(57)【要約】【課題】　合成が比較的容易で、かつ標識に用いた同位体が容易に離脱しないなど、フラバン−３−オール類の生体内動態や様々な生理活性の作用機序等を解明するのに適した標識化合物を提供すること。【解決手段】　一般式（１）で表される４位を重水素あるいはトリチウムで標識したフラバン−３−オール類、一般式（２Ａ）で表される４位を重水素あるいはトリチウムで標識したフラバン−３−オール類及び一般式（２Ｂ）で表される４位を重水素あるいはトリチウムで標識したフラバン−３−オール類。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）で表される４位を重水素あるいはトリチウムで標識したフラバン−３−オール類。
【化１】
2004043497.tif 000007
（式中、Ｒ1 は水素原子あるいはアシル基を、Ｒ2 は重水素あるいはトリチウムを、Ｒ3 〜Ｒ6 はそれぞれ独立して水素原子あるいは水酸基（ただし、２つのＲ5 は同じ基）を示し、ベンゾピラン環の２位と３位の立体配置はそれぞれＲ配置またはＳ配置のいずれであってもよい。）
【請求項２】
一般式（２Ａ）で表される４位を重水素あるいはトリチウムで標識したフラバン−３−オール類。
【化２】
2004043497.tif 000008
（式中、Ｒ1'はアシル基を、Ｒ2 は重水素あるいはトリチウムを、Ｒ5 とＲ7 はそれぞれ独立して水素原子あるいは水酸基を示し、ベンゾピラン環の２位と３位の立体配置はそれぞれＲ配置またはＳ配置のいずれであってもよい。）
【請求項３】
請求項２記載の一般式（２Ａ）において、Ｒ1'のアシル基がガロイル基である請求項２記載の４位を重水素あるいはトリチウムで標識したフラバン−３−オール類。
【請求項４】
一般式（２Ｂ）で表される４位を重水素あるいはトリチウムで標識したフラバン−３−オール類。
【化３】
2004043497.tif 000009
（式中、Ｒ1"は水素原子を、Ｒ2 は重水素あるいはトリチウムを、Ｒ5 は水素原子あるいは水酸基（ただし、２つのＲ5 は同じ基）を示し、ベンゾピラン環の２位と３位の立体配置はそれぞれＲ配置またはＳ配置のいずれであってもよい。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、４位を重水素あるいはトリチウムで標識したフラバン−３−オール類に関する。
【背景技術】
【０００２】
　フラバン−３−オール類は植物中に広く存在し、その中には有用な特性を有する化合物が数多く含まれている。例えば、フラバン−３−オール類の代表的な化合物として知られるカテキン類は、抗酸化作用、抗菌作用、抗ウイルス作用、抗突然変異作用、抗腫瘍性、コレステロール上昇抑制作用、血圧上昇抑制作用等、ヒトの健康維持、増進に対して優れた効果を有することが報告されており、近年カテキン類を有効成分とする健康食品や医薬品の開発が活発に行われている。
【０００３】
　ところで、ヒトの体内におけるフラバン−３−オール類の動態やヒトに対する様々な生理活性の作用機序に関しては、依然として不明な点が多い。そこで、これらを明らかにするため、これまでにフラバン−３−オール類の水素原子や炭素原子をそれらの同位体で置換した標識化合物を得る試みがなされてきた。
　例えば、非特許文献１には、植物（Uncaria Gambir) を用いて14Ｃを標識した（＋）−カテキン（以下、カテキンをＣと略記することがある。）を得る方法が記載され、また非特許文献２には、14Ｃを標識した（＋）−Ｃを用いた体内動態に関する報告がなされている。
【０００４】
　しかし、フラバン−３−オール骨格を形成している炭素原子を同位体で標識化するには、前駆体からの複雑な合成過程、あるいは植物などの生体を用いた合成などを行うため、多大な労力と費用を要する。
　そのため、上記の炭素原子を同位体で標識化する方法よりも比較的容易にフラバン−３−オール類を標識化する方法として、この化合物の水素原子を同位体で標識化する方法が検討されている。
　例えば、非特許文献３には、（−）−エピガロカテキンガレート（以下、ＥＧＣｇと略記することがある。）の２’、６’、２”、６”位の水素のうち、少なくとも１個をトリチウムで標識した（−）−ＥＧＣｇをマウスに経口投与し、（−）−ＥＧＣｇの体内分布を調べたことが報告されている。
【０００５】
　しかし、（−）−ＥＧＣｇの２’、６’、２”、６”位に結合したトリチウムは、水中において水の水素原子と容易に置換される可能性がある。また、（−）−ＥＧＣｇの２’、６’、２”、６”位の水素原子は、メチルメルカプタンのような求核性の化合物と置換反応を起こすことが知られており、このような置換反応は生体内でも容易に起こることが予想される。
