(57)【要約】【課題】光学活性２−プロパンジオール類の経済的製法。【解決手段】１，２−プロパンジオール類のＲ体あるいはＳ体資化能を有し、該光学異性体を単一炭素源として生育しうるシュードモナス属またはアルカリゲネス属に属する微生物もしくはその培養菌体を、１，２−プロパンジオール類のエナンチオマー混合物を単一炭素源とする培地を培養槽に添加しながら連続培養し、該光学異性体を資化分解せしめ、培養槽から流出する培養物から、残存する光学活性１，２−プロパンジオール類を分取することを特徴とするその光学活性２−プロパンジオール類の製法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）で示される１，２−プロパンジオール類のＲ体あるいはＳ体資化能を有し、該光学異性体を単一炭素源として生育しうるシュードモナス属またはアルカリゲネス属に属する微生物もしくはその培養菌体を、式（１）で示される１，２−プロパンジオール類のエナンチオマー混合物を単一炭素源とする培地を培養槽に添加しながら連続培養し、該光学異性体を資化分解せしめ、培養槽から流出する培養物から、残存する式（１）で示される光学活性１，２−プロパンジオール類を分取することを特徴とする該光学活性１，２−プロパンジオール類の製法。
【化１】
2004041076.tif 000012
（式中、Ｘは水素原子またはハロゲン原子を表す。）
【請求項２】
式（１）で示される１，２−プロパンジオール類のＲ体あるいはＳ体資化能を有し、該光学異性体を単一炭素源として生育しうるシュードモナス属またはアルカリゲネス属に属する微生物もしくはその培養菌体を、連続した複数の培養槽を用い、単一炭素源として式（１）で示される１，２−プロパンジオール類のエナンチオマー混合物を含む培地を一槽目に添加しながら連続培養し、該光学異性体を資化分解せしめ、末端の培養槽から流出する培養物から、残存する式（１）で示される光学活性１，２−プロパンジオール類を分取することを特徴とする該光学活性体１，２−プロパンジオール類の製法。
【化２】
2004041076.tif 000013
（式中、Ｘは水素原子またはハロゲン原子を表す。）
【請求項３】
単一炭素源が１，２−プロパンジオールのエナンチオマー混合物である請求項１または２に記載の光学活性１，２−プロパンジオールの製法。
【請求項４】
単一炭素源が３−クロロ−１，２−プロパンジオールのエナンチオマー混合物である請求項１または２に記載の光学活性３−クロロ−１，２−プロパンジオールの製法。
【請求項５】
連続培養を制御するに際し、滞留時間により、一槽目内の式（１）の化合物濃度により、菌体濃度により、比増殖速度μにより、および／または比基質消費速度νにより、培養を制御する請求項１または２に記載の光学活性１，２−プロパンジオール類の製法。
【請求項６】
使用する微生物がシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．ＤＳ−ＳＩ−５株（　国際寄託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ−７０８０）、シュードモナスニトロレデューセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｅｎｓ）　ＤＳ−Ｓ−ＲＰ８株（国際寄託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ−７７９３）、またはアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）ｓｐ．ＤＳ−Ｓ−７Ｇ株（国際寄託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ−３０９８）である、請求項１〜３および５のいずれかに記載の（Ｒ）−１，２−プロパンジオールの製法。
【請求項７】
使用する微生物がシュードモナス　シュードアルガリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）ＤＳ−Ｔ−ＳＰ３２株（国内寄託番号：ＦＥＲＭ　Ｐ−１８４０２）である、請求項１〜３および５のいずれかに記載の（Ｓ）−１，２−プロパンジオールの製法。
【請求項８】
