(57)【要約】【課題】　インスリン抵抗性改善剤の標的遺伝子を見出し、該遺伝子やその産物を利用することにより、インスリン抵抗性の治療や改善のための新規な方法を提供すること。【解決手段】　被験物質の投与条件下における検体中のアディプシンまたはアディプシン遺伝子の発現量を指標として、該被験物質のインスリン抵抗性改善効果を評価する方法、該被験物質のインスリン抵抗性改善効果の評価用キット、および、アディプシンまたはアディプシン遺伝子を含むインスリン抵抗性改善剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
　被験物質の投与条件下における検体中のアディプシンまたはアディプシン遺伝子の発現量を指標として、該被験物質のインスリン抵抗性改善効果を評価する方法。
【請求項２】
　被験物質の投与および非投与条件下における、検体中のアディプシンまたはアディプシン遺伝子の発現量を比較することにより、該被験物質によるインスリン抵抗性改善効果を評価する方法。
【請求項３】
　下記の工程を含む、被験物質のインスリン抵抗性改善効果の評価方法：
１）動物を被験物質の投与または非投与条件下で飼育する；
２）上記動物の血液または細胞中におけるアディプシン遺伝子の発現量を検出する；
３）被験物質の投与または非投与条件下における、アディプシン遺伝子の発現量の相違に基づき、該被験物質のインスリン抵抗性改善効果を評価する。
【請求項４】
　前記方法において、さらに、血液または細胞中より全ＲＮＡを抽出する工程を含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
　遺伝子の発現量が、遺伝子チップ、ｃＤＮＡアレイ、およびメンブレンフィルターから選ばれる固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション法、ＲＴ-ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、ならびにクロスハイブリダイゼーション法から選ばれるいずれか一つの方法によって検出されることを特徴とする、請求項３または４記載の方法。
【請求項６】
　遺伝子の発現量が、ＲＴ-ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法によって検出されることを特徴とする、請求項３または４記載の方法。
【請求項７】
　下記の工程を含む、被験物質のインスリン抵抗性改善効果の評価方法：
１）動物を被験物質の投与または非投与条件下で飼育する；
２）上記動物の血液または細胞中におけるアディプシンの発現量を、該アディプシンに特異的に結合する抗体を用いて検出する；
３）被験物質の投与または非投与条件下における、アディプシンの発現量の相違に基づき、該被験物質のインスリン抵抗性改善効果を評価する。
【請求項８】
　アディプシンの発現量が、ウェスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＥＬＩＳＡ法、およびＲＩＡ法から選ばれるいずれか一つの方法によって検出されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
　アディプシンの発現量が、ウェスタンブロット法によって検出されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
　細胞が肝臓細胞である、請求項３〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
　動物が２型糖尿病モデル動物である、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
　動物がマウスである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
　下記の工程を含む、被験物質のインスリン抵抗性改善効果の評価方法：
１）細胞を被検物質の投与または非投与条件下で培養する；
２）上記細胞中のアディプシン遺伝子の発現量を検出するか、または、アディプシンの発現量を該アディプシンに特異的に結合する抗体を用いて検出する；
３）被検物質の投与または非投与条件下における、アディプシン遺伝子またはアディプシンの発現量の相違に基づき、該被験物質のインスリン抵抗性改善効果を評価する。
【請求項１４】
　下記のａ）〜ｅ）からなる群より選ばれる、少なくとも一つ以上を含む、被験物質のインスリン抵抗性改善効果の評価用キット。
ａ）アディプシン遺伝子（配列番号１または配列番号１２）を特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー
ｂ）アディプシン遺伝子に特異的に結合し、該遺伝子を検出するための２０〜１５００塩基長の連続したポリヌクレオチドプローブ
ｃ）上記ｂ）記載のポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料
ｄ）アディプシン（配列番号２または配列番号１３）に特異的に結合し、該アディプシンを検出するための抗体
ｅ）上記ｄ）記載の抗体に特異的に結合しうる二次抗体
【請求項１５】
　ヒト・アディプシンまたはヒト・アディプシン遺伝子を含む、インスリン抵抗性改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、アディプシンまたはアディプシン遺伝子を利用した被験物質のインスリン抵抗性改善効果の評価方法、該被験物質のインスリン抵抗性改善効果の評価用キット、およびインスリン抵抗性改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
　糖尿病は近年その患者数が増加しており、成人病のひとつとして注目されている。糖尿病には、インスリン依存型の１型糖尿病と非依存型の２型糖尿病があるが、このうち２型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病、ＮＩＤＤＭ）は日本人に多い糖尿病のタイプであり、早期発見、早期治療がその予後の点から重要である。
【０００３】
　しかし、２型糖尿病は成因が多様であるため、予想される原因についての知見は乏しい。２型糖尿病におけるインスリン作用不足の原因としては、インスリン感受性機構の異常とインスリン分泌の低下が挙げられる。欧米では多くは前者、すなわちインスリン抵抗性が２型糖尿病の主な原因であるが、日本ではインスリン分泌不全が主な原因である場合も少なくない。
【０００４】
　経口糖尿病治療薬としては、スルホニル尿素系のインスリン分泌促進剤が古くから用いられているが、近年では、インスリン抵抗性改善剤も開発されている。「インスリン抵抗性改善剤」とは、インスリンレセプターの感受性を増強することによってインスリンの作用不足を補い、インスリン抵抗性を改善する薬剤である。そのようなインスリン抵抗性改善剤としては、例えば、トログリタゾン（例えば、特許文献１参照）、ピオグリタゾン（例えば、特許文献２〜４参照）、ロシグリタゾン（例えば、特許文献５〜７参照）、ＧＩ−２６２５７０（例えば、特許文献８参照）、ＪＴＴ−５０１（例えば、特許文献９〜１１参照）、ＡＺ−２４２（例えば、特許文献１２〜１４参照）、ＭＣＣ−５５５（例えば、特許文献１５〜１７参照）、ＹＭ−４４０（例えば、特許文献１８〜２０参照）、ＫＲＰ−２９７（例えば、特許文献２１および２２参照）、Ｔ−１７４（例えば、特許文献２３〜２５参照）、ＮＣ−２１００（例えば、特許文献２６〜２８参照）、ＮＮ−６２２（例えば、特許文献２９および３０参照）、ＢＭＳ−２９８５８５（例えば、特許文献３１参照）、５−[４−（６−メトキシ−１−メチルベンズイミダゾール−２−イルメトキシ）ベンジル]チアゾリジン−２,４−ジオンおよびその薬理学上許容される塩（例えば、特許文献３２〜３４参照）等のオキサゾール化合物、オキサジアゾリジン化合物、チアゾリジン化合物またはフェノキサジン化合物等を挙げることができる。
【０００５】
　これらのインスリン抵抗性改善剤のうち、ロジグリタゾンおよびピオグリタゾンのようなチアゾリジン誘導体は、既に臨床の場で用いられている（例えば、非特許文献１〜３、および特許文献３５参照）。これらの薬剤は、基本構造としてチアゾリジン環骨格を有することを特徴とし、核内レセプターであるＰＰＡＲγを標的分子として結合する。そして、肝臓、筋肉、および脂肪細胞における遺伝子発現を変化させることにより、２型糖尿病患者のインスリン抵抗性を改善すると考えられている。
【０００６】
　ＰＰＡＲγの主要な発現臓器である脂肪組織では、インスリン抵抗性改善剤はＰＰＡＲγに直接作用し、脂肪組織のインスリン感受性を亢進する（例えば、非特許文献４参照）。一方、ＰＰＡＲγを標的分子とするインスリン抵抗性改善剤は、肝臓では糖利用を促進し、筋肉では糖放出を抑制する。しかし、筋肉や肝臓におけるインスリン抵抗性の改善が、筋肉や肝臓に発現しているＰＰＡＲγに対する直接の作用であるかに関しては、今なお不明な点が多い（例えば、非特許文献５参照）。
【０００７】
　最近では、チアゾリジン誘導体に代表されるインスリン抵抗性改善剤が脂肪組織から分泌される因子の産生量を調節することが、生体のインスリン感受性を調節し、２型糖尿病を改善する一因ではないかと考えられている。脂肪組織は単なる脂肪の貯蔵器官ではなく、多数の因子を分泌する内分泌器官であり、これら分泌因子の中には、節食およびエネルギー代謝を調節するレプチン (leptin)（非特許文献６および７参照）、インスリン感受性を低下させる腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor: TNF-α（例えば、非特許文献８参照））やレジスチン（resistin（例えば、非特許文献９参照））；インスリン感受性を亢進させるアディポネクチン（adiponectin（例えば、非特許文献１０および１１参照））等、肥満やインスリン抵抗性、２型糖尿病と関連する多数の因子が含まれている。
【０００８】
　例えばTNF-αは、肥満・糖尿病を呈するマウスの脂肪組織では発現が上昇しており、TNF-αを中和することによりインスリン抵抗性が改善する（例えば、非特許文献１２参照）またピオグリタゾン投与によりインスリン抵抗性が改善した状態では、肥満・糖尿病モデルマウスで認められたTNF-αの発現亢進が抑制される（例えば、非特許文献１３参照）。
【０００９】
　逆にアディポネクチンは、肥満・糖尿病を呈するマウスやヒトでは発現が低下しており（例えば、非特許文献１４および１５参照）、インスリン抵抗性改善剤投与時には、アディポネクチンの発現が上昇する（例えば、非特許文献１６および１７参照）。
【００１０】
　アディプシンは、アディポネクチン同様、脂肪細胞で大量に産生される分泌タンパク質である（例えば、非特許文献１８参照）。しかし、アディプシンの臨床的意義はまだ明らかにされておらず、糖尿病やインスリン抵抗性との関連についても報告されてはいない。
【特許文献１】特開昭６０−０５１１８９公報
【特許文献２】特開昭６１−２６７５８０号公報
【特許文献３】欧州特許第１９３，２５６号明細書
【特許文献４】米国特許第４，６８７，７７７号明細書
【特許文献５】特表平９−５１２２４９号公報
【特許文献６】国際公開第９５／２１６０８号パンフレット
【特許文献７】米国特許第５，００２，９５３号明細書
【特許文献８】国際公開第００／８００２号パンフレット
【特許文献９】国際公開第９５／１８１２５号パンフレット
【特許文献１０】欧州特許出願公開第６８４，２４２号明細書
【００１１】
【特許文献１１】米国特許第５，７２８，７２０号明細書
【特許文献１２】国際公開第９９／６２８７２号パンフレット
【特許文献１３】欧州特許出願公開第１，０８４，１０３号明細書
【特許文献１４】米国特許第６，２５８，８５０号明細書
【特許文献１５】特開平６−２４７９４５号公報
【特許文献１６】欧州特許出願公開第６０４，９８３号明細書
【特許文献１７】米国特許第５，５９４，０１６号明細書
【特許文献１８】国際公開第９４／２５４４８号パンフレット
【特許文献１９】欧州特許第６９６，５８５号明細書
【特許文献２０】米国特許第５，６４３，９３１号明細書
【００１２】
【特許文献２１】特開平１０−８７６４１号公報
【特許文献２２】米国特許第５，９４８，８０３号明細書
【特許文献２３】特開昭６４−５６６７５号公報
【特許文献２４】欧州特許第２８３，０３５号明細書
【特許文献２５】米国特許第４，８９７，３９３号明細書
【特許文献２６】特開平９−１００２８０号公報
【特許文献２７】欧州特許出願公開第７８７，７２５号明細書
【特許文献２８】米国特許第５，６９３，６５１号明細書
【特許文献２９】国際公開第９９／１９３１３号パンフレット
【特許文献３０】米国特許第６，０５４，４５３号明細書
【００１３】
【特許文献３１】国際公開第０１／２１６０２号パンフレット
【特許文献３２】欧州特許出願公開第７４５，６００号明細書
【特許文献３３】特開平９−２９５９７０号公報
【特許文献３４】米国特許第５，８８６，０１４号明細書
【特許文献３５】特開昭６０−０５１１８９号公報
【００１４】
【非特許文献１】「ライフ・サイエンス (Life Science)」 2000;67:p2405-2416
【非特許文献２】「日本臨床」 2000;58:p389-404
【非特許文献３】「ファーマコセラピー (Pharmacotherapy)」 2001;21:p.1082-1099
【非特許文献４】「エンドクライノロジー (Endocrinology)」 1996;137:p.1984-1990
【非特許文献５】「エンドクライノロジー (Endocrinology)」 1998;139:p.5034-5041
【非特許文献６】「ネイチャー (Nature)」 1994;372:p.425-432
【非特許文献７】「ネイチャー (Nature)」 1998;395:p.763-770
【非特許文献８】「ネイチャー (Nature)」 1997;389:p.610-614
【非特許文献９】「ネイチャー (Nature)」 2001;409:p.307-312
【非特許文献１０】「ネイチャー・メディスン (Nature Medicine)」 2001;7:p.941-946
【００１５】
【非特許文献１１】「ネイチャー・メディスン (Nature Medicine)」 2001;7:p.947-953
【非特許文献１２】「サイエンス (Science)」 1993;259:p.87-91
【非特許文献１３】「エンドクライノロジー (Endocrinology)」 1994;134:p.264-270
【非特許文献１４】「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー (Journal of Biological Chemistry)」 1996;271:p.10697-10703
【非特許文献１５】「バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス・リサーチ・コミュニケーション (Biochemistry and Biophysics Research Communication)」 1999;257:p.79-83
