(57)【要約】　　　（修正有）【課題】膜透過し易く、融合蛋白質として調製することが可能であり、かつ感度が高い蛍光物質のスクリーニング方法、及び蛍光標識体の製造方法を提供する。【解決手段】（１）希土類元素イオンとキレートを形成する際のリガンドとなり得るペプチドをコードする遺伝子分子集団を、（２）１〜数１０遺伝子分子毎に分割して互いに隔てられた容器内でＰＣＲを行って増幅させ、（３）次いで、それぞれの容器内容物を分割し、分割された一部を残し、（４）他部を収容した容器内で無細胞蛋白合成を行い、希土類元素イオンを添加した後、容器内容物の蛍光を測定し、蛍光強度のより大きい容器内容物を選択し、（５）次いで、上記選択された容器内容物の無細胞蛋白合成前の容器内容物を上記工程（３）の分割物から選び、遺伝子の塩基配列解析を行い、（６）遺伝子が１種類になるまで上記工程（２）〜（５）を繰り返すことを特徴とする蛍光物質のスクリーニング方法。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）希土類元素イオンとキレートを形成する際のリガンドとなり得るアミノ酸部分を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするアミノ酸コドン部分、転写プロモーター部分、リボゾーム結合部位、開始コドン、停止コドン及び転写ターミネーター部分を分子内に含有してなる遺伝子分子が、少なくとも１個は含まれる遺伝子分子集団を、
（２）１〜数１０遺伝子分子毎に分割して互いに隔てられた容器内に収容してＰＣＲを行って増幅させ、
（３）次いで、それぞれの容器内容物を分割し、分割された一部を残し、
（４）他部を収容した容器内でｍＲＮＡへの転写と蛋白質への翻訳を行う無細胞蛋白質合成を行い、次いで、
蛋白質合成後のそれぞれの容器内に希土類元素イオンを添加した後、もしくは、希土類元素イオンを含む別の容器に蛋白質合成後の各溶液を別々に添加した後、
容器内容物の蛍光を測定し、蛍光強度のより大きい容器内容物を選択し、
（５）次いで、上記選択された容器内容物の無細胞蛋白質合成前の容器内容物を上記工程（３）の分割物から選び、選ばれた分割物の遺伝子の塩基配列解析を行い、
（６）遺伝子の種類が１種類以上含まれていた場合は、遺伝子の種類が１種類になるまで上記工程（２）〜（５）を繰り返すことを特徴とする蛍光物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
請求項１のスクリーニング方法によって得られた蛍光物質の蛋白質もしくはペプチド部分を、標識しようとする蛋白質との融合蛋白質として合成し、次いで、希土類元素イオンを添加することを特徴とする蛍光標識体の製造方法。
【請求項３】
請求項１のスクリーニング方法によって得られた蛍光物質の蛋白質もしくはペプチド部分を合成し、次いで、希土類元素イオンとのキレートを形成させ、次いで、標識しようとする物質と化学反応させることを特徴とする蛍光標識体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光を発するマーカーとして使用可能な蛍光物質のスクリーニング方法、及び蛍光標識体の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内で、遺伝子もしくは蛋白質などの生体分子の動態を調べる場合、又は、生体分子間の相互作用を調べる場合によく使われるマーカーとして蛍光物質がある。このような蛍光物質として、従来、ローダミン、フルオレセイン、Ｃｙ５、Ｃｙ３などの有機系化合物、ユーロピウム、テルビウムなどの希土類元素をガラスに含有させた希土類ガラス、Ｅｕ２　Ｏ３　／Ｙ２　Ｏ３　粒子などの無機化合物がある。また、最近では、希土類元素イオンをＮ、ＣＯＯ−　などのリガンドでキレートした希土類錯体（Ｙｕａｎ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，（１９９８）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７０，５９６−６０１；Ｙｕａｎ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７３，１８６９−１８７６）、粒子状のＣｄＳｅ−ＺｎＳ半導体微粒子などが知られている。
