(57)【要約】【課題】　生物学的材料中の感染性化合物の分離および／または検出および／または定量を行うための方法を提供すること。【解決手段】　ａ）（β２ＧＰＩ）ｎ／ＩＣ複合体およびｂ）（β２ＧＰＩ）ｎ／ｎＶＩＣ（非ウイルスＩＣ）複合体からなる群より選択されるβ２ＧＰＩ／ＩＣ複合体が、分離および／またはスクリーニングおよび／または定量されることに特徴づけられる、生物学的材料中の１つ以上の感染性化合物（ＩＣ）を分離および／またはスクリーニングおよび／または定量するための方法である。１つの実施形態において、本発明の方法は、そのＩＣが、β２ＧＰＩに結合する物質を使用して、β２ＧＰＩ／ＩＣ複合体を認識することによって、分離および／または検出および／または定量されることに特徴づけられる。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　生物学的材料中の感染性化合物（ＩＣ）、特にタンパク質性感染性化合物を分離および／または検出および／または定量する方法であって、該化合物は、感染因子の特異構成性化合物、内因性または外因性の完全または不完全な感染因子を含む構造体、それらの代謝物を含む構造体、該感染因子のある種の特異性を示すこれらの感染因子の組み立て体を含む構造体、および上述の化合物によるかまたは異常様式で発現される遺伝子の発現によって生物において特異的に誘導される化合物からなる群より選択され、β２ＧＰＩ／ＩＣ複合体（ここでβ２ＧＰＩはβ２糖タンパク質Ｉであり、かつＩＣは感染性化合物であり、該複合体は適切な手段によって同定され得、かつ
　（ａ）（β２ＧＰＩ）ｎ／ＩＣ；（β２ＧＰＩ）ｎは生物学的材料中に存在するβ２糖タンパク質Ｉであり、そしてＩＣはウイルス化合物ＶＩＣまたは非ウイルス化合物ｎＶＩＣである、
　（ｂ）（β２ＧＰＩ）ａ／ｎＶＩＣ；（β２ＧＰＩ）ａは生物学的材料中に添加されるβ２糖タンパク質Ｉであり、そしてｎＶＩＣは非ウイルス感染性化合物である、
からなる群より選択される）が、分離および／または検出および／または定量されることに特徴づけられる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、生物学的材料中の感染性化合物（ｃｏｍｐｏｓｅ　ｉｎｆｅｃｔｉｅｕｘ）の分離および／または検出および／または定量を行うための方法、およびこの方法を実施するための支持体に関する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
　本発明は、以下の項を提供する：
　項１．生物学的材料中の感染性化合物（ＩＣ）、特にタンパク質性感染性化合物を分離および／または検出および／または定量する方法であって、該化合物は、感染因子の特異構成性化合物、内因性または外因性の完全または不完全な感染因子を含む構造体、それらの代謝物を含む構造体、該感染因子のある種の特異性を示すこれらの感染因子の組み立て体を含む構造体、および上述の化合物によるかまたは異常様式で発現される遺伝子の発現によって生物において特異的に誘導される化合物からなる群より選択され、β２ＧＰＩ／ＩＣ複合体（ここでβ２ＧＰＩはβ２糖タンパク質Ｉであり、かつＩＣは感染性化合物であり、該複合体は適切な手段によって同定され得、かつ
　（ａ）（β２ＧＰＩ）ｎ／ＩＣ；（β２ＧＰＩ）ｎは生物学的材料中に存在するβ２糖タンパク質Ｉであり、そしてＩＣはウイルス化合物ＶＩＣまたは非ウイルス化合物ｎＶＩＣである、
　（ｂ）（β２ＧＰＩ）ａ／ｎＶＩＣ；（β２ＧＰＩ）ａは生物学的材料中に添加されるβ２糖タンパク質Ｉであり、そしてｎＶＩＣは非ウイルス感染性化合物である、
からなる群より選択される）が、分離および／または検出および／または定量されることに特徴づけられる、方法；
　項２．前記ＩＣが、β２ＧＰＩに結合する物質を使用して、β２ＧＰＩ／ＩＣ複合体を認識することによって、分離および／または検出および／または定量されることに特徴づけられる、項１に記載の方法；
　項３．前記β２ＧＰＩ／ＩＣ複合体が、該複合体が形成される媒体において、該複合体を支持体へ前もって付着させずに、該媒体を付着させてまたは付着させないで、分離および／または検出および／または定量されることに特徴づけられる、項１または２に記載の方法；
　項４．前記β２ＧＰＩ／ＩＣ複合体に含まれる要素の１つが、支持体上に保持されることに特徴づけられる、項１または２に記載の方法；
　項５．前記支持体が固体支持体であることに特徴づけられる、項４に記載の方法；
　項６．使用される前記支持体が、膜、マイクロタイタープレート、または顕微鏡スライドであることに特徴づけられる、項５に記載の方法；
　項７．前記β２ＧＰＩ／ＩＣ複合体が、複合体のβ２ＧＰＩ要素によって前記支持体に保持されることに特徴づけられる、項４から６のいずれか一項に記載の方法；
　項８．前記β２ＧＰＩ／ＩＣ複合体が、複合体のＩＣ要素によって前記支持体に保持されることに特徴づけられる、項４から６のいずれか一項に記載の方法；
　項９．前記ＩＣ要素が、前記β２ＧＰＩ／ＩＣ複合体が形成される前に前記支持体に付着され、次に、該複合体が形成され、そして次に、該複合体の該β２ＧＰＩ要素が分離および／または検出および／または定量されることに特徴づけられる、項８に記載の方法；
　項１０．物理的、化学的、または生化学的に支持体へ付着される、生物学的材料のＩＣが、前記複合体のβ２ＧＰＩに結合する物質を使用して、分離および／または検出および／または定量されることに特徴づけられる、項８または９に記載の方法；
　項１１．前記β２ＧＰＩ／ＩＣ複合体が、該複合体のβ２ＧＰＩ部分またはＩＣ部分のいずれかに結合する化合物によって支持体に保持され、そこで該支持体に付着される複合体が、生物学的材料から分離され、そして該複合体が、複合体の他方の部分の認識により分離および／または検出および／または定量されることに特徴づけられる、項１または４に記載の方法；
　項１２．前記複合体が、複合体のβ２ＧＰＩ部分に結合する化合物によって前記支持体に保持されることに特徴づけられる、項１１に記載の方法；
　項１３．前記複合体が、複合体のＩＣ部分に結合する化合物によって前記支持体に保持されることに特徴づけられる、項１１に記載の方法；
　項１４．β２ＧＰＩに結合する化合物が、β２ＧＰＩに特異的である抗体、別のタンパク質、およびβ２ＧＰＩに結合する生物学的または化学的化合物からなる群より選択されることに特徴づけられる、項２に記載の方法；
　項１５．β２ＧＰＩを認識するタンパク質がＨＩＶ２　ｐ２６　ＲＯＤタンパク質であることに特徴づけられる、項１４に記載の方法；
　項１６．前記複合体のＩＣが、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＳＶ、ＨＢＶ、およびウイルス起源の粒子またはタンパク質からなる群に属することに特徴づけられる、項１に記載の方法；
