(57)【要約】【課題】組換えサブユニット生ワクチン組成物及びその製造方法【解決手段】注射可能なエマルジョンと組み合わせられた組換えサブユニット生ワクチンからなる組換えサブユニット生ワクチン組成物、その製造方法、およびその使用。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　エンベロープを有するウイルスまたは病原微生物に対する生ワクチン組成物であって、水と、少なくとも１種類の油および適切であれば乳化系を含む油相と、エンベロープを有するウイルスまたは病原微生物に対する抗体の産生および／または防御効果を誘発する抗原サブユニットをコードする配列がゲノム中に含まれるウイルス生体の組換えベクターからなる組換えサブユニット生ワクチンとを基本成分とする、注射可能なエマルジョンとの組み合わせであることを特徴とする生ワクチン組成物。
【請求項２】
　前記ウイルスベクターがエンベロープを持たないウイルスであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
　前記配列がＨＩＶ１またはＨＩＶ２ウイルスのようなＨＩＶウイルスに対する防御効果を誘発する抗原サブユニットをコードすることを特徴とする請求項１または２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４】
　前記配列がＦＩＶウイルスに対する防御効果を誘発する抗原サブユニットをコードすることを特徴とする請求項１または２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
　前記配列がオージェスキーウイルスに対する防御効果を誘発する抗原サブユニットをコードすることを特徴とする請求項１または２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
　ウイルスベクターのゲノムに含まれる配列が、オージェスキーウイルスの糖タンパク質であるｇｐ５０をコードする配列であり、かつオージェスキーウイルスの感染に対して防御的であることを特徴とする請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
　前記油が鉱物性または非鉱物性であることを特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
　４℃において１２か月以上の安定性を有することおよび粘性が２５℃において３００ミリパスカル・秒未満であることを特徴とする請求項１ないし７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
　油分および必要な場合はさらに乳化系をも含む油相と、抗原または活性成分を含有する水相との重量比がそれぞれ、９５〜５％の水相に対して５〜９５％の油相、特に７５〜２５％の水相に対して２５〜７５％の油相の範囲であることを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
　前記油相が、（i）２０℃で液体の脂肪酸と糖またはグリセロールとの縮合により得られたエステル、および／または（ii）そのエステルの誘導体からなる乳化系を含むことを特徴とする請求項１ないし９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
　前記糖がマンニトールであることを特徴とする請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
　ヒトまたは動物を対象としたワクチンの製造における、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１３】
　特にインターロイキンであるサイトカインの産生を誘発することを目的としたワクチンの製造における請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１４】
　前記インターロイキンがＩＬ２またはＩＬ６であることを特徴とする請求項１３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、動物またはヒトの医薬として投与するための、特に油中水（Ｗ／Ｏ）型、水中油（Ｏ／Ｗ）型、または水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）型の、注射可能なエマルジョンに組み込まれた組換えサブユニット生ワクチンが結合した新規ワクチン組成物に関する。
【０００２】
　より具体的には、本発明は組換え生ワクチンであって、微生物、特にエンベロープを有するウイルスに対する自己防衛的な免疫反応に関与する組換えタンパク質が、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、カナリアポックスウイルスまたはバキュロウイルスのようなエンベロープを持たないウイルスからなるウイルスベクターによって生体内で発現される、組換え生ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００３】
