(57)【要約】　　　（修正有）【課題】ＴＧＦ−βシグナル伝達制御物質設計用ペプチドミメティックステンプレートの提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列又はＳｅｒ　Ｇｌｕのアミノ酸配列からなるペプチドミメティックステンプレート。【効果】本発明により、ＴＧＦ−βシグナル伝達制御物質設計用ペプチドミメティックステンプレート及び当該テンプレートを用いたＴＧＦ−βシグナル伝達制御物質のスクリーニング方法が提供される。本発明は、ＴＧＦ−β異常産生に起因する繊維症等の治療薬の開発に有用である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号９で表されるアミノ酸配列又はＳｅｒ　Ｇｌｕのアミノ酸配列からなるペプチドミメティックステンプレート。
【請求項２】
Ｓｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合を阻害する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程：
（ａ）　配列番号９のアミノ酸配列で表されるペプチド及び／又はＳｅｒ　Ｇｌｕのアミノ酸配列で表されるペプチドをペプチドミメティックステンプレートとして用い、候補化合物を設計・合成する工程、及び
（ｂ）　工程（ａ）において得られた候補化合物の存在下で、Ｓｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質とを接触させた場合、及び当該候補化合物の非存在下でＳｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質とを接触させた場合における、Ｓｍａｄ３タンパク質へのｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質の結合量、あるいはｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質へのＳｍａｄ３タンパク質の結合量をぞれぞれ測定し比較する工程、
を包含すること特徴とする前記スクリーニング方法。
【請求項３】
Ｓｍａｄ３タンパク質が標識物で標識されたタンパク質であり、当該標識物を、ｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質へのＳｍａｄ３タンパク質の結合量測定のための指標とすることを特徴とする請求項２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
ｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質が標識物で標識されたタンパク質であり、当該標識物を、Ｓｍａｄ３タンパク質へのｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質の結合量測定のための指標とすることを特徴とする請求項２記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
標識物が、ペプチド、放射性同位元素、酵素及び蛍光物質からなる群から選択される少なくとも１つであることを特徴とする請求項４記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
Ｓｍａｄ３タンパク質あるいはｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質が、支持体と結合していることを特徴とする請求項２〜５記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
支持体がビーズ又はプレートであることを特徴とする請求項６記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
Ｓｍａｄ３タンパク質へのｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質の結合量をｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質に対する一次抗体若しくはｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質と融合した標識ペプチドに対する一次抗体を用いて測定することを特徴とする請求項２記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
ｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質へのＳｍａｄ３タンパク質の結合量をＳｍａｄ３タンパク質に対する一次抗体若しくはＳｍａｄ３タンパク質と融合した標識ペプチドに対する一次抗体を用いて測定することを特徴とする請求項２記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
Ｓｍａｄ３タンパク質へのｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質の結合量を、ｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質に対する一次抗体及び当該一次抗体に対する二次抗体、あるいはｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質と融合した標識ペプチドに対する一次抗体及び当該一次抗体に対する二次抗体を用いて測定することを特徴とする請求項２記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
ｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質へのＳｍａｄ３タンパク質の結合量を、Ｓｍａｄ３タンパク質に対する一次抗体及び当該一次抗体に対する二次抗体、あるいはＳｍａｄ３タンパク質と融合した標識ペプチドに対する一次抗体及び当該一次抗体に対する二次抗体を用いて測定することを特徴とする請求項２記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
一次抗体又は二次抗体が、放射性同位元素、酵素及び蛍光物質からなる群から選択される少なくとも１つで標識されていることを特徴とする請求項１０又は１１記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＴＧＦ−βシグナル伝達制御物質設計用ペプチドミメティックステンプレート及び当該テンプレートを用いたＴＧＦ−βシグナル伝達制御物質のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＴＧＦ−βは、様々な細胞の増殖、分化、アポトーシス及び細胞接着の制御に幅広く関与していることが明らかとなっている。ＴＧＦ−βは、２つの異なるセリン／スレオニンキナーゼレセプター（タイプＩ及びタイプＩＩ）に結合し、Ｓｍａｄタンパク質を介して細胞内シグナルを伝達する。シグナル伝達には、タイプＩ及びタイプＩＩレセプターの両方が必要とされる。リガンドが結合するとタイプＩＩレセプターは、タイプＩレセプターをリン酸化し、これにより、Ｓｍａｄ経路が活性化される。レセプターにより制御されるＳｍａｄ（Ｒ−Ｓｍａｄ：ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　Ｓｍａｄ）は、タイプＩレセプターによって直接リン酸化され、リン酸化されたＲ−ＳｍａｄはコモンパートナーＳｍａｄ（Ｃｏ−Ｓｍａｄ：ｃｏｍｍｏｎ−ｐａｒｔｎｅｒ　Ｓｍａｄ）と複合体を形成する。形成されたＲ−Ｓｍａｄ−　Ｃｏ−Ｓｍａｄ複合体は、核内へと移行し、そこで、ＦＡＳＴ−１及びＦＡＳＴ−２、ｃ−Ｆｏｓ、ＡＴＦ−２、Ｇｌｉ３、ＰＥＢＰ２／ＣＢＦ／ＡＭＬ等の転写因子、あるいはＣＢＰ／ｐ３００、ＭＳＧ１等の転写コアクチベーターと結合し、標的遺伝子の転写を制御する。一方、抑制型Ｓｍａｄ（Ｉ−Ｓｍａｄ：ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｓｍａｄ）は、タイプＩレセプターとの相互作用を介して、Ｒ−ＳｍａｄとＣｏ−Ｓｍａｄとによるシグナル伝達を阻害する。
【０００３】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーのシグナル伝達は、上記以外にも、核内での様々な転写コリプレサーとの相互作用によっても制御されている。例えば、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３は、転写コリプレサーＴＧＩＦ１及びＴＧＩＦ２との相互作用を介して、ヒストンデアセチラーゼ（ヒストン脱アセチル酵素）と複合体を形成し、ヒストンの脱アセチル化によるクロマチン構造の緩みを誘発することによって転写を抑制することが知られている。また、ｃ−Ｓｋｉ及びその関連タンパク質ＳｎｏＮは、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３及びＳｍａｄ４との相互作用を介してＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害することが知られている。このようにＳｍａｄは細胞内で様々なタンパク質分子と相互作用し、その機能を発揮しているが、その詳細は不明な点が多い。それらをより詳細に理解することはＳｍａｄ、ひいてはＴＧＦ−βが関与する疾患の治療薬の開発に有用である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＴＧＦ−βシグナル伝達制御物質設計用ペプチドミメティックステンプレート及び当該テンプレートを用いたＴＧＦ−βシグナル伝達制御物質のスクリーニング方法等を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、Ｓｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合に関与する及びＳｍａｄ３タンパク質上のペプチド領域を同定することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１２）である。
（１）　配列番号９で表されるアミノ酸配列又はＳｅｒ　Ｇｌｕのアミノ酸配列からなるペプチドミメティックステンプレート。
（２）　Ｓｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合を阻害する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程：