　項１７．前記複合体のＩＣが、細菌、寄生虫、マイコプラズマ、真菌、および異常動物細胞からなる群に属することに特徴づけられる、項１に記載の方法；
　項１８．支持体に付着される前記β２ＧＰＩ／ＩＣ複合体のＩＣが、感染性、特異酵素反応、蛍光または放射性標識トレーサー、標識プローブとのハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸の検出、あるいはＩＣに特異的である抗体の使用によって、分離および／または検出および／または定量されることに特徴づけられる、項７に記載の方法；
　項１９．使用されるβ２ＧＰＩの形態が、純粋形態であるかまたは純粋形態ではないβ２’ＧＰＩであることに特徴づけられる、項１から１８のいずれか一項に記載の方法；
　項２０．前記ＩＣとの複合体を組み立てるために使用されるβ２ＧＰＩが標識され、該複合体が、該標識により検出および／または定量されることに特徴づけられる、項１から１９のいずれか一項に記載の方法；
　項２１．前記β２ＧＰＩが、酵素、放射性産物、または蛍光産物によって標識されることに特徴づけられる、項２０に記載の方法；
　項２２．前記β２ＧＰＩ要素が、前記β２ＧＰＩ／ＩＣ複合体が形成される前に前記支持体に付着され、次に、該複合体が形成され、そして次に、該複合体のＩＣ要素が検出および／または定量されることに特徴づけられる、項６に記載の方法；
　項２３．前記複合体の要素の少なくとも１つが、動物起源であるか、あるいは遺伝子工学および／または化学工学によって生成されることに特徴づけられる、項１から２２のいずれか一項に記載の方法；
　項２４．項４または１１のいずれかに記載の方法を実施するための固体支持体であって、それが（β２ＧＰＩ）ｎ／ＩＣ複合体をその構成性要素の少なくとも１つによって、直接または間接に、特異的または非特異的に保持するのに適していることに特徴づけられる、固体支持体。
【０００３】
　本発明によれば、感染性化合物（総体的に、以下、省略型「ＩＣ」と称する）は、特定のタンパク質性化合物において、それが、感染因子の成分であるもの、および、感染性化合物を含む構造体であるものの、両化合物を意味することが理解される。これらの構造体は、特に、完全または不完全な内因性または外因性の感染因子、それらの代謝物、または他にこれらの感染因子の成分化合物を含む他の組み立て体である。これらは、上記感染因子のある種の特性、特に、感染性化合物に特異的である特定の抗体によって検出される特性を示す。ＩＣはまた、既に定義されたＩＣによってまたは異常様式で発現される遺伝子の発現によって生物において特異的に誘導される化合物であり得る。言及され得るＩＣは、例えば、ウイルス、細菌、カビ、マイコプラズマ、寄生虫、および異常動物細胞である。ウイルス感染性化合物は、以下省略型「ＶＩＣ」と称され、一方、非ウイルス感染性化合物（すなわち、単ウイルス型以外の感染性化合物）は、「ｎＶＩＣ」と称される。
【０００４】
　「生物学的材料」は、本明細書では、生物学的組織、液体または固体標本、あるいは生物学的組織からの抽出物、あるいは上記の意味での感染性化合物を含有し得る天然媒体（例えば、ドレナージ水）であることは理解される。材料はまた、上述の少なくとも２種類の材料の混合物であり得る。従って、このような生物学的材料は、特に感染（例えば、ウイルス、細菌、寄生虫、真菌またはマイコプラズマ感染）患者からの組織、器官、便、あるいは生物学的液体のいずれかから調製され得るか、または「インビトロ」培養物から得られ得る。このような生物学的材料はまた、血清、血漿、尿、脳脊髄液、滑液、腹膜液、胸膜液、精液、または腹水であり得る。
【０００５】
　β２−糖タンパク質Ｉ（以下、「β２ＧＰＩ」と省略）は、特に、Ｊ．　ＬＯＺＩＥＲら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＩＳＡ、第８１巻、３６４０〜３６４４頁、１９８４年７月、およびＴ．　ＫＲＩＳＴＥＮＳＥＮら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、第２８９巻、１９９１年、１８３〜１８６頁の論文において、その配列が示されている血漿糖タンパク質である。β２ＧＰＩはまた、アポリポタンパク質Ｈと呼ばれる。このタンパク質が多型性を示すことが示されており、名称β２ＧＰＩを、以下全形態に対する属名として見なす。
【０００６】
　ＥＰ−Ａ−０　６００　０８８において、抗リン脂質抗体症候群では、カルジオリピン−β２ＧＰＩ複合体に特異的であり、この症候群に出現する抗カルジオリピン抗体が、血清中に検出されること、およびこれらの抗カルジオリピン抗体が、血清をカルジオリピン−β２ＧＰＩ複合体と反応させることによってアッセイされ得ることが指摘されている。カルジオリピンは、感染性化合物（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｐａｌｌｉｄｕｍ）と結合し得るが、他の供給源由来であり得、特に病原性のない状態で存在するので、これは、感染因子によって生物において特異的に誘導され、従って、この感染因子の生物中での存在を検出するために信頼のおける方法では使用され得ない化合物である。
【０００７】
　国際特許出願ＷＯ　９４／１８５６９に、ある種のウイルス化合物が、β２ＧＰＩの１つの形態、すなわち、フランス特許出願第２　７０１　２６３号に記載される形態であり、この形態のβ２ＧＰＩが、純粋状態であれ、またはタンパク質組成物に含まれていても、これに特異的に結合することが示された。この形態のβ２ＧＰＩは、ＦＲ−Ａ−２　６９０　４４４に記載の血漿からのアルブミン精製の方法で使用される、アフィニティークロマトグラフィーカラムに結合される残留物から単離される。それは、５０，０００　±　３０００ダルトンの分子量を有する。本特許出願に関しては、この形態のβ２ＧＰＩを、省略型「β２’ＧＰＩ」で称した。従って、ウイルス化合物（ＶＩＣ）（β２’ＧＰＩによって結合されるウイルス化合物）を検出および／またはアッセイする方法が、ＷＯ　９４／１８５６９において提案された。従って、このような方法では、β２’ＧＰＩが、検出および／またはアッセイするためにこのように捕捉されたＶＩＣを分離するようにして、生物学的材料に含有されているＶＩＣに添加される。
【０００８】
　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，　６８，　Ｎｏ．４，　１９９４年４月、２４１５〜２４２４頁には、ＨＢｓＡｇが、インビトロにおいてβ２糖タンパク質と複合体を形成し得ることが報告されている。
【０００９】
　ＷＯ　９２／１９７９５は、ヒトβ２糖タンパク質Ｉと特異的に反応し、これをアッセイし得るモノクローナル抗体を得ることが可能であることを、指摘している。
