(57)【要約】　　　（修正有）【課題】肥満、過食症または食欲不振などの治療に関連して、食物の消費の増大または減少を含む摂食挙動を改善する方法の提供。【解決手段】選択されたＹ５受容体の作動剤または拮抗剤の投与を含む方法。このような拮抗剤の一つは、下記の構造の化合物を有する。加えて、Ｙ５受容体をコードする単離された核酸分子、単離されたＹ５受容体タンパク、Ｙ５受容体をコードする単離された核酸分子を含むベクター、かかるベクターを含む細胞、Ｙ５受容体に向けられた抗体、Ｙ５受容体をコードする核酸を検出するために有用な核酸プローブ、Ｙ５受容体をコードする核酸分子の何れかのユニークな配列に対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、および正常または変異体のＹ５受容体ＤＮＡを発現する非ヒト遺伝子導入動物を提供する。2004137276.tif 000035【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　哺乳類のＹ５受容体の活性を増加するのに有効な量のＹ５受容体作動剤を含む薬学的組成物であって、
（ａ）前記Ｙ５受容体作動剤は、哺乳類のY５受容体をコードする核酸をトランスフェクトされ、それらの細胞表面上に発現している非神経細胞を、前記細胞からの機能的なＹ５受容体応答の活性化を可能とする条件下で、前記化合物と接触せしめ、セカンドメッセンジャーアッセイのようなバイオアッセイによって、哺乳類のＹ５受容体活性の増加を検出することにより、前記化合物がＹ５受容体の作動剤であるかどうか決定することにより決定され、
（ｂ）前記Ｙ５受容体作動剤は担体と混合されており、
前記哺乳類のＹ５受容体が、
（ｉ）　　　配列番号：２、又は配列番号：４に示されたアミノ酸配列を有する哺乳類のＹ５受容体タンパク質；
（ｉｉ）　　（１）（ｉ）の受容体をコードするヌクレオチド配列により、または（２）適切な条件下に（ｉ）の受容体をコードする前記ヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされた哺乳類のＹ５受容体；
（ｉｉｉ）　プラスミドｐｃＥＸＶ−ｈＹ５（ＡＴＣＣ受付番号７５９４３）、またはプラスミドｐｃＥＸＶ−ｒＹ５（ＡＴＣＣ受付番号７５９４４）により示されるアミノ酸配列を含む哺乳類のＹ５受容体タンパク質；又は
（ｉｖ）　　（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）の哺乳類のＹ５受容体タンパク質と同じ結合特性を有し、実質的に同じアミノ酸配列を含むたんぱく質
であって、（ｉｖ）の前記結合特性が、（１）表６又は表７に示されるヒトＹ５受容体の薬理学的プロフィール特性、または（２）表４又は表５に示されるラットＹ５受容体の薬理学的プロフィール特性に相当する薬学的組成物。
【請求項２】
　（ａ）哺乳類のＹ５受容体をコードする核酸をトランスフェクトされ、それらの細胞表面上に発現している非神経細胞を、前記細胞からの機能的なＹ５受容体応答の活性化を可能とする条件下で、前記化合物と接触せしめることと、セカンドメッセンジャーアッセイのようなバイオアッセイによって、哺乳類のＹ５受容体活性の増加を検出することにより、前記化合物がＹ５受容体の作動剤であるかどうか決定することとを備えた方法により、Ｙ５受容体作動剤である化合物を同定すること、及び
（ｂ）前記Ｙ５受容体作動剤を担体と混合すること、
を具備する組成物の調製方法であって、前記哺乳類のＹ５受容体が、
（ｉ）　　　配列番号：２、又は配列番号：４に示されたアミノ酸配列を有する哺乳類のＹ５受容体タンパク質；
（ｉｉ）　　（１）（ｉ）の受容体をコードするヌクレオチド配列により、または（２）適切な条件下に（ｉ）の受容体をコードする前記ヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされた哺乳類のＹ５受容体；
（ｉｉｉ）　プラスミドｐｃＥＸＶ−ｈＹ５（ＡＴＣＣ受付番号７５９４３）、またはプラスミドｐｃＥＸＶ−ｒＹ５（ＡＴＣＣ受付番号７５９４４）により示されるアミノ酸配列を含む哺乳類のＹ５受容体タンパク質；又は
（ｉｖ）　　（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）の哺乳類のＹ５受容体タンパク質と同じ結合特性を有し、実質的に同じアミノ酸配列を含むたんぱく質
であって、（ｉｖ）の前記結合特性が、（１）表６又は表７に示されるヒトＹ５受容体の薬理学的プロフィール特性、または（２）表４又は表５に示されるラットＹ５受容体の薬理学的プロフィール特性に相当する方法。
【請求項３】
　（ａ）哺乳類のＹ５受容体をコードする核酸をトランスフェクトされ、それらの細胞表面上に発現している非神経細胞を、機能的なＹ５受容体応答の活性化を可能とする条件下で、PPのような公知のY５受容体作動剤の存在下において前記化合物と接触せしめることと、セカンドメッセンジャーアッセイのようなバイオアッセイによって、Ｙ５受容体活性の減少を検出することにより、前記化合物がＹ５受容体の拮抗剤であるかどうかを決定することを備えた、Ｙ５受容体拮抗剤である化合物を同定すること、及び
（ｂ）前記Ｙ５受容体拮抗剤を担体と混合すること、
を具備する組成物の調製方法であって、前記哺乳類のＹ５受容体が、
（ｉ）　　　配列番号：２、又は配列番号：４に示されたアミノ酸配列を有する哺乳類のＹ５受容体タンパク質；
（ｉｉ）　　（１）（ｉ）の受容体をコードするヌクレオチド配列により、または（２）適切な条件下に（ｉ）の受容体をコードする前記ヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされた哺乳類のＹ５受容体；
（ｉｉｉ）　プラスミドｐｃＥＸＶ−ｈＹ５（ＡＴＣＣ受付番号７５９４３）、またはプラスミドｐｃＥＸＶ−ｒＹ５（ＡＴＣＣ受付番号７５９４４）により示されるアミノ酸配列を含む哺乳類のＹ５受容体タンパク質；又は
（ｉｖ）　　（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）の哺乳類のＹ５受容体タンパク質と同じ結合特性を有し、実質的に同じアミノ酸配列を含むたんぱく質
であって、（ｉｖ）の前記結合特性が、（１）表６又は表７に示されるヒトＹ５受容体の薬理学的プロフィール特性、または（２）表４又は表５に示されるラットＹ５受容体の薬理学的プロフィール特性に相当する方法。
【請求項４】
　哺乳類のＹ５受容体の活性を減少させるのに有効な量のＹ５受容体拮抗剤を含む薬学的組成物であって、
（ａ）前記Ｙ５受容体拮抗剤は、哺乳類のＹ５受容体をコードする核酸をトランスフェクトされ、それらの細胞表面上に発現している非神経細胞を、機能的なＹ５受容体応答の活性化を可能とする条件下で、PPのような公知のY５受容体作動剤の存在下において前記化合物と接触せしめ、セカンドメッセンジャーアッセイのようなバイオアッセイによって、Ｙ５受容体活性の減少を検出することにより、前記化合物がＹ５受容体の拮抗剤であるかどうかを決定することにより決定され、
（ｂ）前記Ｙ５受容体拮抗剤は担体と混合されており、
前記哺乳類のＹ５受容体が、
（ｉ）　　　配列番号：２、又は配列番号：４に示されたアミノ酸配列を有する哺乳類のＹ５受容体タンパク質；
（ｉｉ）　　（１）（ｉ）の受容体をコードするヌクレオチド配列により、または（２）適切な条件下に（ｉ）の受容体をコードする前記ヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされた哺乳類のＹ５受容体；
（ｉｉｉ）　プラスミドｐｃＥＸＶ−ｈＹ５（ＡＴＣＣ受付番号７５９４３）、またはプラスミドｐｃＥＸＶ−ｒＹ５（ＡＴＣＣ受付番号７５９４４）により示されるアミノ酸配列を含む哺乳類のＹ５受容体タンパク質；又は
（ｉｖ）　　（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）の哺乳類のＹ５受容体タンパク質と同じ結合特性を有し、実質的に同じアミノ酸配列を含むたんぱく質
であって、（ｉｖ）の前記結合特性が、（１）表６又は表７に示されるヒトＹ５受容体の薬理学的プロフィール特性、または（２）表４又は表５に示されるラットＹ５受容体の薬理学的プロフィール特性に相当する薬学的組成物。
【請求項５】
　異常症状を治療する薬学的組成物を調製するための化学的化合物の使用であって、前記異常症状は、（１）プラスミドｐｃＥＸＶ−ｈＹ５（ＡＴＣＣ受付番号７５９４３）、又は（２）配列番号：３の核酸分子によりコードされたヒトＹ５受容体の活性を増加することにより緩和され、前記異常症状は食欲不振又は癲癇発作である、化学的化合物の使用。
【請求項６】
　前記異常症状が食欲不振である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
　前記異常症状が癲癇発作である、請求項５に記載の使用。
【請求項８】
　異常症状を治療する薬学的組成物を調製するための化学的化合物の使用であって、前記異常症状は、（１）プラスミドｐｃＥＸＶ−ｈＹ５（ＡＴＣＣ受付番号７５９４３）、又は（２）配列番号：３の核酸分子によりコードされたヒトＹ５受容体の活性を減少させることにより緩和され、前記異常症状は摂食障害、肥満、神経性過食症、糖尿病、不安症、うつ病、疼痛、性的又は生殖器疾患、非脂肪血症、または高血圧である、化学的化合物の使用。
【請求項９】
　前記異常症状が摂食障害である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
　前記異常症状が肥満である、請求項８に記載の使用。
【請求項１１】
　前記異常症状が神経性過食症である、請求項８に記載の使用。
【請求項１２】
　前記異常症状が糖尿病である、請求項８に記載の使用。
【請求項１３】
　前記異常症状が不安症である、請求項８に記載の使用。
【請求項１４】
　前記異常症状がうつ病である、請求項８に記載の使用。
【請求項１５】
　前記異常症状が疼痛である、請求項８に記載の使用。
【請求項１６】
　前記異常症状が性的又は生殖器疾患である、請求項８に記載の使用。
【請求項１７】
　前記異常症状が非脂肪血症である、請求項８に記載の使用。
【請求項１８】
　前記異常症状が高血圧である、請求項８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
　本出願は、１９９４年１２月２日に提出された米国特許出願０８／３４９,０２５号の一部継続出願であり、その内容は、ここでは参考文献によって主題出願に包含されている。
【０００２】
　本出願全体にわたって、種々の参考文献が、括弧内に引用されている。これらの公表出版物の全開示内容は、本出願に関連する従来技術をより完全に記載するため、ここでは参考文献によって本出願に包含されている。これらの参考文献の完全な書誌引用は、本出願の最後において、配列表および特許請求の範囲の前に見られる。
【０００３】
　神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）は、哺乳類神経系全体にわたって広い分布を持つ膵臓ポリペプチド属のメンバーである。NPYおよびその関連物（ペプチドYＹまたはＰＹＹ、および膵臓のポリペプチド又はＰＰ）は、 Y１,Y２,Y３,Y４（又はＰＰ）として知られる、少なくとも５つのＧ蛋白連結受容体のサブタイプ、および “異型Ｙ１”を活性化することによって広範な生理学的効果を引き出す。　記載された摂食行動の最も有力な作用物質であるＮＰＹの作用は、初めは視床下部の”異型Ｙ１”受容体の活性化を通して引き起こされると考えられている。当該受容体は、Y１,Y２,Y３,およびＹ４（又はＰＰ）受容体（各々については前記記載済み）が放射線リガンド結合および作用性分析の両方で分類されるのと違い、その分類が放射線リガンド結合データよりもむしろ、単に摂食行動に基づいて行われる点で、ユニークである。出願人は、Y５サブタイプとここで呼称される異型Ｙ１受容体をコードするラットの視床下部ｃＤＮＡを単離するために、１２５Ｉ―ＰＹＹをもとにした発現クローニング技術の利用についてここに報告する。出願人は、またヒト海馬起源のＹ５相同体の単離および特徴の解明を報告する。蛋白配列分析によって、Ｙ５受容体が、Ｇ蛋白連結受容体・スーパー・ファミリーに属することを解明している。ヒトおよびラットの相同体は両者共、膜内外ドメインで、先にクローンした”Y型”受容体と４２％以下の同一性を示す。in situハイブリデイゼーション技術を使用したラットの脳局在化研究では、視床下部におけるＹ５受容体ｍＲＮＡの存在が解明された。薬理学的評価では、Y５と”異型Ｙ１受容体”の間に下記相同性のあることがわかった。　１）摂食反応について記載されていた有効性：ＮＰＹ≧ＮＰＹ２ー３６＝PYY＝「Leu３１、Ｐｒｏ３４」ＮＰＹ＞＞ＮＰＹ１３−３６，と同等のランク・オーダーの有効性をもって、ペプチドはＹ５受容体に結合した。２）該Ｙ５受容体は、”異型Ｙ１受容体について提案されていたように、ｃＡＭＰ蓄積とはネガテイブな関係にあった。　３）摂食反応について記載されていたものと同等のランクオーダーの有効性をもって、ペプチドはＹ５受容体を活性化した、４）報告された摂食モジュレータ[Ｄ−Ｔｒｐ３２]ＮＰＹは、該Ｙ５受容体に選択的に結合し、続けて受容体を活性化した。５）Ｙ５および”異型Ｙ１”受容体の両者は、NPYおよび関連ペプチドリガンドの中間領域における欠損又は変異について感受性が高い。これらのデータは、Ｙ５受容体と先に述べた”異型Y１”が同一であることを支持し、更に、肥満、代謝、および食欲疾患の治療において、Ｙ５受容体の役割が、有望なターゲットとなる事が示唆される。
【０００４】
　ペプチド神経伝達物質、神経ペプチドY（ＮＰＹ）は、哺乳類神経系にわたって広い分布を持つ膵臓ポリペプチド族の３６アミノ酸メンバーである。ＮＰＹは、記載された摂食行動の最も有力な作用物質である（Clark et al., 1984; Levine and Morley, 1984; Stanley and Leibowitz, 1984）。飽食ラットの視床下部に直接注入すると、例えば、食物取り込みを４時間にわたり１０倍に増やす事ができる（Stanley et al., 1992）。通常および異常摂食行動におけるNPYの役割、および食欲および体重を制御するための手段としてのＮＰＹ依存経路を阻害する事の可能性は、薬理学的および医学的研究の大いに興味ある領域である（Sahu and Kalra, 1993; Dryden et al., 1994）。　しかしながら、NPY依存摂食行動を研究又は制御する確かな手段はいづれも、ＮＰＹが少なくとも５つの薬理学的に規定された受容体のサブタイプを通して作用し、多種の生理学的作用を誘導するように、高度に特異的である必要がある（Dumont et al., 1992）。それゆえ、サブタイプ選択性化合物を開発するための論理的ドラッグデザインアプローチの一部として、分子生物学的知識および個々の受容体サブタイプの構造的多様性を理解することが重要である。ＮＰＹ受容体薬理学の簡単なレビューは要約して、下記および表１に示す。
【０００５】
　表１：　NPYおよび関連膵臓ポリペプチドの薬理学的に規定されたレセプタ
　鍵となる重要なペプチド（NPY,　PYY,　ＰＰ、[Leu31, Pro34]NPY, NPY2-36, NPY13-36）に対する親和性のランクオーダーは、先に報告した結合および作用性データをもとにしている（Schwarts et al., 1990; Wahlestedt et al., 1991; Dumont et al., 1992; Wahlestedt and Reis, 1993）。Ｙ２受容体についてのデータは、2/3/94に提出され、現在保留中のＵ．Ｓ．特許出願08/192,288に開示されており、そのこれまでの内容は、ここでは参考文献によって開示されている。Ｙ４受容体は、12/28/93に提出され、現在保留中のＵ．Ｓ．特許出願08/176,412に開示されており、そのこれまでの内容は、ここでは参考文献によって開示されている。これらのシリーズ中で、削除されたペプチドは、公表された情報にも欠けている。
【表１】
2004137276.tif 000002
ＮＰＹ受容体薬理学
　ＮＰＹ受容体薬理学は、歴史的に膵臓ポリペプチド族内での構造／活性の関係を基にしていた。この族全体には、膵臓における内分泌細胞によって主に合成される、名前通りの膵臓ペプチド（ＰＰ）；腸における内分泌細胞によって主に合成されるペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、神経で主に合成されるNPYが含まれる（Michel, 1992; Dumont et al., 1992; Wahlestedt and Reis, 1993）。　膵臓ポリペプチド族の全てのメンバーは、”ＰＰ折り”をはじめとする圧縮構造およびＴｙｒ３６（又は一文字コードではＹ３６）で終わる保存C末端ヘキサペプチドの末端を共通に持つ。Ｙ３６の保存が顕著であることによって、”Ｙ型”受容体が膵臓ポリペプチドであるという言及が支持されてきた（Wahlestedt et al. 1987）。これらすべてによって、7つの膜内外にわたるＧ蛋白連結受容体として作用が提示される（Dumont et al., 1992）。
【０００６】
　Ｙ受容体は、NPY≧ＰＹＹ＞＞ＰＰを認識する（Grundemar et al., 1992）。該受容体による最適認識のためには、該ペプチドのＮ−およびＣ−末端領域の両方が必要とされる。　しかし、NPY又はＰＹＹ中でＧｌｎ３４がＰＰ起源の類似残基と交換されていても十分許容される。Ｙ１受容体は、ヒト、ラットおよびマウスを含む多くの種からクローンされている（Larhammar et al, 1992; Herzog et al, 1992; Eva et al.、1990; Eva et al, 1992）。Ｙ２受容体はＰＹＹ―ＮＰＹ＞＞ＰＰを認識し、Ｎ末端に欠損があっても比較的許容される（Grundemar et al., 1992）。該受容体は、そのC末端における構造がＡｒｇ３３−Ｇｌｎ３４−Ａｒｇ３５−Ｔｙｒ３６―ＮＨ２である事が厳密に要求される；　PP中におけるように、Ｇｌｎ３４　をＰｒｏ３４を置換する事はあまり許容できない。該Ｙ２受容体は、最近クローンされた（1994年2月3日に提出されたＵＳ特許出願シリーズ番号08/192,288）。該Ｙ３受容体は、PYYおよびＰＰよりもNPYに対する選択性が強いという特徴がある（Wahlestedt et al., 1991）。　[Pro34]NPYは、やはりＰｒｏ３４を含んでいるＰＰが該Y3受容体には十分結合しなくても、かなり十分な許容性がある。この受容体（Ｙ３）は、まだクローンされていない。Ｙ４受容体（1993年12月28日に提出されたＵＳ特許出願シリーズ番号08/176,412に開示されている）は、ＰＰ＞ＰＹＹ＞ＮＰＹに結合する。Ｙ１と同様に、Ｙ４が最適認識を行なうためには、該ペプチドのＮ−およびＣ−末端領域の両方が必要である（シナプチックＹ４特許）。　該　”異型Ｙ１”すなわち摂食受容体は、幾つかの膵臓ポリペプチド類似物を、ラットの視床下部の室傍核（ここでは、下記ランクオーダー：ＮＰＹ≧ＮＰＹ２―３６＝PYY＝「Leu３１、Ｐｒｏ３４」ＮＰＹ＞＞ＮＰＹ１３−３６をもって摂食行動を刺激する）へ注入することによってのみ規定される(Kalra et al., 1991; Stanley et al., 1992)。該プロフィルは、ＮＰＹと同等かより高い有効性をもって食物の取り入れを刺激するＮＰＹ２−３６の例外的な能力を除いては、Ｙ１様受容体のプロフィルと同様である。 Balasubramanianおよび共同研究者（１９９４）による　J. Med. Chem.におけるその後のレポートで、摂食は、[Ｄ−Ｔｒｐ３２]ＮＰＹによって調整できる事が分かった。このペプチドは、ＮＰＹ拮抗的阻害物質として提供される一方、公表されたデータの少なくとも一部によって、[Ｄ−Ｔｒｐ３２]ＮＰＹが摂食を刺激する効果があることが支持された。それによって、[Ｄ−Ｔｒｐ３２]ＮＰＹは、受容体認識を診断するもう一つの道具である事が分かる。他のＮＰＹ受容体サブタイプとは対照的に、該摂食受容体は、 放射性リガンド分析におけるペプチド結合親和性によって特徴づけされたことはなく、単一の受容体が、摂食反応に関与しうるという事実は、単離された受容体蛋白無しでは確認することは不可能であった。例えば、摂食反応がＹ１およびＹ２サブタイプの複合プロフィルであるというもありうるからである。
【０００７】
　出願人は、ラット視床下部ｃＤＮＡライブラリーから新規Ｙ型受容体を発現クローニングによって単離することについて、その薬理学的特徴およびin-situ局在化、ヒト相似物と共にここに報告する。この得られたデータによって、この新規クローンされた受容体のサブタイプ（現時点より、Ｙ５サブタイプと呼ばれる）と”異型Ｙ１”摂食反応とが関連付けられる。それゆえ、この発見は、異種発現システムを使用を通して、肥満および他の指標に対するサブタイプ選択性拮抗的阻害物を開発するための新規アプローチを提供する。
【０００８】
　出願人は、更に、イヌＹ５受容体の単離を報告する。加えて、出願人は、本願のＹ５受容体に選択的に結合し、Ｙ５受容体の拮抗的阻害物質として働く化合物を発見したことを報告する。ラットにおいて、食物の取り入れを阻害するように見える幾つかの化合物が、更に提示される。
【０００９】
　Ｙ５受容体サブタイプの阻害に関係する疾患又は疾病、特に肥満、大食症、神経症（nervosa）、糖尿病、非脂肪血症(dislipidimia, dislipidemia)等の摂食疾患によって引き起こされる疾病の処置は、Ｙ５受容体に選択的に結合し、Ｙ５受容体の活性化を阻害する化合物を投与によって行われる。更に、Ｙ５受容体サブタイプが関与する疾病、例えば、記憶喪失、癲癇発作、片頭痛、睡眠障害、および痛み等の疾病状態はどれも、Ｙ５受容体に選択的に結合する化合物を使用して治療でき得る。
【発明の開示】
【００１０】
　〔発明の概要〕
　本発明は、被験者の摂食行動を変える方法を提供するものであって、該方法は、Ｙ５受容体の作用物質(agonist)又は拮抗的阻害物質(antagonist)である化合物をある量被験者に投与し、該被験者による食物の消費を増やしたり、減らしたりし、これによって被験者の摂食行動を変える事を包含する。
【００１１】
　本発明は、被験者における摂食疾患を治療する方法を提供するものであって、該方法は、被験者のＹ５受容体の活性を阻害するのに効果的な、Ｙ５受容体拮抗的阻害物質である非ペプチジル化合物をある量被験者に投与することを包含し、ヒト受容体に対する該化合物の結合は、１２５Ｉ―ＰＹＹの存在下で測定した場合、Ｋｉが１００ナノメータ未満である事を特徴とする。
【００１２】
　本発明は、被験者における摂食疾患を治療する方法を提供するものであって、該方法は、被験者のＹ５受容体の活性を阻害するのに効果的な、Ｙ５受容体拮抗的阻害物質であるペプチジル化合物をある量被験者に投与することを包含し、ヒトＹ５受容体に対する該化合物の結合は、１２５Ｉ―ＰＹＹの存在下で測定した場合に、Ｋｉが１０ナノメータ未満であることを特徴とする。
【００１３】
　本発明は、被験者における摂食疾患を治療する方法を提供するものであって、該方法は、被験者のＹ５受容体の活性を増加させるのに効果的な、Ｙ５受容体作用物質である非ペプチジル化合物をある量被験者に投与することを包含し、（ａ）ヒトＹ５受容体に対する該化合物の結合は、１２５Ｉ―ＰＹＹの存在下で測定した場合、Ｋｉが１００ナノメータ未満であることを特徴とし、（ｂ）他のヒトＹ型受容体に対する化合物の結合が、１２５Ｉ―ＰＹＹの存在下で測定した場合、Ｋｉが１０００ナノメータより大きいことを特徴とする。
【００１４】
　本発明は、被験者における摂食疾患を治療する方法を提供するものであって、該方法は、被験者のＹ５受容体の活性を増加させるのに効果的な、Ｙ５受容体作用物質である非ペプチジル化合物をある量被験者に投与することを包含し、（ａ）ヒトＹ５受容体に対する該化合物の結合は、１２５Ｉ―ＰＹＹの存在下で測定した場合、Ｋｉが１ナノメータ未満であることを特徴とし、（ｂ）他のヒトＹ型受容体に対する化合物の結合が、１２５Ｉ―ＰＹＹの存在下で測定した場合、Ｋｉが１００ナノメータより大きい事を特徴とする。
【００１５】
　本発明は、被験者における摂食疾患を治療する方法を提供するものであって、該方法は、被験者のＹ５受容体の活性を増加させるのに効果的な、Ｙ５受容体作用物質であるペプチジル化合物をある量被験者に投与することを包含し、（ａ）ヒトＹ５受容体に対する該化合物の結合は、１２５Ｉ―ＰＹＹの存在下で測定した場合、Ｋｉが１ナノメータ未満であることを特徴とし、（ｂ）他のヒトＹ型受容体に対する化合物の結合が、１２５Ｉ―ＰＹＹの存在下で測定した場合、Ｋｉが２５ナノメータより大きい事を特徴とする。
【００１６】
　本発明は、被験者における摂食疾患を治療する方法を提供するものであって、該方法は、被験者のＹ５受容体の活性を増加させるのに効果的な、Ｙ５受容体作用物質であるペプチジル化合物をある量被験者に投与することを包含し、（ａ）ヒトＹ５受容体に対する該化合物の結合は、１２５Ｉ―ＰＹＹの存在下で測定した場合、ｋｉが０．１ナノメータ未満であることを特徴とし、（ｂ）他のヒトＹ型受容体に対する化合物の結合が、１２５Ｉ―ＰＹＹの存在下で測定した場合、Ｋｉが１ナノメータより大きい事を特徴とする。
【００１７】
　本発明は、被験者における摂食疾患を治療する方法を提供するものであって、該方法は、被験者のＹ５受容体の活性を増加させるのに効果的な、Ｙ５受容体作用物質であるペプチジル化合物をある量被験者に投与することを包含し、（ａ）ヒトＹ５受容体に対する該化合物の結合は、１２５Ｉ―ＰＹＹの存在下で測定した場合、Ｋｉが0.01ナノメータ未満であること特徴とし、（ｂ）他のヒトＹ型受容体に対する化合物の結合が、１２５Ｉ―ＰＹＹの存在下で測定した場合、Ｋｉが１ナノメータより大きい事を特徴とする。
【００１８】
本発明は、Ｙ５受容体をコードしている単離された核酸を提供する。　本発明は、またY５受容体蛋白を提供する。本発明は、上記記載の核酸からなるベクターを提供する。
【００１９】
　本発明は、ヒトＹ５受容体をコードしているＤＮＡに効果的に連結されている、哺乳類細胞中での該ＤＮＡの発現に必要な調節要素を包含し、その発現をさせる、ｐｃＥＸＶ−hY５（ＡＴＣＣ　認可番号７５９４３）と呼称されるプラスミドを提供する。　　
　本発明は、ヒトＹ５受容体をコードしているＤＮＡに操作上連結されている、哺乳類細胞中での該ＤＮＡの発現に必要な調節要素を包含し、その発現をさせる、ｐｃＥＸＶ−ｒY５（ＡＴＣＣ　認可番号７５９４４）と呼称されるプラスミドを提供する。　　
　本発明は、上記プラスミド又はベクターを包含する哺乳類細胞を提供する。
【００２０】
　本発明は、Ｙ５受容体をコードしている核酸の配列内に含まれる特異配列によって特異的にハイブリダイズすることができる、少なくとも１５ヌクレオチドの核酸からなる核酸プローブを提供する。
【００２１】
　本発明は、Ｙ５受容体をコードしているｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができ、該ｍＲＮＡの翻訳を阻止する配列を但持するアンチセンス・オリゴヌクレオチドを提供する。
【００２２】
　本発明は、Ｙ５受容体に向けられる抗体を提供する。
【００２３】
　本発明は、細胞膜を通過し該細胞内でヒトＹ５受容体をコードしているｍＲＮＡと特異的に結合させる事によって、ヒトＹ５受容体の活性を減少させるのに効果的なオリゴヌクレオチドをある量包含する薬学組成物、および細胞膜を通過することが可能な、薬学的に許容可能な担体を提供する。
【００２４】
　本発明は、ヒトＹ５受容体の活性を減らすに効果的な拮抗的阻害物質をある量包含する薬学組成物および薬学的に許容可能な担体を提供する。
【００２５】
　本発明は、ヒトＹ５受容体の活性を増加させるのに効果的な作用物質をある量包含する薬学組成物および薬学的に許容可能な担体を提供する。
【００２６】
　本発明は、該Ｙ５受容体に対するリガンドの結合を阻害するに効果的な抗体をある量包含する上記記載の薬学組成物および薬学的に許容可能な担体を提供する。
【００２７】
　本発明は、ヒトＹ５受容体をコードしているトランスジェニックな非ヒト哺乳類発現ＤＮＡを提供する。
【００２８】
　本発明は、リガンドがＹ５受容体に特異的に結合できるかどうかを決定するための方法を提供するものであって、該方法は、Ｙ５受容体をコードしているＤＮＡでトランスフェクトされ該ＤＮＡを発現する細胞を、このような受容体に対してリガンドの結合を許容するような条件下で、リガンドと接触させ、Ｙ５受容体に特異的に結合したこのようなリガンドの存在をいづれも検出し、これによって該リガンドがＹ５受容体に特異的に結合するかどうかを決定する事を包含する。