　したがって、２’、６’、２”、６”位の水素原子をトリチウムで標識した（−）−ＥＧＣｇは、（−）−ＥＧＣｇの生体内動態を調べる試験には適さない。
【０００６】
　また、非特許文献４には、３位をトリチウムで標識した（＋）−Ｃの製造法が記載されている。しかしながら、この標識化合物の合成方法は、３位の水酸基の酸化還元反応を利用しているために、（−）−ＥＧＣｇや（−）−エピカテキンガレート（以下、ＥＣｇと略記することがある。）のような３位にエステル構造を持つフラバン−３−オール類に適用することができない。
【０００７】
【非特許文献１】Biochemical Journal、105 、p.73〜77 (1967)
【非特許文献２】Biochemical Journal、115 、p.831〜836 (1969)
【非特許文献３】Carcinogenesis、19(10)、p.1771〜1776 (1998)
【非特許文献４】Radioisotopes 、32、p.225〜230 (1983)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
　本発明の目的は、合成が比較的容易で、かつ標識に用いた同位体が容易に離脱しないなど、フラバン−３−オール類の生体内動態や様々な生理活性の作用機序等を解明するのに適した標識化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
　本発明者らは、かかる標識化合物を得るため、鋭意研究を行った。その結果、フラバン−３−オール類の４位の水素原子を重水素あるいはトリチウムで置換することによって、目的とする化合物が得られることを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成した。
【００１０】
　請求項１記載の本発明は、一般式（１）で表される４位を重水素あるいはトリチウムで標識したフラバン−３−オール類である。
【００１１】
【化１】
2004043497.tif 000002
【００１２】
（式中、Ｒ1 は水素原子あるいはアシル基を、Ｒ2 は重水素あるいはトリチウムを、Ｒ3 〜Ｒ6 はそれぞれ独立して水素原子あるいは水酸基（ただし、２つのＲ5 は同じ基）を示し、ベンゾピラン環の２位と３位の立体配置はそれぞれＲ配置またはＳ配置のいずれであってもよい。）
【００１３】
　請求項２記載の本発明は、一般式（２Ａ）で表される４位を重水素あるいはトリチウムで標識したフラバン−３−オール類である。
【００１４】
【化２】
2004043497.tif 000003
【００１５】
（式中、Ｒ1'はアシル基を、Ｒ2 は重水素あるいはトリチウムを、Ｒ5 とＲ7 はそれぞれ独立して水素原子あるいは水酸基を示し、ベンゾピラン環の２位と３位の立体配置はそれぞれＲ配置またはＳ配置のいずれであってもよい。）
【００１６】
　請求項３記載の本発明は、請求項２記載の一般式（２Ａ）において、Ｒ1'のアシル基がガロイル基である請求項２記載の４位を重水素あるいはトリチウムで標識したフラバン−３−オール類である。
　請求項４記載の本発明は、下記の一般式（２Ｂ）で表される４位を重水素あるいはトリチウムで標識したフラバン−３−オール類である。
【００１７】
【化３】
2004043497.tif 000004
【００１８】
（式中、Ｒ1"は水素原子を、Ｒ2 は重水素あるいはトリチウムを、Ｒ5 は水素原子あるいは水酸基（ただし、２つのＲ5 は同じ基）を示し、ベンゾピラン環の２位と３位の立体配置はそれぞれＲ配置またはＳ配置のいずれであってもよい。）
【発明の効果】
【００１９】
　本発明により、４位を重水素あるいはトリチウムで標識したフラバン−３−オール類が提供される。フラバン−３−オール類の４位に結合した重水素あるいはトリチウムは、生体内での置換反応を受け難い。
　したがって、本発明に係る４位を重水素あるいはトリチウムで標識したフラバン−３−オール類は、生体内におけるフラバン−３−オール類の挙動や、様々な生理活性の作用機序を解明する上で極めて有用である。
　しかも、本発明によれば、該化合物を効率的に製造することができるので、フラバン−３−オール類の研究や用途開発等の進展に貢献することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
　一般に、フラバン−３−オールとは、次式で表される化合物の総称である。
【００２１】
【化４】
2004043497.tif 000005
【００２２】
　これに対し、本発明においてフラバン−３−オール類とは、前記一般式（１）において、Ｒ2 は水素原子を示し、他は前記と同じものを示す化合物の総称である。
【００２３】
