(57)【要約】【課題】本発明は、簡便で効率よく光学純度の高いＬ−アミノ酸を得る新規な方法を提供することを課題の一つとし、フェニル基上に置換基を持つ桂皮酸誘導体や複素環を有するアクリル酸誘導体を原料として、簡便で効率よく光学純度の高いＬ−アミノ酸を得る新規な方法を提供することを課題の一つとする。【解決手段】微生物、および動物由来のヒスチジンアンモニアリアーゼに、従来知られる、ウロカニン酸よりヒスチジンを与える反応以外に、様々なアクリル酸誘導体に対し光学選択的にアミノ基を付加する活性があり、該ヒスチジンアンアンモニアリアーゼを用いることにより、上記課題を解決可能となった。【選択図】　　　　　なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）
【化１】
2004041107.tif 000038
（但し、式中Ｚはヘテロ原子を含んでいてもよい芳香環基を、Ｒは該芳香環上の置換基を表し、ｎは０以上の整数を表し、ｎが２以上の場合、Ｒは同一または相異なっていてもよい。但し、Ｚがイミダゾールであり、且つｎが０の場合を除く。）
で示されるアクリル酸誘導体に、アンモニアの存在下、ヒスチジンアンモニアリアーゼを作用させることを特徴とする、下記式（２）
【化２】
2004041107.tif 000039
（但し、式中Ｚはヘテロ原子を含んでいてもよい芳香環基を、Ｒは該芳香環上の置換基を表し、ｎは０以上の整数を表し、ｎが２以上の場合、Ｒは同一または相異なっていてもよい。但し、Ｚがイミダゾールであり、且つｎが０の場合を除く。）
で示されるＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項２】
Ｒｎ−Ｚ−が下記式（３）
【化３】
2004041107.tif 000040
（但し、Ｒは、ベンゼン環上の置換基であり、シアノ基、水酸基、カルボキシル基、アミド基、ハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基、ヒドロキシメチル基、炭素数１〜６のアルキル基または炭素数１〜６のアルコキシ基を表す。ｎは０〜５の整数を表し、ｎが２以上の場合、Ｒは同一または相異なっていてもよい。）
で示される請求項１に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項３】
Ｒの少なくとも一つが、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基およびニトロ基であることを特徴とする請求項２に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項４】
ｎが１であることを特徴とする請求項３に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項５】
Ｒｎ−Ｚ−が下記式（４）
【化４】
2004041107.tif 000041
（但し、式中ＸはＳ、Ｏ、ＮＨまたはＮＲ１を表し、Ｒ１は炭素数１〜６のアルキル基を表し、式中ＹはＮ、ＣＨまたはＣＲ２を表す。Ｒ、Ｒ２は、シアノ基、水酸基、カルボキシル基、アミド基、ハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基、ヒドロキシメチル基、炭素数１〜６のアルキル基または炭素数１〜６のアルコキシ基を表す。ｎは０〜３の整数を表し、ｎが２以上の場合、Ｒは同一または相異なっていてもよく、ＲとＲ２は同一または相異なっていてもよく、隣り合うＲ、Ｒ２は互いに結合し、炭素数１〜６であるヘテロ原子を含んでよい環を形成してもよい。但し、ＸがＮＨであり、且つＹがＮであり、且つｎが０の場合を除く。）
で示される請求項１に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項６】
ＹがＣＨであることを特徴とする請求項５に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項７】
ｎが０であり、且つＸがＳ、ＯまたはＮＨであることを特徴とする請求項６に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項８】
Ｒｎ−Ｚ−が下記式（５）
【化５】
2004041107.tif 000042
（但し、式中Ｒはヘテロ環上の置換基であり、シアノ基、水酸基、カルボキシル基、アミド基、ハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基、ヒドロキシメチル基、炭素数１〜６のアルキル基または炭素数１〜６のアルコキシ基を表す。ｎは０〜４の整数を表し、ｎが２以上の場合、Ｒは同一または相異なっていてもよく、隣り合うＲは互いに炭素数１〜６であるヘテロ原子を含んでよい環を形成してもよい。）
で示される請求項１に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項９】
ｎが０であることを特徴とする請求項８に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１０】
ヒスチジンアンモニアリアーゼを、ヒスチジンアンモニアリアーゼを含む微生物の培養物、該培養物の処理組成物および／または該培養物より得られる酵素の形態で作用させることを特徴とする請求項１ないし９のいずれかに記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１１】
ヒスチジンアンモニアリアーゼを含む微生物が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属のいずれかから選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１０に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１２】
ヒスチジンアンモニアリアーゼを含む微生物が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＪＣＭ６１５６であることを特徴とする請求項１０に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１３】
ヒスチジンアンモニアリアーゼを含む微生物が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＩ１１３であることを特徴とする請求項１０に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１４】
ヒスチジンアンモニアリアーゼを含む微生物が、ヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子により形質転換された微生物であることを特徴とする請求項１０に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１５】
ヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＪＣＭ６１５６由来のアミノ酸配列と９８％以上の相同性を有する配列をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１４に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１６】
ヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子が微生物に由来するものであることを特徴とする請求項１４に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１７】
ヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子の由来となる微生物が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｖｉｂｒｉｏ属およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属のいずれかから選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１６に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１８】
ヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子の由来となる微生物が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＪＣＭ６１５６であることを特徴とする請求項１６に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１９】
ヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子の由来となる微生物が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＩ１１３であることを特徴とする請求項１６に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項２０】
ヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子が動物に由来するものであることを特徴とする請求項１４に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項２１】
動物が、マウス、ラット、ヒトのいずれかであることを特徴とする請求項２０に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項２２】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＪＣＭ６１５６由来のヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子がコードするアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する配列をコードする遺伝子、該遺伝子を含むプラスミド、および該プラスミドで形質転換された形質転換微生物。