【００２９】
　本発明は、リガンドがＹ５受容体に特異的に結合できるかどうかを決定するための方法を提供する物であり、該方法は、Ｙ５受容体をコードしているＤＮＡでトランスフェクトされ該ＤＮＡを発現する細胞から細胞抽出物を調整し、該細胞抽出物から膜分画を単離し、該膜分画を、このような受容体に対するリガンドの結合を許容するような条件下で該リガンドに接触させ、Ｙ５受容体に特異的に結合したこのようなリガンドの存在を検出し、これによって該リガンドがＹ５受容体に特異的に結合するかどうかを決定する事を包含する。
【００３０】
　本発明は、リガンドがＹ５受容体作用物質であるかどうかを決定するための方法を提供するものであって、該方法は、ヒトＹ５受容体をコードしている核酸でトランスフェクトされ該核酸を発現する細胞を、該Ｙ５受容体の活性化が許容される条件下で、リガンドに接触させ、Ｙ５受容体活性の増加を検出し、これによって該リガンドがヒトＹ５受容体作用性物質であるかどうかを決定する事を包含する。
【００３１】
　本発明は、リガンドがＹ５受容体拮抗的阻害剤であるかどうかを決定するための方法を提供するものであって、Ｙ５受容体をコードしているＤＮＡでトランスフェクトされ、該ＤＮＡを発現する細胞を、PYY又はＮＰＹのような既知のＹ５受容体作用性物質存在下、該Ｙ５受容体の活性化が許容される条件下で、該リガンドと接触させ、Ｙ５受容体活性の低下を検出し、これによって該リガンドがヒトＹ５受容体拮抗的阻害物質であるかどうかを決定する事を包含する。
【００３２】
　本発明は、 Ｙ５受容体に特異的に結合する化合物を確認するために該Ｙ５受容体に結合することが知られていない複数の化合物をスクリーニングする方法を提供するものであって、該方法は、（ａ）Ｙ５受容体をコードしているＤＮＡでトランスフェクトされ、該DNAを発現する細胞を、該Ｙ５受容体に特異的に結合する事が知られる化合物と接触させ、（ｂ）ステップ（ａ）の調整物を、該Ｙ５受容体に特異的に結合する事が知られていない複数の化合物と、該Ｙ５受容体が結合すると知られている化合物の結合を許容する条件下で、接触させ、（ｃ）該複数化合物の非存在下での該化合物の結合と比較して、Ｙ５受容体に結合することが知られる化合物が、該化合物の存在下で減少するかどうかを決定し、もしそうであれば、（ｄ）複数の化合物中に含まれる各化合物のＹ５受容体に対する結合を別々に確認し、これによってヒトＹ５受容体と特異的に結合する化合物を確認する事を包含する。
【００３３】
　本発明は、Ｙ５受容体に特異的に結合する化合物を確認するために該Ｙ５受容体に結合することが知られていない複数の化合物をスクリーニングする方法を提供するものであって、該方法は、（ａ）Ｙ５受容体をコードしているＤＮＡでトランスフェクトされ、該DNAを発現する細胞から細胞抽出物を調整し、該細胞抽出物から膜分画を単離し、該膜分画を、Ｙ５受容体と特異的に結合することが知られる化合物と接触させ、（ｂ）ステップ（ａ）の調整物を、該Ｙ５受容体に特異的に結合する事が知られていない複数の化合物と、該Ｙ５受容体が結合すると知られている化合物の結合を許容する条件下で、接触させ、（ｃ）該複数化合物の非存在下での該化合物の結合と比較して、Ｙ５受容体に結合することが知られる化合物が、該化合物の存在下で減少するかどうかを決定し、もしそうであれば、（ｄ）複数の化合物中に含まれる各化合物のＹ５受容体に対する結合を別々に確認し、これによってヒトＹ５受容体と特異的に結合する化合物を確認する事を包含する。
【００３４】
　本発明は、 Ｙ５受容体を活性化する化合物を確認するために、Ｙ５受容体を活性化することが知られていない複数の化合物をスクリーニングする方法を提供するものであって、該方法は、（ａ）Ｙ５受容体でトランスフェクトされ、該Ｙ５受容体を発現する細胞とＹ５受容体と特異的に結合することが知られる複数の化合物とを、該Ｙ５受容体の活性化を許容する条件下で接触させ、（ｂ）該化合物の存在下でＹ５受容体の活性が増加するかどうかを決定し、もしそうであれば、（ｃ）Ｙ５受容体の活性化が、複数の化合物中に含まれる各化合物によって増加するかどうかを別個に決定し、これによって、該Ｙ５受容体を活性化する化合物を確認する事を包含する。
【００３５】
　本発明は、 Ｙ５受容体を活性化する化合物を確認するために、該Ｙ５受容体を活性化することが知られていない複数の化合物をスクリーニングする方法を提供するものであって、該方法は、（ａ）Ｙ５受容体をコードしているＤＮＡでトランスフェクトされ、該DNAを発現する細胞から細胞抽出物を調整し、該細胞抽出物から膜分画を単離し、該膜分画を、Ｙ５受容体と特異的に結合することが知られていない複数の化合物と、該Ｙ５受容体の活性化を許容する条件下で接触させ、（ｂ）該化合物の存在下で、Ｙ５受容体の活性が増加するかどうかを決定し、もしそうであれば、（ｃ）複数の化合物中に含まれる各化合物によって、Ｙ５受容体の活性が増加するかどうかを別々に決定し、これによってＹ５受容体を活性化する化合物を確認することを包含する。
【００３６】
　本発明は、 Ｙ５受容体を活性化を阻害する化合物を確認するために、Ｙ５受容体を活性化を阻害することが知られていない複数の化合物をスクリーニングする方法を提供するものであって、該方法は、（ａ）Ｙ５受容体でトランスフェクトされ、該Ｙ５受容体を発現する細胞と、複数の化合物とを該Ｙ５受容体作用性物質存在下、該Ｙ５受容体の活性化を許容する条件下で接触させ、（ｂ）該複数化合物の非存在下でのＹ５受容体の活性化と比較して、該複数の化合物の存在下で、Ｙ５受容体の活性化が減少するかどうかを決定し、もしそうであれば、（ｃ）複数の化合物中に含まれる各化合物のＹ５受容体の活性化阻害を別個に決定し、これによってヒトＹ５受容体の活性化を阻害する化合物を確認する事を包含する。
【００３７】
　本発明は、 Ｙ５受容体を活性化を阻害する化合物を確認するために、該Ｙ５受容体の活性化を阻害することが知られていない複数の化合物をスクリーニングする方法を提供するものであって、該方法は、（ａ）Ｙ５受容体をコードしているＤＮＡでトランスフェクトされ、該DNAを発現する細胞から細胞抽出物を調整し、該細胞抽出物から膜分画を単離し、該膜分画を、既知Ｙ５受容体作用性物質の存在下で複数の化合物と接触させ、（ｂ）該複数化合物の非存在下におけるＹ５受容体の活性化と比較して、該複数化合物の存在下で、該Ｙ５受容体の活性化が減少するかどうかを決定し、もしそうならば、（ｃ）複数の化合物中に含まれる各化合物がＹ５受容体の活性を阻害するかどうかを別々に決定し、これによってＹ５受容体の活性化を阻害する化合物を確認する事を包含する。
【００３８】
　本発明は、細胞表面のＹ５受容体に特異的に結合する薬剤を確認するために薬剤をスクリーニング方法を提供するものであって、該方法は、Ｙ５受容体をコードしているＤＮＡでトランスフェクトされ該ＤＮＡを発現する細胞を、該Ｙ５受容体に対して薬剤の結合を許容するような条件下で、複数の薬剤に接触させ、トランスフェクトされた細胞に特異的に結合するそれらの薬剤を決定し、これによってＹ５受容体に特異的に結合する薬剤を確認することを包含する。
【００３９】
　本発明は、 Ｙ５受容体の作用性物質として作用する薬剤を確認するために薬剤スクリーニングする方法を提供するものであって、該方法は、Ｙ５受容体をコードしているＤＮＡでトランスフェクトされ該ＤＮＡを発現する細胞を、機能的な該Ｙ５受容体反応を活性化させる条件下で、複数の薬剤と接触させ、該細胞中でこのような受容体を活性化する薬剤を決定し、これによって該Ｙ５受容体の作用性物質として働く薬剤を確認することを包含する。
【００４０】
　本発明は、 Ｙ５受容体の拮抗的阻害物質として作用する薬剤を確認するための薬剤スクリーニング方法を提供するものであって、該方法は、Ｙ５受容体をコードしているＤＮＡでトランスフェクトされ該ＤＮＡを発現する細胞を、PYY又はＮＰＹ等の既知Ｙ５受容体作用性物質存在下、機能的な該Ｙ５受容体反応を活性化させる条件下で、複数の薬剤と接触させ、哺乳類細胞中で該受容体の活性化を阻害する薬剤を決定し、これによって該Ｙ５受容体拮抗的阻害物質として働く薬剤を確認することを包含する。
【００４１】
　本発明は、Ｙ５受容体の阻害によって異常性を軽減する、被験者において異常性を治療する方法を提供するものであって、該方法は、Ｙ５受容体の拮抗的阻害物質を有効量被験者に投与することを包含する。
【００４２】
　本発明は、Ｙ５受容体の活性化によって異常性を軽減する、被験者において異常性を治療する方法を提供するものであって、該方法は、Ｙ５受容体の作用性物質を有効量被験者に投与することを包含する。
【００４３】
　本発明は、ヒトＹ５受容体対立遺伝子の活性に関与する疾病に対する疾病素因を診断するための方法を提供するものであって、該方法は、　ａ．該疾病に罹患した被験者のＤＮＡを得、b．制限酵素類のパネルによって、該ＤＮＡの制限消化を行い、ｃ．得られたＤＮＡ断片を、選別基準ゲル上で、電気泳動的に分離し、ｄ．得られたゲルを、ヒトＹ５受容体をコードしているＤＮＡと特異的にハイブリダイズできる核酸プローブと接触させ、検出可能なマーカーで標識し、ｅ．検出可能なマーカーで標識されたヒトＹ５受容体をコードしているＤＮＡとハイブリダイズされた標識バンドを検出し、該疾病に罹患している被験者のＤＮＡに特異的なユニークなバンドを作り、f．工程ａ−ｅによって得られる診断用のＤＮＡを調整し、g．ステップｅからの該疾病罹患患者のＤＮＡと、工程ｆからの診断用ＤＮＡに特異的なバンドパターンを比較して、該パターンが同一か異なるかを決定し、それによって、もしパターンが同一であれば、疾病の疾病素因が診断される、事を包含する。
【００４４】
　本発明は、該単離Ｙ５受容体を調整する方法を提供する。該方法は、
　ａ．Ｙ５受容体をコードしている核酸を、Ｙ５受容体をコードしている核酸に有効に連結している核酸の発現に必要な調整因子を包含する適切なベクター中に挿入し、b．得られたベクターを適切なホスト細胞に挿入し、Ｙ５受容体を産生する細胞を得、ｃ．得られた細胞によって産生される受容体を回収し、ｄ．このように回収した該受容体を精製する、事を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
　この巣津眼の全体を通して、特定のヌクレオチド塩基を示すために、下記の標準的な略記号を用いた。
【００４６】
　　　　　　　　　Ｃ＝シトシン、　　　　　Ａ＝アデニン
　　　　　　　　　Ｔ＝チミン、　　　　　　Ｇ＝グアニン
　更に、「拮抗剤」の用語は、この出願の全体を通して、本発明の受容体の何れかの活性を増大する何れかのペプチドまたは非ペプチジル化合物を示すために用いられる。
【００４７】
　Ｙ５受容体のようなＧタンパク結合受容体の活性は、問題の受容体の活性化によって、何らかのセカンドメッセンジャー系のレベルに観察され得る変化が生じるような種々の適切な機能試験の何れかを用いて測定すればよい。このようなセカンドメッセンジャー系には、アデニル酸サイクラーゼ、カルシウム可動化、イノシトールリン脂質加水分解またはグアニリルサイクラーゼが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
　本発明は、患者の摂食挙動を改善する方法であって、患者に対して、患者による食物の消費を増大または減少させ、それによって患者の摂食挙動を改善するのに有効な量の、Ｙ５受容体の作動剤または拮抗剤である化合物を投与することを具備した方法を提供する。一つの態様において、この化合物はＹ５受容体の拮抗剤であり、その量は、患者による食物の消費を減少させるのに有効な量である。もう一つの態様において、該化合物は食物と組み合わせて投与される。更なる態様において、この化合物はＹ５受容体の作動剤であり、その量は、患者による食物の消費を増大させるのに有効な量である。他の態様において、該化合部は食物と共に投与される。患者は、脊椎動物、哺乳動物、ヒト、またはイヌの患者であり得る。
【００４９】
　本発明は、患者における摂食障害を治療する方法であって、患者に対して、患者のＹ５受容体の活性を阻害するのに有効な量の、Ｙ５受容体拮抗剤である非ペプチジル化合物を投与することを具備した方法であって、前記化合物のヒト受容体に対する結合が、１２５Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに100ナノモル未満のＫｉであることを特徴とする方法を提供する。一態様において、当該化合物は５ナノモル未満のＫｉを有する。他の態様において、当該化合物は１ナノモル未満のＫｉを有する。更なる態様において、他の何れかのヒトＹ型受容体への当該化合物の結合は、１２５Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに10ナノモルよりも大きいＫｉを有することを特徴とする。更なる態様において、ヒトＹ１、ヒトＹ２およびヒトＹ４受容体の夫々に対する当該化合物の結合は、１２５Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに10ナノモルよりも大きいＫｉを有することを特徴とする。他の態様において、他の何れかのヒトＹ型受容体に対する当該化合物の結合は、50ナノモルよりも大きいＫｉを特徴とする。他の態様において、他の何れかのヒトＹ型受容体に対する当該化合物の結合は、100ナノモルよりも大きいＫｉを特徴とする。一態様において、当該化合物はヒトＹ５受容体に対して、該化合物が他の何れかのヒトＹ型受容体に結合する親和性の１０倍よりも大きな親和性で結合する。他の態様において、当該化合物はヒトＹ５受容体に対して、該化合物がヒトＹ１、ヒトＹ２およびヒトＹ４受容体の夫々に結合する親和性の１０倍よりも大きな親和性で結合する。
【００５０】
　更なる態様において、前記摂食障害は過食症(bulimia)である。前記患者は、脊椎動物、哺乳動物、ヒトまたはイヌの患者であり得る。
【００５１】
　本発明は、患者における摂食障害を治療する方法であって、患者に対して、該患者のＹ５受容体の活性を阻害するのに有効な量の、Ｙ５受容体拮抗剤であるペプチジル化合物を投与することを具備し、ヒトＹ５受容体に対する前記化合物の結合が、１２５Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに10ナノモル未満のＫｉであることを特徴とする方法を提供する。一態様において、当該化合物は１ナノモル未満のＫｉを特徴とする。他の態様において、他の何れかのヒトＹ型受容体への当該化合物の結合は、１２５Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに10ナノモルよりも大きいＫｉによって特徴付けられる。更なる態様において、ヒトＹ１、ヒトＹ２およびヒトＹ４受容体の夫々に対する当該化合物の結合は、１２５Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに10ナノモルよりも大きいＫｉによって特徴付けられる。他の態様において、他の何れかのヒトＹ型受容体に対する当該化合物の結合は、１２５Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに50ナノモルよりも大きいＫｉによって特徴付けられる。他の態様において、他の何れかのヒトＹ型受容体に対する当該化合物の結合は、１２５Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに100ナノモルよりも大きいＫｉによって特徴付けられる。他の態様において、当該化合物はヒトＹ５受容体に対して、該化合物が他の何れかのヒトＹ型受容体に結合する親和性の１０倍よりも大きな親和性で結合する。一態様において、当該化合物はヒトＹ５受容体に対して、該化合物がヒトＹ１、ヒトＹ２およびヒトＹ４受容体の夫々に結合する親和性の１０倍よりも大きな親和性で結合する。
【００５２】
　上記方法の一態様において、摂食障害は肥満である。他の態様において、摂食障害は過食症である。前記患者は、脊椎動物、哺乳動物、ヒトまたはイヌの患者であり得る。
【００５３】
本発明は、患者における摂食障害を治療する方法であって、患者に対して、該患者のＹ５受容体の活性を増大するのに有効な量の、Ｙ５受容体作動剤である非ペプチジル化合物を投与することを具備し、（ａ）ヒトＹ５受容体に対する当該化合物の結合は、１２５Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに100ナノモル未満のＫｉによって特徴付けられ；また（ｂ）他の何れかのヒトＹ型受容体に対する当該化合物の結合は、１２５Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに1000ナノモルよりも大きいＫｉによって特徴付けられる方法を提供する。
【００５４】
　一態様において、ヒトＹ５受容体に対する当該化合物の結合は、10ナノモル未満のＫｉによって特徴付けられる。
【００５５】
本発明は、患者における摂食障害を治療する方法であって、患者に対して、該患者のＹ５受容体の活性を増大するのに有効な量の、Ｙ５受容体作動剤である非ペプチジル化合物を投与することを具備し、（ａ）ヒトＹ５受容体に対する当該化合物の結合は、１２５Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに１ナノモル未満のＫｉによって特徴付けられ；また（ｂ）他の何れかのヒトＹ型受容体に対する当該化合物の結合は、１２５Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに100ナノモルよりも大きいＫｉによって特徴付けられる方法を提供する。
【００５６】
　一態様において、当該化合物はヒトＹ５受容体に対して、該化合物が他の何れかのヒトＹ型受容体に結合する親和性の１０倍よりも大きな親和性で結合する。他の態様において、当該化合物はヒトＹ５受容体に対して、該化合物のヒトＹ１、ヒトＹ２およびヒトＹ４受容体の夫々に結合する親和性の１０倍よりも大きな親和性で結合する。
【００５７】
　上記方法の一態様において、摂食障害は食欲不振である。前記患者は、脊椎動物、哺乳動物、ヒトまたはイヌの患者であり得る。
【００５８】
本発明は、患者における摂食障害を治療する方法であって、患者に対して、該患者のＹ５受容体の活性を増大するのに有効な量の、Ｙ５受容体作動剤であるペプチジル化合物を投与することを具備し、（ａ）ヒトＹ５受容体に対する当該化合物の結合は、１２５Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに１ナノモル未満のＫｉによって特徴付けられ；また（ｂ）他の何れかのヒトＹ型受容体に対する当該化合物の結合は、１２５Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに25ナノモルよりも大きいＫｉによって特徴付けられる方法を提供する。
【００５９】
本発明は、患者における摂食障害を治療する方法であって、患者に対して、該患者のＹ５受容体の活性を増大するのに有効な量の、Ｙ５受容体作動剤であるペプチジル化合物を投与することを具備し、（ａ）ヒトＹ５受容体に対する当該化合物の結合は、１２５Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに0.1ナノモル未満のＫｉによって特徴付けられ；また（ｂ）他の何れかのヒトＹ型受容体に対する当該化合物の結合は、１２５Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに１ナノモルよりも大きいＫｉによって特徴付けられる方法を提供する。
【００６０】
　一態様において、当該作動剤の他の何れかのヒトＹ型受容体に対する結合は、10ナノモルよりも大きいＫｉによって特徴付けられる。
【００６１】
本発明は、患者における摂食障害を治療する方法であって、患者に対して、該患者のＹ５受容体の活性を増大するのに有効な量の、Ｙ５受容体作動剤であるペプチジル化合物を投与することを具備し、（ａ）ヒトＹ５受容体に対する当該化合物の結合は、１２５Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときには0.01ナノモル未満のＫｉによって特徴付けられ；また（ｂ）他の何れかのヒトＹ型受容体に対する当該化合物の結合は、１２５Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに１ナノモルよりも大きいＫｉによって特徴付けられる方法を提供する。
【００６２】
　一態様において、当該化合物はヒトＹ５受容体に対して、該化合物が他の何れかのヒトＹ型受容体に結合する親和性の１０倍よりも大きな親和性で結合する。他の態様において、当該化合物はヒトＹ５受容体に対して、該化合物のヒトＹ１、ヒトＹ２およびヒトＹ４受容体の夫々に結合する親和性の１０倍よりも大きな親和性で結合する。
【００６３】
　一態様において、前記摂食障害は食欲不振である。前記患者は、脊椎動物、哺乳動物、ヒトまたはイヌの患者であり得る。
【００６４】
　本発明は、患者の摂食挙動を改善するための薬学的組成物、医薬または薬物を製造するための、ここに開示する化合物の使用を提供する。
【００６５】
　本発明は、Ｙ５受容体の拮抗阻害が有用であるような摂食障害、特に、肥満または過食症を治療するための薬学的組成物、医薬または薬物を製造するための、ここに開示する化合物の使用を提供する。
【００６６】
　本発明は、Ｙ５受容体の拮抗阻害が有用であるような疾患、特に、食欲不振のような摂食障害を治療するための薬学的組成物、医薬または薬物を製造するための、ここに開示する化合物の使用を提供する。
【００６７】
　本発明は、Ｙ５受容体をコードする単離された核酸配列を提供する。一態様において、このＹ５受容体は脊椎動物または哺乳動物のＹ５受容体である。一つの態様において、前記単離された核酸は、膜貫通領域におけるアミノ酸配列によって特徴付けられる受容体をコードし、このアミノ酸配列は図６に示すヒトＹ５受容体の膜貫通領域におけるアミノ酸配列に対して60％以上の相同性を有する。他の態様において、当該Ｙ５受容体は図４に記載したアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有する。
【００６８】
　本発明は、前記核酸がＤＮＡであるような上記の単離された核酸を提供する。一態様において、前記ＤＮＡはｃＤＮＡである。更に別の実施例において、前記核酸はＲＮＡである。別の実施例において、前記核酸はヒトＹ５受容体をコードする。一態様において、このヒトＹ５受容体は、図６に記載したアミノ酸配列を有する。
【００６９】
　本発明は更に、図３，５および１４に示したＤＮＡの何れかと縮重したＤＮＡを提供し、このＤＮＡは、夫々図４，６および１５に示すアミノ酸配列を有するＹ５受容体をコードする。
【００７０】
　本発明はまた、Ｙ５受容体のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列をコードするＤＮＡおよびｃＤＮＡを包含するが、これらは発現型の変化を生じてはならない。或いは、本発明はまた、本発明のＤＮＡおよびｃＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡおよびｃＤＮＡをも包含する。ハイブリダイゼーションの方法は、当業者に周知である。
【００７１】
　本発明のＤＮＡ分子はまた、１以上のアミノ酸残基の種類または位置において天然に存在する形とは異なり且つ天然に存在する型の特性の幾つか又は全部を共有する、抗原性ポリペプチドのポリペプチド類縁体、フラグメントまたは誘導体（当該タンパクについて特定された残基の全部よりも少ない残基を含有する欠失類縁体、１以上の特定された残基が他の残基で沖かえっれた置換類縁体、および当該ポリペプチドの末端および中間部分に１以上のアミノ酸残基が不可された不可類縁体）をコードするＤＮＡをも包含する。これらの核酸には、選択された非哺乳動物宿主による発現にとって「好ましい」コドンの組み込み；制限エンドヌクレアーゼ酵素による開裂部位の提供；および、追加の開始ＤＮＡ配列、末端ＤＮＡ配列または中間ＤＮＡ配列の提供が含まれる。
【００７２】
　ここに記載され、また請求の範囲に記載された核酸は、当該ポリペプチドのアミノ酸配列に関してそれらが提供する情報の故に有用であり、また種々の組み替え技術によるポリペプチドの大規模な合成のための物として有用である。当該核酸は、新たなクローニングベクターおよび発現ベクター、形質転換およびトランスフェクトされた原核および真核宿主細胞を作製するために有用であり、また、このようなポリペプチドおよび関連生成物を発現できる宿主細胞を培養増殖するための新しく且つ有用な方法として有用である。
【００７３】
　別の態様において、当該核酸はラットＹ５受容体をコードする。他の態様において、ラットＹ５受容体は、図４に示したアミノ酸配列を有している。他の態様において、当該核酸はイヌＹ５受容体をコードする。更なる態様において、イヌＹ５受容体は図１５に示したアミノ酸配列を有する。
【００７４】
　本発明はまた、単離されたＹ５受容体タンパクを提供する。別の態様において、Ｙ５タンパクはヒト、ラットまたはイヌのタンパクであり得る。
【００７５】
　本発明は、上記の核酸を含むベクターを提供する。
【００７６】
　また、上記の単離された核酸を含むベクター類が提供される。適切なベクター類にはプラスミド又はウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。こられベクターは、Ｙ５受容体の生物学的仮性を有するポリペプチドの製造のための宿主ベクター系を形成するために、適切な宿主細胞に形質転換され得る。
【００７７】
　本発明は、バクテリア細胞内での発現に適用される上記ベクターであって、更に、バクテリア細胞内での当該核酸の発現のために必要な、Ｙ５受容体をコードする前記核酸に機能的にリンクしてこれを発現させる調節要素をも含んだベクターを提供する。
【００７８】
　本発明は、酵母細胞内での発現に適用される上記ベクターであって、更に、酵母細胞内での当該核酸の発現のために必要な、Ｙ５受容体をコードする前記核酸に機能的にリンクしてこれを発現させる調節要素をも含んだベクターを提供する。
【００７９】
　本発明は、昆虫細胞内での発現に適用される上記ベクターであって、昆虫細胞内での当該核酸の発現のために必要な、Ｙ５受容体をコードする前記核酸に機能的にリンクしてこれを発現させる調節要素をも含んだベクターを提供する。
【００８０】
　一態様において、当該ベクターは哺乳類細胞内での発現に適用されるものであり、哺乳類細胞内での当該ＤＮＡの発現のために必要な、哺乳類Ｙ５受容体をコードする前記ＤＮＡに機能的にリンクしてこれを発現させる調節要素を含んでいる。
【００８１】
　更なる態様において、当該ベクターは哺乳類細胞内での発現に適用されるものであり、哺乳類細胞内での当該ＤＮＡの発現のために必要な、ヒトＹ５受容体をコードする前記ＤＮＡに機能的にリンクしてこれを発現させる調節要素を含んでいる。
【００８２】
　更なる態様において、当該ベクターは哺乳類細胞内での発現に適用されるものであり、哺乳類細胞内での当該ＤＮＡの発現のために必要な、ラットＹ５受容体をコードする前記ＤＮＡに機能的にリンクしてこれを発現させる調節要素を含んでいる。
【００８３】
　本発明は、哺乳類細胞内での発現に適用される上記プラスミドであって、哺乳類細胞内でのＤＮＡの発現のために必要な、哺乳類Ｙ５受容体をコードする前記ＤＮＡに機能的にリンクしてこれを発現させる調節要素を含んだベクターを提供する。
【００８４】
　本発明は、哺乳類細胞内でのＤＮＡの発現のために必要な、ヒトＹ５受容体をコードする前記ＤＮＡに機能的にリンクしてこれを発現させる調節要素を含んだ、ｐｃＥＸＶ−ｈＹ５と命名されたベクターを提供する（ＡＴＣＣ受付番号第75943号）。
【００８５】
　このプラスミド（ｐｃＥＸＶ−ｈＹ５）は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に従って、１９９４年１１月４日に、アメリカ合衆国メリーランド州ロックビルパークローンドライブ12301（郵便番号20852）のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ受付番号第75943号が付与された。
【００８６】
