(57)【要約】【課題】アトピー性皮膚炎の研究や診断に好適なアトピー性皮膚炎モデル動物、そのスクリーニング方法、およびその医薬品を提供する。【解決手段】外来性のカスパーゼ１遺伝子が皮膚特異的に発現するように組み込まれ、かつ、Ｓｔａｔ６が欠損した組み換えＤＮＡを体細胞及び生殖細胞の少なくとも一方に有する、トランスジェニック非ヒト哺乳動物、並びにそれを用いたスクリーニング方法および医薬品。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イムノグロブリンＥを介した炎症機構を阻害するように遺伝子が組み換えられた組み換えＤＮＡを有することを特徴とするアトピー性皮膚炎モデル動物。
【請求項２】
インターロイキン−４およびインターロイキン−１３に対する応答性を抑制するように遺伝子が組み換えられた組み換えＤＮＡを有することを特徴とする請求項１記載のアトピー性皮膚炎モデル動物。
【請求項３】
インターロイキン−１８を皮膚特異的に発現するように遺伝子が組み込まれた組み換えＤＮＡを有することを特徴とする請求項１または２記載のアトピー性皮膚炎モデル動物。
【請求項４】
インターロイキン−１８を発現するための遺伝子は、カスパーゼ１遺伝子であることを特徴とする請求項３記載のアトピー性皮膚炎モデル動物。
【請求項５】
インターロイキン−１８を発現するための遺伝子は外来性であることを特徴とする請求項３または４記載のアトピー性皮膚炎モデル動物。
【請求項６】
イムノグロブリンＥを介した炎症機構を阻害するように遺伝子が組み換えられた組み換えＤＮＡは、Ｓｔａｔ６を欠損させた組み換えＤＮＡであることを特徴とする請求項１ないし５の何れか１項に記載のアトピー性皮膚炎モデル動物。
【請求項７】
カスパーゼ１遺伝子を皮膚特異的に発現するように組み込まれた組み換えＤＮＡを有することと、ＩＬ−１８が欠損した組み換えＤＮＡを有することとを特徴とする非アトピー性皮膚炎モデル動物。
【請求項８】
請求項７記載のモデルマウスから演繹できるカスパーゼ１非存在下でＩＬ−１８に依存してアトピー性皮膚炎を自然発症するアトピー性皮膚炎モデル動物。
【請求項９】
請求項１ないし６，８の何れか１項に記載のアトピー性皮膚炎モデル動物に対して、被験物質を投与し、アトピー性皮膚炎の改善効果を検定することを特徴とするアトピー性皮膚炎の治療用物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
請求項９記載のスクリーニング方法によりアトピー性皮膚炎の改善効果を有すると判定される物質を含有するアトピー性皮膚炎用医薬品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アトピー性皮膚炎の研究に好適なアトピー性皮膚炎モデル動物、アトピー性皮膚炎の治療用物質のスクリーニング方法、およびアトピー性皮膚炎用医薬品に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
アトピー性皮膚炎（Ａｔｏｐｉｃ　Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ、以下、ＡＤと記す）は、主に外的刺激に対する炎症性皮膚病であり、掻痒性、慢性反復性、遺伝的背景を有し、血清中において高いＩｇＥレベルをしばしば伴うことを特徴とするものである。
【０００３】
ＡＤ発症のメカニズムは未だ完全には解明されていないが、活性化Ｔ細胞、好塩基球（ｂａｓｏｐｈｉｌｓ）、肥満細胞（ｍａｓｔ　ｃｅｌｌｓ）が、ＡＤ発症に大きく関与する。アレルゲンによる好塩基球あるいは肥満細胞上のＦｃεＲに結合したイムノグロブリン（以下、Ｉｇと記す）Ｅ分子の架橋によって誘導された好塩基球と肥満細胞との活性化の結果、Ｔｈ２に関連したサイトカインとケミカルメディエーターの生成がおこることが重要と考えられる。
【０００４】
上記サイトカインとは、インターロイキン（以下、ＩＬと記す）−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−５であり、ケミカルメディエーター（ｍｅｄｉａｔｏｒｓ）とはヒスタミン、セロトニン等である。特に好塩基球と肥満細胞の活性化に、抗原（Ａｇ）／Ａｇ特定的ＩｇＥが、重要な役割を果たすものである（獲得型のアレルギー性応答）。
【０００５】
既に、獲得型のＡＤの病態や治療等の研究のために、ＮＣ／Ｎｇａマウスがアトピー性皮膚炎モデル動物として注目されている（Ｉｎｔ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　ｖｏｌ．９　（１９９７），　ｐｐ４６１−４６６，参照）。このマウスは、非常に清潔度の高い環境であるＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｐａｔｈｏｇｅｎ　Ｆｒｅｅ）飼育下ではＡＤを発症せず、コンベンショナルな飼育室に移されると、ダニ等をアレルゲンとするＡＤを発症する。このように、Ｎｃ／Ｎｇａマウスは外因性の刺激でＡＤを発症するモデルマウスであるため、飼育室のダニ等の繁殖程度に応じて、その発症の時期と症状の程度が大きく影響されるのが特徴である。従って、ＡＤの病態研究や治療等の開発には、生後、外因性の刺激なしに一定時期に１００％ＡＤを発症するモデルマウスの樹立が極めて重要である。
【０００６】
そこで、そのようなＡＤの病態や治療薬の研究のために、アトピー性皮膚炎を自然発症するモデル動物が作製され、国際公開ＷＯ０１／９５７１０Ａ１号公報（国際公開日２００１年１２月２０日）に開示された。上記アトピー性皮膚炎モデル動物は、外来性のカスパーゼ１遺伝子を皮膚特異的に発現するように組み込まれたＤＮＡを有するトランスジェニックマウス（以下の本明細書中ではＫＣＡＳＰ１Ｔｇと記す）である。
【０００７】
上記ＫＣＡＳＰ１Ｔｇは、遺伝的背景が確立され、免疫学的特徴も明らかで、様々な病原微生物を排除した条件下でも、全てのマウスが一定時期（生後８週頃）にＡＤを発症することから、各種治療法及び薬剤の開発研究に利用可能なものである。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ＡＤの発現に複数の経路が関与することが分かってきた。すなわち、特定のＩｇＥが必須な経路と、それを必要としない経路の２経路の存在がわかってきた。上記のＫＣＡＳＰ１Ｔｇは血清中に高濃度のＩｇＥを有するため、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇを用いた研究では、常にＩｇＥの関与が除外できない。そのため、ＩｇＥが関与しないＡＤの病態やその病態に基づく治療薬の研究がＫＣＡＳＰ１Ｔｇを用いては出来ない、あるいは不正確になるという問題が生じてきた。
【０００９】
