(57)【要約】【課題】　ヒトの異常リン酸化タウタンパク質に属する抗原のリン酸化されたエピトープと免疫複合体を形成するモノクローナル抗体を提供すること。【解決手段】　アルツハイマー病を有するか又はアルツハイマー病で死亡した患者の大脳皮質から分離された脳ホモジネートから得られる、ヒトの異常にリン酸化されたタウタンパク質中に存在し、ヒト正常タウタンパク質中に存在しない、リン酸化されたエピトープと免疫複合体を形成するモノクローナル抗体。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　アルツハイマー病を有するか又はアルツハイマー病で死亡した患者の大脳皮質から分離された脳ホモジネートから得られる、ヒトの異常にリン酸化されたタウタンパク質中に存在し、ヒト正常タウタンパク質中に存在しない、リン酸化されたエピトープと免疫複合体を形成するモノクローナル抗体。
【請求項２】
　−　正常タウタンパク質と免疫複合体を形成せず、
−　ヒトの脳から誘導された脳ホモジネートの中に存在するタウタンパク質であって該ホモジネートが非神経系障害で死亡した患者から分離されたものであるタウタンパク質と、免疫複合体を形成せず、
−　脱リン剤で予め処理されたリン酸化エピトープと免疫複合体を形成しない、
請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
　−　アルツハイマー病で死亡した患者から得たヒトの脳のホモジネートの中に存在するタウタンパク質の異常にリン酸化された形態と免疫複合体を形成することを特徴とし、
−　ここで、該異常にリン酸化されたタンパク質は、非神経系障害で死亡した患者から分離された脳ホモジネートから誘導される正常なタウタンパク質のものよりも高い見かけの分子量を呈し、
−　ここで、該見かけの分子量は、脱リン剤でこの異常にリン酸化されたタウタンパク質を処理した時点で正常なタウタンパク質の見かけの分子量まで減少されうることを特徴とする、
請求の範囲第１項又は第２項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
　請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ。
【請求項５】
　−　☆印でマークされた位置でリン酸化された配列
【化１】
2004043487.tif 000013
を含む、
請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか１項記載のモノクローナル抗体のいずれとでも免疫複合体を形成する、ヒト異常リン酸化タウタンパク質に属する抗原のリン酸化されたエピトープを含む約１００個のアミノ酸のペプチド。
【請求項６】
　ヒト以外の動物を免疫化すると請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を生成する、請求の範囲第５項に記載のペプチド。
【請求項７】
　請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体と免疫複合体を形成することができることを条件として、
　Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5を２０個のアミノ酸のいずれか１つとし、ｐ、ｑ、ｒ、ｓが０又は１であるものとして、☆印のついた場所でリン酸化された、
【化２】
2004043487.tif 000014
という配列を含む約１００個のアミノ酸のペプチド（抗原）。
【請求項８】
　−　No.９１１００８０６という番号で１０月８日にＥＣＡＣＣに寄託されたモノクローナル抗体により認識される抗原を用いてインビボで予め免疫化されたマウス又はラットといったヒト以外の動物の脾細胞から又はこの抗原を用いてインビトロで予め免疫化されたこのような細胞の脾細胞から開始する段階；
−　ハイブリドーマ形成条件下で骨髄腫細胞と前記免疫化した細胞を融合させる段階；及び
−　請求の範囲第５項又は第６項のいずれか１つのペプチドのエピトープを特異的に認識し、このエピトープと免疫複合体を形成するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを選択する段階、
を含むことを特徴とする、請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの獲得及び分離方法。
【請求項９】
　−　適切な培地内で請求の範囲第４項に記載の選択されたハイブリドーマを培養する段階；及び
−　前記選択されたハイブリドーマにより排出されたモノクローナル抗体を回収する段階；又は代替的に
−　マウスの腹膜内に請求の範囲第４項の選択されたハイブリドーマを移植し、動物が腹水を産生した時点で、このときこの腹水から形成されたモノクローナル抗体を回収する段階、
を含む請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体の調製方法。
【請求項１０】
　−　ペプチドの非リン酸化エピトープを認識することができまた、請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体により認識されるリン酸化されたエピトープへとこのエピトープを修飾することのできる、脳から抽出したキナーゼ酵素を用いて、リン酸化されていないものである前記ペプチドを反応させる段階、
を含む、非リン酸化形態の前記ペプチドから開始した、請求の範囲第５項乃至第７項のいずれか１項に記載のペプチドの調製方法。
【請求項１１】
　−　抗原−抗体複合体を産生するのに適した条件下で、アルツハイマー病を患った患者から分離された洗浄剤抽出された脳ホモジネート又はＮＦＴの調製物と、請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を接触させる段階；及び
−　前記複合体から抗原を分離し、精製された形で求められた抗原を検出する段階（ここで、コントロールよりも多い量の抗原の存在は、異常リン酸化タウが該脳疾患に関与したことを示す）、
を含む、異常リン酸化タウタンパク質が関与する脳疾患のインビトロ検出のための方法。
【請求項１２】
　−　異常リン酸化タウタンパク質が関与する神経系障害を患っていると疑われている患者からの脳ホモジネート又は脳脊髄液又は血清の試料を、抗原−抗体複合体を産生するのに適した条件下で、請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体とインビトロ条件下で接触させる段階；
−　脳ホモジネート又は脳脊髄液又は血清の前記試料に対する前記抗体の免疫学的結合を検出する段階、
を含む、異常リン酸化タウタンパク質が関与する脳疾患のインビトロ検出のための方法。
【請求項１３】
　異常にリン酸化されたタウタンパク質が関与しているアルツハイマー病、ダウン症候群、ピック病、ＳＳＰＥ及びその他の神経系障害のうちの１つのインビトロ診断のためのキットにおいて、
−　請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか１項に記載の第１のモノクローナル抗体、
−　・　第１抗体のエピトープとは異なる、正常なタウ又は異常リン酸化されたタウタンパク質又は請求の範囲第５項乃至第７項のいずれか１項に記載のペプチドのエピトープを認識するモノクローナル抗体であってもよく、
・　全て第１抗体のエピトープと異なるエピトープと免疫複合体を形成することができ、固定化されたタウタンパク質を用いたイムノアフィニティクロマトグラフィにより精製されている、正常なタウ又は異常にリン酸化されたタウ又は請求の範囲第５項乃至第７項のいずれか１項に記載のペプチドのポリクローナル抗体であってもよい、
第２の抗体、又は
−　前記第２の抗体での特異的標識づけ（タギング）又はカップリングのいずれかをするための標識、
−　一方では本発明のモノクローナル抗体とテスト用試料、また他方では結合された第２の抗体と標識の間の免疫反応を実施するための適切な緩衝液；
−　標準として、又は求められる抗原との関係における競合を目的とした、請求の範囲第５項乃至第７項のいずれか１項に記載のペプチド、