　本発明は、該フラバン−３−オール類の４位が重水素又はトリチウムで標識された化合物を提供するものであり、これらの具体例としては、前記一般式（２Ａ）において式中のＲ1'がアシル基であり、Ｒ2 が重水素又はトリチウムである場合の化合物には、Ｒ5 、Ｒ7 がそれぞれ水素原子である３−Ｏ−アシル（＋）及び（−）−アフゼレキン（afzelechin) 、３−Ｏ−アシル（＋）及び（−）−エピアフゼレキン（epiafzelechin)の標識化合物、Ｒ5 、Ｒ7 のうち一方が水素原子、他方が水酸基である３−Ｏ−アシル（＋）及び（−）−Ｃ、３−Ｏ−アシル（＋）及び（−）−エピカテキン（epicatechin)（以下、ＥＣと略記することがある。）の標識化合物、Ｒ5 、Ｒ7 が共に水酸基である３−Ｏ−アシル（＋）及び（−）−ガロカテキン（gallocatechin)（以下、ＧＣと略記することがある。）、３−Ｏ−アシル（＋）及び（−）−エピガロカテキン（epigallocatechin) （以下、ＥＧＣと略記することがある。）の標識化合物などを挙げることができる。
【００２４】
　なお、式中のＲ1'がアシル基であるときの具体例としては、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、バレリル基、ヘキサノイル基、ヘプタノイル基、オクタノイル基などの直鎖脂肪酸残基や、ベンゾイル基、ガロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、ジニトロベンゾイル基、シクロペンチルオキシカルボニル基などのアロイル基等を挙げることができる。
【００２５】
　また、式中のアシル基を示すＲ1'がガロイル基であり、Ｒ2 が重水素又はトリチウムである場合の化合物には、Ｒ5 、Ｒ7 がそれぞれ水素原子である（＋）及び（−）−アフゼレキンガレート（afzelechin gallate) 、（＋）及び（−）−エピアフゼレキンガレート（epiafzelechin gallate)の標識化合物、Ｒ5 、Ｒ7 のうち一方が水素原子、他方が水酸基である（＋）及び（−）−カテキンガレート（catechin gallate) 、（＋）及び（−）−ＥＣｇの標識化合物、Ｒ5 、Ｒ7 が共に水酸基である（＋）及び（−）−ガロカテキンガレート（gallocatechin gallate)（以下、ＧＣｇと略記することがある。）、（＋）及び（−）−ＥＧＣｇの標識化合物などを挙げることができる。
【００２６】
　さらに、一般式（２Ｂ）において式中のＲ1"が水素原子であり、Ｒ2 が重水素又はトリチウムである場合の化合物には、Ｒ5 が水素原子である（＋）及び（−）−アフゼレキン（afzelechin) 、（＋）及び（−）−エピアフゼレキン（epiafzelechin)の標識化合物、Ｒ5 が水酸基である（＋）及び（−）−ＧＣ、（＋）及び（−）−ＥＧＣの標識化合物を挙げることができる。
【００２７】
　次に、本発明の４位を重水素あるいはトリチウムで標識したフラバン−３−オール類の製造方法について説明する。
　まず、下記の一般式（２Ｃ）で表される化合物（式中、Ｒ1'はアシル基を、Ｒ5 とＲ7 はそれぞれ独立して水素原子あるいは水酸基を示し、ベンゾピラン環の２位と３位の立体配置はそれぞれＲ配置またはＳ配置のいずれであってもよい。）のすべての水酸基に保護基を導入する。
【００２８】
【化５】
2004043497.tif 000006
【００２９】
（式中、Ｒ1'はアシル基を、Ｒ5 とＲ7 はそれぞれ独立して水素原子あるいは水酸基を示し、ベンゾピラン環の２位と３位の立体配置はそれぞれＲ配置またはＳ配置のいずれであってもよい。）
【００３０】
　保護基としては、アセチル基、ベンゾイル基、テトラヒドロピラニル基、メトキシメチル基等を挙げることができる。これらの中では、アセチル基が脱保護のし易さの点で最も好ましい。
【００３１】
　アセチル基の導入には、無水塩化アルミニウムなどのルイス酸存在下で無水酢酸、酢酸クロリド、塩化アセチルなどの化合物を用いることができるが、その中では、無水酢酸が最も好ましい。アセチル基を導入する際の好ましい反応条件としては、塩基触媒であるピリジンを含む無水酢酸中で、反応温度２０〜６０℃、好ましくは４０〜５０℃、より好ましくは４５℃、反応時間３〜４８時間、好ましくは１５〜２５時間、より好ましくは２０時間である。また、反応中は攪拌を続ける。
　このようにして、上記一般式（２Ｃ）の化合物のすべての水酸基に保護基を導入した化合物は、必要に応じて溶媒抽出、各種クロマトグラフィー等の公知の方法により、所望の純度に精製することができる。
【００３２】