使用する微生物がシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．ＤＳ−Ｋ−２Ｄ１株（国際寄託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ−３０９６）である請求項１、２、４および５のいずれかに記載の（Ｒ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールの製法。
【請求項９】
使用する微生物がシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．ＤＳ−ＳＩ−５株（国際寄託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ−７０８０）またはアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）ｓｐ．ＤＳ−Ｓ−７Ｇ株（国際寄託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ−３０９８）である請求項１、２、４および５のいずれかに記載の（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールの製法。
【請求項１０】
シュードモナス　シュードアルガリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）ＤＳ−Ｔ−ＳＰ３２株（国内寄託番号：ＦＥＲＭ　Ｐ−１８４０２）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は医薬品・農薬・生理活性物質などの光学活性化合物の製造において極めて重要、且つ有用な化合物である光学活性１，２−プロパンジオール類の連続培養法を用いた連続生産法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に培養法としては、バッチ培養法、流加培養法、連続培養法が知られている。バッチ培養法は、培養当初にすべての基質を添加して培養終了時に培養液を回収する方法であり、少量、多品種生産に適した培養法である。流加培養法は、培養中に適宜基質を加えて最後に培養液を回収する方法であり、阻害性の基質を用いる場合やカタボライトリプレッションがかかる場合などに有効な培養法である。しかしながら、これら培養法は、培養終了まで培養液を取り出さないため、代謝産物による阻害が生じる。また、その都度培地の滅菌や種菌の調製といった煩雑な操作が必要であるため、手間と労力のかかる培養法であり、大量生産には適さない。
一方、連続培養法は培養中、連続的に培地を供給し、連続的に培養液を取り出す培養法である。この培養法では、一度培養を始めると連続的に培地を供給し連続的に培養液を得ることができ、培養槽を常に稼動状態に保てるため、バッチ培養や流加培養に見られるような煩雑な操作は不必要であり、また大量生産に最適な培養法である。しかしながら、長期にわたり連続培養を維持するには、雑菌による汚染などを防ぐために、特開平４−２１１３５７にあるような除菌または滅菌装置が必要となる。
【０００３】
連続培養法による連続生産法としては、連続醗酵によるＬ−グルタミン酸の製造法（特開平１０−１５０９９６）やエリスリトールの連続生産法（特開平５−１３７５８５）などが知られているが、ラセミ体化合物またはエナンチオマー混合物を単一炭素源とした連続培養法による光学活性体化合物の連続生産法は知られていない。
【０００４】
光学活性１，２−プロパンジオールの製法に関して、鈴木らはアルカリゲネス属細菌を用いることにより、ペプトンや酵母エキスなどの栄養源を含有する培地中で好気的に培養しながらラセミ体１，２−ジオールを光学分割する方法を報告しているが、工業的なスケールでは雑菌の汚染などの可能性があり実際的な方法とは言い難い（特開２００２−２９２）。
また、鈴木らはＳ体１，２−プロパンジオール資化能を有し、Ｓ体１，２−プロパンジオールを単一炭素源として資化増殖する能力を有するシュードモナス属またはアルカリゲネス属に属する細菌を、ラセミ体１，２−プロパンジオールを単一炭素源とする培地あるいは完全合成培地中で培養し、培養液より残存するＲ体１，２−プロパンジオールを分離回収することを特徴とする資化培養法によるＲ体１，２−プロパンジオールの製法につき特許出願している（特願２００１−３８７６６０）。なお、資化培養法によるＳ体１，２−プロパンジオールの製法については報告されていない。
