(57)【要約】【課題】耐熱性チオレドキシン及び耐熱性チオレドキシンレダクターゼ、並びに、これらの酵素をコードするＤＮＡ等を提供する。【解決手段】９０〜１００℃という高温下で生育できる超好熱性古細菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ　ＯＴ３株からチオレドキシン及びチオレドキシンレダクターゼを単離し、アミノ酸配列およびＤＮＡ配列を決定した。これらのタンパク質又は酵素は、１００℃で０．５時間熱処理した場合にも実質的に活性が低下しない、極めて耐熱性に優れるタンパク質又は酵素である。本発明のチオレドキシン等は、耐熱性が高いことから、高温で効率的に反応を行うことができるとともに、医薬品、食品、化粧品などに添加した場合には加熱滅菌を行うことができる。【選択図】　図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１００℃で０．５時間熱処理した場合に実質的に活性が低下しない耐熱性チオレドキシン。
【請求項２】
至適温度が６０℃以上である請求項１に記載の耐熱性チオレドキシン。
【請求項３】
超好熱性古細菌パイロコッカスホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）由来の請求項１又は２に記載の耐熱性チオレドキシン。
【請求項４】
以下の（１）または（２）のポリペプチド。
（１）　　配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）　　配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは２以上のアミノ　酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、１００℃で０．５時間熱処理した場合に実質的にチオレドキシン活性が低下しないポリペプチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項６】
以下の（３）または（４）のＤＮＡ。
（３）　　配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ。
（４）　　配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、１００℃で０．５時間熱処理した場合に実質的に活性が低下しない耐熱性チオレドキシンをコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項５または６に記載のＤＮＡを含有するベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターを含有する形質転換体。
【請求項９】
請求項８の形質転換体を培養し、該形質転換体から耐熱性チオレドキシンを分離および精製する耐熱性チオレドキシンの生産方法。
【請求項１０】
１００℃で０．５時間熱処理した場合に実質的に活性が低下しない耐熱性チオレドキシンレダクターゼ。
【請求項１１】
至適温度が６０℃以上である請求項１０に記載の耐熱性チオレドキシンレダクターゼ。
【請求項１２】
超好熱性古細菌パイロコッカスホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）由来の請求項１０又は１１に記載の耐熱性チオレドキシンレダクターゼ。
【請求項１３】
以下の（５）または（６）のポリペプチド。
（５）　　配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（６）　　配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しくは２以上のアミノ　酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、１００℃で０．５時間熱処理した場合に実質的にチオレドキシンレダクターゼ活性が低下しないポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１５】
以下の（７）または（８）のＤＮＡ。
（７）　　配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ。
（８）　　配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、１００℃で０．５時間熱処理した場合に実質的に活性が低下しない耐熱性チオレドキシンレダクターゼをコードするＤＮＡ。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載のＤＮＡを含有するベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載のベクターを含有する形質転換体。
【請求項１８】
請求項１７の形質転換体を培養し、該形質転換体から耐熱性チオレドキシンレダクターゼを分離および精製する耐熱性チオレドキシンレダクターゼの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高温下で機能できるチオレドキシン及びチオレドキシンレダクターゼ、これらの酵素をコードする各ＤＮＡ、これらのＤＮＡを組み込んだ各ベクター、これらのベクターで形質転換された各形質転換体、並びに、これらの各形質転換体を用いた耐熱性チオレドキシン及び耐熱性チオレドキシンレダクターゼの生産方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
