(57)【要約】【課題】成人Ｔ細胞白血病の治療に有効な新規成人Ｔ細胞白血病治療用組成物の提供。【解決手段】マウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａ（ＦＥＲＭ−ＢＰ５８２８）が産生する抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体ＨＦＥ７Ａまたはそのヒト化抗体を有効成分として含有する組成物。【選択図】なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８２８）が産生する抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体ＨＦＥ７Ａまたはそのヒト化抗体を有効成分として含有する成人Ｔ細胞白血病治療用組成物。
【請求項２】
マウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８２８）により産生されるモノクローナル抗体により認識されるエピトープに特異的な抗原結合領域を有することを特徴とする抗体を有効成分として含有する成人Ｔ細胞白血病治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、成人Ｔ細胞白血病の治療に有効な新規成人Ｔ細胞白血病治療用組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】生体内において、正常な細胞交代のために生じる生理的な細胞死はアポトーシスと呼ばれ、病理的な細胞死である壊死（ネクローシス）とは区別されている（例えば、非特許文献１参照。）。いわゆるプログラム細胞死は、生体内において予め死滅するべくプログラム化されている、ある種の細胞にみられる細胞死であるが、アポトーシスもそのひとつである。アポトーシスにおいては細胞表面の湾曲、核クロマチンの凝縮、染色体ＤＮＡの断片化等の現象が特徴的に観察される。
【０００３】
このようなアポトーシスに関与する分子としてはＦａｓ（例えば、非特許文献２参照。）をはじめとして、腫瘍壊死因子受容体（Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（例えば、非特許文献３参照）、ＣＤ４０（例えば、非特許文献４参照）、パーフォリン／グランザイムＡ（例えば、非特許文献５参照。）など種々の分子が同定されてきた。Ｆａｓは細胞表面に存在する膜貫通型タンパク質で、Ｆａｓリガンドと呼ばれるタンパク質がその細胞外領域に結合するとその細胞にアポトーシスを誘導する。
【０００４】
抗Ｆａｓモノクローナル抗体の中には、Ｆａｓリガンド同様に細胞のアポトーシスを誘導する細胞障害活性を有するものが存在することから、自己免疫疾患、エイズおよび腫瘍の治療剤となり得ると報告されている（例えば、特許文献１及び２参照。）。抗Ｆａｓ抗体は葉酸拮抗作用またはジヒドロ葉酸還元酵素阻害作用を有する化合物と組み合わせると単独で用いる場合に比べ、自己免疫疾患、慢性関節リウマチ等に高い予防または治療効果を有することが知られている（例えば、特許文献３参照）。
【０００５】
抗ヒトＦａｓマウスモノクローナル抗体は既に数種得られており（例えば、非特許文献６及び７参照）、また、自己免疫疾患モデル動物やリウマチ性関節炎モデル動物でその治療効果および安全性が示された抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体ＨＦＥ７Ａも見出されている（例えば、特許文献４参照。）。
【０００６】
Ｃａｓｐｅｒ　ｌｏｎｇ　ｆｏｒｍｐ　ｒｏｔｅｉｎおよびｅｑｕｉｎｅ　ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　２　Ｅ８　ｐｒｏｔｅｉｎはＦａｓを介した細胞内シグナル伝達系にはたらき細胞死を抑制する作用が報告されている（例えば、非特許文献８〜１２参照。）。
【０００７】
成人Ｔ細胞白血病は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ｈｕｍａｎ　Ｔ−ｃｅｌｌ　ｌｅｕｋｅｍｉａｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　Ｉ：ＨＴＬＶ−Ｉ）がＴ細胞に感染することにより引きおこされる白血病である。成人Ｔ細胞白血病を発症するのは、ＨＴＬＶ−Ｉ感染者１０，０００人について年間６人あまりで、大部分の人はＨＴＬＶ−Ｉに感染していても成人Ｔ細胞白血病を発症しないが、発症した場合は、大部分の人が数年で死亡する。
【０００８】
抗Ｆａｓ抗体がＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞の増殖を阻害することは知られているが（例えば、特許文献５参照。）、未だ、成人Ｔ細胞白血病の有効な治療法は確立されておらず、更に効果的な、成人Ｔ細胞白血病の治療薬の開発が期待されている。一方、抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体ＨＦＥ７Ａもしくはヒト化したＨＦＥ７Ａが成人Ｔ細胞白血病に対して治療効果を示すかどうかは明らかとなっていなかった。
