(57)【要約】【課題】安定性、安全性、価格に優れた大動脈平滑筋細胞、エンドセリン変換酵素、心房性ナトリウム利尿ペプチド、ホスホジエステラーゼＩＶが関与する疾患、例えば循環器系疾患や炎症性疾患の予防又は治療のための組成物を提供すること。【解決手段】ケール又はその抽出物を含有する、大動脈平滑筋細胞、エンドセリン変換酵素、心房性ナトリウム利尿ペプチド、ホスホジエステラーゼＩＶの関与により引き起こされる、粥状動脈硬化、糖尿病性血管障害、脳虚血発作、狭心症、心筋梗塞、肺高血圧症、慢性腎不全などの循環器系疾患や喘息、皮膚炎、リューマチ、多発性硬化症などの炎症性疾患に有用な組成物及びそれらを含有する経口又は非経口組成物、食品、化粧料、医薬。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケール又はその抽出物を含有することを特徴とする大動脈平滑筋細胞増殖抑制剤。
【請求項２】
ケール又はその抽出物を含有することを特徴とするエンドセリン変換酵素阻害剤。
【請求項３】
ケール又はその抽出物を含有することを特徴とする心房性ナトリウム利尿ペプチド受容体作動剤。
【請求項４】
ケール又はその抽出物を含有することを特徴とするホスホジエステラーゼＩＶ阻害剤。
【請求項５】
ケール又はその抽出物を含有することを特徴とする循環器系疾患の予防又は治療剤。
【請求項６】
ケール又はその抽出物を含有することを特徴とする炎症性疾患の予防又は治療剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の剤を含有する経口用又は非経口用組成物
【請求項８】
食品の形態である請求項７記載の経口用組成物。
【請求項９】
化粧料の形態である請求項７記載の非経口用組成物。
【請求項１０】
医薬の形態である請求項７記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、大動脈平滑筋細胞、エンドセリン変換酵素、心房性ナトリウム利尿ペプチド、ホスホジエステラーゼＩＶが関与する疾患に有用な組成物及びそれらを含有する経口又は非経口組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】日本人の三大死因は、脳卒中、癌、心筋梗塞（虚血性心疾患）である。このうち脳卒中、心疾患は血管の障害に基づく循環器系疾患であり、血管の老化、損傷、機能低下等がその要因と考えられている。一例として、心臓血管障害により生じる心筋梗塞は、冠状動脈の閉塞または急激な血流減少により心筋細胞の虚血性壊死を生じて心機能低下をもたらす。心筋梗塞の直接的原因は、冠状動脈硬化や冠状動脈内の血栓形成による心筋への血流減少又は停止である。
【０００３】
冠動脈硬化症は、動脈壁に加えられる様々な刺激・傷害による内皮細胞の脱落や機能障害に端を発し、マクロファージ、リンパ球の内皮下への浸潤と脂質の取り込みによる泡沫細胞化、内皮細胞傷害部位に対する血小板付着とその活性化に誘発される平滑筋細胞の遊走・増殖によるプラーク形成へと進む。プラークが破綻し、潰瘍を形成すると血栓が生じ、脳虚血発作、狭心症、心筋梗塞などの動脈硬化性疾患に至る。動脈が傷害されたあとに起こる血管壁の細胞増殖性の変化は内膜肥厚につながり、病態の悪化をもたらす。
【０００４】
このように、動脈硬化性疾患は、血管平滑筋細胞の過剰増殖が原因の一つと考えられている（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１４，ｐ４８８，１９８６）。従って、血管平滑筋細胞の過剰増殖を抑制することによって、動脈硬化性疾患の予防または治療が可能であると考えられており、これまでに、血管平滑筋細胞増殖抑制能を有する物質の開発が多数行われている。（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３，ｐ１１２９，１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，ｐ８４７４，１９９３、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，１１，ｐ１０７３，１９９３など）。
【０００５】
