(57)【要約】【課題】  スギ花粉の主要抗原であるCry j 1の糖鎖構造を利用した医薬組成物の提供。【解決手段】  下記式で示される糖鎖構造(M3FX)を含む化合物を有効成分として含有する、医薬組成物が提供された。式（１）：Manα1-6(Manα1-3)(Xylβ1-2)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc  GN2M3FXは、スギ花粉アレルゲンの一つであるCry j 1の主要な糖鎖である。そしてM3FXは、GN2M3FXのコア糖鎖である。M3FXは、Cry j 1によるTh2の活性化を抑制する。したがって、M3FXは、T細胞のCry j 1によるTh2の活性化の制御、あるいはスギ花粉症の治療や予防に有用である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式で示される構造を含む糖鎖、該糖鎖を結合した薬学的担体、またはその塩からなる群から選択されるいずれかの化合物を有効成分として含有する、医薬組成物。
式（１）：
Manα1-6(Manα1-3)(Xylβ1-2)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc
（式中、Manはマンノース残基を、Xylはキシロース残基を、GlcNAcはN-アセチルグルコサミン残基を、そしてFucはフコース残基を表す。）
【請求項２】
糖鎖が、下記式で示される糖鎖である請求項１に記載の医薬組成物。
式（１）：
Manα1-6(Manα1-3)(Xylβ1-2)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc
【請求項３】
下記式で示される構造を含む糖鎖、該糖鎖を結合した薬学的担体、またはその塩からなる群から選択されるいずれかの化合物を有効成分として含有する、スギ花粉症の治療剤および／または予防剤。
式（１）：
Manα1-6(Manα1-3)(Xylβ1-2)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc
【請求項４】
下記式で示される構造を含む糖鎖、該糖鎖を結合した薬学的担体、またはその塩からなる群から選択されるいずれかの化合物を有効成分として含有する、下記式で示される糖鎖を含むアレルゲンによるTh2活性化の抑制剤。
式（１）：
Manα1-6(Manα1-3)(Xylβ1-2)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc
【請求項５】
アレルゲンが、スギ花粉抗原である請求項４に記載の抑制剤。
【請求項６】
Th2の活性化が、T細胞の増殖および／またはTh2サイトカインの産生である請求項４に記載の抑制剤。
【請求項７】
Th2サイトカインが、IL-4、IL-5、およびIL-10からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインである請求項６に記載の抑制剤。
【請求項８】
下記式で示される構造を含む糖鎖、該糖鎖を結合した薬学的担体、またはその塩からなる群から選択されるいずれかの化合物をT細胞に接触させる工程を含む、下記式で示される糖鎖を含むアレルゲンによるTh2活性化の抑制方法。
式（１）：
Manα1-6(Manα1-3)(Xylβ1-2)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc
【請求項９】
次の工程を含む、アレルゲンによるTh2活性化を抑制する作用を有する化合物のスクリーニング方法であって、被験化合物としてアレルゲンを構成する糖鎖構造を含む糖鎖を用いる方法。
（１）被験化合物およびアレルゲンをT細胞に接触させる工程
（２）アレルゲンによるTh2活性化を測定する工程、および
（３）対照と比較してTh2活性化を抑制する被験化合物を選択する工程
【請求項１０】
請求項９に記載のスクリーニング方法によって選択された糖鎖を有効成分として含むアレルゲンによるTh2活性化の抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の糖鎖構造有する化合物を有効成分とする医薬組成物、およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
花粉症は、スギ花粉が飛散する春先にほぼ全国的に観察されるアレルギー性疾患である。スギ花粉症患者は、くしゃみや鼻汁、目のかゆみ等を伴うアレルギー症状を呈する。スギ花粉症の患者数は、１９７０年以降急激に増加し、現在全国民の10% 弱に当たる約一千万人がスギ花粉症に苦しめられている。
【０００３】
現在、スギ花粉症の治療には、抗ヒスタミン剤やステロイド剤の投与、あるいは減感作療法が利用されている。抗ヒスタミン剤の投与は、眠気の原因となる。またステロイド剤の連続投与も、副作用をもたらす可能性がある。ステロイド剤の副作用には、糖尿病誘発、感染抵抗力低下、肥満、高血圧、あるいは骨粗しょう症等が知られている。更にステロイド剤の長期投与には、しばしばその治療効果がしだいに低下する現象が観察される。ステロイド剤の治療効果の低下は、ステロイド抵抗性と呼ばれている。ステロイド抵抗性が見られる患者において、ステロイド剤の投与量を増やすことは、副作用の危険性を高める原因となるので好ましくない。
【０００４】
抗ヒスタミン剤やステロイド剤のような、対症療法に対して、減感作療法は、現在のところほとんど唯一のアレルギー性疾患の根治治療と言って良い。減感作療法においては、微量のアレルゲンを少しづつ増量しながら長期にわたって投与する。治療が成立すれば、アレルゲンに対する過敏な応答を和らげることができる。しかし、治療効果を達成するまでには、長い時間がかかる。したがって、減感作療法には即効性は期待できない。そのため、スギ花粉症に対する新たな治療方法の提供が待たれている。
【０００５】
アレルギー性疾患を形成するアレルギー反応は、R. G. H. Gell とR.R. A. Coombs によりＩ型〜IV型の４種に分類されている。スギ花粉症はＩ型に属するアレルギー性疾患である。Ｉ型アレルギーの発症機序は以下の通りである。
【０００６】
アレルギー反応を引き起こす抗原性分子をアレルゲンという。本明細書においては、アレルゲンを単に抗原ともいう。スギ花粉においては、スギ花粉を構成するタンパク質抗原がアレルゲンとして作用している。外来タンパク質抗原が体内に侵入すると、抗原提示細胞（マクロファージ）に取込まれ、タンパク分解酵素によってペプチド断片に分解される。
【０００７】
