(57)【要約】【課題】複数種の細胞が混在する系における特定細胞の存在を、該細胞を単離することなく解析する。【構成】末梢血から抽出した白血球細胞由来ＲＮＡをそのまま用いて、測定値に補正をほどこすことにより、ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞のバランス（Ｔｈ１／Ｔｈ２）と、核酸サンプル中のＴｈ１細胞数／Ｔｈ２細胞数または患者及び健常者のＴｈ１／Ｔｈ２データと比較してアレルギーを解析する方法及びシステムを提供する。また、Ｔｈ１／Ｔｈ２を調べる上で不可欠な遺伝子群を特定することでアレイ上に載せるＤＮＡ断片（オリゴヌクレオチド）数を必要最小限とし、再現性・信頼性の高いアレルギー解析用アレイを用いた解析方法、解析システムを提供する。【効果】特定細胞を単離することなく、信頼性の高い解析を行うことができる。【選択図】　図８
2004041121.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞の比率（Ｔｈ１／Ｔｈ２）のバランスによりアレルギーを解析する方法において、
ヒト末梢血由来核酸サンプルを蛍光標識し、
前記蛍光標識した核酸サンプルを、複数のプローブと混合してハイブリダイゼーションを行い、
前記複数のプローブには、Ｔｈ細胞特異的、Ｔｈ１細胞特異的、Ｔｈ２細胞特異的に発現する遺伝子が含まれており、
前記ハイブリダイゼーションを発現量として前記蛍光により検出し、
前記検出された蛍光強度により、Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞特異的に発現する１以上の遺伝子の発現量をそれぞれ測定し、
前記核酸サンプル中の（Ｔｈ１細胞数）／（Ｔｈ２細胞数）又は患者及び健常者におけるＴｈ１／Ｔｈ２データと、（Ｔｈ１／Ｔｈ２）＝（Ｔｈ１細胞特異的に発現する１以上の遺伝子の発現量）／（Ｔｈ２細胞特異的に発現する１以上の遺伝子の発現量）とを比較することによりアレルギーを解析することを特徴とするアレルギー解析方法。
【請求項２】
請求項１記載のアレルギー解析方法において、前記複数のプローブが、Ｔｈ細胞以外の細胞特異的に発現する遺伝子をも含み、前記核酸サンプルが前記Ｔｈ細胞以外の細胞でも発現している場合、前記Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞特異的に発現する１以上の遺伝子の発現量を、それぞれ（蛍光強度値）×（α／（α＋１））（α：Ｔｈ細胞特異的に発現している１以上の遺伝子の発現量／Ｔｈ細胞以外の細胞特異的に発現している１以上の遺伝子の発現量）とすることを特徴とするアレルギー解析方法。
【請求項３】
請求項２記載のアレルギー解析方法において、前記Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞特異的に発現する１以上の遺伝子の発現量をそれぞれ前記蛍光強度の和又は平均値とし、β（Ｔｈ１：Ｔｈ２＝１：１のときに、Ｔｈ１／Ｔｈ２＝１となるようにする規格化関数）との積をＴｈ１／Ｔｈ２とすることを特徴とするアレルギー解析方法。
【請求項４】
請求項２記載のアレルギー解析方法において、前記Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞特異的に発現する１以上の遺伝子の発現量を、それぞれ前記複数のプローブ内での蛍光強度の順位の中央値とし、βとの積をＴｈ１／Ｔｈ２とすることを特徴とするアレルギー解析方法。
【請求項５】
請求項２記載のアレルギー解析方法において、前記Ｔｈ細胞以外の細胞が、好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、Ｂ細胞及びＮＫ細胞から選択される１種以上の細胞であることを特徴とするアレルギー解析方法。
【請求項６】
Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞の比率（Ｔｈ１／Ｔｈ２）のバランスによりアレルギーを解析するシステムにおいて、
複数のプローブを固定したオリゴヌクレオチドアレイと、
前記複数のプローブには、Ｔｈ細胞特異的、Ｔｈ１細胞特異的、Ｔｈ２細胞特異的に発現する遺伝子が含まれており、
前記プローブにハイブリダイズした核酸サンプルの蛍光を発現量として検出する検出手段と、
前記核酸サンプル中のＴｈ１細胞数及びＴｈ２細胞数、又は患者及び健常者におけるＴｈ１／Ｔｈ２をデータとして格納するデータ格納手段と、
前記検出された蛍光強度により、Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞特異的に発現する１以上の遺伝子の発現量をデータとして格納するデータ格納手段と、
前記核酸サンプル中の（Ｔｈ１細胞数）／（Ｔｈ２細胞数）又は前記患者及び健常者におけるＴｈ１／Ｔｈ２データと、（Ｔｈ１／Ｔｈ２）＝（Ｔｈ１細胞で発現する１以上の遺伝子の発現量）／（Ｔｈ２細胞で発現する１以上の遺伝子の発現量）とを比較するコンピュータとを含むことを特徴とするアレルギー解析システム。
【請求項７】
請求項６記載のアレルギー解析システムにおいて、前記プローブがＴｈ細胞以外の細胞特異的に発現する遺伝子をも含み、前記核酸サンプルがＴｈ細胞以外の細胞でも発現している場合、前記Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞特異的に発現する遺伝子の発現量を、それぞれ（蛍光強度値）×（α／（α＋１））（α：Ｔｈ細胞特異的に発現している１以上の遺伝子の発現量／Ｔｈ細胞以外の細胞特異的に発現している１以上の遺伝子の発現量）とすることを特徴とするアレルギー解析方法。
【請求項８】
請求項７記載のアレルギー解析システムにおいて、前記Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞特異的に発現する１以上の遺伝子の発現量をそれぞれ前記蛍光強度の和又は平均値とし、β（Ｔｈ１：Ｔｈ２＝１：１のときに、Ｔｈ１／Ｔｈ２＝１となるようにする規格化関数）との積をＴ１／Ｔｈ２とすることを特徴とするアレルギー解析システム。
【請求項９】
請求項７記載のアレルギー解析システムにおいて、前記Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞特異的に発現する１以上の遺伝子の発現量をそれぞれ前記複数のプローブ内での蛍光強度の順位の中央値とし、βとの積をＴｈ１／Ｔｈ２とすることを特徴とするアレルギー解析システム。
【請求項１０】
請求項７記載のアレルギー解析システムにおいて、前記Ｔｈ細胞以外の細胞が、好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、Ｂ細胞及びＮＫ細胞から選択される１種以上の細胞であることを特徴とするアレルギー解析システム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数の細胞を含む系において特定の細胞の存在をオリゴヌクレオチドアレイを用いた遺伝子発現を介して解析する方法及びシステムに関する。本発明は特に、アレルギーの程度を簡便に評価するためのオリゴヌクレオチドアレイを用いた解析方法及びシステムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
生活習慣病やアトピー・アレルギー疾患の増加が、今日の国民の医療負担を増大させる要因の一つとなっている。従来、アレルギー疾患の治療法として局所ステロイド薬があるが、症状を完全に抑えることはできない。その一方で、減感作療法が近年注目されている。これは抗原（例えばダニ抗原）の抽出液を、舌下などに投与する方法である。減感作療法は、アレルギーの原因抗原が明らかな患者に対し、その抗原を繰り返し投与することで、過敏反応を減弱させる治療法であり、抗原としてダニ、スギ花粉などが用いられる。減感作療法は他の薬物療法と比較して副作用が小さく、かつ成功すれば顕著な治療効果が見られるので、アレルギー患者にもたらされる福音は大きい。しかし、治療が成功するか否かは抗原液濃度の最適化にかかっている。治療効果は抗原液濃度が高いほどよいが、副作用を誘発してはならない。個人ごとに異なる最適抗原液濃度を求める方法は現在のところ存在しない。また治療効果が表面に現れない場合に、治療を続けるべきかそれとも別の治療法に切り替えるべきかの診断指標も存在していない。
【０００３】
しかしアレルギーは、多くの患者が関連する重要現象である。専門医療機関はもとより、一般の開業医等で手軽にアレルギー治療や診断が可能となれば有益である。そのような観点からアレルギーの治療方針の適否、治療効果を調べることに的を絞った診断機器の開発が求められている。
【０００４】
前述の減感作療法の効果発現機序は、ヘルパーＴ細胞のバランスが変化し、炎症性サイトカインの遊走を抑えるためと考えられている。ヘルパーＴ細胞は産生するサイトカインの違いから、Ｔｈ１とＴｈ２と呼ばれる細胞集団に分類することができ、異なる免疫反応を制御している。Ｔｈ１細胞は主に細胞性免疫反応による細胞内寄生性微生物に対する感染防御に、Ｔｈ２細胞は体液性免疫反応による細胞外寄生性微生物に対する感染防御に関与している。この２種類の細胞集団はお互いが産生するサイトカインによって相互のバランスを平衡に保つことにより、過剰な反応がおこらないよう相互に制御しあっている。アレルギー疾患等、Ｔｈ１あるいはＴｈ２反応に起因しておこる疾患の多くは、このバランスが崩れたことによって起こると考えられている。
【０００５】