チオレドキシンは、大腸菌、酵母、高等植物及び高等動物等に普遍的に存在する分子量１万〜１．３万の電子伝達タンパク質である。チオレドキシンは、２個のアミノ酸を挟んで２個のシステイン残基が存在する部位（―Ｃｙｓ―Ｘ―Ｘ―Ｃｙｓ―）を活性中心として有し、ジチオールの可逆的な酸化還元反応を通して、生体内の酸化還元状態を制御していると考えられている（Ｌａｕｒｅｎｔ，　Ｔ．Ｃ．，Ｍｏｏｒ，Ｅ．Ｃ．，＆Ｒｅｉｎｃｈａｒｄ，Ｐ．（１９６４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３９，３４３６−３４４４；Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ａ．（１９８９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４，２３７−２７１；Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ａ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１３９６３−１３９６６；Ｂｕｃｈａｎａｎ，Ｂ．Ｂ．，Ｓｃｈｕｒｍａｎｎ，Ｐ．，Ｄｅｃｏｔｔｉｇｎｉｅｓ，Ｐ．＆Ｌｏｚａｎｏ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３１４，２５７−２６０）。チオレドキシンは、活性中心の２個のシステインのチオール基がジスルフィドとなった酸化型またはチオール基となった還元型のどちらの状態でも存在している。
【０００３】
チオレドキシンの生体内での機能の１例としてタンパク質の分子内または分子間Ｓ−Ｓ結合の開裂が挙げられる。この際、還元型チオレドキシンは、タンパク質のジスルフィドをジチオールに還元するのに伴い、酸化されて酸化型チオレドキシンとなる。生成した酸化型チオレドキシンは、チオレドキシンレダクターゼ及びＮＡＤＰＨにより還元されて還元型チオレドキシンに戻る。
【０００４】
チオレドキシンの生体内での機能の他の例として過酸化水素や過酸化脂質などの過酸化物の消去が挙げられる。この際、還元型チオレドキシンは、過酸化物（ＲＯＯＨ）を水酸化物（ＲＯＨ）に還元するとともに、酸化されて酸化型チオレドキシンとなる。この反応はチオレドキシンペルオキシダーゼにより行われる。酸化型チオレドキシンは、チオレドキシンレダクターゼ及びＮＡＤＰＨにより還元されて還元型チオレドキシンに戻る。
【０００５】
また、チオレドキシンの生体内での機能の更に他の例として、紫外線照射による細胞障害防止機能、転写因子の制御機能等も挙げられる。
【０００６】
このような機能を有するチオレドキシンは、例えば、酸化型システインの状態で活性を示す消化酵素インヒビタータンパク質の還元によるインヒビター活性の阻害、蛇毒タンパク質のシステイン残基間のＳ−Ｓ結合の除去による無毒化、紫外線照射による皮膚の炎症の予防等の目的で、医薬品として用いることが提案されている。また、食物アレルゲンの除去等の目的で食品に添加して用いたり、乾燥や紫外線等に起因する酸化ストレスによる肌荒れの改善剤等の目的で化粧品として用いることが提案されている（特開２００１−２８８１０３号公報、特表２００１−５２００２７号公報、特開２０００−１０３７４３号公報）。
【０００７】
しかし、固体状態または半固体状態の医薬品、食品及び化粧品等ではろ過滅菌が困難であるため、通常加熱滅菌が行われるところ、従来知られているチオレドキシンは、耐熱性が低い。従って、従来の易熱性のチオレドキシンを医薬品等として用いたり、食品等に添加して用いる場合には、高温での滅菌を行うことができないという難点がある。
【０００８】
また、一般に溶質の水に対する溶解度は温度と共に上昇するため、高温下で機能できる耐熱性のチオレドキシン及びチオレドキシンレダクターゼを用いることができれば、タンパク質中のジスルフィドの還元による還元型タンパク質の合成反応、過酸化水素等の活性酸素の除去反応等を、高温下で調製した高濃度の基質溶液に該酵素を作用させることにより効率よく行うことができる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、耐熱性のチオレドキシン及びチオレドキシンレダクターゼ、これらの酵素をコードするＤＮＡ、これらのＤＮＡを組み込んだベクター、これらのベクターで形質転換された形質転換体、並びに、これらの形質転換体を用いた耐熱性チオレドキシン及びチオレドキシンレダクターゼの効率的な生産方法を提供することを主目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明者は、９０〜１００℃という高温下で生育できる超好熱性古細菌に着目した。古細菌は、真核生物及び原核生物のいずれにも属さない第３の生物群に属する生物である。また、太古の地球の生物の末裔と考えられ、常温環境に対する進化・適用を免れた特殊な生物である。
【００１１】
本発明者は、このような超好熱性古細菌由来のチオレドキシン及びチオレドキシンレダクターゼであって、１００℃で０．５時間の熱処理によっても実質的に活性が低下しない極めて耐熱性に優れたチオレドキシン及びチオレドキシンレダクターゼを単離することに初めて成功した。また、これらのタンパク質または酵素は、従来公知のチオレドキシン等に比べて非常に耐熱性が高く、また常温下での安定性にも優れること、有機溶媒の存在下でも活性を示すことを見出した。
【００１２】
さらに、これらのタンパク質又は酵素をコードするＤＮＡ配列を決定し、ベクターに組み込んで、これらを効率よく生産することに成功した。
【００１３】
前記知見に基づき、本発明者は、以下の各項のチオレドキシン及びチオレドキシンレダクターゼ等を提供する。
【００１４】
項１．　１００℃で０．５時間熱処理した場合に実質的に活性が低下しない耐熱性チオレドキシン。
【００１５】
項２．　至適温度が６０℃以上である項１に記載の耐熱性チオレドキシン。
【００１６】
項３．　超好熱性古細菌パイロコッカスホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）由来の項１又は２に記載の耐熱性チオレドキシン。