【請求項２３】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＪＣＭ６１５６由来のヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子、該遺伝子を含むプラスミド、および該プラスミドで形質転換された形質転換微生物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒスチジンアンモニアリアーゼの作用によりアクリル酸誘導体にアンモニアを付加し、対応する光学活性アミノ酸を得る製造方法に関する。光学活性アミノ酸は、医薬、農薬、その他精密化学品の合成原料として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性アミノ酸を得る方法としては、不斉触媒を利用した有機合成的反応、また微生物の特異性を生かした発酵的製造方法が多数検討されている。
【０００３】
たとえば、アンモニアリアーゼを、アンモニアの存在下アクリル酸誘導体に作用させ、アクリル酸基のα位炭素にアミノ基を付加し、Ｌ−アミノ酸を得る方法が知られている。これは生物の持つ、本来アミノ酸からのアンモニア脱離反応を触媒する酵素の逆反応を利用するものである。たとえば、桂皮酸に、微生物由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼあるいは該酵素活性を有する微生物体を作用させ、光学選択的に光学活性フェニルアラニンを得る方法は、英国特許第１４８９４６８号、特開昭５３−９６３８８号公報等、多数報告されている。これらは高アンモニア濃度下、同酵素の作用により桂皮酸のα−炭素にアミノ基を付加する反応を利用したものであり、光学純度よくＬ−フェニルアラニンを生成することができる。
【０００４】
アンモニアリアーゼによりＬ−アミノ酸を得る方法は、有機合成的な手法に比べ、穏和な反応条件による副反応の回避と高転化率、高い光学選択性、などの優れた特性を持つ。特に医薬分野においては、遺伝子情報をベースとする生体内での物質動態や情報伝達の解析が進み、ドラッグデザイン手法の多様化が進んでいる昨今、生体物質アナログとして様々な非天然型のＬ−アミノ酸を用いた応用研究事例が増大している。こうした用途に求められる高純度の非天然Ｌ−アミノ酸を得るために、上記のようにアンモニアリアーゼによる反応は好適である。たとえば米国特許第５９８１２３９号ではロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属微生物のフェニルアラニンアンモニアリアーゼを用いたアクリル酸誘導体よりＬ−アミノ酸の製造方法が開示されている。また、特開昭６３−１４８９９２号公報ではフッ素化フェニル基を有する桂皮酸誘導体を原料とし、同酵素の作用により光学活性フッ素化フェニルアラニンを得る方法が開示されている。またＰｏｐｐｅらは、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　５：５１２−５２４（２００１）において、フェニルアラニンアンモニアリアーゼの基質特異性について論じている。しかしながら実用上は、対象となる化合物が一部のフェニル置換体に限られている、また工業的に十分な検討がなされていない、などの課題があった。
【０００５】
フェニルアラニンアンモニアリアーゼに類似の、不斉アミノ付加を触媒する酵素としては、ヒスチジンアンモニアリアーゼの存在が知られている。ヒスチジンアンモニアリアーゼは、動物、およびバクテリアの広範に分布していることが知られている。
【０００６】
バクテリアではＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属などにその反応が確認されており、類縁の種々のアンモニアリアーゼとの関連も含めて、その構造や反応機構についても多数の検討がなされてきた。
【０００７】
一方動物では、ヒスチジンアンモニアリアーゼは、ヒト、マウス、ラット等で詳細に検討されているが、普遍的に存在すると考えられている。体内におけるヒスチジン代謝に必須の酵素であり、特にヒトにおいて、その遺伝的欠損にもとづく先天性代謝異常、いわゆるヒスチジン血症のメカニズムや治療をめぐり医学的、生理学的に詳細な検討がなされてきた。
【０００８】
さらに、ヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子（以下「ｈａｌ遺伝子」と記載する）もまた、既に多くのものが報告されている。すなわち、微生物由来では、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ　（２００１），　２９４，　２３１７−２３２３．）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８８），　１７０，　３１９９−３２０５．）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　（２０００），　２８，　４３１７−４３３１．）、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ　ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．（２００１），　９８，　４１３６−４１４１．）、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９），　２８６，　１５７１−１５７７．）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ（Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９０），　１７２，　２２２４−２２２９．）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｎａｔｕｒｅ（２０００），　４０６，　９５９−９６４．）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ（Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９２），　１７４，　１６４７−１６５５．）、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ　ｄａｔａｂａｓｅｓ　ａｓ　Ｏ３１１９７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．（２００１），　９８，　４６５８−４６６３．）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ　ｄａｔａｂａｓｅｓ　ａｓ　Ｑ９ＥＷＷ１）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＷＯ２００１０７９４６９）などが知られている。動物由来では、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（１９９５），　２９，　９８−１０４．）、Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（１９９３），　１６，　２３１−２４０．）、Ｒａｔｔｕｓ　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ラット、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．（１９９０），　２６５，　１８１９２−１８１９９．）などが報告されている。これらの遺伝子の幾つかは、適当な発現ベクターを用いて発現させる試みがなされており、点突然変異法などの方法により酵素の触媒反応機構の研究が既に報告されている（ＷＯ２００１０７９４６９，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９４），　３３，　６４６２−６４６７．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．（１９９０），　２６５，　１８１９２−１８１９９．）。
【０００９】
このようにヒスチジンアンモニアリアーゼについては多くの研究報告が存在するにもかかわらず、該酵素を用いた物質生産という観点からの試みは、ウロカニン酸よりＬ−ヒスチジンの製造方法について特開昭６３−１４８９９２号公報、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，　１６２，　１：９８（１９８５）などいくつかの開示例が見られる他はほとんど知られていない。また該酵素のヒスチジンまたはウロカニン酸以外の化合物に対する基質特異性については、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，　８７，　１：３４３（１９７９）　においてニトロヒスチジン、またＴｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２５０，　１３：５０３３（１９７５）においてはフルオロヒスチジンに対するアンモニア脱離活性、またフルオロウロカニン酸に対するアンモニア付加反応によるフルオロヒスチジン生成について論じられている例があるのみである。このように、該酵素を用いたアミノ基付加による非天然Ｌ−アミノ酸生成の反応に関する報告はごく限られており、特に工業生産の観点からの実用検討の事例は知られていない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、簡便で効率よく、多様な、光学純度の高いＬ−アミノ酸を得る新規な方法を提供することを課題の一つとし、種々の置換基を持つアクリル酸誘導体を原料として、簡便で効率よく、多様な、光学純度の高いＬ−アミノ酸を得る新規な方法を提供することを課題の一つとする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、様々な置換基を持つアクリル酸誘導体に対し、立体選択的アミノ基付加反応を触媒することができるアンモニアリアーゼを、動植物、微生物の生物界全般を対象とし探索した。
【００１２】
その結果、本発明者らは微生物、および動物由来のヒスチジンアンモニアリアーゼに、従来知られる、ウロカニン酸よりヒスチジンを与える反応以外に、様々なアクリル酸誘導体に対し立体選択的にアミノ基を付加する活性があることを見出した。先述したように、ヒスチジンアンモニアリアーゼの関与する生体内でのヒスチジンの代謝反応については詳細に検討がなされており、またその逆反応によるヒスチジンの生成反応についても知られていたが、ヒスチジン以外の、非天然アミノ酸を含む種々のアミノ酸生成の可能性についてはほとんど検討されていなかった。
【００１３】