【０００９】
また、抗体は　Ｆｃ　ｒｅｃｅｐｔｏｒを有する細胞を介したａｎｔｉｇｅｎ−ｄｅｐｅｄｅｎｔ　ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙなどの作用や補体系の活性化によって抗腫瘍作用を示す場合が示唆されている（例えば、非特許文献１３参照。）。
【００１０】
一方、抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体ＨＦＥ７Ａもしくはヒト化したＨＦＥ７Ａがアポート−シスの誘導以外の機構で細胞障害作用を示しうるか否かも明らかとなっていなかった。
【００１１】
【特許文献１】
特開平２−２３７９３５号公報
【特許文献２】
特表平５−５０３２８１号公報
【特許文献３】
特開２００１−３９８９２号公報
【特許文献４】
特開平１１−１７１９００号公報
【特許文献５】
特許第２９６３５３５号公報
【非特許文献１】
「ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ）」、１９７２年、第２６巻、ｐ．２３９−２５７
【非特許文献２】
「ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、１９８９年、第１６９巻、ｐ．１７４７−１７５６
【非特許文献３】
「セル（Ｃｅｌｌ）」、１９９０年、第６１巻、ｐ．３５１−３５９
【非特許文献４】
「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、１９９３年、第３６４巻、ｐ．６４５−６４８
【非特許文献５】
「イムノロジカル・レビューズ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ）」、１９８８年、第１０３巻、ｐ．５３−７１
【非特許文献６】
「ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、１９８９年、第１６９巻、ｐ．１７４７−１７５６
【非特許文献７】
「サイエンス（ＳＣＩＥＮＣＥ）」、１９８９年、第２４５巻、ｐ．３０１−３０５
【非特許文献８】
「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、１９９７年、第３８８巻、ｐ．１９０−１９５
【非特許文献９】
「ネイチャー・レビューズ・イムノロジー（Ｎａｔｕｒｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、２００１年、第１巻、ｐ．５０−５８
【非特許文献１０】
「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・ザ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９９７年、第９４巻、ｐ．１１７２−１１７６
【非特許文献１１】
「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｉｔｒｙ）」、１９９７年、第２７２巻、ｐ．９６２１−９６２４
【非特許文献１２】
「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、１９９７年、第３８６巻、ｐ．５１７−５２１
【非特許文献１３】
Ｐ　Ｔｒａｖｅｒｓ　、「イムノバイオロジー（ＩｍｍｕｎｏＢｉｏｌｏｇｙ）」、第２版、Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅａｙ、　Ｇａｒｌａｎｄ　ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＩｎｃ．　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　ａｎｄ　Ｌｏｎｄｏｎ　、８章、ｐ．２４−５２、１２章、ｐ．２２−２３頁
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、肝毒性を有さず、副作用の少ない新規成人Ｔ細胞白血病治療用組成物を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明は、
（１）　マウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８２８）が産生する抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体ＨＦＥ７Ａまたはそのヒト化抗体を有効成分として含有する成人Ｔ細胞白血病治療用組成物、
（２）　マウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８２８）により産生されるモノクローナル抗体により認識されるエピトープに特異的な抗原結合領域を有することを特徴とする抗体を有効成分として含有する成人Ｔ細胞白血病治療用組成物、
