(57)【要約】【課題】異常増殖等を引き起こした滑膜細胞のアポトーシスを誘導し、その異常な増殖を抑制しうる薬剤を提供する。【解決手段】下記式（１）又は（２）：【化１】2004168713.tif 000009〔式中、Ｒ１は酸素原子又はヒドロキシ基を示し、Ｒ２は水素原子又はヒドロキシ基を示す。〕で表されるジテルペン化合物を有効成分とする滑膜細胞のアポトーシス誘導剤。。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）又は（２）：
【化１】
2004168713.tif 000008
〔式中、Ｒ１は酸素原子又はヒドロキシ基を示し、Ｒ２は水素原子又はヒドロキシ基を示す。〕
で表されるジテルペン化合物を有効成分とする滑膜細胞のアポトーシス誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、滑膜細胞のアポトーシスを誘導する薬剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アポトーシスは、動物の形態形成や恒常性維持の過程において、不要となった細胞や害となる細胞を取り除く際に行われる、能動的な細胞死である。例えば、発生の過程において、手指は塊状に形成された手から、指間の細胞がアポトーシスを起こし、指が削り出されていくような過程で形成されることが確認されている。また、成人の小腸細胞は、約２週間で古い細胞がアポトーシスによって消滅し、新しい細胞と入れ替わるとされている。その他、ウイルスに感染した細胞等もアポトーシスを起こして、被害の拡大を防いでいると考えられている。
【０００３】
アポトーシスは、核クロマチンの凝集や断片化、細胞の小体化を伴う点で、形態学上においてもネクローシスと区別され、更に小体化した細胞は、最終的に食細胞により貪食され、細胞内の内容物が漏出することなく処理されるため、炎症を惹起しないという特徴を有しており、生体の恒常性を維持する点で有利に働いている。
【０００４】
このように、アポトーシスは固体の発生・成長及び生体の恒常性維持のために必須の機構であり、近年このアポトーシスの制御異常が増殖性皮膚疾患、慢性関節リウマチ、自己免疫疾患、ＨＩＶ感染症、肝炎、腎疾患等、様々な疾患の発生に深く関与していることが指摘されている。
例えば、関節リウマチでは、正常な関節滑膜が滑膜細胞の増殖とアポトーシスがバランスよく保たれ、関節の機能が維持されているのに対して、アポトーシスの調節機構が何らかの原因で破壊されて滑膜細胞が異常に増殖し、滑膜肥厚を形成し、これが肉芽組織（パンヌス）に成長して関節軟骨及び骨破壊を引き起こし、最終的には関節機能障害を招くことが明らかにされている（非特許文献１、非特許文献２参照）。
従って、滑膜細胞にアポトーシスを誘導し、その異常な増殖を抑制する薬剤が関節リウマチ等の治療薬として有用であり、その開発が期待される。
【０００５】
一方、トリプトライドは、ニシキギ科に属するつる植物の雷公藤（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ  Ｈｏｏｋ．  ｆ．）等に含まれるジテルペントリエポキシドの１種であり、これまでに、抗喘息作用（非特許文献３参照）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）産生抑制作用（非特許文献４参照）、動脈硬化予防作用（特許文献１参照）を有すること、更には癌細胞や白血病細胞に対してアポトーシスを誘導することが報告されている（非特許文献５，  非特許文献６参照）。
しかしながら、トリプトライドが滑膜細胞に対してアポトーシスを誘導することはこれまでに知られていない。
【０００６】
【特許文献１】
特開平１１−３０２１７１号公報
【非特許文献１】
Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ３７（６），  ７８３−７８９（１９９４）
【非特許文献２】
Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４０（４），  ２７５−２８４（２００１）
【非特許文献３】
Ｚｈｏｎｇｈｕａ  Ｊｉｅ  Ｈｅ  Ｈｅ  Ｈｕ  Ｘｉ  Ｚａ  Ｚｈｉ  ２０，  ２９１−２９３  （１９９７）
【非特許文献４】
Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｉｎ  ２２，  ６５１−６５６  （２００１）
【非特許文献５】
Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４，  １３４５１−１３４５５  （１９９９），  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｌｅｔｔ  １２２，  ８１−８７（２００１）
【非特許文献６】
Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６，  ２２２１−２２２７  （２００１）
