(57)【要約】【課題】検出感度および特異性の高い核酸配列を検出する方法を提供する。【解決手段】基体と前記基体に固定化され標的配列に相補的な配列を含む核酸プローブとを具備する核酸プローブ固定化基体を用いて当該標的配列を含む標的核酸を検出する方法であって、（１）当該標的核酸が標的配列で前記核酸プローブとハイブリダイズしたときに当該標的配列部位の基体側末端部から４０塩基以内に前記標的核酸の末端が位置するように当該標的核酸を増幅するためのプライマーを準備することと、（２）前記（１）で準備されたプライマーを用いて試料核酸を増幅することと、（３）前記（２）で得られた増幅産物を一本鎖にすることと、（４）前記（３）で得られた一本鎖を前記核酸プローブと反応させることと、（５）前記（４）で生じたハイブリダイゼーションを検出することによって当該試料核酸中の標的核酸の存在を検出することとを具備する核酸検出方法。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基体と、前記基体に固定化され、標的配列に相補的な配列を含む核酸プローブとを具備する核酸プローブ固定化基体を用いて、当該標的配列を含む標的核酸を検出する方法であって、
（１）当該標的核酸が標的配列で前記核酸プローブとハイブリダイズしたときに、当該標的配列部位の基体側末端部から４０塩基以内に、前記標的核酸の末端が位置するように、当該標的核酸を増幅するためのプライマーを準備することと、
（２）前記（１）で準備されたプライマーを用いて試料核酸を増幅することと、
（３）前記（２）で得られた増幅産物を一本鎖にすることと、
（４）前記（３）で得られた一本鎖を前記核酸プローブと反応させることと、
（５）前記（４）で生じたハイブリダイゼーションを検出することによって、当該試料核酸中の標的核酸の存在を検出することと、
を具備する核酸検出方法。
【請求項２】
前記プライマーが、当該標的核酸が標的配列で前記核酸プローブとハイブリダイズしたときに、当該標的配列部位の基体側末端から２６塩基から１２塩基以内に、前記標的核酸の末端が位置するように、当該標的核酸を増幅するためのプライマーでることを特徴とする請求項１に記載の核酸検出方法。
【請求項３】
前記核酸プローブがスペーサを介して前記基体に固定化されていること特徴とする請求項１または２の何れか１項に記載の核酸検出方法。
【請求項４】
前記基体が、更に電気化学的検出を行うための電極を具備し、前記核酸プローブの固定化がその電極に対して固定されることによりなされることを特徴とする請求項１から３の何れか１項に記載の核酸検出方法。
【請求項５】
前記基体が、電気化学的検出を行うための電極であり、その電極に対して前記核酸プローブが固定化されることを特徴とする請求項１から３の何れか１項に記載の核酸検出方法。
【請求項６】
前記核酸プローブ固定化基体が、ＭｘＡ遺伝子の−８８位のＳＮＰの遺伝子型を決定するための核酸プローブを具備することと、前記プライマーが配列番号１２および配列番号１３で記載される核酸、その相補的核酸、並びに前記核酸の多型遺伝子の存在する部位以外において１若しくは数個のヌクレオチドの欠失、置換または付加のある核酸からなる群より選択される核酸からなることを特徴とする請求項１から５の何れか１項に記載の核酸検出方法。
【請求項７】
前記核酸プローブ固定化基体が、ＭｘＡ遺伝子の−１２３位のＳＮＰの遺伝子型を決定するための核酸プローブを具備することと、前記プライマーが配列番号１４および配列番号１５で記載される核酸、その相補的核酸、並びに前記核酸の多型遺伝子の存在する部位以外において１若しくは数個のヌクレオチドの欠失、置換または付加のある核酸からなる群より選択される核酸からなることを特徴とする請求項１から５の何れか１項に記載の核酸検出方法。
【請求項８】
前記核酸プローブ固定化基体が、ＭＢＬ遺伝子の４２５位のＳＮＰの遺伝子型を決定するための核酸プローブを具備することと、前記プライマーが配列番号１６および配列番号１７で記載される核酸、その相補的核酸、並びに前記核酸の多型遺伝子の存在する部位以外において１若しくは数個のヌクレオチドの欠失、置換または付加のある核酸からなる群より選択される核酸からなることを特徴とする請求項１から５の何れか１項に記載の核酸検出方法。
【請求項９】
前記核酸プローブ固定化基体が、ＭＢＬ遺伝子の８７５位のＳＮＰの遺伝子型を決定するための核酸プローブを具備することと、前記プライマーが配列番号１８および配列番号１９で記載される核酸、その相補的核酸、並びに前記核酸の多型遺伝子の存在する部位以外において１若しくは数個のヌクレオチドの欠失、置換または付加のある核酸からなる群より選択される核酸からなることを特徴とする請求項１から５の何れか１項に記載の核酸検出方法。
【請求項１０】
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５で記載される核酸、その相補的核酸、並びに前記核酸の多型遺伝子の存在する部位以外において１若しくは数個のヌクレオチドの欠失、置換または付加のある核酸からなる群より選択される核酸からなることを特徴とするプライマー。
【請求項１１】
前記プライマーが配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９で記載される核酸、その相補的核酸、並びに前記核酸の多型遺伝子の存在する部位以外において１若しくは数個のヌクレオチドの欠失、置換または付加のある核酸からなる群より選択される核酸からなることを特徴とするプライマー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標的核酸の存在を検出するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
最近、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイなどの所謂ＤＮＡチップを使ったＳＮＰやｍＲＮＡに関する解析が広く行われるようになってきた。ＤＮＡチップは、基板に複数種類の核酸プローブを具備する装置であり、これを使用すれば、複数の遺伝子情報が同時に検出できる。従って、そのような装置のテイラーメード医療や創薬の分野における実用化が期待されている。しかしながら、現在知られているＤＮＡチップの場合、検出感度および特異性が低いなどの問題点が指摘されており、このような問題が解決された新しい手法の開発が望まれている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上記のような状況に鑑み、本発明の目的は、検出感度および特異性の高い核酸配列を検出する方法およびそれに使用するプライマーを提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