（ａ）　配列番号９のアミノ酸配列で表されるペプチド及び／又はＳｅｒ　Ｇｌｕのアミノ酸配列で表されるペプチドをペプチドミメティックステンプレートとして用い、候補化合物を設計・合成する工程、及び
（ｂ）　工程（ａ）において得られた候補化合物の存在下で、Ｓｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質とを接触させた場合、及び当該候補化合物の非存在下でＳｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質とを接触させた場合における、Ｓｍａｄ３タンパク質へのｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質の結合量、あるいはｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質へのＳｍａｄ３タンパク質の結合量をぞれぞれ測定し比較する工程、
を包含すること特徴とする前記スクリーニング方法。
（３）　Ｓｍａｄ３タンパク質が標識物で標識されたタンパク質であり、当該標識物を、ｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質へのＳｍａｄ３タンパク質の結合量測定のための指標とすることを特徴とする上記（２）のスクリーニング方法。
【０００７】
（４）　ｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質が標識物で標識されたタンパク質であり、当該標識物を、Ｓｍａｄ３タンパク質へのｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質の結合量測定のための指標とすることを特徴とする上記（２）のスクリーニング方法。
（５）　標識物が、ペプチド、放射性同位元素、酵素及び蛍光物質からなる群から選択される少なくとも１つであることを特徴とする上記（４）のスクリーニング方法。
（６）　Ｓｍａｄ３タンパク質あるいはｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質が、支持体と結合していることを特徴とする上記（２）〜（５）のスクリーニング方法。
（７）　支持体がビーズ又はプレートであることを特徴とする上記（６）のスクリーニング方法。
（８）　Ｓｍａｄ３タンパク質へのｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質の結合量をｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質に対する一次抗体若しくはｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質と融合した標識ペプチドに対する一次抗体を用いて測定することを特徴とする上記（２）のスクリーニング方法。
（９）　ｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質へのＳｍａｄ３タンパク質の結合量をＳｍａｄ３タンパク質に対する一次抗体若しくはＳｍａｄ３タンパク質と融合した標識ペプチドに対する一次抗体を用いて測定することを特徴とする上記（２）のスクリーニング方法。
【０００８】
（１０）　Ｓｍａｄ３タンパク質へのｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質の結合量を、ｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質に対する一次抗体及び当該一次抗体に対する二次抗体、あるいはｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質と融合した標識ペプチドに対する一次抗体及び当該一次抗体に対する二次抗体を用いて測定することを特徴とする上記（２）のスクリーニング方法。
（１１）　ｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質へのＳｍａｄ３タンパク質の結合量を、Ｓｍａｄ３タンパク質に対する一次抗体及び当該一次抗体に対する二次抗体、あるいはＳｍａｄ３タンパク質と融合した標識ペプチドに対する一次抗体及び当該一次抗体に対する二次抗体を用いて測定することを特徴とする上記（２）のスクリーニング方法。
（１２）　一次抗体又は二次抗体が、放射性同位元素、酵素及び蛍光物質からなる群から選択される少なくとも１つで標識されていることを特徴とする上記（１０）又は（１１）のスクリーニング方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明は、具体的にはＳｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合を阻害する物質のスクリーニング方法に関する。なお、本発明では、新規に明らかとなったＳｍａｄ３タンパク質上のｃ−Ｓｋｉタンパク質結合ドメインの構造を模倣することにより１以上の阻害候補物質を設計する工程、あるいは前記結合ドメインの構造に基づいて、既存の化合物ライブラリーの中から前記結合ドメインに類似の構造を有する化合物を選択する工程も含めて、「スクリーニング方法」という用語を用いる。
【００１０】
１．本発明において使用するタンパク質
ヒト由来Ｓｍａｄ３タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に、ヒト由来ｃ−Ｓｋｉタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４に、ヒト由来ＳｎｏＮタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６に、ヒト由来Ｓｍａｄ１タンパク質のアミノ酸配列を配列番号８に示した。なお、配列番号２、４、６又は８で示されたアミノ酸配列を有する以外にも、配列番号２、４、６又は８で示されたアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものも、それぞれのタンパク質の生理学的活性が維持されている限り、本発明において使用することができる。このようなタンパク質は、配列番号２、４、６又は８で示されたアミノ酸配列と通常、８０％以上、好ましくは９０％以上のホモロジーを有する。
【００１１】
また、ヒト由来Ｓｍａｄ３タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号１に、ヒト由来ｃ−Ｓｋｉタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号３に、ヒト由来ＳｎｏＮタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号５に、ヒト由来Ｓｍａｄ１タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号７に示した。本発明において使用する各タンパク質を得るための、遺伝子組換え細胞の構築に使用できるＤＮＡとしては、配列番号１、３、５又は７で示された塩基配列を有するもののほか、配列番号１、３、５又は７で示された塩基配列からなるＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを含むものが挙げられる。このようにハイブリダイズし得るＤＮＡは、そのＤＮＡにコードされるタンパク質がそれぞれのタンパク質の元来の生理学的活性を有するものであればよい。このようなＤＮＡは配列番号１、３、５又は７で示された塩基配列と通常、７０％以上、好ましくは８０％以上の塩基配列のホモロジーを有する。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見される変異型遺伝子、人為的に改変した変異型遺伝子、異種生物由来の相同遺伝子等が含まれる。本発明において、ハイストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、通常、ハイブリダイゼーションを、５×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、３７〜４２℃の温度条件下、約１２時間行い、５×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液などで必要に応じて予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。
【００１２】
ヒト由来のＳｍａｄ３、ｃ−Ｓｋｉ、ＳｎｏＮ又はＳｍａｄ１をコードするＤＮＡはそれぞれ、ヒト由来の組織や細胞から調製したｍＲＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行うことにより得ることができる。例えば、Ｓｍａｄ３をコードするＤＮＡの調製においては、Ｓｍａｄ３発現細胞を分離し、これからｍＲＮＡ（ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ）を調製する。これからｃＤＮＡを構築し、ヒトＳｍａｄ３遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、ＲＴ−ＰＣＲを行うことによってヒトＳｍａｄ３をコードするｃＤＮＡを得ることができる。なお、本発明において使用する各タンパク質をコードするｃＤＮＡは、例えば発現に利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い配列を設計し、それを使用することができる。設計した塩基配列を持つＤＮＡは、ＤＮＡの化学合成、前記ｃＤＮＡの断片化と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用して部位特異的変異導入法［Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　８１：５６６２（１９８４）］等によって実施できる。
【００１３】
