(57)【要約】【課題】　　　　　　エンドセリン−１に対する阻害剤を提供する。【解決手段】　　　　フジバカマ（Eupatorium fortunei Turcz.），セイヨウノコギリソウ（Achillea millefolium L.），ノコギリソウ（Achillea sibirica Ledeb.），イタドリ（Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.），ハチジョウイタドリ（Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. var. hachidyoense Ohwi），オオイタドリ（Polygonum sachalinense Fr. Schm.），タチジャコウソウ（Thymus vulgaris L.），ベニバナ（Carthamus tinctorius L.）より選択した１種又は２種以上の植物の抽出物を含有させる。【選択図】　　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フジバカマ（Eupatorium fortunei Turcz.），セイヨウノコギリソウ（Achillea millefolium L.），ノコギリソウ（Achillea sibirica Ledeb.），イタドリ（Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.），ハチジョウイタドリ（Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. var. hachidyoense Ohwi），オオイタドリ（Polygonum sachalinense Fr. Schm.），タチジャコウソウ（Thymus vulgaris L.），ベニバナ（Carthamus tinctorius L.）より選択した１種又は２種以上の植物の抽出物を含有して成る、エンドセリン−１に対する阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、特定の植物の抽出物を含有して成り、エンドセリン−１に対する阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
　従来より、紫外線により生じる皮膚の色素沈着症状の防止，改善を目的として、メラニン生成を触媒するチロシナーゼの活性を阻害するものや、生成したメラニン色素を還元する作用を有するものが検索され、皮膚外用剤への応用が提案されてきた。かかる作用を有するものとしては、アスコルビン酸及びその誘導体（特許文献１〜３参照），コウジ酸及びその誘導体（特許文献４参照），イソコウジ酸及びその誘導体（特許文献５参照），ヒドロキノン誘導体（特許文献６参照），ヒドロキノン配糖体（特許文献７参照），エラグ酸及びその誘導体（特許文献８参照）などや、植物の抽出物（特許文献９〜１１参照）、胎盤，肝臓等の動物組織抽出物（特許文献１２，１３参照）などが開示されている。
【０００３】
　また、紫外線による皮膚の炎症や黒化を防止するため、パラアミノ安息香酸系化合物，サリチル酸系化合物，メトキシ桂皮酸系化合物，ベンゾフェノン系化合物といった紫外線吸収剤を含有する皮膚外用剤や化粧料も上市されている。
【０００４】
　しかしながら、上記のチロシナーゼ阻害作用或いはメラニン生成抑制作用を有する物質には、安定性に問題があるため皮膚外用剤への配合に注意を要するものや、作用効果が十分でなかったり、皮膚に対し刺激性を有していたりするものが存在していた。また、上記したような有機系の紫外線吸収剤についても、皮膚刺激反応や皮膚感作作用、或いは光刺激又は光感作反応を引き起こすことがあり、安全性上問題があった。
【０００５】
　一方皮膚のメラニン色素は、日常曝露する紫外線による悪影響から皮膚を保護する働きを有するため、通常のメラニン生成に対しては抑制作用を示さず、過度の紫外線照射を受けた際に亢進するメラニン生成に対し、特異的な抑制作用を発揮することが好ましい。しかし、かかる紫外線照射により生じる過剰なメラニン生成を特異的に抑制し得る皮膚外用剤は、これまで得られていない。
【０００６】
【特許文献１】特公昭６０−２６０８８号公報
【特許文献２】特開平８−３３３２６０号公報
【特許文献３】特開平９−１１８６１３号公報
【特許文献４】特開昭５３−３５３８号公報
【特許文献５】特公昭６２−５９０８４号公報
【特許文献６】特公昭６２−６６８３号公報
【特許文献７】特公平４−２７９６２号公報
【特許文献８】特公平５−５２８０６号公報
【特許文献９】特公昭６１−１０４４２号公報
【特許文献１０】特公平５−２７６０５号公報
【特許文献１１】特公平５−８７４８２号公報
