(57)【要約】【課題】クレアチニンの新たな測定用試験片を提供する。【解決手段】多孔質材に、下記式（１）の化合物、前記化合物と呈色錯体を形成する金属および緩衝剤を含有させ、前記化合物と前記金属とから形成される呈色錯体を光学的に測定し、クレアチニンによる前記呈色錯体の形成阻害の程度を測ることによって、クレアチニン量を測定する。下記式（１）において、Ｒ１は、Ｈ、ＳＯ３Ｘ、ＣＯＯＸであって、Ｒ４およびＲ６は、ＯＨ、ＳＯ３Ｘ、ＣＯＯＸであり、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ７は、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、ＮＯ、ＣＨ３であって、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、前記Ｒ１、Ｒ４およびＲ６におけるＸが、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ４であって、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。【化１】2004138408.tif 000019【選択図】　図１
2004138408.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表わされる化合物を含むクレアチニン測定用試験片。
【化１】
2004138408.tif 000012
前記式（１）において、Ｒ１は、Ｈ、ＳＯ３Ｘ、ＣＯＯＸであって、Ｒ４およびＲ６は、ＯＨ、ＳＯ３Ｘ、ＣＯＯＸであり、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ７は、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、ＮＯ、ＣＨ３であって、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、前記Ｒ１、Ｒ４およびＲ６におけるＸが、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ４であって、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。
【請求項２】
前記化合物が、下記式（２）で表わされる化合物である請求項１記載のクレアチニン測定用試験片。
【化２】
2004138408.tif 000013
前記式（２）において、Ｒ１は、Ｈ、ＳＯ３Ｘ、ＣＯＯＸであって、Ｒ４およびＲ６は、ＯＨ、ＳＯ３Ｘ、ＣＯＯＸであり、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ７は、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、ＮＯ、ＣＨ３であって、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、前記Ｒ１、Ｒ４およびＲ６におけるＸが、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ４であって、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。
【請求項３】
前記化合物が、下記式（３）で表わされる化合物である請求項２記載のクレアチニン測定用試験片。
【化３】
2004138408.tif 000014
前記式（３）において、Ｒ１は、Ｈ、ＳＯ３Ｘ、ＣＯＯＸであって、Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、ＮＯ、ＣＨ３であって、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、前記Ｘが、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ４であって、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。
【請求項４】
前記化合物が、下記式（４）で表わされる化合物である請求項１記載のクレアチニン測定用試験片。
【化４】
2004138408.tif 000015
【請求項５】
前記化合物が、下記式（５）で表わされる化合物である請求項１記載のクレアチニン測定用試験片。
【化５】
2004138408.tif 000016
【請求項６】
前記化合物が、下記式（６）で表わされる化合物である請求項１記載のクレアチニン測定用試験片。
【化６】
2004138408.tif 000017
【請求項７】
前記化合物が、下記式（７）で表わされる化合物である請求項１記載のクレアチニン測定用試験片。