すなわち、本発明者らは、従来のＩｇＥが関与したアレルギー反応の活性化経路（獲得型のアレルギー性応答）と相違する、ＩｇＥ非依存性の好塩基球、肥満細胞の活性化経路を見出した。ＩｇＥ非依存性の活性化経路は、ＩｇＥが無くても、ＩＬ−３の存在下でＩＬ−１８が直接好塩基球や肥満細胞を試験管内で（ｉｎｖｉｔｒｏ）活性化して、Ｔｈ２細胞関連サイトカインとケミカルメディエイターを産生させるというものである（非獲得型のアレルギー性応答）。
【００１０】
ＩＬ−１８は、精製直後のＴ細胞を、ＩＬ−１２あるいはＩＬ−２とともに刺激した場合、抗原受容体を介するＴ細胞の活性化が無くとも、インターフェロン（以下、ＩＦＮと記す）−γあるいはＩＬ−４の一方の産生を促進する。このようなユニークなＴ細胞の活性化は、ＩＬ−１８の重要な特性の一つである。
【００１１】
その上、正常なＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７ＢＬ／６マウスにＩＬ−１８を投与すると、ＣＤ４＋Ｔ細胞が活性化され、ｓｔａｔ６およびＩＬ−４依存性に、多クローン性にＢ細胞が刺激されてＩｇＥ産生が誘導される。
【００１２】
ＩＬ−１βのようにＩＬ−１８も、生物学的に不活性な前躯体の形態（ｐｒｏ）で、マクロファージあるいはケラチン細胞内に産生蓄積されており、カスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）−１またはカスパーゼ−１様の酵素の作用で、開裂され、活性型に変換された後に、細胞外に分泌される。
【００１３】
既に報告しているように、ケラチン細胞中、カスパーゼ−１を過剰発現させたＫＣＡＳＰＴｇが、生物学的に活性を有するＩＬ−１８を恒常的に分泌し、ＩＬ−１８依存性にＩｇＥを産生する。また、ＳＰＦ飼育下であってもＫＣＡＳＰ１Ｔｇは慢性の皮膚炎を自然発症することも示されている。
【００１４】
一方、ＩＬ−１８は、アレルギー性疾患のなかでも、特に、対応する抗原（アレルゲン）が不明あるいは特定のＩｇＥの産生が無い内因性のアトピー性疾患を誘発する可能性がある（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．，　ｖｏｌ．９６（１９９９），　ｐｐ１３９６２−１３９６６，　参照）。
【００１５】
しかしながら、前記のＫＣＡＳＰ１Ｔｇにおいては、ＡＤ発症がなおもＩｇＥに依存する経路に基づくのか、あるいはＩｇＥに非依存性の経路に基づくのかが不明である。さらに、ＫＣＡＳＰ１ＴｇのＡＤ発症がＩＬ−４／ＩＬ−１３に依存した経路に基づくか否かも不明であるため、ＡＤの病態や治療薬の研究が不正確にならざるを得ないという問題が生じてきた。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明のアトピー性皮膚炎モデル動物は、以上の課題を解決するために、ＩｇＥを介した炎症機構を阻害するように遺伝子が組み換えられた組み換えＤＮＡを有することを特徴としている。
【００１７】
上記アトピー性皮膚炎モデル動物では、ＩＬ−４およびＩＬ−１３に対する応答性を抑制するように遺伝子が組み換えられた組み換えＤＮＡを有していてもよい。
【００１８】
上記アトピー性皮膚炎モデル動物においては、ＩＬ−１８を皮膚特異的に発現するように遺伝子が組み込まれた組み換えＤＮＡを有することが好ましい。
【００１９】
上記アトピー性皮膚炎モデル動物では、ＩＬ−１８を発現するための遺伝子は、カスパーゼ１遺伝子であってもよい。
【００２０】
上記アトピー性皮膚炎モデル動物においては、ＩＬ−１８を発現するための遺伝子は外来性であることが望ましい。
【００２１】
上記アトピー性皮膚炎モデル動物では、ＩｇＥを介した炎症機構を阻害するように遺伝子が組み換えられた組み換えＤＮＡは、Ｓｔａｔ６を欠損させた組み換えＤＮＡであってもよい。
【００２２】
本発明の非アトピー性皮膚炎モデル動物は、カスパーゼ１遺伝子を皮膚特異的に発現するように組み込まれた組み換えＤＮＡを有することと、ＩＬ−１８が欠損した組み換えＤＮＡを有することとを特徴としている。上記構成によれば、本発明のアトピー性皮膚炎モデル動物における、ＩＬ−１８に起因するアトピー性皮膚炎の作用機序を、より正確に確認できる。
【００２３】
本発明の他のアトピー性皮膚炎モデル動物は、上記非アトピー性皮膚炎モデル動物から演繹できるカスパーゼ１非存在下でＩＬ−１８に依存してアトピー性皮膚炎を自然発症することを特徴としている。
【００２４】
上記構成によれば、カスパーゼ１遺伝子を皮膚特異的に発現するように組み込むことにより、皮膚のみに、カスパーゼ１遺伝子を発現させるだけでＩＬ−１８を過剰に発現させることが可能となり、上記ＩＬ−１８に起因するアトピー性皮膚炎を発症させることができる。
【００２５】
さらに、上記構成においては、ＩＬ−４やＩＬ−１３の細胞内のシグナル伝達に必須の分子であるＳｔａｔ６を欠損させているので、ＩＬ−４やＩＬ−１３に対する応答性がなくなり、ＩＬ−１８を過剰に発現させても、ＩｇＥの産生は阻害される。
【００２６】
したがって、上記構成では、ＩｇＥ（ＩｇＥの発現に関与しているＩＬ−４やＩＬ−１３にも）の影響を受けない条件下で、アトピー性皮膚炎を発症させることが可能となる。さらに、ＩｇＥやＳｔａｔ６の関与を全く考慮せずに皮膚の病態を解析することが可能になるばかりでなく、ＩＬ−１８のみを標的とした治療法（スクリーニング法）を検討できる。
【００２７】
Ｓｔａｔ６はアレルギー性炎症を誘導するＩＬ−４やＩＬ−１３のシグナル伝達に必須の転写因子で、この分子が欠損するとＩＬ−４とＩＬ−１３のシグナルの多くは伝達されず、従って、ＩｇＥの産生も観られなくなる。このことから、現在Ｓｔａｔ６はアレルギー治療の重要な標的分子となっている。
【００２８】
また、上記構成によれば、カスパーゼ１遺伝子が外来性であるため、内因性と比べて、カスパーゼ１遺伝子によるＩＬ−１８の発現を、より的確に制御できる。その結果、本導入遺伝子アトピー性皮膚炎発症の時期と程度において、個体差を極めて小さくすることができる。
【００２９】
本発明のアトピー性皮膚炎の治療用物質のスクリーニング方法は、上記の何れかに記載の本発明のアトピー性皮膚炎モデル動物に対して、被験物質を投与し、アトピー性皮膚炎の改善効果を検定することを特徴としている。
【００３０】
上記方法によれば、本発明のアトピー性皮膚炎モデル動物を用いたことによって、投与した被験物質における、アトピー性皮膚炎の改善効果を、より定量的に検定することができる。
【００３１】
本発明のアトピー性皮膚炎用医薬品は、上記のスクリーニング方法によりアトピー性皮膚炎の改善効果を有すると判定される物質を含有することを特徴としている。
【００３２】
上記構成によれば、本発明のアトピー性皮膚炎モデル動物を用いたスクリーニング方法によって、投与した被験物質における、アトピー性皮膚炎の改善効果の検定をより正確にできることから、アトピー性皮膚炎の機構に応じた、より的確な医薬品を得ることが可能となる。
