(57)【要約】【課題】少なくとも１つの病害に対して抵抗性を示す植物を作出すること。【解決手段】チオニン遺伝子を含み、このチオニンを発現し得る発現カセットを有する、少なくとも１つの病害に対して抵抗性を示す植物。この植物は、上記チオニン遺伝子を含み、このチオニンを発現し得る発現カセットを含む発現ベクターを構築する工程、この発現ベクターで細胞を形質転換する工程、この形質転換された細胞から植物を再生する工程を包含する方法により作出される。この植物は、イネ白葉枯病菌もしくはイネ苗立枯細菌病菌のような植物病原細菌由来、またはイネいもち病菌のような植物病原糸状菌由来の病害の少なくとも１つの病害に抵抗性を示す。本発明はまた、上記病害抵抗性植物から得られる種子を包含する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオニン遺伝子を含み、該チオニンを発現し得る発現カセットを有し、イネ白葉枯病菌、イネ苗立枯細菌病菌、イネ籾枯細菌病およびジャガイモ疫病菌からなる群より選択される病原菌に由来する少なくとも１つの病害に対して抵抗性を示す植物、植物。
【請求項２】
前記チオニンがエンバク葉由来である、請求項１に記載の植物。
【請求項３】
前記植物が、単子葉綱または双子葉綱の植物である、請求項１または２に記載の植物。
【請求項４】
前記単子葉綱の植物が、イネ科の植物である、請求項３に記載の植物。
【請求項５】
前記双子葉綱の植物が、ナス科の植物である、請求項３に記載の植物。
【請求項６】
前記病害は、イネ白葉枯病またはイネ苗立枯病である、請求項１に記載の植物。
【請求項７】
前記病害は、ジャガイモ疫病である、請求項１に記載の植物。
【請求項８】
請求項１に記載の植物から得られる種子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、少なくとも１つの病害に抵抗性を示す形質転換植物に関する。さら
に詳細には、チオニン遺伝子を含み、このチオニンを発現し得る発現カセットを
有する、少なくとも１つの病害に対して抵抗性を示す形質転換植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
　農作物生産においては一般に、高品質植物の安定生産および農薬依存度の軽減
が要望されている。そのため、植物細胞融合技術や組換えＤＮＡ技術などの有用
な植物バイオテクノロジー技術を利用して、病害虫および病原菌に対して抵抗性
を示す植物の品種の改良、育種および開発が盛んに行われている。既に除草剤耐
性を示す形質転換植物（特開平２−１８６９２５）、ウイルス抵抗性を示す形質
転換植物（特開平４−３３０２３３）および害虫抵抗性を示す形質転換植物（特
開平３−２４７２２０）が、組換えＤＮＡ技術を利用して作出されている。さら
に、病原糸状菌の産生する毒素を不活化する酵素の遺伝子の導入により、病原糸
状菌に対して抵抗性を示す形質転換植物（Plant Physiology, 104:109-118）や
、昆虫由来の抗菌性タンパク質の遺伝子の導入により、少なくとも１つの病原菌
に抵抗性を示す形質転換植物（特開平７−２５０６８５）のように、植物病原菌
に対して抵抗性を示す形質転換植物も数種作出されている。
【０００３】
　本発明者らは、抗菌性タンパク質である新規チオニンをエンバクの葉より単離
し、公知の手法を用いてチオニンがコードされる遺伝子の配列決定を行った。そ
してそのチオニン遺伝子を用いてタバコの形質転換を試みた（特開平８−２６６
２７９）。この試みにより、形質転換され、再分化したタバコが得られている。
【０００４】
　しかし、形質転換された植物がすべて、高い病害抵抗性を示す実用的で有用な
植物になるとは限らない。なぜなら、植物種、形質転換方法、導入遺伝子の発現
量および発現部位ならびに産物のその植物に対する影響などの要因により、その
病害抵抗性が変化し得たり、あるいは生育が阻害され得るからである。さらに、
得られた病害抵抗性が後代に安定に受け継がれるか否かも状況によって異なるこ
とが知られている。このような理由から、高い病害抵抗性を示す実用的で有用な
植物の作出が望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
　本発明は、上記従来の問題の解決を課題とするものであり、その目的とすると
ころは、チオニン遺伝子を含み、このチオニンを発現し得る発現カセットを有す
る植物を作出し、少なくとも１つの病害に対して高い抵抗性を示す植物を提供す
ることである。本発明の他の目的は、この性質が後代においても安定に保存され
る植物および種子を提供することである。本発明のさらに他の目的は、上記病害
に対して高い抵抗性を示す植物を得るための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
　本発明の病害抵抗性植物は、チオニン遺伝子を含み、このチオニンを発現し得
る発現カセットを有する、少なくとも１つの病害に対して抵抗性を示す植物であ
る。
【０００７】
　本発明の病害抵抗性植物を作出する方法は、チオニン遺伝子を含み、このチオ
ニンを発現し得る発現カセットを含む発現ベクターを構築する工程、この発現ベ
クターで植物細胞を形質転換する工程、およびこの形質転換された植物細胞から
植物を再生する工程、を包含する。
【０００８】
　本発明の１つの実施態様においては、上記チオニンはエンバク葉由来である。
【０００９】
　本発明の他の実施態様においては、上記病害抵抗性植物は、単子葉綱または双
子葉綱の植物である。
【００１０】
　本発明のさらに他の実施態様においては、上記病害抵抗性植物は、イネ科の植
物であるか、またはナス科の植物である。
【００１１】
　本発明のさらに他の実施態様においては、上記病害抵抗性植物の病害は、植物
病原菌由来の病害、例えば、イネ白葉枯病菌もしくはイネ苗立枯細菌病菌のよう
な植物病原細菌由来、またはジャガイモ疫病菌のような植物病原糸状菌由来の病
害である。
【００１２】
　本発明はまた、上記病害抵抗性植物から得られる種子を包含する。
【発明の効果】
【００１３】
　本発明によれば、抗菌性タンパク質であるチオニンの遺伝子を植物に導入する
ことによって、少なくとも１つの病害、通常は複数種の病害に対して抵抗性を示
す形質転換植物が作出される。このような植物を作出する方法もまた、本発明に
よって提供される。これまで病害に弱かった多くの高品質植物品種が、本発明の
実施によって病害に抵抗性を示すようになるため、高品質植物品種を安定して生
産できる。さらに病害に抵抗性を示すことから、病原菌を殺傷する農薬の依存度