　生きている微生物を用いたワクチン接種は、良く知られているように、死んだ微生物または単離されたペプチドもしくはタンパク質による非生ワクチンによるワクチン接種に比べて多くの長所を有する。
【０００４】
　生ワクチンにおいては、弱毒化された生ワクチンが広く用いられている。しかし、これには発病の危険という欠点がある。というのは、一方ではウイルスの核酸が宿主のゲノムに融合し、他方では毒性を有する生活型を回復するといった可能性が常に存在するからである。
【０００５】
　さらに、突然変異または欠失による弱毒化生ワクチンのさらなる弱毒化は、ときには免疫応答の低減を生じ、ワクチン組成物の注射量を増大する必要を生じさせることもある。この免疫応答の低減を克服するために、アジュバントの使用がこれまで試みられてきた。
【０００６】
　したがって、特許文献１（ヨーロッパ特許ＥＰ１２９９２３号）では、水中油（Ｏ／Ｗ）型の油性アジュバントが免疫応答の増強に用いられている。　
　このようにすることで免疫応答のある程度の改善が得られるが、弱毒化ウイルス生体のような弱毒化微生物生体は、通常凍結乾燥品であり、本質的に水性の溶媒中に溶解する必要がある。この水相に導入し得る油成分の量は、著しく制限される。　
　加えて、弱毒化生ワクチンから調製できるのは、水中油（Ｏ／Ｗ）型のエマルジョンだけである。
【０００７】
　さらに、エンベロープをもつウイルスの弱毒化生体のような弱毒化微生物生体には、油成分または油相への直接の接触により、生体膜に破損が生じるために不活性化してしまうものもある。
【０００８】
　遺伝子工学の進歩は、これまでよりも純度の高い抗原、または完全な合成抗原からなる組換えサブユニットワクチンを得ることを可能にする。　
　組換えサブユニットワクチンの高い純度は、ワクチンの安全性という点では、弱毒生ワクチンに比べて問題にならないくらい優れた長所を与える。
【０００９】
　通常、組換えサブユニットワクチンは、組換え微生物によって作られ宿主に注射される、１種類またはそれ以上の種類の精製されたタンパク質からなる。　
　他ならぬその純度のために、これら組換えサブユニット非生ワクチン、すなわち組換え微生物によって産生され精製されたタンパク質からなるワクチンでは、普通は免疫学的な作用効率の低下という結果に導かれる。これが、組換えサブユニットワクチンの使用が抗原の大量使用を必要とする理由である。
【００１０】
　さらに、組換えサブユニット非生ワクチンは、複数回の注射を必要とするのだが、これでは経済的な要請にほとんど応えることができない。
【００１１】
　ごく最近では、一般的に、組換えベクターである外来遺伝子が挿入されたウイルスを用いた微生物生体からなる、組換えサブユニット生ワクチンが製造されている。そういった発明によれば、免疫反応誘発のために、組換えサブユニット生ワクチンが宿主に直接導入され、前記微生物に挿入された外来遺伝子のタンパク質が宿主の生体内で発現される。
【００１２】
　この様なワクチンは、非特許文献１（学術雑誌の記事（M．Eloit et al.，Journal of General Virology（1990），71，2425-2431））に、あるいは特許文献２（国際出願ＷＯ−Ａ−９１，００１０７号公報）に記載されている。後者の公報の方が、組換えサブユニット生ワクチンを使ってヒトまたは動物に免疫応答させる方法について、より正確な記載がなされている。ただし、それはＨＩＶ逆転写酵素（ＨＩＶＲＴ）をコードするベクターからなる別なワクチンと組み合わせる必要があるものである。
【００１３】
　これら２種のワクチンはそれぞれ別々に、数日から数週間の間隔をおいて注射される。ＨＩＶＲＴワクチンは、油中水（Ｗ／Ｏ）型エマルジョン、無機塩類、ポリヌクレオチドまたはバクテリア起源の天然物のようなアジュバントと組み合わせられる。ＨＩＶＲＴワクチンは、組換えサブユニット生ワクチンの免疫促進剤として有用である。
【００１４】
　組換えサブユニット生ワクチンを用いることで、組換えサブユニット非生ワクチンの欠点を部分的に克服できる。しかしながら、この場合には組換えウイルスのような組換え微生物を大量かつ高濃度で注射する必要がある。
【００１５】
　しかしこの方法さえも、得られる免疫応答はいまだ不十分なままにとどまる。こういった短所を回避するために、前出の特許文献２（国際出願ＷＯ−Ａ−９１，００１０７号公報）で推奨されているように、組換えサブユニットワクチンに加えて、免疫促進剤として作用する他のワクチンを注射することが必要であると考えられている。
【特許文献１】ＥＰ１２９９２３号公報
【特許文献２】ＷＯ−Ａ−９１，００１０７号公報
【非特許文献１】M．Eloit et al.，Journal of General Virology（1990），71，2425-2431）
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
　本発明は、この点において上記欠点が克服された組換えサブユニット生ワクチンよりなる。　
　驚くべきことに、本発明はさらに、エンベロープを有するウイルスの少なくとも１つの抗原を発現する組換えウイルス生体のような微生物生体に対して、多量の油成分を直接組み合わせることをも可能にする。
【００１７】
　本発明は、新規な組換え生ワクチン組成物であって、（i）少なくとも１種類の水相および（ii）少なくとも１種類の油成分を含有する油相を含む、注射可能なエマルジョンと組み合わされた、少なくとも１種類の組換えサブユニット生ワクチンを含むことを特徴とする生ワクチン組成物に関する。
【００１８】
　より具体的には、本発明のワクチンは、組換えベクターとしての組換えウイルスを含有する組換えサブユニット生ワクチンである。このウイルスはエンベロープを持たない方が有利であり、特に、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、カナリアポックスウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルスから選ぶことができる。
【００１９】
　本発明の組換えワクチンはまた、油分と、水分と、適切な場合は乳化系と、好ましくはエンベロープを有するウイルスの複製に不可欠ではない部分に挿入された、上記エンベロープを有するウイルスもしくは病原微生物に対する抗体の合成及び／または防御機能を誘発する抗原サブユニットをコードする配列がゲノム中に含まれるエンベロープを持たないウイルス生体とに基づく、注射可能なエマルジョンとの組み合わせによって特徴づけられる。抗原サブユニットは、例えば、エンベロープを有するウイルス、細菌もしくは寄生虫のような微生物の感染に対して免疫原及び／または防御的機能となるタンパク質、糖タンパク質、ペプチドまたはペプチド分画であり得る。
【００２０】
　上記のエマルジョンは、水中油（Ｏ／Ｗ）型、油中水（Ｗ／Ｏ）型、または水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）型であり得る。
【００２１】
　本発明の有用性は、液状で、免疫原性を有する、安定な組成物を油性のエマルジョンとして得られることにあり、該組成物は驚くべきことに、同じ免疫原の水性の組成物に比べて免疫原の量を低減することが可能である。
【００２２】
　本発明のワクチン組成物に用いることができる、エマルジョンの油相を構成する油分は、毒性がないか、もしくは毒性が低いことが周知であるような、天然もしくは合成の鉱物油または植物、動物もしくは合成起源の非鉱物油から選択される液状油が好ましい。　
　それらは、貯蔵温度（＋４℃）において液体であるか、さもなければ、少なくともその温度で液状エマルジョンを形成するものでなければならない。　
　好ましくは１６より大きい炭素原子数を有する直鎖の鉱物油が選択され、芳香族化合物は除かれる。
【００２３】
　公知の例を挙げれば、ＭＡＲＣＯＬ−５２（フランス、エッソ製）とＤＲＡＫＥＯＬ−６ＶＲ（合衆国、ペレンコ製）である。
【００２４】
　また、ポリイソブタンまたはポリイソプロペンのような合成油も用いることができる。
【００２５】
　植物油の中では、生分解性で、オレイン酸含有量の高い不飽和油が選択される。例えば、ピーナッツ油、オリーブ油、ゴマ油、大豆油及び小麦胚芽油である。
【００２６】
　動物油としては、耐性及び免疫学的効率について同様の水準が要求される。動物油の例としては、スクアレン、スクアランおよび鯨ロウ油が挙げられる。
【００２７】
　上記の油脂類の混合物は、本発明の枠組みの中で有利に用いられる。
【００２８】
　通常は、本発明のワクチン組成物は、さらに乳化系をも含有する。　
　それは、液状で、安定な油中水（Ｗ／Ｏ）型、水中油（Ｏ／Ｗ）型、または水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）型の注射可能な製剤を与えるために適用されなければならない。
【００２９】
　それは、混合物において、親油性または親水性がＨＬＢ（親水親油平衡）数で１から１９の間の値で特徴づけられる１種またはそれ以上の種類の界面活性剤により作られる。
【００３０】
　乳化剤は、好ましくは、２０℃で液体の脂肪酸とマンニトール、グルコース、スクロースなどの糖もしくはグリセロールとの縮合により得られたエステル、またはその誘導体である。
【００３１】
　飽和脂肪酸は、少なくとも炭素原子数を１６以上持つものが好ましく、特にオレイン酸、リノレン酸、リシノレン酸、ケトステアリン酸が好ましい。
【００３２】
　マンニトールエステルまたはマンニトールエステルの誘導体が好ましく用いられる。マンニトールエステルとしては、１−４位または２−６位で環化する多水酸化された炭素鎖の脱水で得られるオレイン酸マンニトールが挙げられる。
【００３３】