【００１７】
項４．　以下の（１）または（２）のポリペプチド。
（１）　　配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）　　配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは２以上のアミノ　酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、１００℃で０．５　時間熱処理した場合に実質的にチオレドキシン活性が低下しないポリペプチド。
【００１８】
項５．　項４に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【００１９】
項６．　以下の（３）または（４）のＤＮＡ。
（３）　　配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ。
（４）　　配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、１００℃で０．５時間熱処理した場合に実質的に活性が低下しない耐熱性チオレドキシンをコードするＤＮＡ。
【００２０】
項７．　項５または６に記載のＤＮＡを含有するベクター。
【００２１】
項８．　項７に記載のベクターを含有する形質転換体。
【００２２】
項９．　項８の形質転換体を培養し、該形質転換体から耐熱性チオレドキシンを分離および精製する耐熱性チオレドキシンの生産方法。
【００２３】
項１０．　１００℃で０．５時間熱処理した場合に実質的に活性が低下しない耐熱性チオレドキシンレダクターゼ。
【００２４】
項１１．　至適温度が６０℃以上である項１０に記載の耐熱性チオレドキシンレダクターゼ。
【００２５】
項１２．　超好熱性古細菌パイロコッカスホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）由来の項１０又は１１に記載の耐熱性チオレドキシンレダクターゼ。
【００２６】
項１３．　以下の（５）または（６）のポリペプチド。
（５）　　配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（６）　　配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しくは２以上のアミノ　酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、１００℃で０．５時間熱処理した場合に実質的にチオレドキシンレダクターゼ活性が低下しないポリペプチド。
【００２７】
項１４．　項１３に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【００２８】
項１５．　以下の（７）または（８）のＤＮＡ。
（７）　　配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ。
（８）　　配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、１００℃で０．５時間熱処理した場合に実質的に活性が低下しない耐熱性チオレドキシンレダクターゼをコードするＤＮＡ。
【００２９】
項１６．　項１４または１５に記載のＤＮＡを含有するベクター。
【００３０】
項１７．　項１６に記載のベクターを含有する形質転換体。
【００３１】
項１８．　項１７の形質転換体を培養し、該形質転換体から耐熱性チオレドキシンレダクターゼを分離および精製する耐熱性チオレドキシンレダクターゼの生産方法。
【００３２】
【発明の実施の形態】
（１）本発明のタンパク質・酵素
耐熱性
▲１▼チオレドキシン
本発明の耐熱性チオレドキシンは、非常に耐熱性が優れるタンパク質であり、１００℃で０．５時間熱処理した場合に実質的に活性が低下しないタンパク質である。活性を示す最高温度は、通常８０℃程度である。また、反応を行う緩衝液の種類によっても異なるが、反応の初速度を測定した場合の至適温度が６０℃以上の酵素であることが好ましい。
【００３３】
本明細書において、「実質的に活性が低下しない」には、例えば９５％以上の活性を有する場合が含まれる。
【００３４】
本明細書において、チオレドキシンの活性は、実施例に記載の方法で測定した値である。
▲２▼チオレドキシンレダクターゼ
本発明の耐熱性チオレドキシンレダクターゼは、非常に耐熱性に優れる酵素であり、１００℃で０．５時間熱処理した場合に実質的に活性が低下しない酵素である。活性を示す最高温度は、通常８０℃程度である。また、酵素反応を行う緩衝液の種類によっても異なるが、酵素反応の初速度を測定した場合の至適温度が６０℃以上の酵素であることが好ましい。
【００３５】
本明細書において、チオレドキシンレダクターゼの活性は、実施例に記載の方法で測定した値である。
常温での安定性
▲１▼チオレドキシン
本発明のチオレドキシンは、常温下での安定性にも優れる。例えば、本発明のチオレドキシンは、３０℃の５０　ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で、１２　時間インキュベートした場合に、９０％以上の活性が残存する酵素であることが好ましい。
▲２▼チオレドキシンレダクターゼ
本発明のチオレドキシンレダクターゼは、常温下での安定性にも優れる。例えば、本発明のチオレドキシンレダクターゼは、３０℃の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で、１２時間インキュベートした場合に、９０％以上の活性が残存する酵素であることが好ましい。
有機溶媒耐性