【特許文献１２】特公昭６２−３７０１１号公報
【特許文献１３】特公昭６２−５９０８５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
　そこで本発明においては、紫外線により生じる過剰なメラニン生成を特異的に抑制し、その結果、紫外線により生じる色素沈着症状に対し、有効な防止，改善作用を有する皮膚外用剤を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
　　上記の課題を解決するため、紫外線に曝露されたケラチノサイトより分泌されるメラノサイト活性化因子であるエンドセリン−１に対する阻害作用を指標として検討を行った。その結果、フジバカマ（Eupatorium fortunei Turcz.），セイヨウノコギリソウ（Achillea millefolium L.），ノコギリソウ（Achillea sibirica Ledeb.），イタドリ（Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.），ハチジョウイタドリ（Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. var. hachidyoense Ohwi），オオイタドリ（Polygonum sachalinense Fr. Schm.），タチジャコウソウ（Thymus vulgaris L.），ベニバナ（Carthamus tinctorius L.）より選択した１種又は２種以上の植物の抽出物が、エンドセリン−１により活性化されるチロシナーゼに対し、特異的な阻害効果を有することを見いだし本発明を完成するに至った。
【０００９】
　なお、カワラヨモギ，フジバカマ，セイヨウノコギリソウ及びイタドリについてはチロシナーゼ生合成阻害作用を有すること（特開平８−１０４６４６）が、イタドリ，ハチジョウイタドリ，オオイタドリ，タチジャコウソウ，ベニバナについてはチロシナーゼ活性阻害作用を有すること（特開平５−２９４８１９，特開平６−１９９６４７，特公平４−６３８５０）が、それぞれ開示されている。しかしながら、これらの抽出物にα-ＭＳＨ又はエンドセリン-1に対する阻害作用が存在し、その作用を介して、紫外線により過剰に活性化されたチロシナーゼを抑制することについてはこれまで報告されておらず、まして、紫外線による過度の色素沈着の防止，改善に応用した例は存在しない。
【発明の効果】
【００１０】
　本発明により、優れたエンドセリン−１阻害剤を得ることができた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
　本発明において抽出に供するフジバカマ（Eupatorium fortunei Turcz.）は中国渡来の多年生草本で、日本西部の川辺に自生する。セイヨウノコギリソウ（Achillea millefolium L.）は、北米，ヨーロッパに野生する多年草で、ノコギリソウ（Achillea sibirica Ledeb.）はその近縁植物である。イタドリ（Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.）は山野に自生する多年草で、生薬コジョウコンの基原植物であり、ハチジョウイタドリ（Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. var. hachidyoense Ohwi）及びオオイタドリ（Polygonum sachalinense Fr. Schm.）は、その近縁植物である。タチジャコウソウ（Thymus vulgaris L.）はヨーロッパ温暖地原産の常緑小低木で、スペイン，フランス，ドイツ，地中海沿岸で自生又は栽培される。ベニバナ（Carthamus tinctorius L.）は各国で栽培される一年草又は多年草で、生薬コウカの基原植物である。
【００１２】
　上記植物は生のまま抽出操作に供しても良いが、抽出効率を考えると、細切，乾燥，粉砕等の処理を行った後抽出を行うことが好ましい。抽出は、抽出溶媒に浸漬して行う。抽出効率を上げるため攪拌を行ったり、抽出溶媒中でホモジナイズすることもできる。抽出温度としては５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は、４時間〜１０日間程度である。
【００１３】
　抽出溶媒としては、水の他、メタノール，エタノール，プロパノール，イソプロパノール等の低級アルコール、1,3-ブチレングリコール，プロピレングリコール，ジプロピレングリコール，グリセリン等の多価アルコール、エチルエーテル，プロピルエーテル等のエーテル類、酢酸エチル，酢酸ブチル等のエステル類、アセトン，エチルメチルケトン等のケトン類などの極性有機溶媒を用いることができ、これらより１種又は２種以上を選択して用いる。また、生理食塩水，リン酸緩衝液，リン酸緩衝生理食塩水等を用いても良い。これらの溶媒のうち、エタノール又はエタノール−水混合溶媒を用いるのが特に好ましい。
