(57)【要約】【課題】複数の核酸関連物質が基板上にマトリクス状に配置された核酸チップのプローブを、飛行時間型２次イオン質量分析法により分析する際、高い定量性を達成可能な核酸チップの分析方法と、かかる分析方法を利用することで、核酸チップ上に配置される核酸プローブ・ドットに存在する核酸量のを簡便に決定することが可能な形態とされた核酸チップを提供する。【解決手段】チップ基板上に、核酸プローブ・ドットの形成と同じ手法により形成される、ドット当たりの平均的な核酸密度が決定された、濃度基準用の核酸プローブ・ドットを具え、２次イオン質量分析を行った際に検出される２次イオンの信号強度に基づいて作成される検量線を用いて、未知濃度の核酸プローブ・ドットの核酸濃度を決定する。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の核酸関連物質からなる核酸プローブ・ドットが基板上にマトリクス状に配置された核酸チップであって、
前記核酸プローブ・ドットが形成されている基板表面の一部に、
前記核酸プローブ・ドットの形成と同じ手法により形成される、ドット当たりの平均的な核酸密度が決定された、濃度基準用の核酸プローブ・ドットを具えていることを特徴とする核酸チップ。
【請求項２】
前記濃度基準用の核酸プローブ・ドットとして、
複数段階の平均的な核酸密度を有する、ドット当たりの平均的な核酸密度が決定された、複数種の核酸プローブ・ドットを具えていることを特徴とする請求項１に記載の核酸チップ。
【請求項３】
ドット当たりの平均的な核酸密度が決定された、核酸プローブ・ドットは、
別途に、該ドット当たりの平均的な核酸密度を、化学分析により決定されていることを特徴とする請求項１または２に記載の核酸チップ。
【請求項４】
前記化学分析手段として、
誘導結合プラズマ質量分析法（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ　Ｃｏｕｐｌｅｄ　Ｐｌａｓｍａ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、以下ＩＣＰ−ＭＳと略す）による分析を用いて、該ドット当たりの平均的な核酸密度が決定されていることを特徴とする請求項３に記載の核酸チップ。
【請求項５】
前記核酸プローブは、一本鎖核酸で構成されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸チップ。
【請求項６】
前記核酸プローブは、
ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）、ｃＲＮＡ（コンプリメンタリーＲＮＡ）のいずれかから構成されている一本鎖であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸チップ。
【請求項７】
前記核酸チップは、
一本鎖核酸で構成される前記核酸プローブと、該核酸プローブに対するハイブリダイゼーションにより導入された標的核酸の両者が、その基板上に配置されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸チップ。
【請求項８】
複数の核酸関連物質からなる核酸プローブ・ドットが基板上にマトリクス状に配置された核酸チップの分析方法であって、
前記核酸プローブ・ドットが形成されている基板表面の一部に、
前記核酸プローブ・ドットの形成と同じ手法により形成される、ドット当たりの平均的な核酸密度が決定された、濃度基準用の核酸プローブ・ドットを設け、
前記濃度基準用の核酸プローブ・ドットとして、
複数段階の平均的な核酸密度を有する、ドット当たりの平均的な核酸密度が決定された、複数種の核酸プローブ・ドットを具え、
前記複数段階の平均的な核酸密度を有する、複数種の核酸プローブ・ドットに対して、２次イオン質量分析を行った際に検出される２次イオンの信号強度に基づいて作成される検量線を用いて、
基板上に配置される、未知濃度の核酸プローブ・ドットの核酸濃度を、２次イオン質量分析法によって決定することを特徴とする核酸チップの分析方法。
【請求項９】
前記２次イオン質量分析として、飛行時間型２次イオン質量分析法を用いることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記２次イオン質量分析において検出される２次イオン強度は、
１次イオンのドーズ量を、１×１０１４／ｃｍ２以下に選択される一定値とした際、１次イオンの照射される一定の面積から放出される、前記核酸プローブに由来する特定の２次イオンの積分強度（カウント数）であることを特徴とする請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記２次イオン質量分析において検出される２次イオン強度は、
１次イオンのドーズ量を、１×１０１２／ｃｍ２以下に選択される一定値とした際、１次イオンの照射される一定の面積から放出される、前記核酸プローブに由来する特定の２次イオンの積分強度（カウント数）であることを特徴とする請求項８または９に記載の方法。
【請求項１２】
前記２次イオン質量分析において検出される２次イオンとして、
アデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシルの各塩基から水素原子が１個脱離した陰イオン、あるいは、Ｐ−、ＰＯ−、ＰＯ２−、ＰＯ３−からなる、核酸プローブに由来する２次イオン種の群から選択される陰イオンを利用することを特徴とする請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記２次イオン質量分析において検出される２次イオンの強度に基づき、
