(57)【要約】【課題】稲発酵粗飼料などのサイレージを調製する際の環境において、乳酸発酵能が高く、有害微生物を抑えることができる乳酸菌を探索し、選抜すると共に、当該乳酸菌をサイレージ材料草に添加して高品質稲発酵粗飼料を調製する技術を開発し、飼料自給率の向上を目指すこと。【解決手段】耐酸性と乳酸発酵能に優れた乳酸菌、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍ）畜草１号株（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１８９３０）、好気性細菌と酪酸菌に対する抗菌作用を有する乳酸菌、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ）ＲＯ５０株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９３１）及びこれら乳酸菌を含有するサイレージ調製用微生物製剤並びに当該微生物製剤をサイレージ材料草に添加することを特徴とするサイレージの調製方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
耐酸性と乳酸発酵能に優れた乳酸菌、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍ）畜草１号株（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１８９３０）。
【請求項２】
好気性細菌と酪酸菌に対する抗菌作用を有する乳酸菌、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ）ＲＯ５０株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９３１）。
【請求項３】
請求項１及び／又は２記載の乳酸菌を含有するサイレージ調製用微生物製剤。
【請求項４】
請求項３記載の微生物製剤をサイレージ材料草に添加することを特徴とするサイレージの調製方法。
【請求項５】
サイレージ材料草が飼料用稲である請求項４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規乳酸菌株、それを含有する微生物添加剤及び当該添加剤を用いる稲発酵粗飼料の調製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
稲発酵粗飼料の生産は、遊休水田の有効活用と飼料自給率の向上等の観点から、普及に向けた取り組みが積極的に推進されている。
具体的には、稲発酵粗飼料向け品種の育成、専用の収穫・調製機械の開発、直播による省力・低コスト化、収穫ロスの軽減、堆肥施与による多収栽培、サイレージ給与技術への取り込みが進められている。
今後、稲発酵粗飼料の生産量は、急速に増えると考えられており、高品質の飼料を調製する技術の開発は緊急の課題となっている。
【０００３】
しかし、飼料用稲は茎が中空で、保有する空気量が多いため、サイレージ発酵過程においては糸状菌と酵母が良く増殖する。しかも、飼料用稲に付着する有効な乳酸菌が少ないため、乳酸発酵が円滑に進まず、酪酸やアンモニア態窒素が多い劣質な発酵飼料となりやすい。
稲発酵粗飼料の発酵パターンは、他の飼料作物の場合と異なっており、市販乳酸菌製剤を添加しても、発酵品質が向上しないことがしばしば見受けられる。
したがって、稲発酵粗飼料の調製にあたっては、制御された微生物発酵によって高品質の飼料を生産する必要がある。すなわち、有害微生物を抑制し、好ましい乳酸菌の増殖を促進するために、有用な乳酸菌の探索並びにその潜在機能を発掘することが極めて重要である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記した課題を解決するために、稲発酵粗飼料などのサイレージを調製する際の環境において、乳酸発酵能が高く、有害微生物を抑えることができる乳酸菌を探索し、選抜すると共に、当該乳酸菌をサイレージ材料草に添加して高品質稲発酵粗飼料などのサイレージを調製する技術を開発し、飼料自給率の向上を目指すことである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、飼料用稲の微生物菌種構成とサイレージ発酵過程における微生物動態を解析すると共に、稲発酵粗飼料調製用優良乳酸菌のスクリーニングを行った。すなわち、各種飼料作物とサイレージから乳酸菌を分離し、これらの生理的・生化学的性状、糖分解性状並びにサイレージの調製適性試験を実施し、優良菌株を選抜した。次いで、飼料用稲を供試し、選抜した乳酸菌を添加して飼料用稲ロールベールサイレージを調製し、サイレージ発酵過程における微生物菌叢の変遷、有機酸組成の変化及び発酵損失を経時的に追求した。
