(57)【要約】【課題】テロメレース阻害剤、及びテロメレース阻害作用を有する物質を有効成分として含み抗腫瘍剤等に有用な医薬を提供する。【解決手段】下記の式で表される化合物（Ｉ）、又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含むテロメレース阻害剤を提供する。また、下記の式で表される化合物（Ｉ）、又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含む医薬を提供する。【化１】2004137204.tif 000010【選択図】　　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式で表される化合物（Ｉ）、又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含むテロメレース阻害剤。
【化１】
2004137204.tif 000009
【請求項２】
請求項１に記載の式で表される化合物（Ｉ）、又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含む医薬。
【請求項３】
癌細胞増殖抑制剤であることを特徴とする請求項２に記載の医薬。
【請求項４】
抗腫瘍剤であることを特徴とする請求項２に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定のアンスラニル酸誘導体、又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含むテロメレース阻害剤に関する。また、本発明は、特定のアンスラニル酸誘導体、又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含み、癌細胞増殖抑制剤や抗腫瘍剤として有用な医薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ホジキン病に代表されるいくつかの癌が根治可能となり、他の多くの癌種に対しても有効な治療方法が開発されている。また、細胞の悪性化のメカニズム、増殖因子やその受容体、細胞内情報伝達系、癌遺伝子や癌抑制遺伝子の役割に関して多くの報告がなされている。もっとも、癌に対しての理解が深まるに連れて、癌を形成するに至る悪性化のメカニズムが個々の癌に共通のものではなく、癌が非常に多様性に富んだ疾患であることも解明されつつあり、それぞれの癌が持つ悪性化要因の組み合わせの複雑さが癌治療の大きな障壁となることも明らかになってきている。
【０００３】
一方、最近、正常細胞の老化と癌細胞の不死化のメカニズムとの関係が遺伝子レベルで解明されつつある。真核細胞の染色体ＤＮＡは直鎖状であり、この末端部分はテロメアと呼ばれる単純な繰り返し配列からなる。このテロメアが染色体の構造、機能に重要な役割を果たすことは以前から知られていた（例えば非特許文献１参照）。
【０００４】
また、非特許文献２では、細胞が分裂を重ねるごとにテロメアを徐々に失い、一定回数分裂した後に増殖能力を失って細胞の老化が生じること、及びテロメアを合成付加する酵素であるテロメレースが癌細胞の不死化に重要な働きを担っていることが示唆された。
【０００５】
ほとんどの癌細胞はテロメレース活性を有していることが既に知られている。これにより、ほとんどの癌細胞は、細胞分裂に伴うテロメア短小化に拮抗してテロメアを合成付加することで無制限な増殖を可能にしていると考えられる。一方、多くの正常体細胞はテロメレース活性をもたず、細胞分裂に伴うテロメア短小化と、それによる細胞老化が観察される。これらのことから、テロメレース活性の阻害剤は、癌細胞の無限増殖性を選択的に阻害することができ、より多様な癌種に適応可能な抗腫瘍剤になると考えられる（例えば非特許文献３参照。）。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｍｏｙｚｉｓ　Ｒ．Ｋ．ら，“Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　ＳｃｉＵＳＡ”，８５，１９８８年，ｐ．６６２２
【非特許文献２】
Ｋｉｍ　Ｎ．Ｗ．ら，“Ｓｃｉｅｎｃｅ”，２６６，１９９４年，ｐ．２０１１
【非特許文献３】
Ｅｇｏｒｏｖ　Ｅ．Ｅ．ら，“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，６２，１９９７年，ｐ．１２９６
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、テロメレース阻害剤を提供することにある。また、本発明の別の課題は、テロメレース阻害作用を有する物質を有効成分として含み、抗腫瘍剤等に有用な医薬を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、特定構造のアンスラニル酸誘導体がテロメレース阻害作用と癌細胞増殖抑制作用を有することを見出し、本発明に到達した。
【０００９】
すなわち、本発明は、下記の式で表される化合物（Ｉ）又はこの化合物の生理学的に許容される塩を有効成分として含むテロメレース阻害剤である。
【００１０】
【化２】
2004137204.tif 000002
【００１１】
また、本発明は、上記の式で表される化合物（Ｉ）又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含む医薬である。この医薬は、細胞のテロメレース活性を阻害する作用を有しており、癌細胞増殖抑制剤として、また抗腫瘍剤、好ましくは抗悪性腫瘍剤として、多様な癌種の治療に用いることができる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につき詳細に説明する。
