(57)【要約】【課題】  好適な感度の組織因子系ＰＴ試薬を再現可能に生成できる組織因子系プロトロンビン時間（ＰＴ）試薬の製造方法を提供する。【解決手段】  所定量の組織因子（ＴＦ）、リン脂質、及び界面活性剤を含むバッファを組み合わせてＴＦ／リン脂質混合物を作成する、組み合わせステップと、そのＴＦ／リン脂質混合物からその界面活性剤を除去して、実質的に界面活性剤を含まないＴＦ／リン脂質小胞混合物を生成し、これにより組織因子系ＰＴ試薬を生成する、除去ステップとを含み、所定量のＴＦが測定されたそのＴＦ活性に基づいている、組織因子系プロトロンビン時間（ＰＴ）試薬を製造するための方法。【選択図】        図１
2004157122.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織因子系プロトロンビン時間（ＰＴ）試薬を製造するための方法であって、
所定量の組織因子（ＴＦ）、リン脂質、及び界面活性剤を含むバッファを組み合わせてＴＦ／リン脂質混合物を作成する、組み合わせステップと、
前記ＴＦ／リン脂質混合物から前記界面活性剤を除去して、実質的に界面活性剤を含まないＴＦ／リン脂質小胞混合物を生成し、これにより組織因子系ＰＴ試薬を生成する、除去ステップとを含み、
前記所定量のＴＦが測定されたそのＴＦ活性に基づいていることを特徴とする方法。
【請求項２】
組換え組織因子系プロトロンビン時間（ＰＴ）試薬を製造するための方法であって、
所定量の組換え組織因子（ｒＴＦ）、リン脂質、及び界面活性剤を含むバッファを組み合わせ、前記所定量のｒＴＦをリン脂質及び界面活性剤を含むバッファの混合物に加えることでｒＴＦ／リン脂質混合物を作成するステップであって、
前記所定量のｒＴＦが、その測定されたｒＴＦ活性に基づいており、前記ｒＴＦ活性が、６−ペプチジルアミノ−１−ナフタレンスルホンアミド（6-peptidylamino-1-naphthalenesulfonamide）蛍光原基質を用いた蛍光発生系ｒＴＦアッセイを用いて測定される、前記ステップと、
予備スクリーニングされた疎水性樹脂を前記ｒＴＦ／リン脂質混合物に添加するステップと、
前記ｒＴＦ／リン脂質混合物が実質的に界面活性剤を含まなくなるまで、前記ｒＴＦ／リン脂質混合物及び前記添加された予備スクリーニングされた樹脂をインキュベートするステップと、
前記疎水性樹脂を前記ｒＴＦ／リン脂質混合物から除去し、これにより実質的に界面活性剤を含まないｒＴＦ／リン脂質小胞混合物を得るステップと、
前記実質的に界面活性剤を含まないｒＴＦ／リン脂質小胞混合物の全リン脂質濃度を測定するステップと、
前記測定された全リン脂質濃度に基づいて、組換え組織因子系ＰＴ試薬として前記実質的に界面活性剤を含まないｒＴＦ／リン脂質混合物を利用できるか否か決定するステップとを含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロトロンビン時間（ＰＴ）試薬に関し、特にＰＴ試薬の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固検査は、外科手術を受ける患者の「出血しやすさ」の決定や、血液凝固を予防するために抗凝血治療を受ける患者のモニタリングを含む様々な目的のために用いられる。多数の血液凝固検査が存在し、その１つに「プロトロンビン時間（ＰＴ）」検査がある。ＰＴ検査は、ＰＴ検査をする血液サンプルに加えられるトロンボプラスチンによる外因系凝固経路の活性化に依存する。外因性凝固経路の活性化によりトロンビンが生成される。トロンビンは、フィブリノーゲンのフィブリンへの変換を触媒する蛋白分解酵素であって、凝血に必須の触媒である。
【０００３】
組織因子（ＴＦ）としても知られるトロンボプラスチンは、ＶＩＩａ因子と複合体を形成する膜関連糖タンパク質である。ＶＩＩａ因子／ＴＦとの複合体は、血液凝固プロセスを開始させる。一旦形成されると、ＶＩＩａ因子／ＴＦ複合体は、凝血カスケードの外因系経路及び内因系経路に関与する一連の特定の酵素を活性化し、最終的にトロンビンの生成、フィブリンの生成、血小板の活性化、及び凝固の形成が起こる。これについては、非特許文献１を参照されたい。
【０００４】