現在までに、Ｔｈ１とＴｈ２とで発現量の異なる遺伝子が、ＤＮＡチップないしは、ＳＡＧＥ（Ｓｅｒｉａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）法により調べられ、報告されている。Ｒｏｇｇｅらは、６０００個の遺伝子の載ったＤＮＡチップを用いてＴｈ１とＴｈ２とで発現の異なる２１５個の遺伝子を報告している（Ｒｏｇｇｅ，Ｌ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｉｍａｇｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　Ｔ　ｈｅｌｐｅｒ　ｃｅｌｌｓｕｓｉｎｇ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ａｒｒａｙｓ，　Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　２５，　９６−１０１，　２０００）。またＮａｇａｉら（Ｎａｇａｉ，　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｆｉｌｅ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｔｈ１−　ａｎｄ　Ｔｈ２−ｐｏｌａｒｉｚｅｄ　ｃｅｌｌｓ，　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１３，　３６７−３７６，　２０００）は、ＳＡＧＥ法を用いてＴｈ１とＴｈ２細胞のそれぞれの転写産物２万個以上を解析し、Ｔｈ１細胞でより多く発現している遺伝子６６個（危険率５％以下）、Ｔｈ２細胞でより多く発現している遺伝子１４個（危険率５％以下）を報告している。両者の報告を総合すると、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞では、サイトカイン、成長因子、レセプター、転写因子、細胞接着関連蛋白質、細胞遊走関連蛋白質、イオンチャンネル、トランスポーター、アポトーシス関連蛋白質、信号伝達関連蛋白質、代謝経路関連蛋白質などの蛋白質をコードする多岐に渡る遺伝子で発現量の差が認められている。ただし、両者で報告された遺伝子は、一部を除き、ほとんど一致していない点に注意する必要がある。
【０００６】
上記で報告された遺伝子の発現分布を見ることで、Ｔｈ１／Ｔｈ２のバランスを測定することは、原理的に可能である。しかし、そのような解析はこれまで医療現場で行われたことはない。その理由の一つは、上記報告があらかじめ所定の方法で血液から単離されたＴｈ１、Ｔｈ２細胞を用いているためである。実際の医療現場で、被検査者から１度に採血できる妥当な血液の量は、５〜１０ｃｃである。その５〜１０ｃｃの血液から抽出できるトータルＲＮＡ量は、個人差もあるが、高々１０μｇである。ヒトの場合、トータルＲＮＡ量の高々５％がメッセンジャーＲＮＡなので、５〜１０ｃｃの血液から抽出可能なメッセンジャーＲＮＡは０．５μｇにすぎない。その上、血液は、Ｔ細胞のほかに、Ｂ細胞やＮＫ細胞などのリンパ球、好中球、好酸球、好塩基球や単球／マクロファージなどの顆粒球などを含んでいる。そのため、５〜１０ｃｃの血液から抽出可能なＴｈ１、Ｔｈ２細胞由来のメッセンジャーＲＮＡは０．０５μｇ以下と、通常ＤＮＡチップに用いられるメッセンジャーＲＮＡ量の２６．０μｇと比較して極めて少ない量である。すなわちＴｈ１及びＴｈ２細胞のみを被検査者から取り出して、更にＲＮＡを抽出する検査をルーチンで行うことは技術的に非常に難しい。またＴｈ１とＴｈ２細胞のみを血液から単離するには種々の工程が必要なので、一回の診断コストが高くなってしまい、医療経済の観点からも好ましくない。また各工程での回収率は必ずしも１００％とはなり得ないので、前処理工程が増加するほど、診断に用いることのできるＲＮＡ量は目減りすることになる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記難点を解決するためには、ヘルパーＴ細胞のみから得られるＲＮＡでなく、全血から得られたＲＮＡを用いてＴｈ１細胞とＴｈ２細胞の比率が求められることが望まれる。
【０００８】
本発明の目的は、複数種の細胞が混在する系における特定の細胞の存在を、該細胞を単離することなく解析できる方法を提供することである。その好適な一態様として、アレルギーの治療方針の適否、治療効果の程度を簡便、低コストでかつ信頼性高く調べることができるオリゴヌクレオチドアレイを用いた解析方法及び解析システムを提供することにある。Ｔ細胞のみを分離して解析するという従来法では、Ｔ細胞分離、更に場合によっては培養という操作を行う必要があるので解析費用、解析時間がかかる。またＴ細胞分離及び培養等の処理により、細胞の遺伝子発現分布が影響を受ける可能性もあるので、できるかぎりＴ細胞分離は行わない方が望ましい。そこで本発明では、末梢血から抽出した白血球細胞由来ＲＮＡをそのまま用いて、補正をほどこすことにより、ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞のバランス（Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞の比率；Ｔｈ１／Ｔｈ２）を調べ、核酸サンプル中のＴｈ１細胞数／Ｔｈ２細胞数または患者及び健常者のＴｈ１／Ｔｈ２データと比較してアレルギーを解析する方法及びシステムを提供する。また、Ｔｈ１／Ｔｈ２を調べる上で不可欠な遺伝子群を特定することでアレイ上に載せるＤＮＡ断片（オリゴヌクレオチド）数を必要最小限とし、再現性・信頼性の高いアレルギー解析用アレイを用いた解析方法、解析システムを提供することも目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、オリゴヌクレオチドアレイを用いて、アレルギーの程度を評価するという目標を達成するために検討した結果、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞の比率を測定するに際し、白血球中で発現する（１）Ｔｈ細胞に特異的に発現する遺伝子、（２）Ｂ細胞、単球などのＴ細胞以外の細胞に特異的に発現する遺伝子、（３）Ｔｈ細胞とその他の細胞で同程度発現している遺伝子、（４）Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞において発現量に差のある遺伝子などの発現を、好ましくは同一アレイ上で測定することが必要であることを見いだした。特に全血から得られるＲＮＡを用いる際には、上記（１）と（４）の条件を満たす遺伝子、すなわちＴ細胞に特異的に発現し、かつＴｈ１細胞とＴｈ２細胞において発現量に差のある遺伝子に基づき、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞の比率を求める方法、ないしは上記（１）と（２）の発現量、すなわちＴｈ細胞に特異的に発現する遺伝子とＴ細胞では発現しない遺伝子の発現量および（３）Ｔｈ細胞とその他の細胞で同程度発現している遺伝子の発現量を用いて、（４）の発現量、すなわちＴｈ１細胞とＴｈ２細胞において発現量に差のある遺伝子の発現量を補正することが望ましい。
【００１０】
具体的には、本発明は、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞の比率（Ｔｈ１／Ｔｈ２）のバランスによりアレルギーを解析する方法において、
ヒト末梢血由来核酸サンプルを蛍光標識し、
前記蛍光標識した核酸サンプルを、Ｔｈ細胞特異的、Ｔｈ１細胞特異的、Ｔｈ２細胞特異的に発現する遺伝子を含む複数のプローブと混合してハイブリダイゼーションを行い、
前記ハイブリダイゼーションを発現量として前記蛍光により検出し、
前記検出された蛍光強度により、Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞特異的に発現する１以上の遺伝子の発現量をそれぞれ測定し、
前記核酸サンプル中の（Ｔｈ１細胞数）／（Ｔｈ２細胞数）又は患者及び健常者におけるＴｈ１／Ｔｈ２データと、（Ｔｈ１／Ｔｈ２）＝（Ｔｈ１細胞特異的に発現する１以上の遺伝子の発現量）／（Ｔｈ２細胞特異的に発現する１以上の遺伝子の発現量）とを比較することによりアレルギーを解析することを特徴とするアレルギー解析方法を提供する。
【００１１】
核酸サンプルとしては、ヒト末梢血由来の白血球またはＴ細胞から得られたＲＮＡを鋳型として逆転写酵素反応を行って相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する際に、標識物質を結合ないしは鎖伸長時に取り込ませて標識化したｃＤＮＡを用いることができる。
【００１２】
本明細書において、「細胞Ａで特異的に発現する遺伝子」とは、例えばＤＮＡチップやＲＴ−ＰＣＲ等の測定方法を用いて、細胞Ａで遺伝子発現が統計的有意に認められるが、測定対象検体に含まれる細胞でかつ細胞Ａ以外の細胞での遺伝子発現が、測定下限以下もしくは、統計的有意には認められない遺伝子を言う。
【００１３】
本発明の方法において使用する、Ｔｈ１及びＴｈ２において特異的に発現する遺伝子、Ｔｈ細胞以外の細胞において特異的に発現する遺伝子、及びＴｈ１及びＴｈ２において発現量に差のある遺伝子の数は、いずれも１以上であり、正確な解析のために好ましくは５０〜２００個の範囲である。より多数の遺伝子を用いることでより正確に解析することが可能となるが、多すぎると実験操作や補正等の作業量が増大するため、上記範囲の遺伝子数で十分信頼性のある値を得ることができる。Ｔｈ細胞以外の細胞としては、好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、Ｂ細胞及びＮＫ細胞から選択される１種以上の細胞が挙げられる。
【００１４】
本明細書において「発現量」とは、当該細胞内におけるメッセンジャーＲＮＡ量、もしくは蛋白質量を意味するものとする。複数の遺伝子の発現量としては、各遺伝子の発現量の和、平均値または中央値を用いる。蛍光強度によって発現を測定する場合には、複数のプローブ内での蛍光強度の順位の中央値とすることができる。
【００１５】
本発明の方法において、複数のプローブがＴｈ細胞以外の細胞特異的に発現する遺伝子をも含み、核酸サンプルがＴｈ細胞以外の細胞でも発現している場合、Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞特異的に発現する１以上の遺伝子の発現量を、それぞれ（蛍光強度値）×（α／（α＋１））（α：Ｔｈ細胞特異的に発現している１以上の遺伝子の発現量／Ｔｈ細胞以外の細胞特異的に発現している１以上の遺伝子の発現量）とすることができる。
【００１６】
更に、Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞特異的に発現する１以上の遺伝子の発現量をそれぞれの蛍光強度の和又は平均値として、β（Ｔｈ１：Ｔｈ２＝１：１のときに、Ｔｈ１／Ｔｈ２＝１となるようにする規格化関数）との積をＴｈ１／Ｔｈ２とすることができる。
あるいは、Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞特異的に発現する１以上の遺伝子の発現量を、それぞれの複数のプローブ内での蛍光強度の順位の中央値とし、βとの積をＴｈ１／Ｔｈ２とすることができる。
【００１７】
本発明の方法は、例えばサンプル中におけるＴｈ１／Ｔｈ２を測定することによって、疾患の有無及び／または疾患の程度を判定するために使用することができる。「特定の状態」とは、例えばアレルギー等の疾患の有無及び／または程度を解析する場合であれば、正常な状態等の対照の状態を意味し、正常な場合にＴｈ１／Ｔｈ２＝１であれば、１に対して統計的に有意な差であるか否かを評価する。本発明において使用される統計手法としては、例えばベイズ推定法、ネイマン・ピアソン推定法等が挙げられるが、特に限定するものではない。
