(57)【要約】　　　（修正有）【課題】　ヒト免疫不全ウイルスタイプＩ（ＨＩＶ−Ｉ）の感染により生じる中枢神経系の障害の治療、ヒト免疫不全ウイルスに感染したヒト患者のＣＮＳニューロンの死滅を抑制する方法を提供する。【解決手段】　患者にｇｐ１２０に応答する該患者のＣＮＳの細胞内遊離Ｃａ＋＋イオン濃度の上昇を抑制しうる化合物を、抑制に有効な濃度で投与することよりなる方法。【効果】　ヒト免疫不全ウイルスの感染に伴う、痴呆、脊髄障害および視覚喪失を軽減することができる。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　カルシウムチャネル拮抗剤を除くＣａ＋＋透過性チャネルの拮抗剤であって、ヒト免疫不全ウイルスに感染したヒト患者のｇｐ１２０に応答するＣＮＳニューロン中の遊離Ｃａ＋＋イオン濃度の上昇を減少させることができる化合物を、該減少をひきおこすのに有効な濃度で含有してなる、ヒト免疫不全ウイルスに感染したヒト患者のＣＮＳニューロンの死滅を減少させる医薬組成物。
【請求項２】
　カルシウムチャネル拮抗剤を除くＣａ＋＋流入の拮抗剤であって、ヒト免疫不全ウイルスに感染したヒト患者のｇｐ１２０に応答するＣＮＳニューロン中の遊離Ｃａ＋＋イオン濃度の上昇を減少させることができる化合物を、該減少をひきおこすのに有効な濃度で含有してなる、ヒト免疫不全ウイルスに感染したヒト患者のＣＮＳニューロンの死滅を減少させる医薬組成物。
【請求項３】
　ヒト患者の血液がＨＩＶ−１に対する抗体を含む場合に使用される請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
　ヒト患者がエイズ関連併合症または後天性免疫不全症の症状を有する場合に使用される請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
　前記化合物を二種類、同一又は別々の容器に含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項６】
　前記化合物が血液−脳関門を通過することができるものである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項７】
　前記化合物がニモジピンである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項８】
　ニモジピンを患者に経口または静脈投与するための、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項９】
　前記化合物が患者の脳脊髄膜内にまたは硝子体内に投与される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項１０】
　前記化合物がニフェジピン、ベラパミル、ネトレンジピンまたはジルチアゼムの一種もしくは一種以上である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項１１】
　前記化合物がニカルジピン、フルナリジンまたはジプロテベリンである、請求項１または２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
　本発明はヒト免疫不全ウイルスタイプＩ（ＨＩＶ−Ｉ）の感染により生じる中枢神経系の障害の治療に関する。
【０００２】
　ヒトヘのＨＩＶ−Ｉ感染は、全身的免疫不全を生じそして、失明、脊髄障害、または発狂性の神経障害、即ちエイズ発狂性合併症のような他の症状も含まれ、これは感染の進行した段階の患者の症状の重要な原因である。ＨＩＶ−Ｉ感染はＣＮＳの種々の領域において報告されており、脳皮質、脊髄、および網膜が含まれる。プライス（Ｐｒｉｃｅ）ら（１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：５８６）およびホー（Ｈｏ）ら（１９８９，Ａｎｎａｌｓ　ｉｎ　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１１１：４００）は、エイズ発狂性合併症の臨床的、疫病学的、そして病理学的なまとめを行い、そして神経異常の原因のメカニズムは、感染細胞から放出されるウイルス由来または細胞由来の毒性物質による間接的組織破壊であろうと示唆している。
【０００３】
　ポメランツ（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ）ら（１９８７，Ｎｅｗ　Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１７：１６４３）は、二人のエイズ患者の網膜のＨＩＶ−Ｉ感染の存在を報告した。ブレネマン（Ｂｒｅｎｎｅｍａｎ）ら（１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３５：６３９）は、ＨＩＶの外皮蛋白質であるｇｐ１２０が、海馬のニューロンを殺すことを見出した。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の概要
　本発明は、ヒト免疫不全ウイルスに感染したヒト患者のＣＮＳニューロンの死滅を抑制する方法に関し、その方法は患者にｇｐ１２０に応答する該患者のＣＮＳの細胞内遊離Ｃａ＋＋イオン濃度の上昇を抑制しうる化合物を、抑制に有効な濃度で投与することよりなる。
