(57)【要約】【課題】土壌中に存在する白色腐朽菌から特定の白色腐朽菌株を簡便かつ精度よく検出することができる白色腐朽菌株の検出方法や定量方法を提供すること。【解決手段】土壌中に存在する白色腐朽菌から特定の白色腐朽菌株を検出・定量する方法であって、土壌からＤＮＡを抽出精製するＤＮＡサンプル調製工程と、特定の白色腐朽菌株のゲノムＤＮＡ中の特異的な塩基配列を決定する工程と、特異的塩基配列の配列情報に基づいて設計した塩基配列からなるプライマーを調製する工程と、かかるプライマーを用いて前記ＤＮＡサンプルを鋳型として、特定の白色腐朽菌株のゲノムＤＮＡ中の株特異的塩基配列を選択的に複製・増幅する複製・増幅工程と、前記選択的に複製・増幅された株特異的塩基配列を検出・測定する検出・測定工程とを有する検出方法及び定量方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
土壌中に存在する白色腐朽菌から特定の白色腐朽菌株を検出する方法であって、
土壌を冷却下に粉砕し、溶出緩衝液を用いてＤＮＡを回収し、得られるＤＮＡ回収液を保温した後、ＤＮＡ精製処理を行ってＤＮＡサンプルを調製するＤＮＡサンプル調製工程と、
前記特定の白色腐朽菌株のゲノムＤＮＡ中の菌株特異的な塩基配列を決定する菌株特異的塩基配列決定工程と、
前記菌株特異的塩基配列の配列情報に基づいて設計した塩基配列からなるプライマーを調製するプライマー調製工程と、
前記プライマーを用いて、前記ＤＮＡサンプルを鋳型として、前記特定の白色腐朽菌株のゲノムＤＮＡ中の菌株特異的塩基配列を選択的に複製・増幅する複製・増幅工程と、
前記選択的に複製・増幅された菌株特異的塩基配列を検出する検出工程とを有することを特徴とする白色腐朽菌株の検出方法。
【請求項２】
溶出緩衝液が、ＣＴＡＢ溶液であることを特徴とする請求項１に記載の白色腐朽菌株の検出方法。
【請求項３】
ＤＮＡ精製処理が、ＤＮＡ回収液にフェノール−クロロホルムを加え混合した後に遠心分離処理し、上清に冷エタノールを加えて放置するステップを含む処理であることを特徴とする請求項１又は２に記載の白色腐朽菌株の検出方法。
【請求項４】
特定の白色腐朽菌株が、セリポリア属微生物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の白色腐朽菌株の検出方法。
【請求項５】
セリポリア属微生物が、セリポリア・エスピー（Ｃｅｒｉｐｏｒｉａ　ｓｐ．）ＭＺ−３４０株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６８６４）であることを特徴とする請求項４に記載の白色腐朽菌株の検出方法。
【請求項６】
菌株特異的塩基配列が、配列表の配列番号１で示される塩基配列であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の白色腐朽菌株の検出方法。
【請求項７】
配列表の配列番号２及び配列番号３で示される塩基配列からなる一組のプライマーを用いることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の白色腐朽菌株の検出方法。
【請求項８】
土壌中に存在する白色腐朽菌から特定の白色腐朽菌株を定量する方法であって、
土壌を冷却下に粉砕し、溶出緩衝液を用いてＤＮＡを回収し、得られるＤＮＡ回収液を保温した後、ＤＮＡ精製処理を行ってＤＮＡサンプルを調製するＤＮＡサンプル調製工程と、
前記特定の白色腐朽菌株のゲノムＤＮＡ中の菌株特異的な塩基配列を決定する菌株特異的塩基配列決定工程と、
前記菌株特異的塩基配列の配列情報に基づいて設計した塩基配列からなるプライマーを調製するプライマー調製工程と、
前記プライマーを用いて、前記ＤＮＡサンプルを鋳型として、前記特定の白色腐朽菌株のゲノムＤＮＡ中の菌株特異的塩基配列を選択的に複製・増幅する複製・増幅工程と、
前記選択的に複製・増幅された菌株特異的塩基配列の量を測定する定量工程とを有することを特徴とする白色腐朽菌株の定量方法。
【請求項９】
溶出緩衝液が、ＣＴＡＢ溶液であることを特徴とする請求項８に記載の白色腐朽菌株の定量方法。
【請求項１０】
ＤＮＡ精製処理が、ＤＮＡ回収液にフェノール−クロロホルムを加え混合した後に遠心分離処理し、上清に冷エタノールを加えて放置するステップを含む処理であることを特徴とする請求項８又は９に記載の白色腐朽菌株の検出方法。
【請求項１１】
特定の白色腐朽菌株が、セリポリア属微生物であることを特徴とする請求項８〜１０のいずれかに記載の白色腐朽菌株の定量方法。
【請求項１２】
セリポリア属微生物が、セリポリア・エスピー（Ｃｅｒｉｐｏｒｉａ　ｓｐ．）ＭＺ−３４０株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６８６４）であることを特徴とする請求項１１に記載の白色腐朽菌株の定量方法。