【０００５】
光学活性３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオールの製法、例えばＲ体３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオールの製法に関しては、Ｓ体３−クロロ−１，２−プロパンジオール資化能を有し、Ｓ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを単一炭素源として資化増殖する能力を有するシュードモナス属に属する細菌を、ラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを単一炭素源とする培地あるいは完全合成培地中で培養し、培養液より残存するＲ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを分離回収することを特徴とする資化培養法によるＲ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールの製法が、特開平３−１９１７９４に開示されている。
【０００６】
Ｓ体３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオールの製法に関しては、Ｒ体３−クロロ−１，２−プロパンジオール資化能を有し、Ｒ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを単一炭素源として資化増殖する能力を有するシュードモナス属またはアルカリゲネス属に属する細菌を、ラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを単一炭素源とする培地あるいは完全合成培地中で培養し、培養液より残存するＳ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを分離回収することを特徴とする資化培養法によるＳ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールの製法が、特開平３−１９１７９５、特開２００１−１４９０９０に開示されている。
【０００７】
上に挙げた、微生物を用いる資化培養法による製法は、いずれも、それらの実施例に記載されているのように、バッチ培養法及び流加培養法による光学活性１，２−プロパンジオール類の生産法であるため、その都度培地の滅菌や種菌の調製といった煩雑な操作が必要となる手間と労力のかかる培養法であり、大量生産に適しているとはいい難い。また、代謝産物や生成物等の影響により、長時間にわたり安定に生産性を維持することは難しく、より簡便で安価な光学活性１，２−プロパンジオール類の製法が求められている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、光学活性１，２−プロパンジオール類を、より経済的に安価で且つ簡便に大量生産することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、従来のバッチ培養法及び流加培養法による光学活性１，２−プロパンジオール類の製造法を改良すべく鋭意検討した結果、該光学異性体を単一炭素源として資化増殖する能力を有するシュードモナス属またはアルカリゲネス属に属する細菌を、１，２−プロパンジオール類のエナンチオマー混合物を含む最少培地の供給速度を制御しながら連続培養することにより、光学活性１，２−プロパンジオール類を生産させる方法を見出し本発明に到達した。
【００１０】
本発明の要旨は、式（１）で示される１，２−プロパンジオール類のＲ体あるいはＳ体資化能を有し、該光学異性体を単一炭素源として生育しうるシュードモナス属またはアルカリゲネス属に属する微生物もしくはその培養菌体を、式（１）で示される１，２−プロパンジオール類のエナンチオマー混合物を単一炭素源とする培地を培養槽に添加しながら連続培養し、該光学異性体を資化分解せしめ、培養槽から流出する培養物から、残存する式（１）で示される光学活性１，２−プロパンジオール類を分取することを特徴とする該光学活性１，２−プロパンジオール類の製法に関する。