【０００５】
　好ましくは、感染患者の血液は、ＨＩＶ−Ｉに対する抗体を含み、最も好ましくは、患者はエイズ関連合併症または後天性免疫不全症候群の症状を発現している。本発明の方法は、細胞内遊離Ｃａ＋＋イオン濃度の上昇を抑制することのできる第二の化合物の投与も含む。最も好ましい化合物は、血液−脳関門を通過することが可能なカルシウムチャネル拮抗剤であり、これらは経口的にまたは静脈を通して投与できる。そのような化合物のうちで、現在のところニモジピン（Ｎｉｍｏｄｉｐｉｎｅ）が最も好ましい。血液−脳関門を自由に通過しないカルシウムチャネル拮抗剤はそれ程好ましくはないが、そのような化合物は脳および／または脊髄の膜内に投与でき、または硝子体内から網膜に投与できる。そのなかで最も好ましい拮抗剤は、ニフェジピン（ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ）、ベラパミル（ｖｅｒａｐａｍｉｌ）、ニトレンジピン（ｎｉｔｒｅｎｄｉｐｉｎｅ）、ジルチアゼム（ｄｉｌｔｉａｚｅｍ）、ニカルジピン（ｎｉｃａｒｄｉｐｉｎｅ）、フルナリジン（ｆｌｕｎａｒｉｚｉｎｅ）およびジプロテベリン（ｄｉｐｒｏｔｅｖｅｒｉｎｅ）である。経口または静脈からの投与も効果的でありうる。
【０００６】
　本発明は、ヒト免疫不全ウイルスの感染に伴う、痴呆、脊髄障害および視覚喪失を軽減することができる。
　本発明の他の態様および利点は、以下の好ましい態様の記載および請求の範囲の記載から明らかにされる。
好ましい態様の説明
Ｃａ＋＋チャネル拮抗剤の選択
　一般に神経電位−依存性Ｃａ＋＋チャネルの任意の適当な拮抗剤を、エイズ関連視覚喪失、脊髄障害、または痴呆の軽減に使用可能である。好ましいカルシウムチャネル拮抗剤の非限定的例は、以下の薬剤であるが、中でも最も好ましいものは、血液脳関門を通過できるもので、例えば、ニモジピン（Ｍｉｌｅｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ウェストヘブン，ＣＴ）、スミスクラインドラッグＮｏ．９５１２（Ｓｍｉｔｈ　Ｋｌｉｎｅ，フレンチ−ビーチャム，フィラデルフィア，ＰＡ）、およびジプロテベリン（ｄｉｐｒｏｔｅｖｅｒｉｎｅ）（Ｓｍｉｔｈ　Ｋｌｉｎｅ，フレンチ−ビーチャム）である。好ましさが劣る拮抗剤はＣＮＳ通過性の低いもの、例えば、ペラパミル（ｖｅｒａｐａｍｉｌ），（Ｃａｌａｎ，Ｇ．Ｄ．Ｓｅａｒｌｅ社，シカゴ，イリノイ）、イソプチン（Ｉｓｏｐｔｉｎ）（Ｋｎｏｌｌ，ウィッパニー，ＮＪ）、ニトレンジピン（ｎｉｔｒｅｎｄｉｐｉｎｅ）、ジルチアゼム（ｄｉｌｔｉａｚｅｍ）（Ｃａｒｄｉｚｅｍ，Ｍａｒｉｏｎ，カンザスシティー，ＭＯ）およびニフェジピン（米国特許３，４８５，８４７，参照により本明細書に含まれる）（Ｐｒｏｃａｒｄｉａ，Ｐｆｉｚｅｒ，ＮＹ，ＮＹ；Ａｄａｌａｔ，Ｍｉｌｅｓ）である。有用と思われる他のＣａ２＋チャネル拮抗剤は、ミオフラジン（ｍｉｏｆｌａｚｉｎｅ）、フルナリジン（ｆｌｕｎａｒｉｄｉｎｅ）、ベプリジル（ｂｅｐｒｉｄｉｌ）、リドフラジン（ｌｉｄｏｆｌａｚｉｎｅ）、ＣＥＲＭ−１９６、Ｒ−５８７３５、Ｒ−５６８６５、ラノラジン（Ｒａｎｏｌａｚｉｎｅ）、ニソルジピン（Ｎｉｓｏｌｄｉｐｉｎｅ）、ニカルジピン（Ｎｉｃａｒｄｉｐｉｎｅ）、ＰＮ２００−１１０、フェロジピン（Ｆｅｌｏｄｉｐｉｎｅ）、アムロジピン（Ａｍｌｏｄｉｐｉｎｅ）、Ｒ−（−）−２０２−７９１およびＲ−（＋）−Ｂａｙ−Ｋ−８６４４（Ｍｉｌｅｓ，Ｂｙｅｒ）であり、これらの化学構造はボデッケ（Ｂｏｄｄｅｋｅ）らの「トレンヅインファーマコロジックサイエンシズ（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」，（１９８９）１０：３９７およびトリグル（Ｔｒｉｇｇｌｅ）らの「トレンヅインファーマコロジックサイエンシズ」（１９８９）１０：３７０に記載されている。
【０００７】
　どのカルシウムチャネル拮抗剤に関しても、ＨＩＶ−Ｉ（または他のＨＩＶ）の感染に伴う神経障害を防止するための有効性は、試験薬剤を神経細胞機能に対する次のアッセイの一つまたはそれ以上でスクリーニングして決定される。即ち、神経細胞死、ニューロン内での細胞内遊離Ｃａ２＋イオン濃度の検出、およびＣａ２＋チャネルを通過するイオンの流れの検出。有効な拮抗剤はＨＩＶ−Ｉ−関連のニューロン細胞の死滅を減少させ、ｇｐ１２０の存在下で生じる紹胞内Ｃａ２＋イオン濃度の上昇を抑制するであろう。それに加えて、有効な拮抗剤はニューロンのカルシウムチャネルを通過するＣａ＋＋イオンの流入をニューロン細胞の死滅を減少させるに十分だが、夫自体がニューロン細胞を死滅させるような完全なＣａ＋＋イオンの流入阻害を行わない程度に減少させるであろう。拮抗剤は、当業者によく知られている製剤技術を用いて医薬製剤に加工されるが、拮抗剤化合物の具体的剤形は投与経路によって定まる。
ニューロン細胞機能および死滅のアッセイ