を含むことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、ヒトの微小管結合タンパク質タウ上に存在する特定のエピトープに対する新規なモノクローナル抗体、これらのモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ、タウタンパク質の特定のエピトープが関与する脳疾患の診断方法及びこのエピトープを認識するモノクローナル抗体に関する。
【０００２】
　タウは、ヒトをはじめとするいくつかの種のニューロン内で合成され（Kosik, K.S. et al., 1989）、かつ、これらのニューロンの軸索区画内に豊富に存在する（Birder, L.I. et al., 1985）微小管結合タンパク質である。機能的には、このタウタンパク質は、チューブリンの重合に関与し（Weingarten, M.D. et. al., 1975）、また、おそらくは微小管の不安定性を低減することにも関与している（Bre. M.H. 及びKarsenti, E. 1990）。
【０００３】
　タウタンパク質は同様に、アルツハイマー病患者の脳の組織切片内に神経原繊維のもつれとして見られる特徴的構造である対らせんフィラメント（ＰＨＦ）の主要成分である（Greenberg, S. 及びDavies, P., 1990; Lee, V.M. -Y. et al., 1991）。このタンパク質は異なるイソ型タンパク質の一群として存在し、そのうち４〜６種のイソ型タンパク質は正常な成人の脳内に発見されるが胎児の脳にはわずか１個のイソ型タンパク質しか検出されない（Goedert, M. et al., 1989）。交互のｍＲＮＡスプライシングにより、単一の遺伝子から多様なイソ型タンパク質が生成される（Himmler, A., 1989）。分子クローニングから予想されるようなタウタンパク質の最も著しい特徴は、３回又は４回反復される分子のカルボキシ末端部分で起こる３１個又は３２個のアミノ酸の伸張である。分子のＮＨ2 末端部分内へ２９個又は５８個長のアミノ酸を挿入することによって、さらなる多様性が生み出される（Goedert, M. et al., 1989）。
【０００４】
　アルカリ性ホスファターゼ処理の後に観察されたその分子質量の減少によって明らかにされるように、異常にリン酸化されている６４及び６９kDa のタウ変異体が、神経原繊維のもつれ及び老人斑を示す脳の部域内に限定して検出された（Flament, S. et al., 1989及び1990）。４つの異なるキナーゼによるリン酸化の部位は、タウのＣ末端から半分の微小管結合部分内にマッピングされており、細菌により発現されるタウ上のカルシウムカルモジュリン依存性キナーゼの作用が、より低い電気泳動移動度を誘発するＳｅｒ（４０５）のリン酸化がもたらすということが示された（Steiner, B. et al., 1990）。
【０００５】
　神経フィラメント上に存在する非特異的リン酸化エピトープに対するものであって、その結果、正常なタウ及び異常にリン酸化されたタウと交叉反応することが示されている（Nukina, N. et al., 1987; Ksiezak-Redring et al., 1987）か、又は、正常な及び異常にリン酸化されたタウ上の特異的エピトープを認識したために、ヒトのタウに対する反応性を示すいくつかの抗体が報告されている。
【０００６】
　ウシ由来の及びヒトからの正常なタウ及び異常にリン酸化されたタウ（Ksiezak-Reding, H. et. al., 1988, Flament, S. 及びDelacourte, A. 1990）のタウ変異体上に存在するリン酸塩依存性エピトープを認識するＡｌｚ５０モノクローナル抗体（Wolozin, B.L. et al., 1986; Nukina et al., 1988）は、後者の抗体クラスに属する。このモノクローナルにより認識されるエピトープは、アルツハイマー病の間に変質しつつある皮質ニュートロンの細胞体樹状突起ドメイン内で特異的に発現される（Delacourte, A et al., 1990）。
【０００７】
　Ａｌｚ５０エピトープは近年、タウ分子のＮＨ2 −末端部分にマッピングされた（Ksiezak-Reding, H. et al., 1990; Goedert, M. et al., 1991）。正常なタウとの交叉反応性のため、この抗体は、脳ホモジネートのウエスタンブロット検出の使用もしくは硫酸アンモニウム濃縮ＣＳＦにより、又は脳ホモジネットに対するサンドイッチ免疫検定法を用いて、正常なタウを異常にリン酸化されたタウから識別することしかできない（Ghanbari et al., 1990; Wolozin, B 及びDauies, P. 1987;　欧州特許公報（「ＥＰ」４４４８５６）。ＰＨＦに対する抗体を用いたＣＳＦベースの検定が、Mehta et al 1985によって初めて記述されたが、対照からのＣＳＦとアルツハイマーＣＳＦの間に著しい重複を示している。この抗体によって認識されたエピトープは、ユビキチンの一部として同定された（Perry et al., 1989）。
【０００８】
　その他のモノクローナル抗体が、タウタンパク質を認識するために開発されてきた。例えば、モノクローナル抗体５Ｅ２は、ヒトの胎児熱安定性微小管結合タンパク質での免疫化により生み出されたものであり、正常な及び異常にリン酸化されたタウの中に存在するアミノ酸１５６〜１７５にわたるエピトープを認識する（Kosik, K. et al., 1988）。
【０００９】
　タウ１及びその他のいくつかのような他の抗体が、ウシのタウ、ウシの熱安定性微小管結合タンパク質又はラットの脳抽出物での免疫化によって生み出され（Binder, L.I. et al., 1985; Kosik, K.S. et al., 1988）、大部分の抗体は、正常な及び異常にリン酸化されたタウを認識する（Ksiezak-Reding, H. et al., 1990）。
【００１０】
　ＰＨＦのコアに対して誘起された「４２３」という名称の抗体は、タウの反復要素内に局在化されたタウタンパク質の９．５及び１２−kDa のフラグメントと特異的に反応したが、アルツハイマーの脳中の異常にリン酸化されたタウも正常なヒトのタウも認識しなかった（Wischik, C.H. et al., 1988）。
【００１１】
　この抗体は、脳ホモジネート内の正常な対照から、アルツハイマーＰＨＦ病理を区別するのに用いられてきた（Harrington, G.R. et al., 1990;特許ＷＯ０８９／０３９９３）。
【００１２】
　これまで、以上に記されてきた全ての抗体のいずれも、免疫組織学、ウエスタンブロット又はＥＬＩＳＡのどれによっても、異常にリン酸化されたタウに対する絶対的な特異性を有していなかった。正常な及び異常にリン酸化されたタウの定量的測定は、これまで、ウエスタンブロッティングの後の濃縮ＣＳＦ試料中、又はＰＨＦを含む脳の抽出物、又は脳ホモジネート中で、タウを検出することしかできなかった（Ghanbari H. A. et al., 1990; Harrington C.R. et al., 1990, Wisniewski, H.M. et al., 1989; Wolozin, B. 及びDauies, P. 1987）。
【００１３】
　従って、本発明の目的は、脳の組織切片、脳抽出物又は脳脊髄液といった体液内に存在する異常リン酸化タウのみを特異的に検出することのできるモノクローナル抗体を提供することにある。
【００１４】
　本発明は同様に、このようなモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマも提供する。
【００１５】
　本発明はさらに、脳の組織切片又は脳のホモジネート又は脳脊髄液といった体液内の異常リン酸化タウの中で発現され、このようなモノクローナル抗体により認識されるタウタンパク質のエピトープをも提供する。
【００１６】
　本発明はさらに、アルツハイマー病及びダウン症候群といった神経系障害を患う患者の脳の中で発現されるタウタンパク質のエピトープを提供する。
【００１７】
　本発明はさらに、タウタンパク質が関与する脳疾患のインビトロ検出及び診断のための方法をも提供する。
【００１８】
　本発明のモノクローナル抗体は、異常にリン酸化されたヒトのタウの中に存在するエピトープと反応することを特徴とする。モノクローナル抗体はさらに、異常にリン酸化されたヒトのタウ、より具体的には、異常にリン酸化されたヒトのタウ内に存在する非構造的エピトープと免疫複合体を形成することを特徴とする。