　上記エステル誘導体は、アルコール、ポリオール、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイド、カルボン酸、アミン、アミドのような親水性官能基をグラフトすることにより、その親水性を改良したエステルであり得る。
【００３４】
　使用する全ての乳化剤は、注射剤中に用いる上で薬学的に許容可能でなければならず、特に、重金属を含有せず、酸価および過酸化物が極めて低いものでなければならない。　
　それらは、例えば、Ｓ．Ｓ．ＢＥＲＬＩＮによる報告（Annals of allergy，1962，20，473）に記載されている安全性試験の基準をも充足していることが望ましい。
【００３５】
　使用される乳化剤は、上記の選択された油と共に透明かつ安定で均一な油相を形成し、各注射剤に適した水性溶媒と共に乳化される。
【００３６】
　表１は、鉱物油または非鉱物油別の（即ち、いわば油の代謝的性質）、得られたワクチンエマルジョンのタイプ、およびこれらの油の基本的特徴を要約したものである。
【００３７】
　本発明のワクチン組成物は、ヒトまたは動物、特にブタ、ヒツジ、ウシ、アミア類（Ａｍｉｄａｅ）、ネコ類（Ｆｅｌｉ−ｄａｅ）、家禽類及び魚類に接種することを意図したワクチンの製造に用い得る。
【００３８】
　本発明の組成物における組換えサブユニット生ワクチンの濃度は、接種される動物の性質及びワクチンの性質に応じて様々に異なり得る。この濃度は、一般的に、１ｍｌ当り102から1015の微生物個体数もしくはウイルス個体数であり、好ましくは、１ｍｌ当り105から1012の微生物個体数もしくはウイルス個体数である。
【００３９】
　本発明のワクチン組成物のヒトまたは動物への注射容量は、ワクチンの性質と共に接種対象の重量にも依存する。これは、１０μｌから５ｍｌの範囲であればよい。ヒトまたは体重がヒトに近い動物（例えば霊長類）に対しては、注射容量は０．２５から２ｍｌの範囲であればよい。
【００４０】
　通常、本発明のワクチン組成物中の抗原量は、１μｇ／ｍｌ未満であり、好ましくは０．３μｇ／ｍｌ未満である。ただし、この抗原量は、上記組成物の注射に先立って、組換えサブユニット生ワクチンの外来遺伝子の量として表されたものである。実際のところ、本発明によれば、免疫現象を誘発する抗原は、接種対象であるヒトまたは動物に注射された後に、上記ワクチンによって本質的に生体内で発現される。
【００４１】
　本発明のワクチン組成物は、例えばヨーロッパ特許ＥＰ４８０９８１号公報およびヨーロッパ特許ＥＰ４８０９８２号公報に記載の方法にしたがうなどして、様々な従来の方法により調製できる。本発明の組成物を製造するための方法は、組換え生ワクチンを水溶液中で、鉱物油もしくは非鉱物油または鉱物油と非鉱物油との混合物と共に、油中水（Ｗ／Ｏ）型、水中油（Ｏ／Ｗ）型、または水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）型のエマルジョンの形態に乳化することよりなる。油は、アブリジンのような細胞免疫のためのアジュバントと組み合わせても良い。
【００４２】
　エマルジョンにおける、組み合わされた油分および、場合によっては乳化系をも含む油相とまたは活性成分を含有する水相との重量比は、それぞれ広い範囲をとり、９５から５％の水相に対して５から９５％の油相であり、特に７５から２５％の水相に対して２５から７５％の油相である。
【００４３】
　油相と水相の混合は、２０℃から４０℃の温度範囲で撹拌により、従来の手法にしたがって為される。得られた製剤はすべて安定でなければならない。即ち、エマルジョン製には相分離があってはならず、このことは、この種の製品の普通の貯蔵条件の下では、抗原相もしくは油相の離脱がないことを意味する。本発明の組成物は、４℃で１２か月以上の保存安定性を有し得る。
【００４４】
　さらに、このワクチン製剤は、ブルックフィールド型粘度測定器により組成物中でローターを回転させて計測された粘度が２５℃で２００ｍＰａ・ｓ未満、好ましくは３００ 
ｍＰａ・ｓ未満であるような液体である。
【００４５】
　エマルジョン連続相の油性または水性の性質は、１ｃｍ当りのマイクロジーメンス単位で計測される伝導度により特徴づけられる。
【００４６】
　室温で得られる油性連続相の伝導度の値は、１ｃｍ当り約２０マイクロジーメンス未満である。
【００４７】
　前期ワクチンにおけるコード配列が、例えばＨＩＶ１もしくはＨＩＶ２のようなＨＩＶウイルスまたはＦＩＶウイルスの抗原サブユニットをコードし、この抗原サブユニットの発現が上記のウイルスに対する抗体の合成および／または防御的作用を誘発する組換え生ワクチンもまた、本発明の一部をなす。
【００４８】
　下記の例において、用いられるワクチン組成物は、シュードラビーズウイルス（ＰＲＶ）の糖タンパク質のｇｐ５０を発現する不完全アデノウイルスである。
【００４９】
