＭＴＯは、ジメトキシトリチル基、
ｉＰｒは、イソプロピル基、
ＣＮＥｔは、２−シアノエチル基を、それぞれ表す。）
あるいは、前記核酸プローブまたは前記標的核酸は、少なくとも、合成ＲＮＡ鎖部分を有し、
各標識物質に選択される前記ハロゲン原子の導入は、前記合成ＲＮＡ鎖部分になされ、
該合成ＲＮＡ鎖部分をＲＮＡ自動合成装置で合成する際、
使用される複数種の核酸塩基用合成ユニットの少なくとも一つに、該ハロゲン原子が前記核酸塩基上の修飾部位に結合したリボヌクレオシド−３’−フォスフォロアミダイト型合成ユニットを選択することで、該ハロゲン原子の導入がなされている形態を選択することができる。また、前記核酸プローブまたは前記標的核酸は、少なくとも、合成ＰＮＡ鎖部分を有し、
各標識物質に選択される前記ハロゲン原子の導入は、前記合成ＰＮＡ鎖部分になされ、
該合成ＰＮＡ鎖部分をＰＮＡ自動合成装置で合成する際、
使用される複数種の核酸塩基用合成ユニットの少なくとも一つに、該ハロゲン原子が前記核酸塩基上の修飾部位に結合した核酸塩基結合ペプチドアナログ型合成ユニットを選択することで、該ハロゲン原子の導入がなされている形態を選択することもできる。さらには、前記核酸プローブまたは前記標的核酸は、ＲＮＡを鋳型として調製されるｃＤＮＡであり、
各標識物質に選択される前記ハロゲン原子の導入は、鋳型のＲＮＡに基づき、ＤＮＡプライマーを用いて、逆転写酵素による伸展合成される該ｃＤＮＡの塩基鎖部になされ、
該逆転写酵素による伸展合成の際、
使用される複数種の核酸塩基の三リン酸ユニットの少なくとも一つに、該ハロゲン原子が前記核酸塩基上の修飾部位に結合した２’−デオキシリボヌクレオシド−５’−三リン酸ユニットを選択することで、該ハロゲン原子の導入がなされている形態を選択してもよい。あるいは、前記核酸プローブまたは前記標的核酸は、ゲノムＤＮＡを鋳型として誘導調製されるＤＮＡ断片であり、
各標識物質に選択される前記ハロゲン原子の導入は、鋳型のゲノムＤＮＡに基づき、ＤＮＡプライマーを用いて、ＤＮＡポリメレースによる伸展合成される該ＤＮＡ断片の塩基鎖部になされ、
該ＤＮＡポリメレースによる伸展合成の際、
使用される複数種の核酸塩基の三リン酸ユニットの少なくとも一つに、該ハロゲン原子が前記核酸塩基上の修飾部位に結合した２’−デオキシリボヌクレオシド−５’−三リン酸ユニットを選択することで、該ハロゲン原子の導入がなされている形態を選択してもよい。同様に、前記核酸プローブまたは前記標的核酸は、ゲノムＤＮＡを鋳型として誘導調製されるｃＲＮＡであり、
各標識物質に選択される前記ハロゲン原子の導入は、鋳型のゲノムＤＮＡに基づき、プライマーを用いて、ＲＮＡポリメレースによる伸展合成される該ｃＲＮの塩基鎖部になされ、
該ＲＮＡポリメレースによる伸展合成の際、
使用される複数種の核酸塩基の三リン酸ユニットの少なくとも一つに、該ハロゲン原子が前記核酸塩基上の修飾部位に結合したリボヌクレオシド−５’−三リン酸ユニットを選択することで、該ハロゲン原子の導入がなされている形態を選択してもよい。
【００３８】
その他、本発明の方法においては、前記核酸プローブと前記標的核酸とをそれぞれ標識する、各標識物質の少なくとも一つは、
金属、または、金属化合物のいずれかから選択されることも可能である。その際、前記金属、または、金属化合物中の金属元素は、
Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ａｌ、Ｔａ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｚｎ、Ｓｎ、Ｒｕ、Ｒｈからなる群から選択されることが好ましい。また、前記金属化合物は、有機金属錯体であることがより好ましい。その場合には、前記有機金属錯体は、
Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ａｌ、Ｔａ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｚｎ、Ｓｎ、Ｒｕ、Ｒｈからなる群から選択される金属元素を含む錯体であることがより好ましい。
【００３９】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明について、より詳細に説明する。
【００４０】