１次イオンの照射位置に対応させ、２次イオン強度を二次元的に表示するイメージ像として、検出結果を表示する工程を設けることを特徴とする請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
複数の核酸関連物質からなる核酸プローブが基板上にマトリクス状に配置された核酸チップの製造方法であって、
核酸チップにおいて、前記核酸プローブ・ドットが形成されている基板表面の一部に、ドット当たりの平均的な核酸密度が決定された、濃度基準用の核酸プローブ・ドットを設ける際、少なくとも、
前記基板上に核酸プローブ・ドットをマトリクス状に形成する工程、
前記核酸プローブ・ドットが形成されている基板表面の一部に、
前記核酸プローブ・ドットの形成と同じ手法により、ドット当たりの平均的な核酸密度が決定された、濃度基準用の核酸プローブ・ドットを基板上に形成する工程とを有することを特徴とする核酸チップの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、基板上にマトリクス状に配置された核酸プローブ、言謂、核酸チップ、ならびに核酸チップを構成する核酸の分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡチップ、ＲＮＡチップ等、各種の核酸プローブ分子を基板上にマトリクス状に配置したもの、所謂、核酸チップは、ゲノム解析、あるいは、遺伝子の発現解析などの目的に利用されるようななってきた。また、それら核酸チップを利用した解析の結果は、癌、遺伝病、生活習慣病、感染症等の診断、予後予想、治療方針の決定等に重要な指標を提供するものと期待されている。
【０００３】
核酸チップの作製方法には、幾つかの手法が知られている。ＤＮＡチップを例にとって説明すると、フォトリソグラフィーを用いて、直接基板上にＤＮＡプローブを逐次的に合成していく方法（米国特許第５４０５７８３公報等）、あるいは、予め合成したＤＮＡ、または、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）を、基板上に供給し結合する方法（米国特許第５６０１９８０公報、特開平１１−１８７９００号公報、Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｖｏｌ．２７０，　４６７，　１９９５等）が代表的なＤＮＡチップの作製法である。
【０００４】
一般的には、前記二種の方法によって核酸チップは作製されるが、作製された核酸チップを先に述べた用途に使用しようとする場合、解析の信頼性、すなわち、定量性、再現性を保証するためには、各マトリクスに存在するプローブ、すなわち、プローブに利用する核酸の量、つまり、密度を知ることが重要である。また、実際にどのようなマトリクス形状（形状、サイズ、状態）で存在するかを知ること（イメージング）も、やはり、定量性、再現性の確保といった見地から重要である。
【０００５】
しかし、核酸チップ上の核酸プローブは、原理的には単分子膜レベルとされており、基本的に、マトリクス位置の顕影化を含めた核酸プローブの分析には、きわめて高感度な表面解析技術が必要となる。
【０００６】
前記の要件を満足する高感度な表面解析技術の一つとして、プローブ自体にアイソトープラベルを施す方法が知られてはいるが、ラベル化の手法が煩雑であり、利用されるアイソトープラベル自体、被爆源となる危険性を有し、そのため、特殊な施設、装置が必要等の理由で、汎用性の観点で難点を有している。
【０００７】
別の方法として、プローブを蛍光標識する方法、または、プローブと特異的に結合する物質に蛍光標識を施し、これとプローブを結合させる方法、すなわち、ＤＮＡチップにおいては、蛍光ハイブリダイゼーション法が考えられる。しかしながら、標識に利用する蛍光色素の安定性、蛍光クエンチング、あるいは、蛍光色素の基板表面への非特異的吸着、さらには、特異的結合（ハイブリダイゼーション）の定量性（安定性、再現性）等、高い定量性を達成する上では、種々の問題が存在しており、プローブ自体の存在量を定量的に把握するには、なお課題が残る。
【０００８】
その他、一般的な検出対象に利用可能な高感度表面分析手段として、ＦＴ−ＩＲ（フーリエ変換赤外分光）法を用いたＡＴＲ法、ＸＰＳ（Ｘ線光電子分光）法等があるが、いずれも、生体関連物質である、核酸チップの核酸プローブ自体の定量的分析、あるいは、イメージングには十分な感度を有しているとはいえない。特に、核酸チップの作製用基板として、一般的なガラスを用いる場合には、例えば、ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）法では、基板のガラス自体に起因する吸収の影響、また、ＸＰＳ法では、ガラス自体は絶縁性材料であるため、チャージアップの影響等があり、有効な分析手段とはいえない。
【０００９】
また、生体関連物質に利用可能な、別の高感度表面分析手段として、レーザー共鳴イオン化法（ＲＩＳ：Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）によるＤＮＡの検出方法が、米国特許第５８２１０６０公報に開示されている。この方法では、試料表面から放出される注目元素のイオン化エネルギーに相当する波長のレーザービームを照射して、当該元素をイオン化し検出するものである。その際、試料表面から元素を放出させる手段としては、レーザービームを用いる方式、イオンを用いる方式が開示されているが、特定元素の検出しかできないという技術的な制約を持つ。