【００１９】
　「非構造的」エピトープというのは、その抗体認識に関して、その一次構造ならびに翻訳後修飾及びコンフォメーションに依存し、特定の処理（例えばホルマリン固定、洗浄剤処理、脱リン）によって変更又は破壊され得るようなエピトープのことを言う。
【００２０】
　「〜と免疫複合体を形成する」という表現は、本発明のモノクローナル抗体が、以下の技術のうちのいずれか１つの中で用いられる条件の下で前述の抗原に結合することを意味する。
【００２１】
　光学免疫顕微鏡検査法
　外科手術又は剖検で得た脳の組織試料を、４％のホルマリン又はブアン固定液の中に浸漬することによって固定し、パラフィン内に包埋させる。厚み４mmの切片を調製する。顕色のため３，３′−ジアミノベンチジンテトラヒドロ塩化物を用いたアビジン−ビオチニル化ペルオキシダーゼ複合体技術（Hsu, S.M. et al., 1981）といった、形成された免疫複合体を視覚化するための技術と合わせて、本発明のモノクローナル抗体を応用する。切片をハリスのヘマトキシリン染色で対比染色する。
【００２２】
　組織切片中の免疫電子顕微鏡検査法
　外科手術又は剖検で得た脳の組織試料を、包埋無しで厚み６０mmに薄切りする前にブアン固定液又は１０％の緩衝ホルマリンのいずれかの中で固定させる（Vibratome）。間接イムノゴールド法により免疫染色するため本発明のモノクローナル抗体を用い、その後切片を固定し、包埋し、切断して電子顕微鏡検査に付す。なお全て、当業者にとっては既知の標準的プロトコルに従って行なう（Brion, J.P. et al., 1985）。
【００２３】
　免疫ブロット法手順
　免疫ブロット法のためには、Igbal, K. et al.（1984）又はGreenberg, S. 及びDavies, P.（1990）によって記述されているように、ＰＨＦが富化された分画を調製する。第２の方法のためには、組織学的に確認されたアルツハイマー病患者から得られた前頭及び側頭皮質からの灰白質で大部分が構成されている死後組織が使用される。このアルツハイマー灰白質脳試料（５〜１０ｇ）を、テフロン／ガラスポッターＳ（Braun,ドイツ）ホモジナイザー内で１０体積の低温緩衝液Ｈ（１０mMのトリス／１mMＥＧＴＡ／０．８ＭのＮａＣｌ／１０％のショ糖、pH７．４）で均質化させる。４℃で２０分間２７，０００×ｇで６０Ｔｉ　ＭＳＥローター内で遠心分離した後、ペレットを除去し、上清を１％（重量／体積）のＮ−ラウロシルサルコシンと１％（体積／体積）の２−メルカプトエタノールに調整し、３７℃で２．５時間ミキサー８２０（Swelab, スウェーデン）で回転させながらインキュベートさせる。上清混合物を２０℃で３５分間１０８，０００×ｇで遠心分離する。ＰＢＳで、ＰＨＦ−タウ含有ペレットを穏やかに洗浄し、同じ緩衝液１ml中で最終的に懸濁させる。
【００２４】
　１２％のゲル上で、還元性条件下で、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を実施する（Laemmli U.K., 1970）。電気泳動後、タンパク質は、クマシーブリリアントブルーで固定、染色されるか、或は又、ニトロセルロースシート（Hybond-C, Amersham）又はImmobilon フィルター（Millipore）にトランスファーされる（Towbin H. et al., 1979）。
【００２５】
　トランスファー後フィルターを、０．０５％（ｖ／ｖ）のTween ２０（Tween −ＰＢＳ）を含むＰＢＳ内に予め浸し、次に５％（ｗ／ｖ）の乾燥スキムミルク及び１０％（ｖ／ｖ）の新生仔牛血清を含むTween −ＰＢＳ（ブロッキング緩衝液）内で１時間インキュベートする。次に、フィルターを、ブロッキング緩衝液内で適切に希釈された本発明のモノクローナル抗体を用いて４℃で一晩処理する。
【００２６】
　次に、Tween −ＰＢＳ内で三回フィルターを洗浄し、ブロッキング緩衝液中で１／３，０００に希釈されたホースラディッシュペルオキシダーゼで標識づけされたウサギ抗マウスＩｇＧ（Dakopatts,デンマーク）を用いて室温で１．５時間処理する。Tween −ＰＢＳ中で３回洗浄した後、ブロッキング緩衝液内で１／２５０に希釈されたストレプトアピジンでビオチニル化されたホースラディッシュ（西洋わさび）ペルオキシダーゼ複合体（Amersham）を１．５時間室温で適用する。その後フィルターを、０．０５％（ｗ／ｖ）のジアミノベンチジン及び０．０３％（ｖ／ｖ）の過酸化水素を含むＰＢＳ内でバックグラウンド染色が顕色するまでインキュベートする。
【００２７】
　モノクローナル抗体と抗原の間の免疫複合体の形成は、上述した厳密な条件に制限されず、抗体及び抗原結合の免疫化学特性に係るあらゆる技術が、同様な免疫複合体の形成をもたらすことは明らかである。
【００２８】
　ヒトの異常リン酸化タウは、その低い電気泳動移動度を異常なリン酸化に帰せしめることができ、かつ、アルツハイマー病の間の変質しつつある皮質ニューロンの細胞体樹状突起ドメイン内で特異的に発現される６４及び６８kDa の少なくとも２つのタウタンパク質を含む一群のものである（Flament, S. et al., 1989及びDelacourte, A. et al., 1990）。電気泳動移動度における付随するシフトを有する正常なタウの付加的リン酸化を誘発することができるキナーゼ活性について記述されてきたが、これらのリン酸化のいずれも、本発明のエピトープの形成を誘発することができない（Ishiguro, K. et al., 1988, Steiner, B et al., 1990）。
【００２９】
　本発明の有利な一実施態様に従うと、モノクローナル抗体は、アルツハイマー病を有するか又はアルツハイマー病で死亡した患者から得た大脳皮質からそれ自体が分離された脳ホモジネートから得られる、ヒトの異常リン酸化タウタンパク質に属する抗原のリン酸化されたエピトープと免疫複合体を形成する。
【００３０】
　「リン酸化されたエピトープ」という表現は、アルカリ性ホスファターゼといったようなホスファターゼ酵素で処理された場合に破壊されるエピトープのことを意味する。リン酸化されたエピトープの中で、セリンはホスホセリンの形をしている。
【００３１】
　「脳ホモジネート」及び異常にリン酸化されたタウタンパク質は、Iqbal, K. et al（1984）の方法又はGreenberg, P.G及びDauies, P.（1990）の方法といったような標準的方法に従って、当業者が得ることのできるものである。
【００３２】
　本発明のモノクローナル抗体は、それらが
−　☆印でマークされた位置でリン酸化されたペプチド
【００３３】
【化３】
2004043487.tif 000002
【００３４】
好ましくは
【００３５】
【化４】
2004043487.tif 000003
【００３６】
と、又は、
−　それ自体前記ペプチドと複合体を形成するモノクローナル抗体と免疫複合体を形成することのできる他のいかなるペプチドとも、
免疫複合体を形成することを特徴とする。
【００３７】
　ペプチド
【００３８】
【化５】
2004043487.tif 000004
【００３９】
好ましくは
【００４０】
【化６】
2004043487.tif 000005
【００４１】
を、以下、本発明の「エピトープ」と呼ぶ。ヒトのタウ４０の番号付けを用いると１９９及び２０２に位置するセリン（Goedert, M. et al., 1989）は、ホスホセリンの形をしている。このエピトープは、上述の番号付けを用いるとアミノ酸１９７〜２０５にわたっている。
【００４２】
　それ自体前述のペプチドと複合体を形成する傾向をもつモノクローナル抗体と免疫複合体を形成することのできるペプチドを、「変異体ペプチド」と定義づけする。
【００４３】
　一定の位置でリン酸化されたペプチドは、セリンがホスホセリンの形をしていることを意味する。
【００４４】
　本発明は同様に、正常なタウタンパク質と免疫複合体を形成する傾向をもたないモノクローナル抗体にも関する。
【００４５】
　本発明のモノクローナル抗体は、非神経系障害で死亡した患者から分離されたヒトの脳から誘導された脳ホモジネートの中に存在するタウタンパク質と免疫複合体を形成することができない。