【００１０】
　一般に、少なくとも１つのＩＣと１つのβ２ＧＰＩとの直接あるいは間接的な会合は、本明細書では一般に「複合体（ｃｏｍｐｌｅｘｅ）」と称し、これらの複合体は、以下、「β２ＧＰＩ／ＩＣ」の表記によって呼ばれる。ＷＯ　９４／１８５６９に記載の方法は、ＶＩＣウイルス複合物と、β２’ＧＰＩ（純粋状態であるかまたはタンパク質組成物に含有される）とのＶＩＣ／β２’ＧＰＩ複合体を、検出および／またはアッセイされるべきＶＩＣを含有する生物学的材料に添加されるβ２’ＧＰＩを用いて、検出および／またはアッセイする。
【００１１】
　下記の方法を実施する前に、生物学的材料中に天然に存在し、そしてこのように意図的に添加されるのではないβ２ＧＰＩの形態を、本明細書では（β２ＧＰＩ）ｎと称する。以前に定義されたＩＣ／β２ＧＰＩ複合体を形成するために意図的に添加されるβ２ＧＰＩの形態を、（β２ＧＰＩ）ａと称する。
本発明によれば、新規な方法で、ＷＯ　９４／１８５６９に記載のもの以外の生物学的材料から、ＩＣ／β２ＧＰＩ複合体を分離、検出、および／または定量し得ることが見出された。すなわち、
　　　 ＩＣ部分が、ＶＩＣウイルスまたはｎＶＩＣ非ウイルス型であり得、（β２ＧＰＩ）ｎ部分が、研究下の生物学的材料に天然に由来する、（β２ＧＰＩ）ｎ／ＩＣ複合体；
　　　 （β２ＧＰＩ）ａ部分が、この目的のために意図的に添加され、異なる純粋または混合形態で調製され、ｎＶＩＣ部分が、研究下の生物学的材料中の非ウイルス感染性化合物に由来する、（β２ＧＰＩ）ａ／ｎＶＩＰ複合体。
従って、本発明は、
（ａ）（β２ＧＰＩ）ｎ／ＩＣ複合体
　（ｂ）（β２ＧＰＩ）ａ／ｎＶＩＣ複合体
よりなる群から選択されるβ２ＧＰＩ／ＩＣ複合体が、分離および／または検出および／または定量されることによって特徴づけられる、生物学的材料中の感染性化合物（ＩＣ）を、分離および／または検出および／または定量するための方法に関する。
【００１２】
　一般には、β２ＧＰＩは、ＩＣと同様に、本方法のいくつかの適用について、動物起源であり得るか、または遺伝子工学および／または化学工学によって生成され得る。この方法は、ヒトおよび動物の両方に適用され得る。
【００１３】
　本発明に従って、複合体のβ２ＧＰＩ部分は、この部分に優先的に結合し得るかまたは特異的に結合し得る基質の助けにより認識されることによって同定され、そして、ＩＣ部分は、任意の適切な手段によって同定される。
【００１４】
　複合体の形成は、直接的または間接的であり得、そして、ある種の脂質または界面活性剤、特にリン脂質のような、化学物質、生化学物質、または生物学的物質であり得る特定の添加物によって、媒介または促進され得る。複合体は、生物学的材料の調製の間および／または方法の一工程の間に、形成され得る。
【００１５】
　既に指摘されたように、ＩＣは、ＶＩＣおよびｎＶＩＣを包含する。特に記載され得るＶＩＣは、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＢＶ、ＨＳＶ、およびウイルス起源の粒子またはタンパク質からなる群のものであり得る。特に記載され得るｎＶＩＣは、細菌、寄生虫、カビ、およびマイコプラズマによりなる群のものであり、より詳細には、細菌の場合はＢｏｒｅｌｌｉａであり、そして寄生虫の場合はリーシュマニア属（（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）（特にｉｎｆａｎｔｕｍ））、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ　ｇｏｎｄｉｉ）、および赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ　ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）である。
【００１６】
　好都合には、複合体中に保持されるβ２ＧＰＩは、本方法の実施態様に従って、標識され得るかまたはされ得ない。この標識は、前もって実施され得るかまたは前もっては実施され得ず、例えば、抗体、酵素、放射性産物、蛍光産物、または金属剤によって、実施され得る。
【００１７】
　本発明によれば、異なる感染因子を検出し得る多重特異テストは、各因子に対して異なる検出法、例えば、ＨＩＶ２ｐ２６に対するアルカリホスファターゼ複合体化抗体およびＨＢｓＡｇに対するペルオキシダーゼ複合体化抗体を、特に同時または連続的に使用して、実施され得る。
【００１８】
　本発明の実施態様の第一部分（ここでは外来（β２ＧＰＩ）ａが生物学的媒体に添加される）では、β２’ＧＰＩが使用され得る。これは、純粋であるか、または特に複合体のβ２ＧＰＩ部分のβ２ＧＰＩ形態として他の糖タンパク質を含有するタンパク質組成物の形態である。この組成物は、フランス特許出願第２　７０１　２６３号に記載のように、特に、硫酸基を有するゲルアフィニティーカラムの溶出によって得られる組成物であり得る。しかし、β２ＧＰＩの他の形態もまた、Ｊ．　ＡｒｖｉｅｕｘらのＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　（１９９１），　１４３，　２２３〜２２９頁により記載のプロトコールに従って得られるものが使用され得る。カルバミル化β２ＧＰＩは、いくつかの複合体を形成し得る。
【００１９】
　上記の第一部分に属する実施態様では、複合体は、ｎＶＩＣを分離および／またはアッセイおよび／または定量するために、（β２ＧＰＩ）ａを生物学的材料に添加することによって形成される。
【００２０】
　本発明に従う方法の実施態様の第二部分では、生物学的材料中に天然および／または最初から存在する（β２ＧＰＩ）ｎが使用される。ＷＯ　９４／１８５６９の方法は、生物学的材料が遊離ＶＩＣを含有するとき、満足な結果を与えることが知られる。このＶＩＣは、生物学的材料に天然に存在するβ２ＧＰＩに付着（ｆｉｘｅｒ）されていないＶＩＣである。この遊離ＶＩＣは、結果的に、この方法に従って添加されるβ２’ＧＰＩにそれ自身付着し得る。従って、この方法において、応答シグナルはＶＩＣの増加に伴って増加し、それは、依然遊離しているか、または生物学的材料中に天然に存在する複合体から競合によって遊離され得る部位を有する。一方、いくつかの場合において、例えば感染の初期で、ＶＩＣは、天然に存在する（β２ＧＰＩ）ｎに比較して少ない量で存在し、そして従ってこのＶＩＣは主として、（β２ＧＰＩ）ｎ／ＩＣ複合体の形態で（β２ＧＰＩ）ｎに結合されていると仮定することが可能である。出願ＷＯ　９４／１８５６９で提案されるテストは、複合体化されたＶＩＣはマスクされ得るので、その場合には重要ではあり得ない。従って、本発明のこの第二部分によれば、それは、生物学的材料中に存在するＩＣを、特に、これらの化合物が、通常存在する（β２ＧＰＩ）ｎと比較して、それらが主として（β２ＧＰＩ）ｎ形態の少なくとも１つと複合体化される（または複合体化可能である）ような量で存在する場合、または他にこのＩＣが、（β２ＧＰＩ）ａの導入によって示され得ない場合、観察および／または分離および／または検出および／または定量するために提案される。