【００３３】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態について図１ないし図１３に基づいて説明すれば、以下の通りである。本発明に係るアトピー性皮膚炎モデル動物又はその子孫の、モデルマウスは、カスパーゼ１遺伝子（より好ましくは外来性）が皮膚特異的に発現するように組み込まれ、かつ、Ｓｔａｔ６が欠損した組み換えＤＮＡを体細胞及び生殖細胞の少なくとも一方に有する、トランスジェニック非ヒト哺乳動物である。
【００３４】
ここで外来性カスパーゼ１遺伝子としては、ヒト又はマウスのカスパーゼ１遺伝子が好ましく、例えばヒト前駆型カスパーゼ１（ｈｐｒｏＣＡＳＰ１）、マウス前駆型カスパーゼ１（ｍｐｒｏＣＡＳＰ１）、ヒトカスパーゼ１（ｈＣＡＳＰｌ）、マウスカスパーゼ１（ｍＣＡＳＰ１）等の遺伝子が挙げられるが、ｈｐｒｏＣＡＳＰｌの完全なコード領域の１．４ｋｂのｃＤＮＡが特に好ましい。
【００３５】
外来性のカスパーゼ１遺伝子を皮膚特異的に発現するように組み込んだＤＮＡとしては、外来性カスパーゼ１遺伝子と皮膚特異的蛋白のプロモータとを含む組み換えＤＮＡが好ましい。ここで、皮膚特異的蛋白のプロモータとしては、皮膚に特異的に存在する蛋白のプロモータが挙げられ、例えばケラチン１４、ケラチン５、ケラチン１、ケラチン１０、インボルクリン等のプロモータが挙げられるが、ケラチン１４プロモータが、高い発現効率を発揮できることから特に好ましい。
【００３６】
外来性カスパーゼ１遺伝子は、皮膚特異的蛋白のプロモータの下流に結合されるが、このとき、遺伝子の発現効率を上げるためβ−ｇｌｏｂｉｎイントロン等を結合することが好ましい。
【００３７】
上記ＤＮＡは、遺伝子導入哺乳動物において、目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（ポリＡ、一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来、各種哺乳動物由来の各遺伝子の配列を用いて遺伝子発現を操作することができる。好ましくは、前記皮膚特異的蛋白のポリＡ、特に好ましくはケラチンのポリＡなどが用いられる。
【００３８】
その他、目的の遺伝子をさらに高発現させる目的で、各遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核遺伝子のイントロンの一部を、プロモータ領域の５’上流、プロモータ領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結することも目的により可能である。
【００３９】
かくして得られる組み換えＤＮＡを導入するための非ヒト哺乳動物としては、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなどが挙げられる。好ましくは、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス又はラットであり、なかでも醤歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）が好ましく、とりわけマウスが好ましい。
【００４０】
また、本発明は、上記トランスジェニック動物に対して、アトピー性皮膚炎の治療用治験薬としての被験物質を投与し、アトピー性皮膚炎の改善効果を検定することを特徴とするアトピー性皮膚炎の予防又は治療用物質のスクリーニング方法、及び当該スクリーニングによりアトピー性皮膚炎の改善効果を有すると判定される物質を含有するアトピー性皮膚炎の予防又は治療用医薬を提供するものである。
【００４１】
前述の、カスパーゼ１遺伝子が皮膚特異的に発現するように組み込まれた組み換えＤＮＡは、図１に示す各遺伝子の結合状態を備えている。上記各遺伝子は、Ｋ１４プロモータ、β−グロブリンイントロン、ＰＴＨ−ｍＩＬ−１８、マウス由来のＫ１４ポリＡである。
【００４２】
成熟型のＩＬ−１８に関するｃＤＮＡのコード化領域が、図１に示すように、ヒトのケラチン１４（Ｋ１４）と、ウサギ由来のβ−グロブリンイントロンとに平滑末端ライゲーションによって結合されている。
【００４３】
リニアＫ１４／ＩＬ−１８ＤＮＡ断片は、以前の報告（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　ｖｏｌ．１６５（２０００），　ｐｐ９９７−１００３，参照）に記載のように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの受精卵に注入された。ケラチン細胞に特異的な活性型のＩＬ−１８遺伝子変異マウスの系統（ＫＩＬ−１８Ｔｇ）は、こうして確立された合計５０匹のマウスから、活性型ＩＬ−１８遺伝子を発現した２つの系統を起源とするものである。
【００４４】
雄のＫＩＬ−１８Ｔｇを雌のＣ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）と交配して、ＫＩＬ−１８Ｔｇ型と野生型の子を１：１の割合で得た。すべての実験は、同腹の野生型とヘテロ型のｋＩＬ−１８Ｔｇを用いて行われた。
【００４５】
マウス
ヒトのカスパーゼ−１前駆体の遺伝子をケラチン細胞に対して特異的に過剰発現させた、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇ（雌、４−６０週齢）を本発明に用いた（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　ｖｏｌ．１６５（２０００），　ｐｐ９９７−１００３，参照）。
【００４６】
ＩＬ−１α／β欠損ＫＣＡＳＰ１Ｔｇは、Ｃ５７ＢＬ／６をバックグラウンドとするＩＬ−１α／βの二重ノックアウトマウス（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．１８７（１９９８），　ｐｐ１４６３−１４７５，参照）とＫＣＡＳＰ１Ｔｇとの交配によって樹立した。
【００４７】
また、Ｓｔａｔ６欠損のＫＣＡＳＰ１ＴｇまたはＩＬ−１８欠損のＫＣＡＳＰ１Ｔｇは、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇと、ｓｔａｔ６欠損マウス（Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），　ｖｏｌ．３８０（１９９６），　ｐｐ６２７−６３０，　参照）、またはＩＬ−１８欠損マウス（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，　ｖｏｌ．８（１９９８），　ｐｐ３８３−３９０，　参照）との交配によってそれぞれ樹立した。
