(57)【要約】【課題】微生物を利用して、キチン原料から直接にＮ‐アセチルグルコサミンを効率よく製造する新規な方法を提供する。【解決手段】キチン原料に、海洋低温細菌ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属に属するキチナーゼ生産菌の培養液を加えて培養を行い、その培養基中よりＮ‐アセチルグルコサミンを回収することによりＮ‐アセチルグルコサミンを製造する。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キチン原料に、海洋低温細菌ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属に属するキチナーゼ生産菌の培養液を加えて培養を行い、その培養基中よりＮ‐アセチルグルコサミンを回収することを特徴とするＮ‐アセチルグルコサミンの製造方法。
【請求項２】
エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含む培養基を用いる請求項１記載のＮ‐アセチルグルコサミンの製造方法。
【請求項３】
キチン原料として、イカの甲殻の構成成分であるβ‐キチンを用いる請求項１又は２記載のＮ‐アセチルグルコサミンの製造方法。
【請求項４】
キチンの原料がキチン、再生キチン、キチン分解物及びキチン誘導体の中から選ばれた少なくとも１種である請求項１又は３記載のＮ‐アセチルグルコサミンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物を用いてキチン原料からＮ‐アセチルグルコサミンを製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
キチンは、Ｎ‐アセチルグルコサミンを構成単位とする多糖であり、微生物界、植物界及び動物界にわたって広く存在しており、その年間生産量はセルロースに匹敵し、最も豊富なバイオマス資源の１つとして注目されている。
そして、このキチンを強酸によって加水分解して得られるグルコサミンは、変形性関節炎の症状を改善することが知られ、欧米では医薬品として、わが国では食品素材として、その需要が増加する傾向にある。
【０００３】
ところで、最近に至り、Ｎ‐アセチルグルコサミンについては、これがグルコサミンと同様の作用を有することが判明し、しかもグルコサミンは苦味を呈するのに対し、Ｎ‐アセチルグルコサミンは爽やかな甘味を有するため摂取しやすいという利点があるため、グルコサミンに代わるものとしてＮ‐アセチルグルコサミンが注目されるようになってきた。
【０００４】
このＮ‐アセチルグルコサミンは、これまで、カニ、エビなどの甲殻を水酸化ナトリウム水溶液内で熱処理し、タンパク質を除去したのち、塩酸で灰分を除いて得られるキチンを原料とし、これを塩酸加水分解してグルコサミンを生成させ、次いでこれを無水酢酸でアセチル化することにより製造されていた。
しかしながら、このようにして得たＮ‐アセチルグルコサミンは化学合成工程を含むという理由で食品素材として用いることはできなかった。
【０００５】
他方、キチン分解酵素を生産する微生物の存在が知られている。一般に酵素は基質特異性を有し、特定の基質の特定の部位のみに作用して所定の物質を生成するので、副生物が少なく、所望の目的物が選択的に得られる上に、温和な反応条件を用いることができるため、工業的に実施する場合にコストを軽減しうるという利点があるにもかかわらず、これまで酵素を利用してキチンからＮ‐アセチルグルコサミンを製造する方法は知られていなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、微生物を利用して、キチン原料から直接にＮ‐アセチルグルコサミンを効率よく製造する新規な方法を提供することを目的としてなされたものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、キチンを原料としてＮ‐アセチルグルコサミンを製造する方法について種々研究を重ねた結果、海洋では大量のキチンが生産されるが、これは微生物によって分解され、海洋の安定した生態系が保たれていること、したがってこの微生物すなわち海洋低温細菌ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属に属する菌が生産する酵素のキチナーゼを利用すれば、キチンから１段階でＮ‐アセチルグルコサミンを生成しうることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、キチン原料に、海洋低温細菌ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属に属するキチナーゼ生産菌の培養液を加えて培養を行い、その培養基中よりＮ‐アセチルグルコサミンを回収することを特徴とするＮ‐アセチルグルコサミンの製造方法を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明方法においては、キチンを原料として用いる。このキチンには、カニやエビなどの甲殻を構成するα‐キチンとイカの甲殻を構成するβ‐キチンとが存在し、いずれもＮ‐アセチルグルコサミンのβ‐１，４結合重合体である。本発明方法においては、このいずれも用いることができるが、特に軟質結晶構造を有するβ‐キチンを用いるのが好ましい。
【００１０】
