(57)【要約】【課題】　ヒトＰＰＡＲαに対して作用するが実験動物の内因性ＰＰＡＲαには作用しないヒトＰＰＡＲα作動薬もしくは拮抗薬の薬効をインビボで評価し得る動物モデルの提供。【解決手段】　異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを発現可能な状態で安定に保持し、且つＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変、あるいはＰＰＲＥを有するプロモーターの制御下にある外来ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物またはその生体の一部、並びに該動物を用いた異種ＰＰＡＲα作動薬／拮抗薬のスクリーニング方法。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを発現可能な状態で安定に保持し、且つ１以上の他の遺伝子改変を有する非ヒト哺乳動物またはその生体の一部。
【請求項２】
　他の遺伝子改変の少なくとも１つが、ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせるものである、請求項１記載の動物またはその生体の一部。
【請求項３】
　他の遺伝子改変の少なくとも１つが、ＰＰＲＥを有するプロモーターの制御下にある外来ＤＮＡの導入である、請求項１記載の動物またはその生体の一部。
【請求項４】
　異種ＰＰＡＲαがヒト由来ＰＰＡＲαである請求項１記載の動物またはその生体の一部。
【請求項５】
　異種ＰＰＡＲαが配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する請求項１記載の動物またはその生体の一部。
【請求項６】
　非ヒト哺乳動物が、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウスまたはラットである請求項１記載の動物またはその生体の一部。
【請求項７】
　非ヒト哺乳動物がマウスである請求項１記載の動物またはその生体の一部。
【請求項８】
　内因性ＰＰＡＲαを欠損するかわりに異種ＰＰＡＲαを発現させた動物である請求項１記載の動物またはその生体の一部。
【請求項９】
　内因性ＰＰＡＲαを欠損する動物と、異種ＰＰＡＲαを発現する、該動物と同種の動物とを交配することにより得られうる、請求項８記載の動物またはその生体の一部。
【請求項１０】
　内因性ＰＰＡＲαがマウス由来ＰＰＡＲαであり、異種ＰＰＡＲαがヒト由来ＰＰＡＲαである請求項８記載の動物またはその生体の一部。
【請求項１１】
　ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患が、高脂血症、高トリグリセリド血症、混合型脂質異常症、低ＨＤＬ血症、動脈硬化症、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、壊疽、高血圧症、血栓症、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心不全、鬱血性心不全、不安定狭心症、ＰＴＣＡ後の再狭窄、ステント留置後の再狭窄、高フィブリノーゲン血症、心筋症、脳出血、一過性脳虚血発作、脳梗塞、脳卒中、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎動脈硬化症、皮膚炎、免疫不全、低血糖、低ケトン血症、脂肪肝、糖尿病、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、肥満、アルツハイマー病、貧血性低酸素症、性腺障害、肝臓癌、乳癌および子宮内膜炎からなる群より選択される１もしくは２以上の疾患である請求項２記載の動物またはその生体の一部。
【請求項１２】
　異種ＰＰＡＲαが、肝臓、心臓、腎臓、副腎、血管、消化管および脳からなる群より選択される１もしくは２以上の部位で特異的に発現することを特徴とする請求項１記載の動物またはその生体の一部。
【請求項１３】
　異種ＰＰＡＲαが、肝臓で特異的に発現することを特徴とする請求項１記載の動物またはその生体の一部。
【請求項１４】
　請求項１記載の動物またはその生体の一部に被験物質を適用し、該物質の異種ＰＰＡＲαに対するアゴニストまたはアンタゴニスト活性を検定することを特徴とする異種ＰＰＡＲα作動薬または拮抗薬のスクリーニング方法。
【請求項１５】
　請求項３記載の動物またはその生体の一部に被験物質を適用し、該物質の異種ＰＰＡＲαに対するアゴニストまたはアンタゴニスト活性を、ＰＰＲＥを有するプロモーターの制御下にある外来ＤＮＡの発現を指標にして検定することを特徴とする、異種ＰＰＡＲα作動薬または拮抗薬のスクリーニング方法。
【請求項１６】
　請求項２記載の動物に被験物質を投与し、該動物におけるＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態に及ぼす該物質の効果を検定することを特徴とする、異種ＰＰＡＲαの由来する動物における該ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患に対して予防・治療活性を有する物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は異種ＰＰＡＲα遺伝子導入非ヒト哺乳動物に関する。より詳細には、本発明は、異種ＰＰＡＲα遺伝子が導入され、且つＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患の実験的動物モデルとして使用し得る表現型を示す遺伝子改変を有する非ヒト哺乳動物、およびそれを用いた異種ＰＰＡＲαの由来する動物におけるＰＰＡＲαの活性調節が関与する各種疾患の予防・治療薬のスクリーニング方法、該方法により得られうる該疾患の予防・治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
　ペルオキシソーム増殖剤活性化レセプター（Peroxisome Proliferator-Activated Receptor；以下、ＰＰＡＲと略記する）αは肝臓、心臓、腎臓等で高発現する核内レセプター型転写因子であり、脂肪酸β酸化系酵素群やアポリポ蛋白などの種々の脂質代謝関連蛋白質をコードする遺伝子の発現を調節することにより、脂質のホメオスタシスにおいて中心的な役割を担っている。ＰＰＡＲαはレチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）とヘテロダイマーを形成し、リガンド存在下に標的遺伝子の５’上流に存在するペルオキシソーム増殖剤応答エレメント（ＰＰＲＥ）配列に結合して遺伝子の転写を促進する。一方で、ＰＰＡＲαによってリガンド存在下に発現が抑制される遺伝子も知られているが、これは他の転写因子との標的ＤＮＡ配列への結合やコアクチベーターをめぐる競合によるものと考えられている。
【０００３】
　ＰＰＡＲαは長鎖不飽和脂肪酸やフィブレート系薬剤などの脂溶性分子によって活性化される。ＰＰＡＲα作動薬は肝臓において脂肪酸酸化活性を高める一方で、アポリポ蛋白C-III（apoC-III；中性脂肪（ＴＧ）との主要な血漿リポ蛋白構成成分）の発現を抑制するため、血中ＴＧ濃度を低下させる効果がある。また、高比重リポ蛋白−コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）の主要構成成分であるアポリポ蛋白A-I（apoA-I）およびアポリポ蛋白A-II（apoA-II）の発現を促進するため、血中ＨＤＬ−Ｃ濃度を増加させる効果がある。したがって、ＰＰＡＲα作動薬は高ＴＧ血症や低ＨＤＬ−Ｃ血症を含む高脂血症、および動脈硬化の予防・治療薬として実際に用いられている（例えば、非特許文献１参照）。ＰＰＡＲα作動薬はまた、虚血に対して心臓保護効果を示すことも知られている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００４】
　新規ＰＰＡＲα作動薬の開発は、通常、例えばヒトＰＰＡＲαを用いた結合アッセイやヒト細胞株におけるＰＰＲＥ制御下にある遺伝子（例：apoA-I、ＰＰＲＥ−レポーターキメラ遺伝子等）の発現アッセイなどのインビトロでのスクリーニングを行ない、高活性が得られた化合物についてマウスやラットなどの実験動物に投与してインビボでの効果を評価するといった順序で進められる。しかしながら、ヒトと他の哺乳動物との間にはＰＰＡＲαの構造に差異があるため（例えば、ヒトとマウスの間のアミノ酸同一性は９２％）、薬物によってはヒトＰＰＡＲαに対してしかアゴニスト活性を示さない場合もあり得る。そのような薬物は実験動物の内因性ＰＰＡＲαに対しては活性がないので、現存の動物モデルでは評価することが不可能であった。
【非特許文献１】ジャン−シャルル・フルシャール（Jean-Charles Fruchart）ら，カレント・アテロスクレローシス・リポーツ（Current Atherosclerosis Reports），（米国），2001年，第3巻（第1号），p. 83-92
【非特許文献２】アントニア・タベルネロ（Antonia Tabernero）ら，ビーエムシー・ファーマコロジー（BMC Pharmacology），（英国），2002年4月9日（オンライン公開），バイオメッド・セントラル（BioMed Central），インターネット＜http://www.biomedcentral.com/1471-2210/2/10＞
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
　したがって、本発明の目的は、ヒトＰＰＡＲαに対してのみアゴニスト活性を示すＰＰＡＲα作動薬のインビボでの効果を有効に評価することができる新規動物モデルを提供することであり、当該動物モデルを用いた、高脂血症、混合型脂質異常症、動脈硬化、高血圧症、血栓症、虚血性心疾患、虚血性脳疾患などの各種疾患の予防・治療薬のスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
　本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ヒトＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを発現可能な状態で安定に保持するトランスジェニックマウスを作製し、これにヒトＰＰＡＲαに対して活性を有するが、マウスＰＰＡＲαに対しては活性を有しない化合物を投与したところ、当該マウスはペルオキシソーム増殖や脂質代謝関連遺伝子の発現増強を含む、ペルオキシソーム増殖剤により誘導される種々の特徴的応答を示すことを見出した。さらに、得られたヒトＰＰＡＲα発現トランスジェニックマウスと、高脂血症や動脈硬化をはじめとするＰＰＡＲαの活性調節が関与し得る各種疾患の実験的動物モデルとを交配することにより、ヒトＰＰＡＲαを発現する当該疾患モデル動物を作製することに成功した。
【０００７】
　本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００８】
　すなわち、本発明は、
［１］異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを発現可能な状態で安定に保持し、且つ１以上の他の遺伝子改変を有する非ヒト哺乳動物またはその生体の一部、
［２］他の遺伝子改変の少なくとも１つが、ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせるものである、上記［１］記載の動物またはその生体の一部、
［３］他の遺伝子改変の少なくとも１つが、ＰＰＲＥを有するプロモーターの制御下にある外来ＤＮＡの導入である、上記［１］記載の動物またはその生体の一部、
［４］異種ＰＰＡＲαがヒト由来ＰＰＡＲαである上記［１］記載の動物またはその生体の一部、
［５］異種ＰＰＡＲαが配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する上記［１］記載の動物またはその生体の一部、
［６］非ヒト哺乳動物が、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウスまたはラットである上記［１］記載の動物またはその生体の一部、
［７］非ヒト哺乳動物がマウスである上記［１］記載の動物またはその生体の一部、
［８］内因性ＰＰＡＲαを欠損するかわりに異種ＰＰＡＲαを発現させた動物である上記［１］記載の動物またはその生体の一部、
［９］内因性ＰＰＡＲαを欠損する動物と、異種ＰＰＡＲαを発現する、該動物と同種の動物とを交配することにより得られうる、上記［８］記載の動物またはその生体の一部、
［１０］内因性ＰＰＡＲαがマウス由来ＰＰＡＲαであり、異種ＰＰＡＲαがヒト由来ＰＰＡＲαである上記［８］記載の動物またはその生体の一部、
［１１］ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患が、高脂血症、高トリグリセリド血症、混合型脂質異常症、低ＨＤＬ血症、動脈硬化症、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、壊疽、高血圧症、血栓症、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心不全、鬱血性心不全、不安定狭心症、ＰＴＣＡ後の再狭窄、ステント留置後の再狭窄、高フィブリノーゲン血症、心筋症、脳出血、一過性脳虚血発作、脳梗塞、脳卒中、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎動脈硬化症、皮膚炎、免疫不全、低血糖、低ケトン血症、脂肪肝、糖尿病、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、肥満、アルツハイマー病、貧血性低酸素症、性腺障害、肝臓癌、乳癌および子宮内膜炎からなる群より選択される１もしくは２以上の疾患である上記［２］記載の動物またはその生体の一部、
［１２］異種ＰＰＡＲαが、肝臓、心臓、腎臓、副腎、血管、消化管および脳からなる群より選択される１もしくは２以上の部位で特異的に発現することを特徴とする上記［１］記載の動物またはその生体の一部、
［１３］異種ＰＰＡＲαが、肝臓で特異的に発現することを特徴とする上記［１］記載の動物またはその生体の一部、
［１４］上記［１］記載の動物またはその生体の一部に被験物質を適用し、該物質の異種ＰＰＡＲαに対するアゴニストまたはアンタゴニスト活性を検定することを特徴とする異種ＰＰＡＲα作動薬または拮抗薬のスクリーニング方法、