【００２１】
　その事実を考慮して、本発明の実施態様のこの第二部分によれば、β２ＧＰＩが添加されなければ、ＷＯ　９４／１８５６９の方法のマスキング現象は回避され、そして生物学的材料中に存在する複合体量の関数、従ってＩＣの関数として増加し得る応答シグナルが、これらのＩＣ量が非常に少ない場合でさえも、得られる。適切なところで、その方法は、病変の初期状態を検出することを可能にし得、一方、以前の方法は、例えば、ＩＣ過剰または（β２ＧＰＩ）ｎ不足、またはＩＣに結合することに関して非関数性であるβ２ＧＰＩ形態の天然存在に対応して、確立している病状を調査するのにより適している。
【００２２】
　これらの２つの実施態様部分が、互いに矛盾しないことは、注目されるべきである。
【００２３】
　本発明に従って方法を実施するために、ＩＣは、β２ＧＰＩ／ＩＣ複合体を前もって支持体へ付着させることなく、または、複合体に含まれる要素によってこの複合体を支持体に付着させて、検出され得る。第一の場合には、検出および／または定量が、複合体が形成される媒体において達成される。この形成は、この媒体が、例えば、物理的、化学的、または生化学的方法によって表面に付着された後、あるいはこの媒体を付着させずになされる。第二の場合には、好都合には、支持体は固体支持体であり得る。
【００２４】
　本発明の記載では、用語「支持体への付着」は、複合体が形成される時間を早まって判断することなく使用される。
【００２５】
　本発明の１つの変形によれば、β２ＧＰＩ／ＩＣ複合体は、複合体のβ２ＧＰＩ部分によって、すなわち、このβ２ＧＰＩ部分へ結合する化合物を支持体に提供することによって、保持される。次に、ＩＣに対応する複合体部分が、適切な手段によって分離／検出／定量される。
【００２６】
　本発明の他の変形によれば、β２ＧＰＩ／ＩＣ複合体は、該複合体のＩＣ部分によって、すなわち、後者を、複合体のこのＩＣ部分へ結合する化合物を提供される支持体に付着させることによって、保持される。次に、この複合体のβ２ＧＰＩ部分が、任意の適切な手段によって検出および／または分離および／または定量される。好都合には、特に、複合体化され、β２ＧＰＩに特異的な抗体を用いる。界面活性剤または脂質の天然状態での存在、または添加が、これらの抗体の付着の助けとなり得る。
【００２７】
　本発明によれば、検出は、特に目視または顕微鏡（特に、光学顕微鏡、電子顕微鏡、またはＵＶ顕微鏡）によって、ＩＣに対して特徴的な構造体を可視化および／または計測（ｃｏｕｎｔｉｎｇ）することによって実施され得る。この検出は、これらの構造体上でＩＣと会合される（β２ＧＰＩ）ｎを、特に、特異標識抗体（例えば、酵素分子または蛍光分子に複合体化される抗体）の助けによって検出することによる。生物学的材料のＩＣ（これは、複合体化され得るかまたはされ得ない）は、物理的、化学的、または生物学的に支持体に付着され得るか、または液相（特に、酸、ケトン、アルコール、パラフィン、またはアルデヒド液）であり得る。各部分に特異的な二重標識もまた、各部分に特異的であり、そして２つの異なるトレーサー（例えば、異なる波長の蛍光を発するトレーサー）に複合体化される抗体を特に使用して、複合体を検出するために使用され得る。最後に、生物学的材料中のＩＣは、粒子または構造体の数、容積、大きさ、または形状のようなシグナルを分析するための装置の助けによって、例えば、特にフローサイトメトリーによって、検出またはアッセイされ得る。
【００２８】
　本発明の他の変形によれば、β２ＧＰＩ／ＩＣ複合体は、複合体のβ２ＧＰＩ部分またはＩＣ部分のいずれかに結合する化合物によって、支持体に保持される。その後、この支持体に付着される複合体が、この生物学的材料から分離され、そしてこの（ＩＣ／β２ＧＰＩ）複合体は、複合体の他方の部分の認識により分離および／または検出および／または定量および／またはアッセイされる。
【００２９】
　支持体は、好都合には固体支持体である。これは、膜（例えば、ニトロセルロース膜）、あるいはマイクロタイタープレート（例えば、ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート）、あるいは顕微鏡スライドであり得る。
【００３０】
　複合体の部分の一方に結合する化合物（例えば抗体）は、この化合物の反応基を支持体の反応部位と反応させることによって、支持体に付着される。好ましくは、この反応は、０℃と４０℃との間の温度で実施される。複合体の部分の一方に結合する化合物は、好都合には４．５と１０．５との間のｐＨ、好ましくは６．５と７．５との間のｐＨを有する緩衝液中に置かれる。この緩衝液は、好都合にはリン酸型または酢酸型であり得る。支持体は、０℃と４０℃との間の温度での３０分と２４時間との間のインキュベーション時間の間、化合物を含有する緩衝液と接触されて、好都合に維持される。インキュベーション後、反応しなかった緩衝液は支持体から分離され、そして支持体は洗浄される。好ましくは、支持体は、それが上記化合物を含有しないこと以外は以前の緩衝液と同じ緩衝液で洗浄される。この化合物と反応しなかった支持体の活性部位を飽和する必要があり得る。この場合、他の活性基を、これらの活性部位と反応させる。この目的のために、好都合には、血清アルブミン（例えばウシ血清アルブミン）溶液またはカゼイン溶液および／またはポリビニルピロリドン溶液および／またはゼラチン溶液および／または界面活性剤溶液が使用され、これは同時または連続的に使用される。反応後、支持体は、好ましくはリンスされて、乾燥される。
【００３１】
　次に、複合体に結合する化合物が付着される支持体は、探索ＩＣ（ｓｏｕｇｈｔ−ａｆｔｅｒ　ＩＣ）を含有する生物学的材料（特に液体）と接触させて置かれる。この生物学的材料は、好都合には４．５と１０．５との間のｐＨ、好ましくは５．６と７．５との間のｐＨを与える緩衝液で希釈される。支持体での反応は、好ましくは０℃と４０℃との間の温度で、好都合には約３７℃の温度で、継続時間が３０分と２４時間との間の期間で実施される。次に、反応しなかったＩＣを含有する溶液が、好都合には支持体から分離される。適切なところで、次に、支持体が、生理食塩水、好ましくは緩衝化生理食塩水で洗浄される。
【００３２】
　複合体の支持体への付着が、複合体のβ２ＧＰＩ部分によってなされる場合には、β２ＧＰＩへ結合する化合物は、β２ＧＰＩを認識する抗体であり得、または、別のタンパク質（（例えば、ウイルス起源または原核あるいは真核細胞起源のタンパク質）（例えば、アルブミン））、または生物学的化合物（例えば、脂肪酸または脂質（例えば、リン脂質））、または化学的化合物（例えば、デキストラン硫酸、ヘパリン硫酸、または界面活性剤）であり得る。支持体のフリーラジカルまたは活性型ラジカルが、ときには優先的にβ２ＧＰＩと結合し得る。