上記の目的は、以下の本発明により達成される。即ち；
基体と、前記基体に固定化され、標的配列に相補的な配列を含む核酸プローブとを具備する核酸プローブ固定化基体を用いて、当該標的配列を含む標的核酸を検出する方法であって、
（１）当該標的核酸が標的配列で前記核酸プローブとハイブリダイズしたときに、当該標的配列部位の基体側末端部から４０塩基以内に、前記標的核酸の末端が位置するように、当該標的核酸を増幅するためのプライマーを準備することと、
（２）前記（１）で準備されたプライマーを用いて試料核酸を増幅することと、
（３）前記（２）で得られた増幅産物を一本鎖にすることと、
（４）前記（３）で得られた一本鎖を前記核酸プローブと反応させることと、
（５）前記（４）で生じたハイブリダイゼーションを検出することによって、当該試料核酸中の標的核酸の存在を検出することと、
を具備する核酸検出方法；
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５で記載される核酸、その相補的核酸、並びに前記核酸の多型遺伝子の存在する部位以外において１若しくは数個のヌクレオチドの欠失、置換または付加のある核酸からなる群より選択されることを特徴とするプライマー；および
前記プライマーが配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９で記載される核酸、その相補的核酸、並びに前記核酸の多型遺伝子の存在する部位以外において１若しくは数個のヌクレオチドの欠失、置換または付加のある核酸からなる群より選択されることを特徴とするプライマー；
である。
【０００５】
【発明の実施の形態】
１．発明の概要
本発明の１態様に従うと、基体と、前記基体に固定化された核酸プローブとを具備する核酸プローブ固定化基体を用いて行う核酸検出方法が提供される。当該核酸プローブは、標的配列に相補的な配列を有するように設計されている。試料核酸に標的配列が存在する場合には、当該核酸プローブ固定化基体上でハイブリダイゼーションが生じる。従って、本発明の装置は、基本的には、このハイブリダイゼーションの結果、生じた二本鎖核酸の存在を検出することにより、または当該核酸プローブにハイブリダイズした核酸の存在を検出することにより、試料核酸中に標的配列が存在することを検出することが可能である。
【０００６】
このような検出方法においては、核酸プローブとの相対的な関係における、核酸プローブに結合する標的配列を有した標的核酸の長さや、その標的核酸における標的配列の位置が問題となる。図１を参照されたい。即ち、核酸プローブと、標的核酸の長さおよび標的配列の位置との関係によっては、図１のＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥのような結合状態が得られる。標的配列よりも基体寄りの部分が標的核酸に長く存在する場合には、ハイブリダイゼーションの効率が低下したり、特異的なハイブリダイゼーションが阻害されるなどの問題が生じる。
【０００７】
本発明は、そのような問題に焦点をあて、それを解決しようとする観点における本発明者らの鋭意研究により、標的核酸に含まれる標的配列の位置と、当該標的配列よりも基体寄りの部分の好ましい長さを見出したことにより達成された。
【０００８】
即ち、本発明の態様に従うと、上述のような核酸プローブ固定化基体と試料核酸とを反応させる前に、好ましい標的核酸が得られるような核酸プローブを用いて試料核酸を増幅する工程を具備する方法が提供される。そのような核酸プローブは、標的核酸が標的配列で核酸プローブとハイブリダイズしたときに、当該標的配列部位の基体側末端部から約４０塩基以内、好ましくは約２６塩基〜約１２塩基に、前記標的核酸の末端が位置するように、試料核酸を増幅するためのプライマーであればよい。
【０００９】
本発明の態様に従って行う増幅は、それ自体公知の一般的に核酸を増幅する手段であれば何れでもよいが、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（一般的にＰＣＲと称される、以下、ＰＣＲと記す）や逆転写ＰＣＲなどを利用した方法を用いることが可能である。また、Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｔｒａｎｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＮＡＳＢＡ）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＴＭＡ）、Ｌｉｇａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＣＲ）、Ｓｔｒａｎｄ　ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＳＤＡ）、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｎｄ　Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ（ＩＣＡＮＮ）、Ｒｏｌｌｉｎｇ　ｃｉｒｃｌｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＣＡ）法等の増幅法も利用可能である。
【００１０】
２．用語の説明
ここで使用される「核酸」の語は、リボ核酸（即ち、ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（即ち、ＤＮＡ）、ペプチド核酸（即ち、ＰＮＡ）、メチルフォスホネート核酸、Ｓ−オリゴ、ｃＤＮＡおよびｃＲＮＡ等、並びに何れのオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド等、核酸及び核酸類似体を総括的に示す語である。また、そのような核酸は、天然に存在するものであっても、人工的に合成されたものであってもよい。
【００１１】