【００１８】
本明細書において、「同程度に発現する」とは、±１０％の発現であることをいう。すなわち、ある遺伝子が２以上の細胞において「同程度に発現する」とは、該遺伝子の２以上の細胞における発現量が±１０％の範囲内であることをいう。
【００１９】
本発明の方法において使用する複数種の細胞全てにおいて同程度に発現する遺伝子の数は、１以上であり、好ましくは１０〜５０である。
本発明の方法はまた、１または複数の細胞種の細胞数の全細胞数に対する比率の経時変化を解析することができ、複数種の細胞が混在する系において特定の細胞種の細胞数が上昇または低下したか否かを該細胞を単離することなく解析することができる。
【００２０】
上記方法によってサンプル中のＴｈ１／Ｔｈ２の値を各細胞を単離することなく解析することで、正常の値と比較してＴｈのバランスが異常となっているか否か、またその程度が速やかに判定でき、治療の有効な判断材料を提供することができる。更に、事前に患者及び健常者におけるデータを蓄積することで、Ｔｈ１／Ｔｈ２の値と疾患確率との関係を閾値モデルとして表現することができ、検査ごとに得られるＴｈ１／Ｔｈ２の値から、検査者に対して治療すべきか否かの治療方針を判定することができる。更にまた、ベイズ統計もしくは決定に基づく判定法を用いて診断精度を向上させることが可能である。
【００２１】
本発明はまた、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞の比率（Ｔｈ１／Ｔｈ２）のバランスによりアレルギーを解析するシステムにおいて、
Ｔｈ細胞特異的、Ｔｈ１細胞特異的、Ｔｈ２細胞特異的に発現する遺伝子を含む複数のプローブを固定したオリゴヌクレオチドアレイと、
前記プローブにハイブリダイズした核酸サンプルの蛍光を発現量として検出する検出手段と、
前記核酸サンプル中のＴｈ１細胞数及びＴｈ２細胞数、又は患者及び健常者におけるＴｈ１／Ｔｈ２をデータとして格納するデータ格納手段と、
前記検出された蛍光強度により、Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞特異的に発現する１以上の遺伝子の発現量をデータとして格納するデータ格納手段と、
前記核酸サンプル中の（Ｔｈ１細胞数）／（Ｔｈ２細胞数）又は前記患者及び健常者におけるＴｈ１／Ｔｈ２データと、（Ｔｈ１／Ｔｈ２）＝（Ｔｈ１細胞で発現する１以上の遺伝子の発現量）／（Ｔｈ２細胞で発現する１以上の遺伝子の発現量）とを比較するコンピュータとを含むことを特徴とするアレルギー解析システムを提供する。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明についてより具体的に説明する。
本明細書において「校正用内部標準遺伝子」とは、例えばハウスキーピング遺伝子のことである。ハウスキーピング遺伝子は、細胞の生存に必要な構成タンパク質やエネルギー代謝系の酵素などをコードしている遺伝子であり、分化の異なるどのような細胞でも発現していると考えられる遺伝子である。例えば、βアクチン、ＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ、αチューブリン、トランスフェリン受容体、ユビキチンなどである。白血球等の被検査者サンプルに予め含まれているので、校正の際、内部標準となる。なお内部標準とは、外部から加えなくても予めサンプル中に存在しており、校正の際に標準となるものである。
【００２３】
本明細書において「校正用外部標準遺伝子」とは、例えば、測定対象がヒトの場合に、ヒトには存在しない、植物、微生物、昆虫などの遺伝子配列のことである。例えばシロイヌナズナ遺伝子、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、ファイアフライルシフェラーゼ（Ｆｉｒｅｆｌｙ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子などである。白血球等の被検査者サンプルには含まれていないので、測定時に外部から、既知濃度の外部標準遺伝子を加えることで、校正の際、外部標準となる。なお外部標準とは、予めサンプル中に存在していないので、外部から別途加えることで校正の際に標準となるものである。
【００２４】
Ｔ細胞について説明する。Ｔ細胞はＴリンパ球ともいい、末梢血リンパ球の６０〜８０％を占める亜集団で骨髄の幹細胞に由来し、そのほとんどが胸腺で成熟する。成熟したＴ細胞の多くはヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞もしくはキラーＴ細胞となる。ヘルパーＴ細胞は、抗体刺激により各種サイトカインを産生してＢ細胞、Ｔ細胞、マクロファージなどに働いて免疫反応の促進、増強を誘導する。キラーＴ細胞は、移植片、ウイルス感染細胞、腫瘍細胞を認識してこれを傷害する活性を有している。
【００２５】
Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞が産生するサイトカインによって保たれているバランスを遺伝子レベルで表現すれば、複数のＴｈ１／Ｔｈ２関連遺伝子群のスイッチがオンオフされることで、Ｔｈ１／Ｔｈ２関連の蛋白質量が増減し、それら蛋白質活性全体のバランスで生体機能調節がなされていると考えられる。すなわちＴｈ１／Ｔｈ２関連遺伝子群のオンオフの異常が、結果として蛋白質活性のバランスの異常となり、Ｔｈ１／Ｔｈ２のような生体機能調節の異常として現れるのである。遺伝子のオンオフとは、例えば遺伝子発現量の増加ないしは減少により制御されている。遺伝子発現量は、メッセンジャーＲＮＡ量、もしくは蛋白質量を指標として測定することができる。現在の技術ではメッセンジャーＲＮＡ量を指標とする方が、蛋白質を指標とするより、極めて簡便に測定が行える。そこで、アレルギーを簡便に評価するには、Ｔｈ１／Ｔｈ２に関連する複数遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ発現量の増減を同時に観察すればよい。この目的には、関連遺伝子数が１００を超える場合にはＤＮＡアレイ（オリゴヌクレオチドアレイとも呼ばれる）が最も適しているし、関連遺伝子が１００以下の場合には、ＤＮＡアレイもしくは、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写―ポリメラーゼ連鎖反応）法が適している。尚、本発明において「ＤＮＡアレイ」及び「オリゴヌクレオチドアレイ」には、支持体上でオリゴヌクレオチドを合成するものと、増幅した遺伝子断片（オリゴヌクレオチド）を支持体上にスポットして得られるもののいずれも含まれ、名称によって製法が特定されることを意図するものではない。
【００２６】
ＤＮＡアレイ（オリゴヌクレオチドアレイ）は、複数のＤＮＡ断片（オリゴヌクレオチド）を基板上に固定化したものである。それぞれのオリゴヌクレオチドはそれぞれ異なる遺伝子に対応している。測定に際しては、測定すべきサンプル由来のメッセンジャーＲＮＡを鋳型として逆転写酵素反応を行い、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）断片を合成する。また、サンプル量が微量である場合には、ＰＣＲ等によって増幅しても良い。その逆転写酵素反応またはＰＣＲ反応の際に、蛍光物質などの適当な標識物質を結合ないしは鎖伸長時に取り込ませることで、ｃＤＮＡ断片を標識化する（以後、標識されたｃＤＮＡを、標識化ｃＤＮＡと呼ぶ）。基板上に固定化されたオリゴヌクレオチドは、標識化ｃＤＮＡ断片と相補結合する。オリゴヌクレオチドは基板上の異なる座標値に固定化されている。予めどの座標値にどのオリゴヌクレオチドが固定化されているかが分かっていれば、複数の遺伝子のそれぞれについてメッセンジャーＲＮＡの増減を、同時に測定することができる。
【００２７】
ＲＴ−ＰＣＲ法は、例えばハウスキーピング遺伝子など、細胞間で発現量変化の少ない遺伝子を基準として、測定対象遺伝子の発現を測定する方法である。ＲＴ−ＰＣＲにより、測定サンプル由来のメッセンジャーＲＮＡを増幅できるので、ＤＮＡアレイ法より少ないサンプル量で測定できることが利点である。
【００２８】
図５は、一般的なＤＮＡチップ作成の概略図である。図６にそのフローチャートを示す。まずインターネット等のネットワークより接続可能な公共データベース２５もしくはインハウスデータベース２６より遺伝子情報（配列情報や機能情報）を取得する。この遺伝子情報にもとづき、遺伝子ごとのプローブ配列を設計するが、この配列設計はプローブ配列設計コンピュータ２７により行う。計算された塩基配列２８を、核酸合成装置２９に入力し、オリゴヌクレオチドプローブを合成する。合成されたプローブセット３０を、スポッター３１を用いて、ＤＮＡチップ（作成途上）３３の支持体上にスポットし、ＤＮＡチップ３４が作成される。
【００２９】
図７は、ＤＮＡチップデータ解析の概略図である。図８にそのフローチャートを示す。まず被検査者から得られた核酸サンプルを蛍光標識で標識し、蛍光標識サンプル３５を作成する。次に、蛍光標識サンプル３５を核酸サンプルと配列特異的にハイブリダイズし得る複数のプローブ（オリゴヌクレオチド）を固定したチップ（オリゴヌクレオチドアレイ）３６とハイブリダイズする。ハイブリダイズ後のチップ３６を蛍光検出器（検出手段）３７で検出し、各プローブに対応する蛍光量（蛍光強度）を取得する。取得された蛍光量は、蛍光検出器制御コンピュータ（データ格納手段）３８内に、実験データ（遺伝子発現分布データ）３９として格納される。次に、実験データ３９を実験データ解析コンピュータ４０にデータ転送し、本願明細書で開示された方法等で、数式による補正や統計解析を行う。解析結果は、解析者に対し、画面出力もしくはレポート出力の形式で示される。
【００３０】
サンプルとしてアレルギーを有するか、または有するおそれのある被験者由来の核酸サンプルを用いる場合、上記の方法及びシステムによってアレルギーの状態の有無及び／または程度を解析することができる。
本発明は、塩基配列の異なる複数のオリゴヌクレオチドを、支持体上の異なる位置に固定化したアレイを用いた解析方法及びシステムであって、該オリゴヌクレオチドが前記（１）から（４）の遺伝子の、あるいは下記の遺伝子の相補配列鎖の、少なくとも２０塩基以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とするオリゴヌクレオチドアレイを用いた解析方法及びシステムを提供する。
【００３１】
（１）−（４）の群とは、以下の群：