本発明の分析方法は、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法を用いて、上記ハイブリッド形成時のイメージングと、量的分析を行うにあたり、プローブ核酸と、標的核酸を、それぞれ既定の数の、異なる物質で標識し、該異なる物質のフラグメントイオンをＴＯＦ−ＳＩＭＳ法によって検出、分析することを特長とする。
【００４１】
その際、利用する標識物質が、プローブ核酸、および、標的核酸を構成する物質、核酸などの構成要素と異なっていれば、標識物質に由来する二次イオンと核酸に起因するフラグメントイオと明確に分別可能であるので好ましい。
【００４２】
また、プローブ核酸と、標的核酸の、それぞれの標識物質の数が既定の数であることにより、それぞれの核酸を量的に把握することが可能となる。
【００４３】
本発明では核酸チップのイメージング方法として、一次イオンを、該核酸チップ表面の特定の面積を有する部分に対して、該面積に対して相対的に小さな面積を有するスポットとしてパルス的に順次照射して、該パルス照射によって発生する二次イオンを、それぞれのパルス照射ごとに飛行時間的に質量分析する方法を用いるが、その際、チャージアップの影響を排除する方法として、一次イオンのパルス照射を、非連続的パターンに基づいて行い、得られたそれぞれの質量分析の結果を、一次パルス照射のパターンに基づいて再構成して画像化することが極めて有効で望ましい形態である。
【００４４】
その場合、非連続的パターンとして、ランダムなパターン、あるいは、非連続的なパターンを例としてあげることができる。
【００４５】
標識物質としては、限定的ではないが、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン原子を例にあげることができる。
【００４６】
ハロゲン原子はイオン化効率が比較的高いので、その二次イオンを用いての検出の感度の向上が期待できるとともに、一次イオン強度を低減することによりチャージアップの影響も、その分排除でき、後述する方法と合わせて、抵抗率の高い基板上での大面積のイメージングが可能となる。
【００４７】
ハロゲン原子による標識数に関しては、特に限定されず、標識の位置、標識方法も、それが可能であり、後の核酸プローブと標的核酸とのハイブリッド形成（ハイブリダイゼーション）を阻害しければ、いかような方法も可能である。実際には、ひとつのヌクレオチドに対し一個所の標識が現実的であり、その意味では、ハロゲン原子による標識を用いる際、標識の既定の数は、１から上記標的核酸のヌクレオチド数までのいずれかであることが望ましく、例えば、核酸が合成オリゴヌクレオチドの場合には、標識の手間、コスト、また、ハロゲン原子のイオン化効率の高さ等を勘案して、１〜５個であれば、さらに望ましいといえる。
【００４８】
また、ＰＣＲ法のように酵素的伸長反応を利用して、標識の導入を図ろうとする場合、標識が蛍光色素のように比較的大きな分子の場合には、立体障害等により、標識の導入数には上限がある。一方、標識がハロゲン原子である場合は、顕著な立体障害を引き起こすこともなく、例えば、伸長反応に用いる核酸塩基ユニットとして、ハロゲン修飾体を用いると、伸長産物において、一種類の塩基（例えばアデニン）を全て標識することも可能である。従って、標識にハロゲン原子を選択する場合は、標識数を定量的に把握できるとともに、感度、標識導入方法の点からも望ましいといえる。
【００４９】
ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法を用いる際には、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素原子の各二次イオンは、高い感度で検出可能であり、また、後述の方法によれば、標的核酸にも、上記４種のハロゲン原子を導入可能なので、本発明には、これらのハロゲン原子が利用できる。
【００５０】
ハロゲン原子の標的核酸への導入方法についても、特に限定されないが、よく知られている例としては、ハロゲン原子を標的核酸のヌクレオチドの塩基に結合させる方法をあげることができる。本発明でも、この方法を好適に用いることができる。その際、ハロゲン原子が標的核酸の、該標的核酸がプローブ核酸とハイブリッドを形成する際に、該ハイブリッド形成を阻害しない位置に結合していることが望ましい。そのような修飾位置は、ピリミジン塩基の５位、プリン塩基の８位である。ただし、標的核酸の全てのヌクレオチド塩基のハロゲン原子がこの位置に結合していることは必ずしも必須ではない。