【００３３】
　β２ＧＰＩによって支持体へ結合されるβ２ＧＰＩ／ＩＣ複合体のＩＣは、感染性、特異酵素反応、トレーサー（例えば、蛍光または放射性標識トレーサー）、標識プローブとのハイブリダイゼーションによる特異核酸の検出、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）、アッセイ、計測、可視化、または光学または（電子）顕微鏡法のような任意の公知手段によって、分離および／またはアッセイおよび／または定量され得る。しかし、検出および／またはアッセイは、検出されるべきＩＣのタンパク質を特異的に認識する抗体の助けによって好ましく実施される。公知の様式で、この抗体は、酵素標識（例えばペルオキシダーゼ）に複合体化され得る。抗体の過剰分は、洗浄によって除去される。次に、抗体に複合体化された酵素に特異的な基質が添加され、公知の様式で、この基質は、予め決定された条件下で、発色産物に転換し、この発色産物の形成は、探索ＩＣの存在を示し、このＩＣがアッセイされることを可能にする。同位体標識に結合され、次に放射分析によって検出されるＩＣに対する抗体もまた、使用され得る。
【００３４】
　支持体への付着が複合体のＩＣ部分によってなされる場合、特に特異検出が望まれるとき、それは、好都合に標識に複合体化されるβ２ＧＰＩによって可視化される。ＩＣは、支持体に直接または間接に、例えば抗体によって、付着され得る。好都合には、標識は、酵素、放射性産物、または蛍光産物であり得る。ＩＣは、付着が直接であるときにはＩＣの反応基を支持体の反応部位と反応させることによって、または化合物（例えば抗体）を支持体の反応基に付着させ、そして前もって支持体に付着しておいたこの化合物にＩＣを付着させることによって、支持体に付着され得る。
【００３５】
　ＩＣ部分に結合する化合物によって複合体が付着された複合体のβ２ＧＰＩ部分は、任意の適切な手段によって検出され得るが、それは、β２ＧＰＩに特異的であり、そして例えば複合体化される抗体を使用して、好都合に検出され得る。
【００３６】
　本発明はまた、上記の方法を実施するための固体支持体に関連し、これは、β２ＧＰＩ／ＩＣ複合体の要素の１つ、またはこの複合体の要素の１つを付着するのに適した基質を付着するのに適していることに特徴づけられる。
【００３７】
　下記の実施例は、純粋に例示により、かつ限定ではなく、本発明を説明することを助ける。いくらかは、フランス特許出願第２　７０１　２６３号に従って得られたβ２’ＧＰＩを使用して、実施された。
【実施例】
【００３８】
　（実施例１．レーシュマニアの視覚化）
　ａ）蛍光β２’ＧＰＩの使用
　血液寒天上でのインビトロ培養によって得たＬｅｉｓｈｍａｎｉａ　ｉｎｆａｎｔｕｍ　プロマスティゴート（ｐｒｏｍａｓｔｉｇｏｔｅｓ）の懸濁液を、光学顕微鏡下での観察のためにスライド上で、アセトンで０℃で１０分間固定する。次に、スライドを、リン酸緩衝液中に５分間浸漬する。この緩衝液は以下「ＰＢ」と称し、０．０１　Ｍの濃度のリン酸一ナトリウムおよびリン酸二ナトリウム、および０．１５　Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含有し、７．２±０．１のｐＨである。β２’ＧＰＩをフルオレセインに結合させる。次に、それを固定化プロマスティゴート懸濁液上に２０μｇ／ｍｌおよび２μｇ／ｍｌの濃度で堆積させ、次に、これを加湿チャンバー中に２０℃にて３０分間置く。結合されなかった蛍光β２’ＧＰＩを、２つの連続ＰＢ浴で５分間、そのスライドを浸漬することにより除去する。寄生虫の蛍光可視（特にそれらの外面（ｐｏｕｒｔｏｕｒ））の蛍光は、複合体形成の証拠を提供し、そしてこれらの複合体が可視化および同定されることを可能にする。
【００３９】
　ｂ）β２’ＧＰＩのための別の標識の使用
　別の実験では、Ａｖｒａｍｅａｓ（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．　（１９６９）　８，　４３〜５２頁）に従って、アルカリホスファターゼに結合させたβ２’ＧＰＩ（以下「ＤＡＰ」と呼ばれる）は、スライドにアセトンで固定した寄生虫と反応した。リン酸緩衝液は、アルカリホスファターゼを阻害しないように、取り替えた。
【００４０】
　実験室温度で実施したプロトコールは、以下のようであった：生理食塩水中５分間の寄生虫の再水和；ＤＡＰ形態のβ２’ＧＰＩの３７℃３０分間のインキュベーションおよび「Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ１００」の商品名で販売されている界面活性剤０．０５％を含有する酢酸緩衝液中での希釈；５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　＝　８．２）、５０　ｍＭ　ＮａＣｌ中１０分間の１回洗浄、生理食塩水中１０分間の１回洗浄、および「速読ＴＲ／ナフトール（ｆａｓｔ　ｒｅａｄ　ＴＲ／ｎａｐｈｔｈｏｌ）」の商品名で販売されているシステムを用いるアルカリホスファターゼ活性の検出。これらの条件下では、光学顕微鏡下の観察は、β２’ＧＰＩが、１μｇ／ｍｌの濃度でまだ有意に反応することを示す。
【００４１】
　ｃ）数株のレーシュマニアについての蛍光アッセイ
　種々の種のレーシュマニアを、蛍光β２’ＧＰＩとレーシュマニアとの相互作用を示すために使用した。以下をこの内容に関してテストした：Ｌ．　ｉｎｆａｎｔｕｍ、Ｌ．　ｍａｒｊｏｎ、Ｌ．　ｇｕｙａｎｅｎｓｉｓ、Ｌ．　ｔｒｏｎｉｃｅｒ、Ｌ．　ｄｏｎｏｒｉｕｍ、およびＬ．　ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ。全ての種が、反応の間、０．０５％　ＴＸ１００および０．２５Ｍ　ＮａＣｌの添加存在下で、蛍光β２’ＧＰＩとの有意な反応を示した。
【００４２】
　（実施例２）
　実施例１と同じ実験を、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ　ｇｏｎｄｊｉ）［ｓｉｃ］を使用して実施し、寄生虫の蛍光を、少なくとも２０μｇのβ２’ＧＰＩ／ｍｌで観察した。
【００４３】
　これらの実施例１および２の場合、他の実験は、蛍光β２’ＧＰＩによるレーシュマニアおよびトキソプラズマの検出感度を、インキュベーション緩衝液中に０．０５％　ＴＸ１００および０．２５Ｍ　ＮａＣｌを添加することによって増大させ得た。
【００４４】