続いて抗原由来のペプチド断片は、主要組織適合抗原複合体(Major Histocompatibility Complex: MHC)クラスII分子と結合した状態で、細胞膜上に提示される。ヒトにおいては、HLAクラスII分子がMHCクラスII分子に相当する。HLAクラスII分子は多型性を示す。
【０００８】
HLAクラスII分子には、HLAクラスII分子の多型性に対応した一次構造を持つペプチドが結合し、ペプチド−HLAクラスII複合体を形成する。CD4+T細胞レセプターは、この複合体を認識して結合し、CD4+T細胞レセプター−ペプチド−HLAクラスIIの３者からなる複合体を形成して抗原特異的にT細胞が活性化される。活性化されたCD4+T細胞は、Th0細胞、Th1細胞、またはTh2 細胞に分化し、種々のサイトカインを産生する。各細胞のサイトカイン産生パターンは、次のように異なっている。
Th1: IL-2、IFN γ等
Th2: IL-4、IL-5、IL-10 等
Th0: Th1とTh2の両者のサイトカイン
【０００９】
抗体の産生等の液性免疫、あるいは細胞障害性を示す細胞免疫等の反応を制御しているのはT細胞である。免疫システムは、これらのT細胞のバランスによって支えられている。たとえばアレルギー反応は、Th2の活動がTh1に比べて優性になっている状態と考えられている。したがってこのバランスをThl優性な状態にする薬剤には抗アレルギー作用が期待され、既に幾つかの薬剤が開発されている。具体的には次のような作用のいずれか、あるいは両方を有する物質は、抗アレルギー作用を持つと考えられる。
IFN-γの産生の増加
IL-4の産生の抑制
【００１０】
一方、B 細胞は細胞表面にIgM あるいはIgD を発現している。抗原を細胞内に取込むことによってB細胞は活性化される。Th2 から産生されるサイトカインの作用によって、活性化されたB 細胞は抗体産生細胞に分化し、増殖する。その結果、B細胞は抗原特異的なIgEを産生する。産生されたIgEは、気道あるいは鼻粘膜組織中のマスト（肥満）細胞や血液中の好塩基球にIgE レセプターを介して強固に結合し、感作が成立する。
【００１１】
アレルゲンによる感作が成立した個体に再びアレルゲンが侵入すると、１ 分子のアレルゲンは、直ちにマスト細胞や好塩基球上の２分子以上のIgE と結合し、架橋構造が形成される。その結果、IgE分子と結合しているレセプター同士が会合する。この現象が引き金となって、細胞膜内の幾種類もの酵素が活性化される。その結果、肥満細胞や好塩基球は、ヒスタミン、プロスタグランジン、ロイコトリエンといった種々の化学伝達物質を放出する。これらの化学伝達物質が鼻粘膜や気道などの局所に作用して、多様なアレルギー症状を引き起こす。
【００１２】
さて、Ｔ細胞によって認識されるエピトープをＴ細胞エピトープ、Ｂ細胞によって認識されるエピトープはＢ細胞エピトープと呼ばれる。アレルゲンのエピトープは、Ｉ型アレルギーの発症及び増悪に直接関与していると考えられる。スギ花粉の主要アレルゲンは、安枝らによって単離精製され、Sugi Basic Protein(SBP)と名付けられた(非特許文献１：Yasueda, H., et al., J. Allergy Clin.Immunol.71, 77-86, 1983)。SBPは、分子量が45〜50kDa で、WHO の命名法に従い現在Cry j 1と呼ばれている。更にその後、Cry j 1の分離精製の過程で、Cry j 1とは抗原性の異なる、分子量が37kDa のCry j 2が分離された(非特許文献２：Taniai,M.et al. FEBS Letters 239, 329-332,1988、Sakaguchi, M. et al. Allergy 45,309-312,1990)。
【００１３】
一方、蛋白質のみならず、アレルゲンを構成する糖鎖が、免疫システムに対して多彩な作用を及ぼすことが明らかにされている。たとえば、花粉や食物などのアレルゲンを構成する糖鎖には、IgE抗体の認識に関与するものがある。さらに異なる抗原分子上の共通した糖鎖が共通抗原として抗原の交差性に関与することも報告されている。またハチ毒やイラクサでは糖鎖がCD4やCD8といつたT細胞のエピトープとなる可能性が指摘されている。その他、アスベルギルス抗原分子上の糖鎖がIgE抗体産生の誘導に関与している(非特許文献３：Yamashita, Y., et al. Clin. Exp. Allergy 2002, 32(5), 776-82.)。
【００１４】
スギ花粉の主要アレルゲンCry j 1は6％の糖を含んでおり、その糖鎖構造も明らかにされている。コア部分にフコースおよびキシロースが結合していることが、Cry j 1の糖鎖の特徴である。このコア糖鎖をM3FXと呼んでいる。コア糖鎖の側鎖にN-アセチルグルコサミンが結合した構造を有する糖鎖は、Cry j 1の糖鎖に最も多く含まれている。このような構造を有する糖鎖は、GN2M3FXと呼ばれる。GN2M3FXは、次の式（２）に示す構造を有する。
式（２）：
GlcNAcβ1-2Manα1-6(GlcNAcβ1-2Manα1-3)(Xylβ1-2)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc
【００１５】
下記の構造式に示すとおり、M3FX（式３）は、GN2M3FX（式４）の部分構造を構成する。
【００１６】
【化１】
2004168765.tif 000002
（式３）
【００１７】
【化２】
2004168765.tif 000003
（式４）
【００１８】
【非特許文献１】Yasueda, H., et al., J. Allergy Clin.Immunol.71, 77-86, 1983
【非特許文献２】Taniai,M.et al. FEBS Letters 239, 329-332,1988、Sakaguchi, M. et al. Allergy 45,309-312,1990
【非特許文献３】Yamashita, Y., et al. Clin. Exp. Allergy 2002, 32(5), 776-82.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、Cry j 1の糖鎖構造を利用した医薬組成物の提供を課題とする。より具体的には、Cry j 1の糖鎖が関与する病態の改善に有用な医薬組成物、並びにその用途を提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