【非特許文献１６】「ネイチャー・メディスン (Nature Medicine)」 2001;7:p.941-946
【非特許文献１７】「ネイチャー・メディスン (Nature Medicine)」 2001;7:p.947-953
【非特許文献１８】「ヌクレイックアシッドリサーチ（Nucleic Acids Research）」 1986;25;14(22):p.8879-8892
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
　本発明は、インスリン抵抗性改善剤の標的遺伝子を見出し、該遺伝子やその産物を利用することにより、被験物質のインスリン抵抗性改善効果の評価方法、該被験物質のインスリン抵抗性改善効果の評価用キット、およびインスリン抵抗性改善剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、インスリン抵抗性改善剤を投与した糖尿病モデルマウスで、アディプシンの発現が顕著に誘導されることを見出した。さらに、当該マウスの肝臓でアディプシンを過剰発現させると、血糖値および血中インスリン値が低下し、インスリン抵抗性改善の兆候が現れることを見出した。これらの結果から、本発明者らは、アディプシンはインスリン抵抗性やその改善の指標となることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１８】
　すなわち、本発明は、被験物質の投与条件下における検体中のアディプシンまたはアディプシン遺伝子の発現量を指標として、該被験物質のインスリン抵抗性改善効果を評価する方法を提供する。
　前記方法において、評価は、被験物質の投与および非投与条件下における、検体中のアディプシンまたはアディプシン遺伝子の発現量との比較することにより行ってもよい。
【００１９】
　一つの実施態様［Ｉ］において、本発明の方法は下記の工程を含む。
１）動物を被験物質の投与または非投与条件下で飼育する；
２）上記動物の血液または細胞中におけるアディプシン遺伝子の発現量を検出する；
３）被験物質の投与または非投与条件下における、アディプシン遺伝子の発現量の相違に基づき、該被験物質のインスリン抵抗性改善効果を評価する。
【００２０】
　ここで、前記工程２）は、さらに、血液または細胞中より全ＲＮＡを抽出する工程を含み、この全ＲＮＡよりアディプシン遺伝子の発現量を検出してもよい。
【００２１】
　前記アディプシン遺伝子の発現量は、遺伝子チップ、ｃＤＮＡアレイ、およびメンブレンフィルターから選ばれる固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション法、ＲＴ-ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、ならびにクロスハイブリダイゼーション法から選ばれるいずれか一つの方法によって検出することができ、特にＲＴ-ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法が好ましい。
【００２２】
　また、別な実施態様［II］において、本発明の方法は下記の工程を含む。
１）動物を被験物質の投与または非投与条件下で飼育する
２）上記動物の血液または細胞中におけるアディプシンの発現量を、該アディプシンに特異的に結合する抗体を用いて検出する；
３）被験物質の投与または非投与条件下における、アディプシンの発現量の相違に基づき、該被験物質のインスリン抵抗性改善効果を評価する。
【００２３】
　ここで、前記アディプシンの発現量は、ウェスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＥＬＩＳＡ法、およびＲＩＡ法から選ばれるいずれか一つの方法によって検出することができ、特にウェスタンブロット法が好ましい。
【００２４】
　前記態様［Ｉ］および態様［II］において、細胞は肝臓細胞を用いることが好ましい。また、動物は２型糖尿病モデル動物、特に２型糖尿病モデルマウスを用いることが好ましい。
【００２５】
　さらに、別な実施態様［III］において、本発明の方法は下記の工程を含む。
１）細胞を被検物質の投与または非投与条件下で培養する；
２）上記細胞中のアディプシン遺伝子の発現量を検出するか、または、アディプシンの発現量を該アディプシンに特異的に結合する抗体を用いて検出する；
３）被検物質の投与または非投与条件下における、アディプシン遺伝子またはアディプシンの発現量の相違に基づき、該被験物質のインスリン抵抗性改善効果を評価する。
【００２６】
　本発明は、被験物質のインスリン抵抗性改善効果の評価用キットを提供する。該キットは、下記のａ）〜ｅ）からなる群より選ばれる、少なくとも一つ以上を含む、
ａ）アディプシン遺伝子（配列番号１または配列番号１２）を特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー
ｂ）アディプシン遺伝子に特異的に結合し、該遺伝子を検出するための２０〜１５００塩基長の連続したポリヌクレオチドプローブ
ｃ）上記ｂ）記載のポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料
ｄ）アディプシン（配列番号２または配列番号１３）に特異的に結合し、該アディプシンを検出するための抗体
ｅ）上記ｄ）記載の抗体に特異的に結合しうる二次抗体
　さらに、本発明は、ヒト・アディプシンまたはヒト・アディプシン遺伝子を含む、インスリン抵抗性改善剤を提供する。
【発明の効果】
【００２７】
　本発明により、アディプシンがインスリン抵抗性やその改善を評価するための新たな指標となりうることが示された。該アディプシンやアディプシン遺伝子の発現を指標とすれば、インスリン抵抗性改善剤の簡便なスクリーニングを行うことができる。また、該アディプシンやアディプシン遺伝子をインスリン抵抗性を有する患者に投与することにより、インスリン抵抗性の治療を行うこともできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
　本発明は、検体中のアディプシンまたはアディプシン遺伝子の発現量を指標とした、被験物質のインスリン抵抗性改善効果の評価方法およびインスリン抵抗性改善剤に関する。
１．　アディプシン
１．１　アディプシンとインスリン抵抗性
　本発明にかかる「アディプシン」とは、主に哺乳類の脂肪細胞で大量に産生される分泌タンパクの１つであって、補体因子Ｄ（complement factor D）のホモログであることが報告されている（White RT et al, J. Biol. Chem. 1992, May 5, 267(13) 9210-9213）。
【００２９】
　本発明で用いられるアディプシンやアディプシン遺伝子の由来は特に限定されないが、哺乳動物由来のものが好ましく、霊長類、ゲッ歯動物由来のものがより好ましく、特にその機能やアミノ酸配列および塩基配列がよく研究されている、ヒト・アディプシンおよびマウス・アディプシンが最も好ましい。
【００３０】
　後述する実施例に示すように、本発明者らはインスリン抵抗性改善剤を投与した２型糖尿病モデル動物において、アディプシン遺伝子の発現が顕著に、しかも用量依存的に増加することを確認した。さらに、当該マウスでアディプシンを過剰発現させると、インスリン抵抗性の改善がみられることを確認した。これらの結果は、アディプシンやその遺伝子の発現量が、インスリン抵抗性やその改善を評価する指標となりうることを示すものである。
【００３１】
１．２　アディプシンタンパク
　アディプシンは、シグナルペプチドを含む前駆体として転写され、該シグナルペプチド部分が切り離された後、成熟タンパクとして分泌される。本発明にかかるアディプシンタンパクのうち、ヒト・アディプシンのアミノ酸配列（シグナルペプチド含む）を配列番号２に示すが、この配列に限定されず、該配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列で示されるペプチドもヒト・アディプシンとしての機能を有する限り、本発明のヒト・アディプシンに含まれる。同様に、マウス・アディプシンのアミノ酸配列を配列番号１３に示すが、この配列に限定されず、該配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列で示されるペプチドもマウス・アディプシンとしての機能を有する限り、本発明のマウス・アディプシンに含まれる。
　なお、本明細書中において、「アディプシン」という用語には、シグナルペプチドを有する前駆体とシグナルペプチドを有しない成熟タンパクのいずれをも含むものとする。
【００３２】
１．３　アディプシン遺伝子
　本発明にかかるアディプシン遺伝子のうち、ヒト・アディプシンをコードするｍＲＮＡの配列を配列番号１に示すが、この配列に限定されず、ヒト・アディプシンをコードする限り、その遺伝子は本発明のヒト・アディプシン遺伝子に含まれる。同様に、マウス・アディプシンをコードするｍＲＮＡの配列を配列番号１２に示すが、マウス・アディプシンをコードする限り、その遺伝子は本発明のマウス・アディプシン遺伝子に含まれる。
【００３３】
　なお、本明細書中において、「遺伝子」という用語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびｃＲＮＡも含まれるものとする。したがって、本発明にかかる「アディプシン遺伝子」には、アディプシンのＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、およびｃＲＮＡの全てが含まれる。
【００３４】
２　インスリン抵抗性改善効果を評価する方法
　本発明は、被験物質の投与条件下における検体中のアディプシンまたはアディプシン遺伝子の発現量を指標として、該被験物質のインスリン抵抗性改善効果を評価する方法を提供する。
【００３５】
　前記方法は、１つの被験物質について、その投与および非投与条件下における、検体中のアディプシンまたはアディプシン遺伝子の発現量を比較して評価するものであってもよいし、２つ以上の被験物質についての同様な比較評価であってもよい。あるいは、アディプシンまたはアディプシン遺伝子の発現量とインスリン抵抗性改善効果の相関が経験的に確立されれば、その関係に基づき、被験物質のインスリン抵抗性改善効果を比較対照なしに絶対評価してもよい。
【００３６】
　本発明の評価方法において、インスリン抵抗性改善効果は、アディプシンの発現量を指標として評価してもよいし、アディプシン遺伝子の発現量を指標として評価しても良い。また、評価系は動物を用いたin vivo系であってもよいし、培養細胞を用いたin vitro系であってもよい。
【００３７】
　本発明の方法において、「検体」とは、培養細胞やその抽出物、あるいは動物から単離された血液、体液、組織、細胞、排泄物またはそれらの抽出物等、本発明のアディプシン遺伝子が含まれる試料を意味する。特に検体としては、血液またはアディプシンやその遺伝子が高発現している細胞が好ましく、脂肪細胞や肝臓細胞が最も好ましい。
　また、被験物質の「投与」とは、生物への投与や培養液への添加など、被験物質が検体中に存在する状態を作り出すことの全てを含むものとする。
【００３８】
　以下、アディプシン遺伝子を指標とした評価方法とアディプシン（タンパク）を指標とした評価方法のそれぞれについて、具体的に説明する。
２．１　アディプシン遺伝子を指標とした被験物質の評価方法（in vivo系）
　アディプシン遺伝子を指標としたin vivoにおける被験物質のインスリン抵抗性改善効果の評価方法は、下記の工程を含むことが好ましい。
工程１：動物を被験物質の投与または非投与の条件で飼育する。
工程２：上記動物の血液または細胞中におけるアディプシン遺伝子の発現量を検出する。
工程３：被験物質の投与または非投与条件下における、アディプシン遺伝子の発現量の相違に基づき、該被験物質のインスリン抵抗性改善効果を評価する。
【００３９】
工程１：動物の飼育
　本発明の方法で用いられる「動物」は特に限定されないが、インスリン抵抗性を呈する２型糖尿病モデル動物が好ましい。そのような動物は市販のものであっても、公知の方法にしたがって作製されたものでもよい。市販の２型糖尿病モデル動物としては、例えば、KKマウス（例えば、KK/Taマウス、KK/Sanマウス等）、KK-Ayマウス（例えば、KK-Ay/Taマウス等）、C57BL/KsJ-db/dbマウス、C57BL/KsJ-db/+mマウス、C57BL/KsJ-+m/+m マウス、ob/obマウス等の２型糖尿病モデルマウス、およびGKラット等の２型糖尿病モデルラット等を挙げることができる。これらのマウスやラットは、例えば、日本クレア株式会社より購入することができる。
【００４０】
　前記動物は、被験物質の投与または非投与条件下で適当な期間飼育を行う。動物への被験物質の投与量は特に限定されず、被験物質の性状や動物の体重に合わせて、適宜用量を設定すればよい。また、動物への被験物質の投与方法および投与期間も特に限定されず、被験物質の性状に合わせて、適宜その投与経路と投与期間を設定すればよい。
【００４１】
工程２：アディプシン遺伝子の検出
　次に、被験物質の投与または非投与条件下で飼育された動物から血液または細胞を単離し、該血液または細胞中のアディプシン遺伝子の発現量を検出する。
　検出対象とする細胞としては、アディプシンやその遺伝子が高発現している細胞が好ましく、脂肪細胞や肝臓細胞が最も好ましい。
【００４２】
　アディプシン遺伝子の検出方法としては、例えば、単離された血液または細胞からまず全ＲＮＡを抽出し、該全ＲＮＡ中におけるアディプシン遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現量を検出する方法を挙げることができる。
（１）全ＲＮＡの抽出
　全ＲＮＡの抽出は、公知の方法にしたがい、単離された血液または細胞よりＲＮＡ抽出用溶媒を用いて抽出する。該抽出溶媒としては、例えば、フェノール等のリボヌクレアーゼを不活性化する作用を有する成分を含むもの（例えば、TRIzol試薬：ギブコ・ビーアールエル社製等）が好ましい。ＲＮＡの抽出方法は特に限定されず、例えば、チオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法（Chomczynski, P. and Sacchi, N., (1987) Anal. Biochem., 162, 156-159）等を採用することができる。なかでも、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法が好適である。
【００４３】
　抽出された全ＲＮＡは、必要に応じてさらにｍＲＮＡのみに精製して用いてもよい。精製方法は特に限定されないが、真核細胞の細胞質に存在するｍＲＮＡの多くは、その３’末端にポリ（Ａ）配列を持つため、この特徴を利用して、例えば、以下のように実施することができる。まず、抽出した全ＲＮＡにビオチン化オリゴ（ｄＴ）プローブを加えてポリ（Ａ）+ＲＮＡを吸着させる。次に、ストレプトアビジンを固定化した常磁性粒子担体を加え、ビオチン／ストレプトアビジン間の結合を利用して、ポリ（Ａ）+ＲＮＡを捕捉させる。洗浄操作の後、最後にオリゴ（ｄＴ）プローブからポリ（Ａ）+ＲＮＡを溶出する。この方法のほか、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用いてポリ（Ａ）+ＲＮＡを吸着させ、これを溶出して精製する方法も採用してもよい。溶出されたポリ（Ａ）+ＲＮＡは、さらに、ショ糖密度勾配遠心法等により分画してもよい。