　次に、上記保護基を導入した一般式（２Ｃ）の化合物の４位の水素原子をハロゲン原子に置換する。このハロゲン化には、塩素化、ヨウ素化、臭素化、フッ素化がある。ハロゲン化の方法としては、例えば塩素化には、塩化トリクロルメタンスルホニル又は塩化スルフリル又は次亜塩素酸ｔ−ブチル中で、過酸化ベンゾイル又はアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）又はテトラフェニルホスフィンパラジウムを用いる方法、あるいは四塩化炭素中で黄赤色ガス（Ｃｌ2 Ｏ) を用いる方法を挙げることができる。
　また、ヨウ素化には、四塩化炭素中で次亜塩素酸ｔ−ブチルとヨウ化水銀（ＨｇＩ2)を用いる方法が、臭素化には、過酸化ｔ−ブチル存在下で無水酢酸中、臭化銅（ＣｕＢｒ2)を用いる方法又はブロモトリクロロメタン中で光反応させる方法がある。
【００３３】
　本発明においては、ハロゲン化として臭素化を行うことが、物質の安定性の面から特に好ましい。臭素化の具体的な方法を示すと、Ｎ−ブロモサクシニイミド（ＮＢＳ）と触媒量のＡＩＢＮまたは過酸化ベンゾイルを非極性の有機溶媒に懸濁して還流し、４位を臭素化する方法がある。このとき使用する非極性有機溶媒としては、四塩化炭素、クロロホルム、ベンゼン、トルエン等が挙げられるが、この中では、四塩化炭素が最も好ましい。ＮＢＳの使用量は、前駆体に対してモル比で１．１の割合で用いることが好ましい。還流時間は、３０分から６時間、好ましくは１時間である。
【００３４】
　以上の方法により、前記一般式（２Ｃ）のすべての水酸基に保護基が導入され、さらに４位にハロゲン原子が導入された化合物を得ることができる。なお、該化合物は、必要に応じて溶媒抽出、各種クロマトグラフィー等の公知の方法を適用することにより、所望の純度に精製することができる。
【００３５】
　次に、上記４位にハロゲン原子が導入された一般式（２Ｃ）の化合物の該ハロゲン原子を水素の同位体と置換する。その方法としては、重水素化ホウ素ナトリウム、トリチウム化ホウ素ナトリウム、重水素化アルミニウムリチウム、トリチウム化アルミニウムリチウム、シアン化重水素化ホウ素ナトリウム、シアン化トリチウム化ホウ素ナトリウム、重水素化トリエチルホウ素リチウム、トリチウム化トリエチルホウ素リチウム、重水素化トリブチルスズ、トリチウム化トリブチルスズ等で４位のハロゲン原子を水素の同位体と置換する方法、あるいはパラジウム、白金、ロジウム、ルテニウム、イリジウム、ラネーニッケルなどを触媒として重水素ガス又はトリチウムガスで接触還元することにより、４位の臭素原子などのハロゲン原子を水素の同位体と置換する方法がある。
【００３６】
　このようにして、前記一般式（２Ｃ）のすべての水酸基に保護基が導入され、さらに４位に水素の同位体が導入された化合物を得ることができる。なお、該化合物は、前記と同様に、必要に応じて溶媒抽出、各種クロマトグラフィー等の公知の方法を適用して、所望の純度に精製することができる。
【００３７】
　次いで、該化合物から常法にしたがって保護基をはずし、目的とする一般式（２Ａ）で表される４位を重水素又はトリチウムで標識したフラバン−３−オール類（式中、Ｒ1'はアシル基を、Ｒ2 は重水素あるいはトリチウムを、Ｒ5 とＲ7 はそれぞれ独立して水素原子あるいは水酸基を示し、ベンゾピラン環の２位と３位の立体配置はそれぞれＲ配置またはＳ配置のいずれであってもよい。）を得る。
【００３８】
　特に、保護基がアセチル基である場合は、重水素化ホウ素ナトリウム、トリチウム化ホウ素ナトリウム、重水素化アルミニウムリチウム又はトリチウム化アルミニウムリチウムを用いることによって、４位の水素同位体標識化と脱保護が同時に完了し、目的とする一般式（２Ａ）（式中、Ｒ1'はアシル基を、Ｒ2 は重水素あるいはトリチウムを、Ｒ5 とＲ7 はそれぞれ独立して水素原子あるいは水酸基を示し、ベンゾピラン環の２位と３位の立体配置はそれぞれＲ配置またはＳ配置のいずれであってもよい。）で表される化合物を得ることができる。
【００３９】
　上記の方法における反応条件としては、前駆体に対して重水素化ホウ素ナトリウム、トリチウム化ホウ素ナトリウム、重水素化アルミニウムリチウム又はトリチウム化アルミニウムリチウムをモル比で１０倍量から１０００倍量用い、反応溶媒としてメタノール、２−プロパノール、ピリジン、ＴＨＦ等を用いる。これらの溶媒中では、無水メタノールが最も好ましい。また、反応時間は、３０分から２４時間の間で適宜調節すればよい。
【００４０】
　一方、一般式（２Ａ）（式中、Ｒ1'はアシル基を、Ｒ2 は重水素あるいはトリチウムを、Ｒ5 とＲ7 はそれぞれ独立して水素原子あるいは水酸基を示し、ベンゾピラン環の２位と３位の立体配置はそれぞれＲ配置またはＳ配置のいずれであってもよい。）で表される化合物から該化合物の一般式中のＲ1’をアシル基から水酸基に置換した化合物を得るには、上記一般式（２Ａ）で表される化合物にエステラーゼを作用させて３位のアシル基を加水分解すればよい。例えば、３位のアシル基がアセチル基、プロピオニル基などである場合は、エステラーゼとしてカルボキシエステラーゼを使用し、アシル基がガロイル基である場合は、エステラーゼとしてタンナーゼを使用する。なお、このとき用いる酵素は、市販の製剤を利用することもできる。