本発明のチオレドキシン及びチオレドキシンレダクターゼは、有機溶媒に耐性である。例えば、エタノール、ブタノール、テトラヒドロフラン、酢酸エチル等の有機溶媒を３０容量％以上含む緩衝液中で活性を示すタンパク質または酵素（以下、「タンパク質等」という。）であることが好ましい。本発明のこれらのタンパク質等が活性を示し得る、緩衝液中の有機溶媒の容量比率の上限は、当該タンパク質等が沈殿しない範囲である。なお、有機溶媒に対する耐性は、古細菌由来の酵素に特有の性質である。
活性
本発明のチオレドキシンは、還元型チオレドキシンの形で、種々のタンパク質のシステイン残基のジスルフィドをジチオールに還元できるタンパク質である。また本発明のチオレドキシンは、還元型チオレドキシンの形で、過酸化水素等を還元できるタンパク質であることが好ましい。
【００３６】
本発明のチオレドキシンレダクターゼは、酸化型チオレドキシンを、そのジスルフィドをジチオールに還元することにより還元型チオレドキシンに変換できる酵素である。また、本発明のチオレドキシンレダクターゼは、酸化型グルタチオン等を還元できる酵素であることが好ましい。これらの還元反応には、通常、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨ、ＦＡＤＨ及びＦＡＤＨ２等の補酵素が用いられる。補酵素は、チオレドキシンレダクターゼ１分子に対して、通常１００〜１０００００モル程度の比率で用いることが好ましい。
生産細菌
また、本発明のチオレドキシン及びチオレドキシンレダクターゼとしては、好熱性細菌、例えばＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ属、Ｓｕｆｏｌｏｂｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｍａｓｔｉｇｏｃｌａｄｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｕｓ属等の細菌により生産されたものが挙げられる。特に、超好熱性古細菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属により生産されたものが好ましく、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉにより生産されたものがより好ましい。
アミノ酸配列
▲１▼チオレドキシン
本発明のチオレドキシンとしては、以下の（１）又は（２）のポリペプチドが挙げられる。
（１）　　配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは２以上のアミノ酸　　が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、１００　　℃で０．　　５　　時間熱処理した場合に実質的にチオレドキシン活性が低下しないポリペプ　　チド。
【００３７】
（２）のポリペプチドのアミノ酸配列は、１００℃で０．５　　時間熱処理した場合に実質的にチオレドキシン活性が低下しないものであれば特に制限されないが、（１）のポリペプチドのアミノ酸配列において、通常２０％以下、特に１０％以下のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたものであることが好ましい。
【００３８】
（１）のポリペプチドについての生物学的機能を喪失しない範囲での改変は、例えばチオレドキシン間で保存されていない全ての領域について行うことができる。また、チオレドキシン間で保存されていない領域でのアミノ酸の欠失又は付加であれば、全アミノ酸数の３０％以下の範囲で欠失又は付加を行うことができる。
【００３９】
具体的には、例えばアミノ酸の置換の場合には、タンパク質の構造保持の観点から、極性、電荷、可溶性、親水性／疎水性、極性等の点で、置換前のアミノ酸と類似した性質を有するアミノ酸に置換することができる。例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリンは非極性アミノ酸に分類され；セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンは極性アミノ酸に分類され；フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンは芳香族側鎖を有するアミノ酸に分類され；リジン、アルギニン、ヒスチジンは塩基性アミノ酸に分類され；アスパラギン酸、グルタミン酸は酸性アミノ酸に分類される。従って、同じ群のアミノ酸から選択して置換することができる。
▲２▼チオレドキシンレダクターゼ
本発明のチオレドキシンレダクターゼとしては、以下の（３）又は（４）のポリペプチドが挙げられる。
（３）　　配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（４）　　配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、１００　　℃で０．５　　時間熱処理した場合に実質的にチオレドキシンレダクターゼ活性が低下しないポリペプチド
（４）のポリペプチドのアミノ酸配列は、１００　　℃で０．５　　時間熱処理した場合に実質的にチオレドキシンレダクターゼ活性が低下しないものであれば特に制限されないが、（３）のポリペプチドのアミノ酸配列において、通常２０％以下、特に１０％以下のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたものであることが好ましい。
【００４０】
（３）のポリペプチドの生物学的機能を喪失しない範囲で（４）のポリペプチドを得る方法は前述した通りである。
【００４１】
本発明のチオレドキシン及びチオレドキシンレダクターゼは、これらのタンパク質等を生産する細菌を培養し、菌体から精製することにより得られる。また、配列番号２又は４のアミノ酸配列を基に、ペプチド化学合成により得られる。さらに、後述する本発明方法によっても得られる。
（２）本発明のＤＮＡ
▲１▼チオレドキシン
