(57)【要約】　　　（修正有）　【課題】中性またはアルカリ性条件で使用される洗濯洗浄剤組成物に適したＥＧＩＩＩセルラーゼやキシラナーゼの提供。【解決手段】無機塩の存在下において効果的な量のポリエチレングリコールをトリコデルマ培養物からなる水性混合物に添加することにより、キシラナーゼも含有するセルラーゼタンパク質の水性混合物から実質的に純粋なキシラナーゼを単離する方法。ポリエチレングリコールを酵素の水性混合物に添加して２相系を形成させ、キシラナーゼの多い相を分離することによる、前記水性混合物からキシラナーゼ成分を分離する工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　セルラーゼタンパク質を含有する水性混合物からキシラナーゼの豊富な組成物を単離する方法であって、
（ａ）ＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分以外の実質的に全てのセルラーゼタンパク質がキシラナーゼ成分の少ない水相に保持され、かつキシラナーゼ成分がキシラナーゼ成分の多いポリエチレングリコール相に保持されるように、セルラーゼタンパク質を含有する水性混合物に、無機塩、および０.５から１０％（ｗ／ｖ）の約５,０００から１０,０００までの分子量を有するポリエチレングリコールを添加する工程；および
（ｂ）前記キシラナーゼ成分の少ない水相から前記キシラナーゼ成分の多いポリエチレングリコール相を分離して、該キシラナーゼ成分の多いポリエチレングリコール相を集める工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
　前記キシラナーゼ成分の多いポリエチレングリコール相からキシラナーゼ成分を分離して、該キシラナーゼ成分を集める工程をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
　沈殿によって、前記キシラナーゼ成分の多いポリエチレングリコール相からキシラナーゼ成分を分離することを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
　低分子量のアルコールを前記キシラナーゼ成分の多いポリエチレングリコール相に添加して前記キシラナーゼ成分を沈殿させることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
　前記低分子量のアルコールがエタノールであることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
　前記無機塩が、前記ポリエチレングリコールを添加する前に、前記水性混合物に添加されることを特徴とする請求項１から５いずれか１項記載の方法。
【請求項７】
　添加される前記無機塩が、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カリウムからなる群より選択されることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
　出発物質である前記水性混合物が、濾過された全細胞抽出物であることを特徴とする請求項１から７いずれか１項記載の方法。
【請求項９】
　出発物質である前記水性混合物が、細胞を含まないセルラーゼ混合物であることを特徴とする請求項１から７いずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は実質的に純粋なＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分を含有するポリエチレングリコール溶液を製造する方法に関するものである。特に本発明の方法の一部は、特定のポリエチレングリコールを水性混合物に添加してＥＧ　ＩＩＩが多いポリエチレングリコール相とＥＧ　ＩＩＩが少ない水相とからなる２相系を調製してＥＧ　ＩＩＩが多いポリエチレングリコール相を分離することにより、ＥＧ　ＩＩＩ含有セルラーゼタンパク質の水性混合物からＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分を分離する方法に関するものである。本発明はまた一部は、分画により、または上記２つの方法の組合せにより、実質的に純粋なＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分を調製する方法に関するものである。本発明はまた一部は、キシラナーゼをも含有するセルラーゼタンパク質の水性混合物からキシナーゼ　ポリエチレングリコール相を集積する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
　セルラーゼは、セルロース（β−１、４−グルカン結合）を加水分解し、それによって、グルコース、セロビオース、セロオリゴ糖等を生成させる酵素として従来技術において知られている。セルラーゼは、菌類、細菌等内で産生（発現）されるけれども、セルロースの結晶構造を分解することのできる完全セルラーゼ系が発酵方法により大量に容易に産生されるので、ある菌類、特に菌類網トリコデルマ　ｓｐｐ．（Trichoderma spp.）（特にトリコデルマ　リーセイ（Trichoderma reesei））により産生されたセルラーゼは最も注目を集めている。
【０００３】
　上記点に関して、Schulein、“Methods in Enzymology ”、160 、25、234 頁et seq.(1988) は、完全菌類セルラーゼ系が、エキソセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ　３．２．１．９１）（「ＣＢＨ」）、エンドグルカナーゼ（ＥＣ　３．２．１．４）（「ＥＧ」）、およびβ−グルコシダーゼ（ＥＣ　３．２．１．２１）（「ＢＧ」）として同定される酵素を含むいくつかの異なる酵素分類からなることを開示している。ＣＢＨ、ＥＧおよびＢＧの菌類セルラーゼ分類をさらに発展させて、各々の分類内に多数の成分を含むようにできる。例えば、多数のＣＢＨおよびＥＧが様々な菌類源から単離されている。
【０００４】
　ＣＢＨ成分、ＥＧ成分およびＢＧ成分からなる完全セルラーゼ系は、結晶性セルロースをグルコースに能率的に転化させるのに必要とされる。いやしくも、結晶性セルロースを加水分解する際には、単離された成分はほとんど効果的ではない。さらに、特にセルラーゼ成分が異なる分類のものである場合、セルラーゼ成分の間で相乗関係が観察される。
【０００５】
　一方で、単独または組合せのいずれかにより使用するセルラーゼおよびその成分は、洗浄剤組成物に有用であることが従来技術において知られている。例えば、菌類セルラーゼのエンドグルカナーゼ成分は、柔軟剤として使用するための、そして綿織物等の感触を改善するのに使用するための、洗浄剤組成物の洗浄力を増強させる目的に使用されている。しかしながら、洗浄剤組成物中にトリコデルマ　ｓｐｐ．そして特にトリコデルマ　リーセイから由来したＥＧ　Ｉ成分およびＥＧ　ＩＩ成分を使用するには問題がある。特に、そのような成分は酸性ｐＨで最大活性を有しているが、ほとんどの洗濯洗浄剤組成物は中性またはアルカリ性（ｐＨ＞７から約１０まで）条件で使用するように配合されている。洗浄剤組成物中にトリゴデルマ　リーセイの１種類以上の酸性エンドグルカナーゼ成分を使用すると、アルカリ性条件下で使用した場合でさえも、綿含有織物に対する感触、柔軟性および色の保持と復元を改良できることが米国特許出願第07/668,640号に開示されているが、トリコデルマ　ｓｐｐ．のＥＧ　ＩＩＩ成分は、トリコデルマ　リーセイのＥＧ　Ｉ成分およびＥＧ　ＩＩ成分と比較して、洗浄剤組成物において予期せぬ優れた利点を有することが米国特許出願第07/707,647号に開示されている。
【０００６】
　特に、ＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分は、アルカリ条件下で著しい酵素活性を有することがわかっており、中性またはアルカリ性の洗浄剤洗濯媒質を用いた洗濯条件に使用するのにも特に適している。
【０００７】
　洗濯洗浄剤に使用することに加えて、ここに記載する実質的に純粋なＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分はさらに、1991年 5月30日に出願され、ここに引用する米国特許出願第07/707,647号に記載されているように、色の保持と復元、柔軟性および感触を望ましく改良する十分な活性がある場合、中間のｐＨの適切な溶液中において予洗工程に使用することができる。
【０００８】
　また、ここに記載する実質的に純粋なＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分は、スポットリムーバーに使用できるだけでなく、また色褪せた織物に対して色を復元するのに適した孤立組成物（例えば、ここに全てを引用する、米国特許第4,738,682 号を参照のこと）としての家庭用途に使用することもできると考えられている。
【０００９】
　さらに、中性からアルカリ性の条件下でＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分の大きい活性は、緑蔵飼料加工および／または堆肥化加工と同様に、綿含有織物を処理する繊維加工（ここに全てを引用する米国特許出願第07/677,385号および同第07/678,865号を参照のこと）にも有益であると考えられている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
　上述した点は著しく異なって、本発明は、水性酵素混合物から、特に完全菌類セルラーゼ組成物からＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分を分離して精製する、特に商業規模のＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分の製造のための能率的な方法に関するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
　特に、本発明は、ＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分を含むセルラーゼタンパク質を含有する水性混合物から、実質的に純粋なＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分を含有するポリエチレングリコール溶液を製造する方法に関するものである。したがって、その方法の一面において、本発明は、ＥＧ　ＩＩＩセルラーゼを含むセルラーゼタンパク質を含有する水性混合物からＥＧ　ＩＩＩを選択的に回収する方法に関し、その方法は、無機塩の存在下において効果的な量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の水性混合物を添加する工程を含んでいる。その混合物は、ＥＧ　ＩＩＩが多いポリエチレングコール相およびＥＧ　ＩＩＩが少ない水相からなる二相液体混合物を形成している。この方法において、ＥＧ　ＩＩＩが多い相には他のセルラーゼタンパク質は実質的に含まれず、ＥＧ　ＩＩＩが多い相は後に分離される。
【００１２】