本発明は、下記式で表される化合物（Ｉ）、又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含む。
【００１３】
【化３】
2004137204.tif 000003
【００１４】
上記の化合物（Ｉ）はテロメレース阻害作用を有しており、抗腫瘍剤、好ましくは悪性腫瘍の治療のための医薬の有効成分として有用である。上記化合物（Ｉ）のテロメレース阻害作用は、Ｔａｔｅｍａｔｓｕらの方法［Ｔａｔｅｍａｔｓｕ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１３、ｐ２２６５（１９９６年）、特公平８−０１８８０３号公報］や本明細書の実施例に具体的に記載した方法等に従って、当業者が容易に確認することが可能である。
【００１５】
本発明の医薬を抗腫瘍剤として用いる場合には、対象となる腫瘍の種類は特に限定されず、固形腫瘍又は非固形腫瘍のいずれにも適用可能である。固形腫瘍又は非固形腫瘍の種類も特に限定されない。このような固形腫瘍や非固形腫瘍としては、例えば、肺癌、胃癌、食道癌、十二指腸癌、小腸癌、大腸癌、肝臓癌、胆嚢癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、口腔癌、骨癌、脳腫瘍、皮膚癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、神経芽腫等の固形腫瘍、白血病、悪性リンパ腫等の非固形腫瘍等を挙げることができる。本発明の医薬の適用対象はこれらの疾患に限定されることはない。
【００１６】
本発明の医薬の有効成分としては、上記化合物（Ｉ）及びこの化合物（Ｉ）の生理学的に許容される塩の少なくともいずれか一種又は二種以上である。上記化合物（Ｉ）及びその上記塩は、水和物や溶媒和物の状態であっても良い。これらの水和物や溶媒和物も、本発明のテロメレース阻害剤や医薬の有効成分に含まれる。
【００１７】
上記化合物（Ｉ）は、公知の試薬、触媒、及び溶剤を適宜用いて合成することにより得られる。上記化合物（Ｉ）の合成経路は、以下の経路に限定されないが、上記化合物（Ｉ）は、例えば５−ブロモ−１Ｈ−インドール−２，３−ジオンを出発原料とし、これを、３，４−ジクロロベンジル誘導体をアルキル化剤としてＮ−アルキル化し、これを酸化してイサト酸無水物誘導体とし、さらにアルカリ加水分解した後、酸を加えることにより得ることができる。５−ブロモ−１Ｈ−インドール−２，３−ジオンは、例えば「５−Ｂｒｏｍｏｉｓａｔｉｎ」として東京化成工業株式会社から販売されている。
【００１８】
上記化合物（Ｉ）の生理学的に許容される塩としては、塩酸塩、硫酸塩、炭酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、あるいはギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、フタル酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、グルクロン酸塩、グルコン酸塩等の有機酸との塩が挙げられる。また、上記化合物（Ｉ）の生理学的に許容される塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩等の金属付加塩等を挙げることができる。
【００１９】
本発明の医薬としては、上記化合物（Ｉ）及び生理学的に許容されるその塩、並びにそれらの水和物及びそれらの溶媒和物からなる群から選ばれる物質をそのまま医薬として用いても良いが、通常は、一種又は二種以上の製剤用添加物を用いて製造される医薬組成物の状態で用いることが望ましい。本発明の医薬には、他のテロメレース阻害剤、癌細胞増殖抑制剤、又は抗腫瘍剤の有効成分等を配合しても良い。本発明の医薬の投与経路は特に限定されず、経口投与又は非経口投与のいずれも選択可能である。
【００２０】
経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、溶液剤、懸濁剤等を挙げることができ、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等を挙げることができる。もっとも、本発明の医薬の形態はこれらに限定されることはない。本発明の医薬は、医薬組成物の形態に応じて適宜の製剤用添加物を用いることができ、常法に従って製剤化することができる。
【００２１】
経口投与用の固形製剤を調製するにあたり、製剤用添加物として、慣用の賦形剤、結合剤、滑択剤、着色剤、及び崩壊剤等を用いることができる。賦形剤としては、例えば、乳糖、デンプン、タルク、ステアリン酸マグネシウム、結晶セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム等挙げることができ、結合剤としてはポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、アラビアゴム、シエラック、白糖等を挙げることができる。滑沢剤としてはステアリン酸マグネシウム、タルク等が挙げられ、着色剤、崩壊剤も通常使用されるものから適宜選択可能である。
【００２２】