【０００３】
また、オワンクラゲ由来蛋白質で蛍光を発する、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）やその変異体であるＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＢＦＰ（Ｂｌｕｅ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＹＦＰ（Ｙｅｌｌｏｗ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＲＦＰ（Ｒｅｄ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）は、遺伝子工学的手法を用いて、蛍光を発するＧＦＰなどの遺伝子と種々の蛋白質の遺伝子とを連結させて、蛍光を発するＧＦＰなどの蛋白質と種々の蛋白質との融合蛋白質として発現させることにより、蛋白質の蛍光マーカーとして汎用されている。
【０００４】
しかしながら、有機系化合物は蛍光寿命が短く、生体分子の動態や相互作用を観測中に消光しやすいという欠点がある。また、生体分子との結合は化学的な結合であり、結合反応時の生体分子の変性、副産物の生成、精製の煩雑さ、などの問題点もある。また希土類ガラスは蛍光の消光は少ないものの、ガラス中に希土類元素を含有させる製造方法が煩雑であり、また微小な粒子にすることが難しいため、生体分子に１：１で付加させるような使い方はできない、という問題もある。また、希土類錯体やＣｄＳｅ−ＺｎＳ半導体微粒子は、蛍光ピークがシャープで寿命が長く感度が高いが、生体分子との結合は化学結合が多く、ラベル時の生体分子の変性や精製の煩雑さの問題が依然としてある。また、Ｅｕ２　Ｏ３　／Ｙ２　Ｏ３　粒子も同様の問題がある。
【０００５】
ＧＦＰ及びその変異体は自然界に存在する蛋白質やその一部のアミノ酸を改変させた蛋白質である。ＧＦＰ及びその変異体は融合蛋白質として発現させるだけでラベルできる利便性があり、種々の蛍光波長を持つ変異体同士を組み合わせることにより、ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）を用いた検出系をつくることも可能である。しかしながら、分子量が約２８ｋＤａであるため、生体中での膜透過ができない場合があるという問題がある。従来、アミノ酸の数が少なく、分子量の小さいペプチド性の物質で、蛍光を発する物質は今までに報告されていない。そこで、膜透過し易く、ＧＦＰと同様に融合蛋白質として調製することが可能であり、かつ感度が高い蛍光物質が望まれている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記の問題に鑑みてなされたものであり、膜透過し易く、融合蛋白質として調製することが可能であり、かつ感度が高い蛍光物質のスクリーニング方法、及び蛍光標識体の製造方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の蛍光物質のスクリーニング方法は、
（１）希土類元素イオンとキレートを形成する際のリガンドとなり得るアミノ酸部分を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするアミノ酸コドン部分、転写プロモーター部分、リボゾーム結合部位、開始コドン、停止コドン及び転写ターミネーター部分を分子内に含有してなる遺伝子分子が、少なくとも１個は含まれる遺伝子分子集団を、
（２）１〜数１０遺伝子分子毎に分割して互いに隔てられた容器内に収容してＰＣＲを行って増幅させ、
（３）次いで、それぞれの容器内容物を分割し、分割された一部を残し、
（４）他部を収容した容器内でｍＲＮＡへの転写と蛋白質への翻訳を行う無細胞蛋白質合成を行い、次いで、
蛋白質合成後のそれぞれの容器内に希土類元素イオンを添加した後、もしくは、希土類元素イオンを含む別の容器に蛋白質合成後の各溶液を別々に添加した後、
容器内容物の蛍光を測定し、蛍光強度のより大きい容器内容物を選択し、
（５）次いで、上記選択された容器内容物の無細胞蛋白質合成前の容器内容物を上記工程（３）の分割物から選び、選ばれた分割物の遺伝子の塩基配列解析を行い、
（６）遺伝子の種類が１種類以上含まれていた場合は、遺伝子の種類が１種類になるまで上記工程（２）〜（５）を繰り返すことを特徴とする。