ここで「核酸プローブ」とは、標的配列に相補的な塩基配列を含む核酸であって、基体に固定化されるための核酸断片をいう。核酸プローブは、目的とする標的配列に相補的な配列を有し、それによって適切な条件下で標的配列とハイブリダイズすることが可能である。
【００１２】
ここで「標的配列」とは、その存在を検出したい塩基配列、または核酸プローブの塩基配列によって捕捉しようとする配列を指す。また、そのような標的配列を含む核酸を標的核酸と称す。
【００１３】
ここで使用される「相補」、「相補的」および「相補性」の語は、５０％〜１００％の範囲で相補的あればよく、好ましくは１００％で相補的であることをいう。また、ここで使用される「相同」、「相同的」および「相同性」の語は５０％〜１００％の範囲で相同であればよく、好ましくは１００％で相同的であることをいう
ここで使用される「スペーサ」の語は、核酸プローブと基板の間に配置されるある程度の長さを有した鎖状物質をいう。
【００１４】
ここで使用される「試料核酸」の語は、本願発明の態様に従う方法によって解析を行おうとする対象である核酸を指す。試料核酸は、個体から採取した試料、例えば、末梢静脈血等の血液、白血球、血清、尿、糞便、精液、唾液、培養細胞、臓器及び組織等の核酸が含有される試料から、それ自身公知の方法により抽出され調製されればよい。ここで使用される「個体」の語は、ヒト、ヒト以外の動物及び植物、並びにウイルス、細菌、バクテリア、酵母及びマイコプラズマ等の微生物であってもよい。試料は、必要に応じて、ホモジネートおよび抽出等の必要な任意の前処理を行ってもよい。このような前処理は試料に応じて当業者によって選択され得るであろう。
【００１５】
ここで使用される「ハイブリダイゼーションを検出する」の語は、生じた当該二本鎖核酸を検出すること、または試料核酸を予め何れかの標識物質により標識しておいて、ハイブリダイゼーション後にその標識物質に由来する信号を検出すること、或いはそれ自身公知の他の手段により、反応によって二本鎖核酸が存在することまたはハイブリダイゼーションが生じたことを検出することを総括的に示す語である。
【００１６】
３．核酸プローブ固定化基体
本発明の態様において使用され得る核酸プローブ固定化基体は、基本的には、基体と、前記基体に固定化された核酸プローブとからなる。好ましくは前記核酸プローブはスペーサを介して前記基体に固定化される。本発明の態様において使用される核酸プローブ固定化基体について、例を用いて以下に説明する。
【００１７】
（１）第１の例
図２を用いて、本発明の態様において使用され得る核酸プローブ固定化基体の第１の例を説明する。第１例である核酸プローブ固定化基体１は、基体２に具備された電極３に、スペーサ４を介して固定化された核酸プローブ５を具備する（図２）。電極３は、電気的情報を取り出すためのパット６に接続されている。図２では、便宜上、スペーサ４を太線で示し、核酸プローブ５を鎖状の線で示した。
【００１８】
このような核酸プローブ固定化基体１は、例えば、それ自身公知の手段によりシリコン基板に電極を配置し、その電極表面に対してスペーサを介して核酸プローブを固相化することにより製造することが可能である。
【００１９】
本態様においては、電極の数を６としたが１つの基体に配置する電極の数はこれに限定するものではない。また、電極の配置パターンも図２に示したものに限定されるものではなく、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。必要に応じて参照電極および対極を設けてもよい。そのような核酸プローブ固定化基体も本発明の範囲内である。
【００２０】
（２）第２の例
図３に本発明の態様に従い使用され得る核酸プローブ固定化基体の第２の例を模式的に示した。第２の例である核酸プローブ固定化基体１１は、基体１２に、スペーサ１３を介して固定化された核酸プローブ１４を具備する（図３）。図３においても、便宜上、スペーサ１３を太線で示し、核酸プローブ１４を鎖状の線で示した。
【００２１】
このような核酸プローブ固定化基体１１は、例えば、それ自身公知の手段によりシリコン基板に対してスペーサを介して核酸プローブを固相化することにより製造することが可能である。
【００２２】
本態様においては、１つの基体に配置する核酸プローブの数はこれに限定するものではなく、所望に応じて変更してもよく、また、複数種類の塩基配列を有する核酸プローブを１つの基体に配置してもよい。複数および／または複数種類の核酸プローブの基体への固相パターンは、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。そのような核酸プローブ固定化基体も本発明の範囲内である。
【００２３】
４．核酸プローブと標的核酸の結合状態
図４に、核酸プローブと標的核酸の結合状態の１例を示す。図４の左側には、核酸プローブ固定化基体３０と一般的な標的核酸の例を模式的に示す。基体３１に配置された電極３２の表面にリンカー剤３３ａおよびブロッキング剤３３ｂが処理されている。当該リンカー剤３３ａにより、核酸プローブ３５はスペーサ３４を介して電極３２に固定されている。このような核酸プローブ３５の配列に対して相補的な標的配列をその一部分に有する標的核酸３６を、その隣に並べて示した。
【００２４】
個体や組織および細胞などの対象から得られた試料や、それを所望に応じて処理して得られた試料から得られた試料核酸のうち、検出しようとする標的配列を含む標的核酸であっても、標的核酸の存在する位置は様々であると考えられる。図４の左図の試料核酸３６はそのような多様な標的核酸のうちの平均的な１例としてここに示した。
【００２５】
このように固定化された核酸プローブ３５と標的核酸３６がハイブリダイズした場合の状態を、基線３７から上部を比較するように図４の右側に示す。図から明かであるように、スペーサ３４の長さが「Ｘ」であり、核酸プローブ３５に対して標的配列を介して標的核酸３６がハイブリダイズした際に、標的配列部分の基体側の末端からこの標的核酸の基体側の末端までの長さが「Ｙ」である。
【００２６】
例えば、Ｘ＜Ｙの場合には、標的配列に相補的な配列を有する核酸プローブ３５と標的核酸３６とのハイブリダイズの効率は低い。即ち、このような場合には、標的核酸の長さや、その標的核酸における標的配列の位置を考慮すると、固定化される核酸プローブは基体表面近くに存在し過ぎる。そのために核酸プローブ同士が互いに立体障害の原因となったり、固相である基体が立体障害の原因となり得る。その結果、核酸プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション効率は低いと考えられる。