【実施例】
【００４１】
　以下に、本発明を製造例によって詳しく説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【００４２】
製造例１
　[4−2H] −（−）−ＥＧＣｇの製造
　（１）（−）−ＥＧＣｇのアセチル化
　ナスフラスコに、無水酢酸３３ｍｌとピリジン２７ｍｌをスターラーバーと共に入れて混和した。次に、攪拌しながら（−）−ＥＧＣｇ２ｇ（４．３７ｍｍｏｌ）を加え、オイルバス中で４５℃に保温しながら、２０時間反応させた。
　その後、冷水中に反応液を少しずつ加えることにより、白い沈殿を生じさせ、濾紙フィルターで該沈殿物を回収した。さらに、濾紙フィルター上で、純水を用いて沈殿物を洗浄した後、これを乾燥器で乾固させた。
　次いで、乾固した反応物を、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：３の混合比の溶媒で充填したシリカゲルオープンカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒　ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：３）に供することにより、精製物３．４ｇを得た。
【００４３】
　次に、質量分析（ＥＩ−ＭＳ）及び 1Ｈ−ＮＭＲにより、この精製物が（−）−ＥＧＣｇオクタアセテートであることを確認した。以下に、質量分析のデータ及び 1Ｈ−ＮＭＲのデータを示す。
【００４４】
　質量分析（ＥＩ−ＭＳ）：７９４（Ｍ+ )
　 1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ：2.2-2.4(24H 、アセチル基×8)、3.0(ｄｄ、2H、H-4a、b 、J=4.1Hz)、5.2(s 、1H、H-2)、5.6(m 、1H、H-3)、6.6(ｄ、1H、H-8 、J6、8=2.1Hz)、6.7(ｄ、1H、H-6 、J6、8=2.1Hz)、7.2(ｓ、2H、H-2'、6')、7.6(ｓ、2H、H-2"、6")
【００４５】
　（２）（−）−ＥＧＣｇオクタアセテートの４位臭素化
　上記の（−）−ＥＧＣｇオクタアセテート１．２ｇ（１．５１ｍｍｏｌ）を１５０ｍｌの脱水四塩化炭素に加熱、溶解した。次に、Ｎ−ブロモサクシニイミド２９０ｍｇ（１．６３ｍｍｏｌ）及びアゾビスイソブチロニトリル３ｍｇを添加し、１時間加熱還流した。
　反応液を冷却後、減圧濃縮・乾固した。得られた反応物をｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：３の混合比の溶媒で充填したシリカゲルオープンカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒　ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：３）に供して目的物の粗精製を行った後、さらに下記のＨＰＬＣ条件下で目的物を精製した。
【００４６】
　ＨＰＬＣ条件１：
　カラム：資生堂Capcell Pak 、ＵＧ１２０、２０ｍｍφ×２５０ｍｍ
　移動相：５０％　アセトニトリル水（０．０１％　ＴＦＡを含む）
　流速：９．９ｍｌ／ｍｉｎ
　カラム温度：３５℃
【００４７】
　次に、質量分析（高性能ＣＩ−ＭＳ）及び 1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲにより、この精製物が４位臭素化−（−）−ＥＧＣｇオクタアセテートであることを確認した。以下に、質量分析、 1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲのデータを示す。
【００４８】
　質量分析（高性能ＣＩ−ＭＳ）：
　　計算値　８７３．０８７８、　実測値　８７３．０９３５（＋5.7 mmass)
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ：2.24(s、6H、アセチル基×2)、2.26(s、3H、アセチル基) 、2.27(s、3H、アセチル基) 、2.28(s、6H、アセチル基×2)、2.29(s、3H、アセチル基) 、2.37(s、3H、アセチル基) 、5.4(d 、1H、H-4 、J=2.0Hz)、5.6(dd、1H、H-3 、J=0.8 、2.0Hz)、5.9(s 、1H、H-2)、6.7(d 、1H、H-8 、J=1.5Hz)、6.8(d 、1H、H-6 、J=1.5Hz)、7.3(s 、2H、H-2'、6') 、7.6(s 、2H、H-2"、6")