［１５］上記［３］記載の動物またはその生体の一部に被験物質を適用し、該物質の異種ＰＰＡＲαに対するアゴニストまたはアンタゴニスト活性を、ＰＰＲＥを有するプロモーターの制御下にある外来ＤＮＡの発現を指標にして検定することを特徴とする、異種ＰＰＡＲα作動薬または拮抗薬のスクリーニング方法、および
［１６］上記［２］記載の動物に被験物質を投与し、該動物におけるＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態に及ぼす該物質の効果を検定することを特徴とする、異種ＰＰＡＲαの由来する動物における該ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患に対して予防・治療活性を有する物質のスクリーニング方法を提供する。
【０００９】
　さらに、本発明は、
［１７］上記［１４］または［１５］記載の方法により得られうる異種ＰＰＡＲα作動薬、
［１８］上記［１７］記載の作動薬を含有してなる、異種ＰＰＡＲαの由来する動物における高脂血症、高トリグリセリド血症、混合型脂質異常症、低ＨＤＬ血症、動脈硬化症、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、壊疽、高血圧症、血栓症、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心不全、鬱血性心不全、不安定狭心症、ＰＴＣＡ後の再狭窄、ステント留置後の再狭窄、高フィブリノーゲン血症、心筋症、脳出血、一過性脳虚血発作、脳梗塞、脳卒中、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎動脈硬化症、皮膚炎、免疫不全、低血糖、低ケトン血症、脂肪肝、糖尿病、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、肥満、アルツハイマー病、貧血性低酸素症および性腺障害からなる群より選択される１もしくは２以上の疾患の予防・治療薬、
［１９］異種ＰＰＡＲαの由来する動物がヒトである上記［１８］記載の予防・治療薬、
［２０］上記［１７］記載の作動薬の有効量を異種ＰＰＡＲαの由来する動物に投与することを含む、該動物における高脂血症、高トリグリセリド血症、混合型脂質異常症、低ＨＤＬ血症、動脈硬化症、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、壊疽、高血圧症、血栓症、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心不全、鬱血性心不全、不安定狭心症、ＰＴＣＡ後の再狭窄、ステント留置後の再狭窄、高フィブリノーゲン血症、心筋症、脳出血、一過性脳虚血発作、脳梗塞、脳卒中、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎動脈硬化症、皮膚炎、免疫不全、低血糖、低ケトン血症、脂肪肝、糖尿病、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、肥満、アルツハイマー病、貧血性低酸素症および性腺障害からなる群より選択される１もしくは２以上の疾患の予防・治療方法、
［２１］異種ＰＰＡＲαの由来する動物における高脂血症、高トリグリセリド血症、混合型脂質異常症、低ＨＤＬ血症、動脈硬化症、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、壊疽、高血圧症、血栓症、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心不全、鬱血性心不全、不安定狭心症、ＰＴＣＡ後の再狭窄、ステント留置後の再狭窄、高フィブリノーゲン血症、心筋症、脳出血、一過性脳虚血発作、脳梗塞、脳卒中、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎動脈硬化症、皮膚炎、免疫不全、低血糖、低ケトン血症、脂肪肝、糖尿病、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、肥満、アルツハイマー病、貧血性低酸素症および性腺障害からなる群より選択される１もしくは２以上の疾患の予防・治療薬の製造のための、上記［１７］記載の作動薬の使用、
［２２］上記［１４］または［１５］記載の方法により得られうる異種ＰＰＡＲα拮抗薬、
［２３］上記［２２］記載の拮抗薬を含有してなる、異種ＰＰＡＲαの由来する動物における肝臓癌、乳癌および子宮内膜炎からなる群より選択される１もしくは２以上の疾患の予防・治療薬、
［２４］異種ＰＰＡＲαの由来する動物がヒトである上記［２３］記載の予防・治療薬、
［２５］上記［２２］記載の拮抗薬の有効量を異種ＰＰＡＲαの由来する動物に投与することを含む、該動物における肝臓癌、乳癌および子宮内膜炎からなる群より選択される１もしくは２以上の疾患の予防・治療方法、
［２６］異種ＰＰＡＲαの由来する動物における肝臓癌、乳癌および子宮内膜炎からなる群より選択される１もしくは２以上の疾患の予防・治療薬を製造するための、上記［２２］記載の拮抗薬の使用、
［２７］上記［１６］記載の方法により得られうる、異種ＰＰＡＲαの由来する動物における該ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患に対して予防・治療活性を有する物質、
［２８］上記［２７］記載の物質を含有してなる、異種ＰＰＡＲαの由来する動物における該ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患の予防・治療薬、
［２９］異種ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患が、高脂血症、高トリグリセリド血症、混合型脂質異常症、低ＨＤＬ血症、動脈硬化症、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、壊疽、高血圧症、血栓症、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心不全、鬱血性心不全、不安定狭心症、ＰＴＣＡ後の再狭窄、ステント留置後の再狭窄、高フィブリノーゲン血症、心筋症、脳出血、一過性脳虚血発作、脳梗塞、脳卒中、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎動脈硬化症、皮膚炎、免疫不全、低血糖、低ケトン血症、脂肪肝、糖尿病、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、肥満、アルツハイマー病、貧血性低酸素症および性腺障害からなる群より選択される１もしくは２以上の疾患である上記［２８］記載の予防・治療薬、
［３０］上記［２７］記載の物質の有効量を異種ＰＰＡＲαの由来する動物に投与することを含む、該動物におけるＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患の予防・治療方法、および
［３１］異種ＰＰＡＲαの由来する動物における該ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患の予防・治療薬の製造のための、上記［２７］記載の物質の使用
などを提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
　本発明の異種ＰＰＡＲα遺伝子導入非ヒト哺乳動物は、該異種ＰＰＡＲαに対しては作用するが、該非ヒト哺乳動物の内因性ＰＰＡＲαに対しては作用しないＰＰＡＲα作動薬もしくは拮抗薬の薬効をインビボで評価し得る動物モデルである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
　異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを発現可能な状態で安定に保持する非ヒト哺乳動物（以下、「本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物」または単に「本発明の遺伝子導入動物」という場合もある）は、異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを発現可能な状態で「安定に保持」する。「安定に保持」するとは、該動物の細胞内に異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡが発現可能な状態で永続的に存在することを意味し、該ＤＮＡが宿主染色体上に組み込まれていても、あるいは染色体外ＤＮＡとして安定に存在していてもよいが、好ましくは、該ＤＮＡは宿主染色体上に組み込まれた状態で保持される。
【００１２】
　本発明の遺伝子導入動物は、非ヒト哺乳動物の受精卵や、未受精卵、精子およびその前駆細胞（始原生殖細胞、卵原細胞、卵母細胞、卵細胞、精原細胞、精母細胞、精細胞等）などに、好ましくは受精卵の胚発生の初期段階（さらに好ましくは８細胞期以前）において、リン酸カルシウム共沈殿法、電気穿孔（エレクトロポレーション）法、リポフェクション法、凝集法、顕微注入（マイクロインジェクション）法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などの遺伝子導入法によって、目的とする異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを導入することにより作製される。また、該遺伝子導入法により、非ヒト哺乳動物の体細胞、組織、臓器などに目的とするＤＮＡを導入し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、この細胞を上述の胚（もしくは生殖）細胞と公知の細胞融合法を用いて融合させることにより遺伝子導入動物を作製することもできる。あるいは、ノックアウト動物を作製する場合と同様に、非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に上記の遺伝子導入法を用いて目的とするＤＮＡを導入し、予め該ＤＮＡが安定に組み込まれたクローンを選択した後に、該ＥＳ細胞を胚盤胞に注入するかあるいはＥＳ細胞塊と８細胞期胚とを凝集させてキメラマウスを作製し、生殖系列に導入ＤＮＡが伝達されたものを選択することによっても遺伝子導入動物を得ることが可能である。
【００１３】
　また、このようにして作製された遺伝子導入動物の生体の一部（例えば、(1)異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを安定に保持する細胞、組織、臓器など、(2)これらに由来する細胞または組織を培養し、必要に応じて継代したものなど）も、本発明の「異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを発現可能な状態で安定に保持する非ヒト哺乳動物の生体の一部」として、本発明の「異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを発現可能な状態で安定に保持する非ヒト哺乳動物」と同様な目的に用いることができる。
【００１４】
　本発明の遺伝子導入動物の生体の一部としては、肝臓、心臓、腎臓、副腎、血管、消化管、脳などの臓器や、当該臓器由来の組織片および細胞などが好ましく例示される。
【００１５】
　本発明で対象とし得る「非ヒト哺乳動物」は、トランスジェニック系が確立されたヒト以外の哺乳動物であれば特に制限はなく、例えば、ウシ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなどが挙げられる。好ましくは、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット等であり、なかでも疾患モデル動物作製の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、繁殖が容易な齧歯動物がより好ましく、とりわけマウス（例えば、純系としてＣ５７ＢＬ／６系統、ＤＢＡ２系統など、交雑系としてＢ６Ｃ３Ｆ1系統、ＢＤＦ1系統、Ｂ６Ｄ２Ｆ1系統、ＢＡＬＢ／ｃ系統、ＩＣＲ系統など）およびラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ、ＳＤなど）が好ましい。
【００１６】
　また、哺乳動物以外にもニワトリなどの鳥類が本発明で対象とする「非ヒト哺乳動物」と同様の目的に用いることができる。
【００１７】
　「異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡ」とは、遺伝子導入の対象となる非ヒト哺乳動物（例えば、マウス）にとって異種の哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラットなど）由来のＰＰＡＲαもしくはそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡを意味する。好ましくは、本発明の異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡは、ヒトＰＰＡＲαもしくはそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡである。ヒトＰＰＡＲαをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、好ましくは配列番号：１で表わされる塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。「実質的に同一のアミノ酸配列」としては、例えばヒトＰＰＡＲαの場合、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と約９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは約９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。アミノ酸配列の同一性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；マトリクス=BLOSUM62；フィルタリング=OFF）にて計算することができる。
【００１８】