【化７】
2004138408.tif 000018
【請求項８】
さらに、前記化合物と呈色錯体を形成する金属またはその塩を含有する請求項１〜７のいずれか一項に記載のクレアチニン測定用試験片。
【請求項９】
前記金属が遷移金属である請求項８記載のクレアチニン測定用試験片。
【請求項１０】
前記遷移金属が、Ｃｕ（ＩＩ）およびＰｄ（ＩＩ）の少なくとも一方である請求項９記載のクレアチニン測定用試験片。
【請求項１１】
さらに、緩衝剤を含有する請求項１〜１０のいずれか一項に記載のクレアチニン測定用試験片。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クレアチニンの測定に使用する試験片に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床医療の分野において、腎機能の指標として優れることからクレアチニンの測定が行われている。
【０００３】
前記クレアチニンの測定方法としては、例えば、化学法や酵素法が一般的であり、前記化学法としては、例えば、クレアチニンがアルカリ条件下でピクリン酸と反応して、橙赤色に呈色する性質を利用したヤッフェ（Ｊａｆｆｅ）法（例えば、非特許文献１参照。）や、ピクリン酸の代りに３，５−ジニトロ安息香酸を使用する　Ｂｅｎｅｄｉｃｔ・Ｂｅｈｒｅ　法（例えば、非特許文献２参照。）等が採用されている。一方、前記酵素法としては、クレアチニンに酵素を作用させてアンモニアを生成し、これを比色法で測定するクレアチニンデアミナーゼ法や、クレアチニナーゼでクレアチニンをクレアチンに変換し、このクレアチンをサルコシンオキシダーゼやペルオキシダーゼで処理し、比色法で測定するクレアチニンアミドヒドロラーゼ法（クレアチニナーゼ法）（例えば、非特許文献３参照。）等が採用されている。
【０００４】
【非特許文献１】
ホ゛ンスネスおよびタウスキイ（Ｂｏｎｓｎｅｓ　ａｎｄ　Ｔａｕｓｓｋｙ）、シ゛ャーナルオフ゛ハ゛イオロシ゛カルケミストリー（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ）、１９４５年、１５８、ｐ．５８１
【非特許文献２】
ヘ゛ネテ゛ィクトおよびヘ゛ーレ（Ｂｅｎｅｄｉｃｔ　ａｎｄ　Ｂｅｈｒｅ）、シ゛ャーナルオフ゛ハ゛イオロシ゛カルケミストリー（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ）、１９３６年、１１３、ｐ．５１５
【非特許文献３】
タンカ゛ネリら（Ｔａｎｇａｎｅｌｌｉ　ｅｔ　ａｌ．）、クリニカルケミストリー（Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ）、１９８２年、２８、ｐ．１４６１
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
前記ヤッフェ法や　Ｂｅｎｅｄｉｃｔ　法は、化学的縮合反応を用いているため、使用する試薬コストは非常に安い。しかし、その反応が、反応温度を、例えば、３５℃以上に上げなければ反応し難いことから、高温で長時間（例えば、１０分以上）の反応を必要とする。さらに、強アルカリ条件（ｐＨ１１以上）で反応させるために、強アルカリ試薬を使用するので、測定のために特別な装置や冶具等が必要となり、測定後の廃液処理も大きな問題であった。
【０００６】
一方、前記酵素法は、前述の化学法に比べて、例えば、中性付近の温和な条件で反応が進み、クレアチニンに対する特異性も高く、化学法の欠点の大部分が解決されている。しかし、例えば、使用する酵素の価格が非常に高く、また、使用する酵素の種類も多いために、試薬コストが高く、微量測定ができる特殊な施設以外での測定が困難な状況にある。
【０００７】
特に近年においては、生活習慣病である糖尿病が世界的に増加しており、これに伴なって、その合併症の一つである糖尿病性腎症や、ひいては重篤な腎不全が増加している。このような疾患に対しては、例えば、腎透析や腎移植が必要となるという問題がある。したがって、このような腎症、特に糖尿病性腎症を、早期に防止するためにも、腎機能の指標であるクレアチニンを、安全で、しかも迅速かつ簡便に測定する新たな測定方法が望まれている。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、クレアチニン測定に使用する試験片の提供である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明のクレアチニン測定用試験片は、下記式（１）で表わされる化合物を含むクレアチニン測定用試験片である。
【化８】
2004138408.tif 000003
前記式（１）において、Ｒ１は、Ｈ、ＳＯ３Ｘ、ＣＯＯＸであって、Ｒ４およびＲ６は、ＯＨ、ＳＯ３Ｘ、ＣＯＯＸであり、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ７は、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、ＮＯ、ＣＨ３であって、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、前記Ｒ１、Ｒ４およびＲ６におけるＸが、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ４であって、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。
【００１０】
本発明者は、クレアチニンの新たな測定方法を開発すべく、錯体生成剤と金属との呈色錯体生成反応において、クレアチニンの共存により、競合的に錯体生成反応をおこさせ、前記呈色錯体の退色を利用して、クレアチニン量を測定することを試みた。この結果、前記式に表わされる化合物によれば、クレアチニン非存在の場合は遷移金属との呈色錯体を形成するが、クレアチニンが存在すると、クレアチニンによって前記呈色錯体の形成が阻害され、クレアチニンと前記遷移金属とが非呈色錯体を形成することを、本発明者が初めて見出したのである。したがって、このような化合物を含有させた本発明のクレアチニン測定用試験片によれば、例えば、前記呈色錯体の形成の有無や程度を測定することによって、クレアチニンによる前記呈色錯体の形成阻害の程度がわかり、これによって試料中のクレアチニン量を求めることが可能になる。また、本発明の測定用試験片を用いた測定は、例えば、室温での反応が可能であることから、従来の酵素法のように、酵素の至適温度に温度を調節する必要もなく、かつ短時間での反応が可能であることから、迅速かつ容易に行うことができる。このため、腎機能の指標としてのクレアチニンの測定方法として、臨床医療の分野等に有用である。
【００１１】
本発明のクレアチニン測定用試験片は、多孔質材が、前記化合物を含有する試験片である。前述のように前記化合物によれば、容易にクレアチニン量を求めることができるため、このような試験片であれば、より一層簡便な測定が可能となり、臨床医療の分野等において有用である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明のクレアチニン測定用試験片は、前述のように前記式（１）で表わされる化合物を含む試験片である。
【００１３】
前記化合物としては、例えば、下記式（２）で表わされる化合物が好ましく、より好ましくは下記式（３）で表わされる化合物であり、特に好ましくは下記式（４）で表わされる化合物である。これらの化合物は水溶性であるため、例えば、液体試料等のクレアチニンを測定する場合、反応し易く、より一層優れた感度での測定が可能になる。
【００１４】
【化９】
2004138408.tif 000004
前記式（２）において、Ｒ１は、Ｈ、ＳＯ３Ｘ、ＣＯＯＸであって、Ｒ４およびＲ６は、ＯＨ、ＳＯ３ＲＸ、ＣＯＯＸであり、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ７は、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、ＮＯ、ＣＨ３であって、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、前記Ｒ１、Ｒ４およびＲ６におけるＸが、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ４であって、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。
【００１５】
【化１０】
2004138408.tif 000005
前記式（３）において、Ｒ１は、Ｈ、ＳＯ３Ｘ、ＣＯＯＸであって、Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、ＮＯ、ＣＨ３であって、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、Ｘが、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ４であって、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。
【００１６】
このような化合物の中でも、下記式（４）〜（７）で表わされる化合物が好ましい。
【化１１】
2004138408.tif 000006
【化１２】
2004138408.tif 000007
【化１３】
2004138408.tif 000008