　本発明は、哺乳類細胞内でのＤＮＡの発現のために必要な、ラットＹ５受容体をコードする前記ＤＮＡに機能的にリンクしてこれを発現させる調節要素を含んだ、ｐｃＥＸＶ−ｒＹ５と命名されたベクターを提供する（ＡＴＣＣ受付番号第75944号）。
【００８７】
このプラスミド（ｐｃＥＸＶ−ｈＹ５）は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に従って、１９９４年１１月４日に、アメリカ合衆国メリーランド州ロックビルパークローンドライブ12301（郵便番号20852）のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ受付番号第ＣＲＬ75944号が付与された。本発明は、Ｙ５−ｂｄ−５と命名されたプラスミド（ＡＴＣＣ受付番号第　　　　　　　号）を提供する。本発明はまた、Ｙ５−ｂｄ−８と命名されたプラスミド（ＡＴＣＣ受付番号第　　　　　　　号）を提供する。これらのプラスミドは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に従って、１９９５年１２月１日に、アメリカ合衆国メリーランド州ロックビルパークローンドライブ12301（郵便番号20852）のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、夫々、ＡＴＣＣ受付番号第　　　　　　　号および
第　　　　　　　号が付与された。
【００８８】
　本発明は、ｈＹ５−ＢＢ３と命名されたバキュウロウイルス（ＡＴＣＣ受付番号第　　　　　　　号）を提供する。このバキュウロウイルスは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に従って、１９９５年１１月１５日に、アメリカ合衆国メリーランド州ロックビルパークローンドライブ12301（郵便番号20852）のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ受付番号第　　　　　　　号が付与された。
【００８９】
　本発明は、上記プラスミドまたはベクターを含む哺乳類細胞を提供する。一態様において、この哺乳類細胞はＣＯＳ−７細胞である。
【００９０】
　他の態様において、該哺乳類細胞は２９３−ｒＹ５−１４と命名された２９３ヒト胎児腎臓細胞（ＡＴＣＣ受付番号ＣＲＬ11757号）である。
【００９１】
　この細胞（２９３−ｒＹ５−１４）は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に従って、１９９４年１１月４日に、アメリカ合衆国メリーランド州ロックビルパークローンドライブ12301（郵便番号20852）のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ受付番号ＣＲＬ11757号が付与された。
【００９２】
　更なる態様において、当該哺乳類細胞は、 Ｌ−ｈＹ５−７と命名された、プラスミドｐｃＥＸＶ−ｈＹ５を含むマウス繊維芽（ｔｋ−）細胞（ＡＴＣＣ受付番号ＣＲＬ−11995）である。他の態様において、当該哺乳類細胞は、Ｎ−ｈＹ５−８と命名された、プラスミドｐｃＥＸＶ−ｈＹ５を含むマウス胎児ＮＩＨ−３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ受付番号ＣＲＬ−11994）である。これらの細胞は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に従って、１９９５年１１月１５日に、アメリカ合衆国メリーランド州ロックビルパークローンドライブ12301（郵便番号20852）のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、夫々ＡＴＣＣ受付番号ＣＲＬ-11995号およびＣＲＬ-11994号が付与された。
【００９３】
　本発明は、Ｙ５受容体をコードする核酸の配列内に含まれるユニークな配列と特異的にハイブリダイズできる少なくとも１５ヌクレオチドの核酸を含んだ核酸プローブを提供する。一態様において、該核酸はＤＮＡである。
【００９４】
この製造された核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡの何れかである。ここで用いられる「特異的にハイブリダイズする」の語は、それ自身の配列に対して相補的な核酸配列を認識して、相補的な塩基対間の水素結合を介して二重螺旋セグメントを形成する能力を意味する。
【００９５】
　ヒトＹ５受容体をコードする核酸の配列と特異的にハイブリダイズできる少なくとも１５ヌクレオチドの核酸は、プローブとして用いることができる。核酸プローブ技術は当業者に周知であり、かかる当業者は、このようなプローブはその長さが非常に大きく変化する可能性があり、また該プローブの検出を容易にするために、放射性アイソトープまたは蛍光色素のような検出可能なラベルで標識され得ることを容易に理解するであろう。ＤＮＡプローブは、当該技術で周知の方法を用いて、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをプラスミド又はバクテリオファージのような適切なベクターに挿入し、続いてこれを適切なバクテリア宿主細胞に形質転換し、形質転換されたバクテリア宿主細胞中で複製し、ＤＮＡプローブを回収することによって製造すればよい。或いは、プローブはＤＮＡ剛性によって化学的に作製すればよい。
【００９６】
　ＲＮＡプローブは、Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６のようなバクテリオファージの下流に、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡを挿入することによって作製すればよい。大量のＲＮＡプローブは、ラベルされたヌクレオチドを、上流プロモータを含む線形化したフラグメントと共に、適切なＲＮＡポリメラーゼの存在下でインキュベートすることによって製造すればよい。
【００９７】
　本発明はまた、Ｙ５受容体をコードする哺乳類核酸に対して相補的な核酸配列と特異的にハイブリダイズすることができる、少なくとも15ヌクレオチドの核酸を提供する。この核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡの何れであってもよい。
【００９８】
　本発明は、Ｙ５受容体をコードするｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズして、該ｍＲＮＡの翻訳を阻止することができる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００９９】
　本発明は、Ｙ５受容体のゲノムＤＮＡに対して特異的にハイブリダイズできる配列をもったアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１００】
　本発明は、ヌクレオチドの化学的類縁体を含む、Ｙ５受容体のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１０１】
本発明は、Ｙ５受容体に向けられた抗体を提供する。また、本発明はヒトＹ５受容体に向けられた抗体を提供する。
【０１０２】
　本発明は、Ｙ５受容体を発現する細胞の表面に存在するヒトＹ５受容体のエピトープに向けられたモノクローナル抗体に関する。
【０１０３】
　本発明は、細胞膜を通過して細胞内のヒトＹ５受容体をコードするｍＲＮＡと特異的に結合し、その翻訳を阻止することによってヒトＹ５受容体の活性を低下させるのに有効な量のオリゴヌクレオチドと、細胞膜を通過できる薬学的に許容可能なキャリアとを含有する薬学的組成物を提供する。一態様において、このオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡを不活性化する物質に結合される。他の態様において、ｍＲＮＡを不活性化する物質はリボザイムである。
【０１０４】
　本発明は、上記の薬学的組成物であって、細胞膜を通過できる前記薬学的に許容され得るキャリアは選択された細胞タイプに特異的な受容体に結合し、これにより該選択された細胞タイプに取り込まれる構造を具備した薬学的組成物を提供する。
【０１０５】
　本発明は、ヒトＹ５受容体の活性を低減するのに有効な量の拮抗剤と、薬学的に許容可能なキャリアとを含有する薬学的組成物を提供する。
【０１０６】
　本発明は、Ｙ５受容体活性を増大するのに有効な量の作動剤と、薬学的に許容可能なキャリアとを含有する薬学的組成物を提供する。
【０１０７】
　本発明は、上記の薬学的組成物であって、Ｙ５受容体へのリガンドの結合を阻止するのに有効な量の抗体と、薬学的に許容可能なキャリアとを含有する組成物を提供する。
【０１０８】
　ここで用いる「薬学的に許容可能なキャリア」とは、何れかの標準的な薬学的に許容され得るキャリアを意味する。その例には、リン酸緩衝食塩水、生理的食塩水、水、および油／水エマルジョンのようなエマルジョンが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１０９】
　本発明は、ヒトＹ５受容体をコードするＤＮＡを発現する非ヒト遺伝子導入哺乳動物を提供する。
【０１１０】
本発明は、相同的組換えによる本来のＹ５受容体のノックアウトを含む、非ヒト遺伝子導入哺乳動物を提供する。
【０１１１】
　本発明は、非ヒト遺伝子導入哺乳動物であって、そのゲノムが、Ｙ５受容体をコードするｍＲＮＡに対して相補的で且つＹ５受容体をコードするｍＲＮＡとハイブリダイズしてその翻訳を低減するようなアンチセンスｍＲＮＡ中に転写されるように配置された、ヒトＹ５受容体をコードするＤＮＡに対して相補的なアンチセンスＤＮＡを含む非ヒト遺伝子導入哺乳動物を提供する。
【０１１２】
　本発明は、上記の非ヒト遺伝子導入哺乳動物であって、ヒトＹ５受容体をコードする前記ＤＮＡが更に誘導性プロモータを具備する非ヒト遺伝子導入哺乳動物を提供する。
【０１１３】
　本発明は、非ヒト遺伝子導入哺乳動物であって、ヒトＹ５受容体をコードする前記ＤＮＡが、更に組織特異的な調節要素を具備する非ヒト遺伝子導入哺乳動物を提供する。
【０１１４】
　一態様において、前記非ヒト遺伝子導入哺乳動物はマウスである。
【０１１５】
　Ｙ５受容体の生理学的および行動上の役割を解明する動物モデル系は、種々の技術によりＹ５受容体の活性が増大または減少され、或いは発現されたＹ５受容体のアミノ酸配列が変わるような、遺伝子導入動物を創出することによって製造される。これらの技術の例には、１）遺伝子導入動物を製造するために、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡの正常または変異種を、マイクロ注入、電気穿孔、レトロウイルストランスフェクションまたは当業者に周知の他の手段によって適切な受精胚の中に導入すること；および２）これら遺伝子の変異体または正常なヒトまたは動物種の、遺伝子導入動物の本来の遺伝子座との相同組換えにより、これらＹ５受容体配列の発現の調節または構造を変化させることが含まれるが、これに限定されるものではない。相同組換えの技術は当業者に周知である。この技術は、本来の遺伝子を挿入された遺伝子で置き換えるものであり、従って、本来のＹ５受容体は発現できないが、例えば、組換えによって動物ゲノムの本来の受容体を置換することにより挿入された突然変異Ｙ５受容体を発現させ、これによりそのトランスポータの過小発現をもたらす動物を製造するために有用である。マイクロ注入はゲノムに遺伝子を追加するが、これを取り除かないから、それ自身のものおよび追加されたＹ５受容体を発現死、Ｙ５受容体の過剰発現をもたらすような動物を製造するために有用である。
【０１１６】
　例えばマウスを用いて、遺伝子導入動物を製造するために利用できる一つの手段は次の通りである。即ち、雌のマウスを交配させ、得られた受精卵を輸卵管から切除する。この卵を、Ｍ２培地のような適切な培地中に保存する。導入遺伝子の発現を調節するための実験的手段を与えるために、誘導性プロモータをＤＮＡのコード化領域に融合させる。その代わりに或いはこれに加えて、組織特異的な調節要素をコード化領域に融合して、導入遺伝子を組織特異的に発現させてもよい。このＤＮＡを、適切な緩衝溶液中でマイクロ注入針（ピペット引き機を使用して毛細管から作製すればよい）の中に採取し、注入されるべき卵を凹部スライドの中に置く。この針を上記卵の前核中に挿入し、ＤＮＡ溶液を注入する。次いで、こうして注入された卵は擬妊娠マウス（適切なホルモンによる刺激で妊娠を維持するが実際には妊娠していないマウス）の卵管の中に移され、そこでは子宮に進み、着床し、分娩日まで発生を続ける。上記のように、マイクロ注入は卵細胞中にＤＮＡを挿入する唯一の方法ではなく、ここでは単に例示のみの目的で用いられている。
【０１１７】
　本発明はまた、或るリガンドがＹ５受容体に特異的に結合できるかどうかを決定するための方法であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされてこれを発現している細胞と前記リガンドとを、このような受容体に対してリガンド類を結合させる条件下において接触させることと、前記Ｙ５受容体に特異的に結合した何等かのリガンドの存在を検出することと、これによって前記リガンドが前記Ｙ５受容体に対して特異的に結合するかどうかを決定することとを具備した方法を提供する。
【０１１８】
　本発明は、或るリガンドがヒトＹ５受容体に特異的に結合できるかどうかを決定するための方法であって、ヒトＹ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされてこれを発現している細胞と前記リガンドとを、このような受容体に対してリガンド類を結合させる条件下において接触させることと、前記Ｙ５受容体に特異的に結合した何等かのリガンドの存在を検出することと、これによって前記リガンドが前記Ｙ５受容体に対して特異的に結合するかどうかを決定することとを具備した方法を提供する。
【０１１９】
　本発明は、或るリガンドがＹ５受容体に特異的に結合できるかどうかを決定するための方法であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされてこれを発現している細胞と前記リガンドとを、このような受容体に対してリガンド類を結合させる条件下において接触させることと、前記Ｙ５受容体に特異的に結合した何等かのリガンドの存在を検出することと、これによって前記リガンドが前記Ｙ５受容体に対して特異的に結合するかどうかを決定することとを具備し、このようなＹ５受容体は図６に示したアミノ酸配列と実質的に同じ配列を有する方法を提供する。
【０１２０】
　本発明は、或るリガンドがＹ５受容体に特異的に結合できるかどうかを決定するための方法であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされてこれを発現している細胞と前記リガンドとを、このような受容体に対してリガンド類を結合させる条件下において接触させることと、前記Ｙ５受容体に特異的に結合した何等かのリガンドの存在を検出することと、これによって前記リガンドが前記Ｙ５受容体に対して特異的に結合するかどうかを決定することとを具備し、このようなＹ５受容体は、図６に示したＹ５受容体の膜貫通領域のアミノ酸配列に対して60％以上の相同性をもった、膜貫通領域のアミノ酸配列によって特徴付けられる方法を提供する。
【０１２１】
本発明は、或るリガンドがＹ５受容体に特異的に結合できるかどうかを決定するための方法であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされてこれを発現している細胞から細胞抽出物を調製することと、該細胞抽出物から膜フラクションを単離することと、該膜フラクションと前記リガンドとを、このような受容体に対してリガンド類を結合させる条件下において接触させることと、前記Ｙ５受容体に特異的に結合した何等かのリガンドの存在を検出することと、これによって前記リガンドが前記Ｙ５受容体に対して特異的に結合するかどうかを決定することとを具備した方法を提供する。
【０１２２】
　上記方法の別の態様において、前記Ｙ５受容体は、ヒトＹ５受容体、ラットＹ５受容体、またはイヌＹ５受容体であり得る。
【０１２３】
本発明は、或るリガンドがＹ５受容体に特異的に結合できるかどうかを決定するための方法であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされてこれを発現している細胞細から胞抽出物を調製することと、該細胞抽出物から膜フラクションを単離することと、該膜フラクションと前記リガンドとを、ヒトＹ５受容体に対してリガンド類を結合させる条件下において接触させることと、前記Ｙ５受容体に特異的に結合した何等かのリガンドの存在を検出することと、これによって前記リガンドが前記Ｙ５受容体に対して特異的に結合するかどうかを決定することとを具備した方法を提供する。
【０１２４】
本発明は、或るリガンドがＹ５受容体に特異的に結合できるかどうかを決定するための方法であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされてこれを発現している細胞から細胞抽出物を調整することと、該細胞抽出物から膜フラクションを単離することと、該膜フラクションと前記リガンドとを、前記Ｙ５受容体に対してリガンド類を結合させる条件下において接触させることと、前記Ｙ５受容体に特異的に結合した何等かのリガンドの存在を検出することと、これによって前記リガンドが前記Ｙ５受容体に対して特異的に結合するかどうかを決定することとを具備し、このようなＹ５受容体は、図６に示したのと実質的に同じアミノ酸配列を有する方法を提供する。
【０１２５】
本発明は、或るリガンドがＹ５受容体に特異的に結合できるかどうかを決定するための方法であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされてこれを発現している細胞から細胞抽出物を調整することと、該細胞抽出物から膜フラクションを単離することと、該膜フラクションと前記リガンドとを、前記Ｙ５受容体に対してリガンド類を結合させる条件下において接触させることと、前記Ｙ５受容体に特異的に結合した何等かのリガンドの存在を検出することと、これによって前記リガンドが前記Ｙ５受容体に対して特異的に結合するかどうかを決定することとを具備し、このようなＹ５受容体は、図６に示したＹ５受容体の膜貫通領域のアミノ酸配列に対して60％以上の相同性をもった、膜貫通領域のアミノ酸配列によって特徴付けられる方法を提供する。
【０１２６】
　上記方法の別の態様において、前記Ｙ５受容体はヒトＹ５受容体、ラットＹ５受容体、またはイヌＹ５受容体であり得る。上記方法の一態様において、前記リガンドは予め知られているものである。
【０１２７】
　本発明は更に、上記方法の何れか一つによって同定されたリガンドを提供する。
【０１２８】
本発明は、或るリガンドがＹ５受容体の作動剤であるかどうかを決定する方法であって、Ｙ５受容体をコードする核酸をトランスフェクトされてこれを発現している細胞と前記リガンドとを、機能的なＹ５受容体応答を活性化させる条件下で接触させることと、Ｙ５受容体活性における機能増大を検出することと、これによって前記リガンドがＹ５受容体作動剤であるかどうかを決定することとを具備した方法を提供する。
【０１２９】
本発明は、或るリガンドがＹ５受容体の作動剤であるかどうかを決定する方法であって、ヒトＹ５受容体をコードする核酸をトランスフェクトされてこれを発現している細胞と前記リガンドとを、前記Ｙ５受容体を活性化させる条件下で接触させることと、Ｙ５受容体活性における増大を検出することと、これによって前記リガンドがヒトＹ５受容体作動剤であるかどうかを決定することとを具備した方法を提供する。
【０１３０】
本発明は、或るリガンドがＹ５受容体の作動剤であるかどうかを決定する方法であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされてこれを発現している細胞から細胞抽出物を調製することと、該細胞抽出物から膜フラクションを単離することと、該膜フラクションと前記リガンドとを、前記Ｙ５受容体を活性化させる条件下で接触させることと、Ｙ５受容体活性における増大を検出することと、これによって前記リガンドがＹ５受容体作動剤であるかどうかを決定することとを具備した方法を提供する。
【０１３１】
本発明は、或るリガンドがＹ５受容体の拮抗剤であるかどうかを決定する方法であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされてこれを発現している細胞と前記リガンドとを、ＰＹＹまたはＮＰＹのような公知のＹ５受容体作動剤の存在下において、機能的なＹ５受容体応答を活性化させる条件下で接触させることと、Ｙ５受容体活性における低下を検出することと、これによって前記リガンドがＹ５受容体拮抗剤であるかどうかを決定することとを具備した方法を提供する。
【０１３２】
本発明は、或るリガンドがＹ５受容体の拮抗剤であるかどうかを決定する方法であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされてこれを発現している細胞と前記リガンドとを、ＰＹＹまたはＮＰＹのような公知のＹ５受容体作動剤の存在下において、Ｙ５受容体を活性化させる条件下で接触させることと、Ｙ５受容体活性における低下を検出することと、これによって前記リガンドがＹ５受容体拮抗剤であるかどうかを決定することとを具備した方法を提供する。
【０１３３】
本発明は、或るリガンドがＹ５受容体の拮抗剤であるかどうかを決定する方法であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされてこれを発現している細胞から細胞抽出物を調製することと、該細胞抽出物から膜フラクションを単離することと、該膜フラクションとと前記リガンドとを、ＰＹＹまたはＮＰＹのような公知のＹ５受容体作動剤の存在下において、Ｙ５受容体を活性化させる条件下で接触させることと、Ｙ５受容体活性における低下を検出することと、これによって前記リガンドがＹ５受容体拮抗剤であるかどうかを決定することとを具備した方法を提供する。
【０１３４】
　上記方法の別の態様において、前記Ｙ５受容体はヒトＹ５受容体、ラットＹ５受容体またはイヌＹ５受容体である。
【０１３５】
　上記方法の一態様において、前記細胞は非神経起源である。更なる態様において、この非神経細胞はＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胎児腎細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、またはＬＭ（ｔｋ−）細胞である。
【０１３６】
　上記方法の一つの態様において、前記リガンドは予め既知ではない。
【０１３７】
本発明は、上記方法によって検出されるＹ５受容体作動剤を提供する。本発明は、上記方法によって検出されるＹ５受容体拮抗剤を提供する。
【０１３８】
本発明は、 Ｙ５受容体に特異的に結合する化合物を同定するために、該Ｙ５受容体に結合することが知られていない複数の化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ） Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされ且つ該DNAを発現している細胞を、該Ｙ５受容体に特異的に結合することが知られる化合物と接触させる工程と；　（ｂ） 工程（ａ）の調製物と該Ｙ５受容体に特異的に結合する事が知られていない複数の化合物とを、該Ｙ５受容体に結合することが知られている化合物の結合を許容する条件下で接触させる工程と；　（ｃ） Ｙ５受容体に結合することが知られる化合物の結合が、前記複数の化合物の非存在下での当該化合物の結合と比較して、 前記複数の化合物の存在下において減少するかどうかを決定する工程と；　もしそうであれば、（ｄ） 前記複数の化合物中に含まれる夫々の化合物のＹ５受容体に対する結合を別々に測定し、これによってヒトＹ５受容体と特異的に結合する化合物を同定する工程とを具備する方法を提供する。
【０１３９】
本発明は、 Ｙ５受容体に特異的に結合する化合物を同定するために、該Ｙ５受容体に結合することが知られていない複数の化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ） Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされ且つ該DNAを発現している細胞から細胞抽出物を調製し、該細胞抽出物から膜フラクションを単離し、該膜フラクションを前記Ｙ５受容体に特異的に結合することが知られる化合物と接触させる工程と；　（ｂ） 工程（ａ）の調製物と該Ｙ５受容体に特異的に結合することが知られていない複数の化合物とを、該Ｙ５受容体に結合することが知られている化合物の結合を許容する条件下で接触させる工程と；　（ｃ） Ｙ５受容体に結合することが知られる化合物の結合が、前記複数の化合物の非存在下での当該化合物の結合と比較して、前記複数の化合物の存在下において減少するかどうかを決定する工程と；　もしそうであれば、（ｄ） 前記複数の化合物中に含まれる夫々の化合物のＹ５受容体に対する結合を別々に測定し、これによってヒトＹ５受容体と特異的に結合する化合物を同定する工程とを具備する方法を提供する。
【０１４０】
本発明は、 Ｙ５受容体を活性化することが知られていない複数の化学的化合物をスクリーニングして、前記Ｙ５受容体を活性化する化合物を同定する方法であって、（ａ） Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされ且つ該DNAを発現している細胞を、Ｙ５受容体を活性化させる条件下で、該Ｙ５受容体に特異的に結合することが知られていない複数の化合物と接触させる工程と；　（ｂ） 前記化合物の存在下で、前記Ｙ５受容体の活性が増大するかどうかを決定する工程と； もしそうであれば、(c) 前記複数の化合物中に含まれる夫々の化合物によって前記Ｙ５受容体の活性が増大するかどうかを別々に決定し、これによってヒトＹ５受容体を活性化する化合物を同定する工程とを具備する方法を提供する。
【０１４１】
本発明は、 Ｙ５受容体を活性化することが知られていない複数の化学的化合物をスクリーニングして、前記Ｙ５受容体を活性化する化合物を同定する方法であって、（ａ） Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされ且つ該DNAを発現している細胞から細胞抽出物調製し、該細胞抽出物から膜フラクションを単離し、該膜フラクションを、Ｙ５受容体を活性化させる条件下で、該Ｙ５受容体に特異的に結合することが知られていない複数の化合物と接触させる工程と；　（ｂ） 前記化合物の存在下で、前記Ｙ５受容体の活性が増大するかどうかを決定する工程と； もしそうであれば、(c) 前記複数の化合物中に含まれる夫々の化合物によって前記Ｙ５受容体の活性が増大するかどうかを別々に決定し、これによってヒトＹ５受容体を活性化する化合物を同定する工程とを具備する方法を提供する。
【０１４２】
本発明は、 Ｙ５受容体の活性化を阻害することが知られていない複数の化学的化合物をスクリーニングして、前記Ｙ５受容体の活性化を阻害する化合物を同定する方法であって、（ａ） Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされ且つ該DNAを発現している細胞を、公知のＹ５受容体拮抗剤の存在下において、Ｙ５受容体を活性化させる条件下で、前記複数の化合物に接触させる工程と；　（ｂ） 前記Ｙ５受容体の活性化が、前記複数の化合物の非存在下でのＹ５受容体の活性化に比較して、前記複数の化合物の存在下において減少するかどうかを決定する工程と； もしそうであれば、(c) 前記複数の化合物中に含まれる夫々の化合物について、前記Ｙ５受容体の活性化の阻害を別々に決定し、これによってヒトＹ５受容体の活性化を阻害する化合物を同定する工程とを具備する方法を提供する。
【０１４３】