従来のＰＴ検査は、試験管内環境の制御された条件下で上記した一連の酵素反応を利用して、患者の血液凝固系の機能障害や欠失を診断する。凝血が始まるまでの時間は、プロトロンビン時間或いはＰＴ値と呼ばれる。
【０００５】
様々なタイプのトロンボプラスチンが、異なったプロトロンビン時間の血液サンプルを区別するＰＴ検査能力を増大したり減少させたりすることができる。高い識別性をもつトロンボプラスチンを「高感度」と呼ぶことにする。トロンボプラスチン製剤の液相の感度は、国際感度指数（ＩＳＩ：International Sensitivity Index）によって等級付けされる。ＩＳＩ値は、所定のロットのトロンボプラスチンで得たプロトロンビン時間の値を、標準化された基準ロットのトロンボプラスチンで得たプロトロンビン時間の値に対して対数目盛り上にプロットして得ることができる。所定のロットのトロンボプラスチンのＩＳＩ値は、標準化された基準ロットのトロンボプラスチンのＩＳＩ値を乗じて得られた線の傾きである。より感度の高いトロンボプラスチンは、ＩＳＩ値が約１．０と低く、感度の低いトロンボプラスチンは通常、ＩＳＩ値が約２．０〜３．０と高い。
【０００６】
ＰＴ検査に使用する場合、ＩＳＩ値が約１．０の高感度ＰＴ試薬は、ＩＳＩ値が１．０の場合、国際標準比（ＩＮＲ）が単純化されて正確であるため、最も有利で適していると考えられる。当業者であれば、ＩＮＲを使用することにより、感度の差によるトロンボプラスチンのばらつきを補償することができることを理解できよう。ＩＮＲは、式：ＩＮＲ＝（患者のＰＴ／平均正常ＰＴ）ISI を用いて求めることができる（非特許文献２を参照されたい）。ここで、ＰＴは患者の血液サンプルのプロトロンビン時間であり、平均正常ＰＴ（ＭＮＰＴ）は少なくとも２０人の正常な（基準）サンプルドナーからの血液サンプルの平均プロトロンビン時間である。
【０００７】
ＰＴ試薬の従来の製造方法は、天然或いは組換えの供給源からの組織因子（ＴＦ）、天然或いは合成のリン脂質、カルシウム、及びバッファ成分を用いる。言及することを以ってその内容を本明細書の一部とする特許文献１に、ＰＴ試薬の製造方法が開示されている。この試薬はリポソーム成分を含み、天然或いは組換えの組織因子がそのリポソームのリン脂質二重層に結合して、その中に取り込まれている。この特許に記載されているＰＴ試薬の製造方法では、ＰＴ試薬の製造に用いられるＴＦの量が、質量と容積の方式（mass to volume basis）で完全に決定されている。
【０００８】
言及することを以ってその内容を本明細書の一部とする特許文献２に、ＰＴ検査に使用するＰＴ試薬並びに組織因子を含む脂質小胞を生成するための方法が開示されている。このＰＴ試薬は、組換えヒト組織因子、天然或いは合成起源のリン酸脂質、バッファ成分、及びカルシウムイオンを含む。安定剤及び塩をこのＰＴ試薬に用いることもできる。
【０００９】
言及することを以ってその内容を本明細書の一部とする特許文献３及び特許文献４に、ＰＴ検査装置における乾燥したトロンボプラスチンの使用が開示されている。特許文献３には、乾燥試薬プロトロンビン時間アッセイにおける組換えトロンボプラスチンの使用が開示されている。組換えトロンボプラスチンは、検査精度を改善するために使用される。加えて、この特許では、乾燥試薬ＰＴアッセイに用いられた時に感度が低く精度の低いＩＳＩ値になる天然トロンボプラスチンに対して組換えトロンボプラスチンを比較している。特許文献４には、トロンボプラスチンを含む３つの測定領域を備えた液状検査装置が開示されている。これらの測定領域の１つは、血液サンプルのＰＴ時間を測定するために用いられる。他の２つの測定領域は、コントロール領域として用いられ、これにより液状検査装置を用いて測定されるＰＴ時間の信頼性が高められる。コントロール領域は、トロンボプラスチンに加えて、血液サンプルに存在する抗凝血薬の効果を部分的或いは完全に無効にするための要素を含む。
【特許文献１】米国特許第５，３１４，６９５号
【特許文献２】米国特許第５，６２５，０３６号
【特許文献３】米国特許第５，４１８，１４１号
【特許文献４】米国特許出願第２００２／０１１０９２２号