【００４８】
試薬（ｒｅａｇｅｎｔｓ）
ＦＩＴＣを結合したａｎｔｉ−ＣＤ３、ＰＥを結合したａｎｔｉ−Ｂ２２０、ＦＩＴＣを結合したａｎｔｉ−ＣＤ４、Ｃｙを結合したａｎｔｉ−ＣＤ８、ＦＩＴＣを結合したａｎｔｉ−Ｍａｃ−１、ＰＥを結合したａｎｔｉ−Ｇｒ−１、ビオチン化したａｎｔｉ−ＣＤ１５４（ＣＤ４０リガンド（Ｌ））、ＰＥ−ストレプトアビジンは、すべてＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社（サンディエゴ、カルフォルニア）から購入したものである。本発明に用いた培地は、１０％のＦＣＳ、１００　Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０μＭの２−メルカプトエタノールおよび２ｍＭ　Ｌ−グルタミンが補充されたＲＰＭＩ−１６４０である。
【００４９】
ＩＬ−１８の活性測定法
様々なマウス血清中のＩＬ−１８活性は、従来公知の方法（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ｖｏｌ．１１，　ｐｐ３５９−３６７）に従って、ＬＮＫ細胞と呼ばれる、ＩＬ−１８に応答性を有するＮＫ細胞クローンを用いて決定した。
【００５０】
ノーザンブロット法
総リボ核酸は、ＫＩＬ−１８Ｔｇと野生型の各マウスの皮膚からＩｓｏｇｅｎ試薬（日本ジーン社製）を使用して抽出された。ノーザンブロット解析は、マウスのＩＬ−１８またはＧ３ＰＤＨをコードするｃＤＮＡを、３２Ｐでラベルして用い、すべて従来の方法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　ｖｏｌ．１６５（２０００），　ｐｐ９９７−１００３，参照）に基づき行われた。
【００５１】
フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）
様々な変異体や野生型のマウスから得た胸腺細胞と脾臓細胞は、ｍＡｂｓの様々な組み合わせで染色された。染色された細胞は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ，　カルフォルニア）を使用して二つのレーザーにより分析された。１万の各細胞が分析され、得られたデータは、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて処理された（Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　ｖｏｌ．１（２０００），　ｐｐ１３２−１３７，　参照）。
【００５２】
組織学的な評価方法
様々なタイプの遺伝子変異マウスから摘出された皮膚標本は、ホルマリン固定後、ヘマトキシリンとエオシンによって、染色された。変移染色性（ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｓｉａ）を有する肥満細胞を識別するために皮膚標本の一部はトルイジンブルーによって染色された。
【００５３】
細胞の調製法
脾臓由来のＣＤ４＋Ｔ細胞は、ａｎｔｉ−ＣＤ４を結合した磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ，　Ａｕｂｕｒｎ，　カルフォルニア）と共に培養した後、ＭＡＣＳにより分離された。脾臓由来のＣＤ４＋Ｔ細胞（１×１０６／ｍｌ）は、ａｎｔｉ−ＣＤ３を結合した９６穴プレートの各凹部内にて４８時間培養された。個々の細胞の上澄み液中のサイトカインの濃度は、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ‐ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙの略、酵素免疫測定法）により決定された。
【００５４】
サイトカインと免疫グロブリン（Ｉｇ）を定量するためのＥＬＩＳＡ法
ＩＬ−４およびＩＦＮ−γの各濃度は、それらに対応するＥＬＩＳＡキット（Ｇｅｎｚｙｍｅ　ＴＥＣＨＮＥ，　ボストン，マサチューセッツ）によって測定された。ＩＬ−１８濃度はＥＬＩＳＡキット（ＭＢＬ、日本）により決定された。血漿ヒスタミン濃度はＲＩＡ（ＳＲＳ，大阪，日本）によって測定された。血清でのＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＭの各濃度は、以前に報告されたＥＬＩＳＡ（Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　ｖｏｌ．１（２０００），　ｐｐ１３２−１３７，　参照）に基づいて測定された。
【００５５】
皮膚の引っ掻き頻度
マウスは少なくとも１時間静置された後、１時間にわたりビデオカメラでモニターされた。引っ掻き頻度は、ランダムに選択された３ポイントの１０分間の観察結果から割り出した。
【００５６】
皮膚変化の評価
皮膚の変化は、１週間隔にて観測された。上記変化の評価は、個々の測定時における、各々の遺伝系統において、最大変化に対する相対的な皮膚変化により評価された。
【００５７】
ＡＤに関与する因子のパーセントレベル
ＫＣＡＳＰ１Ｔｇとその様々な遺伝子変異マウスを用いて検討がなされた。皮膚標本と血清中のＩＬ−１８量、血清中のＩｇＥとＩｇＧ１濃度、血漿中のヒスタミン濃度、肥満細胞数のパーセントレベル、およびパーセント皮膚引っ掻き頻度が計算された。
【００５８】
成熟型のＩＬ−１８を皮膚内に過剰発現する遺伝子変異マウス
ＫＩＬ−１８Ｔｇは、正常に生まれて健康に生長するが、誕生の６カ月後にＳＰＦ条件下で皮膚病を発症した（図２参照）。対照的に、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇは生後８週間以内に皮膚異常を現した。ＫＣＡＳＰ１Ｔｇのように、ＫＩＬ−１８Ｔｇは頻繁に皮膚、特に皮膚病巣を引っ掻いた（それは、後に、図１２に基づき詳細に説明される）。
【００５９】
ノーザンブロット分析により、ＫＩＬ−１８Ｔｇの皮膚でのみ導入された成熟型のＩＬ−１８の存在（図３参照）が確認された。対照実験として、野生型とＫＩＬ−１８Ｔｇとの両方の皮膚において、ｐｒｏＩＬ−１８をコードする１０５ｂｐより大きい内因性のＩＬ−１８のｍＲＮＡは、両者とも明らかに存在した（データ示さず）。ＫＣＡＳＰ１Ｔｇ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　ｖｏｌ．１６５（２０００），　ｐｐ９９７−１００３，参照）のように、ＫＩＬ−１８Ｔｇは、皮膚に導入遺伝子を選択的に発現しているが、肝臓、腎臓、顆粒球／マクロファージ（ｃｏｌｏｎ）、肺、脳および脾臓には発現されていない（データ示さず）。
【００６０】
ＫＩＬ−１８Ｔｇは、誕生時から血清ＩＬ−１８値は高く、その程度はＫＣＡＳＰ１Ｔｇのそれよりも常時高かった（図４（ａ）参照）。