エンドセリン（以下、ＥＴと略す）は、２１残基のアミノ酸からなるペプチドであり、血管内皮から分泌され、強力な血管収縮作用や気管平滑筋収縮作用を有し、肺高血圧症、虚血性心疾患、慢性腎不全などの発症因子であることが示唆されている（Ｎａｔｕｒｅ，３３２，ｐ４１１，１９８８　など）。ＥＴはその生合成において、活性の低い前駆体であるビッグエンドセリン；（以下、ｂｉｇ　ＥＴと略す）から特異的プロテアーゼであるＥＴ変換酵素（以下、ＥＣＥと略す）により生成される（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，１７１，ｐ６６９，１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　１７１，　ｐ１１９２，１９９０　）。従ってＥＣＥを阻害してＥＴの生成を抑制すれば、上記疾患の予防、治療等に有効であると考えられる。これまでに、ＥＣＥ阻害剤の探求が行われ、例えばホスホラミドン（特開平４−４１４３０号公報）、アスペルギロマラスミンＡ及びＢ（特開平６−１９２０８１号公報）特定のキナゾリン誘導体（特表平１０−５１０８３４号公報）などが知られている。
【０００６】
また、ＥＣＥを阻害する化合物の作用として、犬のクモ膜下出血モデルにおける脳血管攣縮抑制作用（Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ．，４９，ｐ８４１，１９９１）が確認されている。また、エンドセリン受容体拮抗剤によって、ラット肝移植後の組織不適合による急性腎不全が抑制されたことが報告されている（移植２８，２６１　，１９９３）。
【０００７】
ナトリウム利尿ペプチドには、３種類あり、心房性ナトリウム利尿ペプチド（以下、ＡＮＰと略す）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）およびＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）がある。これらのナトリウム利尿ペプチドは腎臓、副腎、血管壁に作用して全身の体液電解質や血圧の調節に重要な働きをしている（循環調節ペプチドと関連疾患，　ｐ１４，１９９２）。特に高血圧やうっ血性心不全において心臓におけるＡＮＰ及びＢＮＰの生合成が代償的に亢進することはよく知られている。ＡＮＰは血管拡張作用と利尿作用を有し、心不全等の心血管系疾患の治療剤として用いられている（薬理と治療，２３，ｐ９４９，１９９５）。
【０００８】
ホスホジエステラーゼ（以下、ＰＤＥと略す）は、５種類のアイソザイム（ＰＤＥ　Ｉ〜Ｖ）に分類されている（Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１２，ｐ１９，１９９１）。このうちＰＤＥ　ＩＶは、炎症細胞や内皮細胞などに分布しており、気道平滑筋の弛緩及び炎症細胞の機能の調節に関るサイクリックアデノシンモノリン酸（ｃＡＭＰ）の特異的分解酵素である。これまでに、ＰＤＥを阻害し、組織内のｃＡＭＰ濃度を高めることによって、狭心症、不整脈などを抑制することが報告されており、リューマチ（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１００，ｐ１２６，１９９５）、喘息や皮膚炎　（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２６６，ｐ３０６，１９９３、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１１２，ｐ３３２，１９９４、Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．，７，ｐ５７９，１９９４）、多発性硬化症（Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１，ｐ２４４，１９９４）、などの炎症性疾患にも有用であると考えられている（Ｔｈｏｒａｘ，４６，ｐ５１２，１９９１）。
【０００９】