【化１４】
2004138408.tif 000009
【００１７】
なお、前記式（４）の化合物名は、２，６−ジクロロ−４’−ヒドロキシ−３’，３’’−ジメチル−３−スルホフクソン−５’，５’’−ジカルボン酸三ナトリウム塩（以下「クロマス゛ロール　Ｓ　（Ｃｈｒｏｍａｚｕｒｏｌ　Ｓ）」という）であり、前記式（５）の化合物名は、２，６−ジクロロ−４’−ヒドロキシ−３’，３’’−ジメチルフクソン−５’，５’’−ジカルボン酸二ナトリウム塩（以下「クロマス゛ロール　Ｂ　（Ｃｈｒｏｍａｚｕｒｏｌ　Ｂ）」という）であり、前記式（６）の化合物名は、クロモキサンシアニンＲ（以下「エリオクロムシアニン　Ｒ　（Ｅｒｉｏｃｈｒｏｍｅ　Ｃｙａｎｉｎｅ　Ｒ）」という）であり、前記式（７）の化合物名は、ピロカテコールスルホンフタレイン（以下「ヒ゜ロカテコールハ゛イオレット（Ｐｙｒｏｃａｔｅｃｈｏｌ　ｖｉｏｌｅｔ）」という）である。
【００１８】
前記各化合物の製造方法は、特に制限されず、従来公知の合成方法によって製造してもよい。また、前記クロマズロール　Ｓは、例えば、商品名Ｃｈｒｏｍｅ　Ａｚｕｒｏｌ　Ｓ（ナカライ社製）が、前記クロマズロール　Ｂは、例えば、商品名Ｃｈｒｏｍａｚｕｒｏｌ　Ｂ（同仁化学社製）が、前記エリクロムシアニン　Ｒは、例えば、商品名ＥｒｉｏｃｈｒｏｍｅＣｙａｎｉｎｅ　Ｒ（ナカライ社製）が、前記ピロカテコールバイオレットは、例えば、商品名Ｐｙｒｏｃａｔｅｃｈｏｌ　ｖｉｏｌｅｔ（同仁化学社製）が使用できる。
【００１９】
本発明において、前記多孔質材は、さらに前記化合物と呈色錯体を形成する金属またはその塩（以下、「金属」ともいう）を含有することが好ましい。
【００２０】
前記金属としては、例えば、遷移金属またはこれらの塩が好ましく、前記遷移金属としては、例えば、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｐｄ（ＩＩ）、Ｕ（ＶＩ）、Ｚｒ（ＩＶ）、Ｔｉ（ＩＶ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｍｏ（ＶＩ）、Ｓｎ（ＩＶ）等またはこれらの塩があげられ、この中でも好ましくはＣｕ（ＩＩ）、Ｐｄ（ＩＩ）であり、より好ましくはＰｄ（ＩＩ）である。また、これらの塩としては、ハロゲン化物、硫酸塩のような水溶性の高いものが好ましい。
【００２１】
前記化合物と金属との組み合わせとしては、例えば、クロマズロール　ＳとＰｄ（ＩＩ）との組み合わせ、クロマズロール　ＢとＰｄ（ＩＩ）との組み合わせ、エリオクロムシアニン　ＲとＣｕ（ＩＩ）との組み合わせ、ピロカテコールバイオレットとＣｕ（ＩＩ）との組み合わせ等があげられ、この中でも好ましくは、クロマズロールＳとＰｄ（ＩＩ）との組み合わせである。
【００２２】
本発明において、さらに緩衝剤を含有することが好ましい。前記緩衝剤としては、例えば、リン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタン等が使用でき、好ましくは、リン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩であり、より好ましくはリン酸塩である。
【００２３】
本発明において、例えば、前記式（１）に表わされる化合物と金属とから形成される呈色錯体の安定性を制御できることから、前記試験片は、さらに、界面活性剤を含有することが好ましい。つまり、界面活性剤の存在によって、前記呈色錯体の安定性を調整できるということは、クレアチニンが存在する場合に、金属と前記化合物との呈色錯体形成よりも、金属とクレアチニンとが錯体を形成する競合反応を起し易くなるため、金属とクレアチニンとの反応性を向上できるということである。このため、クレアチニンの測定をより一層精度良く行うことができる。
【００２４】
前記界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、ノニオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤、およびカチオン系界面活性剤等が使用でき、これらは一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００２５】
前記ノニオン系界面活性剤としては、例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、Ｔｒｉｔｏｎ系、Ｔｗｅｅｎ系、Ｂｒｉｊ系等が使用でき、この中でも好ましくはＰＶＡ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、ポリエチレングリコールであり、より好ましくはポリエチレングリコールである。
【００２６】