【請求項１３】
菌株特異的塩基配列が、配列表の配列番号１で示される塩基配列であることを特徴とする請求項８〜１２のいずれかに記載の白色腐朽菌株の定量方法。
【請求項１４】
配列表の配列番号２及び配列番号３で示される塩基配列からなる一組のプライマーを用いることを特徴とする請求項８〜１３のいずれかに記載の白色腐朽菌株の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、土壌中に存在する白色腐朽菌から特定の白色腐朽菌株を検出、定量する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ダイオキシンは、ゴミ焼却炉における焼却灰や、集塵灰等に偶発的に発生し、環境に放出され、一般に、化学的に安定で分解されにくく、生体組織中に蓄積され濃縮されやすく、毒性が高いため、特に、土壌中の含有量が高いゴミ焼却施設周辺において多量に検出され、環境汚染源となっている。ダイオキシンは有機塩素化合物の一種で、２個のベンゼン環が１個又は２個の酸素によって結ばれた骨格構造を有するジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（ＤＤ）又はジベンゾフラン（ＤＦ）等の塩素化合物の総称であり、ポリ塩化ジベンゾダイオキシン（ＰＣＤＤ）やポリ塩化ジベンゾフラン（ＰＣＤＦ）等のダイオキシンの他、塩素の替わりに臭素が結合したダイオキシン、コプラナーＰＣＢを含むポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢｓ）類、クロロベンゼン（ＣＢ）、クロロフェノール（ＣＰ）等も広義には含まれ、毒性が高く、突然変異、皮膚の色素沈着、脱毛、多毛、肝機能異常等の誘因となることが知られ、その処理が重大な問題となっている。
【０００３】
このような難分解性のダイオキシンを化学的に分解する方法としての高温溶融法、加熱分解法、アルカリ処理法、超臨界水分解法、触媒酸化法、オゾン分解法等はエネルギー消費量が大きく、別途の環境問題にも発展し兼ねず、これらの方法に替わる方法として、細菌等の微生物を用いる方法が検討されている。ジベンゾ−Ｐ−ダイオキシン及びジベンゾフランの生分解の研究において、多くの細菌株及び数種の真菌についての報告がなされている。細菌株であるＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．（Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　６２，　３６７−３７１，　１９９６、Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　５８，　１００５−１０１０，　１９９２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．（Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　６２，４０７３−４０８０，　１９９６）、及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｉｃｕｌａｎｓ（Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　５９，　２８５−２８９，　１９９３）は、酸素添加酵素による塩化ＤＤ及び塩化ＤＦの酸化における触媒作用を及ぼすことが明らかにされている。また、ダイオキシン汚染土壌から単離した酵母株であるＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｍｕｃｏｉｄｅｓはジベンゾフランの芳香族構造を分解する能力を有することが報告されている（Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　６４，　２２１５−２２１９，　１９９８）。また、白色腐朽菌Ｐｈａｎｅｒｏｃｈｅｔｅ　ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍについては、ＤＤ、２，７−ジクロロジベンゾ−Ｐ−ダイオキシン（ｄｉＣＤＤ）及び２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−Ｐ−ダイオキシン（ｔｅｔｒａＣＤＤ）に対する生分解能をもつことが知られており（Ｓｃｉｅｎｃｅ．　２２８，　１４３４−１４３６，１９８５、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．　３３，　１０９６９−１０９７６，　１９９４、Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１７４，　２１３１−２１３７，　１９９２）、リグニンペルオキシダーゼによる芳香環の電子１個の酸化が起こることが報告されている（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６１，　１６９４８−１６９５２，　１９８６等）。また、Ｐ．　ｓｏｒｄｉｄａがテトラからオクタクロロジベンゾ−Ｐ−ダイオキシン（ｏｃｔａＣＤＤ）までを生分解するとの報告もなされている（Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　６２，　４３２３−４３２８，　１９９６）。