本発明において使用される各タンパク質の発現ベクターは、各タンパク質をコードするＤＮＡを、適当なプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。プロモーターとしては、哺乳動物由来のプロモーター（例えばＥＦ１−αプロモーター、アクチンプロモーター）、昆虫ウィルス由来のプロモーター（例えば、ポリヘドリンウィルスプロモーター）、植物由来のプロモーター（例えば、タバコモザイクウィルスプロモーター）、動物ウィルス由来のプロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ヒトＣＭＶプロモーター）、酵母由来のプロモーター（例えば、アルコール脱水素酵素プロモーター）、大腸菌由来のプロモーター（例えば、Ｌａｃプロモーター、Ｔｒｐプロモーター、Ｔａｃプロモーター）等が挙げられる。本発明に使用される各タンパク質の発現には、発現に用いられる宿主に適したシグナル配列を付加して使用してもよい。シグナル配列としては、例えば分泌タンパク質のシグナル配列が挙げられる。分泌タンパク質のシグナル配列としては、宿主が哺乳動物細胞である場合は、哺乳動物由来分泌蛋白質のシグナル配列（例えば、イムノグロブリンのシグナル配列）を使用することができ、宿主が大腸菌の場合には、分泌タンパク質のシグナル配列としては、大腸菌由来分泌蛋白質のシグナル配列（例えばＯｍｐＡ等のペリプラズム分泌シグナル配列）を使用することができる。このように作製した発現ベクターは、公知の方法により宿主に導入することができる。宿主への導入の方法としては、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、リポソーム法が挙げられる。
【００１４】
次いで、形質転換された細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養することによりポリペプチドが得られる。培養は、宿主細胞に応じて、公知の方法に従って行う。例えば、宿主細胞が哺乳動物細胞の場合、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができる。その際、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、撹拌を加える。タンパク質を産生させ、回収する。前記のように発現、産生されたタンパク質は、細胞内外、宿主から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用されるタンパク質の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、ポリペプチドを分離、精製することができる［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ　Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｄ　Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］。タンパク質は、公知の方法を用いて濃度を測定することができる。例えは、吸光度の測定又はＢｒａｄｆｏｒｄ法を用いればよい。
【００１５】
２．Ｓｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合を阻害する物質の作製
（１）　ペプチドミメティックス
本発明において、Ｓｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合に関与しているＳｍａｄ３タンパク質上の領域として、（Ｎ末端）Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ（Ｃ末端）（配列番号９；以下ＱＰＳＭＴ配列ともいう）と（Ｎ末端）Ｓｅｒ　Ｇｌｕ（Ｃ末端）（以下ＳＥ配列ともいう）が同定された。従って、この配列は、Ｓｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合を阻害する化合物をデザインする場合のペプチドミメティックテンプレートとして使用することができる。すなわち、このペプチドを模倣した比較的小さな分子（ペプチドミメティックス）をデザインすることにより、ｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質への特異的結合活性を保持し、Ｓｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合を阻害する活性を有し得る候補物質を得る。なお、デザインした結果、得られた化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。ペプチドミメティックスは、当該技術分野で公知の方法［Ｏｓｔｒｅｓｈ：Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　２６７：２２０−２３４（１９９６）；Ｄｏｒｎｅｒ：Ｂｉｏｏｒｇ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．　４：７０９−７１５（１９９６）等］により、連続的なアミド・アルキル化によるペプチドミメティクスコンビナトリアルライブラリーを作製する方法等により行うことができる。
【００１６】
（２）　結合阻害活性を有するモノクローナル抗体
一方、ｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合に関与しているＳｍａｄ３タンパク質上のペプチド部位のアミノ酸配列を含む合成ペプチドを抗原として用い、Ｓｍａｄ３タンパク質上の前記結合部位に特異的に結合し、ｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合を阻害するモノクローナル抗体を作製することができる。合成ペプチドは、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて合成することができる。合成方法としては、公知の文献［ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９６６；Ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ　２　，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９７６；ペプチド合成，丸善（株），１９７５；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），１９８５；医薬品の開発　続第１４巻・ペプチド合成，広川書店，１９９１］などに記載の方法が挙げられる。
【００１７】
次いで、モノクローナル抗体は、前記合成ペプチドを感作抗原として使用し、これを通常の免疫方法に従って哺乳動物に免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナル抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。具体的には、以下のようにして行うことができる。感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が使用される。げっ歯目の動物としては、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。ウサギ目の動物としては、ウサギが使用される。霊長目の動物としては、サルが使用される。サルとしては、狭鼻下目のサル（旧世界ザル）、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等が使用される。感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行うことができる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または、皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法により確認する。
【００１８】
上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を取り出し、細胞融合に使用する。この際、細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として、特に脾細胞が挙げられる。前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞としては、既に公知の種々の細胞株、例えば、ＮＳ−１［Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ｅｔ　ａｌ．：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９（１９７６）］、ＭＰＣ−１１［Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｄ．Ｈ．ｅｔ　ａｌ．：Ｃｅｌｌ　８：４０５−４１５（１９７６））］、ＳＰ２／０［Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ　２７６：２６９−２７０（１９７８）］、Ｓ１９４［Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．：Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．　１４８：３１３−３２３（１９７８）］、Ｒ２１０［Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ　ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ　２７７：１３１−１３３（１９７９）］等が好適に使用される。前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、例えば、ミルスタインらの方法［Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　７３：３−４６（１９８１）］等に準じて行うことができる。より具体的には、前記細胞融合は、例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等が使用され、さらに必要に応じて融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ等が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清を併用することもできる。細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１０００〜６０００程度のＰＥＧ溶液を通常、３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。次いで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイフリドーマのスクリーニングおよびクローニングが行われる。