このように、循環器系疾患、炎症性疾患に関る因子は、数多く研究され、メカニズムの解明や多数の化合物の提案に努められているが、副作用の低減された、より有効な薬剤を提供する必要性は依然として存在する。このことは、患者のＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ）をさらに改善するうえで重要な課題である。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、安定性、安全性、価格に優れた大動脈平滑筋細胞、ＥＣＥ、ＡＮＰ、ＰＤＥ　ＩＶが関与する疾患、例えば粥状動脈硬化（アテローム性硬化症）、糖尿病性血管障害、脳虚血発作、狭心症、心筋梗塞などの循環系疾患や喘息や皮膚炎、リューマチ、多発性硬化症などの炎症性疾患の予防又は治療のための組成物を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ケールが大動脈平滑筋細胞増殖抑制作用、ＥＣＥ阻害作用、ＡＮＰ受容体作動作用、ＰＤＥ　ＩＶ阻害作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明は、ケール又はその抽出物を含有することを特徴とする、大動脈平滑筋細胞増殖抑制作用、ＥＣＥ阻害作用、ＡＮＰ受容体作動作用、ＰＤＥ　ＩＶ阻害作用を有する剤、これらを含有する経口用組成物、非経口用組成物、さらに、食品、化粧料、医薬の形態であるこれらの組成物に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明で使用されるケール（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｏｌｅｒａｃｅａ　ｖａｒ．ａｃｅｐｈａｌａ　ＤＣ．）には、キッチンケール、マローケール、ブッシュケール、ツリーケール、コラード、緑葉カンランなどがある。アブラナ科の植物でもともと南ヨーロッパ原産の野菜であり、キャベツの原種といわれている。使用するケールは、葉など通常食用として供されているもので構わないし、栽培方法や栽培地も特に限定されるものでもない。
【００１４】
ケール、その抽出物としては、ケール自身を乾燥させた乾燥物、その粉砕物、圧搾汁、水あるいはアルコール、エーテル、アセトンなどの有機溶媒による粗抽出物、および粗抽出物を分配、カラムクロマトなどの各種クロマトグラフィーなどで段階的に精製して得られた抽出物画分など、全てを含む。これらは単独で用いても良く、また２種以上混合して用いても良い。
【００１５】
例えば、ケールの葉、茎、花や根などの乾燥物１Ｋｇに９９．５％エタノール抽出液３Ｌを加え、室温で一晩浸漬することにより得た抽出液を、そのまま使用しても良いし、その抽出液を各種クロマトグラフィーを組み合わせて、精製したものを使用しても良い。
【００１６】
抽出されたケール抽出物の溶液中の抽出物濃度は特に制限はないが、１５〜７０質量％、好ましくは２０〜６０質量％程度が好ましい。この濃度が１５質量％未満では、乾燥時に多量のエタノールや水などの溶液を蒸発させる必要があり、７０質量％を超えると溶液の粘度が高くなり過ぎ、加工適性が悪くなる恐れがある。
【００１７】
ケール又はその抽出物は、大動脈平滑筋細胞増殖抑制作用、ＥＣＥ阻害作用、ＡＮＰ受容体作動作用、ＰＤＥ　ＩＶ阻害作用を有するので、血管拡張作用、気管支拡張作用、平滑筋弛緩作用、抗炎症作用などによって、それに関る疾患、例えば粥状動脈硬化（アテローム性硬化症）、糖尿病性血管障害、脳虚血発作、狭心症、心筋梗塞などの循環系疾患や喘息や皮膚炎などの炎症性疾患の予防又は治療に有効である。
【００１８】
本発明のケール又はその抽出物を含有する、大動脈平滑筋細胞増殖抑制作用、ＥＣＥ阻害作用、ＡＮＰ受容体作動作用、ＰＤＥ　ＩＶ阻害作用を有する組成物は、経口用の食品、非経口用の化粧料、経口用あるいは非経口用の医薬として製造することができる。
【００１９】
医薬としての適用方法は、経口投与又は非経口投与のいずれも採用することができる。投与に際しては、有効成分を経口投与、直腸内投与、注射などの投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与することができる。このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤、凍結乾燥製剤などが挙げられ、これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングルコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水などが挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤などの慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