に関する。
【００１４】
本発明者らは、抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体ＨＦＥ７Ａが、成人Ｔ細胞白血病由来のＡＴＬ−４３Ｔｂ（−）（４３Ｔｂ）細胞株に対して、他の抗Ｆａｓモノクローナル抗体に比べ非常に高い抗腫瘍効果を生体内の腫瘍に対して示すこと、Ｆａｓを介したアポートーシスシグナルに不全がある成人Ｔ細胞白血病由来ＡＴＬ−４３Ｔｂ（−）／Ｅ８細胞株に対しても抗腫瘍効果を生体内において示すことを見出し、本発明を完成させた。
【００１５】
本発明において、「アポトーシス誘導活性」とは、細胞膜表面にＦａｓを発現している細胞に対し、そのＦａｓに結合することによってその細胞のアポトーシスを導くことができる活性をいう。
【００１６】
本発明において「葉酸拮抗作用またはジヒドロ葉酸還元酵素阻害作用を有する化合物」とは、細胞内のＤＮＡ合成において必須の過程である葉酸の代謝を拮抗的に阻害する活性を有する、薬理的に許容可能な化合物をいう。好適には，以下に記載する化合物を挙げることができる：
メトトレキセート、エダトレキセート（英国特許公報ＧＢ　２０５８７７０　Ｂ参照、エピロプリム（国際特許出願ＷＯ９２／８４６１号公報参照、イオメトレキソール（国際特許出願ＷＯ８６／５１８１号公報参照、ピリトレキシム（欧州特許２１２９２号公報参照、トリメトレキセート（英国特許公報ＧＢ　１３４５５０２参照、ブロジモプリム（英国特許公報ＧＢ　１４４９３８７参照、下記式（ＶＩＩ））、ＭＸ−６８（国際特許出願ＷＯ９７／３４６０６号公報参照、Ｎ−［４−［３−（２，４−ジアミノ−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−シクロペンタ［ｄ］ピリミジン−５−イル）プロピル］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸（Ｊ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．　（１９９４）　３７，　１６１６−１６２４、Ｎ−［［５−［２−（２−アミノ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−４−オキソピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）エチル−２−チエニル］カルボニル］−Ｌ−グルタミン酸（欧州特許３４３８０１号公報参照、Ｎ−（（２，４−ジアミノ−３，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）エチル）−２−チエニルカルボニル−Ｌ−グルタミン酸（米国癌研究学会第８８回年会（１９９７）抄録番号６６０参照、（Ｓ）−２−［［［４−カルボキシ−４−［［４−［［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］アミノ］ベンゾイル］アミノ］ブチル］アミノ］カルボニル］ベンゾイル酸（欧州特許３４５３０８号公報参照、Ｎ−［４−［３−（２，４−ジアミノ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）プロピル］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸（欧州特許３３４６３６号公報参照、２，４−ジアミノ−６−（Ｎ−（４−（フェニルスルホニル）ベンジル）メチルアミノ）キナゾリン（米国癌研究学会年会（１９９２）抄録番号２４５８参照、
２，４−ジアミノ−５−［４−［３−（４−アミノフェニル−４−スルホニルフェニルアミノ）プロポキシ］−３，５−ジメトキシベンジル］ピリミジン（欧州特許２３１８８８号公報参照、）、Ｎ−［４−［４−（２，４−ジアミノ−５−ピリミジニル）ブチル］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸（国際特許出願ＷＯ９５／９８４５号公報参照、Ｎ−［４−［３−（２，４−ジアミノ−５−ピリミジニル）プロピル］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸（（国際特許出願ＷＯ９５／９８４５号公報参照）、Ｎ−［４−［２−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）エチル］ベンゾイル］−４−メチレン−ＤＬ−グルタミン酸（国際特許出願ＷＯ９１／１０６６６号公報参照）およびＮ−（１−メチルエチル）−Ｎ’［３−（２，４，５−トリクロロフェノキシ）プロポキシ］イミドジカルボニミジックジアミドヒドロクロリド（ＰＳ１５）（国際特許出願ＷＯ９３／１６０３７号公報参照）：
これらの化合物はいずれも、葉酸拮抗作用乃至はジヒドロ葉酸還元酵素阻害作用を有することが知られている。上記化合物群のうち、本発明の医薬組成物に含有せしめる化合物として最適なものはメトトレキセートである。