を軽減することも可能となり、本発明は農作物生産に大きく貢献する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
　本発明の理解を容易にするために、本明細書中において使用する用語を説明す
る。
【００１５】
　本明細書中において使用する用語「病害」は、植物病原菌（植物病原細菌およ
び／または植物病原糸状菌）に由来する病害をいう。植物病原細菌に由来する病
害としては、イネ白葉枯病、イネ苗立枯細菌病、イネもみ枯細菌病、タバコ空胴
病、タバコ野火病、各種野菜類の軟腐病、斑点細菌病、青枯病などが挙げられ、
植物病原糸状菌に由来する病害としては、イネいもち病、イネ紋枯病、イネ苗腐
病、イネ苗立枯病、イネばか苗病、イネ黄化萎縮病、イネごま葉枯病、ムギ類さ
び病類、ムギ類うどんこ病、ジャガイモ疫病、タバコ疫病、タバコ灰色かび病、
タバコ舞病、シバ類さび病類、立枯病類、雪腐病類、野菜類の疫病、べと病、う
どんこ病、灰色かび病、炭そ病、苗立枯病、根こぶ病、カーネーション萎ちょう
病、キク白さび病などが挙げられる。本発明において、特に有効に抵抗性が示さ
れる病害は、イネ白葉枯病、イネ苗立枯細菌病、およびジャガイモ疫病である。
【００１６】
　本明細書中において使用する用語「チオニン」は、抗菌作用、血圧降下作用な
どの種々の薬理作用を有し、酸および熱に安定である塩基性タンパク質をいう。
チオニンは、一般的には植物（例えば、コムギ、オオムギ、ライムギ、オートム
ギ、およびエンバク）由来であり、例えば、４６アミノ酸残基、分子量約５kDa
のシステインに富むタンパク質であることが知られているが、上記の特性を有す
る限り、少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、および置換を有するタンパク
質を包含する。本発明において、好ましくは、エンバク葉由来のチオニンをいう
。
【００１７】
　本明細書中において使用する用語「形質転換植物」は、外部から導入された遺
伝子を有し、かつこの遺伝子より生物学的な特定の機能を有する遺伝子産物（例
えば、酵素などのポリペプチド）を、安定的または一時的に発現し得る植物をい
う。発現は、構成的であってもよく、誘導的（温度、薬剤などの特定の刺激に応
答する）であってもよい。導入される遺伝子は、形質転換を行う植物に由来する
か、形質転換を行う植物と同じ種もしくは異なる種の植物に由来するか、または
他種の生物（例えば、昆虫などの動物、微生物）に由来する。これには、酵素な
どの遺伝子産物がその生物学的機能が喪失しない限り、これらの遺伝子の一部を
互いに組み合わせて再構築された遺伝子もまた含まれる。
【００１８】
　本明細書中において使用する用語「遺伝子」は、酵素などのポリペプチドを構
成するアミノ酸をコードするヌクレオチドが方向性をもって直鎖状に連結したポ
リマーである。遺伝子は、一本鎖状（例えば、ＲＮＡ）であっても、二本鎖（例
えば、ＤＮＡ）であってもよい。ＤＮＡは、例えば、転写されたＲＮＡ（ｍＲＮ
Ａ）から酵素的に調製されるｃＤＮＡ、染色体由来のゲノムＤＮＡ、または化学
合成されたＤＮＡであり得る。これらの遺伝子は、酵素などのポリペプチドをコ
ードする配列（コード領域または翻訳領域）以外に、コード領域の転写を制御す
るためのプロモーター領域、このプロモーター領域に作用するエンハンサー領域
、および他の調節領域（例えば、ターミネーターおよびポリＡ領域）、ならびに
イントロンなどを含み得る。これらの遺伝子が、上記の各領域の活性を失わない
限り、付加、欠失、置換などの改変がなされ得ることは、当該分野において公知
である。
【００１９】
　本明細書中において使用する用語「発現カセット」は、タンパク質、例えば、
チオニンをコードする遺伝子配列とその発現を調節するプロモーター、エンハン
サーなどの種々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動し得る状態で連結されて
いるＤＮＡフラグメントをいう。
【００２０】
　本明細書中において使用する用語「ベクター」は、上記発現カセットを、宿主
細胞中に伝達するＤＮＡをいう。上記ベクターのタイプおよび使用される各調節
エレメントの種類を宿主細胞に応じて変更し得ることは、当該分野において公知
である。本発明のベクターの好ましいタイプはプラスミドベクターであり、微生
物、動物細胞、または植物細胞に上記発現カセットを伝達可能なベクターである
。植物細胞に伝達し得るものが特に好ましい。
【００２１】
　以下、本発明について詳細に説明する。本発明の実施は、特に記載がない限り
、分子生物学、生化学、遺伝学、遺伝子工学、および植物育種学の従来手法を用
いて実施し得る。
【００２２】
　本発明の方法に従って形質転換される植物は、単子葉植物および双子葉植物を
問わない。本発明において好ましい単子葉植物は、イネ科の植物である。イネ科
の植物としては、例えば、マダケ、チシマザサ、スズタケ、メダケ、イネ、イチ
ゴツナギ、ドジョウツナギ、コメガヤ、カラスムギ、ヌカボ、イヌムギ、カモジ
グサ、オオムギ、パンコムギ、タルホコムギ、ライムギ、ヨシ、カゼクサ、オヒ
シバ、ノガリヤス、シバ、キビ、ヒエ、アワ、メヒシバ、サトウキビ、ススキ、
チガヤ、モロコシ、ハトムギ、トウモロコシなどがある。特に、イネが好ましい
。本発明において好ましい双子葉植物は、ナス科の植物である。ナス科の植物と
しては、クコ、ハシリドコロ、ホオズキ、ナス、ジャガイモ、トマト、トウガラ
シ、タバコ、チョウセンアサガオ、ツクバネアサガオなどがある。特に、タバコ
が好ましい。
【００２３】
　本発明において使用されるチオニン遺伝子は、コムギ、オオムギ、ライムギ、
オートムギ、エンバクなどのムギ類の胚乳または葉由来のチオニンの遺伝子であ
る。あるいは、上記チオニンに類似するタンパク質の遺伝子、例えば、ヤドリギ
由来のビスコトキシンの遺伝子、アビシニアン・マスタードの油種子由来のクラ
ンビンの遺伝子、またはPyrularia pubera（ビャクダン科の寄生植物）の葉およ
び漿果由来のチオニン類似タンパク質の遺伝子（和田および尾崎、植物細胞工学
、３(３)、200-207頁、（1991））を用い得る。本発明において、好ましくは、
エンバク葉由来のチオニン遺伝子が用いられる。
【００２４】
　上記のチオニン遺伝子は単離され、そしてそのヌクレオチド配列は公知である
。それらのヌクレオチド配列はGenBank（登録商標）などの遺伝子配列登録機関
に登録されている。当業者は、遺伝子配列登録機関または遺伝子配列登録機関の
登録配列に基づく各種のデータベース（例えば、DNASISTM）を検索することによ