【００４６】
　本発明のモノクローナル抗体は同様に、アルカリ性ホスファターゼといったような脱リン剤で予め処理された上述のエピトープと免疫複合体を形成することができない。
【００４７】
　本発明のモノクローナル抗体はさらに、上述の予め脱リン剤で処理されたあらゆる変異体ペプチドと免疫複合体を形成することができない。
【００４８】
　有利にも、本発明のモノクローナル抗体は、
−　アルツハイマー病で死亡した患者から得たヒトの脳のホモジネートの中に存在するタウタンパク質の異常にリン酸化された形態と免疫複合体を形成すること、及び
−　これらの異常リン酸化タンパク質が、非神経系障害で死亡した患者から分離された脳ホモジネートから誘導される正常なタウタンパク質のものよりも高い見かけの分子量を呈していること、及び
−　これらの異常リン酸化タウタンパク質の見かけの分子量は、脱リン剤でこの異常にリン酸化されたタウタンパク質を処理することにより、正常なタウタンパク質の見かけの分子量まで減少されうること、
を特徴とする。
【００４９】
　本発明は同様に、上述のような脳のホモジネート内に存在するタウタンパク質の異常にリン酸化された６４kDa 及び６８kDa の形態と免疫複合体を形成するモノクローナル抗体にも関する。
【００５０】
　本発明の好ましいモノクローナル抗体は、９１１００８０６という番号で１９９１年１０月８日にＥＣＡＣＣ（ヨーロッパ動物細胞培養収集所、ワクチン研究・生産研究所、公共保健・研究所サービス（ＰＨＬＳ）、応用微生物・研究センター、Porton Down, GB-Salisbury Wiltshire SP4. OJG）に寄託されたハイブリドーマによって分泌される。このハイブリドーマを、以下「ハイブリドーマＡＴ８」と呼び、分泌されるモノクローナル抗体を、「モノクローナル抗体ＡＴ８」と呼ぶことにする。
【００５１】
　本発明は同様に、本発明に従ったモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ、特に１９９１年１０月８日に９１１００８０６という番号でＥＣＡＣＣに寄託されたハイブリドーマにも関する。
【００５２】
　本発明のモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの取得し単分離する方法により得られる。
【００５３】
　このようなハイブリドーマを獲得するための方法には、
−　No.９１１００８０６という番号で１０月８日にＥＣＡＣＣに寄託されたハイブリドーマによって分泌されたモノクローナル抗体のような、本発明のモノクローナル抗体により認識される抗原を用いてインビボで予め免疫化された例えばマウス又はラットといった動物の脾細胞から、または、この抗原を用いてインビトロで予め免疫化されたこのような動物の脾細胞から開始する段階；
−　ハイブリドーマ形成条件下で骨髄腫細胞とこのような免疫化した細胞を融合させる段階；及び
−　上述の抗原のエピトープを特異的に認識し、タウタンパク質の異常にリン酸化された形態と、又はタウタンパク質のエピトープを含むリン酸化されたペプチドと、免疫複合体を形成するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを選択する段階、
が関与している。
【００５４】
　相応するモノクローナル抗体を産生するための方法には、
−　適切な培地内で上述のような選択されたハイブリドーマを培養する段階；及び
−　選択されたハイブリドーマにより排出されたモノクローナル抗体を回収する段階、
　又は代替的に、
−　マウスの腹膜内に選択されたハイブリドーマを移植し、動物の体内で腹水が産生された時点で、そのときこのような腹水から形成されたモノクローナル抗体を回収する段階、
が関与している。
【００５５】
　本発明のモノクローナル抗体は、例えばホローファイバー又はマイクロカプセルを用いた固定化された細胞の培養、又は例えばエアリフト型反応装置又は撹拌型バイオリアクタを用いた均質な懸濁液中での細胞の培養のような従来のインビトロ技術により調製され得る。
【００５６】
　本発明は同様に、アルツハイマー病を患う患者から得た大脳皮質から分離された脳ホモジネートから得ることができしかも本発明のモノクローナル抗体と免疫複合体を形成するペプチド（抗原）にも関する。
【００５７】
　本発明はさらに、本発明のモノクローナル抗体のいずれか１つと免疫複合体を形成する傾向をもち、しかも
−　☆印でマークされた位置でリン酸化された配列
【００５８】
【化７】
2004043487.tif 000006
【００５９】
を含むか又はこれにより構成されているか、又は
−　それ自体ペプチド
【００６０】
【化８】
2004043487.tif 000007
【００６１】
を複合体を形成する傾向をもつモノクローナル抗体と、免疫複合体を形成することのできるペプチドのような上述の変異体ペプチドの配列を含むか又はこれにより構成されている、
ペプチド（抗原）にも関する。
【００６２】
　本発明は同様に、
−　☆印のついた位置でリン酸化された配列
【００６３】
【化９】
2004043487.tif 000008
【００６４】
を含むか又は
−　上述の変異体ペプチドの配列を含む、
約１００個のアミノ酸のペプチド（抗原）にも関する。
【００６５】
　本発明は又、本発明のモノクローナル抗体と免疫複合体を形成できることを条件として、
　Ｘ1 、Ｘ2 、Ｘ3 、Ｘ4 、Ｘ5 を２０個のアミノ酸のいずれか１つとし、ｐ、ｑ、ｒ、ｓが０又は１であるモノクローナルとして、☆印のついた場所でリン酸化された配列、
【００６６】
【化１０】
2004043487.tif 000009
【００６７】
を含むペプチド（抗原）にも関する。
【００６８】
　本発明は同様に、本発明のモノクローナル抗体を生成する傾向をもつ上述のペプチドにも関する。
【００６９】
　本発明は同様に、アルツハイマー病又はＰＨＦ又はタウタンパク質が関与するあらゆる脳疾患を有する患者の脳、脳脊髄液又は血清中に含まれ、本発明のモノクローナル抗体と免疫複合体を形成するペプチド（抗原）にも関する。
【００７０】
　本発明のペプチドを調製するための方法には、好ましくは、Ｃ末端アミノ酸から始めて、必須順序の連続的アミノアシル、又は予め形成されすでに適切な順序でいくつかのアミノアシル残基を含んでいるアミノアシル及びフラグメント又は代替的にはこの要領で予め調製されたいくつかのフラグメントが連続的に対をなしてカップリングされること、ここで、ペプチド合成等において既知の方法に従って、特にカルボキシル基の活性化後ペプチド結合の形成に通常関与する一方のアミノ基と他方のカルボキシル基を除くこれらのアミノアシル又はフラグメントによって支持される全ての反応性基を保護するよう注意が払われること、そしてＮ末端アミノ酸に至るまで段階的に進行させること、を含んでいる。
【００７１】
　この方法においては、予めリン酸化されたアミノ酸を使用することが可能であり（De Bont H.B.A. et al., 1990）、又以下に説明するように、非リン酸化配列の合成の後、リン酸化を実施することも可能である。
【００７２】
　本発明は同様に、非リン酸化形態での本発明に従った抗原から出発して、
−　リン酸化されていないこの抗原を、抗原の非リン酸化エピトープを認識し本発明のモノクローナル抗体によって認識されたリン酸化エピトープへと、このエピトープを修飾することのできるキナーゼ酵素と反応させること、
を含む、この抗原の調製方法にも関する。
【００７３】
　使用されるキナーゼは、当業者にとって既知の方法に従って、有利にも脳から抽出され（Ishiguro K. et al., 1988; Baudier, J.及びCole, R.D., 1987; Vallee, R.B., 1980）, Steiner et al.（1990）内に言及されているキナーゼとは異なるものである。
【００７４】
　非リン酸化抗原は、例えば、上述のキナーゼでのリン酸化によって、本発明のモノクローナル抗体により認識される異常リン酸化タウタンパク質を生み出す正常なヒトタウタンパク質である。このような異常リン酸化タウタンパク質は、新しいものである。
【００７５】
