(57)【要約】【課題】ＨＥＲ−２陽性の対象例選択に有用な、形態学的シグナルと遺伝子レベルのシグナルとが明瞭に可視画像として判別可能とされる、高精度なガン検出診断方法を提供する。【解決手段】次の手順によりガン組織の検出診断を行う。（Ｉ）病理標本を免疫染色して細胞膜をＤＡＢ発色させる。（ＩＩ）  細胞染色体に蛍光マーカーを付与する。（ＩＩＩ）ニューフクシン発色させてガン細胞の輪郭形状をあきらかにすると同時にその染色体動原体を可視化する。【選択図】      図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の手順によりガン組織の検出診断を行うことを特徴とする二重染色法によるガン診断方法。
（Ｉ）病理標本を免疫染色して細胞膜をＤＡＢ発色させる。
（ＩＩ）細胞染色体に螢光マーカーを付与する。
（ＩＩＩ）ニューフクシン発色させてガン細胞の細胞染色体および形状を可視化する。
【請求項２】
細胞染色体への螢光マーカーの付与は、マイクロウェーブ間欠照射による螢光Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションとして行うことを特徴とする請求項１の二重染色法によるガン診断方法。
【請求項３】
ＨＥＲ−２陽性の対象例についてガン組織の検出診断を行うことを特徴とする請求項１または２の二重染色法によるガン診断方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、二重染色法によるガン診断方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、近年注目されるガン細胞増殖阻害剤であるハーセプチン等の治療対象症例（ＨＥＲ−２陽性）の選択に有用な、形態学的シグナルと遺伝子レベルのシグナルとが明瞭に可視画像として判別可能とされる、高精度なガン検出診断方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＨＥＲ−２タンパク質を産生する遺伝子、すなわち、ＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子はがん遺伝子のひとつとして注目されており、１９８６年にその配列が決定されている。この遺伝子はチロシンキナーゼ活性をもつ受容体型のタンパクで分子量１８５ｋＤａの膜貫通型タンパクをコードしており、細胞外のシグナルを細胞内に伝達し細胞増殖を促進する機能を担っている。そして、乳癌や卵巣癌・胃癌において高頻度に増幅または過剰発現していることが知られている。このためＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子の増幅あるいはタンパクの過剰発現は、癌の早期再発や予後不良と相関し、乳癌や卵巣癌・胃癌などの臨床経過を予測する上で非常に有用である。特に乳癌においては、全患者の２５〜３０％においてＨＥＲ−２タンパクの過剰発現がみられ、こういった患者では転移をきたしやすく、進行が早いため生存率も低いことがわかっている。
【０００３】
そこで、新規なガン治療剤のスクリーニング等においては、一般病理検査の対象とされた細胞がＨＥＲ−２タンパク質を過剰発現しているかどうかを迅速に判定し、しかも対象とされる細胞を高精度に検出・診断することが重要な課題になっている。
【０００４】
このような状況において、免疫染色法による判定方法が開発され、また、螢光マーカーの付与による観察との比較方法が提案されている（文献１および２）。
【０００５】
【文献】
【表１】
2004157053.tif 000003
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来の方法においては、免疫染色によるＨＥＲ−２発現状況と予後および治療効果の予測との間にはばらつきが認められたり、一方乳癌の１０％前後で遺伝子の増幅なしにタンパクの発現のみが過剰となる例が認められるとの報告もある。
【０００７】
このため、ガン診断のための方法としては精度が低いのが実情であった。そしてこのことは、従来の免疫組織染色法と螢光マーカー付与による比較観察においては、形態的細胞膜シグナルと核内染色体シグナルとの判別ができないという状況をともなっていた。
【０００８】
この出願の発明は、以上のとおりの従来技術の問題点を解消し、ＨＥＲ−２陽性、つまりＨＥＲ−２タンパク質発現の対象症例について、高精度でガン診断することを可能とする新しい技術手段を提供することを課題としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、第１には、次の手順によりガン組織の検出診断を行うことを特徴とする二重染色法によるガン診断方法を提供する。
【００１０】
（Ｉ）病理標本を免疫染色して細胞膜をＤＡＢ発色させる。
【００１１】
（ＩＩ）細胞染色体に螢光マーカを付与する。
【００１２】
（ＩＩＩ）ニューフクシン発色させて癌細胞の染色体および輪郭形状を可視  化する。
【００１３】
そして、第２には、細胞染色体への螢光マーカーの付与は、マイクロウェーブ間欠照射による螢光Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションとして行うことを特徴とする上記の二重染色法によるガン診断方法を提供し、第３には、ＨＥＲ−２陽性の対象例についてガン組織の検出診断を行うことを特徴とする上記の二重染色法によるガン診断方法を提供する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