（１）細胞１及び細胞２において特異的に発現する遺伝子由来のオリゴヌクレオチド、または該オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド、
（２）細胞ｋ（ｋ＝３，４，．．，ｎ）において特異的に発現する遺伝子由来のオリゴヌクレオチド、または該オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド、
（３）前記ｎ種の細胞全てにおいて同程度に発現する遺伝子由来のオリゴヌクレオチド、または該オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド、及び
（４）細胞１及び細胞２において発現量に差のある遺伝子由来のオリゴヌクレオチド、または該オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド、
である。
【００３２】
オリゴヌクレオチドアレイにおいて、固定化する各群に属するオリゴヌクレオチドの数としては、特に限定するものではないが、群（１）、（２）、及び（３）についてはそれぞれ１０〜５０個、群（４）については５０〜２００個の範囲とすることが好ましい。
【００３３】
さらに、オリゴヌクレオチドを基板上に固定化する際の配置を各群に基づいて区分けして行うことで、オリゴヌクレオチドアレイの測定結果を、測定者が瞬時に視覚的に理解し判定できる。
【００３４】
また、本発明は、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞において発現量に差のある遺伝子の少なくとも２０塩基以上の塩基配列またはその相補配列を有するオリゴヌクレオチド（（４）に相当）を固定化したことを特徴とするオリゴヌクレオチドアレイを用いた解析方法及びシステムである。このＴｈ１細胞とＴｈ２細胞において発現量に差のある遺伝子としては、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、転写因子、アポトーシス関連蛋白質、プロテオリシス関連蛋白質、信号伝達関連蛋白質、酵素、イオンチャンネル、トランスポータ、代謝関連蛋白質、細胞接着関連蛋白質、細胞遊走関連蛋白質、アレルギー蛋白質などをコードする多岐に渡る遺伝子がある。具体的な遺伝子名称は例えば、ＵｎｉｇｅｎｅのＳｙｍｂｏｌ名でＡＤＣＹ７，ＡＧＸＴ，ＡＫＡＰ１，ＡＬＤＨ３Ｂ１，ＡＮＸＡ３，ＡＲＣＮ１，ＡＲＥＧ，ＡＲＲＢ２，ＡＴＰ１Ａ１，ＡＴＰ６Ｄ，ＡＴＰ６Ｆ，ＢＡＫ１，ＢＩＲＣ３，ＣＡＣＮＢ３，ＣＡＳＰ８，　ＣＤ２，ＣＤ３８，ＣＤ３Ｄ，ＣＤ６，ＣＤ６９，ＣＤ９７，ＣＤＨ３，ＣＥＢＰＤ，ＣＮＫ，ＣＯＰＳ３，ＣＯＸ５Ｂ，ＣＲＩ１，ＣＳＦ２，ＣＳＴ３，ＣＴＮＮＢ１，ＤＡＦ，ＤＮＴＴ，ＤＰＰ４，ＤＴＲ，Ｅ２−ＥＰＦ，Ｅ２Ｆ４，ＥＢＩ２，ＥＤＧ１，ＥＧＲ２，ＥＴＳ１，ＦＡＣＬ１，ＦＧＤ１，ＦＧＦＲ１，ＬＪ２０７４６，ＦＯＳ，ＦＯＸＧ１Ａ，ＦＵＳ，ＧＡＴＡ１，ＧＡＴＡ３，ＧＢＰ１，ＧＢＰ２，ＧＣ２０，ＧＣＨ１，ＧＮＬＹ，ＧＯＴ１，ＧＰＲ６，ＧＰＲ９，ＧＺＭＢ，ＧＺＭＫ，ＨＩＦ１Ａ，ＨＮＲＰＡ１，ＨＯＸＡ１，ＨＳＰ１０５Ｂ，ＨＳＰＡ１Ａ，ＨＳＰＣＡ，ＨＳＸＩＡＰＡＦ１，ＨＴ０１３，ＩＣＡＭ２，ＩＣＳＢＰ１，ＩＦＩ３５，ＩＦＮＧ，ＩＬ１０ＲＡ，ＩＬ１２ＲＢ２，ＩＬ１３，＋ＩＬ１８Ｒ１，ＩＬ２，ＩＬ３，ＩＬ９，ＩＬＦ２，ＩＲＦ１，ＩＲＦ７，ＩＴＧＢ７，ＩＴＫ，ＪＵＮ，ＫＣＮＢ２，ＫＣＮＫ３，ＫＩＡＡ０２３９，ＫＬＫ６，ＫＳＲ，ＬＤＨＢ，ＬＥＰ，ＬＩＦＲ，ＬＯＣ５１０４２，ＬＯＣ６４１１６，ＬＲＰ８，ＬＴＡ，ＬＴＢ，ＭＡＰ２Ｋ２，ＭＡＰ３Ｋ５，ＭＩＧ，ＭＫＮＫ１，ＭＲＦ−１，ＭＳＮ，ＭＴ１Ｈ，ＭＹＢ，ＮＤＵＦＢ５，ＮＦＡＴＣ１，ＮＫＧ７，ＮＭＥ４，ＮＲ４Ａ２，ＮＴ５，ＯＳＭ，Ｐ２ＲＸ５，ＰＤＣＤ５，ＰＤＥ４Ｂ，ＰＥＦ，ＰＥＭＴ，ＰｈｅＨＢ，ＩＭ１，ＰＬＡＵＲ，ＰＰ，ＰＰＩＦ，ＰＰＰ１Ｒ２，ＰＰＰ２Ｒ５Ｄ，ＰＲＤＸ１，ＰＲＦ１，ＰＲＫＣＢ１，ＰＲＫＣＨ，ＰＳＣＤＢＰ，ＰＳＭＢ４，ＰＳＭＣ４，ＰＳＭＣ６，ＰＴＢ，ＰＴＧＥＲ４，ＰＴＰＲＡ，ＰＴＰＲＺ１，ＲＡＢ３２，ＲＤＢＰ，ＲＯＲＡ，ＲＰＳ２４，ＳＣＹＡ１５，ＳＣＹＡ１７，ＳＣＹＡ３，ＳＣＹＡ４，ＳＣＹＡ５，ＳＣＹＣ１，ＳＤＨ，ＳＥＬＬ，ＳＥＲＰＩＮＢ１，ＳＥＴ，ＳＦ３Ａ３，ＳＦＲＳ１０，ＳＦＲＳ５，ＳＬＡ，ＳＰＰ１，ＳＲＭ３００，ＳＴＡＴ１，ＳＴＩＰ１，ＴＡＦ２Ｓ，ＴＡＮＫ，ＴＡＰ１，ＴＢＸＡ２Ｒ，ＴＩＥＧ，ＴＩＭＰ１，ＴＮＦＲＳＦ１Ａ，ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ，ＴＮＦＳＦ１０，ＴＮＦＳＦ５，ＵＲＯＤ，ＵＳＦ２，ＵＳＰ１２，ＵＳＰ７，ＸＢＰ１，ＹＭＥ１Ｌ１，ＹＲ−２９などが挙げられる。表１−６に上記遺伝子をそのＧｅｎＢａｎｋ登録番号と共に挙げる。
【００３５】
【表１】
2004041121.tif 000003
【００３６】
【表２】
2004041121.tif 000004
【００３７】
【表３】
2004041121.tif 000005
【００３８】
【表４】
2004041121.tif 000006
【００３９】
【表５】
2004041121.tif 000007
【００４０】
【表６】
2004041121.tif 000008
【００４１】
また、本発明は、Ｔｈ細胞に特異的に発現する遺伝子の少なくとも２０塩基以上の塩基配列またはその相補配列を有するオリゴヌクレオチド（（１）に相当）を固定化したことを特徴とするオリゴヌクレオチドアレイを用いた解析方法及びシステムである。このようなオリゴヌクレオチドとして、例えば、ＵｎｉｇｅｎｅのＳｙｍｂｏｌ名でＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ８Ａ、ＣＴＬＡ４、ＭＩＣ２、ＳＥＭＡ４Ｄ、ＴＨＹ１、ＴＲＡ＠、ＴＲＢ＠などの遺伝子に由来するものが挙げられる。表７に上記遺伝子をそのＧｅｎＢａｎｋ登録番号と共に挙げる。
【００４２】
【表７】
2004041121.tif 000009
【００４３】
また、本発明は、Ｔｈ細胞ではあまり発現がなく、Ｂ細胞、単球などのＴ細胞以外の細胞で発現する遺伝子の少なくとも２０塩基以上の塩基配列またはその相補配列を有するオリゴヌクレオチド（（２）に相当）を固定化したことを特徴とするオリゴヌクレオチドアレイを用いた解析方法及びシステムである。
【００４４】
このようなオリゴヌクレオチドとして、例えば、ＵｎｉｇｅｎｅのＳｙｍｂｏｌ名でＡＤＡＭ８、ＡＮＰＥＰ、ＢＳＴ１、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ６８、ＣＤ７２、ＣＤ７４、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＦ２ＲＡ、ＣＳＦ２ＲＢ、ＣＳＦ３Ｒ、ＦＣＧＲ１Ａ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＣＧＲ３Ｂ、ＦＬＴ３、ＧＰ１ＢＡ、ＧＰ１ＢＢ、ＧＰ５、ＧＰ９、ＩＣＡＭ２、ＩＧＳＦ２、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ３、ＩＴＧＢ４、ＫＩＴ、ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、ＬＲＰ１、ＭＳ４Ａ２、ＭＳＴ１Ｒ、ＮＣＡＭ１、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＶＲ、ＳＥＬＰ、ＳＥＭＡ７Ａ、ＶＣＡＭ１などの遺伝子に由来するものが挙げられる。表８−９に上記遺伝子をそのＧｅｎＢａｎｋ登録番号と共に挙げる。
【００４５】
【表８】
2004041121.tif 000010
【００４６】
【表９】
2004041121.tif 000011
【００４７】
また本発明は、Ｔｈ細胞とその他の細胞で同程度発現している遺伝子の少なくとも２０塩基以上の塩基配列またはその相補配列を有するオリゴヌクレオチド（（３）に相当）を固定化したことを特徴とするオリゴヌクレオチドアレイを用いた解析方法及びシステムである。このようなオリゴヌクレオチドとして、例えば、白血球等の被検査者サンプルに予め含まれる内部標準遺伝子、もしくはヒトには存在しない植物、微生物、昆虫などの遺伝子配列を測定時に予め定められた量だけ測定サンプルに加える外部標準遺伝子由来のもの、具体的にはＵｎｉｇｅｎｅのＳｙｍｂｏｌ名でＡＰ１Ｂ１，ＡＰ１Ｇ１，ＡＰ１Ｓ１，ＡＰ１Ｓ２，ＡＰ１Ｍ２，ＣＡＭＫ１，ＣＡＭＫ２Ａ，ＣＡＭＫ２Ｂ，ＣＡＭＫ２Ｄ，ＣＡＭＫ２Ｇ，ＣＤ２８，ＣＤ４７，ＣＲ１，ＣＲＥＢ１，ＣＴＬＡ４，ＩＦＮＧＲ１，ＩＬ１Ｒ１，ＩＬ１Ｒ２，ＩＬ２ＲＢ，ＩＬ６ＳＴ，ＩＴＧＡ１，ＩＴＧ２６，ＩＴＧＡ３，ＩＴＧＡ４，ＩＴＧＡ５，ＩＴＧＡ６，ＬＡＴ，ＭＡＰＫ１３，ＭＡＰＫ２Ｋ４，ＭＡＰＫ２Ｋ７，ＮＦＫＢ１，ＮＦＫＢ２，ＲＡＦ１，ＳＬＣ３２６，ＴＮＦＲＳＦ１Ａ，ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ及びＺＡＰ７０などの遺伝子に由来するものが挙げられる。
【００４８】
アレルギーの程度を評価するためには、例えばＴｈ１とＴｈ２細胞の比率を高精度に解析する必要があるため、１種類の遺伝子とのみ相補的結合するはずのＤＮＡ断片が、他遺伝子とも結合すること（クロスハイブリダイゼーション）は避けなくてはならないことは自明である。これは１枚のアレイ上に固定化する遺伝子数が多くなるほど困難になる。従って、遺伝子数が５千から数万という探索用途のＤＮＡアレイで各遺伝子間のクロスハイブリダイゼーションを皆無にすることは非常に困難である。ブラストアルゴリズムに基づく配列相同性の検討の結果、プローブとして用いるＤＮＡ断片の塩基長が１０００塩基以下である場合、１０００−１５００種類以下のＤＮＡ断片を同一アレイ上に載せることが好ましいことが判明した。そのため、ＤＮＡアレイを使用する目的がアレルギーの程度の評価、診断であれば、アレルギーの作用機序に関連する遺伝子のみを可能なかぎり必要最小限集め、アレイ化することが望ましい。アレルギーと無関係の遺伝子を載せることは、プローブ作成費用の上昇、ひいてはオリゴヌクレオチドアレイの価格上昇につながり好ましくない。また、アレイのプローブとして用いるオリゴヌクレオチドの種類の数を少なく抑えることができることから、１つの種類のオリゴヌクレオチドを複数箇所にプローブとして固定することができ、複数箇所の信号強度を平均化することで信頼性を高めることができる。
【００４９】
すなわち、アレルギーの程度を解析するには、
（１）Ｔｈ細胞に特異的に発現する遺伝子、
（２）Ｔｈ細胞ではあまり発現がなく、Ｂ細胞、単球などのＴ細胞以外の細胞に特異的に発現する遺伝子、