【非特許文献１】Nemerson, Yale著、「組織因子及び止血（Tissue Factor and Hemostasis）」、Blood、１９８８年、１頁〜８頁
【非特許文献２】Hirthら著、「経口凝血薬：動作機構、臨床効果、及び最適治療範囲（Oral Anticoagulants：Mechanism of Action，Clinical Effectiveness，and Optimal Therapeutic Range）」、Chest、２００１年、１１９：８Ｓ〜２１Ｓ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
経験から、従来のＰＴ試薬製造方法が好適な感度のＰＴ試薬を再現可能に生産できないことが明らかである。従って、好適な感度のＰＴ試薬を再現できるＰＴ試薬製造方法が要望されている。加えて、この方法は単純であって、製造されたＰＴ試薬の合格判定試験を含むべきである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、好適な感度の組織因子系ＰＴ試薬を再現可能に生成できる組織因子系プロトロンビン時間（ＰＴ）試薬の製造方法を提供する。加えて、この方法は単純であって、製造された組織因子系ＰＴ試薬の合格判定検査を含む。
【００１２】
本発明では、組織因子系ＰＴ試薬の再現性（例えば、ロット間のばらつき）及び適正（例えば、感度）が、これまでに知られていない製造中の様々な極めて重要な因子によって決定される。これらの極めて重要な因子には、（ｉ）製造中に用いられる特定のＴＦ活性、及び（ｉｉ）製造中及び最終的な組織因子系ＰＴ試薬のリン脂質濃度が含まれる。ＴＦ活性及びリン脂質濃度が共に極めて重要な因子であるため、製造中に用いられるリン脂質濃度に対する活性なＴＦ（活性の単位として測定）の割合もまた関心事である。従って、本発明に従った方法の実施形態は、１或いは複数の極めて重要な因子を制御するステップを含む。このような制御により、好適な感度の組織因子系ＰＴ試薬を再現可能に生成する製造方法（プロセス）が得られる。
【００１３】
本発明の例示的な実施形態に従った組織因子系ＰＴ試薬の製造方法は、所定量の組織因子（ＴＦ）、リン脂質、及び界面活性剤を含むバッファを組み合わせて、ＴＦ／リン脂質混合物を作成するステップを含む。この組み合わせステップでは、ＴＦの量はその測定されたＴＦ活性に基づいて予め決定される。次に、界面活性剤をＴＦ／リン脂質混合物から除去して、実質的に界面活性剤を含まないＴＦ／リン脂質小胞混合物を生成する。このような界面活性剤を含まないＴＦ／リン脂質小胞混合物は、組織因子系ＰＴ試薬として有用である。
【発明の効果】
【００１４】
好適な感度の組織因子系ＰＴ試薬を再現可能に生成できる組織因子系プロトロンビン時間（ＰＴ）試薬の製造方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の原理を利用した例示的な実施形態について述べる次の詳細な説明を添付の図面を照らし合わせながら読むと、本発明の特徴及び利点をよりよく理解できるであろう。
【００１６】
図１は、本発明の例示的な実施形態に従った組織因子を用いたＰＴ試薬（以下、組織因子系ＰＴ試薬と呼ぶことにする）を製造するためのプロセス１００のフローチャートである。プロセス１００は、所定量の組織因子（ＴＦ）、リン脂質、及び界面活性剤を含むバッファを組み合わせて、ＴＦ／リン脂質混合物を作成するステップ１１０を含む。ＴＦの量は、その測定したＴＦ活性に基づいたこのステップで予め決定される。
【００１７】
本発明に従ったプロセス１００を含むプロセスに用いられる組織因子は、当業者に周知のあらゆる好適な組織因子を用いることができる。好適な組織因子として、例えば、天然或いは合成起源の組織因子を挙げることができる。組換え組織因子（ｒＴＦ）の使用は、例えば乾燥状態で用いられた時に感度が高い組織因子系ＰＴ試薬を提供するのに特に有益である。
【００１８】
所定量の組織因子のＴＦ活性は、当業者に周知の任意の好適なＴＦ活性アッセイ及び／または本発明に従った方法と共に用いるために特に開発された好適なＴＦ活性アッセイを用いて測定することができる。当業者であれば、このようなＴＦ活性アッセイにより、単にＴＦの量ではなくＴＦの機能的な活性を測定できることを理解できよう。