【実施例】
【００１４】
　さらに本発明の特徴について、実施例により詳細に説明する。
【００１５】
　［実施例１〜実施例６］ 色素沈着防止用ローション剤
　表１に示す各植物５００ｇを細切し、５０容量％エタノール４．５リットルに浸漬して２０℃にて５日間静置し、ろ過して植物片を除去した後のろ液を表１に示す濃度となるように、下記のローション基剤に添加し、均一に溶解した。
【００１６】
【表１】
2004043514.tif 000002
【００１７】
［ローション基剤］
(１)エタノール　　　　　　　　　　　　１０．０(w/v)％
(２)ヒドロキシエチルセルロース　　　　　１．０
(３)パラオキシ安息香酸メチル　　　　　　０．１
(４)精製水　　　　　　　　　　全量を１００(w/v)％とする量
製法：(１)から(３)を順次(４)に添加し、均一に混合，溶解する。
【００１８】
　上記の実施例２〜実施例６のローション剤について、エンドセリン-1存在下におけるチロシナーゼ活性に対する阻害作用を評価した。前記評価は、正常ヒトメラノサイトを３×１０4 個／ウェルとなるように９６穴マイクロプレートに播種し、１(w/v)％牛胎仔血清を添加した１５４Ｓ培地にて３７℃で２４時間培養し、次いで培地を１(w/v)％牛胎仔血清，試料（実施例２〜実施例６，各１０μｌ）及び１０ｎＭのエンドセリン-1を添加した１５４Ｓ培地に交換し、３７℃でエンドセリン-1添加の場合は２４時間さらに培養した後、チロシナーゼ活性を測定して行った。
【００１９】
　なおチロシナーゼ活性は、メラノサイトを１(w/v)％のＴｒｉｔｏｎ-Ｘ１００を含有するリン酸緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ６．８）にて溶解した後、０．０２５(w/v)％のL-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニンを含有するリン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ６．８）５０μｌを添加し、３７℃で３時間反応させた後、４０５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて測定し、生成したメラニン量を算出して、Ｌｏｗｒｙ法により定量したタンパク質量とから、（１）式により求めた。
チロシナーゼ活性（Ｔ）＝メラニン含量(μg/μL)／タンパク質含量(μg/μL)　　（１）
【００２０】
　チロシナーゼ活性の阻害作用は、（２）式を用いて算出したチロシナーゼ活性阻害率（％）により表した。また各実施例について、エンドセリン-1の非存在下においても同様にチロシナーゼ活性阻害作用を評価した。この際のチロシナーゼ活性阻害率は（３）式により求めた。これらの結果は表２にまとめて示した。なお表結果中−は有意なチロシナーゼ活性の阻害が認められなかったことを示す。
【００２１】
【数１】
2004043514.tif 000003
式中、ＴS はα-ＭＳＨ又はエンドセリン-1と試料のそれぞれを添加した場合のチロシナーゼ活性、ＴM はα-ＭＳＨのみ添加した場合のチロシナーゼ活性、ＴE はエンドセリン-1のみ添加した場合のチロシナーゼ活性、ＴCはL-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニンを添加しない対照のついてのチロシナーゼ活性を示す。）
【００２２】
【数２】
2004043514.tif 000004
（式中、ＴS は各試料を添加した場合のチロシナーゼ活性、Ｔは試料を添加しない場合のチロシナーゼ活性、ＴC はL-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニンを添加しない対照のついてのチロシナーゼ活性を示す。）
【００２３】
【表２】
2004043514.tif 000005
【００２４】
　表２より明らかなように、本発明に係る実施例２〜実施例６のローション剤は、エンドセリン-1非存在下ではメラノサイトのチロシナーゼ活性に影響を与えないが、α-ＭＳＨにより活性化されるチロシナーゼに対しては実施例１が、エンドセリン-1により活性化されるチロシナーゼに対しては実施例２〜実施例６が、それぞれ最終濃度にして２５μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬという低濃度で高い阻害活性を示していた。