【００１７】
本発明における、「Ｆａｓ細胞死誘導シグナル不全株」とは、抗Ｆａｓ抗体によるアポトーシス誘導作用に対して感受性の低下した株のことをいう。
【００１８】
【発明の実施の形態】本発明の成人Ｔ細胞白血病治療用組成物は、抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体ＨＦＥ７Ａまたはそのヒト化抗体を製剤化することによって得ることができる。
【００１９】
抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体ＨＦＥ７Ａまたはそのヒト化抗体は、例えば特開平１１−１７１９００号公報、特開２０００−１６６５７３号公報、特開２０００−１６６５７４号、特開２００１−３４２１４８号または特開２００１−３４２１４９号公報記載の方法によって得ることができる。抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体の産生細胞であるマウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａは独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（旧：工業技術院生命工学工業技術研究所）に平成９年２月１９日付けで国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８２８が付されている。また、ＨＥＦ７Ａの産生する抗Ｆａｓモノクローナル抗体の重鎖をコードするＤＮＡを動物細胞で発現させる組換えＤＮＡベクターで形質転換された大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＭＥ−Ｈ及びＨＥＦ７Ａの産生する抗Ｆａｓモノクローナル抗体の軽鎖をコードするＤＮＡを動物細胞で発現させる組換えＤＮＡベクターで形質転換された大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＭＥ−Ｌは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成９年（１９９７年）３月１２日付で国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８６８及びＦＥＲＭ　ＢＰ−５８６７が付されている。ドナー由来の構造領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ　ｒｅｇｉｏｎ：ＦＲ）のアミノ酸も一部移植されているヒト化抗Ｆａｓ抗体の軽鎖をコードするＤＮＡを組み込んだ３種の形質転換体、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＨＳＧＭＭ６　ＳＡＮＫ　７３６９７株、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＨＳＧＨＭ１７　ＳＡＮＫ　７３５９７株およびＥ．ｃｏｌｉ　ｐＨＳＧＨＨ７　ＳＡＮＫ　７３４９７株、ならびに、同ヒト化抗Ｆａｓ抗体の重鎖をコードするＤＮＡを組み込んだ形質転換体、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐｇＨＳＬ７Ａ６２　ＳＡＮＫ７３３９７株は、平成９年（１９９７年）８月２２日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託され、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６０７１、ＦＥＲＭ　ＢＰ−６０７２およびＦＥＲＭ　ＢＰ−６０７３、ならびにＦＥＲＭ　ＢＰ−６０７４が付されている。さらに、同ヒト化抗Ｆａｓ抗体の軽鎖をコードするＤＮＡを組み込んだ２種類の形質転換体、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＨＳＨＭ２　ＳＡＮＫ　７０１９８株およびＥ．ｃｏｌｉ　ｐＨＳＨＨ５　ＳＡＮＫ　７０３９８株は、平成１０年２月２６日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託され、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６２７２およびＦＥＲＭ　ＢＰ−６２７４が付されている。同ヒト化抗Ｆａｓ抗体の重鎖をコードするＤＮＡを組み込んだ形質転換体、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐｇＨＰＤＨＶ３　ＳＡＮＫ　７０２９８株は、平成１０年（１９９８年）２月２６日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６２７３が付されている。
【００２０】