　「実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質」としては、例えばヒトＰＰＡＲαの場合、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質が好ましい。「実質的に同質の活性」としては、例えば、リガンド（アゴニスト、アンタゴニストを含む）結合活性、脂質代謝関連遺伝子の発現調節作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性や脂質代謝関連遺伝子の発現調節作用などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。リガンド結合活性や脂質代謝関連遺伝子の発現調節作用などの活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、後に記載するスクリーニング方法に従って測定することができる。
【００１９】
　異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡは、例えば配列番号：１で表わされる塩基配列を有するＤＮＡのように、イントロンを含まない形態（即ち、相補ＤＮＡ）であることが好ましいが、イントロンの５’および３’末端配列はほとんどの真核生物遺伝子で共通であるので、別の実施態様においてはイントロンを含む形態（即ち、ゲノムＤＮＡ）もまた好ましく用いられ得る。
【００２０】
　異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡは、ヒトや各種非ヒト哺乳動物（ウシ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）の肝臓、心臓、腎臓、副腎、血管、消化管などに由来するＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーに由来するゲノムＤＮＡの全てあるいは一部を原料として用い、あるいはヒトや各種非ヒト哺乳動物の肝臓、心臓、腎臓、副腎、血管、消化管などに由来するＲＮＡから公知の方法により調製されたｃＤＮＡを原料として用い、公知のＰＰＡＲα遺伝子配列をもとに作製したオリゴヌクレオチドをプローブもしくはプライマーとして、ハイブリダイゼーション法もしくはＰＣＲ法などにより単離することができる。
【００２１】
　本発明の遺伝子導入動物は、異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを「発現可能な状態で」保持している。したがって、当該ＤＮＡを対象動物に導入するにあたっては、当該ＤＮＡを対象動物の細胞内で機能し得るプロモーターの下流に連結した発現カセットを含む形態（例、発現ベクターなど）で用いるのが一般に有利である。
【００２２】
　異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを担持するベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物もしくは昆虫ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられ、特に大腸菌由来のプラスミドが好ましい。
【００２３】
　異種ＰＰＡＲαの遺伝子発現調節を行うプロモーターとしては、例えばウイルス（サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルスなど）に由来する遺伝子のプロモーター、各種哺乳動物（ヒト、ウシ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）および鳥類（ニワトリなど）に由来する遺伝子［例えば、アルブミン、エンドセリン、オステオカルシン、筋クレアチンキナーゼ、Ｉ型およびＩＩ型コラーゲン、サイクリックＡＭＰ依存蛋白キナーゼβＩサブユニット、心房ナトリウム利尿性因子、ドーパミンβ−水酸化酵素、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、平滑筋αアクチン、ポリペプチド鎖伸長因子１α（ＥＦ１−α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン塩基性蛋白、血清アミロイドＰコンポーネント、レニンなど］のプロモーターなどが挙げられる。好ましくは、目的とする疾患モデルに応じて、標的組織で異種ＰＰＡＲαを特異的もしくは高発現させ得るプロモーター（例：肝臓で高発現可能な血清アミロイドＰコンポーネント（ＳＡＰ）、アルブミン、トランスフェリン、フィブリノーゲン、アンチトロンビンIII、α１−アンチトリプシンなどの遺伝子プロモーター；心臓で高発現可能なαおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２などの遺伝子プロモーター；腎臓で高発現可能なＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体などの遺伝子プロモーター；副腎で高発現可能なＡＣＴＨ受容体などの遺伝子プロモーター；消化管で高発現可能な脂肪酸結合蛋白質などの遺伝子プロモーター；脳で高発現可能なミエリン塩基性蛋白、グリア線維性酸性蛋白などの遺伝子プロモーター等）を適宜選択することができる。例えば、本発明の遺伝子導入動物が高脂血症や動脈硬化症のモデルである場合、肝臓で高発現可能なプロモーターを用いることが好ましい。
【００２４】
　異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡの下流には、遺伝子導入動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結させる配列（ポリアデニレーション（ｐｏｌｙＡ）シグナル、ターミネーターとも呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス遺伝子由来、あるいは各種哺乳動物または鳥類の遺伝子由来のターミネーター配列を用いて、効率よい導入遺伝子の発現を達成することができる。好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネーターなどが用いられる。その他、目的の遺伝子をさらに高発現させる目的で、各遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核遺伝子のイントロンの一部を、プロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結することも目的により可能である。
【００２５】
　また、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いて遺伝子導入動物を作製する場合、上記のベクターは、導入ＤＮＡが安定に組み込まれたクローンを選択するための選択マーカー遺伝子（例：ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子）をさらに含むことが好ましい。さらに、相同組換えにより宿主染色体の特定の部位に導入ＤＮＡを組み込むこと（即ち、ノックイン動物の作製）を意図する場合には、上記のベクターは、ランダムな挿入を排除するために、標的部位と相同なＤＮＡ配列の外側に単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ（HSV-tk）遺伝子やジフテリア毒素遺伝子をネガティブ選択マーカー遺伝子としてさらに含むことが好ましい。これらの実施態様については後で詳述する。
【００２６】
　上記のプロモーター、異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡ、ターミネーターなどは、適当な制限酵素およびＤＮＡリガーゼ等を用いた通常の遺伝子工学的手法により、上記のベクター中に正しい配置で、即ち遺伝子導入動物において異種ＰＰＡＲαを発現可能な配置で、挿入することができる。
【００２７】
　好ましい一実施態様においては、上記のようにして得られる異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、マイクロインジェクション法により対象となる非ヒト哺乳動物の初期胚に導入される。
【００２８】
　対象非ヒト哺乳動物の初期胚は、同種の非ヒト哺乳動物の雌雄を交配させて得られる体内受精卵を採取するか、あるいは同種の非ヒト哺乳動物の雌雄からそれぞれ採取した卵と精子を体外受精させることにより得ることができる。
【００２９】
　用いる非ヒト哺乳動物の齢や飼育条件等は動物種によってそれぞれ異なるが、例えばマウス（好ましくはＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）などの近交系マウス、Ｂ６と他の近交系とのＦ1など）を用いる場合は、雌が約４〜約６週齢、雄が約２〜約８月齢程度のものが好ましく、また、約１２時間明期条件（例えば７：００−１９：００）で約１週間飼育したものが好ましい。
【００３０】
　体内受精は自然交配によってもよいが、性周期の調節と１個体から多数の初期胚を得ることを目的として、雌非ヒト哺乳動物に性腺刺激ホルモンを投与して過剰排卵を誘起した後、雄非ヒト哺乳動物と交配させる方法が好ましい。雌非ヒト哺乳動物の排卵誘発法としては、例えば初めに卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺激ホルモン、一般にＰＭＳＧと略する）、次いで黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、一般にｈＣＧと略する）を、例えば腹腔内注射などにより投与する方法が好ましいが、好ましいホルモンの投与量、投与間隔は非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。例えば、非ヒト哺乳動物がマウス（好ましくはＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）などの近交系マウス、Ｂ６と他の近交系とのＦ1など）の場合は、通常、卵胞刺激ホルモン投与後、約４８時間後に黄体形成ホルモンを投与し、直ちに雄マウスと交配させることにより受精卵を得る方法が好ましく、卵胞刺激ホルモンの投与量は約２０〜約５０ＩＵ／個体、好ましくは約３０ＩＵ／個体、黄体形成ホルモンの投与量は約０〜約１０ＩＵ／個体、好ましくは約５ＩＵ／個体である。
【００３１】
　一定時間経過後、膣栓の検査等により交配を確認した雌非ヒト哺乳動物の腹腔を開き、卵管から受精卵を取り出して胚培養用培地（例：Ｍ１６培地、修正Whitten培地、ＢＷＷ培地、Ｍ２培地、ＷＭ−ＨＥＰＥＳ培地、ＢＷＷ−ＨＥＰＥＳ培地等）中で洗って卵丘細胞を除き、微小滴培養法等により５％炭酸ガス／９５％大気下でＤＮＡ顕微注入まで培養する。直ちに顕微注入を行わない場合、採取した受精卵を緩慢法または超急速法等で凍結保存することも可能である。
【００３２】
　一方、体外受精の場合は、採卵用雌非ヒト哺乳動物（体内受精の場合と同様のものが好ましく用いられる）に上記と同様に卵胞刺激ホルモンおよび黄体形成ホルモンを投与して排卵を誘発させた後、卵子を採取して受精用培地（例：ＴＹＨ培地）中で体外受精時まで微小滴培養法等により５％炭酸ガス／９５％大気下で培養する。他方、同種の雄非ヒト哺乳動物（体内受精の場合と同様のものが好ましく用いられる）から精巣上体尾部を取り出し、精子塊を採取して受精用培地中で前培養する。前培養終了後の精子を卵子を含む受精用培地に添加し、微小滴培養法等により５％炭酸ガス／９５％大気下で培養した後、２個の前核を有する受精卵を顕微鏡下で選抜する。直ちにＤＮＡの顕微注入を行わない場合は、得られた受精卵を緩慢法または超急速法等で凍結保存することも可能である。
【００３３】
　受精卵へのＤＮＡの顕微注入は、マイクロマニピュレーター等の公知の装置を用いて常法に従って実施することができる。簡潔に言えば、胚培養用培地の微小滴中に入れた受精卵をホールディングピペットで吸引して固定し、インジェクションピペットを用いてＤＮＡ溶液を雄性もしくは雌性前核、好ましくは雄性前核内に直接注入する。導入ＤＮＡはＣｓＣｌ密度勾配超遠心等で高度に精製したものを用いることが好ましい。また、導入ＤＮＡは制限酵素を用いてベクター部分を切断し、直鎖状にしておくことが好ましい。
【００３４】
　ＤＮＡ導入後の受精卵は胚培養用培地中で微小滴培養法等により５％炭酸ガス／９５％大気下で１細胞期〜胚盤胞期まで培養した後、偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の卵管または子宮内に移植される。受胚用雌非ヒト哺乳動物は移植される初期胚が由来する動物と同種のものであればよく、例えば、マウス初期胚を移植する場合は、ＩＣＲ系の雌マウス（好ましくは約８〜約１０週齢）などが好ましく用いられる。受胚用雌非ヒト哺乳動物を偽妊娠状態にする方法としては、例えば、同種の精管切除（結紮）雄非ヒト哺乳動物（例えば、マウスの場合、ＩＣＲ系の雄マウス（好ましくは約２月齢以上））と交配させて、膣栓の存在が確認されたものを選択する方法が知られている。
【００３５】
　受胚用雌は自然排卵のものを用いてもよいし、あるいは精管切除（結紮）雄との交配に先立って、黄体形成ホルモン放出ホルモン（一般にＬＨＲＨと略する）もしくはその類縁体を投与し、受精能を誘起させたものを用いてもよい。ＬＨＲＨ類縁体としては、例えば、[3,5-DiI-Tyr5]-LH-RH、[Gln8]-LH-RH、[D-Ala6]-LH-RH、[des-Gly10]-LH-RH、[D-His(Bzl)6]-LH-RHおよびそれらのEthylamideなどが挙げられる。ＬＨＲＨもしくはその類縁体の投与量、ならびにその投与後に雄非ヒト哺乳動物と交配させる時期は、非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。例えば、非ヒト哺乳動物がマウス（好ましくはＩＣＲ系のマウスなど）の場合には、通常、ＬＨＲＨもしくはその類縁体を投与した後、約４日目に雄マウスと交配させることが好ましく、ＬＨＲＨあるいはその類縁体の投与量は、通常、約１０〜６０μｇ／個体、好ましくは約４０μｇ／個体である。
【００３６】
　通常、移植される初期胚が桑実胚期以後の場合は受胚用雌の子宮に、それより前（例えば、１細胞期〜８細胞期胚）であれば卵管に胚移植される。受胚用雌は、移植胚の発生段階に応じて偽妊娠からある日数が経過したものが適宜使用される。例えばマウスの場合、２細胞期胚を移植するには偽妊娠後約０．５日の雌マウスが、胚盤胞期胚を移植するには偽妊娠後約２．５日の雌マウスが好ましい。受胚用雌を麻酔（好ましくはAvertin、ネンブタール等が使用される）後、切開して卵巣を引き出し、胚培養用培地に懸濁した初期胚（約５〜約１０個）を胚移植用ピペットを用いて、卵管腹腔口もしくは子宮角の卵管接合部付近に注入する。