錠剤は、周知の方法により腸溶性コーティング等を施しても良い。水性又は油性の懸濁液、溶液、シロップ、エリキシル剤等の液状製剤は、通常用いられる方法で適宜の水性媒体を用いて調製可能である。注射剤を調製する場合には、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、等張剤、又は局所麻酔剤等の製剤用添加物を加え、常法により皮下、筋肉内、静脈内用の注射剤として調製すれば良い。坐剤を製造する際の基剤としては、例えばカカオ脂、ポリエチレングリコール、ラノリン、脂肪酸トリグリセライド、ウイテプゾール（ダイナマイトノーベル社の登録商標）等の油脂性基剤を用いることができる。
【００２３】
本発明の医薬の投与量は、特に限定されないが、治療すべき腫瘍の種類、患者の症状、体重、年齢、他の抗腫瘍剤の使用の有無等の条件によって適宜選択することが望ましい。例えば上記化合物（Ｉ）の量として、通常、成人１日当たり約１〜２０００ｍｇの範囲が好ましい。上記投与量を１日１〜４回に分けて投与することができ、数日又は数週間に一回の割合で間欠的に投与しても良い。
【００２４】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
【００２５】
例１：５−ブロモ−２−［（３，４−ジクロロベンジル）アミノ］安息香酸塩酸塩の製造
５−ブロモ−１Ｈ−インドール−２，３−ジオン（下記式中（１）、１０．０ｇ、４４．２ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１５０ｍＬ）に溶解し、水素化ナトリウム（６０％　ｉｎ　ｏｉｌ、１．９４ｇ、４８．５ｍｍｏｌ）を加えた。１０分後、３，４−ジクロロベンジルクロライド（下記式中（２）、７．３ｍＬ、５３．０ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で３時間攪拌し、反応させた。反応液に１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を加え、生成物を酢酸エチルで抽出した。油層を乾燥、濃縮した後、残渣をヘキサン−酢酸エチルより再結晶し、５−ブロモ−１−（３，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−インドール−２，３−ジオン（下記式中（３））を結晶（１２．５２ｇ、７４％）として得た。化合物（３）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおける化学シフトを以下に示す。
【００２６】
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：４．９１（ｓ，２Ｈ）、６．９０（ｄｄ，Ｊ＝２．０，１０．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．４２（ｄｄ，Ｊ＝２．０，９．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．６０（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．７４（ｍ，３Ｈ）。
【００２７】
【化４】
2004137204.tif 000004
【００２８】
化合物（３）（１０．０ｇ、２６．０ｍｍｏｌ）をジクロロメタンに溶解し、ｍ−クロロ過安息香酸（１９．０ｇ、４９．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌し、反応させた。反応液を水、飽和炭酸水素ナトリウム水で洗浄し、乾燥、濃縮し、６−ブロモ−１−（３，４−ジクロロベンジル）−２Ｈ−３，１−ベンゾオキサジン−２，４−（１Ｈ）−ジオン（下記式中（４）、７．７５ｇ、７４％）を得た。この化合物（４）（２．０ｇ、５．０ｍｍｏｌ）に１ｍｏＬ／Ｌ水酸化ナトリウム（２０ｍＬ）を加え室温で攪拌し、反応させた。反応液から生成物を酢酸エチルで抽出し、油層を飽和食塩水、０．１ｍｏＬ／Ｌクエン酸水溶液で洗浄し、乾燥、濃縮後、残渣を酢酸エチル−エタノールに溶解し、１ｍｏＬ／Ｌの塩酸−エタノールを用いて塩酸塩（２．１４ｇ、１００％）とした。得られた５−ブロモ−２−［（３，４−ジクロロベンジル）アミノ］安息香酸（化合物（Ｉ））の塩酸塩の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおける化学シフトを以下に示す。
【００２９】
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：４．５０（ｓ，２Ｈ）、６．５７（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．３１（ｄｄ，Ｊ＝２．０，９．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．４１（ｄｄ，Ｊ＝２．０，１０．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．５７（ｍ，２Ｈ）、７．８７（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ）。
【００３０】
【化５】
2004137204.tif 000005
【００３１】
例２：テロメレースに対する阻害活性の測定
上記例１で得られた５−ブロモ−２−［（３，４−ジクロロベンジル）アミノ］安息香酸塩酸塩（以下、「化合物（Ｉ）塩酸塩」と称す）について、テロメレースを阻害する活性を測定した。この測定は、Ｔａｔｅｍａｔｓｕ　Ｋ．らの方法［Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１３、ｐ２２６５（１９９６年）、特公平８−０１８８０３号公報］を改変して行った。