現在までにCry j 1を構成する糖鎖がIgE抗体による認識あるいはT細胞応答に直接関与するという報告はない。本発明者らは、Cry j 1由来の糖鎖の免疫系に対する直接的な作用を解析するため、精製された遊離型の糖鎖がT細胞に与える影響を解析した。そして、遊離型のM3FXがTh2誘導を抑制することを見出した。更にM3FXが、Cry j 1が関与するアレルギー性の疾患に対する治療効果を有することを見出し本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の医薬組成物、スギ花粉症の治療剤、Th2活性化の抑制剤、あるいはTh2活性化の抑制方法に関する。
〔１〕下記式で示される構造を含む糖鎖、該糖鎖を結合した薬学的担体、またはその塩からなる群から選択されるいずれかの化合物を有効成分として含有する、医薬組成物。
式（１）：
Manα1-6(Manα1-3)(Xylβ1-2)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc
（式中、Manはマンノース残基を、Xylはキシロース残基を、GlcNAcはN-アセチルグルコサミン残基を、そしてFucはフコース残基を表す。）
〔２〕糖鎖が、下記式で示される糖鎖である〔１〕に記載の医薬組成物。
式（１）：
Manα1-6(Manα1-3)(Xylβ1-2)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc
〔３〕前記式（１）で示される構造を含む糖鎖、該糖鎖を結合した薬学的担体、またはその塩からなる群から選択されるいずれかの化合物を有効成分として含有する、スギ花粉症の治療剤および／または予防剤。
〔４〕前記式（１）で示される構造を含む糖鎖、該糖鎖を結合した薬学的担体、またはその塩からなる群から選択されるいずれかの化合物を有効成分として含有する、前記式（１）で示される糖鎖を含むアレルゲンによるTh2活性化の抑制剤。
〔５〕アレルゲンが、スギ花粉抗原である〔４〕に記載の抑制剤。
〔６〕Th2の活性化が、T細胞の増殖および／またはTh2サイトカインの産生である〔４〕に記載の抑制剤。
〔７〕Th2サイトカインが、IL-4、IL-5、およびIL-10からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインである〔６〕に記載の抑制剤。
〔８〕前記式（１）で示される構造を含む糖鎖、該糖鎖を結合した薬学的担体、またはその塩からなる群から選択されるいずれかの化合物をT細胞に接触させる工程を含む、前記式（１）で示される糖鎖を含むアレルゲンによるTh2活性化の抑制方法。
〔９〕次の工程を含む、アレルゲンによるTh2の活性化を抑制する作用を有する化合物のスクリーニング方法であって、被験化合物としてアレルゲンを構成する糖鎖構造を含む糖鎖を用いる方法。
（１）被験化合物およびアレルゲンをT細胞に接触させる工程
（２）アレルゲンによるTh2の活性化を測定する工程、および
（３）対照と比較してTh2の活性化を抑制する被験化合物を選択する工程
〔１０〕〔９〕に記載のスクリーニング方法によって選択された糖鎖を有効成分として含むアレルゲンに対するT細胞の応答抑制剤。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、M3FXを有するアレルゲンに対するT細胞のアレルギー性の応答が、M3FXによって制御されることが明らかにされた。M3FXは、スギ主要抗原の一つであるCry j 1を構成する主要な糖鎖である。したがって、本発明は、スギ花粉症の治療、あるいは予防に有用な医薬組成物を提供する。
【００２２】
本発明に基づく医薬組成物は、M3FXを有するアレルゲンによるTh2の活性化を制御する。したがって、スギ花粉症に対して迅速な治療効果を期待できる。あるいは、本発明の医薬組成物を予防的に投与した場合には、スギ花粉アレルゲンによるTh2の活性化を未然に防ぐことができる。すなわち本発明の医薬組成物は、スギ花粉症の予防剤として有用である。
【００２３】
本発明の医薬組成物、あるいはM3FXを有するアレルゲンによるTh2活性化抑制剤は、糖鎖を有効成分として含有する。糖鎖を構成している糖類は、もともと生体を構成する成分でもあるので、本発明の医薬組成物あるいはTh2の活性化抑制剤は、高い安全性を有すると考えられる。更に、本発明の医薬組成物あるいはTh2の活性化抑制剤は、M3FXを有するアレルゲンに特異的に作用する。つまり、副作用を起こしにくい、安全な薬剤とすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、下記式で示される構造を含む糖鎖、該糖鎖を結合した薬学的担体、またはその塩からなる群から選択されるいずれかの化合物を有効成分として含有する医薬組成物に関する。
式（１）：
Manα1-6(Manα1-3)(Xylβ1-2)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc
（式中、Manはマンノース残基を、Xylはキシロース残基を、GlcNAcはN-アセチルグルコサミン残基を、そしてFucはフコース残基を表す。）
【００２５】
本発明の医薬組成物は、式（１）で示される構造を含む糖鎖を有効成分として利用する。式（１）は、M3FXの構造を示している。本発明における糖鎖は、M3FXをその構造中に含む任意の糖鎖が含まれる。M3FXは、スギ花粉の主要アレルゲンであるCry j 1由来の糖鎖であるGN2M3FXの部分構造を構成する糖鎖である。したがって、本発明における糖鎖には、GN2M3FXも含まれる。本発明における好ましい糖鎖は、M3FXである。
【００２６】
本発明において有効成分を構成する糖鎖は、任意の方法によって製造することができる。たとえば、特定の構造を有する糖鎖を合成するための方法が公知である（糖鎖工学；糖鎖工学編集委員会編集、産業調査会バイオテクノロジー情報センター、1992/8/1）。
【００２７】
あるいは目的とする構造を有する糖鎖を含む天然材料から、糖鎖を切り出すこともできる。天然材料としてはスギ花粉やその抽出物、あるいはRicinus communis agglutinin(RCA 120)などを示すことができる。蛋白質に結合した糖鎖は、ヒドラジン分解などの化学的な方法によって切り出すことができる（新生化学実験講座「糖質Ｉ糖タンパク質（上）」P95-98；日本生化学会編集、東京化学同人発行、1990）。この方法は、無水ヒドラジンを糖蛋白質に加えて１００℃で加熱すると、ペプチド結合の切断とともに、糖鎖の還元末端に位置するN-アセチルグルコサミンとアスパラギンの結合も切断されることを利用している。切り出された糖鎖を回収し、ゲルろ過などの手法によって目的とする糖鎖を精製することができる。
【００２８】