【００４４】
（２）アディプシン遺伝子の検出
　次に、被験物質の投与または非投与条件下における、全ＲＮＡ中のアディプシン遺伝子の発現量を検出する。遺伝子の発現量は、得られた全ＲＮＡよりｃＲＮＡまたはｃＤＮＡを調製し、これを適当な標識化合物でラベルすることにより、そのシグナル強度として検出することができる。
【００４５】
　以下、遺伝子の発現量の検出方法について、ｉ）固相化試料を用いた解析方法、ii）ＲＴ−ＰＣＲ法（リアルタイムＰＣＲ法）、iii）その他の解析方法に分けて、具体的に説明する。
ｉ）固相化試料を用いた解析方法
　公知の遺伝子を固定した固相化試料に、投与または非投与条件下における標識したｃＤＮＡまたはｃＲＮＡ（以下、「標識プローブ」という。）を、同じ条件で別個に、あるいは混合して同時にハイブリダイズさせる（Brown, P. O. et al. (1999) Nature genet. 21, suppliment、33-37）。前記標識プローブは、アディプシンのｍＲＮＡクローンでも、発現している全てのｍＲＮＡを標識したものでもよい。プローブ作製のための出発材料としては、精製していないｍＲＮＡを用いてもよいが、前述の方法で精製したポリ（Ａ）+ＲＮＡを用いることがより好ましい。以下、各種固相化試料を用いた解析方法について説明する。
【００４６】
ａ）遺伝子チップ：
　本発明で用いられる遺伝子チップは、検出対象であるアディプシン遺伝子が固相化されているものであれば、市販のものであっても、公知の方法（Lipshutz, R. J. et al. (1999) Nature genet. 21, suppliment、20-24）に基づき作製されたものであってもよい。例えば、マウス・アディプシン遺伝子が固定化されたものとしては、アフィメトリクス社製マウスMG-U74（U74A,U74B,U74C）等を挙げることができる。
　遺伝子チップによる検出は、常法にしたがって実施することができる。例えば、アフィメトリクス社製チップを用いる場合であれば、製品に添付されたプロトコールにしたがい、ビオチン標識したｃＲＮＡプローブを調製する。次いで、該プロトコールにしたがいハイブリダイゼーションを行い、アビジンによる発光を検出、解析すれば遺伝子の発現量を求めることができる。
【００４７】
ｂ）アレイまたはメンブレンフィルター：
　本発明で用いられるアレイまたはメンブレンフィルターは、検出対象であるアディプシン遺伝子が固相化されているものであれば、市販のもの（例えば、インテリジーン：宝酒造社製、アトラスシステム：クローンテック社製等）であっても、公知の方法に基づいて作製されたものであってもよい。固相化される遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ等の配列情報をもとに作製されたプライマーで逆転写酵素反応やＰＣＲを実施することによりクローン化されたｃＤＮＡまたはＲＴ−ＰＣＲ産物を用いる。
【００４８】
　アレイを用いた検出では、逆転写酵素反応でポリ（Ａ）+ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、蛍光色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５等）で標識されたｄ−ＵＴＰ等を加えることにより標識プローブを調製する。このとき、被験物質の投与下におけるポリ（Ａ）+ＲＮＡと被験物質の非投与下におけるポリ（Ａ）+ＲＮＡをそれぞれ異なる色素で標識しておけば、後のハイブリダイゼーション時に両者を混合して用いることができる。蛍光シグナルは蛍光シグナル検出機を用いて検出する。例えば、宝酒造社の市販アレイであれば、同社のプロトコールにしたがい、ハイブリダイゼーションおよび洗浄を行い、蛍光シグナル検出機（例えば、ＧＭＳ４１８アレイスキャナー：宝酒造社製等）で蛍光シグナルを検出、解析する。
【００４９】
　メンブレンフィルターを用いた検出では、逆転写酵素反応でポリ（Ａ）+ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、放射性同位元素（例えば、32Ｐ、33Ｐ）で標識されたｄ−ＣＴＰ等を加えることにより標識プローブを調製し、常法によりハイブリダイゼーションを行う。例えば、市販のフィルター製マイクロアレイである、アトラスシステム（クローンテック社製）を用いてハイブリダイゼーションおよび洗浄を行った後、解析装置（例えば、アトラスイメージ：クローンテック社製等）を用いて検出、解析を行う。
【００５０】
　いずれの固相化試料を用いる場合も、被験物質の投与または非投与条件下のプローブをそれぞれハイブリダイズさせ、その遺伝子発現量の相違を検出する。このとき、使用するプローブ以外のハイブリダイゼーション条件は同じにする。前述したように、蛍光標識プローブの場合は、それぞれのプローブを異なる蛍光色素で標識しておけば一つの固相化試料に両プローブの混合物を一度にハイブリダイズさせて蛍光強度を読み取ることで、遺伝子発現量の相違を検出することができる（Brown, P. O. et al. (1999) Nature genet. 21, suppliment、33-37）。
【００５１】
ii）ＲＴ−ＰＣＲ法（リアルタイムＰＣＲ法）
　ＲＴ−ＰＣＲ法やその１つであるリアルタイムＰＣＲ（TaqMan PCR）法は微量なＤＮＡを高感度かつ定量的に検出できるという点で本発明の評価方法に好適である。リアルタイムＰＣＲ（TaqMan PCR）法では、5’端を蛍光色素（レポーター）で、3’端を蛍光色素（クエンチャー）で標識した、目的遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが使用される。該プローブは、通常の状態ではクエンチャーによってレポーターの蛍光が抑制されている。この蛍光プローブを目的遺伝子に完全にハイブリダイズさせた状態で、その外側からTaq DNAポリメラーゼを用いてＰＣＲを行う。Taq DNAポリメラーゼによる伸長反応が進むと、そのエキソヌクレアーゼ活性により蛍光プローブが5’端から加水分解され、レポーター色素が遊離し、蛍光を発する。リアルタイムＰＣＲ法は、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングすることにより、鋳型ＤＮＡの初期量を正確に定量することができる。
【００５２】
　例えば、本発明の場合であれば、マウス・アディプシン遺伝子（ｍＲＮＡ）を特異的に増幅するプライマー（例えば、配列番号４および配列番号５に示される塩基配列からなるプライマー）、およびマウス・アディプシン遺伝子を特異的に検出するためのプローブ（例えば、配列番号６に示される塩基配列からなるプローブ）を設計し、リアルタイムＰＣＲ（TaqMan PCR）を行う。被験物質の投与条件下でのアディプシン遺伝子の発現量が非投与条件下より著しく増加していれば、該被験物質はインスリン抵抗性改善効果を有すると評価できる。
【００５３】
iii）その他の解析方法
　上記以外に、遺伝子発現量を解析する方法としては、例えば、サブトラクション法（Sive, H. L. and John, T. St. (1988) Nucleic Acids Research　16, 10937、Wang, Z., and Brown, D. D. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88, 11505-11509）、ディファレンシャル・ディスプレイ法（Liang, P., and Pardee, A. B. (1992) Science 257, 967-971、Liang, P., Averboukh, L.,Keyomarsi, K., Sager, R., and Pardee, A. B. (1992) Cancer Research 52, 6966-6968）、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法（John, T. St., and Davis, R. W. Cell (1979) 16, 443-452）、また、適当なプローブを用いたクロスハイブリダイゼーション法（"Molecular Cloning, A Laboratory Manual" Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1982) Cold Spring Harbor Laboratory Press）等を挙げることができる。上記方法は、アディプシン遺伝子に加えて、被験物質の投与条件下で特異的に発現する他の遺伝子の発現プロファイルも併せて検討する場合に有用である。
【００５４】
ａ）サブトラクションクローニング法：
　特定の細胞に特異的に発現する遺伝子のｃＤＮＡを取得し、該ｃＤＮＡをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより遺伝子をクローニングする方法である。サブトラクションの方法としては、全ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを作製し、これと別の細胞から得られた全ＲＮＡをハイブリダイズさせた後、ハイドロキシアパタイトカラムでハイブリダイズしなかった一本鎖ＤＮＡを単離し、このｃＤＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する方法（バイオマニュアルシリーズ３、遺伝子クローニング実験法、羊土社 (1993)、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー）や、ｃＤＮＡライブラリーをまず作製し、このライブラリーからヘルパーファージ等を用いて一本鎖ＤＮＡを調製し、この一本鎖ＤＮＡと別の細胞から得られた全ＲＮＡにビオチン標識したものとをハイブリダイズさせた後、アビジンを利用してハイブリダイズしなかった一本鎖ＤＮＡを単離し、ＤＮＡポリメラーゼによって二本鎖に戻してｃＤＮＡライブラリーを作製する方法（Tanaka, H., Yoshimura, Y., Nishina, Y., Nozaki, M., Nojima, H., and Nishimune, Y. (1994) FEBS Lett. 355, 4-10）等が挙げられる。
【００５５】
　具体的には、まず被験物質の投与または非投与条件下の検体それぞれについてｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを精製し、投与条件下の検体から精製した全ＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵素でｃＤＮＡを合成する。合成時に［α-32Ｐ］ｄＮＴＰを加えることでｃＤＮＡを標識することもできる。標識されたｃＤＮＡと鋳型となった全ＲＮＡは安定な二本鎖ＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッドを形成しているが、アルカリ存在下で高温処理することによりＲＮＡのみを分解し一本鎖ｃＤＮＡを生成する。この一本鎖ｃＤＮＡと、非投与条件下の検体から抽出したＲＮＡとを混合し、適当な条件下で静置すると、ヌクレオチド配列の相補性より安定な二本鎖ＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッドを形成する。すなわち、非投与条件下でも発現している全ＲＮＡを鋳型とするｃＤＮＡはハイブリッドを形成するが、投与条件下でのみ特異的に発現しているＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡは一本鎖のままである。次いで、ハイドロキシアパタイトカラムで二本鎖ＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッドと一本鎖ｃＤＮＡとを分離し、一本鎖ｃＤＮＡのみを精製する。このステップを繰り返すことで目的とした組織に特異的なｃＤＮＡを濃縮することができる。濃縮された特異的ｃＤＮＡは放射性同位元素等で標識されている場合は、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするプローブとして使用することができる。なお、この操作は市販のキット（例えば、ＰＣＲセレクトｃＤＮＡサブトラクションキット：クローンテック社製等）を利用して行うこともできる。
【００５６】
ｂ）ディファレンシャル・ディスプレイ法：
　Liangらの方法（Science (1992) 257, 967-971）に準じ、例えば、以下のように実施できる。まず比較する２つの試料（本発明の場合は被験物質の投与または非投与条件下の検体）からｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いてこれを一本鎖ｃＤＮＡに変換する。次いで、得られた一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、適当なプライマーを用いてＰＣＲを行う。プライマーとしては、例えば、ランダムプライマー（任意の配列からなる約１０〜１２ｍｅｒのプライマー）を用いることができる。あるいは、アンカードプライマー（anchored primer）およびアービトラリープライマー（arbitrary primer）各一種ずつを組み合わせて用いてもよい。アンカードプライマーとしては、オリゴｄ（Ｔ）nＶＸ［ｎ＝１１〜１２；Ｖ＝グアニン、アデニンまたはシトシン；Ｘ＝グアニン、アデニン、チミンまたはシトシン］からなるプライマーを用いることができる。また、アービトラリープライマーとしては、任意の配列からなる約１０ｍｅｒのランダムプライマーを用いることができる。このようなＰＣＲを、種々のプライマーを組み合わせて行うことで、より広い範囲の遺伝子群をスクリーニングすることが可能となる。続いて、得られたＰＣＲ産物をゲル電気泳動し、ゲル上に展開（ディスプレイ）される全ＲＮＡの発現パターン（フィンガープリント）を比較解析することにより、いずれかの検体で特異的に発現している遺伝子（アディプシン遺伝子）を選択し、そのｃＤＮＡ断片を単離することができる。なお、この方法は、市販されているキット（例えば、ＲＮＡイメージ・キット：ジェンハンター社製等）を用いて行うこともできる。
【００５７】
ｃ）ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法：