　アルツハイマー病を患うか又はアルツハイマー病で死亡した患者から得た大脳皮質から当業者にとって既知の方法により調製されうる本発明の抗原（Iqbal, K, et al., 1984; Greenberg S.G 及びDavies, P., 1990）は、本発明のモノクローナル抗体、特に、９１１００８０６号という番号でＥＣＡＣＣに寄託されたハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体と免疫複合体を形成するその能力によって特徴づけられる。
【００７６】
　本発明の抗原は、有利にも、アルツハイマー病、ダウン症候群、ピック病、ＳＳＰＥ又はその他のＰＨＦ及び異常リン酸化タウタンパク質の発生が関与する神経疾患を患う患者の脳、脳脊髄液又は血清中に含まれており、この抗原は、本発明のモノクローナル抗体との免疫学的反応を誘発する。
【００７７】
　本発明は同様に、
−　抗原−抗体複合体を産生するのに適した条件下で、アルツハイマー病を患う患者又好ましくはアルツハイマー病を患っていた死亡患者から分離されたＰＨＦの調製物と本発明のモノクローナル抗体のうちの１つを接触させる段階；
−　前記複合体から抗原を分離し精製された形で求められる抗原を回収する段階、
が関与する、ＰＨＦ及びタウタンパク質が関与する脳疾患すなわちアルツハイマー病のインビトロ検出又は診断のための方法にも関する。
【００７８】
　ＰＨＦの調製は、Iqbal K et al.（1984）又はGreenberg et al.（1990）に従って行なうことができる。
【００７９】
　有利にも、使用されるモノクローナル抗体は、樹脂といった適切な支持体上に固定化された状態にある。このとき抗原の検出のための方法は、以下のように実施される：
−　既知の要領で脳組織から抽出されたタンパク質及びポリペプチドを含む上清（Iqbal, K. et al., 1989; Greenberg S.S.及びDavies, P., 1990）を、免疫複合体の形成を可能にする条件下でモノクローナル抗体と接触させる；
−　このように形成された固定化された抗体−抗原複合体を洗浄する；
−　抗原−抗体複合体の解離を生み出すことのできる溶液（例えば、３Ｍのチオシアン酸カリウム、２．５Ｍの塩化マグネシウム、０．２Ｍのクエン酸塩−クエン酸、pH３．５又は０．１Ｍの酢酸）を用いて複合体を処理する；
−　精製された形態で抗原を回収する。
【００８０】
　タウタンパク質及びＰＨＦが関与する脳疾患例えばアルツハイマー病のインビトロ検査又は診断のための本発明の方法は、
−　タウタンパク質及びＰＨＦが関与する脳疾患、より特定的にはアルツハイマー病を患っている疑いのある患者からの脳ホモジネート又は脳脊髄液又は血清の試料を、抗原−抗体複合体を産生するのに適した条件下で、本発明のモノクローナル抗体とインビトロ条件で接触させる段階；及び
−　前記脳ホモジネート又は脳脊髄液又は血清の試料に対する前記抗体の免疫学的結合を検出する段階；
を含んでいる。
【００８１】
　免疫学的に結合したモノクローナル抗体の検出は、従来の要領で達成することができる。有利には、本発明のモノクローナル抗体はそれ自体、以下で例示するように標識又は標識と直接又は間接的にカップリングするための基を支持している。同様に、動物、好ましくはウサギの体内に本発明の抗原を注射し、抗原が結合したカラム上にポリクローナル抗体を通過させるイムノアフィニティ精製により抗血清を回収し、そして従来の要領でポリクローナル抗体を溶離させることによって生成されたポリクローナル抗血清も使用することができる。検出は、本発明のエピトープを含む標識づけされたペプチドと抗原を競争的に結合させることによっても達成できる。
【００８２】
　本発明の方法の特に有利な実施態様は、診断すべき患者から得た（相応する抗原を含む）脳脊髄液の試料と、本発明のモノクローナル抗体を接触させる段階を含んでいる。
【００８３】
　本発明は同様に、異常リン酸化タウタンパク質又は対らせんフィラメント（ＰＨＦ）が関与している、アルツハイマー病、ダウン症候群、ピック病、ＳＳＰＥ、その他の神経系障害のうちの１つのインビトロ診断用のキットにも関する。このようなキットには、
−　本発明のいずれかのモノクローナル抗体を上に被着させるための少なくとも１つのマイクロプレート；
−　本発明のエピトープを含む標識づけされたペプチド及び好ましくは☆印のついた位置でリン酸化されたペプチド
【００８４】
【化１１】
2004043487.tif 000010
【００８５】
を伴っていてもよい、インビトロで診断すべき試料を含む調製物；
−　・　本発明のエピトープとは異なる、正常なタウ又は異常リン酸化されたタウタンパク質又は本発明のいずれかのペプチドのエピトープを認識するモノクローナル抗体であってよく、
・　全て本発明のエピトープと異なるエピトープと免疫複合体を形成する傾向をもち、好ましくは固定化されたタウタンパク質を用いてイムノアフィニティクロマトグラフィにより精製された、正常なタウ又は異常リン酸化タウ又は本発明のペプチドのポリクローナル抗体でありうる、第２の抗体、又は、
−　前記第２の抗体と、特異的標識づけ（タギング）又はカップリングのいずれかをするための標識；
−　１）本発明のモノクローナル抗体及びテスト用試料と、２）結合された第２の抗体及び標識、との免疫反応を実施するための適切な緩衝液、
が含まれる。
【００８６】
　上述の標識づけされたペプチドは、当業者にとって既知のあらゆる手段により標識づけされたペプチドであってよい。同様にして、標識づけ（タギング）及びカップリングのための特異的な標識は、当業者にとって既知のあらゆる標識であってよい。
【００８７】
　本発明はまた、対象となる抗原に関して標準（対象となる抗原の定量的測定のための）又は競合物質のいずれかである本発明の抗原をも含む上述のキットに関し、かくしてこのキットは競合的用量プロセスで使用することができる。
【００８８】
　例Ｉ：モノクローナル抗体ＡＴ８の調製物（ＩｇＧ１、λ）
　１．免疫化用抗原の調製：
　大部分が前頭及び側頭皮質からの灰白質から成る死後組織を、組織学的に確認されたアルツハイマー患者から得た。このアルツハイマー灰白脳試料（５〜１０ｇ）を、テフロン／ガラスPotter S（ドイツ、Braun 社）ホモジナイザーの中で、１０体積の低温緩衝液Ｈ（１０mMのトリス／１mMＥＧＡＴ／０．８Ｍ　ＮａＣｌ／１０％のショ糖、pH７．４）で均質化した。４℃で２０分間２７，０００×ｇで６０Ｔｉ　ＭＳＥローター内で遠心分離した後、ペレットを除去し、上清を１％（重量／体積）のＮ−ラウロシルサルコシン及び１％（体積／体積）の２−メルカプトエタノールに調整し、３７℃で２．５時間、ミキサー８２０（Swelab, スウェーデン）上で回転させながらインキュベートした。上清混合物を２０℃で３５分間１０８，０００×ｇで遠心分離した。ペレットを含むＰＨＦ−タウをＰＢＳで穏やかに洗浄し、同じ緩衝液１ml中で最終的に懸濁させた。
【００８９】
　抗原調製物を、１０％のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動法により評価し、続いてポリクローナルウサギ抗ヒト正常タウ抗血清を用いて、ウエスタンブロッティングによって、免疫ブロットを行なった。
【００９０】
　２．免疫プロトコル及び融合手順：
　Ｂａｌｂ／ｃマウスに対し、完全フロイントアジュバンドの中で１００μgの部分的に精製されたＰＨＦ−タウを用いて初回感作（プライミング）し、その後３回３週間の間隔をおいて、不完全フロイントの中で同じ抗原１００μgを用いて追加感作した。融合の３日前及び２日前に、マウスを１００μgのＰＨＦ−タウ食塩水で追加感作した。
【００９１】
　マウスの脾細胞を、ＰＥＧ４０００で、Kohler及びMilsteinの改良法（Kohler, G 及びMilstein, C., 1975）を用いて、ＳＰ２／０細胞と融合させた。
【００９２】
　細胞の半分を、３０枚の９６−ウエルの腹腔内マクロファージ支持プレート上に１ウエルあたり４．５×１０４脾細胞の密度で懸濁させた。正常なタウ又はＰＨＦ−タウに対して特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡで抗タウ抗体の産生に関して、１２日後にこれらのウエルをスクリーニングした。融合のもう１方の半分を組織培養フラスコ内で３日間成長させ、液体窒素内に凍結状態で保存した。２０％のウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム（１mM）、Ｌ−グルタミン（２mM）、ペニシリン（１００Ｕ／ml）、ストレプトマイシン（１００mg／ml）及び可欠アミノ酸で補足したダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）により、ハイブリドーマを成長させた。全ての製品は、Gibco, Paisley, U.K.から購入した。細胞を、加湿した８％のＣＯ2 空気インキュベータ内でインキュベートした。