【００６１】
それらの血清は、ＩＬ−１８に応答性を有する細胞株からの（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　ｖｏｌ．１５７（１９９６），　ｐｐ３９６７−３９７３，参照）　ＩＦＮ−γ産生を誘発したことから、血清中のＩＬ−１８は生物学的に活性型であった（図４（ｂ）参照）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　ｖｏｌ．１６５（２０００），　ｐｐ９９７−１００３，参照）。
【００６２】
両方のタイプの遺伝子変異マウスは、高い血清ＩＬ−１８濃度を示した。ＩＬ−１８の下流に位置する（後段にて産生される）ＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γなどのサイトカインは、市販されているＥＬＩＳＡキットでは検出されなかった。
【００６３】
ＫＩＬ−１８ＴｇとＫＣＡＳＰ１Ｔｇとの脾臓中の好中球の蓄積とＴｈ２細胞への分化
ＫＩＬ−１８ＴｇおよびＫＣＡＳＰ１Ｔｇの双方とも、胸腺におけるＴ細胞の分化は正常だった（図５（ａ）〜（ｃ）参照）。しかし、それらの脾臓リンパ球は、野生型と比べて、Ｔ細胞の含有率が相対的に低かった（図６（ａ）〜（ｃ）参照）。
【００６４】
しかしながら、それらの脾臓における、ＣＤ４＋Ｔ細胞／ＣＤ８＋Ｔ細胞比や、Ｂ細胞の割合は、野生型のそれらと同じであった（図６（ｄ）参照）。
【００６５】
Ｇｒ−１＋Ｍａｃ−１＋細胞によって規定される好中球の割合は、ＫＩＬ−１８ＴｇおよびＫＣＡＳＰ１Ｔｇの脾臓で顕著に増加していた（図６（ｅ）参照）。Ｔ細胞がＩＬ−１８に応答して好中球の増殖因子であるＧＭ−ＣＳＦが産生されるというｉｎ　ｖｉｔｒｏの事実から、この好中球の増加がＧＭ−ＣＳＦに起因する可能性が示唆された。
【００６６】
両方のタイプの遺伝子変異マウスの脾臓での好中球の蓄積は、発病前ではわずかであったが、発病後においては顕著に増加することから（データ示さず）、好中球が皮膚病変の形成に関与する可能性を示唆している。
【００６７】
次に、ＫＩＬ−１８Ｔｇの細胞内部に蓄積・分泌されたＩＬ−１８が、血清中で認める高濃度のＩｇＥ／ＩｇＧ１の原因になるか否か、および、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇと同様に、Ｔｈ２応答が優性か否かについて本発明者らは調べた。
【００６８】
以前の本発明者らの報告（Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　ｖｏｌ．１（２０００），　ｐｐ１３２−１３７，　参照）と同様に、図７（ａ）ないし（ｃ）に示すように、ＩｇＥとＩｇＧ１濃度はいずれもＫＩＬ−１８ＴｇとＫＣＡＳＰ１Ｔｇとで著しく上昇していた。
【００６９】
新たに精製された脾臓由来のＣＤ４＋Ｔ細胞の固相化された抗ＣＤ３抗体刺激に対するサイトカイン産生能が調べられた。ＫＣＡＳＰ１ＴｇからのＣＤ４＋Ｔ細胞は、図８（ａ）ないし（ｄ）に示すように、野生型と比べて、ＩＬ−３、ＩＬ−４およびＩＬ−５の産生量は多いが、ＩＦＮ−γの産生量は少なかった。ＫＩＬ−１８ＴｇからのＣＤ４＋Ｔ細胞は、図９（ａ）および（ｂ）に示すように、野生型と比べて、ＩＬ−４の産生量は大きいが、ＩＦＮ−γの産生量は少なかった。
【００７０】
ＣＤ４＋Ｔ細胞が、Ｂ細胞からのＩｇＥ産生に必要な分子であるＣＤ４０Ｌを発現するか否かを調べたところ、図１０に示すように、上記のＫＩＬ−１８ＴｇとＫＣＡＳＰ１Ｔｇとの双方のＣＤ４＋Ｔ細胞にて、野生型と比べて、３倍のＣＤ４０Ｌを発現することが観察された。
【００７１】
これらの結果は、ＳＰＦ条件下において、ＩＬ−１８が、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｈ２細胞に分化させ、ＣＤ４０Ｌを発現することによって、ＩｇＥ／ＩｇＧ１応答を誘発していることを示している。
【００７２】
ＫＣＡＳＰ１ＴｇとＫＩＬ−１８Ｔｇとにおける慢性の皮膚炎
次に、皮膚病巣の組織がそれぞれ調べられた。それらの結果を図１１（ａ）ないし（ｆ）にそれぞれ示した。ＫＣＡＳＰ１Ｔｇは、８週齢時に顕著な皮膚変化を示した。その変化は、激しい侵食性の皮膚炎として始まり、続いて、再上皮化（ｒｅｅｐｉｔｈｅｌｉｚａｔｉｏｎ）と苔癬（ｌｉｃｈｅｎｏｉｄ）へと変化を示し、最後に、細胞間の浮腫と共に顕著な表皮の乳頭化（ｐａｐｉｌｌｏｍａｔｏｓｉｓ）、および、表皮肥厚を伴う痂皮（ｐａｒａｋｅｒａｔｏｔｉｃ　ｓｃａｌｅ−ｃｒｕｓｔ）形成が見られた。
【００７３】
対照的に、ＫＩＬ−１８Ｔｇでは、図２および図１２に示すように、皮膚病巣の発病がＫＣＡＳＰ１Ｔｇより著しく遅く、その病巣は、目の周りの局所的な皮膚の変化から始まり、徐々に顔、頭、背に達した。ＫＩＬ−１８Ｔｇの皮膚変化はＫＣＡＳＰ１Ｔｇのものとわずかに異なり、著しい苔癬化（ｌｉｃｈｅｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が特徴的であった。
【００７４】
ＫＣＡＳＰ１ＴｇとＫＩＬ−１８Ｔｇの真皮は、図１１に示すように、好中球などの多核白血球とリンパ球とで著しく浸潤されているが、それらの表皮は明らかに表皮腫様（ａｃａｎｔｈｏｔｉｃ）であった（データは示さず）。肥満細胞の数は、ＫＣＡＳＰ１ＴｇとＫＩＬ−１８Ｔｇとにおいて、表１、表２および図１３に示すように、真皮の浸潤部にて顕著にかつ選択的に増加し、脾臓、肺、末梢血、または腸（示されないデータ）では増加していない。これらのことは、皮膚に限局したＩＬ−１８の産生が肥満細胞の蓄積に寄与していることを示唆している。表１、表２、図１２および図１３では、対応する遺伝子の欠損を−／−にて表示した。また、表１および表２に記載のＮＤは検出できず（Ｎｏｔ　Ｄｅｔｅｃｔｅｄ）を示す。
【００７５】
【表１】
2004041123.tif 000002
【００７６】
【表２】
2004041123.tif 000003
【００７７】
肥満細胞が皮膚かゆみの誘発に重要な役割を果たすことから、皮膚引っ掻き頻度が数えられた。皮膚炎の発生後は、ＫＩＬ−１８ＴｇはＫＣＡＳＰ１Ｔｇと同様に、野生型よりもはるかに頻繁に、それらのびらん性の病巣を含む皮膚を引っ掻いた（表１、表２および図１３参照）。しかしながら、皮膚変化の開始の前では、両方のタイプの遺伝子変異マウスは、野生型のマウスと同程度の皮膚引っ掻き頻度を示した（データ示さず）。
【００７８】