【００１９】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。得られたハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に移植して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。本発明の抗体は、所望の結合活性を有するかぎり、その抗体断片や抗体修飾物であってもよい。例えば、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる［例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１５２：２９６８−２９７６（１９９４）；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　１７８：４７６−４９６（１９８９）；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　１７８：４９７−５１５（１９８９）；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　１２１：６５２−６６３（１９８６）；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　１２１：６６３−６６９（１９８６）；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．：　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　９：１３２−１３７（１９９１）］。
【００２０】
前記のようにして産生された抗体は、細胞又は宿主から分離し均一にまで精製することができる。本発明の抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ　Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｄ　Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８］。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。上記で得られた抗体の濃度測定又は活性確認は、公知の方法、例えばＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。
【００２１】
３．本発明のスクリーニング方法
本発明は、Ｓｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合を阻害する物質のスクリーニング方法であって、Ｓｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質とを被験試料存在下で接触させ、Ｓｍａｄ３タンパク質に結合したｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質、あるいはｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質に結合したＳｍａｄ３タンパク質を検出又は測定することを特徴とするスクリーニング方法である。本発明のスクリーニング方法は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏのアッセイ系により実施することができる。
【００２２】
具体的には、Ｓｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質とのいずれか一方のタンパク質を支持体に結合させ、このタンパク質にもう一方のタンパク質と被験試料を加え、インキュベートをした後洗浄して支持体に結合したタンパク質に対するもう一方のタンパク質の結合を検出又は測定すればよい。あるいは、Ｓｍａｄ３タンパク質及びｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質のいずれも支持体に結合させることなく、均一下に被検試料を加え、インキュベートした後、Ｓｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質とのいずれかに対する抗体を用いて免疫沈降することで、結合体の量を検出又は測定してもよい。
【００２３】
Ｓｍａｄ３タンパク質あるいはｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質は、それらのタンパク質を元来発現している細胞又はそれらのタンパク質をコードするＤＮＡを導入した細胞において産生されるタンパク質を精製した状態又は粗精製の状態で使用することができる。精製された又は粗精製されたＳｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質とのいずれか一方のタンパク質を支持体に結合させる。支持体へのタンパク質の結合は、当該技術分野において標準的に使用される方法で行うことができる。タンパク質を結合させる支持体としては、例えば不溶性の多糖類（例えば、アガロース、デキストラン、セルロース等）、合成樹脂（例えば、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等）が挙げられる。より具体的には、それらを原料として製造される市販のビーズやプレートが用いられる。ビーズの場合、これらが充填されたカラム等を用いてもよい。プレートの場合、マルチウェルプレート（９６穴マルチウェルプレート等）やバイオセンサーチップが挙げられる。タンパク質と支持体との結合は、化学結合、物理的な吸着等、当該技術分野において通常用いられる方法により行うことができる。その他、タンパク質を特異的に認識する抗体を予め支持体に結合させた後、その抗体にタンパク質を結合させることにより支持体にタンパク質を結合させることもできる。さらに、アビジン／ビオチンを介して結合させることもできる。
【００２４】
Ｓｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合は、通常緩衝液中で行われる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液等が使用される。また、インキュベートの条件としては、一般的な条件（例えば、４℃〜室温）にて１〜２４時間のインキュベーションが行われる。インキュベート後の洗浄は、Ｓｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合に影響を及ぼすことのないものであればいずれでもよく、０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０等の界面活性剤を含む緩衝液が挙げられる。
【００２５】
本発明においてスクリーニングされる被験試料としては、Ｓｍａｄ３分子上でｃ−Ｓｋｉ及びＳｎｏＮとの結合に重要な役割を果たしていることが本発明において見出されたＱＰＳＭＴ配列及び／又はＳＥ配列をミミックすることにより作製した合成化合物又はペプチド、あるいはＱＰＳＭＴ配列を含むペプチドに対して作製したモノクローナル抗体が挙げられる。このような合成化合物又はペプチドの全て、あるいは作成したモノクローナル抗体の全てが、必ずＳｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合を阻害するとは限らない。従って、ミミックすることにより作製された複数の合成化合物又はペプチド、あるいはモノクローナル抗体から、Ｓｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合を阻害するものを選択しなければならない。
【００２６】
前記被験試料に含まれるＳｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合を阻害する物質を選択するには、適切な条件下でインキュベート及び洗浄することにより、特異的な結合と非特異的な結合を分離することが重要である。そして、本発明に使用されるタンパク質−タンパク質間の結合状態を評価すればよい。本発明のスクリーニング方法において、被験試料をポリペプチドに接触させる群と共にコントロール群を設置してもよい。コントロール群としては、被験試料を含まない陰性コントロール群あるいはＳｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との明らかな結合阻害物質を含む陽性コントロール群あるいはその両群を設定することができる。
【００２７】
本発明において、一方のタンパク質に結合したもう一方のタンパク質を検出又は測定する場合、単に結合したタンパク質を検出するだけでもよいし、あるいは結合した一方のタンパク質を定量的に測定してもよい。これらの場合、被験試料を含まない陰性コントロール群で得られた結果と、被験試料を含むテスト群で得られた結果並びに／あるいはＳｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との明らかな結合阻害物質を含む陽性コントロール群で得られた結果を比較することにより、Ｓｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合を阻害する物質を検出することができる。
【００２８】
さらに、前記の結果を数値化し、それらの数値を比較することにより、Ｓｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合阻害物質の活性を定量的に測定することもできる。定量的に測定する場合、Ｓｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との明らかな結合阻害物質を既知量含む陽性コントロール群で得られた数値により作成された標準曲線を元に定量することができる。結合したタンパク質が多い場合、その被験試料に含まれる物質は、Ｓｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合阻害物質の活性が低く、一方結合したポリペプチドが少ない場合、その被験試料に含まれるＳｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合阻害物質の結合阻害活性が高いことが推測される。
