(57)【要約】【課題】本発明の課題は、心筋梗塞、特に心電図でＳＴ上昇の認められない症例（ＮＳＴＥＭＩ）を診断するための、および／または急性冠症候群の危険度の階層化のための方法を提供することである。【解決手段】心筋梗塞を診断するための、および／または急性冠症候群の危険度の階層化のための方法であって、検査しようとする患者について少なくとも３種のマーカーの測定を行い、それによって各症例において少なくとも１種の神経ホルモンマーカー、少なくとも１種の虚血マーカー、および少なくとも１種の炎症マーカーを測定する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋梗塞を診断するための、および／または急性冠症候群の危険度の階層化のための方法であって、
検査しようとする患者について少なくとも３種のマーカーの測定を行い、それによって各症例おいて、少なくとも１種の神経ホルモンマーカー、少なくとも１種の虚血マーカー、および少なくとも１種の炎症マーカーを測定する、該方法。
【請求項２】
該神経ホルモンマーカーが、Ａ型ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、プロＡＮＰのＮ末端断片（ＮＴ−ＰｒｏＡＮＰ）、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、およびプロＢＮＰのＮ末端断片（ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰ）から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
神経ホルモンマーカーとしてＮＴ−ＰｒｏＢＮＰが測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該虚血マーカーが、トロポニンＴおよびトロポニンＩから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
虚血マーカーとしてトロポニンＴが測定される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該炎症マーカーが、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ＩＬ−６などのインターロイキン、およびＶＣＡＭまたはＩＣＡＭなどの接着分子から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
炎症マーカーとしてＣＲＰおよび／またはＩＬ−６が測定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
危険度の高い、および／または予後不良の患者を同定するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
複数のマーカーの並行測定が行われる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
該測定が単一の患者サンプルに対して行われる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
該測定が自動分析機で行われる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
該測定が迅速アッセイ法として行われる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
心筋梗塞を診断するための、および／または急性冠症候群の危険度の階層化を行うための試薬キットであって、
少なくとも３種類のマーカーを測定するための検出試薬を含み、そして、神経ホルモンマーカーの検出試薬が少なくとも１種存在し、虚血マーカーの検出試薬が少なくとも１種存在し、炎症マーカーの検出試薬が少なくとも１種存在する、該試薬キット。
【請求項１４】
複数の該マーカーの並行測定を行うための、請求項１３に記載の試薬キット。
【請求項１５】
単一の患者サンプルに対して測定を行うための、請求項１３または１４に記載の試薬キット。
【請求項１６】
該測定を自動分析機で行うための、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の試薬キット。
【請求項１７】
該測定を迅速アッセイとして行うための、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の試薬キット。
【請求項１８】
危険度の高い、および／または予後不良の急性冠症候群の患者を同定するための、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の試薬キットの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、心筋梗塞、特に心電図でＳＴ上昇の認められない症例（ＮＳＴＥＭＩ）を診断するための、および／または急性冠症候群の危険度の階層化のための方法に関し、その方法によって検査しようとする患者について、少なくとも３種類のマーカーが測定される。さらに、該診断方法を行うためのキットを提供する。
【０００２】
【従来の技術】