【０００４】
また、本発明者らは、先に、腐朽木材からダイオキシン類を分解する白色腐朽菌をスクリーニングし、カーク（Ｋｉｒｋ）液体培地（ＨＣＬＮ）やポテトデキストロース（ＰＤＢ）培地で培養することが可能であるＭＺ−３４０株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６８６４）を単離し、このＭＺ−３４０株を用いて、焼却灰中のダイオキシン類を分解する新たな系の構築を行い、液相系および固相系の両方において、焼却灰中のダイオキシン類を効果的かつ効率的に分解することが可能となり、これにより、焼却により発生するダイオキシン類による環境汚染を防止し、ダイオキシン類汚染物の浄化を行うことが可能となることを報告している（ＷＯ００／１５３６１）。
【０００５】
他方、土壌その他の試料中における微生物の存否の確認や菌数の測定に当たっては、対象とする微生物を選択的に増殖し得る選択培地を使用して行うことが広く行われている。かかる選択培地を使用する場合、検出対象である特定の“属”や“種”のレベルの微生物の増殖に適する選択培地を比較的簡単に選択することができる場合が多いが、“株”レベルで選択・同定することができる選択培地は殆ど存在しないというのが現状である。そこで、試料中における特定の菌株の存否を検出する方法として、従来、特定の菌株が本来持っていない外来遺伝子をマーカーとして該菌株に導入し、マーカー遺伝子を導入した菌株を土壌などの所定の環境に施した後、その土壌などを試料として採取して、その環境下における該菌株の増殖状態、生残状態、菌数の調査や測定を行う方法（Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｆｅｂ．，　４４６−４５３，　１９８８）や、複数の菌株を含む試料にランダムプライマーを用いてＰＣＲを実施し、複製・増幅されたＤＮＡ断片混合物を電気泳動によって、それぞれの菌株に特有のバンドを検出する方法（Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｊｕｎｅ，　１７５２−１７５５，　１９９３）や、特定の種に属する菌に共通する特異的な塩基配列を複製・増幅できるランダムプライマーを用いてＰＣＲを実施し、試料中の特定の種に属する微生物を検出する方法（Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｏｃｔ．，　３７３９−３７４５，　１９９４）や、ＰＣＲによってランダムに複製・増幅されたＤＮＡ断片から特定の塩基配列を決定し、その塩基配列を選択的に複製・増幅し得る特異的プライマーを合成し、この特異的プライマーを用いてＰＣＲをする方法（特開平８−２５６７９９号公報）などが提案されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように土壌中に存在する白色腐朽菌はダイオキシン類の分解に有用であるが、このような白色腐朽菌から特に有用な特定の白色腐朽菌株の存否やその存在量を明らかにする方法は未だ報告されておらず、かかる方法の開発が望まれている。従って、本発明の課題は、土壌中に存在する白色腐朽菌から特定の白色腐朽菌株を簡便かつ精度よく検出することができる白色腐朽菌株の検出方法や定量方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記のようなダイオキシンの分解に有用な白色腐朽菌についての研究を鋭意行っており、セリポリア・エスピー（Ｃｅｒｉｐｏｒｉａ　ｓｐ．）ＭＺ−３４０株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６８６４）（以下、単に「ＭＺ−３４０株」ということがある。）等のダイオキシンの分解能に優れた微生物菌株を多数分離・同定している。また、ＭＺ−３４０株のゲノムＤＮＡ中の菌株特異的な塩基配列（菌株特異的塩基配列）、すなわちＩＴＳ１領域を大腸菌ベクターにクローニングし、プローブ作製用の組換えベクターもすでに構築している。