得られた結果から、ホモ発酵型乳酸菌で低ｐＨ耐性と乳酸生成能が特に優れていたラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍ）畜草１号株と、ホモ発酵乳酸菌でバクテリオシンを生産し、好気性細菌や酪酸菌などの有害微生物の増殖を抑制するラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ）ＲＯ５０株の選抜に成功し、本発明を完成するに至った。さらに、当該微生物をサイレージ材料草に添加してサイレージを調製する方法についても完成した。
【０００６】
請求項１に記載の本発明は、耐酸性と乳酸発酵能に優れた乳酸菌、ラクトバチルス・プランタルム畜草１号株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９３０）である。
請求項２に記載の本発明は、好気性細菌と酪酸菌に対する抗菌作用を有する乳酸菌、ラクトコッカス・ラクティスＲＯ５０株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９３１）である。
請求項３に記載の本発明は、請求項１及び／又は２記載の乳酸菌を含有するサイレージ調製用微生物製剤である。
請求項４に記載の本発明は、請求項３記載の微生物製剤をサイレージ材料草に添加することを特徴とするサイレージの調製方法である。
請求項５に記載の本発明は、サイレージ材料草が飼料用稲である請求項４記載の方法である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下に、上記の本発明について詳しく説明する。
請求項１及び２に記載の乳酸菌は、以下に示した方法で取得した。
栃木県下の酪農家が栽培した飼料作物から乳酸菌の分離を行った。すなわち、飼料作物の新鮮試料１０ｇをストマッカー用ビニール袋（飛竜ＫＮ２０８、旭化成（株）製）に採取し、滅菌した生理食塩水９０ｍｌを加えて１０倍希釈液とした後、この液をさらに１０８　倍まで希釈した。
この希釈液を乳酸菌用培地であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ　ＭＲＳ寒天培地（ＤＩＦＣＯ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　Ｄｅｔｒｏｉｔ，　ＵＳＡ）　及び　ＧＹＰ白亜寒天培地（小崎ら、「乳酸菌実験マニュアル」、１９９２）　に塗布して、嫌気培養装置（ヒラサワ（株）製）で３７℃にて２日間培養した。
培養物から分離した乳酸菌株について、菌学的諸性質や生理的・生化学的性質等を調べ、さらにサイレージの調製適性試験を実施し、前記２種類の乳酸菌株を選抜した。
【０００８】
ラクトバチルス・プランタルム畜草１号株は、ホモ発酵型乳酸菌で低ｐＨ耐性と乳酸生成能が特に優れている菌株である。一方、ラクトコッカス・ラクティスＲＯ５０株は、同様にホモ発酵型乳酸菌で、バクテリオシンを生産し、好気性細菌や酪酸菌などの有害微生物の増殖を抑制する乳酸菌である。
これら菌株は、それぞれの基準株と最も近縁な系統関係にあるが、糖類発酵特性や抗菌作用等において基準株と異なることから、本発明者らは新菌種であると判定し、上記の如く命名した。これら菌株は、独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はラクトバチルス・プランタルム畜草１号株がＦＥＲＭ　Ｐ−１８９３０であり、ラクトコッカス・ラクティスＲＯ５０株がＦＥＲＭ　Ｐ−１８９３１である。
【０００９】
請求項３に記載の本発明は、これら２種類の乳酸菌を単独で、もしくは組み合わせて含有するサイレージ調製用微生物製剤である。
次に、請求項４に記載の発明であるサイレージの調製方法について説明する。
栃木県と埼玉県の農家が栽培した飼料用稲（品種：はまさり、クサホナミ）を供試し、ロールベールサイレージ調製用システムを用いて、前記乳酸菌を添加して稲発酵粗飼料を調製し、サイレージ発酵過程の状況や飼料の品質等について調べ、これら乳酸菌はサイレージ調製に適した微生物であることを確認した。なお、サイレージ材料草としては、請求項５に記載したように、飼料用稲が好適である。
【００１０】
本発明のサイレージ調製方法によれば、材料草に由来するヘテロ発酵型乳酸菌でなく、ホモ発酵型乳酸菌による発酵が行われるため、発酵飼料の品質が改善されるばかりでなく、サイレージのガス生成量と乾物損失率が顕著に減少する。この発酵損失の抑制は、特定の乳酸菌の添加によって他の有害微生物の活動期を短縮し、乳酸発酵が旺盛に行われた結果である。