【０００８】
以下、本発明の蛍光物質のスクリーニング方法について詳述する。
本発明のスクリーニング方法で得ようとする蛍光物質は、ペプチドと希土類元素イオンとからなるキレート化合物である。この蛍光物質は蛋白性の蛍光物質の利点と、希土類錯体蛍光物質の利点を併せ持つと考えられる。
【０００９】
従来の希土類錯体蛍光物質は、希土類元素イオンをＮやＣＯＯ−　などのリガンドでキレートしたものであるが、このリガンド部分のＮやＣＯＯ−　は、アミノ酸のヒスチジンや、グルタミン酸、アスパラギン酸に置き換えることが可能である。また紫外部の吸収が大きいトリプトファン、チロシンなどのアミノ酸を導入することも蛍光強度を上げるためには有効である。このようなペプチド性のリガンドと希土類元素イオンとからなるキレート化合物において、ペプチド部分を構成するアミノ酸の数がある程度少なく、かつ大きな蛍光を有するものを得ることができれば、融合蛋白質として調製でき、感度が高い蛍光物質を製造することができる。
【００１０】
しかしながら、アミノ酸の数がある程度少ないペプチドと言っても、その組み合わせは膨大である。そこで、本発明のスクリーニング方法を用いると、上記目的の蛍光物質をスクリーニングすることができる。
【００１１】
本発明の蛍光物質のスクリーニング方法は、（１）希土類元素イオンとキレートを形成する際のリガンドとなり得るアミノ酸部分を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするアミノ酸コドン部分、転写プロモーター部分、リボゾーム結合部位、開始コドン、停止コドン及び転写ターミネーター部分を分子内に含有してなる遺伝子分子が、少なくとも１個は含まれる遺伝子分子集団を、まず用意する。
【００１２】
上記のアミノ酸コドン部分は、ランダムな塩基配列を持つ遺伝子とすることができる。しかしながら、ペプチドに翻訳後、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はシステインなどのリガンドになり得るアミノ酸や蛍光強度を上げるトリプトファンやチロシンなどのアミノ酸があることが望ましい。また希土類元素イオンとの間でキレートを形成する際に、水分子があると蛍光強度が弱まるので場合によっては疎水性のアミノ酸があることが望ましい。また、例えば、２つのシステインを入れて、Ｓ−Ｓ結合を作るようにする等のように、ペプチドの構造を保つアミノ酸があってもよい。
【００１３】
また、希土類元素イオンとの間でキレートを形成する際に、リガンドとして機能するアミノ酸コドンの中の特定の配列に対して変異が起きやすい組成でＰＣＲを行い、人為的に遺伝子に変異を起こさせるｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ　ＰＣＲなど変異が入り易いＰＣＲを行なった後に、転写プロモーター部分、リボゾーム結合部位、開始コドン、停止コドン、転写ターミネーター部分を付加した遺伝子集団や、ディジェネレート　プライマー（ｄｅｇｅｎａｒａｔｅ　ｐｒｉｍｅｒ；塩基配列が縮重したプライマー）を用いてＰＣＲを行なった後に、転写プロモーター部分、リボゾーム結合部位、開始コドン、停止コドン、転写ターミネーター部分を付加した遺伝子集団を用いることもできる。
【００１４】
リガンドとなるアミノ酸部分の数は任意であるが、希土類元素イオンのリガンドとなるためには４個以上が望ましく、また生体膜透過性をよくするため分子量をあまり大きくしたくないことから２００個程度までが望ましい。
【００１５】
また、翻訳される部分をリガンドとなるアミノ酸とｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　Ｆｖ；一本鎖Ｆｖタンパク質）との融合配列としてもよい。このようにすると、ｓｃＦｖはそれのみで抗体の機能をある程度有するので、それが希土類元素イオンとキレートを形成するアミノ酸との融合蛋白になると（すなわち、蛍光マーカーが付くと）抗原抗体反応の検出に都合が良くなる。
【００１６】
また、翻訳される部分をリガンドとなるアミノ酸とラベルしたい蛋白質との融合配列としてもよい。この場合は、翻訳後、リガンド部分との融合蛋白が合成できる。
【００１７】