有効成分として用いる糖鎖は、薬学的担体に結合することができる。薬学的担体とは、生理学的に許容される化合物を言う。一般に糖鎖は、生体中では容易に代謝あるいは排泄される。そのため、糖鎖を有効成分とする薬剤が高い作用濃度を長時間にわたって維持することは難しいとされている。糖鎖は、担体と結合させることにより、その代謝あるいは排泄を遅らせることができる。たとえば、糖鎖を親水性ポリマーに結合させることによって血中半減期を延長させた薬剤が公知である（特開平９−１５７３２５）。
【００２９】
上記構造を有する糖鎖も、薬学的担体との結合によって、生体中の作用濃度の低下を遅らせることができる。好ましい薬学的担体として、親水性ポリマーを示すことができる。親水性ポリマーの分子量は、腎糸球体で濾過されない程度の分子量が好ましい。より具体的には、平均分子量として１千〜５０万、好ましくは１千〜１０万を示すことができる。たとえば、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレングリコールモノアルキルエーテル、ポリビニルピロリドン、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー、スチレンマレイン酸コポリマー、α，β−〔（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミド〕、イヌリン、デキストラン及びヒト血清アルブミンを、親水性ポリマーとして用いることができる。
【００３０】
これらの親水性ポリマーのうち、ポリアルキレングリコール及びポリアルキレングリコールモノアルキルエーテルがより好ましい。好ましい具体例としては、平均分子量１千〜１０万のポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール、これらのモノＣ1-5アルキルエーテルが挙げられる。特に好ましい親水性ポリマーは、平均分子量１千〜５万のポリエチレングリコール又はポリエチレングリコールモノＣ1-5アルキルエーテルである。また、ポリエチレングリコールモノＣ1-5アルキルエーテルのうち、ポリエチレングリコールモノメチルエーテルが特に好ましい。
【００３１】
これらの親水性ポリマーと糖鎖は、任意の方法によって結合することができる。たとえば両者の官能基を直接結合させることもできるし、架橋剤を利用して両者を結合することもできる。薬学的担体と糖鎖とは、１：１となるように結合させるのが望ましい。多数の糖鎖を結合した薬学的担体は、アレルゲンと同様に免疫システムを刺激する可能性がある。
【００３２】
本発明における糖鎖、あるいは薬学的担体に結合した糖鎖は、塩であっても良い。たとえば、ナトリウムやカリウムのようなアルカリ金属、カルシウムやマグネシウム等のアルカリ土類金属の塩とすることができる。また、本発明における糖鎖、あるいは薬学的担体に結合した糖鎖は、有機酸や無機酸の塩とすることもできる。有機酸には、酢酸やギ酸が含まれる。また無機酸としては、塩酸や硫酸が挙げられる。更に、一般に糖鎖は酢酸で処理することにより溶解性が改善されることが知られている。たとえば糖鎖を酢酸に溶解後に、酢酸を留去することによって糖鎖の溶解性が高まる現象が知られている。このような処理を施した糖鎖も、本発明の有効成分として利用することができる。
【００３３】
M3FXは、スギ花粉抗原の主要抗原であるCry j 1の刺激に対するTh2の活性化を抑制した。したがって、M3FXの構造を含む糖鎖を有効成分とする本発明の医薬組成物は、Cry j 1の刺激によるTh2の活性化の制御に有用である。あるいは本発明の医薬組成物は、Cry j 1によってもたらされるスギ花粉症症状の緩和、あるいは予防に有用である。
【００３４】
M3FXがTh2の活性化を抑制する機序は、たとえば次のように推測することができる。本発明者らの得た知見によれば、Cry j 1を構成するコア糖鎖であるM3FXが、T細胞エピトープとなる可能性は否定的であった。しかし遊離型糖鎖によって抗原特異的T細胞応答が抑制されたことから、Cry j 1を構成するコア糖鎖M3FXが特異的T細胞応答に促進的に関与する可能性が示唆された。そのメカニズムとしては、糖鎖に特異的なレセプターを介した免疫応答の活性化が考えられた。つまり、遊離型糖鎖であるM3FXの投与がIL-4産生を抑制し、その結果、スギ花粉症に対する治療効果を期待できる。更に、このような作用機序は、スギ花粉抗原のみならず、Cry j 1と同様の糖鎖構造を含むアレルゲンによるTh2の活性化の制御にも、遊離型糖鎖であるM3FXを応用することができることを裏付けている。
【００３５】
したがって本発明の知見によれば、M3FXは、Cry j 1によるTh2活性化のみならず、M3FXをその構造中に含むアレルゲンによるTh2活性化の制御にも用いることができる。すなわち本発明は、式（１）で示される構造を含む糖鎖、該糖鎖を結合した薬学的担体、またはその塩からなる群から選択されるいずれかの化合物を有効成分として含有する、M3FXを含むアレルゲンによるTh2活性化の抑制剤を提供する。
【００３６】
本発明において、M3FXを含むアレルゲンとは、糖鎖で構成されたアレルゲンであって、該糖鎖の構造中にM3FXを含み、かつその糖鎖がT細胞のアレルギー性の応答を引き起こしているアレルゲンを言う。糖鎖の構造中にM3FXを含むことは、糖鎖の切り出しとその構造解析によって明らかにすることができる。糖鎖の構造解析方法は公知である（新生化学実験講座「糖質Ｉ糖タンパク質（上）」P95-98；日本生化学会編集、東京化学同人発行、1990）。
【００３７】
また当該糖鎖がアレルゲンによるTh2活性化の原因となっていることは、バイオアッセイによって明らかにすることができる。すなわち、in vitroにおいて当該アレルゲンをT細胞に接触させ、T細胞の応答を観察することにより、アレルゲンの作用を明らかにすることができる。N-アセチルグルコサミニダーゼ、グルコシダーゼ、あるいはフコシダーゼなどの糖鎖を分解する酵素を作用させることによって、当該アレルゲンがT細胞刺激作用を失えば、T細胞の刺激に糖鎖が関与していることが確認できる。
【００３８】
M3FXを含むアレルゲンとして、スギ花粉症抗原を示すことができる。この他、同様の糖鎖が、次のような植物からも見出されている。
イチョウ(Ginko biloba)の種子((Kimura, Y.,and Matsuo, S. Enzymatic properties of Ginkgo biloba endo-β-N-acetylglucosaminidase and N-glycan structures of storage glycoproteins in the seeds. Biosci. Biotech. Biochem., 62, 253-261, 1998)
【００３９】