　目的の組織から精製した全ＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーを、目的組織および対照組織の全ＲＮＡから合成した32Ｐ標識ｃＤＮＡプローブでスクリーニングし、目的組織のプローブとのみハイブリダイズするクローンを選択する方法である。例えば、まず非投与条件下の検体から精製した全ＲＮＡから常法に従いｃＤＮＡライブラリーを作製し、そのライブラリーから２組のレプリカフィルターを作製する。次に、該非投与条件下の検体から精製した全ＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素でｃＤＮＡを合成する。合成時に［α-32Ｐ］ｄＮＴＰを加えることでｃＤＮＡを標識する。標識されたｃＤＮＡと鋳型となった全ＲＮＡは安定な二本鎖ＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッドを形成しているが、アルカリ存在下で高温処理することにより全ＲＮＡのみを分解し、一本鎖ｃＤＮＡを精製する。同様に、被験物質投与条件下の検体から精製した全ＲＮＡを鋳型に32Ｐで標識された一本鎖ｃＤＮＡを作製する。両標識ｃＤＮＡをそれぞれプローブとして、非投与条件下の検体から作製したフィルターとハイブリダイゼーションを行う。Ｘ線フィルムのオートラジオグラフィー像を比較し、投与または非投与条件下のｃＤＮＡプローブの一方にのみハイブリダイズするクローンを選ぶことにより、被験物質の投与条件下で特異的に発現する遺伝子（アディプシン遺伝子）をクローニングすることができる。
【００５８】
ｄ）クロスハイブリダイゼーション法：
　被験物質の投与または非投与条件下の検体のいずれかに由来するｃＤＮＡライブラリーに対して、適当なＤＮＡをプローブとして、ストリンジェンシーの低い条件でハイブリダイゼーションを行い、陽性クローンを得る。得られた陽性クローンをプローブとして、それぞれの検体に由来する全ＲＮＡに対してノーザンハイブリダイゼーションを行い、一方にのみ発現しているクローンを選択する。
　こうして得られたｃＤＮＡをプローブとして、投与または非投与条件下の検体の全ＲＮＡに対してノーザンブロッティングを行い、選択した遺伝子（アディプシン遺伝子）の全ＲＮＡが、投与条件下で特異的に発現していることを確認できる。
【００５９】
工程３：インスリン抵抗性改善効果の評価
　最後に、被験物質の投与または非投与における、アディプシンの発現量の相違に基づき、該被験物質のインスリン抵抗性改善効果を評価する。
　すなわち、被験物質の投与条件下で非投与条件下よりもアディプシン遺伝子の発現量が有意に増加している場合、該被験物質はインスリン抵抗性改善効果を有すると評価できる。ここで、「有意に増加している」とは、例えば、被験物質の投与および非投与条件下でのアディプシン遺伝子の発現量に統計的有意差（ｐ＜０．０５）があることを意味する。
【００６０】
２．２　アディプシンを指標とした被験物質の評価方法（in vivo）
　アディプシンを指標としたin vivoにおける被験物質のインスリン抵抗性改善効果の評価は、下記の工程を含む方法であることが好ましい。
工程１：動物を被験物質の投与または非投与の条件下で飼育する。
工程２：上記動物の血液または細胞中におけるアディプシンの発現量を、該アディプシンに特異的に結合する抗体を用いて検出する。
工程３：被験物質の投与または非投与における、アディプシンの発現量の相違に基づき、該被験物質のインスリン抵抗性改善効果を評価する。
【００６１】
工程１：動物の飼育
　動物は、前項２．１に記載した方法にしたがい、被験物質の投与または非投与の条件下で飼育する。
工程２：アディプシン発現量の検出
　次に、上記動物の血液または細胞中におけるアディプシンの発現量を、該アディプシンに特異的に結合する抗体を用いて検出する。
【００６２】
　抗体を利用したアディプシンの検出方法は特に限定されないが、ウェスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＥＬＩＳＡ法、およびＲＩＡ法から選ばれるいずれか１の方法であることが好ましい。以下、これらの検出方法について、試料の調製から検出までを具体的に説明する。
（１）試料の調製
　検体としては、血液またはアディプシンやその遺伝子が高発現している細胞が好ましく、脂肪細胞や肝臓細胞が最も好ましい。これらの血液または細胞（細胞抽出液として使用する）は、必要に応じて高速遠心を行うことにより不溶性の物質を除去した後、以下のようにＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料やウエスタンブロット用試料として調製する。
　ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料は、例えば、回収した血清をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈したものを用いる。ウエスタンブロット用（電気泳動用）試料は、例えば、細胞抽出液をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用の２−メルカトルエタノールを含むサンプル緩衝液（シグマ社製等）と混合したものを用いる。ドット／スロットブロット用試料は、例えば、回収した細胞抽出液そのもの、または緩衝液で適宜希釈したものを、ブロッティング装置を使用するなどして、直接メンブレンへ吸着させたものを用いる。
【００６３】
（２）試料の固相化
　上記方法では、まず、アディプシンが含まれる試料中のポリペプチドをメンブレンあるいは９６穴プレートのウェル内底面等に固相化する。
　メンブレンに固相化する方法としては、試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動を経てメンブレンにポリペプチドを転写する方法（ウエスタンブロット法）と、直接メンブレンに試料またはその希釈液を染み込ませる方法（ドットブロット法やスロットブロット法）を挙げることができる。用いられるメンブレンとしては、ニトロセルロースメンブレン（例えば、バイオラッド社製等）、ナイロンメンブレン（例えば、ハイボンド−ＥＣＬ（アマシャム・ファルマシア社製）等）、コットンメンブレン（例えば、ブロットアブソーベントフィルター（バイオラッド社製）等）またはポリビニリデン・ジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレン（例えば、バイオラッド社製等）等を挙げることができる。また、ブロッティング方法としては、ウエット式ブロッティング法（CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY volume 2 ed by J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober）、セミドライ式ブロッティング法（上記CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY volume 2 参照）等を挙げることができる。
【００６４】
　一方、９６穴プレートに固相化する方法としては、固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）や放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）等を挙げることができる。固相化は、例えば、前記９６穴プレート（例えば、イムノプレート・マキシソープ（ヌンク社製）等）に試料またはその希釈液（例えば、０．０５％　アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（以下「ＰＢＳ」という）で希釈したもの）を入れて４℃〜室温で一晩、または３７℃で１〜３時間静置して、ウエル底面にポリペプチドを吸着させればよい。
【００６５】
（３）アディプシンに特異的に結合する抗体（抗アディプシン抗体）
　本工程で用いられる「アディプシンに特異的に結合する抗体（以下、「抗アディプシン抗体」という。）」は、公知の方法にしたがって調製してもよいし、市販のもの（例えば、抗マウスアディプシン抗体ｐ−１６、サンタクルズ社製等）を用いてもよい。
【００６６】
　前記抗体は、常法により（例えば、新生化学実験講座１、タンパク質１、p.389-397、1992）、抗原となるアディプシン、あるいはそのアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを用いて動物を免疫し、該動物生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。また、公知の方法（例えば、Kohler and Milstein, Nature 256, 495-497, 1975、Kennet, R. ed., Monoclonal Antibody p.365-367, 1980, Prenum Press, N.Y.）にしたがって、本発明のアディプシンに対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、これよりモノクローナル抗体を得ることもできる。
【００６７】
　抗体作製用の抗原としては、本発明のアディプシンまたはその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはこれらに任意のアミノ酸配列や担体が付加された誘導体を挙げることができる。なかでも、本発明のアディプシンのＮ末端に、キーホールリンペットヘモシアニンを担体として結合させたものが好ましい。
【００６８】
　前記抗原ポリペプチドは、本発明のアディプシンを遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、本発明のアディプシン遺伝子の発現可能なベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させればよい。
【００６９】
　前記宿主細胞としては、原核細胞であれば、例えば、大腸菌（Escherichia coli）や枯草菌（Bacillus subtilis）等が挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。該ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与しうる配列を有するものが好ましい。
【００７０】
　例えば、大腸菌であれば、Ｋ１２株等がよく用いられ、ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドが用いられるが、これらに限定されず、公知の各種菌株やベクターを使用できる。また、大腸菌で用いられるプロモーターとしては、例えば、トリプトファン（trp）プロモーター、ラクトース（lac）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（tac）プロモーター、リポプロテイン（lpp）プロモーター、ポリペプチド鎖伸張因子Tu（tufB）プロモーター等を挙げることができ、いずれも好適に用いることができる。
【００７１】
　また、枯草菌であれば、２０７−２５株が好ましく、ベクターとしてはｐＴＵＢ２２８（Ohmura, K. et al. (1984) J. Biochem. 95, 87-93）等が用いられるが、これに限定されるものではない。なお、ベクターに枯草菌のα−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能となる。
【００７２】
　真核細胞の宿主細胞としては、脊椎動物、昆虫、酵母等の細胞が挙げられる。脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Gluzman, Y. (1981) Cell 23, 175-182、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１６５０）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ　ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Urlaub, G. and Chasin, L. A. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4126-4220）等がよく用いられているが、これらに限定されない。
【００７３】
　脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現させようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列等を有するものを使用できる。さらに、これは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、サイトメガロウイルス初期プロモーターを有するｐＣＲ３．１（Invitrogen社製）、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Subramani, S. et al. (1981) Mol. Cell. Biol. 1, 854-864）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
　宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自立増殖が可能であり、さらに、転写プロモーター、転写終結シグナル、およびＲＮＡスプライス部位を備えたものを好適に用いることができる。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res, 11, 1295-1308）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Graham, F. L. and van der Eb, A. J. (1973) Virology 52, 456-457）、および電気パルス穿孔法（Neumann, E. et al. (1982) EMBO J. 1, 841-845）等によりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。
【００７５】
　また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えば、ｐＲＳＶｎｅｏ（Sambrook, J. et al. (1989) : "Molecular Cloning A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY）やｐＳＶ２ｎｅｏ（Southern, P. J. and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341）等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、目的のポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
【００７６】
　昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、鱗翅類ヤガ科のSpodoptera frugiperdaの卵巣細胞由来株化細胞（Ｓｆ−９またはＳｆ−２１）やTrichoplusia niの卵細胞由来High Five細胞（Wickham, T. J. et al, (1992) Biotechnol. Prog.ｉ: 391-396）等が宿主細胞としてよく用いられ、バキュロウイルストランスファーベクターとしてはオートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリンタンパクのプロモーターを利用したｐＶＬ１３９２／１３９３がよく用いられる（Kidd,ｉ. M. and V.C. Emery (1993) The use of baculoviruses as expression vectors. Applied Biochemistry and Biotechnology 420, 137-159)。この他にも、バキュロウイルスのＰ１０や同塩基性蛋白質のプロモーターを利用したベクターも使用できる。さらに、ＡｃＮＰＶのエンベロープ表面蛋白質ＧＰ６７の分泌シグナル配列を目的蛋白質のＮ末端側に繋げることにより、組換え蛋白質を分泌蛋白質として発現させることも可能である（Zhe-mei Wang, et al. (1998) Biol. Chem., 379, 167-174）。
【００７７】
　真核微生物を宿主細胞とした発現系としては、酵母が一般によく知られており、その中でもサッカロミセス属酵母、例えば、パン酵母Saccharomyces cerevisiaeや石油酵母Pichia pastorisが好ましい。該酵母等の真核微生物の発現ベクターとしては、例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Bennetzen, J. L. and Hall, B. D. (1982) J. Biol. Chem. 257, 3018-3025）や酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター（Miyanohara, A. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1-5）等を好ましく利用できる。また、分泌型蛋白質として発現させる場合には、分泌シグナル配列と宿主細胞の持つ内在性プロテアーゼあるいは既知のプロテアーゼの切断部位をＮ末端側に持つ組換え体として発現させることも可能である。例えば、トリプシン型セリンプロテアーゼのヒトマスト細胞トリプターゼを石油酵母で発現させた系では、Ｎ末端側に酵母のαファクターの分泌シグナル配列と石油酵母の持つＫＥＸ２プロテアーゼの切断部位をつなぎ発現させることにより、活性型トリプターゼが培地中に分泌されることが知られている（Andrew, L. Niles,et al. (1998) Biotechnol.Appl. Biochem. 28, 125-131）。
【００７８】
　上記のようにして得られる形質転換体は、常法にしたがい培養することができ、該培養により細胞内、または細胞外に目的のポリペプチドが産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択できる。例えば、上記ＣＯＳ細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地やダルベッコ変法イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という）等の培地に、必要に応じウシ胎児血清等の血清成分を添加したものを使用できる。
【００７９】
　上記培養により、形質転換体の細胞内または細胞外に産生される組換え蛋白質は、該蛋白質の物理的性質や化学的性質等を利用した公知の分離操作法により、分離・精製することができる。該方法としては、例えば、タンパク沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、を単独あるいは組合せて利用できる。また、発現させる組換え蛋白質に６残基からなるヒスチジンを繋げれば、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。目的とするアディプシンタンパクは、以上に記載した方法を適宜組み合わせることにより、容易に高収率、高純度で製造できる。
【００８０】
（４）検出
　上記（３）記載の方法で得られる抗アディプシン抗体は、それを直接標識するか、または該抗体を一次抗体とし、該一次抗体を特異的に認識する（抗体を作製した動物由来の抗体を認識する）標識二次抗体と協同で検出に用いられる。
【００８１】
　前記標識の種類として好ましいものは、酵素（アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）またはビオチン（ただし二次抗体のビオチンにさらに酵素標識ストレプトアビジンを結合させる操作が加わる）であるが、これらに限定されない。標識二次抗体（または標識ストレプトアビジン）としては、予め標識された抗体（またはストレプトアビジン）が、各種市販されている。なお、ＲＩＡの場合は125Ｉ等の放射性同位元素で標識された抗体を用い、測定は液体シンチレーションカウンター等を用いて行う。
【００８２】
　これら標識された酵素の活性を検出することにより、抗原であるアディプシンの発現量が測定される。アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼで標識する場合、これら酵素の触媒により発色する基質や発光する基質が市販されている。
【００８３】
　発色する基質を用いた場合、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法を利用すれば、目視で検出できる。ＥＬＩＳＡ法では、市販のマイクロプレートリーダーを用いて各ウェルの吸光度（測定波長は基質により異なる）を測定し、定量することが好ましい。また上述の抗体作製に使用した抗原の希釈系列を調製し、これを標準抗原試料として他の試料と同時に検出操作を行い、標準抗原濃度と測定値をプロットした標準曲線を作成することにより、他の試料中の抗原濃度を定量することも可能である。
【００８４】
　一方、発光する基質を使用した場合は、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法においては、Ｘ線フィルムまたはイメージングプレートを用いたオートラジオグラフィーや、インスタントカメラを用いた写真撮影により検出することができる。また、デンシトメトリーやモレキュラー・イメージャーＦｘシステム（バイオラッド社製）等を利用した定量も可能である。さらに、ＥＬＩＳＡ法で発光基質を用いる場合は、発光マイクロプレートリーダー（例えば、バイオラッド社製等）を用いて酵素活性を測定する。
【００８５】
（５）測定操作
ａ）ウエスタンブロット、ドットブロットまたはスロットブロットの場合
　まず、抗体の非特異的吸着を阻止するため、予めメンブレンをそのような非特異的吸着を阻害する物質（スキムミルク、カゼイン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等）を含む緩衝液中に一定時間浸しておく操作（ブロッキング）を行う。ブロッキング溶液の組成は、例えば、５％　スキムミルク、０．０５〜０．１％　ツイーン２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）が用いられる。スキムミルクの代わりに、ブロックエース（大日本製薬）、１〜１０％のウシ血清アルブミン、０．５〜３％のゼラチンまたは１％のポリビニルピロリドン等を用いてもよい。ブロッキングの時間は、４℃で１６〜２４時間、または室温で１〜３時間である。
【００８６】
　次に、メンブレンを０．０５〜０．１％　ツイーン２０を含むＰＢＳまたはＴＢＳ（以下「洗浄液」という）で洗浄して余分なブロッキング溶液を除去した後、ブロッキング溶液で適宜希釈した溶液中に抗アディプシン抗体を一定時間浸して、メンブレン上の抗原に該抗体を結合させる。このときの抗体の希釈倍率は、例えば、前記組換え抗原を段階希釈したものを試料とした予備的なウエスタンブロッティング実験を行って決定することができる。この抗体反応操作は、好ましくは室温で２時間行う。抗体反応操作終了後、メンブレンを洗浄液で洗浄する。ここで、用いた抗体が標識されたものである場合は、ただちに検出操作を行うことができる。未標識の抗体を用いた場合には、引き続き二次抗体反応を行う。標識二次抗体は、例えば、市販のものを使用する場合はブロッキング溶液で２０００〜２００００倍に希釈して用いる（添付の指示書に好適な希釈倍率が記載されている場合は、その記載に従う）。一次抗体を洗浄除去した後のメンブレンを二次抗体溶液に室温で４５分〜１時間浸し、洗浄液で洗浄してから、標識方法に合わせた検出操作を行う。洗浄操作は、例えば、まずメンブレンを洗浄液中で１５分間振盪してから、洗浄液を新しいものに交換して５分間振盪した後、再度洗浄液を交換して５分間振盪することにより行う。必要に応じてさらに洗浄液を交換して洗浄してもよい。
【００８７】
ｂ）ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ
　まず、試料を固相化させたプレートのウェル内底面への抗体の非特異的吸着を阻止するため、ウエスタンブロットの場合と同様、予めブロッキングを行っておく。ブロッキングの条件については、ウエスタンブロットの項に記載した通りである。
【００８８】
　次に、ウェル内を０．０５〜０．１％　ツイーン２０を含むＰＢＳまたはＴＢＳ（以下「洗浄液」という）で洗浄して余分なブロッキング溶液を除去した後、洗浄液で適宜希釈した抗アディプシン抗体を分注して一定時間インキュベーションし、抗原に該抗体を結合させる。このときの抗体の希釈倍率は、例えば、上記組換え抗原を段階希釈したものを試料とした予備的なＥＬＩＳＡ実験を行って決定することができる。この抗体反応操作は、好ましくは室温で１時間程度行う。抗体反応操作終了後、ウェル内を洗浄液で洗浄する。ここで、用いた抗体が標識されたものである場合は、ただちに検出操作を行うことができる。未標識の抗体を用いた場合には、引き続き二次抗体反応を行う。標識二次抗体は、例えば、市販のものを使用する場合は洗浄液で２０００〜２００００倍に希釈して用いる（添付の指示書に好適な希釈倍率が記載されている場合は、その記載に従う）。一次抗体を洗浄除去した後のウェルに二次抗体溶液を分注して室温で１〜３時間インキュベーションし、洗浄液で洗浄してから、標識方法に合わせた検出操作を行う。洗浄操作は、例えば、まずウェル内に洗浄液を分注して５分間振盪してから、洗浄液を新しいものに交換して５分間振盪した後、再度洗浄液を交換して５分間振盪することにより行う。必要に応じてさらに洗浄液を交換して洗浄してもよい。
【００８９】
　例えば、本発明において、いわゆるサンドイッチ法のＥＬＩＳＡは以下に記載する方法により実施することができる。まず、本発明のアディプシンタンパクの各アミノ酸配列より、親水性に富む領域をそれぞれ２箇所選択する。次に、各領域中のアミノ酸６残基以上からなる部分ペプチドを合成し、該部分ペプチドを抗原とした２種類の抗体を取得する。このうち一方の抗体を標識しておく。標識しなかった方の抗体は、９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートのウェル内底面に固相化する。ブロッキングの後、試料液をウェル内に入れて常温で１時間インキュベーションする。ウェル内を洗浄後、標識した方の抗体希釈液を各ウェルに分注してインキュベーションする。再びウェル内を洗浄後、標識方法に合わせた検出操作を行う。
【００９０】
工程３：インスリン抵抗性改善効果の評価
　最後に、被験物質の投与または非投与における、アディプシンの発現量の相違に基づき、該被験物質のインスリン抵抗性改善効果を評価する。
　すなわち、被験物質の投与条件下で非投与条件下よりもアディプシンの発現量が有意に増加している場合、該被験物質はインスリン抵抗性改善効果を有すると評価できる。ここで、「有意に増加している」とは、例えば、被験物質の投与および非投与条件下でのアディプシンの発現量に統計的有意差（ｐ＜０．０５）があることを意味する。
【００９１】
２．３　アディプシンまたはアディプシン遺伝子を指標とした被験物質の評価方法（in vitro）
　アディプシンまたはアディプシン遺伝子を指標としたin vitroにおける被験物質のインスリン抵抗性改善効果の評価方法は、下記の工程を含むことが好ましい。
工程１：細胞を被検物質の投与または非投与条件下で培養する。
工程２：上記細胞中のアディプシン遺伝子の発現量を検出するか、または、アディプシンの発現量を該アディプシンに特異的に結合する抗体を用いて検出する。
工程３：被検物質の投与または非投与条件下における、上記アディプシン遺伝子またはアディプシンの発現量の相違に基づき、該被験物質のインスリン抵抗性改善効果を評価する。
【００９２】
工程１：細胞の培養
　本発明の評価方法で用いられる細胞は、アディプシン遺伝子を発現する哺乳動物細胞であれば特に限定されない。好ましくは哺乳動物由来、特に哺乳動物の肝臓由来の培養細胞（好ましくは、初代培養肝細胞）が好ましい。前記哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラットまたはハムスター等が好ましく、ヒトまたはマウスがより好ましい。特に好適な例としては、２型糖尿病モデル動物（例えば、前述のKKマウス等）由来の初代培養肝細胞を挙げることができるが、これらに限定されない。
　また、アディプシン遺伝子をそのプロモーター領域とともに導入した細胞など、人為的に形質転換された細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）を使用してもよい。
【００９３】
　細胞は、被検物質を投与または非投与条件下で培養する。培養方法は特に限定されず、当該細胞に適した培養方法を適宜選択すればよい。培養細胞への被検物質の投与（添加）方法や投与量も特に限定されず、上記細胞の培養中、被検物質を培養培地に添加し一定期間培養すればよい。被検物質存在下で培養する期間も適宜設定すればよいが、好ましくは３０分〜２４時間である。
【００９４】
工程２：アディプシンまたはアディプシン遺伝子の発現量の検出
　次に、被検物質の投与または非投与条件下における、上記細胞中のアディプシン遺伝子の発現量の相違を検出するか、または、アディプシンの発現量の相違を該アディプシンに特異的に結合する抗体を用いて検出する。
【００９５】
　アディプシン遺伝子の検出は、基本的に２．１に記載した方法にしたがって行えばよい。また、抗アディプシン抗体を用いたアディプシンの検出は、２．２に記載した方法にしたがって行えばよい。
【００９６】
　上記方法のほか、アディプシン遺伝子のプロモーター支配下に、該プロモーター活性の検出を可能にする遺伝子（以下「レポーター遺伝子」という。）を利用して、間接的にアディプシンやアディプシン遺伝子の発現を検出することもできる。以下、レポーター遺伝子を利用した検出方法について説明する。
（１）レポーター遺伝子