【化３】
2004041076.tif 000002
（式中、Ｘは水素原子またはハロゲン原子を表す。）
培養槽は一槽でもよいが、連続した少なくとも２つの培養槽を用い、滞留時間、一槽目の培養槽内の１，２−プロパンジオール類の濃度、菌体濃度、比増殖速度μ、比基質消費速度νのいずれかを一定に保つ様に制御する連続培養法により行うことが好ましい。
滞留時間、一槽目の培養槽内の１，２−プロパンジオール類の濃度、菌体濃度、比増殖速度μ、比基質消費速度νを一定に保つには、例えば最少培地の供給速度を調整すればよい。
以下に、本発明の連続培養法及びその制御方法について詳細に説明する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の方法において、培養条件は至適ｐＨ　、至適温度の範囲内で行うのがよい。例えばｐＨ　を４　〜　１　０　、好ましくは５　〜　９　、培養温度は１５　〜　５　０℃、好ましくは２　０　〜　３　７℃の範囲で行なう。なお、１，２−プロパンジオール類のエナンチオマー混合物の資化反応の進行に伴い、培養液中のｐＨが徐々に低下あるいは上昇する場合、適当なアルカリ源あるいは酸源を添加することにより培養液中のｐＨ　を至適範囲内にコントロールする必要がある。例えば、アルカリ源としては炭酸カルシウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸アンモニウ水溶液などの炭酸アルカリ塩水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液などの水酸化アルカリ金属塩水溶液、あるいはアンモニア水溶液など、酸源としては塩酸、燐酸など、通常酸またはアルカリを中和させることができるものを用いてｐＨ　を至適範囲内に制御するのがよい。
【００１２】
本発明の方法において、炭素源は、１，２−プロパンジオール類のみであり、窒素源としては、使用する菌株が利用し得る無機物質であれば特に制限は無く、例えば硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、リン酸アンモニウム等の無機窒素化合物、およびそれらの混合物を挙げることができる。これらの炭素源、窒素源を使用することにより、雑菌汚染などを防ぐことができる。更にリン酸塩、金属塩を必要に応じて加えることもできる。
【００１３】
本発明の方法において、培養槽の形式は、通気攪拌槽であればいずれでも利用可能であり、例えばエアーリフト式培養槽、機械的攪拌槽、気泡塔型培養槽などを利用することができる。培地の供給方法は、炭素源、窒素源、無機塩類、各種添加剤などが、一括してまたは個別に連続的にあるいは断続的に供給される。たとえば１，２−プロパンジオール類のエナンチオマー混合物は他の培地成分との混合物として培養槽に供給してもよいし、また他の培地成分とは別に独立して培養槽に供給してもよい。また、消泡剤も必要に応じて添加する。本発明の方法は、培養槽内に常に生育状態の良い対数増殖期の菌を安定に存在させることができるので、生産効率の高い製法である。
【００１４】
本発明の方法において、一槽目に連続的あるいは断続的に供給される１，２−プロパンジオール類のエナンチオマー混合物を含む最少培地は、単一炭素源である１，２−プロパンジオール類のエナンチオマー混合物以外は、無機窒素化合物、リン酸塩、金属塩などの無機塩類であるため、雑菌が生育しがたい環境であり、別途滅菌などの操作を必要ない特徴を有する。最少培地のｐＨは、好ましくは３程度に調整するのがよい。なお、単一炭素源として用いられる１，２−プロパンジオール類のエナンチオマー混合物に占めるＲとＳ体の混合比は特に制約が無い。
また、本発明の方法は、分割基質を単一炭素源とし、他に栄養培地を含まないため培養制御がきわめて容易である。生産量の調節も基質濃度の調整で、でき簡便である。
【００１５】
本発明の方法において、連続培養初期における一槽目の培養液中の菌体濁度ＯＤ（６６０ｎｍでの濁度、以下同様）は特に制限は無いが、通常は本発明における定常状態時の菌体濁度と同程度か、やや低い菌体濁度に達した後、連続培養へ移行することが望ましい。また、本発明において、連続培養中の一槽目の培養液の菌体濁度は通常４　ＯＤ〜１３　ＯＤである。