【００３７】
　移植胚が首尾よく着床し受胚雌が妊娠すれば、自然分娩もしくは帝王切開により仔非ヒト哺乳動物が得られる。自然分娩した受胚雌にはそのまま哺乳を継続させればよく、帝王切開により出産した場合は、産仔は別途用意した哺乳用雌（例えばマウスの場合、通常に交配・分娩した雌マウス（好ましくはＩＣＲ系の雌マウス等））に哺乳させることができる。
【００３８】
　受精卵細胞段階における異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡの導入は、導入ＤＮＡが対象非ヒト哺乳動物の生殖系列細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。導入ＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれているか否かは、例えば、産仔の尾部より分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ法によりスクリーニングすることにより検定することができる。上記のようにして得られる仔非ヒト哺乳動物（Ｆ0）の生殖系列細胞において異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡが存在することは、その後代（Ｆ1）の動物全てにおいて、その生殖系列細胞および体細胞のすべてに異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡが存在することを意味する。
【００３９】
　通常、Ｆ0動物は相同染色体の一方にのみ導入ＤＮＡを有するヘテロ接合体として得られる。また、個々のＦ0個体は相同組換えによらない限り異なる染色体上にランダムに挿入される。相同染色体の両方に異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを有するホモ接合体を得るためには、Ｆ0動物と非トランスジェニック動物とを交雑してＦ1動物を作製し、相同染色体の一方にのみ導入ＤＮＡを有するヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すればよい。１遺伝子座にのみ導入ＤＮＡが組み込まれていれば、得られるＦ2動物の１／４がホモ接合体となる。
【００４０】
　別の好ましい一実施態様においては、異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、エレクトロポレーション法等の公知の遺伝子導入法により対象となる非ヒト哺乳動物のＥＳ細胞に導入される。
【００４１】
　ＥＳ細胞は胚盤胞期の受精卵の内部細胞塊（ＩＣＭ）に由来し、インビトロで未分化状態を保ったまま培養維持できる細胞をいう。ＩＣＭの細胞は将来、胚本体を形成する細胞であり、生殖細胞を含むすべての組織の基になる幹細胞である。ＥＳ細胞としては、既に樹立された細胞株ものを用いてもよく、また、EvansとKaufmanの方法（ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981年）に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系マウス由来のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ1マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ1）から樹立されるＥＳ細胞なども良好に用いることができる。ＢＤＦ1マウスは、採卵数が多く、かつ卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これ由来のＥＳ細胞は疾患モデルマウスを作製したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと戻し交雑することでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
【００４２】
　ＥＳ細胞の調製は、例えば以下のようにして行うことができる。交配後の雌非ヒト哺乳動物［例えばマウス（好ましくはＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）などの近交系マウス、Ｂ６と他の近交系とのＦ1など）を用いる場合は、約２月齢以上の雄マウスと交配させた約８〜約１０週齢程度の雌マウス（妊娠約３．５日）が好ましく用いられる］の子宮から胚盤胞期胚を採取して（あるいは桑実胚期以前の初期胚を卵管から採取した後、胚培養用培地中で上記と同様にして胚盤胞期まで培養してもよい）、適当なフィーダー細胞（例えばマウスの場合、マウス胎仔から調製される初代繊維芽細胞や公知のＳＴＯ繊維芽細胞株等）層上で培養すると、胚盤胞の一部の細胞が集合して将来胚に分化するＩＣＭを形成する。この内部細胞塊をトリプシン処理して単細胞を解離させ、適切な細胞密度を保ち、培地交換を行いながら、解離と継代を繰り返すことによりＥＳ細胞が得られる。
【００４３】
　ＥＳ細胞は雌雄いずれを用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作製するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０6個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
【００４４】
　また、第二次セレクションとして、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、細胞株樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞への遺伝子導入の後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
【００４５】
　このようにして得られるＥＳ細胞株は、未分化幹細胞の性質を維持するために注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上で、分化抑制因子として知られるＬＩＦ（１〜１０，０００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス／９５％空気または５％酸素／５％炭酸ガス／９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１〜０.５％トリプシン／０.１〜５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１〜３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
【００４６】
　ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin　プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschman ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明の異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを導入されたＥＳ細胞を分化させて得られる異種ＰＰＡＲα発現非ヒト哺乳動物細胞は、インビトロにおける異種ＰＰＡＲαの細胞生物学的検討において有用である。
【００４７】
　ＥＳ細胞への遺伝子導入には、リン酸カルシウム共沈殿法、電気穿孔（エレクトロポレーション）法、リポフェクション法、レトロウイルス感染法、凝集法、顕微注入（マイクロインジェクション）法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などのいずれも用いることができるが、簡便に多数の細胞を処理できること等の点からエレクトロポレーション法が一般的に選択されている。エレクトロポレーションには通常の動物細胞への遺伝子導入に使用されている条件をそのまま用いればよく、例えば、対数増殖期にあるＥＳ細胞をトリプシン処理して単一細胞に分散させた後、１０6〜１０8細胞／ｍｌとなるように培地に懸濁してキュベットに移し、異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを含むベクターを１０〜１００μｇ添加し、２００〜６００Ｖ／ｃｍの電気パルスを印加することにより行なうことができる。
【００４８】
　導入ＤＮＡが組み込まれたＥＳ細胞は、単一細胞をフィーダー細胞上で培養して得られるコロニーから分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ法によりスクリーニングすることによっても検定することができるが、ＥＳ細胞を用いるトランスジェニック系の最大の長所は、薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子の発現を指標として細胞段階で形質転換体を選択できることである。したがって、ここで使用される導入ベクターは、異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを含む発現カセットに加えて、薬剤耐性遺伝子（例：ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（nptII）遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（hpt）遺伝子など）やレポーター遺伝子（例：β−ガラクトシダーゼ（lacZ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（cat）遺伝子など）等の選択マーカー遺伝子をさらに含むことが望ましい。例えば、選択マーカー遺伝子としてnptII遺伝子を含むベクターを用いた場合、遺伝子導入処理後のＥＳ細胞をＧ４１８などのネオマイシン系抗生物質を含有する培地中で培養し、出現した耐性コロニーをそれぞれ培養プレートに移してトリプシン処理、培地交換を繰り返した後、一部を培養用として残し、残りをＰＣＲもしくはサザンハイブリダイゼーションにかけて導入ＤＮＡの存在を確認する。
【００４９】
　導入ＤＮＡの組込みが確認されたＥＳ細胞を同種の非ヒト哺乳動物由来の胚内に戻すと、宿主胚のＩＣＭに組み込まれてキメラ胚が形成される。これを仮親（受胚用雌）に移植してさらに発生を続けさせることにより、キメラトランスジェニック動物が得られる。キメラ動物の中でＥＳ細胞が将来卵や精子に分化する始原生殖細胞の形成に寄与した場合には、生殖系列キメラが得られることとなり、これを交配することにより導入ＤＮＡが遺伝的に固定された遺伝子導入非ヒト哺乳動物を作製することができる。
【００５０】
　キメラ胚の作製方法としては、桑実胚期までの初期胚同士を接着させて集合させる方法（集合キメラ法）と、胚盤胞の割腔内に細胞を顕微注入する方法（注入キメラ法）とがある。ＥＳ細胞によるキメラ胚の作製においては従来より後者が広く行なわれているが、最近では、８細胞期胚の透明帯内へのＥＳ細胞の注入により集合キメラを作る方法や、マイクロマニピュレーターが不要で操作が容易な方法として、ＥＳ細胞塊と透明帯を除去した８細胞期胚とを共培養して凝集させることによって集合キメラを作製する方法も行われている。
【００５１】
　いずれの場合も、宿主胚は受精卵への遺伝子導入における採卵用雌として使用され得る非ヒト哺乳動物から同様にして採取することができるが、例えばマウスの場合、キメラマウス形成へのＥＳ細胞の寄与率を毛色（コートカラー）で判定し得るように、ＥＳ細胞の由来する系統とは毛色の異なる系統のマウスから宿主胚を採取することが好ましい。例えば、ＥＳ細胞が１２９系マウス（毛色：アグーチ）由来であれば、採卵用雌としてＣ５７ＢＬ／６マウス（毛色：ブラック）やＩＣＲマウス（毛色：アルビノ）を用い、ＥＳ細胞がＣ５７ＢＬ／６もしくはＤＢＦ1マウス（毛色：ブラック）由来やＴＴ２細胞（Ｃ５７ＢＬ／６とＣＢＡとのＦ1（毛色：アグーチ）由来）であれば、採卵用雌としてＩＣＲマウスやＢＡＬＢ／ｃマウス（毛色：アルビノ）を用いることができる。
【００５２】
　また、生殖系列キメラ形成能はＥＳ細胞と宿主胚との組み合わせに大きく依存するので、生殖系列キメラ形成能の高い組み合わせを選択することがより好ましい。例えばマウスの場合、１２９系統由来のＥＳ細胞に対してはＣ５７ＢＬ／６系統由来の宿主胚等を用いることが好ましく、Ｃ５７ＢＬ／６系統由来のＥＳ細胞に対してはＢＡＬＢ／ｃ系統由来の宿主胚等が好ましい。
【００５３】
　採卵用雌マウスは約４〜約６週齢程度が好ましく、交配用の雄マウスとしては約２〜約８月齢程度の同系統のものが好ましい。交配は自然交配によってもよいが、好ましくは性腺刺激ホルモン（卵胞刺激ホルモン、次いで黄体形成ホルモン）を投与して過剰排卵を誘起した後に行なわれる。
【００５４】
　胚盤注入法による場合は、胚盤胞期胚（例えばマウスの場合、交配後約３．５日）を採卵用雌の子宮から採取し（あるいは桑実胚期以前の初期胚を卵管から採取した後、上述の胚培養用培地中で胚盤胞期まで培養してもよい）、マイクロマニピュレーターを用いて胚盤胞の割腔内に異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡが導入されたＥＳ細胞（約１０〜約１５個）を注入した後、偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の子宮内に移植する。受胚用雌非ヒト哺乳動物は受精卵への遺伝子導入における受胚用雌として使用され得る非ヒト哺乳動物を同様に用いることができる。
【００５５】
　共培養法による場合は、８細胞期胚および桑実胚（例えばマウスの場合、交配後約２．５日）を採卵用雌の卵管および子宮から採取して（あるいは８細胞期以前の初期胚を卵管から採取した後、上述の胚培養用培地中で８細胞期または桑実胚期まで培養してもよい）酸性タイロード液中で透明帯を溶解した後、ミネラルオイルを重層した胚培養用培地の微小滴中に異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡが導入されたＥＳ細胞塊（細胞数約１０〜約１５個）を入れ、さらに上記８細胞期胚または桑実胚（好ましくは２個）を入れて一晩共培養する。得られた桑実胚または胚盤胞を上記と同様にして受胚用雌非ヒト哺乳動物の子宮内に移植する。