【００３２】
（１）テロメレース抽出液の調製
１０％非働化ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変最小必須培地中、５％ＣＯ２、３７℃で培養したテロメレース活性陽性腫瘍細胞株ＰＡ−１（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（受託番号：ＣＲＬ１５７２）をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、培養皿からはがして遠心回収した。
【００３３】
この細胞に細胞溶解液［１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭの塩化マグネシウム、０．５％の３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミノ］−１−プロパンスルフォネート（３−［（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｅｐｒｏｐｙｌ）−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＣＨＡＰＳ））、１ｍＭのエチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（ＥＧＴＡ）、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、１０％のグリセロール、０．１ｍＭの４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルヒドロクロリン（４−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｎｅ（ＡＥＢＳＦ）］を加えて懸濁した。得られた液を氷中に３０分間静置した後、１６，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心した。
【００３４】
その上清をテロメレース抽出液として、ドライアイス／エタノールバス中で急速凍結した後、使用するまで−８０℃で保存した。
【００３５】
（２）テロメレース反応
溶媒（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））で所望濃度に希釈された化合物（Ｉ）塩酸塩、最終濃度１μＭのｂｐＴＧ３（基質プライマー：ビオチン化されたｐＴＧ３（５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＴＴＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＴＧ−３’）（配列番号１））、１ｍＭのｄＴＴＰ、１ｍＭのｄＡＴＰ、１ｍＭのｄＧＴＰ、５０ｍＭのトリス酢酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭの酢酸カリウム、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、１ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのスペルミン、１ｍＭのスペルミジン、及び細胞溶解液で所望の濃度に希釈したテロメレース抽出液を混合し、３０℃で保温した。一定時間後、最終濃度１６ｍＭとなるようにエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を加えて９５℃で加熱し、反応を停止した（得られた液を「テロメレース反応産物」とする）。
【００３６】
なお、反応開始前に予め２０ｍＭのＥＤＴＡを加え、テロメレースを不活化した条件で得られた値をバックグランドとして結果より差し引いた。また、コントロールとしてＤＭＳＯを上記化合物（Ｉ）塩酸塩の代わりに用いた。
【００３７】
（３）アビジンクロスリンクプレートの作製
９６ウェルＰＣＲプレートに、滅菌水に溶解したストレプトアビジンを９μｌ／ウェルにて加え、０．１Ｍの２−［モルフォリノ］エタンスルホン酸（２−［Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＭＥＳ））緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解した１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＥＤＣ、シグマ））を９μｌ／ウェルにて追加し、３７℃で一定時間保温した。その後、各ウェルを、ツイン２０（シグマ）を含むＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ）及び滅菌水で洗浄・乾燥し、「アビジンクロスリンクプレート」とした。
【００３８】
（４）ストレッチＰＣＲ
２５μｌのテロメレース反応産物をアビジンクロスリンクプレートに加え、３７℃で保温してテロメレース反応産物をプレートに結合させ、蒸留水で洗浄した。ＰＣＲ反応液［２０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．３）、７５ｍＭの塩化カリウム、０．００５％のＷ−１（界面活性剤）、１．５ｍＭの塩化マグネシウム、４μＭのｐＴＧ３（センスプライマー）、１μＭのｐＴＡＧγ（アンチセンスプライマー：５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴ−３’）（配列番号２）、５０μＭのｄＡＴＰ、５０μＭのｄＧＴＰ、５０μＭのｄＣＴＰ、５０μＭのｄＴＴＰ、１Ｕ／２５μｌのＴａｑ　ＤＮＡポリメレース］を２５μｌ／ウェルにて加え、ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰ（宝酒造）を用いてＰＣＲを行った（９３℃１分、６９℃１分、７２℃２分を３０サイクル）。ＰＣＲ終了後、反応液２５μｌに滅菌水を１００μｌ加え、計１２５μｌとした（「ＰＣＲ産物」）。ＰＣＲに用いたプライマー及び試薬は全てライフテックオリエンタルより購入した。