【００１６】
本発明の方法において、連続培養に先立って、菌を活発に増殖させて培養液中の菌体濁度が所定の値となるまで予備培養が行われる。予備培養としてバッチ培養または流加培養を行って菌体濁度を高くした後に連続培養を行ってもよいし、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続培養を行ってもよい。
【００１７】
予備培養は通常の方法により行われ、培養温度、ｐＨ、基質及び培地成分などは前記の本発明の連続培養における条件と同様である。予備培養に引き続き、前記の滞留時間、一槽目の培養槽内の１，２−プロパンジオール類濃度、菌体濃度、比増殖速度μ、比基質消費速度νにより制御される連続培養が行われる。
【００１８】
本発明の方法において、連続培養に切り替えられた後は、培地供給流量あるいは１，２−プロパンジオール類のエナンチオマー混合物の供給量を調整して、滞留時間、一槽目の培養槽内の１，２−プロパンジオール類濃度、菌体濃度、比増殖速度μまたは比基質消費速度ν、が一定となるように調整することが好ましい。
本発明の方法において、一槽目の培養液中の１，２−プロパンジオール類濃度は１〜２０％、好ましくは１〜１５％、更に好ましくは２．０〜８％に保つのが望ましい。
【００１９】
本発明の方法において、定常状態では、１，２−プロパンジオール類がラセミ体の場合、二槽目以降の滞留時間は、末端の培養槽から流出する培養物をガスクロマトグラフィー等で分析し、ラセミ体１，２−プロパンジオール類の残存濃度が初期濃度に比して５０％　、あるいは目的とする光学活性体の光学純度を測定して調節すればよい。また、ラセミ体以外の場合は、目的とする光学活性体の光学純度を測定して、調節すればよい。すなわち、基質である１，２−プロパンジオール類のエナンチオマー混合物中の一方の光学異性体１，２−プロパンジオール類が全て分解資化された時点で末端の培養槽から流出するように調節するのがよい。
滞留時間の調節は、二槽目以降の培養槽の体積で調節してもよいし、培養槽の数で調節してもよい。また培地供給流量で調節してもよい。
【００２０】
このようにして末端の培養槽から流出した培養液中に残存する光学活性１，２−プロパンジオール類は一般的な方法で回収および精製できる。例えば、培養液から菌体を遠心分離で除いた後、上清をエバポレーターにより濃縮し、酢酸エチル等の溶媒で抽出する。次いで抽出液を無水硫酸マグネシウムにより脱水した後、減圧下で溶媒を除去し光学活性１，２−プロパンジオール類のシロップを得ることができる。さらに蒸留により精製してもよい。
【００２１】
なお、シュードモナス　シュードアルガリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）ＤＳ−Ｔ−ＳＰ３２株は文献未載の新菌株であり、その生理学的、菌学的諸性質を以下に記載する。
菌株：シュードモナス　シュードアルガリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）　ＤＳ−Ｔ−ＳＰ３２
【００２２】
2004041076.tif 000003
【００２３】
2004041076.tif 000004
【００２４】
2004041076.tif 000005
【００２５】
2004041076.tif 000006
【００２６】
2004041076.tif 000007
【００２７】
2004041076.tif 000008
【００２８】
2004041076.tif 000009
【００２９】
2004041076.tif 000010
【００３０】
【実施例】
次に本発明を実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、実施例中の％は特に記載のない限り％（ｗ／ｖ）を表す。
【００３１】
実施例１
１２１℃で１５分間、加圧蒸気滅菌したグリセリン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌを含む液体培地１００ｍｌ（ｐＨ７．２）を入れた５００ｍｌ容バッフル付き三角フラスコに、あらかじめ同栄養培地プレートで生育させたシュードモナスｓｐ．ＤＳ−ＳＩ−５株の菌体を１白金耳分植菌し、３０℃で２４ｈｒ培養を行ない種培養液を得た。