り、チオニン遺伝子のヌクレオチド配列を入手できる。
【００２５】
　本発明に有用なチオニン遺伝子は、公知のヌクレオチド配列に基づいて、当業
者に公知の方法を用いて種々の植物から直接単離することができる。あるいは、
既に単離され、そしてベクター中にクローン化されているチオニン遺伝子もまた
使用される。あるいは、公知のヌクレオチド配列に基づいて、化学合成した遺伝
子もまた使用される。
【００２６】
　種々の植物からのチオニン遺伝子の単離は、簡単に記載すると、例えば、その
植物のチオニンを発現する細胞からのｍＲＮＡの単離、単離ｍＲＮＡからの遺伝
子（ｃＤＮＡ）ライブラリーの構築、ハイブリダイゼーション法による遺伝子ラ
イブラリーのスクリーニングにより実施することができる。ハイブリダイゼーシ
ョンには、ハイブリダイゼーションプローブとして、公知のヌクレオチド配列に
基づいて化学合成されたポリヌクレオチド、あるいは既にクローン化されている
チオニン遺伝子の全体またはそのフラグメントを用いることができる。これらの
操作の一部は、各操作段階に応じた市販の各種のキットを用いて行うこともでき
る。この一連の操作における条件および手順などは、例えば、Molecular Clonin
g A Laboratory Manual第２版（Sambrook, J.ら編、Cold Spring Harborlabora
tory Press, 1989）およびCurrent Protocols inMolecular Biology（Ausubel,
F.M.ら編、John Wiley & Sons, 1987）などの当該分野の標準的な実験マニュア
ル、および使用するキットの使用説明書に記載されている。
【００２７】
　このようにして得られたチオニン遺伝子は、必要に応じて、その活性および特
異性を変更するため、あるいはその後の遺伝子組換え操作を容易にするためにそ
の配列の一部または領域を改変することができる。このような改変は、部位特異
的変異誘発法またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの当業者に周知の方法
を用いて行うことができる。このようなヌクレオチド配列の改変により、１つ以
上のアミノ酸またはアミノ酸配列領域が変更されることは当業者には明らかであ
る。これらの条件は、当業者の範囲内である。これらの標準的な方法は、上記の
実験マニュアルに記載されている。
【００２８】
　植物細胞内でチオニンを効率的に発現させるための発現カセットは、チオニン
遺伝子のコード領域以外に、チオニン遺伝子をｍＲＮＡに転写するためのプロモ
ーター、そして必要に応じてプロモーターに作用してその転写活性を調節するエ
ンハンサー、および転写されたｍＲＮＡの安定性に関与しているターミネーター
の領域から構成される。
【００２９】
　プロモーターは、導入された植物細胞内でチオニン遺伝子をｍＲＮＡに転写す
ることができれば、特に限定されない。このようなプロモーターは、植物に由来
しないプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス35Ｓ（CaMV35S）
ＲＮＡ、ノパリン合成酵素（nos）、またはオクトピン合成酵素（ocs）のプロモ
ーター）であってもよく、また植物に由来するプロモーター（例えば、カルコン
合成酵素などの二次代謝系の酵素のプロモーター、またはグリシニンなどの貯蔵
タンパク質のプロモーターなど）であってもよい。プロモーターを適切に選択す
ることによって、高い病害抵抗性を示す植物の作出が可能となる。植物でのチオ
ニンの発現を可能にするために好適なプロモーターとしては、例えば、CaMV35S
プロモーターである。CaMV35Sプロモーターは、例えば、pBI121（Clontech）、p
BI221（Clontech）およびpCaMVCN（Pharmacia）などのベクター中にクローン化
されている。本発明において、好ましくは、形質転換植物の細胞内でのチオニン
遺伝子の発現のためにCaMV35Sプロモーターが使用される。
【００３０】
　導入されたチオニン遺伝子の発現レベルは、エンハンサー領域を導入すること
により高くなる。エンハンサー領域は、イントロンなどの非翻訳領域またはプロ
モーター領域内の特定の領域部分であり、用いるプロモーター領域の５'または
３'、あるいはその両方に配置することもできる。エンハンサー領域は、例えば
、CaMV35Sプロモーター内の-343〜-90の領域（Kar, R.ら、Science, 236：1299-
1302, 1987）、Ω配列と呼ばれるタバコモザイクウイルスの５'非翻訳領域（Gal
lie, D.R.ら、Nucl. Acids. Res., 15：3257-3272, 1987）、アルファルファモ
ザイクウイルスの５'非翻訳領域（Jobling, S.A.ら、Nature, 325：622-625, 19
87）、およびインゲンマメファゼオリンのイントロン配列（Slightom, J.L.ら、
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80：1897-1901, 1983）がある。これらのエンハン
サー領域は、単独で使用してもよく、また互いに組み合わせて使用してもよい。
さらに、これらのエンハンサー領域は複数個用いることができる。本発明におい
て、好ましくは、タバコモザイクウイルスのΩ配列、CaMV35Sプロモーター内の
領域、またはインゲンマメファゼオリンのイントロン配列、そしてより好ましく
はそれらすべてが使用される。CaMV35Sプロモーターと組み合わせてそれらエン
ハンサー配列を使用するとき、好ましくは、Ω配列およびインゲンマメファゼオ
リンのイントロン配列はCaMV35Sプロモーターのコア領域（-90〜-1）に対して３
'側に、CaMV35Sプロモーター内の領域のエンハンサー領域は５'側に配置される
。エンハンサー配列の数は、形質転換を行う植物に依存する。
【００３１】
　チオニンの酵素としての発現量（翻訳量）は、チオニン遺伝子の３'に存在す
る３'非翻訳領域（すなわち、ターミネーター）によって変化する（Ow, D.W.ら
、上記）。ポリアデニル化シグナル部位を含むターミネーターをコード領域の３
'に導入することにより、転写されたｍＲＮＡが安定化され、その結果、チオニ
ンの翻訳量が変化する。このようなターミネーターとしては、CaMV35Sターミネ
ーター、ノパリン合成酵素およびオクトピン合成酵素のターミネーターが挙げら
れるが、これらには限定されない。本発明においては、好ましくは、ノパリン合
成酵素ターミネーターが用いられる。
【００３２】
