(57)【要約】【課題】この発明は、メシマコブ（Ｐｈｅｌｌｉｎｕｓ  ｌｉｎｔｅｕｓ  ）  の菌糸体由来物質が、ヒスタミン遊離抑制作用を有するという知見に基づき、ヒスタミン遊離抑制剤及びその製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】▲１▼メシマコブ菌糸体由来物質を含有するヒスタミン遊離抑制剤、▲２▼メシマコブ熱水抽出物を含有するヒスタミン遊離抑制剤、▲３▼メシマコブ熱水抽出物中のメタノール可溶画分を含有するヒスタミン遊離抑制剤、▲４▼イオン吸着剤に吸着させたメシマコブ熱水抽出物中のメタノール可溶画分のメタノール溶出画分を含有するヒスタミン遊離抑制剤、▲５▼メタノール溶出画分のうち、分子量２００〜１０００の成分を含有するヒスタミン遊離抑制剤、▲６▼ヒスタミン遊離抑制剤を乾燥粉末とし、これを他の食品粉末と混合するヒスタミン遊離抑制剤の製造方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
メシマコブ菌糸体由来物質を含有することを特徴とするヒスタミン遊離抑制剤。
【請求項２】
メシマコブ菌糸体の熱水抽出物を含有することを特徴とするヒスタミン遊離抑制剤。
【請求項３】
請求項２の熱水抽出物中のメタノール可溶画分を含有することを特徴とするヒスタミン遊離抑制剤。
【請求項４】
イオン吸着剤に吸着させた請求項３のメタノール可溶画分のメタノール溶出画分を含有することを特徴とするヒスタミン遊離抑制剤。
【請求項５】
請求項４のメタノール溶出画分のうち、分子量２００〜１０００の成分を含有することを特徴とするヒスタミン遊離抑制剤。
【請求項６】
請求項２〜請求項５のヒスタミン遊離抑制剤を乾燥粉末とし、これを他の食品粉末、又は健康食品粉末と混合することを特徴するヒスタミン遊離抑制剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、メシマコブ（Ｐｈｅｌｌｉｎｕｓ  ｌｉｎｔｅｕｓ  、以下単にＰＬともいう）  の菌糸体由来物質を含有するヒスタミン遊離抑制剤、及びその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
メシマコブ子実体の熱水抽出物は、サルノコシカケ科のキノコの中でも最も高い抗腫瘍効果が認められているものである（Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  （Ｇａｎｎ）．  ５９  ：  １５５−１５７）  。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、メシマコブの子実体又は菌糸体に関し、ヒスタミン遊離抑制作用は知られていない。
そこで発明者は、メシマコブの薬理効果として、ヒスタミン遊離抑制作用に着目して鋭意研究したところ、メシマコブの菌糸体由来物質には、顕著なヒスタミン遊離抑制作用が存在することを知り本発明を完成した。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本願発明は、下記の請求項１〜請求項６により構成されている。
請求項１：メシマコブ菌糸体由来物質を含有することを特徴とするヒスタミン遊離抑制剤。
請求項２：メシマコブ菌糸体の熱水抽出物を含有することを特徴とするヒスタミン遊離抑制剤。
請求項３：請求項２の熱水抽出物中のメタノール可溶画分を含有することを特徴とするヒスタミン遊離抑制剤。
請求項４：イオン吸着剤に吸着させた請求項３のメタノール可溶画分のメタノール溶出画分を含有することを特徴とするヒスタミン遊離抑制剤。
請求項５：請求項４のメタノール溶出画分のうち、分子量２００〜１０００の成分を含有することを特徴とするヒスタミン遊離抑制剤。
請求項６：請求項２〜請求項５のヒスタミン遊離抑制剤を乾燥粉末とし、これを他の食品粉末、又は健康食品粉末と混合することを特徴するヒスタミン遊離抑制剤の製造方法。
【０００５】
【発明の実施の形態】
＜有効成分の取得＞
（Ａ）メシマコブ菌糸体
大型タンク（１０００Ｌ）を用いて、炭素源としてグルコースを４．０％、天然物由来窒素源イーストエキス及びポリぺプトンを各０．３％、ＫＨ２ＰＯ４及びＮａ２ＨＰＯ４  を各０．５％を含み、初発培地ｐＨ５．５の培養液に、メシマコブの菌糸体を接種し、強制的に０．２２μｍフィルターを通した無菌空気を培地内へ通気し、温度２８℃で４５日間培養した。