　寄生虫（レーシュマニア）およびウサギまたはヒト赤血球細胞の混合物をアセトンでスライドに固定し、次に、上記の改良条件下で反応させた。観察された画像は、強く蛍光した寄生虫と赤血球（これは非常に弱く標識されている）との間で鮮明な対照を示す。
【００４５】
　コントロールとして、β２’ＧＰＩ以外の蛍光試薬を、蛍光β２’ＧＰＩと同じタンパク質およびフルオレセイン濃度で、上記の改良条件下で実施した。この試薬は、免疫精製し、フルオレセインに結合させ、かつヤギＩｇＧに特異的であり、従って先験的に寄生虫に対して特異性を有さないウサギＦ（ａｂ’）ｃ’から構成される。ところで、この試薬はまた、匹敵する濃度のフルオレセイン純粋溶液と同様に、同じ条件で使用されるとき、寄生虫において「バックグラウンドノイズ」程度の非常に弱い蛍光のみを与えた。
【００４６】
　（実施例３）
　実施例１と同じ実験を、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ　ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）において実施し、そして寄生虫の蛍光を、少なくとも２０μｇの蛍光β２’ＧＰＩ／ｍｌで観察した。
【００４７】
　（実施例４：可溶性Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ　ｉｎｆａｎｔｕｍ抗原の検出）
　使用する支持体は、９６ウエルを有し平底であるマイクロ−ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートであり、これにＬｅｉｓｈｍａｎｉａ　ｉｎｆａｎｔｕｍ可溶性抗原を付着させる。この感作支持体に、ＢＩＯＫＥＭＡ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｓｗｉｔｅｒｌａｎｄ）を散布する。
【００４８】
　１０μｇ／ｍｌ濃度を有するペルオキシダーゼ標識β２’ＧＰＩ溶液を、０．０５ｍｏｌ／ｌ酢酸および酢酸ナトリウム、０．０１％ウシ血清アルブミン、および０．０５重量％「Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ１００」を含有する酢酸緩衝液（ｐＨ　５．６　±　０．１）中で調製する。この溶液の１００μｌを各ウエルに加え、プレートを３７℃で１時間３０分の間インキュベートさせる。このインキュベーション後に、プレートのウエル内容物を吸引して取り出す。３００μｌリン酸緩衝液を各ウエルに入れ、次に、２分間の接触時間後に、緩衝液を吸引して取り出す：この洗浄操作を３回繰り返す。
【００４９】
　クエン酸ナトリウム緩衝液中のｏ−フェニレンジアミンＯＰＤ２　ＨＣｌの溶液１００μｌを、各ウエルに加える。プレートを常温にて３０分間インキュベートさせ、次に、反応を、各ウエルに５０μｌ　２Ｎ　Ｈ２ＳＯ４を加えて停止させる。反応の終点で得られる４９２ｎｍでの吸光度を、光学密度単位（ＯＤＵ）で測定する。この測定は、自動プレートリーダーを使用して実施される。
【００５０】
　得られた結果は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ　ｉｎｆａｎｔｕｍの可溶性抗原がβ２’ＧＰＩにより認識されることを示す。同じ結果が、未標識β２’ＧＰＩを使用するときに得られる。この後者の場合には、結合は、ペルオキシダーゼ標識抗β２’ＧＰＩモノクローナル抗体によって続いて検出される。
【００５１】
　（実施例５：β２’ＧＰＩのＢｏｒｒｅｌｉａ抗原への結合）
　Ｂｏｒｒｅｌｉａ抗原（Ｉ．　Ｎｉｌｓｓｏｎからの寄贈）が電気泳動後に移されたニトロセルロース膜を用いた。
【００５２】
　０．１重量％ゼラチンおよび０．５％「ＴＸ１００」を含有し、５．６　±　０．１のｐＨを有する１　ｍｌ酢酸緩衝液（０．０５ｍｏｌ／ｌ酢酸／酢酸ナトリウム）の溶液中の約４０ｎｇのアルカリホスファターゼ結合β２’ＧＰＩを、常温で１時間３０分間、この膜と反応させる。次に、この膜を、０．０５重量％「ＴＸ１００」を含有し、５．６　±　０．１のｐＨを有する０．０５ｍｏｌ／ｌ酢酸緩衝液で１回リンスする。次に、この膜を、０．０１ｍｏｌ／ｌリン酸一ナトリウムおよび二ナトリウム、０．１５ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、０．０５重量％「ＴＸ１００」を含有し、７．００　±　０．１のｐＨを有するリン酸緩衝液で２回リンスする。アルカリホスファターゼ活性は、塩酸で中和してｐＨ　８．８にされた５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、および０．１Ｍ　ＮａＣｌを含有する溶液中のニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ｂｏｍｏ　４−ｃｈｌｏｒｏ　３　ｏｎｄｏｌｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＢＣＩＰ）の存在下で検出される。β２’ＧＰＩが、Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ａｆｚｅｌｉｉ抗原、特に、病原性を示すと考えられる抗原（例えば、Ｉｎｇｒｉｄ　Ｎｉｌｓｓｏｎら（Ｓｅｒｏｄｉａｇｎ．　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．　Ｉｎｆｅｃｔ．　　Ｄｉｓｅａｓｅ，　１９９３，　５，　２４５〜２５０頁）による刊行物に使用されている用語に従った、ｐ３９、ｏｓｐ　Ｂ、ｏｓｐ　Ａ、およびｏｓｐ　Ｃ）の存在を検出することを可能にすることが、膜上で見られる。同じ条件下で、アルカリホスファターゼ単独との反応はみられない。
【００５３】
　（実施例６：Ｂ型肝炎ウイルスのＨＢｓ抗原の検出）
　使用する支持体は、９６ウエルを有し平底であるマイクロ−ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートであり、これは、「ＤＹＮＡＴＥＣＨ」によって販売されている。「ＴＲＡＮＳＧＥＮＥ」から供給されたＨＩＶ２　ｐ２６　ＲＯＤ組換えタンパク質の２μｇ／ｍｌ溶液を、０．０１ｍｏｌ／ｌリン酸一ナトリウムおよび二ナトリウム、および０．１５ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムを含有し、７．００　±　０．０５のｐＨを有するリン酸緩衝液中に調製する。この溶液の１００μｌを、マイクロプレートの各ウエルの底に堆積させる。次に後者を＋４℃で１８時間インキュベーションする。この後、各ウエルの液体を吸引して取り出す。次に、０．０５重量％界面活性剤（市販商品名「ＴＸ１００」で販売されている）を含有する上記リン酸緩衝液３００〜４００μｌを、各ウエルに入れる。この緩衝液を、支持体と３分間接触させ、そして吸引して取り出す。この洗浄操作を３回実施する。