（３）Ｔｈ細胞とそれ以外の細胞で同程度発現する遺伝子、及び
（４）Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞において発現量に差のある遺伝子、
に由来するオリゴヌクレオチドプローブをそれぞれ必要最小限、固定化したＤＮＡアレイを用いて解析することが最も適している。
【００５０】
上記の遺伝子由来の配列を持つオリゴヌクレオチドまたはその相補配列をプローブとしてアレイ上に載せるためには、遺伝子配列のどの部分の配列をプローブとするかを決める必要がある。その際考慮しなければならないのが、融解温度（Ｔｍ，　ｍｅｌｔｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）とクロスハイブリダイゼーションである。ＤＮＡアレイ上に固定化された各ＤＮＡ断片と試料由来ＤＮＡ断片間での、ハイブリダイゼーションを高精度（ないしは高ストリンジェント、ｈｉｇｈｌｙ　ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）に行うためには、ハイブリダイゼーション温度（Ｔｈ，　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）と固定化ＤＮＡ断片のＴｍの関係が重要であり、固定化ＤＮＡ断片の融解温度とハイブリダイゼーション温度との差異が３０℃を超えないことが必要である。また、クロスハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ配列同士のホモロジーが高いために生じるので、クロスハイブリダイゼーションを防ぐためには、特定の固定化ＤＮＡ断片とハイブリダイズすべき試料由来のＤＮＡ断片と、試料由来のＤＮＡ断片のうち固定化ＤＮＡ断片と本来ハイブリダイズしないＤＮＡ断片との相同性が十分低いことが必要である。さらには、分子内でミニヘアピン構造をとるような配列や、ヒト遺伝子の場合にＡｌｕ配列として知られているような繰り返し配列と相同性が有意に高い部分が含まれないことが望ましい。また、１枚のアレイ上に固定化する遺伝子配列同士のホモロジーを計算するのみならず、ある生物種のＤＮＡ配列とＧｅｎＢａｎｋ等に登録された対象となる生物種の遺伝子配列とのホモロジーを計算する必要もある。ＤＮＡアレイ上に固定化するＤＮＡ断片候補の配列と、測定対象試料に含まれている可能性のある遺伝子群のＤＮＡ配列とを比較して、ホモロジーが有意に高いＤＮＡ配列は、固定化ＤＮＡ断片としては選択しないことが望ましい。
【００５１】
プローブとして固定化するＤＮＡ断片は、市販のｃＤＮＡライブラリをテンプレートとしてＰＣＲ反応により合成することができる。これを所定の濃度（０．１−１．０μｇ／μｌ）になるよう調整し、スポッターを用いて、あらかじめポリリジンあるいはアミノシランをコートしたスライドガラス上にスポットすることでオリゴヌクレオチドアレイを作製できる。あるいはまた、プローブは当分野において公知の方法で支持体上で直接合成することもできる。
【００５２】
上記オリゴヌクレオチドアレイを用いてアレルギーの程度を調べるには、以下の手順で行うことができる。まず予め、アレルギー症状が見られないボランティア数名のおのおのから末梢血を採取し、白血球細胞からトータルＲＮＡもしくはメッセンジャーＲＮＡを抽出する。例えば、複数名のメッセンジャーＲＮＡを混合することで、健常人の平均的なメッセンジャーＲＮＡのプールができる。このメッセンジャーＲＮＡのプールのことを、本願明細書の以下の記述では、ユニバーサルコントロール（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ）と記載する。次に被検査者の末梢血を採血し、白血球細胞からメッセンジャーＲＮＡを抽出する。オリゴｄＴプライマーを用いた逆転写反応により被検査者末梢血のメッセンジャーＲＮＡについて、Ｃｙ５−ｄＣＴＰ等を用いて標識化ｃＤＮＡを合成する。またユニバーサルコントロールのメッセンジャーＲＮＡについては、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ等を用いて異なる標識を有する標識化ｃＤＮＡを合成する。被検査者ｃＤＮＡ（Ｃｙ５標識）とユニバーサルコントロールｃＤＮＡ　（Ｃｙ３標識）を混合して同一の前記オリゴヌクレオチドアレイにかけ、所定の温度、時間の間ハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション温度は４５−７０℃、ハイブリダイゼーション時間は６−１８時間が好ましい。ハイブリダイゼーション後、蛍光スキャナーにより各遺伝子をスポットした箇所のＣｙ５とＣｙ３のそれぞれの蛍光強度を比較し、両者での発現量の差を求めることができる。
【００５３】
また上記（１）、（２）、（３）、（４）の遺伝子をＲＴ−ＰＣＲ法や、ノーザンハイブリダイゼーションなどの他の方法により調べることによっても、Ｔｈ１とＴｈ２細胞、およびそれらからのサイトカイン発現量の比を求めることができる。上記（１）〜（４）を用いてＴｈ１／Ｔｈ２の発現比を計算する方法は、以下に示す。
【００５４】
まず、本明細書において使用される補正方法について説明する際に必要な、いくつかの式を定義する。
本明細書において、Ｔｈ１／Ｔｈ２は、
【００５５】
【数１】
Ｔｈ１／Ｔｈ２＝Ｔｈ１細胞数／Ｔｈ２細胞数　　　　　　（式１）
もしくは、
【００５６】
【数２】
Ｔｈ１／Ｔｈ２＝Ｔｈ１細胞で発現する１以上の遺伝子の発現量／Ｔｈ２細胞で発現する１以上の遺伝子の発現量　　　　　　　　　　　　（式２）
のいずれかである。Ｔｈ細胞と単球との存在比（以後、αとも記す）は、以下の式３により定義できる。
【００５７】
【数３】
Ｔｈ細胞と単球の存在比（α）＝Ｔｈ細胞の存在数／単球の存在数＝（Ｔｈ細胞で特異的に発現している１以上の遺伝子の発現量／Ｔｈ細胞と単球の両者で同程度発現する１以上の遺伝子の発現量）／（単球細胞で特異的に発現している１以上の遺伝子の発現量／Ｔｈ細胞と単球の両者で同程度発現する１以上の遺伝子の発現量）　（式３）
すると、Ｔｈ１／Ｔｈ２は以下のように求めることができる。
【００５８】
すなわち、チップ基板上に存在するｍ個のプローブを考える。それぞれのプローブには別々の遺伝子が対応している。あるプローブが対応する遺伝子（図９ではプローブ遺伝子と記載した）ｎがＴｈ細胞のみで発現している（Ｔｈ細胞特異的）か、Ｔｈ細胞以外でも発現しているか、Ｔｈ１のみで発現している（Ｔｈ１細胞特異的）か、Ｔｈ２細胞のみで発現している（Ｔｈ２細胞特異的）かによって、図９に示すフローチャートに従って計算式を選択する。
【００５９】
例えば、図９に示すように、ｍ個のプローブ中、遺伝子ｎに関し、Ｔｈ細胞特異的か否かによって用いる式が異なり、Ｔｈ細胞だけでなくＴｈ細胞以外でも発現している場合には式４−３〜４−５を用いる。
遺伝子ｎがＴｈ細胞特異的であり、更にＴｈ１細胞特異的またはＴｈ２細胞特異的に発現するものである場合には、式４−６を用いる。
【００６０】
遺伝子ｎがＴｈ細胞特異的であり、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞のいずれにおいても発現する場合、式４−１、４−２、及び４−５を用いる。
具体的な式４−１から式４−６を下記に示す。
【００６１】
【数４】
Ｔｈ１（ｎ）＝Ｔｈ１細胞で発現する遺伝子ｎの発現量（遺伝子由来の蛍光強度値）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（式４−１）
【００６２】
【数５】
Ｔｈ２（ｎ）＝Ｔｈ２細胞で発現する遺伝子ｎの発現量（遺伝子由来の蛍光強度値）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（式４−２）
【００６３】
【数６】
Ｔｈ１（ｎ）＝Ｔｈ１細胞で発現する遺伝子ｎの発現量（遺伝子由来の蛍光強度値）×（α／（α＋１））　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（式４−３）
【００６４】
【数７】
Ｔｈ２（ｎ）＝Ｔｈ２細胞で発現する遺伝子ｎの発現量（遺伝子由来の蛍光強度値）×（α／（α＋１））　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（式４−４）
【００６５】
測定対象遺伝子の総数をｋとすると、
【数８】
2004041121.tif 000012
によりＴｈ１／Ｔｈ２を求める。
【００６６】
また、β（ｐ，ｑ，ｒ…）はＴｈ１：Ｔｈ２が１：１のときに、Ｔｈ１／Ｔｈ２が１に等しくなるように規格化する関数であり、実験により求められる。βを実験的に求める場合、予めＴｈ１：Ｔｈ２が既知の比率、例えば、９：１、８：２、７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８、１：９、となるように調製したサンプル群を用意する。そして、既知の比率に調製したそれぞれのサンプルを用いて、Ｔｈ１／Ｔｈ２を測定する。次に、縦軸（Ｙ軸）を予め調製されたＴｈ１／Ｔｈ２比率、横軸（Ｘ軸）を測定により求められたＴｈ１／Ｔｈ２比率をプロットする。理想的にはＹ＝Ｘの直線上に各点はプロットされるはずであるが、実際には、ずれが生じる。そこで、上記プロットに対し、最小二乗法などを用いたカーブフィッティングを行い、校正曲線を得る。線形関数でカーブフィッティングを行った場合、例えばＹ＝ｐＸ＋ｑの校正曲線が得られたとする。ｐとｑはフィッティングにより得られるパラメータである。すると、式４−５は具体的には、下記の式４−５’のように記述できる。
【００６７】
【数９】
2004041121.tif 000013
フィッティングにより得られた校正曲線が２次関数（Ｙ＝ｐＸ２＋ｑ＋ｒ）の場合や、３次関数（Ｙ＝ｐＸ３＋ｑＸ２＋ｒＸ＋ｓ）、もしくはその他の非線形関数の場合も同様に、式４−５を修正して用いることができる。
遺伝子ｎがＴｈ細胞特異的であり、更にＴｈ１細胞特異的またはＴｈ２細胞特異的に発現するものである場合には、以下の式４−６を用いる。
【００６８】
【数１０】
Ｔｈ１／Ｔｈ２＝ｍｅｄｉａｎ（Ｒａｎｋ（Ｘ１）、・・・、Ｒａｎｋ（Ｘｎ１））／ｍｅｄｉａｎ（Ｒａｎｋ（Ｙ１）、・・・、Ｒａｎｋ（Ｙｎ１））×β２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（式４−６）
【００６９】
なお、Ｒａｎｋ（Ｘ１）はＴｈ１細胞特異的な遺伝子に対応するプローブ蛍光強度の順位、Ｒａｎｋ（Ｙ１）はＴｈ２細胞特異的な遺伝子に対応するプローブ蛍光強度の順位、ｍｅｄｉａｎは中央値、β２は式４−５と同様の規格化パラメータである。以後、式４−６について説明する。