本発明者らはさらに鋭意研究を重ねた結果、種々の微生物、動物由来のヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子を高発現する微生物を用いることにより非常に高い効率でアミノ酸を製造しうることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち本発明は例えば下記の項目からなる。
［１］下記式（１）
【化６】
2004041107.tif 000002
（但し、式中Ｚはヘテロ原子を含んでいてもよい芳香環基を、Ｒは該芳香環上の置換基を表し、ｎは０以上の整数を表し、ｎが２以上の場合、Ｒは同一または相異なっていてもよい。但し、Ｚがイミダゾールであり、且つｎが０の場合を除く。）
で示されるアクリル酸誘導体に、アンモニアの存在下、ヒスチジンアンモニアリアーゼを作用させることを特徴とする、下記式（２）
【化７】
2004041107.tif 000003
（但し、式中Ｚはヘテロ原子を含んでいてもよい芳香環基を、Ｒは該芳香環上の置換基を表し、ｎは０以上の整数を表し、ｎが２以上の場合、Ｒは同一または相異なっていてもよい。但し、Ｚがイミダゾールであり、且つｎが０を除く。）
で示されるＬ−アミノ酸の製造方法。
【００１５】
［２］Ｒｎ−Ｚ−が下記式（３）
【化８】
2004041107.tif 000004
（但し、Ｒは、ベンゼン環上の置換基であり、シアノ基、水酸基、カルボキシル基、アミド基、ハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基、ヒドロキシメチル基、炭素数１〜６のアルキル基または炭素数１〜６のアルコキシ基を表す。ｎは０〜５の整数を表し、ｎが２以上の場合、Ｒは同一または相異なっていてもよい。）
で示される［１］に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
［３］Ｒの少なくとも一つが、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基およびニトロ基であることを特徴とする［２］に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
［４］ｎが１であることを特徴とする［３］に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【００１６】
［５］Ｒｎ−Ｚ−が下記式（４）
【化９】
2004041107.tif 000005
（但し、式中ＸはＳ、Ｏ、ＮＨまたはＮＲ１を表し、Ｒ１は炭素数１〜６のアルキル基を表し、式中ＹはＮ、ＣＨまたはＣＲ２を表す。Ｒ、Ｒ２は、シアノ基、水酸基、カルボキシル基、アミド基、ハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基、ヒドロキシメチル基、炭素数１〜６のアルキル基または炭素数１〜６のアルコキシ基を表す。ｎは０〜３の整数を表し、ｎが２以上の場合、Ｒは同一または相異なっていてもよく、ＲとＲ２は同一または相異なっていてもよく、隣り合うＲ、Ｒ２は互いに結合し、炭素数１〜６であるヘテロ原子を含んでよい環を形成してもよい。但し、ＸがＮＨであり、且つＹがＮであり、且つｎが０の場合を除く。）
で示される［１］に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
［６］ＹがＣＨであることを特徴とする［５］に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
［７］ｎが０であり、且つＸがＳ、ＯまたはＮＨであることを特徴とする［６］に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【００１７】
［８］Ｒｎ−Ｚ−が下記式（５）
【化１０】
2004041107.tif 000006
（但し、式中Ｒはヘテロ環上の置換基であり、シアノ基、水酸基、カルボキシル基、アミド基、ハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基、ヒドロキシメチル基、炭素数１〜６のアルキル基または炭素数１〜６のアルコキシ基を表す。ｎは０〜４の整数を表し、ｎが２以上の場合、Ｒは同一または相異なっていてもよく、隣り合うＲは互いに炭素数１〜６であるヘテロ原子を含んでよい環を形成してもよい。）
で示される［１］に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
［９］ｎが０であることを特徴とする［８］に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【００１８】
［１０］ヒスチジンアンモニアリアーゼを、ヒスチジンアンモニアリアーゼを含む微生物の培養物、該培養物の処理組成物および／または該培養物より得られる酵素の形態で作用させることを特徴とする［１］ないし［９］のいずれかに記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
［１１］ヒスチジンアンモニアリアーゼを含む微生物が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属のいずれかから選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする［１０］に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
［１２］ヒスチジンアンモニアリアーゼを含む微生物が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＪＣＭ６１５６であることを特徴とする［１０］に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。［１３］ヒスチジンアンモニアリアーゼを含む微生物が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＩ１１３であることを特徴とする［１０］に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
［１４］ヒスチジンアンモニアリアーゼを含む微生物が、ヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子により形質転換された微生物であることを特徴とする［１０］に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【００１９】
［１５］ヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＪＣＭ６１５６由来のアミノ酸配列と９８％以上の相同性を有する配列をコードする遺伝子であることを特徴とする［１４］に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
［１６］ヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子が微生物に由来するものであることを特徴とする［１４］に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
［１７］ヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子の由来となる微生物が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｖｉｂｒｉｏ属およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属のいずれかから選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする［１６］に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【００２０】
［１８］ヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子の由来となる微生物が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＪＣＭ６１５６であることを特徴とする［１６］に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
［１９］ヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子の由来となる微生物が、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＩ１１３であることを特徴とする［１６］に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
［２０］ヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子が動物に由来するものであることを特徴とする［１４］に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
［２１］動物が、マウス、ラット、ヒトのいずれかであることを特徴とする［２０］に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【００２１】
［２２］Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＪＣＭ６１５６由来のヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子がコードするアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する配列をコードする遺伝子、該遺伝子を含むプラスミド、および該プラスミドで形質転換された形質転換微生物。
［２３］Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＪＣＭ６１５６由来のヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子、該遺伝子を含むプラスミド、および該プラスミドで形質転換された形質転換微生物。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下本発明について詳細に説明する。
【００２３】
本発明のＬ−アミノ酸の製造方法は、種々の置換基を有してもよく、またヘテロ原子を含んでもよい芳香環基を有するアクリル酸誘導体より、光学活性なアミノ酸を、１段階の酵素反応で簡便に得ることができるものである。