　拮抗剤は本発明の方法における有用性を、以下のアッセイを用いて、慣用の技術で健全に単離できる細胞である限り中枢神経系の任意のタイプのニューロン細胞を用いて試験することができる。次のアッセイにおいては網膜培養を用いた（しかしながら、海馬の皮質ニューロンも例えばニューロンの死滅および細胞内カルシウムのアッセイで使用されている）。これを用いた理由は網膜培養は出生直後の哺乳類から得られ、十分に特性が調べられ、そして螢光標識で明瞭に同定可能な中枢ニューロンである網膜神経節細胞を含んでいるためである。培養中の網膜神経節細胞の実質的部分は、機能的シナプス活性を示すとともに、健全網膜中に見られる神経伝達物質のリセプターの全てではないとしても多くを含んでいるからである。
ｇｐ１２０はインビトロでニューロン細胞の死滅を増大する
　ニューロン細胞の死滅は、網膜の神経節細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで、精製した天然のまたは組換えのｇｐ１２０とともにインキュベートすることによりアッセイした。Ｃａ２＋チャネル拮抗剤がニューロン細胞の死滅を減少させる能力を、ｇｐ１２０および拮抗剤の両者と共にインキュベートした時の生存細胞を数えて決定した。
【０００８】
　出生直後のラットの網膜神経節細胞をつきとめ、その生存性を次のようにして確認した。全身麻酔の下で、蛍光色素のグラニュラーブルー（Ｍａｃｋｒｏｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃ，ウムスタット，ＦＲＧ）を、生理食塩水中の約２％（ｗ／ｖ）懸濁液として、４〜７日齢のロングエバンス（Ｌｏｎｇ　Ｅｖａｎｓ）ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ウィルミントン，ＭＡ）の上丘（ｓｕｐｅｒｉｏｒ　ｃｏｌｌｉｃｕｌｕｓ）に注射した。２〜７日後、動物を断頭して殺して眼球を摘出し、素早く網膜を取り出した。網膜細胞を分散させ、リプトン（Ｌｉｐｔｏｎ）ら，１９８７，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８５：３６１に記載されたように、イーグルの最少必須培地（ＭＥＭ，カタログ＃１０９０，Ｇｉｂｃｏ，グランドアイランド，ＮＹ）に０．７％（ｗ／ｖ）メチルセルロース、２ｍＭグルタミン，１μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１６ｍＭデキストロースおよび５％（ｖ／ｖ）ラット血清を添加した培地で培養した。次に細胞を３５ｍｍの組織培養皿内のポリ−Ｌ−リジンでコートした７５平方ミリメートルのガラスカバースリップ上にまき、次にｇｐ１２０を添加した。同じ条件の培養に、種々の用量のｇｐ１２０、ｇｐ１２０＋Ｃａ２＋チャネル拮抗剤を添加しまたは薬物を全く添加しないものも含めた。
【０００９】
　ｇｐ１２０の二種類の単離標品であるＲＦ２および３Ｂ（ブレネマン（Ｂｒｅｎｎｅｍａｎ）ら、１９８８，上記；Ｎａｔｕｒｅ　３３５；４４５）は、国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのフレデリック（Ｆｒｅｄｒｉｃｋ），ＭＤから入手し、ロベイ（Ｒｏｂｅｙ）ら（１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．，８３：７０２３）、パイル（Ｐｙｌｅ）ら（１９８８，ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．，３：３８７）およびコーンフェルド（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ）ら（１９８８，上記）に記載されたようにして、イムノアフィニティークロマトグラフィーで精製した。さらに、ｇｐ１２０−３Ｂをコードする遺伝子に由来する組換えｇｐ１２０は次のようにして得た。
【００１０】
　組換えｇｐ１２０はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞ライン（ＡＴＣＣ）を、アミノ酸６１−５３１（ラスキー（Ｌａｓｋｙ）ら，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：２０９）をコードする、単離された３Ｂエンベロープコード配列を含むプラスミドでトランスフェクトして製造した。遺伝子を切断して天然のアミノ末端シグナル配列およびカルボキシ末端トランスメンブレン領域を除去し、次いで、単純ヘルペスウイルスのグリコプロテイン−Ｄシグナル配列（ベルマン（Ｂｅｒｍａｎ）ら，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７：１４９０）に読み枠をあわせて連結し、エンベロープ蛋白質がＣＨＯ細胞により構成的に分泌されるようにした。哺乳類細胞内での製造は、エンベロープ蛋白質のグリコシル化を確実にした。このエンベロープグリコプロテイン，ｒｇｐ１２０−３Ｂはイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウェスタンブロッティングにより測定して１００万分の５（９９．９９５％）の純度にした。ｇｐ１２０の調製物は（低濃度では）非常に不安定で、活性を示すためには、新たに解凍したものでなければならず、再凍結は避けねばならない。
【００１１】