そこで、ＭＺ−３４０株の検出方法について鋭意検討した結果、土壌試料中の微生物からから抽出・精製したＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによりＭＺ−３４０株に特異的な塩基配列を選択的に複製・増幅することにより、ＭＺ−３４０株のみを検出・定量することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、土壌中に存在する白色腐朽菌から特定の白色腐朽菌株を検出する方法であって、土壌を冷却下に粉砕し、溶出緩衝液を用いてＤＮＡを回収し、得られるＤＮＡ回収液を保温した後、ＤＮＡ精製処理を行ってＤＮＡサンプルを調製するＤＮＡサンプル調製工程と、前記特定の白色腐朽菌株のゲノムＤＮＡ中の菌株特異的な塩基配列を決定する菌株特異的塩基配列決定工程と、前記菌株特異的塩基配列の配列情報に基づいて設計した塩基配列からなるプライマーを調製するプライマー調製工程と、前記プライマーを用いて、前記ＤＮＡサンプルを鋳型として、前記特定の白色腐朽菌株のゲノムＤＮＡ中の菌株特異的塩基配列を選択的に複製・増幅する複製・増幅工程と、前記選択的に複製・増幅された菌株特異的塩基配列を検出する検出工程とを有することを特徴とする白色腐朽菌株の検出方法（請求項１）や、溶出緩衝液が、ＣＴＡＢ溶液であることを特徴とする請求項１に記載の白色腐朽菌株の検出方法（請求項２）や、ＤＮＡ精製処理が、ＤＮＡ回収液にフェノール−クロロホルムを加え混合した後に遠心分離処理し、上清に冷エタノールを加えて放置するステップを含む処理であることを特徴とする請求項１又は２に記載の白色腐朽菌株の検出方法（請求項３）や、特定の白色腐朽菌株が、セリポリア属微生物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の白色腐朽菌株の検出方法（請求項４）や、セリポリア属微生物が、セリポリア・エスピー（Ｃｅｒｉｐｏｒｉａ　ｓｐ．）ＭＺ−３４０株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６８６４）であることを特徴とする請求項４に記載の白色腐朽菌株の検出方法（請求項５）や、菌株特異的塩基配列が、配列表の配列番号１で示される塩基配列であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の白色腐朽菌株の検出方法（請求項６）や、配列表の配列番号２及び配列番号３で示される塩基配列からなる一組のプライマーを用いることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の白色腐朽菌株の検出方法（請求項７）に関する。
【０００９】
また本発明は、土壌中に存在する白色腐朽菌から特定の白色腐朽菌株を定量する方法であって、土壌を冷却下に粉砕し、溶出緩衝液を用いてＤＮＡを回収し、得られるＤＮＡ回収液を保温した後、ＤＮＡ精製処理を行ってＤＮＡサンプルを調製するＤＮＡサンプル調製工程と、前記特定の白色腐朽菌株のゲノムＤＮＡ中の菌株特異的な塩基配列を決定する菌株特異的塩基配列決定工程と、前記菌株特異的塩基配列の配列情報に基づいて設計した塩基配列からなるプライマーを調製するプライマー調製工程と、前記プライマーを用いて、前記ＤＮＡサンプルを鋳型として、前記特定の白色腐朽菌株のゲノムＤＮＡ中の菌株特異的塩基配列を選択的に複製・増幅する複製・増幅工程と、前記選択的に複製・増幅された菌株特異的塩基配列の量を測定する定量工程とを有することを特徴とする白色腐朽菌株の定量方法（請求項８）や、溶出緩衝液が、ＣＴＡＢ溶液であることを特徴とする請求項８に記載の白色腐朽菌株の定量方法（請求項９）や、ＤＮＡ精製処理が、ＤＮＡ回収液にフェノール−クロロホルムを加え混合した後に遠心分離処理し、上清に冷エタノールを加えて放置するステップを含む処理であることを特徴とする請求項８又は９に記載の白色腐朽菌株の検出方法（請求項１０）や、特定の白色腐朽菌株が、セリポリア属微生物であることを特徴とする請求項８〜１０のいずれかに記載の白色腐朽菌株の定量方法（請求項１１）や、セリポリア属微生物が、セリポリア・エスピー（Ｃｅｒｉｐｏｒｉａ　ｓｐ．）ＭＺ−３４０株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６８６４）であることを特徴とする請求項１１に記載の白色腐朽菌株の定量方法（請求項１２）や、菌株特異的塩基配列が、配列表の配列番号１で示される塩基配列であることを特徴とする請求項８〜１２のいずれかに記載の白色腐朽菌株の定量方法（請求項１３）や、配列表の配列番号２及び配列番号３で示される塩基配列からなる一組のプライマーを用いることを特徴とする請求項８〜１３のいずれかに記載の白色腐朽菌株の定量方法（請求項１４）に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の白色腐朽菌株の検出方法としては、土壌中に存在する白色腐朽菌から特定の白色腐朽菌株を検出する方法であって、土壌を冷却下に粉砕し、溶出緩衝液を用いてＤＮＡを回収し、得られるＤＮＡ回収液を保温した後、ＤＮＡ精製処理を行ってＤＮＡサンプルを調製するＤＮＡサンプル調製工程と、前記特定の白色腐朽菌株のゲノムＤＮＡ中の特異的な塩基配列を決定する菌株特異的塩基配列決定工程と、前記株特異的塩基配列の配列情報に基づいて設計した塩基配列からなるプライマーを調製するプライマー調製工程と、前記プライマーを用いて、前記ＤＮＡサンプルを鋳型として、前記特定の白色腐朽菌株のゲノムＤＮＡ中の株特異的塩基配列を選択的に複製・増幅する複製・増幅工程と、前記選択的に複製・増幅された株特異的塩基配列を検出する検出工程とを有する方法であれば特に制限されるものではなく、かかる本発明の白色腐朽菌株の検出方法によれば、多種にわたる微生物が多数混在する土壌中から、例えば、有毒物質であるダイオキシンの分解に特に有用な白色腐朽菌株（特定の白色腐朽菌株）の検出を簡便かつ精度よく行うことができる。
【００１１】
また、本発明の白色腐朽菌株の定量方法としては、土壌中に存在する白色腐朽菌から特定の白色腐朽菌株を定量する方法であって、土壌を冷却下に粉砕し、溶出緩衝液を用いてＤＮＡを回収し、得られるＤＮＡ回収液を保温した後、ＤＮＡ精製処理を行ってＤＮＡサンプルを調製するＤＮＡサンプル調製工程と、前記特定の白色腐朽菌株のゲノムＤＮＡ中の菌株特異的な塩基配列を決定する菌株特異的塩基配列決定工程と、前記菌株特異的塩基配列の配列情報に基づいて設計した塩基配列からなるプライマーを調製するプライマー調製工程と、前記プライマーを用いて、前記ＤＮＡサンプルを鋳型として、前記特定の白色腐朽菌株のゲノムＤＮＡ中の菌株特異的塩基配列を選択的に複製・増幅する複製・増幅工程と、前記選択的に複製・増幅された菌株特異的塩基配列の量を測定する定量工程とを有する方法であれば特に制限されるものではなく、かかる本発明の白色腐朽菌株の定量方法によれば、多種にわたる微生物が多数混在する土壌中から、例えば、有毒物質であるダイオキシンの分解に特に有用な白色腐朽菌株（特定の白色腐朽菌株）の定量を簡便に行うことができる。
【００１２】
検出・定量対象とする前記特定の白色腐朽菌株としては特に制限されないが、ダイオキシン類を効率よく分解することができる微生物であるセリポリア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉａ）属微生物であることが好ましく、ＭＺ−３４０株であることがより好ましい。
【００１３】
前記菌株特異的塩基配列としては、検出目的とする特定の白色腐朽菌株のゲノムＤＮＡ中の菌株特異的な塩基配列であれば特に制限されないが、例えば、配列表の配列番号１で示される塩基配列が挙げられ、これはＭＺ−３４０株に特異的である。また、本検出方法に用いるプライマーとしては、前記菌株特異的塩基配列の配列情報に基づいて設計される塩基配列であれば特に制限されないが、例えば、配列表の配列番号２で示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号３で示される塩基配列からなる一組のプライマーが挙げることができ、これらはＭＺ−３４０株の検出に好適に用いることができる。
【００１４】
以下、本発明の白色腐朽菌株の検出・定量方法における工程を各工程ごとに説明する。
ＤＮＡサンプル調製工程においては、土壌を冷却下に粉砕し、溶出緩衝液を用いてＤＮＡを回収し、得られるＤＮＡ回収液を保温した後、ＤＮＡ精製処理を行ってＤＮＡサンプルを調製する。液体窒素等を用いて土壌を冷却下に粉砕することで、ＤＮＡ分解酵素の活性を抑制し、ＤＮＡの分解や変質を防ぐことができるばかりでなく、細胞を壊しやすくすることができる。また、溶出緩衝液としてはＤＮＡを効率よく抽出することができる緩衝液であればどのようなものでもよく、ポリサッカライドを効率的に除去することができるＣＴＡＢ溶液（０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ，２％　ＣＴＡＢ，１．４Ｍ　ＮａＣｌ，２０ｍＭ　ＥＤＴＡ，２％　ＰＶＰ；ｐＨ８．０）を好適に例示することができる。かかるＣＴＡＢ溶液を用いたＤＮＡ回収液は、例えば６５℃で３０分間保温した後、等量のフェノール−クロロホルムを添加・混合し、タンパク等の不純物を遠心分離により除去し、上清に冷エタノールを加えて−２０℃程度で放置してするＤＮＡを沈殿させるステップを含む処理を行うことが好ましい。また、冷エタノール処理後の遠心分離により得られるペレットを滅菌水に溶かし、クロロホルム処理を２回以上行って再度冷エタノール処理を行うことが好ましい。
【００１５】