前記アニオン系界面活性剤としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム等が使用でき、この中でも好ましくはＳＤＳ、コール酸ナトリウムであり、より好ましくはＳＤＳである。
【００２７】
前記カチオン系界面活性剤としては、例えば、臭化ベンジルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ゼフィラミン等が使用でき、この中でも好ましくは臭化ベンジルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウムであり、より好ましくは臭化ベンジルトリメチルアンモニウムである。
【００２８】
前述のように界面活性剤は、いずれか一種類でもよいが、二種以上を併用してもよい。その組み合わせとしては、例えば、ノニオン系とアニオン系との組み合わせ、具体的にはＰＶＡとＳＤＳの組み合わせ、ポリエチレングリコールとコール酸ナトリウムとの組み合わせ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００とＳＤＳとの組み合わせ等があげられる。また、ノニオン系とカチオン系との組み合わせとしては、例えば、ポリエチレングリコールと臭化ベンジルトリメチルアンモニウムとの組み合わせ、ＰＶＰと臭化セチルトリメチルアンモニウムとの組み合わせ等があげられる。
【００２９】
また、界面活性剤は、例えば、前述のように前記式（１）の化合物と金属とから形成される呈色錯体の安定性や、発色性に影響するため、前記化合物および金属の種類に応じて適宜決定することが好ましい。
【００３０】
また、本発明の試験片において、前記多孔質材の種類は、特に制限されず、例えば、ろ紙、ガラスフィルター、樹脂製の多孔質膜等の多孔質材が使用できる。このなかで、コストや取り扱い性等の理由から、濾紙が好ましい。また、前記樹脂製多孔質膜の材料としては、例えば、ポリスルホン、ポリエステル、ナイロン、ニトロセルロース、ポリカーボネート等があげられる。そして、この多孔質材の平均孔径は、例えば、液体試料が浸透し、保持されればよく、例えば、３〜１０μｍの範囲である。
【００３１】
（実施形態１）
つぎに、本発明について、前記多孔質材に、前記式（１）の化合物、前記金属および緩衝剤を含有させた試験片の一例を示す。
【００３２】
前記多孔質材における各種試薬の含有量は、特に制限されず、試料の量等によって適宜決定できる。具体的な例としては、前記多孔質材の体積１ｃｍ３当たり、例えば、前記化合物が３×１０−３〜１．５μｍｏｌの範囲、金属が６×１０−３〜０．９μｍｏｌの範囲、緩衝剤が９〜４５μｍｏｌの範囲であり、好ましくは、前記化合物が０．０３〜０．９μｍｏｌの範囲、金属が０．０６〜０．４５μｍｏｌの範囲、緩衝剤が１２〜３０μｍｏｌの範囲の範囲である。なお、前記多孔質材１ｃｍ３当たりに添加する試料の体積は、通常、２０〜４０μｌの範囲である。
【００３３】
また、さらに界面活性剤を含有する場合は、前記多孔質材の体積１ｃｍ３当たり、例えば、３〜６００μｇの範囲であり、好ましくは３０〜３００μｇの範囲である。
【００３４】
このような試験片は、例えば、前記各種試薬を混合した溶液を準備して、前記溶液を前記多孔質材に含浸させ、乾燥することによって調製できる。なお、前記混合溶液のｐＨは、前記緩衝剤の種類等によって調製でき、例えば、ｐＨ５〜９の範囲であることが好ましく、より好ましくは６〜８の範囲である。このように中性付近に設定できるため、例えば、塩基性物質や酸性物質を含有させる試験片とは異なり、多孔質材が損傷を受けることを防止できる。このため、安定性にも優れた試験片となる。
【００３５】
前記混合溶液における各種試薬の濃度は、例えば、前記多孔質材に保持させる前記各種試薬の設定量に応じて決定できる。例えば、前記化合物が０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、金属が０．２〜３０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、緩衝剤が０．３〜１．５ｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは、前記化合物が１〜３０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、金属が２〜１５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、緩衝剤が０．４〜１ｍｏｌ／Ｌの範囲である。また、さらに界面活性剤を含有する場合は、例えば、０．０１〜２重量％の範囲であり、好ましくは０．１〜１重量％の範囲である。なお、前記多孔質材に対する前記混合溶液の含浸および乾燥を繰り返し、保持させる量を調整してもよい。
