(57)【要約】【課題】医薬品の中間体として有用な４−ヒドロキシインドールを安価な原料から簡便に製造する方法を提供する。【解決手段】微生物存在下に、インドールの４位を水酸化するか、又は、１−ベンゾイルインドールの４位を水酸化及び１位を脱ベンゾイル化することを特徴とする４−ヒドロキシインドールの製造法。【選択図】　なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンブロシオジーマ属、キャンディダ属、ディポダスカス属、ガラクトマイセス属、クリベロマイセス属、クライシア属、メッチニコビア属、オガタエア属、パチソレン属、ピキア属、ロドトルーラ属、バシラス属、ノカルディア属、シュードモナス属、ロドコッカス属、又はロイコノストック属に属する微生物の培養物またはその処理物の存在下、下記式（１）；
【化１】
2004041131.tif 000009
で表されるインドールの４位を水酸化することを特徴とする下記式（２）；
【化２】
2004041131.tif 000010
で表される４−ヒドロキシインドールの製造法。
【請求項２】
微生物が、アンブロシオジーマ・プラチポディス、キャンディダ・アルビカンス、キャンディダ・ケフィル、キャンディダ・マルトサ、キャンディダ・モギー、キャンディダ・ノルベゲンシス、キャンディダ・サイトアナ、ディポダスカス・オベテンシス、ガラクトマイセス・レッシー、クリベロマイセス・マルキアヌス、クライシア・カプスラタ、メッチニコビア・グレッシー、オガタエア・ミヌタ・バー・ノンファーメンタンス、パチソレン・タノフィラス、ピキア・ジャディニー、ピキア・ロダネンシス、ピキア・ビカーハミー、ロドトルーラ・グラミニス、バシラス・コアグランス、ノカルディア・フスカ、シュードモナス・オキサラチカス、ロドコッカス・エクイ、ロドコッカス・ロドクロウス、又はロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・メセンテロイデスである請求項１記載の製造法。
【請求項３】
ブラチスポリウム属、クラミドマイセス　属、グロエオフィラム属、又はアスペルギルス属に属する微生物の培養物またはその処理物の存在下、下記式（３）；
【化３】
2004041131.tif 000011
で表される１−ベンゾイルインドールの４位を水酸化及び１位を脱ベンゾイル化することを特徴とする下記式（２）；
【化４】
2004041131.tif 000012
で表される４−ヒドロキシインドールの製造法。
【請求項４】
微生物が、ブラチスポリウム・ニグラム　、クラミドマイセス・パルマラム、又はグロエオフィラム・セピアリウムである請求項３記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬品、農薬などの合成原料として有用な４−ヒドロキシインドールの製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、４−ヒドロキシインドールの製造方法としては、以下のような方法が知られている。
１）シクロヘキサン−１，３−ジオンとハロゲノピルビン酸エステルを塩基性化合物の存在下に反応さた後、加水分解及び脱水せしめて得られる４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロクマロン−３−カルボン酸をアンモニアと反応させて４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロインドールとし、さらにこれをパラジウムカーボン等の触媒の存在下に脱水素して４−ヒドロキシインドールを得る方法（特開２０００−４４５５５）。
２）３−ニトロフェノールと塩素酸ナトリウムを酸化合物の存在下に反応せしめて得られた２−クロロ−３−ニトロフェノールと塩化ベンジルを塩基化合物の存在下で反応せしめて２−クロロ−３−ニトロフェニルベンジルエーテルを得る。次いでこれとシアノ酢酸エチルエステルを無水第３ブチルアルコールの存在下に反応せしめて６−ベンジルオキシ−２−ニトロベンジルシアノ酢酸エステルを得、これとジメチルホルムアミドを反応せしめて６−ベンジルオキシ−２−ニトロベンジルシアニドを得る。さらに、これをパラジウムカーボン等の触媒の存在下に水素添加して４−ヒドロキシインドールを得る方法（特開昭５６−１１５７７１）。
【０００３】
しかし上記の方法は、いずれも出発物質から多段階の工程を経て合成されること、高価な触媒を大量に必要とすることなど種々の問題点を有しており、工業的に有利な方法とは言えない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、医薬品、農薬の合成原料として有用な４−ヒドロキシインドールを安価な材料から簡便に製造する方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、安価で入手容易なインドールの４位を水酸化して４−ヒドロキシインドールを与える微生物群、及び、１−ベンゾイルインドールの４位を水酸化及び１位を脱ベンゾイル化して４−ヒドロキシインドールを与える微生物群を見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、下記式（１）；
【０００７】
【化５】
2004041131.tif 000002
【０００８】
で表されるインドールの４位を水酸化する活性を有する微生物の菌体あるいは培養物の存在下、前記式（１）で表されるインドールの４位を水酸化することを特徴とする下記式（２）；
【０００９】
【化６】
2004041131.tif 000003
【００１０】
で表される４−ヒドロキシインドールの製造法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、下記式（３）；
【００１２】
【化７】
2004041131.tif 000004
【００１３】
で表される１−ベンゾイルインドールの４位を水酸化する活性及び１位を脱ベンゾイル化する活性を有する微生物の菌体あるいは培養物の存在下、前記式（３）で表される１−ベンゾイルインドールの４位を水酸化及び１位を脱ベンゾイル化することを特徴とする下記式（２）；