【００７０】
Ｔｈ１細胞特異的な遺伝子に対応するプローブがｎ１個あり、それらのプローブ由来の蛍光強度がそれぞれＸ１，Ｘ２，・・・Ｘｎ１だったとする。またＴｈ２細胞特異的な遺伝子に対応するプローブがｎ２個あり、それらのプローブ由来の蛍光強度がＹ１，Ｙ２、・・・Ｙｎ２だったとする。バックグラウンドノイズを引けば、理想的には、Ｔｈ１細胞特異的遺伝子に対応するプローブのＴｈ２細胞サンプル由来の蛍光強度はゼロである。その反対に、Ｔｈ２細胞特異的遺伝子に対応するプローブのＴｈ１細胞サンプル由来の蛍光強度はゼロである。そのため、Ｔｈ１細胞特異的な遺伝子に対応するプローブ由来の蛍光強度はＴｈ１細胞サンプル由来であり、Ｔｈ２細胞特異的な遺伝子に対応するプローブ由来の蛍光強度はＴｈ２細胞サンプル由来となる。しかし、Ｘ１，Ｘ２，・・・Ｘｎ１の平均値（あるいは中央値）とＹ１，Ｙ２、・・・Ｙｎ２の平均値（あるいは中央値）を比較しても、Ｔｈ１／Ｔｈ２を正確に求めることはできない。なぜなら、Ｔｈ１細胞特異的遺伝子とＴｈ２細胞特異的遺伝子はそれぞれ異なる遺伝子のため、単純に比較することはできないためである。しかし、チップ上に十分な数のプローブが存在し、蛍光強度が高いプローブから低いプローブまで連続的に存在すれば、蛍光強度を大きい順（降順）もしくは昇順に並び替えた場合、その順位が等しい遺伝子は、細胞中に存在する種々の遺伝子の中で、その発現強度もほぼ等しいことが期待される。そこで、ＤＮＡチップ上にある全プローブを蛍光強度の順番に降順に並び替えたときのＸ１，Ｘ２，・・・Ｘｎ１の順番をＲａｎｋ（Ｘ１）、Ｒａｎｋ（Ｘ２）・・・Ｒａｎｋ（Ｘｎ１）、Ｙ１，Ｙ２，・・・Ｙｎ１の順番をＲａｎｋ（Ｙ１）、Ｒａｎｋ（Ｙ２）・・・Ｒａｎｋ（Ｙｎ１）とする。Ｔｈ１特異的遺伝子とＴｈ２特異的遺伝子は複数存在するので、それぞれ中央値（ｍｅｄｉａｎ）で代表させることとし、例えばｍｅｄｉａｎ（Ｒａｎｋ（Ｘ１）、・・・Ｒａｎｋ（Ｘｎ１））とｍｅｄｉａｎ（Ｒａｎｋ（Ｙ１）、・・・Ｒａｎｋ（Ｙｎ１））の比をＴｈ１／Ｔｈ２とする。このＲａｎｋを用いる方法は、特に、Ｔｈ１／Ｔｈ２比が１の近傍にある場合に、蛍光強度値を用いるよりも正確である可能性が高い。但し、Ｔｈ１／Ｔｈ２比が１から大きく外れる場合には、正確な比率を必ずしも反映しない恐れもある。
【００７１】
次にベイズ推定法を用いた統計手法について説明する。予め、同一ＲＮＡを二つに分けて、片方をＣｙ３、もう片方をＣｙ５で標識し、同一チップ上で競合ハイブリダイズさせる実験（チップ枚数は５、１０枚程度必要）を行うことを考える。この実験のデータは、Ｃｙ５／Ｃｙ３の平均値＝ｃは１．０であるが、分散σ２については未知である正規母集団Ｎ（ｃ、σ２）から大きさｎの無作為標本［Ｙ１，Ｙ２，・・・，Ｙｉ，・・・，Ｙｎ］を抽出し、その観測値ｙ＝（ｙ１，　ｙ２，　・・・，ｙｉ，・・・，ｙｎ）を得たことに相当する。チップ間差、色素間差、ハンドリングの個人差等の誤差要因は、実験間で相関がないと考えられるため［Ｙ１，Ｙ２，・・・，Ｙｉ，・・・，Ｙｎ］は相互に独立（ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｃａｌｌｙ　ｄｉｓｔｒｉｕｔｅｄ；　ｉ．ｉ．ｄ）と言える。
【００７２】
【数１１】
Ｙｉ〜ｉ．ｉ．ｄ．　Ｎ（ｃ、σ２）＝Ｎ（１、σ２）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（式５）
【００７３】
本ベイズ推定の最終目的は、Ｙｉ　のσ２を推定することにある。本推定により母集団Ｎ（１、σ２）のσ２を推定すれば、式５より、Ｙｉのσ２も同一である。ベイズ推定ではσ２は分布を持つとするので、あくまでσ２の推定値が得られる。推定値としては、平均、モード（度数が最大となる点）や、信頼区間として最高密度信頼区間（Ｈｉｇｈｅｓｔ　Ｄｅｎｓｉｔｙ　Ｒｅｇｉｏｎ；ＨＤＲ）が得られる。９０％最高密度区間は、いわば未知母数σ２の９０％区間のうちで最も短く、また事後分布のピーク値（事後モード）を必ず含み、かつ区間の両端における事後密度が等しくなるものである。
【００７４】
上記式５が成り立つとき、［Ｙ１，Ｙ２，・・・，Ｙｉ，・・・，Ｙｎ］の同時確率密度分布（ａ１　＜　Ｙ１　≦　ｂ１，　ａ１　＜　Ｙ１　≦　ｂ１，・・・、ａｎ　＜　Ｙｎ　≦　ｂｎが同時に満たされる確率密度分布）ｐ（ｙ‘｜ｃ，　σ２）は、
【００７５】
【数１２】
2004041121.tif 000014
のように正規分布を掛け合わせた形式で書ける。但しΠは積記号である。従って、観測値ベクトルｙ＝（ｙ１，　ｙ２，　・・・，ｙｉ，・・・，ｙｎ）が与えられたときの尤度関数ｌ（σ２｜　ｙ）は、
【００７６】
【数１３】
2004041121.tif 000015
または
【数１４】
ｌ（σ２｜　ｙ）∝（σ２）−ｎ／２　　×ｅｘｐ（−ｎｓ２／２σ２）　　　　　　　（式８）
となる。ただし、ｓ２は母平均ｃを中心とした観測値分布であり、下記の式で表される。
【００７７】
【数１５】
2004041121.tif 000016
【００７８】
ここで、分散の事前分布ｐ（σ２）として、無情報事前分布（ｎｏｎｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ　ｐｒｉｏｒ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を仮定する。この仮定は母数に関して未知であるとすることで、事前分布についての恣意性を出来る限り排除し、事後分布はできるだけデータによって支配されるようにする点で妥当である。無情報事前分布として、局所一様事前分布を用いるのが一般的である。局所一様分布とは、未知母数を二乗しようが、三乗しようが、対数値をとろうが、事前情報の漠然性を表すために少なくとも局所的には一様に分布するような分布のことである。具体的にはフィッシャー情報量の平方根に比例するように定めればよいことが分かっている。事前分布として局所一様分布を用いるならば、
【００７９】
【数１６】
ｐ（σ２）　∝σ−２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（式１０）
とすれば良い。つまりσ２の事前分布ｐ（σ２）は、σ−２すなわち定数とする。次に事後分布を考える。ベイズの定理より
【００８０】
【数１７】
ｐ（σ２｜ｙ）　∝ｌ（σ２｜　ｙ）ｐ（σ２）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（式１１）
が成立するので、
【００８１】
【数１８】
ｐ（σ２｜ｙ）　∝（σ２）−（ｎ／２＋１）　×ｅｘｐ　（−ｎｓ２／２σ２）　　　　　　　　　　（式１２）
より、σ２の事後分布ｐ（σ２｜ｙ）は、χ−２（ｎ、ｎｓ２）と等しい分布になる。なおχ−２（ν、λ）とは、尺度母数λをもつ自由度νの逆カイ二乗分布と呼ばれる分布である。χ−２（ν、λ）の平均はλ／（ν−２）、モード（度数が最大となる点）はλ／（ν＋２）となることが分かっているので、
σ２の点推定値として、
【００８２】
【数１９】
平均値を基準とした場合：σ２＝ｎｓ２／（ｎ−２）　　　　　　　　（式１３）
【００８３】
【数２０】
モードを基準した場合：σ２＝ｎｓ２／（ｎ＋２）　　　　　　　　　（式１４）
を考えることができる。また式１２より事後的に、
【００８４】
【数２１】
ｎｓ２／σ２〜χ２（ｎ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（式１５）
の関係が得られる。式１５のχ２（ｎ）とは、自由度ｎのカイ二乗分布である。ここでは、ｎｓ２が固定値（観測値）、σ２が確率変数になっている。式１５と数表を用いることで、ＨＤＲを求めることができる。式１３，１４，１５を用いることで、Ｔｈ１とＴｈ２の比率のデータが得られたとき、その比率が１．０（対照の状態におけるＴｈ１／Ｔｈ２の値）と比較してどの程度、統計的有意に異なるかを知ることができる。
【００８５】
例えば５回の実験で、ｙ１＝１．４、ｙ２＝０．８９、ｙ３＝１．２４、ｙ４＝０．９１、ｙ５＝１．０４が得られたとすると、ｓ２＝０．０４７８８である。平均値を基準とした点推定（式１３）より、Ｙｉ〜Ｎ（１，　０．０７９８）となる。またモードを基準とした点推定より（式１４）より、Ｙｉ〜Ｎ（１，　０．０３４２）となる。式１５より、σ２〜０．２３９４χ−２（５）、となることから、数表を用いることでσ２の９０％ＨＤＲは０．０１９−０．１７７となる。
式５から式１５までに示したベイズ推定法は統計手法の一つの方法であるので、ベイズ推定法以外の方法、例えば、ネイマン・ピアソン流の推定法を用いてもよい。
【００８６】
本ベイズ推定法を用いることで、例えば、全白血球細胞におけるＴｈ細胞の比率を予めＸ（上記例では１．０）としたとき、次に測定したＴｈ細胞の比率がＹだったときに、Ｔｈ細胞の比率がどの程度、統計的有意に異なるかを知ることができる。全白血球細胞中のＴ細胞、Ｂ細胞などの比率も、被測定者の健康状態を知る上で貴重なデータとなる。もし、全白血球細胞におけるＴｈ細胞の比率に有意な変化があれば、その前になんらかの体調の変化があったと診断することができる。
【００８７】
【実施例】
本発明について、一実施例として、被検査者におけるアレルギーの程度の変化を調べる例を模擬したものを記す。アレルギー患者の血液を入手することは困難なので、ここでは、健常人ボランティア末梢血より、Ｔｈ１、Ｔｈ２細胞、単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）を分離抽出し、それら細胞の混合比を変化させることで、全血を用いた検査を模擬した。単球はＴｈ細胞と同様の遺伝子を多数発現しているので、全血を用いた測定における主要なバイアスとなる。そのため単球を加えた場合でもＴｈ１及びＴｈ２細胞の比率を正確に求めることができれば、全血を測定した場合でも、その他Ｂ細胞などが存在することに由来するバイアスを同様の手段で取り除き、正確な測定が行えると考えられる。
【００８８】
Ｔｈ１／Ｔｈ２の測定値を、（１）Ｔｈ１とＴｈ２細胞の二者のみ含むサンプルを測定した場合、（２）Ｔｈ１，Ｔｈ２細胞に単球細胞を加えたサンプルを測定した場合について記す。Ｔｈ１とＴｈ２細胞の混合比率はあらかじめ、１：９、２：８、３：７、４：６、５：５、６：４、７：３、８：２、９：１としておく。
【００８９】