【００１９】
ＴＦ活性の測定に用いることができる特に有益で単純なＴＦ活性アッセイが、言及することをもって本明細書の一部とする代理人整理番号ＭＢＨＢ−０２−１０４９である同日出願の同時係属の米国特許出願第＿＿＿＿＿＿号（名称：「組織因子及びＶＩＩａ因子のためのアッセイ（Assay for Tissue Factor and Factor VIIa)」）に開示されている。このＴＦ活性アッセイは蛍光原基質を用いて、ＶＩＩａ因子の補助因子として機能するＴＦの能力を測定する。この場合、ＴＦ活性アッセイは、組織因子の存在下で蛍光原基質（例えば、言及することをもってその内容を本明細書の一部とする米国特許出願第５，３９９，４８７号に開示されている６−ペプチジルアミノ−１−ナフタレンスルホンアミド（6-peptidylamino-1-naphthalenesulfonamides））蛍光原基質を切断するＶＩＩａ因子の能力を決定する。このアッセイでは、ＶＩＩａ因子がＴＦに結合することにより、この能力が約１００倍になる。このＴＦ製剤を標準的な組織因子製剤（例えば、世界保健機構標準（World Health Organization Standard）が販売する）と比較することにより、このＴＦ製剤の活性を決定することができる。このＴＦ活性アッセイの更なる詳細については、上記した米国特許出願第＿＿＿＿＿＿号（代理人整理番号ＭＢＨＢ−０２−１０４９）に開示されている。
【００２０】
この米国特許出願（代理人整理番号ＭＢＨＢ−０２−１０４９）のＴＦ活性アッセイがＴＦ活性を測定するために用いられる場合、ＴＦ／リン脂質混合物が１リットル当たり９０００単位〜１８０００単位の範囲のＴＦ活性を有するようにＴＦを加えることが、再現性がある高感度の組織因子系ＰＴ試薬を提供する際に特に有益であることが確認されている。このＴＦ活性の単位について、ＷＨＯ（世界保健機構）による指示に従って作成されたＷＨＯ標準トロンボプラスチンに対して１単位／ｍｌのＴＦ活性を割り当てると定義されている。当業者であれば、１リットル当たり９０００単位〜１８０００の単位の範囲は、ＴＦ／リン脂質混合物の関係に適用され、界面活性剤を含まないＴＦ／リン脂質小胞混合物には適用されないことを理解できよう。
【００２１】
ステップ１１０に用いられる界面活性剤含有バッファは、当業者が周知のあらゆる好適な界面活性剤含有バッファとすることができる。例えば、界面活性剤含有バッファは、１００ｍＭ  ３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propanesulfonate）（ＣＨＡＰＳ）バッファ及び／またはＣＨＡＰＳ／ウシγグロブリン（ＢＧＧ）バッファとすることができる。ステップ１１０に用いられるリン脂質は、当業者に周知のあらゆる好適なリン脂質或いはリン脂質の混合物とすることができる。例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジルセリンを含むリン脂質混合物を用いることができる。
【００２２】
組み合わせステップ１１０は、例えば、所定量のＴＦをリン脂質と界面活性剤含有バッファの混合物に加えることを含み得る。このような組み合わせステップにより、ＴＦがリン脂質と界面活性剤含有バッファの混合物の中に簡単に組み入れられる。当分野で周知のＰＴ試薬製造方法では、このようなリン脂質と界面活性剤含有混合物へのＴＦの添加は、質量と容積の方式で完全に行われる（例えば、米国特許第５，３１４，６９５号を参照）。この従来の方法では、ＰＴ試薬の製造中に加えられるＴＦの質量は分かるが、加えられるＴＦの機能的な性質（即ち、活性）は全く分からない。
【００２３】
次に図１のステップ１２０に示されているように、界面活性剤をＴＦ／リン脂質混合物から除去して実質的に界面活性剤を含まないＴＦ／リン脂質小胞混合物を得ることができる。当業者であれば、このような界面活性剤を含まないＴＦ／リン脂質小胞混合物は、組織因子系ＰＴ試薬として作用し得ることを理解できよう。
【００２４】