　13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ：14.1(CH3−アセチル基）、20.2(CH3−アセチル基）、20.6(CH3−アセチル基×2)、21.12(CH3 −アセチル基) 、21.14(CH3 −アセチル基) 、22.7(CH3−アセチル基) 、31.6(CH3−アセチル基) 、37.2(C-4)、72.4(C-3)、72.7(C-2)、108.1(C-8)、109.9(C-6)、110.4(C-4a)、118.8(C-2"、6")、122.5(C-2'、6')、126.6(C-1")、134.1(C-4')、134.7(C-1')、139.3(C-4")、143.4(C-3"、5")、143.6(C-3'、5')、150.1(C-7)、151.9(C-8a)、154.3(C-5)、163.2(C=O)、166.1(C=O −アセチル基)、166.7(C=O −アセチル基)、167.4(C=O −アセチル基×2)、167.6(C=O −アセチル基×2)、167.9(C=O −アセチル基)、168.5(C=O −アセチル基)
【００４９】
　（３）４位臭素化−（−）−ＥＧＣｇオクタアセテートの４位重水素置換及び脱保護
　上記の４位臭素化−（−）−ＥＧＣｇオクタアセテート２０ｍｇ（２２．９μｍｏｌ）を３０ｍｌの脱水メタノールに溶解した後、重水素化ホウ素ナトリウム３０３ｍｇを添加し、室温（２４℃）で８０分反応後、１０％リン酸水１５ｍｌと水８５ｍｌを添加して反応を停止した。
　次に、反応液中のメタノール分を減圧留去した後、水で平衡化したダイアイオンＨＰ−２０（三菱化学（株）製）を充填したカラムに反応液を供した。純水でカラムを洗浄した後、アセトニトリルで目的物を溶出し、乾固した。さらに、以下のＨＰＬＣ条件下で目的物を精製した。
【００５０】
　ＨＰＬＣ条件２：
　カラム：資生堂Capcell Pak 、ＵＧ１２０、２０ｍｍφ×２５０ｍｍ
　移動相：アセトニトリル：酢酸エチル：０．０５％リン酸水＝１２：０．６：９０（体積比）
　流速：９．９ｍｌ／ｍｉｎ
　検出：ＵＶ２８０ｎｍ
　カラム温度：室温（２４℃）
【００５１】
　次いで、上記精製物をＨＰＬＣで分析した結果、無標識（−）−ＥＧＣｇと保持時間及びＵＶスペクトルが一致し、重水素ラベル化（−）−ＥＧＣｇが合成されていることが示唆された。
　さらに、質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）、1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ及び元素分析（重量法）により、上記の精製物は [4-2H] −（−）−ＥＧＣｇ、すなわち一般式（２Ａ）（式中、Ｒ1'はガロイル基を、Ｒ2 は重水素を、Ｒ5 とＲ7 は水酸基を示し、ベンゾピラン環の２位、３位の立体配置はそれぞれＲ配置である。）で表される、４位が重水素で標識された（−）−ＥＧＣｇであることが確認された。
【００５２】
　ＨＰＬＣ条件３：
　カラム：資生堂Capcell Pak 、ＵＧ１２０、４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ
　移動相：アセトニトリル：酢酸エチル：０．０５％リン酸水＝１２：０．６：９０（体積比）
　流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
　検出：ＵＶ２００〜４００ｎｍ
　カラム温度：４０℃
【００５３】
　以下に、1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析及び元素分析のデータを示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3 ＯＤ）δ：2.8(d 、1H、H-4 、J=2.7Hz)、5.0(s 、1H、H-2)、5.5(dd、1H、H-3 、J=1.5 、2.7Hz)、5.9(s 、2H、H-6 、8)、6.5(s 、2H、H-2'、6')、6.9(s 、2H、H-2"、6")
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ3 ＯＤ）δ：28.1(C-4)、69.9(C-3)、78.7(C-2)、95.9(C-8)、96.6(C-6)、99.4(C-4a)、106.9(C-2"、6")、110.3(C-2'、6')、121.5(C-1")、130.9(C-4')、133.8(C-1')、139.9(C-4")、146.4(C-3"、5")、146.7(C-3'、5')、157.3(C-8a or 7)、157.9(C-8a or 7)、158.0(C-5)、167.7(C=O)