【００５１】
ハロゲン原子の標的核酸への導入のより具体的な方法としては、標的核酸が合成ＤＮＡの場合、ＤＮＡをＤＮＡ自動合成装置で合成する際に、ハロゲン原子を結合した合成ユニット、すなわち、以下に構造式で示す２’−デオキシリボヌクレオシド−３’−フォスフォロアミダイトを用いる方法を例としてあげることができる。
【００５２】
【化３】
2004037123.tif 000003
【００５３】
（式中、Ｘは、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、
ＤＭＴＯは、ジメトキシトリチル基、
ｉＰｒは、イソプロピル基、
ＣＮＥｔは、２−シアノエチル基を、それぞれ表す。）
また、核酸プローブが合成ＲＮＡの場合には、ＲＮＡをＲＮＡ自動合成装置で合成する際に、ハロゲン原子を結合した合成ユニット、すなわち、リボヌクレオシド−３’−フォスフォロアミダイトを用いればよく、そのような合成ユニットの例として、以下に構造式の化合物をあげることができる。
【００５４】
【化４】
2004037123.tif 000004
【００５５】
（式中、Ｘは、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、
ＤＭＴＯは、ジメトキシトリチル基、
ｉＰｒは、イソプロピル基、
ＣＮＥｔは、２−シアノエチル基
Ｍｅは、メチル基、
ＴＢＤＭＳは、ｔ−ブチルジメトキシシリル基を、それぞれ表す。）
さらに、核酸プローブが合成ＰＮＡの場合では、ＰＮＡをＰＮＡ自動合成装置で合成する際に、ハロゲン原子を結合した合成ユニット、すなわち、核酸塩基結合ペプチドアナログを用いれば好適である。
【００５６】
また、標的核酸がｃＤＮＡの場合には、ｃＤＮＡを逆転写酵素によって伸展合成する際に、ハロゲン原子を結合した２’−デオキシリボヌクレオシド−５’−三リン酸を用いる方法がハロゲン原子導入法の例としてあげることができる。
【００５７】
標的核酸がゲノムＤＮＡから誘導されたＤＮＡの場合には、ハロゲン原子の該ＤＮＡへの導入が、該ＤＮＡをＤＮＡポリメレースによって伸展合成する際に、ハロゲン原子を結合した２’−デオキシリボヌクレオシド−５’−三リン酸を用いる方法を例としてあげることができ、標的核酸がｃＲＮＡの場合には、ハロゲン原子の該ｃＲＮＡへの導入が該ｃＲＮＡをＲＮＡポリメレースによって伸展合成する際に、ハロゲン原子を結合したリボヌクレオシド−５’−三リン酸を用いて行うことができる。
【００５８】
加えて、上記の各鎖の伸展反応には、ＰＣＲ反応、またはＲＴ‐ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）反応を用いることも可能である。
【００５９】
本発明が対象とする核酸チップのプローブ核酸種は、特に限定されるものではなく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）、ｃＲＮＡ（コンプリメンタリーＲＮＡ）、オリゴデオキシヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド等を用いることができる。
【００６０】
本発明の分析方法に利用可能な標識物質の他の例として、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ａｌ、Ｔａ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｚｎ、Ｓｎ、Ｒｕ、Ｒｈ等の金属、または、これらの錯体、有機（金属）錯体をあげることができる。有機金属錯体の核酸への導入法方法は、例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｖｏｌ．　２６２，　１０２５，　１９９３に記載されている方法を採用することができる。
【００６１】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。なお、これら実施例は本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるものの、本発明はかかる形態に限定されるものではない。