　本発明の方法はまた一部には、無機塩の存在下において効果的な量のポリエチレングリコールを水性混合物に添加することにより、キシラナーゼも含有するセルラーゼタンパク質の水性混合物から実質的に純粋なキシラナーゼを単離する方法に関するものである。水性混合物がＥＧ　ＩＩＩも含有する場合には、回収したポリエチレングリコール相はＥＧ　ＩＩＩおよびキシラナーゼの両方を含有している。
【００１３】
　別の方法において、本発明は、ＥＧ　ＩＩＩを含有する水性セルラーゼタンパク質混合物からＥＧ　ＩＩＩセルラーゼを選択的に回収する方法に関し、その方法は、その水性混合物を陰イオン交換カラムに通すことを含んでいる。陰イオン交換カラムに結合しなかったタンパク質分画はＥＧ　ＩＩＩ成分を含有している。次いでこの分画を陽イオン交換カラムに通す。この陽イオン交換カラムは、ＥＧ　ＩＩＩセルラーゼと結合し、後に塩溶液により樹脂から溶離せしめられる。
【００１４】
　本発明の３番目の方法は、いずれかの順番で上記した２つの方法の組合せである。
【００１５】
　水性セルラーゼタンパク質混合物は、全細胞抽出物、より好ましくは、野生型トリコデルマ　ｓｐｐ．菌株、遺伝的に修飾されたトリコデルマ　ｓｐｐ．または本発明の方法に適合しているＥＧ　ＩＩＩを含むセルラーゼタンパク質を含有する他の水性混合物からの全セルラーゼ組成物であり得る。
【００１６】
　第１図は、ＣＢＨ　ＩおよびＣＢＨ　ＩＩを発現できないように形質転換したトリコデルマ　リーセイの菌株由来のＥＧの多い菌類セルラーゼ組成物の40℃での所定のｐＨ範囲におよぶＲＢＢ−ＣＭＣ活性プロファイル、並びに40℃での所定のｐＨ範囲におよぶトリコデルマ　リーセイ由来のＥＧ　ＩＩＩの多いセルラーゼ組成物の活性プロファイルを示すグラフである。
【００１７】
　第２図は、レーン１において、野生型トリコデルマ　リーセイにより発現されたタンパク質を示し、レーン２において、ＥＧ　ＩおよびＥＧ　ＩＩ成分を発現できないように形質転換したトリコデルマ　リーセイの菌株により発現されたタンパク質を示し、レーン３において、実施例１の方法により得られたタンパク質と同一の実質的に純粋なＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ中に発見されるタンパク質を示す等電点電気泳動ゲルを示すものである。この図の左の余白に、ＣＢＨ　Ｉ、ＣＢＨ　ＩＩ、ＥＧ　Ｉ、ＥＧ　ＩＩ、ＥＧ　ＩＩＩおよびキシラナーゼに帰するバンドを同定できるように印が付けてある。
【００１８】
　第３図は、ＥＧ　ＩＩＩの２つの断片から得られたアミノ酸配列である。
【００１９】
　第４図は、ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４の構築を示す概略図である。
【００２０】
　第５図は、トリコデルマ　リーセイ染色体のうちの１つの染色体上のｃｂｈ１座にｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４からのより大きなＥｃｏＲＩ断片を組み込むことよるトリコデルマ　リーセイ遺伝子の欠失を説明する概略図である。
【００２１】
　第６図は、プローブとして３２Ｐで標識したｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４を用いた、サザンブロット分析後のＥｃｏＲＩ切断ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４により形質転換したトリコデルマ　リーセイ菌株ＧＣ６９からのＤＮＡのオートラジオグラフである。分子量マーカーの大きさを図面の左側にキロ塩基対で示している。
【００２２】
　第７図は、プローブとして３２Ｐで標識したｐＩｎｔＣＢＨＩを用いた、ＥｃｏＲＩ切断ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４により形質転換したトリコデルマ　リーセイ菌株ＧＣ６９からのＤＮＡのオートラジオグラフである。分子量マーカーの大きさを図面の左側にキロ塩基対で示している。
【００２３】
　第８図は、野生型のトリコデルマ　リーセイにより分泌されたタンパク質およびトリコデルマ　リーセイの形質転換菌株により分泌されたタンパク質を示す等電点電気泳動ゲルである。具体的には第８図において、等電点電気泳動ゲルのレーンＡは、部分的に精製したトリコデルマ　リーセイからのＣＢＨＩが作用したものである。レーンＢは、野生型のトリコデルマ　リーセイが作用したものである。レーンＣは、ｃｂｈ１遺伝子が欠失したトリコデルマ　リーセイ菌株からのタンパク質が作用したものである。レーンＤは、ｃｂｈ１およびｃｂｈ２遺伝子が欠失したトリコデルマ　リーセイ菌株からのタンパク質が作用したものである。第８図において、図面の右側には、１つ以上の分泌タンパク質に発見された単一タンパク質の座を示すように印付けてある。具体的には、ＢＧはβ−グルコシダーゼを意味し、Ｅ１はエンドグルカナーゼＩを意味し、Ｅ２はエンドグルカナーゼＩＩを意味し、Ｅ３はエンドグルカナーゼＩＩＩを意味し、Ｃ１はエキソセロビオヒドロラーゼＩを意味し、Ｃ２はエキソセロビオヒドロラーゼＩＩを意味するものである。
【００２４】
　第９Ａ図は、ゲノムＤＮＡ上の4.1 ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片としてクローニングしたトリコデルマ　リーセイｃｂｈ２座を示す概略図であり、第９Ｂ図は、ｃｂｈ２遺伝子が欠失したベクターｐＰΔＣＢＨＩＩを示す概略図である。
【００２５】
　第１０図は、プローブとして３２Ｐで標識したｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４を用いた、サザンブロット分析後のＥｃｏＲＩ切断ｐΔＣＢＨＩＩにより形質転換したトルコデルマ　リーセイ菌株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩＰｙｒ２６からのＤＮＡのオートラジオグラフである。分子量マーカーの大きさを図面の左側にキロ塩基対で示している。
【００２６】
　第１１図は、ｐΔＥＧＩｐｙｒＧ−３の構成を示す概略図である。
【００２７】
　第１２図は、トリコデルマ　リーセイ染色体の１つのｅｇｌ１座にｐΔＥＧＩｐｙｒＧ−３からのＨｉｎｄＩＩＩ断片を組み込むことによるｅｇｌ１遺伝子の欠失を説明する概略図である。
【００２８】
　第１３図は、ｐＡΔＥＧＩＩ−１の構成を示す概略図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
　上述したように、本発明は概して、ポリエチレングリコール溶液中において、または回収したタンパク質として、実質的に純粋なＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分を産生する方法に関するものである。
【００３０】
　しかしながら、本発明をさらに詳細に説明する前に、以下の用語を最初に定義しておく。
【００３１】
１．　定義
　本明細書に使用する場合、以下の用語は以下の意味を有するものである。
【００３２】
　「ＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ」とは、トリコデルマ　ｓｐｐ．由来のエンドグルカナーゼ成分、または約5.5 から約6.0 までの範囲ｐＨ最適値、約7.2 から約8.0 までの範囲の等電点（ｐＩ）、および約23キロダルトンから約28キロダルトンまでの範囲の分子量により特徴付けられる、トリコデルマ　ｓｐｐ．により産生されるＥＧ　ＩＩＩと同等のタンパク質を産生する微生物由来のエンドグルカナーゼ成分を意味する。好ましくは、ＥＧ　ＩＩＩセルラーゼは、トリコデルマ　リーセイかまたはトリコデルマ　ビリデ（Trichoderma viride）由来のものである。トリコデルマ　リーセイ由来のＥＧ　ＩＩＩセルラーゼは、約5.5 から約6.0 までの範囲のｐＨ最適値、約7.4 の等電点（ｐＩ）および約25キロダルトンから約28キロダルトンまでの範囲の分子量を有する。トリコデルマ　ビリデ由来のＥＧ　ＩＩＩセルラーゼは、約5.5 のｐＨ最適値、約7.7 の等電点（ｐＩ）および約23.5キロダルトンの分子量を有する。さらに、ＥＧ　ＩＩＩセルラーゼのアミノ酸配列が変更されていてもよいと考えられる。この酵素の活性部位を変更すると、ｐＨ最適値、最適温度または基質に対する親和性のような様々な特性を変化させてしまうかもしれない。
【００３３】
　ＥＧ　ＩＩＩ成分は、ｐＩが高いために、ｐＩの高いキシラナーゼ、およびトリコデルマ　ｓｐｐ．により発現されるｐＩの高い他の成分が一般的に発見される等電点電気泳動ゲルの領域に発見される。実際、第２図にＥＧ　ＩＩＩとして認識されているバンドはＥＧ　ＩまたはＥＧ　ＩＩのうちいずれかの分解生成物であると、文献に仮定されている。しかしながら、ＥＧ　ＩおよびＥＧ　ＩＩが欠失したセルラーゼ（米国特許出願第07/770,049号および同第07/668,640号の方法により調製された）の等電点電気泳動ゲルは、このバンドはＥＧ　ＩまたはＥＧ　ＩＩのうちのいずれの分解生成物にも起因するものではないことを示した　（第２図）。
【００３４】
　ＥＧ　ＩＩは以前には、ある著者による専門語の「ＥＧ　ＩＩＩ」により示されていたが、現在の専門語では、「ＥＧ　ＩＩ」と称している。いずれにしても、ＥＧ　ＩＩタンパク質は、以下に示す実施例２の表２に証拠付けられるように、分子量、ｐＩ、およびｐＨ最適値について、ＥＧ　ＩＩＩタンパク質とは実質的に異なる。
【００３５】
　「実質的に純粋なＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ」とは、セルラーゼタンパク質の総重量に対して、少なくとも50重量パーセント、より好ましくは少なくとも70重量パーセント、最も好ましくは少なくとも90重量パーセントのＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分を含有するセルラーゼタンパク質の組成物（固体または液体）を意味する。
【００３６】
　「他の全てのセルラーゼタンパク質を実質的に含まない」とは、ＥＧ　ＩＩＩ以外のセルラーゼタンパク質の少なくとも50重量パーセント、より好ましくは60重量パーセント、そして最も好ましくは少なくとも90重量パーセントが、元のセルラーゼ酵素の水性混合物から除去されている組成物を意味する。
【００３７】
　「キシラナーゼが豊富」とは、少なくとも４倍、より好ましくは10倍、本発明の方法によってキシラナーゼの濃度が増大した水溶液または組成物、もしくはポリエチレングリコール相を意味する。
【００３８】
　「セルラーゼタンパク質」とは、野生型菌類源、または野生型菌類源から得られるセルラーゼ遺伝子の全てまたは一部を包含し発現させるように遺伝子的に修飾した微生物由来の、エキソセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）タンパク質、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）タンパク質およびβ−グルコシダーゼ（ＢＧ）タンパク質のいずれかまたは全てを含有するセルラーゼタンパク質を意味する。集団的に、そのようなタンパク質（すなわち、ＣＢＨ、ＥＧおよびＥＧタンパク質）の全てを「セルラーゼタンパク質」と称する。これに反して、セルラーゼタンパク質は、キシラナーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ等を含む、トリコデルマ　ｓｐｐ．により発現される他のタンパク質を含まない。