【００５４】
　質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）：ｍ／ｚ 460に[M＋H]+ (positive)
質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）：ｍ／ｚ 458に[M−H]- (negative)
　元素分析（重量法）： C22H17D1O11・2H2O (MW: 495.396); 計算値 C 53.34% 、H(+D) 4.68% 、実測値 C 53.42% 、H(+D) 4.63%
【００５５】
製造例２
　[4−3H] −（−）−ＥＧＣｇの製造
　製造例１の（−）−ＥＧＣｇオクタアセテートの４位臭素化で得られた４位臭素化−（−）−ＥＧＣｇオクタアセテート１０ｍｇを０．７ｍｌの脱水メタノールに溶解し、この溶液を予め１７Ｃｉのトリチウム化ホウ素ナトリウム（比放射活性６０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を添加したフラスコに加え、室温で一晩反応させた。
　その後、水素化ホウ素ナトリウム８ｍｇを反応液に加え、さらに３時間反応させた。次に、４ｍｌの５％リン酸水を加えて反応を停止した。この反応液は、約半分の容量になるまで減圧濃縮した。これを３ｍｌの酢酸エチルで４回抽出し、これら酢酸エチル層を合わせ、１０ｍｌの純水で該酢酸エチル層を３回洗浄した。その結果、酢酸エチル層の放射線量は８０ｍＣｉであった。
　次に、下記のＨＰＬＣ条件下で目的物の精製を行った。
【００５６】
　ＨＰＬＣ条件４：
　カラム：Prodigy ODS-2
　移動相：メタノール：水：酢酸＝２０：８０：０．１
　流速：３ｍｌ／ｍｉｎ
　検出：ＵＶ（２８０ｎｍ）及びラジオアイソトープ
【００５７】
　次に、上記精製物を下記条件のＨＰＬＣで分析した結果、ラジオアイソトープ検出器で一本のピークが検出され、その保持時間とＵＶ検出器における非標識（−）−ＥＧＣｇのピークの保持時間が一致し、トリチウムラベル化（−）−ＥＧＣｇが合成されていることが示唆された。
　さらに、質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）及び 3Ｈ−ＮＭＲにより、上記の精製物は [4-3H] −（−）−ＥＧＣｇ、すなわち一般式（２Ａ）（式中、Ｒ1'はガロイル基を、Ｒ2 はトリチウムを、Ｒ5 とＲ7 は水酸基を示し、ベンゾピラン環の２位、３位の立体配置はそれぞれＲ配置である。）で表される、４位がトリチウムで標識された（−）−ＥＧＣｇが合成されていることが確認された。
　また、ＨＰＬＣによる分析結果から、放射化学的純度は９９．５％であることが示された。以下に、質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）と 3Ｈ−ＮＭＲの結果を示す。
【００５８】
　質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）：[M＋H]+ イオン  ｍ／ｚ 461.3 (positive)
　 3Ｈ−ＮＭＲ（ＣＨ3 ＯＨ）δ： 2.97
　なお、質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）の結果から計算された該標識化合物の比放射活性は、１３Ｃｉ／ｍｍｏｌであった。
【００５９】
　ＨＰＬＣ条件５：
　カラム：資生堂Capcell Pak 、ＵＧ１２０、４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ
　移動相：アセトニトリル：酢酸エチル：０．０５％リン酸水＝１２：０．６：９０（体積比）
　流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
　検出：ＵＶ２８０ｎｍ及びラジオアイソトープ
　カラム温度：４０℃
【００６０】
製造例３
　[4−2H] −（−）−ＥＧＣの製造
　（−）−ＥＧＣｇの４位の水素原子のうち１つが重水素標識された製造例１で得られる[4−2H] −（−）−ＥＧＣｇ（２１．８μＭ）をタンナーゼ（三共（株）製）水溶液１ｍｌ（タンナーゼ２５ｍｇ／１０００ｍｌリン酸緩衝液）に溶かし、３７℃で２時間反応させた。
　続いて、前記製造例１のＨＰＬＣ条件２により目的物を精製した。
【００６１】