ＮＳＴＥＭＩおよび急性冠症候群などの冠状動脈疾患の診断に用いられるマーカーは多数知られており、例えば、トロポニンＴ、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、および脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）が挙げられる。これらのマーカーのうちの１種の濃度の上昇は、虚血イベント（それには死亡も含まれる）の可能性の増大と関連する。このことは例えば、Ｈａｍｍら（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．　３２７（１９９２），　１４６−１５０）、Ｈａｍｍら（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．　３４０（１９９９）　１８２３−１８２９）、Ｈｅｅｓｃｈｅｎら（Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ　３５４（１９９９），　１７５７−１９６２）、ＫｌｏｏｔｗｉｊｋとＨａｍｍ（Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ　３５３，　Ｓｕｐｐｌ．ＩＩ　（１９９９），　１０−１５）、Ｗｅｉら（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　８８（１９９３），　１００４−１００９）、Ｄｅ　Ｌｅｍｏｓ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．　３４５（２００１），　１０１４−１０２１）などの文献中に述べられている。Ｄｅ　Ｗｉｎｔｅｒら（Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．　Ｒｅｓ．　４２（１９９９），　２４０−２４５）、およびＤｅ　Ｗｉｎｔｅｒら（Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．　４６（２０００），　１５９７−１６０３）では、ＣＲＰおよびトロポニンＩもしくはトロポニンＴは急性冠症候群の患者の危険度の階層化のための２種類の独立したマーカーであることが既に結論づけられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、１種または２種のマーカーを用いた公知の診断法の不利な点は、高危険度の患者をうまく同定できないという点である。従って本発明が目的とする課題は、高危険度の患者をより効果的に同定しうる、心筋梗塞を診断するためおよび／または急性冠症候群の危険度の階層化のための方法を開発することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
この目的は、検査しようとする患者に対して少なくとも３種類のマーカーの測定を行うことによって達成されるものであり、その方法によって少なくとも１種の神経ホルモンマーカー、少なくとも１種の虚血マーカー、および少なくとも１種の炎症マーカーが測定される。
【０００５】
驚くべきことに、神経ホルモンマーカー、虚血マーカー、および炎症マーカーが独立した危険度指標の３群を表し、これらの３種類のマーカー群を本発明に従って組み合わせることにより、危険度の高い患者および／または予後不良の患者を同定しようとする際には、感度と特異性の相加的増加、それによる高度な予測価およびより有効性の高い診断がもたらされる。試験される患者の側について言えば、これは、適切な治療方法のための改善された指標の確立を可能にする。
【０００６】
【発明の実施の形態】
この方法でもたらされる利点は、個々のマーカーを測定する現行の診断方法を用いた場合よりも、患者に心臓疾患がある場合−特に心電図でＳＴ上昇の認められない心筋梗塞（ＮＳＴＥＭＩ）がある場合−危険度の高いおよび／または予後不良の患者をより多数同定することができ、より適切にその患者を処置できることである。本発明に従って、３種の異なるマーカーを組み合わせて診断を行うと、死亡例、およびその他の心臓合併症の頻度をさらに低減することができる。
【０００７】
本発明の方法は、少なくとも３種類のマーカーを測定することを含んでなり、該方法において、少なくとも１種の神経ホルモンマーカー、少なくとも１種の虚血マーカー、および少なくも１種の炎症マーカーが測定される。
【０００８】
神経ホルモンマーカーは、例えば、心房性（Ａ型）ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳（Ｂ型）ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、またはそれぞれのプロペプチドのＮ末端断片であるＮＴ−ＰｒｏＡＮＰおよびＮＴ−ＰｒｏＢＮＰから選択することができる。プロＢＮＰが神経ホルモンマーカーとしては好ましい。
【０００９】
例えば、虚血マーカーとして、トロポニンＴまたはトロポニンＩを測定することができる。トロポニンＴは虚血マーカーとして特に好ましい。
【００１０】
炎症マーカーは、例えば、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、インターロイキン、特にＩＬ−６、ならびにＶＣＡＭおよびＩＣＡＭなどの接着分子から選択することができる。炎症マーカーとしてはＣＲＰまたはＩＬ−６が好ましい。
【００１１】
本発明の組み合わせ測定では、検査しようとする患者から得た１つ以上のサンプルに対して、複数のマーカーの並行測定を行うことが好ましい。その患者から採取した１つ以上のサンプル、例えば血液または血清サンプルに対して、１種以上の試験を同時に、またはすぐに続けて検査することが好ましい。その測定は単一の患者サンプルについて行うことが特に好ましい。
【００１２】
マーカーの組み合わせ測定は、原則的には、一般に市販されているアッセイ方法を用いて公知の任意の方法に基づいて行うことができる。例えば、自動分析機を測定に用いることができる。別の方法として、例えば、救急治療室、病棟、集中治療室、救急車、もしくは医師のオフィスなどで使用するための、または患者自身が行う試験法として、迅速アッセイ法を用いることもできる。
【００１３】