【００３９】
　「エンドグルカナーゼ（ＥＧ）成分」とは、トリコデルマ　リーセイのＥＧ　Ｉ、ＥＧ　ＩＩおよび／またはＥＧ　ＩＩＩ成分を含む、トリコデルマ　ｓｐｐ．のＥＧ成分を意味する。単体または組合せいずれかのトリコデルマ　ｓｐｐ．のエンドグルカナーゼ成分（例えば、トリコデルマ　リーセイのＥＧ　Ｉ、ＥＧ　ＩＩ、ＥＧ　ＩＩＩ）は、これらの成分を繊維処理媒質に含有させて、綿含有織物をこの媒質中で処理する場合には、その織物について、感触、外観、柔軟性、色、および／またはストーンウォッシュの外観を改良する（処理する前の織物と比較して）。上記した事項に加え、ＥＧ　ＩＩＩは、多くの洗浄剤組成物が使用されるアルカリ性のｐＨで実質的な活性を有する。
【００４０】
　「エキソセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）成分」とは、トリコデルマ　リーセイのＣＢＨ　ＩおよびＣＢＨ　ＩＩ成分を含む、トリコデルマ　ｓｐｐ．のＣＢＨ成分を意味する。トリコデルマ　ｓｐｐ．のＥＧ成分を含まない状態でトリコデルマ　ｓｐｐ．のＣＢＨ成分を使用する場合、このＣＢＨ成分単体では、処理した綿含有織物の、色の保持／復元および感触が著しくは改良されない。さらに、そのようなＥＧ成分と組み合わせてトリコデルマ　リーセイのＣＢＨ　Ｉ成分を用いる場合には、綿含有織物の強度損失を高め、洗浄することの利点を高めることができる。
【００４１】
　「β−グルコシダーゼ（ＢＧ）成分」とは、ＢＧ活性を示すセルラーゼ成分を意味する。すなわち、そのような成分は、セロビオースおよび他の溶性セロオリゴ糖（「セロビオース」）の非還元末端から作用しはじめ、唯一の生成物としてグルコースを生成させる。ＢＧ成分は、セロビオース重合体上には吸着されず、または反応しない。さらに、そのようなＢＧ成分は、グルコースにより競合的に阻害される（Ｋｉはほぼ１ｍＭである）。厳密に言えば、ＢＧ成分はセルロースを分解できないので、本当はセルラーゼではないが、これらの酵素は、ＣＢＨ成分およびＥＧ成分の組合せ作用によって生成される阻害セルロース分解生成物　（特にセロビオース）をさらに分解することによりセルロースの全体的な分解を促進させるので、そのようなＢＧ成分はセルラーゼ系の定義に含まれる。ＢＧ成分が存在しないと、結晶性セルロースの加水分解はわずかしか、またはほとんど行なわれない。ＢＧ成分はしばしば、ｐ−ニトロフェノール　Ｂ−Ｄ−グルコシド（ＰＮＰＧ）のようなアリール基質に特徴付けられる。あるアリール−グルコシダーゼはセロビオースを加水分解しないという点で、全てのアリール−グルコシダーゼがＢＧ成分であるわけではないことに注意すべきである。
【００４２】
２．　方法論
Ａ．　ポリエチレングルコールによるＥＧ　ＩＩＩの回収
　本発明の一部は、特定のポリエチレングリコールを添加することにより、ＥＧ　ＩＩＩを含有するセルラーゼタンパク質の水性混合物から、他のセルラーゼタンパク質を実質的に含まないＥＧ　ＩＩＩセルラーゼが得られるという発見に関するものである。驚くべきことに、これらの条件下において、ＥＧ　ＩＩＩ以外の実質的に全てのセルラーゼタンパク質が水相に残存するが、ＥＧ　ＩＩＩは実質的に純粋な量でポリエチレングリコール相中に回収される。これらの条件下で、多量のキシラナーゼがポリエチレングリコール相中に回収されることも発見された。
【００４３】
　本発明を実施する好ましい方法の１つにおいて、セルラーゼを含有する水性混合物を濾過して、細胞ブイヨン（cell debris ）および他の固体を除去し、セルラーゼタンパク質を含むタンパク質の混合物を含有する濾液を作成した。より好ましくは、シトラーゼ１２３（CYTOLASE123 ）（カリフォルニア州、サウスサンフランシスコのジェネンカー　インターナショナル社から市販されている）のような細胞を含まないセルラーゼタンパク質混合物を使用する。別の方法において、すでにＥＧ　ＩＩＩが多い相溶性水性混合物を含む相溶性供給源、より具体的には、「アルコールを用いた実質的に純粋なＥＧ　ＩＩＩセルラーゼを産生する方法」と題し、ここに全てを引用する代理人番号010055-107の本出願と同時に出願された米国特許出願に記載されたＥＧ　ＩＩＩ溶液から水性混合物を得ることができる。
【００４４】
　濾液を濾過段階にて得た後、その濾液をポリエチレングルコール（ＰＥＧ）と接触させる前に、濾液に無機塩を加えてもよい。ある場合には、無機塩を添加すると、水相からポリエチレングリコール相中へのＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分の分割を高めることができる。
【００４５】
　次いで、有為な量のＥＧ　ＩＩＩをポリエチレングリコール相に運搬するのに十分な期間に亘りポリエチレングリコールと水性混合物を混合する。そのような特定の期間は、添加するポリエチレングリコールの量、添加する塩の量等により変化する。そのような要件は当業者により容易に確かめられる。しかしながら、好ましい実施態様においては、少なくとも約２時間、より好ましくは約４時間、そして最も好ましくは約18時間に亘りポリエチレングリコールを水性混合物と混合する。相が分離するのに十分な期間、好ましくは少なくとも約４時間、より好ましくは８時間、最も好ましくは約18時間に亘り、混合後にポリエチレングリコール水性混合物を放置する。２相混合液が形成される。ＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分はポリエチレングリコール相に存在している。次いでＥＧ　ＩＩＩが多いポリエチレングリコール相を水性相から分離する。回収したＥＧ　ＩＩＩが多い溶液は、これらのタンパク質のうち約50重量パーセントから約90重量パーセントをこえるまでの量がＥＧ　ＩＩＩであるセルラーゼタンパク質の混合物を含有している。
【００４６】
　様々な方法によりポリエチレングリコール相からＥＧ　ＩＩＩ成分を精製することができる。好ましい実施態様において、ＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分を冷たいエタノールにより沈殿させ、所望の水溶液中に再懸濁させる。適切な緩衝液は、ｐＨ５の50ｍＭの酢酸ナトリウム、またはｐＨ５の10ｍＭのクエン酸リン酸のような、ＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分を変性しない従来技術で知られている緩衝液である。
【００４７】
　本発明の本質的な特徴の１つは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用することである。ＰＥＧは固有に活性であり、他のセルラーゼタンパク質を含有する水性混合物からＥＧ　ＩＩＩセルラーゼを回収するのに選択性を有することが分かった。この点に関して、「効果的な量のポリエチレングリコール」とは、有為な量のＥＧ　ＩＩＩ成分を他のセルラーゼタンパク質から分割するのに必要な、水性混合物の添加される量を意味する。添加するポリエチレングリコールの量は、好ましくは0.5 ％（ｗ／ｖ）から10％（ｗ／ｖ）までの範囲にあり、より好ましくは４％（ｗ／ｖ）である。本発明の方法に使用するＰＥＧの平均分子量は、約5,000 から約10,000までの範囲に亘り、好ましくは約7,000 から約9,000 までの範囲に亘り、そして最も好ましくは約8,000 である。
【００４８】
　上述した方法に関して、実質的に約5,000 未満の分子量を有するポリエチレングリコールを使用すると、他のセルラーゼ酵素からの分離が好ましくなくなってしまう。一方約10,000より実質的に大きい分子量を有するポリエチレングリコールを使用すると、ＰＥＧ相から捕獲するＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分の量が減少してしまう。好ましい実施態様において、ポリエチレングリコールの分子量は約8,000 である。
【００４９】
　セルラーゼタンパク質の水性混合物は、ＥＧ　ＩＩＩの百分率と比較して高い百分率の他のセルラーゼタンパク質を含有しているので、そのような水性混合物からＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分を分離するのにポリエチレングリコールが特に有用であることが分かった。シトラーゼ１２３セルラーゼ系中のセルラーゼタンパク質の標準分布を以下に示す：
　　　　　　　ＣＢＨ　Ｉ　　　　　45−55重量パーセント
　　　　　　　ＣＢＨ　ＩＩ　　　　13−15重量パーセント
　　　　　　　ＥＧ　Ｉ　　　　　　11−13重量パーセント
　　　　　　　ＥＧ　ＩＩ　　　　　８−10重量パーセント
　　　　　　　ＥＧ　ＩＩＩ　　　　１−４重量パーセント
　　　　　　　ＢＧ　　　　　　　　0.5−１重量パーセント
本発明の方法により、有用な量のＥＧ　ＩＩＩ成分が得られる。他の方法と比較した本発明のＰＥＧ抽出方法によるＥＧ　ＩＩＩ成分の回収の損失は、ＥＧ　ＩＩＩ成分の回収速度により補償される。この方法には精製のための大規模な分画工程は必要ないが、所望であれば、さらなる精製のためにそのような工程を続いて行なうこともできる。
【００５０】
　「無機塩」とは、ポリエチレングリコールとともに使用する場合に、タンパク質を変性させることなくＥＧ　ＩＩＩの精製を促進させる硫酸イオンまたはリン酸イオンを有する相溶性無機塩を意味する。そのような無機塩の例としては、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等が挙げられる。「効果的な量の無機塩」とは、ポリエチレングリコールを含有する水性混合物に添加するときに、ＥＧ　ＩＩＩ成分をポリエチレングリコール相中に優先的に分離し、水相中にＥＧ　ＩＩＩ以外のセルラーゼタンパク質を保持する量を意味する。
【００５１】
　無機塩の濃度を変更させて、所望の結果を得ることができる。約４％（ｗ／ｖ）から約20％（ｗ／ｖ）の濃縮塩溶液、より好ましくは約10％（ｗ／ｖ）から約14％（ｗ／ｖ）の濃縮塩溶液の存在下で、ＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分がＰＥＧ相中で最良に金属イオン封鎖されることが分かった。塩のレベルが約20％（ｗ／ｖ）より実質的に多い場合には、沈殿を生じてしまい、塩のレベルが約４％（ｗ／ｖ）より実質的に少ない場合には、分離が望ましくなくなるか、または溶液が１つの相のままとなってしまう。
【００５２】
Ｂ．　分画によるＥＧ　ＩＩＩセルラーゼの回収
　本発明の方法を実施する別の好ましい方法において、分画によりシトラーゼ１２３のような、セルラーゼタンパク質を含有する濾過した水性混合物からＥＧ　ＩＩＩを回収する。適切な脱塩樹脂を用いて適切な段階で水性混合物を脱塩し、陽イオン交換樹脂および陰イオン交換樹脂を用いてＥＧ　ＩＩＩを分離することにより、そのような分画を行なうことができる。具体的には、ｐＨ6.8 の10ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液を用いてセファデックスＧ−25ゲル濾過樹脂カラムにより水性混合物を最初に脱塩することによりＥＧ　ＩＩＩを回収した。次いで脱塩した溶液をＱＡトリスアクリルＭ陰イオン交換樹脂カラムに充填する。このカラム上に結合しなかった分画はＥＧ　ＩＩＩを含有している。この分画を、ｐＨ4.5 の10ｍＭのクエン酸ナトリウムで平衡状態にしたセファデックスＧ−25ゲル濾過樹脂カラムを用いて脱塩する。この溶液をＳＰトリスアクリルＭ陽イオン交換樹脂カラムに充填する。200 ｍＭの塩化ナトリウムの水溶液によりＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分を溶離させる。