【００２７】
一方、Ｘ≧Ｙの場合には、標的配列に相補的な配列を有する核酸プローブ３５と標的核酸３６とのハイブリダイズの効率が高い。Ｘ≧Ｙの場合には、図４の右図から分かるように、核酸プローブと標的配列がハイブリダイズした場合に、標的配列よりも基体３１側に存在する標的核酸３６の部分に余剰は、仮にあったとしても短く、或いはそのような余剰は存在しない。また、スペーサ３４が、標的核酸の長さおよび標的配列の位置からみても、充分な長さがあるために、核酸プローブは、反応溶媒中で自由に動く範囲が広くなり（即ち、自由度が十分に大きく）、ハイブリダイゼーション反応中に標的配列と遭遇する確率が向上すると考えられる。
【００２８】
ＸとＹとの関係を図５に示す。図５のグラフは横軸がＸの長さであり、Ｙ軸がＹの長さである。中央の直線はＹ＝Ｘのグラフである。図中、領域Ａは、標的核酸と固相との立体障害を小さくするためにＸ＞Ｙを満たす領域である。領域Ｂは、領域Ａに含まれ、更に核酸プローブの自由度を向上させるためにＸ−１０＞Ｙを満たす領域である。領域Ｃは、Ｂ領域に含まれ、更に核酸プローブ合成の際の費用や収量を考慮した場合に望ましい領域である。領域Ｄは、Ｙが数１０Åよりも短い場合でも、Ｘは自由度を確保するために一定の長さが以上必要であるということを考慮した場合に、回避することが望ましい領域である。更に領域Ｅは、Ｙが０であるか、または極短いために、スペーサの有無や長さによってもハイブリダイゼーションの効率に影響が生じない領域である。
【００２９】
このような条件を満たすための手段として、標的配列を選択する際に工夫したり、試料から標的配列を含む標的核酸を増幅する場合に使用するプライマーの配列を選択する際に工夫したりすることが可能ある。
【００３０】
また、スペーサの長さを調節することも可能であるが、スペーサ３４を使用しない場合（即ち、Ｘ＝０）であっても、プライマーの配列を選択することによりＹの長さを調整することが可能である。
【００３１】
５．構成
核酸プローブの固定化をスペーサを介して行う場合を説明する。当該スペーサとして使用される物質の例は、有機鎖状分子であればよく、例えば、核酸、アルカンおよびポリエチレングリコールなどであればよい。
【００３２】
例えば、スペーサが核酸からなる核酸スペーサである場合、その塩基配列は、標的核酸や試料中に含まれ得る核酸と結合しないような配列とすることが好ましい。また、後述するような電気化学的検出により生じたハイブリダイゼーションを検出を行う場合、そこにおいて使用する二本鎖認識体の核酸塩基との結合傾向を考慮した配列とすることが好ましい。例えば、ヘキスト３３２５８は、シトシンとは結合し難く、チミンおよびグアニンとはやや結合し易く、アデニンとは結合し易い。従って、シトシンのみまたはシトシンを多く含有する塩基配列がより好ましく、チミンおよびグアニンからなるまたはそれらを多く含む塩基配列が好ましく、アデニンのみまたはアデニンを多く含有する塩基配列はあまり好ましくない。
【００３３】
このようなスペーサを配置することにより、核酸プローブと標的核酸との効率よいハイブリダイゼーションが達成される。
【００３４】
本発明において使用される核酸プローブは、一般的にプローブとして使用されるような長さであればよい。例えば、核酸プローブの長さは約３塩基長から約１０００塩基長であってよく、好ましくは約１０塩基長から約２００塩基長であってよい。
【００３５】
本発明において使用され得る基体は、標的配列とのハイブリダイゼーションを行うための核酸プローブが固定化される基体であればよい。核酸を固定化すべき基体の材質、大きさ、形状などは特に限定されるものではなく、核酸を固定化することが可能な任意の基体を使用してよい。そのような基体の例は、例えば、非多孔性、硬質および半硬質な材質であってよく、ウェル、溝または平らな表面を有する板状であっても、並びに球体および立方体などの立体形状からなる形態であってもよい。基体は、これに限定されるものではないが、シリコン、ガラスおよび石英などのシリカ含有基材、並びにポリアクリルアミド、ポリスチレンおよびポリカーボネート等のなどのプラスチックおよびポリマーなどで製造されてもよい。しかしながら、基体を使用せずに後述するような電極自体を基体として、または核酸プローブを担持するための担体として使用することも可能である。
【００３６】
蛍光検出を行うための核酸プローブ固定化基体の場合は、上記の何れかの基体に対して核酸プローブをスペーサを介して固定化すればよい。また、電気化学的検出を行うための核酸プローブ固定化基体の場合は、上記の何れかの基体に電気化学的な検出が可能であるように電極を配置し、その電極上に核酸プローブを固定化すればよい。
【００３７】
本発明において使用され得る電極は、特に限定されるものではないが、例えば、グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバーのような炭素電極、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウムのような貴金属電極、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛のような酸化物電極、Ｓｉ、Ｇｅ、　ＺｎＯ、　ＣｄＳ、　ＴｉＯ２　、ＧａＡｓのような半導体電極、チタン等が挙げられる。これらの電極は導電性高分子によって被覆しても、単分子膜によって被覆してもよく、所望に応じてその他の表面処理剤を処理してもよい。
【００３８】
スペーサを介しての核酸プローブの固定は、それ自身公知の何れの手段によっても行ってよい。例えば、スペーサを電極に対して固定し、その後、更にスペーサに対して核酸プローブを固定してもよい。または、予め核酸プローブにスペーサを結合させ、若しくは核酸プローブとスペーサを同時に調製し、当該スペーサを介して電極に固定してもよい。或いは、電極上でスペーサと核酸プローブをそれ自身公知の手段によって合成していってもよい。また、スペーサを介しての核酸プローブの固定は、処理または無処理の基体または電極表面に対して当該スペーサを、共有結合、イオン結合または物理吸着等によって直接固定化してもよい。或いは、スペーサ介しての核酸プローブの固定を助けるリンカー剤を用いてもよく、そのようなリンカー剤を利用し、基板または電極に対してスペーサを介して核酸プローブを固定化してもよい。また、電極に対する試料核酸の非特異的な結合を防止するためのブロッキング剤をリンカー剤と共に電極に処理してもよい。また、ここで使用されるリンカー剤およびブロッキング剤は、例えば、電気化学的検出を有利に行うための物質であってもよい。