菌株特異的塩基配列決定工程においては、前記特定の白色腐朽菌株のゲノムＤＮＡ中の菌株特異的な塩基配列（菌株特異的塩基配列）を決定する。この菌株特異的塩基配列の決定は、検出対象となる特定の白色腐朽菌株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＩＴＳ領域の塩基配列を真菌特異的に設計されたプライマー（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１６：　８７−１７３，　１９８８）を用いてＰＣＲ法にて増幅し、例えば、増幅断片を市販の精製カラム（ＱＩＡＧＥＮ社製）等で精製後、４色ダイターミネーター法によるシークエンスをＡＢＩ　ＰＲＩＺＭＴＭ　３７７　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　（Ｐ．Ｅ．　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行うことができる。シークエンスデータは解析用ソフト”ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ　９．０”（Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｃｏ．　Ｌｔｄ．）を用いて相補鎖の配列とあわせ、シークエンスを確定する。他の担子菌との相同性を比較し、前記の特定白色腐朽菌に固有の配列を特異的プライマーとして設計することができる。
【００１６】
プライマー調製工程においては、前記菌株特異的塩基配列の配列情報に基づいてプライマーを設計する。このプライマーの設計は常法により行うことができ、また、プライマーの塩基配列の長さは、検出対象とする菌株のゲノムＤＮＡ中の特異的な塩基配列の長さなどに応じて適宜設計することができるが、通常１０〜５０−ｍｅｒ、好ましくは１５〜３０−ｍｅｒである。例えば、ＭＺ−３４０株の検出を行う場合、配列表の配列番号２で示される塩基配列からなるフォワード及び配列表の配列番号３で示される塩基配列からなるリバースの一組のプライマーを具体的に例示することができる。
【００１７】
複製・増幅工程においては、前記プライマーを用いて、前記ＤＮＡサンプルを鋳型として、前記特定の白色腐朽菌株のゲノムＤＮＡ中の菌株特異的塩基配列を選択的に複製・増幅する。前記ＤＮＡサンプルを鋳型とする菌株特異的塩基配列の複製・増幅は、ＰＣＲにより行うことができる。具体的には、ＤＮＡサンプル中の二本鎖ＤＮＡの一本鎖への解離、ＤＮＡの一本鎖とプライマーとのアニーリング、及びＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成の３反応を繰り返すことによって行うことができる。具体的には、例えば、菌株から採取したゲノムＤＮＡを緩衝液に入れてＤＮＡ液を形成し、これにプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを加えて、加熱下におけるＤＮＡ二本鎖の一本鎖への解離、それよりも低い温度でのＤＮＡの一本鎖とプライマーとのアニーリング、及びアニーリング温度よりも高い温度でのＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成の３反応を複数サイクル（通常２０〜５０回程度）繰り返して、特異的塩基配列の複製・増幅を行う。
【００１８】
上記ＰＣＲの条件としては、二本鎖ＤＮＡの一本鎖への解離を９０〜９５℃程度に加熱して行うことが好ましく、その場合、ＤＮＡポリメラーゼとしては、９０〜９５℃程度に加熱してもその活性が失われない耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを使用するのが好ましい。耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを用いた場合には、上記の３反応の繰り返しごとにＤＮＡポリメラーゼを新たに反応系に添加する必要がなく、ＤＮＡ断片の複製・増幅を速やかに且つ簡単に行うことができる。そのような耐熱性のＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、宝酒造株式会社製の「ＴＡＫＡＲＡ　ＥｘＴａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」（商品名）等が挙げられる。なお、上記の複製・増幅を行う反応系における、菌株から採取したゲノムＤＮＡの量（濃度）、プライマーの量（濃度）、ＤＮＡポリメラーゼの量（濃度）、反応時間等は、菌株の種類やその他の状況に応じて、適宜決定することができる。
【００１９】