【００３２】
【表１】
2004041076.tif 000011
【００３３】
次いで、表１に示す組成の無機成分水溶液にラセミ体１，２−プロパンジオールを４％添加した最少培地１Ｌ（ｐＨ６．９）を２Ｌ容の培養槽に入れ、１２１℃で１５分間、加圧蒸気滅菌し、ラセミ体１，２−プロパンジオールを単一炭素源とする培地を作製した。これに、種培養液４％（ｖ／ｖ）を加え、温度３０℃、通気量０．１Ｌ／ｍｉｎ、回転数５００ｒｐｍの条件で１２ｈｒ、バッチ培養により予備培養を行った。１２ｈｒ後の時点で菌体濁度は８．６　ＯＤ（６６０ｎｍでの濁度）で、そのときの１，２−プロパンジオール濃度は２．２％　であった。なお、ｐＨの測定および制御は連動させたｐＨ　コントローラーを用いて行い、３Ｎ　の水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ６．９に制御した。
次に連続培養に移り、図１に示すように、表１に示す組成の無機成分水溶液１Ｌ（ｐＨ６．９）を２Ｌ容の培養槽に入れ１２１℃で１５分間、加圧蒸気滅菌後、二層目培養槽として一槽目と接続した。一槽目、二槽目とも、温度、通気量、ｐＨ等の条件は予備培養時と同じ条件で行った。表１に示した無機成分水溶液に単一炭素源としてラセミ体１，２−プロパンジオールを１００ｇ／Ｌ加え、連続培養時の供給培地とした。一槽目の滞留時間を７３ｈｒにするため、培地供給流量を０．０１３７Ｌ／ｈｒ、として連続培養を行った。
結果として、定常状態において一槽目の１，２−プロパンジオール濃度は６．２％、菌体濁度は８．０　ＯＤ（６６０ｎｍでの濁度）、比増殖速度μは０．０１３７（ｈ−１）、比基質消費速度νは０．０６５（ｇ／ＯＤ・ｈｒ・Ｌ）に維持された。このとき、二槽目の菌体濁度は１３　ＯＤ（６６０ｎｍでの濁度）、　１，２−プロパンジオール濃度は３．２％であった。
【００３４】
二槽目から流出する培養液中の１，２−プロパンジオールを回収し無水トリフルオロ酢酸によりトリフルオロ酢酸化した後、アステック社製のキャピラリーカラムＧ−ＴＡ（　０．２５ｍｍ（ＩＤ）ｘ３０ｍ（長さ））を用いたガスクロマトグラフィーにより光学異性体の分析を行なった（Ｓｕｚｕｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：　Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，　Ｖｏｌ．　５，　２３９−２４６　（１９９４）　）。
その結果、得られた１，２−プロパンジオールは光学純度９８％ｅｅ　以上のＲ体１，２−プロパンジオールであった。光学異性体の分析条件：カラム温度，６０℃；　検出器温度，　２００℃；　キャリアーガス，窒素；流速，０．５ｍｌ／ｍｉｎ　；　検出器，ＦＩＤ；スプリット比，２００／Ｌ　。１，２−プロパンジオールのリテンションタイム：Ｒ体，１１．４　分；Ｓ体，１７．６　分。
【００３５】
実施例２
種培養から予備培養の終了段階までの方法は、菌株をシュードモナス　ニトロレデューセンス　ＤＳ−Ｓ−ＲＰ８株に変えた以外は、実施例１と同様に行い、以降、連続培養に移った。一槽目の菌体濁度を１１　ＯＤ（６６０ｎｍでの濁度）に保つように培地供給流量を調節して連続培養を行った。結果として、培地供給量０．０１５９Ｌ／ｈｒで定常状体となった。このときの一槽目の滞留時間は６２．９ｈｒ、一槽目の１，２−プロパンジオール濃度は６．８％、比増殖速度μは０．０１５９（ｈ−１）、比基質消費速度νは０．０４６（ｇ／ＯＤ・ｈｒ・Ｌ）に維持された。このとき、二槽目の菌体濁度は１４　ＯＤ（６６０ｎｍでの濁度）、　１，２−プロパンジオール濃度は３．８％であった。実施例１と同様の方法で二槽目から流出する培養液中の１，２−プロパンジオールの光学純度を測定したところ、９８％ｅｅ　以上のＲ体１，２−プロパンジオールであった。
【００３６】
実施例３