【００２９】
本発明のＳｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合に対する阻害物質のスクリーニング方法において、結合したタンパク質を検出又は測定する手段として表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することができる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーはタンパク質−タンパク質間の相互作用を微量のタンパク質で且つ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製ＢＩＡｃｏｒｅ）。従って、それらのバイオセンサーを用いることにより、Ｓｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合を評価することができる。すなわち、Ｓｍａｄ３タンパク質あるいはｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質を固定化したセンサーチップに、ｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質あるいはＳｍａｄ３タンパク質を接触させ、Ｓｍａｄ３タンパク質あるいはｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質に結合するｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質あるいはＳｍａｄ３タンパク質を共鳴シグナルの変化として検出しようとするものである。
【００３０】
具体的には、例えば以下のようにして行うことができる。まず、センサーチップＣＭ５（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ社）を活性化して、Ｓｍａｄ３タンパク質、あるいはｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質をセンサーチップ上に固定化する。すなわち、ＥＤＣ／ＮＨＳ水溶液〔２００ｍＭ　ＥＤＣ［Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カーボネート，塩酸塩］、５０ｍＭ　ＮＨＳ［Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド］〕によりセンサーチップを活性化した後、ＨＢＳバッファー（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．４，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，３．４ｍＭ　ＥＤＴＡ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）によりセンサーチップを洗浄する。次いで、ＨＢＳバッファーに溶解した適量のＳｍａｄ３タンパク質、あるいはｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質をセンサーチップに接触させ固定化する。ＨＢＳバッファーによりセンサーチップを洗浄後、エタノールアミン溶液（１Ｍエタノールアミン塩酸塩、ｐＨ８．５）によりセンサーチップ上の残存活性基をブロックする。再びＨＢＳバッファーによりセンサーチップを洗浄し結合評価に用いる。次いで、ＨＢＳバッファーに溶解した適量のｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質、あるいはＳｍａｄ３タンパク質を注入する。このときにセンサーチップに固定化されたＳｍａｄ３タンパク質、あるいはｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質に結合するｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質、あるいはＳｍａｄ３タンパク質の量の増大が、共鳴シグナル値の増加として観察される。
【００３１】
さらに、上記結合評価系において、ｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質、あるいはＳｍａｄ３タンパク質に引き続いて被験試料を注入する。また、被験試料を注入する群と共に、コントロール群を設置してもよい。コントロール群としては被験試料を含まない陰性コントロール群、あるいはＳｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との明らかな結合阻害物質を含む陽性コントロール群あるいはその両群を設置することができる。結合したタンパク質は共鳴シグナル値の変化量として定量的に測定することができる。この場合、被験試料を含まない陰性コントロール群で得られた結果、被験試料を含む群で得られた結果並びに／あるいはＳｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との明らかな結合阻害物質を含む陽性コントロール群で得られた結果を比較することにより、Ｓｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合に対する阻害物質を検出・決定することができる。
【００３２】
本発明のＳｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合を阻害する物質のスクリーニング方法において、結合したタンパク質を検出又は測定する手段として、一方のタンパク質を標識しその標識に基づいて検出又は測定する方法が挙げられる。例えば、本発明のスクリーニング方法において、被験試料とともに、一方のタンパク質に接触させるもう一方のタンパク質を予め標識しておき、被験試料とともにインキュベートした後、洗浄して結合しているタンパク質をその標識により検出又は測定する。すなわち、好ましくは支持体に結合させた一方のタンパク質に、被験試料と標識したもう一方のタンパク質を接触させる。インキュベートした後、洗浄して、結合しているタンパク質の標識を検出又は測定すればよい。Ｓｍａｄ３タンパク質あるいはｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質は、通常知られる方法により標識することができる。標識物質としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、ビオチン／アビジン等が挙げられる。これらの標識物質は市販のものを使用することができる。放射性同位元素しては、３２Ｐ、３３Ｐ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ等が挙げられる。酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ等が挙げられる。蛍光物質としては、フロオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン等が挙げられる。これらは市販のものを使用することができ、公知の方法によって標識することができる。
【００３３】
具体的には、以下のようにして行うことができる。すなわち、一方のタンパク質を含む溶液をプレートに加え、一夜放置する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため例えばＢＳＡでブロッキングする。再洗浄し、被験試料ともう一方の標識されたタンパク質をプレートに加える。同時に被験試料を含まない群（陰性コントロール）及び／又は既知濃度の結合阻害物質を加えた群（陽性コントロール）を置き、これらをインキュベートする。インキュベート後、洗浄し結合したタンパク質を検出又は測定する。検出又は測定には、放射性同位元素の場合液体シンチレーションにより検出又は測定することができる。酵素の場合、その基質を加え基質の酵素的変化、例えば発色を吸光度計により検出又は測定することができる。蛍光物質の場合、蛍光光度計により検出又は測定することができる。これらの結果を、コントロール群で得られた数値を比較すれば阻害物質を含む被験試料を決定することができる。
【００３４】
本発明のＳｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合を阻害する物質のスクリーニング方法において、結合したタンパク質を検出又は測定する手段として、一方のタンパク質を特異的に認識する一次抗体を用いることができる。例えば、一方のタンパク質に、被験試料存在下でもう一方のポリペプチドを接触させ、被験試料とともにインキュベートした後、洗浄して結合しているタンパク質をそのタンパク質を特異的に認識する一次抗体により検出又は測定する。すなわち、好ましくは支持体に結合させた一方のタンパク質に被験試料ともう一方のタンパク質を接触させる。インキュベートした後、洗浄して、結合しているタンパク質をそのタンパク質を特異的に認識する一次抗体により検出又は測定すればよい。一次抗体は、好ましくは標識物質により標識されているものが好ましい。
【００３５】
抗体は、当該技術分野において通常知られる方法により標識することができる。標識物質としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質等が挙げられる。これらの標識物質は市販の標識物質を使用することができる。放射性同位元素しては、３２Ｐ、３３Ｐ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ等が挙げられる。酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ等が挙げられる。蛍光物質としては、フロオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン等が挙げられる。これらは市販のものを使用することができ、公知の方法によって標識することができる。具体的には、以下のようにして行うことができる。すなわち、一方のタンパク質を含む溶液をプレートに加え、一夜放置する。プレートを洗浄の後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため例えばＢＳＡでブロッキングする。再洗浄し、被験試料ともう一方のタンパク質をプレートに加える。同時に被験試料を含まない群（陰性コントロール）及び／又は既知濃度の結合阻害物質を加えた群（陽性コントロール）を置き、これらをインキュベートする。インキュベートの後、洗浄し被験試料と共に加えたタンパク質に対する抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄しそのタンパク質を特異的に認識する一次抗体によりタンパク質を検出又は測定する。検出又は測定には、放射性同位元素の場合液体シンチレーションにより検出又は測定する。酵素の場合その基質を加え、基質の酵素的変化、例えば発色を吸光度計により検出又は測定する。蛍光物質の場合蛍光光度計より検出又は測定する。これらの結果を、コントロール群で得られた数値を比較すれば阻害物質を含む被験試料を決定することができる。