本発明は、 Ｙ５受容体の活性化を阻害することが知られていない複数の化学的化合物をスクリーニングして、前記Ｙ５受容体の活性化を阻害する化合物を同定する方法であって、（ａ） Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされ且つ該DNAを発現している細胞から細胞抽出物を調製し、該細胞抽出物から膜フラクションを単離し、該膜フラクションを、公知のＹ５受容体拮抗剤の存在下において、Ｙ５受容体を活性化させる条件下で、前記複数の化合物に接触させる工程と；　（ｂ） 前記Ｙ５受容体の活性化が、前記複数の化合物の非存在下でのＹ５受容体の活性化に比較して、前記複数の化合物の存在下において減少するかどうかを決定する工程と； もしそうであれば、(c) 前記複数の化合物中に含まれる夫々の化合物について、前記Ｙ５受容体の活性化の阻害を別々に決定し、これによってヒトＹ５受容体の活性化を阻害する化合物を同定する工程とを具備する方法を提供する。
【０１４４】
　上記方法の別の態様において、前記Ｙ５受容体は、ヒトＹ５受容体、ラットＹ５受容体、またはイヌＹ５受容体である。一態様において、前記細胞は哺乳類細胞である。更なる態様において、前記細胞は非神経起源である。更なる態様において、前記細胞は、ＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胎児腎細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞、またはＮＩＨ−３Ｔ３細胞である。
【０１４５】
本発明は、薬物をスクリーニングして、細胞表面のＹ５受容体に対して特異的に結合する薬物を同定する方法であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされ且つこれを発現している細胞と複数の薬物とを、薬物を前記Ｙ５受容体に結合させる条件下で接触させることと、前記トランスフェクトされた細胞に特異的に結合した薬剤を決定し、これによって前記Ｙ５受容体に対して特異的に結合する薬物を同定することとを具備した方法を提供する。
【０１４６】
本発明は、薬物をスクリーニングして、細胞表面のヒトＹ５受容体に対して特異的に結合する薬物を同定する方法であって、ヒトＹ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされ且つこれを発現している細胞と複数の薬物とを、薬物が前記ヒトＹ５受容体に結合される条件下で接触させることと、前記トランスフェクトされた細胞に特異的に結合した薬剤を決定し、これによって前記ヒトＹ５受容体に対して特異的に結合する薬物を同定することとを具備した方法を提供する。
【０１４７】
本発明は、薬物をスクリーニングして、Ｙ５受容体の作動剤として作用する薬物を同定する方法であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされ且つこれを発現している細胞と複数の薬物とを、機能的Ｙ５受容体応答を活性化させる条件下で接触させることと、細胞におけるこのような受容体を活性化する薬物を決定し、これによってＹ５受容体の作動剤として作用する薬物を同定することとを具備した方法を提供する。
【０１４８】
本発明は、薬物をスクリーニングして、ヒトＹ５受容体の作動剤として作用する薬物を同定する方法であって、ヒトＹ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされ且つこれを発現している細胞と複数の薬物とを、機能的ヒトＹ５受容体応答を活性化させる条件下で接触させることと、細胞におけるこのような受容体を活性化する薬物を決定し、これによってヒトＹ５受容体の作動剤として作用する薬物を同定することとを具備した方法を提供する。
【０１４９】
本発明は、薬物をスクリーニングして、Ｙ５受容体の拮抗剤として作用する薬物を同定する方法であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされ且つこれを発現している細胞と複数の薬物とを、ＰＹＹまたはＮＰＹのような公知のＹ５受容体作動剤の存在下において、機能的Ｙ５受容体応答を活性化させる条件下で接触させることと、哺乳類細胞における前記受容体の活性化を阻害する薬物を決定し、これによってＹ５受容体の拮抗剤として作用する薬物を同定することとを具備した方法を提供する。
【０１５０】
本発明は、薬物をスクリーニングして、ヒトＹ５受容体の拮抗剤として作用する薬物を同定する方法であって、ヒトＹ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされ且つこれを発現している細胞と複数の薬物とを、ＰＹＹまたはＮＰＹのような公知のＹ５受容体作動剤の存在下において、機能的Ｙ５受容体応答を活性化させる条件下で接触させることと、哺乳類細胞における前記受容体の活性化を阻害する薬物を決定し、これによってヒトＹ５受容体の拮抗剤として作用する薬物を同定することとを具備した方法を提供する。一態様において、前記細胞は非神経起源である。更なる態様において、前記細胞は、ＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胎児腎細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞、またはＮＩＨ−３Ｔ３細胞である。
【０１５１】
　本発明は、上記方法によって同定された薬物と、薬学的に許容され得るキャリアとを含有する薬学的組成物を提供する。
【０１５２】
　本発明は、Ｙ５受容体をコードするｍＲＮＡ存在を検出することによりＹ５受容体の発現を検出する方法であって、細胞から全ｍＲＮＡを得ることと、こうして得たｍＲＮＡをハイブリダイズ条件下で上記の核酸プローブと接触させる工程と、これによって細胞によるＹ５受容体の発現を検出することとを具備した方法を提供する。
【０１５３】
　本発明は、患者において、Ｙ５受容体の阻害によって緩和される異常を治療する方法であって、患者に対し、該患者のＹ５受容体を阻害するのに有効な量の上記薬学的組成物を投与することを具備した方法を提供する。
【０１５４】
　本発明は、患者において、Ｙ５受容体の活性化によって緩和される異常を治療する方法であって、患者に対し、該患者のＹ５受容体を活性化するのに有効な量の上記薬学的組成物を投与することを具備した方法を提供する。
【０１５５】
　本発明は、患者において、Ｙ５受容体の阻害によって緩和される異常を治療する方法であって、患者に対し、有効量のＹ５受容体拮抗剤を投与することを具備した方法を提供する。
【０１５６】
本発明は、患者において、Ｙ５受容体の活性化によって緩和される異常を治療する方法であって、患者に対し、有効量のＹ５受容体作動剤を投与することを具備した方法を提供する。更なる態様において、前記異常な症状は食欲不振である。別の態様において、前記異常な症状は性的／再生障害である。別の態様において、前記異常症状は抑鬱症である。他の態様において、前記異常症状は不安症である。
【０１５７】
　一態様において、前記異常症状は胃潰瘍である。更なる態様において、前記異常症状は記憶喪失である。更なる態様において、前記異常症状は偏頭痛である。更なる態様において、前記異常症状は疼痛である。更なる態様において、前記異常症状は癲癇性の発作である。更なる態様において、前記異常症状は高血圧である。更なる態様において、前記異常症状は脳出血である。更なる態様において、前記異常症状はショックである。更なる態様において、前記異常症状は鬱血性心不全である。更なる態様において、前記異常症状は睡眠障害である。更なる態様において、前記異常症状は鼻鬱血である。更なる態様において、前記異常症状は下痢である。
【０１５８】
　本発明は、患者における肥満を治療する方法であって、前記患者に対して、有効量のＹ５受容体拮抗剤を投与することを具備した方法を提供する。
【０１５９】
　本発明は、患者における食欲不振を治療する方法であって、前記患者に対して、有効量のＹ５受容体作動剤を投与することを具備した方法を提供する。
【０１６０】
　本発明は、患者における神経性過食症を治療する方法であって、前記患者に対して、有効量のＹ５受容体拮抗剤を投与することを具備した方法を提供する。
【０１６１】
　本発明は、患者が食事をするように誘導する方法であって、患者に対して、有効量のＹ５受容体作動剤を投与することを具備した方法。一態様において、前記患者は脊椎動物である。他の態様において、前記患者はヒトである。
【０１６２】
　本発明は、患者による食物の消費を増大させる方法であって、患者に対して、食物および有効量のＹ５受容体作動剤の組成物を投与することを具備した方法。一態様において、前記患者は脊椎動物である。他の態様において、前記患者はヒトである。
【０１６３】
本発明は、ヒトＹ５受容体の活性を低減することによって緩和される異常を治療する方法であって、患者に対し、ヒトＹ５受容体の活性を低減し、これによりヒトＹ５受容体の過剰活性からもたらされる異常を緩和するのに有効な量の上記薬学的組成物を投与することを具備した方法を提供する。
【０１６４】
本発明は、ヒトＹ５受容体の過剰活性に関連した異常症状を治療する方法であって、患者に対し、Ｙ５受容体へのリガンドの結合をブロックて前記異常症状を緩和するのに有効な量の上記薬学的組成物を投与することを具備した方法を提供する。
【０１６５】
　本発明は、細胞表面のヒトＹ５受容体の存在を検出する方法であって、前記細胞とヒトＹ５受容体に結合することができる抗体とを、該抗体の当該受容体への結合を可能にする条件下で接触させることと、前記細胞に結合した前記抗体の存在を検出することと、これによって前記細胞表面におけるヒトＹ５受容体の存在を検出することとを具備した方法。
【０１６６】
　本発明は、ヒトＹ５受容体の活性レベルを変化させることの生理学的効果を決定する方法であって、ヒトＹ５受容体の発現を調節する誘導性プロモータの使用によりヒトＹ５受容体活性のレベルが変化するような、非ヒト遺伝子導入哺乳動物を製造することを具備した方法を提供する。
【０１６７】
　本発明は、ヒトＹ５受容体の活性レベルを変化させることの生理学的効果を決定する方法であって、夫々が異なった量のヒトＹ５受容体を発現する複数の非ヒト遺伝子導入哺乳動物のパネルを製造することを具備した方法を提供する。
【０１６８】
　本発明は、ヒトＹ５受容体の過剰活性からもたらされる異常を緩和することができる物質を同定する方法であって、或る物質を上記の非ヒト遺伝子導入動物に投与することと、該物質が、ヒトＹ５受容体の過剰活性の結果として前記非ヒト遺伝子導入動物の示す生理学的および挙動的な異常を緩和するかどうかを決定することとを具備した方法を提供する。
【０１６９】
　本発明は、ヒトＹ５受容体の過剰活性からもたらされる異常を治療する方法であって、患者に対し、ヒトＹ５受容体の過剰活性の結果としてもたらされる異常を緩和するのに有効な量の上記薬学的組成物を投与することを具備した方法を提供する。
【０１７０】
　本発明は、ヒトＹ５受容体の過小活性からもたらされる異常を緩和することができる物質を同定する方法であって、或る物質を上記の非ヒト遺伝子導入動物に投与することと、該物質が、ヒトＹ５受容体の過小活性の結果として前記非ヒト遺伝子導入動物が示す生理学的および挙動的な異常を緩和するかどうかを決定することとを具備した方法を提供する。
【０１７１】
　本発明は、ヒトＹ５受容体の過小活性からもたらされる異常を治療する方法であって、患者に対し、ヒトＹ５受容体の過小活性の結果としてもたらされる異常を緩和するのに有効な量の上記薬学的組成物を投与することを具備した方法を提供する。
【０１７２】
本発明は、ヒトＹ５受容体対立遺伝子の活性に関連した疾患に対する疾病素因を診断するための方法であって、該方法は、　ａ．該疾患に罹患している患者のＤＮＡを採取する工程と；　ｂ．制限酵素類のパネルを用いて、該ＤＮＡの制限消化をおこなう工程と；　ｃ．得られたＤＮＡ断片を、サイジングゲル上で電気泳動的に分離する工程と；　ｄ．得られたゲルを、ヒトＹ５受容体をコードするＤＮＡと特異的にハイブリダイズでき且つ検出可能なマーカーで標識された核酸プローブと接触させる工程と；　ｅ．検出可能なマーカーで標識されたヒトＹ５受容体をコードするＤＮＡとハイブリダイズした標識バンドを検出して、該疾患に罹患している患者のＤＮＡに特異的なユニークなバンドを作製する工程と；　f．工程ａ〜ｅによって、診断用に採取したＤＮＡを調製する工程と；　g．工程ｅで得られた前記疾患に罹患している患者のＤＮＡおよび工程ｆで得られた診断用のＤＮＡに特異的なバンドパターンを比較して、両パターンが同一であるか異なるかを決定し、それによって、もしパターンが同一であれば、当該疾患の疾病素因ありと診断する工程とを具備した方法を提供する。一態様では、特異的なヒトＹ５受容体対立遺伝子の活性に関連した疾患が診断される。
【０１７３】
　本発明は、単離されたＹ５受容体を調製する方法であって、　ａ．細胞に対して前記Ｙ５受容体の発現を誘導する工程と；　ｂ．得られた細胞から前記受容体を回収する工程と；　ｃ．こうして回収された前記受容体を精製する工程とを具備する方法を提供する。
【０１７４】
　本発明は、単離されたＹ５受容体を調製する方法であって、　ａ．Ｙ５受容体をコードする核酸を、該Ｙ５受容体をコードする核酸に機能的にリンクした該核酸の発現に必要な調節因子を有する適切なベクター中に挿入する工程と；　b．得られたベクターを適切なホスト細胞に挿入し、Ｙ５受容体を産生する細胞を取得する工程と；　ｃ．得られた細胞によって産生された受容体を回収する工程と；　ｄ．こうして回収された前記受容体を精製する工程とを具備する方法を提供する。
【０１７５】
　本発明は、下記の実験の詳細を参照することによって更に良く理解されるであろう。しかしながら、そこで議論されている特定の方法および結果は、後述の請求の範囲に更に完全に記載されている本発明の単なる例示に過ぎないことを、当業者は容易に承認するであろう。
【０１７６】
〔実験の詳細〕
　材料と方法
ｃＤＮＡクローニング
　総ＲＮＡは、グアニジンチオシアネート法（Kingston, 1987）を修飾して、５ｇのラット視床下部（ロックランド（Rockland）、ギルバーツビル（Gilbertsville ）、ペンシルバニア州）から調製した。ポリＡ＋ ＲＮＡは、ファーストトラック（FastTrack）キット（インビトロゲン社（Invitrogen, Inc）、サンジエゴ、カリホルニア州）で精製した。２本鎖（ｄｓ）ｃＤＮＡは、第２の鎖のｃＤＮＡ合成でリガーゼを省略した以外は、GublerとHoffman法（GublerとHoffman, 1983）に従って、７μg のポリＡ＋ ＲＮＡから合成した。得られたＤＳ　ｃＤＮＡをＢｓｔＥｘＩ／ＥｃｏＲＩアダプター（インビトロゲン社（Invitrogen, Inc））に連結し、過剰のアダプターをセファクリル（Sephacryl ）５００ＨＲ（ファルマシア（Pharmacia ）−ＬＫＢ）でクロマトグラフィーにより除去し、ｄｓ−ｃＤＮＡを、ジーンパック・ファックス（Gen-Pak Fax ）ＨＰＬＣカラム（ミリポア社（Millipore Corp. ）、ミルフォード、マサチューセッツ州）でサイズ選択した。高分子量画分を、AruffoとSeedの記載したように（AruffoとSeed, 1987）ＢｓｔｘＩで切断したｐＥＸＪ．ＢＳ（ｐｃＥＸＶ−３由来のｃＤＮＡクローニング発現ベクター；Okayama とBerg, 1983；MillerとGermain , 1986）中で連結した。連結したＤＮＡを、大腸菌（E. coli）ＭＣ１０６１Ｆ＋（ジーンパルサー（Gene Pulser）、バイオラッド（Bio-Rad））中で電気泳動した。挿入体の平均サイズが２．７kbの全部で３．４×１０６ 個の独立のクローンが作成された。ライブラリーを、６．９〜８．２×１０３ 個の独立のクローンのプールでシャーレ（アンピシリン選択）上に蒔いた。１８時間増幅後、各プールの細菌を掻き取り、４mlのＬＢ培地に再懸濁し、プラスミド精製のために１．５mlをキアプレップ−８（QIAprep-8 ）プラスミドキット（キアゲン社（Qiagen Inc）、チャツワース（Chatsworth）、カリホルニア州）を用いて、プラスミド精製のために処理した。各細菌プールの１mlアリコートを、２０％グリセロール中で−８５℃で保存した。
【０１７７】
非定型ラット視床下部ＮＰＹ５受容体をコードするｃＤＮＡクローンの単離
　約７０００個の独立したクローンのプールからのＤＮＡを、ＤＥＡＥ−デキストラン法（WardenとThorne, 1968）を修飾して、ＣＯＳ−７細胞中にトランスフェクションした。１０％胎児牛血清、１００単位/ml のペニシリン、１００μg/mlのストレプトマイシン、２mMのＬ−グルタミンを補足したダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ−Ｃ）中で、５％ＣＯ２ 中で３７℃で増殖させた。トランスフェクションの１日前に、３０，０００細胞／cm２ の密度で、ラボ−テック（Lab-Tek）チャンバースライド（１チャンバー、ヌンク社（Nunc Inc.）、ナパービル（Naperville）、イリノイ州のパーマノックス（Permanox）スライド）上に接種した。翌日、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ　Ｉ無血清培地（ギブコ（登録商標）ビーアールエル・ライフテクノロジーズ社（Gibco BRL LifeTechnologies Inc. ）、グランドアイランド（Grand Island）、ニューヨーク州）中の各プールからのＤＮＡとＤＥＡＥ−デキストラン（５００μg/ml）の１／１０を含有するトランスフェクションカクテル７３５μl を加えた。３７℃で３０分インキュベーション後、３mlのクロロキン（ＤＭＥＭ−Ｃ中８０μM ）を加え、細胞を３７℃でさらに２．５時間インキュベートした。各チャンバーから培地を吸引し、各チャンバーを２mlのＰＢＳで１回洗浄し、細胞をＤＭＥＭ−Ｃ中で４８時間インキュベートし、スライド上で結合測定法を行なった。ＰＢＳで１回洗浄後、細胞を、２０mMのヘペス−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、ＣａＣｌ２ １．２６mM、ＭｇＳＯ４　０．８１mM、ＫＨ２ＰＯ４　０．４４mM、ＫＣＬ　５．４、ＮａＣｌ　１０mM、０．１％ＢＳＡ、０．１％バシトラシン（bacitracin）中の１nM（３×１０６ cpm／スライド）のブタ［１２５Ｉ］−ＰＹＹ（ＮＥＮ；ＳＡ＝２２００ Ci/ミリモル）と、室温で１時間インキュベートして陽性プールを同定した。リガンドを含まない結合緩衝液中で６回洗浄後（各回３秒間）単層をＰＢＳ中２．５％のグルタルアルデヒドで固定し、エタノール浴（７０、８０、９５、１００％）中で各２分間脱水し、空気乾燥した。次にスライドを、４２℃で１００％の写真乳剤（コダックＮＴＢ２型）に浸し、ドリエライト（drierite）を含有する遮光箱中で、４℃で４８時間感光させた。スライドをコダックＤ１９展開液（３２g/l 水）中で３分間現像し、水で洗浄し、コダック固定液中で５分間固定し、水で洗浄し、空気乾燥し、アクア−マウント（ラーナー・ラボラトリーズ（Lerner Laboratories ）、ピッツバーグ、ペンシルバニア州）でマウントした。スライドを２５×の全倍率でスクリーニングした。既に記載されているように（マコーミック（McCormick ）、1987）ＳＴＢ選択により、１つのクローン（ＣＧ−１８）を単離した。製造業者の方法に従ってシーケナーゼ（Sequenase ）キット（ユーエスバイオケミカル（US Biochemical）、クリーブランド、オハイオ州）で、ＤＳ−ＤＮＡの配列を決定した。ＧＣＧプログラム（ジェネティックスコンピューターグループ（Genetics Compute group）、マジソン、ウィスコンシン州）を用いて、ヌクレオチドとペプチド配列解析を行なった。
【０１７８】
ヒトＹ５同族体の単離
　ＴＭ３（センスプライマー；図１Ａ中の４８４〜５０９位）およびＴＭ６（アンチセンスプライマー；図３Ａ中の１２１９〜１２４３位）中のラットのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、本出願人は、ポリメラーゼチェイン反応によりヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。約５０００の独立したクローンを含有する４５０の増幅したプール（全部で２．２×１０６ ）の各１μl （４×１０６ 個の細菌）を、直接４０サイクルのＰＣＲにかけ、得られた生成物をアガロースゲル電気泳動で解析した。３つの陽性プールのうちの１つをさらに解析し、同胞選択（sib selection ）により、単一のｃＤＮＡクローンを単離し性状解析した。このｃＤＮＡは、全長であることが判明し、発現のために正しい配向にあった。製造業者の方法に従ってシーケナーゼ（Sequenase ）キット（ユーエスバイオケミカル（US Biochemical）、クリーブランド、オハイオ州）で、ＤＳ−ＤＮＡの配列を決定した。
【０１７９】
イヌＹ５同族体の単離
　一対のＰＣＲプライマーを合成するのに、ラットとヒトのＹ５受容体のコードヌクレオチド配列を使用した。ラットとヒトで１００％保存されているＴｍ IIIの上流の領域を、前進プライマーＣＨ１５６を合成するのに選択した：
５’−ＴＧＧＡＴＣＡＧＴＧＧＡＴＧＴＴＴＧＧＣＡＡＡＧ−３’（配列番号：７）。
【０１８０】
　ＴＭ６のすぐ上流の５−６ループのカルボキシ末端の領域（これもラットとヒトの配列で１００％保存されている）を、逆プライマーＣＨ１５３を合成するのに選択した：
５’−ＧＴＣＴＧＴＡＧＡＡＡＡＣＡＣＴＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣＴＴ−３’（配列番号：８）。
【０１８１】
　ＳＳＩＩ逆転写酵素（ギブコ・ビーアールエル（Gibco BRL ）、ゲイサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州）を用いて逆転写したラット脳のポリ（Ａ＋）ＲＮＡの１０ngを増幅するのに、プライマーＣＨ１５６−ＣＨ１５３を使用した。Ｔａｑポリメラーゼ（パーキン・エルマー−ロッシュモレキュラーシステムズ（Perkin-Elmer-Roche Molecular Systems）、ブランチバーグ（Branchburg）、ニュージャージー州）を用いて、１本鎖ｃＤＮＡについて以下の条件でＰＣＲを行なった：９４℃で１分、６０℃で１分、７２℃で１分を４０サイクル。得られた７９８塩基対のＰＣＲ　ＤＮＡ断片を、ｐＣＲスクリプト（pCR Script）（ストラタジーン（Stratagene）、ラホイア（La Jolla）、カリホルニア州）中でサブクローニングし、シーケナーゼ（Sequenase ）キット（ユーエスバイオケミカル（US Biochemical）、クリーブランド、オハイオ州）で配列を決定し、Ｙ５−ｂｄ−５と名付けた。
【０１８２】
３’と５’ＲＡＣＥ
　ビーグル犬Ｙ５受容体配列の欠失している３’末端と５’末端を、マラソン（Marathon）ｃＤＮＡ増幅キット（クロンテック（Clontech）、パロアルト（Palo Alto ）、カリホルニア州）を用いて、３’と５’ＲＡＣＥにより単離した。上記のビーグル犬ＰＣＲ　ＤＮＡ断片の配列から、以下のＰＣＲプライマーを合成した：
（３’ＲＡＣＥ）
ＣＨ２０４：
５’−ＣＴＴＣＣＡＧＴＧＴＴＴＣＡＣＡＧＴＣＴＧＧＴＧＧ−３’（配列番号：９）；
ＣＨ２１８（重なり（nested）プライマー）：
５’−ＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＴＡＴＴＴＡＴＧＴＧＴＴＧ−３’（配列番号：１０）；
（５’ＲＡＣＥ）
ＣＨ２１９：
５’−ＣＴＧＧＡＴＧＡＡＧＡＡＴＧＣＴＧＡＣＴＴＣＴＴＡＣＡＧ−３’（配列番号：１１）；
ＣＨ２４５（重なりプライマー）：
５’−ＴＴＣＴＴＧＡＧＴＧＧＴＴＣＴＣＴＴＧＡＧＧＡＧＧ−３’（配列番号：１２）；
　前述のプライマーを用いて、キット説明書に従って、ビーグル犬の視床ｃＤＮＡについて、３’と５’ＲＡＣＥ反応を行なった。得られたＰＣＲ　ＤＮＡ（０．７〜１０kbの塗末）をアガロースゲルから精製し、前述の重なりプライマーを用いて再度増幅した。得られたＤＮＡバンドをアガロースゲルから再度精製し、ｐＣＲスクリプト（pCR Script）（ストラタジーン（Stratagene）、ラホイア（La Jolla）、カリホルニア州）中でサブクローニングした。
【０１８３】
　ｃＤＮＡの３’末端に対応するヌクレオチド配列を決定し、プラスミドをＹ５−ｂｄ−８と名付けた。近い将来５’末端に対応するヌクレオチド配列が決定されるであろう。次にこれらのヌクレオチド配列を用いて、開始コドンおよび停止コドン領域に対する正確なプライマーを合成し、次にこれらの正確なプライマーを用いてイヌの視床ｃＤＮＡが増幅されて、エキスパンドハイフィデリティ（Expand High Fidelity）ポリメラーゼ（ベーリンガー・マンハイム（Boehringer-Mannheim ）、インディアナポリス、インディアナ州）を用いて、イヌＹ５受容体の全長コード配列に対応するＰＣＲ産物が作成されるであろう。得られたＰＣＲ　ＤＮＡは、発現ベクターｐＥＸＪにサブクローニングされて、シーケナーゼ（Sequenase ）キット（ユーエスバイオケミカル（US Biochemical）、クリーブランド、オハイオ州）を用いて、イヌＹ５ヌクレオチド配列の全コード配列が決定されるであろう。
【０１８４】
ノーザンブロット
　製造業者の説明書に従って高厳密性条件下で、種々のヒト脳領域から精製したｍＲＮＡを有するヒト脳の複数の組織ノーザンブロット（ＭＴＮブロットIIとIII、クロンテック（Clontech）、パロアルト（Palo Alto）、カリホルニア州）をハイブリダイズさせた。プローブは、ヒトＹ５受容体サブタイプのコード領域中の５−６ループのＴＭ III−カルボキシ末端に対応する０．８kbのＤＮＡ　ＰＣＲ断片であった。
【０１８５】
　製造業者の説明書に従って高厳密性条件下で、種々のラット組織から精製したｍＲＮＡを有するラットの複数の組織ノーザンブロット（ラットＭＴＮブロット、クロンテック（Clontech）、パロアルト（Palo Alto ）、カリホルニア州）をハイブリダイズさせた。プローブは、ラットＹ５受容体サブタイプのコード領域中の５−６ループのＴＭ III−カルボキシ末端に対応する０．８kbのＤＮＡ　ＰＣＲ断片であった。
【０１８６】
サザンブロット
　５つの異なる酵素（１レーンにつき８μg のＤＮＡ）で切断したヒトまたはラットのゲノムＤＮＡを含有するサザンブロット（ゲノ−ブロット（Geno-Blot）、クロンテック（Clontech）、パロアルト（Palo Alto ）、カリホルニア州）を、製造業者の説明書に従って高厳密性条件下で、ハイブリダイズさせた。プローブは、ヒトおよびラットＹ５受容体サブタイプのコード領域中の５−６ループのＴＭIII−カルボキシ末端に対応する０．８kbのＤＮＡ　ＰＣＲ断片であった。
【０１８７】
組換えバキュロウイルスの産生
　ｈＹ５の初めの約１００塩基対（すなわち、開始メチオニンから内部ＥｃｏＲＩ部位まで）を、５’ＢａｍＨＩ部位と３’ＥｃｏＲＩ部位を含有する２つの重複する合成したオリゴヌクレオチド（各、約１００塩基対）で置換して、ヒトＹ５の開始メチオニンのすぐ５’のＢａｍＨＩ部位を、遺伝的に作成した。これにより、ｈＹ５のコード領域を含有する約１．５kbのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII断片が単離された。この断片を、ポリリンカーに存在するｐＢｌｕｅＢａｃIII（登録商標）中のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII部位にサブクローニングした（ｐＢＢ／ｈＹ５と呼ぶ作製体）。バキュロウイルスを作成するために、０．５μgのウイルスＤＮＡ（バキュロゴールド（Baculogold）（登録商標））と３μgのｐＢＢ／ｈＹ５を、ファルミンゲン（Pharmingen）（「バキュロウイルス発現ベクター系：操作と方法マニュアル」（"Baculovirus Expression Vector System: Procedures and Methods Manual"）中）に要約されているように、リン酸カルシウム共沈殿法により２×１０６ のスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）昆虫Ｓｆ９細胞中に同時トランスフェクションした。細胞を２７℃で５日間インキュベートした。同時トランスフェクションプレートの上清を遠心分離して集め、組換えウイルス（ｈＹ５ＢＢ３）をプラーク精製した。ウイルスで感染させる方法、ウイルスのストックを調製する方法、およびウイルスストックを力価測定する方法は、ファルミンゲン（Pharmingen）のマニュアルに記載のように行なった。