次に、上記の遺伝子分子集団を、（２）１〜数１０遺伝子分子毎に分割して互いに隔てられた容器内に収容してＰＣＲを行って増幅させる。上記の分割は、例えば、紫外部の吸収を指標にして、適当な溶液で希釈することにより行なうことができる。上記の互いに隔てられた容器内に収容する方法としては、例えば、９６穴プレートの各ウェルに分注する方法が挙げられる。上記のＰＣＲは、通常の方法でよく、プライマー、緩衝液、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼを添加して行う方法でよい。なお、この時のＤＮＡポリメラーゼはできるだけ忠実度の高いものを用いることが好ましい。
【００１８】
上記（２）の工程を行った後には、互いに隔てられた容器内の各々において、遺伝子が増幅しており、１容器内（１ウェル内）には増幅した１〜数十種類の遺伝子が存在している。次に、（３）ＰＣＲを行って増幅させた、それぞれの容器内容物を分割し、分割された一部を残しておく。分割された一部を残しておく方法としては、例えば、９６穴プレートの各ウェルに分注しておく方法が挙げられる。
【００１９】
次に、（４）（上記の一部を分割した後の）他部を収容した容器内でｍＲＮＡへの転写と蛋白質への翻訳を行う無細胞蛋白質合成を行い、次いで、蛋白質合成後のそれぞれの容器内に希土類元素イオンを添加した後、もしくは、希土類元素イオンを含む別の容器に蛋白質合成後の各溶液を別々に添加した後、容器内容物の蛍光を測定し、蛍光強度のより大きい容器内容物を選択する。
【００２０】
上記の無細胞蛋白質合成系としては、例えば、大腸菌抽出物、小麦胚芽抽出物、ウサギ網状赤血球などの系が知られているが、いずれも好適に用いられる。また、汎用されている市販のキット（例えば、ロシュ・ダイアグノスティックス社製、東洋紡社製など）を用いてもよいし、自家製抽出物を用いてもよい。
【００２１】
上記希土類元素イオンにおける、希土類元素とは、原子番号２１のスカンジウム、原子番号３９のイットリウム、原子番号５７〜７１のランタン系列の元素のことを指すが、ユウロピウム、テルビウム、サマリウム、ジスプロシウムなどがキレートとした際に、強い蛍光を発するので好ましい。
【００２２】
次に、（５）上記選択された容器内容物の無細胞蛋白質合成前の容器内容物を上記工程（３）の分割物から選び、選ばれた分割物の遺伝子の塩基配列解析を行う。
【００２３】
次に、（６）（上記工程（５）の塩基配列解析により）遺伝子の種類が１種類以上含まれていた場合は、遺伝子の種類が１種類になるまで上記工程（２）〜（５）を繰り返す。
なお、遺伝子の種類が１種類以上含まれている場合は、上記塩基配列解析データのピークが複数重なっているので判定できる。遺伝子の種類が１種類となっていれば、その遺伝子が目的の蛍光物質の蛋白質部分をコードする遺伝子であり、得られたペプチドと希土類元素イオンとからなるキレート化合物が目的の蛍光物質である。
【００２４】
次に、本発明の請求項２記載の蛍光標識体の製造方法は、請求項１のスクリーニング方法によって得られた蛍光物質の蛋白質もしくはペプチド部分を、標識しようとする蛋白質との融合蛋白質として合成し、次いで、希土類元素イオンを添加することを特徴とする。
【００２５】
上記の、蛍光物質の蛋白質もしくはペプチド部分を、標識しようとする蛋白質との融合蛋白質として合成する方法は、無細胞蛋白質合成、すなわちｉｎ　ｖｉｔｒｏの方法でもよいし、大腸菌や酵母などの宿主を用いたｉｎ　ｖｉｖｏの方法でもよい。また、化学的なペプチド合成法でもよい。合成後の融合蛋白質を定法により精製後、希土類元素イオンを含む溶液を添加し、必要であれば透析等で余分な希土類元素イオンを除去して、蛍光標識体を得る。上記希土類元素イオンとしては前述のものと同様である。
【００２６】
また、本発明の請求項３記載の蛍光標識体の製造方法は、請求項１のスクリーニング方法によって得られた蛍光物質の蛋白質もしくはペプチド部分を合成し、次いで、希土類元素イオンとのキレートを形成させ、次いで、標識しようとする物質と化学反応させることを特徴とする。
【００２７】