【００２０】
食品としては、ケール乾燥物又は抽出物などをそのまま、又は種々の栄養成分を加えて、若しくは飲食品中に含有せしめて、大動脈平滑筋細胞、ＥＣＥ、ＡＮＰ、ＰＤＥ　ＩＶの関与する疾患の症状改善及び予防に有用な保健用食品又は食品素材として使用できる。例えば、澱粉、乳糖、麦芽糖、植物油脂粉末、カカオ脂末、ステアリン酸などの適当な助剤を添加した後、慣用の手段を用いて、食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペーストなどに成形して食用に供してもよく、また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージなどの食肉加工食品、かまぼこ、ちくわなどの水産加工食品、パン、菓子、バター、粉乳、発酵乳製品に添加して使用したり、水、果汁、牛乳、清涼飲料などの飲料に添加して使用してもよい。
【００２１】
本発明の配合量は、当該食用組成物の種類や状態などにより適宜設定される。本発明のケール又はその抽出物の有効投与量は、患者の年齢、体重、症状、患者の程度、投与経路、投与スケジュール、製剤形態などにより、適宜決定することができ、例えば、ケール抽出物の経口投与の場合、乾燥重量として、通常成人換算で０．１ｇ／体重ｋｇ以上である。１日に数回に分けて投与してもよい。
【００２２】
また、本発明のケール又はその抽出物を配合した化粧料素材、化粧料の形態で製造することができる。例えば、ケールの乾燥物又は抽出物などを小麦胚芽油あるいはオリーブ油に添加して、これを化粧料素材として使用することができる。
【００２３】
また、ケール乾燥物又は抽出物などを直接、化粧料成分として使用し、化粧料を製造することができる。化粧料には、植物油のような油脂類、高級脂肪酸、高級アルコール、シリコーン、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤、防腐剤、糖類、金属イオン封鎖剤、水溶性高分子のような高分子、増粘剤、粉体成分、紫外線吸収剤、紫外線遮断剤、ヒアルロン酸のような保湿剤、香料、ｐＨ調整剤等を含有させることができる。ビタミン類、皮膚賦活剤、血行促進剤、常在菌コントロール剤、活性酸素消去剤、抗炎症剤、美白剤、殺菌剤等の他の薬効成分、生理活性成分を含有させることもできる。
【００２４】
化粧料としては、化粧水、乳液、クリーム、パック等の皮膚化粧料、メイクアップベースローション、メイクアップクリーム、乳液状又はクリーム状あるいは軟膏型のファンデーション、口紅、アイカラー、チークカラーといったメイクアップ化粧料、ハンドクリーム、レッグクリーム、ボディローション等の身体用化粧料等、入浴剤、口腔化粧料、毛髪化粧料とすることができる。本発明の方法で得られる、ＥＣＥ阻害作用、ＰＤＥ　ＩＶ阻害作用などを有する組成物を含有せしめた化粧料としては、機能面からは、例えば乳液、化粧液、フェイスクリーム、ハンドクリーム、ローション、エッセンスなどが好ましい。
【００２５】
このような化粧料は、常法に従って製造することができる。化粧料における本発明の植物の乾燥物または抽出物の添加量は、特に限定されるものではないが、一例としてあげると、乾燥重量で、化粧料全重量の０．０１〜２０質量％程度が適当である。
【００２６】
本発明のケール又はその抽出物は、天然物であるためその毒性は低く、有害な副作用など報告されていない。また、ケールは栽培により入手できる野菜類であるから、ケール、又はその抽出物を有効成分とする本発明の組成物は、安全であるとともに、価格面においても問題のない優れたものである。
【００２７】
【実施例】以下に実施例を挙げて具体的に説明するが、これに限定されるものではない。
【００２８】
［製造例１］ケール抽出物
ケールの葉を９０℃で乾燥させ、苦みの渋味成分となる酵素を失活させた。なお、ケール葉乾燥方法については、特に限定されるものではない。その粉砕物４ｋｇを電熱式水浴機で加熱還流しながら、９９．５％エタノール（和光純薬工業）２０Ｌを用いて抽出を行い、ケール抽出物８０ｇを得た。
【００２９】
［実施例１］大動脈平滑筋細胞の増殖抑制試験