本発明のＤＮＡは、前記説明した本発明の（１）又は（２）のポリペプチドをコードするＤＮＡである。特に、　以下の（５）または（６）のＤＮＡが好ましい。
（５）　　配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ。
（６）　　配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、１００℃で０．５　　時間熱処理した場合に実質的にチオレドキシン活性が低下しないポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【００４２】
（６）のＤＮＡは、１００　　℃で０．５時間熱処理した場合に実質的にチオレドキシン活性が低下しないポリペプチドをコードするＤＮＡであれば特に制限されないが、（５）のＤＮＡ配列において、通常２０％以下、特に１０％以下のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたものであることが好ましい。
【００４３】
（５）のＤＮＡの生物学的機能を喪失しない範囲での改変は、例えばチオレドキシン間で保存されていない全ての領域について行うことができる。また、チオレドキシン間で保存されていない領域でのヌクレオチドの欠失又は付加であれば、全ヌクレオチド数の３０％以下の範囲で欠失又は付加を行うことができる。
▲２▼チオレドキシンレダクターゼ
本発明のＤＮＡは、前記説明した本発明の（３）又は（４）のポリペプチドをコードするＤＮＡである。特に、　以下の（７）または（８）のＤＮＡが好ましい。
（７）　　配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ。
（８）　　配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、１００℃で０．５時間熱処理した場合に実質的にチオレドキシンレダクターゼ活性が低下しないポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【００４４】
（８）のＤＮＡは、１００℃で０．５時間熱処理した場合に実質的にチオレドキシンレダクターゼ活性が低下しないポリペプチドをコードするＤＮＡであれば特に制限されないが、（７）のＤＮＡ配列において、通常２０％以下、特に１０％以下のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたものであることが好ましい。
【００４５】
（９）のＤＮＡの改変により（１０）のＤＮＡを得る方法は前述した通りである。
【００４６】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、例えば、通常のハイブリダイゼーション溶液中であれば６８℃で行う条件が挙げられ、５０％フォルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中であれば４２℃で行う条件が挙げられる。詳しくは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ第２版第２巻に記載のサザンハイブリダイゼーションに用いられる条件が挙げられる。
【００４７】
本発明のＤＮＡは、配列番号１又は３のＤＮＡ配列を基に合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、例えばＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ属、Ｓｕｆｏｌｏｂｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｍａｓｔｉｇｏｃｌａｄｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｕｓ属等の好熱性細菌の染色体ＤＮＡのライブラリーをハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることにより得ることができる。また、これらの好熱性細菌の染色体ＤＮＡのライブラリーを鋳型として用いて、配列番号１又は３のＤＮＡ配列を基に合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことによっても得ることができる。また、化学合成によっても取得できる。
【００４８】
また、前記の（６）又は（８）の変異したＤＮＡは、化学合成法又は遺伝子工学的手法などの公知の方法で作成することができる。遺伝子工学的手法としては、　（５）のＤＮＡ又は（７）のＤＮＡに対して、エキソヌクレアーゼを用いたＤＮＡ欠失導入、リンカー導入、位置指定突然変異導入、変異プライマーを用いたＰＣＲ法による塩基配列の改変などの公知の方法を挙げることができる。
（３）本発明のベクター
本発明のベクターは、前記説明した本発明の各ＤＮＡを含有する組換えベクターである。本発明のＤＮＡが組み込まれるベクターは公知のものを広く利用でき、細菌用ベクターの他、酵母用ベクター、動物細胞用ベクター等も利用できる。酵素の生産効率の点から、通常は細菌用ベクターを用いればよい。公知のベクターとしては、大腸菌ベクターのｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＫＫ２３３−２等、バチルス属細菌ベクターのｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、ｐＥ１９４、ｐＴＨＴ１５、ｐＢＤ１６等、酵母用ベクターＹｉｐ５、Ｙｒｐ１７、Ｙｅｐ２４等、動物細胞用ベクターｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｍ１３ｍｐ１８等を例示できる。
（４）本発明の形質転換体