【００３９】
（５）ストレッチＰＣＲ産物の定量
１００μｌのＰＣＲ産物を９６ウェル黒色プレート（住友ベークライト）に移し、これに滅菌水で２００倍希釈したピコグリーン（モレキュラプロブス）を１００μｌ加え、室温で５分間放置した後、励起波長４８５ｎｍ、吸収波長５３８ｎｍにおける蛍光強度を、蛍光プレートリーダー、フルオロスキャンＩＩ（大日本製薬）にて測定した。その結果、テロメレースに対する化合物（Ｉ）塩酸塩の５０％阻害濃度は６７μＭであり、化合物（Ｉ）塩酸塩がテロメレースを阻害することが明らかとなった。
【００４０】
例３：癌細胞の増殖抑制活性及びテロメア短縮効果の測定
上記例１で得られた化合物（Ｉ）塩酸塩について、癌細胞の増殖抑制活性及びテロメア短縮効果を測定した。
【００４１】
ストレッチＰＣＲ法にてテロメレース活性陽性と判断され、培養液中に浮遊した状態でも増殖するヒト白血病由来細胞株Ｕ９３７（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入）（受託番号：ＣＲＬ−２３６７）を用いて増殖試験を行った。
【００４２】
培養は、牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ）を用いて行った。浮遊培養のＵ９３７細胞は、直接コールターカウンターにて細胞数を計測した。各測定時に得られる細胞数を基に、実験開始時からの累積細胞数を計算し、分裂回数を導き出した。各測定時に残った細胞についてはさらに培養を継続した。培地に加える前の溶媒としてはＤＭＳＯを用い、いずれの群もＤＭＳＯが最終濃度０．１％となるように調整して実験を行った。その結果、化合物（Ｉ）塩酸塩は５０μＭでＵ９３７細胞の増殖を阻害した（図１）。
【００４３】
さらに、化合物（Ｉ）塩酸塩が実際に癌細胞のテロメレースを阻害して、その結果として染色体テロメア長が短くなったかどうかを知るために、サザンブロット法によりテロメア長を解析した。
【００４４】
阻害物質の存在下又は非存在下で培養した培養癌細胞から、染色体ＤＮＡ精製キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてゲノムＤＮＡを精製し、適当量のＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｆ　Ｉ及びＲｓａ　Ｉにより完全消化したものをアガロース電気泳動し、ナイロンメンブレンに定法にてキャピラリートランスファーした。ナイロンメンブレン上のテロメアＤＮＡは、５’端ジゴキシゲニン修飾（ＴＴＡＧＧＧ）３のオリゴヌクレオチドプローブ（配列番号３）、及びＨＲＰ結合抗ジゴキシゲニン抗体及び化学発光剤を用いて可視化した。
【００４５】
その結果、化合物（Ｉ）塩酸塩を添加した後の培養日数が増すに連れ、テロメア長分布のピークが小さくなることが示された（図２）。以上より、化合物（Ｉ）塩酸塩がＵ９３７細胞のテロメレースを阻害することによりテロメア短縮化を引き起こし、その結果として癌細胞の増殖を抑制することが明らかになった。
【００４６】
【発明の効果】
以上のことから明らかなように、下記化合物（Ｉ）又はその塩は低濃度でテロメレースを阻害するので、化合物（Ｉ）又はその塩を有効成分として含む本発明の医薬は、多様な腫瘍の治療剤として有用である。したがって、本発明によれば、テロメレース阻害剤を提供することができ、また、テロメレース阻害作用を有する物質を有効成分として含み抗腫瘍剤等に有用な医薬を提供することができる。
【００４７】
【化６】
2004137204.tif 000006
【００４８】
また、本発明によれば、テロメレース阻害剤の製造のための上記の式で表される化合物（Ｉ）又はその塩の使用、及び、上記の医薬、好ましくは抗腫瘍剤、より好ましくは抗悪性腫瘍剤の製造のための上記の式で表される化合物（Ｉ）又はその塩の使用、及び、腫瘍、好ましくは悪性腫瘍の治療方法であって、上記の式で表される化合物（Ｉ）又は生理学的に許容されるその塩の治療有効量を、ヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法が提供され得る。
【００４９】
【配列表】
2004137204.tif 000007
2004137204.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【図１】化合物（Ｉ）塩酸塩又はＤＭＳＯを添加したときのヒト白血病由来細胞株Ｕ９３７の細胞分裂回数（＝ｌｏｇ２（累積増殖細胞数））と、化合物添加後の培養日数をプロットした図である。
【図２】化合物（Ｉ）塩酸塩又はＤＭＳＯを添加したときのヒト白血病由来細胞株Ｕ９３７をサザンブロット法にて解析し、サザンブロット法におけるスメアバンドで一番濃い部分の分子量、すなわちＴＲＦ長（テロメアリピートフラグメントの長さ（平均値））と、化合物添加後の培養日数をプロットした図である。
【図１】
2004137204.tif 000011
【図２】
2004137204.tif 000012