【００５６】
　移植胚が首尾よく着床し受胚雌が妊娠すれば、自然分娩もしくは帝王切開によりキメラ非ヒト哺乳動物が得られる。自然分娩した受胚雌にはそのまま哺乳を継続させればよく、帝王切開により出産した場合は、産仔は別途用意した哺乳用雌（通常に交配・分娩した雌非ヒト哺乳動物）に哺乳させることができる。
【００５７】
　生殖系列キメラの選択は、まずＥＳ細胞の雌雄が予め判別されている場合はＥＳ細胞と同じ性別のキメラマウスを選択し（通常は雄性ＥＳ細胞が使用されるので、雄キメラマウスが選択される）、次いで毛色等の表現型からＥＳ細胞の寄与率が高いキメラマウス（例えば、５０％以上）を選択する。例えば、１２９系マウス由来の雄性ＥＳ細胞であるＤ３細胞とＣ５７ＢＬ／６マウス由来の宿主胚とのキメラ胚から得られるキメラマウスの場合、アグーチの毛色の占める割合の高い雄マウスを選択するのが好ましい。選択されたキメラ非ヒト哺乳動物が生殖系列キメラであるか否かの確認は、適当な系統の同種動物との交雑により得られるＦ1動物の表現型に基づいて行なうことができる。例えば、上記キメラマウスの場合、アグーチはブラックに対して優性であるので、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスと交雑すると、選択された雄マウスが生殖系列キメラであれば得られるＦ1の毛色はアグーチとなる。
【００５８】
　上記のようにして得られる異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡが導入された生殖系列キメラ非ヒト哺乳動物（ファウンダー）は、通常、相同染色体の一方にのみ導入ＤＮＡを有するヘテロ接合体として得られる。また、個々のファウンダーは相同組換えによらない限り異なる染色体上にランダムに挿入される。相同染色体の両方に異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを有するホモ接合体を得るためには、上記のようにして得られるＦ1動物のうち相同染色体の一方にのみ導入ＤＮＡを有するヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すればよい。ヘテロ接合体の選択は、例えばＦ1動物の尾部より分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ法によりスクリーニングすることにより検定することができる。１遺伝子座にのみ導入ＤＮＡが組み込まれていれば、得られるＦ2動物の１／４がホモ接合体となる。
【００５９】
　本発明の遺伝子導入動物は、異種ＰＰＡＲαに対する被験物質の作用を定量的に測定可能な程度に異種ＰＰＡＲαの発現量が確保される限り、内因性ＰＰＡＲαの発現については特に制限はない。しかしながら、本発明の遺伝子導入動物を異種ＰＰＡＲαだけでなく内因性ＰＰＡＲαにも作用し得る薬剤の評価にも使用する場合は、内因性ＰＰＡＲαの発現を不活性化することが望ましい。内因性ＰＰＡＲαの発現が不活性化された本発明の遺伝子導入動物は、公知の方法（例えば、Lee S.S.ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol. Cell. Biol.）、第15巻、第3012頁、1995年を参照）により選択されるＰＰＡＲα遺伝子がノックアウトされたＥＳ細胞、あるいは該ＥＳ細胞から上記の方法に従って作製されるＰＰＡＲαノックアウト動物由来の初期胚もしくはＥＳ細胞に、上記の方法に従って異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを導入することによって得ることができる。ＰＰＡＲα遺伝子をノックアウトする具体的な手段としては、対象非ヒト哺乳動物由来のＰＰＡＲα遺伝子を常法に従って単離し、例えば、そのエキソン部分に他のＤＮＡ断片（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）等のレポーター遺伝子等）を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか（この場合、前述のように導入ＤＮＡの組込みは薬剤耐性やレポーター遺伝子の発現を指標として選択され得る）、Cre-loxP系やFlp-frt系を用いてＰＰＡＲα遺伝子の全部または一部を切り出して該遺伝子を欠失させるか、蛋白質コード領域内へ終止コドンを挿入して完全な蛋白質の翻訳を不能にするか、あるいは転写領域内部へ遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ付加シグナルなど）を挿入して、完全なメッセンジャーＲＮＡの合成を不能にすることによって、結果的に遺伝子を不活性化するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、相同組換えにより対象非ヒト哺乳動物のＰＰＡＲα遺伝子座に組み込ませる方法が好ましく挙げられる。
【００６０】
　通常、哺乳動物における遺伝子組換えは大部分が非相同的であり、導入されたＤＮＡは染色体の任意の位置にランダムに挿入される。したがって、薬剤耐性やレポーター遺伝子の発現を検出するなどの選択によっては相同組換えにより標的となる内因性ＰＰＡＲα遺伝子にターゲッティングされたクローンのみを効率よく選択することができず、選択されたすべてのクローンについてサザンハイブリダイゼーション法もしくはＰＣＲ法による組み込み部位の確認が必要となる。そこで、ターゲッティングベクターの標的配列に相同な領域の外側に、例えば、ガンシクロビル感受性を付与するHSV-tk遺伝子を連結しておけば、該ベクターがランダムに挿入された細胞はHSV-tk遺伝子を有するため、ガンシクロビル含有培地では生育できないが、相同組換えにより内因性ＰＰＡＲα遺伝子座にターゲッティングされた細胞はHSV-tk遺伝子を有しないので、ガンシクロビル耐性となり選択される。あるいは、HSV-tk遺伝子の代わりに、例えばジフテリア毒素遺伝子を連結すれば、該ベクターがランダムに挿入された細胞は自身の産生する該毒素によって死滅するので、薬剤非存在下で相同組換え体を選択することもできる。
【００６１】
　また、内因性ＰＰＡＲαの発現が不活性化された本発明の遺伝子導入動物は、このようにして作製される内因性ＰＰＡＲαをノックアウトされた動物と、上述の異種ＰＰＡＲαを導入された、該動物と同種の動物とを交配することによっても得ることができる。例えば、内因性ＰＰＡＲαホモ欠損マウスと、ヒトＰＰＡＲαホモトランスジェニック（Tg）マウスとを交配して得られる産仔（内因性ＰＰＡＲαヘテロ欠損・ヒトＰＰＡＲαヘテロTgマウス）の雌雄同士をさらに交配して、２コピーのヒトＰＰＡＲαおよびノックアウトされたマウスＰＰＡＲαの欠損部分のみが確認されたマウスを選択することにより、内因性ＰＰＡＲαホモ欠損・ヒトＰＰＡＲαホモTgマウスを作製することができる。
【００６２】
　あるいは、内因性ＰＰＡＲαの発現が不活性化された本発明の遺伝子導入動物は、相同組換えを用いた遺伝子ターゲッティングにより異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡで内因性ＰＰＡＲα遺伝子を置換したノックイン動物であってもよい。
【００６３】
　ノックイン動物はノックアウト動物と基本的に同様の手法に従って作製することができる。ＰＰＡＲαのＯＲＦは第３エキソン〜第８エキソンに存在するので、例えば、対象非ヒト哺乳動物由来のＰＰＡＲα遺伝子のこれらの領域を適当な制限酵素を用いて切除し、代わりに異種ＰＰＡＲα遺伝子の対応する領域を挿入することにより得られるＤＮＡを含むターゲッティングベクターを、上記の方法に従って対象非ヒト哺乳動物由来のＥＳ細胞に導入し、相同組換えにより該動物の内因性ＰＰＡＲα遺伝子座に異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡが組み込まれたＥＳ細胞クローンを選択すればよい。クローン選択はＰＣＲ法やサザン法を用いて行なうこともできるが、例えば、ターゲッティングベクターのＰＰＡＲα遺伝子の３’非翻訳領域などにネオマイシン耐性遺伝子等のポジティブ選択用マーカー遺伝子を挿入し、さらに標的配列と相同な領域の外側にHSV-tk遺伝子やジフテリア毒素遺伝子等のネガティブ選択用マーカー遺伝子を挿入すれば、薬剤耐性を指標にして相同組換え体を選択することができる。
【００６４】
　また、ポジティブ選択用マーカー遺伝子が導入された異種ＰＰＡＲαの発現を妨げる場合があるので、ポジティブ選択用マーカー遺伝子の両端にloxP配列もしくはfrt配列を配したターゲッティングベクターを用い、相同組換え体選択後の適当な時期にCreもしくはFlpリコンビナーゼまたは該リコンビナーゼ発現ベクター（例：アデノウイルスベクターなど）を作用させることにより、ポジティブ選択用マーカー遺伝子を切り出すことが好ましい。あるいは、Cre-loxP系やFlp-frt系を用いる代わりに、ポジティブ選択用マーカー遺伝子の両端に標的配列と相同な配列を同方向に繰り返して配置し、該配列間での遺伝子内組換えを利用してポジティブ選択用マーカー遺伝子を切り出してもよい。
【００６５】
　本発明の遺伝子導入動物は、異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを発現可能な状態で安定に保持することに加えて、１以上の他の遺伝子改変を有することをさらなる特徴とする。「他の遺伝子改変」とは、異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡが導入される以外の遺伝子改変を意味し、自然突然変異により内因性遺伝子が改変された自然発症疾患モデル動物、他の遺伝子をさらに導入されたトランスジェニック動物、内因性遺伝子を不活化されたノックアウト動物（挿入突然変異等による遺伝子破壊のほか、アンチセンスＤＮＡや中和抗体をコードするＤＮＡの導入により遺伝子発現が検出不可能もしくは無視し得る程度にまで低下したトランスジェニック動物を含む）、変異内因性遺伝子が導入されたドミナントネガティブ変異体などが含まれる。したがって、内因性ＰＰＡＲα遺伝子の改変もまた、本発明における「他の遺伝子改変」に該当する。
【００６６】
　「他の遺伝子改変」は、異種ＰＰＡＲαに特異的な作動薬もしくは拮抗薬の薬効評価用としての本発明の遺伝子導入動物の用途に有利なものであれば特に制限はないが、例えば、ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせるような遺伝子改変であることが好ましい。
【００６７】
　「ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患」とは、ＰＰＡＲα活性の異常に起因するかもしくは結果的にＰＰＡＲα活性の異常を生じる疾患だけでなく、ＰＰＡＲα活性を調節することにより予防および／または治療効果が得られ得る疾患をも含めた概念として把握されるべきである。例えば、ＰＰＡＲαを活性化することにより予防・治療可能な疾患として、高脂血症、高トリグリセリド（ＴＧ）血症、混合型脂質異常症、低ＨＤＬ血症、動脈硬化症、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、壊疽、高血圧症、血栓症、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心不全、鬱血性心不全、不安定狭心症、ＰＴＣＡ（経皮的冠動脈内腔拡張術）後の再狭窄、ステント留置後の再狭窄、高フィブリノーゲン血症、心筋症、脳出血、一過性脳虚血発作、脳梗塞、脳卒中、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎動脈硬化症、皮膚炎、免疫不全、低血糖、低ケトン血症、脂肪肝、糖尿病、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、肥満、アルツハイマー病、貧血性低酸素症および性腺障害等が、ＰＰＡＲαを阻害することにより予防・治療可能な疾患として、肝臓癌、乳癌および子宮内膜炎等がそれぞれ挙げられる。
【００６８】
　「ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変を有する疾患モデル」としては、例えば、高脂血症もしくは動脈硬化症モデルとしてＷＨＨＬウサギ（低比重リポ蛋白レセプター（LDLR）に変異を有する；Watanabe Y.、アテロースクレローシス（Atherosclerosis）、第36巻、第261頁、1980年）、ＳＨＬＭ（apoE欠損変異を有する自然発症マウス；Matsushima Y.ら、マンマリアン・ゲノム（Mamm. Genome）、第10巻、第352頁、1999年）、LDLRノックアウトマウス（Ishibashi S.ら、ジャーナル・オヴ・クリニカル・インヴェスティゲーション（J. Clin. Invest.）、第92巻、第883頁、1993年）、apoEノックアウトマウス（Piedrahita J.A.ら、プロシーディングズ・オヴ・ナショナル・アカデミー・オヴ・サイエンシーズ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、第89巻、第4471頁、1992年）、ヒトapo A,ヒトapoBダブルトランスジェニックマウス（Callow M.J.ら、プロシーディングズ・オヴ・ナショナル・アカデミー・オヴ・サイエンシーズ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、第91巻、第2130頁、1994年）等が、虚血性心疾患モデルとしてCD55 CD59ダブルトランスジェニックマウス（Cowan P.J.ら、Xenotransplantation、第5巻、第184-90頁、1998年）等が、皮膚炎モデルとしてinterleukin 1トランスジェニックマウス（Groves R.W. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第92巻、11874頁、1995年）等が、免疫不全モデルとしてCD19ノックアウトマウス（Spielman J.ら、Immunity、第3巻、39頁、1995年）等が、低血糖モデルとしてSPC2ノックアウトマウス（Furuta M.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第94巻、6646頁、1997年）等が、脂肪肝モデルとしてob/obマウス（Herberg L.