【００５４】
　健常ドナーからの３つの血清試料およびＢ型肝炎ウイルス感染患者からの４つの血清試料を使用した。血清試料を、０．０５ｍｏｌ／ｍｌ酢酸および酢酸ナトリウム、０．５重量％ＴＸ１００、および０．０１重量％ウシ血清アルブミンを含有し、５．６±０．１のｐＨを有する酢酸緩衝液で、１０、１００、または１０００倍に希釈する。１００μｌ溶液を、上記のように調製したプレートの各ウエルの底に堆積させる。このプレートを３７℃で９０分間インキュベートさせる。このインキュベーション後、０．０５重量％ＴＸ１００を含有するリン酸緩衝液３００μｌを各ウエルに入れることにより洗浄を行う。この緩衝溶液を２分間接触させて、吸引して取り出す。この洗浄操作を４回繰り返す。
【００５５】
　次に、Ｂ型肝炎ウイルスのＨＢｓ抗原に対するペルオキシダーゼ複合体化特異モノクローナル抗体の溶液１００μｌを、各ウエルに加える。このプレートを３７℃で６０分間インキュベートさせる。このインキュベーション後、プレートの各ウエルの内容物を吸引して取り出す。０．０５重量％ＴＸ１００を含有するリン酸緩衝液３００μｌを、各ウエルに入れ、そして次に、この緩衝溶液を、２分間接触後に吸引して取り出す。この洗浄操作を５回繰り返す。
【００５６】
　クエン酸ナトリウム緩衝液中のｏ−フェニレンジアミン、２ＨＣｌの溶液１００μｌを、各ウエルに加える。プレートを常温にて３０分間インキュベートさせ、次に、反応を、各ウエルに５０μｌ　２Ｎ　Ｈ２ＳＯ４を加えて停止させる。反応の終点で得られる４９２ｎｍでの吸光度を、自動プレートリーダーを用いて測定する。
【００５７】
　各患者またはドナーから得た吸光度の平均値を表１に示す（光学密度単位×１０００）。ＨＢｓＡｇは、４人の患者の場合には効率よく検出されたが、３人の健常被検体の場合には検出されなかった。
【００５８】
【表１】
2004037469.tif 000002
　（実施例７）
　β２ＧＰＩに対して特異的なモノクローナル抗体（「８Ｃ３」と呼ばれる：Ｊ．　Ａｒｖｉｅｕｘからの寄贈）を支持体に付着させること以外は、実施例６と同様に、同じ方法を使用した。同様の結果が得られた。
【００５９】
　これらの２つの実施例６および７の場合には、一方では、β２ＧＰＩが支持体に付着するようになることが、特異抗体によりそれを検出することにより示され、そして他方では、Ｂ型肝炎を患う患者の血清中に存在する（β２ＧＰＩ／ＨＢｓＡｇ）複合体の付着を、β２ＧＰＩ付着のために調製した支持体へのその付着を、β２ＧＰＩに特異的な抗体と共に患者の血清を３７℃で３０分間プレインキュベーションを行うことによってブロックすることにより、阻害し得た。これらの結果は、Ｂ型肝炎ウイルスのＨＢｓＡｇが、血漿中に存在するβ２ＧＰＩによって認識され得ることを示す。この後者は、これらのアッセイで、ＨＩＶ２　ｐ２６　ＲＯＤまたは特異抗体に結合される。
【００６０】
　（実施例８）
　実施例６の場合と同じ方法を使用すると、結果は、感染組織から抽出したレーシュマニア（ＬＥＩＳＨＭＡＮＩＡ）寄生虫によってもたらされる表面抗原を検出するのにポジティブであった。
【００６１】
　（実施例９：β２ＧＰＩ／不死化リンパ球細胞系細胞複合体の形成）
　蛍光β２ＧＰＩを、ＰＢＳ緩衝液中で３７℃で１時間、２回前もってリンスした「ＣＥＭ」細胞系細胞（１０６／ｍｌ）とインキュベートする。ＰＢＳ緩衝液中３回の洗浄後、細胞を、２％パラホルムアルデヒドで固定し、次にフローサイトメトリーで分析する。結合スペクトルの分析は、ほとんどの細胞にβ２ＧＰＩが存在することを示す。この量は、最初の投与量に依存して存在し、１０〜１００μｇ／ｍｌであった。
【００６２】
　この結合は、健常ドナーからの正常末梢血リンパ球とは違って、他の不死化細胞系の場合（例えばＴ細胞系：ＳＶＰＴ１およびＭＯＬＴ４、または単球系：ＴＦＰＩおよびＵ９３７）において観察された。この不死化細胞系は、市販「Ｆｉｃｏｌｌ」溶液の緩衝を介して遠心分離により単離し、次にＰＢＳでリンスした。
【００６３】
　（実施例１０：（β２ＧＰＩ）ｎ／ＨＢｓＡｇ複合体の結合）
　本実施例では、（β２ＧＰＩ）ｎ部分に結合する化合物は、ＷＯ　９３／２１２２８に記載の方法によって精製されたヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ　Ｍａｘｉｓｏｒｂ）に０．１Ｍ　Ｔｒｉｓグリシン（ｐＨ　８．８）中の１％　ＨＳＡ溶液を予め添加し、次いでＰＢＳ（ｐＨ　７．２）で全体的に洗浄する。
【００６４】
　ＨＢｓＡｇ＋血清または健常ドナー血清を、酢酸ナトリウム（５０ｍＭ、ｐＨ　５．６）での１０００倍希釈で、３７℃で１時間インキュベートさせ、実施例６と同様に但しＴＸ１００非存在下で実験を実施する。
【００６５】
　ドナー血清または血清なしコントロールは、いかなる著しいシグナルをも与えない（＜０．０５　ｏｄｕ）。ＨＢｓＡｇ血清は、有意なシグナルを与える（近似１．５　ｏｄｕ）。従って、ＨＢｓＡｇは捕捉される。血清希釈物がインキュベートされる場合、
　（ａ）８００μｇ　ＨＳＡ／ｍｌの存在下では、シグナルは、８０％より大きく減少され、このことは、支持体に付着されるＨＳＡへの結合が事実であることを示す；
　（ｂ）４μｇ　β２ＧＰＩ／ｍｌの存在下、すなわち血清から生じる内部β２の単なる２０倍量で、シグナルはほとんど４０％減少され、このことは、内部複合体のいくらかが支持体へ付着していることを表す。
【００６６】
　同様の実験が、プレートへの予備添加を行わずに実施される場合、ＨＢｓもまた可視化され、ＨＳＡ存在下でのプレインキュベーションで９７％阻害され、そして添加β２ＧＰＩの存在下では６５％阻害されることが観察される。
【００６７】
　（実施例１１：Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｅｎｅｔｒａｎｓタンパク質との（β２’ＧＰＩ）ａの複合体の形成）
　本方法は、２％オクチルグルコシドで処理した数マイクログラムのＩＣを含有し、ＥＵＲＩＳ法（１４，　ｒｕｅ　ｄｕ　Ｃｈａｐｅａｕ　Ｒｏｕｇｅ−３４５００　ＢＥＺＩＥＲＳ　（フランス））によって飽和されたニトロセルロース細片上で、実施例５と同様に実施した。ＤＡＰ形態で標識されたβ２ＧＰＩは、免疫特異血清、またはｐ３５（特に、３５、４０、および４５Ｋｄの抗原に対して強く、そして６５Ｋｄ抗原に対しては弱い）に特異的な血清によって検出される特異抗原に明らかに結合される。
【００６８】
　（実施例１２：破傷風トキソイドへの（β’２ＧＰＩ）［ｓｉｃ］の結合）
　破傷風トキソイド（ＥＬＯＣＯＲＩＤＥ，　Ｂｅｈｒｉｎｇ）を、１０％アクリルアミドゲルでの電気泳動後に、約０．５〜２μｇ／ｍｍ２の速度でニトロセルロースへ移した。
【００６９】