【００２４】
あらかじめ芳香環基に導入された置換基、例えばシアノ基、水酸基、カルボキシル基、アミド基、ハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基、ヒドロキシメチル基、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基は、本発明の温和な反応条件下では影響を受けることなく反応の終了まで保持され、対応する所望のＬ−フェニルアラニン誘導体をほぼ１００％の変換率で収率よく得ることができる。
【００２５】
また、本発明のＬ−アミノ酸の製造方法は、複素環構造を有するアクリル酸誘導体より、複素環構造を有する光学活性なアミノ酸を、一段の酵素反応で簡便に得ることができる。
【００２６】
当該アクリル酸誘導体中のフリル基、チエニル基、ピロリル基、イミダゾリル基等の複素環構造は、本発明における温和な反応条件下では影響を受けることなく反応の終了まで保持され、対応する所望のＬ−アミノ酸をほぼ１００％の変換率で収率よく得ることができる。
【００２７】
なお本発明の反応原料となる、種々の置換基を有するアクリル酸誘導体は、任意の置換基が導入されたアルデヒド誘導体のアルデヒド基と無水酢酸を作用させる、いわゆるパーキン反応による方法（Ａｒｃｈ．　Ｐｈａｒｍ．　（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）　（１９９４），　３２７（１０），　６１９−６２５等を参照）、もしくはピリジン溶媒中、ピペリジンの存在下マロン酸などを作用させる方法（Ｊ　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　（１９３９），　３５７−３６０等を参照）、ほか種々の改良された方法（Ｓｙｎｔｈ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　（１９９９），　２９（４），　５７３−５８１等を参照）等を適用することにより調製される。
【００２８】
本発明の実施形態の一つとしては、培養されたヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を持つ微生物の培養物を用いる。本発明における微生物の培養物とは微生物を培養した液および該培養液から微生物菌体のみを取り出した微生物菌体も示す。
【００２９】
本発明において適用される、ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を提供する微生物に特に制限はない。該酵素活性を有することが知られる微生物の具体例としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の各属の微生物が挙げられる。
【００３０】
さらに本発明の異なる実施形態の一つとしては、ｈａｌ遺伝子を微生物に導入して発現可能に存在させた、形質転換微生物を用いることもできる。
【００３１】
本発明で用いるｈａｌ遺伝子は、天然に存在するｈａｌ遺伝子の他、同じ機能を有する（同じ活性の変異体酵素をコードする）遺伝子であってもよい。該酵素遺伝子の由来生物からの単離、および該遺伝子を用いた形質転換微生物の作成方法、また該形質転換微生物より該酵素を分取する方法等については、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａを用いた事例としてＬａｎｇｅｒらの報告（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９４），　３３，　６４６２−６４６７．）、またラットを用いた事例としてＴａｙｌｏｒらの報告（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．（１９９０），　２６５，　１８１９２−１８１９９．）が知られる。
【００３２】
ｈａｌ遺伝子の取得法、発現可能なプラスミドの作製法、及びこれらのプラスミドの各種生物への導入・発現法の例についてさらに詳しく説明する。
【００３３】
＜ｈａｌ遺伝子の取得法＞
動物由来のｈａｌ遺伝子は、公知の手法により作成したｃＤＮＡライブラリーから、ｈａｌ遺伝子の既知配列に相当する部分断片をプローブとして取得することができるが、対象によってはＡＴＣＣのごとき遺伝子バンクから当該ｃＤＮＡを入手することもできる。ｃＤＮＡライブラリーの作成には、まずｍＲＮＡを単離精製する必要があり、従来の方法によっても可能であるが、近年では組織から簡便にｔｏｔａｌＲＮＡを取得できるキットなども販売されている。ｃＤＮＡは、取得されたｔｏｔａｌＲＮＡまたはここからｏｌｉｇｏＴカラムなどによって単離したｍＲＮＡを鋳型にし、Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを用いて得ることができる。こうして得たｃＤＮＡを適当なプラスミドベクター、例えばｐＢＲ３２２やｐＵＣ１８などに接続し、宿主とする大腸菌を形質転換する。
【００３４】
上記のようにして作成したｃＤＮＡライブラリーから目的のｈａｌ遺伝子を取得するには、ｈａｌ遺伝子の保存配列をコードするオリゴＤＮＡをプローブとして用いたコロニーハイブリダイゼーション法により得ることができる。
【００３５】
一方、微生物由来のｈａｌ遺伝子は、公知の手法により作成したｇｅｎｏｍｅＤＮＡライブラリーから、ｈａｌ遺伝子の保存配列に相当する部分断片をプローブとして取得することができる。ｇｅｎｏｍｅＤＮＡライブラリーの作成に必要なｇｅｎｏｍｅＤＮＡの取得には、従来の方法を用いて得ることもできるが、近年では微生物菌体から効率的にｇｅｎｏｍｅＤＮＡを取得できるキットなども販売されている。こうして得たｇｅｎｏｍｅＤＮＡを適当なプラスミドベクター、例えばｐＢＲ３２２やｐＵＣ１８などに接続し、宿主とする大腸菌を形質転換する。
【００３６】
上記のようにして作成したｇｅｎｏｍｅＤＮＡライブラリーから目的のｈａｌ遺伝子を取得するには、ｈａｌ遺伝子の保存配列をコードするオリゴＤＮＡをプローブとして用いたコロニーハイブリダイゼーション法により得ることができる。
【００３７】
さらに配列既知なものに関しては末端配列に相当する部分断片をプライマーとして、ｃＤＮＡあるいはｇｅｎｏｍｅＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法を行うことにより容易に十分な量のｈａｌ構造遺伝子断片を得ることができる。こうして得たｈａｌ遺伝子を適当なプラスミドベクター、例えばｐＢＲ３２２やｐＵＣ１８などに接続し、宿主とする大腸菌を形質転換する。
【００３８】
＜発現プラスミドの作製法および製造に用いる組換え微生物の作製法＞
ｈａｌ遺伝子は適当なベクター（具体例は後述）により、大腸菌等の細菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等の酵母等の微生物、好ましくは大腸菌等の細菌に導入し、発現させることにより、目的のＬ−アミノ酸生成活性を有する組換え体を得ることができる。生成したＬ−アミノ酸は、後述するように微生物反応生成物を反応物から分離するための通常の方法により単離精製することができる。
外来遺伝子を含むプラスミドの作製法、大腸菌等の微生物へのプラスミドの導入および発現のための手順ないし方法は、遺伝子工学の分野で慣用されている方法（たとえば、”Ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｇｅｎｅｓ”，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，　２１６，　ｐ．　４６９−６３１，　１９９２，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　、および、”Ｏｔｈｅｒ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｓｙｓｔｅｍｓ”，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，　２０４，　ｐ．３０５−６３６，　１９９　１，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ参照）に準じて実施すればよい。
【００３９】
大腸菌大腸菌への外来遺伝子（ｈａｌ遺伝子群）の導入法は、ハナハンの方法、ルビジウム法などすでに確立されたいくつかの効率的方法があり、それを用いて行えばよい（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．，　Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．　Ｆ．，　Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．，　”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　−Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ．”　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９参照）。大腸菌での外来遺伝子の発現は常法に従って行えばよいが（たとえば、前述の　”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　−　Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ．”参照）、たとえば、ｐＵＣ　系やｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　系等のｌａｃ　のプロモーター等を有する大腸菌用ベクターを用いて行うことができる。本発明者等は、ｔｒｃプロモーターを有する大腸菌用ベクターｐＴｒｃ９９Ａを用いて、プロモーターの下流にｈａｌ遺伝子を挿入し、大腸菌で発現させた。
【００４０】