　細胞の生存は培養１日後にアッセイした。インキュベートは５％ＣＯ２／９５％空気の雰囲気中で３７℃において２０−２４時間行った。神経節細胞は、蛍光青色色素の継続的存在により明確に同定できた。網膜神経節細胞がフルオレセインダイアセテートを取り込んでフルオレセインに分解する能力を、細胞の生存活性の指標として用いた。この詳細は前記ハーン（Ｈａｈｎ）ら，１９８８に記載されている。色素の取り込みおよび分解は、点電極を用いた通常の電気生理学的特性と良く相関する。
【００１２】
　生存活性試験を行うため、細胞培養培地を０．０００５％のフルオレセインダイアセテートを含む生理食塩水に１５〜４５秒間交換し、そして細胞を生理食塩水で洗浄した。蛍光色素を含まず（したがって生きていない）網膜神経節細胞が、しばしば位相差顕微鏡およびＵＶ蛍光顕微鏡の両者で、観察できる状態に残っていた。これは、マーカー色素であるグラニュラーブルーが存在し続けるためである。他の死滅網膜神経節細胞は崩壊し、デブリスを残すのみであった。これに対して、観察可能な網膜神経節細胞はＵＶ光の中で青色を呈するだけでなく、フルオレセインに適するフィルターで黄緑をも呈した。したがって、二つの交換可能な蛍光フィルターを用いると、培養中の活性な生存神経節細胞を迅速に調べることが可能であり、そのような細胞は単一のニューロンとしてまたは他の細胞の間に小さい集団（クラスター）として認められた（通常、単独とクラスターの比率は約１：１０）。
【００１３】
　図１は、１０−９Ｍないし１０−１３Ｍ未満の範囲のｇｐ１２０濃度に対する用量反応曲線であり、天然の精製ｇｐ１２０（ＲＦ２）または組換えｇｐ１２０調製物と培養網膜細胞とのインキュベートが、２４時間以内に有意の数の神経節細胞の死滅を生じたことを示している。細胞死滅の有意な増加（Ｐ＜０．０１）は、ｇｐ１２０の２×１０−１２Ｍ以上の濃度で観察された。生存細胞は各培養物にいかなる処置を行ったか分からないようにして採点した。コントロール培養物のカウント数は７５平方ミリメートルのカバースリップ当たり９５ないし２５０の網膜神経節細胞であり、これは全網膜細胞数の約１％に相当した。各実験における各点は、少なくとも三連で行い、そしてデータは３回の実験の結果である。値は、平均値＋／−標準誤差で示す。統計分析のために、変数の一方向分析に続いて平均値のシェフェ（Ｓｃｈｅｆｆｅ）多次元比較を行った。これらの結果はこの実験におけるニューロン細胞の死滅がｇｐ１２０の添加に起因するものであることを示した。この結果を確認するために、コントロール実験を行い、ニューロン細胞の死滅がｇｐ１２０エンベロープ蛋白質に特異的な抗血清の添加により防止されることを認めた。
ｇｐ１２０抗血清がｇｐ１２０に伴うニューロン細胞死を防止する
　山羊抗−ｇｐ１２０免疫血清は、ｇｐ１２０−３Ｂ単離物の組換えフラグメントをフロインドのアジュバントと共に一次および二次筋肉内免疫して調製した。これらの免疫の前に免疫前血清を各ヤギから採取した。免疫後の血清中のｇｐ１２０抗体の存在は免疫的に精製したｇｐ１２０のポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウェスタンブロッティングにより確認した。
【００１４】
　図２は抗ｇｐ１２０血清が、組換えエンベロープ蛋白質（ｒｇｐ１２０−３Ｂ）によるラット網膜神経節細胞のニューロン細胞の殺滅を防止したことを示す。８日齢のラットの網膜培養を、２０ｐＭのｇｐ１２０とヤギＧ１０８４からのポリクローナルｇｐ１２０抗体を含む免疫後血清または同じヤギの免疫前血清との存在下または不存在下で、プレートにまいた。血清はコントロール増殖培地中で１：５００の濃度に希釈して用いた。図２は５回の独立のアッセイのデータである。誤差の棒は平均値からの標準誤差を示す。統計分析は前記のようにして行った。アッセイの結果は、抗ｇｐ１２０が精製ｇｐ１２０調製物の効果を中和することを示し、即ち２０ｐＭのｇｐ１２０で処理した培養物の細胞死が培養培地にヤギ抗−ｇｐ１２０血清を添加することで防止された。該抗体のみまたは免疫前血清のみでは、コントロール培養培地について観察された結果と比較して細胞の生存に有意な影響を与えなかった。これに対して、ｇｐ１２０またはｇｐ１２０と免疫前血清との添加は網膜神経節細胞の有意な殺滅をもたらした（ｐ＜０．０１）。さらに、ｇｐ１２０またはｇｐ１２０と免疫前血清で処理した培養物に比較して、二つの抗体調製物は、ｇｐ１２０に暴露された網膜神経節細胞を有意な割合で救済した（ｐ＜０．０１）。ｇｐ１２０の存在下における抗血清Ｇ１０８４での処理は、コントロール培地のみの中でインキュベートした培養物と統計的に差が無いニューロン細胞数をもたらした。これらの数値は、培養物中の単独細胞およびクラスター細胞の両者の結果を示すが、しかしながら、最も重要な結果はクラスター細胞の結果であり、何故ならニューロンは脳内で相互に連結しているからである。
ｇｐ１２０はＣａ２＋の細胞内濃度に影響する
　ｇｐ１２０−が促進する神経毒性は細胞内Ｃａ２＋濃度の増加を伴うことが以下の実験で示される。
【００１５】