大動脈平滑筋細胞増殖抑制試験は、Ｋｏｙａｍａらの方法（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７５，４，ｐ６８２，１９９４）を参考に行った。大動脈平滑筋細胞としてＡ７ｒ５を用いて、ケールの増殖抑制作用を、［３Ｈ］　チミジンの取り込みで評価した。Ａ７ｒ５を、２４穴ミクロプレート上に　２．５　ｘ　１０４／ｗｅｌｌ　まき、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中で、６時間培養した。その後、培養上清を捨てて、インシュリン（５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）及びナトリウムセレナイト（５　ｎｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ培地で２４時間培養し、それから血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）５０　ｎｇ／ｍｌを含む血清無含有培地に交換した。２４時間後、製造例１で得られたケール抽出物（最終濃度：３００、３μｇ／ｍｌ）と［３Ｈ］チミジン（２０μＣｉ／ｍｌ）を添加して、さらに６時間培養した。培養上清を除去後、Ａ７ｒ５をリン酸緩衝液で洗浄し、０．２５％のトリプシンを３７℃で５分間作用させて、細胞をウエルから剥離させた。それから、　［３Ｈ］チミジンに由来する放射活性を液体シンチレーションカウンターを使用して測定した。
ここで示す阻害率（％）は、次式により算出した。
Ａ７ｒ５増殖抑制率（％）＝［（Ｃ１−Ｃ０）／Ｃ１］×１００
（式中、Ｃ０は、既知量の試料サンプルが存在している状態での［３Ｈ］チミジン量を表わし、Ｃ１は、試料サンプル非存在下の［３Ｈ］チミジン量を表わす。）なお、参考として本反応系のポジティブコントロールである、チルホスチン９（Ａ７ｒ５増殖抑制剤）のＩＣ５０値（［３Ｈ］チミジンの取り込みを約５０％阻害する濃度）は、０．４８μＭであった。表１から、ケール抽出物が、大動脈平滑筋細胞の増殖抑制作用を有するので、動脈硬化性疾患の予防又は治療に有効であることがわかる。
【００３０】
【表１】
2004043381.tif 000002
【００３１】
［実施例２］ＥＣＥ阻害試験
ＥＣＥ阻害試験は、Ｄｏｎａｌｄ　Ｈｕｐｅらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，ｐ８６０６，１９９２）を参考に行った。培養したヒト血　管内皮細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ　７．４）で洗浄し、０．２５　Ｍスクロース、２０　ｍＭ塩化カリウムを含む　１０　ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ　７．５）を加え、セルスクレイパーを用いて細胞を掻き集めた。その細胞の懸濁液をｍｏｄｅｌ　ＧＥ　５０　ｓｏｎｉｃａｔｏｒ　（ｓｅｒｉａｌ　１９２１４Ｃ　）を用いて超音波破砕し、１０，０００ｇ×２０分、４℃の条件で遠心した。さらに上清を８０，０００ｇ×６０分、４℃の条件で遠心し、沈澱を０．２５　Ｍスクロース、２０　ｍＭ塩化カリウム、０．５％トリトンＸ−１００を含む　１０　ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ　７．５）に溶解し、膜画分とした。
【００３２】
酵素反応は、２μＭ　ｂｉｇ　ＥＴ−１、０．２５％トリトンＸ−１００、０．０１％窒化ナトリウムを含む１００　ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００μｌに、６μｇの膜画分、及び製造例１で得られたケール抽出物（最終濃度：５００μｇ／ｍｌ）を混合し、３７℃で１５分間プレインキュベートした。次いで、３７℃で２時間反応させた後、５　ｍＭ　ＥＤＴＡを１００μｌ加えて反応を停止させた。それから得られた反応液中のエンドセリンを、酵素免疫測定法を用いたサンドイッチ法（エンドセリン１測定キット：ＩＢＬ社）により定量した。まず、ヒトエンドセリン１に対するウサギＩｇＧ抗体を前もって固相した９６穴プレートに、上記反応終了後の反応液とヒトエンドセリン１標準液を１００μｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ヒトエンドセリン１標準液は、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で稀釈して調製した。それからリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）でプレートを洗浄後、抗エンドセリン１ウサギＦａｂ’ペルオキシダーゼ標識抗体を０．３μｇ添加し、３７℃で３０分間反応させた。さらにリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）でプレートを洗浄後、０．０３％過酸化水素含有緩衝液に０．４ｍｇ／ｍｌになるように溶解した基質となるＯ−フェニレンジアミンを、１００μｌ添加した。室温暗所で１５分間反応させた後、１Ｎ硫酸を１００μｌ添加して反応を停止させた。次いでＥＬＩＳＡ　プレートリーダー（ｍｏｄｅｌ　３５５０：Ｂｉｏ−Ｒａｄ　社）を用いて、４９０　ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００３３】
ＥＣＥ阻害活性の算出は、試料サンプルを含有しない場合をコントロールとして、試料サンプルのＥＣＥ阻害活性を次の式により算出した。ＥＣＥ阻害活性＝｛１−（試料サンプルを含有した場合の吸光度／コントロールの吸光度）｝×１００（％）。結果を表２に示す。なお、参考として本反応系のポジティブコントロールであるホスホラミドン（ＥＣＥ阻害剤）のＩＣ５０値（ＥＴ産生を５０％阻害する濃度）は、２．１μＭであった。表２から、ケール抽出物が、ＥＣＥ阻害作用を有するので、抗血管収縮作用や抗気管平滑筋収縮作用を介して、肺高血圧症、虚血性心疾患、慢性腎不全などの予防又は治療に有効であることがわかる。
【００３４】
【表２】
2004043381.tif 000003
【００３５】
［実施例３］ＡＮＰ受容体結合阻害試験
ＡＮＰ受容体結合阻害試験は、Ｔｈａｎ−Ｖｉｎｈ　Ｄａｍらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８３，ｐ１７４，１９８６）を参考に行った。モルモットの小脳を摘出し、既存の方法に従って膜粗画分を調製し、受容体膜標品とした。それから各試験管に、製造例１で得られたケール抽出物（最終濃度：５００μｇ／ｍｌ）とＡＮＰ受容体の作動剤である［１２５Ｉ］　ＡＮＰ　（最終濃度０．０５　ｎＭ）及び受容体膜標品（２００〜５００μｇの蛋白質を含む）を加えて反応液（総量６００　μｌ）とし、反応の開始は膜標品の添加により行った。なお、反応液には、１５０　ｍＭ塩化ナトリウム、５　ｍＭ塩化マンガン、０．００４％バシトラシンを含む５０　ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４　）を用いた。２２℃、６０分間のインキュベーションの後、受容体に結合した標識リガンドをセルハーベスター（ブランデル社製）を用いてワットマンＧＦ／Ｂグラスファイバーフィルター上に吸引濾過して反応を停止し、直ちに、氷冷５０　ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．７）５　ｍｌで３回洗浄した。次いで、フィルター上の放射能活性をγ−カウンターにより測定し、全結合量を求めた。また、同時に測定した０．１　μＭ　ＡＮＰ存在下における結合量を非特異的結合量とし、これを全結合量から差し引くことにより特異的結合量を求めた。
【００３６】
結果を表１に示す。ここで示す阻害率（％）は、次式により算出した。
阻害率（％）＝１００−〔（Ｃ２−Ｂ１）／（Ｃ３　−Ｂ１）〕×１００
（式中、Ｃ２は、既知量の試料サンプルと［１２５Ｉ］　ＡＮＰが共存している状態での［１２５Ｉ］　ＡＮＰの膜画分に対する結合量を表わし、Ｃ３は、試料サンプルを除いた時の［１２５Ｉ］　ＡＮＰの膜画分に対する結合量を表わし、Ｂ１は、過剰のＡＮＰ（０．１μＭ）存在下での［１２５Ｉ］　ＡＮＰの膜画分に対する結合量を表わす。）なお、本反応系におけるポジティブコントロールとして、ＡＮＰのＩＣ５０値（ＡＮＰ受容体結合を５０％阻害する濃度）は、０．１１　ｎＭであった。表３から、ケール抽出物が、ＡＮＰ受容体作動作用を有するので、血管拡張作用等によって、それに関る疾患、例えば循環器系疾患の予防又は治療に有効であることがわかる。
【００３７】
【表３】
2004043381.tif 000004
【００３８】
［実施例４］ＰＤＥ　ＩＶ阻害試験