【００３６】
本発明のＳｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合を阻害する物質のスクリーニング方法において、結合したタンパク質を検出又は測定する手段として、Ｓｍａｄ３タンパク質あるいはｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質と融合させた他のペプチド又はポリペプチドを特異的に認識する一次抗体を用いることができる。例えば、一方のタンパク質に、被験試料存在下でもう一方のタンパク質を接触させ、被験試料とともにインキュベートした後、洗浄して結合しているタンパク質を、そのタンパク質に融合させた他のペプチド又はポリペプチドを特異的に認識する一次抗体により検出又は測定する。すなわち、好ましくは支持体に結合させた一方のタンパク質に、被験試料存在下でもう一方のタンパク質を接触させる。インキュベート後、洗浄して、結合しているタンパク質をそのタンパク質に融合させた他のペプチド又はポリペプチドを特異的に認識する一次抗体により検出又は測定すればよい。一次抗体は、好ましくは標識物質により標識されている。抗体は、前述の方法により標識することができる。
【００３７】
具体的には、次のようにして行うことができる。すなわち、一方のタンパク質を含む溶液をプレートに加え、一夜放置する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため例えばＢＳＡでブロッキングする。再び洗浄し、被験試料と他のペプチド又はポリペプチドを融合させたもう一方のタンパク質をプレートに加える。同時に被験試料を含まない群（陰性コントロール）及び及び／又は既知濃度の結合阻害物質を加えた群（陽性コントロール）を置き、これらをインキュベートする。インキュベートの後、洗浄し被験試料と共に加えたタンパク質に融合している他のペプチド又はポリペプチドに対する抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄しそのタンパク質と融合させた他のペプチド又はポリペプチドを特異的に認識する一次抗体によりタンパク質を検出又は測定する。検出又は測定には、放射性同位元素の場合、液体シンチレーションにより検出又は測定することができる。酵素の場合、その基質を加え基質の酵素的変化、例えば発色を吸光度計により検出又は測定することができる。蛍光物質の場合、蛍光光度計により検出又は測定する。これらの結果を、コントロール群で得られた数値を比較すれば阻害物質を含む被験試料を決定することができる。
【００３８】
本発明のＳｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合を阻害する物質のスクリーニング方法において、結合したタンパク質を検出又は測定する手段として、Ｓｍａｄ３タンパク質あるいはｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質を特異的に認識する一次抗体及び一次抗体を特異的に認識する二次抗体を用いることができる。例えば、一方のタンパク質に被験試料とともにもう一方のタンパク質を接触させ、被験試料とともにインキュベートした後、洗浄して結合しているタンパク質を、そのタンパク質を特異的に認識する一次抗体及び一次抗体を特異的に認識する二次抗体により検出又は測定する。すなわち、好ましくは支持体に結合させた一方のタンパク質に被験試料ともう一方のタンパク質を接触させる。インキュベートした後、洗浄して、結合しているタンパク質をそのタンパク質を特異的に認識する一次抗体及び一次抗体を特異的に認識する二次抗体により検出又は測定すればよい。二次抗体は、好ましくは標識物質により標識されている。抗体は、前述の方法により標識することができる。
【００３９】
具体的には、次のようにして行うことができる。すなわち、一方のタンパク質を含む溶液をプレートに加え、一夜放置する。プレートを洗浄の後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため例えばＢＳＡでブロッキングする。再び洗浄し、被験試料ともう一方のタンパク質をプレートに加える。同時に被験試料を含まない群（陰性コントロール）及び及び／又は既知濃度の結合阻害物質を加えた群（陽性コントロール）を置き、これらをインキュベートする。インキュベートの後、洗浄し被験試料と共に加えたタンパク質に対する一次抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、次いで一次抗体を特異的に認識する二次抗体を加える。適度なインキュベーションの後、洗浄して、そのタンパク質を特異的に認識する一次抗体を特異的に認識する二次抗体によりタンパク質を検出又は測定する。検出又は測定には、放射性同位元素の場合液体シンチレーションにより検出又は測定することができる。酵素の場合その基質を加え、基質の酵素的変化、例えば発色を吸光度計により検出又は測定する。蛍光物質の場合蛍光光度計により検出又は測定する。これらの結果を、コントロール群で得られた数値を比較すれば阻害物質を含む被験試料を決定することができる。
【００４０】
本発明のＳｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合を阻害する物質のスクリーニング方法において、結合したタンパク質を検出又は測定する手段として、Ｓｍａｄ３タンパク質あるいはｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質と融合させた他のペプチド又はポリペプチドを特異的に認識する一次抗体及び一次抗体を特異的に認識する二次抗体を用いることができる。例えば、前述のスクリーニング方法において、一方のタンパク質に被験試料とともにもう一方のタンパク質を接触させ、被験試料とともにインキュベートした後、洗浄して結合しているタンパク質をそのタンパク質に融合させた他のペプチド又はポリペプチドを特異的に認識する一次抗体及び一次抗体を特異的に認識する二次抗体により検出又は測定する。すなわち、好ましくは支持体に結合させた一方のタンパク質に被験試料ともう一方のタンパク質を接触させる。インキュベートした後、洗浄して、結合しているタンパク質をそのタンパク質に融合させた他のペプチド又はポリペプチドを特異的に認識する一次抗体及び一次抗体を特異的に認識する二次抗体により検出又は測定すればよい。二次抗体は、好ましくは標識物質により標識されている。抗体は、前述の方法により標識することができる。
【００４１】
具体的には、次のようにして行うことができる。すなわち、一方のタンパク質を含む溶液をプレートに加え、一夜放置する。プレートを洗浄の後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため例えばＢＳＡでブロッキングする。再び洗浄し、被験試料と他のペプチド又はポリペプチドを融合させたもう一方のタンパク質をプレートに加える。同時に被験試料を含まない群（陰性コントロール）及び及び／又は既知濃度の結合阻害物質を加えた群（陽性コントロール）を置き、これらをインキュベートする。インキュベート後、洗浄し被験試料と共に加えたタンパク質と融合させた他のペプチド又はポリペプチドに対する一次抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、次いで一次抗体を特異的に認識する二次抗体を加える。適度なインキュベーションの後、洗浄して、そのタンパク質と融合させた他のペプチド又はポリペプチドを特異的に認識する一次抗体を特異的に認識する二次抗体によりタンパク質を検出又は測定する。検出又は測定には、放射性同位元素の場合液体シンチレーションにより検出又は測定する。酵素の場合その基質を加え、基質の酵素的変化、例えば発色を吸光度計により検出又は測定する。蛍光物質の場合蛍光光度計により検出又は測定する。これらの結果を、コントロール群で得られた数値を比較すれば阻害物質を含む被験試料を決定することができる。
【００４２】
本発明のスクリーニング方法は、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ：ＨｉｇｈＴｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）にも応用することができる。具体的には、ブロッキングまでを手作業で行い、その後の反応はロボットによって行うことでオートメーション化し、ＨＴＳを実現することができる。すなわち、他のペプチド又はポリペプチド（例えば６×Ｈｉｓタグ）を融合させたＳｍａｄ３タンパク質を固相化バッファー（０．１Ｍ　ＮａＨＣＯ３、０．０２％ＮａＮ３、ｐＨ９．６）により希釈する。９６穴のイムノプレートの各穴に希釈したこの水溶液を適量加え４℃で一晩インキュベートする。洗浄バッファーで３回各穴を洗浄後、ＰＢＳに溶解した５％ＢＳＡ溶液を加え、４℃で一晩ブロッキングする。次に、例えばＢｉｏｍｅｋ２０００　ＨＴＳ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）にブロッキング済みのイムノプレートをセットしてシステムのコントロールプログラムを実行する。この際、分注機としてはＢｉｏｍｅｋ　２０００分注機（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）あるいはＭｕｌｔｉｐｉｐｅｔｔｅ９６穴同時分注器（Ｓａｇｉａｎ社製）を用いることでイムノプレート各穴への溶液の分注や溶液の除去を行うことができる。また、イムノプレートの各穴の洗浄にはＥＬ４０４マイクロプレートウオッシャー（Ｂｉｏ　Ｔｅｋ社）を用いることができる。また、吸光度の測定にはＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ２５０プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いることができる。
【００４３】