【００５３】
　本発明の方法を実施する別の好ましい方法において、陽イオン交換カラムから得たＥＧ　ＩＩＩ試料をさらに分画することができる。事前にｐＨ４の10ｍＭのクエン酸ナトリウムにより平衡状態にしたセファデックスＧ−25カラムによりＥＧ　ＩＩＩ試料を脱塩する。モノ−Ｓ−ＨＲ５／５カラム（ニュージャージー州、ピスキャタウェイのファーマシアＬＫＢバイオテクノロジーから得られる）を用いて、その溶液をＦＰＬＣシステムに供した。次いで、0.5 ｍｌ／分の速度で塩化ナトリウム水溶液の０−200 ｍＭの勾配によりそのカラムを溶離させる。ＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分を回収した。ゲル電気泳動によってこのＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分の純度は90％よりも大きいことが分かった。ＥＧ　ＩＩＩのこの純度は、既知の技術によりＮ末端アミノ酸配列を求めるのに適している。
【００５４】
　セファロース樹脂はよく知られた種類の樹脂である。ここに使用している「セファロース」とは、塩を保持するがＥＧ　ＩＩＩを排除するのに十分な排除サイズ（exclusion size）を有する任意のセファロース樹脂を意味する。ここに使用している「陰イオン交換樹脂」とは、ＥＧ　ＩＩＩのｐＨより低いｐＨにおいて、ＥＧ　ＩＩＩ以外のセルラーゼタンパク質の少なくともいくらかと結合するのに十分な電荷密度を供する陽イオン官能基を有する任意の樹脂を意味する。適切な陰イオン樹脂は、アミノエチル（ＡＥ）官能基、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）官能基および第４アミノエチル（ＱＡＥ）官能基を有する。ここに使用している「陽イオン交換樹脂」とは、ＥＧ　ＩＩＩのｐＩより低いｐＨでＥＧ　ＩＩＩと結合するのに十分な電荷密度を供する陰イオン官能基を有する任意の樹脂を意味する。適切な陽イオン樹脂は、スルホプロピル（ＳＰ）官能基、ホスホ（Ｐ）官能基およびカルボキシメチル（ＣＭ）官能基を有する。
【００５５】
　上述したＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分をさらに精製することが望ましい場合もある。例えば、最初のＰＥＧ抽出方法から得た物質を２番目の分画方法に用いることにより、またその逆に２番目の分画方法から得た物質を最初のＰＥＧ抽出方法に用いることにより、上述した方法において単離したＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分をさらに精製することもできる。
【００５６】
　代理人番号010055-107として本出願とともに出願し、ここに全てを引用する、「アルコールを用いた、実質的に純粋なＥＧ　ＩＩＩセルラーゼを産生する方法」と題する米国特許出願に記載されている方法により、ここに回収したＥＧ　ＩＩＩをさらに精製することもできる。
【００５７】
　上述した記載は本発明の方法を実施する好ましい方法に関するものであり、本発明の教示により上述した方法を様々に変更できることが分かるであろう。様々な方法の条件を変更することができ、使用する試薬を変更して、ＥＧ　ＩＩＩ成分を含有する任意の適した酵素の水性混合物からＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分を回収する様々な所望のまたは最適な操作条件を供することができる。
【００５８】
　当業者には理解されるように、本発明の方法の記載において上述した酸、塩基および塩を変更できるか、または本発明の操作を妨害せずに所望のｐＨまたは所望の塩含有量を供するが、ＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分を変性しない等価の酸、塩基または塩と置換できる。
【００５９】
　さらに、本発明の分画方法の前に本発明の抽出方法を行なうこともできるが、その逆でもよい。本発明の分画方法によってさらに精製して実質的に純粋なＥＧ　ＩＩＩセルラーゼを含有する水溶液を供することができる、ＥＧ　ＩＩＩが多いポリエチレングリコールの最初の相を提供するように、水性混合物をポリエチレングリコールにより抽出することができる。
【００６０】
　適切な発酵条件下でＥＧ　ＩＩＩを産生するトリゴテルマ　ｓｐｐ．の菌株を含む任意の供給源からＥＧ　ＩＩＩセルラーゼを精製できる。ＥＧ　ＩＩＩの特定の供給源は重要ではないが、好ましい供給源は、トリコデルマ　リーセイおよびトリコデルマ　ビリデである。トリコデルマ　リーセイからのＥＧ　ＩＩＩの特に好ましい供給源は、ジェネンカー　インターナショナル社（94080 、カリフォルニア州、サウスサンフランシスコ、180 キンボールウェイ）から市販されているシトラーゼ１２３である。トリコデルマ　ｓｐｐ．由来の完全セルラーゼ系　（「全セルラーゼ」）から実質的に純粋なＥＧ　ＩＩＩセルラーゼを得る適切な方法としては、以下に述べる実施例に記載された方法が挙げられる。これらの実施例は、全セルラーゼにＰＥＧ抽出および／または異なる分画物質（カラム）を用いた繰返しの分画工程を行なうことにより、実質的に純粋なＥＧ　ＩＩＩセルラーゼが容易に得られることを示している。
【００６１】
　ＥＧ　ＩＩＩの単離効率を高めるために、ＥＧ　ＩＩＩを過剰発現（overexpress ）するように、および／またはＥＧ　Ｉ成分、ＥＧ　ＩＩ成分、ＣＢＨ　Ｉ成分および／またはＣＢＨ　ＩＩ成分のうちの１つ以上を産生できないように、遺伝子的に修飾した微生物（例えば、トリコデルマ　リーセイ）を用いることが望ましいと思われる。このようにすることにより必ず、例えば、上述したような分画および／またはＰＥＧ抽出によってＥＧ　ＩＩＩをより能率的に単離することができる。トリコデルマ　リーセイのこれらの菌株のうちのいくつかの産生が、1991年 3月13日に出願された米国特許出願第07/668,640号および下記の実施例に開示されている。
【００６２】
　さらに、実質的に純粋なＥＧ　ＩＩＩセルラーゼを産生するように微生物を遺伝子的に修飾することにより、実質的に純粋なＥＧ　ＩＩＩセルラーゼを調製できると考えられる。例えば、下記の実施例に述べる分画方法により調製した実質的に純粋なＥＧ　ＩＩＩを使用して、既知の塩基配列決定法を用いてタンパク質の一部のアミノ酸配列を決定した（実施例４）。ＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分をコード化する遺伝子をクローニングするために、この情報を用いて合成ＤＮＡプローブを調製することができる。一度ＥＧ　ＩＩＩ遺伝子をクローニングしたら、既知の技術によりＥＧ　ＩＩＩ遺伝子を操作し、最終的には様々なトリコデルマ　ｓｐｐ．菌株中かまたは他の微生物中に挿入できる。例えば、1990年10月 5日に出願された米国特許出願第07/593,919号の一部継続出願である、1991年10月 4日に出願された米国特許出願第07/770,049号、および1991年 3月13日に出願された米国特許出願第07/668,640号を参照のこと。それらの特許出願には、修飾した微生物が１つ以上のセルラーゼ遺伝子を発現できず、実際に別のセルラーゼ遺伝子を過剰産生し得るように、トリコデルマ　リーセイを遺伝子操作する方法が開示されている。1991年10月 4日に出願された米国特許出願第07/770,049号、1990年10月 5日に出願された米国特許出願第07/593,919号、および1991年 3月13日に出願された米国特許出願第07/668,640号の開示の全てを引用する。
【００６３】
　これらの特許出願に記載された方法を用いて、他のセルラーゼタンパク質とともに、またはそれを除いてＥＧ　ＩＩＩを産生するようにトリコデルマ　リーセイを遺伝子操作することができる。さらに、これらの出願に記載された方法では、どのような異種タンパク質をも産生しないトリコデルマ　リーセイ菌株を調製している。
【００６４】
　さらに、他の微生物中にＥＧ　ＩＩＩコード化遺伝子を発現することが可能である。そのような微生物の例としては、以下に限定されるものではないが、サッカロミセス　セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピチア　パストリス（Pichia pastoris ）、ハンセニューラ　ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、クルイベロミセス　ラクチス（Kluyveromyces lactis）、ヤロウィア　リポリチカ（Yarrowia lipolytica ）、シャンニオミセス　オクシデンタリス（Schanniomyces occidentalis）等のような酵母種が挙げられる。例えば、ＰＣＴ特許出願第wo 85/04672 号を参照のこと。非トリコデルマ宿主であるこれらの代替物において発現を行なうためには、ＥＧ　ＩＩＩコード化ＤＮＡ配列をその特定の宿主からの遺伝子より得られたプロモーター配列およびターミネーター配列に機能的に結合させる必要があることもある。また、ＥＧ　ＩＩＩ分泌信号配列をコード化するＤＮＡ配列の代わりに、代替宿主からの分泌信号配列をコード化するＤＮＡ配列を用いる必要があると思われる。他の生物内でＥＧ　ＩＩＩを産生および分泌することにより、実質的に純粋な形態でＥＧ　ＩＩＩを得ることができる。　上述した実質的に純粋なＥＧ　ＩＩＩセルラーゼをさらに、液体希釈物、顆粒、エマルジョン、ゲル、ペースト等に加工することもできる。そのような形態は当業者によく知られている。固体の洗浄剤組成物が望ましい場合、セルラーゼ組成物を好ましくは顆粒として調合する。好ましくは、セルラーゼ保護剤を含有するように顆粒を調合することができる。例えば、代理人番号第010055-073号として1991年 1月17日に出願された、「酵素および酵素保護剤の両方を含有する顆粒並びにそのような顆粒を含有する洗浄剤組成物」と題する米国特許出願第07/642,669号を参照のこと。この出願の全てを引用する。同様に、顆粒の洗浄媒質中への溶解速度を遅くする物質を含有するようにその顆粒を調合することもできる。そのような物質と顆粒が、代理人番号第GCS-171-US1 番として1991年 1月17日に出願された、「顆粒組成物」と題する米国特許出願第07/642,596号に開示されており、その出願の全てをここに引用する。次いでＥＧ　ＩＩＩを含有する顆粒または他の洗浄剤配合物を織物の洗浄に用いて、柔軟特性を織物等に与えることができる。
【００６５】
　以下の実施例は本発明を説明することを意図したものであり、本発明の範囲を制限するものとして考えるべきではない。
【実施例１】
【００６６】
　　　　　　　　ＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ酵素の大規模な抽出