界面活性剤の除去は、当業者に周知のあらゆる好適な方法で行うことができる。このような好適な方法として、例えば、疎水性樹脂（例えば、ＸＡＤ−１６疎水性樹脂）をＴＦ／リン脂質混合物に添加し、ＴＦ／リン脂質混合物に実質的に界面活性剤が含まれなくなるまでそのＴＦ／リン脂質混合物及び加えた樹脂をインキュベートし、次にこの疎水性樹脂をＴＦ／リン脂質混合物から除去する方法が挙げられる。別の好適な方法として、透析や接線流動ろ過（tangential flow filtration）による界面活性剤の緩徐除去が挙げられる。
【００２５】
実質的に界面活性剤を含まないＴＦリン脂質小胞混合物は、機能的に微量の界面活性剤を含み得るが、それでも実質的に界面活性剤を含まないとみなされる。機能的に微量とみなされる界面活性剤の濃度は、常用の実験により当業者が決定することができる。一例として、０．２ｍＭ或いはそれ以下のＣＨＡＰｓ界面活性剤は、本発明の或る実施形態では機能的に微量とみなされる。
【００２６】
上述したように、本発明の実施形態は、所定量のＴＦをリン脂質と界面活性剤を含まないバッファの混合物に添加することを伴い得る。このような実施形態では、リン脂質を非変性両性イオン界面活性剤と混合して、リン脂質と界面活性剤の混合されたミセルを含むリン脂質と界面活性剤を含む混合物を作成することができる。例示的な非変性両性イオン界面活性剤は、３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propanesulfonate）（ＣＨＡＰＳ）である。
【００２７】
本発明に従った方法において界面活性剤を除去するために用いることができる好適な疎水性樹脂には、限定するものではないが、ミズーリ州セントルイスに所在のシグマケミカルズ社（Sigma Chemicals）が販売するAmberlite XAD-16が含まれる。当業者であれば、本発明に従ったプロセスで界面活性剤を除去することにより、例えば、リン脂質が単層小胞を形成し、ＴＦがその膜結合ドメインによりその小胞内に取り込まれる。得られた実質的に界面活性剤を含まないＴＦ／リン脂質小胞混合物は、ＴＦを含む単層小胞の均一な混合物であり、ＴＦの中には、その単層小胞の表面に露出した界面部分を向いているものもある。ＶＩＩａ因子の補助因子として作用するこのような組織因子系ＰＴ試薬の効果は、小胞の表面に存在する多数の機能的なＴＦ分子に依存すると考えられる。従来の質量と容積の方式のＴＦの添加では、添加したＴＦの量は分かるが、ＴＦの機能的な質については分からない。この代わりに所定量のＴＦを活性に基づいて添加することにより、小胞の表面に存在する機能的なＴＦの量がより正確に制御され、組織因子系ＰＴ試薬のロット毎に事実上標準化され得る。
【００２８】
機能的なＴＦの量に加えて、組織因子系ＰＴ試薬の製造中に用いられるリン脂質の量もまた、その適合性及び再現性に影響を与えることが分かっている。更に、実質的に界面活性剤を含まないＴＦ／リン脂質小胞混合物に存在するリン脂質の量が、界面活性剤の除去の際のリン脂質の喪失に関係することが分かっている。
【００２９】
組織因子系ＰＴ試薬に存在するリン脂質の量を制御するために、リン脂質濃度の合格判定試験を本発明に従ったプロセスに含めることができる。例えば、このプロセスは、（ｉ）実質的に界面活性剤を含まないＴＦ／リン脂質小胞混合物の全リン脂質濃度を測定するステップと、（ｉｉ）測定された全リン脂質濃度に基づいて、実質的に界面活性剤を含まないＴＦ／リン脂質小胞混合物が組織因子系ＰＴ試薬として利用できるか否かを決定するステップとを含み得る。
【００３０】
全リン脂質濃度は、例えば、当分野で周知であって容易に利用できる無機リン酸塩のアッセイを用いて測定することができる（Chenら著、「リンの微量決定（Microdetermination of Phosphorus）」、分析化学（Analytical Chemistry）、２８（１１），１７５６〜１７５８（１９５６）を参照）。本発明に従ったプロセスにおいて、リン脂質が無機リン酸塩の唯一の可能性のある大きな供給源であるため、リン酸塩のモル濃度はサンプル中のリン脂質のモル濃度に正比例する。実質的に界面活性剤を含まないＴＦ／リン脂質小胞混合物における特に有益なリン脂質濃度（無機リン酸塩として測定された）は、２．５ｍＭ〜５．０ｍＭの範囲である。更に有益なリン脂質濃度は、３．０ｍＭ〜５．０ｍＭの範囲であり、３．８ｍＭのリン脂質濃度が最適である。