従って、該寄託菌株からプラスミドを単離するか、もしくは該寄託菌株の抽出物を鋳型にしてＰＣＲを行うなどの方法により、ヒト化抗Ｆａｓ抗体タンパク質の各サブユニットをコードするＤＮＡを取得することができる。本発明の抗体は、これらのＤＮＡをオーバーラップ・エクステンション・ＰＣＲ等で改変したものを宿主細胞に発現させることによっても得ることができる。
【００２１】
抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体ＨＦＥ７Ａまたはそのヒト化抗体が成人Ｔ細胞白血病細胞にアポトーシスを誘導する活性を有し、成人Ｔ細胞白血病治療剤の有効成分として有用であることは、例えばヒト成人Ｔ細胞白血病由来株ＡＴＬ−４３Ｔｂ（−）の培養培地中に一次抗体として抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体ＨＦＥ７Ａまたはそのヒト化抗体を、二次抗体として抗ＩｇＧ抗体（ハイブリドーマ由来ＨＦＥ７Ａの場合は抗マウスＩｇＧ抗体、ヒト化抗体の場合には抗ヒトＩｇＧ抗体）を添加し、それら癌細胞数の減少乃至増殖抑制をトリパンブルー染色法や下記実施例で記載するＭＴＴアッセイ［Ｇｒｅｅｎ，　Ｌ．　Ｍ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９８４）　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　７０，　２５７−２６８参照］等の方法で測定することにより確認することができる。
【００２２】
さらに、抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体ＨＦＥ７Ａまたはそのヒト化抗体は生体内のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞由来成人性Ｔ細胞白血病腫瘍に対して、他の抗Ｆａｓ抗体よりも高い抗腫瘍作用を示すので、成人Ｔ細胞白血病に対しては極めて有効な治療剤となり得る。
【００２３】
本発明の成人Ｔ細胞白血病治療用組成物は、成人Ｔ細胞白血病に対する治療剤として使用することができる。かかる治療剤は、種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、注射剤、点滴剤、坐薬等による非経口投与を挙げることができる。
【００２４】
本発明の成人Ｔ細胞白血病治療用組成物は、成人Ｔ細胞白血病に対する治療効果を有する限り、抗Ｆａｓモノクローナル抗体又はそのヒト化抗体を製剤化したものでも、抗Ｆａｓモノクローナル抗体またはそのヒト化抗体と他の薬剤を適宜混合したものを製剤化したものでもよい。他の薬剤としては、例えば、葉酸拮抗作用またはジヒドロ葉酸還元酵素阻害作用を有する化合物や、レフロノマイド（Ｌｅｆｌｕｎｏｍｉｄｅ　：Ｈｏｅｃｈｓｔ　ＡＧ社より販売）等の核酸合成阻害作用やＣＯＸ−２（シクロオキシゲナーゼ−２）阻害作用を有する化合物を挙げることができる。
【００２５】
本発明の成人Ｔ細胞白血病治療用組成物中における、抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体ＨＦＥ７Ａまたはそのヒト化抗体の用量は、用いられる配合剤や投与形態などによって変化しうる。例えば、本発明の成人Ｔ細胞白血病治療用組成物は、好ましくは抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体ＨＦＥ７Ａまたはそのヒト化抗体を１００μｇ／ｍｌ乃至５ｍｇ／ｍｌ、で含有する溶液として調製されるが、本発明はこの範囲に限定されるものではない。抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体ＨＦＥ７Ａまたはそのヒト化抗体と葉酸拮抗作用またはジヒドロ葉酸還元酵素阻害作用を有する化合物を組み合わせた成人Ｔ細胞白血病治療用組成物中における葉酸拮抗作用またはジヒドロ葉酸還元酵素阻害作用を有する化合物の用量も同様に用いられる配合剤や投与形態などによって変化しうる。
【００２６】
本発明の成人Ｔ細胞白血病治療用組成物の投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、通常、抗ヒトＦａｓ抗体の量として、１回１ｍｇ乃至１００ｍｇを例えば皮下注射、筋肉注射または静脈注射によって投与することができる。
【００２７】
上記のようにして調製される本発明の成人Ｔ細胞白血病治療用組成物の、成人Ｔ細胞白血病の治療における有効性は、例えば、ヒト成人Ｔ細胞白血病由来のＡＴＬ−４３Ｔｂ（−）（以下、「４３Ｔｂ」とする）等の細胞株をＢＡＬＢ／Ｃ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ　Ｊｃｌ（日本クレア株式会社）に皮下摂取し、同時に、あるいは一定期間増殖させた後、本発明の成人Ｔ細胞白血病治療用組成物を静脈に投与して腫瘤形成の有無、腫瘤の縮小または腫瘤の増大抑制を観察することにより確認することができる。