　本発明に使用されるチオニン発現ベクターは、チオニン遺伝子以外に、形質転
換された植物細胞（または植物）の容易な選択を可能にする選択マーカーとなる
形質を付与する遺伝子を含有する。このような遺伝子は、例えば、カナマイシン
およびネオマイシンの両抗生物質に対する耐性のためのネオマイシンホスホトラ
ンスフェラーゼ（ＮＰＴII）遺伝子、ならびにハグロマイシン耐性のためのハイ
グロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）遺伝子である。これらの選択
マーカー遺伝子は、単独で使用してもよく、または２つ以上を組合せて使用して
もよい。本発明において、チオニン発現ベクターは、好ましくは、選択マーカー
遺伝子としてＮＰＴII遺伝子およびＨＰＴ遺伝子を含有する。これらの遺伝子も
また、CaMV35Sプロモーターの制御下にあり、そしてnosターミネーターをその３
'に有する。その結果、得られる形質転換植物は、カナマイシンおよびハイグロ
マイシンの両方に対して耐性を有する。
【００３３】
　本発明に使用されるチオニン発現ベクターは、さらに、必要に応じて、植物細
胞内で安定に発現し得るチオニン遺伝子および選択マーカー遺伝子を含む領域を
植物細胞の染色体内に組み込むための領域（例えば、土壌細菌Agrobacterium tu
mefaciensの感染により腫瘍誘発に関係するＴｉプラスミド由来のＲＢ配列領域
およびＬＢ配列領域）、ならびにAgrobacterium tumefaciens（植物細胞内に発
現ベクターを導入するために使用される）内での複製に必要な領域をさらに含む
。さらに、このような発現ベクターは、このベクター上での遺伝子組換え操作を
容易に行うために、大腸菌（E.coli）での複製および選択可能を可能にするマー
カー（例えば、アンピシリン耐性）遺伝子領域を含み得る。本発明における発現
ベクターは、好ましくは、チオニン遺伝子、選択のための薬剤耐性遺伝子、植物
細胞の染色体内への組み込みを可能にするＲＢおよびＬＢ配列領域、Agrobacter
ium tumefaciens内での複製に必要な領域、ならびに大腸菌での複製および選択
マーカー遺伝子領域を含む。
【００３４】
　このような発現ベクターは、これらの配列領域を既に含む、例えば、Ｔｉプラ
スミドに由来するpBI121（Clontech）などの植物用の発現ベクターを用いて構築
することができる。pBI121（Clontech）は、ＬＢ配列とＲＢ配列に挟まれた領域
内に、いずれも、CaMV35Sプロモーターの制御下のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵ
Ｓ）およびＮＰＴII遺伝子の２つの発現ユニットを有する。
【００３５】
　本発明に使用できるチオニン発現ベクターは、例えば、pBI121（Clontech）の
ＧＵＳ領域をチオニンのコード領域と置換することによって得られる。簡潔に記
載すると、この発現ベクターは、制限酵素（BamHIおよびSacI）消化によりＧＵ
Ｓ領域を除いたpBI121（Clontech）に、制限酵素（BamHIおよびSacI）消化によ
り得られたチオニンのコード領域を挿入することによって作製される。エンハン
サー配列は、例えば、pL11A-A25（Nishiguchi, Mら、Nucl. Acids Res., 13：55
85-5590, 1985）および上記のpBI121（Clontech）から制限酵素による消化、ま
たはこれらをテンプレートとして、適切なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）により得ることができる。その後、これらの配列を、例えば、Hi
ndIII部位を用いて、CaMV35Sプロモーターの５'側に、および／またはBamHI部位
を用いてその３'側に導入することができる。
【００３６】
　あるいは、本発明に使用されるチオニン発現ベクターは、他のクローニングベ
クター（例えば、pUC18およびpBluescriptTM（Stratagene））上で、必要な領域
の特定の部分（例えば、エンハンサー配列を有するプロモーター領域、コード領
域とプロモーター領域および／またはターミネーター領域とを組み合わせた領域
、およびその一部）を構築することができる。そのような部分領域を植物細胞発
現用ベクター（例えば、pBI121（Clontech））へ置換などにより導入することに
より、目的とする最終の植物細胞導入用のチオニン発現ベクターを構築すること
ができる。このように発現ベクターの構築方法は、上記の手順に限定されること
なく、当業者の範囲内である。
【００３７】
　構築されたチオニン発現ベクターのチオニン発現カセットの植物細胞への導入
は、植物に対して感染能を有するAgrobacterium tumefaciensまたはAgrobacteri
um rizogenesなどの土壌細菌を介する方法、エレクトロポレーションによる方法
などの方法を用いて実施することができる。
【００３８】
　Agrobacteriumtumefaciensを介する方法は、植物細胞への感染に先立って、
構築した発現ベクターのAgrobacterium tumefaciensへの導入を必要とする。Agr
obacterium tumefaciensへの構築した発現ベクターの導入は、E.coliに対する方
法と同様な方法、例えば、カルシウム処理による導入、凍結融解法、またはエレ
クトロポレーション法を用いて行われる。導入に必要なAgrobacterium tumefaci
ensの培養は、例えば、ＬＢ培地またはＹＥＢ培地などの培地を用いて、適切な
条件下（例えば、２５〜３０℃で、２４〜３６時間）で行うことができる。
【００３９】
　Agrobacteriumtumefaciensの感染による発現ベクターの植物細胞内への導入
は、植物の種子または組織片（例えば、葉および／または茎の切片）と、発現ベ
クターを含有するAgrobacterium tumefaciensの菌体（または、培養液）とを所
定の時間接触させることにより達成される。葉の切片を用いる方法は、リーフデ
ィスク法として当業者には公知である（例えば、Horsch, R.B.ら、Science 227
：1229,1985）。Agrobacteriumtumefaciensが感染する植物の範囲およびその
効率は、その菌種によって異なる。例えば、Agrobacterium tumefaciens LBA440
4株は、双子葉植物、特にタバコには容易に感染するが、イネなどの単子葉植物