　Ａ．　細胞を含まないセルラーゼの濾液100 リットルを約30℃に加熱した。加熱した物質を、約４％（ｗ／ｖ）カーボワックス（登録商標）ＰＥＧ８０００　（ポリエチレングリコール、約8000の平均分子量）（コネチカット州、ダンバリー、ユニオンカーバイド）および約10％（ｗ／ｖ）無水硫酸ナトリウムとして調製した。混合物を２相の液体混合物を形成した。ＳＡ−１ディスク　スタック遠心分離機を用いて相を分離した。銀染色（silver staining ）等電点電気泳動ゲルを用いて相を分析した。ＥＧ　ＩＩＩおよびキシラナーゼについて分画と集積を行なった。回収した組成物は約20重量パーセントから約50重量パーセントまでの範囲のＥＧ　ＩＩＩを含有していた。ポリエチレングリコール相中に回収されたキシラナーゼの量は、少なくとも４倍キシラナーゼが豊富であった。
【００６７】
　Ｂ．　細胞を含まないセルラーゼ濾液100 リットルを、円錐形の底および底の中心に排出口を有する130 リットルの容器に加えた。出発物質は、ＥＧ　ＩＩＩ以外のセルラーゼが欠失したおよび／またはＥＧ　ＩＩＩが過剰発現された菌株からのセルラーゼまたは全セルラーゼであってもよい。限外濾過は必要条件ではないけれども、タンパク質の濃度を約10ｇ／ｌから約50ｇ／ｌまでの範囲に保持すべきである。
【００６８】
　次に、平均分子量8000のポリエチレングリコール４ｋｇと硫酸アンモニウム10ｋｇをセルラーゼ濾液に加えた。混合物を18時間に亘りオーバーヘッドミキサー中で混合した。混合後、18時間におよび相を分離させた。相を分離したままにするように底の排出口から底の相を除去した。ＰＥＧ相を採集し、30分間に亘り5,000 ｘｇで遠心分離して不溶性物質を除去した。ＥＧ　ＩＩＩ活性はポリエチレングリコール溶液中において安定である。
【００６９】
　ポリエチレングリコールからのタンパク質の除去は、ポリエチレングリコールはエタノールに溶性であり、タンパク質は溶性ではないという事実を利用するものである。この段階において、ある塩も除去し、タンパク質を濃縮させている。ＰＥＧ相のアリコート200 ｍｌおよび冷たい（−20℃）エタノール800 ｍｌを１リットルの遠心分離ボトル中でよく混合し、−20℃で約18時間に亘り放置した。混合物を30分間に亘り5,000 ｘｇで遠心分離し、溶液にデカンテーションを行ない、沈殿物を脱イオン水で濯いだ。
【００７０】
　沈殿したタンパク質を溶解させる緩衝液の選択は、それに続くクロマトグラフィー工程か、または最終工程の場合にはＥＧ　ＩＩＩが多い溶液を調製する工程に依存する。一般的に、緩衝液は、陽イオン交換クロマトグラフィーの調製において、ｐＨ５の50ｍＭ酢酸塩、またはｐＨ４の10ｍＭクエン酸リン酸のいずれかである。
【００７１】
　ＰＥＧ抽出物の回収は、ＲＢＢ−ＣＭＣ活性に基づいて測定でき、合計容量を以下に示す。ＲＢＢ−ＣＭＣ活性を測定する方法を実施例３に記載する。
【表１】
2004041205.tif 000002
【００７２】
活性の回収はＰＥＧ相中への15パーセントから30パーセントまでの範囲におよぶ。この工程は、出発物質がＥＧ　ＩおよびＩＩの欠失したセルラーゼである場合、合計のエンドグルカナーゼ活性の百分率としての最高損失を示している。各々のクロマトグラフィーの工程による損失は、各々の工程について比較により約20％以下、小さくなる傾向にある。
【００７３】
クロマトグラフィー
　10ｍＭ、ｐＨ５のクエン酸／リン酸緩衝液に対してオメガシリーズ接線流動8,000 限外濾過膜（omega series tangential flow 8,000 ultra filtration membrane）（マサチューセッツ州、ノースボロー、フィルトン　テクノロジー社）を用いて、実施例Ｉから得たＥＧ　ＩＩＩが多い溶液であるパート（ｂ）を完全に濾過した（diafiltered ）。溶液を、平衡状態にある（ｐＨ５、10ｍＭ　クエン酸／リン酸）ＳＰトリスアクリルカラムに装填し、通過した溶液（flow-through）を集積し、0.5 Ｍのクエン酸によりｐＨを４に調節した。通過した溶液を平衡状態にある（ｐＨ４、10ｍＭ　クエン酸／リン酸）ＳＰトリスアクリルカナムに装填した。ＥＧ　ＩＩＩ成分を250 ｍＭの塩化ナトリウムにより溶離させた。
【実施例２】
【００７４】
　　　　　　　　　　　分画によるＥＧ　ＩＩＩの精製
　野生型トリコデルマ　リーセイにより産生される完全菌類セルラーゼ組成物　（シトラーゼ１２３、カリフォルニア州、サウスサンフランシスコ、ジェネンカー　インターナショナル社から得られる）を分画することにより、ＥＧ　ＩＩＩの精製を行なう。具体的には、以下の樹脂：シグマケミカル社（ミズーリ州、セントルイス）から得られるセファデックスＧ−２５濾過樹脂、ＩＢＦバイオテクニクス社（メリーランド州、サベージ）から得られるＱＡトリスアクリル陰イオン交換樹脂およびＳＰトリスアクリル陽イオン交換樹脂を含有するカラムを用いて分画を行なう。10ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液によりｐＨ6.8 に緩衝された３リットルのセファデックスＧ−２５ゲル濾過樹脂のカラムを用いて0.5 ｇのシトラーゼ１２３セルラーゼを脱塩させる。次いで脱塩した溶液を、10ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液によりｐＨ6.8 に緩衝された20ｍｌのＱＡトリスアクリルＭ陰イオン交換樹脂のカラムに装填する。このカラムに結合した分画はＣＢＨ　ＩおよびＥＧ　Ｉを含有していた。このカラムに結合しなかった分画はＣＢＨ　ＩＩ、ＥＧ　ＩＩおよびＥＧ　ＩＩＩを含有している。10ｍＭ　クエン酸ナトリウムによりｐＨ4.5 に緩衝したセファデックスＧ−２５ゲル濾過樹脂のカラムを用いて、これらの分画を脱塩する。この溶液200 ｍｌを、20ｍｌのＳＰトリスアクリルＭ陽イオン交換樹脂のカラムに装填する。200 ｍＭ　塩化ナトリウムの水溶液100 ｍｌによりＥＧ　ＩＩＩを溶離させた。
【００７５】
　ＥＧ　ＩＩＩをさらに精製する方法の１つは、この実施例２により得られたＥＧ　ＩＩＩ試料をさらに分画することにより行なわれる。Ｍｏｎｏ−Ｓ−ＨＲ　５／５カラム（ニュージャージー州、ピスキャタウェイ、ファーマシア　ＬＫＢバイオテクノロジー社から得られる）を用いてＦＰＬＣシステムにより分画を行なった。ＦＰＬＣシステムは、液体クロマトグラフィーコントローラ、２つのポンプ、二重通路モニター、分画コントローラおよびチャートレコーダ（全てニュージャージー州、ピスキャタウェイ、ファーマシア　ＬＫＢバイオテクノロジー社から得られる）からなる。事前に10ｍＭ　クエン酸ナトリウムによりｐＨ４に緩衝しておいた20ｍｌのセファデックスＧ−２５カラムを用いてこの実施例２で調製した５ｍｌのＥＧ　ＩＩＩ試料を脱塩することにより分画を行なった。事前に10ｍＭ　クエン酸ナトリウムでｐＨ4.0 に緩衝しておいたＭｏｎｏ−Ｓ−ＨＲ　５／５カラムにその溶液を装填し、0.5 ｍｌ／分の速度で０−200 ｍＭのＮａＣｌの水溶液勾配により溶離させ、１ｍｌの分画に試料を集積した。分画１０および１１においてＥＧ　ＩＩＩを回収した。ゲル電気泳動によりこのＥＧ　ＩＩＩは90％より大きく純粋であることが測定された。この純度のＥＧ　ＩＩＩは既知の技術によるＮ末端アミノ酸配列を決定するのに適している。
【００７６】
　実質的に純粋なＥＧ　ＩＩＩは、トリコデルマ　リーセイから単離した他のエンドグルカナーゼと匹敵する以下の特性を有している。
【表２】
2004041205.tif 000003
【００７７】
　上記表から分かるように、トリコデルマ　リーセイの他のエンドグルカナーゼ成分と比較して、ＥＧ　ＩＩＩは大きいｐＨ最適値および大きいｐＩの両方を有する。下記の実施例３において、ＥＧ　ＩＩＩはアルカリｐＨの条件下で相当なＲＢＢ−ＣＭＣ活性を保持することが分かる。
【００７８】
　同様に、他の菌株を含む他の供給源から得たＥＧ　ＩＩＩセルラーゼも上記方法により精製することができる。トリコデルマ　ビリデ由来のＥＧ　ＩＩＩセルラーゼが、Voragen 等のMethods in Enzymology 、160:243-249 に記載されている。この参考文献は、約23.5キロダルトンの分子量、5.5 のｐＨ最適値、および7.7 のｐＩを有するＥＧ　ＩＩＩセルラーゼを記載している。
【００７９】
　ＥＧ　ＩＩＩの単離効率を高めるために、ＥＧ　ＩＩＩを過剰発現するようにおよび／または１つ以上のＥＧ　Ｉ成分、ＥＧ　ＩＩ成分、ＣＢＨ　Ｉ成分および／またはＣＢＨ　ＩＩ成分を産生できないように、遺伝子的に修飾したトリコデルマ　リーセイを用いることが望ましいと思われる。
【００８０】
同様に、上述したＥＧ　ＩＩＩ組成物をさらに精製することが望ましいと思われる。例えば、実施例１において単離したＥＧ　ＩＩＩタンパク質を、上述した方法によりさらに精製することもでき、またはその逆を行なうこともできる。
【実施例３】
【００８１】
　　　　　　　　あるｐＨ範囲に亘るセルラーゼ組成物の活性
　以下の方法を用いて、２つの異なるセルラーゼ組成物のｐＨプロファイルを求めた。最初のセルラーゼ組成物は、ＣＢＨ　Ｉ成分およびＣＢＨ　ＩＩ成分を産生できないように、以下に記載する方法と同様な方法で遺伝子的に修飾したトリコデルマ　リーセイから調製したＣＢＨ　ＩおよびＩＩの欠失したセルラーゼ組成物であった。約58パーセントから約70パーセントまでの範囲のトリコデルマ　リーセイ由来のセルラーゼ組成物から一般的になるこのセルラーゼ組成物は、ＣＢＨ　ＩおよびＣＢＨ　ＩＩを含有しないかぎり、このセルラーゼ組成物は必然的にＥＧ成分を多く含んでいる。ＥＧ　ＩＩＩはトリコデルマ　リーセイのエンドグルカナーゼ成分の最も少ない成分であるので、この組成物においてはＥＧ　Ｉ成分およびＥＧ　ＩＩ成分が優位を占めている。
【００８２】
　第２のセルラーゼ組成物は、実施例２と同様な精製方法によりトリコデルマ　リーセイ由来のセルラーゼ組成物から単離したＥＧ　ＩＩＩの約20−40％の純粋な分画であった。
【００８３】
　これらのセルラーゼ組成物の活性を40℃で測定した。この測定は以下の方法を用いて行なったものである。
【００８４】
　必須の量の酵素を提供するのに十分な濃度の、５μｌから20μｌまでの範囲の適切な酵素溶液を最終溶液に加える。ｐＨ４、５、５.５、６、６.５、７、７.５および８で0.05Ｍ　クエン酸／リン酸緩衝液中に、２重量パーセントの250 μｌのＲＢＢ−ＣＭＣ（レマゾル　ブリリアント　ブルー　Ｒ−カルボキシメチルセルロース；オーストラリア国、２１５１、Ｎ．Ｓ．Ｗ．、ノースロック、６アルトナプレース、メガザイムから市販されている）を加える。
【００８５】
　ボルテックス混合（vortex）し、30分間に亘り40℃で定温放置する。氷浴中で５分間から10分間までの期間に亘り冷却する。0.3 Ｍの酢酸ナトリウムおよび0.02Ｍの酢酸亜鉛を含有する1000μｌのメチルセロソルブを加える。ボルテックス混合し、５分間から10分間までの期間に亘り放置する。遠心分離し、キュベット中に上澄を注ぎ入れる。
【００８６】
　各々のキュベット中において溶液の光学密度（ＯＤ）を590 ｎｍで測定することにより、相対酵素活性を求めた。光学濃度が高いほど、酵素活性が高い。
【００８７】