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、異常増殖等を引き起こした滑膜細胞のアポトーシスを誘導し、その異常な増殖を抑制しうる薬剤を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決すべく、ニシキギ科植物の成分について鋭意研究を行った結果、下記式（１）又は（２）で表されるジテルペン化合物に、滑膜細胞のアポトーシスを誘導し、その増殖を強力に抑制する作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、下記式（１）又は（２）：
【００１０】
【化２】
2004168713.tif 000002
【００１１】
〔式中、Ｒ１は酸素原子又はヒドロキシ基を示し、Ｒ２は水素原子又はヒドロキシ基を示す。〕
で表されるジテルペン化合物を有効成分とする滑膜細胞のアポトーシス誘導剤を提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明のジテルペン化合物は、式（１）で示されるトリプトライド誘導体又は式（２）で示されるトリプトフェノライド誘導体である。
式（１）で示されるトリプトライド誘導体としては、トリプトライド（ｔｒｉｐｔｏｌｉｄｅ；Ｒ１：−ＯＨ、Ｒ２：Ｈ）、トリプディオライド（ｔｒｉｐｄｉｏｌｉｄｅ；Ｒ１：−ＯＨ、Ｒ２：−ＯＨ）、トリプトナイド（ｔｒｉｐｔｏｎｉｄｅ；Ｒ１：＝Ｏ、Ｒ２：Ｈ）等が挙げられ、式（２）で示されるトリプトフェノライド誘導体としては、例えばトリプトフェノライド（ｔｒｉｐｔｏｐｈｅｎｏｌｉｄｅ；Ｒ１：−ＯＨ、Ｒ２：Ｈ）が挙げられる。
【００１３】
【化３】
2004168713.tif 000003
【００１４】
上記ジテルペン化合物には、例えばナトリウム、カリウム塩等のアルカリ金属類が付加して、薬理学的に許容される塩を形成することができ、斯かる塩もまた本発明に包含される。
また、本発明のジテルペン化合物には、例えば酢酸、プロピオン酸、乳酸、酪酸等の低級脂肪酸類が付加して、薬理学的に許容されるエステルを形成することができ、斯かるエステル体もまた本発明に包含される。
【００１５】
本発明のジテルペン化合物は、いずれも公知化合物であり、ニシキギ科植物の雷公藤、昆明山海棠、東北雷公藤、蒼山雷公藤等の根、葉、花等から抽出すること、Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ  ６５，  ２２０８−２２１７  （２０００）に記載の合成法若しくはそれに準ずる方法又は半合成法等によって化学合成することにより得ることができる。
【００１６】
植物から本発明のジテルペン化合物を取得する方法は、特に限定されず公知の方法に従って行えばよく、例えば植物の根、葉、花部を水、メタノール、エタノール等の低級アルコール又はアセトンのような水溶性有機溶媒で、室温又は加熱する方法、水とこれらの水溶性有機溶媒との混合物により抽出する方法、更にクロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エステル類、トルエン、炭酸ガスによる超臨界流体等の疎水性有機溶媒とメタノール等の水溶性有機溶媒の混合物により抽出する方法が使用できるが、特に、根、葉を裁断又は粉砕し、エタノール等の低級アルコールで抽出するのが好ましい。そして、得られた抽出物をそのまま或いは濃縮、必要に応じてカラムカラムクロマト等を用いて分画・精製することにより、本発明のジテルペン化合物を単離することができる。
【００１７】
かくして得られる本発明のジテルペン化合物は、後記実施例に示すように、関節リウマチ患者の滑膜細胞に対してアポトーシスを誘導すると共にその異常な増殖を抑制する作用を有する。
【００１８】
本発明のジテルペン化合物は、そのままでも投与することができるが、効果を低減させない範囲内で、分散補助剤、賦形剤等の通常製剤化に使用されるような担体と混合し、粉剤、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、トローチ剤、リモナーデ剤等の経口剤又は注射剤等の剤形で使用することができる。
【００１９】
このような担体としては、例えば、マンニトール、乳糖、デキストラン等の水溶性の単糖類ないしオリゴ糖類もしくは多糖類；例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース等のゲル形成性又は水溶性のセルロース類；例えば結晶性セルロース、α−セルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、及びそれらの誘導体等の水吸収性でかつ水難溶性のセルロース類；例えばヒドロキシプロピル澱粉、カルボキシメチル澱粉、架橋澱粉、アミロース、アミロペクチン、ペクチン及びそれらの誘導体等の水吸収性でかつ水難溶性の多糖類；例えばアラビアガム、トラガントガム、グリコマンナン及びそれらの誘導体等の水吸収性でかつ水難溶性のガム類；例えばポリビニルピロリドン、架橋ポリアクリル酸及びその塩、架橋ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシエチルメタクリレート及びそれらの誘導体等の架橋ビニル重合体類；リン脂質、コレステロール等のリポソーム等分子集合体を形成する脂質類糖を挙げることができる。