　出生直後のラットの網膜神経節細胞および海馬ニューロン中の細胞内遊離Ｃａ２＋〔Ｃａ２＋〕の濃度を、Ｃａ２＋感受性螢光色素であるｆｕｒａ　２を用いてデジタル造映顕微鏡法で、以下のようにして測定した。網膜神経節細胞を１〜２周齢のロングエバンスラットから、ライファー（Ｌｉｅｆｅｒ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，３０３（１９８４）およびリプトン（Ｌｉｐｔｏｎ）ら，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３８５，３６１（１９８７）に記載されたようにして培養した。神経節細胞の同定は、分解的に移動した（ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅｌｙ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｄ）赤い螢光色素（ＤｉＩまたはローダミンで標識した微粒子）の存在により又は形態的および免疫螢光法による基準で（例えば、大型またはα−様神経節細胞は神経繊維抗体で染色される；リプトンら，Ｎａｔｕｒｅ，３０９，６２４，１９８４）行った。Ｃａ２＋の測定の間、特に記載しないかぎり、ニューロンを浸す浴液は、ハンクスのバランス塩溶液；１３６．７ｍＭ　ＮａＣｌ，１ｍＭ　ＮａＨＣＯ３，０．３４ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４，０．４４ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４，５．３６ｍＭ　ＫＣｌ，２．５ｍＭ　ＣａＣｌ２，０．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４，０．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ＮａＯＨ，２２．２ｍＭグルコースおよびフェニルレッド指示薬（０．００１％ｖ／ｖ）；ｐＨ７．２を用いた。外皮蛋白質のｇｐ１２０および他の材料は、通常、この浴液で希釈した後、注入によりニューロンに適用した。Ｋ＋の高濃度溶液は、ＮａＣｌをＫＣｌに置き換えて調製した。ニューロンの〔Ｃａ２＋〕の分析は、ｆｕｒａ　２−アセトキシ−メチルエステル（ＡＭ）を用いて、グリンキービッツ（Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，３４４０（１９８５）；ウィリアムズら，Ｎａｔｕｒｅ，３１８，５５８（１９８５）；コナーら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，７，１３８４（１９８７）；コナーら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，６４９（１９８８）；コーハンら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，７，３５８８（１９８７）；およびマットンら，同上，９，３７２８（１９８９）に記載されているようにして行った。１０μＭのｆｕｒａ　２−ＡＭを含むイーグルの最少必須培養液を網膜または海馬細胞のニューロンに添加した後、培養物を３７℃において、５％ＣＯ２／空気の湿潤チャンバー内でインキュベートして、次いで軽く洗った。安定な螢光比率および測定する〔Ｃａ２＋〕に対するＣａ２＋イオノフォアイオノマイシンの効果で決定した通り、色素を負荷し、捕捉し、そして１時間以内に脱エステル化た。Ｃａ２＋のイメージングの間、細胞はハンクスのバランスソルトを含むＨＥＰＥＳ−緩衝化塩溶液の中でインキュベートした。〔Ｃａ２＋〕ｉは、ツァイスアクショバート（Ｚｅｉｓｓ　Ａｘｉｏｖｅｒｔ）３５顕微鏡に設置したＤＡＧＥ　ＭＴＩ　６６　ＳＩＴカメラで、３５０および３８０ｎｍで励起された５００ｎｍの螢光を測定して得られたイメージの割合から計算した。各写真の露出時間は５００ｍｓである。分析は、カリフォルニア州サニーベールのクォンテックス（Ｑｕａｎｔｅｘ）ＱＸ７−２１０映像処理システムで行った。細胞はデータの採取の間のみ紫外線に暴露したので��概ね細胞当たり合計２０秒以下）、ｆｕｒａ　２の色あせは最小限であった。前記のようにして、組換え源からの高度精製ｇｐ１２０を２００ｐＭ適用すると、〔Ｃａ２＋〕が驚異的に増加した（図３）。外皮蛋白質の添加の前に得たコントロールのレベル（Ｃａ２＋＝６３±４ｎＭ，平均±ＳＥＭ，ｎ＝４２）と比較すると、ｇｐ１２０の適用７分以内にレベルが３３倍増大した（２１００±３３０ｎＭ，ｎ＝１０；値の範囲９３４〜３９４３ｎＭ）。天然単離物（ＲＦ２および３Ｂ）から精製した他のｇｐ１２０調製物も同様の結果を生じた。ここに示した全ての実験は、高度精製租換えｇｐ１２０を用いた。
【００１６】
　ｇｐ１２０を海馬ニューロンに適用したときも同様の結果が観察された。ＣＤラットの１８日齢胎児の海馬皮質をトリプシン（０．０２７％ｗ／ｖ）で分散し、３５ｍＭの培養皿当たり６００，０００細胞の密度でまき、その際、各皿にはポリ−Ｌ−リジンでコートしたガラスのカバースリップを５枚存在させた。増殖培地〔ローゼンベルクら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，Ｌｅｔｔ．，１０３，１６２（１９８９）〕は、１週間に３回交換した。これらの実験において、Ｃａ２＋の測定は培養の１４から２１日に行った。概括的に述べると、２００ｐＭのｇｐ１２０は試験したニューロン（ｎ＝７５）の７６％において〔Ｃａ２＋〕の増加を生じた。
【００１７】