　レポーター遺伝子は、宿主細胞が本試験方法の一連の過程において産生し得る他のいかなるタンパク質とも特異的に区別可能な、レポーター蛋白質をコードするものであればよい。好ましくは、形質転換前の細胞が該レポーター蛋白質と同一または類似のタンパク質をコードする遺伝子を持たないようなものがよい。例えば、レポーター蛋白質が該細胞に対して毒性を有するようなものや、該細胞が感受性を有する抗生物質の耐性を付与するものであるような場合でも、レポーター遺伝子の発現の有無は細胞の生存率で判定することが可能である。しかしながら、本発明で用いられるレポーター遺伝子としてより好ましいものは、発現量を特異的かつ定量的に検出することができる（例えば、該レポーター遺伝子にコードされるタンパク質に対する特異的抗体が取得されているような）構造遺伝子である。より好ましくは、外来の基質と特異的に反応することにより定量的測定が容易な代謝産物を生じるような酵素等をコードする遺伝子である。そのようなレポーター遺伝子としては、例えば、以下のタンパク質をコードする遺伝子を例示することができるが、本発明はそれらに限定されない。
【００９７】
ａ）クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ：
　クロラムフェニコールにアセチル基を付加する酵素で、いわゆるＣＡＴアッセイ等で検出することができる。プロモーターを組み込むだけでレポーターアッセイ用のベクターを調製できるベクターとして、ｐＣＡＴ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社製）が市販されている。
ｂ）ホタルルシフェラーゼ：
　ルシフェリンを代謝した際に生じる生物発光を測定することにより定量できる。レポーターアッセイ用のベクターとしては、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社製）が市販されている。
ｃ）β−ガラクトシダーゼ：
　呈色反応、蛍光または化学発光でそれぞれ測定可能な基質がある。レポーターアッセイ用のベクターとしては、ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）が市販されている。
ｄ）分泌型アルカリホスファターゼ：
　呈色反応、生物発光または化学発光でそれぞれ測定可能な基質がある。レポーターアッセイ用のベクターとしては、ｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ（クロンテック社製）が市販されている。
ｅ）緑色蛍光タンパク質（green-fluorescent protein）：
　酵素ではないが、自らが蛍光を発するので直接定量できる。同じくレポーターアッセイ用のベクターとしてｐＥＧＦＰ−１（クロンテック社製）が市販されている。
【００９８】
（２）レポーター遺伝子の導入
　公知の方法に従い、レポーター遺伝子発現プラスミドと、本発明のアディプシン遺伝子を哺乳類細胞で発現可能にした組換えベクターを作製し、これらを細胞に同時トランスフェクションする。ベクターとしては、ｐＣＲ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン社製）等を好適に用いることができるが、これらに限定されない。
【００９９】
　細胞に発現プラスミドを導入する方法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Graham, F. L. and van der Eb, A. J. (1973) Virology 52, 456-457）、電気パルス穿孔法（Neumann, E. et al. (1982) EMBO J. 1, 841-845）、リポフェクション法（Lopata et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12, 5707-5717, Sussman and Milman (1984) Mol. Cell. Biol. 4, 1641-1643）等を挙げることができるが、これらに限定されず、本発明の属する技術分野において汎用される任意の方法を採用することができる。ただし、細胞がいわゆる浮遊細胞である場合は、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法以外の方法を用いることが好ましい。いずれの方法においても、用いる細胞に応じて、至適化されたトランスフェクション条件を用いることが必要である。
【０１００】
（３）評価
　かくして、本発明のアディプシン遺伝子の発現ベクターと、レポーター発現ベクターを同時トランスフェクションした細胞を培養すると、該アディプシン遺伝子の発現依存的にレポーター遺伝子の転写が促進される。したがって、レポーター遺伝子の発現が可能な条件下において、培地中に任意の被検物質を添加した場合と添加しない場合でのレポーター遺伝子の発現量変化をみれば、アディプシン遺伝子の発現量が評価できる。ここで、「レポーター遺伝子の発現が可能な条件」とは、レポーター発現ベクターによってトランスフェクトされた細胞が生存して、レポーター遺伝子の産物（レポーター蛋白質）の生産が可能な条件であればよい。好ましくは、使用される細胞株に適合した培地（ウシ胎児血清等の血清成分を添加してもよい）で、４〜６％（最も好適には５％）の炭酸ガスを含む空気存在下、３６〜３８℃（最も好適には３７℃）で２〜３日間（最も好適には２日間）培養する。
【０１０１】
（４）その他（形質転換細胞株の樹立）
　以上のような、一過的な遺伝子導入法を利用した試験方法とは別に、レポーター遺伝子、および本発明のアディプシン遺伝子の発現ベクターで、宿主細胞を二重に形質転換した細胞を利用した試験方法も採択可能である。この場合には、ｐＩＮＤ（インビトロジェン社製）やｐＴｅｔ−Ｏｎ（クロンテック社製）等の発現ベクターを利用して、本発明のアディプシン遺伝子の発現を誘導する条件下で該レポーター遺伝子の発現が促進されるような細胞株を樹立することが必要となる。かかる形質転換細胞の作出においては、導入される遺伝子は、宿主細胞の染色体に組み込まれるなどして、宿主細胞の継代を重ねても安定的に保持されることが望ましい。そのように形質転換された細胞を選択するために、導入遺伝子に抗生物質耐性等の選択マーカー（例えば、ネオマイシン（またはＧ４１８）耐性遺伝子ｎｅｏ等）を連結してトランスフェクションしたり、もしくは別個に調製した該選択マーカーと導入遺伝子とを同時トランスフェクションすることが好ましい。その後は、該選択マーカーの特性を利用することにより、安定的に形質転換された細胞を選択することができる。
【０１０２】
　こうして得られた細胞株を、本発明のアディプシン遺伝子の発現が誘導される条件下におくと、該アディプシン遺伝子の発現依存的にレポーター遺伝子の転写が促進される。したがって、レポーター遺伝子の発現が可能な条件下において、培地中に任意の被検物質を添加した場合と添加しない場合でのレポーター遺伝子の発現量変化をみれば、アディプシン遺伝子の発現量が評価できる。
【０１０３】
工程３：インスリン抵抗性改善効果の評価
　最後に、被験物質の投与または非投与における、アディプシンまたはアディプシン遺伝子の発現量の相違に基づき、該被験物質のインスリン抵抗性改善効果を評価する。
　すなわち、被験物質の投与条件下で非投与条件下よりもアディプシンまたはアディプシン遺伝子の発現量が有意に増加している場合、該被験物質はインスリン抵抗性改善効果を有すると評価できる。ここで、「有意に増加している」とは、例えば、被験物質の投与および非投与条件下でのアディプシンまたはアディプシン遺伝子の発現量に統計的有意差（ｐ＜０．０５）があることを意味する。
【０１０４】
３．インスリン抵抗性改善効果の評価用キット
　本発明は、また、本発明のアディプシン遺伝子またはアディプシンの発現量を指標とした、インスリン抵抗性改善効果の評価用キットを提供する。
【０１０５】
　前記キットは、以下のａ）〜ｅ）からなる群より選ばれる少なくとも1以上を含む。
ａ）アディプシン遺伝子（配列番号１または配列番号１２）を特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー
ｂ）アディプシン遺伝子に特異的に結合し、該遺伝子を検出するための２０〜１５００塩基長の連続したポリヌクレオチドプローブ
ｃ）上記ｂ）記載のポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料
ｄ）アディプシン（配列番号２または配列番号１３）に特異的に結合し、該アディプシンを検出するための抗体
ｅ）上記ｄ）記載の抗体に特異的に結合しうる二次抗体
【０１０６】
　前記ａ）記載のプライマーは、本発明のアディプシン遺伝子の塩基配列（配列番号１または１２）に基づき、市販のプライマー設計ソフトを用いる等、常法にしたがい容易に設計し、増幅することができる。このようなプライマーの例としては、例えば配列番号４、配列番号５、配列番号１０、配列番号１１に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができる。
【０１０７】
　また、前記ｂ）記載のプローブは、本発明のアディプシン遺伝子に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、２０〜１５００塩基長程度のものが好ましい。具体的には、ノーザンハイブリダイゼーション法であれば、２０塩基長程度の1本鎖オリゴヌクレオチドか２本鎖ＤＮＡが好適に用いられる。また、マイクロアレイであれば、１００〜１５００塩基長程度の２本鎖ＤＮＡ、または２０〜１００塩基長程度の１本鎖オリゴヌクレオチドが好適に用いられる。一方、Affimetrix社のGene Chipシステムは２５塩基長程度の１本鎖オリゴがよい。これらは、特に本発明のアディプシン遺伝子の３’非翻訳領域に存在する配列特異性が高い部分に特異的にハイブリダイズするプローブとして設計することが好ましい。これらのプライマーやプローブは、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよく、またビオチン、リン酸、アミン等により修飾されていてもよい。このようなプローブの例としては、配列番号６に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができる。
【０１０８】
　また、前記ｃ）記載の固相化試料は、前記ｂ）記載のプローブをガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ等の固相に固定することにより作製される。このような固相化試料とその作製方法については、既に２．１で説明したが、例えば、遺伝子チップ、ｃＤＮＡアレイ、オリゴアレイ、メンブレンフィルター等を挙げることができる。
【０１０９】
　前記ｄ）およびｅ）記載の抗体は、２．２に記載した方法により作製することができる。該抗体は、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよいし、ビオチン等により適当に修飾されていてもよい。
【０１１０】
　本発明のキットは上記した構成要素のほか、必要に応じて、ハイブリダイゼーション、プローブの標識、ラベル体の検出等、本発明にかかる被験物質のインスリン抵抗性改善効果の評価方法に必要な、その他の試薬等を適宜含んでいてもよい。
【０１１１】
４．インスリン抵抗性改善剤
　本発明者らは２型糖尿病モデル動物において、アディプシン遺伝子を過剰発現させると、インスリン抵抗性改善の兆候がみられることを確認した。この結果は、アディプシンやアディプシン遺伝子が、インスリン抵抗性の治療に有用であることを示す。
　すなわち、本発明は、ヒト・アディプシンまたはヒト・アディプシン遺伝子を含む、インスリン抵抗性改善剤を提供する。
【０１１２】
４．１　ヒト・アディプシン遺伝子を含むインスリン抵抗性改善剤
　２型糖尿病等のインスリン抵抗性を有する患者に、ヒト・アディプシン遺伝子の全オープンリーディングフレーム配列を含む組換えベクター（gene transfer vector）を投与し、該患者の細胞で発現させることにより、インスリン抵抗性を改善させることができる。
【０１１３】
　ここで、使用されるベクター・プロモーター系は、ヒト細胞に対する遺伝子導入が可能であればよい。例えば、MoMLVベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、AAVベクター、HIVベクター、S1Vベクター、センダイウイルスベクタ一等のウイルスベクターが挙げられる。ウイルス以外のベクターとしてはリン醸カルシウムと核酸の複合体、リボソーム、カチオン脂質複合体、センダイウイルスリポソーム、ポリカチオンを主鎖とする高分子キャリアー等も使用可能である。さらに、エレクトロポレーション、遺伝子銃等の方法を用いてもよい。
【０１１４】
　プロモーターは、ヒト細胞内で遺伝子を発現させることができるものであれば、特に限定されない。例えば、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、シミアンウイルス40、ラウス肉腫ウイルス、単純ヘルペスウイルス、マウス白血病ウイルス、シンビスウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、JCウイルス、パルボウイルスB19、ポリオウイルス等のウイルス由来のプロモーター、アルブミン、SRα、熱ショック蛋白、エロンゲーション因子等の哺乳類由来のプロモーター、CAGプロモーター等のキメラ型プロモーター、テトラサイクリン、ステロイド等によって発現が誘導されるプロモーターが挙げられる。その他、シュードタイプのウィルスベクターを用いても良い。その一例としては、ＨＩＶの外皮蛋白質であるＥｎｖ蛋白質を、小水痘性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ：ＶＳＶ）の外皮蛋白質であるＶＳＶ−Ｇ蛋白質に置換したシュードタイプウイルスベクターが挙げられる（Ｎａｌｄｉｎｉ Ｌ等：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２ ２６３（１９９６））。
【０１１５】
４．２　ヒト・アディプシンを含むインスリン抵抗性改善剤
　２型糖尿病等のインスリン抵抗性を有する患者に、ヒト・アディプシンまたはヒト・アディプシンを含む組成物を投与することにより、インスリン抵抗性を改善させることができる。
【０１１６】
　まず、アディプシン遺伝子の全オープンリーディングフレーム配列を適当なベクター・プロモーター系に連結し、宿主細胞系に導入して目的とするアディプシンタンパクを産生させ、抽出・精製して組換えアディプシンを生産する。
【０１１７】
　前記ベクターとしては、前項のベクター・プロモーター系で列挙したものうち哺乳類、特にヒト細胞に遺伝子導入可能なベクターが挙げられる。同様に、使用可能なプロモータとしては、前項のベクター・プロモーター系で列挙したものうち哺乳類、特にヒト細胞で遺伝子発現が可能なプロモータが挙げられる。また、Ｌａｃプロモーター等大腸菌宿主内で発現可能なプロモーターも使用できる。
【０１１８】