【００１０】
さらに、他の高感度表面分析手段としては、動的二次イオン質量分析法（ｄｙｎａｍｉｃ−ＳＩＭＳ）があるが、この手法では、二次イオンを生成する過程で、有機化合物を小さいフラグメントイオン、または粒子にまで分解している。そのため、質量スペクトルから得られる化学構造情報は多くなく、例えば、構成する塩基は共通した四種しかない核酸関連物質のような有機物の分析には、得られる情報は不十分であり、汎用的に利用するには適していない。
【００１１】
これに対して、同じく二次イオン質量分析法の一手法として知られている、飛行時間型二次イオン質量分析（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）法は、固体試料の最表面にどのような原子または分子が存在するかを調べるための分析方法であり、下記する特長を持つ。すなわち、１０９ａｔｏｍｓ／ｃｍ２（最表面１原子層の１／１０５に相当する量）の極微量成分の検出能があること、有機物、無機物のどちらにも適用できること、表面に存在するすべての元素や化合物を測定できること、試料表面に存在する物質からの二次イオンのイメージングが可能なことである。
【００１２】
以下に、この飛行時間型二次イオン質量分析法の原理を簡単に説明する。
【００１３】
高真空中において、高速のイオンビーム（一次イオン）を固体試料表面に照射すると、スパッタリング現象によって表面の構成成分が真空中に放出される。この過程で発生する正または負の電荷を帯びたイオン（二次イオン）を、電場によって一方向に収束し、一定距離だけ離れた位置で検出する。スパッタの際には、試料表面の組成に応じて、様々な質量をもった二次イオンが発生するが、一定の電界中では、質量の軽いイオンほど早く、反対に重いイオンほど遅い速度で飛行する。そのため、二次イオンが発生してから、検出器に到達するまでの時間（飛行時間）を測定することで、発生した二次イオンの質量を分析することができる。
【００１４】
一方、ｄｙｎａｍｉｃ−ＳＩＭＳ法では、既に述べたように、イオン化の際、有機化合物は小さいフラグメントイオンまたは粒子にまで分解してしまうため、質量スペクトルから得られる化学構造情報、例えば、質量範囲は限定されるのに対し、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法では、一次イオン照射量が著しく少ないため、有機化合物は化学構造を保った状態でイオン化され、幅の広い質量範囲で測定される質量スペクトルから有機化合物の構造をより直接的に知ることができる。加えて、固体試料表面の最も外側で発生した二次イオンのみが、真空中へ放出されるので、試料の最表面（深さ数Å程度）の情報を、選択的に得ることができる。
【００１５】
また、試料が絶縁物の場合には、一次イオンの照射、ならびに、二次イオンの発生に伴い、絶縁性固体表面に正の電荷が蓄積する。この蓄積電荷による電界の影響を除去するため、一次イオンをパルス的に照射し、そのパルスの間隙に、電子線をパルス照射することにより、蓄積電荷を中和する手法が採用されている。そのため、絶縁物についても、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法による分析を行うことが可能である。加えて、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法では、一次イオンビームを走査しつつ、二次イオンの分析を行うことによって、試料表面の二次イオン像（二次元的なマッピング）を測定することもできる。
【００１６】
ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法により、基板に固定した単分子膜レベルの核酸を検出した例は、既に報告があり（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　１２ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　Ｉｏｎ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ　９５１，　１９９９）、この例では、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法で検出可能な核酸由来のフラグメントイオンとして、塩基の分解フラグメントイオン、および、リン酸バックボーンの分解フラグメントイオンがあげられている。
【００１７】
また、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法を用いた定量分析の試みとしては、異なる濃度の標準溶液を清浄なシリコン基板上に塗布、乾燥後、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法でこの標準試料を測定し、二次イオンピーク強度から検量線を作成した上で、被分析試料の二次イオンピーク強度と比較する方法（Ｃ．Ｍ．　Ｊｏｈｎ　ｅｔ　ａｌ．，　ＳＩＭＳ　■，　ｐ６５７，　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，　１９９２）や、シリコン基板上に微量金属元素をスピンコートした全反射蛍光Ｘ線分析用の標準試料を用いる方法（Ｐ．　Ｌａｚｚｅｒｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｕｒｆａｃｅａｎｄ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ，　Ｖｏｌ．　２９，　７９８　（２０００））などが知られている。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来のＴＯＦ−ＳＩＭＳ法により定量分析をする上では、以下のような問題点があった。すなわち、検出される２次イオン強度は、その測定条件、具体的には、１次イオンの照射条件（加速エネルギー、入射角、イオン種、照射量）、２次イオンの検出条件（エネルギー幅）、加えて、試料が絶縁体の場合には、帯電補正のためにパルス照射される電子線に因る脱離、また、帯電中和の程度などに依って、相違するという問題があった。