【００３９】
また、異なる塩基配列を有する核酸プローブは、それぞれ、異なる電極に対してスペーサを介して固定化されてもよく、異なる塩基配列を有する複数種類の核酸プローブが混合された状態で１つの電極に対してスペーサを介して固定化されてもよい。
【００４０】
６．検出
本発明に従う核酸プローブ固定化基体は、前記基体に固定化された核酸プローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーション反応の結果生じた二本鎖の存在を検知するための手段として、電気化学的方法および蛍光検出法を利用することが可能である。
【００４１】
（１）電気化学的検出
電気化学的による二本鎖核酸の検出は、例えば、それ自身公知の二本鎖認識物質を用いて行えばよい。
【００４２】
ここで用いられる二本鎖認識体は特に限定されるものではないが、例えば、ヘキスト３３２５８、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーターおよびポリインターカレーター等を用いることが可能である。更に、これらのインターカレーターを電気化学的に活性な金属錯体、例えば、フェロセン、ビオロゲン等で修飾しておくことも可能である。また、その他の公知の何れの二本鎖認識物質も本発明において好ましく使用される。
【００４３】
本発明に従う核酸プローブ固定化基体では、スペーサを介して核酸プローブが電極に固定化されている。このような電極を用いての二本鎖核酸の検出は他の一般的な電気化学的検出法と同じように、更に対極や参照極を使用してもよい。参照極を配置する場合、例えば、銀／塩化銀電極や水銀／塩化水銀電極などの一般的な参照極を使用してよい。
【００４４】
例えば、試料核酸中に標的核酸が含まれているか否かを検出する場合には、以下のように試験を行えばよい。例えば、ヒトを含む動物などの個体、組織または細胞などの対象から採取した試料より核酸成分を試料核酸として抽出する。得られた試料核酸は、必要に応じて、逆転写、伸長、増幅および／または酵素処理などの処理を行う。
【００４５】
前処理された試料核酸を、本発明の態様に従うプライマーを用いて増幅する。得られた増幅産物をそれ自身公知の手段により一本鎖にし、核酸プローブ固定化基体に固定化された核酸プローブと接触させる。続いて、適切なハイブリダイゼーションが可能な条件下で反応を行う。そのような適切な条件は、標的配列に含まれる塩基の種類、核酸プローブ固定化基体に具備されるスペーサおよび核酸プローブの種類、試料核酸の種類およびそれらの状態などの諸条件に応じて、当業者であれば適宜選択することが可能である。これに限定されるものではないが、例えば以下のような条件下で反応を行ってもよい。
【００４６】
即ち、ハイブリダイゼーション反応溶液は、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液中で行う。この溶液中にはハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキストラン、並びに、サケ精子ＤＮＡ、牛胸腺ＤＮＡ、ＥＤＴＡおよび界面活性剤などを添加してもよい。ここに得られた試料核酸を添加し、９０℃以上で熱変性させる。熱変性された試料核酸への核酸プローブ固定化基体の挿入は、変性直後、あるいは０℃に急冷後に行ってもよい。また、基体上に液を滴下することでハイブリダイゼーション反応を行うことも可能である。
【００４７】
反応中は、撹拌、あるいは振とうなどの操作で反応速度を高めてもよい。反応温度は、例えば、１０℃〜９０℃の範囲で、反応時間は１分以上１晩程度で行えばよい。ハイブリダイゼーション反応後、電極を洗浄する。洗浄には、例えば、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いればよい。試料核酸中に標的配列を含む標的核酸が存在した場合、核酸プローブとハイブリダイズし、それにより二本鎖核酸が生じる。
【００４８】
続いて、電気化学的手段により、以下のような手順で生じた二本鎖核酸の検出を行う。一般的には、ハイブリダイゼーション反応の後に、基体を洗浄し、電極表面に形成された二本鎖部分に二本鎖認識体を作用させて、それにより生じる信号を電気化学的に測定する。
【００４９】
二本鎖認識体の濃度は、その種類によって異なるが、一般的には１ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの範囲で使用する。この際には、イオン強度０．００１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いればよい。
【００５０】
例えば、電気化学的な測定は、二本鎖認識体が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加し、二本鎖認識体に由来する反応電流値を測定してよい。この際、電位は定速で掃引するか、あるいはパルスで印加するか、あるいは、定電位を印加してもよい。測定の際に、例えば、ポテンショスタット、デジタルマルチメーターおよびファンクションジェネレーター等の装置を用いて電流、電圧を制御してもよい。例えば、得られた電流値を基に、検量線から標的核酸の濃度を算出してもよい。
【００５１】
また、それ自体公知の電気化学的検出手段、例えば、以下の文献に開示されている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．　１９９４，　Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．　１９９８）手段なども本発明の方法において好ましく使用できる。当該文献において、橋本らは、ＤＮＡプローブで修飾された金電極と電気化学的に活性な色素を用いる配列特異的遺伝子検出を報告した。色素に由来する陽極の電流は、標的ＤＮＡの濃度に相関する。また、ワンらは、インディケーターフリーの電気化学的なＤＮＡのハイブリダイゼーションを報告した。このバイオセンサーの構成は、カーボンペースト電極へのイノシン置換プローブ（グアニンを含まない）の固定化と、当該標識のグアニン酸化ピークの存在による二重鎖の形成のクロノポテンショメトリック検出を含む。これらの文献に記載される検出手段は好ましく本発明において使用されてよい。