への感染は困難である。これに対して、例えば、Agrobacterium tumefaciens EH
A101株は、LBA4404株と比較して、単子葉植物に対しても十分に高い感染効率を
有する。
【００４０】
　Agrobacteriumtumefaciensの感染を確実にするために、その後、植物の種子
または組織片は、固体培地上に置かれる。この培地には、植物細胞を植物体への
分化／誘導および増殖のために、サイトカイニンおよびオーキシンを組み合わせ
て添加される。サイトカイニンとしては、例えば、カイネチン、ベンジルアデニ
ン、ゼアチン、2-イソペンテニルアデニンが、通常、0.1〜１０ppmの濃度で用い
られる。オーキシンとして、例えば、インドール酢酸、インドール酪酸、2-ナフ
タレン酢酸、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸が、通常、１〜１０ppm濃度で用いら
れる。これらの組み合わせ、およびそれらの濃度は、使用する植物および組織に
依存して変化するが、例えば、下記の実験マニュアルを参考にして、当業者はそ
れらを決定し得る。
【００４１】
　具体的には、発現ベクターを含有するAgrobacterium tumefaciens（例えば、E
HA 101株）の培養液と、種子を培養することによって得たカルスとを混合し、ゆ
っくりと撹拌する（例えば、１５分間）。その後、カルスから植物体を分化／誘
導するために、例えば、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸および糖（通常、３％スク
ロース）を添加した植物組織培養用培地（例えば、ムラシゲ−スクーグ（ＭＳ）
培地、リンスマイヤー−スクーグ（ＬＳ）培地、またはガンボルグＢ５培地など
）の寒天培地上にカルスを置き、その後、例えば、２７℃で３日間培養する。こ
こで使用される培地の組成は、形質転換する植物およびその組織に応じて変化す
ることは、当業者には明らかである。
【００４２】
　その後、感染させたAgrobacterium tumefaciensの除菌処理と合わせて、チオ
ニン遺伝子を含む感染細胞の選択が行われる。
【００４３】
　Agrobacteriumtumefaciensの除菌は、上記の固体培地に抗生物質（例えば、5
00ppmカルベニシリン）をさらに添加した培地を用いて、上記カルスの培養を行
う。発現ベクターが組込まれたカルスの選択は、発現ベクター中に存在する選択
マーカー遺伝子に対応した抗生物質を添加した培地で行われる。例えば、カナイ
マシンまたはハイグロマイシン耐性である場合には、それぞれ、例えば、100ppm
カナイマシン、30ppmハイグロマイシンが使用される。２〜３週間毎に、新しい
選択培地上に移植して、除菌および選択を行うと同時に、不定芽を分化／誘導さ
せる。Agrobacterium tumefaciensの除菌を完全にするために、選択培地での培
養の初期にカルベニシリンをさらに添加してもよい。培養温度は、通常、２０〜
３０℃である。明暗条件は、典型的には、１６時間の明期／８時間の暗期である
。このときの培養条件は植物に応じて変化することは、当業者には明らかである
。形成した不定芽を切り取り、オーキシンおよびサイトカイニンを含まない選択
培地に移し、そして、上記と同様の条件で、さらに培養を続けて発根させる。こ
のようにして得られた幼植物体を馴化し、そして、自然環境下または人工環境下
で通常の土壌で生育できるようする。
【００４４】
　本発明の別の実施態様において、チオニン遺伝子を含む発現カセットの植物細
胞への導入（感染）は、種子の代わりに、植物の組織（例えば、葉）から調製し
たプロトプラストを用いて行うことができる（例えば、Marton, L.ら、Nature 2
77：1229, 1979）。プロトプラストを用いる場合には、エレクトロポレーション
によって、直接、チオニン遺伝子を含む発現ベクターを植物細胞に導入すること
もできる。発現ベクターが導入されたプロトプラストは、細胞壁を再生させるた
めに、適切な条件下で培養される。その後の手順は、上記の種子から得られるカ
ルスの場合と同様の手順を用いて、植物を分化／誘導する。
【００４５】
　このような植物の形質転換の手順は、例えば、Plat Genetic Transformation 
and Gene Expression A Laboratory Manual（Draper,J.ら編、Blackwell Scient
ific Publications, 1988）およびDNA Cloning, apractical approach（Glover
, D.M.ら編、第２巻、IRL Press, 1985）などの実験マニュアルに記載されてい
る。
【００４６】
　本発明の形質転換植物の導入遺伝子を、以下の方法により定性的および定量的
に分析することができる。例えば、チオニン遺伝子を導入した植物の葉を回収し
、液体窒素で凍結して粉砕することを包含する方法（Verwoerd et al., (1989) 
Nucl. Acids Res. 17, 2362）によりｍＲＮＡを回収する。回収したｍＲＮＡを
電気泳動によって分離し、ニトロセルロース膜などに転移し、チオニン遺伝子の
ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズする標識ＤＮＡまたはＲＮＡプローブと反応
させるノーザンブロット解析によって調べることができる。ｍＲＮＡの回収方法
およびノーザンブロット解析方法の条件を、状況に応じて変更し得ることが当業
者には理解される。また、形質転換植物から公知の方法によりタンパク質を回収
し、電気泳動によって分離し、ニトロセルロース膜などに転移し、チオニンに対
する抗体と結合させ、その抗体に特異的な標識抗体（125I標識抗体、ペルオキシ
ダーゼ結合抗IgG）で検出するウェスタンブロット解析によっても調べることが
できる。形質転換植物の導入遺伝子の定性的および定量的な分析は、上記方法に
限定されない。
【００４７】
　本発明の形質転換植物の病害抵抗性を、以下の方法によって検定することがで
きる。例えば、得られた形質転換植物の葉に針、刃などで傷を付け（Mock処理）
、病原菌を含む菌液を接種し、感染によって傷害を受けた部分の面積を同様に処
理した非形質転換植物のそれと比較することにより形質転換植物の抵抗性を検定
することができる。検定条件は、検定される植物種および病原菌種により変更さ
れ得ることが当業者には理解される。検定の際に、組織または細胞を、固定した
後または生きた状態のまま、アニリンブルー（Eschrich W.およびCurrier H.B.