【０１８８】
細胞培養
　ＣＯＳ−７細胞を、補足Ｄ−ＭＥＭ（１０％胎児牛血清、４mMグルタミン、１００単位/ml のペニシリン、１００μg/mlのストレプトマイシンを含有するダルベッコー改変イーグル培地）中でプレート上で、５％ＣＯ２ で３７℃で増殖させた。ＣＯＳ−７細胞のストックプレートをトリプシン処理し、３〜４日毎に１：６に分けた。ヒト胚腎２９３細胞を、ハンクス塩と補足物を有する補足Ｄ−ＭＥＭ（最小基本培地）（１０％胎児牛血清、４mMグルタミン、１００単位/ml のペニシリン、１００μg/mlのストレプトマイシンを含有するダルベッコー改変イーグル培地）中でプレート上で、５％ＣＯ２ で３７℃で増殖させた。２９３細胞のストックプレートをトリプシン処理し、３〜４日毎に１：６に分けた。マウス繊維芽細胞ＬＭ（ｔｋ−）細胞を、補足Ｄ−ＭＥＭ（１０％胎児牛血清、４mMグルタミン、１００単位/ml のペニシリン、１００μg/mlのストレプトマイシンを含有するダルベッコー改変イーグル培地）中で１５０mmプレート上で、５％ＣＯ２ で３７℃で増殖させた。ＬＭ（ｔｋ−）細胞のストックプレートをトリプシン処理し、３〜４日毎に１：１０に分けた。
【０１８９】
　ヒトＹ５受容体で安定にトランスフェクションしたＬＭ（ｔｋ−）細胞を、粘着性単層から生育能を有する懸濁液に日常的に変換した。コンフルエンスの時点で、粘着性細胞をトリプシンで集め、完全ＤＭＥＭの最小量に再懸濁して細胞数を数え、懸濁培地（１０％子牛血清、１０％１０×培地１９９（ギブコ（Gibco））、９mM　ＮａＨＣＯ３ 、２５mMグルコース、２mM　Ｌ−グルタミン、１００単位/ml ペニシリン、１００μg/mlストレプトマイシン、および０．０５％メチルセルロース）中に１０６ 細胞/ml の濃度でさらに希釈した。細胞懸濁液を浸透培養器中で３７℃で５％ＣＯ２ 中で２４時間維持した。こうして増殖させた細胞から集めた膜は、大きな均一のバッチで液体窒素中で保存できる。あるいは、細胞を、ポリ−Ｄ−リジン（０．０１ｍｇ/ml ）でコーティングした９６ウェルマイクロタイタープレート中に分散させて、次に３７℃で５％ＣＯ２ 中で２４時間インキュベートして、完全ＤＭＥＭ中の粘着性細胞培養物にもどすことができる。こうして調製した細胞は、後述するｃＡＭＰのラジオイムノアッセイで確実な信頼できるＮＰＹ−依存性応答を与えた。
【０１９０】
　マウス胚繊維芽細胞ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、補足物（１０％胎児牛血清、４mMのＬ−グルタミン、１００単位/mlのペニシリン、１００μg/mlのストレプトマイシン）を有するダルベッコー改変イーグル培地中で、１５０mmプレートで増殖させた。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞のストックプレートをトリプシン化し、３〜４日毎に１：１５に分けた。
【０１９１】
　Ｓｆ９とＳｆ２１細胞を、１０％胎児牛血清を補足したＴＭＮ−ＦＨ培地中で１５０mm組織培養プレートで単層で２７℃でＣＯ２ 無しで増殖させた。ハイファイブ（High Five ）昆虫細胞を、Ｌ−グルタミンを補足したＥｘ−Ｃｅｌｌ　４００（登録商標）培地中で１５０mm組織培養プレートで単層で２７℃でＣＯ２ 無しで増殖させた。
【０１９２】
一過性トランスフェクション
　試験したすべての受容体サブタイプ（ヒトおよびラットＹ１、ヒトおよびラットＹ２、ヒトおよびラットＹ４、ヒトおよびラットＹ５）を、１μg ＤＮＡ／１０６ 細胞（Cullen, 1987）を用いて、ＤＥＡＥ−デキストラン法によりＣＯＳ−７細胞中に一過性トランスフェクションを行なった。ヒトＹ１受容体は、既知の方法を用いて調製した（Larhammarら、1992）。
【０１９３】
安定なトランスフェクション
　ヒトＹ１、ヒトＹ２、およびラットＹ５受容体を、Ｇ−４１８耐性遺伝子とともに、ヒト胚腎２９３細胞株中に、リン酸カルシウム法（Cullen, 1987）により同時トランスフェクションを行なった。安定にトランスフェクションされた細胞を、Ｇ−４１８で選択した。ヒトＹ４およびヒトＹ５受容体を同様にマウス繊維芽細胞ＬＭ（ｔｋ−）細胞とＮＩＨ−３Ｔ３細胞中にトランスフェクションした。
【０１９４】
他のＧタンパク質結合受容体の発現
　α１ ヒトアドレナリン作用性受容体：ヒトα１ 受容体への化合物の結合を測定するために、α１ａ、α１ｂ、およびα１ｄ受容体をコードする遺伝子で安定にトランスフェクションしたＬＭ（ｔｋ−）細胞株を使用した。α１ 受容体の命名法は最近変更され、以前α１ａと呼ばれていた受容体は現在α１ｄと呼ばれ、以前α１ｃと呼ばれていた受容体は現在α１ａと呼ばれる（参考文献）。これらの受容体を発現する細胞株は、命名法が変わる前にＡＴＣＣに寄託されているため、これらの受容体に以前採用されていたサブタイプ名を反映している。すなわち、本明細書でα１ａ受容体として表現される受容体を発現する細胞株は、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ　１１１４０でＬ−α１Ｃ　して、１９９２年９月２５日にＡＴＣＣに寄託された。本明細書でα１ｄ受容体として表現される受容体を発現する細胞株は、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ　１１１３８でＬ−α１Ａとして、１９９２年９月２５日にＡＴＣＣに寄託された。α１ｂ受容体を発現する細胞株は、Ｌ−α１Ｂと命名され、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ　１１１３９で１９９２年９月２５日に寄託された。
【０１９５】
　α２ ヒトアドレナリン作用性受容体：ヒトα２ 受容体への化合物の結合を測定するために、α２Ａ、α２Ｂ、およびα２Ｃ受容体をコードする遺伝子で安定にトランスフェクションしたＬＭ（ｔｋ−）細胞株を使用した。α２Ａ受容体を発現する細胞株は、Ｌ−α２Ａと命名され、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ　１１１８０で１９９２年１１月６日に寄託された。α２Ｂ受容体を発現する細胞株は、Ｌ−ＮＧＣ−α２Ｂと命名され、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ　１０２７５で１９８９年１０月２５日に寄託された。α２Ｃ受容体を発現する細胞株は、Ｌ−α２Ｃと命名され、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ　１１１８１で１９９２年１１月６日に寄託された。後述（膜懸濁物への放射性リガンド結合を参照）するように細胞溶解物を調製し、２５mMグリシルグリシン緩衝液（室温でｐＨ７．６）に懸濁した。［ ３Ｈ］ラウオルスシン（rauwolscine ）（０．５nM）を用いて、平衡競合結合測定法を行い、１０μM フェントラミン （phentolamine ）とともにインキュベートして非特異結合を測定した。結合した放射性リガンドを、細胞ハーベスターを用いてＧＦ／Ｂフィルターでろ過して分離した。
【０１９６】
　ヒトヒスタミンＨ１ 受容体：ウシＨ１ 受容体と相同的なヒトヒスタミンＨ１ 受容体のコード配列を、ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーから得て、真核生物発現ベクターｐＣＥＸＶ−３中にクローン化した。Ｈ１ 受容体のプラスミドＤＮＡをｐｃＥＸＶ−Ｈ１と命名し、ＡＴＣＣ受託番号７５３４６で１９９２年１１月６日に寄託した。この作製体を、ＤＥＡＥ−デキストラン法によりＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションした。７２時間後細胞を集め、５mMトリス−塩酸、５mMＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）中で超音波処理して溶解した。細胞溶解物を４℃で１０００rpm で５分間遠心分離して、上清を４℃で３０，０００ｇで２０分間遠心分離した。ペレットを、３７．８mM　ＮａＨＰＯ４ 、１２．２mM　ＫＨ２ ＰＯ４ （ｐＨ７．５）に懸濁した。ヒスタミンＨ１ アンタゴニストの［ ３Ｈ］メピラミン（mepyramin ）（１nM、比活性：２４．８ Ci/mM）の結合は、最終容量０．２５mlで行い、室温で６０分間インキュベートした。１０μM メピラミンの存在下で非特異結合を測定した。結合した放射性リガンドを、細胞ハーベスターを用いてＧＦ／Ｂフィルターでろ過して分離した。
【０１９７】
　ヒトヒスタミンＨ２ 受容体：ヒトＨ２ 受容体のコード配列を、ヒト胎盤ゲノムライブラリーから得て、真核生物発現ベクターＰＣＥＸＶ−３中にクローン化した。Ｈ２ 受容体のプラスミドＤＮＡをｐｃＥＸＶ−Ｈ２と命名し、ＡＴＣＣ受託番号７５３４５で１９９２年１１月６日に寄託した。この作製体を、ＤＥＡＥ−デキストラン法によりＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションした。７２時間後細胞を集め、５mMトリス−塩酸、５mM　ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）中で超音波処理して溶解した。細胞溶解物を４℃で１０００rpm で５分間遠心分離して、上清を４℃で３０，０００ｇで２０分間遠心分離した。ペレットを、３７．８mM　ＮａＨＰＯ４ 、１２．２mM　Ｋ２ＰＯ４ （ｐＨ７．５）に懸濁した。ヒスタミンＨ２ アンタゴニストの［ ３Ｈ］チオチジン（tiotidine）（５nM、比活性：７０ Ci/mM）の結合は、最終容量０．２５mlで行い、室温で６０分間インキュベートした。１０μM ヒスタミンの存在下で非特異結合を測定した。結合した放射性リガンドを、細胞ハーベスターを用いてＧＦ／Ｂフィルターでろ過して分離した。
【０１９８】
　ヒトセロトニン受容体：
５ＨＴ１Ｄα 、５ＨＴ１Ｄβ 、５ＨＴ１Ｅ、５ＨＴ１Ｆ受容体：これらの５ＨＴ受容体サブタイプのそれぞれをコードする遺伝子で安定にトランスフェクションしたＬＭ（ｔｋ−）クローン性細胞株を、前述のように調製した。Ｌｔｋ−８−３０−８４と命名した５ＨＴ１Ｄα 受容体の細胞株を、１９９０年４月１７日に寄託し、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ　１０４２１を与えられた。Ｌｔｋ−１１と命名した５ＨＴ１Ｄβ 受容体の細胞株を、１９９０年４月１７日に寄託し、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ　１０４２２を与えられた。５ＨＴ１Ｅ−７と命名した５ＨＴ１Ｅ受容体の細胞株を、１９９１年１１月６日に寄託し、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ　１０９１３を与えられた。Ｌ−５−ＨＴ１Ｆと命名した５ＨＴ１Ｆの細胞株を、１９９１年１２月２７日に寄託し、ＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣ１０９５７を与えられた。これらの受容体を含有する膜調製物を前記したように調製し、１０mM　ＭｇＣｌ２ 、０．２mM　ＥＤＴＡ、１０μM パルギリン（pargyline ）、および０．１％アスコルビン酸塩を含有する５０mMトリス−塩酸緩衝液（３７℃でｐＨ７．４）に懸濁した。化合物の結合は、５nM［ ３Ｈ］セロトニンの存在下で３７℃で３０分間インキュベートして競合結合測定を行なって測定した。非特異結合は、１０μM セロトニンの存在下で測定した。結合した放射性リガンドを、細胞ハーベスターを用いてＧＦ／Ｂフィルターでろ過して分離した。
【０１９９】
　ヒトヒスタミン５ＨＴ２ 受容体：ヒト５ＨＴ２ 受容体のコード配列を、ヒト脳皮質ｃＤＮＡライブラリーから得て、ｐＣＥＸＶ−３真核生物発現ベクター中にクローン化した。ＤＥＡＥ−デキストラン法により、この作製体をＣＯＳ−７細胞中にトランスフェクションした。７２時間後細胞を集め、５mMトリス−塩酸、５mM　ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）中で超音波処理して溶解した。この細胞株は、Ｌ−ＮＧＣ−５ＨＴ２ と命名して、１９８９年１０月３１日にＡＴＣＣに寄託し、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ　１０２８７を与えられた。細胞溶解物を４℃で１０００rpm で５分間遠心分離して、上清を４℃で３０，０００ｇで２０分間遠心分離した。ペレットを、１０mM　ＭｇＳＯ４ 、０．５mM　ＥＤＴＡ、および０．１％アスコルビン酸塩を含有する５０mMトリス−塩酸緩衝液（３７℃でｐＨ７．７）に懸濁した。５ＨＴ２ 受容体でのアルファ−１アンタゴニストの力価を、［３Ｈ］ケタンセリン（１nM）を用いる平衡競合結合測定法で測定した。１０μM ミアンセリン（mianserin ）を添加して非特異結合を規定した。結合した放射性リガンドを、細胞ハーベスターを用いてＧＦ／Ｂフィルターでろ過して分離した。
【０２００】
　ヒト５−ＨＴ７ 受容体：５ＨＴ７ 受容体サブタイプをコードする遺伝子で安定にトランスフェクションしたＬＭ（ｔｋ−）クローン性細胞株を、前述のように調製した。Ｌ−５ＨＴ４Ｂと命名した５ＨＴ７ 受容体の細胞株を、１９９２年１０月２０日に寄託し、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ　１１１６６を与えられた。
【０２０１】
　ヒトドパミンＤ３ 受容体：ヒトＤ３受容体への化合物の結合は、ヒトＤ３ 受容体をコードする遺伝子でトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞からの膜調製物を用いて測定した。ヒトドパミンＤ３ 受容体は、公知の方法（Sokoloff, P.ら、Nature, 347, 146, 1990、ＥＭＢＬジーンバンク（Genbank ）にＸ５３９４４として寄託された）に従って調製した。７２時間後細胞を集め、５mMトリス−塩酸、５mM　ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）中で超音波処理して溶解した。細胞溶解物を４℃で１０００rpm で５分間遠心分離して、上清を４℃で３０，０００ｇで２０分間遠心分離した。ペレットを、１mM　ＥＤＴＡ、５mM　ＫＣｌ、１．５mM　ＣａＣｌ２ 、４mM　ＭｇＣｌ２ 、および０．１％アスコルビン酸塩を含有する５０mMトリス−塩酸（ｐＨ７．４）に懸濁した。細胞溶解物を、１０μM （＋）ブタノールを用いて［ ３Ｈ］スピペロン（spiperone ）（２nM）とともにインキュベートして、非特異結合を求めた。
【０２０２】
膜採集物
　一過性トランスフェクションの４８時間後、ＣＯＳ−７細胞から膜を採集した。粘着性細胞を、氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水（１３８mM　ＮａＣｌ、８．１mM　Ｎａ２ ＨＰＯ４ 、２．５mM　ＫＣｌ、１．２mM　ＫＨ２ ＰＯ４ 、０．９mM　ＣａＣｌ２ 、０．５mM　ＭｇＣｌ２ 、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、氷冷した超音波緩衝液（２０mMトリス−塩酸、５mM　ＥＤＴＡ、ｐＨ７．７）で超音波処理して溶解した。大きい粒子と破片を低速度遠心分離（２００×ｇ、５分間、４℃）して除去した。遠心分離（３２，０００×ｇ、１８分間、４℃）して上清画分から膜を集め、氷冷した低張緩衝液で洗浄し、再び遠心分離（３２，０００×ｇ、１８分間、４℃）して集めた。最終の膜ペレットを超音波処理して、少量の氷冷結合緩衝液（プレート５枚毎に約１ml：１０mM　ＮａＣｌ、２０mMヘペス、０．２２mM　ＫＨ２ ＰＯ４ 、１．２６mM　ＣａＣｌ２ 、０．８１mM　ＭｇＳＯ４ 、ｐＨ７．４）に再懸濁した。バイオラッド（Bio-Rad ）試薬を用いてウシ血清アルブミンを標準物質として、ブラッドフォード（Bradford）法（Bradford, 1976）によりタンパク質濃度を測定した。膜を１時間まで氷の上に置き、新鮮なまま使用するか、または瞬間凍結して液体窒素中で保存した。
【０２０３】
　２９３細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞、およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞から同様に膜を調製した。バキュロウイルス感染細胞から膜を調製し、１５０mm組織培養プレート中で２×１０７ のＳｆ２１細胞を増殖させ、ｈＹ５ＢＢ３の高力価ストックで感染させた。細胞を２７℃でＣＯ２ 無しで２〜４日間インキュベートした後、細胞を集め、膜調製を前記したように行なった。
【０２０４】
　切り出したラットの視床下部から、同様に膜を調製した。凍結視床下部を、ビルチシア（Virtishear）ホモジナイザー（ビルティス（Vritis）、ガーディナー（Gardiner）、ニューヨーク州）の細いプローブで１０００rpm で氷冷した超音波処理緩衝液中で２０秒間ホモジネートした。大きい粒子と破片を、遠心分離（２００×ｇ、５分間、４℃）で除去し、上清画分を氷上に保存した。ホモジネートと遠心分離操作をさらに２回繰り返して、ペレットから膜をさらに抽出した。上清画分をプールし、高速遠心分離（１００，０００×ｇ、２０分間、４℃）を行なった。最終の膜ペレットを、静かにホモジネートして少量の氷冷結合緩衝液（湿潤組織１ｇ当たり１ml）に再懸濁し、１時間まで氷の上に置き、新鮮なまま使用するか、または瞬間凍結して液体窒素中で保存した。
【０２０５】
膜懸濁物への放射性リガンド結合
　膜懸濁物を、０．１％ウシ血清アルブミンを補足した結合緩衝液に希釈して、最適の膜タンパク質濃度を得て、その結果、測定で膜が結合した １２５Ｉ−ＰＹＹ３−３６（または、 １２５Ｉ−ＮＰＹ、 １２５Ｉ−ＰＹＹ３−３６、または １２５Ｉ−［Ｌｅｕ３１Ｐｒｏ３４］ＰＹＹのような別の放射性リガンド）は、試料に供給した １２５Ｉ−ＰＹＹ（または、別の放射性リガンド）の１０％未満であった（競合結合測定法で１００，０００dpm/試料＝０．０８nM））。 １２５Ｉ−ＰＹＹ（または、別の放射性リガンド）およびペプチド競合物質も、補足した結合緩衝液で所望の濃度に希釈した。次に、 １２５Ｉ−ＰＹＹ（または、別の放射性リガンド）、競合ペプチドまたは補足した結合緩衝液（２５μｌ）、そして最後に膜懸濁物（２００μｌ）を混合して、各試料を９６ウェルマイクロタイタープレート中に調製した。試料を、３０℃水浴中で攪拌しながら１２０分間インキュベートした。ワットマンＧＦ／Ｃフィルター（１％ポリエチレンイミンでプレコーティングし、使用前に空気乾燥した）でろ過してインキュベーションを停止させ、５mlの氷冷結合緩衝液で洗浄した。フィルターに捕捉された膜に、マルチレックスソリッドシンチラント（MultiLex solid scintillant）（ワラック（Wallac）、ツルク（Turku）、フィンランド）を含浸させ、ワラックベータプレートリーダー（Wallac Beta-Plate Reader）中で １２５Ｉについて計測した。Ｙ４サブタイプ以外のすべての受容体について、非特異結合は３００nMのヒトＮＰＹにより規定した；ヒトＹ４については１００nMのヒトＰＰを使用し、ラットＹ４については１００nMのラットＰＰを使用した。経時変化および競合試験の非特異結合は典型的には８０％であり、ほとんどの非特異結合は、フィルターに結合していた。結合データは、グラフパッドプリズム（GranphPad Prism）パッケージ（サンジエゴ、カリホルニア州）中の非線形回帰統計法を用いて解析した。
【０２０６】
機能性測定法：ｃＡＭＰのラジオイムノアッセイ
　安定にトランスフェクションされた細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレートに接種し、コンフルエンスになるまで培養した。受容体の脱感作の可能性を低下させるために、測定の前に４〜１６時間、培地の血清成分を１．５％に低下させた。細胞をハンクス緩衝化食塩水、または０．１％ウシ血清アルブミン＋５mMテオフィリンを補足したＨＢＳ（１５０mM　ＮａＣｌ、２０mMヘペス、１mM　ＣａＣｌ２ 、５mM　ＫＣｌ、１mM　ＭｇＣｌ２ 、１０mMグルコース）で洗浄し、同じ溶液中で５％ＣＯ２ 中で３７℃で２０分間あらかじめ平衡化させた。次に細胞を、１０μM フォルスコリン（forskolin ）と種々の濃度の受容体選択性リガンドで５分間インキュベートした。ＨＢＳを除去し、１００mMのＨＣｌで細胞を酸性化して、測定を停止させた。細胞内ｃＡＭＰを抽出し、磁性ビーズ式のラジオイムノアッセイ（アドバンストマグネティクス（Advance Magnetics ）、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を修飾した方法により定量した。最終の抗原／抗体複合体を、マイクロタイタープレート（ミリポア（Millipore ）、ベッドフォード、マサチューセッツ州）中でＰＶＤＦフィルターにより真空ろ過して、遊離の １２５Ｉ−ｃＡＭＰから分離した。フィルターを穿孔し、パッカード（Packard ）ガンマカウンター中で １２５Ｉを計測した。結合データは、グラフパッドプリズム（GranphPad Prism ）パッケージ（サンジエゴ、カリホルニア州）中の非線形回帰統計法を用いて解析した。
【０２０７】
機能性測定法：細胞内カルシウム動員
　蛍光指示色素Ｆｕｒａ−２／ＡＭ（文献）を用いて、蛍光分光測定法により細胞内遊離カルシウム濃度を測定した。安定にトランスフェクションした細胞を、カバーガラスを挿入した３５mmの培養プレートに接種した。細胞をＨＢＳで洗浄し、１００μｌのＦｕｒａ−２／ＡＭ（１０μM ）を２０〜４０分間のせた。ＨＢＳで洗浄してＦｕｒａ−２／ＡＭ溶液を除去した後、細胞をＨＢＳ中で１０〜２０分間ＨＢＳで平衡化させた。次にライツフルオベルト（Leiz Fluovert ）ＦＳ顕微鏡の対物レンズ４０×で細胞を検鏡し、励起波長を３４０nmと３８０nmを交互に変えて蛍光波長５１０nmで測定した。蛍光の生データを、カルシウム濃度標準曲線とソフトウェア解析法を用いてカルシウム濃度に変換した。
【０２０８】
神経解剖学的試験のための組織調製
　オスのスプラーグ−ドーレイ（Sprague-Dawley）ラット（チャールズリバー’（Charles Rivers））を断頭し、迅速に脳を取り出し、イソペンタンで凍結した。凍結切片作製機で頭頂部分を１１μに切断し、ポリ−Ｌ−リジンコーティングしたスライドに融解マウントし、使用するまで−８０℃に保存した。ハイブリダイゼーションの前に、組織を４％パラホルムアルデヒドで固定し、５mMジチオスレイトールで処理し、０．２５％無水酢酸を含有する０．１Ｍトリエチルアミンでアセチル化し、クロロホルムで脱脂し、段階的濃度のエタノールで脱水した。
【０２０９】
プローブ
　ラットＮＰＹ　Ｙ５　ｍＲＮＡの分布の性状解析に使用されるオリゴヌクレオチドプローブは、ラットＹ５　ｍＲＮＡ（図３Ａ）の４５量体アンチセンスに相補的であり、センスオリゴヌクレオチドプローブは、ミリポアエクスペダイト（Millipore Expedite）８９０３核酸合成システムで合成した。次にプローブを凍結乾燥し、無菌水で復元し、１２％ポリアクリルアミド変性ゲルで精製した。精製したプローブを再度、１００ng/μlの濃度に復元し、−２０℃で保存した。
【０２１０】
ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション
　末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ファルマシア（Pharmacia））を用いて、比活性１０９ dpm/μｇになるように３５Ｓ−ｄＡＴＰで３’末端を標識した。放射能標識したプローブを、バイオスピン（Biospin ）６クロマトグラフィーカラム（バイオラッド（Bio-Rad ）；リッチモンド、カリホルニア州）で精製し、ハイブリダイゼーション緩衝液で１．５×１０４ cpm/μｌの濃度に希釈した。ハイブリダイゼーション緩衝液は、５０％ホルムアミド、４×クエン酸ナトリウム緩衝液（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、および０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）、１×デンハルツ溶液（０．２％ポリビニルピロリドン、０．２％フィコール、０．２％ウシ血清アルブミン）、５０mMジチオスレイトール、０．５ｍｇ/ml サケ精子ＤＮＡ、０．５ｍｇ/ml 酵母ｔＲＮＡ、および１０％デキストラン硫酸からなっていた。希釈した放射能標識プローブ１００μｌを各切片に加え、次にこれをパラフィルムのカバーガラスでカバーした。ハイブリダイゼーションは、４０〜５５℃で加湿チャンバー中で行なった。翌日切片を、２×ＳＳＣを２回交換して室温で１時間洗浄し、最後に０．１×ＳＳＣで室温で３０分間洗浄した。組織を段階的濃度のエタノールで脱水し、コダックＸＡＲ−５フィルムに３日間〜３週間−２０℃で露光し、次に０．２％グリセロールで１：１に希釈したコダックＮＴＢ３オートラジオグラフィーエマルジョンに浸した。４℃で２〜８週間露光後、スライドをコダックＤ−１９現像液中で現像し、固定し、クレゾールバイオレットで逆染色した。
【０２１１】
ハイブリダイゼーション対照
　プローブ／ハイブリダイゼーション特異性のための対照は、放射能標識センスプローブとのハイブリダイゼーションと、トランスフェクションした細胞株の使用をからなっていた。要約すると、ＣＯＳ−７細胞をラットのＹ１、Ｙ２（１９９４年２月３日出願の、米国特許出願第０８／１９２，２８８号に開示されている）、Ｙ４（１９９３年１２月２８日出願の、米国特許出願第０８／１７６，４１２号に開示されている）またはＹ５の受容体ｃＤＮＡとトランスフェクションした（前述）。前記したように、トランスフェクションした細胞を処理し、放射能標識Ｙ５アンチセンスおよびセンスオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせ、洗浄し、１〜７日間フィルムに露光させた。
【０２１２】
ハイブリダイゼーションシグナルの解析
　ラット脳の切片を、以下のようにハイブリダイゼーションシグナルについて解析した。本明細書で使用する「ハイブリダイゼーションシグナル」とは、ラット脳の選択された部分のニューロンの上で観察される銀粒子の相対的な数を意味する。２人の別々の観察者が、特定の脳の部分のハイブリダイゼーションシグナルの強度を、存在せず、弱い、中程度、強いとして評価した。次にこれらを、０、＋１、＋２、または＋３として主観的な数値に変換し、ラット脳の頭頂切片の略図上にマッピングした。
【０２１３】
化学合成法
化合物２８
２−（ナフタレン−１−イルアミノ）−３−フェニルプロピオニトリル
　３０mlのＣＨＣｌ３ と１０mlのＭｅＯＨ中の１−ナフタレンメチルアミン（２．９ｇ，２０ミリモル）とベンジルアルデヒド（２．０ｇ，１７ミリモル）の溶液に、ＴＭＳＣＮ（６．６ml，５１ミリモル）を加え、得られた溶液を２５℃で１２時間攪拌した。反応混合物を真空下で濃縮し、油状物を得て、これをカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル，高純度）にかけて、所望の生成物３．５ｇ（７４％）を無色の油状物として得た。生成物をＮＭＲで同定した。
【０２１４】
２−（ナフタレン−１−イル）−３−フェニルプロパン−１，２−ジアミン
　ＴＨＦ中のニトリル（０．５ｇ，１．８ミリモル）の溶液に、ＴＨＦ中の６．９mlの１Ｎ　ＬｉＡｌＨ４ を滴下して添加し、得られた溶液を２時間攪拌した。数片の氷を溶液に加えて、反応を停止させた。反応混合物を酢酸エチルで希釈して、セライトのパッドでろ過した。有機ろ液を真空下で濃縮して油状物残渣を得て、これをカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル、高純度）にかけて、所望の生成物０．２８ｇ（５７％）を無色の油状物として得た。生成物をＮＭＲで同定した。
【０２１５】
ラットでのインビボ試験