次に、本発明方法においては、原料のキチンに、キチンを資化する海洋低温細菌ビブリオ属に属するキチナーゼ生産菌を作用させて加水分解する。このキチナーゼ生産菌としては、海洋低温細菌ビブリオ属に属し、キチン資化能を有する微生物であれば、どのようなものでもよく、特に制限はない。このような微生物としては、例えば、房総沖日本海溝の深層水から分離された海洋低温細菌Ｐ２Ｋ−５菌株を挙げることができる。この菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−５７６９として寄託されており、以下に示す菌学的性質を有している。
【００１１】
１．形態的性質
（１）細胞形態：稈状（ｒｏｄ）
（２）鞭毛形態：極べん毛
（３）グラム染色：陰性
【００１２】
２．生理的性質
（１）増殖温度：４℃＋、２５℃＋、３０℃＋
（２）Ｏ−Ｆテスト：Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ
（３）塩類要求性：＋
（４）色素生産：−
（５）オキシダーゼ：＋
（６）カタラーゼ：＋
【００１３】
３．分離源
房総沖日本海溝の水深６０００ｍの海水
【００１４】
これらの菌学的性質は、１９８５年学会出版センター発行，駒形和男著，改訂版，長谷川武治編著，「微生物の分類と同定」下巻，第９９〜１６１ページを参考にし、１９９０年，恒星社厚生閣発行，日本海洋学会編，絵面良男著，「沿岸環境調査マニュアルＩＩ（水質・微生物篇）」，第３５７〜３６４ページに記載された試験方法に従って行った。
【００１５】
これらの菌学的性質を、上記の「沿岸環境調査マニュアルＩＩ（水質・微生物篇）」，第３５７〜３６４ページの記載に基づき、１９８４年，ボルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒ），ウイリアムス・アンド・ウィルキンス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆　Ｗｉｌｋｉｎｓ）社発行，ノエル・アール・クリーグ（Ｎｏｅｌ．Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）及びジョン・ジー・ホールト（Ｊｏｈｎ．Ｇ．Ｈｏｌｔ）編，「バージェイズ・マニュアル・オブ・システマチック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ´ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」，第１巻及び１９９４年同社発行，ジョン・ジー・ホールト（Ｊｏｈｎ．Ｇ．Ｈｏｌｔ）、ノエル・アール・クリーグ（Ｎｏｅｌ．Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）、ピーター・エイチ・スニース（Ｐｅｔｅｒ．Ｈ．Ａ．Ｓｎｅａｔｈ）及びジェイムズ・ティー・スタレイ（Ｊａｍｅｓ．Ｔ．Ｓｔａｌｅｙ）編，「バージェイズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ´ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第９版」を参照して対比した結果、海洋低温細菌Ｐ２Ｋ−５菌株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５７６９）は、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属に属する細菌と同定された。
【００１６】
本発明方法においては、基質としての役割を果すキチン原料の存在下で海洋低温細菌Ｐ２Ｋ−５菌株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５７６９）を培養する。この際のキチン原料のα‐キチンやβ‐キチンのみでなく、その類似物質を用いてもよい。このようなキチンの類似物質としては、例えばコロイダルキチンのような再生キチン、キチン分解物又はグリコールキチンのようなキチン誘導体などがある。これらのキチン原料は単独で用いてもよいし、また２種以上の組合せでもよい。キチンにキチン類似物質を組み合わせて用いる場合には、後者を通常０．１ｇ／リットル以上、好ましくは１〜５０ｇ／リットルの範囲の濃度で加える。
【００１７】
本発明方法における培養のための培地としては、一般に固体培地と称される寒天で固化させた固体状のものも用いることができるが、タンク培養が可能で、しかも生成物の分離が容易な液体培地を用いるのが好ましい。この培地は天然培地又は合成培地のいずれでもよく、特に制限はない。
【００１８】
この培地の炭素源としては、例えば、グルコース、キシロース、スクロース、ペプトン又はこれらの誘導体などが、窒素源としては、例えばイーストエキス、ペプトン、肉エキス、アミノ酸溶液のような有機窒素源や、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムのような無機窒素源が、また、無機塩としては、例えば硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウムなどがそれぞれ用いられる。これらの栄養源は、それぞれ単独で組み合わせて用いることもできるが、通常は２種以上を組み合わせた、炭素原、窒素源、無機塩が用いられる。さらに、前記したキチン原料を炭素源、窒素源として利用することもできる。これらの栄養源を含む培地は、酸又は塩基を加えてｐＨ６．５〜８．５に調整されたのち、例えばオートクレーブにより加熱加圧して殺菌後、使用される。
本発明方法における培養は、温度５〜３５℃、好ましくは２０〜２８℃において、２０〜７２時間程度、静置又は振とう又は撹拌しながら行うことができる。
【００１９】