　ＥＵＲＩＳ法により膜を飽和し、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　＝　８．２）、５０ｍＭ　ＮａＣｌ溶液で４回リンスし、５０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ　６．８±０．１）で１回リンスした後、後者の緩衝液１ｍｌ中の１００ｎｇ　ＤＡＰを膜に加え、これを、１０μｇカルジオリピン（「ＣＬ」と呼ぶ）の存在または非存在下で、２５℃にて１時間インキュベーションを行った。この膜を、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　＝　７．２）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌの１ｍｌで４回リンスした。
【００７０】
　実施例５と同様に可視化した後、破傷風抗原を含有する帯が、ＣＬの存在下で着色される唯一のものである。ＣＬの非存在下では、反応は起こらず、これは、これらの条件下で複合体を形成させるためにはＣＬの存在が必要であることを示す。
【００７１】
　β２ＧＰＩ／ＩＣ複合体形成での界面活性剤および／または脂質の役割は、以下に報告されている実験によって、より詳細に説明された。
【００７２】
　１リットルあたり７．５ｇ　Ｔｒｉｓおよび１４．４ｇ　グリシン、および２０％メタノールを含有する水溶液中の１００〜２００ｎｇのウイルスタンパク質を、２〜４ｍｍ２のニトロセルロース膜（「Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　Ｓｃｈｕｌｌ」によって販売されているＢＡ０４）にゆっくりと濾過させる。この膜を、メタノールを含まないが、１％　ＨＳＡを含有する同じ緩衝液で飽和させる。この緩衝液は、実施例１０に示されているようにして得た。次に、支持体を、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　＝　８．２）、５０ｍＭ　ＮａＣｌ中で４回、短時間予備洗浄し、次に、β２ＧＰＩと、反応媒体中で１〜４時間インキュベートさせ、最後に、アフターリンスで洗浄する。β２ＧＰＩは下記に示すように可視化する。
【００７３】
　一般には、脂質および／または界面活性剤の非存在下では、β２ＧＰＩは、飽和に使用されるアルブミンに結合し、そして特定のウイルスタンパク質には結合しないことが観察される。しかし、界面活性剤の存在下では、逆が観察される。すなわち、β２ＧＰＩはアルブミンに結合しないが、特定のウイルスタンパク質に結合する。カルジオリピンのようなリン脂質はこのような結合を誘導する。
【００７４】
　より正確には、以下の結果が観察された：
　　Ａ）以下の工程を実施する：１ｍｌあたり５０ｎｇのＤＡＰとの反応；５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　＝　８．２）、５０ｍＭ　ＮａＣｌでの４回アフターリンス；Ｍｅｒｃｋ推奨条件に従って、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　＝　８．８）、ＮＢＴ、およびＢＣＩＰでのＤＡＰの可視化。
【００７５】
　反応媒体（５０ｍＭ　酢酸ナトリウム、ｐＨ　＝　５．６）中に界面活性剤が存在しない場合、組換えタンパク質ＨＶＩ１　ｐ１８およびｐ２５およびＨＩＶ２　ｐ２６（ＴＲＡＮＳＧＥＮＥ）は、反応しない（支持体の白色帯）が、一方、組換えタンパク質ＨＩＶ　ｇｐ１６０は、ＤＡＰにわずかに結合し、そしてヒトアルブミンもまた反応する（着色バックグラウンド）。逆に、０．５％　ＴＸ１００または「Ｔｒｉｔｏｎ　４０５」または０．２％「Ｔｗｅｅｎ　２０」の存在下では、アルブミンはもはやいかなる反応も示さないが、一方、ＨＩＶ２　ｐ２６およびＨＩＶ１　ｐ１８は、強い反応を示す。ＨＩＶ１　ｇｐ１６０は、界面活性剤なしでの反応より強い反応を示し、そしてＨＩＶ１　ｐ２５は、弱い反応を示す。
【００７６】
　Ｂ）同条件下であるが、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　＝　８．２）の異なる反応媒体では、ＨＩＶ１　ｐ１８のみが、界面活性剤の存在下で弱く反応する。
【００７７】
　Ｃ）以下の工程を実施する：５０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、ＮａＯＨ（ｐＨ　＝　６．８）での１回前洗浄；同じ緩衝液中での、１０μｇのカルジオリピン／ｍｌの存在または非存在下での１００ｎｇ　ＤＡＰ／ｍｌとの１時間反応；０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　＝　７．２）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌでの４回アフターリンス、および０．１５　Ｍ　ＮａＣｌでの１回アフターリンス、およびＡ）と同様の可視化。
【００７８】
　４つのＨＩＶタンパク質はいずれもカルジオリピンの非存在下では反応しないが、この４つはそれが存在するとき反応する。
【００７９】
　Ｄ）以下の工程を実施する：５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　＝　７．６）中、および１μｇのβ２’ＧＰＩ／ｍｌおよび２０μｇのＣＬ／ｍｌの存在下での１時間反応、反応緩衝液での４回洗浄、ならびに０．１５Ｍ　ＮａＣｌおよび０．０５％「Ｔｗｅｅｎ　２０」が加えられた同じ緩衝液中での、溶液中の５４μｇのアルカリホスファターゼ結合モノクローナル抗体８Ｃ３／ｍｌの存在下での１時間インキュベーションによるβ２’ＧＰＩの可視化；次に、同じ溶液での４回リンスおよび０．１５Ｍ　ＮａＣｌでの１回リンス、ならびにＡ）と同様の可視化。
【００８０】
　４つのウイルスタンパク質が反応し、そしてＨＩＶ１　ｐ２５が強く反応するが、一方、β２’ＧＰＩのないまたはＣＬのないコントロールは、眼に見える反応を全く示さない。
【００８１】
　とりわけ、これらの実施例は、界面活性剤およびまたは脂質（特にリン脂質）が、もしこの相互作用に関与しなければ、ウイルスタンパク質との相互作用を促進し得ること、およびアルブミンとの結合は、それが使用される界面活性剤に感受性であるので、異なる特性のものであることを示す。
【００８２】
　界面活性剤またはリン脂質は、β２ＧＰＩの存在の前の段階で加えられ得ることもまた、注目される。ＨＩＶ１ウイルスタンパク質におけるリン脂質レベルは高いことが知られ、そして界面活性剤の存在下でβ２ＧＰＩと組換えＨＢｓＡｇとの間の結合が記載されたことは、注目される。いくつかのＩＣの場合、およびいくつかの環境条件下では、界面活性剤または脂質が、β２ＧＰＩ／ＩＣ複合体を形成させるために必要であることが、このことから分かる。