【００１９】
特に、試料が絶縁体の場合には、標準試料と被測定試料とでは、１次イオンを照射した際の帯電状況は必ずしも同じとは限らない。そのため、試料を替えるごとに、高い定量性を達成する上では、厳密に測定条件を最適化する必要があり、最適化が不十分の場合には測定結果の精度が失われることとなる。また、検量線の作成は、測定対象となる濃度の水準数だけ、標準試料を必要とするため、煩わしい作業を伴っていた。
【００２０】
また、核酸チップの標準試料を、Ｐ．　Ｌａｚｚｅｒｉらが報告したようなスピンコート法で作製する場合、広い面積で平均すると、その濃度の再現性はよく、塗布形成がなされているものの、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法のスポットサイズの測定領域、具体的には、数１０μｍ２から数１００μｍ２の微少な領域毎では、塗布面内の均一性が十分とはいえず、測定結果の信頼性に大きな問題を与えていた。
【００２１】
本発明は、前記の課題をが解決するもので、本発明の目的は、複数の核酸関連物質が基板上にマトリクス状に配置された、所謂、核酸チップのプローブを構成する核酸関連物質を、飛行時間型２次イオン質量分析（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）法により分析する上、高い定量性を達成可能な、核酸チップの分析方法と、かかる分析方法を利用することで、核酸チップ上に配置される核酸プローブ・ドットに存在する核酸の量すなわち、形成密度（プローブ・ドットあたりの核酸の量）を簡便に決定することが可能な形態とされた核酸チップを提供することである。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記の課題を解決すべく鋭意検討を進めたところ、核酸チップ上に配置される、形成密度は判明していない核酸プローブ・ドットに加えて、基板表面の一部に、前記核酸プローブ・ドットの形成と同じ手法により形成される、ドット当たりの平均的な核酸密度が決定された、濃度基準用の核酸プローブ・ドットを設け、前記濃度基準用の核酸プローブ・ドットに対して、２次イオン質量分析を行った際に検出される２次イオンの信号強度を基準として、基板上に配置される、未知濃度の核酸プローブ・ドットの核酸濃度を、２次イオン質量分析法によって決定することが可能であり、また、その定量性は優れた再現性を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２３】
すなわち、本発明にかかる核酸チップは、
複数の核酸関連物質からなる核酸プローブ・ドットが基板上にマトリクス状に配置された核酸チップであって、
前記核酸プローブ・ドットが形成されている基板表面の一部に、
前記核酸プローブ・ドットの形成と同じ手法により形成される、ドット当たりの平均的な核酸密度が決定された、濃度基準用の核酸プローブ・ドットを具えていることを特徴とする核酸チップである。その際、前記濃度基準用の核酸プローブ・ドットとして、
複数段階の平均的な核酸密度を有する、ドット当たりの平均的な核酸密度が決定された、複数種の核酸プローブ・ドットを具えていることが好ましい。また、ドット当たりの平均的な核酸密度が決定された、核酸プローブ・ドットは、
別途に、該ドット当たりの平均的な核酸密度を、化学分析により決定されていることが望ましい。例えば、前記化学分析手段として、
誘導結合プラズマ質量分析法（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ　Ｃｏｕｐｌｅｄ　Ｐｌａｓｍａ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、以下ＩＣＰ−ＭＳと略す）による分析を用いて、該ドット当たりの平均的な核酸密度を決定することが可能である。
【００２４】
また、本発明にかかる核酸チップでは、前記核酸プローブは、一本鎖核酸で構成されていることが好ましい。その際、前記核酸プローブは、
ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）、ｃＲＮＡ（コンプリメンタリーＲＮＡ）のいずれかから構成されている一本鎖であることできる。
【００２５】
さらには、本発明にかかる核酸チップでは、
一本鎖核酸で構成される前記核酸プローブと、該核酸プローブに対するハイブリダイゼーションにより導入された標的核酸の両者が、その基板上に配置されていることもできる。
【００２６】
対応して、本発明にかかる核酸チップの分析方法は、
複数の核酸関連物質からなる核酸プローブ・ドットが基板上にマトリクス状に配置された核酸チップの分析方法であって、
前記核酸プローブ・ドットが形成されている基板表面の一部に、
前記核酸プローブ・ドットの形成と同じ手法により形成される、ドット当たりの平均的な核酸密度が決定された、濃度基準用の核酸プローブ・ドットを設け、