また、本発明の形質転換体は、前記説明した本発明の各組換えベクターを含有する形質転換体である。宿主としては、ベクターに応じて細菌、酵母、動物細胞等を利用できる。形質転換は、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等の公知の方法で行うことができる。これらの公知の方法の中から、宿主の種類に応じて選択すればよい。
（５）本発明のタンパク質または酵素の製造方法
本発明のチオレドキシン又はチオレドキシンレダクターゼの製造方法は、本発明の各形質転換体を培養し、この形質転換体から各タンパク質等を精製する方法である。
【００４９】
これらの細菌が生産した酵素は、遠心分離、塩析、溶媒沈殿法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティクロマトグラフィー法、逆相高速液体クロマトグラフィー法等の公知の蛋白精製方法を組み合わせて精製することができる。本発明の酵素が細胞内またはペリプラズム内に生産される場合には超音波処理、界面活性剤処理等の公知の方法で細胞を破壊した後に前記の精製を行えばよい。
【００５０】
また、本発明の耐熱性タンパク質等を精製するにあたっては、目的耐熱性タンパク質等を１０〜３０分間程度（特に２０分間程度）インキュベートした場合に通常６０％以上、特に８０％以上活性が残存し、かつ、当該耐熱性タンパク質等を生産する宿主の生育限界温度より通常１０℃以上、特に１５℃以上高い温度で、被精製タンパク質溶液を通常１０〜１２０分間程度、特に１０〜３０分間程度インキュベートすることが好ましい。これにより、目的タンパク質を殆ど失活させることなく、宿主が生産する夾雑タンパク質を変性、失活させることができる。この加熱処理工程後に、タンパク質溶液を、それには限定されないが、例えば１５０００ｒｐｍ程度で２０分間程度遠心することにより変性した夾雑タンパク質を沈殿させることができる。この加熱処理工程は、精製のいずれの段階で行ってもよい。
【００５１】
このような加熱処理工程は、本発明のチオレドキシン及びチオレドキシンレダクターゼの精製に限らず、いずれの耐熱性タンパク質の精製においても行うことができ、これにより耐熱性タンパク質の精製度を飛躍的に向上させることができる。
【００５２】
【実施例】
超好熱古細菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ　ＯＴ３株のチオレドキシン遺伝子、チオレドキシンレダクターゼ遺伝子の単離
実施例１（菌の培養）
１３．５ｇの食塩、４ｇのＮａ２ＳＯ４、　０．７　ｇのＫＣｌ、　０．２ｇ　のＮａＨＣＯ３　、０．１ｇのＫＢｒ、３０　ｍｇ　のＨ３ＢＯ３、１０ｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１．５ｇ　のＣａＣｌ２　、２５ｍｇのＳｒＣｌ２、１．０ｍｌのレザスリン溶液（０．２ｇ／Ｌ）、１．０ｇの酵母エキス、５ｇのバクトペプトンを１Ｌの水に溶かし、この溶液のｐＨを６．８に調整し加圧殺菌した。次いで、乾熱滅菌した元素硫黄を０．２重量％となるように加え、この培地をアルゴンで飽和して嫌気性とした後、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ　ＯＴ３株（理化学研究所においてＪＣＭ９９７４として登録）を植菌した。培地が嫌気性となったか否かはＮａ２Ｓ溶液を加えて、培養液中でＮａ２Ｓによるレザスリン溶液のピンク色が着色しないことにより確認した。この培養液を９５℃で２〜４日間培養し、培養液を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより集菌した。
実施例２（染色体ＤＮＡの調製）
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ　ＯＴ３株の染色体ＤＮＡを以下の方法により調製した。集められた菌体を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ　７．５）−１ｍＭ　ＥＤＴＡ　溶液で２回洗浄後ＩｎＣｅｒｔ　Ａｇａｒｏｓｅ（ＦＭＣ社製）ブロック中に封入した。このブロックを１％Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ−１ｍｇ／ｍｌ　プロテアーゼＫ溶液中で処理することにより、染色体ＤＮＡをＡｇａｒｏｓｅブロック中に分離調製した。
実施例３（発現プラスミドの構築）
実施例２により得られたＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ　ＯＴ３株の染色体ＤＮＡを鋳型として、当該ＤＮＡの配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ条件はＰＣＲキットの添付マニュアルに従った。構造遺伝子領域の５’末端側に対応するプライマーとしては、制限酵素（ＮｄｅＩ）サイトを付与したＤＮＡプライマーＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＧＡＣＴＡＡＴＡＡＧＴＧＡＧＧＡＧＧＡ（配列番号５）を合成した。構造遺伝子領域の３’末端側に対応するプライマーとしては、制限酵素（ＢａｍＨＩ）サイトを構築する目的でＤＮＡプライマーＣＧＧＧＡＴＣＣＴＡＧＣＴＴＡＧＧＧＣＴＧＡＡＡＧＴＡＧＧ（配列番号６）を合成した。ＰＣＲ反応後、制限酵素（ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ）で完全分解（３７℃で一晩）した。次いで、チオレドキシン構造遺伝子を精製カラムキットを用いて精製した。
【００５３】