【００２８】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００２９】
実施例１．　ヒト成人Ｔ細胞白血病細胞株ＡＴＬ−４３Ｔｂ（−）細胞に対するヒト化ＨＦＥ７Ａの抗腫瘍効果の測定
１）　ヒト成人Ｔ細胞白血病細胞株ＡＴＬ−４３Ｔｂ（−）細胞株の樹立
成人Ｔ細胞白血病細胞株ＡＴＬ−４３Ｔｂ（−）（以下、「４３Ｔｂ細胞」という）は、文献［Ｍａｅｄａ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８５）　Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ．　１６２，　２１６９−２１７４、　Ｍａｅｄａ　Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｌｏｏｄ．　（１９８７）　７０，　ｐ１４０７−１４１１参照］記載の方法にしたがって、成人Ｔ細胞白血病患者の末梢血から末梢血単核球を分離し、１から５ユニット／ｍＬの組換ヒトインターロイキン−２（もしくは２５％から５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のインターロイキン−２を含有するコンディションメディウムと１０−２０％の非働化した牛胎児血清（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で数週間培養を続けることで樹立した。
【００３０】
２）　４３Ｔｂ細胞に対する、ヒト化ＨＦＥ７Ａの抗腫瘍作用
特開平１１−１７１９００号公報または特開２００１−３４２１４８号公報記載の方法に従って、ヒト化ＨＦＥ７Ａ軽鎖（特開２００１−３４２１４８号公報記載の配列表の配列番号１０７）、ヒトＨＦＥ７Ａ重鎖（特開２００１−３４２１４８号公報記載の配列番号１１７）を生産する哺乳動物細胞を組換えＤＮＡ技術を用いて作製し、これを用いてヒト化ＨＦＥ７Ａを生産し、精製した。
【００３１】
なお、４３Ｔｂ細胞の培養は　ＲＰＭＩ−１６４０　ｍｅｄｉｕｍ　（ＳＩＧＭＡ　ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ：＃Ｒ８７５８）に終濃度１０％（ｖ／ｖ）のＦＥＴＡＬ　ＢＯＶＩＮＥ　ＳＥＲＵＭ　（ＳＩＧＭＡ，　＃Ｆ−２１３８，　ｌｏｔ＃１２８Ｈ８４２８）、終濃度　５０　ｕｎｉｔｓ／ｍｌの結晶ペニシリンＧカリウム明治（明治製菓株式会社）、終濃度２５０μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマシン（明治製菓株式会社）を添加した培地を用いて、３７℃、５％炭酸ガス存在下でおこなった。
【００３２】
２−１）皮下移植実験
４３Ｔｂ細胞をマウス　Ｃ．　Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ　Ｊｃｌ（日本クレア株式会社、雌性、４週齢）の皮下に、１匹あたり１×１０７個接種した。４３Ｔｂ細胞接種と同時に、被験物質として、ヒト化ＨＦＥ７Ａ、ヒトＩｇＧ（ＣＡＰＰＥＬ，コード＃５５９０８）、抗Ｆａｓ抗体ＣＨ１１（（株）医学生物学研究所　コード＃ＳＹ−００１）をリン酸緩衝生理食塩水（１３７ｍＭ　ＮａＣｌ（ナカライテスク社製）、８．１　ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４（ナカライテスク社製）、　２．６８ｍＭ　ＫＣｌ（ナカライテスク社製）、１．４７ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４（ナカライテスク社製））（以下「ＰＢＳ」という）を用いて希釈し、マウス一匹あたり１０μｇを尾静脈より投与した。なお、ヒト化ＨＦＥ７Ａ群、ヒトＩｇＧ投与群、抗Ｆａｓ抗体ＣＨ１１投与群は各々３匹ずつとした。腫瘍移植後３４日目に腫瘤（腫瘍）の長径および短径を測定した。測定した腫瘍サイズから下記の計算式を用いて腫瘍容積を計算し、各群間の腫瘍増殖阻害率（ＧＩ％）を比較した。なお腫瘍増殖阻害率算出法は以下の式に示す。
ＧＩ（％）＝（１−Ａ／Ｂ）×１００
Ａ：被検物質投与群の平均腫瘍体積（＊）
Ｂ：ヒトＩｇＧ投与群の平均腫瘍体積（＊）
＊：腫瘍体積とは、１／２×［腫瘍長径］×［腫瘍短径］×［腫瘍短径］を示す。
【００３３】
結果を表１に示した。ヒトＩｇＧ投与群では全例で腫瘤の形成が認められた。ＣＨ１１投与群では３例中１例に、ヒトＩｇＧ投与群と同等の大きさの腫瘤の形成が認められた。ヒト化ＨＦＥ７Ａ投与群では全例において腫瘤の形成が全く観察されず、ヒト化ＨＦＥ７Ａの強力な腫瘤形成抑制が確認された。ヒト化ＨＦＥ７Ａ投与群にはＩｇＧ投与群、ＣＨ１１に比べ著しい腫瘤形成抑制が認められた。
【００３４】
【表１】
2004043444.tif 000002
２−２）皮下移植実験２
さらに、表１に示した実験と同様のプロトコールで４３Ｔｂ細胞の移植実験を行った場合、１匹あたり１μｇのヒト化ＨＦＥ７Ａを静脈内投与した場合でも腫瘤の形成は完全に抑制された。
【００３５】
【表２】