白色腐朽菌株の検出方法における検出工程においては、前記選択的に複製・増幅された菌株特異的塩基配列を検出する。具体的には、例えば、上記の複製・増幅処理を行ったＰＣＲ産物を電気泳動等により分析する。その結果、プライマーによって複製・増幅された検出対象とする菌株に特異的な塩基配列（菌株特異的塩基配列）が検出された場合（電気泳動による場合は該特異的な塩基配列に基づくバンドが出現した場合）には、土壌試料に含まれる菌類から分離・採取されたゲノムＤＮＡ混合物中に検出対象とする菌株に由来するゲノムＤＮＡが含まれているということができ、試料中には検出目的とする菌株が存在していることを確認することができる。一方、特異的プライマーによって複製・増幅された検出目的とする菌株に特異的な塩基配列が検出されない場合（電気泳動の場合は該特異的な塩基配列に基づくバンドが出現しない場合）は、試料に含まれる菌類から分離・採取されたゲノムＤＮＡ混合物中には検出目的とする菌株に由来するゲノムＤＮＡが含まれず、したがって試料中に検出対象とする菌株が存在しないことを確認することができる。
【００２０】
他方、白色腐朽菌株の定量方法における定量工程においては、前記選択的に複製・増幅された菌株特異的塩基配列の量を測定する。具体的には、例えば、上記の複製・増幅処理を行ったＰＣＲ産物の吸光度（Ａ２８０）を測定する。得られた測定値に基づいて、あらかじめ作成しておいた標準曲線から菌体量を求めることができる。標準曲線は、定量対象である白色腐朽菌株の各種菌体量と、同様に複製・増幅処理を行った各種ＰＣＲ産物の吸光度（Ａ２８０）との関係をプロットすることにより作成することができる。
【００２１】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［実験例１］
＜ＭＺ−３４０株の検出＞
セリポリア属を含む以下の白色腐朽菌株を供試菌株として用い、ＭＺ−３４０株の検出を試みた。
2004041024.tif 000002
【００２２】
（菌株特異的塩基配列決定工程）
まず、ＰＤＢブロス培地を用いて供試菌株を３０℃で２日間培養し、遠心濾過により集めた菌体から、文献（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　１５（１）：　８−１５，　１９９７）記載の方法に準じてゲノムＤＮＡを単離した。合成オリゴヌクレオチドプライマー（北海道システムサイエンス社製）及びＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社製「ＴＡＫＡＲＡ　ＥｘＴａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」）を用いてＰＣＲによって増幅・複製を行った。なお、ＰＣＲ反応は、ＤＮＡサーマルサイクラー（ＡＳＴＥＣ社製、モデル名「ＰＣ８０１」）を用い、９４℃１分→（９４℃３０秒→５５℃３０秒→７２℃１分）×２２サイクル→７２℃５分の条件で行った。複製・増幅した複数のＤＮＡ断片の混合物を、ＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭ　トリス酢酸／１ｍＭ　ＥＤＴＡ；ｐＨ８．０）を用いて１．０％アガロースゲル上に電気泳動させた後、エチジウムブロミドを用いて染色して発色させて、それぞれのＤＮＡ断片に起因するバンドをアガロースゲル上に出現させ、ＭＺ−３４０株由来のものと他の供試菌由来のものとを比較し、ＭＺ−３４０株のゲノムＤＮＡ中の特異的な塩基配列を見い出し、それをＭＺ−３４０株の菌株特異的塩基配列とした。かかる菌株特異的塩基配列を常法により配列決定をしたところ、配列表の配列番号１で示される塩基配列であった。
【００２３】
（プライマーの調製）
前記菌株特異的塩基配列工程で決定したＭＺ−３４０株の菌株特異的塩基配列（配列番号１）に基づいて、Ｆ側（ＩＴＳ１−Ｕ）５’−ＧＧＴＴＧＴＡＧＣＴＧＧＣＣＴＴＴＡＡＣ−３’（配列番号２）プライマー及びＲ側（ＩＴＳ−２Ｒ）５’−ＧＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＡＴＧＣ−３’（配列番号３）プライマーをそれぞれ常法により合成し、ＭＺ−３４０ゲノム特異的プライマーとした。
【００２４】
（増幅・複製工程）
上記Ｎｏ．１〜Ｎｏ．１０の菌株についてそれぞれ、上記合成したＭＺ−３４０ゲノム特異的プライマー及びＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社製「ＴＡＫＡＲＡＥｘＴａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」）を用いてＰＣＲによって増幅・複製を行った。なお、ＰＣＲ反応は、ＤＮＡサーマルサイクラー（ＡＳＴＥＣ社製、モデル名「ＰＣ８０１」）を用い、９４℃１分→（９４℃３０秒→５５℃３０秒→７２℃１分）×２２サイクル→７２℃５分の条件で行った。
（検出工程）
上記Ｎｏ．１〜Ｎｏ．１０の菌株について、ＰＣＲにより複製・増幅したＤＮＡ断片を、ＴＡＥ緩衝液を用いて１．０％アガロースゲル上に電気泳動させた後、エチジウムブロミドを用いて染色して発色させて、それぞれのＤＮＡ断片に起因するバンドをアガロースゲル上に出現させた。結果を図１Ｂに示す。
【００２５】