前記濃度基準用の核酸プローブ・ドットとして、
複数段階の平均的な核酸密度を有する、ドット当たりの平均的な核酸密度が決定された、複数種の核酸プローブ・ドットを具え、
前記複数段階の平均的な核酸密度を有する、複数種の核酸プローブ・ドットに対して、２次イオン質量分析を行った際に検出される２次イオンの信号強度に基づいて作成される検量線を用いて、
基板上に配置される、未知濃度の核酸プローブ・ドットの核酸濃度を、２次イオン質量分析法によって決定することを特徴とする核酸チップの分析方法である。その際、前記２次イオン質量分析として、飛行時間型２次イオン質量分析法を用いることが好ましい。
【００２７】
また、前記２次イオン質量分析において検出される２次イオン強度は、
１次イオンのドーズ量を、１×１０１４／ｃｍ２以下に選択される一定値とした際、１次イオンの照射される一定の面積から放出される、前記核酸プローブに由来する特定の２次イオンの積分強度（カウント数）であることができる。さらには、前記２次イオン質量分析において検出される２次イオン強度は、
１次イオンのドーズ量を、１×１０１２／ｃｍ２以下に選択される一定値とした際、１次イオンの照射される一定の面積から放出される、前記核酸プローブに由来する特定の２次イオンの積分強度（カウント数）であることもできる。
【００２８】
本発明にかかる核酸チップの分析方法においては、
前記２次イオン質量分析において検出される２次イオンとして、
アデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシルの各塩基から水素原子が１個脱離した陰イオン、あるいは、Ｐ−、ＰＯ−、ＰＯ２−、ＰＯ３−からなる、核酸プローブに由来する２次イオン種の群から選択される陰イオンを利用することが好ましい。
【００２９】
さらには、本発明にかかる核酸チップの分析方法では、前記２次イオン質量分析において検出される２次イオンの強度に基づき、
１次イオンの照射位置に対応させ、２次イオン強度を二次元的に表示するイメージ像として、検出結果を表示する工程を設けることも望ましい。
【００３０】
加えて、本発明は、核酸チップの製造方法として、
複数の核酸関連物質からなる核酸プローブが基板上にマトリクス状に配置された核酸チップの製造方法であって、
核酸チップにおいて、前記核酸プローブ・ドットが形成されている基板表面の一部に、ドット当たりの平均的な核酸密度が決定された、濃度基準用の核酸プローブ・ドットを設ける際、少なくとも、
前記基板上に核酸プローブ・ドットをマトリクス状に形成する工程、
前記核酸プローブ・ドットが形成されている基板表面の一部に、
前記核酸プローブ・ドットの形成と同じ手法により、ドット当たりの平均的な核酸密度が決定された、濃度基準用の核酸プローブ・ドットを基板上に形成する工程とを有することを特徴とする核酸チップの製造方法をも提供している。
【００３１】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明をより詳細に説明する。
【００３２】
本発明にかかる核酸チップは、核酸チップ基板上の一部に、形成されているプローブ・ドットの核酸濃度が既知である領域を形成し、該領域でＴＯＦ−ＳＩＭＳ法により検出される２次イオン強度から検量線を作成し、この検量線を用いて、核酸チップ基板上の他の領域で検出された２次イオン強度から、そのプローブ・ドットに固定されている核酸プローブの核酸量（形成密度）を決定するものである。
【００３３】
すなわち、本発明にかかる核酸チップでは、複数の核酸関連物質が基板上にマトリクス状に配置された、所謂、核酸チップが形成されている基板上の一部に、ドット当たりの核酸濃度が既知である核酸プローブ・ドットを設け、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法により定量的測定の際、濃度基準に利用する。また、そのドット当たりの核酸濃度が既知である核酸プローブ・ドットとして、核酸チップ基板上に、段階的に核酸濃度を変えた核酸プローブ・ドットを形成することで、その場で検量線を作成でき、より高い定量性を有する測定が可能となる。一般に、濃度基準に利用する、ドット当たりの核酸濃度が既知である核酸プローブ・ドットに関しては、別途、同一の作製条件で作製した核酸プローブ・ドットを用いて、予め化学分析により、ドット当たりに含有される核酸濃度を決定された核酸プローブ・ドットを用いる。
【００３４】
本発明の対象とする核酸チップは、一般的には、その外形サイズが１ｃｍ×１ｃｍ、１インチ×１インチ（２５．４ｍｍ×２５．４ｍｍ）、あるいは、スライドグラスサイズ（例えば、２６ｍｍ×７６ｍｍ）の基板を利用して作製し、プローブ・ドットのマトリクスは、その内部に配置されている平面形態とされる。本発明は、既に述べたように、複数の核酸関連物質が基板上にマトリクス状に配置された、所謂、核酸チップについて、その核酸チップ表面の各マトリクス・ドットに固定されている核酸プローブの濃度を、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法を用いて分析する手段を採用し、同一基板内に設けてある前記濃度基準を利用して、高い確度で検定することを可能としている。
【００３５】
本発明の核酸チップにおいては、基板上に配置する核酸プローブは、後述するように基板上に共有結合で固定されていることが好ましい。その共有結合による固定に利用するため、例えば、基板表面処理過程で、該基板表面を、アミノ基を結合したシランカップリング剤（Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン）および架橋剤であるＮ−マレイミドカプロイロキシスクシンイミド（ＥＭＣＳ）で処理し、被覆膜を形成する形態とすることも有効である。