本発明者らは、以前に、試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）において、ＩＬ−１８がＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激してＩＬ−３の産生を誘導すると共に、ＩＬ−１８がＩＬ−３と共同して好塩基球と肥満細胞を活性化してヒスタミンを放出させることを示した（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａａｄ．　Ｓｃｉ．，　ｖｏｌ．９６（１９９９），　ｐｐ１３９６２−１３９６６）。このことから、血漿中のヒスタミンレベルが測定された。ヒスタミンレベルは、両方のタイプの遺伝子変異マウスにおいて明らかに増加しており、両方のタイプの遺伝子変異マウスの真皮の浸潤部内における、ＩＬ−１８に依存する肥満細胞の活性化が示唆された。
【００７９】
ＫＣＡＳＰ１Ｔｇのヒスタミン濃度は、表１、表２および図１３に示すように、ＫＩＬ−１８Ｔｇのヒスタミン濃度よりもはるかに高いことは、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇの肥満細胞の数がＫＩＬ−１８Ｔｇの肥満細胞の数より多いという事実を反映している可能性がある。
【００８０】
それらの結果は、皮膚病巣がかゆみを起こすのに深く関連づけられる可能性と、ＩＬ−１８が、皮膚の肥満細胞の活性化、あるいはリンパ球および好中球の活性化を促し、炎症性の皮膚病を引き起こす可能性を示唆する。
【００８１】
ＩｇＥ／ｓｔａｔ６非依存性で、ＩＬ−１８に依存性の掻痒性の皮膚炎
アレルゲン特異的なＩｇＥとアレルゲンが花粉症、またその他のアレルギー性疾患で重要な役割を果たしていることはよく知られている。しかしながら、ＡＤにおいては、アレルゲン特異的なＩｇＥとアレルゲンの関与はあまり明確ではなく、Ｔｈ１とＴｈ２サイトカインの関与が、今まで、かなり明確に示唆されてきている。
【００８２】
ＫＣＡＳＰ１ＴｇとＫＩＬ−１８Ｔｇとが、明白な免疫も感染もなしで、高濃度のＩｇＥと共に炎症性の皮膚病巣を自然発生的に発症することから、これらの遺伝子変異マウスで認める多クローン性ＩｇＥが、これらの皮膚変化の発生に関与しない可能性について調べられた。
【００８３】
この可能性を確認するために、炎症性の皮膚変化が迅速におこる利点を活用するために、本発明者らは、ｓｔａｔ６遺伝子を欠損させることでＩｇＥを産生しなくなったＫＣＡＳＰ１Ｔｇを作製した。以前に、報告されているように、血清レベルで高濃度のＩＬ−１８を検出することが出来るこのｓｔａｔ６欠損のＫＣＡＳＰ１Ｔｇは、検出限界以下のＩｇＥと、極めて少量のＩｇＧ１を示した（表１、表２および図１３参照）。
【００８４】
さらに、上記ｓｔａｔ６欠損のＫＣＡＳＰ１Ｔｇは、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇと比べて、皮膚局所における肥満細胞の数と、血漿レベルでのヒスタミン濃度の顕著な減少を示した（表１、表２および図１３参照）。ｓｔａｔ６を欠損したＫＣＡＳＰ１Ｔｇは、Ｔｈ２細胞への分化誘導、ＩＬ−４産生およびＩＬ−４のシグナル伝達系に欠陥があるため、ＩＬ−４がその重要な増殖因子である肥満細胞は減少し、血漿ヒスタミンレベルも減少する可能性がある。それにもかかわらず、ｓｔａｔ６欠損ＫＣＡＳＰ１Ｔｇにおける皮膚の変化は、図１２に示すように、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇの皮膚の変化の開始時期とほとんど同じであった。それらの結果から、高濃度のＩＬ−１８が、かゆみを伴う皮膚の変化を誘発する主な原因であることを示唆する。
【００８５】
この示唆を証明するために、ＫＣＡＳＰ１ＴｇとＩＬ−１８欠損マウスとを交配した。得られた、ＩＬ−１８欠損ＫＣＡＳＰ１Ｔｇは、血清中のＩｇＥとＩｇＧ１レベルは低いが、検出できる程度のレベルであった。しかし、皮膚の引っ掻きは少なく、生後６カ月の時点でも皮膚炎の発現は観察されなかった。これらの結果は、皮膚病変の発症がＩｇＥとＩｇＧ１の増加によるものではなく、ＩＬ−１８が皮膚の病変を誘発する主な原因であることを証明するものである。
【００８６】
ＩＬ−１８欠損ＫＣＡＳＰ１Ｔｇでは、表１、表２および図１３に示すように、皮膚の肥満細胞の数や血清ヒスタミンのレベルが顕著に減少したので、ＩｇＥではなくＩＬ−１８が、肥満細胞およびＴ細胞を活性化して炎症性の皮膚炎を発症させる原因である可能性が高い。ＩＬ−１８は、Ｔ細胞に作用してＩＬ−３とＩＬ−４の産生を誘導し、次に、ＩＬ−１８とＩＬ−３のコンビネーションで肥満細胞の蓄積を誘導すると考えられる。
【００８７】
ヒスタミンレベルまたは肥満細胞の数と、かゆみの発現との間には明白な相関関係はないが、肥満細胞の数の減少と、ヒスタミンレベル（ｐ＜０．０５）との間には明白な関係がある。これらの結果は、皮膚のかゆみの誘発に必要なヒスタミンレベルにしきい値が存在する可能性を示すものである。ＫＩＬ−１８Ｔｇとｓｔａｔ６欠損ＫＣＡＳＰ１Ｔｇとでは、上記のしきい値より高い量のヒスタミンが遊離されているものと考えられた。
【００８８】
実際、ＫＩＬ−１８Ｔｇとｓｔａｔ６欠損ＫＣＡＳＰ１Ｔｇは、野生型と比較すると、はるかに高いレベルの肥満細胞の数とヒスタミンレベルを示していて、また、掻痒性の皮膚変化を発生した（図１１および図１３参照）。
【００８９】
しかしながら、このことから、ロイコトリエン（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　ｖｏｌ．１７（１９９８），　ｐｐ９３−９６）などの他の因子が皮膚かゆみの発生に関与する可能性は否定できない。ＩＬ−４／ＩＬ−１３および／または他の因子にかわってＩＬ−１８は、肥満細胞および／または炎症性の細胞を直接的に活性化して、ｓｔａｔ６非依存的にかゆみを誘発する可能性が有る。また、ＩＬ−４とＩＬ−１３とがｓｔａｔ６非依存的にかゆみを誘発する可能性もある。この皮膚病における、ｓｔａｔ６に非依存的なＩＬ−４／ＩＬ−１３の作用の役割をはっきりさせるために一層の研究を必要とする。
【００９０】
ＩＬ−１はＡＤ発症を促進する
ＫＩＬ−１８Ｔｇは、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇに比べて、皮膚変化を形成するのにはるかに長時間を要した。ＫＩＬ−１８Ｔｇは、血清中のＩＬ−１８レベルがＫＣＡＳＰ１Ｔｇより高い（図４参照）が、皮膚変化を現し始めるのはＫＣＡＳＰ１Ｔｇと比べて極めて遅かった（図１２参照）。
【００９１】
これは、カスパーゼ−１を過剰に発現するケラチン細胞がＩＬ−１８だけではなく別の産物であるＩＬ−１βを分泌し、このＩＬ−１βが発症時間の短縮に関与している可能性を示唆するものである。この可能性を調査するために、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇと、ＩＬ−１α／βの二重ノックアウトマウス（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．１８７（１９９８），　ｐｐ１４６３−１４７５，参照）とを交配した。ＩＬ−１α／β欠損ＫＣＡＳＰ１Ｔｇに観られる皮膚変化（図１２参照）の開始はＫＩＬ−１８Ｔｇのそれと同程度に遅れた。このことから、ＩＬ−１がこれらのアトピー性変化の発症を促進する可能性が示唆される。