【００２０】
本発明アポトーシス誘導剤の投与量は、患者の症状等に合わせて適宜調整すれば良いが、例えば固形物量にして１〜１００ｍｇ／日、好ましくは１０〜１００ｍｇ／日、特に１０ｍｇ／日投与するのが好ましい。
【００２１】
【実施例】
次に本発明を実施例を挙げて更に詳細に説明するが、これらは単に例示であって本発明を限定するものではない。
【００２２】
実施例１  細胞に対するアポトーシス誘導作用：ＤＮＡ断片化試験
細胞に対するトリプトライドのアポトーシス誘導作用をＤＮＡの断片化を指標に確認した。尚、トリプトライドは、ＢＩＯＭＯＬ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  ５１００Ｃａｍｐｕｓ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｐｌｖｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，  ＰＡ  １９４６２−１１３２，  ＵＳＡより購入した「Ｔｒｉｐｔｏｌｉｄｅ」を用いた（実施例２〜５についても同様）。
細胞は、アメリカリウマチ学会の診断基準をもとに関節リウマチと診断された患者の人工膝関節置換術時に、無菌的に採取された滑膜組織より分離した。なお、関節リウマチ滑膜組織は、患者の同意を得た上で本実施例に使用した。組織分散用酵素溶液Ｄｉｓｐｅｒｓｏｌ（免疫生物研究所）を使用して単離した細胞を１０％  ＦＢＳ、１００  Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有したＲＰＭＩ１６４０培地（１０％  ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０）に懸濁してフラスコに移し、５％  ＣＯ２、３７℃条件下で培養後、フラスコ底面に付着した細胞を滑膜細胞とし、１〜２回継代した細胞を使用した。
【００２３】
細胞を１０％  ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０に懸濁し、９６ウェルマイクロプレートに播種して５％  ＣＯ２、３７℃条件下で培養した（２×１０４  ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌ）。２４時間後、培地を除去し、トリプトライド（ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解）を添加した１％  ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０を２００μｌ加え、５％  ＣＯ２、３７℃条件下で２４時間培養した。培養後、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡＰＬＵＳ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して細胞内のＤＮＡ断片量を測定した。ＤＮＡ断片化誘導率（％）は、上記の操作を３回繰り返して得たＤＮＡ断片量の平均値から、トリプトライドの代わりにＤＭＳＯを用いて同様の処理を行った場合のＤＮＡ断片量を１００％として算出した。各濃度におけるＤＮＡ断片化誘導率を表１に示す。
【００２４】
【表１】
2004168713.tif 000004
【００２５】
表１に示すように、トリプトライドに濃度依存的なＤＮＡ断片化誘導作用、すなわちアポトーシス誘導作用が認められた。
【００２６】
実施例２  細胞に対するアポトーシス誘導作用：ＴＵＮＥＬ染色法
細胞に対するトリプトライドのアポトーシス誘導作用をｔｅｒｍｉｎａｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄＵＴＰ  ｎｉｃｋ  ｅｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ（ＴＵＮＥＬ）染色法により確認した。