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅへのｈａｌ遺伝子の導入法は、リチウム法などすでに確立された方法があり、それを用いて行えばよい（たとえば、秋山裕一監修バイオインダストリー協会編集、「酵母のニューバイオテクノロジー」医学出版センター刊参照）。酵母での外来遺伝子の発現は、ＰＧＫ　やＧ　ＰＤ　（ＧＡＰ）等のプロモーターおよびターミネーターを用いて、外来遺伝子をこのプロモーターとターミネーターの間に転写制御を受けるように挿入した発現カセットを構築し、この発現カセットを、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのベクター、たとえば、ＹＲｐ　系（酵母染色体のＡＲＳ　配列を複製起点とする酵母用マルチコピーベクター）、ＹＥｐ　系（酵母の２　　μｍ　ＤＮＡ　の複製起点を持つ酵母用マルチコピーベクター）、ＹＩｐ　系（酵母の複製起点を持たない酵母染色体組込み用ベクター）等のベクターに挿入することにより行うことができる（前述の「酵母のニューバイオテクノロジー」医学出版センター刊、日本農芸化学会ＡＢＣ　シリーズ「物質生産のための遺伝子工学」朝倉書店刊　参照）。
【００４１】
＜ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性微生物の培養＞
本発明に関連する微生物（形質転換微生物を含む）の培養は、微生物の一般的な培養法に準じて行うことができる。
【００４２】
微生物を培養するための培地炭素源としては、微生物が炭素源とすることができるもの、例えばグルコースやシュークロース、フルクトース、廃糖蜜等の糖類、エタノールや酢酸、クエン酸、コハク酸、乳酸、安息香酸、脂肪酸などの有機物又はこれらのアルカリ金属塩、ｎ−パラフィンなどの脂肪族炭化水素類、また例えばペプトン、肉エキス、魚エキス、大豆粉、ふすま、麦芽抽出物、ジャガイモ抽出物等の天然有機物を、単独あるいはこれらの組み合わせにより、通常０．０１％〜３０％、好ましくは０．１％〜１０％程度の濃度で用いることができる。例えば大腸菌の形質転換微生物を用いる場合、グルコース、ペプトン、肉エキス、麦芽抽出物等が好適に用いられる。
【００４３】
微生物（形質転換微生物を含む）を培養するための培地窒素源としては、微生物が窒素源とすることができるもの、例えば硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素化合物、また尿素、尿酸などの含窒素有機物、ペプトン、肉エキス、魚エキス、大豆粉、麦芽抽出物、ジャガイモ抽出物等の天然有機物を、単独あるいはこれらの組み合わせにより、通常０．０１％〜３０％、好ましくは０．１％〜１０％程度の濃度で用いることができる。例えば大腸菌を形質転換微生物として用いる場合には、硫酸アンモニウム、ペプトン、肉エキス、麦芽抽出物等が好適に用いられる。
【００４４】
さらに必要に応じて、リン酸２水素カリウム等のリン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、酢酸カルシウム、塩化マンガン、硫酸銅、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、硫酸ニッケルなどの金属塩が菌の生育改善のために添加される。添加濃度は培養条件により異なるものの、通常、リン酸塩に関しては０．０１％〜５％、マグネシウム塩においては１０ｐｐｍ〜１％、他の化合物では０．１ｐｐｍ〜１０００ｐｐｍ程度である。また選択する培地により、ビタミン類、アミノ酸、核酸などの供給源として例えば酵母エキス、カザミノ酸、酵母核酸を１ｐｐｍ〜１００ｐｐｍ程度添加することにより、菌の生育を改善することができる。
【００４５】
また培養中、必要に応じ、ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を高めるために、培養液中に酵素誘導源として、Ｌ−ヒスチジンを１０ｐｐｍ〜１％程度添加することができる。
【００４６】
形質転換微生物においては、必要に応じ、形質転換に供された該酵素遺伝子を宿主微生物で高度に発現させるため、ベクターの発現プロモーターに対応する誘導物質を培養中に添加することができる。例えばＬａｃプロモーターを用いる場合はＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ程度、またアンピシリンやカナマイシン等の薬剤耐性プロモーターを用いる場合は対応する薬剤を０．１ｐｐｍ〜１０００ｐｐｍ程度添加する。
【００４７】
いずれの組成を用いた場合も培養のｐＨは、５〜９、好ましくは５．５〜８に調整される。培養液はそのまま反応に供することができるが、上記のごとき培地であらかじめ培養された微生物菌体を、遠心分離、膜ろ過などの方法により培養液から分取し、反応に供することは、培養液から持ち込まれる夾雑物を低減し、のちの生成物の分取を簡便にするために有用である。
【００４８】
培養して得た微生物は、そのまま遠心分離や膜分離など公知の方法により回収して、あるいは培養液そのものを目的反応に供することができる。
【００４９】
本発明の異なる実施形態の一つとしては、微生物（形質転換微生物を含む）より分離されたヒスチジンアンモニアリアーゼを用いる。すなわち、微生物より酵素を分離精製するための公知の方法、たとえば破砕した微生物菌体の画分からアセトン分画沈澱、硫安沈澱、各種分離カラムなどの常法により分離精製された該酵素を反応触媒として供することができる。種々の微生物からの具体的なヒスチジンアンモニアリアーゼの分離精製法としては、たとえばＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ属微生物について特開昭５０−２４４８８号公報、またＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微生物についてのＫｌｅｅらの報告、（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２４５，　３１４３−３１５２（１９７０））等が知られる。
【００５０】
また本発明の異なる実施形態の一つとして、前記のごとき微生物（形質転換微生物を含む）の処理物を、目的反応に供する。微生物の処理物としては、例えば微生物の摩砕物・凍結乾燥物や微生物菌体からの無細胞抽出液、さらに抽出液から目的反応を触媒する成分を濃縮・抽出したもの、また、これら微生物体の処理物や抽出液、抽出成分を、難溶性の担体に固定化したもの、等を反応に供することができる。このような目的に供される固定化担体としては、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリ−Ｎ−ビニルホルムアミド、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン、メチルセルロース、グルコマンナン、アルギン酸塩、カラギーナン等、さらにこれらの（架橋）重合物など、微生物もしくはその抽出成分を包合した水難溶性の固形分を形成するような化合物を、単独もしくは混合して用いることができる。また、活性炭、多孔質セラミックス、グラスファイバー、多孔質ポリマー成型体、ニトロセルロース膜など、あらかじめ固形物として形成された物体上に形質転換微生物もしくはその抽出液、抽出成分を保持させたものを用いることもできる。
【００５１】
＜ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性によるＬ−アミノ酸生成反応＞
本発明における、Ｌ−アミノ酸の生成反応は、以上のごとく種々の公知の方法で調製されるヒスチジンアンモニアリアーゼを作用させることによりなされる。反応原料としてアクリル酸誘導体濃度は、好ましくは１ｐｐｍ〜２０％、より好ましくは１０ｐｐｍ〜１０％であり、またアンモニアを終濃度として２Ｍ〜１２Ｍとなるよう添加することが好ましい。さらにｐＨを８〜１１に調整するのが好ましく、より好ましくは８．５〜１０．５である。反応時間は基質により異なるが、通常１時間〜２００時間程度反応することにより達せられる。ここにいうヒスチジンアンモニアリアーゼを作用させるとは、ヒスチジンアンモニアリアーゼを含む微生物の培養物、該培養物の処理組成物、該培養物より得られる酵素のいずれか、または、それらの混合物を作用させることをいい、微生物の培養物とは、培養液、培養物中の微生物菌体そのものも含み、菌体を分離して使用してもよい。更に、ヒスチジンアンモニアリアーゼを含む微生物としては、微生物、動物より単離された該酵素遺伝子で形質転換された微生物でもよい。
【００５２】
反応のｐＨを調整するために用いる酸としては、硫酸、塩酸、リン酸、ホウ酸、炭酸等の無機酸、また蟻酸、酢酸、プロピオン酸等の有機酸及びこれらの塩を用いることができる。この際、揮発性の酸を用いることは、反応液の除菌と留去により、脱塩の工程を省き簡便に生成物を分取することができ、有用である。このような酸としては炭酸が好適である。この場合の炭酸とは、二酸化炭素として水溶液中にバブリング等により溶解し、解離により生成する炭酸を含む。またこれらの酸とアンモニアの塩を、反応液へのアンモニア源として用いることもでき、上記のような理由からアンモニア源の一部または全部として炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウムを用いることは好適である。
【００５３】
なお添加されるアクリル酸誘導体は必ずしも全量が溶解していなくてもよいが、反応液中での溶解性や分散性を改善するような溶媒、界面活性剤等を添加することもできる。また反応の進行による化合物の消費に応じて、連続的あるいは間欠的に化合物を添加してもよく、この場合の化合物の反応液中濃度は前記の限りではない。
【００５４】
反応液中に生成したＬ−アミノ酸は、その反応液中での性状により、遠心分離、膜ろ過、減圧乾燥、蒸留、溶媒抽出、塩析、イオン交換、各種クロマトグラフィーなど公知の方法で分取される。簡便には、以下のようにして達せられる。例えば、反応液からろ過、遠心、透析等により酵素、酵素処理物、形質転換微生物やその処理物を除去後、溶媒抽出、または反応液を酸性に調整し未反応の原料アクリル酸誘導体を析出させ、沈殿を除去する。
【００５５】
得られた上清のｐＨを再度、Ｌ−アミノ酸の等電点付近に調整し析出する誘導体を同様に回収する。このようにして反応液より生成物を収率・純度よく回収することができる。また、あらかじめ反応液から蒸留などにより余剰のアンモニアを除去すること、等電点での生成物の回収率を向上するために水を留去し濃度を高めておくこと等は有用である。
【００５６】
さらに簡便には、反応液のｐＨ調整を、揮発性の酸により実施する。変換率が十分高い場合は除菌後そのまま、また原料が多量に残存する場合は酸性として溶媒抽出し除去した後に水・酸塩基を留去することにより、生成物をＬ−アミノ酸のアンモニウム塩として単離することができる。このような方法に適した揮発性の酸としては炭酸及びそのアンモニウム塩が好適である。
【００５７】