食物を充分与えたラットの食物摂取
　これらの測定のために食物摂取は、試験化合物の存在下でまたは非存在下でＮＰＹを脳室内に投与（i.c.v.）後、正常の食物を充分与えたラットで測定した。すべての試験で、体重１８０ｇ〜２２０ｇのオスのスプラーグ−ドーレイ（Sprague-Dawley）ラット（ギバガイギー社（Ciba-Geigy AG）、シセルン（Sisseln）、スイス）を使用した。ラットを１匹ずつステンレスのケージに入れ、温度を絶えず２１〜２３℃に調節して、１１：１３時間の明暗サイクル（１８：００時に消灯）で維持した。水と食物（ナファグ（NAFAG）ラボ食ペレット、ナファグ（NAFAG）、コッソー（Gossau）、スイス）は自由に与えた。
【０２１６】
　ペントバルビタールで麻酔したラットに、右脳側室にステンレスのガイドカニューレを定位移植する。耳を結ぶ線の−２．０mm下に切歯をセットした定位座標は：ブレグマに対して前方に−０．８mm、後方に＋１．３mmである。ガイドカニューレを硬膜の上に置く。注入カニューレをガイドカニューレから延長させる：頭蓋表面から横に３．８mm。手術後の回復のためにラットを少なくとも４日間放置し、その後実験に使用した。５０ngのアンギオテンシンIIの脳室内（i.c.v.）注入について、ラットの飲水応答を試験して、カニューレの位置を術後にチェックした。アンギオテンシンII注入３０分以内に少なくとも２．５mlの水を飲んだラットのみを、摂食実験に使用した。
【０２１７】
　すべての注入は、朝の点灯後２時間目に行なった。ペプチドは、人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）中５μｌの容量で注入した。ＡＣＳＦは以下を含有する：ＮａＣｌ　１２４mM、ＫＣｌ　３．７５mM、ＣａＣｌ２ ２．５mM、ＭｇＳＯ４ ２．０mM、ＫＨ２ＰＯ４　０．２２mM、ＮａＨＣＯ３ ２６mM、およびグルコース１０mM。ブタ−ＮＰＹを人工脳脊髄液（ＡＣＳ）に溶解した。i.c.v.注入のために、試験化合物をＤＭＳＯ／水（１０％、v/v ）に溶解することが好ましい。化合物の腹腔内投与（i.p.）、皮下（s.c.）、または経口（p.o.）的送達のための賦形剤には、それぞれ水、生理食塩水もしくはＤＭＳＯ／水（１０％、v/v ）、またはクレモフォール（cremophor）／水（２０％、v/v ）が好ましい。
【０２１８】
　試験化合物とｐ−ＮＰＹの両方で処理するラットは、まず試験化合物で処理する。次に試験化合物または賦形剤（対照）のi.c.v.投与１０分後、試験化合物または賦形剤のi.p.、s.c.およびp.o.投与の３０〜６０分後、３００ピコモルのＮＰＹを脳側室内投与（i.c.v.）した。
【０２１９】
　食物摂取は、ＮＰＹ注入時にケージ内にあらかじめ秤量したペレットを入れて測定した。次に各選択時点でケージからペレットを取り、あらかじめ秤量したペレットの新しいセットと交換した。試験化合物で処理したラットの食物摂取は、対照ラット（すなわち、賦形剤で処理したラット）の食物摂取のパーセントとして計算した。あるいは、同じ実験条件においたラットの群の食物摂取を、平均±標準誤差として表すことができる。統計解析は、スチューデント−ニューマン−ケウルス（Student-Newman-Keuls）検定を用いる分散解析により行なった。
【０２２０】
食物を欠乏させたラットの食物摂取
　体重２２０〜２５０ｇのオスのスプラーグ−ドーレイ（Sprague-Dawley）ラットで食物欠乏実験を行なった。ラットを受領後、試験の期間中１匹ずつ檻に入れ、水道水とともに通常の食物は自由に与えた。ラットを２４℃で１２時間の明／暗サイクル（午前８：００〜午後８：００が明るい）で維持し、湿度を追跡した。個別のケージに入れた後、４日間ラットの平衡期間を設け、この間新しい環境に慣れさせ、粉末化またはペレット食を与えた（ナファグ（NAFAG ）、コッソー（Gossau）、スイス）。
【０２２１】
　平衡期間後、午前８：００時に開始して２４時間ラットから食物を取った。この絶食期間の最後に、経口的または腹腔内または静脈内投与により、ラットに化合物または賦形剤を投与した。１０〜６０分後、食物をラットに戻し、以後２４時間ラットの食物摂取を種々の時間間隔で追跡した。試験化合物で処理したラットの食物摂取は、対照ラット（すなわち、賦形剤で処理したラット）の食物摂取のパーセントとして計算した。あるいは、同じ実験条件においたラットの群の食物摂取を、平均±標準誤差として表すことができる。
【０２２２】
肥満ズッカー（Zucker）ラットの食物摂取
　本発明の化合物の肥満抑制作用は、肥満の動物モデルとして知られているズッカー（Zucker）肥満ラットでも現れるかも知れない。これらの実験は、体重４８０ｇ〜５００ｇのオスのズッカー（Zucker）肥満ラット（ｆａ／ｆａハーラン（Harlan）ＣＰＢ、アウステリッツ（Austerlitz）、エヌエル（ＮＬ））を用いて行なった。試験の期間中ラットを１匹ずつ代謝ケージに入れ、通常の食物と水は自由に与えた。ラットを２４℃で１２時間の明／暗サイクル（午前８：００〜午後８：００が明るい）で維持し、湿度を追跡した。代謝ケージに入れた後、６日間ラットの平衡期間を設け、この間新しい環境に慣れさせ、粉末食を与えた。平衡期間後、明期間と暗期間の食物摂取を測定した。３日間の対照期間後、ラットを試験化合物または賦形剤（好ましくは、水または生理食塩水またはＤＭＳＯ／水（１０％、v/v ）またはクレモフォア（cremophor ）／水（２０％、v/v ）で処理した。次に以後３日間食物摂取を追跡して、試験化合物担体のみの投与の影響を測定した。前述の試験と同様に、薬物の存在下での食物摂取は、賦形剤で処理したラットの食物摂取のパーセントとして計算した。
【０２２３】
材料
　細胞培養培地と補足物は、スペシャルティメディア（Specialty Media ）（ラバレッテ（Lavallette）、ニュージャージー州）から得た。細胞培養プレート（１５０mmプレートおよび９６ウェルマイクロタイタープレート）は、コーニング（Corning ）、ニューヨーク州）から得た。Ｓｆ９、Ｓｆ２１、およびハイファイブ（High Five ）昆虫細胞、およびバキュロウイルス移動プラスミドであるｐＢｌｕｅＢａｃIII （登録商標）は、インビトロゲン社（Invitrogen Corp.）、サンジエゴ、カリホルニア州）から購入した。１０％胎児牛血清を補足したＴＭＮ−ＦＨ昆虫培地と、バキュロウイルスＤＮＡであるバキュコゴールド（BaculoGold）（登録商標）は、ファルミンゲン（Pharmingen）（サンジエゴ、カリホルニア州）から得た。Ｌ−グルタミン含有Ｅｘ−Ｃｅｌｌ　４００（登録商標）培地は、ジェイアールエィチサイエンティフィック（JRH Scientific）から購入した。ポリプロピレン製９６ウェルマイクロタイタープレートは、コースター（Co-star ）（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）から得た。市販のＮＰＹと関連ペプチド類似体は、バケムカリホルニア（Bachem California）（トランス（Torrance）、カリホルニア州）またはペニンスラ（Peninsula）（ベルモント、カリホルニア州）から得た。［Ｄ−Ｔｒｐ３２］ＮＰＹとＰＰ　Ｃ−末端断片は注文によりカイロンミモトープスペプチドシステムズ（Chiron Mimotopes Peptide Systems）（サンジエゴ、カリホルニア州）から合成した。バイオラッド（Bio-Rad ）試薬はバイオラッド（Bio-Rad ）（ハーキュリーズ（Hercules）、カリホルニア州）から得た。ウシ血清アルブミン（ウルトラファットフリー（ultra-fat free）、Ａ−７５１１）は、シグマ（Sigma ）（セントルイス、ミズーリ州）から得た。他のすべての材料は試薬等級であった。
【０２２４】
実験結果
ｃＤＮＡクローニング
　ラットの視床下部「非定型」ＮＰＹ受容体サブタイプをクローン化するために、本出願人はＣＯＳ−７細胞での発現クローニング法を使用した（Gearing ら、1989；Kluxenら、1992；Kieferら、1992）。この方法は、直接顕微鏡オートラジオグラフィーにより単一の「受容体陽性」細胞の検出を可能にし、非常に感度が高いため選択した。「非定型」受容体は、ラット視床下部のＮＰＹとＮＰＹ関連リガンドの注入を伴う摂食行動試験で記載されているのみである（緒言参照）ため、本出願人はまず、ラットの視床下部から調製した膜上での １２５Ｉ−ＰＹＹおよび １２５Ｉ−ＰＹＹ３−３６の競合的置換実験を行って結合プロフィールを調べた。競合的置換データは、以下を示す。１）ヒトＰＰは、結合した １２５Ｉ−ＰＹＹの２０％をＩＣ５０が１１nMで置換することができる（図１と表２）。表５に示すように、この値は、単離されたラットのＹ１、Ｙ２およびＹ４クローンと一致せず、従って他のＮＰＹ／ＰＹＹ受容体サブタイプに対応する可能性がある。２）［Ｌｅｕ３１、Ｐｒｏ３４］ＮＰＹ（Ｙ１特異的リガンド）は、高親和性（ＩＣ５０が０．３８）で、結合した １２５Ｉ−ＰＹＹ３−３６リガンド（Ｙ２特異的リガンド）の２７％を置換することができる（図２と表２）。これらのデータは、ラットの視床下部膜が、摂食行動試験で規定された薬理学に一致する混合Ｙ１／Ｙ２（以後「非定型」サブタイプと呼ぶ）で、ＮＰＹ受容体サブタイプを有する可能性のあるという結合測定法に基づく、最初の証拠を提供する。
【０２２５】
表２：ラット視床下部の薬理学的プロフィール
　結合データは、ラット視床下部膜からの １２５Ｉ−ＰＹＹおよび １２５Ｉ−ＰＹＹ３−３６の競合的置換を反映する。ペプチドは、特に明記しない場合は０．００１nM〜１００nMの範囲の濃度で試験した。５０％置換に対応するＩＣ５０値と、３００nMのヒトＮＰＹにより産生されたものに対する置換割合は、非線形回帰分析により求めた。示したデータは、少なくとも2つの独立した実験を代表する。
【表２】
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　上記データに基づき、２．７kb平均挿入体サイズの３×１０６ の独立した組換え体のラット視床下部ｃＤＮＡライブラリーを、約７５００の独立したクローンの４５０プールに分画した。すべてのプールは、前述のように（米国出願第０８／１９２，２８８号） １２５Ｉ−ＰＹＹを用いる結合測定法で試験した。スクリーニング測定法で７つのプールが陽性の細胞を与えた（第８１、９２、１４７、２４６、２５４、２９０、３１２）。Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４およびＹ５受容体サブタイプ（ＰＣＲまたは結合解析による）はラット視床下部で発現されるため、本出願人は、ラットＹ１、Ｙ２およびＹ４特異的プライマーを用いるＰＣＲにより、陽性プールのＤＮＡを解析した。プール１４７、２４６、２５４および３１２は、Ｙ１受容体をコードするｃＤＮＡを含有し、プール２９０はＹ２受容体サブタイプをコードするｃＤＮＡを含有したが、プール８１と９２は、Ｙ１、Ｙ２およびＹ４についてＰＣＲ解析で陰性であったため、従って新しいラット視床下部ＮＰＹ受容体（Ｙ５）をコードするｃＤＮＡを含有する可能性がある。プール８１と９２は後に同一のＮＰＹ受容体ｃＤＮＡを含有することが明らかになった。プール９２を、単一のクローン（ＣＧ−１８と命名）が単離されるまで米国出願第０８／１９２，２８８号に記載のように同胞選択を行なった。
【０２２６】
　単離したクローンは、２．８kbのｃＤＮＡを有する。このｃＤＮＡは、ヌクレオチド７７９と２１４６の間に読みとり枠を含有し、４５６アミノ酸のタンパク質をコードする。長い５’非翻訳領域は、翻訳効率またはｍＲＮＡ安定性の制御に関係している。推定の開始コドンの周りの隣接配列は、最適の翻訳開始のためのコザック（Kozak）共通配列と一致しない（コザック（Kozak）、１９８９、１９９１）。疎水性プロットは、７つの疎水性の推定の膜にまたがる領域を示し、これはラット視床下部Ｙ５受容体をＧタンパク質結合スーパーファミリーの１つにしている。ヌクレオチドと推定アミノ酸配列をそれぞれ図３と４に示す。ほとんどのＧタンパク質結合受容体のように、Ｙ５受容体は膜タンパク質の正しい発現（KornfelgとKornfeld、１９８５）に関与するアミノ末端（２１位と２８位）のＮ−結合グリコシル化のための共通配列を含有する。Ｙ５受容体は、機能性タンパク質構造（Probstら、１９９２）を安定化させるジスルフィド結合を形成すると考えられる最初の２つの細胞外ループ中に２つの高度に保存されたシステイン残基を有する。Ｙ５受容体は、２０４、２１７、２５４、２７３、２８５、３０１、３２８、３２６、および４０９位にタンパク質キナーゼのための可能性のある９つのリン酸化部位、および２９８と３７０位にｃＡＭＰ−およびｃＧＭＰ−依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位を示す。これらの１１の可能性のああるリン酸化部位のうち８つは、第３の細胞内ループに位置し、２つは第２の細胞内ループに位置し、１つは受容体のカルボキシ末端に位置し、従ってＹ５受容体の機能性特徴の制御にある役割を果たしている（Probstら、１９９２）。さらにラットＹ５受容体は、最初の推定膜貫通（transmembrane ）ドメインにロイシンジッパーモチーフ（leucine zipper motif）を有する（Landschulzら、１９８８）。チロシンキナーゼリン酸化部位は、ロイシンジッパーの真ん中に存在する。
【０２２７】
　局在化試験（後述）は、ラット海馬のいくつかの領域にＹ５　ｍＲＮＡが存在することを示す。ヒト脳において同等の局在化を仮定して、本出願人は、米国出願第０８／１９２，２８８号に記載のように、ラットオリゴヌクレオチドプライマーを用いてヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、ヒト海馬ｃＤＮＡでＰＣＲ反応を行うと予測されたサイズのＤＮＡバンドが得られた（C. Gerald 、未公表結果）。このＰＣＲスクリーニング方策（Geraldら、１９９４、発表のために投稿中）、３つの陽性プールが同定された。これらのプールの１つをさらに解析し、単離されたクローンを同胞選択により精製した。単離したクローン（ＣＧ−１９）は、機能性発現のための正しい配向でクローン化された全長ｃＤＮＡを含有していた（後述）。ヒトＹ５ヌクレオチドと推定されるアミノ酸配列を、それぞれ図５と６に示す。ラットのＹ５受容体と比較すると、ヒトの配列は、８４．１％のヌクレオチド同一性（図７Ａと７Ｅ）、および８７．２％のアミノ酸同一性（図７Ｆと７Ｇ）を示す。ラットのタンパク質配列は、ラットと比較すると、受容体のアミノテールとカルボキシテールの両方の末端で１アミノ酸長い。ヒト５−６ループは、ラットより１アミノ酸長く、複数の非保存的置換を示している。５−６ループは、ラットとヒトの同族体の間で大きな変化を示すが、ラットの受容体中に存在するタンパク質モチーフのすべては、ヒトの同族体中に存在する。すべての推定膜貫通ドメインおよび余分の細胞性ループ例は高度に保存されている（図７Ｆと７Ｇ）。従って、ラットとヒトのＹ５受容体サブタイプ同族体の薬理学的プロフィールと機能性特徴は、密接に一致することが予測される。
【０２２８】
　ヒトおよびラットのＹ５受容体配列を、他の受容体サブタイプまたは他のヒトＧタンパク質結合受容体サブタイプと比較すると、全体的および膜貫通ドメインの同一性は非常に低く、Ｙ５受容体遺伝子は他のすでに性状解析されているｃＤＮＡのいずれにも密接な関連はないことを示している。ヒトのＮＰＹ受容体ファミリーの中でも、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４およびＹ５メンバーは、異常に低レベルのアミノ酸同一性を示す（図８Ａ〜８Ｃ）。
【０２２９】
　表３：他のヒトＮＰＹ受容体サブタイプおよび他のヒトＧタンパク質結合受容体とのヒトＹ５膜貫通ドメインの同一性
【表３】
2004137276.tif 000004
　ノーザンブロット解析
　ラットＹ５プローブを用いると、ノーザンハイブリダイゼーションは、ラット脳全体で２．７kbで強いシグナルそして８kbで弱いバンドを示す。弱いシグナルは、睾丸の２．７kbで観察される。心臓、脾臓、肺、肝臓、骨格筋および腎臓では、３日間の曝露後にシグナルは見られなかった（図１６Ａ）。これは、発現クローニングにより我々がラット海馬から単離した２．７kbのｃＤＮＡに一致し、我々のｃＤＮＡクローンが全長であることを示す。脳全体で見られる８kbのバンドは、おそらくスプライスされていないプレｍＲＮＡに対応する。
【０２３０】
　ヒトＹ５プローブでは、ノーザンハイブリダイゼーション（図１６Ｂと１６Ｃ）は、尾状核、被殻および大脳皮質で２．２と１．１kbではるかに弱いバンド、前葉および扁桃で中程度のシグナル、そして海馬、後頭葉、脊髄、骨髄、視床、視床下核、および黒質で弱いシグナルを示した、小脳または脳梁では４８時間の曝露後３．５kbにシグナルは検出されなかった。クロンテック（Clontech）のＭＴＮ　IIとIII ブロットは、視床下部、水道周囲灰白質、上丘および縫線からのｍＲＮＡを含有しないことに注意すべきである。
【０２３１】
　ヒトゲノムＤＮＡに対するサザンブロット解析は、５つの制限消化物のうち４つでユニークなバンドパターンを示す（図１７Ａ）。ＰｓｔＩ消化物で観察される２つのバンドは、ヒトＹ５遺伝子のコード配列中のＰｓｔＩの存在により説明できる。ラットのサザンブロット解析は、試験した５つの制限消化物のすべてでユニークなバンドパターンを示した（図１７Ｂ）。これらの解析結果は、Ｙ５受容体遺伝子濃縮単一のコピーを含有するヒトおよびラットゲノムに一致する。
【０２３２】
　イヌＹ５同族体
　今日までに得られているイヌのヌクレオチド配列（ＰＣＲまたは３’ＲＡＣＥ産物）は、ＴＭ　III のすぐ上流の最初の細胞外ループから３’非翻訳領域までのイヌＹ５受容体にまたがる（図１４）。コード領域では、ヒトとラットの配列の両方に、このヌクレオチド配列は高度に似ている（それぞれ、９１％と８３．３％）。推定されるＹ５アミノ酸配列を図１５に示す。このアミノ酸配列は、再びヒトとラットのＹ５配列の両方に非常によく似ており（それぞれ、９４．６％と８９．５％）、ほとんどのアミノ酸の変化は５−６ループに位置している。従って、イヌのＹ５受容体サブタイプの薬理学的プロフィールは、ヒトおよびラットＹ５プロフィールによく似ていると予測される。
【０２３３】
　結合試験
　詳細な薬理学的評価のために、ラット視床下部Ｙ５受容体のｃＤＮＡをＣＯＳ−７細胞で一過性に発現させた。 １２５Ｉ−ＰＹＹは、ラットＹ５受容体作製体で一過性トランスフェクションを行なったＣＯＳ−７細胞の膜に特異的に結合した。特異的結合の経時変化を、３０℃で０．０８nMの １２５Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定した。結合曲線は１相性であり、観察された会合速度（Ｋｏｂｓ ）は０．０６分−１でｔ１／２ は１１分であった。７１分以内に平衡結合は９９％完了し、少なくとも１８０分安定であった。以後のすべての結合測定法は、３０℃で１２０分行なった。一過性に発現したラットＹ５受容体への １２５Ｉ−ＰＹＹの結合は、放射性リガンド濃度０．４pM〜２．７nMで飽和可能であった。結合データは、見かけのＫｄ が０．２９nM（ｐＫｄ ＝９．５４±０．１３、ｎ＝４）で１部位結合モデルに一致した。５〜１０ピコモル/mg 膜タンパク質の受容体密度を、凍結し液体窒素で保存した膜で測定した（図１０）。疑似（mock）トランスフェクション細胞の膜はＣＧ−１８でトランスフェクションした細胞と同じ方法で調製し解析した時、 １２５Ｉ−ＰＹＹの特異的結合は示さなかった（データは示していない）。本出願人は、記載した条件下で観察される １２５Ｉ−ＰＹＹ結合部位は、ラットＹ５受容体作製体に由来すると結論する。
【０２３４】
　密接に関連するペプチド類似体であるブタ １２５Ｉ−［Ｌｅｕ３１，Ｐｒｏ３４］ＰＹＹも、ラットＹ５受容体ｃＤＮＡで一過性にトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞の膜に特異的に結合した。標準的結合緩衝液（［Ｎａ＋ ］＝１０mM）と等張結合緩衝液（［Ｎａ＋ ］＝１３８mM）の両方で、０．０８nMの １２５Ｉ−［Ｌｅｕ３１，Ｐｒｏ３４］ＰＹＹを用いて室温で特異的結合の経時変化を測定した（図１８）。１０mM［Ｎａ＋ ］での結合曲線は１相性であり、観察された会合速度（Ｋｏｂｓ ）は０．０４２分−１でｔ１／２ は１７分であった。１１０分以内に平衡結合は９９％完了し、少なくとも２１０分安定であった（特異的結合は、４８０フェトモル/mg 膜タンパク質で最大であった）。１３８mM［Ｎａ＋ ］での結合曲線もまた１相性であり、経時変化は少し遅かった。（Ｋｏｂｓ ）は０．０２９分−１でｔ１／２ は２４分であった。１６０分以内に平衡結合は９９％完了し、少なくとも２１０分安定であった（特異的結合は、３３０フェトモル/mg 膜タンパク質で最大であった）。［Ｎａ＋ ］が増加すると特異的結合が低下することに注意されたい。他のＧタンパク質結合受容体についても同様の現象が観察されており、Ｎａ＋ により調節されるこの受容体ファミリーの一般的性質を反映しているかも知れない（Horstmanら、1990）。飽和結合試験は、等張緩衝液中の １２５Ｉ−［Ｌｅｕ３１，Ｐｒｏ３４］ＰＹＹで室温で１２０分かけて行なった。一過性にトランスフェクションしたラットＹ５受容体への特異的結合は、０．６pM〜１．９nMの放射性リガンド濃度範囲で飽和可能であった。結合データは、見かけのＫｄ が０．０７２nM（ｐＫｄ ＝１０．１４±０．０７、ｎ＝２）で１部位結合モデルに一致した。凍結し液体窒素で保存した膜上の受容体密度５６０±１５０ピコモル／mg。 １２５Ｉ−［Ｌｅｕ３１，Ｐｒｏ３４］ＰＹＹで室温でラットＹ５受容体に高親和性で結合できることは、オートラジオグラフィー法を用いてラット組織で未変性のＹ５受容体を性状解析するための有用なリガンドとなる可能性がある。しかし、Ｙ１やＹ４受容体のような他の受容体の放射能標識の可能性を阻止するために、適当なマスキング剤を用いることに注意すべきである（表５において、ラットＹ１とＹ４は、構造同族体［Ｐｒｏ３４］ＰＹＹに結合する）。Ｙ１−選択性放射性リガンドとしての １２５Ｉ−［Ｌｅｕ３１，Ｐｒｏ３４］ＰＹＹのすでに公表されている報告は、ラットＹ５受容体で得られた新しいデータの点から再評価すべきである（Dumontら、1995）。
【０２３５】
　ラットＹ５受容体の薬理学的プロフィールを、まず膜結合測定法において膵臓ポリペプチド類似体を用いて試験した。選択された化合物の親和性のランクオーダーを、 １２５Ｉ−ＰＹＹの競合的置換から得た（図１１）。ラットＹ５受容体を、ヒト（表４）およびラット（表５）からのＹ１、Ｙ２およびＹ４受容体（すべてＣＯＳ−７細胞中で一過性に発現した）と比較した。放射性リガンドスクリーニングに適したモデルが同定されていないため、我々のパネルにない１つの受容体サブタイプはＹ３（ヒトまたはラット）である。
【０２３６】
表４：ラットＹ５受容体対ヒトからクローン化したＹ型受容体の薬理学的プロフィール
　結合データは、ラットＹ５とヒトサブタイプクローンを一過性に発現するＣＯＳ−７細胞の膜からの １２５Ｉ−ＰＹＹの競合的置換を反映する。ペプチドを、記載した０．００１nM〜１０００nMの範囲の濃度で試験した。５０％置換に対応するＩＣ５０値は、非線形回帰分析から求め、チェン−プルソフ（Cheng-Prusoff ）式に従ってＫｉ 値に変換した。示したデータは、少なくとも２つの独立した実験の代表値である。
【表４】
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　表５：ラットＹ５受容体対ラットからクローン化したＹ型受容体の薬理学的プロフィール
　結合データは、ラットＹ５とラットサブタイプクローンを一過性に発現するＣＯＳ−７細胞の膜からの １２５Ｉ−ＰＹＹの競合的置換を反映する。ペプチドを、０．００１nM〜１０００nMの範囲の濃度で試験した。５０％置換に対応するＩＣ５０値は、非線形回帰分析から求め、チェン−プルソフ（Cheng-Prusoff ）式に従ってＫｉ 値に変換した。示したデータは、少なくとも２つの独立した実験の代表値である。例外：新しいペプチド（２つの星印で示した）は、１つまたは２つの独立した実験で試験した。
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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　ラットＹ５受容体は、ヒトおよびラットＹ型受容体と比較するとユニークな薬理学的プロフィールを有していた。ほとんどのＰＰ誘導体について、これはラット／ヒトＮＰＹ（Ｋｉ＝０．６８nM）およびラット／ブタＰＹＹ（Ｋｉ＝０．６４nM）の構造類似体に対して親和性を示した。サケＰＰ（Ｋｉ＝０．３１nM）に対する高親和性は、８１％のアミノ酸配列を共有し、重要な点（Ｔｙｒ１ 、Ｇｌｎ３４、およびＹｔｒ３６）で同一性を保持する、サケＰＰとラットＮＰＹの間の密接な類似性を反映している。Ｎ−末端とＣ−末端ペプチドドメインの両方が、受容体認識に重要であると思われる。ＮＰＹまたはＰＹＹのＮ−末端チロシンを欠失させても結合親和性（ラット／ヒトＮＰＹ２−３６についてＫｉ＝０．８６nM）は大きく低下しないが、さらにＮ−末端を欠失させると親和性がなくなる（ブタＮＰＹ１３−３６ についてＫｉ＝７３nM）。このパターンは、Ｙ５受容体の結合プロフィールをＹ２受容体（極端なＮ−末端欠失に耐える）とＹ１受容体（この受容体は、たった１つのＮ−末端残基の欠失に対しても感受性がある）の結合プロフィールの間のどこかに位置させる。ヒトのＹ４受容体も同様に説明できることに注意されたい（ヒトＰＰについてＫｉ＝０．０６nM、ヒトＰＰ２−３６についてＫｉ＝０．０６nM、そしてヒトＰＰＹ１３−３６ についてＫｉ＝３９nM）。Ｙ５受容体は、Ｐｒｏ３４を含有するリガンドに対する耐性において、Ｙ１受容体およびＹ４受容体の両方に似ていた（ヒト［Ｌｅｕ３１，Ｐｒｏ３４］ＮＰＹ、ヒト［Ｐｒｏ３４］−ＰＹＹ、およびヒトＰＰのように）。興味深いことに、ラットＹ５受容体は、ラットＰＰ（Ｋｉ＝１８０nM）よりヒトＰＰ（Ｋｉ＝５．０nM）に対して親和性を示した。このパターンが、ラットＹ５受容体をラットＹ４受容体から区別しており、後者はヒトおよびラットＰＰに対して、Ｋｉ値＜０．２nMで結合する。ＮＰＹ遊離酸のように、カルボキシ末端アミドを加水分解して遊離カルボン酸にすると、ラットＹ５受容体に対する結合親和性がなくなった（Ｋｉ＝４８０nM）。またアミドは、膵臓のポリペプチドファミリー／受容体相互作用に共通に必要な構造的要求と思われる。
【０２３７】
　Ｋｉ≦５．０nMでラットＹ５受容体に結合するいくつかのペプチドは、ラットの摂食行動を刺激することがすでに証明されている。これらには、ラット／ヒトＮＰＹ（Ｋｉ＝０．６８nM）、ラット／ブタＰＰＹ（Ｋｉ＝０．６４nM）、ラット／ヒトＮＰＹ２−３６（Ｋｉ＝０．８６nM）、ラット／ヒト［Ｌｅｕ３１，Ｐｒｏ３４］ＮＰＹ（Ｋｉ＝１．０nM）、およびヒトＰＰ（Ｋｉ＝５．０nM）がある。逆に、食欲促進剤としての作用が比較的小さいペプチドは、ＣＧ−１８への結合は弱かった。これらには、ＮＰＹ１３−３６ （Ｋｉ＝７３nM）、ブタＣ２−ＮＰＹ（Ｋｉ＝４７０nM）、およびヒトＮＰＹ遊離酸（Ｋｉ＝４８０nM）がある。ｋｉ値のランクオーダーは、ペプチドをi.c.v.またはラットの視床下部に直接注入して摂食行動を刺激する力価や活性のランクオーダーと一致していた（Clarkら、1984；Stanleyら、1985；Kalraら、1991；Stanleyら、1992）。ラットＹ５受容体はまた、Balasubramaniam ら（1994）によりＮＰＹ−誘導性摂食を制御すると報告されている修飾ペプチドである［Ｄ−Ｔｒｐ３２］ＮＰＹに対して中程度の結合親和性を示す（Ｋｉ＝５３nM）。［Ｄ−Ｔｒｐ３２］ＮＰＹはＣＧ−１８に対して、試験した他のクローン化受容体（ヒトでもラットでも）より１０倍以上の選択性を示すことは注目すべきである。これらのデータは、クローン化Ｙ５受容体を摂食応答に明らかにかつ明確に結びつけている。
【０２３８】