ホソムギのアレルゲンLolp11(Ree RV. et al.,β(1,2)-Xylose and α(1,3)-Fucose Residues Have Strong Contrbution in IgE Binding to Plant Glycoallergens. J. Biol. Chem.,Vol275. No.15, 11451-11458,2000)
【００４０】
本発明において、Th2の活性化の抑制とは、アレルゲンの刺激によってもたらされるTh2の活性化を抑制することを言う。具体的は、T細胞の増殖および／またはTh2サイトカインの産生を、Th2の活性化として示すことができる。Th2サイトカインには、IL-4、IL-5、IL-10などが含まれる。本発明において、Th2サイトカインの産生抑制とは、これらのTh2サイトカインの少なくとも１種類の産生を抑制することを言う。
【００４１】
また本発明は、式（１）で示される構造を含む糖鎖、該糖鎖を結合した薬学的担体、またはその塩からなる群から選択されるいずれかの化合物をT細胞に接触させる工程を含む、M3FXを含むアレルゲンによるTh2活性化の抑制方法を提供する。本発明のTh2活性化の抑制方法は、in vivoであるいはex vivoで実施することができる。たとえば、スギ花粉症患者のリンパ球を採取し、M3FXで処理した後に患者に戻すことにより、アレルギー症状を緩和することができる。また上記有効成分を生体に投与することにより、生体内において、Th2の活性化を抑制することもできる。
【００４２】
上記構造を含む糖鎖、該糖鎖を結合した薬学的担体、あるいはそれらの塩は、スギ花粉症の治療または予防に用いることができる。すなわち本発明は、前記式（１）で示される構造を含む糖鎖、該糖鎖を結合した薬学的担体、またはその塩からなる群から選択されるいずれかの化合物を有効成分として含有する、スギ花粉症の治療剤および／または予防剤を提供する。
【００４３】
あるいは本発明は、前記式（１）で示される構造を含む糖鎖、該糖鎖を結合した薬学的担体、またはその塩からなる群から選択されるいずれかの化合物を投与する工程を含む、スギ花粉症の治療方法、および／または予防方法を提供する。また本発明は、前記式（１）で示される構造を含む糖鎖、該糖鎖を結合した薬学的担体、またはその塩からなる群から選択されるいずれかの化合物の、スギ花粉症の治療剤および／または予防剤の製造における使用に関する。
【００４４】
本発明における「予防」には、疾患を呈することを防ぐための予防だけではなく、治療後の疾患の再発を防ぐための予防も含まれる。本発明において予防、改善または治療の対象となる「スギ花粉症」は、スギ花粉への曝露によって引き起こされる過敏症状を伴った疾患を言う。
【００４５】
本発明によって、Cry j 1を構成する糖鎖を遊離の状態で存在させることにより、T細胞のCry j 1によるTh2の活性化を抑制することが明らかになった。つまり、アレルゲンを構成する糖鎖は、遊離の状態では当該アレルゲンによるTh2の活性化を抑制する。この知見に基づいて、アレルゲンによるTh2の活性化を抑制する作用を有する化合物を選択することができる。すなわち本発明は、次の工程を含む、アレルゲンによるTh2の活性化を抑制する作用を有する化合物のスクリーニング方法であって、被験化合物としてアレルゲンを構成する糖鎖構造を含む糖鎖を用いる方法に関する。
（１）被験化合物およびアレルゲンをT細胞に接触させる工程
（２）アレルゲンによるTh2の活性化を測定する工程、および
（３）対照と比較してTh2の活性化を抑制する被験化合物を選択する工程
【００４６】
本発明のスクリーニング方法において、アレルゲンは糖鎖構造を有する任意のアレルゲンを用いることができる。したがって、アレルゲンとして作用する糖蛋白質や糖鎖抗原を用いることができる。アレルゲンを構成する糖鎖構造を含む糖鎖は、アレルゲンから切り出して精製することもできるし、糖鎖の構造に基づいて合成することもできる。本発明の方法において、被験化合物である糖鎖とアレルゲンは、任意のタイミングでT細胞に接触させることができる。具体的には、次のタイミングで被験化合物である糖鎖、アレルゲン、およびT細胞を接触させることができる。
【００４７】
被験化合物をT細胞に接触させた後にアレルゲンと接触させる、
被験化合物とアレルゲンを同時にT細胞に接触させる、または
アレルゲンとT細胞を接触させた後に被験化合物を加える
被験化合物とT細胞を接触させた後にアレルゲンと接触させる場合には、被験化合物の特に予防的作用が評価される。
【００４８】
本発明に用いるT細胞は、アレルゲンに対して過敏症状を示す患者から得ることができる。末梢血からT細胞を単離し培養する方法は公知である。またT細胞のアレルゲンによるTh2の活性化を測定する方法は任意である。たとえば、実施例に示すように、T細胞のTh2サイトカインの産生やT細胞の増殖を指標として、Th2の活性化を測定することができる。これらの指標に基づいてTh2の活性化を測定し、対照と比較してTh2の活性化の抑制が観察されたとき、当該被験化合物は、その糖鎖を含むアレルゲンによるTh2の活性化を抑制する作用を有する。本発明のスクリーニング方法において、対照にはアレルゲンによるTh2の活性化に対する作用が明らかな物質を用いることができる。たとえば、T細胞に対して不活性な化合物を陰性対照として用いることができる。具体的には、生理食塩水やグルコースなどを陰性対照とすることができる。あるいは、予めTh2活性化の抑制能を有することがわかっている化合物を対照として、当該化合物よりも抑制作用に優れる化合物を選択することもできる。こうして選択された糖鎖は、そのアレルゲンによるTh2の活性化抑制剤として有用である。この糖鎖を投与することによって、アレルゲンによるTh2の活性化を抑制することができる。
【００４９】
本発明のスギ花粉症を予防、改善または治療するための医薬組成物、あるいはアレルゲンによるTh2活性化抑制剤を使用する場合は、一般的な医薬製剤として調製される。例えば、本発明の医薬を製剤上許容しうる担体と混合して各種の医薬製剤を得ることができる。製剤上許容しうる担体には、賦形剤、結合剤、崩壊剤、矯味剤、矯臭剤、乳化剤、希釈剤、溶解補助剤等を示すことができる。また本発明の医薬組成物の剤型は任意である。たとえば、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、トローチ剤、シロップ剤、液剤、乳剤、懸濁剤、注射剤等の製剤として経口投与または非経口投与に適した形態で処方される。
【００５０】
賦形剤としては、例えば、乳糖、コンスターチ、白糖、ブドウ糖、ソルビット、血漿セルロース等が挙げられる。結合剤としては、例えば、ポリビニルビアゴム、トラガント、ゼラチン、シュラック、ヒドロキシプロピルセルロース、シドロキシプロピルスターチ、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