【００５２】
（２）蛍光検出法
蛍光標識物質を用いる方法の場合には、試料核酸が、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５若しくはローダミンなどの蛍光色素、またはビオチン、ハプテン、オキシダーゼ若しくはポスファターゼ等の酵素、またはフェロセン若しくはキノン類等の電気化学的に活性な物質で標識される。或いは前述した物質で標識したセカンドプローブを用いることで検出を行う。複数の標識物質を同時に使用してもよい。
【００５３】
幾つかの態様においては、試料から抽出した核酸成分とプローブ固定化チップに固定化されたプローブとのハイブリダイゼーション反応は、例えば、以下のように行う。即ち、ハイブリダイゼーション反応溶液は、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液中で行う。この溶液中にはハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキストラン、並びに、サケ精子ＤＮＡ、牛胸腺ＤＮＡ、ＥＤＴＡおよび界面活性剤などを添加してもよい。ここに抽出した核酸成分を添加し、９０℃以上で熱変性させる。プローブ固定化チップの挿入は、変性直後、あるいは０℃に急冷後に行ってよい。また、基体上に液を滴下することでハイブリダイゼーション反応を行うことも可能である。反応中は、撹拌、あるいは振とうなどの操作で反応速度を高めてもよい。反応温度は、例えば、１０℃〜９０℃の範囲で、反応時間は１分以上１晩程度で行えばよい。ハイブリダイゼーション反応後、洗浄を行う。洗浄には、例えば、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いる。
【００５４】
蛍光検出の場合、ハイブリダイゼーション反応の検出は、標識の種類に応じた適宜の検出装置を用いて、試料中の標識された塩基配列又は２次プローブ中の標識を検出することによって行う。標識が蛍光物質の場合には、例えば、蛍光検出器を用いて標識を検出すればよい。
【００５５】
本発明に従う核酸解析方法は、サンプル中に含まれる検体核酸の解析、例えば、標的配列の存在の検出および定量、遺伝子発現の出現消失などの発現解析、ゲノムにおける単塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、即ち、ＳＮＰ）やマイクロサテライト配列などの多型の解析、疾患関連遺伝子の解析による疾患の診断や発症危険率の予測、感染の存在の検出、ウイルス型の解析、並びに毒性試験などを実施する場合などに利用され得る。従って、臨床的診断や発症予測などの種々の臨床的目的のために利用され得る。また、例えば、食品検査、検疫、医薬品検査、法医学、農業、畜産、漁業および林業など、種々の基礎的研究および応用研究などに広範に利用され得る。
【００５６】
７．プライマー
本発明の態様に従うプライマーは、標的核酸が標的配列で核酸プローブとハイブリダイズしたときに、当該標的配列部位の基体側末端部から４０塩基以内の近傍に、前記標的核酸の末端が位置するように、当該標的核酸を増幅するためのプライマーであれば、特に限定されるものではない。
【００５７】
本発明の態様に従って使用されるプライマーは、約８ヌクレオチド以上５００ヌクレオチド以下の核酸であり、より好ましくは１０ヌクレオチド以上１００ヌクレオチド以下の核酸、更に好ましくは、１５ヌクレオチド以上３０ヌクレオチド以下の核酸、または１０ヌクレオチド以上１５ヌクレオチド以下の核酸である。
【００５８】
そのようなプライマーの例は、ＭｘＡ遺伝子の二箇所（−８８位と−１２３位）のＳＮＰの遺伝子型を夫々決定するために、本発明の態様に従う方法に供される標的核酸を増幅するためのプライマーである。
【００５９】
そのようなプライマーは、例えば、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５で記載される核酸、その相補的核酸、並びに前記核酸の多型遺伝子の存在する部位以外において１若しくは数個のヌクレオチドの欠失、置換または付加のある核酸からなる群より選択される核酸を含むプライマーである。
【００６０】
更なるプライマーの例は、ＭＢＬ遺伝子の二箇所（４２５位と８７５位）のＳＮＰの遺伝子型を夫々決定するために、本発明の態様に従う方法に供される標的核酸を増幅するためのプライマーである。
【００６１】
そのようなプライマーは、例えば、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９で記載される核酸、その相補的核酸、並びに前記核酸の多型遺伝子の存在する部位以外において１若しくは数個のヌクレオチドの欠失、置換または付加のある核酸からなる群より選択される核酸を含むプライマーである。
【００６２】
以下、上記のＳＮＰについて説明する。
【００６３】
例えば、Ｃ型肝炎に感染すると、肝硬変を経て肝癌に進行することが知られている。その治療法の１つにインターフェロン（以下、ＩＦＮと記す）を投与するＩＦＮ治療がある。多くはＩＦＮαおよびβが治療に使用されている。しかし、ＩＦＮの有効性には大きなばらつきがあることが知られている。例えば、日本人のヒト患者ではＩＦＮ治療は約２〜３割の人にしか効果がなく、効果があっても非常に強い副作用が報告されている。このような個体の違いによる治療効果の違いは、個体が感染したＣ型肝炎ウイルス（以下、ＨＣＶと記す）の遺伝子型（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　３４，　２５１６　（１９９６））及び存在するウイルスの量に加えて、個体自身が有する核酸配列の個体差に起因していると考えられる。
【００６４】