　いくつかの実験が、ｇｐ１２０がこの〔Ｃａ２＋〕ｉの増大の原因であることを示唆した。普通の浴液は〔Ｃａ２＋〕ｉの変化を生じなかったが、続いて同じ網膜神経節細胞ニューロンにｇｐ１２０を添加すると、〔Ｃａ２＋〕ｉが〜２μＭに増大した（ｎ＝１０）。ｇｐ１２０をトリプシンで処理して大豆トリプシンインヒビター（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．）で中和すると、もはや〔Ｃａ２＋〕ｉの増大活性をしめさなかった。ｇｐ１２０は、単純ヘルペスウイルスのグリコプロテインＤシグナル配列を含む構造から製造されたものであるため、組換えｇｐ１２０の場合と全く同じ培地中に調製したグリコプロテインＤを網膜神経節細胞に添加した（ｎ＝６）。グリコプロテインＤは全く効果がないか又は〔Ｃａ２＋〕を若干増大させた（＜２００ｎＭ，ｎ＝６）が、しかしこれは同モル量のｇｐ１２０を添加した後に典型的に観察されるマイクロモルレベルまでの増大ではなかった。
【００１８】
　これらのニューロンに５０ｎＭ　ＫＣｌを注入すると〔Ｃａ２＋〕を６００ｎＭの範囲（６００±９９ｎＭ，ｎ＝５）に増大させた。ＫＣｌに対する３０秒ないし３分間の短時間暴露がこのようなレベルのＣａ２＋を生じ、最大値には添加開始から１．５分以内に到達し、その後の数分間に〜２５０ｎＭのレベル（２４０±２１ｎＭ，ｎ＝５）に回復した。これに対して〔Ｃａ２＋〕の増大を少しでも引き起こすためには、２００ｐＭのｇｐ１２０は最低１分間の添加が必要であり、しかもその効果は持続的で、単一細胞において実験の間中不可逆であった（３０秒間隔で測定しながら、〔Ｃａ２＋〕を１０ないし３０分間モニターした結果）。種々の用量のｇｐ１２０を３分間適用して誘発された〔Ｃａ２＋〕ｉの変化の時間経過を図３Ａに示す。最大レベルには添加開始後〜７分で到達している。したがって、Ｋ＋に応答する〔Ｃａ２＋〕の増大観察結果はｇｐ１２０の場合とは質的にも量的にも相違した。
【００１９】
　極度に低いｇｐ１２０の用量（ピコモル量）が、段階的、用量依存的な〔Ｃａ２＋〕の増大に有効であった（図３Ｂ）。２０ｐＭという少量のｇｐ１２０が〔Ｃａ２＋〕ｉの増大を生じた。ｇｐ１２０の２００ｐＭまたはそれ以上の濃度で、非常に高レベルの遊離Ｃａ２＋（≧２μＭ）が得られた。
【００２０】
　ｇｐ１２０で観察された〔Ｃａ２＋〕の増大が、ウイルスエンベロープ蛋白質の精製調製物中の夾雑物に起因する可能性は依然として否定できないかもしれないが、高度精製組換えｇｐ１２０においてはそのようなことは考えられない。さらなる証明として、本発明者らは、プロテインＡ−をコートしたセファロースビーズに結合したｇｐ１２０に対するヤギ抗体（抗−ｇｐ１２０）を用いた免疫沈降試験を行った。
【００２１】
　ｇｐ１２０の免疫沈降は上記の方法に若干の変更を加えて行った。１：１００または１：５００希釈の抗−ｇｐ１２０または同じヤギからの免疫前血清を、プロテインＡ−をコートしたセファロースビーズに結合し、洗浄し、そして７ｎＭのｇｐ１２０を含む溶液で４℃にて１８時間インキュベートし、遠心分離した。免疫前血清で処理した材料の上清は、ｇｐ１２０活性を有し、このことはイムノブロッティングにより、および〔Ｃａ２＋〕濃度および細胞死の増大を生じる（１：３５０希釈して〜２０ｐＭにしたとき）ことから確認された；抗−ｇｐ１２０に暴露した材料は、殆どまたは全く活性を示さなかった。
【００２２】
　そのような実験３回のうちの一つの結果が図４に示されている。免疫前血清での処理は、ｇｐ１２０が〔Ｃａ２＋〕ｉを増大する能力を有意には変化させなかった（斜線棒と灰色棒を比較せよ；平均〔Ｃａ２＋〕ｉは免疫前血清で処理されたｇｐ１２０の適用後においてｇｐ１２０単独後よりも高いが、この相違は統計的有意には達していない。ｇｐ１２０および免疫前血清処理ｇｐ１２０の両者ともにコントロールに比べて有意な〔Ｃａ２＋〕の増大を生じた（ｐ＜０．０１，シェフェによる平均値の多次元比較による偏差分析（ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｖａｒｉａｎｃｅ（ＡＮＯＶＡ）））；有意性はアステリクスで示されている）。これに対して、抗−ｇｐ１２０を含む免疫後血清で免疫沈降を行うと、ｇｐ１２０の効果を完全に排除した（図右の最終カラム）。
ｇｐ１２０が促進するニューロン細胞の死滅はカルシウムチャネル拮抗剤で防止される
　ニフェジピン（５００ｎＭ−１μＭ）は網膜神経節細胞に対する天然ｇｐ１２０単離物３ＢおよびＲＦ２の致死作用に拮抗する。図５において、培養物にｇｐ１２０（２０ｐＭ）および／またはニフェジピン（１０μＭ）を、プレートにまくときに添加し、１日後にニューロン細胞の生存をアッセイした。各値は４連の組織培養皿で得られた平均値である。コントロール群のクラスター状網膜神経節細胞は、ｇｐ１２０で処理したものよりも有意に大きかった（ｐ＜０．０１）。ｇｐ１２０処理培養物に比較して、ニフェジピンの添加は網膜神経節細胞の生存を有意に増大した（ｐ＜０．０１）。コントロールに比較して、１０μＭのニフェジピン単独への暴露は細胞の死滅をもたらした（ｐ＜０．０５）が、ｇｐ１２０単独の場合に観察されたのと同程度ではなかった。さらにまた、２２回の試行のうち２０回において、同様の実験は、ｇｐ１２０とニフェジピンとの処理により網膜神経節細胞の生存が、ｇｐ１２０単独（３ＢおよびＲＦ２天然単離物並びに組換え３Ｂ体を含む）と比較して増大したことが示された（有意性ｐ＜０．００１，Ｓｉｇｎ検定）。