上記のとおりの特徴を有するこの出願の発明は、ＨＥＲ−２陽性の治療対象症例の選択に有効であって、免疫組織化学的方法（ＩＨＣ）と、蛍光Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ、暗視野で蛍光レーザー顕微鏡で観察）並びに明視野での可視化（ＣＩＳＨ）との２重染色を用いることにより、乳癌、卵巣癌、胃がん、肺癌等のガン組織の高精度検出診断を可能としている。
【００１５】
その手順は▲１▼免疫染色（ＩＨＣ）▲２▼染色体への螢光マーカー付与（ＦＩＳＨ）、▲３▼ニューフクシン発色（ＣＩＳＨ）である。
【００１６】
すなわち、患者から患部組織を採取し常法に従い作成されたパラフィン包埋薄切り病理標本を、たとえば、先ず米ＤＡＫＯ社の手法
（たとえば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｓｉｑ．ｎｅｔ／〜ｄａｋｏｊ／ｈｅｒ／ｓｅｎｓｈｏｋｕ．ｈｔｍｌを参照することができる）
に準じて処理しＨＥＲ−２陽性の患者特有に見られるガン細胞表層に過剰生産されたＨＥＲ−２タンパク質をＤＡＢ染色により褐色に発色（可視化）させてその発色強度を判定する（ＩＨＣステップ）。次いで細胞染色体に螢光マーカーを付ける（ＦＩＳＨ法：この段階で暗視野下螢光レーザー顕微鏡観察すると染色体は緑色点として観測され、ガン細胞は染色体数異常（正常細胞に比べて数が多い）が見られる。しかしＦＩＳＨ法だけでは可視領域の光学顕微鏡では観察できないため、ガン細胞部分と正常細胞部分とを形状で同時に区別できない。そこで螢光観察後、さらにＣＩＳＨ処理を組み合わせニューフクシン発色させることにより、ガン細胞の癌特異蛋白（ＨＥＲ−２）を茶褐色に、染色体動原体を紫色の点として発色させて可視化観測する。
【００１７】
たとえばその手順が上記のとおりのこの出願の発明による形態学的シグナルと遺伝子シグナルのシグナルとが組合された特有の可視画像はガン細胞の高精度判定において極めて有用である。
【００１８】
そして、この出願の発明においては、従来二重染色を行うと、形態的シグナルと核内染色体シグナルが重なって十分な染め分けができないとされてきたが、最初に免疫染色（ＩＨＣ）を行い、細胞膜をＤＡＢ染色し、さらにＦＩＳＨ処理時のハイブリダイゼーション工程におけるマイクロウェーブ（ＭＷ）間欠照射処理条件を最適化することにより、形態学的シグナルと核内染色体増幅シグナルとが重なることなく染め分けることが可能とされている。
【００１９】
マイクロウェーブ（ＭＷ）間欠照射について、たとえば、出力コントロールが約１５０Ｗ〜４００Ｗの範囲において可変とされ、ＭＷ照射中に温度が急激に上昇する場合には出力を下げ、温度の上昇が好ましくないときは出力を挙げることで照射中にも可能とされるようにする。ハイブリダイゼーションにおけるＭＷの間欠照射の温度は４０〜４５℃、出力は４／３００Ｗ、３秒照射／２秒停止の繰返しの操作条件がたとえば好適に採用される。
【００２０】
従来法では、ＩＨＣ染色とＦＩＳＨを別に行い、各々を観測比較したのに対して、この出願の発明では同一細胞でタンパク発現と遺伝子増幅を同時に観察できることから、より的確で信頼性の高い判定が可能となる。
【００２１】
そこで以下により具体的にこの出願の発明の実施の形態について説明する。
【００２２】
＜Ａ＞  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ．ＩＨＣ
以下の手順とする。
【００２３】
【表２】
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【００２４】
添付した図面の図１は、ＨＥＲ−２タンパク質をＤＡＢ染色により褐色に発色（可視化）させた状態を示した白黒の写真である。
【００２５】
＜Ｂ＞  ＦＩＳＨ
以下の手順とする。
【００２６】
【表３】
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【００２７】
暗視野下螢光レーザー顕微鏡観察すると染色体は緑色点として観察され、ガン細胞には染色体異常が見られる。図２は、この観察像を白黒写真として例示したものである。
【００２８】
＜Ｃ＞  ＣＩＳＨ
以下の手順とする。
【００２９】
【表４】
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【００３０】
ＦＩＳＨだけでは染色体シグナルが可視光線の光学顕微鏡では観察できないがＣＩＳＨ後には、染色体動原体が紫色の点として発色され、可視化観察することができる。
【００３１】
図３は、この観察像を白黒写真として例示したものである。
【００３２】
【発明の効果】
以上のとおりのこの出願の発明によって、ＨＥＲ−２陽性の対象例選択に有用な、形態学的シグナルと遺伝子レベルのシグナルとが明瞭に可視画像として判別可能とされる、高精度なガン検出診断方法が提供される。
【００３３】
なお、米国およびヨーロッパにおけるＨＥＲ２検査ガイドラインでは通常
１）ＦＩＲＳＴ  ＬｉｎｅとしてＩＨＣ法を実施し、結果３＋の場合治療薬の投与を決定する。
【００３４】
２）ＩＨＣ法の結果２＋の場合、再検およびＦＩＳＨ法での確認を推奨する。とされている。この出願の発明法は、乳癌をはじめとするガン診断法として大いに注目を集めるものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＩＨＣ後の観察像を例示した写真である。
【図２】ＦＩＳＨ後の観察像を例示した写真である。
【図３】ＣＩＳＨ後の観察像を例示した写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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