【００３６】
前記混合溶液の溶媒としては、特に制限されないが、水、緩衝液等が使用できるが、前述のように試薬として緩衝剤を含むため、前記緩衝剤を含む緩衝液を溶媒とすることが好ましい。また、例えば、エタノール、メタノール、アセトン等の有機溶媒を含むことも好ましい。
【００３７】
なお、予め、前記化合物と金属とを混合した場合、前記両者が反応して呈色錯体が形成されるが、前記混合溶液を多孔質材に含浸させても、クレアチニン含有試料を添加することによる、クレアチニンと金属との錯体形成には問題はない。なぜなら、クレアチニンは、前記両者の呈色錯体の形成阻害のみならず、すでに呈色錯体が形成されていても、この呈色錯体から前記金属を奪い、前記金属と錯体を形成する能力を有すると推測されるからである。
【００３８】
前述のように、前記混合溶液において、前記化合物と金属とが呈色錯体を形成しても、クレアチニンと金属との錯体形成には影響ない。しかし、予め呈色錯体が形成されることを抑制する場合には、例えば、前記化合物を含む溶液と、金属および緩衝剤を含む溶液を調製し、前記多孔質材への含浸および乾燥を、各溶液についてそれぞれ行えばよい。具体的には、例えば、クレアチニン測定用化合物を、金属が溶解し難い有機溶媒に溶解し、一方、金属と緩衝剤を水に溶解して水溶液を調製する。そして、前記水溶液を含浸乾燥させた後、前記有機溶媒のクレアチニン測定用化合物溶液を含浸させる。そうすれば、前記化合物と金属とが反応することなく、多孔質材中へ保持させることができる。
【００３９】
また、取扱性に優れることから、各種試薬を含有する前記多孔質材を、支持体上に積層してもよい。この場合、前記支持体の材料としては、特に制限されないが、例えば、透明樹脂等が好ましい。
【００４０】
つぎに、前記試験片を用いて、液体試料のクレアチニン量を測定する一例を説明する。
【００４１】
まず、前記試験片に前記液体試料を滴下して、一定時間反応させる。前記液体試料は、前記多孔質材内部に浸透し、これによって、前記多孔質材中の前記化合物と金属とが接触し、呈色錯体を形成する。一方、前記液体試料にクレアチニンが含まれる場合には、前記クレアチニンが、前記呈色錯体の形成を阻害する。このように、前記液体試料におけるクレアチニンの有無および含有量に応じて、多孔質膜内部における前記呈色錯体の形成量は異なるため、この呈色錯体の形成の程度が、すなわちクレアチニンの有無または含有量を示すことになるのである。
【００４２】
前記反応条件は、特に限定されないが、例えば、反応温度は、１０〜４０℃の範囲が好ましく、より好ましくは２０〜３５℃の範囲であり、反応時間は、３０秒〜５分の範囲が好ましく、より好ましくは１〜３分の範囲である。なお、室温以上の温度で反応させる場合は、測定前に、試料をさらに室温に放置しておくことが好ましい。
【００４３】
前記反応を行った後、前記呈色錯体の形成の程度、すなわち、クレアチニンによる前記呈色錯体の形成阻害の程度を測定する。これは、例えば、前記試験片を光学的に測定することによって行うことができる。一方、予め、既知濃度のクレアチニン標準溶液について、本発明の試験片により、同様にして光学的測定を行い、前記測定値とクレアチニン濃度とをプロットすることによって検量線を作成しておく。そして、前記液体試料についての測定値を前記検量線に代入することによって、試料のクレアチニン濃度を求めることができる。
【００４４】
前記試験片の光学的な測定方法としては、例えば、反射率の測定や吸光度の測定があげられる。
【００４５】
前記反射率や吸光度の測定波長は、前記化合物と金属とから形成される呈色錯体の種類によって異なるため、例えば、使用する化合物と金属との組み合わせによって適宜決定できる。例えば、クロマズロール　ＳとＰｄ（ＩＩ）との組み合わせ、クロマズロール　ＢとＰｄ（ＩＩ）との組み合わせ、エリオクロムシアニン　ＲとＣｕ（ＩＩ）との組み合わせ、または、ピロカテコールバイオレットとＣｕ（ＩＩ）との組み合わせの場合、測定波長は、５６０〜７００ｎｍの範囲が好ましく、より好ましくは６００〜６７０ｎｍ、特に好ましくは６２０〜６５０ｎｍの範囲である。
【００４６】
【実施例】
つぎに、実施例について比較例と併せて説明する。
【００４７】
（実施例１〜３）
下記組成１の混合液５０ｍＬ、組成２の混合液５０ｍＬおよび組成３の混合液５０ｍＬを調製し、各混合液にろ紙（厚み３４０ｍｍ、商品名　Ｗｈａｔｍａｎ　３ＭＭＣｈｒ：ワットマン社製）を含浸させた。前記ろ紙を５０℃で約１０分間乾燥した後、長さ５ｍｍ×幅５ｍｍに裁断し、ＰＥＴフィルム上に両面テープで貼り付け、これを試験片とした。組成１の混合液を含浸させた試験片を実施例１とし、組成２の混合液を含浸させた試験片を実施例２とし、組成３の混合液を含浸させた試験片を実施例３とした。なお、前記化合物として、前記式（６）に示す商品名Ｅｒｉｏｃｈｒｏｍｅ　Ｃｙａｎｉｎｅ　Ｒ　（ナカライ社製）、前記式（４）に示す商品名Ｃｈｒｏｍｅ　Ａｚｕｒｏｌ　Ｓ　（ナカライ社製）、前記式（５）に示す商品名Ｃｈｒｏｍａｚｕｒｏｌ　Ｂ　（同仁化学社製）を使用した。