【００９３】
　３．抗体スクリーニングのためのサンドイッチＥＬＩＳＡ：
　抗タウモノクローナル抗体の検出のために用いられるスクリーニングＥＬＩＳＡは、コーティング相にポリクローナルウサギ抗−ヒトタウ抗体を有するサンドイッチＥＬＩＳＡシステムであった。この目的のため、ポリクローナルウサギ抗−ヒトタウ血清を、アフィニティ精製した（例IVにおいて「ポリクローナルウサギ抗−タウ抗血清の産生」という題の説明内で記述されている通り）。（例IVで「アフィニティ精製されたヒトのタウ」という題で記述されている通りに調製された）精製されたヒトの正常なタウを、臭化シアン活性化セファロース（Pharmacia, LKBスウェーデン）を用いたイムノアフィニティカラムの調製のために使用した。このカラムから、pH２．５のクエン酸緩衝液を用いて、親和性結合された抗−タウ分画を溶出させた。中和した後、抗−タウ含有分画をプールし、コーティング緩衝液（１０mMのトリス、１０mMのＮａＣｌ、１０mMのＮａＮ3 、pH８．５）を用いて、高結合性マイクロタイタープレート（Nunc, Gibco, Paisley, UK）上で、４℃で一晩コーティングした（１μg／ml）。非特異的結合を減少させるためＰＢＳ中で１２５μlの１０％飽和カゼインで３０分間オーバーコーティングさせた後、プレートを１００μlの適切に希釈させたＰＨＦ−タウ調製物と共に、６０分間３７℃でインキュベートした。プレートを３回、ＰＢＳ−０．０５％のTween ２０（ｖ／ｖ）で洗浄し、１００μlのハイブリドーマ上清を加え、インキュベーションを１時間３７℃で続行した。洗浄の後、ペルオキシダーゼ接合したウサギ抗マウス血清（Dakopatts, Glostrup,デンマーク）を用いて、結合したモノクローナル抗体を検出した。全ての試薬は、１０％のカゼインを伴うＰＢＳ内で希釈した。最後の洗浄の後、ペルオキシダーゼ基質として、１００mMのクエン酸、１００mMのリン酸水素二ナトリウム、pH４．３中の１００μlの０．４２mMの３，５，３′，５′−テトラメチルベンチジン、０．００３％のＨ2 Ｏ2 ｖ／ｖを加えた。２ＭのＨ2 ＳＯ4 溶液５０μlを用いて反応を停止させた。
【００９４】
　４５０nmでTitertek Multiscan（Flow Laboratories, Eflab; Oy, フィンランド）内で吸光度を読み取った。
【００９５】
　ＥＬＩＳＡでの、正常なタウとモノクローナル抗体との交差反応性は、ＰＨＦ−タウの代わりにアフィニティ精製された正常なタウを使用するという点を除いて、スクリーニング検定と同じサンドイッチＥＬＩＳＡでテストされた。ＰＨＦ−タウを特異的に認識するハイブリドーマ分泌抗体を、限界希釈法によってサブクローニングした。ＡＴ８抗体を分泌する前記ハイブリドーマを、ＡＴ８と呼称する。
【００９６】
　例II：ウエスタンブロッティングによるＥＬＩＳＡでの、病的タウの検出及び正常なタウの非検出
　１．ＥＬＩＳＡでの、異常リン酸化タウの検出及びＥＬＩＳＡ内の正常なタウの非検出；
　例Ｉの第３項において概略的に示したプロトコルに従って、ＥＬＩＳＡプレート上でアフィニティ精製されたポリクローナル抗タウ抗体をコーティングし、各々ＰＢＳと１０％カゼインの溶液中で調製された「アフィニティ精製されたヒトのタウの産生」という題の説明において記述されているようなアフィニティ精製された正常なタウか又はＰＨＦ−タウのいずれかの異なる希釈液と反応させた。洗浄の後、一定の濃度のＡＴ８モノクローナル抗体でプレートをインキュベートさせた。これ以降の手順は全て、記述のとおりであった（例Ｉ、第３項）。表Ｉに記す結果は、ＡＴ８モノクローナル抗体がＰＨＦ−タウのみと反応することを明らかに示している。
【００９７】
【表１】
2004043487.tif 000011
【００９８】
　検定は、例Ｉ第３項に概略的に記されている通りに行なわれた。表に記されている通りＰＨＦ−タウ又は正常なタウのさまざまな希釈液が使用された。
【００９９】
　脳ホモジネート内で、ＡＴ８モノクローナル抗体の反応性パターンも同じく研究された。この目的のため、コーティング緩衝液（１０mMのトリス、１０mMのＮａＣｌ、１０mMのＮａＮ3 、pH８．５）内の精製されたＡＴ８モノクローナル抗体２μg／mlを用いて４℃で一晩、高結合性マイクロタイタープレート（Nunc, Gibco, Paisley, UK）をコーティグした。
【０１００】
　非特異的結合を減少させるためのオーバーコーティングを、１２０μlのブロット緩衝液（５％ｗ／ｖの乾燥スキムミルク及び１０％ｖ／ｖのウシ新生児血清）を用いて行なった。ＰＢＳ−０．０５％Tween ２０（ｖ／ｖ）で３回洗浄した後、１００μlの試料を付加し、３７℃で一時間インキュベーションを行なった。プレートを再度３回洗浄し、ウサギ抗−タウ血清の１／２，０００希釈液１００μlを用いてインキュベートした。次に、プレートを再び三度洗浄した後、ブロット緩衝液中で１／２，０００に希釈した１００μlのホースラディッシュペルオキシダーゼが結合したロバの抗ウサギ血清を付加し、インキュベーションを３０分間続行した。プレートを洗浄し、０．４２mMの３，５，３′，５′−テトラメチルベンチジン、１００mMのクエン酸中の０．００３％のＨ2 Ｏ2 ｖ／ｖ、１００mMのリン酸水素二ナトリウム、pH４．３から成る溶液１００μlを基質として付加した。２ＭのＨ2 ＳＯ4 溶液５０μlで反応を停止させた。４５０nmでTitertek Multiscan（Flow Laboratories, Eflab, Oy, フィンランド）内で吸光度を読み取った。
【０１０１】
　図１から分かるように、４人のアルツハイマー患者（ＡＤ1 〜ＡＤ4）の脳ホモジネートは、２つの異なる希釈度で陽性反応したのに対し、非神経系疾患で死亡した患者（Ｃ1 〜Ｃ4）に由来する脳から調製された抽出物は全て、両方の希釈度で明らかに陰性であった。
【０１０２】
　２．ウエスタンブロッティングでの病的タウの検出及び、ウエスタンブロッティングにおける正常なタウの非検出；
　１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに対して精製された正常なヒトのタウ及びＰＨＦ−タウを適用し、Laemmli（1970）に従って変性条件下で行った。
【０１０３】
　ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、冷却しながら、５５Ｖで１２０分間、１０mMのＮａＨＣＯ3 、３mMのＮａ2 ＣＯ3 、pH９．９の中でニトロセルロース（Hybond-C、 Amersham, ブリュッセル、ベルギー）へのトランスファーを行なった。ブロッティングの後、ニトロセルロースをリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）と平衡化させ、ブロット緩衝液（５％ｗ／ｖの乾燥スキムミルクおよび１０％ｖ／ｖのウシ新生児血清で補足されたＰＢＳ）でタンパク質結合部位をブロックした。ブロッティングを受けたタンパク質を、一次抗体としてＡＴ８を用いて４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ−０．０５％Tween ２０（ｖ／ｖ）で三度洗浄した後、１／３，０００の希釈度でホースラディッシュペルオキシダーゼ標識づけされたウサギ抗マウス免疫グロブリン（Dakopatts, Glostrup,デンマーク）を使用し、室温で９０分間インキュベートした。全ての抗血清をブロット緩衝液中で希釈した。次にブロットを三回ＰＢＳ／Tween 内で洗浄し、基質溶液（ＰＢＳ、０．５８％ｗ／ｖの３，３′−ジアミノベンチジン、０．０３％ｖ／ｖのＨ2 Ｏ2）で発色させ、その後、Ｈ2 Ｏ中で反応を停止させた。図２に示されている結果は、ＡＴ８抗体が６４及び６８kDa のタウイソ型タンパク質を認識することを示しているものの、正常なタウバンドが染色されない状態にとどまっていることも示している。