反応生成物の性質によっては、反応液中に生成物が蓄積することにより、反応速度が低下する場合がある。このような場合は、生成物の濃度に応じて反応液中に、アンモニアを含む水、生理食塩水、反応緩衝液を追加し連続的に希釈してゆく方法は好適である。また反応速度が低下した時点で菌を分取し、上清を生産物溶液として回収し、分取した菌は再度反応原料を含む溶液あるいは懸濁液に戻すことにより、反応速度を回復することができる。これらの方法は、微生物のアンモニアリアーゼ活性が維持される範囲において、何回でも繰り返すことができる。
【００５８】
本発明の原料となる好適な化合物は、下記式（１）
【００５９】
【化１１】
2004041107.tif 000007
（但し、式中Ｚはヘテロ原子を含んでいてもよい芳香環基を、Ｒは該芳香環上の置換基を表し、ｎは０以上の整数を表し、ｎが２以上の場合、Ｒは同一または相異なっていてもよい。但し、Ｚがイミダゾールであり、且つｎが０の場合を除く。）で示されるアクリル酸誘導体である。（１）式のアクリル酸部分の二重結合に対するＺとＣＯＯＨ基の立体配置はトランス、シスのいずれでも原料として使用し可能であるが、好ましくはトランス体である。
【００６０】
また、得られる化合物は、下記式（２）
【００６１】
【化１２】
2004041107.tif 000008
（但し、式中Ｚはヘテロ原子を含んでいてもよい芳香環基を、Ｒは該芳香環上の置換基を表し、ｎは０以上の整数を表し、ｎが２以上の場合、Ｒは同一または相異なっていてもよい。但し、Ｚがイミダゾールであり、且つｎが０の場合を除く。）
で示されるＬ−アミノ酸である。
【００６２】
前記式中、一価以上の基であるＺとしては、たとえば下記式（６）〜（９）
【００６３】
【化１３】
2004041107.tif 000009
で表される芳香環からなる基、下記式（１０）〜（１３）
【００６４】
【化１４】
2004041107.tif 000010
で表される芳香環からなる基、下記式（１４）〜（１９）
【００６５】
【化１５】
2004041107.tif 000011
で表される芳香環からなる基、下記式（２０）〜（２３）
【００６６】
【化１６】
2004041107.tif 000012
で表される芳香環からなる基、下記式（２４）〜（２８）
【００６７】
【化１７】
2004041107.tif 000013
で表される芳香環からなる基、下記式（２９）〜（３２）
【００６８】
【化１８】
2004041107.tif 000014
で表される芳香環からなる基、下記式（３３）〜（３６）
【００６９】
【化１９】
2004041107.tif 000015
で表される芳香環からなる基、下記式（３７）〜（４０）
【００７０】
【化２０】
2004041107.tif 000016
で表される芳香環からなる基、下記式（４１）〜（４５）
【００７１】
【化２１】
2004041107.tif 000017
で表される芳香環からなる基等が挙げられる。
【００７２】
Ｒとしては、シアノ基、水酸基、カルボキシル基、アミド基、ハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基、ヒドロキシメチル基、炭素数１〜６のアルキル基または炭素数１〜６のアルコキシ基等が挙げられる。芳香環の種類にもよるが、好ましくは、シアノ基、水酸基、ハロゲン原子、ニトロ基、メチル基、エチル基、メトキシ基、エトキシ基が挙げられる。
【００７３】
ｎは、０以上で、芳香環の置換しうる位置の数から１を引いた数以下である整数とすることができる。ｎが２以上の場合には、Ｒは同一または相異なっていてもかまわない。
【００７４】
また本発明の原料となる好適な化合物は、前記式（１）において、Ｒｎ−Ｚ−が下記式（３）
【００７５】
【化２２】
2004041107.tif 000018
（但し、Ｒは、ベンゼン環上の置換基であり、シアノ基、水酸基、カルボキシル基、アミド基、ハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基、ヒドロキシメチル基または炭素数１〜６のアルキル基もしくはアルコキシ基を表す。ｎは０〜５の整数を表し、ｎが２以上の場合、Ｒは同一または相異なっていてもよい。）で示される化合物が挙げられる。
【００７６】
また、好適に得られる化合物は、前記式（２）において、Ｒｎ−Ｚ−が前記式（３）（但し、Ｒ、ｎは、前記に同じ意味を表す。）で示される化合物が挙げられる。
【００７７】
好ましくは、前記式（１）、（２）において、Ｒが、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基およびニトロ基であり、更に好ましくは、Ｒが、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基およびニトロ基であり、ｎが１である。
【００７８】
このような化合物の具体例としては２−シアノ桂皮酸、３−シアノ桂皮酸、４−シアノ桂皮酸、２−ヒドロキシ桂皮酸、３−ヒドロキシ桂皮酸、４−ヒドロキシ桂皮酸、３、４−ジヒドロキシ桂皮酸、２−ニトロ桂皮酸、３−ニトロ桂皮酸、４−ニトロ桂皮酸、２−カルボキシ桂皮酸、３−カルボキシ桂皮酸、４−カルボキシ桂皮酸、２−アミノ桂皮酸、３−アミノ桂皮酸、４−アミノ桂皮酸、２−クロロ桂皮酸、３−クロロ桂皮酸、４−クロロ桂皮酸、２−フルオロ桂皮酸、３−フルオロ桂皮酸、４−フルオロ桂皮酸、２−ブロモ桂皮酸、３−ブロモ桂皮酸、４−ブロモ桂皮酸、２−メチル桂皮酸、３−メチル桂皮酸、４−メチル桂皮酸、２−メトキシ桂皮酸、３−メトキシ桂皮酸、４−メトキシ桂皮酸、４−イソプロピル桂皮酸、４−ｔ−ブチル桂皮酸、等が挙げられる。
【００７９】
例えばＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＩ１１３由来酵素を用いた場合、原料として２−シアノ桂皮酸、４−シアノ桂皮酸、２−メチル桂皮酸、３−メチル桂皮酸、４−メチル桂皮酸、２−メトキシ桂皮酸、３−メトキシ桂皮酸、４−メトキシ桂皮酸は好適であり、それぞれ２−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、２−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、３−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、４−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、２−メトキシ−Ｌ−フェニルアラニン、３−メトキシ−Ｌ−フェニルアラニン、４−メトキシ−Ｌ−フェニルアラニン等が得られる。
【００８０】
また特に、本発明の原料となる好適な化合物は、前記式（１）において、Ｒｎ−Ｚ−が下記式（４）
【００８１】
【化２３】
2004041107.tif 000019
（但し、式中ＸはＳ、Ｏ、ＮＨまたはＮＲ１を表し、Ｒ１は炭素数１〜６のアルキル基を表し、式中ＹはＮ、ＣＨまたはＣＲ２を表し、Ｒ、Ｒ２は、シアノ基、水酸基、カルボキシル基、アミド基、ハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基、ヒドロキシメチル基、炭素数１〜６のアルキル基または炭素数１〜６のアルコキシ基を表す。ｎは０〜３の整数を表し、ｎが２以上の場合、Ｒは同一または相異なっていてもよく、ＲとＲ２は同一または相異なっていてもよく、隣り合うＲ、Ｒ２は互いに結合し、炭素数１〜６であるヘテロ原子を含んでよい環を形成してもよい。但し、ＸがＮＨであり、且つＹがＮであり、且つｎが０の場合を除く。）が挙げられる。
【００８２】
また得られる化合物は、前記式（２）において、Ｒｎ−Ｚ−が前記式（４）
（但し、式中Ｘ、Ｙ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、ｎは、前記と同じ意味を表す。）で示されるＬ−アミノ酸である。
【００８３】
好ましくは前記式（１）、（２）でＹがＣＨであり、更に好ましくは、ＹがＣＨであり、且つｎが０であり、且つＸがＳ、ＯまたはＮＨである。
【００８４】
このような化合物の具体例としてはβ−（２−フリル）アクリル酸、β−（３−フリル）アクリル酸、β−（２−チエニル）アクリル酸、β（３−チエニル）アクリル酸、β−（２−ピロリル）アクリル酸、β−（３−ピロリル）アクリル酸等が挙げられる。
【００８５】
例えばＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＩ１１３由来酵素を用いた場合、原料としてβ−（２−フリル）アクリル酸、β−（３−フリル）アクリル酸、β−（２−チエニル）アクリル酸、β−（３−チエニル）アクリル酸、β−（２−ピロリル）アクリル酸、β−（３−ピロリル）アクリル酸、イミダゾールアクリル酸（ウロカニン酸）は好適であり、対応して２−アミノ−３−（２−フリル）プロピオン酸、２−アミノ−３−（３−フリル）プロピオン酸、２−アミノ−３−（２−チエニル）プロピオン酸、２−アミノ−３−（３−チエニル）プロピオン酸、２−アミノ−３−（２−ピロリル）プロピオン酸、２−アミノ−３−（３−ピロリル）プロピオン酸が得られる。
【００８６】
また、本発明の原料となる好適な化合物は、前記式（１）において、Ｒｎ−Ｚ−が下記式（５）
【００８７】
【化２４】
2004041107.tif 000020
（但し、式中Ｒはヘテロ環上の置換基であり、シアノ基、水酸基、カルボキシル基、アミド基、ハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基、ヒドロキシメチル基、炭素数１〜６のアルキル基または炭素数１〜６のアルコキシ基を表す。ｎは０〜４の整数を表し、ｎが２以上の場合、Ｒは同一または相異なっていてもよく、隣り合うＲは互いに炭素数１〜６であるヘテロ原子を含んでよい環を形成してもよい。）で示される化合物である。
【００８８】
また得られる化合物は、前記式（２）において、Ｒｎ−Ｚ−が前記式（５）
（但し、式中ＸはＳ、Ｏ、ＮＨまたはＮＲ１を表し、Ｒ１は炭素数１〜６のアルキル基を表し、式中ＹはＮまたはＣを表し、式中Ｒはヘテロ環上の置換基であり、シアノ基、水酸基、カルボキシル基、アミド基、ハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基、ヒドロキシメチル基または炭素数１〜６のアルキル基もしくはアルコキシ基を表す。ｎは０〜３の整数を表し、ｎが２以上の場合、Ｒは同一または相異なっていてもよく、隣り合うＲは互いに炭素数３〜５の、ヘテロ原子を含んでよい環を形成してもよい）で示される化合物である。
【００８９】
前記式（１）で示され、Ｒｎ−Ｚ−が前記式（５）の例としては、β−（２−ピリジル）アクリル酸、β−（３−ピリジル）アクリル酸、β−（４−ピリジル）アクリル酸があげられ、生成するＬ−アミノ酸は、２−アミノ−３−（２−ピリジル）プロピオン酸、２−アミノ−３−（３−ピリジル）プロピオン酸、２−アミノ−３−（４−ピリジル）プロピオン酸である。