　組換えアデノウイルスＡｄ−ｇｐ５０の調製、細胞培養における抗原ｇｐ５０の発現、並びにＡｄ−ｇｐ５０のワクチン接種によるネズミおよびウサギの免疫反応および防御反応は、刊行物（M．Eloit et al.，Journal of General Virology（1990），71：2425-2431）に記載されている。
【００５０】
　その概略を説明すると、タイプ５のアデノウイルス（Ａｄ−５）により形質転換されたヒト胎生由来のセルライン２９３（Graham et al.，1977，Journal of General Virology，36：59-72参照）が、上記の組換えアデノウイルスの形質転換、増幅および滴定に用いられた。
【００５１】
　Ａｄ−ｇｐ５０の調製には、ウイルスの増殖に影響のないＥ３領域に欠失が存在するＡｄ−５が用いられる。　
　Ａｄ−ｇｐ５０は、Ｅ１Ａ遺伝子を補ったセルライン又は補わないセルライン、特にＥ１Ａ遺伝子を欠失したＨｅｌａ細胞において、高レベルのｇｐ５０を発現する。
【００５２】
　著者らは、ＰＲＶの感染による攻撃誘発後に、マウスまたはウサギに与えられる防御反応が小さいにもかかわらず、ＥＬＩＳＡ試験で測定された、高濃度のＡｄ−ｇｐ５０に対する抗体応答は顕著であることに注目している。
【００５３】
　本発明の有用性は、このタイプの組換え生ワクチンを上述の乳化剤と組み合わされた油分中にエマルジョン化することによって、一方では、注射されるウイルス生体の投与量を減らしつつ免疫力と防御力を増強させ、他方では、特にＩＬ２およびＩＬ６に代表されるインターロイキンのようなサイトカイン類の合成能を増幅することにある。
【００５４】
　下記の別の例でのオージェスキーウイルスとは、ＰＲＶと同じものである。
【００５５】
　例１（比較例）：アジュバントを用いない場合の抗体の誘発およびワクチン接種の効果 ワクチンは、上記の組換えアデノウイルスＡｄ−ｇｐ５０からなる。
【００５６】
　このワクチン組成物は、第０日に、Ｃ１、Ｃ２およびＣ３の３種のＡｄ−ｇｐ５０の濃度で、１グループ当たり１０個体からなる３グループに分けたＯＦ１マウスの皮下に、１個体当たり１００μｌの割合で接種される。用いられた３種のワクチン濃縮物は、以下のように定義される。
【００５７】
　‐１０9ウイルス／ｍｌ，すなわち 1０8ＴＣＩＤ５０／マウス（Ｃ１）
　‐３ｘｌ０8ウイルス／ｍｌ，すなわち　１０7.4ＴＣＩＤ／５０マウス（Ｃ２）
　‐３ｘ１０7ウイルス／ｍｌ，すなわち　１０6.4ＴＣＩＤ／５０マウス（Ｃ３）
ワクチン製剤の効果を評価するための手順は、図１に記載されている。
【００５８】
　ワクチン製剤により誘発された抗ｇｐ５０抗体の定量のために、２週間後に血清試料が集められる。
【００５９】
　ワクチンの効果を評価するために、予備実験で決定された２０ ＬＤ５０濃度の有毒なオージェスキーウイルス製剤の存在下で攻撃誘発試験が実施される。　
　上記濃度は、ワクチン接種されないマウスが１００％死亡する濃度に相当する。　
　死亡は、２４０時間に亘って観察する。これ以上の時間では、マウスはすべて、攻撃への抵抗力を獲得する。次の２変数が確認される。
【００６０】
　一つは、実験終了時に観察される、百分率表示の生存レベルである。　
　もう一つは、死亡の動態（カイネティックス）である。
【００６１】
　結果
‐抗ｇｐ５０抗体の測定：
　血清試料は、免疫付与の２週間後に採取された。抗ｇｐ５０抗体の測定は、エロワらの記載による技術（Eloit et al．coll.，Veterinary Record，1989，124：91-94．）を用いたＥＬＩＳＡで行う。
【００６２】
　得られた結果は図２に示す。それによれば、 ‐Ｃ１、Ｃ２およびＣ３は、次の３種類のＡｄ−ｇｐ５０濃度を示す：１０9、３ｘ１０8および３ｘ１０7ウイルス／ｍｌ；
‐力価はｙ軸に示され、バックグラウンドノイズより大きなＯＤ（吸光度）を得るために必要な希釈度が示されている；
　‐Ｔは、ワクチン接種されていない絶対標準を示す。
【００６３】
　アジュバントが無い場合、抗体の誘発は１０9Ａｄ−ｇｐ５０／ｍｌ濃度のもののみであり、３ｘ１０8および３ｘ１０7Ａｄ−ｇｐ５０／ｍｌ濃度のものでは、抗ｇｐ５０抗体は検出されなかった。
【００６４】
‐有毒ウイルスによる攻撃誘発 
　オージェスキーウイルスによる攻撃への耐性は、Ｃ１、Ｃ２およびＣ３の３種類のウイルス濃度において評価される。攻撃誘発後の生存レベルは図３に示される。生存百分率は、ｙ軸に表される。
【００６５】
　攻撃誘発に対する不完全な（５０％）防御が、Ｃ１（１０9Ａｄ−ｇｐ５０／ｍｌ）の存在の下で観察される。
【００６６】
　Ｃ２（３ｘ１０8／ｍｌ）およびＣ３（３ｘ１０7／ｍｌ）では、ワクチン接種されていない絶対標準と比べて目立った防御は観察されない。ワクチン接種されていない絶対標準の死亡率は１００％である。
【００６７】
　図４は、アジュバントなしで免疫感作した後の、オージェスキーウイルス感染攻撃に対する生残の動態を表す。
【００６８】
　生存率は、百分率でｙ−軸上に表わされている。
【００６９】
　１２０時間以前に、対照試料ならびにＣ２およびＣ３濃度について死亡が観察されることが注目される。