ＰＤＥ　ＩＶ阻害試験は、Ｌｅｎｏｒａ　Ｂ．Ｃｉｅｓｌｉｎｓｋｉらの方法（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２６３，３，ｐ１１９５，１９９２）を参考に行った。ＰＤＥ　ＩＶはヒト培養細胞株Ｕ９３７細胞より常法に従って精製した。酵素反応は、５　ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０　ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に、精製したＰＤＥ　ＩＶと基質として　［３Ｈ］ｃＡＭＰ（１μＭ）及び製造例１で得られたケール抽出物（最終濃度：５００μｇ／ｍｌ）を添加し３０℃、３０分間反応させた。それから１００℃の沸騰液中に５分間浸漬することによって反応を停止した。続いて洗浄用緩衝液（０．１　Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１　Ｍ　４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ），ｐＨ８．５）を各試験管に０．５　ｍｌずつ氷浴上で添加した。各試験管の内容物を、洗浄用緩衝液で予め平衡化したアフィ−ゲル６０１カラム（バイオラッド・ラボラトリーズ）に付与した。洗浄用緩衝液６ｍｌで２回洗浄し、次いで０．２５　Ｍ酢酸を４　ｍｌ加え［３Ｈ］５’ＡＭＰを溶離し、放射活性を液体シンチレーション・カウンターにて測定した。ここで示す阻害率（％）は、次式により算出した。
阻害率（％）＝［（Ｃ５−Ｃ４）／Ｃ５］×１００
（式中、Ｃ４は、既知量の試料サンプルが存在している状態での［３Ｈ］５’ＡＭＰ量を表わし、Ｃ５は、試料サンプル非存在下の［３Ｈ］５’ＡＭＰ量を表わす。）なお、参考として本反応系のポジティブコントロールである、ロリプラム（ＰＤＥ　ＩＶ阻害剤）のＩＣ５０値（［３Ｈ］ｃＡＭＰの［３Ｈ］５’ＡＭＰへの加水分解を約５０％阻害する濃度）は、０．２２μＭであった。表４から、ケール抽出物が、ＰＤＥ　ＩＶ阻害作用を有するので、組織内のｃＡＭＰ濃度を高めることによって、狭心症、喘息、皮膚炎、リューマチ、多発性硬化症などの予防又は治療に有効であることがわかる。
【００３９】
【表４】
2004043381.tif 000005
【００４０】
以下に処方例を示す。
［ジュースの製造］
製造例１で得られたケールのエタノール抽出物を用いて、常法に従って、下記の組成のジュースを製造した。
（組　　　　　　　成）　　　　　　　　　　　　　（配合：質量％）
冷凍濃縮温州みかん果汁　　　　　　　　　　　　　５．０
果糖ブドウ糖液糖　　　　　　　　　　　　　　　１１．０
クエン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．２
Ｌ−アスコルビン酸　　　　　　　　　　　　　　　０．０２
香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．２
色素　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１
ケール抽出物　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．２
水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　８３．２８
【００４１】
［錠剤の製造］
製造例１で得られたケールのエタノール抽出物を用いて、常法に従って、下記の組成の錠剤を製造した。
（組　　　　　　成）　　　　　　　　　　　　　　（配合：質量％）
ケール抽出物　　　　　　　　　　　　　　　　　２４
乳糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６３
コーンスターチ　　　　　　　　　　　　　　　　１２
グァーガム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
【００４２】
【発明の効果】本発明のケール又はその抽出物は、大動脈平滑筋細胞増殖抑制作用、ＥＣＥ阻害作用、ＡＮＰ受容体作動作用、ＰＤＥ　ＩＶ阻害作用を有することから、粥状動脈硬化、糖尿病性血管障害、脳虚血発作、狭心症、心筋梗塞、肺高血圧症、慢性腎不全などの循環器系疾患や喘息、皮膚炎、リューマチ、多発性硬化症などの炎症性疾患に有効に使用される。本発明により、上記疾患に有効な予防又は治療剤が提供され、有用な食品、化粧料、医薬として提供される。これらは、安全性、安定性、価格に優れたものである。