【００６２】
（実施例１）
核酸プローブアレイの作製
特開２００１−０６６３０５号公報に開示した方法で、ガラス基板を利用する核酸プローブアレイを作製した。
【００６３】
（１）基板洗浄
２５．４ｍｍ×２５．４ｍｍ×１ｍｍの合成石英基板をラックに入れ、純水で１０％に稀釈した超音波洗浄用洗剤（ブランソン：ＧＰＩＩＩ）に一晩浸した。その後、該洗剤中で２０分間超音波洗浄を行い、その後、水洗により洗剤を除去した。純水ですすいだ後、純水の入った容器中でさらに超音波処理を２０分間行った。次に、予め８０℃に加温した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に、この基板を１０分間浸した。引き続き水洗、純水洗浄を行って、そのまま乾燥せず、洗浄済基板として、次工程に供した。
【００６４】
（２）表面処理
アミノ基を結合したシランカップリング剤、Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン　ＫＢＭ６０３（信越化学工業）の１ｗｔ％水溶液を室温下で２時間攪拌し、該シラン化合物の分子内のメトキシ基を加水分解した。この溶液に、上記（１）で得た洗浄済基板を室温で１時間浸漬した後、純水で洗浄し、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に、基板を１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークして、最終的に基板表面にアミノ基を導入した。
【００６５】
次いで、Ｎ−マレイミドカプロイロキシスクシンイミド（同仁化学研究所：以下、ＥＭＣＳ）２．７ｍｇを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／エタノールの１：１（容量比）溶液に濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなる様に溶解した。前記シランカップリング処理を行った石英基板を、このＥＭＣＳ溶液中に室温で２時間浸漬して、シランカップリング処理によって基板表面に導入されているアミノ基と、ＥＭＣＳのスクシイミド基を反応させた。この反応に伴い、基板表面にはＥＭＣＳ由来のマレイミド基が存在することになる。ＥＭＣＳ溶液から引き上げた基板は、前記ＤＭＳＯ／エタノール混合溶媒、及びエタノールで順次洗浄した後、窒素ガスを吹き付けて乾燥させた。
【００６６】
（３）プローブＤＮＡの合成
ＤＮＡ合成業者（ベックス）に依頼し、４０塩基長となる、配列番号１の一本鎖核酸（ｄＴの３５量体に対し、その３’末端側に５−フルオロ−３’−デオキシウリジン：Ｕ（Ｆ）が５個連結されたもの）を合成した。なお、配列番号１の一本鎖ＤＮＡの５’末端には、合成時にチオールモディファイア（グレンリサーチ）を用いて、スルファニル基（ＳＨ）を導入した。ＤＮＡ合成後、脱保護、ＤＮＡの回収は定法により行い、また、精製には、ＨＰＬＣを用いた。合成から精製までの一連の工程は、すべて合成業者に依頼して行った。
【００６７】
なお、前記３’末端側のＵ（Ｆ）の導入は、下記に構造を示すフォスフォロアミダイト（グレンリサーチ）を用いて行った。
【００６８】
【化５】
2004037123.tif 000005
【００６９】
なお、チミンに代えて導入されている、このＵ（Ｆ）のフッ素置換位置である５位は、ハイブリダイゼーションには影響がないことが知られており、従って、ｄＴの４０量体と同様のハイブリダイゼーション反応を起こす。
配列番号：１
５’ＨＳ−（ＣＨ２）６−Ｏ−ＰＯ２−Ｏ−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　ＴＴＴＴ　Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｔ　３’
（４）サーマルジェットプリンターによるＤＮＡ吐出、および基板への結合
（３）に記載する配列番号１の一本鎖ＤＮＡを、それぞれ最終濃度１０μＭ、５μＭ、２．５μＭ、１．２５μＭ、０．６２５μＭで、グリセリン７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、アセチレンアルコール（商品名：アセチレノールＥＨ；川研ファインケミカル（株）社製）１ｗｔ％を含む溶液に溶解した。