Ｔｈ１／Ｔｈ２は、式１もしくは式２のいずれかであるが、本願明細書の実施例ではサンプル調整においては式１の定義を用いる。そして、測定値については式２の定義を用いることとなる。一般に式１と式２は、細胞１個あたりの遺伝子発現量が検査対象ごとに変化しない場合には一致する。しかし、例えばＴｈ細胞が予め遺伝的な異常を有していて、例えばあるサイトカインの発現量が通常と異なる場合には、式１と式２は必ずしも一致しない。本願明細書では、健常人の血液を用いた結果、式１と式２はほぼ一致したので問題ないが、ある特定の疾患については、健常人の結果がそのままあてはまらない可能性もある。その場合は、それぞれの疾患について、式１と式２を独自に評価した後、本発明を適用すれば良い。
【００９０】
また単球細胞で特異的に発現している遺伝子の発現量は、Ｔｈ細胞でほとんど発現がなく、Ｂ細胞、単球などのＴ細胞以外の細胞で特異的に発現する遺伝子に相当する。例えばＴｈ細胞とＢ細胞の存在比等も、式３と同様にして求めることができる。
【００９１】
なお本願明細書の以下の記載において、Ｔｈ細胞で特異的に発現している遺伝子の発現量は、Ｔｈ細胞で特異的に発現している複数遺伝子由来の蛍光強度の平均値とする。同様に単球細胞で特異的に発現している遺伝子の発現量は単球細胞で特異的に発現している複数遺伝子由来の蛍光強度の平均値とし、Ｔｈ細胞と単球の両者で同程度発現する遺伝子の発現量は、Ｔｈ細胞と単球の両者で同程度発現する複数遺伝子由来の蛍光強度の平均値とする。
【００９２】
Ｔｈ１／Ｔｈ２をＤＮＡチップの測定結果より求める際、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞において発現量に差のある遺伝子でかつ、Ｔｈ細胞に特異的に発現する遺伝子のみを用いる方法が考えられる。Ｔｈ細胞に特異的に発現する遺伝子（ＵｎｉｇｅｎｅのＳｙｍｂｏｌ名）は例えば、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ８Ａ、ＣＴＬＡ４、ＭＩＣ２、ＳＥＭＡ４Ｄ、ＴＨＹ１、ＴＲＡ＠、ＴＲＢ＠などである。しかし、この範疇に該当する遺伝子数が少ないので、我々のデータ解析の結果、測定値のばらつきが比較的大きいことが分かった。そこで本実施例では以下、Ｔｈ１／Ｔｈ２を式４により求めることとした。
【００９３】
但し、ヒトゲノムのアノテーション作業が進むことで、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞において発現量に差のある遺伝子でかつ、Ｔｈ細胞に特異的に発現する遺伝子に該当する遺伝子数が、測定ばらつきを十分に低減できる程度、例えば５０から２００個まで増大することも将来予想される。その場合、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞において発現量に差のある遺伝子でかつ、Ｔｈ細胞に特異的に発現する遺伝子を用いることで十分な測定感度や再現性を達成することが考えられる。その際には式４−１と式４−２のみを用いればよい。以下、実験方法について記す。
尚、本願明細書の式１〜４は、表１〜９の全遺伝子を用いて計算した。
【００９４】
１．血液からのＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞の取得
健常人ボランティアから、ヘパリンコートされた注射針により５０ｍｌの全血を採取した。全血に、血清フリーのＲＰＭＩ１６４０培地（１％ペニシリン／ストレプトマイシン添加）５０ｍｌを加え希釈した。この希釈液を１０ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅの入った５０ｍｌ遠心チューブにいれ、室温下、８００ｇで３０分遠心分離した。界面の部分から、末梢血細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）を注意深く採取し、ＰＢＳ（Ｐｈｓｏｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ）で２度洗った。単球は、ゼラチンコート組織培養フラスコに付着させて取り除いた。ＰＢＭＣにＲＰＭＩ１６４０培地＋１０％ＦＣＳ＋５μｇ／ｍｌ　ＰＨＡを加えた。Ｔｈ１細胞の培養には、上記ＰＢＭＣ培地にＩＬ１２（１ｎｇ／ｍｌ）と抗ＩＬ４抗体（５００μｇを５０００倍希釈して０．１μｇ）を加え培養した。培地は３日ごとに交換した。またＴｈ２細胞の培養には、上記ＰＢＭＣ培地にＩＬ４（５０ｎｇ／ｍｌ）と抗ＩＬ１２抗体（５００μｇを５０００倍希釈して０．１μｇ）を加え培養した。培地は３日ごとに交換した。この培養条件では、細胞の約３分の２がＣＤ４＋、残りの３分の１がＣＤ８＋細胞であった。単球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞の混入はほとんどなかった。ＣＤ８＋細胞を除くために、抗ＣＤ８＋モノクローナル抗体を加え、４℃で３０分間インキュベートした。その後、未結合のモノクローナル抗体を取り除き、ヤギ抗マウスＦｃ特異的抗体が表面コートされた磁性ビーズと結合させた。ビーズ数と細胞数の比率は２５：１になるようにした。磁力を用いたビーズトラップにより、ＣＤ８＋細胞を除くことで、ＣＤ８＋の残留率は１％以下であった。こうして得られたＴｈ１細胞とＴｈ２細胞は、すぐに使用されるかもしくは、液体窒素中に凍結保存された。保存液組成は、９５％培地／５％ＤＭＳＯとした。
【００９５】
２．血液からの単球の取得
健常人ボランティアから、ヘパリンコートされた注射針により５０ｍｌの全血を採取した。全血に、血清フリーのＲＰＭＩ１６４０培地（１％ペニシリン／ストレプトマイシン添加）５０ｍｌを加え希釈した。この希釈液を１０ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅの入った５０ｍｌ遠心チューブにいれ、室温下、８００ｇで３０分遠心分離した。界面の部分から、ＰＢＭＣを注意深く採取し、ＰＢＳで２度洗った。その後、ＰＢＭＣはＲＰＭＩ６４０培地＋７．５％ＦＣＳ＋１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンを加え培養した。ＰＢＭＣを抗ＣＤ１４モノクローナル抗体で表面コートされた磁性ビーズと混合してインキュベートし、磁力を用いたビーズトラップにより分離した。この分離された単球を３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで３０分培養し、高純度の単球細胞を得た。ＣＤ１４を用いたポジティブ染色を行いフローサイトメトリー測定したところ、９９％以上が単球細胞であることが確認された。こうして得られた単球細胞は、すぐに使用されるかもしくは、液体窒素中に凍結保存された。保存液組成は、９０％培地／１０％ＤＭＳＯとした。
【００９６】
３．Ｔｈ細胞と単球からのトータルＲＮＡの取得とＲＮＡ混合液の作成
細胞からのトータルＲＮＡの取得は、ＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン社）を用いて行った。具体的には、Ｔｈ１、Ｔｈ２，単球それぞれ５×１０６個に対し、ＩＳＯＧＥＮ７５０ｍｌを加えた。この処理は、細胞膜を壊して内部の核酸を取り出すと共にフェノール抽出を行うことに相当する。４℃、１５０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離を行った後、上清部分をピペットで注意深くとり、新しいエッペンドルフチューブに移した。その後、クロロホルム抽出を２回、イソプロピル沈殿を１回、７０％エタノールでリンスを１回行った。エッペンドルフチューブ底に残ったＲＮＡを、ＴＥバッファーに溶かし、吸光計測を行いＲＮＡ濃度を測定した。ＯＤ２６０／ＯＤ２８０は、１．９から２．０であった。こうして得られたＴｈ１細胞由来のトータルＲＮＡとＴｈ２細胞由来のトータルＲＮＡを、ＲＮＡの重量比で、１：９、２：８、３：７、４：６，５：５、６：４，７：３、８：２、９：１となるように混合した。単球を加える場合は、白血球内におけるＴ細胞と単球の存在比率を考慮して両者のＲＮＡ重量比が、Ｔｈ１細胞もしくはＴｈ２細胞：単球＝５：４となるようにした。これはヒト血液１リットル当たりに含まれるＴ細胞数１×１０９の半分である５×１０８と、ヒト血液１リットル当たりに含まれる単球／マクロファージ数４×１０８の比率に相当する。
【００９７】
４．ＤＮＡアレイの作成
次に、
１．遺伝子配列ファイルの読み込み工程、
２．塩濃度・ハイブリダイゼーション等の実験条件の入力工程、
３．固定化すべきＤＮＡ断片の長さ範囲の入力工程、
４．固定化の候補とされた各ＤＮＡ断片の融解温度を計算し、その融解温度がある一定の範囲を外れているＤＮＡ断片を候補リストから除外する工程、
５．特異な高次構造をとる短配列や短繰り返し配列のあるＤＮＡ断片を候補リストから除外する工程、
６．Ａｌｕ配列などの反復配列とのホモロジーの高いＤＮＡ断片を候補リストから除外する工程、
７．他遺伝子配列とのホモロジーの高いＤＮＡ断片を候補リストから除外する工程等からなるアルゴリズムに従って、特異性が高く、Ｔｍが揃ったオリゴヌクレオチドプローブ７９３本を設計した。それら７９３種類のヒト遺伝子プローブと、３種類のヒトに存在しないオリゴヌクレオチド配列（ラムダＤＮＡ、ｐＵＣ１８プラスミドＤＮＡ、Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ）を校正用外部標準遺伝子として加えた７９６種類のオリゴヌクレオチドを以下に開示する方法でガラス基板上に固定化した。ガラス基板に固定化する際のＤＮＡ断片の配置は例えば図１のようにした。図１においては、Ｔｈ細胞に特異的に発現する遺伝子のプローブＤＮＡ（１２）、Ｔｈ細胞ではあまり発現がなく、Ｂ細胞、単球などのＴ細胞以外の細胞に特異的に発現する遺伝子のプローブＤＮＡ（１３）、Ｔｈ細胞とその他の細胞で同程度発現している遺伝子のプローブＤＮＡ（１４）、及びＴｈ１細胞とＴｈ２細胞において発現量に差のある遺伝子配列もしくはその相補配列鎖を有するＤＮＡ断片（プローブＤＮＡ）（１１）をそれぞれ区分けして固定化し、更に、
Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞において発現量に差のある遺伝子でありかつＴｈ１細胞での発現量がＴｈ２細胞での発現量より大きい遺伝子のプローブＤＮＡ（１１１）、及びＴｈ１細胞とＴｈ２細胞において発現量に差のある遺伝子でありかつＴｈ２細胞での発現量がＴｈ１細胞での発現量より大きい遺伝子のプローブＤＮＡ（１１２）を区分けして固定化してある。
【００９８】
プローブの固定化に先立ち、まず、市販のスライドガラス（Ｇｏｌｄ　Ｓｅａｌ　Ｂｒａｎｄ社製）をアルカリ溶液に室温で２時間浸した。その後、スライドガラスを蒸留水中に移し３回リンスしてアルカリ溶液を完全に除去した。続いて、洗浄したスライドガラスを１０％のポリ−Ｌ−リジン（シグマ社製）水溶液に１時間浸した後、スライドガラスを引き出しマイクロタイタープレート用遠心機を用いて１分間遠心してポリ−Ｌ−リジン水溶液を除去した。次に、スライドガラスを吸引式恒温機に入れ、４０℃で５分間乾燥させスライドガラス上にアミノ基を導入した。