　前記宿主細胞系としては、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、大腸菌、発育鶏卵等が挙げられる。さらに、遺伝子導入した宿主細胞系から産生された蛋白質を抽出する方法としては、例えば、細胞をホモジュナイズする方法、ＳＤＳ等の界面活性剤や酵素を用いて細胞膜を溶解させる方法、超音波処理、凍結・融解を繰り返す方法等が挙げられる。いずれの方法で得られた組換えアディプシンタンパクも、常法により精製する。例えば、超遠心や密度勾配遠心を利用した遠心分離、イオン交換カラムやアフィニティーカラム（例えば、前述の特異的な抗体を用いる）、逆相カラム等を利用したカラム分離、ポリアクリルアミドゲル等を用いたゲル分離等、一般的な生化学的手法が精製に利用できる。
【０１１９】
　上記のようにして製造、精製されたアディプシンは、公知の方法にしたがって、薬学的に許容される担体或いは希釈剤と混合され、薬学的に有用な組成物に製剤化することができる。前記薬学的組成物は、一または複数の治療的に有効な量の前記ポリペプチドを含んでいても良い。適当な担体、および希釈剤については、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences等に記載されている。
【０１２０】
　前記蛋白質に関して、投与に適した剤型は特に限定はされないが、既に医薬として使用されている多くのヒト蛋白質を含む薬学的組成物と同様に注射剤として調製されることが好ましい。より具体的に言えば、アディプシンを、水、生理食塩水、等張化した緩衝液等の適当な溶媒に溶解することで注射剤とする。その際、ポリエチレングリコール、グルコース、各種アミノ酸、コラーゲン、アルブミン等を保護剤として添加して調製してもよい。また、リボソーム等の封入体にポリペプチドを包埋させて投与することも可能である。
【０１２１】
６　その他
６．１　インスリン抵抗性（感受性）の予測
　本発明にかかるアディプシンやその遺伝子の発現量は、その動物のインスリン抵抗性（感受性）を反映する可能性が高い。したがって、例えば、被験者の血液や細胞におけるアディプシン遺伝子発現量を測定することによって、該被験者のインスリン抵抗性を予測することができる。こうした予測は、アディプシン遺伝子とともに、他のインスリン抵抗性（感受性）を反映する因子、例えば、TNF-αやアディポネクチン等の遺伝子の発現プロファイルを総体的に比較解析することにより、より正確に行うことが可能できる。
６．２　インスリン抵抗性を有するモデル動物の作製
　本発明にかかるアディプシンやアディプシン遺伝子の発現を人為的に低下させることにより、インスリン抵抗性を有する動物（例えば、マウス等）を作製することも可能である。例えば、アディプシン遺伝子に対するリボザイムやＲＮＡｉを動物に導入し、ヒト２型糖尿病に代表される、インスリン抵抗性病態に類似した表現的変化が現れれば、該動物を利用してインスリン抵抗性病態やその改善剤の研究を行うことができる。同様に、抗アディプシン抗体を直接動物に導入することによって、インスリン抵抗性を有するモデル動物を作製することができる。
【実施例】
【０１２２】
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：　ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析
　チップ解析は、アフィメトリクス社の発現解析技術マニュアル（Expression Analysis Technical Manual）にしたがい、以下に記載する方法により行った。
ａ）マウスの準備
　２型糖尿病モデルマウスとして、ＫＫ/Ｔａマウス（日本クレア社製、Ｎ＝２）を準備した。また、インスリン抵抗性改善剤として、ＥＰ公開第７４５６００号公報に記載された５−[４−（６−メトキシ−１−メチルベンズイミダゾール−２−イルメトキシ）ベンジル]チアゾリジン−２,４−ジオンおよびその薬理上許容される塩（塩酸塩等）（ここで、５−[４−（６−メトキシ−１−メチルベンズイミダゾール−２−イルメトキシ）ベンジル]チアゾリジン−２,４−ジオンの塩酸塩を、以下、「化合物Ａ」という。）を準備した。各マウスは、化合物Ａを重量比0.0003%で、1日、3日、または8日間混餌投与した。コントロールとして、化合物Ａを含まない飼料でマウス（Ｎ＝２）を同様に飼育した。全てのマウスは、全ＲＮＡを調製するために投与終了後に肝臓の摘出を行った。
【０１２３】
ｂ）全ＲＮＡの調製
　摘出された肝臓は、全ＲＮＡ抽出用試薬（TRIzol試薬：ギブコ・ビーアールエル社製）を用い、添付のプロトコールにしたがって全ＲＮＡの抽出を行った。次いで、得られた全ＲＮＡを再度TRIzol試薬に溶解し、フェノール、クロロホルム抽出を行った後、エタノール沈殿を行い、得られたペレットをＲＮＡ分解酵素（以下「ＲＮａｓｅ」という）を含まない純水に溶解して、全ＲＮＡ溶液とした。
【０１２４】
ｃ）ｃＤＮＡの合成
　得られた各10μgの全ＲＮＡを出発材料として、上記マニュアル記載にしたがってｃＤＮＡの合成および精製を行った。具体的には、全ＲＮＡを65℃で10分間保温し、急冷して変性させた後、逆転写酵素（SuperscriptII、ギブコ・ビーアールエル社製）およびT7プロモーター配列を含む下記の配列：
5'-ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata gggaggcggt tttttttttt tttttttttt ttt-3'（配列番号３）
を有するオリゴ（dT）プライマー（OligoExpress、アマシャム・ファルマシア社製）を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。合成の反応条件は、42℃、1時間とした。続いて、この反応系中にＤＮＡポリメラーゼＩ（ギブコ・ビーアールエル社製）を加えてｃＤＮＡを二本鎖とした。反応条件は16℃、2時間とした。
ｄ）ｃＲＮＡの合成
　上記のようにして得られたｃＤＮＡ全量を鋳型として、上記マニュアルの記載にしたがってｃＲＮＡの作製を行った。（反応条件は37℃、4.5時間とした）。この操作で得られた20μgのｃＲＮＡを断片化し、うち15μg相当をプローブ溶液に加えた。
【０１２５】
ｅ）プローブ溶液の作製
　プローブ溶液に加えるコントロールｃＲＮＡ作製用のプラスミドＤＮＡを保持する形質転換大腸菌は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）から購入した（pglks-bioB（ATCC87487）、pglks-bioC（ATCC87488）、pglks-bioD（ATCC87489）およびpglks-cre（ATCC87490））。これらの形質転換菌は、それぞれ200mlの100μg/mlのアンピシリンを含むＴＢ培地（1リットルあたり12gのバクトトリプトン、24gのバクトイーストエキストラクト、2.3gのKH2PO4、12.5gのK2HPO4および4mlのグリセロールを含む）中で培養した後、アルカリ法にてプラスミドを回収した。これらプラスミドは、さらに塩化セシウム密度勾配超遠心法により精製された。以下、コントロールｃＲＮＡの作製方法およびプローブ溶液の組成は、ともに上記マニュアル記載に従った。
【０１２６】
ｆ）ハイブリダイゼーション
　上記のようにして得られたプローブとハイブリダイズさせるチップとして、アフィメトリクス社製マウスMG-U74（U74A,U74B,U74C）を用いた。ハイブリダイゼーションとその後の洗浄操作は上記マニュアル記載にしたがって行った。なお、ハイブリダイゼーション条件は、45℃、18-22時間とした。
ｇ）解析
　ハイブリダイゼーション操作を行ったチップのデータ解析を、上記マニュアル記載にしたがって行った。
【０１２７】
　遺伝子の発現レベルは、各遺伝子の相対的発現量を表す「Fold Change値」で示した。この実施例では、Fold Change値は薬剤非投与群（コントロール）に対する薬剤投与群における各遺伝子の相対的発現量を表す。例えば、ある遺伝子のFold Change値が10のとき、その遺伝子は化合物Ａ投与群において非投与群より10倍多く発現している。
【０１２８】
　こうして、各遺伝子のFold Change値を解析した結果、投与群の肝臓において非投与群より高発現しているものとして、識別番号（probe set No.）99671_atの遺伝子が同定された。アフィメトリクス社の配列情報より、この配列はマウス・アディプシンをコードするヌクレオチド配列としてGenBankデータベースに登録されているもの（GenBank Accession No.：NM_013459）であることがわかった。
【０１２９】
　表１に、ＫＫ/Ｔａマウス投与群における識別番号：99671_at（マウス・アディプシン）のFold Change値を示した（U74Aチップのデータ）。この結果より、アディプシン遺伝子は、非投与群に対し投与群では、投与1日目で3.1倍、3日目で19倍、8日目で18.9倍高く発現していることが確認された。
【０１３０】
【表１】
2004041208.tif 000002
【０１３１】
実施例２：　アディプシン発現量の測定
ａ）ｃＤＮＡの調製
　実施例１にしたがい、化合物Ａを重量比0．0003％の用量で1日、3日、または7日間混餌投与したＫＫ/Ｔａマウス、および化合物Ａを投与しないマウス（コントロール）から肝臓を摘出し、全ＲＮＡ溶液を調製した。
【０１３２】
　得られた全ＲＮＡ6μgに純水を加えて全量を40μｌとし、65℃、10分間保温した後、急激に4℃まで冷却して熱変性を行った。この全ＲＮＡ溶液を20μｌずつ２本のサーマルサイクラー用マイクロチューブに分注し、それぞれにｃＤＮＡ合成キット（ファースト・ストランド　ｃＤＮＡ合成キット、アマシャム・ファルマシア社製）のジチオスレイトール溶液１μｌ、ＲＮａｓｅを含まない純水で５倍に希釈したＮｏｔＩ−オリゴ−（ｄＴ）−プライマー1μl、バルク・ファースト・ストランド・ミックス　11μlを加え、サーマルサイクラー（ＤＮＡエンジンＰＴＣ−２００、ＭＪリサーチ社製）を使用して37℃で1時間保温し、一本鎖ｃＤＮＡの合成を行った。
【０１３３】
　反応終了後、1本のチューブには17μlのＲＮａｓｅを含まない純水を加え、検量線作成用一本鎖ｃＤＮＡ溶液とした。もう一方のチューブには217μlのＲＮａｓｅを含まない純水を加え、定量用一本鎖ｃＤＮＡ溶液とした。核酸精製スピンカラム（クロマ−スピン１００、クロンテック社製）を添付のプロトコールにしたがって用いることによりこれら一本鎖ｃＤＮＡ溶液を精製し、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ用鋳型一本鎖ｃＤＮＡ溶液とした。
【０１３４】
ｂ）ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ
　一方、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ用のマウス・アディプシンＤＮＡ増幅用プライマーとして、下記の配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した（OligoExpress、アマシャム・ファルマシア社）。
5'- gagtgtcaat catgaaccgg a -3'（配列番号４）
5'- tgttaatggt gactaccccg tc -3'（配列番号５）
【０１３５】
　また、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ用のマウス・アディプシンＤＮＡ検出用プローブとして、下記の配列を有し、その５’末端にレポーター色素Famを、３’末端にレポーター消光体のTamaraを結合したオリゴヌクレオチドを合成した（ＴａｑＭａｎフルオレセント・プローブ、アプライドバイオシステムズジャパン社製）。
5'- aacctgcaat ctgcgcacgt acca -3' （配列番号６）
【０１３６】
　他方、マウス・アディプシンの発現量を標準化するため、リボソームタンパク質である36B4 mRNA発現量の測定を同時に行うこととし、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ用のマウス36B4増幅用プライマーとして、下記の配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した（oligoExpress、アマシャム・ファルマシア社製）。
5'- gctccaagca gatgcagca -3'（配列番号７）
5'- ccggatgtga ggcagcag -3'（配列番号８）
【０１３７】
　また、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ用のマウス36B4検出用プローブとして、下記の配列を有し、その5’末端にレポーター色素Famを、3’末端にレポーター消光体のTamaraを結合したオリゴヌクレオチドを合成した（ＴａｑＭａｎ　フルオレセント・プローブ、アプライドバイオシステムズジャパン社製）。
5'- caagaacacc atgatgcgca aggc -3' （配列番号９）
【０１３８】
ｃ）アディプシン発現量の定量
　上記のようにして調製した試料を用いて、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法によるマウス・アディプシンの発現量の定量を行った。
　ＰＣＲ反応溶液の組成は、１サンプルあたり、マウス肝臓由来鋳型一本鎖ｃＤＮＡ溶液５μｌ、プライマー（100pmol/μｌ）を正方向側、逆方向側ともに0.1μl（最終濃度200nM）、プローブ（6.5μM）1.5μl（最終濃度195nM）、ＰＣＲ増幅用混合液（ＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスター・ミックス、アプライドバイオシステムズジャパン社製）25μl、超純水18.3μlとした。なお、検量線作成用一本鎖ｃＤＮＡ溶液は、原液濃度の相対値を便宜的に「625」とし、以降5倍希釈を繰り返して濃度値「625」、「125」、「25」、「5」および「1」の5段階の希釈系列を作成し、一本鎖ｃＤＮＡ以外の組成を上記と同じにした反応液を調製した。
【０１３９】
　これら反応液を９６穴反応プレート（マイクロアンプ・オプチカル・９６ウェル・リアクション・プレート、アプライドバイオシステムズジャパン社製）のウェルに入れ、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ専用サーマルサイクラー・検出器（ABI7700、アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いてＰＣＲを行った。反応は、50℃で2分間、95℃で10分間保温の後、95℃で15秒間、60℃で１分間の反応を40サイクル繰り返し、１サイクル毎にレポーター色素の発光量を測定した。
【０１４０】
ｄ）解析
　各サイクル毎のレポーター色素の発光量から36B4およびアディプシンのそれぞれをコードするＤＮＡ断片の増幅曲線を作成した。検量線作成用一本鎖ｃＤＮＡ溶液の希釈系列の増幅曲線から横軸に濃度、縦軸にサイクル数をとった検量線を作成し、各発現定量用サンプルについてはその対数増幅期において任意に設定した一定の発光量を超えたサイクル数を検量線上にプロットし、相対的な発現量を算出した。アディプシンの発現量は、同一サンプルにおける36B4の発現量の値で補正を行った。