ラクトコッカス・ラクティスＲＯ５０株は、乳酸球菌であり、酸素が比較的少ない環境で良く発育するので、サイレージ発酵の初期段階でスターターとして活発に増殖する。初期発酵過程における乳酸菌の増殖は、サイレージ発酵に極めて重要である。しかも、本菌が生産する抗菌性物質により好気性細菌の増殖を抑制する先兵的な役割をし、その後の乳酸桿菌による優勢発酵へのスムーズな移動を助ける環境造りをする。
一方、ラクトバチルス・プランタルム畜草１号株は、乳酸桿菌であり、サイレージ発酵過程の長期にわたって増殖し、旺盛な乳酸発酵によってサイレージのｐＨを急速に低下させる。
このようなバクテリオシンの生産や乳酸の多量生成は、サイレージ発酵に対する不良微生物である酪酸菌や好気性細菌等の生育を抑え、サイレージ発酵品質を効率的に向上させることができる。
【００１１】
【実施例】
以下に、実施例により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
実施例１
栃木県下の酪農家が栽培した飼料作物の新鮮試料１０ｇをストマッカー用ビニール袋（飛竜ＫＮ２０８、旭化成（株）製）に採取し、滅菌した生理食塩水９０ｍｌを加えて１０倍希釈液とした後、この液をさらに１０８　倍まで希釈した。
この希釈液を乳酸菌用培地であるＬａｃｔｂａｃｉｌｌｉ　ＭＲＳ　寒天培地（ＤＩＦＣＯ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　Ｄｅｔｒｏｉｔ，　ＵＳＡ）　及び　ＧＹＰ白亜寒天培地（小崎ら、「乳酸菌実験マニュアル」、１９９２）　に塗布して、嫌気培養装置（ヒラサワ（株）製）で３７℃にて２日間培養した。
培養物から分離した乳酸菌株について、菌形態観測、グラム染色、胞子形成、カタラーゼ反応及び乳酸の生成に関する試験を行った。
さらに、これらの分離菌株の生理的・生化学的性状、糖分解性状及びサイレージの調製適性試験を行った。これらの結果に基づいて、ホモ発酵型乳酸菌で、低ｐＨ耐性と乳酸生成能が最も優れていたラクトバチルス・プランタルム畜草１号株と、同様にホモ発酵型乳酸菌で、抗菌生物質を生産してサイレージ発酵品質を劣化させる酪酸菌や好気性細菌等の有害微生物の増殖を抑えるラクトコッカス・ラクティスＲＯ５０株を選抜することができた。
これら乳酸菌の生理的・生化学的性質を第１表に示す。
【００１２】
【表１】
第１表
2004041064.tif 000002
＋，陽性反応；　−，陰性反応；　Ｗ，弱陽性反応
＊　畜草１号株：ラクトバチルス・プランタルム畜草１号株
ＲＯ５０株：ラクトコッカス・ラクティスＲＯ５０株
【００１３】
第１表から明らかなように、ラクトバチルス・プランタルム畜草１号株及びラクトコッカス・ラクティスＲＯ５０株は共にグラム陰性で、カタラーゼ陰性、グルコースからガスを産生しないホモ発酵型で、主にＤＬ型とＬ型の乳酸異性体を生成する乳酸菌である。
ラクトバチルス・プランタルム畜草１号株は耐酸性が強く、低ｐＨ条件下でよく生育し、乳酸菌用ＭＲＳ液体培地で培養した場合、多量の乳酸を生成し、培養液の最終ｐＨは３．６程度まで低下する。
また、ラクトコッカス・ラクティスＲＯ５０株は、バクテリオシンを生産し、第２表に示したように、幅広い抗菌スペクトルを有している。それ故、サイレージ劣質の原因菌である酪酸菌、バチルス属菌、ブドウ球菌等に強い抗菌作用を示した。
【００１４】
【表２】
第２表
2004041064.tif 000003
＊：第１表と同じ
【００１５】
これらのことから、本発明に係る上記乳酸菌は、サイレージ調製用微生物製剤として適していることが分かる。
次に、ラクトバチルス・プランタルム畜草１号株とラクトコッカス・ラクティスＲＯ５０株の同定を行った。まず、これら乳酸菌の分類学的位置を図１及び図２に示す。
【００１６】
これら２菌株の全領域の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定し、他の菌種と比較したところ、畜草１号株の分子系統位置はラクトコッカス属のクラスター、ＲＯ５０株はラクトコッカス属のクラスターにあった。
ラクトバチルス・プランタルム畜草１号株はラクトバチルス・プランタルムの基準株、ラクトコッカス・ラクティスＲＯ５０株はラクトコッカス・ラクティスの基準株とそれぞれ最も近縁な系統関係にあり、互いに９９％以上の１６Ｓ　ｒＲＮＡシーケンス相同性を示すため、これらを上記のように同定した。
また、第３表に示したように、これら菌株の糖類発酵特性は基準株と異なる。すなわち、ラクトバチルス・プランタルム畜草１号株は、ラムノース、ズルシトール、α−メチル−Ｄ−グルコシド及びエスクリンの発酵特性において基準株と相違し、ラクトコッカス・ラクティスＲＯ５０株は、マンニトール、α−メチル−Ｄ−マンノシド、サッカロース、アミドン及びβ−ゲンチオビオースの発酵特性において基準株と相違する。また、ラクトコッカス・ラクティスＲＯ５０株は、バクテリオシンの生産などにおいて基準株と異なる。