【０１０４】
　例III：免疫細胞化学によるタウの検出
　数人のアルツハイマー病患者及び年齢を一致させた対照の新皮質、海馬、小脳、橋及び脊髄からのホルマリン定着させた脳組織のパラフィン切片を、１人の対照患者からの抹消神経の切片と共に調製した。
【０１０５】
　アルツハイマー病患者及び年齢を一致させた対照の脳からのクリオスタット切片も調製した。それぞれDakopatts（デンマーク）及びAmersham（英国）試薬を用いて、ペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ（ＰＡＰ）技術（Steinberger, L.A. et al., 1970）又はアビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ）技術（Hsu, S.M. et al., 1981）のいずれかにより、組織を免疫学的に染色した。簡単に言うと、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）中で、１：２５に希釈された正常なブタの血清（Dakopatts X901）との非特異的相互作用をブロックした後、切片を、ＴＢＳ／ＢＳＡで適切に希釈されたＡＴ８一次抗体を用いて一晩インキュベートした。次に各々３０分間ずつ、ＴＢＳ中での中間水洗を伴って、二次抗体及びペルオキシダーゼ複合体を適用した。色は３，３′−ジアミンベンチジンテトラヒドロ塩化物（Sigma）で発色した。切片をハリスのヘマトキシリンで対比染色し、脱水しカバーガラスをつけて、光学顕微鏡の下で観察した。
【０１０６】
　図３（Ａ〜Ｄ）は、ＡＴ８が正常な構造を全く装飾せず、ＮＦＴの豊富な染色、プラーク内での異栄養性神経突起及び神経網の分散した染色（神経網糸状構造）をもたらすにすぎないということを明確に示している。いくつかの明らかにもつれの無い神経細胞は、拡散した形で染色され、往々にして強い核周囲染色を示していた。
【０１０７】
　例IV：本発明の抗体を用いた既知の抗体のエピトープを特徴づけするための競争的ＥＬＩＳＡ
　ウエル内で４℃で一晩、アフィニティ精製したウサギの抗ヒトタウポリクローナル抗体をコーティングした。プレートを洗浄し、アフィニティ精製された正常なタウと混合させた１００μlの精製された異常にリン酸化されたタウを３７℃で一時間、１ウエル毎に加えた。洗浄後、テストすべき標識付けされていない異ったモノクローナル抗体を５０μl、いくつかの希釈度で添加した。その後、「モノクローナル抗体ＢＴ２の産生」という題の箇所で記述する通りに得た５０μlのビオチニル化されたＡＴ８抗体又はビオチニル化されたＢＴ２抗体を、最大結合の５０％を誘発するように予め定められた量で付加した。３７℃で一時間の後、プレートを洗浄し、３，５，３′，５′−テトラメチルベンチジンと共に、ＥＬＩＳＡの検出を可能にするよう３０分間、ストレプトアビジンビオチンペルオキシダーゼ複合体を付加した。２ＭのＨ2 ＳＯ4 で反応を停止した後、４５０nmでTitertek Multiscanプレート読取り装置（Flow）内で読みとった。
【０１０８】
　表IIの結果が示すように、ＢＴ２抗体は、ビオチニル化されたＢＴ２の結合を阻害し、一方カゼイン又はＡＴ８はこの結合に影響を及ぼさない。逆に言うと、ＡＴ８抗体はビオチニル化されたＡＴ８の結合をブロックするが、カゼインもＢＴ２もこの反応を阻害しない。
【０１０９】
【表２】
2004043487.tif 000012
【０１１０】
　ＢＴ２又はＡＴ８は、左欄の示された濃度にて使用した。全ての抗体の希釈は、同様にカゼイン対照内でも同じ濃度で用いられたカゼイン内で行なわれた（カゼインと記された欄）。
【０１１１】
−　ポリクローナルウサギ抗−タウ抗血清の産生：
　ニュージーランド産白ウサギを、アフィニティ精製したヒトのタウで免疫化した。ウサギに対し、完全フロインドアジュバンド内で乳化した１００μgのアフィニティ精製したヒトのタウを用いて皮内注射をほどこした。２週間後、不完全フロインド内の２００μgのアフィニティ精製したヒトのタウを用いてこれを筋内に繰返し行ない、１週間後に１００μgのアフィニティ精製したヒトのタウを用いて３度目の筋内注射を行なった。ウサギを３回目の注射の後１週間出血させ、評価をし、さらに一週間の間隔をおいて２度、３回目の注射のために使用したものと同量のタウを用いて注射した。コーティング相にアフィニティ精製したヒトのタウを用いた固相ＥＬＩＳＡにより、及びアフィニティ精製したヒトのタウに対するウエスタンブロットにより、血清を評価した。
【０１１２】
−　アフィニティ精製したヒトのタウの産生：
　標準的には、５０ｇのヒトの死後の脳をハサミで小片に切断し、テフロンプランジャを備えたPotterホモジナイザーを用いて緩衝液Ａ（２０mMｗの（２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸）、８０mMのＮａＣｌ、２mMのＥＤＴＡ、０．１mMのＥＧＴＡ、１mMのＭｇＣｌ2 、１mMのメルカプトエタノール、pH６．７５）内で１／１（ｗ／ｖ）に均質化した。ホモジネートを１時間４℃で１５０，０００ｇで遠心分離させ、沸とう水中で上清を５分間加熱した後、氷上で１０分間再度冷却した。４℃１５０，０００ｇで２時間スラリーを遠心分離し、その後上清を収集した。これを「熱安定性細胞質ゾル抽出物」と呼ぶ。
【０１１３】
　プロテインＧ上で腹水から精製した１０mgのＢＴ２抗タウモノクローナル抗体（Pharmacia, Uppsala, スウェーデン）を、メーカーにより提案された方法に従ってセファロース（Pharmacia）により活性化された１グラムの臭化シアンに結合させた。熱安定性細胞質ゾル抽出物５０mlを０．１Ｍのリン酸緩衝液pH８．５の中で１／２に希釈し、カラムに適用した。カラムを０．１Ｍのリン酸塩で洗浄し、ｔａｕを０．１Ｍのクエン酸pH２．５で希釈し、１ＭのＮａＯＨで直ちに中和させた。抗タウ抗体を用いた免疫ブロッティングにおいて１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ内での分画を評価した。
【０１１４】
−　モノクローナル抗体ＢＴ２の産生：
・　抗原の精製：
　ウシのタウ：Lindwall et al.（1984）の過塩素酸法の改良によりウシの脳からタウを精製した。標準的には、５０グラムの新鮮な脳をハサミで小片に切断し、テフロンプランジャを備えたPotterホモジナイザを用いて緩衝液Ａ（２０mMのω（２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸）、８０mMのＮａＣｌ、２mMのＥＤＴＡ、０．１ＭのＥＧＴＡ、１mMＭｇＣｌ2 、１mMのメルカプトエタノール、pH６．７５）の中で１／１（ｗ／ｖ）に均質化した。４℃、１５０，０００ｇで１時間ホモジネートを遠心分離させ、上清を沸とう水中で５分間加熱し、氷上で１０分間再度冷却した。スラリーを４℃、１５０，０００ｇ２時間遠心分離し、その後上清を収集した。熱安定性細胞質ゾル抽出物を２．５％の過塩素酸になるようにし、４℃１５０，０００ｇで１時間遠心分離した後、上清を３Ｍのトリスで中和させた。次に上清を透析し、centriprep濃縮器（Amicon, ローザンヌ、スイス）内で水中において濃縮させた。以下「ウシ・タウ」と呼ぶ最終産物を、Laemmli の方法（１９７０）に従って行なったドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において評価した。
【０１１５】
・　モノクローナル抗ウシタウ抗体の産生：