【００９９】
一方、ＤＮＡ自動合成機を用いてオリゴヌクレオチドを合成した後、高速液体クロマトグラフィーでオリゴヌクレオチドを精製した。次に、合成・精製された濃度２μＭのオリゴヌクレオチド１μｌと添加剤等を混合してスポッティング溶液を作成した。調製されたスポッティング溶液をスポッタを用いてスライドガラス上の任意の点にスポッティングした。図２にＤＮＡチップの一般的な構造を示した。図２に示すように、支持体２４上に固定化されたＤＮＡプローブ２２に対して、蛍光標識された遺伝子２３が配列特異的にハイブリダイズし、結合した標識から発せられる蛍光を蛍光検出器２１によって検出する。
【０１００】
５．測定結果
図３にＴｈ１とＴｈ２細胞の二者のみ含むサンプルを測定してＴｈ１／Ｔｈ２を評価した例を、図４にＴｈ１及びＴｈ２細胞に単球細胞を加えたサンプルを測定して評価した例を示す。図３（Ａ）はＴｈ１細胞とＴｈ２細胞において発現量の異なる遺伝子のみを用いてＴｈ１／Ｔｈ２を評価した場合の結果である。図３（Ｂ）は式４（式４−１〜４−６）を用いて、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞において発現量に差のある遺伝子、Ｔｈ細胞に特異的に発現する遺伝子、Ｔｈ細胞ではあまり発現がなく、Ｂ細胞、単球などのＴ細胞以外の細胞に特異的に発現する遺伝子並びにＴｈ細胞とその他の細胞で同程度発現している遺伝子を用いた場合の結果である。図４（Ａ）と図４（Ｂ）についても、図３と同様である。また図３、図４それぞれのグラフは、横軸が測定値（Ｏｂｓｅｒｖｅｄ）、縦軸が期待値（Ｅｘｐｅｃｔｅｄ）を表す。期待値はＴｈ１細胞とＴｈ２細胞の混合比よりもとめたＴｈ１／Ｔｈ２（式１）を、測定値は遺伝子発現量よりもとめたＴｈ１／Ｔｈ２（式２）をそれぞれ示す。図３に示すようにＴｈ１とＴｈ２細胞の二者のみ含むサンプルでは、（Ａ）でも（Ｂ）でも、Ｔｈ１／Ｔｈ２をほぼ等しく測定できていることがわかる。この理由は、式４のα／（α＋１）がほぼ１になるためである。しかし、図４に示すように、サンプル中にＴｈ細胞以外の細胞、ここでは単球が存在することにより、図４（Ａ）では、Ｔｈ１／Ｔｈ２を正しく測定できず、かつ測定ばらつきも大きいことがわかる。この理由は、α／（α＋１）が１に等しくないためである。本例では、Ｔｈ１細胞もしくはＴｈ２細胞：単球＝５：４、すなわちα＝５／４であるため、α／（α＋１）＝０．５５５となる。この０．５５５を式４−５に代入して、別途得られているＴｈ１：Ｔｈ２が１：１のときの規格化パラメータβ＝０．９２を用いることで、図４（Ｂ）に示すように、ほぼ正しいＴｈ１／Ｔｈ２が測定できることがわかる。これは、単球由来の遺伝子発現の寄与を式４により補正しているためである。このように、Ｔｈ細胞のみを分離するという操作を行うことなく、Ｔｈ１／Ｔｈ２が測定できるので、本法により実験の簡略化、低コスト化、迅速化を達成できる。
【０１０１】
このように、本発明においては（イ）Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞とで発現量に差がある遺伝子のみならず、別途（ロ）Ｔｈ細胞で特異的に発現している遺伝子、（ハ）Ｔｈ細胞で発現していない遺伝子、（ニ）Ｔｈ細胞とその他の細胞で同程度発現している遺伝子の発現量変化を知ること、とくに（ロ）、（ハ）、（ニ）の値を用いて（イ）の値を補正したことにより、測定精度を向上させ本発明を完成するに至った。
【０１０２】
Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞は様々な免疫疾患に関係している。例えばＴｈ１細胞は慢性関節リュウマチ患者の関節液に有意に浸潤しており、Ｔｈ２細胞はアトピー性皮膚炎患者の皮膚に選択的に浸潤することが分かっている。アトピー性皮膚炎では、正常人に比較して血中にＣＣＲ４を発現するＴｈ２細胞の増加、ＣＸＣＲ３発現のＴｈ１細胞の減少が観察されている（村井と松島、細胞工学　Ｖｏｌ．１９、７０３−７０７、２０００）。その他、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランス異常と、喘息、エイズ、結核菌感染症、ライム病、インスリン依存性糖尿病、慢性関節リューマチ、多発性硬化症などとの関連性が深いことが指摘されている。Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスのコントロールによるこれらの疾患の予防や治療が期待されている。
【０１０３】
Ｔｈ１細胞で産出されるサイトカインは例えば、ＩＦＮガンマ、ＩＬ２など複数ある。そしてＴｈ２細胞で産出されるサイトカインも、例えば、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ９，ＩＬ１０，ＩＬ１３など複数ある。これら複数のサイトカインのうちもっともＴｈ１細胞とＴｈ２細胞の比率に忠実なのは、ＩＦＮガンマ：ＩＬ４の比率だといわれている。しかし、ＩＦＮガンマとＩＬ４の比率が正常な免疫疾患も少なくない。例えばアトピー皮膚炎と関わりの深いといわれているイデオパシックネフロティック症候群（Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ　Ｎｅｐｈｒｏｔｉｃ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）では、末梢血細胞中のＩＦＮガンマｍＲＮＡ：ＩＬ４ｍＲＮＡの比率は患者と健常人とで差がない。しかし、末梢血細胞中のＩＬ１３ｍＲＮＡの量が患者で有意に上昇している（Ｙａｐ，　Ｈ−Ｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｈ１　ａｎｄ　Ｔｈ２　ｃｙｔｏｋｉｎｅ　ｍＲＮＡ　ｐｒｏｆｉｌｅｓ　ｉｎ　ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ　ｎｅｐｈｒｏｔｉｃ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ：　Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ＩＬ−１４　ｍＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎｒｅｌａｐｓｅ，　Ｊ．　Ａｍ．　Ｓｏｃ．　Ｎｅｐｈｒｏｌ　１０，　５２９−５３７，　１９９９）。これはＴｈ１細胞数とＴｈ２細胞数にたとえ差がなくとも、Ｔｈ１細胞もしくはＴｈ２細胞のいずれかに異常があれば、産出されるサイトカイン量のバランスが崩れることを意味する。その点で、ＤＮＡマイクロアレイは、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスに関係する数多くの遺伝子を一度に見ることができるので、種々の免疫疾患に対応でき、かつ一回の診断に要する費用が少なくてすむのである。
【０１０４】
【発明の効果】
末梢血から抽出した白血球細胞由来ＲＮＡをそのまま用いて、補正をほどこすことにより、ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞のバランス（Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞の比率；Ｔｈ１／Ｔｈ２）を調べ、核酸サンプル中のＴｈ１細胞数／Ｔｈ２細胞数または患者及び健常者のＴｈ１／Ｔｈ２データと比較してアレルギーを解析する方法及びシステムを提供することができる。また、Ｔｈ１／Ｔｈ２を調べる上で不可欠な遺伝子群を特定することでアレイ上に載せるＤＮＡ断片（オリゴヌクレオチド）数を必要最小限とし、再現性・信頼性の高いアレルギー解析用アレイを用いた解析方法、解析システムを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】基板へのプローブＤＮＡ配置例を示す。
【図２】ＤＮＡチップの一般的な構造を示す。
【図３】Ｔｈ１とＴｈ２細胞の二者のみ含むサンプルを測定してＴｈ１／Ｔｈ２を評価した例を示す。
【図４】Ｔｈ１及びＴｈ２細胞に単球細胞を加えたサンプルを測定してＴｈ１／Ｔｈ２を評価した例を示す。
【図５】ＤＮＡチップ作成の概略図を示す。
【図６】ＤＮＡチップ作成のフローチャートを示す。
【図７】ＤＮＡチップデータ解析の概略図を示す。
【図８】ＤＮＡチップデータ解析のフローチャートを示す。
【図９】式４の計算式選択の方法を示すフローチャートを示す。
【符号の説明】
１．基板、２．プローブＤＮＡ固定化領域、
１１．Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞において発現量に差のある遺伝子配列もしくはその相補配列鎖を有するＤＮＡ断片（プローブＤＮＡ）の固定化領域、
１２．Ｔｈ細胞に特異的に発現する遺伝子のプローブＤＮＡ、
１３．Ｔｈ細胞ではあまり発現がなく、Ｂ細胞、単球などのＴ細胞以外の細胞に特異的に発現する遺伝子のプローブＤＮＡの固定化領域、
１４．Ｔｈ細胞とその他の細胞で同程度発現している遺伝子のプローブＤＮＡの固定化領域、
１１１．Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞において発現量に差のある遺伝子でありかつＴｈ１細胞での発現量がＴｈ２細胞での発現量より大きい遺伝子のプローブＤＮＡの固定化領域、
１１２．Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞において発現量に差のある遺伝子でありかつＴｈ２細胞での発現量がＴｈ１細胞での発現量より大きい遺伝子のプローブＤＮＡの固定化領域、
２１．蛍光検出器、２２．ＤＮＡプローブ、２３．蛍光標識された遺伝子、２４．支持体、
２５．公共データベース、２６．インハウスデータベース、２７．プローブ配列設計コンピュータ、２８．プローブ配列、２９．核酸合成装置、３０．オリゴヌクレオチドプローブセット、３１．スポッター、３２．スポッター制御コンピュータ、３３．チップ（作成途上）、３４．チップ（完成後）、
３５．蛍光標識サンプル、３６．チップ、３７．蛍光検出器、３８．蛍光検出器制御コンピュータ、３９．実験データ、４０．実験データ解析コンピュータ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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