この培養液を遠心分離して得られた菌糸体を凍結乾燥してメシマコブ菌糸体の乾燥粉末を得た。
【０００６】
（Ｂ）メシマコブ菌糸体の熱水抽出物
前記メシマコブ菌糸体の乾燥粉末に１０倍量のイオン交換水を加え、１００℃で２時間、熱水抽出処理を行ない、不溶物を除去してメシマコブ菌糸体の熱水抽出物を得た。この熱水抽出物を約７０℃で減圧濃縮した（サンプル▲１▼）。
なお、前記メシマコブの乾燥菌糸体粉末１３００ｇより、前記メシマコブ熱水抽出液濃縮物が約２８０ｇ得られた。
この熱水抽出物を図１に示す方法により分画した。
【０００７】
（Ｃ）メシマコブ菌糸体の熱水抽出物のメタノールによる分画
前記メシマコブ熱水抽出物に対し、３倍量のメタノールを加え、２時間静置した後遠心分離し、メタノール可溶画分（サンプル▲２▼）と、メタノール不溶画分を得た（サンプル▲３▼）。
なお、前記メシマコブ熱水抽出物濃縮液２８０ｇから、メタノール可溶画分が５１ｇ、及びメタノール不溶画分が２２６ｇ得られた。
【０００８】
（Ｄ）前記メタノール可溶画分のイオン吸着剤による分画
（イ）カラムに充填したイオン吸着剤（Ｄｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０（日本錬水社）、以下ＨＰ−２０ともいう）に、前記メタノール可溶画分を吸着させた後，水溶出画分（サンプル▲４▼）とメタノール溶出画分（サンプル▲５▼）に分画した。
なお、前記メタノール可溶画分５１ｇから、水溶出画分が４３ｇ及びメタノール溶出画分が４．０ｇが得られた。
【０００９】
（Ｅ）イオン吸着剤処理後のメタノール可溶画分の分画
ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０  （ファルマシア社製、以下ＬＨ−２０ともい）カラムを用い、ゲルろ過クロマトグラフィーにより、前記（Ｃ）で得られたメタノール可溶画分４．０ｇを、下記のように分画・分取した。
目的成分の溶出は、蒸留水を用いて行ない、全体を８フラクション（Ｆｒ１〜Ｆｒ８）として分取した（前記メタノール可溶画分４．０ｇを０．５ｇずつ５回に分けて分画・分取した。）。
表１に、ＬＨ−２０による分画条件を示す。
【００１０】
【表１】
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【００１１】
得られた８フラクションのうち、Ｆｒ４〜Ｆｒ８が、分子量２００〜１０００に該当するものである。
表２に前記した各サンプル量を示す（各サンプルの含水量は約３％）。
【００１２】
【表２】
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【００１３】
＜ヒスタミン遊離抑制効果の確認＞
（１）表１のメシマコブ菌糸体由来成分（サンプル▲１▼〜▲５▼、及びＦｒ．１〜Ｆｒ．８）を被検体として、マスト細胞からのヒスタミン遊離抑制効果を調べることで、Ｉ型アレルギー反応抑制効果を調べた。
（２）被験動物及び細胞の調製方法
（ａ）被験動物には、Ｗｉｓｔｅｒ系ラット雄（６〜８週齢）を用いた。
（ｂ）細胞の調製方法
ラットをエーテルで麻酔させ、脱血死させた後、ラットの腹腔内に  Ｔｙｒｏｄｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  １５ｍｌを注入し、腹腔内液を回収した。更にラットの腹腔内にＴｙｒｏｄｅＢｕｆｆｅｒ  １０ｍｌを注入し、更に腹腔内液を回収して先に採取した腹腔内液と混合した。この腹腔内液を、８００ｒｐｍ・４℃・１０分間遠心分離を行い、上澄を除去してフィルターをかけた。
更に、Ｔｙｒｏｄｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  を加えた細胞懸濁液を、８００ｒｐｍ・４℃・１０分間遠心分離を行い、上清を除去して、細胞を均一にした。この細胞懸濁液を血球計算盤で測定し、８×１０６  ｃｅｌｌｓ  ／ｍｌに調製して用いた。
【００１４】
（３）生物検定の実験方法およびヒスタミンの分析方法
（ａ）生物検定の実験方法