Ｃ型肝炎に関するＩＦＮ治療の効果を予測する方法の例は、特願２００１−６２３７１号及び特願２００１−６２３７２号で報告されている。即ち、ヒト遺伝子のＭｘＡたんぱく質をコードする遺伝子のプロモーター領域、即ち、ＭｘＡのプロモーター領域の−８８位（以下、ＭｘＡ−８８と記す）に存在する特定の一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、以下ＳＮＰと記す）がＩＦＮ治療効果の大小を決定するため、そのＳＮＰを調べることによりＩＦＮ治療効果の大小を予測する方法である。即ち、ＩＮＦは、ＭｘＡプロモーター領域のＳＮＰの特定の型を有する患者においては有効である。したがって、そのＳＮＰの存在をチェックすることにより、ＩＦＮ療法の効果が評価される。
【００６５】
上記の知見では、当該ＭｘＡのプロモーター領域の−８８位（以下、ＭｘＡ−８８と記す）がＧ／Ｇ型の場合にはＩＦＮ治療効果が低く、Ｇ／ＴおよびＴ／Ｔ型の場合には治療効果が高いこと、同領域の−１２３位（以下、ＭｘＡ−１２３と記す）がＣ／Ｃ型の場合にはＩＦＮ治療効果が低く、Ｃ／ＡおよびＡ／Ａ型の場合には治療効果が高いことを基にＩＦＮの治療効果を予測する。ここで「−８８位」および「−１２３位」の表記は、ＭｘＡ遺伝子の転写開始部位を＋１とした場合の位置である。
【００６６】
また、更なるＣ型肝炎に関するＩＦＮ治療の効果を予測する方法の例としては、マンノース結合レクチン（以下、ＭＢＬと記す）の遺伝子の二箇所のＳＮＰのタイプによって、ＩＦＮ治療効果の大小を予測する方法が知られている（Ｍ．Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，　２９；６９５−７００，　１９９８）。ＭＢＬは、生来の免疫系の重要な因子であり、遺伝子多型が存在する。ＭＢＬ遺伝子型のグループ「ＸＢ」は、ＩＦＮに反応しない。ローセンは、ＭＢＬの配列について報告している（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　９３，　４２１　（１９９８））。従って、上記のようなＭｘＡたんぱく質をコードする遺伝子のプロモーター領域の遺伝子診断の共に、またはそれに代わってマンノース結合レクチン（以下、ＭＢＬと記す）の遺伝子に関する遺伝子診断を行うことが可能である。
【００６７】
ＩＦＮの効果に影響を及ぼすＭＢＬの多型部位は、ＭＢＬ遺伝子のプロモータ領域の−２２１位（以下、ＭＢＬ−２２１と記す）と、ＭＢＬ遺伝子のエクソン１のコドン５２、５４および５７に存在する。ここで「−２２１位」の表記は、ＭＢＬ遺伝子の転写開始部位を＋１とした場合の位置である。
【００６８】
ＭＢＬ−２２１の遺伝子型の取り得る塩基は、ＣまたはＧであり、Ｃの場合にはタイプＸと称し、Ｇの場合にはタイプＹと称す（この命名法はマッドセンらに従う；Ｍａｄｓｅｎ　ＨＯ，　Ｇａｒｒｅｄ　Ｐ，　Ｔｈｉｅｌ　Ｓ，　Ｋｕｒｔｚｈａｌｓ　ＪＡＬ，　Ｌａｍｍ　ＬＵ，　Ｒｙｄｅｒ　ＬＰ，　ｅｔ　ａｌ．　「プロモータと構造遺伝子との間の相互作用はヒトマンナン結合蛋白質の最低血清レベルをコントロールする」　Ｊ　Ｉｍｍｕｏｌ　１９９５；１５５：３０１３−２０）。
【００６９】
また、ＭＢＬ遺伝子のエクソン１のコドン５２、５４および５７は、構造遺伝子であるコラーゲン様ドメイン内に存在する。コドン５２の取り得る遺伝子型は、ＣＧＴまたはＴＧＴであり、マッドセンらの分類によると前者がタイプＡ、後者がタイプＤである。同様に、コドン５４の取り得る遺伝子型は、ＧＧＣまたはＧＡＣであり、同分類によると前者がタイプＡ、後者がタイプＢである。また、コドン５７の取り得る遺伝子型はＧＧＡまたはＧＡＡであり、同分類によると前者がタイプＡ、後者がタイプＣである。これら全てコドンにおいて、タイプＡは野生型対立遺伝子であり、その他のタイプＢ、ＣおよびＤは変異型対立遺伝子である。コドン５２、５４および５７の対立遺伝子が全てタイプＡである場合には、他の場合、即ち、少なくとも何れかの対立遺伝子がタイプＡではない場合に比較してＩＦＮの効果は高い。
【００７０】
上記ＭＢＬ−２２１がタイプＹであり、且つコドン５２、５４および５７の対立遺伝子がタイプＡである、ＹＡ−ＹＡホモ接合である患者の場合、他のタイプの患者に比べてＩＦＮの効果は得られやすい。また、上記ＭＢＬ−２２１がタイプＹであり、且つコドン５２、５４および５７の対立遺伝子の何れかがタイプＡではない場合、即ち、ＹｎｏｎＡ−ＹＡヘテロ接合またはＹｎｏｎＡ−ＹｎｏｎＡホモ接合である患者の場合には、ＹＡ−ＹＡホモ接合の患者に比べてＩＦＮの効果は得られにくい。
【００７１】
配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７の塩基配列は、ヒトＭｘＡ遺伝子のプロモーター領域を包含する塩基配列であり、これらの塩基配列の４５５位および４２０位に存在するＳＮＰがＩＦＮ療法の効果に対する応答性に関与している
配列番号２０〜２３の塩基配列は４５５位の塩基を除き共通の配列を有する。配列番号２０の４５５位はチミンである。配列番号２１の４５５位はグアニンである。また、配列番号２２の４５５位アデニンである。配列番号２３の４５５位はシトシンである。
【００７２】
これらの４５５位の塩基がチミンである配列番号２０の核酸配列を有するＨＣＶ感染者は、ＩＦＮ療法が有効であるのに対して、４５５位の塩基がチミンである配列番号２０の核酸配列を持たないＨＣＶ感染者は、ＩＦＮ療法が有効でない。つまり、４５５位の塩基配列がチミンである配列番号２０の核酸と、４５５位の塩基配列がグアニンである配列番号２１の核酸をヘテロ接合で有する（以下、Ｇ／Ｔヘテロと略記する）ＨＣＶ感染者、又は４５５位の塩基配列がチミンである配列番号２０の核酸をホモ接合で有する（以下、Ｔ／Ｔホモと略記する）ＨＣＶ感染者と比べて、４５５位の塩基配列がグアニンである配列番号２１の核酸をホモ接合で有する（以下、Ｇ／Ｇホモと略記する）ＨＣＶ感染者はＩＦＮ療法が有効でない。
【００７３】
あるいは、Ｔ／ｎｏｎ−Ｔヘテロ又はＴ／ＴホモのＨＣＶ感染者と比べて、４５５位の塩基配列がチミンでないＭｘＡ遺伝子のプロモーター領域をホモ接合で有するＨＣＶ感染者（以下、ｎｏｎ−Ｔ／ｎｏｎ−Ｔホモと略記する）は、ＩＦＮ療法が有効でないことが示された。ｎｏｎ−Ｔ／ｎｏｎ−Ｔホモの組み合わせとしてはＧ／Ｇ、Ｇ／Ａ、Ｇ／Ｃ、Ａ／Ａ、Ａ／Ｃ、Ｃ／Ｃがある。Ｔ／ｎｏｎ−Ｔの組み合わせとしては、Ｔ／Ｇ、Ｔ／Ａ、Ｔ／Ｃがある。
【００７４】
配列番号２４〜２７の塩基配列は４２５位の塩基を除き共通の配列を有する。配列番号２４の４２５位はアデニンである。配列番号２５の４２５位はシトシンである。また、配列番号２６の４２５位はチミンである。配列番号２７の４２５位はグアニンである。