【００１４】
【化８】
2004041131.tif 000005
【００１５】
で表される４−ヒドロキシインドールの製造法を提供する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明の原料である前記式（１）で表されるインドールは工業的に安価で入手可能である　。また、前記式（３）で表される１−ベンゾイルインドールは、インドールと塩化ベンゾイルを水酸化カリウム等の塩基性化合物の存在下に反応させることにより、容易に合成することができる。
【００１８】
本発明では、インドールの４位を水酸化する活性を有する微生物、または、１−ベンゾイルインドールの４位を水酸化及び１位を脱ベンゾイル化する活性を有する微生物を用いて４−ヒドロキシインドールを製造する。
【００１９】
本発明に使用できる、インドールの４位を水酸化する活性を有する微生物としては、例えば、アンブロシオジーマ（Ａｍｂｒｏｓｉｏｚｙｍａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ　）属　、ディポダスカス（Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ　）属、ガラクトマイセス（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ　）属、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　）属、クライシア（Ｋｕｒａｉｓｈｉａ　）属、メッチニコビア（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ　）属、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属、パチソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ　）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ　）属、ロドトルーラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ　）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　）属、又はロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　）属に属する微生物が挙げられる。好ましくは、アンブロシオジーマ・プラチポディス（Ａｍｂｒｏｓｉｏｚｙｍａ　ｐｌａｔｙｐｏｄｉｓ）ＩＦＯ１４７１、キャンディダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）ＩＦＯ０７５９、キャンディダ・ケフィル（Ｃａｎｄｉｄａｋｅｆｙｒ）ＩＦＯ０００８、キャンディダ・マルトサ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｍａｌｔｏｓａ）ＩＦＯ１９７６、キャンディダ・モギー（Ｃａｎｄｉｄａ　ｍｏｇｉｉ）ＩＦＯ０４３６、キャンディダ・ノルベゲンシス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｎｏｒｖｅｇｅｎｓｉｓ）ＩＦＯ１０２０、キャンディダ・サイトアナ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｓａｉｔｏａｎａ）ＩＦＯ０３８０、ディポダスカス・オベテンシス（Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ　ｏｖｅｔｅｎｓｉｓ）ＩＦＯ１２０１、ガラクトマイセス・レッシー（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｅｅｓｓｉｉ）ＩＦＯ１０８２３、クリベロマイセス・マルキアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｍａｒｘｉａｎｕｓ）ＩＦＯ０５４１、クライシア・カプスラタ（Ｋｕｒａｉｓｈｉａ　ｃａｐｓｕｌａｔａ）ＩＦＯ０７２１、メッチニコビア・グレッシー（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ　ｇｒｕｅｓｓｉｉ）ＩＦＯ０７４９、オガタエア・ミヌタ・バー・ノンファーメンタンス（Ｏｇａｔａｅａ　ｍｉｎｕｔａ　ｖａｒ．　ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）ＩＦＯ１４７３、パチソレン・タノフィラス（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ　ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ）ＩＦＯ１００７、ピキア・ジャディニー（Ｐｉｃｈｉａ　ｊａｄｉｎｉｉ）ＩＦＯ　０９８７、ピキア・ロダネンシス（Ｐｉｃｈｉａ　ｒｈｏｄａｎｅｎｓｉｓ）ＩＦＯ１２７２、ピキア・ビカーハミー（Ｐｉｃｈｉａ　ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ）ＩＦＯ１２７８、ロドトルーラ・グラミニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｇｒａｍｉｎｉｓ）ＩＦＯ０１９０、バシラス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＩＦＯ３８８６、ノカルディア・フスカ（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｆｕｓｃａ）ＩＦＯ１４３４０、シュードモナス・オキサラチカス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｘａｌａｔｉｃｕｓ）ＩＦＯ１３５９３、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕｉ）ＪＣＭ１３１３、ロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＩＦＯ３３３８、又はロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｓｕｂｓｐ．　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＩＦＯ３４２６等の微生物が挙げられる。