【００７０】
一方、サーマルジェット法の一種であるバブルジェット法を用いたバブルジェットプリンターＢＪＦ−８５０（キヤノン）用のプリンターヘッドＢＣ−５０（キヤノン）を、数１００μｌの溶液を吐出可能とするべく改造した。この改造を施したヘッドを、平板である石英基板上へ、インク吐出が可能となるよう改造した吐出描画機に搭載した。このヘッドの改造タンク部に、前記ＤＮＡ溶液を数１００μｌ注入し、吐出描画機にＥＭＣＳ処理基板を装着して、ＥＭＣＳ処理表面にスポッティングした。なお、スポッティング時の吐出量は４ｐｌ／ｄｒｏｐｌｅｔで、スポッティングの範囲は、基板の中央部に１０ｍｍ×１０ｍｍの範囲に、２００ｄｐｉ、すなわち、１２７μｍのピッチで吐出した。この条件ではスポッティングされたドットの直径は約５０μｍであった。
【００７１】
スポッティング終了後、基板を３０分間加湿チャンバー内に静置し、基板表面のマレイミド基と、核酸プローブ５’末端のスルファニル基（−ＳＨ）とを反応させ、ＤＮＡプローブを固定させた。次いで、基板を純水で洗浄し、１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０、以下溶液Ａ）中に保存した。ＤＮＡ結合基板（ＤＮＡチップ）は、ＴＯＦ−ＳＩＭＳによる分析直前に窒素ガスを吹き付けて乾燥し、真空デシケーター中でさらに乾燥した。
【００７２】
（実施例２）
ハイブリダイゼーション反応、および、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法によるイメージングと定量的分析
（１）モデル標的核酸の合成
予め、５’末端側の５個アデニン塩基に臭素原子による修飾を施したモデル標識核酸（配列番号：２、ｄＡの４０量体）を、合成業者（ベックス）に依頼して合成した。この５’末端側の５個の臭素修飾塩基は、下に構造を示す、８−ブロモ−３’−デオキシアデノシンフォスフォロアミダイト（グレンリサーチ）を用いて、自動合成機による合成時に導入した。脱保護、ＤＮＡの回収は、定法により行い、また、精製にはＨＰＬＣを用いた。合成から精製までの一連の工程はすべて合成業者に依頼して行った。なお、配列中のＡ（Ｂｒ）が臭素修飾デオキシアデノシンを示す。また、修飾位置であるアデニンの８位は、ハイブリダイゼーションを阻害しない位置であることが知られている。
配列番号：２
５’　Ａ（Ｂｒ）Ａ（Ｂｒ）Ａ（Ｂｒ）Ａ（Ｂｒ）Ａ（Ｂｒ）ＡＡＡＡＡ　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　３’
【００７３】
【化６】
2004037123.tif 000006
【００７４】
（２）ブロッキング、および、ハイブリダイゼーション
実施例１で作製したＤＮＡチップを、２％牛胸腺アルブミン（ＢＳＡ）を含む溶液Ａ中に室温下、３時間浸漬し、チップ表面をブロッキング（核酸等の非特異的吸着を目的とする）し、溶液Ａでリンスした。その後、上記配列番号：２のモデル標的核酸を５０ｎＭの濃度で溶解した溶液Ａに浸漬し、４５℃で１５時間ハイブリダイゼーションを行った。次いで、純水（室温）でリンスした後、窒素ガスを吹き付けて乾燥し、ＴＯＦ−ＳＩＭＳの分析まで真空デシケーター中で保存した。
【００７５】
（３）ＴＯＦ−ＳＩＭＳによる分析
ハイブリダイゼーションを行ったＤＮＡチップのイメージング、および、分析をＩＯＮ　ＴＯＦ社製ＴＯＦ−ＳＩＭＳ　ＩＶ型装置を用いて行った。
【００７６】
以下に、測定に用いた装置、条件をまとめて示す。
【００７７】
＜一次イオン＞
一次イオン：２５ｋＶ　Ｇａ＋、ランダムスキャンモード
一次イオンのパルス周波数：２．５ｋＨｚ（４００μｓｅｃ　／　ｓｈｏｔ）
一次イオンパルス幅：１ｎｓ
一次イオンビーム直径：５μｍ
＜二次イオン＞一次イオンの照射パターンについて再構成しイメージング
二次イオン検出モード：ｎｅｇａｔｉｖｅ
測定領域：３００μｍ×３００μｍ
二次イオンｉｍａｇｅのｐｉｘｅｌ数：１２８×１２８
積算回数：２５６
（４）結果
図１に、（２）でハイブリダイゼーションを行った、核酸プローブ濃度５μＭのＤＮＡ溶液により作製したＤＮＡチップを、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ　ＩＶ型装置で上記条件に基づき分析し、得られたデータに基づき、プローブＤＮＡ由来のフッ素イオンと、標的ＤＮＡ由来の臭素イオンとについて、それぞれ二次元的なイメージングを行った結果を示す。図１−１は、フッ素イオン、図１−２、１−３は、それぞれ、７９Ｂｒ−イオン、８１Ｂｒ−イオンに対するイメージング画像である。