　ヒト海馬から単離したヒトＹ５同族体に対応するｃＤＮＡを、膜結合試験のためにＣＯＳ−７細胞中で一過性にトランスフェクションさせた。ヒトＹ５受容体（ＣＧ−１９）への １２５Ｉ−ＰＹＹの結合は、放射性リガンド濃度８pM〜１．８nMの範囲で飽和可能であった。最初の実験で結合データは、見かけのＫｄ が０．１０nMで１部位結合モデルに一致した。繰り返し試験すると、見かけのＫｄ は０．１８nM（ｐＫｄ ＝９．７６±０．１１、ｎ＝４）であった。新鮮な膜では最大の受容体密度５００フェトモル/mg 膜タンパク質が測定された。膵臓ポリペプチドファミリーのペプチド類似体を用いて測定されるように、ヒトＹ５薬理学的プロフィールは、ラットＹ５受容体に著しくよく似ている（表６と７）。
【０２３９】
表６：ＣＯＳ−７細胞で一過性に発現およびＬＭ（ｔｋ−）細胞で安定に発現した、ヒトＹ５受容体に対するラットＹ５受容体の薬理学的プロフィール
　結合データは、ラットＹ５受容体およびそのヒト同族体を一過性に発現するＣＯＳ−７細胞およびヒトＹ５受容体を安定に発現するＬＭ（ｔｋ−）細胞の膜からの放射性リガンド（記載のように、 １２５Ｉ−ＰＹＹまたは １２５Ｉ−ＰＹＹ３−３６）の競合的置換を反映する。ペプチドを、０．００１nM〜１０００nMの範囲の濃度で試験した。５０％置換に対応するＩＣ５０値は、非線形回帰分析から求め、チェン−プルソフ（Cheng-Prusoff ）式に従ってＫｉ 値に変換した。新しいペプチドは２つの星印で示した。
【表６−１】
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【表６−２】
2004137276.tif 000010
　表７：ヒトからクローン化したＹ型受容体に対するヒトＹ５受容体の薬理学的プロフィール
　結合データは、他のヒトＹ５サブタイプクローンを一過性に発現するＣＯＳ−７細胞の膜からの １２５Ｉ−ＰＹＹの競合的置換を反映する。ペプチドを、０．００１nM〜１０００nMの範囲の濃度で試験した。５０％置換に対応するＩＣ５０値は、非線形回帰分析から求め、チェン−プルソフ（Cheng-Prusoff）式に従ってＫｉ 値に変換した。示したデータは、少なくとも２つの独立した実験の代表値である。
【表７】
2004137276.tif 000011
　昆虫細胞で発現したｈＹ５の結合試験
　まずｈＹ５受容体の発現を最適化するために試験を行なった。Ｓｆ９、Ｓｆ２１およびハイファイブ（High Five ）細胞を、感染多重度（ＭＯＩ）５でｈＹ５ＢＢ３ウイルスで感染させ、感染後４５時間目に結合分析のために膜を調製すると、４１７〜８２０フェトモル/mg タンパク質の範囲でＢｍａｘ が観察され、Ｓｆ２１細胞でのｈＹ５ＢＢ３が最大の発現を示した。従って、我々の次の実験ではＳｆ２１細胞を使用した。次に我々は、ＭＯＩ　１、２、５および１０を試験して、最適感染多重度（ＭＯＩ、細胞に対するウイルス粒子の比率）を調べた。Ｂｍａｘ 値はいずれのＭＯＩでも約１．１〜１．２ピコモル/mg タンパク質であり、細胞当たりのウイルス粒子の数を増加させても有害でも有益でもないことを示唆している。ウイルス力価計算値は近似値であるため、我々は以後の実験のためにＭＯＩ＝５を選択した。我々が試験した最後のパラメータは、感染後４５〜９６時間の範囲の、タンパク質発現のための感染後の時間である。我々は、感染の４５〜７３時間後に最適の発現が起きることを見いだした。要約すると我々は、Ｂｍａｘ が約１．２ピコモル/mg タンパク質で １２５Ｉ−ＰＹＹを結合するｈＹ５組換えバキュロウイルスを作成した。
【０２４０】
　ヒトＹ５同族体：バキュロウイルス感染したＳｆ２１昆虫卵巣細胞での一過性発現
　ヒトＹ５バキュロウイルス作製体で感染したＳｆ２１細胞を膜ホモジネートのように採取し、０．０８nMの放射性リガンドを用いて １２５Ｉ−ＰＹＹの特異的結合についてスクリーニングした。特異的結合は、Ｓｆ２１細胞から得られた試料Ｄ−２／［４］が最大（５００フェトモル／mg膜タンパク質）であった。バキュロウイルスプラスミドのみで感染させると、非特異結合は観察されなかった（データは示していない）。発現系がＣＯＳ−７細胞でもバキュロウイルス／Ｓｆ２１でも、ヒトＹ５受容体に対するブタ １２５Ｉ−ＰＹＹの結合親和性は同じ（０．１８nM）であると仮定すると、試料Ｄ−２／［４］の特異的結合は、見かけのＢｍａｘ が１６００フェトモル/mg タンパク質と予測させる。従ってバキュロウイルス／Ｓｆ２１発現系のバキュロウイルスのＹ５受容体収率は、ＣＯＳ−７細胞中と同等かまたはそれ以上である。我々は、バキュロウイルスはヒトＹ５受容体の大量生産に適した代替トランスフェクション法を与えると結論する。
【０２４１】
　Ｙ５受容体の安定な発現系：結合測定法における性状解析
　ラットＹ５受容体のｃＤＮＡは、特異的 １２５Ｉ−ＰＹＹ結合の欠如についてあらかじめスクリーニングした２９３細胞に安定にトランスフェクションされた（データは示していない）。ラットＹ５ｃＤＮＡ＋Ｇ−４１８耐性遺伝子による同時トランスフェクションとＧ−４１８による選択後、生存しているコロニーを０．０８nMの放射性リガンドを用いて １２５Ｉ−ＰＹＹの特異的結合について、膜ホモジネートのようにスクリーニングした。選択されたクローン（２９３クローン＃１２）は６５フェトモル １２５Ｉ−ＰＹＹ/mg タンパク質を結合し、機能性測定法でさらに試験するために単離した。
【０２４２】
　ヒトＹ５受容体のｃＤＮＡは、それぞれ特異的 １２５Ｉ−ＰＹＹ結合の欠如についてあらかじめスクリーニングしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞とＬＭ（ｔｋ−）細胞の両方に安定にトランスフェクションされた（データは示していない）。ヒトＹ５ｃＤＮＡ＋Ｇ−４１８耐性遺伝子による同時トランスフェクションとＧ−４１８による選択後、生存しているコロニーを０．０８nMの放射性リガンドを用いて １２５Ｉ−ＰＹＹの特異的結合について、膜ホモジネートのようにスクリーニングした。ＮＩＨ−３Ｔ３クローン＃８は４６フェトモル １２５Ｉ−ＰＹＹ/mg タンパク質を結合し、ＬＭ（ｔｋ−）クローン＃７は３２フェトモル １２５Ｉ−ＰＹＹ/mg タンパク質を結合した。これらの２つのクローンは、機能性測定法でさらに試験するために単離した。２５フェトモル/mg タンパク質を結合した第３のクローン（ＬＭ（ｔｋ−）＃３）は、カルシウム動員測定法で評価した。
【０２４３】
　ＮＩＨ−３Ｔ３細胞で安定に発現されたヒトＹ５（クローン＃８）は、 １２５Ｉ−ＰＹＹを用いて飽和結合測定法でさらに性状解析した。結合は放射性リガンド濃度０．４pM〜１．９nMの範囲で飽和可能であった。結合データは、見かけのＫｄ が０．３０nM（ｐＫｄ ＝９．５３、ｎ＝１）で１部位結合モデルに一致し、新鮮な膜を用いると見かけのＢｍａｘ は２１００フェトモル/mg 膜タンパク質であった。
【０２４４】
　ＬＭ（ｔｋ−）細胞で安定に発現されたヒトＹ５（クローン＃７）はさらに、 １２５Ｉ−ＰＹＹ、 １２５Ｉ−ＰＹＹ３−３６、および １２５Ｉ−ＮＰＹを用いる飽和結合測定法で性状解析した。 １２５Ｉ−ＰＹＹ結合は、０．４pM〜１．９nMの濃度範囲で１部位結合モデルに従って飽和可能であり、膜を凍結し液体窒素に保存した時、見かけのＫｄ が０．４７nM（ｐＫｄ ＝９．３２±０．０７、ｎ＝５）で、見かけのＢｍａｘ は最大８ピコモル/mg 膜タンパク質であった。ＬＭ（ｔｋ−）からのヒトＹ５受容体への １２５Ｉ−ＰＹＹ結合から得られたペプチドＫｉ値は、既に記載したヒトおよびラットＹ５発現系から得られたものと同様であった（表６）。ＬＭ（ｔｋ−）細胞中のヒトＹ５への １２５Ｉ−ＰＹＹ３−３６結合は、０．５pM〜２．０９nMの濃度範囲で１部位結合モデルに従って飽和可能であり、膜を凍結し液体窒素に保存した時、見かけのＫｄ が０．４０nM（ｐＫｄ ＝９．４０、ｎ＝１）で、見かけのＢｍａｘ は４９０フェトモル/mg 膜タンパク質であった。使用した放射性リガンドが １２５Ｉ−ＰＹＹであっても １２５Ｉ−ＰＹＹ３−３６でも、ペプチドリガンドは、ＬＭ（ｔｋ−）細胞中のヒトＹ５受容体に同等の親和性で結合するようであった（表６）。最後に、ＬＭ（ｔｋ−）細胞中のヒトＹ５への １２５Ｉ−ＰＹＹの結合は、０．４pM〜１．１９nMの濃度範囲で１部位結合モデルに従って飽和可能であり、膜を凍結し液体窒素に保存した時、見かけのＫｄ が０．２８nMで、見かけのＢｍａｘ は３６０フェトモル/mg 膜タンパク質であった。
【０２４５】
　全体としてのヒトおよびラットＹ５受容体の飽和結合試験を考慮すると、データは、Ｙ５受容体が膵臓ポリペプチドファミリー（ １２５Ｉ−ＰＹＹ、 １２５Ｉ−ＮＰＹ、 １２５Ｉ−ＰＹＹ３−３６、および １２５Ｉ−［Ｌｅｕ３１，Ｐｒｏ３４］ＰＹＹを含む）の複数の放射性リガンドペプチド類似体の標的であるという証拠を提供している。いわゆるＹ１およびＹ２選択性放射性リガンド（例えば、それぞれ １２５Ｉ−［Ｌｅｕ３１，Ｐｒｏ３４］ＰＹＹおよび １２５Ｉ−ＰＹＹ３−３６）（Dumontら、1995）は、Ｙ型受容体発現のための未変性の組織をプローブ探索する時注意すべきである。
【０２４６】
　受容体／Ｇタンパク質相互作用：グアニンヌクレオチドの作用
　特定のＧタンパク質結合受容体について、受容体集団の一部は典型的には、区別するためのアゴニストを用いて、高親和性リガンド結合部位で性状解析することができる。Ｇタンパク質へのＧＴＰまたは非加水分解性類似体の結合は、低親和性結合状態が好ましいウイルス競合のコンフォメーション変化を引き起こす。我々は、非加水分解性ＧＴＰであるＧｐｐ（ＮＨ）ｐが、ＣＯＳ−７細胞およびＬＭ（ｔｋ−）細胞中のＹ５への １２５Ｉ−ＰＹＹの結合を変化させるか否かを調べた（図１９）。ＣＯＳ−７細胞でのヒトおよびラットＹ５受容体の両方への １２５Ｉ−ＰＹＹの結合は、１nM〜１００μM の範囲の増加する濃度のＧｐｐ（ＮＨ）ｐに対して、比較的低感度であった。しかしＬＭ（ｔｋ−）細胞中のヒトＹ５受容体は、放射性リガンド結合において濃度依存性低下を示した（全濃度範囲で約８５フェトモル/mg タンパク質）。受容体調製物間の差は、１）高親和性受容体−アゴニスト複合体を支持する宿主細胞中で利用できるＧタンパク質の型、２）宿主細胞中の受容体貯蔵レベル、および３）受容体／Ｇタンパク質結合の効率、および４）受容体の多数のコンフォメーションを区別するアゴニスト（この場合、 １２５Ｉ−ＰＹＹ）の本質的能力、を含むいくつかの要因で説明できる。
【０２４７】
　機能性測定法
　これまで説明したＹ型受容体の活性化は、アデニル酸シクラーゼ活性（Ｇｉ またはＧｏ ）を阻害する百日咳毒素感受性Ｇタンパク質への結合が関与すると考えられる（WahlestedtとReis、1993）。非定型Ｙ１受容体がシクラーゼ阻害に関係していることは、百日咳毒素がインビボでのＮＰＹ誘導性摂食を阻害したという観察により支持される（Chanceら、1989）。単離される受容体の非存在下で、より決定的な解析は不可能であった。前記観察に基づき、本出願人は、ラットＹ５受容体で安定にトランスフェクションされたヒト胚腎２９３細胞中のフォルスコリン刺激ｃＡＭＰ蓄積を阻害するＮＰＹの能力を試験した。完全な細胞を１０μM のフォルスコリンとともにインキュベートすると、５分間でｃＡＭＰ蓄積（ラジオイムノアッセイで測定）が１０倍増加した。ラット／ヒトＮＰＹとともに同時にインキュベートすると、安定にトランスフェクションされた細胞中でフォルスコリン刺激ｃＡＭＰ蓄積が６７％低下した（図１２）が、トランスフェクションしない細胞では低下しなかった（データは示していない）。本出願人は、ラットＹ５受容体の活性化は、おそらくアデニル酸シクラーゼ活性の阻害により、ｃＡＭＰ蓄積を低下させると結論する。この結果は、すべてＹ型受容体そして特に非定型Ｙ１受容体の提唱されているシグナル化経路に一致する。
【０２４８】
　ラットの摂食行動を刺激する能力について選択されたペプチドは、ＥＣ５０＜１０nMでラットＹ５受容体を活性化することができた（Kalra ら、1991；Stanley ら、１９９２；Balasubramaniam ら、1994）。これらには、ラット／ヒトＮＰＹ（ＥＣ５０＝１．８nM）、ラット／ヒトＮＰＹ２−３６（ＥＣ５０＝２．０nM）、ラット／ヒト［Ｌｅｕ３１，Ｐｒｏ３４］ＮＰＹ（ＥＣ５０＝０．６nM）、ラット／ブタＰＹＹ（ＥＣ５０＝４．０nM）、およびラット／ヒト［Ｄ−Ｔｒｐ３２］ＮＰＹ（ＥＣ５０＝７．５nM）がある（表８）。 １２５Ｉ−ＰＹＹとペプチドリガンドのラットＹ５依存性結合から得られたＫｉ値（表５）は、ｃＡＭＰ蓄積のラットＹ５依存性制御から得られたＥＣ５０値と近い範囲にあった（表８）。表６のすべてのペプチドにより産生されたｃＡＭＰの最大抑制は、ＦＬＲＦアミド（FLRFamide ）（４２％）を除いて、ヒトＮＰＹにより産生されるものの８４％〜１２０％であった。特に興味深いのは、Ｙ５選択性ペプチド［Ｄ−Ｔｒｐ３２］ＮＰＹである。これは、ラット視床下部に注入された時食物摂取を刺激し、同じ方法でのＮＰＹ誘導性摂食も減弱させることが証明されているペプチドである（Balasubramaniam 、1994）。本出願人は、［Ｄ−Ｔｒｐ３２］ＮＰＹは、Ｋｉ＞５００nMで他のＹ型クローンに弱く結合し（表４と５）、機能性測定法で何の活性も示さないことを観察した（表１０）。これとは極めて対照的に、［Ｄ−Ｔｒｐ３２］ＮＰＹはＫｉ＝５３nMでＹ５受容体に結合し、ＥＣ５０が２５nmでＥｍａｘ ＝７２％の、フォルスコリン刺激ｃＡＭＰ蓄積に及ぼすＮＰＹの阻害作用に似ていた。［Ｄ−Ｔｒｐ３２］ＮＰＹがＹ５受容体を選択的に活性化するが他のサブタイプクローンでは検出可能な活性を有さないことは、Ｙ５受容体活性化は、インビボの摂食行動に及ぼす［Ｄ−Ｔｒｐ３２］ＮＰＹの刺激作用の原因であることを示唆している。
【０２４９】
　表８：ラットＹ５受容体の機能性活性化
　機能性データは、１０μM のフォルスコリンで刺激した安定にトランスフェクションした２９３細胞における、ｃＡＭＰ蓄積のラジオイムノアッセイから得られた。アゴニスト活性について、ペプチドを０．０３pM〜０．３μM の濃度範囲で試験した。ｃＡＭＰ蓄積の最大の阻害（Ｅｍａｘ ）および最大作用の半分を示す濃度（ＥＣ５０）を、４パラメータロジスティック式に従って非線形回帰分析により求めた。新しいペプチドを２つの星印で示す。
【表８】
2004137276.tif 000012
　ｃＡＭＰ蓄積を阻害するヒトＹ５受容体の能力を、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞とＬＭ（ｔｋ−）細胞（いずれも、Ｙ５作製体無しに［ｃＡＭＰ］のＮＰＹ依存性制御を示さない）で評価した。ヒトＹ５受容体で安定にトランスフェクションした完全な細胞を、ラットＹ５ｃＡＭＰ測定法で記載したように解析した。安定にトランスフェクションしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞を１０μM のフォルスコリンとインキュベートすると、［ｃＡＭＰ］が平均２１倍増加した（ｎ＝２）。ヒトＮＰＹとの同時インキュベーションでは、Ｅｍａｘ が４２％、ＥＣ５０が８．５nMでフォルスコリン刺激［ｃＡＭＰ］が低下した（図２０）。Ｙ５−トランスフェクションしたＬＭ（ｔｋ−）細胞を懸濁し次に再度蒔く方法は、ＮＰＹ様ペプチドに対する確実で信頼できる細胞応答と相関したため、ＬＭ（ｔｋ−）中のヒトＹ５の機能性評価のための標準的方法として取り込んだ。こうして調製した安定にトランスフェクションされたＬＭ（ｔｋ−）細胞をインキュベートすると、［ｃＡＭＰ］が平均７．４倍増加した（ｎ＝８７）。ヒトＮＰＹと同時にインキュベートすると、Ｅｍａｘ が７２％、ＥＣ５０が２．４nMでフォルスコリン刺激［ｃＡＭＰ］が低下した（図２１）。ヒトＹ５受容体は、ラットＹ５受容体について記載した応答と同様のランクオーダーでＮＰＹ様ペプチドに対する細胞性応答を支持した（表８、９）。ラットＹ５受容体は、Ｄ−Ｔｒｐ３２−ＮＰＹおよび他の薬理学的手段により摂食行動のＮＰＹ依存性制御に明らかに関係しているため、ヒトＹ５受容体は、同様の方法で機能すると予測される。ヒトおよび受容体同族体ともに、ＮＰＹ依存性経路を妨害して摂食行動を調節するための化合物のスクリーニングの有用なモデルである。
【０２５０】
　表９：ｃＡＭＰラジオイムノアッセイにおけるヒトＹ５受容体の機能性活性化
　機能性データは、１０μM のフォルスコリンで刺激した安定にトランスフェクションしたＬＭ（ｔｋ−）細胞における、ｃＡＭＰ蓄積のラジオイムノアッセイから得られた。アゴニスト活性について、ペプチドを０．０３pM〜０．３μM の濃度範囲で試験した。ｃＡＭＰ蓄積の最大の阻害（Ｅｍａｘ ）および最大作用の半分を示す濃度（ＥＣ５０）を、４パラメータロジスティック式に従って非線形回帰分析により求めた。
【表９】
2004137276.tif 000013
　表１０：［Ｄ−Ｔｒｐ３３］ＮＰＹの結合と機能性性状解析
　結合データは、表４と５に記載のように得た。機能性データは、１０μM のフォルスコリンで刺激した安定にトランスフェクションした細胞における、ｃＡＭＰ蓄積のラジオイムノアッセイから得られた。アゴニスト活性について、［Ｄ−Ｔｒｐ３３］ＮＰＹを０．０３pM〜０．３μM の濃度範囲で試験した。あるいは、［Ｄ−Ｔｒｐ３３］ＮＰＹを、ヒトＹ１およびヒトＹ２受容体のヒトＰＹＹ濃度曲線、またはヒトＹ４受容体のヒトＰＰ濃度曲線中の単一のスパイク（０．３μM ）として含有させ、アンタゴニスト活性は、右側（ＥＣ５０からＥＣ５０’へ）へのシフトの存在により検出した。Ｋｂ 値は、以下の式から計算した：Ｋｂ ＝［［Ｄ−Ｔｒｐ３３］ＮＰＹ／（（ＥＣ５０／ＥＣ５０’）−１）。示したデータは、少なくとも２つの独立した実験の代表値である。
【表１０】
2004137276.tif 000014
　機能性測定法：細胞内カルシウム動員
　１００nMのヒトＮＰＹでインキュベートすると３０秒以内に、ヒトＹ５受容体で安定にトランスフェクションしたＬＭ（ｔｋ−）細胞中で、細胞内遊離カルシウム濃度が増加した（ΔＣａ２＋＝３４、図２１Ｄ）。トランスフェクションしなかったＬＭ（ｔｋ−）細胞は、ヒトＮＰＹに応答しなかった（データは示していない）。カルシウム動員は、Ｙ５受容体活性化が測定できる第２の経路を提供する。これらのデータはまた、Ｙ５受容体を他のクローン化したヒトＹ型受容体（そのすべては、種々の発現系で細胞内カルシウムを動員することが証明されている）と関係付けるのにも有用である（図２１）。
【０２５１】
　局在化試験
　ＮＰＹ　Ｙ５受容体のｍＲＮＡは、ラット脳内に広く分布しており、適度に豊富なようである（表１１と図１３）。正中線視床（特に視床傍室核、菱形核、および結合核）は、その上に銀色の粒子を有する多くのニューロンを含有した。さらに、視床中内側核および視床前背核の両方でニューロンの上に適度に強いハイブリダイゼーションシグナルが観察された。視床下部では、外側視床下部核、傍室核、視索上核、弓状核、および背内側核において、分散したニューロンの上に適度なレベルのハイブリダイゼーションシグナルが見られた。内側視索前核および視交叉上核の両方で、銀粒子の弱いまたは適度の蓄積があった。視交叉上核では、ハイブリダイゼーションシグナルは主に腹側外側に限定されていた。視床下部傍室では、陽性のニューロンが、主に内側小細胞性網様部分で観察された。
【表１１】
2004137276.tif 000015
　海馬の歯状回の多形部分のほとんどのニューロンの上に適度のハイブリダイゼーションシグナルが見られ、ＣＡ３領域の分散したニューロン上には低レベルが見られた。扁桃体では、中心核と前皮質核は、適度なレベルのハイブリダイゼーションシグナルを有するニューロンを含有していた。中脳では、多くの場所でハイブリダイゼーションシグナルが観察された。最も強いシグナルは、前核および視蓋オリーブ前核、水道周囲灰白質中のニューロン、および頭側縫線上に見られた。適度なハイブリダイゼーションシグナルが、上丘の内部灰白層、黒質、緻密部、背側縫線、および橋核中のニューロンの上に観察された。下丘中のほとんどのニューロンは、低レベルのハイブリダイゼーションシグナルを示した。髄質と脳橋では、実質的なハイブリダイゼーションシグナルはほとんど見られなかった。前庭神経内側核は、小細胞性網様核、アルファ部、および巨大細胞性網様核のように、適度に標識された。
【０２５２】
　放射能標識したセンスオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズした切片では、ほとんどまたは全くハイブリダイゼーションシグナルは観察されなかった。さらに重要なことは、トランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞では、アンチセンスプローブは、ラットＹ５ｃＤＮＡでトランスフェクションした細胞にのみハイブリダイズしたことである（表１２）。これらの結果は、ラット脳のＹ５　ｍＲＮＡの分布を性状解析するために使用したプローブは、このｍＲＮＡに対して特異的であり、他の既知のＮＰＹ受容体ｍＲＮＡのいずれともハイブリダイズしないことを示している。
【０２５３】
表１２：トランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション
　ハイブリダイゼーションは、「方法」で記載のように行なった。ＮＰＹ　Ｙ５プローブは、Ｙ５　ｃＤＮＡでトランスフェクションした細胞にのみハイブリダイズする。ＮＤ＝試験しなかった。
【表１２】
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　Ｙ５選択性化合物によるインビボ試験
　前述の報告結果は、摂食行動の制御におけるＹ５受容体の役割を強く支持する。従って、本出願人は、いくつかの化合物を合成し、クローン化したヒトＹ１、ヒトＹ２、ヒトＹ４、およびヒトＹ５受容体におけるその化合物の機能的性質を評価した。表１３に示すように、本出願人は、ヒトＹ５受容体に選択的に結合するのみでなく、Ｙ５受容体アンタゴニストとしても作用（クローン化したヒトＹ５受容体で安定にトランスフェクションされたフォルスコリン刺激ＬＭ（ｔｋ−）細胞でのｃＡＭＰ蓄積の、ＮＰＹ誘導性阻害を阻止する能力により測定）するいくつかの化合物を発見した。そのような化合物の例を図２２に示す。予備的実験は、化合物２８はＹ５受容体アンタゴニストであることを示している。
【０２５４】
表１３：ヒトＹ５受容体アンタゴニストの評価
　Ｙ型受容体に拮抗する化合物の能力を、Ｋｂ として報告する。Ｋｂ は、化合物の存在下（ＥＣ５０）または非存在下（ＥＣ５０’）でのＥＣ５０または最大作用の半分の濃度から、以下の式に従って得られる：Ｋｂ ＝［ＮＰＹ］／（（ＥＣ５０／ＥＣ５０’）−１）。示した結果は、少なくとも３つの独立した実験の代表値である。Ｎ．Ｄ．＝試験しなかった。
【表１３】
2004137276.tif 000017
　これらの化合物を、摂食行動のインビボの動物モデルを用いてさらに試験した。摂食行動の既知の刺激物質の中でＮＰＹが最も強いため、充分に食餌を与えたラットのＮＰＹ誘導性摂食行動について、上記化合物の作用を評価するために、いくつかの化合物で実験を行なった。
【０２５５】
　まず、化合物賦形剤（１０％ＤＭＳＯ／水）を腹腔内投与投与するとともに、賦形剤（Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｆ．）中の３００ピコモルのブタＮＰＹを脳室内（i.c.v.）投与し、ＮＰＹ刺激ラットの食物摂取を、賦形剤で処理したラットの食物摂取と比較した。３００ピコモルのＮＰＹは、食物摂取を有意に誘導した（ｐ＜０．０５；スチューデント−ニューマン−ケウルス（Student-Newman-Keuls））。
【０２５６】
　摂食を刺激するのに有効であることがわかった３００ピコモルのＮＰＹを用いて、他のラットを腹腔内（i.p.）投与で処理し、次に３０〜６０分後ＮＰＹをi.c.v.投与し、そして以後の食物摂取を測定した。表１４に示すように、ＮＰＹ誘導性食物摂取は、最初に化合物で処理したラットで有意に低下した（ｐ＜０．０５；スチューデント−ニューマン−ケウルス（Student-Newman-Keuls））。これらの実験は、ＮＰＹ誘導性食物摂取は、Ｙ５選択性アンタゴニストである化合物をラットに投与することにより、有意に低下することを示している。
【０２５７】
表１４：i.c.v.とi.p.賦形剤（対照）、３００ピコモルのＮＰＹのみ（ＮＰＹ）で処理したラット、またはまず化合物で処理し次にＮＰＹで処理したラット（ＮＰＹ＋化合物）中のＮＰＹ誘導性累積食物摂取。食物摂取は、ＮＰＹで刺激の４時間後に測定した。食物摂取は、一群のラットについて平均±標準誤差として報告する。
【表１４】
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　食物欠乏は、視床下部ＮＰＹレベルの上昇を誘導するため、食物欠乏期間後の食物摂取はＮＰＹ仲介性であると提唱されている。従って、表１３のＹ５アンタゴニストを、意識のあるラットに投与した。表１３に示す各ヒトＹ５受容体アンタゴニストは、下記の表１５に示すように、ラットのＮＰＹ誘導性食物摂取を有意に低下させることができた。試験化合物で処理したラットの食物摂取は、対照ラット（賦形剤で処理）で測定した食物摂取のパーセントとして示した。すなわち、２５％は、試験化合物で処理したラットは、対照ラットのわずか２５％の食物しか消費しないことを意味する。測定は、試験化合物の投与２時間後に行なった。
【０２５８】
　表１５　ＮＰＹ刺激ラットの２時間食物摂取
　食物摂取は、対照ラットと比較した摂取のパーセントとして表した。
【表１５】
2004137276.tif 000019
　これらの実験は、本発明の化合物は、特に約０．０１〜約１００mg/kg ラットの範囲を、経口、腹腔内投与または静脈内投与により投与した時、ラットの食物摂取を阻害することを示す。これらの実験の間ラットは正常であると思われ、摂食実験の後に、ラットに有害な影響は観察されなかった。
【０２５９】
　他のクローン化したヒトＧタンパク質結合受容体に関して、化合物の結合性もまた評価した。以下の表１６に示すように、前述のＹ５選択性化合物は、Ｙ型受容体以外の受容体に対して低い親和性を示した。
【０２６０】
　表１６　他のクローン化ヒト受容体における化合物の交差反応性
【表１６−１】
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【表１６−２】
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　実験の考察
　新規なＮＰＹ受容体サブタイプを単離するために、本出願人は、高特異的ヨウ素化リガンドを使用する、トランスフェクションされた細胞の表面上に機能性受容体が鋭敏な感度で実際に検出される発現クローニング法を選択する。この方策を利用して、本出願人は、新規なＹ型受容体（Ｙ５）をコードするラット視床下部ｃＤＮＡを同定した。２つのクローンを見い出すために平均２．７kbの挿入断片の３．５×１０６ 個の独立クローンをスクリーニングする必要があったという事実により、ｃＤＮＡライブラリー作製方法においてＹ５　ｃＤＮＡクローニングに対する非常に強い偏りがあったか、またはラットの視床下部組織ではＹ５　ｍＲＮＡが非常に低レベルで発現するかのいずれかであることがわかる。ラットＹ５　ｃＤＮＡ（ＣＧ−１８）の最も長い読み取り枠は、５０．１kDの推定分子量を持つ４５６アミノ酸タンパク質をコードする。アミノ末端に２つのＮ結合グリコシル化部位があるとすれば、見掛けの分子量はもう少し大きいであろう。本出願人は、ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーからヒトＹ５同族体を単離した。ヒトＹ５　ｃＤＮＡ（ＣＧ−１９）の最も長い読み取り枠は、５０kDの推定分子量を持つ４５５アミノ酸のタンパク質をコードする。ヒトＹ５受容体は、ラットＹ５よりも１アミノ酸短く、タンパク質のＮ末端と３番目の細胞内ループの真ん中の両方に重大なアミノ酸の違いを示す。しかし、７つの膜貫通ドメインおよび細胞外ループは、実際上同一であり、かつ両方の種の同族体に見い出されるタンパク質モチーフは同一である。ヒトおよびラットＹ５受容体は両方とも、その２番目および３番目の細胞内ループに多くのリン酸化可能部位を有し、そしてこの部位が、これらの機能的特性の調節に関与しているのであろう。
【０２６１】