【００４８】
（混合液組成１）
ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）　　　　　　　０．５Ｍ
硫酸銅（ＩＩ）　　　　　　　　　　　　　　３．０ｍＭ
Ｅｒｉｏｃｈｒｏｍｅ　Ｃｙａｎｉｎｅ　Ｒ　　　　　　　　　　６．０ｍＭ
【００４９】
（混合液組成２）
クエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）　　　　　　０．５Ｍ
塩化パラジウム　　　　　　　　　　　　　　　８ｍＭ
Ｃｈｒｏｍａｚｕｒｏｌ　Ｓ　　　　　　　　　　　　　　　１５ｍＭ
ポリエチレングリコール　　　　　　　　　０．５重量％
【００５０】
（混合液組成３）
ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）　　　　　　　０．５Ｍ
塩化銅（ＩＩ）　　　　　　　　　　　　　　　３．０ｍＭ
Ｃｈｒｏｍａｚｕｒｏｌ　Ｂ　　　　　　　　　　　　　　３．０ｍＭ
ポリエチレングリコール　　　　　　　　　０．１重量％
【００５１】
（クレアチニンの測定）
生理食塩水、生理食塩水にクレアチニン（ナカライ社製）を溶解したクレアチニン溶液（５０、１００および２００ｍｇ／１００ｍＬ）を、測定試料として準備した。そして、作製した実施例１〜３の前記試験片を、前記各測定試料にそれぞれ約２秒間浸漬した後、引き上げて、室温で１分間放置した。そして、これらの試験片について、色差計（商品名Σ９０；村上色彩技術研究所製）を用いて、６３０ｎｍにおける反射率（単位％）を測定した。これらの結果を下記表１および図１に示す。図１は、クレアチニン濃度と反射率の相関関係を示すグラフである。
【００５２】
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【００５３】
前記表１および図１に示すように、各実施例におけるクレアチニン濃度と反射率との相関式は、実施例１「ｙ＝０．１０７ｘ＋２５（相関係数ｒ＝０．９８６）」、実施例２「ｙ＝０．１５７ｘ＋８．６（相関係数ｒ＝０．９９８）」、実施例３「ｙ＝０．１０８ｘ＋４３（相関係数ｒ＝０．９９９）」であった。このことから、クレアチニン濃度と、実施例の試験による反射率とは良好な相関関係が確認できた。
【００５４】
（実施例４）
測定試料として尿検体を２０検体準備し、予め、ヤッフェ法の定量試薬（商品名クレアチニン−ＨＡ　テストワコー；和光純薬社製）と商品名日立７０７０型自動分析装置（日立製作所製）とを用いてクレアチニン濃度を測定した。次に、実施例２の前記試験片を、前記測定試料に約２秒間浸漬した後、引き上げて、室温で１分間放置した。そして、これらの試験片について、色差計（商品名Σ９０；村上色彩技術研究所製）を用いて、６３０ｎｍにおける反射率（単位％）を測定した。
【００５５】
前記各測定試料についての前記ヤッフェ法によるクレアチニン濃度測定の結果と実施例２の前記試験片を用いた反射率測定の結果を、下記表２および図２に示す。図２において、ｘ軸は、前記自動分析装置による各測定試料のクレアチニン濃度（ｍｇ／１００ｍｌ）を示し、ｙ軸は、実施例２の前記試験片による各測定試料の反射率（％）を示す。
【００５６】
【表２】
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【００５７】
前記表２および図２に示すように、各測定試料における前記ヤッフェ法で測定されたクレアチニン濃度と、実施例２の前記試験片から得られた反射率との関係は、相関式「ｙ＝０．２０１ｘ＋７．４（相関係数ｒ＝０．９３８）」で表される良好な相関関係であることが確認された。
【００５８】
【発明の効果】
以上のように、本発明のクレアチニン測定方法は、本発明のクレアチニン測定用化合物を用いた新たな測定方法であり、クレアチニンによる呈色錯体の生成阻害を利用して容易にクレアチニン量を測定することができる。このため、本発明の測定方法は、前述のような臨床医療等において、腎機能の指標としてのクレアチニン測定に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例における、クレアチニン濃度と反射率との関係を示すグラフである。
【図２】本発明の実施例における、クレアチニン濃度と反射率との関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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