該マーカーの測定は、典型的にはそのマーカーに対する抗体を用いたイムノアッセイ法で行われる。炎症マーカーとしてのＣ−反応性タンパク質の検出に関しては例えば、Ｌｉｕｚｚｏら（Ｎ．　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．　３３１（１９９４），　４１７−４２４）、Ｋｕｌｌｅｒら（Ａｍ．　Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍ．　１４４（１９９６），　５３７−５４７）、Ｐｒｉｃｅら（Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ．　９９（１９８７），　２０５−２１１）、またはＥｄａら（Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｌａｂ．　Ａｎａｌ．　１２（１９９８），　１３７−１４４）を参照されたい。Ｃ−反応性タンパク質の特に好ましい検出法は、例えばＲｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＧｍｂＨ，　Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手できるＴｉｎａ−Ｑｕａｎ（登録商標）−Ｔｅｓｔなどの免疫濁度測定試験法（ｉｍｍｕｎｏｔｕｒｂｉｄｍｅｔｒｉｃ　ｔｅｓｔ）である。
【００１４】
神経ホルモンマーカーとしてのＢＮＰまたはＮＴ−ＰｒｏＢＮＰの検出については、例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓら（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　９７（１９９８）、１９２１−１９２９）、Ｓｔｒｕｔｈｅｒｓ（Ｅｕｒ．　Ｈｅａｒｔ　Ｊ．　２０（１９９９），　１３７４−１３７５）、Ｈｕｎｔら（Ｃｌｉｎ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．　４７（１９９７），　２８７−２９６）、　Ｔａｌｗａｒら（Ｅｕｒ．　Ｈｅａｒｔ　Ｊ．　２０（１９９９），　１７３６−１７４４）、Ｄａｒｂａｒら（Ａｍ．　Ｊ．　Ｃａｒｄｉｏｌ．　７８（１９９６），　２８４−２８７）、ならびにＥＰ−Ａ−０　６４８　２２８およびＷＯ　００／４５１７６に述べられている。特に好ましい試験法は電気化学発光イムノアッセイ、例えばＲｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＧｍｂＨ，　Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手できる「ＥＣＬＩＡ」試験フォーマットである。
【００１５】
虚血マーカーの例としてのトロポニンＴの測定に関しては、Ｋａｔｕｓら（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｃａｒｄｉｏｌ．　２１（１９８９），　１３４９−１３５３）、Ｈａｍｍら（Ｎ．　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．　３２７（１９９２），　１４６−１５０）、Ｏｈｍａｎｎら（Ｎ．　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．　３３５（１９９６），　１３３３−１３３４）、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｏｎら（Ｃｌｉｎ，．　Ｃｈｅｍ．　４４（１９９８），　４９４−５０１）およびその他の多数の文献、ならびにＥＰ−Ａ−０　３９４８１９を参照されたい。トロポニンＴの検出のための特に好ましい試験法は、電気化学発光イムノアッセイで、例えば、Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＧｍｂＨ，　Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手できるＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）　Ｔｒｏｐｏｎｉｎ−ＴおよびＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）　Ｔｒｏｐｏｎｉｎ−Ｔ　ＳＴＡＴ試験フォーマットである。
【００１６】
本発明のさらに別の１態様は、急性冠症候群の診断のための試薬キットであり、該キットは少なくとも３種類のマーカーを測定するための検出試薬を含んでおり、各場合について神経ホルモンマーカーの検出試薬が少なくとも１種存在し、各場合について虚血マーカーの検出試薬が少なくとも１種存在し、各場合について炎症マーカーの検出試薬が少なくとも１種存在する。
【００１７】
該試薬キットは、好ましくは複数のマーカーの並行測定に適するように、特に単一の患者サンプルに対する測定に適するように設計する。単一の試験フォーマットを用いて３種のマーカーの全てを測定することが可能な検出試薬を用いることが有利であり、そのようなものとしては例えば、Ｅｎｚｙｍｕｎ試験法、電気化学発光試験法、濁度測定法、または試験紙での迅速アッセイ法などが挙げられる。
【００１８】
該試薬キットは危険度の高いおよび／または予後不良の急性冠症候群の患者を同定するために用いることができる。該試薬キットは、自動分析機または迅速アッセイ法での測定に適するように設計することができる。
【００１９】
本発明をさらに実施例を用いて説明する。
【００２０】
【実施例】
実施例１
トロポニンＴ、ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰ、およびＣＲＰの３種のマーカーについての検査を、急性冠症候群（ＮＳＴＥＭＩ）の５００例の患者について行った。Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＧｍｂＨ，　Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手したＴｒｏｐｏｎｉｎ−Ｔ　ＳＴＡＴ−ＴＥＳＴをトロポニンＴの測定に用いた。Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＧｍｂＨ，　Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手したＴｉｎａ−Ｑｕａｎ（登録商標）ＣＲＰ　ＴｅｓｔをＣＲＰの測定に用い、Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＧｍｂＨ，　Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手したＥＣＬＩＡ　ＴｅｓｔをＮＴ−ＰｒｏＢＮＰの測定に用いた。各試験は製造者の使用説明書に従って行った。