上記の、蛍光物質の蛋白質もしくはペプチド部分を合成する方法は、無細胞蛋白質合成、すなわちｉｎ　ｖｉｔｒｏの方法でもよいし、大腸菌や酵母などの宿主を用いたｉｎ　ｖｉｖｏの方法でもよい。また、化学的なペプチド合成法でもよい。合成後の蛋白質もしくはペプチド部分を定法により精製後、希土類元素イオンを含む溶液を添加し、希土類元素イオンとのキレートを形成させ、次いで、標識しようとする物質と化学反応させて、蛍光標識体を得る。上記希土類元素イオンとしては前述のものと同様である。また、標識しようとする物質としては、特に限定されず、例えば、蛋白質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖類、薬物等の低分子化合物、などが挙げられる。
【００２８】
【発明の実施の形態】
本発明をさらに詳しく説明するため以下に実施例を挙げるが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００２９】
（実施例１）
金属結合蛋白質の金属結合モチーフを参考にして、配列番号１に示される塩基配列を持つアミノ酸コドン部分を合成し、Ｉｂａ，Ｙ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ１９４，３５−４６（１９９７）に記載されたニワトリ卵白リゾチームｓｃＦｖの遺伝子の３’末端との融合配列をＰＣＲ法により得た。得られた融合配列を配列番号２に示した。配列番号２の７０９〜７４４番目の塩基部分について、いくつかのディジェネレート　プライマー（ｄｅｇｅｎａｒａｔｅ　ｐｒｉｍｅｒ）を用いて、定法に従い、プライマー、緩衝液、ｄＮＴＰ（宝酒造社製）及びＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を添加し、ＰＣＲを行なった後、転写プロモーター部分、リボゾーム結合部位、開始コドン、停止コドン、転写ターミネーター部分のオリゴマーを付加して、遺伝子分子集団を作製した。次いで、１ウェル当たり約１分子になるように遺伝子分子集団を希釈し、９６穴プレート５枚分に分注し、プライマー、緩衝液、ｄＮＴＰ（宝酒造社製）、ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を添加しＰＣＲを行なった。
【００３０】
次いで、各ウェル内の内容物の一部を別の９６穴プレートの各ウェルに取り分けた後、残ったウェル内容物について、大腸菌抽出物の無細胞蛋白質合成系（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて、各ウェル内遺伝子の転写、翻訳を３０℃、１２０ｒｐｍの条件で行い、ペプチドを合成した。次いで、合成されたペプチドが入っている各ウェル内の溶液２００μｌに１ｍＭ塩化テルビウム水溶液を各１μｌ添加し、ウェル毎に蛍光強度を測定した。種々のＥｘｃｉｔａｔｉｏｎ／ｅｍｉｓｓｉｏｎのペアで蛍光強度を測定したところ、４８０個のウェル中、２個のウェルで５５０ｎｍに大きな蛍光が観測された。
【００３１】
上記の大きな蛍光が観測されたウェル内容物の無細胞蛋白質合成前の内容物に相当するものを、上記の取り分けておいた９６穴プレートのウェルから取り出し、その一部を用いて遺伝子の塩基配列解析を行なったところ、２個ともデータのピークが複数重なっていたので、各々それを再度希釈し、遺伝子の種類が１種類になるまでＰＣＲ、無細胞蛋白合成、塩化テルビウム添加、蛍光測定を繰り返し、それぞれ最後に１種類の遺伝子から翻訳されたペプチドとテルビウムイオンからなるキレート物質である蛍光物質が得られた。
【００３２】
（比較例１）
配列番号２に示される融合配列に、転写プロモーター部分、リボゾーム結合部位、開始コドン、停止コドン、転写ターミネーター部分のオリゴマーを付加して得られた遺伝子を、遺伝子濃度が実施例１における最後のＰＣＲと同程度になるまでＰＣＲを行い、次いで、大腸菌抽出物の無細胞蛋白質合成系を用いて、遺伝子の転写、翻訳を行い、ペプチドを合成した。得られたペプチドが入っている溶液２００μｌに１ｍＭ塩化テルビウム水溶液を１μｌ添加し、蛍光強度を測定した。種々のＥｘｃｉｔａｔｉｏｎ／ｅｍｉｓｓｉｏｎのペアで蛍光強度を測定したが、大きな蛍光は観測されなかった。
【００３３】
【発明の効果】
本発明の蛍光物質のスクリーニング方法によると、膜透過し易く、融合蛋白質として調製することが可能であり、かつ感度が高い蛍光物質をスクリーニングできる。本発明の蛍光標識体の製造方法によると、膜透過し易く、かつ感度が高い蛍光標識体を容易に製造できる。
【００３４】
【配列表】
2004041081.tif 000002
2004041081.tif 000003