【００７８】
図２に、実施例１に記載する、異なる核酸プローブ濃度のＤＮＡ溶液により作製したＤＮＡチップ５種について、ハイブリダイゼーション後、それぞれ、各チップ上のひとつのスポットにおいて、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ測定で検出される、フッ素イオン、７９Ｂｒ−イオン、８１Ｂｒ−イオンのカウント数を、用いた核酸プローブ濃度に対してプロットしたものである。
【００７９】
図１から、本発明による分析方法により、核酸チップ上の核酸プローブ、および、核酸プローブとハイブリッド体を形成した標的核酸を、それぞれに修飾してある修飾原子を利用することで、ハイブリッド形成後に同時に、かつ、個別にイメージング可能であることが判る。図示しなかったが、イメージを加算することにより、核酸プローブと標的核酸の双方を含むハイブリッド体そのもののイメージングも可能である。また、各核酸分子に由来するリン酸バックボーン由来のフラグメント、核酸塩基由来のフラグメント等も、併せて観察することも可能である。
【００８０】
次に、図２から、ぞれぞれのスポットについて、固定されているプローブ核酸量、および、標的核酸量に関して、同時に、かつ、個別な量的把握が可能であることが判る。
【００８１】
（実施例３）
標的ＤＮＡ濃度に相違がある検体によるハイブリダイゼーションのイメージング、および、量的分析
実施例１に記載する、プローブ核酸濃度１０μＭのＤＮＡ溶液で作製したＤＮＡチップに対して、同じく実施例２に記載する臭素修飾の標的ＤＮＡを、５００ｎＭ、５０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、０．２ｎＭの濃度で含有する条件で、それぞれハイブリダイゼーションを行い、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法によるイメージングと量的分析をおこなった。
【００８２】
図３に、量的分析結果に基づき、標的ＤＮＡ濃度に対して、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ測定で検出される、フッ素イオン、７９Ｂｒ−イオン、８１Ｂｒ−イオンのカウント数をプロットした結果を示す。図３から、ＤＮＡチップ上のプローブ濃度（フッ素イオンのカウント数）は、各基板についてほぼ一定であり、一方、用いた標的核酸濃度に従って、ハイブリッド体の量が変化することが、臭素イオンのカウント数から量的に把握可能であることがわかる。
【００８３】
（実施例４）
ゲノム由来の標的ＤＮＡに対するハイブリダイゼーション後のイメージング、および、量的分析：モデル系
（１）ゲノム由来の標的ＤＮＡ検出用核酸チップの作製
Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ．　１８，　４３８，　２０００には、ヒト口腔扁平上皮癌の二つのセルライン、ＨＳＣ４とＨＳＣ５における、ゲノムＤＮＡのエキソン７の変異を検出するため、オリゴヌクレオチド・チップの作製と、このＤＮＡチップを用いて、該エキソン７から誘導された蛍光標識ｃＤＮＡの検出に関して記載されている。
【００８４】
本実施例では、この文献に記載する検出方法に準じて、フッ素標識を施したオリゴヌクレオチド・チップを作製し、また、臭素標識を施したモデル標的オリゴヌクレオチドを合成し、両者のハイブリダイゼーションを行った。
【００８５】
以下に、具体的な手順について述べる。
【００８６】
（１）　フッ素標識ＤＮＡプローブの合成と、ＤＮＡチップの作製
フッ素標識核酸プローブとして、上記ＨＳＣ４のエキソン７に含まれる塩基配列の一部（コドンＮｏ．２４８を含む部分）に相補的な塩基配列を有し、５’末端に基板への結合のためのスルファニル基を導入し、また、チミンに代えて、フッ素標識デオキシウリジンを計５個結合した、配列番号：３のＤＮＡを、実施例１に記載すると同様の合成法で作製した。さらに、この配列番号：３のＤＮＡを用いて、実施例１と同様の手順でＤＮＡチップを作製した。なお、チップ作製時に用いる溶液中のプローブＤＮＡ濃度は１０μＭとした。