【００７０】
　従って、アジュバントが無い場合、１０9Ａｄ−ｇｐ５０／ｍｌ未満の濃度の組換えアデノウイルスは、オージェスキーウイルスの感染による攻撃に対して、抗ｇｐ５０抗体の誘発もいかなる防御の誘発もなし得ないことがわかる。濃度が１０9Ａｄ−ｇｐ５０／ｍｌのときには、わずかに不十分な防御反応が得られる。
【００７１】
　‐例２：Ｗ／Ｏ、Ｏ／Ｗ、Ｗ／Ｏ／Ｗ型の油性アジュバントの存在下でのオージェスキーウイルスの攻撃に対する免疫反応および防御の誘発： 
　下記の表１に記載の６種類のアジュバントについて、例１に示した伝染性のオージェスキーウイルスによる攻撃後の抗ｇｐ５０抗体の誘発および抵抗力の誘発をする潜在能力を試験した。ワクチン製剤は、以下に示す処方で、アジュバントと例１で定義したＣ１、Ｃ２およびＣ３の濃度の組換えウイルスとを、シリンジを用いて混合して作られる。
【００７２】
　１）Ｗ／Ｏ型ワクチン製剤
　 製剤Ｎｏ．１ 
　２５％アジュバント（油＋乳化系）(1) 
　７５％免疫原組成物 
　　（1）=モンタニド（Montanide）ＩＳＡ２５ 
　製剤Ｎｏ．２ 
　２５％アジュバント（油＋乳化系＋アブリジン）(2) 
　７５％免疫原組成物 
　　（2）=モンタニドＩＳＡ２５Ａ 
　製剤Ｎｏ．３ 
　２０％アジュバント（油＋乳化系）(3)
　８０％免疫原組成物 
　　（3）モンタニドＩＳＡ２８２）Ｗ／Ｏ／Ｗ型ワクチン製剤 
　製剤Ｎｏ．４ 
　５０％アジュバント（油十乳化系）(4) 
　５０％免疫原組成物 
　　（4）モンタニドＩＳＡ２０６３）Ｗ／Ｏ型ワクチン製剤 
　製剤Ｎｏ．５ 
　５５％アジュバント（油＋乳化系）(5) 
　４５％免疫原組成物 
　　（5）モンタニドＩＳＡ５０ 
　製剤Ｎｏ．６ 
　７０％アジュバント（油＋乳化系）(6) 
　３０％免疫原組成物 
　　（6）モンタニドＩＳＡ７０８
【表１】
2004137283.tif 000002
【００７３】
　上記のモンタニドＩＳＡはすべて、ＳＥＰＰＩＣ社により製造販売されている。それらに含まれる乳化剤は、マンニトールエステル誘導体である。
【００７４】
　これらの製剤は以下のものと比較される： 
　‐例１に記載の、アジュバントのないワクチン製剤（Ｔ１）
　‐２つのグループの標準試料、すなわち１つはワクチン接種されていないマウス（Ｔ２）、もう１つはＡｄ−ｇｐ５０を含まないモンタニドＩＳＡ５０アジュバントを注射されたマウス（Ｔ３）
　抗ｇｐ５０抗体の測定、生存レベルの百分率の計測および死亡の動態の計測は、上記例１記載の方法にしたがって行われる。
【００７５】
　得られた結果は、下記の表２および図５、６、７、８、９、１０に要約される。なお、そこでのＣ１、Ｃ２およびＣ３の意味は、例１における意味と同じである。
【表２】
2004137283.tif 000003
【００７６】
　ａ） Ｗ／Ｏ型エマルジョンでの結果 
　‐抗ｇｐ５０抗体の測定 
　表２は、抗ｇｐ５０抗体のレベルが、アジュバントなしの対照試料並びにモンタニドＩＳＡ２５、モンタニドＩＳＡ２５に細胞免疫の刺激剤であるアブリジンを付け加えたモンタニドＩＳＡ２５Ａ、およびモンタニドＩＳＡ２８のそれぞれにみられるよりも著しく大きいことを示す。
【００７７】
　‐有毒ウイルスによる攻撃 
　図５、６、７は、対照試料Ｔ２と比較して、３種類のワクチン濃度での生存百分率を時間の関数として示している。これらは、モンタニドＩＳＡ２５（図５）、モンタニドＩＳＡ２５Ａ（図６）およびモンタニドＩＳＡ２８（図７）についてのものである。
【００７８】
アジュバントの効果は、アジュバントなしで得られた結果と比較して図４に示される。
【００７９】
　ｂ） Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンでの結果：
　‐抗ｇｐ５０抗体の測定 
　表２に表された結果は、モンタニドＩＳＡ２０６の存在の下で得られた抗ｇｐ５０抗体のレベルが、試験された３種類のｇｐ５０の濃度について、対照試料Ｔ２で得られたレベルよりも著しく大きいことを明瞭に示している。
【００８０】
　‐有毒ウイルスによる攻撃誘発 
　図８は、Ａｄ−ｇｐ５０と組み合わせた鉱物油モンタニドＩＳＡ２０６による攻撃誘発後に得られた結果を示す。
【００８１】
　７０％および５０％の生存レベルが、Ａｄ−ｇｐ５０の最低濃度で得られた。
【００８２】
ｃ）Ｗ／Ｏ型エマルジョンでの結果
　‐抗ｇｐ５０抗体の測定 
　表２は、３ｘ１０8　Ａｄ−ｇｐ５０／ｍｌの濃度において、有意に検出可能な抗体のレベルを示す。一方、同じ濃度でも、アジュバントの不存在下では抗ｇｐ５０抗体の検出は不可能であることを示す。
【００８３】
　‐有毒ウイルスによる攻撃誘発 
　モンタニドＩＳＡ５０（鉱物油）およびモンタニドＩＳＡ７０８（鉱物油）により得られた結果は、それぞれ図９および図１０に示されている。
【００８４】
　Ａｄ−ｇｐ５０のすべての濃度において、モンタニドＩＳＡ５０では６０％を超える生存レベルが、またモンタニドＩＳＡ７０８では５０％を超える生存レベルが得られた。