【００７５】
ＭＢＬ−２２１とコドン５２、５４および５７にコードされる多型を含むＭＢＬ遺伝子を配列番号２８から配列番号４３に示す。ＭＢＬ−２２１はこれらの配列の４２５位に存在する。配列番号２８から配列番号４３には、夫々、異なる遺伝子型の場合の配列を示す。
【００７６】
また、エクソン１はこれらの配列の６４６位から始まり、コドン５２は同８６８から８７０位に、コドン５４は同８７４から８７６位に、コドン５７は同８８３から８８５位に存在する。コドン５２のＳＮＰは同８６８位に、コドン５４のＳＮＰは同８７５位に、コドン５７のＳＮＰは同８８４位に存在する。
【００７７】
本発明の態様に従うプライマーにより増幅された被検核酸は、核酸プローブ固定化基体を用いた核酸の検出方法において好ましく使用される。従って、本発明により提供されるプライマーを用いることにより、簡便、高速、高感度に特定の核酸配列を特異的に検出することが可能となる。
【００７８】
本発明の態様において使用されるＭｘＡ遺伝子の−８８位のＳＮＰの遺伝子型を決定するための核酸プローブ、ＭｘＡ遺伝子の−１２３位のＳＮＰの遺伝子型を決定するための核酸プローブ、ＭＢＬ遺伝子の４２５位のＳＮＰの遺伝子型を決定するための核酸プローブおよびＭＢＬ遺伝子の８７５位のＳＮＰの遺伝子型を決定するための核酸プローブは、夫々、目的とする遺伝子多型の部位を含み、且つ当該遺伝子の配列に相同するまたは相補的な核酸プローブであればよい。また、そのような核酸プローブは、当該核酸の目的とする多型遺伝子の存在する部位以外において１若しくは数個のヌクレオチドの欠失、置換または付加のある核酸であってもよい。そのような核酸プローブは、核酸であればよく、その長さは一般的に使用される核酸プローブの長さを有すればよい。
【００７９】
【実施例】
実施例１
図６は、本発明の第１の実施形態に係る増幅断片とプローブ関係を示す図である。図６ではヒトゲノム中のＭｘＡ遺伝子検出系での結果を示した。図６に、配列番号１の核酸プローブと二種類のＰＣＲ産物を示した。配列番号１の核酸プローブは、２０塩基のスペーサ部分を有している。ＰＣＲ産物Ａは５‘末端をビオチン化した配列番号２とｃｙ５標識した配列番号３のプライマーを用いて作製した。ＰＣＲ産物Ｂは５‘末端をビオチン化した配列番号４番とｃｙ５標識した配列番号５のプライマーを用いて作製した。一本鎖の調製はアビジン標識磁気微粒子を用いて行った。図６でＡは核酸プローブ結合部位の末端からの距離が１２塩基（図中、１２ｍｅｒ）、Ｂは２６塩基（図中、２６ｍｅｒ）である。このターゲットを用いてハイブリダイゼーション反応を行い、蛍光強度を測定した。その結果、ＡはＢの約１０倍の蛍光強度示した（図７）。
【００８０】
また、Ｂは約１時間で反応がほぼ飽和に達したのに対し、Ａは約１０分で反応が飽和に達した。更に、ＳＮＰ検出の特異性を調べた結果、Ａ、Ｂ間でＳ／Ｎが約２倍異なっていた。
【００８１】
実施例２
図８は、本発明の第２の実施形態に係る増幅断片とプローブ関係を示す図である。図８ではヒトゲノム中のＭＢＬ遺伝子検出系での結果を示した。図８において配列番号６のプローブと三種類のＰＣＲ産物を示した。ＰＣＲ産物Ｃは５’末端をリン酸化した配列番号７番とｃｙ５標識した配列番号８のプライマーを用いて作製した。ＰＣＲ産物Ｄは５’末端をリン酸化した配列番号９番とｃｙ５標識した配列番号８のプライマーを用いて作製した。ＰＣＲ産物Ｅは５’末端をリン酸化した配列番号１１番とｃｙ５標識した配列番号１０のプライマーを用いて作製した。更に、ＰＣＲ産物のプローブ結合部位の末端からの距離が４０塩基となるようなプライマーを用いた。一本鎖の調製はλヌクレアーゼを用いて行った。図８に示すようにＰＣＲ産物は、それぞれ、Ｃはプローブ結合部位の末端からの距離が１３塩基（図中、１３ｍｅｒ）、Ｄは３３塩基（図中、３３ｍｅｒ）、Ｅは４８塩基（図中、４８ｍｅｒ）である。図示はしないが、更に、プローブ結合部位の末端からの距離が４０塩基となるＰＣＲ産物も得られた。これらのターゲットを用いてハイブリダイゼーション反応を行い蛍光強度を測定した。その結果、ＣはＤの約６倍、Ｅの約４０倍の蛍光強度を示した（図９）。
【００８２】
また、図１０には電気化学的な手法によるＭＢＬ検出系の検出結果を示した。それぞれのターゲットとハイブリダイゼーション反応後、ヘキスト３３２５８の電流測定を行った。その結果、ターゲットＣはＤの約３倍、Ｅの１０倍以上の電流値を示した。
【００８３】
以上の結果から、核酸プローブの結合する部位の中心から４０塩基以上プライマーの３’末端が、離れた部位に位置するとハイブリダイゼーション効率が大幅に低下することがわかった。更に、特異性も低下する現象が見られたことから、高速、高選択性、高感度に核酸検出を行うためには核酸プローブの結合する部位の中心から４０塩基以内に位置するプライマーを用いて増幅することが重要である。
【００８４】
【発明の効果】
上述のような本発明により、検出感度および特異性の高い核酸配列を検出する方法およびそれに使用するプライマーが提供された。
【００８５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の態様に従う核酸プローブ固定化基体と標的核酸の結合状態を示す図。
【図２】本発明の態様に従う核酸プローブ固定化基体の例を示す図。
【図３】本発明の態様に従う核酸プローブ固定化基体の例を示す図。
【図４】本発明の態様に従う核酸プローブ固定化基体と標的核酸の結合状態を示す図。
【図５】ＸとＹの関係を示すグラフ。
【図６】実施例１で使用されたプライマーと標的核酸を示す図。
【図７】実施例１で得られた結果を示す図。
【図８】実施例２で使用されたプライマーと標的核酸を示す図。
【図９】実施例２で得られた結果を示す図。
【図１０】実施例２で得られた結果を示す図。
【符号の説明】
１．核酸プローブ固定化基体　　２．基体　　３．電極　　４．スペーサ　　５．核酸プローブ　　６．パット　　１１．核酸プローブ固定化基体　　２．基体
１３．スペーサ　　１４．核酸プローブ　　３０．核酸プローブ固定化基体
３１．基体　　３２．電極　　３３．リンカー＆ブロッキング剤　　３４．スペーサ　　３５．核酸プローブ　　３６．標的核酸
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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