　完全フロインドアジュバンドの中で精製された１００μgウシタウを用いてＢａｌｂ／ｃマウスを初回抗原刺激し、２週間毎に完全フロインドの中で１００μgのウシタウを用いて３回追加抗原投与した。融合の３日前と２日前に、マウスに、食塩水中の１００μgのウシタウを用いて再度追加抗原投与した。融合パートナーとしてＳＰ２／０骨髄腫細胞を用い、マウスの腹腔内マクロファージ支持細胞上に融合した細胞を播種した。ハイブリドーマの半分を９６ウエルの場所に播種し、抗タウ抗体産生についてウシタウ上の固相ＥＬＩＳＡにより、１０日間スクリーニングした。融合のもう１方の半分は組織フラスコ内で１日成長させ、これらの細胞を液体窒素内で凍結させて保存した。全てのハイブリドーマは、１０％のウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム（１mM）、Ｌ−グルタミン（２mM）、ペニシリン（１００Ｕ／ml）、ストレプトマイシン（１００μg／ml）及び可欠アミノ酸で補足したダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）の中で成長させた。製剤は全て、イギリス、Paisley のGibco 社から購入した。加湿した８％のＣＯ2 エアインキュベータ内で３７℃で細胞をインキュベートした。ＥＬＩＳＡ内での陽性シグナルは、ウシの脳からの熱安定性細胞質ゾルに関して、対照として抗タウ抗体タウ−２（Sigma, St. Louis, MO）を用いて、ウエスタンブロットによりテストした。陽性ウエルはサブクローニングし、クローンを液体窒素内で凍結した。
【０１１６】
　例Ｖ：ＡＴ８エピトープの必須リン酸化部位を決定するための変異組換え型タウタンパク質の発現とリン酸化
　タウの４反復イソ型タンパク質に相応し、イニシエータコドンに関連するＮｄｅＩ部位を伴う全長ｃＤＮＡクローン（ｈｔａｕ２４）を、Ｍ１３ｍｐ１８のＥｃｏＲＩ部位内へサブクローニングした。最長のヒト脳タウイソ型タンパク質の番号づけ（Goedert, M. et al., 1989）（Goedert, M. et al., 1989）されたコドン１９９（Ｓ〜Ａ）又はコドン２０２（Ｓ〜Ａ）を変更するために部特異的変異誘発を使用した２つの構成体を作製し、コドン１９９及び２０２が両方共Ａに変更された３番目の構成体を作製した。ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩでの開裂の後、結果として得られたフラグメントを発現プラスミドｐＲＫ１７２内でＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータの下流でサブクローニングし、組換え型プラスミドをE. coli ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。記述されている通り（Goedert, M. et al., 1989）、細胞培養を成長させ、誘発させ、収穫した。
【０１１７】
　５００mlの培養からのペレットを２０mlの抽出緩衝液（５０mMのＰＩＰＥＳ、pH６．８、１mMのＤＴＴ、１mMのＥＤＴＡ、０．２mMのＰＭＳＦ、０．５μg／mlのロイペプチン、０．５μg／mlのペプスタチン）中で再懸濁させ、Kontesマイクロ超音波細胞破壊機を用いて２×３分間超音波処理した。遠心分離（１５分間１５，０００rpm で）した後、上清をＤＥ−５２セルロースカラム内に通過させた。抽出緩衝液内で均衡化したホスホセルロースカラム（ベッド体積３ml）上に、流動物を装荷した。抽出緩衝液で徹底的に洗浄した後、タンパク質を、０．５ＭのＮａＣｌを含む抽出緩衝液の３mlアリコートで１回分ずつ溶離させた。組換え型タウイソ型タンパク質を含む分画をプールし、５０mMのＭＥＳ、１mMのＤＴＴ、pH６．２５に対し一晩透析した。遠心分離の後、高速流カルボキシメチル−セファロースＨＲ５／５カラム上に透析物を装荷した。カラムを５０mMのＭＥＳ、１mMのＤＴＴ、５０mMのＮａＣｌ、pH６．２５で洗浄し、５０mMのＭＥＳ、１mMのＤＴＴ、pH６．２５中１００〜３００mMＮａＣｌの勾配を用いてタンパク質を溶離した。カラム分画をゲル電気泳動によりスクリーニングし、ピークタウ分画をプールして、４０mMのＨＥＰＥＳ、１mMのＤＴＴ、０．２mMのＰＭＳＦ、pH７．２において透析した。タンパク質濃度をアミノ酸化合物により決定した。
【０１１８】
　得られた組換え型タウタンパク質を、脳タンパク質キナーゼ活性を用いて、以下のようにリン酸化した：
【０１１９】
　成熟したラットの脳を１０mMのトリス／ＨＣｌ、pH７．４、５mMのＥＧＴＡ、２mMのＤＴＴ、１μMのOkadaic 酸、１mMのＰＭＳＦ、２０μg／mlのロイペプチン、２０μg／mlのアプロチニン及び２０μg／mlのペプスタチンの中で均質化し（１ｇ／２．５ml）、４℃で一時間４０，０００rpm で遠心分離した。リン酸化のために直接上清を使用した。２４時間、３７℃で、４０mMのＨＥＰＥＳ、pH７．２、２mMのＡｔｐ、２mMのＭｇＣｌ2 、組換え型タウタンパク質（１μM）、及びラットの脳抽出物（０．０５ml）を用いてインキュベーションを行ない、次に免疫ブロッティングのためアリコートを採取した。脳抽出物を削除した点を除いて同一条件下で対照をインキュベートした。
【０１２０】
　リン酸化した組換え型タウタンパク質のＡＴ８エピトープを免疫ブロットにより分析した。１０％又は１０〜２０％のグラジェントミニゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。免疫ブロッティングのため、リン酸化された及びリン酸化されていない組換え型タウタンパク質を、二弗化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜にトランスファーし、残留タンパク質結合部位をリン酸緩衝溶液内の１％のゼラチンを用いてブロックした。次に、抗タウ抗血清１３４（希釈度１：２５０）（Goedert, M. et al., 1989）及び抗体ＡＴ８（希釈度１：５００）を用いて室温で５時間、ブロットをインキュベートした。結合した抗体を、ビオチン／ペルオキシダーゼシステム（Vectastain）により検出した。
【０１２１】
　免疫ブロットの結果は、少なくともＡＴ８エピトープのＳｅｒ２０２のリン酸化が抗体認識のために必要とされることを示している。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】検出のためホースラディッシュペルオキシダーゼが結合したロバ抗ウサギ抗血清と共にウサギ抗タウポリクローナル抗体及び結合抗体としてのＡＴ８モノクローナル抗体を用いた、アルツハイマー病又は正常な対照の脳ホモジネートに対するＡＴ８の反応性。　ＡＤ1 〜ＡＤ4 ：１／２００（中実棒）又は１／１，０００（斑点入り棒）に希釈された４人の異なるアルツハイマー患者からの脳ホモジネート。　Ｃ1 〜Ｃ4 ：１／２００（中実棒）又は１／１，０００（斑点入り棒）に希釈された４人の異なる対照からの脳ホモジネート。　縦座標は、４５０nmでの光学密度を、また、横座標は異なる試料を表わす。
【図２】モノクローナル抗体Ｔａｕ−１又はＡＴ８のいずれかを用いた正常なタウ又はＰＨＦ−タウのウエスタンブロット検出。レーン１及び２：ＰＨＦ−タウ（レーン１）、または正常なタウ（レーン２）のクマシーブリリアントブルー染色。レーン３〜６：タウ−１モノクローナル抗体（レーン３及び４）又はＡＴ８モノクローナル抗体（レーン５及び６）のいずれかを用いたＰＨＦ−タウ（レーン３及び５）又は正常なタウ（レーン４及び６）のウエスタブロッティング。
【図３Ａ】免疫化学によるタウタンパク質の検出。　アルツハイマー病を患う患者の海馬からの切片、倍率：７８×
【図３Ｂ】免疫化学によるタウタンパク質の検出。　非神経系の原因により死亡した高齢の対照患者の海馬からの切片、倍率：７８×
【図３Ｃ】免疫化学によるタウタンパク質の検出。　アルツハイマー病を患う患者の海馬からの切片、倍率：２４５×
【図３Ｄ】免疫化学によるタウタンパク質の検出。　非神経系の原因で死亡した高齢対照患者の海馬からの切片、倍率２４５×
【図４】ラットの脳からのタンパク質キナーゼ活性を用いてリン酸化され、変化した変異組換え型タウ（クローンｈｔａｕ２４）の例５の免疫プロット分析。免疫プロットは、抗タウ抗体１３４及びＡＴ８を用いて行なわれた。レーン：１、タウ２４；２、タウ２４＋脳抽出物；３、タウ２４Ｓ１９９Ａ；４、タウ２４Ｓ１９９Ａ＋脳抽出物；５、タウ２４Ｓ２０２Ａ；６、タウ２４Ｓ２０２Ａ＋脳抽出物；７、タウ２４Ｓ１９９Ａ、Ｓ２０２Ａ；８、タウ２４Ｓ１９９Ａ、Ｓ２０２Ａ＋脳抽出物。
【図１】
2004043487.tif 000015
【図２】
2004043487.tif 000016
【図３Ａ】
2004043487.tif 000017
【図３Ｂ】
2004043487.tif 000018
【図３Ｃ】
2004043487.tif 000019
【図３Ｄ】
2004043487.tif 000020
【図４】
2004043487.tif 000021