―――――――――――――――――――――――――――――――――
投与時期　　　　ヒト化ＨＦＥ７Ａ投与量（ｍｇ／ｋｇ）　　ＧＩ（％）
―――――――――――――――――――――――――――――――――
同時　　　　　　　　　　　０．４　　　　　　　　　　　　１００
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以下の実施例２（４）に示すように、４３Ｔｂ細胞における細胞障害作用は　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　では　０．１　μｇ／ｍｌの濃度でＣＨ−１１を作用させた場合の方が、１μｇ／ｍｌの濃度でヒト化ＨＦＥ７Ａを作用させた場合よりも強力であった。しかしながら、皮下移植実験２−１）及び２−２）に記載したように、皮下移植実験ではヒト化ＨＦＥ７ＡはＣＨ−１１よりも強い抗腫瘍効果を示した。
【００３６】
２−３）腫瘤形成後のヒト化ＨＦＥ７Ａ投与の抗腫瘍作用
マウス　Ｃ．　Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ　Ｊｃｌ（日本クレア株式会社、雌性、４週齢）の皮下に、４３Ｔｂ細胞を１匹あたり１×１０７個接種した。４３Ｔｂ細胞接種と同時、１週間後又は２週間後に、被験物質として、ヒト化ＨＦＥ７Ａ、ヒトＩｇＧをＰＢＳに希釈し、マウス一匹あたり２００μｇを尾静脈より投与した。なお、ヒト化ＨＦＥ７Ａ群、ヒトＩｇＧ投与群は各々２匹ずつとした。腫瘍移植後３５日目に腫瘤（腫瘍）の長径および短径を測定した。測定した腫瘍サイズから下記の計算式を用いて腫瘍容積を計算し、各群間の腫瘍増殖阻害率（ＧＩ％）を比較した。
【００３７】
結果を表３から表５に示した。ヒト化ＨＦＥ７Ａ投与群は腫瘍移植１週間、２週間後に投与した場合においても著しい腫瘤形成抑制が認められた。本実験においては腫瘤形成は移植１２日以内に肉眼的に認められ、ＩｇＧ投与群の６匹のマウスの移植２週間後の腫瘤体積は全例２００ミリ立法メートル以上であり、平均４５４ミリ立法メートルであった。このような腫瘤が形成された後に投与してもヒト化ＨＦＥ７Ａは抗腫瘍効果を示した（表５）。
【００３８】
【表３】
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【００３９】
【表４】
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【００４０】
【表５】
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実施例２　ヒト化ＨＦＥ７Ａの抗腫瘍効果
１）Ｆａｓ由来細胞死誘導シグナル不全４３Ｔｂ細胞の作製
ヒト化ＨＦＥ７Ａの抗腫瘍細胞へのＦａｓを介した細胞死誘導の関与を調べる目的でｅｑｕｉｎｅ　ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　２　Ｅ８　ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｅ８）を以下に示すような方法で４３Ｔｂ細胞に導入し、Ｆａｓを介した細胞死誘導シグナルに不全のある細胞を作製した。
【００４１】
プラスミドｐＭＥ１８ＳおよびｐＭＥ１８Ｓｎｅｏは丸山和夫博士（東京医科歯科大学医学部衛生学教室）より入手した。ｐＭＥ１８ＳｎｅｏはｐＭＥ１８Ｓ（横田　崇ら編、「遺伝子導入と発現・解析法　バイオマニュアルシリーズ〈４〉」（１９９４年）羊土社、ｐ１４０参照）のＨｉｎｄＩＩＩサイトにプラスミドｐＳＶ２ｎｅｏ　（ＧｅｎＢａｎｋ：ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｕ０２４３４）より切り出したＳＶ４０プロモーターとネオマイシン耐性遺伝子を導入することによって作製することができる。なお、ｐＭＥ１８ＳへのＳＶ４０プロモーターとネオマイシン耐性遺伝子の導入の際に新たなＥｃｏＲＩサイト、ＮｏｔＩサイト、ＸｈｏＩサイト、ＳｃａＩサイトができないようにプラスミドを構築する。
【００４２】
プラスミドｐＭＥ−ｆｌａｇ−Ｅ８［ＯｈＹａｍａ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　（２０００）　４４，　ｐ２８９−２９７参照］を制限酵素ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで処理し、アガロースゲル電気泳動を行ない、Ｅ８蛋白（ｃａｓｐａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）をコードする遺伝子断片を回収した。これを、同じ制限酵素で処理したｐＭＥ１８Ｓｎｅｏにライゲーションし、プラスミドｐＭＥ１８Ｓｎｅｏ−Ｅ８を構築した。
【００４３】
２）Ｆａｓ細胞死誘導シグナル不全株の樹立