【００５１】
崩壊剤としては、例えば、デンプン、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストラン、ペクチン等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油等が挙げられる。着色剤としては、医薬品に添加する事が許可されている物が使用できる。矯味矯臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香酸、ハッカ油、竜脳、桂皮末等が使用できる。これらの錠剤は、顆粒剤には、糖衣、ゼラチン衣、その他必要により適宜コーティングしても良い。
【００５２】
注射剤を調製する場合、必要により、pH調製剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤等を添加し、常法により、皮下、筋肉内、静脈内注射剤とする。注射剤は、溶液を容器に収納後、凍結乾燥等によって、固形製剤として、用時調製の製剤としてもよい。また、一投与量を容器に収納してもよく、また、投与量を同一の容器に収納してもよい。
【００５３】
本発明の感染症、大腸炎、またはアレルギー疾患等の疾患を予防、改善または治療するための医薬組成物の投与量は、剤型の種類、投与方法、被検対象（ヒトを含む哺乳動物）の歳や体重、被検対象の症状等を考慮して決定される。成人患者では、例えば１日当たり、０．０１〜６００mgを1〜数回に分けて投与することができる。より好ましくは０．１〜４００mg／日、更により好ましくは１〜２００mg／日の投与量を例示することができる。これらの投与量は患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。投与期間も、患者の治癒経過等に応じて適宜決定することが好ましい。本発明の医薬組成物は、経口、皮下注射、筋肉注射などにより患者に投与することができる。更に、経鼻投与あるいは点眼等の局所的な投与方法を利用することもできる。
以下実施例に基づいて、本発明を更に具体的に説明する。
【実施例】
【００５４】
１．アレルゲン抽出と糖鎖の除去
Cry j 1はスギ（Cryptomeria japonica）の花粉粗抽出物から、Yasueda等（Yasueda H., Yui Y.，Shimizu T.，Shida T.，"Isolation and partial characterization of the major allergen from Japanese cedar（Cryptomeria japonica）pollen."J. Allergy Clin. lmmunol., 1983, 71, 77-86.）の方法で精製した。タンパク量はBCA法により測定した。更に精製されたCry j 1から、公知の方法により、GN2M3FXを抽出した。更に、Ricinus communis agglutinin(RCA 120)からM3FXを、またsoybean storage glycoproteinからM9Aを抽出した。各糖鎖の構造を以下に示す。PAはpyridylaminoである。
【００５５】
GN2M3FX:
GlcNAcβ1-2Manα1-6(GlcNAcβ1-2Manα1-3)(Xylβ1-2)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc-PA
M3FX:
Manα1-6(Manα1-3)(Xylβ1-2)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc-PA
M9A:
Manα1-2Manα1-6(Manα1-2Manα1-3)Manα1-6(Manα1-2Manα1-2Manα1-3)Manβ1-4G1cNAcβ1-4GlcNAc-PA
【００５６】
精製法は以下のとおりである。それぞれの植物由来の糖タンパクを無水ヒドラジンにより１００℃で、１２時間加水分解した。分解後、飽和重炭酸アンモニウム中、無水酢酸でN-グリカンをアセチル化し、Dowex樹脂で脱塩した。各糖鎖はKondo等(Kondo A. et al., Agric. Biol. Chem. 54, 2169-2170, 1990)の方法でビリジルアミノ化した。更にHPLC法により各糖鎖を分離した。HPLCに用いたカラムは次のとおりである。
Cosmosil 5C18-ARカラム
Shodex Asahipak NH2P-50カラム
【００５７】
Cosmosil 5C18-ARカラムの場合、0.02％トリフルオロ酢酸(TFA)存在下のアセトニトリル濃度勾配、0％から20％（直線法）で目的物が得られる（流速1.5 ml/min）。Shodex Asahipak NH2P-50カラムの場合、ビリジルアミノ化オリゴ糖鎖は、水−アセトニトリル混合物における水濃度を、30％から50％へ60分で直線的に増加させることにより得られる（流速1.5 mi/min）。
【００５８】
M3FX構造は、α-マンノシダーゼ、β-キシロシダーゼ、およびα- フコシダーゼによるグリコシダーゼ消化法、糖鎖２次元マップ法、ESI-MS 分析、並びに1H-NMR分析により同定した。これらの糖鎖についての構造解析は、公知の方法にしたがった(Kimura, Y.,and Matsuo, S. Enzymatic properties of Ginkgo biloba endo-β-N-acetylglucosaminidase and N-glycan structures of storage glycoproteins in the seeds. Biosci. Biotechnol. Biochem., 62/2, 253-261, 1998)。
【００５９】
２．血清
４５名のスギ花粉症患者（男性；２２名、女性；２３名、平均年齢；33.61±19.61才、範囲；7-81才）の血清を試料とした。スギ花粉症であることは、CAP（Pharmacia，Uppsala，Sweden）による抗原特異的IgE抗体価（1.27-146.34 UA/ml）を測定して確認した。この実験は、岡山大学医学部の倫理委員会によって認められた。
【００６０】
３．Cry j 1特異的IgE ELISAと阻害実験
captured ELISA法によって、血清のCry j 1特異的IgEを測定した。captured ELISA法のプロトコルは次のとおりである。まずELISA用プレート（Corning lnc., NY）にラット抗ヒトIgEモノクローナル抗体（clone LO-HE-17；Biosource，CA）を5μg/ml（0.05M炭酸バッファー、pH 9.6の溶液中）濃度溶液で各ウエルにl00 μlづつ入れて4℃、一晩放置した。10％FCSを含むPBS、200 μlを各ウエルに入れて37℃、2時間プレートをプロッキングした。