【００３１】
本発明に従ったプロセスの別の例示的な実施形態では、界面活性剤の除去に用いる樹脂は、プロセスで使用する前に予めスクリーニングされる。このような予備スクリーニングは、リン脂質の回収率（％）に基づいており（後述する例１を参照）、例えば、上記した無機アッセイを用いることができる。本発明の実施形態に従った予備スクリーニングは、界面活性剤除去ステップにおけるリン脂質の喪失を有利に制御することができ、実質的に界面活性剤を含まないＴＦ／リン脂質小胞混合物が、制御された濃度のリン脂質を含むようにすることができる。
【００３２】
例１：組織因子系ＰＴ試薬の製造に用いるための疎水性クロマトグラフ樹脂の予備スクリーニング
後述する実験は、本発明に従った組織因子系ＰＴ試薬製造プロセスに使用するために、疎水性樹脂のロットをリン脂質の回収率に基づいて上手く予備スクリーニングする例示的な方法を実証する。疎水性樹脂のロットを予備スクリーニングするために、４．９５ｍＭの可溶化リン脂質混合物（ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジルセリンを含み、アラバマ州アラバスタに所在のアバンティ・ポーラー・リピッド社（Avanti Polar Lipids）より入手可能）及び３０ｇのAmberlite XAD-16疎水性樹脂（マサチューセッツ州セントルイスに所在のシグマケミカルカンパニーより入手可能）を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ＴＢＳ）バッファ（０．８％グリシン、１５０ｍＭ トレハロース、１００ｍＭ  ＣＨＡＰＳ、及び０．０５％アジ化ナトリウムを含む）及び１００ｍＬの２０ｍＭ Ｔｒｉｓに混合した。このバッファのｐＨは７．４であった。
【００３３】
リン脂質及び疎水性樹脂を室温で約１時間混合した。混合物の上清を収集して、リン脂質についてアッセイした（従来の無機リン酸塩アッセイを用いて無機リン酸塩として測定した）。次に、リン脂質の回収率（％）を無機リン酸塩アッセイの結果から計算した。６つのロットの疎水性樹脂の検査からのデータが表１に示されている。樹脂ロット番号２で調製した組織因子系ＰＴ試薬は、一貫して最終リリース試験で不合格だった。表１のデータ並びに回収率（％）に関連した測定精度の理解に基づき、７５％〜９５％のリン脂質回収率が得られる疎水性樹脂のロットのみが、組織因子系ＰＴ試薬の製造に利用できると考えられた。
【表１】
2004157122.tif 000003
【００３４】
例２：組織因子系ＰＴ試薬を製造するための例示的なプロセス
アラバマ州アラバスタに所在のアバンティ・ポーラー・リピッド社より入手したモル比が６７：１６：１０：７（ホスファチジルコリン：ホスファチジルグリセロール：ホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルセリン）の凍結乾燥リン脂質（１．５ｇ）を、１００ｍＬのＴＢＳバッファ（０．８％グリシン、１５０ｍＭ トレハロース、１００ｍＭ ＣＨＡＰＳ、及び０．０５％アジ化ナトリウムを含む）に溶解した。この例示的なプロセスの全てのステップにおいて、試薬溶液を混合し、３０℃〜３７℃に維持した。この溶解したリン脂質のアッセイされた無機リン酸塩濃度に基づいて、２．２５ｍｍｏｌの溶解したリン脂質を後のプロセスのために除去した。
【００３５】
後のプロセスのために除去した２．２５ｍｍｏｌのリン脂質を含む容量を、ＴＢＳバッファ（０．８％グリシン、１５０ｍＭ トレハロース、１００ｍＭ ＣＨＡＰＳ、及び０．０５％アジ化ナトリウムを含む）を添加して１００ｍｌに調節した。次に５０ｍｌのウシγグロブリン溶液（ＴＢＳ（２０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、０．８％グリシン、１５０ｍＭ トレハロース、及び０．０５％アジ化ナトリウムを含む）において０．１％）を可溶化リン脂質混合物に添加した。次に、ｒＴＦ（１０ｍＭ ＣＨＡＰＳを含むＴＢＳにおける）及び追加バッファ（ＴＢＳバッファ（０．８％グリシン、１５０ｍＭ トレハロース、及び０．０５％アジ化ナトリウムを含む））を、ｒＴＦ濃度が１３，５００単位／Ｌの５００ｍｌのＴＦ／リン脂質混合物を得るためにリン脂質混合物に加えた。