【００２０】
また、１−ベンゾイルインドールの４位を水酸化及び１位を脱ベンゾイル化する活性を有する微生物としては、例えば、ブラチスポリウム（Ｂｒａｃｈｙｓｐｏｒｉｕｍ　）属、クラミドマイセス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｙｃｅｓ　）属、グロエオフィラム（Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、又はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する微生物が挙げられる。好ましくは、アスペルギルス・パラシチカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）ＩＦＯ４３０１、アスペルギルス・ソヤエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）ＩＦＯ４３８６、アスペルギルス・ソヤエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）ＩＦＯ４２７９、アスペルギルス・ソヤエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）ＩＡＭ２６３１、アスペルギルス・ソヤエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）ＩＦＯ４２３９、アスペルギルス・ソヤエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）ＩＦＯ４２４１、アスペルギルス・ソヤエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）ＩＦＯ４２４３、アスペルギルス・ソヤエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）ＩＦＯ４２４４、アスペルギルス・ソヤエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）ＩＦＯ４２５２、アスペルギルス・ソヤエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）ＩＦＯ４２７４、アスペルギルス・ソヤエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）ＩＦＯ４３９１、アスペルギルス・ソヤエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）ＩＦＯ４４０３、アスペルギルス・ソヤエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）ＩＦＯ５２４１、アスペルギルス・ソヤエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）ＩＡＭ２６６９、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔｅｒｒｅｕｓ）ＩＦＯ５４４５、ブラチスポリウム・ニグラム（Ｂｒａｃｈｙｓｐｏｒｉｕｍ　ｎｉｇｒｕｍ）ＩＦＯ９５８８、クラミドマイセス・パルマラム（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｍａｒｕｍ）ＩＦＯ８８６１、又はグロエオフィラム・セピアリウム（Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ　ｓｅｐｉａｒｉｕｍ）ＩＦＯ４９４４等の微生物が挙げられる。
【００２１】
これらの微生物は一般に入手または購入が容易な保存株から得ることや、自然界から分離することができる。また、これらの微生物に変異を生じさせてより本反応に有利な性質を有する変異株を得ることもできる。更に、上記微生物に由来する酵素を高生産するように形質転換された形質転換微生物を利用することもできる。形質転換微生物の作成方法としては、当該分野において周知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）に記載されている。
【００２２】
上記微生物を培養する為の培地は、その微生物が増殖し得るものである限り特に限定されない。例えば、炭素源として、グルコース、シュークロース等の糖質、エタノール、グリセロール等のアルコール類、オレイン酸、ステアリン酸等の脂肪酸及びそのエステル類、菜種油、大豆油等の油類、窒素源として、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、ふすま、酵母エキスなど、無機塩類として、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウムなど、他の栄養源として、麦芽エキス、肉エキス等を含有する通常の液体培地が使用され得る。培養は好気的に行い、通常、培養時間は１〜５日間程度、培地のｐＨは３〜９、培養温度は１０〜５０℃で行い得る。
【００２３】
本発明の反応は適当な溶媒中に基質であるインドール又は１−ベンゾイルインドール、補酵素ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、及び、上記微生物の培養物またはその処理物を添加し、ｐＨ調整下攪拌することにより行い得る。ここで、培養物とは微生物の培養液、培養液から遠心分離等によって分離された菌体、菌体を緩衝液等に懸濁した懸濁液等を表し、その処理物とは凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体の破砕物、無細胞抽出液、精製酵素等を表す。更にそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化して得た固定化酵素としても用いられ得る。