【００３６】
ドット当たりに含有される核酸濃度を決定する際に利用する、化学分析では、段階的に核酸濃度を変えた核酸プローブが多数形成された核酸チップを、例えば、酸処理することによって、核酸プローブを基板から分離し、この溶液に含まれる核酸プローブ量を、その核酸中のリンの量を、微量分析手段を用いて分析することで、別途定量するものである。核酸中のリンの量の定量に利用する微量分析手段は、特に限定されるものではないが、高感度かつ高精度なものが好ましく、例えば、ＩＣＰ−ＭＳ法などが挙げられる。ＩＣＰ−ＭＳ法でのリンの検出限界は、１０ｐｐｂ程度であり、定量を行うには、少なくとも、この２〜３倍、すなわち２０〜３０ｐｐｂ程度が必要である。また、試料量（溶液量）としては、最低限１ｍｌ必要である。
【００３７】
一方、後述のインクジェット法により、核酸プローブを形成する場合には、１インチ×３インチの面積に、例えば、２００行×３００列程度のマトリクス・サイズの核酸プローブを形成することも、さほど困難なことではない。また、インクジェット法での１回の吐出量は、高い再現性を示し、その平均値（ｐｌのオーダー）は高い確度で推定できる。一方、上記濃度基準用ドットの作製に利用する、吐出溶液中のプローブＤＮＡ濃度（μＭのオーダー）は、前もって設定するものであり、勿論判明している。
【００３８】
これらの値に加えて、吐出量中の、プローブＤＮＡの固定量（水洗等で固定されなかった分を差し引いた量、数１０％のレベル）を用いて、上記ＩＣＰ−ＭＳ分析に必要な試料量を達成する上で、基板上から溶出させるべき、核酸プローブ・ドットの総数は、ある程度推定できる。具体的には、上記の標準的な条件で核酸チップを作製した場合、一種類の濃度（μＭのオーダー）につき、２００行×３００列程度のマトリクス・サイズ、ドット当たりの吐出量（ｐｌのオーダー）の核酸チップで、数１０枚を用いることが必要となる。
【００３９】
なお、核酸チップ上に付設される濃度基準用ドットに関して、各濃度毎の、核酸濃度が既知のプローブ・ドット数は、特に限定されるものではないが、複数個形成するのが好ましい。
【００４０】
また、本発明の核酸チップでは、上記核酸プローブが一本鎖核酸で構成され、具体的には、一本鎖核酸で構成される核酸プローブを、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）、ｃＲＮＡ（コンプリメンタリーＲＮＡ）のいずれかで構成することができる。さらには、核酸チップが、核酸プローブとする一本鎖核酸と、この核酸プローブに対するハイブリダイゼーションにより導入された標的核酸の両者から構成されている形態の核酸チップとなっていてもよい。
【００４１】
本発明は、段階的に核酸濃度を変えた、濃度基準用の核酸プローブ・ドット複数間で検出される２次イオンの信号強度に基づき作成された検量線を用いて、未知濃度の核酸プローブ・ドットの核酸濃度を決定することを可能とする。その際、本発明の分析方法では、飛行時間型２次イオン質量分析で検出される２次イオン強度を用いることが、より高い定量性を達成する上で有効である。
【００４２】
なお、上述の２次イオン強度とは、計数率ではなく、一定条件で一定時間計数した積分強度であることが好ましい。正確には、１次イオンのドーズ量を、いわゆるｓｔａｔｉｃ条件と言われる１×１０１２／ｃｍ２以下の一定値とし、一定の面積から放出される下記２次イオンの計数値（カウント数）とすることが好ましい。なお、１次イオンのドーズ量は、少なくとも１×１０１４／ｃｍ２以下とする必要がある。
【００４３】
ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法による測定において、利用される１次イオンとしては、Ｃｓ＋イオン、Ｇａ＋イオンあるいはＡｒ＋イオンを用いることが可能である。２次イオン種としては、プローブ核酸、およびハイブリダイゼーションで導入された標的核酸が、一本鎖核酸、より具体的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）、ｃＲＮＡ（コンプリメンタリーＲＮＡ）の場合、核酸の骨格を構成するリン酸に由来するＰ−，ＰＯ−，ＰＯ２−，ＰＯ３−等が挙げられる。また、塩基種からプロトンが脱離したもの、即ち、塩基種がアデニンの場合は、Ｃ５Ｈ４Ｎ５−（１３４ａ．ｍ．ｕ．）、グアニンの場合はＣ５Ｈ４Ｎ５Ｏ−（１５０ａ．ｍ．ｕ．）、シトシンの場合はＣ４Ｈ４Ｎ３Ｏ−（１１０ａ．ｍ．ｕ．）、チミンの場合はＣ５Ｈ５Ｎ２Ｏ２−（１２５ａ．ｍ．ｕ）も、２次イオン種として検出可能である。また、核酸プローブが、ＲＮＡプローブの場合にはチミンの代わりにウラシルに由来するＣ４Ｈ３Ｎ２Ｏ２−（１１１ａ．ｍ．ｕ）を検出する以外は、ＤＮＡプローブと同様な２次イオンを検出することが可能である。また、核酸チップを構成する基板として、例えば、ガラスなどの絶縁物基板を用いる際には、１次イオン照射と併せて、併用される電子線照射は、１次イオンのパルス幅、周波数および試料の誘電率、さらには、ガラス基板の厚さを考慮して、適切な照射条件を決定する必要がある。
【００４４】
本発明の核酸チップの分析方法では、また、核酸に起因する２次イオン強度を、１次イオン照射のスキャンに合わせて、二次元的なイメージとして、定量的に表示できることも特徴である。