【００８５】
　本発明では、アジュバントが存在しないときは、Ｃ２およびＣ３の濃度での生存レベルは１０％であることが思い起こされる（図４参照）。
【００８６】
　表２はそれ故、本発明のアジュバントの存在下における抗ｇｐ５０抗体レベルは、油性アジュバントの不存在下で得られる抗体レベルよりもはるかに大きいことを明瞭に示している。
【００８７】
　図４から図１０は、本発明の油性アジュバントを欠くにもかかわらず、109Ａｄ−ｇｐ５０／ｍｌの存在下では攻撃誘発に対して部分的な防御（５０％）が見られ、3x108および3x107Ａｄ−ｇｐ５０／ｍｌの存在下では防御が欠如すること（１０％）を示す。（図４参照）。
【００８８】
　モンタニドＩＳＡの使用により、最大濃度（109Ａｄ−ｇｐ５０／ｍｌ）での１００％の防御を初め、９０％（3x108Ａｄ−ｇｐ５０／ｍｌ）および６０％（3x107Ａｄ−ｇｐ５０／ｍｌ）の防御レベルを得ることが可能となる。
【００８９】
　この研究は全体として、発現された遺伝子に対して特異的な抗体レベルおよび感染媒体に対する防御レベルを著しく向上できる組換えサブユニット生ワクチンにおいて、本発明による油性アジュバントを用いることの有用性を示し得るものである。
【００９０】
　最初のワクチン接種において、３つの重要な結果が得られる。
【００９１】
　試験された有効なアジュバント含有ワクチンについて、結果として以下のことがいい得る。
【００９２】
‐Ｗ／Ｏ型ワクチン（モンタニドＩＳＡ５０およびＩＳＡ７０８）： 
　　*これらは、１０9および３ｘ１０8Ａｄ−ｇｐ５０／ｍｌの濃度では高い抗体レベルを誘発するが、３ｘ１０7Ａｄ−ｇｐ５０／ｍｌの濃度では、抗体レベルを検出できない。
【００９３】
　　*これらは、試験された３種類の濃度において、５０％を超えるレベルで伝染性オージェスキーウイルスによる攻撃誘発に対する防御を達成する。
【００９４】
　以上より、この場合は、生存レベルと抗ｇｐ５０抗体の誘発との間に厳密な相関がみられない。
【００９５】
　この現象は、以下のことと関連しているかも知れない： 
　‐使用したＥＬＩＳＡ測定法によっては検出できないイムノグロブリンのクラスが極めて高度に誘発されている（ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＥ）。
【００９６】
　‐および／または細胞性免疫が誘発されている。
【００９７】
　‐Ｗ／Ｏ／Ｗ型ワクチン（モンタニドＩＳＡ２０６）： 
　　*これらは、試験された３種類の濃度のＡｄ−ｇｐ５０（１０9／ｍｌ、３ｘ１０8／ｍｌおよび３ｘ１０7／ｍｌ）について極めて高いレベルの抗体を誘発する。
【００９８】
　　*これらは、試験された３種類の濃度について、伝染性のオージェスキーウイルスに対して５０％を超えるレベルの防御を達成する。
【００９９】
　‐モンタニドＩＳＡ２５およびＩＳＡ２８によるＯ／Ｗ型ワクチン 
　　*これらは、１０9および３ｘ１０8Ａｄ−ｇｐ５０／ｍｌの濃度において、特異的な抗ｇｐ５０抗体を高いレベルで誘発する。一方、モンタニドＩＳＡ２８の存在の下では、最も低いＡｄ−ｇｐ５０濃度（３ｘ１０7／ｍｌ）でもやはり抗ｇｐ５０抗体の存在を検出できる。
【０１００】
　　*これらは、伝染性のオージェスキーウイルスに対して、モンタニドＩＳＡ２８では、４０から５５％のレベルでの防御を達成する。
【０１０１】
　しかしながら、このタイプのワクチン（Ｏ／Ｗ型）は、Ｗ／Ｏ型またはＷ／Ｏ／Ｗ型ワクチンに比べて全体的に効果が小さいことは明らかである。
【０１０２】
　‐細胞性免疫アジュバント併用のＯ／Ｗ型ワクチン。
【０１０３】
　モンタニドＩＳＡ２５へのアブリジンタイプにアジュバントを付加することにより、最高濃度のＡｄ−ｇｐ５０濃度（１０9／ｍｌ）による攻撃誘発に対しても、大量の抗ｇｐ５０抗体を誘発することなく、１００％の防御を得ることができる。
【０１０４】
　‐局所反応の観察： マクロ的な観察では、注射部位に局所反応も肉芽腫も見られない。
【０１０５】
　例３
　抗体およびインターロイキンの合成の誘発 
　表１に記載の６種類のアジュバントについて、インターロイキンＩＬ２の合成を誘発する能力を試験した。
【０１０６】
　上記のアジュバントを含有するワクチン組成物が、それぞれ１０個体のマウスからなる異なるグループに注射された。
【０１０７】
　それぞれのグループは、６種類のアジュバントのひとつと、例１において定義したＣ１、Ｃ２またはＣ３濃度のＡｄ−ｇｐ５０とを含有するワクチン組成物によりワクチン接種された。
【０１０８】
　比較の対照として、本発明のアジュバントもしくはＡｄ−ｇｐ５０のいずれかを含まない組成物、またはアジュバントおよびＡｄ−ｇｐ５０のいずれをも含まない組成物を１０個体のマウスからなるグループに注射した。
【０１０９】
　すべての場合について、それぞれのマウスは１００μｌの組成物で処理された。
【０１１０】