配列番号：３
５’　ＨＳ−（ＣＨ２）６−Ｏ−ＰＯ２−Ｏ−ＧＡＵ（Ｆ）ＧＧＧＣＣＵ（Ｆ）ＣＣＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＣＡＵ（Ｆ）Ｇ　３’
（２）　ゲノム由来の臭素標識モデル標的ＤＮＡの合成と、ハイブリダイゼーション
臭素標識モデル標的ＤＮＡとして、配列番号：３のＤＮＡの塩基配列と相補的な配列を有し、アデノシンに代えて、臭素修飾デオキシアデノシンを合計５個結合した、配列番号：４の標識モデルＤＮＡを、実施例２に記載すると同様の合成法で作製した。この臭素標識モデル標的ＤＮＡと（１）に記載のＤＮＡチップを、同じく実施例２と同様のハイブリダイゼーション条件（標的ＤＮＡ濃度５０ｎＭ）においた。その後、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法による分析を行った。
配列番号：４
３’　ＣＴＡ（Ｂｒ）ＣＣＣＧＧＡ（Ｂｒ）ＧＧＣＣＡ（Ｂｒ）Ａ（Ｂｒ）ＧＴＡ（Ｂｒ）Ｃ　５’
（３）　ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法によるイメージングと、量的分析
実施例２と同様な条件で、ブロッキング、および、ハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイゼーション後のＤＮＡチップのＴＯＦ−ＳＩＭＳでのイメージング、および、量的分析を行った。
【００８７】
表１に、量的分析結果で得られた、フッ素イオン、７９Ｂｒ−イオン、８１Ｂｒ−イオンのカウント数データを示す。
【００８８】
【表１】
2004037123.tif 000007
【００８９】
表１に示す結果は、実施例２、および、実施例３の同じハイブリダイゼーション、分析条件における分析結果と、ほぼ同様の結果を示しており、本発明の分析方法により、実際のプローブＤＮＡ、および、標的ＤＮＡと同様に、４種の塩基が混合した塩基配列のセットに関しても、それぞれ、別個のハロゲン標識を施すことにより、プローブＤＮＡと標的ＤＮＡとを、個別に検出、分析可能であることが確認された。
【００９０】
（実施例５）
ゲノム由来の標的ＤＮＡのハイブリダイゼーション後のイメージングと、量的分析
本実施例では、実施例４で作製した、ゲノム由来の標的ＤＮＡの分析用ＤＮＡチップを用いて、実際に、ゲノム由来の標的ＤＮＡのイメージング、量的分析について例示する。
【００９１】
（１）ゲノム由来の臭素標識標的ＤＮＡの調製
配列番号：５
Ｅ７Ｓ：　５’　−ＡＣＴＧＧＣＣＴＣＡＴＣＴＴＧＧＧＣＣＴ−　３’
（ｅｘｏｎ　７，　ｓｅｎｓｅ）
配列番号：６
Ｅ７Ａ：　５’　−　ＴＧＴＧＣＡＧＧＧＴＧＧＣＡＡＧＴＧＧＣ−　３’
（ｅｘｏｎ　７，　ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）
【００９２】
【化７】
2004037123.tif 000008
【００９３】
５−ブロモ−２’−デオキシウリジン三リン酸（Ｂｒ−ｄＵＴＰ）
まず、配列番号：５、６のＰＣＲプライマー（ＨＳＣ４、ＨＳＣ５に共通：ベックスに合成依頼）を用いて、ＨＳＣ４のゲノムからエキソン７の部分をＰＣＲ反応で合成した。すなわち、２０ｎｇのゲノムＤＮＡと、各０．４μＭのセンス・プライマー、アンチセンス・プライマーを含む５０μｌのＰＣＲミクスチャーを９４℃（３０ｓｅｃ）、６０℃（４５ｓｅｃ）のサイクルを４０回繰り返して、ＰＣＲ増幅を行った。得られる増幅産物の鎖長は、１７１ヌクレオチドと設計されている。
【００９４】
次に、増幅産物の一部を鋳型として、０．２μＭのセンス・プライマー（配列番号：４）と、上に構造を示す、臭素標識ヌクレオチドの一種である、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン三リン酸（シグマ・アルドリッチ・ジャパン）を１０μＭで用いて、他の三種の核酸塩基を加えて、ｓｓＰＣＲ（一本鎖ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲサイクルは９６℃（３０ｓｅｃ）、５０℃（３０ｓｅｃ）、６０℃（４ｍｉｎ）、２５サイクルである。なお、得られた臭素標識一本鎖ＤＮＡは、ゲルろ過によって精製した。なお、センス・プライマーより伸長される鎖部は、チミン塩基に代えて、全ての臭素標識のウリジンとなった。