【００４５】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。なお、これら実施例は本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるものの、本発明はかかる形態に限定されるものではない。
【００４６】
図１は、基板上にプローブを複数個スポット状に結合させたプローブアレイの平面配置および断面構造を模式的に示す図ある。１０１は、任意の条件で作製したプローブ群、１０２は、核酸濃度が既知であるプローブ群である。断面図では、１０３は基板、１０４は有機物質からなる表面処理層、１００は核酸プローブである。以下、図１に例示する構成のプローブアレイについて、公知の方法（特開平１１−１８７９００号公報に記載の方法９）を応用して、作製する工程について説明する。
【００４７】
（実施例１）
塩基種をチミン、塩基長を４０ｍｅｒとしたＤＮＡプローブを用いるＤＮＡチップの作製
（１）基板洗浄
２５．４ｍｍ×５０．８ｍｍ×１ｍｍの合成石英基板１０３をラックに入れ、純水で１０％に稀釈した超音波洗浄用洗剤（ブランソン：ＧＰ■）に一晩浸した。さらに、洗剤中で２０分間超音波洗浄を行い、その後、水洗により洗剤を除去した。純水ですすいだ後、純水の入った容器中でさらに超音波処理を２０分間行った。次に、予め８０℃に加温した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に、基板を１０分間浸した。引き続き水洗、純水洗浄を行って、洗浄済基板は、そのまま次の表面処理工程に供した。
【００４８】
（２）表面処理
アミノ基を結合したシランカップリング剤、Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン　ＫＢＭ６０３（信越化学工業）の１ｗｔ％水溶液を室温下で２時間攪拌し、上記シラン化合物の分子内のメトキシ基を加水分解した。次いで、この溶液に、（１）で得た洗浄済基板を室温で１時間浸漬した後、純水で洗浄し、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。さらに、基板を１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークして、最終的に基板表面にアミノ基を導入しシランカップリング層を形成した。
【００４９】
一方、Ｎ−マレイミドカプロイロキシスクシンイミド（同仁化学研究所：以下ＥＭＣＳ）２．７ｍｇを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／エタノールの１：１（容量比）混合溶媒に、濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなる様に溶解し、ＥＭＣＳ溶液とした。シランカップリング処理を行った石英基板を、このＥＭＣＳ溶液に室温で２時間浸漬して、シランカップリング処理によって基板表面に担持されているアミノ基と、ＥＭＣＳのスクシイミド基を反応させ、表面にＥＭＣＳ層を形成した。以上の処理により、結合可能な官能基を有する有機物質からなる表面処理層１０４を形成した。すなわち、この段階で、基板表面にはＥＭＣＳ由来のマレイミド基が存在することになる。ＥＭＣＳ溶液から引き上げた基板は、ＤＭＳＯ／エタノール混合溶媒及びエタノールで順次洗浄した後、窒素ガスを吹き付けて乾燥させた。
【００５０】
（３）プローブＤＮＡの合成
ＤＮＡ合成業者（ベックス）に依頼して、配列番号１の一本鎖核酸（ｄＴの４０量体）を合成した。なお、配列番号１の一本鎖ＤＮＡの５’末端には、合成時にチオールモディファイア（グレンリサーチ）を用いて、スルファニル基（ＳＨ）を導入した。ＤＮＡ合成後、脱保護、ＤＮＡの回収は定法により行い、また、精製には、ＨＰＬＣを用いた。合成から精製までの一連の工程は、すべて合成業者に依頼して行った。
配列番号：１
５’−ＨＳ−（ＣＨ２）６−Ｏ−ＰＯ２−Ｏ−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　３’
（４）サーマルジェットプリンターによるＤＮＡ吐出、および基板への結合
（３）に記載する配列番号１の一本鎖ＤＮＡを、最終濃度８μＭで、グリセリン７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、アセチレンアルコール（商品名：アセチレノールＥＨ；川研ファインケミカル（株）社製）１ｗｔ％を含む溶液に溶解した。
【００５１】
一方、サーマルジェット法の一種であるバブルジェット法を用いたバブルジェットプリンターＢＪＦ−８５０（キヤノン）用のプリンターヘッドＢＣ−５０（キヤノン）を、数１００μｌの溶液を吐出可能とするべく改造した。この改造を施したヘッドを、平板である石英基板上へ、インク吐出が可能となるよう改造した吐出描画機に搭載した。このヘッドの改造タンク部に、前記ＤＮＡ溶液を数１００μｌ注入し、吐出描画機にＥＭＣＳ処理基板を装着して、ＥＭＣＳ処理表面にスポッティングした。なお、スポッティング時の吐出量は４ｐｌ／ｄｒｏｐｌｅｔで、スポッティングの範囲は、基板上の２０ｍｍ×３０ｍｍの範囲に、２００ｄｐｉ、すなわち、１２７μｍのピッチで吐出した。この条件では、マトリックス（１５７行２３６列）状にスポッティングされたドットの直径は約５０μｍであった。
【００５２】
スポッティング終了後、基板を３０分間加湿チャンバー内に静置し、基板表面のマレイミド基と、核酸プローブ５’末端のスルファニル基（−ＳＨ）とを反応させ、ＤＮＡプローブを固定させた。次いで、基板を純水で洗浄し、純水中で保存した。ＤＮＡ結合基板（ＤＮＡチップ）は、ＴＯＦ−ＳＩＭＳによる分析直前に窒素ガスを吹き付けて乾燥し、真空デシケーター中でさらに乾燥した。この条件で、ＤＮＡチップを計１５枚作製した。