一方、ｐＭＥ１８Ｓｎｅｏ−Ｅ８　５０μｇを制限酵素ＳｃａＩによる制限酵素処理を行ない線状化し、フェノール、クロロフォルム処理により除蛋白した後に、エタノール沈殿を行った。沈殿を７０％エタノールおよび１００％エタノールで洗浄し、０．０５ｍｌのＫ−ＰＢＳ（３０．８ｍＭ　ＮａＣｌ，１２０．７ｍＭ　ＫＣｌ，８．１ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４，１．４７ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４，５ｍＭ　ＭｇＣｌ２）に溶解した。一方、４３Ｔｂ細胞　１０７個をＫ−ＰＢＳ０．５５ｍｌに懸濁しＧｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ　Ｃｕｖｅｔｔｅ　（電極幅２ｍｍ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）に移した。次に、Ｋ−ＰＢＳ　０．０５ｍｌに溶解した線状化したｐＭＥ１８Ｓｎｅｏ−Ｅ８を、４３Ｔｂ細胞のＫ−ＰＢＳ懸濁液に加えた。氷上で１０分間静置した後、Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用い、エレクトロポレーション法（電圧；２８０Ｖ，電気容量；９６０μＦＤ、抵抗；無限大）により遺伝子導入を行なった。
【００４４】
遺伝子導入処理を行った細胞はＲＰＭＩ−１６４０　ｍｅｄｉｕｍ　（ＳＩＧＭＡ社製）に終濃度１０％（ｖ／ｖ）のＦＥＴＡＬ　ＢＯＶＩＮＥ　ＳＥＲＵＭ　（ＳＩＧＭＡ社製）、終濃度　５０ｕｎｉｔ／ｍｌの結晶ペニシリンＧカリウム明治（明治製菓株式会社），終濃度２５０μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマシン（明治製菓株式会社），最終濃度４００μｇ／ｍｌのＧ４１８、二硫酸塩溶液を添加した培地を用いて、３７℃，５％炭酸ガス存在下で培養し、Ｆａｓ細胞死誘導シグナル不全細胞株ＡＴＬ−４３Ｔｂ（−）／Ｅ８を樹立した。
【００４５】
３）４３Ｔｂ細胞およびＡＴＬ−４３Ｔｂ（−）／Ｅ８細胞のヒト化ＨＦＥ７Ａに対する感受性（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）
細胞株としてＡＴＬ−４３Ｔｂ（−）／Ｅ８、ＡＴＬ−４３Ｔｂ（−）を用いた。細胞をヒト化ＨＦＥ７Ａ（１μｇ／ｍｌ）と室温で１時間反応させ、クロスリンクのため、０．１μｇ／ｍｌ抗ヒトＩｇＧ　抗体（ＢＩＯ　ＳＯＵＲＣＥ社製）存在下で培養し、２４、４８時間後の細胞生存率（％）をＭＴＴアッセイにより測定した。また、抗Ｆａｓ抗体ＣＨ１１（０．１μｇ／ｍｌ）（（株）医学生物学研究所、＃ＳＹ−００１）とＡＴＬ−４３Ｔｂ（−）／Ｅ８、ＡＴＬ−４３Ｔｂ（−）を２４、４８時間インキュベートした後の細胞生存率（％）を測定した。
結果を表６に示す。Ｆａｓ細胞死誘導シグナル不全細胞株ＡＴＬ−４３Ｔｂ（−）・Ｅ８に対するヒト化ＨＦＥ７Ａ、およびＣＨ−１１の細胞障害作用は親株のＡＴＬ−４３Ｔｂ（−）細胞に比べ著しく低下していた。これにより、ヒト化ＨＦＥ７Ａの細胞障害作用にはＦａｓを介したアポトーシスシグナル伝達系が関与していることが強く示唆された。また、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　では０．１μｇ／ｍｌのＣＨ−１１の方が、１μｇ／ｍｌのヒト化ＨＦＥ７Ａよりも強力な細胞障害活性を示したことから、ＣＨ−１１の方が　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　では細胞障害活性が強力であると推察された。
【００４６】
なお細胞生存率算出法の計算式は以下に示す。
細胞生存率（％）＝（（Ａ−Ｂ）／Ａ）×１００
Ａ：抗体未処理細胞群の平均吸光度（４５０ｎｍ）
Ｂ：抗体処理細胞群の平均吸光度（４５０ｎｍ）
【００４７】
【表６】
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４）Ｆａｓ細胞死誘導シグナル不全細胞株の生体内での感受性
ＳＣＩＤマウス（雌性、５週齢）の皮下に、ヒトＴ細胞白血病細胞株ＡＴＬ−４３Ｔｂ（−）／Ｅ８を１×１０７個移植した。被検化合物は、ＰＢＳに懸濁し、腫瘍細胞移植の１週間後　に８ｍｇ／ｋｇを尾静脈投与した。対照用化合物として、ヒトＩｇＧ（ＣＡＰＰＥＬ社製、コード＃５５９０８）を用いた。抗腫瘍活性は、移植３５日後の腫瘍の長径および短径を測定し、腫瘍体積を実施例１と同様の方法を用いて算出し、腫瘍増殖阻害率（ＧＩ％）を求めた（表７）。ヒト化ＨＦＥ７Ａは平均８１％の腫瘍像即阻害率を示し、生体内に投与した場合にはＦａｓを介したアポトーシス誘導以外の機構で強い抗腫瘍作用を有することが明らかとなった。
【００４８】
【表７】
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【００４９】
【発明の効果】本発明により、成人Ｔ細胞白血病治療剤として有用な新規医薬組成物が提供され、本発明の成人Ｔ細胞白血病治療用組成物は、成人Ｔ細胞白血病の治療剤として有用である。