、(1964)Stain Technology 39, 303-307）などの色素で染色することでさらに
容易に比較することができる。あるいは、形質転換植物から得られる種子を、病
原菌液に浸漬した後に土壌にまき、発芽、生育させて正常に生育する個体の数と
、同様に処理した非形質転換植物の種子から生育する個体の数とを比較すること
によっても調べることができる。そのほか、形質転換した植物細胞および非形質
転換植物の細胞を病原菌を加えた培地で所定の期間（例えば、３日）培養し、そ
の生存数を比較することによっても検定することができる。本発明の形質転換植
物の病害抵抗性の検定方法は、上記に限定されないことが当業者には理解される
。
【００４８】
　本発明の形質転換植物は、交配（例えば、自家受粉、形質転換植物間での受粉
または形質転換植物と非形質転換植物との間の受粉）により繁殖のための種子を
形成させることができる。
【００４９】
　さらに、上記の感染細胞からの植物体の分化／誘導の手順を用いて、形質転換
された植物体の組織（例えば、根、茎、葉）または器官（例えば、生長点、花粉
）の組織培養によって、生殖過程（種子）を介することなく、さらなる形質転換
植物を得ることができる。このような技術および手順は、当業者には公知である
。組織培養の一般的な方法は、種々の実験マニュアルに記載されている。
【００５０】
　このようにして得られた本発明の形質転換植物は、形質転換により導入された
チオニン遺伝子により阻害されることなく正常に生育し、かつチオニン遺伝子の
発現によって少なくとも１つの病害に対して高い抵抗性を示す。さらに、形質転
換植物から得られる種子においても正常に発芽、成長し、そして少なくとも１つ
の病害に対して高い抵抗性を示す。これは導入されたチオニン遺伝子が次世代に
おいても保存されることを示し、それゆえ上記病害抵抗性が安定して後代に受け
継がれることを示す。従って、本発明により、高い病害抵抗性を示す実用的で有
用な植物が得られる。
【００５１】
　以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は実施例のみに限定される
ものではない。
【実施例】
【００５２】
＜実施例１＞
形質転換イネ（チヨホナミ）の作出
（１）チオニン遺伝子の調製
　チオニンのｃＤＮＡクローンＬＴＨ９２（特開平８−２６６２７９）、および
既知のチオニンの塩基配列の保存された領域（5'領域および酸性タンパク質領域
）に基づいて合成された、配列番号１および２によって示される以下の配列：
正方向：5'-AATCAAGCTTCCAAGTAGAAGGCAAGAGTTGC-3'　（配列番号１）
逆方向：5'-AGTCTCTAGAGTCCATGTTGTCACAGACGG-3'　（配列番号２）
を有する２組のプライマーを用いて、ＰＣＲによりチオニンｃＤＮＡにBamHI、S
acIの制限酵素部位を付加したチオニン遺伝子を得た。
【００５３】
　ＰＣＲの反応系は、0.5μlのTaqポリメラーゼ（５U/ml）、５μlの10×緩衝液
（100mMTris (pH 8.3)、500mMKCl、１％TritonX100）、４μlの2.5mM MgCl2
、４μlの10mMｄＮＴＰ、1.25μlの上記の各プライマー（10pmol）、および約5
00ngのｃＤＮＡを、蒸留水で５０μlに調製した系を用いた。ＰＣＲの反応条件
としては、９４℃で２分間の変性反応を１回行った後、９４℃で１分間の変性反
応、５０℃で１分間のアニーリング反応、７２℃で２分間の伸長反応からなるサ
イクルを25回繰り返し、最後に７２℃で５分間の追加の伸長反応を行う条件を用
いた。
（２）チオニン発現カセットおよび発現ベクタ−の構築
　pE7133GUS（Mitsuharaら、Plant Cell Physiol.,37(1):49-59(1996)）を制限
酵素HindIII/BamHIで消化し、アガロース電気泳動により分離し、GeneClean2(B
IO101)によりプロモーターカセット部分を得た。また、pBI121(Clontech)を制限
酵素HindIII/BamHIで消化し、アガロース電気泳動により分離し、GeneClean2(B
IO101）によりベクター部分を得た。これらをTakara Ligation Kit(Takara)を用
いて連結し、pBE7133GUSを得た。
【００５４】
　次に、pFF19(Timmermans, M.C.P.ら、J. Biotechnol., 14：333-344, 1990)を
BamHI/SacIで制限酵素消化することにより、CaMV35SプロモーターおよびCaMV35S
ターミネーターを含むハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）遺
伝子を単離した。得られたＨＰＴ遺伝子フラグメントの両端を平滑化した後にSm
aIリンカーを連結し、そしてSmaIのアイソシゾマーの制限酵素Cfr9Iで消化した
。その後、このＨＰＴ遺伝子フラグメントをpBE7133GUSのＧＵＳ遺伝子の３'に
位置するCfr9I部位に挿入して、pBE7133GUS-HPTを得た。
【００５５】
　次に、pBE7133GUS-HPTをBamHI/SacIの制限酵素で消化して、ＧＵＳのコード領
域を除き、上記で得られたチオニン遺伝子を挿入して、チオニン発現ベクターpB
E7133H-Thioninを得た。pBE7133H-Thionin中のＮＰＴII遺伝子を制御するCaMV35
Sプロモーターからチオニン遺伝子を挟んでＨＰＴ遺伝子の３’側に位置するnos