　この分析の結果を第１図に示す。この図面は、ＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ組成物と比較したＣＢＨ　ＩおよびＩＩが欠失したセルラーゼ組成物の相対活性を示すものである。この図面より、ＣＢＨ　ＩおよびＣＢＨ　ＩＩの欠失したセルラーゼ組成物は、ｐＨ５.５付近でＲＢＢ−ＣＭＣに対して最適セルロース分解活性を有し、アルカリ性のｐＨ、すなわち、７を越えて８までのｐＨにおいてある程度活性を有することが分かる。一方で、ＥＧ　ＩＩＩの多いセルラーゼ組成物はほぼｐＨ５.５−６において最適セルロース分解活性を有し、アルカリ性のｐＨでも相当な活性を有している。
【実施例４】
【００８８】
　　　　　　　　　　　　　　等電点電気泳動ゲル
　この実施例の目的は、異なるＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ組成物の等電点電気泳動ゲルを説明することにある。具体的には、野生型トリコデルマ　リーセイにより産生されたセルラーゼ；ＥＧ　ＩおよびＥＧ　ＩＩのセルラーゼタンパク質を発現できないように実施例１６および１７の方法により形質転換したトリコデルマ　リーセイ菌株由来のセルラーゼ；および実施例１の方法と同様な方法により産生した実質的に純粋なＥＧ　ＩＩＩセルラーゼを等電点電気泳動ゲルを用いて分析した。
【００８９】
　製造者の説明にしたがって、ファーマシアＩＥＦシステム（ニュージャージー州、ピスキャタウェイ、ファーマシア社、ＦＢＥ−３０００）およびｐＨ３−１０プレキャストゲル（ドイツ、カールベルグ、サーバから得られるサーバリト　プレコテ）を用いて、これらのセルラーゼ試料を等電点電気泳動により分析した。ゲルをエフォルテック（登録商標）染料（11590 ニューヨーク州、ウエストバリー、サーバ　ファイン　バイオケミカルス社から得られるサーバブルーＷ）により染色し、タンパク質のバンドを視覚化した。得られたゲルを第２図に示す。第２図のレーン１は、野生型トリコデルマ　リーセイ菌株由来のセルラーゼの等電点電気泳動ゲルを示している。レーン２は、ＥＧ　ＩおよびＩＩを発現できないように遺伝子的に修飾したトリコデルマ　リーセイ菌株由来のセルラーゼの等電点電気泳動ゲルを示している。レーン３は、実質的に純粋なＥＧ　ＩＩＩセルラーゼの等電点電気泳動ゲルを示している。この図面において、レーン１に隣接する縁に、タンパク質を同定するようにセルラーゼタンパク質に対応するバンドを記載している。
【００９０】
　この図面から、ＥＧ　ＩＩＩのｐＩが大きいので、このタンパク質は、ｐＩの大きいキシラナーゼ、ｐＩの大きいβ−グルコシダーゼのような他のｐＩの大きい成分と通常関連する領域に見られるのが分かる。さらに、この図面のレーン２には、ＥＧ　ＩおよびＩＩのタンパク質は存在しないがＥＧ　ＩＩＩタンパク質は存在するので、ＥＧ　ＩＩＩはＥＧ　ＩまたはＥＧ　ＩＩのタンパク質のいずれの分解生成物ではないことがこの図面から分かる。
【実施例５】
【００９１】
　　　　　　　　　　　ＥＧ　ＩＩＩのペプチド配列決定
　0.9 ｍｌのアセトンを0.1 ｍｌのタンパク質溶液（１ｍｇ／ｍｌの濃度で）に加えることによりＥＧ　ＩＩＩ成分を沈殿させ、−20℃で10分間に亘り定温放置した。遠心分離によりタンパク質を集積し、集積物を乾燥させてペレット化し、88％のぎ酸中に溶解させた８Ｍ　尿素溶液0.01ｍｌおよび88％のぎ酸中に溶解させた臭化シアン（200 ｍｇ／ｍｌ）溶液0.01ｍｌ中に再懸濁させた。混合物を４時間に亘り室温で定温放置した。
【００９２】
　個々のペプチドをＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）カラムを用いて精製した。シンクロパックＲＰ−４カラムを、脱イオンしたミリＱ水（milliQ）中で0.05％のＴＥＡ（トリエチルアミノ）および0.05％のＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）により平衡状態させた。試料をＨＰＬＣカラムに装填し、100 ％のアセトニトリルおよび0.05％のＴＥＡ並びに0.05％のＴＦＡにより、１分当たり１％の勾配で溶離を行なった。単離したペプチドのアミノ末端領域を、全自動装置を用いたエドマンの方法により配列分析した。ＥＧ　ＩＩＩ成分の２つの断片から得られたアミノ酸配列を第３図に示す。
【実施例６】
【００９３】
　　　　　　　トリコデルマ　リーセイのｐｙｒ４−誘導体の選択
　ｐｙｒ４遺伝子は、ウリジンの生合成に必要な酵素であるオロチジン−５′−モノホスフェートデカルボキシラーゼをコード化する。毒性阻害因子５−フルオロオロチン酸（ＦＯＡ）を野生型細胞によりウリジン中に取り込み、細胞を被毒させる。しかしながら、ｐｙｒ４遺伝子が欠けた細胞は、この阻害因子に対して抵抗性を有するが、成長のめたにウリジンを必要としている。したがって、ＦＯＡを用いてｐｙｒ４誘導体菌株を選択することが可能である。実際、トリコデルマ　リーセイ菌株ＲＬ−３７の芽胞（Sheir-Neiss,G.およびMontenecourt,B.S. 、Appl. Microbiol. Biotechnol. 20 、46-53 頁（1984））を、２ｍｇ／ｍｌのウリジンおよび1.2 ｍｇ／ｍｌのＦＯＡを含有する凝固培地の表面に広げた。任意のＦＯＡ抵抗性コロニーが３日から４日以内に現れ、成長のためにウリジンを必要としたそれらのＦＯＡ抵抗性誘導体を続いて同定することが可能であった。欠損ｐｙｒ４遺伝子を有するそれらの誘導体を同定するために、プロトプラストを産生し、野生型ｐｙｒ４遺伝子を含有するプラスミドにより形質転換した（実施例８および９を参照のこと）。形質転換後、ウリジンを欠いた培地上にプロトプラストを平板固定（plate ）した。形質転換したコロニーの成長は、プラスミドボーン（plasmid-borne ）ｐｙｒ４遺伝子により欠損ｐｒｙ４遺伝子の相補性を示した。このようにして、菌株ＧＣ６９を菌株ＲＬ−Ｐ３７のｐｙｒ４−誘導体として同定した。
【実施例７】
【００９４】
　　　　　　　　　　　ＣＢＨ　Ｉ欠失ベクターの調製
　ＣＢＨ　Ｉタンパク質をコード化するｃｂｈ１遺伝子を、既知のプローブ合成方法（Shoemaker 等、1983b ）を用いてこの遺伝子の公表されている配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーションにより、トリコデルマ　リーセイ菌株ＲＬ−Ｐ３７のゲノムＤＮＡからクローニングした。ｃｂｈ１遺伝子は6.5 ｋｂのＰｓｔＩ断片上にあり、ＰｓｔＩにより切断したｐＵＣ４Ｋ　（ニュージャージー州、ピスキャタウェイ、ファーマシア社から購入した）中に挿入し、従来技術で知られている技術を用いてこのベクターのＫａｎΓ　を置換した。この技術は、Maniatis等（1989）に述べられており、ここに引用する。得られたプラスミドｐＵＣ４Ｋ：：ｃｂｈ１をＨｉｎｄＩＩＩにより切断し、約６ｋｂの大きな断片を単離し、再度連結してｐＵＣ４Ｋ：：ｃｂｈ１ΔＨ／Ｈを得た（第４図を参照のこと）。この方法により、全縁ｃｂｈ１コード配列および上流の約1.2 ｋｂのフランキング配列（flanking sequence ）ならびに下流の約1.5 ｋｂのフランキング配列を除去した。元のＰｓｔＩ断片のいずれかの末端からほぼ１ｋｂのフランキングＤＮＡが残っている。
【００９５】
　Maniatis等（前出）の方法にしたがって、ｐＵＣ１８中のゲノムＤＮＡの6.5 ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてトリコデルマ　リーセイｐｙｒ４遺伝子をクローニングしてｐＴｐｙｒ２（Smith 等、1991）を形成した。プラスミドｐＵＣ４Ｋ：：ｃｂｈＩΔＨ／ＨをＨｉｎｄＩＩＩにより切断し、末端をウシ腸アルカリ性ホスファターゼにより脱リンした。この末端脱リンＤＮＡを、トリコデルマ　リーセイｐｙｒ４遺伝子を含有する6.5 ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片と連結し、ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４を得た。第４図はこのプラスミドの構築を示している。
【実施例８】
【００９６】
　　　　　　　　　　　　　プロトプラストの単離
　約５×10７　のトリコデルマ　リーセイＧＣ６９芽胞（ｐｙｒ４−誘導体菌株）を有する500 ｍｌのフラスコ中の100 ｍｌのＹＥＧ（0.5 ％の酵母抽出物、２％のグルコース）を接種することにより、菌糸を得た。約16時間に亘り振とうさせながらフラスコを37℃で定温放置した。2,750 ｘｇでの遠心分離により菌糸を収穫した。収穫した菌糸をさらに1.2 Ｍのソルビトール溶液中で洗浄し、５ｍｇ／ｍｌのノボザイム（登録商標）２３４溶液（コネチカット州、ダンバリー、ノボ　バイオラボ社から得られる、１，３−アルファ−グルカナーゼ、１，３−ベータ−グルカナーゼ、ラミナリナーゼ、キシラナーゼ、キチナーゼおよびプロテアーゼを含有する多成分酵素系の商標名である）；５ｍｇ／ｍｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２　Ｏ；0.5 ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン；1.2 Ｍのソルビトールを含有する40ｍｌの溶液中に再懸濁させた。ミラクロス（カリフォルニア州、ラジョラ、カルバイオケム社）を通過させる濾過により、細胞ブイヨン（cellular debris ）からプロトプラストを除去し、2,000 ｘｇでの遠心分離により採集した。プロトプラストを1.2 Ｍのソルビトール中で３回洗浄し、さらにもう一度1.2 Ｍのソルビトール、50ｍＭのＣａＣｌ２　中で洗浄し、遠心分離し、1.2 Ｍのソルビトール、50ｍＭのＣａＣｌ２　の１ｍｌ当たり約２×10８のプロトプラストの密度で再懸濁させた。
【実施例９】
【００９７】
　　　　　菌類プロトプラストのｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４による形質転換
　実施例８において調製した200 μｌのプロトプラスト懸濁液を、ＴＥ緩衝液　（10ｍＭのトリス、ｐＨ７.４；１ｍＭのＥＤＴＡ）中のＥｃｏＲＩ切断ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４（実施例７で調製した）20μｌおよび25％のＰＥＧ４０００と、0.6 ＭのＫＣｌと、50ｍＭのＣａＣｌ２　とを含有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液50μｌに加えた。この混合物を20分間に亘り氷上で定温放置した。この定温放置の後、2.0 ｍｌの上述したＰＥＧ溶液をそこに加え、得られた溶液をさらに混合し、５分間に亘り室温で定温放置した。この第２の定温放置後、1.2 Ｍのソルビトールおよび50ｍＭのＣａＣｌ２　を含有する溶液4.0 ｍｌをその溶液に加え、これにより得られた溶液をさらに混合した。そのプロトプラスト溶液を、１％のグルコース、1.2 Ｍのソルビトールおよび１％のアガロースを含有するボゲルの培地Ｎの溶融アリコート（１リットル当たり、３ｇのクエン酸ナトリウム、５ｇのＫＨ２ＰＯ４　、２ｇのＮＨ４ＮＯ３、0.2 ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、0.1 ｇのＣａＣｌ２・７Ｈ２Ｏ、５μｇのα−ビオチン、５ｍｇのクエン酸、５ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｍｇのＦｅ(ＮＨ４)２・６Ｈ２Ｏ、0.25ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、50μｇのＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ）にただちに加えた。プロトプラストと培地の混合物を、上述したボゲルの培地を含有する固体培地上に注いだ。ウリジンは培地中には存在せず、したがって、ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４中の野生型ｐｙｒ４遺伝子挿入物による菌株ＧＣ６９のｐｙｒ４突然変異の補完の結果として形質転換コロニーのみが成長できた。これらのコロニーを続いて形質転換し、添加剤として１％のグルコースを含有する固体のボゲルの培地Ｎ上で精製し、安定な形質転換体をさらなる分析のために選択した。