【００９０】
本発明の方法は、光学純度の高いＬ−アミノ酸を、有機合成的に簡便に得られるアクリル酸誘導体を基質として１段階の反応で効率よく得ることができる。このようにして得られるＬ−アミノ酸は、高度な光学純度が要求される医薬・農薬などファインケミカル分野の合成中間体として有用である。
【００９１】
【実施例】
以下実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によりなんら限定されるものではない。
【００９２】
なお実施例において、０．１Ｍ　ホウ酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．５、基質としてＬ−ヒスチジン１０ｍＭの存在下、３０℃において毎分１μｍｏｌｅのウロカニン酸を遊離する酵素量を１ｕｎｉｔと定義した。
【００９３】
また酵素タンパク質量の定量は、ビウレット法により、ウシ血清アルブミンを基準として定量し、酵素比活性はｕｎｉｔ／ｍｇタンパク質として表記した。
またアクリル酸誘導体、およびアミノ酸の同定は、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、および反応液をＨＰＬＣに供し標品とＵＶ吸収強度を比較することにより実施した。
【００９４】
アミノ酸、アクリル酸誘導体の分離定量は、以下の分析条件で行った。
逆相ＨＰＬＣ分析条件
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ（昭和電工株式会社登録商標）　ＲＳｐａｋ　ＮＮ−６１４（昭和電工株式会社製）
カラム温度：４０℃
溶離液：アセトニトリル／水／５０ｍＭ　Ｈ３ＰＯ４−ＫＨ２ＰＯ４水溶液（ｐＨ３）＝２０／７０／１０
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ　２１０ｎｍの吸収による
【００９５】
また、得られたアミノ酸の光学純度の分析は、以下の条件による光学分割ＨＰＬＣで行った。
光学分割ＨＰＬＣ分析条件
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ（昭和電工株式会社登録商標）　ＯＲｐａｋ　ＣＲＸ−８５３（昭和電工株式会社製）
カラム温度：室温（２２℃）
溶離液：アセトニトリル／水＝１５／８５　　ＣｕＳＯ４　２．５ｍＭ
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ．
検出方法：ＵＶ　２５６ｎｍの吸収による
【００９６】
［実施例１］　微生物の培養液から得た菌体による反応
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＩ１１３を、５００ｍｌフラスコ中、Ｌブロス１００ｍｌで３０℃、１８時間振盪培養した。培養液を遠心分離して得た菌体を、４Ｍアンモニア／炭酸アンモニウム（ｐＨ１０）２０ｍｌに再懸濁し、１％（ｗ／ｖ）相当の種々のアクリル酸誘導体を加え、３０℃で攪拌しながら反応を行った。反応８時間後、反応液中の生成物をＨＰＬＣにより定量した。それぞれの反応で得られた生成物と濃度、および光学純度について表１に示す。
【００９７】
【表１】
2004041107.tif 000021
【００９８】
［実施例２］　微生物の培養物の処理組成物による反応
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＪＣＭ６１５６を、５００ｍｌフラスコ中、Ｌブロス１００ｍｌで３０℃、１８時間振盪培養した。全量を、ジャーファーメンター中、グルコース１％、尿素０．２％、酵母エキス０．２％、リン酸１カリウム０．２％、リン酸２ナトリウム０．０５％、硫酸マグネシウム０．０１％、硫酸第一鉄７水和物０．００１％、Ｌ−ヒスチジン０．１％　を含み、ｐＨ＝７に調整した培地２Ｌに移植し、３０℃、撹拌８００回転、通気１Ｌ／分　で３０時間培養した。菌体を全量、８０００回転１０分間の遠心により回収し、５０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７）２００ｍＬに懸濁し、氷冷しつつ超音波処理し菌体を破砕した。この懸濁液を１５０００回転３０分間の遠心に供し、得られた上清を、あらかじめ０．５Ｎ　ＮａＯＨで活性化したのち１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７）で平衡化したＤＥＡＥセルロース充填カラムに供した。同ｐＨの１０ｍＭ？５００ｍＭリン酸緩衝液により吸着分を溶出させ、ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性画分を分取した。この画分液全量を凍結乾燥に供した。得られた粗精製物の全タンパク量は５０．３ｍｇ、比活性は０．１７Ｕ／ｍｇであった。
【００９９】
実施例１の菌体に代えて、上記粗精製物１ｍｇを、４Ｍアンモニア／炭酸アンモニウム（ｐＨ１０）２０ｍｌに添加し、１％（ｗ／ｖ）相当の種々のアクリル酸誘導体を加え、３０℃で攪拌しながら反応を行った。反応８時間後、反応液中の生成物をＨＰＬＣにより定量した。それぞれの反応で得られた生成物と濃度、および光学純度について表２に示す。
【０１００】
【表２】
2004041107.tif 000022
【０１０１】
［実施例３］動物ヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子（ｈａｌ）断片の取得
（マウスｈａｌ遺伝子断片の取得）
ｈａｌ遺伝子の取得には、マウスの肝臓の組織からＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてｔｏｔａｌＲＮＡを取得した。方法は全て同キットの標準的な使用法に従った。即ち、３０ｍｇのマウス肝臓をホモジナイザーで破砕し、添付のＲＬＴ緩衝液中０．６ｍｌに懸濁した。懸濁液を遠心機（１５，０００ｒｐｍ）で３分間遠心し、上清０．５ｍｌを新しい容器に取り、等量の７０％エタノールを加えて混合した。混合液の０．７ｍｌをＲＮｅａｓｙカラムに供し、遠心機（１０，０００ｒｐｍ）で１５秒遠心して通過液を捨て、添付のＲＷ１緩衝液をカラムに加え、同じように遠心して液を通過させた。さらに添付のＲＰＮ緩衝液０．５ｍｌをカラムに供し、ｔｏｔａｌＲＮＡをカラムより溶出させた。
【０１０２】
通常は得られたｔｏｔａｌＲＮＡよりｍＲＮＡ精製しｃＤＮＡライブラリーを作製するが、マウスｈａｌ遺伝子の配列が既知であったためｔｏｔａｌＲＮＡを鋳型としたＲＴ−ＰＣＲ法により直接目的遺伝子を増幅した。ＲＴ−ＰＣＲに用いるプライマーは、マウスｈａｌ遺伝子の両末端配列とした。
配列番号１：マウスｈａｌ遺伝子フォワードプライマー：５’−ａｔｇｃｃｔａｇｇｔａｃａｃａｇｔｇ３’
配列番号２：マウスｈａｌ遺伝子リバースプライマー：５’−ｔｔａａａｇａｔｃｇｔｃａｇａｃｔｃ３’
ＲＴ−ＰＣＲにはＯｎｅｓｔｅｐ　ＲＴ−ＰＣＲ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、同キットの標準的な使用法に従って目的遺伝子断片の増幅を行った。鋳型ｔｏｔａｌＲＮＡ溶液の量、アニーリング温度、伸張反応時間の長さ等を最適化した。反応液のうち、ＲＮＡテンプレート（ｔｏｔａｌＲＮＡ）を除く全てを混合し、ＲＮＡテンプレート（ｔｏｔａｌＲＮＡ）を最後に混合した。ミネラルオイルを重層し、あらかじめ５０℃に加温したサーマルサイクラーに反応液をセットし、ＲＴ−ＰＣＲを行った結果、目的遺伝子断片長２〜２．２ｋｂの断片がほぼ特異的に増幅された。この断片をアガロースゲル電気泳動に供して分離精製し、制限酵素によるカットパターンを調べたところ、マウスｈａｌ遺伝子と一致した。
【０１０３】
2004041107.tif 000023
（ＲＴ−ＰＣＲ条件）
逆転写反応　　　　　　　　　　　　　５０℃、３０分
ＰＣＲ初期活性化　　　　　　　　　　９５℃、１５分
続いて、
変性　　　　　　　　　　　　　　　９４℃、３０秒
アニーリング　　　　　　　　　　　４８℃、３０秒
伸張　　　　　　　　　　　　　　　７２℃、６０秒
（４０サイクル）
さらに、
最終伸張　　　　　　　　　　　　　７２℃、１０分
（ラットｈａｌ遺伝子断片の取得）
ラットｈａｌ遺伝子はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）　Ｎｏ．６３１４９としてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ−上にクローニングされ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１株を形質転換したものが販売されているため、これを購入して用いた。
【０１０４】
［実施例４］動物ｈａｌ遺伝子発現系の構築
（マウスｈａｌ遺伝子）
実施例３で得られたｈａｌ遺伝子断片の両末端を平滑化し、発現ベクターｐＴｒｃ９９ＡのＳｍａＩサイトに接続した。このプラスミドｐＴｒｍｈで宿主Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株を形質転換し、実施例１に従って培養しｈａｌ活性を測定したところ、殆ど活性が認められなかった。
【０１０５】
発現を改善するため、ベクター上のＲｉｂｏｓｏｍｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｓｉｔｅ（ＲＢＳ）と開始コドンの距離を調節した。即ち、ベクター上のＲＢＳから８塩基下流から、上流に向かって２３塩基の相補鎖をリバースプライマーとし、ｈａｌ遺伝子の増幅に用いたフォワードプライマーと組み合わせて、ベクターとｈａｌ構造遺伝子を含む約６．２ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した。
配列番号３：ＲＢＳ〜開始コドン間短縮用のリバースプライマー：
５’−ｇｇｔｃｔｇｔｔｔｃｃｔｇｔｇｔｇａａａｔｔｇ−３’
【０１０６】
生じた断片を０．７％アガロースゲル電気泳動に供し目的の断片を抽出精製し、得られた断片を平滑化した後セルフライゲーションして得られたプラスミド、ｐＴｒｍｈｓで宿主Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換微生物を実施例１に従って培養し、ｈａｌ活性を測定した（表３参照）。
（ラットｈａｌ遺伝子）