プログラムは、以下の操作を行うよう設定する。すなわち、洗浄バッファーで３回各穴を洗浄し、被験試料と希釈バッファー（１％ＢＳＡ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ）で希釈した他のペプチド又はポリペプチドを融合させたｃ−Ｓｋｉタンパク質を適量加える。同時に被験試料を含まない群（陰性コントロール）及び既知濃度の結合阻害物質を加えた群（陽性コントロール）を置き、これらを室温で１時間インキュベートする。洗浄バッファーで各穴を３回洗浄し、ｃ−Ｓｋｉタンパク質に融合させた他のペプチド又はポリペプチドに対する抗体を含むウサギ血清を各穴に加え、室温で１時間インキュベートする。洗浄バッファーで各穴を３回洗浄し、希釈バッファーで希釈したアルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を各穴に加え、室温で１時間インキュベートする。洗浄バッファーで５回各穴を洗浄し、発色溶液（基質バッファー；５０ｍＭ　ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．８に１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解したｐ−ニトロフェニルフォスフェート）を１００μｌ各穴に加え、室温で反応させた後に４０５ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー、Ｂｉｏｍｅｋプレートリーダー（Ｂｅｃｋｍａｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定する。これらの結果を、コントロール群で得られた数値と比較すれば阻害物質を含む被験試料を同定することができる。本発明に使用される抗体は、市販の抗体や市販のキットに含まれる抗体を用いることもできるし、公知の手段を用いてモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体として得ることができる。
【００４４】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られるＳｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合を阻害する物質は、Ｓｍａｄ３分子上のｃ−Ｓｋｉ又はＳｎｏＮ結合ドメインのＱＰＳＭＴ配列をミミックすることにより設計あるいは選択された候補物質群から、上記スクリーニング工程の経て、実際に阻害活性のあることが認められた物質である。検出された阻害活性をさらに増強するため（比活性を上昇させるため）、結合阻害物質の構造式の一部を、付加、欠失あるいは置換により変換される化合物も本発明のスクリーニング方法を用いて得られる。
【００４５】
４．Ｓｍａｄ３タンパク質−ｃ−Ｓｋｉタンパク質間結合阻害物質の医学薬学的応用
Ｓｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質とは、各々が結合することにより、ＴＧＦ−βのシグナル伝達系を担う。従って、本発明のスクリーニング方法により得られたＳｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質ととの結合阻害物質はＴＧＦ−βのシグナル伝達を制御（活性化あるいは抑制）する物質として得ることができる。ＴＧＦ−βは様々な傷害に伴う組織の修復及び再生を司っていることが知られている［Ｂｏｒｄｅｒ，Ｗ．　Ａ．ｅｔ　ａｌ．：Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　３３１，　１２８６−１２９２　（１９９４）］。慢性化した傷害におけるＴＧＦ−β異常産生により、組織の修復・再生のバランスが崩れ病的な線維化が生じ、様々な臓器の線維症の主要な原因因子として作用することが明らかになっている［Ｂｏｒｄｅｒ，　Ｗ．　Ａ．ｅｔ　ａｌ．：　Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　３３１，１２８６−１２９２（１９９４）］。例えば、肝線維症の場合、ＴＧＦ−βは、肝臓において細胞外マトリックス蛋白質分解酵素の合成を阻害し、細胞外マトリックス蛋白質分解酵素の阻害物質を誘導することにより、線維化の原因となる細胞外マトリックス蛋白質の産生を亢進させる。その他、ＴＧＦ−βは、細胞増殖阻害作用、単球遊走作用、生理活性物質誘導作用、免疫抑制作用、アミロイドβタンパク質沈着作用等の生理作用を有することが知られている。従って、本発明のスクリーニング方法によって得られるＳｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合阻害物質は、ＴＧＦ−β異常産生に起因する線維症等の治療薬の開発、その他ＴＧＦ−βが関与する前記生理作用の制御に使用することができる。
【００４６】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られるＳｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合を阻害する物質は、ヒトや哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、マントヒヒ、チンパンジー）の医薬として使用する場合、通常知られる方法に従って実施することができる。例えば、必要に応じてカプセル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、Ｓｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合を阻害する物質を生理学的に認められる単体、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、吸着防止剤とともに一般に認められた製剤に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）、結晶性セルロース、アルギン酸、ステアリン酸マグネシウム、ショ糖、乳糖が用いられる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム）を含む等張液が挙げられる。
【００４７】
Ｓｍａｄ３タンパク質とｃ−Ｓｋｉタンパク質又はＳｎｏＮタンパク質との結合を阻害する物質の投与量は、各物質の生理活性、症状等により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日当たり約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は症状、投与方法等により異なるが、例えば、注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日当たり約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４８】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を示して具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕　ｃ−Ｓｋｉタンパク質との結合におけるＳｍａｄ３タンパク質のＭＨ２中の各領域の役割の解析
以下のようにして、ｃ−Ｓｋｉタンパク質との結合におけるＳｍａｄ３タンパク質のＭＨ２中の各領域の役割について解析した。なお、Ｓｍａｄ１とＳｍａｄ３のキメラ分子及び変異体は常法に従い、ＰＣＲ法に基づいた手法により調製した。キメラ分子の作成にあたって、Ｓｍａｄ１およびＳｍａｄ３のＭＨ２ドメインに必要に応じて制限酵素切断部位を導入した。この時、制限酵素切断部位の導入によりアミノ酸残基に置換が起こらないようにした。本発明で用いたＳｍａｄキメラ分子や変異体は、恒常活性化型のＡＬＫ−５やＡＬＫ−６により効率よくリン酸化された。また、ＣＯＳ７細胞（ＡＴＣＣ）は１０％ウシ胎児血清、抗生物質含有ＤＭＥＭ培地にて培養し、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて遺伝子導入を行った。細胞に導入するＤＮＡの量は各検体あたり２マイクログラムになるように調整した。免疫沈降とイムノブロットは常法に従った。
【００４９】
また、ヒトＳｍａｄ３とＳｍａｄ２のＭＨ２ドメインのアミノ酸配列は、解析ソフトＣｌｕｓｔａｌＷを用いて整列させた。また、Ｓｍａｄ３　ＭＨ２ドメイン単量体の比較モデリングは、リン酸化型Ｓｍａｄ２　ＭＨ２ドメインの構造座標（タンパク質データバンク　コード；　１　ｋｈｘ）を鋳型とし、プログラムＭＯＤＥＬＬＥＲを用いて行った。こうして作成した単量体のモデル構造をＳｍａｄ１　ＭＨ２ドメインオリゴマーの結晶構造　（タンパク質データバンクコード；　１　ｋｈｕ）のサブユニットＡ、Ｂ、Ｃに重ね合わせた。このときアミノ酸のα炭素の位置に対する根二乗平均　が最小となるようにした。
【００５０】
哺乳類のＳｍａｄタンパク質のうちではＳｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ４がｃ−Ｓｋｉと結合するが、Ｓｍａｄ１とＳｍａｄ５はごく弱くしか結合しないことが知られている［Ａｋｉｙｏｓｈｉ，　Ｓ．　ｅｔａｌ．：Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７４：３５２６９−３５２７７（１９９９）］。Ｓｍａｄ３においてはＭＨ２ドメインが主要なｃ−Ｓｋｉ結合部位であることが示されている［Ａｋｉｙｏｓｈｉ，　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．：Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７４：３５２６９−３５２７７（１９９９）；Ｌｕｏ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．：Ｇｅｎｅ　Ｄｅｖ．１３：２１９６−２２０６（１９９９）］。そこで、Ｓｍａｄ３　ＭＨ２ドメインにおけるｃ−Ｓｋｉ結合部位をより詳細に決定する目的で、Ｓｍａｄ３　ＭＨ２ドメインを４つの部分に分割し（本発明において、この４つの部分をそれぞれ２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ領域と称する）、Ｓｍａｄ１／Ｓｍａｄ３のキメラ分子を作成した（図１及び図２）。２ｄ領域はＬ３ループを含むが、これはＳｍａｄとＩ型受容体との結合に重要であることが既に知られている［Ｌｏ，　Ｒ．　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．：ＥＭＢＯ　Ｊ．　１７：９９６−１００５（１９９８）］。２ｃ領域はＨ２（へリックス２）を含むが、これはＭｉｘｅｒやＦｏｘＨ３との相互作用に重要であることが知られている［Ｇｅｒｍａｉｎ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．：Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　１４：４３５−４５１（２０００）；Ｒａｎｄａｌｌ，　Ｒ．　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．：ＥＭＢＯ　Ｊ．：２１：１４５−１５６（２００２）；Ｃｈｅｎ，　Ｙ．　Ｇ．ｅｔ　ａｌ．：Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　１２：２１４４−２１５２（１９９８）］。