種培養からバッチ培養の終了段階までの方法は、菌株をアルカリゲネスｓｐ．ＤＳ−Ｓ−７Ｇ株に変えた以外は、実施例１と同様に行い、以降、連続培養に移った。比基質消費速度νが０．０５３（ｇ／ＯＤ・ｈｒ・Ｌ）に保つように培地供給流量を調節して連続培養を行った。結果として、培地供給量０．００８０Ｌ／ｈｒで定常状態となった。このときの一槽目の滞留時間は１２５ｈｒ、一槽目の１，２−プロパンジオール濃度は３．２％、比増殖速度μは０．００８０（ｈ−１）、菌体濁度１０．２　ＯＤ（６６０ｎｍでの濁度）に維持された。このとき、二槽目の菌体濁度は１３．５　ＯＤ（６６０ｎｍでの濁度）、　１，２−プロパンジオール濃度は１．２％であった。実施例１と同様の方法で二槽目から流出する培養液中の１，２−プロパンジオールの光学純度を測定したところ、９８％ｅｅ　以上のＲ体１，２−プロパンジオールであった。
【００３７】
実施例４
種培養からバッチ培養の終了段階までの方法は、菌株をシュードモナスシュードアルガリゲネス　ＤＳ−Ｔ−ＳＰ３２株に変えた以外は、実施例１と同様に行い、以降、連続培養に移った。一槽目の滞留時間を８０ｈｒになるように、培地供給流量を０．０１２５Ｌ／ｈｒ、として連続培養を行った。
結果として、定常状態において一槽目の１，２−プロパンジオール濃度は４．９％、菌体濁度は１０．０　ＯＤ（６６０ｎｍでの濁度）、比増殖速度μは０．０１２５（ｈ−１）、比基質消費速度νは０．０６４（ｇ／ＯＤ・ｈｒ・Ｌ）に維持された。このとき、二槽目の菌体濁度は１４　ＯＤ（６６０ｎｍでの濁度）、１，２−プロパンジオール濃度は１．８％であった。実施例１と同様の方法で二槽目から流出する培養液中の１，２−プロパンジオールの光学純度を測定したところ、９８％ｅｅ　以上のＳ体１，２−プロパンジオールであった。
【００３８】
実施例５
１２１℃で１５分間、加圧蒸気滅菌したグリセリン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌを含む液体培地１００ｍｌ（ｐＨ７．２）を入れた５００ｍｌ容バッフル付き三角フラスコに、あらかじめ同栄養培地プレートで生育させたシュードモナスｓｐ．ＤＳ−Ｋ−２Ｄ１株の菌体を１白金耳分植菌し、３０℃で２４ｈｒ培養を行ない種培養液を得た。
【００３９】
次いで、表１に示す組成の無機成分水溶液にラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを２％添加した最少培地１Ｌ（ｐＨ６．９）を２Ｌ容の培養槽に入れ１２１℃で１５分間、加圧蒸気滅菌し、ラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを単一炭素源とする培地を作製した。これに、種培養液４％（ｖ／ｖ）を加え、温度３０℃、通気量０．１Ｌ／ｍｉｎ、回転数４００ｒｐｍの条件で１９ｈｒ、バッチ培養により予備培養を行った。１９ｈｒ後の時点で菌体濁度は５．４　ＯＤ（６６０ｎｍでの濁度）で、そのときの３−クロロ−１，２−プロパンジオール濃度は０．９％　であった。なお、ｐＨ　の測定および制御は連動させたｐＨ　コントローラーを用いて行い、３Ｎ　の水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ６．９に制御した。次に連続培養に移り、図１に示すように、表１に示す組成の無機成分水溶液１Ｌ（ｐＨ６．９）を入れた２Ｌ容の培養槽を１２１℃で１５分間、加圧蒸気滅菌後、二槽目培養槽として一槽目と接続した。一槽目、二槽目とも、温度、通気量、ｐＨ等の条件は予備培養時と同じ条件で行った。表１に示した無機成分水溶液に単一炭素源としてラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを２４ｇ／Ｌ加え、連続培養時の供給培地とした。一槽目内の３−クロロ−１，２−プロパンジオール濃度を２．０％に保つように、培地供給流量を調節して連続培養を行った。
結果として、培地供給流量が０．０６３Ｌ／ｈｒで定常状態となった。このときの一槽目の滞留時間は１５．９ｈｒ、比増殖速度μは０．０６３（ｈ−１）、比基質消費速度νは０．０５３　（ｇ／ＯＤ・ｈ・Ｌ）、菌体濁度４．８　ＯＤ（６６０ｎｍでの濁度）に維持された。このとき、二槽目の菌体濁度は６．８　ＯＤ（６６０ｎｍでの濁度）、３−クロロ−１，２−プロパンジオール濃度は１．０％であった。
【００４０】