及びColeman D.L.、メタボリズム（Metabolism）、第26巻、第59頁、1977年）、KKマウス（Nakamura M.及びYamada K.、ダイアベトロジア（Diabetologia）、第3巻、第212頁、1967頁）、FLSマウス（Soga M.ら、ラボラトリー・オヴ・アニマル・サイエンス（Lab. Anim. Sci.）、第49巻、第269頁、1999年）、糖尿病モデルとしてNODマウス（Makino S.ら、エクスペリメンタル・アニマル（Exp. Anim.）、第29巻、第1頁、1980年）、BBラット（Crisa L.ら、ダイアビーティス・メタボリズム・レヴュー（Diabetes Metab. Rev.）、第8巻、第4頁、1992年）、ob/obマウス、db/dbマウス（Hummel L.ら、サイエンス（Science）、第153巻、第1127頁、1966年）、KKマウス、GKラット（Goto Y.ら、トウホク・ジャーナル・オヴ・エクスペリメンタル・メディシン（Tohoku J. Exp. Med.）、第119巻、第85頁、1976年）、Zucker fattyラット（Zucker L.M.ら、アニュアル・オヴ・ニューヨーク・アカデミー・オヴ・サイエンス（Ann. NY Acad. Sci.）、第131巻、第447頁、1965年）、OLETFラット（Kawano K.ら、ダイアビーティス（Diabetes）、第41巻、第1422頁、1992年）等が、肥満モデルとしてob/obマウス、db/dbマウス、KKマウス、Zucker fattyラット、OLETFラット等が、アルツハイマー病モデルとして変異アミロイド前駆体蛋白質遺伝子導入マウス等が、貧血性低酸素症モデルとしてbeta SAD (beta S-Antilles-D Punjab)トランスジェニックマウス（Trudel M.ら、EMBO J、第10巻、3157頁、1991年）等が、性腺障害モデルとしてSteroidogenic factor 1ノックアウトマウス（Zhao L.ら、Development、第128巻、147頁、2001年）等が、肝臓癌モデルとしてp53ノックアウトマウス（Kemp C.J. Molecular Carcinogenesis, 第12巻、132頁、1995年）等が、乳癌モデルとしてc-neuトランスジェニックマウス（Rao G.N.ら、Breast Cancer Res Treat, 第48巻、265頁、1998年）等が、子宮内膜炎モデルとしてperforin Fas-ligandダブルノックアウトマウス（Spielman J.ら、J Immunol. , 第161巻、7063頁、1998年）等が、知られている。
【００６９】
　これらの「他の遺伝子改変を有する疾患モデル」は、例えば、米国のJackson研究所などから購入可能であるか、あるいは周知の遺伝子改変技術を用いて容易に作製することができる。
【００７０】
　本発明の遺伝子導入動物は、「ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変」に加えて、同一もしくは他の疾患モデルを作製し得る非遺伝的処理を施されていてもよい。「非遺伝的処理」とは対象非ヒト哺乳動物における遺伝子改変を生じさせない処理を意味する。このような処理としては、例えば、高脂肪食負荷処理、糖負荷処理、飢餓処理、血管結紮／再灌流等が挙げられる。
【００７１】
　ＰＰＡＲαは哺乳動物の肝臓、心臓、腎臓、副腎、消化管、脳などで高発現しており、それらの臓器における疾患と関連している。従って、本発明の遺伝子導入動物は、肝臓、心臓、腎臓、副腎、消化管および脳のうちの１もしくは２以上の部位で異種ＰＰＡＲαを特異的に発現するものであることが好ましい。そのような部位特異的発現は、前記した標的組織で異種ＰＰＡＲαを特異的もしくは高発現させ得るプロモーターを用いることにより達成することができる。例えば、肝臓で高発現可能な血清アミロイドＰコンポーネント（ＳＡＰ）プロモーターを用いることにより、異種ＰＰＡＲαを肝臓特異的に、あるいは肝臓で高発現する本発明の遺伝子導入動物を作製することができる。
【００７２】
　また、異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを導入された非ヒト哺乳動物がＰＰＡＲαを著しく高発現する場合、他の遺伝子改変を有することなく肝臓癌、乳癌、子宮内膜炎などの疾患を発症する表現型を示すものがある。したがって、本発明はまた、肝臓癌、乳癌および子宮内膜炎からなる群より選択される１以上の疾患を発症する、異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを導入された非ヒト哺乳動物を提供する。
【００７３】
　異種ＰＰＡＲαに特異的な作動薬もしくは拮抗薬の薬効評価用としての本発明の遺伝子導入動物の用途に有利な「他の遺伝子改変」の別の好ましい態様としては、ＰＰＲＥを有するプロモーターの制御下にある外来ＤＮＡの導入が挙げられる。上述のように、ＰＰＡＲαはリガンド存在下に標的遺伝子の５’上流に存在するＰＰＲＥ配列に結合して該遺伝子の転写を促進する（遺伝子によっては抑制する場合もある（例：apoC-III等））。したがって、ＰＰＲＥを有するプロモーターの制御下にある外来ＤＮＡを導入された非ヒト哺乳動物では、該ＤＮＡの発現に及ぼす被験物質の効果を検定することにより、該物質のアゴニストまたはアンタゴニスト活性を評価することができる。ここで「外来ＤＮＡ」とは、外部より人為的に遺伝子導入されたＤＮＡを意味し、異種ＤＮＡだけでなく同種ＤＮＡをも包含する。「ＰＰＲＥを有するプロモーターの制御下にある外来ＤＮＡ」としては、ＰＰＡＲαの本来の標的遺伝子であり、ＰＰＲＥ配列をプロモーター領域に内在するヒトまたは他の哺乳動物由来遺伝子（ゲノムＤＮＡ）、例えば、CYP4A11、CYP7A1、PAI-1、ApoA-I、ApoA-II、ApoC-III、Acyl-CoA等の遺伝子が挙げられる。あるいは、これらの遺伝子由来のＰＰＲＥ配列を含む任意のプロモーター（対象非ヒト哺乳動物の細胞内で機能的である）の下流に適当なリポーター遺伝子（例：β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、ペルオキシダーゼ遺伝子等）を連結したキメラＤＮＡもまた好ましい。
【００７４】
　異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを導入された非ヒト哺乳動物に、ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変、あるいはＰＰＲＥを有するプロモーターの制御下にある外来ＤＮＡを導入する方法は特に制限はなく、例えば、異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを導入された非ヒト哺乳動物と、ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変、あるいはＰＰＲＥを有するプロモーターの制御下にある外来ＤＮＡを有する同種の非ヒト哺乳動物とを交雑する方法；ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変、あるいはＰＰＲＥを有するプロモーターの制御下にある外来ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物の初期胚やＥＳ細胞に、上述の方法により異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを導入してトランスジェニック動物を得る方法；異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを導入された非ヒト哺乳動物の初期胚やＥＳ細胞に、上述の方法により、あるいはノックアウト技術により、ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変、あるいはＰＰＲＥを有するプロモーターの制御下にある外来ＤＮＡを導入する方法等が挙げられる。また、ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変が外来遺伝子やドミナント変異遺伝子の導入による場合、野生型非ヒト哺乳動物の初期胚やＥＳ細胞に、該外来遺伝子等と異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡとを同時にもしくは順次導入してトランスジェニック動物を得てもよい。他の遺伝子改変がＰＰＲＥを有するプロモーターの制御下にある外来ＤＮＡの導入である場合も同様に、該外来ＤＮＡと異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡとを同時にもしくは順次導入してトランスジェニック動物を得ることができる。さらに、ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変が内因性遺伝子の破壊による場合は、異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを破壊すべき内因性遺伝子にターゲッティングされ得るようにデザインして野生型非ヒト哺乳動物のＥＳ細胞に導入してもよい。この場合、ターゲッティングベクターは、内因性ＰＰＡＲα遺伝子を破壊されるべき内因性遺伝子に置き換える以外は、上記のノックイン動物の作製に関して例示したものが好ましく使用され得る。
【００７５】
　異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを導入された非ヒト哺乳動物と、ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変（あるいはＰＰＲＥを有するプロモーターの制御下にある外来ＤＮＡ）を有する同種の疾患モデル非ヒト哺乳動物とを交雑する場合、ホモ接合体同士を交雑することが望ましい。例えば、異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡが１遺伝子座に組み込まれたホモ接合体と、apoEホモ欠損高脂血症（動脈硬化）モデルとを交雑して得られるＦ1は両遺伝子についてヘテロである。このＦ1同士を兄妹交配して得られるＦ2個体の１／１６は異種ＰＰＡＲαホモ導入・apoEホモ欠損となる。
【００７６】
　上記のようにして得られる「本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物」は、内因性ＰＰＡＲαに加えて（あるいはそれに代えて）異種ＰＰＡＲαを発現するので、異種ＰＰＡＲαに対してアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有するが、内因性ＰＰＡＲαに対しては活性を有しない異種ＰＰＡＲα特異的作動薬または拮抗薬について、その薬効をインビボで評価することを可能にする。したがって、本発明は、本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物またはその生体の一部に被験物質を適用し、該物質の異種ＰＰＡＲαに対するアゴニストまたはアンタゴニスト活性を検定することを特徴とする異種ＰＰＡＲα作動薬または拮抗薬のスクリーニング方法を提供する。
【００７７】
　ここで「アゴニスト活性」とは、ＰＰＡＲαに特異的に結合し、ＰＰＡＲαの活性型（即ち、ＲＸＲとのヘテロダイマーとしてＰＰＲＥに結合し、標的遺伝子の転写を活性化し得る状態）と不活性型の平衡状態をより活性側にシフトさせる性質をいい、その程度は特に限定されない。従って、「アゴニスト活性を有する物質（作動薬）」には、いわゆるフルアゴニストの他、パーシャルアゴニストも包含される。一方、「アンタゴニスト活性」とは、ＰＰＡＲαのリガンド結合部位に拮抗的に結合するが、活性型と不活性型の平衡状態にほとんど又は全く影響を及ぼさない性質、あるいはＰＰＡＲαの任意の部位に結合して、ＰＰＡＲαの活性型と不活性型の平衡状態をより不活性側にシフトさせる性質をいう。従って、本明細書において「アンタゴニスト活性を有する物質（拮抗薬）」とは、いわゆるニュートラルアンタゴニストとインバースアゴニストの両方を包含する概念として定義されるものとする。
【００７８】
　具体的には、本発明のスクリーニング方法では、本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物に被験物質を投与する。被験物質としては、公知の合成化合物、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡライブラリーなどの他に、例えば哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出物、細胞培養上清などが用いられる。該被験物質は、本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物の内因性ＰＰＡＲαおよび異種ＰＰＡＲαのそれぞれとインビトロでの結合実験を行なって異種ＰＰＡＲαのみに結合することを確認するか、あるいは、ＰＰＲＥの制御下に置かれたレポーター遺伝子をそれぞれ導入した非ヒト哺乳動物由来細胞および異種哺乳動物由来細胞における発現アッセイを行なって、後者でのみレポーター遺伝子の発現が活性化されることを確認することなどにより、予め異種ＰＰＡＲα特異的に作用することを確認しておくことが望ましい。本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物において内因性ＰＰＡＲαがノックアウトされている場合は、この予備スクリーニングを省略することができる。
【００７９】
　被験物質のＰＰＡＲαアゴニスト／アンタゴニスト活性は、例えば、脂肪酸β酸化活性またはそれに伴う血中ＴＧ濃度の変化、apoC-III産生またはそれに伴う血中ＴＧ濃度の変化、apoA-I産生またはそれに伴う血中ＨＤＬ−Ｃ濃度の変化、apoA-II産生またはそれに伴う血中ＨＤＬ−Ｃ濃度の変化などを指標として検定することができる。これらは自体公知の方法、例えば、Chung, B.H., Segrest, J.P., Ray, M.J., Brunzell, J.D., Hokanson, J.E., Krauss, R.M., Beaudrie, K., and Cone, J.T. 1986. Methods Enzymol. 128: 181-209に記載の方法に準じて測定することができる。「他の遺伝子改変」が「ＰＰＲＥを有するプロモーターの制御下にある外来ＤＮＡの導入」である本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物においては、該外来ＤＮＡの発現を調べることによって、被験物質のＰＰＡＲαアゴニスト／アンタゴニスト活性を容易に測定することができる。