【００２１】
３種のパラメーターは全て、３０日後の死亡および心筋梗塞で判断したとき、予後不良であった患者と３０日間異常のなかった患者とを区別し得た。
【００２２】
さらに、多変量解析によって、これら３種のパラメーターは互いに独立のものであることが明らかとなった。
【００２３】
実施例２
トロポニンＴ、ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰ、およびＣＲＰの３種のマーカーについての検査を、１８４８例の患者について行った。Ｒｏｃｈｅによる各ＥＬＩＳＡ試験を使用して、３種のパラメーターを全て測定した。実施例１の結果を確認することができた。トロポニンＴ試験（検出限界０．０１　ｐｇ／ｌ）については、０．１　ｐｇ／ｌのカットオフ値（陽性と陰性を区別する値）を使用した。ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰ試験（検出限界５　ｎｇ／ｌ）については、４００　ｎｇ／ｌのカットオフ値を使用した。ＣＲＰ試験（検出限界０．５　ｍｇ／ｌ）については、１５．０ｍｇ／ｌのカットオフ値を使用した。ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰ値は、特に、短期予後（例えば、７２時間）にとって重要である。
【００２４】
略語の説明：
ＮＳＴＥＭＩ：ＳＴ部分の上昇が見られない心筋梗塞
ＶＣＡＭ：ｖｃ接着分子
ＩＣＡＭ：ｉｃ接着分子
ＥＣＬＩＡ：電気化学発光イムノアッセイ
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、トロポニンＴ（ＴｎＴ）の曲線を示す。
【図２】図２は、ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰの曲線を示す。
【図３】図３は、ＣＲＰの曲線を示す。
【図４】図４は、ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰ値とトロポニンＴ値の相関関係を示す。検査した患者のうちの何人かにおいては、パラメーターのうちの１つのみに関して値の増加がみられることがわかる。
【図５】図５は、ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰ値とトロポニンＴ値の相関関係を示す。
【図６】図６は、パラメーターとしてのＮＴ−ＰｒｏＢＮＰおよびトロポニンＴ、ならびにこれらの組合せに関する、全ての患者（ａ）またはＮＳＴＥＭＩの患者（ｂ）における、死亡した患者または心筋梗塞（ＭＩ）を有する患者の割合の３０日間の追跡結果を示す。
【図１】
2004037455.tif 000002
【図２】
2004037455.tif 000003
【図３】
2004037455.tif 000004
【図４】
2004037455.tif 000005
【図５】
2004037455.tif 000006
【図６】
2004037455.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成15年7月10日(2003.7.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図６ａ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図６ａ】
図６ａは、パラメーターとしてのＮＴ−ＰｒｏＢＮＰおよびトロポニンＴ、ならびにこれらの組合せに関する、全ての患者における死亡した患者または心筋梗塞（ＭＩ）を有する患者の割合の３０日間の追跡結果を示す。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図６ｂ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図６ｂ】
図６ｂは、パラメーターとしてのＮＴ−ＰｒｏＢＮＰおよびトロポニンＴ、ならびにこれらの組合せに関する、ＮＳＴＥＭＩの患者における死亡した患者または心筋梗塞（ＭＩ）を有する患者の割合の３０日間の追跡結果を示す。


【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６ａ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図６ａ】
2004037455.tif 000008
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６ｂ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図６ｂ】
2004037455.tif 000009
【外国語明細書】
2004037455.tif 000010
2004037455.tif 000011
2004037455.tif 000012
2004037455.tif 000013
2004037455.tif 000014
2004037455.tif 000015
2004037455.tif 000016
2004037455.tif 000017
2004037455.tif 000018
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