【００２３】
　図５ａに示すように、ｇｐ１２０−３Ｂとともに１０μＭのニフェジピンを培養培地にインキュベートのときに添加すると、ｇｐ１２０−３Ｂ単独で処理した培養物に比較して、ニューロンの殺滅が有意に減少した。ニフェジピンは同様にして、他の精製ｇｐ１２０単離物であるＲＦ２によるニューロンの殺滅も軽減した（図５ｂ）。興味深いことは、６回の実験の５回において（各回３連または４連のサンプルを使用）１０μＭのニフェジピンがコントロールに比較してそれ自体有意な細胞殺滅を示した事実にもかかわらず、上記防止効果が観察されたことである。事実、６回の全ての実験において、ｇｐ１２０とニフェジピンとで処理した培養皿は、ニフェジピン単独よりも高いレベルの生存率を有した（ｐ＜０．０５，Ｓｉｇｎ検定）。この現象に対する一つの可能な説明は、ニューロンの健康と快適に必要な細胞内Ｃａ２＋の最適レベルが存在するという仮説を誘導する。少なすぎるＣａ２＋は（ここでニフェジピンの存在で認められたように）生存を阻止し、他方、過剰量のＣａ２＋もまた細胞の死滅をもたらすのであろう（ｇｐ１２０がＣａ２＋の流れに及ぼす影響としてここで証明されたように）。これらの二つの両極端の間で（コントロールのＣａ２＋の値またはｇｐ１２０とニフェジピンの共存下でのＣａ２＋濃度）、生存が増大するのであろう。別の可能性として、ニフェジピン単独ではこれとは無関係な他のなんらかの理由で、これらのニューロンに毒性である可能性もあるが、そうとすれば、１０μＭニフェジピン単独にくらべてｇｐ１２０と１０μＭニフェジピンとの併用において生存が若干良好であったという上記発見を説明するのが困難である。
【００２４】
　ｇｐ１２０処理に続くニューロン生存に対するカルシウムチャネル拮抗剤の低用量を用いた場合の効果が図６に示されている。図６Ａにおいて、低用量（１μＭ）のニフェジピンが、該カルシウムチャネル拮抗剤自体による網膜神経節細胞の生存の実質的抑制なしに、ｇｐｌ２０（２０ｐＭ）の致死作用に拮抗している。処理された培養物をプレートにまくときに、ｇｐ１２０−３Ｂ（２０ｐＭ）および／またはニフェジピン（１μＭ）を添加し、１日後に網膜神経節細胞の生存をアッセイした。ｇｐ１２０でのインキュベートは、コントロールの同時培養物に比べてニフェジピン細胞の殺滅をおこした（ｐ＜０．０１）。１μＭニフェジピン単独の存在は、１０μＭの場合（図５で観察された）に比べて網膜神経節細胞の生存に対する悪影響が少なかった。したがって、この用量−応答曲線を詳細に検討して、それ自身による細胞死を最小限としつつｇｐ１２０の毒性を実質的に阻止するに最適のカルシウムチャネル拮抗剤のレベルを見つけることが可能である。
【００２５】
　ＨＩＶ−Ｉ感染に起因するニューロン細胞の死滅を減少させるための治療方法には、他の特異的カルシウムチャネル拮抗剤、例えばニフェジピンよりも優れたＣＮＳ透過性を有するニモジピン（アレンら，１９８３，Ｎｅｗ　Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０８：６１９）の使用も含まれる。図６ｂは１μＭのニモジピンによる処理で、クラスター状の網膜神経節細胞がｇｐ１２０−誘発殺滅から有意に救済されたことをしめす（ｐ＜０．０１）；しかしながら、１０μＭのニフェジピンで観察された（図５）のと同様に、１μＭのニモジピンはそれ自身による殺滅を生じた。図６はニフェジピンの濃度を１μＭまで低下させた時、ｇｐ１２０−誘発細胞死滅の減少を依然として生じることを示しており、そしてこの濃度におけるニフェジピン単独処理ではニューロン細胞の殺滅は生じないことを示している。これらを併せて考察すると、ニフェジピンによる結果とニモジピンによる結果は、明らかにカルシウムチャネル阻害剤の用量が重要な因子であることを証明している；濃度が高すぎると、ｇｐ１２０の不在下で正常ニューロンを害するようである。
【００２６】
　図７は、ｇｐ１２０とインキュベートした網膜神経節細胞における細胞内遊離Ｃａ２＋イオン濃度に対する１００ｎＭのニモジピンの効果を示している。細胞には前記のようにしてｆｕｒａ　２を負荷した。ウイルスエンベロープ蛋白質ｇｐ１２０（２００ｐＭ）を、通常培地または１００ｎＭ〜１μＭのニモジピンを含む培地中で予め数分間加温しておいたニューロンにピペットで添加した。図７において通常のカルシウム培地で加温したニューロンに対して、ｇｐ１２０は予測どおり〔Ｃａ２＋〕の増大をもたらした（○；ｎ＝１０）。これに対して、ニモジピンでの処理の後は、ｇｐ１２０は〔Ｃａ２＋〕の有意な増大を生じなかった（■；ｎ＝１１）。
ｇｐ１２０の存在下におけるイオンの流れがカルシウムチャネル拮抗剤で阻害される
　以下の、ニューロン細胞機能アッセイは、Ｃａ２＋チャネルを通過するＣａ２＋イオンの流れに対するカルシウムチャネル拮抗剤の効果を試験する。ｇｐ１２０が細胞の死滅を増大させるメカニズムに関する理論に縛られるものではないが、ｇｐ１２０がＣａ２＋チャネルを通過するイオンの流れを増大させる可能性がある。ｇｐ１２０に伴なう細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇を減少させることのできる化合物のスクリーニングにおける念のための手段として、次のＣａ２＋の流れのアッセイをｇｐ１２０の存在下で行う必要がある。
【００２７】