【００８０】
　このようにして選択された異種ＰＰＡＲα作動薬は、該異種ＰＰＡＲαの由来する動物における安全で低毒性な高脂血症、高トリグリセリド血症、混合型脂質異常症、低ＨＤＬ血症、動脈硬化症、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、壊疽、高血圧症、血栓症、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心不全、鬱血性心不全、不安定狭心症、ＰＴＣＡ後の再狭窄、ステント留置後の再狭窄、高フィブリノーゲン血症、心筋症、脳出血、一過性脳虚血発作、脳梗塞、脳卒中、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎動脈硬化症、皮膚炎、免疫不全、低血糖、低ケトン血症、脂肪肝、糖尿病、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、肥満、アルツハイマー病、貧血性低酸素症および性腺障害などの疾患の予防・治療薬として使用することができる。
【００８１】
　異種ＰＰＡＲα作動薬は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。該作動薬は、生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。これら製剤における有効成分量は後述する投与量を考慮して適宜選択されれる。
【００８２】
　錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
【００８３】
　注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
【００８４】
　また、異種ＰＰＡＲα作動薬がＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸である場合、当該核酸を単独で、あるいは当該ＤＮＡ（または当該ＲＮＡに対応するＤＮＡ）をレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは他の哺乳動物に投与することができる。当該核酸は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化した後、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
【００８５】
　このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、異種ＰＰＡＲαと同一もしくは実質的に同一のＰＰＡＲαを有する哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど；「実質的に同一」とは上記と同義である）、好ましくは異種ＰＰＡＲαの由来する動物（好ましくはヒト）に対して投与することができる。
【００８６】
　異種ＰＰＡＲα作動薬の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより異なるが、例えば、高ＴＧ血症の治療目的で経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口投与の場合、当該作動薬の投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、高ＴＧ血症の治療目的で注射剤として成人（体重６０ｋｇ）に投与する場合、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度である。投与対象がヒト以外の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００８７】
　また、本発明のスクリーニング法により選択された異種ＰＰＡＲα拮抗薬は、哺乳動物（好ましくは異種ＰＰＡＲαの由来する動物、さらに好ましくはヒト）における安全で低毒性な肝臓癌、乳癌または子宮内膜炎などの疾患の予防・治療薬として使用することができる。異種ＰＰＡＲα拮抗薬は、上記異種ＰＰＡＲα作動薬と同様の方法により製剤化され、経口的もしくは非経口的に哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど；「実質的に同一」とは上記と同義である）に投与することができる。
【００８８】
　異種ＰＰＡＲα拮抗薬の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより異なるが、例えば、肝臓癌の治療目的で経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口投与の場合、当該拮抗薬の投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、肝臓癌の治療目的で注射剤として成人（体重６０ｋｇ）に投与する場合、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度である。投与対象がヒト以外の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００８９】
　「本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物」はＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を示すので、該動物に被験物質を投与してその病態に及ぼす該物質の効果を検定することによって、異種ＰＰＡＲαの由来する哺乳動物（好ましくは、ヒト）における該ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患に対して予防・治療活性を有する物質をスクリーニングすることができる。指標となる病態は疾患モデルの種類に応じて適宜選択され得るが、例えば、本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物が高脂血症モデルであれば、血中コレステロール濃度（総コレステロール濃度、ＴＧ濃度、ＨＤＬ−Ｃ濃度等）の改善など、動脈硬化モデルであれば動脈硬化病変の退縮など、虚血性心疾患や脳血管疾患のモデルであれば血流の改善など、肝臓癌や乳癌のモデルであれば癌病巣の退縮などをそれぞれ指標として、被験物質の疾患予防・治療効果を評価することができる。
【００９０】
　上述のように、異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを導入された非ヒト哺乳動物がＰＰＡＲαを著しく高発現する場合、他の遺伝子改変を有することなく肝臓癌、乳癌、子宮内膜炎などの疾患を発症する表現型を示すものがある。したがって、このような異種ＰＰＡＲα導入非ヒト哺乳動物に同様に被験物質を投与して上記疾患の病態改善効果を検定することによっても、該疾患の予防・治療活性を有する物質をスクリーニングすることができる。
【００９１】
　このようにして選択された物質は、安全で低毒性な高脂血症、高トリグリセリド血症、混合型脂質異常症、低ＨＤＬ血症、動脈硬化症、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、壊疽、高血圧症、血栓症、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心不全、鬱血性心不全、不安定狭心症、ＰＴＣＡ後の再狭窄、ステント留置後の再狭窄、高フィブリノーゲン血症、心筋症、脳出血、一過性脳虚血発作、脳梗塞、脳卒中、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎動脈硬化症、皮膚炎、免疫不全、低血糖、低ケトン血症、脂肪肝、糖尿病、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、肥満、アルツハイマー病、貧血性低酸素症、性腺障害、肝臓癌、乳癌および子宮内膜炎などの疾患の予防・治療薬として使用することができる。選択された物質は、上記異種ＰＰＡＲα作動薬と同様の方法により製剤化され、経口的もしくは非経口的に哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に投与することができる。
【００９２】
　選択された物質の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより異なるが、例えば、高ＴＧ血症の治療目的で経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口投与の場合、当該物質の投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、高ＴＧ血症の治療目的で注射剤として成人（体重６０ｋｇ）に投与する場合、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度である。投与対象がヒト以外の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００９３】
　本発明の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
【００９４】
　〔配列番号：１〕ヒトＰＰＡＲαをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
【００９５】
　〔配列番号：２〕ヒトＰＰＡＲαのアミノ酸配列を示す。
【００９６】
　〔配列番号：３〕ヒトＳＡＰプロモーターを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
【００９７】
　〔配列番号：４〕ヒトＳＡＰプロモーターを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
【００９８】
　〔配列番号：５〕ウサギβ−グロビンエンハンサーを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
【００９９】
　〔配列番号：６〕ウサギβ−グロビンエンハンサーを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
【０１００】
　〔配列番号：７〕ヒトＰＰＡＲα ｃＤＮＡフラグメントを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
【０１０１】
　〔配列番号：８〕ヒトＰＰＡＲα ｃＤＮＡフラグメントを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
【０１０２】
　〔配列番号：９〕ＰＣＲにより増幅されたヒトＰＰＡＲα ｃＤＮＡフラグメントを検出するための蛍光発生プローブとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
【０１０３】
　本願明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を次に挙げる。
【０１０４】
　ＤＮＡ　　　　　：デオキシリボ核酸
　ｃＤＮＡ　　　　：相補的デオキシリボ核酸
　　Ａ　　　　　　：アデニン
　　Ｔ　　　　　　：チミン
　　Ｇ　　　　　　：グアニン
　　Ｃ　　　　　　：シトシン
　ＲＮＡ　　　　　：リボ核酸
　ｍＲＮＡ　　　　：メッセンジャーリボ核酸
　ｄＡＴＰ　　　　：デオキシアデノシン三リン酸
　ｄＴＴＰ　　　　：デオキシチミジン三リン酸
　ｄＧＴＰ　　　　：デオキシグアノシン三リン酸
　ｄＣＴＰ　　　　：デオキシシチジン三リン酸
　ＡＴＰ　　　　　：アデノシン三リン酸
　ＥＤＴＡ　　　　：エチレンジアミン四酢酸
　ＳＤＳ　　　　　：ドデシル硫酸ナトリウム
　Ｇｌｙ          ：グリシン
　Ａｌａ        　：アラニン
　Ｖａｌ      　  ：バリン
　Ｌｅｕ        　：ロイシン
　Ｉｌｅ          ：イソロイシン
　Ｓｅｒ          ：セリン
　Ｔｈｒ　        ：スレオニン
　Ｃｙｓ          ：システイン
　Ｍｅｔ          ：メチオニン
　Ｇｌｕ          ：グルタミン酸
　Ａｓｐ          ：アスパラギン酸
　Ｌｙｓ          ：リジン
　Ａｒｇ          ：アルギニン
　Ｈｉｓ          ：ヒスチジン
　Ｐｈｅ          ：フェニルアラニン
　Ｔｙｒ          ：チロシン
　Ｔｒｐ          ：トリプトファン
　Ｐｒｏ          ：プロリン
　Ａｓｎ          ：アスパラギン
　Ｇｌｎ          ：グルタミン
　ｐＧｌｕ　　　　：ピログルタミン酸
　Ｍｅ　　　　　　：メチル基
　Ｅｔ　　　　　　：エチル基
　Ｂｕ　　　　　　：ブチル基
　Ｐｈ　　　　　　：フェニル基
　ＴＣ　　　　　　：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
　以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
【実施例１】
【０１０５】
ＰＰＡＲαベクター構築
　肝臓での導入遺伝子の高発現に必要なhSAP（human serum amyloid P component）プロモーターをPCRによりクローニングした。GENBANKヒトゲノムデータよりhSAPは第一番染色体上に存在することが公知である。cDNA配列とのホモロジーサーチにより5’上流域が特定できたため、文献（J. Biol. Chem., 111, 736, 1992; Dev. Genet., 10, 336, 1989）で使用されているプロモーター領域のゲノム配列をもとにプライマーSA1（5’-ACTGAGTAGAAGTAGCAGAA-3’（配列番号：３））およびSA4（5’-CAGCGGCTTGTTCATATTCC-3’（配列番号：４））を設計し、開始コドンに隣接するHindIII-AvrII断片0.67Kbpを、PCR（宝酒造：Ex Taq DNA polymerase使用；94℃、2分間処理後、94℃、0.5分、60℃、0.5分、68℃　1分を30サイクル）で増幅し、得られた断片をpCR2.1ベクター（invitrogen社）にTA cloning（invitrogen社）法にてクローニングしてシーケンスの確認を行った。4クローンの解析を行い、塩基置換のないクローン1個を取得した（プラスミド名：pCR2.1-SA4）。