【００５１】
我々はＳｍａｄ１　ＭＨ２ドメインの４つの領域を、Ｃ−末端側から順に対応するＳｍａｄ３由来の配列に置換したキメラ分子を用いて検討を行った（図１）。図１において、Ｓｍａｄ１とＳｍａｄ３のキメラ蛋白質の構造を上に示した。Ｓｍａｄ１とＳｍａｄ３のＭＨ２ドメインを４つの領域に分割し、２ａ〜２ｄと名付けた。Ｓｍａｄのキメラとｃ−Ｓｋｉの物理的な結合を恒常的に活性化したＩ型レセプター（ＡＬＫ−５またはＡＬＫ−６）の存在下、もしくは非存在下でＤＮＡをトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞を用いて行った。ＦＬＡＧタグを付加したＳｍａｄのキメラ蛋白質をＦＬＡＧの抗体で免疫沈降し、そのあと６Ｍｙｃタグの付いたｃ−ＳｋｉをＭｙｃ抗体でイムノブロットした（一番上のパネル）。遺伝子をトランスフェクションした蛋白質のそれぞれの発現レベルはイムノブロットで確認した（下３つのパネル）。
【００５２】
図１に示したように、Ｓｍａｄ１キメラ分子を免疫沈降後、イムノブロットによりｃ−Ｓｋｉを検出したところ、Ｓｍａｄ３由来の２ｂ領域を含むキメラ、すなわち１−１−３と１−１−１３３３がｃ−Ｓｋｉと結合することがわかった。また、この結合は恒常活性化型ＴＧＦ−β　Ｉ型受容体（ＡＬＫ−５）の共存により増強された（図１）。対照的に、Ｓｍａｄ１由来の２ｂ領域を含むキメラ分子は効率よくｃ−Ｓｋｉと結合することができなかった。ＭＨ１とリンカーがＳｍａｄ３由来であり、他の部分は図１で用いたＳｍａｄ１キメラと同様の一連のキメラ分子を用いても、一致する結果が得られた（図３）。すなわち、図３に示したように、Ｓｍａｄ３の２ｂ領域を含むＳｍａｄ３のキメラ（３−３−３３３１と３−３−３３１１）はｃ−Ｓｋｉと強く結合する。一方、Ｓｍａｄ１の２ｂ領域を含むキメラ（３−３−１と３−３−３１１１）はｃ−Ｓｋｉと結合するが、Ｓｍａｄ３の２ｂ領域を含むキメラや野性型のＳｍａｄ３にくらべると結合ははるかに弱いことがわかった。
【００５３】
さらに、ＭＨ２ドメインの４つの領域のうちのひとつだけを、それに対応するＳｍａｄ３のものに置換したＳｍａｄ１キメラを用いた解析によっても、Ｓｍａｄ３の２ｂ領域がｃ−Ｓｋｉとの結合に最も重要であることが示された（図４及び図５）。すなわち、図４の上側は、Ｓｍａｄ１の変異体の構造である。ここで、Ｓｍａｄ１の変異体とｃ−Ｓｋｉの物理的な結合を恒常的に活性化したＩ型レセプター（ＡＬＫ−５またはＡＬＫ−６）の存在下、もしくは非存在下で、ＤＮＡをトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞を用いて行った。１ＡＡはＳｍａ１（ＡＡ）を、１ＳＥはＳｍａｄ１（ＳＥ）を示す。また、図５は、Ｓｍａｄ１のキメラでＭＨ２ドメインの一つの領域のみをＳｍａｄ３の対応する部分に変えたものについて、ｃ−Ｓｋｉとの結合を調べた結果を示したものである。結果から明らかなように、Ｓｍａｄ１のキメラのうち２ｂ領域をＳｍａｄ３に変えたもの（１−１−１３１１）のみがｃ−Ｓｋｉと結合した。
【００５４】
〔実施例２〕　ｃ−Ｓｋｉに対するＳｍａｄ１とＳｍａｄ３の結合性の違いの原因の解析
まず、実施例１の結果より２ｂ領域がｃ−Ｓｋｉとの結合に重要であるとのことから、２ｂ領域に注目し、以下解析を行った。図２は、Ｓｍａｄ１とＳｍａｄ３の２ｂ領域のアミノ酸配列の比較である。Ｓｍａｄ１とＳｍａｄ３のアミノ酸で保存されていないものを四角で囲んだ。アミノ酸配列の２次構造は模式的に下に示した。Ｂはβシート構造を、Ｈはαヘリックス構造を、Ｌはループ構造を示す。キメラを作成するための制限酵素部位を示してある。２ａから２ｄまでの境界領域のＳｍａｄ１とＳｍａｄ３のアミノ酸番号を下に示した。Ｓｍａｄ１とＳｍａｄ３の２ｂ領域のアミノ酸配列を比較した結果、他の部分と比べて、Ｓｍａｄ１とＳｍａｄ３の間で配列の差異が特に大きい部分が２箇所見いだされた。Ｓｍａｄ３のＳＥ配列とＳｍａｄ１の対応する配列（ＮＫＮ）は荷電状態がほぼ正反対である。Ｓｍａｄ３のＡＡＶＥＬ配列（配列番号１０）とＳｍａｄ１の対応するＳＴＩＥＮ配列（配列番号１１）は疎水的な性質が異なっている。Ｓｍａｄの単量体および三量体の立体構造上におけるこれらの２つの配列の位置を同定するために、Ｓｍａｄ１のＭＨ２ドメインの結晶構造、およびＳｍａｄ２のＭＨ２ドメインの結晶構造に基づいて相同性を利用して作成したＳｍａｄ３のモデル構造について検討した。その結果、ＳＥ配列とＡＡＶＥＬ配列はＭＨ２ドメイン三量体のドーナッツ構造（トロイドとここでは呼ぶ）のＮ−末端側上面と底面に各々、遠く離れて位置しているという解析結果が得られた。
【００５５】
そこで、ＳＥ配列あるいはＡＡＶＥＬ配列を他方のＳｍａｄの対応する配列に置き換えたＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ３変異体を作成した。図４に示したようにＳｍａｄ１（ＡＡ）（Ｓｍａｄ１のＳＴＩＥＮ配列をＳｍａｄ３由来のＡＡＶＥＬ配列に置き換えたもの）はｃ−Ｓｋｉと相互作用しなかった。対照的にＳｍａｄ１（ＳＥ）（Ｓｍａｄ１のＮＫＮ配列をＳｍａｄ３由来のＳＥ配列に置換したもの）はＳｍａｄキメラ１−１−１３１１と同じくらい効率よくｃ−Ｓｋｉと相互作用した。我々の結果はＳｍａｄ３のたった２つのアミノ酸残基がＳｍａｄ３とｃ−Ｓｋｉの相互作用に決定的な役割を果たしていることがわかった。しかしながら、Ｓｍａｄ３（ＮＫ）（Ｓｍａｄ３のＳＥ配列をＳｍａｄ１由来のＮＫＮ配列に置き換えたもの）はなおｃ−Ｓｋｉに対する結合能を保持していた（図６）。このことより、Ｓｍａｄ３の他の部分もｃ−Ｓｋｉとの相互作用に関与していると考えられる。
【００５６】
次いで、ｃ−Ｓｋｉとの相互作用に関与しているＳｍａｄ３のＭＨ２ドメイン中の、上記以外の部分を明らかにするため、まずＳｍａｄ１とＳｍａｄ３のＭＨ２ドメインのアミノ酸配列と三次元構造について検討した。その結果、Ｓｍａｄ３のＭＨ２ドメイン内の２ａ領域に存在するＱＰＳＭＴ配列が、Ｓｍａｄ１のそれに相当する部位と配列が非常に異なっていることを見いだした（図７）。ＱＰＳＭＴ配列とＳＥ配列は、アミノ酸の一次配列上はお互いに離れた位置に存在するが、立体構造のコンピュータ解析の結果から、実際にはＭＨ２ドメインの作る３量体トロイドのアミノ末端側の上面においてお互いに近傍に存在していることが判明した（図８）。そこで、このＱＰＳＭＴ配列に相当する部分をお互いに入れ替えたＳｍａｄ１とＳｍａｄ３の変異体を作製した。図９に示すようにＳＴＳＶＬ配列をＱＰＳＭＴ配列に変えたＳｍａｄ１の変異体であるＳｍａｄ１（ＱＰ）はｃ−Ｓｋｉに弱く結合できた。さらに、ＱＰＳＭＴ配列とＳＥ配列の両方を入れ替えたＳｍａｄ１の変異体であるＳｍａｄ１（Ｑ／Ｓ）はＳｍａｄ１（ＳＥ）より強くｃ−Ｓｋｉに結合した。
【００５７】
次いで、Ｓｍａｄ３のＱＰＳＭＴ変異体とｃ−Ｓｋｉとの結合を調べた。ＱＰＳＭＴをＳＴＳＶＬ配列に変えたＳｍａｄ３（ＳＴ）はｃ−Ｓｋｉに強く結合した。しかしＳｍａｄ３のＱＰＳＭＴ配列とＳＥ配列のダブル変異体Ｓｍａｄ３（Ｓ／Ｎ）はＳｍａｄ３（ＮＫ）やＳｍａｄ３（ＳＴ）に比べｃ−Ｓｋｉとの結合が弱かった（図６）。従ってＱＰＳＭＴ配列はそれ自身強くｃ−Ｓｋｉと結合しないが、ＳＥ配列がｃ−Ｓｋｉに結合するのをサポートしていると考えられる。
【００５８】
さらに、ｃ−Ｓｋｉと構造的相同性の高いＳｎｏＮとＳｍａｄキメラや変異体（図１０）との結合を調べた。ｃ−Ｓｋｉと同様にＳｎｏＮもＳｍａｄ１（ＳＥ）と弱く、Ｓｍａｄ１（Ｑ／Ｓ）とは更に強く結合した。従って、ＳＥ配列とＱＰＳＭＴ配列とが、Ｓｍａｄ３がｃ−ＳｋｉやＳｎｏＮに結合する際の重要な領域であることが判明した。
【００５９】
【発明の効果】
本発明により、ＴＧＦ−βシグナル伝達制御物質設計用ペプチドミメティックステンプレート及び当該テンプレートを用いたＴＧＦ−βシグナル伝達制御物質のスクリーニング方法が提供される。本発明は、ＴＧＦ−β異常産生に起因する線維症等の治療薬の開発に有用である。
【００６０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】複数種のＳｍａｄ１−Ｓｍａｄ３キメラを用い、Ｓｍａｄ３上のｃ−Ｓｋｉとの結合領域を絞り込むための結合実験の結果を示した図である。
【図２】Ｓｍａｄ１とＳｍａｄ３の２ｂ領域のアミノ酸配列の比較を示した図である。
【図３】複数種のＳｍａｄ３−Ｓｍａｄ１キメラを用い、Ｓｍａｄ３上のｃ−Ｓｋｉとの結合領域を絞り込むための結合実験の結果を示した図である。
【図４】ＳＥ配列とＡＡＶＥＬ配列に変異を導入した変異型Ｓｍａｄ１とｃ−Ｓｋｉとの結合実験の結果を示した図である。
【図５】Ｓｍａｄ１のキメラでＭＨ２ドメインの一つの領域のみをＳｍａｄ３の対応部分に変えたものについてｃ−Ｓｋｉとの結合実験を行った結果を示した図である。
【図６】Ｓｍａｄ３のＳＥ配列及び／又はＱＰＳＭＴ配列をＳｍａｄ１の対応配列に変異させた変異型Ｓｍａｄ３とｃ−Ｓｋｉとの結合実験の結果を示した図である。
【図７】Ｓｍａｄ１とＳｍａｄ３の２ａ−２ｂ領域のアミノ酸配列の比較を示した図である。
【図８】Ｓｍａｄ３の立体構造モデルを示した図である。
【図９】ＳＴＳＶＬ配列をＱＰＳＭＴ配列に、及び／又はＮＫＮ配列をＳＥ配列に変えた変異型Ｓｍａｄ１とｃ−Ｓｋｉとの結合実験の結果を示した図である。
【図１０】ＳＴＳＶＬ配列をＱＰＳＭＴ配列に、及び／又はＮＫＮ配列をＳＥ配列に変えた変異型Ｓｍａｄ１とＳｎｏＮとの結合実験の結果を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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