ターミネーターまでの部分をチオニン発現カセットと称する。
（３）チオニン発現カセットのAgrobacterium tumefaciens EHA101株への導入
　Agrobacteriumtumefaciens EHA101株（東北大学農学部植物育種学研究室より
入手）を、５mlのＹＥＢ培地（0.1％酵母抽出物、0.5％肉抽出物、0.5％ペプト
ン、0.5％スクロース、0.05％MgSO4・7H2O）で３０℃で一晩振盪培養した。次い
で、１リットルフラスコ中で200mlのＹＥＢ培地に５mlの上記培養物を加え、さ
らに３０℃で５〜６時間培養した。遠心分離（4000rpmで５分間）により菌体を
集め、そして100mlの10mM Tris-HCl（pH 8.0）中に懸濁した。再度、遠心分離を
行い、得られた菌体を２mlのＹＥＢ培地中に懸濁した。微量遠心チューブ中でこ
の懸濁液の200μlと0.5μgのpBE7133H-Thioninを含む100μlのＤＮＡ溶液とを混
合し、ドライアイス／エタノール浴中で凍結させた（５分間）。次いで、３７℃
の温浴中で融解し、25分間放置した。その後、２ｍｌのＹＥＢ培地を添加し、３
０℃で１時間、振盪培養した。100μlの培養液をカナマイシン（５０μg／ml）
およびハイグロマイシン（５０μg／ml）を含有するＹＥＢ培地上に塗布し、そ
して３０℃で約３６時間の培養によりAgrobacterium tumefaciens EHA101株の耐
性菌を得た。このAgrobacterium tumefaciens EHA101株中のチオニン発現カセッ
トをアルカリ−ＳＤＳ法により単離して、制限酵素分析によりその存在および構
造を確認した。
（４）イネの形質転換
　滅菌したイネの種子を、２mg/mlの2.4-ジクロロフェノキシ酢酸（以下2.4-Ｄ
）を含むＭＳ培地（T. Murashige et al., Physiol. Plant., 15, 473 (1962)）
で２７℃で２週間培養し、カルスを形成させた。このカルスを共存培地（２mg/m
l 2.4-Ｄおよび１g/l カザミノ酸を含むＭＳ培地）に移植し、２７℃で培養を行
った。培養３日目に、カナマイシンおよびハイグロマイシンを含むＹＥＢ培地で
上記チオニン発現カセットを含むAgrobacterium tumefaciens EHA101株を増殖さ
せ、遠心分離した。ペレット化した菌体をＬＢ培地に懸濁させた後、アセトシリ
ンゴンを添加して感染用のAgrobacterium tumefaciens EHA101株菌液を作製した
。この菌液を３０℃で２０分間保温した。培養４日目に感染用Agrobacterium tu
mefaciens EHA101株菌液に上記カルス塊を加え、３０℃で１５分間緩やかに撹拌
して、このカルス塊を感染させた。１５分後にカルスを回収し、共存培地に置床
した。27℃、16時間日長で３日間培養し、次いで、カルベニシリンを含むＬＢ培
地にて30℃で１時間培養し、その後、カルスのみを回収して選抜（増殖）培地（
500mg/l カルベニシリン、50mg/l ハイグロマイシンを含む共存培地）に置床し
た。これを、27℃、16時間日長で２週間培養した。新たに増殖してきた黄白色の
カルスを選抜（再分化前処理）培地（１mg/l 2.4-Ｄ、0.5mg/l BAP、２g/l カザ
ミノ酸、20g/l ショ糖、30g/l ソルビトール、500mg/l カルベニシリン、100mg/
l ハイグロマイシンを含むＮ６培地）に移植し、約２週間培養した後、選抜（再
分化）培地（0.01mg/l β-ナフタレン酢酸(NAA)、0.1mg/l BAP、１g/l カザミノ
酸、500mg/lカルベニシリン、100mg/lハイグロマイシンを含むＮ６培地）に移
植した。約２〜３週間で再分化した形質転換イネが得られた。
＜実施例２＞
イネ白葉枯病に対するイネ（チヨホナミ）の抵抗性の検定
　イネ白葉枯病に対する抵抗性検定は、ハイグロマイシンで選択して得られた形
質転換イネの自殖第１世代系統2-1、同系統11-2および同系統13-3の葉ならびに
非形質転換イネの葉を用いて行った。イネの葉に短針を用いて２カ所傷を付け、
1×107cfu/mlのイネ白葉枯病菌を含む細菌懸濁液を用いてイネ白葉枯病菌を接種
した。２週間栽培後、イネ白葉枯病菌の感染によって傷害を受けた葉の面積を肉
眼で評価した。イネ白葉枯病に対する抵抗性の指標として、野田ら（「北陸農試
報告」1989年）の葉身針接種によるイネ白葉枯病発病指数を用いた。
【００５６】
　イネ白葉枯病菌を接種した非形質転換イネにおいては、発病指数が4.4であっ
たのに対し、同じくイネ白葉枯病菌を接種した形質転換イネ自殖第１世代系統2-
1では1.8、同系統11-2では0.8、同系統13-3では2.2であった。形質転換イネは、
イネ白葉枯病に対して高い病害抵抗性を示した。結果を図１および図２に示す。
図１は、イネ白葉枯病菌に対する抵抗性をイネ白葉枯病発病指数を用いて示した
グラフである。各個体の葉についてそれぞれ８枚ずつ検定し、イネ白葉枯病発病
指数を決定して、その平均値をグラフで示した。図２は、上記抵抗性検定の結果
を示す写真である。上段の葉は、イネ白葉枯病菌を接種した形質転換イネ自殖第
１世代系統2-1の葉を示し、下段の葉は、イネ白葉枯病菌を接種した非形質転換
イネの葉を示す。
＜実施例３＞
イネ苗立枯細菌病に対するイネ（チヨホナミ）の抵抗性の検定
　イネ苗立枯細菌病に対する抵抗性検定は、形質転換イネ自殖第２世代系統2-1.