ワクチン接種の１４日後に得られた血清ＩＬ２の力価は、下記の表３に示される。この力価は、ゲンザイム社（Genzyme corp）から販売されているＥＬＩＳＡ技術で測定された。
【表３】
2004137283.tif 000004
【０１１１】
　得られた結果から明らかなように、ＩＬ２の合成は、本発明に従って、Ａｄ−ｇｐ５０と組み合わせられたアジュバントにより強い刺激を受ける。
【０１１２】
　例４ 
　表１に記載のアジュバントであるモンタニドＩＳＡ２５、モンタニドＩＳＡ２０６およびモンタニド５０について、インターロイキンＩＬ６の合成を誘発する能力が試験された。
【０１１３】
上記アジュバントを含有するワクチン組成物は、それぞれ１０個体のハツカネズミからなる異なるグループに注射された。
【０１１４】
　それぞれのグループは、上記のアジュバントのひとつと、例１でＣ1、Ｃ2およびＣ3として定義された濃度のＡｄ−ｇｐ５０とを含有するワクチン組成物で接種された。
【０１１５】
　比較のために、１０個体のマウスからなる異なるグループが、本発明のアジュバントもしくはＡｄ−ｇｐ５０のいずれかを含まない組成物またはアジュバントおよびＡｄ−ｇｐ５０のいずれをも含まない組成物を注射することにより治療された。すべての場合において、１００μｌの組成物がそれぞれのマウスに注射された。注射１４日後に得られた血清ＩＬ６の力価は、下記の表４に表されている。このＩＬ６の力価は、エンドジェン社（Endogen）から販売されている従来のＥＬＩＳＡ測定法により計測された。
【表４】
2004137283.tif 000005
【０１１６】
　上記で得られた結果から明らかなように、ＩＬ６の合成は、Ａｄ−ｇｐ５０と組み合わせられた、モンタニドＩＳＡ２０６アジュバントを含有するＷ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンであるワクチン組成物により刺激される。
【０１１７】
　例５ 
　表１に記載された６種類のアジュバントについて、４種類の異なるサブクラスの抗ｇｐ５０抗体、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３の産生を誘発する能力を試験した。
【０１１８】
　ワクチン組成物は、それぞれ１０個体のマウスからなるグループに注射された。それぞれのマウスのグループは、６種のアジュバントのひとつ並びに、例１でＣ1、Ｃ2およびＣ3として定義された濃度のＡｄ−ｇｐ５０を含有するワクチン組成物で接種された。
【０１１９】
比較のために、１０個体のマウスからなる異なるグループが、本発明のアジュバントもしくはＡｄ−ｇｐ５０のいずれかを欠いた組成物、またはアジュバントおよびＡｄ−ｇｐ５０のいずれも含まない組成物の注射によって治療された。
【０１２０】
　すべての場合において、マウスは、それぞれ１００μｌの本発明の組成物または比較例の組成物の注射により治療された。
【０１２１】
　上記組成物の注射１４日後に得られた血清の力価（アジュバントを含むがＡｄ−ｇｐ５０を含まない組成物による比較対照品よりも吸着度が大きくなる最終希釈で示される）は、下記の表５に表される。この血清の力価は、従来のＥＬＩＳＡ測定法により測定された。
【表５】
2004137283.tif 000006
【０１２２】
　結果から明らかなように、本発明のワクチン組成物は、４種類のサブクラスの抗ｇｐ５０抗体の合成を促す。
【０１２３】
　いうまでもなく、上記の例は例示のために記載したものでる。本発明は、乳化系と組み合わせられた、モンタニドＩＳＡの物理化学的特性を有する鉱物油、非鉱物油もしくは（鉱物油＋非鉱物油の）混合油のいずれかを含み、かつ組換えワクチンを含有する水溶液とのエマルジョン化が可能であり、前記ワクチンにおいて、いずれかの病原体の免疫原性のタンパク質またはペプチドは油性エマルジョンに適合した複製可能なベクターによって発現されるような、あらゆる組成物にも関するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】ワクチン製剤の効果を評価するための手順を示す図。
【図２】抗ｇｐ５０抗体の測定結果を示す図。
【図３】攻撃誘発後の生存レベルを示す図。
【図４】オージェスキーウイルス感染攻撃に対する生残の動態を表す
【図５】モンタニドＩＳＡ２５のワクチン濃度での生存百分率を示した図。
【図６】モンタニドＩＳＡ２５Ａのワクチン濃度での生存百分率を示した図。
【図７】モンタニドＩＳＡ２８のワクチン濃度での生存百分率を示した図。
【図８】Ａｄ−ｇｐ５０と組み合わせた鉱物油モンタニドＩＳＡ２０６による攻撃誘発後に得られた結果を示す図。
【図９】モンタニドＩＳＡ５０（鉱物油）により得られた結果を示す図。
【図１０】モンタニドＩＳＡ７０８（鉱物油）により得られた結果を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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