実施例１にて調製した細胞を１％  ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０に懸濁し、８ウェルチャンバースライドに播種して５％  ＣＯ２、３７℃条件下で培養した（６  ×  １０４  ｃｅｌｌｓ／３００μｌ／ｗｅｌｌ）。４時間後、トリプトライド（０．１μＭ）を溶解した１％  ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０  ３００μｌをさらに加え、５％  ＣＯ２、３７℃条件下で２４時間培養した。培養後、Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｗｏｋｏ）を使用して細胞にＴＵＮＥＬ染色を施した。対比染色ではメチルグリーン染色を施した。図１は、ＤＭＳＯ処理した細胞（ａ）及びトリプトライド処理した細胞（ｂ）にＴＵＮＥＬ染色を施した後の顕微鏡写真である。
【００２７】
図１に示すように、ＤＭＳＯで処理した細胞ではＴＵＮＥＬ陽性作用は観察されなかった。一方、トリプトライドで処理した細胞にはＴＵＮＥＬ陽性細胞が観察され（矢印）、トリプトライドが細胞に対してアポトーシスを誘導することが確認された。
【００２８】
実施例３  細胞の生存率に及ぼす作用
実施例１にて調製した細胞を１％  ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０に懸濁し、９６ウェルマイクロプレートに播種して５％  ＣＯ２、３７℃条件下で培養した（２  ×  １０４  ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌ）。４時間後、トリプトライド（ＤＭＳＯに溶解）を添加した１％  ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０  １００μｌを加え、５％  ＣＯ２、３７℃条件下で２４時間培養した。培養後、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＷＳＴ−１）（和光純薬）を使用して生細胞数を測定した。細胞生存率（％）は、上記の操作を３回繰り返して得た測定値から、トリプトライドの代わりにＤＭＳＯを用いて同様の処理を行った場合の測定値を１００％として算出した。各濃度における細胞生存率を表２に示す。
【００２９】
【表２】
2004168713.tif 000005
【００３０】
表２に示すように、トリプトライドは濃度依存的に細胞に細胞死を誘導した。この結果は、トリプトライドがアポトーシスを介して細胞に細胞死を誘導することを示唆するものである。
【００３１】
実施例４  細胞の増殖に対する作用
実施例１にて調製した細胞を１％  ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０に懸濁し、９６ウェルマイクロプレートに播種して５％  ＣＯ２、３７℃条件下で４時間培養した（１  ×  １０４  ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌ）。その後、トリプトライド（ＤＭＳＯに溶解）を添加した１％  ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０を５０μｌ加え、５％  ＣＯ２、３７℃条件下で２４時間培養した。さらに、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）（最終濃度１０μＭ）溶液を１５μｌ加えて１６〜１８時間培養した。培養後、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ，  ＢｒｄＵ（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）（Ｒｏｃｈｅ）を使用して細胞に取り込まれたＢｒｄＵ量を測定した。細胞増殖率（％）は、上記の操作を３回繰り返して得た測定値から、トリプトライドの代わりにＤＭＳＯを用いて同様の処理を行った場合の測定値を１００％として算出した。各濃度における細胞増殖率を表３に示す。
【００３２】
【表３】
2004168713.tif 000006
【００３３】
表３に示すように、トリプトライドは濃度依存的に細胞の増殖を抑制した。この結果は、トリプトライドがアポトーシスを介して細胞に細胞死を誘導し、その増殖を抑制することを示唆するものである。
【００３４】
実施例５
以下に示す成分を混和して、その混和物を打錠した。
【００３５】
【表４】
2004168713.tif 000007
【００３６】
【発明の効果】
本発明のアポトーシス誘導剤は、異常増殖した滑膜細胞にアポトーシスを誘導し、その増殖を強力に抑制することから、当該滑膜細胞の異常増殖が関与する疾患、例えば慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎（ｐｓｏｒｉａｔｉｃ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）等の予防又は治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例２において、ＤＭＳＯ処理した細胞及びトリプトライド処理した細胞にＴＵＮＥＬ染色を施した後の顕微鏡写真である。
【図１】
2004168713.tif 000010