【００２４】
反応条件は用いる微生物、基質濃度等によって異なるが、通常、基質濃度は約０．０１〜１０重量％、反応温度は１０〜５０℃、反応のｐＨは２〜１０、反応時間は１〜７２時間で行い得る。基質は一括、または連続的に添加し得る。反応はバッチ方式または連続方式で行い得る。
【００２５】
また反応は、一般に用いられるＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの再生系を組み合わせて用いる事により、高価な補酵素の使用量を大幅に減少させ得る。代表的なＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの再生系としては、例えば、グルコース脱水素酵素及びグルコースを用いる方法が挙げられる。
【００２６】
反応で生じた４−ヒドロキシインドールは、常法により精製され得る。例えば、必要に応じ遠心分離、濾過等の処理を施して菌体等の懸濁物を除去し、次いで一般的な抽出溶剤、例えば酢酸エチル、トルエン等の有機溶剤で抽出し、有機溶剤を減圧下で除去し、そして減圧蒸留またはクロマトグラフィー等の処理を行う事により精製され得る。
【００２７】
【実施例】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２８】
（実施例１）酵母を用いたインドールからの４−ヒドロキシインドールの製造表１に示した微生物を、試験管中で滅菌した５ｍｌの培地Ａ（グルコース４０ｇ、イーストエキス３ｇ、リン酸二水素カリウム７ｇ、リン酸水素二アンモニウム１３ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．８ｇ、硫酸第一鉄七水和物０．０９ｇ、硫酸亜鉛七水和物０．０６ｇ、硫酸マンガン七水和物０．０１ｇ、硫酸銅五水和物０．００５ｇ、塩化ナトリウム０．１ｇ、水１ｌ、滅菌前ｐＨ６．５）に接種し、２８℃で３日間振とう培養した。培養終了後、培養液０．５ｍｌから遠心分離により菌体を分離・回収した。分離した微生物の菌体に反応液Ａ（インドール２ｇ、グルコース１０ｇ、ＮＡＤ１ｇ、ＮＡＤＰ１ｇ、２−ケトグルタル酸３．７ｇ、アスコルビン酸ナトリウム６ｇ、グルコース脱水素酵素３０ｋｕ、０．２Ｍカリウム−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｌ）０．２５ｍｌを加えて懸濁し、３０℃で２４時間振とうした。反応終了後、菌体反応液に酢酸エチル０．７５ｍｌを加えて抽出し、減圧濃縮した。得られた濃縮物をＨＰＬＣにより分析し、高速液体クロマトグラフィーにて生成した４−ヒドロキシインドールの収率を調べた結果を表１に示した。
高速液体クロマトグラフィー分析条件
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ　５Ｃ１８−ＡＲＩＩ（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、ナカライテスク社製）、溶離液：メタノール／１０ｍＭカリウム−リン酸緩衝液（ｐＨ２．５）＝１／９、流速：１．５ｍｌ／分、温度：４５℃、検出波長：２５４ｎｍ
【００２９】
【表１】
2004041131.tif 000006
【００３０】
（実施例２）細菌を用いたインドールからの４−ヒドロキシインドールの製造表２に示した微生物を、試験管中で滅菌した５ｍｌの培地Ｂ（ポリペプトン１０ｇ、イーストエキス５ｇ、肉エキス５ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、水１ｌ、滅菌前ｐＨ７．０）に接種し、２８℃で３日間振とう培養した。培養終了後、培養液１ｍｌから遠心分離により菌体を分離・回収した。分離した微生物の菌体に反応液Ｂ（インドール２ｇ、グルコース１０ｇ、ＮＡＤ１ｇ、ＮＡＤＰ１ｇ、２−ケトグルタル酸３．７ｇ、グルコース脱水素酵素３０ｋｕ、０．２Ｍカリウム−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｌ）０．２ｍｌを加えて懸濁し、３０℃で２４時間振とうした。反応終了後、菌体反応液に酢酸エチル０．６ｍｌを加えて抽出し、減圧濃縮した。得られた濃縮物をＨＰＬＣにより分析し、高速液体クロマトグラフィーにて生成した４−ヒドロキシインドールの収率を調べた結果を表２に示した。
【００３１】
【表２】
2004041131.tif 000007
【００３２】
（実施例３）１−ベンゾイルインドールからの４−ヒドロキシインドールの製造
表３に示した微生物を、試験管中で滅菌した７ｍｌの培地Ｃ（グルコース２０ｇ、イーストエキス５ｇ、リン酸水素二カリウム１ｇ、リン酸水素二アンモニウム２ｇ、塩化カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．５ｇ、硫酸第一鉄七水和物０．１ｇ、炭酸カルシウム３ｇ、水１ｌ、滅菌前ｐＨ６．５）に接種し、２８℃で３日間振とう培養した。培養終了後、培養液７ｍｌに１−ベンゾイルインドール７ｍｇ及び反応液Ｃ（グルコース５０ｇ、ＮＡＤ１ｇ、ＮＡＤＰ１ｇ、グルコース脱水素酵素１００ｋｕ、１Ｍカリウム−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｌ）０．７ｍｌを加え、３０℃で３日間振とうした。反応終了後、菌体反応液に酢酸エチル１４ｍｌを加えて抽出し、減圧濃縮した。得られた濃縮物をＨＰＬＣにより分析し、高速液体クロマトグラフィーにて生成した４−ヒドロキシインドールの収率を調べた結果を表３に示した。
【００３３】
【表３】
2004041131.tif 000008
【００３４】
【発明の効果】
本発明の方法により、医薬品中間体として有用な４−ヒドロキシインドールを安価な原料から簡便に製造する事ができる。