【００５３】
さらに、スポッティングに用いるＤＮＡ溶液中の、配列番号１の一本鎖ＤＮＡ濃度を、５μＭ、２．５μＭに選択して、同様の操作で、ＤＮＡチップを各々２５枚、３５枚作製した。以上の３種を、標準ＤＮＡチップとした。
【００５４】
次に、一本鎖ＤＮＡの一般的な溶液濃度（約８μＭ）を用いたＤＮＡチップを上記と同条件で作製した。ただし、該ＤＮＡチップにおいては、端部の１行目から３行目には標準ＤＮＡチップ作製に使用した同じ一本鎖ＤＮＡ溶液三種を用いた。すなわち、基板最端の１行目を、濃度１０μＭのＤＮＡ溶液でプローブを形成した行、２行目を、濃度５μＭのＤＮＡ溶液でプローブを形成した行、３行目を、濃度２．５μＭのＤＮＡ溶液でプローブを形成した行となるように設定した。また、端部の１行目から３行目以外の行（４行目から１５７行目）を、別ロットのＤＮＡ濃度８μＭとした溶液を用いて作製した。なお、プローブアレイの数は任意に設定できる。
【００５５】
（実施例２）
核酸チップ上の核酸の定量
３種類のＤＮＡ濃度で作製した標準ＤＮＡチップを、それぞれ酸で洗浄してＤＮＡプローブを溶解させた後、該酸溶液をＰが飛散しない条件で１ｍｌ以下になるまで濃縮した。次いで、該濃縮溶液に超純水を加えて１ｍｌになるように定容した。この溶液を、ＩＣＰ−ＭＳ装置に導入してＰの重量を測定した。この値をもとに、測定に供したドットの数（スポッティングの数）を考慮して、各濃度で作製したＤＮＡプローブの（１ドット当たりの）ＤＮＡ分子数の平均値を決定した。なお、各ＤＮＡ濃度で作製した基板の枚数は、ＩＣＰ−ＭＳ装置でのＰの検出限界濃度（約１０ｐｐｂ）と、各基板上のＤＮＡの分子数を考慮して決定すればよく、実施例１で示した枚数に限定されるものではない。
【００５６】
（実施例３）
ＴＯＦ−ＳＩＭＳ測定
図１に示したＤＮＡチップを、飛行時間型二次イオン質量分析装置（ＴＯＦＳＩＭＳ　ＩＶ：ＩＯＮ　ＴＯＦ社）の分析室に搬送し、表１の条件で１次イオンの注入ドーズ量が１×１０１２　ａｔｏｍｓ／ｃｍ２になるまで照射して、その間に検出される２次イオンＰＯ３−（質量電荷比７８．９５８ａｍｕ（アトムマスユニット））を積算して累積強度を求めた。図２に、１行目から３行目までの各ＤＮＡ濃度のドット位置で測定された２次イオン強度の平均値と、ＤＮＡの形成密度（１ドット当たりのＤＮＡ分子数）との対応を示した。ここでは、プローブＤＮＡを固定する直前、表面処理済基板において測定されたＰＯ３−の強度を、バックグランドとした。
【００５７】
各行のドットにおけるＤＮＡの形成密度と２次イオン強度は比例することが確認された。同じ測定条件で、インクジェットプリンターで吐出させるＤＮＡ溶液中の核酸濃度を８μＭとして形成した、核酸プローブについて、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ測定したところ、ＰＯ３−のカウント数から求められた各ドットにおけるＤＮＡの形成密度（１ドット当たりのＤＮＡ分子数）は、およそ２．０×１０７で、任意に選択した１０個のドット内でのバラツキは、２０％以下であった。
【００５８】
【表１】
2004037122.tif 000002
【００５９】
（実施例４）
形成密度分布の画像表示
実施例３に用いた同じ試料の複数の核酸プローブを設定して、１次イオンを試料面で走査し、発生する２次イオンを各走査点に対応させて表示させ、各走査点で得られたＰ−の強度を複数の段階に分けて擬似カラーを設定し、Ｐ−の強度分布すなわち、核酸の面密度（プローブ・ドット当たりの核酸の分子数）形成密度の分布を定量的に比較した。
【００６０】
【発明の効果】
本発明の核酸チップでは、チップ基板上に、前記核酸プローブ・ドットの形成と同じ手法により形成される、ドット当たりの平均的な核酸密度が決定された、濃度基準用の核酸プローブ・ドットを具え、ＤＮＡ等の核酸プローブを含むドット内のプローブ核酸量、あるいは、ハイブリダイゼーション後の標的核酸量などを定量的に評価する際、前記の濃度基準用の核酸プローブ・ドットを利用して、例えば、複数段階の平均的な核酸密度を有する、複数種の濃度基準用の核酸プローブ・ドットに対して、２次イオン質量分析を行った際に検出される２次イオンの信号強度に基づいて作成される検量線を用いて、
基板上に配置される、未知濃度の核酸プローブ・ドットの核酸濃度を、２次イオン質量分析法によって決定することができ、従来法と比較して、再現性、定量性が向上する。本発明の手法を用いることにより、核酸チップ製品の信頼性を高めることができる。また、核酸チップ内にマトリックス状に配置されている、核酸プローブ・ドットの形成密度の分布を画像として表示することも可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明にかかるバイオチップについて、その構成の一例を示す平面配置と断面形状（ＡＡ’での断面）を模式的に示す図である。
【図２】バイオチップについて、測定される２次イオン強度とＤＮＡ形成密度（プローブ・ドット当たりのＤＮＡ分子数）の関係を示すグラフである。
【符号の説明】
１００：核酸プローブ
１０１：核酸濃度が未知の核酸プローブが形成される領域
１０２：核酸濃度が既知の核酸プローブが形成される領域
１０３：基板
１０４：有機物質からなる表面処理層
【図１】
2004037122.tif 000003
【図２】
2004037122.tif 000004