【００３６】
ｒＴＦ／リン脂質混合物を１時間混合した後、１５０ｇの予備スクリーニングし（上記した例示的な方法により）かつ予備洗浄したＸＡＤ−１６疎水性樹脂を添加した。３時間半混合した後、ｒＴＦ／リン脂質混合物をろ過して、疎水性樹脂を除去し、２℃〜８℃で保管した。樹脂を添加し、インキュベーションし、樹脂を除去し、実質的に界面活性剤を含まないｒＴＦ／リン脂質小胞混合物（即ち、組織因子系ＰＴ試薬）を得た。
【００３７】
次に、この組織因子系ＰＴ試薬をアッセイして、その最終リン脂質濃度を決定した（無機リン酸塩として測定）。組織因子系ＰＴ試薬はまた、検査ストリップ形態にコーティングし、乾燥させた。次に、複数の組織因子系ＰＴ試薬ロットのそれぞれのＩＳＩ及びＭＮＰＴを、少なくとも１００の全血毛細血管サンプルで検査ストリップを検査して決定した。１００の全血毛細血管サンプルの内少なくとも２０は正常な患者から得たものであり、少なくとも８０は経口抗凝血治療を受けている患者から得たものであった。ＩＳＩ値は、そのロットで得たプロトロンビン時間の値を、基準器具で検査されたトロンボプラスチンの標準化されたロットで得たプロトロンビン時間の値に対して対数目盛り上にプロットして得ることができる。ＩＳＩ値は、基準トロンボプラスチンのＩＳＩ値を乗じて得られた線の傾きである。ＭＮＰＴは、少なくとも２０人の正常なドナーの平均プロトロンビン時間である。
【００３８】
表２は、比較的広範囲でｒＴＦを添加し、予備スクリーニングされていない樹脂を用いた方法で製造された組織因子系ＰＴ試薬のロットについてのＩＳＩ及びＭＮＰＴを示す。許容できる範囲のＩＳＩ及びＭＮＰＴはそれぞれ、１．０秒〜１．３秒及び７．０秒〜９．０秒である。表２のデータは、ＴＦ及びリン脂質の或る組み合わせにより、複数のロットがＩＳＩ及びＭＮＰＴのリリース判定基準に不合格になったことを示している。例えば、共に濃度の低いＴＦ及びリン脂質を用いてＰＴ試薬を生成すると、得られるＩＳＩは許容範囲を超えている。
【表２】
2004157122.tif 000004
【００３９】
表３は、上記した例示的なプロセスに従って、様々なｒＴＦ及びリン脂質濃度で製造された組織因子系ＰＴ試薬の各ロットについてのＩＳＩ及びＭＮＰＴの結果の一覧を示す。表３の結果から分かるように、本発明に従って製造された組織因子系ＰＴ試薬の各ロットが、一貫した（即ち、再現性のある）量のｒＴＦ及びリン脂質を含み、従来の方法で製造されたロットよりも再現可能で適切なＩＳＩ及びＭＮＰＴの値を有する。表３には、ＩＳＩ及びＭＮＰＴの基準に不合格のロットがなかった。
【表３】
2004157122.tif 000005
【００４０】
表３のデータから、好適なｒＴＦ活性の濃度は９，０００〜１３，５００の範囲であり、好適なリン脂質の濃度が２．５ｍＭ〜３．９ｍＭの範囲である。当業者に興味深い添加されたｒＴＦ活性濃度及びリン脂質濃度の様々な比率を、表２及び表３のデータから容易に得ることができる。しかしながら、加えられたＴＦ活性及びリン脂質に用いた所定の濃度範囲は、再現可能に好適な感度のＴＦ系ＰＴ試薬を生成するのに十分であると考えられる。
【００４１】
一定濃度のｒＴＦにおけるリン脂質濃度（無機リン酸塩として測定）のＩＳＩ及びＭＮＰＴへの影響がそれぞれ、図２及び図３に示されている。図２は、無機リン酸塩濃度が約２．５ｍＭ〜約３．９ｍＭの範囲である場合、ＩＳＩが１．０〜１．３の所望の範囲内であることを実証している。図３に示されているように、同じ無機リン酸塩濃度範囲で、ＭＮＰＴも７．０秒〜９．０秒の所望の範囲内である。
【００４２】
上記した本発明の実施形態の代替を用いて本発明を実施できることを理解されたい。添付の特許請求の範囲は本発明の範囲を規定し、特許請求の範囲内の方法及びそれらの同等物が本発明の範囲内であることを理解されたい。
【００４３】
本発明の実施態様は以下の通りである。
（１）前記組み合わせステップが、前記所定量のＴＦをリン脂質と界面活性剤を含むバッファとの混合物に添加するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