【００９８】
　この段階では、より速い成長速度およびウリジンを欠如した固体培養物上のでこぼこの外形よりもむしろ滑らかな円形コロニーの形成により不安定な形質転換体とは区別される。ある場合には、固体の非選択性培地（すなわち、ウリジンを含有している）上で形質転換体を成長させ、続いて発芽してウリジンの欠如した選択的な培地上に成長するこれらの芽胞の百分率を求めた。
【実施例１０】
【００９９】
　　　　　　　　　　　　　　形質転換体の分析
　実施例９で得られた形質転換体を、１％のグルコースを含有するボゲルの培地Ｎの液体中で成長させた後、ＤＮＡをその形質転換体から単離した。これら形質転換体のＤＮＡ試料をさらにＰｓｔＩ制限酵素により切断し、これにアガロースゲルの電気泳動を行なった。そのゲルをニトラン膜フィルター上にブロットし、３２Ｐ標識ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４プローブを用いてハイブリダイズさせた。プローブを選択して、6.5 ｋｂのＰｓｔＩ断片としての天然ｃｂｈ１遺伝子、天然ｐｙｒ４遺伝子および形質転換ＤＮＡ断片由来の任意のＤＮＡ配列を同定した。
【０１００】
　ハイブリダイゼーションからの放射性バンドをオートラジオグラフィーにより視覚化した。オートラジオグラフを第６図に示す。５つの試料（すなわち、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）について上述したように実験した。レーンＥは非形質転換菌株ＧＣ６９であり、この分析においては対照として用いた。レーンＡ−Ｄは、上述した方法により得られた形質転換体を示すものである。オートラジオグラフの左側の数字は、分子量マーカーの大きさを示すものである。このオートラジオグラフから分かるように、レーンＤは6.5 ｋｂのＣＢＨＩバンドを有しておらず、ｃｂｈ１遺伝子でのＤＮＡ断片の組込みによりこの遺伝子が形質転換体中で全体的に欠失されたことを示している。ｃｂｈ１欠失菌株をＰ３７ＰΔＣＢＨＩと称する。第５図は、トリコデルマ　リーセイ染色体のうちの１つのｃｂｈ１座でｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４からの大きなＥｃｏＲＩ断片を二重に交差させて組み込んだことによるトリコデルマ　リーセイｃｂｈ１遺伝子の欠失について概略を説明したものである。分析した他の形質転換体は、非形質転換対照菌株と同一であるように思われる。
【実施例１１】
【０１０１】
　　　　　　　　　ｐＩｎｔＣＢＨＩによる形質転換体の分析
　使用したプローブを３２Ｐ標識ｐＩｎｔＣＢＨＩプローブに変えたことを除いては、実施例１０と同様に方法をこの実施例に用いた。このプローブは、ｐＵＣ４Ｋ：：ｃｂｈ１ΔＨ／Ｈが欠失した領域内のｃｂｈ１座からの２ｋｂのＢｇｌＩＩ断片を含有するｐＵＣ型のプラスミドである。非形質転換菌株ＧＣ６９である対照の試料Ａおよび形質転換体Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩの試料Ｂの２つの試料をこの実施例で分析した。第７図から分かるように、6.5 ｋｂでのバンドにより示したとおり、試料Ａはｃｂｈ１遺伝子を有した。しかしながら、形質転換体である試料Ｂはこの6.5 ｋｂのバンドを有しておらず、したがって、ｃｂｈ１遺伝子を有しておらず、ｐＵＣプラスミド由来の配列をなにも有していない。
【実施例１２】
【０１０２】
　　　　　　　　菌株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩによるタンパク質分泌
　１％のグルコース、0.14％の(ＮＨ４)２ＳＯ４　、0.2 ％のＫＨ２ＰＯ４、0.03％のＭｇＳＯ４、0.03％の尿素、0.75％のバクトトリプトン（bactotryptone ）、0.05％のＴｗｅｅｎ８０、0.000016％のＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、0.001 ％のＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、0.000128％のＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、0.0000054 ％のＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、0.0000007 ％のＭｎＣｌ・４Ｈ２Ｏを含有するトリコデルマ基本培地50ｍｌ中に産生したＰ３７ＰΔＣＢＨＩ菌株からの芽胞を接種した。約48時間に亘り250 ｍｌのフラスコ中で振とうさせながら培地を37℃で定温放置した。ミラクロス（カルバイオケム社）を通過させる濾過により、得られた菌糸を採集し、17ｍＭのリン酸カリウムにより２、３回洗浄した。菌糸を最終的に１ｍＭのソホロース（sophorose ）を含む17ｍＭのリン酸カリウムの溶液中に懸濁させ、さらに振とうさせながら30℃で24時間に亘り定温放置した。これらの培養液から上澄を採集し、菌糸を捨てた。製造者の説明にしたがって、ファーマシア　ファストゲル　システムおよびｐＨ３−９プレキャスト　ゲルを用いた等電点電気泳動により培養液の上澄の試料を分析した。ゲルを銀染料で染色し、タンパク質のバンドを視覚化した。第８図に示すように、ｃｂｈ１タンパク質に対応するバンドは、菌株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩ由来の試料には存在しなかった。この等電点電気泳動ゲルは、トリコデルマ　リーセイの異なる上澄培養液中に様々なタンパク質が存在することを示している。レーンＡは部分的に精製したＣＢＨＩである。レーンＢは非形質転換トリコデルマ　リーセイの培養液からの上澄である。レーンＣは、本発明の方法により産生した菌株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩからの上澄である。様々なセルラーゼ成分の位置を、ＣＢＨＩ、ＣＢＨＩＩ、ＥＧＩ、ＥＧＩＩ、およびＥＧＩＩＩと印付けた。ＣＢＨＩは全体の細胞外タンパク質の50％を構成するので、ＣＢＨＩは主要な分泌タンパク質であり、ゲル上で最も暗いバンドである。この等電点電気泳動ゲルは、Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩ菌株においてはＣＢＨＩタンパク質が除去されているのを示している。
【実施例１３】
【０１０３】
　　　　　　　　　　　　　ｐＰΔＣＢＨＩＩの調製
　ＣＢＨＩＩタンパク質をコード化するトリコデルマ　リーセイのｃｂｈ２遺伝子を、第９Ａ図に示すゲノムＤＮＡの4.1 ｋｂのＥｃｏＲＩ断片としてクローニングした（Chen等、1987、Biotechnology 、5:274-278 ）。この4.1 ｋｂの断片をｐＵＣ４ＸＬのＥｃｏＲＩ部位の間に挿入した。後者のプラスミドはｐＵＣ誘導体である（ジェネンカー　インターナショナル社のR. M. Berka により構築された）。このｐＵＣ誘導体は、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ、ＳｍａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｈｏＩ、ＢｇｌＩＩ、ＣｌａＩ、ＢｇｌＩＩ、ＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩ、ＳａｃＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩの順番で並んだ左右対称の制限エンドヌクレアーゼ部位を有する多数のクローニング部位を含んでいる。従来技術で知られている方法を用いて、ＨｉｎｄＩＩＩ部位（ＣＢＨＩＩ翻訳開始部位の74ｂｐの３′）とＣｌａＩ部位（ＣＢＨＩＩの最後のコドンの265 ｂｐの３′）との間のこの遺伝子の1.7 ｋｂの中央領域が除去され、トリコデルマ　リーセイｐｙｒ４遺伝子を含有する1.6 ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＣｌａＩ　ＤＮＡ断片により置換されたプラスミドｐＰΔＣＢＨＩＩ（第９Ｂ図）を構築した。
【０１０４】
　トリコデルマ　リーセイｐｙｒ４遺伝子を1.6 ｋｂのＮｈｅＩ−ＳｐｈＩ断片上のｐＴｐｙｒ２（実施例７参照）から切除し、ｐＵＣ２１９のＳｐｈＩ部位とＸｂａＩ部位との間に挿入し、ｐ２１９Ｍを産生した（Smith 等、1991、Curr. Genet 、19 27-33頁）。ｐＵＣ２１９の多重クローニング部位由来の一方の末端で７ｂｐのＤＮＡおよび他方の末端で６ｂｐのＤＮＡを有するＨｉｎｄＩＩＩ−ＣｌａＩ断片としてｐｙｒ４遺伝子を除去し、ｃｂｈ２遺伝子のＨｉｎｄＩＩＩ部位とＣｌａＩ部位に挿入してプラスミドｐＰΔＣＢＨＩＩを形成した（第９Ｂ図参照）。
【０１０５】
　このプラスミドをＥｃｏＲＩにより切断することによって、一方の末端においてｃｂｈ２座からの0.7 ｋｂのフランキングＤＮＡ、他方の末端においてｃｂｈ２座からの1.7 ｋｂのフランキングＤＮＡおよび中間においてトリコデルマ　リーセイｐｙｒ４遺伝子を有する断片が解放される。
【実施例１４】
【０１０６】
　　　　　　　　Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩのｐｙｒ４−誘導体の産生
　ｃｂｈ１遺伝子が欠失した形質転換体（Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩ）の芽胞を、ＦＯＡを含有する培地上に広げた。その後実施例６の方法を用いて、この形質転換体のｐｙｒ４−誘導体を得た。このｐｙｒ４−菌株をＰ３７ＰΔＣＢＨＩＰｙｒ−２６と称した。
【実施例１５】
【０１０７】
　　　　事前にｃｂｈ１が欠失されている菌株中のｃｂｈ２遺伝子の欠失
　実施例８および９において概説した方法にしたがって、菌株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩＰｙｒ４−２６のプロトプラストを産生し、ＥｃｏＲＩ切断ｐＰΔＣＢＨＩＩにより形質転換した。
【０１０８】