［比較実験例１］
調製したＭＺ−３４０ゲノム特異的プライマーに代えて、Ｆ側（ＦＯ−５１３）５’−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＣＡＡＡＣＴＴＧＧＴＣＡＴＴＴＡＧＡＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴ−３’（配列番号４）プライマー及びＲ側（ＩＴＳ−２Ｒ）５’−ＧＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＡＴＧＣ−３’（配列番号３）プライマーからなる真菌用の合成プライマーを用いた以外は実験例１と同様にして、対象用菌株の検出を行った。結果を図１Ａに示す。
【００２６】
（結果）
図１Ｂから明らかなように、ＭＺ−３４０ゲノム特異的プライマーを用いた実験例１では、ＭＺ−３４０株のレーンにのみＤＮＡ断片の増幅が確認され、検出対象とするＭＺ−３４０株（特定の白色腐朽菌株）のみが検出された。それに対し、図１Ａから明らかなように、真菌用の合成プライマーを用いた比較実験例１では、Ｎｏ．１〜Ｎｏ．１０のすべての供試菌株（全レーン）においてＤＮＡ断片の増幅が確認され、検出対象とするＭＺ−３４０株（特定の白色腐朽菌株）のみを検出することはできなかった。
【００２７】
［実施例１］
＜土壌中におけるＭＺ−３４０株の生育の挙動解析＞
２０ｇの土壌にＭＺ−３４０株懸濁液を植菌し３０℃で培養を行い、３日ごとに培養フラスコ内で均一となるよう混合後、５ｇのサンプルを乳鉢中で液体窒素を用いながら処理した。処理したサンプルを１０ｍｌのＣＴＡＢ溶液（０．１ＭＴｒｉｓ，２％　ＣＴＡＢ，１．４Ｍ　ＮａＣｌ，２０ｍＭ　ＥＤＴＡ，２％ＰＶＰ／ｐＨ９．０）で回収し６５℃で３０分間保温した。保温後、等量のフェノール−クロロホルムを加え混合後、１００００×ｇで１２ｋｒｐｍで２０分間遠心し、上清に１．５倍量の冷エタノールを加え、−２０℃で一晩放置した。１００００×ｇで２０分間遠心しペレットを６００μｌの滅菌水に溶かし、クロロホルム処理を２回行った。１．５倍量の冷エタノールを加え−２０℃で一晩放置後、１００００×ｇで２０分間遠心し、ペレットを１００μｌの滅菌水に溶かした。ＱＩＡＧＥＮ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔにより精製し、５０μｌの溶出バッファーで溶出しＤＮＡサンプルとした。本サンプルを１００倍希釈した溶液、１μｌを用い１回のＰＣＲ反応に供した。ＰＣＲ反応は、上記実験例１で調製したＭＺ−３４０ゲノム特異的プライマー、及びＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社製「ＴＡＫＡＲＡ　ＥｘＴａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」）を用い、９４℃
１分→（９４℃　３０秒→５５℃　３０秒→７２℃　１分）×２２サイクル→７２℃　５分の反応条件で行った。ＰＣＲ後のサンプル１０μｌを電気泳動に供した。また、ＰＣＲ後のサンプルの吸光度（Ａ２８０）を測定した。
【００２８】
（結果）
各培養日数における電気泳動の結果を図２に示し、培養日数に対するサンプルの吸光度の変化を図３に示す。図２から明らかなように、電気泳動によってＭＺ−３４０株のＤＮＡ断片の増幅が確認され、検出目的とするＭＺ−３４０株（特定の白色腐朽菌株）が検出され、ＭＺ−３４０株の生育の定性的な挙動が明らかとなった。また、図３から明らかなように、サンプルの吸光度を測定することにより各培養日数におけるＰＣＲ産物量が数値化され、ＭＺ−３４０株の生育の定量的な挙動がより明らかとなった。
【００２９】
【発明の効果】
本発明の白色腐朽菌株の検出方法及び定量方法によれば、土壌中に存在する白色腐朽菌から特定の白色腐朽菌株を簡便かつ精度よく検出又は定量することができる。
【００３０】
【配列表】
2004041024.tif 000003
2004041024.tif 000004
2004041024.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】Ａは、ランダムプライマーを用いたＰＣＲ後の電気泳動による検出結果を示す図であり、Ｂは、ＭＺ−３４０ゲノム特異的プライマーを用いたＰＣＲ後の電気泳動による検出結果を示す図である。
【図２】本発明の白色腐朽菌株の検出方法を用いた、各培養日数におけるＭＺ−３４０株のＰＣＲ後の電気泳動による検出結果を示す図である。
【図３】本発明の白色腐朽菌株の定量方法を用いた、各培養日数におけるＭＺ−３４０株の吸光度による定量結果を示す図である。
【図１】
2004041024.tif 000006
【図２】
2004041024.tif 000007
【図３】
2004041024.tif 000008