（２）前記組み合わせステップが、所定量の組換え組織因子（ｒＴＦ）を添加するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
（３）前記除去ステップが次の方法によって実施され、この方法が、疎水性樹脂を前記ＴＦ／リン脂質混合物に添加するステップと、前記ＴＦ／リン脂質混合物が実質的に前記界面活性剤を含まなくなるまで、前記ＴＦ／リン脂質混合物及び前記添加された樹脂をインキュベートするステップと、前記疎水性樹脂を前記ＴＦ／リン脂質混合物から除去するステップとを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
（４）前記除去ステップが、前記添加するステップの前に前記疎水性樹脂を予備スクリーニングするステップを更に含む前記方法を用いて達成されることを特徴とする実施態様（３）に記載の方法。
（５）前記予備スクリーニングするステップが、可溶化リン脂質の回収率に基づいて前記疎水性樹脂を予備スクリーニングすることを含むことを特徴とする実施態様（４）に記載の方法。
【００４４】
（６）前記予備スクリーニングするステップが、７５％〜９５％の範囲の可溶化リン脂質の回収率に基づいて前記疎水性樹脂を予備スクリーニングすることを含むことを特徴とする実施態様（４）に記載の方法。
（７）更に、前記実質的に界面活性剤を含まないＴＦ／リン脂質小胞混合物の全リン脂質濃度を測定するステップと、その測定した全リン脂質濃度に基づいて、組織因子系ＰＴ試薬として前記実質的に界面活性剤を含まないＴＦ／リン脂質小胞混合物を用いることができるか否か決定するステップとを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
（８）前記測定するステップが、無機リン酸塩濃度という形で前記リン脂質濃度を測定し、前記決定するステップが、前記測定された全リン脂質濃度が無機リン酸塩濃度という形で２．５ｍＭ〜５．０ｍＭの範囲である組織因子系ＰＴ試薬を用いることができるとするステップを含むことを特徴とする実施態様（７）に記載の方法。
（９）前記ＴＦ活性が蛍光発生ＴＦ活性アッセイによって測定されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
（１０）前記蛍光活性ＴＦ活性アッセイが、６−ペプチジルアミノ−１−ナフタレンスルホンアミド（6-peptidylamino-1-naphthalenesulfonamide）蛍光原基質を用いることを特徴とする実施態様（９）に記載の方法。
【００４５】
（１１）前記組み合わせステップが、前記ＴＦ／リン脂質混合物のＴＦ活性が１リットル当たり９，０００単位〜１８，０００単位の範囲となるように、所定量のＴＦを組み合わせることを特徴とする実施態様（１０）に記載の方法。
（１２）前記組み合わせステップが、前記ｒＴＦ／リン脂質混合物の前記ｒＴＦ活性が１リットル当たり９，０００単位〜１８，０００単位の範囲となるように所定量のｒＴＦを組み合わせることを特徴とする請求項２に記載の方法。
（１３）前記予備スクリーニングが、可溶化リン脂質の回収率に基づいて前記疎水性樹脂を予備スクリーニングすることを含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
（１４）前記予備スクリーニングが、７５％〜９５％の範囲の可溶化リン脂質の回収率に基づいて前記疎水性樹脂を予備スクリーニングすることを含むことを特徴とする実施態様（１２）に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の例示的な一実施形態に従ったプロセスにおける連続ステップを例示するフローチャートである。
【図２】国際感度指数に対するリン脂質濃度の影響を示すグラフである。
【図３】平均正常プロトロンビン時間に対するリン脂質濃度の影響を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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