【０１０６】
　次に、宿主哺乳動物細胞における高発現に必要なrabbit β-globinエンハンサーのクローニングを以下の方法で行った。ウサギの血液より調製したゲノムDNAを鋳型にし、5’末端に発現ベクター構築用の制限酵素サイトを付加したプライマーBG2（5'-TCCTAGGTGAGAACTTCAGGGTGAGTTTG-3'（配列番号：５）；AvrIIサイトが付加されたもの）およびBG3（5'-CGGTACCTTTGCCAAAATGATGAGACAGC-3'（配列番号：６）；KpnIサイトが付加されたもの）を用いてPCR（宝酒造：Ex Taq DNA polymerase使用；94℃、2分間処理後、94℃、0.5分、60℃、0.5分、72℃　1分を30サイクル）を行ない、増幅されたエンハンサー領域約640bpを得た。増幅断片をpCR2.1-TOPOベクターにTA cloning（invitrogen社）し、8クローンについてシーケンスの確認（ABI社 BigDye Terminator使用）を行った。 8クローンのシーケンス解析結果をエンハンサー配列と比較した結果、ほぼ既知の配列と一致したのでPCRテンプレートのウサギゲノム由来のものであると判断された。
【０１０７】
　PPARα cDNAはpMCMV-neo-hPPARα（Biochem. Biophys. Res. Commun., 278: 704-711 (2000)）より切り出した1.4Kbp KpnI-SalI断片を使用した。SV40 polyAはpTB399（R. Sasadaら、Cell Structure and Function, 12：205, 1987）由来のpolyA付加シグナルを含むBglIIからHindIIIまでの断片をpSP73（stratagene社）にクローニングし、BglIIサイトにSalIリンカーを付与後、0.27Kbp のSalI-HindIII断片として使用した。
【０１０８】
　発現ベクターの構築にあたり、最初pCR2.1-SA4のAvrII-KpnIサイトにpCR2.1-enh5より回収したAvrII-KpnI断片をTakara ligation kit（宝酒造）を用いてライゲーションし、プロモーターとエンハンサーが入ったpCR2.1-SAPENH1を作製した。一方、pBluescriptII KS-（stratagene）のKpnI-HindIIIサイトにpMCMV-neo-hPPARαより調製した約1.4KbpのhPPARα cDNAと約0.27KbpのSV40 polyA断片（R. Sasadaら、Cell Structure and Function, 12： 205, 1987）をライゲーションし、cDNAとpolyAが入ったpKS-PPARpolyA1を作製した。その後、pBluescriptII KS-（stratagene）のNotIサイトにpCR2.1-SAPENH1より回収したNotI-KpnI断片（約1.3Kbp）とpMCMV-neo-hPPARαより回収したKpnI-NotI断片（約1.7Kbp）をライゲーションし、発現ベクターの構築を完了した（プラスミド名：pKS-SEPP2；本プラスミドを大腸菌JM109株にクローニングした形質転換体（Escherichia coli JM109/pKS-SEPP2）はFERM BP-8151の受託番号を付され、平成１４年８月１４日付で独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東1-1-1 中央第6）に寄託されている。）。トランスジェニックマウス作製のため使用されるインジェクション断片はNotI切断により切り出され、サイズは約3.0Kbpである（図１）。
【実施例２】
【０１０９】
ヒトＰＰＡＲαを導入したトランスジェニックマウスの作製
　採卵用雌マウス（C57BL/6J系統、9〜13週齢）に5IUのPMSGを腹腔内投与し、12時間明期／12時間暗期の飼育室で2日間飼育後、5IUのhCGを腹腔内投与して雄マウス（C57BL/6J系統、15〜20週齢）と交配させた。別途、自然発情している受胚用雌マウス（ICR系統、９〜20週齢）を精管結紮雄マウス（ICR系統、15〜20週齢）と交配させた。翌日、膣栓形成により交尾を確認した採卵用雌マウスの腹腔を開いて卵管を取り出し、M2培地中、実体顕微鏡下にピンセットで受精卵を取り出した。卵丘細胞がとれた受精卵をピペットで吸い上げ、ミネラルオイルで覆われたM16培地のドロップ中に入れて、インジェクションするまでの間37℃、5% CO2下で２時間培養した。
【０１１０】
　受精卵をミネラルオイルで覆われたM2培地のドロップ中に入れてホールディングピペットで吸引固定した。実施例１で調製したインジェクション断片溶液（0.3〜1.0μg/ml）をインジェクションピペットに吸引し、実体顕微鏡下にインジェクションピペットを受精卵の雄性前核に突き刺し、インジェクション断片を注入した。インジェクション終了後、受精卵をミネラルオイルで覆われたM2培地のドロップ中に入れて、受胚用雌への移植までの間37℃、5% CO2下で培養した。
【０１１１】
　膣栓形成により偽妊娠状態を確認した受胚用雌マウスをネンブタールで麻酔後、後背部を切開して脂肪塊をピンセットで摘まんで引き出し、クレンメで固定した。実体顕微鏡下に卵巣嚢をピンセットで引き裂き、各卵管当たり10〜15個の受精卵をトランスファーピペットを用いて卵管開口部に注入した。卵巣と卵管を体内に戻して切り口を縫合した後、12時間明期／12時間暗期の飼育室で飼育を続けた。胚移植から21日後に仔マウス（F0）が産まれた。仔マウスへの導入DNAの伝達は、尾部を1cm程度ハサミで切り取り、該組織抽出液から常法によりDNAを単離してPCR法により確認した。
【０１１２】
　導入DNAの伝達が確認されたF0個体は、生殖可能になった段階でC57BL/6Jマウスと交配させて産仔（F1）を得た。上記と同様に導入DNAの伝達を確認し、導入DNAを有するF1個体同士を(兄妹)交配させ、導入DNAに関してホモ接合体を得た。
【実施例３】
【０１１３】
トランスジェニックマウスの遺伝子発現解析
　実施例２において得られたトランスジェニックマウスのヒトＰＰＡＲαの発現程度を調べるため、得られた5〜6週齢トランスジェニックマウスから肝臓を採取し、アイソジェン（ニッポンジーン社製）を使用してtotal RNAを抽出した。次に、RNase-free DNase set（キアゲン社製）およびRNeasy Mini Kit（キアゲン社製）により精製したtotal RNAをもとにキットTaqMan Transcription Reagents（アプライドバイオシステムズ社製）を用いた逆転写反応によりcDNAを調製した。Real-time PCR（TaqMan PCR）のためのプライマーとしては5’-CGCCAGCACGGACGA-3’（配列番号：７）および5’-TTGTCCCCACATATTCGACACTC-3’（配列番号：８）を用い、FAM（fluorescent 5-carboxyfluorescein）標識TaqManプローブとしては5’-CCCCCGGCAGTGCCCTGAA-3’（配列番号：９）を用いた。さらにTaqMan PCR Master Mix（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、専用プレート中で各20μlのcDNAサンプルを鋳型としてReal-time PCR反応を行った。反応は、PCR装置7700シークエンスディテクター（アプライドバイオシステムズ社製）により、50℃、2分間；95℃、10分間処理後、95℃、15秒；60℃、1分のサイクルを40回行った。反応後、解析マニュアルに従ってデータ解析を行った。以上の定量の標準として同じcDNAサンプルを用いてTaqMan Rodent GAPDH Control Reagent（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてGAPDH遺伝子発現の定量を行ってデータ値補正に用いた。実験の結果、トランスジェニックマウスの肝臓においてヒトＰＰＡＲαの発現が確認された。
【実施例４】
【０１１４】
ＰＰＡＲαホモ欠損マウスとの交配
　実施例２において作製されたヒトＰＰＡＲαホモTgマウスとＰＰＡＲαホモ欠損マウス（Jackson研究所、米国）とを交配させて産仔を得る。マウス産仔の尾からDNAを抽出してサザン解析を行ない、ヒトＰＰＡＲαおよびノックアウトされたマウスＰＰＡＲα遺伝子欠損部分が全ての産仔から検出された親マウスを、ヒトＰＰＡＲαヘテロTg・マウスＰＰＡＲαヘテロ欠損マウスとして選択する。次にその雌雄同士を交配させる。遺伝子判定を同様の方法で行ってヒトＰＰＡＲαが2コピーおよびノックアウトされたマウスＰＰＡＲα遺伝子の欠損部分のみが確認されるマウスをヒトＰＰＡＲαホモTg・マウスＰＰＡＲαホモ欠損マウスとして選択する。
【実施例５】
【０１１５】
各種高脂血症（動脈硬化）モデルマウスとの交配
(1) apoEホモ欠損マウスとの交配
　実施例２において作製されたヒトＰＰＡＲαホモTgマウスと高脂血症（動脈硬化）疾患モデルであるapoEホモ欠損マウス（Jackson研究所、米国；C57BL/6Jを遺伝的背景とする）とを交配させて得られる産仔の雌雄同士を交配させる。得られるマウス産仔の尾から上記と同様にしてDNAを抽出してサザン解析を行ない、ヒトＰＰＡＲαのDNAおよびノックアウトされたapoE遺伝子が全ての産仔から検出された親マウスを、ヒトＰＰＡＲαヘテロTg・apoEヘテロ欠損マウスとして選択する。次にその雌雄同士を交配させる。遺伝子判定を同様の方法で行ってヒトＰＰＡＲαが2コピーおよびノックアウトされたapoE遺伝子の欠損部分のみが確認されたマウスをヒトＰＰＡＲαホモTg・apoEホモ欠損マウスとして選択する。
(2) LDL受容体ホモ欠損マウスとの交配
　実施例２において作製されたヒトＰＰＡＲαホモTgマウスと高脂血症（動脈硬化）疾患モデルであるLDL受容体ホモ欠損マウス［武田薬品工業株式会社において作製されたマウス（特開平10-56915号公報に記載）、あるいはJackson研究所で保存されているマウス、米国；いずれもC57BL/6Jを遺伝的背景とする］とを交配させて産仔を得る。得られるマウス産仔の尾から上記と同様にしてDNAを抽出してサザン解析を行ない、ヒトＰＰＡＲαのDNAおよびノックアウトされたLDL受容体遺伝子が全ての産仔から検出された親マウスを、ヒトＰＰＡＲαヘテロTg・LDL受容体ヘテロ欠損マウスとして選択する。次にその雌雄同士を交配させる。遺伝子判定を同様の方法で行ってヒトＰＰＡＲαが2コピーおよびノックアウトされたLDL受容体遺伝子の欠損部分のみが確認されたマウスをヒトＰＰＡＲαホモTg・LDL受容体ホモ欠損マウスとして選択する。
(3) ヒトapoA-IホモTgマウスとの交配
　実施例２において作製されたヒトＰＰＡＲαホモTgマウスと高脂血症（動脈硬化）疾患モデルであるヒトapoA-IホモTgマウス（Jackson研究所、米国；C57BL/6Jを遺伝的背景とする）とを交配させて得られる産仔の雌雄同士を交配させる。得られるマウス産仔の尾から上記と同様にしてDNAを抽出してサザン解析を行ない、ヒトＰＰＡＲαのDNAおよびヒトapoA-Ｉ遺伝子が全ての産仔から検出された親マウスを、ヒトＰＰＡＲα・ヒトapoA-ＩヘテロTgマウスとして選択する。次にその雌雄同士を交配させる。得られた産仔の遺伝子判定を同様の方法で行ってヒトPPARαおよびヒトapoA-Ｉがそれぞれ2コピー確認されたマウスをヒトＰＰＡＲα・ヒトapoA-ＩホモTgマウスとして選択する。
(4) さらに、上記(1)〜(3)のそれぞれにおいて、実施例２で作製されたヒトＰＰＡＲαホモTgマウスの代わりに、実施例４において作製されたヒトＰＰＡＲαホモTg・マウスＰＰＡＲαホモ欠損マウスを用いて、同様の手順によりapoEホモ欠損マウス、LDL受容体ホモ欠損マウスおよびヒトapoA-I Tgマウスとそれぞれ交配させる。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
　本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物は、該異種ＰＰＡＲαに対しては作用するが、該非ヒト哺乳動物の内因性ＰＰＡＲαに対しては作用しないＰＰＡＲα作動薬もしくは拮抗薬の薬効をインビボで評価し得る動物モデルであり、当該動物モデルを用いることにより、ＰＰＡＲαの活性調節が関与する各種疾患の予防・治療薬の開発において有用なスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】ヒトＰＰＡＲα発現ベクターｐＫＳ−ＳＥＰＰ２の制限酵素地図を示す図である。図中の矢印は転写方向を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１１８】
配列番号：３
　ヒトＳＡＰプロモーターを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号：４
　ヒトＳＡＰプロモーターを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号：５
　ウサギβ−グロビンエンハンサーを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号：６
　ウサギβ−グロビンエンハンサーを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号：７
　ヒトＰＰＡＲα ｃＤＮＡフラグメントを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号：８
　ヒトＰＰＡＲα ｃＤＮＡフラグメントを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号：９
　ＰＣＲにより増幅されたヒトＰＰＡＲα ｃＤＮＡフラグメントを検出するための蛍光発生プローブとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
【図１】
2004041211.tif 000002
【配列表】
2004041211000001.app