　図１に各マウスにおける、アディプシン遺伝子の相対的発現量を示した。この結果から、アディプシン遺伝子はインスリン抵抗性改善剤：化合物Ａの投与により著しく発現が増加することが確認された。
【０１４１】
実施例３：組換えアデノウイルスの作製
ａ）アディプシンｃＤＮＡの調製
　アデノウイルスベクターを用いた発現系を構築するため、マウス・アディプシンのアミノ酸をコードするｃＤＮＡをＰＣＲ法を利用して調製した。
【０１４２】
　具体的には、実施例１と同様に化合物Ａを重量比で0.0003%混入させた粉末餌を1週間投与したＫＫ/Ｔａマウスから肝臓を摘出し、全ＲＮＡ溶液を調製した。得られた全ＲＮＡ溶液 6μgに純水を加えて全量を40μlとし、65℃、10分間保温した後、急激に4℃まで冷却して熱変性を行った。この全ＲＮＡ溶液を20μlずつ2本のサーマルサイクラー用マイクロチューブに分注し、それぞれに一本鎖相補ＤＮＡ（以下「ｃＤＮＡ」という）合成キット（ファースト・ストランド　ｃＤＮＡ合成キット、アマシャム・ファルマシア社製）のジチオスレイトール溶液１μl、ＲＮａｓｅを含まない純水で５倍に希釈したＮｏｔＩ−オリゴ−（ｄＴ）−プライマー1μl、バルク・ファースト・ストランド・ミックス　11μlを加え、サーマルサイクラー（ＤＮＡエンジンＰＴＣ−２００、ＭＪリサーチ社製）を使用して37℃で１時間保温し、一本鎖ｃＤＮＡの合成を行った。
【０１４３】
　反応終了後、チューブに217μｌのＲＮａｓｅを含まない純水を加え、一本鎖ｃＤＮＡ溶液とした。核酸精製スピンカラム（クロマ−スピン１００、クロンテック社製）を添付のプロトコールにしたがって用いることにより、これら一本鎖ｃＤＮＡ溶液を精製し、ＰＣＲ用鋳型一本鎖ｃＤＮＡ溶液とした。
【０１４４】
　また、ＰＣＲ増幅用のプライマーとして下記の配列を有するオリゴＤＮＡを合成し（アマシャム・ファルマシア社）、アディプシン ｃＤＮＡクローニング用プライマーとした。
5'-agg gaa ttc atg cac agc tcc gtg tac ttc gtg-3'（配列番号１０）
5'-agg gga tcc tca gga tgt cat gtt acc att tgt-3'（配列番号１１）
【０１４５】
　上記鋳型一本鎖ｃＤＮＡ1μl、増幅用プライマー各10pmol、10mM dNTPs溶液（宝酒造社製）3μl、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしてplatinum Pfx（ギブコ・ビーアールエル社製）0.5μlを専用緩衝液（ギブコ・ビーアールエル社製）に混合して計50μlとした。増幅反応は、サーマルサイクラー（ＤＮＡエンジンＰＴＣ−２００、ＭＪリサーチ社製）を用いて、94℃で30秒、Ｘ℃で30秒、72℃で2分間を１サイクルとし、Ｘを74→70→66→62→58と変化させて各3サイクル、その後94℃で30秒、54℃で30秒、72℃で2分間を1サイクルとして20サイクル行った。
【０１４６】
　増幅産物は１％アガロースゲル中で電気泳動することにより展開し、目的産物として予想されるおよそ800bp付近のＤＮＡをレコチップ（宝酒造社製）を用いて回収し、エタノール沈殿を行って精製した。得られたＤＮＡ沈殿をＫ緩衝液（宝酒造社製）に溶解し、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩを各2 Unitずつ添加して37℃、2時間処理し、再び１％アガロースで電気泳動を行って展開し、目的のＤＮＡバンドを回収して10μlの超純水に溶解した。このＤＮＡ溶液4μl、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化した後バクテリア由来アルカルフォスファターゼで処理したpSG5ベクター（ストラタジーン社製）100ngを混合し、ＤＮＡライゲーションキットバージョンＩ（宝酒造社製）のＡ液を20μl、Ｂ液を5μl加えて混合し、16℃で1時間反応させた後エタノール沈殿を行って精製した。沈殿したＤＮＡを超純水に溶解し、ＪＭ１０９エレクトロセル（宝酒造社製）に加え、エレクトロポレーション法にて大腸菌にプラスミドを導入し、アンピシリンを100μg/mlの濃度で含む寒天培地上で37℃、一晩培養した。得られた形質転換株をＬＢ培地中で培養した後プラスミドを抽出して、導入されたｃＤＮＡの配列をダイターミネーション法により決定した。
【０１４７】
ｂ）組換えアデノウィルスの調製
　得られたアディプシンｃＤＮＡを強制発現させるための組換えアデノウイルスは、市販のキット（アデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キット、宝酒造社製）を用いて作製した。すなわち、前項で得られたプラスミドＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、得られた約800bpのＤＮＡ断片の末端を平滑化したものを挿入ＤＮＡ断片として以下の操作に用いた。
【０１４８】
　また、サイトメガロウイルスエンハンサーとニワトリβ−アクチンプロモーターにより発現されるように設計されているコスミドベクターｐＡｘＣＡｗｔ（アデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キットに添付）の制限酵素ＳｗａＩ認識部位にインサートＤＮＡ断片を挿入したコスミドｐＡｘＣＡ−adipsinを作製した。ｐＡｘＣＡ−adipsin ＤＮＡ若しくは対照用のｐＡｘＣＡＤＮＡおよび末端タンパク質結合ウイルスＤＮＡ（ＤＮＡ−ＴＰＣ、アデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キットに添付）をリン酸カルシウムトランスフェクションシステム（アマシャム・ファルマシア社製）を用いて２９３細胞（ATCC CRL1573）にコ・トランスフェクションして組換えアデノウイルスを単離し、さらに２９３細胞中で増幅させた。増幅させたウイルスの２９３細胞からの回収は、まずウイルス感染２９３細胞に30秒×４回の超音波処理（ブランソン社製Ｂ−１２００を使用）を行い、次いで塩化セシウム密度勾配遠心による精製を２回繰り返すことによって行った。こうして、アディプシンＤＮＡを含む組換えアデノウィルス（以下、「Ad/Adipsin」という。）、対照用のアディプシンＤＮＡを含まない組換えアデノウィルス（以下、「Ad/empty」という。）が調製された。
　得られたウイルス液は、10％グリセロールを添加したＰＢＳに対して4℃で２回透析した後、使用するまで-70℃以下で凍結保存した。
【０１４９】
実施例４：アディプシンのin vivoでの発現
ａ）組換えアデノウィルスの接種
　実施例３で作製したAd/AdipsinまたはAd/emptyを、1×1010pfu/ml、2×109pfu/ml、5×108pfu/mlとなるように生理食塩水で希釈し、それぞれ３匹の20週齢の雄ＫＫ／Ｔａマウスに200μlずつ尾静脈注射により接種した。
【０１５０】
ｂ）血中パラメーターの測定
　接種3、8、14日後に各マウスの尾静脈よりへパリン処理ヘマトクリット管を用いて採血して、卓上遠心機で5200rpmで15分、2回遠心して血漿を分離し、グルコース測定用キット（グルコースＣII−テストワコー、和光純薬社製）を用いて血糖値を、中性脂肪測定用キット（トリグリセリドＥ−テストワコー、和光製薬社製）を用いて中性脂肪濃度を、インスリン測定キット（森永生化学研究所製）を用いて血中インスリン値をそれぞれ測定した。各種パラメーターの変化を図２（Ａ〜Ｅ）に示す。
　その結果、Ad/empty接種マウス群では血中パラメーターに有意な差が認められなかったのに対し、Ad/Adipsin接種マウス群には血糖値、中性脂肪濃度、血中インスリン値に低下傾向が認められた。
【０１５１】
ｃ）ウェスタンブロッティング
　また、これら血中パラメーターに差が認められたアデノウイルス感染マウス群の血漿を、10-20％ポリアクリルアミド密度勾配ゲル（マルチゲル4/20、第一化学薬品社製）を用いて、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開した。
　電気泳動後、ポリアクリルアミドゲルからバンドを転写緩衝液（192mM  グリシン、20％メタノール、2ＶmMトリス）中でゲルメンブレン転写装置（ＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴ　ＳＤ、バイオラッド社製）を用いて45分、15Vの条件でニトロセルロースメンブレン（バイオラッド社製）に転写した。転写後のニトロセルロースメンブレンについて、抗マウスアディプシン抗体（ｐ−１６、サンタクルズ社製）を用いたウエスタンブロット解析を行った。すなわち、まずニトロセルロースメンブレンを0.1%のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下「ＰＢＳＴ」という）で洗浄した（室温で15分間を１回、次いで5分間を2回）後、プラスチックバッグ（ハイブリバック、コスモバイオ（株）社製）に入れ、１％ＢＳＡ（ピアス社製）を含む0.1% ＰＢＳＴを20ml加え、4℃で一晩振とうした。その後メンブレンを取り出し、0.1%ＰＢＳＴ中で、15分間×1回、次いで5分間×2回洗浄した。洗浄後、メンブレンを新しいプラスチックバッグに移し、抗アディプシン抗体（100倍希釈）、１％BSAを含む0.1%ＰＢＳＴを5ｍｌ添加して室温で1時間振とうした。１時間後、メンブレンを取り出し0.1%ＰＢＳＴで15分間×1回、5分間×2回洗浄した。その後、メンブレンを新しいプラスチックバッグに移し、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヤギＩｇＧ抗体（バイオラッド社製）を0.1%ＰＢＳＴで1000倍に希釈した溶液5ｍｌを入れ、室温で１時間振とうした。さらに１時間後、メンブレンを取り出し、0.1%ＰＢＳＴで１５分間×１回、次いで５分間×２回洗浄した。洗浄後、メンブレンをラップフィルム上に置き、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出溶液（アマシャム・ファルマシア社製）を用いて、マウスアディプシンの検出を行った（メンブレンをラップフィルム上に置き、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出溶液に１分間浸した後、Ｘ線フィルムを感光させた（３秒間））。その結果、Ad/Adipsinを感染させたＫＫ/Ｔａマウスの血漿中に特異的なバンドが検出された（図３）。
【０１５２】
　以上の結果から、インスリン抵抗性改善剤を投与した糖尿病モデルマウスでは、アディプシン遺伝子の発現が顕著に誘導されること、また、当該マウスの肝臓でアディプシン遺伝子を過剰発現させると、インスリン抵抗性改善の兆候が現れることが確認された。すなわち、アディプシンやアディプシン遺伝子はインスリン抵抗性やその改善の指標となりうる。したがって、化合物Ａの代わりに適当な被験化合物をマウスに投与し、上記と同様の手順で該マウスにおけるアディプシンやアディプシン遺伝子の発現量を調べれば、当該被験化合物のインスリン抵抗性改善効果を評価することができる。
【０１５３】
参考例：５−[４−（６−メトキシ−１−メチルベンズイミダゾール−２−イルメトキシ）ベンジル]チアゾリジン−２,４−ジオン塩酸塩の製造
　欧州特許出願公開第７４５６００号に記載の方法によって合成した、５−[４−（６−メトキシ−１−メチルベンズイミダゾール−２−イルメトキシ）ベンジル]チアゾリジン−２,４−ジオン１０．６ｇおよび４規定塩酸−１，４−ジオキサン１００ｍｌの混合物を濃縮後、酢酸エチルを加え、析出した成績体を濾取し、酢酸エチルで洗浄して、融点２７５−２７７℃を有する目的化合物１１．０ｇを得た。
【０１５４】
　1Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：δ（ｐｐｍ）：重ジメチルスルホキシド中、内部標準にＴＭＳ（テトラメチルシラン）を使用して測定した1Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（４００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）は次の通りである。
【０１５５】
　3.11 (1H, dd, J=14Hzおよび9Hz), 3.34 (1H, dd, J=14Hzおよび4Hz),3.89 (3H, s), 3.98 (3H, s), 4.91 (1H, dd, J=9Hzおよび4Hz),5.64 (2H, s), 7.14 (2H, d, J=9Hz), 7.15 (1H, d, J=9Hz)7.25 (2H, d, J=9Hz), 7.50 (1H, s), 7.70 (1H, d, 9Hz),12.04 (1H, s, D2O添加により消失)。
【配列表フリーテキスト】
【０１５６】
　配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（プライマー）
　配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（プライマー）
　配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（プライマー）
　配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（プローブ）
　配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（プライマー）
　配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（プライマー）
　配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（プローブ）
　配列番号10−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（プライマー）
　配列番号11−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（プライマー）
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】図１は、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲによるアディプシン遺伝子の相対的発現量を示す。
【図２】図２は、２型糖尿病モデルマウスにおけるアディプシン遺伝子の導入による各種パラメーターの変化を示す。（Ａ：血中グルコース、Ｂ：血中インスリン、Ｃ：体重、Ｄ：血中トリグリセライド、Ｅ：摂餌量）
【図３】図３は、ウェスタンブロットの結果を示す。
【図１】
2004041208.tif 000003
【図２】
2004041208.tif 000004
【図３】
2004041208.tif 000005
【配列表】
2004041208000001.app