　精製した安定な形質転換体を実施例１２のように振とうフラスコ中で培養し、等電点電気泳動により培養上澄中のタンパク質を調べた。ＣＢＨＩＩタンパク質をまったく産生しない１つの形質転換体（Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７と称する）を同定した。第８図のレーンＤは、本発明の方法にしたがって産生されたｃｂｈ１遺伝子およびｃｂｈ２遺伝子の両方が欠失した形質転換体からの上澄を示している。
【０１０９】
　ＤＮＡを菌株Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７から抽出し、抽出したＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＡｓｐ７１８により切断し、この切断されたＤＮＡについてアガロースゲル電気泳動を行なった。このゲルからのＤＮＡをメンブレンフィルターにブロットし、３２Ｐ標識ｐＰΔＣＢＨＩＩを用いてハイブリダイズさせた（第１０図）。第１０図のレーンＡは、非形質転換トリコデルマ　リーセイ菌株からのＤＮＡについて観察されたハイブリダイゼーションパターンを示している。野生型ｃｂｈ２遺伝子を含有する4.1 ｋｂのＥｃｏＲＩ断片が観察された。レーンＢは、菌株Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７について観察されたハイブリダイゼーションパターンを示している。単一の4.1 ｋｂバンドがなくなり、約0.9 ｋｂおよび約3.1 ｋｂの２つのバンドに置き換えられている。これは、ｐＰΔＣＢＨＩＩからのＥｃｏＲＩ断片の単一のコピーがｃｂｈ２座で正確に組み込まれた場合に予期されるパターンである。
【０１１０】
　同一のＤＮＡ試料をＥｃｏＲＩにより切断し、サザンブロット分析を上述したように行なった。この実施例においては、プローブには３２Ｐ標識ｐＩｎｔＣＢＨＩＩを用いた。このプラスミドは、プラスミドｐＰΔＣＢＨＩＩにおいて欠失されたｃｂｈ２遺伝子のセグメント内からのｃｂｈ２遺伝子コード配列の部分を含有している。菌株Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７からのＤＮＡについてはハイブリダイゼーションは見られず、このことは、ｃｂｈ２遺伝子は欠失され、ｐＵＣプラスミド由来の配列はこの菌株内には存在しなかったことを示している。
【実施例１６】
【０１１１】
　　　　　トリコデルマ　リーセイのｐｙｒ４欠失菌株の形質転換体
　　　　　　　　　　およびｐΔＥＧＩｐｙｒ−３の構築
　ＥＧＩをコード化するトリコデルマ　リーセイｅｇｌ１遺伝子を、公表されている配列にしたがって合成したオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションにより、菌株ＲＬ−Ｐ３７からのゲノムＤＮＡの4.2 ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片としてクローニングした（Pentilla等、1986、Gene、45:253-263；van Arsdell 等、1987、Bio/Technology、5:60-64 ）。
【０１１２】
　このＤＮＡ断片をｐＵＣ１００のＨｉｎｄＩＩＩ部位で挿入した。ＥＧＩコード配列の中間に近い位置からコード配列の３′末端を越えた位置まで延長した内部の１ｋｂのＥｃｏＲＶ断片を酵素切断により除去し、クローニングされた黒色アスペルギルスｐｙｒＧ遺伝子を含有する2.2 ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片による連結によって置き換えて（Wilson等、1988、Nucl. Acids Res. 16 2339頁）ｐΔＥＧＩｐｙｒＧ−３を得た（第１１図）。実施例８および９に述べた方法によるトリコデルマ　リーセイのｐｙｒ４欠失菌株（菌株ＧＣ６９）をＨｉｎｄＩＩＩにより切断し、いずれかの末端でｅｇｌ１からのフランキング領域を備えたｐｙｒＧ遺伝子を含有する断片を解放した後、その菌株をｐΔＥＧＩｐｙｒ−３により形質転換して、第１２図に概説した機構によりゲノムｅｇｌ１遺伝子が分断された形質転換体が得られた。ＤＮＡを形質転換体から抽出し、抽出したＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩにより切断し、この切断したＤＮＡについてアガロースゲル電気泳動を行ない、メンブレンフィルター上にブロットした。そのフィルターを放射線標識ｐΔＥＧＩｐｙｒ−３を用いてハイブリダイズさせた。トリコデルマ　リーセイの非形質転換菌株において、ｅｇｌ１遺伝子がＤＮＡの4.2 ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片上に存在した。しかしながら、ｐΔＥＧＩｐｙｒ−３からの所望の断片の取込みによるｅｇｌ１遺伝子の欠失後、この4.2 ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片は消失し、約1.2 ｋｂ大きなＨｉｎｄＩＩＩ断片により置き換えられた。このパターンは１つの形質転換体について観察された。この形質転換体をΔＥＧＩ−３と称した。
【実施例１７】
【０１１３】
　　　　　ＰＡΔＥＧＩＩ−１の構築およびＥＧ　ＩＩ遺伝子の欠失
　公表された配列にしたがって合成したオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションによって、ＥＧ　ＩＩ（文献には、ＥＧ　ＩＩＩとも称されている）をコード化するｅｇｌ３遺伝子を、４ｋｂのＰｓｔＩゲノムＤＮＡ断片としてトリコデルマ　リーセイ菌株ＲＬ−Ｐ３７からクローニングした（Saloheimo 等、1988、Gene 63:11-21 ）。このＤＮＡ断片をｐＵＣ１８のＰｓｔＩ部位に挿入した。このプラスミドｐＥＧＩＩをＥｃｏＲＶにより切断し、ＥＧＩＩコード領域の５′末端の約180 ｂｐの位置からコード領域の末端を数百塩基対越えた位置まで延長した約２ｋｂのセグメント上の全縁ＥＧ　ＩＩコード領域を除去した。このセグメントを、ａｍｄＳ遺伝子を含有するアスペルギルス　ニジュランス（Aspergillus nidulans）ゲノムＤＮＡのＳｓｐＩ断片により置き換え（Corrick 等、1987、Gene 53:63-71 ）、プラスミドＰＡΔＥＧＩＩ−１を産生した（第１３図参照）。
【０１１４】
　トリコデルマ　リーセイの野生型菌株は、唯一のニトロゲン供給源としてのアセトアミド上では成長できない。ａｍｄＳ遺伝子により形質転換を行なうと、このアセトアミド上で成長する能力が与えられ、このことがこの遺伝子を含有する形質転換体の選択システムの基礎となっている。
【０１１５】
　実施例１０および１１において記載した方法により、菌株ΔＥＧＩ−３のプロトプラストを、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩにより切断したｐＡΔＥＧＩＩ−１により形質転換し、アセトアミド上で成長できる形質転換体を選択した。その後、ＤＮＡを安定な形質転換体から抽出し、抽出したＤＮＡをＰｓｔＩにより切断し、切断したＤＮＡについてアガロースゲル電気泳動を行ないメンブレンフィルター上にブロットした。そのフィルターを放射線標識ｐＡΔＥＧＩＩ−１を用いてハイブリダイズさせた。ｅｇｌ３フランキング領域およびａｍｄＳを含有した、ｐＡΔＥＧＩＩ−１からのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片の、形質転換体中のゲノムｅｇｌ３座で同種組込みを行なうと、ｅｇｌ３遺伝子を含有する４ｋｂのゲノムＰｓｔＩ断片が、長さで約1.0 ｋｂおよび約2.8 ｋｂである２つの遺伝子を含有する小さなＰｓｔ１断片により置き換えられることになる。ハイブリダイゼーションのこのパターンは、菌株ΔΔＥＧ−１と称する１つの形質転換体に観察された。この菌株は、ＥＧＩおよびＥＧＩＩコード化遺伝子の両方が欠失しており、結果としてこれらのタンパク質のいずれも産生できない。
【０１１６】
　実施例７−１７および1991年10月 4日に出願された米国特許第07/770,049号（ここに全てを引用する）に記載された方法を用いて、以下のセルラーゼ成分（すなわち、ＥＧ　Ｉ、ＥＧ　ＩＩ、ＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩ）およびキシナラーゼ成分のいくつかまたは全てを産生できないトリコデルマ　リーセイの形質転換体を得てもよい。さらに、それらの記載された方法を用いて、ＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分を過剰に産生するトリコデルマ　リーセイ形質転換体を得てもよい。
【０１１７】
　本発明を様々な好ましい実施態様に関して記載したが、本発明の精神と範囲から逸脱せずに、様々な変更、置換等を行ってもよいことが当業者に理解されよう。したがって、本発明の範囲は以下の請求の範囲のみにより制限される。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】第１図は、ＣＢＨ　ＩおよびＣＢＨ　ＩＩを発現できないように形質転換したトリコデルマ　リーセイの菌株由来の菌類セルラーゼ組成物のプロファイルを示すグラフである。
【図２】第２図は、等電点電気泳動ゲルを示す。
【図３】第３図は、ＥＧ　ＩＩＩの２つの断片から得られたアミノ酸配列である。
【図４】第４図は、ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４の構築を示す概略図である。
【図５】第５図は、トリコデルマ　リーセイ遺伝子の欠失を説明する概略図である。
【図６】第６図は、ＥｃｏＲＩ切断ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４により形質転換したトリコデルマ　リーセイ菌株ＧＣ６９からのＤＮＡのオートラジオグラフである。
【図７】第７図は、ＥｃｏＲＩ切断ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４により形質転換したトリコデルマ　リーセイ菌株ＧＣ６９からのＤＮＡのオートラジオグラフである。
【図８】第８図は、野生型のトリコデルマ　リーセイおよびトリコデルマ　リーセイの形質転換菌株により分泌されたタンパク質を示す等電点電気泳動ゲルである。
【図９】第９図は、ゲノムＤＮＡ上の4.1 ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片としてクローニングしたトリコデルマ　リーセイｃｂｈ２座、およびｃｂｈ２遺伝子が欠失したベクターｐＰΔＣＢＨＩＩを示す概略図である。
【図１０】第１０図は、サザンブロット分析後のＥｃｏＲＩ切断ｐΔＣＢＨＩＩにより形質転換したトルコデルマ　リーセイ菌株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩＰｙｒ２６からのＤＮＡのオートラジオグラフである。
【図１１】第１１図は、ｐΔＥＧＩｐｙｒＧ−３の構成を示す概略図である。
【図１２】第１２図は、ｅｇｌ１遺伝子の欠失を説明する概略図である。
【図１３】第１３図は、ｐＡΔＥＧＩＩ−１の構成を示す概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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