ベクターｐＥＴ−１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで完全分解した後、精製カラムキットを用いて精製した。上記のチオレドキシン構造遺伝子とＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃、３時間反応させることにより連結した。連結したＤＮＡの一部をＥ．　ｃｏｌｉ−ＸＬ２−ＢｌｕｅＭＲＦ’　のコンピテントセルに導入した。形質転換体を、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上でのコロニー形成を指標に選択した。得られたコロニーからチオレドキシン発現プラスミドをアルカリ法で抽出し、精製した。
実施例４（組換えチオレドキシン遺伝子の発現によるチオレドキシンの生産）
大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ）　Ｒｏｓｅｔｔａ　（ＤＥ３）株（　Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のコンピテントセルを融解して、１．５ｍｌチューブに０．０４ｍＬ移した。その中に実施例３により得たチオレドキシン発現プラスミド溶液０．００３ｍＬを加え、氷中に３０分間放置した後４２℃でヒートショックを３０秒間与えた。さらに、ＳＯＣｍｅｄｉｕｍ０．２５ｍＬを加え、３７℃で１時間振とう培養した。その後アンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに適量塗布し、３７℃で一晩培養することにより、形質転換体コロニーを形成させた。
【００５４】
この形質転換体をアンピシリンを含むＮＺＣＹＭ培地で６００ｎｍにおける吸光度が０．６に達するまで培養した後、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を加えさらに４時間培養した。培養後、７０００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより集菌した。
実施例５（耐熱性チオレドキシンの精製）
実施例５において集菌した菌体に１ｍＭ　ＤＴＴ及び１ｍＭＥＤＴＡ　を含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）ｂｕｆｆｅｒを加え超音波破砕した。破砕液を遠心分離（１５０００ｒｐｍで３０分間）した後、得られた上清を８５℃で３０分間加熱後、１５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上澄みをＨｉｔｒａｐ　Ｑ（ファルマシア社製）陰イオン交換クロマトグラフィー、Ｈｉｌｏａｄ　ｐｈｅｎｙｌ　疎水性相互作用クロマトグラフィー及びＳｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−１００（ファルマシア社製）ゲル濾過クロマトグラフィーにこの順にかけることより、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで均一バンドを与える標品を得た。
【００５５】
得られた標品のゲル濾過により測定された分子量は、約２７ｋＤａであった。（製品評価技術基盤機構；登録番号ＰＨ０１７８）
実施例６（耐熱性チオレドキシンレダクターゼの精製）
実施例２により得た染色体ＤＮＡを鋳型に用いて、構造遺伝子の５’末端側に対応するプライマーとしてＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＴＴＣＡ（配列番号７）を用い、構造遺伝子の３’末端側に対応するプライマーとしてＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＴＣＡＡＴＡＧＴＣＴＴＴＣＣＡＴＴＣＣ（配列番号８）を用いてＰＣＲを行った。この他は、実施例３と同様の操作を行うことによりチオレドキシンレダクターゼ発現プラスミドを得た。
【００５６】
さらに、このチオレドキシンレダクターゼ発現プラスミドを用いて、実施例４と同様にして、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ）株に組み換えチオレドキシンを生産させた。
【００５７】
集菌した菌体に１ｍＭ　ＤＴＴ及び１ｍＭＥＤＴＡ　５０ｍＭを含む　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）ｂｕｆｆｅｒを加え超音波破砕した。遠心分離（１５０００ｒｐｍで３０分間）した後、得られた上清を８５℃で３０分間加熱した後、１５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上澄みをＨｉｔｒａｐ　Ｑ（ファルマシア社製）陰イオン交換クロマトグラフィー、Ｈｉｌｏａｄ　ｐｈｅｎｙｌ　疎水性相互作用クロマトグラフィー及びＳｕｐｅｒｄｅｘ　２００（ファルマシア社製）ゲル濾過クロマトグラフィーに順次かけることにより、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで均一バンドを与える標品を得た。
【００５８】
得られた標品のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された分子量は、約３７ｋＤａであった（製品評価技術基盤機構；登録番号ＰＨ１４２６）。
実施例７（塩基配列及びアミノ酸配列の決定）
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ　ＯＴ３株由来の耐熱性チオレドキシンの塩基配列を配列番号１に示し、アミノ酸配列を配列番号２に示す。また、同株由来の耐熱性チオレドキシンレダクターゼの塩基配列を配列番号３に示し、アミノ酸配列を配列番号４に示す。
＜活性測定法＞
本発明において、精製工程における目的タンパク質又は酵素の検出、至適温度の検討および安定性の検討における目的タンパク質又は酵素の活性検出は、以下の方法で行った。
▲１▼チオレドキシン