【００６１】
その後、10％FCSで連続希釈したヒト血清サンプルを入れて、37℃、2時間反応させた。さらに6nMビオチン化Cry j 1（林原生物研究所）を加えて、37℃で2時間反応させた。続いて、1/1,000倍希釈したexravidin-peroxidase conjugate(Sigma chemical Co., MO)を加えて37℃で1時間反応させた。プレートの洗浄後、tetramethylbenzidine (TMB)基質(Kirkegaard & Perry Laboratories lnc., MD)を加え、反応後に5％リン酸（和光純薬）を酵素反応の停止試薬として加えた。automatic microplate reader(Bio-Rad, CA)で波長450 nmの吸光度を測定した。プレートへの抗体の吸着、免疫反応、あるいはアビジン−ビオチンの結合反応の終了ごとに、0.05％Tween20を含むPBSでプレートを4回洗浄した（ただし、最後のステップでは6回洗浄）。
【００６２】
Cry j 1特異的IgE抗体に対するCompetitive inhibition ELISAのプロトコルは次のとおりである。まず上記のCry j 1特異的IgEの測定方法に準じて、コーティング、プロッキング、および血清サンプルの反応を行った。その後、ビオチン化Cry j 1（終濃度6nM）と各糖鎖（GN2M3FX、M3FX、もしくはコントロールとしてM9A）の連続希釈溶液（終濃度、0、30、300、3，000 nM）を混合した溶液をIgE抗体が結合したプレートに加えた。続いて上記のcaptured ELISA法に順じて、exravidin-peroxidase conjugateを反応後、TMBでペルオキシダーゼ活性を測定した。結果は各糖鎖を加えない時の吸光度に対する糖鎖存在下での吸光度を％結合として表した。
【００６３】
４．Cry j 1特異的T cell line(TCL)
７名のスギ花粉症患者（男性；4名、女性：3名、平均年齢：31.29±8.48、範囲：21−43才）から短期培養Cry j 1特異的T cell lineを作製した。以下の成分を含むRPMI1640(Sigma)を培養液として用いた。以下の実験でも培養液には同じ組成を利用した。
10％ヒトAB血清(ICN Biomedicals, Aurora, OH),
100U/ml penicillin、
100 mg/m1 streptomycin、そして
20 mM l-glutamin（Gibco, Grand lsland, NY）
【００６４】
2x106の末梢血単核球(PBMC)を、 10μg/ml Cry j 1を加えた培養液(1.5 ml)と共に24穴プレート(Corning)で７日間培養した。幼若化したT cellをRPMI1640で2回洗浄し、20U/mlのヒトrecombinant IL-2（Boeringer Mannheim GmbH. Germany）を含む培養液でさらに7日間培養した。3日後、培養液の1/2量を、IL-2を含む培養液で置換した。さらに3x105の幼若化T cellを、2μg/mlのCry j 1と30 Gy-irradiated autologous PBMC（PBMCx，1.5x106）を含む1.5 mlのIL-2を含む培養液で再刺激した。細胞はさらに2週間培養し、その間、3日おきにIL-2を含む培養液を半分量置換した。このようにして作製したTCLの細胞増殖反応、あるいはサイトカイン産生能を解析した。
【００６５】
５．花粉関連糖鎖への細胞の応答
M3FX刺激によるCry j 1特異的TCLの細胞増殖とサイトカイン産生の測定のプロトコルは次のとおりである。2x104のT cellとl x 105 autologous irradiated PBMC（PBMCx）を、M3FXの連続希釈（終濃度；0、0.5、5.0、そして50μM）溶液もしくは陰性コントロールとしてM9Aを加えた溶液を96穴プレート(Corning)で反応させ、10μg/ml濃度のCry j 1を加えた系を陽性コントロールとして用いた。抗原添加あるいは非添加の65時間培養上清分画を回収し、サイトカインの定量測定を行うまで−80℃に保存した。
【００６６】
培養65時間後に１μCi 3H-thymidine（ICN Radiochemicals，Irvine, CA）を各ウェルに加えてさらに7時間培養後、細胞を回収して細胞に取り込まれた放射活性を液体シンチレーター(Aloka Co.)で測定した。各試験は3回培養した平均cpm（count per minute）で表した。
【００６７】
この実験とは別に、2x104のT cellと1 x 105 autologous irradiated PBMC（PBMCx）を、10 μg/mlのCry j 1と、M3FXの連続希釈（終濃度；0、0.5、5.0、そして50μM）溶液もしくはM9Aを加えた溶液を添加あるいは非添加で培養した。この系の細胞増殖反応とサイトカイン産生能を上記と同様の方法で測定した。
【００６８】
６．サイトカイン測定
IL-4とIFN-γは、Opt EIA sets(BD Biosciences，CA)で測定した。方法はセットの添付説明書に従った。この測定系の検出限界値はIL-4で3 pg/mlであり、IFN-γは20pg/mlであった。
統計処理
測定値は平均値 ±標準偏差で表した。測定結果についてBartlett testを行った後Wilcoxon's signed-rank test、あるいはFisher's exact probability testで統計処理して、p＜0.05を統計的に有意差があるとした。
【００６９】
７．結果
Cry j 1関連糖鎖によるIgEとCry j 1との結合阻害：
Cry j 1関連糖鎖であり、一価の糖鎖であるGN2M3FXとM3FXを阻害剤として、Cry j 1の糖鎖がIgE抗体エピトープとして機能しているのかを検討するために、IgE ELISA阻害実験を行つた。先ずcaptured ELISAにおいて、基礎的な検討を行った。本実験での個々の血清IgE titer（血清32倍希釈）はCAPによるスギ花粉特異的IgE titerと明らかに正の相関を示している（図１Ｂ，r＝0.615，p＜0.0001）。検討した45名中40名のIgE titerはバックグラウンドの2倍であることから、これら40名の個々の血清、あるいはプール血清を用いてさらに検討を行った。患者プール血清を連続希釈してビオチン化Cry j 1の結合の変化を検討すると、希釈に伴って吸光度が減少した(図１Ａ)。