二槽目から流出する培養液中の３−クロロ−１，２−プロパンジオールを回収し、水酸化ナトリウム水溶液を用いたアルカリ処理により相当するグリシドールの光学異性体に変換後、アステック社製のキャピラリーカラムＧ−ＴＡ［（０．２５ｍｍ（ＩＤ）ｘ３０ｍ（長さ））を用いたガスクロマトグラフィーにより光学異性体の分析を行なった（Ｓｕｚｕｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　Ｖｏｌ．　４０，　２７３−２７８　（１９９３））。その結果、得られた３−クロロ−１，２−プロパンジオールは光学純度９８％ｅｅ　のＲ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールであった。
光学異性体の分析条件：カラム温度，４５℃；検出器温度，２００℃；キャリアーガス，窒素；流速，０．５ｍｌ／ｍｉｎ；検出器，ＦＩＤ；スプリット比，２００／Ｌ。グリシドールのリテンションタイム：Ｒ体，８０．６分；Ｓ体，８２．１分。
【００４１】
実施例６
種培養からバッチ培養の終了段階までの方法は、菌株をシュードモナス　ｓ　ｐ．　ＤＳ−ＳＩ−５株に変更した以外は実施例５と同様の方法で行い、以降、連続培養に移った。表１に示した無機成分水溶液に単一炭素源としてラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを４０ｇ／Ｌ加え、連続培養時の供給培地とした。一槽目内の３−クロロ−１，２−プロパンジオール濃度を２．３％に保つように、培地供給流量を調節して連続培養を行った。結果として、培地供給流量が０．０７０Ｌ／ｈｒで定常状態となった。このときの一槽目の滞留時間は１４．３ｈｒ、比増殖速度μは０．０７０（ｈ−１）、比基質消費速度νは０．１７０　（ｇ／ＯＤ・ｈｒ・Ｌ）、菌体濁度７．０　ＯＤ（６６０ｎｍでの濁度）に維持された。このとき、二槽目の菌体濁度は９．８　ＯＤ（６６０ｎｍでの濁度）　、３−クロロ−１，２−プロパンジオール濃度は０．８％であった。実施例５と同様の方法で二槽目から流出する培養液中の３−クロロ−１，２−プロパンジオールの光学純度を測定したところ、９８％ｅｅ　以上のＳ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールであった。
【００４２】
実施例７
種培養からバッチ培養の終了段階までの方法は、菌株をアルカリゲネスｓｐ．ＤＳ−Ｓ−７Ｇ株に変更した以外は実施例５と同様の方法で行い、以降、連続培養に移った。表１に示した無機成分水溶液に単一炭素源としてラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを３４ｇ／Ｌ加え、連続培養時の供給培地とした。菌体濁度を６．０　ＯＤ（６６０ｎｍでの濁度）に保つように培地供給流量を調節して連続培養を行った。結果として、培地供給量０．０２５Ｌ／ｈｒで定常状態となった。このときの一槽目の滞留時間は４０ｈｒ、一槽目の３−クロロ−１，２−プロパンジオール濃度は３．０％、比増殖速度μは０．０２５（ｈ−１）、比基質消費速度νは０．０１７（ｇ／ＯＤ・ｈｒ・Ｌ）に維持された。このとき、二槽目の菌体濁度は７．５　ＯＤ（６６０ｎｍでの濁度）、　３−クロロ−１，２−プロパンジオール濃度は１．４％であった。実施例５と同様の方法で二槽目から流出する培養液中の３−クロロ−１，２−プロパンジオールの光学純度を測定したところ、９８％ｅｅ　以上のＳ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールであった。
【００４３】
【発明の効果】
本発明によれば高光学的純度のＲ体及びＳ体１，２−プロパンジオール、Ｒ体及びＳ体３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオールを原料的に安価で、きわめて簡便な方法で、効率的に量産することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の二槽による連続培養装置の概略図である。
【符号の説明】
１　培養槽（第一槽）
２　培溶液面
３　撹拌翼
４　培養槽（第二槽）
５　ｐＨ電極
６　スパージャー
７　ポンプ
８　アルカリ液
９　酸液
１０　ｐＨメーター
１１　培溶液流出管
１２　基質液
【図１】
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