チオレドキシンの活性測定は、還元型チオレドキシンによるインスリンサブユニット間のジスルフィド結合を還元する活性を測定するＭｏｌｍｇｒｅｎらの方法（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１９９３）に従った。
【００５９】
すなわち、先ず０．４ｍＭ　ＤＴＴ及び０．４ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含む１００ｍＭ　リン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で３７℃、１５分間チオレドキシンサンプルを前処理して還元型チオレドキシンとした。次いで、基質として１ｍｇ／ｍｌのウシ膵臓インスリン（シグマ社製）を含む１００ｍＭＴｒｉｓ−塩酸バッファー（ｐＨ７．５）に、チオレドキシンを２５０００ｎｇ添加し、インスリンの還元分解による６５０ｎｍにおける吸光度の上昇を２５℃で１０分間測定した。
▲２▼チオレドキシンレダクターゼ
基質としての０．５ｍＭジチオビス２−ニトロベンゾイックアシッド（ＤＴＮＢ）０．２ｍＭ　ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に、精製チオレドキシンレダクターゼ　２μｇを添加し、ＴＮＢ（ＤＴＮＢの分解物）の濃度の指標である４１２ｎｍにおける吸光度の増加速度を１分間測定することによりチオレドキシンレダクターゼの活性を測定した。
【００６０】
チオレドキシン及びチオレドキシンレダクターゼのいずれも精製工程では、６０℃の緩衝液中で活性を測定した。
【００６１】
前記の方法により得られたＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉｉ　ＯＴ３株由来のチオレドキシン及びチオレドキシンレダクターゼの諸特性を評価した。
至適温度
前述したチオレドキシン及びチオレドキシンレダクターゼの活性測定方法において、酵素反応を行う緩衝液の温度を２５〜６５℃の範囲で変化させて、酵素活性を測定した。チオレドキシンの活性測定において、反応時間に対して６５０ｎｍにおける吸光度の変化をプロットした結果を図１（Ａ）に示す。また、チオレドキシンレダクターゼの活性測定において、反応時間に対して４１２ｎｍにおける吸光度の変化をプロットした結果を図１（Ｂ）に示す。図１（Ａ）及び（Ｂ）から、このチオレドキシンの至適温度は６５℃以上であり、このチオレドキシンレダクターゼの至適温度も６５℃以上であることが分かる。
耐熱性
ｐＨ７．０の　５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中に、チオレドキシンを２５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように添加した酵素溶液サンプルを用意し、１００℃でインキュベートして、経時的に残存活性を測定した。チオレドキシンレダクターゼについても同様にして、インキュベートし、経時的に残存活性を測定した。
【００６２】
結果を図２の（Ａ）及び（Ｂ）に示す。図２（Ａ）から、チオレドキシンは、１００℃での０．５時間のインキュベートにより約１００％の活性が残存することが分かる。また図２（Ｂ）から、チオレドキシンレダクターゼは、１００℃での０．５時間のインキュベートにより約９９％の活性が残存することが分かる。
【００６３】
【発明の効果】
本発明によると優れた耐熱性を有するチオレドキシン及びチオレドキシンレダクターゼを提供することができる。
【００６４】
従って、これらを医薬品や化粧品として用いたり、医薬品、食品及び化粧品に添加して用いる場合には、高温での殺菌を行うことができる。
【００６５】
詳述すれば、本発明の耐熱性チオレドキシンは、消化酵素インヒビターの阻害、蛇毒及びサソリ毒等の酸化による無毒化、紫外線照射による皮膚の炎症の治療及び予防等の目的で医薬品として用いたり、食物アレルゲンの除去等の目的で食品に添加して用いたり、乾燥や紫外線等に起因する酸化ストレスによる肌荒れの改善等の目的で化粧品に添加して用いたりすることができる。また、本発明のチオレドキシンレダクターゼは、チオレドキシン併用して医薬品等として用いることにより、チオレドキシンを活性な還元型チオレドキシンに保つことができる。これらの場合に、本発明のチオレドキシン及びチオレドキシンレダクターゼは、耐熱性であることから加熱殺菌をすることができる。
【００６６】
また、本発明のチオレドキシン及びチオレドキシンレダクターゼは、タンパク質中のシスチンの還元による還元型タンパク質の合成反応等を高温下で調製した高濃度の基質溶液に対して効率よく行うことができる。
【００６７】
また、本発明のチオレドキシンは、過酸化水素等の活性酸素の除去反応等を、高温下で調製した高濃度の基質溶液に対して効率よく行うことができる。
【００６８】
また、本発明のチオレドキシン及びチオレドキシンレダクターゼは、常温での安定性にも優れるため、比較的長い期間保存することができ、また繰り返し使用にも耐えることができる。
【００６９】
また、一般的にタンパク質または酵素は、有機溶媒の存在により失活し易いが、本発明のチオレドキシン及びチオレドキシンレダクターゼは、有機溶媒に対しても安定である。従って、有機溶媒中あるいは有機溶媒を含む水溶液中で、反応を行うことができる。その結果、水溶液には溶解し難い物質に対しても作用させることができ、反応の適用対象が広がる。
【００７０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の１実施例であるチオレドキシン（Ａ）及びチオレドキシンレダクターゼ（Ｂ）の至適温度を示すグラフである。
【図２】本発明の１実施例であるチオレドキシン（Ａ）及びチオレドキシンレダクターゼ（Ｂ）の１００℃における熱安定性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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