【００９５】
（２）　ブロッキング、および、ハイブリダイゼーション
実施例４で作製したＤＮＡチップを、実施例２と同様な方法よりブロッキングした後、純水でリンスし、以下のハイブリダイゼーションに用いた。
【００９６】
（２）で合成したゲノム由来の臭素標識一本鎖ＤＮＡを１０ｎＭの濃度で溶解した、２０％ホルムアミドを含む６×ＳＳＰＥ（０．９Ｍ　ＮａＣｌ、　６０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、　６ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に、ブロッキングを施したＤＮＡチップを浸漬し、８０℃で１０ｍｉｎ加熱し、ついで、４５℃で１５時間ハイブリダイゼーションを行った。その後、２×ＳＳＰＥを用いて、５５℃で洗いの操作を加えた。次に、純水（室温）で軽くリンスし、ハイブリダイゼーションを行ったＤＮＡチップを、窒素ガスを吹き付けて乾燥した後、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法による分析まで真空デシケーター中で保存した。
【００９７】
（３）　ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法によるイメージング、量的分析
実施例２と同様な条件で、ハイブリダイゼーション後のＤＮＡチップのＴＯＦ−ＳＩＭＳでのイメージング、および、量的分析を行った。
【００９８】
表２に、量的分析結果で得られた、フッ素イオン、７９Ｂｒ−イオン、８１Ｂｒ−イオンのカウント数データを示す。
【００９９】
【表２】
2004037123.tif 000009
【０１００】
表２から、本発明の分析方法を応用することで、フッ素標識プローブを具えたＤＮＡチップ上で、ゲノムから誘導し、かつ、臭素ラベルをほどこした標的ＤＮＡのハイブリダイゼーションを行った後、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法によって、ＤＮＡチップ上に固定されているプローブＤＮＡ、および、標的ＤＮＡ双方を。個別に検出、分析が可能であることが示された。
【０１０１】
なお、本実施例とほぼ同様の手順により、ｍＲＮＡから誘導したｃＤＮＡに対しても、ハロゲン原子による標識を施した核酸プローブの作製とチップ化、および、別のハロゲン標識を施した標的ＤＮＡのＰＣＲ調製を行うことで、ハイブリダイゼーションを行った後、核酸プローブと、標的ＤＮＡを、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法による個別のイメージング、および、分析も可能である。
【０１０２】
【発明の効果】
本発明の分析法により、飛行時間型二次イオン質量分析法を用いて、核酸チップ上でハイブリッドを形成したプローブ核酸と標的核酸に関して、それぞれ別個の標識物質、例えば、ハロゲン原子で予め標識しておくことで、ハイブリッドを形成した後、プローブ核酸と、標的核酸を、標識している別個の標識物質に起因する二次イオンの測定を介して、個別にイメージングするとともに、量的分析することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２のイメージング結果を示し、それぞれ、図１−１は、Ｆ−イオン、図１−２は、７９Ｂｒ−イオン、図１−３は、８１Ｂｒ−イオンのイメージングを示す。
【図２】実施例２の量的分析結果に基づき、核酸チップ上にスポットする核酸プローブ溶液中の核酸プローブ濃度に対して、ハイブリダイゼーションを行った後、核酸プローブの標識Ｆ−イオン、標的ＤＮＡの標識７９Ｂｒ−イオン、８１Ｂｒ−イオンの測定量をプロットしたグラフを示す。
【図３】実施例３の量的分析結果に基づき、核酸チップ上の核酸プローブにハイブリダイゼーションさせる検体溶液中の標的ＤＮＡ濃度に対して、ハイブリダイゼーションを行った後、核酸プローブの標識Ｆ−イオン、標的ＤＮＡの標識７９Ｂｒ−イオン、８１Ｂｒ−イオンの測定量をプロットしたグラフを示す。
【図１】
2004037123.tif 000011
【図２】
2004037123.tif 000012
【図３】
2004037123.tif 000013