【００９２】
ＩＬ−１α／β欠損ＫＣＡＳＰ１Ｔｇの皮膚病巣の組織病理学（ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ）的な変化はＫＩＬ−１８Ｔｇのものと同様であるが、その程度はＫＣＡＳＰ１Ｔｇ（図１１参照）よりも低かった。したがって、過剰に遊離されたＩＬ−１は、過剰なＩＬ−１８が惹起する皮膚変化を拡大・加速する役目を果たすようである。
【００９３】
本発明である、上記の各遺伝子変異マウスの解析結果から、アレルゲン／アレルゲン特異的なＩｇＥに依存しないＡＤ様の炎症性の皮膚病が、多量に蓄積されたＩＬ−１８により誘発されることが証明された。上記の各遺伝子変異マウスに観られる、頻繁な皮膚引っ掻き行動、および、高レベルの血漿ヒスタミンは、これらの皮膚病が掻痒性のものであることを示唆している（図１３参照）。
【００９４】
ＡＤの患者に観られるように、これらの変異マウスの皮膚変化はまず顔で現れ、次に、背や手、足等の先端部に広がる。すべてのＫＣＡＳＰ１ＴｇとＫＩＬ−１８Ｔｇは、遅かれ早かれ、皮膚病に羅患し、高血清ＩｇＥを示す（図７（ａ）および図１３参照）。したがって、上記両方のタイプの遺伝子変異マウスの皮膚病は、皮膚病巣（図１１参照）の好酸球浸潤は少ないが、ＡＤの評価基準を満たすように思われる。
【００９５】
両方のタイプの遺伝子変異マウスは少なくとも炎症性の皮膚病のためのモデルマウスである。これまで、特定のＩｇＥとアレルゲンが、アトピー症の表現型を誘発するのに不可欠であると信じられていた。しかしながら、上記の両方のタイプの遺伝子変異マウスは、ＡＤのような炎症性の皮膚炎を、特定のアレルゲンに曝露しなくても自然に発症する（図２、図１１および図１３参照）。このことから、上記各遺伝子変異マウスの多クローン性のＩｇＥとＩｇＧ１が、それらの皮膚における炎症性の変化を発生させる肥満細胞の活性化にほとんど寄与しないことを示唆している。
【００９６】
実際、ｓｔａｔ６欠損ＫＣＡＳＰ１Ｔｇは、その血清においてＩｇＥが検出されず、さらにＩｇＧ１レベルが低値であるにもかかわらず、図１１および図１２に示すように、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇと同様に掻痒性の皮膚炎を発生させていた。ＩｇＥと同様に特定のＩｇＧ１とＡｇ抗原はアナフィラキシーの発生に深くかかわるが、これらの結果は、ＩｇＥもＩｇＧ１もＫＣＡＳＰ１Ｔｇにおける皮膚の病理学的な変化の発生には関与していないことを強く示唆している。
【００９７】
ＩｇＥが低レベルのＡＤ患者の小集団が少なからずある（Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｂｌ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，　ｖｏｌ．２８（１９９９），　ｐｐ２９−３６）。ＫＣＡＳＰ１ＴｇからＩＬ−１８遺伝子を排除すると病理学的な皮膚の変化が減少した（図１１参照）。それらの結果は、皮膚でのＩＬ−１８の過剰産生が、ＩｇＥあるいはｓｔａｔ６を介したシグナル伝達系に非依存的に、炎症性の皮膚の変化を発症させることを強く示している。したがって、ＡＤ患者の血清中のＩＬ−１８レベルの測定は重要となろう。しかしながら、ＩＬ−１８はＩＬ−１２が共存すると、ＩＦＮ−γの産生を誘発するので、ＩｇＥかＩＬ−１８かのどちらを標的とした治療が重要であるかを決定するためには、ＩＬ−１８とＩＬ−１２との両方の血清レベルを測定するのがより有益であるように思われる。
【００９８】
ヒトのカスパーゼ−１をコードした導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）またはネズミ科由来活性型ＩＬ−１８導入遺伝子が、ＫＣＡＳＰ１ＴｇとＫＩＬ−１８Ｔｇのケラチン細胞の中で、ケラチン１４のコントロールの下で、選択的にそれぞれ発現された（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１６５（２０００），　ｐｐ９９７−１００３，参照、データを示さず）。
【００９９】
導入遺伝子は、皮膚内で選択的に発現し、脾臓を含む他の何れの組織でもその発現は認められなかった（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　ｖｏｌ．１６５（２０００），　ｐｐ９９７−１００３，参照、データを示さず）。しかし、これらの変異体マウスの脾臓でＣＤ４＋Ｔ細胞はＳＰＦ条件下であっても、自然にＴｈ２細胞に分化していた（図８および図９参照）。これは、ＩＬ−１８の濃度上昇（図４参照）が部分的に関与している可能性を示すものである。高濃度のＩＬ−１８は、常在細菌のもつ構造体をＡｇとしたＴｈ２細胞分化を誘導する可能性がある（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　ｖｏｌ．１９（２００１），　ｐｐ４２３−４７４）。
【０１００】
あるいは、皮膚の樹状細胞が、高濃度のＩＬ−１８環境下では、Ｔｈ２細胞を導く抗原提示細胞になり、脾臓を含む末梢免疫器官内にリクルートして、Ｔｈ２細胞への選択的な分化に関与する可能性もある。
【０１０１】
ＫＣＡＳＰ１ＴｇとＫＩＬ−１８Ｔｇの両方の脾臓中の好中球数は皮膚変化発生の後に増加した（図６参照）。興味深いことに、同等数の好中球蓄積がｓｔａｔ６欠損ＫＣＡＳＰ１ＴｇおよびＫＣＡＳＰ１Ｔｇの各皮膚病巣中に観測された（データを示さず）。
【０１０２】
実際、ＩＬ−１８には、ヒトのＩＬ−８などの好中球走化性因子の産生を誘導して好中球を集積したり（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，　ｖｏｌ．３０３（１９８０），　ｐｐ２７−３４）、直接好中球を活性化したりする作用がある（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．　ｖｏｌ．３１（２００１），　ｐｐ１０１０−１０１６）。また、ＩＬ−１８にはＧＭ−ＣＳＦ産生を誘導して好中球の増殖を誘発　（Ｂｌｏｏｄ，　ｖｏｌ．９８（２００１），　ｐｐ２１０１−２１０７）する能力が備わっている。活性化された好中球は、様々な生物活性分子をリリースすることによって、これらの変異体マウスにおける炎症性の皮膚変化の発生に関与している可能性を備えている（Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏ．，　ｖｏｌ．２（２００１），　ｐｐ６７５−６８１）。