次に、このようにして得られた培養液に、キチン原料を加え、さらに培養を継続することにより、Ｎ‐アセチルグルコサミンを製造することができる。この際、上記の培養液から、菌体を除去し、上清のみにキチン原料を加えて培養を継続するのが有利である。この菌体の除去は、常法に従い、遠心分離又はろ過によって行うことができる。また、このようにして得た上清をそのまま粗酵素液として利用することができるが、所望ならば硫酸アンモニウム塩析により酵素を沈殿させ、これを濃縮し、ろ別して精製したものを用いることもできる。このようにして得られた酵素沈殿は、水に再溶解し、所望に応じ、さらに透析して硫酸アンモニウムを除いて酵素液とする。
【００２０】
本発明方法においては、培養液中の酵素を安定化するために、エチレンジアミンテトラ酢酸（以下ＥＤＴＡと略す）を添加するのが好ましい。この際のＥＤＴＡの濃度は０．５〜５ｍＭの範囲で選ばれる。
キチンを分解する反応は、上記のようにして調製した酵素液にキチン原料を、好ましくは粉末として加え、５〜５５℃、好ましくは３０〜４５℃、ｐＨ６〜９、好ましくは６．８〜８．５において、振とう又は撹拌することによって行われる。
このようにして、キチンを原料として、１段階でＮ‐アセチルグルコサミンを効率よく製造することができる。
【００２１】
【実施例】
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
なお、各例中のＮ‐アセチルグルコサミンの定量は、モルガン−エルソン法（１９６８年，共立出版株式会社発行，「生物化学実験　第１１巻，糖質実験法」，第２２〜２３ページ）による比色定量で行った。
【００２２】
また、キチナーゼ生産菌培養用培地としては、以下の組成の１／２ＴＺ培地を用いた。
ポリペプトン［ダイゴ（Ｄａｉｇｏ）社製］　　　２．５ｇ／リットル
イーストエキス［ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社製］　０．５ｇ／リットル
Ｎ‐２‐水酸化エチルピペラジン‐Ｎ´‐エタン
スルホン酸［ドジン（Ｄｏｊｉｎ）社製］　　　　４．７７ｇ／リットル
塩化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　２１．５３３ｇ／リットル
硫酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　３．６０７ｇ／リットル
塩化カリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　０．６０９ｇ／リットル
炭酸水素ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　０．１７６ｇ／リットル
臭化カリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０８８ｇ／リットル
ホウ酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０２３ｇ／リットル
フッ化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　０．００３ｇ／リットル
塩化マグネシウム・六水塩　　　　　　　　　　　９．７４７ｇ／リットル
塩化カルシウム・二水塩　　　　　　　　　　　　１．３６８ｇ／リットル
塩化ストロンチウム・六水塩　　　　　　　　　　０．０２２ｇ／リットル
【００２３】
実施例１
栓付き試験管に１／２ＴＺ培地５ｍｌを採り、冷蔵保存されたキチナーゼ生産菌（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５７６９）２００μｌを植菌し、２５℃において１晩振とう培養した。
次に、このようにして得た培養液１ｍｌをマリン・ブロス［ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社製］１００ｍｌに加え、さらに２４時間振とう培養したのち、その２５ｍｌを分取し、キチン粉末２０ｇを含む１／２ＴＺ培地１リットルに添加し、２５℃において４８時間、好気的に振とう培養した。次いで、これを２０分間遠心分離（８０００×ｇ）し、上清を回収した。この上清に硫酸アンモニウムを８０％飽和に達するまで加え、生じた沈殿を遠心分離により捕集した。このようにして得た沈殿を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）８ｍｌに溶解したのち、同じ緩衝液３リットルを用いて１晩透析を行うことにより、酵素液２０ｍｌを調製した。
次に、サンプル管に、上記酵素液１ｍｌを分取し、イカキチン粉末２０ｍｇを加え、３７℃で所定時間振とう培養したのち、遠心分離し、その上清中に含まれるＮ‐アセチルグルコサミンを定量したところ、２時間後は０．０１ｍｇ／ｍｌ、４日後は０．２ｍｇ／ｍｌであった。
【００２４】
実施例２
実施例１と同様にして調製した酵素液１ｍｌにＥＤＴＡ１ｍＭを添加し、さらにイカキチン粉末２０ｍｇを加えて実施例１と同様にして培養したところ、２時間後に０．０１ｍｇ／ｍｌ、４日後に０．２ｍｇ／ｍｌ、８日後に０．３ｍｇ／ｍｌのＮ‐アセチルグルコサミンを生じた。
【００２５】
実施例３
イカキチン粉末の代りにカニ粉末から調製したコロイダルキチンを用い、実施例１と同様にして培養したところ、２時間後にＮ‐アセチルグルコサミン０．０１ｍｇ／ｍｌを得た。
【００２６】
実施例４
イカキチン粉末の代りにカニ粉末を用いて、実施例１と同様にして培養したところ、２時間後にＮ‐アセチルグルコサミン０．００４ｍｇ／ｍｌを得た。
【００２７】
【発明の効果】
本発明方法によると、酸を使用することなく、キチン原料から１段階で有用なＮ‐アセチルグルコサミンを、酸の中和などの付加的な処理を必要とせずに、しかもきょう雑物としてグルコサミンを含まない純粋な状態で効率よく製造することができる。