　図８は、網膜神経節細胞中において、ｇｐ１２０の存在下でニフェジピンがＣａ２＋の流れを抑制することをしめす。図８ａにおいて、別のニューロン中で、２０ｐＭのｇｐ１２０−ＲＦ２の添加の間に、カルシウムチャネルを通過してＢａ２＋により運ばれる流れに対して、ニフェジピン（１０μＭ）が部分的に拮抗した。これら三つの追跡は全てｇｐ１２０の存在下で行った。ニフェジピンによる阻害が特に顕著であった（５３％減少）のは、電位ステップ（このケースでは，ＶＣ＝−１０ｍＶ）を脱分極保持電位（ＶＨ＝４０ｍＶ）から開始した場合であった；この観察結果は、他の組織におけるＣａ２＋の流れに対するカルシウムチャネルブロッカーの作用と一致している。図８ｂは図８ａと同様の細胞に対するＩ−Ｖ関係を示し、２０ｍＭ　ｇｐ１２０−ＲＦ２の連続的存在下において、種々の試験電位でのニフェジピンの効果を説明する。記録条件は電荷運搬成分としてバリウムを用いている。Ｃａ２＋の流れに対する拮抗のための濃度範囲は、ニモジピン（１００ｎＭ〜１０μＭ）においてもニフェジピン（１００ｎＭ〜１０μＭ）と同様の値が得られた。
他のニューロンもｇｐ１２０に感受性である
　もう一つの重要な考慮事項は、網膜神経節細胞以外の哺乳類中枢神経内のＣａ２＋レベルもｇｐ１２０に感受性で、したがってカルシウムチャネルブロッカーによる治療が可能かどうかである。ミラー（１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：４６）は、種々の脳領域からのニューロンの９０％以上において、ジヒドロピリジン類がＣａ２＋の流入に少なくともある程度は影響するが、しかしながら、これらの薬剤の有効性に領域による相違があることを示唆した。例えばフェニルアルキルアミンのような他のクラスのカルシウムチャネル拮抗剤について、異なる脳領域における有効性が証明されることはありうる。例えば、海馬ニューロン中のＣａ２＋の流れは、ベラパミル（１００μＭ）で部分的に抑制されることが示されている（ヤーリら，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：６８０）；さらにまた、新規カルシウムチャネルブロッカーまたはＧ蛋白質およびそれらの効果に影響する細胞内メッセンジャー類も、この点の有用性が証明される可能性がある（オリベラら，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：３３８；ドルフィンら，９８７，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，８６：１；およびヤーリら，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１２８８）。ミラー（前述）は、海馬ニューロンは線状体ニューロンに比べて、カルシウムチャネル拮抗剤に対する感受性が大きいことを示した。この相違は、おそらくＣａ２＋流れの長期成分（Ｌ−型流れに類似する）のみがジヒドロピリジン類に感受性であることに起因するのであろう。
用途
　本発明の拮抗剤は、多くの経路の中の任意の一つで投与可能であり、例えば、ニモジピンまたはスミスクラインドラッグＮｏ．９５１２、ニカルジピン、フルナリジンまたはジプロテベリンのようなＣＮＳ−通過性拮抗剤においては、経口または静注で、６０〜１２００ｍｇ／日を分割して投与することになるであろう。ＣＮＳの通過性がこれより劣る拮抗剤については投与はカテーテルまたは硝子体を通して行われるであろうが、しかしながら、経口または静注投与も特に患者の血液−脳関門に損傷が存在するときは有効であろう；ニフェジピンは２０〜８００ｍｇ／日の用量で投与され、ベラパミルは８０〜７２０ｍｇ／日の用量で投与され、そしてジルチアゼムは６０〜９６０ｍｇ／日の用量で投与される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は種々のｇｐ１２０濃度において網膜神経節細胞の死を示す用量反応曲線である。
【図２】図２は組換えｇｐ１２０および抗血清の存在下における網膜細胞の生存のグラフである。
【図３】図３（ａ）は、種々の用量のｇｐ１２０に応答する網膜神経節細胞内の細胞内遊離Ｃａ２＋濃度（〔Ｃａ２＋〕ｉ）のカイネティックのグラフであり、そして（ｂ）は、静的状態におけるｇｐ１２０濃度と〔Ｃａ２＋〕の用量−反応グラフである。
【図４】図４は、ｇｐ１２０単独もしくはｇｐ１２０抗血清で免疫沈降したｇｐ１２０の存在下において、ｇｐ１２０により促進される〔Ｃａ２＋〕の上昇の棒グラフである。
【図５】図５は、ｇｐ１２０および／または１０μＭニフェジピンの存在下における網膜細胞生存のグラフである。
【図６】図６は、ｇｐ１２０および／または１μＭのニフェジピンまたはニモジピンの存在下における網膜細胞の生存のグラフである。
【図７】図７は、ｇｐ１２０および細胞内Ｃａ２＋チャネル拮抗剤のニモジピンの存在下における〔Ｃａ２＋〕のグラフである。
【図８】図８（ａ）は、ニフェジピンおよびｇｐ１２０の存在下において、カルシウムチャネルを通過する流れを示し、そして（ｂ）は該流れと電位の関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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