購入した形質転換微生物から当該プラスミドを抽出精製し、発現用プラスミドを再構築した。即ち、配列番号４及び５で示されるラットのｈａｌ遺伝子ｃＤＮＡの両末端配列をプライマーとしてｈａｌ構造遺伝子部分のみを増幅し、この断片を平滑化した後、発現ベクターｐＴｒｃ９９ＡのＳｍａＩサイトに接続した。得られたプラスミドをｐＴｒｒｈと命名した。
配列番号４：ラットｈａｌ遺伝子フォワードプライマー：５’−ａｔｇｃｃｔａｇｇｔａｃａｃｇｇｔｇ３’
配列番号５：ラットｈａｌ遺伝子リバースプライマー：５’−ｔｔａａａｇａｔｃｇｔｃａｇａｃｔｃ３’
2004041107.tif 000024
（反応条件）
変性　　　　　　　　　　　　　　　　９６℃、３０秒
アニーリング　　　　　　　　　　　　５０℃、３０秒
伸張　　　　　　　　　　　　　　　　７２℃、３００秒
（３０サイクル）
さらに、
最終伸張　　　　　　　　　　　　　　７２℃、５分
【０１０７】
マウスと同様に、このプラスミドを鋳型としてベクター上のＲｉｂｏｓｏｍｅ　ＢｉｎｄｉｎｇＳｉｔｅ（ＲＢＳ）と開始コドンの距離を短縮するＰＣＲ反応を行った。即ち、配列番号３で示されるリバースプライマーとｈａｌ遺伝子の増幅に用いたフォワードプライマーと組み合わせてベクターとｈａｌ構造遺伝子を含む約６．２ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した。
【０１０８】
生じた断片を０．７％アガロースゲル電気泳動に供し目的の断片を抽出精製し、得られた断片を平滑化した後セルフライゲーションして得られたプラスミド、ｐＴｒｒｈｓで宿主Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換微生物を実施例１と同様に培養し、ｈａｌ活性を測定した（表３参照）。なおＬ−ヒスチジンの生成反応は、実施例１に準じて実施した。またウロカニン酸の生成反応は、１ｍｌの培養液から菌体を遠心分離し、０．１％　Ｌ−ヒスチジンを含む０．１Ｍ　ピロリン酸緩衝液（ｐＨ９．３）１ｍｌに再懸濁し、３０℃、１８時間反応後に反応液中の生成物をＨＰＬＣで確認した。
【０１０９】
【表３】
2004041107.tif 000025
【０１１０】
［実施例５］動物ｈａｌ遺伝子による形質転換微生物を用いたＬ−アミノ酸の生産実施例４で得られた形質転換微生物ｐＴｒｒｈｓ／ＪＭ１０９株を用いて、各種のＬ−アミノ酸の生産試験を行った。即ち、形質転換微生物ｐＴｒｒｈｓ／ＪＭ１０９株を栄養培地（Ｌブロス）２Ｌで１６時間培養し、０．２ｍＭのＩＰＴＧを添加してさらに４時間培養した培養液から、遠心（８，０００ｒｐｍ）して菌体を分離した。培養液１００ｍＬ分の菌体を各種のアクリル酸誘導体０．１％を含む４Ｍアンモニア／炭酸アンモニウム（ｐＨ１０）反応液に２０ｍＬに再懸濁し、３０℃で８時間反応させて生成物の蓄積をＨＰＬＣで定量した。その結果表４に示すように、各種のＬ−アミノ酸の蓄積が観察された。
【０１１１】
【表４】
2004041107.tif 000026
【０１１２】
［実施例６］微生物ｈａｌ遺伝子断片の取得
微生物ｈａｌ遺伝子は、各微生物細胞を直接鋳型としたＰＣＲにより取得した。増幅用のプライマーには、各株と同じ属で知られているｈａｌ遺伝子の末端配列を用いた。
配列番号６：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ用フォワードプライマー：５’−　ａｔｇａｃｃｇａａｃｔｃａｃｃ　−３’
配列番号７：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ用リバースプライマー：５’−　ｔｔａｃａｇｇｃｔｔｇｇｃａｇ　−３’
配列番号８：Ｂａｃｉｌｌｕｓ用フォワードプライマー：５’−　ａｔｇｇｔｇａｃｔｔｔａｇａｃ　−３’
配列番号９：Ｂａｃｉｌｌｕｓ用リバースプライマー：５’−　ｔｃａｔａｔｇｔｔｃａｔｃｃｃ　−３’
2004041107.tif 000027
（反応条件）
変性　　　　　　　　　　　　　９６℃、４５秒
アニーリング　　　　　　　　　５０℃、３０秒
伸張　　　　　　　　　　　　　７２℃、１２０秒
（３０サイクル）
さらに、
最終伸張　　　　　　　　　　　７２℃、５分
増幅反応終了後、反応液中の生成物をアガロースゲル電気泳動で確認したところ、幾つかの株で約１．５ｋｂの断片が特異的に生成した（表２参照）。
【０１１３】
【表５】
2004041107.tif 000028
【０１１４】
［実施例７］断片のＴ／Ａクローニング及び配列決定
実施例６で得られた断片をアガロースゲル電気泳動して抽出精製し、ベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＩサイトにライゲーションした（Ｔ／Ａクローニング）。挿入した断片の塩基配列をＴ７　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｐｒｉｍｅｒとＭ１３　Ｍ４　ｐｒｉｍｅｒを用いて解読した。その結果、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＩ１１３より得たｈａｌ遺伝子は既知のＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　１６８株のｈａｌ遺伝子配列と完全に一致した。一方、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＪＣＭ６１５６より得たｈａｌ遺伝子は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＡＴＣＣ　１２６３３と相同性を示すが、異なる配列を有する、配列番号１０で示されるアミノ酸配列をコードするｈａｌ遺伝子であることが判明した。
【０１１５】
［実施例８］微生物ｈａｌ遺伝子発現系の構築
ｐＴ７Ｂｌｕｅ上の挿入ｈａｌ断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切り出し、アガロースゲル電気泳動で分離精製後、同じ組み合わせの制限酵素で切断した発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａとライゲーションした。
【０１１６】
このプラスミドを鋳型としてベクター上のＲｉｂｏｓｏｍｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｓｉｔｅ（ＲＢＳ）と開始コドンの距離を短縮するＰＣＲ反応を行った。即ち、配列番号３で示されるリバースプライマーと、各微生物のｈａｌ遺伝子の増幅に用いたフォワードプライマーと組み合わせてベクターとｈａｌ構造遺伝子を含む約５．７ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した。
【０１１７】
生じた断片を０．７％アガロースゲル電気泳動に供し目的の断片を抽出精製し、断片を平滑化した後セルフライゲーションしたもので宿主Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株を形質転換した。それぞれに由来するｈａｌ遺伝子を有するプラスミドの名称は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＩ１１３株由来をｐＴｒｂｃｈ３、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＪＣＭ６１５６由来をｐＴｒｐｓｈ１、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＡＴＣＣ１２６３３由来をｐＴｒｐｓｈ２と命名した。得られた形質転換微生物を実施例１と同様に培養し、ｈａｌ活性を測定した（表６参照）。なお活性測定は実施例１および４に準じて実施した。この結果、得られた微生物由来のｈａｌ遺伝子のうち、特にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＪＣＭ６１５６について、アミノ脱離方向の活性に対しアミノ付加反応活性が高いことが判った。
【０１１８】
【表６】
2004041107.tif 000029
【０１１９】
［実施例９］微生物ｈａｌ遺伝子による形質転換微生物を用いたＬ−アミノ酸の生成
実施例８で得られた形質転換微生物ｐＴｒｐｓｈ１／ＪＭ１０９株を用いて、各種のヒスチジン誘導体の生産試験を行った。即ち、形質転換微生物ｐＴｒｐｓｈ１／ＪＭ１０９株を栄養培地（Ｌブロス）２Ｌで１６時間培養し、０．２ｍＭのＩＰＴＧを添加してさらに４時間培養した培養液から、遠心（８，０００ｒｐｍ）して菌体を分離した。培養液１００ｍＬ分の菌体を各種のアクリル酸誘導体１％を含む４Ｍアンモニア／炭酸アンモニウム（ｐＨ１０）反応液２０ｍＬに再懸濁し、３０℃で８時間反応させて生成物の蓄積をＨＰＬＣで定量した。その結果表４に示すように、各種のＬ−アミノ酸の蓄積が観察された。
【０１２０】
【表７】
2004041107.tif 000030
【０１２１】
【発明の効果】
本発明によれば、微生物あるいは動物のヒスチジンアンモニア−リアーゼを用いることによって、アクリル酸誘導体を原料として、簡便で効率よく、対応するＬ−アミノ酸を得ることができる。
【０１２２】
本発明のＬ−アミノ酸の製造法により得られるＬ−アミノ酸は、医薬中間体、農薬中間体をはじめとする生理活性有機化合物のキラルビルディングブロックとして幅広い分野に有用であり、主として医薬中間体として有用である。
【０１２３】
【図面の簡単な説明】
【図１】マウスｈａｌ遺伝子発現系の構築
【図２】ラットｈａｌ遺伝子発現系の構築
【図３】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＪＣＭ６１５６　ｈａｌ遺伝子発現系の構築
【図４】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＡＴＣＣ１２６３３　ｈａｌ遺伝子発現系の構築
【図５】Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＩ１１３　ｈａｌ遺伝子発現系の構築
【０１２４】
【配列表】
2004041107.tif 000031
2004041107.tif 000032
2004041107.tif 000033
2004041107.tif 000034
2004041107.tif 000035
2004041107.tif 000036
2004041107.tif 000037
【図１】
2004041107.tif 000043
【図２】
2004041107.tif 000044
【図３】
2004041107.tif 000045
【図４】
2004041107.tif 000046
【図５】
2004041107.tif 000047