【０１０３】
ＡＤの誘発および／または活性化は、細菌感染によって強く影響されることが知られている（Ｌａｎｃｅｔ，　ｖｏｌ．３５１（１９９８），　ｐｐ１７１５−１７２１）。いくつかの細菌由来の産物がＴｏｌｌ様受容体を介してＩＬ−１８の分泌を誘発する（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．　ｖｏｌ．１６６（２００１），　ｐｐ２６５１−２６５７）。その結果、ＩＬ−１８依存性のＡＤ様皮膚病巣を誘導する可能性がある。実際、マクロファージは、バクテリア、ウイルスおよび原虫を含む様々な微生物に感染したとき、ＩＬ−１８を分泌する（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．　ｖｏｌ．１６７（２００１），　ｐｐ５９２８−５９３４）。
【０１０４】
上記の本願発明を要約すると以下の通りである。本発明者らは、ＫＣＡＳＰ１ＴｇとＫＩＬ−１８Ｔｇとの両方がＡＤ様の皮膚病を発生させることを示した。上記皮膚病は、血漿レベルでの高濃度のヒスタミン、病巣での頻繁な掻痒や同病巣中での肥満細胞蓄積などによって特徴付けられている。
【０１０５】
しかしながら、ＫＩＬ−１８Ｔｇは、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇと比較すると、皮膚の病巣を顕現するためにはるかに長い潜伏期間を必要とした。ＩＬ−１欠損ＫＣＡＳＰ１Ｔｇが皮膚病巣を顕現化するために、ＫＩＬ−１８Ｔｇとほとんど同じ潜伏期間を必要としたことは、ＩＬ−１が疾病の発症を促進する可能性を示唆している。
【０１０６】
対照的に、ＩＬ−１８の減少は、血漿ヒスタミンレベルと同様に皮膚内の肥満細胞蓄積の減少をひきおこし、掻痒性の皮膚炎をほとんど完全に解消した。さらに、ｓｔａｔ６欠損ＫＣＡＳＰ１Ｔｇは、その血清のＩｇＥレベルが検出できないほどの低レベルにもかかわらず、掻痒性の皮膚炎を少しの遅延もなしに発生させた。したがって、アレルゲンとそれに対するＩｇＥの産生を引き起こさなくても、ＩＬ−１８は、例えば皮膚炎の発症を誘発できることが分かる。
【０１０７】
これらの結果は、ＩＬ−１８に依存しているが、ＩｇＥ／ｓｔａｔ６に非依存のアトピー性皮膚炎の重要性を明確に示しており、ＩｇＥ／ｓｔａｔ６依存した獲得性アトピーとは全く異なる成因の存在を示唆し、ＩＬ−１８に依存する先天的な、新しいアレルギー性応答の概念を提供するものである。
【０１０８】
【発明の効果】
本発明のアトピー性皮膚炎モデル動物は、以上のように、イムノグロブリンＥを介した炎症機構を阻害するように遺伝子が組み換えられた、例えばＳｔａｔ６が欠損した組み換えＤＮＡを有する構成である。
【０１０９】
それゆえ、上記構成は、アトピー性皮膚炎を、ＩｇＥに対して非依存的に発症させることができて、より的確に把握でき、アトピー性皮膚炎モデル動物を用いた治験薬のスクリーニングや、アトピー性皮膚炎の症状に合った医薬品をより確実に得ることが可能となるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明を説明するために用いたアトピー性皮膚炎モデル動物としてのＫＩＬ−１８Ｔｇの導入遺伝子の模式図である。
【図２】上記ＫＩＬ−１８Ｔｇの、２４週齢での皮膚での変化を示す正面図である。
【図３】上記ＫＩＬ−１８Ｔｇ（４８週齢）と野生型（ＷＴ）との、ノーザンブロット分析の結果をそれぞれ示すグラフである。
【図４】上記ＫＩＬ−１８Ｔｇと、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇと、野生型（ＷＴ）とにおけるＩＬ−１８発現をそれぞれ示すグラフであって、（ａ）はＩＬ−１８濃度、（ｂ）はＩＬ−１８活性度を示す。
【図５】上記ＫＩＬ−１８Ｔｇと、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇと、野生型（ＷＴ）とにおける、３６週齢（同腹児）からの、各好中球の割合をサイトメトリーにより測定した結果をそれぞれ示すグラフである。
【図６】上記ＫＩＬ−１８Ｔｇと、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇと、野生型（ＷＴ）とにおける、３６週齢（同腹児）からの、各好中球の割合をサイトメトリーにより測定した結果をそれぞれ示すグラフである。
【図７】上記ＫＩＬ−１８Ｔｇと、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇと、野生型（ＷＴ）とにおける、各Ｉｇの割合をそれぞれ示すグラフである。
【図８】上記ＫＣＡＳＰ１Ｔｇと、野生型（ＷＴ）とにおける、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５、ＩＬ−３の各血清中の含量をそれぞれ示すグラフである。
【図９】上記ＫＩＬ−１８Ｔｇと、野生型（ＷＴ）とにおける、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γの各血清含量をそれぞれ示すグラフである。
【図１０】上記ＫＩＬ−１８Ｔｇと、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇと、野生型（ＷＴ）とにおける、ＣＤ４＋細胞のＣＤ４０Ｌ発現頻度をそれぞれ示すグラフである。
【図１１】種々なトランスジェニックマウスと野生型のマウスとにおける、皮膚の各組織変化をそれぞれ示す。
【図１２】上記種々なトランスジェニックマウスにおける皮膚の変化を経時的に示すグラフである。
【図１３】上記種々なトランスジェニックマウスにおける、ＩＬ−１８、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ヒスタミン、肥満細胞、引っ掻き頻度の変化をそれぞれ示すグラフである。
【図１】
2004041123.tif 000004
【図２】
2004041123.tif 000005
【図３】
2004041123.tif 000006
【図４】
2004041123.tif 000007
【図５】
2004041123.tif 000008
【図６】
2004041123.tif 000009
【図７】
2004041123.tif 000010
【図８】
2004041123.tif 000011
【図９】
2004041123.tif 000012
【図１０】
2004041123.tif 000013
【図１１】
2004041123.tif 000014
【図１２】
2004041123.tif 000015
【図１３】
2004041123.tif 000016