　ラットおよびヒトＹ５受容体は両方とも、１番目の推定膜貫通ドメインにロイシンジッパーを有する。このような構造において、ロイシン残基の周期的配列を含有するセグメントは、アルファらせんコンホメーションで存在することが提唱されている。１つのアルファらせんから伸長するロイシン側鎖は、第２のポリペプチドの同様なアルファらせんからの側鎖と相互作用して、コイル化コイルの形成により二量体化を促進する（O'Sheaら, 1989）。通常、このようなパターンは、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎのような核ＤＮＡ結合タンパク質に関連しているが、いくつかのタンパク質においてはロイシンの繰り返しが単純に二量体化を促進し、ＤＮＡ結合領域の位置にはほとんど関係ないという可能性がある。特異的な７つの膜貫通受容体の二量体化が起こりうるという説を指示するさらなる証拠は、キメラＧタンパク質結合受容体間の分子間「クロストーク（cross-talk）」が報告（Maggioら, 1993）されている、ムスカリン／アドレナリン受容体の同時発現試験から得られる。膜貫通ドメイン１（ＴＭ　Ｉ）のこのロイシンジッパーの中央部にあるチロシンリン酸化部位は、Ｙ５受容体の二量体化の調節に関与している可能性がある。Ｇタンパク結合受容体の二量体化の生理学的意義は解明されていないが、ペプチドホルモン受容体のオリゴマー化との類似により、これは、受容体活性化およびシグナル伝達に関与するであろう（Wells, 1994）。
【０２６２】
　Ｙ５（ラットおよびヒト）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列解析により、Ｙ１、Ｙ２およびＹ４受容体を含む全部で７つのＴＭ受容体では、通常受容体サブファミリー内では高度に保存されている膜貫通ドメイン内でさえ、同一性レベルが低いことが判る。本出願人は、ＣＧ−１８およびＣＧ−１９を、これらのユニークなアミノ酸配列（相互に８７．２％同一であり、以前にクローン化された「Ｙ」受容体サブタイプのＴＭ領域とは≦４２％同一である）および薬理学的プロフィールのため、「Ｙ５」受容体と命名した。この名称は、膵臓ポリペプチドファミリーの他のどのメンバーに対しても片寄らない。「Ｙ」は、Ｙ１およびＹ２受容体サブタイプの元々に分類に基づいている（Wahlestedtら, 1987）。この文字は、１文字アミノ酸コードで「Ｙ」として記載される、Ｃ末端チロシンの膵臓ポリペプチドファミリーメンバーにおける保存を反映している。数字は、Ｙ型の一連のもので次の利用可能なものであり、位置数の３は、薬理学的に定義されたＹ３受容体のためにとっておかれている。本出願人は、クローン化ヒトＹ１受容体が、Larhammarらにより「Ｙ１型のヒト神経ペプチドＹ／ペプチドＹＹ受容体」（Larhammarら, 1992）として紹介されたことを注目している。同様に、本明細書に記載される新規なクローンは、Ｙ５型のラットおよびヒト神経ペプチドＹ／ペプチドＹＹ受容体として説明することができる。
【０２６３】
　ラット視床下部Ｙ５受容体は、ラット視床下部におけるＮＰＹ誘導性食物摂取を仲介すると考えられる、薬理学的に記載された「非定型」Ｙ１受容体に非常に類似した薬理学的プロフィールを示す。Ｙ５受容体および「摂食（feeding）受容体」は、ＮＰＹおよびＰＹＹ様類似体に対する選択性、Ｎ末端ペプチド欠失に対する感受性およびＰｒｏ３４に対する寛容を示す。各々、ＮＰＹ同様に結合し活性化するＮＰＹ２−３６の変則的な能力を除いて、Ｙ１と同様であると考えらる。各々、ペプチドリガンドの中央部の変化に敏感であるように見える。例えば、Kalra ら（1991）による研究により、アミノ−オクタン酸鎖によるＮＰＹ中央領域の置換によって、摂食行動測定において劇的に活性の低下したＮＰＹ１−４ −Ａｃａ−２５−３６ が生成することが示された。同様に、本出願人は、ラットＹ５受容体に対するヒトＰＰ結合（Ｋｉ＝５．０nM）およびラットＰＰ結合（Ｋｉ＝２３０）における大きな差が、ペプチドリガンドにおける残基６〜３０の間の一連の８アミノ酸変化によるものであり、ヒトＰＰはヒトＮＰＹに対して類似性が高いことを注目している。また、ラットの摂食を促進することが報告されているＦＭＲＦアミドペプチドの構造類似体であるＦＬＲＦアミドは、比較的高濃度ではあるが、ラットＹ５受容体に結合して活性化することができることに注意されたい（Oroscoら, 1989）。報告された摂食「調節物質（modulator）」の［Ｄ−Ｔｒｐ３２ ］ＮＰＹによるラットＹ５の選択的活性化に関係した、これらの一致するプロフィールは、ラット視床下部におけるＮＰＹ誘導性摂食を説明するために最初に提案された「摂食受容体」としてのラットＹ５の同一性を支持する。ヒトＹ５受容体が、結合においても機能性アッセイにおいても、ラットＹ５の受容体と同様の薬理学的プロフィールを有することは、２つの受容体がインビボで類似した機能を有することを示唆している。
【０２６４】
　ラット脳におけるＹ５　ｍＲＮＡの分布は、摂食行動におけるＹ５受容体の役割に関する議論をさらに拡大する。例えば、摂食応答の解剖学的な位置は、少なくとも部分的には視床下部傍室核（ＰＶＮ）に、そして視床下部外側野（lateral hypothalamus）（Ｙ５　ｍＲＮＡが豊富に検出される２つの場所である）にも存在することが示唆されている。これらの両方の領域におけるＹ５受容体のシナプス後の局在により、インビボの内因性に放出されるＮＰＹに対する応答を調節することができる。傍室核は、Ｙ５　ｍＲＮＡが検出されるもう１つの領域である弓状核におけるＮＰＹ含有ニューロンからの投射を受ける。このことは、弓状核−傍室核投射によるＮＰＹ放出の制御における（そして、結果として摂食行動の制御における）Ｙ５受容体のシナプス前の役割を示している。正中線視床核（midline thalamic nuclei ）におけるＹ５　ｍＲＮＡの局在も重要である。視床傍室核／中心内側核複合体は、視床下部傍室核および扁桃核に多量に投射する。このように、Ｙ５受容体は、食欲行動の情動面の基質である。
【０２６５】
　Ｙ５受容体は、いくつかの研究ラインに基づく、食欲および体重コントロールのための非常に魅力的な標的である（SahuおよびKalra , 1993）。ＮＰＹは、これまでに報告された摂食行動の最も強力な刺激物質である（Clark ら, 1984; LevineおよびMorley, 1984; StanleyおよびLeibowitz, 1984）。ラットの視床下部へのＮＰＹの直接注射は、４時間にわたって食物摂取を約１０倍に増加させうる（Stanley ら, 1992）。ＮＰＹで刺激したラットは、タンパク質や脂肪よりも炭水化物への好みを示す（Stanley ら, 1985）。興味深いことに、ＮＰＹおよびＮＰＹ　ｍＲＮＡは、欠食ラット（Bradyら, 1990; O'SheaおよびGundlach, 1991）において、さらには遺伝的に肥満のラット（Sanacoraら, 1990）またはストレプトゾトシンでの処理により糖尿病にしたラット（White ら, 1990）においても増加する。可能性ある１つの説明は、正常ラットにおける摂食行動の強力な刺激物質であるＮＰＹは、超過重量または糖尿病の動物においては、肥満に伴って、調節不調となり食物摂取が増大する。肥満の生理学的ストレスにより、成人型糖尿病の予後の悪化と共に、冠血管機能不全、変形性関節症、および高インスリン血症のような健康上の問題のリスクが上昇する。したがってＹ５受容体を標的とする非ペプチド性アンタゴニストは、食欲と体重を制御するだけでなく、肥満−および糖尿病−関連疾患の全範囲を制御する方法として有効であろう（Drydenら, 1994）。また、ＮＰＹ介在性機能が、大食症および神経性食思不振症のような食行動異常において調節不調となり、そのため、これらもＹ５選択性薬剤による治療に応答性であるということを示唆する神経化学的な証拠もある。例えば、ＮＰＹ誘導ラットにおける食物摂取は、大食症における食行動耽溺に関連した大量食物消費によく似ている（Stanley , 1993）。ＮＰＹでなくてＰＹＹのＣＳＦレベルは、耽溺を断った大食症被験体において上昇し、そして耽溺を許すと減少した（Berrettiniら, 1988）。逆に、体重不足の食欲不振被験体ではＮＰＹレベルは上昇し、そして体重が正常に戻ると減少した（Kayeら, 1990）。
【０２６６】
　上述のように、ヒトおよびラットのインビトロ発現モデルは、ＮＰＹ依存性摂食行動を調節することを意図した化合物をスクリーニングするために、組合せて使用した。この研究方法を使用して、本出願人は、動物モデルにおいて摂食行動を阻害するいくつかの化合物を発見したが、これらは、さらなる薬剤の発見をもたらすはずである。本発明の化合物は、ズッカー（Zucker）肥満ラットにおける食物摂取を、特に約０．０１〜約１００mg/kg の範囲で経口、腹腔内または静脈投与後、阻害する。
【０２６７】
　Ｙ５薬理学的プロフィールはさらに、全てのＮＰＹ依存性プロセスの分子的基礎を検討するための新規な基準を提供する：例は表１１にリストする。このような検討は、Ｙ５受容体が、摂食行動を超えて生理学的重要性を有するらしいことを示唆する。例えば、Ｙ型受容体が、インビトロで、非定型Ｙ１の薬理学的プロフィールにより、ステロイドでプライムしたラットの内側隆起からの黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）放出を調節することができることが報告された。ＮＰＹ、ＮＰＹ２−３６、およびＬＰ−ＮＰＹは全て１μM で有効であったが、ＮＰＹのＮ末端からわずか４アミノ酸の欠失により生物学的活性は消失した。従ってＹ５は、性的または生殖器疾患の治療標的でありうる。海馬および他の部位のラットＹ５　ｍＲＮＡの予備的ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションにより、例えば記憶の調節における、さらなる役割が明らかになる。Ｙ５が、薬理学的プロフィールにおいて他のＹ型受容体と類似しているため、Ｙ１、Ｙ２およびＹ４受容体の混合集団の中で見落としがちであることは、考慮する価値がある。従って、現在これらのサブタイプに関連しているいくつかの機能は、我々の薬理学的な手段がさらに洗練されると、Ｙ５に割り当て直すこともあろう（表１８）。ＮＰＹ受容体の薬理学への新規な洞察を提供することにより、Ｙ５は、薬剤設計の分野においてさらなる明快さと焦点を提供する。
【表１７】
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　Ｙ５受容体に基づく薬剤の設計、または単一のＧタンパク結合受容体サブタイプを標的とする任意の薬剤のための成功する方策は、候補化合物を、１）放射性リガンド結合アッセイでスクリーニングして、交差反応性Ｇタンパク結合受容体に対する親和性を検出し、そして２）生理学的測定法でスクリーニングして、望ましくない副作用を検出することを含む。Ｙ５選択性薬剤のスクリーニングの具体的な方法において、交差反応するため放射性リガンド結合スクリーニングにおいて最も重要な受容体サブタイプは、他の「Ｙ型」受容体である、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、およびＹ４を含む。Ｙ５と任意の他のサブタイプの間の交差反応性は、表１７にリストされる病態生理学的適応症により示唆されるような、合併症の可能性を引き起こす。例えば、肥満および食欲コントロールのためのＹ５アンタゴニストを設計する際、高血圧または不安の増大を引き起こすＹ１アンタゴニスト、記憶喪失を引き起こすＹ２アンタゴニスト、または食欲増進を引き起こすＹ４アンタゴニストを設計しないことが重要である。
【表１８】
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　ヒトおよびラットからのＹ５受容体のクローニングは、ｉｎ　ｓｉｔｕ局在化に基づく受容体の性状解析、アンチセンス機能性ノックアウト、および遺伝子誘導のために、特に有用である。これらの研究は、Ｙ５受容体機能およびその治療的意義に関する重要な情報を与える。クローン化されたＹ５受容体は、受容体／リガンド相互作用をモデル化することが可能な突然変異誘発研究に役立つ。Ｙ５受容体により、我々はさらに、相同クローニングにより他のＹ型受容体の可能性を調べることができる。これらは、ヒトの病態に関連している実験動物モデルの確立のための、Ｙ５種の同族体のみならず新規な受容体サブタイプも含む。従ってＹ５受容体は、新規で選択的な薬物療法、詳細には食欲および体重コントロールを標的とするだけでなく、記憶喪失、うつ病、不安、胃潰瘍、癲癇発作、疼痛、高血圧、クモ膜下出血、睡眠障害、鼻うっ血、神経性排尿機能不全、および下痢の薬物療法を開発するための大きな機会となる。
【０２６８】
　特に、ラットの食物摂取を阻害するＹ５選択的アンタゴニストの発見は、広範な脊椎動物の摂食行動を調節する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０２６９】
【図１】ラット視床下部起源の１２５Ｉ―ＰＹＹの競合置換。膜は、競合ペプチドの濃度をあげながら１２５Ｉ―ＰＹＹでインキュベートした。５０％置換に匹敵するＩＣ５０は、非直線回帰分析によって決定された。データは少なくとも二つの独立して行われた実験のものを示す。これらの化合物のＩＣ５０値は、表２に別々に掲載されている。
【図２】ラット視床下部起源の１２５Ｉ−ＰＹＹ３―３６の競合置換。膜は、競合ペプチドの濃度をあげながら、１２５Ｉ―ＰＹＹ３―３６と共にインキュベートした。５０％置換に匹敵するＩＣ５０は、非直線回帰分析によって決定された。データは少なくとも二つの独立実験のものを示す。これらの化合物のＩＣ５０値は、表２に別々に掲載されている。
【図３】ラットの視床下部Ｙ５ ｃＤＮＡクローン（配列認識番号１）のヌクレオチド配列。開始コドンおよび停止コドンには下線が施してある。部分的５’および３’未翻訳配列のみ示されている。
【図４】ラット視床下部Ｙ５ ｃＤＮＡクローン（配列認識番号２）の対応アミノ酸配列。
【図５】ヒト海馬交連Ｙ５ ｃＤＮＡクローン（配列認識番号３）のヌクレオチド配列。開始コドンおよび停止コドンには下線が施してある。部分的５’および３’未翻訳配列のみ示されている。
【図６】ヒト海馬交連Ｙ５ ｃＤＮＡクローン（配列認識番号４）の対応アミノ酸配列。
【図７−１】ラット視床下部Ｙ５（上列）およびヒト海馬交連Ｙ５（下列）のｃＤＮＡクローン（８４．１％ヌクレオチド認識）間のヌクレオチド配列コードの比較。
【図７−２】ラット視床下部Ｙ５（上列）およびヒト海馬交連Ｙ５（下列）のｃＤＮＡクローン（８４．１％ヌクレオチド認識）間のヌクレオチド配列コードの比較。
【図７−３】ラット視床下部Ｙ５（上列）およびヒト海馬交連Ｙ５（下列）のｃＤＮＡクローン（８４．１％ヌクレオチド認識）間のヌクレオチド配列コードの比較。
【図７−４】ラット視床下部Ｙ５（上列）およびヒト海馬交連Ｙ５（下列）のｃＤＮＡクローン（８４．１％ヌクレオチド認識）間のヌクレオチド配列コードの比較。
【図７−５】ラット視床下部Ｙ５（上列）およびヒト海馬交連Ｙ５（下列）のｃＤＮＡクローン（８４．１％ヌクレオチド認識）間のヌクレオチド配列コードの比較。
【図７−６】ラット視床下部Ｙ５（上列）およびヒト海馬交連Ｙ５（下列）のｃＤＮＡクローン（全体では８７．２％、膜内外ドメイン98.8％の同一性）の推定アミノ酸配列の比較。
【図７−７】ラット視床下部Ｙ５（上列）およびヒト海馬交連Ｙ５（下列）のｃＤＮＡクローン（全体では８７．２％、膜内外ドメイン98.8％の同一性）の推定アミノ酸配列の比較。
【図８−１】ヒトＹ１，Ｙ２，Ｙ４配列の推定アミノ酸配列とヒトＹ５受容体の推定アミノ酸配列との比較。黒線は、７つの推定膜通過ドメイン（ＴＭＩ−ＶＩＩ）。影を付けた部分は、同一受容体配列部を示す。
【図８−２】ヒトＹ１，Ｙ２，Ｙ４配列の推定アミノ酸配列とヒトＹ５受容体の推定アミノ酸配列との比較。黒線は、７つの推定膜通過ドメイン（ＴＭＩ−ＶＩＩ）。影を付けた部分は、同一受容体配列部を示す。
【図８−３】ヒトＹ１，Ｙ２，Ｙ４配列の推定アミノ酸配列とヒトＹ５受容体の推定アミノ酸配列との比較。黒線は、７つの推定膜通過ドメイン（ＴＭＩ−ＶＩＩ）。影を付けた部分は、同一受容体配列部を示す。
【図９】ラットＹ５受容体を一時的に発現するＣＯＳ―７細胞起源の膜に対する125I-PYYの平衡結合。膜は、１２５Ｉ−ＰＹＹで３００ｎｍヒトＮＰＹの存在下又は非存在下で、表示回数インキュベートされた。特異的結合Ｂを、時間ｔに対してプロットし、等式Ｂ＝Ｂｍａｘ　＊（１―ｅ　-（ｋｏｂｓ＊ｔ））に従って、最大数の平衡結合部位Ｂｍａｘおよび観察される連合率Ｋｏｂｓを得た。結合は、非直線回帰分析によって決定された全平衡結合Ｂｍａｘのパーセンテージとし表示される。各ポイントは、測定三回の代表値を示す。
【図１０】ラットＹ５受容体を一時的に発現するＣＯＳ―７細胞起源の膜に対する125I-PYYの飽和平衡結合。膜は、１２５Ｉ−ＰＹＹで、0.4ｐMから 2.7nMの濃度範囲で，３００ｎｍヒトＮＰＹの存在下又は非存在下でインキュベートされた。特異的結合Ｂを、遊離１２５Ｉ−ＰＹＹ濃度[L]に対してプロットし、結合等式　Ｂ＝Ｂｍａｘ　[L]/([L]+ Kd)に従って、最大数の飽和平衡結合部位Ｂｍａｘ、　１２５Ｉ−ＰＹＹ平衡解離定数をＫｄを得た。特異結合が示されている。データは、３つの独立した実験を代表する物を示し、各ポイントは三回測定された。
【図１１】ラットＹ５受容体を一時的に発現するＣＯＳ―７細胞起源の125I-PYYの競合置換。膜は、１２５Ｉ−ＰＹＹで、競合ペプチドの濃度をあげながら印キュベートされた。５０％の置換に相当するＩＣ５０値は、非直線回帰分析によって決定され、等式：Ｋｉ＝ＩＣ５０（１＋[1]/Kd）（ここで、[L]は、１２５Ｉ−ＰＹＹ濃度、Ｋｄは、１２５Ｉ−ＰＹＹの平衡解離定数）に従って、Ｋｉ値に変換された。これらおよび他の化合物の親和性のランクオーダーが、表４に別個に掲載されている。
【図１２】ラットＹ５受容体を安定的に発現する完全な２９３細胞におけるフォルスコリンに刺激されたｃＡＭＰの蓄積の阻害。　１０μＭのフォルスコリンで５分間に渡って刺激された２９３細胞におけるｃＡＭＰのラジオイムノアッセイから得られた関数データ。　ラット／ヒトＮＰＹを、0.03pMから0.3μMの範囲の濃度で、作用物質活性につい、同一期間に渡ってテストした。５０％の最高活性に相当するＥＣ５０値は、非直線回帰分析によって決定された。該データは、３つの独立した実験を代表させたものを示す。
【図１３−１】：　ＮＰＹ　Ｙ５受容体ｍＲＮＡの分布を示すラット脳の冠状断片の概略図。ここでは、液体エマルジョンに浸した断片が微視的に視覚化されている。該断片は、［図１３−１］〜［図１３−３］に亘り吻側（Ａ）から尾側（Ｈ）に並べらているうちの（Ａ）から（Ｃ）。任意領域での個々のニューロンを覆う銀粒子の密度の差は、陰影勾配で表示されている。省略記号の完全な定義は次の通りである：　　　　Ａｃｏ＝　前皮質扁桃核　　　　ＡＤ　＝　前背側核　　　　ＡＲＴ＝　前プレテクタル（背十二指腸の隠れた部分より口側）の核　　　　Ａｒｃ　＝　弓状視床下部核　　　　ＢＬＡ　＝　基底外側扁桃核前部　　　　ＣＡ３　＝　アモンの角のフィールドＣＡ３、海馬　　　　ＣｅＡ　＝　中央扁桃核　　　　Ｃｇ　＝　帯状皮質　　　　ＣＬ　＝　中央外側視床核　　　　ＣＭ　＝　中央視床内側核　　　　ＤＧ　＝　歯状回、海馬　　　　ＤＭＨ　＝　背側内側視床下部核　　　　ＤＲ　＝　背面線　　　　ＧｉＡ　＝　巨大細胞性網様体核、アルファ　　　　ＨＤＢ　＝　核状水平四肢対角帯　　　　ＩｎＧ　＝　中間灰層上丘　　　　ＬＣ　＝　青斑　　　　ＬＨ　＝　 外側視床下部領域　　　　ＭｅＰＶ　＝　中央扁桃核、後方腹部側　　　　ＭＶｅ　＝　前庭神経内側核　　　　ＭＨｂ　＝　内側小帯核　　　　ＭＰＮ　＝　内側視索前核　　　　ＰＡＧ　＝　ペリアクエダクタル・グレイ（periaqueductal　gray）　　　　ＰａＳ　＝傍鉤状回　　　　ＰＣ　＝　視床中心傍核　　　　ＰＣＲｔＡ　＝パルヴォセルラー（parvocellular）網様体核、アルファ　　　　Ｐｅ　＝　脳室周囲視床下部核　　　　ＰｒＳ　＝　前鉤状核　　　　ＰＮ　＝　ポンテイン（pontine）核　　　　PVH ＝　室傍視床下部核　　　　ＰＶＨｍｐ　＝　室傍視床下部核、　内側小細胞部　　　　ＰＶＴ　＝　室傍視床核　　　　Ｒｅ　＝　再結成視床核　　　　ＲＬｉ　＝　吻状直線縫線核　　　　ＲＳＧ　＝　膨大後方皮質　　　　ＳＣＮ　＝　交叉上核　　　　ＳＮｃ　＝　黒質、緻密部、および　　　　　　　ＳＯＮ　＝　視索上核
【図１３−２】：　ＮＰＹ　Ｙ５受容体ｍＲＮＡの分布を示すラット脳の冠状断片の概略図。ここでは、液体エマルジョンに浸した断片が微視的に視覚化されている。該断片は、［図１３−１］〜［図１３−３］に亘り吻側（Ａ）から尾側（Ｈ）に並べらているうちの（Ｄ）から（Ｆ）。任意領域での個々のニューロンを覆う銀粒子の密度の差は、陰影勾配で表示されている。省略記号の完全な定義は次の通りである：　　　　Ａｃｏ＝　前皮質扁桃核　　　　ＡＤ　＝　前背側核　　　　ＡＲＴ＝　前プレテクタル（背十二指腸の隠れた部分より口側）の核　　　　Ａｒｃ　＝　弓状視床下部核　　　　ＢＬＡ　＝　基底外側扁桃核前部　　　　ＣＡ３　＝　アモンの角のフィールドＣＡ３、海馬　　　　ＣｅＡ　＝　中央扁桃核　　　　Ｃｇ　＝　帯状皮質　　　　ＣＬ　＝　中央外側視床核　　　　ＣＭ　＝　中央視床内側核　　　　ＤＧ　＝　歯状回、海馬　　　　ＤＭＨ　＝　背側内側視床下部核　　　　ＤＲ　＝　背面線　　　　ＧｉＡ　＝　巨大細胞性網様体核、アルファ　　　　ＨＤＢ　＝　核状水平四肢対角帯　　　　ＩｎＧ　＝　中間灰層上丘　　　　ＬＣ　＝　青斑　　　　ＬＨ　＝　 外側視床下部領域　　　　ＭｅＰＶ　＝　中央扁桃核、後方腹部側　　　　ＭＶｅ　＝　前庭神経内側核　　　　ＭＨｂ　＝　内側小帯核　　　　ＭＰＮ　＝　内側視索前核　　　　ＰＡＧ　＝　ペリアクエダクタル・グレイ（periaqueductal　gray）　　　　ＰａＳ　＝傍鉤状回　　　　ＰＣ　＝　視床中心傍核　　　　ＰＣＲｔＡ　＝パルヴォセルラー（parvocellular）網様体核、アルファ　　　　Ｐｅ　＝　脳室周囲視床下部核　　　　ＰｒＳ　＝　前鉤状核　　　　ＰＮ　＝　ポンテイン（pontine）核　　　　PVH ＝　室傍視床下部核　　　　ＰＶＨｍｐ　＝　室傍視床下部核、　内側小細胞部　　　　ＰＶＴ　＝　室傍視床核　　　　Ｒｅ　＝　再結成視床核　　　　ＲＬｉ　＝　吻状直線縫線核　　　　ＲＳＧ　＝　膨大後方皮質　　　　ＳＣＮ　＝　交叉上核　　　　ＳＮｃ　＝　黒質、緻密部、および　　　　　　　ＳＯＮ　＝　視索上核
【図１３−３】：　ＮＰＹ　Ｙ５受容体ｍＲＮＡの分布を示すラット脳の冠状断片の概略図。ここでは、液体エマルジョンに浸した断片が微視的に視覚化されている。該断片は、［図１３−１］〜［図１３−３］に亘り吻側（Ａ）から尾側（Ｈ）に並べらているうちの（Ｇ）から（Ｈ）。任意領域での個々のニューロンを覆う銀粒子の密度の差は、陰影勾配で表示されている。省略記号の完全な定義は次の通りである：　　　　Ａｃｏ＝　前皮質扁桃核　　　　ＡＤ　＝　前背側核　　　　ＡＲＴ＝　前プレテクタル（背十二指腸の隠れた部分より口側）の核　　　　Ａｒｃ　＝　弓状視床下部核　　　　ＢＬＡ　＝　基底外側扁桃核前部　　　　ＣＡ３　＝　アモンの角のフィールドＣＡ３、海馬　　　　ＣｅＡ　＝　中央扁桃核　　　　Ｃｇ　＝　帯状皮質　　　　ＣＬ　＝　中央外側視床核　　　　ＣＭ　＝　中央視床内側核　　　　ＤＧ　＝　歯状回、海馬　　　　ＤＭＨ　＝　背側内側視床下部核　　　　ＤＲ　＝　背面線　　　　ＧｉＡ　＝　巨大細胞性網様体核、アルファ　　　　ＨＤＢ　＝　核状水平四肢対角帯　　　　ＩｎＧ　＝　中間灰層上丘　　　　ＬＣ　＝　青斑　　　　ＬＨ　＝　 外側視床下部領域　　　　ＭｅＰＶ　＝　中央扁桃核、後方腹部側　　　　ＭＶｅ　＝　前庭神経内側核　　　　ＭＨｂ　＝　内側小帯核　　　　ＭＰＮ　＝　内側視索前核　　　　ＰＡＧ　＝　ペリアクエダクタル・グレイ（periaqueductal　gray）　　　　ＰａＳ　＝傍鉤状回　　　　ＰＣ　＝　視床中心傍核　　　　ＰＣＲｔＡ　＝パルヴォセルラー（parvocellular）網様体核、アルファ　　　　Ｐｅ　＝　脳室周囲視床下部核　　　　ＰｒＳ　＝　前鉤状核　　　　ＰＮ　＝　ポンテイン（pontine）核　　　　PVH ＝　室傍視床下部核　　　　ＰＶＨｍｐ　＝　室傍視床下部核、　内側小細胞部　　　　ＰＶＴ　＝　室傍視床核　　　　Ｒｅ　＝　再結成視床核　　　　ＲＬｉ　＝　吻状直線縫線核　　　　ＲＳＧ　＝　膨大後方皮質　　　　ＳＣＮ　＝　交叉上核　　　　ＳＮｃ　＝　黒質、緻密部、および　　　　　　　ＳＯＮ　＝　視索上核
【図１４】ＴＭ１１１のすぐ上流から始まって停止コドンまでの（下線部）（配列番号５）イヌＹ５cDNAクローンの部分ヌクレオチド配列。　３’未翻訳配列のみが部分的に示す。
【図１５】イヌＹ５ ｃＤＮＡクローン（配列認識番号６）の対応アミノ酸配列。
【図１６−１】Ａ．　種々ラット組識のノーザレン・ブロット分析。実験の詳細に記載されたように、高度に厳密な条件のもとにハイブリデイゼーションが行われた。
【図１６−２】Ｂ．　種々のヒト脳領域のノーザレン・ブロット分析：扁桃、尾状核、脳梁、海馬、全脳、黒質、視床腹部核、視床。実験の詳細に記載されたように、高度に厳密な条件のもとにハイブリデイゼーションが行われた。
【図１６−３】Ｃ．別のヒト脳の種々領域のノーザレン・ブロット分析：小脳、大脳皮質、延髄、脊椎、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻。実験の詳細に記載されたように、高度に厳密な条件のもとにハイブリデイゼーションが行われた。
【図１７−１】ヒトＹ５受容体・サブタイプをコードする、ヒトおよびラットのゲノムＤＮＡのサザン・ブロット分析。実験の詳細に記載されたように、高度に厳密な条件のもとに、ハイブリデイゼーションが行われた。
【図１７−２】ヒトＹ５受容体・サブタイプをコードする、ヒトおよびラットのゲノムＤＮＡのサザン・ブロット分析。実験の詳細に記載されたように、高度に厳密な条件のもとに、ハイブリデイゼーションが行われた。
【図１８】１２５Ｉ―Ｌｅｕ３１、Ｐｒｏ３４―ＰＹＹのラットＹ５受容体に対する平衡結合の時間的変化。　膜は、0.08ｎＭ放射線リガンドで室温にて、１０ｍＭ Ｎａ＋又は１３８ｍＭ Ｎａ＋のいずれかを含む結合緩衝液中で、表示された時間インキュベートされた。
【図１９】Ｙ５ペプチド結合のグアニン・ヌクレオチドの変更。ＣＯＳ−７細胞膜中で一時的に発現するヒトおよびラットのＹ５受容体、又はＬＭ（ｔｋ）細胞膜中で安定的に発現するヒトＹ５受容体を、標準結合分析条件下で、表示されたように、Ｇｐｐ（ＮＨ）ｐの濃度を増しながら、　０．０８ｎＭ １２５Ｉ−ＰＹＹでインキュベートした。　放射線リガンド結合はｃｐｍで、効率＝０.8との報告である。ＬＭ（ｔｋ-）中のヒトＹ５ (0.007 mg 膜蛋白／サンプル）では、最大Δｃｐｍは-2343。　それゆえ、任意の２２００Ｃｉ／ミリモルの特異活性では、放射線リガンド結合における変化は、　-0.6 fモル／0.007ｍｇ蛋白＝-85fモル／ｍｇ膜蛋白になると計算される。
【図２０】クローンされたＹ５受容体によるフォルスコリン刺激ｃＡＭＰ蓄積のＮＰＹ依存阻害。　ヒト又はラットＹ５受容体で、安定的にトランスフェクトされた完全細胞は、フォルスコリン＋表示された濃度の範囲のヒトＮＰＹで、インキュベートされた。各受容体システム（ｎ≧２）について代表的な実験を示す。
【図２１−１】カルシウム移動：フラ２（Fura-2）分析。表示したホスト細胞中でクローンされたヒトＹ型受容体を、ＮＰＹおよび関連ペプチドに反応して起こる細胞内カルシウム移動についてスクリーンニングした。
【図２１−２】カルシウム移動：フラ２（Fura-2）分析。表示したホスト細胞中でクローンされたヒトＹ型受容体を、ＮＰＹおよび関連ペプチドに反応して起こる細胞内カルシウム移動についてスクリーンニングした。
【図２１−３】カルシウム移動：フラ２（Fura-2）分析。表示したホスト細胞中でクローンされたヒトＹ型受容体を、ＮＰＹおよび関連ペプチドに反応して起こる細胞内カルシウム移動についてスクリーンニングした。
【図２１−４】カルシウム移動：フラ２（Fura-2）分析。表示したホスト細胞中でクローンされたヒトＹ型受容体を、ＮＰＹおよび関連ペプチドに反応して起こる細胞内カルシウム移動についてスクリーンニングした。
【図２２】ヒトおよびラットＹ５受容体に選択的に結合する化合物の構造を示す。
【参考文献】
【０２７０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【図２２】
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【配列表】
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