1および同系統11-2.1から得られた種子ならびに非形質転換イネから得られた種
子を用いて行った。1×106cfu/mlのイネ苗立枯細菌病菌懸濁液中で、イネの種子
を、１時間吸引し、３時間浸漬し、その後室温で一晩風乾した。浸種を、２０℃
で３日間、２倍量のイオン交換水中で行い、催芽を３０℃の高湿度下で１日行っ
た。その後、水稲育苗用培土に、ミニカップ当たり２４粒の種子を播種し、３０
℃、高湿度、暗黒化で出芽を３日間行い、その後閉鎖系温室内で栽培した。抵抗
性は、播種後約１０日目に、上記種子から正常に生育する個体の数および苗立ち
率を比較することにより検定した。
【００５７】
　非形質転換イネから得られた種子をイネ苗立枯細菌病菌で感染させた場合、す
べての個体が出芽後間もなく枯死した。これに対して、形質転換イネ自殖第２世
代系統2-1.1から得られた種子をイネ苗立枯細菌病菌で感染させた場合、播種し
た種子は７５％の苗立ち率を示し、正常に生育した。また、同系統11-2.1の場合
でも播種した個体は９６％の苗立ち率を示し、同様に正常に生育した。形質転換
イネは、イネ苗立枯細菌病に対して高い病害抵抗性を示した。結果を表１および
図３に示す。図３は、上記抵抗性検定の結果を示す写真である。左の植物は、イ
ネ苗立枯細菌病菌を接種していない非形質転換イネを示し、中央の植物は、イネ
苗立枯細菌病菌を接種した形質転換イネ系統2-1.1を示し、右の植物は、イネ苗
立枯細菌病菌を接種した非形質転換イネを示す。
【００５８】
【表１】
2004041209.tif 000002
【００５９】
＜実施例４＞
形質転換タバコ（Nicotiana tabacum Sammsun NN）の作出
　チオニン遺伝子の調製ならびにチオニン発現カセットおよび発現ベクターの構
築は実施例１と同様に行った。
（１）チオニン発現カセットのAgrobacterium tumefaciens LBA4404株への導入
　Agrobacteriumtumefaciens LBA4404株(Clontech)を２５０μg/mlのストレプ
トマイシンおよび５０μg/mlのリファンピシンを含むＬＢ培地（１０g/lバクト
トリプトン、５g/l酵母エキストラクト、１０g/l NaCl（pH7.2））中で２８℃で
培養した。Nagelら（Microbiol. Lett., 67, 325 (1990)）の方法に従って、Agr
obacterium tumefaciens LBA4404株の細菌懸濁液を調製し、実施例１（２）で作
製したチオニン発現ベクターpBE7133H-Thioninをエレクトロポレーションにより
上記菌株に導入した。Agrobacterium tumefaciens LBA4404株中のチオニン発現
カセットをアルカリ−ＳＤＳ法により単離して、制限酵素分析によりその存在お
よび構造を確認した。
（２）タバコの形質転換
　上記で得られたチオニン発現カセットを含むAgrobacterium tumefaciens LBA4
404株をＹＥＢ培地で２８℃で一晩振盪培養した。タバコ植物体より完全に伸長
した葉を切り取り滅菌した。滅菌した葉をペーパーパンチで切り取ってリーフデ
ィスクを作製し、このリーフディスクを滅菌水で２０倍に希釈した上記培養液に
浸し、１〜２分間、緩やかに浸透した。浸透後、リーフディスクをＭＳ培地で２
７℃で２日間培養した。培養後にリーフディスクをカルベニシリンを含むＭＳ寒
天培地上に移し、照明下、２６℃で１週間培養して、リーフディスクからAgroba
cterium tumefaciens LBA4404株を除いた。除菌したリーフディスクをカルベニ
シリン、カナマイシン、およびハイグロマイシンを含むＭＳ寒天培地で２週間ご
とに継代培養し、形質転換したリーフディスクを選択した。このリーフディスク
から常法によりカルスを誘導し、タバコ植物体へと再分化させた。
＜実施例５＞
ジャガイモ疫病に対するタバコ（Nicotiana tabacum Sammsun NN）の抵抗性の検
定
　ジャガイモ疫病に対する抵抗性検定は、上記で得られた形質転換タバコの当代
系統４、５、１５、１８、４１、および４４の葉ならびに非形質転換タバコの葉
を用いて行った。ジャガイモ疫病菌をＰＤＡ培地（Tifco）にて１８〜２０℃で
約１週間培養し、得られた菌叢を直径３mmのコルクボーラーで打ち抜いて、ジャ
ガイモ疫病菌寒天ブロックを作製した。この寒天ブロックを上記の葉の上に菌叢
と葉とが接するように置いてジャガイモ疫病菌を接種し、２７℃で保温した。ジ
ャガイモ疫病菌による葉の病斑の面積を、２〜３日後に肉眼で評価した。
【００６０】
　ジャガイモ疫病菌を接種した非形質転換タバコにおいては病斑面積が976mm2で
あったのに対し、同じくジャガイモ疫病菌を接種した形質転換タバコ当代系統４
では48mm2、同系統４４では57mm2、同系統１８では40mm2であった。さらに、同
系統５、１５、および４１においてはジャガイモ疫病菌による傷害をほとんど受
けなかった。このように、形質転換タバコは、ジャガイモ疫病に対して高い病害
抵抗性を示した。結果を図４および図５に示す。図４は、ジャガイモ疫病菌に対
する抵抗性を病斑面積により示したグラフである。各個体の葉の上で４点ずつ検
定し、ジャガイモ疫病菌による病斑面積の平均値をグラフで示した。図５は、上
記抵抗性検定の結果を示す写真である。ジャガイモ疫病菌の接種３日後の各固体
の状態を示している。左から、ジャガイモ疫病菌を接種した非形質転換タバコ（
SNN）の葉、ジャガイモ疫病菌を接種した形質転換タバコ当代系統４（M7TH４）
および５（M7TH５）の葉を示す。
（配列表）
【表２】
2004041209.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】チオニン遺伝子を導入した形質転換イネのイネ白葉枯病に対する抵抗性を病斑指数により示したグラフ。
【図２】チオニン遺伝子を導入した形質転換イネのイネ白葉枯病に対する抵抗性検定の結果を示す写真。
【図３】チオニン遺伝子を導入した形質転換イネのイネ苗立枯細菌病に対する抵抗性検定の結果を示す写真。
【図４】チオニン遺伝子を導入した形質転換タバコのジャガイモ疫病菌に対する抵抗性を病斑面積により示したグラフ。
【図５】チオニン遺伝子を導入した形質転換タバコのジャガイモ疫病菌に対する抵抗性検定の結果を示す写真。
【図１】
2004041209.tif 000004
【図２】
2004041209.tif 000005
【図３】
2004041209.tif 000006
【図４】
2004041209.tif 000007
【図５】
2004041209.tif 000008