これらのことから、これら２菌株を新菌種と判定した。これら菌株は、独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はラクトバチルス・プランタルム畜草１号株がＦＥＲＭ　Ｐ−１８９３０であり、ラクトコッカス・ラクティスＲＯ５０株がＦＥＲＭ　Ｐ−１８９３１である。
【００１７】
【表３】
第３表（その１）
2004041064.tif 000004
＊：第１表と同じ
【００１８】
【表４】
第３表（その２）
2004041064.tif 000005
＊：第１表と同じ
【００１９】
実施例２
栃木県と埼玉県の農家が栽培した飼料用稲（品種：はまさり、クサホナミ）を供試し、飼料稲収穫調製用ロールベールシステムを用いて稲発酵粗飼料の調製を行った。添加用乳酸菌は　Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ　ＭＲＳ　液体培地（ＤＩＦＣＯ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　Ｄｅｔｒｏｉｔ，　ＵＳＡ）に接種し、嫌気条件下で３０℃で１６時間培養した後、菌培養液を１．０×１０８　ｃｆｕ／ｍｌに調整して飼料用稲１ｋｇ当たり１ｍｌをロールベーラに装着した自動添加装置で均一に添加した。
これらロールベールサイレージは屋外（温度：１９〜３５℃）に放置して、貯蔵後１７６日後にロールベールサイレージを解体して発酵品質を分析した。稲発酵粗飼料の微生物菌種構成（貯蔵後１７６日目）を第４表に、ロールベールサイレージの発酵品質を第５表に示した。
【００２０】
【表５】
第４表
2004041064.tif 000006
ｎｄ，　検出されず
＊：第１表と同じ
【００２１】
【表６】
第５表
2004041064.tif 000007
＊：第１表と同じ
【００２２】
第４表から明らかなように、本発明に係る乳酸菌を添加して調製したサイレージは、乳酸菌無添加の場合のサイレージに比べ、サイレージ発酵過程において、乳酸菌数が顕著に増えており、好気性細菌、酪酸菌及びバチルス属菌等の菌数が急減した。有害微生物の増殖が抑えられた理由は、乳酸の多量生成によるｐＨ低下にある。すなわち、乳酸菌添加による高い初発菌数は、他の微生物との競合でも優勢となり、しかも添加したホモ発酵型乳酸菌の強力な乳酸生成能は、ｐＨを速やかに低下させると共に乳酸菌の生産する抗菌性物質などにより、他の不良微生物の増殖を有効に抑制した。
さらに、本発明に係る乳酸菌は、いずれもサイレージ環境において良好な増殖を示し、サイレージ発酵過程において酪酸菌、大腸菌等の有害微生物の増殖を抑えることが判明した。
【００２３】
また、第５表から、本発明に係る乳酸菌を添加して調製したサイレージは、乳酸菌無添加の場合のサイレージに比べてｐＨ値、酢酸と酪酸の生成量並びにアンモニア態窒素含量が低下し、乳酸生成量が高まり、良質のサイレージが得られ、またいずれの乳酸菌を添加した場合も、サイレージの発酵ロスが顕著に減少している。
サイレージ発酵品質の改善は、材料草に由来するヘテロ発酵型乳酸菌でなく、上記ホモ発酵型乳酸菌を用いたことに起因するものと言える。
【００２４】
【発明の効果】
本発明により、有害微生物の増殖を抑制し、好ましい乳酸菌の増殖を促進するために有用な新規乳酸菌が提供される。すなわち、サイレージ発酵の環境において乳酸菌発酵が高く、低ｐＨ耐性のホモ発酵型乳酸菌並びに抗菌性物質の生産により好気性細菌や酪酸菌等の有害微生物の増殖を抑えるホモ発酵型乳酸菌が提供され、これらを単独で、あるいは組み合わせて含有する微生物製剤はサイレージ調製のために有用である。
さらに、本発明により、当該微生物製剤を飼料用稲等のサイレージ材料草に添加することにより高品質のサイレージを調製する方法が提供される。
したがって、本発明によれば、遊休水田の有効活用と飼料自給率の向上を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ラクトバチルス・プランタルム畜草１号株と近縁乳酸菌の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の分子系統樹（Ｋｎｕｃで求めた進化距離をＮＪ法で作成）　である。
【図２】ラクトコッカス・ラクティスＲＯ５０株と近縁乳酸菌の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の分子系統樹（Ｋｎｕｃで求めた進化距離をＮＪ法で作成）　である。
【図１】
2004041064.tif 000008
【図２】
2004041064.tif 000009