１．２ｍｌのマイクロチューブに分注した、細胞懸濁液３７０μｌを３７℃のウォーターバスでプレインキュベートした。
１０分後、各濃度に設定したサンプル２０μｌを添加した。
更に、１０分後、アレルギー誘発剤であるｃｏｍｐｏｕｎｄ４８  ／  ８０  （マスト細胞刺激用試薬：和光純薬）１０μｌ（０．５μｇ／ｍｌ）  を添加した。
１５分後、氷上で反応を停止した。
更に、マスト細胞を除去するため、１３．０００ｒｐｍ  ・４℃・１５分間遠心分離し、上清を回収した。
この上清を、ＨＰＬＣ分析のジアゾ化するサンプルとした。
【００１５】
（ｂ）ヒスタミンジアゾ化誘導体の調製
等量の２０ｍＭ  ｐ  −ニトロアニリン塩酸溶液と２００ｍＭ  亜硝酸ナトリウム水溶液をよく混合した  （ジアゾ試薬）  。
ジアゾ試薬１０μｌに、前記（ヒスタミン）ジアゾ化用サンプル２０μｌを加え、ボルテックスミキサーでよく混合した。
更に、１０％  炭酸ナトリウムエタノール溶液３０μｌを加え、ボルテックスミキサーでよく混合した。
この溶液の２０μｌをＨＰＬＣ分析に用いた。
【００１６】
（ｃ）ヒスタミンの分析は、ジアゾ化法により行った（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｉｎ  Ｆｉｓｈ  ｂｙ  Ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ａｆｔｅｒ  Ｄｉａｚｉ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ：  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５９（７），  １２０８−１２１０（１９９５）  ）。
生物検定におけるヒスタミンのＨＰＬＣ分析条件〈ジアゾ法）は、表３のとおりである。
【００１７】
【表３】
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【００１８】
（４）メシマコブの各画分の一定濃度におけるマスト細胞からのヒスタミン遊離の抑制効果の結果を表４に示す。
【００１９】
【表４】
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【００２０】
抑制値は下記の計算式によった。
計算式：
（１−サンプルのピーク積分値／コントロールのピーク積分値）×１００
【００２１】
前記、サンプル▲１▼（メシマコブ熱水抽出液濃縮物）、サンプル▲２▼（メタノール可溶画分）、サンプル▲５▼、及びＦｒ．４〜Ｆｒ．８の成分は、粉末化することが可能であり、そのまま、又は他の任意の食品（粉末）、又は任意の健康食品（粉末）と混合して摂取することができる。
【００２２】
なお、本願発明に用いたメシマコブは、１９９８年１０月に宮崎県西諸県郡須木村で子実体を採取し、株式会社アイビーアイ（ＩＢＩ）応用きのこ研究所で菌糸体化した上でＰＬ−０８株として保存していたものを使用した。この菌株は、子実体を農林水産省林野庁総合研究所  森林生物部森林微生物科  腐朽病害研究室の阿部恭久博士の鑑定により、▲１▼メシマコブ子実体に特有の黄褐色の剛毛体を持つこと、及び▲２▼担子胞子の形態、からメシマコブと同定されたものを用いた。
【００２３】
供試菌株の前培養は、５℃で低温保存してあった菌糸体を、内径９０ｍｍのペトリ皿内のＰｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ  社製）へ接種して、２５℃暗黒下で１５日間表面培養した。この培養菌糸体を内径５ｍｍのコルクボーラーで切り取り（乾燥菌糸体重量  ０．３５ｍｇに相当）、段落０００６、（Ａ）の菌株として用いた。
【００２４】
【発明の効果】
本願発明のヒスタミン遊離抑制剤及びその製造方法によれば、メシマコブの菌糸体から、顕著な効果を有するヒスタミン遊離抑制剤が容易に得られるという効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】メシマコブ菌糸体の熱水抽出物の分画過程を示す図である。
【図１】
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