【００７０】
一方、プール血清を56℃で1時間加熱処理後は32倍以上の希釈で反応しなくなり、さらに、健常人の血清はビオチン化Cry j 1と反応しなかった。すなわちプール血清とビオチン化Cry j 1の反応はIgE抗体が関与している反応であることを確認した。40名の花粉症患者血清について、単離精製したM3FX、GN2M3FX、さらに無関係な糖鎖として用いたM9Aを用いて阻害実験を行った（図２）。
【００７１】
阻害剤として用いている一価の糖鎖、すなわちGN2M3FX、M3FX、およびM9A、の濃度は30、300、そして3000 nMとした。これらの濃度は、ビオチン化Cry j 1上の糖鎖を１とすると、それぞれ、1：1、1：10、および1：100に相当する。実験の結果、Cry j 1関連糖鎖であるGN2M3FXとM3FXは、Cry j 1とは無関係な糖鎖であるM9Aと同様にIgE抗体とCry j 1の結合を阻害しないことが明らかとなった。これらの結果から、GN2M3FX又はM3FXはスギ花粉症における主要なIgE抗体エピトープにはなっていないことが明らかである。
【００７２】
しかしながら、この結果の個々の血清について詳細に分析すると、多くの血清（31/40：77.5%）では阻害を示さなかったが、GN2M3FX単独，M3FX単独、そしてGN2M3FXとM3FXの両者を含んだ場合には、それぞれ4（10.0%），2（5.0%）そして3（7.5%）サンプルが部分的な阻害を示した。これらの結果から、スギ花粉関連糖鎖は40名中9名の割合（22.5%）でマイナーなIgE抗体エピトープとして機能している可能性を示している。
８．Cry j 1関連糖鎖に対するT細胞の応答
【００７３】
Cry j 1特異的なT細胞がCry j 1関連糖鎖をT細胞エピトープとして認識できるかどうかを検討するために、花粉症患者7名からCry j 1特異的なT細胞ラインを作製した。作製した全てのCry j 1特異的なT細胞ラインは、Cry j 1が10μg/mlの濃度で増殖反応を示し（平均32、592±466 cpm，p＜0.05）、比較的高濃度のIL-4（平均563±466 pg/ml p＜0.05）を産生して、それよりも低いIFN-γ（平均93±161 pg/ml，p＜0.05）を産生した（図３）。
【００７４】
しかしながら、これらのT細胞は0.5μM、5.OμM、50μMの濃度のM3FXと反応しなかった。なお、陰性コントロールの糖鎖として使ったM9Aもこれらの濃度で反応していない。例えば7つのT細胞ラインの平均増殖能は、50μMのM3FXとM9Aで、それぞれ124±76cpm (p＝0.8658)、136±102 cpm(p＝0.7353)であり、IL-4又はIFN-γはこれらの糖鎖で産生誘導が認められなかった。
【００７５】
９．Cry j 1関連糖鎖によるCry j 1特異的Th2活性化の抑制反応
Cry j 1関連糖鎖が抗原特異的T細胞応答に影響を与えるかどうかを検討した。Cry j 1存在下にM3FX又はM9Aの連続希釈液を加えて、特異的T細胞の応答を検討した（図４)。その結果、M9AはT細胞の応答に何の変化も与えないが、M3FXはM3FXが存在しない場合に比べて、T細胞の増殖反応に明らかな抑制を示した（図４Ｄ)。さらに、M3FXが低濃度ではT細胞によるIL-4の産生に影響を与えないが、50μMでは明らかに抑制した（図４Ｅ)。一方、IFN-γの産生には影響を与えなかった（図４Ｆ)。従ってM9Aに比べ、M3FXは濃度50μMでIL-4の産生抑制を行い、IFN-γの産生には何の影響の与えないという選択的な抑制を引き起こすと考えられた。
【００７６】
以上の結果からCry j 1を構成するコア糖鎖であるM3FXが、T細胞エピトープとなる可能性は否定的であった。しかしながら、遊離型糖鎖にて特異的T細胞応答が抑制されたことから、Cry j 1を構成するコア糖鎖M3FXは特異的T細胞応答に促進的に関与する可能性が示唆された。そのメカニズムとしては、糖鎖に特異的なレセプターを介した免疫応答の活性化が考えられ、このレセプターの同定および解析が期待される。逆に言えば、遊離糖鎖であるM3FXによりIL-4産生が抑制されることは、M3FXがアレルギーの治療薬として有効であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１Ａは、captured ELISAによるスギ花粉症患者プール血清の連続希釈サンプルのビオチン化Cry j 1との結合の変化を示す。図中縦軸は４５０nmの吸光度、横軸はサンプルの希釈倍数を示す。  図１Ｂは、４５名のスギ花粉症患者血清の、CAP法およびcaptured ELISAによって測定された、スギ花粉特異的IgE(CAP)およびCry j 1特異的IgE(captured ELISA)のtiterの相関を示す。縦軸はCAP法の測定値、横軸がcaptured ELISAの測定値である。
【図２】単離精製したM3FX、GN2M3FX、および無関係な糖鎖であるM9Aによる、Cry j 1とIgEの結合阻害実験の結果を示す。40名の花粉症患者血清を試料に用いた。GN2M3FX、M3FX、およびM9Aの濃度は、30nM（図２Ａ）、300nM（図２Ｂ）、そして3000 nM（図２Ｃ）である。図中、縦軸は結合阻害剤として用いる各糖鎖を加えない場合のCry j 1の結合を１００とする結合阻害％を、横軸は結合阻害剤として用いた糖鎖の種類を示す。
【図３】花粉症患者７名から樹立したCry j 1特異的なT細胞株の、Cry j 1または各糖鎖に対する応答を示す。図３Ａは細胞増殖応答、図３ＢはIL-4産生応答、そして図３ＣはIFN-γ産生応答の結果である。図中、縦軸は細胞の放射活性(cpm)（図３Ａ）、または培養上清中のサイトカイン濃度（図３Ｂおよび図３Ｃ）を示す。各図の横軸は、Ｔ細胞の刺激に用いた化合物の種類（Cry j 1または各糖鎖）を示す。
【図４】花粉症患者7名から樹立したCry j 1特異的なT細胞株の、Cry j 1に対する応答に与えるM3FXの影響を示す。図４Ａ−図４Ｃが対照であるM9Aの結果、図４Ｄ−図４ＦがM3FXの結果である。図４Ｄおよび図４Ａは細胞増殖応答、図４Ｅおよび図４ＢはIL-4産生応答、そして図４Ｆおよび図４ＣはIFN-γ産生応答の結果である。図中、縦軸は細胞の放射活性(cpm)（図４Ｄおよび図４Ａ）、または培養上清中のサイトカイン濃度（図４Ｅおよび図４Ｂ、並びに図４Ｆおよび図４Ｃ）を示す。各図の横軸は、M3FXまたはM9Aの濃度μMを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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