　この精製物は、前記製造例１のＨＰＬＣ条件３において無標識（−）−ＥＧＣと保持時間及びＵＶスペクトルが一致することを確認した。
　このことから、上記の精製物は、[4−2H] −（−）−ＥＧＣｇのガロイル基が水酸基に変換した[4−2H] −（−）−ＥＧＣ、すなわち一般式（２Ｂ）（式中、Ｒ1"は水素原子を、Ｒ2 は重水素を、Ｒ5 とＲ7 は水酸基を示し、ベンゾピラン環の２位、３位の立体配置はそれぞれＲ配置である。）で表される、４位が重水素で標識された（−）−ＥＧＣであることが確認された。
【００６２】
製造例４
　[4−3H] −（−）−ＥＧＣの製造
　（−）−ＥＧＣｇの４位の水素原子のうち１つがトリチウム標識された製造例２で得られる[4−3H] −（−）−ＥＧＣｇ　１０ｍＣｉをタンナーゼ（三共（株）製）水溶液１ｍｌ（タンナーゼ２５ｍｇ／１０００ｍｌリン酸緩衝液）に溶かし、３７℃で２時間反応させた。
　続いて、前記製造例２のＨＰＬＣ条件４により目的物を精製した。
【００６３】
　次に、この精製物を、前記製造例２のＨＰＬＣ条件５で分析した。その結果、ラジオアイソトープ検出器で一本のピークが検出され、その保持時間と非標識（−）−ＥＧＣのＵＶ検出器におけるピークの保持時間が一致した。
　このことから、[4−3H] −（−）−ＥＧＣｇのガロイル基が水酸基に変換した[4−3H] −（−）−ＥＧＣ、すなわち一般式（２Ｂ）（式中、Ｒ1"は水素原子を、Ｒ2'はトリチウムを、Ｒ5 とＲ7 は水酸基を示し、ベンゾピラン環の２位、３位の立体配置はそれぞれＲ配置である。）で表される、４位がトリチウムで標識された（−）−ＥＧＣが合成されていることが確認された。
【００６４】
製造例５
　[4−2H] −（−）−ＧＣｇ及び[4−2H] −（−）−ＧＣの製造
　前記製造例１で得られた１０ｍｇの[4−2H] −（−）−ＥＧＣｇ及び製造例３で得られた１０ｍｇの[4−2H] −（−）−ＥＧＣをそれぞれ１ｍｌのMacIlvaine buffer （ｐＨ５．０）に溶解し、１２０℃で３０分間オートクレーブにかけた。続いて、製造例１のＨＰＬＣ条件２により目的物を精製した。
【００６５】
　各精製物は、製造例１のＨＰＬＣ条件３において、それぞれ無標識（−）−ＧＣｇ、無標識（−）−ＧＣの保持時間及びＵＶスペクトルが一致した。
　このことから、上記の各精製物は、[4−2H] −（−）−ＧＣｇ、すなわち一般式（２Ａ）（式中、Ｒ1'はガロイル基を、Ｒ2 は重水素を、Ｒ5 とＲ7 は水酸基を示し、ベンゾピラン環の２位、３位の立体配置はそれぞれＳ配置、Ｒ配置である。）で表される、４位が重水素で標識された（−）−ＧＣｇ及び[4−2H] −（−）−ＧＣ、すなわち一般式（２Ｂ）（式中、Ｒ1"は水素原子を、Ｒ2 は重水素を、Ｒ5 とＲ7 は水酸基を示し、ベンゾピラン環の２位、３位の立体配置はそれぞれＳ配置、Ｒ配置である。）で表される、４位が重水素で標識された（−）−ＧＣが合成されていることが確認された。
【００６６】
製造例６
　[4−3H] −（−）−ＧＣｇ及び[4−3H] −（−）−ＧＣの製造
　　前記製造例２で得られた５ｍＣｉの[4−3H] −（−）−ＥＧＣｇ及び製造例４で得られた５ｍＣｉの[4−3H] −（−）−ＥＧＣをそれぞれ１ｍｌのMacIlvaine buffer （ｐＨ５．０）に溶解し、１２０℃で３０分間オートクレーブにかけた。続いて、製造例２のＨＰＬＣ条件４により目的物を精製した。
【００６７】
　次に、これらを前記製造例２のＨＰＬＣ条件５で分析した。その結果、それぞれラジオアイソトープ検出器で一本のピークが検出され、その保持時間は非標識（−）−ＧＣｇ及び非標識（−）−ＧＣのＵＶ検出器におけるピークの保持時間と一致した。
　このことから、これらは、それぞれ[4−3H] −（−）−ＧＣｇ、すなわち一般式（２Ａ）（式中、Ｒ1'はガロイル基を、Ｒ2 はトリチウムを、Ｒ5 とＲ7 は水酸基を示し、ベンゾピラン環の２位、３位の立体配置はそれぞれＳ配置、Ｒ配置である。）で表される、４位がトリチウムで標識された（−）−ＧＣｇ及び[4−3H] −（−）−ＧＣ、すなわち一般式（２Ｂ）（式中、Ｒ1"は水素原子を、Ｒ2 はトリチウムを、Ｒ5 とＲ7 は水酸基を示し、ベンゾピラン環の２位、３位の立体配置はそれぞれＲ配置である。）で表される、４位がトリチウムで標識された（−）−ＧＣが合成されていることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
　本発明に係る４位を重水素あるいはトリチウムで標識したフラバン−３−オール類は、生体内におけるフラバン−３−オール類の挙動や、様々な生理活性の作用機序を解明する上で極めて有用である。
　したがって、本発明はフラバン−３−オール類の研究や用途開発等の進展に貢献することができる。